FR 3088077 A1 20200508 FR 1860174 A 20181105 METHODE DE DIAGNOSTIC D'UN CANCER ET KIT ASSOCIE La présente invention concerne une méthode de diagnostic (l'un cancer et un kit utile pour la mise en oeuvre d'une telle méthode. La présente invention concerne également une méthode mise en oeuvre par ordinateur afin d'analyser les résultats d'une étape de PCR, notamment effectuée dans le cadre d'un diagnostic d'un cancer. Les cancers sont dus à une accumulation d'anomalies génétiques par les cellules tumorales. Parmi ces anomalies figurent de nombreux réarrangements chromosomiques (translocations, délétions et inversions) qui entraînent la formation de gènes de fusion et des mutations sur des sites d'épissage qui entraînent des sauts d'exon. Les gènes de fusion et les sauts d'exon sont usuellement détectés par des techniques différentes. (1) Les gènes de fusions sont souvent associés à des formes particulières de tumeur, et leur mise en évidence peut contribuer de façon significative à poser le diagnostic (The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Mitelman F, Johansson B, Mertens F., Nat Rev Cancer. 2007 Apr;7(4):233-45.). Ils sont aussi souvent utilisés comme marqueurs moléculaires pour contrôler l'efficacité des traitements et suivre l'évolution de la maladie, comme par exemple dans les leucémies aiguës (Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acutc leukemia. van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, Delabesse E, Rossi V, Saglio G, Gottardi E, Rambaldi A, Dotti G, Griesinger F, Parreira A, Gameiro P, Diàz MG, Malec M, Langerak AW, San Miguel JE, Biondi A. Leukemia. 1999 Dec;13(12):1901-28.). Les trois principales techniques qui sont couramment utilisées pour rechercher les gènes de fusion sont la cytogénétique conventionnelle, la cytogénétique moléculaire, et la RT-PCR. *La cytogénétique conventionnelle consiste à établir le caryotype des cellules cancéreuses pour rechercher d'éventuelles anomalies de nombre et/ou de structure des chromosomes. Elle possède l'avantage de fournir une vision globale de l'ensemble du génome. Elle est cependant relativement peu sensible, son efficacité dépendant fortement du pourcentage de cellules tumorales dans l'échantillon à analyser et de la possibilité 2 d'obtenir des cultures cellulaires viables. Un autre de ses inconvénients est sa faible résolution qui ne permet pas de détecter certains réarrangements (en particulier des inversions et délétions de petite taille). Enfin, certaines tumeurs sont associées à une instabilité génomique majeure qui masque les anomalies génétiques pathognomoniques. 5 Cela est par exemple le cas dans les tumeurs solides telles que le cancer du poumon. L'analyse des caryotypes est donc souvent difficile et ne peut être réalisée que par du personnel possédant une excellente expertise, ce qui induit des coûts importants. *La cytogénétique moléculaire, ou FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation), consiste à hybrider des sondes fluorescentes sur les chromosomes des cellules tumorales 10 afin de visualiser leurs anomalies de structure. Sa résolution, supérieure à la cytogénétique conventionnelle, lui confère un avantage significatif pour détecter les réarrangements de petite taille. Elle permet aussi (le mettre en évidence (les anomalies dans des tumeurs à forte instabilité génomique, en ciblant précisément un réarrangement. Son inconvénient majeur est que chaque anomalie doit être recherchée individuellement, 15 à l'aide de sondes spécifiques. Elle induit donc des coûts importants et, du fait de la grande diversité des anomalies qui ont été décrites et de la faible quantité de matériel tumoral disponible au diagnostic, seuls quelques réarrangements peuvent être recherchés. Par exemple, en pratique, dans le contexte du diagnostic d'un carcinome pulmonaire, seul un arrangement est recherché de façon courante par cette méthode, la recherche de 20 deux réan-angements restant très exceptionnelle. *La troisième technique, la RT-PCR, est réalisée à partir de l'ARN extrait des cellules tumorales. Elle possède une excellente sensibilité, bien supérieure à la cytogénétique. Cette sensibilité en fait la technique de référence pour analyser (les échantillons biologiques où le pourcentage de cellules tumorales est faible, par exemple 25 pour contrôler l'efficacité (les traitements ou pour anticiper très précocement d'éventuelles rechutes. En revanche, sa limite principale est liée au fait qu'il est extrêmement difficile de multiplexer ce type d'analyse. Comme pour la cytogénétique moléculaire, chaque translocation devant en général être recherchée par un test spécifique, seules quelques fusions récurrentes parmi les très nombreuses qui sont 30 aujourd'hui connues sont recherchées dans les laboratoires d'analyse de routine. La RT- PCR nécessite également de pouvoir extraire des ARNs de bonne qualité, ce qui est rarement le cas pour les tumeurs solides où, pour faciliter le diagnostic anathomo- 3 pathologique, les prélèvements sont fixés au formol et inclus en paraffine dès l'obtention de la biopsie. (2) Les sauts d'exon entraînent généralement l'expression d'une protéine anormalement courte qui est impliquée dans le processus tumoral. Par exemple le saut de 5 l'exon 14 du gène MET est impliqué dans le développement (lu carcinome pulmonaire. Ils sont souvent dus à des mutations ponctuelles qui touchent les sites d'épissage des exons (sites donneurs en 3', accepteurs en 5', ainsi que les enhancers introniques ou exoniqucs). Il est aujourd'hui particulièrement difficile de mettre ces anomalies en évidence pour le diagnostic des cancers, puisque ni la cytogénétique ni la FISH ne sont informatives. La 10 RT-PCR pourrait constituer une alternative, niais elle est fortement limitée du fait de la fixation des biopsies tumorales au formol nécessaire pour le diagnostic anatomopathologique. Ces anomalies sont donc aujourd'hui principalement recherchées par séquençage de nouvelle génération, qui est une méthode onéreuse et d'interprétation parfois complexe (il est souvent difficile de déterminer si une mutation observée 15 influence réellement le processus d'épissage). (3) La demande internationale PCT/FR2014/052255 décrit une méthode de diagnostic d'un cancer par la détection des gènes de fusion. Ladite méthode comprend une étape de RT-MLPA à l'aide de sondes fusionnées à au moins une extrémité avec une séquence d'amorçage. 20 (4) L'article de Piton et al. décrit par ailleurs la détection par RT-PCR de réarrangement liés aux gènes ALK, ROS et RET dans le contexte des adénocarcinomes pulmonaires (Ligation-dependant-RT-PCR : a new specific and low-cost technique to detect ALK, ROS and RET rearrangements in lung adenocarcinoma ; Laboratory Investigation, Volume 00 2017). 25 Des techniques permettant aujourd'hui de détecter des gènes de fusion et des sauts d'exon sont donc connues. La méthode décrite dans la demande internationale PCT/FR2014/052255 est plus spécifique, simple et rapide à mettre en oeuvre par rapport aux techniques de 30 cytogénétique et de RT-PCR. 4 Cependant, il existe toujours un besoin pour des techniques de diagnostic de gènes de fusion de plus en plus spécifiques, sensibles, fiables, tout en restant simples et rapides à mettre en oeuvre. La demande internationale PCT/FR2014/052255 décrit, également des sondes 5 spécifiques pour des types de translocation observée dans des cancers. Cependant, de nouvelles anomalies génétiques ont depuis lors été mises en évidence et ne peuvent pas être détectées par la méthode décrite dans la demande internationale ci-dessus référencée. Il existe ainsi un besoin pour une méthode de diagnostic permettant de détecter de nouvelles anomalies génétiques. 10 Par ailleurs, les techniques permettant aujourd'hui de détecter des sauts d'exon nécessitent de réaliser des tests complexes. Ces techniques sont donc coûteuses et longues à mettre en oeuvre. Il existe ainsi un besoin pour une technique permettant de détecter des sauts d'exon qui soit sensible, fiable, simple, économique et rapide à mettre en oeuvre. 15 Les techniques permettant de détecter les gènes de fusion et les sauts d'exon étant par ailleurs différentes, il existe également un besoin pour une méthode permettant de détecter ces deux types d'anomalies génétiques de façon simultanée. Enfin, les biopsies chirurgicales tumorales disponibles au diagnostic des cancers solides étant souvent de très petite taille, fixées au formol et incluses en paraffine, il 20 existe un besoin pour une méthode permettant de détecter un grand nombre d'anomalies de façon simultanée à partir de matériel génétique en faible quantité et de mauvaise qualité. La présente invention vise ainsi à répondre à ces différents besoins. La présente 25 invention repose en effet sur les résultats des inventeurs qui (i) ont identifié de nouvelles anomalies génétiques liées aux gènes RET, MET, ALK et/ou ROS (à la fois des gènes de fusion et des sauts d'exon), et (ii) ont développé une technique permettant de les identifier. La présente invention repose également sur l'utilisation de sondes comprenant au moins un barcode moléculaire qui permet d'améliorer de façon significative la 30 sensibilité et la spécificité de la détection. 5 La présente invention fournit ainsi une méthode qui permet de détecter des gènes de fusion et des sauts d'exon. La présente invention présente également l'avantage d'être spécifique, sensible, fiable, mais également simple, économique et rapide à mettre en oeuvre. Typiquement, grâce à la technique selon l'invention, les résultats peuvent être 5 obtenus en deux jours après réception (le l'échantillon par le laboratoire d'analyse, contre plusieurs semaines pour des techniques habituelles. Elle présente également comme avantage d'être applicable sur les tissus fixés, tels qu'ils sont utilisés dans les laboratoires d'anatomo-pathologie. La présente invention permet ainsi d'identifier les anomalies génétiques à partir de matériel génétique en faible quantité et de mauvaise qualité. Enfin, 10 sa très grande sensibilité (elle permet de détecter moins d'une dizaine de molécules anormales dans un échantillon), couplé à sa très grande spécificité (les résultats obtenus sont des séquences d'ADN, c'est-à-dire des données qualitatives, ce qui n'induit pas de biais d'interprétation comme pour les méthodes quantitatives de type IHC) en font une méthode très efficace. 15 Dans un premier aspect, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'un cancer chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet, dans laquelle l'étape de RT-MLPA est réalisée à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi : 20 - les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et/ou - les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, chacune des sondes étant fusionnée, à au mo ns une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode 25 moléculaire. Selon l'invention, le terme « MLPA » signifie Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification, qui permet l'amplification simultanée de plusieurs cibles d'intérêt contiguës l'une de l'autre, en utilisant une ou plusieurs sondes spécifiques. Cette technique est très avantageuse, dans le cadre de la présente invention, pour déterminer la 30 présence de translocations, qui sont fréquentes dans les tumeurs malignes. Selon l'invention, le terme « RT-NILPA » signifie Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification précédée d'une Transcription Inverse (Reverse transcription, RT), 6 qui permet, dans le cadre de la présente invention, de partir de l'ARN d'un sujet pour amplifier et caractériser les gènes de fusion ou les sauts d'exon d'intérêt. Selon l'invention, l'étape de RT-MLPA est réalisée en mode multiplex. Le mode multiplex permet un gain de temps, car il est plus rapide que plusieurs monoplex, et est 5 économiquement avantageux. H permet également de rechercher simultanément un nombre beaucoup plus élevé d'anomalies que les autres techniques actuellement disponibles. L'étape de RT-MLPA est dérivée de la MLPA, décrite notamment dans le brevet US 6,955,901. Elle permet la détection et le dosage simultané d'un grand nombre de séquences oligonucléotidiques différentes. Le principe est le suivant (voir la Figure 1 10 qui expose le principe avec un gène de fusion) : l'ARN extrait du tissu tumoral est d'abord converti en ADN complémentaire (ADNc) par transcription inverse. Cet ADNc est ensuite incubé avec le mélange de sondes adéquates, chacune pouvant alors s'hybrider sur les séquences des exons auxquels elles correspondent. Si un des transcrits de fusion ou un des transcrits correspondant à un saut d'exon recherché est. présent dans 15 l'échantillon, deux sondes viennent se fixer côte à côte sur l'ADNc correspondant. Une réaction de ligation est alors réalisée à l'aide d'une enzyme à activité ADN ligase, qui établit une liaison covalente entre les deux sondes contiguës. Une réaction de PCR (Polymérase Chain Reaction) est ensuite réalisée, en utilisant des amorces correspondant aux séquences d'amorçage, qui permet d'amplifier spécifiquement les deux sondes 20 liguées. L'obtention d'un produit d'amplification après l'étape de RT-MLPA indique que l'une des translocations recherchée est présente dans l'échantillon analysé. Lc séquençage de ce produit d'amplification permet d'identifier les gènes réarrangés. Selon l'invention, le terme « sujet » signifie un individu sain ou susceptible d'être atteint d'un cancer ou en quête de dépistage, de diagnostic ou de suivi. 25 Selon l'invention, le terme « échantillon biologique » signifie un échantillon contenant de la matière biologique. Plus préférentiellement, cela signifie tout échantillon contenant de l'ARN. Cet échantillon peut provenir d'un prélèvement biologique effectué chez un être vivant (patient humain, animal). Préférentiellement, les échantillons biologiques selon l'invention sont choisis parmi le sang et une biopsie, obtenus à partir 30 d'un sujet, notamment humain. La biopsie est notamment tumorale, notamment issue d'une coupe de tissu fixé (par exemple fixée au formol et/ou incluse en paraffine) ou d'un échantillon congelé. 7 Selon l'invention, le terme « cancer » signifie une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormalement importante au sein d'un tissu normal de l'organisme, de telle manière que la survie de ce dernier est menacée. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer est lié à une anomalie 5 génétique, de préférence un gène de fusion ou un saut d'exon. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer implique au moins un gène choisi parmi RET, MET, ALK ctlou ROS, et est notamment associé à la formation d'un gène de fusion et/ou à un saut d'exon, plus particulièrement un saut d'exon du gène MET. Selon l'invention, le cancer est de préférence un carcinome. Les carcinomes sont 10 des tumeurs malignes développées aux dépens d'un tissu épithélial. Plus particulièrement le cancer est un carcinome pulmonaire, plus particulièrement un carcinome bronchopulmonaire encore plus particulièrement un carcinome pulmonaire associé à une anomalie génétique du gène MET. Selon l'invention, le terme « sonde » signifie une séquence d'acide nucléique de 15 longueur comprise entre 15 et 55 nucléotides, de préférence comprise entre 15 et 45 nucléotides, et complémentaire d'une séquence d'ADNc issue d'un ARN du sujet (endogène). Elle est donc capable de s'hybrider avec ladite séquence d'ADNc issue d'un ARN du sujet. Le terme « couple de sondes » s'entend d'un ensemble de deux sondes (i.e. une sonde « Forward » et une sonde « Reverse ») ; l'une étant située en 5' (voir 20 notamment « G » dans le Tableau 1) de la translocation du gène de fusion ou du saut d'cxon, l'autre étant située en 3' (voir notamment « D » dans le Tableau 1) de la translocation du gène de fusion ou du saut d'exon. De préférence, un couple de sondes selon l'invention est formé a minima des sondes de SEQ ID NO : 1 à 13, et/ou les sondes de SEQ ID NO: 96 à 99 et/ou les sondes SEQ ID NO : 14 à 91. Encore plus 25 particulièrement, un couple de sondes selon l'invention est formé a. minima des sondes de SEQ ID NO : 1 à 13, des sondes de SEQ ID NO : 96 à 99 et des sondes de SEQ ID NO : 14 à 91. Selon l'invention, le terme « séquence d'amorçage » signifie une séquence d'acide nucléique de longueur comprise entre 15 et 30 nucléotides, de préférence 30 comprise entre 19 et 25 nucléotides, et non complémentaire des séquences d'ADNc issues d'ARN du sujet. Elle n'est donc pas complémentaire de l'ADNc correspondant à l'ARN endogène. Elle ne peut. donc pas s'hybrider avec lesdites séquences d'ADNc. De 8 préférence, dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention la séquence d'amorçage est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93 ou SEQ ID NO : 94 et SEQ ID NO : 95. Selon l'invention, le terme « séquence index » signifie une séquence d'acide 5 nucléique de longueur comprise entre 5 et 10 nucléotides, de préférence comprise entre 6 et 8 nucléotides, notamment 8 nucléotides, et non complémentaire des séquences d'ADNc issues d'ARN du sujet. Elle n'est donc pas complémentaire de l'ADNc correspondant à l'ARN endogène. Elle ne peut donc pas s'hybrider avec lesdites séquences d'ADNc. De préférence, la séquence index est représentée par la séquence 10 SEQ ID NO : 836. Ladite séquence index est une constituée de bases (A, T. G ou C). Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, ladite séquence index peut être fusionnée à une séquence d'amorçage, notamment à l'extrémité 3' de la séquence d'amorçage. La séquence index est propre à chaque sujet/patent dont l'échantillon est testé. Chaque couple de sondes utilisé dans l'étape de PCR comprend 15 une séquence index différente qui permet d'identifier les patients. Selon l'invention, k terme « barcode moléculaire » signifie une séquence d'acide nucléique de longueur comprise entre 5 et 10 nucléotides, de préférence comprise entre 6 et 8 nucléotides, notamment 7 nucléotides, et non complémentaire des séquences d'ADNc issues d'ARN du sujet. Elle n'est donc pas complémentaire de l'ADNc 20 correspondant à l'ARN endogène. Elle ne peut donc pas s'hybrider avec lesdites séquences d'ADNc. De préférence, la séquence de barcode moléculaire est représentée par la séquence SEQ ID NO : 100. Ladite séquence de barcode moléculaire est une séquence aléatoire, constituée de bases aléatoires (A, T, G ou C). L'utilisation de cette séquence permet de renseigner sur le nombre exact de molécules d'ADNc détectées par 25 ligation, en s'abstenant du biais lié à l'amplification par PCR. Selon l'invention, au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire. En d'autres termes, au moins une des sondes dudit couple est fusionnée à une extrémité avec une séquence de barcode moléculaire Dans un mode de réalisation préféré, une séquence de barcode moléculaire est ajoutée en 5' de la sonde « F » ou « Forward », appelées aussi 30 « G » ou « Gauche ». Dans un mode de réalisation préféré, chacune des sondes peut comprendre une séquence de barcode moléculaire, en particulier les sondes SEQ ID NO : 9 14 à 91 et les sondes SEQ ID NO : 96 et 98, de préférence les sondes SEQ ID NO 14 à 91. Selon l'invention, le terme « séquence d'extension » fait référence aux séquences qui peuvent être présentes aux extrémités des amorces utilisées pendant l'étape de PCR, 5 et qui permet l'analyse des produits de PCR sur un séquenceur de nouvelle génération de type Illumina. Une séquence dite 'extension' correspond à toute séquence appropriée permettant l'analyse des produits de PCR sur un séquenceur de nouvelle génération. Une séquence d'extension est une séquence d'acide nucléique de longueur comprise entre 5 et 20 nucléotides, de préférence comprise entre 5 et 15 nucléotides, et non complémentaire 10 des séquences d'ADNc issues d'ARN du sujet. Elle n'est donc pas complémentaire de l'ADNc correspondant à l'ARN endogène. Elle ne peut donc pas s'hybrider avec lesdites séquences d'ADNc. Elle est notamment représentée par la SEQ ID NO : 865. Les connaissances de l'homme du métier lui permettent aisément d'adapter ces séquences d'extension. 15 Selon l'invention, le terme « sensibilité » signifie la proportion de tests positifs chez les sujets atteints de cancers et réellement porteurs des anomalies recherchées (calculée par la formule suivante : nombre de vrais positifs / (nombre de vrais positifs plus nombre de faux négatifs)). Selon l'invention, le terme « spécificité » signifie la proportion de tests négatifs 20 chez les sujets non atteints de cancers et non porteurs des anomalies recherchées (calculé par la formule suivante : nombre de vrais négatifs / (nombre de vrais négatifs plus nombre de faux positifs)). Les inventeurs de la présente invention ont identifié des sondes spécifiques pour de nouvelles anomalies génétiques observées dans certains cancers. Cette identification 25 repose sur l'analyse de la structure intron-exon des gènes impliqués dans les translocations, comme cela est montré en Figure 1, ou les sauts d'exon, comme cela est montré en Figure 2. En particulier, s'agissant de la Figure 1, les points de cassures susceptibles de conduire à l'expression de protéines chimériques fonctionnelles sont recherchés (Figure lA). A partir de ces résultats, des séquences d'ADN de 25 à 50 paires 30 de bases sont définies, correspondant précisément aux extrémités 5' et 3' des exons des deux gènes juxtaposés après épissage des transcrits hybrides (Figure lA). Un ensemble de sondes est ensuite défini de la façon suivante : une séquence d'amorçage (SA sur la 10 Figure 1B) d'une vingtaine de paires de bases, est ajoutée en 5' de toutes les sondes complémentaires des exons des gènes formant la partie 5' des transcrits de fusion (S1 sur la Figure 1B). Une deuxième séquence d'amorçage (SB sur la Figure 1B), également d'une vingtaine de paires de bases mais différente de SA, est ajoutée aux extrémités 3' de 5 toutes les sondes complémentaires des exons des gènes formant la partie 3' des transcrits de fusion (S2 sur la Figure 1B). Au moins une séquence de barcode moléculaire (SA, sur la Figure 1B) est ajoutée, par exemple en 5' de la sonde complémentaire des exons des gènes formant la partie 5' des transcrits de fusion. Ces sondes sont ensuite regroupées dans un mélange, et contiennent tous les éléments nécessaires à la détection d'un ou de 10 plusieurs transcrits de fusion, produits par une ou plusieurs translocations. Les sondes utilisées dans l'invention sont donc capables de s'hybrider soit avec les derniers nucléotides du dernier exon en 5' de la translocation, soit avec les premiers nucléotides du premier exon en 3' de la translocation. De préférence, les sondes utilisées dans l'invention, capables de s'hybrider avec les premiers nucléotides du premier exon en 3' 15 de la translocation, sont phosphorylées en 5' avant leur utilisation. Le même principe s'applique lorsque l'anomalie génétique est un saut d'exon. La Figure 2 représente la stratégie qui permet de détecter un saut de l'exon 14 du gène MET grâce à la présente invention. La Figure 2A montre qu'en situation normale, l'épissage des transcrits du gène MET induit des jonctions entre les exons 13 et 14, et 14 et 15. En situation 20 pathologique, par exemple si une mutation vient détruire le site donneur d'épissage de l'exon 14, les cellules tumorales expriment un transcrit anormal, résultant de la jonction des exons 13 et 15. Un ensemble de sondes est ainsi défini de la façon suivante : une séquence d'amorçage (SA sur la Figure 2B) d'une vingtaine de paires de bases, est ajoutée en 5' de toutes les sondes complémentaires de l'exon 13 formant la partie 5' des 25 transcrits de fusion (S 13G sur la Figure 2B). Une deuxième séquence d'amorçage (SB sur la Figure 2B), également d'une vingtaine de paires de bases mais différente de SA, est ajoutée aux extrémités 3' de toutes les sondes complémentaires de l'exon 15 formant la partie 3' des transcrits de fusion (Sut) sur la Figure 2B). Au moins une séquence de barcode moléculaire (SA' sur la Figure 2B) est ajoutée, par exemple en 5' de la sonde 30 complémentaire des exons formant la partie 5' du saut d'exon, notamment l'exon 13 du gène MET. 11 Selon l'invention, au moins une des sondes d'un couple utilisé comprend une séquence de barcode moléculaire, notamment la sonde «G ». Cela signifie que la séquence de barcode moléculaire est fusionnée à la séquence de la sonde, à l'une de ses extrémités, de préférence en 5'. Lorsqu'elle est présente, ladite séquence de barcode 5 moléculaire est préférentiellement insérée entre la séquence d'amorçage et la sonde complémentaire des exons des gènes. Selon l'invention, un mode de réalisation préféré peut aussi comprendre une séquence d'amorçage en 5' d'une séquence de barcode moléculaire, ladite séquence de barcode étant elle-même ajoutée en 5' de la sonde complémentaire de l'exon du gène formant la partie 5' des transcrits de fusion ou du 10 transcrit correspondant à un saut d'exon. Selon l'invention un mode de réalisation alternatif peut aussi comprendre une séquence d'amorçage ajoutée à l'extrémité 3' d'une séquence de barcode moléculaire, ladite séquence de barcode étant elle-même ajoutée en 3' de la sonde complémentaire de l'exon du gène formant la partie 3' des transcrits de fusion ou du transcrit correspondant à un saut d'exon. Selon l'invention, un mode de 15 réalisation particulier peut ainsi comprendre une séquence d'amorçage en 5' d'une séquence de barcode moléculaire, ladite séquence de barcode étant elle-même ajoutée en 5' de la sonde complémentaire de l'exon du gène formant la partie 5' des transcrits de fusion ou du transcrit correspondant à un saut d'exon, ainsi qu'une séquence d'amorçage ajoutée à l'extrémité 3' d'une séquence de barcode moléculaire, ladite séquence de 20 barcode étant elle-même ajoutée en 3' de la sonde complémentaire de l'exon du gène formant la partie 3' des transcrits de fusion ou du transcrit correspondant à un saut d'exon. Un exemple des différentes translocations (gènes de fusion) identifiées selon la présente invention est illustré dans la Figure 4. Un exemple de sauts d'exon identifiés 25 selon la présente invention est illustré dans la Figure 2. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, les sondes SEQ ID NO : 14 à 91 sont également utilisées pour l'étape de RT-MLPA. Dans cet aspect, chacune des sondes est également fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes comprend de préférence une séquence 30 de barcode moléculaire. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, chacune des sondes « F » du couple comprend une séquence de barcode moléculaire. 12 Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT-MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant chacun une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 1 à 13 et les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence 5 d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT-MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant les sondes choisies parmi les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, et les sondes 10 SEQ ID NO : 14 à 91, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire, en particulier les sondes SEQ ID NO : 14 à 91 et optionnellement les sondes SEQ ID NO : 96 et 98. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de 15 RT-MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant chacun les sondes choisies parmi les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, SEQ ID NO : 14 à 91, SEQ ID NO : 96 à 99, SEQ ID NO : 103 à 127, SEQ ID NO : 128, SEQ ID NO : 129, SEQ ID NO : 130 à 137, SEQ ID NO : 138 à 168, SEQ ID NO : 169 à 194, SEQ ID NO : 826 à 835, SEQ ID NO : 195 à 198, SEQ ID NO : 199 à 245, SEQ ID NO : 246 à 344, SEQ ID NO : 345 à 20 403, SEQ ID NO : 404 à 428, SEQ ID NO : 429 à 436, SEQ ID NO : 437 à 479, SEQ ID NO : 480 à 504, SEQ ID NO : 505, SEQ ID NO : 506, SEQ ID NO : 507 à 514, SEQ ID NO : 515 à 546, SEQ ID NO : 547 à 582, SEQ ID NO : 583 à 586, SEQ ID NO : 587 à 633, SEQ ID NO : 634 à 732, SEQ ID NO : 733 à 791, SEQ ID NO : 792 à 816, SEQ ID NO : 817 à 824 et SEQ ID NO : 825, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une 25 extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer associé à la formation d'un gène de fusion est diagnostiqué à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, 30 optionnellement les sondes SEQ ID NO : 14 à 91, et chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les 13 séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire. Alternativement, et dans un autre mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer associé à un saut d'exon est diagnostiqué à l'aide d'au moins un 5 couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, et chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 94 et SEQ ID NO : 95, et optionnellement au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire. Plus particulièrement selon ce mode de réalisation, 10 le cancer est associé à un saut d'exon du gène MET, plus particulièrement un saut de l'exon 14 du gène MET. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, ladite étape de RT-MLPA comprend au moins les étapes suivantes : a) extraction de l'ARN de l'échantillon biologique du sujet, 15 b) conversion de l'ARN extrait en a) en ADNc par transcription inverse, c) incubation de l' ADNc obtenu en 11) avec un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi : - les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et/ou - les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, 20 chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant unc séquence de barcode moléculaire, d) addition d'une ADN ligase dans le mélange obtenu en c), afin d'établir une liaison covalente entre deux sondes contiguës, 25 e) amplification par PCR des sondes contiguës liées de manière covalente obtenues en d), afin d'obtenir des amplicons. Typiquement, l'extraction d' ARN de l'échantillon biologique selon l'étape a) s'effectue selon les techniques classiques, bien connues de l'homme du métier. Par exemple, cette extraction peut être effectuée par lyse cellulaire des cellules issues de 30 l'échantillon biologique. Cette lyse peut être de nature chimique, physique ou thermique. Cette lyse cellulaire est généralement suivie d'une étape de purification permettant de séparer et concentrer les acides nucléiques d'autres débris cellulaires. Pour la mise en 14 oeuvre de l'étape a), les kits commerciaux de type QIAGEN et Zymo Research, ou encore ceux commercialisés par Invitrogen, peuvent être utilisés. Bien entendu, les techniques pertinentes diffèrent en fonction de la nature (le l'échantillon biologique testé. Les connaissances de l'homme du métier lui permettent aisément d'adapter ces étapes de lyse 5 et de purification audit échantillon biologique testé. De préférence, l'ARN extrait à l'étape a) est alors converti par transcription inverse en ADNc ; c'est l'étape b) (voir Figure 1B). Cette étape b) peut être effectuée à l'aide de toute technique de transcription inverse connue de l'art antérieur. Elle peut notamment se faire à l'aide de la transcriptase inverse commercialisée par Qiagen, 10 Promega ou Ambion, selon les conditions classiques d'utilisation, ou encore à l'aide de M-MLV Reverse Transcriptase de chez Invitrogen. De préférence, l'ADNc obtenu à l'étape b) est ensuite incubé avec au moins les sondes SEQ ID NO : 1 à 13 et/ou SEQ ID NO : 96 à 99, préférentiellement également les sondes SEQ ID NO : 14 à 91, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une 15 extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire, de préférence les sondes de SEQ ID NO : 14 à 91 et optionnellement les sondes de SEQ ID NO : 96 et 98. C'est l'étape c) d'hybridation des sondes (voir Figure 1B). En effet, les sondes qui sont complémentaires d'une portion d'ADNc vont venir s'hybrider avec cette portion si celle-ci est présente 20 dans l'ADNc. Comme cela est montré dans la Figure 1B, en raison de leur séquence, les sondes vont donc s'hybrider : - soit avec la portion d'ADNc correspondant aux derniers nucléotides du dernier exon en 5' de la translocation. Il s'agit alors de sondes «F» ou « Forward », appelées aussi « G » ou « Gauche » ; 25 - soit avec la portion d'ADNc correspondant aux premiers nucléotides du premier exon en 3' de la translocation. Il s'agit alors de sondes « R » ou « Reverse », appelées aussi « D » ou « Droite ». De préférence, les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, 97 et 99 sont des sondes « D » et les sondes SEQ ID NO : 96 et 98 sont des sondes « G », de même que les sondes SEQ ID 30 NO : 14 à 91. A la fin de l'étape c), les sondes hybridées à l'ADNc sont contiguës, si et seulement si la translocation (gène de fusion) ou le saut d'exon a eu lieu. Cette étape c) 15 est typiquement réalisée en incubant l'ADNc et le mélange de sondes à une température comprise entre 90°C et 100°C afin dénaturer les structures secondaires des acides nucléiques, pendant une durée de 1 à 5 minutes, puis en laissant incuber pendant une durée d'au moins lh, de préférence 16h, à une température d'environ 60°C pour 5 permettre l'hybridation des sondes. Elle peut être réalisée à l'aide du kit commercial, vendu par la société MRC-Holland (SALSA MLPA Buffer) ou à l'aide d'un tampon commercialisé par la société NEB (Buffer U). A la fin de l'étape c), une ADN ligase est typiquement ajoutée pour lier de manière covalente uniquement les sondes contiguës ; c'est l'étape d) (voir Figures lB et 10 2B). L'ADN ligase, est notamment la ligasc 65, vendue par MRC-Holland, Amsterdam, Netherlands (SALSA Ligase-65) ou les ligases thermostables (Hifi Taq DNA Ligase ou Taq DNA ligase) commercialisées par la société NEB. Elle est typiquement réalisée à une température comprise entre 50°C et 60°C, pendant une durée de 10 à 20 minutes, puis pendant une durée de 2 à 10 minutes à une température comprise entre 95°C et 15 100°C. A la fin de l'étape d), chaque couple de sondes contiguës G et D est hé de manière covalente, et la séquence d'amorçage de chaque sonde est toujours présente en 5' et en 3', de môme que la séquence de barcode moléculaire. De préférence, la méthode comprend également une étape e) d'amplification par 20 PCR des sondes contiguës liées de manière covalente obtenues en d) (voir Figures 1B et 2B). Cette étape. de PCR se fait à l'aide d'un couple d'amorces, l'une des amorces étant identique à la séquence d'amorçage en 5', l'autre amorce étant complémentaire de la séquence d'amorçage en 3'. De préférence, l'amplification par PCR de l'étape e) se fait à l'aide du couple d'amorces SEQ ID NO : 101 et 92 pour détecter les gènes de fusion ou 25 du couple d'amorces SEQ ID NO : 102 et 94 pour détecter les sauts d'exon du gène MET. La PCR est typiquement réalisée à l'aide de kits commerciaux, tels que les kits prêts à l'emploi vendus par Eurogentcc (Redy'Star Mix) ou NEB (Q5 High fidclity DNA polymerase). Typiquement, la PCR se déroule en une première phase de dénaturation 30 initiale à une température comprise entre 90°C et 100°C, typiquement d'environ 94°C, pendant un temps de 5 à 8 minutes ; puis une seconde phase d'amplification comprenant plusieurs cycles, typiquement 35 cycles, chaque cycle comprenant 30 secondes à 94°C, 16 puis 30 secondes à 58°C, puis 30 secondes à 72°C ; et une dernière phase de retour à 72°C pendant 4 minutes environ. A la fin de la PCR, les amplicons sont conservés de préférence à -20°C. Selon l'invention, les amplicons correspondent aux transcrits (le fusion ou au transcrits correspondant à un saut d'exon présent. dans l'échantillon du 5 patient/sujet à tester. Selon l'invention, dans un mode de réalisation particulier, et lorsqu'elle est présente, la séquence index est notamment introduite, au cours de l'étape de PCR à l'extrémité 3' d'une séquence d'amorçage, notamment la séquence d'amorçage « R ». Selon l'invention, dans un mode de réalisation particulier, une première séquence 10 d'extension peut être introduite en 5' d'une séquence d'amorçage, et une deuxième séquence d'extension peut être introduite en 3' de la séquence index. Selon l'invention, dans un mode de réalisation particulier, chaque couple de sondes utilisé dans l'étape de PCR comprend une séquence index différente qui permet d'identifier les patients. La PCR est typiquement réalisée à l'aide de kits commerciaux, 15 tels que les kits prêts à l'emploi vendus par Eurogentec (Red'y'Star Mix) ou NEB (Q5 High fidelity DNA polymerase). Typiquement, la PCR se déroule en une première phase de dénaturation initiale à une température comprise entre 90°C et 100°C, typiquement d'environ 94°C, pendant un temps de 5 à 8 minutes ; puis une seconde phase d'amplification comprenant plusieurs cycles, typiquement 35 cycles, chaque cycle 20 comprenant 30 secondes à 94°C, puis 30 secondes à 58°C, puis 30 secondes à 72°C ; et une dernière phase de retour à 72°C pendant 4 minutes environ. A la fin de la PCR, les amplicons sont conservés de préférence à 4°C. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT-MLPA comprend également une étape f) d'analyse des résultats de la PCR de l'étape 25 e), de préférence par séquençage. Selon l'invention, l'étape de séquençage est de préférence une étape de séquençage capillaire ou de séquençage de nouvelle génération. A cette fin, il est possible d'utiliser un séquenceur capillaire (par exemple de type ABI3130 Genetic Analyser, Thermo Fisher) ou un séquenceur de nouvelle génération (par exemple MySeq System, Illumina, ou ion S5 System, Thermo Fisher). Plusieurs 30 séquences sont analysées simultanément, la séquence index permet ainsi d'associer l'anomalie génétique éventuellement identifiée à un sujet testé. 17 Cette étape d'analyse permet une lecture immédiate du résultat, et indique directement si l'échantillon du sujet est porteur d'une translocation spécifique identifiée ou non et/ou (l'un saut d'exon tel que le saut de l'exon 14 (lu gène MET. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de 5 RT-MLPA comprend également une étape g) de détermination du niveau d'expression des amplicons obtenus à la fin de l'étape de PCR. La détermination du niveau d'expression des amplicons permet notamment de s'assurer que les ligations obtenues sont bien représentatives d'un transcrit de fusion ou d'un transcrit correspondant à un saut d'exon, et ne correspondent pas à un artefact de ligation. Selon l'invention, cette 10 étape g) est notamment mise en oeuvre par ordinateur. Cette détermination du niveau d'expression est mise en oeuvre par les étapes suivantes : (1) démultiplexage des résultats obtenus à l'issue de l'étape de PCR (i.e. l'étape e)) afin d'isoler les séquences obtenues pour un sujet donné, (2) détermination du nombre de fragments d'ADN ou d'ARN présents dans l'échantillon du patient à tester (avant amplification), et optionnellement 15 (3) fourniture d'une matrice d'expression pour chaque transcrit de fusion ou transcrit correspondant à un saut d'exon identifié pour le sujet testé. Cette détermination du niveau d'expression des amplicons obtenus à la fin d'une étape de PCR permet d'apporter plus de précision aux résultats de l'étape de PCR, et notamment aux erreurs de séquençage pouvant survenir (cf l'étape f) indiquée ci-dessus). In fine la détermination du 20 niveau d'expression des amplicons obtenus à la fin d'une étape de PCR permet d'apporter plus de précision au diagnostic du cancer selon la présente invention. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l'étape g) est une étape d'analyse des amplicons obtenus à la fin de l'étape de PCR qui est mise en oeuvre par ordinateur, notamment par une composition d'algorithmes bioinformatiques. Plus 25 particulièrement, cette étape g) comprend les étapes suivantes : (1) une étape de démultiplexage, (2) une étape d'identification des couples de sondes, (3) une étape de comptage des lectures (résultats) et des séquences de barcode moléculaire (séquence UMI, Unique Molecular Index), et optionnellement (4) une étape d'évaluation de la qualité de séquençage de l'échantillon. Les séquences telles qu'analysées par le logiciel 30 sont représentées en Figure 7. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, si, pour un échantillon biologique d'un sujet, une amplification par PCR est obtenue à l'étape e) 18 suite à l'hybridation avec un couple de sondes ciblant les gènes de fusion et/ou les sauts d'exon, alors le sujet est porteur du cancer lié à l'anomalie génétique correspondant au couple (le sondes identifiées. De préférence, cette anomalie est typiquement analysée dans l'étape f) et/ou g) telle que mentionnée ci-dessus. 5 Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'amplification par PCR de l'étape e) se fait à l'aide du couple d'amorces SEQ ID NO : 101 et 92 ou SEQ ID NO : 102 et 94. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, un cancer est ainsi identifié et permet au patient (c'est-à-dire le sujet à qui appartient l'échantillon 10 biologique testé) de bénéficier d'une thérapie ciblée. Selon l'invention, la « thérapie ciblée » s'entend de toute thérapie anticancéreuse, telle que la chimiothérapie, la radiothérapie ou l'immunothérapie, mais de préférence s'entend des inhibiteurs pharmacologiques des protéines ALK, ROS, RET et MET. 15 L'invention concerne également un kit comprenant au moins les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et/ou les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, de préférence comprenant en outre les sondes SEQ ID NO : 14 à 91, chacune des sondes étant de préférence fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire, notamment les 20 sondes SEQ ID NO : 14 à 91 et optionnellement SEQS ID NO : 96 et 98. L'invention concerne également un kit comprenant au moins les sondes suivantes : SEQ ID NO : 1 à 13, SEQ ID NO : 14 à 91, SEQ ID NO : 96 à 99, SEQ ID NO : 103 à 127, SEQ ID NO : 128, SEQ ID NO : 129, SEQ ID NO : 130 à 137, SEQ ID NO : 138 à 168, SEQ ID NO : 169 à 194, SEQ ID NO : 826 à 835, SEQ ID NO : 195 à 25 198, SEQ ID NO : 199 à 245, SEQ ID NO : 246 à 344, SEQ ID NO : 345 à 403, SEQ ID NO : 404 à 428, SEQ ID NO : 429 à 436, SEQ ID NO : 437 à 479, SEQ ID NO : 480 à 504, SEQ ID NO : 505, SEQ ID NO : 506, SEQ ID NO : 507 à 514, SEQ ID NO : 515 à 546, SEQ ID NO : 547 à 582, SEQ ID NO : 583 à 586, SEQ ID NO : 587 à 633, SEQ ID NO : 634 à 732, SEQ ID NO : 733 à 791, SEQ ID NO : 792 à 816, SEQ ID NO : 817 à 30 824 et SEQ ID NO : 825, chacune des sondes étant de préférence fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire. 19 La détermination du niveau d'expression des amplicons obtenus à la fin d'une étape de PCR (par exemple celle réalisée selon l'étape e) ci-dessus) est très avantageuse car elle permet de s'assurer que les résultats obtenus sont fiables. Elle permet notamment de déterminer le nombre de fragments d'ADN ou d'ARN (notamment les transcrits de 5 fusion ou les transcrits correspondant à un saut d'exon) présents dans l'échantillon à tester. Ceci confère plus de précision au diagnostic effectué. Dans cet aspect, l'invention concerne ainsi une méthode de détermination du niveau d'expression des amplicons obtenus à la fin d'une étape de PCR, ladite méthode étant mise en oeuvre par ordinateur et comprenant les étapes suivantes : 10 (a) la fourniture d'un échantillon à tester, ledit échantillon comprenant des amplicons obtenus à l'issue d'une étape de PCR, et (b) la détermination du niveau d'expression des amplicons. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode mise en oeuvre par ordinateur selon l'invention, la détermination du niveau d'expression des amplicons vise 15 notamment à : (1) démultiplexer les résultats d'amplicons obtenus à l'issue d'une étape de PCR, (2) déterminer le nombre de fragments d'ADN ou d'ARN présents dans l'échantillon du patient à tester (avant amplification), et optionnellement (3) fournir une matrice d'expression pour chaque transcrit de fusion ou transcrit 20 correspondant à un saut d'exon identifié pour le patient testé. Cette détermination du niveau d'expression des amplicons obtenus à la fin d'une étape de PCR permet d'apporter plus de précision aux résultats. L'analyse des amplicons et leur quantification peuvent en outre être réalisées très rapidement. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode mise en oeuvre par ordinateur 25 comprend les étapes suivantes : (1) une étape de démultiplexage des résultats d'amplicons obtenus à l'issue d'une étape de PCR, (2) une étape de recherche des couples de sondes utilisés pendant l'étape de PCR, (3) une étape de comptage des lectures (résultats, i.e. transcrits de fusion ou sauts 30 d'exon) et des séquences de barcode moléculaire (séquence UMI, Unique Molecular Index), éventuellement de la séquence index, et optionnellement (4) une étape d'évaluation de la qualité de séquençage de l'échantillon. 20 Le logiciel selon l'invention requiert 3 fichiers pour son exécution : un FASTQ, un fichier d'index et un fichier de marqueurs. FAST() : Lors d'une expérimentation (le séquençage, les données brutes sont générées sous la forme d'un fichier standard appelé FASTQ. Ce format FASTQ va 5 rassembler pour chaque lecture séquencée par l'appareil avec : (1) un identifiant unique de séquence, (2) la séquence de la lecture, (3) le sens de lecture, (4) une séquence ASCII rassemblant les scores de qualité par base de chaque base lue. Un exemple de lecture au format FASTQ est représenté en Figure 8. Un fichier FASTQ est donc composé de cette répétition de 4 lignes, pour chaque lecture séquencée. Une expérimentation de 10 séquençage haut-débit génère plusieurs centaines de millions de séquences. Le fichier FASTQ est le fichier brut nécessaire pour le lancement du logiciel selon l'invention. Fichier de marqueurs : Ce fichier rassemble l'ensemble des séquences de chaque sonde ainsi que leur nom. Il regroupe l'ensemble des couples de sondes utilisés lors d'un diagnostic. Il est. propre à chaque kit (mesure d'expression, recherche de transcrits de 15 fusion, de saut d'exon ...). Fichier d'index : Ce fichier rassemble la liste des séquences permet d'identifier les sujets testés. Il regroupe l'ensemble des séquences index utilisé lors d'un diagnostic. Chaque séquence va correspondre à un sujet testé et va permettre la réattrihution des lectures séquencécs. Ce fichier est propre à chaque expérimentation. 20 Selon l'invention, le terme « étape de démultiplexage » signifie l'étape qui vise à identifier les différentes séquences index utilisées lors de la construction de la librairie pour identifier les lectures de chacun des sujets testés. Cette recherche est effectuée par un algorithme de comparaison de séquences exacte et inexacte permettant de prendre en compte les erreurs de séquençage liées à la méthode d'acquisition par séquençage haut- 25 débit. Selon l'invention, une « librairie » s'entend de la construction comprenant au moins une séquence index, une sonde gauche et une sonde droite caractéristiques d'une anomalie génétique, et éventuellement une séquence de barcode moléculaire. Selon l'invention, le terme « étape de recherche des couples de sondes » signifie l'étape qui vise à identifier, pour chaque séquence du fichier FASTQ, s'il existe 30 un couple de sondes dans le fichier des marqueurs permettant son attribution à une entité que l'on souhaitait mesurer (transcrits de fusion, saut d'exon...). Une structure de données dans l'algorithme permet d'associer à chaque séquence une étiquette portant le 21 nom des deux sondes gauche (« G ») et droite (« D »). Cette recherche est conduite de manière exacte par comparaison de séquences (e.g. le calcul de distance de Hamming et de Levenshtein) et par une méthode approchée permettant de tolérer t' erreurs. Ce paramètre `1C peut être modifié lors du lancement de l'outil. Pour la mesure d'expression, 5 chaque couple de sondes (droite et gauche) est spécifique d'une entité dont on souhaite mesurer l'expression. Pour mesurer l'expression d'un gène, deux sondes venant s'hybrider strictement l'une derrière l'autre sur ce gène sont utilisées. Ces sondes seront ensuite assemblées lors de l'étape de ligation puis amplifiées et lues. Les séquences n'ayant aucune étiquette logique lors de la recherche des sondes sont stockées afin de 10 procéder à une recherche de chimères. En effet, il est possible que certaines sondes croisent lors des étapes d'hybridation, de ligation et d'amplification lors de la construction de la librairie conduisant à l'apparition de séquences hybrides (par exemple une sonde droite d'un gène A avec une sonde gauche d'un gène B). Ces séquences sont là encore détectées par comparaison exacte et inexacte de séquences. Pour la recherche 15 de transcrits de fusion, on ne sait pas quelles sondes vont s'hybrider ensemble et être amplifiées. La recherche des sondes est donc effectuée sans a priori par comparaison de tous les couples de séquences droite/gauche possibles. Selon l'invention, le terme « une étape de comptage des lectures (résultats) et des séquences de barcode moléculaire » signifie l'étape se produisant lorsque le fichier 20 FASTQ est parcouru et les couples de sondes identifiés (marqueurs et chimères). L'algorithme va procéder à leur comptage. Ces comptages sont de deux natures : (1) la quantification du nombre de séquences lues par le séquenceur d'une part, et (2) le nombre de séquence de barcode moléculaire unique (UMI) attribué au marqueur d'autre part. Le comptage des séquences est réalisé à partir de la structure de données 25 précédemment décrites lors de l'identification des marqueurs. Le nombre d'étiquettes attribuées pour chaque marqueur sera déterminé par parcourt de la structure de données. Le comptage des UMI est plus complexe. Il passe par une étape d'extraction de l'UM I de chaque séquence et par une étape de correction des erreurs de séquençage dans les UMI. La combinatoire importante de ces séquences aléatoires, leur comptage et le facteur 30 d'amplification de l'échantillon vont permettre d'identifier les UMI porteurs d'erreurs de séquençage pour corriger les données de comptage. Cette correction des UMI passe par la création d'une structure de graphe associant un compteur à chaque UMI unique. Les 22 UMI sont ensuite regroupés par comptage croissant à k erreurs tolérées. Les UMI permettent d'identifier le nombre de séquences uniques lues par le séquenceur avant l'étape d'amplification lors de la préparation de la librairie. Ils renseignent donc sur le nombre de transcrits lus réellement et. non sur le nombre de transcrits lus après 5 amplification. Selon l'invention, le terme « une étape d'évaluation de la qualité de séquençage de l'échantillon » signifie l'étape qui vise à déterminer les séquences analysées qui ne sont pas significatives. Un score de qualité témoignant de la diversité des librairies, c'est à dire le nombre de transcrits uniques lus, a été implémenté dans 10 l'algorithme de sorte à témoigner de la richesse de l'échantillon analysé et à éliminer des échantillons qui seraient considérés en échec (c'est-à-dire ayant un score REVENDICATIONS1. Méthode de diagnostic d'un cancer chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet, dans laquelle : - l'étape de RT-MLPA est réalisée à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi : - les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et/ou - les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence 10 d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire. 2. Méthode selon la revendication I, dans laquelle les sondes SEQ ID NO : 14 à 91 sont 15 également utilisées pour l'étape de RT-MLPA, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire. 3. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, dans laquelle le cancer 20 implique au moins un gène choisi parmi RFT, MET, AIX et/ou RUS, et est notamment associé à la formation d'un gène de fusion et/ou à un saut d'exon, plus particulièrement un saut d'exon du gène MET. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le cancer est 25 un carcinome, notamment un carcinome pulmonaire, et plus particulièrement un carcinome broncho-pulmonaire 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la séquence d'amorçage est choisie parmi les séquences : 30 - SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, ou - SEQ ID NO : 94 et SEQ ID NO 95. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle la séquence de barcode moléculaire est représentée par la SEQ ID NO : 100. T Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le cancer 5 associé à la formation d'un gène de fusion est diagnostiqué à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, optionnellement les sondes SEQ ID NO : 14 à 91, et dans laquelle chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et 10 SEQ ID NO : 93, et dans laquelle au moins une des sondes comprend une séquence de barcode moléculaire. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le cancer 15 associé à un saut d'exon est diagnostiqué à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, et dans laquelle chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 94 et SEQ ID NO : 95 20 et dans laquelle au moins une des sondes comprend une séquence de barcode moléculaire. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à. 8, dans laquelle ledit échantillon biologique est choisi parmi le sang et une biopsie dudit sujet. 25 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle ladite étape de RT-MLPA comprend au moins les étapes suivantes : a) extraction de l'ARN de l'échantillon biologique du sujet, b) conversion de l'ARN extrait en a) en ADNe par transcription inverse, 30 c) incubation de l'ADNc obtenu en b) avec un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi - les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et/ou - les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode 5 moléculaire d) addition d'une ADN ligase dans le mélange obtenu en c), afin d'établir une liaison covalente entre deux sondes contitmës, e) amplification par PCR des sondes contiguës liées de manière covalente obtenues en d), afin d'obtenir des amplicons. 10 11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape f) d'analyse des résultats de la PCR de l'étape e), de préférence par séquençage. 12. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle l'étape de séquençage est une étape 15 de séquençage capillaire ou de séquençage de nouvelle génération. 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape g) caractérisée au moins par les étapes suivantes : - (1) démultiplexage des résultats obtenus à l'issue de l'étape e) de PCR, 20 - (2) détermination du nombre de fragments d'ADN ou d'ARN présents dans l'échantillon du patient à tester (avant amplification), et optionnellement - (3) fourniture d'une matrice d'expression pour chaque transcrit de fusion ou transcrit correspondant à un saut d'exon identifié pour le sujet testé de détermination du niveau d'expression des amplicons. 25 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, dans laquelle si, pour un échantillon biologique d'un sujet, une amplification par PCR est obtenue à l'étape e) suite à l'hybridation avec un couple de sondes, alors le sujet est porteur du cancer lié à l'anomalie génétique correspondant au couple de sondes identifiées. 30 4 15. Méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, dans laquelle l'amplification par PCR de l'étape e) se fait à l'aide des amorces SEQ ID NO : 101 et 102. 5 16. Kit comprenant au moins les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, etiou les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, de préférence comprenant en outre les sondes SEQ ID NO : 14 à 91, chacune des sondes étant de préférence fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire. 17. Kit comprenant au moins les sondes suivantes SEQ ID NO : I à 13, SEQ ID NO : 14 à 91, SEQ ID NO : 96 à 99, SEQ ID NO : 103 à 127, SEQ ID NO : 128, SEQ ID NO : 129, SEQ ID NO : 130 à 137, SEQ ID NO : 138 à 168, SEQ ID NO : 169 à 194, SEQ ID NO : 195 à 198, SEQ ID NO : 199 à 245, SEQ ID NO : 246 à 344, SEQ ID NO : 345 à 403, SEQ ID NO : 404 à 428, SEQ ID NO : 429 à 436, SEQ ID NO : 437 à 479, SEQ ID NO : 480 à 504, SEQ ID NO : 505, SEQ ID NO : 506, SEQ ID NO : 507 à 514, SEQ ID NO : 515 à 546, SEQ ID NO : 547 à 582, SEQ ID NO : 583 à 586, SEQ ID NO : 587 à 633, SEQ ID NO : 634 à 732, SEQ ID NO : 733 à 791, SEQ ID NO : 792 à 816, SEQ ID NO : 817 à 824, SEQ ID NO : 825, SEQ ID NO : 826 à 835, chacune des sondes étant de préférence fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire.