FR 3101538 A1 20210409 FR 1911117 A 20191007 Composition de la solution physiologique contenant de l’eau de mer et de la glutamine et utilisable pour augmenter la viabilité fonctionnelle des tissus biologiques et des cellules vivantes. Selon l'invention, cette solution physiologique dite de Renéville permet également d’étudier le passage intestinal des médicaments, des nutriments, de vitamines et des xénobiotiques à longue libération Composition de la solution physiologique contenant de l’eau de mer et de la glutamine et utilisable pour augmenter la viabilité fonctionnelle des tissus biologiques et des cellules vivantes. La présente invention concerne une nouvelle utilisation de l’eau de mer pour augmenter la viabilité fonctionnelle des tissus et des cellules vivantes. Quelques définitions. Pour mieux comprendre ce texte il est souhaitable de définir quelques mots et termes qui y sont employés. La majorité de tous les termes et mots employés sont définis dans le le dictionnaire illustré des termes de médecine de Garnier Delamare 28 e édition. Solution physiologique : Une solution physiologique est un liquide isotonique au sang, c’est-à-dire présentant la même osmolarité que les principaux fluides corporels, en particulier le sang, soit environ 300 mosm/L. Une telle solution est également nommée liquide physiologique ou improprement sérum physiologique (car il ne s'agit pas d'un sérum). La solution est généralement composée d'eau distillée et de chlorure de sodium (NaCl) dilué à 9 pour 1000 (= solution à 0,9 % de masse/volume de NaCl, soit 9 g/L). Elle contient 154 mEq/L de Na + et de Cl - . La concentration du sérum sanguin étant de 6 g/L, les 3 g supplémentaires visent à compenser l'osmolarité des autres ions présents. Certaines solutions physiologiques d'usage commun sont commercialement disponibles à diverses concentrations à des fins différentes. Pour l'étude de certains organes ou préparations cellulaires (humains ou animaux), le liquide physiologique est plus complexe, contenant par exemple également du KCl, CaCl 2 , MgSO 4 . Il est alors commun de l'appeler liquide de Ringer, en référence à Sydney Ringer, le premier scientifique à avoir utilisé une telle solution. Définition de la viabilité fonctionnelle du tissu biologique et des cellules vivantes: Maintenir les tissus et les cellules vivantes pendant plusieurs heures ou plusieurs jours est l’objectif principal pour les chercheurs en biologie et en sciences du vivant. Maintenir les tissus et les cellules vivantes aussi longtemps que possible permet au biologiste de réaliser des tests biologiques reproductibles qui sont proches de l’expérimentation sur l’animal vivant ou sur l’homme au moment où les restrictions et les interdictions sont faite sur l’expérimentation animale. Pour maintenir les tissus ou les cellules vivantes le plus longtemps possible, les chercheurs ont mis au point différents types de milieux physiologiques en fonction du but recherché. Il existe des milieux de cultures cellulaires, les milieux de conservation des cellules ou des tissus, des milieux pour réaliser les expérimentations. La viabilité fonctionnelle d’un tissu ou d’une cellule c’est la conservation d’une cellule ou d’un tissu vivant avec tous ses fonctions biologiques vitales. Il existe plusieurs types de milieux physiologiques. Parmi les plus connus on peut citer les milieux suivants : Ringer, Sorensen, SRO, PBS, HPBC, NaCl 9%, DMEM (Dulbecco’s Modified Medium), Adjuvant de médicament : Auxiliaire thérapeutique ou produit thérapeutique. Ce sont généralement les produits administrés préalablement à des produits thérapeutiques. En chimiothérapie, ces produits sont administrées avant les anticancéreux. Biodisponibilité: Disponibilité biologique des médicaments comme il est défini dans le dictionnaire illustré des termes de médecine de Garnier Delamare 28 e édition. Bioéquivalence : La bioéquivalence est l’absence d’une différence significative de la biodisponibilité d’un principe actif à partir d’une forme pharmaceutique équivalente, administrée à la même dose dans des conditions similaires au cours d’une étude appropriée. La bioéquivalence correspond à l'équivalence de la biodisponibilité des médicaments comparés. La notion de la bioéquivalence tolère pour ces critères une certaine différence entre une substance de référence et un générique dans la limite qui séparent un intervalle défini par les autorités de santé. Barrières biologiques : Ensemble des structures qui séparent un compartiment biologique à un autre. Parmi les barrières biologiques on peut citer la barrière intestinale qui sépare le contenu de l’intestin (compartiment muqueux) et sang (compartiment séreux). Les barrières biologiques les plus importantes sont: l’intestin, la peau, la cornée, la barrière hémato-encéphalique, la barrière alvéo-capillaire. Excipient : C’est un véhicule d’un médicament. C’est une substance à laquelle on incorpore les principes actifs pour les rendre facilement absorbables. Nutriments: substance alimentaire pouvant être directement et entièrement assimilée, sans avoir à subir les modifications de la digestion et pouvant être introduite par injection intraveineuse. Exemple : glucose, vitamines, sels minéraux etc. Médicament: Substance ou combinaison de substances présentée comme possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines ou animales, ainsi que tout produit pouvant être administré à l’homme ou à l'animal en vue d'établir un diagnostic médical, restaurer, corriger ou modifier leurs fonctions organiques. Médicament essentiel: Médicament qui satisfait aux besoins prioritaires de la population en matière de soins de santé. Ces médicaments sont généralement utilisés pour des pathologies prioritaires et sont inscrits sur la liste nationale des médicaments essentiels. Principe actif : Substance qui induit l’effet thérapeutique. Traceur biologique : Encore appelé marqueur biologique ou bio marqueur ou indicateur biologique. Élément permettant de dépister une substance sur laquelle il est fixé. Utilisé pour le diagnostic médical le traceur biologique est une substance dont le dosage permet l’exploration des affections spécifiques. Exemple, marqueur de tumeur, de l’hépatite virale, du métabolisme etc. Promoteur ou facilitateur de l’absorption intestinale des médicaments: substance qui favorise l’absorption intestinale des nutriments, des médicaments ou des xénobiotiques. Xénobiotiques : Produits chimique, ménager ou industriel, étranger à la chimie biologique et se comportant comme un toxique ou un allergène vis-à-vis de l’organisme. Sels minéraux : sont des substances provenant de roches qui entrent dans la composition des organismes et qui sont présents dans l'alimentation animale. Parmi les sels minéraux les plus courant ont peut citer: calcium, chlore, magnésium, phosphore, potassium, sodium, soufre. Exploration fonctionnelle : Ensemble d'examens destinés à explorer les grandes fonctions de l’organisme: les fonctions respiratoires, cardiaques, circulatoire, digestives, reproduction etc. La présente invention concerne une nouvelle utilisation de l’eau de mer comme solutions physiologique. Il s’agit d’une dilution de l’eau de mer au tiers (1/3, c’est-à-dire pour 1 volume de l’eau de mer on ajoute 2 volumes de l’eau), plus de la L-glutamine pou avoir une concentration finale de 5 milli-molaire (5 mM). Composition de la solution physiologique selon l’invention. 1. L’eau de mer (sérum marin) dilué au tiers (1/3) 2. L-glutamine, (de préférence à une concentration finale d’au moins 5 milli-molaire) Mise en œuvre de l’invention La mise en œuvre de l’invention peut se faire sur l’action de la composition selon l’invention sur l’absorption intestinale ou la sécrétion intestinale de l’eau, des ions, des électrolytes, des xénobiotiques, des nutriments et oligo-éléments. Matériels et méthodes utilisés Étude de la sécrétion d’eau et d’électrolytes et de l’absorption intestinale de glucose. Produits chimiques La Phloridzine, la Forskoline, l’Acétylcholine, le D-glucose et le Mannitol, L-glutamine ont été achetés chez Sigma (St Quentin-Fallavier, France). La composition de la solution physiologique selon l’invention obtenue à partir du mélange de l’eau de mer et la L-glutamine. Préparation de tissus Les souris de laboratoire de 7 semaines ont été obtenues chez Janviers SA (France) et ont été nourries par les aliments standard de laboratoire (UAR, Villemoisson s / Orge, France) jusqu'à la réalisation de ces études. Pour les expériences à jeun, la nourriture a été retirée 18 h avant les expériences, mais les animaux avaient l'accès libre à l’eau potable. Pour les études de l'électrophysiologie, les animaux ont été tués par la dislocation cervicale après anesthésie et des segments d'intestin d'animaux à jeun ont été prélevés et rincés de leur contenu intestinal avec une solution de Renéville frais. Les estomacs de tous les animaux ont été trouvés vides. Les morceaux de tissus ont été ensuite ouverts le long de la bordure mésentérique puis ont été montés bien aplatis entre les deux demi-chambres Ussing (Biomécatronics SAS, ZI de Ruitz, France). Études de l’absorption intestinale du glucose, d’eau et des électrolytes à l’aide des chambres d’Ussing : mesure du courant de Court-circuit. La solution physiologique selon l’invention (ou solution de Renéville) est utilisée dans toutes les expériences qui suivent et est composée de l’eau de mer (encore appelé comme sérum marin) diluée au tiers (1/3) et de la L-glutamine (5 mM). Le pH était ± 7,40 et la température à 37±5 °C. Une préparation intestinale est montée entre deux demi chambres en plexiglas déterminant un compartiment muqueux et un compartiment séreux. Ces demi-chambres, dont l'ouverture est appliquée contre la surface exposée du tissu intestinal, sont perforées en compartiments contenant la solution de Renéville qui est une solution tamponnée à pH = 7,6 tempérée à 37°C. Le pH de la solution de Renéville et sa saturation en oxygène sont maintenus constamment par un bullage permanent de carbogène, mélange gazeux composé d’oxygène et de dioxyde de carbone dans les proportions 95% d’O 2 et 5% de CO 2 . Le bullage assure également le brassage permanent du milieu d’incubation dans les deux compartiments. Le potentiel électrique transepithelial reflétant l'asymétrie de charges électriques entre le coté muqueux et séreux de la membrane, a été mesuré par les électrodes de calomel (Biomécatronics SAS, France) reliées par des ponts d’agaroses plongés dans une solution de KCl à 3 molaire, 4% (w/v). Ces ponts ont été placés sur les deux côtés du tissu et sont adaptés à chaque demi-chambre. Le tout est relié à un voltmètre à haute impédance (Biomécatronics SAS, France). La différence de potentiel a été court-circuitée par un courant de court-circuit (I sc ) via des ponts d’agaroses à 3M de KCl placés dans chaque réservoir, adapté aux électrodes Ag-AgCl, le tout étant relié à un système de la voltage-Clamp (Biomécatronics SAS, France). I sc délivré et corrigé pour la résistance du liquide physiologique, a été enregistré de façon continue sur un ordinateur à l’aide d’un logiciel Biodaqsoft (Biomécatronics SAS, France). I sc représente la somme des flux d'ions nets transportés à travers l'épithélium en absence d'un gradient électrochimique (principalement Na+, Cl - et HCO - 3 ). Mise en œuvre et essais de la solution physiologique L’invention est actuellement mise en œuvre sous le nom solution de Renéville, dont la composition est faite de l’eau de mer diluée au tiers additionnée avec de la L-glutamine à 5 milli-molaire. Effet de la solution de Renéville sur l’absorption intestinale du sucre et ou la sécrétion d’eau et des électrolytes. Après la stabilisation des paramètres électriques des tissus, dans la solution de Renéville selon l’invention le glucose a été introduit à une concentration de 30 mM dans les compartiments muqueux des préparations, alors que le mannitol à 30 mM a été introduit que dans les compartiments séreux. Les variations des paramètres électriques (courant de court-circuit – I sc et conductance - G) sont ensuite relevées puis enregistrés sur l’ordinateur) en fonction du temps (30 minutes à 10 heures) toutes les 30 minutes. Statistiques Les résultats, montrés sur les figures annexées, sont rapportés en moyenne (M) de mesures plus l’écart type (M ± ET). Toutes les déterminations ont été faites avec une moyenne d’au moins de 7 morceaux de tissu (n). L’analyse de la variance a une voie été effectuée suivi du test de Dunnett grâce au logiciel GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc. CA 92037 USA). Les comparaisons des l’action de la solution de Renéville sur les paramètres physiologiques ont été effectuée par le test t de students. Résultats 1. Effet de la solution de Renéville sur le courant de court-circuit de base Figure 1 . Effet de la solution de Renéville sur la conductance électrique après ajout de glucose (Glc), de la Phloridzine (Phz). Effet de la solution de Renéville diluée au ½ et au 1/3. La figure 1 montre que les fonctionnalités de l’intestin sont meilleures lorsque l’eau de Mer est diluée au 1/3. 2. Effet de la solution de Renéville sur l’absorption intestinale du glucose Figure 2 ; Effet de la solution de Renéville sur l’absorption du glucose au niveau de l’intestin grêle (jéjunum). La figure 2 A montre que lorsqu’on dilue la solution de mer au 1/3 on restaure l’absorption intestinale de glucose et en même temps la fonctionnalité des transporteurs intestinaux comme le transport Na-glucose (SGLT1). L’ajout de la phloridzine qui est un inhibiteur naturel de ce transporteur induit une inhibition de l’absorption de glucose. Ce qui se traduit par une diminution du courant de court-circuit. La figure 2 B montre que lorsqu’on dilue le solution au ½, la fonction d’absorption du glucose est inhibé par rapport à la solution diluée au 1/3. 3. Effet de la solution de Renéville sur la sécrétion intestinale de l’eau et les électrolytes Figure 3 . Effet de la solution de Renéville (eau de mer diluée au 1/3 plus 5 mM de L-glutamine, sur le courant de circuit de base après stimulation de la secrétions intestinale par la Forskoline (FSK) et l’inhibition de la secrétions par la Bumétanide (Bum). L’eau suit le mouvement des ions à travers la barrière intestinale. Etant donné que le courant de court-circuit (I sc ) reflète le transport des ions à travers la barrière intestinale (principalement les ions sodium, chlorure et bicarbonate), cette variation du courant de court-circuit (I sc ) nous donne une indication des mouvements d’eau et des électrolytes à travers la barrière intestinale. 4. Effet de la solution de Renéville sur la viabilité fonctionnelle à long terme des cellules intestinales Figure 4. Effet de la solution de Renéville sur la viabilité à long terme des cellules intestinales. L’absorption du glucose au niveau de l’intestin grêle (jéjunum) a été mesurée deux fois dans l’intervalle de 11 heures. Cette figure montre que après 11 h les fonctions d’absorption et de sécrétion de l’intestin sur conservés alors que dans les conditions d’études in vitro, la viabilité de l’intestin n’excède pas 3 heures. Figure 5 . Lorsque l’eau de mer diluée au 1/3 est remplacée par la solution de Ringer , on obtient également une durée de survie de la muqueuse intestinale plus longue que le Ringer sans L-glutamine. Mais cette durée de survie du tissu reste toujours inférieure à celle de l’eau de mer diluée au 1/3 plus L-glutamine. La figure 5 A montre l’enregistrement du courant de court-circuit (I sc ) pendant 8 heures suivi de l’action de la forskoline (viabilité fonctionnelle du tissu qui montre que la muqueuse intestinale peut encore secréter de l’eau et des électrolytes). La figure 5 B, montre l’enregistrement de la conductance de la muqueuse intestinale pendant 8 heures (l’ajout du glucose montre la viabilité fonctionnelle de la muqueuse intestinale. Elle peut encore absorbée le glucose). Selon l'invention, cette solution physiologique dite de Renéville permet également d’étudier le passage intestinal des médicaments, des nutriments, de vitamines et des xénobiotiques à longue libération et de conserver les tissus et cellules vivants. Applications Cette solution physiologique peut être utilisée notamment : -. En tant que composition pharmaceutique et ou diététique utilisable pour étudier le passage intestinal des médicaments, nutriments, vitamines, oligoéléments et xénobiotiques à longue libération. -. en tant qu’outils pharmacologiques pour faire les études expérimentales. -. en tant que solution physiologique pour les études expérimentales et la conservation des tissus et les cellules vivantes. Cependant, la composition préférée selon l’invention est l’utilisation de l’eau de mer diluée au tiers (1/3) et une concentration totale de la L-glutamine soit égale à 5 milli-molaire (5 mM). Composition, comprenant l’eau de mer diluée au tiers (1/3) et la L-glutamine pour son utilisation pour augmenter la viabilité fonctionnelle des tissus et de cellules biologiques vivants. Composition selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration totale de la L-glutamine soit d’au moins supérieur ou égale à 5 milli-molaire (5 mM). Composition selon les revendications 1 et 2, pour son utilisation en tant que solution physiologique de Renéville pour conserver les cellules et les tissus vivants. Composition selon la revendication 2 caractérisé en ce que l’eau de mer peut être remplacée par la solution de Ringer non diluée. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu’elle soit utiliser pour augmenter la perméabilité intestinale aux nutriments, vitamines, sels minéraux et xénobiotiques. Composition selon les revendications 1, 2, 4 caractérisée en ce qu’elle soit utiliser pour étudier le passage intestinal des médicaments, des nutriments, de vitamines et des xénobiotiques à longue libération.