FR 3092666 A1 20200814 FR 1901263 A 20190208 Description Titre de l'invention : Procédé de fabrication d'un capteur de mesure du pH à base de fibre optique. [0001] La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'un capteur d'ions à base d'une fibre optique. Elle concerne également un système de mesure optique du pH d'une solution en utilisant un capteur conçu selon le procédé de l'invention. [0002] La présente invention trouve une application particulièrement intéressante dans la mesure du pH dans des systèmes biologiques de faible volume, mais elle est d'un cadre plus large puisqu'elle peut s'appliquer à la mesure de pH dans le domaine de la physico-chimie. Technique antérieure [0003] D'une façon générale, les besoins industriels actuels sont remplis par l'utilisation de pH-mètre à électrode de verre miniature ou pH-mètre à ISFET. Pour le premier, les volumes requis restent élevés pour une application dans le domaine biologique par exemple ; et pour le second il existe de nombreux problèmes liés à l'électrode de référence. [0004] On connaît des capteurs de pH à fluorescence à base de fibre optique destinés à la mesure in vivo. De tels capteurs utilisent des molécules greffées à l'extrémité clivée d'une fibre optique ; les propriétés de fluorescence de ces molécules étant dépendantes du pH. Des molécules permettent de mesurer le pH en calculant le rapport de la fluorescence émise à deux longueurs d'onde distinctes. Cette technique ratiométrique nécessite une calibration (étalonnage) et les fabricants de molécules conseillent aux utilisateurs d'effectuer un étalonnage préalable en utilisant respectivement les points de terminaison acide et basique du titrage (« titration » en langue anglaise). Cette procédure d'étalonnage nécessite de contrôler très précisément les conditions expérimentales et prend beaucoup de temps pour les applications cliniques. 100051 On connaît également la publication "Improving the sensitivity of amino-silanized sensors using self-structured silane layers: Application to fluorescence pH measurement", Rutjaphan Kateklum et al., avril 2017, Sensors and Actuators B, Vol. 248, pp. 605-612.. Ce document décrit une méthode de fonctionnalisation d'une extrémité de fibre optique en appliquant une couche tri fonctionnelle et une couche difonctionnelle. L'un des problèmes du processus de conception décrit dans cette publication est la durée et la complexité de conception. 100061 On connaît également la publication « Calibration free and fluorescein based fiber optic pH sensor for clinical applications », Bernard Gauthier-Manuel et al., IEEE SENSORS, 28-31 octobre, New Delhi, 2018, Proceedings IEEE Sensors, ISBN: 2 978-1-5386-4707-3, Part Number: CFP18SEN-ART, pp. 1173-1176. Ce document décrit une méthode de calcul permettant d'obtenir une valeur de pH à partir de mesure de fluorescence. [0007] La présente invention a pour but un nouveau procédé dc fonctionnalisation rapide et simple d'une fibre optique clivée. [0008] L'invention a encore pour but la réalisation d'une couche fonctionnalisée homogène et circonscrit à la zone de clivage. [0009] Un autre but dc l'invention est la conception d'un capteur pour lequel l'utilisation ne nécessite pas de calibration. [0010] Exposé de l'invention [0011] On atteint au moins l'un des objectifs précités avec un procédé dc fabrication d'un capteur d'ions à base d'une fibre optique, ce procédé comprenant les étapes suivantes : - clivage de la fibre optique, des groupes hydroxyles libres apparaissant sur la surface clivée, - greffage d'une couche de silane trifonctionncl directement sur des groupes hydroxyles libres ainsi apparus sur la surface clivée de la fibre optique, sans une étape préalable d'activation exogène, - greffage d'une couche de silane difonctionnel sur la surface clivée de la fibre optique, - greffage d'un colorant fluorescent. [0012] Lc procédé selon l'invention permet de réaliser une couche active qui est particu- lièrement homogène et propre sur la section clivée de la fibre optique. Une telle couche est facilement reproductible. [0013] Contrairement à la technique classique de l'art antérieur qui consiste à générer des fonctions hydroxyles par activation exogène comme par exemple par utilisation d'un procédé UV-ozone ou d'un mélange piranha, le procédé selon l'invention permet dc greffer directement le silane sur des groupes hydroxyles libres apparus suite au clivage. Les inventeurs se sont rendu compte de la présence spontanée des fonctions Si-OH libres lors du clivage. En effet, le clivage produit des groupes hydroxyles libres sur lesquels peuvent être greffés directement une couche de silane. [0014] Il n'est plus nécessaire de réaliser, comme dans l'art antérieur, une opération d'activation par UV qui prenait beaucoup de temps et nécessitait des précautions contraignantes. Cette opération d'activation avait pour but la création des fonctions Si-OH libres sur l'extrémité de la fibre optique. Mais malheureusement, il était difficile de contrôler cette activation uniquement sur la section clivée (la surface de clivage) de la fibre optique. 3 [0015] Avec le procédé selon l'invention, on simplifie considérablement la procédure de greffage. Les molécules ne sont greffées que sur la surface de clivage à l'extrémité de la fibre clivée, seule zone active. Un capteur conçu de cette manière permet une mesure de pH sans calibration sur de très petits échantillons. [0016] L'invention est notamment remarquable par le fait que la première étape de greffage consiste à réaliser une couche mince dc silane trifonctionnel présentant des sites greffages. La seconde étape permet notamment de greffer un polymère linéaire de silane difonctionnel pour créer une couche active d'épaisseur désirée. En effet, le greffage sur une surface de silice nécessite deux fonctions. L'utilisation d'un silane di-fonctionnel ne peut générer que des monocouchcs, ce qui est insuffisant pour obtenir un signal de fluorescence utilisable. L'utilisation d'un silane trifonctionnel génère des multi couches denses qui ne pourront fixer les grosses molécules de colorant qu'à la surface, ce qui ne contribuera pas à l'augmentation significative du signal. Ainsi, les deux étapes de greffages selon l'invention permettent d'obtenir une couche apte à être fonctionnalisée en profondeur et un niveau de signal de fluorescence utilisable. [0017] Selon l'invention, les étapes de greffage d'une couche de silane trifonctionnel et de greffage d'une couche de silane difonctionncl peuvent être réalisées de façon simultanée par un mélange contenant moins de 1% de silane trifonctionnel. Il est ainsi possible de réaliser une couche avec un mélange dc silane difonctionncl et tri-fonctionnel mais avec une très faible proportion de trifonctionnel pour réticuler les chaînes de difonctionnel. Cela permet de former une structure de type gel au lieu d'une structure de type brosse lorsque les étapes sont distinctes et successives. [0018] Un capteur est ainsi constitué par la fibre optique clivée comportant sur sa surface de clivage des molécules fluorescentes sensibles au pH. [0019] [0020] Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, le silane difonctionnel peut être un composé amino-silane permettant de constituer une surface de composés amines pour le greffage du colorant fluorescent. [0021] En d'autres termes, le greffage s'effectue en deux phases. Dans une première phase on génère des fonctions amines par greffage d'un amino-silane. Dans une seconde phase on greffe les molécules fluorescentes comportant un radical réactif vis-à-vis d'un groupement amine. [0022] La réaction entre les fonctions amines et les fonctions amino-sensibles du colorant fluorescent choisi permet la fixation covalente des molécules optiquement actives dans la couche de silane. [0023] A titre d'exemple non limitatif, le greffage du colorant fluorescent peut être réalisé en utilisant une fonction ester succinimidylique comme agent de couplage avec la surface aminée. [0024] Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, le greffage du colorant fluorescent peut être réalisé en utilisant un chlorure de sulfonyle comme agent de couplage avec la surface aminée. On peut également utiliser un isothiocyanate comme agent de couplage avec la surface aminée. [0025] Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention, le silane difonctionnel peut être un composé thiol permettant de constituer une surface de composés thiols pour le greffage du colorant fluorescent. On peut également utiliser un iodoacétamide ou un maléimide comme agent de couplage avec la surface de composés thiols. [0026] TI a été constaté que les fonctions hydroxyles libres obtenues après clivage ont tendance à disparaître au bout d'un certain temps. [0027] Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'étape de greffage de la couche de silane trifonctionnel peut être réalisée dans un temps inférieur à 1 minute ou dans les 30 minutes suivant le clivage de la fibre optique. En d'autres termes, le greffage de silane trifonctionnel est réalisé le plus rapidement possible pour disposer du maximun de fonctions SiOH libres. [0028] On peut même envisager de réaliser ce greffage dans l'heure suivant le clivage. [0029] TI s'agit en fait de réaliser le greffage sur une surface fraîchement clivée, c'est-à-dire dans une durée prédéterminée pendant laquelle des fonctions hydroxyles apparues de manière spontanée sont encore libres. Par expérience, on peut déterminer à partir de quel moment après le clivage, le taux de fonctions hydroxyles libres n'est plus suffisant pour réaliser un greffage efficace de couche mince de silane trifonctionnel. Cette détermination est obtenue en fonction notamment du type de fibre optique, de la température ambiante, et de l'environnement. [0030] Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, la fibre optique présente une teneur en ions hydroxyles supérieure à 10 ppm, de préférence entre 100 et 1200 ppm. [0031] Plus généralement, il s'agit d'une fibre optique dite à haute concentration en ions hy- droxyles OH. Avec une telle fibre optique, on s'assure d'avoir une grande concentration de fonctions hydroxyles libres lors du clivage. [0032] Selon un mode de réalisation, le silane peut comprendre au moins un radical réactif du groupe C1-10alkoxy, tel que par exemple l'ethoxy, le methoxy, le propoxy, ou le butoxy. [0033] Selon une mode de réalisation de l'invention, le silane peut comprendre au moins un radical réactif à base d'atomes halogènes tels que par exemple le fluor, le chlore, le brome_ [0034] Selon un autre aspect de l'invention, il est proposé un système de mesure optique de pH d'une solution, comprenant : - une fibre optique ayant des molécules fluorescentes greffées sur une première extrémité de la fibre optique selon un procédé tel que décrit ci-dessus, - une source lumineuse pour exciter les molécules fluorescentes depuis une seconde extrémité et via la fibre optique, - un spectromètre pour recueillir un signal de fluorescence provenant des molécules fluorescentes via la seconde extrémité, et - une unité de traitement pour déterminer le pH de la solution. [0035] [0036] DESCRIPTION DES FIGURES ET MODES DE REALISÀTION [0037] D'autres avantages et caractéristiques apparaîtront à l'examen de la description détaillée d'exemples de réalisation nullement limitatifs, et des dessins annexés sur lesquels : [0038] [fig.1] est un organigramme illustrant différentes étapes du procédé de fonctionna- lisation d'une fibre optique selon l'invention ; [0039] [fig.2] est une représentation schématique d'une vue en coupe d'une extrémité de fibre optique après clivage selon l'invention ; [0040] [fig.3] est une représentation schématique d'une vue en coupe de l'extrémité de la fibre optique de la figure 2 sur laquelle un greffage trifonctionncl a été réalisé ; [0041] [fig.4] est une représentation schématique d'une vue en coupe de l'extrémité de la fibre optique de la figure 3 sur laquelle un greffage de chaines difonctionncllcs a été réalisé ; [0042] [fig.5] est une représentation schématique d'un processus chimique lors d'un greffage de molécules fluorescente sur l'extrémité de la fibre optique de la figure 4 ; et [0043] [fig.6] est une représentation schématique d'un système de mesure optique de pH selon l'invention. [0044] Il est bien entendu que les modes de réalisation qui seront décrits dans la suite ne sont nullement limitatifs. On pourra notamment imaginer des variantes de l'invention ne comprenant qu'une sélection de caractéristiques décrites par la suite isolées des autres caractéristiques décrites, si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieure. Cette sélection comprend au moins une caractéristique de préférence fonctionnelle sans détail structurel, ou avec seulement une partie des détails structurels si cette partie uniquement est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieure. [0045] [0046] Bien que l'invention n'y soit pas limitée, on peut maintenant décrire un procédé de fonctionnalisation d'une fibre optique selon l'invention en utilisant une fonction ester succinimidylique comme agent de couplage avec une surface d'amino-silane [0047] D'une façon générale, le silane trifonctionnel et le silane difonctionnel sont préparés 6 en amont en solutions qui sont ensuite utilisées avec un grand nombre de fibres optiques. Par exemple, on peut utiliser un flacon en polypropylène que l'on fixe dans une bouteille en verre. On remplit le flacon d'une solution de silane trifonctionnel. Avantageusement, un des adjuvants du polypropylène agit comme catalyseur. On peut également utiliser du toluène comme solvant et atteindre un pH de 2. D'autres solvants peuvent être utilisés. L'ensemble bouteille et flacon est ensuite placé dans un congélateur afin d'interrompre la polymérisation. [0048] De la même manière on remplit un autre flacon du silane difonctionnel. Ce flacon est fixé à une autre bouteille en verre. L'ensemble passe au four à 60° pour quelques heures. La durée d'enfournement dépend de la longueur souhaitée des chaînes de silane, en fait du nombre de groupements NH2 souhaités. L'ensemble bouteille et flacon est ensuite placé dans un congélateur afin d'interrompre la polymérisation. [0049] [0050] La figure 1 est un organigramme illustrant différentes étapes du procédé de fonction- nalisation d'une fibre optique selon l'invention. On distingue quatre étapes : clivage, greffage trifonctionnelle, greffage difonctionnelle, et greffage de molécules fluorescentes. Nous allons reprendre ci-dessous ces différentes étapes en référence aux figures 1 à 5. [0051] A l'étape 1, on dénude et on clive l'extrémité de la fibre optique. Après avoir préa- lablement décongelé la solution de silane trifonctionnel, on plonge l'extrémité de la fibre optique fraichement clivée dans la solution de silane trifonctionnel lors d'une étape 2 de greffage trifonctionnel. [0052] Comme on le voit sur la figure 2, des ions hydroxyles libres OH sont spontanément présents sur la surface clivée 5 de la fibre optique 6 et restent disponibles pendants un certain temps. Pour ce faire, on utilise une fibre optique multimode à saut d'indice présentant une teneur en ions OH supérieure à 10 ppm. Une haute teneur en ions. [0053] Dans le cas présent, quelques minutes seulement séparent l'étape 1 de clivage de l'étape 2 de greffage du silane trifonctionnel de sorte que pendant cette durée de quelques minutes, un minimum de fonctions hydroxyles OH libres sont perdues par liaison avec des contaminants de l'atmosphère. Il n'est pas nécessaire de réaliser une activation pal- rayons UV-ozone ou par utilisation d'un mélange piranha ou toute autre méthode. L'étape 2 de greffage du silane trifonctionnel est réalisée à température ambiante pendant quelques minutes. Cela suffit pour former complètement la couche mince trifonctionnelle. [0054] [0055] Avantageusement, les greffages trifonctionnels et difonctionnels utilisent le silane. Une molécule de silane se compose de trois parties. Une première partie formée par l'atome de silicium comportant 1, 2 ou 3 liaisons avec une deuxième partie comprenant 7 un radical réactif R pouvant être un groupe alcoxyl, des atomes halogènes ou un groupe hydroxyle. Par exemple le groupe alcoxyl peut comprendre un groupe éthoxyl - OCH2CH3, un groupe méthoxyl -OCH3 on parle alors d'alcoxysilane, et les atomes halogènes peuvent comprendre un chlorure -Cl, on parle alors de chlorosilane. [0056] La troisième partie est la ou les liaisons restantes de l'atome de silicium avec un atome de carbone d'une chaîne aliphatique dénommée espaceur qui se termine par un groupe fonctionnel (-SH, -NH2, COOH, -CH3, -OH...) déterminant les propriétés du produit final. La longueur de cet espaccur est variable et peut même être supprimée comme par exemple dans le triethoxysilanc. [0057] Le nombre des radicaux réactif R définit le nombre de liaisons Si-O-Si qu'il est possible de réaliser lors de la réaction de greffage. Une surface de silice nécessite deux liaisons de cc type pour attacher correctement l'atome de silicium. Donc l'utilisation d'un silane difonctionnel (deux groupes fonctionnels) ne pourra conduire qu'à la création d'une monocouche. Pour faire croître l'épaisseur de la couche greffée, on utilise avantageusement un silane trifonctionnel (trois groupes fonctionnels) pour créer la première couche greffée et disposer ainsi d'une fonction supplémentaire. [0058] Sur la figure 3, on voit que les molécules d'amino-silane se sont liées à des atomes d'oxygène des groupes OH qui étaient libres tout de suite après clivage. Un tel arrangement propose théoriquement comme disponible un radical R comme par exemple un radical amine NUL et un radical OH sur lequel viendra se greffer un amino-silane difonctionnel. [0059] [0060] A l'étape 3 sur la figure 1, la fibre optique est ensuite plongée dans la solution de silane difonctionnel pendant quelques hem-es à température ambiante. De la même manière il n'est pas nécessaire de placer l'ensemble dans un four. Ensuite, la fibre optique est rincée dans le toluène et dans le DMSO (Diméthylsulfoxyde). Ce dernier étant utilisé pour nettoyer tout ce qui ne s'est pas greffé de façon covalente. [0061] Sur la figure 4, les chaînes de molécules du polymère linéaire d'amino-silane di- fonctionnel entrent en contact avec la couche tri-fonctionnelle et se lient à celles-ci par liaison covalente. Les chaînes courtes se lient plus rapidement que les chaînes longues. On constate que les fonctions amines NH2 sont disponibles. La couche n'est pas développée sur les parois latérales de la fibre. Comme la couche trifonctionnelle n'existe qu'au bout de la fibre, sur la section clivée, la couche difonctionnelle se développe principalement, voire uniquement, sur cette section. Les parois latérales de la fibre optique 6 sur la figure 4 peuvent éventuellement recevoir quelques chaines de silanes mais la couche se développe dans le prolongement de la fibre optique, à son extrémité, sur la surface clivée. [0062] 8 [0063] A l'étape 4 sur la figure 1, la fibre optique est plongée dans une solution de molécules fluorescentes de façon à greffer de façon covalente suffisamment de molécules fluorescentes sur toutes les fonctions amines NH2disponibles. Cette étape 4 peut durer plusieurs heures ou moins, par exemple six heures. A la fin, on nettoie éventuellement la fibre optique à l'eau, puis on la rince. On peut également effectuer un rincagc avec du DMSO (dimethylsulfoxidc) qui élimine toutes les molécules non liées par des liaisons covalentes au support. [0064] La figure 5 est une équation chimique illustrant le greffage de molécules de fluo- rescence sur la couche difonctionnelle. On utilise par exemple une fonction ester succinimidylique comme agent de couplage avec la surface aminée. Cet ester comporte un fluorophorc tel que par exemple la fluorescéine diacétatc. La combinaison avec la surface aminée permet d'obtenir une surface portant le fluorophorc via une liaison CONH. Encore une fois, le développement de la couche se fait principalement sur la surface de clivage, ce qui permet d'obtenir une zone active distribuée le long des chaincs difonctionnelles. Cela améliore le rendement de la détection de la fluorescence. [0065] Plusieurs fluorophores peuvent être utilisés. Dans l'exemple décrit, la couche de silane présente des groupes amines disponibles. Différents agents de couplage entre le fluorophorc et la surface aminée peuvent être utilisés comme par exemple : [0066] - une fonction ester succinimidyliquc comme décrit ci-dessus, [0067] - un chlorure de sulfonyle, [0068] - une fonction isothiocyanate, [0069] - [0070] On peut également avoir à la place des fonctions amines des fonctions thiolées HS sur laquelle seront greffées des molécules réactives à des thiols. On peut par exemple utiliser comme agent de couplage [0071] - l'iodoacétamide, [0072] - le maléimide, [0073] - [0074] [0075] Ces listes ne sont pas exhaustives et d'autres molécules peuvent être utilisées : le 7-Hydroxycoumarin-3-carboxylic acid N-succinimidyl ester (greffable sur surface aminée ) ou encore le pHrodo iFL Red STP Ester (greffable sur surface aminée). [0076] [0077] On va maintenant décrire en référence à la figure 6, un système de mesure optique de pH d'une solution en utilisant la fibre optique conçue selon le procédé de l'invention. On distingue la fibre optique 6 selon l'invention présentant un diamètre de 200 mm par exemple et dont l'extrémité libre comporte une couche fonctionnalisée 7. Il s'agit 9 d'une couche comportant des molécules fluorescentes qui sont sensibles au pH de la solution 8 à mesurer. L'autre extrémité de la fibre 6 est connectée à un séparateur de faisceaux. Ce dernier est relié à une voie d'excitation 10 et une voie de mesure 11. La voie d'excitation 11 est destinée à recevoir un signal d'excitation provenant d'un laser à 488 nm (non représenté). La voie de mesure est destinée à transmettre vers un spectromètre (non représenté) le signal de fluorescence provenant de la couche fonctionnalisée 7. [0078] Les molécules sont directement excitées par la lumière émise par la fibre optique 6 à la longueur d'onde choisie. La fluorescence est collectée par cette même fibre et transmise au spectromètre via le séparateur de faisceaux 9. Ce dernier est équipé d'un prisme dichroïque 17 filtrant la raie d'émission pour ne renvoyer que le signal de fluorescence vers le spectromètre. On distingue également dans le séparateur de faisceaux 9 des lentilles de collimation 12-14, un filtre d'excitation 15 pour avoir un signal d'excitation le plus propre possible, et un filtre d'émission 16 pour le signal allant vers le spectromètre. Un miroir 18 est disposé entre le filtre d'excitation 15 et le prisme dichroïque 17 de façon à orienter le faisceau d'excitation vers ce prisme dichroïque. [0079] La fibre optique 6 sert à la fois de capteur pH, de canal d'excitation véhiculant un signal d'excitation des molécules fluorescentes greffées à son extrémité, et de canal d'émission véhiculant la lumière émise par les molécules fluorescentes. [0080] L'estimation de la valeur de pH peut se faire de différentes manières par exemple au moyen d'un protocole utilisant la forme du spectre de fluorescence, c'est-à-dire la totalité des points de mesure fournie par le spectromètre. [0081] Ce protocole peut être mis en place par exemple lorsqu'on utilise des molécules de fluorescéine diacétate, un fluorophore courant bon marché, stable et possédant un rendement quantique élevé (0,93). Lorsque la valeur du pH environnant croit, la molécule de fluorescéine diacétate se déprotone plus ou moins conduisant à quatre espèces (forme cationique, neutre, anionique et dianionique). Il faut donc trois lois d'action de masse caractérisées par différents pKa (2,2 ; 4,3 et 6,38) pour calculer les concentrations de chaque espèce. Seules les espèces anioniques et dianioniques sont fluorescentes. Les autres sont converties, dans une certaine proportion, en forme anionique et participent de ce fait à la fluorescence. Le présent protocole peut être appliqué en se référant à la publication « Calibration free and fluorescein based fiber optic pH sensor for clinical applications", Bernard Gauthier-Manuel et al., IEEE SENSORS, 28-31 octobre, New Delhi, 2018, Proceedings IEEE Sensors, ISBN: 978-1-5386-4707-3, Part Number: CFP18SEN-ART, pp. 1173-1176. [0082] De façon générale, le principe est d'obtenir une fonction mathématique Fluo (X, pH, pKa'i, pKa' 2, pKa' 3 ) représentant le spectre de fluorescence de la fluorescéine greffée ne dépendant que de la longueur d'onde X, du pH et des trois constantes d'acidité ap- parentes pKa'i, pKa',, pKa'3 ... qui sont fonction de l'environnement vu par les molécules greffées. Un simple ajustement d'un spectre mesuré avec la fonction k*Fluo() donnera la valeur du pH vue par le capteur ainsi que les valeurs des pKa', le paramètre k rendant compte de la concentration en molécules fluorescentes en extrémité de fibre. [0083] [0084] La présente invention permet donc la mesure du pH dans des systèmes biologiques ou physico-chimiques, mais elle peut aussi s'appliquer à la mesure d'ions tels que des ions Can, Mg-k-k,... [0085] [0086] Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l' invention. [0087] 11