FR 3115110 A1 20220415 FR 2101445 A 20210215 La présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro d’une infection virale due à la présence d’un virus chez un individu, comprenant une étape de détection d’au moins un antigène spécifique dudit virus par un test immunologique réalisé sur un échantillon biologique dudit individu, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique consiste en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur dudit individu. TEST IMMUNOLOGIQUE POUR DETECTION D’INFECTIONS VIRALES La présente demande concerne un procédé de diagnostic d’une infection virale touchant les êtres humains. Ce procédé est réalisé sur un échantillon biologique d’un individu susceptible d’être infecté par ledit virus, en particulier par un coronavirus, et plus spécifiquement par le coronavirus SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2). Un virus est un agent infectieux capable de s’intégrer dans les cellules d’un organisme, dites « cellules hôtes », et de s’y reproduire en utilisant la machinerie cellulaire desdites cellules hôtes. De nombreux virus sont pathogènes, c’est-à-dire qu’ils causent une maladie chez leur hôte dite « infection virale ». Les infections virales chez l’être humain sont caractérisées par des signes cliniques et symptômes tels que fièvre, frissons, maux de tête, courbatures, toux et fatigue. Ces signes cliniques sont communs à des infections virales générées par des virus distincts, et ne permettre de distinguer le virus à l’origine de la pathologie. Or, il est indispensable pour les personnels de santé de connaitre l’origine virale des infections qu’ils doivent traiter, d’une part pour choisir la thérapie adaptée, et d’autre part pour anticiper la contagion et le risque de dissémination du virus au sein de la population. L’importance de l’identification du virus pathogène est essentielle en cas de virus très contagieux, afin de pouvoir isoler les personnes infectées et prévenir les personnes ayant été en contact avec une personne infectée. Parmi les virus particulièrement contagieux, l’année 2020 a été marquée par l’apparition d’une pandémie liée au SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) générant la forme de pneumonie dénommée maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Cette épidémie a été déclarée « urgence de santé publique de portée internationale » par l'Organisation mondiale de la santé (OMS) le 30 janvier 2020. Le virus SARS-CoV-2 est un virus enveloppé à ARN positif qui appartient à la famille des Coronaviridae , à la sous-famille des Coronavirinae , au genre Betacoronavirus et au sous-genre Sarbecovirus . Comme le SARS-CoV, le SARS-CoV-2 est un virus de chauve-souris qui s’est adapté à l’homme selon des modalités qui restent encore à élucider. L’ARN viral, d’une longueur d’environ 30 000 bases, a été séquencé pour la première fois le 5 janvier 2020 par une équipe de l'université Fudan de Shanghai (Chine). Cet ARN simple brin code notamment une volumineuse ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp pour RNA-dependent RNA polymerase) et plusieurs protéines structurales dont une glycoprotéine de surface (S pour « Spike protein ») responsable de l’aspect en couronne du virus en microscopie électronique. A la fin de l’année 2020, sont apparus de nouveaux variants viraux du SARS-CoV-2 dont l’efficacité de la transmission interhumaine est accrue, suite à l’apparition de nouvelles mutations du génome. De nombreuses techniques de diagnostic in vitro de la présence d’un virus spécifique chez un être humain hôte (infecté) sont connues de la personne de l’art. Sont présentées ci-dessous les techniques les plus utilisées de diagnostic direct, c’est-à-dire indiquant la présence ou l’absence du virus dans un échantillon biologique issu d’un individu, avec ou sans quantification de la charge virale. Ces techniques de détection sont de deux types : celles basées sur la détection de l’acide nucléique du virus, et celles basées sur la détection d‘antigènes (protéines ou sucres) du virus, au sein de l’échantillon biologique. En ce qui concerne la détection du SARS-CoV-2, ces deux types de techniques ont été développées au cours de l’année 2020. Techniques de détection de l’acide nucléique viral basées sur l’amplification des acides nucléiques Ces techniques sont basées sur l’amplification du matériel génétique de l’agent infectieux, ADN ou ARN en fonction de la nature du virus. Il existe trois types de technologies qui sont présentées ci-dessous. 1. Technique basée sur l’amplification par polymérisation en chaîne (PCR), en particulier la RT-PCR en temps réel. La RT-PCR en temps réel comporte 3 étapes : (i) l’extraction des acides nucléiques de l’échantillon, (ii) la transcription inverse des ARN de l’échantillon en ADN complémentaires grâce à l’utilisation d’une réverse transcriptase (RT) et (iii) l’amplification du génome viral grâce à des amorces spécifiques de certains gènes de ce virus par technique de PCR en temps réel. Cette amplification « en temps réel », abrégée rt-PCR ou qPCR (pour real-time PCR ou quantitative PCR), permet d’avoir une estimation de la charge virale de l’échantillon exprimée en valeur de Ct, le terme Ct ou cycle threshold correspondant au nombre de cycles de PCR à partir duquel un signal fluorescent est détecté en PCR : plus la valeur de Ct est faible, plus le signal apparait précocement au cours du processus d’amplification et plus la charge virale estimée est élevée. En termes pratiques, la réaction de RT-PCR quantitative comprenant les 3 étapes mentionnées ci-dessus nécessite 3 à 4 heures à partir de l’arrivée de l’échantillon au laboratoire, ce qui constitue pour le moment un délai de réponse incompressible de la technique. Certains tests moléculaires basées sur la PCR permettent d’obtenir un résultat en environ une heure. Il s’agit de tests commerciaux comme BioFire® (BioMérieux), Cobas LIAT® (Roche Diagnostics), QIAstat Respiratory Panel-A (QIAGEN) ou Xpert® Xpress SARS-CoV-2 (Cepheid). Hormis leur coût, leur principale limite reste la difficulté à les utiliser dans le cadre de grandes séries, ce qui les réserve plutôt à l’investigation de situations d’urgence et des cas graves. La PCR digitale (dPCR) est une variante technologique de test PCR qui permet de réaliser simultanément plusieurs dizaines de milliers de réactions PCR au sein d’une puce microfluidique ou d’un aérosol de gouttelettes micronisées dans une émulsion d’huile. Comme la RT-PCR classique, la RT-PCR digitale en temps réel permet d’obtenir une semi-quantification de la charge virale des signaux PCR. 2. Techniques moléculaires basées sur l’amplification isotherme Lors de ces tests, l’amplification du matériel génétique se fait à température constante, ce qui ne nécessite pas, contrairement aux techniques basées sur la PCR, l’utilisation d’un thermocycleur. On parle alors de techniques d’amplification isotherme. L’une des méthodes les plus utilisées est la Transcription-mediated amplification (TMA). Cette technique ne permet pas de semi-quantification car le signal positif est généré en fin de réaction. Sa sensibilité est équivalente à celle de la RT-PCR. Une autre technique, la RT-LAMP pour Loop-mediated isothermal amplification, combine une transcriptase inverse, une ADN polymérase possédant une forte activité de déplacement de brin et 4 à 6 amorces ciblant différentes régions du génome à détecter ; la lecture se fait par détection colorimétrique ou de fluorescence. Du fait de leur coût modeste, les tests commerciaux basés sur ce principe connaissent actuellement un grand essor pour la détection de l’ARN du SARS-CoV-2. Ces tests sont faciles à mettre en œuvre et fournissent un résultat en moins d’une heure. Néanmoins, outre la possibilité de faux-positifs, la principale limite des tests LAMP reste la difficulté à les utiliser à grande échelle, ce qui conduit à les réserver plutôt à des situations d’urgence. Enfin, la technique NEAR pour Nicking and extension amplification reaction utilise une ADN polymérase, deux amorces spécifiques de la cible à détecter et une enzyme de restriction capable de ne couper qu’un seul brin d’ADN (nicking enzyme). Cette technique, commercialisée par Abbott Diagnostics pour le diagnostic rapide de l’infection à SARS-CoV-2 (test ID NOW COVID-19), est très simple à mettre en œuvre et donne un résultat en moins de 15 minutes. Il s’agit, comme la précédente, d’une technique destinée à des déterminations individuelles en situation d’urgence. Son manque de sensibilité a été pointé dans certaines études. 3. Techniques moléculaires basées sur le séquençage haut débit Les techniques NGS (Next Generation Sequencing) permettent de séquencer à haut débit les acides nucléiques présents dans un échantillon environnemental ou clinique. Plusieurs plateformes commerciales sont actuellement disponibles dans les laboratoires spécialisés de biologie moléculaire. Néanmoins, la limite de la plupart de ces techniques reste actuellement leur délai de réalisation, de l’ordre de 9 à 12 heures, sans compter le temps d’analyse des résultats. Tests antigéniques rapides Ces tests immunologiques permettent de détecter, grâce à un ou des anticorps spécifiques, des antigènes spécifiques d’un virus. Il existe des tests antigéniques spécifiques de nombreux virus respiratoires (virus grippaux, virus respiratoire syncytial, …). De tels tests antigéniques ont été développés pour détecter les antigènes spécifiques de SARS-CoV-2 (1). Ils détectent la présence d’une des protéines du virus SARS-CoV-2, généralement mais pas uniquement, la protéine de nucléocapside NP, dans un échantillon biologique. Les grands avantages de ces tests sont leur rapidité, leur facilité d’utilisation et d’interprétation. Ils sont majoritairement distribués sous la forme de tests unitaires rapides, également dénommés tests de diagnostic rapide (TDR). La lecture des résultats se fait à l’œil nu (voir ) ou à l’aide d’un lecteur permettant une interprétation objective. Le résultat est disponible en une quinzaine de minutes. Ces tests peuvent être utilisés par des non biologistes sous forme de tests rapides d’orientation diagnostique (TROD) ou sous forme de tests de diagnostic rapide (TDR) au sein des laboratoires d’analyses médicales. Les mêmes normes de sécurité que pour des tests moléculaires (équipements de protection individuels, zone de manipulation dédiée, élimination sécurisée des déchets …) doivent être appliquées par les manipulateurs. Le principal écueil de ces tests antigéniques est leur manque de sensibilité par rapport aux tests moléculaires, les meilleurs d’entre eux permettant la détection du virus dans des échantillons qui, analysés en RT-PCR classique, présentent des valeurs de Ct de l’ordre de 30 ou inférieures. Cependant, ce type de test permet d’identifier rapidement des personnes présentant des charges virales élevées, par exemple dans les services d’urgence ou parmi les personnels soignants afin de prévenir les départs d’épidémie. Leur utilisation dans le cadre du dépistage de patients asymptomatiques ou pauci-symptomatiques dits « super-contaminateurs », dans un objectif de santé publique (dépistage de masse et dépistage ciblé) est donc recommandé. Echantillons biologiques utilisés pour le diagnostic d’une infection à SARS-CoV-2 Les échantillons utilisés pour le diagnostic d’infection virales, notamment par le virus SARS-CoV-2, dépendent du stade de l’infection. Durant la phase précoce de l’infection, les prélèvements naso- ou oro-pharyngés obtenus par écouvillonnage profond du nez ou de la gorge (luette) sont les plus utilisés et les plus sensibles. Ils nécessitent une technique de prélèvement parfaitement maîtrisée. Le préleveur doit se protéger correctement (masque FFP2, lunettes ou visière de protection, double gantage, surblouse, hygiène des mains avant et après le geste) pour éviter les contaminations nosocomiales. Le prélèvement naso-pharyngé profond peut s’avérer sinon douloureux du moins très désagréable pour le patient ; il reste néanmoins le mieux standardisé, sensible et constitue l’examen de référence, notamment chez les sujets symptomatiques suspects de maladie Covid-19. Durant cette même phase précoce, des prélèvements alternatifs de type auto-prélèvements, faciles à répéter chez des patients pauci- ou asymptomatiques, peuvent s’envisager au prix d’une sensibilité dégradée ; c’est le cas du prélèvement de salive au niveau de la gorge recueilli après des efforts de toux, en se raclant la gorge, et sans avoir bu et mangé depuis au moins 30 minutes, voire du prélèvement de salive endo-buccale ou de l’écouvillonnage du vestibule nasal antérieur. Ces auto-prélèvements seraient adaptés à un dépistage de masse. Ils présentent en effet l’avantage d’être non-invasifs, non douloureux, et peuvent facilement être réalisés sur des enfants. Au stade de pneumonie virale, il faut avoir recours à des prélèvements plus profonds : crachats induits (et non salivaires) chez les patients non intubés, aspirations trachéales ou lavage broncho-alvéolaire (LBA) chez les patients en réanimation ; dans un certain nombre de cas, évalué à 30 % environ, l’ARN viral a été détecté dans les échantillons respiratoires profonds sans être amplifié dans les prélèvements oro- ou naso-pharyngés ; dans les formes très inflammatoires, le virus n’est même plus présent au niveau pulmonaire. Le virus peut également être recherché dans le sang et dans les selles, notamment au cours des infections sévères. Tests diagnostiques pour détecter le SARS-CoV-2 En l'absence de couverture vaccinale dont l’efficacité a été démontrée et de traitement spécifique, l'endiguement des épidémies repose principalement sur l'identification rapide et l'isolement des patients atteints de COVID-19 afin d'éviter une nouvelle propagation du virus. Le diagnostic précoce est important dans ce contexte, non seulement pour le diagnostic et le suivi virologique éventuel des patients hospitalisés, mais aussi pour assurer la sécurité sanitaire des soignants, des premiers intervenants et de la population en général. Le test de référence est aujourd’hui la détection par RT-PCR du virus SARS-CoV-2 dans des échantillons de sécrétions nasopharyngées. Ce test est sensible mais requiert quelques heures pour obtenir les résultats. Or, en fonction du contexte clinique et épidémiologique, d’autres types de stratégie diagnostique peuvent être considérées. En effet, dans le but de limiter la transmission interhumaine d’un virus contagieux, la sensibilité des tests de diagnostic peut devenir un critère de second plan, au regard de la praticabilité et de la rapidité de rendu des résultats desdits tests. La présente les différents types de tests existants et leurs intérêts relatifs en termes de sensibilité et de rapidité d’obtention du résultat. Dans le cas du SARS-CoV-2, différentes études (2-4) contribuent à démontrer que la transmission interhumaine n’obéit pas à des règles suivant une distribution normale, mais qu’un faible nombre d’individus infectés pendant un laps de temps très court (deux jours avant et cinq jours après le pic de charge virale au niveau oro-naso-pharyngé) est à l’origine de la majorité des évènements de contamination. On désigne parfois ces individus par le terme de « super-contaminateurs ». En parallèle, des travaux récents de modélisation basés sur la cinétique de l’excrétion virale et la durée d’incubation de l’infection à SARS-CoV-2 ont cherché à préciser quel est l’impact de la rapidité de rendu du résultat sur la diminution de la transmission, appréciée par la réduction du taux de reproduction (R0) (5, 6). Les auteurs constatent que les exigences propres aux tests de dépistage pour la surveillance et le contrôle de l’épidémie sont différentes de celles des tests de diagnostic clinique. En effet, les tests qui ciblent les personnes symptomatiques nécessitent une sensibilité et une spécificité élevées et ne sont pas limités par le coût. Parce qu'ils sont symptomatiques, ces individus peuvent s'isoler dès l’apparition des symptômes, de telle sorte qu'un diagnostic retardé a moins de répercussion sur la transmission. En revanche, chez les personnes asymptomatiques ou pauci-symptomatiques, un retard de rendu de résultat, même très court (un jour), compromet l’efficacité du programme de dépistage, surtout si le sujet est à l’acmé de son excrétion virale. A ce stade, le délai de rendu de résultats est beaucoup plus important que la sensibilité du test car même un test peu sensible sera capable de repérer l’infection. Il est donc essentiel de mettre en œuvre des stratégies de dépistage qui identifient les individus les plus à risque de disséminer l’infection, dans un temps court. Les tests destinés aux campagnes de dépistage à grande échelle, dans le cadre d’une surveillance épidémiologique, doivent répondre aux critères suivants : la facilité d’exécution, la rapidité de rendu du résultat, le caractère peu invasif du prélèvement et un coût faible. En effet, lors de ces campagnes de dépistage, l’objectif est de détecter les sujets les plus à risque de transmission, et notamment les sujets dits super-contaminateurs. Un autre objectif est de pouvoir répéter ces tests le plus souvent possible. Afin de rendre cette stratégie acceptable pour le plus grand nombre, il faut pouvoir recourir à des auto-prélèvements d’échantillons biologiques (salive, prélèvements de la cavité nasale antérieure …) donnant des résultats moins sensibles mais beaucoup plus adaptés à des surveillances continues. Ainsi, dans un contexte de stratégie de dépistage à grande échelle et en continu, il est urgent de proposer des tests de diagnostic direct peu invasifs en termes d’échantillons biologiques, et permettant un rendu de résultats plus rapide que les tests par RT-PCR. Illustration d’un test immunochromatographique (COVID19Speed-Antigen Test de la Société Biospeedia). Le prélèvement est déposé dans la cupule S située au bas de la figure. La ligne C correspond au Contrôle de bon fonctionnement du test ; son absence est synonyme d’un test invalide. La ligne T (Test) correspond à la détection de la protéine N du virus SARS-CoV-2. Le test présenté à gauche montre une réactivité négative. Le test présenté au centre montre une réactivité faiblement positive. Le test présenté à droite montre une réactivité positive. Distribution des principaux tests de diagnostic direct de l’infection à SARS-CoV-2 en fonction de leur sensibilité et de leur délai de réponse. Dans le cadre d’un dépistage non ciblé, la répétition de tests faciles à mettre en œuvre et de rendu rapide peut être plus efficace en termes de santé publique, pour détecter les sujets infectés et les isoler, que des techniques très sensibles. Figure 3. Réalisation du prélèvement et du test selon l’invention, avec un kit comprenant un écouvillon pour prélèvement de salive. Les conclusions diagnostiques sont présentées. Page 1 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique Page 2 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique – prélèvement de salive avec écouvillon Page 3 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique Page 4 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique : lecture des résultats positif / négatif du procédé selon l’invention. Dans cet exemple, la ligne C est celle du contrôle interne qui doit être positif, la ligne T est celle du test de l’échantillon. Le cercle S représente le puits dans lequel deux gouttes d’échantillon biologique ont été déposées pour effectuer le test. Figure 4. Réalisation du prélèvement et du test selon l’invention, avec un kit comprenant un contenant pour prélèvement de salive par salivation. Page 1 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique Page 2 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique – Prélèvement de salive par salivation dans un contenant Page 3 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique : prélèvement nasal et combinaison avec le prélèvement de salive. Les différents schémas sont commentés ci-dessous. (1) et (2) Retirer l’écouvillon de son emballage puis (3) l’insérer dans la partie antérieure de la narine du patient (zone intermédiaire entre la partie humide et sèche). TOUTE la partie floquée doit être introduite dans le vestibule de la narine antérieure. Cette étape ne doit pas être douloureuse mais un réflexe lacrymal peut être observé. (4) Demander au patient de se pincer la narine pour positionner l’écouvillon contre la paroi nasale tout en tournant doucement l’écouvillon 10 fois (environ 10 secondes) ; l’écouvillon doit toucher la paroi nasale pendant toute cette étape. Retirer l’écouvillon en maintenant la narine pincée. (5) Prendre le tube dans le portoir et immerger la tête de l’écouvillon jusqu’au fond du tube. (6) Mélanger soigneusement en tournant l’écouvillon au moins 10 fois ET en le pressant dans le tampon d’extraction en appuyant sur les parois du tube d’extraction (dripper) puis le ressortir en essorant fermement la tête de l'écouvillon le long de la paroi intérieure du tube d'extraction pour retenir autant de solution que possible dans le tube. Jeter l'écouvillon dans un conteneur pour produits présentant un risque biologique et fermer le tube d’extraction à l’aide du capuchon compte-gouttes. Attendre 2 minutes que le réactif agisse. (7) Prenez le tube et déposez 2 gouttes de la solution d'échantillon traité dans le puits « S » (tube d’extraction à la verticale). Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulle d'air. L'échantillon commencera à migrer le long de la membrane. Page 4 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique : lecture des résultats positif / négatif du procédé selon l’invention. Négatif : Seule la ligne de contrôle (C) est visible. Aucun antigène du virus SARS-CoV-2 n'est détecté. Le résultat n'exclut pas une infection par le COVID-19 (voir la section limitations). Positif : Des bandes colorées apparaissent à la ligne de contrôle (C) et à la ligne de test (T). Le test est positif pour l'antigène du virus SARS-CoV-2. Invalide : La ligne de contrôle (C) est absente. Si cela se produit, le test doit être répété en utilisant une nouvelle cassette de test. Procédé de diagnostic in vitro d’une infection virale due à la présence d’un virus chez un individu, comprenant une étape de détection d’au moins un antigène spécifique dudit virus par un test immunologique réalisé sur un échantillon biologique dudit individu, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique consiste en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur dudit individu. Procédé de diagnostic selon la revendication 1, caractérisé en ce que la salive, préalablement à son prélèvement, a été enrichie en sécrétions nasales et/ou en sécrétions nasopharyngées et/ou en expectorations. Procédé de diagnostic selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le virus est le coronavirus SARS-CoV-2. Procédé de diagnostic selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est fluidifié avant réalisation de l’étape de détection. Procédé de diagnostic selon la revendication 4, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est fluidifié par ajout d’un fluidifiant, notamment à base de N-acétyl-cystéine ou du dithiothréitol. Procédé de diagnostic selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le test immunologique est un test immuno-chromatographique. Procédé de diagnostic selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le test immunologique comprend au moins un anticorps se liant à au moins un antigène spécifique dudit virus. Procédé de diagnostic selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l’individu dont est issu l’échantillon biologique est âgé de plus de 3 ans. Trousse de diagnostic pour la mise en œuvre du procédé selon l’une des revendications 1 à 8, comprenant : i) des dispositifs médicaux pour effectuer et collecter des prélèvements salivaires et narinaires antérieurs, ii) un test immunologique comprenant au moins un anticorps se liant à au moins un antigène spécifique du virus, ainsi que les réactifs nécessaires à la mise en œuvre de ce test. Trousse de diagnostic selon la revendication 9, caractérisée en que le test immunologique comprend au moins un anticorps se liant à au moins un antigène spécifique du coronavirus SARS-CoV-2.