FR 3111519 A1 20211224 FR 2006336 A 20200617 Selon la méthode, visant à produire une souris présentant une susceptibilité a l'infection par le SARS-CoV-2, on croise une première souris, ayant une perte de fonction constitutionnelle du gène Eif2ak4, avec une deuxième souris, ayant intégré dans son génome la séquence codante du gène humain hACE2. La souris produite possède des cellules germinales et des cellules somatiques qui ont intégré dans leurs génomes ces deux modifications génétiques, expriment le gène humain hACE2 et sont déficientes pour le gène Eif2ak4, à l'état homozygote ou hétérozygote. La souris est intéressante comme outil de criblage pour identifier des traitements de la CoVID-19 humaine. Figure de l’abrégé : Aucune Méthode pour produire une souris transgénique, la souris produite et l’utilisation de la souris comme criblage d’identification pour la COVID-19 sévère Depuis Décembre 2019, le monde subit une pandémie d’une ampleur inédite depuis un siècle, engendrée par une nouvelle souche de Coronavirus, le SARS-CoV-2. La maladie qu’entraine ce nouveau virus chez l’homme, appelée COVID-19, atteint de nombreux organes, dont le poumon, le cœur, les vaisseaux, et le rein, principalement. La mortalité de l’affection, autant que l’on puisse en juger de façon approximative à quelques mois du début de l’épidémie se situe entre 0,5 et 2% selon les études et les pays. Il est apparu que la maladie est particulièrement grave chez les personnes âgées de plus de 60 ans et surtout très âgées, ainsi que chez les sujets obèses ou ayant d’autres comorbidités. Cependant, pour une raison inconnue à ce jour, des sujets plus jeunes et en bonne condition physique développent des formes graves sans que l’on ait pu identifier ce qui déclenche cette gravité. Deux facteurs semblent affecter l’évolution de la maladie. D’une part, la charge virale, et d’autre part, un excès de production de cytokines pro-inflammatoires qui provoquent ce qui est appelé un orage cytokinique et qui survient vers le 8-10ème jour de l’évolution de la maladie. De nombreux essais thérapeutiques ont débuté dès le début de l’épidémie, fondés sur ces différentes hypothèses. Des antiviraux et un antagoniste de l’Il-6, une cytokine pro-inflammatoire, ont été testés dans plusieurs essais cliniques. Des traitements ont également été mis en place dans certains pays avec des associations incluant des antiviraux et de l’interféron. Ce sont essentiellement les formes graves de la maladie qui nécessitent la mise au point d’un traitement efficace puisque les formes bénignes régressent spontanément en quelques jours. Or il n’existe pas de modèle murin de la forme grave de la maladie, s’accompagnant de détresse respiratoire aiguë et du décès de l’animal. On sait depuis les travaux menés sur le SARS-CoV que la voie d’entrée moléculaire du virus dans la cellule est la partie extra-cellulaire de l’enzyme de conversion de l’angiotensine de type 2 (ACE2) sur laquelle se fixe la protéine spike (S) du virus. L’ACE2 est une carboxypeptidase membranaire exprimée dans la muqueuse nasopharyngée, le poumon sur l’endothélium des vaisseaux et sur les cellules épithéliales alvéolaires, ainsi que dans le rein, le cœur, les testicules, l’intestin grêle au niveau des entérocytes, ainsi que d’autres organes. Yang et al (Yang, X.-H. et al. Comp. Med. 57, 450–459 (2007)) ont décrit en 2007 une lignée de souris transgéniques (transgénèse additionnelle) pour l’ACE2 humaine où le gène est placé sous le contrôle du promoteur murin de ce gène et chez lesquelles le SARS-CoV est pathogène. Ce même modèle murin a été utilisé par Bao et al (Bao, L. et al. Nature (2020) doi:10.1038/s41586-020-2312-y) avec le SARS-CoV-2 et les lésions décrites dans ce modèle de souris transgénique sont des lésions de pneumopathie interstitielle avec une infiltration significative de macrophages et de lymphocytes dans l’interstitium alvéolaire et une accumulation de macrophages dans les cavités alvéolaires. PRESENTATION DE L’INVENTION L’invention concerne tout d’abord une méthode pour produire une souris transgénique présentant une susceptibilité particulière à l’infection virale, en particulier par le coronavirus tel que le SARS-CoV-2, selon laquelle on croise une première souris, ayant une perte de fonction constitutionnelle du gène de la kinase 4 du facteur eucaryote d’initiation de la traduction (Eif2ak4) à l’état homozygote, avec une deuxième souris ayant intégré dans son génome la séquence codante du gène humain de l’enzyme de conversion de l’angiotensine de type 2 (hACE2) sous contrôle de son propre promoteur ou d’un autre promoteur permettant son expression dans les cellules endothéliales et épithéliales pulmonaires. L’invention concerne également une souris transgénique dont les cellules germinales et les cellules somatiques contiennent la séquence codante du gène humain de l’enzyme de conversion de l’angiotensine de type 2 sous contrôle transcriptionnel de son propre promoteur ou de tout autre promoteur permettant l’expression du gène dans les cellules endothéliales et épithéliales pulmonaires et qui est dépourvue, à l’état homozygote ou hétérozygote, d’une forme active du gène Eif2ak4. La souris sera, d’une part, transgénique pour le gène humain de l’ACE2 comme décrit par Yang et al, et , d’autre part, sera rendue génétiquement déficiente à l‘état hétérozygote ou homozygote pour le gène de la kinase 4 du facteur eucaryote d’initiation de la traduction (EIF2AK4) codant pour le General Control Nonderepressible 2 (GCN2), une kinase importante pour le déclenchement de la réponse intégrée au stress en réponse à une déficience de la cellule en acides aminés et pour l’activation de l’autophagie (Munn, D. H. et al. Immunity 22, 633–642 (2005)). Il a été montré que la souris knock-out pour Eif2ak4 a un déficit de la voie de l’autophagie en réponse à un stress infectieux et inflammatoire, déficit conduisant à un excès de cytokines libéré par les macrophages et un déficit de présentation des antigènes viraux aux lymphocytes par les cellules présentatrices d’antigène (APC). La souris de la présente demande (Eif2ak4-/-;hACE+) n’aura pas de gène Eif2ak4 actif et aura un phénotype normal de base mais lors d’une infection par le virus SARS-CoV-2, elle développera une infection grave potentiellement léthale. La souris Eif2ak4-/-;hACE+ sera donc générée par croisement de ces deux lignées de souris déjà existantes et disponibles. L’invention vise également une utilisation d’une souris produite selon la méthode précédente comme outil de criblage pour identifier des traitements préventifs et curatifs des formes sévères de COVID-19 humaine sur les bases physiopathologiques déduites du génotype et du phénotype de ladite souris. L’invention concerne encore une utilisation de la souris transgénique contenant la séquence codante du gène humain de l’enzyme de conversion de l’angiotensine de type 2 comme outil de criblage pour identifier des traitements préventifs et curatifs des formes sévères de COVID-19 humaine sur les bases physiopathologiques déduites du génotype et du phénotype de ladite souris.   DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION Rôle de GCN2 dans l’autophagie et conséquences de son déficit sur la réponse immunitaire et l’infection par un virus à ARN. D’une part, l’autophagie permet d’amplifier la présentation des antigènes de l’agent pathogène détecté dans l’organisme aux cellules immunocompétentes, les lymphocytes T, qui vont développer une immunité de type « acquise » contre le pathogène. D’autre part, la voie de l’autophagie a un effet inhibiteur sur les réactions inflammatoires du macrophage liées à l’activation de l’inflammasome provoquée par la souffrance des mitochondries en entrainant leur élimination. L’autophagie contrebalance l’effet de l’inflammasome, une étape clé de l’immunité « innée » déclenché par la souffrance mitochondriale par l’intermédiaire de NLRP3 et qui aboutit à la production de cytokines. Les mécanismes d’action de l’autophagie au cours de la réaction immunitaire ont été décrits par de multiples travaux. A été montré le rôle majeur de GCN2, lui-même activé par le déficit en acides aminés dans la cellule, dans la réponse immunitaire à la vaccination contre la fièvre jaune par un virus atténué, le YF17-D (Ravindran et al. Science, 343, 2014, 313-317). En effet, en réponse à l’injection du virus, les souris déficientes en GCN2 (souris Gcn2-/-) ont une baisse des CD8+ (CD8+T) secrétant de l’interféron gamma et une baisse des T lymphocytes CD4+ (CD4+T). C’est GCN2 qui est responsable de l’autophagie déclenchée par le virus et, en l’absence de GCN2, les cellules dendritiques ne montrent pas de baisse des cytokines inflammatoires. L’autophagie impacte positivement la présentation des antigènes par les MHC de classe II et de classe I par les cellules dendritiques (avec présentation croisée des antigènes d’origine endogène et exogène). En cas de déficience pour les principaux acteurs de l’autophagie (ATG5 ou 7, ou becline), on observe une baisse de la présentation croisée des antigènes, indispensable à l’activation des CD8+T et des CD4+T. GCN2 est une kinase, activée par autophosphorylation lors d’un déficit de la cellule en acides aminés, qui phosphoryle un facteur d’élongation de la traduction sur sa sous-unité alpha (EIF2A), ce qui entraine la formation de granules de stress, active la voie intégrée de réponse au stress par la cellule et induit un arrêt de la traduction des protéines. En l’occurrence, lors d’une infection par le virus YF17-D, c’est la multiplication virale à l’intérieur de la cellule dendritique qui est supposée entrainer un déficit en acides aminés. Cependant, il a été également montré que des fragments de virus Sindbis, un virus à ARN comme le SARS-CoV-2, pouvaient activer GCN2 et que des souris déficientes en GCN2 étaient plus sensibles à l’infection par ce virus. Ainsi, l’autophagie induite par l’activation de GCN2 joue un rôle majeur dans la défense contre l’infection par les virus. Dans la mesure où GCN2 est un activateur de l’autophagie en réponse à une infection virale, et que son déficit provoque une infection plus sévère, l’infection au SARS-CoV-2 est plus sévère en cas d’un déficit de l’autophagie ou d’un déficit d’activation de GCN2. L’autophagie peut être induite par d’autres facteurs que GCN2, tels que la sirtuin 1, qui agit directement par déacetylation des facteurs de l’autophagie Atg5 et Atg7. PROTOCOLE DE GENERATION DES SOURIS KNOCK-OUT POUR EIF2AK4 ET TRANSGENIQUES POUR hACE2 1/Croisement des souris déficientes pour le gène EIF2AK4 et des souris transgéniques hACE2. On utilise les souris knock-out pour EIF2AK4, dite Eif2ak4 tm1.2Dron selon la nomenclature, et qui seront appelées Eif2ak4-/+ ou Eif2ak4-/- dans la présente demande, selon qu’elles sont hétérozygotes ou homozygotes pour le knock-out, disponibles auprès du Jackson Laboratory. Une délétion de l’exon 12 du gène a été créée par action de la recombinase Cre sur les sites Lox insérés artificiellement de part et d’autre de cet exon, rendant le gène inactif (Munn DH et al). Ce modèle a été largement utilisé par différentes équipes. Elles sont viables à l’état homozygote et ne présentent pas de phénotype à l’état basal. Le génotype des souris sera contrôlé pour la présence de la délétion de l’exon 12 d’Eif2ak4 dans leur génome par technique de PCR. Les souris transgéniques pour le gène humain de l’ACE2 par transgénèse additive (hACE2+) ont été développées par Yang et al. La séquence codante du gène de l’hACE2 a été placée sous le contrôle du promoteur murin de l’ACE2 dans un plasmide qui a été micro-injecté dans le pronucleus d’ovocytes fécondés selon les techniques standards. L’utilisation du promoteur du gène lui-même permet une meilleure spécificité du patron d’expression du gène. La souris hACE2 est accessible par l’Institute of Laboratory Animal Science, Peking Union Medical College, Chine. Les souris mâles homozygotes adultes Eif2ak4-/- seront croisées par mises en reproduction avec des femelles hétérozygotes pour le transgène hACE2. Les portées obtenues seront testées pour les deux génotypes parentaux. Les animaux de la génération F1 seront tous hétérozygotes pour le knock-out de Eif2ak4 et 50 % des souris seront hétérozygotes pour le transgène hACE2. Les animaux de la génération F1 seront croisés entre eux et les animaux de génotype Eif2ak4-/-;hACE2+ et les animaux Eif2ak4-/+ ;hACE2+ seront gardés pour l’exposition au virus. L’hétérozygotie ou l’homozygotie pour le knock-out de Eif2ak4 pourra conférer des niveaux de susceptibilité différents au SARS-CoV-2. 2/ Exposition des souris knock-out pour EIF2AK4 et transgéniques pour hACE2 au virus SARS-CoV-2. Le virus SARS-CoV-2 (lignée HB-01) est cultivé sur cellules Vero E6 en laboratoire de sécurité de type L3. Le titre du virus cultivé est déterminé en utilisant l’essai standard du TCID50 correspondant à un titre viral où 50% des cellules d’une culture mises en présence de la suspension virale sont infectées. Les souris du génotype Eif2ak4-/-;hACE2+ et les animaux Eif2ak4-/+ ;hACE2+ sont infectées par le virus dans une animalerie de sécurité de type P3 (animal biosafety level 3, ABSL3). Une dose de 105 TCID50 sera inoculée en intra-nasal dans 10 à 20 microlitres de PBS après anesthésie de l’animal. Un lot de souris sera inoculé avec une solution de PBS dans le même volume. Des souris de génotype contrôle pour Eif2ak4 et pour hACE2 seront inoculées avec le virus ou le PBS contrôle afin de mesurer l’effet des génotypes sur l’infection virale. 3/ L’interprétation de l’expérience d’exposition au virus chez les animaux tests et les animaux contrôles. Elle porte sur la survie de l’animal, sa courbe de poids, la morphologie et l’immunohistochimie des poumons, la mesure de différentes protéines impliquées dans la réaction immunitaire par western-blot. Des séries d’animaux sont ensuite étudiées tous les jours pour leur réaction à l’exposition au virus pendant 8 jours. Les études portent sur l’histologie pulmonaire, l’infiltration par les différents types de cellules immunitaires (les populations sont caractérisées selon l’expression de marqueurs spécifiques de chaque type cellulaire, comme MAC2 par exemple) et la présence de cytokines, la présence des antigènes viraux par immunohistochimie de la protéine S virale, l’expression des protéines de l’autophagie et de l’inflammation. APPLICATIONS PHYSIOPATHOLOGIQUES ET THERAPEUTIQUES DE LA SOURIS Gcn2-/hACE2. Les souris du génotype Eif2ak4-/- ;hACE2+ et les animaux Eif2ak4-/+;hACE2+ constituent des modèles de gravité génétiquement induite de l’infection au virus SARS-CoV-2. En effet, du fait de l’inactivation de Eif2ak4, la sévérité de leur phénotype doit être imputée au déficit en autophagie dans la réponse à l’infection virale. Ce résultat ouvre la voie à des thérapeutiques agissant sur cette voie. Ces souris sont bien adaptées comme outil de criblage pour identifier des traitements préventifs et curatifs des formes sévères de COVID-19 humaine sur les bases physiopathologiques déduites du génotype et du phénotype de ces souris. Des médicaments pourront être testés sur ce modèle animal afin de mettre en place des traitements utilisables chez l’homme. Des médicaments ou cofacteurs pourront compenser la baisse de l’autophagie qui pourrait être anormalement basse chez certaines personnes, quel que soit leur âge, et d’une façon fréquente chez les personnes âgées, dont on sait qu’un inducteur majeur de la voie, la Sirtuin 1, est diminué avec l’âge. Ainsi, la supplémentation alimentaire en NAD ou le Resveratrol pourront être testés sur ce modèle. A l’inverse, il a été montré que la fumée de cigarette avait un effet inducteur sur l’autophagie via la sirtuin-1 et cette observation est à mettre en rapport avec le fait qu’il y a un déficit en fumeurs chez les patients hospitalisés pour la COVID-19, ce qui ferait suspecter un effet protecteur de la nicotine ou d’un autre produit de la fumée de tabac sur les formes plus sévères de COVD-19. Celui-ci pourra être testé sur ce modèle. L’activation pharmacologique de la voie de l’autophagie aura pour effet attendu de favoriser la réaction immunitaire de l’hôte vis-à-vis du virus pathogène, le SARS-COV-2, et d’autre part, de diminuer la réaction inflammatoire qui survient de façon secondaire et qui est une cause de létalité. Le protocole de traitement proposé chez l’homme consiste : A traiter de façon curative les personnes ayant déclaré la maladie par un ou plusieurs inducteurs de l’autophagie. A traiter de façon préventive les personnes à risque de contamination ou à risque de formes graves par un ou plusieurs inducteurs de l’autophagie Ainsi, les personnes chez qui on suspecte une baisse de l’autophagie pourront être traitées de façon systématique (personnes âgées, obèses) par un inducteur de l’autophagie selon les résultats obtenus dans le modèle animal décrit dans la présente demande. Méthode pour produire une souris transgénique présentant une susceptibilité particulière à l’infection virale, en particulier par le coronavirus tel que le SARS-CoV-2, selon laquelle on prend une première souris, on lui fait perdre la fonction constitutionnelle du gène de la kinase 4 du facteur eucaryote d’initiation de la traduction (Eif2ak4) à l’état homozygote, on prend une deuxième souris, dans le génome de laquelle on intègre la séquence codante du gène humain de l’enzyme de conversion de l’angiotensine de type 2 (hACE2) sous contrôle de son propre promoteur ou d’un autre promoteur permettant son expression dans les cellules endothéliales et épithéliales pulmonaires, puis on croise les deux souris. Souris transgénique produite selon la méthode de la revendication 1, dont les cellules germinales et les cellules somatiques contiennent la séquence codante du gène humain de l’enzyme de conversion de l’angiotensine de type 2 sous contrôle transcriptionnel de son propre promoteur ou de tout autre promoteur permettant l’expression du gène dans les cellules endothéliales et épithéliales pulmonaires et qui est dépourvue, à l’état homozygote ou hétérozygote, d’une forme active du gène Eif2ak4. Utilisation d’une souris produite selon la méthode de la revendication 1 comme outil de criblage pour identifier des traitements préventifs et curatifs des formes sévères de COVID-19 humaine sur les bases physiopathologiques déduites du génotype et du phénotype de ladite souris. Utilisation d’une souris telle que décrite dans la revendication 2 comme outil de criblage pour identifier des traitements préventifs et curatifs des formes sévères de COVID-19 humaine sur les bases physiopathologiques déduites du génotype et du phénotype de ladite souris.