FR 3096374 A1 20201127 FR 1905329 A 20190521 Description Titre de l'invention : NOUVELLES SOUCHES DE BACTE- RIOPHAGES ET LEURS UTILISATIONS Domaine technique [0001] L'invention concerne de nouvelles souches de bactériophages efficaces contre Sta- phylococcus aureus et des compositions de celles-ci, ainsi que la combinaison d'une souche de bactériophage efficace contre Staphylococcus aureus avec une bactériocine et/ou avec du lysozyme et/ou avec un antibiotique. L'invention concerne également l'utilisation de ces bactériophages en tant que conservateurs alimentaires, additifs alimentaires, probiotiques, solution désinfectante ou encore leur utilisation thérapeutique pour traiter des infections ou les contaminations par Staphylococcus aureus, en particulier pour le traitement de la mammite. Contexte de l'invention [0002] Au cours des dernières années, avec l'émergence de souches bactériennes multi- résistantes aux antibiotiques, les recherches se tournent vers les phages. L'utilisation de phages pour inactiver les bactéries pathogènes est considérée comme un moyen intéressant de remplacement des antibiotiques en médecine humaine, vétérinaire et pour la conservation des produits alimentaires ainsi que pour l'éradication des biofilms. En effet, les phages sont considérés comme des «antimicrobiens intelligents» pour leur spécificité. Ils infectent les bactéries cibles sans aucun effet sur la flore commensale et sont éliminés naturellement lorsque les bactéries hôtes sont totalement éliminées [0003] Il est important de noter qu'il y a deux différents types de phages existent : les phages lytiques (virulents) et tempérés (lysogéniques). Pour les lytiques, la première étape de l'infection du phage est l'adsorption des phages à la paroi de la cellule bactérienne grâce à des interactions spécifiques entre des protéines virales et des récepteurs de la cellule hôte. Après avoir pénétré dans la cellule bactérienne, les phages virulents se répliquent rapidement. pour synthétiser leurs protéines de capside et leur génome dans l'intérieur de la cellule hôte. Enfin, les nouveaux phages s'échappent de la bactérie hôte par la rupture de la paroi cellulaire qui conduit à la mort de la cellule bactérienne. Alors que les phages tempérés intègrent leur matériel génétique dans le chromosome de la cellule hôte, qui est répliqué avec le génome de la cellule hôte (sous forme de prophage). Seuls les phages tempérés peuvent s'intégrer dans le génome bactérien et participer aux transferts horizontaux de gènes entre les populations bactériennes. Pour des applications en thérapie, uniquement les phages lytiques sont sélectionnés pour leur capacité à lyser rapidement des bactéries ciblées. 100041 En médecine vétérinaire, l'utilisation de l'antibiotique est actuellement réduite en 2 production animale. Les phages sont apparus comme une méthode alternative pour lutter contre les maladies bactériennes chez les animaux et pour contrôler la transmission des agents pathogènes responsables de maladies d'origine alimentaire à l'homme. Par exemple, la réduction de de Campylohacter et de toute autre bactérie pathogène par des phages a été étudiée dans plusieurs travaux y compris pour la destruction des biofilms ou en aquaculture (Fiorentin et al., 2005; Higgins et al., 2008 ; Lee and Park, 2015). L'administration des phages est possible par voie orale, intraveineuse, ou par voie topique. Plusieurs études ont montré que la diffusion des phages dans le sang, dans les reins ou dans le foie. [0005] Certains produits de phages ont été approuvés et commercialisés. Par exemple, en 2006, la FDA (Food and Drug Administration) a approuvé que l'utilisation et la préparation des bactériophages soit reconnues inoffensives et qu'ils soient utilisés comme additifs alimentaires pour le contrôle de bactéries pathogènes. Le produit ListexTM est appliqué pour contrôler Listeria tnonorytogenes du saumon fumé, dans la viande et les produits à base de volaille. Le ListexTM a également été approuvé pour l'application en industrie alimentaire par la Food Standards Australia & New Zcaland (FSANZ) en 2012. En Europe, le phage P100 est un produit similaire au ListexTM. [0006] Cependant, certaines études ont rencontré des échecs dans l'utilisation de phages. D'après Ly-Chatain (2014) plusieurs facteurs peuvent intervenir sur l'efficacité du traitement. Pour les applications antibactériennes, les phages doivent être lytiques et avoir un large spectre d'activité (capacité d'infecter plusieurs souches bactériennes cibles). Ils doivent être stables dans des conditions du traitement et surtout avoir accès aux bactéries ciblées. Le dernier facteur dépend de la composition et la structure de la matrice. Certains composés pourraient limiter l'accès des phages aux bactéries. Par exemple, O'Flaherty et al (2005) ont suggéré que certaines protéines présentes dans le lait cru puissent s'adsorber sur la surface bactérienne réduisant ainsi l'accessibilité des phages aux bactéries. [0007] Staphylocoecus aureus est l'espèce bactérienne la plus rencontrée en pathologie humaine et vétérinaire. [0008] Plusieurs études ont été menées sur les phages anti- Staphylococcus attreus pour dé- velopper des applications dans le traitement d'infection bactérienne chez l'homme et chez les animaux, mais aussi pour la conservation des produits alimentaires. Parmi les phages isolés et caractérisés jusqu'à présent, le phage K est le plus intéressant pour sa capacité d'infecter plusieurs souches de S. attretts (O'Flaherty, Ross et al. 2005) (large de spectre (l'activité). Cependant, certaines études ont montré que l'infection du phage K est inhibée dans le lait cru (Gin, Sabour et al. 2006). Ces auteurs ont suggéré que le phage K n'est pas dégradé dans le lait cru mais il est inhibé en présence d'un composant du lait cru. Ce composant qui pourrait être une protéine ou un groupe de 3 protéines s'attachent à la surface de la bactérie et la rendre inaccessible aux phages. L'autre hypothèse suggérée est que les bactéries seraient agrégées dans le lait cru et cette agrégation bactérienne empêcherait les phages de s'adsorber à la surface cellulaire. [0009] En élevage d'animaux de ferme allaitants, cette bactérie est la responsable majeure de la mammite. Le traitement courant est l'utilisation des antibiotiques ou le tarissement. Cependant, l'émergence de souches mufti-résistantes a rendu l'antibiotique inefficace. Les traitements actuels ne permettent pas d'avoir un taux de guérison élevé (20 à 50% (Bosquet., et al. 2013) et l'infection des phages est inactive dans le lait cru, ce qui pourrait réduire l'efficacité du traitement par les phages en milieu lactation. [0010] Dans ce contexte, il est donc nécessaire de trouver un nouveau traitement pour soigner les infections liées à S. aureus. [0011] Les inventeurs ont découvert que dc manière surprenante les bactériophages déposés la Collection Nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409 et CNCM 1-5410, permettaient d'infecter un large spectre de souches de S. aureus et étaient également capables d'inhiber efficacement le développement de cette bactérie, y compris dans un milieu composé de lait cru. [0012] Par ailleurs, les inventeurs ont également découvert que la combinaison d'un bacté- riophage anti-S. aureus avec une bactériocinc, telle que la nisinc, et/ou avec du lysozyme et/ou avec un antibiotique, avait un effet synergique sur l'inhibition du développement de S. aureus, y compris dans un milieu composé de lait cru. Résumé de l'invention [0013] L'un des aspects de la présente invention porte sur des souches de bactériophages nouvellement identifiées, permettant d'inhiber le développement dc S. aureus. [0014] La présente invention concerne également une composition comprenant l'une de ces souches de bactériophage, pour son utilisation chez l'Homme ou chez l'animal dans le traitement d'infections par S. aureus. [0015] La présente invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant l'une de ces souches dc bactériophage comme additif alimentaire, comme conservateur alimentaire, comme probiotique ou comme solution désinfectante. [0016] Un autre aspect de la présente invention porte sur la combinaison d'une souche de bactériophage avec la nisine et/ou le lysozyme et/ou un antibiotique, en particulier pour le traitement d'infections par S. aureus chez l'Homme ou l'animal. Exposé de l'invention [0017] Souches de bactériophages [0018] La présente invention porte sur la souche de bactériophage déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro CNCM 1-5408. [0019] La présente invention porte également sur la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5409. [0020] La présente invention porte également sur la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5410. [0021] Compositions comprenant une souche de bactériophage [0022] Selon un premier aspect, la présente invention concerne une composition comprenant une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous les numéros CNCM 1-5409 et CNCM 1-5410. [0023] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend en outre au moins une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées sous les numéros CNCM 1-5708, CNCM 1-5409 et CNCM 1-5410. La ou les souches additionnelles comprises en outre dans la composition sont différentes de la souche choisie en premier lieu. [0024] Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les souches CNCM 1-5709 et CNCM-5410, les souches CNCM 1-5709 et CNCM-5408, ou les souches CNCM 1-5710 et CNCM-5408. [0025] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les souches CNCM 1-5410, CNCM 1-5709 et CNCM-5408. [0026] Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition comprenant au moins une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM 1-5409 ou CNCM I5410. [0027] Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur une com- position comprenant au moins deux souches de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I5409 ou CNCM I-5410. [0028] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comporte un véhicule phatmaceutiquement acceptable. Ce véhicule peut être une solution d'eau saline, en particulier à 15% de NaC1 ou une solution de tampon phosphate (PBS). [0029] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comporte un agent sta- bilisant, par exemple le glycérol et/ou le sorbitol et/ou sucrose. [0030] Dans un mode de réalisation particulier, dans ladite composition, la concentration de chaque une souche de bactériophage est comprise entre 106/m1 et 109/ml, en particulier de 108 /ml, plus particulièrement 107/ml. [0031] Dans un mode de réalisation particulier, la composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison en combinaison avec une bactériocine. [0032] Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant ladite composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, et une bactériocinc. [0033] Les bactériocincs sont une famille de peptides ou protéines synthétisés naturellement par certaines bactéries. Une bactériocinc consiste généralement en un composé protéique de 20 à 60 acides aminés. Les bactériocines ne sont pas des antibiotiques niais elles possèdent des propriétés antibiotiques. Au sens de la présente demande, la bactériocine est par exemple choisie parmi la nisinc, la col icinc et la natamycinc. Dans un mode de réalisation particulier, ladite bactériocinc est la nisinc. Dans un autre mode de réalisation, ladite bactériocinc est une bactériocinc recombinante, en particulier de la nisinc recombinante. [0034] Dans un cas plus particulier, la concentration en bactériocinc, par exemple la nisinc, est comprise entre 0.05 mg/mi et 0.5 mg/ml, plus particulièrement de 0.1 mg/m1 à 0.4 mg/ml, plus particulièrement de 0.1 mg/m1 à 0.3 mg/ml, encore plus particulièrement de 0.2 mg/ml. [0035] Dans un mode de réalisation particulier, la composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec une enzyme chargée positivement et ayant capacité d'hydrolyser le peptidoglycane de la paroi bactérienne. En particulier, l'enzyme est le lysozyme. [0036] Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant ladite composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, et du lysozyme. [0037] Le lysozyme est une enzyme présente dans divers liquides biologiques, comme le blanc d'oeuf, le mucus nasal, les larmes, le lait ou le mucus cervical. Les lysozymes sont divisés en différents types : lysozymes de type-c (pour "chicken"), lysozymes de type-g (pour "goose"), lysozymes de type-i (pour "invertebrate"), lysozymes de type-ch (pour Chalaropsis), les lysozymes de plantes, les lysozymes bactériens et les lysozymes phagiques. [0038] Dans un mode de réalisation plus particulier, le lysozyme est un lysozyme de type-c, et plus particulièrement du lysozyme de jaune d'oeuf. [0039] Dans un mode de réalisation particulier, le lysozyme est utilisé à une concentration supérieure à 1,25 mg/ml. [0040] Dans un autre mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec une bactériocine, par exemple la nisine, et du lysozyme. [0041] Dans un mode de réalisation particulier, la composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec au moins un antibiotique. 6 [0042] Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant ladite composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, et au moins un antibiotique. [0043] Dans un mode de réalisation particulier, ledit antibiotique est choisi parmi : la cloxacilline, l'oxytétracycline, la streptomycine, la gentamycine, le chloramphénicol, la tétracycline, l'ampicilline ou l'érythromycinc. [0044] Dans un mode de réalisation particulier, l'antibiotique est utilisé à une concentration comprise entre 0.125 pg/mL et 5 pg/mL, en particulier entre 0.625 pg/mL et 2.5 pg/ mL, plus particulièrement 1.25 pg/mL. [0045] Dans un mode de réalisation particulier, l'antibiotique, tel que la tétracycline et la gentamycine, est utilisé à une concentration comprise entre 0.125 pg/mL et 0.625 pg/ mL, en particulier 0.25 pg/mL. [0046] Dans un mode de réalisation particulier, l'antibiotique, tel que le chloramphénicol, la kanamycine et l'ampicilline, est utilisé à une concentration comprise entre 2.5 pg/mL et 5 pg/mL, en particulier 3.75 pg/mL. [0047] Dans un mode de réalisation particulier, l'antibiotique, tel que la streptomycine, la cloxacilline et l'oxytétracycline, est utilisé à une concentration comprise entre 0.625 pg/mL et 2.5 pg/mL, en particulier 1.25 pg/mL. [0048] Dans un mode de réalisation particulier, l'antibiotique est utilisé à une concentration comprise entre 25 pg/mL et 100 pg/mL, en particulier entre 25 pg/mL et 75 pg/mL [0049] Dans un mode de réalisation particulier, l'antibiotique est utilisé à une concentration de 50 pg/mL [0050] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec de la cloxacilline et/ou l'oxytétracycline et/ou de la streptomycine et /ou de chloramphénicol. [0051] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec la cloxacilline. [0052] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec Foxytétracycline. [0053] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec la streptomycine. [0054] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec le chloram- 7 phénicol. [0055] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme et/ou un antibiotique. [0056] Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant ladite composition précédemment décrite comprenant une souche de bactériophage, et une bactériocine, par exemple la nisine, et/ou du lysozyme et/ou un antibiotique. [0057] Combinaison d'une souche de bactériophage avec une bactériocine [0058] Un autre aspect de l'invention porte sur une composition comprenant une souche de bactériophage pour son utilisation dans le traitement d'une infection par S. aureus, caractérisée en ce que ladite composition comprenant une souche de bactériophage est utilisé en combinaison avec une bactériocine. [0059] Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant une composition comprenant une souche de bactériophage, et une bactériocine. [0060] En particulier ladite bactériocine est la nisine. [0061] Typiquement la souche de bactériophage est une souche capable d'inhiber le déve- loppement du Staphyloetteetts aureus. Typiquement, un test permettant de déterminer si un bactériophage inhibe le développement de S. aureus est celui décrit au point 8 de la partie Exemples ci-après. [0062] Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en bactériocine, en par- ticulier en nisine, est comprise entre 0.05 mg/1ml et 0.5 mg/ml, plus particulièrement de 0.1 mg/rn1 à 0.4 mg/ml, plus particulièrement de 0.1 mg/m1 à 0.3 mg/ml, encore plus particulièrement de 0.2 mg/ml. [0063] Dans un mode de réalisation plus particulier, ladite composition comprenant une souche de bactériophage est également utilisée en combinaison avec du lysozyme. Plus particulièrement, la concentration en lysozyme est supérieure à 1,25 mg/ml, en particulier d'au moins 2.5 mg/mL, plus particulièrement de 2.5 mg/mL [0064] Dans un mode de réalisation particulier, la concentration de la souche de bacté- riophage est comprise entre 106/m1 et 109/ml, en particulier de 10' /ml, plus particulièrement 107/ml. [0065] Dans un mode de réalisation plus particulier, ladite composition comprenant une souche de bactériophage est également utilisée en combinaison avec au moins un antibiotique, en particulier un antibiotique choisi parmi la cloxacilline, l'oxytétracycline la streptomycine, la gentamycine, le chloramphénicol, la tétracycline, l'ampicilline ou F érythromycine. [0066] Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche de bactériophage est choisie 8 parmi les souches déposées sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1- 5410 ou ATCC 19685-B1 (phage K). [0067] Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche de bactériophage est un mélange de deux ou des trois bactériophages tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409 et CNCM 1-5410. [0068] Combinaison d'une souche de bactériophage avec du lysozyme [0069] Dans un autre aspect, l'invention porte également sur une composition comprenant une souche de bactériophage pour son utilisation pour le traitement d'une infection par S. aureus, caractérisée en ce que ladite souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec du lysozyme. [0070] Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant une composition comprenant une souche de bactériophage, et du lysozyme. [0071] Typiquement la souche de bactériophage est une souche capable d'inhiber le déve- loppement de Staphyloeceeus aureus. [0072] En particulier, la concentration en lysozyme est supérieure à 1,25 mg/ml, en par- ticulier d'au moins 2.5 mg/mL, plus particulièrement de 2.5 mg/mL. [0073] Dans un mode de réalisation particulier, la concentration de la souche de bacté- riophage est comprise entre 106/m1 et 109/ml, en particulier de 10s /ml, plus particulièrement 1 07/ml. [0074] Dans un mode de réalisation, l'invention porte sur une composition comprenant une souche de bactériophage, ledit bactériophage étant capable d'inhiber le développement de Staphylococcus aureus, en combinaison avec une bactériocine, par exemple la nisine, et du lysozyme et/ou un antibiotique. [0075] Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche de bactériophage est choisie parmi les souches déposées sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM I5410 ou ATCC 19685-B1 (phage K). [0076] Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche de bactériophage est un mélange de deux ou des trois bactériophages tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM I-5409 et CNCM I-5410. [0077] Combinaison d'une souche de bactériophage avec au moins un antibiotique [0078] Dans un autre aspect, l'invention porte également sur une composition comprenant une souche de bactériophage pour son utilisation pour le traitement d'une infection par S. aureus, caractérisée en ce que ladite souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un antibiotique. [0079] Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant une composition comprenant une souche de bactériophage, et au moins un antibiotique. 9 [0080] Typiquement la souche de bactériophage est une souche capable d'inhiber le déve- loppement de Staphyloeoecus aureus. [0081] Dans un mode de réalisation plus particulier, ledit antibiotique est choisi parmi la cloxacilline, l'oxytétracycline la streptomycine, la gentamycine, le chloramphénicol la tétracycline, l'ampicilline, l'érythromycine ou la kanamycinc. [0082] Dans un mode de réalisation plus particulier, ladite composition comprenant une souche de bactériophage est utilisée en combinaison la cloxacillinc et/ou l'oxytétracycline et/ou la streptomycine, et/ou le chloramphénicol. [0083] Dans un mode de réalisation particulier, une composition comprenant une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec la cloxacillinc. [0084] Dans un mode de réalisation particulier, une composition comprenant une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec roxytétracycline. [0085] Dans un mode de réalisation particulier, une composition comprenant une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec la streptomycine. [0086] Dans un mode de réalisation particulier, une composition comprenant une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec le chloramphénicol. [0087] Dans un mode de réalisation particulier, l'antibiotique est utilisé à une concentration comprise entre 0.125 pg/mL et 5 pg/mL, en particulier entre 0.625 pg/mL et 2.5 pg/ mL, plus particulièrement 1.25 pg/mL. [0088] Dans un mode de réalisation particulier, l'antibiotique est utilisé à une concentration comprise entre 25 pg/mL et 100 pg/mL, en particulier entre 25 pg/mL et 75 pg/mL, plus particulièrement 50 pg/mL [0089] Dans un mode (le réalisation particulier, ladite souche de bactériophage est choisie parmi les souches telles que déposées sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410 ou ATCC 19685-B1 (phage K). [0090] Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche de bactériophage est un mélange de deux ou des trois bactériophages tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409 et CNCM 1-5410. [0091] Utilisations des compositions et de leurs combinaisons [0092] La présente demande porte également sur l'utilisation des compositions comprenant une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment. [0093] En particulier, il s'agit d'une utilisation comme solution désinfectante. En par- ticulier, il s'agit d'une utilisation comme solution anti-Staphylocoque doré. Ces solutions peuvent être utilisées sur toutes sortes de surfaces, par exemple sur du matériel médical, des instruments chirurgicaux, des dispositifs médicaux destinés à l'implantation in vivo (prothèses par exemple). [0094] Elles peuvent également être utilisées sur la peau chez le mammifère, aussi bien chez l'Homme que chez l'animal. [0095] Une utilisation particulière est une utilisation sur le pis des mammifères allaitants, plus particulièrement des mammifères allaitants de ferme. [0096] La présente demande porte également sur l'utilisation des compositions comprenant au moins un bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, comme additif alimentaire. [0097] Par « additif alimentaire », on entend un produit ajouté aux denrées alimentaires commerciales (notamment aliments industriels) destinés à l'alimentation humaine et/ou animale. [0098] En particulier, il s'agit d'additif alimentaire pour l'alimentation animale. Ces additifs ont pour but d'améliorer certaines caractéristiques des aliments, par exemple pour en relever le goût ou pour rendre plus digestes les matières premières des aliments pour animaux. [0099] Plus particulièrement, ladite composition est utilisée comme additif zootechnique. [0100] La présente demande porte également sur l'utilisation des compositions comprenant au moins un bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, comme conservateursalimentaires. [0101] Par « conservateur alimentaire », on entend un produit ajouté pour prévenir du déve- loppement de micro-organismes dans les denrées alimentaires et ainsi prévenir d'éventuelles intoxications alimentaires. [0102] La présente demande porte également sur l'utilisation des compositions comprenant au moins un bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, comme probiotique. [0103] Par « probiotique », on entend microorganisme vivants, qui lorsqu'ils y sont consommés en quantités adéquates, confèrent un effet bénéfique sur la santé et l'immunité de l'hôte sain. Utilisations thérapeutiques des compositions et de leurs combinaisons [0104] La présente demande porte également sur les compositions comprenant un bacté- riophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, pour une utilisation comme médicament. [0105] La présente demande porte également sur les compositions comprenant un bacté- riophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, pour une utilisation dans l'élimination d'un biofilm ou la prévention de la formation d'un biofilm Typiquement, il s'agit d'un biofilm formé ou pouvant se former à la surface d'un dispositif médical (par exemple prothèse) après son implantation in vivo. [0106] La présente demande porte également sur les compositions comprenant un bacté- riophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une infection par à S. aureus. [0107] La caractérisation d'une infection par S. aureus est bien connue de l'Homme du 11 métier. Une infection par S. aureus peut entrainer, de manière non limitative, les pathologies suivantes : - des infections cutanées suppuratives c'est-à-dire avec production de pus (formes les plus fréquentes) telles que furoncles, panaris, folliculite, sycosis, cellulite, érysipèle, suppurations de plaies, pemphigus néonatal, impétigo, mammites ; - des myosites algues ; - des otites et sinusites ; - des infections de différents viscères : infections de l'appareil respiratoire : pneumonies, endocardite (en particulier chez les patients porteurs de prothèses infections urinaires, phlébites, certains types d'entérite, méningites ; - syndrome du choc toxique ; - intoxication alimentaire ; - infection des os tel que les ostéomyélites. [0108] En particulier, la présente demande porte sur les compositions comprenant un bacté- riophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une infection par S. aureus chez le mammifère. [0109] En particulier, la présente demande porte sur les compositions comprenant un bacté- riophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une infection par S. aureus chez l'Homme. [0110] En particulier, la présente demande porte sur les compositions comprenant un bacté- riophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une infection par S. aureus chez l'animal. [0111] Dans un autre mode de réalisation, la présente invention porte sur l'une des com- positions précédemment décrites pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une infection par S. aureus, dans laquelle ladite infection par S. aureus est la mammite chez le mammifère allaitant. [0112] Typiquement, ledit mammifère allaitant est un mammifère allaitant de ferme, plus particulièrement choisi parmi les bovins, les ovins, les caprins et les camélidés. En particulier, le mammifère allaitant de ferme est choisi parmi la vache, la brebis, la chèvre, la bufflonne ou la chamelle. [0113] Dans un mode de réalisation plus particulier, ladite infection par S. aureus est la mammite bovine. [0114] Méthode de traitement ou de prévention [0115] La présente demande porte également sur une méthode de traitement et/ou de prévention d'infection par S. aureus, comprenant l'administration d'une dose efficace, de ladite composition comprenant un bactériophage telle que précédemment décrite, ou d'une des combinaisons de cette composition telle que précédemment décrite. [0116] Les modes de réalisations décrits ci-dessus pour les utilisations thérapeutiques sont 12 valables pour une telle méthode de traitement et/ou de prévention d'infection pars. aureus. [0117] Mode d'administration [0118] Dans la présente demande, les compositions comprenant un bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, peut être administrée par voie parentérale, par voie orale ou par voie topique. [0119] Par voie parentérale, on entend une injection intramusculaire, intraveineuse, sous- cutanée, intramam maire ou intradermique. [0120] Par voie orale, on entend une administration par ingestion. Une administration par voie orale peut être, de manière non limitative, sous la forme de comprimé, gélule, suspension buvable, sachet, poudre, sirop ou capsule. [0121] Par voie topique, on entend une application externe sur une surface du sujet telle que la peau ou les muqueuses. Une administration par voie topique peut être, de manière non limitative, sous la forme de sprays, crèmes telles qu'une crème de nettoyage ou de désinfection, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions telles qu'une lotion de nettoyage ou de désinfection, d'émulsions ou de suspensions. Une administration par voie topique peut également être sous la forme d'une préparation solide telle qu'un savon ou un pain de nettoyage. [0122] Dans un mode de réalisation particulier, lorsque ladite composition comprenant un bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un autre élément tel qu'une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique, des voies d'administration différentes peuvent être utilisées les éléments. [0123] Dans la présente demande, lorsque ladite composition comprenant un bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un autre élément tel qu'une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique, l'utilisation peut être réalisée de manière simultanée, séparée ou séquentielle. [0124] En particulier, lorsque ladite composition comprenant un bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un autre élément, l'administration de ladite composition est séparée dans le temps, et ladite composition étant utilisée en dernier. Dans ce mode de réalisation, le ou les autres éléments de combinaison peuvent utilisés de manière simultanée, ou séparée dans le temps. [0125] En particulier, lorsque la composition comprenant un bactériophage est utilisée en combinaison avec une bactériocine, telle que la nisine, l'administration de ladite composition est séparée dans le temps, la bactériocine étant utilisée en premier. [0126] En particulier, lorsque la composition comprenant un bactériophage est utilisée en combinaison avec un antibiotique, l'administration de ladite composition est séparée dans le temps, l'antibiotique étant utilisé en premier. [0127] En particulier, lorsque la composition comprenant un bactériophage est utilisée en 13 combinaison avec une bactériocine, telle que la nisine, et un antibiotique, l'administration de ladite composition est séparée dans le temps, la composition comprenant un bactériophage étant utilisée en dernier lieu et la bactériocine et l'antibiotique étant utilisés de manière simultanée ou séparée. Brève description des dessins Fig. 1 [0128] [fig.1] Profil de digestion de l'ADN des phages 2 à 7 (notés P2 à P7) par EcoRI; Fig. 2 [0129] [fig.2] Illustration de l'appréciation de la lyse des phages : (-) pas d'activité, +, ++, +++, ++++; Fig. 3 [0130] [fig.3] Différence de la taille de plage de lyse entre le phage K (phage 1) et le phage 2 (CNCM I-5408) sur la souche bactérienne S. aureus 81; Fig. 4 [0131] [fig.4] Différence de la taille de plage de lyse entre le phage K (phage 1) et le phage 2 (CNCM I-5408) sur la souche bactérienne S. aureus Ulla.; Fig. 5 [0132] [fig.5]Différcnoe de la taille dc plage dc lyse entre le phage K (phage 1) ct le phage 2 (CNCM I-5408) sur la souche bactérienne S. aurcus E2V-A Fig. 6 [0133] [fig.6] Observation du phage K (phage 1) et phage 2 (CNCM I-5408) en microscopie électronique ; Fig. 7 101341 Ifie.71 Stabilité des phages en fonction du pH. Les phages sont dénombrés par la technique dc double couche à t=1 h; Fig. 8 [0135] [fie.81 Stabilité des phages en fonction de la température. Les phages sont dénombrés par la technique de double couche à t=lh ; Fig. 9 [0136] [fig.9] Suivi du développement des phages dans le milieu BHI en fonction du temps. Les phages sont dénombrés par la technique de double couche à t=0h, t=2h, t=4h, t=6h, t=8h et t=24h; Fig. 10 [0137] [fig.10] Suivi de la prolifération de S. aureus (DO à 600 nm en fonction du temps) dans le milieu BHI en fonction de la présence des phages 1 à 7 ou du mélange des phages 2, 3 et 7 ; Fig. 11 14 101381 Ifie.111 Suivi du développement des phages 1 à 7 dans le lait cru en fonction du temps. Les phages sont dénombrés par la technique de double couche à t=Oh, t=6h, t=8h et t=24h ; Fig. 12 101391 Ifie.121 Suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en fonction de la présence des phages 1 à 7 ou du mélange des phages 2, 3 et 7. Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker après Oh (t0), 6h (t 6h) et 24h (t 24h) d'incubation à 37°C ; Fig. 13 [0140] [fie.111 Suivi de la prolifération de S. aureus (mesure en continu de la DO à 600 nm en fonction du temps (min)) dans le milieu BHI en présence dc différentes concentration en nisine (composé A) (TM= bactéries sans nisine) ; Fig. 14 [0141] [fig.14] Suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en présence de la nisine (composé A) et d'un mélange des phages 2, 3 et 7. Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker après Oh (t 0), 6h (t 6h) et 24h (t 24h) d'incubation à 37°C. Fig. 15 [0142] [fig.15] Suivi de la prolifération de S. aureus (mesure en continu de la DO à 600 nm en fonction du temps (mm)) dans le milieu BHI en présence de différentes concentrations en lysozyme (composé B) (TM= bactéries sans lysozyme) ; Fig. 16 [0143] [fig.16] Suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en présence de la nisine à 0.2 mg/mL (composé A) et/ou de lysozyme à 0.5 mg/mL (composé B). Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker après Oh (t 0), 6h (t 6h) et 24h (t 24h) d'incubation à 37°C. Fig. 17 [0144] [fig.17] Suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en présence du mélange des phages 2, 3 et 7, ainsi que de nisine à 0.2 mg/mL (composé A) et/ou de lysozyme à 0.5 mg/mL (composé B). Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker après Oh (t 0), 6h (t 6h) et 24h (t 24h) d'incubation à 37°C. Fig. 18 [0145] [fig.18] Photos de boites de Pétri montrant la taille de la plage de lyse obtenue avec le phage 2 (CNCM I-5408) en combinaison avec AB9 (Cloxacilline à 1.25 mg/mL), (à gauche) ou AB10 (Oxytétracycline à 1.25 itg/mL) (à droite), et au centre une boite comprenant le phage 2 sans antibiotique. Fig. 19 [0146] [fig.19] Photos de boites de Pétri montrant la taille de la plage de lyse obtenue avec le phage 6 en combinaison avec AB9 (Cloxacilline à 1.25 pg/mL) (au milieu) par rapport à la plage de lyse obtenue avec le phage 6 seul (à gauche) ou AB9 seul (à droite). Fig. 20 101471 Ifie.201 Réduction du nombre de bactéries S. aureus par une combinaison phage 3/streptomycine. (B=bactéries, AB6=Streptomycine). Exemples [0148] 1. Isolement et caractérisation des phages [0149] 1.1. Isolement des phages [0150] Les phages spécifiques aux S.atiretis ont été isolés à partir de 286 échantillons provenant des milieux d'élevage de toute la France. Ces échantillons comprenaient 117 échantillons de laits crus, 45 échantillons de la peau de vache, 59 échantillons d'eau et 65 échantillons de fèces. Seuls les phages lytiques et naturels ont été recherchés. La présence des phages a été détectée par la méthode des spots en boîtes de Pétri. Il s'agit de déposer une goutte d'un échantillon sur la gélose de culture inondée préalablement avec une culture de la bactérie hôte en phase exponentielle. La présence de phages se traduit par l'apparition d'une zone de lyse autour du spot déposé. Ensuite, les échantillons à l'origine d'une lyse seront testés par la technique de la double couche. La culture de bactéries hôtes est mélangée avec l'échantillon dans un volume de gélose molle en surfusion puis additionnée de CaC12 ou/et de MgC12 (10mM). Ce mélange est versé à la surface d'une boîte de Pétri contenant une couche de gélose. La présence d'un phage est matérialisée par l'apparition d'une plage de lyse. Un repiquage des plages de lyse est ensuite effectué pour obtenir un seul phage isolé. L'étape de multiplication a été effectuée afin d'augmenter la concentration en phages en vue de leur caractérisation. [0151] Résultats [0152] 184 isolats de phages ont été isolés à partir de l'ensemble des échantillons. [0153] Les phages isolés ont été mis dans la culture pour la multiplication pour la caracté- risation. Après chaque cycle de la multiplication la présence de phage a été vérifiée par la méthode de spot. La concentration des phages isolés après la multiplication a été vérifiée par la technique de double couche. [0154] 1.2.Caractérisation des phages par les enzymes de restriction [0155] Après extraction et purification de l'ADN phagique, celui-ci a subi une digestion en- zymatique par EcoRl. La séparation est effectuée par électrophorèse en gel d'agarose. Les fragments de digestion sont révélés par une coloration au GelRed comme agent intercalant de l'ADN. [0156] Résultats 16 [0157] L'ADN de différents phages isolés a été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI (Figure 1). [0158] Les résultats de migration sur gel des fragments de digestion ont montré des profils de digestion différents selon les différents isolats. Cela démontre qu'il s'agit de phages différents. Les phages ayant le même profil ont été regroupés. Six profils ont été identifiés : phage 2, phage 3, phage 4, phage 5, phage 6 et phage 7. Pour la suite, pour chaque profil, un phage a été sélectionné pour la suite des tests afin d'étudier leur activité. [0159] Pour confirmer que ces phages sont différents à ceux publiés, la morphologie des phages est observée par microcopic électronique et le séquençage du génome est réalisé. [0160] Pour cela, les phages ont été cultivés avec une bactérie hôte de Staphylococus aureus . Cette culture de phage a été centrifugée à 10000g pendant 10 min. Le surnageant a été récupéré et filtré sur une membrane 0,22 p.m. Le surnageant a ensuite été traité par r ADNasc, ARNase (1 pg/mL) avant de faire l'extraction d'ADN des phages par un protocole du laboratoire en utilisant du phénol/chloroforme et de r isopropanol. [0161] L'ADN de phage a ensuite été séquence par la technologie NGS en PE 2 x 300 bp sur MiSeq system. [0162] 2. Activité et stabilité des pliages [0163] 2.1. Détermination du spectre d'activité des phages isolés [0164] Selon les profils de digestion, six phages ont finalement été sélectionnés pour tester leur activité sur différentes souches de S. aureus isolées à partir des échantillons d'élevage. [0165] L'activité des phages isolés est comparée celle du phage de référence qui est le phage K. [0166] Résultats [0167] Le spectre d'activité a été testé sur les 30 souches de S. aureus par la méthode de spot. L'intensité de lyse de ces phages sur chacune des souches de S. aureus est détaillée dans le tableau 1. Le tableau 1 représente donc le spectre d'activité des phages isolés sur les souches de S. aureus bovine. La lyse obtenue par la méthode de spot est noté de (-) = pas d'activité à (++++) = très active. [0168] 17 [Tableaux 1] Bac es Cocktail de 3 phages 3,et mtm N N N\N N N -.` - . ^.' '',. - N '. \ as.tet.\> \ :-stata. \ eakb.\>\. \ --- ,eet- \Net. N.,' et- "*.- in;.- "II'.-- N.-'.-- --- N.- ``,..- We W- ktkiuck«. "ileaMIM «"SMN- - - - - - - - ^7-%' t-%. \kt. ', ,CSI- \f,--^:'.`Sj.:.-\'`.. "\-1/4 \k'. 4.- - Z.4.9"..kke92 ktenk:\ %L.- \ate LtD \\*. Ak>, -41/4*.:kt Vehatea... \ .a. \ " \- - N.`'', `'.- ,-;.»,:\:.. z -.:::- ":":"..\ -,..----- "-,:e" `,.- b.... ,.......à....\ Nes-;. `'.- -.1.,R. a.',:,...):-:"».-\ \e k t \ \\.«,t 7e,',.:E-\-;"\kvar.w.':-: -,-%,kstat..- '-nea.aU MML-"1:"nZere7 ese,: \-e-i*,.:::,-.Nesta t. a r..(:.-Xelbl,.. .': natutu,,uuthr [0169] L'appréciation de l'intensité de lyse (de 0 (-) à ++++) est illustrée sur en Figure 2. La notation « C » signifie que quelques colonies sont observées dans la plage de lyse. [0170] Ces résultats montrent que : - Le phage K (ATCC 19685-B1) (phage 1) infecte 28 souches sur les 30 souches testées, soit 93 %. - Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5408 (phage 2) infecte 29 souches sur les 30 souches testées, soit 97% ; - Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5409 (phage 3) infecte 22 souches sur les 30 souches testées, soit 73% ; - Le bactériophage 4 infecte 25 souches sur les 30 souches testées, soit 83 % ; - Le bactériophage 5 infecte 14 souches sur les 30 souches testées, soit 47 % ; - Le bactériophage 6 infecte 14 souches sur les 30 souches testées, soit 47 % ; - Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5410 (phage 7) infecte 28 souches sur les 30 souches testées soit 93 % ; - Le cocktail des trois phages (2, 3 et 7) infecte 30 souches sur les 30 souches testées, soit 100% [0171] Le spectre d'activité du phage 2 (CNCM 1-5408) est le plus large et comparable au 18 phage K (phage référence). Cependant, le phage K ne peut pas infecter toutes les souches testées. En revanche, certains mélanges de bactériophages selon l'invention permettent d'infecter plus de souches de S. aureus que le phage K, voire 100% des souches de S. aureus testées. [0172] En particulier, il a été montré que le mélange des phages n'CNCM 1-5408 (phage 2), neCNCM 1-5409 (phage 3), et neCNCM 1-5410 (phage 7) permettait d'infecter la totalité des 30 souches, soit 100% des souches testées. [0173] Les phages selon l'invention ont un large spectre d'activité sur l'infection de souches de S. aureus et ont aussi été sélectionnées pour leur vitesse d'élimination de S. aureus (après 3 h d'incubation à 37°C en BHI). [0174] Différence entre le phage K (phage 1) et le phage 2 (CNCM 1-5408) [0175] Le phage K (noté phage 1 dans les figures) est utilisé comme phage de référence. Le phage 2 et le phage K ont leur spectre activité similaire, sauf leur infection sur la souche Q1 4b. Le phage 2 infecte cette souche de bactérie et non le phage K. [0176] D'autres caractéristiques permettent de distinguer l'activité du phage K de celle du phage 2, telle que la différence de la morphologie de la plage de lyse du phage 1 (phage K) et phage 2 sur la souche bactérienne de S. aureus 81. En effet, comme montré en Figure 3, la taille de la plage de lyse du phage K est plus large que celle du phage 2. [0177] Un autre exemple est la morphologie de la plage de lyse du phage 1 (phage K) et phage 2 sur les souches bactériennes de S. aureus U 1 la (Figure 4) et E2V-A (Figure 5). [0178] Le phage 2 et le phage K se distinguent également par rapport à leur morphologie observée en microscopie électronique comme montré en Figure 6. [0179] 2.2. Stabilité des phages [0180] Les expériences ont été réalisées avec la souche hôte de S. aureus (ATCC25923). Les bactéries se développent à 37°C en bouillon BHI (Brain Heart Infusion) composé d'extrait coeur-cervelle (17,5 g/L), peptone pancréatique de gélatine (10 g/L), chlorure de sodium (5 g/L), phosphate disodique (2.5 g/L), glucose (2 g/L). Les bactéries sont conservées à -80°C dans BHI contenant 15% (v/v) de glycérol. [0181] La concentration des phages est évaluée par la méthode de double couche. Cette méthode permet d'observer les plages de lyses révélant la présence de phages. Pour cela, 100 kit de la souche bactérienne hôte en début de phage stationnaire, 100 pL de l'échantillon à tester contenant par exemple le ou les phages à tester, ainsi que 20 mM de MgSO4 sont ajoutés dans 3 mL de BHI semi solide (0,4% d'agar) stocké à 46°C. Ce mélange est ensuite étalé uniformément sur une boite de gélose de BHI solide 1% d'agar. Après une incubation de 18 h à 37°C, le nombre de phage est estimé par le nombre de plages PFU (Plaque formation unité)/mL sur boite. Les échantillons sont 19 dilués dans du tampon SM composé de NaCI (100 mM), MgSO4(7FL0) (8 mM), Tris HCI pH 7,5 (50 mM), gélatine 0,002%. [0182] L'activité antibactérienne d'un phage ou d'un mélange (cocktail) de phage peut être évaluée par le suivi de la densité optique (DO) au cours du temps à 600 nm. Pour cela, une culture de bactérie hôte (S. atireus) à la phase exponentielle est incubée avec les phages. La concentration de bactéries est de 106UFC/mL et les phages ont été ajoutés à 107UFP/ml. Le ratio de phages/bactéries est : 1/10. Le suivi de la DO à 600 nm est réalisé avec l'aide d'un spectromètre pendant 24 h à 37°C (température pour les bactéries S.aureus). Si la DO de la culture de bactéries incubées avec les phages est diminuée par rapport à une culture témoin comprenant seulement les bactéries, cela signifie que le phage ou mélange de phages peut inhiber la croissance bactérienne de S. aureus. [0183] L'activité antibactérienne d'un phage ou d'un mélange (cocktail) de phage peut également être évaluée par le dénombrement des bactéries sur un milieu spécifique, la gélose Baird Parker (milieu à pH 6,8 ± 0,2 composée de tryptone (10 g/L), d'extrait de viande de boeuf (5 g/L), d'extrait de levure (1g/L), de pyruvatc de sodium (10 g/L), de glycocolle (12 g/L), de chlorure de lithium (5 g/L), agar (20 g/L)). Pour cela, à différents temps d'expérience, 1 mL de milieu expérimental est prélevé. Une série de dilution de 1/10 est réalisée. 1001.1L de chaque dilution est étalé sur la gélose Baird Parker pour visualiser les colonies de S.aureus. Après 48 h d'incubation à 37°C, le nombre de bactéries est traduit par le nombre de colonies de S.aureus sur le milieu Baird Parker. En tenant compte de la dilution et du nombre de colonies sur la gélose, le nombre de bactéries contenues dans un ml est calculé. En comparant la concentration de bactéries d'une culture TM (sans phage) et celle de la culture avec des phages, il est possible d'estimer la capacité du phage ou du mélange de phages à réduire la population de bactéries. [0184] 2.2.1. Stabilité des phages à différents pH [0185] Les 6 phages phage 2 (n°CNCM 1-5408), phage 3 (n°CNCM 1-5409), phage 7 (n°CNCM 1-5410), phage 4, phage 5 et phage 6, ont été sélectionnés pour tester leur stabilité à différents pH. Les résultats sont comparés avec le phage K (phage 1). [0186] Les phages à une concentration initiale de 10 UFP/ml (unité formatrice de plaque) ont été incubés pendant 1 heure à températures à 37°C, à différents pH : 3 ; 3.5, 4.5, 5.5; 6.5; 7,8 et 9. [0187] La concentration des phages a alors évaluée par la technique de la double couche, pour évaluer l'effet du pH sur l'activité des phages (Figure 7). [0188] Les résultats en Figure 7 montrent que la concentration de tous les phages est maximale de pH 4.5 à 9.0, ils ont conservé leurs concentrations initiales. En revanche une réduction de la concentration de phages a été observée au pH 3,5 et au pH 3. Les phages 2 (CNCM 15408), 3 (CNCM 1-5409) et 7 (CNCM 1-5410) sont les plus stables à pH 3,5, en particulier le phage 3. Tous les phages sont inactivés à pH 3, à l'exception du phage 3qui résiste à un pH 3.0, cependant une réduction de sa concentration initiale de quasiment 6log est observée. Parmi les phages selon l'invention, les phages 2 (CNCM 1-5408) et 3 (CNCM 1-5409) sont donc plus stables à pH acide. Il est également important de noter qu'à pH 3.5, les phages 2 (CNCM 1-5408) et 3 (CNCM 1-5409) conservent une bonne stabilité contrairement au phage K de référence. [0189] Le pH de l'estomac étant entre 2 et 5, dans le cadre d'une administration par voie orale, il est important que les phages soient stables à des pH acides. [0190] 2.2.2. Stabilité des pliages à différentes températures [0191] Les 6 phages phage 2 (n"CNCM 1-5408), phage 3 (n"CNCM 1-5409), phage 7 (n'CNCM 1-5410), phage 4, phage 5 et phage 6, ont été sélectionnés pour tester leur stabilité à différentes températures. Les résultats sont comparés avec le phage K (phage 1). [0192] Les phages à une concentration initiale de 107 UFP/ml, ont été incubés pendant 1 heure à différentes températures : 20°C ; 30°C ; 37°C, 45°C, 55 °C, 60 °C et 65°C. [0193] La concentration des phages a alors évaluée par la technique de la double couche pour évaluer l'effet du pH sur l'activité des phages (Figure 8). [0194] Les résultats en Figure 8 montrent que la concentration de tous les phages est maximale de 30°C à 45°C. Ils conservent leurs concentrations initiales, ce qui indique qu'ils sont stables à ces températures. A 55°C, une diminution de la concentration des phages 3 (CNCM 1-5409), 4 et 5 a été observée (respectivement 2 log, 2.5 log et 2log). Cependant, à une température de 60°C, la concentration des phages 1 et 2 (CNCM I5408) est réduite de 2 log par rapport à leur concentration initiale, contrairement au phage 3 (CNCM I-5409) pour lequel la concentration initiale est réduite de 6 log par rapport à la concentration initiale. Les phages 4 et 5 sont complètement inhibés. Enfin, à une température de 65°C tous les phages sont désactivés, à l'exception des phages 6 et 7 (CNCM 1-5410). [0195] La Figure 8 permet également de constater que les températures optimales des phages sont de 30 à 45°C. Les phages 1,2 (CNCM 1-5408) et 3 (CNCM I-5409) sont résistants jusqu'à une température de 60°C, contrairement aux phages 4 et 5. Les phages 2 (CNCM 1-5408) et le phage 3 (CNCM 1-5409) sont les plus stables à des températures élevées. [0196] La température corporelle des mammifères étant très variable, par exemple 37°C pour l'Homme, 39°C pour les ovins et les bovins, il est important que les phages soient stables sur une large gamme de température. [0197] 2.2.3.Activité des phages dans le BHI [0198] 2.2.3.1. Prolifération des phages dans le milieu BHI 21 [0199] Afin de comparer l'activité entre les phages en milieu BHI, la prolifération des phages (concentration initiale de 107 UFP/ml) a été étudiée au cours du temps à 37°C. La concentration des phages a été évaluée par la technique de double couche à T=Oh, 2h, 4h, Rh et 24h. L'objectif est de trouver le ou les phages ayant la concentration la plus élevée au cours du temps. [0200] La Figure 9 montre qu'après R h d'incubation, la concentration du phage 3 (CNCM I- 5409) et du phage 5 est plus élevée que celle des autres phages (1010UFP/mL) par comparaison avec le phage 1 et le phage 2 (CNCM 1-5408) (10g UFP/mL environ). [0201] 2.2.3.1. Réduction des bactéries par des pliages dans le milieu BHI [0202] La réduction des bactéries (concentration initiale 106UFC/m1) par les phages en milieu BHI (concentration initiale de 107 UFP/ml) a été étudiée par suivi de la densité optique de la culture bactérienne à 600 nm (Figure 10). La concentration des bactéries est proportionnelle avec la densité optique dans une gamme de concentrations. La réduction de la densité optique reflète la capacité d'inhiber le développement bactérien. [0203] La Figure 10 montre une différence significative en milieu BHI entre le témoin (culture sans phages) et la culture en présence des phages. Les bactéries dans la culture témoin se développent rapidement dès les premières heures et atteignent une phase stationnaire après 8h d'incubation (DO environ 2,2). Le développement des bactéries est inhibé par l'ensemble des phages. Le phage 1, le phage 2 (CNCM 1-5408) et le mix des phages 2, 3 et 7, inhibent complètement la croissance bactérienne pendant les premières heures. L'activité du phage 3 est similaire à celle du phage 6 (résultat non présenté) et l'activité du phage 4 est similaire à celle du phage 7 (résultat non présenté). [0204] Pour obtenir la meilleure inhibition du développement de S. aureus en milieu BFII, l'utilisation du mélange des phages 2 (CNCM 1-5408), 3 (CNCM 1-5409) et 7 (CNCM I-5410) est la plus efficace. [0205] 2.2.4. Activité des phages dans le lait cru [0206] L'activité des phages a été ensuite étudiée dans le lait cru afin d'évaluer leur ef- ficacité dans le milieu de la lactation. [0207] Le lait cru a été tout d'abord contaminé artificiellement par les bactéries de S. aureus à une concentration d'environ 106UFC/mL Les phages ont été ajouté à 107UFP/mL (M.O.I=10). [0208] La concentration en phages a été évaluée au cours du temps par la méthode de double couche à T=Oh, 6h, 8h et 24h (Figure 11). [0209] Les bactéries ont été dénombrées sur milieu Baird Parker à T=Oh, 8h et 24h (Figure 12). [0210] 2.2.4.1. Prolifération des phages dans le lait cru [0211] Par rapport au milieu BHI, la prolifération des phages est plus limitée dans le lait cru. La concentration des phages est stable pendant les 8 premières heures, puis diminue légèrement pour certains phages après 24h d'incubation (Figure 11). Toutefois, une différence entre les phages a été observée. Les phages 3 (CNCM 1-5409) est le phage le plus stable dans le lait cru. En effet, après 24h d'incubation, la concentration la plus élevée est observée pour ce phage. Une concentration tout aussi élevée après 24h d'incubation est également observée pour le mélange de phages 2 (CNCM 1-5409), 3 (CNCM 1-5410) et 7 (CNCM 1-5410). [0212] 2.2.4.2. Réduction des bactéries par des phages dans le lait cru [0213] En milieu BHI, l'ajout des phages permet de réduire complétement les bactéries. Dans le lait cru, une plus faible réduction des bactéries est observée (Figure 12). L'ajout individuel des phages ne permet pas de réduire significativement la concentration bactérienne, y compris l'ajout du phage K de référence. Seul l'ajout du cocktail de phages 2, 3 et 7 permet d'avoir une forte réduction (environ 4 log) de la concentration bactérienne. L'effet sur la réduction de la population bactérienne de S. aureus dans le lait cru est plus importante avec l'ajout d'un mélange comprenant les phages 2 (CNCM 1-5408), 3 (CNCM 1-5409) et 7 (CNCM 1-5410) qu'avec l'ajout individuel de ces mêmes phages, ou encore que l'ajout du phage K (phage 1) seul. [0214] 3. Combinaison des phages avec la nisine [0215] 3.1. Activité anti- S. aureus de la nisine [0216] La CMI (concentration minimale inhibitrice) de la nisine a été évaluée. Pour cela, la nisine (seule) a été ajoutée dans une culture de bactéries en BHI à différentes concentrations : 0.025 mg/mL, 0.05 mg/mL, 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL et 0 3 mg/mL [0217] La croissance de S. aureus en milieu BHI (concentration initiale 106UFC/m1), a été suivi au cours du temps par DO à 600 nm, en présence des différentes concentrations en nisine (composé A) (Figure 13). [0218] La Figure 13 montre que la croissance bactérienne est inhibée complétement à une concentration de 0,3 mg/mL La concentration de la nisine, la plus faible (0,025 mg/ mL) n'a pas d'effet sur la croissance des bactéries. [0219] La concentration en nisine de 0,1 mg/mL et 0,2 mg/mL peuvent inhiber partiellement la croissance bactérienne. La concentration de la nisine de 0,2 mg/mL a été choisie pour une utilisation en combinaison avec des phages [0220] 3.2. Activité de la combinaison phage et nisine [0221] Le lait cru a été tout d'abord contaminé artificiellement par des bactéries de S. aureus à une concentration de 106UFC/mL La nisine a ensuite été ajoutée dans le lait à une concentration de 0,2 mg/mL, et le cocktail de phages 2, 3 et 7 à une concentration de 10' UFP/mL (ratio des phages dans le cocktail 1 :1 :1) (ratio phages/bactéries (M.O.I) =10). [0222] Les bactéries ont été dénombrées sur milieu Baird Parker à T=Oh, T=6h et T=24h 23 pour suivre la réduction de la bactérie S. aureus dans le lait cru en présence de la nisine et/ou des phages (Figure 14). [0223] La Figure 14 montre que lorsque la nisine est ajoutée seule dans le lait, l'effet in- hibiteur sur la bactérie dans le lait cru est observé à la concentration de 0,2 mg/mL. Une réduction d'environ 0,5 log est observée après 6 h et une réduction de 2.3 log après 24h. [0224] Lorsque le cocktail de phages 2 (CNCM 1-5408), 3 (CNCM 1-5409) et 7 (CNCM J- 5410) est ajouté seul dans le lait, il permet d'avoir une réduction de la concentration bactérienne d'environ 4 log après 24h d'incubation. [0225] Lorsque les phages sont ajoutés dans le lait en combinaison avec la nisinc, un effet synergique est observé. En effet, de manière inattendue, une réduction de la concentration bactérienne d'environ 6 log est obtenue après 6 h d'incubation, et une réduction d'environ 6,5 log est obtenue après 24 h. [0226] 4. Combinaison des phages avec le lysozyme [0227] La CMI (concentration minimale inhibitrice) du lysozyme a été évaluée. Pour cela, le lysozyme (seul) a été ajouté dans une culture de bactéries en BHI à différentes concentrations : 0.625 mg/mL, 1.25 mg/mL, 1.85 mg/mL et 2.5 mg/mL. [0228] La croissance de S. aureus en milieu BHI (concentration initiale 106UFC/m1), a été suivie au cours du temps par DO à 600 nm, en présence des différentes concentrations en lysozyme (composé B) (Figure 15). [0229] La Figure 15 montre que la croissance bactérienne est inhibée en présence d'une concentration de lysozyme de 0,625 mg/mL [0230] 5.Combinaison des phages avec la nisine et le lysozyme [0231] Le lait cru a été tout d'abord contaminé artificiellement par des bactéries de S. aureus à une concentration d'environ 106UFC/mL Ensuite, la nisine (composé A) a ensuite été ajoutée dans le lait cru à une concentration de 0,2 mg/mL, et/ou le lysozyme (composé B) à une concentration de 0.5 m/mL, et/ou le cocktail de phages 2, 3 et 7 à une concentration de 10 UFP/mL (ratio des phages dans le cocktail 1 :1 :1) (ratio phage/bactérie (M.O.I) =10). [0232] Les bactéries ont été dénombrées sur milieu Baird Parker à T=Oh, 8h et 24h d'incubation à 37°C. [0233] La Figure 16 représente l'effet de la nisine et/ou du lysozyme sur la concentration de bactérie S. aureus dans le lait cru. [0234] La Figure 17 représente l'effet de la nisine et/ ou du lysozyme en présence du cocktail de phages 2, 3 et 7 sur la concentration de bactéries S. aureus dans le lait cru. [0235] La présence du lysozyme (Composé B) à 0,5 mg/mL a montré un faible effet sur le développement de la souche de S. aureus testée. Le fait de combiner le lysozyme avec le cocktail de phages 2, 3 et 7 a peu amélioré l'inhibition du développent des bactéries 24 dans le lait cru. [0236] Comme observé précédemment, la nisinc (composé A) permet d'obtenir une in- hibition du développement bactérien. Cette inhibition est accrue en présence du cocktail de phages 2, 3 et 7. [0237] Cependant, un effet antibactérien très surprenant a été observé lorsque les phages étaient combinés avec la nisinc (composé A) et le lysozyme (composé B). En effet, avec cette combinaison la population de S. aureus est drastiquemcnt diminuée. Cet effet sur le développement de S. aureus est supérieur à l'effet obtenu séparément avec la nisine, le lysozyme et les combinaisons nisinc/phagcs et lysozyme/phages. En combinant le cocktail de phages 2, 3 et 7 avec la nisinc et le lysozyme une très faible quantité de bactéries est détectée. A noter même que pour certains réplicas de cette expérience, l'absence de bactéries a été observée après 24 h. [0238] 6. Combinaison des phages avec des antibiotiques [0239] 6.1. Etude de l'effet de la combinaison phages/antibiotiques [0240] Pour étudier l'effet de la combinaison des phages avec des antibiotiques sur le déve- loppement de S. aureus, le titre de phages a été réalisé en présence de différents antibiotiques (AB) à différentes concentrations (mg/rnL) : Tétracycline (AB1), Gentamycinc (AB2), Chloramphénicol (AB3), Kanarnycinc (AB4), Ampicilline (AB5), Streptomycine (AB6), Cloxacilline (AB9), Oxytétracycline (AB10), Erythromycine (AB11). Les phages ont été ajoutés à une concentration de 107phages/mL dans une culture de la bactérie S.aureus. [0241] La technique de la double couche est réalisée pour chaque culture : phages sans AB, phages+AB. Pour cela, les 100 pl contenant le phage contiennent également l'antibiotique à une concentration donnée dans le BHI. Après 24h d'incubation à 37°C, la taille de la plage de lyse et le nombre de plages de lyse obtenus sont comparés entre la condition sans AB (témoin) et la condition avec AB. Le nombre de plages de lyse reflète le nombre de phages. [0242] L'étude a été réalisée avec le phage 3 (CNCM 1-5409). Les résultats sont rapportés dans le tableau 2. [0243] Tablcaux21 Effet5w flaHI B1 O2Spjrn pas 1tet pas Uee ABî 0,2 pas l'a336.3 pas P3P63a3 Bi a 2 Ce53 [0244] Une taille de plages de lyse plus grande que le témoin (TM) et/ou un nombre de plages plus élevé traduisent un meilleur effet de la combinaison antibiotique /phage 3. [0245] Après avoir testé 9 antibiotiques, une différence au niveau de la taille de plages est observée pour trois antibiotiques : AB9 (Cloxaciline), AB6 (Streptomycines) et AB10 (Oxytétracyclinc). La taille des plages pour le phage 3 est plus importante lorsqu'est ajouté l'AB 9, l'AB 10 ou l'AB6. [0246] Par la suite, les antibiotiques Cloxacillinc (AB9), Oxytétracycline (AB10) et Strep- tomycine (AB6) ont été testés sur les phages 1 à 7 (Tableau 3). De la même manière que précédemment, la taille des plages de lyse a été observée, de même que le nombre de plage de lyse obtenu. [0247] [Tableaux3] spent Tag 2:3-3e3,3' p33 «eus rt3fe pas 'n3 plkie:j3.1e,3e3 mcfls enet OrÉcrias ,-.tegrei {E.513e, 334:L BA 0,253466L ABB 0,1253.4g6t3L. -*Ba tepflac - *Sale - R A8102 &wirnL tRIO ,25Wres3.. 0 0,G263.3atmL 2::Bgehr, pas pas weget -wwwïe.seematee. etrety AEY 225 :3e5'- 7.5 aa pas 2E5e! Tallfs de pf a9es en present z rie I Asia31,z ::3-35,3' 333,33:.a. a.-343affl^ ' Nt31/4.:4yer, 26 [0248] Un effet sur la taille des plages de lyse est observé pour quasiment tous les phages en combinaison avec AB9 (Cloxacillinc) ou AB10 (Oxytétracycline) ou AB6 (Streptomycine). [0249] A titre d'exemple, la Figure 18 montre la taille de la plage de lyse obtenue avec le phage 2 (CNCM I-5408) en combinaison avec AB9 (Cloxacillinc) (à gauche) ou AB10 (Oxytétracycline) (à droite). [0250] La Figure 19 montre la taille de la plage de lyse obtenue avec le phage 6 en com- binaison avec AB9 (Cloxacillinc) (au milieu) par rapport à la plage de lyse obtenue avec le phage 6 seul (à gauche) ou AB9 seul (à droite). [0251] Concernant le nombre de plages, l'effet maximum (nombre de plages le plus élevé) est obtenu avec le phage 2 et le phage 3 respectivement combiné avec AB9 (Cloxacilline), avec le phage 2 et le phage 7 respectivement combiné avec AB10 (Oxytétracycline), et avec le phage 2 et le phage 4 respectivement combiné avec AB6 (Streptomycine). [0252] 7. Réduction du nombre de bactéries S. aureus dans la lait cru par une com- binaisons phages/antibiotiques [0253] 20 mL de lait cru ont tout d'abord été contaminé artificiellement par des bactéries de S. aureus à une concentration de 106UFC/mL. Les phages (ou cocktail de phages) sont ensuite ajouté à une concentration de 107 UFP/mL. L'AB est ajouté à la concentration de 50 pg/mL. [0254] La concentration des bactéries est mesurée en début d'expérience à t=0 (moment d'ajout des phages), puis après 24 h et 48h d'incubation à' 37°C. Le nombre de bactéries est évalué par la méthode d'étalement sur boite de gélose Baird Parker. [0255] La Figure 20 montre l'effet d'une combinaison phage 3/streptomycine (AB6) sur la population de S. aureus dans le lait cru. [0256] Dans le témoin (bactéries seules (B)), les bactéries se développement pendant 48h et la concentration de bactéries est de 7 log et 8 log environ, respectivement après 24h et 48h. [0257] L'ajout des phages permet de réduire le nombre de bactéries de 2 log après 48h d'incubation. [0258] L'ajout de streptomycine (AB6) permet de réduire le nombre de bactéries après 24h d'incubation mais la population bactérienne n'est pas désactivée par l'antibiotique. Cette population se développe et le nombre de bactéries est important après 48h - environ 6 log). Ce phénomène correspond à la mutation de la bactérie par rapport à l'antibiotique. [0259] Lorsque les phages sont combinés avec l'antibiotique, aucune bactérie n'est détectée après 24h et 48h. Cela montre une synergie de la combinaison phage/antibiotique sur la réduction des bactéries dans le lait cru. De plus, présence des phages permet de réduire 27 le phénomène de la résistance des bactéries à l'antibiotique. 8. Test d'évaluation de l'activité anti- S. aureus d'une souche de bactériophage [0260] Afin de d'établir la capacité d'un bactériophage phage ou d'un mélange de bacté- riophages, à inhiber le développement de S. aureus, une culture de bactérie hôte (S. aureus) à la phase exponentielle est incubée avec le bactériophage. Le ratio de phages/ bactéries est peut-être testé : 1/100 ; 1/10 ou 1 ou 10. Le suivi de la densité optique (OD ou DO) à 600 mn est réalisé pendant 24 h à 37°C, à raison d'une mesure toutes les 15 min. La croissance de la S. aureus est proportionnelle avec la DO de la culture bactérienne. [0261] En parallèle, une culture témoin correspondant à une culture de S. aureus seul (sans phage), est réalisée. [0262] Si la DO de la culture de S. alunis incubée avec la souche de bactériophage diminue d'au moins 50% après 8h et 18h d'incubation par rapport au témoin, cela signifie que la souche de bactériophage inhibe la croissance de S. aureus. Références à du matériel biologique déposé [0263] Dans la présente demande, il est fait référence aux souches de bactériophages suivantes, toutes déposées à la CNCM le 21 Mars 2019 par Vetophage SAS, dont l'adresse est ENS Lyon, 46 Allée d'Italie -Bat. LR6, 69364 Lyon Cedex 07 : - phage 2, référence d'identification auprès de la CNCM « Vctophage - phi 2 dont le numéro d'enregistrement est « 1-5408 »; - phage 3, référence d'identification auprès de la CNCM « Vctophage - phi 3 dont le numéro d'enregistrement est « 1-5409 »; et - phage 7, référence d'identification auprès de la CNCM « Vctophage - phi 7 dont le numéro d'enregistrement est « 1-5410 ». Liste des documents cités 102641 A toute fin utile, les publications suivantes sont citées dans la présente demande : Fiorentin, L., Vieira, N. D. and Barioni, W., Jr. (2005) 'Oral treatment with bacteriophages reduces the concentration of Salmonella Ente ritidis PT4 in caecal contents of broilers', Avian Pat hology 34(3): 258-63. Bosquet G., Faroult B.. Labbé .IF., Le Page P., Sérieys F., 2013. Référentiel Vé- térinaire 2013 pour le traitement des mammites bovines. Paris : SNGTV. 100p Gill, J. J., P. M. Sabour, et al. (2006a). "Bovine whey proteins inhibit the interaction of Staphylococcus aureus and bacteriophage K." Journal of Applied Microbiolo2y 101(2): 377-386. Hi22ins, J. P., Andreatti Filho, R. L., Higgins, S. E., Wolfenden, A. D., Tellez, G. and Hargis, B. M. (2008) 'Evaluation of Salmonella-lytic propertics of bactcriophages isolatcd from commercial broder bouses', Avian Diseases 52G): 139-42. 28 Lcc, Y.-D. and Park, J.-H. (2015) 'Characterization and application of phages isolated from sewage for reduction of Escherichia cou i 0157:H7 in biofiltni, LliVT - Food Science and Technology 60(1): 571-577. Ly-Chatain, M. H. (2014) 'The factors affccting effectiveness of treattnent in phages therapy'. Front Microbiol. 5: 51. O'Flahcrty, S., Coffcy, A., Mcancy, W. J., Fitzgerald, G. F. and Ross, R. P. (2005) Inhibition of bactcriophage K proliferation on Staphylococcus aureus in raw bovine milk', Le/ter in Applied Microbiolagy 41(3): 274-9. O'Flahcrty, S., Ross, Meaney, W.,Fitzgerald, G.F., Elbrcki, M.F. and Coffcy, A. (2005) Potential of the polyvalent anti-Staphylocaccus bacteriophage K for the control of antibiotic-resistant staphylococci from hospitals. Appl Environ Microbiol 71,1836-1842. 29 [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6] [Revendication 7] [Revendication 8] [Revendication 9] REVENDICATIONSComposition comprenant une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I5409 et CNCM 1-5410. Composition selon la revendication I. comprenant en outre au moins une souche de bactériophage choisies parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409 et CNCM 1-5410. Composition selon la revendication I ou 2, comprenant les trois souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409 et CNCM I-5410. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, pour son utilisation comme médicament. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une infection par Staphylococcus aureus chez l'Homme. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, pour son utilisation selon la revendication 8, dans laquelle ladite infection par Staphylococcus aureus est la mammite chez le mammifère domestique allaitant, en particulier la vache, la brebis, la chèvre, la bufflonne ou la charnelle. Composition pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle ladite composition est utilisée en combinaison avec une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique. Souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I5409. Souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I5410.