FR 3096229 A1 20201127 FR 1905296 A 20190521 Description Titre de l'invention : RUCHE CONNECTEE PERMETTANT LE SUIVI A DISTANCE DE L'ETAT DE SANTE D'UNE COLONIE D'ABEILLES pool j L'invention a trait au domaine de la surveillance de l'état de santé des abeilles. Plus particulièrement, elle concerne un biocaptcur capable de détecter les modifications qualitatives et quantitatives dans l'atmosphère intérieur de la ruche en cas d'intoxication ou de maladies au sein de la colonie d'abeilles. Elle concerne également un système de surveillance à distance de l'état de santé d'une colonie d'abeilles mettant en oeuvre un tel biocapteur. Etat de la technique 100021 En apiculture, la production de miel est directement liée a la sante' des abeilles. Lorsque la colonie est touchée par une pathologie bactérienne ou virale ou bien lorsqu'elle subit les effets de toxiques de l'environnement (pesticides, fongicides...), les affaiblissements engendrés peuvent décimer la colonie très rapidement. Or, les abeilles jouent un rôle majeur dans la pollinisation, aux côtés d'autres insectes pollinisateurs. Il a été évalué que la disparition de l'abeille domestique pouvait entrainer une diminution d'environ 70% de la production en fruits et légumes. [0003] Il est donc impératif d'avoir un moyen de surveillance sanitaire permettant d'obtenir une information sur la sante' des abeilles formant la colonie, et cc. au cours du temps et durant l'année apicole. [0004] Les effets néfastes des pesticides sur la santé des abeilles sont connus depuis longtemps. Ces effets ont été étudiés par des méthodes de biologie moléculaire classiques, en particulier sur des échantillons de matière solide provenant du corps des abeilles. Inconvénients [0005] La surveillance de la santé des abeilles au sein des ruches est primordiale pour assurer la pérennité de l'ensemble du rucher. Or les systèmes de surveillance utilisés à ce jour sont assez rudimentaires et nécessitent de se déplacer auprès des ruches, ce qui est chronophagc et coûteux en transport. Ces systèmes renseignent sur des paramètres tels que la température, le taux d'humidité, le vol des abeilles... Ces opérations requièrent généralement d'intervenir sur les ruches ce qui est de nature à perturber la vie de la colonie d'abeilles. Enfin, ces surveillances permettent de constater les dégâts une fois que la ruche est affaiblie et ne permettent pas d'agir précocement. Ils permettent principalement de comprendre a posteriori la cause des intoxications. [0006] Aucun des systèmes disponibles à ce jour ne renseigne sur l'état de la colonie elle- 2 même et sur la santé des abeilles. Résumé de l'invention [0007] La présente invention apporte une solution à ces problèmes en proposant un biocapteur doté de capteurs de gaz capables de détecter les modifications qualitatives et/ou quantitatives s'opérant dans les composés volatils qui forment l'atmosphère interne d'une ruche, en particulier en cas d'intoxication de la colonie ou de survenue de pathologies virales ou bactériennes. Ce biocapteur est relié à un logiciel d'analyse de données de façon à délivrer à l'apiculteur une information relative à la santé de la colonie d'abeilles en temps réel. [0008] Cette invention repose sur le fait qu'une relation forte existe entre d'une part, le dé- veloppement de pathologies ou la survenue d'une intoxication et d'autre part, les modifications des constantes physiologiques de l'abeille. Ces modifications se traduisent par une variation de la composition chimique de l'hémolymphe et des phéromones émises. [0009] Ainsi, les inventeurs ont mis au point un biocapteur pour une surveillance d'intoxication/pathologies au moyen d'une analyse chimique de l'atmosphère de la ruche, cette dernière étant générée par la colonie dans son ensemble au cours du temps. L'analyse chimique est ensuite associée à un traitement chimiométrique des données dont l'objectif est de mettre en évidence une anomalie dans l'évolution enregistrée au cours du temps. [0010] La concentration et les variations de concentration des composés volatils dégagés au cours du temps dans l'atmosphère interne de la ruche est donc le point d'entrée du système de surveillance selon l'invention. Avantages de l'invention 100111 L'utilisation de biocapteurs accolés à la ruche permet la détection précoce des modi- fications physiologiques liées a' un épisode d'intoxication ou aux premières phases de développement de certaines pathologies bactériennes. Le dispositif étant non invasif et externe par construction, il aura donc un impact très limité sur le fonctionnement de la colonie. Ainsi alerté, l'apiculteur peut intervenir rapidement sur son rucher : en cas d'intoxication, il pourra déplacer son rucher ; en cas de pathologies, il pourra isoler la ruche contaminée. 10012] La présente invention permet donc un suivi permanent et régulier de l'état de sante' des colonies d'abeilles. Le dispositif est facile à installer, il ne perturbe pas la vie de la ruche et ne nécessite pas la présence de l'apiculteur sur le rucher, ce qui représente un gain de temps. L'apiculteur peut ainsi surveiller toutes ces ruches simultanément, quelle que soit la distance qui les sépare. Description des modes de réalisation 3 [0013] Un premier objet de l'invention concerne un biocapteur destiné au suivi de l'état de santé d'une colonie d'abeilles comprenant un ensemble de capteurs de gaz capables de détecter une modification qualitative et/ou quantitative dans les composés volatils formant l'atmosphère interne de la ruche. [0014] Ce biocapteur, une fois disposé au contact de la ruche, détecte différentes signatures olfactives générées par la colonie d'abeilles dans sa globalité et par les produits de la ruche (miel et cire essentiellement) grâce aux capteurs gaz d'oxydes métalliques. [0015] Ces capteurs gaz réagissent à certaines familles de composés organiques volatils avec une spécificité plus ou moins importante. L'association de différents capteurs permet la détection d'une signature complexe correspondant aux phéromones émises par les abeilles. La spécificité du biocapteur repose donc sur une combinaison adaptée et optimisée de capteurs gaz générant des signatures olfactives caractéristiques d'une intoxication ou de la survenue d'une pathologie au sein de la colonie d'abeilles. [0016] Dans un mode de réalisation préféré, les capteurs gaz sont spécifiques de signatures olfactives caractéristiques d'une agression subie par la colonie d'abeilles. Une telle agression peut être provoquée par l'utilisation de pesticides ou d'engrais ou par une pathologie virale ou bactérienne. [0017] Les signatures olfactives détectées pendant la phase précoce de la réponse sont si- milaires quelque que soit le type d'agressions ; il s'agit d'une réponse dite « dégénérée » c'est-à-dire que physiologiquement, la réponse n'est pas spécifique de l'agent agresseur. Des réponses immunitaires spécifiques se mettent en place dans un second temps, mais ne sont pas adaptées à l'objectif recherché ici d'une alerte précoce. [0018] Le biocapteur selon l'invention comprend au moins 8 capteurs gaz différents. De manière préférée, il comprend au moins 16 capteurs gaz différents. [0019] Deux capteurs gaz peuvent être considérés différents du fait qu'ils détectent des molécules de nature différente (qualitatif) ou qu'ils détectent la même molécule mais à une concentration différente, c'est-à-dire que le seuil de détection est différent (quantitatif). [0020] De préférence, ces capteurs de gaz sont choisis de sorte à ce que les modifications détectées correspondent à des signatures des phases précoces de l'intoxication ou des maladies, de sorte à permettre une intervention le plus tôt possible de l'apiculteur. [0021] Des capteurs gaz sont connus de l'état de la technique. Les capteurs de type MOS et/ ou MOSFET sont par exemple adaptés à l'utilisation dans un biocapteur destiné au suivi de l'état de santé d'une colonie d'abeilles. L'utilisation de tels capteurs est par exemple décrite dans l'article de Konduru T. et al., Journal of Food Engeneering 160 (2015) 19-27. [0022] Par « atmosphère interne d'une ruche », on entend au sens de l'invention la phase gazeuse présente à l'intérieur de la ruche. Cette phase gazeuse comprend des composés organiques volatils, notamment les phéromones produites par les abeilles. [0023] Un deuxième objet de l'invention concerne un système de surveillance de l'état de santé d'une colonie d'abeilles comprenant : au moins un biocapteur tel que défini précédemment au moins un élément électronique capable de transmettre les données relatives auxdits composés volatils détectés à un logiciel d'analyse un logiciel d'analyse desdites données un système d'affichage du résultat de l'analyse. [0024] Dans un tel système, le biocaptcur et l'élément électronique se trouvent par exemple à l'intérieur d'un boitier accolé à la ruche alors que le logiciel et le système d'affichage se trouvent à l'extérieur de la ruche, par exemple chez l'apiculteur ou dans un local dédié à proximité du rucher. Ainsi alerté, l'apiculteur saura adapter son intervention en fonction de la nature de l'agression. [0025] Le biocaptcur reçoit l'air provenant de l'intérieur de la ruche via une ouverture aménagée dans l'une des parois de la ruche. Le biocaptcur est de préférence placé en haut de la ruche, de sorte à récupérer l'air en surface en haut de la ruche. [0026] Un tuyau peut être placé à travers cette ouverture pour faciliter l'échange gazeux. [0027] Dans un mode de réalisation préféré, l'air à l'intérieur de la ruche est aspiré vers le biocaptcur. Un système d'aspiration est alors associé au biocapteur. [0028] De manière préférée, le logiciel et le système d'affichage sont situés à distance de la ruche, dans un lieu choisi par l'apiculteur (son atelier, sa miellerie...) ou sont intégrés dans un système embarqué tel qu'un smartphone. [0029] Un troisième objet de l'invention concerne une ruche connectée comprenant un système de surveillance tel que défini précédemment. Une telle ruche permet le suivi de l'état de santé de la colonie d'abeilles qu'elle héberge, notamment à distance. [0030] La ruche connectée selon l'invention comprend une ouverture aménagée dans l'une de ces parois. Cette ouverture peut accueillir un tube. Il est préférable de placer une petite grille au niveau de l'ouverture à l'intérieur de la ruche, par exemple à l'embouchure du tube. [0031] Un quatrième objet de l'invention concerne une méthode de surveillance à distance de l'état de santé d'une colonie d'abeilles consistant à : installer, contre la ruche, au moins un biocapteur tel que défini précédemment, et un élément électronique capable de transmettre les données relatives aux composés organiques volatils détectés dans la ruche à un logiciel d'analyse, installer, à distance de la ruche, le logiciel d'analyse des données et un système d'affichage du résultat de l'analyse. [0032] Le logiciel d'analyse est composé d'un module de traitement intelligent basé sur un algorithme d'apprentissage tel que les réseaux de neurones et complété par des al- gorithmes d'analyse factorielles permettant la séparation en aveugle des mélanges de signaux, tel que 1CA (lndependent Component Analysis). Les premiers auront pour rôle d'apprendre l'odeur de la ruche dans un fonctionnement dit "normal", c'est-à-dire sans pathologies majeures en développement, ni épisode d'intoxication. Les seconds auront pour objectif de proposer une visualisation simple et lisible du suivi de l'état de santé de la colonie. [0033] L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent, qui ne sont présentés qu'à titre d'illustration et qui ne doivent pas être compris comme limitant la portée de l'invention. Brève description des dessins [0034] [fig.1A] [0035] [fig.1B] [0036] [fig.1C]Figure 1 : Chromatogrammes d'échantillons de têtes d'abeilles intoxiquées. A, B, C représentent trois portions distinctes du chromatogramme. Abeilles stressées (lignes en pointillés) ; abeilles témoins (lignes continues) [0037] [fig.2A] [0038] [fig.2B]Figure 2 : Chromatogrammes d'échantillons d'abdomens d'abeilles in- toxiquées. A B représentent deux portions distinctes du chromatogramme - Abeilles stressées (lignes en pointillés) ; abeilles témoins (lignes continues). [0039] [fig.3]Figure 3 : Analyse ANOVA (analyse de variance) réalisées sur certaines com- posantes principales extraites dc la matrice de données chromatographiques. TE SD : Têtes d'abeilles intoxiquées ; TE TD : Têtes d'abeilles témoin. [0040] [fig.4]Figure 4 : Analyse ANOVA (analyse de variance) réalisées sur certaines com- posantes principales extraites dc la matrice de données chromatographiques. TH SD : Thorax d'abeilles intoxiquées ; TH TD : Thorax d'abeilles témoin. [0041] [fig.5]Figure 5: Analyse ANOVA (analyse de variance) réalisées sur certaines com- posantes principales extraites dc la matrice de données chromatographiques. AB SD : Abdomens d'abeilles intoxiquées ; AB TD : Abdomens d'abeilles témoin. [0042] [fig.6A] [0043] [fig.6B]Figure 6 : Représentation d'une configuration des capteurs de gaz sur un biocapteur EXEMPLES 100441 EXEMPLE l : Analyse en spectroscopie de fluorescence sur le corps des abeilles 100451 Les inventeurs ont réalisé une étude par spectrométrie de fluorescence frontale sur le corps des abeilles pour détecter la présence de pesticides à des doses très faibles de l'ordre de 0.5 à 1.5 qq ppb. Cette dose correspond à la quantité de pesticides retrouvée dans le corps des abeilles en conditions d'utilisation des pesticides dans les champs. 6 Une telle intoxication a été décrite en 2012 dans Science, étude qui valide l'effet néfaste des pesticides sur le retour de abeilles à la ruche (Henry M. et al., Science 20 April 2012, Vol 336, Issue 6079, P 348-350). [0046] Cette analyse combine la spectroscopie de fluorescence et l'analyse en composantes indépendantes pour détecter et suivre l'effet du pesticide chez l'abeille, en observant les fluorophores impliqués dans les changements métaboliques et physiologiques. 1-1 Matériels et méthodes 1-1-1 Préparation de l'échantillon [0047] Des abeilles de tout âge de l'espèce Apis mellifera ont été prélevées sur le rucher ex- périmental d'AgroParisTech (Paris, France). Les abeilles ont été réparties en 12 cagettes de 40 abeilles. Le pesticide utilisé pour l'expérience est un organophosphoré, le diméthoate (C5 1-11,NO3PS,), administré dans le sirop de nourrissement des abeilles . Le sirop contaminé avec le pesticide a été délivré à 6 des 12 cagettes, et les autres cagettes ayant reçu le sirop non contaminé ont servi de contrôle. [0048] La phase d'intoxication s'est déroulée sur 5 jours, les réservoirs de sirop ont été changés quotidiennement et la masse de sirop ingéré a été pesée de façon à évaluer la quantité de pesticide absorbée par abeille (0,6 lig/abeille). Les abeilles mortes ont été comptées et collectées puis stockées à -20°C. Au bout de 5 jours, les abeilles (contrôles et intoxiquées) ont été découpées pour séparer la tête, le thorax et l'abdomen, puis on a regroupé chacun de ces compartiments et on les a broyés dans de l'azote liquide pour stopper l'activité notamment de la protease et ainsi conserver autant que possible l'état physiologique des échantillons avant analyse. Une fois préparés, les échantillons ont été conservés à -80°C. 1-1-2 Préparation du sirop 100491 Deux types de nourrissement ont été administrés, l'un sans pesticide, l'autre avec pesticide selon les préconisations de Faucon et al.. La composition finale du sirop est la suivante : pâte de sucre (70%). MilliQO water (20%) et acétone (10%). Le sirop contenait environ 5 mg pesticide/kg sirop. 1-1-3 Spectroscopie de fluorescence 100501 Les prises d'empreintes en spectroscopie de fluorescence ont été réalisées sur un spectromètre FluoroMax-4 (Spex-Jobin Yvon, Longjumeau, France). Les gammes de longueurs d'onde sont entre 280 nm - 400 nm et entre 300 nm - 550 nm, respectivement pour l'excitation et l'émission. Pour chaque échantillon, trois spectres ont été enregistrés dans des cuvettes en quartz suprasil (Helma, France), en utilisant différents aliquotes d'abeilles (10 têtes, 10 thorax et 10 abdomens) aussi bien pour les abeilles contrôles que pour les intoxiquées. Les mesures ont été réalisées dans une salle de laboratoire tempérée (environ 20°C) afin d'éviter un éventuel effet de la température sur 7 les spectres de fluorescence . 1-1-4 Activité de l'acétylcholine estérase (AchE) 100511 L'évaluation quantitative de l'activité de l'acétylcholinestérase a été réalisée par la méthode d'Ellman basée sur la mesure de la production de thiocholine à partir d'acetylthiocholine (un substrat analogue), qui interagit avec le DNTB (acide 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoïque)) pour produire un composé jaune mesurable à 412 nm avec un spectrophotomètre UV-Visible. La détermination de l'activité enzymatique de l'acétylcholinestérase passe par la détermination de la concentration protéique de l'échantillon. Cette étape se fait grâce à la méthode de Bradford. La quantité d'échantillon d'abeille nécessaire au dosage est de 0,05 g de Tête, 0,25 g de Thorax et de 0,3 g d'Abdomens prélevé dans une préparation obtenue à partir de 10 abeilles par compartiment (tête, thorax ou abdomen). L'extraction protéique a été réalisée dans un tampon d'extraction 0,1 M pH 8 dans NaC10,01 M, avec une concentration d'échantillon de 5% p/V. L'extrait a été centrifugé à 3000 x g (Q-sep 3000 centrifuge, Restek Corporation, USA), pendant 15 min. Les réactifs de la réaction de l'acétylcholinestérase utilisés sont : 10 mL d'une solution de DNTB à 0,01 M en tampon phosphate à pH 70,1 M; et une solution d'acétylthiocholine à 0,075 M. La réaction a été conduite à température ambiance dans 3 ml de tampon d'extraction à pH 8, 100 pl de solution de DNTB, 20 pl de substrat acetylthiocholine et 200 pl d'extrait protéique, pendant 5 min, avec 1 mesure toutes les 30 s. L'activité enzymatique est comme suit : [0052] [Math.1] [0053] Où: 4A = variation de l'absorbance - A0)/5]; V, = volume to al de la réaction. Dans ce cas, le volume est de 3320 pl; 13600 = coefficient d'absorption moléculaire du DNTB; L = longueur de la cuvette (1 cm); V. = Volume de l'échantillon (200 pl); [P] = Concentration en protéines (mg/mi). 1-1-5 Analyse en Composantes Indépendantes [0054] Les traitements statistiques et chinnoméniques ont été réalisés sous Matlab, version 2012b (MathWorks, Rance) avec les fonctions de notre package SAISIR® . [0055] La stratégie d'analyse chimiométrique s'appuie sur l'analyse en composantes indé- pendantes (ICA) appliquant l'algorithme JADE sur le cube de fluorescence (collection de matrice d'émission-excitation). Ce cube de données doit être réarrangé avant de 8 pouvoir être analysé par des techniques factorielles bilinéaires telles que l'analyse en composantes principales ou l'analyse en composantes indépendantes. Ce prétraitement ne sera pas détaillé ici mais le lecteur trouvera les détails par ailleurs . [0056] L'analyse en composantes indépendantes (ICA) est une technique de séparation de signaux-sources (Blind Source Separation) issue du domaine du traitement du signal et de la neurobiologie. En d'autres termes. ICA peut extraire N signaux-sources inconnus, dans des proportions inconnues, dans un ensemble de P signaux issus eux-mêmes de mélanges. Pour ICA, chaque signal est un mélange de signaux-sources avec comme hypothèse sous-jacente leur indépendance statistique. Plus précisément, ICA fait l'hypothèse que ces signaux ont des intensités qui se distribuent de manière moins gaussienne que leurs mélanges, on parle de non-gaussianité. Ainsi, ICA cherche à maximiser la non-gaussianité des signaux extraits afin de construire de nouvelles variables (les ICs) combinaisons linéaires des variables d'origine. Les ICs n'ont pas de contraintes d'orthogonalité comme c'est le cas avec les composantes principales de r ACP, la conséquence est une plus grande aptitude à la discrimination des groupes lorsque ceux-ci existent entre les échantillons. L'avantage majeur de ICA sur l'ACP est que le moteur de construction des ICs n'est pas mu par la variance, contrairement à r ACP car l'une des premières étapes de ICA est précisément d'appliquer une ACP et de soustraire un certain nombre de composantes principales de façon à obtenir un ensemble de données isovariant. Le modèle général de ICA est un modèle linéaire tel que : [0057] [Math.2] I X AS [0058] où X est la matrice de signaux mélangés enregistrés, S la matrice des signaux-sources « purs » et A est la matrice de mélange correspondant à l'équivalent des scores de l'ACP mais que l'on nomme « proportions » dans le cas de ICA. Ce sont les proportions des signaux-sources dans chaque mélange. Contrairement à l'ACP, les loaclings (matrice S) produits par ICA sont beaucoup plus interprétables chimiquement ce qui est un avantage supplémentaire de la technique. Depuis quelques années, le nombre d'applications d'ICA est en très forte croissance dans le domaine de la chimie analytique et notamment dans le traitement des signaux enregistrés en agroalimentaire. [0059] Les scores ou proportions du modèle ICA ont servi d'entrée à une analyse de la variance (ANOVA) afin de vérifier si les différences observées, tant sur les données de fluorescence que sur les mesures d'activité de l'acétylcholinestérase, étaient statistiquement significatives entre le groupe « Stressées » et le groupe « Contrôle ». Le test est positif pour toute p-value REVENDICATIONSBiocapteur destiné au suivi de l'état de santé d'une colonie d'abeilles caractérisé en ce qu'il comprend un ensemble de capteurs gaz capables de détecter une modification qualitative et/ou quantitative dans les composés organiques volatils formant l'atmosphère interne de la ruche. Biocapteur selon la revendication I comprend au moins 8 capteurs gaz différents. Système dc surveillance dc l'état dc santé d'une colonie d'abeilles caractérisé en ce qu'il comprend : au moins un biocaptcur tel que défini à l'une des revendications 1 ou 2, au moins un élément électronique capable de transmettre les données relatives auxdits composés organiques volatils détectés à un logiciel d'analyse, un logiciel d'analyse desdites données, et un système d'affichage du résultat de l'analyse. [Revendication 4] Système de surveillance selon la revendication 3 dans lequel : ledit biocaptcur et ledit élément électronique se trouvent accolés à la ruche ledit logiciel et ledit système d'affichage se trouvent à l'extérieur de la ruche, notamment à distance dc la ruche [Revendication 5] Ruche connectée permettant le suivi de l'état dc santé de la colonie d'abeilles qu'elle héberge, ladite ruche comprenant un système de surveillance tel que défini à la revendication 4. [Revendication 6] Méthode de surveillance à distance de l'état de santé d'une colonie d'abeilles consistant à : installer, contre la ruche, au moins un biocaptcur tel que défini à l'une des revendications 1 ou 2, et un élément électronique capable de transmettre les données relatives auxdits composés organiques volatils détectés dans la ruche à un logiciel d'analyse externe, installer, à distance de la ruche, ledit logiciel d'analyse desdites données et un système d'affichage du résultat de l'analyse. 14