FR 3082852 A1 20191227 FR 1870754 A 20180626 Description Titre de l'invention : COMPOSITION DE MICROORGANISMES TÉMOINS DE DÉCONTAMINATION Domaine technique [0001] La présente invention concerne la validation de procédés de décontamination, et en particulier une composition comprenant des organismes témoins et un colorant, employée pour valider les procédés de décontamination. Technique antérieure [0002] Les procédés de pasteurisation sont appliqués dans de multiples domaines, qu'il s'agisse de la stérilisation de matériel ou de la décontamination d'aliments, en particulier d'aliments secs. Ces procédés consistent en des étapes spécifiques de décontamination/stérilisation, ou bien sont le résultat concomitant d'une étape d'un procédé de traitement, comme par exemple une étape de cuisson d'un aliment, par exemple la torréfaction de produits d'origine végétale. [0003] Les produits d'origine végétale, comme les amandes ou les épices sont souvent contaminés par des microorganismes pathogènes présents dans leur environnement de culture, de stockage et d'utilisation qui nécessite une étape de décontamination avant leur usage pour la consommation humaine. Souvent, cette décontamination est effectuée comme un traitement par la température de ces aliments, comme une cuisson, une torréfaction ou un séchage. Toutefois, certains pathogènes peuvent être résistants à certaines conditions de décontamination et il faut bien s'assurer, avant la mise en oeuvre du procédé que l'objectif de décontamination sera bien atteint. [0004] Cette validation ne peut pas se faire avec un microorganisme pathogène à cause des risques de contamination. Pour ce faire, on emploie des microorganismes témoins dits « substituts », dont le comportement face aux conditions de traitement doit être proche de celui de l'organisme pathogène. De préférence, les substituts seront choisis pour être plus résistants aux conditions de traitement que les pathogènes, sans pour autant avoir un comportement trop éloigné de celui de ces pathogènes cibles. Ces substituts sont généralement spécifiques d'un pathogène particulier dans un procédé de décontamination, comme par exemple Enterocoecus faecium (ATCC 8459) recommandé pour la validation de procédés de pasteurisation des amandes susceptibles d'être contaminées par des salmonelles pathogènes. Les substituts ne sont pas forcément les microorganismes plus proches philogénétiquement des pathogènes cibles, comme par exemple le genre Citrobacterium, genre plus roche d'un point de voie évolutive de Salmonella, n'est pas décrit comme substitut de ce pathogène. [0005] De nouveaux substituts sont décrits dans la demande WO 2017/186907, ainsi que les compositions qui les comprennent pour un usage dans un procédé de validation de procédé de décontamination. [0006] Si ces substituts sont connus, il reste un besoin de faciliter leur usage, notamment pour mieux détecter leur présence et faciliter le comptage des microorganismes après le traitement de décontamination, notamment par l'ajout d'un marqueur de présence dans la composition de microorganismes témoins, sachant que ces marqueurs doivent non seulement résister au traitement de décontamination pur être détectés en fin de procédé, mais également ne pas affecter la viabilité des microorganismes témoins tant lors de leur formulation et leur stockage qu'au cours du procédé de décontamination. [0007] L'invention vient résoudre ce problème par la sélection de colorants particuliers qui peuvent être ajoutés à la composition de microorganismes témoins. Exposé de l'invention [0008] La présente invention concerne une composition de microorganisme témoin destinée à être utilisée dans un procédé de contrôle d'un procédé de décontamination dans lequel on met en oeuvre le procédé de décontamination avec ledit organisme témoin. [0009] La composition selon l'invention comprend au moins un organisme témoin et un colorant choisi parmi les colorants de la famille des cyclohexadiène-2,5-ylidènes, en particulier choisis parmi le bleu brillant FCF, le bleu patenté V et le vert brillant BS. [0010] De manière préférée, le colorant est le bleu brillant FCF (E133). 11 a été constaté que ce colorant, non seulement n'affecte pas la viabilité des microorganismes témoins, mais augment leur résistance aux procédés de décontamination de sorte qu'ils ajoutent une marge de sécurité supplémentaire lors de la mise en oeuvre des procédés de validation. Description des modes de réalisation 100111 La présente invention concerne une composition de microorganisme témoin destinée à être utilisée dans un procédé de contrôle d'un procédé de décontamination dans lequel on met en oeuvre le procédé de décontamination en présence d'au moins un microorganisme témoin, ou un mélange de microorganismes témoins, et on observe le comportement dudit du ou des un microorganismes témoins au cours dudit procédé de décontamination. 100121 La composition selon l'invention comprend au moins un microorganisme témoin et un colorant de la famille des cyclohexadiène-2,5-ylidènes. 100131 Les colorants de la famille des cyclohexadiène-2,5-ylidènes sont bien connus de l'homme du métier, comprenant une structure commune de formule 100141 3 [Chcm.1] Ri RI [0015] dans laquelle au moins un RI est un groupe aliphatique, en CI-C6 en particulier éthyle ou méthyle, et l'autre est également un groupe aliphatique en en C1-C6 ou un résidu aromatique, en particulier substitué par au moins un groupe acide sulfonique (-S0' ) et les groupes R2 sont des résidus aromatiques, don au moins un R2 est un résidu aromatique substitué par au moins un groupe acide sulfoniquc (-S03) et au moins un RI est un groupe aliphatique, en CI-C6 cn particulier éthyle ou méthyle, et l'autre est également un groupe aliphatique en en CI-C6 ou un résidu aromatique, en particulier substitué par au moins un groupe acide sulfonique. [0016] On citera en particulier [0017] le bleu brillant FCF de formule [Chem.2] 100181 le bleu patenté V de formule IChem.3I [0019] et le vert brillant BS de formule 4 [Chem.4] Oi Na 0 yb [0020] Ces colorants sont connus pour leur usage en alimentation ou en cosmétique, le bleu brillant FCF sous la référence E133, le bleu patenté V sous la référence E131 et le vert brillant BS sous la référence E142. [0021] De manière préférée, le colorant est le bleu brillant FCF (E133). Il a été constaté que cc colorant, non seulement n'affecte pas la viabilité des microorganismes témoins, mais augment leur résistance aux procédés de décontamination de sorte qu'ils ajoutent une marge de sécurité supplémentaire lors de la mise en oeuvre des procédés de validation. Cette amélioration de la résistance des microorganismes témoins est particulièrement vue du point de vue de leur thermorésistance, ce qui est un avantage supplémentaire dès lors que les microorganismes sont soumis ou peuvent être soumis à des conditions de température élevées, notamment lors de la fabrication des compositions ou de leur transport ou leur stockage. [0022] Par « microorganisme » on entend un ensemble de plusieurs individus de microor- ganismes d'une même espèce. De préférence, les microorganismes sont appropriés pour un usage industriel, c'est à dire qu'ils peuvent être produits en grandes quantités par fermentation, jusqu'à au moins 1010 CFU/2, plus préférentiellement jusqu'à au moins 10" CFU/g. [0023] On citera notamment les bactéries choisies parmi les espèces Enwrococcus faccium, Geobacillus stearothennophilus, Clostridium sporogenes, Staphylococcus carnosus, Enterobacter honnatchei' Erwinia persicina, Pantoca agglomerans, Panwea candit, Pantoca dispersa et Panwea gaviniat, non pathogènes, de préférence capables d'être produits de manière industrielle, plus particulièrement choisies parmi les espèces suivantes, Enterococcus faccium, Enterobacter honnacchei' Erwinia persicina, Pantoca agglomerans, Pan toea calida, et. Pante-Jeu gaviniat et notamment les souches Enwrococcus jaccium (ATCC 8459) et les souches déposées à la CNCM selon le Traité de Budapest : Enterobacter hormacchei CNCM I-5058, Pantota agglonwrans CNCM I-5059' Pantoca calida CNCM I-5061, Erwinia persicina CNCM 1-5062, H Erwinia persicina CNCM 1-5063, Panmea agglonzerans CNCM 1-5054, Pantoea agglonzerans CNCM 1-5055, Patztoea couda CNCM 1-5056. [0024] D'autres microorganismes employés comme témoins dans l'état de la technique peuvent également être employés dans la composition selon l'invention. On citera notamment Geobacillus stearothertnophilus ATCC 12980 (Okelo et al., 2006 et 2008), Emerococcus faecium NRRL B-2354 (Annous & Kozempel, 1998; ABC, 2007 ; Bianchit, 2014), Panutea agglortzerans SPS 2F-1 (ABC, 2007), Pantoea dispersa (Fudgc & al., 2016). Pediococens spp. et Pediococcus acidilactici (Borowski et al, 2009 ; Williams, 2010 ; Ceylan and Bautista, 2015), Staphylococcus earnosus CS-299 (Vasan et al., 2014). Clostridium. sporogenes PA3679, PA3676 et PA3678 (Wallace et al. 2006) ; Listeria itztzocua (Sommets et al., 2008). Escherichia cou i K12 (Rodriguez et al., 2006) et autres E. cou i (Gurtler, 2010 ; Garcia Hernandcz et al., 2015). [0025] Ces microorganismes témoins non pathogènes ont pour avantage de montrer une ré- sistance aux conditions de mise en oeuvre de différents procédés de décontamination supérieure à celle d'au moins un organisme pathogène cible. Ces organismes pathogènes cibles sont des microorganismes responsables de contaminations, en particulier les bactéries pathogènes des genres Salmonella, Escherichia, Bacillus, Listeria, Campylobacter, Cronobacter, etc. Le procédé de décontamination qui fait l'objet du contrôle a pour but d'éliminer l'ensemble de ces pathogènes dans l'éventualité où ils seraient présents dans le produit traité. [0026] De manière avantageuse, les microorganismes témoins ont une résistance thermique supérieure au pathogène cible. [0027] Dans le procédé de décontamination, le microorganisme témoin sera employé sous une forme appropriée, correspondant à la forme du pathogène ciblé susceptible d'être présent dans le produit à décontaminer, en particulier sous forme végétative et/ou forme végétative sèche. [0028] Par « forme sèche » ou « forme végétative sèche » on entend bactéries sous vé- gétative qui ont suivi un procédé de séchage permettant leur conservation pour une durée déterminée sans modification de ses caractéristiques de résistance. [0029] Les microorganismes témoins produits par fermentation sont ensuite séchés pour leur conservation selon des techniques connues de l'homme du métier, comme la lyophilisation, l'atomisation ou le séchage. [0030] De manière avantageuse, le rapport pondéral microorganismes temoins /colorant va de 0,01 à 5, de préférence 1 à 3. [0031] De préférence, la composition selon l'invention comprend outre le microorganisme témoin et le colorant un support approprié, bien connu de l'homme du métier, de préférence inerte, par exemple avec des cryoprotecteurs comme la maltodexhine et/ou poudre du lait et des supports solides comme le talc, la silice et/ou le chai-bon actif, et 6 lieurs mélanges en toutes proportions. Le support est dit « inerte » en ce sens qu'il n'interagit pas avec le métabolisme des bactéries sous forme sèche permettant une conservation optimale dans le temps. [32] L'usage d'un support approprié permet une standardisation en l'utilisation des microorganismes sur différents matrices en apportent à la fois une meilleure stabilité des microorganismes et évite d'avoir à valider la stabilité de chaque microorganisme témoin sur chaque support après inoculation. Il facilite la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. [33] La composition selon l'invention est avantageusement sous une forme pulvérulente comprenant le mélange de microorganismes sous une forme sèche, de colorant et de support inerte. [34] La composition comprend avantageusement une teneur en microorganismes témoins d'au moins 1010 CFU/g de composition sèche. [35] La composition selon l'invention comprend avantageusement [36] de 1 à 5% en poids, de colorant [37] de 85 à 98% en poids de support inerte et [38] de 1 à 10% en poids de microorganismes témoins sous une forme sèche. [39] La composition sèche est avantageusement une poudre qui a une activité de l'eau égale ou inferieure à 0,3. [40] La composition selon l'invention peut comprendre d'autres additifs connus de l'homme du métier, comme le charbon actif. [41] De manière préférentielle, la composition selon l'invention est constituée des microorganismes témoins sous forme sèche, du colorant et du support inerte. [42] L'effet observé d'augmentation de la thermorésistance des microorganismes témoins observé par l'ajout de colorant selon l'invention est encore plus marqué pour les compositions comprenant un support inerte, en particulier lorsque ce support est une maltodextrine. [43] Ces compositions sont préparées selon des méthodes connues de l'homme du métier en mélangeant selon les techniques usuelles, les microorganismes témoins sous une forme sèche avec le support, dans les proportions souhaitées, le colorant étant ajouté avant, pendant ou après le mélange des microorganismes avec le support inerte. Selon un autre mode de réalisation, les microorganismes témoins sont mélangés au support approprié, le mélange étant ensuite séché pour sa conservation. [44] De manière générale, les compositions de microorganismes témoins microorganismes témoins avec le colorant et leur support sont ajoutés aux produits à décontaminer en quantité appropriée pour permettre la vérification de l'efficacité du procédé de décontamination. [45] Les procédés de décontamination comprennent généralement une ou plusieursétapes 7 de pasteurisation, séchage, extrusion, torréfaction, cuisson, stérilisation, autoclavage et traitements à la vapeur. [0046] Ces procédés sont bien connus de l'homme du métier, notamment pasteurisation, séchage, extrusion, torréfaction, cuisson, stérilisation, autoclavage, traitements à la vapeur, lumière pulsée, traitements à haute pression, ou irradiation, la stérilisation par les gaz (EtO, ppo, ozone) et par des désinfectants (eau de javel, acide peracétique...), en particulier pour le traitement de produits naturels ou manufacturés, comme les fruits à coques, herbes aromatiques, graines, épices, poudres alimentaires, aliments pour animaux de compagnie et bétail, céréales, etc. [0047] Les compositions comprenant les substituts, et mélanges de substituts, selon l'invention pourront être employés, selon les aliments et procédés sélectionnés, pour valider les décontaminations de pathogènes tels que Salmonella, Escherichia coli, Durians, Listeria, Campylobacter, Cronobamer sok.azakii, etc. [0048] Les microorganismes et leur support avec colorant pourront, le cas échéant, subir un traitement préalable à la décontamination, similaire à celui subi par le produit à décontaminer, c'est à dire qui va mimer les processus connus de contamination des produits. Par exemple, dans le cas de produits naturels qui sont broyés (épices notamment) il est possible de les broyer après ajout des microorganismes témoins sur leur support pour arriver à des poudres en recréant les conditions classiques de contamination des produits naturels. [0049] Le procédé de contrôle selon l'invention peut être mis en oeuvre avant toute mise en oeuvre d'un procédé de décontamination sur le produit à décontaminer, pour valider l'efficacité du procédé de décontamination (procédé de validation). Il peut aussi être mis en oeuvre pendant les opérations de décontaminations sur le produit à décontaminer, comme témoin de décontamination ou comme témoin de conformité de mise en oeuvre du procédé de décontamination (procédé de contrôle). [0050] Le procédé selon l'invention, qu'il s'agisse d'un procédé de validation ou de contrôle peut être mis en oeuvre sous la responsabilité de celui qui réalise la décontamination ou encore sous celle d'un organisme de contrôle ou d'homologation. [0051] L'invention concerne aussi un produit de contrôle de décontamination qui comprend un produit à décontaminer associé à une composition de microorganisme témoin selon l'invention. [0052] Selon la nature et la composition du produit à décontaminer, la composition selon l'invention pourra être déposée à sa surface ou bien mélangée avec le produit à décontaminer, par exemple quand le produit et la composition sont sous forme de poudre. [0053] L'homme du métier saura préparer un tel produit de contrôle de décontamination, par exemple, par mélange direct avec les produits pulvérulents (proportion 1%-10%), resuspension du microorganisme sec dans un butter approprié et mélange avec diffèrent 8 types des produits ou inoculation directe et mélange sur produits liquides. [0054] Les microorganismes de contrôle seront avantageusement fournis sous forme de kit, avec leur support d'utilisation, et le cas échéant une notice d'emploi. [0055] L'observation du comportement du microorganisme témoin consiste généralement à contrôler la présence d'individus viables, en cours de procédé de décontamination ct/ ou à son terme. Les méthodes employées sont connues de l'homme du métier : dénombrement des colonies sur gélose et/ou méthodes moléculaires comme la PCR et/ou qRT-PCR, ou des tests de détection de microorganismes comme les tests immunologique, par exemple les tests utilisant des technologies de SPR, comme ceux développés par la société PRESTODIAG, ou encore des tests de détection par phages. [0056] L'invention concerne aussi un kit de contrôle d'un procédé de décontamination, ca- ractérisé qui comprend au moins un microorganisme ci-dessus et un support approprié tel que défini ci-dessus pour son utilisation dans le procédé de décontamination, et le cas échéant une notice d'utilisation. Brève description des dessins [0057] La figure 1 représente les courbes de perte de log d'Enterococcus faecium en fonction des colorants après traitement thermique à 100°C. [0058] La figure 2 représente les courbes de perte de log d'Enterococcus faecium avec et sans colorant Blcu Brillant FCF après traitement thermique à 100°C sur support inerte. [0059] Par « perte de log » on entend la différence cntrc la viabilité initiale et la viabilité à un temps donné. EXEMPLES 100601 Exemple 1: Essai de colorants : Chlorophyline et Bleu Brillant FCF 100611 Méthode : La souche d'Enterococcus faecium sous forme sèche a été mélange avec un support inerte (maltodextrine) et avec chaque colorant individuellement. Le mélange en suite est placé dans un tube eppendorf dans un bain sec à une température de I00°C. Des échantillons ont été prises à 2,5 et 10 min et dénombrements cellulaires ont été réalisés sur milieu TSA (Tryptine Soy Agar) pendant 24h à 37°C. 100621 Les résultats sont représentés sur la Figure I. 100631 Exemple 2 : Comparaisons de compositions de E faceium à 100°C 100641 On compare la thermorésistance de E. facecium avec ou sans colorant Bleu Brillant FCF sous trois formes de compositions : le moût de fermentation (Moût), sans support (Pur) et sur support inerte (Support). 100651 Moût : ajout de 3% de colorant bleu en poudre à 5rnL de moût de fermentation dans un pot stérile. Vortex pour homogénéisation, répartition dans les tubes et traitement thermique. [0066] Pur : ajout de 3% de colorant à 5g de lyophilisat pur dans un pot stérile. Vortex pour 9 homogénéisation, répartition dans les tubes et traitement thermique. [0067] Support : ajout de 1% de lyophilisat pur à 5g de maltodextrine dans un pot stérile (dilution au 100ème). Vortex pour homogénéisation, puis ajout de 3% de colorant. Vortex puis répartition dans les tubes et traitement thermique. [0068] Les résultats de perte de log dans chacun des cas sont donnés dans le Tableau 1. [TableauxTableauxl] Perte de fog à met Avec Coinrant 113 144 2.16 Sans Colorant 4.03 Coteront 0,13 0,94 Support s Colorant 0.76 1.89 100691 Exemple 3 : Essai sur lait lyophilisé non gras NEMI pour 3 souches à 90 et I00°C 100701 L'essai est réalisé pour les 3 souches suivantes : E. fizecium ATCC 8459, P. ag- glomeroels CNCM 1-5055 et A. pascens CNCM 1-5181. 100711 Ajout de 10% de lyophilisat pur des souches à 5g de maltodextrine. Vortex pour ho- mogénéisation. Ajout de 3% de colorant Bleu Brillant FCF. Vortex. Ajout de 1% du mélange coloré de souche dilué au 10eme à 5g de NFDM. Vortex. Dépôt de 0.1g dans tubes Eppendorf puis traitement thermique des tubes au bain sec à 90 et 100°C pour 2, 5 et 10 minutes [0072] Les résultats sont donnés dans le Tableau 2. [0073] Exemple 4 : Essai sur poivre noir pour 3 souches à 90 et 100°C [0074] L'essai est réalisé pour les 3 souches suivantes : E. faecium ATCC 8459, P. ag- glomerans CNCM I-5055 et A. pascetzs CNCM I-5181 [0075] Ajout de 10% de lyophilisat pur des souches à 5g de maltodextrine. Vortex pour ho- mogénéisation. Ajout de 3% de colorant Bleu Brillant FCF. Vortex. Ajout de 1% du mélange coloré de souche dilué au 10eme à 5g de poivre noir suivi d'un spray d'agent fixant humide pour bonne adhésion. Mélange avec une spatule stérile. Séchage 2h. Dépôt de 0.2g dans tubes Eppendorf puis traitement thermique des tubes au bain sec à 90 et 100°C pour 2, 5 el 10 minutes [0076] Les résultats sont donnés dans le Tableau 3. [TablcauxTableaux3] Souche Perte de log à 90°C Perte de log à 100°C 2 5 10 2 5 10 min min min min min min E. faecium Avec Colorant 0,31 0,82 1,46 1,35 1,37 2,19 ATCC 8459 Sans Colorant 0,91 1,43 3,39 1,05 0,91 5,6 P. agglomerans Avec Colorant 1,12 1,6 1,77 1,26 1,45 2,14 CNCM 1-5055 Sans Colorant 1,15 1,75 2,88 1,84 3,41 3,95 A. pascens Avec Colorant 0,59 0,76 0,85 0,27 0,64 0,85 CNCM 1-5181 Sans Colorant 0,91 1,09 1,67 1,09 1,79 2,69 [0077] Exemple 5 : Essai sur macadamia pour 3 souches à 90 et 100°C [0078] L'essai est réalisé pour les 3 souches suivantes : E. faecium ATCC 8459, P. ag- glomerans CNCM 1-5055 et A. pascens CNCM 1-5181. [0079] Ajout de 10% de lyophilisat pur des souches à 5g de maltodextrine. Vortex pour ho- mogénéisation. Ajout de 3% de colorant. Vortex. Ajout de 1% du mélange coloré de souche dilué au 10ème à 5g de rnacadamia. Mélange avec une spatule stérile. Séchage 2h. Dépôt de 0.3g dans tubes eppendorf puis traitement thermique des tubes au bain sec à 90 et 100°C pour 0.2.5.10 minutes [0080] Les résultats sont donnés dans le Tableau 4. ]TableauxTableaux41 Souche Perte de log à 90°C I Perte de log à 100°C 2 5 10 2 5 10 min min min min min min E. faecium Avec Colorant 0,2 0,53 1,2 0,24 0,47 1,24 ATCC 8459 Sans Colorant 0,58 0,69 0,54 0,23 0,94 1,24 P. agglamerans Avec Colorant 0,3 0,6 0,14 0,14 0,15 1,36 CNCM 1-5055 Sans Colorant 0,31 2,01 2,46 0,74 1,1 2,31 A. pascens Avec Colorant 0,25 0,18 0,38 0,05 0,12 0,6 CNCM 1-5181 Sans Colorant 0,27 0,19 1,24 0,65 0,8 1,54 Liste des documents cités [0081] Annous, 1998Annous BA, Kozempel MF. 1998. Influence of grovvth medium on thermal resistance of Pediococcus sp. NRRL B-2354 (formel-1y Micrococcus freuclemreichii) in liquid foods..I Food Prot. 61(5):578-81. [0082] Bianchini & al., Use of Enterococcu.s faecium as a Surrogate for Salmonella emerica during Extrusion of a Balanccd Carbohydratc-Protein Meal..1. 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