FR 3097723 A1 20210101 FR 1907012 A 20190627 Description Titre de l'invention : PROCÉDÉ DE PRODUCTION DE LA RUBISCO À PARTIR D'UNE BIOMASSE VÉGÉTALE [0001] La présente invention est relative à un procédé de production de la ribulose- 1,5-biphosphate carboxylase-oxygénase, également dénommée Rubisco, à partir d'une biomasse végétale. [0002] La Rubisco est une enzyme végétale impliquée dans le cycle de Calvin et plus parti- culièrement dans la fixation du dioxyde de carbone. La Rubisco, située dans les chloroplastes, est une protéine parmi les plus abondantes dans la biomasse végétale et même la plus abondante sur terre. Cette enzyme est impliquée dans le processus dc photosynthèse et porte deux activités enzymatiques : i) une activité carboxylase au cours de laquelle la Rubisco fixe un CO2 sur le D-ribulose-1,5-diphosphate pour former deux molécules dc 3-phospho-D-glycérate, et ii) une activité oxygénasc au cours de laquelle la Rubisco fixe une molécule d'On sur le D-ribulose-1,5-diphosphate pour former du 3-phospho-D-glycérate et du 2-phosphoglycolate. Elle est ainsi présente dans la plupart des organismes autotrophes qu'il s'agisse des procaryotes ou d'organismes plus développés comme les algues ou les plantes supérieures. Chez les eucaryotes, la Rubisco est située dans les chloroplastes, organite présent dans le cytoplasme des organismes photosynthétiques et qui contient la chlorophylle et d'autres molécules nécessaires à la fonction photosynthétique. [0003] En plus de son importance du point de vue biologique, la Rubisco est aussi réputée pour ses qualités nutritionnelles et est peu allergène. En effet, la Rubisco contient un amino-gramme équivalent à celui des protéines du lait ou dc ce qui la positionne avantageusement devant les autres protéines d'origine végétale. De plus, différentes études ont mis en évidence les propriétés fonctionnelles de la Rubisco telles que son pouvoir émulsifiant, moussant et gélifiant, ce qui, associé à une bonne solubilité, a éveillé un fort intérêt pour son usage dans de nouvelles applications à haute valeur ajoutée. [0004] Dans ce contexte, la mise en place de procédés permettant la séparation et la puri- fication de la Rubisco représente un enjeu économique et sociétal évident. Comme pour la plupart des protéines, les diverses méthodologies proposées jusqu'à présent ont peimis l'obtention de produits de différentes qualités en fonction principalement du degré de pureté attendu pour les applications envisagées. [0005] Ainsi, la demande de brevet FR 2 819 685 décrit un procédé pour traiter le jus vert issus du pressage d'une matière foliaire riche en protéines telle que la luzerne, pour en récupérer des produits ayant un fort intérêt en alimentation, notamment humaine. Ce 2 procédé comprend a) une étape de séparation pour obtenir, d'une part, un jus brun riche en protéines cytoplasmiques et, d'autre part, une fraction riche notamment en protéines, pigments, vitamines, insolubles et oligoéléments, puis b) séchage de cette fraction issue de l'étape a) pour obtenir un produit riche notamment en protéines, vitamines et oligo-éléments. Selon ce procédé, il est ensuite possible de soumettre le jus brun à une séparation sur résine afin de récupérer un jus décoloré riche en protéines et un extrait polyphénolique. Ce procédé comprend de très nombreuses étapes et est complexe à mettre en oeuvre. De plus, il ne permet pas d'accéder à de la Rubisco pure. En effet, le jus obtenu contient un mélange de différentes protéines, et des polyphénols. [0006] La demande internationale WO 2011/078671 décrit un procédé pour isoler de la Rubisco dépourvue de chlorophylle à partir d'un matériel végétal comprenant des cellules végétales intactes renfermant de la Rubisco et de la chlorophylle, consistant à provoquer la lyse du matériel végétal par exemple par pressage mécanique afin de libérer la Rubisco et la chlorophylle contenues dans les cellules végétales, puis après séparation du jus liquide et du gâteau de pressage, à mettre en contact le jus liquide avec du charbon actif pour adsorber la chlorophylle. Après élimination du charbon actif sur lequel est adsorbé la chlorophylle, on obtient un jus liquide contenant la Rubisco qui est ensuite soumis à un traitement thermique à une température de 50 à 80°C pour provoquer la coagulation de la protéine qui est ensuite récupérée, par exemple par centrifugation ou décantation du jus, et filtration. Ce procédé ne conduit pas nécessairement à de la Rubisco pure dans la mesure où le jus pressé peut renfermer d'autres protéines. Par ailleurs, l'étape de coagulation conduit à la dénaturation de la ou des protéines présentes dans le jus liquide, ce qui peut altérer leurs propriétés fonctionnelles. [0007] La demande internationale WO 2012/150421 décrit un procédé de préparation d'un extrait protéique de luzerne à partir des feuilles de la luzerne, comprenant une étape préalable de défibrage des feuilles de luzerne fraîche dans une extrudeuse, et une étape d'hydrolyse enzymatique. L'extrait de luzerne ainsi obtenu présente une teneur en protéines supérieure à 50 % en poids de matière de l'extrait, une teneur en chlorophylle inférieure à 10 % de sa teneur initiale dans la luzerne, exprimée en poids de matière de l'extrait, et une teneur en saponines et en phytates inférieure à 10 % de leur teneur initiale dans la luzerne, exprimée en poids de matière de l'extrait. Ainsi encore, le procédé proposé ne permet pas d'accéder à de la Rubisco pure. De plus, l'utilisation d'une étape d'hydrolyse enzymatique peut entraîner des modifications de la structure des protéines et donc en altérer les propriétés fonctionnelles. [0008] Enfin, il a également déjà été proposé un procédé de séparation/purification de la Rubisco par chromatographie échangeuse d'ions sur résine à partir d'un jus de luzerne (Thèse de Syrine Kerfai, mars 2011, INSA Toulouse, « Etude d'un procédé chromato- 3 graphique d'échange d'ions pour la séparation de la ribulose I,5-bipho.sphate carboxylase oxygénase (Rubisco) clans le cade de la valorisation d'un sous-produit agricole »). Selon ce procédé, un jus issu du pressage de feuilles de luzerne est déshydraté, puis reconstitué avec de l'eau et centrifugé avant d'être mis en contact avec une résine anionique se présentant sous la forme d'une matrice composite comprenant de l'oxyde de Zr et un polymère d'acrylatc et ayant comme ligand une amine quaternaire (Résine Q Hyper Z ® commercialisée par la société Pall). La chromatographie a été réalisée en lit fixe et en lit expansé. Ce procédé implique l'utilisation d'une résine dont la compatibilité chimique et économique avec le secteur alimentaire n'est pas satisfaisante. [0009] A cc jour, il n'existe donc toujours aucun procédé qui permettrait la production de la Rubisco à une échelle industrielle et malgré ses propriétés fonctionnelles, cette protéine n'a jamais été utilisée dans les marchés ciblés faute d'une filière de production adaptée et rentable. [0010] Les inventeurs se sont donc donnés pour but de pourvoir à un procédé de production et de purification de la Rubisco qui soit à la fois simple et économique à mettre en oeuvre, transposable à l'échelle industrielle, pour conduire à l'obtention, avec de forts rendements, d'une Rubisco purifiée et dont les propriétés fonctionnelles ne sont pas altérées. [0011] Ces buts sont atteints par le procédé qui fait l'objet de la présente invention et qui va être décrit ci-après. [0012] La présente invention a donc pour objet un procédé de production de Rubisco purifiée à partir d'une biomasse végétale, ledit procédé comprenant, dans cet ordre, au moins les étapes suivantes : 1) une étape de déshydratation (l'un jus végétal issu du pressage d'une biomasse végétale contenant de la Rubisco, pour obtenir une poudre dudit jus végétal déshydraté, 2) une étape de reconstitution d'un jus végétal à partir de la poudre obtenue à l'étape 1), pour conduire à un jus végétal reconstitué, 3) une étape de centrifugation du jus végétal reconstitué obtenu ci-dessus à l'étape 2), pour conduire à un jus centrifugé et à un culot de centrifugation, 4) une étape de rétention chromatographique de la Rubisco contenue dans le jus centrifugé obtenu ci-dessus à l'étape 3), sur une résine échangeuse d'ions, 5) une étape d'élution de la Rubisco fixée sur la résine à l'aide d'une solution saline, pour obtenh- une solution saline comprenant de la Rubisco, 6) une étape de conditionnement de la solution saline de Rubisco obtenue ci-dessus à l'étape 5) à l'aide d'une solution de conditionnement, pour conduire à une solution de Rubisco purifiée, ledit procédé étant caractérisé en ce que : - l'étape 1) de déshydratation est réalisée à une température inférieure ou égale à 200°C environ, - l'étape 4) de rétention chromatographique est réalisée en lit fixe ou en lit expansé ou en lit fluidisé, dans une colonne de chromatographie contenant une résine échangeuse d'ions choisie parmi les résines hydrophiles anioniques contenant des groupements fonctionnels choisis parmi les amines tertiaires et les ammoniums quaternaires, lesdites résines comportant i) soit une matrice d'au moins un polymère réticulé, ii) soit une matrice composite d'oxyde de silicium et d'au moins un polymère polyacrylique. [0013] Selon l'invention, on entend par Rubisco purifiée, une Rubisco libre d'autres macro- molécules (analyse par HPLC SEC à 280 nm) mais pouvant se présenter néanmoins sous la forme d'un mélange avec des composés tels que des sels, de l'eau ou d'autres petites molécules. En général, ces petites molécules ont une taille inférieure à 1 kna et ne peuvent être qualifiées de protéines. Ces petites molécules assurent la stabilité et/ou la solubilité de la Rubisco. Ces autres composés représentent de 1 à 5 % en masse maximum par rapport à la masse totale Rubisco + autres composés. Ainsi, selon l'invention, une Rubisco purifiée est une Rubisco pure à 95-99%. [0014] Les résines hydrophiles anioniques utilisables selon le procédé conforme à la présente invention peuvent avoir des diamètres de pores variables mais ont préférentiellement un diamètre suffisant pour permettre la bonne diffusion de la Rubisco dans l'ensemble de la résine pendant l'étape 4) de rétention chromatographique. [0015] Le diamètre des pores des résilles hydrophiles anioniques est de préférence compris entre 20 et 100 nrn environ, et encore plus préférentiellement entre 50 et 100 nrn environ, bornes incluses. [0016] Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les résines comportant une matrice de polymère réticulé sont choisies parmi les résines dans lesquelles ledit polymère réticulé est un polysaccharide, en particulier un polymère de galactose, tout particulièrement l'agarose (ou agar-agar) ou polymère ramifié de dextrose (glucose), tout particulièrement le dextrane. En effet, ce type de résine permet de conduire à des rendements en Rubisco purifiée de l'ordre de 20 à 40 g / L de résine utilisée. A titre d'exemples de telles résines, on peut notamment citer : a) les résines d'agarose anioniques faibles et faiblement réticulées (taux de réticulation d'environ 4 %) comportant des fonctions amines tertiaires diéthylaminopropyle, telles qu'en particulier la résine ANX Sepharose® 4 Fast Flow fabriquée par la société GE Healthcare, b) les résines d'agarose anioniques fortes et faiblement réticulées (taux de réticulation d'environ 4 %) comportant des fonctions ammonium quaternaire, telles qu'en particulier la résine Q Sepharose0 Fast Flow fabriquée par la société GE Healthcare, c) les résines d'agarose anioniques fortes et fortement réticulées (taux de réticulation d'environ 6 à 7 %) comportant des fonctions ammonium quaternaire, telles qu'en particulier la résine Capto Q Irnpress ® fabriquée par la société CE Healthcarc, et d) les résines d'agarosc et de dextrane anioniques fortes et fortement réticulées (taux de réticulation d'environ 6 à 7 %) comportant des fonctions ammonium quaternaire, telles qu'en particulier la résine Capto Q ® fabriquée par la société CE Healthcare. [0017] Parmi de telles résines, les résines mentionnées aux points a) et c) sont tout particu- lièrement préférées, celles-ci conduisant à des rendements en Rubisco purifiée de l'ordre de 7 à 9g, respectivement de 4 à 6 g, de Rubisco purifiée IL de résine utilisée. [0018] Parmi les résines à matrice composite d'oxyde de silicium et d'au moins un polymère polyacrylique, on peut notamment mentionner la résine vendue sous la dénomination commerciale Q Ccramic Hyper D ® par la société Pall. [0019] Toutes les plantes à feuilles produisant de la Rubisco sont utilisables à titre de biomasse végétale selon le procédé de l'invention. La biomasse végétale utilisée pour obtenir le jus vert de l'étape 1) peut en particulier être issue d'une plante cultivée spécifiquement pour produire de la Rubisco telle qu'une plante fourragère comme la luzerne, le trèfle, le ray grass, le sorgho fourrager, etc... ; une plante potagère telle que le choux, l'épinard, la salade ; le tabac ; une plante grasse ; et plus généralement toutes plantes ayant un rapport feuilles/plante élevé. Parmi de telles plantes, la luzerne est tout particulièrement préférée. Le procédé conforme à l'invention ouvre, dans cc cas, d'autres débouchés pour les filières agricoles. La biomasse végétale peut également être un co-produit d'une industrie ou un déchet vert. Dans ce cas, le procédé conforme à l'invention permet une valorisation matière de filières déjà en place ou permet de développer de nouvelles filières (par exemple la valorisation des tontes de gazon qui peuvent être récupérées et constituer la biomasse végétale). [0020] La biomasse végétale contenant de la Rubisco est de préférence de la biomasse fraîche. En d'autres termes, la biomasse utilisée dans l'étape 1) vient d'être ramassée ou cueillie. [0021] Selon la nature de la biomasse végétale mise en oeuvre, un pré-broyage grossier peut être utile avant le pressage. [0022] Le pressage est généralement effectué dans une presse à vis qui fonctionnent en continu. A la fin du pressage, on obtient un jus végétal qui est une solution complexe contenant de la Rubisco et d'autres composés tels que de nombreux polysaccharides et un résidu solide (tourteau de pressage) qui peut être valorisé, par exemple, par méthanisation ou être utilisé pour l'alimentation animale. [0023] Juste avant la réalisation de l'étape 1), le pH du jus végétal issu du pressage peut être ajusté entre 6,5 et 7,5 si nécessaire afin d'assurer une meilleure stabilité de la Rubisco pendant les étapes suivantes du procédé. [0024] L'étape 1) de déshydratation peut être effectuée à une température allant de 58 à 6 200°C environ, de préférence allant de 60 à 150°C environ, et de façon particulièrement préférée allant de 65 à 130°C environ. [0025] L'étape 1) de déshydratation du jus végétal peut notamment être réalisée par un procédé de séchage par atomisation, lyophilisation ou évapoconcentration. [0026] Selon une forme de réalisation préférée de la présente invention, l'étape 1) de déshy- dratation est réalisée par séchage par atomisation. Ce procédé consiste en réaliser une nébulisation ou dispersion (aussi appelée atomisation) du jus végétal en gouttelettes liquides qui sont mises en contact avec un courant d'air chaud qui apporte l'énergie nécessaire à l'évaporation et au transport du solvant. Un grand nombre de paramètres non indépendants influencent les propriétés de la poudre sèche, en particulier, des variables liées au procédé de séchage et des variables liées à la formulation ou à la composition de la charge liquide. [0027] Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'étape 1) de déshydratation est réalisée par séchage par atomisation à une première température allant de 110 à 200°C environ, de façon particulièrement préférée à une première température allant de 120 à 150°C environ, et de façon plus particulièrement préférée à une première température allant de 120 à 130°C environ ; suivi d'un séchage par atomisation à une deuxième température allant de 58 à 95°C environ, de façon particulièrement préférée à une deuxième température allant de 60 à 75°C environ, et de façon plus particulièrement préférée à une deuxième température allant de 65 à 75°C environ. Cette forme de réalisation peut permettre d'éviter la dégradation des protéines formées telles que la Rubisco, et ainsi de préserver l'état natif de la Rubisco (notamment ses propriétés enzymatiques) et ses propriétés fonctionnelles. [0028] Lorsqu'un séchage par atomisation est effectué lors de l'étape 1), le procédé peut par exemple être réalisé dans un sécheur-atomiseur de laboratoire tel que le dispositif vendu sous la dénomination commerciale Mini Büchi Spray-Dryer B-290 par la société Büchi Büchi ou dans un sécheur-atomiseur pilote vendu sous la dénomination commerciale Niro Minor SD 2 par la société GEA. [0029] Selon une forme de réalisation préférée du procédé de l'invention, le sécheur peut avoir une température d'entrée correspondant à la première température telle que définie dans l'invention, et une température de sortie correspondant à la deuxième température telle que définie dans l'invention. [0030] Selon l'invention, l'étape I) de déshydratation réalisée dans les conditions men- tionnées ci-dessus garantie la stabilité de la Rubisco et facilite la conservation en réduisant le volume. Il est ainsi possible de stocker les jus séchés pour s'affranchir des périodes de récoltes de la biomasse végétale et mieux répartir tout au long de l'année la production de la Rubisco. De plus, cette étape 1) de déshydratation a un effet positif sur le déroulement de l'étape 4) ultérieure de rétention chromatographique. Il est aussi 7 possible de mélanger des poudres issues de jus différents (différents lots, origine végétale différente...). [0031] L'étape 2) de reconstitution d'un jus végétal peut être réalisée par ajout d'eau ou d'une solution permettant d'ajuster le pH ou la salinité du jus si besoin. Le volume d'eau ou de solution ajouté à la poudre (jus végétal déshydraté) lors de l'étape 2) est de préférence égal au volume du jus végétal issu du pressage de la biomasse végétale avant sa déshydratation. [0032] L'étape 3) de centrifugation du jus végétal reconstitué est de préférence réalisée à une vitesse de 4000 à 6000 tours/min, et encore plus particulièrement à 6000 tours/ min. [0033] La durée de l'étape 3) de centrifugation peut varier de 15 à 25 minutes environ. [0034] L'étape 3) de centrifugation est de préférence réalisée à une température de 1 à 4 °C environ. [0035] A la fin de l'étape 3) de centrifugation, on obtient un jus vert centrifugé qui contient très peu de particules et un culot de centrifugation qui peut être lui aussi valorisé, par exemple, par méthanisation ou être utilisé pour l'alimentation animale. Ainsi, l'étape 3) de centrifugation permet d'éliminer les fines particules présentes en suspension dans le jus végétal liquide reconstitué qui va ensuite être engagé dans l'étape 4) de rétention chromatographique. [0036] Selon une forme de réalisation particulière de l'invention, le procédé peut comprendre en outre, avant la réalisation de l'étape 1) de déshydratation, une étape de centrifugation préalable du jus végétal issu du pressage d'une biomasse végétale contenant de la Rubisco. Dans ce cas, ladite étape de centrifugation préalable est de préférence réalisée dans les mêmes conditions que celles définies ci-dessus pour l'étape 3) pour conduire à un jus préalablement centrifugé qui est ensuite engagé dans l'étape 1) de déshydratation. [0037] Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'étape 4) de rétention chro- matographique comprend, dans cet ordre, les sous-étapes suivantes : - une sous-étape 4a) de rinçage et d'équilibration de la résine échangeuse d'ions, à l'aide d'une solution tampon ayant un pH de 6 à 8, - une sous-étape 4b) de fixation de la Rubisco contenue dans le jus végétal centrifugé, sur la résine présente dans la colonne de chromatographie, et - une sous-étape 4c) de lavage de la colonne par de l'eau déminéralisée. [0038] La sous-étape 4a) permet la préparation de la résine échangeuse d'ions avant son uti- lisation dans la colonne de chromatographie. La solution tampon utilisée lors de cette sous-étape 4a) est de préférence une solution de tampon phosphate ayant pH d'environ 6,0 ± 0,2. Lors de cette sous-étape 4a), la résine est de préférence équilibrée avec ledit tampon utilisé pour les lavages. De préférence, le tampon servant à l'équilibration peut 8 par exemple être introduit dans la colonne de chromatographie avec un débit d'alimentation d'environ 10 mL/min. [0039] La durée de la sous-étape 4a) de rinçage et d'équilibration de la résine est de préférence d'au moins une heure. [0040] La sous-étape 4b) de fixation (également appelée étape de charge) a pour objectif la fixation de la molécule d'intérêt, ici la Rubisco, sur la résine. Cette étape entraîne également la fixation d'autres molécules présentes dans le jus végétal centrifugé (notamment de protéines autres que la Rubisco, de polysaccharides, de polyphénols, etc...). [0041] La sous-étape 4b) est de préférence réalisée à un pH compris entre 6,0 et 8,0 ± 0,2, et encore plus préférentiellement entre 6,5 et 7,5 ± 0,2. [0042] Lors de la sous-étape 4b), l'alimentation de la colonne avec le jus végétal centrifugé peut être effectuée en mode ascendant ou descendant. Le débit peut être contrôlé, par exemple à l'aide d'une pompe péristaltique ou d'une pompe à membrane. Le débit d'alimentation peut varier de 80 mL/min à 200 mL/min environ. La vitesse superficielle d'alimentation varie de préférence de 0,2 cm/min à 2 cm/min environ. [0043] La sous-étape 4b) conduit à la récupération d'un jus végétal appauvri en Rubisco, qui est éliminé ou valorisé selon sa teneur en protéine, la Rubisco restant fixée sur la résine échangcuse d'ions. [0044] Une fois la sous-étape 4b) terminée, la sous-étape 4e) de lavage permet d'éliminer de la colonne les restes du jus végétal centrifugé. [0045] L'étape d'élution 5) à l'aide (l'une solution saline, permet de récupérer la Rubisco fixée sur la résine, puis, une fois que la Rubisco est récupérée, de nettoyer la résine pour une nouvelle utilisation ultérieure. [0046] Cette étape d'élution 5) est de préférence réalisée à l'aide d'une solution saline (ion Na, K, Br, sulfate, etc...), et en particulier d'une solution de NaC1, par exemple à 0,5 moUL, qui permet d'éluer la totalité de la Rubisco fixée sur la résine. D'autres solutions, de force ionique et/ou pH adéquats, en particulier des solutions ayant un pH inférieur au point isoélectrique de la Rubisco, peuvent aussi être utilisées L'utilisation, ensuite, d'une solution saline plus concentrée que la précédente, par exemple d'une solution de NaC1 à 1 mol/L, permet de forcer l'élution d'autres molécules présentes sur la résine et nécessitant une force ionique plus importante pour les éliminer et permettre ainsi la réutilisation ultérieure de la colonne. Un gradient ou des paliers de concentration peuvent également être utilisés. [0047] Lors de l'étape 5) d'élution, la vitesse superficielle de la solution saline varie de préférence de 0,5 à 1,5 cm/min environ. [0048] 11 n'est pas possible d'obtenir une solution de Rubisco pure dans l'eau car la présence de sel est indispensable pour solubiliser la Rubisco. Cependant, l'étape 6) de condi- 9 tionnement permet d'abaisser la teneur en sel de la solution saline de Rubisco obtenue à l'issue de l'étape 5) d'élution et, si nécessaire, de modifier la nature du sel (par exemple remplacer le sodium par du potassium afin de le rendre plus compatible avec certains usages comme en cas de régime alimentaire pauvre en sodium). L'étape 6) de conditionnement permet également une post-purification de la solution. En effet, à la fin de cette étape, on obtient une solution saline (faible salinité : de l'ordre 20 à 100 mM) de Rubisco purifiée, ainsi qu'une solution saline contenant des impuretés. [0049] Selon l'invention, l'étape 6) de conditionnement peut être réalisée par chroma- tographie d'exclusion de taille ou par ultrafiltration en mode diafiltration. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'étape 6) de conditionnement est réalisée par ultrafiltration en mode diafiltration en utilisant une solution de remplacement de la solution d'élution (par exemple un tampon phosphate 50 mM ou 100 mM). Cette technique d'ultrafiltration est préférée à la chromatographie d'exclusion de taille car elle est facile à transposer à l'échelle industrielle et permet également de concentrer la solution de Rubisco purifiée. [0050] L'ultrafiltration en mode diafiltration peut en particulier être réalisée en cellules agitées (Amicon0 par exemple) en utilisant une membrane en polyéthersulfone (PES) ayant un diamètre de coupe de 300 kDa et à une pression de travail de 0,5 à 1,1 bars environ, ou bien à l'aide de cartouches de filtration tangentielle. [0051] A la fin de l'étape 6) de conditionnement, la solution de Rubisco purifiée présente une concentration en sel de 3 à 7 g/L, et encore plus préférentiellement de 4 à 6 g/L environ. Cette solution peut être utilisée directement ou bien être stockée. [0052] Lorsque la solution de Rubisco purifiée doit être stockée, le procédé conforme à la présente invention comprend alors de préférence une étape 7) supplémentaire de déshydratation de ladite solution. [0053] Cette étape 7) de déshydratation est de préférence réalisée par séchage par ato- misation à une température allant de 65 à 75°C. Cette étape 7) peut donc être réalisée dans les mêmes conditions que celles appliquées lors de l'étape 1 et telles que décrites précédemment. [0054] On obtient alors une poudre de Rubisco purifiée, avec une teneur en eau entre 4 et 10% en masse, préférablement entre 4% et 6%, qui peut être conservée plus aisément. [0055] Ainsi le procédé conforme à l'invention et tel que décrit précédemment présentent les avantages suivants : - il permet d'accéder à plusieurs grades de Rubisco purifiée, soit sous forme solide (poudre), soit sous forme d'une solution avec une concentration et une salinité contrôlées, - il comprend peu d'étapes et met en oeuvre peu de réactifs, - il permet l'utilisation de biomasses variées selon leur période production/récolte, - l'étape 1) de séchage par atomisation du jus végétal permet d'obtenir un jus végétal séché qui se conserve très bien sur une longue période ce qui permet de rendre indépendant le flux de jus végétal utilisable dans le procédé de celui de la biomasse, ce dernier étant saisonnier et fortement variable, notamment à cause des conditions climatiques, - il met en oeuvre des produits courants de faibles coûts avec une production de sous-produits pouvant en outre être valorisés (méthanisation, alimentation animale), - il peut s'insérer dans des filières de production d'aliments pour les animaux (par exemple extraits concentrés de luzerne), - il est possible de faire fonctionner le procédé en continu en utilisant deux ou plusieurs colonnes de chromatographie, - le procédé (matériaux et produits chimiques) peut être compatible avec les domaines alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique. Brève description des dessins [0056] Les dessins annexés illustrent l'invention : [0057] [fig.1] représente des photos du jus de luzerne frais (figure la) et du jus de luzerne séché par séchage par atomisation (figure 1h). [0058] [fig.2] représente un schéma d'un dispositif de séparation chrornatographique utilisable selon les étapes 4) et 5) du procédé conforme à l'invention. [0059] [fig.3] représente la courbe d'élution de la Rubisco isolée à l'étape 5) de l'exemple 1. Sur cette figure, la concentration de la Rubisco dans la fraction collectée (en g/L) est fonction du volume d'élution (en L). Sur cette figure, tR est le temps de rétention de la protéine sur la colonne, caractéristique de l'affinité de la protéine par le support. [0060] [fig.4] représente un schéma du dispositif d'ultrafiltration utilisé lors de l'étape 6) de conditionnement de la solution saline de Rubisco préparée dans l'exemple 1. [0061] W8.51 représente les chromatogrammes obtenus par 11PCL-SEC de la solution initiale de Rubisco avant ultrafiltration, du premier prélèvement du perméat et du rétentat obtenu à la fin de l'ultrafiltration pour l'expérience de l'étape 6) de l'exemple [0062] [fig.6] représente les courbes d'élution de la Rubisco sur une colonne contenant une résine Q Sepharose CD Fast Flow (figure 6a) ou une colonne contenant une résine ANX Sepharose (9 4 Fast Flow (figure 6b). EXEMPLES 100631 Exemple I : Production de Rubisco purifiée à partir de luzerne selon le procédé conforme à l'invention [0064] Dans cet exemple, on a préparé unc solution de Rubisco purifiée à partir d'une biomasse végétale issue d'une luzerne de printemps de couleur vert foncé comportant 11 des tiges courtes et fines, sans fleurs, et un ratio feuilles/tiges élevé. [0065] Préalablement à la réalisation de l'étape 1) de déshydratation, un jus végétal de luzerne a été préparé de la façon suivante. [0066] La luzerne fraîche (feuilles et tiges) a été pré-broyée à l'aide d'un broyeur électrique avec un système de coupe à entraînement automatique (AXT 25 TC, Bosch) afin de réduire la taille des tiges à une longueur d'environ 5 à 10 cm. [0067] La luzerne pré-broyée a ensuite été pressée à l'aide d'une presse à vis fabriquée par FEMAG Industries, d'une capacité maximale de 100 kg/h. La presse est constituée de trois corps principaux : la trémie d'alimentation, la vis, et la sortie munie d'un obturateur. Un boîtier électrique permet de régler les paramètres de fonctionnement et un bac permet la collecte des jus produits. L'ensemble est construit en acier inoxydable. La fréquence réglable de fonctionnement (de 15 à 60 Hz) détermine la vitesse de rotation de la vis. [0068] Pour ce faire, la luzerne pré-broyée a été pesée (79,6 kg) puis introduite dans la presse par la trémie d'alimentation. La fréquence de rotation de la vis a été réglée à 25 Hz (soit 12 tours/min.). [0069] Une fois la presse montée en pression, le liquide s'écoule dans la trémie de récu- pération du jus et un tourteau est formé en sortie, au niveau de l'obturateur. Le jus végétal de luzerne ainsi obtenu (41,8 kg ; rendement de production du jus : 52 %) a ensuite été stocké à 4°C immédiatement après pressage. [0070] Les caractéristiques du jus végétal de luzerne sont données ci-après : - pH :5,8 ± 0,1 - Conductivité : 8,4 ± 0,2 mS/cm - Teneur en matière sèche : 7,2 ± 0,3 % - Masse volumique 1025 à 1050 kg/m3 [0071] 1) Etape de déshydratation par séchage par atomisation [0072] Le jus végétal de luzerne obtenu ci-dessus a ensuite été séché par un procédé de séchage par atomisation à l'aide d'un sécheur-atomiseur Niro Minor SD2 de la société GEA d'une capacité de 4 L/h à une vitesse de traitement de 1 L/h. les conditions d'atomisation ont été fixées pour avoir une température d'entrée de 120°C et une température de sortie de 70 ± 1°C. Après atomisation, le jus végétal de luzerne (Figure la) séché (poudre avec une teneur en eau résiduelle de 6% en masse, Figure lb) a été conservé à -20°C. [0073] 2) Etape de reconstitution du jus végétal de luzerne [0074] Après atomisation, la poudre de jus végétal de luzerne déshydraté obtenu ci-dessus à l'étape précédente, a été utilisée pour obtenir un jus végétal de luzerne reconstitué par ajout d'une solution de carbonate de sodium afin d'ajuster son pH à 7,5, en respectant la teneur en matière sèche déterminée dans le jus de départ, soit 7,2 ± 0,3 %. 12 [0075] 3) Etapc de centrifugation du jus végétal de luzerne [0076] Le jus végétal de luzerne reconstitué obtenu ci-dessus à l'étape précédente a ensuite été centrifugé à une vitesse de 6000 tours/min pendant 20 minutes à une température de 4°C. [0077] Le jus centrifugé ainsi obtenu présentait un pH de 7,5. [0078] La concentration en Rubisco du jus ainsi obtenu a été déterminée par HPLC SEC, avec une colonne Shodex KW-804, de limite d'exclusion 106 Da et détecteur UV-Vis à 280 nm. La phase mobile est une solution tampon phosphate à pH 6,8 et à un débit de 1 mL/rnin. L'acquisition de données ainsi que le traitement des résultats est effectué par le logiciel UNICORN 5.1® (GE Hcalthcarc). La concentration en Rubisco de cc jus était de 4,1 g/L. [0079] La conductivité du jus était de 12,1 mS/cm. [0080] Le jus centrifugé ainsi obtenu a ensuite été engagé dans l'étape suivante de rétention chromatographique. [0081] 4) Etapc de rétention chromatographiquc de la Rubisco [0082] La rétention chromatographique a été réalisée en utilisant la résine ANX Sepharose® 4 Fast Flow fabriquée par la société GE Healthcare sur le dispositif de séparation chromatographique représenté sur la figure 2 annexée. Ce dispositif 1 comprend une colonne de chromatographie 2 vendue sous la dénomination commerciale Resolutc FM 40 par la société Pall, d'un diamètre interne de 140 mm contenant la résine 3 et ladite colonne 2 étant équipée d'un adaptateur (non représenté) permettant d'ajuster la hauteur du lit de la résine 3 durant le remplissage de la colonne 2. La colonne 2 est alimentée en mode ascendant (ou éventuellement descendant) à l'aide des pompes 4 et 4' (pompe à membrane 4 pour l'alimentation du jus végétal reconstitué centrifugé et pompe péristaltique 4' pour l'alimentation d'autres solutions). Le dispositif 1 comprend également un premier réservoir 5 contenant successivement un liquide 6, à savoir la solution d'équilibration 6a, l'eau de lavage 6b et la solution saline d'élution 6 c, ainsi qu'un second réservoir 7 contenant le jus végétal centrifugé à traiter 8. Des vannes 9 et 9' sont disposées en aval des deux réservoirs 5 et 7 et en amont des pompes 4 et 4'. Les vannes 9 et 9' permettent d'introduire successivement dans la colonne 2 la solution d'équilibration 6a, le jus végétal centrifugé à traiter 8, l'eau de lavage 6b et la solution saline d'élution 6e. Des vannes 10 et 10' situées respectivement en aval des pompes 4 et 4' et en amont de la colonne 2 permettent d'assurer si besoin l'isolement de la colonne 2. En sortie de colonne 2, les fractions sont collectées à l'aide d'un collecteur de fractions 11. [0083] Sur cette figure, le sens de circulation des liquides est indiqué par les flèches présentes sur les traits reliant les différents éléments du dispositif 1 sauf pour le lavage qui a lieu en flux descendant. 13 [0084] La colonne 2 a été remplie par la résine 3 ANX Sepharose0 4 Fast Flow sur une hauteur de 15 cm environ. [0085] Le tableau 1 ci-après résume les principales caractéristiques du lit fixe, les conditions opératoires et les paramètres du dispositif 1 de séparation chromatographique utilisé. [0086] [Tableaux 1] Variables opératoires Paramètres du dispositif Hauteur du lit : H = 0,150 m Diamètre interne de la colonne : D = 0,14- m Masse sèche de résine introduite : Ms = 0,290 Kg Section interne de la colonne : S =0,0154 m2 Volume du lit : V = 2,3 L Taille moyenne des particules : dp = 9.10-, m Volume mort à l'entrée : Vme = 0,275 L [0087] La colonne 2 a d'abord été alimentée par une solution d'équilibrage 6a constituée d'une solution tampon phosphate à 100 rnM et de pH 7,5. Le débit d'alimentation a été réglé à 166 mL/min à de la pompe à membrane 4, soit une vitesse superficielle de 1,08 cm/min. [0088] La colonne 2 a ensuite été alimentée par le jus végétal de luzerne centrifugé à traiter 8 obtenu ci-dessus à l'étape précédente (28,55 L). Le débit d'alimentation a été réglé à 107,8 mL/min à l'aide de la pompe à membrane 4, soit une vitesse superficielle de 0,7 cm/min. [0089] Une fois l'étape d'alimentation de la colonne 2 par le jus de luzerne centrifugé 8 terminée, la colonne 2 a été lavée par de l'eau déminéralisée, jusqu'à ce que la conductivité de l'eau à la sortie de la colonne 2 soit très faible et stable. [0090] 5) Etape d'élution de la Rubisco fixée sur la résine [0091] Une solution saline d'élution 6e, constituée par une solution de chlorure de sodium de concentration 0,5 mollL, a été utilisée pour procéder à l'élution de la Rubisco fixée sur la résine 3. [0092] L'étape d'élution a été réalisée en utilisant 6000 mL de cette solution de chlorure de sodium, et avec un débit de 32,3 mL/min, ce qui con-espond à une vitesse superficielle de 0,21 cm/min. Le temps total d'élution a été de 186 minutes. [0093] 2000 mL d'une solution saline de Rubisco ont ainsi été récupérés. [0094] La courbe d'élution de la Rubisco est donnée par la figure 3 annexée. Sur cette figure, la concentration de la Rubisco dans la fraction collectée (en g/L) est fonction du volume d'élution (en L). La concentration de Rubisco dans la solution d'élution est dé- 14 terminée par HPLC SEC. Sur cette figure, t' est le temps de rétention chromatographique. [0095] Le tableau 2 ci-après résume les résultats de charge et d'élution de la Rubisco. [0096] [Tableaux2] Charge Masse de Rubisco alimentée Masse de Rubisco fixée sur la résine 117,0 g 55,1 g Elution Masse de Rubisco éluée Facteur de concentration maximal 41g 5,7 Rendement d'élution 74,4 % M Rubisco / V ItSine 23,9 g/L 100971 La colonne 2 a ensuite été nettoyée avec des solutions successives de chlorure de sodium de concentration de 1 et 2 mol/L, d'hydroxyde de sodium à 1 mol/L, d'acide acétique à 1 mol/L et d'éthanol à 70% (v/v). 100981 6) Etape de conditionnement de la solution saline de Rubisco [0099] Le conditionnement de la solution saline de Rubisco obtenue ci-dessus à l'étape précédente a été réalisé par ultrafiltration en mode diafiltration à l'aide d'une cellule Amicon 8400 à agitation (Merck-Millipore) d'un volume de 400 mL, ladite cellule étant équipée d'une membrane en polyéthersulfone (PES), compatible avec la production d'eau potable, de diamètre de coupe de 300 kD (seuil de coupure), ladite membrane étant vendue sous la référence PBMK par la société Merck-Millipore. La smface de la membrane était de 41,8 cm2. [0100] Le mode de fonctionnement des cellules Amicon0 est un mode d'écoulement frontal (perpendiculaire à la membrane), qui grâce au mécanisme d'agitation, cherche à se rapprocher des conditions d'un écoulement tangentiel. [0101] Le dispositif d'ultrafiltration utilisé dans cette étape est représenté sur la figure 4 annexée. Ce dispositif 12 comprend un réservoir pressurisé 13 d'une capacité de 5 L (Sartorius, France) contenant la solution de conditionnement et qui connecte la cellule Amicon0 8400 14 à un circuit d'air comprimé 15 et qui permet d'appliquer des pressions transmembranaires constantes. Une vanne 16 permet d'ajuster la pression de l'air comprimé 15, celle-ci étant mesurée à l'aide d'un manomètre 17 situé en aval de la vanne 16. La masse du perméat 18 en sortie de la cellule 14 est mesurée au cours du temps et suivie par une balance électronique 19 (Sartorius 1500S, France), connectée à un système d'acquisition de données 20. La cellule de filtration 14 est composée d'un support 14a qui maintient la membrane (non représentée), de pièces raccordement (non représentées), d'un réservoir 14b contenant la solution saline de Rubisco à filtrer, d'un couvercle 14e permettant l'entrée de la solution de conditionnement provenant du réservoir pressurisé 13 et d'un agitateur magnétique 14d. L'agitation (non représenté) minimise la formation d'une couche de polarisation et la dénaturation de la protéine éventuellement accumulée par cisaillement. [0102] Avant l'étape d'ultrafiltration, la solution saline de Rubisco a été pré-filtrée à l'aide d'un filtre de 0,45 pm. [0103] Avant utilisation de la membrane de filtration, celle-ci a été rincée à l'eau et laissée dans l'eau pendant une nuit à une température de 4°C afin d'éliminer les restes de produits chimiques dans lesquels elle a été conditionnée et d'humidifier les pores. Après installation de la membrane de filtration dans la cellule de filtration 14, le système a été rempli avec de l'eau ultra-pure grâce au réservoir pressurisé 13, et une forte pression (au moins 0,1 bar en plus de la pression transrnembranaire qui va être appliquée) a été maintenue pendant 10 minutes afin de compacter la membrane et de bien humidifier les pores. [0104] La teneur en Rubisco initiale de la solution saline a tout d'abord été mesurée par chromatographie d'exclusion de taille (HPLC-SEC) à l'aide d'un Chromatographe à haute pression ATKA Purifier (CE Healthcare), avec une colonne KW-804 (Shodcx) et un logiciel d'acquisition de données Unicorn 5.1. [0105] La teneur en Rubisco initiale de la solution saline était de 16,5 g/L. [0106] Cette analyse permet également de connaitre le profil chromatographique global de la solution saline de Rubisco obtenue ci-dessus à l'étape précédente, caractérisé par la présence d'autres pics associés aux composés que l'on souhaite éliminer Une comparaison des profils chromatographiques de la solution saline de Rubisco avant sa filtration et des prélèvements de perméat, réalisés pendant l'étape d'ultrafiltration, a permis de suivre l'expérience et de vérifier la sélectivité de la membrane. [0107] La cellule de filtration 14 a été complètement remplie par la solution saline de Rubisco obtenue ci-dessus à l'étape précédente. Un volume de 4 L de solution tampon phosphate 50 mmol/L à pH 7,5 a été placée dans le réservoir pressurisé 13. Une fois le montage effectué, la cellule de filtration 14 a été mise sous agitation à 1200 tours/min et une pression de 0,7 bar a été appliquée au dispositif de filtration à l'aide de la vanne 16 permettant d'ajuster la pression de l'air comprimé 15. Cette pression a été maintenue constante pendant toute l'étape d'ultrafiltration. [0108] La masse de perméat 18 récupérée a été suivie par le système d'acquisition des données 20 durant toute la durée de l'ultrafiltration. [0109] Une fraction de 0,5 mL du perméat a été prélevée au tout début de l'ultrafiltration, puis toutes les heures afin d'être analysée par HPLC-SEC. L'ultrafiltration a été arrêtée lorsque l'analyse des prélèvements du perméat a indiqué qu'il n'y avait plus d'espèces 16 extraites dans le perméat. [0110] La solution de Rubisco purifiée conditionnée contenue dans le réservoir 14h (rétentat) a été récupérée et une petite fraction a été utilisée pour analyse. La conservation de la solution de Rubisco purifiée conditionnée a été faite à une température de 4cC. [0111] La concentration en Rubisco purifiée dans le rétentat était de 15,4 g/L, ce qui correspond à un taux de perte très faible de 6,4 %. [0112] Les chromatogrammes obtenus par HPCL-SEC de la solution initiale de Rubisco avant ultrafiltration, du premier prélèvement du perméat et du rétentat obtenu à la fin de la filtration sont donnés sur la figure 5 annexée. Sur cette figure, l'absorbance à 280 nm (en mAU) est fonction du volume (mL). La courbe en traits longs et discontinus (courbe la plus haute) correspond à la solution initiale de Rubisco avant ultrafiltration, la courbe en traits courts et discontinus correspond au premier prélèvement du perméat et la courbe en trait continu correspond au rétentat. [0113] Ces résultats montrent que l'étape d'ultrafiltration permet non seulement de conditionner la solution saline de Rubisco obtenue ci-dessus à l'étape précédente dans le but de remplacer NaC1 par un tampon phosphate, mais également d'effectuer une post-purification de la Rubisco (disparition des pics situés entre 11 et 15 mL sur le chromatographe correspondant au rétentat par rapport aux deux autres courbes correspondant respectivement à la solution initiale de Rubisco avant ultrafiltration et au premier prélèvement du perméat. [0114] Exemple 2 : Production de Rubisco purifiée à partir de luzerne selon le procédé conforme à l'invention [0115] Dans cet exemple, on a également préparé une solution de Rubisco purifiée à partir d'une biomasse végétale issue de la luzerne selon les différentes étapes telles que détaillées ci-dessus à l'exemple 1, mais en remplaçant la résine ANX Sepharose0 4 Fast Flow utilisée à l'exemple 1, par la résine anionique Q Sepharose 0 Fast Flow vendue par la société GE Healthcare, également utilisable selon le procédé de l'invention. Dans cet exemple, la colonne utilisée était une colonne de type XK 16/20 ayant un diamètre interne de 16 mm (GE Healthcare). A titre comparatif, on a également effectué la préparation en utilisant la résine ANX Sepharose0 4 Fast Flow utilisée à l'exemple 1. [0116] Les conditions opératoires utilisées durant l'étape d'équilibration de la colonne de chromatographie sont données dans le Tableau 3 ci-après. [0117] 17 [Tableaux3] Résine utilisée Q Sepharose ® FF ANX Sepharose® 4 FF Masse de résine sèche 2,2 g 2,0 g Equilibration Solution alimentée Tampon phosphate 100 mM pH 5,8 Vitesse superficielle 20,1 cm/min Charge Jus C 0 Rubisco 4,6 g/L 4,2 g/L centrifugé ei 5,8 6,0 Conductivité 16,4 mS/cm 16,8 mS/cm Volume de jus alimenté 250 ml 220 ml Vitesse superficielle 2,5 cm/min 2,5 cm/min [0118] Dans ce tableau Co est la concentration initiale en Rubisco dans le jus de luzerne re- constitué centrifugé. [0119] Les conditions utilisées pour l'étape d'élution sont données dans le tableau 4 ci- après. [0120] [Tableaux4] Résine utilisée Concentration NaC1 Vitesse superficielle Q Sepharose ® FF 0,5 mol/L, puis 1 mol/L 0,5 cm/min 1,3 cm/min ANX Sepharose® 4 FF 101211 Les courbes d'élution pour chacune de ces deux résines sont. données par la figure 6 annexée : fleure 6a pour la résine Q Sepharose ® Fast Flow et courbe 6b pour la résine ANX Sepharose 0 4 Fast Flow. Sur ces figures, la concentration en Rubisco des éluats (en e/L) est fonction du volume d'éluant passé (mL) sur les résines en colonne. 101221 L'ensemble des résultats expérimentaux obtenus pour chacune de ces deux résines est résumé dans le tableau 5 ci-dessous. [0123] 18 [Tableaux5] Résine utilisée Q Scpharose 0 Fast Flow ANX Sepharose ® Fast Flow Charge Masse Rubisco alimentée 1,15 g 0,92 g Masse Rubisco fixée 016g 0,14g Elution Masse Rubisco éluée 0,15 g 0,14g Facteur de concentration maximale 2,34 2,90 Rendement de l'élution 93,7 % 100 % MR nbisconVIRési ne sèche 68,2 g/kg 70 g/kg 101241 L'ensemble de ces résultats montre que la résine Q Sepharose 0 Fast Flow permet, au même titre que la résine ANX Sepharose 0 4 Fast Flow, de préparer une solution de Rubisco purifiée avec de bons rendements. 19 [Revendication I] [Revendication 2] [Revendication 3] REVENDICATIONSProcédé de production de Rubisco purifiée à partir d'une biomasse végétale, ledit procédé comprenant, dans cet ordre, au moins les étapes suivantes: I) une étape de déshydratation d'un jus végétal issu du pressage d'une biomasse végétale contenant de la Rubisco, pour obtenir une poudre dudit jus végétal déshydraté, 2) une étape de reconstitution d'un jus végétal à partir de la poudre obtenue ci-dessus à l'étape I), pour conduire à un jus végétal reconstitué, 3) une étape de centrifugation du jus végétal reconstitué obtenu ci-dessus à l'étape 2), pour conduire à un jus centrifugé et à un culot de centrifugation, 4) une étape de rétention chromatographique de la Rubisco contenue dans le jus centrifugé obtenu ci-dessus à l'étape 3), sur une résine échangeuse d'ions, 5) une étape d'élution de la Rubisco fixée sur la résine à l'aide d'une solution saline, pour obtenir une solution saline comprenant de la Rubisco, 6) une étape de conditionnement de la solution saline de Rubisco obtenue ci-dessus à l'étape 5) à l'aide d'une solution de conditionnement, pour conduire à une solution de Rubisco purifiée, ledit procédé étant caractérisé en ce que : - l'étape 1) de déshydratation est réalisée à une température inférieure ou égale à 200°C, - l'étape 4) de rétention chromatographique est réalisée en lit fixe ou en lit expansé ou en lit fluidisé, dans une colonne de chromatographie contenant une résine échangeuse d'ions choisie parmi les résines hydrophiles anioniques contenant des groupements fonctionnels choisis parmi les amines tertiaires et les ammoniums quaternaires, lesdites résines comportant i) soit une matrice d'au moins un polymère réticulé, ii) soit une matrice composite d'oxyde de silicium et d'au moins un polymère polyacrylique. Procédé selon la revendication I. caractérisé en ce que les résines comportant une matrice de polymère réticulé sont choisies parmi les résines dans lesquelles ledit polymère réticulé est un polysaccharide. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit poly- 20 saccharide est un polymère de galactose ou un polymère ramifié de dextrose. [Revendication 4] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisé en ce que la résine échangeuse d'ions est choisies parmi : a) les résines d'agarosc anioniques faibles et faiblement réticulées comportant des fonctions amines tertiaires diéthylaminopropyle, b) les résines d'agarosc anioniques fortes et faiblement réticulées comportant des fonctions ammonium quaternaire, c) les résines d'agarosc anioniques fortes et fortement réticulées comportant des fonctions ammonium quaternaire, et d) les résines d'agarosc et de dextrane anioniques fortes et fortement réticulées comportant des fonctions ammonium quaternaire. [Revendication 5] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisé en ce que la biomasse végétale est issue d'une plante choisie parmi les plantes fourragères les plantes potagères et les plantes grasses. [Revendication 6] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisé en ce que l'étape 1) de déshydratation du jus végétal est réalisée par séchage par atomisation. [Revendication 7] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisé en ce que l'étape 2) de reconstitution d'un jus végétal est réalisée par ajout d'eau ou d'une solution permettant d'ajuster le pH ou la salinité du jus. [Revendication 8] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisé en ce que l'étape 3) de centrifugation du jus végétal reconstitué est réalisée à une vitesse de 4000 à 6000 tours/min. [Revendication 9] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisé en ce qu'il comprend en outre, avant la réalisation de l'étape 1) de déshydratation, une étape de centrifugation préalable du jus végétal issu du pressage d'une biomasse végétale contenant de la Rubisco. [Revendication 10] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisé en ce que l'étape 4) de rétention clu-omatographique comprend, dans cet ordre, les sous-étapes suivantes : - une sous-étape 4a) de rinçage et d'équilibration de la résine échangeuse d'ions, à l'aide (l'un tampon ayant un pH de 6 à 8, - une sous-étape 4b) de fixation de la Rubisco contenue dans le jus végétal centrifugé, sur la résine présente dans la colonne de chromatographie, et - une sous-étape 4c) de lavage de la colonne par de l'eau déminéralisée. 21 [Revendication 11] [Revendication 12] [Revendication 13] [Revendication 14] [Revendication 15] [Revendication 16] [Revendication 17] Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la sous-étape 4b) est réalisée à un pH compris entre 6,0 et 8,0 ± Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que la sous-étape 4b) est réalisée en mode ascendant ou descendant, avec une vitesse superficielle d'alimentation de 0,2 cm/min à 2 cm/min. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape 5) d'élution est réalisée à l'aide d'une solution saline ou d'une solution ayant un pH inférieur au point isoélectrique de la Rubisco. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape 6) de conditionnement est réalisée par chromatographie d'exclusion de taille ou par ultrafiltration en mode dia-filtration. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'étape 6) de conditionnement est réalisée par ultrafiltration en mode diafiltration en utilisant une solution de remplacement de la solution d'élution. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, une étape 7) supplémentaire de déshydratation de la solution de Rubisco purifiée. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'étape 7) de déshydratation est réalisée par séchage par atomisation à une température allant de 65 à 75°C.