FR 3111349 A1 20211217 FR 2006128 A 20200611 L'invention se rapporte à un procédé d'extraction/purification des alcaloïdes pyrrolizidiniques présents dans un extrait végétal d'intérêt, comprenant au moins une étape de lavage à l'eau dudit extrait. Procédé d'extraction/purification des alcaloïdes pyrrolizidiniques Les alcaloïdes pyrrolizidiniques (APs) forment une classe d'alcaloïdes et de métabolites secondaires, caractérisés par une structure pyrrolizidine formée de deux cycles pyrroles. Ces alcaloïdes sont produits par les plantes et constituent un mécanisme de défense contre les animaux herbivores. Il n'a été trouvé aucune application thérapeutique à ces alcaloïdes et c'est plutôt leur toxicité qui retient l'attention. Il est soupçonné que les extraits de plantes utilisables en parfumerie, cosmétique, pharmacie, voire en alimentation, pourraient contenir des alcaloïdes pyrrolizidiniques. Ces impuretés naturelles sont des contaminants particulièrement indésirables en raison de leur toxicité élevée. De ce fait, les préparations à base de plantes, en général, sont sous surveillance et une dose quotidienne ingérée de 1,5µg de ces impuretés semble être une valeur qui ne présente pas de risques carcinogéniques. Les autorités de certains pays, particulièrement européens, ont publié une déclaration sur l'analyse des alcaloïdes pyrrolizidiniques afin de garantir la qualité et la sécurité des médicaments, déclaration qui mentionnait une liste de plantes dans lesquelles des alcaloïdes pyrrolizidiniques ont été mesurés. Les concentrations sont généralement faibles de l’ordre de quelques µg/kg: Le millepertuis ( Hyperici herba ), La fleur de la passion ( Passiflorae herba ), La camomille ( Matricariae flos ), Le manteau de dame ( A lchemillae herba ), La réglisse ( Liquiritiae radix ), La mélisse ( Melissae folium ), La menthe poivrée ( Menthae piperitae folium ), La sauge ( Salviae folium ), Le pissenlit et racine ( Taraxaci herba cum radice ). Il est cependant notable que les alcaloïdes pyrrolizidiniques sont susceptibles de se retrouver dans tous les végétaux et que donc l'invention ne s'adresse pas aux seuls végétaux et/ou extraits desdits végétaux listés précédemment mais à tous les végétaux et/ou extraits susceptibles de comprendre des alcaloïdes pyrrolizidiniques. La structure générale des alcaloïdes pyrrolizidiniques comprend un motif pyrrolizidine ou 1H-Pyrrolizine, hexahydro- (système cyclique 5/5 condensé avec un atome d’azote sur une tête de pont, Formule 1) appelé nécine (base) et substitué par un groupe hydroxyméthyle en C-1 et un groupe hydroxyle en C-7 (Formule II). Formule 1 Ces deux fonctions hydroxyles sont généralement estérifiées avec un ou deux acide(s) appelés acides néciques. Ces deux chaînes latérales peuvent également se cycliser en formant une structure macrocyclique. Formule II À ce jour, plus de 370 structures de pyrrolizidine individuelles provenant de plus de 560 espèces de plantes ont été isolées. Compte tenu des études chimio-systématiques et biogénétiques, la majorité des alcaloïdes pyrrolizidiniques connus appartiennent à l’un des quatre types de squelette de base dont les structures moléculaires III, IV, V et VI sont illustrées ci-après. Formule III Formule IV Formule V Formule VI En outre, la rupture de la liaison intracyclique N-C commune à tous les alcaloïdes pyrrolizidiniques peut être obtenue par synthèse pour conduire à un cinquième squelette d’alcaloïde pyrrolizidinique de type otonécine (Formule VII) comme par exemple, la senkirkine. Formule VII Le cinquième type englobe les phalaénopsines (alcaloïdes pyrrolizidiniques d’orchidées) rares et structurellement plus simples, auxquels il manque la double liaison 1,2 et le groupement hydroxyle en position 7 sur le squelette de base de la nécine (Formule VIII). Formule VIII Une étude Européenne réalisée sur plus d’un millier d’échantillon a pu faire ressortir 35 alcaloïdes pyrrolizidiniques dans les échantillons d’origine animale et 28 alcaloïdes pyrrolizidiniques dans les échantillons d’origine végétale listés dans le tableau 1 suivant. Ce sont ces 28 alcaloïdes pyrrolizidiniques qui sont pris en compte dans le contrôle de la qualité des extraits de plantes destinés à être utilisés en pharmacie, en alimentation, en cosmétique ou en parfumerie. Tableau 1 : liste des 28 alcaloïdes pyrrolizidiniques suivis dans les échantillons d’origine végétale Tous, sont des représentants des quatre types de structure de base répondant aux formules III, IV, V et VI. Malgré la diversité structurelle apparente des alcaloïdes pyrrolizidiniques, leurs propriétés chimiques sont très similaires. Outre le fait que les 28 alcaloïdes pyrrolizidiniques mentionnés appartiennent à quatre types de base différents, ils portent tous des chaînes latérales hydrocarbonées avec des fonctions polaires, principalement des groupes hydroxyle, méthoxyle et ester, et leurs poids moléculaires sont supérieurs ou égaux à 300 Da. Ainsi, en termes de polarité et de volatilité, qui sont les caractéristiques clés déterminant dans quelle mesure une substance est entrainable à la vapeur, les propriétés chimiques de tous les alcaloïdes pyrrolizidiniques sont très étroitement liées et contrastent de manière frappante avec les propriétés des composants généralement présents dans les extraits de plantes, particulièrement les huiles essentielles, absolues, concrètes ou résinoïdes. Les alcaloïdes pyrrolizidiniques sont principalement rencontrés dans deux familles botaniques Boraginaceae et les Asteraceae et accessoirement chez les Fabaceae, Apocynaceae, les Euphorbiaceae, les Orchidaceae, et les Poaceae. En ce qui concerne les propriétés chimiques, les alcalcaloïdes de pyrrolizidine constituent un groupe relativement homogène. La plupart des alcaloïdes pyrrolizidiniques sont mutagènes et inducteurs de tumeurs hépatiques. Il a été montré chez le rat que des alcaloïdes pyrrolizidiniques comme les rétrorsine, senkirkine, monocrotaline, lasiocarpine et symphytine et plusieurs plantes ( Tussilago farfara L., Symphytum officinale L., Petasites j alcaloïdes pyrrolizidiniques onicus Maxim. etc.) pouvaient provoquer des tumeurs hépatiques lorsqu'ils sont administrés régulièrement par voie orale. Il a aussi été prouvé expérimentalement que plusieurs alcaloïdes du groupe étaient mutagènes et tératogènes. Les alcaloïdes pyrrolizidiniques macrocycliques de type III et V (sénécionine, rétrorsine, sénéciphylline, ridelline) sont les plus toxiques. Puis viennent les diesters, qui sont plus toxiques que les monoesters. Une consommation régulière de végétaux contenant des alcaloïdes pyrrolizidiniques peut être responsable de graves intoxications hépatiques. Une intoxication par ces alcaloïdes pyrrolizidiniques peut se traduire par une perte d'appétit, des douleurs, une distension abdominale, une augmentation du volume du foie (hépatomégalie). A titre d'exemple, on peut citer la consoude ( Symphytum officinale ) qui contient des alcaloïdes pyrrolizidiniques comme l'intermédine, la lycopsamine, la 7-acétyl-intermédine et qui en raison de leur toxicité, voit son usage interdit dans de nombreux pays. En Guadeloupe, une plante commune, la sonnette ( Crotalaria retusa L.) sert à confectionner un "thé de sonnette" remède populaire contre beaucoup d'indispositions. Cependant des cas d'intoxication sévère ont été décrits. Plusieurs alcaloïdes pyrrolizidiniques ont été identifiés dans Crotalaria retusa L. principalement la monocrotaline, mais également rétronécine-N-oxyde, rétusine, rétusamine. La monocrotaline, présente surtout dans les graines, est réputée être hépatotoxique, neurotoxique et génotoxique. Cette molécule et ses métabolites ont la capacité de franchir la barrière hémato-encéphalique. Crotalaria retusa L. est notamment responsable (avec C . crispata ) de la maladie de Kimberley qui affecte les chevaux dans le nord de l'Australie (précisément dans la région du Kimberley). Les autres "plantes médicinales" contenant ces composés hépatotoxiques sont le tussilage, la bourrache, les héliotropes, les cynoglosses, les séneçons etc. Des alcaloïdes pyrrolizidiniques ont été identifiés dans les herbes médicinales de Chine, d'Amérique du Sud et du Sri Lanka. De grands épisodes d'empoisonnement ont été décrits en Afghanistan, en Inde et dans l'ancienne URSS du fait de la contamination des récoltes de blé par des Boraginacées ( Heliotropium lasiocarpum, H. popovii, H. europaeum ). On comprend de ce qui précède qu'il peut être intéressant de disposer d'un moyen rapide, efficace et sur d'éliminer les alcaloïdes pyrrolizidiniques potentiellement présents dans des extraits de plantes utilisables en pharmacie, en alimentation, en cosmétique ou en parfumerie. C'est un des buts de la présente invention. En effet, la Demanderesse a montré qu'une étape d’hydrodistillation d'une composition organique contenant des alcaloïdes pyrrolizidiniques permet d'éliminer ces dernières de la composition. Tel que montré par la Demanderesse, il s'avère qu'au cours de l'hydrodistillation de phases organiques comprenant des alcaloïdes pyrrolizidiniques, comme par exemple pourraient l’être des huiles essentielles exprimées ou hydrodistillées, les alcaloïdes pyrrolizidiniques ne sont pas entrainés par la vapeur d’eau et restent piégés dans la phase aqueuse. De ce fait, l’hydrodistillation constitue une méthode de choix pour éliminer les alcaloïdes pyrrolizidiniques éventuellement présents dans une composition organique. Ainsi, la présence potentielle des alcaloïdes pyrrolizidiniques dans les huiles essentielles, particulièrement dans les huiles essentielles exprimées, serait ainsi éliminée par une étape d’hydrodistillation supplémentaire. L'invention a pour objet premier un procédé d'élimination/extraction/purification des alcaloïdes pyrrolizidiniques présents dans un extrait végétal d'intérêt, hydrophile ou lipophile, comprenant au moins une étape de lavage à l'eau dudit extrait. Avantageusement, ladite étape de lavage à l'eau peut être une étape de distillation/rectification. Ainsi l'invention vise à traiter un extrait végétal quelconque (hydrophile ou organique), susceptible de contenir des alcaloïdes pyrrolizidiniques, par hydrodistillation ou distillation/rectification en vue de l’élimination/séparation desdits alcaloïdes pyrrolizidiniques, présents dans les produits de départ par dissolution/concentration dans une phase aqueuse (résidus de distillation ou hydrolat). Selon l'invention, l’extrait de départ, duquel il est souhaité de retirer les alcaloïdes pyrrolizidiniques, peut être tout extrait végétal pouvant potentiellement contenir des alcaloïdes pyrrolizidiniques ou leurs extraits représentatifs comme par exemple une huile essentielle, une solution alcoolique, une solution hydroalcoolique, un extrait aqueux obtenu par procédé subcritique ou supercritique, éventuellement des extraits solvants comme les concrètes ou résinoïdes, absolues, ou des extraits supercritiques. Selon une variante de l'invention, l'extrait à traiter peut être traité à la vapeur d'eau pour entrainer les substances volatiles contenues dans ledit extrait à traiter. La vapeur ainsi formée peut être ensuite dirigée vers un condensateur et le liquide ainsi récolté peut se séparer en deux phases : - une phase supérieure, plus légère que l'eau qui contient les substances volatiles, et une phase inférieure, la phase aqueuse, qui peut être redirigée (ou non) vers le bouilleur pour être remise en circulation afin d'éliminer les éventuelles substances volatiles résiduelles par un (ou plusieurs) même(s) cycle(s) d'évaporation/condensation/séparation. Selon la variante du procédé, il peut être possible d'ajouter un solvant organique apolaire dans les condensats, ce qui peut permettre d'obtenir une meilleure décantation. Selon cette variante, le solvant peut être choisi parmi les hydrocarbures linéaires, ramifiés ou cycliques préférentiellement parmi le pentane, l’hexane, l’heptane, le trimethylpentane, le cyclohexane... Encore selon cette variante, le solvant peut être ajouté en que quantité comprise entre 5% et 20% du volume initial à traiter, préférentiellement entre 10% et 15%. L'extrait à traiter, débarrassé des alcaloïdes pyrrolizidiniques, peut être alors récupéré et la phase aqueuse contenant les alcaloïdes pyrrolizidiniques peut être éliminée. D'autres avantages et particularités de l'invention apparaitront dans les exemples non limitatifs présentés ci-après, ainsi que dans les figures annexées dans lesquelles : La présente les profils UPLC-MS d’une huile essentielle d’Orange dopée en APs (a), la même essence d’Orange dopée en APs, distillée (b), l’huile essentielle d’Orange brute (c) et l’huile essentielle d’Orange brute distillée (d). La présente les profils UPLC-MS d’une huile essentielle d’Eucalyptus dopée en APs (a), la même essence d’Eucalyptus dopée en APs, distillée (b), l’huile essentielle d’Eucalyptus brute (c) et l’huile essentielle d’Eucalyptus brute distillée (d). Exemples Exemple 1 : Traitement d’échantillon d’huiles essentielles d’ Eucalyptus globulus Labill . , de Citrus sinensis (L.) Osbeck et de Citrus x limon (L.) Burm. f. Mode opératoire Dans un ballon de 500 mL, on introduit 300 mL d'eau distillée, un barreau magnétique, quelques pierres ponces et une quantité pesée d'échantillon entre 15 et 30 g. Le ballon est alors raccordé à un appareil de type Clevenger et placé dans un bain d’huile chauffant. On ajoute quelques mL d’eau distillée et 4 à 5 mL du solvant d’extraction parmi ceux précédemment cités afin de remplir le séparateur. Ouvrir l’arrivée d’eau pour le réfrigérant et on porte à reflux pendant deux heures. On arrête alors le chauffage et on laisse décanter. La phase organique et la phase aqueuse décantent dans le séparateur et sont recueillies. Analyse Conditions HR-TOF-MS Les analyses ont été effectuées sur un Waters XEVO G2 TOF. Conditions de source ESI : tension capillaire : 0,5 kV, tension de cône : 45 V, cône d'extraction : 4 V, température de source : 120 °C, température de désolvatation : 400 °C, débit de gaz : 10 L/h, débit de gaz de désolvatation : 1200 L/h. Les analyses ont été effectuées en mode positif. Le spectromètre de masse a été étalonné avec du formiate de sodium pour une gamme de masse allant de 50 à 1200 Da. La Leucine-Enképhaline (lockmass) est le standard utilisé pour corriger les masses. Les deux masses caractéristiques de la Leucine-Enképhaline ont été vérifiées (278,1141; 556,2771). Les acquisitions ont été réalisées en mode MSE en utilisant l’argon comme gaz de collision. Fragmentation Le mode MSE permet l’acquisition simultanée de spectres de masse à l’énergie de collision faible et élevée, le premier permettant d’obtenir un ion parent, le dernier de produire des ions fragments. Expérimental Après dilution des extraits d'huile essentielle dans du méthanol, les alcaloïdes pyrrolizidiniques sont chromatographiés par système RP-UPLC, en mode gradient d'élution, détectés et identifiés par spectrométrie de masse et quantifiés par une méthode d’étalonnage externe. Substances de référence Les différents alcaloïdes pyrroliziniques et leurs oxydes sont obtenus auprès de Sigma-Aldrich. Leur pureté est donnée à 95 % minimum. Solutions de référence Des solutions standards d’alcaloïdes pyrrolizidiniques sont préparées comme suit : Dans une fiole jaugée de 100 mL (Vf), pesez exactement 10 mg (Ms) des substances étalons et ajustez avec du méthanol. Les solutions sont homogénéisées avec un bain à ultrasons pendant 3 min. La concentration de la solution standard est donnée par l'équation suivante : C (mg/mL) = (Ms x Pu)/(100 x Vf) Ms = Poids de la substance standard Pu = Pureté de la substance étalon en pourcentage Ensuite, cette solution mère est diluée jusqu'à obtenir les concentrations appropriées pour la sensibilité du détecteur. La solution standard sera préparée pour chaque étalonnage de la méthode quantitative. Préparation des échantillons Dans une fiole jaugée de 20 mL, on pèse exactement 1 g (Pe) de l'échantillon et on ajuste avec du méthanol. La solution est homogénéisée pendant 3 min avec un bain à ultrasons, puis filtrée à l’aide d’une seringue sur un filtre en PTFE de 0,25 µm, puis transférée dans un flacon d’injection. Si nécessaire, cette solution doit être successivement diluée pour tomber dans une plage de linéarité appropriée du détecteur. Exemple 2 : Démonstration du principe de l'invention Une étude quantitative destinée à montrer la présence ou l’absence d'alcaloïdes pyrrolizidiniques dans des échantillons d'huile essentielle enrichis en alcaloïdes pyrrolizidiniques a été réalisée avant et après hydrodistillation. Cette étude était limitée à quelques alcaloïdes pyrrolizidiniques disponibles commercialement et représentant deux classes précédemment décrites de type II et IV : alcaloïde type cyclique (classe la plus représentée) pour la sénécionine [130-01-8], sénécionine-N-oxyde [13268-67-2], rétrorsine [480-54-6], retrorsine-N-oxyde [15503-86-3], jacobine [3870-67-3], jacobine-N-oxyde [38710-25-7], seneciphylline [480-81-9], seneciphylline-N-oxyde [38710-26-8], et alcaloïde type mono-ester pour la lycopsamine [10285-07-1], lycopsamine-N-oxyde [95462-15-0], intermedine [10285-06-0], intermedine-N-oxyde [95462-14-9]. Préparation des échantillons enrichis en alcaloïdes pyrrolizidiniques Trois huiles essentielles de citron, d'orange et d'eucalyptus, jusqu'à 100 ppm de chacun des alcaloïdes pyrrolizidiniques et de leurs oxydes respectifs, ont été hydrodistillées séparément pendant deux heures selon le protocole décrit à l'exemple 1. L’expérimentation est réalisée en duplicate. Avant et après hydrodistillation, les phases organique et aqueuse sont séparées et injectées en UPLC-HRMS/TOF. Tableau 2 : Fragmentation des APs et de leurs oxydes respectifs obtenue en UPLC-HRMS Aucun des signaux correspondant à la sénécionine, sénécionine-N-oxyde, rétrorsine, retrorsine-N-oxyde, jacobine, jacobine-N-oxyde, seneciphylline, seneciphylline-N-oxyde, lycopsamine, lycopsamine-N-oxyde, intermedine, intermedine-N-oxyde n'a été observé dans la phase organique recueillie après hydrodistillation. (Tableau 2) . Ces expériences confirment les hypothèses de l’homme de l’art. Les alcaloïdes pyrrolizidiniques sont des substances classées dans la catégorie des petites molécules selon CAS. Néanmoins, avec des masses moléculaires supérieures à 300 DA, ainsi que des points d’ébullition élevés, une forte polarité, une forte solubilité et une très faible pression de vapeur, ces paramètres constituent un frein à leur transfert dans la phase huileuse pendant le procédé d’entrainement à la vapeur. La quasi-totalité des alcaloïdes pyrrolizidiniques ajoutés dans la phase organique est retrouvée dans la phase aqueuse comme le montre le tableau 3. φ Organique (d istill at ) φ Aqueus e (r é sidu de distillation) φ Organique (distillat) φ Aqueuse (résidu de distillation) C [ppm] CT [ppm] C [ppm] C [ppm] CT [ppm] C [ppm] 1 0,806 0,810 0,868 0,839 2 0,662 0,691 0,621 0,605 3 0,656 0,678 0,626 0,698 1 : Retrorsine ; 2 : Retrorsine-N-oxyde; 3 : Lycopsamine C : Concentration ; CT : Concentration théorique LOQ : 2 ppb Tableau 3 : Huile essentielle de Citron dopée – Dosage des APs sur le distillat et la phase aqueuse correspondante φ Organique (distillat) φ Aqueuse (résidu de distillation) φ Organique (distillat) φ Aqueuse (résidu de distillation) C [ppm] CT [ppm] C [ppm] C [ppm] CT [ppm] C [ppm] 1 0.797 0.663 0.828 0.711 2 0.457 0.678 0.593 0.612 3 0.550 0.588 0.597 0.621 4 0.028 0.024 0.030 0.027 1 : Retrorsine ; 2 : Retrorsine-N-oxyde; 3 : Lycopsamine ; 4 : Lycopsamine-N-oxyde C : Concentration ; CT : Concentration théorique LOQ : 2 ppb Tableau 4 : Huile essentielle de Citron dopée – Dosage des APs sur le distillat et la phase aqueuse correspondante Pour exemple, les profils UPLC-MS ciblés sur la retorsine et son oxyde, sur la lycopsamine ( , ) montrent que ces substances sont absentes dans l’huile essentielle de citron brute et distillée, mais aussi dans l’huile essentielle avec standards et distillée. Il en est de même pour les essences d’orange et d’eucalyptus. Procédé d'extraction/purification des alcaloïdes pyrrolizidiniques présents dans un extrait végétal d'intérêt, comprenant au moins une étape de lavage à l'eau dudit extrait. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit extrait végétal d'intérêt est hydrophile ou lipophile. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit extrait végétal d'intérêt est une huile essentielle, une solution alcoolique, une solution hydroalcoolique, un extrait aqueux obtenu par procédé subcritique ou supercritique, éventuellement des extraits solvants comme les concrètes ou résinoïdes, absolues, ou des extraits supercritiques. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite étape de lavage à l'eau est une étape d'hydrodistillation ou de distillation/rectification.