FR 3086759 A1 20200403 FR 1858997 A 20180928 Procédé microfluidique d'analyse de métaux La présente invention concerne un procédé d'analyse d'un fluide contenant un élément-trace métallique, par exemple l'arsenic, mettant en oeuvre une méthode microfluidique. L'invention concerne également un circuit microfluidique, permettant la manipulation simple, automatisée, de très petites quantités de fluides, permettant notamment de mettre en oeuvre un tel procédé. L'arsenic est un élément naturel de la croûte terrestre largement présent dans l'environnement, que ce soit dans l'air, dans l'eau ou dans la terre. Il est très toxique sous forme inorganique. Les populations s'exposent à des niveaux élevés d'arsenic inorganique en buvant de l'eau contaminée, en l'utilisant pour préparer les repas, irriguer les cultures, au cours des procédés industriels, en mangeant des aliments contaminés ou en fumant du tabac. L'exposition prolongée à l'arsenic inorganique, principalement en buvant de l'eau contaminée ou en mangeant des aliments préparés avec cette eau ou provenant de cultures irriguées avec des eaux riches en arsenic, peut entraîner une intoxication chronique. Les lésions et les cancers de la peau en sont les effets les plus caractéristiques. Les autres effets indésirables pour la santé qu'on peut associer à une ingestion prolongée d'arsenic inorganique sont les suivants: effets sur le développement, neurotoxicité, diabète, atteintes pulmonaires et atteintes cardiovasculaires. En particulier, l'infarctus du myocarde induit par l'arsenic peut être une cause importante de surmortalité (cf site internet de l'OMS). La plus grande menace de l'arsenic pour la santé publique provient des eaux souterraines contaminées. L'arsenic inorganique est naturellement présent à des teneurs élevées dans les eaux souterraines d'un certain nombre de pays, parmi lesquels l'Argentine, le Bangladesh, le Chili, la Chine, les États-Unis d'Amérique, l'Inde et le Mexique (cf site internet de l'OMS). Dans ses Directives de qualité pour l'eau de boisson, l'OMS estime que la limite actuellement recommandée pour l'arsenic dans l'eau potable est fixée à 10 pg/litre, bien que cette valeur soit provisoire en raison des difficultés de dosage et des complications pratiques pour l'éliminer de l'eau potable. 2 Classiquement, le dosage de l'arsenic dans l'eau de boisson est effectué par des prélèvements, qui sont transmis et analysés en laboratoire. Par conséquent, ce type de tests nécessite de multiples manipulations de l'échantillon (notamment lors du transport, du conditionnement...), au risque d'en modifier sa composition. Par ailleurs, de tels tests 5 sont longs à mettre en oeuvre (au moins quelques jours), avant d'obtenir les résultats. La présente invention a pour objectif de pallier ces inconvénients de l'art antérieur. En particulier, la présente invention a pour objectif de proposer un procédé d'analyse d'un fluide contenant un élément-trace métallique (ETM), notamment l'arsenic, mettant en 10 oeuvre une méthode microfluidique, qui soit simple et rapide à mettre en oeuvre, mais aussi fiable, ayant une très bonne sensibilité et dont les mesures soient reproductibles. En particulier, le procédé selon l'invention ne dénature pas l'échantillon testé, et/ou évite l'hydrolyse des ETM à analyser. La limite de détection de l'espèce à analyser est compatible avec les seuils règlementaires (pg/L ou moins). Enfin, il nécessite un très petit 15 volume d'échantillon. Un autre objectif de la présente invention est de fournir un circuit microfluidique permettant la mise en oeuvre d'un tel procédé. 20 L'invention se rapporte ainsi à un procédé microfluidique d'analyse d'un fluide contenant au moins un élément-trace métallique comprenant les étapes suivantes : a) introduction d'un échantillon de fluide dans au moins un microcanal d'un circuit microfluidique ; b) mélange, au sein du microcanal du circuit microfluidique, de l'échantillon de fluide 25 introduit à l'étape a), avec des réactifs, et c) mesure de la quantité d'élément-trace métallique présent dans l'échantillon obtenu en b), en utilisant une méthode de détection électrochimique. De préférence, l'étape c) est effectuée en utilisant au moins 2 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes dont une en or. De 30 préférence, la mesure de l'étape c) est effectuée en utilisant les trois électrodes suivantes : - une électrode en or, comme électrode de travail, - une électrode en platine, comme électrode de référence, et - une contre-électrode en platine. 35 3 De préférence, l'invention se rapporte à un procédé microfluidique d'analyse d'un fluide contenant de l'arsenic, comprenant les étapes suivantes : a) introduction d'un échantillon de fluide dans au moins un microcanal d'un circuit microfluidique ; 5 b) mélange, au sein du microcanal du circuit microfluidique, de l'échantillon de fluide introduit à l'étape a), avec de l'acide nitrique et de la L-cystéine, et c) mesure de la quantité d'arsenic présent dans l'échantillon obtenu en b), en utilisant une méthode de détection électrochimique. De préférence, l'étape c) est effectuée en utilisant au moins 2 électrodes, de préférence 10 au moins 3 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes dont une en or. L'électrode peut être toute électrode utilisable en électrochimie, comme une électrode faite d'or, éventuellement recouverte de nanoparticules d'or ; une électrode en couche mince ; ou bien une électrode en nanotubes de carbone. 15 Ce procédé peut être mis en oeuvre particulièrement facilement, dans un seul circuit microfluidique dans lequel sont réalisées les différentes étapes. Ce circuit est illustré dans la figure détaillée ci-dessous. Le procédé selon l'invention est de préférence entièrement automatisé, et permet à 20 l'utilisateur de s'affranchir des différentes étapes de prétraitement de l'échantillon et des étapes d'analyse qui sont parfois complexes et nécessitent la manipulation de produits chimiques tels que des acides concentrés ou des solutions étalons d'ETM à analyser. Par « fluide », on entend tout corps liquide capable de prendre la forme du récipient qui le 25 contient. De préférence, le fluide selon l'invention est une solution. De préférence, le fluide selon l'invention est l'eau. Par « élément-trace métallique », appelé aussi « ETM », on entend un métal toxique ou toxique au-delà d'un certain seuil. De préférence, l'ETM est choisi parmi le plomb, le 30 mercure, l'arsenic, le cuivre, le zinc et le cadmium. De préférence, l'ETM selon l'invention est l'arsenic. De préférence, le procédé selon l'invention est un procédé d'analyse de l'eau contenant un ETM, notamment l'arsenic. 35 De préférence, il est mis en oeuvre grâce à un dispositif portatif incluant le circuit microfluidique. 4 Le procédé selon l'invention peut également être utilisé pour l'analyse de tout ETM présent dans une solution ou un fluide à l'état de traces. 5 L'utilisation d'acide nitrique comme réactif utilisé dans le procédé selon l'invention, en particulier pour la détection d'arsenic, est particulièrement pertinente : en effet, l'analyse des ETM à l'état de traces comme l'arsenic se fait le plus souvent en milieu acide pour minimiser les interférences, pour améliorer la sensibilité et pour éviter l'hydrolyse des ETM à analyser ou des espèces formées après transformation électrochimique (D. 10 Jagner, M. Josefson, S. Westerlung, Anal. Chem. 53 (1981) 2144; J. Lexa, K. Stulik, Talanta 30 (1983) 845 et E. Munoz, S. Palmero, Talanta 65 (2005) 613-620). L'acide chlorhydrique (HCI) est le plus utilisé car il conduit aux meilleures limites de détection (en anglais « level of detection » ou LOD) (E. Munoz et al précité). Cependant, cet acide est connu pour attaquer les électrodes en or utilisées pour mesurer la quantité d'ETM, et 15 donc diminuer la durée de vie du système d'analyse (E. Munoz et al précité). On pourrait aussi utiliser un autre acide, tel que notamment l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide acétique. 20 Cependant, de façon avantageuse, l'utilisation de l'acide nitrique, en combinaison avec la L-cystéine et le caractère confiné des réactifs dans les canaux microfluidiques (réaction et diffusion rapide des espèces), a permis d'obtenir des LOD comparables à celles obtenues avec l'acide chlorhydrique. En outre, contrairement à l'acide chlorhydrique, l'utilisation d'acide nitrique permet de réaliser un très grand nombre d'analyses, i.e. au moins 400, de 25 préférence au moins 450, de préférence au moins 500 analyses, sans destruction de l'électrode d'or. La L-cystéine est un réactif qui permet de convertir l'arsenic (V) (AsV) en arsenic (III) (AslIl) lorsque la solution est chauffée. Elle permet donc la spéciation de l'arsenic, i.e. de 30 différencier l'Asl II et l'AsV. La réaction de transformation est donnée ci-dessous (Talanta 58 (2002) 45-55): H2As04 ÷ 2 SI-1 CH2-CH(-NH3)- 00011 tcygebiz) H 2As01- HOOC- CH(---Naq-C S-C3-f2 -CH( NH7)-COOFI(ystine) 1120 soit de façon simplifiée : AsV + cystéine => AsIll + cystine. 5 De préférence, le procédé selon l'invention n'utilise pas de chlorhydrate d'hydrazine (N2H4.HCI). 5 L'invention concerne également un circuit microfluidique d'analyse d'un fluide, notamment apte à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, comprenant : - au moins un réservoir de stockage de réactif(s), de préférence l'acide nitrique et la L-cystéine, et optionnellement au moins un second réservoir de stockage comprenant au moins une solution étalon ; 10 - au moins une première puce microfluidique, dite puce de prémélange, comprenant au moins un premier microcanal relié fluidiquement : o à une première extrémité, aux deux réservoirs et à une entrée, et o à la seconde extrémité, à une cuve, ladite entrée convenant à l'injection d'un échantillon de fluide à analyser ; et 15 - au moins une seconde puce microfluidique, dite puce d'analyse, comprenant au moins un second microcanal relié à la cuve et comprenant au moins deux électrodes, de préférence au moins trois électrodes dont une en or. La première puce et la seconde puce selon l'invention peuvent également, selon un mode 20 de réalisation, être préparées sur un seul et même substrat. Dans un tel cas, on obtient ainsi une puce unique, comprenant un premier compartiment (correspondant à la puce de prémélange) et un second compartiment (correspondant à la puce d'analyse). De préférence, le circuit microfluidique comprend, dans la première puce, un premier 25 réseau de microcanaux dans lesquels circulent l'échantillon de fluide à analyser et les réactifs (comme l'acide nitrique et la L-cystéine) ; et dans la seconde puce, un second réseau de microcanaux comprenant au moins 2 électrodes, de préférence au moins trois électrodes. De préférence, le premier réseau de microcanaux est présent dans une première puce 30 microfluidique, généralement appelée 3x10' pAV, alors le système ouvre les électrovannes 26 et 28, qui fournissent des concentrations d'ajouts dans le mélange de 2 et 4 ppb respectivement (i.e. réservoirs R.8 et R.9). A chaque 10 ajout, Amoy (ajout) est mesuré. Ainsi, les valeurs de Amoy, Amoy (ajout1) et Amoy (ajout2) sont utilisés pour déterminer la concentration de l'As(III) dans l'échantillon ; si Amoy > 3x10-2 pAV, l'échantillon est dilué de façon automatique au niveau de la puce de prétraitement 50, et en fonction de Amoy mesuré. Ensuite, un Tdep de 15 360 secondes ou de 120 secondes est appliqué. Ensuite, la quantité d'As(V) est déterminée ; c'est l'étape c2). La mesure de l'As(V) est obtenue de façon indirecte en faisant la soustraction du contenu en As(III) réel par rapport au contenu en arsenic total (As tot) (soit As(V) = As tot - 20 As(III)). L'arsenic total (As tot) est obtenu en convertissant tout l'As(V) en As(III). Pour convertir l'arsenic (V) en arsenic (III), de préférence une étape d'incubation de l'échantillon obtenu en b) a lieu dans la cuve, préférentiellement par chauffage. Typiquement, cette étape d'incubation est effectuée pendant quelques minutes. 25 Pour cela, lorsque le mélange se trouve dans la cuve, les électrovannes sont fermées, et la cuve est chauffée à l'aide de la résistance chauffante, notamment pendant 10 minutes. Ainsi tout l'As(V) est transformé en As(III), qui, combiné à l'As(III) déjà présent dans l'échantillon, donne la quantité d'arsenic totale. Ce mélange est par la suite acheminé dans la puce d'analyse 60 comme précédemment décrit (i.e. en ouvrant les électrovannes 30 14, 15 et 29), pour être dosé. La puce d'analyse 60, disposant d'un système de refroidissement, permet de refroidir le mélange autour de 22-23°C, puis d'effectuer la mesure en As(III), de la même façon que décrit ci-dessus. Enfin, typiquement, après analyse, les électrovannes 7, 12, 5 et 29 sont ouvertes, 35 notamment pendant 30 secondes, pour nettoyer la cuve et les microcananux contenant de l'acide nitrique. L'acide nitrique restant dans la cuve est utilisé pour nettoyer la puce 21 d'analyse 60, typiquement en ouvrant les électrovannes 14, 15 et 29, pendant environ 30 secondes. Cette puce est nettoyée à nouveau, puis remplie d'acide nitrique pour stockage, généralement pendant 30 minutes, en ouvrant les électrovannes 20 et 29. L'invention est maintenant illustrée par l'exemple suivant. Exemple 1 : mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour mesurer le taux d'arsenic dans un échantillon d'eau Des analyses d'échantillons d'eau dopés à l'arsenic ont été effectuées. Le choix s'est porté sur l'eau ulptrapure et deux eaux minérales (Volvic et Evian). Avant analyse, ces eaux sont analysées au préalable par ICP-MS pour s'assurer qu'elles 15 ne contiennent pas d'arsenic, ou bien que la quantité d'arsenic contenue est inférieure à la limite de quantification de l'instrument utilisée (0,1 ppb). Par la suite, ces eaux à analyser sont dopées avec 10 ppb de As(III) pour obtenir une eau ultrapure contenant 10 ppb de As(III) et deux échantillons d'eau minérale contenant chacun 10 ppb. Le choix de 10 ppb de As (III) est relatif à la norme de l'OMS qui fixe les seuils d'arsenic dans l'eau 20 potable à 10 ppb. As(III) est choisi dans ce test car c'est la forme la plus toxique d'arsenic. Pour l'analyse, 40 mL d'échantillon d'eau à l'As(III) sont injectés à l'aide d'une seringue dans le système microfluidique d'analyse selon l'invention. Le procédé selon l'invention est mis en oeuvre pour l'analyse de ces échantillons tour à tour sur la puce en verre. La 25 réponse des capteurs est enregistrée en triplicate pour chaque échantillon et les résultats ci-dessous sont obtenus : Echantillon Volvic Evian Eau Ultrapure As (III) ajouté (ppb) 10,00 10,00 10,00 As (III) Mesuré (ppb) 9,34 ± 0,39 10,67± 0,56 9,77 ± 0,44 5 10 L'arsenic introduit est quasiment totalement détecté par le procédé décrit ici. 30 En conclusion, le procédé selon l'invention peut être utilisé de façon efficace pour la détection automatique des ETM dans l'eau. REVENDICATIONS1. Procédé microfluidique d'analyse d'un fluide contenant au moins un élément-trace métallique comprenant les étapes suivantes : a) introduction d'un échantillon de fluide dans au moins un microcanal d'un circuit microfluidique ; b) mélange, au sein du microcanal du circuit microfluidique, de l'échantillon de fluide introduit à l'étape a), avec des réactifs, et c) mesure de la quantité d'élément-trace métallique présent dans l'échantillon obtenu en b), en utilisant une méthode de détection électrochimique. 2. Procédé microfluidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'élément-trace métallique est l'arsenic, et en ce que le procédé comprend les étapes suivantes : a) introduction d'un échantillon de fluide dans au moins un microcanal d'un circuit microfluidique ; b) mélange, au sein du microcanal du circuit microfluidique, de l'échantillon de fluide introduit à l'étape a), avec de l'acide nitrique et de la L-cystéine, et c) mesure de la quantité d'arsenic présent dans l'échantillon obtenu en b), en utilisant une méthode de détection électrochimique, de préférence au moins 2 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes dont une en or. 3. Procédé microfluidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la mesure de l'étape c) est effectuée en utilisant les trois électrodes suivantes : - une électrode en or, comme électrode de travail, - une électrode en platine, comme électrode de référence, et - une contre-électrode en platine. 4. Procédé microfluidique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape a) est effectuée selon les sous-étapes suivantes : a1) injection de l'échantillon dans le circuit microfluidique ; puis a2) mise sous pression de l'échantillon dans le circuit. 5. Procédé microfluidique selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que, entre les étapes a) et b), une étape de nettoyage N) est réalisée et comprend de préférence au moins une, de préférence au moins deux, de préférence au moins trois, de préférence les quatre sous-étapes suivantes : 23 N1 : une sous-étape de nettoyage du circuit microfluidique ; et/ou N2 : une sous-étape de nettoyage des électrodes, notamment de l'électrode en or ; et/ou N3 : une sous-étape de dépôt d'or par voie électrochimique ; et/ou N4 : une sous-étape de contrôle, notamment par mesure d'une solution témoin. 5 6. Procédé microfluidique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le circuit microfluidique comprend : - au moins un réservoir de stockage de réactif(s), de préférence l'acide nitrique et la Lcystéine et optionnellement au moins un second réservoir de stockage comprenant au 10 moins une solution étalon ; - au moins une première puce microfluidique, dite puce de prémélange, comprenant au moins un premier microcanal relié fluidiquement : o à une première extrémité, aux deux réservoirs et à une entrée, et o à la seconde extrémité, à une cuve, 15 ladite entrée convenant à l'injection de l'échantillon; et - au moins une seconde puce microfluidique, dite puce d'analyse, comprenant au moins un second microcanal relié à la cuve et comprenant au moins deux électrodes, de préférence au moins trois électrodes dont une en or. 20 7. Procédé microfluidique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend deux réservoirs de stockage de deux réactifs distincts et en ce que, lors de l'étape b), les deux réactifs présents dans les deux réservoirs reliés à une extrémité de la première puce sont libérés dans le premier microcanal de ladite première puce, et se mélangent à l'échantillon injecté dans l'entrée, et de préférence le mélange obtenu est ensuite 25 acheminé dans une cuve, de préférence dans la cuve reliée à la seconde extrémité du premier microcanal de la première puce. 8. Procédé microfluidique selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que le mélange d'échantillon, d'acide nitrique utilisé à 2,2 mM et de L-cystéine utilisée 30 à 50 mM de l'étape b) est réalisé dans un ratio volumique respectif de 0,6-0,7 : 0,03-0,05 : 0,25-0,40, de préférence ce ratio volumique respectif est égal à 0,63: 0,04: 032. 9. Procédé microfluidique selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que l'étape c) comprend : 35 cl ) mesure de la quantité d'arsenic (III) présent dans l'échantillon, appelée As(III), puis 24 c2) conversion de l'arsenic (V) restant dans l'échantillon en arsenic (III), puis mesure de la quantité d'arsenic (III) obtenue, appelée As tot, et enfin c3) la détermination de la quantité d'arsenic effectivement présente dans l'échantillon par la formule As(V) = As tot - As(III). 5 10. Circuit microfluidique d'analyse d'un fluide, notamment apte à la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 2 à 9, comprenant : - au moins deux réservoirs de stockage de l'acide nitrique et de la L-cystéine ; - au moins une première puce, dite puce de prémélange, comprenant au moins un 10 premier microcanal relié fluidiquement : o à une première extrémité, aux deux réservoirs et à une entrée, et o à la seconde extrémité, à une cuve, ladite entrée convenant à l'injection d'un échantillon de fluide à analyser ; et - au moins une seconde puce, dite puce d'analyse, comprenant au moins un second 15 microcanal relié à la cuve et comprenant au moins trois électrodes dont une en or.