FR 3092397 A1 20200807 FR 1901018 A 20190201 Description Titre de l'invention : DISPOSITIF DE COLLECTE, DE CONSERVATION ET DE STOCKAGE DES CELLULES EU- CARYOTES CONTENUES DANS UN ECHANTILLON DE FLUIDE BIOLOGIQUE POUR ANALYSE CELLULAIRE UL- TERIEURE Domaine technique [0001] L'invention se situe dans le domaine de l'analyse de cellules contenues dans un échantillon de fluide biologique mettant en oeuvre un média apte à maintenir l'intégrité membranah-e des cellules. [0002] Dans la suite de la description et dans les revendications, on désigne par l'expression «fluide biologique», un échantillon de sang total (c'est-à-dire comprenant du plasma, des globules rouges, des globules blancs et des plaquettes), d'urine, de salive, de pus, de sérosité, de fluide vaginal, de larmes ou encore de fèces. [0003] Plus précisément, l'invention concerne un dispositif de collecte, de conservation et de stockage d'un échantillon biologique au sein duquel l'intégrité membranaire à la fois des cellules et de leurs constituants, est conservée, en vue d'analyses ultérieures du type phénotype cellulaire, quantification de biomarqueurs, dosage de fonctions cellulaires et enzymatiques, isolement d'organites intracellulaires etc. 100041 Les cellules concernées sont majoritairement de globules rouges et/ou de globules blancs et/ou de cellules cancéreuses pour ce qui concerne les échantillons de sang. Il s'agit essentiellement de globules blancs et/ou de cellules cancéreuses et/ou de toute cellule pouvant être isolée pour ce qui est des autres échantillons, à savoir un échantillon d'urine, de salive, de pus, de sérosité, de fluide vaginal, de larmes ou encore de fèces. Il s'agit donc de cellules eucaryotes. 100051 A titre d'exemple, d'autres types cellulaires peuvent être isolés d'un échantillon d'urine ou de salive comme des cellules épithéliales ou encore des parasites tel que des espèces de protistes. 100061 Par « cellule cancéreuse », on désigne une cellule normale dont le génome accumulé plusieurs altérations. La cellule cancéreuse devient peu sensible ou insensible aux mécanismes d'homéostasie tissulaire (mécanismes de contrôle et de réparation de l'ADN, apoptose,...) et possède une capacité de prolifération indéfinie (immortalisation). 100071 11 est à noter que les globules rouges sont des cellules eucaryotes malgré l'absence de noyau. En effet, au cours de la différenciation du proérythroblaste en érythrocytes (ou 2 globules rouges), l'hémoglobine s'accumule clans le cytoplasme ce qui conduit à condenser le noyau qui est ensuite expulsé de la cellule. [0008] La collecte des cellules eucaryotes mentionnées ci-dessus permet en outre d'avoir ul- térieurement accès à de nombreux composants des cellules du type organites, protéines, acides nucléiques, parasites intracellulaires etc. ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE [0009] L'analyse des cellules de fluide biologique est aujourd'hui effectuée sur des échantillons collectés au moyen d'un prélèvement classique. En ce qui concerne par exemple le sang, il s'agit d'un prélèvement d'un volume de plusieurs millilitres au moyen d'un dispositif de ponction veineuse ou artérielle (aiguille et corps de prélèvement ou aiguille à ailettes), dont le contenu est stocké dans des tubes de prélèvement. Pour les autres types d'échantillons biologiques, ils peuvent être stockés directement dans des boites stériles. [0010] Il existe d'autres techniques de collecte d'un échantillon biologique mais qui ne permettent pas de maintenir l'intégrité membranaire des cellules et par conséquent, ne permettent pas une analyse cellulaire. [0011] En particulier, on peut citer la technologie connue sous le nom de « Dried Blood Spot » (DBS). Elle consiste à collecter un échantillon de sang sur un support fibreux (historiquement du coton), dénommé papier buvard ou papier filtre, pour le faire sécher, le stocker à température ambiante puis l'utiliser ultérieurement pour des analyses des molécules et/ou biomolécules présentes dans le sang. Les supports fibreux très classiquement utilisés sont des bases coton. A température ambiante, les cellules sèchent, ce qui cntraine leur dessiccation et leur lyse. Les cellules perdent ainsi leur intégrité membranaire rendant l'échantillon impropre à une analyse cellulaire. En pratique, l'analyse de gouttes de sang séché permet de pratiquer des dosages de protéines, de métabolites ou d'acide désoxyribonucléique (ADN), notamment en vue d'un diagnostic de cancers, de maladies métaboliques telles que la phénylcétonurie, ou de maladies génétiques telles que la drépanocytose ou la mucoviscidose. [0012] La collecte d'un échantillon de fluide biologique sur un support fibreux a été également mise en oeuvre dans le cadre du développement de la technologie connue sous le nom de « Lateral Flow Assays » (LFA). Cette technologie est basée sur des dispositifs à base de papier destinés à détecter la présence ou l'absence d'un composé cible (protéines, métabolites, etc.) dans des échantillons liquides, sans nécessiter d'équipement spécialisé et coûteux. Selon cette technologie, l'échantillon est déposé sur un premier média à base de fibres, dit média de collecte. Dans ce média l'échantillon est traité en retenant par filtration certains constituants qui pourraient altérer l'analyse de telle sorte que ledit échantillon soit compatible avec le test. L'échantillon migre ensuite latéralement par capillarité, vers un second média à base 3 de fibres, dit « média conjugué ». Ce média a pour rôle d'accepter le conjugué, de le maintenir stable pendant toute la durée de conservation et de le libérer de manière efficace et reproductible. En pratique, le média est traité avec des particules sur lesquelles sont greffés des anticorps ou des antigènes en fonction de la cible recherchée. Lorsque l'échantillon passe à travers le média conjugué, la molécule cible à analyser se lie au conjugué et le complexe ainsi formé passe ensuite sur une membrane de nitrocellulose au sein de laquelle la présence de la molécule cible est détectée. Généralement, le test est chromatographique, c'est-à-dire que le résultat de l'analyse est visuel. En pratique, une bande colorée indique que le test a fonctionné (bande contrôle) et une autre bande se colore s'il est positif [0013] A titre d'exemple, si l'analyse a pour but d'identifier la présence d'un antigène tel que la sous-unité p de l'hormone chorionique gonadotrope ou p-hCG, le conjugué sera un anticorps dirigé spécifiquement contre cet antigène, i.e. un anticorps anti-p-hCG. [0014] Plus précisément, l'anticorps anti-p-hCG de conjugaison est marqué par exemple par une particule colorée (e.g. particule de latex mauve). L'anticorps capte la p-hCG contenue dans les urines. Par capillarité, le complexe antigène/anticorps constitué (p-hCG / anticorps anti-p-hCG -particule de latex coloré) ainsi que l'anticorps antihCG-latex coloré seul, migrent latéralement par capillarité. Le complexe antigène/ anticorps formé rencontre l'anticorps anti-p-hCG de capture au niveau de la zone de test pour former un complexe (anticorps anti-p-hCG de capture! p-hCG / anticorps anti-P-hCG de conjugaison / particule de latex coloré). C'est la formation de ce complexe qui permet la coloration de la bande test. L'anticorps anti-P-hCG de conjugaison non couplé avec la P-hCG poursuit sa migration jusqu'à la bande de contrôle où il rencontre l'anticorps anti-P-hCG, qui le fixe à son tom- sur la bande contrôle. Il y a formation d'une bande colorée au niveau de la fenêtre, contrôle permettant de valider que le test a bien fonctionné, notamment dans le cas où il serait négatif. [0015] Ces technologies permettent de conduire des analyses qualitatives et quantitatives comme l'identification et le dosage de molécules telles qu'essentiellement les protéines, métabolites intra et/ou extracellulaires ou ADN. En effet l'utilisation de cellulose (DBS) ou nitrocellulose (LFA) induit une dessiccation des cellules présentes dans l'échantillon à tester. Il s'ensuit une perte de l'intégrité des membranes cellulaires (membranes plasmique et nucléaire), ce qui rend impossible toute analyse cellulaire, telle que par exemple l'identification de populations cellulaires. [0016] Le problème que se propose de résoudre l'invention est donc celui de mettre au point un dispositif de collecte qui puisse être utilisé directement par l'utilisateur à l'instar du LFA » et du « DBS » et qui permette de conserver l'intégrité membranaire des cellules d'un échantillon biologique pour analyse cellulaire subséquente. 100171 Plus précisément, le problème que se propose de résoudre l'invention est donc celui de mettre au point un média de collecte, de conservation et de stockage qui puisse maintenir l'intégrité membranaire des cellules eucaryotes pendant un temps suffisant pour permettre (l'effectuer des analyses biologiques et des tests qui s'avèrent impossibles à réaliser avec les technologies disponibles, à savoir le DBS et le LFA. Exposé de l'invention [0018] Le Demandeur a constaté que, de manière tout à fait surprenante, la mise en oeuvre d'un média à base de composants artificiels seuls ou en combinaison avec un agent liant permet de répondre aux problèmes mentionnés précédemment. [0019] Plus précisément, l'invention a pour objet un dispositif de collecte, de conservation et de stockage d'un échantillon de fluide biologique comprenant un média poreux de collecte et de maintien de l'intégrité membranaire des cellules eucaryotes contenues dans l'échantillon, et de leurs constituants, le média comprenant au moins 80% en poids de composants artificiels, avantageusement au moins 85%, de préférence au moins 90%; et présentant une taille de porcs moyenne (MFP) d'au moins 3 pm. [0020] Dans la suite de la description et dans les revendications, l'expression « taille de porc moyenne » désigne la MFP, acronyme pour « Meatz Flow Pore size », mesurée selon la norme ASTM F316-03 (2011). [0021] Au sens de l'invention, par « cellules eucaryotes », on désigne les cellules possédant un noyau et des compartiments internes limités par des membranes, Il s'agit des globules rouges (ou érythrocytes ou hématies), des globules blancs (leucocytes) et des cellules cancéreuses. [0022] Pour la suite de l'exposé de l'invention, les termes « cellules eucaryotes » et « cellules » sont utilisés indifféremment. [0023] Au sens de l'invention, par « maintien de l'intégrité membranaire », on désigne le fait que la membrane plasmique de la cellule ne soit pas endommagée ni détruite. En d'autres termes, la cellule eucaryote présente un aspect physique extérieur compatible avec des analyses cellulaires ou subcellulaires, sans avoir subi de lyse membranaire, que la cellule eucaryote soit vivante, en quicscence ou morte après la collecte. 11 importe peu que toutes les cellules présentes dans l'échantillon de fluide biologique aient conservé leur intégrité membranaire. En effet, il suffit qu'une quantité de cellules suffisante ait conservé leur intégrité membranaire pour disposer d'un échantillon représentatif et pouvoir mettre en oeuvre l'analyse souhaitée. Beaucoup de technologies permettant d'étudier des cellules individuellement peuvent être utilisées sur ce type d'échantillon biologique. [0024] Avantageusement, le dispositif selon l'invention permet de conserver l'intégrité membranaire des cellules eucaryotes et de leurs constituants. A titre d'exemple, l'intégrité des membranes plasmique, nucléaire, rnitochondriale ou encore lysosomiale est conservée. [0025] Au sens de l'invention, par « quantité de cellules suffisante », on désigne au moins une cellule eucaryote ayant conservée l'intégrité de sa membrane plasmique. [0026] Selon la présente invention, les cellules collectées sont individualisées. [0027] Selon l'invention, par « stockage », on désigne le maintien de l'intégrité des membranes cellulaires aux températures adaptées en fonction de la nature de l'échantillon biologique, selon les connaissances de l'homme du métier. A titre d'exemple, le stockage peut s'effectuer à température ambiante (23-25°C) ou 4°C. [0028] Avantageusement, le dispositif selon l'invention permet le stockage de l'échantillon biologique à une température ambiante (23-25°C) tout en conservant l'intégrité membranaire des cellules. A titre d'exemple le stockage d'un échantillon de sang peut être réalisé à température ambiante. [0029] Selon un mode de réalisation particulier, le composant artificiel est choisi dans le groupe comprenant les fibres artificielles, avantageusement des fibres semisynthétiques et/ou des fibres synthétiques, et les mousses artificielles. [0030] Au sens de l'invention, « artificiel » signifie fabriqué ou produit par l'homme, c'est-à-dire n'existant pas à l'état naturel. [0031] Pour la suite de l'exposé de l'invention, les termes « composant artificiel » et « matériau artificiel » sont utilisés indifféremment. [0032] Au sens de l'invention, par « fibres semi-synthétiques », on désigne des fibres pour lesquelles des matériaux d'origine naturelle ont été transformés et/ou régénérés après passage dans une filière pour former des fibres. A titre d'exemple, il s'agit des fibres de rayonne, de lyocell ®, de diacétate, de triacétate ou encore de modal [0033] Au sens de l'invention, par « fibres synthétiques », on désigne des fibres pour lesquelles les unités chimiques de base ont été obtenues par synthèse chimique suivie par la formation de fibres. A titre d'exemple, il s'agit des fibres à base de polymères comme les fibres de polyéthylène téréphtalate (PET), de polybutylène téréphtalate (PBT), de polypropylène (PP), de polyéthylène (PE), de nylon, de polychlorure de vinyle (PVC), d'aramide, de polyuréthane (PU) ou encore d'élastomère, les fibres de verre et les microfibres de verre. [0034] Selon un mode de réalisation particulier, le média est un non tissé. [0035] Le dispositif de l'invention présente l'avantage d'une collecte peu invasive qui peut être opérée directement par l'utilisateur, c'est-à-dire un patient ou un personnel de santé. Le volume de l'échantillon prélevé est faible, avantageusement entre 10 pL et 50 pL et donc moins incommodant pour l'individu prélevé. Ces deux caractéristiques présentent un avantage certain par rapport à une prise de sang standard en vue d'une analyse cellulaire qui nécessite le prélèvement minimum de 4 mL pour un adulte. 6 [0036] Le principal avantage de l'invention est le maintien de l'intégrité membranaire des cellules eucaryotes pendant un temps suffisant pour permettre leur analyse. Le délai peut être de plusieurs heures, voire plusieurs jours. L'homme du métier sait comment vérifier que l'intégrité membranaire des cellules eucaryotes a été préservée en effectuant une analyse après élution des cellules depuis le média. [0037] A titre d'exemple, la détermination du maintien de l'intégrité de la membrane plasmique peut être vérifiée par analyse au microscope à contraste de phases, par marquage immunologique, par exemple de protéines membranaires, ou encore par marquage au moyen d'agents intercalants des acides nucléiques permettant de caractériser une perméabilité membranaire et donc une perte de l'intégrité, par exemple l'iodure de propidium (IP) ou le 41,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). En effet, la perméabilisation membranaire permet l'entrée de tout type de composés indépendamment des mécanismes physiologiques de transport actif ou passif. [0038] A titre indicatif, l'IP, est un colorant cationique et un agent intercalant des acides nu- cléiques sans spécificité de base qui lui permet de réagir avec l'ADN ou r ARN. Ce composé est excité à 488 nm, et émet une fluorescence à 617 nm quand il est lié à l'ADN. Son utilisation, notamment en cytométrie en flux, est liée à sa lipophobie relativement élevée, qui l'empêche de traverser facilement les membranes plasmiques, sauf celles endommagées. Cette caractéristique fait de ce composé un puissant marqueur de l'intégrité de la membrane plasmique et donc de la viabilité cellulaire. Dans le cas d'une cellule viable, l'IP ne peut pénétrer et se lier à l'ADN de la cellule, contrairement à une cellule morte qui présente une membrane perméabilisée, fragilisée. [0039] Une autre technique plus spécifiquement propre au sang ou sang total consiste à cen- trifuger l'échantillon. Si une quantité suffisante de cellules eucaryotes a conservé son intégrité membranaire, un culot se forme au fond du tube à l'issue de la centrifugation du fait du gradient de densité différent entre le plasma et les débris cellulaires légers. Ainsi, le plasma et les débris cellulaires légers sont localisés dans le surnageant alors que les cellules intègres, plus lourdes, sont stockées dans le culot. [0040] En revanche, dans le cas où un trop grand nombre de cellules a perdu leur intégrité membranaire, il n'y aura pas de gradient de densité permettant de séparer les constituants de l'échantillon. En conséquence, l'échantillon après centrifugation se présentera sous forme d'un liquide homogène, c'est-à-dire sans séparation culot/ surnageant. [0041] En d'autres termes, la présence d'un culot cellulaire caractérise le maintien de l'intégrité membranaire des cellules. A l'inverse, l'absence de culot caractérise l'absence d'intégrité membranaire des cellules. Ainsi, l'homme du métier peut savoir sans effort particulier si l'intégrité membranaire des cellules, après élution depuis le media, a été conservée au moins en pallie. 7 [0042] L'homme du métier sait choisir la méthode de détermination de l'intégrité [nem- branaire en fonction de type d'échantillon collecté. [0043] Ainsi, l'intégrité rnembranaire des cellules contenues dans un échantillon de sang peut être déterminée soit par la méthode de centrifugation et identification de la présence d'un culot cellulaire, soit, par unc analyse au microscope à contraste dc phase, soit par un marquage immunologique, ou encore par un marquage au moyen d'un agent intercalant de l'ADN. [0044] L'intégrité rnembranaire des cellules contenues dans d'autres échantillons, à savoir un échantillon d'urine, de salive, de pus, de sérosité, de fluide vaginal, de larmes ou encore de fèces, peut être déterminée soit par une analyse au microscope à contraste de phase, soit par un marquage immunologique, ou encore par un marquage au moyen d'un agent intercalant de l'ADN. [0045] Avantageusement, le média participe, permet et/ou assure, la collecte et le maintien de l'intégrité membranairc. [0046] Les propriétés physiques du média selon l'invention, en termes de résistance mécanique, de poids et de capacité absorbante dépendent de plusieurs facteurs, parmi lesquels la quantité, le type et la nature des composants artificiels compris dans le média selon l'invention, de préférence des fibres semi-synthétiques et/ou des fibres synthétiques. La conservation de l'intégrité mernbranaire des cellules contenues dans l'échantillon de fluide biologique est obtenue grâce à la nature et la quantité des fibres du média, de préférence du non tissé. [0047] Ainsi, le média du dispositif selon l'invention contient au moins 80% en poids de composants artificiels, avantageusement au moins 85%, de préférence au moins 90%, et de manière encore plus préférée au moins 95%. [0048] Selon un mode de réalisation particulier, les fibres semi-synthétiques sont choisies dans le groupe comprenant : des fibres de rayonne, des fibres de lyocell®, des fibres de viscose et leurs mélanges. [0049] Selon un mode de réalisation particulier, les fibres synthétiques sont choisies dans le groupe comprenant : des fibres de polyéthylène téréphtalate (PET), des fibres de verre, des microfibres de verre et leurs mélanges. [0050] Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le média contient exclu- sivement des composants artificiels, de préférence des fibres semi-synthétiques et/ou synthétiques, et est avantageusement dépourvu d'agent liant [0051] Selon un mode de réalisation particulier, la MFP du média est d'au moins 3 pm, d'au moins 4 pm, d'au moins 5 pm, voire d'au moins 10 pin, avantageusement comprise entre 10 pin et 200 pm, de préférence entre 30 pm et 180 pm, préférentiellement entre 45 pm et 150 pm. [0052] Comme déjà dit, le paramètre correspondant à la taille de pores moyenne ou MFP est 8 mesuré selon la norme ASTM F316-03 (2011). La mesure peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment un poromètre. Ti peut s'agir, par exemple, d'un poromètre de perméabilité avancée PMI (ou PMI Advanced Perm Pommeler). [0053] Selon un mode de réalisation particulier, l'épaisseur du média selon l'invention est comprise entre 100 et 2500 pm, de préférence entre 200 et 1200 pm. [0054] Selon l'invention, l'épaisseur du média est mesurée par la méthode TAPPI/ANSI T411 om-15 (2015), identique à la norme ASTM D645/D645M-97 (2007). La seule différence avec cette méthode de mesure correspond à l'application d'une pression par surface de 100 KPa, et non pas de 50 KPa. Cette alternative du paramètre de pression exercée est présentée par la méthode de mesure de l'épaisseur comme étant acceptable. [0055] Selon l'invention, par « perméabilité à l'air », on désigne le débit d'air traversant les 2 surfaces d'un matériau sous un différentiel de pression d'air connu. Ce paramètre est mesuré paria norme ASTM D737-18 (2018) au moyen d'un différentiel de pression d'air prescrit de 200 Pa. [0056] Selon un mode de réalisation particulier, la perméabilité à l'air du média est comprise entre 10 et 5000 L/m2.s, de préférence entre 25 et 4500 L/rn2.s. [0057] Selon un mode de réalisation particulier, le composant artificiel, de préférence les fibres scull-synthétiques et/ou les fibres synthétiques, a une valeur de reprise d'humidité inférieure à environ 5%. [0058] Selon l'invention, la « valeur de reprise d'humidité » est mesurée par la norme ASTM D629-15 (2015). [0059] Selon un autre mode de réalisation particulier, le composant artificiel, de préférence les fibres semi-synthétiques et/ou les fibres synthétiques, a un angle (le contact avec l'eau inférieur à environ 75°, avantageusement inférieur à environ 60°. [0060] Selon l'invention, « l'angle de contact avec l'eau », est mesuré par la norme ASTM D7490-13 (2013). [0061] Avantageusement, le composant artificiel selon l'invention, de préférence les fibres semi-synthétiques et/ou les fibres synthétiques, a un diamètre d'au moins 3 pm. [0062] Selon un autre mode de réalisation particulier, le média est constitué à 100% de sa masse de fibres de PET, la MFP étant avantageusement comprise entre 50 pm et 100 pm, de préférence entre 65 pin et 75 pm, l'épaisseur étant avantageusement comprise entre 800 pin et 1500 pm, de préférence entre 1050 pm et 1150 pm. [0063] Néanmoins, la cohésion des fibres peut être améliorée par l'ajout d'un liant, qui peut, le cas échéant, lui-même être sous forme de fibres. De manière avantageuse, le média, de préférence le non tissé, peut contenir jusqu'à 15% en poids d'un liant, avantageusement jusqu'à 10%. [0064] Selon un mode de réalisation particulier, le liant est choisi dans le groupe comprenant 9 le polyvinylalcool (PVOH) et les latex, de préférence les latex de styrènes acryliques. [0065] Un liant particulièrement avantageux pour le média de la présente invention est PVOH. [0066] Avantageusement, le PVOH est sous forme de fibres. [0067] Selon un mode de réalisation particulier, le liant est choisi dans le groupe comprenant le polyvinylalcool (PVOH), avantageusement sous forme de fibres, et les latex, de préférence les latex de styrènes acryliques. [0068] Selon un mode de réalisation particulier, le média selon l'invention est constitué d'un mélange de fibres de verre et/ou de fibres de PET en combinaison avec du PVOH. [0069] Selon un autre mode de réalisation particulier, le média est constitué de fibres de verre en combinaison avec de la PVOH, la MFP étant avantageusement comprise entre 50 !lm et 150 pm, de préférence entre 60 prn et 125 pm, l'épaisseur étant avantageusement comprise entre 200 pin et 400 pm, de préférence entre 300 pm et 350 !lm. [0070] Selon un mode de réalisation particulier, le média est constitué de fibres de verre en combinaison avec de la PVOH sous forme de fibres, la MFP étant avantageusement comprise entre 40 pin et 100 pm, de préférence entre 60 pin et 70 pm, l'épaisseur étant avantageusement comprise entre 200 pm et 500 pm, de préférence entre 300 pm et 350 [0071] Selon un mode de réalisation particulier, le média est constitué de fibres de verre en combinaison avec de la PVOH, la MFP étant avantageusement comprise entre 50 pm et 200 pm, de préférence entre 90 pm et 130 pm, l'épaisseur étant avantageusement comprise entre 150 pm et 400 pm, de préférence entre 200 pin et 250 pin. [0072] Selon un mode de réalisation particulier, le média est constitué de fibres de verre en combinaison avec de la PVOH et un tensioactif (ou surfactant), par exemple, le polysorbate 20, la MFP étant avantageusement comprise entre 50 pm et 300 pm, de préférence entre 90 pm et 150 pm, l'épaisseur étant avantageusement comprise entre 200 pm et 450 pin, de préférence entre 300 mn et 350 pm. [0073] Selon un mode de réalisation particulier, le média est constitué de fibres de PET en combinaison avec un liant acrylique, par exemple un latex styrène acrylique, la MFP étant avantageusement comprise entre 20 pm et 80 pm, de préférence entre 40 mn et 50 pm, l'épaisseur étant avantageusement comprise entre 200 pin et 500 pm, de préférence entre 300 pm et 400 pm. [0074] Selon un mode de réalisation particulier, le média est constitué de fibres de verre en combinaison avec de la PVOH, la MFP étant avantageusement comprise entre 50 pm et 150 pm, de préférence entre 75 pm et 100 pm, l'épaisseur étant avantageusement comprise entre 400 pm et 700 pm, de préférence entre 550 pin et 600 pin. [0075] Selon un mode de réalisation particulier, le média est constitué de fibres de verre en combinaison avec de la PVOH sous forme de fibres, des fibres de viscose et des fibres de PET, la MFP étant avantageusement comprise entre 50 pin et 200 pm, de préférence entre 100 pm et 130 pm, l'épaisseur étant avantageusement comprise entre 400 pm et 700 pm, de préférence entre 450 pin et 550 pm. [0076] Selon un mode de réalisation particulier, le média est constitué de fibres de verre et de microfibres de verre en combinaison avec de la PVOH, la MFP étant avantageusement comprise entre 5 pin et 50 pm, de préférence entre 8 pm et 15 pm, l'épaisseur étant avantageusement comprise entre 200 pin et 500 pm, de préférence entre 250 pm et 300 pm. [0077] Selon un mode de réalisation particulier, le média est constitué de fibres de PET en combinaison avec un tensioactif (ou surfactant), par exemple, le polysorbate 20, la MFP étant avantageusement comprise entre 50 pin et 150 pm, de préférence entre 65 pm et 85 pm, l'épaisseur étant avantageusement comprise entre 200 pm et 500 pm, de préférence entre 350 pm et 400 pin. [0078] Selon un mode de réalisation particulier, le média est constitué de fibres de verre en combinaison avec de la PVOH et des protéines, par exemple, l'albumine de sérum de bovin (ou BSA pour la dénomination anglaise « Bovine Serum Albumine »), la MFP étant avantageusement comprise entre 80 m et 200 pin, de préférence entre 100 pin et 140 pm, l'épaisseur étant avantageusement comprise entre 200 pm et 400 pm, de préférence entre 300 pm et 350 pin. [0079] Selon un mode de réalisation particulier, le média est constitué de fibres de verre en combinaison avec de la PVOH sous forme de fibres, un tensioactif (ou surfactant), par exemple le polysorbate 20, et du lyocell®, la MFP étant avantageusement comprise entre 80 pin et 200 pm, de préférence entre 115 pm et 130 pm, l'épaisseur étant avantageusement comprise entre 300 pin et 500 pin, de préférence entre 400 pm et 450 pm. [0080] Afin de pouvoir maintenir l'intégrité membranaire des cellules eucaryotes, le média doit permettre de maintenir l'échantillon dans un environnement permettant de conserver la partie liquide, et/ou éventuellement le sérum, du fluide biologique. [0081] Pour ce faire, le média, de préférence un non tissé, présente avantageusement une MFP d'au moins 3 pin, avantageusement comprise entre 10 pm et 200 pm, de préférence entre 30 pm et 180 pm, préférentiellement entre 45 pm et 150 pm. [0082] Selon un mode de réalisation particulier, le média selon l'invention présente une épaisseur comprise entre 100 pin et 2500 pin, avantageusement entre 200 'lm et 1200 pm. [0083] Selon un mode de réalisation particulier, pour améliorer la durée de conservation des cellules eucaryotes, le média selon l'invention est imprégné avec un conservateur isotonique (ou tampon de conservation isotonique), comme classiquement le tampon phosphate salin (PBS), éventuellement combiné à un ou des agents anticoagulants (acide éthylène diamine tetraacétique (EDTA), héparine, citrate dextrose (ACD) etc.) 11 et/ou des agents de conservation (tel que l'azoture de sodium, la paraformaldéhyde etc). [0084] Selon un mode de réalisation particulier, le tampon de conservation isotonique éven- tuellement combiné ou supplémenté en agents de conservation et/ou anticoagulants est imprégné sur le média avant dépôt de l'échantillon de fluide biologique. [0085] Selon un autre mode de réalisation, le tampon de conservation isotonique éven- tuellement combiné ou supplémenté en agents de conservation et/ou anticoagulants est imprégné de façon concomitante avec le dépôt de l'échantillon de fluide biologique. [0086] Selon un mode de réalisation préféré, le tampon de conservation isotonique éven- tuellement combiné ou supplémenté en agents de conservation et/ou anticoagulants est imprégné sur le média après dépôt de l'échantillon de fluide biologique. [0087] Les proportions de tampon de conservation isotonique et/ou des agents anti- coagulants et/ou des agents de conservation utilisées sont celles classiquement utilisées dans le domaine et connu de l'homme du métier. [0088] A titre d'exemple, pour un échantillon de fluide biologique selon l'invention, le volume de tampon de conservation isotonique et/ou des agents anticoagulants et/ou des agents de conservation imprégné sur le média selon l'invention est compris entre 50 et 100 pL. [0089] A titre d'exemple, pour un échantillon sang, le volume de tampon de conservation isotonique et/ou des agents anticoagulants et/ou des agents de conservation imprégné sur le média selon l'invention est compris entre 10 et 50 pL. [0090] Ceci est avantageux, car le média selon l'invention, en contenant un tampon de conservation isotonique avec ou sans des additifs de conservation et/ou anticoagulants, permet de conserver plus longtemps l'échantillon, ce qui prolonge le temps de stockage possible de l'échantillon de fluide biologique tout en maintenant l'intégrité membranaire d'un nombre de cellules suffisant pour réaliser l'analyse souhaitée. [0091] Avantageusement, l'échantillon de fluide biologique est analysé jusqu'à 168 heures après collecte, de préférence jusqu'à 72 heures après collecte, par exemple 12 hem-es, 24 heures, 48 hem-es voire 72 heures après collecte. [0092] Selon un mode de réalisation particulier, la conservation de l'échantillon biologique peut être renforcée en isolant le média de l'air ambiant. [0093] Selon un mode de réalisation particulier, la conservation de l'échantillon biologique peut être renforcée en isolant le média de la lumière, tel que le rayonnement ultraviolet. [0094] Ainsi et selon une autre caractéristique, le dispositif selon l'invention comprend au moins un moyen physique et/ou un moyen chimique apte à limiter l'évaporation de l'échantillon biologique et/ou son altération par la lumière. [0095] Le moyen apte à limiter l'évaporation et/ou protéger l'échantillon de la lumière peut être par exemple un film ou équivalent imperméable aux gaz et liquides. 12 [0096] A titre d'exemple, le moyen apte à limiter l'évaporation et/ou protéger l'échantillon de la lumière peut être une membrane barrière à la vapeur d'eau telle qu'une membrane microporcuse, ou encore un film monolithique tel qu'un film multicouches. [0097] Selon un mode de réalisation particulier, pour permettre d'identifier la zone de collecte du média par le patient, le média selon l'invention est pris en sandwich entre deux supports, les 2 supports étant perforés en regard l'un de l'autre pour laisser apparaitre le média. [0098] La présence des deux supports permet d'améliorer la rigidité du média selon l'invention. Ainsi, le dispositif peut être manipulé et transporté facilement. La fenêtre permet le dépôt de l'échantillon de fluide biologique sur le média. [0099] Selon un mode de réalisation particulier, pour limiter l'évaporation et/ou protéger l'échantillon de la lumière, un des supports est recouvert d'un film imperméable aux gaz et liquides, au moins dans la zone en regard du média, alors que l'autre support se prolonge latéralement par un rabat venant recouvrir au moins la zone du support en regard du média, de préférence toute la surface du support. [0100] La plupart des fluides biologiques peut être collectée avec le dispositif selon l'invention, parmi lesquels on peut citer le sang ou sang total, l'urine, la salive, le pus, la sérosité, le fluide vaginal, les larmes ou encore les fèces. Le dispositif est particulièrement adapté au sang. [0101] Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le fluide biologique est le sang. [0102] L'invention concerne également un procédé de collecte, de conservation et de stockage d'un échantillon de fluide biologique en vue d'une analyse cellulaire comprenant une étape de dépôt de l'échantillon de fluide biologique sur le média du dispositif décrit ci-dessus. [0103] En pratique, on prélève un échantillon d'un fluide biologique que l'on dépose di- rectement sur le média selon l'invention. Le dispositif est ensuite conservé et/ou stocké et/ou transporté en vue de l'analyse cellulaire du fluide. Comme mentionné précédemment, il n'est pas nécessaire que l'ensemble des cellules ait conservé une intégrité membranaire, l'essentiel étant qu'une quantité suffisante de cellules soit disponible pour l'analyse, éventuellement au moins une cellule, par exemple pour une analyse génomique ultérieure. [0104] Selon une autre caractéristique, le procédé comprend une étape ultérieure de récu- pération des cellules eucaryotes stockées sur le média. [0105] Selon un mode de réalisation particulier, la récupération se fait par élution. Elle est éventuellement effectuée à la suite de la collecte de l'échantillon, avantageusement dans un délai de 12 à 168h. [0106] Les cellules eucaryotes ainsi récupérées peuvent ensuite être analysées. En par- 13 ticulier, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape ultérieure d'analyse des cellules et/ou des constituants des cellules contenues dans l'échantillon. [0107] Le procédé peut être mis en oeuvre avec la plupart des fluides biologiques parmi lesquels on peut citer le sang, l'urine, la salive, le pus, la sérosité, le fluide vaginal, les larmes ou encore les fèces. Le procédé est particulièrement adapté au sang, Ainsi, dans un mode particulier de l'invention, l'échantillon est un échantillon de sang. [0108] Après récupération de l'échantillon, le maintien de l'intégrité membranaire des cellules eucaryotes permet non seulement l'analyse des cellules en tant que telles niais également l'analyse de la plupart de leurs constituants. En particulier, les constituants sont choisis parmi les : a. Organites tels que : i. Noyau, ii. Mitochondries, iii. Lysosomes iv. Exosomes b. Acides nucléiques tels que : i. Acide ribonucléique messager (ARNm), micro-ARN (ARNmi), iii. Acide désoxyribonucléique (ADN) circulaire, iv. ARN long non-codant, v. ADN mitochondrial, vi. ADN non fragmenté, vii. Chromosomes intacts, c. Protéines et Molécules telles que : i. Hémoglobines (HBs), ii. Molécules cytoplasmiques, iii. Ribosomes, d. Parasites intracellulaire tels que : i. Plasmodium, Leishmania, ii. Bactérie intracellulaire, e. et toutes molécules intracellulaire ou tous organites, endogène ou exogène d'intérêt. Brève description des dessins [0109] La manière de réaliser l'invention, ainsi que les avantages qui en découlent, res- sortiront bien de la description du mode de réalisation qui suit, à l'appui des figures annexées. [0110] [fig.]] 14 représente une vue éclatée en perspective d'un dispositif de collecte selon l'invention. [0111] [fig.2] représente le procédé de prélèvement et de collecte des échantillons pour analyse cellulaire mettant en oeuvre le dispositif selon la figure 1. [0112] [fig.3] est une photographie par microscopie à contraste de phases de l'échantillon obtenu au moyen du dispositif selon la figure 1 mis en oeuvre dans le procédé de la figure 2. [0113] [fig.4] représente un diagramme à deux dimensions obtenus à l'issue d'une analyse par cytométrie en flux, en fonction de l'expression des marqueurs spécifiques DAVI et CD45, d'un échantillon biologique obtenu au moyen du dispositif de la figure 1 mis en oeuvre dans le procédé de la figure 2. [0114] [fig.5] représente un diagramme à deux dimensions obtenus à l'issue d'une analyse par cytométrie en flux, en fonction de l'expression des marqueurs spécifiques CD3 et CD19, d'une population cellulaire. [0115] [fig.6] représente un diagramme à deux dimensions obtenus à l'issue d'une analyse par cytométrie en flux, en fonction de l'expression des marqueurs spécifiques CD4 et CD8, d'une population cellulaire. [0116] [fig.7] représente un diagramme à deux dimensions obtenus à l'issue d'une analyse par cytométrie en flux, en fonction de l'expression des marqueurs spécifiques EpCAM et CD45, d'une population cellulaire. [0117] [fig.8] représente sous forme de tableau les caractéristiques d'exemples de médias selon l'invention et de contre-exemples. EXEMPLES DE REALISATION DE L'INVENTION [0118] Exemple I: Exemple de dispositif selon l'invention [0119] La figure 1 illustre un mode particulier d'un dispositif selon l'invention sous forme de carte (1), comprenant un média poreux sous forme de non tissé (2). [0120] Le média non tissé (2) est pris en sandwich entre deux supports identiques (3) et (4) en carton. Les supports (3) et (4) présentent respectivement des fenêtres (31) et (41). Ces fenêtres sont placées en vis-à-vis. [0121] La présence de fenêtres sur le support (3) permet l'accès au média non tissé (2) pour le dépôt de l'échantillon de fluide biologique. La présence de fenêtres permet de récupérer par poinçonnage (ou punchage) ou par fluage l'échantillon déposé sur le média non tissé (2). [0122] Un film adhésif (5) imperméable aux gaz et aux liquides est collé sur la face externe du support (4). Un rabat (6) est destiné à être rabattu sur la face externe du support (3) après dépôt de l'échantillon biologique. [0123] Le rabat (6) permet après dépôt de l'échantillon d'enfermer le média non tissé (2) entre le film adhésif (5) et le rabat (6). Ainsi le média non tissé (2) et l'échantillon biologique se trouvent dans une atmosphère confinée isolée de l'air, de la lumière et de l'humidité ambiante. [0124] Exemple 2 : Mise en oeuvre du dispositif de collecte selon l'invention et analyse cellulaire [0125] a) Application à un échantillon de sang [0126] Comme le montre la figure 2, le procédé de l'invention contient plusieurs étapes, à savoir : [0127] Étape I : collecte de l'échantillon de sang au moyen du média selon l'invention. [0128] Étape 2 : stockage du dispositif à température ambiante, soit environ 23°C. [0129] Étape 3 : récupération de l'échantillon par découpage d'un disque de média selon l'invention placé dans un tube. Ensuite, les cellules sont éluées, c'est-à-dire récupérées et mises en solution à l'aide d'un tampon isotonique, le PBS. Cette opération est effectuée après 24 heures de stockage. [0130] Étape 4 (optionnelle, selon la nature de l'échantillon biologique et le type d'analyse cellulaire ultérieure) : centrifugation des éluats pendant 1 à 5 minutes entre 300 et 600g. [0131] Dans le cas où l'échantillon ne contient pas de cellules intactes, toutes les membranes cellulaires sont lysées c'est-à-dire que l'intégrité membranaire n'est pas conservée. La centrifugation ne permet pas d'obtenir un culot cellulaire mais uniquement des débris de constituants cellulaires en suspension. Dans le cas d'un échantillon contenant des cellules ayant conservé leur intégrité membranaire, la centrifugation va former un culot constitué des cellules intègres qui pourront alors être récupérées en vue de leur analyse. En d'autres termes et dans cet exemple, le maintien de l'intégrité membranaire des cellules obtenues à partir d'un échantillon de sang est évalué par centrifugation. [0132] Étape 5: analyse cellulaire effectuée sur le culot cellulaire obtenu en étape 4. [0133] Dans cette étape, les cellules récupérées à l'étape 4 sont mises en suspension pour être analysées, par exemple par cytométrie en flux. [0134] Cette technique permet de trier les populations cellulaires via l'identification de signaux de fluorescence : - fluorescence émise par la cellule elle-même (autofluorescence) ; - fluorescence émise par l'anticorps, couplé à un tluorochrome, qui se lie spécifiquement à la cellule. [0135] Des paramètres morphologiques de taille et de granulosité peuvent également être 16 mesurés et exploités par cytométric en flux. [0136] Comme le démontre la figure 8 ci-après, les médias 1 à 11, présentant les caracté- ristiques selon l'invention permettent de conserver l'intégrité membranaire des cellules du sang pendant 24 heures après collecte, sur un média humide (c'est-à-dire imprégné de tampon de conservation isotonique) ou sec (c'est-à-dire non imprégné de tampon de conservation isotonique) et après stockage à 4cC ou à température ambiante (23-25°C). [0137] En outre, quand les médias 1 à 11 sont imprégnés avec un tampon de conservation isotonique, la conservation de l'intégrité membranaire des cellules de l'échantillon s'étend jusqu'à 72 heures après leur collecte et stockage à 4°C ou à température ambiante (23-25°C). [0138] Le média 12 permet de conserver l'intégrité membranaire des cellules de l'échantillon après 24h de stockage à 4°C ou à température ambiante en milieu humide, et après 24h de stockage à 4°C en milieu sec. [0139] Les médias 13 et 14 (contre-exemples) ne présentent pas les caractéristiques selon l'invention (ces médias contiennent 100% en poids de fibres naturelles). Les résultats montrent que ces médias utilisés en condition sèche, c'est-à-dire sans imprégnation avec un tampon de conservation isotonique, ne permettent pas de conserver l'intégrité membranaire des cellules après 24 heures de stockage à 4nC ou à température ambiante (23-25°C). [0140] Les médias 15 et 16 (contre-exemples) ne possèdent pas les caractéristiques selon l'invention. En particulier, ces médias présentent une MFP inférieure à 3 pm (respectivement 2,2 pm et 2,9 pm), ne permettant pas de conserver l'intégrité membranaire des cellules d'un échantillon de sang, quelles que soient les conditions de collecte, de conservation et de stockage. [0141] La détermination de la survie des cellules de l'échantillon de sang a été évaluée après 72h de stockage en milieu sec, à 4°C ou température ambiante. [0142] Les résultats sont représentés dans le tableau 1. 17 [Tableaux 1] Compositi on (en % en poids total du média) Epaisse ur (pm) à 100 Kpa MFP (pm) 72 heures MILIEU SEC 4°C Température ambiante Média 100 % PET 110 70 Oui Oui N°1 Média 91% de fibres de verre + 9% PVOH 324 119 Oui Oui N°2 [0143] Les résultats du tableau 1 mo itrent que l'intégiité membranaire est conservée, au moins pour les médias 1 et 2, après 72h de stockage à 4°C ou à température ambiante, en milieu sec, c'est-à-dire sans ajout de tampon de conservation isotonique. [0144] b) Analyse des résultats [0145] Le culot cellulaire obtenu au terme de l'étape 4 mentionnée précédemment contient notamment des globules rouges (hématies ou érythrocytes) et des globules blancs (leucocytes). [0146] Les hématies sont des cellules eucaryotes anucléées c'est-à-dire dépourvues de noyau suite à son expulsion au cours de la différenciation de la lignée érythrocytaire, comme mentionné précédemment. Elles possèdent une forme concave caractéristique qui permet leur identification via la microscopie à contraste de phases. [0147] Les leucocytes possèdent un noyau, éventuellement multilobé. La présence de ce noyau induit alors un changement de phase de l'onde lumineuse qui permet de les identifier. [0148] Les résultats sont représentés sur la heure 3. [0149] Les cellules foncées correspondent aux hématies et les cellules blanches aux leucocytes. Cette photographie confirme que les cellules ont gardé leur intégrité membranaire, jusqu'à leur forme, comme le montre la biconcavité caractéristique des globules rouges, permettant ainsi de les analyser. [0150] Ces résultats visuels sont confirmés par une analyse de l'échantillon par cytométrie en flux, soit par une autolluorescence, soit par une liaison à des anticorps particuliers (anti-CD8, anti-EpCAM etc). Ce type d'identification nécessite l'utilisation de marqueurs spécifiques exprimés à la surface des cellules ce qui implique que l'intégrité membranaire soit conservée. 18 [0151] Les résultats obtenus après analyse de l'échantillon par cytométric en flux se présentent sous forme d'un diagramme en 2 dimensions. [0152] Tel que représenté sur la figure 4, l'identification et l'analyse ou le tri cellulaire s'effectuent en fonction de l'expression des marqueurs spécifiques DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) et CD45 (« cluster cf differentiation 45 » ou groupe de différenciation) présents à la surface des cellules. [0153] Ainsi, les cellules émettant une faible fluorescence correspondant au signal DAPI de même qu'une faible fluorescence correspondant au signal CD45 (DAPI- et CD45-) sont des cellules annelées (pas de marquage DAPI), qui ne sont pas des leucocytes (pas de marquage CD45). Ces cellules sont identifiées comme correspondant à des hématies. [0154] De la même façon, les cellules DAPI- et CD45- sont des leucocytes vivants et les cellules DAPft et CD45.- sont des leucocytes morts mais qui ont gardé leur intégrité membranaire. [0155] Après l'identification et la collecte de ces différents types cellulaires et via la technique du multiplex°, les leucocytes vivants identifiés précédemment sont analysés pour identifier les sous-populations (figure 5) : - CD3 et CD19+ : lymphocytes B ; et - CD3+ et CD19 : lymphocytes T. [0156] Après l'identification et la collecte de ces différents types cellulaires, les lym- phocytes T sont analysés pour identifier les sous-populations (figure 6) : - CD4 et CD8+ : lymphocytes T8 ; et - CD4+ et CD8 : lymphocytes T4. [0157] Les différentes populations cellulaires présentes dans un échantillon obtenu au moyen du dispositif selon l'invention peuvent être identifiées par la technique de cytométrie en flux. [0158] La figure 7 représente l'identification d'hématies, de leucocytes et de cellules can- céreuses selon si les cellules expriment les biomarqueurs EpCAM (« Epithelial cell adhesion molecule » ou molécule d'adhérence des cellules épithéliales) et CD45, dans un échantillon de sang obtenu au moyen du dispositif selon l'invention. [0159] Ainsi, les populations présentes dans l'échantillon sont : - EpCAM et CD45 : hématies - EpCAM et CD45+ : leucocytes ; et - EpCAM + : cellules cancéreuses. [0160] Comme le montrent ces résultats, le dispositif de l'invention permet de collecter, de conserver et de stocker, grâce au média qu'il contient, un échantillon de fluide biologique dans des conditions telles que l'intégrité membranaire des cellules est conservée rendant ainsi possible une analyse cellulaire ultérieure. 19