FR 3099770 A1 20210212 FR 1908970 A 20190805 Description Titre de l'invention : METHODE D'ANALYSE DE LA PERTE DE DIVERSITE BACTERIENNE DU MICROBIOME INTESTINAL HUMAIN Résumé de l'invention 100011 La présente invention décrit une méthode permettant de diagnostiquer la perte de diversité bactérienne du microbiote intestinal humain, in vitro, à partir d'un échantillon de selle. Cette méthode implique un ensemble d'étapes calibrées permettant une reproductibilité parfaite des résultats, et une fiabilité accrue du diagnostic. Les inventeurs ont ainsi identifié une valeur de référence permettant de séparer les individus en deux groupes en fonction de leur niveau de diversité bactérienne. Les personnes diagnostiquées pour avoir une faible diversité sont statistiquement plus fréquemment en mauvaise santé que les autres. Des méthodes de traitement appropriées peuvent donc être développées spécifiquement pour ces individus. Description de l'Art Antérieur : 100021 La recherche scientifique et médicale a récemment révélé l'importance du microbiote intestinal dans la santé humaine. En particulier, une perte de diversité du microbiote intestinal a été associée avec de nombreuses pathologies, dont notamment les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin et l'obésité. 100031 Deux études pionnières publiées dans Nature en 2013, réalisées par les équipes de MetaGenoPolis de l'INRA, ont montré qu'il existait dans environ 24% de la population européenne une perte de richesse bactérienne associée avec un mauvais profil métabolique (augmentation de l'adiposité, de l'insulino résistance et dyslipidémie ainsi qu'un profil plus inflammatoire, cf / ; 2). Ces deux études sont basées sur une technologie similaire à la présente invention, à savoir le séquençage métagénomique. Elles illustrent bien la perte de richesse bactérienne chez ces patients. [0004] En outre, une perte de diversité bactérienne au niveau de la flore intestinale a été reportée dans de nombreuses pathologies, et en particulier dans l'obésité, le diabète de type l et II et la maladie de Crohn (3). [0005] En 2009, Turnbaugh et al. ont également montré sur 154 personnes que l'obésité était associée à une perte de la diversité bactérienne et une altération des voies métaboliques (4). Chez les personnes en surpoids, unc diversité basse est indicative d'un profil plus inflammatoire et par conséquent d'un risque accru de complications métaboliques (5). Une autre équipe a de plus montré qu'une intervention alimentaire (régime sur 6 semaines) permettait d'augmenter la diversité chez les personnes en perte de diversité ( 2). 2 100061 Plus récemment, une étude longitudinale anglaise (6) portant sur plus de 1600 personnes a également confirmé ces résultats en montrant que les individus sains avec une perte de diversité prennent plus de poids au cours de leur vie. [0007] Il est également connu que la prise d'antibiotiques est responsable d'une perte temporaire de diversité, qui varie en durée d'un individu à l'autre. Cette perte de diversité diminue le potentiel protecteur du microbiote intestinal, c'est-à-dire sa capacité à combattre les bactéries pathogènes extérieures et ouvre une opportunité pour l'émergence de bactéries commensales qui deviennent nocives suite à des perturbations de leur environnement (7). [0008] Dans ce contexte, il est indispensable de disposer d'un test rapide et fiable pour détecter très facilement l'état de diversité bactérienne intestinale d'un individu (sans avoir à prélever d'échantillon par biopsie ou par colonoscopie, ce qui est douloureux et dangereux pour le patient). La présente invention remplit ce besoin, en proposant une méthode très fiable et reproductible, à réaliser sur des échantillons de selles et donc entièrement in vitro. [0009] L'inventeur a identifié une valeur précise qui témoigne de l'état de perte de diversité d'un individu et révèle son état de santé global, comme décrit ci-dessous. Description de l'invention : [0010] En se basant sur les techniques innovantes de séquençage génétique d'un gène spécifique des bactéries, le gène ARN16s, la méthode de l'invention permet de connaitre la diversité bactérienne du microhiote intestinal à partir d'un échantillon de selles et d'établir ainsi un diagnostic sûr et rapide de perte de diversité bactérienne. L'inventeur a mis au point une méthode extrêmement performante, dont la répétabilité est de 0.10, et la justesse de la mesure est de 0.05. [0011] Cette méthode permet in fine d'établir objectivement un diagnostic de perte de diversité bactérienne et, dans ce cas, de travailler avec des médecins, nutritionnistes, diététiciens ou naturopathes à augmenter la diversité chez ces patients, de sorte à améliorer la santé générale du patient. [0012] Les différents choix technologiques tels que la méthode de prélèvement, la technique d'extraction et les méthodes de séquençage influencent les valeurs quantitatives obtenues. L'inventeur a identifié une valeur de référence qui, pour la combinaison des bactéries utilisées dans la méthode de l'invention, permet de classer les patients dans deux catégories, en fonction de leur état de santé. Cette valeur de référence (ou « seuil ») ne se base pas sur la littérature, mais sur une étude exhaustive de deux populations de patients, cumulant plus de 120 échantillons. [0013] La méthode de l'invention permet de renseigner l'individu sur son état de santé global. Plus précisément, il permet à l'individu de savoir s'il est plus à risque de tomber malade dans les mois à venir, s'il est plus « fragile » que d'autres individus ou 3 dans le cas d'une pathologie établie, s'il est plus à même de se rétablir. Dans ce cas, des compléments diététiques ou un régime alimentaire ou un traitement adapté pourraient rétablir un équilibre du microhiote et permettre audit individu de rétablir une flore diversifiée, plus saine. [0014] De manière plus générale, la méthode de l'invention permet de diagnostiquer une faible diversité bactérienne intestinale chez un individu humain. [0015] Par « faible diversité bactérienne », on entend, au sens de la présente invention, une diversité alpha calculée selon la formule de Shannon sur la hase de 10000 reads qui est inférieure au seuil de 5.57. [0016] Dans le cadre de l'invention, la « diversité a » ou « alpha diversité » ou « diversité alpha » est la mesure du nombre total d'espèces bactériennes présentes dans un échantillon de selles de taille fixe pondéré par la fréquence à un temps donné. Cette diversité se mesure par exemple en utilisant la formule de Shannon (ou « entropie »), bien connue depuis 1948 (9) et couramment appliquée en métagénomiquc (10). [0017] La méthode de l'invention nécessite de mesurer la diversité alpha des bactéries contenues dans l'échantillon de selles de l'individu testé (voir ci-dessous). [0018] Le calcul de l'alpha diversité peut s'obtenir automatiquement à partir de logiciels d'analyses existants comme Mothur, Qiime ou d'autres, connus de l'homme de l'art. [0019] Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de l'invention comprenant les étapes in vitro suivantes: [0020] a) Mesurer la diversité alpha des bactéries présentes dans un échantillon de selles dudit individu, [0021] b) Comparer la valeur obtenue à l'étape a) avec la valeur seuil de 5.57. [0022] De préférence, si la diversité alpha calculée à l'étape b) est inférieure strictement à 5.57, alors ledit individu présente une flore bactérienne intestinale de faible diversité. [0023] A l'inverse, si la diversité alpha calculée à l'étape b) est supérieure à 5.57, alors ledit individu présente une flore bactérienne intestinale ayant une diversité normale, voire élevée, ce qui permet de déduire que l'état de santé dudit individu est bon. [0024] La méthode de l'invention utilise un ensemble d'éléments spécialement conçus pour permettre la collecte des échantillons de selle au domicile des patients, dans des conditions d'hygiène acceptables et reproductibles. Plus précisément, la méthode de l'invention nécessite d'utiliser un kit contenant au moins : [0025] Un réceptacle protège toilette propre, Une cuillère stérile, Tube récipient, Un tampon de conservation des ADNs, Une notice d'utilisation expliquant au patient comment utiliser les différents éléments en vue de permettre à la méthode de l'invention d'être fiable et re- productible, Eventuellement, une enveloppe et/ou une boite pour envoyer l'échantillon au laboratoire de séquençage. [0026] Collecte (les selles [0027] Par « échantillon de selle », on entend directement les selles d'un patient, recueillies dans des conditions d'hygiène acceptables. [0028] Il est essentiel pour une interprétation correcte des résultats que la selle soit prélevée directement après émission et sans être entrée en contact avec autre chose que le protège siège. En particulier, il est très important que la selle n'ait pas été en contact direct avec l'eau des toilettes ni les toilettes directement. Il est également important de s'assurer qu'il n'y ait eu aucun contact avec d'autres substances du corps humain, telles que les urines ou le sang. [0029] Le kit de l'invention contient donc un réceptacle protège-toilette qui permet de collecter les selles en toute sécurité et hygiène. Cc protège toilette est par exemple le réceptacle à selles « EasySampler de GP Medical Deviccs ApS ». [0030] Dilution (le l'échantillon de selles [0031] Un petit échantillon de selles est ensuite placé à l'aide d'une cuillère propre (voire stérile) dans un diluant liquide, notamment un tampon de dilution, ce qui permet d'extraire des selles, les microorganismes susceptibles d'être présents, les cibles à détecter et autres composants permettant ensuite de caractériser la présence ou non des bactéries cibles dans l'échantillon liquide obtenu. [0032] Le tampon de dilution présent dans l'échantillon liquide contient, en général, une base tampon, une protéine de charge dénaturée et un détergent. A titre d'exemple de base tampon, on peut citer un tampon phosphate, un tampon tris-HCI. A titre d'exemple de protéine de charge dénaturée, on peut citer la caséine, l'ovalbumine et l'albumine sérique bovine. A titre de détergent, on peut citer les détergents ioniques tels que le TritonTM X100 et le Tween@ 20. De préférence, le tampon de dilution utilisé dans le kit de l'invention est le stabilisateur DNA/RNA ShieldTM commercialisé par Ozyme, ou encore le tampon RNA later0 (Ambion) ou le Stool DNA stabilizer (Invitek), ou OMNIgene GUT (DNAGenotek) ou un mélange de EDTA et de DMSO. [0033] La quantité de selles par volume de tampon de dilution est, de préférence, de 10 à 500 mg/ml de tampon de dilution, de préférence encore de 100 à 300 mg/ml, 100 et 130 mg/ml étant préférés. [0034] Pour pouvoir détecter l'ADN bactérien en toute sécurité, il convient que sa quantité minimale dans l'échantillon soit comprise entre 0.8 et 8.8pg/µl (cette quantité dépend du type de bactérie). [0035] La méthode de l'invention peut être mise en oeuvre sur tout individu humain. De préférence, elle est mise en oeuvre sur des individus âgés de plus de quatre ans. En effet, des études ont montré que le microhiote intestinal atteint l'âge adulte à l'âge de 4 ans. De manière encore plus préférée, elle est mise en oeuvre sur des individus issus de population européennes. En effet, le microhiote américain serait moins diversifié que le microhiote français et, à l'inverse, les peuples vivant dans des conditions « primitives » auraient une diversité plus élevée. [0036] De préférence, l'individu est un humain ne souffre d'aucun symptôme au moment de la collecte de l'échantillon. D'apparence « saine », il peut pourtant présenter une faible diversité bactérienne intestinale et risquer de tomber malade dans un futur proche. [0037] L'individu peut également présenter des symptômes d'une maladie ou infection (fièvre, douleurs, gêne, etc.) et la méthode de l'invention sert alors à évaluer si son état peut s'améliorer ou si le traitement auquel il s'astreint est efficace. Notamment, la méthode de l'invention peut être appliquée à un individu à qui un traitement a été prescrit, mais qui ne répond pas à ce traitement. [0038] Détection des bactéries par la technologie 16s [0039] La technologique de séquençage « ARN16s » est bien connue de l'homme du métier (8). Cette technique innovante est très fiable. Les séquences permettant d'amplifier ce gène ou une partie de ce gène, en particulier les régions hypervariahles V3-V4, sont bien connues. [0040] La détection de l'ADN rihosomal 16s peut se faire par n'importe quel moyen connu de l'homme du métier. [0041] Les amorces utilisées par l'inventeur dans le cadre des exemples ci-dessous sont listées dans le listage de séquences associé à la demande, sous les numéros SEQ ID NO :1 et 2. [0042] SEQ ID NO :1 (amorce sens) = [0043] 5' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3' [0044] SEQ ID NO :2 (amorce anti-sens) = [0045] 5'-GTCTCGTOGGCTCGGAGATOTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTAT CTAATCC - 3' [0046] La détection des cibles bactériennes par la technologie 16s est bien décrite dans l'art (cf (8)). Il n'est donc pas nécessaire de reproduire les détails ici. [0047] A partir des échantillons de selles des individus, les principales étapes au préalable de cette détection sont : [0048] i) extraire l'ADN présent dans l'échantillon (lyse cellulaire, séparation des molécules contaminantes non-ADN et récupération des ADNs purifiés, concentrés) [0049] ii) quantifier l'ADN obtenu pour vérifier qu'il est en quantité suffisante pour réaliser l'analyse 16s (typiquement au moins 5ngIpL) [0050] iii) éventuellement, amplifier l'ADN de l'échantillon avant le séquençage 16s. 6 [0051] TI est recommandé d'amplifier l'ADN ribosomal contenu dans l'échantillon par des techniques de PCR, en utilisant des amorces spécifiques des régions hypervariahles, pour ensuite séquencer les amplicons obtenus et en détecter la quantité, qui sera représentative de la quantité de bactéries initialement présente dans l'échantillon. [0052] L'amplification passe par l'utilisation d'amorces nucléotidiques capables d'hybrider avec des séquences complémentaires présentes dans les molécules d'acides nucléiques servant de matrices. TI s'agit là d'une technique simple, facile à mettre en oeuvre en routine, fiable et reproductible car les outils utilisés, notamment les amorces, l'ADN polymérase et, dans le cas des amplifications thermo-dépendantes, les conditions de température, sont spécifiques et adaptées. [0053] Dans le cadre de l'identification des bactéries, l'amplification, notamment la PCR, peut être appliquée seule ou, pour une différenciation plus fine des espèces, couplée à d'autres techniques, parmi lesquelles la détermination de la séquence des produits d'amplification, le RFLP et le polymorphisme de taille des produits d'amplification. La mise en oeuvre de ces dernières combinaisons de techniques, plus longue et plus lourde, n'est cependant pas nécessaire à l'établissement d'une analyse de routine. [0054] Le séquençage 1 6s peut ensuite être réalisé grâce à une technologie classique, par exemple ABI 3730, 454FLX Titanium, Illumina, PacBio, Ton Torrent, OxfordNanopore, etc. (voir tableau 1 de (8)). [0055] Les fichiers de séquençage obtenus sont des fichiers « fastq », format connu de l'homme de l'art. [0056] Calcul de la diversité bactérienne [0057] La diversité bactérienne est déterminée selon la formule de Shannon, sur la base d'un nombre fixé de reads d'ARN16s. [0058] La formule pour calculer la diversité de Shannon est la suivante : [0059] [Math. t] L 'Pi 1°8212i [0060] Où n est le nombre d'OTU, Operational Taxonomie Units, détectés à une profondeur donnée, préférentiellement 10.000 reads. p est la fréquence pour chaque OTU. L'équation utilisée ici se hase sur un log2, néanmoins elle peut également se baser sur le logarithme naturel (ln). [0061] La valeur de l'alpha diversité d'un échantillon peut s'obtenir automatiquement à partir de logiciels d'analyses existants comme Mothur, Qiime ou d'autres, connus de l'homme de l'art (10). [0062] Kit de l'invention [0063] Dans un autre aspect, la présente invention concerne un kit pour détecter la diversité bactérienne intestinale humaine, ledit kit comprenant les moyens aptes à détecter 7 l'ensemble des bactéries présentes à au moins 1/10000 clans un échantillon d'ADN. [0064] Dc préférence, ledit kit comprend les moyens aptes à détecter les séquences permettant de caractériser la composition taxonomique bactérienne. [0065] Dc manière encore plus préférée, ledit kit comprend les amorces de la région V3-V4 du gène rARN16s, par exemple les amorces ayant pour séquences SEQ ID NO :1 et/ou 2. [0066] Cc kit peut être mis en vente et servir à un laboratoire d'analyse médicale ou à un hôpital désireux de mettre en pratique la méthode de l'invention sur les échantillons de selle qu'il reçoit, ou qui sont collectés sur place. [0067] Ledit kit peut également contenir tous moyens permettant de stabiliser l'échantillon de selle, notamment un tube de collecte contenant un tampon de dilution, un stabi- lisateur d'ADN ou d'ARN, un échantillon contrôle, une notice explicative, etc. Légendes des figures : [0068] [fig.1] La figure 1 décrit la proportion de chaque bactérie dans les échantillons de patients testés dans l'étude de calibration (le niveau gris foncé représente les bactéries en quantité importante). [0069] [fig.2] La figure 2 décrit les caractéristiques démographiques des patients testés au cours de l'étape dc validation. A : Répartition par sexe dans la cohorte dc validation. Celle-ci se compose de 100 personnes, dont 63 femmes et 37 hommes. B : Distribution de l'âge des patients. L'âge moyen de la cohorte est de 49 ans. C : distribution dc l'IMC (Indice dc Masse Corporelle) des patients. [0070] [fig.3] La figure 3 représente un boxplot de la diversité bactérienne en fonction des cohortes analysées. La figure en haut se base sur les 100 patients en fonction de leur état dc santé. La figure en bas présente les valeurs dc la cohorte de calibration (saine). On voit clairement une diminution de la diversité dans le groupe en mauvaise santé (résultat significatif p-val 29 « pas très bon » et 7 « mauvais ». [0116] Afin de comparer la diversité entre deux groupes de patients, le test de wilcoxon a été appliqué sur la mesure de diversité. La p-valeur a été calculée en se basant sur l'hypothèse que la diversité est diminuée chez les malades. [0117] Comme attendu, la diversité des patients qui se déclarent en mauvaise santé est diminuée de façon significative par rapport à la cohorte de référence saine (p-value REVENDICATIONS[Revendication 1] Méthode in vitro permettant de diagnostiquer une faible diversité bac- térienne intestinale chez un individu humain, comprenant les étapes : a) Mesurer la diversité alpha des bactéries présentes dans un échantillon de selles dudit individu, h) Comparer la valeur obtenue à l'étape a) avec la valeur seuil de 5.57. [Revendication 2] Méthode selon la revendication 1, dans laquelle, si la diversité alpha calculée à l'étape h) est inférieure strictement à 5.57, alors ledit individu présente une flore bactérienne intestinale de faible diversité. [Revendication 3] Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle les bactéries sont détectées en séquençant les gènes codant pour l'ARN16s desdites bactéries, amplifiés au préalable. [Revendication 4] Méthode selon la revendication 3, dans laquelle lesdits gènes ont été amplifiés en utilisant les amorces de SEQ ID NO :1 et 2. [Revendication 5] Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, contenant une étape préalable de collecte de l'échantillon de selle en utilisant un réceptacle protège-toilette, un tube et une cuillère stériles. [Revendication 6] Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ledit échantillon de selles est dilué dans un tampon de conservation des ADNs. [Revendication 7] Méthode in vitro permettant de pronostiquer si un individu risque de tomber malade, comprenant les étapes : a) Mesurer la diversité alpha des bactéries présentes dans un échantillon de selles dudit individu, b) Comparer la valeur obtenue à l'étape a) avec la valeur seuil de 5.57, dans laquelle, si la diversité alpha calculée à l'étape b) est inférieure strictement à 5.57, alors ledit individu risque de tomber malade. [Revendication 8] Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle l'individu est un être humain de plus de quatre ans. [Revendication 9] Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle l'individu est un humain ne souffre d'aucun symptôme au moment de la collecte de l'échantillon ou ne répond pas au traitement prescrit.