FR 3087538 A1 20200424 FR 1859618 A 20181017 Procédé d'observation d'un échantillon Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est lié à l'observation d'un échantillon, en particulier un échantillon biologique, par imagerie sans lentille, en mettant en oeuvre un algorithme de reconstruction holographique aux performances améliorées. ART ANTERIEUR L'observation d'échantillons, et en particulier des échantillons biologiques, par imagerie sans lentille connaît un développement important depuis ces dix dernières années. Cette technique permet d'observer un échantillon en le disposant entre une source de lumière et un capteur d'image, sans disposer de lentille de grossissement optique entre l'échantillon et le capteur d'image. Ainsi, le capteur d'image collecte une image de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon. Cette image est formée de figures d'interférence entre l'onde lumineuse émise par la source de lumière et transmise par l'échantillon, et des ondes de diffraction, résultant de la diffraction par l'échantillon de l'onde lumineuse émise par la source de lumière. Ces figures d'interférences sont parfois dénommées figures de diffraction, ou désignées par le terme anglais « diffraction pattern ». Le document W02008090330 décrit un dispositif permettant l'observation d'échantillons biologiques, en l'occurrence des cellules, par imagerie sans lentille. Le dispositif permet d'associer, à chaque cellule, une figure d'interférence dont la morphologie permet d'identifier le type de cellule. L'imagerie sans lentille apparaît alors comme une alternative simple, et peu onéreuse, à un microscope classique. De plus, son champ d'observation est nettement plus important que ne peut l'être celui d'un microscope. On comprend alors que les perspectives d'application liées à cette technologie sont importantes. D'une façon générale, l'image formée sur le capteur d'image, comportant des figures d'interférence, peut être traitée par un algorithme de reconstruction holographique, de manière à estimer des propriétés optiques de l'échantillon, par exemple un facteur de transmission ou une phase. De tels algorithmes sont bien connus dans le domaine de la reconstruction holographique. Pour cela, la distance entre l'échantillon et le capteur d'image étant connue, on 2 applique un algorithme de propagation, prenant en compte cette distance, ainsi que la longueur d'onde de l'onde lumineuse émise par la source de lumière. On peut alors reconstituer une image d'une propriété optique de l'échantillon. L'image reconstruite peut, en particulier, être une image complexe de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon, comportant des 5 informations sur les propriétés optiques d'absorption ou de variation de phase de l'échantillon. Mais les algorithmes de reconstruction holographiques peuvent induire un bruit de reconstruction dans l'image reconstruite, désigné par le terme de « twin image ». Cela est essentiellement dû au fait que l'image formée sur le capteur d'image ne comporte pas d'information relative à la phase de l'onde lumineuse atteignant ce capteur. De ce fait, la 10 reconstruction holographique s'effectue sur la base d'une information optique partielle, basée uniquement sur l'intensité de l'onde lumineuse collectée sur le capteur d'image. L'amélioration de la qualité de la reconstruction holographique fait l'objet de nombreux développements, en mettant en oeuvre des algorithmes fréquemment dénommés « Phase retrieval », permettant une estimation de la phase de l'onde lumineuse auquel le capteur 15 d'image est exposé. Un algorithme de reconstruction numérique est par exemple décrit dans US2012/0218379. Des algorithmes de reconstruction ont également été décrits dans W02016189257 ou dans W02017162985. Les inventeurs proposent un procédé d'observation d'un échantillon par une méthode 20 d'imagerie holographique, le procédé comprenant une étape de reconstruction d'une image complexe de l'échantillon. Cette étape de reconstruction permet d'obtenir une image complexe de bonne qualité, donnant des informations sur les propriétés optiques de l'échantillon. EXPOSE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention est un procédé d'observation d'un échantillon, l'échantillon 25 s'étendant selon un plan de l'échantillon définissant des coordonnées radiales, le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière, apte à émettre une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon selon un axe de propagation; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image, d'une image de l'échantillon, formée dans un 30 plan de détection, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le capteur d'image, de telle sorte que l'onde lumineuse incidente subit une différence de trajet optique, parallèlement à l'axe de propagation, en traversant l'échantillon ; 3 c) traitement de l'image acquise par le capteur d'image ; le procédé étant caractérisé en ce que le traitement de l'image acquise comporte les étapes itératives suivantes: i) prise en compte d'un ensemble de vecteurs de paramètres, décrivant l'échantillon, et 5 respectivement définis en plusieurs coordonnées radiales, dans le plan de l'échantillon, chaque vecteur de paramètres étant associé à une coordonnée radiale, et comportant un terme représentatif d'un paramètre optique l'échantillon, au moins un paramètre optique étant une différence de trajet optique induite par l'échantillon à chaque coordonnée radiale; 10 ii) à partir des vecteurs de paramètres, formation d'une image complexe de l'échantillon dans le plan de l'échantillon ; iii) application d'un opérateur de propagation à l'image complexe de l'échantillon formée dans le plan de l'échantillon, pour calculer une image de l'échantillon dans le plan de détection ; 15 iv) comparaison de l'image acquise lors de l'étape b) et de l'image calculée lors de l'étape iii), pour calculer un indicateur de validité; v) mise à jour de l'ensemble des vecteurs de paramètres, de façon à faire tendre l'indicateur de validité vers une valeur prédéterminée ; vi) réitération des étapes ii) à y) en prenant en compte les vecteurs de paramètres estimés 20 lors de l'étape v). L'étape y) peut comporter une détermination d'un gradient de l'indicateur de validité en fonction d'au moins un paramètre, de telle sorte que les vecteurs de paramètres sont mis à jour pour réduire l'indicateur de validité de l'itération suivante. L'étape v) peut mettre en oeuvre un algorithme de type descente de gradient. 25 Chaque vecteur de paramètre peut comporter: - au moins un terme représentatif d'une différence de trajet optique selon l'axe de propagation ; - un terme représentatif de l'absorbance. Selon un mode de réalisation, l'étape y) comporte un calcul d'un critère morphologique à partir 30 des vecteurs de paramètres, le critère morphologique quantifiant un écart des vecteurs de paramètres, décrivant l'échantillon, par rapport à une contrainte morphologique de l'échantillon, de telle sorte que l'indicateur de validité est obtenu à partir d'une combinaison : 4 - d'un critère d'erreur, déterminé à partir d'une comparaison entre l'image acquise lors de l'étape b) et de l'image obtenue lors de l'étape iii) ; - et du critère morphologique. L'indicateur de validité peut être une somme, éventuellement pondérée, du critère d'erreur et 5 du critère morphologique. Selon un mode de réalisation, l'indicateur de validité est une somme pondérée du critère d'erreur et du critère morphologique, la pondération variant entre au moins deux itérations successives. Selon un mode de réalisation : - lors de l'étape b), une image de l'échantillon est acquise dans différentes bandes 10 spectrales ; - au moins un vecteur de paramètres, ou chaque vecteur de paramètres, comporte au moins un paramètre optique défini dans une des bandes spectrales ; le procédé étant tel que : - lors de l'étape iii), l'image complexe de l'échantillon est propagée dans chaque bande 15 spectrale, de façon à calculer, dans chaque bande spectrale, une image de l'échantillon; l'étape iv) comporte une comparaison, dans chaque bande spectrale, de l'image calculée lors de l'étape iii) et de l'image acquise lors de l'étape b) ; - de telle sorte que l'indicateur de validité calculé dans l'étape iv) est calculé à partir des comparaisons effectuées lors de l'étape iv). 20 Selon un mode de réalisation : - lors de premières itérations, un paramètres optique est considéré comme ne variant pas en fonction de la bande spectrale ; - au-delà de premières itérations, le paramètre optique est considéré comme variable en fonction de la bande spectrale. 25 Lors de l'étape iii), le calcul de l'image dans le plan de détection peut notamment comporter une application d'un produit de convolution par un noyau de convolution, le noyau de convolution représentant une étendue spatiale de la source de lumière. Lors de l'étape iii), le calcul de l'image dans le plan de détection peut comporter une intégrale d'une image élémentaire, définie dans une bande spectrale élémentaire, l'intégrale étant 30 calculée pour tenir compte d'une bande spectrale d'émission de la source de lumière. La bande spectrale d'émission est alors formée par une juxtaposition de différentes bandes spectrales élémentaires. Autrement dit, chaque bande spectrale élémentaire forme la bande spectrae Un deuxième objet de l'invention est un dispositif d'observation d'un échantillon comportant : 5 - une source de lumière, configurée pour émettre une onde lumineuse incidente pour illuminer l'échantillon ; - un support d'échantillon, configuré pour recevoir l'échantillon ; - un capteur d'image, configuré pour acquérir une image de l'échantillon lorsque 5 l'échantillon est disposé sur le support d'échantillon ; - un processeur, programmé pour exécuter des instructions permettant de mettre en oeuvre les étapes i) à vi) d'un procédé selon le premier objet de l'invention à partir d'une image acquise par le capteur d'image. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre 10 de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous. FIGURES La figure 1A représente un dispositif permettant une mise en oeuvre de l'invention. La figure 1B représente un exemple de source de lumière pouvant être utilisée dans le dispositif 15 de la figure 1A. La figure 2 montre l'évolution d'une onde lumineuse et illustre le retard induit par une différence de trajet optique. Le retard génère un déphasage de l'onde lumineuse. La figure 3 représente les principales étapes d'un mode de réalisation de l'invention. Les figures 4A à 4E illustrent un exemple de mise en oeuvre de l'invention. 20 La figure 5 montre un autre dispositif permettant une mise en oeuvre de l'invention. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS La figure lA représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est apte à émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse est émise selon 25 une bande spectrale AX, comportant une longueur d'onde X. Cette longueur d'onde peut être une longueur d'onde centrale de ladite bande spectrale. Selon un mode de réalisation, la source de lumière 11 comporte des sources de lumières élémentaires 11f. L'indice j désigne l'indice de la source de lumière élémentaire. Chaque source de lumière émet une onde lumineuse, selon l'axe de propagation Z, dans une bande spectrale 30 3,1- On peut par exemple utiliser une source de lumière 11 comportant trois sources de lumière élémentaire 111, 112,113 comme représenté sur la figure 1B. Les sources élémentaires émettent dans des bandes spectrales différentes les unes des autres, par exemple dans le bleu, 6 dans le vert et dans le rouge. Le recours à une telle source de lumière a été décrit dans W02016189257. L'échantillon 10 est un échantillon que l'on souhaite caractériser. Il peut notamment s'agir d'un milieu 10m comportant des particules 10p. Les particules 10p peuvent être des particules 5 sanguines, par exemple des globules rouges. Il peut également s'agir de cellules, de microorganismes, par exemple des bactéries ou des levures, des microalgues, des microbilles, ou des gouttelettes insolubles dans le milieu liquide, par exemple des nanoparticules lipidiques. De préférence, les particules 10p ont un diamètre, ou sont inscrites dans un diamètre, inférieur à 1 mm, et de préférence inférieure à 100 [lm. Il s'agit de microparticules (diamètre inférieur à 10 1 mm) ou de nanoparticules (diamètre inférieur à 1 pm). Le milieu 10m, dans lequel baignent les particules, peut être un milieu liquide, par exemple une phase liquide d'un liquide corporel, d'un milieu de culture ou d'un liquide prélevé dans l'environnement ou dans un procédé industriel. Il peut également s'agir d'un milieu solide ou ayant la consistance d'un gel, par exemple un substrat de type gélose, propice à la croissance de colonies bactériennes. 15 L'échantillon peut également être un échantillon solide, par exemple une fine lame de tissu biologique, de type lame d'anatomopathologie, ou un extrait sec d'un fluide, par exemple d'un fluide biologique. L'échantillon est de préférence transparent ou suffisamment translucide pour pouvoir permettre la formation d'une image par le capteur d'image. 20 Dans cet exemple, l'échantillon 10 est contenu dans une chambre fluidique 15. La chambre fluidique 15 est par exemple une micro-cuvette, d'utilisation courante dans les dispositifs de type point of care, dans laquelle l'échantillon 10 pénètre, par exemple par capillarité. L'épaisseur e de l'échantillon 10, selon l'axe de propagation varie typiquement entre 20 pm et 1 cm, et est de préférence comprise entre 50 pm et 500 pm, par exemple 150 pm. 25 L'échantillon s'étend selon un plan P10, dit plan de l'échantillon, perpendiculaire à l'axe de propagation. Il est maintenu sur un support 10s. Le plan de l'échantillon est repéré par deux axes orthogonaux X et Y, définissant respectivement des coordonnées x et y. Chaque couple de coordonnée (x, y) correspond à une coordonnée radiale r. Les coordonnées radiales sont définies dans le plan de l'échantillon et dans un plan de détection décrit ci-après. 30 La distance D entre la source de lumière 11 et l'échantillon 10 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. De préférence, la source de lumière, vue 7 par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre l'échantillon et la source de lumière. Ainsi, de préférence, la lumière parvient à l'échantillon sous la forme d'ondes planes, ou pouvant être considérées comme telles. 5 La source de lumière 11 peut être une diode électroluminescente ou une diode laser. Elle peut être associée à diaphragme 18, ou filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5µm et 1 mm, de préférence entre 50 pm et 500 i.tm. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs sous la référence P1505 et son diamètre est de 150 pm. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée 10 face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée face à l'échantillon 10 Le dispositif comporte de préférence un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de la source de lumière 11 par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. La fonction d'un tel 15 diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par la source de lumière élémentaire 11 selon un cône d'angle a, cc étant égal à 30° dans le cas présent. De préférence, l'angle de diffusion cc varie entre 10° et 80°. De préférence, la bande spectrale d'émission 02'. de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur inférieure à 100 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de 20 ladite bande spectrale. Dans la suite du texte, chaque bande spectrale est désignée par une longueur d'onde X représentative de la bande spectrale, par exemple la longueur d'onde centrale. L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et un capteur d'image 16. Ce dernier s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement au plan selon lequel 25 s'étend l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 20° ou 10° étant admise. Le capteur d'image 16 est apte à former une image selon un plan de détection Po. Dans l'exemple représenté, il s'agit d'un capteur d'image comportant une matrice de pixels, de type 30 CCD ou un CMOS. Les CMOS sont les capteurs préférés car la taille des pixels est plus faible, ce qui permet d'acquérir des images dont la résolution spatiale est plus favorable. Le plan de détection P0 s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde 8 lumineuse incidente 12. Ainsi, le plan de détection P0 est parallèle au plan de l'échantillon P10. Le capteur d'image comporte des pixels, à chaque pixel étant associé une coordonnée radiale r. La distance cl entre l'échantillon 10 et la matrice de pixels du capteur d'image 16 est préférentiellement comprise entre 50 pm et 2 cm, de préférence comprise entre 100 pm et 2 5 mm. Sur le dispositif représenté sur la figure 1A, on remarque l'absence d'optique de grossissement ou de formation d'image entre le capteur d'image 16 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 16, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image acquise par le 10 capteur d'image. Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, l'échantillon 10 peut engendrer une onde diffractée, susceptible de produire, au niveau du plan de détection P0, des interférences, en particulier avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12 transmise par l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 12. Ainsi, l'onde 15 lumineuse 14, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le capteur d'image 16, comporte est formée suite à l'absorption et la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par l'échantillon. Ainsi, l'échantillon entraîne une absorption d'une partie de l'onde lumineuse incidente, ainsi qu'un déphasage de cette dernière. Le déphasage est dû à une variation d'indice de réfraction (ou indice optique) lorsque l'onde lumineuse 14 se propage à travers l'échantillon. 20 L'onde lumineuse 14 peut également être désignée par le terme onde lumineuse d'exposition. Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image acquise par le capteur d'image 16. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Le processeur 25 peut être couplé à un écran 24 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 16 ou calculées par le processeur 20. L'image acquise par le capteur d'image forme un hologramme. Elle ne permet généralement pas une représentation visuelle satisfaisante de l'échantillon, en particulier lorsque l'échantillon comporte des éléments diffractants rapprochés les uns des autres. C'est notamment le cas 30 lorsque l'échantillon comporte des particules rapprochées les unes des autres, ou lorsque l'échantillon est une fine lame de tissu biologique. Afin d'obtenir une observation satisfaisante de l'échantillon, des algorithmes itératifs de reconstruction d'image ont été développés, tels que 9 ceux décrits dans l'art antérieur. Ces algorithmes comportent une application itérative d'un opérateur de propagation holographique, de façon à propager l'hologramme, formé dans le plan de détection, dans un plan de reconstruction, ce dernier correspondant généralement un plan de l'échantillon, selon lequel s'étend l'échantillon. Le plan de l'échantillon est généralement 5 parallèle au plan de détection. Les algorithmes décrits dans l'art antérieur comportent des successions de propagation / rétropropagation, d'images entre le plan de détection et le plan de l'échantillon. L'image acquise par le capteur d'image ne comporte pas d'information relative à la phase de l'onde lumineuse d'exposition. L'objectif de ces algorithmes est d'estimer, de façon itérative, la phase de l'onde lumineuse d'exposition dans le plan de détection. Cela permet de 10 former une image correcte de l'échantillon, dans le plan de reconstruction. Ainsi, ces algorithmes permettent d'obtenir des propriétés optiques de l'onde lumineuse d'exposition 14. Il peut s'agir par exemple du module ou de la phase. L'approche proposée par l'inventeur est différente, puisqu'elle vise non pas à obtenir des propriétés de l'onde lumineuse d'exposition 14, mais des propriétés de l'échantillon lui-même, 15 et notamment des propriétés optiques de ce dernier. Pour cela, l'échantillon est décrit par des vecteurs F(r), chaque vecteur étant défini à une coordonnée radiale r dans le plan de l'échantillon. Chaque terme de chaque vecteur correspond à une propriété optique de l'échantillon. L'inventeur a considéré qu'une propriété importante à considérer est une différence de trajet 20 optique induite par l'échantillon, selon l'axe de propagation Z. Pour cela, on considère les coordonnées radiales r = (x,y), définies dans le plan de l'échantillon. On définit, à chaque coordonnée radiale r, un vecteur de paramètres F(r), décrivant l'échantillon. Le vecteur de paramètres F(r) a une dimension (1, N,,'), où N,,' désigne le nombre de paramètres considérés. Chaque composante du vecteur de paramètres est un paramètre optique de l'échantillon. 25 Une composante du vecteur est une différence de trajet optique L(r) induit par l'échantillon selon une direction parallèle à l'axe de propagation Z. La figure 2 montre un détail d'une particule 10p de l'échantillon. Dans cet exemple, la particule 10p est une cellule adhérente. Elle adhère à une paroi transparente de la chambre fluidique 15. La particule 10p a un indice de réfraction np, tandis que le milieu 10m dans lequel elle baigne a un indice de réfraction nm. 30 En chaque coordonnée radiale r, la différence de trajet optique L(r) produite par la particule est telle que L(r) = (np - nm) x e(r) où e(r) : épaisseur de la particule à la coordonnée radiale r et x est l'opérateur multiplication. 10 Sur la figure 2, on a représenté, par des pointillés, le front d'onde de l'onde lumineuse 12, incidente à l'échantillon, ainsi que de l'onde lumineuse d'exposition 14, à laquelle est exposé le capteur d'image 16, l'onde lumineuse d'exposition se propageant de l'échantillon vers le capteur d'image. Dans cet exemple, np > nm. Le front d'onde est plan avant d'atteindre l'échantillon. 5 En aval de l'échantillon, le front d'onde est déformé du fait de l'apparition de différences de trajet optique induites par la particule. Une autre composante du vecteur F(r) peut être une absorbance a(r) de l'échantillon. Lorsque la source de lumière 11 comporte différentes sources de lumière élémentaires 111, le trajet optique et/ou l'absorbance peuvent être exprimés dans chaque longueur d'onde À. 10 Soit A10, l'amplitude complexe de l'onde lumineuse d'exposition 14 dans le plan de l'échantillon P10. A chaque coordonnée radiale r, l'amplitude complexe A10(r) peut être définie à partir du vecteur de paramètres F(r), en fonction d'hypothèses établies a priori : soit l'échantillon est considéré comme transparent, auquel cas l'absorbance a est nulle et ilo(r) = b1 (r)exp(2in-r)) (1) . L'index À désigne une longueur d'onde et i2 = -1 15 Comme précédemment indiqué, est la longueur d'onde centrale d'une bande spectrale d'émission da. Le terme 62' est une amplitude représentative de l'onde lumineuse incidente 12 atteignant l'échantillon. Cette amplitude peut être mesurée par le capteur d'image 16 en l'absence d'échantillon 10 sur le support 10s. La source de lumière 11 éclaire alors directement le capteur d'image. A partir de l'image loam(r) 20 acquise par le capteur d'image 16 dans la bande spectrale d'émission dl, on obtient l'amplitude ha par ba(r) =b(r).(1') soit l'échantillon présente une absorbance non nulle, auquel cas : = ba (r)exp(2in- + aa(r)) (2), où aa(r) est l'absorbance dans la bande spectrale à la coordonnée radiale r. 25 On peut considérer que la différence de trajet optique L(r) dépend de la bande spectrale d'émission, auquel cas elle est notée La(r). Dans ce cas, l'amplitude complexe dans le plan de l'échantillon s'écrit : 4(r) = ba (r)exp(2in- Li r)) (3) ou A10(r) = ba (r)exp(2i7r-Lifr) + aa(r)) (4) lorsque l'absorbance est respectivement considérée comme nulle ou non nulle. Selon une configuration, on définit une variable d'ajustement, définissant un saut de phase. En 30 effet, la phase d'une onde lumineuse est définie modulo 27r. On peut définir un entier N4,, permettant d'obtenir une valeur quantitative de la phase, de telle sorte que : 11 L(r)-No (1-do) itilm(r) = bÀ (r)exp(2iff + a/1(r)) (5). Où 20 désigne une longueur d'onde centrale d'une des bandes spectrales utilisées. Chaque vecteur F(r) comporte N,',' termes F3/4,(r) avec 1 P0 de l'échantillon P10 vers le plan de détection Po, à la longueur d'onde 1. Il peut s'agir d'un 2+), opérateur de Fresnel, par exemple h(x, y, z) = -iaze12,T kexp(i)rx -) (7) , avec r = (x, y). xx 10 D'une façon générale, l'opérateur de propagation holographique modélise un transport de l'onde lumineuse d'exposition entre au moins deux points distants l'un de l'autre. Dans l'application décrite, le produit de convolution décrit en lien avec l'équation (6) modélise un transport de l'onde lumineuse d'exposition 14 entre le plan de l'échantillon P10 et le plan de détection P©. 15 En considérant la racine carrée du module de l'onde lumineuse d'exposition 14, on obtient une estimation roa'n de l'image acquise par le capteur d'image C. Ainsi, foli'n =.1 mod (A0' n) (8) où mod désigne l'opérateur module. L'étape 120 est mise en oeuvre dans chaque bande spectrale. Étape 130: Dans chaque bande spectrale, comparaison de l'image m estimée lors de l'étape 120 20 avec l'image /c.1- acquise par le capteur d'image lors de l'étape 100. La comparaison peut être exprimée sous forme d'une différence ou d'un ratio, ou d'un écart quadratique. Étape 140: Calcul d'un indicateur de validité à partir de la comparaison effectuée, lors de l'étape 130, dans chaque bande spectrale. L'indicateur de validité Eln.7n représente la pertinence de l'ensemble Fn des vecteurs Fn(r) décrivant l'échantillon. L'indice IP' signifie que l'indicateur 25 de validité est établi sachant l'ensemble Y' des vecteurs Fn(r). Dans cet exemple, l'indicateur de validité est d'autant plus faible que l'échantillon est correctement décrit par l'ensemble F. L'indicateur de validité E(n comporte un critère d'erreur con1.7n, ce dernier quantifiant une erreur globale de l'image estimée en par rapport à l'image mesurée J. Par erreur globale, on entend une erreur pour chaque coordonnée radiale et pour chaque bande spectrale considérée. 30 Le critère d'erreur estt établi à partir de la comparaison des images 4t'n et I. Par exemple, 13 (10), où : Egi7" = NA/a dr EA (11;16(r(i(2:ne;)(f))2 - est le nombre de coordonnées radiales considérées ; - /VA est le nombre de bandes spectrales considérées ; u est l'opérateur écart-type, moyennant une prise en compte d'un modèle de bruit. 5 L'indice 0 Mn attribué au critère d'erreur Eonlyn représente le fait que cet indicateur est calculé dans le plan de détection, sachant l'ensemble des vecteurs Fu pris en compte lors de l'itération. Le critère d'erreur conTn est un critère d'attache aux données, dans le sens ou sa minimisation permet de se rapprocher des données mesurées, en l'occurrence chaque image C. Aussi, lorsque 1:'n tend vers /6a, c'est-à-dire lorsque l'ensemble Y'n des vecteurs décrivent 10 correctement l'échantillon 10, tend vers 1. En effet, compte tenu du bruit, le terme 2 (*lisetoi) tend vers 1. cr(1,1'n (I) En prenant en compte la transformée de Anscombe, en considérant que l'image e est affectée ri a n n 3 d'un bruit poissonnien, on a m ' = / ' + -8 (11) et M0À = I + 2 (11') H n e À' et J. où R(tIn et M0a correspondent respectivement aux modules des images Î0 0. 15 L'expression (10) devient alors : Egi'. = 4 f dr Eeta'n - Mli)2(12) car du fait de cette transformation, l'écart type est NrN a transformé en un écart type constant de valeur Yi. Selon un mode de réalisation, Eint, = Eol (13) : l'indicateur de validité ne prend en compte que le critère d'erreur. 20 Dans un autre mode de réalisation, détaillé par la suite, l'indicateur de validité comporte également un critère morphologique, correspondant à la prise en compte de contraintes géométriques ou optiques de l'échantillon ou des particules formant l'échantillon. Etape 150 : Mise à jour des vecteurs Fn(r) en par minimisation de l'indicateur de validité cn'.. L'indicateur de validité einFn est une variable scalaire. Cependant, il dépend de l'ensemble .7" 25 des vecteurs paramètres sur la base desquels il a été établi, par l'intermédiaire de l'image k2"1 estimée dans chaque bande spectrale considérée. 14 Au cours de l'étape 150, on applique un algorithme de minimisation, de type descente de gradient, de façon à s'approcher progressivement, à chaque itération, de l'ensemble Fn permettant une minimisation satisfaisante de l'indicateur de validité Eln,En. Aussi, l'objectif de cette étape est d'établir un ensemble Yn+1 de vecteurs Fn+1(r) visant à obtenir, suite à une 5 réitération des étapes 110 à 140, un indicateur de validité Eln:frtn1+, plus faible que l'indicateur de validité cn de l'intération courante Cette étape permet de mettre à jour au moins un terme F,Z; (r) de chaque vecteur Fn(r). Pour cela, on définit un gradient GC(r) de l'indicateur de validité eln,Fn à l'égard du paramètre optique correspondant au terme Fj; (r), de telle sorte que : Erfn 10 g (r) - -D FiLl (r) (14) Un algorithme de descente de gradient définit alors une direction cltny ainsi qu'un pas d'avancement awn. Le terme Fw(r) de chaque vecteur de paramètre est mis à jour selon l'expression : (r) = Fie (r) + dw o-C (15) Le gradient Gwn (r) peut être défini pour chaque terme Fte (r) des vecteurs Fn(r). 15 Etape 160: réitération des étapes 120 à 150, en prenant en compte, lors de l'étape 120 de l'itération suivante, l'ensemble F11÷1 mis à jour lors de l'étape 150 de l'itération dernièrement effectuée. Les étapes 120 à 160 sont réitérées jusqu'à ce que la valeur de l'indicateur de validité Elnyn soit considérée comme représentative d'une bonne description de l'échantillon par l'ensemble Fn 20 de vecteurs Fn(r). En prenant en compte un indicateur tel que défini dans les équations (10) et (13), les itérations cessent lorsque la valeur de l'indicateur de validité ei!in est suffisamment faible. Selon une variante, lors de l'étape 140, l'indicateur de validité Einyn prend également en compte un critère morphologique E111012.. 25 A la différence du critère d'erreur %/Fi, qui est défini à partir de données mesurées ou estimées dans le plan de détection P0, le critère morphologique crovEn est défini dans le plan de l'échantillon P10. D'une façon générale, le critère morphologique Ein013, dépend de la valeur des termes des vecteurs de paramètres déterminés lors de l'étape 110 ou lors de l'étape 150 d'une itération 15 précédente, ou de leur dérivées spatiales. Il est représentatif de la morphologie de l'échantillon, telle que déterminée à partir des vecteurs de paramètres. Autrement dit, le critère morphologique représente un critère d'attache à des données morphologiques de l'échantillon, ces dernières pouvant être définies par des hypothèses. 5 Le critère morphologique cinomn peut prendre en compte une dérivée spatiale de la différence de trajet optique, de façon à prendre en compte une forme prédéfinie d'une particule. Par exemple, lorsque l'échantillon comporte des cellules adhérentes, la forme prédéfinie peut être un hémisphère, un tel cas de figure étant représenté sur la figure 2. Lorsque l'échantillon comporte des cellules flottantes, la forme prédéfinie peut être une sphère lorsque les cellules 10 sont sphériques. D'une façon générale le critère morphologique peut être exprimé comme suit : 2 nie E n = f X k ak (El bu.. 0 XT. fki (Fân (r))1 (16) - ak et bk, sont des réels, formant des facteurs de pondération ; - 0 kt est un opérateur, par exemple un opérateur de type dérivée partielle spatiale, ou 15 racine carrée, ou le laplacien. - Fkiain(r) désigne un terme d'un vecteur Fn (r), auquel est associé le terme de pondération bu, le terme étant défini à la longueur d'onde À. - fkj désigne une fonction appliquée au terme din(r), par exemple une fonction trigonométrique, de type sinus ou cosinus, mais il peut également s'agir de la fonction 20 identité, telle que fkl (Fàn(r)) = Fklin(r) ; nk est un réel positif, par exemple égal à 0.5 lorsqu'on souhaite utiliser une norme d'ordre 1, ou égal à 1 lorsqu'on souhaite utiliser une norme d'ordre 2 ; - * désigne, dans cette expression, l'application de l'opérateur Ok1. Le critère morphologique est donc, dans sa forme la plus générale, une somme pondérée 25 d'opérateurs que l'on applique à différents termes de chaque vecteur Fn (r). Cette somme pondérée est intégrée selon les différentes coordonnées radiales considérées, de façon à former un indicateur morphologique einjo_n prenant la forme d'une variable scalaire. Par exemple, si l'amplitude complexe de l'onde lumineuse d'exposition 14 est définie selon l'expression (1), chaque vecteur de paramètre comporte un terme Ln(r) un exemple de critère 30 morphologique est : 16 crn f/_ f Ln(r)\2 OL"0-))2 (16)' - ur ax Dy Ce critère tend à diminuer lorsque la grandeur Ln (r) ne présente un minium d'oscillations, ce qui est par exemple le cas lorsque les particules ont une morphologie sphérique ou hémisphérique de particules. Les valeurs de Ln(r) pour lesquelles le critère est minimal 5 correspondent donc à des particules, par exemple sphériques ou hémisphériques, isolées les unes des autres, avec un minimum d'oscillation de Ln(r) entre les particules ou sur ces dernières. Le critère morphologique Ely,. est minimal lorsque les vecteurs de paramètres Fn(r) formant l'ensemble Fr' décrivent des objets répondant à des hypothèses morphologiques établies à 10 priori. Lorsque l'indicateur de validité elfe inclut une prise en compte du critère morphologique cinolfrn, il peut être défini sous la forme d'une somme pondérée du critère d'erreur eonr et du critère morphologique Einown. L'expression de l'indicateur de validité peut alors être, par exemple : E 17, = + yE1olyn (17) 15 où y est un scalaire positif. La variation de El, pour une variation de trajet optique SLn(r) peut être exprimée par l'expression : DEn(r)OLn(r) aLn (r)01,n(r) 64. = 2 f dr EA(I - Mè) Slen + y f dr dx dx °Y °Y (18) OÙ : raLn (1\2 (OLn(r)\2 ', x ) dy ) it4( est le module de l'amplitude complexe i.4) estimée dans le plan de l'échantillon ; 20 (Mill représente une variation du module (Mt; sous l'effet d'une variation 61,(r) du trajet optique en chaque coordonnée radiale r. On peut montrer que : a (aLn(r. )) + g(r) = "tir - 4-ff/m Ea (((B (r)(1 - den)* haï, y aL(r) -À mp >. 0.a dx E2,4(-) a (aL an r)) Dx em(r)1 (19), où 1m désigne l'opérateur partie imaginaire. 17 avec : em (r) = .1(a:(12 + CL ay (19 ) Le terme e(r) est déterminé lors d'une exposition du capteur d'image à une illumination de la source de lumière sans échantillon disposé entre la source de lumière et le capteur d'image. On peut ainsi déterminer, à chaque itération, une variation 61,n(r), en chaque coordonnée 5 radiale r, induisant une décroissance progressive de l'indicateur de validité cil,. Lorsqu'entre deux itérations successives, l'indicateur de validité Eln.n ne décroît plus de façon significative, les itérations cessent. L'échantillon est alors considéré comme représenté, de façon correcte, par les vecteurs Fn(r) formant l'ensemble V. Les itérations peuvent également cesser lorsqu'un nombre prédéterminé d'itérations est atteint. 10 Selon un mode de réalisation, la valeur du scalaire y varie en fonction des itérations. Ainsi, au cours de chaque itération, on calcule un indicateur de validité tel que : rt n n elTn = EULFn + Yrt enun (20) y' est la valeur du coefficient de pondération lors d'une itération n. Au cours des premières itérations, yn est nul ou proche de zéro. L'indicateur de validité privilégie 15 alors l'attache aux données, par le biais du critère d'erreur convn. Lorsque le rang n des itérations augmente, la valeur du terme de pondération yn augmente, de façon à davantage prendre en compte le critère morphologique Eincip, Selon ce mode de réalisation, lors de premières itérations, l'indicateur de validité el;. est uniquement calculé à partir du critère d'erreur Puis, lorsqu'on dispose d'une détermination un peu plus précise de l'échantillon, par le biais des 20 vecteurs Fn(r), l'indicateur de validité prend en compte le critère morphologique einolyn. Selon un mode de réalisation, les vecteurs r(r) décrivant l'échantillon 10 évoluent. Par exemple, au cours des premières itérations des étapes 120 à 160, la différence de trajet optique est considérée comme indépendante de la longueur d'onde. Chaque vecteur Fn(r) comporte donc un terme Ln(r) correspondant à la différence de trajet optique. Dans un second temps, 25 par exemple lorsque le terme Ln(r) n'évolue pas de façon significative entre deux itérations successives, ou au bout d'un nombre prédéterminé d'itérations, chaque vecteur Fn(r) comporte autant de termes Lain(r) que de bandes spectrales d'émission, ces termes étant indépendants les uns des autres. Cela permet de raffiner le modèle de l'échantillon. 18 Selon un mode de réalisation, lors de l'étape 120, on prend en compte des imperfections de la source de lumière. Il est par exemple possible de prendre en compte la taille de la source. Il s'agit de considérer le fait que la source n'est pas parfaitement ponctuelle. A cette fin, l'image estimée dans le plan de détection est convoluée par un noyau de convolution K traduisant une 5 surface de la source parallèlement au plan de détection. Ainsi, \imod (Ao") * K (21), où * est le produit de convolution. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape 120, on prend en compte la largeur spectrale de chaque bande spectrale d'émission O.l. Ainsi, dans chaque bande spectrale, l'image tOk'n est définie en prenant en compte un taux d'émission s(d,1.) dans une bande spectrale élémentaire 10 d,l. La bande spectrale élémentaire d,1 correspond au pas de discrétisation de la bande spectrale considérée. À ro,n = f d,1s(cL1)1A 02-±caln * h2-±da I ->Po (22) On peut considérer que A, = a'n, en négligeant les variations de Ao avec di Exemple 15 Un exemple a été réalisé en utilisant un échantillon comportant des cellules de type A549 disposées dans un échantillon comportant un milieu de culture liquide, à une distance de 1400 pm d'un capteur d'image de type CMOS : taille des pixels : 1.67 pm x 1.67 pm - 10 millions de pixels. La source de lumière comportait 3 diodes électroluminescentes émettant respectivement dans le rouge, le vert et le bleu. La source de lumière était disposée à une distance de 50 mm de 20 l'échantillon. Elle était couplée à un diaphragme définissant une ouverture de diamètre 50 pm. Les figures 4A, 4B et 4C montrent les images respectivement acquises dans les bandes spectrales rouges, vertes et bleues. La figure 4D montre une image du gradient Gwn(r) de l'indicateur de validité e Fn établi pour chaque pixel r, en fonction du paramètre L(r) lors de la première itération (n = 1). Dans cet 25 exemple, l'indicateur de validité est tel que : = En n + yen n (24) 1Y (.11Y ne 4 ^an 2 Avec col,Fn = f dr EMo' - Mo) (25) et NrN2 n(n( crolipn = f dr .\/(aL drr))2 + (at r))2 + V(Ln(r))2 (26) 19 La figure 4E montre une distribution spatiale de l'épaisseur optique L'1(r) dans l'échantillon à l'itération n = 100. Cette figure permet de visualiser les cellules et d'obtenir, pour chacune d'entre elle, une valeur quantitative de l'épaisseur optique. La figure 5 schématise un dispositif permettant une mise en oeuvre de l'invention. 5 Contrairement au dispositif représenté sur la figure 1A, le dispositif de la figure 5 comporte un système optique 19 de formation d'image. Le système optique 19 définit un plan image et un plan objet. Le système optique peut être une lentille ou un objectif. Lors de l'acquisition de l'image de l'échantillon, le capteur d'image est disposé selon une configuration défocalisée. Le plan de détection est décalé par rapport au plan image et/ou le plan selon lequel s'étend 10 l'échantillon est décalé par rapport au plan objet. Le décalage est généralement faible, en étant de préférence inférieur à 1 mm, et typiquement dans une plage 50 p.m - 500 p.m. L'invention pourra être mise en oeuvre pour l'observation d'échantillons dans le domaine de la biologie ou de la santé, dans le domaine du contrôle de l'environnement ou dans d'autres domaines industriels, y compris l'agroalimentaire. REVENDICATIONS1. Procédé d'observation d'un échantillon (10), l'échantillon s'étendant selon un plan de l'échantillon (P10) définissant des coordonnées radiales, le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière (11), apte à émettre une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon selon un axe de propagation (Z); b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image (16), d'une image (/(1) de l'échantillon (10), formée dans un plan de détection (P0), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (16), de telle sorte que l'onde lumineuse incidente subit une différence de trajet optique (L(r)), parallèlement à l'axe de propagation (Z), en traversant l'échantillon ; c) traitement de l'image acquise par le capteur d'image ; le procédé étant caractérisé en ce que le traitement de l'image acquise comporte les étapes itératives suivantes: i) prise en compte d'un ensemble (Pi) de vecteurs de paramètres (Fn(r)), décrivant l'échantillon, et respectivement définis en plusieurs coordonnées radiales (r), dans le plan de l'échantillon, chaque vecteur de paramètres étant associé à une coordonnée radiale (r), et comportant un terme (F,e (r)) représentatif d'un paramètre optique l'échantillon, au moins un paramètre optique étant une différence de trajet optique (Ln (r)) induite par l'échantillon à chaque coordonnée radiale; ii) à partir des vecteurs de paramètres (En (r)), formation d'une image complexe (Ai/1'0n) de l'échantillon dans le plan de l'échantillon (P10); iii) application d'un opérateur de propagation à l'image complexe de l'échantillon formée dans le plan de l'échantillon, pour calculer une image (roa'n) de l'échantillon dans le plan de détection ; iv) comparaison de l'image (M) acquise lors de l'étape b) et de l'image (e'll) calculée lors de l'étape iii), pour calculer un indicateur de validité (el v) mise à jour de l'ensemble des vecteurs de paramètres, de façon à faire tendre l'indicateur de validité (Ep vers une valeur prédéterminée ; vi) réitération des étapes ii) à v) en prenant en compte les vecteurs de paramètres (Fn+1(x.)) estimés lors de l'étape y). 21 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape v) comporte une détermination d'un gradient (Ge(r)) de l'indicateur de validité (Er:7) en fonction d'au moins un paramètre (Fe (r)), de telle sorte que les vecteurs de paramètres (Fn+1 (r)) sont mis à jour pour réduire l'indicateur de validité de l'itération suivante (Er). 5 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel l'étape y) met en oeuvre un algorithme de type descente de gradient. 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel chaque vecteur de paramètre (Fn (r)) comporte: - au moins un paramètre optique (L(r)) représentatif d'une différence de trajet optique 10 selon l'axe de propagation ; - un paramètre optique (a (r)) représentatif de l'absorbance. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape v) comporte un calcul d'un critère morphologique (finory) à partir des vecteurs de paramètres (Fn (r)), le critère morphologique quantifiant un écart des vecteurs de paramètres, décrivant 15 l'échantillon, par rapport à une contrainte morphologique de l'échantillon, de telle sorte que l'indicateur de validité (c(.) est obtenu à partir d'une combinaison : - d'un critère d'erreur (cor,.), déterminé à partir d'une comparaison entre l'image acquise lors de l'étape b) et de l'image obtenue lors de l'étape iii) ; - et du critère morphologique (Eire_ ). 20 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'indicateur de validité KIF) est une somme, éventuellement pondérée, du critère d'erreur (cone) et du critère morphologique (Ell.F). 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel l'indicateur de validité (6117) est une somme pondérée du critère d'erreur (eloilfr) et du critère morphologique (einor,J, la pondération (y) variant entre au moins deux itérations successives. 25 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : - lors de l'étape b), une image de l'échantillon (/61) est acquise dans différentes bandes spectrales (X); - chaque vecteur de paramètres comporte au moins un paramètre optique défini dans une des bandes spectrales ; 30 le procédé étant tel que : 22 - lors de l'étape iii), l'image complexe de l'échantillon (Aixo'n) est propagée dans chaque bande spectrale, de façon à calculer, dans chaque bande spectrale, une image de l'échantillon (em); l'étape iv) comporte une comparaison, dans chaque bande spectrale (X), de l'image 5 (102"n) calculée lors de l'étape iii) et de l'image (161) acquise lors de l'étape b); - de telle sorte que l'indicateur de validité calculé dans l'étape iv) est calculé à partir des comparaisons effectuées lors de l'étape iv). 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel : - lors de premières itérations, un paramètres optique est considéré comme ne variant pas 10 en fonction de la bande spectrale ; - au-delà de premières itérations, le paramètre optique est considéré comme variable en fonction de la bande spectrale. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape iii), le calcul de l'image de l'échantillon (roaln) dans le plan de détection (P0) comporte 15 l'application d'un produit de convolution par un noyau de convolution (K), le noyau de convolution représentant une étendue spatiale de la source de lumière. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape ^À n iii), le calcul de l'image de l'échantillon (/0' ) dans le plan de détection (P0) comporte une intégrale d'une image élémentaire, définie dans une bande spectrale élémentaire, l'intégrale 20 étant calculée pour tenir compte d'une bande spectrale d'émission de la source de lumière. 12. Dispositif d'observation d'un échantillon (10) comportant : - une source de lumière (11), configurée pour émettre une onde lumineuse incidente pour illuminer l'échantillon ; - un support d'échantillon (10s), configuré pour recevoir l'échantillon ; 25 - un capteur d'image (16), configuré pour acquérir une image de l'échantillon lorsque l'échantillon est disposé sur le support d'échantillon (10s) ; - un processeur (20), programmé pour exécuter des instructions permettant de mettre en oeuvre les étapes i) à vi) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes à partir d'une image acquise par le capteur d'image. 30