FR 3086539 A1 20200403 FR 1858890 A 20180927 La présente invention concerne l'utilisation comme agent inhibiteur de hyaluronidase de particules de polymère bloc d'acide hyaluronique et un procédé, notamment cosmétique, de soin de la peau, destiné à atténuer les rides, comprenant l'application sur la peau d'une composition comprenant lesdites particules. Au cours du processus de vieillissement, il apparaît différents signes sur la peau, très caractéristiques de ce vieillissement, se traduisant notamment par une modification de la structure et des fonctions cutanées. Les principaux signes cliniques du vieillissement cutané sont notamment l'apparition de ridules et de rides profondes, en augmentation avec l'âge. L'acide hyaluronique est le composant principal de la matrice extracellulaire de la peau et son rôle est important pour l'homéostasie de la peau L'enzyme hyaluronidase présente dans la peau est impliquée dans la dégradation (hydrolyse) de l'acide hyaluronique. La diminution de la quantité d'acide hyaluronique peut influencer sur la qualité de la peau. Il est connu, par exemple de la publication « Anti skin aging benefits of exopolymers from Aureobasidium pullulans SM2001 », Kyung Hu Kim and al, Journal of Cosmetic Science, 65, p 285-298 (sept/oct 2014) que l'inhibition de la hyaluronidase présente un intérêt dans le domaine de la cosmétique notamment comme action anti-âge, et particulièrement anti- rides. L'acide hyaluronique est également connu comme composant principal des produits de comblement (fillers) utilisés pour la chirurgie esthétique par injection comme décrit par exemple dans les articles « The Hyaluronic Acid Fillers », Greene, J. J. et al Facial Plastic Surgery Clinics 23 (4), 423 et « The science of hyaluronic acid dermal fillers » Tezel, A. et al Journal of cosmetic and laser therapy : official publication of the European Society for Laser Dermatology 2008, 10 (1), 35. Toutefois, la durée de vie de tels produits de comblement est limitée en raison de la dégradation de l'acide hyaluronique par la hyaluronidase présente dans la peau. Les inventeurs ont découvert que des particules de polymère dibloc d'acide hyaluroniqueb-polypeptide hydrophobe présentent une activité anti-hyaluronidase, en particulier antihyaluronidase-1, et permettent ainsi d'atténuer les signes de vieillissement cutanés, en particulier les rides de la peau. Des polymères diblocs d'acide hyaluronique et de polypeptides ainsi que leurs particules micellaires sont décrits dans le document WO 2010/049611. Il n'est pas connu de particules de polymère capable d'inhiber la hyaluronidase, notamment la hyaluronidase-1. En outre, comme démontré dans les exemples décrits ci-après, les particules utilisées selon la présente invention ont une activité inhibitrice de hyaluronidase-1 supérieure à celle des inhibiteurs connus que sont le polystyrène sulfonate et le néomycine sulfate. 2 De façon plus précise, la présente invention a pour objet l'utilisation, notamment cosmétique, en tant qu'inhibiteur de hyaluronidase, notamment de hyaluronidase-1, de particules de polymère dibloc d'acide hyaluronique -b- polypeptide hydrophobe telles que 5 définies ci-après. L'invention a également pour objet un procédé, notamment cosmétique, de soin de la peau présentant des signes de vieillissement cutané, en particulier de la peau ridée, comprenant l'application sur la surface de la peau d'une composition, notamment cosmétique, 10 comprenant des particules de polymères diblocs acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe telles que décrites ci-après. De plus, les inventeurs ont découvert que l'activité inhibiteur hyaluronidase des particules de polymère dibloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe pouvait être modulée en 15 associant au sein des particules un polymère dibloc additionnel (dénommé deuxième polymère bloc par la suite) de type segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe tel que décrit ci-après. Aussi, l'invention a également pour objet des particules comprenant un mélange d'un 20 premier polymère dibloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe et d'un deuxième polymère dibloc segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe tels que décrits ci-après. L'invention a également pour objet une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, les particules de mélange de premier et deuxième 25 polymères diblocs décrites précédemment. La présente invention peut être mise en oeuvre pour le traitement et/ou la réduction des effets inesthétiques du vieillissement de la peau. Le procédé conforme à la présente invention s'avère ainsi avantageux pour le traitement 30 de la peau présentant des signes de vieillissement cutané et/ou de photo-vieillissement cutané. Il permet ainsi de traiter les signes cutanés du vieillissement ou du photo-vieillissement choisis parmi la peau ridée, la peau présentant une altération de ses propriétés viscoélastiques ou biomécaniques, la peau présentant une altération dans la cohésion de 35 ses tissus, la peau amincie, la peau présentant une altération de son aspect de surface et/ou de grain. Avantageusement, le procédé conforme à l'invention concerne le traitement de la peau ridée. 3 Le procédé selon l'invention est en particulier destiné à traiter la peau humaine du visage et/ou du corps et/ou à diminuer ou effacer les signes du vieillissement cutané, en particulier à réduire ou effacer les rides et/ou les ridules de la peau. 5 Par « polymère dibloc », on entend une structure linéaire dans laquelle un premier bloc et un deuxième bloc sont reliés par une de leurs extrémités. Polymère bloc d'acide hyaluronique 10 L'acide hyaluronique est un glycosaminoglycane linéaire composé d'unités répétitives de D-acide glucuronique et de N-acetyl-D-glucosamine liés entre elles par des liaisons glycosidiques alternées beta-1,4 et beta-1,3. Le bloc d'acide hyaluronique comprend de 5 à 5000 unités d'acide hyaluronique, de 15 préférence de 10 à 500 unités, et préférentiellement de 10 à 50 unités. Le bloc polypeptide hydrophobe peut être constitué de polypeptides issus de la polycondensation de composés acides aminés choisis parmi l'alanine, l'isoleucine, la leucine, la phénylalanine, la proline, la pyrrolysine, la sérine, la valine, le glutamate de 20 benzyle, le glutamate d'alkyle(C1-C22), la trifluoroacétyl-lysine, hydroxyalkyl(C1-C22)- asparagine, I' hydroxyalkyl(Ci-C22)-aspartamide, l'aspartate de benzyle. Le bloc polypeptide hydrophobe peut être constitué de polypeptide choisi parmi la poly(alanine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(phénylalanine), la poly(proline), 25 la poly(pyrrolysine), la poly(sérine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle(C1-C22)), la poly(trifluoroacétyl-lysine), la poly(hydroxyalkyl(C1- C22)-asparagine), la poly(hydroxyalkyl(C1-C22)-aspartamide, le poly(aspartate de benzyle). 30 De préférence, le polypeptide hydrophobe est choisi parmi la poly(alanine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(phénylalanine, la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), la poly(trifluoroacétyl-lysine), le poly(aspartate de benzyle). Selon un mode de réalisation préféré, le polypeptide hydrophobe est le poly(glutamate 35 de benzyle). Le bloc polypeptide hydrophobe comprend de 5 à 500 unités peptidiques, de préférence de 10 à 100 unités, et préférentiellement de 20 à 50 unités peptidiques. 40 Avantageusement, le polymère dibloc est tel que le rapport massique du bloc acide hyaluronique/ bloc polypeptide hydrophobe peut aller entre 0,2 et 5, de préférence entre 0,5 et 2. 4 Avantageusement, les polymères diblocs utilisés selon l'invention présentent un poids moléculaire moyen en poids (Mw) allant de 1000 à 50 000 g/mole. Le poids moléculaire peut être mesuré par chromatographie d'exclusion stérique. 5 L'éluant utilisé est le DMSO contenant 1g/L LiBr. La colonne utilisée est une combinaison de trois colonnes ayant pour références commerciales : TSKgeI HHR-L G3000HHR(7.8*300) ; G2000HHR(7.8*300) de chez TOSOH. Le débit d'éluant est de 0.5m1/min avec une pression à 9 x 106 Pa (90 bars) à 80°C. Le produit à la sortie de la colonne est détecté avec un réfractomètre et par la diffusion de lumière multiangle. 10 Selon un mode de réalisation de l'invention, les particules de polymère dibloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe peuvent comprendre un polymère dibloc additionnel (appelé aussi deuxième polymère dibloc) segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe. 15 Ainsi, les particules comprennent un mélange d'un premier polymère dibloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe et d'un deuxième polymère dibloc segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe. Le deuxième polymère dibloc additionnel est distinct du premier polymère dibloc. 20 Avantageusement, les particules peuvent comprendre un mélange des premiers et deuxièmes polymère blocs selon un ratio massique premier polymère bloc/deuxième polymère bloc allant de 0,25 à 4. Le segment hydrophile du polymère bloc additionnel est choisi parmi, ou constitué de : 25 a) le poly(éthylène glycol) ayant un poids moléculaire allant de 1 KDa à 500 KDa, de préférence allant de 2 kDa à 100 kDa ; b) un polysaccharide choisi parmi le dextran, le chitosane, la laminarine, le pullulane, les alginates, l'héparine, l'héparane sulfate, le chondroitine sulfate, la pectine, le xylane, l'amylose, l'amylopectine, l'agarose , le polysaccharide ayant un degré de polymérisation 30 allant de 5 à 5000, de préférence allant de 10 à 500. De préférence, le segment hydrophile est constitué de poly(éthylène glycol) . Le poly(éthylène glycol) peut être fonctionnalisé en bout de chaine par un groupement 35 choisi parmi les groupements méthoxy, amine, alcool, thiol, alcyne, azide, maléimide, et de préférence par un groupement méthoxy. Ledit segment est hydrophile en conditions physiologiques : il est soluble dans l'eau à 25 °C à au moins 1 % en poids. 40 Le bloc polypeptide hydrophobe est similaire à celui décrit précédemment pour le polymère bloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe. 5 Selon un mode préféré de réalisation, le premier polymère dibloc comprend un segment de liaison reliant les deux blocs tels que décrits précédemment et ci-après. Le segment de liaison est notamment issu de la réaction d'un groupe azoture et 5 d'un groupe alcyne, et a par exemple pour la structure suivante : Le segment de liaison est notamment issu de la réaction d'un groupe azoture et d'un groupe alcyne, et a par exemple pour la structure suivante : 10 * désignant les points de fixation avec un bloc du polymère Le mode de préparation des polymères utilisés selon l'invention est connu et notamment décrit dans le VVO-A-2010/049611, dans l'ouvrage Peptide-Based Materials Cheng, J. Deming, T. J., edition Timothy Deming (ISBN 978-3-642-27138-0) et dans les articles 15 « Biocompatibility study of two diblock copolymeric nanoparticles for biomedical applications by in vitro toxicitytesting », Goni-de-Cerio F. et al, J Nanopart Res (2013) 15:2036 ; "Amphiphilic PEO-b-PBLG Diblock and PBLG-b-PEO-b-PBLG Triblock Copolymer Based Nanoparticles: Doxorubicin Loading and ln Vitro Evaluation" Kakkar D. et al , Macromolecular Bioscience, 2015, 15, 124-137. 20 La synthèse des polymères diblocs met en oeuvre des réactions chimiques bien contrôlées, en particulier les réactions de « chimie-click » permettant un couplage efficace et quantitatif dans des conditions douces. 25 Parmi les réactions de « chimie-click », on peut citer, par exemple, les cycloadditions d'espèces insaturées (par exemple, les cycloadditions 1 ,3-dipolaires azide-alcyne, les réactions de Diels Aider entre un diène et un diénophile), les réactions impliquant un groupe carbonyle électrophile, de type non aldol (par exemple, formation d'éthers d'oxime à partir d'une oxyamine, 30 d'hydrazones à partir d'une hydrazine, ou de thiosemicarbazones à partir d'une thiosemicarbazine), les réactions mettant en jeu un groupement thiol (formation de thioéthers à partir d'un alcène et de disulfures mixtes), les réactions impliquant des fonctions acides thiocarboxyliques ou thioesters (formation des liaisons thioesters et amides) et les ligations de Staudinger impliquant des fonctions phosphine et 35 azide. Chacun des groupes fonctionnels cités ci-dessus peut être introduit indifféremment sur le groupement polypeptide ou sur le groupement polysaccharide pour le couplage. 6 De façon connue, des polymères diblocs polysaccharide-b-polypeptide peuvent être préparé selon un procédé de synthèse comprenant les étapes consistant à : - soumettre ledit polysaccharide à une amination réductrice de manière à introduire 5 une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polysaccharidique, - introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne polypeptidique, et - coupler la chaîne polysaccharidique et la chaîne polypeptidique dans un solvant commun. 10 Selon une autre alternative, ledit procédé de synthèse comprend les étapes consistant à : - introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polypeptidique, - soumettre ledit polysaccharide à une amination réductrice de manière à introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne polysaccharidique, et 15 - coupler la chaîne polypeptidique et la chaîne polysaccharidique dans un solvant commun. L'amination réductrice peut être effectuée, par exemple, à l'aide d'une amine telle que la propargylamine en présence d'un agent réducteur tel que le 20 borocyanohydrure de sodium. La fonction azoture peut être introduite à l'extrémité de la chaîne polypeptidique à l'aide d'un agent bifonctionnel, tel que le 3- azidoaminopropane, la fonction aminée servant à amorcer la polymérisation par ouverture de cycle du monomère NCA de l'acide aminé correspondant. La longueur du bloc polypeptide peut ainsi être contrôlée par le rapport molaire monomère 25 NCA/agent bifonctionnel. Formation des particules en dispersion aqueuse : Les premier et deuxième polymères diblocs décrits précédemment sont des composés 30 amphiphiles aptes à s'auto-assembler pour former des particules de type vésicules micellaires en dispersion aqueuse. Ces particules présentent une bonne stabilité, notamment après un stockage d'un mois à la température ambiante (25 °C). 35 Les particules de polymères diblocs (vésicules micellaires) peuvent être préparées par différents procédés usuels tels que, par exemple, la dissolution directe, l'hydratation de film, le procédé d'émulsification/diffusion ou la nanoprécitation. On utilisera de préférence la nanoprécipitation qui consiste à mélanger une solution de polymère dibloc ou d'un mélange de polymères diblocs le cas échéant, dans un solvant organique miscible à l'eau. 40 L'introduction d'une solution organique du copolymère dibloc dans l'eau sous agitation modérée induit simultanément une séparation de phases et un auto-assemblage qui progresse au fur et à mesure que le solvant organique diffuse dans la phase aqueuse, celle- 7 ci étant en excès par rapport à la phase organique. Un solvant organique approprié est, par exemple, le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le formamide. Après élimination du solvant organique par évaporation et/ou dialyse, on récupère les particules (vésicules) directement en dispersion aqueuse. La taille des particules peut être modulée en ajustant le procédé 5 d'émulsification/diffusion ou de nanoprécitation (sens d'ajout, nature du solvant organique, volume des phases, concentration en copolymère...). Pour préparer les particules de mélange des premier et deuxième polymères diblocs, on effectue d'abord le mélange des premier et deuxième polymères diblocs dans ledit solvant 10 organique puis on prépare les particules avec ce mélange des deux polymères diblocs. La taille moyenne en volume des particules de polymère dibloc peut aller de 10 nm à 1 pm, de préférence de 10 à 500 nm et préférentiellement de 20 à 100 nm. La taille moyenne peut être mesurée par analyse de la diffusion dynamique de lumière. 15 La composition utilisée selon l'invention comprend un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire un milieu compatible avec la peau et/ou ses phanères. Il s'agit de préférence d'un milieu cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire qui présente une couleur, une odeur et un toucher agréables et qui ne génère pas d'inconforts inacceptables (picotements, 20 tiraillements, rougeurs), susceptibles de détourner la consommatrice d'utiliser cette composition. La composition selon l'invention peut se présenter sous toutes les formes galéniques classiquement utilisées pour une application topique et notamment sous forme de 25 dispersions du type lotion ou gel aqueux, d'émulsions de consistance liquide ou semi- liquide du type lait, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou de suspensions ou émulsions de consistance molle, semisolide ou solide du type crème ou gel, ou encore d'émulsions multiples (E/H/E ou H/E/H), de microémulsions, de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique, ou de 30 dispersions cire/phase aqueuse. Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la composition se présente sous forme d'une émulsion H/E ou d'un gel aqueux. 35 Avantageusement, la composition utilisée selon l'invention comprend de l'eau, notamment en une teneur pouvant aller de 10 à 99 % en poids, par rapport au poids total de la composition, et de préférence allant de 50 à 99 % en poids. 40 La composition utilisée selon l'invention peut contenir en outre contenir un ou plusieurs adjuvants couramment utilisés dans le domaine cosmétique, tels que des émulsionnants, 8 des charges, des conservateurs, des séquestrants, des parfums, des épaississants, des matières colorantes, des huiles, des cires, des polymères filmogènes. Les particules de polymère dibloc décrites précédemment peuvent être présentes dans la 5 composition en une teneur allant de 0,1 à 20 % en poids, par rapport au poids total de la composition, et de préférence allant de 0,1 à 10 % en poids. Selon un mode particulier de réalisation, les régions cutanées avantageusement traitées par un procédé de l'invention peuvent être le contour des lèvres, la peau du visage et du 10 cou, plus particulièrement des joues, du décolleté. La présente invention peut être mise en oeuvre pour le traitement et/ou la réduction des effets inesthétiques du vieillissement de la peau. Le procédé conforme à la présente invention s'avère ainsi avantageux pour le traitement de la peau présentant des signes de vieillissement cutané et/ou de photo-vieillissement 15 cutané. Il permet ainsi de traiter les signes cutanés du vieillissement ou du photo-vieillissement choisis parmi la peau ridée, la peau présentant une altération de ses propriétés viscoélastiques ou biomécaniques, la peau présentant une altération dans la cohésion de ses tissus, la peau amincie, la peau présentant une altération de son aspect de surface 20 et/ou de grain, dans un dispositif pour administration sous-cutanée intradermique et/ou intraépidermique. Avantageusement, le procédé conforme à l'invention concerne le traitement de la peau ridée. 25 Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir ce ou ces éventuels composés additionnels et/ou leur quantité de manière telle que les propriétés anti-rides de la composition selon l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées par l'adjonction envisagée. 30 L'application de la composition selon l'invention se fait selon les techniques habituelles, par exemple par application (notamment de crèmes, de gels, de sérums, de lotions) sur la peau destinée à être traitée, en particulier la peau du visage et/ou du cou, notamment la peau du contour de l'oeil. Dans le cadre de ce procédé, la composition peut être, par exemple, une composition de soin ou une composition de maquillage de la peau, en particulier de fond 35 de teint. L'invention va maintenant être décrite en référence aux exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif. 9 Exemple 1: Synthèse du copolymère bloc HA-b-PBLG 0 N N H 2 H 30 0 0 5 OH OH HO-' H 0 OH NHOH NH OS\ 14 Etape 1: synthèse de poly(L-glutamate de benzyle) avec une fonction azoture (PBLGazoture) 10 0 0 + 1 eq. N3 rs1"'"2'. NH 2 CH CI , N 30 eq. 2 2 2 NH 0 10°C 5 g (19 mmol) de N-carboxyanhydride de L-glutamate de y-benzyle ont été introduits sous atmosphère d'argon dans un ballon de type schlenk préalablement flammé sous vide, et 15 dissous dans 60 ml de dichlorométhane anhydre. La solution a été agitée 10 minutes et 60 mg (0,59 mmol) de 1-azido-3-aminopropane ont été ajoutés au moyen d'une seringue purgée à l'azote. La solution a été agitée 40 heures sous vide à température ambiante. Le polymère formé a été récupéré par précipitation dans l'éther diéthylique puis séché sous vide. La masse de produit récupérée est 3,1 g. 20 Analyse H RMN (CDCI3: acide trifluoroacétique deutérié, 85 : 15) conforme au produit attendu. 25 Etape 2: synthèse d'acide hyaluronique avec une fonction alcyne (HA-alcyne) H 1-12N NaCNBH, 0 OH OH 14 OH NH H 0 0 o\ OH H 01-1 OH Vs. OH N H 15 Tampon acétate pl-k5.6 7 jours 10 L'acide hyaluronique (2,2 g ; 6.10-4 mol) possédant un degré de polymérisation moyen en nombre égal à 15 a été solubilisé dans un tampon acétate (pH= 5,6) à une concentration massique de 2 %. 2,82 ml (4,4.10-2 mol) de propargylamine et 2,77 g (4,4.10-2 mol) de 5 borocyanohydrure de sodium ont été ajoutés au milieu sous agitation. Après 5 jours de réaction à 501C et sous agitation, le mélange réactionnel a été concentré à l'évaporateur rotatif et précipité dans 400 ml de méthanol froid. Le solide a été récupéré par centrifugation et lavé au méthanol refroidi. Le précipité a été séché sous vide pendant 2 jours. La masse de produit récupéré est 2 g. 10 Analyse 1H RMN (D20) conforme au produit attendu. Etape 3 : 15 HA-alcyne + PBLG-azoture O CuSO4 Ascorbate de sodium OH OH OH OH 0 OH O DMSO, N2, 50°C, 24h HOO OH Ni OH NH od 14 o\ o OH00 OH H OHO IOII N H2 H Z 30 Acide hyaluronique alcyné (1,5 g ; 0,3 mmol) et PBLG azoture (1,32 g ; 0,2mmol) ont été 20 solubilisés dans 50 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) anhydre à 60°C. Le mélange a été agité et CuSO4.5H20 (100 mg, 0,4 mol) et sodium L-ascorbate (125 mg ; 0,7 mmol) ont été ajoutés sous atmosphère d'azote. Le mélange réactionnel a été laissé sous agitation à 40 °C pendant 12 heures. Le mélange a été dialysé avec une solution d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) dans l'eau (1 L, 20g/ml) pendant 3 jour en utilisant une membrane de 25 dialyse 6 Spectra/Por® caractérisée par un seuil de coupure de 100kDa (de chez Spectrum Laboratories), puis avec l'eau purifiée MiIIQ pendant 3 jours. Le mélange a été concentré par ultrafiltration, et le copolymère obtenu a été récupéré par précipitation dans le méthanol et séché sous vide. On a obtenu 2 g de polymère. 30 Analyse 'H RMN (DMSO deutérié) conforme au produit attendu. Exemple 2 : Synthèse de copolymère bloc PEG-b-PBLG 35 Le a- aminoéthyl-w-méthoxy polyoxyethylene CH3-0-(CH2CH20)n-CH2CH2N H2 n = 270 Mw=12 kDa (vendu sous la dénomination SUNBRIGHT® ME-100EA par la société NOF) (3 11 g, 0,25 mM) a été solubilisé dans 30 ml de diméthyl formamide (DMF) sec. Le Ncarboxyanhydride de y-benzyl-L-glutamate (2,63 g, 10 mM) a été solubilisé dans 26,3 ml de DMF sec, puis ajouté goutte-à-goutte dans la solution de polyéthylène glycol amine. Le mélange a été agité à 40°C pendant 48 heures, puis concentré par cryodistillation. Le 5 produit a été précipité dans le diéthyléther froid et séché sous vide pour obtenir 3,8 g de produit sous forme de poudre blanche. Analyse 1H-RMN (DMF-d7) conforme au produit attendu 10 Exemple 3 : Préparation de dispersion aqueuse de particules de polymère bloc On a préparé 5 dispersions aqueuses de particules (P1 à P5) ayant les compositions en polymères blocs des exemples 1 et 2 suivantes (teneurs en % pourcentage massique par rapport au poids total de polymères) 15 Particules HA-b-PBLG PEG-b-PBLG taille Polydispersité de taille P1 100 33,6 nm 0,156 P2 70 30 38,2nm 0,09 P3 50 50 48,6nm 0,2 P4 30 70 48,5nm 0,12 P5 - 100 81,6nm 0,13 Les dispersions de particules de polymères blocs ont été préparées selon le protocole suivant 20 Les copolymères (HA-b-PBLG, PEG-b-PBLG ou mélange des deux polymères selon les proportions relatives citées dans le tableau ci-dessus) (masse totale 0,1g) ont été solubilisés dans 0,9 g de diméthyl sulfoxyde (DMSO). Le tampon phosphate saline (137 mM NaCI, 10 mM phosphate, pH=7.2, 9 ml) a été chauffé à 60°C. La solution de copolymères dans DMSO a été ajoutée dans le tampon phosphate sous agitation, et le 25 mélange a été agité à 60°C pendant 1 heure. La solution a été dialysée avec 1L de solution tampon phosphate saline pendant 3 jours pour avoir la dispersion aqueuse de particules de polymère dans le tampon et sans DMSO. Le volume de la solution a été réajusté à 10 ml par ultrafiltration contre une membrane de dialyse à 100 kDa pour avoir une dispersion aqueuse de particules à la concentration de 10 mg/ml. 30 La taille des particules obtenues a été mesurée par la diffusion dynamique de lumière. Exemple 4 : Evaluation in vitro de l'inhibition de hyaluronidase-1 des particules de polymère bloc 12 L'activité d'inhibition de hyaluronidase-1 a été mesurée en utilisant le test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Ce test consiste à suivre la dégradation d'acide hyaluronique par l'hyaluronidase-1 dans une solution contenant les particules de polymère bloc. 5 Dans ce test, l'intensité de la densité optique (le signal) dépend de la masse moléculaire de HA présente dans le milieu (le principe est décrit la publication « Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein" de H. Yuan et al, Glycobio/ogy 2013 Nov;23(11):1270-80). 10 Aussi, lors de la dégradation d'un échantillon d'acide hyaluronique, l'intensité de la densité optique va diminuer. Plus la densité optique est faible, plus l'acide hyaluronique est dégradé (poids moléculaire plus faible). Protocole : 15 Le test ELISA est fait avec le kit Hyaluron duoset ELISA de chez R&D system en suivant les instructions du fournisseur. Toutes les mesures de densité optique ont été faites 6 fois sur le même échantillon pour calculer la valeur moyenne et l'écart type de mesure. On a utilisé : 20 - un tampon acétate (10 mM, pH=4) de chez GE lifescience. - Hyaluronidase-1 human recombinant (HYAL1) de chez R&D system. - L'acide hyaluronique de masse moléculaire d'environ 1000 kDa (HA-1000kDa) de chez Lifecore. 25 Une solution à 1 mg/ml de HA-1000k Da a été préparée dans un tampon phosphate saline (150 mM NaCI, 10 mM phosphate, pH=7.2). Une solution à 10 dag/ml d'HYAL1 a été préparée dans le tampon acétate. Acide hyaluronique dégradé au contact de HYAL1 : 30 10 pL de solution HA-1000kDa, 5pL de solution HYAL1 et 985pL de tampon acétate ont été mélangés, et le mélange a été agité à 37°C pendant 20 minutes. Le mélange a été testé en ELISA en diluant 20 fois avec la solution de dilution du kit. On a noté la densité optique mesurée (DO HA) : celle-ci est quasi nulle. 35 Contrôle = acide hyaluronique sans dégradation (HA-1000kDa) : 10 pL de solution HA-1000kDa, 990 pL de tampon acétate ont été mélangés, et le mélange a été agité à 37°C pendant 20 minutes. Le mélange a été testé en ELISA en diluant 20 fois avec la solution de dilution du kit. On a noté la densité optique mesurée (DO contrôle). 40 On a ensuite testé les dispersions de particules P1 à P5 dans la même condition que celle qui permet de dégrader complètement l'acide hyaluronique HA-1000kDa. Pour cela, chaque particules P1 à P5 l'inhibiteur a été ajouté à différentes doses dans la condition de dégradation. Avec les mesures de densité optiques obtenues pour chacune des particules testées, on a défini l'efficacité d'enzyme en présence des particules. Efficacité d'enzyme = (DO contrôle - DO particules) / (DO contrôle - DO HA) 13 La valeur de la densité optique mesurée diminue lorsque l'acide hyaluronique est dégradé (hydrolysé). Protocole de la mesure d'efficacité d'enzyme en présence d'inhibiteur: 5 Une solution à 1mg/m1 de HA-1000kDa a été préparée dans le tampon phosphate saline (150mM NaCI, 10mM phosphate, pH=7.2). Une solution à 10 pg/mld'HYAL1 a été préparéé dans le tampon acétate Les solutions de l'inhibiteur (particules de polymère) à 100 tag/ml et 10pg/m1 (en matière active de polymère) ont été préparées dans le tampon acétate. L'activité d'enzyme ont été mesuré en présence de l'inhibiteur à plusieurs concentrations : 10 10 ; 3,3 ; 1,1 ; 0.37 ; 0.12 ; 0.04 ; 0.01 tag/mi dans le mélange de dégradation. 10pL de solution HA-1000kDa, 5pL de solution HYAL1, 100 ou 33 ou 11 pL respectivement de solution d'inhibiteur à 100 pg/ml et 885 ou 952 ou 974 pL respectivement de tampon acétate ont été mélangés et agités à 37°C pendant 20 min. (le mélange final contient respectivement 10 ou 3.3 ou 1.1 pg/ml de l'inhibiteur). 15 D'autre part, 101.1 de solution HA-1000kDa, 5pL de solution HYAL1, 37 ou 12 ou 4 ou 1 pL respectivement de solution d'inhibiteur à 10F.ig/m1 et 948 ou 973 ou 981 ou 984 pL respectivement de tampon acétate ont été mélangés et agités à 37°C pendant 20 min. (le mélange final contient respectivement 0,37 ou 0,12 ou 0,04 ou 0.01 pg/ml de l'inhibiteur). Chacun des mélanges préparés a été testé en ELISA en le diluant 20 fois avec la solution 20 de dilution du kit. On a également testé deux références connues d'inhibiteur de hyaluronidase-1 : Polystyrène sulfonate (PSS) (Mw d'environ 75 000 ; référence 561223 de chez Aldrich) 25 [activité inhibitrice décrite dans l'article "Differential selectivity of hyaluronidase inhibitors toward acidic and basic hyaluronidases" Isoyama, T.; et al.. Glycobiology 2006, 16 (1), 11] néomycine sulfate [activité inhibitrice décrite dans l'article "The use of neomycin trisulfate to inhibit enzyme-mediated glycosaminoglycan degradation in bioprosthetic heart valves" Raghavan, D et al ; Biomaterials 2007, 28 (18), 2861] 30 Pour chaque dose d'inhibiteur testée, l'activité d'enzyme a été évaluée comme indiqué précédemment. On a également déterminé la concentration critique pour une inhibition à 50% (IC 50) à partir des courbes de l'activité enzymatique en fonction des concentrations d'inhibiteur. 35 Les résultats obtenus sont décrits dans les figures. La figure 1 montre les résultats d'efficacité enzymatique pour chacune des particules P1, P2, P3, P4, P5 en fonction de leur concentration. La figure 2 montre les résultats d'efficacité enzymatique des particules P1, du polystyrène 40 sulfonate et du néomycine sulfate en fonction de leur concentration. Particules IC 50 (en pg/ml) P1 0,156 ± 0,007 P2 0,410 ± 0,035 P3 6,067 ± 0,786 P4 >10 P5 >10 45 Les résultats obtenus montrent que l'efficacité de particules pour inhiber la hyaluronidase- 1 augmente en fonction de la teneur en acide hyaluronique présent dans la particule. 14 Les particules P1 ont une activité d'inhibition de la hyaluronidase-1 supérieur à celle des deux références Polystyrène sulfonate et néomycine sulfate 5 Exemple 5 : On prépare un gel anti-rides ayant la composition suivante : - Dispersion aqueuse de particules P1 de l'exemple 3 1 g MA 10 - hydroxyéthyl cellulose (NATROSOL® 250 HHR CS de chez Ashland) 0,5 g - Conservateurs qs - Eau qsp 100 g Une composition similaire est également préparée en utilisant l'une des dispersions de 15 particules P2, P3 ou P4 de l'exemple REVENDICATIONS1. Utilisation comme agent inhibiteur de hyaluronidase de particules d'un premier polymère dibloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe, le bloc acide hyaluronique ayant de 5 à 5000 unités d'acide hyaluronique; le bloc polypeptide hydrophobe ayant de 5 à 500 unités peptidiques. 2. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le bloc d'acide hyaluronique a de 10 à 500 unités d'acide hyaluronique, de préférence de 10 à 50 unités. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les particules comprennent un deuxième polymère dibloc segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe, le segment hydrophile étant choisi parmi : a) le poly(éthylène glycol) ayant un poids moléculaire allant de 1 KDa à 500 KDa, de préférence allant de 2 kDa à 100 kDa ; b) un polysaccharide choisi parmi le dextran, le chitosane, la laminarine, le pullulane, les alginates, l'héparine, l'héparane sulfate, le chondroitine sulfate, la pectine, le xylane, l'amylose, l'amylopectine, l'agarose , le polysaccharide ayant un degré de polymérisation allant de 5 à 5000, de préférence allant de 10 à 500 ; le bloc polypeptide du deuxième polymère dibloc ayant de 5 à 500 unités peptidiques. 4. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le segment hydrophile est le poly(éthylène glycol) ayant un poids moléculaire allant de 1 KDa à 500 KDa, de préférence allant de 2 kDa à 100 kDa. 5. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que le poly(éthylène glycol) est fonctionnalisé en bout de chaine par un groupement choisi parmi les groupements méthoxy, amine, alcool, thiol, alcyne, azide, maléimide, et de préférence par un groupement méthoxy. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce le bloc polypeptide hydrophobe est constitué de polypeptide issu de la polycondensation de composés acide aminé choisis parmi l'alanine, l'isoleucine, la leucine, la phénylalanine, la proline, la pyrrolysine, la sérine, la valine, le glutamate de benzyle, le glutamate d'alkyle(C1-C22), la trifluoroacétyl-lysine, l'hydroxyalkyl(C1-C22)-asparagine, l'hydroxyalkyl(C1-C22)-aspartamide, l'aspartate de benzyle. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce le bloc polypeptide hydrophobe est constitué de polypeptide choisi parmi la poly(alanine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(phénylalanine), la poly(proline), la 16 poly(pyrrolysine), la poly(sérine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle(C1-C22)), la poly(trifluoroacétyl-lysine), la poly(hydroxyalkylC(C1- C22)-asparagine), la poly(hydroxyalkyl(C1-C22)-aspartamide), le poly(aspartate de benzyle) ; et de préférence choisi parmi la poly(alanine), la poly(isoleucine), la 5 poly(leucine), la poly(phénylalanine, la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), la poly(trifluoroacétyl-lysine, le poly(aspartate de benzyle). 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le bloc polypeptide hydrophobe est le poly(glutamate de benzyle). 10 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le bloc polypeptide hydrophobe a de 10 à 100 unités peptidiques, de préférence de 20 à 50 unités peptidiques. 15 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les particules de polymère bloc sont sous forme de dispersion aqueuse. 11. Procédé de traitement cosmétique de soin de la peau présentant des signes de vieillissement cutané, comprenant l'application sur la surface de la peau d'une composition 20 comprenant des particules de polymère dibloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe telles que définies selon l'une des revendications 1 à 9. 12. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il concerne le traitement de la peau ridée. 13. Particules d'un mélange d'un premier polymère dibloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe tel que défini selon l'une des revendications 1, 2, 6 à 10 et d'un deuxième polymère dibloc segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe tel que défini selon l'une des revendications 3 à 10. 14. Composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, les particules de mélange de premier et deuxième polymères dibloc selon la revendication 13. 15. Composition selon la revendication précédentes, caractérisée en ce que les particules 35 de polymère dibloc sont présentes en une teneur allant de 0,1 à 20 % en poids, par rapport au poids total de la composition, et de préférence allant de 0,1 à 10 % en poids. 25 30