FR 3089094 A1 20200605 FR 1872157 A 20181130 Description Titre de l'invention : Protéine de légumineuse soluble Domaine technique [0001] La présente invention concerne une protéine de légumineuse ayant un faible degré d'hydrolyse et une excellente solubilité à pH acide, son procédé de préparation ainsi que l'utilisation de cette protéine, notamment dans une composition alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique. Technique antérieure [0002] Les besoins quotidiens humains en protéines sont compris entre 12 et 20% de la ration alimentaire. Ces protéines sont fournies aussi bien par des produits d'origine animale (viandes, poissons, oeufs, produits laitiers) que par des aliments végétaux (céréales, légumineuses, algues). [0003] Cependant, dans les pays industrialisés, les apports en protéines sont majoritairement sous la forme dc protéines d'origine animale. Or, dc nombreuses études démontrent qu'une consommation excessive de protéines d'origine animale au détriment des protéines végétales est une des causes d'augmentation de cancers et maladies cardio-vasculaires. [0004] Par ailleurs, les protéines animales présentent beaucoup de désavantages, tant sur le plan de leur allergénicité, concernant notamment les protéines issues du lait ou des oeufs, que sur le plan environnemental en relation avec les méfaits dc l'élevage intensif [0005] Ainsi, il existe une demande croissante des industriels pour des composés d'origine végétale possédant des propriétés nutritionnelles et fonctionnelles intéressantes sans pour autant présenter les inconvénients dc composés d'origine animale. [0006] Depuis les années 70, le pois est la légumineuse à graines qui s'est le plus dé- veloppée en Europe, majoritairement en France, comme ressource protéique alternative aux protéines animales à destination de l'alimentation animale et humaine. Le pois contient environ 27 % en poids dc matières protéiques. Le terme « pois » est ici considéré dans son acception la plus large et inclut en particulier toutes les variétés sauvages de « pois lisse » (« smooth pea »), et toutes les variétés mutantes de « pois lisse » et de « pois ridé » (« wrinkled pea »), et ce quelles que soient les utilisations auxquelles on destine généralement lesdites variétés (alimentation humaine, nutrition animale et/ou autres utilisations). [0007] La protéine de pois, majoritairement de la globuline de pois, est extraite et valorisée industriellement depuis bon nombre d'années. On peut citer comme exemple de procédé d'extraction de la protéine de pois le brevet EP1400537. Dans ce procédé, la 2 graine est broyée en absence d'eau (procédé dit dc « broyage à sec ») afin d'obtenir une farine. Cette farine sera ensuite mise en suspension dans de l'eau afin d'en extraire la protéine. [0008] Hélas, cette protéine est connue pour être peu soluble, en particulier à pH acide. Par exemple, l'article A. C. Y. Lam, A. Can Karaca, R. T. Tyler & M. T. Nickel-son (2018) « Pca protein isolates: Structure, extraction, and functionality, », Food Reviews International, 34:2, 126-147décrit que la solubilité d'isolats de protéines de pois est minimale autour de son pH isoélectrique, situé autour de 4,5. Les solubilités d'isolats de protéines dc pois commerciaux ne dépassent pas 20% entre pH 4 et pH 5. [0009] Il est du mérite de la Demanderesse d'avoir déjà précédemment proposé une solution pour améliorer cette solubilité par la demande de brevet W02011124862. Celle-ci propose de réaliser un traitement thermique précis permettant d'améliorer les propriétés fonctionnelles des protéines végétales, en particulier la solubilité. Cependant, cette solubilité est mesurée à pH neutre (7,5) et celle-ci est toujours inférieure à 20% à pH acide (entre 4 et 5). [0010] L'hydrolyse, acide et/ou enzymatique, des protéines est un procédé bien connu visant à hydrolyser les liaisons peptidiques et donc réduire le degré de polymérisation des protéines. Il est bien connu de l'homme du métier que plus la taille moyenne des protéines est faible, plus leur solubilité augmente. L'hydrolyse d'une protéine permet donc d'augmenter sa solubilité. Cependant, avec l'hydrolyse, la protéine va également perdre d'autres fonctionnalités telles que sa viscosité ou bien son pouvoir émulsifiant. L'article Poonam R. Bajaj, Kanishka Bhunia, Leslie Kleiner, Helen S. Joyner (Melito), Denise Smith, Girish Ganjyal & Shyam S. Sablani (2017) Improving functional properties of pea protein isolate for microencapsulation of flaxseed oil, Journal of Microencapsulation, 34:2, 218-230, décrit des hydrolyses enzymatiques réalisées avec différentes protéases sur un isolat de protéines de pois commercial. Cet article confirme que l'hydrolyse permet d'augmenter la solubilité. Cependant, à l'instar de W02011124862, celle-ci est mesurée à pH neutre (7,4 qui est le pH de l'hydrolyse). En revanche, la solubilité à pH acide reste inférieure à 30%. [0011] Il est possible d'envisager l'utilisation d'autres fractions protéiques telles les albumines. Cependant, si celles-ci sont effectivement plus solubles à pH acide, elles possèdent également des propriétés fonctionnelles, en particulier un pouvoir moussant très important, qui peuvent être indésirables dans certaines applications industrielles. [0012] Il est donc toujours d'intérêt pour l'homme de l'art d'obtenir un isolat de protéine de légumineuse, en particulier une protéine de pois, dont le degré d'hydrolyse est faible, par exemple inférieur à 15%, mais dont la solubilité à pH acide, par exemple à pH 5, est supérieure à 80%. [0013] Il est du mérite de la Demanderesse d'avoir mis au point une protéine de lé- 3 gumineuse répondant à ces critères. Exposé de l'invention [0014] La présente invention concerne en premier lieu une protéine de légumineuse contenant plus (le 90% en poids (le globulines par rapport au poids total (le protéines, ladite protéine de légumineuse présentant : - une solubilité à pH 5 supérieure à 80%, préférentiellement supérieure à 85%, encore plus préférentiellement supérieure à 90% ; et - un degré d'hydrolyse inférieur à 15%, préférentiellement inférieur à 12%. [0015] La présente invention concerne en second lieu un procédé de préparation de la protéine de légumineuse selon l'invention comprenant les étapes suivantes : - mise en oeuvre d'un isolat de protéine de légumineuse en solution aqueuse ; - hydrolyse de l'isolat par ajout d'une enzyme serine protéase chymotrypsin-like de manière à obtenir une protéine de légumineuse hydrolysée présentant un degré d'hydrolyse inférieur à 15%, préférentiellement inférieur à 12% ; - optionnellernent inhibition de l'enzyme ; - optionnellernent séchage de la protéine de légumineuse hydrolysée. [0016] Enfin, la présente invention concerne également l'utilisation de la protéine de lé- gumineuse selon l'invention pour la préparation d'une composition alimentaire humaine ou animale, d'une composition cosmétique ou d'une composition pharmaceutique. [0017] L'invention sera mieux comprise avec la description détaillée décrite ci-après. Description détaillée de l'invention 10018] La protéine de légumineuse de la présente invention peut notamment être une com- position comprenant un mélange de protéines extraites d'une légumineuse. 10019] La protéine de légumineuse selon l'invention contient plus de 90% en poids de globulines par rapport au poids total des protéines. 10020] Le terme « protéine » doit se comprendre dans la présente demande comme les ma- cromolécules formées d'une ou de plusieurs chaînes polypeptidiques constituées de l'enchaînement de résidus d'acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Dans le cadre particulier des protéines de pois, la présente invention concerne plus particulièrement les globulines (environ 50-60% des protéines du pois) et les albumines (20-25%). Les globulines de pois se subdivisent principalement en trois sous-familles : les légumines, les vicilines et les convicilines. 10021] Par « légumineuse », on comprendra dans la présente demande la famille de plantes dicotylédones de l'ordre des Fabules. C'est l'une des plus importantes familles de plantes à fleurs, la troisième après les Orchidaceae et les Asteraceae par le nombre d'espèces. Elle compte environ 765 genres regroupant plus de 19 500 espèces. Plusieurs légumineuses sont d'importantes plantes cultivées parmi lesquelles le soja, les haricots, les pois, le pois chiche, la féverole, l'arachide, la lentille cultivée, la luzerne cultivée, différents trèfles, les fèves, le caroubier, la réglisse. [0022] Les protéines extraites de ces légumineuses appartiennent majoritairement aux sous- groupes des globulines et des albumines. Dans la présente invention, la protéine de légumineuse est majoritairement constituée de globulines, en particulier elle contient plus de 90% en poids de globulines par rapport au poids total des protéines. Les globulines peuvent être distinguées des albumines par diverses méthodes bien connues de l'homme du métier, notamment par leur solubilité dans l'eau, les albumines étant solubles dans l'eau pure alors que les globulines sont uniquement solubles dans l'eau salée. On peut également identifier les albumines et globulines présentes dans un mélange par électrophorèse ou chromatographie. Une méthode préférée est décrite dans l'article « Peptide and protcin molccular wcight détermination hy clectrophoresis using a high-molarity tris buffer system without urca. » Fling SP, Gregerson DS, Anal. Biochem. 1986;155:83-88.La protéine de légumineuse selon l'invention contient plus de 90% en poids de globulines par rapport au poids total des protéines. [0023] La protéine de légumineuse selon l'invention présente une solubilité à pH 5 su- périeure à 80%, préférentiellement supérieure à 85%, encore plus préférentiellement supérieure à 90%. [0024] Selon un mode de réalisation particulier, la protéine de légumineuse selon l'invention peut également présenter une solubilité à pH 7 supérieure à 80%, préférentiellement supérieure à 85%, encore plus préférentiellement supérieure à 90%. [0025] La solubilité peut être mesurée par dilution de la protéine de légumineuse dans de l'eau distillée, la centrifugation du mélange et l'analyse du surnageant, selon le Test de solubilité décrit ci-après. [0026] La protéine de légumineuse selon l'invention présente un degré d'hydrolyse inférieur à 15%, préférentiellement inférieur à 12%. [0027] Le degré d'hydrolyse peut être déterminé en mesurant la teneur en azote aminé libre par rapport à l'azote total selon le Test de degré d'hydrolyse décrit ci-après. [0028] De manière préférée, la protéine de légumineuse est une protéine de féverole ou une protéine de pois. La protéine de pois est particulièrement préférée. [0029] Le terme « pois » étant ici considéré dans son acception la plus large et incluant en particulier toutes les variétés de « pois lisse » (« smooth pea ») et « de pois ridés » wrinkled pea »), et toutes les variétés mutantes de « pois lisse » et de « pois ridé » et ce, quelles que soient les utilisations auxquelles on destine généralement lesdites variétés (alimentation humaine, nutrition animale et/ou autres utilisations). [0030] Le terme « pois » dans la présente demande inclut les variétés de pois appartenant au genre Pisum et plus particulièrement aux espèces sativum et aestivum. Lesdites variétés mutantes sont notamment celles dénommées « mutants r », « mutants rb mutants rug 3 », « mutants rug 4 », « mutants rug 5 » et « mutants lam » tels que décrits dans l'article de C-L HEYDLEY et al. intitulé « Developing nove' pca starches Proceedings of the Symposium of the Industrial Biochcmistry and Biotechnology Group of the Biochemical Society, 1996, pp. 77-87. [0031] De manière encore plus préférée, la protéine de légumineuse selon l'invention est un isolat dont la teneur en protéines est supérieure à 80% en poids par rapport au poids de matière sèche. [0032] Par « isolat », on entend dans la présente demande une composition comprenant une teneur en protéines supérieure à 80%, préférentiellement supérieure à 90%, en poids par rapport au poids de matière sèche de la composition. [0033] La teneur en protéine est mesurée par toute technique bien connue de l'homme du métier. De préférence, on réalise un dosage de l'azote total (en %/brut) et on multiplie le résultat par le coefficient 6,25. Cette méthodologie bien connue dans le domaine des protéines végétales se hase sur le constat que les protéines contiennent en moyenne 16% d'azote. Toute méthode de dosage de la matière sèche bien connue de l'homme du métier peut être également utilisée. [0034] La protéine de légumineuse de la présent invention peut notamment être obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes : - mise en oeuvre d'un isolat de protéine de légumineuse en solution aqueuse ; - hydrolyse de l'isolat par ajout d'une enzyme sérine protéase chymotrypsin-like de manière à obtenir un degré d'hydrolyse inférieur à 15%, préférentiellement inférieur à 12%; - optionnellement inhibition de l'enzyme ; - optionnellement séchage de la protéine de légumineuse hydrolysée. [0035] Selon un mode de réalisation préféré, l'isolat de protéine de légumineuse est choisi entre un isolat de protéine de féverole ou un isolat de protéine de pois. L'isolat de protéine de pois est particulièrement préféré. [0036] L'isolat de protéine de légumineuse mis en oeuvre peut provenir de plusieurs sources, qu'elles soient commerciales ou à façon, mais l'isolat ne doit pas avoir subi d'hydrolyse préalable, ayant réduit la taille de ses molécules protéiques constitutives. De manière préférée, l'isolat sera obtenu en réalisant les procédés décrits dans les brevets EP1400537 ou EP1909593 de la Demanderesse. [0037] De manière préférée, la solution aqueuse de protéine de légumineuse comprend de 5% à 20%, préférentiellement de 8% à 12% en poids de matière sèche par rapport au poids de la solution aqueuse. [0038] On ajoute ensuite à la solution ainsi préparée une enzyme de type sérine protéase chymotrypsin-like de manière à obtenir une protéine de légumineuse hydrolysée 6 présentant un degré d'hydrolyse inférieur à 15%, préférentiellement inférieur à 12%. [0039] Par « proteus° », on entend dans la présente demande une enzyme apte à cliver des protéines ou des peptides en hydrolysant leurs liaisons peptidiques. Par « sérine protéase », on entend dans la présente demande les protéases ayant un site actif contenant un résidu de sérine qui joue un rôle essentiel dans la catalyse. Les différentes serines protéases sont rassemblées dans la classification internationale dans la famille EC 3.4.21 [0040] La serine protéase utilisée dans la présente invention est chymotrypsin-like. Par « chymotrypsin-like », on entend une sérine protéase présentant un mode d'action caractérisé en ce que le clivage des liaisons peptidiques se situe spécifiquement après les acides aminés aromatiques et hydrophobes tels que la tyrosine, la phénylalanine ou encore la leucine. [0041] La quantité en poids d'enzyme nécessaire à ajouter pour obtenir le degré d'hydrolyse souhaitée est quantifiée par rapport au poids de protéines dans l'isolat mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention. Selon un mode de réalisation particulier, la quantité d'enzyme ajoutée est supérieure à 0,2%, préférentiellement de 0,25% à 0,50%, en poids d'enzyme par rapport au poids de protéines dans l'isolat. On peut également ajouter une quantité d'enzyme supérieure à 0,5%. On obtiendra alors donnera un résultat identique mais dans un temps plus court. L'homme du métier saura ajuster la quantité d'enzyme pour atteindre un temps réactionnel désiré. [0042] Après ajout de l'enzyme, la réaction d'hydrolyse peut être réalisée sous agitation. Selon un mode de réalisation particulier, l'hydrolyse est réalisée pendant une durée de 30 min à 2 hem-es, de préférence environ une heure. Comme décrit ci-dessus, ce temps peut être réduit en augmentant la quantité d'enzyme. Cet ajustement sera accessible de manière évidente pour l'homme du métier. [0043] Selon un mode de réalisation particulier, l'hydrolyse est réalisée à une température de 45 à 65°C, de préférence de 50 à 60°C, plus préférentiellement environ 55°C. Le chauffage peut être réalisé à l'aide de toute installation bien connue de l'homme de l'art telle qu'un échangeur thermique immergé. De préférence, la temperature est ajustée de 45 à 65°C avant l'ajout de l'enzyme et est ensuite régulée à +/- 2°C pendant la durée de l'hydrolyse. [0044] Selon un mode de réalisation particulier, l'hydrolyse est réalisée à un pH de 8 à 10, préférentiellement environ 9. Le pH peut être ajusté par ajout d'acide et/ou de base, par exemple de soude ou d'acide chlorhydrique. L'utilisation d'une solution tampon, bien que non nécessaire, est envisageable. De préférence, le pH est ajusté de 8 à 10 avant l'ajout de l'enzyme et est ensuite régulé à +/- 0,5 unités pH pendant la durée de l'hydrolyse. [0045] Optionnellement, une fois la réaction d'hydrolyse achevée, l'enzyme peut être 7 inhibée. Pour ce faire, par exemple, le milieu réactionnel peut être ajusté à pH 7 et à 90°C pendant 5 min. [0046] Optionnellement, la protéine de légumineuse hydrolysée peut être séchée par tout procédé bien connu de séchage tel que l'atomisation (simple ou multiple effets) ou la lyophilisation. Ce séchage peut éventuellement être précédé d'une étape de filtration permettant d'éliminer des particules solides indésirables. [0047] La protéine de légumineuse de l'invention peut être utilisée pour la préparation d'une composition alimentaire humaine ou animale, d'une composition cosmétique ou d'une composition pharmaceutique. [0048] En effet, du fait de son excellente solubilité à pH acide, une telle protéine dc lé- gumineuse est d'un intérêt certain dans de nombreuses applications industrielles, en particulier dans l'industrie agroalimentaire, cosmétique ou pharmaceutique, et en nutrition animale. [0049] Selon un mode de réalisation particulier, la protéine de légumineuse selon l'invention est utilisée pour la préparation d'une boisson acide, par exemple un soda. [0050] L'incorporation de la protéine selon l'invention dans une boisson acide est particu- lièrement avantageuse. En effet, contrairement à une protéine standard, celle-ci restera solubilisée et n'aura pas tendance à précipiter dans le temps de stockage. Ainsi l'utilisation de la protéine selon l'invention permet d'obtenir une boisson acide stable au stockage. [0051] Par « composition alimentaire » on entend une composition destinée à l'alimentation humaine ou animale. Le terme composition alimentaire englobe les produits alimentaires, les compléments alimentaires et les boissons. Par « composition cosmétique » on entend une composition destinée à un usage cosmétique. Par « composition pharmaceutique» on entend une composition destinée à un usage thérapeutique. [0052] L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants. Exemples [0053] Procédés dc test [0054] Test de solubilité [0055] Dans un bécher de 400 mL, on introduit 150 g d'eau distillée à une température de 20°C +/- 2°C sous agitation avec un barreau magnétique et on ajoute précisément 5 g d'échantillon de protéine de légumineuse à tester. Si besoin, on ajuste le pH à la valeur souhaitée avec NaOH 0,1 N. On complète le contenu en eau pour atteindre 200 g d'eau. On mélange pendant 30 minutes à 1000 rpm et on centrifuge pendant 15 minutes à 3000 g. On collecte 25 g du surnageant que l'on introduit dans un cristallisoir préalablement séché et taré. On place le cristallisoir dans une étuve à 103°C +/- 2°C pendant 1 heure. On le place ensuite dans un dessiccateur (avec agent 8 déshydratant) pour refroidir à température ambiante et on le pèse. [0056] La solubilité correspond au contenu en matières sèches solubles, exprimé en % en poids par rapport au poids de l'échantillon. La solubilité est calculée avec la formule suivante : [0057] [Math.1] rn 1 - 2 ) (200+P) % solubilité P1 x P x 100 où: P = poids, en g, de l'échantillon = 5 g ml = poids, en g, du cristallisoir après séchage m2 = poids, en g, du cristallisoir vide PI = poids, en g, de l'échantillon collecté = 25 g 100581 Test de degré d'hydrolyse 100591 On détermine tout d'abord la teneur en azote aminé (NH2 libre) sur l'échantillon de protéines selon l'invention avec le kit MEGAZYME (référence K-PANOPA). On détermine également la teneur en azote protéique (azote total) de l'échantillon. On peut alors calculer le degré d'hydrolyse. 100601 Détermination de la teneur en azote aminé : 100611 Les groupes « azote aminé » des acides aminés libres de l'échantillon réagissent avec le N-acétyl-L-cystéine et l'OPhthaldialdéhyde (OPA) pour former des dérivés d'isoindole. 100621 La quantité de dérivé d' isoindole formée au cours de cette réaction est stoechio- métrique avec la quantité d'azote aminé libre. C'est le dérivé d'isoindole qui est mesuré par l'augmentation de l'absorhance à 340 nm. 100631 Dans un pécher de 100 mL, on introduit une prise d'essai P*, exactement pesée, de l'échantillon à analyser. Cette prise d'essai sera de 0,5 à 5,0 g en fonction de la teneur en azote aminé de l'échantillon. On ajoute environ 50 mL d'eau distillée, on homogénéise et on transvase dans une fiole jaugée de 100 mL. On ajoute 5 mL de dodécyle sulfate de sodium (SDS) à 20% et on complète avec de l'eau distillée pour atteindre un volume de 100 mL. On agite pendant 15 minutes avec un agitateur magnétique à 1000 rpm. On prépare une solution n'1 en dissolvant un comprimé du flacon 1 du kit Megazyme dans 3 mL d'eau distillée et on agite jusqu'à dissolution complète. Il faut prévoir un comprimé par essai. La solution n°1 est préparée extemporanément. [0064] On prépare un blanc, un standard et un échantillon directement dans les cuves du spectrophotomètre dans les conditions suivantes : - blanc : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 R1 d'eau distillée - standard : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 µl du flacon 3 du kit 9 Megazymc - échantillon : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 pl de la préparation de l'échantillon. [0065] On mélange le contenu de chaque cuve et on lit la mesure d'absorbante (A1) des solutions après 2 mn environ au spectrophotomètre à 340 nm (spectrophotomètre équipé de cuves de 1,0 cm de trajet optique, pouvant mesurer à une longueur d'onde de 340 nm, et vérifié selon le mode opératoire décrit dans le manuel technique du constructeur qui s'y rapporte). [0066] On amorce ensuite les réactions immédiatement en ajoutant 100 pl de la solution n°2 qui correspond à la solution d'OPA du flacon 2 du kit Megazymc dans chaque cuve de spectrophotomètre. [0067] On mélange le contenu de chaque cuve et on les place environ 20 minutes dans l'obscurité. [0068] On lit ensuite la mesure d'absorbante A2 du blanc, du standard et de l'échantillon au spectrophotomètre à 340 nm. [0069] La teneur en azote aminé libre, exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids du produit, est donnée par la formule suivante : [0070] [Math.2] ( A A ech- A Able) x 3,15 x 14,01x V, 100 azote aminé - 6803 x 0,05 x m x 1000 [0071] [Math.3] % azote aminé - ( AechAAblc) x12,974 x 1000 100721 AAech =Aech2 - Aechl AAblc =Ablc2 - Ablc l Aech2 = absorbance de l'échantillon après ajout de la solution n°2 Aechl = absorbance de l'échantillon après ajout de la solution n°1 Ablc2 = absorbance du blanc après ajout de la solution n°2 Ablcl = absorbance du blanc après ajout de la solution n°1 V = volume de la fiole m = masse de la prise d'essai en g 6803 = coefficient d'extinction du dérivé d'isoindole à 340 nm (en L.mol-Lcm-1). 14,01 = masse molaire de l'azote (en g.mol-1) 3,15 = volume final dans la cuve (en mL) 0,05 = prise d'essai dans la cuve (en mL) [0073] Détermination de la teneur en azote protéique : [0074] La teneur d'azote protéique est déterminée selon la méthode de DUMAS selon la norme ISO 16634 (2016). Elle est exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids du produit. [0075] Calcul du degré d'hydrolyse [0076] Le degré d'hydrolyse (DH) est calculé avec la formule suivante: [0077] [Math.4] DI-1% azote aminé x100 % azote protéique [0078] Exemple 1 : Réalisation d'un isolat de protéine selon l'invention [0079] On utilise un isolat de protéines de pois commercial NUTRALYSO S85F produit par la société ROQUETTE. L'isolat comprend 83% en poids de protéines par rapport au poids de matière sèche. 100801 On introduit 150 g de cet isolat avec 1290 g d'eau potable à 20°C dans un réacteur agité d'un volume d'1,5 litres. On ajuste sa température à 55°C à l'aide d'un système de tubulures internes plongeantes, raccordées à un système de régulation de la température. On rectifie le pH à 9 à l'aide de solutions de HC1 et NaOH 1M et d'un pH-mètre convenablement étalonné. 100811 On introduit ensuite 0,3 g d'enzyme Formea® CTL600 (serine protéase chy- motrypsin-like) de la société NOVOZYMES 100821 La réaction est contrôlée ainsi pendant 1 heure, sous agitation permanente. 100831 Le pH est ensuite régulé à 7 et la température à 90°C, ce pendant 5 minutes afin d'inhiber l'enzyme. 100841 Le produit est séché par lyophilisation et correspond au « Produit selon l'invention n°1 ». 100851 Exemple 2 : Réalisation d'un second isolat de protéine selon l'invention 100861 Le « Produit selon l'invention n°2 » est obtenu selon l'exemple 1 en utilisant 0,6 g d'enzyme Formea® CTL600 au lieu de 0,3 g. 100871 Exemple 3 : Réalisation d'isolat de protéine hors invention à but comparatif 100881 Les protocoles d'hydrolyse de cet exemple sont dérivés de l'exemple 1 ci-dessus. Les modifications par rapport à l'exemple sont détaillées dans le tableau ci-dessous. La quantité d'enzyme est exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids de protéines dans l'isolai [0089] 11 [Tableaux 1] Essai Enzyme pH températur e (°C) temps (min) quantité enzyme Comp 1 (Bajab Neutrase (B. amyloliquefaciens, P1236-50ML) 7,4 50 120 cf. Bajab 2017) 2017 Comp 2 FERMGEN® 2,5x 3.5 50 60 0,50% Comp 3 Proteinase T 70 60 0,50% Comp 4 SEBDigest F24 P 3 45 60 1,00% Comp 5 SEBDigest F35 P 3 30 60 1,00% Comp 6 SEBDigest B7 P 60 300 1,00% Comp 7 Flavorpro® F75OMDP 55 60 1,00% Comp 8 Formea® TL1200 9,5 55 60 0,50% Comp 9 Sumizyme ACP-G 5 50 60 1,00% Comp 10 Fungal Protease 400 7.3 55 60 0,50% [0090] Il est à noter que les enzymes utilisées dans cet exemple comparatif ne sont pas des sérines protéases chymotrypsin-like. [0091] Exemple 4 : Comparaison des différents produits obtenus 100921 Pour chaque échantillon, on mesure le degré d'hydrolyse (DH), la solubilité à pH 5 et la solubilité à pH 7 selon les tests décrits précédemment.. 100931 Les résultats sont synthétisés dans le tableau ci-dessous 100941 12 [Tablcaux2] Référence échantillon DH (%) Solubilité pH 5 Solubilité pH 7 Produit selon l'invention n°1 10,5 83,6 92,6 Produit selon l'invention n°2 11,5 92,4 94 Comp 2 7 57,4 76 Comp 3 6,9 46 82,5 Comp 4 9 68,7 81,2 Comp 5 8,7 65,7 73,5 Comp 6 11,6 74,8 80,4 Comp 7 9,6 51,8 62,9 Comp 8 10,7 58,6 89 Comp 10 9,3 59,5 68,5 [0095] Il y apparait clairement que seule l'utilisation d'une sérine protéase chymotrypsin- like permet d'obtenir un isolat de protéine de légumineuse, ici le pois, qui présente une solubilité à pH 5 supérieure à 80% et une solubilité à pH 7 supérieure à 80%, tout en ayant un degré d'hydrolyse inférieur à 12. 13 [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6] [Revendication 7] [Revendication 8]