FR 3096905 A1 20201211 FR 1906031 A 20190606 Description Titre de l'invention : Puce microfluidique pour la structuration d'agrégat de cellules par exclusion optique et lévitation acoustique. [0001] La présente invention se rapporte à une puce microlluidique pour la manipulation d'objets tels que des micro ou nano particules de tailles comprises entre 0.1prn et 300 pm. Elle concerne plus particulièrement la mise en lévitation de cellules par application d'ondes acoustiques. Par la suite il sera principalement question de cellule, mais la présente invention s'applique à toute particule sensible au moins aux ondes acoustiques. [0002] D'une façon générale ; le principe de la lévitation acoustique et de la formation d'agrégats de particules (ou cellules) en lévitation acoustique est rappelé sur la Fig. I. En fonction de la fréquence, il est possible de créer I à N noeuds de pression entre les deux parois opposées I et 2 d'un canal 3. La condition à respecter est h = N.X'/2, avec h l'épaisseur de la cavité et X' la longueur d'onde ultrasonore (onde acoustique). Un transducteur 4 est disposé à l'extérieur du canal à proximité de la paroi 2 dc façon à générer des ondes acoustiques à travers cette paroi 2. La paroi I est un réflecteur renvoyant les ondes acoustiques dans le canal 3 de façon à générer une force de radiation acoustique. La composante radiale de la force de radiation acoustique ainsi créée va alors favoriser la formation d'agrégats dans chaque noeud de pression. Les cellules sont réparties sur plusieurs agrégats, chaque agrégat est disposé sur un noeud de pression définissant un plan. Les traits réalisés sur la figure I sont simplement indicatifs dc la force de radiation acoustique à l'origine des noeuds de pression. [0003] Plus précisément, sous l'effet dc la force de radiation acoustique, des particules en suspension sont forcées à migrer vers les noeuds de pression acoustique. Une fois dans les différents plans de lévitation acoustique, la composante radiale de la force de radiation acoustique force les particules à se rassembler et à former un agrégat à chaque niveau. La fréquence de l'onde ultrasonore est définie dc façon à obtenir plusieurs noeuds de pression distribués sur l'épaisseur h du canal. [0004] Dans les applications acoustofluidiques actuelles, on utilise la force de radiation acoustique pour séparer les espèces en fonction de leurs propriétés mécaniques, à savoir leur densité et leur compressibilité, ainsi que de leurs tailles puisque la force acoustique dépend directement de ces paramètres comme défini dans l'équation suivante : [0005] F, = 47c.f.k'.E0.(1).sin(2k'.z) [0006] Avec r le rayon de la particule, (1) le facteur de contraste acoustique, k, le nombre d'onde acoustique et E,, l'énergie acoustique. Ceci définit la sensibilité des particules à 2 la force de radiation acoustique. Plus dense et plus grosse est la particule, plus grande est la force acoustique subie et plus vite la particule migre vers le noeud de pression. Cette force est habituellement utilisée à séparer des particules ou cellules en écoulement en fonction de ces caractéristiques. [0007] On connaît le document WO 2019/002551 Al décrivant une méthode de séparation de particules en écoulement par application d'ondes acoustiques pour les placer en lévitation. Ce document décrit également le principe d'exclusion optique. La présente invention fait référence à cc document WO 2019/002551 Al pour les modalités de mise en lévitation des particules et l'application du principe d'exclusion optique. [0008] La présente invention a pour but une nouvelle utilisation du principe de lévitation acoustique avec manipulation optique. [0009] Un autre but de l'invention est un dispositif permettant une manipulation optimisée d'agrégat créé par lévitation acoustique. [0010] L'invention a encore pour but une nouvelle méthode de création des agrégats. [0011] On atteint au moins l'un des objectifs précités avec une puce rnicrofluidique comprenant : [0012] - un bloc en matériau l'incompatible, [0013] - un canal de passage réalisé dans le bloc pour le passage de cellules baignant dans un liquide, notamment nutritif (milieu de culture), [0014] - une cavité résonante par exemple destinée à la culture cellulaire, réalisée dans le bloc, reliée au canal de passage et comprenant des parois pour contenir les cellules provenant du canal de passage, [0015] - un générateur d'ondes acoustiques apte à former au moins un agrégat de cellules en lévitation acoustique dans la cavité résonante, [0016] - au moins un émetteur optique apte à illuminer des cellules dans la cavité résonante à travers au moins une paroi de la cavité résonante et simultanément à la génération d'ondes acoustiques de façon à structurer ledit au moins un agrégat par la technique d'exclusion optique. [0017] La cavité résonante comprend des parois pour contenir les cellules. En d'autres termes, les cellules peuvent pénétrer une zone dans la cavité résonante où elles ne sont plus sous influence de l'écoulement dans le canal de passage. [0018] Elles peuvent donc être soumises aux actions des ondes acoustiques et optiques. [0019] Elles peuvent également rester immobiles, relativement au mouvement de l'écoulement dans le canal de passage. Immobile signifie qu'elles sont soumises aux faibles mouvements du milieu mais pas au mouvement de déplacement linéaire de l'écoulement. [0020] On peut ajuster le débit de l'écoulement pour que celui-ci n'entraîne pas les cellules formant notamment un ou plusieurs agrégats. La force acoustique est alors suf- 3 fisamment importante pour s'opposer à l'écoulement. [0021] Avec la puce tnicrofluidique selon l'invention, il est possible d'utiliser simul- tanément les ondes acoustiques et les faisceaux optiques de façon à maintenir les cellules en lévitation sur une ou plusieurs couches par ondes acoustiques tout en les manipulant par faisceaux optiques selon la technique d'exclusion optique. [0022] La puce microfluidique selon l'invention constitue un bioréacteur opto-acoustiquc dans lequel les cellules peuvent être mises en culture en lévitation acoustique et manipulées par illumination spécifique de façon à structurer les couches de cellules. Par structuration, on entend une répartition spatiale des cellules les unes par rapport aux autres. [0023] Dans la cavité résonante, les cellules baignent dans un liquide ne perturbant pas les ondes acoustiques ni les faisceaux optiques utilisés et adapté à la culture cellulaire. [0024] La cavité résonante est avantageusement destinée à une culture de cellules en lé- vitation acoustique. Il est clair pour l'homme du métier que toute micro ou natio particule sensible aux ondes acoustiques et éventuellement à certains faisceaux optiques, de façon endogène ou exogène, peut être utilisée dans l'invention. [0025] En utilisant à la fois les propriétés optiques et acoustiques, il est donc possible de structurer spatialement des agrégats de cellules en lévitation acoustique. Cette opération peut être répétée plusieurs fois, par injections successives de différents types de cellules marquées (marqueurs biologiques fluorescents) ou non et réagissant à différentes longueurs d'onde optiques. [0026] La force de radiation acoustique due aux ondes acoustiques permet de créer des agrégats de particules que l'on peut maintenir en lévitation acoustique aussi longtemps que nécessaire. Cette force est dimensionnée pour maintenir cet agrégat en lévitation acoustique dans la cavité résonante qui constitue un piège acoustique ( « acoustic trap » en anglais). [0027] Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, la puce microtluidique peut en outre comprendre au moins un deuxième émetteur optique, les deux émetteurs étant disposés de façon à émettre à travers respectivement deux parois opposées de la cavité résonante. [0028] De préférence, les deux émetteurs optiques émettent à des longueurs d'ondes dif- férentes. Une telle disposition permet d'agir par la technique d'exclusion optique sur différents types de cellules de façon simultanée ou séquentielle. [0029] Selon un mode de réalisation de l'invention, le générateur d'ondes acoustiques peut comprendre un élément supérieur et un élément inférieur prenant en sandwich au moins une partie de la cavité résonante sur deux parois opposées ; l'élément supérieur, fixe ou amovible, étant un transducteur supérieur ou un réflecteur d'ondes acoustiques ; et l'élément inférieur étant un transducteur inférieur, les transducteurs supérieur et inférieur étant aptes à émettre les ondes acoustiques. Par ailleurs, l'élément supérieur et/ou l'élément inférieur sont transparents aux faisceaux lumineux prévus pour l'illumination des cellules. [0030] En d'autres termes, le générateur comprend un transducteur inférieur associé à un ré- flecteur apte à réfléchir les ondes acoustiques du transducteur inférieur de façon à créer la force de radiation acoustique dans la cavité résonante. Mais le réflecteur peut être remplacé par un transducteur supérieur générant les mêmes ondes acoustiques que le transducteur inférieur de manière synchrone de façon à créer également la force de radiation acoustique dans la cavité résonante. [0031] De préférence, au moins l'un des deux transducteurs est transparent à la longueur d'onde optique ou bien est annulaire pour laisser passer en son centre l'illumination optique. [0032] Le caractère amovible de l'élément supérieur permet éventuellement d'évacuer les cellules formant agrégat. [0033] Selon un mode de réalisation de l'invention, la cavité résonante est fermée sur son extrémité inférieure par le transducteur inférieur. Le transducteur inférieur constitue ainsi la paroi inférieure de la cavité résonante. Dans une telle réalisation, le transducteur inférieur est en contact direct avec le milieu de culture. Cette configuration permet d'améliorer le rendement énergétique de la cavité résonante. [0034] Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, le transducteur inférieur peut être disposé à l'intérieur de la cavité résonante. [0035] On prévoit ainsi un transducteur inférieur amovible capable de glisser à l'intérieur de la cavité résonante. De préférence, les dimensions du transducteur permettent d'assurer l'étanchéité de la cavité résonante. Dans ce cas, le volume utile formant le milieu de culture est inférieur au volume total de la cavité résonante. Il est ainsi possible de définir différents volumes de la cavité résonante. Il s'agit alors d'une cavité à volume variable. [0036] Avantageusement, la cavité résonante peut comporter au moins une butée pour bloquer la tête du transducteur inférieur une fois insérée dans la cavité résonante. [0037] Selon un mode de réalisation de l'invention, la cavité résonante peut être fermée sur son extrémité inférieure par un film fixe ou amovible transparent aux ondes acoustiques provenant du transducteur inférieur disposé à l'extérieur de la cavité de résonnance. [0038] Ce film peut être en matériau polydiméthylsiloxane (PDMS) ou en copolymère oléfinique cyclique (COC) ou être un film adhésif PCR k Polymerase Chain Reaction » en anglais) facilement décollable et permettant un très bon transfert des ondes ultrasonores. [0039] Un film amovible permet le passage d'agrégat de cellules en fin de culture par exemple. [0040] De préférence, la cavité résonante est un cylindre dont les parois latérales sont constituées par le bloc. La base supérieure peut être formée par le réflecteur ou le transducteur supérieur. La base inférieure peut être formée par un film ou directement par le transducteur inférieur. [0041] Selon un mode de réalisation, le canal de passage peut déboucher dans la cavité résonante à l'extrémité supérieure d'une paroi latérale du cylindre. Un tel arrangement permet d'alimenter la cavité en cellules par l'extrémité supérieure de la paroi latérale du cylindre. [0042] Selon l'invention, la cavité résonante peut comporter une butée disposée de façon à ce que la tête du transducteur inférieur puisse être insérée jusqu'à réduire la hauteur du volume utile dans la cavité résonante égale à la hauteur du canal de passage. [0043] Idéalement, le volume utile permet la réalisation d'un ou plusieurs agrégats de cellules en monocouche ou multi-couches. [0044] Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le canal de passage peut être réalisé sur la surface supérieure du bloc et une lame collée ou amovible peut couvrir l'ensemble de la surface du bloc y compris l'extrémité supérieure de la cavité résonante ; cette lame étant transparente aux faisceaux optiques prévus pour illuminer depuis l'extérieur les cellules de la cavité résonante. En complément, lorsqu'un transducteur est disposé en face, cette lame est réfléchissante sur le côté interne de la cavité résonante aux ondes acoustiques du transducteur. [0045] De préférence, le canal de passage et le cylindre peuvent être disposés perpendicu- lairement l'un par rapport à l'autre. Le bloc peut alors comprendre en outre deux microcanaux traversant le bloc de part en part, parallèlement au cylindre et connectés respectivement aux deux extrémités libres du canal de passage ; le premier microcanal étant destiné à l'arrivée de cellules dans le canal de passage et le deuxième microcanal étant destiné à l'évacuation de cellules depuis le canal de passage. [0046] A titre d'exemple non limitatif, le réflecteur est une lame en verre, en Polymé- thacrylate de méthyle (PMMA), en quartz, en silicium, en polydiméthylsiloxane (PDMS) ou en copolymère oléfinique cyclique (COC). Une telle lame est conçue pour assurer une bonne transmission d'un côté et une bonne réflexion de l'autre. De préférence, le réflecteur peut être conçu à partir d'un matériau identique à celui du bloc et présentant une surface interne traitée pour la réflexion d'ondes acoustiques. [0047] La puce selon l'invention peut comprendre plusieurs microcanaux réalisés dans l'épaisseur du bloc et débouchant dans la cavité résonante pour des entrées et/ou des sorties de cellules. De préférence, ces microcanaux sont alignés respectivement avec les noeuds de pression prévus dans la cavité résonante du fait de la force de radiation acoustique. Ces microcanaux peuvent par exemple servir pour l'injection de cellules de 6 natures différentes de celles injectées par le canal de passage, pour l'injection de nutriments,...et également pour l'évacuation de cellules. [0048] Avantageusement, la hauteur de la cavité résonante peut être fonction du nombre de noeuds de pression à créer et de la longueur d'onde des ondes acoustiques générées par le générateur. La cavité résonante est conçue pour contenir une superposition de plusieurs couches cellulaires, alors que la hauteur du canal de passage est de préférence adaptée à la taille d'une cellule. [0049] La cavité résonante est plus haute que le canal de passage, par exemple plusieurs diamètres d'une cellule, notamment 10 diamètres minimum. On peut chercher à mettre le premier noeud de pression au niveau du canal de passage, donc une hauteur de canal de l'ordre de K/4. [0050] De préférence, le canal de passage peut être de forme rectiligne de sorte que la section du canal de passage entre une extrémité d'entrée et la cavité résonante est colinéaire à la section du canal de passage entre la cavité résonante et l'autre extrémité de sortie du canal de passage. [0051] Selon un mode de réalisation de l'invention, le bloc peut être en polydiméthyl- siloxane (PDMS) ou en copolymère oléfinique cyclique (COC). [0052] En particulier, le bloc est conçu à partir d'un matériau perméable aux gaz afin de faciliter les échanges gazeux entre le milieu, le contenu de la cavité résonante, et l'extérieur si nécessaire. Les canaux sont gravés ou moulés dans le bloc et peuvent être installés dans un incubateur de façon à assurer les conditions de culture optimale en termes de gaz et température. [0053] Notamment, la cavité résonante peut être dimensionnée avec une hauteur supérieure au diamètre du canal de passage débouchant dans cette cavité résonante. On distingue ainsi clairement le canal de passage qui est un conduit de faible diamètre, typiquement adapté pour véhiculer les cellules uniquement en ligne, et la cavité résonante qui est de dimension plus grande apte à contenir des agrégats de cellules dans un plan et dans un volume. [0054] A titre d'exemple non limitatif, la cavité résonante peut présenter un diamètre entre 1 et 50mm, une hauteur de la cavité résonante comprise entre 5 et 15mm et une hauteur du canal de passage égale à 450pm. [0055] La puce microtluidique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un mi- crocanal supplémentaire réalisé dans le bloc sur le même plan que le canal de passage. Il s'agit ici d'un arrangement simplifié permettant d'alimenter et évacuer la cavité résonante de cellules pouvant s'agréger sur un même plan que les cellules provenant du canal de passage qui est en fait un microcanal principal. [0056] Ce microcanal supplémentaire peut également servir à injecter d'autres cellules, des biomarqueurs, ou encore de laver le milieu de culture ou récupérer la production des 7 cellules au cours de leur culture. [0057] Selon un autre aspect de l'invention, il est proposé un procédé de manipulation de cellules en lévitation acoustique dans une puce microfluidique telle que définie ci-dessus. Ce procédé comprend les étapes suivantes : [0058] - injection de cellules dans la cavité résonante via une entrée du canal de passage, [0059] - génération d'ondes acoustiques pour mettre en lévitation acoustique les cellules injectées de façon à former un agrégat de cellules en au moins une couche, [0060] - au moins une phase d'illumination des cellules simultanément au maintien des ondes acoustiques de façon à manipuler des cellules selon le principe d'exclusion optique. [0061] Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, les cellules injectées sont de natures différentes, et l'étape de génération d'ondes acoustiques et d'illumination peuvent être réalisées de la manière suivante : [0062] - génération d'ondes acoustiques pour mettre en lévitation acoustique des cellules injectées et en même temps application d'un faisceau lumineux à une longueur d'onde permettant le principe d'exclusion d'une partie des cellules de sorte que seules les cellules insensibles à cette longueur d'onde optique forment un agrégat en une couche, [0063] - maintien des ondes acoustiques et arrêt du faisceau lumineux de sorte que les cellules sensibles à la longueur d'onde du faisceau lumineux viennent maintenant s'agréger en périphérie de l'agrégat déjà formé, et obtenir ainsi un agrégat structuré radialement. [0064] La présente invention permet ainsi la réalisation d'agrégats de cellules monocouche. [0065] Par agrégat de cellules on entend une couche de cellules satisfaisant à toutes les ca- ractéristiques suivantes: au moins deux cellules comprises dans ladite couche, en particulier au moins 10%, mieux 25%, de préférence 50% des cellules comprises dans ladite couche, sont en contact, et ladite couche présente, sur au moins une partie de sa longueur, une succession de cellules lors du déplacement selon au moins l'une de ses dimensions transversales. [0066] Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, on réalise une structure tridimensionnelle formée de plusieurs couches d'agrégats en réalisant les étapes suivantes : [0067] - l'étape d'injection comprend l'injection de cellules dans la cavité résonante via une ou plusieurs entrées, et [0068] - l'étape de génération d'ondes acoustiques comprend en outre la génération d'ondes acoustiques pour mettre en lévitation acoustique plusieurs agrégats de cellules injectées sur plusieurs niveaux, les niveaux étant des noeuds de pression acoustique dont le nombre est fonction de la longueur d'onde des ondes acoustiques et de la hauteur de la cavité résonante. 8 [0069] L'invention permet la création de plusieurs monocouchcs les unes au-dessus des autres, ce qui procure un gain de temps considérable pour la culture cellulaire puisqu'il n'est plus nécessaire de trypsiniscr une feuille de cellules, la décoller d'un éventuel substrat solide pour ensuite la déposer sur un autre. Ce processus est plus particulièrement adapté aux cultures de cellules souches de type MSC (« Mcsenchymal Stem Colis» en anglais) où l'on cultive les cellules pour fabriquer des feuillets de cellules qui sont ensuite superposées, mais est pertinent pour tout type de culture cellulaire destinée à former des feuillets de cellules. [0070] Avec l'invention, il est possible d'envisager la fabrication en lévitation acoustique de sphéroïdes, d'organoïdes ou de tumoroïdes qui pourront être maintenus et cultivés en lévitation acoustique. [0071] L'invention permet la réalisation d'une culture cellulaire en maintenant l'agrégat ou les agrégats obtenus immobiles en lévitation acoustique pendant la durée de la culture. [0072] D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée de mises en oeuvre et de modes de réalisation nullement limitatifs, au regard de figures annexées sur lesquelles : [0073] [FIG.1] La figure 1 est une vue schématique de création de noeuds de pression dans un canal par lévitation acoustique selon l'art antérieur ; [0074] [FIG.2] La figure 2 est une vue schématique éclatée d'un exemple du dispositif selon l' invention, [0075] [FIG.3] La figure 3 est une vue de dessus d'un exemple du dispositif selon l'invention, [0076] [FIG.4] La figure 4 est une vue schématique en coupe selon l'axe longitudinal du canal de passage, avec un émetteur optique et un transducteur d'ondes acoustiques disposé à l'extérieur de la cavité résonante, selon l'invention, [0077] [FIG.5] La figure 5 est une vue schématique en coupe selon l'axe longitudinal du canal de passage, avec un émetteur optique et un transducteur d'ondes acoustiques fermant la cavité résonante sur sa base, selon l'invention, [0078] [FIG.6] La figure 6 est une vue schématique en coupe selon l'axe longitudinal du canal de passage, avec un émetteur optique et un transducteur d'ondes acoustiques disposé à l'intérieur de la cavité résonante, selon l'invention, [0079] [FIG.7] La figure 7 est une vue schématique en coupe selon l'axe longitudinal du canal de passage, avec un émetteur optique et un transducteur d'ondes acoustiques disposé à l'intérieur de la cavité résonante, en buté supérieur, selon l'invention, [0080] [FIG.8] La figure 8 est une vue schématique en coupe selon l'axe longitudinal du canal de passage, avec un émetteur optique et un transducteur d'ondes acoustiques fermant la cavité résonante sur sa base, le canal de passage étant disposé dans l'épaisseur du bloc, selon l'invention, 9 [0081] [F10.9] La figure 9 est une vue du dispositif de la figure 8 avec deux émetteurs optiques et un transducteur d'ondes acoustiques, selon l'invention, [0082] [FI0.10] La figure 10 est une vue schématique d'un transducteur conçu à partir d'un matériau transparent pour le faisceau optique prévu pour la mise en oeuvre du principe d'exclusion, selon l'invention, [0083] [F10.11] La figure 11 est une vue schématique d'un transducteur ayant la forme d'un anneau, selon l'invention, [0084] [F10.12] La figure 12 est une vue schématique en coupe selon l'axe longitudinal du canal de passage, avec deux émetteurs optiques et un transducteur de la forme d'un cylindre creux disposé autour de la cavité résonante, selon l'invention, [0085] [F10.131 La figure 13 est une vue schématique en coupe d'un bloc compatible avec les dispositifs des figures 2 à 12 avec une pluralité de microcanaux gravés dans le bloc et débouchant dans la cavité résonante, selon l'invention, [0086] [F10.14] La figure 14 est une vue schématique en coupe d'un agrégat de cellules structuré radialement, selon l'invention, et [0087] [F10.151 La figure 15 est une vue schématique en coupe de plusieurs agrégats de cellules structurés radialement et latéralement, selon l'invention. [0088] Les modes de réalisation qui seront décrits dans la suite ne sont nullement limitatifs; on pourra notamment mettre en oeuvre des variantes de l'invention ne comprenant qu'une sélection de caractéristiques décrites par la suite isolées des autres caractéristiques décrites, si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieur. Cette sélection comprend au moins une caractéristique de préférence fonctionnelle sans détails structurels, ou avec seulement une partie des détails structurels si cette partie uniquement est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieur. [0089] En particulier toutes les variantes et tous les modes de réalisation décrits sont prévus pour être combinés entre eux dans toutes les combinaisons où rien ne s'y oppose sur le plan technique. [0090] Sur les figures, les éléments communs à plusieurs figures conservent la même référence. [0091] Bien que l'invention n'y soit pas limitée, on va maintenant décrire une puce micro- fluidique adaptée pour la culture d'agrégats de cellules en lévitation acoustique. [0092] Sur la figure 2, sont représentés un ensemble de composants d'un exemple d'une puce microtluidique selon l'invention. On distingue un bloc 5 par exemple en matériau PDMS et de forme parallélépipédique avec une surface supérieur et une surface inférieure. Une cavité résonante 6 de forme cylindrique a été réalisée au centre de ce bloc sur toute l'épaisseur du bloc 5 entre les deux surfaces. Cette cavité résonante 6 a pour objet de piéger des cellules par la force acoustique. [0093] Pour alimenter la cavité résonante 6, un canal de passage 7, 8 est gravé sur la surface supérieure du bloc 5 de sorte que ce canal de passage et l'intérieur de la cavité sont accessibles. Le canal de passage comporte une première partie 7 destinée à l'entrée des cellules depuis un microcanal d'entrée 9 vers la cavité résonante. Il comporte également une seconde partie 8 destinée à l'évacuation de cellules depuis la cavité résonante 6 vers un microcanal de sortie 10. Les deux microcanaux d'entrée et de sortie sont réalisés dans l'épaisseur du bloc, comme la cavité résonante et débouchent sur la surface inférieure du bloc 6, l'arrière de ce bloc étant plus accessible à différents dispositifs d'alimentation et de gestion de la puce microfluidique selon l'invention. [0094] De préférence, ce bloc est conçu à partir d'un matériau bio-compatible apte à assurer des échanges gazeux si nécessaire entre la cavité résonante et l'extérieur. Il est conçu pour que la puce microfluidique selon l'invention puisse assurer un flux de nutriments et un flux de milieu de culture si nécessaire au sein de la cavité résonante. Il permet bien évidemment l'injection des cellules et leur évacuation et permet la création des agrégats de grande dimension au sein de la cavité résonante. [0095] La puce microfluidique peut être installée dans un incubateur de façon à assurer les conditions de culture optimale (gaz et température). [0096] On distingue également une lame de verre destinée à couvrir, notamment par collage au plasma, la surface supérieure du bloc 5. Il peut s'agir d'une lame réalisée ensemble avec le bloc 5. Cette lame de verre 11 présente, au moins sur sa paroi interne faisant face à la cavité résonante, une surface interne apte à réfléchir des ondes acoustiques d'un transducteur 12 prévu en face, côté de la surface inférieure du bloc 6. Avantageusement, la lame de verre est transparente aux faisceaux optiques d'un émetteur optique 13 disposé au-dessus de la lame 11. [0097] La lame 11 peut être conçu à partir d'un ou une combinaison de matériaux suivants : vene, PMMA, quartz, silicium, COC, PDMS, de façon à assurer une bonne transmission d'un côté et une bonne réflexion de l'autre. [0098] Le transducteur 12 est composé d'un cylindre en inox contenant un élément piézo- électrique dont la fréquence de fonctionnement peut être choisie en fonction de la hauteur de la cavité résonante. Cette fréquence peut être choisie entre 0.1 MHz à 10 MHz pour des cavités de résonance dont l'épaisseur (la hauteur) peut varier de quelques mm à quelques dizaines de wu. [0099] La figure 3 est une vue de dessus du bloc 5. On distingue les extrémités des mi- crocanaux 9 et 10 à chaque bout du canal de passage 7, 8. Ce canal de passage présente une forme évasée depuis les microcanaux vers la cavité résonante de façon à assurer une bonne progression des cellules à l'entrée et à l'évacuation. Le canal de passage peut présenter une section transversale (circulaire, rectangulaire, carrée ou autre) d'une 11 hauteur de 1 à 30mm par exemple. Des butées 14 et 15 comme on le verra plus tard sont disposées sur la paroi interne de la cavité résonante et permettent de définir un diamètre au niveau supérieur de la cavité résonante d'environ 5 à 30 mm. [0100] D'autres entrées/sorties (non représentées) de type microcanaux 9, 10 et canal de passage 7,8 peuvent être réalisées pour alimenter la cavité résonante par des cellules identiques ou différentes, des biomarqueurs, ou encore pour laver le milieu de culture ou récupérer la production des cellules au cours de leur culture. [0101] Sur la figure 4, est illustré un mode de réalisation dans lequel la base inférieure de la cavité résonante est fermée par un film 16 étanche. Une telle configuration permet d'éviter toute contamination du milieu de culture par le transducteur 12 qui se trouve à l'extérieur de la cavité. Ce film 16 peut être amovible de façon à permettre l'évacuation d'agrégats formés dans la cavité résonante. Idéalement ce film est transparent pour les ondes acoustiques prévues pour la création de force de radiation acoustique dans la cavité. Il peut être en PDMS, en COC ou un film adhésif PCR. [0102] Sur la figure 4, est illustré l'écoulement 17 de cellules et la création d'agrégat 18 à partir de cellules piégées dans la cavité résonante 6 sous l'action des ondes acoustiques émises par le transducteur 12. [0103] Dans un mode de réalisation comme on le voit sur la figure 5 par exemple, le transducteur 12 package peut être en contact direct avec le milieu de culture dans la cavité résonante. Dans ce cas, il n'y a pas de paroi de transmission, seule la lame de vent 11, rétlectrice, est placée en face du transducteur 12. Cette configuration permet d'améliorer le rendement énergétique de la cavité résonante en supprimant une couche de transmission, par exemple le film 16 de la figure 4, dans laquelle l'énergie peut se dissiper. [0104] La figure 6 illustre un mode de réalisation dans lequel le transducteur 12 est inséré dans la cavité résonante 6. Une telle réalisation permet de définir différents volumes en fonction de l'application visée. Le volume utile de la cavité résonante est alors variable. Les butées 14 et 15 peuvent être disposées à différents endroits sur la paroi interne de la cavité résonante de façon à positionner la tête du transducteur à des positions prédéterminées. Sur la figure 7, ces butées sont disposées au sommet de la cavité résonante. [0105] Sur la figure 8 est illustré un mode de réalisation dans lequel le canal de passage 7, 8 est réalisé complètement dans l'épaisseur du bloc 5 et débouche dans la cavité résonante à un niveau intermédiaire et non à son sommet. Ce mode de réalisation est bien évidemment compatible avec différentes configurations présentées ci-dessus, c'est-à-dire par exemple avec le transducteur à l'intérieur ou à l'extérieur de la cavité. Mais dans le cas du transducteur à l'intérieur, celui-ci doit rester en dessous de l'arrivée du canal 7 dans la cavité résonante. 12 [0106] En plus de la culture cellulaire, on prévoit avantageusement la fabrication des or- ganoïdes ou sphéroïdes structurés spatialement avec différentes couches de cellules. [0107] La puce microfluidique selon l'invention permet notamment d'injecter des particules ou des cellules dans la cavité résonante, et donc de réaliser des agrégats de cellules dans la cavité. Cela permet de réaliser des cultures cellulaires sur des temps longs en apportant le milieu de culture nécessaire aux cellules agrégées et en lévitation acoustique. [0108] L'invention permet également la création de couches de cellules composites et structurées, ce qui peut être utile dans la perspective de l'ingénierie tissulaire. Pour ce faire, on utilise l'émetteur 13 pour illuminer les cellules à des longueurs d'onde spécifiques et réaliser la technique de l'exclusion optique. [0109] On peut injecter un mélange de deux types de particules ou cellules, celles-ci vont venir former un agrégat mélangeant les deux espèces sous l'action d'ondes acoustiques. [0110] Si on veut organiser spatialement l'agrégat, en particulier structurer l'agrégat en couches successives, annulaires et concentriques, il est possible d'utiliser le principe d'exclusion optique. [0111] Le principe d'exclusion optique permet d'expulser des particules ou cellules en lé- vitation acoustique sous l'effet d'une illumination optique à une longueur d'onde donnée. Cet effet dépend des propriétés d'absorption optique des particules / cellules. Des cellules marquées par un marqueur fluorescent réagissent également à une illumination à la longueur d'onde d'absorption du marqueur fluorescent. [0112] L'invention permet de former un agrégat 2D structuré dans le plan par bandes suc- cessives à la périphérie de l'agrégat. On obtient ainsi un agrégat structuré radialement 25 comme illustré sur la Fig. 14. Ceci permet de fabriquer un feuillet composé de bandes circulaires de cellules de natures différentes ce qui peut se révéler utile pour la fabrication des organoïdes complexes. [0113] Pour ce faire, on injecte un mélange de deux cellules Cl et C2, l'une absorbant une longueur d'onde optique donnée X011, et l'autre ne l'absorbant pas. Dans ce cas, on peut aisément structurer un agrégat. En effet si la zone d'agrégation est illuminée à la longueur d'onde cela va empêcher Cl de venir s'agréger sous l'effet de la force acoustique. L'espèce C2 va donc former un premier agrégat. Il suffit ensuite de stopper l'illumination à la longueur d'onde X1 pour que l'espèce Cl vienne s'agréger autour du premier agrégat. [0114] En utilisant à la fois les propriétés optiques et acoustiques, il est donc possible de structurer spatialement des agrégats de cellules en lévitation acoustique. Cette opération peut être répétée plusieurs fois, par injections successives de différents types de cellules marquées ou non et réagissant à différentes longueurs d'onde optiques. 13 [0115] Sur la figure 9, deux émetteurs optiques 13 et 13' sont disposés pour illuminer et/ou d'observer les cellules des deux côtés de la cavité résonante en même temps. Cela permet ainsi d'exclure deux espèces simultanément de la zone d'agrégation acoustique. [0116] Pour ce faire, on prévoit d'utiliser un transducteur piézoélectrique (PZT) 19 transparent comme on le voit sur la figure 10. En effet, il est possible de fabriquer des PZT transparents laissant passer les longueurs d'ondes optiques prévues et donc de s'affranchir de la limitation à une illumination unique d'un seul côté. [0117] On peut également utiliser un transducteur (PZT) annulaire (non package). Dans ce cas, il est possible d'illuminer à travers l'anneau et donc de coupler deux sources optiques simultanément. [0118] La double illumination peut également être réalisée avec le mode de réalisation de la figure 12 dans lequel on dispose un transducteur 24 de la forme d'un cylindre creux autour de la cavité résonante. Dans ce cas on prévoit un film 21 faisant l'étanchéité à la base de la cavité résonante et étant transparent pour les faisceaux optiques prévus. Dans ce cas, les deux émetteurs peuvent illuminer librement les cellules dans la cavité résonante. [0119] Un autre avantage de la culture en lévitation est qu'il est possible de créer plusieurs noeuds de pression dans une cavité et ainsi former des agrégats de cellules en lévitation les uns au-dessus des autres. Comme montré sur la Fig. 13, on peut créer de nombreux noeuds, une quinzaine par exemple, dans une cavité haute de quelques mm, 6mm par exemple. Pour ce faire, on peut créer plusieurs microcanaux d'entrée 22 faisant face à plusieurs microcanaux de sortie 23. Chaque couple de microcanaux entrée/sortie peut être prévu dans le plan d'un noeud de pression. Mais la disposition de cellules en lévitation sur plusieurs noeuds de pression peut aussi être réalisée avec un seul canal d'entrée comme le canal de passage. [0120] On peut utiliser l'effet d'exclusion optique sur plusieurs agrégats de cellules en lé- vitation acoustique et donc structurer des objets dans le volume de la cavité résonante. [0121] La zone d'agrégation est donc centrée sur l'axe du transducteur. Il est alors possible de structurer dans le volume plusieurs agrégats superposés 26 comme représentés sur la figure 15, chaque agrégat pouvant lui-même être composé de plusieurs bandes circulaires (structuration annulaire) de cellules différentes. Cela permet d'envisager la fabrication en lévitation acoustique de sphéroïdes, d'organoïdes ou de tumoroïdes qui peuvent être maintenus et cultivés en lévitation acoustique. [0122] La création de plusieurs monocouches les unes au-dessus des autres est un gain de temps considérable pour la culture cellulaire. [0123] La présente invention propose donc de nouveaux moyens de culture cellulaire apte à remplacer les techniques de cultures cellulaires traditionnelles sur substrat solides. En effet, dans le cas d'une culture cellulaire traditionnelle, les cellules telles que des 14 cellules souches par exemple, vont se multiplier sur le substrat solide, mais aussi se déplacer pour rentrer en contact avec les autres cellules. On considère la culture terminée lorsque les cellules arrivent « à confluence », c'est-à-dire sont en contact les unes avec les autres et forment ainsi une couche de cellules « monocouche » (une seule couche de cellules). [0124] La présente concerne la conception d'un bioréacteur opto-acoustique dans lequel les cellules peuvent être mises en culture en lévitation acoustique et manipulées par illumination spécifique de façon à former des agrégats structurés. [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6] REVENDICATIONSPuce microfluidique comprenant : - un Hoc (5) en matériau biocompatible, - un canal de passage (7, 8) réalisé dans le bloc pour le passage de cellules baignant dans un liquide, - une cavité résonante (6) réalisée dans le bloc (5), reliée au canal de passage et comprenant des parois pour contenir les cellules provenant du canal de passage, - un générateur (12) d'ondes acoustiques apte à former au moins un agrégat (18, 25) de cellules en lévitation acoustique dans la cavité résonante, - au moins un émetteur optique (13) apte à illuminer des cellules dans la cavité résonante à travers au moins une paroi de la cavité résonante et simultanément à la génération d'ondes acoustiques de façon à structurer ledit au moins un agrégat par la technique d'exclusion optique. Puce selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un deuxième émetteur optique (13'), les deux émetteurs étant disposés de façon à émettre à travers respectivement deux parois opposées de la cavité résonante (6). Puce selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les deux émetteurs optiques émettent à des longueurs d'ondes différentes (X'' , , '',,2)- Puce selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le générateur d'ondes acoustiques comprend un élément supérieur et un élément inférieur prenant en sandwich au moins une partie de la cavité résonante sur deux parois opposées ; l'élément supérieur, fixe ou amovible, étant un transducteur supérieur ou un réflecteur (11) d'ondes acoustiques ; et l'élément inférieur étant un transducteur inférieur (12), les transducteurs étant aptes à émettre les ondes acoustiques ; et. en ce que l'élément supérieur et/ou l'élément inférieur étant transparent aux faisceaux lumineux prévus pour l'illumination des cellules. Puce selon la revendication 4, caractérisée en ce que la cavité résonante (6) est fermée sur son extrémité inférieure par le transducteur inférieur (12). Puce selon la revendication 4, caractérisée en ce que le transducteur inférieur (12) est disposé à l'intérieur de la cavité résonante (6). 16 [Revendication 7] Puce selon la revendication 6, caractérisée en ce que la cavité résonante (6) comporte au moins une butée (14, 15) pour bloquer la tête du transducteur inférieur une fois insérée dans la cavité résonante. [Revendication 8] Puce selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée en cc le transducteur inférieur et/ou le transducteur supérieur est conçu à partir d'un matériau (19) laissant passer les faisceaux optiques prévus pour illuminer les cellules depuis l'extérieur de la cavité. [Revendication 9] Puce selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisée en cc Le transducteur inférieur et/ou le transducteur supérieur a la forme d'un anneau (20) permettant au moins le passage à l'intérieur de l'anneau des faisceaux optiques prévus pour illuminer les cellules depuis l'extérieur de la cavité. [Revendication 10] Puce selon l'une quelconque des revendications 1 à4, caractérisée en cc que la cavité résonante est fermée sur son extrémité inférieure par un film (16) fixe ou amovible transparent aux ondes acoustiques provenant du transducteur inférieur disposé à l'extérieur de la cavité de résonnance. [Revendication 11] Puce selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en cc que le générateur d'ondes acoustiques est un transducteur (24) en forme de cylindre creux disposé autour de la cavité résonante à l'extérieur ou formant parois latérales de la cavité résonante, la paroi supérieure et ou inférieure de la cavité étant en matériau transparent aux faisceaux optiques prévus pour illuminer les cellules depuis l'extérieur de la cavité. [Revendication 12] Puce selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisée en ce que la cavité résonante (6) est un cylindre dont les parois latérales sont constituées par le bloc. [Revendication 13] Puce selon la revendication 12, caractérisée en ce que le canal de passage débouche dans la cavité résonante à l'extrémité supérieure d'une paroi latérale du cylindre. [Revendication 14] Puce selon la revendication 13, caractérisée en ce que la cavité résonante comporte une butée disposée de façon à ce que la tête du transducteur inférieur (12) puisse être insérée jusqu'à réduire la hauteur du volume utile dans la cavité résonante égale à la hauteur du canal de passage. [Revendication 15] Puce selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisée en ce que le canal de passage (7, 8) est réalisé sur la surface supérieure du bloc, une lame (11) collée ou amovible couvrant 17 l'ensemble de la surface du bloc y compris l'extrémité supérieure de la cavité résonante ; cette lame étant transparente aux faisceaux optiques prévus pour illuminer depuis l'extérieur les cellules de la cavité résonante ; et en ce que lorsqu'un transducteur est disposé en face, cette lame sert de réflecteur réfléchissant sur le côté interne de la cavité résonante les ondes acoustiques du transducteur. [Revendication 16] Puce selon la revendication 15, caractérisée en ce que le canal de passage (7, 8) et le cylindre sont disposés perpendiculairement l'un par rapport à l'autre, et en ce que le bloc comprend en outre deux microcanaux (9, 10) traversant le bloc de part en part, parallèlement au cylindre (6) et connectés respectivement aux deux extrémités libres du canal de passage (7, 8) ; le premier microcanal (9) étant destiné à l'arrivée de cellules dans le canal de passage et le deuxième rnicrocanal (10) étant destiné à l'évacuation de cellules depuis le canal de passage. [Revendication 17] Puce selon l'une quelconque des revendications 4 à 16, caractérisée en ce que le réflecteur (11) est une lame en verre, en Polyméthacrylate de méthyle (PMMA), en quartz, en silicium, en polydiméthylsiloxane (PDMS) ou en copolymère oléfinique cyclique (COC). [Revendication 18] Puce selon l'une quelconque des revendications 4 à 17, caractérisée en ce que le réflecteur (11) est conçu à partir d'un matériau identique à celui du bloc et présente une surface interne traitée pour la réflexion d'ondes acoustiques. [Revendication 19] Puce selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisée en ce qu'elle comprend plusieurs microcanaux (22, 23) réalisés dans l'épaisseur du bloc et débouchant dans la cavité résonante pour des entrées et/ou des sorties de cellules. [Revendication 20] Puce selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisée en ce que la hauteur de la cavité résonante est fonction du nombre de noeuds de pression à créer et de la longueur d'onde des ondes acoustiques générées par le générateur. [Revendication 21] Puce selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisée en ce que le bloc (5) est en polydiméthylsiloxane (PDMS) ou en copolymère oléfinique cyclique (COC). [Revendication 22] Puce selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisée en ce que la cavité résonante est dimensionnée avec une hauteur supérieure au diamètre du canal de passage débouchant dans cette cavité résonante. [Revendication 23] Puce selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- 18 ractérisée en ce que la cavité résonante (6) présente un diamètre entre 1 et 50mm, la hauteur de la cavité résonante étant comprise entre 5 et 15mm et la hauteur du canal de passage étant égale à 450pm. [Revendication 24] Puce selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un microcanal supplémentaire réalisé dans le bloc sur le même plan que le canal de passage. [Revendication 25] Procédé de manipulation de cellules en lévitation acoustique dans une puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications précédentes, ce procédé comprenant les étapes suivantes : - injection de cellules dans la cavité résonante (6) via une entrée du canal de passage (7, 8), - génération d'ondes acoustiques pour mettre en lévitation acoustique les cellules injectées de façon à former un agrégat (18) de cellules en au moins une couche, - au moins une phase d'illumination des cellules simultanément au maintien des ondes acoustiques de façon à manipuler des cellules selon le principe d'exclusion optique. [Revendication 26] Procédé selon la revendication 25, dans lequel procédé les cellules injectées sont de natures différentes, l'étape de génération d'ondes acoustiques et d'illumination étant réalisées de la manière suivante : - génération d'ondes acoustiques pour mettre en lévitation acoustique des cellules injectées et en même temps application d'un faisceau lumineux à une longueur d'oncle permettant le principe d'exclusion d'une partie des cellules de sorte que seules les cellules insensibles à cette longueur d'onde optique forment un agrégat en une couche, - maintien des ondes acoustiques et arrêt du faisceau lumineux de sorte que les cellules sensibles à la longueur d'onde du faisceau lumineux viennent maintenant s'agréger en périphérie de l'agrégat déjà formé, et obtenir ainsi un agrégat structuré radialement. [Revendication 27] Procédé selon la revendication 25 ou 26 pour la réalisation cl' une structure tridimensionnelle formée de plusieurs couches d'agrégats : - l'étape d'injection comprenant l'injection de cellules clans la cavité résonante via une ou plusieurs entrées, et - l'étape de génération d'oncles acoustiques comprenant en outre la génération d'oncles acoustiques pour mettre en lévitation acoustique plusieurs agrégats de cellules injectées sur plusieurs niveaux, les niveaux étant des noeuds de pression acoustique dont le nombre est 19 [Revendication 28] fonction de la longueur d'onde des ondes acoustiques et de la hauteur de la cavité résonante. Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, caractérisée en cc qu'il comprend en outre une étape dc réalisation d'une culture cellulaire en maintenant l'agrégat ou les agrégats obtenus immobiles en lévitation acoustique pendant la durée de la culture.