FR 3096465 A1 20201127 FR 1905358 A 20190522 Description Titre de l'invention : UTILISATION DES PROTEINES PD-1 ET CD38 COMME MARQUEURS D'UNE PATHOLOGIE AUTO- IMMUNE ACTIVE Domaine technique 100011 La présente invention se rapporte à un procédé de diagnostic, de prédiction et/ou de pronostic d'une pathologie auto-immune active chez un sujet, comprenant la mesure des quantités de certaines protéines dans un échantillon biologique du sujet, ainsi qu'à certaines utilisations de ces protéines. 100021 Dans la description ci-dessous, les références entre crochets (I 1) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique [0003] L'hépatite auto-immune (HAI) est une maladie chronique du foie dont les mé- canismes immunologiques restent inconnus. C'est une maladie rare avec une incidence de 1.1 à 1.9 cas par 100000 personnes par an en Europe, caractérisée par une attaque du parenchyme hépatique par les cellules du système immunitaire de type lymphoïde (Liberal et al. : Cutting edge issues in autoimmune hepatitis. J. Autoimmun (2016) 75, 6-19 ([1D). [0004] Le diagnostic d'une HAI est souvent long à être posé. Il repose, comme pour les autres maladies auto-immunes du foie, sur l'élimination d'autres causes, sur des tests biologiques et biochimiques sanguins peu spécifiques (élévation des transaminases, absence d'hépatite virale, présence d'auto-anticorps et. une hyper gammaglobulinémie) et sur la lecture histologique de biopsie hépatique. Dans les autres cas de désordre auto-immun hépatique ou non, le diagnostic est basé sur les symptômes, la présence ou non d'auto-anticorps et sur la lecture histologique du tissue touché. Le suivi de la réponse aux traitements est généralement basé sur l'amélioration des symptômes, la régulation des paramètres biologiques et éventuellement sur la lecture histologique de biopsie des tissues touchés. [0005] Le traitement associant corticoïdes et azathioprine, inchangé depuis plus de 30 ans (Manns et al. : Diagnosis and management of autoimmune hepatitis. Hepatol. Baltim. Md 51, 2010, 2193-2213 ([2])), vise à contrôler l'inflammation pour éviter la progression vers la fibrose hépatique. Cette immunosuppression non sélective est suffisante pour induire une rémission complète chez 70% des patients la première année. Les recommandations européennes préconisent de tenter d'arrêter l'azathioprine après 2 ans de rémission complète pour limiter les effets néfastes de ceci à long terme (European Association for the Study of the Liver (2015). EASL Cl inical Practice 2 Guidelines: Autoimmune hcpatitis. J. Hepatol. 63, 971-1004 ([3])) ; toutefois le risque de rechute est élevé et concerne 60 à 80 % des patients dans les six à douze mois suivant l'arrêt du traitement (Manns et al., 2010 ([2])). L'état de rémission clinique complète repose actuellement sur des tests biologiques et biochimiques, notamment par une normalisation des transaminases et des IgG sanguins, qui ne prédisent pas le risque de rechute. [0006] Une meilleure compréhension/caractérisation de la réponse immune dans l'HAI serait utile pour prédire le risque de rechute, mais aussi pour identifier les protagonistes immunologiques impliqués dans la pathogénèse de cette maladie. [0007] Les lymphocytes T CD4 (LT CD4) et les LT CD8 ont été décrits comme fortement impliqués dans l'attaque du parenchyme hépatique dans l'HAI. Ils sont largement représentés au niveau de l'infiltrat inflammatoire portal et intra lobulaire. Toutefois, la relation entre les acteurs immunologiques impliqués et l'évolution de la maladie n'est pas encore connue (Libcral et al., 2016 ([1])). [0008] Récemment, ont été mises en évidence des altérations lymphocytaires sanguines au diagnostic, qui persistent lors de la phase de rémission sous traitement (Rcnand et al., : Immune Alterations in Patients With Type 1 Autoimmunc Hepatitis Pcrsist Upon Standard Immunosuppressive Treatment. Hepatol. Commun. (2018) 2, 968-981 ([4])). Cependant certaines de ces altérations lymphocytaires étaient retrouvées chez des patients atteints de steatohépatite dysmétabol igue (NASH), et semblaient donc refléter l'inflammation hépatique non spécifique (Wittcher et al. : MATI cells are chronically activated in patients with autoirnmune liver disease and promote pro-fibrogenic hepatic stellate cell activation. Hepatol. Baltim. Md, 2018 ([5]); JetTery et al. : Biliary epithelium and liver B cells exposed to bacteria activate intrahepatic MATI cells through MR1. J. Hepatol., 2016, 64, 1118-1127 ([6]); Oo et al.: CXCR3-dependent recruitment and CCR6-mediated positioning of Th-17 cells in the infiamed liver. J. Hepatol. 57, 1044-1051, 2012 ([7])). Par ailleurs, des cas d'inflammation hépatique non virale (comme la NASH) avec des signes d'auto-immunité (présence d'auto-anticorps sanguins chez 10% des patients NASH) sont répertoriés, mais ne font pour l'instant l'objet d'aucun traitement spécifique. [0009] Ainsi, il existe un réel besoin d'identifier une signature spécifique de l'auto-immunité hépatique, notamment pour en améliorer le diagnostic ou la prise en charge clinique et thérapeutique. [0010] Description de l'invention [0011] Au terme d'importantes recherches, les inventeurs sont parvenus à résoudre ce problème technique. [0012] De manière surprenante, les inventeurs ont en effet mis en évidence une signature spécifique de l'atteinte auto-immune hépatique. 3 [0013] Les inventeurs ont en effet démontré, par cytométrie en flux sur des lymphocytes T (CD3+) sanguins, que la détection des marqueurs PD-1 (Programmcd ccli dcath 1) et CD38, éventuellement en association avec les marqueurs CD3, CD4, CD8, CD45RA, CXCR5, CD127 et CD27, met en évidence une signature auto-immune hépatique. Cette signature auto-immune permet avantageusement de discriminer les patients ayant une hépatite auto-immune active (HAÏ) des patients ayant une inflammation hépatique non-auto- immune (NASH). [0014] Les avantages de l'invention sont nombreux. [0015] Par exemple, l'invention peut permettre de réduire le temps de diagnostic en apportant de nouvelles informations complémentaires à celles classiquement obtenues. [0016] L'invention a également pour avantage de fournir un moyen permettant une meilleure orientation et/ou une confirmation du diagnostic, notamment dans des cas atypiques (forme séronégative, sans autoanticorps) d'HAL [0017] L'invention peut en outre permettre d'évaluer l'activité auto-immune chez les patients. Une meilleure prise en charge des patients peut donc être avantageusement envisagée, avec par exemple un aménagement ou non du traitement proposé. [0018] Avantageusement, l'invention est applicable aux autres désordres auto-immuns hé- patiques et non-hépatiques qui sont confrontés à la même problématique. [0019] En outre, l'invention permet avantageusement de mettre en évidence parmi des patients ayant une inflammation hépatique un sous-groupe de patients ayant une auto-immunité hépatique associée. Une amélioration de leur prise en charge clinique et thérapeutique est donc avantageusement envisagée. [0020] Avantageusement, l'invention permet une évaluation simplifiée de l'activité auto- immune chez un patient, puisqu'elle peut être réalisée par la détection d'une signature auto-immune selon l'invention dans le sang du patient, par exemple au moyen d'une simple prise de sang. [0021] L'invention permet en outre de manière avantageuse de mesurer dans le sang l'activité des lymphocytes T qui sont les acteurs principaux de l'auto-immunité. Cette méthode est moins invasive pour le patient qu'une biopsie, et permet d'apporter une plus-value aux tests biologiques déjà connus. En outre, le fait de mesurer directement l'activité des protagonistes de la pathologie dans le sang apporte, de manière avantageuse, une meilleure sensibilité et éventuellement un complément dans le cas des diagnostic et suivi atypiques, comme par exemple dans les formes séronégatives ou à faible infiltrat lymphocytaire du tissu. [0022] Ainsi, un premier objet de l'invention se rapporte à un procédé de diagnostic, de prédiction et/ou de pronostic d'une pathologie auto-immune active chez un sujet, comprenant la détection de la co-expression des protéines PD-1 et CD38 à la surface des lymphocytes T dans un échantillon biologique du sujet. [0023] Selon l'invention, la pathologie auto-immune active peut être toute pathologie auto- immune connue. Il peut notamment s'agir d'une pathologie auto-immune choisie parmi une hépatite auto-immune, une cholangitc biliaire primitive, une cholangitc sclérosante primitive, le diabète de type 1, la sclérose en plaques, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus, et une vascularitc ou une toxicité immunologique liées aux immunothérapies dans le traitement du cancer. Préférentiellement, la pathologie auto-immune active est une hépatite auto-immune. Par exemple, le sujet chez qui le diagnostic, la prédiction et/ou le pronostic est recherché peut être un patient ayant une inflammation hépatique. [0024] On entend par « diagnostic », au sens de la présente invention, la mise en évidence d'une auto-immunité chez des patients. Cette mise en évidence peut avantageusement permettre d'en déduire ou de confirmer une atteinte du patient par une HAÏ, ou de mettre en évidence une atteinte auto-immune dans le cadre d'une pathologie à dominante non-auto-immune. Par exemple, le diagnostic peut être réalisé sur des formes atypiques d'HAI, par exemple une forme séronégative, c'est-à-dire sans autoanticorps, et/ou avec peu ou pas d'infiltrat lymphocytaire du tissu hépatique. Dans un autre exemple, le diagnostic peut être une discrimination des patients ayant une hépatite auto-immune des patients ayant une steatose hépatique non-alcoolique (NASH), ou encore une mise en évidence d'une auto-immunité hépatique chez les patients atteints de NASH. [0025] On entend par « prédiction », au sens de la présente invention, l'anticipation de la progression de la maladie chez un sujet lors d'un suivi au cours du temps. Il peut s'agir notamment d'une prédiction d'un risque, par exemple du risque de développer une pathologie auto-immune chez un sujet, ou du risque de rechute d'un patient atteint d'une pathologie auto-immune notamment suite à l'arrêt ou à l'aménagement de son traitement, ou d'un évènement indésirable immun (immun related adverses events : lraes) par exemple lors de l'utilisation d'anticorps ciblant des checkpoint inhibitors dans le cadre d'une immunothérapie anti-cancer. [0026] On entend par « pronostic », au sens de la présente invention, la prédiction des chances de survie d'un patient atteint d'une pathologie auto-immune active chez un sujet. Par exemple, la méthode de pronostic de l'invention peut permettre d'évaluer le taux de survie, ce taux indiquant le pourcentage de personnes ayant participé à une étude et vivant pendant une période donnée, généralement 5 à 10 ans après le diagnostic d'une pathologie auto-immune active. Généralement, un bon pronostic, au sens de l'invention, est associé à une survie médiane supérieure à 5 ans, alors qu'un mauvais pronostic est associé à une survie médiane inférieure à 5 ans. [0027] On entend par « détection de la co-expression des protéines », au sens de la présente invention, toute détection de l'expression conjointe des protéines PD-1 et CD38 à la surface de chaque lymphocyte T présent l'échantillon biologique. C'est donc la fréquence d'expression conjointe des protéines PD-1 et CD38 à la surface de chaque lymphocyte T présent dans l'échantillon biologique qui est mesurée. La détection peut être par exemple une comparaison entre le niveau de la fréquence d'expression conjointe de ces protéines dans un échantillon biologique d'un sujet, et un échantillon ou une valeur de référence (encore appelée « valeur seuil ») représentant un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic avéré de la pathologie auto-immune active. La valeur de référence peut être définie sur la base de mesures obtenues sur un échantillon de sujets sains, c'est-à-dire ne présentant pas la pathologie recherchée. Il peut s'agir par exemple de sujets qui n'ont pas d'hépatite virale, ni de signe d'auto-immunité au niveau du foie et/ou d'affection chronique hormis, éventuellement, une inflammation hépatique duc à un dérèglement dysmétabolique (également appelé « Foie gras » ou « maladie du soda »). Ainsi, on comprend que les « sujets sains » permettant de définir la valeur de référence peuvent être des patients atteints de NASH (ou non atteints de NASH), mais ne présentant pas d'hépatite virale, ni de signe d'auto-immunité au niveau du foie et/ou d'autre affection chronique hormis l'inflammation hépatique duc à un dérèglement dysmétabolique. La valeur de référence peut être définie par exemple selon le protocole décrit dans l'exemple 2 ci-après. La valeur de référence peut être établie sur un nombre significatif de sujets sains, par exemple au moins100 sujets sains. Avantageusement, la valeur seuil peut être définie comme supérieure à une fréquence de LTCD3+ exprimant conjointement PDI et CD38 de 2,77 pourcent. Ainsi, une fréquence supérieure à 2,77 pourcent sera caractéristique d'une auto-immunité hépatique. La détection peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une méthode choisie parmi la cytométrie en flux ou de masse, une technologie de test immunologique, telle que ELISA direct ELISA indirect, ELISA sandwich, ELISA compétitif, ELISA multiplex, un dosage radio-immunologique (RIA) ou une technologie ELISPOT, une méthode d'analyse par spectrométrie de masse, un procédé de chromatographie, un procédé de qPCR et une combinaison d'au moins deux de ces méthodes. Ainsi, dans un mode de réalisation, la détection d'une signature auto-immune peut être réalisée dans le sang, par exemple du sang total, du patient par une simple prise de sang suivi d'un test simplifié consistant à incuber les cellules sanguines avec un mélange d'anticorps spécifiques fluorescents, suivi d'une analyse sur un cytomètre en flux. [0028] Les protéines PD-1 et CD38 peuvent être détectées à la surface de toute cellule connue pour les exprimer à leur surface. Il peut s'agir par exemple des lymphocytes T CD3 et/ou T CD8 et/ou lymphocytes T CD4. [0029] L'échantillon biologique utilisé peut être tout échantillon biologique communément utilisé pour des analyses biologiques. Il peut s'agir par exemple d'un échantillon de 6 sang, par exemple une fraction du sang, ou alternativement un échantillon de sang total, ou d'une fraction de biopsie, par exemple hépatique, dc tissu. [0030] Le procédé de l'invention peut comprendre tout ou partie des étapes consistant à: (i) détecter la co-expression de PD-1 et CD38 dans ledit échantillon et déterminer la fréquence de co-expression de PD-1 et CD38 ; (ii) comparer la fréquence de co-expression de PD-1 et CD38 déterminée en (i) avec une valeur de référence de la fréquence de co-expression de PD-1 et de CD38, ladite valeur de référence représentant un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic avéré de la pathologie auto-immune active ; (iii) rechercher la présence ou l'absence d'un écart de la fréquence de co-expression de PD-1 et de CD38 déterminée en (ii) par rapport à la valeur de référence ; (iv) attribuer la présence ou l'absence d'écart à un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic de la pathologie auto-immune active chez le sujet. [0031] Avantageusement, une fréquence de co-expression de PD-1 et CD38, dans ledit échantillon, supérieure à une valeur de référence indique que le sujet est atteint de la pathologie auto-immune active ou présente un risque de rechute de la pathologie auto-immune active. [0032] Outre les protéines PD-1 et CD38, il est possible, selon l'invention, de détecter la co- expression de PD-1 et de CD38 avec au moins un autre marqueur biologique choisi dans le groupe consistant en CD3, CD4, CD8, CD45RA, CXCR5, CD127 et CD27. Il peut s'agir d'un marqueur, ou de deux marqueurs, ou de trois marqueurs, ou de quatre marqueurs, ou de cinq marqueurs, ou de six marqueurs, ou de sept marqueurs. Cette détection d'au moins un autre marqueur peut être réalisée en même temps que la détection de la co-expression de PD-1 et CD38, ou bien ultérieurement à l'étape de détection de la co-expression de PD-1 et CD38. Par exemple, on peut détecter la coexpression des associations de marqueurs biologiques choisis parmi les associations PD-1/CD38/CD3, PD- 1/CD38/CD3/CD4/CD8/CD45RA, PD1/CD38/CD3/CD4/CD8/CD45RA/CD127, PD1/CD38/CD3/CD4/CD8/CD45RA/CXCR5/CD127 et PD1/CD38/CD3/CD4/CD8/CD45RA/CXCR5/CD127/CD27. Avantageusement, les associations des marqueurs cités peuvent permettent de mettre en évidence des populations lymphocytaires T CD4 et CD8 qui sont significativement augmentées chez les patients ayant une pathologie auto-immune active, notamment une HAI active, en comparaison à une valeur de référence, ou par exemple aux patients atteints de NASH lorsqu'il s'agit d'une comparaison avec la HAI. [0033] Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation du pool de protéines PD-1 (Prograrmrted cell death 1) et CD38 comme marqueurs biologiques pour le diagnostic, la prédiction et/ou le pronostic d'une pathologie auto-immune active chez un sujet. 7 100341 Un autre objet de l'invention se rapporte à un dispositif pour détecter la co- expression de PD-1 et de CD38 clans un échantillon prélevé sur un sujet, comprenant : (i) éventuellement des moyens pour obtenir un échantillon prélevé sur le sujet, et (ii) des moyens pour détecter la co-expression de PD-1 et de CD38 à la surface des lymphocytes T clans ledit échantillon, et (iii) des moyens de détermination de la fréquence de co-expression de PD-1 et de CD38 dans l'échantillon. Avantageusement, lesdits moyens de détermination de la fréquence de co-expression peuvent permettre d'indiquer si cette fréquence, dans ledit échantillon, est supérieure ou inférieure à une valeur de référence et/ou si cette fréquence dans ledit échantillon diffère ou non d'une valeur de référence, ladite valeur de référence représentant un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic d'une pathologie auto-immune active chez le sujet. [0035] D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures [0036] [fig.1] représente : A) représentation de la stratégie d'analyse non supervisée (FlowSOM) des données de cytométric en flux chez 12 patients HAI et 12 patients NASH. B) Hcatmap représentant l'expression des marqueurs de surface des 4 populations lymphocytaires (noeuds) présentants une augmentation significative (p REVENDICATIONS[Revendication 1] Procédé de diagnostic, de prédiction et/ou de pronostic d'une pathologie auto-immune active chez un sujet, comprenant la détection de la coexpression des protéines PD-1 et CD38 à la surface des lymphocytes T dans un échantillon biologique du sujet. [Revendication 2] Procédé selon la revendication I. dans lequel ledit échantillon biologique est une fraction de sang ou un échantillon de sang total, ou une fraction de biopsie, par exemple hépatique, de tissu. [Revendication 3] Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les protéines PD-1 et CD38 sont détectées à la surface des lymphocytes T CD3 et/ou CD8 et/ ou lymphocytes T CD4. [Revendication 4] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre les étapes consistant à : (i) détecter la co-expression de PD-1 et CD38 dans ledit échantillon et déterminer la fréquence de co-expression de PD-1 et CD38; (ii) comparer la fréquence de co-expression de PD-1 et CD38 déterminée en (i) avec une valeur de référence de la fréquence de coexpression de PD-1 et de CD38, ladite valeur de référence représentant un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic avéré de la pathologie auto-immune active ; (iii) rechercher la présence ou l'absence d'un écart de la fréquence de coexpression de PD-1 et de CD38 déterminée en (ii) par rapport à la valeur de référence ; (iv) attribuer la présence ou l'absence d'écart à un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic de la pathologie auto-immune active chez le sujet. [Revendication 5] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une fréquence de co-expression de PD-1 et CD38, dans ledit échantillon, supérieure à une valeur de référence indique que le sujet est atteint de la pathologie auto-immune active ou présente un risque de rechute de la pathologie auto-immune active. [Revendication 6] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on détecte l'expression d'au moins un autre marqueur biologique choisi dans le groupe consistant en CD3, CD4, CD8, CD45RA, CXCR5, CD127 et. CD27. [Revendication 7] Procédé selon la revendication 6, dans lequel on détecte la co- expression des associations de marqueurs biologiques choisis parmi les 12 associations PD-1/CD38/CD3, PD-1/CD38/CD3/CD4/CD8/CD45RA, PD- 1/CD38/CD3/CD4/CD8/CD45R A/CD127, PD1/CD38/CD3/CD4/CD8/CD45RA/CXCR5/CD127 et PD1/CD38/CD3/CD4/CD8/CD45R A/CXCR5/CD127/CD27. [Revendication 8] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la détection est réalisée par une méthode choisie parmi la cytométrie en flux ou de masse, une technologie de test immunologique, telle que ELISA direct, ELISA indirect, ELISA sandwich, ELISA compétitif, ELISA multiplex, un dosage radio-immunologique (RIA) ou une technologie ELISPOT, une méthode d'analyse par spectrométrie de masse, un procédé de chromatographie, procédé de qPCR et une combinaison d'au moins deux de ces méthodes. [Revendication 9] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le ladite prédiction est une prédiction du risque de rechute, notamment suite à l'arrêt ou à l'aménagement d'un traitement. [Revendication 10] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite prédiction est une prédiction du risque de développer une pathologie auto-immune. [Revendication 11] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite pathologie auto-immune active est choisie parmi une hépatite auto-immune, une cholangite biliaire primitive, une cholangite sclérosante primitive, le diabète de type 1, la sclérose en plaques, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus, et une vascularite ou une toxicité immunologique liées aux immunothérapies dans le traitement du cancer. [Revendication 12] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite pathologie auto-immune active est une hépatite auto-immune. [Revendication 13] Procédé selon la revendication 12, dans lequel ladite hépatite auto- immune est une hépatite auto-immune de forme atypique, notamment une forme séronégative et/ou avec peu ou pas d'infiltrat lymphocytaire du tissu hépatique. [Revendication 14] Procédé selon la revendication 12 ou 13, dans lequel le diagnostic est une discrimination des patients ayant une hépatite auto-immune des patients ayant une stéatose hépatique non-alcoolique (NASH), ou une mise en évidence d'une auto-immunité hépatique chez les patients atteints de NASH. [Revendication 15] Utilisation du pool de protéines PD-1 (Programmed cell death 1) et CD38 comme marqueurs biologiques dans un échantillon prélevé sur un 13 [Revendication 16] sujet pour le diagnostic, la prédiction et/ou le pronostic d'une pathologie auto-immune active chez un sujet. Dispositif de test pour détecter la co-epxression de PD-1 et de CD38 dans un échantillon prélevé sur un sujet, comprenant : (i) éventuellement des moyens pour obtenir un échantillon prélevé sur le sujet, et (ii) des moyens pour détecter la co-expression de PD-1 et de CD38 à la surface des lymphocytes T dans ledit échantillon, et (iii) des moyens de détermination de la fréquence de co-expression de PD-1 et de CD38 dans l'échantillon.