FR 3092115 A1 20200731 FR 1900856 A 20190130 Description Titre de l'invention : analogues de GTP fluorescents et utilisation Domaine de l'invention [0001] La présente invention a pour objet des analogues de GTP fluorescents utiles pour détecter, par des techniques de transfert d'énergie, des molécules susceptibles de moduler l'activation d'un récepteur couplé aux protéines G. Etat de la technique [0002] Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG ou GPCR en anglais) sont une famille de récepteurs membranaires chez les mammifères et dans tout le règne animal. Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques (3 sous unités : alpha, bcta et gamma) qui sont activées par les RCPG. Au travers des RCPG, les protéines G ont un rôle de transduction d'un signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur de la cellule (i.c. réponse cellulaire à un stimulus externe). Leur mécanisme d'action communément décrit, est présenté dans la Figure I et résumé ci-après : [0003] - dans son état inactif, de repos, la sous unité alpha de la protéine G est liée au nu- cléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP); [0004] - après activation du RCPG, cc dernier se lie à la sous unité alpha de la protéine G et enclenche un processus d'activation de la protéine G constitué de deux étapes : [0005] 1) la sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G vide, et la formation d'un complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et [0006] 2) la fixation du GTP qui conduit à la formation d'une protéine G active, sous forme GTP (protéine G pleine bée au GTP). Dans la première étape, la protéine G liée au récepteur est sous une forme appelée « forme vide ». Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire puisqu'il est décrit que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous-unité alpha de la protéine G. Par ailleurs, les sous-unités bcta/ gamma de la protéine G activée se dissocient de la sous-unité alpha; [0007] - la sous-unité alpha de la protéine G pleine liée au GTP se fixe alors aux effecteurs pour les activer. Les effecteurs activent à leur tour des voies de signalisation entraînant une réponse cellulaire; [0008] - le GTP est ensuite hydrolysé en GDP par la sous-unité alpha de la protéine G et la sous unité alpha se réassocie aux sous-unités beta/gamma pour reformer la protéine G pleine liée au GDP (état inactif). [0009] Il existe plusieurs sous-types de protéines G alpha présentant des profils de sé- lectivité différents pour les différents effecteurs (Journal Molecular Biology, 2016, 428, 3850) et induisant ainsi l'activation de voies de signalisation préférentielles. [0010] Les RCPG sont associés à de nombreuses fonctions physiologiques importantes et 2 sont considérés comme l'une des cibles thérapeutiques privilégiées pour un grand nombre de pathologies. Ainsi, de nombreux tests de criblage in vitro ont été développés pour identifier des molécules capables de moduler les RCPG. Les tests mis au point exploitent différents mécanismes d'activation des protéines G et mettent en oeuvre des technologies variées (Zhang et al.; Tools for GPCR Drug Discovery; Acta Pharmacologica Sinica, 2012, 33, 372). On peut citer notamment les tests d'affinité qui utilisent des ligands radiomarqués pour mesurer l'affinité du ligand au RCPG, les tests de scintigraphie de proximité qui utilisent des billes de scintigraphie sur lesquelles des RCPG ont été fixés ou les tests fonctionnels utilisant du GTP faiblement ou non hydrolysable comme le GTPyS (GTP gamma-S). Ces tests sont néanmoins difficiles à mettre en oeuvre et nécessitent parfois des étapes dc filtration sur membranes qui peut limiter leur utilisation comme tests de criblage à haut débit (HTS). D'autres tests ont été développés pour mettre en évidence l'activation des RCPG. Ces tests se basent notamment sur les techniques de transfert d'énergie (RET - acronyme anglais de « Resonancc Encrgy Transfcr »), comme le FRET (acronyme anglais de « Fluorescence Rcsonance Encrgy Transfer ») - voir Clinical Chemistry, 1995, 41, 1391 ou le BRET (acronyme anglais de « Bioluminescence Resonance Energy Transfcr ») - voir Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(1), 151. Ces deux techniques font appel à des notions dc molécules capables de donner de l'énergie (on parle de donneurs) ou d'accepter de l'énergie (on parle d'accepteurs) voir Physical Chemistry Chernical Physics, 2007, 9, 5847. On peut citer par exemple les techniques de transfert d'énergie mettant en évidence l'interaction entre un RCPG et la protéine G en utilisant soit un donneur conjugué au RCPG et un accepteur conjugué à la protéine G (WO 2006/086883 et WO 2003/008435) soit un accepteur conjugué à la sous-unité alpha de la protéine G et un donneur conjugué à la sous-unité beta et/ou gamma de la protéine G (Bunemann et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 26, 16077). Ces techniques sont néanmoins contraignantes puisqu'elles nécessitent la préparation de protéines de fusion et elles ne permettent pas d'étudier les RCPG et les protéines G exprimées de façon endogène par les cellules (i.e. non modifiées et non surexprimées). D'autre part, afin de discriminer les différents sous types de protéines G alpha pouvant être activées par le récepteur, ces techniques nécessitent la préparation d'échantillons membranaires multiples (une préparation spécifique pour chaque sous type de protéine G alpha). Les techniques de transfert d'énergie ont également été utilisées pour la mise au point de tests visant à visualiser la modulation de la forme GTP (active) de la protéine G ou de la forme GDP (inactive) de la protéine G. On peut citer par exemple les demandes WO 2006/035208 et US 2007/0287162 dans lesquelles on met en oeuvre un analogue du GTP couplé à une molécule de type cyanine. 3 100111 La demande WO 2009/068751 décrit une méthode dans laquelle un signal de transfert d'énergie est détecté à l'aide de dérivés d'ATP marqués ; ces dérivés ne peuvent toutefois pas se lier à la protéine G. Un analogue du GTP est décrit dans la revue « Drug Discovery Today, 2002, 7(18), S150) » comme susceptible d'être utilisé dans une technique de détection par fluorescence en temps résolu. Cet analogue est constitué d'un chélate d'europium couplé à l'atome de phosphate en position gamma du GTP via un atome d'azote. La structure du chélate d'europium n'est toutefois pas divulguée, pas plus que la méthode utilisée pour synthétiser l'analogue en question. Un autre analogue de GTP est décrit dans Analytical Chemistry, 2009, 81, 5033, qui résulte du couplage du gamma-1(8-aminooctyl)imidolguanosine-5'-triphosphate et de ( 1112-(4-isothiocyanatophény1)-éthyllimino Ibis(méthylène)bis ( 4- [14-(R-D glucopyranoxy)phényl] éthynyl}pyridine-6,2-diy1)bis-(méthylènenitrilo)Itétralds(acétato)} europium(111) dont la synthèse a été décrite dans Analytical Chemistry, 2003, 75, 3193. [0012] Il existe donc un réel besoin de disposer de composés capables de se lier à la protéine G et pouvant de facto être utilisés dans une méthode de détection, par des techniques de transfert d'énergie, de molécules susceptibles de moduler l'activation d'un récepteur couplé aux protéines G. Résumé de l'invention [0013] La présente invention a pour objet la mise à disposition de nouvelles molécules de GTP ou de ses dérivés, couplées à des complexes de lanthanide et représentées par la formule générale : [0014] [Che m.1] o (I) [0015] dans laquelle : [0016] X = 0, NH ou CH2; [0017] Y = 0, NH ou CH2; [0018] L est un groupe dc liaison divalent ; [0019] Ln'` est un complexe dc lanthanide ; 100201 étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln?* n'est pas le ( 112-(4-isothiocyanatophény1)-éthyl I imino Ibis(méthylène)bis ( 4- I 4-(R-D glucopyranoxy)phénylléthynyl)pyricline-6,2-diyllbis-(méthylènenitrilo) )-tétrakis(acét ato)J-europium(111). Brève description des dessins [0021] [fig.1] La figure 1 illustre le mécanisme d'action des protéines G. [0022] [fig.2] La figure 2 illustre le format d'essai utilisé pour détecter la liaison des composés de l'invention à la protéine G. [0023] [fig.3] La figure 3 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai. [0024] [ig.4] La figure 4 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai. [0025] [ig.5] La figure 5 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai. [0026] [ig.6] La figure 6 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai. [0027] [ig.7] La figure 7 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai. [0028] [ig.8] La figure 8 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai. [0029] [ig.9] La figure 9 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai. [0030] [ig.10] La figure 10 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai. [0031] [ig.11A-11B] Les figures 11A et 11B illustrent l'effet de la concentration en membranes et en composé à tester sur la liaison dudit composé à la protéine Gai. Description de l'invention 100321 Selon un aspect la présente invention concerne des composés de formule (I) : 100331 [Chcm.2] o [0034] dans laquelle : [0035] X = 0, NH ou CH2; [0036] Y = 0, NH ou CH2; [0037] L est un groupe de liaison divalent ; [0038] Lii"- est un complexe de lanthanide ; [0039] étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln" n'est pas le [[2-(4-isothiocyanatophényl)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis 4-1[4-(R-D glucopyranoxy)phényl]éthynyllpyridine-6,2-diyll bis-(méthylènenitrilo) -tétrakis(acét ato)}europium(II). [0040] On entend par « complexe de lanthanide » un chélate, un macrocycle, un cryptate ou toute espèce organique capable de complexer un atome de la famille des lanthanides, le lanthanide (Ln) étant choisi parmi : Eu, Sm, Tb, Gd, Dy, Nd, Er, de préférence le lanthanide est Tb, Sm ou Eu et de manière encore plus préférée Eu ou Tb. [0041] Les familles des différents composés de formule (I) sont représentées par les formules (Ia) à (Ig) : [0042] [Chem.3] 6 .Li,, -.:1- 1 c i r '. , Q.i 0(1 Ôfr: 1.--,---:> ÔH t. (é9 H [0043] dans lesquelles L et Le- ont les significations indiquées ci-dessus. [0044] Une première famille de composés selon l'invention est constituée des composés de formules (la), (Id) et (If). Cette famille est dite famille GTP-gamma-O (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTP via un atome d'oxygène). Une deuxième famille de composés selon l'invention est constituée des composés de formules (Ib), (Ie) et (Ig). Cette famille est dite famille GTP-gamma-N (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTP via un atome d'azote). Une troisième famille de composés selon l'invention est constituée des composés de formules (je). Cette famille est dite famille GTP-gamma-C (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTP via un atome de carbone). [0045] Dans un mode de réalisation X est O. Dans un autre mode de réalisation X est NH. Dans un autre mode de réalisation X est CH2. [0046] Dans un mode de réalisation, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi : [0047] - une liaison directe; [0048] - un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C21), de préférence en C1-Cs, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ; [0049] - un groupe cycloalkylène en Cs-Cs ; ou 7 [0050] un groupe arylene en C6-C14; [0051] lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylene contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxarnido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkyl'cne ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en C1-CH, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo. [0052] Le groupe de liaison divalent L est avantageusement choisi parmi les groupes suivants : [0053] 8 [Chcm.4] - -tt.-...42).n.-0--(0-Hfp)-,,,r0. -(CHa')."'"' -- -- (;\1- 12 )n 41. 9 :A a - 0 0 (CF12);k N 0 0 H 0 o H I ' - (10,H)rr cH2bs----N. %N 7 c '?- 0 t- 0 \ U- (C-H') N t, 1-1-5 1 e ( -- ---N Pl" 0 H . . (G1-106. 0 0 (CH 'in- N L so?.. H C) n. je [0054] dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et 9 e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4. [0055] De manière particulièrement avantageuse, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi une liaison directe, un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C8ou un groupe de formule : [0056] [Chem.5] (cH21n [0057] Lc groupe de liaison divalent L est de préférence choisi parmi : [0058] [Chem.6] (cF12),, [0059] le groupe -(CH2)'- étant tout particulièrement préféré. [0060] Dans un mode de réalisation, le complexe de lanthanidc Ln, est choisi parmi l'un des complexes ci-après : [0061] [Chcm.7] NH. NH2 C4 [0062] Eu °' , \ N 00/ 002 D I u02-- Go z- C6 1 1- Eu3"' , ,... : .., '',, C0 i" 00f if ''',N ., ..N ., / I; ...] I à0i(50.2- C5 N - - / C8 Cl H H 'q -0 0 N [0063] 11 H 12 H NH2 N Eu3* Eu4' N 1 \ CO2- CO2- ..N N p N co, do, cg ,..s.' NH: ['Nil MN H ') . k1; .... 0-?: C).':. . ;,>:::::: 0 ...,,,, - : / .- ::'-,:.:4,-..,,,.2'. --' y OH 0= 0 --r{ 0 NH NH HN-', f 'nia" f Cl 1 HN [0064] 13 NH2 Ci 4 100651 14 [0066] :REG PE.G - , i \ ,:.-:;,' ,::-_-`,.'' Ph -.. k /7-7: , ..,-.... , ----r",",- 4, r---\ t---- .-- es4 ii \... ... --- 2 ,.. - y ----- ,. .. - C.; ..,...:' . ' 0 ,t, 0 H 32 [0073] C34 [0074] 23 [0075] 24 [0076] 09 HM ---- Me. 14 N , / L Ph Ph: 0 C40 il -------> [0077] 26 [0078] 27 [0079] 28 ' N ="1 1:::;.^)-^ N ' tj5N- N - L C45 0 ;./ H C.? --N ' C48 N HQ2C C41 N o , [0080] --- N. N Ni. 0 .e.... .. +. -N ?- -- H - N - , . ) (5.,:f2,.. ,,,,,:tt: 29 C49 Ph H N / r-N N., Ni. V N N - HC-2C -Ph C50 HM. - - ^ LN -N4 st:j 0 N HOC' C51 [0081] [0082] [0083] 31 t... s, ,.--Nt7'. \''''' '-- .;., H ", le 'ri---'\-, ' , 14 r4.] .' , - .. ',D."' \ : . N']] _. cl :-...../ NH., L....,2]... 00- '' ''''' ] - .. -r) c 054 055 0,. 11 .,. ----- 'Nb] :- 'N -. 0 ]-...,,,],]- -]"' ... ,I. i] C1' '" '-',-;-7',. 0 Ee] C) 0 C56 32 C 58 C57 [0084] 33 OH 0 - HeilY iSrgre" 0 Oh NH f' t NH---- N HN f ; CO-- to - Me -1 me ----r$ -1\ N ,r4 N r Tb . t : ..- ,-,, N K. (;-0-; -1,} -,(1 --- Me' .."- '.. 4,-, t0.-..- ....,-...- .. 2 C63 N .N 1-6; [0085] 34 , NH Ne' b FIN? .,. , '1/4 LnEu C64a. = -0.c. Ce4b, Ln za Tb ,..,-. C65a, L n Eu C6Sbe Ln Tb 100861 [0087] 36 0 Ph o. N N o., N. NH , Pi 0 NU -'Ma, Ln C68b, in Tb o- Me0- He OMe 5 y. \ Ln:--.- 2 N 1/4 ---- o Cela, Ln ® Eu C69b, Ln Tb [0088] 37 [0089] 38 73a, Ln r^ Ci8b: Ln 7z lb [0090] 39 0 C7 4e, Ln = Eu C74b, Ln [0091] H EKk %E.o. 7 , :-." Me0.-kl-e2Ntrkz, ' n 0-'-lie f ' P' '. L' \--N / it-N'-N ; Meo .i.. isi -.1? , ,,, ', _,., .'"; ) ' C) '."" ( ,:r0 - t'q H.... \',. ... /7 \k, CC P Med Me" 0 C76a, Ln= Etd C76h Lr Tb hi 'j N - 0 -iS . , i ' ..> -I C.) ...e..',.,. Ch Ph , ii ',P. /-"-N ----, 0 Ph n"- \ ,.. , ., ... Mcle.) f N -)=.. ' ,--.. ,- ::."-H, ,)----- o ........, .'-... :. 4 , ).----V mec) . .... Fsh y C77, Lt =Etg C77b, Le= Tb _ [00921 41 8 -»:-.Eu L=a = Tb [0093] CE0a, = Eu C80b, Ln 100941 43 H ( > 0 ^ ' N N - 4,---4,.. ,:.) \:>------N HN----q , , ;1 ..i----, ',.--,./ / H , .._..., --., "-Nt.. 'S \ s- , -.= 0 , .... , 7 \ ,s,;( '...,, 0 t- >44,4; -.' N ',F,i.t.-:>: ? , -',N , -', N -:: .... - --,>. s N \ 0 --7-t/ 0' , H \ 2' N KM , , EL». N 'b''' N. : \ is t 5, / .., N N ..... ')-n-t." Cit,40...N-( ..'?, ...,, ,--',0', i--;-' `--- n -- 1 ...t=0 _ , E: --(::, -«-- , . - N ---`, RH , - - N N 0 H2N C$2 C3 H 0 g, -;-& -1-4 9. n - , \-40 bil--H \ ':;s-N liN -1/4'" / H ' H , ,>-."-: ..- , .------=4:: > -. N--- . . " N -.4 - 4 ,..)- Ett, t; .7.,..,,,,,, O- Ci - 7:+ V-.e-tztO ç)> .--, _ / - 0 NH HN MN HN .. - , , ;------c. > .> 0 ---, I O 0 , 0 0 ---":2\ 14e, ri= 3 14ft, Ide nr, fn, 141 .0t Schéma 7 [0164] Au lieu d'introduire une fonction amine primaire masquée, il est également possible de disposer de GTP-ganuna-C dont la partie terminale du linker cst un motifacétylénique. Cette fonction permet de réaliser unc réaction de « Click Chemistry » entre le GTP-gamma-C acétylénique ct un complexe de lanthanidc portant une fonction azide disponible pour unc réaction de couplage. Lc schéma 8 décrit brièvement les différents Geédiaires préparés selon les protocoles disponibles dans la littérature (Bioorganic Mcdicinal Chemistry, 2018, 26, 191 ct Angewandte Chemie International Edition, 2011, 50, 10699). Les dérivés bromures d'alkyle acétylénique commerciaux sont condensés sur du triméthylsilyl phosphonite, puis hydrolysés pour conduire à la série 18a-f. [0165] [Chem.] 6] TRIS P, ,"0-T MS n 3 ,CAS rn". 4 (CAS 6 -9t (CAS 812 CAS 81 :142/ = 8 (C 228403- [0166] Schéma 8 [0167] Une autre option est possible pour introduire sur le linkcr des GTP-gamma-C une fonction permettant la bioconjugaison. Dans cette approche, le groupement azido est introduit sur l'acide phosphonique en utilisant la séquence décrite dans le schéma 9. Les protocoles sont décrits dans la littérature, par exemple dans Chemistry, A European Journal, 2010, 16, 12718, Langmuir, 2010, 26, 10725, ou bien encore dans The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77, 10450. Les dérivés dibromés réagissent avec le triéthylphosphonite pour donner les composés 20a-f. La fonction azido est ensuite introduite par une simple substitution nucléophile avec l'azoture de sodium. Les di-esters sont ensuite hydrolysés en présence de TMS-Br ce qui conduit aux dérivés 22a-f. [0168] [Chem.17] -1= 2' 18e, 3 18d,m 4 18e, n t>4.c....KL-.: 6.2 i0. 7 .:'CAS Ige. 2ea,' 20h, us" 2 20e.. 2ed rt. 20e.. n''',^> 21n, 22a 2213, 22e :ri-. 3 22d, 22e :k% 22F. rt-", 229; 7 22t.rv, S. 21a'.3) T21b, -21t. :21e. 2le. fi*: 7 21t Schéma 9 [0169] Le couplage des composés 15a-f, 16a-f, 18a-f ou 22a-f avec les complexes de lanthanide est réalisé en utilisant les techniques classiques connues de l'homme de l'art (schémas 10 à 13). [0170] [Chcm.18] 56 SS:331- 'Ss4 13.44 7334 Nne .4 5 14,3773. Dmr: n..15.5:.nn - . . . n- 8. .17, 75 '3 St e?.-,;:. den n'd ell,..3arnru7e fanztionnne S' 41.1...312,427'.74444.737 . 35 Schéma 10 [0171] [Chem.19] N31 ,,, 0 p, ;fi e r, - n :::H 374:47,744,4444 D fH 73 73 C3. -2S 2 2St, r44 343 P, I C.S&'32544, ris 4 C3.412'3253 e. 3 C1432'4257, 44 4 C2»-253.. 4,7 c341 ,n Cirl 34,...^ On 24S, 24e, 44, 1 24s. ns 2 2444 n4 2 2,4s, ns 4 22:9;w:- Schéma 11 [0172] [Chem.20] N- 33 . ,:tt. H 33 `4 :. Schéma 18 [0181] 1Chem.271 sênt.ÇPPC14 Schéma 19 101821 L'invention est illustrée par les exemples ci-après, donnés à titre illustratif. Abréviations utilisées [0183] BRET : Bioluminescence resonance Energy Transfer [0184] BSA : Albumine (le sérum bovin [0185] DMSO : diméthylsulfoxyde [0186] EDC : N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide [0187] éq : équivalent [0188] ESI + : ionisation par électronébulisation en mode positif [0189] FRET : Rirster resonance energy transfer (transfert d'énergie par resonance de type Rirster [0190] GDP : guanosine diphosphate [0191] GPCR (RCPG) : G protein-coupled receptors [0192] GTP : guanosine triphosphate [0193] GTPyS : guanosine 5'-[y-thio]triphosphate [0194] h : heure [0195] HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthanesulfonique [0196] HPLC : chromatographie liquide à haute performance [0197] LC-MS : chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse [0198] LRMS : spectrométrie de masse à faible résolution [0199] MES - acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique [0200] MOPS : acide 3-morpholino-l-propanesulfonique [0201] NCS : isothiocyanate [0202] NHS : N-hydroxysuccinimide [0203] Py : pyridine [0204] RCPG : récepteurs couplés aux protéines G [0205] TA : température ambiante [0206] TEA : triéthylamine HC OH P 61 102071 TRIS : trishydroxyméthylaminométhane [0208] UPLC : chromatographie liquide à ultra haute performance [0209] UPLC-MS : chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à la spec- trométrie de masse [0210] UV : Ultraviolet Chromatographie [0211] Les chromatographies liquides à haute performance (HPLC) analytiques et pré- paratives ont été effectuées sur deux appareils : [0212] HPLC Analytique : ThermoScientific, pompe quaternaire P4000, Détecteur UV 1000 à lampe au deutérium (190-350 nm), colonne analytique Waters XBridge C 18' 3,5 pm, 4,6 x 100 mm. [0213] HPLC Préparative : Shimadzu, 2 pompes LC-8A, détecteur UV à barrette de diodes Varian ProStar, colonne préparative Waters XBridge prép. Cl 8, 5 pin: 19 x 100 mm ou 50 x 150 mm. [0214] Les chromatographies liquides à Ultra-haute performance (UPLC) analytiques ont été réalisées sur un appareil Waters Acquity HClass avec comme détecteur soit un détecteur UV à barrette de diode de type PDA, soit un détecteur de masse simple quadripolaire de type SQD2. La sonde utilisée est un électro-spray en mode positif : tension de capillaire à 3,2 KV - tension de cône à 30 V. [0215] Gradient A : Colonne Waters Xbridgc C18. 5 pm, 10 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 - B/ acétonitrile - t = 0 à 5 min 1 % B - t = 10 min 10 % [0216] B - 20 mLinin ' à 260 nm. Gradient B [0217] Colonne Waters Xbridge Clg, 5 pm, 4,6 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate dc triéthy- lammonium pH 7 - B/ acétonitrile - t = 0 à 2 min 2 % B - t = 19 min 40% B.1 mL.mi n Gradient C 102181 Colonne Waters Xbridge Clg, 3,5 pm, 4,6 x 100 mm - A / eau 5 mM acétate d'ammonium pH 5 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - t = 1 min 2 % B - t = 15 min 40 % B - 1 mL.min ' Gradient D 102191 Colonne Waters Xbridge C18, 5 !am, 19 x 100 mm - A / eau 5 mM acétate d'ammonium pH 6,6 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - t = 2,5 min 2 % B - t = 27 min 40 % B - 12 mL.min-I à 280 et 320 nm. Gradient E 102201 Colonne Waters Xbridge C18, 5 pm, 19 x 100 mm - A / eau 25 mM acétate de trié- 62 thylammonium pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - t = 2 min 2 % B t = 20 min 50 % B - 20 mL min-' à 280 et 320 nm. Gradient F 102211 Colonne Waters Acquity C18, 300 Â, 1,7 pm, 2,1 x 50 mm - A / eau 5 mM acétate d'ammonium pH 5 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - t = 0,2 min 2 % B - t = 5 min 40 % B - 0,6 mL. m in-1 Gradient G [0222] Colonne Waters XBridge C18, 300 A, 5 prn, 10 x 100 mm - eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - B - t = 19 min 20 % B - 5 mL.min Gradient H [0223] Colonne Waters Xbridge CH, 5 pm, 4,6 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate de triéthy- lammonium pH 7 - B/ acétonitrile - t = 0 à 2 min 2 % B - t = 19 min 50 % B - 1 int min* Gradient I [0224] Colonne Waters Xbridge CH, 5 Mm, 10 x 100 mm - A / eau 25 mM acétate de trié- thylamnaonium pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - t = 2 min 2 % B - t = 27 min 50 % B - 3,5 mL min-' à 280 nm. Gradient J [0225] Colonne Waters XBridge C18, 5 pm, 19 x 100 mm - eau 25 mM acétate de triéthy- lammonium B / acétonitrile t = 0 min 5 B - B - t = 17 min 45 % B - 20 mL min-' Gradient K [0226] Colonne Waters XBridge C18, 300 Â, 5µm, 10 x 100 mm - eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - B - t = 19 min 40 % B - 5 mL.min Préparation des composés Préparation 1 : GTP gamma-N-pentyl-NH2 (9e) [0227] [Chcm.28] [0228] Dans un ballon contenant le GTP (10 mg ; 19,1 pmol, 1 éq) en solution dans de l'eau (500 pL), a été ajouté de l'EDC (40 mg ; 210 pmol, 11 éq) et une solution de cadavérine (58 mg, 573 pmol, 30 éq) dans du MOPS à pH 8. Lc mélange réactionnel a été agité pendant une nuit à TA avant d'être purifié par HPLC préparativc (Gradient 63 A). Un solide blanc est obtenu correspondant au composé 9c (5 mg). (ES1+) : calculée CI5H28N7013P3 IM+HI k, m/z = 608,10 trouvée 608,55. Préparation 2 : GTP gamma-O-hexyl-C2 102291 I Chem.29 I [0230] A une solution de composé 2c (0,454 mg, 700 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (500 gL) a été ajouté le complexe C2 fonctionnalisé sous sa forme NCS (isothiocyanate) (473 mg, 700 nmol) en solution dans du DMSO (200 uL) en une seule fois. Le mélange a été agité à TA pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC (gradient B) et UPLC-MS (Gradient C), après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC semipréparative (Gradient D) pour conduire au composé GTP gamma-0 hexyl-C2 (125 mg, 96 nmol, 14%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C40H47EuN 10022P3S [M+3H]2+, = 650,06 trouvée 650,32. Préparation 3 : GTP gamma-O-hexyl-C3 [0231] [Chcm.30] [0232] A une solution de composé 2c (0,442 mg, 710 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (200 pL) a été ajouté le complexe C3 fonctionnalisé sous sa forme dichlorotriazine (0,647 mg, 708 nmol) en solution dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (200 pL) en une seule fois. Le mélange a été agité à 4 °C pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient C), après cette 31'N'.8acee,1-,".> el,