FR 3115993 A1 20220513 FR 2011592 A 20201112 La présente invention porte sur un patch mucoadhésif destiné à la libération buccale ou sublinguale d’une protéine ou d’un polypeptide, ledit patch comprenant au moins 100 bicouches composées chacune d’une couche de chitosan (CHI) et d’une couche d’un polysaccharide anionique. L’invention porte également sur un procédé de fabrication d’un tel patch. SYSTEMES DE LIBERATION DE PROTEINES PAR VOIE BUCCALE L’invention concerne un système de libération, sous la forme d’un patch mucoadhésif, d’une protéine par voie buccale. Arrière-plan technologique L'administration orale de médicaments est la voie d'administration la plus largement utilisée. Cependant, la libération de protéines d’intérêt thérapeutique par cette voie est délicate car les protéines sont hautement sensibles à l’action des enzymes du tractus gastro-intestinal. La muqueuse buccale représente une voie d’administration alternative séduisante, car elle permet de contourner l'effet de premier passage, présente une faible activité enzymatique et une plage physiologique de pH, et est anatomiquement accessible et bien vascularisée. Un système de libération par voie buccale pourrait ainsi fournir soit une libération locale (muqueuse) soit une libération systémique (transmucosale) de la protéine. Il existe toujours un besoin non satisfait d’un système mucoadhésif présentant des capacités de perméation optimisées, qui contribuerait à une réduction significative de la dose thérapeutique administrée ainsi qu'à un meilleur contrôle de l’absorption. Pour répondre à ce besoin, les inventeurs ont développé un patch mucoadhésif composé d'une combinaison de deux polysaccharides : un chitosan (CHI), et un polysaccharide anionique, tel que l’acide hyaluronique (HyA). L’invention fournit ainsi un patch mucoadhésif destiné à la libération buccale ou sublinguale d’une protéine ou d’un polypeptide, ledit patch comprenant au moins 100 bicouches composées chacune d’une couche de chitosan (CHI) et d’une couche d’un polysaccharide anionique ayant un poids moléculaire compris entre 500 et 1000 kDa ou un de ses sels, la couche en contact avec la muqueuse et la couche en contact avec l’environnement buccal ou sublingual du patch étant composées de chitosan (CHI), ladite protéine ou ledit polypeptide étant incorporé dans ledit patch et/ou adsorbé à la surface dudit patch. Le patch est autoportant et se dissout dans la salive en raison de la présence d’enzymes capables de dégrader les deux polysaccharides. Un autre objet de l’invention est un procédé de fabrication d’un tel patch, comprenant les étapes consistant à : i) former une membrane multicouches CHI/polysaccharide anionique au moyen d’un procédé de dépôt couche par couche (« Layer By Layer ») sur un substrat ; ii) détacher la membrane multicouches du substrat ; iii) mettre au contact la membrane multicouches avec une protéine, par ce en quoi la membrane multicouches se charge en protéine. Un autre objet de l’invention porte sur un patch selon l’invention susceptible d’être obtenu par un procédé tel que décrit ici. Légende des figures Figure 1 : Epaisseur et profils de dégradation des membranes autoportantes (CHI/HyA)100. : Epaisseur des membranes en fonction des variations du poids moléculaire de HyA (660 ou 1020 kDa, correspondant respectivement à HyA.LW et HyA.HW) ou de temps de dépôt : Cycles Courts ou Cycles Long. La signification statistique des différences entre deux groupes a été déterminée à l'aide d'un test ANOVA à un facteur contrôlé : ns, non-significatif ; **** p : Profils de dégradation des membranes immergées dans de la salive artificielle, exprimés en pourcentage de perte de masse en fonction des différents paramètres de production des membranes. : Images en microscopie électronique à balayage (MEB) de membranes (CHI/HyA 660 )-CHI cycles courts, immergées dans la salive artificielle durant 30 min, 1h ou 3h. Barre d’échelle correspondant à 44 µm. : Images de membranes (CHI FITC /HyA 660 )-CHI FITC cycles courts obtenues par microscopie confocale après 30 min, 3h, 6h ou 24h dans la salive artificielle. La condition contrôle correspond à l’immersion de la membrane dans un tampon acétate durant 24h. a, b, c, d, e : surface de la membrane ; sections inférieures : images de coupe de profondeur (z-section) des mêmes membranes. Barre d’échelle horizontale correspondant à 50 µm. Figure 2 : Les produits de dégradation des membranes ne montrent aucune toxicité pour les cellules épithéliales humaines. : Viabilité cellulaire après incubation de cellules HeLa avec des produits de dégradation durant 24h. Membrane : membranes (CHI/HyA) 100 ; Membrane.HCl: membranes (CHI/HyA) 100 traitées à l’acide chlorhydrique (HCl). La significativité statistique des différences entre deux groupes a été déterminée à l’aide d’un test ANOVA à un seul facteur contrôlé : ns, non significatif. : Viabilité cellulaire après incubation de cellules Ho-1u-1 avec des produits de dégradation durant 24h. Membrane : membranes (CHI/HyA) 100 ; Membrane.HCl: membranes (CHI/HyA) 100 traitées à l’acide chlorhydrique (HCl). La significativité statistique des différences entre deux groupes a été déterminée à l’aide d’un test ANOVA à un seul facteur contrôlé : ns, non significatif. Figure 3 : Inflammation contrôlée de la muqueuse sublinguale par un traitement à l’HCl des membranes. : L’épaisseur de muqueuse a été évaluée dans la muqueuse entière (épithélium et lamina propria) après l’application d’une membrane ou de 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB). : Le recrutement des cellules CMHII positives (CMHII+) a été évalué dans la muqueuse entière (épithélium et lamina propria) après l’application d’une membrane ou de 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB). Les membranes natives (Patch) ont été administrées durant 30 min ou 60 min et les membranes traitées par HCl (Patch HCl) ou NaCl (Patch NaCl) ont été appliquées durant 30 min. Chaque valeur fournie correspond à la moyenne d’au moins 3 mesures provenant de 3 individus indépendants (N=3). La significativité statistique des différences entre deux groupes a été déterminée à l’aide d’un test ANOVA à un seul facteur contrôlé : ns, non significatif ; *, p : Images représentatives du recrutement de cellules CMHII+ au niveau de la muqueuse, obtenues par marquage histologique. Barre d’échelle : 170 µm. : Niveaux de cytokine inflammatoire IL-1β dans la langue et les tissus sublinguaux mesurés 6h après l’administration de membranes aux souris. : Niveaux de cytokine inflammatoire IL-6 dans la langue et les tissus sublinguaux mesurés 6h après l’administration de membranes aux souris. : Niveaux de cytokine inflammatoire TNF-α dans la langue et les tissus sublinguaux mesurés 6h après l’administration de membranes aux souris. La significativité statistique des différences entre deux groupes a été déterminée à l’aide d’un test ANOVA à un seul facteur contrôlé : ns, non significatif ; *, p : Représentation schématique de l’incorporation de protéines par variation de pH dans un assemblage couche par couche (LbL). Après fonctionnalisation par piégeage des protéines, la membrane LbL devient un patch bioactif, prêt à être appliqué. CHI : chitosan, HyA : acide hyaluronique. Figure 5 : Incorporation et profils de libération depuis la membrane de l’ovalbumine marquée avec Alexa Fluor 647 (OVAAlexa F. 647). : Niveaux d’incorporation d’OVA A lexa F . 647 dans le patch (CHI/HyA) 100 -CHI après une incubation avec 0,5 µg de protéines dans de l’HCl et rinçage avec différents tampons. : Profils de libération de OVA A lexa F . 647 depuis le patch sur une durée de rinçage de 2h avec différentes solutions. Les données correspondent à la moyenne avec erreur type (± SEM) de triplicats provenant de trois expériences indépendantes (N=3). : Image de microscopie confocale de la surface du patch contenant l’OVA A lexa F . 647 , barre d’échelle correspondant à 50 µm (partie supérieure) et coupe optique du patch en profondeur, suivant l’axe (z) (partie inférieure). Les lignes pointillées représentent les limites du patch. : Intensité de fluorescence de l’OVA A lexa F . 647 et du patch (CHI. MW .F ITC ) le long de la flèche représentée en C (partie inférieure). Figure 6 : Temps de rétention du patch sur la muqueuse sublinguale. : Coloration du patch (CHI/HyA) 100 à l’hématoxyline mis en contact avec la muqueuse sublinguale, 20 minutes après l’administration du patch. Barre d’échelle correspondant à 100 µm. M = muqueuse, P = Patch. : Tomographie de fluorescence moléculaire de l’OVA AF647 en solution ou incorporée dans le patch (CHI/HyA) 100 . Le signal de fluorescence a été détecté 2, 10, ou 30 min après administration. : Pénétration tissulaire de l’OVA AF647 après l’administration du patch. Microscopie confocale de coupes de langues de souris avec un marquage nucléaire des cellules au DAPI, 2 min après administration de l’OVA AF647 en solution ou 2 min, 10 min, 30 min et 60 min après administration de l’OVA AF647 incorporée dans le patch (CHI/HyA) 100 . L’OVA AF647 a été observée dans les couches kératinisées 10 min après administration (flèches blanches) et dans la sous-muqueuse 30 min après administration (flèche pointillée). Barre d’échelle : 20 µm. Lignes pointillées correspondant à la limite de la muqueuse. : Les capacités de chimio-attraction de la cytokine CCL20 sont préservées dans le patch. Chimiotaxie in vitro de CCL20 libérée depuis le patch comparé à CCL20 en solution. Une concentration de 25 ng.mL -1 a été utilisée pour évaluer la migration des cellules DC 2.4. Du milieu de croissance, des enzymes salivaires seuls et des membranes (CHI/HyA) 100 ont été utilisés pour les contrôles négatifs. La significativité statistique des différences entre deux groupes a été déterminée en utilisant un test ANOVA à un facteur contrôlé : ns, non significatif ; *, p Figure 9 : Epaisseur et profils de dégradation des membranes autoportantes (CHI/HyA)100-CHI or (VIS/HyA)100-VIS. : Epaisseur des membranes selon le nombre de bicouches : 50, 100, ou 200 bicouches avec une dernière couche d’HyA. Epaisseur des membranes faites de 100 bicouches avec une dernière couche produite avec du CHI provenant de Sigma ou avec du Viscosan ® (VIS) provenant de Flexichem. Chaque type de membrane a été mesuré au moins 20 fois. La significativité statistique entre deux groupes a été déterminée à l’aide d’un test ANOVA à un seul facteur contrôlé : ns, non significatif, ****, p : Profil de dégradation des membranes immergées dans de la salive artificielle exprimée en pourcentage de perte de poids en fonction des différents types de membranes faites de CHI ou de VIS. Chaque valeur fournie correspond à la moyenne de triplicats provenant de trois expériences indépendantes (N=3). Figure 10 : Incorporation et profils de libération de l’OVA647 depuis la membrane. : Niveaux d’incorporation d’OVA AF647 dans le patch (CHI/HyA) 100 -CHI après incubation avec 0,5 µg de protéines dans du NaCl et rinçage avec différents tampons. : Profils de libération de l’OVA AF647 depuis le patch sur une durée de rinçage de 2h avec différentes solutions. Les données correspondent à la moyenne de triplicats provenant de trois expériences indépendantes. : Image de microscopie confocale de la surface du patch contenant l’OVA AF647 , barre d’échelle correspondant à 50 µm (partie supérieure). Coupe optique du patch en profondeur, suivant l’axe (z) (partie inférieure). Les lignes pointillées représentent les limites du patch. : Intensité de fluorescence de l’OVA AF647 et du patch (CHI FITC ) le long de la flèche représentée en C (partie inférieure). : Schéma illustrant l’emprisonnement de la protéine ou polypeptide par gonflement ou resserrage de la membrane multicouches. Description détaillée de l’invention Tel qu’illustré, dans les exemples ci-après, les inventeurs ont développé un patch mucoadhésif pour la libération buccale ou sublinguale d’une protéine assurant un meilleur contrôle de la dose de protéine administrée et de son absorption par les muqueuses. Les inventeurs ont également mis en avant le caractère non toxique d’un tel patch et l’absence d’inflammation des muqueuses après l’application d’un tel patch. La présente invention porte donc sur un patch mucoadhésif destiné à la libération buccale ou sublinguale d’une protéine ou d’un polypeptide, ledit patch comprenant au moins 100 bicouches composées chacune d’une couche de chitosan (CHI) et d’une couche d’un polysaccharide anionique ayant un poids moléculaire compris entre 500 et 1000 kDa ou un de ses sels, la couche en contact avec la muqueuse et la couche en contact avec l’environnement buccal ou sublingual du patch étant composées de chitosan (CHI), ladite protéine ou ledit polypeptide étant incorporé dans ledit patch et/ou adsorbé à la surface dudit patch. Définitions Par « patch », on entend un système adhésif multicouches ou une membrane adhésive multicouches comprenant un composé biologiquement actif, tel qu’une protéine ou un polypeptide. Par « mucoadhésif », on entend un patch tel que défini dans la présente demande pouvant se coller à une muqueuse, de préférence une muqueuse buccale ou sublinguale. Par « autoportant », on entend une structure dénuée de support dont la rigidité permet à elle-seule sa stabilité. Le terme « sujet » signifie toutes personnes humaines ou animaux, de préférence mammifères, tels que des équidés, ovidés, bovidés, les chiens, les chats etc. Protéines et polypeptides Le patch selon l’invention permet la libération de toute protéine ou polypeptide d’intérêt. Par « protéine », on entend typiquement un polypeptide d’au moins 100 acides aminés, ou des polypeptides associés entre eux. Les protéines peuvent de préférence avoir un poids moléculaire compris entre 20 et 200 kDa. Plus spécifiquement, les protéines peuvent avoir un poids moléculaire inférieur à 70 kDa, ou un poids moléculaire plus élevé, par exemple de 100 à 200kDa. Parmi les protéines d’intérêt, on peut citer par exemple des anticorps (tels que des immunoglobulines G). Les polypeptides, qui peuvent être des fragments de protéines, ont typiquement de 10 à 100 acides aminés, de préférence encore de 20 à 80 ou 20 à 60 acides aminés. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine ou le polypeptide est un allergène. Les allergènes comme définis dans la présente invention comprennent des antigènes capables de stimuler une réaction allergique chez un sujet. Les allergènes peuvent être contenus ou être dérivés d’aliments tels que le lait, les œufs, le sésame, le blé, le soja, le poisson, les fruits de mer, les cacahuètes, les noix. Les allergènes peuvent être également contenus ou être dérivés de produits non-alimentaires tels que les acariens, le pollen, les piqures d’insectes, la fourrure d’animaux, la laine, les médicaments, etc. Les allergènes sont de préférence des polypeptides ou protéines formant tout ou partie d’un antigène capable d’être reconnu par une cellule du système immunitaire, et vis-à-vis duquel on cherche à induire une tolérance à l’allergène. Dans un exemple de réalisation préféré, la protéine à délivrer est l’ovalbumine. On peut encore citer, parmi les allergènes alimentaires préférés, la bétalactoglobuline, l'alphalactabumine, les caséines. Un objet de l’invention vise ainsi un allergène pour une utilisation dans la désensibilisation d’un sujet allergique audit allergène, ledit allergène étant administré sous la forme d’un patch tel que décrit ici. La désensibilisation du sujet, appelé également immunothérapie des allergies, permet au sujet de devenir tolérant à un allergène particulier à long terme. Patch multicouches Le patch selon l’invention comprend au moins 100 bicouches composées chacune d’une couche de chitosan (CHI) et d’une couche d’un polysaccharide anionique ayant un poids moléculaire compris entre 500 et 1000 kDa ou un des sels, où la couche en contact avec la muqueuse et la couche en contact avec l’environnement buccal ou sublingual sont composées de chitosan (CHI). Le patch selon l’invention est formé d’une membrane adhésive multicouches comprenant au moins 100 bicouches composées chacune dudit chitosan et dudit polysaccharide anionique où les deux couches situées aux deux extrémités ou à la périphérie de cette membrane sont composées de chitosan (CHI). Selon un mode particulier de l’invention, le patch comprend de 100 à 200 bicouches CHI/polysaccharide anionique. Selon un mode préféré, le patch comprend 100 ou 200 bicouches CHI/polysaccharide anionique, et de manière encore plus préférée 100 bicouches CHI/polysaccharide anionique. Selon un autre mode particulier de l’invention, le patch a une épaisseur de 10 à 20 µm, de préférence de 11 à 19 µm, 12 à 18 µm, 13 à 17 µm, 14 à 16 µm, et de manière encore plus préférée d’environ 15 µm. Le chitosan est un polyoside composé de la distribution aléatoire de D-glucosamine liée en ß-(1-4) (unité désacétylée) et de N-acétyl-D-glucosamine (unité acétylée). Il est produit par désacétylation chimique (en milieu alcalin) ou enzymatique de la chitine, qui est le composant de l'exosquelette des arthropodes (crustacés) ou de l'endosquelette des céphalopodes (calmars...) ou encore de la paroi des champignons. Cette matière première est typiquement déminéralisée par traitement à l'acide chlorhydrique, puis déprotéinée en présence de soude ou de potasse et enfin décolorée grâce à un agent oxydant. Le degré d'acétylation (DA) est le pourcentage d'unités acétylées par rapport au nombre d'unités totales, il peut être déterminé par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IR-TF) ou par un titrage par une base forte. De préférence, le chitosan choisi dans l’invention présente un degré de déacétylation (DD) supérieur ou égal à 75%, de préférence supérieur ou égal à 78%. Le chitosan présente l’avantage d’être un des seuls polysaccharides cationiques naturels facilement utilisable disposant en outre de bonnes propriétés adhésives. Les polysaccharides anioniques sont des polymères de la famille des glucides constitués de plusieurs oses liés entre eux par des liaisons osidiques. Selon l’invention, le polysaccharide ou un de ses sels a un poids moléculaire compris entre 500 et 1000 kDa. Parmi les polysaccharides anioniques, on peut citer par exemple les glycosaminoglycanes (GAGs), le fucoïdane, les alginates, les carraghénanes, et les ulvanes. Les glycosaminoglycanes (GAGs) sont polymères saccharidiques linéaires à longue chaîne présents pratiquement dans tous les tissus. L’unité de base des GAGs est un disaccharide, constitué d’un hexose (acide hexuronique en général) lié à une hexosamine. Une des caractéristiques de ces chaînes oligosaccharides est leur très grande hétérogénéité. En effet, la longueur variable des chaînes et leurs modifications structurales (sulfatations, épimérisations) conduit à un nombre de combinaisons indénombrable. Selon la nature des oses et la manière dont les disaccharides sont reliés entre eux, les GAGs sont classés en 5 grandes familles : les héparines (Hp) et les héparanes sulfates (HS), l’acide hyaluronique (AH), les chondroïtines sulfates (CS), les dermatanes sulfates et les kératanes sulfates. Le fucoïdane est un polysaccharide ayant pour sucre de base le fucose. Il tient son nom des algues de type fucus (algues brunes) où il est retrouvé. Les alginates sont des polysaccharides obtenus à partir d’algues brunes. Les alginates sont des polymères formés de deux monomères liés ensemble par une liaison β-1-4, à savoir l’acide mannuronique et l’acide guluronique. Les carraghénanes sont des polysaccharides (galactane) extraits d’algues rouges. Trois grandes catégories sont commercialisées aujourd’hui le κ-carraghénane, le ι-carraghénane, et le λ-carraghénane qui se différencient par le nombre et la position des groupements sulfates, ainsi que par le nombre de ponts 3,6-anhydrogalactose. Les ulvanes sont des polysaccharides anioniques sulfatés extraits d’algues vertes de type ulve. Ils sont composés de 3-sulfate ulvanobiuronate de sodium de type A comprenant du 3-sulfate rhamnose lié à de l'acide glucuronique par une liaison de type 1-4 et de 3-sulfate ulvanobiuronate de sodium de type B comprenant du 3-sulfate rhamnose lié à de l'acide iduronique par une liaison de type 1-4. Selon un mode particulier de l’invention, le polysaccharide anionique ou un de ses sels est choisi parmi un glycosaminoglycane (GAG), un fucoïdane, un alginate, un carraghénane, et un ulvane. Plus spécifiquement, le glycosaminoglycane (GAG) ou un de ses sels est choisi parmi l’acide hyaluronique (AH), l’héparine (Hp), les héparanes sulfates (Hs), les chondroïtines sulfates (CS), les dermatanes sulfates (DS), et les kératanes sulfates (KS), préférentiellement l’acide hyaluronique, et de manière encore plus préférée le hyaluronate de sodium. De préférence, le polysaccharide anionique tel que défini ci-dessus est hydrolysable par les enzymes salivaires. Fabrication du patch mucoadhésif Le patch mucoadhésif selon la présente invention peut être produit par un assemblage de couches chargées positivement (chitosan) et négativement (polysaccharide anionique) via un procédé de trempage automatisé. Un tel procédé de dépôt couche par couche (« Layer By Layer » LbL) est bien connu de l’homme du métier et est notamment mis en œuvre dans la demande internationale WO 2005/052035 pour préparer des films multicouches de polyélectrolytes réticulés. La membrane multicouches ainsi formée est ensuite mise en contact avec une protéine ou un polypeptide pour fournir un patch mucoadhésif chargé en protéine ou polypeptide. Un objet de l’invention porte donc sur un procédé de fabrication d’un patch tel que décrit dans la présente demande, comprenant les étapes consistant à : i) former une membrane multicouches CH/polysaccharide anionique au moyen d’un procédé de dépôt couche par couche (« Layer By Layer ») sur un substrat ; ii) détacher la membrane multicouches du substrat ; iii) mettre au contact la membrane multicouches avec une protéine ou un polypeptide, par ce en quoi la membrane multicouches se charge en protéine ou polypeptide. L’étape i) du procédé consistant à former une membrane multicouches CH/polysaccharide anionique est produite par la mise en œuvre d’une technologie couche par couche (« Layer By Layer ») sur un substrat. Cette technologie automatisée utilise un robot de trempage, par exemple le robot DR-3 de la société Riegler & Kirstein GmbH. Plus spécifiquement, les solutions de chitosan et du polysaccharide anionique (polyélectrolytes) sont préparées dans une solution tampon, telle qu’une solution tampon d’acétate de sodium. Le pH de la solution peut être ajusté à environ 5,5 avec de l’hydroxyde de sodium (NaOH) et de l’acide acétique (CH 3 COOH). Par ailleurs, le substrat utilisé comme support dans le robot de trempage est préparé sur un ruban adhésif. Un substrat couramment utilisé est le polypropylène. Le substrat est ensuite immergé de manière séquentielle dans la solution de chitosan et du polysaccharide anionique avec au moins une étape de lavage, de préférence deux étapes de lavage dans une solution tampon d’acétate de sodium, d’eau ou de solution saline tamponnée entre pH 5 et 6, de préférence d’acétate de sodium. Le cycle comprenant l’immersion du substrat dans une solution de chitosan, au moins une étape de lavage, , de préférence une seule étape de lavage, suivie de l’immersion dans une solution de polysaccharide anionique et d’au moins une étape de lavage, de préférence une seule étape de lavage, permet la formation d’une bicouche CHI/polysaccharide anionique. Ce cycle est répété autant de fois que nécessaire pour obtenir un nombre de bicouche souhaité. Les temps d’immersion et de lavage peuvent varier. Selon un mode particulier, le temps d’immersion du substrat dans les solutions de polyélectrolytes (CHI et polysaccharide anionique) a une durée comprise entre 2 et 10 minutes, de préférence entre 2 et 8 minutes, et plus avantageusement 3 minutes (Cycle court, CC) ou 6 minutes (Cycle long, CL). Selon un autre mode particulier, le temps de lavage a une durée comprise entre 1 et 10 minutes, de préférence entre 2 et 4 minutes, et plus avantageusement 2 minutes (Cycle court, CC) ou 4 minutes (Cycle long, CL). L’étape ii) du procédé consistant à détacher la membrane multicouches du substrat, en particulier du polystyrène, peut être mise en œuvre avec une étape optionnelle préalable de séchage. La membrane multicouches obtenue peut être ensuite découpée selon la taille désirée. La mise en œuvre de l’étape iii) du procédé permet de charger la multicouches en protéine ou polypeptide. Plus précisément, le chargement de la protéine ou polypeptide dans la membrane multicouches est obtenu par diffusion passive. Particulièrement, l’étape iii) est mise en œuvre en solubilisant la protéine ou le polypeptide dans une solution tampon adaptée de manière à éviter la dénaturation de la protéine. Selon un mode particulier, la membrane multicouches est mise en contact avec une protéine ou polypeptide dans une solution acide, de préférence d’acide chlorhydrique (HCl), à un pH compris entre 2 et 4, de préférence à un pH d’environ 3. Selon un autre mode particulier, la membrane multicouches est mise en contact avec une protéine ou polypeptide dans une solution saline, de préférence une solution de chlorure de sodium (NaCl) ou une solution de chlorure de potassium (KCl), à un pH compris entre 5 et 7, de préférence à un pH d’environ 6,5. De préférence, la mise en contact de la membrane multicouches avec une protéine ou un polypeptide est mise en œuvre en déposant au moins une goutte de la solution tampon comprenant la protéine ou le polypeptide sur la surface de la membrane multicouches. La membrane est ensuite optionnellement séchée pour fournir un patch mucoadhésif dans lequel la protéine ou le polypeptide est incorporé dans le patch et/ou adsorbé à la surface du patch. De préférence, et en particulier dans le cas où la protéine ou le polypeptide reste au moins partiellement adsorbé à la surface, le patch ainsi formé est polarisé, en ce que la concentration en protéine ou polypeptide est supérieure au niveau des couches supérieures où la protéine ou le polypeptide a été déposé, par rapport à la concentration au niveau des couches inférieures. Le procédé peut également comprendre une étape optionnelle d’équilibrage de la membrane multicouches avant sa mise en contact avec la protéine ou le polypeptide (étape désignée iii-0). Cette étape d’équilibrage consiste à tremper la membrane multicouches obtenue après l’étape ii) dans une solution acide, de préférence d’acide chlorhydrique (HCl) à un pH compris entre 2 et 4 ou une solution saline, de préférence de chlorure de sodium (NaCl), à un pH compris entre 5 et 7. Cette étape optionnelle d’équilibrage de la membrane multicouches à pH acide permet notamment de gonfler la membrane et de faciliter ainsi le chargement en protéine ou en polypeptide. La membrane multicouches chargée en protéine ou en polypeptide peut éventuellement se resserrer lorsqu’elle est trempée dans une solution tampon permettant alors l’emprisonnement de la protéine ou du polypeptide dans le patch. Selon un mode particulier, le procédé de l’invention comprend donc outre une étape intermédiaire consistant à équilibrer la membrane multicouches détachée selon l’étape ii) avec une solution d’acide chlorhydrique (HCl) à un pH compris entre 2 et 4, de préférence à un pH d’environ 3 ou de chlorure de sodium (NaCl) à un pH compris entre 5 et 7, de préférence à un pH d’environ 6,5, avant la mise en œuvre de l’étape iii). Un procédé de fabrication préféré de l’invention comprend les étapes consistant à : i) former une membrane multicouches CH/polysaccharide anionique au moyen d’un procédé de dépôt couche par couche (« Layer By Layer ») sur un substrat ; ii) détacher la membrane multicouches du substrat ; iii-0) équilibrer la membrane multicouches détachée selon l’étape ii) avec une solution acide, de préférence d’acide chlorhydrique (HCl), à un pH compris entre 2 et 4, de préférence à un pH d’environ 3 ou avec une solution saline, de préférence de chlorure de sodium (NaCl) à un pH compris entre 5 et 7, de préférence à un pH d’environ 6,5, avant la mise en œuvre de l’étape iii) ; iii) mettre au contact la membrane multicouches avec une protéine ou un polypeptide, par ce en quoi la membrane multicouches se charge en protéine ou polypeptide. Chargement du patch La protéine ou polypeptide peut être incorporé dans le patch ou adsorbé à sa surface, comme décrit ci-dessus. Typiquement, les protéines ou polypeptides de poids moléculaire inférieur à 70 kDa ou 80kDa sont de préférence entièrement ou pratiquement entièrement incorporées, c’est-à-dire de préférence avec au moins 90% de protéines incorporées, dans le patch. Une protéine ou un polypeptide de poids moléculaire plus élevé peut être, en tout ou partie, adsorbée à la surface du patch. La quantité de protéine ou polypeptide incorporée et/ou adsorbée dépend de la protéine ou polypeptide et de l’effet biologique ou pharmacologique souhaité. Cette quantité peut varier par exemple de 50 ng/cm² à 5 mg/cm², de préférence de 10 ng/cm² à 1 mg/cm², 1 µg/cm² à 1 mg/cm². Applications Le patch ainsi obtenu peut être conservé à 4°C ou à température ambiante, avant application. Typiquement le patch mesure 2-3cm² pour une application chez un sujet humain. Le patch peut être appliqué par exemple à l’intérieur des joues, sur le palais, la gencive ou sous la langue. Une application sublinguale (c’est-à-dire sur la face ventrale de la langue) est particulièrement avantageuse. De préférence, le patch est appliqué de telle sorte que la couche de chitosan sur laquelle la protéine ou le polypeptide a été déposé lors de la fabrication du patch, est la couche qui est mise en contact avec la muqueuse. Les figures et exemples illustrent l’invention sans en limiter la portée. Exemples Exemple 1 : Fabrication et tests d’un patch mucoadhésif 1. Matériel et méthodes 1.1 Matériel Le chitosan (CHI) de poids moléculaire moyen a été acheté chez Sigma-Aldrich. Avant son utilisation, le CHI a été purifié par des étapes de filtration et de précipitation dans l’eau et l’éthanol, suivi par une lyophilisation pour obtenir un poids moléculaire final de 770kDa et un degré de désacétylation (DD) de 78%. A pH faible ( LW ) et 1020 kDa (HyA HW ), ont été achetés chez HTL, France et utilisés tels que reçus. Tous les autres réactifs et solvants ont été utilisés sans purification. Pour toutes les expériences, les solutions de polyélectrolytes ont été préparées extemporanément par dissolution dans un tampon d’acétate de sodium (0,1 M CH 3 COOH; 0,15 M NaCl, pH 5,5, à température ambiante) en utilisant des concentrations en polymère de 1 mg/mL pour la production des membranes. 1.2 Chitosan Fluorescent 20 mL de chitosan de poids moyen (CHI, 770 kDa, 10 mg.mL -1 dans de l’acide acétique 0,1 mol.L -1 ) ont été mis en contact pour réagir avec 20 mL de fluorescéinisothiocyanate (FITC, 1 mg.mL -1 dans du méthanol déshydraté), durant 3h à température ambiante et à l’abri de la lumière. Le pH a ensuite été augmenté jusqu’à 10 pour précipiter le CHI, suivi de centrifugations de 15 minutes à 11000 g et de plusieurs lavages à l’eau jusqu’à ce qu’aucune fluorescence ne soit détectée dans le surnageant. Le CHI a ensuite été dissous dans 20 mL d’acide acétique 0,1 mol.L -1 et le reste de FITC non lié a été éliminé par dialyse (Spectrum, USA) effectuée dans de l’eau pendant 3 jours à l’obscurité, l’eau étant remplacée quotidiennement. Les quantités de CHI et de FITC ont été déterminées par spectrophotoscopie à 490 nm et 270 nm respectivement. Le CHI de poids moyen marqué à la Fluorescéine (CHI FITC ) a été aliquoté à 2 mg.mL -1 dans de l’acide acétique 0,1 mol.L -1 et conservé à -20°C. 1.3 Fabrication des membranes CHI/HyA Les membranes autoportantes (CHI/HyA) ont été produites en employant la méthodologie couche par couche (LbL) à l’aide d’un robot de trempage (DR-3, Riegler & Kirstein GmbH). Les membranes ont été fabriquées en utilisant des substrats de polystyrène nettoyés par sonication dans l’éthanol et l’eau distillée (5 minutes pour chaque solution). Les substrats ont été immergés séquentiellement dans du CHI ou du Viscosan ® et dans des solutions de HyA (HyA LW de 610 kDa ou HyA HW de 1020 kDa) concentrés à 0,2% (poids/volume) dans un tampon d’acétate de sodium (CH3COONa 0,2 M, CH3COOH 0,2 M, pH 5,5, à température ambiante), avec 1 étape de lavage utilisant un tampon d’acétate de sodium entre chaque dépôt dans une solution de polymères. Ces immersions ont été répétées 100 fois avec un temps de dépôt de 3 minutes pour les polymères d’origine naturelle et 2 minutes pour chaque étape de lavage. Ensuite les membranes ont été laissées à sécher à température ambiante. Enfin, les membranes ont été détachées facilement de leur substrat sous-jacent respectif, simplement en les décollant à l'aide d'une pincette. Les membranes fluorescentes (CHI FITC /HyA) 100 -CHI FITC ) ont été préparées tel que décrit précédemment, avec 0,5% de CHI FITC dans la solution de chitosan à 2mg.mL -1 dans un tampon d’acétate de sodium de pH 5,5, à l’abris de la lumière. 1.4 Epaisseur des membranes LbL L’épaisseur des membranes produites a été mesurée après séchage et détachement du substrat. L’épaisseur de membrane a été déterminée en utilisant un micromètre (High-Accuracy Digimatic Micrometer, Mitutoyo) ; 20 mesures ont été réalisées à différents endroits au niveau du centre des membranes. 1.5 Salive artificielle et études de dégradation enzymatique Des membranes de 1cm² ont été pesées avant expérience. Une salive artificielle a été préparée avec de l’α-amylase, de l’hyaluronidase et du lysozyme, dissous dans un tampon (0,15 M NaCl, 20mM HEPES, pH 6,5). Toutes les enzymes ont une concentration finale de 100 µg.mL -1 . Les échantillons ont été trempés dans la salive artificielle et incubés à 37°C sous agitation lente durant 30min, 1h, 3h, 6h ou 24h. Après chaque période d’incubation, les membranes ont été séchées à 37°C et pesées. Le pourcentage de perte de masse (WL) des membranes selon les différentes conditions a été déterminé suivant l’Equation 1, avec Wi représentant le poids sec initial de la membrane et Wf représentant le poids de la membrane sèche après chaque point prédéterminé dans le temps. Trois expériences indépendantes ont été réalisées en triplicat pour chaque condition et la valeur moyenne a été retenue comme pourcentage de perte de poids. WL=(Wi-Wf)/Wi×100 (Equation 1) Pour l’observation des membranes en microscopie confocale à balayage laser (MCBL), les membranes fluorescentes ont été immobilisées sur des lames de verres et incubées dans de la salive artificielle à 37°C sous agitation durant 30min, 3h, 6h ou 24h. La dégradation a été stoppée par rinçage avec un tampon acétate jusqu’à observation en MCBL avec un microscope confocal LSM710 (Carl Zeiss SAS, France). Toutes les images ont été analysées à l’aide des logiciels Carl Zeiss Zen et du logiciel Image J. 1.6 Microscopie électronique à balayage (MEB) L’analyse morphologique des échantillons (avant et après dégradation) a été réalisée à l’aide d’un microscope électronique à balayage (Merlin Compact VP, Zeiss) à un voltage accéléré de 5 kV. Les deux côtés des membranes ont été observées. Avant observation, tous les échantillons ont été recouverts de cuivre (Balzers MED 010). 1.7 Tests de cytotoxicité Des cellules Ho-1u-1 immortalisées (une lignée cellulaire humaine dérivée de cellules de carcinome squameux du plancher de la bouche, provenant du GIMAP, St Etienne, France) ont été cultivées dans un milieu Dulbecco’s Eagle’s medium (DMEM) avec du D-glucose (4,5 g.L-1), du pyruvate (1 mmol.L-1) et de la L-glutamine (2 mmol.L-1), un cocktail de nutriments DMEM/Ham’s F12 (1:1) supplémenté avec 10% (volume/volume) de sérum de veau fœtal (FBS) inactivé par la chaleur et 1% (volume/volume) de pénicilline/streptomycine. Les cellules HeLa (lignée cellulaire épithéliale humaine dérivée d’adénocarcinome, ATCC® CCL-2) ont été cultivées dans du DMEM avec du D-glucose (4,5 g.L-1), du pyruvate (1 mmol.L-1) et de la L-glutamine (2 mmol.L-1) contenant 10% (volume/volume) de FBS inactivé par la chaleur et 1% (volume/volume) de pénicilline/streptomycine. Les cellules ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2. Deux jours avant les tests de cytotoxicité, les cellules ont été ensemencées dans des plaques de culture 96 puits. En parallèle, les membranes (CHI/HyA)100-CHI ont été coupées pour être redimensionnées (3cm² par mL de milieu), stérilisées dans l’éthanol 70% et par exposition à une lumière UV. Les membranes ont ensuite été incubées sur la nuit à 37°C dans un milieu de culture contenant des enzymes salivaires (lysozyme, α-amylase and hyaluronidase) à 100 µg.mL-1. Le milieu de culture a ensuite été retiré des puits et remplacé par le milieu contenant les produits de dégradation. Les cellules ont été incubées à 37°C durant 24h. Puis, du bromure de méthylthiazolyldiphényl-tétrazolium (MTT, 0,5 mg.mL-1) a été ajouté à chaque puits pour une incubation de 3h à 37°C. Les cellules ont ensuite été incubées sur la nuit, à 37°C et à l’abris de la lumière, dans une solution de solubilisation contenant 10% (volume/volume) de Triton X-100 et de HCl (0,1 mol.L-1) dans de l’isopropanol anhydre. L’absorbance a été mesurée à 570 nm et 690 nm (i-control Infinite® M1000 Pro, Tecan, Suisse). Des contrôles positifs ont été réalisés avec 0,1% (volume/volume) de dodécylsulfate de sodium (SDS) et des contrôles négatifs avec des cellules seules. Les données ont été retenues en faisant la moyenne de triplicats pour trois expériences indépendantes. 1.8 Souris Des études in vivo ont été réalisées sur des souris CB6F1 femelles âgées de 6 à 8 semaines (Charles River Laboratories, France) et sur des souris SHK-1 mâles (Charles River Laboratories, France) pour des expériences de tomographie. Tous les animaux ont été maintenus dans des conditions exemptes de pathogènes. Toutes les études sur animaux ont été conduites en conformité avec les directives de l’Union Européenne et approuvées par les comités éthiques régionaux et nationaux. 1.9 Administration sublinguale de membranes ou solutions Les membranes ont été coupées pour être ajustées à la taille des langues de souris (2 mm x 7 mm) et stérilisées par lumière UV. Les membranes ou formules liquides ont ensuite été administrées par voie sublinguale (partie ventrale de la langue) à des souris légèrement anesthésiées (isoflurane 4%). Après administration, une pression douce a été exercée durant 10s (jusqu’au réveil) sur la partie dorsale de la langue pour assurer le contact de la membrane ou de la solution liquide avec la muqueuse. Aucune autre contention n’a été réalisée. Après récupération de l’anesthésie, les animaux ont été laissés libres d’avaler ou de se toiletter. L’eau a été retirée durant les 30 min suivant l’administration et rendue pour des expériences plus longues. 1.10 Analyse histologique du gonflement des muqueuses et du recrutement des cellules CMHII positives Des membranes natives, des membranes traitées à l’HCl ou des membranes traitées au NaCl ont été administrées durant 30 min ou 60 min. Un volume de 12.5 µl d’une solution de 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB) à 0,5% a été utilisée comme contrôle positif pour l’inflammation. Le groupe contrôle négatif n’a été soumis à aucune manipulation. Chaque groupe était composé de 3 souris. Sur toute la durée du traitement, les souris étaient alertes et l’eau a été retirée durant les 30 premières minutes. A chaque point dans le temps, les langues ont été placées dans une matrice OCT® (Optimal Cutting Temperature, Tissue Tek) et conservées à -80°C jusqu’à la cryosection. Pour l’étape de cryosection, des tranches de 6µm d’épaisseur ont été réalisées à l’aide d’un cryostat (Leica) et fixées sur lames de verre avec de l’acétone à -20°C. Pour l’analyse du gonflement de la muqueuse, les tranches de langue ont été colorées à l’hématoxyline (formule de Gill, Vector) et les images ont été capturées en utilisant un microscope inversé (Nikon Ti-E). L’analyse du gonflement des muqueuses a été effectuée sur des longueurs de 2mm s’étendant depuis la base de la surface ventrale. Des mesures de surface ont été réalisées en utilisant l’outil polygone du logiciel Image J. Pour la coloration du CMHII, les tranches de langue ont été premièrement incubées avec un réactif bloquant la peroxydase (Dako), puis avec des anticorps de rat anti-souris biotinylés (BD pharmigen), révélés à l’aide du kit Vectastain Elite ABC (Vector) et le substrat de peroxydase AEC (Vector), et finalement contremarquées à l’hématoxyline (Formule de Gill, Vector). Les tranches ont été examinées à l’aide d’un microscope Nikon Ti-E. Le nombre de cellules CMHII positives (CMHII+) a été compté sur des longueurs de 2mm s’étendant depuis la base de la surface ventrale de la membrane sublinguale, en utilisant le plugin Cell Counter du logiciel Image J. 1.11. Préparation des échantillons pour la quantification des cytokines Chaque groupe était composé de 3 souris. Deux groupes ont reçu des membranes natives ou des membranes traitées à l’HCl. Trois autres groupes de souris ont reçu par voie sublinguale 10µL de CHI (770 kDa, 2 mg.mL-1 dans un tampon acétate de pH 5,5, Sigma, USA), 10µL de HyA (610 kDa, 0,95 cm3.kg-1, 2 mg.mL-1, dans un tampon acétate de pH 5,5, HTL, France), ou 10µL d’une combinaison des deux polymères. Les groupes de souris contrôle ont reçu par voie sublinguale soit 10µL de PBS ou de tampon acétate de pH 5,5 pour les contrôles négatifs, soit 12,5µL de DNFB à 0,5% (volume/volume) dans du chloroforme pour les contrôles positifs. Les langues ont été excisées 6h après l’application des membranes ou des solutions, congelées dans de l’azote liquide et conservées à -80°C. Brièvement, les langues ont été incubées dans un tampon RIPA [Tris HCl (50 mmol.L-1), NaCl (150 mmol.L-1), Triton X-100 (1 %), désoxycholate de sodium (0,5 %), SDS (0,1 %) EDTA (1 mmol.L-1) et un cocktail inhibiteur de protéases (1 %, Thermo Scientific)] pendant 2h sur de la glace, après homogénéisation à l’aide de ciseaux. Les préparations ont ensuite été homogénéisées à l’aide d’un batteur à billes (2 x 5 min, 30 Hz, 4°C) (TissueLyser II, Qiagen, Allemagne) et une sonication (2 min, 60 Hz), suivi par une centrifugation de 10 min à 10 000 rpm et 4°C. La concentration protéique totale dans les surnageants a ensuite été déterminée en utilisant le kit BCA protein assay (ThermoFisher Scientific, USA). L’interleukine 1 beta (IL-1β), IL-6 et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) ont été quantifiés simultanément dans chaque échantillon (V-Plex Proinflammatory Panel 1 Mouse Kit, MSD, USA) par électroluminescence à l’aide du système Mesoscale Discovery (Meso QuickPlex SQ 120, MSD, USA). Les données ont été retenues en faisant la moyenne de duplicats avec trois souris pour chaque condition. 1.12 Incorporation de protéines par gonflement en fonction du pH Dans le but d’évaluer la capacité des membranes à incorporer des protéines à différentes valeurs de pH, les membranes ont été équilibrées avec 1 mM d’HCl (pH 3-3,5), une solution saline tamponnée au phosphate (PBS 1X, Gibco® by life technologies™ pH7,4) ou avec un tampon de chlorure de sodium (NaCl 0,15 mol.L -1 , HEPES 0,02 mol.L -1 , pH 6,5) à température ambiante pendant 1h. Avant expérimentation, des membranes de 12 mm de diamètre ont été stérilisées par une exposition aux UV de 20 min. Après équilibrage de l’excès d’HCl, le PBS ou le tampon NaCl a été retiré et une goutte de protéine a été déposée sur le dessus de la membrane. La protéine utilisée était soit de l’ovalbumine marquée avec Alexa Fluor 647 (OVA AF647 ) à 5 µg.mL -1 (500 ng chargés) ou la cytokine CCL20 à 500 ng.mL -1 (50 ng chargés) dans 1 mM d’HCl ou un tampon NaCl. Les membranes ont été incubées sur la nuit à 4°C. Après rinçage avec un tampon acétate de pH 5,5 et séchage sous flux d’air, les membranes fonctionnalisées sont désignées « patch bioactif ». 1.13 Etude de la libération d’ovalbumine Avant les expériences, l’OVA AF647 a été incorporée dans les membranes tel que décrit ci-dessus. La libération des protéines a été suivie à différents pH, du tampon acétate à pH 5,5, PBS à pH 7,4 de Dulbecco (dPBS) ou de la salive artificielle à pH 6,5 étant utilisés comme solutions de rinçage. Immédiatement après l’ajout des solutions de rinçage, les protéines ont été retirées et conservées pour évaluer la quantité de protéines non liées (« quick rinse », QR). La libération de l’OVA AF647 depuis la membrane a été réalisée durant 2h avec des points à 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 min. L’analyse de l’OVA AF647 libérée a été réalisée par spectroscopie de fluorescence (Infinite M1000, Tecan) avec la longueur d'onde d'excitation/émission d’Alexa Fluor 647 fixée à 650/668 nm. Une courbe d’étalonnage pour la protéine marquée a été réalisée dans le dPBS, le tampon acétate, l’HCl et la salive artificielle aux longueurs d’onde mentionnées précédemment. 1.14 Analyse tomographique de la muco-adhésion du patch et du temps de rétention des protéines Pour les analyses tomographiques du temps de rétention protéique dans la région buccale des souris, des groupes de 2 souris ont été anesthésiés dans une chambre recevant durant 5 minutes un flux d’isoflurane à 4%. Pour l’administration de la solution, 10 µl de solution d’OVA AF647 ont été déposés à la base de la face ventrale des langues des souris. Concernant l’administration des patchs, ces derniers ont été placés sur la surface ventrale des langues. Pour chaque formulation, 5µg d’OVA AF647 a été administré. Les souris ont été placées dans la chambre tomographique (FMT 4000, Perkin Elmer) sous isoflurane, en position couchée tête la première pour l'acquisition d'images 2, 10 ou 30 minutes après l'administration. 1.15 Pénétration de l’ovalbumine dans la muqueuse sublinguale La pénétration de l’ OVA AF647 dans la muqueuse sublinguale a été évaluée après administration d’une formulation liquide (10 µl) ou d’un patch (CHIFITC-HyA)100-CHI. OVA AF647 a été incorporée par incubation dans le HCl, comme décrit en 1.12. Des groupes de 2 souris ont reçus les différentes formulations et ont été euthanasiés 2, 10, 30 ou 60 minutes après l’administration. Le muqueuse sublinguale (face ventrale de la langue et plancher de la bouche) ont été prélevés, inclus dans une matrice OCT® et stockés à -80°C. des coupes de 40 µm ont été effectuées, marquées par la sonde nucléaire DAPI puis observées au microscope confocal (LSM 710, Zeiss, Germany). 1.16 Test chimiotactique Une lignée de cellules dendritiques de souris (DC 2.4, #SCC142 Millipore) a été utilisée pour tester l’effet chimiotactique in vitro de la chimiokine CCL20 délivrée par les membranes mises au point. Des cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI supplémenté en GlutaMAX, avec 10% de FBS, 10 mM d’HEPES, 50 µM de β-mercaptoéthanol et un mélange d’acides aminés non essentiels (1X) (appelé par la suite GM) à 37°C et sous atmosphère avec 5% de CO2. Le test chimitactique a été réalisé dans des inserts de culture cellulaire ThinCertTM (Greiner Bio-One ; ref: 665 610) disposés dans des plaques 12 puits, durant 20 minutes. Avant la mise en œuvre du test, les membranes, la chimiokine CCL20 et les membranes chargées en chimiokine CCL20 (500 ng.mL -1 ) ont été incubées pendant 24h dans une solution d’enzymes salivaires (0,1 mg.mL -1 d’α-amylase, d’hyaluronidase et de lysozyme dissous dans du GM sans FBS) à 37°C sous agitation lente. Puis, les inserts de la plaque 12 puits ont été ensemencés avec une densité de 2,0.10 5 cellules/insert et incubés pendant 10 minutes à 37°C. Ensuite, les chambres inférieures de la plaque 12 puits ont été soigneusement remplies avec 1 mL de solution chimiotactique ou de solution contrôle, pour une incubation de 10 minutes à 37°C. Le contrôle positif correspondait à des cellules dendritiques (DC) incubées en présence de GM seulement. Finalement, les faces internes de chaque insert ont été essuyées à l’aide de coton-tige. Les échantillons ont été observés avec un microscope inversé (Nikon Ti-E) après fixation (au paraformaldéhyde 4%) et coloration au DAPI. Les résultats obtenus représentent la moyenne des triplicats de 3 expériences indépendantes. 1.17 Analyse statistique Toutes les données ont été analysées et rentrées dans la version 7.0 du logiciel Graphpad Prism. Les quantités indiquées représentent la moyenne ± écart type (SD) d’au moins trois réplicats ; à l’exception des données de libération représentant des moyennes ± erreur type (SEM). p 2. Résultats 2.1 Dégradation des membranes autoportantes dans la salive artificielle Les membranes natives (CHI/HyA)100 ont été produites en faisant varier 3 paramètres : le poids moléculaire (MW) de HyA, le temps de dépôt des polyélectrolytes et des solutions de rinçage, et les propriétés du CHI. L’influence de tels paramètres a été premièrement examinée sur l’épaisseur de membrane. Il a été montré que la croissance des membranes natives (CHI/HyA)100 est linéaire avec des membranes de 50 bicouches (4,5 +/-1,39µm), de 100 bicouches (10,30 +/- 7.67µm) et de 200 bicouches (17,04 +/- 7,96 µm) (Figure 9). Au moins 50 bicouches ont été nécessaires pour une manipulation aisée sans aucun traitement post-procédure. Aucune différence significative n’a été trouvée au niveau de l’épaisseur de membrane en faisant varier le MW de HyA (610 KDa ou 1000 kDa) ( ). Concernant le temps de dépôt, à savoir les cycles longs (CL, 6 min pour les polyélectrolytes et 4 min pour le tampon de rinçage) et les cycles courts (CC, 3 min pour les polyélectrolytes et 2 min pour le tampon de rinçage), des différences significatives ont été observées au niveau de l’épaisseur de membrane où une augmentation d’environ 32% a été vérifiée lorsque les membranes ont été produites sous des conditions de CL ( ). L’influence des conditions employées pour la construction des membranes a aussi été examinée sur la dégradation. De plus, comme l'intention est d'utiliser les membranes pour des applications sublinguales, une salive artificielle a été produite. La salive artificielle était composée d’une solution physiologique contenant de l’α-amylase, du lysozyme et de l’hyaluronidase, trois enzymes retrouvées dans la salive humaine. La dégradation des membranes produites a été suivie sur une période de 24h et quantifiée pour être exprimée en pourcentage de perte de poids. Les membranes élaborées avec du Viscosan® se sont dégradées plus rapidement que les membranes à base de CHI ( ), comme attendu du fait de la biodégradabilité rapide du Viscosan®. Bien que le profil général de dégradation des membranes à base de CHI n’ait pas été affecté drastiquement par le poids moléculaire de HyA, ni les temps de dépôt ( ) ; dans la phase initiale du processus de dégradation (dans la première heure) un retard a été constaté avec les membranes construites en condition CL (encart de la ). Au bout de 24h, toutes les membranes ont atteint un niveau de perte de poids allant de 75% à 95%. Afin d’obtenir des informations morphologiques concernant leur dégradation, les membranes (CHI/HyALW)100 ont été observées en MEB et en microscopie confocale. En observant les images provenant de ces deux techniques, une érosion initiale de surface a été observée à 30 min, suivi par la formation de trous superficiels à 1h, et finalement de trous plus profonds à 3h (Figures 1C et 1D). La dégradation enzymatique de la surface de la membrane a été aussi observée à partir de 30 min d’immersion dans la salive artificielle, dans des conditions hydratées où la membrane a gonflé jusqu’à environ 30 μm ( ). Aucune dégradation n’a été observée après 24h dans le tampon acétate ( , contrôle). Du fait que ces membranes ont été conçues pour une administration de la protéine à travers les muqueuses, les inventeurs ont choisi des membranes faites de CHI à la place du Viscosan ® pour assurer une diffusion prolongée de la protéine cargo dès les premiers stades de la dégradation au contact de la muqueuse. Les membranes produites en condition de CC ont également été sélectionnées pour diminuer le temps de production, et la HyA LW de 610 kDa a été choisie au hasard car aucune différence d'épaisseur ni de dégradation n'a été observée par rapport à la HyA HW . Pour assurer une mucoadhésion optimale, toutes les membranes utilisées pour l'expérimentation animale avaient une première et dernière couche de CHI. Ainsi, pour les études suivantes, les membranes (CHI/HyA LW )100-CHI ont été simplement désignées par (CHI/HyA)100. 2.2 Cytotoxicité envers les cellules épithéliales humaines La cytotoxicité des produits de dégradation des membranes a été évaluée sur deux lignées cellulaires épithéliales humaines (HeLa et Ho-1u-1) sur une période d’incubation de 24h. Aucune toxicité n’a été observée sur les deux lignées cellulaires car la viabilité est restée autour de 100 % (Figures 2A-B). Ce résultat s’explique par la biocompatibilité connue des deux polysaccarides utilisés pour produire les membranes qui n’ont pas été chimiquement modifiées. La combinaison des polymères n’a pas affecté leur innocuité biologique. Par conséquent, les membranes peuvent être appliquées in vivo sur des muqueuses sublinguales de souris, sans entrainer d’effet cytotoxique sur les cellules épithéliales du tissu. 2.3 Inflammation de la muqueuse sublinguale de souris La réponse inflammatoire induite in vivo par le patch a été évaluée sur des souris par le biais de l'évaluation de différentes caractéristiques principales de l'état inflammatoire. Premièrement, la surface de gonflement de l'épithélium et de la lamina propria de la muqueuse sublinguale des souris dans différentes conditions a été observée. Comme contrôle positif de l'inflammation, du 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB) à 0,5% a été utilisé car il a été démontré qu'il induit une inflammation lorsqu'il est administré par voie sublinguale [LeBorgne et al., 2006]. Une augmentation de l'épaisseur de la muqueuse a été observée 30 min après l'administration de DNFB et a légèrement diminué après 2h ( ). Il est à noter que le gonflement de la lamina propria s'est maintenu pendant 6h alors que l'épaisseur de l'épithélium a déjà diminué après 2h. Afin de quantifier le gonflement induit par la membrane (CHI/HyA)100, des membranes natives et des membranes traitées à l’HCl (incubation d’1h dans 1 mM de HCl, pH 3) ont été appliquées sur la muqueuse sublinguale pendant 30 ou 60 min. Le traitement à l'HCl faisant partie du protocole d'incorporation des protéines, son influence sur la réponse inflammatoire a été évaluée. Le gonflement de la muqueuse après l'application de la membrane native était comparable au gonflement induit par le témoin positif DNFB à 2h, alors que la muqueuse en contact avec la membrane traitée à l'HCl était significativement plus fine. Afin de corréler le gonflement des tissus avec l'infiltration des cellules immunitaires, une coloration immunohistochimique du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMHII) a été réalisée. Le CMHII est un marqueur majeur des cellules présentatrices d’antigènes (CPA), en particulier des cellules dendritiques (CD), des lymphocytes B et des macrophages. Le taux d'infiltration des cellules CMHII+ dans la muqueuse a augmenté significativement 30 minutes après l'administration de la membrane native (Figures 3B-C) et est revenu au niveau du contrôle après 60 minutes. Il est intéressant de noter que les membranes traitées à l’HCl appliquées pendant 30 min n'ont pas provoqué d'infiltration de cellules CMHII+, l’infiltration restant similaire à celle du témoin, comme observé pour le gonflement de la muqueuse ( ). Pour identifier le profil d'inflammation à moyen terme induit par les membranes natives et les membranes traitées à l'HCl, les profils d'expression des cytokines inflammatoires ont été quantifiés 6h après l'administration du patch. Dans toutes les conditions testées (polymères en solution, ou membranes avec ou sans traitement à l’HCl), les niveaux d'IL-1β, IL-6 et TNF-α étaient similaires aux niveaux du contrôle, ce qui signifie qu'aucune signalisation inflammatoire n'a été induite 6h après l'application du patch. 2.4 Incorporation/libération d’une protéine modèle, l’ovalbumine Pour évaluer les membranes (CHI/HyA)100 en tant que systèmes de diffusion de protéines, celles-ci ont été fonctionnalisées avec une protéine modèle, l'ovalbumine, marquée avec le fluorophore Alexa Fluor 647 (OVAAF647). L'OVAAF647 a été incorporée dans les membranes après équilibrage des membranes dans de l’HCl 1 mM, pH 3 (selon le schéma de la ). Le rinçage des membranes avec un tampon d'acétate de pH 5,5 (tampon de rinçage de la superposition des membranes) a permis l'incorporation de 98% de l'OVAAF647 alors que le rinçage avec du PBS (pH 7,4) a entraîné une légère diminution de l'incorporation (94%) ( ). La cinétique de libération sur 2h a confirmé ces écarts puisque, dans le tampon acétate, moins de 7% de l'OVAAF647 a été libéré du patch contre 31% dans le PBS (Figures 5A-B). Lors de l'immersion dans la salive artificielle, 35 % de l'OVAAF647 a été libéré du patch en 2h, et environ 90 % après 24 heures d'immersion (données non présentées). Le profil d'incorporation de l'OVAAF647 à un pH de 3 suivie d'un rinçage au tampon d'acétate a montré qu'environ 80 % de la protéine était incorporée dans les 10 premiers micromètres sous la surface, ce qui correspond à un tiers de l'épaisseur totale hydratée (Figures 5C-D). Les membranes fonctionnalisées sont ainsi devenues un patch asymétrique, la surface présentant la protéine étant celle qui est en contact avec la muqueuse. Comme certaines protéines peuvent être sensibles au pH acide (dénaturation, perte d'activité...), l'incorporation de l'OVAAF647 a également été effectuée à un pH physiologique de 7,4 dans le PBS au lieu de l’HCl à pH 3. Cependant, il n'a pas été possible de manipuler ou de visualiser le patch après l'incorporation des protéines en raison du gonflement important de la membrane. En outre, l'instabilité de la structure a conduit à un taux d'incorporation inférieur à 60 % (données non présentées). Au lieu de cela, un tampon NaCl (NaCl 0,15 mol.L-1, HEPES 0,02 mol.L-1, pH 6,5) a été utilisé pour l'incorporation des protéines. Pour le rinçage des membranes, les mêmes solutions ont été testées (tampon acétate, PBS et salive artificielle). Comme observé pour la charge à pH acide, le rinçage avec un tampon à l'acétate a conduit à 94% d'incorporation de protéines alors que le rinçage avec du PBS n'a conduit qu'à 85% d'incorporation d'OVAAF647 ( ). Les profils de libération ont confirmé que le tampon à l'acétate assure la rétention des protéines à l'intérieur de la membrane, car moins de 10% environ de l'OVAAF647 est libéré de la membrane, tandis que le PBS entraîne une libération rapide d'environ 36 % de l'OVAAF647 ( ). La libération de la protéine après 2h de rinçage dans la salive artificielle a atteint 69%. Lorsqu'elle est incorporée avec du tampon NaCl, la distribution de la protéine à l’intérieur du patch s'est avérée plus homogène que l'incorporation avec l’HCl, et ne présentait aucun gradient de pénétration en profondeur, le long de l'axe Z (Figures 10C, D). 2.5 Mucoadhésion et temps de rétention de la de protéine cargo La mucoadhésion des patchs a été évaluée in vivo par visualisation de la membrane reposant sur la muqueuse sublinguale 20 min après l'administration ( ). Le suivi de l'OVAAF647 par tomographie de fluorescence moléculaire a mis en évidence la rapidité de dispersion de la protéine après administration sous forme de formulation liquide ( ). Pendant les premières minutes d'acquisition de l'image, l'OVAAF647 était déjà distribuée le long du tube digestif et aucun signal n'était détectable dans la bouche après 10 min. Lorsqu'il était co-administré avec la membrane mucoadhésive, l'OVAAF647 a été détectée sous la forme d’un signal concentré dans la bouche pendant au moins 30 min. 2.6 Présentation sur la muqueuse et pénétration de la protéine cargo La pénétration tissulaire de l'OVAAF647 a été suivie par microscopie confocale. L'intensité du signal 2 min après l'administration était beaucoup plus faible sous forme liquide que celle présentée par la membrane ( ). L'OVAAF647 a pénétré dans la couche kératinisée 10 min après l'administration du patch ainsi que dans le CHIFITC (flèches blanches, ). Le patch n'était pas détectable 30 minutes après l'application, mais l'OVAAF647 était présent profondément dans la muqueuse (flèche blanche pointillée, ). Même si une accumulation a été détectée dans l'épithélium (couche superficielle), l'OVAAF647 a été observée dans la lamina propria et la sous-muqueuse. Le signal était à peine détectable 60 minutes après l'administration. Cette diminution du signal de fluorescence de la protéine 60 minutes après l'administration par rapport à 30 minutes pourrait s'expliquer par la clairance de la protéine dans le tissu et son absorption par des cellules immunitaires telles que les CPA. 2.7 Bioactivité de la protéine incorporée Pour évaluer la fonctionnalité et la bioactivité d'une protéine incorporée dans la membrane (CHI/HyA)100, une cytokine chimio-attractive (CCL20) a été chargée dans l'assemblage et prélevée après dégradation de la membrane dans la salive artificielle. La cytokine CCL20 a été utilisée comme chimioattracteur pour les cellules dendritiques murines (DC 2.4) qui possèdent le récepteur CCR6 associé (données non présentées). Les capacités chimioattractives de la cytokine ont été préservées à l'intérieur du patch car une migration similaire a été observée pour la CCL20 en solution et la CCL20 collectée après la dissolution du patch ( ). La bioactivité de la protéine a donc été préservée par le patch et la cytokine a présenté un effet chimioattracteur significatif sur les cellules ciblées. Exemple 2 : Evaluation du taux d’incorporation dans des patchs (CHI/HyA)100 Incorporation de serumalbumine bovine (BSA) Matériels et méthodes Les membranes (CHI/HyA)100 ont été découpées de façon à obtenir des carrés d’1cm² qui ont été incubés soit dans une solution tampon HCl de pH 3, soit dans une solution tampon NaCl de pH 6,5, contenant toutes deux de l’albumine sérique bovine (BSA) concentrée à 10mg.mL -1 . Les carrés de membranes (CHI/HyA)100 étant entièrement recouvert d’un volume de liquide de l’ordre de 200μl, ils contiennent chacun à l’équilibre environ 2mg de BSA absorbée. Les carrés de membranes (CHI/HyA)100 chargés en BSA ont ensuite été incubés dans un tampon de libération (tampon acétate, pH 5.5) dépourvu de BSA afin de mesurer la quantité de protéines libérées, et ce en employant un kit de dosage de protéine basé sur l’acide bicinchoninique (BCA) sur une durée de 4h. Des mesures de densité optique (562nm) ont ainsi été réalisées en prélevant le tampon de libération dès le début (t0) et après 5, 10, 20, 30, 60, 120 et 240 min d’incubation, le tampon de libération étant remplacé après chaque prélèvement. La mesure d’un blanc obtenu avec des puits contenant seulement la solution d’incubation a été systématiquement retranché. A l’aide d’une courbe étalon, la concentration en protéines par mL a pu être déterminée pour chaque temps de libération, puis rapportée à une quantité de BSA pour 200μl. Enfin, la quantité de protéines incorporée au sein de la membrane a été estimée en soustrayant la quantité de BSA déterminée pour 200μl aux 2mg théoriques de BSA initialement absorbés. Résultats La quantité de BSA incorporée par cm² dans des membranes (CHI/HyA)100 a été déterminée à l’aide du dosage de la BSA libérée depuis des membranes pré-incubées dans une solution concentrée de BSA à différents pH. Des profils de libération très similaires ont été observés entre la BSA incorporée à pH 3 et la BSA incorporée à pH 6,5, avec respectivement 0,79mg et 0,75mg libérés instantanément (t0), 0,18mg et 0,16mg supplémentaires libérés après 5 minutes, et encore 0,03mg et 0,01mg libérés au bout de 10 minutes. Après 20 minutes de libération, la BSA libérée entre les temps t10 et t20 n’était plus détectable, ce qui indique que l’essentiel de la libération se produit en 10 minutes. La quantité totale mesurée de BSA libérée correspond à 1,01mg pour la BSA incorporée à pH 3 et à 0,92mg pour la BSA incorporée à pH 6,5. Par conséquent, les carrés de membrane (CHI/HyA)100 ayant initialement absorbé environ 2mg de BSA conservent 1mg de BSA après 4h de rinçage, soit environ 0,99mg de BSA retenue pour l’incorporation effectuée à pH 3 et environ 1,08mg de pour l’incorporation effectuée à pH 6,5. Le taux d’incorporation est donc de 50% dans les deux conditions. Incorporation d’immunoglobulines (IgG) dans les membranes (CHI/HyA)100 Matériels et méthodes Des membranes (CHI /HyA)100 ont été découpées de façon à obtenir des carrés d’1cm² qui ont été incubés durant 1h soit dans 200μl d’une solution d’équilibration d’HCl de pH 3 (échantillons MbA) soit dans 200μl d’une solution d’équilibration NaCl-Hepes de pH 6,5 (échantillons MbB). Les carrés de membrane MbA ont ensuite été incubés dans 150μl d’une solution d’incorporation à base d’HCl de pH 3 contenant 2μg.mL -1 d’immunoglobuline de type G (IgG ; anticorps secondaires d’âne dirigés contre les IgG de chèvre et couplés au fluorochrome Alexa 633 ; Invitrogen, Molecular probes A21082-lot 73A2-1), et les carrés de membrane MbB ont été incubés dans 150μl d’une solution d’incorporation à base de NaCl-Hepes de pH 6,5 contenant aussi 2μg.mL -1 IgG. En parallèle, des carrés de membrane sèche (CHI /HyA)100 (MbC et MbD), n’ayant pas subi l’étape d’équilibration, ont été respectivement incubés dans les mêmes solutions d’incorporation que les échantillons MbA et MbB. Les incubations dans les solutions d’incorporation ont été réalisées sur la nuit, à 4°C. Le jour suivant, les membranes ont été rincées 3 fois 2 minutes dans un tampon acétate (0,1M CH3COOH, 0,1M CH3COONa, pH 5,5) puis séchées sous flux d’air (PSM) à l’abri de la lumière. Les membranes ont enfin été observées au microscope confocal à fluorescence (Zeiss, LSM 710) à l’aide d’un objectif x20. Résultats Les membranes (Alexa 633nm) avec ou sans étape préalable d’équilibration à différents pH ont été observées (images non fournies). La présence d’IgG a pu être détectée de manière comparable et dans toutes les conditions, essentiellement à la surface des membranes MbA, MbB, MbC et MbD qui était opposée à la paroi de la plaque lors des incubations. Néanmoins, le marquage des IgG est plus prononcé pour les échantillons MbA, ce qui indique que l’étape préalable d’équilibration présenterait un avantage uniquement pour une incorporation à pH 3. Par ailleurs, la quantité d’IgG incorporée dans les membranes a pu être estimée à environ 400ng par cm². Références Caridade et al, Biomacromolecules. 2013, 14(5):1653-60 Caridade et al, Acta Biomater. 2015,15:139-49 LeBorgne et al . , Immunity. 24 (2006) 191–201 Patch mucoadhésif destiné à la libération buccale ou sublinguale d’une protéine ou d’un polypeptide, ledit patch comprenant au moins 100 bicouches composées chacune d’une couche de chitosan (CHI) et d’une couche d’un polysaccharide anionique ayant un poids moléculaire compris entre 500 et 1000 kDa ou un de ses sels, la couche en contact avec la muqueuse et la couche en contact avec l’environnement buccal ou sublingual du patch étant composées de chitosan (CHI), ladite protéine ou ledit polypeptide étant incorporé dans ledit patch et/ou adsorbé à la surface dudit patch. Patch selon la revendication 1, comprenant de 100 à 200 bicouches CHI/polysaccharide anionique. Patch selon la revendication 1 ou 2, ayant une épaisseur de 10 à 20 µm, de préférence environ 15 µm. Patch selon l’une quelconques des revendications 1 à 3, dans lequel le polysaccharide anionique ou un de ses sels est choisi parmi un glycosaminoglycane (GAG), un fucoïdane, un alginate, un carraghénane, et un ulvane. Patch selon la revendication 4, dans lequel le glycosaminoglycane (GAG) ou un de ses sels est choisi parmi l’acide hyaluronique (AH), l’héparine (Hp), les héparanes sulfates (Hs), les chondroïtines sulfates (CS), les dermatanes sulfates (DS), et les kératanes sulfates (KS), préférentiellement l’acide hyaluronique, et de manière encore plus préférée le hyaluronate de sodium. Patch selon l’une des revendications 1 à 5, dans lequel la protéine ou le polypeptide est un allergène, de préférence l’ovalbumine. Allergène pour une utilisation dans la désensibilisation d’un sujet allergique audit allergène, ledit allergène étant administré sous la forme d’un patch tel que défini à la revendication 6. Procédé de fabrication d’un patch tel que défini à l’une des revendications 1 à 6, comprenant les étapes consistant à : i) former une membrane multicouches CH/polysaccharide anionique au moyen d’un procédé de dépôt couche par couche (« Layer By Layer ») sur un substrat ; ii) détacher la membrane multicouches du substrat ; et iii) mettre au contact la membrane multicouches avec une protéine ou un polypeptide, par ce en quoi la membrane multicouches se charge en protéine ou polypeptide. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la membrane multicouches est mise en contact avec une protéine ou polypeptide selon l’étape iii) dans une solution d’acide chlorhydrique (HCl) à un pH compris entre 2 et 4, de préférence à un pH d’environ 3. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la membrane multicouches est mise en contact avec une protéine ou polypeptide selon l’étape iii) dans une solution de chlorure de sodium (NaCl) à un pH compris entre 5 et 7, de préférence à un pH d’environ 6,5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, comprenant en outre une étape intermédiaire consistant à équilibrer la membrane multicouches détachée selon l’étape ii) avec une solution d’acide chlorhydrique (HCl) à un pH compris entre 2 et 4, de préférence à un pH d’environ 3 ou de chlorure de sodium (NaCl) à un pH compris entre 5 et 7, de préférence à un pH d’environ 6,5, avant la mise en œuvre de l’étape iii). Patch selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, susceptible d’être obtenu par un procédé tel que défini selon l’une quelconque des revendications 8 à 11.