FR 3115681 A1 20220506 FR 2011304 A 20201104 L’invention a trait au domaine des vaccins thérapeutiques. Elle concerne plus particulièrement un vaccin thérapeutique pour traiter les individus porteurs d’une maladie ou d’un pathogène qui n’atteint pas le cerveau, telle que la Leishmaniose. Figure de l’abrégé : 1 VACCIN THERAPEUTIQUE COMPRENANT UN ANTIGENE SPECIFIQUE D’UNE MALADIE N’ATTEIGNANT PAS LE SYSTEME NERVEUX CENTRAL ET DES NANOPARTICULES ET SON UTILISATION L’invention a trait au domaine des vaccins thérapeutiques. Elle concerne plus particulièrement un vaccin thérapeutique pour traiter les maladies n’atteignant pas le cerveau, telle que la leishmaniose. Domaine de l’invention La vaccination thérapeutique consiste à induire une réponse immunitaire, lorsque cette dernière est insuffisante pour permettre la guérison spontanée. L’activation du système immunitaire nécessite d’une part qu’il reconnaisse l’intrus et, d’autre part, qu’il le considère comme dangereux, puis qu’une réponse appropriée soit induite. La stratégie thérapeutique est très différente de celle de la vaccination prophylactique. Cette solution thérapeutique est basée sur le fait que le pathogène soit déjà présent dans l’organisme. Lors d’une infection, les défenses immunitaires sont souvent débordées par la prolifération infectieuse ou freinées par les mécanismes de contrôle internes. Les principaux vaccins thérapeutiques développés à ce jour ont pour objectif le traitement du cancer. Ils consistent généralement en une injection de l’antigène tumoral et/ou injection de cellules dendritiques différenciées et/ou lymphocytes T. Les vaccins thérapeutiques sont intéressants puisqu’ils constituent une solution thérapeutique efficace pour des individus déjà porteurs de la maladie. Ils permettent également dans le cas de certaines pathologies, de générer des réponses immunitaires non induites par les vaccins prophylactiques classiques. La leishmaniose est une maladie parasitaire touchant de nombreuses espèces de mammifères et notamment l’homme et le chien. On estime à 2,5 millions le nombre de chiens domestiques affectés par la leishmaniose canine, notamment dans le bassin méditerranéen mais plus généralement répartis dans 70 pays dans le monde, et localisés sur tous les continents. L’incidence de cette maladie est également forte chez l’Homme avec environ 2 millions de nouveaux cas par an, recensés dans plus de 80 pays dans le monde. Cette maladie est le résultat d’une infection par un parasite intracellulaire du genre Leishmania . Ce parasite est transmis par un insecte diptère vecteur, le phlébotome. La répartition géographique de la maladie dépend donc de la répartition des phlébotomes et de ses réservoirs : les mammifères. Leishmania infantum est un parasite intramacrophagique responsable de la maladie en Europe, dans le bassin méditerranéen et en Amérique du Sud. La contamination se fait par piqûre de l’insecte sur l’individu. La maladie peut aussi se transmettre de la mère à l’enfant. Les parasites du genre Leishmania infectent des cellules hôtes et détournent le mécanisme de trafic intracellulaire afin de maintenir leur vacuole parasitophore dans lequel ils prolifèrent. L’art antérieur rapporte des développements de formules vaccinales thérapeutiques pour le traitement et/ou le diagnostic de la leishmaniose. Par exemple, le document ES2205059 divulgue une composition pharmaceutique comprenant une partie immunogène d’un antigène de Leishmania. Toutefois, aucun des essais de vaccin thérapeutique contre la leishmaniose n’a montré d’efficacité à ce jour. De plus, les compositions proposées dans l’art antérieur comprennent toutes des adjuvants vaccinaux, nécessaires à leur efficacité, mais dont les effets secondaires sont largement documentés. Enfin, le traitement actuel le plus répandu de la leishmaniose se fait par chimiothérapie. Ce traitement est coûteux, non spécifique, toxique et peut induire l’apparition d’une chimiorésistance. Les molécules connues pour le traitement de la leishmaniose chez le chien sont l’antimoniate de méglumine (Glucantime®) et l’allopurinol, souvent utilisées en association. Dans ce contexte, il existe un besoin de disposer d’un traitement efficace et n’induisant pas de résistance pour des maladies infectieuses dues à un pathogène n’infectant pas le système nerveux central telles que la leishmaniose, mais aussi d’améliorer l’efficacité des vaccins thérapeutiques en général, notament dans le traitement du cancer. Les inventeurs ont mis au point un vaccin thérapeutique, sans adjuvants, destiné à une administration chez un individu porteur d’une maladie ou d’un pathogène n’atteignant pas le système nerveux central. Notamment, le vaccin thérapeutique peut être utilisé comme traitement contre la leishmaniose ou le cancer. Ainsi, l’invention concerne un vaccin thérapeutique destiné au traitement d’un individu porteur d’une maladie ou d’un pathogène n’atteignant pas le système nerveux central comprenant au moins une nanoparticule cationique constituée d’un noyau de polysaccharide cationique et au moins un antigène spécifique de ladite maladie ou dudit pathogène n’atteignant pas le système nerveux central. Dans un mode de réalisation particulier, l’invention concerne un vaccin thérapeutique destiné au traitement de la leishmaniose dans lequel l’antigène est spécifique de la souche Leishmania Infantum . Avantage de l’invention De manière tout à fait surprenante, les inventeurs ont démontré que l’administration à un individu déjà porteur d’une maladie ou d’un pathogène induisant une atteinte des appareils métaboliques, telle que la leishmaniose, d’un vaccin comprenant des nanoparticules et un antigène spécifique dudit pathogène ou de ladite maladie permet de traiter l’individu. Lors d’infection par un pathogène, ce type de traitement est également susceptible d'induire une immunité spécifique à long terme, permettant d’éviter une réinfection ultérieure par le même pathogène. Le fait d’administrer le vaccin alors que l’individu est déjà porteur de la maladie, permet de solliciter efficacement les défenses immunitaires de l’individu et de garantir une guérison par élimination du pathogène ainsi qu’une immunité à long terme par la mise en place de cellules T mémoire. Il est intéressant de noter que cette approche vaccinale therapeutique constitue une solution thérapeutique inédite pour traiter une infection due à un pathogène chimioresistant. Dans le cas de la leishmaniose, les inventeurs ont montré que cette stratégie thérapeutique s’avère aussi efficace que le traitement actuel, à savoir l’administration d’antiparasitaire (voir Exemples 1 et 2). De manière tout à fait avantageuse, l’approche vaccinale n’induit aucun mécanisme de résistance, contrairement aux antibiotiques. Ainsi, soit l’immunité est conservée sur le long terme et empêche la réinfection, soit il est possible de vacciner à nouveau l’individu en cas de réinfection. La composition du vaccin thérapeutique ne contient aucun adjuvant (autre que les nanoparticules elles-mêmes), ce qui évite les effets indésirables associés à ce type de molécule. Ceci est avantageux puisque les adjuvants minéraux (à savoir des sels minéraux tels que sels d’aluminium) restent très longtemps dans le corps (plusieurs dizaines d’années). Les antigènes s’associent aux nanoparticules en solution et sont délivrés au niveau des cellules immunitaires après administration, alors que les nanoparticules sont éliminées rapidement (en moins de 72h après administration nasale). Les nanoparticules jouent donc un triple rôle : agent de stabilisation, vecteur de transport des antigènes, et adjuvant vaccinal. Le vaccin peut être administré par voie orale, nasale, intra-dermale, sous-cutanée ou intraveineuse et permet de traiter, avec une formulation unique, la leishmaniose quel que soit l’espèce de Leishmania qui a infecté l’individu. De plus, une même formulation vaccinale peut être administrée chez l’homme et chez l’animal, notamment chez le chien. DESCRIPTION DES FIGURES la représente un Protocole de l’étude de l’Exemple 1 la représente un SDS-PAGE (gauche) et PAGE en conditions natives (droite) des formulations ETL/NPL réalisés, après 120h de formulation. la représente une mesure de la charge parasitaire dans le foie, la rate et la moelle osseuse des souris, 60 jours après l’infection des souris. la représente un protocole de l’étude de l’Exemple 2 la représente un SDS-PAGE (gauche) et PAGE en condition natives (droite) des formulations ETL/NPL réalisés, après 96h de formulation. la représente une représentation de la charge parasitaire dans le foie, la rate et la moelle osseuse des souris traitées, 90 jours après infection. la représente un dosage des IgG totaux (à gauche) et des IgG 1 et IgG 2a (à droite) chez les souris non traitées et traitées par chimiothérapies ou par administration s.c et i.n des formulations vaccinales. la représente une re-stimulation des splénocytes des souris non traitées et traitées par chimiothérapies ou par administration s.c et i.n des formulations vaccinales, et dosages des cytokines sécrétées dans le surnageant. la représente un protocole de l’étude de l’exemple 3 la représente un PAGE en conditions natives des formulations ETL/NPL. la représente une mesure de la charge parasitaire dans le sérum de souris, non vaccinées et vaccinées par l’ETL ou des formulations ETL/NPL, par voie nasale (A) ou sous-cutanée (B). Mesure de la charge parasitaire dans le foie (C) et la rate (D) de souris, non vaccinées et vaccinées par l’ETL ou des formulations ETL/NPL. EXEMPLES Abréviations : NPL : Nanoparticules de maltodextrine lipidées ; ETL : extraits totaux de leishmanies ; Glu + Allo : Glucantime + Allopurinol ; i.d : Intradermique ; i.n : Intranasal ; i.p : Intrapéritonéal ; i.v : Intraveineux EXEMPLE 1 : Étude de la faisabilité d’un vaccin thérapeutique par voie nasale, à l’aide d’extraits totaux de Leishmanies et de nanoparticules de maltodextrine, en comparaison avec le traitement antiparasitaire de référence (Glucantime + Allopurinol). 1-A Matériels et méthodes a) Modèle expérimental : Des souris Balb/c femelles, âgées de 8 semaines, ont été infectées par 1,2.10 7 amastigotes de la souche L. infantum injectés en i.v ( ). Les premiers traitements vaccinaux et antiparasitaires ont été réalisés 10 jours plus tard (J11). Le traitement médicamenteux a duré 10 jours (jusque J21). Le boost vaccinal a quant à lui été réalisé 15 jours après le prime (J26). Enfin, les souris ont été euthanasiées 35 jours plus tard (J61). Les cellules du foie, de la rate et de la moelle osseuse ont été lysées pour extraire l’ADN. Le gène du cytochrome b du parasite a été utilisé pour estimer la charge parasitaire par qPCR. Chaque picogramme d’ADN parasitaire correspond à 10 parasites. Le nombre de parasites est estimé dans 50ng d’ADN total. Ce protocole est représenté à la . b) Groupes et doses utilisées : Chaque groupe était constitué de 8 souris, réparties comme il suit : Groupe 1 : Témoin infectées non traitées Groupe 2 : Chimiothérapie (Glucantime + Allopurinol) Groupe 3 : Vaccin NPL/ETL s.c Groupe 4 : Vaccin NPL/ETL i.n Les doses administrées étaient de : NPL/ETL s.c : 20µg ETL + 60µg NPL dans 100µL NPL/ETL i.n : 20µg ETL + 60µg NPL dans 20µL Chimiothérapie : Glucantime® 100mgSb/kg/j par injection i.p + Allopurinol 10mg/kg/j par voie orale, pendant 10 jours successifs, dans 100µL. c) Formulations vaccinales Les formulations ont été réalisées, à partir d’extrait totaux issus des formes amastigotes et promastigotes, d’un mélange de souches canines et humaines de L. infantum , et de NPL. 1-B Résultats  a) Caractérisation de l’association des antigènes aux NPL Les NPL ont été caractérisés par analyse SDS-PAGE et PAGE natif. On observe qu’au ratio 1/3 (poids/poids), 93% % des antigènes protéiques sont associés dans les nanoparticules ( ). Les résultats sont présentés à la . b) Charge parasitaire à J 61 On observe à J61, une diminution identique de la charge parasitaire dans les groupes immunisés avec les NPL ETL en intra-veineuse et la chimiothérapie ( ). Dans le foie, tous les parasites sont éliminés (on observe que la valeur est sous le seuil de détection). En revanche, aucune amélioration n’a pu être observée dans les groupes NPL ETL en sous-cutanée. Conclusion : Ces résultats suggèrent que le vaccin thérapeutique par voie nasale est aussi efficace pour réduire la charge parasitaire que le traitement de référence dans cette étude. EXEMPLE 2 : Étude de l’efficacité d’un vaccin nasal thérapeutique dirigé contre la Leishmaniose viscérale canine chez la souris, composé d’extrait totaux de Leishmanies et de nanoparticules de maltodextrine, et de la réponse immunitaire associée. 2-A Matériels et méthodes a) Modèle expérimental : Des souris Balb/c agées de 8 semaines ont été infectées par 1.108 amastigotes de la souche L. infantum , injectés en i.d ( ). Les premiers traitements vaccinaux et antiparasitaires ont été réalisés 10 jours plus tard (J11). Le traitement médicamenteux a duré 10 jours (jusque J21). Le boost vaccinal a quant à lui été réalisé 15 jour après le prime (J26). Enfin, les souris ont été euthanasiées 64 jours plus tard (J90). Les cellules du foie, de la rate et de la moelle osseuse ont été lysées pour extraire l’ADN. Le gène du cytochrome b du parasite a été utilisé pour estimer la charge parasitaire par qPCR. Chaque picogramme d’ADN parasitaire correspond à 10 parasites. Le nombre de parasites est estimé dans 50ng d’ADN total. b) Groupes et doses utilisées : Chaque groupe était constitué de 8 souris, réparties comme il suit : Groupe 1 : Témoin infectées non traitées Groupe 2 : Chimiothérapie (Glucantime® + Allopurinol) Groupe 3 : Vaccin NPL/ETL s.c Groupe 4 : Vaccin NPL/ETL i.n Les doses administrées étaient de : NPL/ETL s.c : 20µg ETL + 60µg NPL dans 100µL NPL/ETL i.n : 20µg ETL + 60µg NPL dans 20µL Chimiothérapie : Glucantime® 100mgSb/kg/j par injection i.p + Allopurinol 10mg/kg/j par voie orale, pendant 10 jours successifs, dans 100µL. c) Formulations vaccinales Les formulations ont été réalisées à partir d’extrait totaux issus d’amastigotes de souches canines de L. infantum et de NPL. Dans cette étude, l’essai a été réalisé par voie intradermique (i.d) pour mimer la piqure par les mouches phlébotomes, vecteurs naturels de l’infection. 2-B Résultats a) Caractérisation de l’association des antigènes aux NPL: Les NPL ont été caractérisés par analyse SDS-PAGE et PAGE natif. On observe qu’au ratio 1/3 (w/w), 100 % des antigènes protéiques étaient associés dans les nanoparticules ( ). Les résultats sont présentés à la , 7 et 8. b) Charge parasitaire à J90 Nous avons observé qu’après 90 jours ( ), la charge parasitaire avait diminué dans le foie, la rate et la MO des souris traitées par le vaccin par voie sous-cutanée, et dans le foie et la MO des souris traitées par le vaccin par voie nasale. c) Réponse humorale et cellulaire : Après dosage sérique des IgG totaux, nous avons observé que l’administration des formulations vaccinales par voie nasale améliorait la réponse humorale par rapport à la voie sous-cutanée et au traitement médicamenteux de référence ( ). Par ailleurs, seule la voie nasale permettait un ratio IgG1 / IgG2a , témoins d’une réponse de type Th1 nécessaire pour lutter contre l’infection des Leishmanies. Après restimulation des splénocytes, nous avons observé une sécrétion importante des cytokines des voies Th1 (INF-y) et Th17 (IL-17a et IL-17f) de la part des souris vaccinées par voie nasale ( ). Conclusion : Le traitement vaccinal thérapeutique permet de diminuer la charge parasitaire des animaux infectés, et ceci d’une manière proche de celle du traitement antiparasitaire. Cette diminution observée avec le traitement vaccinal est directement corrélée avec l’induction d’une réponse immunitaire de type Th1, à la fois humorale et cellulaire. Cette réponse mémoire devrait de plus protéger les animaux d’une future réinfection au parasite, ce qui rend ce traitement fortement attractif pour soigner les animaux infectés. EXEMPLE 3 : Étude de la faisabilité d’un vaccin prophylactique par voie nasale, à l’aide d’extraits totaux de Leishmanies et de nanoparticules de maltodextrine. 3-A Matériels et méthodes a) Modèle expérimental : Des souris Balb/c femelle, âgées de 8 semaines, ont été vaccinées 3 fois par voie nasale ou sous-cutanée, à 20 jours d’intervalle (J1, J22 et J41). Elles ont par la suite été infectées, 9 jours après la dernière administration (J50), par 106 promastigotes de la souche L. donovani injectés en i.v, puis euthanasiées 135 jours plus tard (J185, ). b) Groupes et doses utilisées : Chaque groupe était constitué de 8 à 10 souris, réparties comme il suit : Groupe 1 : Sérum physiologique i.n (20µL) Groupe 2 : Sérum physiologique s.c (50µL) Groupe 3 : ETL i.n (10µg ETL dans 20µL) Groupe 4 : ETL s.c (10µg ETL dans 50µL) Groupe 5 : NPL/ETL i.n (10µg ETL + 30µg NPL dans 20µL) Groupe 6 : NPL/ETL s.c (10µg ETL + 30µg NPL dans 50µL) Des prélèvements sanguins ont été réalisés à J64, J110, J149, et J184 pour analyser la charge parasitaire dans le sang. Celle-ci a été mesurée par qPCR sur l’ADN du kinétoplaste des parasites. Les souris ont été sacrifiées par dislocation cervicale, après 184 jours. A l’euthanasie des souris, les foies et les rates ont été prélevés afin dpérophée déterminer la charge parasitaire dans chacun de ces organes. c) Formulations vaccinales Les formulations ont été réalisées à partir d’extrait totaux de L. donovani LV9 et de NPL. 3-B Résultats a) Caractérisation de l’association des antigènes aux NPL: Les NPL ont été caractérisés par analyse PAGE en condition natives. On observe que lorsqu’on est au ratio 1/3 (poids/poids), 100 % des antigènes protéiques sont associés dans les nanoparticules ( ). b) Charge parasitaire à J 185 L’administration des formulations vaccinales diminue sensiblement la charge parasitaire dans le sang, le foie et la rate des souris ( ). Celle-ci demeure cependant élevée (>10 8 parasites dans les organes), malgré 3 administrations prophylactiques d’extrait totaux associés ou non aux NPL, suggérant que cette stratégie ne permet pas de protéger d’une infection. Conclusion : Le vaccin prophylactique CaniLeish® aujourd’hui sur le marché demeure plus compétitif, avec des résultats significatifs obtenus avec une seule administration. Vaccin thérapeutique destiné au traitement d’un individu porteur d’une maladie périphérique ou d’un pathogène intracellulaire qui ne peut pas passser la barrière hématoencéphalique, comprenant au moins une nanoparticule cationique constituée d’un noyau de polysaccharide cationique et un antigène spécifique, caractérisé en ce ledit antigène est spécifique dudit pathogène ou de ladite maladie. Vaccin thérapeutique selon la revendication 1, dans lequel ledit antigène spécifique provient d’un pathogène responsable de la leishmaniose. Vaccin thérapeutique selon la revendication 2, dans lequel ledit antigène est spécifique de la souche Leishmania infantum . Vaccin thérapeutique selon la revendication 1, dans lequel ledit antigène spécifique est un antigène tumoral. Vaccin thérapeutique, selon l’une des revendications précédentes, dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique poreux est réticulé. Vaccin thérapeutique, selon l’une des revendications précédentes dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique poreux est chargé d’un phospholipide anionique. Vaccin thérapeutique, selon la revendication 6, dans lequel ledit phospholipide anionique est choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l’inositol de diacylphosphatidyle. Vaccin thérapeutique, selon la revendication 7, dans lequel ledit phospholipide anionique est le dipalmitoylphosphatidylglycérol. Composition vaccinale comprenant une nanoparticule cationique constituée d’un noyau de polysaccharide cationique et un antigène spécifique d’un pathogène qui ne peut pas passer la barrière hématoencéphalique ou d’une maladie périphérique pour utilisation dans le traitement des maladies liées audit pathogène ou à ladite maladie. Composition vaccinale selon la revendication 9 pour utilisation selon la revendication 9 dans laquelle ledit antigène provient du genre Leishmania Infantum . Composition vaccinale selon l’une des revendications 9 ou 10 pour utilisation sous une forme adaptée à une administration par voie nasale.