FR 3091296 A1 20200703 FR 1874313 A 20181228 Description Titre de l'invention : SYSTEME FLUIDIQUE DE PRODUCTION DE VESICULES EXTRACELLULAIRES COMPRENANT UN AGENT THERAPEUTIQUE OU D'IMAGERIE ET PROCéDé ASSOCIé Domaine technique [0001] L'invention concerne de manière générale la production de vésicules extracellulaires et le chargement d'au moins un agent thérapeutique ou d'imagerie. L'invention se rapporte plus précisément à un système de chargement dc vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices et d'un agent thérapeutique ou d'imagerie, un procédé de chargement d'agent thérapeutique ou d'imagerie et dc récupération de telles vésicules et des vésicules produites par un tel système, les vésicules extracellulaires peuvent par exemple être d'intérêt comme vecteurs pour la délivrance d'agents thérapeutiques ou d'imagerie, comme alternative à la thérapie cellulaire et dans la médecine régénérative. Technique antérieure [0002] Les cellules sont connues pour libérer des vésicules extracellulaires dans leur envi- ronnement, par exemple, in vivo, dans les fluides biologiques d'un organisme. Les vésicules extracellulaires ont été identifiées comme des moyens efficaces pour délivrer des médicaments, de manière personnalisée ou ciblée, dans le corps humain. Elles présentent d'abord une l'incompatibilité native et une tolérance immunitaire. Elles peuvent également internaliser des nanoparticules théranostiques, permettant à la fois d'imager certaines parties du corps et de délivrer des principes actifs ayant des fonctions thérapeutiques. Les vésicules extracellulaires ont également une fonction de communication intercellulaire : elles permettent, par exemple, dc transporter des lipides, des protéines mcmbranaires et cytoplasmiques et/ou des nucléotides du cytoplasme cellulaire, tels que des ARNm, des microARN ou des ARN longs non-codants, entre différentes cellules. [0003] En particulier, l'utilisation dc vésicules extracellulaires peut permettre de résoudre des problèmes connus lors de l'utilisation thérapeutique de cellules, tels que la réplication cellulaire, la différentiation, les occlusions vasculaires, les risques de rejet et les difficultés de stockage et congélation. Il existe en conséquent un besoin industriel pour la production de vésicules cellulaires fonctionnalisées (cad chargé d'un composé d'intérêt) en quantités suffisantes pour une utilisation thérapeutique, notamment en remplacement ou en complément de thérapies cellulaires. Les propiiétés uniques des EVs et leur tolérance biologique sont maintenant considérées comme des avantages 2 pour délivrer des macromolécules biologiquement actives, tout en les protégeant des enzymes circulant dans les fluides corporels. [0004] Les deux principaux défis pour une utilisation thérapeutique sont (i) la génération des EVs en quantité suffisante pour une utilisation clinique et (ii) l'efficacité de chargement de composés biologiquement actifs d'intérêt. [0005] Aujourd'hui, deux principaux types de techniques de chargement sont décrits, (i) les modifications biologiques des cellules mères, ou (ii) le chargement des EVs après leur production par des moyens physiques. En ce qui concerne le chargement des cellules mères, ont été décrit des techniques de chargement spontané ou par transfcction. Par exemple, des cellules ont été conçues pour exprimer un peptide RVG sur la partie cxtracellulaire de la protéine lamp2b surexprimée sur les EVs (Alvarez-Erviti et al., 2011). Cependant, une telle stratégie de transfection des cellules mères par des plasmides codant le Lamp2b fusionné au peptide d'intérêt prend du temps, pose des défis et peut être difficile à respecter dans un processus évolutif de bonnes pratiques de manipulation (BPF). En parallèle, la méthode d'électroporation est la méthode qui peut être utilisée pour le chargement des EVs après la production. Cette méthode a été utilisée pour charger divers composés dans des EVs tel que r ARNsi (Shtam et al., 2013) l'ADN (Lamihhanc et al., 2015) et la doxorubicinc (Tian et al., 2014). Toutefois, la charge d'ARNsi s'est avérée peu efficace en raison de la formation d'agrégats d'ARNsi. Une autre méthode pour obtenir des EVs fonctionnalisés (c.-à-d. des vésicules chargées d'un composé d'intérêt) consiste à détruire les EVs afin de les fonctionnaliser (Halley et al., 2015). Cette méthode est facile à mettre en oeuvre, mais ne permet pas de préserver la structure vésicale, ce qui provoque la perte de l'asymétrie de la membrane et des protéines avec un mauvais réarrangement des protéines membranaires. Smyth et al. divulguent une méthode de chargement des EVs par chimie click. Cette méthode consiste à charger les protéines membranaires des EVs avec un groupe fonctionnel spécifique afin de fixer à ces protéines le composé d'intérêt. Toutefois, cette méthode ne permet pas de charger la lumière des vésicules. [0006] 11 est donc nécessaire de fournir une méthode pour obtenir des vésicules fonction- nalisées (EVs) dans lesquelles la topologie et les propriétés originales des vésicules sont préservées et permettant de charger la lumière des vésicules. Il est également nécessaire que cette méthode permette de charger des EVs avec toutes sortes de composés, avec tout type de volume d'échantillon. Enfin, il est également nécessaire que cette méthode permette de charger des EVs pour une utilisation en clinique avec un set-up compatible avec les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPE), avoir une facilité de production avec un nombre d'étapes réduites, avec une obtention d'EVs chargées en grande quantité etc. 3 Résumé de l'invention [0007] Un but de l'invention est de proposer une solution pour charger des agents théra- peutiques et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires et ainsi fonctionnaliser des vésicules extracellulaires en grande quantité à partir de cellules productrices, plus rapidement et plus efficacement qu'avec les méthodes connues, dans des conditions conformes aux normes G.M.P. Un autre but de l'invention est de proposer une solution permettant d'augmenter le rendement du système de chargement d'agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans des vésicules, c'est-à-dire le rapport entre le nombre de vésicules chargées d'agent thérapeutique et/ ou d'imagerie et le nombre de vésicules non chargées. Un autre but de l'invention est de proposer une solution pour charger, produire et récupérer des vésicules extracellulaires chargées d'agent thérapeutique et/ou d'imagerie en continu ou en discontinu. Enfin, un autre but de l'invention est de simplifier la structure du système fluidique pour le chargement et la production de vésicules chargées d'agent thérapeutique et/ou d'imagerie et de réduire son coût de fabrication. [0008] Ainsi, l'invention propose une solution pour charger les vésicules extracellulaires produites par le système fluidique d'un agent thérapeutique et/ou agent d'imagerie. [0009] En particulier, un objet de l'invention est un système fluidique de chargement d'un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires (EVs) à partir de cellules productrices, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient, des cellules productrices, un agitateur de milieu liquide et des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices, caractérisé en ce qu'il comprend également des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur et de l'agitateur dont la forme et les dimensions du récipient sont adaptées à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser le chargement d'un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV) produites simultanément par le système fluidique. [0010] On comprend qu'avec un tel système, il est possible de produire des vésicules chargées d'agent thérapeutique et/ou d'imagerie en grande quantité, et dans un système adapté aux normes G.M.P. On comprend également qu'un tel système est plus simple et moins couteux à fabriquer que les systèmes connus pour charger et fonctionnaliser des vésicules extracellulaires, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure à 50 pm. [0011] L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale 50 pm, et préférentiellement inférieure ou égale à 40 pm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 35 pm. le système fluidique comprend une sortie et une connectique reliée à la sortie, la connectique étant susceptible de comprendre du milieu liquide et des vésicules extracellulaires ; le système fluidique comprend des microportcurs sur lesquels vont se fixer des cellules productrices adhérentes ; l'agitateur est préférentiellement un agitateur rotatif dont la ou les vitesses de rotation, la forme, la taille sont adaptées, avec la forme et les dimensions du récipient, à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient ; les microporteurs sont des microbilles, le diamètre des microbilles étant compris entre 100 ttm et 300 [lm ; le système fluidique comprend un séparateur de vésicules extracellulaires, relié fluidiquement au récipient de manière à être susceptible de réintroduire dans le récipient un milieu liquide appauvri en vésicules extracellulaires (EV). Le système fluidique pouvant comprendre un moyen de fermeture en amont du séparateur permettant de fermer ou ouvrir la connectique et ainsi obtenir un système de récupération de vésicules en continu ou discontinu. [0012] Un autre objet de l'invention est un procédé de chargement d'un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices, comprenant : des moyens de commande de la vitesse d'un agitateur entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide dans un récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser le chargement d'un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 pm dans un récipient, le récipient comprenant une sortie, le milieu liquide comprenant l'agent thérapeutique et/ ou d'imagerie, des cellules productrices, et une collecte du milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient. [0013] Le procédé est avantageusement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : - on agite le milieu liquide pendant plus de vingt minutes ; - on commande l'agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide constant, intermittent, d'intensité croissante ou décroissante, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 40 pm ; - un séparateur appauvrit une partie du milieu liquide collecté en sortie du récipient en vésicules extracellulaires, et on réintroduit la partie du milieu liquide dans le récipient. on réalise une étape d'ultracentrifugation ou de filtration tangentielle après la collecte pour séparer les vésicules, les cellules productrices et les agents thérapeutiques et/ou d'imagerie dans le milieu liquide. les vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient comprennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d'un agent thérapeutique et/ou d'imagerie ou des vésicules extracellulaires non chargées. L'écoulement permet de simultanément charger l'agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient. DEFINITIONS [0014] Le terme « vésicule extracellulaire » désigne de manière générale une vésicule libérée de manière endogène par une cellule productrice, dont le diamètre est compris entre 30 nm et 5000 nm. Une vésicule extracellulaire correspond en particulier à un exosome et/ou une uncrovésicule et/ou un corps apoptotique cellulaire. [0015] Le terme « cellule productrice » désigne de manière générale indépendamment soit une cellule qui n'est pas adhérente sur un milieu, soit une cellule adhérente sur un milieu et qui peut se diviser et se multiplier. Selon un autre aspect de l'invention, le terme « cellules productrices » désigne des cellules d'origine humaine, animale ou végétale ou provenant de bactéries ou d'autres micro-organismes capables de sécréter des vésicules extracellulaires. Dans le cas des cellules adhérentes, celles-ci peuvent être adhérentes sur des rnicroporteurs eux même en suspension dans le milieu liquide de culture. Selon un autre aspect de l'invention, le terme « cellules productrices » désigne des agrégats cellulaires. Le terme « agrégats cellulaires » désigne un assemblage de plusieurs cellules productrices qui adhèrent solidement entre elles. Un mélange doux créé par l'agitateur permet aux cellules productrices adhérentes ou non de rester en suspension dans le milieu liquide de culture. [0016] Les termes « microporteur » et « microsupport » désignent une matrice sphérique permettant la croissance de cellules productrices adhérentes à sa surface ou à l'intérieur et dont la taille est comprise entre 50 !lm et 500 pin, et préférentiellement entre 100 pm et 300 nm. Les microporteurs sont généralement des billes dont la densité est choisie sensiblement proche de celle du milieu liquide de culture des cellules productrices. Ainsi, un mélange doux permet aux billes de rester en suspension dans le milieu 6 liquide de culture. [0017] Le terme « agent thérapeutique » ou « agent d'imagerie » désigne de manière générale tout agent d'intérêt pouvant être chargé, inséré dans les vésicules extracellulaires. Ces agents peuvent être des molécules thérapeutiques, d'imagerie, des nanoparticules à visée thérapeutique, d'imagerie etc. [0018] Le terme « agitateur » désigne de manière très générale un moyen d'agiter le liquide. Ce peut être une pièce mécanique au moins partiellement en contact avec une partie du liquide et qui permet de mettre ce liquide en mouvement. C'est par exemple le cas avec un agitateur rotatif L'homme de l'art sait qu'il est possible d'utiliser de nombreuses variantes pour produire un mouvement liquide et un mélange, que ce soit en variant les caractéristiques de forme de l'agitateur rotatif ou soit en utilisant d'autres types d'actions, que ce soit isolément ou en action conjointe, dans la façon d'induire du mouvement dans le liquide. Ainsi un réacteur de type « shake-flask » utilise un mouvement de secouage pour induire mouvement liquide et mélange, un réacteur « air-lift » utilise l'injection de bulles gazeuses dans le liquide pour produire mouvement liquide et mélange. D'autres configurations de réacteurs existent qui mettent éventuellement à profit l'utilisation d'une enceinte souple pour contenir le liquide, associée à une déformation de l'enceinte souple pour produire un mouvement liquide et un mélange. De même, un mouvement de mélange peut être obtenu au moyen d'une variation cyclique d'inclinaison du réacteur par rapport à la gravité, de façon à créer des vagues dans le liquide, et promouvoir écoulement et mélange. Enfin, des structures statiques présentes dans le réacteur, par exemple des baffles, ou encore des structures formant barrières partielles au mouvement liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique, peuvent naturellement aussi être utilisées. [0019] Le terme « agitateur » doit être compris selon un sens extrêmement général, qui est celui d'un moyen ou d'une combinaison de moyens quelconques permettant de générer la combinaison d'un écoulement, du mélange du milieu, et la génération de turbulence dans un milieux liquide. Brève description des dessins [0020] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront encore de la description qui suit, laquelle est purement illustrative et non limitative, et doit être lue en regard des figures annexées, parmi lesquelles : [0021] [fig.1] illustre schématiquement un système fluidique pour le chargement d'un agent thérapeutique ou d'imagerie dans la membrane ou dans la lumière de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension ; [0022] [fig.2] illustre schématiquement un système fluidique pour le chargement d'un agent thérapeutique ou d'imagerie dans la membrane ou dans la lumière de vésicules ex- 7 tracellulaires à partir de cellules productrices adhérentes et comprenant des micro-porteurs [0023] [Fig 3] - Les figures 3A, 3B, 3C illustrent respectivement la distribution de taille des EVs obtenues par NTA, l'analyse morphologique par cryo-TEM et l'analyse par fluorométrie. [0024] [fig.4] illustre la biodistribution d'une formulation liposomale de la mTHPC (mTHPC-lip) (A et B) et de mTHPC-EV (C et D) étudiée en fonction de l'intensité de la fluorescence dans des tissus sélectionnés en fonction du temps après injection intraveineuse (0,3 mg/kg de l'agent d'intérêt) chez des souris porteuses de tumeurs HT29. [0025] [fig.5] illustre la concentration plasmatique en mTHPC exprimée en fonction du temps après l'injection intraveineuse de la formulation liposomalc de la mTHPC ou de mTHPC-EV (0,3 mg / kg de mTHPC) chez des souris porteuses de tumeurs HT29. [0026] [fig.6] illustre des diagrammes de Kaplan-Meier du retard dc croissance tumorale HT29 après traitement avec du mTHPC libre; formulation liposomalc de la mTHPC et mTHPC-EVs avec activation laser du médicament (thérapie photodynamique, thérapies tridimensionnelles), comparés aux mêmes groupes sans activation laser (contrôle, lignes en pointillés). Description des modes de réalisation [0027] Eléments théoriques [0028] La longueur de Kolmogorov (ou dimension de Kolmogorov ou longueur d' eddy) est la longueur à partir de laquelle la viscosité d'un fluide permet de dissiper l'énergie cinétique d'un écoulement de ce fluide. En pratique, la longueur dc Kolmogorov correspond à la taille des plus petits tourbillons dans un écoulement turbulent. Cette longueur LK est calculée dans la publication de Kolmogorov (Kolmogorov, A. N., 1941, January, The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large Reynolds numbers, In Dokl. Akad. Nauk, SSSR, Vol. 30, No. 4, pp. 301-305) et décrite par la formule (1) suivante : [0029] [Math 1] L k = [0030] dans laquelle y est la viscosité cinématique du milieu liquide en écoulement et s est le taux moyen de dissipation d'énergie dans le fluide par unité dc masse (ou taux d'injection d'énergie dans le fluide). [0031] Zhou et al. (Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AlChE journal, 42(9), 2476-2490) décrivent la relation entre s moyen et la géométrie d'un récipient dans lequel un milieu liquide est agité par agitateur dc type roue à aubes. Cette relation est donnée par la formule (2) suivante : [0032] 8 N .D 5.N:3 (2) - [0033] dans laquelle N1, est le nombre de puissance (ou nombre de Newton) adimensionné de l'agitateur dans le milieu liquide, D est le diamètre de l'agitateur (en mètre), N est la vitesse de rotation (en nombre de tours par seconde) et V est le volume de milieu liquide (en mètre cube). Cette relation est utilisée pour le calcul de s. moyen correspondant à la géométrie d'un récipient et d'un agitateur utilisés pour la mise en oeuvre de l'invention. Le nombre de puissance Ni, est donné de manière connue par la formule (3) [0034] [Math 3] Np (3) N D p [0035] dans laquelle P est la puissance apportée par l'agitateur, et p est la densité du milieu liquide. La formule (3) peut être ajustée comme décrit dans Nienow et al. (Nienow, A. W., & Miles, D., 1971, Impeller power numbers in closed vessels, Industrial & Engineering Chemistry Process Design and Development, 10(1), 41-43) ou Zhou et al. (Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers. AIChE journal, 42(9), 2476-2490) en fonction du nombre de Reynolds de l'écoulement du milieu liquide. Il est également possible de calculer le nombre de Reynolds du système par la formule (4) suivante : [0036] [Math 41 ND 2 (4) Re= ui [0037] Alternativement, l'homme du métier de par ses connaissances générales et avec des modes de calcul alternatifs peut calculer la longueur de Kolmogorov basée sur un taux moyen de dissipation d'énergie par unité de volume. En tout état, le calcul présenté ci-dessus n'est qu'une façon parmi tant d'autres connues de l'homme du métier de calculer la longueur de Kolmogorov et illustre un mode de réalisation de l'invention sans en limiter la poilée. [0038] Architecture générale du système fluidique [0039] Les figures 1 et 2 illustrent schématiquement un système fluidique 1 pour le chargement de vésicules extracellulaires EV. Le système fluidique 1 de chargement de vésicules extracellulaires EV vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires EV chargées dans un récipient 4. Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation et peut comprendre une série de récipients 4 reliés fluidiquement en parallèle ou en série. 100401 Le récipient 4 contient un milieu liquide 5. Le récipient 4 peut être une cuve, une flasque, par exemple en verre ou en matière plastique, ou tout autre récipient adapté à contenir un milieu liquide 5. Le volume du récipient 4 est l'un des facteurs permettant de produire des vésicules extracellulaires EV en grande quantité : ce volume peut être 9 compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et préférentiellement entre 300 mL et 40 L. Le volume du récipient 4 illustré schématiquement dans la figure 1 ou 2 est de 1 L. Le récipient 4 comprend typiquement une ou plusieurs entrées gazeuses et une ou plusieurs sorties gazeuses, par lesquelles peut s'écouler une atmosphère comprenant des concentrations en air, N12, 02 et en CO, adaptées à la culture cellulaire, par exemple comprenant 5% de CO2. Cette atmosphère peut provenir d'un injecteur/mélangeur de gaz adapté ou d'une étuve à atmosphère contrôlée en CO2 Une deuxième pompe 17 permet de commander cet écoulement gazeux dans le récipient 4. Le récipient 4 comprend également une sortie 9 susceptible de comprendre du milieu liquide 5 et des vésicules extracellulaires EV. Cette sortie peut être complétée d'un moyen de séparation et/ou de filtration des cellules en suspension permettant de ne pas récupérer des cellules en suspension en dehors du récipient 4. Cette sortie 9 permet d'extraire hors du récipient 4 les vésicules extracellulaires EV produites. Le récipient 4 peut également comprendre au moins une entrée 8 adaptée à introduire le milieu liquide 5 dans le récipient 4. [0041] Le milieu liquide 5 peut être de manière générale une solution saline, par exemple isotonique. Préférentiellement, le milieu liquide 5 est un milieu liquide de culture avec ou adjonction de composés permettant la culture des cellules d'intérêt, ou un milieu complémenté en sérum ou lysat plaquettairc préalablement purifié des vésicules extracellulaires ou un milieu sans sérum, permettant de ne pas contaminer les vésicules extracellulaires EV produites par le système fluidique 1 par des protéines ou d'autres vésicules provenant d'un sérum. Un milieu liquide 5 de type DMEM sans sérum peut être utilisé. Le volume maximum de milieu liquide 5 est déterminé en partie pal- le récipient 4. Ce volume maximum peut également être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et plus préférentiellement entre 300 mL et 40 L. Le volume minimum de milieu liquide 5 contenu par le récipient 4 est en partie déterminé par le choix de l'agitateur? permettant d'agiter le milieu liquide 5. [0042] Le système fluidique 1 peut comprendre, selon un mode de réalisation particulier des microporteurs 3 en suspension dans le milieu liquide 5. Les microporteurs sont particulièrement avantageux lorsque les cellules productrices 6 sont des cellules adhérentes. Les microporteurs 3 peuvent être des microbilles 14, par exemple en Dextran, chaque microbille 14 pouvant être recouverte d'une couche de collagène ou autre matériau nécessaire à la culture de cellules. D'autres matériaux peuvent être utilisés pour la fabrication des microporteurs 3, tels que le verre, le polystyrène, le polyacrylamide, le collagène et/ou l'alginate. De manière générale, l'ensemble des microporteurs adaptés pour la culture cellulaire est adapté à la production de vésicules extracellulaires EV. La densité des microporteurs 3 peut être par exemple légèrement supérieure à celle du milieu liquide 5. La densité des microbilles 14 en Dextran est pal- exemple de 1,04. Cette densité permet aux microbilles 14 d'être suspendues dans le milieu liquide 5 en agitant faiblement le milieu liquide 5, la traînée de chaque microporteur 3 dans le milieu liquide 5 étant dépendante de la densité du microporteur 3. La taille maximale des microporteurs 3 peut être comprise entre 50 pm et 500 pm, préférentiellement entre 100 pm et 300 pm, et préférentiellement entre 130 pm et 210 pm. [0043] Les microporteurs 3 peuvent par exemple être des microbilles 14 dc type Cytodex 1 (marque déposée). On peut réhydrater et stériliser unc poudre formée par ces microbillcs 14 avant utilisation. On peut utiliser 5g du PBS, puis dans un milieu de culture (par exemple du DME1VI) sans sérum, à 4 °C avant une utilisation. [0044] Le système fluidique 1 comprend également des cellules productrices 6. Les cellules productrices 6 peuvent être selon un mode de réalisation, des cellules adhérentes sur les microporteurs 3 ou selon un autre mode de réalisation des cellules en suspension. Les vésicules extracellulaires EV sont chargées et produites par le système fluidique 1 à partir de ces cellules productrices 6 (adhérente ou non). [0045] Les cellules productrices 6 peuvent être cultivées, avant le chargement et la production de vésicules extracellulaires EV chargées par le système fluidique I. sur la surface des microporteurs 3 dans un milieu de culture cellulaire adapté ou en suspension dans un milieu de culture cellulaires adapté pour des cellules en suspension. Ainsi, aucun transfert de cellules n'est nécessaire entre la culture des cellules productrices 6 et le chargement des vésicules extracellulaires EV, ce qui permet d'éviter toute contamination et de simplifier le procédé dans son ensemble. Selon un mode de réalisation, la majorité des cellules productrices 6 sont adhérentes à la surface des microporteurs 3, même si une proportion minoritaire de cellules productrices 6 peuvent être décollées, par exemple par l'agitation du milieu liquide 5. Les autres cellules productrices sont alors et en suspension dans le milieu liquide 5 ou sédimentées au fond du récipient 4. Préférentiellement, le système fluidique 1 est adapté de manière à générer une agitation douce permettant d'homogénéiser les cellules productrices 6 dans le milieu liquide 5 au sein du récipient 4. De manière générale, tout type de cellules productrices 6 peut être utilisé, y compris des cellules productrices non adhérentes. Les cellules productrices en suspension sont alors en suspension dans le milieu liquide 5 ou sédimentées au fond du récipient 4. [0046] Le récipient 4 comprend également un agitateur 7 permettant d'agiter le milieu liquide 5. L'agitateur 7 peut être une roue à aubes, dont les aubes sont au moins en partie plongées dans le milieu liquide 5, et mise en mouvement par une transmission de forces magnétiques ou mécaniques. L'agitateur? peut également être un système de perfusion de milieu liquide 5 à un débit suffisant pour agiter le milieu liquide 5 contenu par le récipient, ou un système à murs rotatifs (par exemple agencés sur des rouleaux). L'agitateur 7 peut alternativement être du type rouleur à bouteilles ou rollers 11 à bouteilles, agitateur orbital pour Erlenmeyers, avec ou sans baffles (shakcn flask), agitateur à bascule (wave), bioréacteur avec agitation pneumatique (air-lift) ou un agitateur rotatif à pales tel qu'un agitateur de type hélice marine, turbine de Rushton, ancres d'agitation, agitateur barrière, hélice rubans hélicoïdaux. Un agitateur rotatif préféré est une turbine à pales verticales. Enfin, des structures statiques peuvent être présentes dans le récipient, par exemple des baffles, ou encore des structures formant barrières partielles au mouvement liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique, peuvent naturellement aussi être utilisées. L'agitateur 7 et les dimensions du récipient 4 sont adaptés à commander un écoulement turbulent du milieu liquide 5 dans le récipient 4. L'homme du métier de par ses connaissances générales sait calculer la longueur de Kolmogorov adaptée pour chaque type d'agitateur 7 en fonction des dimensions du récipient 4, de la géométrie de l'agitateur 7 et de l'intensité de l'agitation. Par écoulement turbulent, on entend un écoulement dont le nombre de Reynolds est supérieur à 2000. Le nombre de Reynolds peut par exemple être calculé par la formule (4). Préférentiellement, le nombre de Reynolds Re de l'écoulement de milieu liquide 5 est supérieur à 7 000, préférentiellement à 10 000 et préférentiellement à 12 000. [0047] D'autres agitateurs 7 permettant de commander un écoulement turbulent selon la présente invention sont des agitateurs bien connus de l'homme du métier et susceptibles d'être implanté dans le système selon la présente invention. [0048] L'agitateur 7 utilisé dans les exemples de réalisation de l'invention comprend une roue à aube agencée dans un récipient 4 et mise en mouvement par un système de transmission de forces magnétiques. La vitesse de la roue à aube dans le milieu liquide 5 entraine un écoulement du milieu liquide 5. L'agitateur est adapté à commander un écoulement, qui, compte-tenu des dimensions du récipient 4, est turbulent. Dans le cas de l'agitateur? illustré en figure 1 ou 2, plusieurs paramètres permettent de calculer une valeur représentative de la turbulence du milieu liquide 5, en particulier la viscosité cinématique y du milieu liquide 5, les dimensions du récipient 4 et en particulier le volume V de milieu liquide 5 contenu dans le récipient 4, le nombre de puissance N,, correspondant à la partie immergée de la roue à aube, le diamètre D de l'agitateur et en particulier de la roue, la vitesse N de rotation de la roue. L'utilisateur peut ainsi calculer, en fonction de ces paramètres, des valeurs représentatives de la turbulence de l'écoulement, et en particulier la longueur de Kolmogorov LK, telle que donnée par les équations (1), (2) et (3). En particulier, l'agitateur 7 est adapté à commander un écoulement dans lequel la longueur LK est inférieure ou égale à 50 pm et préférentiellement à 40 pm. [0049] Dans un exemple de réalisation du système fluidique 1, la vitesse de rotation de l'agitateur? est susceptible d'être commandée à 100 rpm (rotations par minute), le diamètre d'une roue à aube est de 10,8 cm et le volume de milieu liquide contenu par 12 le récipient 4 est de 400 mL. Le nombre dc puissance Ni, mesuré dc la roue à aube dans le milieu liquide 5, par la formule (3), est sensiblement égal à 3,2. L'énergie dissipée par unité de masse r, calculée, par la formule (2), est égale à 5,44.101 J.kg-1. La longueur de Kolmogorov Li, calculée par la formule (1) est ainsi égale à 41, 8 pm. [0050] Préparation des microporteurs et des cellules productrices [0051] Le récipient 4 peut être à usage unique ou bien stérilisé avant toute introduction dc milieu liquide 5, de microportcurs 3, de cellules productrices 6 et de l'agent thérapeutique ou agent d'imagerie. Les rnicroporteurs 3, en l'occurrence des microbilles 14, sont également stérilisés. Les microbilles 14 sont incubées dans le milieu de culture des cellules productrices 6, comprenant du sérum, dans le récipient 4. Cette incubation permet d'oxygéner le milieu de culture et de recouvrir la surface des microbillcs 14 d'une couche, au moins partielle, de protéines, favorisant l'adhésion des cellules productrices 6 à la surface des microbilles 14. [0052] Les cellules productrices 6, avant d'être introduites dans le système fluidique 1, sont mises en suspension au moyen d'un milieu comprenant de la trypsine. Elles peuvent être ensuite centrifugées à 300 G pendant cinq minutes pour être concentrées dans le culot d'un tube, dc manière à remplacer le milieu comprenant de la trypsine par un milieu DMEM. Les cellules productrices 6 ensuite sont introduites dans le récipient 4, comprenant du milieu de culture et les microbillcs 14, dans une quantité correspondant sensiblement à 5 à 20 cellules productrices 6 par microbille 14. Les cellules productrices 6 et les microbilles 14 sont ensuite agitées puis sédimentées, de manière à mettre en contact les microbilles 14 et les cellules productrices 6, et favoriser l'adhésion des cellules productrices 6 sur la surface des microbilles 14. L'agitation peut reprendre périodiquement, de manière à favoriser l'homogénéité de l'adhésion des cellules productrices 6 à la surface des microbilles 14, par exemple toutes les 45 minutes pendant 5 à 24 heures. La culture des cellules productrices est ensuite réalisée avec une faible agitation du milieu de culture (par exemple la rotation d'une roue à aube à une vitesse de 20 rpm), ainsi qu'un remplacement régulier du milieu de culture (par exemple un remplacement de 5% à 40% du milieu de culture chaque jour). [0053] Aspect chargement d'agent thérapeutique ou d'imagerie [0054] Le système fluidique 1 pour le chargement et production de vésicules extracellulaires EV vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires EV dans un récipient 4. Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation et permet également de charger en grande quantité des agents thérapeutiques ou agents d'imagerie dans les vésicules extracellulaires EV produites selon l'invention. Ainsi, les cellules productrices 6 et l'agent thérapeutique ou d'imagerie sont simultanément en suspension dans le milieu liquide 5 et mélangés dans le récipient 4. Alternativement, les cellules productrices 6 peuvent être ajoutées dans le milieu liquide 5 avant ou après 13 l'ajout des agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie dans ledit milieu liquide 5. De manière générale, tout type d'agent thérapeutique ou d'imagerie peut être utilisé, de préférence des agents thérapeutiques molécules ou particules pour traiter les maladies infectieuses, inflammatoires, métaboliques, dégénératives, traumatiques, post-chirurgicales, génétiques, malignes (tumeurs), orphelines, du système vasculaire, lymphatique, locomoteur, digestif, nerveux, reproducteur, excréteur et/ou des agents (molécules ou particules) d'imagerie nucléaire, magnétique, optiques, acoustiques. Le récipient 4 comprend également un agitateur 7 tel que décrit précédemment et permettant d'agiter le milieu liquide 5 comprenant les cellules productrices en suspension 6 et l'agent thérapeutique ou d'imagerie. Préférentiellement, le système fluidique 1 est adapté de manière à générer une agitation douce permettant d'homogénéiser les cellules productrices 6 dans le milieu liquide 5 au sein du récipient 4 et cc afin de charger efficacement les agents thérapeutiques ou d'imagerie dans les cellules productrices 6 et par conséquent dans les vésicules extracellulaires. [0055] Selon un autre objet, l'invention est également un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices, comprenant : des moyens de commande de la vitesse d'un agitateur 7 entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide 5 dans le récipient 4 pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices 6 afin de réaliser le chargement et la production d'un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 pm dans un récipient 4, le récipient comprenant une sortie 9, le milieu liquide 5 comprenant des cellules productrices 6, et une collecte du milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie 9 du récipient 4. [0056] Selon un objet de l'invention, le procédé selon l'invention comprend une étape de chargement d'un agent thérapeutique ou d'imagerie. Bien entendu, cette étape peut également être avant l'étape de production de vésicules extracellulaires. Alternativement, l'étape de chargement peut être après l'étape de production de vésicules extracellulaires. Ce mode de réalisation peut être d'intérêt dans le cas où l'on souhaite obtenir une Fie production de vésicules non chargées suivie d'une rine production de vésicules extracellulaire chargées dudit agent thérapeutique ou d'imagerie, et ce dans le cadre de la mise en place d'un système fluidique avec une collecte du milieu liquide 5 en continu. De manière surprenante, l'écoulement qui permet aux cellules productrices 6 de produire des vésicules extracellulaires permet également et simultanément de charger l'agent thérapeutique ou d'imagerie dans les cellules productrices 6 et par conséquent produire lesdites vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient 4 14 chargé de l'agent thérapeutique et/ou d'imagerie. Alternativement, l'étape de chargement dudit agent thérapeutique ou d'imagerie est simultanée à l'étape de production de vésicules extracellulaires. [0057] Préférentiellement les vésicules extracellulaires (EV) en sortie 9 du récipient 4 com- prennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d'un agent thérapeutique ou d'imagerie et de vésicules extracellulaires non chargées d'un agent thérapeutique ou d'imagerie. [0058] Exemple de production des vésicules extracellulaires EV avec chargement d'agent thérapeutique ou agent d'imagerie [0059] Les vésicules extracellulaires EV sont produites dans un récipient 4 contenant un milieu liquide 5, par exemple sans sérum, des cellules productrices 6. Le milieu utilisé avant la production pour la culture des cellules productrices 6 comprenant du sérum et des agents thérapeutiques et/ou d'imagerie, on lave trois à quatre fois le récipient 4 avec du milieu liquide S DMEM sans sérum, chaque lavage correspondant par exemple à un volume d'environ 400 mL. On commande ensuite l'agitation du milieu liquide 5 par l'agitateur 7 de manière à entraîner un écoulement turbulent dans le récipient 4. L'agitation est préférentiellement réglée de manière à commander un écoulement du milieu liquide 5 dans lequel la longueur de Kolmogorov LK est inférieure ou égale à 50 !lm et préférentiellement à 40 p.m. L'agitation du milieu liquide 5 est commandée au moins pendant 20 minutes, préférentiellement pendant plus d'une heure, et préférentiellement pendant plus de deux heures. Le chargement et la production de vésicules extracellulaires EV chargées peu(ven)t être mesuré(s) pendant la production. A cet effet, l'agitation peut être momentanément interrompue. On laisse sédimenter et/ou on centrifuge les cellules productrices 6 au fond du récipient 4, puis on prélève un échantillon de milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV. On réalise une centrifugation de l'échantillon à 2000 G pendant 10 minutes, de manière à éliminer les débris cellulaires Le surnageant est analysé par une méthode de suivi individuel de particules (ou NTA, acronyme anglais de Nanoparticle Tracking Analysis) de manière à compter le nombre de vésicules extracellulaires EV et d'en déduire la concentration en vésicules extracellulaires EV des échantillons. On peut vérifier que la concentration en vésicules extracellulaires EV au début de l'agitation est proche de zéro ou négligeable. [0060] Les vésicules extracellulaires EV produites peuvent également être observées et/ou comptées par cryo-microscopie électronique à transmission. A cet effet, une goutte de 2,7 1iL de solution comprenant des vésicules extracellulaires EV est déposée sur une grille adaptée à la cryo-microscopie, puis plongée dans l'éthane liquide, entraînant une congélation quasi-instantanée de ladite goutte, évitant la formation de cristaux de glace. La grille supportant les vésicules extracellulaires EV est introduite dans le mi- croscopc et les vésicules extracellulaires EV sont observées à une température de l'ordre de -170°C. [0061] Séparation des vésicules extracellulaires [0062] Les vésicules extracellulaires EV chargées et produites dans le récipient 4 sont sus- ceptibles d'être extraites du récipient 4 par la sortie 9 du récipient 4, suspendues dans du milieu liquide 5. Un filtre 18 peut être agencé à la sortie 9 de manière à filtrer les cellules productrices 6 et les débris cellulaires lors de l'extraction de vésicules extracellulaires EV du récipient 4. Une connectique 13 est fluidiquement reliée à la sortie 9, permettant le transport du milieu liquide 5 comprenant les vésicules extracellulaires EV produites. [0063] Le système fluidique 1 peut comprendre un séparateur 15 de vésicules extracel- lulaires EV. Le séparateur 15 comprend une entrée du séparateur 10, dans laquelle le milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV issu du récipient 4 peut être acheminé de manière directe ou indirecte. Le séparateur 15 peut également comprendre une première sortie 11 du séparateur, par laquelle le milieu liquide 5 est susceptible de sortir du séparateur 15 avec une concentration en vésicules extracellulaires EV plus petite qu'en entrée 10 du séparateur 15, voire sensiblement nulle. Le séparateur 15 peut également comprendre une deuxième sortie 12 du séparateur 15, par laquelle le milieu liquide 5 est susceptible de sortir du séparateur 15 avec une concentration en vésicules extracellulaires EV plus élevée qu'en entrée 10 du séparateur 15. [0064] De manière générale, le séparateur 15 de vésicules extracellulaires EV peut être relié fluidiquement au récipient 4 de manière à être susceptible de réintroduire un milieu liquide 5 appauvri en vésicules EV dans le récipient 4, par exemple par l'entrée 8 du récipient 4. Ainsi, la production et/ou l'extraction de vésicules extracellulaires EV chargées peu(ven)t être réalisée(s) de manière continue, à volume de milieu liquide 5 sensiblement constant dans le récipient 4. Selon un mode de réalisation alternatif, le système fluidique ne comprend pas de séparateur 15 de vésicules extracellulaires EV ou le système fluidique comprend un séparateur 15 de vésicules extracellulaires EV pouvant être relié fluidiquement ou non, par exemple par l'intermédiaire d'un moyen de fermeture dudit séparateur 15, au récipient 4. Ainsi, la production et/ou l'extraction de vésicules extracellulaires EV chargées peu(ven)t être réalisée(s) de manière discontinue ou continu en fonction de l'ouverture ou fermeture du moyen de fermeture disposé en amont du séparateur 15. [0065] Dans l'exemple de réalisation d'un système fluidique 1 illustré dans la figure 1 ou 2, le milieu liquide 5 peut être extrait du récipient 4 par une première pompe 16, via une connectique 13, de manière à transporter le milieu liquide 5 dans un collecteur 19. Une autre première pompe 16 permet d'acheminer le milieu liquide 5 contenu dans le 16 collecteur 19 à l'entrée 10 du séparateur 15, via une autre connectique. La première sortie 11 du séparateur 15 est reliée au récipient 4 via une connectique, de manière à réintroduire du milieu liquide 5 appauvri en vésicules extracellulaires EV dans le récipient 4. La deuxième sortie 12 du séparateur 15 est reliée au collecteur 19 via une connectique, de manière à enrichir le milieu liquide 5 contenu dans le collecteur 19 en vésicules extracellulaires EV. Dans une variante, l'entrée 10 du séparateur 15 peut être directement reliée à la sortie 9 du récipient 4 (ou par l'intermédiaire d'une première pompe 16). La première sortie 11 du séparateur 15 est reliée au récipient 4 et la deuxième sortie 12 du séparateur 15 est reliée au collecteur 19. Plusieurs séparateurs peuvent également être disposés en série pour faire varier le degré de séparation en vésicules extracellulaires EV dans le milieu liquide 5, et/ou en parallèle pour adapter le débit de milieu liquide 5 dans chaque séparateur 15 au débit d'une première pompe 16. [0066] Influence de l'agitation sur le chargement des vésicules extracellulaires EV [0067] La figure 3 illustre la distribution de taille des EVs obtenues par NTA (A) et l'analyse morphologique par cryo-TEM (B). La répartition de la taille des EVs déclenchés par la turbulence provenant des HUVEC a été analysée par NTA et cryoTEM (Figure 3) montrant la forme des vésicules et la plage de taille type des EVs polydispersés (C). Les résultats montrent que les EVs déclenchées par la turbulence, obtenus à une longueur de Kolmogorov de 35 prn affichaient une plage de taille classique (100 à 400 nm). La taille moyenne des EVs étaient respectivement de 236 nm et de 200 nm. La présence de mTHPC dans la fraction des EVs isolés est démontrée par fluorométrie avec un pique d'émission vers 650 nm caractéristique de cette molécule (suite à excitation vers 400-410 nm) (Figure 3 (C)). [0068] La quantification de mTHPC a été effectuée pour les échantillons d'EVs produits par des cellules productrices incubées avec 100 RM mTHPC sous agitation. Des échantillons d'EVs purifiés (EV) obtenus à une longueur de 100 et 35 in Kolmogorov contenaient une concentration mTHPC de 1,3 mM et 7,8 rnM, respectivement, ce qui signifie une augmentation de plus de 5 fois de la charge d'EVs avec le mTHPC. Lorsqu'on compare la quantité d'EV obtenue à 35 'lm à 100 pm, on obtient une augmentation de 10 fois, attestant l'effet de la stimulation de la turbulence pour déclencher la libération des EVs. Des expériences de chargement ont été effectuées à une longueur de 100 et 35 in Kolmogorov afin de déterminer l'effet de la turbulence sur l'internalisation des agents d'intérêt sur les cellules productrices et par la suite sur les EVs libérées. Afin d'établir une comparaison à une quantité équivalente d'EVs, l'étape de chargement à 100 rama été suivie d'un lavage et d'une vésiculation à 35 pm de longueur Kolmogorov. [0069] La figure 4 illustre la biodistribution d'une formulation liposomale de la mTHPC (A et B) et de mTHPC-EV (C et D) en fonction de l'intensité de la fluorescence dans des 17 tissus sélectionnés en fonction du temps après injection intraveineuse (0,3 mg/kg de l'agent d'intérêt) chez des souris porteuses de tumeurs HT29. Le devenir des EVs mTHPC à une longueur de Kolmogorov de 35 pm a été étudié dans un modèle tumoral de souris. La biodistribution à la suite d'une administration intraveineuse a été comparée à une formulation liposomale de la mTHPC (une formulation liposomique mTHPC) en tirant parti des propriétés d'imagerie du médicament. Les données sur la biodistribution (Figure 4) indiquent que les EVs mTHPC ont atteint une concentration maximale dans la tumeur plus rapidement (entre 6 et 15 h après l'injection) que la formulation liposomale de la mTHPC (entre 24 et 48 h après l'injection). L'absorption pulmonaire était plus élevée pour les EVs mTHPC que pour la formulation liposomale de la mTHPC. On a observé une absorption dans le foie aussi élevée pour les EVs mTHPC et la formulation liposomale de la mTHPC. [0070] La figure 5 illustre la concentration plasmatique en mTHPC exprimée en fonction du temps après l'injection intraveineuse de la formulation liposomale de la mTHPC ou de mTHPC-EV (0,3 mg / kg de mTHPC) chez des souris porteuses de tumeurs HT29. Une étude pharmacocinétique a révélé une diminution du mTHPC dans la circulation après l'injection de la formulation liposomale de la mTHPC après un pic de 30 minutes après l'injection (Figure 5). À l'inverse, les concentrations sanguines de mTHPC ont augmenté étonnamment avec un pic à 6 h après l'injection. La diminution des concentrations plasmatiques de [1-ITU-PC à près de 0,2 ng/ml a atteint 6 h et 24 h après l'injection de la formulation liposomale de la mTHPC et mTHPC, respectivement. [0071] La figure 6 illustre des diagrammes de Kaplan-Meier du retard de croissance tumorale HT29 après traitement avec du mTHPC libre; la formulation liposomale de la mTHPC et mTHPC-EVs avec activation laser du médicament (thérapie photo-dynamique, thérapies tridimensionnelles), comparés aux mêmes groupes sans activation laser (contrôle, lignes en pointillés). Les inventeurs ont comparé l'effet thérapeutique des EVs mTHPC, de la formulation liposomale de la mTHPC et de mTHPC libre en termes de croissance de la tumeur, 90 jours après le traitement. Les diagrammes de Kaplan-Meier montrent que, sans activation médicamenteuse induite par laser, le mTHPC EV, la formulation liposomale de la mTHPC et le mTHPC libre avaient le même effet thérapeutique. Toutefois, la thérapie photodynamique (TDP) pour les EVs mTHPC suivie de l'activation laser a permis d'obtenir un effet thérapeutique amélioré par rapport à la formulation liposomale de la mTHPC activée par laser et au mTHPC libre. Les résultats montrent que 0 % des tumeurs témoins ou du groupe traité par le TDP de type formulation liposomale de la mTHPC, ainsi que 20 % des tumeurs traitées par le TDP mTHPC, affichaient une croissance 10 fois plus élevée, tandis que cette valeur était de 33 % pour le groupe traité par le TDP de EV mTHPC au jour 90 (Figure 6). 18 19