FR 3090636 A1 20200626 FR 1874091 A 20181224 Description Titre de l'invention : Procédé de synthèse de peptides Domaine technique de l'invention [0001] L'invention concerne le domaine de la chimie organique, et plus particulièrement de la synthèse de peptides ou protéines à partir d'acides aminés. L'invention porte sur un procédé de synthèse de peptides in vitro, en phase liquide, qui n'utilise pas de support solide ou de résine insoluble. Ce procédé est basé sur l'utilisation d'une nouvelle famille de molécules d'ancrage, à savoir des dérivés de polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes, qui, liée à un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé, présentent une bonne solubilité dans des solvants apolaires, niais présentent une faible solubilité dans l'eau. Ce procédé permet d'obtenir des peptides plus purs et/ou plus faciles à purifier que les procédés sur support solide. Il est facile à automatiser. Etat de la technique [0002] La pharmacologie des peptides présente un énorme intérêt médical et économique, mais sur un plan scientifique elle reste à l'ombre dela biochimie des protéines et de la génétique. Malgré l'immense succès de l'insuline, une protéine naturelle formée de 51 acides aminés, le nombre de peptides qui ont été développés en tant que principes actifs pharmaceutiques est resté faible jusqu'à la fin du 20ème siècle. Cependant, une trentaine de nouveaux principes actifs constitués de peptides ont reçu une autorisation de mise sur le marché entre 2000 et 2016, et un nombre significatif de peptides fait l'objet d'essais cliniques et précl iniques (voir la publication de.l. Med. Chem., 2018, 22, 1382-1414). La plupart de ces candidats médicaments sont des peptides naturels connus pour leur fonction spécifique, d'autres sont dérivés de séquences naturelles, en encore d'autres sont totalement nouveaux. [0003] Pour l'insuline, administrée à des millions de patients, la synthèse par des organismes génétiquement modifiés représente la voie royale pour obtenir des quantités industrielles suffisamment pures. Pour beaucoup d'autres peptides thérapeutiques, la synthèse ah initia (c'est-à-dire à partir des acides aminés individuels) est la principale méthode utilisée pour obtenir des quantités nécessaires. Dans cc contexte la pureté du peptide représente un enjeu technique et économique majeur pour la méthode de synthèse choisie. En effet, la purification d'un peptide (qui se fait en général par chromatographie en phase liquide à haute performance, CLHP) peut représenter une fraction importante du coût de revient du produit fini. [0004] Il existe deux grandes méthodologies de synthèse peptidique qui se distinguent par l'état physique de la phase où a lieu les réactions chimiques : la phase liquide (cette synthèse est aussi appelée « synthèse en solution ») et la phase solide (cette synthèse 2 est aussi appelée « synthèse sur support solide »). [0005] Tous les acides aminés ont au moins deux fonctions chimiques réactives : la fonction amine (centre Na) et la fonction acide carboxylique (C-terminal). Certains acides aminés ont en plus des chaînes latérales susceptibles de réagir avec les centres Na ou C-terminal. La clé d'une stratégie de synthèse de peptides réside dans le choix des groupements protecteurs (appelés aussi groupes de protection) par lesquels les centres réactifs sont protégés pendant certaines étapes du procédé : chaque addition d'un acide aminé nécessite un cycle de protection - activation/couplage - déprotection, et pour certains acides aminés il est nécessaire de bloquer également des fonctions chimiques de la chaîne latérale pour éviter toutes interférences réactionnelles. En fin de synthèse, les groupements protecteurs sont clivés pour générer le peptide cible. Ainsi, selon l'état physique de la phase où a lieu la synthèse peptidique, le cycle de hase commun : protection -activation/couplage - déprotection est invariable mais seul diffère le groupement protecteur utilisé. Plus précisément, un tel cycle comprend plusieurs étapes : La protection de la fonction amine (Na) de l'acide aminé par un groupement protecteur clivable après la réaction de condensation de l'acide aminé ; Si nécessaire, la protection de la chaîne latérale par un groupement protecteur clivable en fin de synthèse du peptide ; L'activation de la fonction acide carboxylique de l'acide aminé protégé Na, puis sa condensation avec un dérivé d'acide aminé ou un peptide dont la fonction amine Na est libre et dont la fonction acide carboxylique est protégée ; A la fin de l'itération (activation/couplage - déprotection) de tous les acides aminés de la séquence, le peptide cible est obtenu par déprotection totale des groupements protecteurs. [0006] Le cycle de protection - activation/couplage - déprotection est expliqué ici pour l'exemple de la synthèse d'un tripeptide. [0007] Selon la stratégie en solution dite « Boc » montrée sur le schéma réactionnel 1, on approvisionne un premier, un deuxième et un troisième acide aminé (appelés ici AA1, AA2 et AA3). On protège la fonction amine (Na) de l'acide aminé AA2 temporairement par un groupement tert-butoxycarbonyle (appelé couramment « Boc »). Puis on active la fonction acide carboxylique (C-terminal) dudit acide aminé protégé que l'on condense avec la fonction amine (Na) libre (i.e. non protégé) d'un ester méthylique de l'acide aminé AAI, ce qui génère un dipeptide. Ensuite on déprotège la fonction amine (Na) de l'acide amine AA2 (i.e. on clive le groupement protecteur Boc avec un acide, tel que l'acide tritluoroacétique) du dipeptide formé. On protège la fonction amine (Na) de l'acide aminé AA3. Puis on active la fonction acide car- 3 boxyliquc (C-terminal) de l'acide aminé AA3 que l'on couple avec la fonction amine (Na) de l'acide aminé AA2 (du dipeptide déprotégé) pour générer le tripcptide protégé. Après la déprotection du groupement Boc porté par AA3, on obtient un tripeptidc. Ce processus comprend un minimum de cinq étapes réactionnelles, dont deux étapes (activation/couplage - déprotection) pour chaque acide aminé additionnel ajouté au peptide. [0008] [Che m.1] Schéma réscfiontel 1 kAl Itte.Me te,ecten W30.-133.a3p F±3,3 3e3.33- e:33i3cn t3333-3,3£33,33p33:3: e-413,33 '3230;31`313e v 03, 3 -3333%'0'3-33 100091 Ce procédé peut se dérouler avec ancrage de l'acide aminé AA1 sur un support solide ou sur une molécule organique en phase liquide. 100101 Le fluorénylméthoxycarbonyle peut être utilisé comme groupement protecteur de la fonction amine, selon la stratégie dite « Fmoc » montrée sur le schéma réactionnel 2. Cette stratégie convient particulièrement pour la synthèse sur support solide. On approvisionne un premier, un deuxième et un troisième acide aminé (AA1, AA2 et AA3). Tout commence par la protection de la fonction amine (Na) de l'acide aminé AA1 par un groupement fluorénylméthoxycarbonyle (appelé couramment « Fmoc »), puis son ancrage sur une résine solide (symbolisée sur le schéma réactionnel 2 par le cercle noir) via sa fonction acide carboxylique (C-terminal), formant une liaison covalente de type ester ou amide avec une fonction chimique de la résine fonctionnalisée (alcool ou amine). On déprotège la fonction amine (Na) de l'acide aminé ancré sur la résine. Ensuite, on protège la fonction amine (Na) de l'acide aminé AA2 par un groupement protecteur Fmoc. Le dérivé obtenu est couplé via l'activation de son acide carboxylique (C-terminal), à la fonction amine (Na) de l'acide aminé AA1 ancré sur la résine, ce qui génère un dipeptide N-protégé et ancré sur la résine. On clive le groupement Fmoc du dipeptide (sur AA2). La protection la fonction amine (Na) de l'acide aminé AA3 par un groupement Fmoc est suivie de l'activation de son acide carboxylique (AA3) puis, on procède au couplage de l'espèce obtenue avec le dipeptide ancré et ayant la fonction amine libre, générant ainsi un tripeptide N-protégé, qui reste fixé sur le support solide par la fonction acide (C-terminal) de son acide aminé AA1. Ce procédé comprend un minimum de sept étapes réactionnelles, dont deux (activation/couplage - déprotection) pour chaque acide aminé additionnel ajouté au peptide. [0011] [Chcm.2] Schém té ctionnel'2 100121 Ces deux voies de synthèse sont bien connues de l'homme du métier (voir la Section 7-5 du manuel « Biochimie » de D. Voet et J .G. Voet, 2,me édition, Bruxelles 2005). Elles peuvent être mises en oeuvre en phase liquide ou sur support solide (dans ce cas l'acide aminé est fixé sur un support solide, i.e. synthèse de Men-i field). En pratique, les acides aminés sont approvisionnés à l'état protégé par le groupement Fmoc ou Boc, et engagés directement dans les réactions d'activations/couplages dans cet état protégé. 100131 Lors de la synthèse peptidique en phase liquide (SPPL), toutes les réactions ont lieu en solution homogène. Cette méthodologie a été décrite par Bodansky et du Vigneaud (J. Am. Chem. Soc., 1959, 51, 5688-5691). La fonction acide carboxylique (C-terminal) de l'acide aminé de départ est protégée sous forme d'un ester méthylique et les acides aminés suivants sont condensés successivement après la protection de leur fonction amine (Na) par un groupement benzyloxycarbonyle et l'activation de leur fonction acide carboxylique par un ester nitrophénylique. Tous les intermédiaires synthétiques sont purifiés par précipitation ou lavage à l'eau (extraction). Cette méthodologie de synthèse peptidique est longue, fastidieuse et génère des peptides avec de faible rendement. A titre d'exemple, on peut citer la synthèse de l'ACTH avec un rendement global d'environ 7%, décrite par Schwyzer et Sicbcr (Hely. Chim. Acta 1966, 49, 134-158). [0014] Une modification de cette méthodologie a été rapportée par Beyermann et al. (Rcc. Trav. Chim. Pays Bas 1973, 92, 481-492). Elle consiste à protéger la fonction acide carboxylique d'un acide aminé ou d'un peptide sous la forme d'un ester benzylique et de réaliser la réaction de couplage (ou condensation) en présence d'un excès d'anhydride d'acide aminé N-protégé, dans l'optique d'améliorer le rendement. Finalement, bien que les rendements des réactions de couplage soient augmentés, on constate une perte de solubilité en phase organique lorsque le peptide formé atteint environ cinq acides aminés. [0015] Pour gagner en solubilité, l'acide aminé ou la protéine peut être lié à un groupement protecteur dit solubilisant, tel que la phénylazobcnzyl sulfonyléthyloxy (OPSE), décrit dans EP 0 017 536 (CM Industries). En effet, cc groupement protecteur permet la solu- hilisation de l'acide aminé ou du peptide synthétisé dans le N,N-diméthylformamide. Après chaque itération (activation/couplage - &protection), la purification se fait par précipitation et filtration des solides, ce qui engendre des difficultés opératoires. [0016] Une approche faisant usage d'un polymère linéaire non réticulé, tel que le poly- éthylène glycol (PEG), afin de maintenir l'acide aminé ou le peptide en solution, a été décrite par Mutter et Bayer (Nature 1972, 237, 512-513). Dans ce cas aussi, les sous-produits sont éliminés par précipitation ou ultracentrifugation. [0017] Plus récemment, EP 2 612 845 Al et US 2014/0296483 (Ajinmoto Co., Inc.) ont décrit de nouveaux groupements protecteurs (ou molécules d'ancrage) permettant la solubilisation de l'acide aminé et du peptide. Ainsi, selon la molécule d'ancrage utilisée, la purification se fait soit par simple lavage à l'eau, soit par précipitation et filtration. Grâce à ces groupements protecteurs très lipophiles de la fonction acide carboxylique, la hivalirudine, un anticoagulant constitué de 20 résidus d'acides aminés a été préparé avec un rendement global de 73% et une pureté de 84% (voir D. Takahashi et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, 7803-7807). Malgré les avantages de cette technique, sa limite, à savoir le nombre de résidus d'acides aminés susceptibles d'être ancré, reste inconnu. De plus, le coût élevé de ces molécules d'ancrage constitue un handicap. [0018] D'autres stratégies de couplage d'acides aminés sont connues. A titre d'exemple, on peut utiliser des groupements hi-fonctionnels qui à la fois, activent la fonction acide carboxylique et protège la fonction amine de l'acide aminé, en formant des structures cycliques intermédiaires hautement réactives. Généralement, celles-ci réagissent facilement avec la fonction amine (Na) d'un second dérivé d'acide aminé pour former un dipeptide. Malheureusement, les espèces obtenues sont très réactives et souvent une réaction indésirable de polymérisation à lieu. Parmi les groupements bi-fonctionnels qui ont été décrits, on peut citer le phosgène (voir R. B. Woodward et C. H. Schramm, J. Am. Chem. Soc., 1947, 69, 1551-1552), le dichlorodiméthylsilane (voir S.H. van Leeuwen et al., Tetrahedron Letters 2002, 43, 9203-9207), l'hexafluoroacétone (voir J. Spengler et al., Chem. Rev., 2006, 106, 4728-4746) et le formaldéhyde (voir J. M. Scholtz, P. A. Bartlett, Synthesis 1989, 542-544). [0019] La synthèse peptidique en phase solide a été décrite par Men-ifield (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154). Elle consiste à fixer la fonction acide carboxylique (C-terminal) du premier acide aminé ou du peptide sur une résine (support) insoluble. En conséquence, les réactifs sont utilisés en excès afin de s'assurer de la conversion totale des étapes d'activations/couplages. Les purifications se font par simple filtration et lavage de la résine. Bien que cette technique soit automatisable et plus simple, de nombreux inconvénients existent tels que le coût des réactifs utilisés en excès et le manque d'homogénéité des peptides synthétisés car il est quasiment impossible 6 d'obtenir des peptides homogènes : on dit que le système est dégénéré. De plus, la purification en chromatographie en phase liquide à haute performance préparative de ces peptides hétérogènes est onéreuse car très consommatrice en solvants et écologiquement peu acceptable. [0020] Sachant que chaque étape réactionnelle est rarement quantitative et donc engendre des pertes qui se cumulent tout le long de la synthèse, et sachant que chaque étape implique quelques réactifs en solution (agents de couplage et produits secondaires) dont l'élimination est problématique, il serait intéressant de disposer d'un procédé plus simple, engendrant à la fois des peptides de hautes pureté et un coût de production moindre. Ce procédé devrait convenir pour tous types d'acides aminés naturels et pour un large spectre d'acides aminés non naturels. Tel est l'objectif de la présente invention. [0021] Tl convient de souligner que dans le cas d'un peptide thérapeutique, un rendement inférieur à 100 % implique non seulement la perte de réactifs, mais également la formation de produits secondaires qui peuvent être difficiles à séparer du peptide cible ; dans la mesure où l'on souhaite avoir des peptides aussi purs que possible pour caractériser clairement leurs effets biologiques, cela veut dire que soit on accepte le surcoût que présente la purification, soit on accepte la présence d'impuretés susceptibles d'engendrer un risque d'erreur d'appréciation des effets biologiques observés. [0022] Le problème que la présente invention cherche à résoudre est de présenter une méthode de synthèse de peptides ou protéines plus purs, à plus fort rendement, plus écologique, moins coûteuse et qui soit automatisable. Ce procédé doit convenir au moins pour tous les acides aminés naturels et de préférence pour un large spectre d'acides aminés non naturels. Objet de l'invention [0023] La présente invention propose de résoudre les difficultés laissées dans l'art antérieur par l'utilisation de polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes pour la production de peptides ou protéines de haute pureté en phase liquide. En effet, les inventeurs ont trouvé que l'utilisation de polyoléfines, et en particulier de dérivés de polyisobutènes (PIB), comme molécules d'ancrage ou support liquide, permet la solubilisation des acides aminés et la synthèse de peptides en solution organique (solvants halogénés et non halogénés), tout en facilitant leur purification par simple extraction ou lavage, en l'occurrence avec de l'eau ou un mélange eau/éthanol ou eau/acétonitrile, ou par simple filtration. En outre, certaines de ces molécules d'ancrage (notamment certains dérivés de polyisobutènes (PIB)) sont des produits disponibles dans le commerce ou alors leur synthèse est simple, directe et peu coûteuse. [0024] L'objet de l'invention est dès lors un procédé de synthèse de peptides ou protéines 7 par élongation successive de la deuxième extrémité d'une chaîne peptidique dont la première extrémité est fixée sur une molécule d'ancrage soluble dans un solvant apolaire, caractérisé en ce que ladite molécule d'ancrage comporte une chaîne polyoléfine avec au moins 10 unités de monomères, et de préférence entre 15 et 50 unités. Avantageusement elle est fonctionnalisée à l'une de ses extrémités, pour permettre l'ancrage du premier acide aminé. [0025] Avantageusement ladite molécule d'ancrage est une polyoléfine. [0026] Ladite molécule d'ancrage peut comprendre dans chacune de ses unités des groupements alkyles identiques ou non, qui sont de préférence sélectionnés dans le groupe formé par le méthyle et l'éthyle. Ladite chaîne polyoléfine présente avantageusement une masse moléculaire moyenne en niasse comprise entre 600 et 20 000, et de préférence entre 700 et 15 000. Ladite chaîne polyoléfine peut comprendre un nombre de liaisons carbone-carbone insaturées ne dépassant pas 5 %, et de préférence ne dépassant pas 3 %. De préférence il s'agit d'une chaîne de polyisobutène. [0027] Dans un mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention, ladite molécule d'ancrage comporte une chaîne polyoléfine (ou est une chaîne polyoléfine) qui est terminée par un groupement sélectionné dans le groupe formé par : - une fonction -X, où X est sélectionnée dans le groupe formé par : -OH, -NH2, -SH ; une fonction -Z-C6H4X', où - Z est O ou absent, - X' est sélectionnée dans le groupe formé par : -OH, -NH2 -S CXRR', -C,,H1R'(CRX) [0028] où X est sélectionné dans le groupe formé par -OH, -NH2, -SH, et R est sélectionné dans le groupe formé par -H, Aryl, Hétéroaryl, et R' est sélectionné dans le groupe formé par -H, -Alkyl, -OAlkyl, -Aryl, - OAryl, Hétéroaryl, -0-Hétéroaryl, une fonction -CR-,CH-CHX ou une fonction -CR-H-CH=CH-CHX, où X est sélectionné dans le groupe formé par -OH, -SH, et R" est méthyle ou éthyle. [0029] Ce groupement représente alors la fonctionnalisation de la chaîne polyoléfine. [0030] Ladite première extrémité de ladite chaîne peptidique est une première unité d'acide aminé AA1 ; c'est elle dont la fonction carboxylique (C-terminal) est ancrée sur la molécule d'ancrage. Ladite chaîne peptidique est formée de n unités d'acide aminé; sa deuxième extrémité est une autre unité d'acide aminé AAn. Lors du déroulement du procédé la chaîne peptidique s'allonge par élongation successive, et pendant chacune de ces étapes d'élongation on ajoute une autre unité d'acide aminé AA(n+1) à ladite deuxième extrémité. [0031] La fonction amine des acides aminés engagée dans le procédé selon l'invention peut 8 être protégée par un groupement Boc ou Fmoc, ou par tout autres groupements protecteurs appropriés. [0032] On peut utiliser dans ladite chaîne pcptidique des acides aminés naturels et/ou non naturels et/ou synthétiques. [0033] Le procédé selon l'invention comprend au moins une étape dans laquelle ladite chaîne peptidique est fixée sur ladite molécule d'ancrage et est séparée du milieu réactionnel par extraction dans un liquide apolaire. [0034] Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des peptides ou protéines très purs, qui sont clivés de leur molécule d'ancrage après la dernière étape d'élongation de la chaîne pcptidiquc, pour être utilisés selon leur destination, par exemple en tant que principe actif pour des essais précliniques ou cliniques. Description détaillée [0035] Définitions [0036] Dans le cadre de la présente invention, nous entendons par « acide aminé » : les acides aminés naturels et les acides aminés non naturels. Les acides aminés « naturels » comprennent la forme L des acides aminés qui peuvent être trouvés dans des protéines d'origine naturelle, c'est-à-dire : alanine (Ala), argininc (Arg), asparagine (Asn), acide aspartique (Asp), cystéine (Cys), glutamine (Gln), acide glutamique (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isolcucine (ILe), leucine (Leu), lysine (Lys), méthionine (Met), phénylalanine (Phc), prolinc (Pro), sérine (Scr), thréonine (Thr), tryptophane (Trp), tyrosine (Tyr) et valine (Val). [0037] Les acides aminés « non naturels » comprennent la forme D des acides aminés naturels définis ci-dessus, les formes homo de certains acides aminés naturels (tels que : argininc, lysine, phénylalanine et serine), et les formes nor de la leucine et de la valine. Ils comprennent aussi des acides aminés non naturels, tels que : [0038] Abu = acide 2-aminohutyriquc CH rCH2-CH(COOH)(NH2) [0039] iPr = isopropyllysine (CH ')2C-N11-(CH2)4-01(COOH)(NH,) [0040] Aih = acide 2-aminoisohutyriquc [0041] F-trp = N-formyl-tryptophanc [0042] Om = ornithine [0043] Na12 = 2-naphthylalanine [0044] Les acides aminés « non naturels » comprennent aussi tous les acides aminés syn- thétiques. [0045] Le terme « acide aminé » est utilisé ici aussi pour désigner des acides aminés tempo- rairement protégés, comme cela est décrit ci-dessus, notamment ; par exemple la fonction amine (Na) peut être protégée par un groupement Fmoc,Boc ou tout autres groupements protecteurs appropriés. 9 [0046] Le procédé de préparation de peptides selon l'invention utilise des polyoléfines, ou plus précisément des oligomères de polyoléfines (les polyoléfines étant appelés aussi polyalcènes), et leurs dérivés comme molécules d'ancrage ou groupement protecteur que cc soit de la fonction acide carboxylique (C-terminal) de l'acide aminé ou du peptide, ou de la chaîne latérale dudit acide aminé ou peptide (sous forme de liaisons ester, amide, ether ou thioether) en phase liquide. Les molécules de polyoléfines comprennent une chaîne d'atomes de carbone reliés par des liaisons simples. Elles peuvent comprendre des ramifications constituées de groupements alkyles identiques ou différents, niais de préférence identiques. De préférence on utilise des polymères avec un nombre d'unités de monomères d'au moins 10 et de préférence compris entre 15 et 50. On préfère des homopolymères, niais on peut également utiliser des copolymères, et dans ce dernier cas le nombre de liaisons insaturées dans la chaîne d'atomes de carbone ne dépasse avantageusement pas 5 %, et préférentiellement ne dépasse pas 3 %. [0047] De préférence il s'agit de dérivés de polyisobutènes (PIB), une classe de polymères connue depuis les années 30 du siècle dernier, mais on peut également utiliser des dérivés de polypropylènes. [0048] Ces molécules d'ancrage sont de préférence employées dans le procédé selon r invention sous la forme de dérivés fonctionnalisés, comme cela sera expliqué en plus grand détail par la suite. [0049] Selon l'invention, ces molécules d'ancrage sont liés à la fonction acide carboxylique d'un acide aminé (C-terminal) par une liaison covalente de type amide ou ester. Cela suppose que les molécules d'ancrage soient engagés sous une forme convenablement fonctionnalisée, qui est appelé dans la présente description « dérivés de PIB », sachant que ce terme englobe ici aussi les dérivés de molécules d'ancrage qui ne sont pas des dérivés du polyisobutène, mais qui sont des dérivés d'autres polyoléfines selon la définition qui est donnée ci-dessus. Cette fonctionnalisation de la molécule d'ancrage est en règle générale une fonctionnalisation terminale, de préférence à l'une des extrémités de la chaîne d'atomes de carbone ; elle sera décrite ci-dessous. [0050] Les oligomères de polyoléfines utilisés comme molécule d'ancrage sont typiquement caractérisés par une masse moléculaire moyenne en masse, mais on peut aussi également utiliser des oligomères « purs » qui comportent des molécules identiques d'une longueur de chaîne donnée. [0051] Cette réaction entre le dérivé de PIB et l'acide aminé conduit à un produit caractérisé par le fait que lorsque le dérivé de PIB est lié à un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé, protégé ou pas sur la fonction amine, ou ayant éventuellement une chaîne latérale protégée, on obtient une molécule dont la solubilité dans l'eau est faible (