FR 3098417 A1 20210115 FR 1907916 A 20190712 Description Titre de l'invention : DISPOSITIF AUTOMATIQUE D'EXTRACTION DE COMPOSANTS BIOLOGIQUES A PARTIR DE MULTIPLES ECHANTILLONS, EXECUTANT DEUX METHODES DISTINCTES DE SEPARATION, LA CENTRI- FUGATION ET LE CHAMPS MAGNETIQUE. [0001] La présente invention concerne un dispositif automatique qui exécute deux méthodes connues de séparation de composants biologiques, pour leurs extractions à partir de biopsies liquides et de produits alimentaires. Il s'agit d'extractions de plasma onde sérum sanguins, de lymphocytes, d'ADN génomique, d'ADN libre circulant, d'exosornes, de protéines et de micro ARN d'exosomes, de pesticides, successivement pour une pluralité d'échantillons à chaque extraction. Ce dispositif utilise à la fois pour les séparations de composants, au moins une centrifugeuse robotisée ainsi que des aimants ou électroaimants pour les techniques qui utilisent des micro particules paramagnétiques revêtues de marqueurs, ajoutées à l'échantillon. La centrifugeuse robotisée, dont le rotor muni de nacelles oscillantes peut recevoir une pluralité de tubes, pour séparer, s'agissant du sang, le plasma ou le sérum, les lymphocytes, l'ADN génomique, des autres constituants du sang, ainsi que des pesticides à partir d'échantillons de produits alimentaires et un agitateur-incubateur à température contrôlée entre 25 et 95 degrés Celsius, à une ou plusieurs rangées de tubes d'une contenance de plus de 5 millilitres. A chaque tube sur l'agitateur-incubateur est associé soit un aimant mobile qui peut être proche ou éloigné de quelques centimètres de la paroi du tube contenant le plasma ou un autre fluide en même temps que des micro-particules paramagnétiques, ou un ou plusieurs électroaimants fixes, proches de la paroi des tubes, sous tension dans les opérations de prélèvement ou de vidange de surnageants, ou hors tension dans les opérations d'incubation-agitation et de mélange-homogénéisation. L'agitateur-incubateur a de plus la capacité de vider simultanément le surnageant à évacuer de tous les tubes qu'il porte, après leur ouverture rangée par rangée, par renversement dans un réservoir poubelle. [0002] Un bras robotisé transporte les tubes à bouchon basculant fermés, à l'aide d'une ventouse, vers les positions de travail, les ouvre et les frime et comporte un nombre de buses qui prolongent des pompes et un ou plusieurs adaptateurs pour pointes de pipette qui prolongent une ou plusieurs seringues automatisées. [0003] Le dispositif automatique est complété par un automate programmable ou un or- dinateur et ses logiciels, un élément de pesage de précision électronique, une caméra 2 numérique, des portoirs de tubes, des portoirs de pointes de pipette, un dispositif d'éjection de pointes de pipette utilisées, des conteneurs de réactifs thermostatés en températures positives ou négatives, ou à température ambiante, un ou plusieurs collecteurs d'effluents. [0004] Cette invention met en oeuvre des constituants connus, mais qui sont intégrés dans un même dispositif, pour exécuter complètement plusieurs techniques connues, ou nouvelles d'extraction de composants à partir d'échantillons, avec des protocoles validés qui ne font pas partie de la présente invention. La polyvalence de cc dispositif est très importante et outre son utilisation en diagnostic moléculaire, il permet sans perte de traçabilité de l'échantillon, d'extraire son ADN génomique. Domaines d'applications : [0005] Le diagnostic précoce et le suivi de maladies et en particulier du cancer augmente grandement les chances de guérison du patient. Le cancer est cité à titre d'exemple, car les méthodes de diagnostic à partir de biopsies liquides peuvent s'appliquer à d'autres pathologies. Les méthodes traditionnelles consistent à diagnostiquer le mal lorsqu'il s'est déclaré. Dans le cas du cancer, une biopsie de la tumeur permet d'affiner le diagnostic, de formuler un pronostic quand à l'évolution de la maladie et de prescrire un traitement. Cette étape est actuellement jugée inévitable, mais au cours du traitement, d'autres analyses génétiques sont nécessaires, pour ajuster ou modifier le traitement. Une prise de sang d'une dizaine de millilitres est moins invasive qu'une biopsie. Une prise de sang est souvent possible, alors qu'une biopsie ne l'est pas toujours. L'analyse des ADN libres circulants, provenant des cellules cancéreuses dans le sang du patient, ou des exosomes et de leurs micro ARN, qui sont de microscopiques vésicules extracellulaires servant en particulier à la communication entre cellules, permet au cours du traitement de suivre l'évolution de la maladie et d'adapter le traitement. Ces analyses pourraient même permettre de détecter la maladie avant qu'elle ne se déclare, de la localiser et de définir un traitement précis, personnalisé. La recherche de marqueurs moléculaires pour diverses pathologies est très active [0006] La présente invention ne concerne pas les analyses, mais seulement les phases pré analytiques qui sont des étapes clé des analyses. Le traitement de l'échantillon, après le prélèvement, doit être effectué rapidement, le volume de plasma ou de fluide biologique et la technique d'extraction de l'ADN libre circulant ou des exosomes, qui sont des cibles de micro particules paramagnétiques revêtues de sondes moléculaires ou d'anticorps spécifiques et des micro ARN des exosomes sont des éléments de première importance, pour la précision des analyses et sont pris en compte par cette invention. [0007] Plusieurs méthodes d'analyse génétique des ADN libres circulants et des micro ARN des exosomes existent et sont utilisées en routine. La présente invention anticipe les 3 analyses avec l'extraction automatique à haut débit du plasma ou du sérum sanguin, des lymphocytes, des ADN génomiques contenus dans les lymphocytes, des ADN libres circulants et des micro ARN des exosomes, pour les analyses, par l'exécution de protocoles validés, sur plusieurs biopsies liquides simultanément. Les quantités d'ADN libre circulants et d'exosomes sont très faibles dans le sang et les ADN tumoraux, les ADN fétaux circulants, par exemple, n'en constituent pas la plus grande population. Il est donc nécessaire de partir d'un volume de sang entre 10 et 20 millilitres, pour assurer l'obtention de quantités suffisantes de plasma, pour effectuer les extractions puis les analyses. Pour d'autres biopsies liquides, salive, urine, liquide céphalo rachidien, les volumes peuvent être plus réduits. Les extractions consistent à isoler les ADN libres circulants et ou les exosomes et les micro ARN des exosomes à partir de biopsies liquides, à l'aide de micro particules paramagnétiques revêtues de marqueurs des cibles recherchées. Les micro particules paramagnétiques ont des rendements supérieurs aux membranes de silice également employées, c'est pourquoi elles sont exclusivement utilisées, dans cette invention. [0008] L'extraction automatique de pesticides contenus dans des produits alimentaires est également réalisée par ce dispositif, qui effectue des distributions de réactifs, l'homogénéisations des mélanges, des centrifugations et des prélèvements et transferts de surnageants. Dispositifs de l'art antérieur : [0009] Nous ne connaissons pas d'automate polyvalent qui effectue à la fois l'extraction du plasma ou du sérum sanguin, l'extraction de lymphocytes, d'ADN génomique, de pesticides d'échantillons de produits par centrifugation et l'extraction des ADN libres circulants, des exosomes et des micro ARN des exosomes, par les techniques de particules paramagnétiques. Il existe des kits d'extraction manuelle d'ADN libre circulant et de micro ARN d'exosomes, avec des micro particules paramagnétiques et des automates adaptés à ces techniques uniquement. Les trois plus connus sont QIAsymphony de la société Qiagen, Maxwell de la société Promega et Chemagie MSM I de la société Chemagen/Perkin-Elmer. Mode de fonctionnement du dispositif : [0010] Ce dispositif permet de traiter automatiquement des échantillons de sang, ou d'autres fluides biologiques. Il identifie l'échantillon préalablement enregistré, au moyen d'un code à barres unique porté par le tube initial et calcule son volume à partir d'une pesée de précision effectuée automatiquement sur le dispositif, ou par analyse de l'image du tube. [0011] S'agissant de sang, les tubes d'échantillons sont ensuite transportés au moyen d'une ventouse, par un robot manipulateur et chargés dans la centrifugeuse, pour séparer le plasma ou le sérum qui va surnager sur les autres constituants du sang après centrifugation. Le plasma est prélevé au moyen, d'une pipette à usage unique, reliée à une seringue automatisée et transféré dans un tube neuf Le volume de liquide prélevé est fonction du volume de sang de la biopsie, calculé initialement après pesage de l'échantillon de sang dans le dispositif II peut aussi être calculé par analyse de l'image du tube, obtenue par une caméra numérique intégrée au dispositif. L'interface entre le plasma et les autres constituants du sang est très facile à localiser par analyse de l'image du tube et le volume à prélever, par calcul. Le tube initial est conservé et peut permettre avec le dispositif automatique et d'autres protocoles d'isoler les lymphocytes et l'ADN génomique contenu dans les lymphocytes du même échantillon. [0012] Les tubes qui reçoivent le plasma peuvent être centrifugés à de plus grandes accé- lérations, par exemple à 4000g et éventuellement stockés à basse température, avant l'extraction des ADN libres circulants ou des exosomes et des micro ARN des exosomcs, avec le dispositif. À titre d'exemple, une extraction comporte 5 étapes, qui sont réalisées sur l'agitateur-incubateur qui reçoit une ou plusieurs rangées de tubes et qui est doté d'aimants mobiles ou d'électroaimants fixes : Une première étape de lyse, une deuxième étape d'accrochage des cibles sur les particules paramagnétiques ajoutées, la troisième étape est un ou plusieurs lavages la quatrième étape est l'élution, c'est à dire la séparation des cibles des microparticulcs paramagnétiques, en général par adjonction d'un tampon de quelques dizaines de microlitres à Ph adapté, avec la seringue automatisée, la cinquième étape consiste à prélever la phase contenant les molécules isolées, pour ce faire, les particules paramagnétiques sont alors collées sur la paroi du tube par le champs magnétique et une pipette transfère le surnageant dans un micro tube, pour l'analyse. Les capuchons des tubes à bouchon basculant sont ouverts au moyen d'un crochet actionné par un vérin à air comprimé et fermés par appui de la base de l'outil du robot. Les différents réactifs et tampons sont distribués par les pompes ou par les seringues automatiques selon les volumes nécessaires et la précision voulue. Les aimants sont tenus éloignés des tubes ou les électroaimants sont hors tension dans les phases d'agitation, d'incubation et de lavage. Ils sont mis à leur contact ou sous tension, pour les opérations de vidanges de surnageants et de prélèvements. [0013] Des protocoles d'extraction d'ADN génornique, à partir des constituants de sang conservés, sont exécutés par le dispositif. Par exemple, Lyse des globules rouges et vidange du surnageant par renversement des tubes dans la centrifugeuse, après centrifugation. Lavage des globules blancs. Lyse des globules blancs pour libérer l'ADN. Prélèvement de la phase aqueuse surnageante qui contient l'ADN et transfert dans un tube neuf, précipitation de l'ADN par adjonction d'alcool concentré et évacuation du surnageant après la centrifugation qui colle l'ADN au fond du tube, par renversement des tubes dans la centrifugeuse. Mise en suspension du culot d'ADN par adjonction de quelques centaines de microlitres de tampon et agitation à une température de l'ordre de 60°C, dans l'incubateur-agitateur. [0014] Pour les extractions de pesticides à partir d'échantillons de produits, les protocoles sont plus simples et utilisent en général la méthode QuEcHERS éventuellement adaptée. Cette extraction s'effectue dans deux tubes qui au préalable ont reçu des mélanges de sels. Le premier tube reçoit l'échantillon. Il s'agit d'ajouter dans les tubes des réactifs liquides au moyen des pompes, d'agiter les tubes et de prélever les surnageants après centrifugation. Le surnageant du deuxième tube est transféré dans un micro tube pour l'analyse. Description de l'invention : [0015] Le dispositif décrit à titre d'exemple est constitué de trois éléments principaux et d'éléments périphériques : [0016] Une centrifugeuse robotisée, dont le rotor peut être positionné précisément en co- ordonnées polaires. Les nacelles du rotor, qui contiennent les tubes, peuvent être animées d'un mouvement pendulaire de différentes amplitudes et à différentes fréquences. Une trappe sur le couvercle permet le passage d'un bras de robot à l'intérieur de la centrifugeuse. La trappe doit être fermée pour que la centrifugeuse puisse fonctionner. Une telle centrifugeuse existe dans le commerce. Elle est contrôlée par l'automate ou par l'ordinateur du dispositif. [0017] Un agitateur-incubateur dont la température est contrôlée entre 25 et 95 degrés Celsius, qui peut recevoir une ou plusieurs rangées de tubes parallèles, dotés d'aimants mobiles ou d'électroaimants qui peuvent être actifs ou non sur le contenu des tubes. Si les aimants sont proches des tube, ils sont actifs. S'ils sont éloignés de plusieurs centimètres ils sont inactifs. S'il s'agit d'électroaimants, sous tension ils sont actifs et hors tension ils sont inactifs. L'incubateur-agitateur est doté de résistances chauffantes qui sont contrôlées par un accessoire programmable du commerce et il peut non seulement agiter les tubes par des oscillations de fréquence et d'amplitude paramétrables et aussi vider les surnageants des tubes par renversement bouchons ouverts, dans une poubelle. Pour les opérations de vidange et de prélèvement des surnageants, les aimants ou les électroaimants sont actifs. [0018] Un robot qui déplace un outil qui a plusieurs fonctions' : Déplacer les tubes fermés au moyen d'une ventouse escamotable par l'action d'un vérin, par exemple, ouvrir plusieurs tubes au moyen d'un crochet et les refermer par appui de la base de l'outil sur les couvercles basculants, distribuer des réactifs grâce à des buses reliées à des pompes du commerce et un ou plusieurs porte pipette à usage unique, reliés chacun à une seringues automatisées du commerce, pour prélever des liquides et en distribuer d'autres en volume précis. 6 [0019] Les éléments périphériques, comprennent un automate programmable ou un or- dinateur et ses logiciels de contrôle des éléments du dispositif, et d'exécution des protocoles formés d'une suite de fonctions paramétrées, de traçabilité des échantillons, des opérations, des lots de réactifs, des opérateurs qui lancent les extractions; de plus, un lecteur de codes à barres et de code 2D pour assurer la traçabilité des échantillons pour chaque opération, une caméra numérique miniature pour prendre l'image des tubes et permettre de calculer la position des interphases, un peson électronique de précision pour aussi calculer les volumes de liquide dans les tubes, un compresseur d'air, des vérins à air comprimé pour actionner le crochet d'ouverture des tubes et positionner la ventouse de transport des tubes et la platine porte buses et porte pipette à usage unique, des capteurs pour contrôler l'ouverture des tubes, un dispositif venturi automatique à air comprimé, pour aspirer et relâcher les tubes depuis la ventouse, par soufflage, un porte tube réfrigéré au moyen d'éléments à effet Peltier et une armoire à réactifs à deux températures, 4°C et -15'C environ, dont le froid est produit par un réfrigérateur congélateur miniature, du commerce, ainsi qu'un compartiment à température ambiante. [0020] Les tubes utilisés par le dispositif sont originaux, dans la mesure où le bouchon basculant garde sa position parallèle à la génératrice du tube après ouverture et comporte à l'intérieur sur la demi-circonférence proche de la charnière, une gouttière en arc de cercle. L'embouchure du tube forme une lèvre circulaire pour éviter les gouttes pendantes après les vidanges de liquide par renversement et le fond conique du tube est non lisse pour éviter de perdre les culots lors des vidanges de surnageants par renversement, après centrifugation. [0021] On comprendra mieux l'invention à l'aide de la description faite ci après, en référence aux figures annexées à titre purement explicatif : [0022] [fig.1] est une vue d'ensemble du dispositif selon la description, avec (1) la cen- trifugeuse robotisée, (2) l'agitateur-incubateur, (3) l'outils à plusieurs fonctions du robot, (4) les portoirs de pointes de pipette à usage unique, (5) les portoirs de tubes. [0023] [fig.2] est une vue de l'agitateur-incubateur, avec (6) le moteur qui actionne ses os- cillations, (7) les tubes de plus de 5m1 à bouchon basculant, (8) les électroaimants de la première rangée, la deuxième rangé comporte les mêmes électroaimants. [0024] [fig.3] est une vue de la face avant de l'outil à plusieurs fonctions du robot, avec (7) les tubes à bouchon basculant, l'un ouvert les deux autres fermés, (9) le crochet d'ouverture des tubes, (10) l'un des capteurs de contrôle de tube ouvert, (11) vérin d'actionnement du crochet d'ouverture des tubes, (12) plateau de l'outil à plusieurs fonctions pour la fermeture des tubes à bouchon basculant. [0025] [fig.4] est une vue de la face arrière de l'outil à plusieurs fonctions du robot, avec (7) un tube à bouchon basculant fermé, tenu par la ventouse, (11) vérin d'actionnement du 7 crochet d'ouverture des tubes, (12) plateau pour la fermeture des tubes, (13) ventouse pour le transport des tubes fermés, (14) porte pipettes à usage unique, (15) platine porte buses et porte pipettes, (16) buses de distribution de réactifs, (17) vérin de positionnement de la ventouse, (18) vérin de positionnement de la platine. [0026] Les autres éléments du dispositif ne sont pas représentés. Ils sont aisément iden- tifiables par l'homme de l'art. 8 [Revendication I] [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] REVENDICATIONSDispositif automatique d'extraction de composants biologiques à partir de multiples échantillons, exécutant deux méthodes différentes de séparation, avec à la fois une centrifugeuse robotisée dont le rotor, doté de nacelles oscillantes peut recevoir une pluralité de tubes de plus de 5 millilitres ainsi qu'un agitateur-incubateur pourvu de résistances chauffantes et d'aimants, qui comporte une ou plusieurs rangées de tubes. Dispositif selon la revendication I, caractérisé en ce que les aimants de l'agitateur-incubateur sont soit des aimants permanents, qui sont ou proches, ou éloignées de la paroi des tubes contenus dans l'agitateur-incubateur, leurs déplacements étant motorisés et contrôlés, ou des électroaimants proches de la paroi des tubes qui sont mis sous tension ou hors tension suivant les besoins. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que l'agitateur- incubateur permet la vidange des surnageants contenus dans les tubes, par leur renversement, après ouverture mécanisée de leur bouchon basculant respectif, au moyen d'un crochet, rangée par rangée. Les effluents sont collectés dans un réceptacle amovible placé sous l'agitateur-incubateur. Les tubes peuvent aussi être agités par oscillations motorisées à fréquence et amplitude contrôlées. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'un bras robotisé comporte un outil réalisant plusieurs fonctions : ouverture au moyen de crochets et fermeture des tubes dotés de bouchons basculants au moyen de plateaux, une pluralité de buses prolongeant des pompes pour la distribution de réactifs, un ou des porte cônes prolongeant chacun une seringue motorisée pour la distribution de réactifs et le prélèvement de liquides, une ventouse escamotable pour le transport des tubes fermés, une caméra numérique et des capteurs de positions pour les éléments mobiles, tels crochets, ventouse et platine porte cône et porte buses. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les tubes utilisés, d'une contenance de plus de cinq millilitres, présentent un fond conique dont l'intérieur est non lisse, une embouchure dotée d'une lèvre circulaire et un bouchon basculant qui garde la position parallèle à la génératrice du tube quand il est ouvert et dont l'intérieur comporte une gouttière en arc de cercle, près de la charnière. 9 [Revendication 6] [Revendication 7] [Revendication 8] [Revendication 9] Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il présente un peson électronique de précision qui permet aussi de calculer les volumes de liquides contenus dans les tubes et si besoin, les volumes à prélever dans chaque tube. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente une caméra numérique fixe, pour permettre de calculer à partir de l'image des tubes, la position des interphases dans les tubes et par là le volume à prélever. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente un lecteur de code à barres et de code 2D pour identifier les tubes et assurer la traçabilité des échantillons avant et après les opérations et leurs manipulations par le bras robotisé. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est contrôlé par un ordinateur ou un automate programmable. L'ordinateur gère les différents éléments du dispositif, pilotés chacun par une fonction informatique paramétrable. Une suite de fonctions paramétrécs constitue un protocole d'extraction. Il commande l'exécution des protocoles, stocke toutes les données et en particulier la traçabilité des échantillons et des opérations, des lots de réactifs, enregistre les protocoles d'extraction, leurs exécutions et les opérateurs qui ont lancé les extractions.