FR 3103378 A1 20210528 FR 1913322 A 20191127 Le complexe médicamenteux pour éliminer les cellules à potentiel métastatiques, comporte des nano/microparticules recouvertes d’anticorps ayant une fonction de ciblage des antigènes correspondant à la surface des cellules tumorales et, encapsulés dans ces nano/microparticules (10), au moins deux molécules de ciblage moléculaire différentes visant à inhiber des molécules-clés dans le processus métastatique. Dans des modes de réalisation, les nano/microparticules (10) sont recouvertes ou non avec du polyéthylène glycol (PEG). Dans des modes de réalisation, les molécules de ciblage comportent de la metformine et au moins un second inhibiteur de facteurs induits par l’hypoxie. DIAGNOSTIC COMPAGNON ET COMPLEXE MEDICAMENTEUX POUR CIBLER LES CELLULES METASTATIQUES DU CANCER DOMAINE TECHNIQUE DE L’INVENTION La présente invention concerne un diagnostic compagnon pour l’identification de patients atteints de cancer qui possèdent des cellules tumorales propres à développer des métastases et un traitement autorisé par la positivité du diagnostic compagnon visant à neutraliser ces cellules. La présente invention vise notamment à supprimer l’évolution métastatique d’un cancer qui est la cause d’une évolution fatale de la maladie. ETAT DE LA TECHNIQUE On rappelle qu’un test diagnostic devient un diagnostic compagnon lorsqu’il peut être utilisé pour définir/autoriser un ciblage thérapeutique spécifique des cellules tumorales identifiées comme cible potentielle. Aucun diagnostic compagnon n’est actuellement validé pour permettre l’identification des patients atteints de cancer qui possèdent des cellules tumorales propres à développer des métastases. De même, aucun traitement ciblé n’a été autorisé pour neutraliser ces cellules. OBJET DE L’INVENTION La présente invention vise à la mise au point (1) d’un diagnostic permettant d’identifier chez les patients atteints de cancer, les cellules tumorales à potentialité métastatique; (2) d’un «diagnostic compagnon» (voir la définition ci-dessus); (3) de la construction d’un complexe thérapeutique pour éliminer les cellules tumorales à potentiel métastatique, caractérisé en ce qu’il comporte un transporteur de type microparticule ou conjugaison médicament-anticorps, intégrant deux inhibiteurs dirigés contre des «check-points» impliqués dans la cascade d’événements moléculaires à la base du développement métastatique. Ces molécules à visée thérapeutiques ciblent les protéines HIFs et AXL. En effet, ces cibles sont connues pour être impliquées dans le mécanisme métastatique. Le ciblage thérapeutique proposé ici consiste à neutraliser les cellules souches tumorales qui ont la capacité de développer des tumeurs à distance de la tumeur primitive. On note que le complexe thérapeutique proposé doit cibler toute cellule tumorale qui pourrait acquérir des capacités métastatiques à un quelconque moment de son évolution par exemple au cours d’une « transition épithélio-mésenchymateuse » qui consiste pour une cellule cancéreuse à revenir en arrière dans son stade de différenciation en activant des caractéristiques de cellules souches avec réactivation de gènes normalement exprimés à des stades embryonnaires très immatures. Le complexe thérapeutique proposé pourra être administré à des patients qui auront été testés aptes à le recevoir grâce à un « diagnostic compagnon » préalable établissant leur exposition au développement métastatique. Le complexe thérapeutique proposé pourra être formulé essentiellement de deux façons basées sur des principes déjà connus : (1) l’encapsulation à l’intérieur d’un transporteur de type micro/nanoparticule de deux molécules de ciblage ; (2) la construction de complexes médicament-anticorps. Notre concept pour cibler les cellules tumorales ayant un potentiel métastatique doit être compris comme un tout, son originalité et nouveauté résidant dans l’association très particulière au sein d’un complexe thérapeutique de deux médicaments de ciblage moléculaire encapsulés dans une microparticule de ciblage cellulaire. Il s’agit donc ici d’un « double ciblage », étant à la fois cellulaire et moléculaire. Le concept habituellement utilisé pour le « diagnostic compagnon », est que la présence ou non d’une altération spécifiquement trouvée sur un gène de cellules tumorale indique la possibilité ou l’impossibilité d’un ciblage moléculaire dirigé contre cette altération (et conditionne l’autorisation ou non de son utilisation chez le patient). L’autre originalité de notre projet est que, contrastant avec le concept établi, la notion de diagnostic compagnon est étendue en identifiant la cible cellulaire tumorale selon un critère épigénétique (méthylation anormale d’un gène dans des cellules tumorales ayant acquis une potentialité métastatique) alors que le traitement ciblé est dirigé contre des protéines de la signalisation intracellulaire. La présente invention vise à remédier à ces inconvénients. A cet effet, selon un premier aspect, la présente invention vise un complexe médicamenteux pour éliminer les cellules à potentiel métastatiques, qui comporte des nano/microparticules recouvertes d’anticorps ayant une fonction de ciblage des antigènes correspondant à la surface des cellules tumorales et, encapsulés dans ces nano/microparticules, au moins deux molécules de ciblage moléculaire différentes visant à inhiber des molécules-clés dans le processus métastatique. Dans des modes de réalisation, les nano/microparticules sont recouvertes ou non avec du polyéthylène glycol (PEG). Dans des modes de réalisation, les molécules de ciblage comportent : - de la metformine et - au moins un second inhibiteur de facteurs induits par l’hypoxie. En effet, l’inventeur a découvert que ces molécules médicamenteuses présentent un effet contre la prolifération des cellules cancéreuses. Le traitement proposé ici consiste à neutraliser des cellules cancéreuses potentiellement métastatiques. Une fois validé, le complexe thérapeutique peut être prescrit aux patients positifs pour le diagnostic compagnon d’emblée ou pour cibler la maladie résiduelle. La combinaison des deux molécules génériques et d’un transporteur spécifique au type de cellule tumorale ciblée ainsi les deux principes actifs au sein de la cellule tumorale à potentialité métastatique permettent une efficacité sans commune mesure avec un traitement per os (par voie buccale). Le transporteur est aussi capable de cibler les cellules tumorales d’intérêt en s’amarrant directement au contact de la cellule tumorale. Un des intérêts de la présente invention réside dans le fait qu’elle d’utilise des molécules génériques dont la toxicité éventuelle est déjà testée et connue. Il serait donc possible d’entrer directement dans des études cliniques de phase 2. Par contre, la notion de complexe médicamenteux implique une place importante de la nanoparticule en tant qu’élément thérapeutique de ciblage des antigènes à la surface de cellules cibles. Il est donc envisageable que la FDA considérera qu’au-delà des molécules génériques, c’est l’ensemble du complexe avec nanoparticules qui devra être validé. L’utilisation de ces molécules comme thérapeutique ciblée, c’est-à-dire amenée directement à l’intérieur d’une cellule tumorale cible permettra de réduire considérablement la concentration intracellulaire et d’éviter toute toxicité périphérique. Dans des modes de réalisation, le complexe médicamenteux objet de la présente invention est destiné à réduire les métastases cancéreuses de cellules présentant une absence d’expression du gène codant pour la fructose1,6-biphosphatase. Dans des modes de réalisation, au moins un inhibiteur de facteurs induits par l’hypoxie comporte de la digoxine. Dans des modes de réalisation, la digoxine est dosée pour obtenir une concentration plasmatique entre 1 et 3 ng/ml. La digoxine présente, dans cette gamme de concentrations plasmatiques, un effet thérapeutique important, sans toxicité notable. Dans des modes de réalisation, au moins un inhibiteur de facteurs induits par l’hypoxie comporte de l’acriflavine. Dans des modes de réalisation, au moins un inhibiteur de facteurs induits par l’hypoxie comporte du PT2385. Ces molécules sont connues pour avoir des effets contre la prolifération des cellules cancéreuses. Dans des modes de réalisation, les nanoparticules sont des nano-liposomes PEGylés ou non, et en particulier des CombiPlex (marque déposée) qui sont utilisés en collaboration avec la société Celator Pharmaceuticals (marque déposée) en collaboration avec le laboratoire du Professeur Thierry Vandamme à l’Université de Strasbourg. Ces nano-liposomes peuvent transporter deux molécules et sont utilisés en injection afin de cibler spécifiquement les cellules tumorales. Dans un autre mode de réalisation, nous construirons des conjugués médicament-anticorps comme cela est détaillé plus loin. Selon un deuxième aspect, la présente invention vise un complexe médicamenteux objet de la présente invention pour le traitement du cancer du sein. Selon un troisième aspect, la présente invention vise un complexe médicamenteux objet de la présente invention pour le traitement du cancer de la prostate. Selon un quatrième aspect, la présente invention vise un complexe médicamenteux objet de la présente invention pour le traitement du cancer du pancréas. Selon un cinquième aspect, la présente invention vise un complexe médicamenteux objet de la présente invention pour le traitement du cancer du foie. Selon un sixième aspect, la présente invention vise un complexe médicamenteux objet de la présente invention pour le traitement du cancer du colorectal. Selon un septième aspect, la présente invention vise un complexe médicamenteux objet de la présente invention pour le traitement du cancer de l’estomac. Selon un huitième aspect, la présente invention vise un complexe médicamenteux objet de la présente invention pour le traitement du cancer du rein. Selon un neuvième aspect, la présente invention vise un complexe médicamenteux objet de la présente invention pour le traitement du cancer des ovaires. Selon un dixième aspect, la présente invention vise un complexe médicamenteux objet de la présente invention pour le traitement du cancer de type glioblastome. Selon un onzième aspect, la présente invention vise un complexe médicamenteux objet de la présente invention pour le traitement du cancer colorectal. Selon un douzième aspect, la présente invention vise un complexe médicamenteux objet de la présente invention pour le traitement du cancer du poumon. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES D’autres avantages, buts et caractéristiques particulières de l’invention ressortiront de la description non limitative qui suit d’au moins un mode de réalisation particulier du complexe médicamenteux objet de la présente invention, en regard des dessins annexés, dans lesquels : la figure 1 représente un liposome PEGylated, la figure 2 représente schématiquement des liposomes et la figure 3 représente, schématiquement, une nanoparticule mise en œuvre dans le complexe médicamenteux objet de la présente invention. DESCRIPTION D’EXEMPLES DE REALISATION DE L’INVENTION La présente invention vise un complexe médicamenteux pour éliminer les cellules à potentiel métastatiques, qui comporte des nano/microparticules recouvertes d’anticorps ayant une fonction de ciblage des antigènes correspondant à la surface des cellules tumorales et, encapsulés dans ces nano/microparticules, au moins deux molécules de ciblage moléculaire différentes visant à inhiber des molécules-clés dans le processus métastatique. Dans des modes de réalisation, les nano/microparticules sont recouvertes ou non avec du polyéthylène glycol (PEG). Dans des modes de réalisation, les molécules de ciblage comportent : - de la metformine et - au moins un second inhibiteur de facteurs induits par l’hypoxie. La présente description est donnée à titre non limitatif, chaque caractéristique d’un mode de réalisation pouvant être combinée à toute autre caractéristique de tout autre mode de réalisation de manière avantageuse. Par ailleurs, chaque valeur de paramètre d’un exemple de réalisation peut être mise en œuvre indépendamment d’autres valeurs de paramètres dudit exemple de réalisation. La figure 1 représente un liposome PEGylated. La figure 2 représente schématiquement des liposomes (extrait de : Lian Jin, Xin Zeng, Ming Liu, Yan Deng, Nongyue He Current Progress in Gene Delivery TechnologyBased on Chemical Methods and Nano-carriers. Theranostics2014 ; 4(3) :240-255. Doi :10.7150/thno.6914). Les liposomes sont des sphères de lipides synthétiques composés d’acide gras sur des polymères avec une ou plusieurs structures bi-membranaires entourant un centre aqueux pouvant être utilisé pour encapsuler des molécules (Figures 2A, 2B), des liposomes cationiques conjugués avec du polyethylene glycol (PEG) et/ou d’autres molécules (Figures 2C, 2D). La figure 3 illustre, schématiquement, une nanoparticule 10 mise en œuvre dans le complexe médicamenteux objet de la présente invention. On observe, en figure 3, que cette nanoparticule comporte : Une membrane bilamellaire composée de phosphatidylcholine désaturé (DSPC) : distearylphosphatidylglycerol (DSPG) et cholestérol dans un rapport molaire de 7 :2 :1, Une charge utile (dans le schéma elle est composée de deux agents cytotoxiques actifs, cytarabine et daunorubicine, encapsulés dans un espace aqueux des deux vésicules à un ratio de 5: 1 molaire constituée. Dans notre construction, nous encapsulons la metformine et au moins un second inhibiteur de facteurs induits par l’hypoxie (HIFs). D’autres types de nanoparticules que nous testons sont montrés dans la figure 2. Il s’agit de liposomes qui sont des sphères de lipides synthétiques composées d’acides gras sur des polymères avec une ou plusieurs structures bi-membranaires entourant un centre aqueux pouvant être utilisé pour encapsuler des molécules (figures 2A,2B). Nous testons aussi des constructions dans des liposomes cationiques conjugués avec du polyéthylène glycol (PEG) et/ou d’autres molécules telles que des ligands et peptides (figures 2C,2D) des particules de petites tailles, des structures contrôlées, avec une morphologie permettant une bonne stabilité. Finalement, nous utiliserons, aussi en collaboration avec Thierry Vandamme et son équipe des microparticules de type « Trojan » contenant des nanoparticules de poly (ethyl acrylate) ou poly (methyl acrylate) (Ikram UllahKhana, Christophe A. Serra, Nicolas Anton, Mériem Er-Rafik, C. Blanck, Marc Schmutz, Isabelle Kraus, Nadia Messaddeq, Christophe Sutter, Halina Anton, Andrey S. Klymchenko, Thierry F. Vandamme Microfluidicconceived Trojan microcarriers for oral delivery of nanoparticules. International Journal of Pharmaceutics 493 (2015) 7–15). Ce type de microparticule a précédemment été utilisé pour transporter efficacement le ketoprofen. De telles microparticules peuvent délivrer les nanoparticules incluses et 35% du ketoprofen encapsulé sur une période de 24 heures Il faut noter que toutes les constructions de nano/microparticules sont réalisées en collaboration dans le laboratoire du Pr. Thierry Vandamme. Des conjugués anticorps-médicament (CAM) (« Antibody-drugconjugates » (ADC)) constituent une classe émergente d'agents thérapeutiques anti-cancéreux qui combine la sélectivité du traitement ciblé avec l'activité cytotoxique des molécules chimiothérapiques. Les nouveaux développements de technologies de liaison associée à de nouvelles charges utiles cytotoxiques très puissantes a permis le développement de CAMs plus efficaces et sûrs. Au cours des dernières années, deux CAMs ont été autorisés dans le traitement du cancer, T-DM1 et brentuximabvedotin, De nombreux CAMs sont en phases I et II d’essais thérapeutiques avec des résultats prometteurs. Le récepteur HER-2 atteint des niveaux d'expression de 2 x 10 6 sur les cellules tumorales HER 2-positives, par rapport à 2 × 10 4 sur d'autres cellules (Shefet-Carasso et Benhar, 2015). Cependant, les études réalisées avec le T-DM1 qui cible HER-2 montrent que les patients atteints de tumeurs exprimant les plus hauts niveaux de HER-2 ont le mieux bénéficié du traitement par T-DM1 (Baselga et al, 2013). Cependant, la valeur seuil souhaitable pour l'expression de l'antigène est très variable et dépend d'autres propriétés de l'antigène cible, comme le taux d'internalisation et de l'affinité de liaison, ainsi que d'autres caractéristiques du CAM, telle que la charge cytotoxique utile et la stabilité de liaison. Il est démontré par ailleurs que les CAMs peuvent être efficaces même quand ils ciblent des antigènes avec une faible expression si l’expression tissulaire normale est négligeable (Perez et al, 2014). Par ailleurs, de nombreux facteurs peuvent influer sur le taux d'internalisation d’un CAM dans la cellule cancéreuse, par exemple la nature de l'épitope sur l'antigène cible. De fait, différents épitopes du récepteur HER-2 ont donné lieu à des taux significativement différents d'internalisation et de dégradation de la molécule de mAb-Ag. En outre, il existe d'autres difficultés en ciblant des antigènes de surface de cellules cancéreuses, telles que la haute pression interstitielle dans la tumeur, la régulation négative de l'antigène et la présence d'autres barrières physiques et cinétiques qui diminuent l'absorption de la charge cytotoxique (Mack et al, 2014 ; Perez et al, 2014). Nous avons défini l’antigène cible selon les critères suivants : L'antigène cible idéal: (a) doit être fortement exprimé sur les cellules identifiées comme potentiellement métastatiques à l’aide du « diagnostic compagnon », et avec une faible expression de tissus normaux; (b) ne doit pas être délesté de sa liaison pour empêcher la liaison d’anticorps libres à sa cible; (c) ne doit pas être régulé à la baisse après le traitement avec le CAM (Mack et al, 2014); (d) L'antigène cible ne doit pas être régulée à la baisse après le traitement avec l'ADC (Mack et al, 2014). L'anticorps doit être bien internalisé par endocytose médiée par le récepteur sans être modulée Dans un premier temps, sur des biopsies, nous évaluons les pourcentages de cellules fructose 1,6 biphosphatase négatives dans différents types de cancers en commençant par les cancers du poumon et de la prostate comme respectivement représentatifs de cancer souvent métastasé au diagnostic ou dont la prévision d’évolution métastatique ne peut être prédite de façon suffisamment précise. Nous évaluons dans ces cellules négatives pour le fructose 1,6 biphosphatasele niveau d’expression de deux antigènes classiquement exprimés sur les cellules tumorales les plus immatures, le CD44 et CD133. Ces deux antigènes sont connus pour être super-exprimés sur les cellules souches tumorales et internalisé lorsqu’exposés à des anticorps spécifiques (Dylan M. Glatt, Denis R. Beckford Vera, Matthew C. Parrott, J. Christopher Luft, S. RahimaBenhabbour, and Russell J. Mumper. The Interplay of Antigen Affinity, Internalization, and Pharmacokinetics on CD44-Positive Tumor Targeting of Monoclonal Antibodies Mol. Pharmaceutics, Article ASAP; doi : 10.1021/acs.molpharmaceut.6b00063; April 14, 2016 ; Monica Bostad, Kristian Berg, Anders Høgset, Ellen Skarpen, Harald Stenmark, Pål K. Selbo. Photochemical internalization (PCI) of immunotoxins targetingCD133 is specific and highly potent at femtomolar levels incells with cancer stem cell properties.Journal of Controlled Release 168 (2013) 317–326). Leur niveau d’expression et leur densité et leur internalisation sur et dans ces cellules sont analysés comme précédemment décrit pour l’antigène CD44 (Dylan M. Glatt, Denis R. Beckford Vera, Matthew C. Parrott, J. Christopher Luft, S. RahimaBenhabbour, and Russell J. Mumper. The Interplay of Antigen Affinity, Internalization, and Pharmacokinetics on CD44-Positive Tumor Targeting of Monoclonal Antibodies Mol. Pharmaceutics, Article ASAP; doi : 10.1021/acs.molpharmaceut.6b00063 ; April 14, 2016) en présence des CAMs qui auront été construits. Une priorité est donnée à l’antigène répondant au mieux à nos critères. Dans notre projet, l’objectif est de cibler des cellules initiatrices de tumeurs ou cellules souches tumorales qui représentent une sous-population agressive des cellules souches tumorales (CST) responsables de la croissance tumorale, la métastase et la récurrence. Nous percevons qu’un ciblage efficace de ces cellules aurait un grand impact sur la lutte contre le cancer (Visvader et Lindeman, 2008). Sapra et al (2013) ont mis au point un CAM combiné avec un inhibiteur de tubuline qui cible l'antigène onco-foetal 5T4, exprimé sur des cellules de NSCLC et associé à un phénotype invasif. Un essai de phase I de cette CAM recrute actuellement des patients atteints de NSCLC et d'autres tumeurs solides (figure 1). Les anticorps devenant une partie du CAM peuvent conserver leurs propriétés (Perez et al, 2014). Nous utilisons des anticorps commerciaux. Les propriétés du « lien » entre l’Ac et le médicament qui influencent grandement la pharmacocinétique du CAM, l'indice thérapeutique et l'efficacité (Hughes, 2010 ; Flygare et al, 2013 ; Shefet-Carasso et Benhar, 2015). Le lien doit être stable pour que le CAM ne libère pas le médicament avant d'atteindre sa cible. Dans le même temps, il doit être en mesure de libérer le médicament de manière efficace une fois internalisée (Teicher et Chari, 2011). Nous analysons le rapport de médicament-anticorps car la fixation de trop peu de molécules de médicaments entraînerait certainement une diminution de l'efficacité et une fixation en trop grand nombre pourrait déstabiliser le CAM et altérer ses propriétés pharmacocinétiques, augmenter la clairance plasmatique, réduire la demi-vie et accroitre la toxicité systémique (Perez et al, 2014). Nous recherchons un ratio Médicament-Ac se rapprochant de 4 (Hamblett et al, 2004 ; Teicher et Chari, 2011). Les liens peuvent être divisés en non-clivable et sécable. Lorsqu’on utilise des liens non clivables, la charge utile cytotoxique reste active tout en restant attachée à l'agent de liaison et un résidu d'acide aminé. T-DM1 est une ADC qui utilise un lieur non sécable (Junttila et al, 2011 ; Shefet-Carasso et Benhar, 2015). Il existe des groupes de liaison sensibles aux acides qui libèrent le médicament libre dans les conditions de pH faible dans les lysosomes ou des endosomes. Un tel mécanisme a été utilisé par gemtuzumabozogamicine et son linker a été caractérisée par certaine instabilité de plasma (Hamann et al, 2002 ; Shefet-Carasso et Benhar, 2015). Inotuzumabozogamicine, actuellement en essais de phase II, utilise le même lien et il est plus stable (Boghaert et al, 2008). Un autre type de liaison clivable sont linkers sensibles aux proteases lysosomales avec l'exemple de la licence brentuximabvedotin (Senter et Sievers, 2012). Un troisième type sont des groupes de liaison sensibles à la glutathione qui bénéficient de la plus forte concentration de glutathion dans les cellules tumorales. (Sapra et al, 2011). Chaque approche présente des avantages et des inconvénients différents, de sorte que différentes constructions sont testées. On détaille, ci-dessous, chacune de ces caractéristiques des molécules médicamenteuses que nous utiliserons. Préférentiellement, le complexe médicamenteux objet de la présente invention est destiné à réduire les métastases cancéreuses de cellules présentant une absence d’expression dela fructose 1,6-biphosphatase. Cette absence d’expression est détectée par un diagnostic compagnon. Le clonage du fructose-1,6-biphosphatase (“FBP”) dans le laboratoire dirigé par le Pr. Yvon Cayre au Memorial Sloan Kettering Cancer Center à New York a permis de montrer que le gène encodant le FBP est activé pendant la différentiation induite des cellules leucémiques. Sous un traitement similaire, le FBP ne peut être induit dans les cellules leucémiques les plus immatures. Il a aussi été montré que le FBP décroît de manière importante dans le carcinome de la cellule rénale (« ccRCC”). Il a ensuite été découvert que le FBP1 (pour fructose-1,6-bisphosphatase 1) s’oppose à la progression du carcinome de la cellule rénale : l’enzyme de la néoglucogenèse, FBP1 est diminué dans la ccRCC. De plus, FBP1, qui n’est pas muté, montre deux fonctions de suppression de tumeurs intervenant dans deux domaines séparés, ce qui explique la perte universelle de l’expression de FBP1 dans les tumeurs ccRCC. Dans les cellules de tumeurs ccRCC, le FBP1 (qui est présentdans le noyau cellulaire) impacte la croissance de la cellule et le métabolisme du glucose indépendament de son activité catalytique, en inhibant les HIFα (pourhypoxia-inducible factor, alpha subunit) par son domaine régulateur. On rappelle ici que les facteurs induits par l’hypoxie (ou HIF, sigle de l’anglais HypoxiaInducibleFactors) sont des protéines agissant comme facteurs de transcription dans tous les tissus et régulés par l’absence d’oxygène. D’un point de vue physiologique, l’hypoxie tissulaire est traitée en stimulant la sécrétion de l’hormone érythropoïétine (EPO) qui engendre la production de globules rouges, et, par conséquent, améliore le transport d’oxygène aux tissus cibles. Au niveau moléculaire, ce travail est majoritairement assuré par les HIF-1, soit le complexe le plus actif de la famille des HIFs. Cette protéine a été découverte en 1992 par un chercheur du nom de Gregg Semanza qui étudiait le gène de l’EPO. En fait, il a découvert une séquence située en position 3’ non-codante dans le promoteur de l’EPO, qui porte le nom d’hypoxiaresponseelement (HRE) et qui fixe les HIF-1 en situation d’hypoxie. Par la suite, la séquence HRE a aussi été localisée sur plus de 70 autres gènes, tel le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire. Ainsi, la protéine FBP1 (qui pourrait être codée par deux ARN messagers initialement identifiés par Yvon Cayre et dont seulement un codait pour la fonction enzymatique) a deux domaines séparés intervenant sur deux fonctions anti-tumorales, la néoglucogenèse et son action comme co-facteur d’inhibition des HIFs, chacune desquelles devant être atténuées pendant la progression des ccRCC. Cette double fonction de la protéine FBP1 explique sa perte permanente dans les ccRCC et suggère fortement une fonction suppressive de tumeur générale, ce qui la distingue des suppresseurs de tumeurs précédemment identifiés qui ne sont pas constamment modifiées dans toutes les tumeurs. Beaucoup d’études ont montré que la méthylation du gène est une modification épigénétique majeure de l’ADN qui peut inhiber la transcription. La méthylation joue un rôle important dans le développement du cancer et contribue aux anomalies métaboliques. Récemment, un complexe Snail-G9a-Dnmt1 a été identifié comme intervenant dans la méthylation de promoteur de FBP1, réduisant le niveau de FBP1 dans les cellules cancéreuses de cancer du sein de type basaloïde, suggérant un possible mécanisme pour réduire encore plus l’expression de FBP1. Un phénomène appelé « EMT » (pour "epithelial-mesenchymal transition", ou transition épithélio-mésenchymateuse) caractéristique du développement de l’embryon, du remodelage tissulaire et de la cicatrisation peut être réactivé dans certaines cellules tumorales. Cet EMT confère aux cellules cancéreuses des caractéristiques de cellules souches (« cellules souches tumorales ») qui facilitent la dissémination métastasique. Le retour de certaines cellules tumorales à des stades très immatures de la différenciation cellulaire permet la réactivation de gènes embryonnaires et en particulier de facteurs et cofacteurs de transcription contrôlant l’expression de gènes qui ne sont pas exprimés dans des cellules tumorales n’ayant pas été l’objet d’une transition épithélio-mésenchymateuse. C’est exactement ce qui se passe pour le gène codant pour la FBP dont la méthylation par le complexe de transcription Snail-G9a-Dnmt1 provoque l’extinction. Il a été montré que la perte de FBP1 est un événement critique dans la transition ontogénétique épithelial-mésenchymal et le cancer du sein de type basal (en anglais « basal-like breast cancer » ou BLBC). Les données indiquent que la perte de FBP1 augmente de manière importante les traits ou lignées de cellules souches circulantes en réduisant la production de ROS (pour « reactiveoxygenspecies »). Il a aussi été montré que le FBP1 est une cible majeure des facteurs Snails pour contrôler la glycolyse. Le complexe Snail-G9a-Dnmt1 est responsable dela réduction de FBP1 dans le BLBC. L’absence d’expression de FBP1 est nécessaire pour que se produise la transition épithélio-mésenchymateuse sous le contrôle de Snail ( Snail-mediated EMT) et la conversion du phénotype du cancer du sein du type luminal au type basal. L’inactivation par méthylation du FBP1 est aussi un phénomène commun dans le cancer du foie et du colon. FBP1 apparaît comme un facteur suppresseur de tumeur fonctionnel aussi dans ces deux types de cancer. Des constatations similaires ont été faites dans le cancer du poumon où les facteurs embryonnaires, en particulier ZEB1 , qui sont des facteurs impliqués dans l’EMT, agissent comme des répresseurs de l’expression de la FBP1, conférant ainsi aux cellules tumorales des capacités de croissance et invasives. Il a été établi depuis longtemps que le cancer est une maladie avec une composante métabolique élevée. Le rôle potentiel de FBP2 a été étudié dans le cancer de l’estomac (ou « GC » pour Gastric Cancer), FBP2 étant une enzyme qui catalyse l’hydrolyse du fructose 1,6-bisphosphate en fructose-6-phosphate et en phosphate inorganique dans le métabolisme du glucose phosphate. Les résultats ont montré que, par méthylation, FBP2 décroît dans les tissus du cancer de l’estomac et son absence ou sa faible expression est corrélée avec une courte survie du patient. Depuis plus de 50 ans, la metformine a été l’un des traitements antidiabétiques prescrits mondialement les plus efficaces et les mieux tolérés. La metformine prise seule est un médicament relativement sans danger pour un usage clinique avec des effets secondaires d’importance limitée, comportant des désordres gastro-intestinaux (diarrhée, nausée et irritation de l’abdomen). La principale toxicité connue est l’acidose lactique, très rare (9 pour 100,000). Un rapport récent suggère que la metformine est associée à des désordres de fonctions cognitives et ces études se poursuivent. La sécurité globale de la metformine avec des effets secondaires rare et de faible importance ajoute à son intérêt comme traitement du cancer du sein et de la co-morbidité pour des patients diabétiques atteints d’un cancer. La metformine a été associée à des réductions de risques de cancer dans des études épidémiologiques sur des patients diabétiques. Il a été reporté que la comorbidité du cancer du sein et des diabètes était associée avec un accroissement de risque de décès de 49 % quelle qu’en soit la cause et des effets averses augmentés en réponse à une chimiothérapie. Les pré-diabètes et l’hyper-insulinémie des patients atteints d’un cancer du sein ont aussi été associés à des taux de mortalité plus élevés. Des études épidémiologiques ont montré que les pré-diabètes, les diabètes sucrés préexistants, sont des facteurs de risque pour le cancer avec un plus faible résultat pour les cancers du sein de patient diabétiques que pour les patients non diabétiques. La metformine permet d’envisager une réduction des risques de cancer, y compris le cancer du sein. Des études précliniques ont montré que la metformine pouvait inhiber la croissance des cellules cancéreuses in vitro et in vivo . La metformine a aussi été associée à une réduction significative des risques relatifs pour des cancers spécifiques, tels que les cancers de la prostate, du pancréas et du sein. Des travaux ont identifié des voies de signalisation prédominantes dans le cancer du pancréas, spécifiquement : l’activité mitochondriale, l’activation de l’AMPK, l’inhibition de mTOR et de l’IGF-1R et HIF-1α. Ils ont mis en évidence la nécessité d’obtenir une meilleure stratification des patients et des essais cliniques mieux planifiés comprenant l’AMPK, mTOR, HIF-1 α, l’IGF-1R, ainsi que le dosage de la metformin. La metformine inhibe la prolifération de cellules malignes de l’endomètre, du sein, de la prostate et des ovaires in vitro . Relation de la metformine et des métastases Le carcinome ovarien, la troisième morbidité parmi les cancers gynécologiques, continue à présenter la plus haute mortalité, malgré la gestion stratégique courante qui a substantiellement amélioré le taux de survie médian. Il a été montré, in vitro , que la metformine inhibe la prolifération, l’adhérence, l’invasion et la migration dans les lignées de cellules cancéreuses ovariennes épithéliales humaines, d’une manière dépendant du temps et de la dose utilisée. De plus, la metformine inhibe la croissance et la métastase de ces cancers ovariens in vivo dans un modèle de souris « nudes ». Dans le cas des carcinomes de cellules squameuses du cou et de la tête (Head and Neck SquamousCellCarcinoma, HNSCC), les approches thérapeutiques conventionnelles sont associées avec des effets adverses qui réduisent la qualité devie. Aussi, l’identification de nouveaux traitements moins cytotoxiques est très importante. Quelques études cliniques ont examiné la relation entre la metformine et les HNSCC. Ces études ont démontré que les personnes prenant de la metformine possèdent un taux réduit de récurrences locorégionales et de métastases et ont un taux moyen de survie et de survie sans maladie améliorés. Les personnes prenant de la metformine ont une incidence réduite de HNSCC par rapport aux personnes ne prenant pas de metformine. Les mécanismes anti-cancer de la metformine. L’action de la metformine a été montrée comme accroissant la sensibilité à l’insuline in vivo , induisant une réduction des concentrations de glucose plasmatique, une assimilation de glucose accrue et une gluconéogenèse réduite. De hauts niveaux d’insuline sont associés à un risque accru de cancer du sein et une faible survie des patients. La preuve que la metformine résulte en (i) l’initiation d’une réponse au stress énergétique dépendant de la « LKB1(Liver Kinase B1) -mediated AMPK (AMP-activatedprotein kinase) » qui peut de façon adverse affecter la survie des lignées de cellules cancéreuses, et (ii) l’inhibition de la « phosphoinositide 3-kinase/Akt/mammaliantargetofrapamycinsignaling », menant à une prolifération réduite de lignées de cellules cancéreuses, a fourni une base moléculaire pour un effet anti-cancer direct, insulino-dépendant et renforcé la compréhension pour évaluer la metformine dans les essais cliniques sur le cancer. La résistance potentielle des cellules cancéreuses à la metformine doit aussi être considérée. Particulièrement, l’exposition chronique à la metformine a été utilisée pour établir la résistance des cellules de cancer du sein, qui développent une haute expression métastatique comme des cellules souches. L’efficacité de la metformine est aussi réduite dans les cancers du sein avec surexpression de BCA2, un gène associé à une fonction de suppression d’AMPK (protéine kinase activée par l'AMP). L’AMPK régule négativement la glycolyse aérobie (l’effet Warburg) dans les cellules cancéreuses et supprime la croissance de la tumeur in vivo . L’inactivation de l’AMPK, tant dans les cellules transformées que dans les cellules non transformées promeut un passage métabolique à la glycolyse aérobie. L’inhibition de l’expression des HIF-1par un « Small Hairpin RNA » (shRNA, ou « RNA en épingle à cheveux ») annihile les effets de la perte d’AMPKsur laglycolyse aérobie, la biosynthèse et la croissance tumorale in vivo . Ces études sont favorables à une approche génétique individualisée pour des mutations génétiques spécifiques, telles que les HIF, avec un traitement combiné pour réduire la résistance acquise à la metformine. Beaucoup d’études sur les effets de la metformine utilisent des surdosages. Cependant, il a été démontré que des faibles concentrations de metformine étaient associés à la réduction de ERK et de phosphorylation mTOR indépendante de la phosphorylation AKT et AMPK dans les cellules cancéreuses du pancréas, exprimant CD133, un marqueur de surface considéré caractéristique de cellules avec prolifération extensive et présentant des capacités d’auto-renouvellement (cellules souches tumorales). Un effet d’inhibition sélectif similaire a été observé sur les cellules positives au CD133 de cancers de type glioblastome. Dans le NSCLC, l’évaluation de l’expression CD133 est corrélée avec des stades pathologiques et est prédictif d’un pronostic défavorable pour les stades II à IV. Ces résultats peuvent fournir un rôle à l’évaluation par immuno-histochimie (Immunohistochemistry ou IHC) de CD133 comme biomarqueur pour prédire la réponse. Des résultats montrant que le FDP est partie prenante dans le développement de métastases et la description des signes mis en œuvre doit impliquer une nouvelle approche des mécanismes par lesquels la metformine peut avoir un effet antitumoral. Il faut noter que la metformine inverse les HIF/Gas6 et la cascade qui la suit la ramenant à un statu quo observé lorsque le FDP est exprimé. En particulier, lorsque la metformine réduit les taux basiques accélérés de néoglucogenèse hépatique sans effet apparent sur le cycle du lactate de la néoglucogenèse ou sur la sécrétion d’insuline accrue, la metformine régule à la baisse la cascade HIF/AXL/ROS qui a été montrée comme étant un chemin critique de la métastase. Il a été montré que la metformine spécifiquement réduit l’expression des HIF-1 et de leurs gènes cibles spécifiques. La metformine provoque une réduction de l’expression d’Axl (une kinase detyrosine récepteur, ou receptor tyrosine kinase), l’inactivation des effecteurs qui en dépendent et réduite le niveau de protéine anti-apoptotique, formant une stratégique possible pour faciliter l’activité anti-cancer aussi bien que pour franchir les chimiorésistances dans les cellules cancéreuses ovariennes. Il a été observé que la metformine réduit significativement les niveaux de ROS (espèces réactives à l’oxygène ou « reactiveoxygenspecies ») intracellulaire induites par l’acide palmitique. De plus, la metformine accroît l’expression de lathiorédoxineanti-oxydante (Trx), qui intervient dans les effets de la metformine dans la réduction de ROS. La metformine active l’AMPK et réduit l’activité d’oxydase du NAD(P)H, menant finalement à la réduction de production de ROS dans les cultures de podocytes. On décrit, ci-dessous, trois exemples d’inhibiteurs de HIF pouvant être mis en œuvre dans le complexe médicamenteux objet de la présente invention. A/ La digoxine Il a été découvert que les HIF-1 (hypoxia-inducible factor) contrôlent les gènes qui permettent aux cellules de survivre en faible oxygène, comme des cellules dans les tumeurs solides. Il a été montré que la chimiothérapie active les HIF et que les HIF augmentent la survie des cellules souches de cancer du sein, qui sont les cellules cancéreuses qui doivent être tuées pour prévenir la rechute et les métastases. Cela est lié à l’augmentation des niveaux de la protéine 1 multi-résistante aux médicaments (PDR1), qui agit comme une pompe pour évacuer la chimiothérapie des cellules cancéreuses. Il a été trouvé que la digoxine, communément utilisée pour traiter des arythmies cardiaques, peuvent bloquer la production des HIF-1 et peut stopper la croissance des cellules cancéreuses de la prostate et du foie. D’autres médicaments qui inhibent les HIFs ont aussi été identifiés et sont testées sur des patients atteints de cancer. Si ces résultats sont vérifiés dans des essais cliniques, les patients potentiellement sans réponse à la chimiothérapie pourraient être identifiés avant le traitement et une combinaison thérapeutique plus efficace pourrait leur être administrée. D’autres chercheurs ont trouvé que, pour les patients atteints d’un cancer du sein, un accroissement de l’activité des HIF-1 est corrélé avec un accroissement des métastases et une décroissance de la survie. Les tumeurs du sein humaines contiennent des régions d’hypoxie dans lesquelles les cellules qui sont éloignées d’un vaisseau sanguin fonctionnel ont des concentrations d’oxygènes significativement réduites, en comparaison avec les tissus mammaires normaux. Les cellules cancéreuses du sein s’adaptent leurs conditions hypoxiques en accroissant les niveaux des HIFs (hypoxia-induciblefactors), ce qui induit l’expression de multiples gènes mis en œuvre dans l’angiogenèse, l’utilisation de glucose, la résistance au stress oxydatif, la prolifération cellulaire, la résistance à l’apoptose, l’invasion et les métastases. Les patients ayant un cancer du sein et des niveaux d’expression des HIF accrus dans les biopsies tumorales primaires présentent un risque accru de métastases. Ceci est une découverte importante parce que 90 % des morts par cancers du sein résultent des métastases, premièrement aux os, poumons, foie, cerveau et aux ganglions lymphatiques régionaux. Certaines études récentes ont impliqué les gènes cibles des HIFs à chaque étape du processus métastatique. Des médicaments tels que la digoxine, montrent des effets thérapeutiques potentiels pour bloquer l’activité des HIF en réduisant la croissance tumorale primaire, la vascularisation, l’invasion et les métastases dans des modèles animaux du cancer du sein. On doit noter que la digoxine inhibe les HIF-1 à 100 nM et discuter de ce que les concentrations plasmatiques thérapeutiques de la digoxine chez les patients cardiaques sont d’environ 10 à 30 nM (nanomoles) c’est-à-dire très au-dessous de la concentration requise pour une inhibition maximale de HIF-1α dans les cellules tumorales hypoxiques après 24 heures d’exposition au traitement. L’utilisation clinique extensive de la digoxine a montré que les concentrations plasmatiques thérapeutiques sont de l’ordre de 2 ng/ml (~2 nM/L), préférentiellement entre 1 et 3ng/ml, et encore plus préférentiellement entre 1,5 et 2,5 ng/ml. La présente invention propose la digoxine comme deuxième thérapie ciblée, utilisée dans des concentrations très inférieures aux concentrations plasmatiques thérapeutiques habituelles. En effet, l’utilisation de la digoxine comme thérapeutique ciblée, c’est-à-dire amenée directement à l’intérieur d’une cellule tumorale cible permet de réduire considérablement la concentration intracellulaire et d’éviter toute toxicité périphérique. Comme exposé ci-dessus, il a été montré que la digoxine stoppe la croissance des cellules cancéreuses de la prostate. Une étude a montré que les hommes prenant de la digoxine pour traiter des insuffisances cardiaques globales ou pour traiter des arythmies avaient 25 % de moins de risque de développer un cancer de la prostate. Et pour ceux prenant de la digoxine depuis plus de 10 ans, le risque était réduit de 40 %. B/ PT2385 Des données précliniques indiquent qu’un nouveau composé, PT2385, supprime l’expression de gènes essentiels pour la croissance tumorale, la prolifération, et l’angiogenèse. PT2385 est le premier antagoniste en phase clinique pour les HIF-2α (hypoxiainducible factor-2α), un facteur de transcription impliqué dans le développement et la progression du cancer du rein, notamment ccRCC. Les données précliniques ont montré que le PT2385 est puissant, sélectif et facilement absorbé. La perte du facteur suppresseur de tumeur de von Hippel-Lindau (VHL) est l’événement oncogénique clé pour au moins 95 % des patients présentant le cancerccRCC. Avec la perte de la protéine VHL (pVHL), le facteur de transcription HIF-2α s’accumule et conduit à une expression déséquilibrée de nombreux gènes. HIF-2α a été largement considéré comme ne pouvant pas être ciblé, et PT2385 est la première molécule envisagée pour une utilisation en clinique et qui se lie directement et spécifiquement à HIF-2α en inhibant fortement son activité transcriptionnelle. Les données précliniques indiquent que le PT2385 biodisponible pour la prise par voie orale désorganise l’activité de HIF-2dans le ccRCC et ainsi bloque l’expression de plusieurs facteurs tumorigéniques responsables de la croissance incontrôlée et la prolifération des cellules cancéreuses, de l’angiogénèse tumorale et de la suppression des réponses immunes anti-tumorale caractéristiques du ccRCC. C/ L’Acriflavine. L’acriflavine stoppe la croissance des vaisseaux sanguins en inhibant la fonction de HIF-1. Lorsque HIF-1 détecte que l’environnement est faible en oxygène, il induit l’expression de gènes nécessaires pour construire de nouveaux vaisseaux sanguins. Bien que essentielles pour la croissance des tissus normaux et la cicatrisation, HIF-1 est aussi induit dans les cellules cancéreuses pour obtenir l’oxygène nécessaire à leur survie. Il est important de noter que, pour que HIF-1 soit activé, deux sous-unités doivent s’assembler comme les pièces d’un puzzle. La plupart des médicaments sont incapables de prévenir l’assemblage de protéines parce que les molécules médicamenteuses peuvent être beaucoup plus petites que les protéines avec lesquelles elles interagissent. Un traitement doit atteindre précisément et uniquement la bonne cible, un domaine critique ou une poche sur la surface d’une protéine, pour l’empêcher de s’assembler avec une autre protéine. Même si les médicaments qui inhibent l’assemblage des protéines sont rares, ils sont un moyen très efficace pour stopper les fonctions des protéines. Un tel médicament qui pourrait bloquer HIF-1 a été recherché activement et l’acriflavine a été identifiée parmi 3000 composants testés comme le candidat recherché. Il a été montré que l’acriflavine peut être utilisée contre les cellules tumorales du cancer colorectal (CRC). L’acriflavine a montré son activité contre les cellules hypoxiques, plus dans le cas des CRC que dans les cancers ovariens. Pour transporter la metformine et la digoxine, l’acriflavine ou PT2385, la présente invention utilise préférentiellement une plateforme de délivrance de médicament qui met en œuvre des nano/microparticules de nature essentiellement nano-liposomes PEGylés ou non, et en particulier des CombiPlexqui sont utilisés en collaboration avec la société Celator Pharmaceuticals en collaboration avec le laboratoire du Professeur Thierry Vandamme à l’Université de Strasbourg. Ces nano-liposomes peuvent transporter deux molécules et sont utilisés en injection afin de cibler spécifiquement les cellules tumorales. Nous utiliserons, aussi en collaboration avec le Professeur Thierry Vandamme et son équipe des microparticules de type « Trojan » contenant des nanoparticules de poly (ethyl acrylate) ou poly (methyl acrylate) comme déjà décrites. Comme détaillé précédemment, nous utilisons aussi des conjugués anticorps-médicament (CAM) selon l’Anglais « Antibody-drugconjugates » (ADC). Comme on le comprend à la lecture de la description qui précède, le complexe médicamenteux objet de la présente invention permet un traitement qui consiste à neutraliser des cellules cancéreuses potentiellement métastatiques. Une des originalités de l’invention est qu’elle utilise des molécules existantes génériques. Pour sa mise en œuvre, on associe à ce complexe médicamenteux, un diagnostic compagnon en utilisant l’absence d’expression de la fructose 1,6-biphosphatase comme une caractéristique des cellules tumorales à potentialité métastatique. Ce diagnostic permet également de quantifier le niveau et l’agressivité métastatique du cancer original. Ce diagnostic compagnon, réalisé à partir des cellules tumorales obtenues par biopsie, chirurgie ou/et du sang circulant du patient est surtout nécessaire pour le marché américain. En effet, la FDA ne permet l’utilisation de traitement ciblé que dans le cas d’un diagnostic probant et non ambigu indiquant que la cellule cible possède spécifiquement les caractéristiques moléculaires permettant à la molécule thérapeutique de ciblage d’être efficace. Considérant que la Food and Drug Administration (FDA) Américaine souhaite fortement que tout nouveau traitement « ciblé » (on peut considérer ici que la metformine aussi bien que l’inhibiteur de HIF sont des thérapeutiques ciblées) soit associé à un « diagnostic compagnon » (i.e. un test qui indique que la cible est bien présente dans la cellule tumorale ; ici l’absence de fructose 1,6-biphosphatase). Un des intérêts de l’approche thérapeutique de la présente invention réside dans le fait d’utiliser des molécules génériques dont la toxicité éventuelle a déjà été testée et connue et qui devraient donc permettre d’entrer directement dans des études cliniques de phase 2. Complexe médicamenteux pour éliminer les cellules à potentiel métastatiques, caractérisé en ce qu’il comporte des nano/microparticules recouvertes d’anticorps ayant une fonction de ciblage des antigènes correspondant à la surface des cellules tumorales et, encapsulés dans ces nano/microparticules (10), au moins deux molécules de ciblage moléculaire différentes visant à inhiber des molécules-clés dans le processus métastatique. Complexe médicamenteux selon la revendication 1, dans lequel les nano/microparticules (10) sont recouvertes avec du polyéthylène glycol (PEG). Complexe médicamenteux selon l’une des revendications 1 ou 2, dans lequel les molécules de ciblage comportent : de la metformine et au moins un second inhibiteur de facteurs induits par l’hypoxie. Complexe médicamenteux selon l’une des revendications 1 à 3, destiné à réduire les métastases cancéreuses de cellules présentant une absence d’expression du gène codant pour le fructose 1,6-biphosphatase. Complexe médicamenteux selon la revendication 3, dans laquelle au moins un inhibiteur de facteurs induits par l’hypoxie comporte de la digoxine. Complexe médicamenteux selon la revendication 5, dans lequel la digoxine est dosée pour obtenir une concentration plasmatique entre 1 et 3 ng/ml. Complexe médicamenteux selon la revendication 3, dans laquelle au moins un inhibiteur de facteurs induits par l’hypoxie comporte de l’acriflavine. Complexe médicamenteux selon la revendication 3, dans laquelle au moins un inhibiteur de facteurs induits par l’hypoxie comporte du PT2385. Complexe médicamenteux selon l’une des revendications 1 à 8, dans lequel les nano/microparticules (10) sont des nano-liposomes PEGylés. Complexe médicamenteux selon l’une des revendications 1 à 8, dans lequel les nano/microparticules sont des nanoparticules de poly (ethylacrylate) ou de poly (methylacrylate). Complexe médicamenteux selon l’une des revendications 1 à 8, dans lequel les nano/microparticules sont des conjugués anticorps-médicament (CAM). Complexe médicamenteux selon l’une des revendications 1 à 11, pour le traitement du cancer du sein, de la prostate, du pancréas, du foie, colorectal, de l’estomac, du rein, des ovaires, de type glioblastome ou du poumon. DIAGNOSTIC COMPAGNON ET COMPLEXE MÉDICAMENTEUX POUR CIBLER LES CELLULES MÉTASTATIQUES DU CANCER