FR 3084836 A1 20200214 FR 1857350 A 20180807 EXTRAITS PROTEIQUES DE MACROALGUES MARINES, COMPOSITIONS EN CONTENANT ET UTILISATION COSMETIQUE ANTI-AGE L'invention a pour objet des extraits protéiques de macroalgues marines et leur utilisation pour un effet cosmétique anti-âge. Elle se rapporte également à des compositions l'incluant ainsi qu'à un procédé de traitement cosmétique de la peau destinée à lutter contre le vieillissement cutané. Le vieillissement de la peau est un phénomène complexe résultant de deux processus biologiques appelés vieillissements intrinsèque et extrinsèque. Il est à l'origine de différentes conséquences sur la peau avec, en particulier, des changements importants de la matrice extracellulaire (MEC) du derme. Or, la structure et la fonction de la peau dépendent largement de la composition de la MEC du derme en termes de nature, quantité et qualité. Parmi les différents composés impactés par le vieillissement cutané, on connaît notamment le collagène. En effet, la diminution âge-dépendante de la quantité de collagène a été identifiée comme l'un des facteurs majeurs à l'origine de nombreuses propriétés physiques du vieillissement cutané, incluant la formation de rides et la perte d'élasticité de la peau. Plusieurs principes actifs cosmétiques revendiqués comme augmentant la production de collagène existent sur le marché, comme en particulier l'acide ascorbique ou le facteur de croissance transformant bêta (TGF-p). L'activité anti-âge de ces stimulants conventionnels provient principalement de leur capacité à stimuler la croissance des fibroblastes dermiques plutôt qu'à stimuler la biosynthèse du collagène par ces cellules. Or, la stimulation de la croissance peut être inadaptée dans certains cas (par exemple en cas de présence de cellules tumorales) et en outre c'est le nombre de cellules qui est augmentée et non la quantité de collagène produite par chaque cellule. L'objectif de la présente invention est de proposer un principe actif cosmétique capable d'augmenter la production de collagène par les fibroblastes du derme. Pour y répondre l'invention propose d'utiliser au moins un extrait de macroalgue marine. En particulier, l'invention a pour objet un extrait aqueux de macroalgues marines appartenant au genre Ulva comprenant au moins 5 %, en poids de matière sèche de l'extrait, de protéines 2 de poids moléculaires compris entre 1 et 100 kDa, et son utilisation comme principe actif cosmétique anti-âge. Des extraits d'algues ont déjà été décrits dans l'art antérieur mais aucun ne présente les caractéristiques et effets des extraits selon l'invention. Les algues sont déjà très largement utilisées en cosmétique, en particulier pour les propriétés gélifiantes et épaississantes de leurs polysaccharides. Des algues entières et des extraits sont également utilisées en cosmétique 5 mais aucun n'a une efficacité sur la biosynthèse collagène telle que celle des extraits selon l'invention. On peut citer par exemple la demande EP1433463 qui décrit l'utilisation de protéines algales et dérivés pour l'hydratation de la peau et des cheveux, les algues étant choisies parmi les genres Porphyra, Spirulina ou Undaria. En effet, de façon avantageuse, les extraits particuliers selon l'invention sont capables 10 d'augmenter la production de collagène synthétisé par les fibroblastes du derme, sans stimuler la prolifération des fibroblastes, ou de façon mineure, et leur utilisation cosmétique est particulièrement efficace pour lutter contre le vieillissement de la peau. L'invention a également pour objet des compositions comprenant de tels extraits et un procédé de traitement cosmétique pour lutter contre le vieillissement cutané qui consiste à 15 appliquer sur la peau ces compositions. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description en détail de l'invention qui va suivre en regard des Figures annexées sur lesquelles : - La Figure 1 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 1A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération de FDHN in vitro après 48 h 20 d'incubation, par rapport au témoin négatif, - La Figure 2A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 1A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif, - La Figure 2B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 1A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif, 3 - La Figure 3 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 1B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération de FDHN in vitro après 48 h d'incubation, par rapport au témoin négatif, - La Figure 4A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 1B, sur l'effet 5 d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence des extraits protéiques par puit par rapport au témoin négatif , - La Figure 4B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 1B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés 10 pendant 48 h en présence des extraits polysaccharidiques par cellule par rapport au témoin négatif (Neg), - La Figure 5 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 2A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération in vitro des FDHN incubés pendant 48 h par rapport au témoin négatif (Neg.), 15 - La Figure 6A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 2A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif (Neg.), - La Figure 6B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 2A, sur l'effet 20 d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif (Neg.). - La Figure 7 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 2B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération in vitro des FDHN incubés pendant 25 48 h par rapport au témoin négatif (Neg.), - La Figure 8A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 2B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif (Neg.), - La Figure 8B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 2B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés 4 pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif (Neg.). - La Figure 9 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 3A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération in vitro des FDHN incubés pendant 5 48 h par rapport au témoin négatif (Neg.), - La Figure 10A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 3A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif (Neg.), 10 - La Figure 10B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 3A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif (Neg.). La Figure 11 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 3B, sur l'effet 15 d'un extrait selon l'invention sur la prolifération in vitro des FDHN incubés pendant 48 h par rapport au témoin négatif (Neg.), - La Figure 12A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 3B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par 20 rapport au témoin négatif (Neg.), - La Figure 12B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 3B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif (Neg.). 25 - La Figure 13 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 4A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération in vitro des FDHN incubés pendant 48 h par rapport au témoin négatif (Neg.), - La Figure 14A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 4A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN 30 incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif (Neg.), 5 - La Figure 14B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 4A, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif (Neg.). 5 - La Figure 15 représente le profil d'élution de la fraction protéique d'Ulva sp dans l'exemple 4B, - La Figure 16 représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 4B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la prolifération in vitro des FDHN incubés pendant 48 h par rapport au témoin négatif (Neg.), 10 - La Figure 17A représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 4B, sur l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par puit par rapport au témoin négatif (Neg.), La Figure 17B représente les résultats d'un essai réalisé avec l'exemple 4B, sur 15 l'effet d'un extrait selon l'invention sur la production de collagène par les FDHN incubés pendant 48 h en présence d'un extrait selon l'invention par cellule par rapport au témoin négatif (Neg.). - La Figure 18 représente les profils chromatographiques obtenus sur une colonne TSK Gel 40005W de la fraction protéique d'Ulva Intestinalis et de la fraction 20 protéique d'Ulva Rigida - La Figure 19 représent les spectres UPLC-MS obtenus après digestion de la fraction protéique d'U/va Intestinalis (A) et de la fraction protéiques d'U/va Rigida (B). - La Figure 20 représente les profils d'élution de la fraction protéique provenant d'Ulva Intestinalis de l'exemple 4B. 25 Définitions Par « extrait » d'algue au sens de l'invention on entend au moins une molécule ou un ensemble de plusieurs molécules obtenues à partir d'une matière première algale. Il peut s'agir de molécules natives ou de molécules qui ont été transformées par tout procédé. Il peut s'agir notamment de protéines. 30 Par « extrait aqueux» au sens de l'invention on entend un extrait obtenu à partir d'une solution aqueuse, préférentiellement par macération utilisant l'eau comme solvant. Il peut 6 s'agir aussi bien d'un extrait aqueux non purifié, d'un rétentat ou d'une fraction de l'extrait aqueux ou du rétentat purifiée concentrée en protéines. Par « protéines » au sens de l'invention on entend toute molécule de nature protéique quel que soit son poids moléculaire, c'est-à-dire que le terme inclut les peptides. 5 Description détaillée L'invention a pour objet un extrait aqueux de macroalgues marines appartenant au genre Ulva, préférentiellement soluble dans l'eau, comprenant au moins 5 %, en poids de matière sèche de l'extrait, de protéines de poids moléculaires compris entre 1 et 100 kDa. Préférentiellement les protéines présentes dans l'extrait de poids moléculaires compris entre 10 1 et 100 kDa ont des poids moléculaires compris entre 2 et 60 kDa, encore plus préférentiellement compris entre 2 et 30 kDa. Ces tailles de protéines entre 1 et 100 kDa, notamment entre 2 et 60 kDa et en particulier entre 2 et 30kDa. Les protéines présentes dans les macroalgues du genre Ulva sont spécifiques et la sélection 15 des protéines de cette origine avec des poids molécules spécifiques sont essentielles dans l'efficacité cosmétique et l'activité biologique des extraits selon l'invention. L'extrait selon l'invention peut également comprendre des polysaccharides et/ou des polyphénols. Il peut éventuellement également comprendre d'autres protéines. Préférentiellement l'extrait est obtenu à partir d'Ulva rigida et/ou Ulva intestinalis aussi 20 connue sous le nom de laitue de mer et Aonori. L'extrait selon l'invention peut se présenter sous forme liquide ou sous forme solide. Les extraits selon l'invention peuvent avoir différents niveaux de purification en protéines : - des extraits aqueux non purifiés, - des rétentats concentrés débarrassés des éléments de petite taille, préférentiellement de 25 taille inférieure à 15 kDa, en particulier des sels minéraux ou des pigments, - des extraits aqueux purifiés, de préférence concentrés à plus de 40% en protéines. Les différents extraits selon l'invention peuvent être obtenus par tout procédé adapté, notamment par une méthode décrite dans le brevet FR2998894. La méthode d'extraction comprend les étapes suivantes : 30 - Extraction aqueuse par macération, de préférence à chaud, préférentiellement à une température supérieure à 60°C, d'un broyat de macroalgues vertes, de préférence dessalées. 7 - Ultrafiltration de l'extrait aqueux sur une membrane permettant la récupération d'une part d'un rétentat concentré contenant les molécules de plus grande taille, et d'autre part d'un perméat contenant les éléments de plus petite taille, préférentiellement inférieure à 15 kDa. - Déminéralisation du rétentat par échange d'ions, préférentiellement par échange d'anions 5 puis échange de cations, en particulier au moyen d'une résine anionique forte et une résine cationique forte. - Floculation du rétentat déminéralisé, préférentiellement à chaud, en particulier à une température supérieure à 60°C, permettant d'obtenir une fraction riche en protéines après centrifugation et neutralisation. 10 Avantageusement, ce procédé est facile à mettre en oeuvre, économique et compatible avec une industrialisation. Sa mise en oeuvre ne fait intervenir ni solvant, ni acide libre. De plus, les extraits selon l'invention sont des produits d'origine naturelle et les matières premières à l'origine des extraits sont des algues autorisées à la consommation humaine qui ont déjà démontré leur innocuité pour la consommation alimentaire. 15 Les extraits protéiques d'algues selon l'invention sont préférentiellement incorporés dans des compositions cosmétiques pour leur utilisation. L'invention a donc également pour objet une composition cosmétique comprenant au moins 0,01% d'un extrait selon l'invention en poids de matière sèche de la composition. L'incorporation des extraits selon l'invention dans des compositions cosmétiques peut être 20 réalisée très facilement du fait de leur caractère soluble dans l'eau. Comme ils forment des solutions non visqueuses dans l'eau ou les solutions salines diluées, il n'ajoutent pas consistance à la formulation cosmétique ce qui constitue un avantage important. La composition cosmétique selon l'invention comprend également des excipients adaptés à une application topique sur la peau, cosmétiquement acceptables, et éventuellement d'autres 25 principes actifs cosmétiques. La composition selon l'invention peut se présenter sous toute forme adaptée à une application topique sur la peau, en particulier elle se présente sous forme de crème, sérum, onguent, gel, lotion, émulsion, solution, solution à pulvériser, huile, bâton, crayon ou gloss à lèvres ou à contour des lèvres, poudre, mousse ou savon. 30 Les extraits selon l'invention et les compositions l'incluant peuvent être utilisés pour un effet anti-âge et lutter contre le vieillissement de la peau. En effet, les extraits protéiques d'algues 8 selon l'invention, lorsqu'ils sont appliqués sur la peau, sont capables de stimuler et d'augmenter la synthèse de collagène par les fibroblastes. Les fibres de collagène au sein du derme ont pour fonction de lui donner son épaisseur et sa résistance aux forces de traction (van der Rest et Garrone 1991; Myllyharju et Kivirikko 2001; 5 Ricard-Blum et Ruggiero 2005; Prost-squarcioni et al. 2008). Au cours du vieillissement cutané, la synthèse de collagène dans le derme diminue ce qui a des conséquences multiples sur la peau : perte d'élasticité et de fermeté menant à l'apparition de rides, de tâches, etc. Les extraits protéiques obtenus à partir d'Ulva selon l'invention sont capables de stimuler la synthèse de collagène au sein du derme et ainsi lutter contre ces 10 manifestations disgracieuses du vieillissement de la peau, en particulier contre l'apparition des rides. L'invention a par conséquent également pour objet l'utilisation cosmétique non thérapeutique d'un extrait selon l'invention, comme principe actif cosmétique anti-âge pour prévenir et/ou retarder et/ou limiter les signes du vieillissement de la peau, en particulier 15 comme principe actif cosmétique anti-âge augmentant la production de collagène par les fibroblastes dermiques. L'invention vise aussi spécifiquement l'utilisation des extraits protéiques d'algues comme principes actifs a nti-rides. Préférentiellement, l'extrait est utilisé dans une composition cosmétique. L'invention a aussi 20 pour objet un procédé de traitement cosmétique de la peau pour lutter contre le vieillissement cutané caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer au moins une fois par jour sur la peau du visage une composition comprenant au moins un extrait protéique d'algue selon l'invention. Avantageusement, les extraits selon l'invention augmentent la production de collagène par 25 cellule individuelle tout en présentant un effet très limité sur la croissance des fibroblastes, différant ainsi des stimulants conventionnels agissant principalement sur la prolifération des cellules. L'invention est à présent illustrée par des exemples d'extraits selon l'invention et par des résultats d'essais démontrant leur efficacité sur la production de collagène par des 30 fibroblastes humains (FDHN). 9 Exemples Exemple 14 : Extraction aqueuse à partir d'Ultra intestinalis Procédé d'obtention de l'extrait aqueux : Le procédé comprend la succession des étapes suivantes : 5 1. Lavage des algues à traiter 2. Broyage des algues lavées 3. Macération dans l'eau des algues lavées dans un volume d'eau réduit 4. Filtration des pulpes de façon à obtenir un jus de pressage d'une part et des pulpes de pressage d'autre part. 10 1 kg d'algues sèches est trempé dans 20 L d'eau brute pendant 10 min à température ambiante. Les algues sont ensuite essorées et pressées à l'aide d'un cône en tissu afin de retirer le plus d'eau possible. Les algues lavées sont ensuite broyées dans 5 L d'eau déminéralisée à 80°C, à l'aide d'un broyeur à couteau, jusqu'à l'obtention de particules de moins de 2 mm de diamètre. Les 5 L de broyat sont ensuite transférés dans une cuve 15 thermostatée à 80°C contenant 10 L d'eau déminéralisée préalablement placée à température. L'extraction est réalisée sous agitation constante à l'aide d'un agitateur à pales à une vitesse de rotation de 10 tours/min pendant 2 h. Le mélange obtenu à l'issue de la macération est soutiré de la cuve, filtré et pressé à l'aide d'un cône en tissu afin d'extraire le plus de jus possible. 20 Détermination de la composition biochimique des extraits : La teneur en sucres a été déterminée par la méthode de Dubois (Dubois et al. 1956), la teneur protéique par la méthode de Kjeldahl (Kjeldahl et al. 1883), la teneur en sulfates liés aux polysaccharides par le dosage à l'Azure A (Jaques et al. 1968; Gao et al. 2003), la teneur en polyphénols par une méthode adaptée de la méthode initiale de Singleton et Rossi (1965) et 25 la teneur en lipides par la méthode de Chabrol et Charonnat (1937). Toutes les analyses ont été réalisées au minimum en triplicata. 10 Tableau 1 : Composition biochimique de l'extrait aqueux d'Ulva intestinalis Ultra intestinalis Composition biochimique (% poids sec de l'extrait aqueux) Protéines Sucres Polyphénols Lipides 13% 44% 2% 0% Effet de l'extrait aqueux d'Ulva intestinalis sur la prolifération des FDHN : L'objectif est d'analyser les effets de l'extrait sur la prolifération de fibroblastes dermiques 5 humains normaux (FDHN). Deux lignées de FDHN fournies par Manassas (USA), ont été testées : des fibroblastes provenant d'une peau de femme de 20 ans, de code CCD-1059Sk (ATCC° CRL-2072TM) et provenant d'une peau de femme de 46 ans, de code CCD-1090Sk (ATCC® CRL-2106-`°). Les cellules sont cultivées dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, PAN Biotech, Dutscher) su pplémenté par 10% (v/v) de sérum de veau foetal 10 (PAN Biotech, Dutscher) et 1% (v/v) de solution antibiotique (pénicilline 10,000 U/mL et streptomycine 10 mg/mL) (PAN Biotech, Dutscher). Les cellules sont cultivées dans un incubateur humide à température contrôlée à 37°C, avec 5% de CO2, dans des flasques ventilées de 75 cm2 (BD Falcon). Elles sont entretenues par trypsination (trypsine 0,05%, PAN Biotech) et le milieu de culture est changé tous les 2 ou 3 jours. Les cellules sont utilisées entre 15 les 3ème et 6ème passages. Test de numération des cellules : Le test MTT a été réalisé en suivant la méthode décrite par Mosmann (1983). Les cellules sont ensemencées dans des plaques 96 puits (BD Falcon) à 5x104 cellules/mL dans 100 p.L de milieu complet et incubées durant 24 h. Le milieu est ensuite retiré et 100 pL de milieu DMEM 20 contenant 1% (v/v) de solution antibiotique associé aux extraits à différentes concentrations, au TGF-I3 (témoin positif) ou sans extrait (témoin négatif) sont ajoutés dans chaque puit. Après 48 h, 25 kit de MTT (5% dans le PBS) sont ajoutés dans chaque puit et les plaques sont incubées pendant 4 h à 37°C. Le milieu est ensuite retiré et 200 pl de diméthylsulfoxyde sont ajoutés dans chaque puit avant une incubation de 10 min. L'absorbance à 550 nm est finalement 25 mesurée à l'aide d'un lecteur microplaques Fluostar Omega (BMG Labtech). Le test de numération des cellules a été effectué de la même façon pour les deux lignées cellulaires. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 1. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait. 11 Le nombre de cellules après 48 h d'incubation en présence de l'extrait semble dose-dépendant. A la plus élevée des concentrations testée (500 p.g.mL-1), les deux lignées présentent un nombre similaire de cellules par puit, aux alentours de 35% par rapport au témoin négatif. Les puits traités à une concentration de 100 p.g.mL-1 comportent 5 respectivement 42% et 98% de cellules par rapport au témoin négatif pour les lignées 1059 et 1090. L'effet est donc différent d'une lignée à l'autre. Cette différence de comportement est confirmée à la concentration de 10 p.g.mL-1 puisque les puits traités comportent respectivement 97% (lignée 1059) et 136% (lignée 1090) de cellules par rapport au témoin négatif. Les résultats obtenus dans les puits traités mettent ainsi en évidence une 10 augmentation de la population cellulaire 1090 de 36% par rapport aux puits non traités. Effet de l'extrait aqueux d'Ulva intestinalis sur la production de collagène par les FDHN : Les cellules sont ensemencées dans des plaques 24 puits (BD Falcon) à 5x104 cellules/mL dans 1 mL de milieu complet, puis incubées 24 h. Le milieu est ensuite retiré et 1 mL de milieu contenant 1% (v/v) de solution antibiotique associé aux extraits à différentes concentrations, 15 ou sans extrait (témoin négatif), est ajouté dans chaque puit. Après 48 h d'incubation à 37°C, la production de collagène est mesurée par le test au Sirius red staining. Le milieu est retiré et les cellules sont lavées deux fois avec du PBS puis fixées pendant 1 h avec 1 mL de solution de Bouin à température ambiante. Suite à la fixation, la solution de Bouin est retirée et les cellules sont lavées deux fois à l'eau ultrapure. Le collagène est ensuite coloré par ajout de 1 mL de 20 solution de Sirius red (0,5 g de Sirius red dans 500 mL d'acide picrique à saturation) et la plaque est agitée 1 h à température ambiante. Les puits sont ensuite lavés successivement avec de l'eau ultrapure et une solution d'HCI 0,01M afin de retirer tout le colorant non lié. Le colorant lié est finalement solubilisé par ajout de 500 pl de NaOH 0,1M puis la plaque est incubée 1 h sous agitation sur un agitateur de microplaques à 200 rpm. Finalement, l'absorbance est lue 25 à 550 nm. Le dosage de collagène a été effectué de la même façon pour les deux lignées cellulaires. Les résultats sur les figures sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait. La figure 2A, représentant la production de collagène par puit, montre une augmentation de 30 la production de collagène dans les puits traités, et ce pour les deux lignées cellulaires. Si aucun effet n'est décelé pour une concentration en extrait de 10 p.g.mL-1, une augmentation 12 de l'ordre de 27% pour la lignée 1059 et 52% pour la lignée 1090 est décelée pour une concentration en extrait de 100 p.g.mL-1. Cette augmentation est par ailleurs encore plus significative à la concentration en extrait de 500 pg.mL-1, de 46% pour la lignée 1059 et 79% pour la lignée 1090. En ce qui concerne la production de collagène par cellule (figure 2B), la 5 quantité de collagène produite est très significativement augmentée, de l'ordre de 300% pour la lignée 1059 et 323% pour la lignée 1090, ce qui est en accord avec les observations relevées précédemment sur l'effet de l'extrait sur la prolifération cellulaire, mettant en évidence à cette même concentration un ralentissement de la prolifération (figure 1). Exemple 1B : Extraction aqueuse à partir d'Ulva sp. 10 L'exemple 1A a été répété en réalisant une extraction à partir d'Ulva rigida Tableau 2 : Composition biochimique de l'extrait aqueux d'Ulva rigida Ulva rigida Composition biochimique (% poids sec de l'extrait aqueux) Protéines Sucres Polyphénols Lipides 25% 72% 1% 0% Effet de l'extrait aqueux d'Ulve rigida sur la prolifération des FDHN : Les résultats sont présentés sur la Figure 3. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait. 15 Le nombre de cellules après 48 h d'incubation en présence de l'extrait est dose-dépendant. A une forte concentration (500 pg.mL-1), les puits traités comportent 70% de cellules en moins que dans les puits non traités. A la concentration de 100 p.g.mL-1, le nombre de cellules dans les puits traités est augmenté d'environ 45% pour la lignée 1059 et 83% pour la lignée 1090. A la plus faible concentration testée de 10 pg.mL-1, l'extrait ne présente qu'un effet très limité 20 sur la prolifération cellulaire de la lignée 1090, avec un nombre de cellules dans les puits traités d'environ 117% par rapport aux puits non traités, ce qui n'est pas le cas pour la lignée 1059, pour laquelle une diminution de l'ordre de 35% est observée. Là encore, une différence de comportement des deux lignées cellulaires est décelée. Les résultats obtenus pour l'extrait aqueux d'Ulva rigida sont similaires à ceux obtenus pour 25 l'extrait aqueux d'Ulva intestinalis. Il n'y pas de différence significative entre les effets des deux extraits sur les profils de production de collagène. 13 Les résultat de l'effet de l'extrait aqueux d'Ulva rigida sur la production de collagène par les FDHN sont présentés sur les Figure 4A e 4B. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait. La production de collagène dans les puits présente une augmentation d'environ 5%, 14% et 5 20% à respectivement 10, 100 et 500 p.g.mL-1 d'extrait pour la lignée 1059 (figure 4A). L'effet sur la lignée 1090 est quant à lui plus limité. En revanche, l'étude montre un fort impact de l'extrait sur la production de collagène par cellule (figure 4B) avec une augmentation très significative de 300% pour la lignée 1059 et 400% pour la lignée 1090, à la concentration en extrait de 500 ktg.m1-1. A la concentration intermédiaire de 100 p.g.m1-1, les augmentations 10 décelées sont toujours significatives, de 151% pour la lignée 1059 et 62% pour la lignée 1090, fait très intéressant sachant que l'impact sur la croissance cellulaire est plus modéré à cette concentration, particulièrement pour la lignée 1090 (figure 3). Exemple 2A : Obtention d'un rétentat à partir d'Ulva intestinalis Procédé d'obtention d'un rétentat à partir d'Ulva intestinalis 15 Le procédé comprend la même succession d'étapes que dans l'exemple 1, suivie d'une 5' étape d'ultrafiltration du jus de pressage de façon à obtenir la récupération d'une part d'un rétentat concentré contenant les molécules de plus grande taille, et d'autre part d'un perméat contenant les éléments de plus petite taille, inférieure à 15 kDa. Après l'extraction aqueuse, environ 13 litres de jus d'extraction sont récupérés puis filtrés via une unité d'ultrafiltration 20 équipée d'une membrane de type Kerasep KBW 15 kDa de Novasep Process. La filtration est réalisée à 80°C, 5 bars et à un débit de circulation de 450 L/h, soit une vitesse de circulation de 5 m/s. La filtration est poursuivie jusqu'à obtenir un rétentat d'environ 4°B, qui est alors soutiré de l'unité. Détermination de la composition biochimique du rétentat d'ultrafiltration : 25 Les compositions biochimiques ont été déterminées de la même manière que dans l'exemple 1. 14 Tableau 3 : Composition biochimique du rétentat d'Ulva intestinalis Cliva intestinalis Composition biochimique (% poids sec du rétentat) Protéines Sucres Polyphénols Lipides 23% 63% 1% 0% Effet du rétentat d'ultrafiltration d'Ulva intestinalis sur la prolifération des FDHN : Les tests cellulaires ont été réalisés de la même manière que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 5. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par 5 rapport au témoin négatif sans rétentat. Le nombre de cellules après 48 h d'incubation avec les extraits est dose-dépendant. En effet, à la plus haute concentration (500 p.g.mL-1), les puits traités en présence du rétentat d'Ulva intestinalis comportent respectivement autour de 60% (lignée 1059) et 73% (lignée 1090) de cellules en moins que dans les puits non traités. Cet effet est ensuite beaucoup moins marqué 10 lorsque la concentration en rétentat diminue, de l'ordre de 45% de diminution à 100 p.g.mL-1 et seulement 22% à 10 kg.mL-1. Effet du rétentat d'Ulva intestinalis sur la production de collagène par les FDHN : Les tests cellulaires ont été réalisés de la même manière que dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés sur les Figures 6A et 6B. Les résultats sont exprimés en 15 pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans rétentat. La production de collagène augmente pour les puits traités de la lignée 1059, avec respectivement +10%, +17% et +32% à 10, 100 et 500 pg.m1-1 (figure 6A). En revanche, l'effet reste limité pour la lignée 1090 et n'est véritablement notable qu'à partir de 500 i.tg ml4 avec une augmentation de 23%de la production de collagène dans les puits traités. L'augmentation 20 de la production de collagène semble être dose-dépendante. Les résultats sont particulièrement intéressants concernant la production de collagène par cellule (figure 6B). En effet, à de faibles concentrations, la production de collagène augmente respectivement de 39% (lignée 1059) et 23% (lignée 1090) à 10 Rg.m1-1, 109% (lignée 1059) et 30% (lignée 1090) à 100 p.g.m1-1 et 212% (lignée 1059) et 387% (lignée 1090) à 500 p.g.m14. 25 Comme observé précédemment avec l'extrait aqueux d'Ulva intestinalis, les résultats montrent ici une différence notable entre les deux lignées cellulaires. L'âge de la donneuse 15 semble impacter et influencer les mécanismes métaboliques mis en jeu lors de la stimulation de la production de collagène. Exemple 2B: Obtention d'un rétentat à partir d'Ulva rigida L'exemple 2A a été répété en réalisant une extraction à partir d'Ulva rigida 5 Tableau 4 : Composition biochimique du rétentat d'Ulva rigida Ulva rigida Composition biochimique (% poids sec du rétentat) Protéines Sucres Polyphénols Lipides 27% 72% 2% 0 % Effet du rétentat d'Ulva rigida sur la prolifération des FDFIN : Les résultats sont présentés sur la Figure 7. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans rétentat. Le nombre de cellules après 48 h d'incubation avec les extraits est dose-dépendant. 10 En ce qui concerne la lignée 1059, les puits traités comportent respectivement 21%, 26% et 35% de cellules en moins que dans les puits non traités, aux trois concentrations en rétentat testées. En revanche, pour la lignée 1090, les puits comportent 21% et 11% de cellules en plus par rapport aux puits contrôles, pour les concentrations de 10 et 100 lig.mL-1. Ici encore, un effet différent en fonction de la lignée cellulaire a pu être observé. 15 Effet du rétentat d'Ulva rigida sur la production de collagène par les FDHN : Les résultats sont présentés sur les Figures 8A et 8B. sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans rétentat. La production de collagène par puit augmente de manière dose-dépendante . L'augmentation de la production de collagène reste très légère pour la lignée 1059 (+10% à 100 j.tg.m1-1 et 20 +20% à 500 jig.m1-1). L'augmentation de la production de collagène dans les puits traités n'est décelable qu'à partir de 500 mg.m1-1 pour la lignée 1090. Concernant la production de collagène par cellule, l'impact est particulièrement important à 500 mg.m1-1 avec des augmentations de 80% pour la lignée 1059 et 70% pour la lignée 1090. L'augmentation de la production de collagène par cellule reste dose-dépendante avec 25 respectivement +35%, +46% (lignée 1059) et -7%, +10% (lignée 1090) à 10 et 100 p.g.m1-1 de rétentat (figure 8B). 16 Exemple 3A : Obtention d'un perméat à partir d'Ulva intestinalis Procédé d'obtention du perméat à partir d'Ulva intestinalis : Cette méthode correspond au procédé de fractionnement décrit dans le brevet FR2998894 de SEPROSYS permettant de récupérer un perméat riche en molécules de poids moléculaire 5 inférieur à 15 kDa décrit dans l'exemple 2. Détermination de la composition biochimique du perméat d'Ulva intestinalis : La composition biochimique du perméat a été mesurée de la même façon que dans l'exemple 1. Tableau 5 : Composition biochimique du perméat d'Ulva intestinalis Ulva intestinalis Composition biochimique (% poids sec du perméat) Protéines Sucres Polyphénols Lipides 10% 26% 2% 0% Effet du perméat d'Ulva intestinalis sur la prolifération des FDHN : 10 Les tests cellulaires ont été réalisés de la même manière que dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés sur la Figure 9. Ils sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans perméat. Le perméat ne présente pas d'effet significatif sur la croissance cellulaire de la lignée 1059 (figure 10). Pour la lignée 1090, seule la concentration de 100 p.g.mL-1 présente un effet sur la 15 prolifération cellulaire avec une augmentation de 74% par rapport au témoin négatif. Effet du perméat d'Ulva intestinalis sur la production de collagène par les FDHN : Les tests cellulaires ont été réalisés de la même manière que dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés sur les Figures 10A et B. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans perméat. 20 La production de collagène par puit ne semble pas être impactée par le perméat (figure 10A). En effet, nous ne remarquons pas de surproduction de collagène par puit, et ce pour les deux lignées cellulaires. En ce qui concerne la production de collagène par cellule (figure 10B), seul la concentration en perméat de 10 p.g.mL-1 induit une augmentation de la production de collagène par cellule 25 pour la lignée 1059 (+40%). Le perméat ne présente pas d'activité stimulante aux autres concentrations d'étude, ce qui diffère donc des extraits précédents. 17 Ce résultat est important car il apporte des informations sur le mode de stimulation des extraits. En effet, s'il ne stimule pas la production de collagène, le perméat induit une augmentation de la densité de cellules pour la lignée 1090 (figure 9), semblant donc orienter le métabolisme des fibroblastes 1090 vers la croissance cellulaire, ce qui se rapproche du 5 mécanisme observé généralement dans le cas des stimulants conventionnels des fibroblastes dermiques humains tels que le TGF-p. En outre, une différence de comportement des deux lignées cellulaires est une fois encore notée, démontrant que l'orientation métabolique des fibroblastes est fonction de l'âge de la donneuse. Exemple 3B : Obtention d'un perméat à partir d'Ulva rigida 10 L'exemple 3A a été répété en réalisant une extraction à partir d'Ulva rigida Tableau 6 : Composition biochimique du perméat d'Ulva rigida Ulva rigida Composition biochimique (% poids sec du perméat) Protéines Sucres Polyphénols Lipides 7% 32% 2% 0% Effet du perméat d'Ulva rigida sur la prolifération des FDHN : Les résultats sont présentés sur la Figure 11. Ils sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans perméat. 15 Concernant le perméat d'Ulva rigida, nous pouvons remarquer une réponse similaire à celle obtenue pour le perméat d'Ulva Intestinalis. La croissance de la lignée cellulaire 1090 est stimulée par l'extrait avec respectivement +28%, +50% et +18% d'augmentation après 48 h d'incubation pour les concentrations en perméat de 10, 100 et 500 p.g.m11 (figure 11). En revanche, l'effet de cette fraction est plutôt négatif sur la croissance cellulaire de la lignée 20 1059, une diminution de prolifération de 24% étant constatée à 10 et 100 pg.m1-1. Aucun effet n'est en revanche observé à 500 pg.m1-1. Effet du perméat d'Ulva rigida sur la production de collagène par les FDHN : Les résultats sont présentés sur les Figures 12A et 12B. Ils sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans perméat. 18 La quantité de collagène par puit augmente légèrement concernant la lignée 1059 (+5% à 100 p,g.m1-1 et +30% à 500 lig.m1-1) (figure 12A). En revanche, à la plus forte concentration, la quantité de collagène par puit diminue pour la lignée 1090. Cette différence entre les deux lignées cellulaires met une fois de plus en évidence la 5 différence d'orientation métabolique induite. La lignée fi broblastiq ue 1090 semble privilégier la croissance à la production de collagène en présence du perméat d'Ulva rigida Ces résultats restent marqués concernant la production de collagène par cellule (figure 12B). En effet, les quantités de collagène produit par cellule sont respectivement augmentées de 30%, 44% et 30% à 10, 100 et 500 p.g.m1-1 pour la lignée 1059, alors qu'un effet négatif est 10 observé sur la lignée 1090 avec -23% et -6% de production à 100 et 500 p.g.m1-1. On note un effet plus remarquable pour le perméat provenant d'Ulva rigida que pour celui provenant d'Ulva intestinalis (exemple 3B), bien que les orientations et valeurs obtenues soient proches entre les deux macroalgues vertes. Exemple 4A : Obtention d'un extrait riche en protéines à partir d'Ulva intestinalis 15 Le procédé mis en oeuvre correspond au procédé de fractionnement décrit dans le brevet FR2998894 de SEPROSYS permettant de récupérer un extrait riche en protéine d'Ulva intestinalis. A partir du rétentat d'ultrafiltration obtenu dans l'exemple 2, deux étapes ont été ajoutées au procédé pour obtenir une fraction enrichie en protéines : - Déminéralisation du rétentat d'ultrafiltration et décantation du rétentat déminéralisé 20 - Récupération des protéines végétales présentes dans les algues par floculation A cette fin, le rétentat (1,5 L) est déminéralisé par passage sur une colonne contenant 100 mL de résine anionique forte de type Amberlite FPA 98 sous forme OH-, montée en série avec une colonne contenant 200 mL de résine cationique forte de type Amberlite IR 120 Na sous forme W. La circulation s'effectue à l'aide d'une pompe péristaltique à un débit de 2 BV/h pour la 25 résine cationique. Le produit déminéralisé est ensuite laissé à décanter dans une cuve à 80°C pendant 2 h. Le surnageant purifié riche en polysaccharides sulfatés est alors séparé du culot protéique par centrifugation à 2150 g pendant 30 min. Détermination de la composition biochimique de l'extrait riche en protéines : La composition biochimique de l'extrait protéique a été mesurée de la même manière que 30 dans l'exemple 1. 19 Tableau 7: Composition biochimique de l'extrait riche en protéines d'Ulva intestinalis Ulva intestinalis Composition biochimique (% poids sec de l'extrait riche en proteines) Protéines Sucres Polyphénols Lipides 49% 22% 2% 0% Les analyses structurales des protéines présentes dans l'extrait ont été effectué sur une HPLC Agilent 1050. La fraction protéique a été séparée par gel perméation afin de déterminer le poids moléculaire moyenne des protéines présentes dans l'extrait à 280 nm. Un tampon 5 phosphate 0.1 M contenant 0.3 M de NaCI nous a permis d'éluer notre échantillon sur une colonne TSIK gel 3000 SW à un débit de 0.8 ml/min. Les résultats mettent en évidence la présence de plusieurs populations protéiques avec des masses moléculaires de 22, 18 et 8 kDa minimum (figure 20). Effet de l'extrait riche en protéines d'Ulva intestinalis sur la prolifération des FDHN : 10 Les tests cellulaires ont été réalisés de la même manière que dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés sur la Figure 13. Ils sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait. Concernant la lignée 1059, le nombre de cellules après 48 h d'incubation en présence de l'extrait est dose-dépendant (figure 15). En effet, à 500 p.g.m1:1, plus haute concentration 15 testée, les puits traités avec l'extrait comportent environ 40% de cellules en moins que dans les puits non traités. A la concentration de 100 pg.m1:1, le nombre de cellules est diminué de 28%. Aux concentrations les plus élevées, l'extrait enrichi en protéines impacte donc négativement la prolifération des fibroblastes. Pour la lignée 1090, aucun effet notable sur la croissance cellulaire n'est relevé jusqu'à la 20 concentration de 100 (.1g.mU1. En revanche, les puits traités avec l'extrait à 500 ktg.mL-1 voient le nombre de cellules diminuer de près de 35%. Effet d'un extrait riche en protéines d'Ulva intestinalis sur la production de collagène par les FDHN : Les tests cellulaires ont été réalisés de la même manière que dans l'exemple 1. 20 Les résultats sont présentés sur les figures 14A et 14B. Les résultats sont exprimés en pourcentage relatif par rapport au témoin négatif sans extrait. La production de collagène par les FDHN traités par l'extrait riche en protéines d'Ulva intestinalis est fortement impactée. Elle augmente par rapport au témoin négatif de manière 5 dose-dépendante (figure 14A) : sans effet notable à 10 p.g.mL-1, l'extrait stimule en effet très fortement les deux lignées fibroblastiques pour la production de collagène par puit (+50% à 100 p.g.mL-1 et respectivement +152% et +80% à 500 p.g.mL-1). Ceci nous conduit à penser que les fibroblastes traités avec l'extrait protéique tendent à ralentir leur métabolisme lié à la croissance cellulaire au profit de celui lié à la production de 10 collagène. Il est à noter que cet extrait riche en protéines présente les meilleurs résultats en termes de stimulation de la production de collagène par puit par les deux lignées fibroblastiques. Cette fraction démontre également une activité particulièrement intéressante sur la production de collagène par cellule, menant à une augmentation significative de la quantité 15 de collagène produit par les FDHN (figure 14B). En effet, la quantité de collagène produit par cellule en présence de cet extrait est respectivement augmentée de 60%, 130% et 300% pour la lignée 1059, et de 15%, 77% et 370% pour la lignée 1090, à 10, 100 et 500 Ltg.mL-1. Cette activité est particulièrement remarquable puisqu'elle s'accompagne d'un faible impact sur la croissance cellulaire. (Figure 13). 20 En outre, ce résultat confirme à nouveau que la stimulation de la production de collagène induite est liée à l'activation de l'anabolisme des fibroblastes et non à l'augmentation de la densité cellulaire, comme c'est le cas pour les stimulants conventionnels. Exemple 4B : Obtention d'un extrait riche en protéines à partir d'Ulve, rigida L'exemple 4A a été répété en réalisant une extraction à partir d'Ulva rigida 25 Tableau 8 : Composition biochimique de l'extrait riche en protéines d'LlIva rigida Ulva rigida Composition biochimique (% poids sec de l'extrait riche en protéines) Protéines Sucres Polyphénols Lipides 43% 23% 1% 21 Les analyses structurales des protéines présentes dans l'extrait ont été effectuées sur une HPLC Agilent 1050. La fraction protéique a été séparée par gel perméation afin de déterminer le poids moléculaire moyenne des protéines présentes dans l'extrait à 280 nm. Un tampon phosphate 0.1 M contenant 0.3 M de NaCI nous a permis d'éluer notre échantillon sur une 5 colonne TSK gel 3000 5W à un débit de 0.8 ml/min. Les résultats mettent en évidence la présence de plusieurs populations protéiques avec des masses moléculaires de 22, 13, 8 et 2 kDa minimum (figure 15). Effet d'un extrait riche en protéines d'Ulva rigida sur la prolifération des FDHN Les résultats sont présentés sur la Figure 16. Ils sont exprimés en pourcentage relatif par 10 rapport au témoin négatif sans extrait. Le nombre de cellules après 48 h d'incubation avec l'extrait riche en protéines d'Ulva rigida est dose-dépendant (figure 16). Un effet opposé est observé en fonction de la lignée cellulaire. En effet, pour la lignée 1059, les puits traités à 500 p.g.m1-1 comportent 43% de cellules en moins que les puits non traités, ce qui révèle un effet négatif de la fraction riche en protéines 15 sur la prolifération de FDHN, toutefois limité à faible concentration, où une diminution du nombre de cellules de l'ordre de 15 à 25% à peine intervient. La lignée 1090 présente quant à elle une augmentation de la prolifération corrélée avec l'augmentation de la concentration de l'extrait, partant de -20% à 10 pg.mL-1 pour atteindre +11% à 500 pg.mL-1. 20 Si nous comparons cet extrait avec l'extrait riche en protéines provenant d'Ulva intestinalis (exemple 4A), il apparaît que les profils de croissance cellulaire sont similaires pour la lignée 1059 mais différents pour la lignée 1090. Effet d'un extrait riche en protéines d'Ulva rigida sur la production de collagène par les FDHN : Les résultats sont présentés sur les Figures 17A et 17B. Ils sont exprimés en pourcentage relatif 25 par rapport au témoin négatif sans extrait. La production de collagène dans les puits traités par l'extrait riche en protéines d'Ulva rigida est très légèrement impactée par rapport à celles des puits non traités (figure 17A). En effet, la quantité de collagène pour les deux lignées n'augmentent que très légèrement à de fortes concentrations : +13% pour la lignée 1059 et +20% pour la lignée 1090 à 500 p.g.mL-1. 22 Comparativement à l'extrait riche en protéines d'Ulva intestinalis (exemple 4A), l'effet est donc beaucoup moins marqué. En ce qui concerne la quantité de collagène produit par cellule, on remarque un effet dose-dépendant très intéressant de l'extrait riche en protéines d'Ulva rigida, principalement sur la 5 lignée 1059, qui voit sa production augmenter respectivement de 23%, 61% et 100% à 10, 100 et 500 ktg.mL-1. L'effet est un peu moins marqué pour la lignée 1090, avec respectivement 20% et 35% d'augmentation à 100 et 500 p.g.mL-1. Ces résultats sont particulièrement dignes d'intérêt, compte-tenu du fait que l'impact de cet extrait sur la croissance cellulaire est limité, y compris à forte concentration (figure 16). Les 10 fibroblastes traités tendent à ralentir leur croissance cellulaire modérément, en particulier la lignée 1090, au profit de la surproduction de collagène. Comparaison entre les deux fractions protéiques (Ulva Intestinalis et Ulva Rigida) Les fractions protéiques ont été séparées par gel perméation afin de déterminer le poids moléculaire moyenne des protéines présentes dans l'extrait à 280 nm. Un tampon phosphate 15 0.1 M contenant 0.3 M de NaCI nous a permis d'éluer notre échantillon sur une colonne TSK gel 4000 SW à un débit de 0.8 ml/min. La colonne TSK gel 4000 SW permet de séparer théoriquement de petites et moyennes protéines (100 à 10 kDa) Les résultats mettent en évidence une similitude entre les profils chromatographiques entre Ulva Intestinalis et Ulva Sp (Figure 18). 20 En effet, les profils protéiques montrent des populations protéiques similaires dans les deux extraits. Un pic majoritaire présent à 36 minutes prouve de la présence d'une population protéique aux alentours de 60-10 kDa. Ensuite, les extraits ont été digérés à l'aide de la protéinase K (une enzyme de la famille des protéases à serine) afin de comparer la composition protéique d'Ulva Rigida et d'Ulva 25 Intestinalis grâce aux profils peptidiques obtenus. Les peptides vont nous permettre d'identifier les profils protéiques grâces aux banques de données. Les extraits sont exposés à la protéinase K (1 mg.ml) pendant 1 heure à 37°C (pH-7). Les échantillons ont été élues sur une colonne C18 (Acuity UPLC Hss T3) avec un gradient eauacétonitrile à un débit de 1 ml/minute sur une chaîne chromatographique L'Acquity UPLC H- 23 class (Waters corporation, Milford, Etats-Unis) couplée à un spectromètre de masse Xevo G2- S Q-TOF (Waters corporation, Milford, Etats-Unis) Les peptides permettent d'identifier les profils protéiques grâces aux banques de données. On retrouve les mêmes familles protéiques dans les fractions protéiques d'Ulva Intestinalis 5 et d'Ulva Sp (figure 19) : - Ribulose bisphosphate carboxylase large chain - Elongation factor Tu, chloroplastic - S'-adenylylsulfate reductase - Actine (cytoplasme) 10 - ATP synthase subunit beta, chloroplastic - p700 chlorophyll a-apoprotein A2 / S'-adenylylsulfate reductase - Translation elongation factor-like protein / Elongation factor-1 alpha-like protein - Cytochrome C/ REVENDICATIONS1. Extrait aqueux de macroalgues marines appartenant au genre Ulva, comprenant au moins 5 %, en poids de matière sèche de l'extrait, de protéines de poids moléculaires compris entre 1 et 100 kDa. 2. Extrait selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 5%, en poids de matière sèche de l'extrait, de protéines de poids moléculaires compris entre 2 et 60 kDa. 3. Extrait selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 5%, en poids de matière sèche de l'extrait, de protéines de poids moléculaires compris entre 2 et 30 kDa. 4. Extrait selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il comprend également des polysaccharides. 5. Extrait selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il comprend également des polyphénols. 6. Extrait selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un extrait aqueux de Ulva rigida et/ou Ulva intestinalis. 7. Extrait selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il est soluble dans l'eau. 8. Utilisation cosmétique non thérapeutique d'un extrait selon l'une des précédentes revendications, comme principe actif cosmétique anti-âge pour prévenir et/ou retarder et/ou limiter les signes du vieillissement de la peau. 9. Utilisation selon la revendication 8, dans une composition cosmétique. 10. Utilisation selon l'une des revendications 8 ou 9, comme principe actif cosmétique anti-âge augmentant la production de collagène par les fibroblastes dermiques. 11. Utilisation selon l'une des revendications 8 à 10, comme principe actif anti-rides. 12. Composition cosmétique comprenant au moins 0,01% d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 7 en poids de matière sèche de la composition. 13. Composition cosmétique selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de crème, sérum, onguent, gel, lotion, émulsion, solution, solution à pulvériser, huile, bâton, crayon ou gloss à lèvres ou à contour des lèvres, poudre, mousse ou savon. 25 14. Procédé de traitement cosmétique de la peau pour lutter contre le vieillissement cutané caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer au moins une fois par jour sur la peau du visage une composition selon la revendication 13.