FR 3094092 A1 20200925 FR 1902814 A 20190319 Description Titre de l'invention : CAPTURE DE MICROVESICULES A VISEE DIAGNOSTIQUE [0001] La présente invention concerne des supports fonctionnalisés et leur utilisation pour le diagnostic de pathologies. Technique antérieure [0002] Les microvésicules cellulaires sont des vésicules émises dans le milieu extracellulaire via le bourgeonnement d'une cellule activée suite à un stress. Les microvésicules larguées dans les fluides biologiques (sang, urine, larme, etc.) renferment et/ou portent à leur surface des constituants de la cellule-mère (lipides, protéines et ARN, ou ADN mitochondrial) et donc peuvent être considérées comme des marqueurs précoces d'un état pathologique d'un tissu. [0003] Une méthode décrite dans la demande internationale PCT/FR2012/050610 emploie un ligand synthétique pour capter des microvésicules phosphatidylsérine-positive. [0004] La présente invention concerne un perfectionnement des moyens et méthodes de capture présentés dans la demande PCT/FR2012/050610. Elle concerne également l'identification de biomarqueurs de pathologies d'intérêt au moyen de supports fonctionnalisés selon les modalités présentées ci-dessous. Résumé de l'invention [0005] L'invention concerne un support solide fonctionnalisé, utile pour la capture, la détection et/ou la caractérisation de microvésicules cellulaires. Le support selon l'invention est également utile dans le domaine médical pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic et/ou de pronostic, notamment pour le diagnostic précoce d'une maladie. [0006] Le support selon l'invention est un support solide, notamment polymérique, mé- tallique ou céramique, fonctionnalisé au moyen d'un composé de formule (I) ou (H) tel que décrit ci-dessous. Selon un mode particulier de réalisation, le support est un support polymérique, notamment un support en poly(chlorure de vinyle) (ou PVC), en poly(téréphtalate d'éthylène) (ou PET), ou en polystyrène (ou PS), fonctionnalisé au moyen d'un composé de formule (I) ou (H) tel que décrit ci-dessous. [0007] L'invention concerne également une méthode pour le diagnostic d'une pathologie, comprenant la détection de la présence ou de l'absence de marqueurs spécifiques identifiés par les inventeurs. Cette détection peut notamment être réalisée après capture de microvésicules selon les modalités présentées dans la présente demande. [0008] LEGENDE DES FIGURES [0009] [fie.11 représente des étapes de fonctionnalisation du PET. 2 [0010] [fig.2] représente des étapes de fonctionnalisation du PVC. [0011] [fig.3] représente une schématisation de la surface du PVC à chaque étape de sa fonc- tionnalisation avec le complexe 1. (A) Etapc 1 : PVC vierge. (B) Etapc 2 : ajout de l'éthylènediamine (EDA). (C) Etapc 3 : ajout du glutaraldéhyde (Glu.). (D) Etapc 4: ajout du complexe 1 (Cl ). [0012] [fig.4] représente une schématisation de la surface du « DNA-B1ND® » à chaque étape de sa fonctionnalisation avec le complexe 1. (A) Etapc 1 : «DNA-BINDCD» vierge. (B) Etape 2: ajout du complexe 1 (Cl ). [0013] [fig.5] est une représentation graphique du ratio podocalyxinc/beta-actine dans les microvésicules issues d'urines de donneurs sains et de patients diabétiques. Chaque point représente le ratio obtenu pour un patient. La valeur de la moyenne mathématique est indiquée au-dessus de chaque groupe de patients. Les statistiques ont été analysés avec un test de Tukey's ANOVA. * : p 2î2076 7 t, OO2 Ech9 Z1'43. 0.09 5 ± OE882.45 0: 0,51 4- 021 microvésicules, dans une variante, le support peut être préparé en suivant le protocole général dans lequel les étapes 2 et 3 ne sont pas réalisées ou dans lequel les étapes 2,3, 4 et 5 ne sont pas réalisées. [0178] En effet, en omettant les étapes d'hydrolyse et/ou d'oxydation du PET, il est possible de moduler la quantité de groupements COOH en surface du PET et donc de moduler la quantité de complexes immobilisés en surface du PET [0179] Dans la variante proposée, les PET vierges sont nettoyés puis fonctionnalisés sans oxydation préalable ou sans oxydation et hydrolyse préalables. Grâce à la variante proposée, seules les fonctions -COOH présentes en surface du support sont activées/ fonctionnalisées en vue du greffage de complexes. Avantageusement, le PET n'ayant pas subi d'étape d'oxydation contient moins de groupements acide carboxylique, la densité obtenue de greffage sera donc plus faible (dl) ) [0180] - 1,5 pmol/ mm2 de COOH pour le PET vierge [0181] - 28 pmol/mm2 de COOH pour le PET hydrolysé [0182] - 210 pmol/mm2 de COOH pout le PET oxydé. [0183] Exemple 2 : Fonctionnalisation du PVC et greffage des complexes [0184] Protocole général : [0185] Le protocole employé va être décrit en référence à la Figure 2. [0186] 1) Une plaque dc PVC de 10 carrés de 1cm2 a été nettoyée par sonication pendant lh dans 40 mL d'eau MilliQ dans un tube de 50mL. Ensuite, la plaque a été plongée dans une solution comprenant 2 mL d'EDA 97% et 38 mL d'eau MilliQ pendant 2h à 30°C. Enfin, la plaque de 10 carrés a été rincée 3 fois dans 10mL (l'eau MilliQ, une sonication étant réalisée à chaque étape de rinçage. [0187] 2) La plaque a été plongée dans une solution comprenant 4 mL de glutaraldéhyde 50% et 30 mL d'eau MilliQ à pH 9,5, pendant 2h à 50°C. Puis la plaque a été rincée 3 fois dans 10mL d'eau MilliQ, une sonication étant réalisée à chaque étape de rinçage. [0188] 3) Enfin, le complexe est greffé en plongeant un carré de chaque plaque traitée selon les étapes ci-dessus dans une solution comprenant 10 M de complexe, 0,1 mL de DMSO et 1,9 mL de tampon phosphate citrate (0,5 M acide citrique, 0,5 M phosphate de sodium disodique) à pH4, pendant 16h à température ambiante sous agitation. Puis le carré de PVC a été rincé 3 fois dans 2mL d'eau MilliQ, une sonication étant réalisée à chacune de ces étapes de rinçage. Le carré de PVC traité a ensuite été rincé 3 fois dans 2 mL d'eau MilliQ sur 2 jours. [0189] Caractérisation des surfaces par spectrométrie de photoélectrons (XPS) [0190] Afin de caractériser la surface des matériaux, des analyses par spectrométrie XPS sur le PVC ont été réalisées à chaque étape de leur fonctionnalisation avec le complexe Cl. Les matériaux sont schématisés respectivement sur la Figure 3. Cinq points de surface, 4 coins et 1 centre, ont été étudiés pour chaque matériau. Ces analyses ont été 23 réalisées avec le spectromètre « VO ESCALAB 220i-XL ». [0191] Résultats [0192] Les spectres et déconvolutions des spectres ainsi que les pourcentages atomiques ( Tableau 3) des différents éléments présents en surface des matériaux montrent, qu'après fonctionnalisation avec le complexe Cl, le Zinc (Zn) est présent à la surface des matériaux et cela à hauteur de 0,25 % pour le PVC. Le Zinc étant le métal constitutif du complexe Cl, sa présence nous indique que le complexe Cl est fixé à la surface des matériaux. La fonctionnalisation est donc efficace sur le PVC. De plus, les pourcentages atomiques déterminés en cinq points de surface différents (4 coins + 1 centre) présentent de faibles écarts-types (Tableau 3) ce qui démontre l'homogénéité du traitement et la reproductibilité des résultats. De cc fait, nous en déduisons que la fonctionnalisation est homogène sur le PVC. [0193] Exemple 3 : Greffage du complexe Cl sur plaque DNA-BIND© [0194] Protocole général [0195] L'immobilisation des complexes sur des plaques commerciales 96 puits DNA-BIND ® de Costar a été réalisée. Cette plaque est en polystyrène pré-fonctionnalisé par des fonctions N-oxysuccinimide (NOS). Cette plaque contient 68 x 1014 NOS/cm2. Cette densité de NOS en surface est comparable à la densité de fonctions COOH que nous avions sur le polyéthylène téréphtalate (PET) (8.18 x 10N COOH/cm2) [0196] 1) On prépare une solution (Vtotal= 2 mL) avec - 1.78g de Complexe - 0.2 mL DMSO - 1.8 mL d'eau MilliQ 200 pL de cette solution sont déposés dans chaque puits (10 puits). La réaction de greffage est effectuée pendant 16h à température ambiante à l'abri de la lumière. [0197] 2) Après ce temps de réaction, la solution est retirée des puits et les puits sont rincés par 3 tlushs avec de l'eau MilliQ Chaque puits est alors mis à incuber avec une eau MilliQ fraiche et est rincé 3 fois/jour pendant 48h. [0198] Caractérisation des surfaces par spectrométrie de photoélectrons [0199] Afin de caractériser la surface des matériaux, des analyses de spectrométrie XPS sur le « DNA-BINDe» ont été réalisées à chaque étape de leur fonctionnalisation avec le complexe Cl. Les matériaux sont schématisés respectivement sur la Figure 4. Cinq points de surface, 4 coins et 1 centre, ont été étudiés pour chaque matériau. Ces analyses ont été réalisées avec le spectromètre «VU ESCALAB 220i-XL ». [0200] Résultats [0201] Les spectres et déconvolutions des spectres ainsi que les pourcentages atomiques ( Table 4) des différents éléments présents en surface des matériaux montrent, qu'après fonctionnalisation avec le complexe Cl, le Zinc (Zn) est présent à la surface des matériaux et cela à hauteur de 0,41 % pour le « DNA-BIND®». Le Zinc étant le métal constitutif du complexe Cl, sa présence nous indique que le complexe 1 est immobilisé 24 en surface des matériaux. La fonctionnalisation est donc efficace sur le « DNA_BIND® ». De plus, les pourcentages atomiques déterminés en cinq points de surface différents (4 coins + 1 centre) présentent de faibles écarts-types (Tableau 4) cc qui démontre r homogénéité du traitement et la reproductibilité des résultats. De ce fait, nous en déduisons que la fonctionnalisation est homogène sur les deux matériaux : PVC et « DNÀ-13-11\1D®». [0202] [Tableaux4] Matihaux PVC PVC rge EDA 3-14 2,25 0,78 0,29 DKA.-BND" Db.1.4-61ND.%. vierge Cl 0,49 843 8 69 0,21 9,46 0,41 0,03 0,16 0,05 [0203] Tableau 4. Pourcentages atomiques des éléments présents en surface des matériaux PVC et « DNÀ-BJND®» obtenus par XPS après chaque étape de leur fonctionnalisation avec le complexe 1 sur cinq points de surface (4 coins + 1 centre) ainsi que les écarts-types correspondant. [0204] Exemple 4 : Recherche de marqueurs portés par les microvésicules suite à leur capture par le kit polystyrène DNA-BINDegreffé avec le complexe Cl [0205] Matériels et méthodes [0206] a/ Prélèvements de fluides biologiques de patients diabétiques [0207] Les prélèvements d'urines et de plasma de patients diabétiques ont été effectués dans le service de diabétologic du Pr Vincent Rigallcau. Tous les patients ont signé un consentement de façon libre et éclairé en accord avec la Déclaration d'Helsinski et approuvé par le comité d'éthique. Le tableau clinique, dont le taux d'albuminurie dans les urines, est établi pour chaque patient diabétique. Trois groupes de patients se distinguent : les patients Normoalbuminuriques ou Normo (Stade 1 des complications de la pathologie), les Microalbuminuriques ou Micro (Stade 2) et les Macroalbuminuriques ou Macro (Stade 3). Des prélèvements d'urines de donneurs sains, sans complication néphropathique connue, sont également collectés. Tous les prélèvements sont conservés à -80C jusqu'à utilisation. [0208] IV Modèle cellulaire Human Umbilical Vcin Endothclial Cens HUVECs [0209] Les cellules endothéliales, Human Utnbilical Vcin Endothclial Cens (HUVECs) (Promocell, C-12208) sont cultivées en milieu Endothclial Cell Growth Medium 2 Kit (Promocell, C-22111) composé d'un milieu basal et d'un mélange de facteurs de croissance sans antibiotiques. [0210] c/ Isolement de microvésicules modèles à partir de culture cellulaire (Human Umbilical Vein Endothelial Cells ou HUVECs) [0211] Pour l'activation de la production de microvésicules modèles, les cellules HUVECs sont rincées 2 fois avec du tampon PBS et sont stimulées pendant 24h dans du milieu de culture avec 100 ng/mL de TNF-alpha (Peprotech, ref 300-01A). Les milieux de culture des cellules sont récupérés après 24h de stimulation et centrifugés en tube de 50 mL à 12000g pendant 2 min à 4°C afin d'éliminer les cellules, débris cellulaires et corps apoptotiques. Les surnageants sont transférés dans des tubes propres et centrifugés à 20000g pendant 90 min à 4°C afin de sédimenter les microvésicules. Le culot de microvésicules modèles obtenu est lavé par resuspension dans 1,5 mL de tampon PBS froid, transféré dans un tube de 1,5 mL puis centrifugé à 20000g pendant 90 min à 4°C. Cette étape de lavage est renouvellée une fois. Le culot de micro-vésicules modèles est ensuite resuspendu selon la taille du culot dans du PBS froid (100 à 500 pL). La quantité de protéines correspondantes est estimée par absorbance 280 nm à l'aide d'un spectrophotomètre, nanodrop. L'échantillon de microvésicules modèles est conservé à -80°C jusqu'à utilisation. 26 [0212] d/ Purification de microvésicules à partir de prélèvements d'urines humaines [0213] Les urines de donneurs sains et de patients sont décongelées et la purification des mi- crovésicules est obtenu par centrifugations différentielles : une première centrifugation est réalisée à 12000g pendant 2 min à 4°C afin d'éliminer les cellules, débris cellulaires et corps apoptotiques. Le surnageant est centrifugé à 20000g pendant 90 min à 4°C afin de sédimenter les microvésicules. Le culot de microvésicules obtenu est lavé par resuspcnsion dans 1,5 mL de tampon PBS froid, transféré dans un tube de 1,5 mL puis centrifugé à 20000g pendant 90 min à 4°C. Cette étape de lavage est renouvelée une fois. L'échantillon est conservé à -80°C jusqu'à utilisation. [0214] c/ Purification de microvésicules à partir de prélèvements de sang humain [0215] Le sang collecté dans un tube sodium citrate est soumis à une première centrifugation à 1500 g. La phase supérieure correspondant au plasma est prélevée soigneusement et est centrifugée à 12000g pendant 2 minutes afin d'éliminer les plaquettes. Le surnageant correspondant au platelet-free plasma, PFP, est centrifugé ensuite à 20000 g à 4°C afin de sédimcnter les microvésicules. Le culot de microvésicules obtenu est lavé par resuspcnsion dans 1,5 mL de tampon PBS froid, transféré dans un tube de 1,5 mL puis centrifugé à 20000g pendant 90 min à 4°C. Cette étape de lavage est renouvellée une fois. L'échantillon est conservé à -80°C jusqu'à utilisation. [0216] f/ Détection de biomarqueurs protéiques [0217] Méthode Enzymatique : Les microvésicules modèles produites par activations des cellules HUVECs présentent à leur surface des activateurs du plasminogène qui activent le plasminogène (présent à la surface des microvésicules) en plasmine: l'activité de cette plasmine peut être détectée à l'aide d'un substrat chromogène, le méthylmalonyl-hydroxypropyl-arginyl-paranitroanilide, CBS0065. Le chromophore est clivé en présence de plasmine en un produit de couleur jaune dont l'absorbance peut être mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à la longueur d'onde de 450 nm. Les microvésicules resuspendues dans du tampon PBS après isolement à partir d'HUVECs sont déposées dans les puits de la plaque de 96 puits en polystyrène (DNA-BINES Costar) greffés avec le complexe métallique &nucléaire I appelé complexe I. Une quantité totale de 2,5 pg de microvésicules (dosage réalisé par la technique de nanodrop A280 nm) dans 25 1iL est incubée lh à température ambiante. Après trois rinçages, l'activité enzymatique de chaque puits est estimée. Certains puits ne sont pas rincés et représentent le contrôle 100 % de l'activité enzymatique. Dans un premier temps, une gamme étalon est obtenue par dilution en cascade avec les concentrations suivantes en activateur du plasminogène en UI/mL 0 ; 0,00078125 ; 0,0015625 ; 0,003125 ; 0,00625 ; 0,0125 ; 0,025 et 0,05. Dans un deuxième temps, une solution de plasminogène à 4 1..tM et une solution du substrat chromogène CBS0065 à 3 mM sont préparées puis mélangées volume à volume. Un volume de 25 pL de ce mélange est 27 ajouté dans chaque puits. La plaque est recouverte d'un film autocollant et placée dans le spectrophotomètre à 37°C pendant 18h pour la lecture de rabsorbance simultanément à 405 nm et à 450 nm dans chaque puits. On réalise ainsi une cinétique ce qui nous permet de calculer la vitesse moyenne d'apparition du produit reflétant l'activité enzymatique de chaque puits, elle est exprimée en mOD/min. [0218] el Western blet [0219] La première étape consiste en la lyse des microvésicules à l'aide du tampon RIPA + inhibiteurs de protéases et de phosphatascs (990 jrl- de tampon RIPA + 10 FIL du cocktail des inhibiteurs de proteases et de phosphatases (100X)). Ajouter un volume de tampon RIPA+inhibiteurs en fonction de la taille du culot de microvésicules obtenu lors de la dernière étape d'isolement avant ajout de PBS (volume de RIPA environ 4x supérieur au volume du culot). Le culot est resuspendu par des allers-retours à la pipette et laissé dans la glace 15 minutes. Puis le lysat est centrifugé à 10000xg pendant 10 minutes à 4°C afin d'éliminer les débris. Le surnageant est transféré dans un tube propre. La quantité de protéines présente dans le lysat de microvésicules est mesurée par la technique de BiCinchoninic acid Assay (BCA). Les protéines sont ensuite dénaturées à l'aide du tampon Laernmli 4X+ agent réducteur (DTT, dithiothreitol). Le lysat dénaturé peut être conservé à -80°C avant utilisation. Les lysats dénaturés de microvésicules sont déposés sur gel d'acrylamidc en conditions dénaturantes SDS-PAGE à gradient de concentration 4-12%. La migration est réalisée sous tension constante de 120V pendant environ 1h30 (jusqu'à que le front de migration atteigne l'extrémité du bas du gel). Le transfert du gel est effectué sur une membrane de PVDF. Suite à la saturation de la membrane 1h à température ambiante avec une solution de lait 5% dans du tampon TBS-tween 0.1%, les 3 anticorps primaires dilués dans la solution de lait 5% en TBS-tween 0.1% sont incubés pendant une nuit à 4°C. Les dilutions utilisées sont les suivantes : anticorps dirigé contre la podocalyxine (Santacruz, sc-23904) 1/2000 ou contre CD41 (Novus, MAB 7616) au 1/1000 ; plus anticorps contre la beta-actine (SIGMA, A1978-10OUL) 1/10000 ; plus anticorps contre l'annexine-A5 (SIGMA, A8604-100UL) 1/2000. Après deux lavages en tampon TBS-tween 0.1%, les anticorps secondaires couplés à l'enzyme HorseRadish Peroxidase, HRP, et à la dilution 1/5000, sont incubés lh à température ambiante dans la solution lait 5% en TBS-tween 0.1%. La révélation par chemiluminescence est réalisée après deux lavages en tampon TBS-tween0.1%. Le signal est capté par une caméra CCD puis l'intensité de celui-ci est analysée par le logiciel gratuit ImageJ. [0220] h/ Analyse statistique [0221] Les statistiques des résultats de western blot pour la validation du biomarqueur dans les microvésicules issues d'urines de patients diabétiques ont été analysées avec le logiciel graphpad Prism version 7. 28 [0222] i/ ELISA [0223] Les microvésicules resuspendues dans du tampon PBS après isolement à partir d'urines ou de plasma de patients ou d'individus sains sont déposées dans les puits de la plaque de 96 puits en polystyrène (DNA-BIND® Costar) greffés avec le complexe métallique dinucléaire T appelé complexe J. Une incubation d'une nuit à 4°C sous agitation horizontale douce est observée. Suite à deux lavages en PBS, la solution de saturation composée de 5% de protéine « Bovine Serurn Albumine» (BSA) est déposée dans tous les puits de la plaque et incubée 2h à température ambiante sous agitation douce. Puis, les anticorps primaires dirigés soit contre la podocalyxine (santacruz, sc23904) au 1/500, soit contre le CD41, marqueur des plaquettes (Novus, MAB 7616) au 1/500 sont mis en contact avec les microvésicules captées dans les puits pendant 2h à température ambiante sous agitation horizontale douce. Suite à deux lavages, les anticorps secondaires couplés à l'enzyme HRP, à la dilution 1/5000, sont incubés pendant lh à température ambiante sous agitation horizontale douce. Après six lavages, 100 pL révélateur chromogène TMB (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine) sont déposés dans les puits pour une durée de 30 minutes à température ambiante sous agitation horizontale douce. La réaction est stoppée par l'ajout de 1001.1L d'acide sulfurique et l'absorbance de chaque puit est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à 450nm. [0224] Résultats [0225] a/ Identification de marqueurs protéiques portes par des microvesicules [0226] Validation du biomarqueur podocalyxine dans les microvésicules issues d'urines de patients diabétiques selon le stade de complication néphropathique par la technique de western blot. [0227] La podocalyxine est une protéine transmembranaire exprimée par les cellules podocytes, cellules glomérulaires présentes uniquement dans le rein, elle est décrite dans la littérature comme marqueur de lésion cellulaire des podocytes. [0228] La protéine beta-actine est une protéine du cytosquelette exprimée dans toutes les cellules ; cette expression universelle et stable, fait qu'elle est souvent utilisée en western blot comme protéine de référence lorsque l'on doit quantifier le taux d'une protéine dont l'expression peut varier en fonction de la pathologie. [0229] La protéine annexine-A5 est localisée proche de la membrane plasmique dans toutes les cellules ; tout comme la beta-actine, elle est aussi utilisée comme protéine de référence en western blot. De ce fait, l'analyse de l'expression de la protéine podocalyxine par western blot dans les microvésicules issues d'urines de donneurs sains ou de patients diabétiques sera donc plutôt exprimée sous forme de ratio : ratio podocalyxine/beta-actine et ratio podocalyxine/annexine-A5. [0230] La Figure 5 représente le ratio podocalyxine/beta-actine. Chaque point représente le 29 ratio obtenu après analyse par western blot de l'échantillon de microvésicules d'urines provenant d'un donneur sain ou d'un patient diabétique. On observe que les donneurs sains expriment un ratio faible de podocalyxine/beta-actine en moyenne de 0,70, cela correspond au taux basal de production naturelle de microvésicules issues de podocytes dans des conditions non pathologiques. Ce ratio augmente progressivement selon les stades de néphropathie liée au diabète. On remarque ainsi que le ratio podocalyxine/beta-actine passe en moyenne à 1,09 chez les patients norrnoalbuminuriques, puis à 1,70 chez les patients microalbuminuriques et enfin à 3,91 chez les patients macroalbuminuriques. L'analyse statistique ANOVA, avec le test de Tukey's de comparaison inter-groupe, par le logiciel GraphPad Prism, révèle une différence significative entre les groupes : Sain versus Macro avec une p-value : p