FR 3119732 A1 20220819 FR 2101599 A 20210218 La présente invention concerne l’utilisation de porphyrines cationique telles que la zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride et la tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride ou leur mélange, en tant qu’agent herbicide foliaire sélectif. Utilisation de porphyrines cationiques en tant que désherbant sélectif La présente invention concerne l’utilisation de porphyrines cationiques telles que la zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride et la tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride ou leur mélange, en tant qu’agent herbicide foliaire sélectif. Les photosensibilisateurs (PS) sont des molécules capables d’induire, grâce à un stimulus lumineux et en présence d’oxygène, la formation d’espèces réactives de l’oxygène (EROs) plus ou moins toxiques pour les cellules vivantes, selon leurs propriétés physicochimiques, les concentrations utilisées ainsi que la nature des cellules et des organismes biologiques. Il existe deux mécanismes de production d’EROs : - Le mécanisme de type I, qui implique un transfert d’électrons du photosensibilisateur vers des substrats biologiques pour former des radicaux libres (anion superoxide O 2 · - , radical hydroxyle OH et peroxyde d’hydrogène H 2 O 2 ) ; - Le mécanisme de type II qui implique quant à lui le transfert de l’énergie vers le dioxygène moléculaire, qui passe de son état fondamental (état triplet : 3 O 2 ) à l’état singulet 1 O 2 . Ces photosensibilisateurs sont majoritairement utilisés dans le domaine médical, dans le contexte de la thérapie photodynamique du traitement du cancer mais également pour la lutte contre les microorganismes tels que les bactéries et les champignons, en tant que thérapie de désinfection ou pour la décontamination de l’eau et des aliments. De façon générale, les EROs sont délétères pour toutes les cellules vivantes. Ces photosensibilisateurs, ont donc été pressentis pour une application en tant que biocides dans le domaine agricole, et plus particulièrement à l’encontre d’agents pathogènes des cultures tels que les bactéries et les champignons, qui génèrent des baisses de rendement agricole. L’utilisation de ces photosensibilisateurs en tant que biocide est également appelé traitement photodynamique antimicrobien. Toutefois, et bien que nécessaires, les études évaluant les effets indésirables des photosensibilisateurs sur les plantes sont rares. Par ailleurs, les effets de molécules sur les plantes sont très difficilement transposables entre différentes espèces. Typiquement, des photosensibilisateurs naturels (coumarines et furocoumarines) ont été évalués en tant que biocides sur des orangers et des fraisiers. Alors que les feuilles des orangers n’ont pas été affectées par les photosensibilisateurs, les feuilles des fraisiers ont été endommagées par les coumarines. Des porphyrines hydrosolubles cationiques (la zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride (Zn-TMPyP) et la tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride (TMPyP)) ont également été appliquées sur des plantules de tomates ( Solanum lycopersicum ) cultivées in vitro sous une photopériode de 16 heures. Il a été démontré que les porphyrines cationiques ont, in vitro , considérablement altéré la croissance des plantules. Les auteurs suggèrent toutefois que ces photosensibilisateurs pourraient être utilisés en tant que biocides à l’encontre des pathogènes de la tomate (Guillaumot et al., Synergistic enhancement of tolerance mechanisms in response to photoactivation of cationic tetra (N-methylpyridyl) porphyrins in tomato plantlets, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, Volume 156, March 2016, Pages 69-78). Toutefois, ces mêmes porphyrines cationiques, également testées in vitro sur des plantules d’Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ) ont complétement tué la plante à très faible dose (3.5µM) (Issawi et al., Responses of an adventitious fast-growing plant to photodynamic stress : comparative study of anionic and cationic porphyrin effect on Arabidopsis thaliana, Physiologia Plantarum 162 : 379-390. 2018). Alors que l’effet racinaire in vitro des photosensibilisateurs sur les plantes est imprévisible et difficilement extrapolable aux conditions en champ ou en serre, et que les porphyrines cationiques telles que Zn-TMPyP appliquées in vitro au mieux inhibent la croissance des plantes testées, au pire les détruisent, les inventeurs ont, de manière inattendue, démontré que les porphyrines cationiques et préférentiellement TMPyP et Zn-TMPyP sont des désherbants sélectifs lorsqu’ils sont appliqués par pulvérisation foliaire. Résumé La présente invention concerne donc l’utilisation de porphyrines cationiques choisies parmi la zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride (Zn-TMPyP), la tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride (TMPyP) ou leur mélange, en tant qu’herbicide foliaire sélectif. Les inventeurs ont en effet avantageusement démontré que Zn-TMPyP peut être utilisée en tant qu’herbicide foliaire sélectif. Alors que Zn-TMPyP inhibe significativement le développement des plantes (adventices et plantes d’intérêt agronomique) lorsqu’elle est appliquée sur les racines des plantes in vitro , les inventeurs ont démontré que Zn-TMPyP préserve les plantes d’intérêt agronomique et n’affecte pas leur développement lorsque Zn-TMPyP est appliquée par pulvérisation foliaire, typiquement dans une serre. En revanche, ce même procédé (application foliaire de Zn-TMPyP dans une serre) entraine la mort des adventices. Zn-TMPyP, est donc un herbicide foliaire sélectif qui permet de lutter contre les adventices tout en préservant les cultures d’intérêt agronomique. Par ailleurs, TMPyP et Zn-TMPyP sont avantageusement photodégradables, permettant ainsi de limiter leur effet à long terme. Leur non-toxicité a également été démontrée envers des vers de pêche (asticots). Avantageusement toujours, TMPyP et Zn-TMPyP sont efficaces à faibles concentrations. Typiquement, le glyphosate, qui reste l’herbicide le plus employé au monde, est utilisé à des concentrations extrêmement importantes (de l’ordre d’environ 360g/L). Les composés herbicides selon l’invention sont quant à eux utilisés à des concentrations de l’ordre du micromolaire (µM). Ces molécules constituent donc une alternative aux herbicides présents sur le marché, plus respectueuses de l’environnement et ayant un impact réduit sur la santé humaine et la biodiversité animale et végétale. La présente invention concerne également un procédé sélectif de désherbage consistant en l’application de porphyrines cationiques choisies parmi TMPyP, Zn-TMPyP ou leur mélange, lesdites porphyrines étant appliquées par pulvérisation foliaire. D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels : Fig. 1 montre l’effet biocide in vitro de 3.5µM de Zn-TMPyP sur les plantes d’intérêt agronomique (orge, tomate, pomme de terre, tabac et vigne). Fig. 2 montre l’effet biocide in vitro de de 3.5µM Zn-TMPyP sur les adventices (ortie, arabidopsis et coquelicot). Fig. 3 montre l’effet herbicide foliaire sélectif de Zn-TMPyP sous serre sur deux systèmes de cultures associées avec leurs adventices (orge / coquelicot et tomate / millet) après deux mois de traitement avec soit 50µM Zn-TMPyP soit de l’eau (culture témoin). Il est à noter que le coquelicot est complètement détruit. Fig. 4 est un comparatif démontrant l’effet biocide in vitro de 3.5µM de Zn-TMPyP sur les plantules de tomate de 22 jours, et l’absence d’effet de 50µM de Zn-TMPyP sur des plantules de tomates sous serre de 22 jours comparativement à leurs milieux témoins respectifs. Fig. 5 est un comparatif démontrant l’effet biocide in vitro de 3.5µM de Zn-TMPyP sur les plantules d’orge de 17 jours, et l’absence d’effet de 50µM de Zn-TMPyP sur des plantules d’orge sous serre de 22 jours comparativement à leurs milieux témoins respectifs. Fig. 6 est un comparatif démontrant l’effet biocide in vitro de 3.5µM de Zn-TMPyP sur les plantules de coquelicot de 22 jours, et l’effet herbicide de 50µM de Zn-TMPyP sur des plantules de coquelicot sous serre comparativement à leurs milieux témoins respectifs. Fig. 7 montre l’innocuité de la Zn-TMPyP 50µM sur la viabilité des asticots en présente et en l’absence de lumière 24 heures après le traitement par pulvérisation de Zn-TMPyP 50µM. Fig. 8 correspond au suivi de la photostabilité/photodégradation de la Zn-TMPyP à 50 µM avec ou sans surfactant dans l’eau sous photopériode (16 h lumière/8 h obscurité) ou à l’obscurité. Fig. 9 correspond au dosage des thiols totaux ainsi que des activités enzymatiques (catalase et guaïacol peroxydase) sur des plantules de tomates cultivées pendant 1 mois in vitro sur le milieu riche en Zn-TMPyP 3.5 µM . Fig. 10 correspond au dosage des thiols totaux ainsi que des activités enzymatiques (catalase et guaïacol peroxydase) sur des plantules de tomates cultivées pendant deux mois sous serre, après application foliaire de 50µM de Zn-TMPyP. Fig. 11 est un comparatif schématique des résultats présentés aux figures 8 et 9 démontrant, notamment, que les résultats in vitro ne sont pas extrapolables aux résultats sous serre. Description détaillée La présente invention concerne donc l’utilisation de porphyrines cationiques choisies parmi la zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride, la tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride ou leur mélange en tant qu’herbicide foliaire sélectif. Porphyrines cationiques Les porphyrines utilisées selon l’invention sont la tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride (TMPyP ou T4MPyP) de formule (I) : [chem 1] (formule I) et la zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride nommée Zn-TMPyP ou Zn-T4MPyP de formule II, où X est un atome de Zinc : [chem 2] (formule II). Zn-TMPyP est une porphyrine cationique métallée au niveau du noyau tétrapyrrolique. Zn-TMPyP et TMPyP sont commercialisées par la société Frontier Scientific (Carnforth, UK). Selon un mode de réalisation préféré, Zn-TMPyP est utilisée en tant qu’herbicide foliaire sélectif. Espace de culture On entend par culture ou espace de culture, tout espace permettant de cultiver des plantes et plus particulièrement des plantes d’intérêt agronomique. On citera, à titre illustratif, une serre, un champ, une prairie, une cour, une allée, un jardin. Herbicide foliaire sélectif Un herbicide est un pesticide à usage agricole dont l'activité sur le métabolisme des plantes entraîne leur mort. Les porphyrines cationiques selon l’invention sont des herbicides sélectifs lorsqu’elles sont appliquées par pulvérisation foliaire. En effet, et contrairement aux résultats vitro démontrant l’effet biocide de Zn-TMPyP, les inventeurs ont avantageusement mis en évidence que Zn-TMPyP et TMPyP peuvent être utilisées comme herbicide sélectif lorsqu’elles sont appliquées par pulvérisation foliaire. Les inventeurs ont en effet prouvé que Zn-TMPyP pulvérisée en serre entraine la mort des adventices et préserve les plantes d’intérêt agronomique. Il a été démontré que les plantes d’intérêt telles que l’orge et la tomate poussent parfaitement que ce soit dans la condition « témoin » (pulvérisation d’H 2 O) ou suite à leur traitement (pulvérisations foliaires de 50 µM de Zn-TMPyP). A l’inverse, le coquelicot et le millet sont complètement morts suite au traitement foliaire par Zn-TMPyP. Les premiers symptômes apparaissent 24 h après le premier traitement. Après 48 heures, le coquelicot est complétement détruit. Ces résultats sont inattendus au regard des effets in vitro : alors que la croissance de l’orge et de la tomate était drastiquement altérée in vitro par 3.5µM de Zn-TMPyP en application racinaire, l’application par pulvérisation foliaire de 50 µM de Zn-TMPyP n’a eu aucun effet sur la croissance des plantes d’intérêt agronomique. En revanche, la même dose de Zn-TMPyP entraine la mort des adventices témoignant de l’effet herbicide sélectif lorsque Zn-TMPyP est appliqué par pulvérisation foliaire. Ainsi, Zn-TMPyP et TMPyP sont avantageusement des herbicides foliaires sélectifs, préférentiellement lorsqu’elles sont appliquées dans une serre. Un herbicide foliaire est appliqué par pulvérisation sur les feuilles et nécessite un adjuvant pour aider le principe actif à pénétrer à l’intérieur des cellules (translocation basipète). A l’inverse, dans le cas d’un herbicide racinaire, le principe actif est absorbé par les racines et conduit par la sève (translocation acropète). Ainsi, et de manière inattendue, alors que Zn-TMPyP s’est révélé être un herbicide racinaire i n vitro , il est avantageusement sélectif lorsqu’il est appliqué par pulvérisation foliaire. Un herbicide sélectif est un herbicide qui vise à éliminer les adventices sans endommager l’espace de culture tel qu’une serre, un champ, une prairie, une cour, une allée, un jardin. Il s’agit donc de lutter contre les adventices ou « mauvaises herbes » qui sont indésirables dans les cultures. Avantageusement, les porphyrines cationiques selon l’invention vont détruire les adventices sans endommager les plantes d’intérêt agronomique. On entend par le terme « adventice » toute plante herbacée ou ligneuse qui se trouve dans un agroécosystème sans y avoir été intentionnellement installée. Il s’agira par exemple d’une espèce végétale indésirable présente dans un champ de culture d’une autre espèce végétale. Selon un mode de réalisation, les plantes d’intérêt agronomique seront choisies parmi des plantes du genre Nicotiana , du genre Solanum , du genre Vitis , du genre Hordeaum , du genre Triticum , du genre Zeva , du genre Helianthus , du genre Allium , du genre Spinacia , du genre Frugaria , du genre Brassica. Typiquement, les plantes d’intérêt agronomique seront choisies parmi le tabac ( Nicotiana tabacum ), la pomme de terre ( Solanum tuberosum ), la vigne ( Vitis vinifera ), l’orge ( Hordeum vulgare ), la tomate ( Solanum lycopersicum ), le blé ( Triticum sativum ), le maïs ( Zeya mays ), le tournesol ( Helianthus annuus ), l’oignon ( Allium cepa ), l’épinard ( Spinacia oleracea ), la fraise ( Frugaria sp. ) et le navet ( Brassica rapa ). Ainsi, selon un mode de réalisation, Zn-TMPyP et TMPyP sont utilisés pour le traitement de cultures choisies parmi les cultures de tabac ( Nicotiana tabacum ), de pomme de terre ( Solanum tuberosum ), de vigne ( Vitis vinifera ), d’orge ( Hordeum vulgare ), de tomate ( Solanum lycopersicum ), de blé ( Triticum sativum ), de maïs ( Zeya mays ), de tournesol ( Helianthus annuus ), d’oignon ( Allium cepa ), d’épinard ( Spinacia oleracea ), de fraise ( Frugaria sp. ) et de navet ( Brassica rapa ). Typiquement, les adventices seront choisies parmi des adventices du genre Urtica , du genre Echinochloa , du genre Papaver , du genre L olium , du genre Datura , du genre Stellaria , du genre Chenopodium , du genre Panicum , du genre Taraxacum , du genre Rumex , du genre Solanum . Selon un mode de réalisation, les adventices seront choisies parmi l’ortie ( Urtica dioïca ), le millet ( E chinochloa frumentacea ),le coquelicot ( Papaver rhoeas ), le ray gras d’italie ( L olium multiforum ), la datura ( Datura stramonium ), le mouron blanc ( Stellaria media ), le chenopode blanc ( Chenopodium album ), le faux millet ( Panicum miliaceum ), le pissenlit ( Taraxacum officinale ), le rumex ( Rumex crispus ), la morelle noire ( Solanum nigrum ). Zn-TMPyP et TMPyP ont donc un effet herbicide sur l’ortie, le millet et le coquelicot, le ray gras d’Italie, la datura, le mouron blanc, le chenopode blanc, le faux millet, le pissenlit, le rumex, la morelle noire tout en préservant les cultures de tabac, de pomme de terre, de vigne, d’orge, de tomate. Composition herbicide sélective La présente invention concerne également une composition herbicide sélective comprenant des porphyrines cationiques choisies parmi la zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride, la tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride ou leur mélange et au moins un surfactant, la teneur en porphyrines cationiques étant d’environ 44mg/L. . L’homme du métier est à même de déterminer la concentration à appliquer ainsi que la fréquence en fonction de la nature des cultures, de la surface du champ, des conditions météorologiques,… Typiquement, le surfactant sera choisi parmi les surfactants neutres et non ioniques tels que le polyoxyethylène nonylphenylether, les surfactants anioniques tels que les produits commercialisés sous la dénomination clasoft®, texapon®, les surfactants cationiques tels que benzalkonium chloride (BAC) ou le Benzethonium chloride (BZT), les surfactants neutres zwitterioniques, Préférentiellement, le surfactant est le polyoxyethylène nonylphenylether) (Igepal CO-630, Sigma Aldrich). Procédé de désherbage La présente invention concerne également un procédé sélectif de désherbage comprenant au moins une étape d’application de porphyrines cationiques choisies parmi la zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride, la tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride ou leur mélange dans un espace de culture, lesdites porphyrines étant appliquées par pulvérisation foliaire. Préférentiellement, l’espace de culture est choisi parmi une serre, un champ, une prairie, une cour, une allée, un jardin. On entend par « pulvérisation foliaire » l’application des porphyrines selon l’invention sur les parties aériennes des adventices et des plantes d’intérêt agronomique en culture, et préférentiellement l’application sur les feuilles des adventices et des plantes d’intérêt agronomique en culture Selon un mode de réalisation du procédé de désherbage, TMPyP et Zn-TMPyP sont pulvérisées au stade cotylédon et/ou au stade premières feuilles tel que le stade 2 feuilles et/ou 4 feuilles. On entend par « stade cotylédonnaire » ou « stade cotylédon », le stade d’émergence des feuilles embryonnaires. On entend par « stade premières feuilles », le stade de développement des vraies feuilles. Méthode herbicide sélective L’invention concerne également une méthode de désherbage sélectif, la méthode comprenant l’application à un espace de culture, de porphyrines cationiques choisies parmi la zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride, la tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride ou leur mélange, lesdites porphyrines étant appliquées par pulvérisation foliaire. Préférentiellement, l’espace de culture est choisi parmi une serre, un champ, une prairie, une cour, une allée, un jardin. Selon un mode de réalisation du procédé de désherbage, TMPyP et Zn-TMPyP sont pulvérisés au stade cotylédon et/ou au stade 2 feuilles et/ou 4 feuilles. Exemples Matériels et Méthodes Dans les exemples qui suivent, les matériels et méthodes ci-après décrits ont été utilisés. Porphyrines cationiques La porphyrine cationique métallée au niveau du noyau tétrapyrrolique utilisée est la Zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride nommée Zn-TMPyP (commercialisée par Frontier Scientific (Carnforth, UK)). La solution mère préparée à 1 mM dans l’eau, est conservée à l’obscurité à température ambiante. Formulation pour la pulvérisation foliaire 50 μM de Zn-TMPyP solubilisé dans l’eau + 0.1% v/v d’un surfactant neutre et non ionique (Polyoxyethylène nonylphenylether) (Igepal CO-630, Sigma Aldrich). Test de photostabilité / photodégradation La photostabilité / photodégradation de Zn-TMPyP a été testée dans l’eau sous photopériode de 16 h et à l’obscurité avec ou sans surfactant . La Zn-TMPyP mélangée avec 0.1%v/v de surfactant est testée à 50 µM sous photopériode et dans l’obscurité en monitorant l’absorption de la bande de Soret par spectrométrie UV-visible. Le suivi de l’intensité de la bande de Soret en fonction du temps d’irradiation permet de calculer le pourcentage des porphyrines dégradées. Modèles végétaux Neuf espèces végétales appartenant à plusieurs grandes familles ont été testées selon les conditions ci-après décrites : Famille des plantules Espèces testées Classification Solanacées Tomate Solanum lycopersicum var Marmande dicot Solanacées Pomme de terre (Solanum tuberosum) Cultivar : Coquine dicot Solanacées Tabac ( Nicotiana benthamiana ) dicot Poacées Orge ( Hordeum sativum ) monocot Vitacées Vigne ( Vitis vinifera ) Cultivar : Sauvignon (clone 379) pérenne Papavéracées Coquelicot ( Papaver rhoeas ) dicot Brassicacées Arabidopsis thaliana écotype ws dicot Poacées Millet echinochloa frumentacea monocot Urticacées La grande Ortie urtica dioica dicot Stérilisation des graines /caryopses La stérilisation des graines se fait selon le protocole suivant. Une stérilisation de surface est tout d’abord effectuée à l’éthanol 70 % (v/v) pendant 2 minutes à température ambiante. L’éthanol est éliminé et les graines sont plongées dans 20 % (v/v) d’hypochlorite de sodium pendant 15-20 minutes puis abondamment rincées avec de l’eau stérile. Les caryopses d’orge sont laissés au moins une heure dans l’eau avant mise en culture. Germination des graines Le milieu de germination pour toutes les graines est le milieu synthétique de Gamborg aussi appelé B5 (Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands) supplémenté par du saccharose 2 % (m/v) et solidifié à l’agar à 0,8% (Difco, Dallas, USA). Le pH est ajusté à 5,8 avec de la soude à 1 M avant autoclavage. Après autoclavage (120°C, 20 minutes, 1 bar) et refroidissement du milieu dans les boîtes de Petri et/ou les bocaux, est rajoutée la porphyrine à la concentration désirée. Après stérilisation, les graines sont déposées sur le milieu B5 solidifié contenant ou non la porphyrine, sous la hotte à flux laminaire. Les boîtes de Pétri comme les bocaux sont placés en chambre de culture (photopériode 16 h, 22 °C, densité du flux de photons ~100 μmol.m−2.s−1 généré par des lampes cool daylight (OSRAM Lumilux 24W)). Les bocaux sont utilisés pour le transfert des plantules et leur permettent une croissance plus appropriée. Multiplication in vitro des clones Les explants sont multipliés de façon stérile à partir de plantules de 1 mois pour la pomme de terre et de deux mois pour les vignes. Les explants de pomme de terre sont multipliés sur un milieu synthétique Murashige et Skoog supplémenté en saccharose 2% et myo-inositol (100 mg/L) pH 5.8. Les explants de vigne sont cultivés sur milieu ½ Chée et Pool supplémenté en saccharose 2%, pH 5.9. Les milieux sont solidifiés par du Sobigel 0.8 %. Les deux milieux sont fournis par Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands. Les milieux sont autoclavés comme décrit précédemment pour le milieu B5. Les explants de vigne sont mis en chambre de culture 25° C et ceux de pomme de terre à 23 °C, même photopériode et intensité lumineuse que pour les germinations de graines. Culture sous serre Les différentes graines sont mises en culture sous serre dans du terreau commercial (Terreau universel, Fertiligène). Les graines ont été semées à la serre dans des conditions de température et d’humidité́ contrôlées (La température varie entre 15 °C et 30 °C selon la saison, et l'humidité́ relative varie de 50 à 70%.). Deux traitements ponctuels (environ 10 pulvérisations chacun) espacés de 48 h ont été réalisés une semaine après la mise en germination. Le premier traitement a été réalisé lorsque les plantules sont au stade cotylédons, le deuxième lorsque les plantules sont au stades premières feuilles. Au bout de deux mois, les plantules ont été́ récoltées. Les racines et les parties aériennes ont été séparées et les racines ont été lavées à l’eau distillée et séchées sur papier absorbant. Ces matériels ont été ensuite conservés à -20° C jusqu’à leur utilisation pour les différentes analyses biochimiques. Test biochimiques Détermination des thiols totaux Les plantules (racines et appareil aérien séparés avant congélation) sont broyées dans de l’azote liquide. La poudre est transvasée dans un tube Eppendorf et pesée (entre 200 et 100 mg par extraction). L’extrait est acidifié par 0,2 N HCL vortexé et centrifugé (13000 g 10 min 4 °C). 500 µL du surnageant est neutralisé par 400 µL NaOH (0,2 N) et 50 µL Na 2 HPO 4 . Ensuite, 700 µL Na 2 HPO 4 0,12 M, 6 mM EDTA et 6 mM DTNB sont ajoutés sur 200 µL de la solution neutralisée. Après établissement d’une gamme de glutathion, on détermine les thiols totaux contenus dans les échantillons par spectrométrie UV-visible à 412 nm et on rapporte à la masse fraiche. Activités enzymatiques Les plantules (racines et appareil aérien séparés avant congélation) sont broyées dans de l’azote liquide. La poudre est transvasée dans un tube Eppendorf dans lequel 50 mg de PolyVynil PolyPyrrolidone (PVPP) (Sigma) ont été préalablement pesés. Le PVPP permet d’éliminer les polyphénols présents dans les organes qui seraient susceptibles d’interférer avec les dosages biochimiques. Le broyat est pris dans du tampon d’extraction (25 mM tampon phosphate pH 7.8, 10 % (v/v) glycérol, et 1 mM EDTA). Les tubes sont ensuite centrifugés 20 minutes à 14 000 rpm à 4°C et les surnageants sont conservés à 4°C pour le dosage des protéines ou conservés à -20°C. Pour le dosage des protéines nous utilisons la méthode de dosage de Bradford (Bradford, 1976) et la BSA pour la gamme étalon. Détermination de l’activité de la catalase (CAT) La catalase est une enzyme de la famille des oxydoréductases. L’activité de la catalase est quantifiable en mesurant la disparition de l’H 2 O 2 par dismutation en H 2 O et O 2 . Pour déterminer cette activité, nous utilisons le protocole réalisé dans la publication de Issawi. et al. (2018). La cinétique de disparition de l’H 2 O 2 est mesurée pendant 200 secondes toutes les 20 secondes à 240 nm. L’activité est calculée en utilisant le coefficient d’extinction molaire de H 2 O 2 qui est de 43.6 mM -1 .cm -1 Détermination de l’activité de la guaïacol peroxydase (GPOX) La guaïacol peroxydase est une enzyme présente uniquement chez les plantes. Elle détoxifie la plante des molécules de peroxyde d’oxygène produites par le champignon. Son activité est mesurée par l’oxydation du guaïacol en présence d’H 2 O 2 . Pour déterminer cette activité, nous utilisons le protocole décrit dans la publication de Issawi. et al. (2018). La cinétique d’apparition du guaïacol oxydé est mesurée pendant 120 secondes toutes les 10 secondes à 436 nm. L’activité́ est calculée en utilisant le coefficient d’extinction molaire de H 2 O 2 qui est de 25.5 mM -1 .cm -1 . Les tests biochimiques ont été réalisés sur 3 expériences indépendantes et validés statistiquement en utilisant le logiciel PAST Exemple 1 : Démonstration de l’effet herbicide foliaire sélectif de Zn-TMPyP vs l’ effet biocide in vitro de de Zn-TMPyP A. Effet biocide in vitro : c as des plantes d’intérêt agronomique Les résultats sont présentés à la . Pour éviter les contraintes mécaniques, les résultats ci-après présentés concernant l’orge et la tomate sont des résultats après 17 et 22 jours respectivement. En effet, les plantules vont rapidement croitre sur les milieux témoins (sans Zn-TMPyP) et toucher le couvercle des bocaux par rapport aux autres cultures. Orge Il apparait clairement que la croissance de l’orge est altérée après un mois de culture sur milieu riche en Zn-TMPyP à 3.5 µM. De plus, les feuilles montrent un jaunissement et par la suite un flétrissement. En revanche, en milieu témoin, l’orge pousse normalement et montre une croissance rapide et parfaite au bout des 17 jours. Tomate Conformément aux résultats de l’état de la technique (Guillaumot et al.), la tomate (variété Marmande) montre un développement significativement inhibé après 22 jours sur le milieu riche en Zn-TMPyP à 3.5 µM par rapport à la condition « témoin ». Pomme de terre La pomme de terre (variété Coquine) montre un léger retard de croissance au niveau de la tige et les racines sur le milieu traité par comparaison aux plantules de la condition témoin. Tabac et vigne Les plantules de tabac et de vigne témoignent d’une inhibition considérable de leur développement après respectivement, un mois et demi et deux mois de culture sur milieu riche en en Zn-TMPyP à 3.5 µM ( ). Conclusion : effet biocide in vitro de Zn-TMPyP sur les plantes d’intérêt agronomique Après traitement avec Zn-TMPyP, les plantes d’intérêt agronomique présentent au mieux un retard de croissance. Dans la majorité des cas, la croissance de ces plantes est inhibée par Zn-TMPyP, comparativement au milieu témoin. Il apparait ainsi très clairement que Zn-TMPyP a un effet biocide in vitro sur les plantes d’intérêt agronomique. B. Effet biocide in vitro : c as des adventices Les résultats sont présentés à la . Ortie et Arabidopsis L’ortie et arabidopsis montrent une inhibition très importante de croissance sur un milieu traité avec la Zn-TMPyP (3.5 µM) au bout de 18 jours et 1 mois respectivement. Coquelicot Pour le coquelicot, les plantules montrent des réponses différentes qui témoignent d’une altération et inhibition remarquable au bout de 6 semaines. Conclusion : effet biocide in vitro de Zn-TMPyP sur les adventices Conformément aux résultats obtenus sur les plantes d’intérêt agronomique, la croissance des adventices est inhibée par Zn-TMPyP, témoignant de son effet biocide in vitro. Les résultats in vitro témoignent d’un effet herbicide racinaire de Zn-TMPyP. C. E ffet herbicide foliaire sélectif : essais sous serre Les résultats sont présentés aux figures 3 à 6. Des essais sur deux systèmes de culture associées avec leurs adventices ont été réalisés : - l’orge (graminée) avec le coquelicot (dicot) - la tomate (dicot) avec le millet (graminée) avec une pulvérisation de 50 µM de Zn-TMPyP en deux temps espacés de 48 h une semaine après la mise en germination. Les plantules ont été suivies chaque 48 h. Le milieu témoin a été pulvérisé avec de l’eau à la même fréquence. Les résultats au bout d’un mois et deux mois montrent que les plantes d’intérêt poussent parfaitement que ce soit dans la condition « témoin » ou suite à leur traitement (environ 10 pulvérisations foliaires) par 50 µM de Zn-TMPyP. A l’inverse, le coquelicot et le millet sont complètement morts suite à leur traitement. Les premiers symptômes apparaissent 24 h après le premier traitement et le coquelicot est détruit au bout de 48 heures après le premier traitement (10 premières pulvérisations) Alors que la croissance de l’orge et de la tomate était drastiquement altérée in vitro par 3.5µM de Zn-TMPyP, l’application par pulvérisation foliaire de 50 µM de Zn-TMPyP n’a eu aucun effet sur la croissance des plantes d’intérêt agronomique. En revanche, la même dose de Zn-TMPyP entraine la mort des adventices témoignant de l’effet herbicide sélectif lorsque Zn-TMPyP est appliqué par pulvérisation foliaire. Ces résultats témoignent de l’effet herbicide foliaire sélectif de Zn-TMPyP. Ces essais confirment également que les résultats obtenus in vitro ne sont pas forcément et automatiquement transposables à l’échelle sous serre. En effet, l’orge et la tomate montrent un développement significativement inhibé in vitro . En revanche, aucun effet visible n’est remarqué sur ces cultures sous serre. D’un autre côté, le coquelicot est complètement détruit suite à la pulvérisation foliaire sous serre tandis qu’on observe des réponses différentes des plantules cultivées in vitro : des plantules présente une inhibition significative de croissance et d’autres témoignent d’un retard de croissance. D. Mécanisme d’action Les thiols totaux, ainsi que l’activité enzymatique (activité catalase et activité guaïcol peroxydase) ont été déterminées sur des plantules cultivées in vitro sur le milieu riche en Zn-TMPyP 3.5 µM ( ) et sur des plantules soumises à 50 µM de Zn-TMPyP par application foliaire ( ). La machinerie antioxydante est significativement inhibée dans les plantules cultivées sur le milieu riche en Zn-TMPyP 3.5 µM. Par contre, les molécules et les enzymes antioxydantes restent constantes chez les plantules traitées par 50 µM de Zn-TMPyP sous serre à part une augmentation des thiols dans les racines ( ). Ces essais confirment que la capacité de Zn-TMPyP à être une herbicide foliaire sélectif était inattendue, sur la base des essais in vitro . Enfin, il est à noter que l’effet suite à la pulvérisation foliaire de Zn-TMPyP n’est pas prévisible selon la nature du groupe de la plante : le développement de l’orge (graminée) et de la tomate (dicot) n’est pas affecté suite à la pulvérisation foliaire de Zn-TMPyP. En revanche l’effet inverse est obtenu sur les plantes du même groupe : le coquelicot (dicot) et le millet (graminée) sont complètement morts après pulvérisation foliaire de Zn-TMPyP. Exemple 2 : Détermination de la non- toxicité de Zn-TMPyP pour des vers de pêche (asticots) Les asticots ont été placés dans des boîtes de Pétri sous photopériode (16h) ou dans des conditions d'obscurité dans un phytotron (24 °C) pendant 24h. 30 asticots par boîte de pétri ont été soumis à 10 pulvérisations de H 2 O ou 50 µM de Zn-TMPyP. Le pourcentage de viabilité a été déterminé après 24 h. 5 à 10 % des asticots meurent dans les conditions normales (pulvérisation de H 2 O) et après traitement avec Zn-TMPyP, établissant l’innocuité de Zn-TMPyP sur les vers de pêche ( ). Zn-TMPyP est avantageusement plus respectueuse de l’environnement en ayant un impact réduit sur la biodiversité animale. Exemple 3 : Photostabilité / photodégradation de Zn-TMPyP A l’obscurité, la Zn-TMPyP reste parfaitement stable que ce soit avec ou sans surfactant durant 29 jours de suivi ( ). Sous photopériode (16 h lumière/8 h obscurité), la stabilité de la Zn-TMPyP (avec ou sans surfactant) chute fortement à partir du 10ème jour. Celle-ci est complètement photodégradée entre le 17éme et le 19ème jour. Quant à a solution sans surfactant, environ 93 % de Zn-TMPyP sont photodégradées au bout de 19 jours sous photopériode, ensuite cette solution continue à se photodégrader lentement pour disparaître au bout de 29 jours de photopériode. Ce suivi a été réalisé en effectuant 3 expériences indépendantes. Le suivi démontre que le temps de demi-vie de la solution du désherbant dans l’eau est de deux semaines quand elle est exposée à la lumière (c’est le cas quand la solution sera pulvérisée sur les plantes dans la nature). La stabilité absolue de la solution à l’obscurité assurera le bon stockage du produit pour de longues périodes, dans son emballage opaque, jusqu’à son utilisation. Ainsi, la photodégradabilité de Zn-TMPyP permet de limiter ses effets à long terme et plaide en faveur de son innocuité pour l’environnement et l’homme. Utilisation de porphyrines cationiques choisies parmi la zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride et la tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride ou leur mélange en tant qu’herbicide foliaire sélectif. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les porphyrines sont des zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrines tetrachloride. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdites porphyrines sont pulvérisées sur un espace de culture tel qu’un champ, une serre, une prairie, une cour, une allée, un jardin. Utilisation selon l’une quelconque des revendicaitons 1 à 3, caractérisée e ce que l’herbicide foliaire est utilisé pour le traitement de cultures choisies parmi les cultures du genre Nicotiana , du genre Solanum , du genre Vitis , du genre Hordeaum , du genre Triticum , du genre Zeva , du genre Helianthus , du genre Allium , du genre Spinacia , du genre Frugaria , du genre Brassica. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que lesdites porphyrines cationiques ont un effet herbicide sur des adventices du genre Urtica , du genre Echinochloa , du genre Papaver, du genre L olium , du genre Datura , du genre Stellaria , du genre Chenopodium , du genre Panicum , du genre Taraxacum , du genre Rumex , du genre Solanum . Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdites porphyrines cationiques ont un effet herbicide sur l’ortie ( Urtica ). Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdites porphyrines cationiques ont un effet herbicide sur le millet ( Echinochloa frumentacea ). Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdites porphyrines cationiques ont un effet herbicide sur le coquelicot ( Papaver rhoeas ). Procédé sélectif de désherbage consistant en l’application de porphyrines cationiques choisies parmi la zinc-tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride, la tetra (N-methylpyridyl) porphyrine tetrachloride ou leur mélange, lesdites porphyrines étant appliquées par pulvérisation foliaire sur un espace de culture tel qu’un champ, une serre, une prairie, une cour, une allée, un jardin. Procédé sélectif de désherbage selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que lesdites porphyrines sont appliqués au stade cotylédon et/ou au stade premières feuilles tel que le stade 2 feuilles et/ou 4 feuilles.