FR 3116696 A1 20220603 FR 2012343 A 20201128 La présente invention a pour objet l’activité bactéricide d’un mélange de terpinen-4-ol et d’α-terpineol agissant en synergie. Ce mélange peut être utilisé en tant qu’agent antimicrobien dans le traitement préventif ou curatif d’infections microbiennes chez l’Homme et l’animal par incorporation dans des médicaments ou dispositifs médicaux ou produits d’hygiène. Ce mélange peut aussi être utilisé pour prévenir ou traiter des contaminations sur des surfaces, dans des compositions d’hygiène ou alimentaires ou cosmétiques, et plus généralement dans toute matrice liquide ou semi-solide. Figures Composition antimicrobienne Description Etat de la technique Depuis leur découverte au début du vingtième siècle, de nombreuses molécules utilisées comme antimicrobiens ou antibiotiques ont permis de traiter différentes infections, jusqu’alors incurables. La résistance aux antibiotiques et plus généralement aux antimicrobiens est l’un des enjeux majeurs de la santé publique du vingt et unième siècle, qui engendre une augmentation des coûts hospitaliers et de la mortalité (1). Elle s’accompagne d’un sévère manque de nouvelles molécules thérapeutiques efficaces. Ces nouvelles molécules, sont le plus souvent de synthèse, similaires aux molécules existantes, et de ce fait engendrent malheureusement l’apparition de résistances, plus rapidement qu’il y a de nouvelles molécules crées. Sans nouveaux traitements, les infections aux bactéries résistantes et multi résistantes aux antibiotiques engendreront 10 millions de morts par ans d’ici 2050 (1, 2). L’utilisation de cocktails de molécules actives, agissant en complémentarité, sur plusieurs cibles et en tuant rapidement les bactéries, sont aujourd’hui la meilleure stratégie contre les infections devenues incurables, et contre l’apparition de résistance aux antibiotiques. Et c’est en s’inspirant de la nature que les cocktails les plus efficaces peuvent être créés. L’homme de l’art connaît parfaitement les propriétés antibactériennes de l’α-terpinéol et du terpinen-4-ol pris individuellement, au travers des nombreux articles scientifiques et brevets disponibles de par le monde. Le brevet WO2010046238 décrit une synergie d’action antimicrobienne et ses applications entre terpinéol et thymol. Cette synergie est spécifique de l’association de ces deux molécules, puisqu’une telle synergie n’est pas retrouvée par les auteurs lors d’associations avec le d’autres molécules tels que le linalool, le géraniol, le citral, le triclosan, l’eucalyptol ou le menthol. Dans ce brevet, le terpinéol est soit de l’α-terpinéol, soit le β-terpinéol, soit le γ-terpinéol, seuls ou en mélange, et préférentiellement l’α-terpinéol. Le brevet WO2011036048 déposé par le même groupe, et s’appuyant sur le brevet WO2010046238, décrit une synergie entre l’eugénol et un mélange de terpinéol et thymol. Le brevet WO2013064360 déposé par le même groupe, et s’appuyant sur le brevet WO2010046238, décrivent un mélange antibactérien composé d’un mélange de terpinéol et thymol, associé à un acide di- ou tricarboxilique. L’acide di- et tricarboxylique est choisi parmi les acides oxalique, fumarique, phtalique, maléique, malique, malonique, citrique. Le brevet WO2011083585 déposé par le même groupe, et s’appuyant sur le brevet WO2010046238, décrit une synergie entre le terpinéol et des isopropylméthylcathécols. Dans ce brevet, le terpinéol est soit de l’α-terpinéol, soit le β-terpinéol, soit le γ-terpinéol, le δ-terpinéol, le 4-terpinéol, seuls ou en mélange, et préférentiellement l’α-terpinéol. Le brevet WO2014001056 déposé par la même société, et s’appuyant sur le brevet WO2010046238, décrit une synergie entre le terpinéol et des crésols monosubstitués. Dans ce brevet, le terpinéol est soit de l’α-terpinéol, soit le β-terpinéol, soit le γ-terpinéol, le δ-terpinéol, le 4-terpinéol, seuls ou en mélange, et préférentiellement l’α-terpinéol. Le brevet W02014001057 déposé par la même société, et s’appuyant sur le brevet WO2010046238, décrit une synergie entre le terpinéol et des dérivés halogénés d’isopropylméthylphénols (chloro-, bromo-, iodo-, isopropylméthylphénols). Dans ce brevet, le terpinéol est soit de l’α-terpinéol, soit le β-terpinéol, soit le γ-terpinéol, le δ-terpinéol, le 4-terpinéol, seuls ou en mélange, et préférentiellement l’α-terpinéol. L’article de Tighe S. et coll. (2013, Transl. Vis. Sci. Technol., 2(7) :2 (3) décrit un effet antagoniste du Terpinen-4-ol et de l’α-terpinéol lorsqu’ils sont associés pour lutter contre l’acarien Demodex. Ainsi, il n’a jamais été décrit de synergie d’effet bactéricide d’un mélange constitué de, ou comprenant de l’ α-terpinéol et du terpinèn-4-ol. A l’inverse même, des antagonismes ont même été décrits concernant les propriétés antiparasitaires (3). Ainsi, l’homme de l’art s’attend à ce que le mélange de contenant des molécules d’α-terpinéol et de terpinèn-4-ol, ne présente aucune activité antibactérienne synergistique, voire présente des activités antagonistes. De manière surprenante, les inventeurs ont constaté que, contrairement à ce que suggéraient les antagonismes décrits dans la littérature scientifique et les brevets, par exemple sur des organismes tels que Demodex, l’ α-terpinéol et le terpinèn-4-ol en mélange pouvaient agir en synergie pour inhiber la croissance des bactéries et les détruire. Exposé de l’invention L’objet de la présente invention est l’activité bactéricide d’un mélange d’α-terpinéol et de terpinèn-4-ol agissant en synergie pour ce qui est de leurs propriétés bactériostatiques et bactéricides, ce qui présente à titre d’exemple, mais de manière non exhaustive, un intérêt pour les industries pharmaceutiques, vétérinaires, nutraceutiques, de l’hygiène, de la cosmétique et de la désinfection de surfaces inertes. La présente invention est basée sur la synergie de bactéricidie de molécules d’ α-terpinéol et de terpinen-4-ol en mélange. Cette synergie concerne aussi bien les bactéries Gram positif que Gram négatif. Cette synergie de bactéricidie est également observée sur des bactéries résistantes à des antibiotiques. Des extraits naturels tels que l’huile essentielle d’arbre à thé (= Tea Tree = Melaleuca alternifolia ) qui contient de l’α-terpinéol et du terpinen-4-ol dans des proportions efficaces similaires présentent des activités inhibitrices de croissance similaires au mélange d’α-terpinéol+terpinen-4-ol pur pour des ratios masse-masse équivalents. Le spectre d’activité d’inhibition de croissance et de bactéricidie du mélange α-terpinéol+terpinen-4-ol couvre un large spectre incluant des bactéries Gram positives et Gram négatives, d’ordres aussi variés que des Bacillales, des Lactobacillales, des Entérobactériales ou encore des Pseudomonales. Ce spectre d’activité couvre le groupe des ESKAPE ( Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella sp , Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa , et Enterobacter sp ), et couvre également des bactéries résistantes à des antibiotiques tels que la méthicilline par exemple, ou multirésistantes à plusieurs antibiotiques. Le mélange d’α-terpinéol et de terpinen-4-ol est tout aussi efficace sur des bactéries au métabolisme actif (division) que ralenti, voire en latence (persistance). La bactéricidie du mélange est très rapide, pouvant dans certains cas diminuer la charge bactérienne de plus de 99,99% en moins d’une heure. Bien que présent dans des concentrations et ratios équivalents à des extraits végétaux tels que l’huile essentielle d’arbre à thé, le mélange d’α-terpinéol et de terpinen-4-ol présente moins de cytotoxicité évaluée in vitro (ou une meilleure survie à concentrations équivalentes d’ α-terpinéol et de terpinen-4-ol). Le mélange d’α-terpinéol et de terpinèn-4-ol agissant en synergie, biocide à spectre large, peut être utilisé par exemple, mais de manière non exhaustive, dans des formulations pour développer des désinfectants ou antiseptiques pour l’Homme ou l’animal Le mélange d’α-terpinéol et de terpinèn-4-ol peut également être incorporé dans des pansements, tissus, et autres dérivés, pour désinfecter les plaies, écorchures ou autres blessures externes. Le mélange d’α-terpinéol et de terpinèn-4-ol peut être aussi utilisé dans des formulations pour l’hygiène de l’Homme ou l’animal en tant que savon, crème, ou lotion aux propriétés multiples, comme par exemple, mais de manière non exhaustive : antipelliculaire, assainissement de la peau, anti-acné. Il peut aussi être utilisé en formulation pour l’hygiène intime en prévention ou traitement d’un déséquilibre de la flore impliquant ou menant à des infections de la sphère uro-vaginale. Le mélange d’α-terpinéol et de terpinèn-4-ol peut être incorporé dans des produits d’hygiènes buccale, tel que des chewing-gums, bain de bouches, dentifrices, fils dentaire. Exemples de réalisation L’invention et son intérêt sont bien illustrés dans les exemples ci-dessous, qui n’ont toutefois aucune portée limitative. Exemple 1 : Synergie d’activité bactériostatique du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol La synergie entre α-terpinéol et terpinèn-4-ol a été mise en évidence par la technique bien connue de l’échiquier. Pour chaque souche testée, le FIC (Fractional Inhibitory Concentration) est calculé, selon la méthode décrite par (Hamilton-Miller JMT (1985) Rationalization of terminology and methodology in the study of antibiotic interaction. J. Antimicro. Chemother. 15 :655-658). Le FIC Index (FICI) est calculé selon la formule : FIC Index = Xa / CMIa + Xb / CMIb etc = FICa + FICb etc La représente les FICI de 3 expériences indépendantes réalisées avec l’ α-terpinéol et le terpinèn-4-ol sur les souches Staphylococcus aureus (Figure 1a), Staphylococcus aureus résistant à la Méthicilline (Figure 1b), Escherichia coli (Figure 1c), Pseudomonas aeruginosa (Figure 1d). Il apparaît clairement que pour chacune des souches testées, l’α-terpinéol et le terpinèn-4-ol agissent de manière synergistique pour inhiber la croissance des bactéries Gram positif et Gram négatif de différents ordres testées. Exemple 2 : Comparaison de l’activité bactériostatique du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol et de l’huile essentielle d’arbre à thé Les Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) de l’huile essentielle de Tea Tree (TTO) et du mélange α-terpinéol et terpinèn-4-ol à un ratio 1 :10 ont été évaluées sur les souches Staphylococcus aureus et Staphylococcus aureus résistant à la Méthicilline (Ordre des Bacillales), Escherichia coli (Ordre des Enterobactériales), Pseudomonas aeruginosa (Ordre des Pseudomonales). Les données sont reportées dans le Tableau 1. Il apparaît que les CMI du TTO et du mélange α-terpinéol + terpinèn-4-ol sont similaires, à un facteur 2 près, correspondant à une dilution sérielle d’ordre 2. CMI (%) Ordre Espèce TTO T4ol :AT Bacillales Staphylococcus aureus 1,25 1,25-2,5 SARM 1,25-2,5 1,25->2,5 Enterobacteriales Escherichia coli 0,62-2,5 0,31-0,62 Pseudomonales Pseudomonas aeruginosa 0,62-2,5 1,25-2,5 Tableau 1 : Activité biologique du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol comparé au TTO. Les valeurs en pourcentage de mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol en solution qui sont reportées dans le ableau correspondent aux valeurs extrêmes de trois expériences indépendantes. Exemple 3 : Spectre d’activité bactériostatique du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol Afin de définir plus largement le spectre d’activité du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol, le pouvoir bactériostatique de ce mélange à été testé sur les principales bactéries impliquées dans des pathologies infectieuses chez l’Homme. Les bactéries testées par la technique de CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) par microdilution sont du groupe ESKAPE ( Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella sp , Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa , et Enterobacter sp ). La souche de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline exprime le gène MecA, et est de ce fait résistante à l’ensemble des β–lactamines. La souche Klebsiella pneumoniae est résistante à l’ampicilline, l’amoxicilline-clavulanate, la pipéracilline, l’aztreonam, la cefotaxime, la cefpodoxime, le cefpodoxime-clavulanate, la ceftazidime, la ceftriaxone, le chloramphenicol, la gentamicine et la tobramycine. Les résultats de 3 expériences indépendantes d’évaluation des Concentrations Minimales Inhibitrices sont reportés dans le Tableau 2. Toutes les souches testées sont inhibées par le mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol, à des concentrations variant de 0,62% à 2,5%. Les bactéries de l’Ordre des Entérococcales sont les plus sensibles au mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol. Ordre Espèce CMI Bacillales Staphylococcus aureus 1,25-2,5 SARM 1,25->2,5 Lactobacillales Enterococcus faecium 2,5->2,5 Enterobacteriales Escherichia coli 0,31-0,62 E nterobacter cloacae 0,62-2,5 Klebsiella oxytoca 0,31-0,62 Klebsiella pneumoniae 0,62 Pseudomonales Acinetobacter baumannii 0,62-1,25 Pseudomonas aeruginosa 1,25-2,5 Tableau 2: Spectre d’activité bactériostatique du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol. Les valeurs en pourcentage de mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol en solution qui sont reportées dans le tableau correspondent aux valeurs extrêmes de trois expériences indépendantes. Exemple 4 : Spectre d’activité bactéricide du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol Le pouvoir bactéricide du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol à été testé sur les mêmes bactéries que dans l’exemple 3. Les bactéries testées par la technique de CMB (Concentration Minimale Bactéricide) par microdilution sont du groupe ESKAPE ( Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella sp , Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa , et Enterobacter sp ). La souche de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline exprime le gène MecA, et est de ce fait résistante à l’ensemble des β–lactamines. La souche Klebsiella pneumoniae est résistante à l’ampicilline, l’amoxicilline-clavulanate, la pipéracilline, l’aztreonam, la cefotaxime, la cefpodoxime, le cefpodoxime-clavulanate, la ceftazidime, la ceftriaxone, le chloramphenicol, la gentamicine et la tobramycine. Les résultats de 3 expériences indépendantes d’évaluation des Concentrations Minimales Bactéricides sont reportés dans le Tableau 3. Ordre Espèce CMI Bacillales Staphylococcus aureus >2,5 SARM 2,5->2,5 Lactobacillales Enterococcus faecium >2,5 Enterobacteriales Escherichia coli 0,62-2,5 Enterobacter cloacae 1,25-2,5 Klebsiella oxytoca 0,31-0,62 Klebsiella pneumoniae 0,62 Pseudomonales Acinetobacter baumannii 1,25-2,5 Pseudomonas aeruginosa 1,25-2,5 Tableau 3: Spectre d’activité bactéricide du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol. Les valeurs en pourcentage de mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol en solution qui sont reportées dans le tableau correspondent aux valeurs extrêmes de trois expériences indépendantes. Les entérobacteriales testées sont les plus sensibles des bactéries testées en termes de bactéricidie, avec des CMB comprises entre 0,31 et 2,5%. Les pseudomonales testées ont une sensibilité intermédiaire. Les bacillales et lactobacillales sont les moins sensibles, avec des concentrations minimales bactéricides supérieures ou égales à 2,5%. Exemple 5 : Effets du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol sur des bactéries latentes La Concentration Minimale Bactéricide (CMB) du mélange α-terpinéol et terpinèn-4-ol à un ratio 1 :10 a été évaluée sur une souche de Staphylococcus aureus en état de croissance exponentielle ou de latence (absence de croissance). Le temps de contact est de 24 h. Les données de 3 expériences indépendantes sont reportées dans le Tableau 4. A fin de contrôle, la numération des bactéries est effectuée au début de l’expérience (T0) et après 24 heures (T24), sur les cultures de bactéries en croissance ou en latence pour s’assurer que les premières continuent de se multiplier, et que les secondes sont en état de non prolifération. Le mélange α-terpinéol et terpinèn-4-ol est bactéricide sur les bactéries latentes ou en croissance Il faut deux à quatre fois plus de mélange α-terpinéol et terpinèn-4-ol sur les bactéries en latences pour avoir un effet similaire aux bactéries en croissance. Le DMSO utilisé comme contrôle négatif (solvant) n’a pas d’effet bactéricide aux concentrations testées, sur les bactéries en latence ou en croissance. Exponentielle Latence Contrôle de T0 (Log10) 5,45±0,05 5,32±1,37 croissance (UFC/mL) T24 (Log10) 8,88±0,005 5,45±0,65 T4ol-AT (%) 0,31 0,62-1,25 CMI (%) DMSO (%) >2,5 >2,5 Amoxicilline (µg/mL) 3,12 >25 Tableau 4 : CMB d’ Escherichia coli en phase exponentielle de croissance ou en phase de latence. Les valeurs en pourcentage de mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol en solution qui sont reportées dans le tableau correspondent aux valeurs extrêmes de trois expériences indépendantes. Exemple 6 : Cinétique d’activité bactéricide du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol La représente les résultats de cinétique d’activité bactéricide (time kill) du mélange α-terpinéol et terpinèn-4-ol comparé à l’antibiotique de référence, sur les souches Staphylococcus aureus, Staphyloccus aureus résistant à la méthicilline (SARM) ,et Escherichia coli . Le mélange α-terpinéol et terpinèn-4-ol est testé à 4 fois la CMI. Le mélange α-terpinéol et terpinèn-4-ol apparait avoir un pouvoir bactéricide significatif (supérieur à 4 logarithmes décimaux) en moins de 1 à 4 heures selon les souches testées. Exemple 7 : Cytotoxicité du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol L’huile essentielle d’arbre à thé (TTO) contient du terpinen-4-ol et de l’α-terpinéol à un ratio 10 :1. Le mélange de terpinen-4-ol et d’α-terpinéol à un ratio de 10 :1 a été comparé à son équivalent naturel, l’huile essentielle d’arbre à thé, dans des tests de cytotoxicité in vitro . La représente les résultats de tests de survie cellulaire, qui reflète la cytotoxicité des produits testés. A concentration équivalentes en terpinen-4-ol et α-terpinéol, le mélange synthétique de terpinen-4-ol et d’α-terpinéol est moins cytotoxique que l’extrait naturel de TTO. La survie cellulaire est ainsi, respectivement pour le mélange de terpinen-4-ol et d’α-terpinéol comparé au TTO de 83% au lieu de 28% à une concentration de 0.05%, ou encore de 97% au lieu de 63% à 0,025%, ou encore de 101% au lieu de 73% à 0.0125%. Exemple 8 : Gel topique Exemple de composition d’un gel topique. Le mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol est composé d’un volume d’ α-terpinéol pour 10 volumes de terpinen-4-ol. Glycérine 12 g Cyclopentasiloxane/Cyclotetrasiloxane/Dimethiconol 2 g Octydodecanol 2 g Carbomère 974P 0,5 g Gomme Xanthane 0,3 g Hydroxyde de sodium 0,25 g Mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol 1 g Eau Qsp 100 g Exemple 9 : Produit cosmétique Exemple de composition d’une crème cosmétique anti-acnéenne. Le mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol est composé d’un volume d’ α-terpinéol pour 10 volumes de terpinen-4-ol. Cire d’abeille 11 g Ethoxydiglycol 4 g Octydodecyl myristate 10 g Isostéaryl Isostéarate 9 g Hydroxyde de sodium 0,4g Mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol 0,5 g Eau, conservateur, parfum Qsp 100 g Exemple 10 : Produit d’hygiène Exemple de solution hydroalcoolique antiseptique. . Le mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol est composé d’un volume d’ α-terpinéol pour 10 volumes de terpinen-4-ol. Alcool 68 % Eau 30,3-28,8 % Mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol 1-2 % Gélifiant 0,5 % Huile essentielle de thym 0,1-0,5% Huile essentielle de ravintsara 0,1-0,2% Matériel s et méthode s L’ampicilline, l’amoxicilline, et la gentamicine (Sigma-Aldrich) sont préparés dans de l’eau stérile. Pour augmenter la solubilité du TTOD, du Dimethyl sulfoxide (DMSO) est utilisé (10% TTOD dans DMSO 10%). Staphylococcus aureus CIP 4.83, SARM CIP 107422, Pseudomonas aeruginosa CIP 82.118, et Escherichia coli CIP 53.126, Enterococcus faecium CIP 103598 , Enterobacter cloacae ATCC 13883 , Klebsiella oxytoca ATCC 49131 , Klebsiella pneumoniae ATCC 700602 , Acinetobacter baumanii CIP 70.34sont cultivés en bouillon/gélose milieu Mueller Hinton (B/GMH). Les cellules primaires de fibroblastes de prépuce humain (HFF-1, ATCC SCRC-1041) sont cultivées en Milieu Eagle Modifié (MEM, 10370-047, Gibco) complété à 10% sérum de bovin fœtal (SBF, 10270, Gibco) inactivé par chauffage, 10 mL/L de L-glutamine (P04-80100, Pan biotech), 100 µg/mL d’ampicilline, 0,1 mU/mL de mélange pénicilline/streptomycine, et 2,5 µg/mL d’amphotericine B. Concentration minimale inhibitrice et bactéricide (CMI/B). Les CMI sont menées en microdilutions selon les directives du CLSI 2009 (4), pendant 18h à 37°C. La concentration maximale testée en TTOD et DMSO est de 2,5%, de 10 µg/ml pour l’ampicilline, et de 25 µg/ml pour l’amoxicilline et la gentamicine. 50µl des puits sans croissance visible sont étalés sur géloses nutritive de tripticase soja (GTS) et incubés minimum 24h pour comptage. La CMB est définie par une réduction de 4 Log 10 de l’inoculum soit 99,99% de diminution. Un contrôle positif sans produit et un contrôle négatif sans bactérie sont réalisés pour chaque test, ainsi qu’un contrôle solvant avec le DMSO pour chaque concentration utilisée dans les préparations de TTOD. Chaque test est effectué trois fois indépendamment. Pour étudier les persisteurs, le même protocole est utilisé sauf que les bactéries sont inoculées dans du PBS. L’absence de nutriment incite les bactéries à ralentir leur métabolisme et à se stabiliser en phase stationnaire. Pour insister sur ce fait, la suspension en PBS est préparée et incubée 3h avant le lancement du test. Le dénombrement de la suspension s’effectue après les 3h d’incubation pré-test (=inoculum), et après les 24h post-test (CMB). La lecture se fait uniquement par CMB en étalant tous les puits et en dénombrement le témoin positif pour valider qu’il soit proche à 1 ou 2 Log 10 près de l’inoculum utilisé pour le test. Essais sur bactéries latentes (phase stationnaire). Le protocole est adapté de la méthode décrite par Matsuo M et al, 2011 et de Belley A et al, 2009. Pour étudier les bactéries en phase stationnaire (ne se divisant pas), le même protocole que pour la Concentrations Minimales Bactéricides (CMB) est utilisé avec quelques modifications. La suspension bactérienne utilisée pour préparer l’inoculum est préparée à partir d’une culture sur gélose en PBS à 1 unité DO 595 . Le PBS ne contient aucune source de carbone susceptible d’être métabolisée. Le témoin de croissance exponentielle est préparé à partir de cette suspension, inoculée dans du milieu MH à 5.10 5 -10 6 UFC/mL. Cette même suspension est aussi utilisée pour inoculer le milieu du test sur les bactéries en phase stationnaire. Induction de la phase stationnaire en milieu appauvri (Belley A et al, 2009) Le milieu appauvri est un milieu MH dont tous les nutriments essentiels à la croissance des bactéries ont déjà été métabolisés. Il n’est donc plus assez nutritif pour permettre une croissance bactérienne mais le milieu possède l’osmolarité qui permet de maintenir l’intégrité et la viabilité des bactéries. Le milieu appauvri est donc spécifique pour chaque microorganisme. Pour l’obtenir, du bouillon MH est inoculé tous les 48 h à partir d’un isolat sur gélose. Après chaque culture, le milieu est centrifugé 5 min à 7500 g. Le surnageant est ensuit filtré sur 0,22 µm puis ré-inoculé à partir d’un isolat sur gélose de la même espèce bactérienne que précédemment. Cette manipulation est répétée jusqu’à que plus aucune croissance ne soit observée visuellement. Le milieu appauvri est ensuite inoculé avec la suspension préparée en PBS avec une concentration en bactérie ajustée à 5.10 5 -10 6 UFC/mL. Induction de la phase stationnaire en PBS (Matsuo M et al, 2011) La suspension bactérienne préparée en PBS est inoculée en PBS à 5.10 5 -10 6 UFC/mL. Avant toute chose, un test de viabilité des bactéries après 24 h d’incubation en PBS à 37°C est effectué. Pour cela, le dénombrement de l’inoculum avant et après les 24 h d’incubation a été comparé. Induction de la phase stationnaire par incubation pré-test Un temps d’incubation de la suspension avant le test est ajouté pour laisser le temps aux bactéries de changer de phase de croissance avant d’être mises en contact avec les produits. Ce temps d’incubation est défini à 0 h, 3 h ou 18 h. Après 24 h de contact, la lecture se fait par évaluation de la CMB, en étalant tous les puits et en dénombrant le témoin positif. Pour le test sur les bactéries en phase stationnaire, la charge bactérienne du témoin positif et de l’inoculum doivent être similaire à 1 Log 10 pour valider l’expérience. Les résultats de sensibilité sont comparés à la CMB des bactéries en phase exponentielle effectuée en parallèle. La charge bactérienne du témoin positif est aussi comparée à l’inoculum pour confirmer qu’il y a eu une croissance. Time kill. L’étude est adaptée de protocoles précédemment décrits (May J et al , 2000 ; Peterson PJ et al, 2007). Trois concentrations en produit à évaluer, antibiotique de référence, et DMSO sont testées pour chaque bactérie, correspondant à la CMI, 2xCMI et 4xCMI (sauf pour le DMSO dont les concentrations sont identiques aux concentrations mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol testés). Les concentrations en antibiotique testées sur le SARM sont les mêmes que celles testées sur S. aureus. La suspension bactérienne utilisée comme inoculum est préparée à 5.10 5 -10 6 UFC/mL dans du bouillon MH. Les essais de bactéricidie sont réalisées en microplaque 96 puits à fond rond. Le volume final des puits est de 100 µL, avec 50 µL de produit (ou d’eau pour le témoin eau), et 50 µL de suspension (ou de bouillon MH stérile pour le témoin négatif). Chaque test est effectué sur trois puits qui sont ensuite regroupés et dénombrés sur gélose TS à chaque mesure (soit un seul dénombrement par condition et par mesure), afin de limiter l’impact des artéfacts parfois observables en microbiologie (par exemple les cas isolés de croissance excessivement faible ou forte). Pour l’interprétation des résultats, les tests avec ATB sont comparés au témoin eau (sans principe actif, ni ATB, ni DMSO), tandis que les résultats du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol sont comparés au témoin DMSO à la concentration correspondante. Test de cytotoxicité. Le rouge neutre est un colorant dit vital, s’accumulant dans les lysosomes des cellules animales vivantes. Plus une cellule est proche de la mort cellulaire plus sa capacité à accumuler le rouge neutre est réduite. La révélation au rouge neutre permet de définir la cytotoxicité d’un produit sur les cellules. Le protocole est adapté de la méthode décrite par Soderberg et coll. (Soderberg et al. 1996). Les cellules sont étudiées en microplaques 96 puits à fond plat à raison de 10 5 -10 6 cellules/puits, et cultivées pendant 48 h en MEM complet avant l’ajout des produits. Le test est effectué sur des cellules à confluence afin d’augmenter la répétabilité et la reproductibilité des résultats. Plusieurs solvants ont été testés: Le solvant utilisé est le DMSO. Les paramètres de sonication sont 10 min en mode normal à 45 KHz, puissance à 100% et à température ambiante (Transsonic TIH5, ELMA). La concentration en solvant est la même pour toutes les concentrations en principe actif testés. Ceci permet, une fois de plus, d’augmenter la répétabilité et la reproductibilité des résultats, mais aussi de n’avoir qu’un seul témoin solvant à effectuer. Plusieurs contrôles sont effectués : un témoin positif (témoin eau), un témoin négatif pour chaque concentrations testées (sans cellules), un témoin solvant, et enfin un témoin de SDS 1 g/L (témoin de validité du test de cytotoxicité). Le temps d’exposition au mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol est de 24 h. Après incubation, le surnageant est retiré et les cellules rincées trois fois avec du PBS avant d’ajouter 200 µL de solution de rouge neutre de travail. La plaque est ensuite incubée 3 h supplémentaires avant d’être révélée avec une solution d’acide acétique 1% : éthanol 50% (volume : volume), et l’absorbance est mesurée à 540 nm avec un lecteur microplaque (Infinite M200 pro, Tecan). Le taux de survie, exprimé en pourcentage, est calculé par comparaison à l’absorbance du témoin solvant. Références (1) Antibiotic resistance threats in the United States (2013), U.S. Department of Health and Human Services, Center for Disease Control and Prevention. (2) Estimating the economic costs of antimicrobial resistance (2014), RAND (3) Tighe S, Gao Y-Y, Tseng SCG. (2013) Terpinen-4-ol is the most active ingredient of tea tree oil to kill Demodex mites. Trans Vis Sci Tech. 2(7):2, http://tvstjournal.org/ doi/full/10.1167/tvst.2.7.2, doi: 10.1167/tvst.2.7.2 (4) Clinical and Laboratory Standards Institute guidelines, CLSI, 2008 L é gende s des Figures : Synergie du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol. Les FICI du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol de 3 expériences indépendantes sont reportées sur un graphique. a : Staphylococcus aureus ; b : SARM ; c : Escherichia coli ; d : Pseudomonas aeruginosa : Courbes de time-Kill de S. aureus , SARM, et E. coli . a, c : en présence d’ampicilline ; e : en présence d’amoxicilline; b, d, f, : en présence de T4ol :AT. Losange noir=Contrôle, Rond blanc=4xCMI ; Chaque expérience a été réalisée deux fois (AT+T4ol) ou trois fois (ATB) dans des expériences indépendantes. Axe des abscisses : temps ; Axe des ordonnées : Log10 UFC/mL. : Cytotoxicité du TTO et du mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol sur des fibroblastes primaires de type HFF cultivés in vitro . Le pourcentage de survie cellulaire (axe vertical) est représenté en présence de 30% de DMSO (témoin de croissance), SDS 10% (témoin de cytotoxicité), ou de concentrations croissantes de TTO ou de mélange α-terpinéol – terpinen-4-ol (de 0,1% à 0,006%). Abbréviations des tableaux et figures : CMI : Concentration Minimale Inhibitrice ; CMB : Concentration Minimale Bactéricide ; FICI : Fractional Inhibitory Concentration Index ; TTO : Tea Tree Oil ; T4ol : Terpinen-4-ol ; AT : α-terpinéol ; SARM : Staphylococcus aureus Résistant à la Méthicilline ; DMSO : DiMéthyl SulfOxyde ; SDS : Sodium Dodécyl Sulfate ; UFC/mL : Unité Formant Colonie par Millilitre ; HFF : Human Foreskin Fibroblast. Utilisation d’un mélange de terpinen-4-ol et d’α-terpinéol pour l’obtention d’une composition antimicrobienne. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition est constituée uniquement de 10% à 90% de terpinen-4-ol, et de 90% à 10% d’α-terpinéol. Utilisation selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le terpinen-4-ol et l’α-terpinéol agissent en synergie pour présenter une activité bactériostatique sur les bactéries Gram négatif et Gram positif. Utilisation selon les revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l’activité bactériostatique inclut les souches bactériennes résistantes ou multirésistantes aux antibiotiques de la famille des β–lactamines, l’ampicilline, l’amoxicilline-clavulanate, la pipéracilline, l’aztreonam, la cefotaxime, la cefpodoxime, le cefpodoxime-clavulanate, la ceftazidime, la ceftriaxone, le chloramphenicol, la gentamicine et la tobramycine. Utilisation selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la composition présente une activité bactéricide sur les souches bactériennes résistantes ou multirésistantes aux antibiotiques de la famille des β–lactamines, l’ampicilline, l’amoxicilline-clavulanate, la pipéracilline, l’aztreonam, la cefotaxime, la cefpodoxime, le cefpodoxime-clavulanate, la ceftazidime, la ceftriaxone, le chloramphenicol, la gentamicine et la tobramycine. Utilisation selon les revendications 1, 2 et 6, caractérisée e, ce que la composition est bactéricide sur les bactéries en latence et les bactéries en croissance. Utilisation selon les revendications 1, 2 et 6, caractérisée en ce que l’activité bactéricide de la composition permet une diminution d’au moins 99,99% de l’inoculum initial en moins d’une heure. Utilisation selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la composition est moins cytotoxique que l’huile essentielle d’arbre à thé sur des cellules humaines en culture in vitro, à concentrations de terpinen-4-ol et α-terpinéol équivalentes. Utilisation selon les revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la composition est incorporée dans des compositions pharmaceutiques, cosmétiques et produits d’hygiène.