FR 3098416 A1 20210115 FR 1907798 A 20190711 Description Titre de l'invention : Procédé de purification de cofacteurs de haut poids moléculaire par dia-filtration tangentielle [0001] La présente invention a trait au domaine de la mise à disposition à grande échelle de cofacteurs de haut poids moléculaire. Elle concerne en particulier un procédé de purification de cofacteurs de haut poids moléculaire mettant en oeuvre une étape de dia-filtration tangentielle. Ce procédé est, par exemple, applicable à la purification du disulfure de coenzyme A ((CoAS)2). Etat de la technique et inconvénient [0002] Les efforts de développement de procédés enzymatiques plus écologiques sont ralentis par plusieurs limitations. La principale d'entre elles concerne l'accessibilité aux cofacteurs dont certaines enzymes sont dépendantes pour catalyser les réactions. [0003] Les procédés actuels de production de cofacteurs comprennent une étape de puri- fication par chromatographie. Le rendement d'une telle étape est très faible, et par conséquent le coût très élevé. De plus, ce procédé implique l'utilisation de solvants néfastes pour l'environnement. 100041 Du fait du prix très élevé des cofacteurs, de nombreuses réactions enzymatiques sont mises en oeuvre par biosynthèse plutôt que par voie synthétique in vitro mais la limite de cette approche réside dans l'acceptabilité du substrat par les microorganismes utilisés. Cependant, il n'est pas possible de produire de la sorte n'importe quelle molécule. 100051 Un exemple de cofacteur d'intérêt pour de nombreuses réactions enzymatiques est la coenzyme A (CoA). Ce cofacteur affiche un prix de $2160/gramme pour une pureté d'environ 85%. De plus, du fait de sa fonction thiol libre, cette molécule est peu stable à des pH de 6 à 14, ce qui rend sa production à grande échelle difficile puisque les enzymes nécessaires à sa production sont actives dans cette gamme de pH. 100061 Afin de s'affranchir de ces problèmes de stabilité, une voie chimio-enzymatique permettant de produire, à l'échelle du gramme, un dimère de CoA, le disulfure de Coenzyme A (CoAS)2 (Figure I), a été développée (Mouterde L. et al. Org. Process Res. Dev.2016205954-959). Il est grâce à ce procédé possible d'accéder au CoA via la simple réduction du dimère de CoA en utilisant un réducteur de pont disulfure. Cette molécule dimérique est aussi disponible dans le commerce mais à un prix très élevé de l'ordre de $31600/gramme. Le coût élevé de la CoA et du (CoAS)2 est très probablement dû aux méthodes de purification, comme énoncé précédemment. A titre d'exemple, l'une des méthodes la plus économique qu'il soit possible dc trouver dans la littérature utilise 1,8 Litre d'une solution aqueuse de LiC1 à 300 mNI, 1,2 L d'une 2 solution aqueuse de LiC1 à 600 mM, 1 Litre d'une solution aqueuse d'acétone 40% (v/v) contenant 0.028% d'hydroxylamine afin de purifier 1,9 gramme de (CoAS),. [0007] Si cc procédé de préparation in vara rend accessible la molécule de (CoAS), à grande échelle, le problème du coût de la purification persiste. Ce qui explique que le cofacteur CoA soit sous-exploité par rapport aux nombreuses applications possibles. [0008] Il existe à ce jour un réel besoin de rendre disponible à grande échelle et à un prix abordable différents cofacteurs de haut poids moléculaire. Exposé de l'invention [0009] La présente invention concerne un procédé de purification d'un cofacteur de haut poids moléculaire caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une filtration tangentielle [0010] Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la molécule purifiée est un dimère de CoA. Avantages de l'invention [0011] Le procédé de purification selon l'invention présente de nombreux avantages tel qu'exposé ci-après. 100121 Les inventeurs ont fait la preuve de concept de l'intérêt de ce procédé en purifiant le dimère de CoA, la forme oxydée d'un cofacteur à fort intérêt. Un procédé de production d'un dimère de CoA par voie microbiologique a été décrit dans les années 1980 mais aucun procédé de purification n'a été développé par la suite. 100131 Récemment, l'un des inventeurs a mis au point un nouveau procédé de synthèse de dimère de CoA par voie synthétique in vitro (Mouterde L. et al. Org. Process Res. Dev.2016205954-959) rendant possible la production de ce dimère à grande échelle. Toutefois, celui-ci n'a jusqu'à présent pas été exploité faute de procédé de purification industrialisable. Les recherches ont été poursuivies jusqu'à la mise au point du procédé selon l'invention qui résout ce problème et ouvre la voie à l'exploitation industrielle du cofacteur CoA, élément limitant dans de nombreux projets restés au stade de la preuve de concept en laboratoire. 100141 Ce procédé industrialisable présente un caractère « durable et vert » renforcé par les faits suivants : 100151 il est, de préférence, mis en oeuvre en l'absence de solvant organique ; la réduction considérable du volume de sels utilisés : ce procédé permet de substituer des solutions tampon de chlorure de lithium (300 et 600 mM), des solvants organiques (tel que l'acétone) et autres composés chimiques (tel que l'hydroxylarnine) par de l'eau milliQ ; il s'agit d'un procédé « 2 en 1 » dans lequel la purification et le 'dessalage" sont réalisés en une seule étape ; l'eau de lavage est recyclée et réinsérée dans le procédé. 3 100161 La dia-filtration tangentielle est également avantageuse du fait qu'elle limite le colmatage et augmente la durée d'utilisation des membranes par rapport à une dia-filtration frontale. Ainsi la fréquence de remplacement de la membrane est réduite. [0017] Le procédé offre la possibilité de réaliser la purification à grande échelle. [0018] Grâce à ses nombreux avantages, ce procédé ouvre la voie à une utilisation à grande échelle des réactions enzymatiques in vitro. Brève description des dessins Figure 1 : Structures de CoA et de (CoAS)2 Figure 2 : Gamme HPLC du CoAS2 [0019] [fig.3] Figure 3 : Pilote de filtration selon une configuration tangentielle en circuit fermé Description des modes de réalisation [0020] Un premier objet de l'invention concerne un procédé de purification d'un cofacteur à haut poids moléculaire caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une dia-filtration tangentielle. [0021] Les cofacteurs sont des composés chimiques non protéiques nécessaires à l'activité biologique de certaines protéines, le plus souvent d'une enzyme. Parmi les cofacteurs à haut poids moléculaire, on peut citer la coenzyme CoA, le Flavine Adénine Dinucléotide (FAD) ou la coenzyme F420. [0022] Dans le cas de la coenzyme A, en raison d'un problème de stabilité lors de sa production, il est préférable de produire un dimère de CoA, le disulfure de CoA ((CoAS)2),En effet, la CoA doit être stockée à -20 °C alors que le dimère de CoA peut être conservé à température ambiante. Une simple réaction de réduction du pont disulfure permet l'obtention du monomère de CoA. Des réducteurs adaptés à cette réaction sont par exemple le mercaptoéthanol, le DTT ou le TCEP. [0023] Ce procédé présente le double avantage d'être peu coûteux et écologique. En effet, il repose sur la mise en oeuvre d'une diafiltration réalisée sur une solution tampon aqueuse qui peut être purifiée avec de l'eau déionisée, ou toute autre solution tampon aqueuse.... La solution qui permet la purification sera choisie en fonction du cofacteur à purifier et du matériau de la membrane. L'homme du métier saura faire ce choix à l'aide de ses connaissances générales. [0024] La matière de la membrane est choisie en fonction du cofacteur à purifier. Il s'agira de préférence d'une membrane de filtration. [0025] La dia-filtration est réalisée de préférence en l'absence de solvant organique, et au contraire en présence d'un solvant aqueux, de préférence une solution tampon aqueuse, notamment avec de l'eau telle que de l'eau déionisée. [0026] Dans un mode de réalisation préféré, le cofacteur à purifier est un dimère de CoA, la membrane utilisée est en polymère de type polyéthersulphone (PES) ou en un matériau assimilé à du polyamide et la solution qui permet la purification est de l'eau &ionisée. [0027] Au sens de l'invention, un cofacteur de haut poids moléculaire est un composé dont le poids moléculaire est supérieur ou égal à 600 Da. [0028] Ainsi, dans l'objectif de purifier des cofacteurs de haut poids moléculaire, le eut-off de la membrane permet de retenir les cofacteurs dont le poids moléculaire est supérieur ou égal à 600 Da. Il est à noter que le eut-off des membranes annoncé par les fabricants ne reflète pas nécessairement la réalité et que d'autres facteurs tels que la conformation du composé, les fonctions chimiques présentes et les interactions membrane-composé peuvent influencer le passage ou non du composé à travers la membrane. A titre d'information, le poids moléculaire du dimère de CoA est de l'ordre de 1500 Da. [0029] Une définition fonctionnelle d'une membrane selon l'invention consiste à dire que la membrane doit laisser passer les molécules de poids moléculaire inférieur à 600 Da tout en retenant le cofacteur d'intérêt. [0030] La filtration membranairc consiste, dans son principe, à appliquer sur la membrane une force motrice de transfert, ici une différence de pression, afin d'effectuer la séparation. Dans le cadre de la présente invention, la pression appliquée sur la solution de cofacteur à purifier est typiquement comprise entre 4 et 35 bars. Dans un mode de réalisation préférée, la pression appliquée est comprise entre 4 et 20 bars. [0031] La dia-filtration permet de faire recirculer la solution dans laquelle se trouve le retentit afin d'éliminer les molécules de petite taille indésirables présentes dans le retentit, par un lavage, et donc d'améliorer la pureté des cofacteurs. [0032] Le procédé est avantageusement réalisé en continu, ce qui permet de purifier, puis de concentrer le cofacteur. Cela permet également d'utiliser peu de solvant et de le réutiliser (recyclage). [0033] Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, dans lequel le procédé permet de purifier le dimère de CoA, les conditions sont les suivantes : la membrane utilisée est en polymère PES ou en un matériau assimilé à du polyamide sur laquelle une pression comprise entre 4 et 20 bars est appliquée et la diafiltration est réalisée avec de l'eau déionisée en continu. [0034] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la membrane est en polymère PES et une pression de 20 bar est appliquée. [0035] Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la membrane est en un matériau assimilé à du polyamide et une pression de 4 bar est appliquée. [0036] Le cofacteur traité par le procédé selon l'invention peut être purifié à au moins 85%. Dans un mode de réalisation particulier, il est purifié à 88%, 90%, 95%, voire 98% ou 99%. [0037] Le procédé selon l'invention permet d'avoir accès aux cofacteurs de haut poids mo- léculaire en grande quantité et à un prix raisonnable via un procédé écologique et industriellement viable. Ce procédé ouvre donc la voie à de nouveaux marchés à fort potentiel. Exemples [0038] EXEMPLE 1 : Etude de l'effet de différentes membranes sur la séparation de molécules de (CoAS) 2 via une filtration tangentielle. [0039] Une gamme étalon a tout d'abord été réalisée en HPLC avec du CoAS2 commercial à 85% à différentes concentrations afin de pouvoir mesurer précisément la quantité de la molécule cible dans les différentes fractions du procédé de purification (alimentation, rétentat, perméat). Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 2. [0040] Une solution contenant (CoAS),, de l'adénosine triphosphate (ATP), de l'adénosine diphosphate (ADP) et de l'adénosine monophosphate (AM P), dans un volume final de 700 mL d'eau milliQ, a été utilisée pour effectuer le criblage des membranes. [0041] Une technique de filtration membranaire tangentielle a été explorée afin de séparer les molécules présentent dans le mélange. Différents types de membrane : NP010, GE, GEL G R15PP, HydraCore50-PS 7450 et 1-IydraCore70pHT Scries 7470P1-IT (Tableau 1), ont été étudiées selon une configuration tangentielle en circuit fermé (Figure 3). [0042] Les caractéristiques des membranes étudiées sont résumées au Tableau I. [0043] [Tableaux l] Fabriquant Type Membrane Cut-off (Da) Gamme de pH Pression maximale Suez UF GE 900 pour PEG 1-1 1 40 bar UF GH 1400 pour PEG 1-11 27 bar UF GK 1500 pour PEG 1-11 27 bar Microdyn-Nadi r NF NP010 1000 0-14 40 bar Alfa Laval UF GR95PP 2000 1.13 10 bar Hydronautics- Nitto UF HydraCore50-PS 7450 1000 2-11 41 bar NF HydraCore70pHT Series 7470PHT 720 1-13,5 41 bar [0044] Tableau 1 : Propriétés principales des membranes étudiées 6 [0045] Quatre pressions différentes ont été étudiées choisies en fonction de la pression maximale applicable à chaque membrane (selon les recommandations du fabriquant). Le pourcentage de rétention des différents composés, pour chaque pression et membrane, a été calculé selon l'équation suivante : [0046] Rétention purpp',, = (1 - C, coiuwsjCr x 100 [0047] où Cp é et Cruo','sé sont respectivement les concentration du composé étudié dans le perméat et le rétentat. [0048] Les résultats obtenus à un temps donné sont représentés au Tableau 2 ci-dessous. [0049] 7 [Tablcaux2] Type de membrane Pression (bar) Rétention de (CoAS) 2 (%) Rétention d'ATP Rétention d'ADP Rétention d'AMP (%) (%) (%) NP010 10 95.26 91.87 88.53 86.78 20 100 91.78 87.57 85.17 30 100 93.72 89.73 86.69 35 100 94.27 90.27 86.94 GE 10 97.52 100 96.68 91.68 20 98.34 100 97.23 96.78 30 94 91.98 90.59 90.57 35 95.20 93.23 91.43 91.12 GH 4 98.94 91.28 79.51 29.61 6 98.54 92.33 83.73 38.61 8 98.06 93.62 86.94 46.46 97.95 94.14 87.98 49.83 GK 4 97.44 62.30 46.64 7.55 6 97.22 66.20 52.07 12.78 8 97.35 67.46 54.05 12.80 10 96.72 67.84 55.48 15.33 HydraCorc50-PS 7450 10 100 99.83 99.93 99.28 20 100 100 100 99.60 30 100 100 100 99.58 35 100 100 100 99.70 HydraCore70pH T Series 10 99.26 98.93 99.73 99.45 7470PHT 20 100 100 100 99.72 30 100 100 100 99.81 35 100 100 100 99.84 8 GR95PP 4 65.38 31.18 22.85 12.87 6 73.11 41.94 32.33 18.44 8 75.01 48.90 39.49 24.63 10 75.44 51.52 42.33 27.26 [0050] Tableau 2 : Résumé des pourcentages de rétention de chacun des composés en fonction de la pression et du type de membrane [0051] Les meilleurs résultats ont été obtenus avec la membrane OK, c'est-à-dire avec une membrane caractérisée par un matériau assimilé à du polyamide, un cut-off de 1500 pour le PEU, et utilisable à un pH compris entre 1 et 11. La pression maximale recommandée pour cette membrane est 27 bar. La rétention différentielle de (CoAS)2est maximale à 4 bars mais également très satisfaisante aux autres pressions testées, à savoir jusqu'à 10 bars. [0052] L'autre membrane ayant permis une purification du (CoAS)2cst la membrane NOP10, c'est-à-dire une membrane en matériau polymère de type polyéthersulphone (PES) présentant un cuti-off de 1000 et utilisable à une pression maximale de 40 bars. Le meilleur résultat est obtenu à une pression de 20 bars. 9 REVENDICATIONS[Revendication 1] Procédé de purification d'un cofacteur de haut poids moléculaire ca- ractérisé en ce qu'il met cn oeuvre unc dia-filtration tangentielle. [Revendication 2] Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite dia-filtration est réalisée avec une solution aqueuse. [Revendication 3] Procédé selon la revendication 2 dans lequel ladite solution aqueuse est de l'eau déionisée. [Revendication 4] Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ledit cofacteur est le (CoAS)2. [Revendication 5] Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel la membrane est choisie parmi une membrane en polymère de type polyéthersulphone (PES) et une membrane en un matériau assimilé à du polyamide [Revendication 6] Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel la pression appliquée pendant ladite filtration est comprise entre 4 et 20 bars.