FR 3104722 A1 20210618 FR 1914543 A 20191216 La présente invention concerne un procédé d’évaluation de l’efficacité de composés biocides vis-à-vis de micro-organismes colonisant des matériaux poreux, à partir d’un échantillon au travers duquel on fait circuler des fluides, avec : - une étape (a) de saturation de l’échantillon de matériau poreux avec un premier fluide aqueux ; - une étape (b) d’injection dans l’échantillon d’un deuxième fluide comportant des nutriment(s) ; - une étape (c) d’injection dans ledit échantillon d’un troisième fluide comportant des micro-organismes ; - une étape (d) d’injection d’un quatrième fluide comportant des nutriment(s) liquide; - une étape (e) d’injection d’un cinquième fluide comportant au moins un composé biocide ; - une étape (f) de mesure et d’analyse d’au moins un paramètre, physique, chimique ou biologique, qui est représentatif d’une activité des micro-organismes et qui est relatif à un fluide sortant du matériau poreux et/ou au matériau poreux lui-même. Figure 1 à publier Procédé d’évaluation de l’efficacité de composés biocides vis-à-vis de micro-organismes colonisant des matériaux poreux La présente invention concerne l’évaluation de l’efficacité de composés biocides vis-à-vis de micro-organismes colonisant des matériaux poreux. Cette évaluation est en effet pertinente dans de nombreuses applications ayant rapport avec l’exploitation de réservoirs naturels souterrains à base de roche poreuse. Parmi ces applications, on peut citer l’exploration et l’exploitation de puits d’hydrocarbures, particulièrement avec récupération assistée d’hydrocarbures (ou EOR selon la terminologie anglo-saxonne pour « Enhanced Oil Recovery »). On peut aussi citer la récupération géothermique de fluides souterrains dans des roches poreuses, ou encore le stockage de gaz du type CH 4 , H 2 ou CO 2 dans des roches poreuses, pour leur utilisation ultérieure (H 2 , CH 4 ) ou pour leur piégeage (CO 2 ). Dans ces trois cas de figures, on est amené à injecter ou réinjecter des fluides, gaz ou liquide, dans des roches poreuses, et, dès le départ de l’exploitation ou du fait même de ces injections/réinjections de fluides qu’implique leur exploitation, les roches poreuses peuvent être le siège de proliférations de micro-organismes. Or l’accumulation ou l’activité des micro-organismes dans ces roches réservoirs est préjudiciable à leur exploitation. En effet, il a été observé que ces micro-organismes tendent à former des biofilms par la production de polymères extracellulaires, causant une réduction significative du volume poral disponible des matériaux poreux colonisés par ces bactéries. (On comprend dans tout le présent texte par volume poral le volume du matériau poreux qui est accessible à un fluide). On parle alors de colmatage biologique, ce qui pose de multiples problèmes : réduction du volume disponible pour le stockage de fluide, pertes de charge pouvant devenir rédhibitoires dans le cas d’injection de fluide, une partie de la porosité de la roche devenant inaccessible aux fluides, réservoir de micro-organismes qui pourront par la suite re-coloniser le milieu. Les micro-organismes généralement impliqués sont notamment des bactéries sulfato-réductrices, qui utilisent le soufre des ions SO 4 , lesquels sont transformés en ions sulfites, en sulfure ou en H 2 S, ce qui favorise en outre la corrosion des circuits, matériaux et équipements utilisés pour l’injection de fluide dans ces roches poreuses. Cette problématique de formation de tels biofilms a été observée dans des applications pétrolières, et documentée par exemple dans la publication « Action of glutaraldehyde and nitrite against sulfate-reducing bacterial biofilms », de Gardner LR, Stewart PS (J.Ind. Microbiol. Biotechnol. (2002) 29 : 354 - 360) Elle a été également documentée dans le cadre de la réinjection d’eau dans des roches poreuses visant une application géothermique, par exemple dans la publication « Biofilm Forming Bacteria during Thermal Water Reinjection », de Máté Osvald, Gergely Maróti, Bernadett Pap, and János Szanyi Geofluids (Indawi Geofluids, Volume 2017, Article ID 9231056, January 2017). Il existe donc un besoin pour lutter contre la prolifération des micro-organismes dans des matériaux poreux, et une première solution envisagée consiste à traiter ces matériaux poreux avec des composés chimiques dits biocides, comme évoqué dans la publication précitée de LR Gardner et Al. Cependant, jusqu’à présent, l’évaluation de l’efficacité de tel ou tel biocide sur telle ou telle colonie de micro-organismes se fait usuellement en milieu libre, en statique, les biocides étant testés sur les micro-organismes en suspension dans une phase liquide ou déposés sur un gel d’agar. Or il s’est avéré que ce type d’évaluation n’était pas représentatif de l’efficacité des biocides sur des micro-organismes ayant colonisé un milieu poreux, notamment du fait de l’apparition de ces biofilms, et qu’il y avait donc un besoin d’un système permettant de mieux rendre compte de leur efficacité vis-à-vis de consortia de micro-organismes logés dans ces matériaux particuliers. Il est par ailleurs connu du brevet WO 2017/129312 un système de mesure dynamique d’au moins une propriété d’écoulement d’un fluide dans un milieu poreux : ledit système comporte des moyens de radiographie X aptes à réaliser une pluralité de radiographies lors d’injections de fluide dans ce milieu poreux. Il n’est cependant pas conçu pour, ni adapté à, évaluer l’efficacité d’un biocide. L’invention a donc pour but la mise au point d’un procédé/d’un dispositif permettant d’évaluer l’efficacité de biocides vis-à-vis de micro-organismes, et qui soit représentatif d’une situation où les micro-organismes en croissance colonisent un matériau poreux. L’invention a tout d’abord pour objet un procédé d’évaluation de l’efficacité de composés biocides vis-à-vis de micro-organismes colonisant des matériaux poreux, notamment souterrains, à partir d’un échantillon de matériau poreux au travers duquel on fait circuler des fluides, tel que ledit procédé comporte : - une étape (a) de saturation de l’échantillon de matériau poreux avec un premier fluide aqueux, notamment salé ; - une étape (b) d’injection dans l’échantillon d’un deuxième fluide comportant des nutriment(s) en phase liquide pour des micro-organismes ; - une étape (c) d’injection dans ledit échantillon d’un troisième fluide comportant des micro-organismes en phase liquide en vue de le coloniser ; - une étape (d) d’injection d’un quatrième fluide comportant des nutriment(s) en phase liquide pour les micro-organismes, identique à ou différent du deuxième fluide ; - une étape (e) d’injection d’un cinquième fluide comportant au moins un composé biocide en phase liquide dans ledit échantillon une fois colonisé ou en cours de colonisation; les fluides injectés traversant l’échantillon pour s’écouler hors de l’échantillon sous forme de fluides sortants ; - une étape (f) de mesure et d’analyse d’au moins un paramètre, physique, chimique ou biologique, qui est représentatif d’une activité des micro-organismes et qui est au moins relatif à un fluide sortant du matériau poreux et/ou au matériau poreux lui-même. De préférence, les étapes du procédé de l’invention énoncées plus haut s’effectuent successivement. A tout le moins, l’étape (a) de saturation est avantageusement réalisée avant l’étape (c) d’injection des micro-organismes, elle-même réalisée avant l’étape (e ) d’injection du ou des biocides. L’invention s’applique à tout micro-organisme, dont les bactéries, les champignons et les levures. On comprend par « au moins un composé biocide » dans tout le présent texte l’utilisation d’un seul biocide ou la combinaison de plusieurs biocides de compositions chimiques différentes, et dans ce dernier cas, les biocides peuvent être injectés ensemble dans un même fluide, ou séquentiellement, en plusieurs injections, chaque injection contenant un ou plusieurs biocides de la combinaison voulue. Les inventeurs ont ainsi découvert que, pour s’assurer de l’efficacité réelle d’un biocide à l’encontre de micro-organismes logées dans un milieu poreux, il fallait recréer à l’échelle du laboratoire les conditions réelles rencontrées dans ce type de milieu, et à savoir, en premier lieu, utiliser un milieu représentatif de celui rencontré dans les milieux rocheux souterrains. L’invention utilise donc des micro-organismes dans un échantillon de milieu poreux, ce qui permet de prendre en compte plus fidèlement le phénomène des biofilms au sein de la porosité des roches. Cet échantillon peut soit être une carotte de roche poreux prélevée au sein même du milieu souterrain d’intérêt, soit être un « modèle » de milieu poreux, que l’on choisit aussi proche que possible du milieu poreux d’intérêt, en termes de perméabilité, porosité et de composition minéralogique notamment. De façon plus générale, cet échantillon est donc un morceau, une partie de matériau poreux. Ensuite on choisit une évaluation en mode dynamique, avec un échantillon poreux dans lequel circulent des fluides, ce qui là encore est plus représentatif de la plupart des situations réelles que des conditions statiques, et ce qui, en outre, permet d’obtenir des résultats plus rapidement, ou, au contraire, de faire un suivi sur la cinétique de l’action biocide dans le temps. En fait, on peut assurer un écoulement permanent au travers de l’échantillon, avec des liquides ayant une fonction spécifique : apport de nutriments aux micro-organismes, micro-organismes, biocides, et, en l’absence de ces fluides « fonctionnels », on peut continuer à balayer en permanence l’échantillon avec un fluide « neutre », c’est- à-dire non fonctionnel, comme de l’eau ou de l’eau salée. Enfin, on choisit ensuite un ou plusieurs paramètres pour évaluer l’efficacité du biocide en faisant un suivi de ce ou de ces paramètres, sur l’échantillon lui-même ou sur le flux sortant de l’échantillon, éventuellement en comparaison avec le même paramètre dans un flux entrant, qui peut être d’ordre chimique, physique ou biologique. Avec l’invention, on peut même choisir de suivre plusieurs de ces paramètres pour en vérifier la concordance et améliorer la fiabilité de l’évaluation de l’action du biocide. De préférence, tous les fluides sont en phase liquide, notamment en solution en phase aqueuse (le fluide sortant, notamment, peut aussi contenir une phase gazeuse dissoute ou non dans la phase liquide). A noter que les deux premières étapes (a) et (b) du procédé visent à stabiliser les conditions au sein de l’échantillon : ainsi, le premier fluide, de type salé, de type saumure, va saturer toute la porosité disponible de l’échantillon et caler différentes conditions opératoires, comme le pH et/ou le potentiel Redox au sein de l’échantillon. Le second fluide vient amener dans la porosité les nutriments nécessaires au développement des micro-organismes qu’on va ensuite inoculer. Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est itératif, en ce qu’il comprend une étape (g) de modification d’au moins un paramètre d’injection d’au moins l’étape (e) d’injection du ou des composé(s) biocide(s), notamment la concentration, la nature et/ou la composition dudit ou des composés, en fonction des résultats de la mesure/de l’analyse faite à l’étape (f). En travaillant en mode dynamique, on peut rétroagir facilement pour tester des améliorations dans l’efficacité du biocide. Le procédé selon l’invention peut comprendre une étape (f1) de détermination, en fonction des résultats de la mesure/ de l’analyse faite à l’étape (f), de la concentration minimale inhibitrice CMI du composé biocide et/ou une étape (f2) de détermination du caractère bactéricide ou bactériostatique du composé biocide injecté. En effet, en évaluant l’efficacité des biocides, on cherche, selon l’invention, à en déterminer la CMI, de façon à pouvoir préconiser les conditions d’utilisation opérationnelles du biocide ou du mélange de biocides à l’échelle de l’exploitation industrielle. Les caractères bactéricide / bactériostatique sont également des caractéristiques importantes à déterminer pour le biocide ou le mélange de biocides testé. En effet, on va, avec le procédé de l’invention, pouvoir déterminer l’efficacité à courte durée du biocide, mais également son efficacité à plus longue durée (c’est-à-dire tester quand/si les bactéries prolifèrent à nouveau après un « coup d’arrêt » dû à l’injection du biocide). L’étape (c) d’injection du troisième fluide comportant des micro-organismes en phase liquide se fait de préférence par inoculation sur une durée, exprimée en volume poral, inférieure aux étapes d’injection de nutriments et/ou de composé biocides : autant les injections de nutriment et de biocide peuvent se faire sur une durée longue, soit par des injections en continu soit par des injections ponctuelles selon une fréquence donnée par exemple, autant l’injection des micro-organismes se fait plutôt « en une fois », sur une courte durée, selon un pic d’injection. Il est possible, selon l’invention, que deux étapes d’injection de fluides soient concomitantes, ou qu’elles aient des durées d’injection différentes, mais qui se chevauchent au moins partiellement. Dans le cas de figure, notamment, où le deuxième et le quatrième fluide utilisent la même composition de nutriments, les deuxièmes et quatrième injections ne peuvent en faire qu’une, avec une seule injection, en continu notamment sur une durée donnée. Avantageusement, on peut piloter un écoulement permanent de fluides en entrée-sortie de l’échantillon de matériau poreux. L’étape (f) de mesure/d’analyse peut se faire en continu ou en discontinu, en ligne, ou hors ligne par prélèvement d’une portion au moins du flux sortant à analyser. Le choix sera en fonction du paramètre suivi et du dispositif de mesure utilisé, notamment. L’étape (f) de mesure/d’analyse comporte au moins un des suivis suivants : - le suivi de la perte de charge et/ou du débit en entrée-sortie de l’échantillon de matériau poreux ; - le suivi de la consommation de nutriments dans un flux sortant ; - le suivi du pH dans un flux sortant; - le suivi de la production de gaz dans un flux sortant; - le suivi de la variation de concentration en biocide dans un flux sortant ; - le suivi de la variation de densité optique du flux sortant ; - le suivi par cytométrie en flux des micro-organismes du flux sortant ; - le suivi de la production d’intermédiaire(s) métabolique(s) dans un flux sortant ; - le suivi de la conductivité du flux sortant ; - le suivi de la viscosité du flux sortant ; - le suivi de la perméabilité hydraulique de l’échantillon de matériau poreux. A noter qu’on peut s’intéresser au niveau de bouchage, et dans ce cas, on fixe la pression et on mesure le débit en entrée/sortie. On comprend par « suivi » le fait que le paramètre en question est mesuré/analysé au moins une fois, ou plusieurs fois, ou en continu. On voit que différents paramètres peuvent être représentatifs de l’activité des micro-organismes : des paramètres physiques comme la viscosité du fluide sortant ou la perte de charge entre l’entrée et la sortie de l’échantillon, des paramètres chimiques comme le pH, et enfin des paramètres biologiques. Ce qui est intéressant, c’est que des paramètres physiques, chimiques, les plus faciles techniquement à suivre, permettent de suivre l’activité microbienne de façon assez fiable, surtout si on combine le suivi de plusieurs de ces paramètres. Quant aux paramètres biologiques, leur suivi est très pertinent et peut se faire de différentes manières : ils peuvent indirectement renseigner sur l’évolution du nombre ou de l’activité des micro-organismes , c’est par exemple le cas du suivi de la formation de gaz (CO 2 ,CH 4 ) ou d’intermédiaires métaboliques (comme des alcools, acides comme l’acide acétique, ou des aldéhydes), ou de la consommation en nutriments, notamment en sucre de type glucose, tous liés à l’activité des micro-organismes. La technique de cytométrie en flux permet, elle, de mesurer directement les micro-organismes contenus dans le flux sortant et de distinguer les vivants et les morts, ce qui donne l’information la plus complète sur le nombre et l’activité des micro-organismes avant, pendant ou après un traitement par biocides. De préférence, le deuxième et/ou le quatrième fluide entrant comprend des nutriments choisis parmi au moins un des composés suivants : acides aminés, peptides, protéines, bases nucléiques, sucre(s), sels minéraux, vitamine(s), un système tampon pour stabiliser son pH. C’est une composition conventionnelle pour stimuler la croissance du micro-organisme, et accélérer sa croissance et sa colonisation de l’échantillon poreux. On cherche, en effet, dans le cadre de l’invention, à favoriser la colonisation de l’échantillon, à l’accélérer par rapport aux conditions réelles dans des roches souterraines, pour diminuer le temps global nécessaire à l’évaluation du biocide. On choisit donc une composition non limitante en carbone ou en azote, et notamment riche en sucres, au moins pour la première phase de colonisation. On peut aussi choisir un quatrième fluide qui ne comprend que des nutriments représentatifs de l’environnement de réservoirs d’hydrocarbures, avec au moins une source de carbone, notamment en excès, du type hydrocarbures, et une source d’azote, notamment en conditions limitantes. Dans ce cas, on cherche à se rapprocher au maximum des conditions réelles, où les éléments nutritifs sont limités, ce qui permet de prendre en compte la cinétique de la colonisation et de l’action du biocide en conditions réelles. De préférence, on stabilise la température de l’échantillon à une température comprise entre 25 et 80°C, notamment entre 30 et 70°C ou entre 30 et 50°C. C’est en effet une gamme représentative de la plupart des conditions réelles des réservoirs poreux souterrains. Avantageusement, on prépare le troisième fluide comportant des bactéries à injecter avec la composition et la concentration voulues dans une étape (c0) préalable de culture de micro-organismes, notamment dans un bioréacteur. Ce bioréacteur est de préférence équipé de connexions fluidiques avec l’enceinte où se trouve l’échantillon de matériau poreux. De préférence, le procédé s’effectue en conditions d’asepsie. Il s’est avéré que si la culture des micro-organismes, avant injection dans l’échantillon poreux, était à réaliser de préférence dans des conditions stériles avec passage en autoclave du bioréacteur utilisé pour cultiver les micro-organismes, par contre le procédé d’évaluation lui-même ne nécessitait pas de conditions stériles : une simple asepsie, par exemple en faisant circuler préalablement dans tout le système (moyens d’injection, échantillon, moyens d’analyse) un liquide aseptisant, du type alcool, suffisait). Selon une variante, le procédé selon l’invention peut aussi comporter une étape d’injection d’au moins un additif utilisé dans la technologie de récupération assistée d’hydrocarbures (ou EOR selon la terminologie anglo-saxonne pour « Enhanced Oil Recovery »). Cette étape peut être concomitante avec une autre étape du procédé. L’invention a également pour objet un dispositif d’évaluation de l’efficacité de composés biocides vis-à-vis de micro-organismes colonisant des matériaux poreux, notamment souterrains, notamment pour mettre en œuvre le procédé décrit plus haut. Ce dispositif prévoit : - une enceinte recevant un échantillon de matériau poreux, ladite enceinte étant munie d’au moins une entrée de fluide et d’au moins une sortie de fluide ; - des moyens d’injection de micro-organismes, de nutriments et de composé biocide en phase liquide ; - des moyens de mesure/d’analyse d’au moins un paramètre, physique, chimique ou biologique, représentatif d’une activité microbienne relatif à un fluide sortant de l’enceinte et/ou relatif à l’échantillon de matériau poreux lui-même, le(s)dit paramètre(s) étant choisi(s) parmi au moins un des paramètre suivants : - la perte de charge en entrée-sortie de l’échantillon de matériau poreux, - la consommation en nutriments dans le fluide sortant ; - le pH dans le fluide sortant , - la production de gaz dans le fluide sortant , - la variation de concentration de composé biocides dans le flux sortant dans le fluide sortant , la cytométrie en flux des micro-organismes du flux sortant , - la production d’intermédiaire(s) métabolique(s) dans un flux sortant - la variation de densité optique du flux sortant, - la perméabilité hydraulique de l’échantillon de matériau poreux. Les moyens de mesure/d’analyse sont choisis parmi au moins un des moyens suivants : des capteurs de pression, un conductimètre, un viscosimètre, une sonde enzymatique de mesure de sucre, un spectrophotomètre, une sonde pH ou rH, un séparateur de gaz, un compteur à gaz, un densimètre, un cytomètre en flux. Les moyens de mesure/d’analyse peuvent être connectés à (intégrés à) des moyens de calculs électroniques/informatiques aptes à traiter les données mesurées/analysées. On peut aussi prévoir des moyens de commande pilotant les moyens d’injection. Lesdits moyens de commande peuvent être connectés ou intégrés auxdits moyens de calcul électroniques/informatiques : on peut alors piloter en automatique ou en semi-automatique des séries de tests, en modifiant les conditions d’injection en fonction des résultats/analyses obtenus. Le dispositif selon l’invention peut aussi comporter un bioréacteur apte à cultiver les micro-organismes avec la composition et la concentration voulues, pour l’injection dans l’échantillon de matériau poreux. Pour la préparation de milieu de culture, il est de préférence associé à un autoclave pour le stériliser, et il peut être prévu une connexion fluidique directe entre une sortie du bioréacteur et une entrée des moyens d’injection. L’invention a également pour objet l’utilisation du procédé ou du dispositif décrits plus haut pour évaluer l’efficacité de composés biocides dans des roches poreuses contaminées par des micro-organismes, notamment de bactéries, notamment en vue de la récupération assistée d’hydrocarbures dans des roches poreuses, ou en vue du stockage de gaz du type méthane, H 2 ou CO 2 dans des roches poreuses, ou en vue de la récupération géothermique de fluides souterrains dans des roches poreuses. Liste des figures La figure 1 représente schématiquement une partie d’un exemple de dispositif de mise en œuvre du procédé d’évaluation de biocide selon l’invention. La figure 2 est une représentation schématique d’un système d’injection de bactéries en boucle fermée dans un exemple de dispositif selon l’invention. La figure 3 est une représentation schématique d’un système d’injection de nutriments en boucle ouverte dans un exemple de dispositif selon l’invention. L’ensemble des figures est très schématique, les figures ne sont pas nécessairement à l’échelle, les mêmes références correspondent aux mêmes composés d’une figure à l’autre. L’invention est maintenant décrite à l’aide d’un exemple non limitatif de procédé/dispositif selon l’invention. Tout d’abord, on rappelle que les bactéries sont des microorganismes unicellulaires et ne sont donc généralement pas organisés en tissus. Chaque bactérie se développe et se divise indépendamment de toute autre bactérie, bien que des agrégats de bactéries, contenant parfois des membres d'espèces différentes, soient fréquemment trouvés. Il existe plusieurs types de bactéries classées en genres et en espèces, qui varient selon leurs formes et leurs couleurs ou mêmes leurs conditions de croissance. Dans le cadre des exemples mettant en œuvre l’invention, la bactérie «modèle » choisie est Escherichia Coli ( E. Coli ), notamment parce qu’elle survit à la fois en présence et en absence d’oxygène. Naturellement, l’invention peut s’appliquer à l’étude de toute autre bactérie ou champignon, aérobie ou anaérobie. Elle peut notamment s’appliquer à des bactéries, généralement en mélange (consortium), prélevées directement depuis les roches poreuses souterraines d’intérêt. Les cellules d’ E. Coli sont généralement en forme de bâtonnets et mesurent environ 2 micromètres de long, avec un diamètre d’environ 0,5 micromètres. Dans des conditions optimales, les bactéries peuvent se développer et se diviser extrêmement rapidement. Le temps de division est variable selon le type de bactéries (en minutes, en heures, ou en jours). Dans la nature, de nombreux organismes vivent dans des communautés (par exemple des biofilms) qui peuvent permettre un apport accru de nutriments et une protection contre les stress environnementaux. Les organismes contenus dans les biofilms présentent souvent des propriétés très différentes d’un même organisme dans l’état individuel ou l’état planctonique. Les bactéries qui se sont agrégées dans des biofilms peuvent donner des informations sur la taille de la population et l'état métabolique. En laboratoire, les bactéries sont généralement cultivées dans des milieux solides ou liquides. Des milieux de croissances solides (gélose d'agar), préparés dans des boîtes de pétri sont utilisés pour isoler une souche bactérienne au sein de cultures en mélange. En complément, des milieux de croissance liquides sont aussi utilisés lorsque la mesure de la croissance ou de grands volumes de cellules sont nécessaires. La croissance dans les milieux liquides agités se présente sous forme de suspensions cellulaires souvent uniformes, ce qui facilite la division et le transfert de gaz (notamment d’oxygène) dans le milieu réactionnel des cultures. L'utilisation de milieux sélectifs (milieux contenant des nutriments spécifiques ajoutés ou déficients, ou contenant des antibiotiques) peut aider à identifier et/ou isoler des organismes spécifiques. La plupart des techniques de laboratoire pour étudier la croissance des bactéries utilisent des niveaux élevés de nutriments pour produire de grandes quantités de cellules à moindre coût et rapidement. Cependant, dans les environnements naturels, les éléments nutritifs sont limités, ce qui signifie que les bactéries ne peuvent pas se reproduire indéfiniment. Cette limitation en éléments nutritifs a conduit à l’évolution de différentes stratégies de croissance. La croissance bactérienne suit en effet quatre phases, l’entrée pour la première fois dans un environnement riche en nutriments d’une population de bactéries va permettre sa croissance : - La première phase I est la phase de latence, une période de croissance lente pendant laquelle les cellules s’adaptent à l’environnement riche en nutriments et à une croissance rapide. La phase de latence est associée à des taux de biosynthèse élevés car les protéines nécessaires à la croissance rapide sont produites. - La deuxième phase de croissance II est appelée phase exponentielle, marquée par une croissance exponentielle rapide. Au cours cette phase, chaque bactérie génère deux bactéries filles, par scission binaire, à chaque génération. Un des paramètres physiques liés à cette croissance est le taux de croissance des cellules au cours de ladite phase, et le temps nécessaire pour que les cellules doublent, appelé temps de génération. Au cours de la phase exponentielle, les nutriments sont métabolisés à la vitesse maximale jusqu'à ce que l'un des nutriments soit épuisé et commence à limiter la croissance. - La troisième phase de croissance III est la phase stationnaire qui est causée par une carence en nutriments. Les cellules réduisent leur activité métabolique (le nombre de cellules qui apparaissent est égal au nombre de cellules qui disparaissent). - La phase finale IV est la phase de mortalité par épuisement des nutriments. Il a été observé que la perméabilité hydraulique d'un matériau poreux peut être réduite jusqu'à trois ou quatre ordres de grandeur en raison de la formation de biofilm au sein de la porosité disponible du matériau. Ainsi, au cours de la phase I de croissance, on a observé que les microorganismes se présentent soit de façon isolée à l’interface « parois des pores – phase liquide », soit en petites colonies. Puis, dans la deuxième phase II, on observe une diminution rapide de la perméabilité, le liquide salin dans les pores est partiellement remplacé par : - La présence des corps biologiques : exopolysaccharides (EPS), biofilm ou agrégats de bactéries. - La formation de bulles de gaz provoquées par la saturation excessive de la solution aqueuse en produits gazeux générés par l'activité biologique des micro-organismes, tels que le CO 2 et le CH 4 . - La précipitation d'insolubles sous forme de sels, tels que le fer sulfurique formé par des micro-organismes utilisant un anion sulfate comme accepteur d'électrons - Une combinaison d’au moins deux des composés précédents. Dans une première hypothèse, appelée «modèle à pores fermés», les pores deviennent complètement bouchés par les biofilms poreux et perméables, et la valeur minimale de la perméabilité du matériau poreux correspond à la perméabilité intrinsèque du biofilm. Dans une deuxième hypothèse, appelée «modèle à pores ouverts», la contrainte de cisaillement exercée par le fluide sur le biofilm provoque le détachement continu des fragments de biofilm et, par conséquent, les pores ne sont jamais complètement bouchés; ici la valeur minimale de la perméabilité du matériau poreux est déterminée par l'équilibre entre croissance et détachement. Au cours de la dernière phase IV, on observe le rétablissement partiel (à cause de la présence de biofilms qui sont constitués de polymères très visqueux souvent difficiles à balayer en totalité), ou complet de la perméabilité (si un facteur limitant vient arrêter la croissance cellulaire). C’est à partir de ces constatations que les inventeurs ont mis au point un procédé et une installation pour évaluer l’efficacité des biocides sur ces micro-organismes en milieu poreux, en prenant en compte les particularités de ces milieux poreux et des éventuels composants venant les colmater, tout particulièrement la formation de ces biofilms non observés en milieu ouvert. Les fluides d’étude - La saumure Par définition, la saumure est une solution d’eau salée faite généralement avec du chlorure de sodium (NaCl), mais on peut utiliser d’autres types de sel. La concentration en sel peut être faible ou saturée, suivant le type d’étude à réaliser. Dans le cadre de l’invention, l’exemple de saumure utilisée est constitué de NaCl dans de l’eau, à la concentration de 10 g/l afin de se rapprocher des conditions réelles. - Les milieux de culture / nutriments Un milieu de culture est composé d’un mélange de substrats nutritifs (acides aminés, peptides, bases nucléiques, sucres, etc.), d’un système tampon pour éviter les variations importantes du pH, de sels minéraux et de vitamines. Le milieu dit « Luria Broth » est un milieu très riche en substrats (carbone, protéines, azote, extrait de levure). Sa composition après dissolution dans l’eau est la suivante : Tryptone 10 g/l, extrait de levure 5g/l, NaCl 10 g/l, le pH de la phase liquide est ajusté à environ 7. Le milieu dit « Fouad » modifié par l’Institut Pasteur est un milieu adapté à l’enrichissement en entérobactéries comme E. Coli , sa composition dans l’eau est indiquée dans le tableau 1 ci-dessous : Composés du Milieu FOUAD modifié Formule Chimique Concentration chlorure de sodium NaCl 5 g/l dihydrogénophosphate de potassium K 2 HPO 4 5 g/l Mono hydrogénophosphate de potassium KH2PO4 5 g/l phosphate d’ammonium (NH 4 ) 3 PO 4 2 g/l phosphate de magnésium MgSO4.7H2O 0,2 g/l sulfate de manganèse MnSO4.4H 2 O 0,0 2g/l Perchlorure de Fer FeCl3 0,005 g/l Extrait de levure 3,5 mg/l (0,0035g/l) Ce milieu est contraint en azote, pour mieux représenter des conditions réelles. Le milieu de culture FOUAD non contraint en azote peut contenir jusqu’à 0,5 g/l d’extrait de levure (soit environ 100 fois plus que dans le milieu préconisé ici). Le couple K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 joue un rôle de tampon afin de réguler le pH autour de la valeur du pH choisi, ici autour de 6,8. L’échantillon de matériau poreux On a choisi ici un matériau poreux « modèle » sous forme d’un échantillon de roche Bentheimer, car il présente une bonne homogénéité et est bien représentatif de la porosité des roches souterraines d’intérêt. Sa porosité est comprise entre 21 et 27%, et sa perméabilité varie entre 0,52 et 3,02 Darcy. La taille de ses pores peut être mesurée par la technique connue de la porosimétrie à intrusion de mercure. Ici, la distribution poreuse va de 0,4 à 80 micromètres, avec un pic à 25 micromètres. On vérifie que la taille des bactéries E. Coli est bien largement inférieure (2 micromètres) à cette porosité moyenne, ce qui autorise l’injection et le balayage de l’échantillon avec une solution de bactéries E. Coli. Le matériel physico-chimique Il est représenté en figure 1. Il comprend une pompe d’injection 1, qui pompe les fluides pour injecter dans la cellule 2 sous forme d’un cylindre et contenant l’échantillon 3 de matériau poreux. La pompe est de type Strata. Elle a une gamme de débit allant de 0,01 à 500 ml/h et une pression maximum de 50 Bars. Elle dispose de deux pistons pour guider le fluide dans son écoulement. Il comprend une cellule Hassler 4: De la pompe 1, le fluide circule dans les lignes, passant par un capillaire pour atteindre la cellule 2 via une vanne trois-voies (avec un by-pass pour assurer la purge). Deux pistons sont fixés sur l’échantillon de roche 3 à ses extrémités à l’aide d’une gaine enveloppante de diamètre intérieur égal à celui de la roche. Les pistons permettent ainsi d’assurer le maintien du sens de l’écoulement lors des injections. Il comprend la cellule 2, avec une partie annulaire (entre le diamètre extérieur de la gaine et le diamètre intérieur de la cellule), qui reçoit l’huile minérale qui sera portée à une pression dite de confinement pour le milieu poreux. Enfin, la cellule 2 est placée dans une enceinte 5 thermostatée (étuve), et équipée d’une sonde de température pour suivre l’évolution de la température. L’étuve est portée à 37°C, qui est la température nécessaire à la croissance de la bactérie modèle E. Coli . Il comprend un collecteur de fraction 6 : En sortie de cellule 2, l’eau de production passe dans un régulateur de pression (il maintient la pression au niveau des pores de la roche), elle est ensuite envoyée dans un contenant à déchets. Dans le cadre de l’invention, on est amené à faire des prélèvements afin d’effectuer des analyses physico-chimiques et biologiques de l’eau de production. Ainsi, on utilise le collecteur de fraction pour recueillir l’eau de production dans des tubes, pour un balayage de volume poral donné. Il comprend des capteurs de pression 8: L’écran 7 permet l’acquisition des mesures de pressions et la température dans la cellule 2, et ainsi que les pertes de charges générées par l’écoulement. Ces pertes de charge sont mesurées à l’aide de capteurs différentiels de pression liquide-liquide 8 entre l’entrée et la sortie de la cellule. Elles permettent de remonter à la perméabilité du milieu poreux (injection de saumure) ou de détecter la présence d’un phénomène de colmatage (injection de solutions bactériennes). Il comprend un conductimètre : Le conductimètre permet d’avoir accès au volume poral d’un milieu poreux par tracé de l’évolution temporelle des concentrations d’ions dans le milieu (mesure de la conductivité électrique). L’unité SI de mesure de la conductivité est le Siemens par mètre (S/m), la conductivité peut aussi s’exprimer en milliSiemens par centimètre (mS/cm). Il comprend (non représenté) aussi un viscosimètre : à partir de la collecte d’eau de production, peut déterminer les caractéristiques rhéologiques de nos fluides d’injection, on utilise un viscosimètre avec différents types de couples rotor- stator de géométrie «Couette». Ce viscosimètre est composé de deux cylindres concentriques : le cylindre intérieur est fixe (stator) tandis que le cylindre extérieur est mobile (rotor). L’entrefer, situé entre des deux cylindres, reçoit le fluide (porté à la température d’expérimentation). La viscosité du fluide est obtenue par mesure de la contrainte nécessaire au cylindre intérieur pour s’opposer au mouvement de rotation du fluide. Au point A du fluide sortant de la cellule, on peut procéder à des mesures de type PH, viscosité… Il comprend des moyens informatiques 9 aptes à piloter les moyens de mesure et/ou à collecter et traiter les résultats de mesure. Méthode de mesure du volume poral du matériau poreux Dans les puits souterrains, préexiste généralement une nappe d’eau salée. Comme on veut se rapprocher des conditions réelles, pour cette mesure, il faut deux solutions salines : une première à la concentration de travail (ici 10g /l) et une seconde à une concentration plus élevée (20 g/l). Ensuite, on calibre l’appareil en faisant passer un prélèvement de chaque solution sur la sonde du conductimètre, cette calibration est suivie du réglage des extremums pour le passage dans le milieu poreux. Le volume poral est donc déterminé à partir du volume injecté à mi-hauteur de la courbe en « S », dans le cas de roches homogènes : cette valeur correspond à la valeur maximale de la dérivée de la courbe. Par la suite, on utilise cette donnée de volume poral (VP) pour exprimer la quantité des différents fluides injectée, plutôt que de l’exprimer en débit/durée, ce qui serait plus difficile à transposer d’un échantillon à l’autre, d’un dispositif à l’autre. Le bioréacteur Pour préparer la culture des micro-organismes à injecter dans l’échantillon poreux, on utilise un bioréacteur présentant les équipements conventionnels, notamment des conduites d’amenée, une entrée d’air, des entrées pour les micro-organismes, les nutriments, les moyens d’agitation éventuels, des sondes de régulations, les moyens pour thermostater le bioréacteur à la température adéquate, etc…. Il a été évalué et confirmé que l’échantillon poreux peut bien être considéré comme un réacteur confiné par les manipulations préalables illustrées aux figures 2 et 3, consistant à optimiser la façon dont on colonise l’échantillon poreux avec les micro-organismes par injection de bactéries et de nutriments destinés à favoriser leur croissance : - A la figure 2, dans une première étape, le bioréacteur 20 avec une arrivée d’air a est en connexion fluidique, via une pompe 21, avec l’échantillon 3 placé dans son enceinte 2 : la pompe permet une circulation de fluide depuis le bioréacteur 20 vers l’échantillon 3, puis un retour depuis l’échantillon vers le bioréacteur, établissant ainsi une boucle de recirculation. On vient, tout d’abord, injecter en boucle une solution d’inoculum provenant du bioréacteur, pour accélérer la colonisation de l’échantillon. - Puis, selon la figure 3, dans un deuxième temps, on vient injecter, cette fois en boucle ouverte (pas de retour depuis l’échantillon vers le bioréacteur) une solution de nutriment (Luria Broth par exemple), l’alimentation de l’échantillon par un milieu nutritif « neuf » permet d’accélérer la croissance des micro-organismes dans l’échantillon Le matériel pour la microbiologie On dispose de deux appareils permettant d’opérer de façon stérile : l’autoclave et la hotte à flux laminaire stérile. L’autoclave est un appareil qui, suivant le type de matériel à traiter (solide ou liquide), permet d’éliminer tous les micro-organismes en le rendant stérile. La durée du traitement thermique est de 20 min et la température est portée à 121°C. Sous la hotte à flux laminaire, on effectue de façon stérile des opérations de prélèvements ou d’ajouts d’éléments (nutriments, souche, etc.) en post-autoclavage. Afin de caractériser la croissance bactérienne et son activité, on dispose d’appareils analytiques utilisés pour l’analyse des solutions réactionnelles: - une sonde enzymatique de mesure de glucose GM10, pour la détermination des vitesses d’assimilation du glucose par E. Coli durant notre étude, cet appareil permet de contrôler la concentration en glucose (substrat bactérien) des solutions nutritives avant injection et au cours de la croissance des micro-organismes - un spectrophotomètre « Shimadzu » permet de déterminer la concentration cellulaire des bactéries en solution, et ainsi d’accéder à la quantité de micro-organismes s en solution par mesure de la densité optique à 600 nanomètres. Les biocides utilisés - Le THPS: Tetrakis (Hydroxymethyl) Phosphonium Sulfate est un microbicide utilisé pour le traitement de l'eau, pouvant inhiber la croissance microbienne de la plupart des micro-organismes aérobies, des microorganismes formant un biofilm dans les processus de récupération assistée du pétrole, des systèmes de production et d'injection d'eau dans les puits souterrains. On a montré que dès 60 ppm (mg/l) et en conditions planctoniques, le THPS a une action très efficace sur la croissance microbienne des bactéries sulfato-réductrices et méthanogènes. Le THPS se caractérise par son faible point de solidité et sa bonne stabilité, il peut se dissoudre facilement dans l’eau et se conserve longtemps. - Le DBNPA : 2,2-dibromo-3-nitrilopropionamide : à 200 ppm (parties par millions), le DBNPA a un effet bactéricide sur toutes les bactéries en culture libre, le temps de réaction pour ce type de biocide est assez court (10 minutes). - Le Glutaraldéhyde (ou Pentane-1,5-dial) est utilisé dans plusieurs domaines d’application, c’est un produit très stable (pour un pH compris entre 4 et 7). En milieu de culture libre, il inhibe de façon instantanée toutes les bactéries présentes pour une concentration à 1000 ppm. Les biocides peuvent, selon le type et la concentration utilisée, avoir un effet bactériostatique (inhibition partielle ou totale de la multiplication) ou bactéricide (mort des bactéries). Afin d’avoir une meilleure approche du choix de biocide ainsi que de la concentration et de la quantité minimale à mettre en œuvre pour prévenir et stopper les mécanismes d'encrassement lors de la croissance de biofilm dans des matériaux poreux, on procède selon l’invention à une étude de la croissance bactérienne en milieu poreux puis de son évolution sous l’effet d’un biocide. Le procédé d’évaluation des biocides selon un premier mode de réalisation de l’invention est le suivant. Tout d’abord, on procède à des préparations et étapes préliminaires : Avant d’insérer l’échantillon de roche 3 dans la cellule 2, on le sèche pendant une durée d’au moins 48 h à 60°C, puis on le déshumidifie et refroidit dans un dessiccateur. On le pèse puis on le monte dans la cellule 2, qui est stabilisée à 37°C. Il est connecté aux lignes de transfert par des vannes. Lui sont alors appliquées des pressions de pores à 10 bars et de confinement à 40 bars. On prépare la saumure, qui est dégazée pour enlever l’air, pour éviter le risque de formation de bulles d’air dans l’échantillon. Après saturation des lignes (volumes morts), l’échantillon de roche 3 est soumis à un balayage par la saumure, selon une étape (a), à un débit compris entre 1 ml/h et 5 ml/h pour 10 VP minimum (VP = Volume Poral) Ce balayage permet de maintenir la saturation de la roche et l’atteinte de l’équilibre en pression et en température. Puis on procède, à l’étape (b), à l’injection dans l’échantillon 3 d’une solution de milieu Luria Broth, en injectant dans la cellule 2 pendant 24 heures l’équivalent de plusieurs fois (3 au minimum) le volume poral VP de l’échantillon 3 : il s’agit ici de favoriser la croissance des bactéries en leur fournissant un milieu de culture optimisé en ce sens. Ensuite, on procède selon une étape (c) à l’inoculation d’une culture de bactéries E. Coli préalablement cultivées dans un bioréacteur (Le taux d’inoculation est contrôlé par la mesure de densité optique à 600 nm de l’inoculum ou par cytométrie en flux). L’étape (c) peut se faire après, ou de préférence, pendant l’étape (b), par exemple au début de l’étape (b), sachant que l’inoculation de l’étape (c) est très rapide, sous forme d’un pic d’injection, contrairement à l’étape (b). Il s’agit ici de déterminer les conditions assurant que les micro-organismes vont bien proliférer dans l’échantillon et tendront à créer des biofilms sur lesquels on veut tester les biocides. On procède à une injection, selon une étape (d) d’un milieu de culture Fouad modifié pendant 170 heures jusqu’à obtention d’un état d’équilibre. Puis on procède à l’injection de biocide, dans une étape (e), à 1000 ppm de Protectol GA, qui est une préparation commerciale du glutaraldéhyde dilué à 50% avec de l’eau): ici, on injecte le Protectol en continu à 5 ml/h pendant 120 heures (20 fois volume poral), tout en continuant d’injecter pendant le même temps le milieu de culture Fouad modifié : on ajoute au milieu nutritif le biocide, et on injecte l’ensemble. Résultats On procède à différentes mesures et analyses selon une étape (f) : Tout d’abord on caractérise l’écoulement dans l’échantillon, assimilé à un milieu poreux confiné, en vérifiant qu’il y a eu colonisation par les micro-organismes, avant (ré)injection du milieu de Fouad et/ou du biocide, avec les suivis de paramètres indiqués dans le tableau 2 ci-dessous (chaque colonne correspondant à une expérience) mesurés sur les flux sortant de la cellule 2 avec les appareils décrits plus haut : Teneur initiale en glucose (g/l) 12,3 12,01 10,99 Teneur en glucose (g/l) après balayage de plusieurs VP en 6 heures 6,62 4,54 4,31 pH à l’équilibre et pH initial (7,34) 6,45 5,50 5,69 Temps d’injection (heures) de milieu Luria 16 58 155 Ces données confirment que les suivis du dosage du sucre et de la mesure du pH sont chacun de bons indicateurs de la colonisation de l’échantillon par les bactéries après inoculation, et de la formation de biofilms au sein de l’échantillon. (Le suivi du pH et de la vitesse d’assimilation du glucose reflètent l’intensité de l’activité microbienne au sein du milieu poreux). Un autre moyen d’évaluation de l’effet de la formation de biofilms sur les caractéristiques de l’échantillon de roche modèle est de faire une mesure de perméabilité avant et après un balayage avec la solution microbienne. On a montré que la perméabilité intrinsèque du milieu passe de 1530 mDarcy à 620 mDarcy après injection d’une solution dont la densité optique en entrée est de 2,2 (soit une diminution d’un facteur 2,5 de la valeur de la perméabilité du milieu poreux). On a aussi montré qu’il y avait une augmentation continue de la pression, qui, en fin d’injection (après balayage par le milieu nutritif Fouad), fluctue autour d’une valeur moyenne de 25 mbar. Cela correspond au dépôt des micro-organismes dans le milieu poreux, puis à la stabilisation de la quantité déposée. On a aussi montré que, lorsque le biocide est efficace sur les biofilms, ces derniers commencent à se détacher des parois et à libérer les pores au cours du lessivage Dans ce cas, le différentiel de pression chute au sein du milieu poreux et la densité optique en sortie augmente (présence d’agrégats bactériens). L’évolution de la pression entre l’entrée et la sortie du matériau poreux montre clairement une diminution continue de la perte de charge : en 16 heures d’injection de solution de biocide (soit 2,7 VP balayé), le différentiel de pression a baissé de 9 mbars. Sachant qu’il faut 6 heures pour balayer le matériau poreux pour un débit d’écoulement de 5 ml/h, ceci démontre que le biocide agit bien dans le milieu confiné. Pendant les cinq jours d’injection de biocide, la perte de charge passe de 25 mbars en début d’injection à 2 mbars en fin d’injection. De plus, on retrouve, par mesure de la teneur en glucose, quasiment la même valeur en entrée et en sortie de l’échantillon de matériau poreux (8,88 g/l comme valeur du taux de sucre en entrée et 8,83 g/l en sortie, soit une vitesse d’assimilation quasi-nulle de 8.10 -3 g/l/h). Il a été également vérifié si, avec ce biocide, on arrivait à stopper définitivement l’activité bactérienne au sein du milieu, ou s’il n’avait qu’un effet partiel et temporaire sur l’inhibition de la croissance pour la durée d’injection choisie, de la façon suivante : l’échantillon 3, après l’injection du biocide comme précédemment, a été soumis à nouveau, pendant 24 heures, à un balayage avec le milieu de culture Fouad pour une teneur en glucose égale à 10,3 g/l. Une analyse du taux de sucre sur le prélèvement des 6 dernières heures (égale à un volume poral balayé), en sortie du milieu poreux, montre qu’il y a bien une reprise de la consommation en glucose dans l’échantillon (teneur en glucose à la sortie G = 7,72 g/l, soit une vitesse spécifique de consommation égale à 0,43 g/l/h). La concentration de micro-organismes présents dans la roche est plus faible et les bactéries n’ont pas eu le temps nécessaire à leur croissance jusqu’à l’atteinte de l’équilibre. Le biocide, à la concentration d’injection (1000 ppm) et sur le temps de balayage choisi, n’a donc pas un effet total (bactéricide) sur l’inhibition de la formation de biofilms (ou à la croissance des bactéries). Parmi les indicateurs de suivi d’évolution de l’activité bactérienne au sein du milieu poreux, on peut conclure de ces résultats que des indicateurs biologiques pertinents pour évaluer l’efficacité de biocides en milieu poreux sont notamment le taux d’assimilation du substrat (ici le sucre) et le pH, et l’indicateur physique pertinent reste le différentiel de pression (ou perte de charge) Enfin, le procédé de l’invention a montré que le glutaraldéhyde présente un effet bactériostatique dans le milieu poreux (alors qu’il est bactéricide en milieu libre pour une même concentration choisie). Cet effet bactériostatique est observé dès 4 VP d’injection de biocide. Le temps de balayage nécessaire à cet effet montre effectivement une résistance du biofilm à l’action du biocide dans le milieu poreux. Le procédé selon l’invention a ainsi permis de montrer que les biofilms sont difficiles à éliminer du fait de leur très grande résistance, ce qui permet de protéger et de garder quelques bactéries en vie malgré l’action d’un biocide. L’invention permet, avec son dispositif, qui permet une approche par itérations, de trouver la concentration de biocide adéquate pour éliminer ou réduire davantage ces biofilms. A noter que l’invention permet non seulement de tester des concentrations différentes de biocides, mais aussi des compositions de biocides différents. On peut ainsi injecter plusieurs biocides différents, avec des concentrations différentes, pour cumuler leurs effets, par exemple en combinant un premier biocide présentant un effet immédiat fort mais qui perd de son efficacité dans la durée, avec un deuxième biocide moins efficace mais qui a une durée d’action plus grande, et qui peut ainsi prendre le relais du premier. L’invention est très flexible dans la nature des bactéries à étudier: elle peut s’adapter à des bactéries aérobies ou anaérobies en choisissant de manière appropriée les milieux et conditions de culture, les équipements et leur utilisation. L’invention est également très flexible dans les moyens de mesure et d’analyse : Ainsi, elle peut aussi choisir d’évaluer et de quantifier la production de gaz par les microorganismes. En effet, comme rapidement mentionné plus haut, les réservoirs souterrains sont généralement le siège d’activités microbiennes dûes à la présence de bactéries anaérobies méthanogènes ou sulfato-réductrices. Or l’activité microbienne de ces bactéries conduit à la production de certains gaz, qui sont CO 2 , H 2 , H 2 S, CH 4 , etc... Si les conditions physico-chimiques nécessaires au développement microbien sont remplies, la réaction microbiologique au sein des réservoirs peut être décrite comme suit : Micro-organismes + éléments nutritifs (sources de C, N, O 2 , etc.) ---) Biomasse cellulaire + Produits de réaction (CO 2 , CH 4 , H 2 S, etc.) Ainsi, on peut avec l’invention choisir d’estimer la quantité de gaz, par exemple CH 4 , produite par des bactéries anaérobies et méthanogènes, en équipant le dispositif d’appareils permettant de récupérer ces gaz et de faire leur analyse, dont - un séparateur de gaz pour séparer les gaz dissous de l’eau de production, par exemple un séparateur à gaz gravitationnel, ou, préférentiellement, un séparateur membranaire, - et un compteur à gaz, par exemple un compteur à tambour Ritter pour quantifier en continu le volume de gaz généré par l’activité microbienne, - et un chromatographe en phase gazeuse équipé d’un détecteur catharométrique pour déterminer la composition du gaz produit. En conclusion, l’invention a mis en place un procédé et une installation très performants pour évaluer l’efficacité de biocides sur des microorganismes en milieu poreux, avec une grande flexibilité dans leur mise en œuvre. Procédé d’évaluation de l’efficacité de composés biocides vis-à-vis de micro-organismes colonisant des matériaux poreux, notamment souterrains, à partir d’un échantillon de matériau poreux (3) au travers duquel on fait circuler des fluides, caractérisé en ce que ledit procédé comporte : - une étape (a) de saturation de l’échantillon de matériau poreux avec un premier fluide aqueux, notamment salé ; - une étape (b) d’injection dans l’échantillon (3) d’un deuxième fluide comportant des nutriment(s) en phase liquide pour des micro-organismes ; - une étape (c) d’injection dans ledit échantillon d’un troisième fluide comportant des micro-organismes en phase liquide en vue de le coloniser ; - une étape (d) d’injection d’un quatrième fluide comportant des nutriment(s) en phase liquide pour les micro-organismes, identique à ou différent du deuxième fluide ; - une étape (e) d’injection d’un cinquième fluide comportant au moins un composé biocide en phase liquide dans ledit échantillon (3) une fois colonisé ou en cours de colonisation; les fluides injectés traversant l’échantillon pour s’écouler hors de l’échantillon sous forme de fluides sortants ; - une étape (f) de mesure et d’analyse d’au moins un paramètre, physique, chimique ou biologique, qui est représentatif d’une activité microbienne et qui est au moins relatif à un fluide sortant du matériau poreux et/ou au matériau poreux lui-même. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’il est itératif et en ce qu’il comprend une étape (g) de modification d’au moins un paramètre d’injection d’au moins l’étape (e) d’injection du composé biocide, notamment la concentration, la nature et/ou la composition dudit composé, en fonction des résultats de la mesure/de l’analyse faite à l’étape (f). Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend une étape (f1) de détermination, en fonction des résultats de la mesure/ de l’analyse faite à l’étape (f), de la concentration minimale inhibitrice CMI du composé biocide et/ou une étape (f2) de détermination du caractère bactéricide ou bactériostatique du composé biocide injecté. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape (c) d’injection du troisième fluide comportant des bactéries en phase liquide se fait par inoculation sur une durée exprimée en volume poral inférieure aux étapes d’injection de nutriments et/ou de composé biocides. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que deux étapes d’injection de fluides sont concomitantes, ou ont des durées d’injection différentes mais se chevauchant au moins partiellement. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on pilote un écoulement permanent de fluides en entrée-sortie de l’échantillon de matériau poreux (3). Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape (f) de mesure/d’analyse se fait en continu ou en discontinu, en ligne, ou hors ligne par prélèvement d’une portion représentative au moins du flux sortant à analyser. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape (f) de mesure/d’analyse comporte au moins un des suivis suivants : - le suivi de la perte de charge et/ou du débit en entré-sortie de l’échantillon de matériau poreux ; - le suivi de la consommation de nutriments dans un flux sortant ; - le suivi du pH dans un flux sortant; - le suivi de la production de gaz dans un flux sortant; - le suivi de la variation de concentration en biocide dans un flux sortant ; - le suivi de la variation de densité optique du flux sortant ; - le suivi par cytométrie en flux des microorganismes vivants et morts du flux sortant ; - le suivi de la production d’intermédiaire(s) métabolique(s) dans un flux sortant ; - le suivi de la conductivité du flux sortant ; - le suivi de la viscosité du flux sortant ; - le suivi de la perméabilité hydraulique de l’échantillon de matériau poreux. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le deuxième et/ou le quatrième fluide entrant comprend des nutriments choisis parmi au moins un des composés suivants : acides aminés, peptides, protéines, sucre(s), sels minéraux, vitamine(s), un système tampon pour stabiliser son pH. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le quatrième fluide comprend des nutriments représentatifs de l’environnement de réservoirs d’hydrocarbures, avec au moins une source de carbone, notamment en excès, du type hydrocarbures, et une source d’azote, notamment en conditions limitantes. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on prépare le troisième fluide comportant des micro-organismes à injecter avec la composition et la concentration voulues dans une étape (c0) préalable de culture de micro-organismes, notamment dans un bioréacteur (20). Dispositif d’évaluation de l’efficacité de composés biocides vis-à-vis de micro-organismes colonisant des matériaux poreux, notamment souterrains, notamment pour mettre en œuvre le procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit dispositif prévoit : - une enceinte (2) recevant un échantillon de matériau poreux (3), ladite enceinte étant munie d’au moins une entrée de fluide et d’au moins une sortie de fluide ; - des moyens d’injection de micro-organismes, de nutriments et de composés biocides en phase liquide ; - des moyens de mesure/d’analyse d’au moins un paramètre, physique, chimique ou biologique, représentatif d’une activité microbienne relatif à un fluide sortant de l’enceinte et/ou relatif à l’échantillon de matériau poreux lui-même, le(s)dit paramètre(s) étant choisi(s) parmi au moins un des paramètre suivants : la perte de charge en entrée-sortie de l’échantillon de matériau poreux, - la consommation en nutriments dans le fluide sortant ; - le pH dans le fluide sortant , - la production de gaz dans le fluide sortant , - la variation de concentration de composé biocides dans le flux sortant dans le fluide sortant , la cytométrie en flux des micro-organismes du flux sortant , - la production d’intermédiaire(s) métabolique(s) dans un flux sortant - la variation de densité optique du flux sortant, - la perméabilité hydraulique de l’échantillon de matériau poreux. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les moyens de mesure/d’analyse sont choisis parmi au moins un des moyens suivants : des capteurs de pression (8), un conductimètre, un viscosimètre, une sonde enzymatique de mesure de sucre, un spectrophotomètre, une sonde pH, un séparateur de gaz, un compteur à gaz, un densimètre, un cytomètre en flux. Dispositif selon l’une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce qu’il comporte un bioréacteur (20) apte à cultiver les micro-organismes avec la composition et la concentration voulues, pour l’injection dans l’échantillon de matériau poreux (3). Utilisation du procédé selon l’une des revendications 1 à 11 ou du dispositif selon l’une des revendications 12 à 14 pour évaluer l’efficacité de composés biocides dans des roches poreuses contaminées par des micro-organismes, notamment des bactéries, notamment en vue de la récupération assistée d’hydrocarbures dans des roches poreuses, en vue du stockage de gaz du type CH 4 , H 2 ou CO 2 dans des roches poreuses, ou en vue de la récupération géothermique de fluides souterrains dans des roches poreuses.