FR 3091177 A1 20200703 FR 1900008 A 20190102 Description Titre de l'invention : Nanoparticules et procédé de préparation [0001] La présente invention concerne des nanoparticules de platine, or et bismuth, uti- lisables notamment dans le domaine du diagnostic et de la thérapie et un procédé de préparation de ces nanoparticules. [0002] Les nanoparticules sont généralement synthétisées par voie chimique en plusieurs étapes. Par conséquent, ces synthèses ont des rendements inférieurs à 100% et sont souvent difficilement reproductives. Par ailleurs, la plupart de ces méthodes nécessitent l'utilisation de solvants et de réducteurs chimiques plus ou moins toxiques. Il est donc nécessaire de prévoir des étapes de rinçage et stérilisation permettant de rendre ces particules biocompatibles et non toxiques pouvant ainsi être injectées à l'homme. Ces étapes supplémentaires de rinçage et de stérilisation allongent le temps de préparation des nanoparticules et diminuent les rendements. [0003] Il existe donc un intérêt à fournir un procédé de préparation de nanoparticules ayant un rendement élevé permettant (l'obtenir en une seule étape des particules non-toxiques et biocompatibles. [0004] Un objectif de la présente invention est de fournir un procédé de préparation de nano- particules présentant un rendement élevé et avec une possibilité de scale-up. [0005] Un autre objectif de la présente invention est de fournir un tel procédé pennettant d'obtenir en une seule étape des particules non toxiques et biocompatibles. [0006] Un autre objectif encore de la présente invention est de fournir des nanoparticules non toxiques, biocompatibles et stériles pouvant notamment être utilisées en diagnostic et en thérapie par rayonnement ionisant (radiothérapie, halronthérapie, protonthérapie. Curie thérapie). [0007] D'autres objectifs encore apparaîtront à la lecture de la description de l'invention qui suit. [0008] La présente invention concerne des nanoparticules de métal choisi parmi platine, or ou bismuth, fonctionnalisées à leur surface par du polyéthylène glycol fonctionnalisé. [0009] Dans le cadre de la présente invention, on entend par polyéthylène glycol fonc- tionnalisé un polyéthylène glycol comprenant au moins une fonction permettant une interaction ou ligandation avec la surface du platine, de l'or ou du bismuth, par exemple ces fonctions sont des fonctions OH, NH,, SH, COOH. [0010] De préférence, les nanoparticules présentent un diamètre moyen compris entre 1 nm et 100 nm, de préférence entre 1 nm et 10 nm. Le diamètre moyen des nanoparticules est obtenu par microscopie électronique en transmission (MET). [0011] De préférence, les nanoparticules présentent un diamètre hydrodynamique moyen compris entre Set 100 nm, de préférence entre 10 et 20 nm. Dans le cadre de la 2 présente invention, on entend par diamètre hydrodynamique celui qui est mesuré par DLS. [0012] De préférence, les nanoparticulcs de l'invention ont un potentiel zeta moyen compris entre -5 et -30 mV, de préférence entre -10 et -20 mV. Le potentiel zcta moyen est de préférence mesuré par zetamétric. [0013] De façon particulièrement avantageuse et préférée, les nanoparticules de l'invention ne présentent aucune trace de solvant autre que de l'eau. [0014] La présente invention concerne également une solution aqueuse comprenant les na- noparticulcs selon l'invention décrites ci-dessus. [0015] La présente invention concerne également un procédé de préparation de nano- particules de métal choisi parmi le platine, l'or ou le bismuth, notamment les nanoparticules de l'invention décrites ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : [0016] a) Mélanger un précurseur de nanoparticulcs avec un polyéthylène glycol fonc- tionnalisé dans de l'eau ; [0017] b) Exposer le mélange au rayonnement ionisant : rayonnement gamma, rayons X, électrons-accélérés ou ions accélérés. [0018] De préférence le métal est le platine. [0019] Dans le cadre de la présente invention, on entend par précurseur de nanoparticulcs tout composé connu de l'homme du métier permettant la préparation de nanoparticules. Notamment les précurseurs sont choisis parmi les sels de platine (notamment chlorure de tetraamine platine (II) (Pt(NH3)4C12, H20), acide chloroplatinique (H2PtC16), potassium tetrachloroplatinate (K2PtC14), les sels d'or (notamment acide chloroaurique (HAuC14)), les sels de bismuth (notamment chlorure de bismuth (BiC13), nitrate de bismuth (Bi(N0')i), et les oxydes (notamment oxyde de bismuth (Bi203)). [0020] Après l'étape b), les particules peuvent être lyophilisées notamment pour être stockées, les particules pouvant ensuite être remises en suspension, par exemple dans l'eau, avant utilisation. [0021] De préférence, le mélange est dégazé sous gaz inerte, par exemple azote ou argon, avant l'exposition au rayonnement ionisant. [0022] De préférence, la solution est irradiée par un rayonnement ionisant, de préférence d'énergies comprises entre 5 keV et 5 MeV, tel que le rayonnement gamma issu d'une source de Cobalt 60, des rayons X, des faisceaux d'électrons accélérés ou d'ions accélérés, notamment rayonnements médicaux d'ions carbone comme utilisés en hadronthérapie. [0023] De façon particulièrement avantageuse, les doses utilisées pour la réduction du platine, de l'or ou du bismuth dépendent du précurseur, de la concentration initiale en précurseur et de la source d'irradiation: elles varient de 1 à 20 kGy pour des concentrations en métal de 0,5 à 20 mM, par exemple elle est typiquement de 10 kGy pour 3 réduire complètement 10 mol/L de complexe métallique contenant un sel comprenant du Prt L'étape d'exposition au rayonnement gamma dure ainsi entre 1 et 20 heures, au débit de dose de 95.5 Gy.min-i. [0024] Les polyéthylènes fonctionnalisés mis en oeuvre dans le procédé de l'invention sont par exemple le PEG-OH, le HO-PEG-COOH, le NH,-PEG-SH, le PEG-2N111 et le PEG-SH. De façon avantageuse, l'utilisation de polyéthylène glycol fonctionnalisé permet d'apporter une stabilité et une biocompatibilité aux nanoparticules obtenues. De préférence, les polyéthylènes glycol mis en oeuvre selon l'invention présente une niasse molaire MW comprise entre 600 et 3000, de préférence entre 1000 et 2000 g/ mol. De façon particulièrement préférée les polyéthylènes glycol mis en oeuvre selon l'invention sont le PEG-OH et le PEG-2NIEL, présentant de préférence une MW comprise entre 1000 et 2000 g/mol. [0025] Dans le procédé selon l'invention, le précurseur de nanoparticules est mis en oeuvre de préférence à raison de 10-4 mol/L à 10-2 mol/L, de préférence de 3x10-3 mol/L à 5x104 mol/L, en concentration molaire dans le mélange de l'étape a). [0026] Dans le procédé selon l'invention, le polyéthylène glycol fonctionnalisé est mis en oeuvre de préférence à raison de 10 là 5x10' mol/L et de préférence de 102 à 10' mol/ L en concentration molaire dans le mélange de l'étape a). [0027] De préférence, dans le procédé de l'invention, le ratio molaire entre le précurseur de nanoparticules et le polyéthylène glycol fonctionnalisé est compris entre 10 et 1000, de préférence entre 25 et 100. [0028] De façon particulièrement avantageuse et préférée, le procédé de l'invention est mis en oeuvre avec l'eau comme unique solvant. Ainsi, de façon particulièrement avantageuse, le procédé de la présente invention ne met en oeuvre aucun solvant notamment aucun solvant organique, aucun solvant toxique. Cela permet avantageusement d'obtenir des nanoparticules ou une suspension de nanoparticules dans l'eau biocompatible et pouvant être utilisées directement sans étape de lavage intermédiaire. [0029] Le procédé de la présente invention permet avantageusement en une seule étape d'obtenir des nanoparticules prêtes à l'emploi dans une solution stérile. Les espèces réductrices sont issues de la radiolyse de l'eau (électrons et radicaux H), on n'ajoute pas de réducteur chimique à la solution. C'est donc un procédé de réduction « propre ». [0030] La mise en oeuvre de la radiolyse (rayonnement gamma, électrons ou ions accélérés, rayons X), tout en permettant la synthèse des nanoparticules, tue tout organisme vivant qui serait présent et donc stérilise la solution obtenue. [0031] Par ailleurs, et de façon particulièrement avantageuse, le procédé de la présente invention permet une conversion de 100% du précurseur métallique. Le procédé n'utilisant que de l'eau, il n'est pas nécessaire de procéder à des étapes fastidieuses et coûteuses en produit et en temps, comme le lavage des nanoparticules, ce qui évite les pertes de produit (comme généralement observé lorsqu'une étape de filtration est nécessaire, ce qui n'est pas le cas ici). [0032] Ainsi, le procédé de la présente invention permet l'obtention de nanoparticules de taille homogène et l'obtention d'une solution colloïdale stérile composée exclusivement de nanoparticules de métal choisi parmi platine, or ou bismuth. [0033] Par ailleurs, le procédé de l'invention permet l'obtention de nanoparticules stables. Par nanoparticules stables on entend des nanoparticules qui n'évoluent pas en taille (notamment pas de modification du corps métallique des nanoparticules), ni en degrés d'oxydation à l'échelle de plusieurs semaines. [0034] La présente invention concerne également une solution aqueuse de nanoparticules susceptible d'être obtenue par le procédé décrit ci-dessus. [0035] La présente invention concerne également des nanoparticules susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention. [0036] De façon particulièrement avantageuse, la présence du polymère biocompatible, PEG fonctionnalisé, à la surface des nanoparticules ainsi que leur faible taille favorise l'accumulation des dites nanoparticules par exemple dans les tumeurs notamment par effet EPR (enhanced permeability and rctention). Les nanoparticules de l'invention, ou susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention, ont la propriété d'amplifier les effets des rayonnements ionisants (photonique ou hadronique) tel que la mort cellulaire radioinduite. Ainsi, la présente invention concerne également des nanoparticules selon l'invention ou susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention pour leur utilisation dans le traitement des cancers et des tumeurs, notamment pour amplifier les effets des rayonnements médicaux utilisés pour le traitement de ces cancers ou tumeurs. [0037] La présente invention concerne également une méthode d'amplification des effets des rayonnements ionisants utilisés pour le traitement de cancer ou tumeur d'un patient comprenant l'injection au dit patient d'une quantité efficace de nanoparticules selon l'invention ou susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention. [0038] De façon particulièrement avantageuse, les nanoparticules de l'invention, ou sus- ceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention, sont composées de métaux avec un numéro atomique et une densité électronique élevés, ce qui leur permet d'être imagées, notamment par CT (Computed Tomography en anglais, ou tomodensitométrie). Ainsi, la présente invention concerne également des nanoparticules selon l'invention ou susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention pour leur utilisation en imagerie médicale pour le diagnostic. [0039] La présente invention va maintenant être décrite à l'aide d'exemples non limitatifs. [0040] [fig.1] La figure 1 est une image des nanoparticules de platine fonctionnalisées par PEU-OH visualisées par MET-HR. [0041] [fig.2] La figure 2 une image des nanoparticules de platine fonctionnalisées par PEG-2NH2 visualisées par MET-HR. [0042] [fig.3] La figure 3 montre les internalisations de particules par les cellules HeLa. [0043] [fig.4] La figure 4 montre la survie mitotique des cellules HeLa en présence ou non de PtNPs (6h d'incubation à 0.5 mM et 1 mM). [0044] [fig.5] La figure 5 montre la survie des cellules HeLa traitées par rayonnement d'ions C6+ ou de photons gamma de Cs 137, avec et sans nanoparticules de platine Exemple 1 : Préparation des nanoparticules [0045] Des nanoparticules de platine (PtNPs) sont synthétisées en utilisant un précurseur de platine, le tetraamineplatinum(II) chloride (Pt(NH3)4C12, 21420). Ce précurseur est dilué dans l'eau à raison de 50 mg dans 10 mL. Un échantillon de cette solution (6,67 mL) est mélangé à 2 mL de polyéthylène glycol 1000 (PEG-OH) (5 M) ou de polyéthylène diamine 2000 (PEG-2NH2), le mélange est dilué dans l'eau (1,33 mL). Cette solution est dégazée sous azote. Elle est ensuite exposée pendant environ 17,5 heures au rayonnement d'une source gamma de cobalt 60 (débit de dose : 95,5 Gy/min). Il en résulte une solution colloïdale de couleur noire, stérile, composée exclusivement de nanoparticules homogènes de platine fonctionnalisées avec du PEU (-OH ou -2NH2). [0046] Dans le cas du PEG-OH, le coeur de platine est de forme sphérique et de diamètre égal à 3,2 nm (figure 1). Dans le cas du PEG-2NH2, des agrégats en forme de fleur sont obtenus, leur taille est de 14,6 nm et contiennent des NPs (nanoparticules) de 3,2 nm de diamètre (figure 2). [0047] Le diamètre hydrodynamique des nanoparticules est obtenu grâce à des mesures par DLS (Dynamic Light Scattering). Il est de 8,8 nm dans le cas du PEG-OH et de 16,1 nm dans le cas du PEG-2NH2. Les nanoparticules de platine fonctionnalisées avec du PEU-OH ont un potentiel zeta moyen de -17 mV. Des mesures complémentaires par XPS (X-ray Photoelectron Spectrometry) ont confirmé l'absence de précurseur de platine dans la solution de PtNPs (nanoparticules de platine) et montre que tout le platine est réduit (nombre d'oxydation zéro), ce qui prouve le rendement à 100% de cette méthode de synthèse. Exemple 2 : Mise en oeuvre des nanoparticules [0048] Après incubation pendant 6 heures de cellules (HeLa) avec une solution de PtNPs 6 fonctionnalisées avec du PEG-OH contenant 0,5 mM de platine (obtenues à l'exemple 1), celles-ci sont internalisées par les cellules HeLa (figure 3) à raison de 1,6 pg par cellule ce qui correspond à 49x10, PtNPs par cellule (quantification réalisée par ICPMS, hzduclively Coupled Plasma Mass Spectrommry). [0049] Les PtNPs fonctionnalisées avec du PEU-OH ou du PEG-2NIT2 ont une faible cyto- toxicité sur les lignées cellulaires humaines. En effet, des cellules HeLa incubées pendant 6h avec une solution de PtNPs (nanoparticulcs de platine) contenant respectivement 0.5 mM ou 1mM de platine, présentent une faible mort mitotique (