FR 3099057 A1 20210129 FR 1908296 A 20190722 Description Titre de l'invention : Inhibiteur du transporteur LAT-1 / SLC7A5 pour son utilisation pour la régulation de la pigmentation cutanée et une composition comprenant ledit inhibiteur Domaine technique 100011 L'invention concerne le domaine de la cosmétique et/ou de la dermatologie. Elle trouve pour application particulièrement avantageuse le domaine des soins de la peau et tout particulièrement pour la régulation de la pigmentation cutanée dont la dépigmentation cutanée ou bien le blanchiment cutané. Technique antérieure [0002] La régulation de la pigmentation cutanée, et notamment la dépigmentation de la peau ou le blanchiment, peut être souhaitée dans diverses circonstances, soit pour un éclaircissement global de celle-ci ou soit pour éliminer ou atténuer des taches provoquées par des troubles locaux de la pigmentation dans le cadre de la cosmétique, soit encore pour traiter des hyperpigmentations dans le cadre de la dermatologie. [0003] La peau comprend plusieurs couches intégrées, allant de la couche superficielle, l'épiderme (tissu épithélial), jusqu'aux couches plus profondes, le derme et l'hypoderme (tissu conjonctif), et chacune possède des propriétés spécifiques permettant à l'ensemble de réagir et de s'adapter aux conditions de son environnement. [0004] La pigmentation de la peau résulte de la présence de mélanine dans l'épiderme et le derme. La mélanine est produite par les mélanocytes situés principalement dans la couche basale. [0005] Il existe des pathologies associées au mauvais fonctionnement des mélanocytes en- gendrant une hyperpigmentation comme les taches de vieillesse (lentigo actinique) ou le mélasma. Ces défauts pigmentaires ne mettent pas en danger la vie des personnes atteintes, mais ont un impact psychologique important. [0006] De nombreux produits sont actuellement disponibles sur le marché pour pallier à ces problèmes d'hyperpigmentation. La plupart de ces produits comportent dans leurs formules un ou plusieurs ingrédients aujourd'hui controversés, car responsables d'effets indésirables. En effets, ces produits contiennent des ingrédients dont l'innocuité est sévèrement remise en question par les autorités sanitaires de différents pays ou communautés. [0007] Un objet de la présente invention est donc de proposer une composition pour la ré- gulation de la pigmentation cutanée présentant une meilleure innocuité. [0008] Les autres objets, caractéristiques et avantages de b présente invention apparaitront à l'examen de la description suivante et des dessins d'accompagnement. Il est entendu 2 que d'autres avantages peuvent être incorporés. [0009] RÉSUMÉ [0010] Pour atteindre cet objectif, selon un mode de réalisation la présente invention prévoit un inhibiteur du transporteur LAT-1 / SLC7A5 pour son utilisation dans la régulation de la pigmentation cutanée. [0011] De manière surprenante, les inventeurs se sont aperçus que l'inhibition du transporteur LAT-1 / SLC7A5 avait un effet sur la mélanogenèse et notamment une diminution de la production de mélanine qui permet de réguler la pigmentation cutanée. [0012] L'utilisation d'un inhibiteur de cc transporteur LAT-1 / SLC7A5 permet en limitant, voire en bloquant, la production de mélanine d'assurer un blanchiment de la peau ou une dépigmentation cutanée. [0013] Le transporteur LAT-1 /SLC7A5 est connu comme étant une protéine ayant pour fonction le transport cellulaire de grands acides aminés neutres, ou dénommés également acides aminés de type L, tels que la phénylalanine, la tyrosine, la leucine, l'argininc, le tryptophane. Le transporteur LAT-lest un transporteur transmembranaire. Le transporteur LAT-1 est codé par le gène SLC7A5. [0014] Le transporteur LAT-1 est exprimé dans un grand nombre de types de cellules allant des cellules T, aux cellules cancéreuses ou bien encore dans les cellules endothéliales du cerveau. [0015] L'implication du transporteur LAT-1 dans la mélanogenèse n'a pas été documentée avant la présente demande. Ainsi, l'inhibition de ce transporteur LAT-1 pour réguler la pigmentation cutanée est surprenante. [0016] Avantageusement, l'inhibiteur du transporteur LAT-1 /SLC7A5 est le BCH ou 2-amino-2-norbomanecarboxylic acid. [0017] Un autre aspect de la présente invention concerne une composition pour son uti- lisation pour la régulation de la pigmentation cutanée comprenant une quantité efficace d'un inhibiteur du transporteur LAT-1 / SLC7A5 ou d'un sel cosmétiquement ou phamarceutiquement acceptable de celui-là. [0018] Un autre aspect de la présente invention concerne un inhibiteur de l'expression du gène SLC7A5 pour son utilisation pour la régulation de la pigmentation cutanée. Avantageusement, l'inhibiteur étant un siRNA. [0019] Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé pour réduire ou inhiber l'expression du transporteur SLC7A5 comprenant l'administration d'un inhibiteur de SLC7A5. Brève description des dessins [0020] Les buts, objets, ainsi que les caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux de la description détaillée d'un mode de réalisation de cette dernière qui est 3 illustrée par les dessins d'accompagnement suivants clans lesquels : [0021] [fig.1] Les Figures 1 et 2 représentent le niveau d'expression de SLC7A5 dans des cellules Bl6F10 transfectées par un siRNA contrôle ou deux siRNA différents dirigés contre SLC7A5 par PCR quantitative (figure 1), et par Western Blot (figure2). [0022] [fig.2] [0023] [fig.3] La figure 3 représente la quantification du niveau de mélanine produit dans les cellules Bl6F10 après transfcction avec un siRNA contrôle ou deux siRNA différents dirigés contre SLC7A5 et stimulation de la pigmentation avec Forskoline et IBMX, au spectrophotomètre à 405nm. [0024] [fig.4] La figure 4 représente la viabilité des cellules Bl6F10 après 72 heures de traitement avec différentes doses de BCH. [0025] [fig.5] La figure 5 représente la quantification du niveau de mélanine produit dans les cellules Bl6F10 après traitement par différentes doses de BCH et stimulation de la pigmentation avec Forskoline et IBMX, au spectrophotomètre à 405nm. [0026] [fig.6] La figure 6 représente la viabilité des cellules MNT 1 après 72 heures de traitement avec différentes doses de BCH. [0027] [fig.7] La figure 7 représente la quantification du niveau de mélanine produit dans les cellules MNT1 après traitement par deux doses de BCH pendant 4 à 7 jours au spectrophotomètre à 405nm. [0028] [fig.8] La figure 8 représente la quantification du niveau de mélanine des épidermes pigmentés humains reconstruits après traitement par l'inhibiteur BCH à 5 ou 10mM pendant 7 ou 12 jours. [0029] Les dessins sont donnés à titre d'exemple et ne sont pas limitatifs de l'invention. Description des modes de réalisation [0030] Avant d'entamer une revue détaillée de modes de réalisation de l'invention, sont énoncées ci-après des caractéristiques optionnelles qui peuvent éventuellement être utilisées en association ou alternativement : [0031] Avantageusement, la régulation de la pigmentation cutanée comprend une dépig- mentation de la peau. [0032] Avantageusement, la régulation de la pigmentation cutanée comprend un blanchiment de la peau. [0033] Avantageusement, la composition comprend comme inhibiteur du transporteur LAT- 1/SLC7A5 le 2-amino-2-norbornanecarboxylic acid (BCH). [0034] Avantageusement, la composition est adaptée à une application topique. [0035] Composition dans laquelle la régulation de la pigmentation cutanée comprend le blanchiment de la peau et/ou la dépigmentation de la peau. [0036] Dans la présente invention, on entend par : « application topique », le fait d'appliquer ou d'étaler les compositions selon l'invention à la surface de la peau, « cosmétiquement ou pharmaccutiquement acceptable », que la composition selon l'invention est appropriée pour entrer en contact avec le corps et plus particulièrement la peau sans provoquer de réactions de toxicité ou d'intolérance. « quantité efficace » et « quantité suffisante » les quantités nécessaires soit des constituants soit de la composition qu'il convient d'utiliser pour obtenir une efficacité de régulation de la pigmentation cutanée sur la peau sans engendrer d'effet indésirable. [0037] L'inhibiteur du transporteur LAT-1 / SLC7A5, l'inhibiteur de l'expression du gène SLC7A5 et la composition selon l'invention sont destinés à être utilisés pour la régulation de la pigmentation cutanée. La régulation de la pigmentation cutanée s'entend comme contrôle de la pigmentation de la peau y compris le cuir chevelu, et des cheveux. Le contrôle de la pigmentation comprend la dépigmentation de la peau, notamment de zones hyper pigmentées et/ou le blanchiment de la peau, en particulier pour obtenir une pigmentation homogène de la peau et/ou une uniformisation du teint et/ou une atténuation des tâches et/ou un éclaircissement de la peau. [0038] Un rôle de LAT-1 et donc de SLC7A5 dans la mélanogenese a été identifié par les inventeurs en étudiant l'effet de l'extinction ou de la réduction de l'expression de SLC7A5, selon l'exemple 1. [0039] La réduction, avantageusement l'inhibition de l'expression du gène SLC7A5 est avan- tageusement obtenue selon l'invention par une technique de petit ARN interférant : siRNA silencing. Avantageusement, le siRNA est dirigé contre le gène SLC7A5. [0040] L'inhibition du transporteur LAT-1 / SLC7A5 est effectuée par un inhibiteur dudit transporteur. Préférentiellement, l'inhibiteur choisi est le BCH. [0041] Le BCH est une molécule de formule 2-Aminobicyclo[2.2.1]heptane-2-carboxylic acid ou encore 2-amino-2-norbomanecarboxylic acid. Le BCH est représenté ci- dessous par la formule Chem. 1 ci-dessous. Le numéro CAS étant 20448-79-7. [0042] [Chem.1] [0043] Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition pour son utilisation pour la régulation de la pigmentation cutanée qui comprend un inhibiteur tel que décrit ci-dessus. Avantageusement, la composition comprend un inhibiteur tel que décrit ci-dessus ou un sel cosmétiquement ou pharmaceutiquement, notamment dermatolo- giquement, acceptable. [0044] Préférentiellement, la composition comprend au moins un inhibiteur du transporteur LAT-1 / SLC7A5. Par exemple, la composition comprend une quantité efficace de BCH. À titre d'exemple préféré, la quantité efficace in vitro de BCH est avantageusement inférieure ou égale à 20 mM. La composition selon l'invention pour son utilisation pour la régulation de la pigmentation cutanée comprend avantageusement comme principe actif principal un inhibiteur du transporteur LAT-1 / SLC7A5. Préférentiellement, le principe actif principal est le BCH. [0045] Selon une possibilité, la composition comprend de 0,5% à 20% en poids d'inhibiteur du transporteur LAT-1 / SLC7A5 par rapport au poids total de la composition. [0046] Selon une possibilité, la composition comprend en plus d'un inhibiteur du transporteur LAT-1 / SLC7A5, comme le BCH, un agent synergique. Par agents synergétiqucs dépigrnentant on peut citer r hydroquinonc, l'acide kojique, l'acide azélaïque, acide phytique, acide mandélique, la vitamine Cet ses dérivés, la vitamine B et ses dérivés, la vitamine A et ses dérivés, les extraits de plantes tels que Glycyrrhiza glabra, Morus Alba, le resveratrol, l'undecylenoyl phénylalanine, les peptides tels que Acetyl Glycyl ri-Alanine, les dérivés du Resorcinol, Hcxyl resorcinol, Butyl Resorcinol, Phenylethyl Resorcinol. [0047] Préférentiellement, la composition selon l'invention est une composition cosmétique ou dermatologique. Avantageusement, la composition est sous une forme adaptée à une application topique. [0048] La composition selon l'invention peut également contenir d'autres ingrédients usuels en cosmétologie ou en dermatologie, tels que des agents humectant, des conservateurs, des colorants, des parfums, des agents de pénétration tels que le monoéthyléther de diéthylèneglycol, etc. [0049] La composition selon l'invention comprend avantageusement un véhicule approprié ou des excipients appropriés pour une administration topique externe, en particulier des excipients acceptables sur le plan dermatologique et cosmétologique. Ces excipients appropriés pour la formulation sont bien connus de l'homme du métier et comprennent en particulier des agents de pénétration tels que l'éthoxydiphénol, le phytantriol, l'octyl dodécanol et l'escine ; les épaississants tels que les gommes naturelles et les polymères de synthèse ; les émollients et les tensioactifs tels que l'octanoate de cétéaryle, le myristate d'isopropyle, l'isononanoate de cétéaryle, la diméthicone, la cyclométhicone, le 3-diisostéarate de polyglycéryle, le polyisobutène hydrogéné, l'alcool cétylique, le palmitate cétylique, le phosphate cétylique, des triglycérides d'acide caprique et caprylique ; les émulsionnants tels que des esters de sorbitane, des dérivés d'acide stéarique ou palmitique, des sucro-esters ou glucolipides du type myristyl glucoside ou stéaryl glucoside ; les conservateurs tels que le phénoxy-éthanol, le parahydroxy- 6 benzoate de méthyle (méthylparahen), le parahydroxyhenzoate d'éthyle (éthylparaben), le parahydroxybenzoate de propyle (propylparahen) et le Phenonip® associant du phénoxyéthanol et des parahydroxybenzoates de méthyle, éthyle, butyle et isobutylc ; une association à effet andmicrobien d'un lipoaminoacide, d'un acide gras hydroxyle de 8 à 12 atomes de carbone et d'un alkyléther de glycérine; les colorants ; les parfums ; etc. [0050] La composition selon l'invention est présente sous toutes les formes galéniques nor- malement utilisées dans les domaines cosmétique et dermatologique convenant pour l'application topique par exemple: lotion sérum, émulsion de consistance plus ou moins fluide, blanche ou colorée, obtenue par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse, émulsion huile dans eau (H/E) ou inversement émulsion eau dans huile (E/H) de type lait, crème, gel, gel-émulsion, d'un masque ou d'un produit anhydre huile baume, poudre. Elles peuvent également se présenter sous forme de bâtonnet. [0051] Parmi ces préparations on préfère les crèmes, les gels fluides ou épais, ou le vapo- risateur dont l'application est simple et facile sur toutes les parties du corps. [0052] Les compositions selon l'invention sont appliquées par voie topique en quantité suffisante chez l'homme, c'est-à-dire en quantité correspondant aux doses d'application usuelles pour le type de composition considéré (gel, crème, lotion, etc.). Par exemple, dans le cas d'une crème pour le visage, on applique de 0,5 à 3 g, et notamment de 1 à 2 g de crème par jour en une ou plusieurs expositions. Par exemple, dans le cas d'une crème pour le corps, on applique de 5 à 12 g, et notamment de 7 à 10 g de crème par jour en une ou plusieurs expositions. [0053] Exemple 1 [0054] Il a été étudié l'effet de l'extinction de l'expression de SLC7A5 par une approche de RNA silencing dans un modèle de culture cellulaire de mélanomes de souris (cellules B16F10), connues pour leur réponse aux activateurs chimiques de la pigmentation (Forskoline et IBMX : activateurs d'AMPc). Pour cela les cellules ont reçu deux siRNA différents dirigés contre SLC7A5 par transfection avec le réactif HiPerfect (si#1 : Flexitube Qiagen, SI01424885, si#2 :ON-TARGET plus SMARTpool L041166-01). Après 24 hem-es, le processus de pigmentation a été induit par ajout des activateurs d'AMPc précédemment cités. Au bout de 48 heures, les cellules ont été observées par microscopie afin d'évaluer leur degré de pigmentation. Le silencing du gène SLC7A5 entrain une très forte diminution de la pigmentation dans ces cellules, et ce avec les deux siRNA utilisés. [0055] Exemple 2 [0056] Il a ensuite été vérifié le niveau d'expression de SLC7A5 en réponse aux deux siRNA au niveau ARN par PCR quantitative (figure 1) et au niveau protéique par Western blot (figure 2). [0057] Les deux siRNA utilisés apparaissent efficaces pour diminuer l'expression de 7 SLC7A5 tant au niveau ARN (figure 1) que protéique (figure 2), confirmant que l'effet observé sur la pigmentation des cellules à l'exemple 1 est bien dû au silencing de SLC7A5. [0058] Exemple 3 [0059] Le niveau de production de mélanine a ensuite été quantifié en réponse à l'extinction de l'expression de SLC7A5 (figure 3). Pour cela les cellules B16F10 ont été transfectécs avec un siRNA contrôle ou deux siRNA différents dirigés contre SLC7A5, et ont reçu 24 heures plus tard les activateurs de la pigmentation (Forskoline et IBMX) pendant 48 heures. Les cellules ont ensuite été reprises dans une solution de NaOH 0.5M pour quantifier leur teneur en mélanine par spectrophotométrie à 405nm. Pour chaque condition, la quantité de mélanine a été rapportée à la quantité de protéines présentes dans les cellules. On observe dans la figure 3 que le silencing de SLC7A5 conduit à une diminution significative de la production de mélanine dans les cellules B16F10, et ce de manière similaire avec les deux siRNA utilisés. [0060] Ces expérimentations ont donc permis de mettre en évidence un rôle de SLC7A5 dans le processus de pigmentation cellulaire, qui n'avait pas été mis en évidence jusqu'à présent. [0061] Exemple 4 [0062] Étude de l'effet d'un inhibiteur commercial spécifique du transporteur LAT-1 / SLC7A5, nommé BCH. [0063] Dans un premier temps, l'effet de cet inhibiteur a été analysé sur la viabilité des cellules B16F10 après traitement par différentes doses pendant 72 heures. La viabilité a été mesurée par spectrophotométrie à 490nm après ajout du réactif Cell Titer (Promega) (figure 4). À partir de 20mM, la viabilité cellulaire diminue à 60% par rapport au contrôle. Il apparait donc nécessaire de travailler à des concentrations inférieures à 20mM sur ce modèle cellulaire. [0064] Exemple 5 [0065] Étude de l'effet de BCH sur la production de mélanine dans les cellules BI6F10 après 72 heures de traitement pour des doses allant jusqu'à 10mM. Pour cela, les cellules ont reçu le BCH à 1, 5 ou 10mM pendant 24h, et 24 heures plus tard, les activateurs d'AMPc (Forskoline et IBMX) ont été ajoutés pour 48 heures comme précédemment. En observant les cellules au microscope, on peut noter une diminution visible de la pigmentation dépendant de la dose de BCH reçue, à partir de 5mM, et encore plus marquée avec 10mM. La quantité de mélanine produite par les cellules BI6F10 en réponse aux activateurs d'AMPc est fortement diminuée après traitement par 5mM et 10mM de BCH et ce de manière significative (figure 5). [0066] L'inhibiteur BCH, spécifique du transporteur d'acides aminés SLC7A5, a donc un effet notable sur la mélanogenèse dans les cellules de mélanome murin Bl6F10. 8 [0067] Exemple 6 [0068] Afin de conforter ces résultats, un autre modèle, à savoir les cellules de mélanome humain MNTI, a été étudié. Ces cellules ont la particularité d'être hasalcmcnt très pigmentées et constituent un modèle de choix pour étudier l'effet de composés dépigmentants. [0069] La viabilité cellulaire de la lignée MNT1 a d'abord été testée en réponse au traitement par des doses croissantes de BCH, et cc pendant 72 heures (figure 6). [0070] Les cellules apparaissent résistantes au BCH, avec une légère diminution de la viabilité à partir de 20mM, comme observée précédemment avec les cellules rnurincs B16F10. Les doses de 5mM et 10mM ont donc été utilisées pour la suite des expérimentations. [0071] La mélanine produite par les cellules MNT1 en réponse au BCH administré à 5 ou 10mM pendant 4 ou 7 jours de traitement continu (figure 7) a été analysée. Ces deux concentrations permettent de diminuer la production de mélanine, de manière dose-dépendante et temps-dépendante. Il est envisageable qu'un traitement plus long ait un effet encore plus fort sur le blocage de la mélanogenèse. [0072] Exemple 7 [0073] L'effet du BCH a ensuite été testé sur des épidermes pigmentés humains reconstruits de phototype VT. Pour cela, deux groupes d'épidermes ont été utilisés. Dans le premier groupe, les épidermes ont reçu quotidiennement le BCH à 5 ou 10mM pendant 7 jours. Dans le second groupe, les mélanocytes ont d'abord été prétraités pendant 5 jours par le BCH à 5 ou 10mM avant reconstruction du tissu, et les épidermes ainsi reconstruits ont ensuite été traités quotidiennement par le BCH à 5 ou 10mM pendant 7 jours (soit un total de 12 jours de traitement). Une analyse histologique de ces tissus permet d'apprécier une diminution de la mélanine par un marquage Fontana Masson, faisant apparaitre les grains de mélanine en marron, dans les deux groupes d'épidermes. Cette diminution a également été observée par quantification du niveau de mélanine dans les tissus à la fin des deux périodes de traitement (figure 8). [0074] Exemple 8 [0075] Dans le groupe où les mélanocytes ont été prétraités par le BCH pendant 5 jours, nous avons pu observer dès le premier jour de traitement des épidermes reconstruits une diminution de la pigmentation avec le BCH, que la dose soit de 5 ou 10mM. Ce résultat reste visible après 7 jours de traitement des épidermes par le BCH à 5 ou 10mM, la différence de pigmentation étant encore plus marquée à ce temps précis par rapport au contrôle. Dans l'autre groupe, la diminution de la pigmentation est apparue au fil des jours, et semble être très similaire pour les deux doses de BCH administrées. [0076] L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisations précédemment décrits et s'étend à tous les modes de réalisation couverts par les revendications. 9 REVENDICATIONS[Revendication 1] Inhibiteur du transporteur membranairc LAT-1 / SLC7A5 pour son uti- lisation dans la régulation de la pigmentation cutanée. [Revendication 2] Inhibiteur pour son utilisation selon la revendication précédente de formule 2-amino-2-norbornanecarboxylic acid (BCH). [Revendication 3] Inhibiteur pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la régulation de la pigmentation cutanée comprend une dépigmentation de la peau. [Revendication 4] Inhibiteur pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la régulation de la pigmentation cutanée comprend un blanchiment de la peau. [Revendication 5] Composition pour son utilisation pour la régulation de la pigmentation cutanée comprenant une quantité efficace d'un inhibiteur du transporteur LAT-1 / SLC7A5 ou d'un sel cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable de celui-là. [Revendication 6] Composition pour son utilisation selon la revendication précédente dans laquelle l'inhibiteur du transporteur SLC7A5 est 2-amino-2-norbornanecarboxylic acid (BCH). [Revendication 7] Composition pour son utilisation selon rune quelconque des deux reven- dications précédentes adaptée à une application topique. [Revendication 8] Composition selon l'une quelconque des trois revendications pré- cédentes dans laquelle la régulation de la pigmentation cutanée comprend le blanchiment de la peau et/ou la dépigmentation de la peau.