FR 3085962 A1 20200320 FR 1858293 A 20180914 PROCÉDÉ D'EXTRACTON D'UNE HUILE RICHE EN PUFA DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé d'extraction d'une huile riche en acides gras polyinsaturés (PUFA), notamment d'une huile de microorganismes riche en acide docosahexaénoïque (DHA, C22:6n3), en particulier d'huiles comprenant plus de 60% de PUFA par' rapport à la masse totale de matière grasse. ETAT DE LA TECHNIQUE 10 Il existe une aujourd'hui une demande d'huiles concentrées à fortes teneurs en PUFA, soit pour la fourniture de produits concentrés, comme des gélules concentrée qui permettent de diminuer les prises pour une quantité équivalent de PUFA. Pour obtenir des huiles à forte teneur en PUFA (par exemple supérieur à 55% de DHA), les huiles sont concentrées par un procédé qui transforme les triglycérides en ethyl esters 15 en impliquant l'utilisation de solvant tel que l'éthanol, Les ethyl esters sont une forme chimique artificielle, ils ne sont pas présents dans la nature. La biodisponibilité des acides gras sous forme d'ethyl esters est bien moindre que sous forme de triglycérides (Ghasemifard et al., 2014). De plus, le procédé élimine les vitamines et les anti-oxidants qui sont présents dans l'huiie brute. Par conséquent, l'huile concentrée est plus 20 vulnérable à l'oxydation. Il est donc intéressant d'obtenir une huile naturellement riche en PUFAs. dent la composition est la plus proche possible des substances liposolubles de l'organisme producteur avec un minimum de contaminants produits lors des traitements. Or, l'extraction des huiles riches en PUFA rencontre des difficultés particulières à cette forte 25 teneur en PUFA, qui limitent les quantités d'acides gras extraits de la biomasse. Les procédés d'extraction utilisés actuellement font intervenir l'ajout de sodium (W02011/153246), de solvant et/ou des températures élevées durant plusieurs heures (W02015/095694) qui peuvent réduire la qualité de l'huile obtenue et du co-produit (biomasse délipidée). En effet; la température est un facteur induisant la formation 30 d'acides gras trans à partir des acides gras gis. Or la réglementation impose une teneur maximale inférieure à 1% d'acides aras trans dans les huiles alimentaires, Les acides gras des microorganismes producteurs de PUFA sont naturellement en conformation gis, toute formation d'acides gras trans réduit donc la qualité de l'huile. La température peut aussi provoquer la formation de 2-MCPD, 3-MCPD et de glycidol, composés toxiques 35 dont la teneur est réglementée (glycidol) ou en cours de réglementation (2- et 3-N1CPD). Il est important de chercher à optimiser la qualité de l'huile enfin d'en avoir le moins possible, en particulier pour l'utilisation des huiles dans l'alimentation infantile. 2 L'ajout de sodium lors de l'extraction, sous forme de sulfate de sodium ou bien de chlorure de sodium, est un procédé connu (W02011/153246). Malheureusement, le sodium se retrouve dans la biomasse délipidée. Cela réduit l'intérêt de cette biomasse, par ailleurs riche en protéines; pour l'alimentation animale notamment. De plus; l'efficacité 5 d'un procédé avec ajout de sodium et des températures inférieure ou égales à 70°C est limitée quant au rendement d'extraction à partir d'une biomasse à plus de 60% de PUFA. L'invention répond à cette demande avec un nouveau procédé d'extraction des matières grasses à forte teneur en PUFA, qui améliore les rendements d'extraction de ces huiles, et en particulier de l'extraction des PUFA de la biomasse qui les contient, tout en 10 préservant la qualité de l'huile. EXPOSE DE L'INVENTION L'invention concerne un nouveau procédé d'extraction d'une huile riche en PUFA à partir d'une biomasse d'organismes producteurs comprenant ladite huile, le procédé comprenant les étapes (a) de lyse cellulaire de la biomasse d'organisme producteur 15 d'huile et (b) de séparation mécanique de l'huile de la biomasse lyses et récupération de l'huile brute, le procédé se caractérisant en ce que la lyse cellulaire comprend deux parties : (al) une première partie mise en oeuvre à une première température, puis (a2) une deuxième partie de poursuite de la lyse à une deuxième température inférieure à 20 la première. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre pour tout type d'organisme producteur d'une huile à forte teneur en PUFA, qu'il s'agisse d'un animal, en particulier un animal marin, de plantes oléagineuses ou de microorganismes. Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour l'extraction d'huiles 25 microbiennes à forte teneur en PUFA. Il ne fait pas intervenir l'ajout de solvants pour l'extraction de l'huile. L'invention concerne aussi une huile riche en PUFA obtenue par le procédé, qu'elle soit brute ou raffinée ou encore l'huile diluée comprenant l'huile extraite avec le procédé selon l'invention qui est mélangée avec une autre huile. 30 L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique, cosmétique ou alimentaire qui comprend une huile obtenue par le procédé selon l'invention, qu'elle soit brute, affinée ou diluée. L'invention concerne également l'utilisation d'une huile obtenue par le procédé selon l'invention, brute; raffinée ou diluée, pour l'alimentation humaine ou animale, en particulier 35 pour l'alimentation des nouveaux nés, des enfants, ou des femmes enceintes ou allaitantes. Elle concerne également une composition, en particulier une composition 3 neutraceutique ou un aliment, qui comprend de l'huile obtenue par le procédé selon l'invention, qu'elle soit brute, raffinée ou diluée. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les PUFA sont bien connus de l'homme du métier; notamment pour leur utilisation 5 comme additifs alimentaires ou pour la préparation d'aliments fonctionnels, notamment pour des laits infantiles ou à destination des femmes enceintes ou allaitantes. On citera en particulier l'acide dccosahexaénoïque (DHA, C22:6n3), le DPA (acide docosapentaénoïque, C22:5n6), l'acide arachidonique (ARA, C20:4n6) ou l'acide eicosapentaénoïque (EPA, C20:5n3). Selon les organismes producteurs considérés, les 10 huiles comprennent majoritairement du DHA, de l'EPA ou de l'ARA, ou encore des mélanges de plusieurs PUFA. Les organismes producteurs d'ARA sont bien connus. On citera en particulier les champignons filamenteux du genre Mortierelia alpine. Les organismes producteurs d'EPA sont également bien connus. On citera en particulier Nannochloropsis gaditana . Les 15 organismes producteurs de DI-IA sont aussi bien connus. On citera notamment les protistes des genres Aurantochytrium ou Schizochytrium. Les plantes sont également de bon producteurs de PUFA, en particulier en niveau des graines : L'huile de lin (Linurn usitatissimum L.) peut contenir plus de 50% d'acide alpha-linolénique (AL,A) ; le colza (Brassica napus) est également un producteur d'ALA très connu. Les plantes ne 20 produisent pas d'acides gras à très longues chaînes (supérieur à 018). Cependant, récemment, des plantes transgéniques de Camelina sativa ont été modifiées pour produire du DHA (Mansour et et, 2014) ou d'EPA (Ruiz-Lopez et al. 2014). Les graines des plantes oléagineuse contiennent typiquement entre 20% (soja) et 70% (noix de coco déhydratée) de matière grasse (Rosenthai et al., 1996). 25 Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour l'extraction d'huiles riches en PUFA à partir de microorganismes producteurs d'huiles. Ces microorganismes sont particulièrement choisis parmi les champignons filamenteux et les protistes. Les souches de microorganismes qui permettent d'obtenir de telles huiles sont des souches industrielles; c'est à dire selon l'invention, des souches dont la teneur en matière 30 grasse représente au moins 45 % de la matière sèche, préférentiellement au moins environ 50 % de la matière sèche, et qui ont une capacité de croissance à une densité cellulaire d'au moins 50 g/L, préférentiellement d'au moins 70 g/L, plus préférentiellement d'au moins 100 g/L. L'homme du métier connaît bien les souches industrie s de microorganismes 35 productrices de PUFA principalement parmi les traustochytrides, les dinophycées, les diatomées, les eustigmatophycées, notamment les microorganismes des genres 4 Crypthecodinium, Schizochytrium, Traustochytrium ou Aurantiochytrium pour la production de DHA. On citera en particulier Crypthecodinium cohnii M64245, Crypthecodinium cohnii FJ821501; Crypthecodinium cohnii, Crypthecodinium cohnii CCAP 1104/3 (1/V02016030631), Crypthecodinium cohnii CCAP 1104/5 or Crypthecodinium cohnii CCAP 1104/4, Aurantiochytrium limacinum AB022107 ; Aurantiochytrium limacinum HM042909 ; Aurantiochytrium limacinum JN986842 ; Aurantiochytrium limacinum SL1101 JN986842 ; Aurantiochytrium mangrove; Aurantiochytrium mangrove' D0323157 Aurantiochytrium manorovei 00356659 ; Aurantiochytrium mangrove; D0367049 Aurantiochytrium mangrove; CCAP 4062/2 ; Aurantiochytrium mangrove' CCAP 4062/3 Aurantiochytrium mangrove/ CCAP 4062/4 ; Aurantiochytrium mangrove' CCAP 4062/5 Aurantiochytrium mangrove/ CCAP 406216 ; Aurantiochytrium mangrove/ CCAP 406211 , Aurantiochytrium sp. AB052555 ; Aurantiochytrium sp. AB073308 ; Aurantiochytrium sp. ATCC PRA27G D0836628 ; Aurantiochytrium sp. BL10 FJ821477 ; Aurantiochytrium sp, LY 2012 PKU Mn5 JX847361 ; Aurantiochytrium sp. LY2012 JX847370 ; Aurantiochytrium sp. N1-27 ; Aurantiochytrium sp. SD116 ; Aurantiochytrium sp, SEK209 AB290574 ; Aurantiochytrium sp. SEK217 AB290572 ; Aurantiochytrium sp. SEK 218 AB290573 Aurantiochytrium sp. 18W-13a ; Botryochytrium radiatum ; Botryochytrium racliatum Raghukurnar 16 ; Botryochylrium radiatum SEK353 ; Botryochytrium sp ; Bottyuchytriurn sp. BUTRBC 143 ; Botryochytrium sp. Raghukurnar 29 ; Oblongichytrium rninutum ; Oblongichytrium rnuitirudimentalis ; Oblongichytrium sp. ; Obiongichytrium sp. SEK347 ; Parieticytrium satkananum ; Parieticytnurn sarkarianum SEK351 ; Paneticytrium sarkarianum SEK364 ; Parieticytrium sp. ; Parieticytrium sp. F3-1 ; Parieticytrium sp. 111- 14 Parieticytrium sp. NBRC102984 ; Phytophthora infestans Schizochytrium agaregatuut 00323159 ; Schizochytrium aggregaturn D0356661 ; Schizochytrium aggregatum Schizochytrium limacinum ; Schizochytrium limacinum OUC166 HM042907 Schizochytrium mangrove" ; Schizochytrium mangrove' FB1 ; Schizochytrium mangrove; F63 ; Schizochytrium mangrove/ FB5 ; Schizochytrium minutum ; Schizochytrium sp. ATCC20888 00367050 ; Schizochytrium sp. KGS2 KC297137 ; Schizochytrium sp, 30 SKA10 J0248009 ; Schizochytriurn sp. ATCC 20111 ; Schizochytrium sp. ATCC 20888 (W01991007498); Schizocliytrium sp. ATCC 20889 ; Schizochytrium sp. ATCC 26185 ; Schizochytrium sp. BR2.1.2 ; Schizochytrium sp. BUCAAA 032 ; Schizochytrium sp, BUCAAA 093 ; Schizochytrium sp. BUCACD 152 ; Schizochytrium sp, BUCARA 021 ; Schizochytrium sp. BUCHAO 113 ; Schizochytnurn sp. BURABQ 13 ; Schizochytriurn sp. 35 BURARM 802 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/3 (W02017012931) ; Schizochytriurn sp. CCAP 4087/1 ; SchizochyMurn sp. CCAP 4087/4 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/5 ;Schizochytrium sp. FJU-512 ; Schizochytrium sp. KH105 Schizochytrium sp. KK17-3 ; Schizochytrium sp. KR-5 ; Schizochytrium sp. PJ10.4 ; Schizochytrium sp. SEK 210 ; Schizochytrium sp. SEK 345 ; Schizochytrium sp. SEK 346 ; Schizochytrium sp. SR21 ; Schizochytrium sp. T1001 ; Sicyoidochytrium minutum SEK354 ; Sicyoidochytriurn minutum NBRC 102975Sicyoidochytrium minutum NBRC 102979 ; Thraustochytriidae sp. 5 BURABG162 DQ100295 ; Thraustochytriidae sp. CG9 ; Thraustochytriidae sp. LY2012 JX847378 ; Thraustochyfrhdae sp. MBIC 11093 AB183664 ; Thraustochyldiclae sp. NIOS1 AN705769 Thmustoehytiiidae sp. #32 DQ323161 ; Thraustochytriidae sp. #32 D0356663 Thraustochytriidae sp. RT49 00323167 ; Thriustochytrlidae sp. RT49 D0356669 ; Thraustochytriidae sp. RT49 ; Thraustochytriidae sp. Thel2 00323162 IO Thraustochytriidae sp. Thel2 ; Thraustochytrium aggregatum Thraustochytrium aggregaturn D0356662 Thraustochytrium aureum ; Thraustochytrium aureum DQ356666 ; Thraustochytrium gaertnerium ; Thraustochytrium kinnei ; Thraustochytrium 'trime/ 00323165 ; Thraustochytrium math/dm ; Thraustochytriurn multirudimentale Thraustochytrium pachydermum Thraustochytrium roseum ; Thraustochytrium sp 15 13A4.1 Thraustochytrium sp. ATCC 26185 ; Thraustochytrium sp. BL13 Thraustochytrium sp. BL14 ; Thraustochytrium sp. BL2 ; Thraustochytrium sp. BL3 austochytrium sp. BL4 ; Thraustochythum sp. BL5 Thraustochytrium sp. BL6 Thraustochytrium sp. BL7 Thraustochytrium sp. BL8 ; Thraustochytriurn sp. BL9 Thraustochytrium sp. BP3.2.2 ; Thraustochytrium sp. BP3.3.3 ; Thraustochytrium sp. 20 caudivOI-Um ; Thraustochytriurn sp. C H N- 1 Thraustochytrium sp. FJ N- 10 Thraustochytrium sp. H K1 ; Thraustochytrium sp. HK10 ; Thraustochytrium sp. HK5 ; Thraustochytrium sp. HK8 ; Thraustochytrium sp. HK8a ; Thraustochytriurn sp. KK17-3 ; Thraustochytriurn sp. KL1 Thraustochytrium sp. KL2 ; Thraustochytrium sp. KL2a ; Thraustochytrium sp. ONC-T18 ; Thraustochytrium sp. PJA10.2 ; Thraustochytrium sp. 25 TR1.4 ; Thraustochytrium sp. TRR2 ; Thraustochytrium striatum ; Thraustochytrium striatum ATCO24473 (W02017131188); Thraustochytrium striaturn 00323163 ; Thraustochytrium striai:dm DQ356665 ; Thraustochytrium visurgense ; Ulkenia ainoeboidea SEK 214 ; Ulkenia profunda; Ulkenia profunda BUTRBG 111 ; Ulkenia sp ; Ulkenia sp. ATCC 28207 (VV01998003671) ; Ulkenia visurgensis ; Ulkenia visurgensis BURAAA 141 ; Ulkenia visurgensis ATCC 28208 ; Thraustochytrides déposées à 'ATCC sous les numéros d'accession PTA-9695, PTA9696, PTA-9697 et PTA-9698 (US 2010239533);. Four la production d'huiles riches en EPA on citera Phaeodactylum tricornutum (Pt1) Bohlin Strain 8.6 CCMP2561 (W02015008160) ; Nitzschia brevirostris (CCAP 1052/21 ; 5 W02013136025) Nitzschia laevis (UTEX 2047 ; W02008004900) ; Pythium irregulare (US9074160) ; Nannochloropsis limnetica (W02016059262) Nannochloropsis satina; Nannochloropsis avicula ; Nannochloropsis accepta ta ; Nannochloropsis cculata 6 CCAP849/1 Nannochloropsis pseudatenelloides ; Nannochloropsis gaditans ; Nannochloropsis sp. CCAP211/46 ; Nannochloropsis saprophila ; Chlorella protothecoides CCAP211/17 (W0201115041); Chlorelle ellipsoidea; Chlorella minutissima ; Ch/ore/la zofinienesi ; Chlorella luteovirldis CCAP211/3; Chlorelle kessleri ; 5 Chlorelle sorokiniene CCAP211/81K; Chlore/fa buscs var vacuobara ; Chlorella sp. Chlorelle emersonli ; Alionadus subterraneus. Pour la production d'huiles riches en ARA on citera Mortierella elongata IF08570, Mortierella exigua I F08571, Mortierella hygrophile I F05941, Mortierella alpins I F08568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, 10 CBS343.66, CE3S527.72, CE3S529.72, CBS608.70; and CBS754 68 (WO 2015/095696). Le procédé selon l'invention est particulier adapté pour extraire les PUFA des organismes qui comprennent des huiles riches en PUFA, en particulier à des teneurs comprenant plus de 50% de PUFA par rapport à la masse totale de matière grasse. Il trouve ses meilleures applications pour extraire les PUFA des microorganismes qui 15 produisent des huiles qui comprennent plus de 60% de PUFA par rapport à la masse totale de matière grasse, avantageusement au moins 62% de PUFA, plus avantageusement au moins 65% de PUFA, de préférence plus de 67%, plus préférentiellement au moins 70%, encore plus préférentiellement 75% de PUFA par rapport à la masse totale de matière grasse. 20 Toutefois; les bénéfices observés de manière significative sur les fortes teneurs en PUFA se retrouve également pour extraire les PUFA de microorganismes qui produisent des huiles moins riches, mais avec des quantités qui restent significatives de PUFA, de 40% à 50% de PUFA par rapport à la masse totale de matière grasse. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le PUFA à extraire est du DHA, 25 ou un mélange DHA+DPA, les microorganismes employés étant des microorganismes producteur d'huiles riches en DHA ou en D/-1A-FDPA. On citera plus particulièrement Aurentiochylrium mangrove CCAP 4062/2 Aürantiochytriium mangrovei CCAP 4062 ) ou « Alcalase 2,4 L» ou « Novozym 37071 » de Novozyrnes) pendant 4h à une température de 65°C, (b) poursuite de la lyse en abaissant la température comprise entre 5 et 40°C, pendant une durée comprise entre 30 minutes et 30h, 15 (c) séparation mécanique de l'huile par séparateur centrifuge à assiettes. Le rendement d'extraction est de 60% de lipides extraits de la biomasse. 17 Tableau 6: profil lipidique de l'huile extraite C-i-6 :0 10m3 180m3 ClUd 0.0 1 0,0 0,0 1 0,0 C13 :0 0,0 0,0 1 C14 :0 0.3 1 0;0 I C14 :1 0,0 1 0,0 i C15 :0 0,0 : 0,0 C15:1 016 1 5.0 I C16 :0 15,4 1 8,3 LC16 :1 0.0 1 0,0 C16 :2 0,0 : 0, 0 k 1 C16 :3 0;0 1 0;0 C16 :4 0,0 0,0 Cl? :0 0;0 1 0,0 1 C17 :1 0,0 0,0 I C18 :0 0,4 1 0,4 1 C18 :1n9 (c+t) 0,0 1 0,0 1 C18 :2n6 (e+t) 0,0 1 010 1 C18 :3n3 0.0 1 0.0 L-28 3n6 51à 14n3 ... 11-------0Ï----1------6;6------ 0,0 1 0,0 1 C20 :0 1 66 I 66- , , 1 C20 :4n6 (ARA) 0,0 1 0,0 1 C20 :5n3 (EPA) 0,5 0,2 1 C21 :0 0.0 1 k 0.0 I C22 :0 0.0 1 0.0 i -22 :5n3 (D. p,n3) 0,0 1 0,0 C22 :5n6 (DPAn6) 11,6 1 I 15,4 1 C22 :6n3 (DHA) 71,5 I 75,5 1 DHA+DPA 83,1 1 90, I AGS 16,1 8,7 I DHAIDPA 6,2 I L 4,9 I DHAISFA 4,4 1 8,7 T I (DHA-FDPAVAGS 5,2 1 10,4 REFERENCES 18 EP 0 223 960 ; EP 1 001 034 WO 1994/008467 ; VVO 1997/037032 ; WO 20011054510 ; WO 02/10322; WO 03/049832 ; WO 2010/107415 ; W020111153246; WO 2012/035262; WO 2013/136025; WO 2013/136028; WO 2014/146098; VVO 2015/004402 ),NO 2015/004403 W02015/095688 ; W02015/095694 ; VVO 2015/150716 ; WO 2016/030631 US 6,750,048 Fedorova-Dahms I. & al., Safety evaluation of DHA-rich algal oil from Schirochytrium 10 sp, Food and Chemical Toxicology, 2011, 49, 3310-3318 Fcich J, et af., A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. 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Procédé d'extraction d'une huile riche en PUFA à partir d'une biomasse d'organismes producteurs comprenant ladite huile, le procédé comprenant les étapes (e) de lyse cellulaire de la biomasse d'organisme producteur d'huile et (b) de séparation mécanique de l'huile de la biomasse lysée et récupération de l'huile brute, caractérisé en ce que la lyse cellulaire (a) comprend deux parties : (al) une première partie mise en oeuvre à une première température, puis (a2) une deuxième partie de poursuite de la lyse à une deuxième température inférieure à mie re. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la biomasse d'organismes producteurs est une biomasse de microorganismes producteurs de PUFA. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la biomasse est une suspension de microorganismes. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'huile produite par les organismes producteurs comprend plus de 50% de PUFA par rapport à la masse totale de matière grasse. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les PUFA sont choisis parmi l'acide docosahexaénoïque (DF1A, C22:6n3), l'acide docosapentaénotque (EWA; C22:5n6), arachidonique (ARA, C20:4n6), eicosapentaénoïque (EPA, 020:5n3) et leurs mélanges. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caracterise en ce que l'étape de lyse est une lyse mécanique. 7. Procédé selon l'une des revendications là 5, caractérisé en ce que l'étape (a) de lyse est une lyse enzymatique. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la température de l'étape (a2) de fin de lyse est inférieure d'au moins 10°C à celle de la première partie (al). 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la température de la seconde partie de lyse (a2) est inférieure ou écale à 40°C. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la séparation mécanique (b) d'une huile à partir d'une biomasse lysée est une séparation continue par séparateur centrifuge à assiettes. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une étape (c) de raffinage de l'huile brute obtenue à l'étape (b). 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend une étape (d) de dilution de l'huile brute obtenue à l'étape (b) ou de l'huile raffinée obtenue à l'étape (c). 20 13. Composition pharmaceutique, cosmétique ou alimentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend une huile obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 12.