FR 3111267 A1 20211217 FR 2006175 A 20200612 PROCEDE POUR DETERMINER UNE CONCENTRATION REELLE D’UN SUBSTRAT A L’AIDE D’UN ENSEMBLE DE BIOCAPTEURS AUTO-CALIBRES ET DISPOSITIF POUR LA MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE La présente invention porte sur un Procédé pour déterminer, de façon stable au cours du temps, une région dans laquelle se situe la concentration réelle, dans un milieu, d’un substrat (S 1 ) constitué par toute molécule susceptible de subir une oxydo-réduction catalysée par un catalyseur, caractérisé par le fait qu’il comprend les étapes suivantes : a) prendre au moins un groupe d’au moins deux biocapteurs, chaque biocapteur présentant une courbe d’étalonnage du signal induit par la réaction d’oxydo-réduction : les biocapteurs d’un groupe présentant des parties initiales identiques de leurs courbes d’étalonnage jusqu’à une valeur de concentration en substrat (S 1 ), dite concentration de séparation (CS), à partir de laquelle la mesure du signal diffère d’un biocapteur à l’autre du groupe ; et lorsque plus d’un groupe est présent, les biocapteurs des différents groupes présentant des courbes d’étalonnage différentes, sans présenter de parties initiales identiques ; b) mettre les biocapteurs en contact avec ledit milieu ; c) mesurer le signal induit par la réaction d’oxydation ou de réduction pour chacun des biocapteurs du ou des groupes ; d) comparer toutes les valeurs des signaux donnés par tous les biocapteurs, et suivre la méthode décrite dans la description. PROCEDE POUR DETERMINER UNE CONCENTRATION REELLE D’UN SUBSTRAT A L’AIDE D’UN ENSEMBLE DE BIOCAPTEURS AUTO-CALIBRES ET DISPOSITIF POUR LA MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE La présente invention porte sur un procédé pour déterminer, de façon stable au cours du temps, une région dans laquelle se situe la concentration réelle dans un milieu, d’un substrat qui est susceptible d’oxydo-réduction avec une enzyme, à l’aide d’un ensemble de biocapteurs et sur un dispositif pour la mise en œuvre du procédé. Le diabète est une maladie épidémique mondiale qui affectait 422 millions de personnes en 2014, contre 108 millions en 1980 et devrait être la septième cause de décès dans le monde si les tendances actuelles de morbidité se poursuivent [1,2,3]. En 2016, près de 12% de la population française était diagnostiqué avec un problème de diabète [4]. En plus d’augmenter le taux de mortalité, le diabète et ses complications infligent des pertes économiques considérables et des dépenses de sécurité sociale importantes (arrêt de travail, traitements, soins hospitaliers…) [4]. En effet, en France, le coût du traitement du diabète est d’environ 10 milliards d'euros, dont 80% liés au traitement des complications. Or ces complications pourraient justement être anticipées et/ou évitées avec des dispositifs fiables de mesure de la glycémie en temps réel [5]. L’émergence de capteurs de glucose a permis aux patients de gérer leurs niveaux d'insuline et donc de contribuer à limiter la mortalité du diabète. Les dispositifs de test de glucose traditionnels comprennent des capteurs de glucose basés sur des méthodes électrochimiques (glucomètre). Un biocapteur à glucose est constitué d’une électrode de travail à base de matériaux conducteurs associés à une enzyme capable de catalyser l’oxydation du glucose telle que la glucose oxydase (GOx) et la glucose déshydrogénase (GDH) et d’une contre-électrode qui peut être en platine, en or ou en carbone. L’enzyme est immobilisée sur ou au voisinage de la surface de l’électrode. Fréquemment, l’enzyme est associée à un médiateur redox qui permet le transfert d’électrons entre l’enzyme et l’électrode. Les médiateurs les plus utilisés dans le cas de la GOx sont le ferrocène, le ferrocynaure et les complexes d’osmium. L’électrode de travail et la contre-électrode sont mises en contact avec l’échantillon à tester et lorsqu’une tension est appliquée entre l’électrode de travail et la contre-électrode un courant électrique circule dans le circuit crée par les électrodes et l’échantillon à tester. Ce courant est induit par la réaction d’oxydation du glucose à l’électrode de travail qui est catalysée par l’enzyme et la valeur de ce courant est fonction de la concentration du glucose dans l’échantillon à tester. L'analyse glycémique la plus courante consiste à effectuer un certain nombre de tests chaque jour ou chaque semaine en analysant un petit échantillon de sang [5,6], ce qui est incommode, peu confortable et entraîne donc une mauvaise acceptabilité par les patients. Par ailleurs, de tels tests ne tiennent pas compte des périodes de repos et entraînent des approximations sur les mesures. En outre, ce type de surveillance ne fournit pas d’informations en temps réel et ne peut donc pas prévenir les événements hypoglycémiants ( 11,1 mM) à l'avance. Une surveillance autonome continue de la glycémie est cruciale pour comprendre les tendances, la direction et la fréquence des changements de celle-ci. Il existe des glucomètres interstitiels qui permettent aux diabétiques de suivre leur glycémie en temps réel avec des patchs placés sur la peau. Cependant, ces dispositifs doivent être remplacés toutes les deux semaines à cause de la dérive du biocapteur. En effet, la dérive dans le temps des biocapteurs enzymatique en général et ceux du glucose en particulier est le verrou majeur de développement de biocapteurs enzymatiques capables de garder leur sensibilité sur de long périodes sans avoir besoin d’être re-calibrés ou remplacés. Un biocapteur enzymatique électrochimique se dégrade au fur et à mesure du temps. La stabilité décroissante des enzymes, la baisse de leurs activités catalytiques et la dégradation de l’électrode en sont la cause . montre ce phénomène et son impact direct sur la quantification du glucose Sur la sont représentés trois graphiques illustrant la vitesse de la réaction se produisant à l’électrode de travail d’un biocapteur électrochimique en fonction de la concentration du glucose. Sur le graphique de gauche, la concentration en glucose à une vitesse donnée est déterminée (les vitesses β et δ correspondent à des taux de glucose sanhuin (TGS) de α et γ). Au fil du temps, la dégradation enzymatique modifie les vitesses réactionnelles. Ceci est visible sur le graphique central de la : le TGS α n’est plus défini par la vitesse β mais par la vitesse δ. Les valeurs délivrées par le biocapteur ne sont donc plus fiables. Ainsi, une calibration est nécessaire, représentée par le graphique de droite. La calibration s’effectue de la manière suivante : L’utilisateur mesure son TGS par le biais d’une goutte de sang et transmet au biocapteur son TGS actuel égal à α. La vitesse δ mesurée par le capteur au même instant est enregistrée. Le programme contenu dans le capteur associant une vitesse à un TGS est réinitialisé avec les deux valeurs mesurées. L’activité catalytique n’est pas restaurée. A partir d’un certain temps, le biocapteur aura perdu trop de précision et devra alors être remplacé. Donc, pour tout biocapteur enzymatique la dérive de mesure est inévitable et une calibration externe est nécessaire. Pour cette raison le développement des biocapteurs à glucose implantables capables de fonctionner sur des longues périodes est aujourd’hui hors de portée. En outre d’une manière générale, pour tout biocapteur enzymatique cette dérive de la mesure est considérée comme étant la raison majeur pour leur non émergence dans le marché. Les biocapteurs de glucose actuels destinés à mesurer le taux de glycémie sanguine sont limités par la dérive du biocapteur dans le temps ce qui constitue un verrou majeur pour le développement de biocapteurs à glucose implantable, ou non, capables de fonctionner sur de longues périodes de temps et de mesurer en continu le taux de glycémie chez les diabétiques. Il existe donc un besoin pour un biocapteur enzymatique de glucose capable de « s’auto-calibrer » en s’affranchissant de la dérive de mesure des biocapteurs existants et de surveiller en continu la glycémie avec une stabilité à long terme sans besoin de remplacement ou de calibration externe. Ceci est réalisé en comparant les valeurs de mesure d’un ensemble de biocapteurs de caractéristiques connues et non sur la base des valeurs telles qu’elles sont mesurées. La présente invention porte donc sur un procédé pour déterminer, de façon stable au cours du temps, une région dans laquelle se situe la concentration réelle, dans un milieu, d’un substrat (S 1 ) constitué par toute molécule susceptible de subir une oxydo-réduction catalysée par un catalyseur, caractérisé par le fait qu’il comprend les étapes suivantes : a) prendre au moins un groupe d’au moins deux biocapteurs, chaque biocapteur présentant une courbe d’étalonnage d’un signal induit par la réaction d’oxydo-réduction : les biocapteurs d’un groupe présentant des parties initiales identiques de leurs courbes d’étalonnage jusqu’à une valeur de concentration en substrat (S 1 ), dite concentration de séparation (CS), à partir de laquelle la mesure du signal diffère d’un biocapteur à l’autre du groupe ; et lorsque plus d’un groupe est présent, les biocapteurs des différents groupes présentant des courbes d’étalonnage différentes, sans présenter de parties initiales identiques ; b) mettre les biocapteurs en contact avec ledit milieu ; c) mesurer le signal induit par la réaction d’oxydation ou de réduction pour chacun des biocapteurs du ou des groupes ; d) comparer toutes les valeurs des signaux donnés par tous les biocapteurs, et dans le cas d’un seul groupe de biocapteurs : si toutes les valeurs des signaux sont égales, la concentration en substrat (S 1 ) est inférieure ou égale à la CS la plus faible ; si toutes les valeurs des signaux sont différentes, la concentration en substrat (S 1 ) est supérieure à la CS la plus élevée ; si une partie des biocapteurs présente les mêmes valeurs des signaux, la concentration en substrat (S 1 ) est inférieure ou égale à la CS la plus faible des biocapteurs de cette partie et supérieure à la CS du biocapteur présentant une CS immédiatement inférieure ; et dans le cas de plus d’un groupe de biocapteurs : si toutes les valeurs des signaux dans chaque groupe sont égales, la concentration en substrat (S 1 ) est inférieure ou égale à la CS la plus faible ; si toutes les valeurs des signaux sont différentes dans tous les groupes, la concentration en substrat (S 1 ) est supérieure à la CS la plus élevée ; si une partie des biocapteurs d’un groupe présente les mêmes valeurs des signaux, la concentration en substrat (S 1 ) est inférieure ou égale à la CS la plus faible des biocapteurs de cette partie et supérieure à la CS du biocapteur présentant une CS immédiatement inférieure dans le groupe considéré ; si dans une partie des groupes des biocapteurs, tous les biocapteurs d’un groupe présentent la même valeur des signaux et dans la partie restante tous les biocapteurs d’un groupe présentent une valeur des signaux différente, la concentration est inférieure ou égale à la CS la plus faible du ou des groupes dont les valeurs des signaux sont identiques dans chaque groupe et supérieure à la CS la plus élevée du ou des groupes dont les valeurs des signaux sont différentes dans chaque groupe. Comme les concentrations de séparation sont déterminées par comparaison successives entre deux courbes d’étalonnage, dans le cas d’un groupe comportant n biocapteurs et n courbes d’étalonnage correspondantes, il y a n-1 concentrations de séparation pour ce groupe. Le signal peut être un signal électrochimique, chaque biocapteur comprenant alors une électrode de travail, une électrode de référence et une contre-électrode entre lesquelles passe un courant induit par la réaction d’oxydation ou de réduction, le signal électrochimique étant soit l’intensité de ce courant, soit la différence de potentiel entre les électrodes lors de la réaction d’oxydo-réduction du substrat (S 1 ). Pour chaque biocapteur, l’électrode de travail peut être une électrode en carbone, en or ou en platine, l’électrode de référence peut être une électrode en platine, en or ou en diamant et l’électrode de référence peut être une électrode au chlorure d’argent. Le catalyseur peut être un catalyseur enzymatique ou un catalyseur chimique, le catalyseur chimique pouvant être un catalyseur abiotique choisi notamment parmi le platine, les nanostructures de platine, les nanostructures d’alliages de platine, les nanostructures d’or et les nanostructures d’alliages d’or, ou pouvant être un catalyseur moléculaire choisi notamment parmi un complexe de porphyrine-or et un complexe de porphyrine-rhodium. Lorsque le catalyseur est un catalyseur enzymatique, un médiateur peut être associé audit catalyseur, ledit médiateur étant notamment choisi parmi le ferrocène, le ferrocyanure, les complexes d’osmium, les dérivés de quinone tels que la naphtoquinone, et les dérivés de phénothiazine. Un transporteur du substrat (S 1 ) peut être disposé sur le ou les biocapteurs. Les biocapteurs de chaque groupe peuvent différer par au moins un paramètre choisi parmi : p1 : la quantité de catalyseur ; p2 : le Km d’oxydo-réduction du catalyseur, dans le cas où ce dernier est un catalyseur enzymatique ou la limite de saturation du catalyseur dans le cas où ce dernier est un catalyseur chimique ; p3 : la quantité d’un médiateur du catalyseur, s’il est présent, dans le cas où celui-ci est un catalyseur enzymatique ; ou p4 : le Km de transport d’un transporteur du substrat (S 1 ) s’il est présent. Le Km d’oxydo-réduction du catalyseur enzymatique désigne la constante de Michaelis dudit catalyseur. Il représente la concentration en substrat pour laquelle la vitesse de la réaction est à la moitié de la vitesse maximale. La limite de saturation du catalyseur chimique est la concentration en substrat (S 1 ) à partir de laquelle la mesure du signal induit par la réaction d’oxydo-réduction du substrat (S 1 ) atteint une valeur limite. Le Km de transport d’un transporteur du substrat désigne la constante de Michaelis dudit transporteur. Il représente la concentration en substrat pour laquelle la vitesse de transport du substrat est à la moitié de la vitesse maximale. On peut noter les biocapteurs (BC) de la façon suivante : BC 11 ………………BC 1i ………………BC 1n … BC 21 ………………BC 2i ………………BC 2n … BC j1 ………………BC ji ………………BC jn … BC m1 ………………BC mi ………………BC mn … m et n représentant chacun un nombre entier, m étant le nombre de groupes et n étant le nombre de biocapteurs dans chaque groupe, les biocapteurs BC 11 jusqu’à BC 1n appartenant au groupe 1, les biocapteurs BC m1 jusqu’à BC mn appartenant au groupe m, entre chaque biocapteur dans un groupe, on fait varier un paramètre choisi parmi p1 à p4 ; et entre les biocapteurs de deux groupes différents, on fait varier un autre de ces paramètres p1 à p4. En particulier : le substrat (S 1 ) peut être le glucose ; le catalyseur peut être un catalyseur enzymatique choisi parmi une glucose oxydase, une glucose déshydrogénase et une cellobiose déshydrogénase ; le médiateur du catalyseur enzymatique, s’il est présent, peut être choisi parmi le ferrocène, le ferrocyanure, les complexes d’osmium, les dérivés de quinone tels que la naphtoquinone, et les dérivés de phénothiazine ; le transporteur du substrat (S 1 ), s’il est présent, peut être un transporteur de glucose qui est choisi notamment parmi GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4, GLUT6, GLUT8, GLUT10 et GLUT12. La présente invention porte également sur un dispositif pour la mise en œuvre du procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé par le fait qu’il comprend au moins un groupe d’au moins deux biocapteurs, chaque biocapteur présentant une courbe d’étalonnage du signal induit par la réaction d’oxydo-réduction : les biocapteurs d’un groupe présentant des parties initiales identiques de leurs courbes d’étalonnage jusqu’à une valeur de concentration en substrat (S 1 ) dite concentration de séparation (CS) à partir de laquelle la mesure du signal diffère d’un biocapteur à l’autre du groupe ; et lorsque plus d’un groupe est présent, les biocapteurs des différents groupes présentant des courbes d’étalonnage différentes, sans présenter de parties initiales identiques entre les groupes, chaque biocapteur étant apte à mesurer un signal induit par une réaction d’oxydo-réduction catalytique du substrat (S1) et chaque biocapteur comprenant : un catalyseur ; dans le cas d’un catalyseur enzymatique, le cas échéant un médiateur de ce dernier ; et le cas échéant un transporteur du substrat (S 1 ). Chaque biocapteur peut être apte à mesurer un signal électrochimique et comprend alors une électrode de travail, une électrode de référence et une contre-électrode entre lesquelles passe un courant induit par la réaction d’oxydation ou de réduction du substrat (S 1 ), le signal électrochimique étant soit l’intensité de ce courant, soit la différence de potentiel entre les électrodes lors de la réaction d’oxydo-réduction du substrat (S 1 ). Pour chaque biocapteur, l’électrode de travail peut être une électrode en carbone, en or ou en platine, l’électrode de référence peut être une électrode en platine, en or ou en diamant et l’électrode de référence peut être une électrode au chlorure d’argent. Le catalyseur peut être un catalyseur enzymatique ou un catalyseur chimique, le catalyseur chimique pouvant être un catalyseur abiotique choisi notamment parmi le platine, les nanostructures de platine, les nanostructures d’alliages de platine, les nanostructures d’or et les nanostructures d’alliages d’or, ou pouvant être un catalyseur moléculaire choisi notamment parmi un complexe de porphyrine-or et un complexe de porphyrine-rhodium. Lorsque le catalyseur est un catalyseur enzymatique, un médiateur peut être associé audit catalyseur, ledit médiateur étant notamment choisi parmi le ferrocène, le ferrocyanure, les complexes d’osmium, les dérivés de quinone tels que la naphtoquinone, et les dérivés de phénothiazine. Les biocapteurs de chaque groupe peuvent différer par au moins un paramètre choisi parmi : p1 : la quantité de catalyseur ; p2 : le Km d’oxydo-réduction du catalyseur, dans le cas où ce dernier est un catalyseur enzymatique ou la limite de saturation du catalyseur dans le cas où ce dernier est un catalyseur chimique ; p3 : la quantité d’un médiateur du catalyseur, s’il est présent, dans le cas où celui-ci est un catalyseur enzymatique ; ou p4 : le Km de transport d’un transporteur du substrat (S 1 ) s’il est présent. Les biocapteurs (BC) peuvent être notés : BC 11 ………………BC 1i ………………BC 1n … BC 21 ………………BC 2i ………………BC 2n … BC j1 ………………BC ji ………………BC jn … BC m1 ………………BC mi ………………BC mn … m et n représentant chacun un nombre entier, m étant le nombre de groupes et n étant le nombre de biocapteurs dans chaque groupe, les biocapteurs BC 11 jusqu’à BC 1n appartenant au groupe 1, les biocapteurs BC m1 jusqu’à BC mn appartenant au groupe m, entre chaque biocapteur dans un groupe, on fait varier un paramètre choisi parmi p1 à p4 ; et entre les biocapteurs de deux groupes différents, on fait varier un autre de ces paramètres p1 à p4. En particulier : le substrat (S 1 ) peut être le glucose ; le catalyseur peut être un catalyseur enzymatique choisi parmi une glucose oxydase, une glucose déshydrogénase et une cellobiose déshydrogénase ; le médiateur du catalyseur enzymatique, s’il est présent, peut être choisi parmi le ferrocène, le ferrocyanure, les complexes d’osmium, les dérivés de quinone tels que la naphtoquinone, et les dérivés de phénothiazine ; le transporteur du substrat (S 1 ), s’il est présent, est un transporteur de glucose qui peut être choisi notamment parmi GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4, GLUT6, GLUT8, GLUT10 et GLUT12. Dans un mode de réalisation particulier, les biocapteurs peuvent être disposés sur un support, l’électrode de travail, l’électrode de référence et la contre-électrode étant imprimées par sérigraphie sur ledit support. Le support sur lequel sont disposés les biocapteurs peut être choisi parmi les plaques de verre, de matière plastique, telle que le poly(téréphtalate d’éthylène), les plaques de céramique, telle que l’alumine ou un composite entre l’alumine et une autre céramique, les plaques de Nylon, les films à base de polystyrène, ou les feuilles de polyester. Le catalyseur peut être déposé sur l’électrode de travail de chaque biocapteur par encapsulation, greffage, absorption ou piégeage. Lorsque le catalyseur est un catalyseur enzymatique, ce dernier peut être présent à la surface de l’électrode de travail de chaque biocapteur en étant appliqué sur ladite surface de l’électrode de travail à l’intérieur d’une couche protectrice, la couche protectrice étant notamment en chitosane, Nafion, polypyrrole, ou acide polyacrylique, on en un polymère conducteur tel que la polyaniline, l’acide polylactique, la polydopamine ou le polyéthylèneglycol. Le médiateur du catalyseur enzymatique peut être renfermé avec ledit catalyseur enzymatique à l’intérieur de la couche protectrice. Un transporteur du substrat (S 1 ) peut être présent en étant appliqué en couche sur l’électrode de travail ou le cas échéant sur la couche protectrice comprenant le catalyseur enzymatique, son médiateur étant éventuellement présent, par dépôt d’une couche de protéoliposomes enfermant le transporteur du substrat (S 1 ). Le dispositif selon l’invention peut être disposé sur la peau d’un utilisateur ou peut être implanté dans l’utilisateur afin de déterminer une région dans laquelle se situe la concentration réelle du substrat (S 1 ), dans un milieu, ledit substrat étant le glucose et ledit milieu étant le sang. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 : Biocapteur « auto-calibré » basé sur la variation de la quantités de médiateur [M] et celle de l’enzyme [E] Un réseau de 6 couples de biocapteurs est fabriqué à la surface d’une plaque de verre. On imprime des électrodes par sérigraphie sur la plaque de verre. Cette méthode de dépôt consiste à imprimer sur un support solide une électrode en carbone et cela à partir d’une encre de carbone en utilisant un appareil d’impression. Chaque biocapteur est composé d’une électrode de travail en carbone, d’une contre-électrode de platine et d’une électrode de référence de Ag/AgCl. représente la disposition de l’électrode de travail, de la contre-électrode et de l’électrode de référence pour chaque biocapteur. L’électrode de travail de chaque biocapteur est fabriquée par sérigraphie à partir d’une encre de carbone contenant 40% en masse de poudre de carbone dispersée dans une solution organique composée de terpinéol et d’éthylcellulose . Les électrodes de référence et les contres électrodes de chaque biocapteur sont fabriquées par sérigraphie respectivement à partir d’une encre de platine contenant 40% en masse de poudre de platine dispersée dans une solution organique composée de terpinéol et d’éthylcellulose et d’une encre d’argent contenant 40% en masse de poudre d’argent dispersé » dans une solution organique composée de terpinéol et d’éthylcellulose. Sur chaque électrode de travail, on dépose 10 µL d’une solution de Nafion-bromure de tétrabutylammonium (TBAB) ( tetrabutylammonium bromide Nafion) à 5% en volume contenant l’enzyme glucose oxydase (GOx) et son médiateur naphtoquinone dans les quantités indiquées dans le Tableau 1 ci-après. On laisse tout sécher à l’air à la température ambiante pendant six heures. On crée ainsi un ensemble de douze biocapteurs appartenant à six groupes de deux biocapteurs. Les biocapteurs au sein du premier groupe sont notés BC 11 et BC 12 , les biocapteurs au sein du deuxième groupe BC 21 et BC 22 , et BC 31 et BC 32 pour le troisième, BC 41 et BC 42 pour le quatrième, BC 51 et BC 52 pour le cinquième et BC 61 et BC 62 pour le sixième. Au sein de chaque groupe de deux biocapteurs, les biocapteurs ont la même quantité d’enzyme GOx et présentent une quantité de médiateur différente. D’un groupe à l’autre, les quantités d’enzyme GOx et de médiateur changent. On procède ensuite à un étalonnage des biocapteurs. Cet étalonnage initial consiste à mesurer l’intensité du courant induit par une réaction d’oxydo-réduction pour des solutions-étalons de glucose dont la concentration en glucose est connue. Le glucose est oxydé à l’électrode de travail alors que le dioxygène est réduit à la contre-électrode. présente les courbes d’étalonnage que l’on a déterminé pour chacun des biocapteurs des six groupes. Ces courbes permettent d’obtenir les concentrations de séparation à partir desquelles, l’intensité du courant de la réaction d’oxydo-réduction du glucose devient différente entre les deux biocapteurs d’un même groupe. Le tableau 1 présente également les valeurs de concentration de séparation (CS) relevées. Biocapteurs Concentration de séparation Concentration en Glucose oxydase [E] Concentration en naphtoquinone [M] BC 11 1 mM 0,02 mM 7 mM BC 12 10 mM BC 21 2 mM 0,01 mM 11 mM BC 22 13 mM BC 31 3 mM 0,007 mM 13 mM BC 32 15 mM BC 41 4 mM 0,005 mM 17 mM BC 42 19 mM BC 51 5 mM 0,004 mM 20 mM BC 52 22 mM BC 61 6 mM 0,003 mM 22 mM BC 62 24 mM Afin de déterminer la région de concentration en glucose d’un échantillon à analyser, on met en contact les groupes de biocapteurs avec ledit échantillon et on mesure la valeur du courant mesuré sur chaque biocapteur et on procède à la détermination de la valeur de la concentration en glucose selon la méthode suivante. Si les valeurs mesurées aux deux biocapteurs BC 11 et BC 12 sont identiques ainsi que celles des autres biocapteurs, cela veut dire que la concentration en glucose dans l’échantillon est inférieure à la concentration de séparation de ce groupe de biocapteurs BC 11 et BC 12 qui est de 1 mM et est la plus faible concentration de séparation parmi les groupes. Si les valeurs mesurées aux deux biocapteurs BC 11 et BC 12 sont différentes, cela veut dire que la concentration en glucose dans l’échantillon est supérieure à la concentration de séparation de ce groupe de biocapteurs BC 11 et BC 12 qui est de 1 mM. On compare ensuite les valeurs mesurées sur le groupe de biocapteurs suivant, à savoir les biocapteurs BC 21 et BC 22 . Si les valeurs mesurées aux deux biocapteurs BC 21 et BC 22 sont identiques, cela veut dire que la concentration en glucose dans l’échantillon est inférieure à la concentration séparation du groupe de biocapteurs BC 21 et BC 22 qui est de 2 mM. En faisant ainsi, on sait alors que la concentration en glucose dans l’échantillon est comprise entre 1 mM et 2 mM. On procède de la même manière pour les biocapteurs suivants, à savoir si les valeurs mesurées aux biocapteurs BC 21 et BC 22 sont différentes et que les valeurs mesurées aux biocapteurs BC 31 et BC 32 sont identiques, alors la concentration en glucose se situe entre 2 mM et 3 mM, et ainsi de suite pour les groupes de biocapteurs suivants. Si toutes les valeurs de tous les biocapteurs sont différentes, cela veut dire que la concentration en glucose dans l’échantillon est supérieure à la concentration de séparation la plus élevée qui est celle du dernier groupe de biocapteurs BC 61 et BC 62 , à savoir 6 mM. Le procédé permet donc d’encadrer la concentration en glucose en comparant les valeurs de l’intensité de la réaction d’oxydo-réduction du glucose mesurée au sein de chaque biocapteur pour chaque groupe. Ce procédé permet de s’affranchir de la dérive des biocapteurs car ce ne sont plus les valeurs directement mesurées qui permettent d’établir la concentration en glucose mais la comparaison entre elles des valeurs mesurées à chaque biocapteur. Exemple 2 : Biocapteur « auto-calibré » basé sur la variation du Km de l’enzyme et la quantité de médiateur Un ensemble de 10 groupes de deux biocapteurs est déposé à la surface d’une plaque de verre. Les électrodes de travail, contre-électrodes et électrodes de référence sont imprimées comme dans l’Exemple 1. Sur chacune des électrodes de travail, on dépose 10 µL d’une solution de nafion-TBAB contenant 3mg/mL d’enzyme glucose oxydase et son médiateur naphtoquinone dans les quantités indiquées dans le tableau 2. Le Km des enzymes glucose oxydase varie selon les biocapteurs et est indiqué dans le tableau 2. On crée ainsi un réseau de vingt biocapteurs appartenant à dix couples de biocapteurs. Ce réseau peut être noté comme suit : BC 11 …………BC 12 BC 21 …………BC 22 BC 31 …………BC 32 BC 41 …………BC 42 BC 51 …………BC 52 BC 61 …………BC 62 BC 71 …………BC 72 BC 81 …………BC 82 BC 91 …………BC 92 BC 101 …………BC 102 Au sein de chaque couple, le Km de la glucose oxydase est le même et la quantité de médiateur est différente. D’un couple à l’autre, seul le Km de la glucose oxydase est différent. présente les courbes d’étalonnage que l’on a déterminé pour chacun des biocapteurs des dix groupes. Ces courbes permettent d’obtenir les concentrations de séparation à partir desquelles, l’intensité du courant de la réaction d’oxydo-réduction du glucose devient différente entre les deux biocapteurs d’un même groupe. Biocapteurs Concentration de séparation Km de la Glucose oxydase Quantité de naphtoquinone (µg) BC 11 4,5 mM 5 18 BC 12 20 BC 21 4,3 mM 10 18 BC 22 20 BC 31 3,8 mM 15 18 BC 32 20 BC 41 3,5 mM 20 18 BC 42 20 BC 51 3,1 mM 25 18 BC 52 20 BC 61 2,7 mM 30 18 BC 62 20 BC 71 2,2 mM 35 18 BC 72 20 BC 81 1,8 mM 40 18 BC 82 20 BC 91 1,3 mM 45 18 BC 92 20 BC 101 1,2 mM 50 18 BC 102 20 On procède de la même manière qu’à l’Exemple 1 afin de déterminer la plage de concentration en glucose. Par exemple, si toutes les valeurs des signaux des couples de biocapteurs BC 11 , BC 12 ; BC 21 , BC 22 ; BC 31 , BC 32 ; BC 41 , BC 42 ; BC 51 , BC 52 ; sont identiques entre chaque couple, de biocapteurs, cela veut dire que la concentration en glucose est inférieure à la concentration de séparation la plus faible de ces couples. Ici, il s’agit de la concentration du couple BC 51 , BC 52 qui est de 3,1 mM. Les valeurs des signaux des autres biocapteurs sont donc différentes, ce qui veut dire que la concentration en glucose est supérieure à la concentration de séparation la plus élevée de ces couples. Ici, il s’agit de la concentration du couple BC61, BC62 qui est de 2,7 mM. La concentration en glucose se trouve donc dans la plage de concentrations comprises entre 2,7 mM et 3,1 mM. Exemple 3 : Biocapteur « auto-calibré » biomimétique Un groupe de quatre biocapteurs sont déposés à la surface d’une plaque de verre. Les électrodes de travail, contre-électrodes et électrodes de référence sont imprimées comme dans l’Exemple 1. Sur chaque électrode de travail 1 en carbone, on dépose par électropolymérisation une couche 2 de polyaniline (PANI) à partir d’une solution tampon de phosphate de potassium (100 mM, pH 7) contenant 2mM d’aniline et 2mg/mL d’enzyme glucose oxydase (GOx) 3. L’électropolymérisation est réalisée par voltamétrie cyclique entre -0,5 V et 1 V (5 cycles, vitesse de balayage 10mV/s) dans une cellule à trois électrodes avec un fil de platine comme contre-électrode et un fil d’argent comme électrode de référence. Sur chaque électrode de travail sur laquelle on a déposé une couche de polyaniline, on dépose 100 µL d’une solution tampon de phosphate de potassium (100 mM, pH 7) contenant des protéoliposomes contenant des protéines transporteurs de glucose 5 avec un Km de 0,3 mM sur la première électrode de carbone, 0,6 mM sur la deuxième électrode de carbone, 2 mM sur la troisième électrode de carbone et de 5 mM sur la quatrième électrode de carbone. La concentration du solution tampon de phosphate en transporteur de glucose est de 0,11 mg/mL. Le diamètre des protéoliposomes 100 nm à 200 nm). On attend pendant 20 minutes pour permettre la fusion des protéoliposomes 4 à la surface de chacune des électrodes de travail. La fusion des protéoliposomes 4 permet la formation d’une double couche lipidique 6 plane à la surface de l’électrode de travail et dans laquelle se trouve le transporteur de glucose 5. schématise une électrode de travail 1 d’un biocapteur ainsi que l’approche du glucose G vers la surface de l’électrode de travail 1. Dans une première étape I, Le glucose G s’approche de la protéine transporteur de glucose 5. Dans une étape II, le glucose G est capté par la protéine transporteur de glucose 5. Dans une étape III, le glucose G est libéré par la protéine transporteur de glucose 5 et se dirige vers la couche 2 de polyaniline dans laquelle se trouve l’enzyme GOx 3 dans le sens de la flèche F où le glucose G va être oxydé. Dans une étape IV, la protéine transporteur de glucose 5 est de nouveau prête à recevoir du glucose. La protéine transporteur de glucose permet de moduler l’accès du glucose vers la glucose oxydase (Gox) déposée sur la surface de l’électrode de travail. Par étalonnage, on peut déterminer la concentration de séparation de séparation entre les biocapteurs. Dans ce cas, les courbes d’étalonnage présentent sous la forme d’histogramme relevé pour chacun des biocapteurs. Dans ce cas, la concentration de séparation correspond à la concentration à partir de laquelle, la valeur d’intensité du courant atteint un palier pour un biocapteur, le transporteur de glucose ne pouvant plus transporter davantage de glucose vers l’électrode de travail. montre les courbes d’étalonnage des quatre biocapteurs de l’Exemple 3. Le tableau 3 indique le Km du transporteur de glucose et les concentrations de séparation entre les biocapteurs. Biocapteur Km du transporteur de glucose Concentration de séparation 1 0,3 mM 0,2 mM 2 0,6 mM 0,5 mM 3 2 mM 1,5 mM 4 5 mM - Afin de déterminer la région de concentration en glucose d’un échantillon à analyser, on met en contact les quatre biocapteurs avec ledit échantillon et on mesure la valeur du courant mesuré sur chaque biocapteur et on procède à la détermination de la valeur de la concentration en glucose selon la méthode suivante. Si toutes les valeurs mesurées à chacun des biocapteurs sont égales, cela veut dire que la concentration en glucose est inférieure ou égale à la concentration de séparation la plus faible, à savoir 0,2 mM. Si la valeur mesurée pour le premier biocapteur est différente de celles des autres biocapteurs et que les valeurs de chacun des trois autres biocapteurs sont identiques, la concentration en glucose est donc supérieure à la concentration de séparation du premier biocapteur et inférieure ou égale à la concentration de séparation du deuxième biocapteur. La concentration en glucose sera donc supérieure à 0,2 mM et inférieure ou égale à 0,5 mM. Si toutes les valeurs mesurées par les biocapteurs sont différentes, cela veut dire la concentration en glucose est supérieure à la concentration de séparation du troisième biocapteur à savoir 1,5 mM. Références [1] Global report on diabetes (2016). World Health Organization [2] International Diabetes federation (2016) [3] Mechanisms of diabetic complications. Forbes JM1, Cooper ME. Physiol Rev. 2013 Jan ;93(1):137-88. doi: 10.1152/physrev.00045.2011 [4] Institut de veille sanitaire (France) [5] Home Blood Glucose Biosensors: A Commercial Perspective. Jeffrey D. Newman & Anthony P.F. Turner. Biosensors and Bioelectronics , Volume 20, Issue 12, 20th Anniversary of Biosensors and Bioelectronics, 15 June 2005, Pages 2435-2453 [6] Electrochemical Glucose Biosensors. J. Wang. Chem. Rev. , 2008, 108 (2), pp 814–825 – Procédé pour déterminer, de façon stable au cours du temps, une région dans laquelle se situe la concentration réelle, dans un milieu, d’un substrat (S 1 ) constitué par toute molécule susceptible de subir une oxydo-réduction catalysée par un catalyseur, caractérisé par le fait qu’il comprend les étapes suivantes : a) prendre au moins un groupe d’au moins deux biocapteurs, chaque biocapteur présentant une courbe d’étalonnage d’un signal induit par la réaction d’oxydo-réduction : les biocapteurs d’un groupe présentant des parties initiales identiques de leurs courbes d’étalonnage jusqu’à une valeur de concentration en substrat (S 1 ), dite concentration de séparation (CS), à partir de laquelle la mesure du signal diffère d’un biocapteur à l’autre du groupe ; et lorsque plus d’un groupe est présent, les biocapteurs des différents groupes présentant des courbes d’étalonnage différentes, sans présenter de parties initiales identiques ; b) mettre les biocapteurs en contact avec ledit milieu ; c) mesurer le signal induit par la réaction d’oxydation ou de réduction pour chacun des biocapteurs du ou des groupes ; d) comparer toutes les valeurs des signaux donnés par tous les biocapteurs, et dans le cas d’un seul groupe de biocapteurs : si toutes les valeurs des signaux sont égales, la concentration en substrat (S 1 ) est inférieure ou égale à la CS la plus faible ; si toutes les valeurs des signaux sont différentes, la concentration en substrat (S 1 ) est supérieure à la CS la plus élevée ; si une partie des biocapteurs présente les mêmes valeurs des signaux, la concentration en substrat (S 1 ) est inférieure ou égale à la CS la plus faible des biocapteurs de cette partie et supérieure à la CS du biocapteur présentant une CS immédiatement inférieure ; et dans le cas de plus d’un groupe de biocapteurs : si toutes les valeurs des signaux dans chaque groupe sont égales, la concentration en substrat (S 1 ) est inférieure ou égale à la CS la plus faible ; si toutes les valeurs des signaux sont différentes dans tous les groupes, la concentration en substrat (S 1 ) est supérieure à la CS la plus élevée ; si une partie des biocapteurs d’un groupe présente les mêmes valeurs des signaux, la concentration en substrat (S 1 ) est inférieure ou égale à la CS la plus faible des biocapteurs de cette partie et supérieure à la CS du biocapteur présentant une CS immédiatement inférieure dans le groupe considéré ; si dans une partie des groupes des biocapteurs, tous les biocapteurs d’un groupe présentent la même valeur des signaux et dans la partie restante tous les biocapteurs d’un groupe présentent une valeur des signaux différente, la concentration est inférieure ou égale à la CS la plus faible du ou des groupes dont les valeurs des signaux sont identiques dans chaque groupe et supérieure à la CS la plus élevée du ou des groupes dont les valeurs des signaux sont différentes dans chaque groupe. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le signal est un signal électrochimique, chaque biocapteur comprenant alors une électrode de travail, une électrode de référence et une contre-électrode entre lesquelles passe un courant induit par la réaction d’oxydation ou de réduction, le signal électrochimique étant soit l’intensité de ce courant, soit la différence de potentiel entre les électrodes lors de la réaction d’oxydo-réduction du substrat (S 1 ). – Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que, pour chaque biocapteur, l’électrode de travail est une électrode en carbone, en or ou en platine, l’électrode de référence est une électrode en platine, en or ou en diamant et l’électrode de référence est une électrode au chlorure d’argent. – Procédé selon l’une des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait que le catalyseur est un catalyseur enzymatique ou un catalyseur chimique, le catalyseur chimique pouvant être un catalyseur abiotique choisi notamment parmi le platine, les nanostructures de platine, les nanostructures d’alliages de platine, les nanostructures d’or et les nanostructures d’alliages d’or, ou pouvant être un catalyseur moléculaire choisi notamment parmi un complexe de porphyrine-or et un complexe de porphyrine-rhodium. – Procédé selon la revendication 4, dans lequel le catalyseur est un catalyseur enzymatique, caractérisé par le fait qu’un médiateur est associé audit catalyseur, ledit médiateur étant notamment choisi parmi le ferrocène, le ferrocyanure, les complexes d’osmium, les dérivés de quinone tels que la naphtoquinone, et les dérivés de phénothiazine. – Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait qu’un transporteur du substrat (S 1 ) est disposé sur le ou les biocapteurs. – Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que les biocapteurs de chaque groupe diffèrent par au moins un paramètre choisi parmi : p1 : la quantité de catalyseur ; p2 : le Km d’oxydo-réduction du catalyseur, dans le cas où ce dernier est un catalyseur enzymatique ou la limite de saturation du catalyseur dans le cas où ce dernier est un catalyseur chimique ; p3 : la quantité d’un médiateur du catalyseur, s’il est présent, dans le cas où celui-ci est un catalyseur enzymatique ; ou p4 : le Km de transport d’un transporteur du substrat (S 1 ) s’il est présent. – Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que, les biocapteurs (BC) étant notés : BC 11 ………………BC 1i ………………BC 1n … BC 21 ………………BC 2i ………………BC 2n … BC j1 ………………BC ji ………………BC jn … BC m1 ………………BC mi ………………BC mn … m et n représentant chacun un nombre entier, m étant le nombre de groupes et n étant le nombre de biocapteurs dans chaque groupe, les biocapteurs BC 11 jusqu’à BC 1n appartenant au groupe 1, les biocapteurs BC m1 jusqu’à BC mn appartenant au groupe m, entre chaque biocapteur dans un groupe, on fait varier un paramètre choisi parmi p1 à p4 ; et entre les biocapteurs de deux groupes différents, on fait varier un autre de ces paramètres p1 à p4. - Procédé selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que : le substrat (S 1 ) est le glucose ; le catalyseur est un catalyseur enzymatique choisi parmi une glucose oxydase, une glucose déshydrogénase et une cellobiose déshydrogénase ; le médiateur du catalyseur enzymatique, s’il est présent, est choisi parmi le ferrocène, le ferrocyanure, les complexes d’osmium, les dérivés de quinone tels que la naphtoquinone, et les dérivés de phénothiazine ; le transporteur du substrat (S 1 ), s’il est présent, est un transporteur de glucose qui est choisi notamment parmi GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4, GLUT6, GLUT8, GLUT10 et GLUT12. – Dispositif pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu’il comprend au moins un groupe d’au moins deux biocapteurs, chaque biocapteur présentant une courbe d’étalonnage du signal induit par la réaction d’oxydo-réduction : les biocapteurs d’un groupe présentant des parties initiales identiques de leurs courbes d’étalonnage jusqu’à une valeur de concentration en substrat (S 1 ) dite concentration de séparation (CS) à partir de laquelle la mesure du signal diffère d’un biocapteur à l’autre du groupe ; et lorsque plus d’un groupe est présent, les biocapteurs des différents groupes présentant des courbes d’étalonnage différentes, sans présenter de parties initiales identiques entre les groupes, chaque biocapteur étant apte à mesurer un signal induit par une réaction d’oxydo-réduction catalytique du substrat (S1) et chaque biocapteur comprenant : un catalyseur ; dans le cas d’ un catalyseur enzymatique, le cas échéant un médiateur de ce dernier ; et le cas échéant un transporteur du substrat (S 1 ). – Dispositif selon la revendication 10, caractérisé par le fait que chaque biocapteur est apte à mesurer un signal électrochimique et comprend alors une électrode de travail, une électrode de référence et une contre-électrode entre lesquelles passe un courant induit par la réaction d’oxydation ou de réduction du substrat (S 1 ), le signal électrochimique étant soit l’intensité de ce courant, soit la différence de potentiel entre les électrodes lors de la réaction d’oxydo-réduction du substrat (S 1 ). - Dispositif selon la revendication 11, caractérisé par le fait que, pour chaque biocapteur, l’électrode de travail est une électrode en carbone, en or ou en platine, l’électrode de référence est une électrode en platine, en or ou en diamant et l’électrode de référence est une électrode au chlorure d’argent. – Dispositif selon l’une des revendications 10 à 12, caractérisé par le fait que le catalyseur est un catalyseur enzymatique ou un catalyseur chimique, le catalyseur chimique pouvant être un catalyseur abiotique choisi notamment parmi le platine, les nanostructures de platine, les nanostructures d’alliages de platine, les nanostructures d’or et les nanostructures d’alliages d’or, ou pouvant être un catalyseur moléculaire choisi notamment parmi un complexe de porphyrine-or et un complexe de porphyrine-rhodium. - Dispositif selon l’une des revendications 10 à 13, dans lequel le catalyseur est un catalyseur enzymatique, caractérisé par le fait qu’un médiateur est associé audit catalyseur, ledit médiateur étant notamment choisi parmi le ferrocène, le ferrocyanure, les complexes d’osmium, les dérivés de quinone tels que la naphtoquinone, et les dérivés de phénothiazine. – Dispositif selon l’une des revendications 10 à 14, caractérisé par le fait que les biocapteurs de chaque groupe diffèrent par au moins un paramètre choisi parmi : p1 : la quantité de catalyseur ; p2 : le Km d’oxydo-réduction du catalyseur, dans le cas où ce dernier est un catalyseur enzymatique ou la limite de saturation du catalyseur dans le cas où ce dernier est un catalyseur chimique ; p3 : la quantité d’un médiateur du catalyseur, s’il est présent, dans le cas où celui-ci est un catalyseur enzymatique ; ou p4 : le Km de transport d’un transporteur du substrat (S 1 ) s’il est présent. – Dispositif selon la revendication 15, les biocapteurs (BC) étant notés : BC 11 ………………BC 1i ………………BC 1n … BC 21 ………………BC 2i ………………BC 2n … BC j1 ………………BC ji ………………BC jn … BC m1 ………………BC mi ………………BC mn … m et n représentant chacun un nombre entier, m étant le nombre de groupes et n étant le nombre de biocapteurs dans chaque groupe, les biocapteurs BC 11 jusqu’à BC 1n appartenant au groupe 1, les biocapteurs BC m1 jusqu’à BC mn appartenant au groupe m, entre chaque biocapteur dans un groupe, on fait varier un paramètre choisi parmi p1 à p4 ; et entre les biocapteurs de deux groupes différents, on fait varier un autre de ces paramètres p1 à p4. – Dispositif selon l’une des revendications 10 à 16, caractérisé par le fait que : le substrat (S 1 ) est le glucose ; le catalyseur est un catalyseur enzymatique choisi parmi une glucose oxydase, une glucose déshydrogénase et une cellobiose déshydrogénase ; le médiateur du catalyseur enzymatique, s’il est présent, est choisi parmi le ferrocène, le ferrocyanure, les complexes d’osmium, les dérivés de quinone tels que la naphtoquinone, et les dérivés de phénothiazine ; le transporteur du substrat (S 1 ), s’il est présent, est un transporteur de glucose qui est choisi notamment parmi GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4, GLUT6, GLUT8, GLUT10 et GLUT12. - Dispositif selon l’une des revendications 11 à 17, caractérisé par le fait que les biocapteurs sont disposés sur un support, l’électrode de travail, l’électrode de référence et la contre-électrode étant imprimées par sérigraphie sur ledit support. – Dispositif selon la revendication 18, caractérisé par le fait que le support sur lequel sont disposés les biocapteurs est choisi parmi les plaques de verre, de matière plastique, telle que le poly(téréphtalate d’éthylène), les plaques de céramique, telle que l’alumine ou un composite entre l’alumine et une autre céramique, les plaques de Nylon, les films à base de polystyrène, ou les feuilles de polyester. – Dispositif selon l’une des revendications 18 et 19, caractérisé par le fait que le catalyseur est déposé sur l’électrode de travail de chaque biocapteur par encapsulation, greffage, absorption ou piégeage. – Dispositif selon la revendication 20, caractérisé par le fait que le catalyseur est un catalyseur enzymatique et est présent à la surface de l’électrode de travail de chaque biocapteur en étant appliqué sur ladite surface de l’électrode de travail à l’intérieur d’une couche protectrice, la couche protectrice étant notamment en chitosane, Nafion, polypyrrole, ou acide polyacrylique, on en un polymère conducteur tel que la polyaniline, l’acide polylactique, la polydopamine ou le polyéthylèneglycol. – Dispositif selon la revendication 21, caractérisé par le fait que le médiateur du catalyseur enzymatique est renfermé avec ledit catalyseur enzymatique à l’intérieur de la couche protectrice. – Dispositif selon l’une des revendications 18 à 22, caractérisé par le fait qu’un transporteur du substrat (S 1 ) est présent en étant appliqué en couche sur l’électrode de travail ou le cas échéant sur la couche protectrice comprenant le catalyseur enzymatique, son médiateur étant éventuellement présent, par dépôt d’une couche de protéoliposomes enfermant le transporteur du substrat (S 1 ).