FR 3096146 A1 20201120 FR 1905159 A 20190516 Description Titre de l'invention : DISPOSITIF DE CREATION D'UN CHAMP EVANESCENT A MOTIFS SUR UNE SURFACE ET PROCEDE ASSOCIE [0001] La photobiologie est un domaine de recherche en rapide croissance, alimenté par le développement de plusieurs générations de protéines photoréceptrices qui peuvent être activées ou désactivées, changer leur état d'oligomérisation, se lier à/se dissocier de partenaires cellulaires spécifiques ou encore être dénaturées localement en réponse à une stimulation lumineuse. Ces outils polyvalents peuvent être exprimés en fusion avec presque n'importe quelle protéine cellulaire, permettant ainsi des études fonctionnelles détaillées d'acteurs moléculaires individuels par l'intermédiaire de leur activation/inactivation spatio-temporelle et d'une photo-manipulation à l'intérieur de cellules vivantes ou même d'organismes entiers à l'aide de faisceaux de lumière de longueurs d'onde spécifiques. [0002] Actuellement, dans les cellules cultivées, l'activation locale est obtenue par formation de motifs de lumière avec des scanners galvanométriques de microscopie, des modulateurs de lumière spatiaux (SLM, acronyme de l'anglais Spatial Light Modulator) ou autres dispositifs à micro-miroirs numériques (DMD, acronyme de l'anglais Digital Micro-mirror Device). Un faisceau de lumière confiné, orthogonal à la surface du substrat, est alors dirigé vers une région cellulaire souhaitée. Cependant, un tel faisceau traverse la totalité de l'épaisseur de la cellule et peut éventuellement activer des récepteurs à la fois sur les membranes plasmiques supérieure et inférieure ainsi que sur les structures cytoplasmiques ou nucléaires présentes entre celles-ci. De plus, la diffusion rapide de protéines photoréceptrices cytosoliques, comme Cry2, étale le signal généré à l'intérieur du volume focal vers le cytosol avoisinant, réduisant ainsi la résolution spatio-temporelle à quelques micromètres et quelques secondes. Un grand volume d'excitation conduit également à une photo-instabilité, une photo-toxicité et un effet thermique importants, ainsi qu'à d'autres effets indésirables, de la lumière sur les cellules vivantes. [0003] Dans la recherche sur la signalisation cellulaire et la mécanotransduction, les photo- récepteurs spécifiques doivent être activés uniquement au niveau de la membrane plasmique basale (par exemple, des composants de structures adhésives, le récepteur de l'EGF, des canaux ioniques...). Dans ce cas, la technique bien établie de microscopie par fluorescence à réflexion interne totale (TIRE, acronyme de l'anglais Total Internai Rellection Fluorescence) peut être utilisée pour introduire la lumière de photo-activation sous la forme d'un champ évanescent au voisinage de la membrane basale. 2 Cette même technique permet également l'observation de la distribution de fluorophores avec un rapport signal sur bruit très élevé, allant jusqu'à la détection d'une seule molécule. De manière surprenante, malgré le nombre toujours croissant de publications traitant de manière séparée la microscopie TIRE ou des applications optogénétiques, une seule publication récente combine les deux techniques: « Optogenctic interrogation of integrin ciV(33 function in endothelial cens» (Interrogation optogénétique de la fonction intégrine aV(33 dans des cellules endothéliales), Liao, Z., Kasirer-Friede, A. & Shattil, S. J.. J. Cell Sci. 130,3532-3541 (2017). [0004] Ceci illustre le manque de flexibilité spatiale des équipements de microscopie TIRE actuels. En effet, tout en réduisant efficacement l'excitation lumineuse dans la direction axiale à proximité de la membrane plasmique, les microscopes TIRF actuels excitent l'ensemble du champ de vision et manquent d'outils de contrôle de lumière latérale pour créer des régions d'intérêt (ROI) avec une excitation TIRF. [0005] Les études concernant la transduction de signal intracellulaire et la structuration spatio-temporelle nécessitent cependant une activation localisée dans des régions de dimensions subcellulaires. L'objet de la présente invention est de décrire un procédé de création de motifs de champ évanescents qui combine à la fois les avantages des techniques TIRF et optogénétiques et permet la création de régions d'intérêt de photo-activation TIRE sur la membrane plasmique, réduisant ainsi l'excitation lumineuse dans les trois dimensions. [0006] L'excitation de fluorescence par lumière évanescente est largement utilisée en mi- croscopie TIRF afin de visualiser spécifiquement la membrane basale étiquetée par des fluorophores ou les structures cytosquelettiques proches dans une cellule vivante, dans des techniques de microscopie à super-résolution comme la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM, acronyme de l'anglais STochastic Optical Reconstruction Microscopy) ou la microscopie par localisation photoactivée (PALM, acronyme de l'anglais Photo-Activated Localization Microscopy) ou pour échantillonner des solutions fluorescentes et des films minces proches du substrat de verre. [0007] Le principe de la microscopie TIRF est basé sur un faisceau collimaté de la lumière d'excitation qui se réfléchit totalement sur l'interface verre/eau à un angle d'incidence supérieur à l'angle critique 0, à peu près égal à 61°. [0008] Dans le cas de structures à indice de réfraction plus important présentes sur le verre, telles que des cellules adhérentes, 0,peut être supérieur de quelques degrés. Dans la plupart des installations optiques TIRF « à travers l'objectif » les plus populaires, les objectifs à grande ouverture numérique permettent d'obtenir des angles d'incidence de presque 80°, bien au-delà de la valeur critique. [0009] La profondeur de pénétration caractéristique de l'onde évanescente résultante dans un milieu aqueux ou des cellules est alors d'environ 100 nm, tandis que la résolution 3 latérale, déterminée par l'ouverture numérique (NA) de l'objectif est proche de 250 nm. Ainsi, le plus petit volume d'échantillonnage peut être inférieur à 10 attolitres (1 attolitre représentant 101, litres), tandis que le volume d'excitation total de l'onde évanescente est bien plus grand (supérieur à 10 femtolitres, 1 fcmtolitre représentant 10-15 litres), en raison du fait que le champ de vision total est excité immédiatement. [0010] Afin de créer le champ évanescent, la lumière d'excitation est focalisée dans le plan focal arrière (BFP, acronyme de l'anglais Back Focal Plane) de l'objectif (également appelé plan de pupille), à proximité de sa périphérie. Le cône de lumière en ce point a une très faible ouverture numérique (par exemple inférieure à 0,04 dans un microscope iMIC, produit par la société FEI Munich GmbH) et la position radiale du point focal peut être ajustée avec un scanner galvanométrique ou un prisme. Ceci conduit à une excitation d'onde évanescente du champ de vision complet par le faisceau parallèle hautement incliné, bien que parfois affecté par un profil de faisceau laser mufti modal ou des franges d'interférence. Un éclairage plus uniforme peut être obtenu par focalisation BFP multipoints (TILL, produit par la société FEI Munich GmbH) ou des configurations azimutales de faisceau rotatif (matériel de la société Roper Scientific, actuellement société GATACA). De nombreux microscopes TTRF commerciaux modernes produisent un champ évanescent homogène de plus de 100 p.m de diamètre qui couvre la totalité de la surface de cellules adhérentes typiques. Il doit être noté, cependant, que certains éléments optiques des microscopes, notamment ceux dans les plans de champ conjugués, ont été identifiés comme sources de lumière non-évanescente, se propageant, qui conduit à une excitation partielle en champ lointain. Afin de limiter cet effet, la technique d'imagerie par fluorescence à angle supercritique (SAF, acronyme de l'anglais Supercritical Angle Fluorescence) a été développée, laquelle est basée sur un filtrage spatial de la lumière émise au niveau du BFP ou un niveau équivalent du BFP. Ainsi, tout élément obstruant la lumière dans le plan de champ conjugué dans le trajet de lumière d'excitation est en fait considéré comme néfaste pour la qualité d'image et est évité. [0011] Très peu d'exemples de création de motif latéral de lumière évanescente ont été rapportés. La demande de brevet américain US2017276922A1 décrit une technique de microscopie à éclairage structure (TIRF-SIM, de la société Nikkon) tire parti du fait qu'une paire de faisceaux lasers TIRF se coupant et mutuellement cohérents peuvent produire un motif de franges d'interférence à bandes très étroitement espacées dans l'intensité évanescente. Ces bandes périodiques, cependant, s'étendant sur l'intégralité du champ de vision et sont utiles pour calculer l'image de microscopie à résolution améliorée de facteur 2 plutôt que pour réaliser une photo-activation localisée. Une autre méthode théorique a été proposée pour créer un point d'éclairage très petit (super-résolution) d'onde évanescente, en étendant l'idée d'interférence laser à une infinité de faisceaux ou un éclairage en anneau au niveau du BFP de l'objectif (« Evancscent excitation and omission in fluorescence microscopy » (Excitation et émission évanescentes en microscopie à fluorescence), Axelrod, D., Biophys. J. 104, 1401-9 (2013)). Malheureusement, le point central résultant pourrait conduire à être entouré par les franges d'interférence circulaires, bien qu'avec des amplitudes décroissantes, et la condition de polarisation nécessaire de l'anneau de lumière dans le BFP n'est pas encore compatible avec les sources de lumière TIRF existantes. [0012] La présente invention vise à surmonter les inconvénients de l'état de la technique et a donc pour objet un dispositif de création d'un champ évanescent à motifs sur la surface d'un dioptre séparant deux milieux d'indices de réfraction respectifs n, et n,, caractérisé par le fait qu'il comprend : un objectif, dans un plan focal image duquel est disposée la surface du dioptre, un élément d'injection de lumière émettant un faisceau de lumière collimaté de diamètre donné, un montage optique entre l'élément d'injection de lumière et l'objectif par lequel le plan objet de l'objectif est conjugué optiquemcnt avec le plan image de l'élément d'injection de lumière, le montage optique étant configure pour qu'un faisceau de lumière collimaté provenant de l'élément d'injection de lumière soit émis vers l'objectif pour être renvoyé vers la surface du dioptre avec un angle d'incidence minimal 0,';,, supérieur ou égal à l'angle critique 0, du dioptre afin que le faisceau de lumière subisse sur la surface du dioptre une réflexion totale interne pour générer une onde évanescente en surface du dioptre, un dispositif optique de formation de motifs dans le plan objet de l'élément d'injection de lumière, de telle sorte que le motif formé par le dispositif optique de formation de motifs en lumière transmise sur le faisceau de lumière dans le plan objet de l'élément d'injection de lumière se retrouve en surface du dioptre. [0013] L'angle critique pour le dioptre est défini par Oc= sM '(ni/n2). [0014] Il est ainsi possible avec l'invention de former une onde évanescente avec une grande liberté de formation de motifs, ce qui n'était pas possible avec l'état de la technique, puisque le motif est formé en amont et peut être défini de manière très précise. [0015] Selon un mode de réalisation, le dispositif comprend en outre au moins un élément optique entre le plan objet de l'élément d'injection de lumière et le montage optique permettant de régler l'un parmi l'amélioration de la résolution du motif formé et le filtrage de l'angle d'incidence du faisceau de lumière sur le dioptre. [0016] On améliore ainsi le motif que l'on souhaite former sur la surface du dioptre par l'onde évanescente. L'invention n'est pas limitée par le nombre d'éléments optiques qui peuvent être ajoutés entre l'élément d'injection de lumière et le montage optique. Ainsi, on pourra avoir par exemple un élément pour l'amélioration de la résolution du motif formé et un élément pour le filtrage de l'angle d'incidence du faisceau de lumière. [0017] Selon un mode de réalisation, l'au moins un élément optique est l'un parmi un diaphragme spatial, un filtre. [0018] Selon un mode de réalisation, le dispositif optique de formation de motifs est au moins l'un parmi un diaphragme, un masque d'amplitude, un modulateur spatial de lumière, une matrice de micro-miroirs. Le masque d'amplitude peut notamment être une fente, un trou ou tout autre motif de dimensions supérieures à la longueur d'onde de la lumière utilisée. [0019] Selon un mode de réalisation, le dispositif de l'invention comprend en outre une source de lumière laser pour générer le faisceau de lumière collimaté à injecter dans l'élément d'injection de lumière. Ainsi, selon l'invention, la lumière collimatée est, de préférence mais pas obligatoirement, un faisceau de lumière cohérent, notamment laser. [0020] Selon un mode de réalisation, le montage optique est constitué par une première lentille intermédiaire dont le plan objet est conjugué optiquement avec le plan image de l'élément d'injection de lumière et dont le plan image est conjugué optiquement avec le plan objet de l'objectif [0021] De préférence, la première lentille intermédiaire peut être conjuguée optiquement avec l'élément d'injection de lumière par une deuxième lentille intermédiaire dont le plan objet correspond au plan image de l'élément d'injection de lumière et dont le plan image correspond au plan objet de la première lentille intermédiaire [0022] Le dispositif selon l'invention peut notamment être un microscope de fluorescence par réflexion totale interne, l'échantillon correspondant au dioptre et étant placé dans le plan image de l'objectif du microscope, le montage optique correspondant à l'optique du microscope, l'élément d'injection de lumière étant placé en amont de l'optique du microscope ou étant intégré à l'optique du microscope, le dispositif optique de formation de motifs étant disposé entre une source de lumière et l'élément d'injection de lumière ou étant intégré dans l'optique du microscope. [0023] La présente invention a également pour objet un procédé de création d'un champ évanescent à motifs sur une surface à l'aide d'un dispositif tel que défini précédemment, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à : disposer la surface sur le plan image de l'objectif ; former le motif d'amplitude en lumière transmise souhaité dans le plan objet de l'élément d'injection de lumière à l'aide du dispositif de formation de 6 motifs ; injecter un faisceau de lumière collimaté dans l'élément d'injection de lumière. [0024] Selon un mode de réalisation, le champ évanescent de surface est créé sur un échantillon biologique afin d'exciter sélectivement par photoactivation, selon le champ évanescent créé, des régions spécifiques de surface de l'échantillon biologique. [0025] La présente invention peut notamment trouver application en biologie, par exemple pour activer de manière sélective avec un motif choisi des protéines placées sur la surface du dioptre, mais peut également trouver application dans la photolithographie en couches minces ou d'autres méthodes de photochimie de surface utilisant les ondes évanescentes, la microscopie et la photostimulation régiospécifique de nanoparticulcs, la création de nano-films et de nano-objets entre des phases liquides formant le dioptre, la gravure de codes à barres, grilles ou autres motifs micrométriques sur des surfaces photosensibles, des évolutions régiospécifiques des technologies de résonance de plasmon de surface, le développement d'une activation régiospécifique dans les capteurs à ondes évanescentes, la régionalisation de la production d'ondes évanescentes, le confinement et la manipulation de la lumière par des cristaux photoniques, l'intégration de motifs photoniques sur puces de silicium, le développement de matériaux composites artificiels pour réaliser de nouvelles fonctions optiques, l'optoélectronique, et plus généralement toute application pour laquelle il est nécessaire de former des ondes évanescentes sur une surface avec des motifs prédéterminés. [0026] Pour mieux illustrer l'objet de la présente invention, on va en décrire ci-après, à titre illustratif et non limitatif, des modes de réalisation particuliers en référence aux dessins annexés. [0027] Sur ces dessins : [0028] [fig.1] est un schéma d'un dispositif selon un premier mode de réalisation de la présente invention ; [0029] [fig.2] est un schéma d'un dispositif selon une première variante d'un deuxième mode de réalisation de la présente invention ; et [0030] [fig.3] est un schéma d'un dispositif selon une deuxième variante du deuxième mode de réalisation de la présente invention . [0031] Si l'on se réfère à la Figure 1, on peut voir que l'on y a représenté un dispositif 1 de création d'un champ évanescent à motifs sur une surface S. [0032] La surface S est un dioptre séparant deux milieux d'indices de réfraction différents n1 et n2. [0033] Dans le mode de réalisation non limitatif représenté, on a placé un échantillon E sur la surface S, l'échantillon E étant ici une cellule dont on souhaite activer des protéines 7 de surface par formation d'une onde évanescente sur la surface S. [0034] Dans ce premier mode de réalisation du dispositif 1 selon l'invention, un élément d'injection de lumière 2, constitué par une source de lumière 3 générant un faisceau de lumière collimaté, de préférence cohérent, et une lentille Ll de distance focale fl, crée un faisceau de lumière collimaté B vers un montage optique 4, constitué par un doublet de lentilles L2 et L3, de distances focales respectives f2 et f3, le plan image de la lentille L2 correspondant au plan objet de la lentille L3. Le plan focal image de l'élément d'injection de lumière 2 correspond au plan focal objet de la lentille L2. [0035] Ce faisceau de lumière B est dirigé en sortie du montage optique 4 vers un objectif O de distance focale f0, le plan focal objet de l'objectif O correspondant au plan focal image de la lentille L3. [0036] La surface S est placée dans le plan focal image de l'objectif 0. [0037] En outre, le montage optique 4 et l'objectif O sont configurés pour que le faisceau de lumière B émis du montage optique 4 vers l'objectif O soit incident sur la surface S avec un angle supérieur à l'angle critique 00= sin '(m/n2) du dioptre constitué par la surface S afin d'avoir une réflexion interne totale et de générer dans l'échantillon E une onde évanescente. Le faisceau de lumière B réfléchi par la surface S est renvoyé vers l'objectif O pour être focalisé dans le plan focal arrière BFP de l'objectif 0. [0038] Un élément de formation de motif FS1 est placé dans le plan focal objet de la lentille Ll et permet de former, à partir de la lumière provenant de la source 3, un faisceau de lumière collimaté B avec un motif formé dans celui-ci qui, par l'intermédiaire du montage optique 4 et de l'objectif, sera formé sur la surface S afin de générer sur celle- ci une onde évanescente avec motif. L'élément de formation de motif FS1 peut notamment être un diaphragme de champ, mais pourrait aussi être, sans s'écarter de la portée de la présente invention, un diaphragme, un masque d'amplitude, un modulateur spatial de lumière, une matrice de micro-miroirs. [0039] Le diaphragme d'ouverture AS dans le plan focal image de la lentille Ll sert à filtrer la lumière réfléchie par les bords du diaphragme de champ FS1, afin d'assurer que la lumière arrive sur la surface S à un angle supérieur ou égal à l'angle critique 0' pour ne pas produire d'excitation en champ lointain. Même si la netteté des bords de motif dans le plan de l'échantillon E diminue avec la diminution de l'ouverture du diaphragme d'ouverture AS, il a été constaté expérimentalement qu'il était possible de former des motifs pour des régions de dimensions supérieures à la longueur d'onde du faisceau de lumière, notamment des régions de dimensions 5 à 10 fois supérieures à la longueur d'onde du faisceau de lumière B (des régions de taille 3-5 mn avec l'excitation à 515 nm). [0040] Dans ce premier mode de réalisation, le montage optique et l'objectif peuvent par exemple être intégrés à un microscope existant. L'invention permet alors, à partir d'un 8 microscope existant, de former un motif sur la surface S, sans avoir à toucher à l'optique du microscope, à partir uniquement de l'extérieur du microscope. Ce mode de réalisation permet d'éviter toute occlusion du chemin optique et par conséquent de conserver l'ouverture, la sensibilité et la résolution du microscope. On évite ainsi toute réduction dans le canal de détection. [0041] Si l'on se réfère à la Figure 2, on peut voir que l'on a représenté un dispositif 10 selon une première variante d'un deuxième mode de réalisation de l'invention. [0042] Dans cette première variante, la source de lumière 13 émet vers le miroir M un faisceau de lumière collimaté, le miroir M réfléchissant le faisceau vers un diaphragme de champ FS. L'élément d'injection de lumière est dans cette variante constitué par le miroir M. Il est à noter que la lumière pourrait aussi être collimatée à la sortie d'une fibre optique directement dans le statif du microscope, ou encore introduite et collimatée grâce à tout autre moyen optique adapté. [0043] Par l'intermédiaire d'une lentille L', de distance focale f', constituant le montage optique 14, le faisceau lumineux B issu du diaphragme de champ FS est envoyé vers l'objectif O, toujours pour arriver sur la surface S avec un angle d'incidence 0 supérieur à l'angle critique 0, pour générer une réflexion totale interne sur la surface S et une onde évanescente dans celle-ci, le faisceau réfléchi par la surface S vers l'objectif O étant focalisé sur le plan focal arrière BFP de l'objectif O. Comme pour le premier mode de réalisation, le diaphragme d'ouverture AS permet de filtrer la lumière réfléchie par les bords du diaphragme FS afin de ne laisser passer que les rayons ayant un angle d'incidence supérieur à l'angle critique 0,. Ce montage pourrait par exemple être intégré directement dans de nouveaux types de microscopes. [0044] La Figure 3 est une variante de la Figure 2 d'un dispositif 20 selon une deuxième variante du deuxième mode de réalisation, et les éléments portant la même référence ne seront pas décrits plus en détail. La différence réside dans le moyen de former un motif en amont du montage optique 24, le motif étant formé ici par une réflexion de la lumière collimatée issue de la source de lumière 23 sur un micro-miroir numérique DMD, ledit micro-miroir numérique DMD réfléchissant la lumière vers un dispositif de formation de motif BS réfléchissant uniquement une partie de la lumière reçue avec un motif vers le micro-miroir numérique DMD, qui l'injecte dans la lentille L' de manière identique à ce qui a été décrit en référence à la Figure 2. [0045] L'invention peut donc être mise en oeuvre avec un microscope existant, par exemple dans le cas du premier mode de réalisation, ou être intégré à un microscope, comme dans le cas du deuxième mode de réalisation. [0046] L'invention peut être appliquée à la photolithographie, la photochimie de surface, la microscopie et la photostimulation régiospécifique de nanoparticules, la création de nano-films et de nano-objets entre des phases liquides formant le dioptre, la gravure de 9 codes à barres, grilles ou autres motifs micrométriques sur des surfaces photosensibles, des évolutions régiospécifiques des technologies de résonance de plasmon de surface, le développement d'une activation régiospécifique dans les capteurs à ondes évanescentes, la régionalisation de la production d'ondes évanescentes, le confinement et la manipulation de la lumière par des cristaux photoniques, l'intégration de motifs photoniques sur puces de silicium, le développement de matériaux composites artificiels pour réaliser de nouvelles fonctions optiques, l'optoélectronique. [0047] La présente invention trouve également une application particulièrement intéressante en biologie, par exemple pour l'adressage optogénétique de structures subcellulaires de périmembranes ou leur formation (par exemple, adhésion focale, podosomc, lamellipodc, vésicule d'endo ou d'exocytose, ancrage cytosquelettique), pour le contrôle local fin de la géométrie, de la polarité et du mouvement cellulaire, pour l'activation locale de récepteurs de membrane plasmique (EGFR, IGFR, ...) ou de facteurs de transcription (Stat3, 5, ...) sans modifier leur réserve nucléaire (essentiel pour des analyses par spectroscopie à corrélation de fluorescence (acronyme anglais FCS pour Fluorescence Correlation Spectroscopy) par exemple), pour la quantification de la vitesse de signalisation subcellulaire entre des structures membranaires séparées , pour la structuration de substrats cellulaires par des procédés de photolithographie avec une résolution latérale micrométrique et axiale nanométrique. [Revendication 1] REVENDICATIONS- Dispositif (1 ; 10 ; 20) de création d'un champ évanescent à motifs sur la surface (S) d'un dioptre séparant deux milieux d'indices de réfraction respectifs n1 et n2, caractérisé par le fait qu'il comprend : un objectif (0), dans un plan focal image duquel est disposée la surface (S) du dioptre, un élément (2 ; 12 ; 22) d'injection de lumière émettant un faisceau de lumière (B) collimaté de diamètre (d), un montage optique (4 ; 14 ; 24) entre l'élément (2 ; 12 ; 22) d'injection de lumière et l'objectif (0) par lequel le plan objet de l'objectif (0) est conjugué optiquement avec le plan image de l'élément (2 ; 12 ; 22) d'injection de lumière, le montage optique (4 ; 14 ; 24) étant configuré pour qu'un faisceau de lumière collimaté (B) provenant de l'élément (4 ; 14 ; 24) d'injection de lumière soit émis vers l'objectif (0) pour être renvoyé vers la surface (S) du dioptre avec un angle d'incidence minimal 0',ir, supérieur ou égal à l'angle critique du dioptre 0, afin que le faisceau de lumière (B) subisse sur la surface (S) du dioptre une réflexion totale interne pour générer une onde évanescente en surface (S) du dioptre, un dispositif optique (FS1 ; BS) de formation de motifs dans le plan objet de l'élément (2 ; 12 ; 22) d'injection de lumière, de telle sorte que le motif formé par le dispositif optique de formation de motifs en lumière transmise sur le faisceau de lumière dans le plan objet de l'élément (2 ; 12 ; 22) d'injection de lumière se retrouve en surface du dioptre. [Revendication 2] - Dispositif (1 ; 10 ; 20) selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre au moins un élément optique (AS) entre le plan objet de l'élément (2 ; 12 ; 22) d'injection de lumière et le montage optique permettant de régler l'un parmi l'amélioration de la résolution du motif formé et le filtrage de l'angle d'incidence du faisceau de lumière (B) sur le dioptre. [Revendication 3] - Dispositif (1 ; 10 ; 20) selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'au moins un élément optique est l'un parmi un diaphragme spatial, un filtre. 11 [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6] [Revendication 7] [Revendication 8] [Revendication 9] - Dispositif (1 ; 10 ; 20) selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le dispositif optique de formation de motifs est au moins l'un parmi un diaphragme, un masque d'amplitude, un modulateur spatial de lumière, une matrice de micro-miroirs. - Dispositif (1 ; 10 ; 20) selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre une source de lumière laser pour générer le faisceau de lumière collimaté à injecter dans l'élément d'injection de lumière. - Dispositif (1 ; 10 ; 20) selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le montage optique est constitué par une première lentille intermédiaire dont le plan objet est conjugué optiquement avec le plan image de l'élément d'injection de lumière et dont le plan image est conjugué optiqucment avec le plan objet de l'objectif (0). - Dispositif (1) selon la revendication 6, caractérisé par le fait que la première lentille intermédiaire est conjuguée optiquement avec l'élément d'injection de lumière par une deuxième lentille intermédiaire dont le plan objet correspond au plan image de l'élément d'injection de lumière et dont le plan image correspond au plan objet de la première lentille intermédiaire. - Dispositif (1 ; 10 ; 20) selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que le dispositif est un microscope de fluorescence par réflexion totale interne, l'échantillon correspondant au dioptre et étant placé dans le plan image de l'objectif du microscope, le montage optique correspondant à l'optique du microscope, l'élément d'injection de lumière étant placé en amont de l'optique du microscope ou étant intégré à l'optique du microscope, le dispositif optique de formation de motifs étant disposé entre une source de lumière et l'élément d'injection de lumière ou étant intégré dans l'optique du microscope. - Procédé de création d'un champ évanescent à motifs sur une surface à l'aide d'un dispositif (1 ; 10 ; 20) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à : disposer la surface (S) sur le plan image de l'objectif (0) ; former le motif d'amplitude en lumière transmise souhaité dans le plan objet de l'élément (2 ; 12 ; 22) d'injection de lumière à l'aide du dispositif de formation de motifs (FS1, BS) ; 12 injecter un faisceau dc lumière collimaté dans l'élément (2 ; 12 ; 22) d'injection de lumière. [Revendication 10] - Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait le champ évanescent dc surface est créé sur un échantillon biologique (E) afin d'exciter sélectivement par photoactivation, selon le champ évanescent créé, des régions spécifiques de surface de l'échantillon biologique (E).