FR 3088823 A1 20200529 FR 1872016 A 20181128 Description Titre de l'invention : NOUVELLES DIHYDROQUINA- ZOLINONES AYANT UNE ACTIVITE PROTECTRICE VIS- A-VIS DE TOXINES AU MODE D'ACTION INTRA- CELLULAIRE, DE VIRUS ET DE BACTERIES [0001] La présente invention a pour objet une nouvelle famille de composés du type 2,3-dihydroquinazolin-4(1H)-one et leur utilisation en tant qu'inhibiteurs des effets toxiques des toxines à activité intracellulaire, comme par exemple la ricine, les toxines de Shiga et la toxine cholérique, utilisant le transport rétrograde pour intoxiquer les cellules, ou des virus ou bactéries utilisant le transport rétrograde, notamment les virus ou bactéries entrant dans les cellules par endocytose. [0002] Les toxines à activité intracellulaire qui utilisent le transport rétrograde représentent un risque majeur (le santé publique et sont associées pour certaines à plus d'un million de décès chaque année dans le monde. Ces toxines sont notamment la ricine (produite dans les graines de la plante Ricinus communis), la toxine de Shiga et les toxines Shiga-like (Stxs) produite par Shigella dysenteriae (Stx) et E. coli (Stxl et Stx2), la toxine cholérique (Ctx de Vibrio cholerae responsable du choléra), la toxine pertussique (Bordetella pertussis agent de la coqueluche), la cytotoxine subtilase et l'entérotoxine thermolabile (E. coli). [0003] La ricine est une glycoprotéine de 66 kDa composée de deux chaînes polypeptidiques reliées par un pont Bisulfure (Figure 1A). La chaîne B (RTB, lectine de 262 résidus) permet à la toxine de se lier aux glycolipides et glycoprotéines des membranes cellulaires et d'assurer son entrée dans la cellule (Figure 1A). La chaîne A (RTA, 267 acides aminés) assure la fonction enzymatique N-glycosidase (le la ricine, catalyse l'élimination de l'adénine 4324 de l'ARN 28S des cellules ciblées et provoque l'arrêt de la synthèse (les protéines. [0004] Les toxines de Shiga incluent la toxine de Shiga (Stx) produite par Shigella dys- enteriae et les toxines Shiga-like 1 (Stxl) et 2 (Stx2) produites par des souches entérohémorragiques d'E. cati. Les toxines Stx et Stxl sont à 99% identiques alors que les Stxl et Stx2 partagent seulement 56% d'identité de leur séquence en acides aminés. La sous-unité A de la toxine (StxA) porte la même activité enzymatique que la ricinc et cible de manière identique l'ARN 28S (Figure 1B). La sous-unité B (StxB), qui se présente sous forme pentamérique, permet la liaison de la toxine avec la cellule via son interaction avec le globo-triaosylcéramide Gb3, ce qui assure son internalisation et son routage intracellulaire. [0005] Après liaison à ses récepteurs membranaires, la ricine est internalisée dans ces 2 cellules par de multiples voies d'endocytose pour atteindre le réseau trans-golgien où elle est acheminée vers le réticulum endoplasmique (RE) par transport rétrograde (Johannes, L. et al., Cell 2008, 135, 1175-87). Les toxines de Shiga sont internalisécs quant à elles par une voie d'endocytose unique et atteignent également l'appareil de Golgi puis le réticulum endoplasmique (ibid.). [0006] Les toxines sont alors partiellement dépliées et la chaîne/sous-unité A est transloquée dans le cytosol (Lord, J.M. et al., Biocheinical Society Transactions 2003, 31, 1260). L'étape ultime de l'action de ces toxines a donc lieu dans le cytoplasme des cellules, les toxines se fixent sur les ribosomes avec une grande efficacité et clivent l'adénine 4324 de l'ARN 28S de la sous-unité 605 du ribosome. Cette dépurination de l'ARN 28S provoque l'arrêt de la synthèse des protéines et conduit à la mort cellulaire. [0007] Pour contrer la menace posée par ces toxines, plusieurs types d'antitoxines ont été développés : anticorps neutralisants, inhibiteurs de l'activité enzymatique (petites molécules, analogues de substrat), mimes solubles de récepteurs et composés chimiques agissant sur les cellules ciblées par la toxine. [0008] Ces dernières années, la recherche de nouvelles molécules visant à bloquer le routage intracellulaire des toxines à activité intracellulaire s'est accélérée. Le principal avantage de ce type de molécules est leur activité de type large spectre puisque ces molécules peuvent protéger efficacement les cellules contre les différentes toxines qui utilisent la voie rétrograde. [0009] Dans le cadre de ses recherches sur des composés bloquant le transport rétrograde et plus particulièrement d'études sur des composés plus avantageux que ceux des travaux précités, la Demanderesse a identifié une nouvelle famille de composés dérivés de 2,3-dihydroquinazolin-4(111)-one, portant un phényle spécifiquement substitué en position ortho ou méta, qui présentent de manière inattendue une activité biologique supérieure à celle de Retro-2.1, la plus active des molécules déjà décrites, et donc un intérêt marqué pour la prévention et/ou le traitement des intoxications à au moins une toxine à mode d'action intracellulaire utilisant le transport rétrograde pour infecter les cellules eucaryotes de mammifères, mais également pour la prévention et/ou le traitement des intoxications à des virus ou bactéries utilisant le transport rétrograde, notamment les virus ou bactéries entrant dans les cellules par endocytose, ou à des parasites intracellulaires. [0010] Ainsi, la présente invention se rapporte à un composé de formule générale (I) : [0011] 3 [Chem.1] (T) [0012] où : [0013] -p est égal à 1, 2 ou 3 ; [0014] - RI représente à chaque occurrence, de façon indépendante, un atome d'hydrogène, un atome d'halogène ou un radical alcoxy de 1 à 3 atomes de carbone, notamment un groupe méthoxy ; [0015] - R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe choisi parmi H, -OH, -S02-NH,, à la condition que l'un au moins de R2 et R3 ne représente pas H; [0016] ainsi que les formes stéréoisomères, les mélanges de formes stéréoisomères ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables. [0017] Selon un mode de réalisation, R3 représente un atome d'hydrogène. Le composé de formule générale (I) selon l'invention est alors de formule suivante [0018] [Chem.2] [0019] Selon un mode de réalisation, R, représente un atome d'hydrogène. Le composé de formule générale (I) selon l'invention est alors de formule suivante : [0020] [Chem.3] 100211 Selon un mode de réalisation, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe choisi parmi -OH, -NH,, -S02-NH2, R2 et R5 représentant notamment-OH. [0022] Selon un mode de réalisation, p est égal à 1. [0023] Selon un mode de réalisation, le composé de formule générale (I) selon l'invention est de formule suivante : [0024] [Chem.4] [0025] R1, R, et R3 étant tels que définis précédemment, R2 et R3 représentant notamment, in- dépendamment l'un de l'autre, un groupe choisi parmi -OH, -NH2, -S02-NH2, R, et R3 représentant par exemple -OH. [0026] Selon un mode de réalisation particulier, le composé de formule générale (I) selon l'invention est de formule suivante : [0027] [Chem.5] [0028] Selon un mode de réalisation particulier, le composé de formule générale (I) selon l'invention est de formule suivante : [0029] [Chem.6] [0030] Selon un mode de réalisation, RI représente un atome d'halogène, en particulier un atome de fluor. [0031] Selon un mode de réalisation, le composé de formule générale (I) selon l'invention est de formule (Ia) suivante : 100321 (la). 100331 Selon un mode de réalisation, le composé de formule générale (I) selon l'invention est de formule (lb) suivante : 100341 IChem.81 (Ib). [0035] Selon un mode de réalisation, le composé de formule générale (I) selon l'invention est choisi parmi : [0036] [Chem.9] [Chcm.7] R, 0 [0037] Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique ou mé- 6 dicamcnt comprenant au moins un composé de formule générale (I) tel que défini précédemment, en tant que principe actif, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ladite composition pharmaceutique ou ledit médicament étant notamment adapté à une administration par les voies aérienne, orale, parentérale ou locale. [0038] Il est à noter que tous les modes de réalisation mentionnés ci-dessus à propos du composé de formule générale (1) s'appliquent également ici, seuls ou en combinaison. [0039] Selon un autre aspect, l'invention concerne un composé de formule générale (1) tel que défini précédemment, pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement des désordres induits par les toxines à mode d'action intracellulaire utilisant le transport rétrograde, ou par les virus ou bactéries utilisant le transport rétrograde, notamment les virus ou bactéries entrant dans les cellules par endocytose, ou par des parasites intracellulaires. [0040] Il est à noter que tous les modes de réalisation mentionnés ci-dessus à propos du composé de formule générale (1) s'appliquent également ici, seuls ou en combinaison. [0041] Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un composé de formule générale (1) tel que défini précédemment, pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement des désordres induits par les toxines à mode d'action intracellulaire utilisant le transport rétrograde. [0042] Selon un mode de réalisation particulier, lesdites toxines à mode d'action intra- cellulaire utilisant le transport rétrograde sont choisies parmi la ricins, la toxine de Shiga et les toxines Shiga-like (Stxs) produite par Shigella dysenteriae (Stx) et E. soli (Stxl et Stx2, Stx, Stxla, Stx2a, Stx2c, Stx2d, tels que décrites par exemple par Melton-Celsa, Microbiol Spectr. 2014 ; 2(2)), la toxine cholérique (Ctx de Vibrio cholerae responsable du choléra), la toxine pertussique (Bordetella pertussis agent de la coqueluche), la cytotoxine subtilase et l'entérotoxine thermolabile (E. coli). [0043] Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un composé de formule générale (I) tel que défini précédemment, pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement des désordres induits par les virus ou bactéries utilisant le transport rétrograde, notamment les virus ou bactéries entrant dans les cellules par endocytose, ou les parasites intracellulaires. [0044] Selon un mode de réalisation particulier, les virus sont les virus pox, notamment le virus de variole et le virus Vaccinia, les cytomégalovirus, les adénovirus, notamment les virus adéno-associés, en particulier de sérotype 2, les polyomavirus, notamment le polyomavirus JC et le polyomavirus BK, les papillomavirus, les filovirus, notamment les virus Ebola et le virus Marburg, les entérovirus, notamment l'entérovirus 71, les virus de l'herpès, notamment le virus Herpes simplex de type 2, les virus du genre Arenavirus, notamment le virus de la chorioméningite lymphocytaire, les virus de la grippe, notamment les influenzavirus A. 7 100451 Selon un mode de réalisation particulier, les bactéries sont des bactéries de l'ordre des Chlamydiales, en particulier du genre Chlamydia, telles que Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psyttaci, ou Symkania, comme Syrnkania negevensis. [0046] Selon un mode de réalisation particulier, les désordres induits par les parasites intra- cellulaires sont la leishmaniose, notamment induite par des trypanosomes du genre Leishmania, en particulier Leishmania infamant, Leishmania clonottani ou Leishmania itzfantunt/donorani hybrid. [0047] La présente invention sc rapporte également à une méthode de prévention et/ou de traitement des désordres induits par les toxines à activité intracellulaire utilisant le transport rétrograde et comprenant l'administration d'une quantité efficace d'au moins un composé de formule générale (1) tel que défini précédemment. [0048] Il est à noter que tous les modes de réalisation mentionnés ci-dessus à propos du composé de formule générale (I) s'appliquent également ici, seuls ou en combinaison. Synthèse [0049] Les composés de la présente invention peuvent être préparés selon des méthodes bien connues de l'homme du métier, y compris, mais sans s'y limiter, celles qui sont décrites ci-dessous, ou par des modifications de ces méthodes en appliquant des techniques standard connues de l'homme du métier de la synthèse organique. Les modifications et les substitutions appropriées seront bien connues, facilement apparentes, ou facilement accessibles de la littérature scientifique à l'homme du métier. En particulier, on peut trouver de telles méthodes dans R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH Puhlishers, 1999. [0050] Tous les procédés divulgués dans le cadre de la présente invention sont envisagés pour être pratiqués à n'importe quelle échelle, y compris le milligramme, le gramme, le multigramme, le kilogramme, le multikilogramme ou l'échelle industrielle commerciale. [0051] 11 est à noter que les composés de la présente invention peuvent comprendre un atome de carbone asymétriquement substitué, et peuvent être isolés sous des formes optiquement actives ou racémiques. Ainsi, toutes les formes chirales, diastéréoisomères, racémiques, isomères d'une structure sont envisagées, à moins que la stéréochimie ou la forme isomère spécifique ne soit spécifiquement indiquée. Il est bien connu de préparer et d'isoler de telles formes optiquement actives. Par exemple, les mélanges de stéréoisomères peuvent être séparés par des techniques standard, y compris, mais sans s'y limiter, la résolution des formes racémiques, la chromatographie classique, en phase inverse et chirale, la formation préférentielle de sel, la recristallisation et autres, ou par synthèse chirale à partir de matières premières chirales ou par synthèse délibérée des centres chiraux cibles. 8 [0052] Les composés de la présente invention peuvent être préparés par diverses voies syn- thétiques. [0053] Dans les réactions décrites ci-après, il peut être nécessaire de protéger les groupes fonctionnels réactifs, par exemple les groupes hydroxy, amino ou thio, lorsque ceux-ci sont présents dans le produit final, afin d'éviter leur participation à des réactions secondaires, non désirées. Les groupes de protection conventionnels peuvent être utilisés conformément à la pratique courante, par exemple, voir T.W. Greene and P. G. M. Wuts in Protective Groups in Organic Chemistry, 3a, cd., John Wilcy and Sons, 1999; J. F. W. McOmie in Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, 1973. [0054] Les réactifs et les composés de départ sont disponibles sur le marché, ou facilement synthétisés par des techniques bien connues de l'homme du métier. Tous les substituants, sauf indication contraire, sont tels que définis précédemment. [0055] Les composés de formule générale (1) peuvent être obtenus selon la réaction suivante : [0056] [Chem. 1 0] [0057] Cette réaction peut notamment être réalisée dans un solvant organique. [0058] Selon un mode de réalisation, les trois composés de départ sont mélangés dans un solvant organique, notamment l'acide acétique. [0059] Selon un mode de réalisation, le solvant organique est chauffé, notamment au reflux ou sous irradiations microondes, par exemple à une température comprise de 100°C à 180°C, en particulier de 110°C à 140°C, plus particulièrement de 120°C à 130°C. [0060] La durée du chauffage est comprise de 10 minutes à 6 heures, notamment de 30 minutes à 5 heures, en particulier de 1 heure à 4 hcurcs, plus particulièrement de 2 à 3 heures. [0061] R, et p sont tels que définis plus haut. [0062] R2' et 12.3' correspondent respectivement aux groupes R2 et R3, ou à des groupes de protections ad hoc. 9 100631 Selon un mode de réalisation, R2' et R3' représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe choisi parmi H, -OH, -NO2. -S0,-NH,, à la condition que l'un au moins de R, et R3 ne représente pas H. [0064] Selon un mode de réalisation particulier, lorsque R2' et/ou R3' représentent -NO2. R2' et/ou R3' sont alors converti en R3 et/ou R3 = -NEL, notamment par l'une des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple par action de zinc au contact d'acide acétique. Définitions [0065] Tel qu'on l'utilise dans la présente description, le terme « environ » se réfère à un in- tervalle de valeurs de ± 10 °k d'une valeur spécifique. A titre d'exemple, l'expression « environ 120 mg » comprend les valeurs de 120 mg ± 10 %, soit les valeurs de 108 mg à 132 mg. [0066] Au sens de la présente description, les pourcentages se réfèrent à des pourcentages en poids par rapport au poids total de la formulation, sauf indication contraire. [0067] Tel qu'on l'entend ici, les plages de valeur sous forme de « x-y » ou « de x à y » ou « entre x et y » incluent les bornes x et y ainsi que les entiers compris entre ces bornes. A titre d'exemple, « 1-5 », ou « de 1 à 5 » ou « entre 1 et 5 » désignent les entiers 1, 2, 3, 4 et 5. Les modes de réalisations préférés incluent chaque entier pris individuellement dans la plage de valeur, ainsi que toute sous-combinaison de ces entiers. A titre d'exemple, les valeurs préférées pour « 1-5 » peuvent comprendre les entiers 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-3, 2-4, 2-5, etc. [0068] Tel qu'il est utilisé ici, le terme «sel pharmaceutiquement acceptable» se réfère à des sels qui sont, dans la portée d'un jugement médical sensé, appropriés pour le contact avec les tissus d'êtres humains et d'animaux sans toxicité excessive, irritation, réponse allergique, ou autres complications problématiques en proportion avec un rapport bénéfice / risque raisonnable. [0069] Par sel pharmaceutiquement acceptable des composés de formule générale (I), on entend notamment les chlorhydrates, bromhydrates, sulfates ou bisulfates, phosphates ou hydrogénophosphates, acétates, oxalates, benzoates, succinctes, fumarates, maléates, lactates, citrates, tartrates, gluconates, méthanesulphonates, benzène-sulphonates et paratoluène-sulphonates. [0070] Par atome d'halogène, on entend les éléments chimiques du groupe VII du tableau périodique des éléments, notamment, le fluor, le chlore, le brome et l'iode. [0071] Le terme radical alkyle de 1 à 3 ou 4 atomes de carbone désigne un radical hydrogé- nocarboné, linéaire ou ramifié ; on peut citer par exemple le méthyle, l'éthyle, le propyle, l'isopropyle ou le tertiobutyle. Brève description des dessins 100721 Ifig.11 La Figure 1 représente les structures cristallographiques de la ricine (A, dont le nom dans la base de données des structures cristallographiques est pdb 2AA1) et de la Stx2 (B, pdb 1R4P). [0073] [fig.2] La Figure 2 est une représentation schématique du test cellulaire mis en oeuvre dans la partie expérimentale. [0074] [fig.3] La Figure 3 illustre la méthode de calcul de l'IC50 réalisée dans la partie II des exemples ; les courbes de toxicité sont réalisées en l'absence d'inhibiteur (Contrôle) puis en présence d'inhibiteur à différentes concentrations. EXEMPLES I. Synthèse de composés selon l'invention [0075] Tous les produits chimiques et solvants utilisés dans les synthèses sont de grade réactif et ont été utilisés sans purification supplémentaire. Le CH2C1, a été distillé sur hydrure de calcium avant utilisation. La verrerie a été séchée à la flamme sous vide et refroidie sous azote à température ambiante. Toutes les réactions ont été effectuées sous azote sec et contrôlées par TLC. [0076] La purification a notamment été réalisée sur un CombiFlash avec un détecteur UV- vis et des colonnes RediScp. Les échantillons ont notamment été adsorbés sur de la Célitc ou de la silice et chargés dans des cartouches à charge solide. Un gradient acétate d'éthyle/cyclohexane ou méthanol/dichlorométhane a notamment été utilisé. Les fractions ont notamment été collectées sur la hase d'une détection à 254 nm. [0077] L'analyse et la purification par CLHP-SM ont notamment été effectuées à l'aide d'un système Waters (modifie de gradient binaire 2525, dégazeur en ligne, gestionnaire d'échantillons 2767, détecteur à barrettes de photodiodes 2996) avec un système binaire pour le gradient de solvant. L'éluant était en particulier un gradient de (99,9 % eau / 0,1 % HCOOH) et (99,9 % McCN / 0,1 % HCOOH) ou (99,9 % eau / 0,1 °k HCOOH) et (99,9 % Me01-1/ 0,1 % HCOOH). Chaque composé a été déposé sur une colonne Zorbax SB-C18 de 100-4.6tnm (5mm) équilibrée avec 1-120/MeCN ou 1-12 0/ Me0H 95:5. [0078] Ce système a été par exemple couplé à un système Waters Micromass ZQ avec un analyseur quadripolaire ZQ2000. L'ionisation a été réalisée par électropulvérisation et les autres paramètres étaient les suivants : température de la source 120 °C, tension du cône 20 V, et injection continue de l'échantillon à un débit de 0,3 mL par min. Les spectres de masse ont été enregistrés en mode ion positif et négatif dans la plage miz 100-2000 et traités avec le logiciel Mass Lynx 4.0. 11 100791 Les spectres infrarouges ont notamment été enregistrés sur un Spectrum Two équipé d'un UATR Two (Perkin Elmer), DiamondlZnSe (1 réflexion). [0080] Les analyses RMN ont notamment été réalisées sur un spectromètre Brukcr Avance 400 Ultrashicld. Les spectres 1H-NMR et 13C ont été enregistrés à température ambiante à 400 MHz et 100 MHz respectivement, les échantillons ont été dissous dans du DMSO-d6 ou CDCI3 à une concentration d'environ 5 mM. Le signal singulet DMSO a été réglé à 2,50 ppm. Les déplacements chimiques sont donnés en ppm et les constantes de couplage en Hz. Les données spectrales sont cohérentes avec les structures associées. Préparation du composé 1 Synthèse du précurseur nitro 1' [0081] [Chcm.11[ 0214 Ac:rde acélique, r p-ondes [0082] [Tableauxl] Réactifs éq. M (g/mol) d n (mmol) m (mg) V (mL) Anhydride 1 195.15 / 1 195 / 5-fluoro-N-méthylisatoïqu e 2-nitroaniline 1 138.13 / 1 138 / 5-(2-méthy1-1.3-thiazol-4- y1)-2-thiophenecarbaldéhy de 1 209.00 / 1 209 / Acide acétique / / / / / 2 [0083] Le mélange a été agité à 120°C pendant 3 heures sous irradiation micro-ondes. Le résidu a été dissous dans de l'Et0Ac et lavé successivement avec une solution saturée de NaHCO1 (trois fois), de la saumure (deux fois) et de l'eau (une fois). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée. Le résidu a été purifié par chromatographie (dépôt solide), éluée par un mélange cyclohexane/EtOAc : 9/1 -> 1/1 (rendement : 62%). Synthèse du composé 1 [0084] IChem.121 12 [0085] [Tableaux2] Réactifs éq. M (g/mol) n (mmol) m (mg) V (mL) Y 1 480.07 0.44 273 / Zn 30 65.39 13.2 860 / EtOH / / / / 10 H2O / / / / 1.8 AcOH / / / / 0.9 [0086] Le mélange a été agité une nuit à température ambiante, à l'abri de la lumière. [0087] Le résidu obtenu a été purifié par chromatographie (dépôt solide), éluée par un mélange cyclohexane/EtOAc : 95/5 -> 0/1, puis reprécipité par dissolution dans le minimum d'EtOAc et ajout de pentane (rendement : 63%). [0088] RMN 'H (CDC11) : 2,69 (s, 3H) ; 2,91 (s, 3H) ; 4 (s large, 2H) ; 5,76 (s, 1H) ; 6,54 (dd, 1H, J: 4, J: 8,9) ; 6,60 (td, 1H, J: 1.3, J: 7,8) ; 6,66 (d, 1H, J: 3,7) ; 6,75 (dd, 1H, J: 1.2, J: 8) ; 6,84 (dd, 1H, J: 1.4, J: 7,9) ; 7-7.1 (m, 3H) ; 7,1 (dd, 1H, J: 3.1, J: 8,7) ; 7.72 (dd, 1H, J: 3, J: 8,6). [0089] RMN (CDCh) : 19,1 ; 36 ; 76,2 ; 111,9 ; 114.4 (d, J: 7,1), 115.5 (d, J: 24) ; 116,7 129,2 ; 129,5 ; [0090] LC/MS : temps de rétention : 3,23 min [0091] M+H. : 451,4. Préparation du composé 2 [0092] [Chem.13] ; 118,8 (d, J: 7,4) ; 118,9 ; 121,3 (d, J: 23,1) ; 122,7 ; 125,2 ; 128,3 ; 137,8 ; 138,6 ; 142 ; 143,1 ; 148,7 ; 156,6 (d, J: 239) ; 161 ; 166,4. N1-12 130t 2h OH - [0093] 13 ITableaux3I Réactifs éq. M (g/mol) n (mmol) m (mg) V (mL) Anhydride 1 195.03 1 195 / 5-fluoro-N-méthylisatoïque 2-aminophénol 1 109.13 1 109 / 1 209.00 1 209 / 5-(2-méthy1-1,3-thiazol 4 2 yl) thiophènecarbaldéhyde Acide acétique / / / / 2 [0094] Le mélange a été agité à 130°C pendant 2 heures. Le résidu a été dissous dans de l'EtOAc et lavé successivement avec une solution saturée de NaHCO3 (trois fois), de la saumure (deux fois) et de l'eau (une fois). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée. Le résidu a été purifié par chromatographie (dépôt solide), éluée par un mélange cyclohexandEt0Ac : 95/5 -> 1/1, puis reprécipité par dissolution dans le minimum d'EtOAc et ajout de pentane (rendement : 25%). [0095] RMN 'H (DMSO-d6) : 2,62 (s, 3H) ; 2,9 (s, 3H) ; 6,16 (s, 1H) ; 6,75 (td, 1H, J : 1,3, J : 7,7) ; 6,79 (dd, 1H, J : 4, J : 9) ; 6,93-7.01 (ni, 3H) ; 7,15 (td, 1H, J : 1,7, J : 7,5) ; 7,28 (d, 1H, J : 3,6) ; 7,35 (td, 1H, J : 3,2, J : 8,8) ; 7,58 (dd, 1H, J : 3,1, J : 8,8) ; 7,71 (s, 1H). [0096] RMN PC (DMSO-d6) : 18,5 ; 35,5 ; 75,3 ; 112,7 ; 113,7 (d, J : 23,6) ; 115 (d, J : 7) ; [0097] [0098] LC/MS : temps de rétention : 3,24 min [0099] M+H. : 452,4. Préparation du composé 3 [0100] [Chem.14] Acide id 2.ft Ll-crd o 116,7 ; 117,8 (d, J : 7) ; 118,8 ; 121.1 (d, J : 23,1) ; 122,6 ; 126,2 ; 128,3 ; 128,7 ; 129,9 ; 137,6 ; 139 ; 143,3 ; 147,8 ; 152,6 ; 155,3 (d, J : 235) ; 159,5 ; 165,9. IR : 1646 ; 1496 ; 1450 ; 1163 ; 806 ; 740 101011 14 ITableaux41 Réactifs Formule Masse mo- léculaire Masse (g) Volume (mL) n (mmol) Anhydride N- C6H4FNO 3 195,15 0,195 / 1.0 méthyl-5-fluoroisatoïqu c 3-aminophénol C61-17N0 109,13 0,109 / 1,0 5-(2-methy1-1,3-thiazol -4-y1)-2-thiophènecarba ldéhyde C9H7NOS 2 209,28 0,209 / 1,0 Acide acétique C2H402 60,05 / 2,00 / [0102] Le mélange a été agité à 130°C pendant 2 heures. Le résidu a été dissous dans de l'Et0Ac et la phase organique lavée successivement avec une solution saturée de NaHCO, et de Peau distillée. La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous vide. Le solide brun ainsi obtenu a été lavé avec une petite quantité d'EtOAc chaud pour donner une poudre jaune (17%). [0103] RMN 'H (DMSO-d6) : 2,62 (s, 3H) ; 2,95 (s, 3H) ; 6,43 (s, 1H) ; 6,7- 6,78 (m, 3H) ; 6,81 (dd, 1H, J : 4,2, J : 9) ; 6,97 (d, 1H, J : 3.7) ; 7,20 (t, 1H, J : 8) ; 7,33 ( d, 1H, J : 3,6) ; 7,36 (dd, 1H, J : 3, J : 8,8) ; 7,61 (dd, 1H, J : 3, J : 8,8) ; 7,71 (s, 1H). [0104] RMN (DMSO-d6) : 18,5 ; 35,4 ; 76 ; 112,8 ; 113,7 ; 113,7 (d, J : 23) ; 114 ; 115,4 (d, J : 7) ; 116,8 ; 118 (d, J : 7) ; 121.3 (d, J : 23) ; 122,9 ; 128,2 ; 129,5 ; 137,7 ; 138,7 ; 140,8 ; 143,2 ; 147,7 ; 155,5 (d, J : 235) ; 157,6 ; 159,8 ; 166. [0105] IR : 3161 (large) ; 1612 ; 1499 ; 1452 ; 1187 ; 1156 ; 795 ; 766 ; 730. [0106] LC/MS : temps de rétention = 3,16 min. [0107] M+H. : 452,3. Préparation du composé 4 Synthèse du précurseur nitro 4' [0108] [Chem.15] 1'2Q0 vende$ [0109] ITableaux51 Réactifs éq. M (g/mol) n (mmol) m (mg) V (mL) Anhydride N-méthylisatoïque 1 177,04 1 177 / 2-n itroan il ine 1 138,13 1 138 / 5-(2-méthy1-1,3-thiazol-4-y1) -2-thiophènecarbaldéhyde 1 209,00 1 209 / Acide acétique / / / / 2 [0110] Le mélange a été agité à 120°C pendant 3 heures sous irradiation micro-ondes. Le résidu a été dissous dans de l'Et0Ac et lavé successivement avec une solution saturée de NaHCO3 (trois fois), de la saumure (deux fois) et de l'eau (une fois). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous vide. Le résidu a été purifié par chromatographie (dépôt solide), Muée par un mélange cyclohexanc/Et0Ac : 9/1 -> 1/1 (rendement : 49%). Synthèse du composé 4 [01 1 1] [Chem.] 6] Zn, Ac .H EtOki, H41) [0112] [Tableaux6] Réactifs éq. M (g/mol) n (mmol) m (mg) V (mL) 4' 1 462,08 0,79 365 / Zn 30 65,39 30 1500 / EtOH / / / / 10 H2O / / / / 1,8 AcOH / / / / 0,9 [0113] Le mélange a été agité une nuit à température ambiante, à l'abri de la lumière. [0114] Le résidu obtenu a été purifié par chromatographie (dépôt solide), éluée par un mélange cyclohexane/EtOAc : 95/5 -> 0/1, puis reprécipité par dissolution dans le minimum d'EtOAc et ajout de pentane (rendement : 81%). 16 101151 RMN 'H (DMSO-d6) : 2,62 (s, 3H) ; 2,90 (s, 3H) ; 5,04 (s, 2H) ; 5,97 (s, 1H) ; 6,48 (td, 1H, J : 1,2, J : 7,3) ; 6,68 (dd, 1H, J : 1,2, J : 7,7) ; 6,77 (d, 1H, J : 8,2) ; 6 ; 6.87 (dd, 1H, J : 1, J : 8) ; 6,9-6,96 (m, 2H) ; 7,03 (td, 1H, J : 1,3, J : 8,4) ; 7,3 (d, 1H, J : [0116] [0117] LUMS : temps de rétention = 3,18 min. [0118] M+H. :433,4. Préparation du composé 5 [0119] [Chem.17] 3,6) ; 7,48 (td, 1H, J : 1,5, J : 8,6) ; 7,72 (s, 1H) ; 7,88 (dd, 1H, J : 1,5, J : 7,7). RMN 13C (DMSO-d6) : 18,5 ; 34,9 ; 74,5 ; 112,7 ; 113 ; 115,9 ; 116,1 ; 117 ; 1183 ; 122,6 ; 124,2 ; 128,1 ; 128.4 ; 128,7 ; 129,4 ; 134,2 ; 137,6 ; 138,7 ; 143,8 ; 143,8 ; 146,7 ; 147,8 ; 160,9 ; 165,9. Acide e6é1ique 120c Ekhoffiies [0120] [Tableaux7] Réactifs éq. M (g/mol) n (mmol) m (mg) V (mL) 2-aminobenzènesulfonamide 1 172,20 0,4 69 / Anhydride 6-fluoro-N - méthylisatoïque 1 195,03 0,4 78 / 5-(2-méthy1-1,3-thiazol-4-y1)-2- thiophènecarbaldéhyde 1 209,28 0,4 84 / Acide acétique / / / / 1 [0121] Le mélange a été agité à 120°C pendant 2 heures sous irradiation micro-ondes. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane et lavé successivement avec une solution saturée de NaHCO3 (trois fois), de la saumure (deux fois) et de l'eau (une fois). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous vide. Le résidu a été purifié par chromatographie (dépôt solide), éluée par un mélange cyclohexane/ EtOAc : 9/1 -> 0/1, puis recristallisé dans le dichlorornéthane (rendement : 13%). [0122] RMN 'H (DMSO-d6) : 2,63 (s, 3H) ; 2,85 (s, 3H) ; 6,18 (s, 1H) ; 6,85 (dd, 1 H, J : 4,2, J : 9,1)] ; 6,89 (dd, 1H, J : 1,3, J : 7,4) ; 6,91 (d, 1H, J : 3.6) ; 7,32 (d, 1H, J : 7,6) ; 7,39 (td, 1H, J : 3,2, J : 8,7) ; 7,47 (s, 2H) ; 7,57-7,59 (m, 3H) ; 7,78 (s, 1 H) ; 8,02 (dd, 1H, .1 : 1,9, J : 7,5). [0123] RMN 17C (DMSO-d6) : 18,5 ; 35,24 ; 76,7 ; 113,09 ; 113,7 (J : 23,6) 114,9 (.1 : 7) ; 116,6 (J : 7) ; 121,6 (J : 22,9) ; 122.6 ; 128.3 ; 128.84 ; 129.4 ; 132.1 ; 132.5 ; 136.1 ; 17 [0124] 137.6 ; 138 ; 141.2 ; 143.3 ; 147.7 ; 155.1 (J : 235) ; 160.4 ; 166. IR : 3175 ; 1653 ; 1496 ; 1474 ; 1450 ; 1357 ; 1342 ; 1160 ; 821 ; 810 ; 710. [0125] LUMS : temps de rétention = 3,20 min. [0126] M+H. :515,4. Préparation du composé 6 (hors invention) [0127] [Chem.18] .A« *le 2h, 130"C d [0128] [Tableaux8] Réactifs Formule Masse mo- léculaire Masse (g) Volume (mL) n (mmol) Anhydride N- C6H4FNO 3 195,15 0,180 / 0,92 méthy1-5-11uoroisatoïqu e 4-aminophénol C6H7NO 109,13 0,100 / 0,92 5-(2-méthy1-1,3-thiazol -4-y1)-2-thioplieneearba ldéhyde C9H7NOS 2 209,28 0,192 / 0,92 Acide acétique C2H402 60,05 / 2,00 / [0129] Le mélange a été agité à 130°C pendant 2 heures sous irradiation micro-ondes. Le résidu a été dissous dans de l'acétate d'éthyle et la phase organique a été lavée successivement avec une solution saturée de NaHCO3 et de l'eau distillée. La phase organique a été séchée sur MgS0.4, filtrée et concentrée sous vide. Le solide brun ainsi obtenu a été lavé avec une petite quantité d'EtOAc chaud pour donner une poudre jaune (73%). [0130] RMN 'H (DMSO-d6) : 2,60 (s, 3H) ; 2,89 (s, 3H) ; 6,32 (s, 1H) ; 6,74-6,77 (m, 3H) ; 6,92 (s large, 1H) ; 7,06 (d, 2H, J : 8,1) ; 7,3-7,35 (m, 2H) ; 7,57 (d, 1H, J : 6,6) ; 7,72 (s, 1H) ; 9,59 (s, 1H). [0131] [0132] [0133] LC/MS : temps de rétention = 3,33 min. [0134] M+H. : 452,4. 101351 II. Mesure d'évaluation de l'activité protectrice des composés de l'invention vis- RMN15C (DMSO-d6) : 18,5 ; 35,3 ; 76,4 ; 112,8 ; 113,7 (J : 24) ; 115,2 (J : 7) ; 115,4 ; 117,9 (J : 7) ; 121.2 (J : 23) ; 122,8 ; 128 ; 128,4 ; 131 ; 137,7 ; 138,5 ; 143,3 ; 147,7 ; 155,5 (J : 235) ; 156,3 ; 159,9 ; 166. 112 : 3216 (large) ; 1630 ; 1513 ; 1498 ; 1267 ; 1163 ; 888 ; 811 ; 737 ; 711. 18 à-vis de la toxine de Shiga Protocole et calcul de PICS° 101361 Les composés ont été testés soit sur cellules A549 (cellules épithéliales pulmonaires humaines) soit sur cellules HeLa (cellules de cancer utérin humain), contre les toxines de Shiga (Stx-1 et/ou Stx-2). Les cellules humaines sont cultivées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 sur des flasques de culture de 150 cm'- dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modificd Eagle Medium) contenant 100 U/mL de pénicilline et 100 pg/mL de streptomycine. Les cellules sont ensemencées à une densité de 50000 cellules par puits dans des plaques 96 puits à fond en scintillant solide Cytostar-T (Figure 2). Les cellules (100 pL dans du DMEM complet: DMEM + 10% de sérum de veau foetal, SVF) sont pré-incubées ou non avec les inhibiteurs (50 pL; différentes concentrations, pré-incubation de 3 h). Le milieu complet cornplérnenté de toxine (50 pL, gamme de concentration variable) est ensuite ajouté à chaque puits. Après une incubation de 20 h, le milieu (200 pL) est éliminé et remplacé par un milieu DMEM sans leucine (Eurohio) contenant 10% de SVF et 0,5 pCi/mL de NC-leucine (GE). Après une incubation de 7 h à 37°C, l'incorporation de radioactivité par les cellules est déterminée par lecture des plaques par un compteur à scintillation Wallac 1450 Microbeta trilux (PE). [0137] Comme ces toxines bloquent la synthèse des protéines, les cellules affectées ne sont plus capables d'incorporer la leucine radiomarquéc. Par contre, les cellules traitées par des inhibiteurs synthétisent toujours des protéines et incorporent donc l'acide aminé radiomarqué. Comme les cellules concentrent le radioélément suffisamment près du fond du puits, cela cntraine une excitation du scintillant contenu dans les plaques et conduit à l'émission de photons détectée par le compteur à scintillation (mesure en coups par minutes, cpm). Ces données sont ensuite exprimées en pourcentage de synthèse de protéine par les cellules. Les courbes de cytotoxicité peuvent ainsi être tracées (Figure 2) sans inhibiteur (ronds blancs) ou en présence d'un inhibiteur (ronds noirs). L'analyse des données par régression non linéaire permet d'estimer l'EC5.0, soit la concentration efficace pour laquelle on observe 50 % d'assimilation de leucine radioactive ce qui correspond à 50% de cellules viables. Plus la valeur de l'ECso est élevée, plus la protection cellulaire est importante car il faut alors une concentration plus élevée de toxine pour générer la même cytotoxicité. Il est ainsi possible de déterminer l'efficacité des inhibiteurs en calculant le ratio R des EC.,t, (Figure 2). Plus la valeur est élevée (> 1), plus la protection des cellules est importante. [0138] Six courbes de cytototoxicité sont obtenues en l'absence puis en présence de concen- trations croissantes d'inhibiteur. Pour chaque concentration (C) d'inhibiteur, un pourcentage de protection est déterminé à partir de la valeur de R calculée par le logiciel Prism avec Rmax correspondant à la valeur maximale de R de la série: 19 101391 IMath.11 % pm ter ti ta n = VRE- 1 elernat-1» * 1 00 [0140] L'ICso est ensuite calcifiée, à l'aide du logiciel Prism par régression non linéaire, à partir d'un graphique où sont reportés pour chaque concentration de composé le pourcentage de protection cellulaire correspondant (cf. Figure 3). [0141] 1Cso correspond à la concentration de composé donnant 50% de son pouvoir in- hibiteur. Plus cette concentration est faible, plus l'inhibiteur est puissant. Résultats [0142] [Tableaux9] Composé IC so (nM) Retro-2.1 (Contrôle) 100,0 4 78,6 1 14,2 2 20,0 3 55,0 5 35,0 6 (hors invention) 483,0 101431 Le composé Retro-2.1 est de formule suivante : 101441 IChem.191 CONCLUSION [0145] Ces résultats montrent que les composés testés sont tous des inhibiteurs de l'effet cellulaire de la toxine Shiga plus puissants que le composé Retro-2.1 (contrôle hors invention, dans lequel la dihydroquinazolinonc porte un phényle non substitué), ainsi que le composé 6 (hors invention, dans lequel la dihydroquinazolinonc porte un phényle substitué en para par un groupe hydroxyle). [0146] III. Mesure d'évaluation de l'activité protectrice des composés de l'invention vis-à-vis de la ricine [0147] Le protocole et le calcul de l'ICs0 des composés de l'invention est analogue à celui présenté au paragraphe II, en prenant pour toxine la riciné. [0148] IV. Mesure d'évaluation de l'activité protectrice des composés de l'invention vis-à-vis d'un virus utilisant le transport rétrograde, notamment un virus entrant dans les cellules par endocytose [0149] Des cellules Hcla ont été ensemencées à une densité de 50 % dans des plaques de 96 puits dans un milieu MEM additionné de 10 % de sérum foetal bovin et incubées à 37 °C, 5 % de CO,. On a laissé les cellules reposer pendant la nuit. Les composés à tester ont été dissous dans le DMSO à 20 mM chacun. Le jour suivant, chaque composé a été dilué 100 fois dans du MEM avec du sérum, dilué en série et ajouté en volume égal au milieu cellulaire dans chaque puits. Après 1 heure de préincubation, le virus a été ajouté à une multiplicité d'infection de 0,1. Le virus utilisé est notamment un virus recombinant qui code une protéine fluorescente verte (Towner et al. 2005. Virology 332:20-7). Ce virus est capable de se répliquer et présente une pathogcnesc normale chez l'animal. Les cellules ont ensuite été fixées à l'aide de formol à 10 % pendant 24 heures. Les noyaux des cellules ont été colorés avec du DAPI selon des méthodes habituelles. L'infection a ensuite été analysée en photographiant chaque puits à l'aide d'un microscope épifluorescent. Les cellules totales et infectées ont été comptées en comptant respectivement les cellules colorées par DAPI et les cellules fluorescentes vertes à l'aide du logiciel Cell Profiler. La fraction de cellules infectées a été calculée en divisant le nombre de cellules fluorescentes vertes par le nombre total de cellules. [0150] V. Mesure d'évaluation de l'activité protectrice des composés de l'invention vis- à-vis d'une bactérie utilisant le transport rétrograde, notamment une bactérie entrant dans les cellules par endocytose [0151] Des cellules HeLa229 sont prétraitées avec le composé de l'invention à évaluer à des concentrations de 25, 50 et 75 pM pendant 30 minutes jusqu'à ce que la bactérie soit ajoutée aux cellules. [0152] Les cellules présentant une infection primaire sont lysées 24 h après l'infection (hpi). [0153] Des cellules traitées avec ledit composé sont également lysées 48 h après l'infection et le lysat obtenu est utilisé pour infecter de nouvelles cellules HeLa229, lesquelles sont lysées 24 h après l'infection et analysées avec les échantillons d'infection primaire par immunoblot. La croissance de la bactérie est détectée à l'aide d'anticorps ad hoc et l'actine est utilisée comme contrôle. 21 [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6]