FR 3094016 A1 20200925 FR 1902972 A 20190322 Description Titre de l'invention : Billes de verre fonctionnalisées, leur utilisation pour capter des micro-organismes et les dispositifs correspondants. [0001] La présente invention concerne des billes de verre fonctionnalisées, leur procédé de préparation et leur utilisation dans la captation de micro-organismes pour la mise en oeuvre d'un procédé d'élimination de micro-organismes ou de diagnostic, ainsi que les dispositifs comprenant ces billes de verre fonctionnalisées permettant la mise en oeuvre de ces différents procédés. [0002] La captation de micro-organismes présente un intérêt fondamental dans de nombreux types d'industrie, tels que les industries pharmaceutique, cosmétique ou alimentaire. Elle peut notamment être utilisée pour des applications qui se découpent en deux grands domaines : [0003] - L'élimination de micro-organismes de solutions potentiellement contaminées, [0004] - L'analyse sous la forme d'un diagnostic permettant d'évaluer la qualité micro- biologique d'une solution. [0005] Pour éliminer des micro-organismes présents au sein de solutions potentiellement contaminées, les techniques utilisées font généralement appel au traitement thermique (Magali, WAGNER, Anne Gaëlle MELLOUET, et François ZUBER. 2016. "Traitement thermique en continu de produits pompables." -Agroalimentaire." Techniques de l'Ingénieur, 10 Septembre 2016) et/ou à la filtration membranaire (Christel, CAUSSERAND, Claire ALBAS1, et Hélène ROUX DE BALMANN. 2017. "Filtration membranaire (01, NF, UF, MF) - Applications en traitement des eaux." "Technologies de l'eau." Techniques de l'Ingénieur, 10 Août 2017). L'inconvénient majeur du traitement thermique provient du fait que la température est susceptible d'engendrer des modifications irréversibles du produit en agissant directement sur ses constituants. Également, au niveau microbiologique, le traitement thermique correspond à une réduction de la charge en microorganismes et il est par exemple susceptible de réactiver des spores bactériennes. Concernant la filtration membranaire, le colmatage de la membrane est le principal problème pouvant être rencontré. Ce dernier peut être dû à la concentration en micro-organismes dans le produit autant qu'à la nature du produit et en particulier aux particules solides présentes en son sein. [0006] L'analyse microbiologique, nécessite l'utilisation de techniques précises pour lesquelles le temps d'obtention du résultat le plus court possible est recherché. En effet, plus les résultats d'analyse sont obtenus rapidement, plus il est possible d'engager des actions correctives en cas de résultats non satisfaisants ou non acceptables. En particulier, dans le domaine médical, il est nécessaire de prévoir et diagnostiquer le risque 2 infectieux : plus le diagnostic est rapide et précis, plus la prise en charge des malades est efficace et le risque de transmission minimisé. [0007] Cependant, pour mettre en évidence la présence de microorganismes, il est nécessaire de réaliser des prélèvements suffisamment importants afin de s'assurer de récupérer une quantité minimale de microorganismes. Il faut ensuite augmenter leur concentration, les isoler et les identifier. [0008] Une étape clé pour la plupart de ces méthodes de détection/quantification de microor- ganismes dans les échantillons liquides ou rendus liquides, est leur capacité à dépasser la limite de détection de la technique d'évaluation mise en oeuvre. Ceci est particulièrement difficile pour les échantillons faiblement concentrés en microorganismes d'intérêt. Une étape d'enrichissement ou de concentration apparait souvent nécessaire pour ce type d'échantillon. [0009] La phase de pré-enrichissement et/ou d'enrichissement nécessite d'utiliser des milieux de culture, sélectifs ou non, qui ont pour but de promouvoir la croissance des microorganismes cibles dans les échantillons biologiques ou environnementaux, tout en limitant la croissance des flores non cibles. Ainsi, la population cible, qui est souvent présente à des niveaux bas par rapport à la flore annexe présente dans les aliments, est amplifiée. Ces étapes d'enrichissement en amont de l'analyse permettent d'accroitre le nombre de microorganismes d'intérêt dans l'échantillon mais condamnent à la fois la possibilité d'une analyse rapide mais également la possibilité de quantifier la population initiale de microorganismes d'intérêt. [0010] L'autre possibilité consiste à passer par une étape de concentration des microor- ganismes à partir de l'échantillon liquide ou rendu liquide. [0011] Une des techniques les plus utilisées pour la concentration de micro-organismes à partir d'échantillons est l'utilisation d'un ou plusieurs filtres membranes de porosité variable à travers lequel le milieu liquide est filtré. Les microorganismes contenus dans l'échantillon sont arrêtés par la membrane et donc concentrés. Une telle technique est généralement mise en oeuvre pour l'analyse rnicrobiologique d'eau de process, d'eau potable, ou de boisson. [0012] Bien que simple d'utilisation, cette méthode de filtration sur membrane reste limitée par des facteurs provoquant le colmatage du filtre membrane tels que la turbidité élevée, ou la présence de particules dans l'échantillon. D'autres facteurs liés à la nature du filtre et à son mode de stérilisation peuvent aussi influer sur le résultat de l'analyse microbiologique pouvant gravement altérer la viabilité, la précision et la sensibilité de la méthode et conduire à des résultats erronés et faiblement reproductibles. Nous pouvons citer à titre d'exemple non exhaustif, l'inhibition de la croissance microbienne, une propagation anormale des colonies, l'existence de zones non mouillantes, la fragilité du filtre, un défaut de planéité du filtre, un faible taux de récu- 3 pération. En outre, la nécessité de concentrer de grandes quantités d'échantillon afin de compenser les variations spatiales et temporelles de l'occurrence des microorganismes, augmente la probabilité de colmatage du filtre membrane. [0013] D'autres méthodes permettent également de concentrer les micro-organismes et de les séparer des éléments constitutifs de l'échantillon. [0014] Par exemple, les méthodes d'immunocapturc ou d'immunoconcentration sont largement utilisées dans de nombreuses applications. Elles mettent très souvent en oeuvre des supports fonctionnalisés avec des anticorps et permettent de capturer spécifiquement ou non les microorganismes contenus dans l'échantillon. Ces méthodes sont largement utilisées pour l'analyse microbiologique de fluides humains ou d'échantillons alimentaires. [0015] De nouvelles méthodes permettent également la capture semi-spécifique de microor- ganismes à l'aide de surfaces cellulaires fonctionnalisées. Elles mettent en oeuvre des dérivés de lectines ou d'hydrates de carbone, des peptides et des composés mimant les peptides et sont appliquées à la capture à large spectre et / ou de liaison spécifique des micro-organismes dans l'échantillon. [0016] En outre, les peptides antirracrobiens liés à des composés non solubles ont été utilisés pour tuer, immobiliser et détecter des microorganismes. [0017] Par ailleurs, la polylysine est connue pour son activité antimicrobienne. [0018] L'un des buts de l'invention est de fournir des billes de verre fonctionnalisées pouvant capter des micro-organismes dans des conditions d'utilisation simples. [0019] Un autre but de l'invention est de fournir un procédé simple de préparation de ces billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine. [0020] Un autre but de l'invention est de fournir un dispositif comprenant les billes de verre fonctionnalisées pour une utilisation dans la captation de micro-organismes. [0021] Un autre but de l'invention est de fournir un procédé efficace de captation de micro- organismes pour une utilisation en élimination de micro-organismes ou en diagnostic. [0022] Un premier objet de la présente invention est une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à sa surface. [0023] Au sens de la présente invention, on entend par « bille de verre » un élément de forme sphérique composé de verre. [0024] Au sens de la présente invention, on entend par « lysine » l'acide aminé représenté par la formule ci-dessous. [Chem.1] [0025] Au sens de la présente invention, on entend par « polylysine » un polymère de la lysine. [0026] Au sens de la présente invention, on entend par « adsorbé » le fait que les molécules de lysine ou de polylysine soit fixées à la surface des billes de verre par des liaisons faibles de type Van der Waals sans modifier la structure moléculaire du verre ou de la lysine ou polylysine. [0027] Le procédé de fonctionnalisation des billes utilisé dans cette invention consiste à adsorber un polycation sur une surface négative telle que le verre. Le procédé d'adsorption présente l'avantage d'être facile à mettre en oeuvre. Ce dernier ne nécessite pas de matériel ou d'appareil particulier contrairement à la mise en oeuvre d'une liaison covalente entre la polylysine et les billes de verre. [0028] Ainsi, l'invention constitue une solution non spécifique de captation/élimination de micro-organismes dans un produit sans pour autant l'altérer puis, dans un objectif de diagnostic, de proposer une solution d'élution permettant le relargage de la totalité des microorganismes retenus sur la colonne et garantissant la viabilité cellulaire. Seules ces deux conditions permettront d'apporter une quantification précise des microorganismes vivants contenus dans l'échantillon analysé. [0029] Dans ce contexte, la présente invention s'appuie sur l'utilisation de la lysine ou de son polymère la polylysine. La polylysine est un polymère cationique qui améliore l'adhésion cellulaire et l'absorption des protéines ou encore des acides nucléiques en modifiant les charges de surface des matériaux sur lesquelles elle est appliquée, par exemple certains plastiques comme le polystyrène ou encore le verre. [0030] Les traitements de surface en polylysine permettent de nombreuses applications parmi lesquelles l'adhésion et l'étalement de diverses lignées cellulaires, la différenciation cellulaire et l'excroissance de neurites, l'adhésion des lignées de cellules transfectées et la survie de neurones primaires dans la culture. [0031] L'invention présente de nombreux avantages par rapport aux techniques de l'art antérieur. Elle permet tout d'abord d'éviter l'utilisation du traitement thermique pour éliminer les micro-organismes de solutions potentiellement contaminées et ainsi de préserver toutes les qualités originelles du produit sans engendrer de modifications sur ses constituants. L'invention permet également d'éviter d'utiliser la filtration membranaire et ses inconvénients liés entre autres au colmatage. Ainsi, l'invention permet d'éliminer les microorganismes contenus dans des échantillons liquides ou rendus liquides de volume important, échantillons pouvant être de natures différentes et posséder par exemple une turbidité élevée ou des particules ou des sédiments en son sein. [0032] En ce qui concerne l'analyse microbiologique, la présente invention concerne notamment un procédé pour capturer et concentrer au moins un microorganisme sus- ceptible d'être présent dans un échantillon en vue de le détecter, le quantifier ou d'en évaluer la viabilité. Ainsi, grâce à l'invention, un très faible nombre de microorganismes est détectable cc qui permet d'éviter de réaliser un enrichissement et ainsi de réduire considérablement le temps d'analyse mais également de pouvoir quantifier la population cible initiale. De même, l'invention résout les problèmes de mortalité pouvant être induites par l'utilisation de la polylysinc dans le cadre d'un diagnostic et permet de maintenir le microorganisme dans son état physiologique initial (mort ou vivant). Le microorganisme pouvant être ici une bactérie, un Futzgi (par exemple une levure ou une moisissure) ou un virus. Cc procédé est particulièrement applicable aux microorganismes contenus dans les milieux complexes. Ces milieux correspondant à des échantillons biologiques peuvent être d'origine humaine, alimentaire, cosmétique, vétérinaire ou pharmaceutique. [0033] L'un des avantages majeurs de la présente invention réside dans le fait que le produit ne subit aucune modification au contact des billes de verre fonctionnalisécs et que celle-ci permet également de s'affranchir des problèmes de colmatage. [0034] Un autre avantage majeur de la présente invention est la possibilité d'utiliser le dispositif de captation de micro-organismes en flux continu, sans étapes d'enrichissement et cc même si la quantité de microorganismes est faible. [0035] Tl est ainsi possible d'intégrer cc dispositif à une unité industrielle de production sur laquelle une étape d'élimination de micro-organismes serait nécessaire, et ce sans interrompre la chaine de production. Par conséquent, cette invention permet un gain de temps considérable par rapport aux méthodes impliquant une étape d'enrichissement. [0036] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre fonctionnalisée par de la polylysine adsorbée à sa surface. [0037] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre telle que décrite ci-dessus ayant un diamètre d'environ 20 à environ 1000 pin, notamment d'environ 20 à 30 pin, d'environ 30 à 40 pin, d'environ 40 à 50 mm, d'environ 50 à 75 pm, d'environ 75 à 100 irn, d'environ 100 à 200 pm, d'environ 200 à 300 pm, d'environ 300 à 400 irn, d'environ 400 à 500 pm, d'environ 500 à 600 pm, d'environ 600 à 700 pm, d'environ 700 à 800 in, d'environ 800 à 900 pm, d'environ 900 à 1000 pm. [0038] Si la taille des billes de verre est inférieure à 20 pm, les billes passent à travers le fritté sensé les retenir. En revanche, pour des billes de taille supérieure à 1000 in les taux de captation obtenus sont faibles. [0039] La diminution de la taille des billes combinée à un nombre de billes plus important permet d'avoir une surface de contact plus élevée. [0040] Par ailleurs, plus la taille des billes est élevée, plus le nombre de billes doit être important pour conserver un taux de captation constant. 6 [0041] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre telle que décrite ci-dessus, dans laquelle le verre est de type sodocalcique ou borosilicate. [0042] Le type de verre utilisé pour la présente invention, notamment le verre sodocalciquc, présente un avantage en termes de coût qui est peu élevé. [0043] Au sens de la présente invention, on entend par « verre de type sodocalciquc un verre à base de silice (Si0,), de calcium et de sodium. [0044] Au sens de la présente invention, on entend par « verre de type borosilicate un verre à base de silice (Si0,), et de trioxydc de bore (3203). [0045] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre telle que décrite ci-dessus ayant une masse d'environ 10 ng à environ 2 mg notamment d'environ 10 à 50 ng, d'environ 50 à 100 ng, d'environ 100 à 200 ng, d'environ 200 à 500 ng, d'environ 500 ng à 1 pg, d'environ 1 à 5 pg, d'environ 5 à 10 itg, d'environ 10 à 20 pg, d'environ 20 à 50 pg, d'environ 50 à 100 pg, d'environ 100 à 200 pg, d'environ 200 à 500 pg, d'environ 500 pg à 1 mg, d'environ 1 à 1,5 mg, d'environ 1,5 à 2 mg. [0046] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre telle que décrite ci-dessus, dans laquelle la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d'environ 146 à environ 146000 Da, notamment d'environ 146 à environ 292 Da, d'environ 292 à environ 1460 Da, d'environ 1460 à environ 2920 Da, d'environ 2920 à environ 4380 Da, d'environ 4380 à environ 7300 Da, d'environ 7300 à environ 14600 Da, d'environ 14600 à environ 36500 Da, d'environ 36500 à environ 58400 Da, d'environ 58400 à environ 116800 Da, d'environ 116800 à environ 146000 Da. [0047] La taille de la polylysine peut être commise de 292 à environ 146000 Da. [0048] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre telle que décrite ci-dessus, dans laquelle la polylysine est constituée d'un enchainement de 2 à 1000 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 800, de 800 à 1000 unités lysine. [0049] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre telle que décrite ci-dessus, dans laquelle la lysine est de la L-lysine ou de la D-lysine ou un mélange de L-lysine et de D-lysine, ou la polylysine est de type a. ou spoly-L-lysine ou de type a ou s-poly-D-lysine ou un mélange de a ou s-poly-L-lysine et cc ou s-poly-D-lysine, linéaire ou ramifiée, éventuellement sous forme d'un sel, notamment hydrobromure ou hydrochlorure. [0050] Au sens de la présente invention, on entend par « L-lysine » et « D-lysine » les énan- tiomères représentés par les formules ci-dessous. Chem.21 7 [0051] Au sens de la présente invention, on entend par « a ou e-poly-L-lysine » et « a ou e- poly-D-lysine » les polymères représentés par les formules ci-dessous. [Chem.3] [0052] Au sens de la présente invention, on entend par « linéaire » un polymère dans lequel l'enchainement des motifs monomères se fait de façon linéaire. [0053] Au sens de la présente invention, on entend par « ramifié » un polymère dans lequel l'enchainement des motifs monomères présente des ramifications. [0054] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille dc verre ayant un diamètre d'environ 20 à environ 1000 Fini, et une masse d'environ 10 ng à environ 2 mg, dans laquelle le verre est de type sodocalcique ou borosilicaté, fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à sa surface, dans laquelle la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d'environ 146 à environ 146000 Da, est de la L-lysine ou de la D-lysine ou un mélange de L-lysine et de D-lysine, ou la a ou epoly-L-lysine ou de la a ou e-poly-D-lysine ou un mélange de a ou e-poly-L-lysine et a ou s-poly-D-lysine, linéaire ou ramifiée, éventuellement sous forme d'un sel, notamment hydrobromure ou hydrochlorure. [0055] Un second objet de l'invention est un procédé de préparation d'une bille de verre telle que décrite précédemment comprenant une étape de mise en contact de la lysine ou de la polylysine avec une bille de verre pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à sa surface. [0056] L'adsorption consiste à mettre en contact la polylysine à une concentration comprise de 0.1% à 2% avec la surface de verre pendant une durée moyenne d'une dizaine de minutes. Il a été démontré qu'un temps plus court permettait également l'adsorption de la polylysine. Avec ou sans rinçage, le procédé permet de capter de façon efficace les microorganismes. Un rinçage à l'eau permet néanmoins d'éliminer la polylysine excé- 8 dentaire, de diminuer la mortalité induite et d'améliorer une éventuelle élution. [0057] Un séchage est ensuite réalisé à l'air libre ou accéléré à l'aide d'un système de chambre sous vide, ou par lyophilisation. Le temps de séchage peut ainsi être réduit à une dizaine de minutes. Des expérimentations ont par ailleurs démontré que lorsque qu'il n'y a pas de séchage de la colonne mais une conservation en condition immergée (dans de l'eau, après que la PLL ait été éliminée et qu'un rinçage ait été réalisé), la captation est conservée. [0058] A l'issue de ces différentes étapes, les billes sont fonctionnalisées et prêtes à l'emploi. [0059] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus comprenant une étape de mise en contact de la lysine ou de la polylysine avec une bille de verre pendant une durée de 1 minute à 24 heures, notamment de 1 à 5 minutes, de 5 à 10 minutes, de 10 à 15 minutes, de 15 à 20 minutes, de 20 à 25 minutes, de 25 à 30 minutes, de 30 minutes à 1 heure, de 1 à 2 heures, de 2 à 5 heures, de 5 à 10 heures, de 10 à 24 heures, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée. [0060] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus comprenant une étape de mise en contact de la lysine ou de la polylysine avec une bille de verre pendant une durée de 10 minutes, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée. [0061] Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus comprenant une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, notamment de 1 à 5 minutes, de 5 à 10 minutes, de 10 à 15 minutes, de 15 à 20 minutes, de 20 à 25 minutes, de 25 à 30 minutes, de 30 minutes à 1 heure, de 1 à 2 heures, de 2 à 5 heures, de 5 à 12 heures, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée. [0062] Selon un autre mode de réalisation encore plus particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus comprenant une étape de séchage pour une durée de 10 minutes, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée. [0063] Le temps de séchage de 10 min correspond à la durée de l'étape de séchage lorsque ce dernier est accéléré à l'aide d'un système de chambre sous vide avec la dépression réglée sur son maximum (-900 mbar au manomètre avant ouverture de la vanne). [0064] Lorsque le séchage est réalisé à l'air libre, le temps de séchage est plus long et peut atteindre 12 heures. [0065] Au sens de la présente invention, on entend par « séchage » une méthode de séchage à l'air libre ou accéléré à l'aide d'un système de chambre sous vide, ou par lyophi- 9 lisation. [0066] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air libre ou accéléré à l'aide d'un système de chambre sous vide, ou par lyophilisation, notamment à une température allant de la température ambiante à 60°C, notamment de la température ambiante à 30°C, de 30°C à 40°C, de 40°C à 50°C et de 50°C à 60°C. [0067] Au sens de la présente invention, on entend par « température ambiante une tem- pérature allant d'environ 20°C à environ 25°C. [0068] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus comprenant une étape de rinçage avec une solution aqueuse, notamment de l'eau, préalable à l'étape de séchage, pour éliminer la polylysine non adsorbée lors de l'étape de mise en contact. [0069] Au sens de la présente invention, on entend par « solution aqueuse » une phase liquide contenant de l'eau. Des exemples de solution aqueuses pouvant être utilisées sont l'eau, des solutions aqueuses de NaCI 150 mM, NaCI 200 mM et HCI 0.01N. [0070] L'objectif pendant le rinçage peut être de diminuer le pH à l'aide d'une solution acide afin de maximiser les charges positives à la surface de la polylysine, il est possible dans cc cas d'utiliser des acides tels que l'acide citrique ou l'acide acétique. [0071] Un troisième objet de l'invention est un dispositif comprenant un récipient contenant des billes de verre telles que décrites ci-dessus. [0072] Ce dispositif peut être utilisé en statique ou en flux. [0073] Le mode statique permet d'augmenter le temps de contact entre les billes de verre fonctionnalisées par la lysine ou la polylysine et le liquide contaminé et donc de maximiser la probabilité de rencontre entre les billes et les microorganismes. Cette probabilité de rencontre peut être encore améliorée en procédant à une agitation manuelle ou mécanique. L'inconvénient de cette technique concerne les grands volumes de solution à analyser ou à débactériser (100 mL, 250 mL) puisqu'ils nécessitent une quantité importante de billes, et par conséquent un coup plus élevé que pour la méthode en flux. [0074] En effet, pour la méthode en flux, il est possible de faire passer de grands volumes dans un espace réduit pour forcer, en quelque sorte, les microorganismes à rencontrer la polylysine adsorbé des billes (la quantité de billes utilisées pouvant-être de 1g). Ainsi, si on souhaite obtenir un coût réduit par analyse, on peut utiliser la méthode statique pour de petits volumes mais pas pour de grands volumes. [0075] Au sens de la présente invention, on entend par « récipient » un objet destiné à recevoir les billes de verre. [0076] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus dans lequel le récipient est sous forme d'un tube, d'un flacon, d'un Mt ou d'un pot. [0077] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel le contenant est sous forme de colonne comprenant de façon optionnelle un fritté. [0078] Au sens de la présente invention, lorsque la colonne comprend un fritté, la colonne et le fritté peuvent être deux éléments d'un même ensemble, ou deux éléments séparés pouvant être assemblés. [0079] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel la colonne a un volume d'environ 0,5 mL à environ 1 L, notamment d'environ 0,1 mL à 1 mL, d'environ 1 mL à 2 ml, d'environ 2 mL à 5 mL, d'environ 5 mL à 10 mL, d'environ 10 mL à 50 mL, d'environ 50 mL à 100 mL, d'environ 100 mL à 200 mL, d'environ 200 mL à 500 mL, d'environ 500 mL à 1 L, et le fritté a une porosité inférieure à la taille des billes de verre utilisées. [0080] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel la masse totale des billes de verre est d'environ 10 mg à environ 1 kg, notamment d'environ 10 à 50 mg, d'environ 50 à 100 mg, d'environ 100 à 200 mg, d'environ 200 à 500 mg, d'environ 500 mg à 1 g, d'environ 1 à 2g. d'environ 2 à 5 g, d'environ 5 à 10 g, d'environ 10 à 50g, d'environ 50 à 100 g, d'environ 100 à 200 g, d'environ 200 à 500 g, d'environ 500 g à 1 kg. [0081] L'une des premières applications du procédé est l'élimination de micro-organismes : grâce à la captation, l'échantillon est déplété des microorganismes initialement présents. [0082] Une seconde application envisagée est le diagnostic : la captation est alors utilisée comme un moyen pour concentrer les microorganismes en vue d'un diagnostic. Ce dernier peut être qualitatif, de type présence/absence, ou quantitatif. Il peut être spécifique ou non du type de microorganisme, et différencier ou non les cellules vivantes des cellules mortes. L'analyse des microorganismes captés peut se faire directement après captation sur billes. Ces tests peuvent être par exemple basés sur la détection de la cellule entière ou de la détection/quantification d'un de ses constituants (ADN, ARN, ATP, enzymes et leurs activités ou plus largement les protéines...). Pour ce faire, il est possible d'éluer les microorganismes ou bien de les lyser. Ensuite, une multitude de techniques sont utilisables, parmi lesquelles la cytométrie en flux ou en phase solide, la colorimétrie, la spectroscopie, la microscopie, l'ATPmétrie (ATP : Adénosine triphosphate), la PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase), la RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse), l'amplification isothermale ou encore la détection immunologique. 11 [0083] Un quatrième objet de l'invention est une utilisation de billes de verre telles que décrites ci-dessus ou d'un dispositif tel que décrit ci-dessus, pour la captation de micro-organismes en vue d'un diagnostic. [0084] Au sens de la présente invention, on entend par « micro-organismes » des organismes microscopiques vivants ou morts. Des exemples de micro-organismes pouvant être captés sont les bactéries, les levures, les champignons, les virus, les archées, les micro-algues, et certains parasites microscopiques. [0085] Au sens de la présente invention, on entend par « diagnostic » la détection des micro- organismes captés. [0086] Des exemples de techniques de diagnostic pouvant être utilisées sont notamment la cytométrie en flux ou en phase solide, la colorimétrie, la spectroscopie, la microscopie, r ATPmetric (ATP : Adénosine triphosphate), la PCR (Polymerasc Chain Rcaction ou réaction en chaîne par polymérasc), la RT-PCR (Reverse Transcriptase Polyrnerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse), l'amplification isothermale, ou la détection immunologique. [0087] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une uti- lisation telle que décrite ci-dessus, pour la captation de micro-organismes en vue de l'élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d'échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes. [0088] Au sens de la présente invention, on entend par « élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes » l'action de diminuer la quantité de micro-organismes présents dans un échantillon. [0089] Un autre objet de l'invention est un procédé de captation de micro-organismes comprenant une étape de mise en contact d'un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec des billes de verre telles que décrites ci-dessus ou d'un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans des conditions permettant de créer une interaction entre les dits micro-organismes et les billes de verre, et d'obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre. [0090] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel la proportion de micro-organismes provenant de l'échantillon et captés sur les billes de verre est comprise de 0,001% à 100% en vue de l'élimination de micro-organismes dudit échantillon. [0091] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, comportant une étape supplémentaire d'élution des microorganismes précédemment captés dans des conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes captés des susdites billes de verre et la récupération des dits micro-organismes. [0092] Dans le cas de l'élution avec une solution enzymatique, la solution en question doit 12 rester en contact avec les billes de verres sur lesquelles ont été captées les microorganismes pour une durée minimum de 5 à 40 minutes, notamment de 5 à 10, de 10 à 15, de 15 à 20, de 20 à 30, et de 30 à 40 minutes. [0093] Dans le cas d'une élution avec une solution enzymatique, cette étape est réalisée à une température pouvant aller de 20 à 55°C, préférentiellement dans les conditions optimales de température de l'enzyme utilisée. [0094] Dans le cas d'une élution avec une solution chimique, cette étape est réalisée à tem- pérature ambiante. [0095] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel lors de l'étape d'élution la proportion des microorganismes séparés des billes de verre sur lesquelles les susdits micro-organismes avaient été précédemment captés, puis récupérés est comprise de 0.001% à 100%. [0096] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel la récupération des micro-organismes est effectuée en vue d'un diagnostic. [0097] Ce diagnostic peut être qualitatif, de type présence/absence, ou quantitatif. Il peut être spécifique ou non du type de microorganisme, et différencier ou non les cellules vivantes des cellules mortes. [0098] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit précédemment, comprenant : [0099] - une étape de mise en contact de la lysine ou de la polylysine avec une bille de verre pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à sa surface, [0100] - une étape de mise en contact d'un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec des billes de verre telles que déciites précédemment ou d'un dispositif tel que décrit précédemment, dans des conditions permettant de créer une interaction entre les dits micro-organismes et les billes de verre, et d'obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre, [0101] - une étape supplémentaire d'élution des micro-organismes précédemment captés dans des conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes captés des susdites billes de verre et la récupération des dits micro-organismes. [0102] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel l'étape d'élution est réalisée en utilisant une solution d'élution de type enzymatique ou chimique. [0103] Au sens de la présente invention, les solutions d'élution de type enzymatique pouvant être utilisées sont par exemples la trypsine, l'accumax (enzymes ACCUMAX dans du PBS Dulbecco (0.2 g/L KC1, 0.2 g/L KELP04, 8 g/L NaC1, et 1.15 g/L Na, HPO4)). l'accutase (enzymes Accutase dans du PBS Dulbecco (0.2 g/L KC1, 0.2 g/L 13 KE2PO4, 8 g/L NaCI, and 1.15 g/L Na21-1PO4) contenant 0.5 mM EDTA-4Na et 3 mg/L de Phono' Red). [0104] Au sens de la présente invention, les solutions d'élution de type chimique pouvant être utilisées sont par exemples : NaCl 1M, EDTA 0.1 à 10%, bicarbonate de soude 1%, citrate de sodium 10%, acide acétique 0.1 à 10%, méthanol 0.1 à 10%, pluronic F127 0.01 à 0.1% (poloxamère 407, copolymère non-ioniques à trois blocs : Poly(éthylène glycol)-block-poly(propylène glycol)-block-poly(éthylène glycol)). [0105] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel la mise en contact de l'échantillon avec les billes de verre ou le dispositif a lieu de façon statique ou en flux. [0106] Au sens de la présente invention, on entend par « de façon statique », le fait que la mise en contact entre l'échantillon et les billes de verre ait lieu dans un récipient sans qu'il y ait un mouvement continu de l'échantillon et que l'échantillon ne soit renouvelé au cours de la mise en contact. La mise en contact de façon statique nécessite qu'à la fin du temps de contact l'échantillon soit séparé des billes de verre. Cette étape peut par exemple se réaliser par aspiration du liquide à travers un fritté ou par prélèvement du liquide. [0107] Lorsque le procédé de captation est réalisé en statique, l'étape de mise en contact de l'échantillon contenant les micro-organismes avec des billes de verre est réalisée sur une durée de 5 à 15 minutes avant que l'aspiration ne soit déclenchée et réalisée à l'aide de la chambre à vide. [0108] Au sens de la présente invention, on entend par « en flux », le fait que la mise en contact entre l'échantillon et les billes de verre ait lieu dans un récipient permettant de faire s'écouler de façon continue l'échantillon entre les billes de verre, [0109] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les micro-organismes sont choisis parmi les bactéries, et les Fungi, notamment les levures et les champignons. [0110] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les Fungi appartiennent notamment aux genres Absidia, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Brettanomyces, Byssochlatnys, Candida, Chaetomium, Cladosporium, Colletotrichum, Cryptococcus, Debanomyces, Emericella, Epicoccum, Ettpenicillium, Eurotium, Fusarium, Galactomyces, Geotrichum, Gliocladium, Hanseniaspora, Humicola, Hyphopichia, Kluyveromyces, Lichthennia, Lodderomyces, Meyerozyma, Monascus, Mucor, Mycoclaclus, Neosartorya, Nigrospora, Paecilomyces, Penicillium, Pestalotia, Phoma, Phytophthora, Pichia, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Rhodotorula, Saccharotnyces, Saccharomycopsis, Schizosaccharotnyces, Sclerotinia, Scopulariopsis, Serpula, Stemphylium Talaromyces, Thielaviopsis, Torulaspora, Trichoderma, Trichosporon, 14 Trichothetium, Ulm:Iodait)), Vert iciiliuni, Walletnia, Wickerhamomyees, Xylaria, Zygosaccharomyces. [0111] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les bactéries sont des bactéries Gram + ou Gram -. [0112] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les bactéries appartiennent notamment aux genres Acetobacter, Achromobacter, Acklovorax, Acinetobacter, Actinotnyces, Aerococcus, Aeromonas, Alcaligenes, Alicyclobacillus, Aquaspirillum, Asaia, Bac illus, Bifidobacterium sp., Bordetella, Brachybacterium, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Burkholderia, Buttiauxella, Campylobacter, Carnobacterium, Cellulomotza, Gambader, Clavibacter Clostridium, Corytzebacterium, Cronobacte, Cupriavidu, Curtobacterium, Elizabeihkingia, Enteractitzoeoceus, Etzterobacter, Enter0(70(7CUS, Escheriehia, Flacklamia, Flavobacterium, Geobacillus, Glulamicibacte, Halobaeillus, Klebsiella, Kocuria, Lactobacillus, Lactococcus, Leclercia, Lelliottia, Leuconosloc, Lysitzibacillus, Maerococcus, Methylobacteriu, Microbacterium spp. (CDC A-5), MICMCOCCUS, Moraxell, Mycobacterium, Nesterenkonia, Oceanobacillus 51), Ochrobactrutn, Paenibaeillus, Pandorae, Pantoea, Paracoccus, Pasteurell, Pediococcus, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Roseomona, Rothia'Salmonella'Sanguibacter'Serratia'Shewanella, Sphingomonas, Sporolactobacillus, Sporosareina'Staphylococcus'Sienotrophomonas'Streptococcus, Streptomyces, Thermoanaerobacterium, Variovorax, Virgibacillus. [0113] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel l'échantillon liquide ou visqueux est choisi parmi : [0114] - un échantillon biologique, tel que l'urine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses, [0115] - un échantillon pharmaceutique, tel que les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques, [0116] - un échantillon cosmétique, tel que les démaquillants, produits pour le nettoyage de la peau, déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants, crèmes de protection solaire, dissolvants, shampoings, après-shampoings, [0117] - un échantillon alimentaire, tel que les boissons, notamment l'eau (plate, pétillante et/ou aromatisée), le lait, les jus de fruits, les sodas, les boissons alcoolisées, les boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits laitiers, les ovoproduits. [0118] Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon biologique », un échantillon provenant d'un liquide corporel ou d'un tissu d'un corps humain ou animal. [0119] Des exemples d'échantillons biologiques pouvant être utilisées sont l'urine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses. [0120] Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon pharmaceutique », un échantillon provenant d'un produit pharmaceutique contenant des substances chimiques, naturelles ou synthétiques à usage humain ou vétérinaire. [0121] Des exemples d'échantillons pharmaceutiques pouvant être utilisées sont les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques. [0122] Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon cosmétique », un échantillon provenant d'un produit cosmétique contenant une substance ou un mélange destiné à être mise en contact avec les diverses parties superficielles du corps humain, en vue, exclusivement ou principalement, de les nettoyer, de les parfumer, d'en modifier l'aspect, de les protéger, de les maintenir en bon état ou de corriger les odeurs corporelles. [0123] Des exemples d'échantillons cosmétiques pouvant être utilisées sont les déma- quillants, produits pour le nettoyage de la peau, déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants, crèmes de protection solaire, dissolvants, shampoings, après-shampoings. [0124] Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon alimentaire », un échantillon provenant d'un produit alimentaire pouvant servir de nourriture ou de boisson à un être humain ou animal. [0125] Des exemples d'échantillons alimentaires pouvant être utilisées sont les boissons, notamment l'eau (plate, pétillante et/ou aromatisée), le lait, les jus de fruits, les sodas, les boissons alcoolisées, les boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits laitiers, les ovoproduits. [0126] Un autre objet de l'invention est un kit comprenant des billes de verre, de la lysine ou de la polylysine et optionnellement un dispositif sous forme de colonne et des solutions d'élution de type enzymatique ou chimique. Description des figures Pl 27] [fig.1 A] Figure 1A : Principe général dc fonctionnement dc captation/élimination des microorganismes en mode flux [0128] La Figure lA représente le principe général de fonctionnement de la captation/éli- mination des microorganismes en mode flux. [0129] 1 représente l'ajout de la solution potentiellement contaminée ; 2 représente la colonne ; 3 représente les billes de verre fonctionnalisées à l'aide de lysine ou polylysine ; 4 représente le fritté ; 5 représente la solution dépourvue de ses microorganismes à la sortie de la colonne ; 6 représente un grossissement des microorganismes immobilisés au contact des billes fonctionnalisées. 16 101301 Ifig.1B I Heure 1B : Principe général de fonctionnement de l'élution en mode flux [0131] 1 représente l'ajout de la solution d'élution ; 2 représente la solution d'élution à la sortie de la colonne contenant les microorganismes précédemment immobilisés. [0132] [fig.2A] Figure 2A : Principe général de fonctionnement de captation/élimination des microorganismes en mode statique [0133] La Figure 2A représente le principe général de fonctionnement de la captation/éli- mination des microorganismes en mode statique. [0134] 1 représente l'ajout de la solution potentiellement contaminée ; 2 représente le contenant ; 3 représente la solution potentiellement contaminée mise en contact avec les billes de verre ; 4 représente les billes de verre fonctionnalisées à l'aide de lysine ou polylysine ; 5 représente un grossissement des microorganismes immobilisés au contact des billes fonctionnalisées ; 6 représente la récupération ou l'élimination de la solution dépourvue de ses microorganismes. [0135] [fig.213] Figure 2B : Principe général de fonctionnement de l'élution en mode statique [0136] 1 représente l'ajout de la solution d'élution ; 2 représente le prélèvement de la solution d'élution pourvue des microorganismes éluées. Exemples [0137] Exemple 1 : Protocole général d'adsorption de la poly-l-lysine sur les billes de verre [0138] lg de billes de verre de diamètre 105-150 pm (réf. 15927, Polysciences Europe GmbH, Germany) a été pesé directement dans des colonnes de filtration de 2.4 mL en polypropylène munies d'un fritté en PEHD de porosité 45-90 prn (réf. 208-3049-035, Evergreen Scicntific, USA). L'ensemble a été placé sur une plaque adaptée pour pouvoir placer 24 colonnes simultanément (NucleoVac Adapter Plate, réf.740694, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany) qui s'intègre à une chambre à vide NucleoVac96 (réf. 740681, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany). Le tout a été relié à une pompe à vide KNF type N816.1.2KN.45.18 (KNF Neuberger SAS, Fnuice). Pour réaliser l'adsorption de la poly-L-lysine sur les billes de verre, 500 uL d'une solution de poly-L-lysine à 0.166% (Poly-L-lysine hydrobromide, réf. PLKBIO, Alamanda Polymers, Inc., USA), préparée dans de l'eau de biologie moléculaire (W4502, Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Darmstadt, Germany), ont été introduits par colonne contenant les billes de verre. La solution a été laissée en contact durant 10 min après homogénéisation à l'aide d'une pointe à filtre. Après mise en contact, la solution de poly-L-lysine a été aspirée sous vide avant qu'un rinçage à l'aide de 6 mL (6 x 1 mL) d'eau désionisée ne soit réalisé pour chaque colonne. Pour chaque aspiration, la pompe à vide a été réglée sur 700 mbar de dépression. Après rinçage, les colonnes sont 17 fonctionnalisées et prêtes à l'emploi. [0139] Exemple 2 : Préparation des souches [0140] Les souches de microorganismes ont été décongelées à l'aide d'une cryobille dans un milieu liquide ou solide approprié avant d'être placées à une température permettant leur croissance pendant le temps nécessaire à leur croissance. Les souches ont subi deux repiquages minimums à 2% dans un milieu liquide approprié ou par transfert sur milieu solide avant d'être utilisées pour les essais. [0141] Exemple 3 : Préparation des suspensions de travail [0142] Les suspensions filles ont été réalisées dans de l'eau supplémentée ou non de NaCI à 0.85% par dilutions successives (habituellement au dixième). A partir des suspensions filles réalisées, des matrices liquides (jus de fruits, sodas, eaux plates, gazeuses, aromatisées ou pas) ont été inoculées afin de contenir des microorganismes pour les essais. Pour ce faire, la dernière dilution a été réalisée dans la matrice à tester. [0143] Exemple 4 : Protocole général de captation en statique [0144] Un faible volume (de 5001.IL à 1 mL) de solution contenant une quantité donnée de microorganismes (de 20 à -107 unités) a été introduit dans une colonne contenant 1g de billes de verre fonctionnalisées par de la poly-l-lysine. Un temps de contact de 5 à 15 min a été appliqué avant que l'aspiration ne soit déclenchée et réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe étant fixée sur 50 mbar. [0145] Exemple 5 : Protocole général de captation en flux [0146] Un volume donné ((le 500 pL à 100 nit) de solution contenant une quantité donnée de microorganismes ((le 20 à -107 unités) a été filtré à travers une colonne contenant lg de billes de verre fonctionnalisées par de la poly-l-lysine. L'aspiration a été déclenchée avant l'introduction de la solution et a été réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe a été fixée sur 50 mbar. [0147] Exemple 6 : Protocole général d'élution [0148] Après passage de l'échantillon d'intérêt au travers de la colonne, une solution d'élution a été introduite afin de procéder au décrochage des microorganismes. La quantité de solution d'élution a été variable mais a été au minimum de 500 pL afin de recouvrir toutes les billes présentes dans la colonne. La solution a été (1) de nature enzymatique, (2) chimique et/ou (3) des deux appliquées en mélange ou successivement. [0149] Exemple 6-1 : Protocole général d'élution enzymatique [0150] Les solutions enzymatiques (trypsine, accumax) ont été achetées prêtes à l'emploi, la concentration pouvant varier (ex : Trypsine 0.05% à 2.5%). L'aspiration a été déclenchée après un temps de contact plus ou moins important (minimum 5 min, la durée la plus importante ayant été testée est de 40 min) afin de laisser du temps aux enzymes d'agir. La température d'incubation appliquée a été de la température ambiante à 42°C selon la solution enzymatique qui a été utilisée. 11 a par exemple été possible de faire 18 agir la trypsine à température ambiante ou à 42°C (37°C étant la température optimale). La filtration a ensuite été réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe a été fixée sur 700 mbar. [0151] Exemple 6-2: Protocole général d'élution chimique [0152] Toutes les solutions chimiques (NaCI 1M, EDTA 0.1 à 10%, bicarbonate de soude 1%, sodium citrate 10%, acide acétique 0.1 à 10%, méthanol 0.1 à 10%, pluronic F127 0.01 à 0.1%) ont été préparées à l'aide d'eau désionisée puis filtrée sur filtre 0.2 !lm. Les pourcentages cités précédemment correspondent à un rapport poids/volume d'eau (g/100 mL). L'aspiration a été déclenchée avant introduction de la solution ou après un temps de contact plus ou moins important (5 minutes minimum testées). La filtration a été réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe étant fixée sur 700 mbar. [0153] Exemple 6-3 : Protocole général d'élution enzymatique et/ou chimique en mélange ou successivement [0154] Les deux types de solutions enzymatique et chimique ont également pu être ap- pliquées en mélange (ex : Trypsine-EDTA) ou successivement (ex : Accumax suivi de NaCI). Il a été nécessaire de respecter un temps de contact obligatoire pour les solutions enzymatiques afin, une nouvelle fois, de permettre aux enzymes d'agir. [0155] Exemple 7 : Protocole générale d'évaluation du taux de captation et/ou d'élution [0156] L'évaluation du taux de captation ou d'élution a pu être réalisée de façons différentes en fonction de la quantité de microorganismes présents et du volume de solution à analyser. [0157] 11 a par exemple été possible d'évaluer le nombre de microorganismes présents dans une solution donnée à l'aide (1) de la cytométrie en flux, (2) de la filtration sur membrane déposée sur milieu gélose-, (3) par observation au microscope ou encore (4) de l'étalement sur boite de Petri. [0158] Exemple 7-1 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par cytométrie en flux [0159] La cytométrie en flux a nécessité une concentration en microorganisme relativement importante pour obtenir un résultat fiable (-10 UFC/mL) Les résultats en termes de taux de captation et d'élution ont été obtenus comme décrits ci-après. Les perméats obtenus après captation ont été analysés au cytomètre pour évaluer le nombre de microorganismes non captés. Il a ainsi été possible de déduire le nombre de microorganismes captés sur la colonne étant donné que la quantité de microorganismes préalablement introduits dans la colonne est connue (dénombrement réalisé au cytomètre). Pour l'élution, le nombre de microorganismes élués a directement été mesuré à l'aide du cytomètre. A noter qu'il a été possible de marquer les microorganismes ce qui a permis à la fois de mieux discriminer les microorganismes du bruit de fond et en même temps de décrire leur état physiologique (vivants ou morts) à un instant donné. 19 [0160] Exemple 7-2 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par filtration sur membrane déposée sur milieu gélose [0161] La filtration sur membrane a permis, elle, de concentrer les microorganismes. Il a ensuite été possible de déposer cette membrane sur un milieu favorable à leur croissance à une température donnée et pendant un temps défini. Les filtrations indépendantes des perméats et des éluats ont permis ainsi de calculer les taux de captation et d'élution de la même manière que pour la cytométric en flux. Pour cela, il a été nécessaire de compter les colonies sur la membrane après le temps d'incubation. [0162] Exemple 7-3 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par filtration sur membrane pour observation au microscope [0163] La filtration sur membrane a permis de concentrer les microorganismes et de les observer après marquage directement au microscope. De la même manière que précédemment, il a ensuite été nécessaire de compter les microorganismes présents sur la membrane à l'aide d'un microscope. Pour rappel, les marqueurs permettent de décrire l'état physiologique des microorganismes (vivants ou morts) à un instant donné ce que ne permet pas la croissance sur membrane en boite de Petri (Exemple 7-2) ou l'étalement sur milieu gélose (Exemple 7-4) pour lesquels seuls les microorganismes viables et cultivables sont observables, et cc, au minimum 24 heures après le dépôt. [0164] Exemple 7-4 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par filtration sur membrane pour de l'étalement sur boite de Petri [0165] Une autre méthode consiste en l'étalement de tout ou une partie des perméats et des éluats sur un milieu gélosé (en boite de Petri) favorable à la croissance des microorganismes. Cette méthode a nécessité un temps d'incubation variable à une température donnée. De la même manière que précédemment, il a ensuite été nécessaire de compter les microorganismes présents sur la boite afin d'en déduire les taux de captation et d'élution, le nombre de microorganismes introduits étant connu grâce à la même méthode d'étalement. [0166] Exemple 8 : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre [0167] 20 g de billes de verre 105-150 pm ont été ajoutés dans un contenant de 25 mL 9 mL de poly-L-lysine (10 lysines par chaine de poly-L-lysine) à 0.166 % (w/v) ont été ajoutés clans le contenant. Une mise en contact de 10 min a été respectée avec agitation toutes les deux minutes. Le tout a ensuite été transféré dans des colonnes munies d'un fritté de porosité 45-90 pin à hauteur de 2 g par colonne. Un rinçage a été réalisé à l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. 4 int d'eau de biologie moléculaire ont été utilisées pour rincer les billes contenues dans chaque colonne afin d'éliminer l'excédent de polylysine. Un séchage des billes de verre d'une durée de 10 min a ensuite été réalisé en réglant la pompe sur 700 mbar de dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine ont été prêtes à l'emploi. Protocole de captation/élimination de micro-organismes [0168] 1 g de billes fonctionnalisées par de la polylysinc a été réparti par colonne munie d'un fritté de porosité 45-90 p.m. Dans un premier temps, un dénombrement des suspensions mères des microorganismes testés a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaCI et étalements sur milieux géloses en boite de Petri pour les concentrations testées inférieures à 105 UFC/mL (UFC : Unité Formant Colonie). Pour les concentrations testées supérieures à 105 UFC/mL, le dénombrement a été réalisé au cytomètre. 500 FIL de suspension, à la concentration souhaitée, ont été ajoutés par colonne sachant que le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 FIL de suspension ayant traversés la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé, par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaCI, par étalements sur milieux géloses en boite de Petri. Les mêmes microorganismes ont été testés à forte et faible concentrations. Efficacité de la captation/élimination de micro-organismes [0169] Le tableau 1 suivant présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant. 21 [Tableaux 1] Espèce UFC introduites Pourcentage de captation S. aureus (3) 5.27E+06 99.78% B. cereus (4) 4.14E+05 99.49% S. enterica subsp. enterica scrovar Cho- lcracsuis (5) 8.77E+06 85.25% S. marcescetzs (8) 1.55E+07 95.41% E. (vil (9) 1.27E+07 87.91% B. cereus (15) 3.50E+05 99.88% B. ptunilus (19) 2.00E+06 100.00% B. subi élis (20) 9.45E+05 100.00% E. cloacae (25) 1.85E+07 76.21% E. faecitun (26) 6.41E+06 99.90% P. mirabilis (28) 3.83E+07 97.66% P. aeruginosa (29) 1.65E+07 97.78% S. enterica subsp. enterica serovar En- teritidis (33) 1.13E+07 82.12% C. parapsilosis (47) 3.23E+05 99.90% C. parapsilosis (106) 3.41E+05 98.10% S. aureus (3) 527 100.00% B. cereus (4) 41 100.00% S. enterica subsp. enterica scrovar Cho- lcracsuis (5) 877 86.51% S. tnarcescens (8) 1555 91.16% E. coli (9) 1273 86.20% B. cereus (15) 35 100.00% B. ptunilus (19) 200 100.00% B. subtilis (20) 95 100.00% E. cloacae (25) 1845 74.14% E. faeciunt (26) 641 100.00% P. rnirabilis (28) 3832 79.37% P. aeruginosa (29) 1655 97.69% S. emerica subsp. enterica scrovar En- tcritidis (33) 1127 80.02% C. parapsilosis (47) 32 100.00% C. parapsilosis (106) 34 100.00% [0170] Tableau 1 Résultats de la captation de microorganismes [0171] Exemple 9 E. coli : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre [0172] 420 mg de billes de verre 30-50 pm ont été ajoutés par boite de Petri 90 mm vide. 10 naL de poly-L-lysine (400 lysines par chaine de poly-L-lysine) à 0.01 % (w/v) ont été ajoutés par boite de Petri. Après homogénéisation, les boites de Petri ont ensuite été laissées ouvertes pendant 17h sous la ventilation d'un PSM (Poste de Sécurité Micro-biologique) afin de faire évaporer l'eau. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine ont été prêtes à l'emploi. Tous les contenus des boites de Petri ont été réunis dans une seule afin d'homogénéiser la production. Protocole de captation/élimination de micro-organismes [0173] 300 g de billes fonctionnalisées à la polylysine ont été réparti par colonne munie d'un fritté de porosité de 20 pm. Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'E. cou CIP 54.8 testée a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaC1 et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri. La dilution au dixième devant être testée a également été réalisée en matrices (Guinness, Lait, Nestea, Oasis, jus d'orange ou jus de pomme) et dénombrée sur boite pour évaluer l'effet matrice. 500 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne sachant que le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 p1_, de suspension ayant traversés la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaC1 et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri. Efficacité de la captation/élimination de micro-organismes en condition matrices [0174] Le tableau 2 suivant, présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant. 23 [Tablcaux2] Matrice UFC introduites Pourcentage de captation Eau physiologique 0.85% NaC1 2.39E+03 100.00% Guinness 2.55E+03 100.00% Lait 2.31E+03 100.00% Nestea 2.38E+03 100.00% Oasis 2.36E+03 100.00% Jus d'orange 2.05E+03 100.00% Jus de pomme 2.41E+03 100.00% 101751 Tableau 2 Résultats de la captation d'E. cou ClP 54.8 101761 Exemple 10 E. Cuti: Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 101771 312 mg de billes de verre 105-150 pm ont été ajoutés dans une boite de Petri 90 mm vide. 2 mL de poly-D-lysine (250 lysines par chaine de poly-D-lysine) à 0.01 % (w/v) ont été ajoutés. Après homogénéisation, la boite de Petri a été laissée ouverte pendant 17h sous la ventilation d'un PSM (Poste de Sécurité Microbiologique) afin de faire évaporer l'eau. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine ont été prêtes à l'emploi. Protocole de captation/élimination de micro-organismes 101781 20 et 25 mg de billes fonctionnalisées à la polylysine ont été répartis dans deux colonnes séparées munies d'un fritté de porosité de 20 pm. Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'E. (vil ClP 54.8 testée a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaC1 et étalements sur milieux géloses en boite de Petri. 350 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne sachant que le procédé de captation est maximisé par agitation manuelle de 15 min à température ambiante. Après 15 min d'agitation, la colonne munie d'un tube collecteur a subi une centrifugation de 15 s à 1500 x g. Un dénombrement du perméat a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaCI et étalements sur milieux géloses en boite de Petri. Efficacité de la captation/élimination de micro-organismes en condition matrices [0179] Le tableau 3 suivant présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant. 24 [Tablcaux3] Colonne UFC introduites Pourcentage de captation 1 (20 g) 4.33E+03 85.15% 2 (25 g) 4.33E+03 85.00% [0180] Tableau 3 Résultats de la captation d'E. cou i CIP 54.8 [0181] Exemple 11 E. Coli : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre [0182] 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 !.tin ont été répartis dans des colonnes de 0.8 inL 142.8 ML de poly-L-lysine (10 lysines par chaine de poly-L-lysine) à 0.5% (w/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et la polylysine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min, Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la polyL-lysine ont été prêtes à l'emploi. Protocole de captation/élimination de micro-organismes [0183] Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'E. coli CIP 54.8 testée a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri. 500 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaCl et étalements sur milieux eélosés en boite de Petri. Protocole d'élution [0184] 7 élutions successives au NaCl 1M de 500 pL chacune ont été réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en flux sans temps de contact prolongé de la solution et à 50 mbar de dépression. Les éluats ont été collectés dans un tube à l'aide du système de chambre à vide. Efficacité du couple captation/élution [0185] Le tableau 4 suivant, présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant. [Tableaux4] Colonne UFC introduites Pourcentage de captation 1 1.21E+07 99.06% 2 1.21E-F07 99.23% 3 1.21E+07 99.21% [0186] Tableau 4 Résultats de la captation d'E. cou i C1P 54.8 [0187] Lc tableau 5 suivant présente la colonne et le taux d'élution correspondant [Tableaux 5] Colonne Pourcentage d'élution 1 89.99% 2 90.30% 3 92.36% [0188] Tableau 5 Résultats dc l'élution d'E. co/i CIP 54.8 [0189] Exemple 12 Bacillus subtilis : Protocole de fonctionnalisation des billes de Verre [0190] 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 pm ont été répartis dans des colonnes de 0.8 mL 142.8 pL de poly-L-lysine (10 lysines par chaîne de poly-L-lysine) à 0.5% (w/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et la polylysine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la polyL-lysine ont été prêtes à l'emploi. Protocole de captation/élimination de micro-organismes [0191] Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère de Bacillus subtilis ATCC 11774 testée a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaC1 et cytométrie. 500 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométrie. Protocole d'élution [0192] 2 élutions successives à la trypsine 0.05% - EDTA 1X (en PBS sans Calcium, sans Magnésium, avec Rouge de Phénol) de 500 pL chacune ont. été réalisées par colonne. La première élution a été réalisée en respectant un temps de contact de 15 min à 37°C. 26 La suivante a été réalisée en flux sans temps de contact prolongé de la solution et à 50 mbar de dépression. Les éluats ont été collectés dans un tube à l'aide du système de chambre à vide. Efficacité du couple captation/élution [0193] Le tableau 6 suivant présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant. [Tableaux6] Colonne UFC introduites Pourcentage de captation B. subtilis (n=8) 9.11E-F06 87.70% [0194] Tableau 6 Résultats de la captation de Bacillus subtilis [0195] Le tableau 7 suivant présente la colonne, le microorganisme et le taux d'élution cor- respondant. [Tableaux?] Colonne Pourcentage d'élution B. subtilis (n=1) 89.50% 101961 Tableau 7 Résultats de la captation de Bacillus subtilis 101971 Exemnle 13 Staahslococcus aureus : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre [0198] 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 !.tna ont été répartis dans des colonnes de 0.8 mL 142.8 gL, de poly-L-lysine (10 lysines par chainc de poly-L-lysine) à 0.5% (w/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et la polylysine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la polyL-lysine ont été prêtes à l'emploi. Protocole de captation/élimination de micro-organismes [0199] Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère de Staphylococcus aureus testée a été réalisé, par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaC1, en cytométrie. 500 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométric. Protocole d'élution 27 [0200] 3 élutions successives à la trypsine 0.05% - EDTA 1X (en PBS sans Calcium, sans Magnésium, avec Rouge de Phénol) de 500 !IL chacune ont été réalisées par colonne. Les trois élutions ont été réalisées en respectant un temps de contact de 15 min à 37°C. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les éluats ont été collectés dans un tube à l'aide du système de chambre à vide. Efficacité du couple captation/élution [0201] Le tableau 8 suivant présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant. [Tableaux8] Colonne UFC introduites Pourcentage de captation S. aureus (n=3) 1.11E+07 99.72% [0202] Tableau 8 Résultats de la captation de Staphylococcus aureus [0203] Le tableau 9 suivant présente la colonne, le microorganisme et le taux d'élution cor- respondant. [Tableaux9] Colonne Pourcentage d'élution S. aureus (n=1) 96.06% 102041 Tableau 9 Résultats de l'élution de Staphylococcus aureus 102051 Exemnle 14 Stanhvlococcus marcescens : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre [0206] 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 pli ont été répartis dans des colonnes de 0.8 mL munies d'un fritté de 20-50 pm de porosité. 500 pL de poly-L-lysine (10 lysines par chainc de poly-L-lysine) à 0.166% (w/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté entre les billes et la polylysine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 2 mL (4 x 500 pL) d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine ont été prêtes à l'emploi. Protocole de captation/élimination de micro-organismes [0207] Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère de Staphylococcus marcescems testée a été réalisé, par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaCI, en cytométrie. 500 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométric. 28 Protocole d'élution [0208] 5 élutions successives utilisant des solutions différentes ont été réalisées. Les 5 solutions et les conditions suivantes ont été utilisées : [0209] Elution 1 : Sodium citrate 1% - EDTA 0.1% (3,5 mL) puis eau physiologique 0.85% NaCI (0.5 mL) [0210] Elution 2 : Trypsine 2.5% (0.5 mL, 30 min à température ambiante) [0211] Elution 3 : NaCI 1M (4 mL) [0212] Elution 4: Pluronic 0.01 % mL) [0213] Elution S : Acide acétique 1 % (4 mL) [0214] L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les éluats ont été collectés dans des tubes différents à l'aide du système de chambre à vide. Efficacité du couple captation/élution [0215] Le tableau 10 suivant présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant. [Tableaux10] Colonne UFC introduites Pourcentage de captation S. marcescens (n=2) 1.44E+07 91.97% [0216] Tableau 10 Résultats de la captation de Staphylococcus marcescens [0217] Le tableau 11 suivant présente la colonne, le microorganisme et le taux d'élution cor- respondant. I Tableaux 1 1 Colonne Pourcentage d'élution S. marcescens (n=1) 73.66% [0218] Tableau 11 Résultats de l'élution de Staphylococcus marcescens [0219] Exemple 15 Fusarium oxysporum : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre [0220] 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 gin sont répartis dans des colonnes de 0.8 mL 142.8 ML de poly-L-lysine (10 lysines par chaine de poly-L-lysine) à 0.5% (w/v) sont ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min est respecté entre les billes et la polylysine. La solution est ensuite éliminée à l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne est réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe est ensuite réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la polyL-lysine sont prêtes à l'emploi. 29 Protocole de captation/élimination de micro-organismes [0221] Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère Fusarium o tysporum testée est réalisé en cytométrie en flux par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaCI. 5001AL de suspension à la concentration souhaitée sont ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats est réalisé en cytométric en flux pour déterminer le taux de Fusarium oxysportan capté (réalisation de dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0.85% NaCI). Protocole d'élution [0222] 3 élutions successives à la trypsine 0.05% - EDTA 1X (en PBS sans Calcium, sans Magnésium, avec Rouge de Phénol) de 500 !IL chacune sont réalisées par colonne. Les trois élutions sont réalisées en respectant un temps de contact de 15 min à 37°C. L'aspiration est réalisée à 50 mbar de dépression. Les éluats sont collectés dans un tube à l'aide du système de chambre à vide. Un dénombrement des éluats en cytométrie en flux est réalisé pour déterminer le taux d'élution. 30