FR 3093734 A1 20200918 FR 1902604 A 20190314 Description Titre de l'invention : METHODE DE DETECTION DE RE- SISTANCES AUX HERBICIDES DE CLASSE B CHEZ LES PLANTES VULPIN ET RAY-GRASS pool La présente invention a trait au domaine de la détection de résistances aux herbicides. Plus particulièrement, elle concerne une méthode de détection de résistances aux herbicides de classe B chez les plantes Vulpin et Ray-grass par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Elle fournit des couples d'amorces spécifiques de polymorphismes mononucléotidiques (SNP pour Single Nucleotide Polymorphism) permettant une détection fiable, simple et rapide de ces résistances, ainsi que des sondes spécifiques pour révéler les amplicons amplifiés grâce à ces amorces. L'invention concerne également des puces sur lesquelles sont disposés des couples d'amorces et des sondes en tant qu'outil de détection rapide et d'aide à la gestion des résistances aux herbicides. Domaine de l'invention 100021 Les adventices 100031 Les adventices, appelées aussi « mauvaises herbes », sont des plantes herbacées ou ligneuses considérées indésirables à l'endroit où elles se trouvent et ce pour différentes raisons. Tout d'abord, elles font concurrence à la plante cultivée. En effet, l'adventice va profiter de l'eau et des nutriments au détriment des vraies cultures. Les adventices peuvent même être toxiques ou dégrader le goût des plantes cultivées. Elles entraînent aussi dans certains contextes une difficulté de ramassage des productions lors des récoltes. Par ailleurs, les adventices créent une sorte de microclimat qui favorise le développement des bactéries, virus, champignons et insectes. Néanmoins, les adventices ne sont pas nécessairement mauvaises en tant que telles, il peut s'agir de plantes comestibles ou médicinales et cc sont souvent des repousses d'une culture précédente apparaissant sur une parcelle où une nouvelle plante est cultivée. Elles sont donc considérées comme des plantes nuisibles du fait qu'elles impactent les rendements et la qualité des cultures et entraînent un salissement des parcelles cultivées. [0004] Il existe différentes espèces d'adventices ayant chacune un comportement plus ou moins spécifique. Néanmoins, les adventices sont classées selon 5 grands facteurs qui permettent de mettre en place des stratégies adaptées pour les maîtriser : [0005] - Le type biologique : annuelle, bisannuelle, pluriannuelle et vivace (= pérenne) ; [0006] - L'époque de levée : indifférente. automne-hiver, printanière, estivale ; [0007] - La profondeur de germination-levée : en effet, certains traitements, qu'ils soient chimiques ou mécaniques, pourront être inefficaces selon la profondeur de la 2 semence ; [0008] - La production grainière ; [0009] - La durée de vie du stock semencier = TAD (Taux annuel de Décroissance), qui est exprimé en % du stock initial de semences et permet d'identifier si la semence est viable d'une année sur l'autre. [0010] Les grandes familles végétales auxquelles les adventices appartiennent sont les suivantes : Astéracées, Poacécs (= graminées, dont les Ray-grass et les Vulpins), Cyperacées, Polygonacées, Brassicacécs, Apiacées. Néanmoins, la plupart des adventices appartiennent à la famille des graminées. Parmi ces familles, il existe également des végétaux non nuisibles. [0011] Les grandes cultures présentant un intérêt économique fort que sont le colza, le blé, l'orge et la betterave sucrière sont particulièrement touchées par les adventices telles que le Ray-grass et le Vulpin. Il existe donc un besoin de pouvoir reconnaître les adventices et de maîtriser leur croissance. [0012] Les mesures préventives [0013] Elles consistent essentiellement en des activités de : [0014] - Labourage des champs : très efficace sur espèces ayant un TAD élevé, peu efficace pour Ray-grass et Vulpin ; [0015] - Réalisation de déchaumage et / ou de faux semis pour stimuler la croissance des ad- ventices puis les éradiquer avant l'implantation d'une culture : efficace sur espèce à faible dormance, donc efficace pour Ray-grass et Vulpin [0016] - Rotation appropriée des cultures permettant de casser la dynamique d'évolution de la flore et d'éviter sa spécialisation. [0017] Les différents moyens de lutte contre les adventices [0018] Les moyens de lutte physique sont de trois types : [0019] - Lutte thermique : consiste à causer des blessures internes aux mauvaises herbes par la chaleur (pyrodésherbage) ; [0020] - Lutte électromagnétique : peu développée pour des raisons de coûts ; [0021] - Lutte mécanique : travail du sol, fauchage, désherbage mécanique (herse étrille, bineuse, houe rotative). [0022] Il est aussi possible de mettre en place une stratégie de lutte de nature génétique avec la création : [0023] - de variétés tolérantes aux herbicides (VTH) qui ne sont pas des OGM (obtenues par sélection variétale, ...) ; [0024] - des cultures OGM qui sont résistantes à un herbicide et que l'agriculteur pourra traiter pour lutter contre les adventices sans impacter sa culture. Toutefois, cette technique n'empêche par l'apparition de résistances aux herbicides. [0025] Enfin, les moyens de lutte chimique sont les plus répandus avec l'utilisation des 3 herbicides. Il existe différentes classes d'herbicides en fonction de leur mécanisme d'action (cible). [0026] Les herbicides [0027] Deux grands types de mode d'action existent : soit la substance herbicide agit avant la levée de l'adventice (herbicide de pré-levée), soit après (herbicide de post-levée). [0028] Les herbicides de pré-levée : l'action de ces substances est assurée par leur dispo- nibilité dans le sol, permettant leur absorption par les racines des jeunes adventices ou parfois, par les téguments des graines en germination. Les herbicides sont donc appliqués de façon régulière sur le sol pour être présents dans la couche superficielle où germent les graines. [0029] Les herbicides de post-levée ; ils sont de deux types : (i) Les herbicides de post-levée de contact qui agissent uniquement par contact. Ces herbicides s'appliquent uniquement sur les adventices levées. Après application, les substances actives agissent en nécrosant les parties chlorophylliennes autour des points d'impact sans migration importante dans la plante. La nature et la morphologie de l'adventice influent sur l'efficacité : des feuilles larges, jeunes sont des facteurs favorables ; (ii) Les herbicides de post-levée systémiques qui présentent la faculté de migrer dans tous les organes des adventices via le xylème et le phloème et donc d'être transportés vers les organes aériens et souterrains non touchés par la pulvérisation. [0030] Les herbicides peuvent aussi être classés en fonction de leur cible. Ils sont classés en 23 groupes et sous-groupes (selon le classement Herbicide Resistance Action Comrnittee (HRAC)). Il existe deux grandes classes d'herbicides permettant de lutter contre les Ray-Grass et les Vulpins : les herbicides de classe A qui inhibent l'activité de l'ACCase et les herbicides de classe B qui inhibent l'activité de l'ALS. [0031] A. Inhibiteurs de l'acétyl-coenzyme A carboxylase (ACCase) (Classe A) [0032] Ils bloquent la synthèse des lipides en agissant sur la voie de synthèse des acides gras. Ce sont des inhibiteurs compétitifs de l'acétyl-CoA sur son site de fixation à l'ACCase. On trouve 3 sous classes : FOP (exemple Diclofop), DIM (exemple Cléthodime), DEN (exemple Pinoxadéne) et ils ciblent préférentiellement les graminées. De plus, ce sont des herbicides lésant les jeunes pousses et susceptibles de migrer des feuilles aux racines. [0033] B. Inhibiteurs de l'acétolactate synthase (ALS) aussi appelée acétohydroxyacide synthase (AHAS) (Classe B) [0034] Ils bloquent la synthèse des acides aminés ramifiés, c'est-à-dire la synthèse de la valine, de la leucine et de l'isoleucine. Ces inhibiteurs sont divisés en 5 sous-classes : les Sulfonylurées (exemple Amidosulfuron), les Imidazolines (exemple Imazamox), les Triazolopyrirnidines (exemple Pyroxsulam) les Pyrimidinyl(thio)benzoates (exemple Pyribenzoxim) et les Sulfonyl-Amino-Carbonyl-Triazolinones (exemple Propoxy- carbazone-sodium). Ils ciblent aussi bien les graminées que les dicotylédones par contact avec les surfaces aériennes. [0035] Malgré leur efficacité démontrée depuis de nombreuses années, l'utilisation massive d'herbicides en agriculture a fait émerger un problème important : la résistance. Il faut savoir que ces résistances sont naturellement présentes en quantités faibles dans les populations. C'est la pression de sélection exercée par l'utilisation d'herbicides qui a conduit à leur développement au sein dcs populations. [0036] Les résistances aux herbicides [0037] Les résistances aux herbicides peuvent être : [0038] - innées, c'est-à-dire que l'espèce végétale est naturellement résistante à un herbicide ; [0039] - acquises, avec l'apparition de mutations affectant le génome d'un ou de quelques individus d'une espèce concernée. [0040] Le mécanisme d'action qui sous-tend la résistance peut également être de nature diverse à savoir qu'il peut être soit lié à la cible du fait d'une mutation dans le gène de la cible ou d'une surexpression de la cible, soit indépendant de la cible par mise en jeu d'une détoxification des herbicides (augmentation de l'activité d'enzymes capables de métaboliser les herbicides) ou d'une séquestration de la molécule active. [0041] Les résistances les plus fortes sont ducs à la sélection de mutations dans le gène codant pour la cible de l'herbicide. Le changement d'une seule base du triplet codant pour un acide aminé entraîne la substitution de celui-ci par un autre. Cela suffit à empêcher l'herbicide de se fixer sur sa cible et à le rendre partiellement voire totalement inactif (certains individus résistants peuvent supporter des quantités 1000 fois plus élevées d'herbicide que les individus sensibles), mais sans affecter l'activité de la cible. Du fait de la modification de la cible, la résistance va concerner l'herbicide responsable de la sélection mais aussi d'autres herbicides inhibant la même cible. Résumé de l'invention [0042] Les inventeurs ont développé des couples d'amorces permettant d'amplifier spéci- fiquement des fragments d'ADN porteurs de mutations ponctuelles ou polymorphismes mononucléotidiques, ainsi que des sondes spécifiques de ces fragments amplifiés. [0043] La présente invention concerne donc une méthode de détection de résistances aux herbicides de classe B inhibiteurs de l'activité de l'ALS chez les plantes du genre Vulpin et Ray-grass par la méthode de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) mettant en oeuvre au moins : [0044] le mélange réactionnel 1 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 2 est. remplacée par toute autre amorce permettant (l'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.1, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 4 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.6 et SEQ ID NO.7, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 6 est. remplacée par toute autre amorce permettant (l'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.7, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 5 comprenant les amorces dc séquences SEQ ID NO.8 et SEQ ID NO.9, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 9 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.8, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 6 comprenant les amorces dc séquences SEQ ID NO.10 et SEQ ID NO.11, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 10 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.11, un fragment contenant ladite mutation. [0045] La présente invention concerne également un dispositif destiné à la détection de ré- sistances aux herbicides de classe B inhibiteurs de l'activité de PALS chez les plantes du genre Vulpin et Ray-grass par la méthode de réaction de PCR sur un support comprenant des puits dans lesquels sont disposés des mélanges réactionnels et comprenant au moins les mélanges réactionnels 1, 4, 5 et 6 tels que définis précédemment. Avantages de l'invention [0046] La présente invention permet la détection de mutations ponctuelles ou poly- morphismes mononucléotidiques (SNP) responsables de résistances aux herbicides chez les plantes de type Vulpin et Ray-grass par une méthode fiable et facile à mettre en oeuvre : la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Cette méthode est de plus beaucoup plus rapide et moins coûteuse que la méthode alternative pour la détection de SNP, à savoir le séquençage. [0047] La méthode de détection selon l'invention permet d'identifier une résistance aux herbicides de classe B chez les principales adventices que sont le Vulpin et le Ray-grass, et couvre la grande majorité des résistances aux inhibiteurs de classe B décrites à ce jour chez ces deux plantes. De plus, elle permet de discriminer entre Vulpin et Ray-grass. Ainsi, elle fournit des couples d'amorces pour amplifier les fragments porteurs de la plupart des mutations responsables d'une résistance aux herbicides agissant sur PALS, et dans un mode de réalisation particulier, également la plupart des mutations 6 responsables d'une résistance aux herbicides agissant sur l'ACCase, décrites à ce jour chez les plantes Vulpin et Ray-grass, ainsi que des couples d'amorces spécifiques du Vulpin et du Ray-grass pour identifier l'adventice en présence. [0048] L'invention présente l'avantage de fournir des mélanges d'amorces qui permettent d'amplifier les fragments porteurs d'une mutation ponctuelle responsable d'une résistance aux herbicides, quels que soient les polymorphismes présents sur les fragments amplifiés. Pour ce faire, les séquences des amorces sont définies comme des séquences consensus (ou séquences dénaturées) et les différentes amorces sont combinées au sein d'un même mélange. L'amplification de tous les fragments porteurs d'une mutation peut ainsi être réalisée simultanément. Ceci implique que les amorces ont été choisies de sorte à permettre une amplification spécifique, que les amorces soient compatibles entre elles au sein d'un même mélange et que les différents mélanges permettent une amplification dans les mêmes conditions (températures, durée, nombre de cycles, ...). Le caractère innovant de l'invention repose fortement sur la combinaison de ces différents paramètres. [0049] Ainsi, la présente invention met à disposition un outil simple d'aide à la gestion des phénomènes de résistance observés chez les plantes Vulpin et Ray-grass. Il s'inscrit dans une stratégie de lutte ciblée contre les adventices, telle que pratiquée en agriculture raisonnée. [0050] Un autre avantage réside dans le fait que les amorces sont choisies de sorte que les réactions d'amplification puissent toutes être réalisées dans les mêmes conditions de PCR, ce qui permet de les réaliser simultanément dans une même machine, et de proposer des supports de PCR « prêts à l'emploi » sur lesquels sont disposés les couples d'amorces de type plaque 96 puits, puce, ... [0051] La présente invention propose donc une méthode de détection et diagnostic de la ré- sistance aux herbicides de classe A les plus communément utilisés chez les plantes Vulpin et Ray-grass qui est plus simple, plus rapide et moins chère que les méthodes classiques de détection de mutations ponctuelles. Description des modes de réalisation [0052] Un premier objet de l'invention concerne une méthode de détection de résistances aux herbicides de classe B inhibiteurs de l'activité de l'ALS chez les plantes du genre Vulpin et Ray-grass par la méthode de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) mettant en oeuvre au moins : [0053] le mélange réactionnel 1 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 2 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.1, un fragment 7 contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 4 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.6 et SEQ ID NO.7, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 6 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.7, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 5 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.8 et SEQ ID NO.9, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 9 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.8, un fragment contenant ladite mutation ; et le mélange réactionnel 6 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.10 et SEQ ID NO.11, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 10 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.11, un fragment contenant ladite mutation. [0054] La résistance aux herbicides est causée notamment par la survenue de mutations qui permettent à la plante de survivre en présence de l'herbicide, même à doses élevées. Les deux protéines cibles des herbicides jouant un rôle majeur dans la mise en place de cette résistance sont VALS et l'ACCase. [0055] La protéine ALS pour « acétolactate synthèse » (aussi appelée AHAS) est la première enzyme commune à la voie de biosynthèse des acides aminés ramifiés, présente chez les plantes et les micro-organismes. Sa séquence correspond à la séquence référencée par le numéro CAD24801.2 chez Vulpin et ABQ85869.1 chez Ray-grass dans la base de données NCBI. [0056] La protéine ACCase pour « acétyl-CoA carboxylase » est une enzyme très répandue chez les êtres vivants. Elle intervient dans la première étape de la synthèse des acides gras. Chez les plantes, elle participe au transfert du bicarbonate pour activer l'acétyl-coenzyme A plastidique en malonyl-coenzyme A, intermédiaire métabolique de la synthèse des acides gras. Sa séquence correspond à la séquence référencée par le numéro CAL63611.1 chez Vulpin et AAU11301.1 chez Ray-grass dans la base de données NCBI. [0057] L'étape d'amplification de l'ADN par réaction de PCR met en oeuvre des couples d'amorces dont l'une est spécifique du site de mutation et l'autre est non spécifique du site de mutation mais choisie de sorte à permettre l'amplification spécifique d'un fragment d'ADN d'une taille comprise globalement entre 85 et 365 nucléotides. [0058] La combinaison des amorces des mélanges réactionnels 1, 4, 5 et 6 tels que définis ci-dessus, permet de détecter les mutations ponctuelles les plus fréquemment re- 8 trouvées dans la protéine ALS. [0059] La réaction de PCR peut être en point final, semi-quantitative ou quantitative (dite PCRq). [0060] Lorsqu'elle est réalisée en point final ou qu'elle est semi-quantitative, la révélation des fragments amplifiés ne nécessite pas de sonde. On utilise généralement des agents intercalants et un dépôt sur gel d'électrophorèse à cette fin. [0061] Lorsque la PCR est quantitative, la révélation de la quantité d'ADN amplifié peut être réalisée par différentes méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la fluorescence via un agent intercalant ou la fluorescence via une sonde. [0062] Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la révélation est réalisée grâce à une sonde marquée. Ce marquage peut être par exemple un groupement fluorescent tel qu'un 6-Carboxyfluorescéine (6-FAM) ou un ROXTM qui permet une lecture directe du résultat. [0063] Ainsi, la présente invention fournit des sondes spécifiques des fragments amplifiés, à savoir : [0064] la sonde spécifique de r amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 1 est de séquence SEQ ID NO.29 ; la sonde spécifique de r amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 4 est de séquence SEQ ID NO.31 ; la sonde spécifique de r amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 5 est de séquence SEQ ID NO.32 ; la sonde spécifique de F amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 6 est de séquence SEQ ID NO.33. [0065] De manière générale, le fait d'augmenter le nombre de mutations ponctuelles détectées (en associant un plus grand nombre de couples d'amorces) permet d'augmenter la complétude de la méthode, de même que le fait de détecter en combinaison les mutations les plus fréquentes. [0066] Dans mode de réalisation particulièrement intéressant, la méthode met en oeuvre également des couples d'amorces permettant de savoir si la résistance détectée se rapporte à une plante de type Vulpin ou de type Ray-grass. Ces couples d'amorces spécifiques de l'espèce sont compris dans : [0067] le mélange réactionnel 15 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.25 et SEQ ID NO. 26 pour Ray-grass ; et le mélange réactionnel 16 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.27 et SEQ ID NO. 28 pour Vulpin. [0068] Si la méthode met en oeuvre une PCRq et que l'on souhaite une révélation par sonde fluorescente, les fragments amplifiés grâce aux amorces du mélange réactionnel 15 peuvent être révélés grâce à la sonde de séquence SEQ ID NO.40 et les fragments 9 amplifiés grâce aux amorces du mélange réactionnel 16 peuvent être révélés grâce à la sonde de séquence SEQ ID NO.41. [0069] Le fait de pouvoir distinguer entre les deux espèces d'adventice permet à l'agriculteur de traiter ses cultures de manière ciblée. [0070] Dans un mode de réalisation préféré, la méthode de détection de résistances aux herhicides de classe B selon l'invention met en oeuvre des couples d'amorces supplémentaires de sorte à augmenter le nombre de mutations détectées et donc la complétude de la méthode. [0071] En particulier, il est avantageux de détecter les mutations responsables de résistances aux herhicides de classe A inhibiteurs de l'activité de r ACCasc en même temps que celles responsables de résistances aux herhicides de classe B précédemment décrites. [0072] Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne une méthode de détection de résistances aux herhicides de classe B inhibiteurs de l'activité de PALS chez les plantes du genre Vulpin et Ray-grass par la méthode de réaction de PCR mettant en oeuvre les mélanges réactionnels 1, 4, 5 et 6 tels que décrits précédemment, et permettant en outre de détecter une résistance aux herhicides de classe A inhibiteurs de l'activité de l'ACCase, comprenant : [0073] le mélange réactionnel 2 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.5, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 5 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.3, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 3 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.4 et SEQ ID NO.5., ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 5 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.4, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 7 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.12 et SEQ ID NO.13, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 12 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.13, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 8 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.14 et SEQ ID NO.15, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 14 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.15, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 10 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.18 et SEQ ID NO.19, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 18 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.19, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 11 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.20 et SEQ ID NO.23, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 23 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.20, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 12 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.21 et SEQ ID NO.23, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 23 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.21, un fragment contenant ladite mutation ; ou le mélange réactionnel 14 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.24 et SEQ ID NO.23, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 23 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.24, un fragment contenant ladite mutation. [0074] Dans un mode de réalisation particulier, la méthode met en oeuvre les mélanges réac- tionnels 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 et 14 ainsi que les mélanges 15 et 16. [0075] Dans un autre mode de réalisation, la méthode met en oeuvre deux mélanges d'amorces supplémentaires pour la détection d'autres mutations ponctuelles responsables de la résistance aux herbicides de classe A, à savoir : [0076] le mélange réactionnel 9 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.16 et SEQ ID NO.17, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 17 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.16, un fragment contenant ladite mutation ; ou le mélange réactionnel 13 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.22 et SEQ ID NO.23, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 23 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.22, un fragment contenant ladite mutation. [0077] Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la méthode met en oeuvre les mélanges réactionnels 1 à 14. [0078] Dans un autre mode de réalisation particulier, la méthode met en oeuvre les mélanges réactionnels 1 à 16. 11 [0079] Sur le même principe qu'énoncé précédemment, les fragments amplifiés grâce aux couples d'amorces spécifiques peuvent être révélés grâce à des sondes spécifiques, notamment dans la mise en oeuvre de PCRq. [0080] Ainsi, lorsque la réaction en réaction de PCR est quantitative, la détection des amplicons décrits précédemment peut être réalisée grâce aux sondes spécifiques suivantes, qui sont marquées, par exemple par couplage à un groupement fluorescent : [0081] la sonde de séquence SEQ ID NO.30 spécifique de l'amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 2 ; la sonde de séquence SEQ ID NO.30 spécifique de l'amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 3 ; la sonde de séquence SEQ ID NO.34 spécifique de l'amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 7 ; la sonde de séquence SEQ ID NO.35 spécifique de l'amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 8 ; la sonde de séquence SEQ ID NO.30 spécifique de l'amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 9 ; la sonde de séquence SEQ ID NO.36 spécifique de l'amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 10 ; la sonde de séquence SEQ ID NO.37 spécifique de l'amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 11 ; la sonde de séquence SEQ ID NO.37 spécifique de l'amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 12 ; la sonde de séquence SEQ ID NO.38 spécifique de l'amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 13 ; la sonde de séquence SEQ ID NO.39 spécifique de l'amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 14 ; la sonde de séquence SEQ ID NO.40 spécifique de l'amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 15 ; ou la sonde de séquence SEQ ID NO.41 spécifique de l'amplicon obtenu grâce aux amorces présentes dans le mélange réactionnel 16. [0082] Le Tableau 1 résume les mutations responsables de résistances aux herbicides dans les cibles ALS et ACCase de Vulpin et Ray-grass, ainsi que les séquences des couples d'amorces pour la PCR décrites dans cette demande. Les séquences des sondes permettant de révéler les différents fragments sont également mentionnées. [0083] 12 [Tableaux 1] Gène ciblé Mutation responsable de la ré- sistance aux herbicides* Numéro du mélange ré- actionnel Amorce sens Amorce antisens Sonde cor-respondant au fragment amplifié ALS W574L 1 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.29 ACCas e 11781 L 2 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.30 ACCas c I1781L 3 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.30 ALS P197T 4 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.31 ALS P19714 5 SEQ ID NO.8 SEQ ID NO.9 SEQ ID NO.32 ALS P107L 6 SEQ ID NO.10 SEQ ID NO.11 SEQ ID NO.33 ACCas e 12041N 7 SEQ ID NO.12 SEQ ID NO.13 SEQ ID NO.34 ACCas e D2078Y 8 SEQ ID NO.14 SEQ ID NO.15 SEQ ID NO.35 ACCas e I1781V 9 SEQ ID NO.16 SEQ ID NO.17 SEQ ID NO.30 ACCas e I1781T 10 SEQ ID NO.18 SEQ ID NO.19 SEQ ID NO.36 ACCas c W2027C 11 SEQ ID SEQ ID NO.23 SEQ ID NO.37 NO.20 ACCas e W2027C 12 SEQ ID SEQ ID NO.23 SEQ ID NO.37 NO.21 ACCas c 12041V 13 SEQ ID SEQ ID NO.23 SEQ ID NO.38 NO.22 ACCas G2096A 14 SEQ ID SEQ ID NO.23 SEQ ID NO.39 13 e NO.24 [0084] *Les numérotations des mutations correspondent aux positions des acides aminés chez Arabidopsis thaliana, organisme de référence. [0085] NB : Les séquences notées en GRAS correspondent aux amorces spécifiques s'hybridant au niveau du codon muté. [0086] Tableau 1 : Mutations responsables de résistance aux herbicides dans les cibles ALS et ACCase de Vulpin et Ray-grass, ainsi que les séquences des couples d'amorces et sondes permettant la détection des séquences amplifiées. [0087] Comme indiqué au Tableau 1, l'une des deux amorces est spécifique de la mutation ponctuelle (elle recouvre le nucléotide muté en s'hybridant) alors que l'autre ne l'est pas. Il en ressort que l'amorce spécifique est celle qui définit l'invention et que l'amorce non spécifique peut être modifiée du moment qu'elle permet l'amplification d'un fragment détectable en combinaison avec l'amorce spécifique. En d'autres termes, l'invention revendiquée est définie par des couples d'amorces dans lesquels l'amorce non spécifique de la mutation ponctuelle peut être remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique, un fragment contenant la mutation ponctuelle à détecter. En particulier cette amorce non spécifique peut inclure totalement ou partiellement la séquence de l'amorce décrite. [0088] Par exemple, la mutation W574L peut être détectée à l'aide du couple d'amorces de SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2 ou d'un couple d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 2 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.1, un fragment contenant ladite mutation. [0089] D'autres couples d'amorces peuvent être associés dans cette méthode de sorte à donner plus d'informations, par exemple en détectant d'autres mutations portées par les gènes codant pour l'ALS et l'ACCase ou en détectant des mutations portées par d'autres gènes codant des protéines responsables d'une résistance aux herbicides. [0090] Dans un mode de réalisation préféré, la méthode permet de détecter toutes les mutations connues et émergentes provoquant des résistances aux herbicides chez Vulpin et Ray-grass. [0091] L'invention met donc à disposition des couples d'amorces permettant l'amplification par PCRq d'un fragment localisé au site d'une mutation ponctuelle responsable d'une résistance aux herbicides et une sonde spécifique du fragment amplifié. Le fait de pouvoir identifier par PCRq la présence d'une mutation ponctuelle est un gain de temps considérable par rapport aux techniques utilisées habituellement pour détecter les mutations ponctuelles, à savoir le séquençage. [0092] Un second objet de l'invention concerne un dispositif destiné à la détection de ré- 14 sistances aux herbicides de classe B inhibiteurs de l'activité de PALS chez les plantes du genre Vulpin et Ray-grass par la méthode de réaction de PCR comprenant un support avec des puits dans lesquels sont disposés des mélanges réactionnels et comprenant au moins : [0093] le mélange réactionnel 1 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 2 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.1, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 4 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.6 et SEQ ID NO.7, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 6 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.7, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 5 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.8 et SEQ ID NO.9, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 9 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.8, un fragment contenant ladite mutation ; et le mélange réactionnel 6 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.10 et SEQ ID NO.11, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 10 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.11, un fragment contenant ladite mutation. [0094] Au sens de l'invention, un dispositif peut être tout support à une PCR, par exemple une plaque 96 puits ou une puce. Les mélanges réactionnels peuvent être disposés dans chacun des puits ou plus généralement sur une zone réactionnelle. [0095] Dans un mode de réalisation préféré, le dispositif comprend en outre au moins l'un des mélanges réactionnels suivants qui permet de détecter des mutations responsables d'une résistance aux herbicides de classe A inhibiteurs de l'activité de l'ACCase [0096] le mélange réactionnel 2 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.5, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 5 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.3, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 3 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.4 et SEQ ID NO.5., ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 5 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en as- sociation avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.4, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 7 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.12 et SEQ ID NO.13, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 12 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.13, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 8 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.14 et SEQ ID NO.15, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 14 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.15, un fragment contenant ladite mutation ; [0097] - le mélange réactionnel 9 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.16 et SEQ ID NO.17, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 17 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.16, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 10 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.18 et SEQ ID NO.19, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 18 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.19, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 11 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.20 et SEQ ID NO.23, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 23 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.20, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 12 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.21 et SEQ ID NO.23, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 23 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.21, un fragment contenant ladite mutation ; le mélange réactionnel 13 comprenant les amorces de séquences SEQ ID NO.22 et SEQ ID NO.23, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 23 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.22, un fragment contenant ladite mutation ; ou le mélange réactionnel 14 comprenant les amorces de séquences SEQ ID 16 NO.24 et SEQ ID NO.23, ou un mélange d'amorces équivalent dans lequel la SEQ ID NO. 23 est remplacée par toute autre amorce permettant d'amplifier, en association avec l'amorce spécifique de séquence SEQ ID NO.24, un fragment contenant ladite mutation. [0098] En particulier, le dispositif comprend dans un mode de réalisation particulier les mélanges réactionnels 1, 4, 5, 6, 9, 13, 15 et 16. [0099] Dans un autre mode de réalisation préféré, le dispositif comprend les mélanges réac- tionnels 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 et 14. [0100] Dans un autre mode de réalisation préféré, le dispositif comprend les mélanges 1 à 14. [0101] De manière avantageuse, le dispositif comprend également deux mélanges réac- tionnels permettant de discriminer entre les espèces Vulpin et Ray-grass à savoir : [0102] le mélange réactionnel 15 comprenant un couple d'amorces de séquences SEQ ID NO.25 et SEQ ID NO.26 ; et le mélange réactionnel 16 comprenant un couple d'amorces de séquences SEQ ID NO.27 et SEQ ID NO.28. [0103] Dans un mode de réalisation particulier, le dispositif comprend les mélanges réac- tionnels 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 et 14, ainsi que les mélanges réactionnels 15 et 16. [0104] Dans un autre mode de réalisation particulier, le dispositif comprend les mélanges ré- actionnels 1 à 16. [0105] Les mélanges réactionnels peuvent être disposés dans des puits indépendants ou combinés en duplex, triplex ou plus, comme c'est le cas dans une réaction PCR multiplex. [0106] L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent, qui ne sont présentés qu'à titre d'illustration et qui ne doivent pas être compris comme limitant la portée de l'invention. Brève description des dessins [0107] [fig.1] La Figure 1 représente les profils de PCR quantitative obtenus avec le mélange réactionnel 4. EXEMPLES 101081 EXEMPLE I : Détection par PCRq de mutations ponctuelles responsables de la résistance aux herbicides inhibant l'activité de l'ALS. 10109] Cet exemple a trait à la détection par PCRq d'une mutation ponctuelle conférant le changement d'acide aminé P 197T dans la cible des herbicides inhibiteurs de l'ALS chez des plantes du genre Vulpin et Ray-Grass suspectées résistantes aux herbicides de Classe B. 17 Matériel et méthodes 101101 Des plantes identifiées morphologiquement comme appartenant au genre Vulpin et Ray-Grass et pressenties comme possédant des suspicions de résistance aux herbicides inhibiteurs de l'ALS (Classe B) ont été collectées à l'automne 2017 sur des parcelles agricoles du Nord de la France. Pour chaque plante individualisée, l'ADN génomique a été extrait à partir de 50 mg de feuille selon la méthode CTAB décrite en 1987 par Doyle and Doyle (Doyle, J. 1, and J. L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure far sizzall quantifies of fresh leaf tissue. Phytochetnical Bulletin 19: 11-15). Les réactions de PCR quantitatives ont été réalisées sur la base d'une quantité d'ADN génomique dc 25 ng et dans un volume final de 5 pl sur un appareil Roche LC480 à l'aide du kit GoTaq® Probe qPCR Mastcr Mix (Promega ; Réf. A6101) selon les recommandations du fournisseur (900 nM d'amorce sens et antisens et 250 nM de sonde ; 2 minutes de dénaturation initiale à 95°C puis 40 cycles comprenant 15 secondes de dénaturation initiale à 95°C et 1 minute d'élongation à 95°C). Résultats [0 1 1 1] Les résultats du génotypagc de différentes plantes sont présentés à la Figure 1. [0112] Les courbes indiquées en (a) et en (b) correspondent à des réactions positives (courbes sigmoïdalcs typiques de la PCR quantitative) : la courbe (a) correspond à un contrôle interne positif « plasmide » et les courbes (b) correspondent à deux individus mutants P197T (mutation du codon CCC en ACC) du genre Vulpin. Les courbes indiquées en (c) correspondent à des réactions négatives, i.c. sur des individus non mutés P197 Vulpin et Ray-grass, sur des individus du genre Vulpin mutés P19711 (mutation du codon CCC en CAC), sur des individus du genre Ray-Grass mutés P197L (mutation du codon CCG en CTG) et sur dcs témoins internes négatifs (H2O). Les courbes (c) démontrent dc l'absence de réactions croisées sur les individus non mutés ou mutés différemment, et ce pour les deux espèces testées. [0113] [Tableau 21 18 [Tablcaux2] Numéro de séquence Séquence correspondante SEQ ID NO.1 GGGAATGGTGGTGCAGTT SEQ ID NO.2 CACCRCTYGGGATCATAGG SEQ ID NO.3 AGGATGGACTAGGTGTGGAG AATC SEQ ID NO.4 AGGATGGACTAGGTGTGGAG AAGT SEQ ID NO.5 GGAACATAGCTGAGCCACCT CA SEQ ID NO.6 CGGCGGYGCYTCAATGGAG SEQ ID NO.7 CGTRCCKATCATGCGGCGGAT SEQ ID NO.8 CGCYATCACGGGRCAGGTTC A SEQ ID NO.9 GCAGCCRCCRCCAACATACA SEQ ID NO.10 CCGSCACGAGCAGGGSGAG SEQ ID NO.11 CCGTGCCGATCATGCGGCGA A SEQ ID NO.12 GTTACTGGCAGAGCWAAAC SEQ ID NO.13 GTTGAYCCRGMCTGCAGAT SEQ ID NO.14 GCTGTRGAGACACAGACCAT GATG SEQ ID NO.15 TCTGGRTTTATCTTSCTAYCTA TA SEQ ID NO.16 AGGATGGACTAGGTGTGGAG AAAG SEQ ID NO.17 ACCACCCAACTGCRTGKGRG A SEQ ID NO.18 AGCTGGATCATTTGGCCCAAG G SEQ ID NO.19 CAATAGCAGCACTTCCATGCG 19 SEQ ID NO.20 TRTTCATMCTTGCTAACTAC SEQ ID NO.21 TRTTCATMCTTGCTAACTAT SEQ ID NO.22 AGAGAYCTTTTTGAWGGGG SEQ ID NO.23 CTGAYCTRAACTTGATCTCAA TCA SEQ ID NO.24 TATGCTGAGASRWCTGYAAA RAC SEQ ID NO.25 TGAGGTGGCTCAGCTATGTTC C SEQ ID NO.26 CATCATGGTCTGTGTCTCTAC AGC SEQ ID NO.27 TTAGTTCGTGGCATGAGGAG SEQ ID NO.28 TATTGTGGTGGGATTGCCT SEQ ID NO.29 GCCCTGGAGTCTCAAGCATCT SEQ ID NO.30 TGGACGAACTGTTGGAATMG GAGC SEQ ID NO.31 GGCACGARCAGGGAGAGGC SEQ ID NO.32 GTATCCTGGCAGACTCATTGG CG SEQ ID NO.33 GTCGAGGAGAGCATCGGCGA GCGC SEQ ID NO.34 AGCAAGKATGAACAGAGGTA ATCC SEQ ID NO.35 CTTGGGGATATAKACAAAGG CAG SEQ ID NO.36 TCTCCACACCTAGTCCATCCT CCTT SEQ ID NO.37 GTATATATCCCCAAGGCTGCA GAGC SEQ ID NO.38 GGCTGCAGAGCTACGTGGAG G SEQ ID NO.39 AATGTTCTCGARCCTCAAGG SEQ ID NO.40 GA ATCCCTCC A AGTTTTGCTC TGCCAG SEQ ID NO.41 ACTCCCTYTTCTGCTGATC [0114] Tableau 2 : Récapitulatif des séquences nucléotidiques décrites de la demande 21 [Revendication I]