FR 3110176 A1 20211119 FR 2004669 A 20200512 La présente invention se rapporte à une souche déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sous le numéro CNCM I-5499. La présente invention se rapporte également à l’utilisation in vitro d’une souche pour la production d’oligosaccharides et/ou dans un procédé de production d’oligosaccharides. La présente invention trouve une application, notamment dans le domaine de la bioproduction, par exemple la production de composés, par exemple de biocomposés. Figure d’abrégé : Fig. 6 Souche et procédé de production d’oligosaccharides La présente invention se rapporte à une souche bactérienne et également à l’utilisation in vitro de la souche pour la production d’oligosaccharides et/ou dans un procédé de production d’oligosaccharides. La présente invention se rapporte également à un procédé in vitro , en particulier in cellulo, de production d’oligosaccharides. La présente invention trouve une application, notamment dans le domaine de la bioproduction, par exemple la production de composés, par exemple de biocomposés. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ( [ ] ) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Les oligosaccharides représentent une classe de biomolécules très diverses constituées de chaînes linéaires ou ramifiées d’unités glycosyles liées entre elles par différents types de liaisons α ou β-osidique. Leur diversité structurale résulte à la fois de la nature des monomères, de la position et de l’anomérie de leurs liaisons covalentes (α ou β). Ces molécules jouent des rôles divers et importants dans une multitude de processus cellulaires, y compris la signalisation et la différenciation cellulaire, la modulation de la réponse immunitaire et de l'inflammation, la médiation des interactions microbiennes et des interactions hôte-microbe. En raison de leurs structures et de leurs fonctions biologiques très diversifiées, les oligosaccharides sont utilisés dans un large éventail d'applications dans l'industrie alimentaire (aliments fonctionnels, prébiotiques ou additifs) et dans l'industrie de la santé (en tant qu’éléments de base pour la synthèse chimique de médicaments, kits de dépistage, supports pharmaceutiques ou intermédiaires de vaccins). Par conséquent, l'intérêt pour la production d'oligosaccharides augmente très rapidement. Le défi est de développer des voies de synthèse conformes aux principes de la chimie verte (Anastas et Warner, 2000 Anastas, P.T., Warner, J.C., 2000. Green chemistry: theory and practice, 1. paperback. ed. Oxford Univ. Press, Oxford. [15]), basées sur l'utilisation de bioressources bon marché et versatiles, pour produire une large diversité d’oligosaccharides. Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen et/ou procédé permettant de maîtriser la production d’oligosaccharides tout en réduisant les coûts de production de différents oligosaccharides et/ou d’améliorer les rendements de production, tout en évitant et/ou réduisant et/ou supprimant l’utilisation de composés et/ou solutions néfastes pour l’environnement. Il existe actuellement différents procédés de productions d’oligosaccharides. Certains oligosaccharides sont actuellement produits par synthèse chimique. Cette approche nécessite de multiples étapes réactionnelles et de purification pour protéger et déprotéger les groupes fonctionnels et réaliser des synthèses régio- et stéréo- spécifiques. Malgré des progrès significatifs dans ce domaine (Rudroff, F., Mihovilovic, M.D., Gröger, H., Snajdrova, R., Iding, H., Bornscheuer, U.T., 2018. Opportunities and challenges for combining chemo- and biocatalysis. Nature Catalysis 1, 12–22. https://doi.org/10.1038/s41929-017-0010-4 [18]), ces voies de production, dans la plupart des cas, conduisent à un faible niveau de production (Ager, 2012 Ager, D., 2012. Final Analysis: Biological or Chemical Catalysis Platinum Metals Review 56 [19]), et nécessitent l'utilisation de solvants polluants. De plus, la diversité des structures oligosaccharidiques qui peuvent être obtenues par synthèse chimique est limitée. Aussi, il existe donc un réel besoin de trouver un moyen et/ou procédé permettant de maîtriser la production d’oligosaccharides tout en réduisant les coûts, notamment de production, d’améliorer les rendements de productions tout en évitant et/ou réduisant et/ou supprimant l’utilisation de composés et/ou solutions néfastes pour l’environnement. Des voies de production d'oligosaccharides chimio-enzymatiques et enzymatiques ont été mises au point ces vingt dernières années afin de tirer parti de la diversité naturelle et de la sélectivité des enzymes, et ainsi élargir le panel des structures oligosaccharidiques pouvant être produits par biocatalyse (Combes, Monsan, 2009. Biocatalyse ou catalyse enzymatique. Procédés chimie - bio- agro I Chimie verte, Techniques de l’ingénieur 1–18. [13]; Reetz, M.T., 2013. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. Journal of the American Chemical Society 135, 12480–12496. https://doi.org/10.1021/ja405051f [20]; Rudroff, F., Mihovilovic, M.D., Gröger, H., Snajdrova, R., Iding, H., Bornscheuer, U.T., 2018. Opportunities and challenges for combining chemo- and biocatalysis. Nature Catalysis 1, 12–22. [14]). Cependant, l'utilisation des enzymes dans les procédés in vitro est limitée en raison du coût de production et de purification des enzymes, de la perte d'activité des enzymes pendant leur stockage, et leur mise en œuvre, et en outre du coût des substrats/matières premières nécessaires. Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen et/ou procédé et/ou nouveaux procédés permettant de maîtriser la production d’oligosaccharides à grande échelle, possédant des coûts de production économiquement viables et avec un faible impact environnemental. Cinq principaux types d'enzymes ont été décrits comme pouvant être utilisés pour catalyser efficacement la production d'oligosaccharides : les glycosides-hydrolases (GH), les glycosynthases (GS), les transglycosylases (TG), les glycoside-transférases (GT) et les glycoside-phosphorylases (GP). Toutefois chacune présente des inconvénients et limites. - Les GH permettent d'hydrolyser plus ou moins spécifiquement les glycanes pour obtenir des mélanges d'oligosaccharides. Leur utilisation est néanmoins limitée à la conversion de polymères très abondants, comme ceux issus de la biomasse végétale, et, dans la majorité des cas, leur spécificité de produit n'est pas suffisante pour donner des fractions d'oligosaccharides monodisperses. - Les GS sont des mutants de GH produites par ingénierie enzymatique. Elles nécessitent des substrats synthétiques onéreux. - Les TG peuvent opérer la synthèse en utilisant des substrats bon marché (comme le saccharose ou l'amidon) mais leur diversité structurale et fonctionnelle naturelle est limitée au transfert d'un type très limité d’unités glycosyles. - Les GT permettent la synthèse d'oligosaccharides à partir de substrats activés très coûteux (glycosyl-mono- ou diphosphonucleotides, et glycosyl-polyprenol mono- ou diphosphates), ce qui rend leur utilisation in vitro peu rentable. - Les GP peuvent catalyser des réactions de synthèse d'oligosaccharides lors de la réaction de "phosphorolyse inverse" La réaction dite de "phosphorolyse inverse" (Puchart, V., 2015. Glycoside phosphorylases: Structure, catalytic properties and biotechnological potential. Biotechnology Advances 33, 261–276. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2015.02.002 [21]), formant une liaison osidique entre l'unité glycosidique issue d'un glycosyl-phosphate, qui agit comme "donneur" de glycosyl, et un « accepteur » hydroxylé, est représentée sur le schéma ci-dessous. Cependant, sans élimination continue du produit de phosphorolyse inverse ou du phosphate inorganique libéré pour modifier l'équilibre réactionnel, les rendements de synthèse des oligosaccharides sont faibles et le coût élevé des glycosyl-phosphates reste un frein important à l'utilisation de ces enzymes dans des procédés industriels in vitro . Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen et/ou procédé permettant de maîtriser la production d’oligosaccharides, en particulier d'oligosaccharides à grande échelle, possédant des coûts de production économiquement viables et avec un faible impact environnemental. Des procédés de synthèse in vitro basés sur l’utilisation de GS ont été décrits (Cobucci-Ponzano, B., Moracci, M., 2012. Glycosynthases as tools for the production of glycan analogs of natural products. Natural Product Reports 29, 697. [22]). Ils nécessitent des donneurs de glycosyl modifiés chimiquement qui sont difficiles à produire à haut rendement à un coût raisonnable. Les GT sont utilisées pour la production d'oligosaccharides, en particulier en utilisant des souches recombinantes d’ Escherichia coli (Samain & Priem (2001) Procédé de production d'oligosaccharides WO0104341 [23] ; WO2008040717 Samain (2008) High yield production of sialic acid (Neu5ac) by fermentation [24]; WO2007101862 Samain (2007) Method of producing sialylated oligosaccharides [54]; WO2007023348, SAMAIN et al. (2007) Production of globoside oligosaccharides using metabolically engineered microorganisms [55] ; Fort, S., Birikaki, L., Dubois, M. P., Antoine, T., Samain, E., & Driguez, H. (2005). Biosynthesis of conjugatable saccharidic moieties of GM 2 and GM 3 gangliosides by engineered E. coli . Chemical communications , (20), 2558-2560 [56]; Fierfort, N., & Samain, E. (2008). Genetic engineering of Escherichia coli for the economical production of sialylated oligosaccharides. Journal of biotechnology , 134 (3-4), 261-265) [57]. Certains de ces procédés connus utilisent des GP dans des souches recombinantes dans le sens de la phosphorolyse, pour augmenter la concentration intracellulaire de monosaccharides phosphorylés. Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen et/ou produit et/ou procédé simple et/ou ne comprenant pas d’étapes complexes et/ou susceptibles d’être mises en œuvre uniquement par un expert, de production d’oligosaccharides notamment in cellulo via un micro-organisme adapté. Il existe également un réel besoin de trouver un moyen et/ou produit et/ou procédé permettant de maîtriser la production d’oligosaccharides en particulier le type d’oligosaccharides produits, et également de réduire les coûts, notamment de production, tout en améliorant les rendements et la quantité d’oligosaccharides produits. Description de l’invention La présente invention permet de résoudre et de surmonter les obstacles et inconvénients de l’art antérieur précités en fournissant une souche déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sous le numéro CNCM I-5499. En particulier, les inventeurs ont élaboré avantageusement un nouveau moyen de production d’oligosaccharides. En particulier, la souche selon l’invention permet la production d’oligosaccharides via des glycoside-phosphorylases et également avantageusement à la fois une internalisation de précurseurs pour la synthèse, en particulier d’hydrates de carbone non phosphorylés, et une accumulation intracellulaire d’hydrates de carbone phosphorylés. En particulier, les inventeurs ont démontré de manière surprenante et inattendue que la souche selon l’invention permet avantageusement notamment d’accumuler des hydrates de carbone non phosphorylés requis pour la synthèse d’oligosaccharides par les glycoside-phosphorylases. Les inventeurs ont également démontré de manière surprenante que la souche selon l’invention permet avantageusement, lors de la production d’oligosaccharides, l’excrétion desdits oligosaccharides dans le milieu de culture. Avantageusement, les inventeurs ont démontré que la souche selon l’invention permet une récupération et une purification facilitée des oligosaccharides produits de par leur excrétion dans le milieu de culture. En outre, avantageusement la diffusion ou excrétion des oligosaccharides dans le milieu extracellulaire pourrait permettre l’obtention d’une réaction catalysée par les glycoside-phosphorylases favorisée dans le sens de la phosphorolyse inverse. La présente invention permet avantageusement, notamment par rapport aux synthèses chimiques d'oligosaccharides connues, une production d’oligosaccharides qui réduit énormément l'impact environnemental. Les inventeurs ont ainsi démontré que l’invention permet avantageusement de fournir un nouveau procédé et/ou une nouvelle voie de synthèse d’oligosaccharides qui surmonte les inconvénients rencontrés dans les procédés connus de synthèse d’oligosaccharides, notamment dans les synthèses enzymatiques in vitro sans utilisation de support biologique vivant. La présente invention permet comme évoqué ci-dessus et de manière synergique de réduire considérablement les coûts de production, le nombre d'étapes de synthèse et de purification par rapport aux procédés de synthèse, notamment chimique et enzymatique in vitro sans utilisation de support biologique vivant. Dans la présente invention, la souche déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sous le numéro CNCM I-5499 est une souche dérivée de Escherichia coli dont les gènes recA1, gyrA96, thi-1, glnV44 relA1 hsdR17, endA1, lacZ, nanKETA , lacA, melA, wcaJ, mdoH, ptsG , manX, manY, et pfkA sont inactivés Dans la présente invention, par recA1 on entend le gène codant pour la protéine RecA 1 (NCBI Gene ID: 947170 UniProtKB - P0A7G6 ) Dans la présente par gyrA96 on entend le gène codant pour la sous-unité A de la DNA gyrase (NCBI GeneID:946614 UniProtKB - P0AES4 ) Dans la présente invention, par thi-1 on entend le gène codant pour la Thiamine thiazole synthase, chloroplastic (NCBI GeneID:948491 UniProtKB P30137) Dans la présente invention, par glnV44 on entend le gène codant pour un glutamine tRNA (NCBI GeneID:945255). Dans la présente invention, par relA1 on entend le gène codant pour la GTP pyrophosphokinase (NCBI GeneID:947244 UniProtKB - P0AG20). Dans la présente invention, par hsdR17 on entend un mutant du gène hsdR codant pour un composant endonucléase de l’enzyme de restriction de type I EcoR124II R protéine (NCBI GeneID: 948878 UniProtKB - P10486) Dans la présente invention, par endA1 on entend le gène codant pour l’endonucléase EndA1 (NCBI GeneID:949092 UniProtKB - P25736) Dans la présente invention, par lacZ on entend le gène codant pour la β-galactosidase (NCBI GeneID: 945006 UniProtKB - P00722) Dans la présente invention, par nanKETA on entend les gènes codant pour l’opéron permettant une internalisation et la métabolisation de l’acide sialique (Neu5Ac), en particulier les gènes : nanA codant pour une N -acétylneuraminate lyase (NCBI GeneID:947742 UniProtKB - P0A6L4); nanT codant pour la N -acétylneuraminate:H + symporter ( NCBI GeneID:947740; UniProtKB - P41036); nanE codant pour la N -acétylmannosamine-6-phosphate épimérase (NCBI GeneID:947745 UniProtKB - P0A761) ; nanK codant pour la N -acétylmannosamine kinase (NCBI GeneID:947757 UniProtKB - P45425). Dans la présente invention, par lacA on entend le gène codant pour la galactoside O-acétyltransférase (NCBI GeneID: 945674 UniProtKB - P07464). Dans la présente invention, par melA on entend le gène codant pour l’α-galactosidase (NCBI eneID:948636 UniProtKB - P06720). Dans la présente invention, par wcaJ on entend le gène codant pour l’UDP-glucose:undecaprényl-phosphate glucose-1-phosphate transférase (NCBI GeneID:946583 UniProtKB - P71241). Dans la présente invention, par mdoH on entend le gène codant pour l’osmorégulé périplasmique glucanes (OPGs) biosynthèses protéine H (« osmoregulated periplasmic glucans OPGs biosynthesis protein H ») (NCBI GeneID:945624 UniProtKB - P62517). Dans la présente invention, par ptsG on entend le gène codant pour la protéine glucose-spécifique PTS enzyme IIBC component (« glucose-specific PTS enzyme IIBC component ») (NCBI GeneID: 945651 UniProtKB - P69786). Dans la présente invention, par manX on entend le gène codant pour la protéine mannose-spécifique PTS enzyme IIAB component (NCBI GeneID: 946334 UniProtKB - P69797). Dans la présente invention, par manY on entend le gène codant pour la protéine mannose-spécifique PTS enzyme IIC component (NCBI GeneID: 946332 UniProtKB - P69801) Dans la présente invention, par pfkA on entend le gène codant pour l’ATP-dépendent 6-phosphofructokinase isozyme 1 (NCBI GeneID: 948412 UniProtKB - P0A796). Selon l’invention, la souche peut comprendre au moins un vecteur d’expression. Dans la présente invention, par vecteur d’expression on entend tout vecteur d’expression connu de l’homme du métier adapté, notamment, pour l’expression de gènes codant pour des protéines dans des microorganismes. Il peut s’agir de tout vecteur d’expression connu de l’homme du métier adapté pour l’expression de gènes codant pour des protéines dans une bactérie. Il peut s'agir par exemple de n'importe quel vecteur sélectionné parmi les vecteurs listés dans le catalogue https://france.promega.com/products/vectors/protein-expression-vectors [35] ou dans le catalogue https://www.thermofisher.com/search/browse/category/fr/fr/85801/Bacterial%20Expression%20Vectors [36]. Il peut s'agir, par exemple, du vecteur d'expression décrit dans le document WO 83/004261 [37]. Le vecteur peut être, par exemple un plasmide, un chromosome artificiel de levure (YAC) ou un chromosome artificiel bactérien (BAC). Il peut s’agir par exemple de tout plasmide connu de l’homme du métier adapté pour l’expression de gènes codant pour des protéines dans des bactéries et/ou disponible dans le commerce. Il peut s'agir par exemple du plasmide pWKS130 décrit dans le document Rong Fu Wang, Kushner, S.R., 1991. Construction of versatile low-copy-number vectors for cloning, sequencing and gene expression in Escherichia coli . Gene 100, 195–199. [10], du plasmide commercialisé par la société Thermofisher sous la référence commerciale pBAD-HisA, du plasmide commercialisé par la société Thermofisher sous la référence commerciale pTRC. Il peut s’agir par exemple d’un plasmide choisi dans le groupe comprenant pBAD-HisA, pTRC, pMX, pUC19, pHP45-CmR, pcDNA3.1(+), pcDNA3.3-TOPO, pcDNA3.4-TOPO, pFastBac1, pET100/D-TOPO, pET151/D-TOPO, pRSET A, pYes2.1V5-His TOPO, pDONR221, pGEX-3X ; pBluescript, pET, pGEX, pLys, pRARE, pDEST, pETG, de préférence le plasmide pBAD-HisA. Il peut s’agir par exemple de tout vecteur d’expression mentionné, par exemple dans les pages internet https://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/strains_vectors/vectors/bacterial_expression_vectors/popup_bacterial_expression_vectors/index.html [38], http://babel.ucmp.umu.se/cpep/web_content/Pages/CPEP_09_vectors.html [39] et/ ou https://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/strains_vectors/vectors/gateway_vectors/index.htm [40] Le vecteur peut être n'importe quel chromosome artificiel de levure (YAC) adapté pour l’expression dans des bactéries, connu de l’homme du métier et/ou disponible dans le commerce. Il peut s'agir par exemple d'un chromosome artificiel de levure choisi dans le groupe comprenant pYAC-RC, pYAC3. Le vecteur peut être n'importe quel chromosome artificiel bactérien (BAC) adapté pour l’expression dans des bactéries, connu de l’homme du métier et/ou disponible dans le commerce. Il peut s'agir par exemple d'un chromosome artificiel bactérien choisi dans le groupe comprenant pUvBBAC, pCC1BAC, pBAC 108L. Selon l’invention, au moins un vecteur d’expression peut permettre l’expression d’au moins une glycoside-phosphorylase. Par exemple, le vecteur d’expression peut permettre l’expression d’une glycoside-phosphorylase choisie parmi les β-glycoside- ou α-glycoside- phosphorylases, par exemple les α-1,3-glucopyranosyl-L-rhamnose-phosphorylases, les α-1,2-glucosyl-glycérol-phosphorylases, les tréhalose-phosphorylases, les D-galactosyl-β-1,4-L-rhamnose phosphorylases, les β-1,4-mannosyl-glucose-phosphorylases, les β-1,2-oligomannan-phosphorylases, les β-1,2-mannobiose-phosphorylases, les β-1,4-mannopyranosyl-[N-glycane]-phosphorylases / les β-1,4-mannopyranosyl-chitobiose-phosphorylases, les β-1,4-mannooligosaccharide-phosphorylases, les β-1,3-mannooligosaccharide-phosphorylases, les β-1,3-mannosyl-glucose phosphorylases, les β-1,4-mannosyl-glucuronate phosphorylases. Par exemple, le vecteur d’expression peut permettre l’expression d’une glycoside-phosphorylase telle que mentionnée dans le tableau 1 ci-dessous. Le tableau 1 décrit des exemples de glycoside-phosphorylases et mentionne leur identifiant GenBank ou Gigabase. [Tableau 1] : Glycoside-phosphorylases et numéros d’accession GenBank ou Gigabase Glycoside-phosphorylase GenBank 3-O-α-glucopyranosyl-L-rhamnose phosphorylase (Cphy_1019) ABX41399.1 1,2-alpha-glucosylglycérol phosphorylase (Bsel_2816) ADI00307.1 tréhalose phosphorylase (TreP) BAB97299.1 tréhalose phosphorylase (TPase) BAC20640.1 D-galactosyl-1,4-L-rhamnose phosphorylase (Cphy_1920) ABX42289.1 D-galactosyl-β-1,4-L-rhamnose phosphorylase (GalRhaP;Oter_1377) ACB74662.1 β-1,4-mannosylglucose phosphorylase (Unk1) AAS19693.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase (Teth514_1788) ABY93073.1 β-1,2-mannobiose phosphorylase (Teth514_1789) ABY93074.1 β-1,4-mannopyranosyl-[N-glycane] phosphorylase / β-1,4-mannopyranosyl-chitobiose phosphorylase (Uhgb_MP) ADD61463.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (MOP;RaMP2;Rumal_0099) ADU20661.1 β-1,4-mannosylglucose phosphorylase (RaMP1;RaMGP;Rumal_0852) ADU21379.1 β-1,2-mannobiose phosphorylase (Lin0857) CAC96089.1 β-1,4-mannosylglucose phosphorylase (MGP;BF0772) CAH06518.1 β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase (zobellia_231) CAZ94304.1 CalpoDRAFT_0075 WP_026485574.1 CalpoDRAFT_1209 WP_026486530.1 Tréhalose phosphorylase AAF22230.1 Tréhalose phosphorylase ABC84380.1 Tréhalose phosphorylase BAA31350.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (RIL182_01100;ROSINTL182_05474) VCV21229.1 mannosylglucose phosphorylase (RIL182_01099;ROSINTL182_07685) VCV21228.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP3 (LMXM_10_1250) XP_003872966.1 CBZ24448.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP4 (LMXM_10_1260) CBZ24449.1 XP_003872967.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP6 (LMXM_10_1280) CBZ24451.1 XP_003872969.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP7 (LMXM_10_1290) CBZ24452.1 XP_003872970.1 Glycoside-phosphorylase GigaDB, DOI: 10.5524/100064 β-1,4-mannosyl-glucuronate phosphorylase (« β-1,4-mannosyl-glucuronic acid phosphorylase ») MH0431_GL0150624 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase MH0373_GL0093988 β-1,3-mannosyl-glucose phosphorylase β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase 340101.Vvad_PD3074 Un vecteur d’expression peut comprendre une séquence polynucléotidique, par exemple une cassette génétique (« expression cassette »), comprenant les éléments suivants dans l'ordre 5' à 3' : une séquence promotrice; une séquence d'acide nucléique codant une enzyme, de préférence une glycoside-phosphorylase. Dans le présent document, "polynucléotide(s)", "oligonucléotide(s)", "acide(s) nucléique(s)", "nucléotide(s)", "acide(s) polynucléique(s)" ou tout équivalent grammatical utilisé fait référence à une forme polymère de nucléotides ou d'acides nucléiques de toute longueur, soit ribonucléotides ou désoxyribonucléotides. Ce terme fait référence à la structure primaire de la molécule. Ainsi, ce terme comprend l'ADN double et simple brin, l'ADN triplex, ainsi que l'ARN double et simple brin. Elle comprend également les formes modifiées, par exemple par méthylation et/ou par coiffage, et les formes non modifiées du polynucléotide. Le terme est également destiné à comprendre les molécules qui comprennent les nucléotides non naturels ou synthétiques ainsi que les analogues nucléotidiques. Les séquences d'acides nucléiques et les vecteurs divulgués ou envisagés ici peuvent être introduits dans une cellule, par exemple par transfection, transformation ou transduction. La glycoside-phosphorylase peut être une glycoside-phosphorylase telle que définie ci-dessus. Le promoteur peut être tout promoteur connu de l’homme du métier adapté pour une expression dans des microorganismes, de préférence dans des bactéries. Il peut s’agir par exemple d’un promoteur constitutif ou d’un promoteur inductible. Il peut s’agir par exemple d’un promoteur constitutif choisi dans le groupe comprenant le promoteur CMV, EF1A, ou SV40. Il peut s’agir par exemple d’un promoteur constitutif mentionné sur la page internet http://parts.igem.org/Promoters/Catalog/Constitutive [41], d’un quelconque promoteur de la souche E. coli K-12 connu de l’homme du métier, par exemple un promoteur choisi parmi les 3908 promoteurs de la souche E. coli K-12 répertoriés sur le site biocyc.org: https://biocyc.org/group?id=:ALL-PROMOTERS&orgid=ECOLI [42]. Il peut s’agir par exemple d'un promoteur inductible, par exemple pBAD ou pLac. Il peut s’agir par exemple d’un promoteur inductible décrit et/ou mentionné sur la page : http://parts.igem.org/Promoters/Catalog [43]. L’homme du métier, de part ces connaissances générales saura choisir le promoteur en fonction de la séquence nucléique à exprimer et/ou de la cellule hôte, de préférence la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sous le numéro CNCM I-5499. Dans la présente invention, l’insertion de la séquence nucléique codante peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple de toute méthode de clonage de gènes connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’un procédé décrit et/ou disponible sur la page internet https://www.addgene.org/mol-bio-reference/cloning [31]. L’homme du métier, de part ces connaissances générales, saura adapter les procédés et/ou méthodes d’insertion et/ou de clonage en fonction du vecteur et/ou du gène. Dans la présente invention, la souche peut comprendre en outre au moins un vecteur d’expression permettant l’expression d’au moins un système de transport, de préférence de monosaccharides ou d’oligosaccharides. Selon l’invention le vecteur d’expression peut être tel que défini ci-dessus. Dans la présente invention, par système de transport on entend toute protéine et/ou ensemble de protéines de transport et/ou transporteur protéique adapté pour le transport de monosaccharides connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une protéine de transport ou perméase d’hydrates de carbone non phosphorylés, de préférence de monosaccharides, choisie parmi les familles de transporteurs comprenant les transporteurs « phosphotransferase system » (PTS)). Il peut s’agir par exemple d’un transporteur non-PTS choisi parmi les transporteurs de la famille des « Major Facilitor Superfamily » (MFS), de la famille des sodium-glucose transporteur (SGLT), de la famille Ton-B dépendant et/ou de la super famille des transporteurs « ATP-Binding Cassette » (ABC). Il peut s’agir par exemple d’un transporteur de la famille des « Major Facilitor Superfamily » (MFS) choisi dans le groupe comprenant la Galactose perméase (GalP), par exemple la Galactose perméase (GalP) d' E. coli ou Salmonella sp , la Glucose perméase (GlcP), par exemple la Glucose perméase (GlcP) de Streptomyces coelicolor ou la glucose perméase (Glf) de Zymomonas mobilis. Il peut s’agir par exemple d’un transporteur de la famille des sodium-glucose transporteur (SGLT) choisi dans le groupe comprenant le transporteur SglS, par exemple le transporteur SglS de la souche Vibrio parahemoliticus . Il peut s’agir par exemple d’un transporteur de la super famille des transporteurs « ATP-Binding Cassette » (ABC) choisi dans le groupe comprenant le transporteur MglABC, par exemple le transporteur MglABC d' E. coli , le transporteur malEFG, par exemple le transporteur malEFG de Thermos termophilus, le transporteur Teth514_1792, par exemple le transporteur Teth514_1792 de Thermoanaerobacter sp , ou le transporteur Teth514_1796, par exemple le transporteur Teth514_1796 de Thermoanaerobacter sp X-514. Dans la présente invention, un vecteur d’expression peut permettre la production d’au moins un système de transport tel que mentionné ci-dessus. Par exemple, le vecteur d’expression peut permettre l’expression d’une perméase ou protéine de transport telle que mentionnée dans le tableau 2 ci-dessous. Le tableau 2 décrit des exemples de perméase ou protéine de transport et mentionne leur famille. [Tableau 2] : perméase ou protéine de transport et famille de transporteurs correspondant Perméase ou protéine de transport Famille Galactose perméase (GalP) E. coli K12 MFS Galactose perméase (GalP) Salmonella sp MFS Glucose perméase (GlcP) Streptomyces coelicolor MFS Glucose perméase facteur facilité (“Glucose facilitated factor permease”) (glf) Z. mobilis MFS Sodium-glucose transporteur SglS de Vibrio parahemoliticus SGLT MglABC de E. coli ABC malEFG of Thermos termophilus ABC Teth514_1792 ABC Teth514_1796 ABC Dans la présente invention, un vecteur d’expression permettant l’expression d’au moins un gène codant pour une protéine de transport ou perméase peut comprendre une séquence polynucléotidique, par exemple une cassette génétique (« expression cassette »), comprenant les éléments suivants dans l'ordre 5' à 3' : une séquence promotrice; une séquence d'acide nucléique codant une protéine, de préférence une protéine de transport ou perméase ; La protéine de transport ou perméase peut être une protéine de transport ou perméase telle que définie ci-dessus. Selon l’invention, le promoteur peut être tel que défini ci-dessus. L’homme du métier, de part ces connaissances générales saura choisir le promoteur en fonction de la séquence nucléique à exprimer et/ou de la cellule hôte, de préférence la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sous le numéro CNCM I-5499. Dans la présente invention, l’insertion de la séquence nucléique codant la protéine de transport ou perméase peut être réalisée par tout procédé tel que décrit ci-dessus. Avantageusement, lorsque la souche comprend en outre un vecteur d’expression permettant l’expression d’au moins un gène codant pour une protéine de transport ou perméase, la souche selon l’invention peut avantageusement internaliser des sucres non phosphorylés qui peuvent être présents dans le milieu de culture. Avantageusement, tel que mentionné ci-dessus, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la souche selon l’invention permet avantageusement d’accumuler des précurseurs de synthèse d’oligosaccharides, et peut avantageusement être utilisée comme un support et/ou moyen pour la production d’oligosaccharides. Tel que mentionné ci-dessus, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la souche selon l’invention peut permettre avantageusement après production d’oligosaccharides une diffusion ou excrétion desdits oligosaccharides produits dans le milieu de culture. En outre, avantageusement la diffusion ou excrétion des oligosaccharides dans le milieu extracellulaire pourrait permettre l’obtention d’une réaction catalysée par les glycoside-phosphorylases dans le sens de la phosphorolyse inverse. La présente invention a donc également pour objet l’utilisation in vitro d’une souche selon l’invention pour la production d’oligosaccharides et/ou dans un procédé de production d’oligosaccharides. Dans la présente invention, la souche peut être utilisée dans tout procédé in vitro, en particulier in cellulo, de production d’oligosaccharides, connu de l’homme du métier. Il peut s’agir de tout procédé de production d’oligosaccharides comprenant une synthèse enzymatique et/ou utilisant au moins un microorganisme. Il peut s’agir de tout procédé de production d’oligosaccharides connu comprenant une synthèse enzymatique et/ou utilisant au moins un microorganisme dans lequel l’enzyme ou le microorganisme peut être remplacé par la souche selon l’invention. Il peut s’agir par exemple d’un procédé de production d’oligosaccharides comprenant une synthèse enzymatique et/ou utilisant au moins un microorganisme, par exemple tel que décrit dans le document : Tathiana Souza Martins Meyer, Ângelo Samir Melim Miguel, Daniel Ernesto Rodríguez Fernández and Gisela Maria Dellamora Ortiz « Biotechnological Production of Oligosaccharides — Applications in the Food Industry » October 22nd 2015 [17], Erju Tang, Xialin Shen, Jia Wang, Xinxiao Sun, Qipeng Yuan, “Synergetic utilization of glucose and glycerol for efficient myo-inositol biosynthesis” Biotechnology and Bioengineering 2020 [32], Constantin Ruprecht, Friedericke Bönisch, Nele Ilmbergera, Tanja V. Heyera, Erhard T.K. Haupt, Wolfgang R. Streit, Ulrich Rabausch “High level production of flavonoid rhamnosides by metagenome-derived Glycosyltransferase C in Escherichia coli utilizing dextrins of starch as a single carbon source”, Metabolic Engineering Volume 55, September 2019, Pages 212-219 [33], Tatiana Antoine, Alain Heyraud Dr., Claude Bosso Dr., Eric Samain Dr “Highly Efficient Biosynthesis of the Oligosaccharide Moiety of the GD3 Ganglioside by Using Metabolically Engineered Escherichia coli ”, Angewandte Chemie, Volume117, Issue9, February 18, 2005 Pages 1374-1376 [34]. Les inventeurs ont également démontré de manière surprenante que la souche selon l’invention permet avantageusement de produire des oligosaccharides et de les excréter dans le milieu de culture. En outre, les inventeurs ont démontré que la souche selon l’invention peut permettre une production/bioproduction d’oligosaccharides en continu. Avantageusement, la présente invention peut permettre la production d’oligosaccharides, il peut s’agir par exemple des oligosaccharides mentionnés dans le tableau 3 ci-dessous. Par exemple la présente invention peut permettre la production d’oligosaccharides en fonction de la glycoside-phosphorylase utilisée tel que mentionnés dans le tableau 3 ci-dessous. [Tableau 3] : oligosaccharides produit en fonction de la glycoside-phosphorylase GenBank Glycoside-phosphorylase Produit ABX41399.1 3-O-α-glucopyranosyl-L-rhamnose phosphorylase (Cphy_1019) 3-O-α-glucopyranosyl-L-rhamnose ABX42289.1 D-galactosyl-1,4-L-rhamnose phosphorylase (Cphy_1920) D-galactosyl-1,4-L-rhamnose ACB74662.1 D-galactosyl-β-1,4-L-rhamnose phosphorylase (GalRhaP;Oter_1377) D-galactosyl-β-1,4-L-rhamnose ADI00307.1 1,2-alpha-glucosylglycérol phosphorylase(Bsel_2816) 1,2-alpha-glucosylglycérol BAB97299.1 tréhalose phosphorylase (TreP) tréhalose BAC20640.1 tréhalose phosphorylase (TPase) tréhalose AAF22230.1 tréhalose phosphorylase tréhalose ABC84380.1 tréhalose phosphorylase tréhalose BAA31350.1 tréhalose phosphorylase tréhalose AAS19693.1 β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylase (Unk1) β-1,4-mannosyl-glucose ABY93073.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase (Teth514_1788) β-1,2-oligomannane ABY93074.1 β-1,2-mannobiose phosphorylase (Teth514_1789) β-1,2-mannobiose ADD61463.1 β-1,4-mannopyranosyl-[N-glycane] phosphorylase (Uhgb_MP) β-1,4-mannooligosaccharide ADU20661.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (MOP;RaMP2;Rumal_0099) β-1,4-mannooligosaccharide ADU21379.1 β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylase (RaMP1;RaMGP;Rumal_0852) β-1,4-mannosyl-glucose CAC96089.1 β-1,2-mannobiose phosphorylase (Lin0857) β-1,2-mannobiose CAH06518.1 β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylase (MGP;BF0772) β-1,4-mannosyl-glucose CAZ94304.1 β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase (zobellia_231) β-1,3-mannooligosaccharide WP_026485574.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (CalpoDRAFT_0075) β-1,4-mannooligosaccharide WP_026486530.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (CalpoDRAFT_1209) β-1,4-mannooligosaccharide VCV21229.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (RIL182_01100;ROSINTL182_05474) β-1,4-mannooligosaccharide VCV21228.1 Mannosyl-glucose phosphorylase (RIL182_01099;ROSINTL182_07685) β-1,4-mannosyl-glucose XP_003872966.1 CBZ24448.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP3 (LMXM_10_1250) β-1,2-oligomannane CBZ24449.1 XP_003872967.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP4 (LMXM_10_1260) β-1,2-oligomannane CBZ24451.1 XP_003872969.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP6 (LMXM_10_1280) β-1,2-oligomannane CBZ24452.1 XP_003872970.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP7 (LMXM_10_1290) β-1,2-oligomannane GigaDB accession number (GigaDB, DOI: 10.5524/100064) Glycoside-phosphorylase Produit MH0373_GL0093988 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase β-1,4-mannooligosaccharide 340101.Vvad_PD3074 β-1,3-mannosyl-glucose phosphorylase/ β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase β-1,3-mannosyl-glucose 340101.Vvad_PD3074 β-1,3-mannosyl-glucose phosphorylase/ β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase β-1,3-mannooligosaccharide MH0431_GL0150624 β-1,4-mannosyl-glucuronate phosphorylase β-1,4-mannosyl-glucuronate La présente invention a donc également pour objet un procédé in vitro, en particulier in cellulo , de production d’oligosaccharides comprenant les étapes de a) transformation de la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sous le numéro CNCM I-5499 avec un vecteur d’expression d’une enzyme, de préférence une glycoside-phosphorylase, b) culture de la souche transformée dans un milieu de culture, c) récupération des oligosaccharides produits. Dans la présente invention, par "transfection", "transformation" ou "transduction" désigne l'introduction d'un ou plusieurs polynucléotides exogènes dans une cellule hôte par des méthodes physiques ou chimiques. Il peut s'agir de n'importe quelle méthode de transfection et/ou de transformation et/ou de transduction adaptée connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’un procédé décrit dans Murray E. J. (éd.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991) [25]) à savoir une coprécipitation d’ADN calcium phosphate, DEAE- dextran ; électroporation ; transfection par liposomes cationiques ; transfection par liposomes ; bombardement par microparticules facilitées de particules de tungstène (Johnston, Nature, 346 : 776-777 (1990) [26]) ; et la co-précipitation de l'ADN du phosphate de strontium (Brash et al., Mol. Cell Biol. 7 : 2031-2034 (1987) [28]). Dans certains cas, la lipofection, la nucléofection ou la rupture temporaire de la membrane (par exemple électroporation ou déformation) peuvent être utilisées pour introduire un ou plusieurs polynucléotides exogènes dans la cellule hôte. Dans la présente invention, le vecteur d’expression peut être tel que décrit ci-dessus. Dans la présente invention, l’enzyme peut être telle que décrite ci-dessus. Par exemple il peut s’agit d’une glycoside-phosphorylase telle que décrit ci-dessus. Selon l’invention invention, le procédé peut comprendre en outre une étape a’) de transformation de la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sous le numéro CNCM I-5499 avec un vecteur d’expression d’au moins une protéine de transport ou perméase. Dans la présente invention, le vecteur d’expression peut être tel que décrit ci-dessus. Dans la présente invention, une protéine de transport ou perméase peut être telle que décrite ci-dessus. Par exemple il peut s’agir de la galactose perméase telle que décrite ci-dessus. Selon l’invention les étapes a) et a’) peuvent être successives ou concomitantes. Dans la présente invention, l’étape de culture de la souche peut être réalisée par tout procédé et/ou méthode adapté(e)(s) connu(e)(s) de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’un procédé de culture continue (« continuous fermentation »), d’une culture discontinue alimentée (« fed-batch fermentation ») ou discontinue (« batch fermentation »). Dans la présente invention, l’étape de culture peut être une culture continue ou une culture pendant une durée. Par exemple la culture peut être réalisée sur une durée de 1 à 12 heures, de 1 à 24 heures de 1 à 36 heures, de 1 à 48 heures de 1 à 240 heures. Par exemple, l’étape de culture peut être réalisée jusqu’à confluence de la souche dans le milieu. Dans la présente invention, l’étape de culture de la souche peut être réalisée dans tout contenant et/ou dispositif adapté pour la culture de microorganismes, de préférence de bactéries, connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’un réacteur de culture disponible dans le commerce, par exemple un bioréacteur Multifors (Infors, Suisse). Dans la présente invention, le milieu de culture peut être ensemencé à partir d’une préculture de la souche, ladite préculture ayant une densité optique (DO) à 600 nm comprises entre 0,01 et 1, de préférence égale à 0,1. Dans la présente invention, le milieu de culture peut être ensemencé avec une concentration de la souche de 2.10 7 à 2.10 10 bactéries par mL, de préférence de 2.10 8 bactéries par mL de milieu de culture. Dans la présente invention, le milieu de culture peut être tout milieu de culture connu de l’homme du métier adapté. Il peut s’agir par exemple d’un milieu liquide ou solide, de préférence un milieu liquide. Il peut s’agir de tous milieux riches connus de l’homme du métier adapté. Il peut s’agir par exemple du milieu LB (Lysogeny Broth), Superbroth, TB (Terrific Broth), YPD (Yeast Extract-Peptone Dextrose). Il peut s’agir par exemple de tout milieu minimum adapté connu de l’homme du métier, par exemple un milieu A, le milieu M9 ou M63 complété d’une source de carbone adéquate, par exemple de glucose, galactose et/ou mannose. Il peut s’agir par exemple de milieux sélectifs adaptés connus de l’homme du métier, par exemple le milieu YNB (Yeast Nitrogen Base). Il peut s’agir de préférence d’un milieu liquide de culture de bactéries. Il peut s’agir par exemple d’un milieu de culture liquide disponible dans le commerce, par exemple le milieu M9 commercialisé par la société Thermofischer, le milieu Terrific Broth commercialisé par la société Thermofischer, le milieu « MagicMedia (marque de commerce) E. coli Expression Medium » commercialisé par la société Thermofischer, le milieu S.O.C. Medium commercialisé par la société Thermofischer. Il peut s’agir d’un milieu décrit dans le document Karen L. Elbing Roger Brent, Recipes and Tools for Culture of Escherichia coli , Current Tools, 09 November 2018 [52] Il peut s’agir de préférence d’un milieu liquide comprenant les composants suivants : Na 2 HPO 4 12H 2 O 17.4 g/L, KH 2 PO 4 3.02 g/L, NaCl 0,51 g/L, NH 4 Cl 2,04 g/L, Na 2 EDTA 2 H 2 O 15 mg/L, ZnSO 4 7 H 2 O 4,5 mg/L, CoCl 2 6H 2 O 0,3 mg/L, MnCl 2 4H 2 O 1 mg/L, H 3 BO 3 1 mg/L, Na 2 MoO 4 2 H 2 O 0,4 mg/L, FeSO 4 7 H 2 O 3 mg/L, CuSO 4 5 H 2 O 0,3 mg/L. MgSO 4 0,5 g/L CaCl 2 4,38 mg/L, Thiamine hypochloride 0,1 g/L, ou d’un milieu liquide comprenant les composants suivants : KH 2 PO 4 3.02 g/L, NaCl 0,51 g/L, NH 4 Cl 2,04 g/L, (NH 4 ) 2 SO 4 5 g/L, Na 2 EDTA 2 H 2 O 15 mg/L, ZnSO 4 7 H 2 O 4,5 mg/L, CoCl 2 6H 2 O 0,3 mg/L, MnCl 2 4H 2 O 1 mg/L, H 3 BO 3 1 mg/L, Na 2 MoO 4 2 H 2 O 0,4 mg/L, FeSO 4 7 H 2 O 3 mg/L, CuSO 4 5 H 2 O 0,3 mg/L. MgSO 4 0,5 g/L CaCl 2 4,38 mg/L, Thiamine hypochloride 0,1 g/L. Dans la présente invention, le milieu de culture peut comprendre en outre au moins un monosaccharide phosphorylé. Par exemple le milieu de culture peut comprendre au moins un monosaccharide phosphorylé choisi dans le groupe comprenant le glucose 1-Phosphate, la N-acétyl-α- d -glucosamine 1-Phosphate, le Galactose 1-Phosphate, le mannose 1-Phosphate; ou un quelconque mélange de ceux-ci . Dans la présente invention, le monosaccharide phosphorylé peut être présent à une concentration comprise de 1 à 200 g.L -1 , de préférence de 5 à 200 g.L -1 de milieu de culture. Dans la présente invention, le milieu de culture peut comprendre en outre au moins un monosaccharide phosphorylé en fonction de la glycoside-phosphorylase exprimée par le vecteur d’expression tel que présenté dans le tableau 4 ci-dessous : [Tableau 4] : monosaccharide phosphorylé en fonction de la glycoside-phosphorylase utilisée GenBank Glycoside-phosphorylase Monosaccharide-phosphorylé ABX41399.1 3-O-α-glucopyranosyl-L-rhamnose phosphorylase (Cphy_1019) Glucose 1-P ABX42289.1 D-galactosyl-1,4-L-rhamnose phosphorylase (Cphy_1920) Galactose 1-P ACB74662.1 D-galactosyl-β-1,4-L-rhamnose phosphorylase (GalRhaP;Oter_1377) Galactose 1-P ADI00307.1 1,2-alpha-glucosylglycérol phosphorylase(Bsel_2816) Glucose 1-P BAB97299.1 tréhalose phosphorylase (TreP) Glucose 1-P BAC20640.1 tréhalose phosphorylase (TPase) Glucose 1-P AAF22230.1 tréhalose phosphorylase Glucose 1-P ABC84380.1 tréhalose phosphorylase Glucose 1-P BAA31350.1 tréhalose phosphorylase Glucose 1-P AAS19693.1 β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylase (Unk1) Mannose 1-P ABY93073.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase (Teth514_1788) Mannose 1-P ABY93074.1 β-1,2-mannobiose phosphorylase (Teth514_1789) Mannose 1-P ADD61463.1 β-1,4-mannopyranosyl-[N-glycan] phosphorylase (Uhgb_MP) Mannose 1-P ADU20661.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (MOP;RaMP2;Rumal_0099) Mannose 1-P ADU21379.1 β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylase (RaMP1;RaMGP;Rumal_0852) Mannose 1-P CAC96089.1 β-1,2-mannobiose phosphorylase (Lin0857) Mannose 1-P CAH06518.1 β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylase (MGP;BF0772) Mannose 1-P CAZ94304.1 β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase (zobellia_231) Mannose 1-P WP_026485574.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (CalpoDRAFT_0075) Mannose 1-P WP_026486530.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (CalpoDRAFT_1209) Mannose 1-P VCV21229.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (RIL182_01100;ROSINTL182_05474) Mannose 1-P VCV21228.1 Mannosyl-glucose phosphorylase (RIL182_01099;ROSINTL182_07685) Mannose 1-P XP_003872966.1 CBZ24448.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP3 (LMXM_10_1250) Mannose 1-P CBZ24449.1 XP_003872967.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP4 (LMXM_10_1260) Mannose 1-P CBZ24451.1 XP_003872969.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP6 (LMXM_10_1280) Mannose 1-P CBZ24452.1 XP_003872970.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP7 (LMXM_10_1290) Mannose 1-P GigaBase accession number (GigaDB, DOI: 10.5524/100064) Glycoside-phosphorylase Monosaccharide-phosphorylé MH0373_GL0093988 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase Mannose 1-P 340101.Vvad_PD3074 β-1,3-mannosyl-glucose phosphorylase/ β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase Mannose 1-P 340101.Vvad_PD3074 β-1,3-mannosyl-glucose phosphorylase/ β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase Mannose 1-P MH0431_GL0150624 β-1,4-mannosyl-glucuronate phosphorylase (“β-1,4-mannosyl-glucuronic acid phosphorylase”) Mannose 1-P Avantageusement, les inventeurs ont démontré que lorsque la souche comprend en outre un vecteur d’expression permettant l’expression d’au moins un gène codant pour une protéine de transport ou perméase non PTS, la souche selon l’invention peut avantageusement internaliser des hydrates de carbone non phosphorylés qui peuvent être présents dans le milieu de culture. Aussi, le procédé selon l’invention peut permettre avantageusement d’utiliser des hydrates de carbone non phosphorylés et de s’affranchir de l’utilisation couteuse de monosaccharides phosphorylés usuels et/ou de monosaccharides phosphorylés tels que mentionnés dans le tableau 4 ci-dessus. Selon l’invention, le milieu de culture peut comprendre en outre au moins un hydrate de carbone non phosphorylé, de préférence un monosaccharide. Par exemple le milieu de culture peut comprendre au moins un hydrate de carbone non phosphorylé choisi dans le groupe comprenant le d - glucose, le L -rhamnose, le glycérol, le d -mannose ou un quelconque mélange de ceux-ci . Dans la présente invention, la concentration dans le milieu de culture dudit au moins un hydrate de carbone non phosphorylé peut être comprise de 1 à 100 g.L -1 , de préférence de 2 à 200 g.L -1 , de préférence de 1 à 5 g.L -1 de milieu de culture, en un ou plusieurs ajouts successifs. Dans la présente invention, le milieu de culture peut comprendre en outre au moins un hydrate de carbone non phosphorylé en fonction de la glycoside-phosphorylase exprimée par le vecteur d’expression par exemple tel que présenté dans le tableau 5 ci-dessous : [Tableau 5] : hydrates de carbone non phosphorylés en fonction de la glycoside-phosphorylase GenBank Glycoside-phosphorylase Hydrates de carbone non phosphorylés ABX41399.1 3-O-α-glucopyranosyl-L-rhamnose phosphorylase (Cphy_1019) L-rhamnose ABX42289.1 D-galactosyl-1,4-L-rhamnose phosphorylase (Cphy_1920) L-rhamnose ACB74662.1 D-galactosyl-β-1,4-L-rhamnose phosphorylase (GalRhaP;Oter_1377) L-rhamnose ADI00307.1 1,2-alpha-glucosylglycérol phosphorylase(Bsel_2816) glycérol BAB97299.1 tréhalose phosphorylase (TreP) D-glucose BAC20640.1 tréhalose phosphorylase (TPase) D-glucose AAF22230.1 tréhalose phosphorylase D-glucose ABC84380.1 tréhalose phosphorylase D-glucose BAA31350.1 tréhalose phosphorylase D-glucose AAS19693.1 β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylase (Unk1) D-glucose ABY93073.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase (Teth514_1788) D-mannose ABY93074.1 β-1,2-mannobiose phosphorylase (Teth514_1789) D-mannose ADD61463.1 β-1,4-mannopyranosyl-[N-glycan] phosphorylase (Uhgb_MP) D-mannose ADU20661.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (MOP;RaMP2;Rumal_0099) D-mannose ADU21379.1 β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylase (RaMP1;RaMGP;Rumal_0852) D-glucose CAC96089.1 β-1,2-mannobiose phosphorylase (Lin0857) D-mannose CAH06518.1 β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylase (MGP;BF0772) D-glucose CAZ94304.1 β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase (zobellia_231) D-mannose WP_026485574.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (CalpoDRAFT_0075) D-mannose WP_026486530.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (CalpoDRAFT_1209) D-mannose VCV21229.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (RIL182_01100;ROSINTL182_05474) D-mannose VCV21228.1 Mannosyl-glucose phosphorylase (RIL182_01099;ROSINTL182_07685) D-glucose XP_003872966.1 CBZ24448.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP3 (LMXM_10_1250) D-mannose CBZ24449.1 XP_003872967.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP4 (LMXM_10_1260) D-mannose CBZ24451.1 XP_003872969.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP6 (LMXM_10_1280) D-mannose CBZ24452.1 XP_003872970.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP7 (LMXM_10_1290) D-mannose GigaDB accession number (GigaDB, DOI: 10.5524/100064) Glycoside-phosphorylase Hydrates de carbone non phosphorylés MH0373_GL0093988 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase D-mannose 340101.Vvad_PD3074 β-1,3-mannosyl-glucose phosphorylase/ β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase D-glucose 340101.Vvad_PD3074 β-1,3-mannosyl-glucose phosphorylase/ β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase D-mannose MH0431_GL0150624 β-1,4-mannosyl-glucuronate phosphorylase (“β-1,4-mannosyl-glucuronic acid phosphorylase”) Acide D-glucuronique Dans la présente invention, lors de l’étape de culture, le procédé peut comprendre en outre au moins une étape d’ajout d’au moins un hydrate de carbone non phosphorylé dans le milieu de culture. Il peut s’agir d’au moins un hydrate de carbone non phosphorylé tel que mentionné ci-dessus. Dans la présente invention, l’étape de culture peut être réalisée à une température de 25 à 45°C, par exemple de 35 à 38°C, par exemple égale à 37°C. Dans la présente invention la récupération d’oligosaccharides produit peut être réalisée dans le milieu de culture ou dans la souche, de préférence dans le milieu de culture. Dans la présente invention, l’étape de récupération d’oligosaccharides peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l’homme du métier. Il peut s’agir, par exemple d’une étape comprenant ou non une ou des étapes de purification. Il peut s’agir par exemple d’un procédé décrit dans le document Israel Pedruzzi, Eduardo Borges da Silva, Alírio E Rodrigues “Selection of resins, equilibrium and sorption kinetics of lactobionic acid, fructose, lactose and sorbitol” Separation and Purification Technology 2008 Volume 63, Issue 3, 3 November 2008, Pages 600-611 [44], Clarisse Nobre, José A. Teixeira & Lígia R. Rodrigues (2015) “New Trends and Technological Challenges in the Industrial Production and Purification of Fructo-oligosaccharides”, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 55:10, 1444-1455, 11 octobre 2013 [45] et/ou sur la page internet https://www.novasep.com/technologies/industrial-technologies-for-evaporation-concentration-and-crystallization.html [46]. Il peut s’agir par exemple d’une étape comprenant une étape de microfiltration, une étape d'ultrafiltration, une étape de nanofiltration, une étape d'osmose inverse, une étape de lyophilisation, une étape d'évaporation, par exemple sur évaporateur rotatif, une étape d'atomisation, une étape d'extraction par phase liquide, une étape de cristallisation du produit, une étape de chromatographie, une étape de dialyse et/ou d'électrodialyse . Il peut s’agir par exemple d’une étape comprenant une filtration du milieu à travers un filtre, par exemple avec des pores de 0,3 nm à 10 µm de diamètre par exemple avec des pores de 0,1 à 10 µm de diamètre pour une microfiltration, de 1 à 100 nm de diamètre pour une ultrafiltration, ou 0,3 à 1 nm de diamètre pour une nanofiltration. Il peut s’agir par exemple d’un procédé comprenant une chromatographie, par exemple en phase gazeuse, en phase liquide ou ionique, d’une électrophorèse, par exemple d’une électrophorèse capillaire, d’une filtration, par exemple d’une nanofiltration, d’une extraction en phase solide, d’une micro-extraction en phase solide, d’une extraction par solvant. Il peut s’agir par exemple d’une chromatographie en phase liquide, une chromatographie liquide à haute performance, une chromatographie liquide-solide, une chromatographie liquide-liquide, une chromatographie de partage à polarité de phases inversée, une chromatographie d'échange d’ions, une chromatographie ionique, une chromatographie d’interactions ioniques, une chromatographie d’interactions hydrophobes, une chromatographie d’exclusion stérique, par exemple avec une résine de type Sephadex G15 ou Biogel P2 , une chromatographie de perméation sur gel, une chromatographie de filtration sur gel, une chromatographie d’échange de ligands, un fractionnement flux forcé, une chromatographie planaire, une chromatographie de partage centrifuge, une chromatographie à contre-courant, une chromatographie liquide-liquide centrifuge, une chromatographie phase stationnaire chirale. L’homme du métier, de part ces connaissances générales saura adapter et/ou choisir le procédé de récupération en fonction du milieu et/ou de l’oligosaccharide produit. Avantageusement, le procédé selon l’invention peut permettre la production d’oligosaccharides, par exemple des oligosaccharides mentionnés dans le tableau 6 ci-dessous. Par exemple la présente invention peut permettre la production d’oligosaccharides en fonction de la glycoside-phosphorylase utilisée tel que mentionnés dans le tableau 6 ci-dessous. [Tableau 6] : oligosaccharides produit en fonction de la glycoside-phosphorylase GenBank Glycoside-phosphorylase Produit ABX41399.1 3-O-α-glucopyranosyl-L-rhamnose phosphorylase (Cphy_1019) 3-O-α-glucopyranosyl-L-rhamnose ABX42289.1 D-galactosyl-1,4-L-rhamnose phosphorylase (Cphy_1920) D-galactosyl-1,4-L-rhamnose ACB74662.1 D-galactosyl-β-1,4-L-rhamnose phosphorylase (GalRhaP;Oter_1377) D-galactosyl-β-1,4-L-rhamnose ADI00307.1 1,2-alpha-glucosylglycérol phosphorylase(Bsel_2816) 1,2-alpha-glucosylglycérol BAB97299.1 tréhalose phosphorylase (TreP) tréhalose BAC20640.1 tréhalose phosphorylase (TPase) tréhalose AAF22230.1 tréhalose phosphorylase tréhalose ABC84380.1 tréhalose phosphorylase tréhalose BAA31350.1 tréhalose phosphorylase tréhalose AAS19693.1 β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylase (Unk1) β-1,4-mannosyl-glucose ABY93073.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase (Teth514_1788) β-1,2-oligomannane ABY93074.1 β-1,2-mannobiose phosphorylase (Teth514_1789) β-1,2-mannobiose ADD61463.1 β-1,4-mannopyranosyl-[N-glycan] phosphorylase (Uhgb_MP) β-1,4-mannooligosaccharide ADU20661.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (MOP;RaMP2;Rumal_0099) β-1,4-mannooligosaccharide ADU21379.1 β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylase (RaMP1;RaMGP;Rumal_0852) β-1,4-mannosyl-glucose CAC96089.1 β-1,2-mannobiose phosphorylase (Lin0857) β-1,2-mannobiose CAH06518.1 β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylase (MGP;BF0772) β-1,4-mannosyl-glucose CAZ94304.1 β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase (zobellia_231) β-1,3-mannooligosaccharide WP_026485574.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (CalpoDRAFT_0075) β-1,4-mannooligosaccharide WP_026486530.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (CalpoDRAFT_1209) β-1,4-mannooligosaccharide VCV21229.1 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase (RIL182_01100;ROSINTL182_05474) β-1,4-mannooligosaccharide VCV21228.1 Mannosyl-glucose phosphorylase (RIL182_01099;ROSINTL182_07685) β-1,4-mannosyl-glucose XP_003872966.1 CBZ24448.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP3 (LMXM_10_1250) β-1,2-oligomannane CBZ24449.1 XP_003872967.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP4 (LMXM_10_1260) β-1,2-oligomannane CBZ24451.1 XP_003872969.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP6 (LMXM_10_1280) β-1,2-oligomannane CBZ24452.1 XP_003872970.1 β-1,2-oligomannane phosphorylase MTP7 (LMXM_10_1290) β-1,2-oligomannane GigaB (GigaDB, DOI: 10.5524/100064) Glycoside-phosphorylase Produit MH0373_GL0093988 β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase β-1,4-mannooligosaccharide 340101.Vvad_PD3074 β-1,3-mannosyl-glucose phosphorylase/ β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase β-1,3-mannosyl-glucose 340101.Vvad_PD3074 β-1,3-mannosyl-glucose phosphorylase/ β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase β-1,3-mannooligosaccharide MH0431_GL0150624 β-1,4-mannosyl-glucuronate phosphorylase (“β-1,4-mannosyl-glucuronic acid phosphorylase”) β-1,4-mannosyl-glucuronate D’autres avantages pourront encore apparaître à l’homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures est une photographie qui présente les produits PCR des fragments d’ADN amplifiés depuis le génome des souches MDO, MGX et PFKA, et ayant migré sur un gel d’agarose. Gel d’agarose des produits PCR des souches MDO, MGX et PFKA. Pistes 1 et 5, marqueur de taille ; pistes 2, 3 et 4, produits PCR du fragment du gène ptsG ; pistes 6, 7 et 8, produits PCR du fragment de l’opéron manXYG. est une photographie qui présente les produits PCR des fragments d’ADN amplifiés depuis le génome des souches MDO, MGX et PFKA, et ayant migré sur un gel d’agarose. Gel d’agarose des produits PCR des souches MDO, MGX et PFKA. Piste 1, marqueur de taille ; pistes 2, 3 et 4, produits PCR du fragment du gène pfkA. est un diagramme représentant les courbes de croissance des souches E. coli MDO (losanges), MGX (carrés gris claires) et MGX1 (carrés gris foncés) dans un milieu minimum M9 supplémenté avec 3 g/L de glucose, l’ordonné correspond à la Densité Optique mesuré à 600 nm (OD600) et l’abscisse au temps en heures (H). est un histogramme représentant une comparaison de concentrations en métabolites entre la souche E. coli MDO et la souche MGX1 (bâtons noirs) et entre la souche E. coli MDO et la souche PFKA1 (bâtons hachurés). Sur la figure F6P signifie Fructose-6-phosphate, FBP signifie Fructose-1,6-Bisphosphate, G1P/M1P : Glucose-1-Phosphate/Mannose-1-Phosphate, G6P : Glucose-6-Phosphate, Galactose-1P : Galactose-1-Phosphate, GluN-6P :Glucosamine-6-Phosphate , Man-6P : Mannose-6-Phosphate, N-AcGlucoseN-1P : N-acétyl glucose-1-Phosphate, N-AcGlucoseN-6P : N-acétyl glucose-6-Phosphate, Rib-5P/Ribulose-5P : Ribose-5-Phosphate/ Ribulose-5-Phosphate, Sed7P sedoheptulose-7-phosphate. L’ordonné correspond à la valeur des rapports des concentrations de métabolites exprimés en log2. représente des photographies gel d'électrophorèse SDS-PAGE (figure 5 A) et un diagramme correspondant à l’évolution de la Densité Optique dans le milieu de culture en fonction du temps (figure 5 B). La figure 5 A correspond à la photographie de 7 gels d'électrophorèse SDS-PAGE effectués respectivement à 22h, 28h, 46h, 55h, 79h, 101h et 126h de culture de la souche PFKA1 non transformée (contrôle), avec le vecteur pBAD-Teth1788 ou pTRC-Teth-1788. La figure 5 B est un diagramme de l’évolution de la Densité Optique à 600nm du milieu de culture (ordonnée) de la souche PFKA1 non transformée (contrôle - croix), avec le vecteur pBAD-Teth1788 (carrés) ou pTRC-Teth1788 (triangle) en fonction du temps (abscisse). correspond à un schéma du métabolisme de la souche PFKA1 transformée avec le vecteur pBAD-Teth1788 ou avec le vecteur pBAD- Uhgb_MP, ou avec le vecteur pBAD-β-1,3-mannoside-phosphorylase. Sur cette figure les abréviations signifient : galP : galactose perméase, PTS : Phosphotransférases, Glk : Glucokinase, manA : mannose-6-phosphate isomérase, pgi : glucose-6-phosphate isomérase, zwf : Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Man-1P : Mannose-1-Phosphate, Man-6P : Mannose-6-Phosphate, Glu-6-P : Glucose-6-Phosphate, Fru-6-P : Fructose-6-Phosphate, FBP : Fructose-1,6-Bisphosphate. correspond au spectre RMN d’échantillons de milieu de culture de souche PFKA1 transformée avec le vecteur pBAD -Teth1788 (courbe supérieure) ou d’échantillons de milieu de culture de souche PFKA1 non transformée (contrôle). correspond au chromatogramme d’une Chromatographie Haute-Performance Echangeuse d’Anion avec Détection par Ampérométrie Pulsée (HPAEC-PAD) d’échantillons de milieu de culture de la souche PFKA1 transformée avec le vecteur pBAD-HisA-Teth1788 (courbe en trait continu gras) ou d’échantillons de milieu de culture de souche PFKA1 non transformée (courbe en pointillés) ou de β-1,2-mannobiose (β-1,2-Man2) purifié (courbe en pointillés discontinus). correspond à un diagramme de l’évolution de la concentration en milliMolaire (mM) en mannose (triangles), β1,2-mannobiose (ronds) et densité optique à 600nm (carrés) en fonction du temps en minutes dans le milieu de culture de la souche PFKA1 transformée avec pBAD-Teth-1788. correspond à des chromatogrammes d’analyses par HPAEC-PAD de la purification du β-1,2-mannobiose (β-1,2-man2) à partir d’un surnageant de culture PFKA1-pBAD-Teth-1788. La figure 10 A correspond au chromatogramme obtenu par HPAEC-PAD avec le surnageant de culture PFKA1-pBAD-Teth-1788 avant purification. B : Chromatogramme du β-1,2-mannobiose après purification. Sur les chromatogrammes, l’ordonnée représente la conductivité en nanoCoulomb (nC) et l’abscisse le temps en minutes (min). est un diagramme de l’évolution de la densité optique à 600nm du milieu de culture (ordonnée) de la souche PKA1 non transformée (contrôle - croix), avec le vecteur pBAD-UhgbMP (carrés) ou pTRC-UhgbMP (triangle) en fonction du temps (abscisse). est un spectre RMN d’échantillons de milieu de culture de souche PFKA1 transformée avec le vecteur pBAD-UhgbMP (courbe intermédiaire) ou d’échantillons de milieu de culture de souche PFKA1 non transformée (contrôle) (courbe inférieure) et d’une solution du standard commercial β-1,4-mannobiose (Carbosynth, Royaume-Uni) (courbe supérieure). correspond à l’analyse HPAEC-PAD d’échantillons, la courbe en trait continu fin correspond au chromatogramme du surnageant de culture souche PFKA1 transformée avec pBAD-UhgbMP, la courbe en trait continu gras correspond au chromatogramme du surnageant de culture de la souche PFKA1 non transformée, la courbe en trait pointillé correspond au standard commercial de β-1,4-mannobiose. représente la séquence plasmidique du vecteur pWKS-galP. représente la séquence plasmidique du vecteur pBAD- Teth1788. représente la séquence plasmidique du vecteur pBAD- Uhgb_MP. représente une courbe étalon de la concentration de β-1,2-mannobiose en milligramme par litre (mg.L-1) (abscisse) en fonction de l’aire sous la courbe en nanoCoulomb (nC) par minute (nC.min), quantifiée par HPAEC-PAD. représente correspond au spectre RMN d’échantillons de β-1,3-mannobiose commercial, du surnageant de culture souche PFKA1 transformée avec le plasmide pBAD-β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase après 3 (t=3h) ou 108 (t=108h) heures de culture. représente les chromatogrammes de différents échantillons analysés par HPAEC-PAD, sur cette figure la courbe en trait continu gras correspond au chromatogramme du surnageant de culture de la souche PFKA1 transformée avec le plasmide pBAD-β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase après 108 heures de culture, la courbe en pointillé correspond au chromatogramme d’une solution commerciale de β-1,3-mannobiose. représente la séquence plasmidique du vecteur pBAD-β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase. Exemples Exemple 1 : fabrication et caractérisation de la souche déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5499 Dans l’exemple ci-dessous, la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sous le numéro CNCM I-5499 est également désignée souche PFKA. Préparation et production de la souche PFKA (CNCM n° I -5499 )/Validation phénotypique La souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sous le n° CNCM I-5499 a été obtenue par modification génétique de la souche Escherichia coli MDO. La souche E. coli MDO, a été obtenue et caractérisée dans le laboratoire Chimie et Biotechnologie des Oligosaccharides (CBO) (CERMAV-CNRS CS40700, 38041 Grenoble cedex 9, France) à partir de la souche Escherichia coli ZLKA tel que décrit dans Fierfort et Samain « Genetic engineering of Escherichia coli for the economical production of sialylated oligosaccharides » J Biotechnol. 2008 Apr 30;134(3-4):261-5. [3]. La souche E. coli ZLKA dérive de la souche E. coli K-12 DH1 ( endA1 recA1 gyrA96 thi-1 glnV44 relA1 hsdR17 ) dont les gènes lacZ, nanKETA et lacA ont été inactivés tel que décrit dans Fierfort et Samain « Genetic engineering of Escherichia coli for the economical production of sialylated oligosaccharides » J Biotechnol. 2008 Apr 30;134(3-4):261-5 [3]. La souche E. coli MDO se caractérise par l’inactivation des gènes melA, wcaJ et mdoH ainsi que par l’insertion du promoteur Plac en amont du gène gmd codant pour une GDP-mannose 4,6-dehydratase. En conséquence, le gène manB de la phosphomannomutase, qui est situé en aval du gène gmd , est inductible par l’isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG). Le génotype complet de la souche MDO est le suivant : endA1 recA1 gyrA96 thi-1 glnV44 relA1 hsdR17 lacZ-wcaF, Plac nanKETA lacA melA wcaJ mdoH . Dans le présent exemple, la kanamycine et l’ampicilline ont été utilisées à une concentration finale de 50 µg/mL pour assurer le maintien des plasmides pWKS-GalP et pBAD-Teth-1788 ou pBAD-Uhgb_MP respectivement dans les cellules. La concentration finale d’IPTG utilisée pour l’induction de galP et manB était de 60 µM. La concentration finale de l -arabinose pour l’induction du gène codant pour la glycoside-phosphorylase (Teth-1788, UhgbMP ou β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase) était de 10 mM. L’IPTG a été ajouté dans le milieu de culture au moment de l’inoculation et le l -arabinose est ajouté à la culture en début de phase de croissance exponentielle (DO 600 ≈ 0,4). 1.1. Insertion du promoteur Plac en aval du gène gmd Un fragment d’ADN de 302 paires de base (pb) incluant la séquence du promoteur d’expression Plac a été intégré dans le chromosome entre le codon stop du gène wcaF et le codon start du gène gmd . Deux séquences d’ADN, un segment de 0,88 kb se terminant 5 pb en aval du codon stop du gène wcaF et un segment de 0,96 kb démarrant 13 pb en amont du codon start du gène gmd ont été amplifiés par PCR à partir de la séquence d’ADN génomique d’ E. Coli K-12, utilisée comme matrice. Le cycle de PCR était 1 cycle de 30 secondes (s) à 98°C, 35 cycles de 15 s à 98°C, 15 s à 69°C et 30 s à 72°C, 1 cycle de 5 minutes à 72°C. La Polymérase utilisée était la Phusion, (NEB). Les amorces PL1 (5’ CTCGAGAGGCGATATTTTTCCCTGTATCC SEQ ID NO 1) et PL2 (5’GGTTTGCGTATTATTCAGTTTCAACGCGTTCG SEQ ID NO 2) ont été utilisées pour amplifier le fragment en amont et les amorces PL5 (5’CTGGAGCTCAGAGGAATAATACATGTCAAAAGTCG SEQ ID NO 3) et PL6 (5’ CTCGAGACAACAGCGATAATCACATCACC SEQ ID NO 4) ont été utilisées pour amplifier le fragment aval. Un segment d’ADN de 0,3 kb incluant la séquence du promoteur Plac a été amplifié par PCR en utilisant le plasmide pBluescript II KS (Addegen) comme matrice et les amorces suivantes: PL3 (5’ GTTGAAACTGAATAATACGCAAACCGCCTCTC SEQ ID NO 5) et PL4 (5’ ATGTATTATTCCTCTGAGCTCCAGCTTTTGTTCC SEQ ID NO 6). Les amorces PL2 et PL3 ont des séquences adjacentes en 5’ qui les rendent complémentaires l’une de l’autre. Les amorces PL4 et PL5 ont été conçues de manière similaire. Les trois fragments d’ADN amplifiés ont été épissés par chevauchement en utilisant les amorces PL1 et PL6. Le fragment d’ADN de 2,1 kb ainsi obtenu a été digéré avec l’enzyme de restriction XhoI puis cloné dans le site de restriction SalI du vecteur suicide pKO3. L’insertion chromosomique du promoteur Plac a ensuite été réalisée selon le protocole décrit dans Link, A.J., Phillips, D., Church, G.M., 1997. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli : application to open reading frame characterization. J. Bacteriol. 179, 6228–6237. [7]. Le plasmide pKO3 a été fourni par le laboratoire Church (Harvard University, USA). Les clones positifs ont été criblés par PCR (Le cycle de PCR était 1 cycle de 3 minutes à 95°C, 35 cycles de 30 s à 95°C, 30 s à 53°C et 1 minute à 68°C, 1 cycle de 5 minutes à 68°C. La polymérase utilisée était la DNA Taq polymerase (NEB) pour la présence d’un fragment amplifié d’ADN de 1,396 kb en utilisant les amorces PL3 et PL7 (5’TCGAGGTCATTAGCCACCA SEQ ID NO 7). 1.2. Génération des mutants de délétion Les gènes sélectionnés ptsG , manXYZ et pfkA ont été inactivés à l'aide du protocole pKO3 tel que décrit dans Link, A.J., Phillips, D., Church, G.M., 1997. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli : application to open reading frame characterization. J. Bacteriol. 179, 6228–6237, 1997 [7]. Pour obtenir le mutant de délétion du gène ptsG , un segment d’ADN de 351 pb situé entre les nucléotides 568 et 919 de ptsG a été supprimé et remplacé par la séquence 5’AGC comme suit: deux segments d’ADN flanquant la séquence à supprimer ont été amplifiés par PCR. Le cycle de PCR était 1 cycle de 30 s à 98°C, 35 cycles de 15 s à 98°C, 15 s à 70°C et 30 s à 72°C, 1 cycle de 5 minutes à 72°C. La polymérase utilisée était la Phusion (NEB) utilisant l’ADN génomique de la souche E. coli K-12 comme matrice. Le fragment de 900 pb en amont a été amplifié avec les amorces (5’CTAGGATCCGCCGAAAATTGGGCGGTGAATAAC SEQ ID NO 8) et (5’GTAAAGCTTCTGGTAAGCAGCCCAGAGAAG SEQ ID NO 9) et le fragment en aval de 958 pb a été amplifié avec les amorces (5’CTCAAGCTTGCGCCGATCCTGTACATCATCC SEQ ID NO 10) et (5’CGTGTCGACCGTTAATCCTAATCTGCCACGCACC SEQ ID NO 11). Les deux fragments amplifiés ont été ligués au niveau de leur site de restriction HindIII terminal et clonés ensemble au niveau des sites de restrictions BamHI et SalI du vecteur suicide pKO3. La délétion a ensuite été réalisée selon le protocole décrit dans Link, A.J., Phillips, D., Church, G.M., 1997. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli : application to open reading frame characterization. J. Bacteriol. 179, 6228–6237 [7]. Dans le fond génétique /souche décrite ci-dessus, un fragment de 1,219 kb situé entre les nucléotides 332 de manX et 522 de manY a été supprimé pour obtenir le mutant de délétion des gènes manXYZ , comme suit : deux fragments d'ADN flanquant la séquence à supprimer ont été amplifiés par PCR en utilisant l'ADN génomique de la souche E. coli K-12 comme matrice. Le segment en amont de 915 pb a été amplifié avec les amorces (5’ACTCGAGAATGGCGATGAAGAGAG SEQ ID NO 12) et (5’CCAGTGCCACCAGTTCATC SEQ ID NO 13), et le fragment en aval de 902 pb a été amplifié avec les amorces (5’CAAGCTTCGATTCCGGAAGTGGTGAC SEQ ID NO 14) et (5’AGGATCCATGCCCCCATGACAAACAG SEQ ID NO 15). Les deux fragments amplifiés ont été ligués au niveau de leur site de restriction HindIII terminal et clonés ensemble au niveau des sites de restrictions BamHI et SalI du vecteur suicide pKO3. La délétion a ensuite été réalisée selon le protocole décrit dans Link, A.J., Phillips, D., Church, G.M., 1997. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli : application to open reading frame characterization. J. Bacteriol. 179, 6228–6237 [7]. La souche ainsi obtenue a été nommée « MGX ». Pour obtenir le mutant de délétion du gène pfkA dans le fond génétique de la souche MGX, un fragment d’ADN de 396 pb situé entre les nucléotides 146 et 542 du gène pfkA a été supprimé et remplacé par la séquence (5’AAGCTT) comme suit : deux fragments d’ADN flanquant la séquence à supprimer ont été amplifiés par PCR en utilisant l’ADN génomique d’ E. coli K-12 comme matrice. Le fragment en amont de 890 pb a été amplifié avec les amorces (5’GGATCCAGGCGTCGGGGATATCGTG SEQ ID NO 16) et (5’AAGCTTCGGTCTTCATACAGACCCAGATAGC SEQ ID NO 17) et le fragment en aval de 931 pb a été amplifié avec les amorces (5’AAGCTTGGCCATTGCCGGGGGCTGTG SEQ ID NO 18) et (5’CTCGAGCCACCGTGTGACTGACGAATC SEQ ID NO 19). Les deux fragments amplifiés ont été ligués au niveau de leur site de restriction HindIII terminal et clonés au niveau des sites de restrictions BamHI et SalI du vecteur suicide pKO3. La délétion a ensuite été réalisée selon le protocole décrit dans Link, A.J., Phillips, D., Church, G.M., 1997. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. J. Bacteriol. 179, 6228–6237 [7]. La souche ainsi obtenue est nommée « PFKA ». 1.3. Clonage du gène galP sur un plasmide (amorces et séquence plasmidique) Un fragment d’ADN de 1,471 kb contenant la séquence du gène galP a été amplifié par PCR. Le cycle de PCR était 1 cycle de 30 s à 98°C, 35 cycles de 15 s à 98°C, 15 s à 68°C et 30 s à 72°C, 1 cycle de 5 minutes à 72°C. La polymérase utilisée était la Phusion (NEB) en utilisant l’ADN génomique d’ E. coli K-12 comme matrice avec les amorces suivantes : (5’TTGTCGACTTAAGGAGGGCATCATGCCTGAC SEQ ID NO 20) et (5’GTTCTAGATGACTGCAAGAGGTGGCTTCC SEQ ID NO 21). Le fragment amplifié a ensuite été cloné au niveau des sites de restriction SalI et Xbal du vecteur d’expression pWKS130 tel que décrit dans Rong Fu Wang, Kushner, S.R., 1991. Construction of versatile low-copy-number vectors for cloning, sequencing and gene expression in Escherichia coli. Gene 100, 195–199 [10] pour former le plasmide pWKS-GalP. La séquence plasmidique résultante est représentée sur la figure 14 et correspond à la séquence d’acides nucléique SEQ ID NO 22. Ce plasmide a été transformé dans les souches MGX et PFKA pour donner les souches « MGX1 » et « PFKA1 » respectivement. Le tableau 7 ci-dessous regroupe les différentes souches et leur génotype. [Tableau 7] : Génotype des mutants générés Souche châssis Génotype MDO endA1 recA1 gyrA96 thi-1 glnV44 relA1 hsdR17 lacZ- wcaF::Plac nanKETA lacA melA wcaJ mdoH MGX1 MDO + ptsG manXYZ pKWS-galP PFKA1 MDO+ ptsG manXYZ pfkA pKWS-galP 1.4. Validation génétique du mutant de délétion des gènes codants pour les transporteurs PTS et le gène pfkA Une vérification de l’effectivité des délétions des gènes ciblés a été effectuée via des contrôles par PCR sur les souches MDO, MGX et PFKA. Mutants de délétion des gènes des systèmes de transport PTS Les mutants dans le système de transport PTS ont été construits par délétion d’un fragment de 350 pb du gène ptsG et d’un fragment de 1200 pb de l’opéron manXYZ comme décrit ci-dessus. Les PCRs ont été réalisées en utilisant de l’ADN génomique de chaque souche comme matrice en utilisant les amorces suivantes pour la vérification de la délétion du fragment du gène ptsG, ptsG_FW: (5’CTTCTCTCAGTGGGCTGCTTACCAG 3’ SEQ ID NO 23), ptsG_RV: (5’CCGTTAATCCTAATCTGCCACGCACC 3’ SEQ ID NO 24). Le cycle de PCR était 1 cycle de 3 minutes à 95°C, 35 cycles de 30 s à 95°C, 30 s à 55°C et 1 minute à 68°C, 1 cycle de 5 minutes à 68°C. la polymérase utilisée était la DNA Taq polymerase (NEB). La taille attendue des fragments amplifiés est de 1300 pb pour la souche sauvage (WT) et de 950 pb pour les souches MGX et PFKA si les constructions génétiques sont correctes et comprennent la délétion. Les amorces suivantes ont été utilisées pour la vérification de la délétion du fragment de l’opéron manXYZ : manXYZ_FW (5’TGTTAGGCGAGCAGGAAAACGTCG 3’ SEQ ID NO 25) manXYZ_RV (5’ACCAATCACACCCAGAGCAACCAG 3’ SEQ ID NO 26). Dans ce cas, la taille des fragments amplifiés attendus est de 1600 pb pour la souche sauvage (WT) et de 450 pb pour les souches MGX et PFKA si les constructions génétiques sont correctes et comprennent la délétion. Le contrôle de la PCR est réalisé par migration du fragment amplifié dans un gel d'agarose 1% dans une cuve d'électrophorèse MUPID-ONE (Eurogentec, Liege, Belgium). 5 µL de produit PCR sont homogénéisés avec 1 µL de tampon de charge 6x” (NEB, Ipswich, MA) puis déposés sur gel pour une migration dans un tampon TAE 1X (Sigma, Seelze, Germany). 5 µL de marqueur de taille1 kB (NEB) sont également déposés dans un autre puit. La migration est faite à 100 V pendant 30 minutes. Le gel est ensuite incubé 10 minutes dans une solution contenant 0,01% d'éthidium bromide (Euromedex, Souffelweyersheim, France). La détection des fragments amplifiés se fait via Gel DOC EZ (Biorad, Berkeley, CA) suivant les instructions du constructeur. La figure 1 est une photographie qui présente les produits PCR des fragments d’ADN amplifiés depuis le génome des souches MDO, MGX et PFKA, et ayant migré sur un gel d’agarose. Tel que représenté et démontré sur la figure 1, la taille des fragments amplifiés par PCR correspond à celle attendue. En effet, les fragments amplifiés depuis la souche MDO (sans délétion) ont une taille de 1300 pb et de 1600 pb pour les fragments du gène ptsG et de l’opéron manXYZ respectivement, au contraire de celles des fragments amplifiés depuis les souches MGX et PFKA, qui correspondent à celles attendues, à savoir respectivement environ 950 pb et 450 pb avec les délétions réalisées. Mutants de délétion du gène pfkA Le mutant de délétion du gène pfkA a été construit par délétion d’un fragment de 400 pb du gène pfkA comme décrit ci-dessus. Les PCRs ont été réalisées en utilisant de l’ADN génomique de chaque souche comme matrice en utilisant les amorces suivantes pour la vérification de la délétion du fragment du gène pfkA, pfkA_FW: (5’ CATTTTGCATTCCAAAGTTCAGAGG3’ SEQ ID NO 27), pfkA_RV: (5’ TCATCGGTTTCAGGGTAAAGGAATCT 3’ SEQ ID NO 28). Le cycle de PCR était1 cycle de 3 minutes à 95°C, 35 cycles de 30 s à 95°C, 30 s à 55°C et 1 s à 68°C, 1 cycle de 5 minutes à 68°C. La polymérase utilisée était la DNA Taq polymérase (NEB). La taille attendue du fragment amplifié est de 1000 pb pour la souche MDO et MGX et de 600 pb pour la souche PFKA si les constructions génétiques sont correctes et comprennent la délétion. Le contrôle de la PCR est réalisé par migration du fragment d’ADN amplifié dans un gel d'agarose 1% dans une cuve d'électrophorèse MUPID-ONE (Eurogentec, Liege, Belgium). 5 µL de produit PCR sont homogénéisés avec 1 µL de tampon de charge 6x” (NEB, Ipswich, MA) puis déposés sur gel pour une migration dans un tampon TAE 1X (Sigma, Seelze, Germany). 5 µL de marqueur de taille1 kB (NEB) sont également déposés dans un autre puit. La migration est faite à 100 V pendant 30 minutes. Le gel est ensuite incubé 10 minutes dans une solution contenant 0,01% d'éthidium bromide (Euromedex, Souffelweyersheim, France). La détection des fragments d’ADN amplifiés se fait via Gel DOC EZ (Biorad, Berkeley, CA) suivant les instructions du constructeur. La figure 2 est une photographie qui présente les produits PCR des fragments d’ADN amplifiés depuis le génome des souches MDO, MGX et PFKA, et ayant migrés sur un gel d’agarose. Tel que représenté et démontré sur la figure 2, la taille du fragment amplifié depuis le génome de la souche PFKA était effectivement inférieure à celle observée pour les souches MDO et MGX, et correspond à la taille attendue à savoir environ 600 pdb, démontrant que la délétion est présente et correcte. 1.5. Validation phénotypique du mutant de délétion des gènes codants pour les transporteurs PTS et sur-exprimant le gène galP Il est connu que la délétion des gènes ptsG and manXYZ diminue la capacité de transport du glucose dans la cellule d’ E. Coli . (Quanfeng Liang,1 Fengyu Zhang,1 Yikui Li,1 Xu Zhang,1 Jiaojiao Li,1 Peng Yang,1 and Qingsheng Qia,1 Comparison of individual component deletions in a glucose-specific phosphotransferase system revealed their different applications Sci Rep. 2015; 5: 13200. Published online 2015 Aug 19. [28], Sonja Steinsiek and Katja Bettenbrock Glucose Transport in Escherichia coli Mutant Strains with Defects in Sugar Transport Systems, J Bacteriol. 2012 Nov; 194(21): 5897–5908. [29]). Pour vérifier que les mutants de délétion des gènes codants pour des protéines des systèmes de transport dit « PTS » (PhosphoTransférase System) - souche nommée MGX – a le phénotype attendu, les souches MDO et MGX ont été cultivées dans un milieu minimum M9 (M9 milieu minimum - M9 sels: Na 2 HPO 4 12H 2 O 17.4 g/L, KH 2 PO 4 3.02 g/L, NaCl 0,51 g/L, NH 4 Cl 2,04 g/L. Trace métaux et sels: Na 2 EDTA 2 H 2 O 15 mg/L, ZnSO 4 7 H 2 O 4,5 mg/L, CoCl 2 6H 2 O 0,3 mg/L, MnCl 2 4H 2 O 1 mg/L, H 3 BO 3 1 mg/L, Na 2 MoO 4 2 H 2 O 0,4 mg/L, FeSO 4 7 H 2 O 3 mg/L, CuSO 4 5 H 2 O 0,3 mg/L. MgSO 4 0,5 g/L CaCl 2 4,38 mg/L, Thiamine hypochloride 0,1 g/L) en utilisant le glucose comme seule source de carbone. De plus, pour vérifier que la sur-expression du gène galP permet de restaurer tout ou partie de la capacité de transport du glucose et donc le taux de croissance, le plasmide pWKS-GalP a été transformé dans la souche MGX. La souche résultante sélectionnée sur milieu LB+Kanamycine a été nommée MGX1 (voir ci-dessus). Cette souche MGX1 a également été cultivée dans le milieu M9 avec du glucose. Cent microlitres d’une culture sur la nuit (10 à 12 heures de culture en milieu LB (Tryptone 10g/L, Extrait de levure 5g/L, NaCl, 10g/L) des souches E. coli MDO, MGX et MGX1 ont été transférés dans des erlenmeyers bafflés de 250 mL contenant 50 mL de milieu M9 minimum supplémenté avec du D-glucose (3 g/L) comme seule source de carbone. Les erlenmeyers ainsi inoculés ont été incubés pendant 16 h à 37°C avec une agitation orbitale de 220 tours par minutes. Les cellules ont ensuite été collectées par centrifugation (Sigma, Seelze, Germany) pendant 10 min à 2 000g à température ambiante, à savoir 25 °C, lavées avec du milieu M9 stérile et utilisées pour inoculer des erlenmeyers bafflés de 250 ml contenant 50 mL de milieu M9 supplémenté avec du D-glucose (3 g/L) à DO 600nm ~0,1. Pour déclencher l’expression du gène galP porté par le plasmide pWKS-GalP, de l’IPTG a été ajouté dans le milieu de culture de la souche MGX1 à une concentration finale de 60µM. Les cultures des souches ont été réalisées à 37°C avec une agitation orbitale de 220 tours par minutes (220 tours par minutes). La croissance a été suivie par mesure de la turbidimétrie à une densité optique de 600 nm en utilisant un spectrophotomètre Genesys 6 (Thermo, USA). Les résultats sont présentés Figure 3. Tel que représenté sur la figure 3, au contraire de la croissance de la souche MDO, celle de la souche MGX se caractérise par une longue phase de latence (de 10h au minium) ce qui est une trait phénotypique reporté dans la littérature, de ce type de souche (Liang, Q., Zhang, F., Li, Y., Zhang, X., Li, J., Yang, P., Qi, Q., 2015. Comparison of individual component deletions in a glucose-specific phosphotransferase system revealed their different applications. Sci. Rep. 5, 13200. [6]). Le taux de croissance (µ) maximal de cette souche est de 0,25 h -1 (calculé entre t=23h et t=34h), soit approximativement la moitié du taux de croissance de la souche MDO. L’induction de l’expression du gène galP , restaure en partie, le taux de croissance. En effet, le profil de croissance de la souche MGX1 est très similaire à celui de la souche MDO, avec une absence de phase de latence et un taux de croissance (µ=0,32h -1 ) atteignant 70% de celui de la souche MDO (µ=0,45 h -1 ). Les résultats démontrent donc clairement que la souche MGX1 possède des capacités de transport supérieures par rapport à la souche MGX. 1.6. Validation phénotypique du mutant de délétion PTS-PFKA a. Capacité de croissance La capacité de croissance des souches MDO, MGX, MGX1, PFKA1 a été déterminée par culture indépendante desdites souches, cultivées dans le milieu M9 supplémenté avec du glucose. Cent microlitres d’une culture sur la nuit (10 à 16 heures de culture en milieu LB (Tryptone 10g/L, Extrait de levure 5g/L, NaCl, 10g/L) des souches E. coli MDO, MGX et MGX1, PFKA1 ont été transférés dans des erlenmeyers bafflés de 250 mL contenant 50 mL de milieu M9 supplémenté avec du D-glucose (3 g/L) comme seule source de carbone. Les erlenmeyers ainsi inoculés ont été incubés pendant 16 h à 37°C avec une agitation orbitale de 220 tours par minutes (220 rpm). Les cellules ont ensuite été collectées par centrifugation (Sigma, Seelze, Germany) pendant 10 min à 2 000g à température ambiante, à savoir 25 °C lavées avec du milieu M9 stérile et utilisées pour inoculer des erlenmeyers bafflés de 250 ml contenant 50 mL de milieu M9 supplémenté avec du D-glucose (3 g/L) à DO600nm ~0,1. Pour déclencher l’expression du gène galP porté par le plasmide pWKS-GalP, de l’IPTG a été ajouté dans le milieu de culture de la souche MGX1 et PFKA1 à une concentration finale de 60µM. Les cultures des souches ont été réalisées à 37°C avec une agitation orbitale de 220 tours par minutes (220 rpm). La croissance a été suivie par mesure de la turbidimétrie à une densité optique de 600 nm en utilisant un spectrophotomètre Genesys 6 (Thermo, USA). La capacité de croissance des souches a été déterminée par mesure du taux de croissance tel que décrit dans Growth Rates Made Easy Barry G. Hall, Hande Acar, Anna Nandipati, Miriam Barlow Author Notes Molecular Biology and Evolution, Volume 31, Issue 1, January 2014, Pages 232–238, https://doi.org/10.1093/molbev/mst187 28 October 2013 des différentes souches. Les résultats obtenus sont représentés dans le tableau 8 ci-dessous. [Tableau 8] Taux de croissance des différentes souches cultivées en milieu M9 glucose (3 g/L) Souche châssis Taux de croissance en milieu M9 glucose (h -1 ) MDO 0,45 MGX 0,18 MGX1 0,32 PFKA1 0,15 Comme indiqué ci-dessus, le gène pfkA , codant pour la phosphofructokinase, a été supprimé du génome de la souche E. coli MGX, générant la souche E. coli PFKA (voir ci-dessus). Les résultats obtenus montrent clairement que l’absence de pfkA , a provoqué une diminution du taux de croissance en milieu M9 avec du glucose (3g/L), et cette souche n’est plus capable de croître en milieu M9 supplémenté en glucose (données non présentées). L’introduction du gène GalP dans ce fond génétique (souche E. coli PFKA) a permis l’obtention de la souche désignée E. coli PFKA1. Le taux de croissance de la souche E. coli PFKA1 mesuré était proche de celui de la souche MGX montrant une « restauration » de la capacité de croissance de la souche malgré l’absence du gène pfkA (0,15 h -1 soit un tiers du taux de croissance de la souche MDO). b. Analyse métabolomique Un autre trait phénotypique caractéristique du mutant de délétion du gène pfkA est l’accumulation intracellulaire de Glucose-6-Phosphate (G6P) et de Fructose-6-Phosphate (F6P) (Ishii, N., Nakahigashi, K., Baba, T., Robert, M., Soga, T., Kanai, A., Hirasawa, T., Naba, M., Hirai, K., Hoque, A., Ho, P.Y., Kakazu, Y., Sugawara, K., Igarashi, S., Harada, S., Masuda, T., Sugiyama, N., Togashi, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Yugi, K., Arakawa, K., Iwata, N., Toya, Y., Nakayama, Y., Nishioka, T., Shimizu, K., Mori, H., Tomita, M., 2007. Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations. Science 316, 593–597. [4]) La vérification de l’accumulation de Glucose-1-Phosphate (G1P) et de Mannose-1-Phosphate (M1P), des monosaccharides phosphorylés nécessaires à la synthèse d’oligosaccharides par les glycoside-phosphorylases (GP), dans la souche PFKA1 a été réalisé par analyse quantitative du métabolome (métabolites intracellulaires). En particulier, la détermination de la concentration d’hexoses phosphates, en particulier du Glucose-1-Phosphate (G1P) et du Mannose-1-Phosphate (M1P) a été réalisé comme suit. b.1. Echantillonnage et extraction des métabolites intracellulaires. Cent microlitres d’une culture en milieu LB (lysogeny broth) (10 g/l de NaCl), sur la nuit (soit 12 à 16 heures), des différentes souches ont été utilisés pour inoculer des erlenmeyers bafflés de 50 mL contenant 10 mL de milieu M9 supplémenté avec du glucose à une concentration finale de 3 g/L. Les erlenmeyers ont été incubés pendant 24h à 37°C avec une agitation orbitale de 220 tours par minutes (rpm). Les cellules ont été collectées par centrifugation (Sigma, Seelze, Germany) pendant 10 min à 2 000g et à température ambiante (25°C), puis lavées avec du milieu M9 dilué cinq fois, et utilisées pour inoculer, à une densité optique à 600nm de DO 600nm = 0,1, des erlenmeyers bafflés de 50 mL contenant 50 mL de milieu M9 dilué supplémenté avec 3 g/L de glucose et incubées à 37°C avec une agitation orbitale de 220 tours par minutes (rpm). La croissance cellulaire a été suivie par mesure de la turbidimétrie à une densité optique de 600 nm en utilisant un spectrophotomètre Genesys 6 (Thermo, USA). En phase exponentielle de croissance, 120 μL de la culture ont été échantillonnés et immédiatement mélangés avec 1,25 mL d’une solution à -20°C d’acétonitrile/méthanol/H 2 O (4:4:2) pour simultanément bloquer l’activité métabolique et extraire les métabolites ; 60 μL d’un extrait cellulaire contenant des métabolites complétement marqués au 13 C ont été ajoutés dans chaque échantillon pour servir d’étalons internes tel que décrit dans Mashego, M.R., Wu, L., Van Dam, J.C., Ras, C., Vinke, J.L., Van Winden, W.A., Van Gulik, W.M., Heijnen, J.J., 2004. MIRACLE: mass isotopomer ratio analysis of U- 13 C-labeled extracts. A new method for accurate quantification of changes in concentrations of intracellular metabolites. Biotechnol. Bioeng. 85, 620–628. [9] et Wu, L., Mashego, M.R., van Dam, J.C., Proell, A.M., Vinke, J.L., Ras, C., van Winden, W.A., van Gulik, W.M., Heijnen, J.J., 2005. Quantitative analysis of the microbial metabolome by isotope dilution mass spectrometry using uniformly 13C-labeled cell extracts as internal standards. Anal. Biochem. 336, 164–171. [12] Les échantillons ont été placés à -20°C pendant 20 minutes, puis centrifugés 10 minutes à 10 000g à 4°C pour éliminer les débris cellulaires. Le surnageant a ensuite été séché sous vide en utilisant un concentrateur sous vide (SC110A SpeedVac Plus, ThermoSavant, Waltham, MA, USA) et conservé à −80°C jusqu’à analyse. b.2. Analyse par IC-ESI-HRMS des métabolites. Pour l’analyse, les échantillons ont été repris dans 120 µL d’eau ultrapure, puis analysés par chromatographie ionique (Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ system, Dionex, Sunnyvale, CA, USA) couplée à un spectromètre de masse (LTQ Orbitrap mass spectrometer, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) équipé d’une source d’ionisation de type électrospray. La méthode de chromatographie ionique est une variante de celle décrite par Kiefer et al., 2007 (Kiefer, P., Nicolas, C., Letisse, F., Portais, J.-C., 2007. Determination of carbon labeling distribution of intracellular metabolites from single fragment ions by ion chromatography tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 360, 182–188. [5]). Le gradient de KOH a été modifié comme suit: 0 min, 0,5 mM; 1 min, 0,5 mM; 9,5 min, 4,1 mM; 12,5 min, 30 mM; 24 min, 50 mM; 36 min, 60 mM; 36,1 min, 90 mM; 43 min, 90 mM; 43,5 min, 0,5 mM; 48 min, 0,5 mM. Tous les gradients sont linéaires. La suppression du signal lié au gradient de KOH a été réalisée par un suppresseur anionique électrochimique (AERS 300 – 2 mm, Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Le courant d’électrolyse appliqué était de 87 mA, en mode de régénération externe à l’aide d’eau ultrapure. Le volume d’injection des échantillons était de 35 μL. L’analyse en spectrométrie de masse a été réalisée en mode négatif, à une résolution of 30 000 en mode « fullscan », avec les paramètres de source suivants: température du capillaire de source, 350°C; température de la source, 300°C; débit du « sheath gas », 50 a.u. (unité arbitraire); gaz auxiliaire, 5 a.u; niveau de radiofréquence (RF) de la S-Lens, 60%; et voltage du spray d’ionisation, 3.5 kV. Les données ont été acquises avec le logiciel Xcalibure et traitées avec le logiciel TraceFinder 3.1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). A l’aide de courbes de calibrations, les concentrations intracellulaires de chaque métabolite pour les différentes souches ont été déterminées. La figure 4 présente les rapports de concentration de chaque métabolite entre les souches MGX1 et PFKA1 et la souche MDO, pour mieux visualiser les différences. Les rapports ont été calculés en Log 2 .Tel que représenté sur la figure 4, les concentrations des métabolites dans la souche MGX1 et celles dans la souche MDO sont très similaires et aucune différence significative n’a été mise en évidence. La délétion du système de transport PTS n’a donc pas d’effet majeur sur cette partie du réseau métabolique. Tel que démontré sur la figure 4, le profil d’accumulation des métabolites dans la souche PFKA1 est différent de celui de la souche MDO. Par exemple, la concentration intracellulaire du Fructose-1,6-Bisphosphate (FBP) est plus faible que celle mesurée dans la souche MDO. L’absence de la phosphofructokinase permet avantageusement une augmentation des concentrations intracellulaires en F6P et en G6P (Ishii, N., Nakahigashi, K., Baba, T., Robert, M., Soga, T., Kanai, A., Hirasawa, T., Naba, M., Hirai, K., Hoque, A., Ho, P.Y., Kakazu, Y., Sugawara, K., Igarashi, S., Harada, S., Masuda, T., Sugiyama, N., Togashi, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Yugi, K., Arakawa, K., Iwata, N., Toya, Y., Nakayama, Y., Nishioka, T., Shimizu, K., Mori, H., Tomita, M., 2007. Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations. Science 316, 593–597. [4]). Tel que représenté et démontré sur la figure 4 la concentration intracellulaire d’autres monosaccharides phosphorylés est avantageusement également plus élevée dans la souche PFKA1. Par exemple, les concentrations de Mannose-6-Phosphate (M6P), de Galactose-1-Phosphate (Gal1P) et la concentration totale en Glucose-1-Phosphate (G1P) et Mannose-1-Phosphate (M1P) – ces deux monosaccharides phosphorylés ne pouvant être séparés ni par chromatographie ionique ni par spectrométrie de masse, sont significativement augmentées dans la souche PFKA1. Ces résultats démontrent donc clairement que la souche selon l’invention permet avantageusement d’accumuler des monosaccharides phosphorylés nécessaires à la synthèse d’oligosaccharides. Ces résultats démontrent également clairement que la souche selon l’invention permet avantageusement, notamment de par l’accumulation des monosaccharides phosphorylés nécessaires à la synthèse d’oligosaccharides, d’être un support et/ou moyen avantageux pour la production d’oligosaccharides. En outre, les résultats démontrent clairement que la souche selon l’invention permet la synthèse d’oligosaccharides et avantageusement leur excrétion dans le milieu de culture. Ainsi la production, la récupération et l’isolement des oligosaccharides ne nécessitent aucune altération ou destruction de la souche, permettant avantageusement une production en continu. Exemple 2 : production d’oligosaccharides avec la souche déposée à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sous le N°CNCM I-5499 Dans cet exemple la souche déposée à la CNCM sous le N°CNCM I-5499 également désignée souche PFKA1 ou souche E. Coli PFKA1 dans l’exemple 1 ci-dessus a été utilisée pour la production d’oligosaccharides. Pour ce faire, la souche a été transformée avec des vecteurs d’expressions comme suit. 1. Transformation de la souche PFKA1 avec les plasmides portant les gènes codant pour une GP 1.1. Clonage du gène codant pour l'enzyme Teth514-1788 dans les plasmides pBAD-HisA et pTRC (amorces et séquence plasmidique) Le gène codant pour la protéine Teth514-1788 de la souche Thermoanaerobacter sp. X-514 (Teth514-1788, numéro d'accès Genbank ABY93073.1) appartenant à la famille GH130 de la classification CAZy (http://www.cazy.org/) (Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P.M., Henrissat, B., 2014. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 42, D490–D495 [30]) a été synthétisé et cloné dans le vecteur pBAD HisA par la société Biomatik (Biomatik, Ontario, Canada) entre les sites de restriction NcoI et XhoI . La séquence plasmidique obtenue correspond à la séquence SED ID NO 29 représentée sur la figure 15. La souche transformée a été mise en culture en milieu M9 supplémenté en mannose (20 g.L -1 ) à 37°C sous agitation 180 tours par minutes (180 rpm) durant 6 jours. L'ajout de l -arabinose à 0,1% dans le milieu de culture lorsque la DO 600 est ≈ 0,4 permet l’expression du gène présent dans le plasmide et la production d’une protéine de fusion Teth514-1788- (His) 6 , de 36,7 kDa. Le gène codant pour la protéine Teth 514-1788 a également été cloné dans le vecteur pTRC-His-A entre les sites de restriction BamH1 et EcoR1 . Le vecteur pTRC-His-A et l'insert (séquence codante de l'enzyme Teth 514-1788) ont été digérés par les enzymes de restrictions BamH1 et EcoR1 suivant le protocole du fournisseur (https://international.neb.com/protocols/2014/05/07/double-digest-protocol-with-standard-restriction-enzymes [47]). Préalablement, les sites de restrictions BamH1 et EcoR1 ont été ajoutés aux extrémités de l'insert par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en utilisant les amorces fw : 5'-GAGGAAGGATCCATGGGCATTAAACTG-3' (SEQ ID NO 31) et rev : 5'-GCTGCAGATGAATTCTTAATGGTG-3' (SEQ ID NO 32) suivant le protocole du fournisseur : https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/pcr-protocol-m0530 [48]. La ligation de l'insert et du vecteur purifiés sur gel d'agarose est faite par la T4 DNA ligase suivant le protocole du fournisseur (https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 [49]). La souche transformée a été mise en culture dans un milieu M9 supplémenté en mannose (20 g.L -1 ) à 37°C sous agitation à 180 rpm durant 6 jours. L'ajout d'isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à 1 mM dans le milieu de culture lorsque la DO 600 est ≈ 0,4 permet l'expression du gène qui conduit à la synthèse d’une protéine recombinante (His) 6 -Teth514-1788, de 38,9 kDa. La souche E. coli PFKA1 a été transformée soit avec le plasmide pBAD-His-Teth514-1788 soit avec le plasmide pTRC-His-Teth514-1788. Le procédé de transformation était identique quel que soit le plasmide et correspondait au protocole classique de transformation de cellules chimio-compétentes. (https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ [50]) La protéine Teth514-1788-(His) 6 est également nommée Teth-1788 dans la présente. Les souches transformées ont été mises en culture en erlenmeyer dans un milieu M9 supplémenté en mannose (Figure 5). Les conditions de réalisation de ces cultures étaient identiques à celles de l’exemple 1 ci-dessus. Des profils d’expressions des protéines ont été déterminés par gel d’électrophorèse SDS-PAGE Any KD de chez Bio-Rad. Les culots cellulaires sont lysés dans du tampon Tris HCl 5 mM contenant du lysosyme (Euromedex ref 5934-C) à 0,5 mg.mL -1 et de la DNAse (NEB, ref M0303L) à 50 µL (100 U) dans 100 mL de tampon Tris HCl 5 mM. Tous les culots ont été repris dans un volume de tampon pour être à une DO 600 de 45 et incubés 30 min à 37 °C puis congelés à - 20 °C. Les échantillons ont été décongelés, centrifugés 25 min à 5000g. 15 µL de chaque surnageant a été repris avec 5 µL de loading dye blue (NEB, ref 50994905) ont été incubés 10 min à 95 °C avant d'être déposé sur gel pour une migration de 35 min à 100V dans une cuve d'électrophorèse afin de vérifier si la protéine Teth-1788 était effectivement produite dans la souche PFKA1 transformée avec les vecteurs pBAD-His-Teth514-1788 ou pTRC-His-Teth514-1788. Tel que démontré sur la figure 5A, les résultats obtenus démontrent une production des protéines Teth-1788 suite à l'induction quel que soit le vecteur d’expression utilisé. En effet, comme démontré sur la figure 5 A, après ajout dans le milieu de l’inducteur, à savoir l’arabinose ou IPTG, l’intensité des bandes correspondantes au poids moléculaire des protéines Teth-1788 augmente, avec une différence concernant la cinétique de production intracellulaire de l'enzyme. Cet exemple démontre clairement que la souche E. coli PFKA1 peut être i) transformée avec des vecteurs d’expression ; et/ou ii) utilisée pour l’expression de gènes codant pour des protéines recombinantes 1.2 Clonage du gène codant pour l'enzyme Uhgb_MP dans les plasmides pBAD-HisA et pTRCa (amorces et séquence plasmidique ) Le gène codant pour la protéine « Unknown human gut bacteria_Mannoside-Phosphorylase », une β-1,4-mannopyranosyl-chitobiose phosphorylase appartenant à la famille GH130 (Uhgb_MP, numéro d'accès Genbank ADD61463.1) a été cloné dans le vecteur pBAD HisA avec les amorces : Uhgb fw : 5’ – CACCATGAGTATGAGTAGCAAAGTTATT -3’ (SEQ ID NO 33) et Uhgb rev : 5’ – GATGATGCTTGTACGTTTGGTAAATTC – 3’ (SEQ ID NO 34). Le procédé de clonage était celui décrit dans le document http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/pentr_dtopo_man.pdf [51]. La séquence plasmidique obtenue correspond à la séquence SED ID NO 30 représentée sur la figure 16. La souche transformée a été mise en culture dans un milieu M9 supplémenté en mannose (20 g.L -1 ) à 37°C sous agitation à 180rpm durant 6 jours. L'ajout de l -arabinose à 0,1% dans le milieu de culture lorsque la DO 600 est ≈ 0,4 permet l'expression du gène présent dans le plasmide et la production d’une protéine recombinante Uhgb_MP-(His) 6 , de 56,3 kDa (en fusion avec une thioredoxine). Le gène codant pour la protéine de fusion Uhgb_MP-(His) 6 , a également été cloné dans le vecteur pTRC-His-A entre les sites de restriction BamH1 et EcoR1 . La souche transformée a été mise en culture dans un milieu M9 supplémenté en mannose (20 g.L -1 ) à 37°C sous agitation (180 tours par minutes (rpm), Infors HT Multitron) durant 6 jours. L'ajout d'isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à 1 mM dans le milieu de culture lorsque la DO 600 est ≈ 0,4 pour expression du gène par ajout d'isopropyl-β- d -thiogalactopyranoside (IPTG) qui a conduit à la synthèse d’une protéine de fusion (His) 6 -Uhgb_MP, de 43,6 kDa. La souche E. coli PFKA1 a été transformée soit avec le plasmide pBAD-His-Uhgb_MP soit avec le plasmide pTRC-His- Uhgb_MP. Le schéma de la figure 6 représente le métabolisme central de la souche E. coli PFKA1 transformée indiquant les modifications des voies métaboliques génétiquement modifiées, la connexion avec les réactions de synthèse de β-1,2-mannobiose et β-1,4-mannobiose par les glycoside-phosphorylases (GPs) respectives et les effets sur l’accumulation intracellulaire des substrats de ces enzymes. 1.3 Clonage du gène codant pour une enzyme β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase dans le plasmide pBAD-HisA (amorces et séquence plasmidique ) Le gène synthétique codant pour la protéine d'une β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase a été fourni par la société Biomatik Limited (Cambridge, Ontario, Canada) avec une optimisation de l'usage des codons pour une expression du gène dans E. coli . Cette enzyme appartient à la famille GH130 (numéro d'accession GigaBase 340101.Vvad_PD3074). Ce gène originellement dans le plasmide pET23a(+) a été cloné dans le plasmide pBAD HisA par la méthode "In-Fusion cloning" avec les amorces : fw : 5’ – GAGGAATTAACCATGCTGAGCGTGGAAAAACGCTG -3’ (SEQ ID NO 35) et rev : 5’ – AGCTGCAGATCTCGATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGA – 3’ (SEQ ID NO 36). Le procédé de clonage était celui décrit sur le site du fournisseur du kit de clonage : https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-overview [58]. La séquence plasmidique obtenue correspond à la séquence SED ID NO 37 représentée sur la figure 20. La souche transformée a été mise en culture dans un milieu M9 supplémenté en mannose (20 g.L -1 ) à 37°C sous agitation à 180 rpm durant 6 jours. L'ajout de l -arabinose à 0,1% dans le milieu de culture lorsque la DO 600 était de ≈ 0,4 a permis l'expression du gène présent dans le plasmide et la production de la protéine recombinante (His) 6 -β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase, de masse molaire 44,4 kDa. La souche transformée a été mise en culture dans un milieu M9 supplémenté en mannose (20 g.L -1 ) à 37°C sous agitation à 180 rpm durant 6 jours. La souche E. coli PFKA1 a été transformée avec le plasmide pBAD- β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase. Le schéma de la figure 6 représente le métabolisme central de la souche E. coli PFKA1 transformée indiquant les modifications des voies métaboliques génétiquement modifiées, la connexion avec les réactions de synthèse de β-1,2-mannobiose, β-1,3-mannobiose et β-1,4-mannobiose par les glycoside-phosphorylases (GPs) respectives et les effets sur l’accumulation intracellulaire des substrats de ces enzymes. 2. Production de β-1,2- mannobiose, du β-1,3- mannobiose et du β-1,4-mannobiose 2.1. Production de β-1,2- mannobiose Des cultures sur la nuit (de 10 à 15 heures) en milieu LB des souches E. coli PFKA1-pBAD-Teth-1788 et PFKA1 non transformée (condition contrôle) ont été utilisées pour inoculer à une DO 600 ≈ 0,1 une culture de 50 mL de milieu M9 additionné de d -Mannose à 3 g/L comme unique source de carbone dans un erlenmeyer bafflé de 250 mL. Les erlenmeyers ont été incubés pendant 24h à 37°C avec agitation orbitale de 220 rpm. Après 24 heures, les cellules ont été récoltées par centrifugation pendant 10 min à 2 000g à température ambiante, à savoir de 24°C, lavées par suspension des cellules dans un milieu M9 et utilisées pour inoculer à DO 600 ≈ 0,1 un bioréacteur de 500 mL contenant 350mL de milieu M9 « modifié » (M9 modifié sels: KH 2 PO 4 3.02 g/L, NaCl 0,51 g/L, NH 4 Cl 2,04 g/L, (NH 4 ) 2 SO 4 5 g/L. Trace métaux et sels: Na 2 EDTA 2 H 2 O 15 mg/L, ZnSO 4 7 H 2 O 4,5 mg/L, CoCl 2 6H 2 O 0,3 mg/L, MnCl 2 4H 2 O 1 mg/L, H 3 BO 3 1 mg/L, Na 2 MoO 4 2 H 2 O 0,4 mg/L, FeSO 4 7 H 2 O 3 mg/L, CuSO 4 5 H 2 O 0,3 mg/L. MgSO 4 0,5 g/L CaCl 2 4,38 mg/L, Thiamine hypochloride 0,1 g/L) supplémenté avec 10 g/L de d -mannose. Les paramètres de fermentation, à savoir un pH de 7,0, une température de 37°C, une pression partielle en O 2 dissout (pO2) supérieure ou égale à 30%, une agitation supérieure ou égale à 500 rpm ont été suivis et contrôlés à l'aide d'un système de bioréacteurs Multifors (Infors, Suisse). La croissance a été estimée par mesure de la turbidimétrie du milieu de culture à une densité optique de 600 nm en utilisant un spectrophotomètre Genesys 6 (Thermo, USA). Des échantillons de culture de la souche PFKA1-pBAD-Teth-1788 et de la souche contrôle PFKA1 ont été collectés à différents temps de la culture et analysés par résonance magnétique nucléaire (RMN). 2.2. Identification des produits par RMN Des prélèvements réguliers du milieu de culture (1 mL) ont été centrifugés 2 min à 18 000g et 500 µL des surnageants ont été mélangés à 100 µL de D 2 O contenant 2,35 g/L d’acide 3-(triméthylsilyl)-1-propanesulfonique tétra-deutéré (TSPd4), composé utilisé comme standard interne pour l’analyse par RMN. Les spectres 1 H-RMN ont été acquis avec un spectroscope RMN Avance 500 MHz équipé d'une sonde BBI 5 mm (Bruker, Rheinstatten, Allemagne). Le traitement des spectres et la quantification des métabolites ont été réalisés avec le logiciel Topspin 3.1 (Bruker, Rheinstatten, Allemagne). Les surnageants de cultures obtenus avec les souches PFKA1-pBAD-Teth-1788 ou PFKA1 ont ainsi été analysés tout au long de la culture. La figure 7 représente les spectres RMN de surnageants de milieu de cultures obtenus avec les souches PFKA1-pBAD-Teth-1788 (courbe supérieure) ou PFKA1 non transformée. Tel que représenté sur la figure 7, les pics caractéristiques du β-1,2-mannobiose dans les cultures PFKA1-pBAD-Teth-1788 ont été détectés alors qu’aucun de ces pics n’est présent dans le surnageant des cultures contrôles PFKA1. En effet, les déplacements chimiques observés sur le spectre des surnageants de culture PFKA1-pBAD-Teth-1788 correspondaient aux pics des atomes d'hydrogène liés au carbone 1 de la partie réductrice du β-1,2-mannobiose (H1 - ManA) et au carbone 1 du mannose de l’extrémité non réductrice du β-1,2-mannobiose (H1 - ManB), donnés à 5,31 et 4,79 ppm respectivement (Faille, C., Michalski, J.C., Strecker, G., Mackenzie, D.W., Camus, D., Poulain, D., 1990. Immunoreactivity of neoglycolipids constructed from oligomannosidic residues of the Candida albicans cell wall. Infect. Immun. 58, 3537–3544. [1], Shibata, N., Hisamichi, K., Kikuchi, T., Kobayashi, H., Okawa, Y., Suzuki, S., 1992. Sequential nuclear magnetic resonance assignment of.beta-1,2-linked mannooligosaccharides isolated from the phosphomannan of the pathogenic yeast Candida albicans NIH B-792 strain. Biochemistry 31, 5680–5686 [11]). Les résultats obtenus démontrent clairement que la souche selon l’invention permet avantageusement la production d’oligosaccharides. En outre, les résultats obtenus démontrent clairement que la souche selon l’invention permet avantageusement et de manière surprenante et inattendue une excrétion des oligosaccharides produits dans le milieu de culture. En d’autres termes, les résultats démontrent clairement que la souche selon l’invention permet la synthèse d’oligosaccharides et avantageusement leurs excrétions dans le milieu de culture. 2.3. Analyse de la présence de β-1,2-mannobiose dans le surnageant de culture par Chromatographie Haute-Performance Echangeuse d’Anion avec Détection par Ampérométrie Pulsée (HPAEC-PAD) Une confirmation de la présence de β-1,2-mannobiose dans le milieu extracellulaire a été réalisée via une méthode d’analyse orthogonale. Les échantillons analysés correspondaient à des surnageants de culture de la souche PFKA1 transformée avec pBAD-Teth-1788 ou de la souche PFKA1 telles que décrites ci-dessus. Des échantillons de 1 mL de surnageants de cultures ont été soumis à un choc thermique de 10 min à 95°C, puis centrifugés 10 minutes à 15 000g et ont été filtrés sur une membrane de 0,22 µm. Une dilution par 25 dans de l’eau ultrapure des échantillons filtrés a été réalisée avant analyse. La séparation des molécules a été réalisée sur une colonne PA100 Dionex Carbopac 2 × 250 mm (Thermo Fisher) avec un gradient d’élution à 0,25 mL/min avec les éluants A (H 2 O), B (150mM NaOH) et C (150mM NaOH+ 500mM acétate de sodium) suivant: 0−3 min, 50%A−50%B; 3 min, 100%B; 3-6 min, 100%B; 6−12 min, 50%B−50%C; 12 min, 5%B−95%C; 12-15 min, 5%B−95%C; 15 min, 50%A−50%B; 15-23 min, 50%A−50%B. La détection a été réalisée par un module Dionex ED40 possédant une électrode en or et une référence de pH Ag/AgCl. Par ailleurs, une production in vitro (sans la souche) à partir d’un mélange réactionnel enzymatique avec la Teth-1788 β-1,2-mannobiose phosphorylase a été réalisée en utilisant du mannose à 300 mM, de l'α- d -Mannose 1-Phosphate à 15 mM, de l'enzyme Teth-1788 à 0,16 mg.mL -1 dans un volume total de 10 mL de tampon tris-HCl 20 mM, pH7. La réaction a été réalisée pendant 24 heures dans un bain marie à 37 °C sous agitation. Le β-1,2-mannobiose obtenue a été purifié comme décrit dans Chiku K, Nihira T, Suzuki E, Nishimoto M, Kitaoka M, et al. (2014) Discovery of Two b-1,2Mannoside Phosphorylases Showing Different Chain-Length Specificities from Thermoanaerobacter sp. X-514. PLoS ONE 9(12): e114882. doi:10.1371/journal.pone.0114882 [61] Les résultats obtenus, à savoir les chromatogrammes sont représentés sur la figure 8. En particulier, sur cette figure, la courbe en trait continu gras correspond au chromatogramme du surnageant de culture de la souche PFKA1 transformée avec pBAD-Teth-1788, la courbe en pointillé correspond au chromatogramme du surnageant de culture de la souche PFKA1 non transformée, la courbe en trait continu fin correspond à un standard de d -mannose (Carbosynth). Tel que démontré sur la figure 8, la souche selon l’invention permet avantageusement la production d’oligosaccharides. En outre, les résultats obtenus démontrent que les oligosaccharides produits sont excrétés dans le milieu permettant avantageusement une récupération facilitée de l’oligosaccharide produit. 2.4. Profil de production du β-1,2-mannobiose en bioréacteur Une étude de la production de β-1,2-mannobiose a été suivie par RMN au cours de cultures en bioréacteur avec les souches MDO, MGX, MGX1 et PFKA1. Les souches ont été préalablement transformées avec le plasmide pBAD-Teth-1788. Les conditions de culture de chacune des souches étaient identiques à celles mentionnées ci-dessus. La figure 9 présente le profil de production du β-1,2-mannobiose par la souche PFKA1 transformée avec le plasmide pBAD-Teth-1788. Sur cette figure 9 sont également reportées l’évolution de la densité optique à 600 nm et celle de la concentration en mannose. La détermination des concentrations ont été réalisée par RMN à partir d’échantillons du surnageant du milieu de culture selon le procédé décrit dans Nord LI, Vaag P, Duus JØ Quantification of organic and amino acids in beer by 1H NMR spectroscopy Anal Chem. 2004 Aug 15;76(16):4790-8 [59] ou Gloriadel Campo, IñakiBerregi, RaúlCaracena, J. IgnacioSantos “Quantitative analysis of malic and citric acids in fruit juices using proton nuclear magnetic resonance spectroscopy” Analytica Chimica Acta, Volume 556, Issue 2, 25 January 2006, Pages 462-468 [60] en utilisant 1 mM de TSP (Acide triméthylsilylpropanoïque) comme standard interne pour calculer la concentration en β-1,2-mannobiose. La concentration finale en β-1,2-mannobiose dans le milieu de culture était de 1,80 mM et le rendement en β-1,2-mannobiose par g de mannose consommé est de 9,02% (g/g). De la même façon et en suivant le même protocole, la production de β-1,2-mannobiose a été évaluée en bioréacteur pour les souches MDO, MGX et MGX1, transformées avec le plasmide pBAD-HisA-Teth514-1788 selon le procédé décrit ci-dessus afin de déterminer l’effet de chaque mutation sur la production de β-1,2-mannobiose. Le tableau 9 regroupe les caractéristiques de production calculées pour les différentes souches à partir des concentrations en β-1,2-mannobiose et en mannose résiduelle déterminées par RMN. [Tableau 9]. Titres et rendements en β-1,2-mannobiose dans les surnageants de cultures en bioréacteur des souches MDO, MGX, MGX1 et PFKA1 exprimant l'enzyme Teth-1788. Les concentrations sont exprimées en mM et les rendements en pourcentage de mannose converti en β-1,2-mannobiose. Souche Caractéristique Titre Man 2 (mM) % Rendement (g Man 2 / g Man) MDO-Teth-1788 Souche contrôle ND ND MGX-Teth-1788 PTS-, pas de GalP; manB non induit 0,21 1,02 MGX1-Teth-1788 PTS- avec GalP induit, manB induit 0,59 2,91 PFKA1-Teth-1788 PTS- avec GalP; délétion de pfka; manB induit 1,8 9,02 ND. Non détecté Tel que démontré ci-dessus, dans le milieu de culture de la souche MDO, le β-1,2-mannobiose n’est pas détecté alors que dans la souche MGX, il est présent en très faible concentration mais quantifiable (0,21 mM). Aussi, il semble que la délétion du gène codant pour le PTS permet l’import du mannose dans la cellule sous une forme non phosphorylée, qui est l’un des substrats de la glycoside-phosphorylase. La souche MGX1 présente une augmentation de la production de β-1,2-mannobiose (0,59 mM). Cette augmentation peut être liée à deux facteurs : 1) l’amélioration du transport du mannose par la sur-expression de GalP et 2) l’augmentation de la concentration intracellulaire en mannose-1-Phosphate (M1P) (en comparaison avec la souche MGX) due à la sur-expression du gène manB dont le produit de ce gène, la protéine ManB, catalyse la formation de M1P à partir de Mannose-6-Phosphate (M6P). M1P est le second substrat de la glycoside-phosphorylase et le niveau intracellulaire de M1P est important pour la biosynthèse de β-1,2-mannobiose. De manière surprenante et inattendue, la production de β-1,2-mannobiose par la souche PFKA1 est triplée par rapport à la souche MGX1 (1,8 mM), ce qui représente une augmentation approximativement d’un facteur 9 par rapport à la souche MGX. Avantageusement, l’augmentation intracellulaire de M1P a possiblement un effet dans l’obtention de ce résultat. Tel que démontré ci-dessus, la souche selon l’invention permet avantageusement et de manière surprenante d’augmenter significativement la production d’oligosaccharides. En outre les résultats obtenus démontrent clairement que la souche selon l’invention permet d’augmenter significativement les rendements de production des oligosaccharides et ainsi d’optimiser/réduire les coûts de production. Purification du β-1,2-mannobiose synthétisé in cellulo Une analyse du β-1,2-mannobiose produit par la souche PFKA1-pBAD-Teth1788 a été réalisée. Pour ce faire 12 mL de surnageant de culture de la souche PFKA1-pBAD-Teth1788 ont été soumis à un choc thermique de 8 min à 95°C, centrifugés 10 min à 15 000g à 15°C. Le surnageant a été filtré sur membrane (sartorius, Minisart) en acétate de cellulose avec des pores de 0,22 µm avant d’être lyophylisé et repris dans 500 µL d’H 2 O au total, dans 2 vials avec insert (250 µL chacun). La purification a été réalisée avec une HPLC 1260 infinity (Agilent) couplée à un collecteur de fractions automatique UltiMate 3000 (Thermo scientific). Une colonne asahipak NH2P-50 4E (Shodex) permet la séparation des composés via une élution isocratique d’un mélange acétonitrile/H 2 O (70/30 respectivement), à un débit de 1 mL/min. Les composés ont été détectés par indice de réfraction (RI). La pureté du β-1,2-mannobiose a été estimée avant (figure 10A) et après la purification (figure 10B). Deux cycles de purification consécutifs ont permis d’obtenir une pureté HPLC ≥ 90 % (tableau 10). La pureté a été calculée en faisant le rapport de l’aire sous le pic du β-1,2-mannobiose et de l’aire sous l’ensemble des pics du chromatogramme. [Tableau 10] pourcentage d’aire sous la courbe n° Pic 1 Contaminant 2 Contaminant 3 β-1,2-man 2 4 Contaminant 5 Contaminant 6 Contaminant Aire relative (%) 1,04 2,10 91,47 4,07 0,67 0,65 A partir des chromatogrammes, les titres et les rendements de purification obtenus ont été calculés à partir de courbes étalons représentées sur la figure 17. Le procédé utilisé correspond à celui décrit dans Quantification of Sugar Compounds and Uronic Acids in Enzymatic Hydrolysates of Lignocellulose Using High-Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection Energy Fuels 2012, 26, 5, 2942-2947 [53] Le tableau 11 ci-dessous résume les résultats de rendements et de purification obtenus. [tableau 11]. Rendements de purification du β-1,2-mannobiose à partir de 12 mL de surnageant de culture PFKA1-pBAD-Teth-1788. Volume de surnageant culture Masse de β-1,2-mannobiose (purifié) 12 mL 6,8 mg Titre dans le surnageant de culture après purification : 567 mg.L -1 Titres dans le surnageant de culture avant purification, calculé à partir des données RMN, 950 mg.L -1 et des données HPAEC-PAD, 1260 mg.L -1 . Rendement de purification : 45% (HPAEC-PAD), 60 % (RMN) Tel que démontré ci-dessus, la souche selon l’invention permet avantageusement de produire des oligosaccharides avec des rendements importants. Par ailleurs, tel que démontré ci-dessus, la souche selon l’invention permet avantageusement l’accumulation des oligosaccharides produits dans le milieu de culture. En outre, la récupération de l’oligosaccharide produit est facilitée à partir du milieu de culture. 3. Production de β-1,4- mannobiose 3.1. Production du β-1,4- mannobiose et identification par RMN Des cultures de la souche E. coli PFKA1 non transformée (condition contrôle), transformée avec le plasmide pBAD-UhgbMP ou transformée avec le plasmide pTRC-UhgbMP ont été réalisées en erlenmeyer selon le protocole décrit dans l’exemple 1. Une étude du profil de croissance de ces 3 cultures a été réalisée. L’analyse du profil de croissance a été réalisée tel que décrit ci-dessus. La figure 11 représente les profils de croissance des différentes cultures. Tel que représentés sur cette figure les profils de croissance sont similaires pour les souches E. coli PFKA1 et PFKA1-pBAD-UhgbMP et montrent après 72 heures un plateau. Ce plateau est atteint après 120 heures de culture pour ce qui concerne la souche E. coli PFKA1-pTRC-UhgbMP. Un surnageant de la culture avec la souche E. coli PFKA1-pBAD-UhgbMP a été analysé par RMN en appliquant les mêmes paramètres que ceux décrits précédemment. La figure 12 présente la zone spectrale caractéristique du β-1,4-mannobiose d’un surnageant récolté d’une culture de la souche E. coli PFKA1 sans le plasmide (Condition contrôle), d’un surnageant de la culture de la souche E. coli PFKA1_pBAD-UhgbMP et d’une solution du standard commercial β-1,4-mannobiose (Carbosynth, Royaume-Uni) . Tel que représenté sur la figure 12, le déplacement chimique à 4,76 ppm est caractéristique du β-1,4-mannobiose. Il s’agit de l’atome d'hydrogène lié au carbone 1 de la partie non réductrice du β-1,4-mannobiose (H1 - ManB). Ce pic est également présent dans le spectre du surnageant de culture de la souche E. coli PFKA1-pBAD-UhgbMP alors qu’il est absent dans celui de la souche E. coli PFKA1. Les résultats obtenus démontrent donc clairement que la souche transformée permet avantageusement de produire des oligosaccharides, notamment le β-1,4-mannobiose. En outre, cet exemple démontre clairement que la souche permet la production d’oligosaccharides qui sont excrétés dans le milieu de culture. Les résultats obtenus démontrent donc clairement que la souche selon l’invention permet avantageusement la production d’oligosaccharides. En outre, les résultats obtenus démontrent clairement que la souche selon l’invention permet avantageusement et de manière surprenante et inattendue une excrétion des oligosaccharides produits dans le milieu de culture. En outre, les résultats démontrent clairement que la souche selon l’invention permet la synthèse d’oligosaccharides et avantageusement leur excrétion dans le milieu de culture. Ainsi la production, la récupération et l’isolement des oligosaccharides ne nécessitent aucune altération ou destruction de la souche, permettant avantageusement une production en continu. 3.2. Confirmation de la production du β-1,4-mannobiose par HPAEC-PAD Les échantillons ont été analysés par HPAEC-PAD en appliquant le même protocole que celui décrit précédemment (voir section 3). La figure 13 présente les chromatogrammes des différents échantillons analysés par cette technique. En particulier, sur cette figure, la courbe en trait continu fin correspond au chromatogramme du surnageant de culture de la souche PFKA1 transformée avec pBAD-Teth-1788, la courbe en trait continu gras correspond au chromatogramme du surnageant de culture de la souche PFKA1 non transformée, la courbe en pointillé correspond à un standard commercial de β-1,4-mannobiose (Carbosynth). Tel que démontré sur la figure 13, la souche selon l’invention permet avantageusement la production d’oligosaccharides. En outre, les résultats obtenus démontrent que les oligosaccharides produits sont excrétés dans le milieu permettant avantageusement une récupération facilitée de l’oligosaccharide produit. Tel que représenté sur la figure 13, le β-1,4-mannobiose est présent uniquement dans le surnageant de la culture de la souche PFKA1 transformée avec pBAD-UhgbMP et confirment donc la production du β-1,4-mannobiose par la souche PFKA1-pBAD-UhgbMP. En outre, les résultats obtenus démontrent que les oligosaccharides produits sont excrétés dans le milieu permettant avantageusement une conservation de la souche/de la culture et également avantageusement un isolement/récupération facilité de l’oligosaccharide produit. 4. Production de β-1,3- mannobiose 4.1. Production du β-1,3- mannobiose et identification par RMN Une culture de la souche E. coli PFKA1 transformée avec le plasmide pBAD-β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase a été réalisée en erlenmeyer selon le protocole décrit dans l’exemple 1. Le surnageant de la culture avec la souche PFKA1-pBAD-β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase a été analysé par RMN en début (3 heures) et en fin de culture (4 jours) en appliquant les mêmes paramètres que ceux décrits précédemment. La figure 18 présente la zone spectrale caractéristique du β-1,3- mannobiose d’un surnageant de la culture de la souche E. coli PFKA1-pBAD-β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase après 3 ou 108 heures de culture et d’une solution du standard commercial β-1,3- mannobiose (Carbosynth, Royaume-Uni) . Tel que représenté sur la figure 18, le déplacement chimique à 5,22 ppm est caractéristique du β-1,3-mannobiose. Il s’agit de l’atome d'hydrogène lié au carbone 1 de la partie réductrice du β-1,3-mannobiose (H1 - ManA). Ce pic est également présent dans le spectre du surnageant de culture de la souche E. coli PFKA1_pBAD-β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase en fin de culture alors qu’il est absent dans celui de la même souche en début de culture. Les résultats obtenus démontrent donc clairement que la souche transformée permet avantageusement de produire des oligosaccharides, notamment le β-1,3-mannobiose. En outre, cet exemple démontre clairement que la souche permet la production d’oligosaccharides qui sont excrétés dans le milieu de culture. Les résultats obtenus démontrent donc clairement que la souche selon l’invention permet avantageusement la production d’oligosaccharides. En outre, les résultats obtenus démontrent clairement que la souche selon l’invention permet avantageusement et de manière surprenante et inattendue une excrétion des oligosaccharides produits dans le milieu de culture. En outre, les résultats démontrent clairement que la souche selon l’invention permet la synthèse d’oligosaccharides et avantageusement leur excrétion dans le milieu de culture. 4.2. Confirmation de la production du β-1,3- mannobiose par HPAEC-PAD Les échantillons ont été analysés par HPAEC-PAD en appliquant le même protocole que celui décrit précédemment (voir section 3). La figure 19 présente les chromatogrammes des différents échantillons analysés par cette technique. En particulier, sur cette figure, la courbe en trait continu gras correspond au chromatogramme du surnageant de culture de la souche PFKA1 transformée avec pBAD-β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase après 108 heures de culture, la courbe en pointillé correspond à un standard de β-1,3-mannobiose (Carbosynth), la courbe en trait continu fin correspond à un standard de d -mannose (Carbosynth). Tel que démontré sur la figure 19, la souche selon l’invention permet avantageusement la production d’oligosaccharides. En outre, les résultats obtenus démontrent que les oligosaccharides produits sont excrétés dans le milieu permettant une récupération facilitée de l’oligosaccharide produit. Tel que représenté sur la figure 19, le β-1,3-mannobiose est présent dans le surnageant de la culture de la souche PFKA1 transformée avec pBAD-β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase et confirment donc la production du β-1,3-mannobiose par la souche PFKA1-pBAD-β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylase. Tel que démontré sur la figure 19, la souche selon l’invention permet avantageusement la production d’oligosaccharides. En outre, le procédé permet avantageusement une synthèse et/ou production d’oligosaccharides à un coût très inférieur par rapport aux procédés enzymatiques in vitro, n’utilisant pas de support biologique vivant. De plus, les résultats obtenus démontrent que les oligosaccharides produits sont excrétés dans le milieu permettant avantageusement une récupération facilitée de l’oligosaccharide produit. Listes des références 1 . Faille, C., Michalski, J.C., Strecker, G., Mackenzie, D.W., Camus, D., Poulain, D., 1990. 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Souche selon la revendication 2, dans laquelle les β-glycoside- ou α-glycoside- phosphorylases sont choisies dans le groupe comprenant les α-1,3-glucopyranosyl-L-rhamnose-phosphorylases, les α-1,2-glucosyl-glycérol-phosphorylases, les tréhaloses phosphorylases, les D-galactosyl-β-1,4-L-rhamnose phosphorylases, les β-1,4-mannosyl-glucose phosphorylases, les β-1,2-oligomannane phosphorylases, les β-1,2-mannobiose phosphorylases, les β-1,4-mannopyranosyl-[N-glycan-phosphorylases / les β-1,4-mannopyranosyl-chitobiose-phosphorylases, les β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylases, les β-1,3-mannooligosaccharide phosphorylases, les β-1,3-mannosyl-glucose phosphorylases, les β-1,4-mannosyl-glucuronate phosphorylases . Utilisation in vitro d’une souche selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 pour la production d’oligosaccharides et/ou dans un procédé de production d’oligosaccharides. Procédé in vitro , en particulier in cellulo , de production d’oligosaccharides comprenant les étapes de a) transformation de la souche selon la revendication 1 avec un vecteur d’expression d’une enzyme, b) culture de la souche transformée obtenue à l’étape a) et/ou d’une souche selon la revendication 2 ou 3 dans un milieu de culture, c) récupération des oligosaccharides produits. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la récupération des oligosaccharides produits est effectuée dans le milieu de culture. Procédé selon la revendication 5 ou 6, dans lequel le procédé comprend une étape a’) de transformation de ladite souche avec un vecteur d’expression d’au moins une protéine de transport ou perméase. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le milieu de culture comprend au moins un hydrate de carbone non phosphorylé choisi dans le groupe comprenant le N-acétyl-α- d -glucosamine, du galactose, du glucose, du lactose, du glycérol, du mannose, du N-acétyl-glucosamine-β-1,4-N-acétyl-glucosamine, du fucose . Procédé selon l’une quelconque des revendications 5 à 8, dans lequel l’enzyme est choisie parmi les β-glycoside- ou α-glycoside- phosphorylases. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l’enzyme est choisie parmi les α-1,3-glucopyranosyl-L-rhamnose-phosphorylases, les α-1,2—glucosyl-glycérol-phosphorylases, les tréhalose-phosphorylases, les D-galactosyl-β-1,4-L-rhamnose phosphorylases, les β-1,4-mannosyl-glucose-phosphorylases, les β-1,2-oligomannane phosphorylases, les β-1,2-mannobiose-phosphorylases, les β-1,4-mannopyranosyl-[N-glycane-phosphorylases, les β-1,4-mannopyranosyl-chitobiose-phosphorylases, les β-1,4-mannooligosaccharide-phosphorylases, les β-1,3-mannooligosaccharide-phosphorylases, les β-1,3-mannosyl-glucose phosphorylases, les β-1,4-mannosyl-glucuronate phosphorylases . Procédé selon l’une quelconque des revendications 5 à 10, dans lequel le milieu est choisi parmi un milieu riche, de préférence le milieu LB (lysogeny broth), Superbroth, TB (Terrific Broth), YPB (Yeast Extract-Peptone Dextrose), un milieu minimum de préférence le milieu M9 ou M63 complété avec une source de carbone, un milieu sélectif, de préférence le milieu YNB (Yeast Nitrogen Base)