FR 3100334 A1 20210305 FR 1909694 A 20190903 Description Titre de l'invention : Dispositif pour la détermination automatisée du passage percutané et de la métabolisation d'une substance Domaine technique [0001] L'invention concerne un dispositif pour la détermination automatisée et simultanée du passage percutané et de la métabolisation d'une substance et son impact biologique. [0002] L'invention appartient au domaine des dispositifs ex vivo ou in vitro permettant d'apprécier la pénétration percutanée de substances et leur métabolisation sur des expiants maintenus en survie ainsi que la réponse biologique des expiants ou des tissus reconstruits. [0003] La pénétration percutanée est une méthode biophaimaceutique qui évalue l'absorption cutanée d'un principe actif ou d'une substance cosmétique dans une forme galénique. [0004] L'évaluation de la pénétration percutanée est importante notamment pour estimer une toxicité locale. [0005] Le métabolisme, ou biotransformation, représente l'ensemble des réactions bio- chimiques que subissent les substances endogènes et exogènes, résultant en une diminution de leur lipophilicité et en une augmentation de leur caractère hydrosoluble. Le but ultime du métabolisme est de faciliter l'excrétion de ces substances hors de l'organisme, ce qui est essentiel à sa survie. 100061 L'invention vise à disposer d'un système plus proche des conditions in vivo, mettant en oeuvre un modèle ex-vivo utilisant des expiants de peau humaine/animale ou d'un modèle in vitro mettant en oeuvre des tissus reconstruits (épidermes reconstruits ou modèle reconstruit épiderme/derme), ou des membranes synthétiques. 100071 La connaissance du métabolisme cutané apparait capitale car ce dernier peut être mis à profit pour développer de nouvelles prodrogues mais aussi pour diminuer les risques de toxicité locale de divers xénobiotiques. Technique antérieure [0008] La peau est un organe complexe qui a de multiples fonctions. [0009] Elle assure non seulement une fonction de protection, mais participe aussi largement à l'homéostasie thermique et hydrique de l'organisme. [0010] Elle est également impliquée dans la défense immunitaire de l'organisme. [0011] La peau participe au contrôle de l'homéostasie générale de l'organisme en régulant la température ainsi que la perte corporelle en eau et en électrolytes. [0012] La peau est une barrière physique à l'entrée de xénobiotiques dans l'organisme. Ce rôle de barrière est principalement joué par le stratum corneum. Cependant, cette 2 barrière n'est pas totale et la peau reste perméable à certaines molécules. Le stratum corneum joue un rôle capital dans ces fonctions et peut-être considéré comme un réservoir à partir duquel la substance stockée peut diffuser vers les couches les plus profondes de la peau. [0013] Anatomiquement, deux voies distinctes s'offrent pour la pénétration des substances : d'une part, la voie transépidermique et d'autre part, la voie transfolliculaire. [0014] Pour la voie transépidermique, la diffusion de la molécule s'effectue soit à travers les cellules cornées, essentiellement constituées de protéines hydrophiles, soit à travers les espaces intercellulaires de la couche cornée, constitués de lipides. [0015] Du fait de son caractère amphiphile, le domaine intercellulaire hydrolipidique constitue un canal de diffusion préférentiel pour les substances lipo- et hydrosolubles. [0016] Les substances lipophiles diffusent à travers les zones hydrophobes des bicouchcs li- pidiques intercellulaires. Les composés plus hydrophiles migrent, d'une part, à travers les zones hydrophiles des hicouches lipidiques intercellulaires et d'autre part, en utilisant la voie intracellulaire. [0017] Les substances lipophiles peuvent également emprunter la voie transfolliculairc via les follicules pilosébacés et/ou les glandes sudoripares. Cependant, cette voie reste minoritaire. [0018] La pénétration ne s'effectue pas uniquement par l'une des voies. Les deux participent au phénomène, et la pénétration globale est la résultante d'un passage transépidermique et d'un passage par les annexes cutanées. [0019] Même si le passage percutané peut-être faible en fonction des composés d'intérêt, celui-ci peut être déterminant pour certaines substances. [0020] En effet, le stratum corneum limite l'absorption percutanée de xénobiotiques grâce à son effet barrière. [0021] La peau est en effet capable de métaboliser les composés avant leur passage dans la circulation sanguine et cette biotransformation est susceptible d'influencer la diffusion d'un composé à travers la peau. [0022] L'épiderme possède des enzymes fonctionnelles qui vont biotransformer les xéno- biotiques ayant traversés le stratum corneum, en particulier, les composés lipophiles en molécules plus hydrophiles qui vont diffuser plus facilement à travers l'épiderme et le derme. [0023] Le métabolisme peut ainsi avoir une influence sur la diffusion percutanée de composés très peu solubles ou lipophiles et modifier les propriétés des molécules et leur impact sur le tissu. [0024] Pour l'évaluation du passage percutané, Franz et Bronaugh ont développé la première cellule de mesure de diffusion percutanée en 1975. [0025] Il existe deux types de cellules : les cellules statiques et les cellules à flux dites dy- 3 namiques, où le liquide est renouvelé de manière continue. [0026] Ces cellules comprennent deux compartiments : le compartiment donneur séparé du compartiment récepteur par une membrane, ladite membrane étant un expiant cutané lorsque la diffusion percutanée est étudiée. [0027] Le compartiment donneur reçoit la formulation contenant la substance à tester et des prélèvements successifs dans le compartiment récepteur permettent d'établir au cours du temps le profil cinétique de passage. [0028] En fin d'expérience, la quantité d'actif qui n'a pas pénétré dans la peau est mesurée ainsi que la distribution dans les différentes couches cutanées (stranun corneum, épiderme, derme) et la quantité présente dans le compartiment récepteur. [0029] Ces données permettent d'établir un bilan massique, un profil de distribution et de calculer un certain nombre de paramètres, dont le coefficient de perméabilité, partage ou de diffusion. [0030] Cependant, l'utilisation des dispositifs de l'art antérieur présente des insuffisances conduisant à des incertitudes sur les résultats obtenus et ne permettent pas l'étude conjointe du passage percutané et métabolisme ainsi que la réponse biologique des expiants ou des tissus reconstruits. [0031] La figure 1 relative à l'art antérieur montre une représentation de principe d'une cellule de diffusion dite de Franz, utilisée pour l'analyse in vitro ou ex vivo de la diffusion d'une substance à travers une membrane et notamment à travers un expiant de peau. [0032] Selon cet exemple, le dispositif de l'art antérieur comprend un compartiment donneur (110) et un compartiment receveur (120). [0033] Le compartiment receveur est contenu dans un flacon à double paroi (130) et des moyens (140) permettent de réaliser une circulation fluide entre lesdites parois du flacon, notamment afin de maintenir l'ensemble à une température prédéterminée. [0034] La substance à tester est déposée dans le compartiment donneur (110). Celle-ci ne peut passer dans le compartiment receveur (120) qu'en traversant la membrane (150). [0035] Ladite membrane (150) est en effet prise en sandwich entre l'extrémité inférieure de l'enveloppe du compartiment donneur et l'extrémité supérieure du flacon (130) à double paroi comprenant le compartiment receveur. [0036] Des moyens de serrage (160) permettent d'assembler les trois pièces (110, 130, 150) de manière étanche. [0037] D'autres moyens (non représentés) permettent de prélever des échantillons dans le compartiment receveur (120) au moyen d'une seringue sans avoir à ouvrir le dispositif. [0038] Ainsi, selon ce dispositif de l'art antérieur, l'étanchéité, à la fois entre le com- partiment donneur (110) et le compartiment receveur (120), mais aussi entre le fluide circulant entre les parois du flacon (130) et ces compartiments est assurée par la membrane (150) elle-même et le serrage sur cette membrane. [0039] Or, lorsque la membrane est un expiant de peau, la présence de ce serrage ne permet pas de maintenir ledit expiant en survie. [0040] En effet, le serrage induit une nécrose du tissu qui se propage rapidement et altère la fiabilité du résultat lors de l'utilisation d'expiants maintenus en survie. Ainsi, ce système n'est pas adapté pour étudier le métabolisme d'une substance par des modèles de peau en survie ainsi que la réponse biologique des expiants ou des tissus reconstruits. [0041] Ce serrage est toutefois nécessaire et doit être suffisant pour assurer une étanchéité ir- réprochable du système sous réserve de doser une proportion d'actif n'ayant pas réellement diffusé dans l'expiant. [0042] Les conditions de maintien en survie de l'expiant (température, humidité, taux de CO 2) nécessitent de placer l'expérimentation dans un milieu adéquat. [0043] Les évaluations de métabolisme cutané sont classiquement réalisées dans un in- cubateur en présence de CO2, d'un milieu de culture contenant des nutriments pour les modèles de peau et d'une atmosphère saturée en eau permettant de maintenir la peau en survie. [0044] Le système est un système statique composé d'une plaque de culture avec des puits contenant le milieu de culture dans lequel se trouve un insert composé d'une membrane. Sur l'insert est placé le tissu reconstruit ou l'expiant de peau. [0045] La substance est déposée à la surface du tissu cutané. [0046] Le métabolisme est évalué par la quantification de la substance testée et de ses mé- tabolites dans les différents compartiments du modèle (surface, stratum corneum, peau et milieu récepteur). [0047] Le tissu cutané recouvre la surface de l'insert mais l'absence de système de serrage de la peau contre l'insert ne permet pas d'assurer une étanchéité et peut entrainer une fuite de la substance testée dans le puits où se trouve le milieu récepteur. [0048] Comme évoqué ci-dessus, la possible fuite de l'actif dans le milieu sans passage par l'expiant est une problématique systématiquement reprochée à ce type d'essai lors de l'utilisation de plaques de culture avec inserts ne permettant pas de créer une étanchéité. Ce système n'est donc pas adéquat pour l'évaluation du passage transcutané. [0049] Les conditions d'hygrométrie et de température bien qu'assurant la viabilité du modèle de peau, peuvent modifier les propriétés d'absorption cutanée et ne miment pas des conditions in vivo (hygrométrie, température, système statique). [0050] La température ainsi que l'hydrométrie peuvent jouer sur l'organisation lipidique, l'hydratation du stratum corneum, la viabilité des enzymes cutanées mais également sur les paramètres physicochimiques des substances à tester. 100511 11 est à noter que ce système statique s'éloigne de la situation in vivo où on retrouve la circulation sanguine. L'absence de flux, peut conduire à une métabolisation plus importante des composés par recaptage dans le milieu. Exposé de l'invention [0052] L'invention vise à résoudre les inconvénients de l'art antérieur et concerne à cette lin une cellule de diffusion permettant de maintenir un expiant cutané en survie tout en assurant une étanchéité parfaite et se rapprochant des conditions in vivo. [0053] A cette fin, la cellule objet (le l'invention comprend : - un expiant (le peau humaine/animale ou épiderme/peau reconstruit ; - un puit comprenant une cavité constituant un compartiment receveur ; - un chapeau comprenant un compartiment donneur ; - des moyens de connexion du puit et du chapeau ; dans lequel, l'expiant est maintenu entre le compartiment donneur et le compartiment receveur entre deux joints, l'un des joints étant lié au puit dans un logement pratiqué dans ledit puit et l'autre au chapeau dans un logement pratiqué dans ledit chapeau, et qu'il comprend des moyens pour régler la pression exercée par les joints sur l'expiant. [0054] Ainsi, l'utilisation de moyens spécifiques permet de définir une pression maximale admissible sur les joints, apte à assurer l'étanchéité mais suffisamment faible pour ne pas entraîner de nécrose de l'expiant et maintenir ce dernier en survie. [0055] L'invention est avantageusement mise en oeuvre selon les modes de réalisation exposés ci-après, lesquels sont à considérés individuellement ou selon toute combinaison techniquement opérante. [0056] Selon un mode de réalisation, les moyens de réglage de la pression exercée par les joints comprennent des moyens d'interface répartis entre le chapeau et le puit et qui définissent, lorsqu'ils sont en contact, une surface de pose du chapeau sur le puit, et des moyens de réglage permettant de modifier la distance entre la surface de pose et le logement de joint pratiqué dans le chapeau ou le logement de joint pratiqué dans le puits. [0057] Ces moyens permettent de régler la pression exercée par les joints sur l'expiant en fonction de l'épaisseur de celui-ci. [0058] Selon un mode de réalisation les moyens d'interface du chapeau et du puit sont maintenus l'un contre l'autre par une force d'attraction magnétique. [0059] Cette disposition sécurise l'assemblage tout en conservant les possibilités de réglage. [0060] Avantageusement, la cellule objet de l'invention comprend une membrane perméable ou semi-perméable maintenu contre l'expiant et apte à maintenir l'expiant dans une configuration sensiblement plane. [0061] Ainsi, la cellule objet de l'invention est utilisable tant verticalement 6 qu' horizontalement. [0062] Dans une configuration le compartiment du chapeau est le compartiment donneur et la cavité du puit est le compartiment receveur. [0063] Selon un mode de réalisation, la cellule objet de l'invention comprend des conduits pour le passage d'un fluide dans la cavité du puit, lesquels conduits débouchent dans la cavité (320) du puit, et des moyens, connectés auxdits conduits, pour le contrôle du débit du fluide dans ladite cavité [0064] Ainsi, l'expiant peut être maintenu en température et en survie par la circulation dudit fluide lui apportant les nutriments nécessaires. [0065] Avantageusement, les moyens de contrôle du débit du fluide dans la cavité (320) comprennent une pompe péristaltique agissant en refoulement dans l'un des conduits et une pompe péristaltique agissant en aspiration dans l'autre conduit. [0066] Cette disposition permet d'assurer le passage d'un fluide à un débit très faible et à faible pression, ainsi que d'effectuer une collecte du fluide à intervalle de temps donné. L'utilisation de pompes péristaltiques évite la formation de bulles d'air dans l'écoulement. [0067] Avantageusement, la cavité du puit est délimitée à une de ses extrémités par l'expiant et à son extrémité opposée par une plaque de fermeture, ladite plaque de fermeture étant constituée d'une matière transparente de sorte à permettre l'observation visuelle de la circulation du fluide dans ladite cavité. [0068] Cette disposition permet de vérifier l'absence de bulles dans la cavité du puit. [0069] L'invention concerne également, un dispositif comprenant une pluralité de cellules selon quelconque des modes de réalisation précédent, et comprenant : - une enceinte et des moyens de régulation aptes à maintenir la pluralité de cellules dans des conditions de température et d'environnement contrôlée ; - des moyens pour le passage d'un fluide dans les cavités de puits de chaque cellule ; - des moyens pour la collecte du fluide passé dans les cavités de puits de chaque cellule. [0070] Avantageusement, les cellules du dispositif objet de l'invention sont montées dans un rack, ledit rack comprenant une surface miroir permettant de refléter l'image observer dans chaque cellule à travers sa plaque de fermeture. [0071] Cette disposition facilite le contrôle de l'absence de bulle dans le fluide passage dans les cavités de puit lorsque les cellules sont montées en rack. [0072] Selon un mode de réalisation du dispositif objet de l'invention, les moyens de passage d'un fluide comprennent un réservoir de fluide, une première pompe aspirant le fluide dans ledit réservoir et l'injectant dans la cavité de puit de chaque cellule par l'un des conduits desdites cellules et une deuxième pompe aspirant le fluide dans la cavité de puit de chaque cellule par l'autre conduit desdites cellules et le refoulant dans 7 les moyens de collecte. [0073] Selon un mode de réalisation, les moyens de collecte comprennent une station d'entrée comprenant des moyens pour connecter les conduits au refoulement de la deuxième pompe, une station de prélèvement comprenant une pluralité de becs de remplissage chacun d'entre eux en connexion hydraulique avec un des conduits de refoulement de la deuxième pompe, un rack apte à contenir une pluralité de flacons et à positionner lesdits flacons en vis-à-vis de chaque bec de remplissage, des moyens de déplacement relatif dudit rack par rapport à la station de prélèvement de sorte à changer les flacons placé en vis-à-vis de chaque bec de remplissage. [0074] Ainsi, en programmant le déplacement du rack comprenant les flacons par rapport à la station de prélèvement, cc dispositif permet dc réaliser des prélèvements à intervalle de temps définie, du fluide ayant traversé la cavité de puit de chaque cellule. [0075] Avantageusement, les moyens de collecte comprennent des moyens pour réfrigérer les flacons compris dans le rack. Ces moyens assurent une meilleure conservation des prélèvements. Description sommaire des dessins [0076] L'invention est exposée ci-après selon ses modes dc réalisations et variantes préférés, nullement limitatifs et en référence des figures I à 8 dans lesquelles : [0077] [fig.l] la figure I relative à l'art antérieur montre, selon une vue en coupe, un exemple dc réalisation d'une cellule de diffusion selon l'art antérieur ; [0078] [fig.2] la figure 2 représente selon une vue en perspective et en éclaté, un exemple dc réalisation d'une cellule de diffusion selon l'invention ; [0079] [fig.3] la figure 3 montre selon une vue en coupe AA, définie figure 2 une exemple de réalisation d'une cellule selon l'invention ; [0080] [fig.4] la figure 4 représente schématiquement un vue de dessus un exemple de réa- lisation d'un dispositif automatisé mettant en oeuvre une pluralité de cellules selon l'invention ; [0081] [fig.5] la figure 5 montre selon une vue en perspective simplifié, un exemple de réa- lisation du dispositif automatisé de récupération du dispositif de la figure 4 ; [0082] [fig.6] et la figure 6 illustre selon une vue en perspective, une exemple de montage en rack d'une pluralité de cellules dans le dispositif de la figure 4. [0083] [fig.7] la figure 7 montre la pénétration cutanée du résorcinol et de ses métabolites 24 h après application topique (% de la dose appliquée, NS : non significatif, test statistique de Kolmogorov-Smirnov p REVENDICATIONS[Revendication 1] Cellule de diffusion comprenant : - un expiant (250) de peau humaine/animale ou épiderme/peau reconstruit ; - un puit (220) comprenant une cavité (320) constituant un compartiment receveur; - un chapeau (210) comprenant un compartiment (310) donneur ; - des moyens de connexion du puit et du chapeau ; caractérisée en ce que l'expiant (250) est maintenu entre le compartiment donneur et le compartiment receveur entre deux joints (271, 272), l'un des joints (272) étant lié au puit dans un logement pratiqué dans ledit puit et l'autre (271) au chapeau dans un logement pratiqué dans ledit chapeau, et qu'il comprend des moyens (211, 221) pour régler la pression exercée par les joints (271, 272) sur l'expiant (250). [Revendication 2] Cellule de diffusion selon la revendication 1, dans laquelle les moyens de réglage de la pression exercée par les joints (271, 272) comprennent des moyens d'interface répartis entre le chapeau et le puit et qui définissent, lorsqu'ils sont en contact, une surface de pose du chapeau sur le puit, et des moyens de réglage (221) permettant de modifier la distance entre la surface de pose et le logement de joint pratiqué dans le chapeau ou le logement de joint pratiqué dans le puits. [Revendication 3] Cellule selon la revendication 2, dans laquelle les moyens d'interface du chapeau et du puit sont maintenus l'un contre l'autre par une force d'attraction magnétique. [Revendication 4] Cellule selon la revendication 1, comprenant une membrane (350) perméable ou semi-perméable maintenue contre l'expiant et apte à maintenir l'expiant dans une configuration sensiblement plane. [Revendication 5] Cellule selon la revendication 3, comprenant des conduits (371, 372) pour le passage d'un fluide dans la cavité du puit, lesquels conduits débouchent dans la cavité (320) du puit, et des moyens, connectés auxdits conduits, pour le contrôle du débit du fluide dans ladite cavité [Revendication 6] Cellule selon la revendication 5, dans laquelle les moyens de contrôle du débit du fluide dans la cavité (320) comprennent une pompe péristaltique agissant en refoulement dans l'un des conduits (371, 372) et une pompe péristaltique agissant en aspiration dans l'autre conduit (371, 372). [Revendication 7] Cellule selon la revendication 3, dans laquelle la cavité (320) du puit 23 [Revendication 8] [Revendication 9] [Revendication 10] [Revendication 11] [Revendication 12] (220) est délimitée à une de ses extrémités par l'expiant (250) et à son extrémité opposée par une plaque de fermeture (325), ladite plaque de fermeture étant constituée d'une matière transparente de sorte à permettre l'observation visuelle de la circulation du fluide dans ladite cavité. Dispositif comprenant une pluralité de cellules selon la revendication 5, et comprenant : - une enceinte (400) et des moyens de régulation aptes à maintenir la pluralité de cellules dans des conditions de température et d'environnement contrôlée ; - des moyens (471, 472) pour le passage d'un fluide dans les cavités de puits de chaque cellule ; - des moyens (490) pour la collecte du fluide passé dans les cavités de puits de chaque cellule. Dispositif selon la revendication 8, comprenant une pluralité de cellules selon la revendication 7 montées dans un rack (640) ledit rack comprenant une surface miroir (641) permettant de refléter l'image observée dans chaque cellule à travers sa plaque de fermeture (325). Dispositif selon la revendication 8, dans lequel les moyens de passage d'un fluide comprennent un réservoir (470) de fluide, une première pompe (471) aspirant le fluide dans ledit réservoir et l'injectant dans la cavité de puit de chaque cellule par l'un des conduits (371) desdites cellules et une deuxième pompe (472) aspirant le fluide dans la cavité de puit de chaque cellule par l'autre conduit (372) desdites cellules et le refoulant dans les moyens de collecte (490). Dispositif selon la revendication 10, dans lequel les moyens de collecte comprennent une station d'entrée (570) comprenant des moyens pour connecter les conduits (572) au refoulement de la deuxième pompe (472), une station de prélèvement (575) comprenant une pluralité becs de remplissage (573) chacun d'entre eux en connexion hydraulique avec un des conduits de refoulement de la deuxième pompe, un rack (520) apte à contenir une pluralité de flacons (530) et à positionner lesdits flacons en vis-à-vis de chaque bec de remplissage (573), des moyens de déplacement (540) relatif dudit rack par rapport à la station de prélèvement (575) de sorte à changer les flacons (530) placé en vis-à-vis de chaque bec de remplissage. Dispositif selon la revendication 11, dans lequel les moyens de collecte comprennent des moyens (990) pour réfrigérer les flacons compris dans le rack (520). 24