FR 3101541 A1 20210409 FR 1911006 A 20191004 Conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie L’invention concerne des conjugués anticorps-médicament, et leur utilisation en thérapie, notamment pour traiter les cancers CD30+. conjugués anticorps-médicament et leur utilisation en thérapie La présente invention concerne des nouveaux conjugués anticorps-médicaments comprenant un anticorps dirigé contre l’antigène CD30 couplé à un médicament cytotoxique et leur utilisation comme médicament, notamment en thérapie anti-cancéreuse. Un conjugué anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC ») constitue un moyen de délivrance sélective d'un médicament cytotoxique. Le conjugué anticorps-médicament permet donc de combiner la spécificité du ciblage par les anticorps avec de nouvelles fonctions effectrices puissantes par les agents qui leur sont conjugués. La structure générale d'un conjugué anticorps-médicament est celle de la formule (I). La partie liant l'anticorps et le médicament est appelée bras de liaison ou linker. Il peut être greffé sur l'anticorps via l'une au moins des huit cystéines formant les 4 ponts disulfures inter-chaînes. Le nombre de molécules de médicaments cytotoxiques greffées sur l'anticorps détermine un ratio appelé Drug-to-Antibody Ratio (DAR). Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est internalisé dans la cellule par endocytose médiée par des récepteurs. Les vésicules fusionnent avec des lysosomes où le médicament cytotoxique est libéré de l'anticorps via différents mécanismes. Le médicament cytotoxique actif agit ensuite directement sur la cellule en induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par transport ou diffusion dans l'environnement. L'anticorps est donc principalement utilisé comme vecteur et apporte le médicament cytotoxique dans la cellule ciblée. Les anticorps anti-CD30 ont déjà été conjugués à des médicaments cytotoxiques, dont la Monométhyle auristatine E (MMAE). Un conjugué cytotoxique portant la MMAE, utilisant un bras de liaison maléimide, a été développé sous le nom de « vedotin ». Ce médicament cytotoxique a été utilisé avec divers anticorps monoclonaux pour la préparation de conjugués anticorps-médicament (ADC). Il est notamment utilisé dans la préparation du brentuximab vedotin, un ADC qui cible le CD30 [1]. Toutefois, la stabilité, en particulier la stabilité du DAR au cours du temps, et l’homogénéité du brentuximab vedotin ne sont pas optimales [2]. Il existe donc un besoin de développer des conjugués anti-CD30-médicament cytotoxiques plus homogènes, plus stables et donc plus efficaces. Brève description des figures représente le profil HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) d’une composition de conjugué anticorps-médicament selon l’invention. La figure montre que la composition est enrichie en DAR4, avec environ 62% de DAR4. représente une analyse SEC (Size Exclusion Chromatography) d’une composition de conjugué anticorps-médicament selon l’invention. La figure montre que la composition est extrêmement homogène, avec plus de 98% de monomère. représente la répartition des DAR de 3 bioconjugaisons indépendantes à l’échelle 1 mg. Cette figure montre la grande reproductibilité de la bioconjugaison. représente la répartition des DAR de différentes bioconjugaisons à différentes échelles (échelles 250 µg, 500 µg, 850 µg et 1 mg). Cette figure montre la grande reproductibilité de la bioconjugaison à différentes échelles à une concentration fixée. représente la reconnaissance de l’antigène CD30 par MF-BTX-MMAE, en comparaison avec l’ADC de référence (brentuximab vedotin) et un ADC de contrôle (ciblant l’antigène HER2). représente la cytotoxicité in vitro de MF-BTX-MMAE, en comparaison avec l’ADC de référence (brentuximab vedotin). représente l’évolution du DAR moyen en solution à 37 °C de MF-BTX-MMAE, par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin) mesurée par la méthode HIC en mesurant les aires sous les courbes (AUC). Cette figure montre la meilleure stabilité du conjugué anticorps-médicament selon l’invention par rapport à l’ADC de référence. représente l’évolution du DAR moyen en solution en présence de HSA (Human Serum Albumin) à 37 °C de MF-BTX-MMAE, par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin) mesurée par la méthode HIC. Cette figure montre la meilleure stabilité du conjugué anticorps-médicament selon l’invention par rapport à l’ADC de référence. représente l’évolution du DAR moyen en solution à 40 °C pendant 28 jours de MF-BTX-MMAE, par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin) mesurée par la méthode HIC. représente l’évolution du pourcentage de DAR4 en solution à 40 °C pendant 28 jours de MF-BTX-MMAE, par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin) mesurée par la méthode HIC. représente l’évolution du pourcentage de monomère en solution à 40 °C pendant 28 jours de MF-BTX-MMAE, par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin) mesurée par la méthode SEC. représente l’évolution du volume tumoral (en moyenne +/- Standard error of mean (SEM) mm3) de souris traitées avec 0,5 mg/kg de MF-BTX-MMAE, 0,5 mg/kg de l’ADC de référence (brentuximab vedotin) ou un véhicule sans ADC. représente le pourcentage de survie après injection (en jour) des souris traitées avec 0,5 mg/kg de MF-BTX-MMAE, 0,5 mg/kg de l’ADC de référence (brentuximab vedotin) ou d’un véhicule sans ADC. Cette figure montre la survie améliorée avec le conjugué anticorps-médicament selon l’invention par rapport à l’ADC de référence à une dose de 0,5 mg/kg. représente l’évolution du volume tumoral (en moyenne +/- SEM mm3) de souris traitées avec 1 mg/kg de MF-BTX-MMAE, 1 mg/kg de l’ADC de référence (brentuximab vedotin) ou un véhicule sans ADC. Cette figure montre l’efficacité similaire de MF-BTX-MMAE par rapport à l’ADC de référence à la dose de 1 mg/kg. représente le pourcentage de survie après injection (en jour) des souris traitées avec 1 mg/kg de MF-BTX-MMAE, 1 mg/kg de l’ADC de référence (brentuximab vedotin) ou d’un véhicule sans ADC. Cette figure montre l’efficacité similaire de MF-BTX-MMAE par rapport à l’ADC de référence à la dose de 1 mg/kg. Exemples Exemple 1 : s ynthèse d’un conjugué cytotoxique selon l’invention Schéma réactionnel général (a) BnOH, SOCl 2 , DCM, 18 h, 75 °C; (b) APS, MeOH, H 2 O, H 2 SO 4 , 1h, 50 °C; (c) H 2 , Pd/C, MeOH, 2h, TA; (d) HATU, 2,6-lutidine, DMF, H 2 N-(CH 2 ) 5 -COOMe, 15h, 0 °C, puis TA; (e) PBr 3 , MeCN, 2h, 45 °C; (f) LiOH, THF, H 2 0, 8,5h, TA; (g) EEDQ, DIPEA, DMF, MeCN, H 2 N-VCPABC-MMAE, 2h20, 25 °C. Schéma réactionnel détaillé Préparation de l’ i sonicotinate de benzyle (2) (2) L’acide isonicotinique (1) (5,00 g ; 40,614 mmol ; 1,0 eq) a été solubilisé dans le chlorure de thionyle (15 mL ; 206,77 mmol ; 5,1 eq) et chauffé à reflux pendant la nuit. Après retour à température ambiante, l’excès de chlorure de thionyle a été éliminé par évaporation sous pression réduite, puis le résidu obtenu a été dissous dans le dichlorométhane anhydre (55 mL). L’alcool benzylique a été additionné (4,2 mL ; 40,614 mmol ; 1,0 eq) et le mélange a été agité à reflux pendant 10 h. Après retour à température ambiante, le milieu réactionnel a été neutralisé avec une solution saturée d’hydrogénocarbonate de sodium et extrait avec du dichlorométhane (3x100 mL). Les phases organiques ont été rassemblées, lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit obtenu a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , cyclohexane/acétate d’éthyle 50:50) pour donner ( 2 ) (6,97 g ; 80%) sous la forme d’une huile incolore. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 8,80 (dd ; J = 6,1 ; 1,6 Hz ; 2H 1,5 ), 7,86 (dd ; J = 6,1 ; 1,6 Hz, 2H 2,4 ), 7,56 – 7,29 (m ; 5H 9-13 ), 5,39 (s ; 2H 7 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 165,0 (1C 6 ) ; 151,3 (2C 1,5 ) ; 137,2 (1C 3 ) ; 136,1 (1C 8 ) ; 129,0 (2C 10,12 ) ; 128,8 (1C 11 ) ; 128,6 (2C 9,13 ) ; 123,0 (2C 2,4 ) ; 67,4 (1C 7 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 13 H 11 NO 2 [M] : 213,0790 ; observée 213,0796. Préparation de 2,6- b is( hydroxyméth yl ) isonicotinate de benzyle (3) ( 3 ) L’ isonicotinate de benzyle (2) (2,48 g ; 11,630 mmol ; 1,0 eq) a été solubilisé dans le méthanol (43 mL), agité à 50 °C et de l’acide sulfurique concentré (320 µL ; 6,016 mmol ; 0,52 eq) a été ajouté. Une solution de persulfate d’ammonium (26,500 g ; 116,000 mmol ; 10,0 eq) dans l’eau (43 mL) a été ajoutée en deux étapes : un premier ajout rapide de 30 gouttes, une suspension blanche se forme, puis en goutte à goutte rapide pendant 5 min. La réaction s’emballe jusqu’à 75 °C, puis la solution jaune obtenue a été agitée à 50 °C pendant 1 h supplémentaire. Après retour à température ambiante, le méthanol a été évaporé sous pression réduite. 50 mL d’acétate d’éthyle ont été ajoutés et le milieu a été neutralisé par ajout d’une solution saturée d’hydrogénocarbonate de sodium. La phase aqueuse a été extraite avec de l’acétate d’éthyle (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été lavées par une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium, puis concentrées sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , dichlorométhane/méthanol, 95:5) pour donner ( 3 ) (1,56 g ; 49%) sous la forme d’un solide beige. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 7,81 (s; 2H 2,4 ) ; 7,55 – 7,32 (m ; 5H 9-13 ) ; 5,60 (t ; J = 5,9 Hz ; 2H 15,17 ) ; 5,40 (s ; 2H 7 ) ; 4,59 (d ; J = 5,9 Hz ; 4H 14,16 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 165,0 (1C 6 ) ; 162,8 (2C 1,5 ) ; 138,0 (1C 3 ) ; 135,7 (1C 8 ) ; 128,6 (2C 10,12 ) ; 128,4 (1C 11 ) ; 128,3 (2C 9,13 ) ; 117,0 (2C 2,4 ) ; 66,9 (1C 7 ) ; 63,9 (2C 14,16 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 15 H 15 NO 4 [M] : 273,1001 ; observée 273,1001. Préparation de l’acide 2,6-bis( hydroxyméthyl ) isonicotinique (4) (4) Le 2,6-bis( hydroxyméthyl ) isonicotinate de benzyle (3) (1,33 g ; 4,867 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans le méthanol (50 mL) et la solution a été dégazée avec de l’argon pendant 15 min. Du palladium sur charbon 10% wt (133 mg) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante sous atmosphère d’hydrogène pendant 2 h. Le milieu réactionnel a été filtré sur dicalite (rinçage méthanol). Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour donner (4) (849 mg ; 95%) sous la forme d’un solide beige. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 7,78 (s ; 2H 2,4 ) ; 5,54 (s large ; 2H 9,11 ) ; 4,59 (s ; 4H 8,10 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 166,7 (1C 6 ) ; 162,5 (2C 1,5 ) ; 139,4 (1C 3 ) ; 117,3 (2C 2,4 ) ; 64,0 (2C 8,10 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 8 H 9 NO 4 [M] : 183,0532 ; observée 183,0526. Préparation du 6-((2,6- b is( hydroxyméthyl )pyridin-4-y l) amidohexanoate de méthyle (5) (5) L’ acide 2,6- bis( hydroxyméthyl ) isonicotinique (4) (50 mg ; 0,273 mmol ; 1 eq) a été dissous dans le N,N- diméthylformamide anhydre (3,0 mL), la solution a été refroidie à 0 °C, puis le HATU (156 mg ; 0,410 mmol ; 1,5 eq) et la 2,6-lutidine (147,0 µL ; 1,260 mmol ; 4,7 eq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée à 0 °C pendant 15 min puis le 6-aminohexanoate de méthyle (59 mg ; 0,322 mmol ; 1,2 eq) a été ajouté. Les parois du ballon ont été rincées avec 2 mL de N ,N - diméthylformamide anhydre et le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 15 h. Le mélange réactionnel a été dilué dans l’acétate d’éthyle, lavé à trois reprises avec une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur sulfate de magnésium, filtré et concentré sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (5) (76 mg ; 91%) sous la forme d’un solide blanc cassé. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 8,79 (t ; J = 5,6 Hz ; 1H 7 ) ; 7,71 (s ; 2H 2,4 ) ; 5,50 (t ; J = 5,8 Hz ; 2H 16,18 ) ; 4,57 (d ; J = 5,8 Hz ; 4H 15,17 ) ; 3,57 (s ; 3H 14 ) ; 3,25 (m ; 2H 8 ) ; 2,30 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H 12 ) ; 1,62 – 1,45 (m ; 4H 9,11 ) ; 1,37 – 1,21 (m ; 2H 10 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 173,3 (1C 13 ) ; 165,1 (1C 6 ) ; 161,8 (2 1,5 ) ; 142,9 (1C 3 ) ; 115,8 (2C 2,4 ) ; 64,1 (2C 15,17 ) ; 51,2 (1C 14 ) ; 38,5 sous le DMSO (1C 8 ) ; 33,2 (1C 12 ) ; 28,6 (1C 9 ) ; 25,9 (1C 11 ) ; 24,2 (1C 10 ). SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C 15 H 22 N 2 O 5 [M] : 310,1529 ; observée 310,1526. Préparation du 6-(2,6- b is( bromométhyl )pyridin-4-y l) amidohexanoate de méthyle (6) (6) Le 6-((2,6- b is( hydroxyméthyl )pyridin-4-yl) amidohexanoate de méthyle (5) (55 mg ; 0,177 mmol ; 1 eq) a été mis en suspension dans l’acétonitrile anhydre (10,5 mL) puis le tribromure de phosphore (50 µL ; 0,532 mmol ; 3,0 eq) a été ajouté goutte à goutte. Le milieu réactionnel a été agité à 45 °C pendant 2 h. La solution a été refroidie à 0 °C, neutralisée avec de l’eau (10 mL) et extraite à l’acétate d’éthyle (3x15 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , cyclohexane/acétate d’éthyle 60:40) pour donner ( 6 ) (57 mg ; 74%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz ; DMSO) δ 8,83 (t, J = 5,6 Hz ;1H 7 ) ; 7,84 (s ; 2H 2,4 ) ; 4,74 (s ; 4H 15,16 ) ; 3,57 (s, 3H 14 ) ; 3,31 – 3,20 (m ; 2H 8 ) ; 2,31 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H 12 ) ; 1,64 – 1,45 (m ; 4H 9,11 ) ; 1,39 – 1,22 (m, 2H 10 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 173,3 (1C 13 ) ; 163,8 (1C 6 ) ; 157,5 (2C 1,5 ) ; 144,2 (1C 3 ) ; 120,8 (2C 2,4 ) ; 51,2 (1C 14 ) ; 38,9 sous le DMSO (1C 8 ) ; 34,1 (2C 15,16 ) ; 33,2 (1C 12 ) ; 28,5 (1C 9 ) ; 25,9 (1C 11 ) ; 24,2 (1C 10 ). SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C 15 H 20 Br 2 N 2 O 3 [M] : 433,9841 ; observée 433,9832. Préparation de l’acide 6-(2,6- bis( bromométhyl )p yridin-4-yl) amidohexanoïque (7) (7) Le 6-(2,6- bis( bromométhyl )pyridin-4-yl) amidohexanoate de méthyle (6) (57 mg ; 0,131 mmol ; 1,0 eq) a été dissous dans le tétrahydrofurane (4 mL) et une solution d’hydroxyde de lithium hydraté (8 mg ; 0,327 mmol ; 2,5 eq) dans l’eau (4 mL) a été ajoutée doucement. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 8,5 h. Le tétrahydrofurane a été évaporé sous pression réduite et le résidu aqueux a été traité avec une solution aqueuse d’acide chlorhydrique 1N et extrait avec de l’acétate d’éthyle (3x10 mL). Les phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (dichlorométhane/méthanol, 90:10) pour donner (7) (44 mg ; 80%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz ; DMSO) δ 12,00 (s ; 1H 14 ) ; 8,83 (t ; J = 5,5 Hz ; 1H 7 ) ; 7,84 (s ; 2H 2,4 ) ; 4,74 (s ; 4H 15,17 ) ; 3,31 – 3,21 (m ; 2H 8 ) ; 2,21 (t ; J = 7,3 Hz ; 2H 12 ) ; 1,60 – 1,46 (m ; 4H 9,11 ) ; 1,39 – 1,25 (m ; 2H 10 ). RMN 13 C (75 MHz ; DMSO) δ 174,4 (1C 13 ) ; 163,8 (1C 6 ) ; 157,5 (2C 1,5 ) ; 144,1 (1C 3 ) ; 120,8 (2C 2,4 ) ; 39,0 sous le DMSO (1C 8 ) ; 34 ,1 (2C 15,16 ) ; 33,6 (1C 12 ) ; 28,6 (1C 9 ) ; 26,0 (1C 11 ) ; 24,2 (1C 10 ). SMHR (ESI) : m/z calculée pour C 14 H 19 Br 2 N 2 O 3 [M+H] + : 420,9757 ; observée 420,9752. Préparation de 6-(2,6- bis( bromométhyl)pyridin-4-yl)amido- N -hexanamide-valine-citrulline- p -amin obenzoyle carbamate de MMAE (8) (8) Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’ acide 6-(2,6- bis( bromométhyl )pyridin-4-yl) amidohexanoïque (7) (13,2 mg ; 0,0313 mmol ; 2,28 eq) a été dissous dans l’acétonitrile anhydre (1,2 mL) puis la N -éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ) (21,2 mg ; 0,0857 mmol ; 6,25 eq) a été ajouté. Le milieu d’activation a été agité à 25 °C pendant 1 h 20. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de valine-citrulline- p -aminobenzoyle carbamate de MMAE (17,0 mg ; 0,0137 mmol ; 1,0 eq), solubilisé dans du N , N -diméthylformamide anhydre (300 µL) en présence de N,N -diisopropyléthylamine (9,4 µL ; 0,0537 mmol ; 3,92 eq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à 25 °C pendant 1 h. Le mélange a été dilué par 2 avec du N , N -diméthylformamide et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 22,1 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1 % d’acide trifluoroacétique (en volume) dans l’eau (solvant A), et de l’acétonitrile (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner ( 8) (18,2 mg ; 87%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ (ppm) 10,04 – 9,95 (m ; 1H) ; 8,94 – 8,79 (m ; 1H) ; 8,20 – 8,06 (m ; 2H) ; 7,98 – 7,87 (m ; 1H) ; 7,84 (s ; 2H) ; 7,81 (s ; 1H) ; 7,70 – 7,61 (m ; 1H); 7,58 (d ; J = 8,2 Hz ; 2H) ; 7,38 – 7,11 (m ; 6H) ; 6,07 – 5,92 (m ; 1H) ; 5,47 – 5,37 (m ; 1H) ; 5,15 – 4,96 (m ; 1H) ; 4,73 (s ; 4H) ; 4,54 – 4,29 (m ; 2H) ; 4,32 – 4,12 (m ; 1H) ; 4,05 – 3,92 (m ; 1H) ; 3,30 – 3,08 (m ; 9H) ; 3,06 – 2,93 (m ; 2H) ; 2,91 – 2,77 (m ; 2H) ; 2,24 – 2,05 (m ; 2H) ; 2,21 – 2,11 (m ; 3H) ; 2,02 – 1,88 (m ; 1H) ; 1,60 – 1,44 (m ; 5H) ; 1,36 – 1,13 (m ; 4H) ; 1,08 – 0,93 (m ; 6H) ; 0,93 – 0,67 (m ; 28H). SMHR (ESI) : m/z calculée pour C 72 H 111 Br 2 N 12 O 14 [M+H] + : 1525,6704 ; observée 1525,6700. Exemple 2 : synthèse d’un conjugué anticorps-médicament selon l’invention Code du produit synthétisé: MF-BTX-MMAE (correspondant à la formule (Ia), également appelé ci-après « conjugué anticorps-médicament selon l’invention » ou de manière générale « ADC »). Anticorps utilisé : brentuximab (aussi appelé cAC10). Préparation des solutions Tampon de bioconjugaison : Tampon salin 1X, par exemple phosphate, borate, acétate, glycine, tris(hydroxymethyl)aminomethane, acide 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic dans une plage de pH comprise entre 6 et 9, avec une concentration finale en NaCl comprise entre 50 et 300 mM et une concentration finale en EDTA comprise entre 0,1 et 10 mM. Brentuximab à une concentration comprise entre 1 et 10 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison. Réducteur : Solution d’un réducteur choisi parmi le dithiotréitol, le β-mercaptoéthanol, l’hydrochlorure de tris(2-carboxyéthyl)phosphine, la tris(hydroxypropryl)phosphine à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans le tampon de bioconjugaison. Solution de linker : conjugué cytotoxique ( 8 ) à une concentration comprise entre 0,1 et 10 mM dans un mélange de solvants organiques choisis parmi le diméthylsulfoxide, le N ,N -diméthylformamide, le méthanol, le tétrahydrofurane, l’actéonitrile, le N,N -diméthylacétamide, le dioxane. Réaction de bioconjugaison Sous atmosphère inerte, au brentuximab dans le tampon bioconjugaison (1mg ; 1 éq) a été ajouté le réducteur (4 à 100 éq) et le milieu réactionnel a été incubé entre 15 et 40 °C pendant 0,25 à 3 h puis la solution de linker (4 à 100 éq) a été ajoutée sous atmosphère inerte et le milieu réactionnel a été agité entre 15 et 40 °C pendant 0,5 à 15 h. Cette réaction a été dupliquée, en parallèle, autant de fois que nécessaire pour obtenir la quantité d’ADC final souhaitée, i.e. quatre fois. Purification de l’ADC Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco pH 7,4 le nombre de fois nécessaire pour éliminer les réactifs chimiques résiduels, i.e. purifié 2 fois. Résultat Les étapes décrites ci-dessus ont permis d’obtenir 2,6 mg de MF-BTX-MMAE (65%). Exemple 3 : analyses du conjugué anticorps-médicament ( MF-BTX-MMAE ) Analyse HIC ( Hydrophobic Interaction Chromatography ) Matériel et méthode L’ADC MF-BTX-MMAE a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d’être filtré sur 0,22 µm. 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 µm, 4,6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. L’ADC MF-BTX-MMAE a été élué à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d’ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu’à 20% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu’à 85% de tampon B en 30 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 1 min. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation. Les résultats sont présentés à la Figure 1 et dans le Tableau 1 ci-dessous. MF-BTX-MMAE DAR 0 DAR 1 DAR 2 DAR 3 DAR 4 DAR 5 Temps de rétention (min) 5,61 8,34 12,24 16,68 20,15 24,76 Aire (%) 0,13 0,68 1,95 14,64 62,62 19,97 DAR moyen 3,99 Analyse SEC (Size Exclusion Chromatography ) Matériel et méthode L’ADC MF-BTX-MMAE a été dilué à 1 mg/mL avec du PBS pH 7,4 avant d’être filtré sur 0,22 µm. 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 µm, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (2998) réglé pour une détection à 280 nm. L’ADC MF-BTX-MMAE a été élué à un débit de 1 mL/min par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d’azoture de sodium, pH 7,0) en 24 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation. Les résultats sont présentés à la Figure 2 et dans le Tableau 2 ci-dessous. MF-BTX-MMAE Agrégats solubles Agrégats solubles Oligomères Monomères Temps de rétention (min) 2,71 5,06 5,59 6,44 Aire (%) 0,05 0,41 0,99 98,54 Reproductibilité Les résultats de reproductibilité sont présentés à la Figure 3 (reproductibilité sur 3 bioconjugaisons indépendantes à une échelle de 1 mg, analyse par HIC) et à la Figure 4 (reproductibilité sur différentes échelles sur 250 µg, 500 µg, 850 µg et 1 mg, à une même concentration de MF-BTX-MMAE, analyse par HIC). Conclusion : la bioconjugaison est parfaitement reproductible sur une même échelle et sur différentes échelles. Exemple 4 : évaluation in vitro du conjugué anticorps-médicament ( MF-BTX-MMAE ) Liaison à l’antigène CD30 : reconnaissance de l’antigène CD30 sur une lignée positive (Karpas-299) avec l’ADC MF-BTX-MMAE en comparaison avec un ADC de référence décrit dans l’art antérieur, appelé brentuximab vedotin (commercialisé sous le nom commercial Adcetris®) et avec un ADC contrôle négatif ciblant l’antigène HER2 (ADC comprenant l’anticorps trastuzumab référencé MF-TTZ-MMAE). Matériel et méthode Les cellules ont été obtenues de DSMZ (Karpas-299). Les cellules ont été cultivées en suspension dans du milieu de culture (RPMI 1640 supplémenté avec 20% de SVF) à 37 °C, dans une atmosphère humide (5% de CO2, 95% air). Les cellules sont comptées et leur viabilité est vérifiée avec un test au bleu de trypan 0,25%. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du tampon FCM (DPBS contenant 0,2% de BSA et 0,02% d’azoture de sodium) et incubées en duplicats pendant 1 h à 0 °C avec du PBS, 10 µg/mL de MF-BTX-MMAE, 10 µg/mL de brentuximab vedotin ou 10 µg/mL de MF-TTZ-MMAE. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du tampon FCM, resuspendues dans 50 µL de tampon FCM contenant l’anticorps secondaire (Fab chèvre anti-IgG humaine Fc-PE) et incubées 1 h à 0 °C. Les cellules ont été lavées de nouveau avec du tampon FCM et resuspendues dans 800 µL de tampon FCM, avant d’être analysées par cytométrie en flux (BD FACSCalibur équipé avec un laser d’excitation à 488 nm). L’acquisition a été conduite, pour chaque échantillon, jusqu’à enregistrement de 10000 évènements ou pour au maximum 2 minutes. Résultats Les résultats, présentés à la Figure 5, montrent que la reconnaissance de CD30 par MF-BTX-MMAE est similaire à la reconnaissance de CD30 par l’ADC de référence (brentuximab vedotin). L’ADC contrôle négatif (anti-HER2) ne reconnait pas l’antigène CD30. Cytotoxicité (MTS assay ) : effet cytotoxique de MF-BTX-MMAE sur une lignée positive (Karpas-299) comparé à l’ADC de référence (brentuximab vedotin). Matériel et méthode Les cellules ont été cultivées à densité optimale dans des plaques 96-puits (ref 167008, Nunc, Dutscher, Brumath, France) et incubées dans 190 µL de milieu de culture (RPMI 1640 supplémenté avec 20% de SVF) à 37 °C dans une atmosphère humide (5% de CO 2 , 95% air) pendant 6 h avant le début du traitement. Les ADC testés ont été ajoutés (10 µL) aux concentrations finales suivantes : 0,3 ; 1 ; 3 ; 10 ; 30 ; 100 ; 300 ; 1000 ; 3000 ng/mL ; et incubés pendant 96 h à 37 °C dans une atmosphère 5% de CO 2 . La viabilité cellulaire a été déterminée par test MTS par ajout de 40 µL d’une solution stérile de MTS (20 mL à 2 mg/mL ; ref: G1111, Promega, Charbonnières, France) et de PMS (1 mL à 0,92 mg/mL ; ref: P9625, Sigma) dans du tampon DPBS (ref: 17 513F, Cambrex ). L’absorbance est mesurée à 490 nm avec un lecteur de plaque Envision multilabeled counter (PerkinElmer, Courtaboeuf, France). Chaque échantillon de la gamme de concentration de composé a été réalisé en tripliqua et deux expériences indépendantes ont été conduites. R ésultats Les résultats, présentés à la Figure 6, montrent un effet cytotoxique similaire du MF-BTX-MMAE par rapport l’ADC de référence, le brentuximab vedotin. Exemple 5 : stabilité de la bio conjugaison Stabilité à 37 °C en présence ou non de HSA (Albumine sérique humaine) Matériel et méthode La concentration de MF-BTX-MMAE et de l’ADC de référence brentuximab vedotin, dans un tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d’azoture de sodium, pH 7,4), a été ajustée à 2 mg/mL. Douze (12) échantillons de 20 µL de MF-BTX-MMAE et de l’ADC de référence brentuximab vedotin ont été déposés dans douze flacons en polyproprylène (fisher scientific, 0,6 mL) puis 20 µL de tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d’azoture de sodium, pH 7,4) ou 20 µL d’une solution de HSA (Sigma Aldrich) à 20 mg/mL dans le tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d’azoture de sodium, pH 7,4) a été ajouté à chaque flacon. Après agitation, chacun des 12 flacons est centrifugé 30 secondes à 5000 g avant incubation à 37 °C dans un incubateur (VWR INCU-line IL23). Les flacons ont été retirés trois par trois de l’incubateur conservés à -80 °C après 1 minute (T0), 24 h, 48 h et 120 h. Après dilution par un facteur 2 avec du tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, 1 mM d’azoture de sodium, pH 7,4), le contenu de chacun des 12 flacons est filtré sur 0,22 µm et analysé par HIC. Pour MF-BTX-MMAE, 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 µm, 4.6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d’ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu’à 100% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 50 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation. Pour l’ADC de référence, brentuximab vedotin, 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne TSKgel Butyl NPR, 2,5 µm, 4,6 x 100 mm (Tosoh), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 0,6 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d’ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, pH 7,0) jusqu’à 80% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) dans le tampon A en 60 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 6 min. La température a été maintenue à 30 °C tout au long de la séparation. Résultats Le suivi de l’évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à 37 °C est présenté à la Figure 7. Les résultats montrent une parfaite stabilité à 37 °C de MF-BTX-MMAE, ce qui n’est pas le cas pour l’ADC de référence, brentuximab vedotin. Cela s’explique par la stabilité accrue du conjugué anticorps-médicament selon l’invention. Le suivi de l’évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation avec un excès de HSA à 37 °C est présenté à la Figure 8. Les résultats montrent une parfaite stabilité en présence de HSA de MF-BTX-MMAE, ce qui n’est pas le cas pour l’ADC de référence, brentuximab vedotin. Cela s’explique par la stabilité accrue du conjugué anticorps-médicament selon l’invention. Stabilité à 40 °C Matériel et méthode La concentration de MF-BTX-MMAE et de l’ADC de référence, brentuximab vedotin, dans un tampon PBS (1 mM de phosphate de sodium monobasique, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 155 mM de chlorure de sodium, pH 7,4), a été ajustée à 1 mg/mL. Six (6) échantillons de 150 µL de MF-BTX-MMAE et de l’ADC de référence, brentuximab vedotin, ont été déposés dans six flacons en polyproprylène (Eppendorf Protein LoBind, 0,5 mL). Après agitation, les échantillons sont incubés dans un incubateur (VWR INCU-line IL23) à 40 °C. Les flacons ont été retirés trois par trois de l’incubateur, centrifugé 2 minutes à 5000 g et conservés à -80 °C après 1 minutes et 4 semaines. Le contenu de chacun des 6 flacons est filtré sur 0,22 µm et analysé par HIC et SEC. HIC Pour MF-BTX-MMAE, 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne MAbPac HIC-Butyl, 5 µm, 4.6 x 100 mm (ThermoScientific), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 1 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d’ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, 5% isopropanol (v/v), pH 7,0) jusqu’à 20% de tampon de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) en 2 minutes puis jusqu’à 85% de tampon B dans le tampon A en 30 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation. Pour l’ADC de référence, brentuximab vedotin, 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne TSKgel Butyl NPR, 2,5 µm, 4,6 x 100 mm (Tosoh), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (e2998) réglé pour une détection à 280 nm. Les échantillons ont été élués à un débit de 0,6 mL/min par un gradient depuis 100% de tampon A (1,5 M sulfate d’ammonium, 50 mM phosphate de sodium monobasique, pH 7,0) jusqu’à 80% de tampon B (50 mM phosphate de sodium monobasique, 20% isopropanol (v/v), pH 7,0) dans le tampon A en 45 minutes puis ce gradient a été maintenu pendant 6 min. La température a été maintenue à 30 °C tout au long de la séparation. SEC 50 µg de produits ont été injectés sur une colonne AdvanceBio SEC 2.7 µm, 7,8 x 300 mm (Agilent Technologies), connectée à une chaine HPLC Waters Alliance (e2695) équipée d’un PDA (2998) réglé pour une détection à 280 nm. L’ADC MF-BTX-MMAE été élué à un débit de 1 mL/min par un isocratique de tampon C (1 mM phosphate de sodium monobasique, 155 mM de chlorure de sodium, 3 mM de phosphate de sodium dibasique, 3 mM d’azoture de sodium, pH 7,4) en 24 minutes. La température a été maintenue à 25 °C tout au long de la séparation. Résultats Le suivi de l’évolution du DAR moyen par la méthode HIC après incubation à 40 °C pendant 28 jours est présenté à la Figure 9 (N=2). Les résultats montrent que le DAR moyen de brentuximab vedotin varie de 3,47 (à t0) à 2,32 (à t28) attestant d’un manque de stabilité dans les conditions stressantes simulées alors que celui de MF-BTX-MMAE varie peu (3,99 (à t0) à 3,94 (à t28)) démontrant sa stabilité améliorée par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin). Le suivi de l’évolution du pourcentage de DAR4 par la méthode HIC après incubation à 40 °C pendant 28 jours est présenté à la Figure 10 (N=2). Les résultats montrent que le pourcentage de DAR4 diminue au cours du temps pour brentuximab vedotin (36 % à t0 contre 19% à t28) alors que celui de MF-BTX-MMAE varie peu (62% à t0 contre 60% à t28). Cela démontre la stabilité accrue et la meilleure conservation du pourcentage de DAR4 de MF-BTX-MMAE par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin). Le suivi de l’évolution du pourcentage de monomère par la méthode SEC après incubation à 40 °C pendant 28 jours est présenté à la Figure 11 (N=2). Les résultats montrent que le pourcentage de monomère diminue davantage pour brentuximab vedotin ( 84% à t28). Cela démontre la stabilité accrue de MF-BTX-MMAE par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin). Exemple 6 : évaluation in vivo du conjugué anticorps-médicament ( MF-BTX-MMAE ) Matériel et méthode Toutes les expériences ont été conduites dans un environnement conforme aux recommandations des autorités françaises (Agrément N° A 91 962 106). L’étude de survie a été réalisée sur un modèle de xénogreffe Karpas-299 (DSMZ). Une suspension de cellules tumorales a été implantées en sous-cutanée dans des souris immunodéprimées CB17-SCID (Charles River) 72 h après une irradiation complète avec une source γ (1,44 Gy, 60Co, BioMep, Bretenières, France). Après prise du greffon tumoral, les souris ont été randomisées en groupes (N=5) une fois le volume moyen ayant atteint 100-200 mm 3 . Les ADCs (MF-BTX-MMAE ou l’ADC de référence brentuximab vedotin) ou un véhicule (PBS à pH 7,4) ont été administrés au jour 1 par voie intraveineuse (IV, bolus) dans la veine caudale des souris à 1 ou 0,5 mg/kg. Le volume tumoral en fonction du temps a été calculé deux fois par semaine en utilisant la formule suivante : (Longueur x épaisseur²)/2. Les animaux ont été euthanasiés quand les volumes tumoraux ont atteint 10% de leur poids, soit approximativement 2000 mm 3 . La survie des souris a été mesurée en pourcentage en fonction des jours après injection du MF-BTX-MMAE, de l’ADC de référence brentuximab vedotin ou du véhicule (contrôle négatif). Résultats Les résultats de l’administration d’une dose de 0,5 mg/kg sont présentés à la Figure 12 et à la Figure 13. Les résultats de l’administration d’une dose de 1 mg/kg sont présentés à la Figure 14 et à la Figure 15. Les résultats montrent qu’à la dose de 0,5 mg/kg, MF-BTX-MMAE est plus efficace que l’ADC de référence (brentuximab vedotin). En particulier, la survie du groupe traité par MF-BTX-MMAE est améliorée par rapport à l’ADC de référence (brentuximab vedotin). A 1 mg/kg, MF-BTX-MMAE et l’ADC de référence brentuximab vedotin permettent une régression tumorale complète chez l’ensemble des animaux (N=8). Listage de séquences Numéro de séquence Type de séquences Séquence en acides aminés SEQ ID NO : 1 CDR1 de la chaîne légère du brentuximab QSVDFDGDSY SEQ ID NO : 2 CDR3 de la chaîne légère du brentuximab QQSNEDPWT SEQ ID NO : 3 CDR1 de la chaîne lourde du brentuximab GYTFTDYY SEQ ID NO : 4 CDR2 de la chaîne lourde du brentuximab IYPGSGNT SEQ ID NO : 5 CDR3 de la chaîne lourde du brentuximab ANYGNYWFAY SEQ ID NO : 6 Chaine légère du brentuximab DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO : 7 Chaine lourde du brentuximab QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Références citées sous le format « [numéro de référence] » : 1. Peter D Senter et Eric L Sievers, Nature B iotechnology , 30(7), 631-637, 2012 2. Pabst et al. , Journal of Controlled Release , 253, 160-164, 2017 3. Goyon, A et al. , J. Chromatogr . B , 1065–1066, 35-43, 2017 4. Fekete, S. et al. , J. Pharm. Biomed . Anal. , 130, 3–18, 2016 Conjugué anticorps-médicament de formule (I) suivante : [Chem. 1] dans laquelle : A est un anticorps ou un fragment d’anticorps anti-CD30 ; la tête d’accroche est représentée par la formule suivante : [Chem. 2] ; le bras de liaison est un bras de liaison clivable représenté par la formule suivante : [Chem. 3] ou [Chem. 4] ; l’espaceur est représenté par la formule suivante : [Chem. 5] ; m est un entier allant de 1 à 10 ; n est un entier allant de 1 à 4. Conjugué anticorps-médicament selon la revendication 1, dans lequel m est égal à 5. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel le médicament cytotoxique est choisi parmi méthotrexate, IMIDs, duocarmycin, combretastatine, calicheamicine, monométhylauristatine E (MMAE), monométhylauristatine F (MMAF), maytansine, DM1, DM4, SN38, amanitine, pyrrolobenzodiazepine, dimère de pyrrolobenzodiazepine, pyrrolopyridodiazepine, dimère de pyrrolopyridodiazepine, un inhibiteur de l’histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et ricine, de préférence MMAE. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 de formule suivante : [Chem. 10] Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel A est Brentuximab. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 de formule (Ia) suivante : [Chem. 11] Composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 6. Composition selon la revendication 7, dans laquelle au moins 50%, de préférence au moins 60%, des conjugués anticorps-médicament ont un n égal à 4. Composition selon l’une quelconque des revendications 7 ou 8, dans laquelle A est un anticorps et le Drug-to-Antibody Ratio moyen (DAR moyen) est compris entre 3,5 et 4,5, de préférence compris entre 3,8 et 4,2, par exemple égal à 4 ±0,1. Composition selon l’une quelconque des revendications 7 à 9, comprenant en outre du paclitaxel, du docétaxel, de la doxorubicine, du cyclophosphamide, du prednisone, de la vinblastine, de la dacarbazine, de la gemcitabine, d’un inhibiteur de l'aromatase tel que l’anastrozole et / ou un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse tel qu’un anti-PD1. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 ou composition selon l’une quelconque des revendications 7 à 10, pour utilisation comme médicament. Conjugué anticorps-médicament selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 ou composition selon l’une quelconque des revendications 7 à 10, pour utilisation dans le traitement d’un cancer CD30+, de préférence les cancers du sang ou les lymphomes. Conjugué anticorps-médicament pour utilisation selon la revendication 12, dans lequel le cancer CD30+ est choisi parmi le lymphome de Hodgkin, le lymphome anaplasique à larges cellules et le lymphome T périphérique.