FR 3087440 A1 20200424 FR 1859753 A 20181022 COMPOSES POLYSACCHARIDIQUES, ET LEUR UTILISATION POUR STIMULER DES REPONSES DE DEFENSE DES PLANTES CONTRE LES MICROORGANISMES PATHOGENES DESCRIPTION Domaine technique de l'invention La présente invention concerne de nouveaux oligogalacturonanes 10 complètement déméthylés et possédant un degré de polymérisation de 1 à 10, et leur utilisation pour stimuler des réponses de défense des plantes contre des microorganismes pathogènes. La présente invention trouve par exemple des applications dans le domaine de la protection des végétaux, du biocontrôle. 15 Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Dans leur environnement, les plantes sont confrontées à des microorganismes 20 pathogènes incluant des bactéries, des champignons, des oomycètes ainsi que des virus. Elles résistent à la plupart de ces agresseurs via l'activation de processus de défense (concept d'immunité des plantes). Toutefois lorsque cette résistance est inefficace, le développement du microorganisme altère la croissance de la plante, voire tue la plante engendrant ainsi des pertes annuelles de récolte avoisinant les 30% à 25 l'échelle mondiale. Comprendre les mécanismes associés aux processus infectieux et à la résistance des plantes aux maladies représente ainsi un enjeu majeur en agriculture. L'utilisation des produits phytosanitaires utilisés classiquement en protection des cultures contre les maladies est problématique en termes de respect de 2 l'environnement et de santé des utilisateurs et des consommateurs [voir par exemple le rapport d'information fait au nom de la mission commune d'information sur les pesticides et leur impact sur la santé et l'environnement présenté par Madame la Sénatrice N. Bonnefoy (Sénat, Session ordinaire de 2012-2013, Vol. 12)). Des 5 dispositions ont déjà été prises, dans le cadre du plan Ecophyto, afin de réduire l'utilisation de ces produits. Le développement de méthodes de protection des cultures plus respectueuses de l'environnement et à moindre risque pour l'utilisateur et les populations est un enjeu majeur. Dans ce contexte, la stimulation des défenses naturelles des plantes par des stimulateurs de défense de plantes (SDP) ou éliciteurs a déjà montré un réel potentiel d'application. L'activation des mécanismes de défense des plantes nécessite la reconnaissance de l'agent pathogène. Les cellules végétales possèdent effectivement des protéines capables de reconnaitre des motifs moléculaires portés par les pathogènes (RAMI", Pathogen-Associated Molecular Patterns) mais également des facteurs de virulence produits par ces derniers. Ce second cas de figure implique des protéines végétales appelées protéines de résistance. Les réactions de défense de la plante peuvent donc être induites et mimées par l'application de molécules produites par le pathogène (notamment par des PAMP) voire issues de la plante elle-même (molécules résultant de la dégradation de la plante par le pathogène ou DAMP, Damage-Associated Molecular Patterns, ces molécules étant considérées comme des SDP ou éliciteurs. De manière plus générale, des molécules mimant les signaux végétaux ou fongiques peuvent être utilisés. Les éliciteurs présentent un intérêt biotechnologique important, Il a été ainsi démontré que l'application de SDP était capable de diminuer la sensibilité aux pathogènes virulents et ainsi assurer une forme de protection (résistance induite). De plus, ces molécules conduisent à une induction de résistance contre une large gamme de pathogènes (Trouvelot et al., 2014) [1]. Certaines de ces molécules ont montré une réelle efficacité en parcelle cultivée et permettent de réduire la quantité de produits phytosanitaires de synthèse classiquement utilisés dans la lutte des cultures contre les maladies. Description de l'invention 3 Les Inventeurs ont identifié de nouvelles molécules élicitrices d'intérêt. Ces molécules naturelles, issues de polysaccharides provenant de la paroi des végétaux, présentent des caractéristiques chimiques et des propriétés originales. Elles présentent une forte activité phyto-protectrice en conditions contrôlées. Elles sont 5 notamment capables d'induire chez la plante modèle Arabidopsis thaliana et chez la vigne (Vitis vinifera) des réponses de défense et un phénomène de résistance très efficace à plusieurs microorganismes pathogènes. L'utilisation de ces molécules va donc permettre de conférer une protection de cultures en serres ou en plein champ (horticulture, plantes maraichères, grandes cultures) contre des maladies 113 cryptogamiques et ainsi réduire l'utilisation de produits phytosanitaires. Ces nouvelles molécules élicitrices des réponses de défenses des plantes sont des oligogalacturonanes possédant un degré de polymérisation inférieur à ceux décrits dans la littérature (Van Cutsem et Messiaen, 1994 Ferrari et al., 2007) [2, 3] et/ou entrant dans la composition des produits actuellement développés (e.g. COS-OGA 15 développé par Fytofend) qui privilégient des molécules plus longues de DP compris entre 9 et 20. Plus précisément ils possèdent un degré de polymérisation de 1 à 10, de préférence de 4 à 10, préférentiellement de 4 à 6, et tout préférentiellement centré sur 5. Une autre caractéristique de ces nouveaux oligogalacturonanes est qu'ils sont complètement déméthylés (DM0). 20 Bien que le procédé de déméthylation des oligogalacturonanes soit connu, la présente invention est la première utilisation de ce type de modification chimique des oligogalacturonanes pour la stimulation des défenses des plantes. La présente invention a donc pour objet un oligogalacturonane de formule (I) suivante : 25 formule (I) possédant un degré de méthylation de 0 et un degré de polymérisation de 1 à 10, de préférence de 4 à 10, préférentiellement de 4 à 6, et tout préférentiellement centré sur 5 et de formule majoritaire suivante : 4 La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention des oligogalacturonanes de l'invention comprenant les étapes de : a) déméthylation des pectines par désestérification ; 5 b) extraction en condition acide d'un homogalacturonane à partir des pectines désestérifiées obtenues à l'étape a) ; c) préparation d'une fraction d'oligogalacturonanes par autolyse acide de l'homogalacturonane obtenu à l'étape b), suivie d'une précipitation en éthanol. Les pectines sont présentes en grande quantité dans les parois primaires des Dicotylédones, en particulier dans les parois végétales de nombreux fruits [agrumes ou citrus (orange, citron, pamplemousse, etc...), pomme, etc...] et légumes. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, les pectines sont de préférence issues du citrus. 15 Il est à noter que la variation de la concentration en éthanol à l'étape c) permet d'obtenir des oligogalacturonanes de DP différents. Par exemple : précipitation en éthanol 85% pour l'obtention d'oligogalacturonanes majoritairement de DP2, précipitation en éthanol 64% pour l'obtention d'oligogalacturonanes majoritairement de DP5, précipitation en éthanol 30% pour l'obtention d'oligogalacturonanes 20 majoritairement de DP12, précipitation en éthanol 15% pour l'obtention d'oligogalacturonanes majoritairement de DP28. Les autres conditions ne varient pas. Le procédé de la présente invention peut comprendre en outre une étape de fractionnement d) de la fraction d'oligogalacturonanes obtenue à l'étape c), par une méthode bien connue de l'Homme du métier, par exemple, par dialyse, par 25 chromatographie en phase liquide à haute performance, ou par chromatographie d'exclusion, etc... afin d'isoler/purifier les oligogalacturonanes selon leur degré de polymérisation (DP). 5 La présente invention a également pour objet l'utilisation des oligogalacturonanes de l'invention en phyto-protection. Ils permettent en effet de stimuler les réponses de défense des plantes contre des microorganismes pathogènes. 5 Brève description des figures La figure 1 représente la production de formes actives de l'oxygène (FAO) induite chez Arabidopsis thaliana par des oligogalacturonanes (OG) majoritairement de degré de polymérisation 5 (DP5) avec différents degrés de méthylation (DMO, so DM30 et DM60) (A), et de différents degrés de polymérisation (DP5, DP12 et DP28) avec un degré de méthylation 0 (DMO) (B) et en comparaison avec la réponse induite par le peptide f1g22 dérivé de la flagelline. La figure 2 représente l'estimation du niveau d'accumulation des transcrits des gènes PER4 (A), WRKY75 (B), RLP7 (C) et PAD3 (D) chez Arabidopsis thaliana par 15 des oligogalacturonanes (OG) majoritairement de degré de polymérisation 5 (DP5) avec différents degrés de méthylation (DMO, DM30 et DM 60). La figure 3 représente l'estimation du niveau d'accumulation des transcrits des gènes PER4 (A), WRKY75 (B), RLP7 (C) et PAD3 (D) chez Arabidopsis thaliana par des oligogalacturonanes (OG) de différents degrés de polymérisation (majoritairement 20 de DP5, DP12 ou DP28) avec un degré de méthylation 0 (DMO). La figure 4 représente les niveaux de protection induits chez Arabidopsis thaliana par des oligogalacturonanes (OG) majoritairement de degré de polymérisation 5 (DP5) avec différents degrés de méthylation (DMO, DM30 et DM60) vis-à-vis de Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa). 25 La figure 5 représente les niveaux de protection induits chez Arabidopsis thaliana par des oligogalacturonanes (OG) de différents degrés de polymérisation (majoritairement de DP5, DP12 ou DP28) avec un degré de méthylation 0 (DMO) vis-à-vis de Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) (A) et de Botrytis cinerea (B). La figure 6 compare les niveaux de protection induits chez Arabidopsis thaliana 30 par des oligoalacturonanes majoritairement de degré de polymérisation 5 (DP5) et de degré de méthylation 0, avec deux oligogalacturonanes de pureté supérieure et de degré de polymérisation 4 (0G4) et 6 (0G6), respectivement, et un degré de 6 méthylation 0 (DM0), et avec un produit OG commercialisé (COS-OGA) vis-à-vis de Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) (A) et de Botrytis cinerea (B). La figure 7 représente les niveaux de protection induits chez la vigne (Vitis vinifera) par des oligogalacturonanes (0G) (A) majoritairement de degré de 5 polymérisation (DP5) avec différents degrés de méthylation (DMO, DM30 ou DM60) vis-à-vis du pathogène Plasmopara viticola (agent du mildiou), et (B) majoritairement de degré de polymérisation 5, 12 ou 28 (DP5, DP12 ou DP28) avec un degré de méthylation 0 (DM0) vis-à-vis du pathogène Plasmopara viticola (agent du mildiou). L'efficacité des produits DP5, DP12 et DP28 est également comparée avec celle de la 1.13 laminarine sulfatée (lam. suif.). EXEMPLES (à vérifier / compléter) 1.5 EXEMPLE 1 : SYNTHESE - PRODUCTION - IDENTIFICATION DES MOLECULES ELICITRICES DE L'INVENTION Les oligogalacturonanes (0G) de degré de polymérisation majoritairement centrés sur 5 (DP5) avec un degré de méthylation 0 (DM0) ont été obtenus comme suit : 20 a) Déméthylation des pectines Les molécules d'intérêt ont été obtenues à partir de pectines de citrus. Les pectines ont été traitées à froid (+4°C) après solubilisation dans l'eau une nuit à 7,5 g/L et désestérification par la soude à pH 12 pendant 24 h. Le pH a ensuite été abaissé à pH 4,5 par ajout d'acide chlorhydrique 1 N. La solution a été concentrée 2 fois puis 25 précipitée par l'éthanol (concentration finale 72%) à 4°C. Le précipité a été lavé à l'éthanol 72% et séché par échange de solvants. Le rendement en pectines désestérifiées a été de l'ordre de 94%. b) Extraction d'un homogalacturonane Les pectines désestérifiées ont été solubilisées dans l'eau à 10 g/I pendant une 30 nuit. La solution a été acidifiée par ajout d'acide chlorhydrique jusqu'à une concentration finale de 0,1 N et maintenue à 80°C pendant 72 h. L'homogalacturonane 7 ainsi isolé a précipité. Le précipité a été lavé par l'acide chlorhydrique 0,1 N puis par de l'eau, puis séché par échange de solvants. Le rendement attendu a été de l'ordre de 55% sur la pectine initiale. c) Préparation d'une fraction d'oligogalacturonanes centrée sur DP 5. 5 L'homogalacturonane obtenu a été solubilisé dans l'eau à 10 g/I et soumis à autolyse en le maintenant à une température de 100°C pendant 24 h. La fraction soluble a été concentrée et précipitée en éthanol (EtOH) 64% à 4°C. Après reprise en eau du précipité et dialyse, le rendement attendu a été de l'ordre de 25% sur l'homogalacturonane, soit environ 14% sur la pectine initiale. 113 Les conditions de précipitation à l'éthanol, telles que décrites ci-dessus à l'étape c) ont été ajustées pour faire varier le DP majoritaire de la fraction d'oligogalacturonanes obtenue à l'issue du procédé de production décrit ci-dessus. Ainsi : - EtOH 85% pour fraction d'oligogalacturonanes de DP centré sur 2. 15 - EtOH 64% pour fraction d'oligogalacturoanes de DP centré sur 5. - EtOH 30% pour fraction d'oligogalacturonanes de DP centré sur 12 - EtOH 15% pour fraction d'oligogalacturonanes de DP centré sur 28. Suite à l'étape de précipitation en éthanol, il a été possible d'isoler des oligogalacturonanes d'une pureté supérieure, d'un DP particulier, (par exemple de 20 DP4 ou DP6) à partir de la fraction d'oligogalacturonanes obtenue selon le procédé décrit ci-dessus qui comprend majoritairement des oligogalacturonanes de DP5, par purification sur colonne semi-préparative Carbopac et détection par HPAEC-PAD après élution dans un tampon KOAc (pH 8). 25 EXEMPLE 2: TEST DE L'ACTIVITE BIOLOGIQUE DES MOLECULES ELICITRICES DE L'INVENTION CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA : MESURE D'EVENEMENTS CELLULAIRES ET MOLECULAIRES MOBILISES LORS DE LA REPONSE IMMUNITAIRE DES PLANTES. 30 Les plantes ont élaboré des stratégies de défense efficaces pour lutter contre les agents pathogènes. Suite à la reconnaissance directe ou indirecte de l'agresseur, des mécanismes moléculaires de défense, caractérisés notamment par la production 8 de formes actives de l'oxygène (FAO) ou l'expression de gènes codant pour des protéines de défenses, sont activés. 2.1. Production de formes actives de l'oxygène (FAO) 5 La production de FAO, et plus particulièrement de H202, a été mesurée par la technique de chimioluminescence du luminol selon le protocole décrit par Rasul et al. (2012) [4] à partir de disques foliaires d'Arabidopsis thaliana traitée par différents oligogalacturonanes à une concentration de 50 pg/ml. Les résultats présentés dans la figure lA ont permis de comparer les effets de trois degrés de méthylation (DM) 0, 30 et 60 pour un oligogalacturonane (0G) de degré de polymérisation 5 (DP5), et ceci en comparaison avec un traitement par f1g22, protéine connue pour déclencher la production d'H202. Le DM0 a induit une production supérieure aux deux autres molécules (DM30 et 60). Les résultats présentés dans la figure 1B ont permis de comparer les effets de 15 trois degrés de polymérisation (DP) 5, 12 et 28 avec un DM0 et ceci en comparaison avec un traitement par f1g22, un éliciteur protéique connu pour déclencher la production d'H202(Felix et al., 1999) [5]. Il est ressorti que DP5 induit une production de FAO au moins deux fois supérieure aux autres molécules testées. 20 2.2. Expression de gènes marqueurs de l'immunité végétale L'accumulation des transcrits de quatre gènes marqueurs de défense (WRKY75, PER4, PAD3 et RLP7) a également été mesurée selon le protocole décrit par Rasul et al. (2012) [4] à partir de disques foliaires d'Arabidopsis thaliana traitée par 25 différents oligogalacturonanes (0G) à une concentration de 50 pg/ml. Les résultats présentés dans la figure 2 ont permis de mettre en évidence que trois oligogalacturonanes (0G) de degré de polymérisation 5 (DP5) avec différents degrés de méthylation (DMO, 30 et 60) ont permis d'induire l'expression des quatre gènes marqueurs. Il est à noter que l'oligogalacturonane de DM0 a induit la plus forte 30 expression des quatre gènes de défense étudiés. Les résultats présentés dans a figure 3 ont permis de mettre en évidence que trois oligogalacturonanes (0G) de différents degrés de polymérisation (DP5, 12 et 28) avec un degré de méthylation 0 (DM0) ont permis d'induire l'expression des quatre 9 gènes marqueurs. Il est à noter que l'oligogalacturonane DP5 a induit en moyenne la plus forte expression des quatre gènes de défense étudiés. EXEMPLE 3 : TEST DE PROTECTION : CAPACITE DES MOLECULES 5 ELICITRICES DE L'INVENTION A INDUIRE LA RESISTANCE FACE AUX PATHOGENES 3.1 Protection chez Arabidopsis thaliana Les niveaux de protection induit par les oligogalacturonanes (0G) ont été so estimés contre deux pathogènes Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) et Botrytis cinerea. Ces deux pathogènes sont taxonomiquement différents ; ils appartiennent respectivement au groupe des oomycètes et au groupe des champignons. De plus, ils possèdent chacun un mode de vie différent (respectivement biotrophe et nécrotrophe) ce qui se traduit, entre autres, par l'induction chez la plantes de mécanismes 15 immunitaires différents (Pieterse et al., 2009) [6]. Les tests de protection ont premièrement été réalisés sur plante entière après traitement par pulvérisation jusqu'à ruissellement avec des oligogalacturonanes (0G) de degré de polymérisation 5 (DP5) avec différents degré de méthylation (DMO, 30 et 60) à une concentration de 200 dag/ml. Les traitements ont été réalisés 24 h avant 20 l'inoculation avec Hpa de plantes de 3 semaines par pulvérisation d'une suspension de spores (2,5x105 conidies/ml) jusqu'à formation de fines gouttelettes sur la face supérieure des feuilles. Les plantes ont ensuite été placées en chambre de croissance, et l'effet des OG a été évalué après 7 jours post-inoculation avec Hpa par comptage du nombre de spores par gramme de poids frais (PF) de plante. 25 La figure 4 présente les résultats concernant l'effet du degré de méthylation pour le DP5. L'oligogalacturonane de DMO a réduit de 60% les symptômes (par rapport au témoin non traité). Deuxièmement, les tests de protection ont été réalisés sur plante entière après traitement par pulvérisation jusqu'à ruissellement avec des oligogalacturonanes (0G) 30 de différents degrés de polymérisation (DP5, 12 et 28) avec un degré de méthylation 0 (DMO) utilisés à une concentration de 200 dag/ml. Les traitements ont été réalisés 24h (i) avant l'inoculation avec Hpa (A) de plantes de 3 semaines par pulvérisation d'une suspension de spores (2,5x105 conidies/ml) jusqu'à formation de fines 10 gouttelettes sur la face supérieure des feuilles, ou (ii) avant l'inoculation avec B. cinerea (B) de plantes de 4 semaines en déposant quatre gouttelettes de 5 pl de suspension de spores (5x104 conidies/ml) sur quatre feuilles de chaque plante. Les plantes ont ensuite été placées en chambre de croissance, et l'effet des OG a été 5 évalué (i) après 7 jours post-inoculation avec Hpa par comptage du nombre de spores par gramme de poids frais de plante, ou (ii) après 3 jours post-inoculation avec B. cinerea par mesure du diamètre moyen (en mm) des lésions. Les résultats présentés dans la figure 5 ont permis de montrer que globalement le produit DP5 est plus efficace que les DP12 et DP28. 10 Concernant la protection contre Hpa (Figure 5A), les DP12 et DP28 n'induisent aucune protection, voire une augmentation des symptômes (valeurs supérieures ou égales à 100%). Les résultats présentés dans la figure 5B ont permis de montrer que les trois molécules ont réduit le diamètre des nécroses induites par B. cinerea en comparaison au témoin non traité ; le produit DP5 réduisant de 33% le diamètre des 15 nécroses induites par B. cinerea. Par la suite, des essais ont permis de comparer le produit DP5 à deux produits de pureté supérieure de DP4 et DP6 et au produit OG commercialisé (Le. COS-OGA) dans la capacité à induire la résistance chez Arabidopsis thaliana contre Hpa et B. cinerea (Figure 6A et 6B, respectivement). 20 Les résultats présentés dans la figure 6 ont montré que la fraction d'oligogalacturonanes de DP centré majoritairement sur 5 (DP5) est la plus efficace contre Hpa (A) et B. cinerea (B) en permettant de retarder la progression de l'infection par rapport aux plantes témoins, mais que les fractions d'oligogalacturonanes de DP4 ou DP6 purifiées qui en dérivent ont montré également une efficacité significative selon 25 le pathosystème étudié. En revanche, le COS-OGA s'est montré inefficace dans les deux cas. Cela a renforcé l'intérêt d'utiliser des fractions d'oligogalacturonanes obtenues après l'étape de précipitation en éthanol, par exemple des fractions d'oligogalacturonanes de DP centré majoritairement sur 5 (contenant un peu de DP4 30 et DP6), car elles présentent au moins la même efficacité sinon meilleure que des sous-fractions plus purifiées qui en dérivent et sont plus simples et moins coûteuses à obtenir. 11 3.2. Test de protection de la vigne (Vitis vinifera) contre le pathogène Plasmopere viticola (agent du mildiou). La capacité des oligogalacturonanes à induire une résistance a été estimée chez la vigne contre P. viticola. Cet oomycète biotrophe est responsable de pertes 5 importantes du rendement et de la qualité des récoltes. Pour ce faire, une estimation de la colonisation par le pathogène P. viticola de la surface de feuilles de V. vinifera préalablement traitées par différents oligogalacturonanes a été réalisée. Le traitement par les oligogalacturonnanes (concentration de 2 mg/ml) a été réalisé 48 h avant inoculation par l'agent pathogène 10 selon le protocole décrit par Khiook et al. (2013) [7]. La figure 7A présente les résultats concernant l'effet du degré de méthylation pour le DP5. DM0 a réduit de près de 80% les symptômes (par rapport au témoin non traité) et a été significativement plus efficace que les autres DM. Les résultats présentés dans la figure 7B concernent l'effet du degré de 15 polymérisation pour des OG déméthylés (DM0). Ces résultats ont permis de montrer que, par rapport au témoin non traité, les produits DP5 et DP28 ont réduit de manière significative la colonisation de P. viticola et la sévérité de la maladie ; le produit DP5 montrant la meilleure efficacité. Les résultats présentés dans la Figure 7B montrent également que le produit 20 DP5 possède une efficacité supérieure à la laminarine sulfatée (traitement à une concentration de 1 mg/ml), autre SDP d'origine polysaccharidique dont la protection sur la vigne vis-à-vis de P. viticola a été décrite dans la littérature par Trouvelot et al. (2008) [8]. 12 Liste des références 1. Trouvelot et al., Front. Plant. Sci., 5 : 592, 2014 2. Van Cutsem et Messiaen, Acta Bot. Neerl., 43 : 231-245, 1994 5 3. Ferrari et al., Plant Physiol., 144: 367-379, 2007 4. Rasul et al., Plant Cell Environ., 35 : 1483-1499, 2012 5. Felix et al., Plant J., 18 : 265-276, 1999 6. Pieterse et al., Nat. Chem. Biol., 5 : 308-316, 2009 7. Khiook et al., J. Microbiol. Methods, 95 : 235-244, 2013 io 8. Trouvelot et al., Mol. Plant-Microb. Interact., 21: 232-243, 2008 13 REVENDICATIONSOligogalacturonane de formule (I) sui e (I) possédant un degré de méthyiation de 0 et un degré de polymérisation de 1 à 10. 2) Oligogalacturonane selon la revendication 1, possédant un degré de polymérisation de 4 à 6. 3) Oligogalacturonane selon la revendication 2, possédant un degré de polymérisation centré sur 5 et de formule suivante 10 4) Procédé de préparation d'un oligogalacturonane selon l'une quelconque des revendications 1 â 3, comprenant les étapes suivantes a) déméthylation des pectines par désestérification ; b) extraction en condition acide d'un homogalacturonane à partir des pectines 15 désestérifiées obtenues à l'étape a) c) préparation d'une fraction d'oligogalacturonani&s par autolyse acide de l'homogalacturonane obtenu â l'étape b), suivie d'une précipitation en éthanol. 5) Procédé selon la revendication 4, comprenant en outre une étape de 20 fractionnement d) afin d'isoler ou purifier les oligogalacturonanes de même degré de polymérisation. 14 6) Procédé selon la revendication 5, où l'étape de fractionnement cl) est réalisée par dialyse, par chromatographie en phase liquide à haute performance, ou par chromatographie d'exclusion. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, où la s concentration en éthanol de l'étape c) est de 64%. 8) Oligogalacturonane obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, de formule (I) suivante : formule (I) possédant un degré de mèthylation de 0 et un degré de polymérisation de 1 à 10. 10 9) Utilisation d'un oligogalacturonane selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 8, en phyto-protection, 10) Utilisation selon la revendication 9, pour stimuler des réponses de défense des plantes contre des microorganismes pathogènes.