FR 3069331 A1 20190125 FR 1770787 A 20170724 SYSTEME D'ILLUMINATION PERMETTANT L'OBSERVATION MICROSCOPIQUE EN CONTRASTE DE PHASE DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne de manière générale le domaine d'analyse optique d'échantillons transparents. Plus particulièrement, la présente invention concerne un système d'illumination pour l'observation microscopique en contraste de phase. ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE Un microscope est principalement composé d'une source de lumière, d'un dispositif optique d'illumination appelé « condenseur », d'un objet W à observer placé sur un support, par exemple une lame de microscope, d'un premier ensemble optique 12 destiné à collecter la lumière transmise après l'objet. Un deuxième système optique 13 permet de former l'image de l'objet par projection sur un plan 14 dit « plan image ». Le premier système optique 12 est tel que la pupille d'ouverture de l'ensemble 11 par les deux systèmes optiques 12 et 13 se forme au plan focal image 17 du premier système optique 12. Un moyen d'observation non représenté, placé dans le plan image, complète le microscope. Si le moyen d'observation est un quatrième système optique appelé « oculaire » est nécessaire et on parle alors d'observation visuelle directe. Si le moyen d'observation est un dispositif d'enregistrement des images comme par exemple un appareil photographique argentique ou numérique ou encore un détecteur électronique comme par exemple une caméra, aucun système optique additionnel n'est requis sauf pour réduire ou agrandir l'image projetée sur le dispositif d'enregistrement. Les objets transparents ont la propriété de transmettre la lumière sans l'atténuer, c'est-à-dire sans l'absorber. Ces objets peuvent modifier localement la phase des ondes lumineuses par les différences locales d'indice de réfraction dans l'objet. L'observation au microscope d'objets transparents n'est possible qu'en utilisant un moyen de transformer les différences de phase en différences d'intensité, visibles en observation visuelle directe ou par enregistrement avec une caméra électronique. Les deux principales méthodes pour observer de tels objets sont le contraste de phase et le contraste interférentiel. La première méthode impose d'utiliser un condenseur équipé d'un écran et d'un objectif équipé d'un anneau de phase placé dans le plan de la pupille de sortie de l'objectif de microscope. La visualisation pas contraste de phase résulte donc de l'association d'un condenseur spécial pour l'illumination et d'un objectif spécial pour former l'image. 1 / 10 La deuxième méthode est basée sur le principe de dédoublement de faisceau : des composants optiques dédoublent le faisceau incident avant la traversée de l'objet en deux faisceaux proches l'un de l'autre : en général, ces composants sont placés dans un condenseur spécial. Après l'objet, des composants optiques recomposent les deux faisceaux : des interférences se produisent qui révèlent la structure de phase de l'objet. La visualisation d'un objet 5 transparent en contraste interférentiel résulte de l'association d'un condenseur spécial pour l'illumination et d'un dispositif optique spécial placé entre l'objet et le plan image pour former l'image. Les techniques de contraste de phase et de contraste interférentiel exigent donc des condenseurs et des objectifs spécifiques à la technique ce qui augmente le coût des microscopes et oblige à des réglages lorsqu'on passe d'une technique à l'autre, par exemple de l'observation en fond clair ou en fond noir à l'observation en contraste de phase. 10 Le document DE102013110497A1 présente un dispositif permettant d'observer des objets transparents sans utiliser d'objectif équipé d'un anneau de phase. Dans ce document, un écran opaque percé de gorges réparties le long d'un anneau est placé dans le condenseur pour générer un cône de lumière. La géométrie du cône est ajustée pour éclairer simultanément l'objet en fond clair et en fond noir et les interférences produites par la superposition des faisceaux émergeant de l'objet révèlent les structures de phase de l'objet. Le réglage de l'anneau est fait par rapport à la pupille 15 d'entrée de l'objectif de microscope : une portion externe du cône de lumière est bloquée par l'objectif de microscope quand la portion interne est transmise. La portion externe est en relation avec l'image en fond noir et la portion interne en relation avec l'image en fond clair. Dans le document US20160306155A1, le principe précédent est repris en décrivant cette fois la distribution de lumière dans le plan de la pupille de sortie de l'objectif de microscope et propose des géométries variées pour les écrans placés dans le condenseur ainsi que des méthodes 20 pour optimiser le contraste observé. Dans ces deux documents, un condenseur spécial est utilisé en amont de l'objet pour structurer le faisceau d'éclairement. Dans le document Lugmaier, Robert A., Thorsten Hugel, Martin Benoit, and Hermann E. Gaub. "Phase Contrast and DIC Illumination for AFM Hybrids." Ultramicroscopy 104, no. 3-4 (October 2005): 255-60. doi:10.1016/j.ultramic.2005.04.008, un dispositif d'éclairage pour le contraste de phase sans condenseur est 25 présenté : plusieurs diodes électroluminescentes sont disposées en anneau et placées sous l'objet. La position des diodes électroluminescentes est ajustée pour que l'image des diodes électroluminescentes dans le plan de la pupille de sortie se superpose à un anneau de phase placé dans le plan de la pupille de sortie de l'objectif de microscope. Dans ce document, un objectif spécial avec un anneau de phase est nécessaire. L'objectif de la présente invention est de proposer un système d'éclairement qui permet de révéler dans le plan 30 image d'un microscope l'image de contraste de phase d'un objet transparent. Ce système d'éclairement est simple dans sa conception et son mode opératoire, économique et permettant d'éviter l'emploi de condenseur ou d'anneau de phase. 2 / 10 A cet effet, l'invention concerne un dispositif d'éclairement apte à former l'image d'un objet transparent dans le plan image d'un microscope par contraste de phase, dispositif comprenant au moins une source de lumière placée sous l'objet de façon à ce que l'image de cette source dans le plan de la pupille de sortie de l'objectif de microscope soit en partie interceptée par le bord de la pupille de sortie de l'objectif. 5 EXPOSE DE L'INVENTION L'invention concerne un dispositif d'éclairement apte à former l'image d'un objet transparent dans le plan image d'un microscope par contraste de phase. Le dispositif comprend au moins une source de lumière placée sous l'objet de façon à ce que l'image de cette source dans le plan de la pupille de sortie de l'objectif de microscope soit en partie 10 interceptée par le bord de la pupille de sortie de l'objectif. Dans différents modes de réalisation, la présente invention concerne également les caractéristiques suivantes qui devront être considérées isolément ou selon toutes leurs combinaisons techniquement possibles : - la source de lumière aura une structure d'anneau lumineux, - la source de lumière sera composée par plusieurs sources discrètes disposées selon un ou plusieurs anneaux 15 ou selon une matrice de sources, - la source de lumière pourra être choisie parmi les diodes électroluminescentes, les diodes électroluminescentes organiques, les diodes lasers, les diodes laser à cavité verticale, les ampoules à incandescence, - chaque source discrète composant la source de lumière pourra être contrôlée de façon Individuelle: par contrôle, on entend le contrôle de l'allumage et de l'arrêt des sources ainsi que le réglage de l'intensité lumineuse 20 émise et le réglage de la couleur de l'onde lumineuse émise par chaque source, L'invention concerne également un microscope. Selon l'invention, ledit microscope comprend un système d'éclairement tel que défini précédemment ainsi que : - des moyens mécaniques de positionner le système d'éclairement dans les trois directions de l'espace, - d'un moyen électronique de contrôler les sources discrètes du système d'éclairement, 25 Dans différents modes de réalisations possibles, l'invention sera décrite plus en détail en référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 représente schématiquement un système d'éclairement dans un premier mode de réalisation de la présente invention, la figure 2 représente schématiquement un système d'éclairement dans un deuxième mode de réalisation 30 de la présente invention, 3 / 10 - la figure 3 représente schématiquement un système d'éclairement dans un troisième mode de réalisation de la présente invention, - la figure 4 représente schématiquement un système d'éclairement dans un quatrième mode de réalisation de la présente invention, 5 - la figure 5 représente schématiquement un système d'éclairement dans un cinquième mode de réalisation de la présente invention, - la figure 6 représente un mode particulier connu de l'art antérieur selon le deuxième mode de réalisation de l'invention, - la figure 7 représente des images expérimentales obtenues avec le premier mode de réalisation de 10 l'invention, - la figure 8 représente des images expérimentales obtenues avec le deuxième ou le quatrième mode de réalisation de l'invention, Un objet de la présente invention est la réalisation d'un système d'illumination apte à former l'image d'un objet 15 transparent dans le plan image d'un microscope par contraste de phase, formé à partir d'au moins une source de lumière 100 éclairant un objet 10 placé sous un système optique 11 composé d'un premier système optique 12 représenté par son plan principal objet 15 et son plan principal image 16 et d'un deuxième système optique 13 représenté par son plan principal objet 18 et son plan principal image 19. Le système optique 11 projette l'image de l'objet 10 dans le plan image 14. Les deux systèmes optiques 12 et 13 sont tels que la pupille de sortie de l'ensemble 20 formé par 12 et 13 est localisée optiquement dans le plan focal image 17 de 12. Le premier système optique forme dans son plan focal 17 une image 200 de la source 100. Dans le plan focal image 17, un diaphragme est placé pour matérialiser une pupille de sortie 20. Des moyens de positionnement non représentés permettent de positionner la source 100 dans les trois directions de l'espace x, y, et z. La source 100 est positionnée de manière à ce que le faisceau de lumière issu de 100 et passant par 200 après avoir traversé l'objet 10 et le système optique 12 soit en partie 25 intercepté par le bord de la pupille de sortie 20. Le réglage de position de la source 100 est ajusté selon les trois directions notées x, y et z pour faire apparaitre la structure d'un objet transparent placé sous le microscope. Cet ajustement est réalisé en observant l'image formée dans le plan image 14 d'un objet transparent. A titre d'exemple, on se réfèrera au Fig. 7A et 7B et au Fig. 8A et 8B. Avant ajustement de la position, on obtient une image telle qu'illustrée en Fig. 7A réalisée en enregistrant avec une caméra électronique l'image d'un film mince hétérogène de 30 laque au travers d'un objectif BRESSER de grossissement 10 fois ne possédant pas d'anneau de phase : la structure du film est très peu visible. L'image de la Fig. 7A est caractéristique de celle d'un objet transparent observé au microscope en illumination fond clair. Après ajustement illustré en Fig 78, la structure est beaucoup plus contrastée. L'image de la Fig. 7B est caractéristique de celle d'un objet transparent observé en contraste de phase. La source de lumière sera choisie, de façon non limitative, parmi les diodes électroluminescentes, les diodes électroluminescentes organiques, les diodes lasers, les diodes laser à cavité verticale, les ampoules à incandescence. 4 / 10 La Fig. 2A représente un deuxième mode de réalisation d'un système d'illumination apte à former l'image d'un objet transparent dans le plan image d'un microscope par contraste de phase selon l'invention, dans lequel la source de lumière est composée d'une pluralité de sources discrètes 1001, 1002, ..., 100,, disposées dans un plan pour former un anneau : n désigne ici le nombre de sources discrètes composant l'anneau. Dans la Fig.2A, on a représenté 5 quatre sources 1001, 1002, 1003 et 1004 mais ce nombre n'est pas limitatif. Par la suite, on désignera par 100,, l'ensemble des sources et par 200n l'ensemble des images des sources 100n par le système optique 12 dans le plan de la pupille de sortie du système optique 11. Par exemple, 2001, 2002, 2003 et 2004 sont respectivement les images dans le plan focal 17 de 12 de 1001, 1002, 1003 et 1004. Des moyens de positionnement non représentés permettent d'ajuster la position de chaque image 200,, pour que les faisceaux de lumière issus de chaque source et passant par 10 chacune des images après avoir traversé l'objet 10 et le système optique 12 soient en partie interceptés par le bord de la pupille de sortie 20. La Fig. 2B représente une vue de dessus de la pupille 20: les images des sources 200,, sont représentées comme des cercles qui matérialisent les faisceaux de lumière provenant des sources 100n. La Fig. 2C représente la même vue que la Fig. 2B mais pour un réglage de la position des sources 100,, tel que les faisceaux issus des sources sont interceptés par le bord de la pupille. La configuration de la Fig.2B permet d'effectuer une 15 observation en mode fond clair comme illustré en Fig. 8A. La configuration représentée par la Fig. 2C permet d'effectuer une observation en contraste de phase comme illustré en Fig. 88. Les Fig. 8A et 88 représentent les images obtenues pour un même objet transparent fabriqué en pulvérisant un aérosol de laque sur une lame de verre non représentée pour former un film mince hétérogène et transparent. Les deux images ont été obtenues dans les mêmes conditions d'acquisition et sont représentées sans traitement 20 numérique. Pour la Fig. 8A, on observe une intensité homogène dans toute la surface de l'image, caractéristique de l'image d'un objet transparent observé par la technique de fond clair. Pour la Fig. 8B, la structure hétérogène du film est nettement visible et cette image est caractéristique d'une observation en contraste de phase. Utiliser plusieurs sources comme représenté en Fig. 2 permet de réduire la durée de l'exposition. De plus, l'éclairement de l'objet est plus homogène et la qualité de l'image est meilleure. 25 Dans un troisième mode de réalisation d'un système d'illumination apte à former l'image d'un objet transparent dans le plan image d'un microscope par contraste de phase, les sources de lumière 100n sont contrôlées individuellement à l'aide d'un circuit électronique choisi parmi dispositifs connus comme un microcontrôleur, un circuit d'adressage. Par contrôle individuel, on entend qu'il est possible de régler, pour chaque source, le niveau de l'intensité envoyée vers l'objet. Dans ce mode de réalisation, les sources 100,, peuvent être choisies de telle sorte que chaque source 30 émet une couleur différente. On a représenté en Fig. 3 et à titre d'exemple un anneau de diodes électroluminescentes composé de diodes électroluminescentes rouges, vertes et bleues disposées en alternant les trois couleurs dans l'ordre rouge, vert et bleu. Le choix du nombre de couleurs n'est pas limitatif et la répartition est ici donnée à titre d'exemple. Par exemple, on pourra avantageusement alterner des diodes électroluminescentes 5 / 10 émettant des couleurs rouge, verte, bleue, blanche. Dans ce mode de réalisation, il est possible de contrôler la couleur d'éclairement de l'objet en ajustant l'intensité de chaque diode électroluminescente. Dans un quatrième mode de réalisation d'un système d'illumination apte à former l'image d'un objet transparent dans le plan image d'un microscope par contraste de phase représenté en Fig. 4A, les sources 100n sont disposées 5 selon plusieurs anneaux concentriques et une source unique est placée au centre. Dans la Fig.4, quatre anneaux 1022, 1022, 1023 et 1024 sont représentés mais ce nombre n'est pas restrictif, et la source au centre est notée 101. Dans un mode avantageux, chaque source individuelle peut être constituée par exemple d'un boîtier comportant plusieurs diodes électroluminescentes adressées individuellement ou non, chaque diode émettant une couleur différente, comme représenté en Fig. 4B. Le boîtier contient alors un groupe de sources. La Fig. 4B est un détail de la Fig. 4A et 10 représente seulement la source centrale 101 et le premier anneau 1022. Chaque groupe de sources est délimité par un carré et un exemple est donné pour un groupe noté 103 et qui comporte trois sources discrètes notées 1032, 1032 et 1033. Le nombre de sources discrètes n'est pas limitatif. Le contrôle de l'allumage d'un anneau est effectué par un circuit électronique. Ce circuit permet d'allumer ou d'éteindre un anneau donné. Ce circuit peut être commandé par des interrupteurs électromécaniques ou par un logiciel fonctionnant avec un microcalculateur. Dans le cas de groupe 15 de sources commerciales comme les diodes électroluminescentes, l'orientation du boîtier sera telle que les sources discrètes seront disposées le long du périmètre d'un cercle dont l'image, dans la pupille de sortie de l'objectif de microscope et après réglage de la position des sources discrètes dans les trois directions de l'espace, est tangent au bord de la pupille. Le quatrième mode de réalisation schématisé en Fig. 4A permet de choisir l'anneau qui éclaire l'objet en fonction du diamètre de son image dans le plan de la pupille de sortie du système optique 11. Ce diamètre 20 dépend de la distance focale et de l'ouverture numérique du système optique 11: une structure en anneaux concentriques telle que représentée en Fig. 4A permet d'associer un anneau à chaque type d'objectif. Dans un mode avantageux, un anneau de la source sera allumé à l'aide du circuit électronique pour l'observation en contraste de phase, conformément au deuxième mode de réalisation, et un ou plusieurs anneaux de diamètres inférieurs seront allumés à l'aide du circuit électronique pour l'observation en fond clair. Les images de la Fig. 8A (fond clair) et de la 25 Fig. 86 (contraste de phase) ont été obtenues par ce procédé. L'observation en fond noir est également possible avec la structure de la Fig. 4A en positionnant un anneau de sources de façon à ce que leurs images dans le plan de la pupille de sortie soient réparties selon un cercle dont le diamètre est supérieur au bord de la pupille comme représenté en Fig. 6. Le résultat est illustré par la Fig. 8C qui correspond au même champ objet que celui des figures 8A et 8B. 30 Dans un cinquième mode de réalisation d'un système d'illumination apte à former l'image d'un objet transparent dans le plan image d'un microscope par contraste de phase schématisé en Fig. 5A et Fig. 5B, les sources 100n sont réparties selon une matrice. Les sources allumées sont choisies de façon à ce que la lumière issue de leurs images dans le plan de la pupille de sortie 20 du système optique 11 après ajustement de la position dans les trois directions de l'espace soit en partie interceptée par le bord de la pupille de sortie 20. La Fig. 5A représente à titre d'exemple 6/10 une matrice carrée de 7 lignes et 7 colonnes. La Fig. 58 représente les images 200, des sources 100, dans le plan de la pupille 20. Les sources 100, allumées sont représentées par des cercles blancs notés 200a1 à 200a8. Les sources 100, éteintes sont représentées par des cercles hachurés. Le contrôle de l'allumage et de l'arrêt des sources est effectué par un circuit électronique. Ce circuit peut être commandé par des interrupteurs électromécaniques ou par 5 un logiciel fonctionnant avec un microcalculateur. 7/10 REVENDICATIONS1. Système d'éclairement d'un objet (10) qui comprend au moins une source de lumière (100) placée sous l'objet, un circuit électronique de contrôle de la source de lumière, un dispositif de réglage de la position de la source de lumière dans les trois directions de l'espace, un système optique (11) apte à former l'image de l'objet dans le plan image (14) du système optique, caractérisé en ce que la source est positionnée dans les trois directions de l'espace pour que son image dans le plan de la pupille de sortie (20) du système optique soit en partie interceptée par le bord de la pupille de sortie et révèle dans le plan image l'image de contraste de phase d'un objet transparent. 10 2. Système d'éclairement selon la revendication 1 caractérisé en ce que la source de lumière est une diode électroluminescente, une diode organique électroluminescente, une diode laser, une diode laser à cavité verticale, une ampoule à incandescence. 3. Système d'éclairement d'un objet (10) qui comprend une pluralité de sources discrètes de lumière 15 (100) placées sous l'objet, un circuit électronique de contrôle des sources discrètes de lumière, un dispositif de réglage de la position des sources discrètes de lumière dans les trois directions de l'espace, un système optique (11) apte à former l'image de l'objet dans le plan image (14) du système optique, caractérisé en ce chaque source discrète de lumière est positionnée dans les trois directions de l'espace pour que son image dans le plan de la pupille de sortie (20) du système optique soit en partie interceptée par le bord de la pupille de sortie et révèle dans le plan image 20 l'image de contraste de phase d'un objet transparent. 4. Système d'éclairement selon la revendication 3 caractérisé en ce que la source (100) est composée d'une pluralité de sources discrètes de lumière réparties selon plusieurs anneaux concentriques, d'un circuit électronique apte à allumer ou éteindre chaque anneau individuellement, caractérisé en ce que : le circuit électronique permet d'allumer individuellement l'anneau sélectionné, les source discrètes de lumière de l'anneau allumé sont positionnées dans les trois directions de l'espace par le dispositif de réglage de position pour que leur image dans le plan de la pupille de sortie (20) du système optique est en partie interceptée par le bord de la pupille pour révéler l'image de contraste de phase d'un objet transparent. 5. Système d'éclairement d'un objet (10) qui comprend une pluralité de sources discrètes de lumière (100) placées sous l'objet et disposées dans un plan pour former une matrice, un circuit électronique de contrôle des sources discrètes de lumière, un dispositif de réglage de la position des sources discrètes de lumière 25 30 8 / 10 dans les trois directions de l'espace, un système optique (11) apte à former l'image de l'objet dans le plan image (14) du système optique, caractérisé en ce que : le circuit électronique permet d'allumer certaines sources discrètes de lumière, les sources discrètes de lumières allumées sont positionnées dans les trois directions de l'espace par le dispositif de réglage de position pour que leur image dans le plan de la pupille de sortie (20) du système optique est en partie interceptée par le bord de la pupille pour révéler l'image de contraste de phase d'un objet transparent. 6. Système d'éclairement selon la revendication 3, 4 ou 5 caractérisé en ce que la source (100) est composée de sources discrètes de couleurs différentes. 7. Système d'éclairement selon les revendications 3, 6, ou 4 caractérisé en ce que les sources de lumière sont choisies parmi les diodes électroluminescentes, les diodes organiques électroluminescentes, les diodes laser, les diodes laser à cavité verticale, les ampoules à incandescence. 20 9 / 10