FR 3080742 A1 20191108 FR 1870542 A 20180507 Description Titre de l'invention : UTILISATION D'UN EXTRAIT OU D'UNE FRACTION D'EXTRAIT D'ALGUE ROUGE AGAROPHYTE COMME ELICITEUR/STIMULATEUR DE DEFENSE VEGETAL ET APPLICATION DUDIT EXTRAIT OU DE LADITE FRACTION D'EXTRAIT mol] La présente invention concerne l'utilisation d'extraits, en particulier d'extraits naturels, ou de fractions d'extraits d'algues rouges agarophytes comme stimulateurs de défense naturelle chez les plantes terrestres. Elle concerne également des procédés d'obtention de ces extraits ou fractions d'extraits. [0002] La présente invention consiste en la récupération d'extraits d'algues rouges aga- rophytes et leur utilisation comme éliciteurs ou stimulateurs des défenses naturelles ayant la capacité de provoquer chez la plante l'expression de la résistance face au stress biotique. [0003] L'usage de produits chimiques tels que les pesticides dans le domaine agricole connaît une limitation imposée en France par le plan Ecophyto 2. L'objectif est de réduire de moitié l'usage de produits chimiques phytopharmaceutiques comme les pesticides d'ici 2025 tout en maintenant les rendements agricoles, ce qui suggère l'élaboration et la mise en application de méthodes alternatives comme l'usage d' éliciteurs qui permettront de mener à bien les ambitions du plan Ecophyto et de réduire les risques et impacts liés à l'usage des pesticides. [0004] Les éliciteurs sont des molécules de signalisation qui initient la reconnaissance d'un microorganisme pathogène chez la plante. Ils sont capables de se lier de manière spécifique à des récepteurs membranaires. A la suite de l'interaction entre l'éliciteur et le récepteur spécifique, on observe, au niveau cellulaire, une cascade d'évènements de signalisation. Il existe une grande variété de récepteurs membranaires pouvant accueillir chacun un éliciteur bien défini (Benhamou, N., et Rey, P. (2012). Stimulateurs des défenses naturelles des plantes : une nouvelle stratégie phytosanitaire dans un contexte d'écoproduction durable.: I. Principes de la résistance induite. Phytoprotection 92, 1). [0005] En ce sens, selon l'interaction, on observera: - une dépolarisation membranaire, l'activation des protéines G, des protéines kinases, la libération intracellulaire d'ions calcium ; - l'expression des gènes de défense participant à la voie de biosynthèse de phytohormones, d'enzymes, des protéines de stress, des inhibiteurs de protéases, des mé- 2 tabolites secondaires à potentiel antimicrobien dont les phytoalexines ; - l'accumulation de formes actives de l'oxygène ou FAOs, molécules très actives présentant une activité antimicrobienne directe, aussi impliquées dans les réactions d'hypersensibilité et dans le renforcement de la paroi cellulaire. [0006] L'accumulation de FAOs est un évènement qui enclenche la production de radicaux libres normalement présents dans la plante en faible quantité. Lors d'une agression, cet équilibre est rompu et la surproduction de radicaux libres est toxique pour le pathogène mais aussi pour la plante car ils peuvent endommager des molécules comme l'ADN, les protéines, certaines enzymes et les lipides membranaires. La zone d'attaque du pathogène peut ainsi être nécrosée (réaction hypersensible). Afin de minimiser cet effet négatif des FAOs, la plante possède des enzymes canalisant leur périmètre d'action dont la peroxydase. Le burst oxydatif s'accompagne donc généralement d'une production en peroxydases, enzymes désactivant les FAOs comme H202 qui constitue donc potentiellement un marqueur de défense de la plante. [0007] Les évènements de signalisation varient d'une plante à une autre en termes d'intensité et d'ordre d'apparition et jouent un rôle majeur dans la transduction du signal de stress. Selon la nature de l'éliciteur, différentes réponses sont donc mises en place afin de résister contre le pathogène. Parmi ces réponses, on peut observer un renforcement pariétal. Une papille est synthétisée à l'endroit où entrent les organismes pathogènes. [0008] L'apposition rapide et localisée de composés phénoliques, de silice, de callose, de protéines, de glycoprotéines (HRGPs), de subérine ou de lignine permet d'épaissir la paroi cellulaire (Garcia-Brugger, A., Lamotte, O., Vandelle, E., Bourque, S., Lecourieux, D., Poinssot, B., Wendehenne, D., et Pugin, A. (2006). Early Signaling Events Induced by Elicitors of Plant Defenses. Molecular Plant-Microbe Interactions 19, 711-724; Senthil-Kumar, M., et Mysore, KS. (2013). Nonhost Resistance Against Bacterial Pathogens: Retrospectives and Prospects. Annual Review of Phytopathology 51, 407-427). [0009] La production de lignine dans la zone agressée s'effectue à l'aide d'enzymes cata- lytiques comme la phénylalanine ammonia-lyase (PAL) qui est indispensable à la biosynthèse des phénylpropanoides. [0010] La plante possède un arsenal varié lui permettant de se défendre et de s'adapter au type de stress auquel elle est soumise. Le type de résistance induit par les éliciteurs est la résistance systémique acquise. C'est une résistance généralisée à l'ensemble de la plante. Elle permet une défense optimisée contre le pathogène et contre de nouvelles attaques potentielles. Elle permet notamment à la plante d'être en état de veille constant tant que l'effet du SDN est actif. C'est une méthode préventive qui induit la résistance chez la plante et réduit considérablement le temps de réponse face à 3 l'attaque d'un pathogène. La stratégie adoptée est de fournir à la plante un éliciteur et ce, à faible concentration, afin de réduire considérablement le temps de réponse face à une agression. (Levine, A., Tenhaken, R., Dixon, R., et Lamb, C. (1994). H202 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Cell 79, 583-593; Bolwell, G.P. (1999). Role of active oxygen species and NO in plant defence responses. Current Opinion in Plant Biology 2, 287-294). [0011] On peut distinguer les éliciteurs d'origine biotique, des stress abiotiques comme les métaux lourds, certains détergents, certains antibiotiques, les rayonnements UV. Il est fréquent de trouver des éliciteurs biotiques dans les algues. En effet, les algues rouges, vertes et brunes possèdent des polysaccharides pariétaux variés et spécifiques capables d'agir comme éliciteurs biotiques en tant que tels ou sous une forme dépolymérisée (Vera, 2011). En particulier, les algues rouges riches en carraghénanes (soit carraghénophytes) possèdent des carraghénanes dont les dérivés oligosaccharidiques ont des propriétés élicitrices (US 20100173779 Al et US 20110099898 Al). A noter que les carraghénanes se différencient des agars par l'absence de L-Galactose et du 3,6 anhydro-L-galactose exclusifs aux agars. Certaines algues vertes possèdent des ulvanes qui, une fois dépolymérisés, agissent comme éliciteurs (W02005094588 Al). Concernant les algues brunes, ces dernières sont riches en laminarine qui est un glucane de réserve agissant comme éliciteur (WO 1994000993 Al). Il existe des oligoagars de degré de polymérisation (DP)4 obtenus par dépolymérisation enzymatique et capables d'éliciter l'algue rouge Gracilaria (Weinberger, F., Friedlander, M., et Hoppe, H.-G. (1999). Oligoa gars elicit a physiological response in Gracilaria conferta (Rhodophyta). Journal of Phycology 35, 747-755). [0012] La Société déposante a maintenant découvert des glucides et fragments de glucides d'algues rouges agarophytes comme celles des genres Gelidium et Gracilaria qui présentent une activité élicitrice. La récupération de ces substances d'origine naturelle est effectuée dans l'objectif d'une application biologique respectueuse de l'environnement. Ces substances naturelles ne nécessitent pas une dépolymérisation préalable pour activer leur caractère éliciteur ; elles sont actives en tant que telles. Aussi, ces substances élicitrices sont hydrosolubles, ce qui conforte leur caractère naturel. [0013] L'invention porte ainsi notamment sur des extraits de molécules naturellement présentes dans Gelidium ses quipedale et capables de provoquer une augmentation de certains marqueurs de l'élicitation, tels que la callose, les composés phénoliques, les activités enzymatiques de la peroxydase et celle de la phénylalanine-ammonia-lyase (PAL). L'invention permet d'améliorer la résistance systémique acquise et/ou la résistance systémique induite en accélérant sa mise en place et en assurant une défense généralisée chez la plante. 4 [0014] Par la demande de brevet japonais JP 2014091709, on connaît des agents favorisant la croissance des plantes consistant en une eau traitée par un alcalin obtenue après le traitement alcalin d'une algue rouge et lavage de l'eau de traitement obtenue lors d'un procédé de fabrication d'agar. Il s'agit d'une application différente de celle selon la présente invention, ces agents étant présentés comme contenant des minéraux en provenance de l'eau de mer d'une manière bien équilibrée, de tels minéraux participant à la croissance de la plante. [0015] Antonio Ramkissoon, Adesh Ramsubhag et Jayaray Jayaraman, J.Appl. Phycol (2017) 29:3235-3244 décrivent l'activité phytoélicitrice d'extraits de trois espèces d'algues des Caraïbes provoquant la diminution des symptômes d'infections pathogènes chez des plants de tomate. Les extraits obtenus sont des mélanges complexes de molécules. Contrairement à cela, la présente invention porte sur des extraits ou fractions d'extraits contenant des oligosaccharides bien définis, jamais évoqués dans l'article cité. Par ailleurs, selon cet article, l'extrait est pulvérisé à une concentration de 0,5%, soit de 5 g/L. Selon la présente invention, les extraits/fractions d'extraits ont été appliqués à des concentrations bien plus favorables pour les plantes, lesquelles sont comprises entre 1 et 10 mg/L, soit environ 1000 fois plus faibles. Ceci vient corroborer la nouveauté et l'intérêt des extraits/fractions d'extraits selon la présente invention. [0016] La présente invention a d'abord pour objet une utilisation comme éliciteur/sti- mulateur de défense chez les plantes terrestres d'un extrait ou d'une fraction d'extrait d'au moins une algue rouge agarophyte, ledit extrait ou ladite fraction d'extrait contenant au moins un oligosaccharide ayant de 2 à 50 unités ose liées entre elles de façon covalente, et des polysaccharides ayant plus de 50 unités ose liées entre elles de façon covalente pouvant être contenus sans dépasser 0,01% en poids par rapport aux oligosaccharides/polysaccharides totaux. [0017] On a défini ici un oligosaccharide comme un composé contenant de 2 à 50 unités ose et un polysaccharide comme un composé contenant plus de 50 unités ose. [0018] On a dans ce qui suit utilisé également l'expression « degré de polymérisation » (DP) pour exprimer ce nombre d'unités ose. [0019] Les algues rouges agarophytes peuvent être choisies parmi celles des genres Gelidium et Gracilaria, et peut notamment être Gelidium ses quipedale. [0020] En particulier, l'extrait ou la fraction d'extrait peut contenir, comme oligo- saccharide(s), au moins un oligosaccharide natif ou substitué choisi parmi : - un (Gal)n-Glycérol avec Gal = unité galactose et 2 Amer. J. Enol. Viticult. 16:144-58, 1965. [0078] L'activité enzymatique de la peroxydase est déterminée selon la méthode décrite par Shindler JS, Childs RE, Bradsley WG. (1976) Peroxidase from human cervical mucus, the isolation and characterisation. Eur J Biochem.; 65(2):325-331. ; celle de la PAL selon Francini, A., Nali, C., Pelle grini, E., et Lorenzini, G. (2008). Characterization and isolation of some genes of the shikimate pathway in sensitive and resistant Centaurea jacea plants after ozone exposure. Environmental Pollution 151, 272-279. [0079] Les résultats sont exprimés en pourcentage du témoin, le Tween à 0,05% en volume. [0080] La fraction F3 appliquée sur les plants de tomate à une concentration de 1 mg/L provoque une augmentation de la teneur en callose deux fois supérieure à celle du témoin et pour une concentration de 2 mg/L, la teneur en callose est triplée. La fraction Fi à 1 mg/L provoque une augmentation de la teneur en composés phénoliques qui subit une hausse de l'ordre de 50% par comparaison avec le témoin. [0081] Tableau 9 : Teneur en callose exprimée en pourcentage du témoin - S 141 [0082] Tableau 10 : Teneur en composés phénoliques exprimée en pourcentage du témoin - , 1D =.: 143 [0083] Une concentration de la fraction Fi de 1 mg/L stimule l'activité de la peroxydase de 70%. Une concentration de la fraction Fi de 2 mg/L renforce l'activité enzymatique de la phénylalanine-ammonia-lyase de 82%. [0084] Tableau 11: Activité enzymatique de la peroxydase exprimée en pourcentage du témoin , - ' 10 157 __ 14 [0085] Tableau 12 : Activité enzymatique de la PAL exprimée en pourcentage du témoin 16 I 34 1.^ [0086] Les résultats obtenus permettent d'affirmer que les fractions extraites présentent bien une activité élicitrice. [0087] Il est démontré que les fractions obtenues selon l'Exemple 2 possèdent une activité élicitrice car les marqueurs de l'élicitation sont plus élevés chez les plantes traitées que chez les plantes témoins. Aussi, la réponse de la plante est différente selon la fraction appliquée. Les trois fractions provoquent une augmentation de l'activité de la peroxydase de façon variable selon la concentration appliquée sur les plantes. [0088] L'enzyme peroxydase est synthétisée lorsque la plante produit des FAOs pour limiter le stress oxydatif. De plus, l'enzyme phénylalanine-ammonia-lyase, participant à la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes antimicrobiens mais aussi à la synthèse de lignines et donc au renforcement de la paroi des cellules, voit son activité stimulée. [0089] Le renforcement de la paroi comprend aussi la formation de callose et de composés phénoliques, la teneur de ces derniers étant augmentée grâce à l'application des fractions isolées de Gelidium. La stimulation de ces défenses naturelles peut permettre de freiner le pathogène et constitue un des premiers signes de résistance de la plante. La plante peut mieux se défendre en présence des extraits et fractions selon l'invention. [0090] Les fractions élicitrices octroient à la plante une résistance accrue en activant et renforçant les marqueurs de l'élicitation. 17 [Revendication 11 [Revendication 21 [Revendication 31 [Revendication 41 [Revendication 51 [Revendication 61 [Revendication 71 REVENDICATIONSUtilisation comme éliciteur/stimulateur de défense chez les plantes terrestres d'un extrait ou d'une fraction d'extrait d'au moins une algue rouge agarophyte, ledit extrait ou ladite fraction d'extrait contenant au moins un oligosaccharide ayant de 2 à 50 unités ose liées entre elles de façon covalente, et des polysaccharides ayant plus de 50 unités ose liées entre elles de façon covalente pouvant être contenus sans dépasser 0,01% en poids par rapport aux oligosaccharides/polysaccharides totaux. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que les algues rouges agarophytes sont choisies parmi celles des genres Gelidium et Gracilaria. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée par le fait que l'algue rouge agarophyte est Gelidium sesquipedale. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait que l'extrait ou la fraction d'extrait contient, comme oligosaccharide(s), au moins un oligosaccharide natif ou substitué choisi parmi : - un (Gal)n-Glycérol avec Gal = unité galactose et 2 2-5% en poids, en faisant suivre par une neutralisation par un acide et par une élimination au moins partielle des polysaccharides ayant plus de 50 unités ose reliées entre elles de façon covalente ; ou - par une solution hydroalcoolique, l'alcool ayant par la suite été éliminé ; ou - par un alcool tel que l'éthanol, l'alcool ayant par la suite été éliminé, 18 [Revendication 81 un extrait pouvant également être : l'une des phases aqueuses obtenues par les filtrations effectuées lors du procédé d'extraction de l'agar à partir d'une algue rouge agarophyte respectivement après traitement alcalin de l'algue, après rinçage à l'eau du résidu ainsi obtenu, après neutralisation à l'acide du résidu obtenu lors de ce rinçage, après rinçage à l'eau du résidu obtenu lors de cette neutralisation ; ou l'extrait obtenu par l'extraction à chaud du résidu obtenu en même temps que le gel d' agar lors d'une extraction à chaud/filtration du résidu obtenu après ce dernier rinçage à l'eau ; et le jus de synérèse obtenu après congélation-décongélation et/ou par pressage mécanique de ce gel d' agar, et une fraction d'extrait résulte d'un fractionnement d'un extrait par ultrafiltration ou par chromatographie d'exclusion stérique, ledit extrait ou ladite fraction d'extrait pouvant ensuite avoir été concentré, déshydraté ou lyophilisé. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que l'extrait ou la fraction d'extrait a été préparé(e) par un procédé suivant lequel on a conduit une extraction aqueuse, alcoolique ou hydroalcoolique, à chaud, de ladite ou desdites algues rouges agarophytes, avec élimination ultérieure de l'alcool dans le cas d'une extraction alcoolique ou hydroalcoolique, ladite extraction pouvant être une extraction aqueuse alcaline, en particulier une extraction aqueuse alcaline, suivant laquelle on obtient, après ledit traitement alcalin et par filtration, d'une part, une phase aqueuse (A1) et d'autre part un résidu (R1) ; puis on peut effectuer un rinçage à l'eau distillée dudit résidu (R1) pour obtenir après filtration d'une part une phase aqueuse (A2) et d'autre part un résidu (R2) ; puis on peut effectuer une neutralisation à l'acide dudit résidu (R2) pour obtenir, après filtration, d'une part une phase aqueuse (A3) et d'autre part un résidu (R3) ; puis on peut effectuer un rinçage à l'eau distillée dudit résidu (R3) pour obtenir, après filtration, d'une part, une phase aqueuse (A4) et, d'autre part, un résidu (R4) ; puis on peut effectuer une extraction à chaud et une filtration dudit résidu (R4) pour obtenir d'une part un résidu (R5) et, d'autre part, un gel d'agar ; puis on peut conduire une extraction à l'eau chaude dudit résidu (R5) pour obtenir une phase aqueuse (A5) ; 19 puis on peut conduire une congélation - décongélation et/ou pressage mécanique dudit gel d'agar pour obtenir d'une part, un jus de synérèse (JS) et un gel d' agar pur ; lesdites phases aqueuses (A1) à (A5) et ledit jus de synérèse (JS) re- présentant chacun également un extrait recherché, ledit extrait pouvant être soumis à un traitement par l'éthanol pour obtenir d'une part, un extrait éthanolique (EE) et d'autre part un précipité, ledit extrait éthanolique étant soumis à un fractionnement par ultrafiltration ou par exclusion stérique permettant d'isoler une fraction d'extrait contenant au moins un oligosaccharide ayant de 2 à 50 unités ose reliées entre elles de façon covalente, et des polysaccharides ayant plus de 50 unités ose liées entre elles de façon covalente pouvant être contenus sans dépasser 0,01% en poids par rapport aux oligosaccharides/polysaccharides totaux, ledit extrait ou ladite fraction d'extrait pouvant ensuite avoir été concentré, déshydraté ou lyophilisé. [Revendication 91 Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée par le fait que l'extrait ou la fraction d'extrait se trouve en milieu aqueux, ou se présente sous forme pulvérulente. [Revendication 10] Procédé pour stimuler la défense naturelle chez une plante terrestre, ca- ractérisé par le fait qu'il consiste à appliquer sur l'ensemble de la plante ou sur une partie de celle-ci, comprenant l'appareil végétatif, racinaire, les fruits, les graines et les semences de ladite plante, ou encore sur le sol ou le substrat de culture de la plante, une quantité efficace pour stimuler les défenses naturelles, de ladite plante, de l'extrait ou de la fraction d'extrait tel(le) que défini(e) à l'une des revendications 1 à 9, à l'état liquide ou sous forme de poudre ou de granules. [Revendication 11] Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que l'on traite les plantes agronomiquement utiles, de grande culture, dont les oléagineux comme le tournesol ou le soja, les protéagineux comme le pois chiche, les céréales comme le maïs ou le blé, les arbres fruitiers comme les poiriers, les pommiers, les nectariniers, les plantes horticoles comme les rosiers, les plantes prairiales, et les plantes maraîchères comme la tomate, le melon, la laitue ou les épinards. [Revendication 121 Procédé selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisé par le fait qu'on applique l'extrait liquide ou la fraction d'extrait liquide sur la plante ou partie de plante ou graines ou semences ou sur le sol ou substrat à une concentration d'oligosaccharide(s) de 0,0001 à 100 g/L, 20 de préférence de 1 à 10 mg/L. [Revendication 131 Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé par le fait que l'on applique l'extrait ou la fraction d'extrait à l'état liquide ou sous forme de poudre ou de granules à raison de 1 à 1000 g d'oligosaccharides par hectare. [Revendication 141 Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, caractérisé par le fait que l'on effectue l'application 1 à 20 fois, de préférence 3 à 5 fois par année de culture. [Revendication 151 Composition pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des reven- dications 10 à 14, caractérisée par le fait qu'elle consiste en un extrait ou fraction d'extrait tel(le) que défini(e) à l'une des revendications 1 à 9, à l'état liquide ou sous forme de poudre ou de granules et le cas échéant incorporé dans un produit phytosanitaire ou fertilisant ou avec au moins un adjuvant choisi parmi les tensio-actifs, les dispersants, les agents conservateurs, les antimottants, les oligoéléments, les amendements, les éléments correcteurs de carence, les fongicides, les insecticides, les herbicides, les hormones de croissance.