FR 3085961 A1 20200320 FR 1858322 A 20180914 DOMAINE DE L'INVENTION L'invention est relative à un procédé de production d'enzymes par un champignon filamenteux, notamment des enzymes de type cellulases (cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques), qui sont nécessaires pour l'hydrolyse enzymatique de biomasse lignocellulosique. Cette hydrolyse enzymatique est mise en oeuvre par exemple dans les procédés de production dits de seconde génération (2G) de biocarburants comme le bioéthanol, ou pour produire des jus sucrés qui peuvent être utilisés pour produire d'autres produits par voie chimique ou voie biochimique/fermentaire (par exemple, des alcools comme l'éthanol, le butanol, le propanol, l'isopropanol ou d'autres molécules, par exemple des solvants tels que l'acétone et d'autres molécules biosourcées), ou dans d'autres procédés des industries chimiques, papetières ou textiles. ART ANTÉRIEUR Trichoderma reesei est le microorganisme le plus utilisé pour la production de cellulases à l'échelle industrielle. Les souches sauvages ont la faculté d'excréter, en présence d'un substrat inducteur, la cellulose par exemple, un complexe enzymatique considéré comme bien adapté à l'hydrolyse de biomasse lignocellulosique. Les enzymes du complexe enzymatique contiennent trois grands types selon leur activité: les endoglucanases, les exoglucanases et les cellobiases. D'autres protéines possédant des propriétés indispensables à l'hydrolyse des matériaux ligno-cellulosiques sont également produites par Trichoderma reesei, les xylanases par exemple. La présence d'un substrat inducteur est indispensable à l'expression des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. La nature du substrat carboné a une forte influence sur la composition du complexe enzymatique. C'est le cas du xylose, qui, associé à un substrat carboné inducteur comme la cellulose ou le lactose, permet d'améliorer significativement l'activité dite xylanase. La régulation des gènes de cellulases sur différentes sources de carbone a été étudiée dans le détail. Ils sont induits en présence de cellulose, de ses produits d'hydrolyse (exemple: cellobiose) ou de certains oligosaccharides comme le lactose ou le sophorose (Ilmén et al., 1997; Appl.Environ. Microbiol. 63: 1298-1306). Les techniques de génétique classique par mutation ont permis la sélection de souches de Trichoderma reesei hyperproductrices de cellulases telles que les souches MCG77 (Gallo - brevet US-4,275,167), MCG 80 (Allen, A.L. et Andreotti, R.E., Biotechnol- Bioengi 1982, 12, 2 451-459 1982), RUT C30 (Montenecourt, B.S. et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) et CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels". Paris. H. HESLOT Ed, pp 39-50). 5 Le procédé de production de cellulases par Trichoderma reesei a fait l'objet de travaux de développement importants pour passer à l'échelle industrielle. Pour obtenir de bonnes productivités en enzymes, il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei, et un substrat inducteur qui permette l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture. La cellulose peut jouer 10 ces deux rôles. Cependant, elle est difficile d'utilisation à l'échelle industrielle, car elle augmente la viscosité du milieu et peut gêner le transfert d'oxygène indispensable à la croissance du microorganisme, qui est aérobie strict. Elle peut être remplacée par des sources de carbone solubles, telles que le glucose, le xylose ou le lactose, le lactose jouant également le rôle de substrat inducteur. D'autres sucres solubles comme le cellobiose et le 15 sophorose ont été décrits comme inducteurs, mais ils peuvent être considérés trop onéreux pour être utilisés à l'échelle industrielle. On a constaté que les productions de cellulases par Trichoderma reesei avec des substrats solubles sont très inférieures à celles obtenues sur cellulose en "batch". Ceci est dû à l'effet 20 répresseur des sucres facilement assimilables à forte concentration. L'alimentation en continu en mode fed-batch des substrats carbonés solubles a permis de lever la répression catabolique en limitant la concentration résiduelle dans les cultures et en optimisant la quantité de sucre, permettant d'obtenir un meilleur rendement et une meilleure productivité enzymatique, comme décrit dans le brevet FR-B-2 555 603. Ce protocole permet d'aboutir à 25 une concentration en protéines de l'ordre de 35 à 40 g/L avec une productivité de l'ordre de 0.2 g/Uh. Pour obtenir ces performances, les procédés industriels de production de cellulases, tels que décrits dans le brevet ci-dessus mentionné, se font donc en deux étapes dans le même 30 réacteur : Une étape de croissance en mode "batch", où il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei. Cette phase se caractérise par une augmentation de la viscosité du milieu, ainsi que par une forte demande en oxygène. 3 Une étape de production en mode "fed-batch" utilisant un substrat inducteur (par exemple le lactose) qui permet l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture. Le flux optimal appliqué est compris entre 35 et 45 mg (de sucre).g (de poids sec cellulaire)-1.11-1. Cette phase se caractérise par une baisse de la 5 viscosité du milieu et une demande en oxygène plus faible. La productivité en protéines est égale au produit entre la concentration en biomasse vivante et la vitesse spécifique de production de protéines. Cette productivité peut être augmentée en augmentant les performances de production de la souche (augmentation de la vitesse spécifique) et/ou en augmentant la concentration en biomasse cellulaire. Mais les méthodes 10 pour améliorer les performances des souches, en les modifiant génétiquement comme évoqué plus haut, peuvent finir par atteindre leurs limites, et augmenter la concentration en biomasse aboutit à une forte augmentation de la viscosité, ce qui limite le transfert d'oxygène, notamment en fin d'étape de croissance. 15 Les étapes de production proposés dans l'art antérieur se font en cuves agitées, les étapes de croissance et de production se faisant dans le même bioréacteur. C'est une solution intéressante car compacte en termes d'installation industrielle, mais pas la solution forcément la meilleure, car les deux étapes, croissance et production, ne requièrent pas les mêmes besoins, par exemple en termes de moyens d'agitation ou en termes de transfert 20 d'oxygène : le bioréacteur doit donc présenter le volume et tous les moyens d'équipement et de fonctionnement lui permettant d'assurer l'ensemble de ces deux étapes, se déroulant pourtant dans des conditions bien différentes. Le but de l'invention est alors de proposer un procédé amélioré de production d'enzymes de type cellulases à partir de souches de champignon filamenteux, notamment un procédé qui 25 permette d'obtenir des productivités en enzymes augmentées, et, accessoirement, qui puisse être mis en oeuvre à l'échelle industrielle dans des installations permettant plus de flexibilité. RÉSUMÉ DE L'INVENTION 30 La présente invention concerne un procédé de production d'enzymes par une souche appartenant à un champignon filamenteux, ledit procédé comprenant trois étapes : (a) une première étape de croissance des champignons, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance, dans un bioréacteur agité et aéré en phase batch, (b) une deuxième étape de dilution du milieu de culture obtenu à la première étape (a), 4 (c) une troisième étape de production d'enzymes à partir du milieu de culture dilué obtenu à la deuxième étape (b), en présence d'au moins un substrat carboné inducteur, en phase fed-batch. 5 L'invention inclut un tel procédé, où l'étape (b) peut commencer (un peu) avant la fin de l'étape (a) ou se terminer (un peu) après le début de l'étape (c). L'invention inclut donc un tel procédé, avec une mise en oeuvre dans laquelle les étapes (a) et (b) d'une part, et les étapes (b) et (c) d'autre part peuvent partiellement se recouvrir. En effet, comme détaillé plus loin, l'étape de dilution (b) peut durer plusieurs heures, et il peut donc s'avérer intéressant de 10 la démarrer entre 0 et 4 heures avant la fin de l'étape (a), et/ou de la finir entre 0 et 4 heures après le passage en étape (c). L'invention a ainsi mis au point une nouvelle conduite de fermentation, avec une étape de dilution intermédiaire entre l'étape de croissance et l'étape de production. De manière tout-à- 15 fait surprenante, il s'est avéré que les productivités spécifiques obtenues après avoir dilué le milieu de culture à la fin de la phase de croissance sont significativement plus élevées que celles obtenues avec le milieu de culture sans dilution (l'augmentation pouvant aller jusqu'à 30% et plus), et cela pour un même flux spécifique de substrat carboné (calculé par rapport à la masse de biomasse dans les réacteurs). 20 De préférence, la troisième étape de production (c) est réalisée dans une colonne à bulles : Dans ce mode de réalisation préféré, l'invention exploite également judicieusement l'idée que les étapes de croissance et de production n'ont pas les mêmes besoins, n'ont pas le même mode opératoire, notamment en termes d'agitation et de transfert d'oxygène, et qu'il 25 est donc plus pertinent de réaliser ces étapes dans deux fermenteurs différents : La production de biomasse peut s'opérer dans de bonnes conditions en cuve agitée, en visant de préférence une concentration de biomasse élevée (par exemple supérieure ou égale à 20 g/L). La production s'opère en colonne à bulles, qui est en effet un réacteur particulièrement approprié pour opérer la production, car c'est un réacteur adaptés aux 30 milieux dilués, peu visqueux, qui présente par ailleurs de nombreux avantages, comme une grande facilité de nettoyage, une efficacité énergétique supérieure aux bioréacteurs agités, la possibilité d'offrir de grands volumes réactionnels (Dans le présent texte, « bioréacteur agité » a la même signification que REVENDICATIONS1. Procédé de production d'enzymes par une souche appartenant à un champignon filamenteux, caractérisé en ce que ledit procédé comprend trois étapes : (a) une première étape de croissance des champignons, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance, dans un bioréacteur agité (1) et aéré en phase batch, (b) une deuxième étape de dilution du milieu de culture obtenu à la première étape (a), (c) une troisième étape de production d'enzymes à partir du milieu de culture dilué obtenu à la deuxième étape (b), en présence d'au moins un substrat carboné inducteur, en phase fed-batch. 2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la troisième étape de production d'enzymes (c ) est réalisé dans une colonne à bulles (7). 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le facteur de dilution volumique du milieu de culture à l'étape (b) de dilution est d'au moins 1,1 ou 1,2, notamment d'au moins 1,5, de préférence d'environ 2, et notamment d'au plus 6, notamment afin d'atteindre une concentration en champignons comprise entre 5 et 20 g/L 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on réalise la deuxième étape (b) de dilution dans le bioréacteur (1) à la fin de l'étape (a) de croissance et/ou dans la colonne à bulles (7) avant ou au début de la troisième étape (c) de production d'enzymes. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on prévoit des moyens de connexion fluidique (13) entre le bioréacteur (1) et la colonne à bulles (7) pour assurer le transfert du milieu de culture obtenu à l'étape de croissance dans le bioréacteur vers la colonne à bulles, moyens notamment sous forme de conduites équipées de vannes manuelles ou pilotées et notamment de pompe(s) (15). 6. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'on réalise la deuxième étape (b) de dilution, en tout ou partie, dans les moyens de connexion fluidique (13) lors du transfert du milieu de culture par lesdits moyens de connexion fluidique depuis le bioréacteur (1) à la colonne à bulles (7). 17 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en substrat carboné de croissance dans le bioréacteur est comprise entre 30 et 100 g/L, et de préférence entre 50 et 80 g/L. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le substrat carboné inducteur alimente la colonne à bulles à une vitesse spécifique comprise entre 30 et 140 mg par gramme de biomasse cellulaire et par heure, de préférence entre 35 et 45 mg par gramme de biomasse cellulaire et par heure. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on poursuit l'étape de croissance jusqu'à une concentration en champignons d'au moins 20 g/L. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est opéré 15 avec un nombre n de bioréacteurs agités et aérés (1) et un nombre m de colonnes à bulles (7), avec n inférieur ou égal à m, une colonne à bulles pouvant être connectée fluidiquement à plusieurs bioréacteurs ou inversement. 11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la souche 20 utilisée est une souche de Trichoderma reesei ou de Trichoderma reesei modifiée par mutation sélection ou recombinaison génétique. 12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les enzymes sont des enzymes cellulolytiques ou hémicellulolytiques. 25 13. Installation de production d'enzymes par une souche appartenant à un champignon filamenteux, caractérisée en ce que ladite installation comprend : - un bioréacteur agité et aéré (1) fonctionnant en phase batch pour opérer une étape de croissance des champignons, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance ; - une colonne à 30 bulles (7) fonctionnant en phase fed-batch pour opérer une étape de production d'enzymes à partir du milieu de culture provenant du bioréacteur ; - des moyens de connexion fluidique (13) reliant le bioréacteur à la colonne à bulles pour opérer le transfert du milieu de culture du bioréacteur vers la colonne à bulles ; - des moyens d'injection de liquide de dilution (2 ;9 ;14) dans le bioréacteur (1) et/ou dans la colonne à bulles (7) et/ou dans les 35 moyens de connexion de fluidique (13). 5 10 18 14. Installation selon la revendication précédente, caractérisée en ce que la colonne à bulles (7) a un volume intérieur au moins deux fois supérieur au volume intérieur du bioréacteur agité (1). 5 15. Installation selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle comprend n bioréacteurs agités et aérés (1) et m colonnes à bulles (7), avec n inférieur ou égal à m.