FR 3106413 A1 20210723 FR 2000544 A 20200120 Production de microréseaux d'aptamères et applications en protéomique. " Mélanges de protéines: analyse, dispositifs, leur production et validation " CHAMPS D'APPLICATION DE L'INVENTION. La présente invention travaille dans le domaine de l'analyse protéomique, l'analyse de l'identité et de la quantité de protéines multiples dans un échantillon ou un système biologique. Un autre domaine est la recherche polypharmacologique, l'étude de pools de cibles multiples qu'une molécule peut moduler.. L'ÉTAT DE L'ART. En fait, les principales méthodes pour déterminer l'abondance de multiples protéines dans un échantillon sont: a. Chromatographie liquide (LC) couplée à un spectromètre de masse (MS). Cette technique pourrait avoir une sensibilité élevée et détecter plusieurs protéines mais elle est coûteuse en termes de dispositifs , de manutention, d'opérateurs et de temps tant pour l'exécution de l'analyse que pour l'interprétation des données.. b. L'électrophorèse sur gel 2D (2DGE) nécessite en théorie un équipement moins cher et permet des tests ratiométriques mais nécessite beaucoup de travail (pour préparer des gels, une focalisation isoélectrique, etc.) et de nombreux réactifs qui sont souvent propriétaires et coûteux. c. la reconnaissance des protéines avec le test ELISA est très spécifique et sensible, mais le débit relativement faible, l'utilisation de temps et de réactifs (environ 2 à 4 heures), en particulier le temps et l'argent coûtent des anticorps. d. La reconnaissance de microarray peut utiliser à la fois des anticorps et des aptamères, mais nécessite des machines spécialisées pour produire des dispositifs, une caractérisation a priori de chaque événement de liaison. Souvent, une validation par les techniques précédentes est requise. [0004] Les avantages de la présente invention comprennent: a. Un coût de production relativement faible, dans la mesure où la zone du réseau est réalisée avec deux processus in vitro simples: la technique SELEX et un séquençage avec expansion clonale des spots. b. Le temps de caractériser les liants et les événements de liaison est réduit de non nécessaire et cela se produit lors de la création du tableau. c. la gamme d'analytes est nettement plus respectueuse des coûts, par rapport à d'autres techniques. d. la mesure des protéines dans les échantillons se fait par imagerie. e. la dimension de l'appareil et la quantité de réactifs sont plus faibles que dans MS et 2DGE. f. La présente méthode est polyvalente en ce qu'elle permet l'étude de l'interaction protéine-protéine ou protéine-médicament, sans anticorps et sans purifier la protéine d'intérêt. BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION. La présente invention utilise une surface de taches en aptamères nucléotidiques, déposées par des techniques de séquençage de nouvelle génération. Les protéines de l'échantillon, comme d'autres molécules qui interagissent avec elles, peuvent être identifiées et quantifiées en toute confiance à l'aide d'une série de métadonnées. DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION . On présente ici une méthode de détermination de protéines dans un échantillon biologique qui nécessite trois étapes principales: création de cartouches, validation et utilisation. La création du réseau commence par une bibliothèque d'aptamères (oligonucléotides en mélange, avec un certain nombre de séquences aléatoires). La complexité (le nombre de séquences) de cette bibliothèque est réduite pour augmenter la fraction d'aptamères ayant une affinité élevée envers les protéines typiques dans un échantillon souhaité. L' enrichissement de ces séquences à haute affinité se fait par la technique SELEX ou ses variantes. La configuration la plus simple de cette technique (SELEX), implique l'immobilisation d'une ou plusieurs protéines d'intérêt. Une fois la bibliothèque ajoutée, les aptamères seront capturés par les protéines. Les aptamères non liants sont éliminés par lavage. Les aptamères liés sont ensuite isolés et amplifiés par ADN-polymérase. Le cycle est répété plusieurs fois jusqu'à ce que l'enrichissement souhaité soit fait. En regardant la figure 1, dans une première phase (1) nous avons une surface revêtue d'amorces polynucléotidiques (A). Lorsque la bibliothèque est séquencée, chaque aptamère (B) forme une microrégion ou tache (3) qui par la suite (4) se liera à une protéine marquée (C), et une fois imagée, fournira l'identité et / ou la quantité. Ainsi, en ce qui concerne l' utilisation Analytica, lorsqu'une protéine se lie à un endroit, il y aura obtenus: a. La détermination de l'identité de la protéine. Cela peut se produire grâce à une corrélation prédéterminée de chaque spot et d'une ou plusieurs protéines connues. Cette relation fait partie des informations fonctionnelles associées au microréseau. b. La détermination de la quantité de protéine, qui peut être effectuée par le signal fluorimétrique de la protéine. c. La détermination d'autres molécules qui se lient à la protéine lorsqu'elle est liée à un point. d. Les informations associées au microréseau sont nécessaires pour faciliter les analyses et comprendre: i. Position (x, y) de chaque point du tableau. Ces informations proviennent de la machine de séquençage. ii. Une liste de protéines qui se lient à chaque endroit dans une ou plusieurs conditions expérimentales. Ces données sont obtenues grâce à une série de méthodes de validation du réseau iii. Une courbe de liaison (Fig 6) associée à chaque spot pour une ou plusieurs conditions expérimentales. Cette courbe est obtenue par une série de méthodes de validation. Cette courbe est tracée après l'ajout de protéines marquées séquentiellement connues à la matrice et est une mesure de la spécificité de chaque tache. Par exemple, sur la figure 6, deux incréments distincts proviennent de la liaison de deux protéines sur place (événements i et ii). Cette information est critique lorsque la protéine d'un échantillon se lie au spot et que nous mesurons le signal, qui proviendrait idéalement d'un spot qui lie une seule protéine (Fig 4, i) et pas plus (Fig 4, ii). iv. La quantification du signal obtenu à partir des aptamères lorsqu'ils sont marqués avec un colorant fluorescent (c'est-à-dire du bromure d'éthidium). Ces informations peuvent normaliser les signaux protéiques à la zone spot. Toutes ces informations sont essentielles pour l'invention en ce qu'elles permettent de marquer les taches sur la base de leur spécificité. Concernant le protocole d'obtention d'informations, il est proposé plusieurs méthodes de validation, visant à obtenir des relations identité-spot plutôt qu'à obtenir la spécificité du spot. a. Method 1: a number of fluorescent labeled proteins are added one by one to the array. By this way, the signal on some spots will augment when it encounter a determined protein. If the signal will augment when subsequent proteins are added, that spot will be scarcely functional to analytical assays made with the array. As shown in figure 5, each incubation can be obtained by putting the array (3) in tandem of a chromatographic system (16). The individual proteins can also spring from other sources like 2D Gel electrophoresis or immunoprecipitation, blocks that can replace 16. This method permit to associate the increment of a proteic signal with the identity of a known protein. b. Méthode 2: pour obtenir une mesure de spécificité de chaque spot, il est possible d'incuber le réseau avec toutes les protéines potentielles dans un échantillon. Ensuite, la variation de l'état du milieu liquide créera des courbes de liaison décroissantes dérivées de l'élution séquentielle de la protéine des taches. La figure 8 montre comment, du temps 0 au temps 4, certaines courbes présentent le point de flexion (iii). Ce point flexible déterminera une baisse de confiance avec le spot BREVE DESCRIPTION DES FIGURES : phases de la production et méthode analytique. : description schématique de l'appareil qui utilise des procédés de la présente invention. :. Illustration d'événements de liaison secondaire (une protéine se lie à une autre protéine qui se lie aptamères place). : exemple non exhaustif de variabilité de spécificité des spots. : configuration pour la validation de la matrice. : Exemple de signal sur un point plurispécifique lorsque plusieurs protéines sont ajoutés séquentiellement pour validation. Fig. 7: Principe du dosage polypharmacologique. Fig. 8: élution séquentielle de protéines à partir du microréseau à des moments déterminés (variation ou validation ambiante. Méthodes analytiques avec le tableau: Les méthodes analytiques réalisables sont: a. Détection directe ou ratiométrique avec une protéine marquée au fluorophore, au radiophore ou à un autre colorant.. b. Dosages de liaison protéine-protéine. Un certain nombre de protéines connues sont ajoutées au réseau pour saturer leurs taches spécifiques. O nce imagé, il sera pris en considération que des points de haute spécificité reconnue en phase de validation. Par la suite, une protéine d'intérêt marquée est ajoutée au réseau et son signal sur place individualisera les protéines et / ou les séquences qui donnent une liaison secondaire c. Un essai de variation environnementale ou d'éluition progressive. Une fois qu'un mélange de protéines de forme native a été incubé avec la matrice pour saturer la plupart des taches monospécifiques et pour permettre aux événements de liaison protéine-protéine de se produire, le tampon sera progressivement changé et, lorsque le signal sur une tache changera, cette tache permettent d'identifier le noyau du complexe protéique influencé par les nouvelles conditions du milieu. Voir la figure 8 où les moments de 0 à 4 génèrent le changement de signal correspondant sur le tracé aux moments 0 à d. Analyses polypharmacologiques: un mélange de protéines est incubé avec le réseau. Par la suite, un médicament d'intérêt marqué est ajouté à la matrice. Son signal sera présent sur les spots soit si la protéine déterminante du spot est connue. Voir figure 7. Dispositif d'analyse: Le dispositif est destiné à la fois à valider (Fig 5) et de lire les microarrays (Fig 2) pour quantifier les protéines ou protéine-protéine à l'étude de liaison. Il est nécessaire:: a. Un système d'imagerie pour surveiller les spots de quelques micromètres. b. L'illumination, qui peut être effectuée par onde évanescente comme dans le NGS, avec de manière optimale au moins deux longueurs d'onde pour l'excitation (Fig 2, 7). c. La caméra (Fig 2, 1) doit posséder une vitesse et une sensibilité appropriées, comme celles des séquenceurs.. d. Le système doit être capable de déplacer des fluides et des tampons sur et loin de la surface du microréseau, d'effectuer des lavages, des incubations et des validations. (Sur la figure 2, voir la tubulure d'entrée 5, la tubulure tampon 6 et la tubulure d'évacuation 9) e. Deux seringues électroniques doivent être présentes si l'appareil applique la méthode de validation 3. f. . Un système mécanique déplacerait la surface du microréseau (Fig 2, 3) verticalement et latéralement pour ajuster la mise au point et l'image comme dans un microscope g. Un système diélectrophorétique adéquat qui confine les protéines sur la puce à ADN pendant l'élution des tampons Le logiciel: fonctions, connexions et calculs. The software should be able to command the device above described and would have these function/routines: a. Une routine pour s'interfacer avec toutes les pièces de l'appareil décrites ci-dessus et notamment avec la caméra. b. Pour imager et quantifier le signal d'un ou deux fluorophores de la zone du spot en soustrayant le fond ou avec d'autres corrections, instantanément ou pendant une durée prolongée pour donner une piste.. c. Routines capables d'interfacer et de commander tous les actionneurs décrits pour l'appareil.. d. Une routine capable d'interfacer le logiciel avec le système de détection d'un chromatographe (qui élue les protéines dérivatisées sur la puce à ADN) et capable de superposer les pics chromatographiques avec la trace du signal de chaque spot e. Une routine capable de trouver un point de flexion dans la trace de chaque tache lors des protocoles d'élution cumulative par les moyens de validation décrits.. f. Une routine qui, à partir de l'image de plusieurs spots, permet d'identifier les spots du fichier à partir du séquenceur, par, pour chaque spot: lister un certain nombre de spots voisins par ordre de distance, à la fois liste ex novo et liste du fichier de le séquenceur est superposé par le logiciel. Ainsi, une tache imagée sera identifiée si les deux listes auront par exemple l'erreur la plus faible ou les coefficients de corrélation les plus élevés.. g. Une routine qui mesure le signal des spots de manière densitométrique et est capable de changer la mise au point, la position du microréseau et de modifier l'exposition, et l'intensité de la lumière d'interrogation et la mise au point de la lentille. Le logiciel doit acquérir le signal de chaque spot, dans le temps, afin de créer des courbes de liaison dans le temps afin d'effectuer une analyse analytique que l'analyse de validation décrite précédemment. Le logiciel doit créer un tableau avec chaque spot représenté par une ligne et les colonnes représenteront la position x, la position y, la séquence, la confiance, l'échantillon de référence utilisé pour la validation, la méthode de validation, l'éventuelle constante de dissociation avec des protéines déterminées. Ces informations peuvent être divisées en plusieurs tableaux. Par conséquent, chaque microréseau doit avoir une hiérarchie. Les fonctions et les logiciels des appareils pourraient être respectivement intégrés dans un séquenceur disponible dans le commerce. . DÉFINITIONS Expansion clonale des oligonucléotides: technique dans laquelle les oligonucléotides sont immobilisés sur une surface et copiés par une réaction de PCR (Polymerase Chain Reaction) pour produire des copies adjacentes immobilisées. Aptamère: oligonucléotide constitué d'ADN ou d'ARN ou d'un autre acide nucléique qui possède une forme tridimensionnelle qui peut reconnaître une autre molécule avec une spécificité et une affinité élevées. Un aptamère est isolé grâce à des techniques de sélection qui impliquent essentiellement l'incubation de plus d'aptamères avec un "antigène", la récupération de complexes antigène-aptamères, l'isolement et le clonage d'aptamères et la répétition de toutes les étapes jusqu'à ce que peu d'espèces ayant une spécificité de liaison élevée aient été isolées . La technique illustrative est la technique SELEX mais il existe un corpus de techniques qui permet la sélection contre plusieurs antigènes, la supervision de l'électrophorèse capillaire et la prédiction in silico des meilleurs motifs. NGS: Next Generation Sequencing: méthode de séquençage dans laquelle, généralement un signal fluorescent est obtenu à partir d'une certaine micro-zone de chaîne nucléotidique en croissance, lorsqu'un nucléotide est ajouté. Microarray: une série de zones micrométriques, recouvertes d'une molécule de reconnaissance comme un anticorps ou un aptamère, afin de quantifier les espèces chimiques par leur signal (luminescent, fluorescent etc.) localisé après liaison. Diélectrophorèse: phénomène qui assure la mobilité des particules non chargées sous l'effet du gradient de densité des lignes de champ électrique et qui est utilisé par exemple pour mobiliser les cellules. Forme native des protéines: la forme tridimensionnelle prise par les protéines dans leurs conditions d'origine naturelles. Protéine: dans le présent texte et dans les revendications, le terme comprend chaque polymère de chaque longueur d'acides aminés , Incubation: mise en contact d'une solution (de protéine ou d'autres molécules) avec le microréseau. DESCRIPTION DES FIGURES : Principe de base et réalisation du microréseau. : Schéma de base du dispositif qui met en œuvre des procédés dans cette invention. : Illustration des événements de liaison secondaire (une protéine se lie à une protéine qui se lie à la tache). : Illustration non exhaustive de la variabilité des spots d'aptamère de spécificité. : Fig.5: Configuration modifiée du dispositif à des fins de validation : La tendance du signal sur un spot plurispécifique en validant le microarray avec addition séquentielle de protéines. : illustre le principe des analyses polypharmacologiques décrites dans cette invention. : illustre l'élution des protéines à partir du microréseau à quelques points finaux explicatifs (par exemple, changement de tampon), avec le cas de la liaison secondaire (test de liaison environnementale, validation par élution séquentielle)). Procédé pour produire des puces à assemblage automatique comprenant les étapes séquentielles: a. Synthèse d'une bibliothèque d'aptamères b. Une sélection de la bibliothèque contre une ou plusieurs protéines, représentative d'un échantillon typique. c. Expansion clonale contextuelle et séquençage de la bibliothèque avec annotation des positions et des séquences d. Application d'une méthode de validation (Méthode de validation 1 ou 2 dans la description) où: des protéines marquées au fluorophore sont ajoutées ou retirées progressivement de la matrice, afin de créer une courbe de liaison liée à la condition expérimentale de validation. e. Enregistrement des données et informations de validation L'ensemble produit en 1, qui comprend: a. Présence de taches aptamériques à sa surface b. Présence d'informations sous forme de fichier numérique, comprenant au moins: position spot, séquence spot, signal d'acide nucléique, signaux protéiques de validation. c. Présence d'une surface en verre ou en matière plastique qui comporte alors une lumière, pour avoir au moins une connexion fluidique d'entrée et une sortie. d. La présence de références informatives et spatiales gravées pour un alignement correct lors de l'imagerie. Méthode analytique, poursuivie avec le réseau en 2 (méthode analytique 1) organisée en: a. Marquage ponctuel avec colorant pour acides nucléiques b. Incubation d'un mélange de protéines marquées par fluorescence avec la surface du réseau. c. Individuation des spots les plus confidentiels (voir description) à partir des données obtenues lors de la phase de validation / tuning. d. Quantification des signaux fluorescents sur les spots et élaboration séquentielle (voir description). Méthode analytique effectuée avec le réseau en 2 (méthode analytique 2), composée d'étapes séquentielles: a. Marquage fluorescent d'une ou plusieurs protéines connues. b. Incubation des protéines avec le réseau en 2, jusqu'à saturation des spots ayant des spécificités plus élevées. c. Une autre incubation d'un mélange de protéines, marqué par fluorescence avec le tableau en 2. d. Identification des protéines qui se lient aux protéines précédemment ajoutées. Méthode analytique réalisée avec le réseau en 2 (méthode analytique 3), composée d'étapes séquentielles: a. Marquage des taches du microréseau avec des colorants fluorescents pour les acides nucléiques b. Ajout d'une forme native d'un mélange de protéines marqué. c. Variation de la composition du tampon (dans la lumière du réseau). d. Évaluation, par les données des spots, des complexes protéiques affectés par la variation du tampon. Une méthode analytique à effectuer avec la matrice en 2, composée d'étapes séquentielles: a. Marquage des taches du microréseau avec des colorants fluorescents pour les acides nucléiques b. Ajout à la matrice d'une forme native d'un mélange de protéines marqué. c. Ajout d'un médicament marqué. d. Identification de la liaison du médicament sur les taches et informations de traitement (voir description). Méthode de validation du microréseau en 2 (méthode de validation 1), composée de phases séquentielles: a. Marquage des taches du microréseau avec des colorants fluorescents pour les acides nucléiques b. Addition séquentielle de protéines marquées par fluorescence pouvant dériver de: i. Séparation chromatographique ii. Séparation électrophorétique iii. Ajout manuel individuel de chaque protéine. Méthode de validation du microréseau en 2 (méthode de validation 2), composée de phases séquentielles: a. Marquage des taches du microréseau avec des colorants fluorescents pour les acides nucléiques b. Ajout d'un mélange de protéines marqué au réseau c. Variation de la composition du tampon et imagerie contextuelle des taches. d. Enregistrement de la trace du signal à chaque endroit. e. Répétition de toutes les étapes précédentes mais avec de nouvelles compositions de tampons. Un dispositif qui remplit au moins une fonction grâce à la production, la validation et l'analyse à partir des points précédents, a une connexion / un logement pour la micropuce du point 1 ou 2 et a la composante séquentielle: a. Une ou plusieurs caméras vidéo qui représentent la surface de la puce à ADN insérée dans l'appareil. b. Une source lumineuse, homogène sur toute la surface du microarray et capable de générer au moins deux longueurs d'onde de lumière contemporaine ou individuelle. c. Un système qui lie correctement le microréseau au dispositif afin d'obtenir l'isolement correct du fluide et la présence d'au moins une entrée et une sortie. d. Un système composé de 1 à 1000 pompes électroniques et / ou seringues, reliées par des tubes à la lumière du microréseau. e. Un compartiment pour l'élimination des déchets, relié à la tubulure de sortie du microarray. f. Actionneurs mécaniques pour mouvements micrométriques sur trois axes, afin de visualiser la partie correcte du réseau et d'ajuster la mise au point (des caméras). g. Un système qui acquiert des commandes à partir d'un ordinateur et les transmet aux systèmes de l'appareil. h. Un système qui envoie des signaux lumineux à un ordinateur. i. Un séquenceur de nouvelle génération éventuellement intégré qui utilise l'expansion clonale (selon la description). Un logiciel capable de s'interfacer avec l'appareil en 9 et capable de surveiller, organiser et exécuter toutes les méthodes de production, de validation et d'analyse décrites aux points précédents, et composé de composants séquentiels: a. Une routine / fonction qui commande les mouvements des actionneurs décrits en 9. b. Une routine / fonction qui s'interface avec les caméras et obtient une image des taches présentes sur le microréseau, et obtient d'éventuels signes techniques / de service pour l'alignement, instantanément ou de manière répétée à des intervalles entre 1 fs et 1 an. c. Une routine / fonction capable de faire la délimitation, manuelle ou automatique, de la région d'intérêt des taches imagées par b. d. Une routine / fonction qui quantifie de manière densitométrique le signal, dans un ou plusieurs canaux de couleur, de taches imagées instantanément ou de manière répétée à des intervalles entre 1 fs et 1 an. e. Une routine / fonction qui lit le fichier de validation du microarray en 1 ou 2. f. Une routine facultative qui interface un système de détection chromatographique, acquiert son signal manuellement ou automatiquement et l'enregistre au fil du temps. g. Une routine facultative capable d'enregistrer des informations inhérentes aux protéines ajoutées par la méthode en 5.