FR 3078540 A1 20190906 FR 1851833 A 20180302 Procédé de dépôt de nanoobjets à la surface d'un gel polymérique comprenant des zones de rigidités distinctes La présente invention concerne un procédé de dépôt de nanoobjets à la surface d'un gel polymérique comprenant des zones de rigidités distinctes, ce procédé permettant avantageusement d'obtenir des densités surfaciques en nanoobjets distinctes, où la densité surfacique en nanoobjets des zones les plus rigides est supérieure à celle des zones les moins rigides, le gel susceptible d'être obtenu et ses applications. Dans de nombreux domaines, en particulier en biologie, pharmaceutique, diagnostic et dans le domaine des capteurs, des dispositifs comprenant un substrat dont la surface comprend des nanoobjets (protéines, nanoparticules...) disposés de façon localisée et ayant donc une densité surfacique variable sont recherchés. Il est relativement aisé de déposer localement des nanoobjets à la surface d'un substrat "dur" comme le verre ou le silicium. Toutefois, afin de renforcer les forces de liaison entre la surface et les nanoobjets et ainsi de prolonger la durée de vie du dispositif, on cherche à remplacer le verre ou le silicium par des substrats plus mous, comme par des gels à base de matrice polymériques, tels que les hydrogels. La densité d'un gel à base d'une matrice polymérique est directement liée à sa porosité. Plus un gel est poreux, moins il est rigide, et réciproquement. Dans un gel comprenant des zones de rigidités distinctes, les zones les plus molles sont les plus poreuses, et les zones les plus rigides sont les moins poreuses. La littérature rapporte des méthodes pour organiser des nanoobjets sur des substrats de rigidité/porosité uniforme : sur des substrats de type hydrogels: (i) par tamponnage, (ii) par dépôt des molécules à travers un pochoir (iii) à l'aide d'un dispenseur de nnicrogouttes, ou (iv) par activation de la surface de l'hydrogel par une irradiation à travers un photomasque ou par un laser. sur des substrats qui ne gonflent pas dans l'eau, type élastomères, verre, silicium, métaux: par auto-assemblage dirigé par les interactions en jeu lors du démouillage d'un film de solution colloïdale, par évaporation d'une émulsion, par évaporation d'un assemblage organisé par une force magnétique ou optique, par auto-assemblage par évaporation dans un substrat texturé ou par tamponnage. Mais ces méthodes ne se transposent pas nécessairement facilement à des substrats de rigidité variable, ou s'ils sont transposables, il n'y a aucun lien entre les zones sur lesquelles les nanoobjets sont déposés et la rigidité du gel. 2 La modulation spatiale de l'affinité chimique de la surface d'hydrogels est un enjeu dans le domaine pharmaceutique, où des puces à cellules sont fabriquées afin de tester l'efficacité de drogues sur une population cellulaire placée dans des conditions contrôlées et reproductibles les plus pertinentes possibles au regard des conditions physiologiques. 5 En sus de la chimie de la surface d'adhérence et de la géométrie imposée aux cellules, un paramètre clé est la rigidité du substrat qui doit s'approcher des rigidités physiologiques (0.1 à 100 kPa). Les hydrogels sont les seuls matériaux couvrant cette gamme de rigidité. Dans ce contexte, il est particulièrement recherché de pouvoir organiser des protéines selon des motifs choisis sur un hydrogel de rigidité choisie. 10 Des techniques de greffage local de protéines par des méthodes de tamponnage ou de pochoir ont été décrites, mais elles sont très limitées en ce qu'elles ne sont pas très adaptées au greffage sur des surfaces molles comme des hydrogels. Le développement de méthodes alternatives de greffage local est donc requis. Dans le domaine du diagnostic, des puces de capture à biomolécules sont 15 utilisées afin de sonder le contenu de solutions biologiques ou de sérum. Certaines puces utilisent comme substrat des gels à base de matrice polymérique ou des hydrogels (« Arrayit Microarray hydrogel protein substrates », « Reichert Sensor Chips » par exemple) car ces derniers permettent une adsorption non spécifique plus efficace et robuste de la molécule sonde qu'une surface de verre, et ce, d'autant plus que le substrat 20 est poreux. Le dépôt des molécules sondes est fait à l'aide d'un dispenseur de microgouttes. Il est toutefois très délicat que tous les dépôts aient des compositions identiques. Par ailleurs, la taille des dépôts est micrométrique et uniforme sur toute la puce, le profil du dépôt est circulaire. Cette méthode ne peut donc pas être utilisée lorsque des dépôts de formes variables en géométrie ou en taille sont souhaités. 25 Dans le domaine des capteurs, l'organisation de nanoparticules en motifs est un moyen de faire de la détection ultrasensible d'analytes par détection plasmonique, de faire de la chimie de surface localisée sur des particules pré-assemblées à façon (chimie des thiols en particulier), ou de fabriquer des sondes locales de pH ou de température lorsque les nanoparticules sont déposées sur un gels à base de matrice polymérique tel qu'un 30 hydrogel. L'assemblage en motifs de nanoparticules est aussi un moyen de miniaturiser des composants opto électroniques tels que des générateurs de lumière. Les méthodes existantes pour déposer des nanoobjets à la surface de gels dont la surface comprend des motifs utilisent des stratégies d'évaporation dirigée d'une solution colloïdale de nanoparticules pour former les organisations souhaitées, telles que 35 Langmuir Blodgett, utilisation d'un pochoir, organisation préliminaire sous champ électrique ou magnétique, organisation préliminaire en 3D par le contrôle des interactions 3 physico-chimiques. L'étape délicate d'évaporation dirigée est toutefois très délicate à mettre en oeuvre. Des méthodes alternatives pour organiser des nanoobjets sur des substrats de rigidité/porosité variable sont donc requises. 5 A cet effet, selon un premier objet, l'invention concerne un procédé de dépôt de nanoobjets sur la surface d'un gel comprenant une matrice polymérique comprenant au moins deux zones contiguës de rigidités distinctes, ledit procédé comprenant les étapes de : a) fournir un gel comprenant une matrice polymérique et un solvant au sein de la 10 matrice polymérique, la matrice polymérique formant un réseau tridimensionnel susceptible de gonfler en présence dudit solvant, où la solubilité de la matrice polymérique à 1 bar et 25°C dans le solvant est inférieure à 1 g/L, la matrice polymérique comprenant au moins deux zones contiguës de rigidités distinctes présentant un gradient de rigidité supérieur ou égal à 0,1 kPa/pm, puis 15 b) déposer des nanoobjets à la surface du gel, puis c) évaporer le solvant du gel au moins jusqu'à ce que la variation du taux d'évaporation du solvant de la au moins une zone la moins rigide du gel ne soit pas constante dans le temps, ce par quoi les nanoobjets migrent vers la au moins une zone la plus rigide du gel et un gel est obtenu dont la surface est au moins 20 partiellement revêtue de nanoobjets, et où la densité surfacique en nanoobjets d'au moins une zone la plus rigide parmi les au moins deux zones contiguës est supérieure à celle d'au moins une zone la moins rigide parmi les au moins deux zones contiguës. Le procédé comprend une étape a) de fourniture d'un gel comprenant une matrice 25 polymérique et un solvant au sein de la matrice polymérique, la matrice polymérique formant un réseau tridimensionnel susceptible de gonfler en présence dudit solvant, où la solubilité de la matrice polymérique à 1 bar et 25°C dans le solvant est inférieure à 1 g/L. Le gel comprend une matrice polymérique et un solvant au sein de la matrice polymérique, la matrice polymérique formant un réseau tridimensionnel susceptible de 30 gonfler en présence dudit solvant. La matrice polymérique est donc capable de retenir une proportion de solvant au sein de sa structure. Généralement, la teneur maximale en solvant au sein de la matrice polymérique du gel à 25°C (calculée comme le ratio entre le poids de solvant maximal par rapport à la somme du poids de solvant maximal et du poids de la matrice polymérique sèche) varie de 20 à 100%, de préférence de 38 à 100%. 35 Quand on continue à ajouter du solvant au-delà de la teneur maximale, le solvant ajouté n'est plus incorporé au sein de la matrice polymérique. 4 Le polymère de la matrice polymérique du gel peut être homopolymérique (réseau tridimensionnel formé à partir d'un homopolymère), copolymérique (réseau tridimensionnel formé à partir d'un copolymère) ou multipolymérique (réseau tridimensionnel de polymères interpénétrant (« interpenetrating polymeric gel » (IPN) en 5 anglais). Généralement, la matrice polymérique comprend (voire est constituée de) un polymère choisi parmi : - les polyacrylamides ; - les polyéthylène glycols, polypropylène glycols et copolymères d'éthylène glycol ou 10 de propylène glycol, ceux-ci comprenant éventuellement des motifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates; - les polysaccharides, comprenant éventuellement des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates) ; - les (co)polymères issus de la polymérisation de composés diacrylates et/ou 15 (méth)acrylates ; - les alcools polyvinyliques comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates; - les dextranes comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (méth)acrylates ; 20 - les polyfumarates de propylène et les poly (fumarate de propylène-co-éthylène glycol); - les polysiloxanes, comme le poly(dimethylsiloxane) (PDMS) ; et - les combinaisons de ceux-ci. Les matrices polymériques à base de polyacrylamides, et en particulier issus de la 25 polymérisation de l'acrylamide et du N,N'-méthylènebisacrylamide, sont particulièrement préférées Par « composés (meth)acrylates », on entend des composés dérivés d'acrylate ou de méthacrylate, par exemple choisis parmi l'acide acrylique (AA), l'acide méthacrylique (MA), le diméthacrylate d'éthylène glycol (EGDMA), le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle 30 (HEMA), l'acrylate de sulfopropyle, où les acides peuvent être sous forme de sel, notamment de sodium ou de potassium. Le solvant peut être tout solvant dans lequel la solubilité de la matrice polymérique à 1 bar et 25°C est inférieure à 1 g/L et dans lequel elle est susceptible de gonfler. Par exemple, le solvant peut être une solution aqueuse ou un solvant organique 35 choisi parmi les alcools, les alcanes (pentane, hexane par exemple), les amines 5 (triéthylamine, diisopropylamine par exemple), les cétones (l'acétone par exemple) et les solvants aromatiques (toluène, xylène par exemple). Dans un mode de réalisation, la matrice polymérique comprend (voire est constituée de) polysiloxanes, comme le poly(dimethylsiloxane) (PDMS), et le solvant est 5 choisi parmi le pentane, la triéthylamine, la diisopropylamine ou le xylène. Le solvant le plus usuel est une solution aqueuse. Le gel est alors un hydrogel. Des exemples d'hydrogel sont fournis dans la revue de Enas M. Ahnned (Journal of Advanced Research, 2015, 6, 105-121). La matrice polymérique comprend alors généralement (voire est constituée de) un polymère choisi parmi : 10 les polyacrylamides, par exemple issues de la polymérisation de l'acrylamide et du N,N'-méthylènebisacrylamide ; - les polyéthylène glycols, polypropylène glycols et copolymères d'éthylène glycol ou de propylène glycol, ceux-ci comprenant éventuellement des motifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates; 15 - les polysaccharides, comprenant éventuellement des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates) ; les (co)polymères issus de la polymérisation de composés diacrylates et/ou (méth)acrylates ; les alcools polyvinyliques comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation 20 de composés (meth)acrylates; les dextranes comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (méth)acrylates ; les polyfumarates de propylène et les poly (fumarate de propylène-co-éthylène glycol) , et 25 les combinaisons de ceux-ci. Le solvant peut comprendre un agent viscosifiant, par exemple du glycérol. Cet agent permet d'augmenter la viscosité du solvant et donc de limiter son évaporation. La matrice polymérique du gel utilisé dans le procédé comprend au moins deux zones contiguës de rigidités distinctes présentant un gradient de rigidité supérieur ou égal 30 à 0,1 kPa/pm, généralement de l'ordre de 1 kPa/pm. La rigidité de chaque zone est généralement de 100 Pa à 500 kPa, notamment de 0,2 kPa à 100 kPa, de préférence de 0,5 kPa à 50 kPa. Par exemple, le(es) zone(s) la(es) plus rigide(s) a(ont) une rigidité de 5 kPa à 100 kPa, de préférence de 5 kPa à 50 kPa et/ou la(es) zone(s) la(es) moins rigide(s) a(ont) une rigidité de 0,2 kPa à 10 kPa, de 35 préférence de 0,5 kPa à 5 kPa. 6 La rigidité locale de chaque zone de la matrice polymérique et le gradient de rigidité entre deux zones contiguës peuvent être déterminés par microscopie à force atomique (AFM), par exemple en suivant le protocole décrit pages 29 et 30 de la demande WO 2013/079231. Le gradient de rigidité est mesuré sur la surface de la zone 5 sur laquelle seront déposés les nanoobjets lors de l'étape b). Généralement, la plus rigide des au moins deux zones contiguës se présente sous la forme d'un motif. Entre un motif moins rigide à une zone plus rigide, il peut y avoir des paliers de rigidité croissante, comme des « marches d'escalier ». De même, entre un motif plus rigide et une zone moins rigide, il peut y avoir des paliers de rigidité 10 décroissante. La frontière entre les régions moins rigide et plus rigide est généralement une droite ou un cercle. Avantageusement, la géométrie du(es) motif(s) est à façon (carrée, circulaire, triangulaire, hexagonale...). Sa taille peut aller de quelques centaines de nanomètres à plusieurs centimètres, typiquement de 10 pm à 10 mm. La surface du gel peut comprendre une alternance de motifs rigides et de motifs 15 mous. En alternative, la surface du gel peut comprendre plusieurs motifs rigides localisés dans une matrice continue molle. Des hydrogels dont la matrice polymérique comprenant au moins deux zones contiguës de rigidités distinctes présentant un gradient de rigidité supérieur ou égal à 0,1 kPa/pm peuvent par exemple être préparés par photopolymérisation en suivant le 20 procédé décrit dans la demande WO 2013/079231. Des polysiloxanes comprenant de zones de rigidités distinctes sont également connus de Roger Piqueras Jover (« Variable rigidity surfaces for mechanobiology ») (polymérisation par voie chimique en utilisant la lithographie électronique pour augmenter le nombre de liaisons formées) ou de K. Tsougeni, A. Tserepi and E. Gogolides ( 25 Microelectronic Engineering 84 (5-8), 1104-1108 (2007)) (PDMS photosensible polymérisé en UV profond). Le procédé comprend une étape b) de dépôt de nanoobjets à la surface du gel. Les nanoobjets sont de préférence choisis parmi : les protéines, les peptides et leurs mélanges, 30 les polysaccharides, et - les nanoparticules, notamment les nanoparticules de métal, de semi-conducteur ou de polymère. Le métal est notamment choisi parmi les métaux alcalins, les métaux alcalino-terreux, les lanthanides, les actinides, les métaux de transition et les métaux dits « 35 pauvres », et est de préférence choisi parmi l'or, l'argent et l'indium. Le semi-conducteur est par exemple de tellurure de cadmium (CdTe). 7 Les nanoparticules de polymère peuvent par exemple être en polystyrène ou en latex. Les protéines, peptides, polysaccharides et mélanges de ceux-ci sont les nanoobjets préférés, notamment des protéines et/ou peptides induisant une adhésion 5 cellulaire via les intégrines, une telle protéine pouvant être de la fibronectine, du collagène, de la laminine ou des peptides du type RGD. Le préfixe « nano » signifie que le diamètre moyen du nanoobjet est compris de 1 à 1000 nm, notamment de 2 à 500 nm, par exemple de 2 à 250 nm. Les nanoparticules d'or ont typiquement des diamètres moyens de 5 à 400 nm. Les nanoparticules d'argent 10 ou d'indium ont typiquement des diamètres moyens de 2 à 10 nm Le diamètre moyen du nanoobjet est donc supérieur au diamètre moyen des pores présents à la surface du gel (de l'ordre de 1 angstrôm), ce qui permet que les nanoobjets restent à la surface du gel et ne s'enfoncent pas ou peu dans la matrice polymérique. Le diamètre moyen des pores du gel peut être mesuré par diffusion de neutrons 15 ou de rayons X aux petits angles. Le diamètre moyen des protéines, peptides ou polysaccharides est typiquement mesuré par électrophorèse par gel. Le diamètre moyen des nanoparticules est typiquement mesurée par microscopie électronique à transmission ou à balayage (« transmission electron microscope » (TEM) et « scanning electron microscope » (SEM) 20 en anglais). Généralement, lors de l'étape b), les nanoobjets sont déposés sous forme d'un mélange comprenant les nanoobjets et un solvant. Le solvant de ce mélange peut être identique ou différent du solvant du gel. De préférence, le solvant du mélange est soluble dans le solvant du gel (soluble dans les conditions de l'étape b)). De manière préférée, le 25 solvant du mélange est identique au solvant du gel. Le mélange peut être colloïdal (les nanoobjets étant en suspension). Le procédé peut comprendre, entre les étapes b) et c), une étape b1) consistant à laisser en contact les nanoobjets à la surface du gel, généralement pendant une durée de 1 min à 24 heures, notamment 1 min à 12 heures, par exemple 5 min à 1 heure. Lorsque 30 les nanoobjets sont des protéines, cette étape correspond à une incubation. Généralement, quelle que soit la durée de cette mise en contact, il existe une différence de densité surfacique en nanoobjets entre les zones rigides et molles sur le gel obtenu à la fin du procédé. Une durée plus importante peut permettre de déposer plus de nanoobjets en surface (plus de nanoobjets à la fois sur les zones rigides et molles, mais 35 la différence de densité surfacique en nanoobjets entre les zones rigides et molles existe quelle que soit cette durée). 8 Le procédé peut également comprendre, entre les étapes b) et c), (et après l'éventuelle étape b1) si elle est présente), une étape b2) consistant à éliminer une partie des nanoobjets de la surface du gel. Généralement, les nanoobjets ont été déposés sous forme d'un mélange comprenant les nanoobjets et un solvant, et l'étape b2) peut être 5 mise en oeuvre en aspirant la solution surnageante au-dessus de la surface du gel, par exemple avec une pipette. Le procédé comprend une étape c) d'évaporation du solvant du gel au moins jusqu'à ce que la variation du taux d'évaporation du solvant de la au moins une zone la moins rigide du gel ne soit pas constante dans le temps. Cette étape conduit à la 10 migration des nanoobjets vers la au moins une zone la plus rigide du gel, et donc à l'obtention d'un gel dont la densité surfacique en nanoobjets d'au moins une zone la plus rigide parmi les au moins deux zones contiguës est supérieure à celle d'au moins une zone la moins rigide parmi les au moins deux zones contiguës. L'évaporation du solvant d'un gel de densité uniforme comprend deux régimes qui 15 sont illustrés sur les figures 1 et 2. Pendant la première période d'évaporation (« A» sur les figures 1 et 2), du solvant est éliminé en continu de la surface du gel par des forces capillaires et la teneur en solvant diminue à taux constant, ce qui s'explique par le fait que la surface du gel est suffisamment mouillée par le solvant et se comporte comme la surface d'un liquide. Son 20 taux d'évaporation est égal à celui d'une surface liquide, qui dépend uniquement du gaz utilisé pour le séchage et du coefficient de transfert de la couche limite de la surface du gel. Lorsque l'évaporation est poursuivie, le taux d'évaporation atteint un taux d'évaporation critique à un temps critique d'évaporation T, qui marque la transition entre 25 les première et deuxième périodes d'évaporation. Pendant la deuxième période d'évaporation (« B » sur les figure 1 et 2), les forces de diffusion deviennent prédominantes par rapport aux forces de capillarité et l'élimination du solvant hors du gel est principalement contrôlée par la diffusion du solvant dans les pores du gel vers sa surface. Le taux d'évaporation du solvant n'est pas constant dans le 30 temps. Il diminue jusqu'à atteindre un taux d'évaporation d'équilibre au-delà duquel le gel ne peut plus être séché. Le temps critique d'évaporation Tc est le temps minimal à partir duquel le taux d'évaporation du solvant n'est pas constant dans le temps lorsque le solvant du gel est évaporé. 35 Le temps critique d'évaporation T, est une caractéristique de chaque gel. 9 Il dépend de la nature du solvant et ses éventuels additifs (lorsque le solvant est une solution aqueuse, Tc dépend de la salinité, du pH, de la force ionique de cette solution). Par exemple, le temps critique d'évaporation Tc d'un gel dont le solvant comprend un agent viscosifiant est supérieur à celui d'un gel comprenant la même 5 matrice polymérique et le même solvant, mais exempt d'agent viscosifiant. L'ajout d'un agent viscosifiant au solvant permet donc d'augmenter le temps critique d'évaporation Tc et la durée de la première période d'évaporation. Lorsque le solvant est une Solution aqueuse (le gel étant alors un hydrogel), l'évaporation du solvant est une déshydratation. Le temps critique d'évaporation Tc est 10 alors le temps critique de déshydratation Tc, qui correspond au temps minimal à partir duquel le taux de déshydratation de la au moins une zone la moins rigide de l'hydrogel n'est pas constant dans le temps lorsque l'hydrogel est déshydraté. Le temps critique d'évaporation Tc dépend également de la matrice polymérique, à savoir de la nature du polymère, mais aussi de sa porosité et donc de sa rigidité. Le 15 temps critique d'évaporation Tc n'est donc pas identique entre les zones les plus rigides et les moins rigides du gel. Lors de l'étape c), l'évaporation est poursuivie au moins jusqu'à ce que la variation du taux d'évaporation du solvant de la au moins une zone la moins rigide du gel ne soit pas constante dans le temps. C'est donc la variation du taux d'évaporation du solvant de la au moins une zone la moins rigide du gel qui est 20 considérée. De plus, le « au moins jusqu'à ce que la variation du taux d'évaporation du solvant ne soit pas constante dans le temps » signifie que l'évaporation du solvant de la au moins une zone la moins rigide du gel est poursuivie au moins jusqu'au temps critique d'évaporation Tc, pour que le taux d'évaporation de cette au moins une zone la moins rigide soit dans la deuxième période d'évaporation. Si on se réfère aux figures 1 et 2, lors 25 de l'étape c), l'évaporation de la au moins une zone la moins rigide du gel est poursuivie au moins jusque Tc, ou plus loin, dans la deuxième période d'évaporation « B ». Aussi, l'étape c) revient généralement à évaporer le solvant du gel pendant une durée supérieure à la durée critique d'évaporation Ac, où la durée critique Ac est la durée entre le début d'évaporation et le temps critique d'évaporation Tc de la au moins une zone la 30 moins rigide du gel. Pour déterminer si la variation dans le temps du taux d'évaporation du solvant de la au moins une zone la moins rigide du gel est constant dans le temps ou non, il suffit de préparer un gel : 35 - dont le polymère de la matrice polymérique est nature identique à celui de la matrice polymérique du gel mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention, 10 dont le solvant est identique au solvant du gel mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention (y compris l'éventuelle présence d'additifs comme d'un agent viscosifiant), et dont la densité est égale à celle de la au moins une zone la moins rigide du 5 gel utilisé dans le procédé selon l'invention. Le gel ainsi préparé a donc une densité uniforme, à la différence du gel utilisé dans le procédé selon l'invention. Le temps critique d'évaporation Tc du gel préparé est donc identique en toute zone du gel. puis évaporer le solvant du gel préparé, cette évaporation étant réalisée dans les 10 mêmes conditions que celles de l'étape c), et en mesurant soit la teneur en solvant, soit le taux d'évaporation du solvant au cours du temps, et traçer : - la courbe du taux d'évaporation moyen en fonction du temps et déterminer le temps à partir duquel le taux d'évaporation n'est pas constant (figure 1), ou - la courbe de la teneur en solvant en fonction du temps et déterminer le temps 15 à partir duquel la dérivée de la teneur en solvant n'est pas constante (figure 2, ou figure 1.3 p. 11 de la thèse de Thai Hong Vu soutenue en 2006 « Influence of Pore Size Distribution on Drying Behaviour of Porous Media by a Continuous Model », Fakultât für Verfahrens- und Systemtechnik der Ottovon-Guericke-Universitât Magdeburg, Allemagne). 20 Ces courbes permettent donc de déterminer le temps critique d'évaporation TC à partir duquel la deuxième période d'évaporation commence pour la au moins une zone la moins rigide du gel utilisé dans le procédé selon l'invention, et donc de déterminer à partir de quel moment, dans les conditions d'évaporation de l'étape c), la variation du taux d'évaporation du solvant de la au moins une zone la moins rigide du gel n'est pas 25 constante dans le temps. Le procédé selon l'invention, et la détermination du « au moins jusqu'à ce que la variation du taux d'évaporation du solvant de la au moins une zone la moins rigide du gel ne soit pas constante dans le temps », ne requièrent pas que les conditions de l'évaporation (nature du gaz, débit du gaz, pression, et/ou température du gaz) soient 30 constantes lors de l'étape c). Il suffit uniquement que l'évaporation de l'étape ii) utilisée pour déterminer « au moins jusqu'à ce que la variation du taux d'évaporation du solvant de la au moins une zone la moins rigide du gel ne soit pas constante dans le temps » soit réalisée dans les mêmes conditions que celles de l'étape c). Par « évaporation réalisée dans les mêmes conditions que celles de l'étape c) » 35 on entend que, l'aire de la surface du gel utilisé à l'étape ii) est identique à ±10% à celle de la surface du gel mis en oeuvre dans l'étape c), l'épaisseur du gel utilisé à l'étape ii) est 11 identique à ±10% à celle du gel mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention, et que, à tout instant « t » de l'évaporation de l'étape ii) : - le gaz servant à évaporer est identique à celui servant l'étape c) et/ou la pression est identique à ± 10% à celle de l'étape c) (si l'évaporation de l'étape c) est réalisée sous 5 vide, la dépression est identique à ±10% pour l'évaporation de de ii)), - la vitesse du gaz mis en contact avec le gel préparé est identique à ±10% au débit de gaz à l'instant t dans l'étape c), et - la température du gaz servant à évaporer est identique à ± 2°C à la température du gaz servant à évaporer à l'instant t dans l'étape c). 10 Généralement, lors de l'étape c) : l'évaporation est réalisée par mise en contact du gel avec un gaz qui est de l'air ou un gaz inerte (tel que l'azote ou l'argon), de préférence de l'air, et/ou la pression est de 0,1 à 1 bar, de préférence à 1 bar, et/ou la température du gaz mis en contact avec le gel est de 4 à 90°C, notamment de 10 à 15 70°C, de préférence de 15 à 35°C, en particulier à température ambiante (20°C), et/ou la vitesse du gaz mis en contact est compris de 0 à 4 m/s, notamment de 0 à 1 m/s, de préférence de l'ordre de 0,45m/s (par exemple lorsque le gel est placé sous une hotte à flux laminaire), 20 ces conditions étant indépendamment constantes dans le temps ou variables dans le temps au cours de l'étape c). De préférence, au moins jusqu'au temps critique d'évaporation T, de la au moins une zone la moins rigide du gel, voire même pendant la durée de l'étape c), les conditions d'évaporation sont constantes dans le temps, c'est-à-dire que : 25 - lorsque l'évaporation est réalisée par mise en contact du gel avec un gaz : - la nature du gaz reste identique dans le temps, le débit de gaz est constant à ±10%, et la température du gaz est constante à ± 2°C, et - la (dé)pression est constante à ±10% dans le temps (où (dé)pression signifie 30 pression (P 1 bar)) ou dépression (P Tc), mais procédé exempt d'étape de déshydratation une fois que la protéine a été déposée : obtention d'une distribution uniforme de protéines. Dans cet exemple, l'hydrogel est utilisé partiellement hydraté, et la fixation de la protéine par illumination UV est effectué alors que la surface du gel est toujours humide ('ta > tc). Ici est transféré le motif représenté sur la Figure 4 par la référence b. 30 a) Préparation des lamelles de verre basales Idem que Exemple 1 comparatif.a. b) Préparation du masque à niveau de gris Ici est transféré le motif représenté sur la Figure 4 par la référence « b ». Idem que Exemple 1. comparatif b, avec un dépôt de chrome de 14 nm. 35 c) Préparation de l'hydrogel Idem que Exemple 1 comparatif.c 22 Ici, l'ensemble (masque, solution, lamelle) est illuminé à l'aide d'une lampe fibrée Eleco UVP281 (2W/cm2) pendant 12s. d) Caractérisation de la rigidité de l'hydrogel Idem que Exemple 1 comparatif d. Un scan de 100pm x 60pm est effectué. Les scans 5 sont réalisés avec un pas de 3.3pm. Les rigidités mesurées sont de l'ordre de 25 kPa sur les motifs, et de 3 kPa sur la matrice continue molle. Les motifs sont triangulaires rigides (25 kPa) de 80 x 40pm, de période 200pm, dans une matrice continue molle (3kPa). e) Greffage covalent de fibronectine sur l'hydrogel Préparation de la protéine idem que Exemple 1 comparatif e. 10 L'eau recouvrant l'hydrogel préparé selon le protocole est délicatement aspirée à l'aide d'une pipette. L'hydrogel est laissé déshydraté sous une hotte à flux laminaire (Aura) à 26°C pendant 10min, de manière que sa teneur en solvant Ta soit supérieure à la teneur en solvant Tc à son temps critique d'évaporation Tc (ta > tc). Dans une pièce à éclairage sans UV, 800pL de solution de fibronectine conjuguée selon 15 le protocole ci-dessus ajustée à une concentration de 2,2pg/mL dans de l'eau stérile déionisée est déposée à l'aide d'une pipette sur le gel. La solution de protéines est laissée incuber pendant une nuit à 26°C sous la hotte à flux laminaire fermée et éteinte, laissant ainsi le temps aux protéines d'approcher le gel sans que pour autant la surface ne se dessèche pendant cette durée (pas de déshydratation). 20 La solution résiduelle est ensuite aspirée délicatement à l'aide d'une pipette, et le gel est immédiatement illuminé par la lampe UV ElecoUVP281 pendant 5min. Il est ensuite rincé délicatement 3 fois avec une solution de PBS+/+. Le gel fonctionnalisé est conservé hydraté dans une solution de PBS+/+, à 4°C. f) Caractérisation de la distribution des protéines greffées 25 Idem que Exemple 1 comparatif.f. Le profil de l'intensité de fluorescence montre une distribution uniforme de protéines (figure 6). L'exemple 1 et l'exemple 2 montrent que la distribution finale des nanoobjets n'est pas 30 dépendante du taux de gonflement qu'avait l'hydrogel lors du dépôt des nanoobjets (hydrogel sec à l'exemple comparatif 1 et hydraté à l'exemple comparatif 2). Ils montrent aussi que cette distribution n'est pas dépendante du temps de mise en contact entre les nanoobjets et la surface de l'hydrogel (incubation de 66 min à 26°C à l'exemple comparatif 1, une nuit à 26°C à l'exemple comparatif 2). 35 23 Exemple 3: Procédé selon l'invention - modulation de la densité surfacique de protéines sur des motifs plus rigides de tailles micrométriques Ici est transféré le motif représenté sur la Figure 4 par la référence « c ». a) Préparation des lamelles de verre basales 5 Idem que Exemple 1 comparatif.a. b) Préparation du masque à niveau de gris Idem que Exemple 2 comparatif.b. c) Préparation de l'hydrogel Idem que Exemple 2 comparatif.c 10 d) Caractérisation de la rigidité de l'hydrogel Idem que Exemple 2 comparatif.d. Ici la rigidité du motif le moins poreux est d'environ 10 kPa, alors que la matrice continue entourant ces motifs est plus poreuse et a une rigidité de l'ordre de 3 kPa. La surface de l'hydrogel présente une alternance de motifs triangulaires durs (10 kPa) de 20 X100 prrl espacés de 100 pnn dans une matrice continue 15 plus molle (3kPa). e) Greffage covalent de fibronectine sur l'hydrogel Préparation de la protéine idem que Exemple 1 comparatif.e. L'eau recouvrant l'hydrogel préparé selon le protocole ci-dessus est délicatement aspirée à l'aide d'une pipette (étape b2)). 20 L'hydrogel est laissé déshydraté sous une hotte à flux laminaire (Aura) à 26°C pendant 1h (étape a0')). Dans une pièce à éclairage sans UV, 800pL de solution de fibronectine conjuguée selon le protocole ci-dessus ajustée à une concentration de 30,6pg/mL dans de l'eau stérile déionisée est déposée à l'aide d'une pipette sur le gel (étape b). La solution de protéines 25 est laissée incuber pendant 60min sous la hotte à flux laminaire (étape b1)). La solution résiduelle est ensuite aspirée délicatement à l'aide d'une pipette (étape b2)). Le gel mouillé de la solution de protéines est laissé déshydrater pendant 15 min sous la hotte à flux laminaire (Aura) à 26°C (étape c)). Puis il est illuminé par la lampe UV ElecoUVP281 pendant 5min (étape d)). Il est ensuite 30 rincé délicatement 3 fois avec une solution de PBS+/+ (étape e)). Le gel fonctionnalisé est conservé hydraté dans une solution de PBS+/+, à 4°C. f) Caractérisation de la distribution des protéines greffées Idem que Exemple 1 comparatif.f. Le profil de l'intensité de fluorescence montre que les protéines sont beaucoup plus 35 denses sur les motifs les plus durs/les moins poreux (figure 7). 24 Exemple 4: Procédé selon l'invention - modulation de la densité surfacique de protéines sur des motifs plus rigides de tailles millimétriques Ici est transféré le motif représenté sur la Figure 4 par la référence « d ». a) Préparation des lamelles de verre basales 5 Idem que Exemple 1 comparatif.a. b) Préparation du masque à niveau de gris Une lame de microscopie optique (26 mm x76 mm) est lavée dans une solution d'eau oxygénée/acide sulfurique concentré en proportion 1:1, pendant 20 minutes. Une plaque de silicium clivée est fixée sur la moitié gauche de la lame. Elle sert à cacher la partie 10 transparente avant de procéder au dépôt. Ensuite 1nm de titane puis 19 nm de chrome sont déposés à l'aide d'un évaporateur à canon d'électrons de type Plassys. La lame est ensuite rendue hydrophobe par un traitement Optool (Daikin DSX) : immersion pendant 1 minute dans l'Optool dilué à 1/1000 dans du perfluorohexane ; puis la lame est laissée 1 heure dans de la vapeur d'eau à 80°C ; enfin elle est immergée sous agitation lente 15 pendant 10 minutes dans du perfluorohexane. c) Préparation de l'hydrogel Idem que Exemple 1. comparatif c. Ici, l'ensemble (masque, solution, lamelle) est illuminé à l'aide d'une lampe fibrée Eleco UVP281 (2W/cm2) pendant 36s. d) Caractérisation de la rigidité de l'hydrogel 20 Idem que Exemple 1. comparatif d. Le profil de rigidité est obtenu en scannant le gel perpendiculairement à la frontière de rigidité avec un pas de 5pm sur 400pm. Chaque point du profil est la moyenne de 5 mesures espacées de 20pm prises parallèlement à la frontière. L'hydrogel est composé d'une région dure de 3 cm2 (40 kPa) et d'une région molle de même taille (1 kPa). 25 e) Greffage covalent de fibronectine sur l'hydrogel Préparation de la protéine idem que Exemple 1. comparatif e. L'eau recouvrant l'hydrogel préparé selon le protocole ci-dessus est délicatement aspirée à l'aide d'une pipette. L'hydrogel est déshydraté sous une hotte à flux laminaire (Aura) à 26°C pendant une nuit 30 (étape a0')). Dans une pièce à éclairage sans UV, 800pL de solution de fibronectine conjuguée selon le protocole ci-dessus ajustée à une concentration de 2,2pg/mL dans de l'eau stérile déionisée est déposée à l'aide d'une pipette sur le gel (étape b)). La solution de protéines est laissée incuber pendant 60min sous la hotte à flux laminaire. 35 (étape b1)) La solution résiduelle est ensuite aspirée délicatement à l'aide d'une pipette (étape b2)). 25 Le gel mouillé de la solution de protéines est laissé déshydrater pendant 60min sous la hotte à flux laminaire (Aura) à 26°C (étape c)). Puis il est illuminé par la lampe UV ElecoUVP281 pendant 5min (étape d)).. Il est ensuite rincé délicatement 3 fois avec une solution de PBS+/+ (étape e)). Le gel 5 fonctionnalisé est conservé hydraté dans une solution de PBS+/+, à 4°C. f) Caractérisation de la distribution des protéines greffées Idem que Exemple 1 comparatif.f pour le marquage des protéines et l'obtention du profil d'intensité à l'échelle micrométrique. La caractérisation à l'échelle millimétrique est effectué en acquérant tous les millimètres une image de 375x375 pm en microscopie 10 confocale. L'image 3D est transformée en une image 2D en moyennant l'intensité de chaque pixel sur l'épaisseur de la pile d'images. Puis une intensité moyenne est calculée à partir de l'image 2D. Le profil de l'intensité de fluorescence montre que la concentration surfacique des protéines est plus importante dans la région dure (figure 8). 15 Exemple 5: Procédé selon l'invention - modulation de la densité surfacique de nanoparticules d'or sur des motifs plus rigides de tailles micrométriques a) Préparation des lamelles de verre basales Idem que Exemple 1 comparatif.a. 20 b) Préparation du masque à niveau de gris Idem que Exemple 2 comparatif.b. Les motifs choisis sont des triangles rectangles de taille 40 pm x 80 pm espacés de 200pnn, issus des motifs présentés sur la Figure 4 « b ». c) Préparation de l'hydrogel Idem que Exemple 2 comparatif.c 25 d) Caractérisation de la rigidité de l'hydrogel Idem que Exemple 2 comparatif.d. e) Adsorption des nanoparticules d'or L'hydrogel préparé selon le protocole ci-dessus est déshydraté sous une hotte à flux laminaire vertical (Aura Mini) à 26°C pendant 60min (étape a0')). 30 Dans une pièce à éclairage sans UV, 800pL d'une solution de billes d'or de diamètre 10nm (BBI Solution, reférence EM GC10) diluée à 5.2 1012 billes/ml dans de l'eau désionisée est déposée soit pendant 5 min, soit pendant 45 min sur la surface du gel (étape b)). La solution résiduelle est ensuite aspirée délicatement à l'aide d'une pipette. 35 Le gel est laissé déshydrater sous la hotte à flux laminaire à 26°C pendant 4h (étape c)). f) Caractérisation de la distribution des nanoparticules d'or 26 La densité de surface des nanoparticules d'or est visualisée par microscopie électronique à balayage (MEB Zeiss Ultra Plus). Le gel avec les nanoparticules est recouvert d'un dépôt métallique de 3nm de platine (métalliseur BioRad SC500, 6,67 Pa (0.05Torr), 16mA, 30s). La visualisation est faite à 5keV, à une distance de travail de 7.5 mm pour 5 l'échantillon ayant vu la suspension colloïdale 45 min, 7.6 mm pour celui correspondant à 5 min. Les deux images montrent une densité plus importante de nanoparticules sur le motif rigide qu'alentours. L'image pour l'échantillon 45 min montre quantitativement un nombre de nanoparticules plus important sur les régions dure et molle que l'échantillon 5 min (influence temps d'incubation). 10 Exemple 6 comparatif : augmentation de Tc du glycérol comme agent viscosifiant Le solvant de la solution de monomères qui permet la fabrication de l'hydrogel contient du glycérol. L'augmentation de la viscosité du solvant ralentit l'évaporation et permet d'obtenir une 15 chimie de surface uniforme malgré un temps d'attente avant fixation qui normalement induit une concentration des nanoobjets dans les régions les moins poreuses/les plus rigides. Ici est transféré le motif représenté sur la Figure 4 par la référence « b ». a) Préparation des lamelles de verre basales 20 Idem que Exemple 1 comparatif.a. b) Préparation du masque à niveau de gris Idem que Exemple 2 comparatif.b. c) Préparation de l'hydrogel La composition de la solution à polymériser est la suivante : 25 - 10% acrylamide (250p1 de solution initialement à 40%) - 0.5% N,N'-nnéthylènebisacrylamide (Bis) (250p1 de solution initialement à 2%) - 0.2% Irgacure 819 w/v (Ciba, photo-initiateur) - 1% propylamine (amorceur) - eau déionisée (489 pl) 30 -0.1 % glycérol (1 pL) Puis idem que Exemple 2 comparatif.c. d) Caractérisation de la rigidité de l'hydrogel Idem que Exemple 2 comparatif.d. L'hydrogel présente des motifs triangulaires rigides (25 kPa) de 80 x 40pm, de période 35 200pm, dans une matrice continue molle (3kPa). e) Greffage covalent de fibronectine sur l'hydrogel 27 Préparation de la protéine idem que Exemple 1 comparatif.e. L'eau recouvrant l'hydrogel préparé selon le protocole ci dessus est délicatement aspirée à l'aide d'une pipette. L'hydrogel est laissé déshydraté sous une hotte à flux laminaire (Aura) à 26°C pendant 5 5min. Dans une pièce à éclairage sans UV, 800pL de solution de fibronectine conjuguée selon le protocole ci-dessus ajustée à une concentration de 2.2pg/rnL dans de l'eau stérile déionisée est déposée à l'aide d'une pipette sur le gel. La solution de protéines est laissée incuber pendant 60min. 10 La solution résiduelle est ensuite aspirée délicatement à l'aide d'une pipette. Le gel est déshydraté pendant 5min sous une hotte à flux laminaire (Aura), puis illuminé par la lampe UV ElecoUVP281 pendant 5min. Il est ensuite rincé délicatement 3 fois avec une solution de PBS+/+. Le gel fonctionnalisé est conservé hydraté dans une solution de PBS+/+, à 4°C. 15 f) Caractérisation de la distribution des protéines greffées Idem que Exemple 1 comparatif.f. Le profil de l'intensité de fluorescence de la coupe du bas montre une distribution uniforme de protéines (figure 9). Cet exemple 6 montre que le temps critique de déshydration Tc peut être augmenté par 20 l'ajout d'un adjuvant qui augmente la viscosité du solvant et limite ainsi l'évaporation. Dans cet exemple, on obtient un greffage uniforme de protéines malgré l'existence d'une étape de déshydratation après le dépôt de protéines. La durée de déshydratation n'était pas suffisante. Le taux critique de déshydratation n'a REVENDICATIONS1. Procédé de dépôt de nanoobjets sur la surface d'un gel comprenant une matrice polymérique comprenant au moins deux zones contiguës de rigidités distinctes, ledit procédé comprenant les étapes de : a) fournir un gel comprenant une matrice polymérique et un solvant au sein de la matrice polymérique, la matrice polymérique formant un réseau tridimensionnel susceptible de gonfler en présence dudit solvant, où la solubilité de la matrice polymérique à 1 bar et 25°C dans le solvant est inférieure à 1 g/L, la matrice polymérique comprenant au moins deux zones contiguës de rigidités distinctes présentant un gradient de rigidité supérieur ou égal à 0,1 kPa/pm, puis b) déposer des nanoobjets à la surface du gel, puis c) évaporer le solvant du gel au moins jusqu'à ce que la variation du taux d'évaporation du solvant de la au moins une zone la moins rigide du gel ne soit pas constante dans le temps, ce par quoi les nanoobjets migrent vers la au moins une zone la plus rigide du gel et un gel est obtenu dont la surface est au moins partiellement revêtue de nanoobjets, et où la densité surfacique en nanoobjets d'au moins une zone la plus rigide parmi les au moins deux zones contiguës est supérieure à celle d'au moins une zone la moins rigide parmi les au moins deux zones contiguës. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la matrice polymérique du gel comprend un polymère choisi parmi : - les polyacrylamides ; les polyéthylène glycols, polypropylène glycols et copolymères d'éthylène glycol ou de propylène glycol, ceux-ci comprenant éventuellement des motifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates; - les polysaccharides, comprenant éventuellement des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates) ; les (co)polymères issus de la polymérisation de composés diacrylates et/ou (méth)acrylates ; - les alcools polyvinyliques comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates; - les dextranes comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (méth)acrylates ; 29 - les polyfumarates de propylène et les poly (fumarate de propylène-co-éthylène glycol) ; les polysiloxanes, comme le poly(dimethylsiloxane) ; et - les combinaisons de ceux-ci, 5 de préférence les polyacrylamides, par exemple issus de la polymérisation de l'acrylamide et du N,N'-méthylènebisacrylamide. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le solvant présent au sein de la matrice polymérique du gel est une solution aqueuse. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le solvant présent au sein de la matrice polymérique du gel est choisi parmi le pentane, la triéthylamine, la diisopropylamine et le xylène et la matrice polymérique comprend du poly(dimethylsiloxane). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le solvant comprend un agent viscosifiant. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les 20 nanoobjets sont choisis parmi : - les protéines, peptides et mélanges de ceux-ci, les polysaccharides, et les nanoparticules, notamment les nanoparticules de métal, de semi-conducteur ou de polymère. 25 7. Procédé selon la revendication 1 à 5, dans lequel les nanoobjets sont choisis parmi les polysaccharides, les protéines, les peptides et les mélanges de ceux-ci, notamment les protéines et/ou peptides induisant une adhésion cellulaire via les intégrines, de préférence la fibronectine, le collagène, la laminine ou les peptides du type 30 RGD. 8. Procédé selon la revendication 7, comprenant, après l'étape c), une étape d) de greffage covalent des protéines et/ou peptides et/ou polysaccharides sur le gel. 10 15 35 9. Gel obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ledit gel comprenant une matrice polymérique comprenant au moins deux zones contiguës de 30 rigidités distinctes, la surface du gel étant au moins partiellement revêtue de nanoobjets, où la densité surfacique en nanoobjets d'au moins une zone la plus rigide parmi les au moins deux zones contiguës est supérieure à celle d'au moins une zone la moins rigide parmi les au moins deux zones contiguës. 10. Utilisation du gel selon la revendication 9 comme capteur photonique ou physico-chimique, comme capteur pour la détection d'analyte, comme puce à protéines ou à peptides, comme puces à cellules ou comme puce de capture à biomolécules.