FR 3099177 A1 20210129 FR 1908335 A 20190723 Description Titre de l'invention : PRODUIT ENZYMATIQUE POUR LA FABRICATION DE VIN ROSÉ [0001] La présente invention s'inscrit dans le domaine de la fabrication du vin, et notamment de vin rosé. [0002] Plus particulièrement, la présente invention concerne un produit enzymatique, du type complexe enzymatique ayant une activité pectinase, convenant à une mise en oeuvre dans un procédé de fabrication du vin, ainsi qu'une solution enzymatique liquide obtenue par dilution ou dissolution d'un tel produit enzymatique dans un milieu liquide. L'invention concerne également un procédé de fabrication de vin rosé mettant en oeuvre un tel produit enzymatique, de même que l'utilisation d'un tel produit enzymatique ou d'une telle solution enzymatique liquide pour la fabrication de vin rosé. [0003] Les procédés de vinification mettent en oeuvre plusieurs types d'enzymes, destinées notamment à augmenter l'extraction des pigments et des substances aromatiques des moûts de raisin, à faciliter le pressurage et à améliorer le rendement de la vinification. Parmi ces enzymes, les pectinases sont couramment utilisées, lors de la fabrication du vin, pour améliorer les étapes de macération, de clarification et de filtration mises en oeuvre. [0004] Lc terme pectinases est un terme générique désignant un complexe enzymatique comprenant différentes activités enzymatiques, parmi lesquelles, notamment, les activités de pectine-lyase, pectine-méthylestérase et polygalacturonase. Ces activités enzymatiques concourent pour catalyser la dégradation des pectines contenues dans le moût de raisin, ce qui libère des molécules de taille plus petite, favorisant ainsi les conditions d'extraction et de clarification du moût. Les pectinases sont typiquement produites par fermentation de microorganismes, plus spécifiquement de souches d' Aspergillus et généralement d'Aspergillus niger, sur des substrats d'origine agricole. [0005] La consommation de vin rosé est en augmentation croissante depuis quelques années. Selon la tendance actuelle, la préférence des consommateurs à cet égard va vers des vins rosés très légèrement colorés, de couleur rose pâle. Il est donc un enjeu, pour les fournisseurs d'outils d'aide à la vinification, et notamment les fournisseurs d'enzymes oenologiques, de proposer des produits facilitant l'obtention de vins rosés dont la couleur est très pâle, qui n'affectent pas les autres propriétés du vin. [0006] La présente invention vise à proposer un tel outil, permettant d'élaborer des vins rosés de couleur rose très pâle, sans pour autant impacter négativement les performances des procédés de vinification usuels. [0007] Confronté à ce problème, le présent inventeur s'est plus particulièrement intéressé 2 aux pectinases. Il a découvert que, de manière tout à fait surprenante, une modification particulière des proportions relatives des différentes activités enzymatiques au sein des pectinases, par rapport aux proportions relatives classiques, qui sont approximativement les mêmes pour toutes les pectinases trouvées dans le commerce, permet de diminuer fortement l'extraction des anthocyanines lors de l'étape de macération du moût de raisin, menant ainsi à une diminution de la coloration du vin produit, sans pour autant modifier les performances de réduction de la viscosité du jus, si bien que la facilité de clarification et le rendement de l'étape de macération ne sont pas impactés, par rapport aux procédés de vinification mettant en oeuvre des pectinases traditionnelles. [0008] Ainsi, il est proposé selon la présente invention un produit enzymatique, de type complexe pectinase, convenant à, c'est-à-dire adapté à, une mise en oeuvre dans un procédé de fabrication du vin. On entend dans la présente description, par le terme pectinases, et par l'expression complexe pectinases, de manière classique en elle-même, un complexe d'activités enzymatiques provoquant la dégradation des pectines. [0009] Le produit enzymatique selon l'invention contient un mélange d'activités enzy- matiques comprenant une activité de pectinelyasc, une activité de pectine-méthylestérase et une activité de polygalacturonase. Il est tel que le rapport de l'activité de pectinelyasc, exprimée en unités par gramme du produit enzymatique, sur l'activité de polygalacturonasc, exprimée en unités par gramme du produit enzymatique, est compris entre 120 et 3000, et le rapport de l'activité de pectine-méthylestérase, exprimée en unités par gramme du produit enzymatique, sur l'activité de polygalacturonase, exprimée en unités par gramme du produit enzymatique, est compris entre 15 et 500. [0010] Ainsi, si PL représente l'activité de pectine-lyase, exprimée en unités par gramme du produit enzymatique, PME représente l'activité de pectine-méthylestérase, exprimée en unités par gramme du produit enzymatique, et PG représente l'activité de polygalacturonase, exprimée en unités par gramme du produit enzymatique : - le rapport PL/PG est compris entre 120 et 3000. Il est de préférence compris entre 180 et 3000, et notamment compris entre 180 et 2500 ; - et le rapport PME/PG est compris entre 15 et 500. Il est de préférence compris entre 25 et 500, et notamment compris entre 25 et 400. [0011] Les différentes activités enzymatiques sont définies comme suit : - 1 unité d'activité de pectine-lyase est définie comme la quantité d'enzyme qui, en présence d'une solution aqueuse de pectine de fruit de Citrus présentant un degré d'estérification de plus 74 %, à une concentration de 0,25 % en poids par rapport au volume de la solution, à 30 °C et pH 5,8, provoque en 1 minute une augmentation de 0.01 de l'absorbance de ladite solution à 235 nm, 3 - 1 unité d'activité de pectine-méthylcstérase est définie comme la quantité d'enzyme qui hydrolyse 1 Ftéquivalent de groupements carboxyméthyle de pectine par minute à 40 °C et pH 4,0, en présence d'une solution aqueuse de pectine de pomme présentant un degré de méthylation de plus 69 %, à une concentration de 1,0 % en poids par rapport au volume de la solution, - et 1 unité d'activité de polygalacturonate est définie comme la quantité d'enzyme en grammes, multipliée par 100, qui, en 30 minutes, diminue de 60 % la viscosité d'l litre d'une solution aqueuse de polygalacturonate de sodium à une concentration de 2,0 % en poids par rapport au volume de la solution, à 30 'G et pH 4,4. [0012] Les méthodes de détermination des unités d'activité enzymatiques définies ci-dessus peuvent être mises en oeuvre par des techniques classiques en elles-mêmes pour l'homme du métier. A cet effet, chaque enzyme présentant une activité enzymatique visée, ou chaque mélange d'enzymes contenant une telle enzyme, est incorporé dans la solution aqueuse contenant le substrat (pectine de fruit de Citrus, pectine de pomme ou polygalacturonate de sodium). [0013] En particulier, les unités d'activité de pectine-Iyase peuvent être déterminées à partir d'une solution aqueuse de pectine de fruit de Citrus présentant un degré d'estérification de plus 74 %, par exemple telle que la pectine de fruit de Citrus estérifiée commercialisée par la société Sigma. La réaction peut être rnonitorée en mesurant au cours du temps, par spectrophotométrie, par exemple pendant une période de 17 minutes, l'évolution de l'absorbance à 235 nm, liée à la formation dans le milieu réactionnel de double-liaisons résultant de l'activité de lyase vis-à-vis du substrat, la pente de la courbe représentant l'absorbance à 235 nm en fonction du temps étant de préférence comprise entre 0,0266 et 0,0800. Un protocole de test pouvant être mis en oeuvre pour déterminer les unités d'activité de pectine-lyase contenues dans un produit enzymatique, conformément à l'invention, est décrit dans le Codex OEnologique International, bien connu de l'homme du métier, dans la Monographie OIV COEI1-ACTPLY: 2012, ce protocole devant être légèrement adapté pour répondre à la définition indiquée ci-dessus. [0014] Les unités d'activité de pectine-méthylestérase peuvent être déterminées à partir d'une solution aqueuse de pectine de pomme présentant un degré de méthylation de plus 69 %, par exemple telle que commercialisée par la société Naturex. Un protocole de test pouvant être mis en oeuvre pour déterminer les unités d'activité de pectineméthylestérase contenues dans un produit enzymatique, conformément à l'invention, est décrit dans le Codex OEnologique International, dans la Monographie OIV COEI1-ACTPME: 2012, ce protocole devant être légèrement adapté pour répondre à la définition indiquée ci-dessus. [0015] Pour la détermination des unités d'activité de polygalacturonase contenues dans un produit enzymatique, conformément à l'invention, toute technique classique en elle-même de mesure de la viscosité cinématique peut être utilisée, en particulier par un viscosimètre à tube capillaire, notamment un viscosimètre d'Oswald, la viscosité étant de préférence mesurée à une température de 30 °C. [0016] Un protocole expérimental détaillé de détermination des unités d'activité en- zymatique est décrit ci-après dans la présente description pour chacune de ces activités enzymatiques visées par l'invention. [0017] Par rapport aux pectinases classiques proposées dans le commerce, telles par exemple que les pectinascs commercialisées sous les dénominations Trenolin® Xtract, Trenolin® Pcxx ou Trenolin® Frio DF par la déposante, les proportions relatives des différentes activités enzymatiques du produit enzymatique selon l'invention diffèrent de manière importante. Les quantités des différentes activités enzymatiques dans les pectinases traditionnelles, telles que trouvées dans le commerce, sont en effet d'environ 500 à 1500 U/g pour l'activité de pectine méthylestérase, 5000 à 10000 U/g pour l'activité de pectine-Iyase et 150 à 500 U/g pour l'activité de polygalacturonase, ces activités étant mesurées comme indiqué ci-dessus. Ces quantités correspondent à un rapport PL/PG inférieur à 70, bien moindre que celui préconisé par la présente invention, et à un rapport PME/PG inférieur ou égal à 10, là encore bien moindre que celui préconisé par la présente invention. [0018] Le produit enzymatique selon l'invention contient de préférence une activité de pectine-lyase bien supérieure, une activité de pectine-méthylestérase bien supérieure, et une activité de polygalacturonase bien moindre, que les pectinases classiques décrites dans l'art antérieur et proposées dans le commerce. [0019] Préférentiellement, il présente l'une ou plusieurs, de préférence l'ensemble, des ca- ractéristiques suivantes - le mélange d'activités enzymatiques comprend 1500 à 5000 unités d'activité de pectine-méthylestérase par gramme du produit enzymatique ; - et/ou le mélange d'activités enzymatiques comprend 12000 à 30000 unités d'activité de pectine-lyase par gramme du produit enzymatique ; - et/ou le mélange d'activités enzymatiques comprend 10 à 100 unités d'activité de polygalacturonase par gramme du produit enzymatique. [0020] Lors du processus de vinification pour la fabrication de vin rosé, le produit en- zymatique selon l'invention présente une activité de macération très basse, et il provoque l'extraction, depuis le raisin, d'une quantité d'anthocyanines qui est très faible, si bien que le vin rosé finalement obtenu comporte une faible quantité d'anthocyanines et présente une coloration très pâle, bien plus que lorsque les pectinases classiques du commerce sont mises en oeuvre pour la vinification. En particulier, par rapport à ces pectinases classiques, le produit enzymatique selon l'invention provoque, notamment, moins d'oxydation des polyphénols contenus dans le moût de raisin, moins d'extraction des composés phénoliques des pellicules, pépins et rafles du raisin, si bien que le vin formé est moins astringent, et une augmentation moindre du pH liée à l'extraction de potassium des parties solides des raisins. [0021] Le rendement en jus de la macération et la facilité de clarification sont en outre aussi élevés que lors de la mise en oeuvre des pectinascs classiques, notamment du fait d'une réduction similaire de la viscosité du milieu lors de la vinification. [0022] Le mélange d'activités enzymatiques du produit enzymatique selon l'invention comprend de préférence 1500 à 5000 unités, et préférentiellement 2000 à 4000 unités, d'activité dc pectine-méthylcstérase par gramme dudit produit enzymatique. [0023] TI comprend en outre de préférence 12000 à 30000 unités, de préférence 12000 à 25000 unités, et préférentiellement 15000 à 25000 unités, d'activité de pectinc-Iyase par gramme dudit produit enzymatique. [0024] Le mélange d'activités enzymatiques du produit enzymatique selon l'invention comprend en outre de préférence 10 à 100 unités, et préférentiellement 10 à 80 unités, d'activité dc polygalacturonase par gramme dudit produit enzymatique. [0025] De telles quantités de ces activités enzymatiques assurent avantageusement des per- formances importantes du produit enzymatique selon l'invention lors du procédé de vinification, notamment en termes de réduction de la viscosité, rendement et pâleur de la couleur du vin obtenu. [0026] L'activité de polygalacturonase du produit enzymatique selon l'invention peut être fournie par une ou plusieurs endo-polygalacturonases, par une ou plusieurs exopolygalacturonases, ou par un mélange de telles enzymes. [0027] Préférentiellement, l'activité de polygalacturonase du produit enzymatique selon l'invention est fournie par au moins une endo-polygalacturonase. Les endopolygalacturonases présentent notamment l'avantage de favoriser de manière importante le processus de clarification lors de la vinification. [0028] Dans le produit enzymatique selon l'invention, au moins une, de préférence au moins deux, et préférentiellement l'ensemble, des activités enzymatiques de pectine-lyase, pectine-méthylestérase et polygalacturonase, sont fournies, respectivement, par une ou des enzymes provenant de souche(s) d'Aspergillus, en particulier d'Aspergillus piger. Une ou plusieurs de ces activités enzymatiques peuvent autrement être fournies, au moins en partie, par une ou des enzymes provenant d'autres microorganismes, tout en assurant bien sûr que ces enzymes soient compatibles avec une utilisation dans le domaine oenologique. De telles enzymes peuvent par exemple provenir de souches du genre Trichoderma, ou encore Penicillium. [0029] La souche du microorganisme, notamment la souche d'Aspergillus, en particulier d'Aspergillus piger, peut être la même pour deux des activités enzymatiques, ou pour 6 les trois activités enzymatiques. Alternativement, les différentes activités enzymatiques peuvent être fournies par des enzymes provenant de souches différentes. Chaque activité enzymatique peut en outre être fournie par une ou plusieurs enzymes, ces enzymes pouvant également provenir de la même souche, ou de souches différentes. [0030] Des enzymes à activité respectivement de pectine-lyase (Enzyme Commission EC n° 4.2.2.10), pectine-méthylestérase (EC 3.1.1.11) et polygalacturonase (EC 3.2.1.15), issues de souches d'Aspergillus figer, sont notamment disponibles dans le commerce, seules ou en mélange. [0031] Le produit enzymatique selon l'invention peut se présenter sous forme solide, notamment sous forme de poudre ou de micro-granulés, en particulier séchés par pulvérisation. Le mélange d'activité enzymatiques peut y être mélangé à tout additif classique en lui-même, par exemple à de la maltodextrine. [0032] Préférentiellement, le produit enzymatique selon l'invention se présente sous forme liquide, le mélange d'activités enzymatiques étant en solution dans un milieu liquide, notamment un milieu aqueux. [0033] Ce milieu peut contenir tout additif classique en lui-même dans le domaine des pré- parations enzymatiques destinées à être utilisées pour la vinification, par exemple : du glycérol, notamment en quantité comprise entre 30 et 50 % en poids par rapport au volume total du milieu additionné du glycérol ; un ou des agents conservateurs ; etc. [0034] Le produit enzymatique selon l'invention peut être obtenu de différentes manières. [0035] Par exemple, il peut être obtenu par mélange de quantités adéquates d'enzymes présentant les activités enzymatiques visées. A cet effet, des préparations contenant une ou plusieurs des activités enzymatiques souhaitées peuvent être analysées de sorte à déterminer leur teneur en chacune des activités enzymatiques, notamment au moyen des protocoles évoqués ci-avant et décrits ci-après de manière détaillée. Les différentes préparations sont ensuite mélangées en quantités adéquates pour former un produit enzymatique selon l'invention. [0036] Les préparations contenant une ou plusieurs des activités enzymatiques selon l'invention peuvent être obtenues dans le commerce. Autrement, elles peuvent être obtenues par des techniques de séparation, à partir de pectinases extraites de microorganismes, notamment de souche d'Aspergillus, en particulier d'Aspergillus figer. Toute technique de séparation de protéines à partir de mélanges protéiques classique en elle-même peut être mise en oeuvre à cet effet, par exemple la chromatographie d'exclusion stérique. En particulier, les enzymes présentant les activités enzymatiques selon l'invention peuvent être isolées d'un complexe pectinase par chromatographie d'exclusion stérique, puis mélangées en quantités respectives adéquates pour former un produit enzymatique conforme à l'invention, dans lequel les rapports PL/PG et PME/ PG sont dans les plages souhaitées. 7 [0037] Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de fabrication de vin, en par- ticulier de vin rosé. Cc procédé comprend une étape de macération de raisin en présence d'un produit enzymatique selon l'invention, répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant. [0038] Cette étape de macération en présence d'un produit enzymatique selon l'invention est préférentiellement réalisée avant l'étape de fermentation alcoolique, entre l'encuvage et le début de fermentation alcoolique, ou avant le pressurage. [0039] Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, le produit enzymatique est utilisé à une dose comprise entre 1 et 8 ml, de préférence entre 2 et 5 ml, pour 100 kg de raisins. Une telle dose est notamment particulièrement adaptée aux configurations du produit enzymatique selon l'invention dans lequel le produit enzymatique contient 1500 à 5000 unités/g d'activité de pectine-méthylestérase, 12000 à 30000 unités/g, d'activité de pectine-Iyase et 10 à 100 unités/g d'activité de polygalacturonase. [0040] L'étape de macération en présence du produit enzymatique selon l'invention est de préférence réalisée pendant une durée la plus courte possible dans l'objectif de rendement visé. Ainsi, dans le processus de vinification, le produit enzymatique selon l'invention est ajouté au raisin le plus tôt possible, dès la mise en cuve ou dès la mise dans le pressoir. L'étape de macération en présence du produit enzymatique selon l'invention est de préférence réalisée pendant une durée comprise entre 1 heure et 4 ou 5 jours. [0041] La température à laquelle est réalisée l'étape de macération des raisins en présence du produit enzymatique selon l'invention est classique en elle-même. Cette étape est de préférence réalisée à une température comprise entre 5 et 30 °C, préférentiellement entre 10 et 25 °C. Elle peut notamment être réalisée à une température comprise entre 15 et 25 °C. [0042] Il entre dans les compétences de l'homme du métier, spécialiste de la vinification, de déterminer à partir de quels cépages le procédé selon l'invention, dont toutes les autres étapes sont par ailleurs classiques, peut être mis en oeuvre pour obtenir un vin rosé. Des exemples de tels cépages sont décrits ci-après, sans pour autant limiter l'invention. [0043] Le produit enzymatique selon l'invention est de préférence ajouté au raisin après sa dissolution ou sa dilution, selon qu'il se trouve initialement sous forme solide ou sous forme liquide, dans un milieu liquide, de préférence un milieu aqueux, par exemple dans de l'eau ou du jus de raisin. Le procédé de fabrication de vin selon l'invention comprend ainsi de préférence une étape préalable de dilution ou dissolution du produit enzymatique selon l'invention dans un milieu liquide, de préférence un milieu aqueux, avant la mise en présence dudit produit enzymatique avec le raisin. Une telle étape assure avantageusement une meilleure uniformité de distribution du produit en- 8 zymatiquc selon l'invention dans tout le volume de raisins. [0044] Ccttc dissolution ou dilution est par cxcmplc réalisée au laérne., c'est-à-dire à raison de 1 kg (ou 1 litre) de produit cnzymatiquc dans 10 litres de milieu liquide, par cxcmplc dans 10 litres d'eau. [0045] Un autre aspect de l'invention concerne ainsi une solution cnzymatiquc liquide sus- ceptible d'être obtenue par dissolution ou dilution d'un produit cnzymatiquc selon l'invention dans un milieu liquide, de préférence dans un milieu aqueux. Ce milieu peut notamment être de l'eau ou du jus dc raisin. [0046] Ccttc dissolution ou dilution peut par cxcmplc avoir été réalisée au laérne, c'est-à-dire à raison de 1 kg (ou 1 litre) de produit cnzymatiquc dans 10 litres de milieu liquide, par exemple dans 10 litres d'eau. [0047] Dans dcs modes de réalisation particuliers de r invention, cette solution cnzymatiquc liquide comprend, par gramme de solution enzymatique : 1200 à 3000 unités d'activité de pectinc-Iyase, 1 à 10 unités d'activité dc polygalacturonase et 150 à 500 unités d'activité dc pectine-méthylestérase, lesdites activités enzymatiques étant définies comme indiqué ci-dessus en référence au produit enzymatique selon l'invention. [0048] Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un produit en- zymatique selon l'invention, répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, ou d'une solution enzymatique selon l'invention, pour la fabrication de vin, en particulier de vin rosé. [0049] Cette utilisation peut répondre à l'une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci- avant en référence au procédé de fabrication de vin selon l'invention. [0050] Le produit enzymatique selon l'invention est notamment utilisé pour faciliter les étapes de clarification et de pressurage mises classiquement en oeuvre lors de la fabrication du vin, tout en extrayant très peu d'anthocyanines du raisin. [0051] Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en oeuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec l'appui de la figure 1 suivante : [0052] [fig.1] La figure 1 montre des photographies de moûts de raisin obtenus à partir d'un cépage de Cabernet Sauvignon, lors d'un procédé de vinification, à l'issue d'une étape de macération mettant en oeuvre un produit enzymatique selon l'invention (« Inv ») ou une préparation enzymatique de pectinase de l'art antérieur (« Cont »). [0053] 1/ Exemple 1 - Préparation d'un produit enzymatique selon l'invention [0054] Un produit enzymatique selon l'invention est préparé à partir des préparations enzy- matiques suivantes, disponibles dans le commerce : - Rapidase® FP Super (solution de pectine méthylestérase dans le glycérol) - Rohapect® 10 L (solution aqueuse de pectine méthylestérase et pectine lyase) - Peclyve0 VP (granulés de polygalacturonase, pectine méthylestérase et pectine 9 lyase). [0055] Chacune de ces préparations enzymatiques est analysée pour en déterminer les activités enzymatiques conformément à l'invention. [0056] A cet effet, pour chaque activité enzymatique, il est appliqué le protocole respectif suivant. [0057] Mesure de l'activité de pectine-méthylestérase [0058] La détermination des unités d'activité de pectine-méthylestérase est réalisée par un test dérivé du test décrit dans le Codex OEnologique International, Monographie COEI1-ACTPME: 2012. Elle repose sur la libération de méthanol à partir de groupements carboxyméthyle d'acide polygalacturonique, par clivage de liaisons méthylester dans la chaîne polymérique de la pectine. La quantité de groupes acide carboxylique libres résultants peut être déterminée par titrage avec une solution d'hydroxyde de sodium, le volume de solution titrage requis, en fonction du temps de titrage, permettant de conclure à une activité enzymatique spécifique. [0059] Une solution de substrat est préparée à base de pectine de pomme hautement es- térifiée (« Pectin, highly csterified apple- and lemon pcctin », Brown Ribbon pure, 100580, Naturex) en tant que substrat : 800 ml d'eau déionisée sont chauffés à 40 nC, et 10 g du substrat y sont dissous lentement en remuant avec un agitateur à pales. Le mélange est agité pendant 30 min, pour former une solution lisse et sans grumeaux, qui est ensuite filtrée sur un filtre en verre. Le pH est ajusté à 3,8, et le volume de la solution complété à 1000 ml. [0060] La solution d'enzyme est préparée par dilution de 1001_d de la préparation en- zymatique à évaluer (ici Rapidase0 FP Super) dans 100 ml. [0061] L'appareil de titrage (titreur Dosimat 685, Metrohm) est rempli et préparé avec une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) à 0,01 M dans l'eau déionisée, qui a été préparée extemporanément. Avant la première mesure, le système de trous est rincé deux fois avec une solution fraîchement préparée de NaOH à 0,01 M. 100 ml de la solution de substrat sont placés dans un bécher de 250 ml et la température est réglée à l'aide d'une plaque chauffante et d'un barreau à agitation, à exactement 40 °C. Lorsque la température requise est atteinte, 0,5 ml de la solution d'enzyme sont ajoutés et le pH de la solution résultante est réglé manuellement à une valeur de 4,0, pendant une période de 240 s, avec une solution de NaOH à 0,01 M. Immédiatement après, le titrage est débuté, et réalisé pendant 10 min avec une valeur de consigne de pH 4,0. La consommation de solution de NaOH à 0,01 M est mesurée. [0062] L'évaluation de l'activité de pectine-méthylestérase doit nécessiter une consommation de NaOH à 0,01 M comprise entre 2 ml et 4,5 ml en 10 min. Au-delà de ces limites, la valeur mesurée doit être rejetée, la concentration de la solution d'enzyme ajustée et la mesure répétée en conséquence. La détermination des unités d'activité dc pectine-méthylestérase est calculée à l'aide dc l'équation 1 suivante : [0063] [Math .1] [0064] dans laquelle : n représente la consommation de solution de NaOH à 0,01 M (en jtmoles) ; t représente le temps (en minutes) - 10 min dans cette expérience ; v représente la quantité de solution d'enzyme introduite (en ml) - 0,5 ml dans cette expérience ; et c représente la concentration de la solution d'enzyme - 100 pl dans 100 ml dans cette expérience. [0065] Mesure de l'activité de pectine-lyase [0066] La détermination des unités d'activité de pectine-lyase est réalisée par un test dérivé du test décrit dans le Codex OEnologique International, Monographie COEI1-ACTPLY: 2012. [0067] L'activité enzymatique de pectine-lyase provoque la décomposition des pectines hautement méthylées par l'élimination p d'acides galacturoniques méthylés, conduisant à la formation d'acide delta4,5-uronique. Ce faisant, un système de doubles liaisons conjuguées hautement délocalisées est créé, absorbant dans l'ultraviolet, par activité de pectine trans-éliminase. L'absorbante à 235 nm est mesurée après un certain temps de réaction et la pente de la courbe représentant l' absorbante à 235 nm en fonction du temps constitue la base de la définition des unités d'activité de pectine-lyase. [0068] Une solution du substrat (pectine de fruit de Citrus de degré d'estérification supérieur à 74 %, Sigma) est préparée dans un tampon de McIlvaine : une solution A (35,9 g d'hydrogénophosphate de disodium dihydraté (Merck) dilués dans 1000 ml d'eau distillée) et une solution B (21,0 g d'acide citrique, Merck, dilués dans 1000 ml d'eau distillée) sont mélangées dans un rapport volumique de 3:2, et le pH est ajusté à 5,8 soit avec la solution A, soit avec la solution B. 80 ml de ce tampon sont chauffés à environ 80 °C. 250 mg du substrat y sont dissous lentement. La solution est agitée jusqu'à ce qu'elle devienne lisse et sans grumeaux, puis elle est refroidie à environ 25 °C et le pH ajusté à 5,8 avec la solution A ou B. Le volume est complété à 100 En spectrophotométrie l'absorbante standard de la solution de substrat est de approximativement 1,5. 100691 La solution d'enzyme est préparée par dissolution de 0,02 g de la préparation en- zymatique à évaluer (ici Rohapect® 10 L) dans 50 ml de tampon de Mcllvaine. 100701 Une solution d'enzyme désactivée est préparée par chauffage de cette solution d'enzyme à 100 °C pendant au moins 30 min. 100711 La détermination de l'activité de pectine-méthylestéra se utilise un photomètre, dans 11 lequel la température est fixée à 30 °C. Pour la correction du bruit de fond, 0,1 ml de solution d'enzyme inactivée sont mélangés avec 3 ml de solution de substrat pour former une solution blanc. [0072] 3 ml de la solution blanc et 3 ml de solution de substrat sont préalablement portés à 30 °C dans le spectrophotomètre. 0,1 ml de la solution d'enzyme sont ajoutés, et la mesure cinétique de l'adsorbante à 235 nm est démarrée et enregistrée pendant une période de temps de 17 min. Le décalage d'absorbante dû aux influences de la matrice est éliminé par correction du bruit de fond avec la solution blanc. [0073] La pente de la courbe représentant l'ahsorhancc à 235 nm en fonction du temps est calculée par l'équation 2 suivante : [0074] [Math.2] mpL4.- temps "Ps 100751 dans laquelle : AbsA représente l'absorbante à 235 nm au temps A (tempsA) et AbsB représente l'absorbante à 235nm au temps B (tempsB). 100761 Pour éviter les effets de bord, la détermination de la pente de la courbe est réalisée dans le domaine temporel de 2 à 17 min, avec une différence minimale de 5 min entre le temps A et le temps B. Pour une meilleure précision du résultat, la pente de la courbe représentant l'absorbante à 235 nm en fonction du temps doit être comprise entre 0,0266 et 0,0800. 100771 Les unités d'activité de pectine-lyase sont déterminées par l'équation 3 suivante : 100781 IMath.31 Acte,t AAbs A ,\1000\V temps [0079] dans laquelle : AAbs/Atemps représente la pente de la courbe représentant l'absorbance à 235 nm en fonction du temps ; m représente le poids de la préparation enzymatique à évaluer dans la solution d'enzyme (en g) - 0,02 g dans cette expérience ; et V représente le volume dans lequel la préparation enzymatique à évaluer a été diluée pour former la solution d'enzymes - 50 ml dans cette expérience. [0080] Mesure de l'activité de polygalacturonase [0081] La détermination des unités d'activité de polygalacturonase repose sur l'hydrolyse aléatoire des liaisons alpha-1,4 glycosidiques dans les chaînes d'acide polygalacturonique, une partie typique de la pectine de plante. La dégradation des chaînes d'acide polygalacturonique en solution entraîne une réduction caractéristique de la viscosité de la solution de pectine. Le taux de réduction de la viscosité est mesuré et utilisé pour la détermination l'activité de polygalacturonase. L'acide polygalac- 12 turoniquc est entièrement déméthylé par saponification avant le test. [0082] Une solution de substrat (pectine de zestes d'agrumes, acide galacturonique estérifié à plus de 74%, Sigma-Aldrich) à 2,2 % en poids, par rapport au volume de la solution, est préparée comme suit : un l'échu de 1 L est rempli d'environ 240 ml d'eau distillée et chauffé à 35 °C. Sous agitation constante, 11 g de substrat sont ajoutés lentement et dissous en au moins 20 min pour obtenir une solution lisse et sans grumeaux. Pour la saponification de l'acide polygalacturonique méthyle, 100 ml d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,5 M sont ajoutés lentement sur une période de temps de 5 min avec un temps de réaction de 60 min. Le pH de la solution est ensuite ajusté à une valeur de 4,4 avec une solution d'acide citrique à 10 % p/v, et la solution est filtrée sur filtre de verre et son volume est ajusté à 500 ml avec du tampon citrate 0,1 M de pH 4,4. [0083] La solution d'enzyme est préparée par dissolution de 100 mg de la préparation en- zymatique à évaluer (ici Peclyve0 VP) dans 100 ml de tampon citrate 0,1 M de pH 4,4. [0084] La viscosité de la solution est mesurée à plusieurs reprises au cours du temps, au moyen d'un viscosimètre d'Ostwald. La viscosité de l'eau (BW) est déterminée en mesurant la viscosité de l'eau distillée à 30 °C. Pour la correction du bruit de fond, après incubation pendant 5 min de 30 ml de substrat à 30 °C, 3 ml de tampon citrate sont ajoutés et le mélange est transféré dans le viscosimètre d'Ostwald. La mesure de la viscosité de cette solution dite blanc (BSV) commence après 30 min Pour une meilleure qualité, la viscosité cinématique mesurée doit être comprise dans une plage allant de 3,8 à 5,2. 30 ml de la solution de substrat sont incubés pendant 5 min à 30 °C, puis la réaction enzymatique est démarrée par addition de 3 ml de la solution d'enzyme. Après 30 min, la mesure de la valeur de la viscosité de la solution de substrat (ESV) est réalisée. La viscosité relative est déterminée par l'équation 4 suivante : [0085] [Math.4] PrïscosyÉTultr EST- B BSY - B la 100861 Pour une meilleure fiabilité du résultat, la valeur obtenue doit être comprise entre 0,37 et 0,43. Comme démontré expérimentalement, l'activité de polygalacturonase est inhibée lorsque la concentration en enzyme augmente. Pour compenser cette erreur, une constante d'activité relative (K) est de préférence utilisée, dont la valeur est corrélée à celle de la viscosité relative, conformément aux indications données dans le tableau 1 ci-dessous. 100871 13 [Tableaux 1] Viscosité relative 0,37 0,38 0,39 0,40 0,41 0,42 0,43 Constante K 1195 1190 1150 1100 1070 1035 995 [0088] L'activité de polygalacturonase est définie par l'équation 5 suivante : [0089] [Math.5] Act/ =tê unités/ cE [0090] dans laquelle cE représente la concentration de préparation d'enzymes dans la solution d'enzyme - 100 mg dans 100 ml dans cette expérience. [0091] A partir des résultats ainsi obtenus, les différents produits commerciaux ci-dessus (Rapidase® FP Super, Rohapect® 10 L et Peclyve® VP) sont mélangés en quantités adéquates pour former un produit enzymatique selon l'invention contenant, dans l'eau additionnée de 30 à 50 % p/v de glycérol : 30 à 70 U/g d'activité de polygalacturonase (PG), 2000 à 3000 U/g d'activité de pectine méthylestérase (PME) et 18000 à 23000 U/g d'activité de pectine lyase (PL). [0092] 2/ Exemple 2 - Utilisation d'un produit enzymatique selon l'invention pour la fa- brication de vin rosé [0093] Le produit enzymatique selon l'invention obtenu à l'exemple 1 (« Inv ») est utilisé dans des procédés de vinification à partir de différents cépages, pour la fabrication de vins rosés. [0094] Dans tous les exemples ci-après, les différentes étapes des procédés de vinification sont classiques en elles-mêmes, et. bien connues de l'homme du métier, si bien qu'elles ne seront pas décrites de manière détaillée, seule l'étant l'étape de macération mettant en oeuvre le produit. enzymatique selon l'invention. [0095] 2.1/ Çabernet Sauvignon [0096] Un procédé de vinification est mis en oeuvre à partir de raisins du cépage Cabernet Sauvignon. [0097] A titre d'exemple comparatif (contrôle), il est également mis en oeuvre, sur ces mêmes cépages, une préparation liquide de pectinase de l'art antérieur, commercialisée sous la dénomination Trenolin® Xtract (« Cont »). Cette préparation enzymatique contient, dans un milieu aqueux : 230 U/g d'activité d'endo-polygalacturonasc (PG), 1100 U/g d'activité de pectine méthylestérase (PME) et 10000 U/g d'activité de pectine lyase (PL) (ces unités d'activité enzymatique étant mesurées conformément à l'invention, selon les protocoles détaillés décrits ci-avant dans l'Exemple 1). [0098] Ce procédé de vinification comprend une étape de macération du raisin en présence d'une préparation de pectinase (produit enzymatique selon l'invention ou contrôle) 14 avant le pressurage, dans une cuve de capacité 320 hl. [0099] Les doses de produit enzymatique mises en oeuvre sont de 2,5 ml/100 kg de raisins pour le contrôle, et 4 ml/100 kg de raisin pour le produit enzymatique selon l'invention. Chacune de ces préparations est diluée au 10,°,e dans l'eau avant d'être mélangée aux raisins. [0100] L'étape de macération des raisins en présence de l'une ou l'autre des préparations en- zymatiques est réalisée à 15 °C, pendant 2 h, avant que le cycle de pressurage ne débute. [0101] A l'issue de l'étape de macération, on obtient des moûts présentant des caracté- ristiques similaires, notamment en termes de taux de sucres, degré Brix, acidité totale, pH, teneur en acide malique, teneur en azote assimilable (YAN), teneur en dioxyde de soufre libre (SO2 L) et teneur en dioxyde de soufre total (S0, T), comme montré dans le tableau 2 ci-dessous. La valeur pour chacun de ces paramètres est déterminée selon le protocole associé décrit dans le Codex OEnologique International. [0102] [Tableaux2] Moût Teneur Degré Brix Acidité pH Teneur Teneur Teneur Teneur en (°Bx) totale en acide en YAN en SO2 en SO2 sucres (g/14 malique (mg/L) T L (g/L) (g/L) (mg/L) (mg/L) Inv 174 10,5 4,15 3,36 4,8 152 4 17 Cont 173 10,3 3,97 3,38 4,4 153 22 57 [0103] Visuellement, la coloration du moût obtenu à l'issue de l'étape de macération mettant en oeuvre le produit enzymatique selon l'invention apparait bien plus claire que pour le moût obtenu en utilisant la préparation enzymatique contrôle, comme on peut le voir sur la figure 1, qui montre des photographies de flacons contenant ces moûts. [0104] La densité optique (DO) de chacun de ces moûts est en outre mesurée par spectro- photométrie, aux longueurs d'ondes suivantes : 280 nm, 320 nm, 420 nm, 520 nm et 620 nm. A partir des valeurs mesurées, on détermine pour chaque moût l'intensité de coloration (somme des densités optiques à 420, 520 et 620 nm) et la teinte (rapport de la densité optique à 420 nm sur la densité optique à 520 nm). Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 3 ci-dessous. [0105] [Tableaux3] Moût DO DO DO DO DO Intensité Teinte 280 nm 320 nm 420 nm 520 nm 620 nm I nv 0,765 0,464 0,182 0,116 0,026 0,324 1,57 Cont 0,894 0,572 0,193 0,257 0,035 0,485 0,75 [0106] Ces résultats démontrent que le produit enzymatique selon l'invention entraine une forte réduction de la coloration du moût, par rapport à la préparation enzymatique contrôle. [0107] 2.2/ Tempranillo [0108] Un procédé de vinification est mis en oeuvre à partir de raisins du cépage Tem- pranillo. [0109] Les conditions opératoires sont les mêmes qu'indiqué au point 2.1/ ci-dessus. [0110] Le contrôle est une préparation enzymatique disponible dans le commerce. Les quantités des différentes activités enzymatiques dans cette préparation sont comprises : entre 500 et 1400 U/g pour l'activité de pectine méthylestérase, entre 5000 et 10000 U/g pour l'activité de pectine-Iyase et entre 150 et 500 U/g pour l'activité de polygalacturonasc. [0111] A l'issue de l'étape de macération, on obtient des moûts présentant des caracté- ristiques similaires, notamment en termes de taux d'alcool, acidité totale (AT), pH, teneur en sucres résiduels, acidité volatile (AV) comme montré dans le tableau 4 ci-dessous. Là encore, la valeur pour chacun de ces paramètres est déterminée selon le protocole associé décrit dans le Codex CEnologique International. [0112] [Tableaux4] Moût Taux d'alcool Acidité Totale pH Sucres résiduels Acidité (%v/v) (g/i) (g/1) volatile (g/1) Inv 12,5 6,65 3,25 2,2 0,27 Cont 12,3 6,78 3,3 2 0,34 [0113] La densité optique (DO) de chacun des moûts obtenus est mesurée par spectropho- tométrie, aux longueurs d'ondes suivantes : 420 nm, 520 nm et 620 nm. A partir des valeurs mesurées, on détermine pour chaque moût l'intensité de coloration (somme des densités optiques à 420, 520 et 620 nm) et la teinte (rapport de la densité optique à 420 nm sur la densité optique à 520 nm). Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 5 ci-dessous. [0114] [Tableaux5] Moût DO 420 nm DO 520 nm DO 620 nm Intensité Teinte Inv 0,08 0,085 0,066 0,231 0,941 Cont 0,11 0,096 0,08 0,286 1,146 pl 15] Là encore, ces résultats démontrent que le produit enzymatique selon l'invention entraine une forte réduction de la coloration du moût, par rapport à la préparation enzymatique contrôle. 16 [0116] 2.3/ Garnacha [0117] Un procédé de vinification est mis en oeuvre à partir de raisins du cépage Garnacha. [0118] Les conditions opératoires sont les mêmes qu'indiqué au point 2.1/ ci-dessus. [0119] Le contrôle est la préparation enzymatique commercialisée sous la dénomination Trenolin® Pcxx. Les quantités des différentes activités enzymatiques dans cette préparation sont comprises : entre 500 et 1400 U/g pour l'activité de pectine méthylesteras°, entre 5000 et 10000 U/g pour l'activité de pectine-lyase et entre 150 et 500 U/g pour l'activité de polygalacturonasc. [0120] A l'issue de l'étape de macération, on obtient des moûts présentant des caracté- ristiques similaires, notamment en termes de taux d'alcool, acidité totale (AT), pH, teneur en sucres résiduels, acidité volatile (AV) comme montré dans le tableau 6 ci-dessous. La valeur pour chacun de ces paramètres est déterminée selon le protocole associé décrit dans le Codex OEnologique International. [0121] [Tableaux6] Moût Taux d'alcool (%v/v) Acidité Totale (g/1) pH Sucres résiduels (g/1) Acidité Volatile (g/1) Inv 12,8 6,33 3,3 3,2 0,33 Cont 12,9 6,4 3,32 3 0,34 [0122] La densité optique (DO) de chacun des moûts obtenus est mesurée par spectropho- tométrie, aux longueurs d'ondes suivantes : 420 nm, 520 nm et 620 nm. A partir des valeurs mesurées, on détermine pour chaque moût l'intensité de coloration (somme des densités optiques à 420, 520 et 620 nm) et la teinte (rapport de la densité optique à 420 nm sur la densité optique à 520 nm). Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 7 ci-dessous. [0123] [Tableaux7] Moût DO 420 nm DO 520 nm DO 620 nm Intensité Teinte Inv 0,04 0,038 0,026 0,104 1,053 Cont 0,06 0,056 0,045 0,161 1,071 pl 24] Pour ce cépage, ces résultats démontrent également que le produit enzymatique selon l'invention cntraine une forte réduction de la coloration du moût, par rapport à la préparation enzymatique contrôle. 17 [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3] REVENDICATIONSProduit enzymatique, adapté à une mise en oeuvre dans un procédé dc fabrication dc vin, contenant un mélange d'activités enzymatiques comprenant une activité dc pectine-lyase, une activité de pectine méthylestérase et une activité de polygalacturonase, caractérisé en ce que le rapport dc l'activité de pectine-lyase, exprimée en unités par gramme dudit produit enzymatique, sur l'activité de polygalacturonase, exprimée en unités par gramme dudit produit enzymatique, est compris entre 120 et 3000, et en cc que le rapport de l'activité de pectine-méthylestérase, exprimée en unités par gramme dudit produit enzymatique, sur l'activité de polygalacturonase, exprimée en unités par gramme dudit produit enzymatique, est compris entre 15 et 500, lesdites activités enzymatiques étant définies comme suit : - 1 unité d'activité de pectine-lyase est définie comme la quantité d'enzyme qui, en présence d'une solution aqueuse de pectine de fruit de Citrus présentant un degré d'estérification de plus 74 %, à une concentration de 0,25 % en poids par rapport au volume de la solution, à 30 °C et pH 5,8, provoque en 1 minute une augmentation de 0,01 de l'absorbance de ladite solution à 235 nm, - 1 unité d'activité de pectine-méthylestérase est définie comme la quantité d'enzyme qui hydrolyse 1 n'équivalent de groupements carboxyméthyle de pectine par minute à 40 °C et pH 4,0 en présence d'une solution aqueuse de pectine de pomme présentant un degré de méthylation de plus 69 %, à une concentration de 1,0 % en poids par rapport au volume de la solution, - et 1 unité d'activité de polygalacturonase est définie comme la quantité d'enzyme en grammes, multipliée par 100, qui, en 30 minutes, diminue de 60 % la viscosité d'l litre d'une solution aqueuse de polygalacturonate de sodium à une concentration de 2,0 % en poids par rapport au volume de la solution, à 30 °C et pH 4,4. Produit enzymatique selon la revendication 1, dans lequel le mélange d'activités enzymatiques comprend 1500 à 5000 unités d'activité de pectine-méthylestérase par gramme dudit. produit enzymatique, de préférence 2000 à 4000 unités d'activité de pectine-méthylestérase par gramme dudit produit enzymatique. Produit enzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel le mélange d'activités enzymatiques comprend 12000 à 18 [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6] [Revendication 7] [Revendication 8] [Revendication 9] [Revendication 10] [Revendication 11] [Revendication 12] [Revendication 13] 30000 unités d'activité de pectine-lyase par gramme dudit produit enzymatique, de préférence 12000 à 25000 unités d'activité de pectinelyasc par gramme dudit produit enzymatique. Produit enzymatique selon rune quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le mélange d'activités enzymatiques comprend 10 à 100 unités d'activité de polygalacturonase par gramme dudit produit enzymatique. Produit enzymatique selon rune quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'activité de polygalacturonasc est fournie par au moins une cndo-polygalacturonase. Produit enzymatique selon rune quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel lesdites activités enzymatiques sont fournies par des enzymes provenant de souche(s) d'Aspergillus, cn particulier d' Aspergillus niger. Produit enzymatique selon rune quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel ledit mélange d'activités enzymatiques est en solution dans un milieu aqueux. Procédé de fabrication de vin rosé, caractérisé cn ce qu'il comprend unc étape de macération de raisin en présence d'un produit enzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. Procédé selon la revendication 8, selon lequel ledit produit enzymatique est utilisé à une dose comprise entre 1 et 8 ml pour 100 kg de raisins. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 9, comprenant une étape préalable de dilution ou dissolution dudit produit enzymatique dans un milieu liquide, de préférence un milieu aqueux, avant la mise en présence dudit produit enzymatique avec le raisin. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, selon lequel ladite étape de macération en présence dudit produit enzymatique est réalisée pendant une durée comprise entre 1 heure et 5 jours. Solution enzymatique liquide susceptible d'être obtenue par dilution ou dissolution d'un produit enzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans un milieu liquide, de préférence dans un milieu aqueux. Utilisation d'un produit enzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une solution enzymatique selon la revendication 12 pour la fabrication de vin rosé.