FR 3090321 A1 20200626 FR 1873741 A 20181221 Description Titre de l'invention : Procédé de filtration du fibrinogène Domaine technique [0001] La présente invention concerne un procédé de filtration du fibrinogène, ainsi que les préparations obtenues. Technique antérieure [0002] Le fibrinogène est une protéine essentielle de la coagulation sanguine, car sa polymé- risation en fibrine insoluble formée au terme de la cascade (le réactions qui gouvernent la coagulation, aboutit à la formation d'un caillot obturant la brèche vasculaire, responsable du saignement. La mise en place du caillot est ainsi essentielle pour assurer l'arrêt du saignement. De plus, la fibrine formée au niveau dc la plaie constitue un réseau fibrillaire qui assure la réparation tissulaire, donc la cicatrisation. [0003] Des déficiences congénitales en fibrinogène peuvent conduire à de graves pa- thologies. Pour soigner ces déficiences, il est nécessaire de disposer dc concentrés de fibrinogène pouvant être administrés à des patients en traitement. D'autres pathologies peuvent également être soignées par des apports de fibrinogène, notamment en cas de pertes massives de sang, en cas de chirurgie ou de traumatismes par exemple, ou à la suite d'une coagulopathic de consommation décompensée, par exemple la CI VD (coagulation intravasculairc disséminée). [0004] Par conséquent, la mise à disposition dc compositions comprenant du fibrinogène, notamment à des fins thérapeutiques, requiert des techniques de purification conduisant à un produit non seulement suffisamment purifié de contaminants de nature diverse, tels que les protéines accompagnantes ou co-purifiées, les anticorps ou les protéases, mais de surcroît sécurisé sur le plan viral et sur le plan des ATNC couvrant le prion. [0005] L'isolement de fractions enrichies en fibrinogène à partir du plasma est connu et a été décrit initialement par les travaux de Cohn et Nitschmann (Cohn et al, J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 et Kistler et al, Vox Sang., 7, 1962, 414-424). Des méthodes plus récentes incorporent notamment des techniques de préparation par précipitation, chromatographie avec des étapes dédiées de sécurisation biologique. [0006] Notamment, certains traitements d'inactivation virale classiques consistent en un traitement thermique, par exemple une pasteurisation à 60°C pendant 20h en présence de stabilisants protecteurs ou un chauffage à sec du produit lyophilisé, et/ou un traitement chimique, tel que par solvant-détergent, destinés à rendre les compositions de fibrinogène compatibles avec un usage thérapeutique. Cependant, ils ne permettent pas d'assurer une totale inactivation des virus, notamment des virus non enveloppés 2 tels que le parvovirus B19 ou le virus de l'hépatite A ou B sans impacter la protéine. En particulier, si ces traitements ne sont pas parfaitement maîtrisés, ils peuvent entraîner la dégradation de la protéine (perte d'activité biologique, dénaturation par action enzymatique) et la formation de fragments, d'agrégats et de polymères. [0007] Les autres méthodes de sécurisation biologique utilisent des techniques d'élimination virale, notamment à l'aide de filtrations. Néanmoins, ces techniques de filtration nécessitent des filtres de faible taille de pores ( 0,9, voire égal à 1,0. [0089] les exemples qui suivent illustrent un mode de réalisation de la présente invention sans toutefois en limiter la portée. [0090] 17 Exemples [0091] Exemple 1 : Evaluation de la filtration du fibrinogène sur filtre symétrique 20 nm selon l'invention [0092] La composition comprenant du fibrinogène prépurifié est obtenue selon la méthode décrite dans la demande EP1739093. [0093] I - Objectifs Evaluer la filtrabilité d'une composition comprenant du fibrinogène sur un filtre symétrique de nanofiltration de taille de pores d'environ 20nm. [0094] II - Paramètres opératoires Séquence de filtration - Filtre 0,2 - 0,1 pm polyéthersulfone (PES) - Filtre symétrique 20 nm Pégasus SV4 de la société Pall Life Sciences, surface 0,00096 m2 (Pegasus VF SV4, 10MCFSV4, surface 9,6 cm2). La solution comprenant le fibrinogène est concentrée à 3g/L et pure à plus de 90% [0095] [Tableauxl] Etapes / Paramètres Evaluation filtre 20 nm Matière première Fibrinogène éluat de chromatographie obtenu selon EP1739093 élue en tampon comprenant de l'arginine Séquence de filtration 0,2 - 0,1 pm PES20 nm 0,00096 m2 Protéines totales g/L 2,7 Pression mBar 2110 ± 10 (sur le filtre 20 nm) [0096] III - Résultats [0097] La pression de filtration a été maintenue constante à 2,1 Bar sur le filtre 20 nm durant toute la filtration. [0098] La séquence de filtration est équilibrée en tampon d'élution de la chromatographie échangeuse d'ions décrite dans le brevet EP1739093 comprenant de l'arginine. Le profil de colmatage du fibrinogène sur le filtre de taille de pores 20 nm est linéaire avec unc décroissance proportionnelle au volume filtré jusqu'à 181 L/m2. [0099] Après 10 heures 15 minutes de filtration correspondant à une utilisation optimale du filtre, un poids de 178 g de solution a été collecté ; à cc stade, le ratio du débit de filtration / débit initial est de 19%. Le débit moyen de filtration calculé de 0,3 2/min correspond à environ 17 L/h/m2 de membrane. [0100] IV - Tableau récapitulatif des résultats [0101] 18 [Tableaux2] Etapes / Paramètres Résultats Durée de filtration h 10 h 15 Capacité de la séquence kg 1m2 185 Ratio débit final / initial % 19 Débit moyen kg/h/m2 18 Fibrinogène antigénique g / L ND Capacité de la séquence kg de protéine / m2 0,5 [0102] La séquence de filtration appliquée a permis de filtrer une quantité équivalente à 0,5kg de fibrinogène par m2 de membrane de taille de pores 20 nm en 6 heures. Des fil- trabilités plus importantes auraient pu être atteintes en prolongeant la durée de filtration. [0103] Grâce au procédé selon l'invention, le rendement de cette nanofiltration est supérieur à 90%. [0104] Lc procédé selon l'invention permet donc la filtrabilité, sur filtre symétrique de taille de pores d'environ 20 nm, d'une composition comprenant du fibrinogène sans étape de congélation/décongélation préalable, ni dilution préalable à partir d'une solution de fibrinogène pré-purifié par chromatographie et éluée par tampon comprenant de l'arginine. [0105] Exemple 2 : Evaluation de la filtration du fibrinogène sur filtre symétrique 20 nm Pall DV 20 selon l'invention [0106] La composition comprenant du fibrinogène prépurifié est obtenue selon la méthode décrite dans la demande EP1739093. [0107] 1- Objectifs Evaluer la filtrahilité d'une composition comprenant du fibrinogène sur un filtre symétrique de nanofiltration de taille de pores d'environ 20nm. [0108] II - Paramètres opératoires Séquence de filtration - Filtre 0,2 - 0,1 pm polyéthersulfone (PES) - Filtre symétrique 20 nm ULTIPOR VF DV20 de la société Pall Life Sciences, surface 0,00106 m2. 19 [0109] La solution comprenant le fibrinogène est concentrée à 3,1 g/L et pure à plus de 90% [0110] [Tableaux3] Etapes / Paramètres Evaluation filtre 20 nm Matière première Fibrinogène eluat de chromatographie obtenu selon EP1739093 élue en tampon comprenant de l'argininc Séquence de filtration 0,2 - 0,1 pm PES20 nm 0,00106 m2 Protéines totales g/L 3,1 Pression mBar 2 027 ± 7 (sur le filtre 0,2 - 0,1 pm)2 025 ± 39 (sur le filtre 20 nm) [0111] HI - Résultats [0112] La pression de filtration a été maintenue constante à 2,0 Bar sur le filtre 20 nm durant toute la filtration. [0113] La séquence de filtration est équilibrée en tampon d'élution de la chromatographie échangeuse d'ions décrite dans le brevet EP1739093 comprenant de l'arginine. Le profil de colmatage du fibrinogène sur le filtre de taille de pores 20 nm est linéaire avec une décroissance proportionnelle au volume filtré jusqu'à 136 L/rn2. [0114] Après 16 heures 30 minutes de filtration correspondant à une utilisation optimale du filtre, un poids de 154,7 g de solution a été collecté ; à ce stade, le ratio du débit de filtration / débit initial est de 27%. Le débit moyen de filtration calculé de 0,1 g/min correspond à environ 9 L/h/m2 de membrane. [0115] IV - Tableau récapitulatif des résultats [0116] [Tableaux4] Etapes / Paramètres Résultats Durée de filtration h 16 h 30 Capacité de la séquence kg/m2 146 Ratio débit final / initial % 27 Débit moyen kg/h/m2 8.8 Fibrinogène antigénique g/L 3,1 Capacité de la séquence kg de fibrinogène / 0,4 m2 [0117] La séquence de filtration appliquée a permis de filtrer une quantité équivalente à 0,4 kg de fibrinogène par m2 de membrane de taille de pores 20 nm en 15 heures. Des fil- trabilités plus importantes auraient pu être atteintes en prolongeant la durée de filtration. [0118] Exemple 3 : Evaluation de la filtration du fibrinogène sur filtre symétrique 20 nm selon l'invention avec préfiltration 20-50 nm [0119] La composition comprenant du fibrinogène prépurifié est obtenue selon la méthode décrite dans la demande EP1739093. [0120] I - Objectifs Evaluer la filtrabilité d'une composition comprenant du fibrinogène sur un filtre symétrique de nanofiltration de taille de pores d'environ 20nm. [0121] H - Paramètres opératoires Séquence de filtration - Filtre 0,2 - 0,1 pm polyéthersulfone (PES) - Filtre 35 nm (Planova 35N d'Asahi) - Filtre symétrique 20 nm Pégasus SV4 de la société Pall Life Sciences, surface 0,00096 m2 (Pegasus VF SV4, 10MCFSV4, surface 9,6 cm2). [0122] La solution comprenant le fibrinogène est concentrée à 3g/L et pure à plus de 90% [0123] [Tableaux5] Etapes / Paramètres Evaluation filtre 20 nm Matière première Fibrinogène éluat de chromatographie obtenu selon EP1739093 élué en tampon comprenant de l'arginine Séquence de filtration 0,2 - 0,1 gm PES35 nm 0,01 m2 + 20 nm 0,00096 m2 Protéines totales g/L 3,1 Pression mBar 300 ± 50 (sur le filtre 35 nm)2100 ± 100 (sur le filtre 20 nm) [0124] HI - Résultats [0125] La pression de filtration a été maintenue constante à 2,1 Bar sur le filtre 20 nm durant toute la filtration. [0126] La séquence de filtration est équilibrée en tampon d'élution de la chromatographie échangeuse d'ions décrite dans le brevet EP1739093. Le profil de colmatage du fibrinogène sur le filtre de taille de pores 20 nm est linéaire avec une décroissance proportionnelle au volume filtré jusqu'à 276 L/m2. [0127] Après 18 heures de filtration correspondant à une utilisation optimale du filtre, un poids de 264,8 g de solution a été collecté ; à ce stade, le ratio du débit de filtration / débit initial est de 14%. Le débit moyen de filtration calculé de 0,3 g/min correspond à environ 15 L/h/m2 de membrane. [0128] IV - Tableau récapitulatif des résultats [0129] 21 [Tableaux6] Etapes / Paramètres Résultats Durée de filtration h 18 Capacité de la séquence kg/m2 290 Ratio débit final / initial % 14 Débit moyen kg/h/m2 16.1 Fibrinogène antigénique g/L 3,0 Capacité de la séquence kg de fibrinogène / m2 0,8 [0130] La séquence de filtration appliquée a permis de filtrer une quantité équivalente à 0,8 kg de fibrinogène par m2 de membrane de taille de pores 20 nm en 18 heures. [0131] Grâce au procédé selon l'invention, le rendement de cette nanofiltration est supérieur à 90%. [0132] Lc procédé selon l'invention permet donc la filtrabilité, sur filtre symétrique de taille de pores d'environ 20 nm, d'une composition comprenant du fibrinogène sans étape de congélation/décongélation préalable, ni dilution préalable à partir d'une solution de fibrinogène pré-purifié par chromatographie et éluée par tampon comprenant de l'argininc. [0133] Exemple 4 : Comparaison du procédé selon l'invention avec un procédé de l'art antérieur sur filtre asymétrique d'environ 20nm [0134] I - Objectifs Comparer le niveau de capacité de fibrinogène par m2 de membrane pouvant être supportée par le procédé selon l'invention et un procédé de l'art antérieur sur filtre asymétrique d'environ 20nm. [0135] Il - Préparation de la matière première : La composition comprenant du fibrinogène pré-purifié est obtenue selon la méthode décrite dans la demande EP1739093. [0136] III - Préparation du tampon d'équilibrage du filtre Il s'agit du même tampon d'élution que celui utilisé pour la préparation de l'éluât de départ (Tp E DEAE Macroprep, ajusté à pH 7,5 ± 0,1 par acide citrique 1M). [0137] IV - Séquence de filtration : 1. Préfiltration : La composition de fibrinogène est préfiltrée à l'aide d'un filtre PES (Polyéther sulfone) modèle Sartopore 2 de porosité 0,2- 0,1 pm (100 nm) 2. Filtration : Selon la condition opératoire testée la composition préfiltréc est alors filtrée : à l'aide d'un filtre Pegasus SV4 (commercialisé par la société Pall Life Sciences) à 2100 ± 100 mbar, ou bien à l'aide d'un filtre Planova 20N (commercialisé par la société Asahi) à 395 ± 23 mbar. [0138] V - Résultats Les résultats obtenus ont été compilés dans le graphique tel que représenté à la Figure 1. [0139] Pour les deux procédés, on observe que plus le débit (en L/h/m2) appliqué est faible et plus la capacité en fibrinogène supportée (en g de fibrinogène par m2 de membrane) augmente. [0140] Cependant on observe que la capacité de fibrinogène supportée par le procédé de l'art antérieur (« procédé antérieur » dans le graphique ci-après) faisant ici appel à un filtre asymétrique Planova 20N d'Asahi est bien inférieure à celle supportée par le procédé selon l'invention (« procédé invention » dans le graphique ci-après), mettant ici en oeuvre un filtre symétrique Pegasus SV4 de Pall Life Sciences. [0141] Ainsi ces résultats illustrent que le procédé selon l'invention sur un filtre symétrique supporte une capacité de fibrinogène d'au moins 200 g/m2 de membrane, notamment une capacité de fibrinogène de 250 g/m2 de membrane. [0142] Exemple 5 : Comparaison du procédé selon l'invention sur filtre symétrique avec les procédés de l'art antérieur sur filtre asymétrique [0143] Dans les mêmes conditions que l'exemple 4, différents filtres asymétriques des procédés de l'art antérieur sont testés en comparaison avec le procédé selon l'invention. [0144] Les résultats sont les suivants : [0145] 23 ITableaux71 Procédé selon 1 invention sur Protée selon l'art a ur filtres filtre symétrique asymétri D_ - UltlperVF D',./20 01 E Planova. o ,__ .. fi) L1 Ta. - ail ,Plari.o.v'eN1 20N. Asahr X o - 4 si l',.xerrfpli) gi .A$alli +1PialtSV11 ilexemple A) . yr o . x (exernpi3 ra > n ,D -à- -=- Q '''l e_ , Durée de !Ir azio n 10n15 16030 ' 2;0 h Capaeited séquence _9v 17 6 6 t0,2 kg de solutionress' Raft débit initial % ,, 7 Débit moyen kehirre 16.-1 4 9 o Fibrinogène antigénique 4 3:4 3.4 3:2 3.2. gel_ 0 .., , Capacité de La séquence 9,5 0 4 u,$ 00055. 0 061 0.320 0 031 kg de fibrinogène 1 ne 101461 Les nanofiltres asymétriques testés sur une solution de fibrinogène prépurifiée par chromatographie ayant une concentration d'au moins 2 g/L montrent des filtrabilités inférieures à 0.1 Kg de fibrinogène par m2 tandis que le procédé selon l'invention sur filtre symétrique permet d'atteindre une filtrabilité supérieure à 0,2 Kg de fibrinogène par m2. Exemple 6 : Evaluation de la réduction virale [0147] I - Objectif : Evaluer la réduction virale obtenue à l'aide du procédé selon l'invention. [0148] II - Préparation de la matière première : La composition comprenant du fibrinogène pré-purifié est obtenue selon la méthode décrite dans la demande EP1739093. [0149] III - Préparation du tampon d'équilibrage du filtre : 11 s'agit du même tampon d'élution que celui utilisé pour la préparation de l'éluât de départ (Tp E DEAE Macroprep, ajusté à pH 7,5 ± 0,1 par acide citrique 1M). [0150] IV - Séquence de filtration : La composition de fibrinogène est préfiltrée à l'aide d'un filtre PES (Polyéther 24 sulfoné) modèle Minisart High flow de porosité 0,2 - 0,1 !lm (100 nm). La nanofiltration est réalisée sur le filtre Pcgasus SV4 de Pall Life Sciences à une pression de 2,1 +/- 0,1 bar. La charge virale est mesurée est produite à l'aide du produit PPV Ultrapure Gold 1% (v/v). Un échantillon est prélevé dans la fraction nanofiltréc après la filtration de 79,2 L/m2 de solution (volume chargé). On observe un colmatage complet du filtre après filtration de 85,5 L chargés par m2 de membrane. V -Résultats Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-après. Ces résultats montrent que pour des capacités de fibrinogène de 250 g/m2 de membrane la réduction virale mesurée est de 3,78 (+/- 0,56) log10. [0151] VI - Tableau récapitulatif des résultats Volume Charge Charge Charge Facteur de chargé fibrinogène virale en virale en sor le , réduction (Um2) cumulée entrée TCID virale (g/m2) (log10 (lo TCID50) 79,2 253 ±0,17 4 33 ± 22 378±0x56 [0152] . 25