FR 3089302 A1 20200605 FR 1872032 A 20181129 Description Titre de l'invention : PROCEDE D'ANALYSE DU GLYCEROL LIBRE DANS UN ECHANTILLON DE BIODIESEL PAR VOIE ENZYMATIQUE pool L'invention concerne un procédé d'analyse du glycérol libre dans un échantillon de biodiesel par voie enzymatique. [0002] Plus précisément, l'invention s'intéresse à un procédé d'analyse par voie photo- enzymatique du glycérol libre présent dans le biodiesel comprenant une étape de séparation en phase solide et une étape de spectrophotométrie. Technique antérieure 100031 Les hiodiesels sont principalement des esters méthyliques d'acides gras (EMAG) obtenus au moyen d'une trans-estérification à partir de la biomasse. 100041 Les esters dérivés du glycérol que sont les mono-glycérides ou mono-acylglycérol (MAG), les di-glycérides ou di-acylglycérols (DAG), les triglycérides ou triacylglycérols (TAG) et le glycérol libre (FG) sont les principaux contaminants du biodiesel. 100051 La présence de ces dérivés du glycérol dans le biodiesel altère ses propriétés com- bustibles et, outre les nuisances environnementales, ces polluants peuvent provoquer des dysfonctionnements des moteurs à combustion dans lesquels ce biocarburant est utilisé. [0006] Dans ce contexte, il est apparu nécessaire de développer des procédés d'analyse de la composition du biodiesel en vue de déterminer la présence et la quantité de ces différents composants et, en particulier, de celle du glycérol libre (FG). [0007] Parmi les procédés connus, celui décrit dans le BR200504024A vise à déterminer la quantité de glycérol dans un échantillon de biocarburant par spectrophotométrie. [0008] Toutefois, du fait que le glycérol est soluble dans l'eau à la différence du biodiesel, ce procédé utilise un agent tensioactif pour effectuer sa séparation sans extraction. Mais la dispersion obtenue présente alors des bulles qui perturbent la lecture d'absorbante lors de la détection spectrophotométrique. [0009] Le W02017119007A1 décrit un procédé de purification et de raffinage du glycérol utilisant, à titre principal, au moins un adsorbant d'impuretés hydrophobe et au moins un adsorbant d'impuretés polaire. [0010] Par ailleurs, dans les domaines médical et clinique (sérum. plasma, ...) ainsi que dans l'industrie alimentaire (produits fermentés, tabac, ...), il existe des méthodes d'analyse des triglycérides et, notamment. du glycérol libre (FG) et du glycérol combiné ou total (TG), qui utilisent la voie enzymatique combinée à des méthodes de détection optique. 2 100111 Dans le cadre de ces méthodes, les triglycérides sont transformés en glycérol et en acides gras. Puis, le glycérol est transformé en di-hydroxy-acétone phosphate par l'action d'enzymes telles que le glycérol-kinase (GK) et le glycérol-3-phosphate oxydase (03P0) selon les réactions suivantes : 1. Glycérol + ATP (en présence de GK) > G-3-P + ADP (où ATP et ADP sont respectivement l'adénosine triphosphate et l'adénosine diphosphate) 2. G-3-P + 02 (en présence de GPO) > DAP + H2O, 3. H,0,+ 4-AAP + OA (en présence de peroxydase) > CC + H2O ; (où 4-AAP est le 4-aminoantipyrine et OA un accepteur d'oxygène tel que le 4-chlorophenol) [0012] Le produit CC obtenu est un composé coloré dont la concentration est mesurée par spectrophotométrie. [0013] Cependant, les méthodes actuelles qui utilisent la détection par spectrophotométrie ne sont pas fiables pour l'analyse des biocarburants car les mesures optiques ne se révèlent pas suffisamment précises en raison d'interférences générées par d'autres produits et, en particulier, des acyle-glycérols qui sont présents au côté du glycérol libre. [0014] En outre, les méthodes connues sont généralement destinées à l'analyse de bio- carburants dans lesquels les teneurs en polluants sont relativement élevées ce qui n'est pas le cas des hiodiesels du commerce. Exposé de l'invention [0015] La présente invention a pour but de résoudre les problèmes techniques posés par l'art antérieur et, en particulier, les problèmes d'interférence avec les acylglycérols, en proposant un procédé d'analyse combinant, d'une part, une étape de séparation du glycérol libre par une étape d'extraction en phase solide avec, d'autre part, une étape ultérieure de détection et de mesure par voie photo-enzymatique. [0016] Cc but est atteint, selon l'invention, au moyen d'un procédé d'analyse d'un échantillon de biodiesel comprenant, notamment, des esters méthyliques d'acides gras (EMAG) et des acylglycérols (MAC, DAG, TAG) en vue de déterminer sa teneur en glycérol libre (FG), caractérisé en ce que ; - on sépare les esters méthyliques (EMAG) et les acylglycérols (MAG, DAG, TAG) du glycérol libre (FG) par extraction en phase solide à partir de l'échantillon dans au moins une cartouche de silice (A), - on élue, d'une part, au moins une phase (F1) contenant les esters méthyliques et/ou les acylglycérols et, d'autre part, une phase (F2) contenant le glycérol libre (FG) puis, - on sèche ladite phase (F2), on la met en suspension dans le solvant éthanol puis on la mélange avec un kit enzymatique de façon à obtenir un composé coloré (CC) et, 3 - on analyse ledit composé coloré par spectrophotométrie en vue de mesurer la concentration en glycérol libre (FG) dans ledit échantillon. [0017] Selon une première caractéristique avantageuse du procédé de l'invention, on détermine la concentration en glycérol libre (FG) dans l'échantillon en comparant ses valeurs d'absorbance avec des valeurs de référence obtenues pour des solutions standards de glycérol libre. [0018] Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé, on élue la phase (F1) avec des solvants choisis dans le groupe constitué des éthers de pétrole, des éthers éthyliques et de mélanges en solution de ces éthers. [0019] Selon encore une autre caractéristique, on élue la phase (F2) avec de l'éthanol de qualité CHLP (Chromatographie Liquide Haute Performance) et on contrôle la séparation des composants par spectroscopie dans une plage de longueurs d'ondes UV-visible autour de 205 nm. [0020] Selon une première variante de mise en oeuvre du procédé, on élimine les esters mé- thyliques (EMAG) et les tri-acylglycérols (TAG), les mono-acylglycérols (MAG) et les di-acylglycérols (DAG) par séparation, respectivement, dans trois phases (F1 a, Flb, Fl c) distinctes de la phase (F2) du glycérol libre (FG). [0021] De préférence, pour un échantillon de 0,150mL de biodiescl, on élue la première phase (FI a) avec 15mL d'éther de pétrole, la seconde phase (F1 b) avec 40mL d'un mélange comprenant 35% d'éther éthylique et de 65% d'éther de pétrole et la troisième phase (Fle) avec 40mL d'éther éthylique tandis que la phase (F2) de glycérol libre (FG) et éluée avec 12mL d' éthanol. [0022] Selon une autre variante de mise en oeuvre du procédé, on analyse le composé coloré (CC) par spectroscopie dans une plage de longueurs d'ondes UV-visible autour de 505 nm. [0023] Selon une autre caractéristique, on conditionne ladite cartouche de silice avec de l'hexane. [0024] Selon encore une autre variante du procédé, un volume de 90mL de solution de phase (F2) est mélangé avec 3mL de kit enzymatique. [0025] Un autre objet de l'invention est une utilisation du procédé d'analyse défini ci-dessus pour l'analyse des polluants d'un biodiesel issu d'une trans-estérification à taux de conversion élevé. [0026] Le procédé d'analyse de l'invention combine une étape préalable de séparation en phase solide permettant d'éliminer les triglycérides (MAG, DAG, TAG) du glycérol libre (FG) avec une étape subséquente de spectrophotométrie par voie photo-enzymatique en supprimant ainsi les risques d'interférence. [0027] La méthode photo-enzymatique constitue une alternative avantageuse à la technique chromatographique en ce qu'elle est plus rapide, facile à mettre en oeuvre, non toxique, moins onéreuse et présente une plus grande sensibilité. [0028] Le procédé de l'invention peut ainsi être mis en oeuvre de façon simple au moyen d'un kit enzymatique tel qu'un kit destiné à l'analyse du taux de triglycérides dans le sang, qui est rapidement et aisément disponible et dont le prix sur le marché est relativement bas. [0029] Ainsi, le procédé de l'invention peut être utilisé aussi bien par les producteurs que les distributeurs de carburants et même par des clients particuliers. Brève description des dessins [0030] D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description qui va suivre, en référence aux figures annexées et détaillées ci-après. [0031] La [fig.1] est un schéma illustrant un mode dc mise en oeuvre particulier de l'étape de séparation en phase solide intervenant dans le procédé d'analyse de l'invention. [0032] La [fig.2] est un graphe représentant la courbe analytique obtenue avec des solutions standard dc glycérol mélangée avec 3mL d'un kit enzymatique de type commercial. [0033] La [fig.3] est un graphe représentant les courbes analytiques obtenues à différents moments avec deux kits enzymatiques distincts. [0034] Pour plus de clarté, les éléments identiques ou similaires sont repérés par des signes de référence identiques sur l'ensemble des figures. Description des modes de réalisation [0035] Naturellement, les modes de mise en oeuvre du procédé de l'invention illustrés par les figures présentées ci-dessus et décrites ci-après, ne sont donnés qu'à titre d'exemples non limitatifs. Il est explicitement prévu que l'on puisse proposer et combiner entre eux différents modes pour en proposer d'autres. 100361 Le procédé d'analyse selon l'invention est mis en oeuvre à partir d'un échantillon de biodiesel en vue de déterminer sa teneur en glycérol libre (FG). Un tel biocarburant comprend, notamment, des esters méthyliques d'acides gras (EMAG) et des acylglycérols (MAG, DAG, TAG). 100371 Ce procédé prévoit d'effectuer les étapes suivantes ; - séparation des esters méthyliques (EMAG) et des acylglycérols (MAG, DAG, TAG) du glycérol libre (FG) par extraction en phase solide à partir de l'échantillon via un collecteur pourvu d'au moins une cartouche ou une colonne de silice A (par exemple, sous forme d'aminopropylsilane), conditionnée avec de l'hexane, - élution, d'une part, d'au moins une phase (FI) contenant les esters méthyliques (EMAG) et/ou les acylglycérols (MAG, DAG, TAG) et, d'autre part, d'une phase (F2) contenant le glycérol libre (FG) puis, - séchage, par exemple à l'azote, de la phase (F2) extraite et mise en suspension dans le solvant éthanol puis mélange de la suspension avec un kit enzymatique de façon à obtenir un composé coloré (CC). Ce composé coloré est ensuite analysé par spectrophotométrie en vue de mesurer la concentration en glycérol libre (FG) dans l'échantillon de biodiesel. [0038] Comme illustré par la figure 1, on sépare, de préférence, les esters méthyliques et les acylglycérols dans des phases distinctes par chromatographie haute performance en phase liquide non-aqueuse inversée. [0039] Le principe de cette étape de séparation se fonde sur la compétition entre l'analyte et la phase mobile pour occuper la surface des sites actifs de la phase stationnaire. Toutefois, pour que les molécules soient adsorbées pendant l'étape de séparation, il est nécessaire que la phase mobile quitte la surface de ces sites. Si cette surface est polaire, par exemple, les groupes apolaires n'auront que très peu d'affinité et ne quitteront pas la phase mobile. Dans ce cas, les groupes polaires auront, au contraire, une forte affinité avec la phase stationnaire et, interagissant avec les liaisons hydrogène, seront alors retenus dans la cartouche A (ou la colonne). De cette manière, la séparation des composants du biodicsel s'opère grâce à la polarité des solvants utilisés, en relation avec la phase stationnaire de la cartouche de silice, et en éliminant d'abord les composants les plus apolaires (ou les moins polaires) pour libérer le glycérol libre (FG) qui est considéré comme le composant le plus polaire du biodiesel. [0040] La phase mobile est constituée, de préférence, d'un mélange de méthanol avec une solution d'isopropanol et de n-hexane (5 :4 en volume) circulant avec un débit de lint/rnin [0041] Ainsi, il est prévu que les esters méthyliques (EMAG) et les tri-acylglycérols (TAG) soient séparés conjointement dans une première phase (Fla) tandis que les monoacylglycérols (MAG) et les di-acylglycérols (DAG) soient séparés, respectivement, dans deux autres phases (Flb, Flc). [0042] Par exemple, pour un échantillon de 0,150mL de biodiesel, les éludons sont alors ef- fectuées, pour la première phase (Fla) avec un solvant constitué de 15mL d'éther de pétrole, pour la seconde phase (Flb) avec un solvant constitué de 40mL d'un mélange comprenant 35% d'éther éthylique et de 65% d'éther de pétrole et pour la troisième phase (Flc) avec un solvant constitué de 40mL d'éther éthylique. [0043] La phase (F2) de glycérol libre (FG) est, quant à elle, éluée avec 12mL d'éthanol de qualité CHLP (Chromatographie Liquide Haute Performance) et la séparation des composants est contrôlée par spectroscopie dans une plage de longueurs d'ondes UV-visible autour de 205 nm. [0044] En outre, à chaque séquence de l'étape de séparation, on prélève 5mL de chaque solvant pour vérifier le taux de séparation des composants (EMAG. MAG. DAG et TAG) et s'assurer que l'étape ultérieure de spectrophotométrie ne portera que sur une fraction de glycérol libre (FG) non polluée. En particulier, la vérification de 6 l'élimination complète des mono-acylglycérols (MAG) est réalisée au moyen du kit enzymatique à partir de la collecte des derniers 2mL du solvant éther éthylique. [0045] Le graphe analytique pour la quantification du glycérol libre (FG) est tracé après addition de 90pL de solution de la phase (F2) de glycérol libre (FG) dans 3mL d'un kit enzymatique. Ce kit enzymatique est, par exemple, celui commercialisé par la société interkit O. Le mélange est agité pendant 2 secondes puis on le laisse reposer pendant 10 min afin que la réaction soit complète. [0046] Le mélange est ensuite introduit dans une cellule en quartz de 1cm3 qui est utilisée pour les mesures d'absorbance avec un spectrophotomètre dans une plage de longueurs d'onde UV-visible autour de 505 nm. La correspondance entre les mesures d'absorbance et la concentration en glycérol libre (FG) est obtenue par comparaison avec des courbes analytiques relatives à des solutions standards de glycérol, comme illustré par la figure 2. Les résultats des mesures d'absorbance sont de 0,005, en dessous de la limite de quantification de la méthode enzymatique et dans la plage d'erreur permise par l'équipement utilisé. [0047] A titre expérimental, trois échantillons de biodicsel ont été analysés. Les concen- trations en glycérol libre (FG) dans ces échantillons ont été comparées avec les valeurs obtenues en référence par chromatographie et sont présentées dans la table 1 ci-dessous (les pourcentages étant en masse). [Tableaux1] Origine de l'échantillon Ref. chromato. % (FG) % Différentiel 50% suif + 50% soja 0,016 0,014 88% soja 1 0,004 0,004 100% soja 2 0,001 0,001 100% [0048] L'échantillon de biodiesel constitué de 50% d'origine animale (suif) et de 50% d'origine végétale (soja) présente un taux d'interférence optique permis par l'Agence Nationale du Pétrole (ANP) avec des teneurs en mono-acylglycérols (MAG) de 0,70% et de 0,25% de glycérol total (pourcentages en masse). [0049] La courbe analytique de référence donnant la quantité de glycérol libre (FG) a été obtenue par addition de 90pL de huit solutions standards de glycérol libre (FG) dans 3mL d'un kit enzymatique. Ces huit solutions standards de glycérol libre comprennent respectivement ; 3.2971 x 10-5% - 6.5941 x 10-5% - 9.8912 x HP% - 1.3188 x 10-4% 1.6485 x 10-4% - 1.9782 x 10-4% - 2.3079 x 10-4% - 2.6377 x 10-4% (les pourcentages étant en masse) et résultent d'une dilution dans de l'éthanol à 99.9%. Toutes ces solutions ont été analysées trois fois. La figure 2 représente les courbes analytiques d'absorbante obtenus à partir de ces huit solutions standards de glycérol dans 3mL 7 d'un kit enzymatique. [0050] Un test de Cochran a été utilisé pour vérifier que les courbes obtenues sont homocé- dastiques, c'est-à-dire, que leur variance est uniforme, en tenant compte du nombre de mesures (ici 3 mesures) et du nombre de variantes de solutions standards (ici 8). La valeur calculée C = 0,282 est inférieure à la valeur donnée par les tables (0,516) ce qui montre que la variance est bien uniforme. Les limites de détection et de quantification déterminées par le critère de pente étaient respectivement de 9,08 x 10-6% et de 2,72 x 10-5% (les pourcentages étant donnés en masse). [0051] Cette valeur est inférieure à la valeur limite requise par les agences de régulation in- ternationales de 0,25% (les pourcentages étant donnés en masse). La méthode était linéaire sur une large plage de travail, de 2,3550 x 10-5 à 2,6377 x 10-4% (les pourcentages étant donnés en masse). Les valeurs d'écart type relatives obtenues pour les concentrations de la courbe analytique de la figure 2 ne dépassaient pas 5%, une valeur acceptable pour cette méthodologie (RTBANT et al., Validaffin em !mandas cromatognifieos e eletroforétiens Qufmica Nova, 2004. 27, p. 771-780) montrant que la méthode présente une bonne répétabilité avec une fiabilité de 95%. La précision intermédiaire (Figure 3) de la méthode proposée a été vérifiée par analyse de variance (ANOVA). Le facteur F calculé par ANOVA (F = 0,28) était inférieur à la valeur tabulée de référence (2.19), ce qui montre qu'il n'y a pas de différence statistique (intervalle de confiance de 95%) entre les courbes. La valeur calculée étant inférieure à la valeur tabulée, les variances sont donc statistiquement les mêmes. La figure 3 confirme, via l'analyse de la variance (ANOVA), que les variances des différentes courbes analytiques sont statistiquement les mêmes. Dans ces conditions, il s'avère possible d'utiliser différents lots de kits enzymatiques, quel que soit le jour prévu pour l'analyse et le type d'opérateur, sans que cela modifie la concordance des résultats. [0052] Un test-T (dit aussi test de Student) qui a été effectué pour comparer les résultats obtenus par spectrophotométrie avec les résultats obtenus par chromatographie gazeuse, montre que ces résultats ne diffèrent pas statistiquement, comme cela ressort de la table 2 ci-dessous. 8 [Tableaux2] Spectrophotométrie Chromatographie Moyenne 0,0043 0,0050 Variance 4,3E-05 7,0E-05 Observations 3 3 Corrélation de Pearson 0,999 Hypothèse de la différence de moyenne 0 Degré de liberté 2 t stat calculé 2 00 P(f