FR 3079525 A1 20191004 FR 1870372 A 20180330 MICROORGANISME MODIFIÉ À ACTIVITÉ RUBISCO AMÉLIORÉE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne l'amélioration de l'activité de la ribulose-1,5- bisphosphate carboxylase / oxygénase (RuBisCO, E.C. 4.1.1.39) dans un microorganisme exprimant une RuBisCO fonctionnelle capable d'utiliser le dioxyde de carbone comme seule source de carbone ou en complément d'une autre source de carbone organique. ETAT DE LA TECHNIQUE La RuBisCO est l'enzyme de fixation du dioxyde de carbone du cycle de Calvin. Cette protéine, ses différentes formes, leurs séquences, leurs structures et leurs activités ont été largement étudiées et sont bien connues de l'homme du métier. Améliorer l'activité RuBisCO dans les microorganismes permettrait d'améliorer 15 l'utilisation du dioxyde de carbone par ces organismes, permettant, notamment, d'améliorer leurs rendements de production. On connaît différents microorganismes exprimant un ensemble de gènes pour l'expression d'une RuBisCO fonctionnelle, qu'il s'agisse d'un ensemble de gènes natifs ou hétérologues (WO 2014/096391, WO 2014/129898, WO 2015/107496, WO 2015/177800). 20 Ces microorganismes sont mis en oeuvre dans des procédés industriels utilisant le dioxyde de carbone comme seule source de carbone ou en combinaison avec une source de carbone organique. Toutefois, l'activité RuBisCO est généralement limitante et il y a un intérêt à améliorer cette activité, notamment pour favoriser la productivité des procédés industriels. 25 Les inventeurs ont maintenant identifié des modifications génétiques à apporter dans les microorganismes de manière à améliorer l'activité de la RuBisCO fonctionnelle exprimée. EXPOSE DE L'INVENTION 30 L'invention concerne un microorganisme capable d'exprimer une RuBisCO fonctionnelle, caractérisé en ce qu'il est génétiquement modifié au niveau d'un facteur d'élongation de la transcription responsable de la modulation de la processivité de l'ARN polymerase pour améliorer l'activité de ladite RuBisCO fonctionnelle. Les microorganismes modifiés selon l'invention peuvent être des microorganismes 35 exprimant les gènes nécessaires à l'expression d'une RuBisCO fonctionnelle native. Ces microorganismes sont en particulier choisis parmi les protistes, notamment les microalgues et les bactéries. 2 Selon un autre aspect de l'invention les organismes modifiés sont des microorganismes qui n'expriment pas de RuBisCO fonctionnelle native et qui sont également modifiés afin d'exprimer un ensemble de gènes hétérologues nécessaires à l'expression d'une RuBisCO fonctionnelle. 5 L'ensemble des gènes pour l'expression d'une RuBisCO fonctionnelle comprend les gènes codant pour les sous-unités de la RuBisCO et les gènes codant pour les protéines chaperonnes nécessaires à l'assemblage des sous-unités de la RuBisCO. Ces différents gènes peuvent être natifs ou hétérologues selon les microorganismes considérés. Les microorganismes qui n'expriment pas de RuBisCO fonctionnelle native sont en 10 particulier choisis parmi les bactéries, les levures, les champignons et les protistes. L'invention concerne également un procédé de culture d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'invention, qu'il exprime ou non une RuBisCO fonctionnelle native, comprenant la culture dudit microorganisme sur un milieu de culture comprenant une source de carbone pour produire une biomasse et le cas échéant une étape de récupération de métabolites d'intérêt à partir de la biomasse et/ou du surnageant de culture obtenus. La source de carbone peut être du dioxyde de carbone ou une source de carbone organique combinée au dioxyde de carbone pour les microorganismes capables de croitre avec une source de carbone organique comme seule source de carbone. DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 représente la séquence consensus identifiée dans les séquences des protéines SPT5 et NusG par alignement des représentations 3D des protéines (la taille relative des lettres représentant un acide aminé à une position donnée est associée au nombre d'occurrences où l'on retrouve ce même acide aminé à la même position dans un gène SPT5 ou nusG). La Figure 2 représente une représentation 3D de la superposition du domaine NGN de SPT5 de S. cerevisiae et NusG de E. coll. En noir sont représentés les éléments de structure secondaire du domaine NGN de SPT5 de S. cerevisiae. L'alanine 339 est représentée en bâton noir. Les éléments de structure secondaire de la protéine NusG d'E. cou ont été superposés à ceux du domaine NGN de SPT5, et sont représentés en gris clair. La chaine latérale de la méthionine équivalente structuralement à A339 est figurée en bâton couleur gris clair. Par souci de clarté, les six premiers résidus N-terminaux de NusG ont été omis sur la représentation. DEFINITIONS Les termes «microorganisme recombinant», «microorganisme modifié», « microorganisme génétiquement modifié » et «cellule hôte recombinante» sont utilisés ici 3 de manière interchangeable et désignent des microorganismes qui ont été génétiquement modifiés pour exprimer ou pour sur exprimer des séquences nucléotidiques endogènes, pour exprimer des séquences nucléotidiques hétérologues, ou qui ont une altération de l'expression d'un gène endogène. Par «altération», on entend que l'expression du gène, ou 5 niveau d'une molécule d'ARN ou molécules d'ARN équivalentes codant pour un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques, ou l'activité d'un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques est régulée, de sorte que l'expression, le niveau ou l'activité soit supérieur ou inférieur à celui observé en l'absence de modification. Il est entendu que les termes «microorganisme recombinant», «microorganisme 10 modifié», « microorganisme génétiquement modifié » et «cellule hôte recombinante» se réfèrent non seulement à un microorganisme génétiquement modifié particulier, mais à la descendance ou à la descendance potentielle d'un tel organisme. Certaines modifications pouvant se produire dans les générations suivantes, du fait d'une mutation ou d'influences environnementales, cette progéniture peut ne pas être identique au microorganisme parent, 15 mais elle est encore comprise dans le cadre du terme tel qu'utilisé ici. Le terme «exogène» tel qu'utilisé ici en référence à diverses molécules (séquences nucléotidiques, peptides, enzymes, etc.), désigne des molécules qui ne sont pas normalement ou naturellement trouvées dans et / ou produites par le microorganisme considéré. A l'inverse, le terme "endogène" ou "natif' en référence à diverses molécules 20 (séquences nucléotidiques, peptides, enzymes, etc.), désigne des molécules qui sont normalement ou naturellement trouvées dans et / ou produit par le microorganisme considéré. L'invention propose des microorganismes génétiquement modifiés, notamment pour la production d'une molécule d'intérêt, endogène ou exogène. 25 Par microorganisme « génétiquement modifié », on entend que le génome du microorganisme a été modifié de manière à intégrer une séquence nucléique soit pour remplacer une séquence nucléique native, soit pour modifier une séquence nucléique native, soit pour supprimer une séquence nucléique native, soit pour ajouter une nouvelle séquence nucléique. Ladite séquence nucléique peut avoir été introduite dans le génome 30 dudit microorganisme ou d'un de ses ascendants, par le biais de toute méthode de clonage moléculaire adaptée. Dans le contexte de l'invention, le génome du microorganisme s'entend de l'ensemble du matériel génétique contenu dans ledit microorganisme, y compris le matériel génétique extrachromosomique contenu par exemple dans des plasmides, épisomes, chromosomes synthétiques, etc. La séquence nucléique introduite 35 peut être une séquence hétérologue, c'est-à-dire qui n'existe pas à l'état naturel dans ledit microorganisme, ou une séquence homologue. La séquence nucléique peut être un fragment de gène introduit pour remplacer le gène natif ou un fragment de ce dernier, en 4 particulier pour remplacer une séquence codante, totalement ou en partie ou bien pour supprimer la séquence codante native, totalement ou en partie. Pour introduire une nouvelle séquence codante, avantageusement, on introduit dans le génome du microorganisme une unité transcriptionnelle comportant la séquence nucléique d'intérêt, 5 placée sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteur(s). Une telle unité transcriptionnelle comprend également, avantageusement, les séquences usuelles telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d'autres éléments de régulation de la transcription. En particulier, on désigne par « microorganisme capable d'exprimer une RuBisCO fonctionnelle native », un microorganisme exprimant de manière endogène des 10 gènes codant pour une RuBisCO fonctionnelle. En particulier, on désigne par « microorganisme qui n'exprime pas une RuBisCO fonctionnelle native», un microorganisme n'exprimant pas de manière endogène des gènes codant pour une RuBisCO fonctionnelle et qui exprime des gènes hétérologues codant pour une RuBisCO fonctionnelle. 15 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention concerne un microorganisme capable d'exprimer une RuBisCO fonctionnelle, génétiquement modifié pour améliorer l'activité de ladite RuBisCO fonctionnelle. L'activité de la RuBisCO peut être mesurée par tout moyen connu de l'homme du 20 métier, notamment la méthode décrite dans l'exemple 8 ci-après. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, les microorganismes génétiquement modifiés expriment une RuBisCO fonctionnelle native, en particulier choisis parmi les microorganismes procaryotes ou eucaryotes qui expriment une RuBisCO fonctionnelle native. Il peut s'agir de microorganismes comme les protistes, notamment les 25 microalgues ou les cyanobactéries. Parmi les bactéries qui expriment une RuBisCO fonctionnelle native, on citera Hydrogenovibrio marinus, Rhodobactercapsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Corynebacterium autotrophicum, Nocardia autotrophica, Nocardia opaca, Rhodospirillum rubrum, Rhizobium japonicum' 30 Hydrogenomonas pantotropha, Hydrogenomonas eutropha, Hydrogenomonas facilis, Hydrogenophilus isieticus, Hydrogenophilus thermoluteolus, Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus, Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga pseudoflava, Bradyrhizobium japonicum, Raistonia eutropha, Aicaligenes eutrophus, Aicaligenes facilis, Aicaligenes hydrogenophilus, Aicaligenes latus, Aicaligenes paradoxus, 35 Aicaligenes ruhletii, Amycolata sp., Aquaspirillum autotrophicum, Arthrobacter strain 11/X, Azospirillum lipoferum, Variovouax paradoxus, Acidovouax facilis, Bacillus schlegelii, Bacillus tusciae, Caiderobacterium hydrogenophilum, Derxia gummosa, Flavobacterium 5 autautresmophilum, Microcyclus aquaticus, Mycobacterium goudoniae, Paracoccus denitrificans, Persephonella marina, Persephonella guaymasensis, Renobacter vacuolatum, Thermocrinis ruber, Wautersia sp. Parmi les cyanobactéries qui expriment une RuBisCO fonctionnelle native, on citera 5 Acaryochloris marina, Anabaena variabilis, Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, Chlorobium tepidum, Chlorobaculum sp., Cyanothece sp., Gloeobacter violaceus, Microcystis aeruginosa, Nostoc punctiforme, Prochiorococcus marinus, Synechococcus elongatus, Synechocystis sp., Thermosynechococcus elongatus, Trichodesmium erythraeum, et Rhodopseudomonas palustris. 10 Parmi les microalgues qui expriment une RuBisCO fonctionnelle native, on citera l'ensemble des algues microscopiques de type eucaryote, appartenant préférentiellement aux classes ou superclasses des Chlorophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Diatomées ou Bacillariophyta, Euglénophyceae, Rhodophyceae, ou Trebouxiophyceae. Préférentiellement, les microalgues génétiquement modifiées selon l'invention sont 15 choisies parmi Nannochioropsis sp. (e.g. Nannochioropsis oculata, Nannochioropsis gaditana, Nannochioropsis satina, Nannochioropsis oceanica), Tetraselmis sp. (e. g. Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii), Chlorella sp. (e.g. Chlorella satina, Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella minutissima, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris), Chlamydomonas sp. (e.g. 20 Chlamydomonas reinhardtii) Dunaliella sp. (e.g. Dunaliella tertiolecta, Dunaliella satina), Phaeodactylum tricornutum, Botrycoccus braunii, Chroomonas satina, Cyclotella cryptica, Cyclotella sp., Ettlia texensis, Euglena gracilis, Gymnodinium nelsoni, Haematococcus pluvialis, Isochrysis galbana, Monoraphidium minutum, Monoraphidium sp., Neochioris oleoabundans, Nitzschia Iaevis, Onoraphidium sp., Pavlova lutheri, Phaeodactylum 25 tricornutum, Porphyridium cruentum, Scenedesmus sp. (e.g. Scenedesmus obliquuus, Scenedesmus quadricaula, Scenedesmus sp.), Stichococcus bacillaris, Spirulina platensis, Thalassiosira sp. Selon l'invention, tous microorganismes qui n'expriment pas une RuBisCO fonctionnelle native peuvent être employés, ces microorganismes étant génétiquement 30 modifiés pour exprimer une RuBisCO fonctionnelle hétérologue. En particulier, ces microorganismes sont choisis parmi les bactéries, les levures, les champignons et les protistes. Dans un mode de réalisation, le microorganisme qui n'exprime pas une RuBisCO fonctionnelle native génétiquement modifié selon l'invention est une levure, 35 préférentiellement choisie parmi les levures ascomycètes (Spermophthoraceae et Saccharomycetaceae), les levures basidiomycètes (Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, et Filobasidiella) et les levures deuteromycètes appartenant 6 au Fungi imperfecti (Sporobolomycetaceae, et Cryptococcaceae). Préférentiellement, la levure génétiquement modifiée selon l'invention appartient au genre Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Lipomyces, Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, ou Debaryomyces. Plus préférentiellement, la 5 levure génétiquement modifiée selon l'invention est choisie parmi Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Candida tropicalis, Rhodotorula glutinis, 10 Rhodosporidium toruloides, Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii et Lipomyces starkeyi. Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme qui n'exprime pas de RuBisCO fonctionnelle native génétiquement modifié selon l'invention est un champignon, et plus particulièrement un champignon « filamenteux ». Dans le contexte de l'invention, les « 15 champignons filamenteux » désignent toutes les formes filamenteuses de la sous-division Eumycotina. Par exemple, le champignon génétiquement modifié selon l'invention appartient au genre Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia, Mucor, Cochiobolus ou Pyricularia. Préférentiellement, le champignon génétiquement modifié selon l'invention est choisi parmi Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus 20 awomari, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, et Trichoderma viride. Dans un mode de réalisation, le microorganisme qui n'exprime pas de RuBisCO fonctionnelle native génétiquement modifié selon l'invention est une bactérie, préférentiellement choisie parmi les phyla Acidobacteria, Actinobacteria, Aquificae, 25 Bacterioidetes, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae, ou Verrucomicrobia. De manière préférée, la bactérie génétiquement modifiée selon l'invention 30 appartient au genre Acaryochloris, Acetobacter, Actinobacillus, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Anaerobiospirillum, Aquifex, Arthrobacter, Arthrospira, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Burkholderia, Chlorobium, Chromatium, Chlorobaculum, Clostridium, Corynebacterium, Cupriavidus, Cyanothece, Enterobacter, Deinococcus, Erwinia, Escherichia, Geobacter, Gloeobacter, Gluconobacter, 35 Hydrogenobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Mannheimia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Microcystis, Nitrobacter, Nitrosomonas, Nitrospina, Nitrospira, Nostoc, Phormidium, Prochlorococcus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, 7 Rhodobacter, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptomyces, Synechoccus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Trichodesmium, ou Zymomonas. De manière encore préférée, la bactérie génétiquement modifiée selon l'invention est choisie parmi les 5 espèces Agrobacterium turnefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium pasteurianum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beigerinckii, Cotynebacterium glutamicum, Cupriavidus necator, Cupriavidus 10 metallidurans, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Gluconobacter oxydans, Hydrogenobacter thermophilus, Kiebsiella oxytoca, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Mannheimia succiniciproducens, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Rhizobium etli, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter 15 sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Streptomyces coelicolor et Zymomonas mobilis. L'invention concerne donc un microorganisme capable d'exprimer une RuBisCO fonctionnelle, caractérisé en ce qu'il est génétiquement modifié au niveau d'un facteur 20 d'élongation de la transcription responsable de la modulation de la processivité de l'ARN polymerase et de la stabilité de la machinerie d'élongation de l'ARN polymérase. Les facteurs d'élongation de la transcription responsable de la modulation de la processivité de l'ARN polymerase sont connus de l'homme du métier, en particulier les gènes nusG et SPT5, facteurs d'élongation de la transcription qui aide à la synthèse d'ARN 25 sur matrice d'ADN par des ARN polymérases cellulaires (ARNP) (Yakhnin and Babitzke, 2015). SPT5, présent chez tous les eucaryotes et les archea, couple le traitement de l'ARN et la modification de la chromatine à l'élongation de la transcription (Blythe et al., 2016). NusG présente chez toutes les bactéries, participe à une grande variété de processus, y compris la pause de l'ARNP et la terminaison Rho-dépendante. NusG/SPT5 régule la 30 processivité de la transcription de l'ARN polymérase et est important dans la stabilité de la machinerie d'élongation de l'ARNP. La composition du domaine modulaire de NusG / SPT5 et la manière dont il se lie à l'ARNP sont conservées dans les trois domaines de la vie. NusG / SPT5 enferme l'ARNP autour d'un canal de liaison à l'ADN, ce qui permet de moduler la processivité de la transcription. Le recrutement de facteurs supplémentaires à 35 l'allongement de l'ARNP peut être une autre fonction conservée de cette protéine omniprésente. Selon l'organisme, les gènes codant pour NusG / SPT5 peuvent s'appeler nusG (e.g. 8 Escherichia cols), SPT5 (e.g. Saccharomyces cerevisiae), facteur d'élongation, facteur d'élongation de la chromatine, protéine de terminaison / anti terminaison de la transcription. Le tableau ci-dessous liste, à titre d'exemples, les séquences codant pour un facteur d'élongation NusG ou SPT5. 5 Tableau 1: Exemples de séquences codant pour NusG / SPT5 Gène GenBank GI Organisme SPT5 EIVV08248.1 854999 Saccharomyces cerevisiae SPT5 XP 501728.1 2909431 Yarrowia lipolytica SPT5 NT 166539.1 4990736 Aspergillus figer SPT5 XP 005852736.1 17360035. Nannochloropsis gaditana SPT5 NC_011681.1 7202533 Phaeodactylum tricornutum NusG NP_418409.1 948485 Escherichia coli NusG NP_387982.1 936851 Bacillus subtilis NusG NP 599720.1 _ 1021480 Corynebacterium glutamicum NusG VVP 010810468.1 34310956 Cupriavidus necator NusG VVP 010888679.1 1800308 Deinococcus radiodurans NusG EHI40717.1 356660353 Rhodococcus opacus NusG BAA17420.1 1652499 Synechocystis sp. PCC 6803 NusG BAD79080.1 56685858 Synechococcus elongatus Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la modification génétique du microorganisme au niveau d'un facteur d'élongation de la transcription responsable de la 10 modulation de la processivité de l'ARN polymerase et de la stabilité de la machinerie d'élongation de l'ARN polymérase comprend l'expression d'un facteur d'élongation de la transcription muté, en particulier l'expression d'une protéine NusG/SPT5 mutée. Cette expression d'une protéine mutée est réalisée par l'expression d'un gène codant pour la protéine mutée dans le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention. 15 Cette mutation est avantageusement une transposition (substitution) d'au moins un acide aminé par un autre acide aminé dans la protéine NusG/SPT5. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, au moins une mutation est localisée dans l'un des éléments de structure secondaire commun au domaine NGN de SPT5 et NusG, c'est-à-dire, les trois hélices alpha (a1, a2 et a3) ainsi que les quatre brins 20 béta 031, f32, f33 et (34). Plus avantageusement, au moins une mutation est introduite au niveau de l'extrémité C-terminale du feuillet f33. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la protéine NusG/SPT5 mutée 9 comprend une mutation dans une séquence consensus de 9 acides aminés représentée sur la Figure 1. Cette séquence peut être identifiée sur la structure 3D des protéines en superposant les représentations 3D comme sur la Figure 2. L'homme du métier connaît bien les 5 méthodes de représentation 3D de protéines, notamment avec le logiciel Pymol. Cette séquence consensus est constituée d'un premier acide aminé qui est soit une Glycine soit une Asparagine, un deuxième acide aminé présentant une chaîne latérale à fort encombrement stérique (Tyrosine, Histidine, Lysine, Arginine, etc...), un troisième acide aminé apolaire, un quatrième acide aminé qui est soit une Tyrosine soit une Leucine, 10 un cinquième acide aminé apolaire, un sixième acide aminé qui pourra être soit un Acide Glutamique soit une Glutamine soit une Arginine, un septième acide aminé qui sera soit une Alanine soit une Serine soit une Méthionine soit une Isoleucine, les deux derniers acides aminés présentent des chaînes latérales polaire et/ou encombrante. Tableau 2: Exemples de séquences consensus de 9 acides aminés dans NusG / 15 SPT5 Gène GenBank Séquence Localisation SPT5 EIVV08248.1 GRIYIEAPK 333-341 SPT5 XP 501728.1 GYIYMEARN 223-241 SPT5 NT 166539.1 GYIYVEARR 268-276 SPT5 XP 005852736.1 GHVLIEARN 44-52 SPT5 NC 011681.1 GKIYLESFS 254-262 NusG NP_418409.1 GYVLVQMVM 67-75 NusG NP_387982.1 GYVLVEIVM 63-71 NusG NP 599720.1 _ GYVLVRM DM 182-190 NusG VVP 010810468.1 GYVLVEMEM 79-87 NusG VVP 010888679.1 GYVFVQMDV 65-73 NusG EHI40717.1 GYILVRMDL 133-141 NusG BAA17420.1 GYVLIRMIM 82-90 NusG BAD79080.1 GYVLVRMIL 86-94 Selon un mode préféré de réalisation, la protéine NusG/SPT5 exprimée dans le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention comprend une mutation consistant en une transposition du septième acide aminé (soit une Alanine soit une Serine soit une 20 Méthionine soit une Isoleucine) en tout acide aminé autre que l'acide aminé présent dans la séquence native. Plus préférentiellement, la mutation consistant en une transposition du septième acide 10 aminé (soit une Alanine soit une Serine soit une Méthionine soit une Isoleucine) en Proline est introduite. L'homme du métier saura repérer l'équivalence structurale de la position de la mutation. 5 Par exemple chez Saccharomyces cerevisiae, l'acide aminé en position 7 de la séquence consensus correspond à l'Alanine en position 339 dans la protéine SPT5. La chaine latérale de l'alanine 339 est orientée vers le coeur hydrophobe de ce domaine et pointe vers les résidus 1322, 1337, V344 et 1345. Par ailleurs, elle est vicinale de l'acide glutamique E338, bien décrit dans la littérature pour interagir par liaison hydrogène 10 directement avec la protéine SPT4 de S. cerevisiae. La mutation consiste avantageusement en une substitution de l'Alanine 339 par tout acide aminé autre qu'une Alanine. Plus préférentiellement, la mutation consiste en une substitution de l'Alanine 339 par une Proline. Par exemple chez Escherichia coll, l'acide aminé en position 7 de la séquence 15 consensus correspond à une Méthionine en position 73 dans la protéine NusG. La mutation consiste avantageusement en une substitution de la Méthionine en position 73 en tout acide aminé autre qu'une Méthionine. Plus préférentiellement, la mutation consiste en une substitution de la Méthionine en position 73 par une Proline. Par exemple chez Cupriavidus necator, l'acide aminé en position 7 de la séquence 20 consensus correspond à une Méthionine en position 85 dans la protéine NusG. La mutation consiste avantageusement en une substitution de la Méthionine en position 85 par tout acide aminé autre qu'une Méthionine. Plus particulièrement, la mutation consiste en une substitution de la Méthionine en position 85 par une Proline. Par exemple chez Synechococcus elongatus, l'acide aminé en position 7 de la 25 séquence consensus correspond à une Méthionine en position 92 dans la protéine NusG. La mutation consiste avantageusement en une substitution de la Méthionine en position 92 par tout acide aminé autre qu'une Méthionine. Plus préférentiellement, la mutation consiste en une substitution de la Méthionine en position 92 par une Proline. Par exemple chez Nannochloropsis gaditana, l'acide aminé en position 7 de la 30 séquence consensus correspond à une Méthionine en position 50 dans la protéine SPT5. La mutation consiste avantageusement en une substitution d'une Méthionine en position 50 en tout acide aminé autre qu'une Méthionine. Plus préférentiellement, la mutation consiste en une substitution de la Méthionine en position 50 par une Proline. Par exemple chez Phaeodactylum tricornutum, l'acide aminé en position 7 de la 35 séquence consensus correspond à une Sérine en position 260 dans la protéine SPT5. La mutation consiste avantageusement en une substitution d'une Sérine en position 260 par tout acide aminé autre qu'une Serine. Plus préférentiellement, la mutation consiste 11 en une substitution de la Sérine en position 260 par une Proline. Par exemple chez Synechocystis sp., l'acide aminé en position 7 de la séquence consensus correspond à une Méthionine en position 88 dans la protéine NusG. La mutation consiste avantageusement en une substitution d'une Méthionine en 5 position 88 par tout acide aminé autre qu'une Méthionine. Plus préférentiellement, la mutation consiste en une substitution de la Méthionine en position 88 par une Proline. Par exemple chez Rhodococcus opacus, l'acide aminé en position 7 de la séquence consensus correspond à une Méthionine en position 139 dans la protéine NusG. La mutation consiste avantageusement en une substitution d'une Méthionine en 10 position 139 par tout autre acide aminé autre qu'une Méthionine. Plus préférentiellement, la mutation consiste en une substitution de la Méthionine en position 139 par une Proline. Par exemple chez Aspergillus piger, l'acide aminé en position 7 de la séquence consensus correspond à une Méthionine en position 274 dans la protéine SPT5. La mutation consiste avantageusement en une substitution d'une Méthionine en 15 position 274 par tout autre acide aminé autre qu'une Méthionine. Plus préférentiellement, la mutation consiste en une substitution de la Méthionine en position 274 par une Proline. L'expression d'un gène codant pour une protéine NusG/SPT5 mutée dans le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention peut être faite par tout moyen connu de l'homme du métier. 20 Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le microorganisme est génétiquement modifié par l'introduction dans son génome d'un gène codant pour une protéine mutée telle que définie précédemment. Ce gène hétérologue comprend une séquence codant pour la protéine mutée et les éléments de régulations nécessaires à son expression dans l'organisme hôte, notamment promoteurs et séquences de terminaison, 25 bien connues de l'homme du métier. Lorsque l'organisme génétiquement modifié comprend une séquence native codant pour une protéine NusG/SPT5, la protéine mutée codée par le gène hétérologue peut être identique à celle de l'organisme hôte, à l'exception de la mutation, ou bien être une protéine d'un autre organisme avec la mutation telle que définie précédemment. 30 Avantageusement, la protéine NusG/SPT5 mutée exprimée dans le microorganisme hôte a la même séquence que la protéine NusG/SPT5 native, à l'exception de la mutation. Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, le microorganisme est génétiquement modifié par mutagénèse dirigée dans le gène natif codant pour la protéine NusG/SPT5, de manière à remplacer les codons codant pour l'acide aminé à substituer par 35 les codons codant pour un autre acide aminé, tel que défini précédemment. Les techniques de mutagénèse dirigée sont bien connues de l'homme du métier, en particulier les techniques de recombinaisons homologues (Datsenko and Wanner, 2000; 12 Lodish et al., 2000) pour modifier l'expression d'un gène et/ou l'activité de la protéine encodée (Thomas and Capecchi, 1987), l'utilisation de nucléases à doigts de zinc (Kim et al., 1996), l'utilisation de nucléases effectrices de type activateur de transcription, dites « TALEN » (Ousterout et al., 2016), l'utilisation d'un système combinant des nucléases de 5 type Cas9 avec des courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées dites `CRISPR' (Cong et al., 2013; Mali Prashant, 2013), ou encore l'utilisation de méganucléases (Daboussi et al., 2012). L'homme du métier saura déterminer les séquences d'acides nucléiques nécessaires à la modification de la séquence codant pour la protéine NusG/SPT5 de manière à 10 substituer un acide aminé par un autre acide aminé. Selon un mode de réalisation de l'invention, le microorganisme génétiquement modifié comprend un gène codant pour une protéine SPT5 ou un homologue de ce dernier. Ces microorganismes sont en particulier les microorganismes eucaryotes, plus particulièrement les protistes, les champignons (fungi) et les levures. 15 Par homologue du gène SPT5 on entend selon l'invention un gène codant pour une protéine ayant un domaine NGN comprenant au moins 40 % d'identité avec le domaine NGN de la protéine SPT5 de Saccharomyces cerevisiae (EIVV08248.1) et ayant une activité de facteur d'élongation de la transcription. La mutation est avantageusement introduite dans la zone conservée définie par la 20 séquence consensus suivante : GRIYIEAPK (SEQ ID NO 1) Cette séquence consensus est localisée entre les acides aminés 333 et 341 de la séquence SPT5 de Saccharomyces cerevisiae (EIVV08248.1) et peut être retrouvée aisément par l'homme du métier par simple alignement de séquence. Cette mutation consiste plus avantageusement à modifier l'alanine en position 7 de 25 cette séquence consensus par un autre acide aminé en particulier par un résidu proline, comme défini précédemment. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le microorganisme génétiquement modifié comprend un gène codant pour une protéine NusG ou un homologue de ce dernier. Ces organismes sont en particulier les microorganismes procaryotes. 30 Par homologue du gène nusG on entend selon l'invention un gène codant pour une protéine comprenant au moins 50 % d'identité avec la protéine NusG de Escherichia cou (NP_418409.1) et ayant une activité de facteur d'élongation de la transcription. La mutation est avantageusement introduite dans la zone conservée définie par la séquence consensus suivante : GYVLVQMVM (SEQ ID NO 7) 35 Cette séquence consensus est localisée entre les acides aminés 67 et 75 de la séquence NusG de Escherichia cou (NP_418409.1) et peut être retrouvée aisément par l'homme du métier par simple alignement de séquence. 13 Cette mutation consiste plus avantageusement à modifier le résidu méthionine en position 7 de cette séquence consensus par un autre acide aminé, en particulier par un résidu proline. Une amélioration de l'activité de la RuBisCO est observée lorsque l'activité du 5 microorganisme modifié au niveau d'un facteur d'élongation de la transcription responsable de la modulation de la processivité de l'ARN polymerase selon l'invention est supérieure à celle du même microorganisme sans cette modification au niveau d'un facteur d'élongation de la transcription responsable de la modulation de la processivité de l'ARN polymerase. De préférence l'activité est améliorée d'au moins un facteur 2, plus préférentiellement d'au 10 moins un facteur 5. Les microorganismes modifiés selon l'invention peuvent comprendre les gènes nécessaires à l'expression d'une RuBisCO fonctionnelle native. De manière avantageuse, le facteur d'élongation de la transcription est le gène nusG/SPT5, ou un homologue de ce dernier, en particulier modifié par l'introduction d'une mutation telle que définie ci-dessus. 15 Selon un autre aspect de l'invention les organismes modifiés sont des microorganismes qui n'expriment pas de RuBisCO fonctionnelle native et sont également modifiés avec un ensemble de gènes hétérologues nécessaires à l'expression d'une RuBisCO fonctionnelle. L'ensemble de gènes pour l'expression d'une RuBisCO fonctionnelle comprend les 20 gènes codant pour les sous-unités de la RuBisCO et les gènes codant pour les protéines chaperonnes nécessaires à l'assemblage des sous-unités de la RuBisCO. Ces différents gènes peuvent être natifs ou hétérologues et selon les microorganismes considérés, certains de ces gènes peuvent être natifs et d'autres hétérologues. 25 Les gènes codant pour ces protéines nécessaires à l'expression d'une RuBisCO fonctionnelle et la modification de microorganismes pour l'expression d'une RuBisCO fonctionnelle sont bien connus de l'homme du métier. Il existe plusieurs formes de RuBisCO dans la nature (Tabita et al., J Exp Bot. 2008;59(7):1515-24. doi: 10.1093/jxb/erm361). Les formes I, Il et III catalysent les réactions de carboxylation et d'oxygénation du ribulose 1,5- 30 biphosphate. La forme I est présente chez les eucaryotes et les bactéries. Elle est constituée de deux types de sous-unités : des grandes sous-unités (RbcL) et des petites sous-unités (RbcS). Le complexe enzymatique fonctionnel est un hexadécamère constitué de huit sous-unités L et huit sous-unités S. L'assemblage correct de ces sous-unités nécessite en outre l'intervention d'au moins une chaperonne spécifique : RbcX (Liu et al., 35 Nature. 2010 Jan 14;463(7278):197-202. doi: 10.1038/nature08651). La forme II se trouve principalement chez les protéobactéries, les archaea et les algues dinoflagellées. Sa structure est beaucoup plus simple : il s'agit d'un dimère formé de deux sous-unités RbcL 14 identiques. Selon l'organisme, les gènes codant pour une RuBisCO de type I peuvent s'appeler rbcL/rbcS (par exemple, Synechococcus elongatus), ou encore cbxLC/cbxSC, cfxLC/cfxSC, cbbL/cbbS (par exemple, Cupriavidus necator). Selon l'organisme, les gènes codant pour une RuBisCO de type II s'appellent généralement cbbM (par exemple, 5 Rhodospirillum rubrum). La forme III est présente chez les archaea. On la trouve généralement sous la forme de dimères de sous-unité RbcL, ou en pentamères de dimères. Selon l'organisme, les gènes codant pour une RuBisCO de type III peuvent s'appeler rbcL (par exemple, Thermococcus kodakarensis), cbbL (par exemple, Haloferax sp.). Dans un mode de réalisation particulier, la mutation NusG/SPT5 décrite dans cette 10 invention sera introduite dans un microorganisme qui n'exprime pas une RuBisCO fonctionnelle native et génétiquement modifié pour exprimer une RuBisCO fonctionnelle de type I tel que décrit dans WO 2014/096391 et WO 2015/107496. Dans un mode de réalisation particulier, la mutation NusG/SPT5 décrite dans cette invention sera introduite dans un microorganisme qui n'exprime pas une RuBisCO 15 fonctionnelle native et génétiquement modifié pour exprimer une RuBisCO fonctionnelle de type II tel que décrit dans WO 2014/129898 et WO 2015/177800. L'assemblage correct des sous-unités de la RuBisCO nécessite en outre l'intervention d'au moins une chaperonne tel que RbcX, GroEL, GroES comme décrit dans WO 2014/129898 et WO 2015/107496. 20 Ces organismes peuvent être eucaryotes ou procaryotes, comme défini précédemment. Avantageusement, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention exprime des protéines natives présentant une activité phosphofructokinase, en particulier PFK, et/ou un répresseur transcriptionnel impliqué dans la voie de signalisation du glucose, 25 en particulier STD1. On citera en particulier les levures et les bactéries. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le microorganisme est également modifié avec une altération de l'activité phosphofructokinase et/ou de l'activité répresseur transcriptionnel impliqué dans la voie de signalisation du glucose lorsque ces activités sont présentes dans le microorganisme modifié selon l'invention. On entend par 30 altération de l'activité, sa diminution, son atténuation ou sa suppression. L'activité phosphofructokinase responsable de la conversion du fructose-6-phosphate en fructose-1,6-bisphosphate, en utilisant le couple ATP/ADP comme cofacteur, est due à une enzyme phosphofructokinase (PFK, EC :2.7.1.11). Selon l'organisme, les enzymes peuvent s'appeler PFK, PFK1, PFK2, pfkA, pfkB, ATP-dependent 6-phosphofructokinase, 35 ATP-PFK, Phosphofructokinase 2, Phosphohexokinase). Cette enzyme est bien connue dans la voie de la glycolyse. 15 Tableau 3 : Exemples de séquences codant pour une PFK Gène GenBank GI Organisme PFK2 NP 013932 855245 Saccharomyces cerevisiae PFK XP 502897 2910306 Yarrowia lipolytica PFK2 XP 721378 3637056 Candida albicans pfkA N P_418351 948412 Escherichia coli PFK XP 002490159 8196884 Pichia pastoris Par exemple, chez Saccharomyces cerevisiae, l'enzyme PFK est un octamère composé de dimères de deux sous-unités différentes: PFK1 et PFK2 (Arvanitidis and 5 Heinisch, 1994). Les deux sous-unités partagent 55% d'identité et 71% d'homologie. Chaque sous-unité a un site catalytique et un site régulateur. Les études de mutations ont montré qu'une activité d'au moins 50% peut être conservée lors de l'inactivation de l'une des sous-unités par des mutations ciblées du domaine catalytique. Aucune activité ne peut être détectée lors du knock-out d'un des deux gènes (Heinisch, 1986). 10 La diminution de l'activité PFK, son atténuation ou sa suppression peut être faite par tous les moyens connus de l'homme du métier. Les moyens mis en oeuvre peuvent consister en particulier à supprimer tout ou partie du ou des gènes codant pour l'enzyme PFK. La suppression d'une partie ou de la totalité d'un gène peut être obtenue par toute méthode connue en soi par l'homme de l'art. Par exemple, la suppression d'une partie ou 15 de la totalité d'un gène peut être obtenue par introduction d'un codon stop dans la séquence codante du gène via des méthodes d'édition génomique qui permettent de directement apporter des modifications génétiques à un génome donné, via l'utilisation de nucléases à doigts de zinc (Kim et al., PNAS; 93: 1156-1160), de nucléases effectrices de type activateur de transcription, dites « TALEN » (Ousterout et al., Methods Mol Biol. 20 2016;1338:27-42. doi: 10.1007/978-1-4939-2932-0_3), d'un système combinant des nucléases de type Cas9 avec des courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées dites `CRISPR' (Mali et al., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63. doi: 10.1038/nmeth.2649), ou encore de méganucléases (Daboussi et al., Nucleic Acids Res. 2012. 40:6367-79). D'autres méthodes peuvent consister en particulier en la 25 modification des éléments de régulation du gène, par exemple en remplaçant le promoteur natif par un promoteur plus faible dans l'organisme hôte. La modification des éléments de régulation d'un gène peut être réalisée par toute méthode connue en soi par l'homme de l'art. Par exemple, la modification des éléments de régulation d'un gène pourra être obtenue par la modification d'une séquence promotrice du gène pour altérer son expression 30 (Kaufmann et al., Methods Mol Biol. 2011;765:275-94. doi: 10.1007/978-1-61779-197- 16 0_16). Par exemple la modification des éléments de régulation d'un gène pourra être obtenue par extinction du gène en utilisant des ARN interférents, ribozymes ou antisens (Daneholt, 2006. Nobel Prize in Physiology or Medicine). Dans le contexte de la présente invention, le terme "ARN interférent" ou "ARNi" désigne toute molécule d'ARNi (par 5 exemple ARN monocaténaire ou ARN bicaténaire) qui peut bloquer l'expression d'un gène cible et/ou faciliter la dégradation de l'ARNm correspondants. Elle peut aussi consister à modifier la protéine, par exemple en supprimant des acides aminés dans sa partie N- ou C- terminale. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la diminution de l'activité est obtenue par l'introduction d'une mutation dans la 10 séquence codante du gène codant pour l'enzyme PFK, en particulier cette mutation consistant en un codon « stop ». En particulier, chez Saccharomyces cerevisiae, cette mutation consiste en un codon « stop » introduit au niveau de sa partie N- ou C- terminale. En particulier, chez Saccharomyces cerevisiae, cette mutation consiste en un codon « stop » introduit au niveau de l'acide aminé Tyrosine 611. 15 La mutation se trouve dans le site de régulation de la phosphofructokinase au Fructose 2,6 diphosphate. Cette mutation engendre la dérégulation de l'enzyme diminuant ainsi son activité. L'activité phosphofructokinase résiduelle est comprise entre 10% et 40%. STD1 est un gène non essentiel, codant pour un répresseur transcriptionnel impliqué dans la voie de signalisation du glucose (Schmidt et al., 1999). 20 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, une mutation est introduite dans la séquence codante du gène codant pour la protéine STD1, cette mutation consistant en une transposition de la Tyrosine 85 en Asparagine, ou en une transposition de tous autres acides aminés conservés à la position équivalente. Selon l'organisme les gènes codant pour STD1 peuvent s'appeler MSN3, SFS3. 25 Tableau 4 : Exemples de séquences codant pour STD1 Gène GenBank GI Organisme STD1 N P 014690.1 854212 Saccharomyces cerevisiae STD1 XP 018735619 30033224 Sugiyamaella lignohabitans STD1 XP 710929 3647459 Candida albicans Encore plus avantageusement, le microorganisme est génétiquement modifié selon l'invention au niveau d'un facteur d'élongation de la transcription (NusG/SPT5), d'une phosphofructokinase (PFK) et d'un répresseur transcriptionnel impliqué dans la voie de 30 signalisation du glucose (STD1), cela de manière combinée, soit en combinant les mutations NusG/SPT5 et PFK, soit en combinant les mutations NusG/SPT5 et STD1, soit en combinant les mutations STD1 et PFK, soit en combinant les mutations NusG/SPT5, 17 PFK et STD1. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les trois mutations telles que décrites ci-dessus et dans les exemples peuvent être introduite seules ou en combinaison dans un microorganisme, exprimant une RuBisCO fonctionnelle, modifié ou non au niveau 5 de la glycolyse et/ou au niveau de la voie des pentoses phosphates afin d'améliorer le rendement de production de molécules d'intérêt à partir de sucres et de dioxyde de carbone comme décrit par exemple dans les demandes WO 2014/129898, PCT/EP2018/052005 déposée le 26 janvier 2018 et PCT/EP2018/052004 déposée le 26 janvier 2018. L'invention concerne également un microorganisme génétiquement modifié, tel que 10 décrit précédemment, qui est en plus modifié pour produire des molécules d'intérêt. Ces molécules d'intérêt peuvent être un un mono ou polyalcool, un ester, un éther, un acide, un aldéhyde, une cétone ou un hydrocarbure tel qu'un alcane, un alcène ou un alcyne. La molécule d'intérêt peut être linéaire ou cyclique et peut être saturée ou insaturée. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour 15 produire ou surproduire des alcools tel que l'éthanol, le 1,3 propanediol, le 1,2 propanediol, le 1,4 butanediol, le 2,3 butanediol, le 1,3 butanediol, etc.. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire au moins un acide aminé, tel que l'arginine, la lysine, la méthionine, la thréonine, la proline, le glutamate, l'homosérine, l'isoleucine et la valine. 20 Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire des molécules de la voie des isoprénoïdes, tel que le farnésène, de la voie des terpènes et de la voie des caroténoïdes. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire une vitamine ou un précurseur, tel que le pantoate, le pantothenate, 25 le transneurosporène, le phylloquinone, la vitamine B12, la vitamine B2, les précurseurs de la vitamine C et tocophérols. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un stérol, tel que le squalène, cholestérol, testostérone, progestérone et la cortisone. 30 Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un flavonoïde, tel que la frambinone et la vestinone. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un acide organique, tel que l'acide citrique, l'acide coumarique, l'acide 3-hydroxypropionique, l'acide acétique, l'acide lactique, l'acide itaconique, l'acide 35 gluconique, etc. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un polyol, préférentiellement choisi parmi le sorbitol, xylitol et le 18 glycérol. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un polyamine, préférentiellement de la spermidine. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour 5 produire ou surproduire une molécule aromatique à partir d'une hydroxylation stéréospécifique, via un cytochrome p450 NADP-dépendant, préférentiellement choisie parmi les phénylpropanoïdes, terpènes, lipides, tannins, arômes, hormones. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire des acides gras et des lipides. 10 L'invention concerne également un procédé de culture d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'invention, comprenant la culture dudit microorganisme dans un milieu de culture approprié en présence d'une source de carbone comprenant du dioxyde de carbone. La croissance des microorganismes produit une biomasse, puis est suivie d'une étape 15 de récupération des métabolites d'intérêt à partir de la biomasse et/ou du surnageant de culture obtenus. La biomasse comme les métabolites d'intérêt présents dans la biomasse et/ou dans le surnageant de culture pourront être récoltés, séparés, puis pourront être traités par toute méthode connue (purification, séchage, broyage, extraction de métabolites, etc.). 20 Le terme « milieu de culture approprié » désigne d'une manière générale un milieu de culture stérile apportant les nutriments essentiels ou bénéfiques à la maintenance et/ou à la croissance dudit microorganisme, tels que les sources azotées telles que le sulfate d'ammonium ; les sources de phosphores, par exemple, le potassium phosphate monobasique ; les oligo-éléments, par exemple, les sels de cuivre, d'iodure, de fer, de 25 magnésium, de zinc ou de molybdate ; les vitamines et autres facteurs de croissance tels que des acides aminés ou autres promoteurs de croissance. Un antimousse peut être ajouté selon les besoins. Selon l'invention, ce milieu de culture approprié peut être chimiquement défini ou complexe. Le milieu de culture peut ainsi être de composition identique ou similaire à un milieu synthétique, tel que défini par Verduyn et al., (Yeast. 1992. 30 8:501-17), adapté par Visser et al., (Biotechnology and bioengineering. 2002. 79:674-81), ou commercialement disponible tel que le milieu YNB (Yeast Nitrogen Base, MP Biomedicals ou Sigma-Aldrich). La source de carbone comprend du dioxyde de carbone. L'apport en dioxyde de carbone se fait par ajout de dioxyde de carbone gazeux ou sous forme de carbonate à l'état 35 solide pour une culture sous atmosphère contrôlée, par exemple en contrôlant l'atmosphère au contact du milieu de culture, ou encore en faisant buller le gaz seul ou en mélange avec d'autres éléments gazeux dans le milieu de culture. 19 Dans un premier mode de réalisation de l'invention, le procédé de culture est mis en oeuvre avec le dioxyde de carbone comme seule source de carbone et un apport d'énergie. Il existe différents types de sources « d'énergie » utilisables par les êtres vivants. Par exemple les composés organiques réduits (glucides, acides organiques), mais aussi les 5 composés minéraux réduits (H2, NH3, CH4, sulfites et thiosulfates) ou encore la lumière et les électrons. Dans mode de réalisation particulier, le procédé de culture est mis en oeuvre avec des microorganismes photosynthétiques en mode autotrophe, avec le dioxyde de carbone comme seule source de carbone et un apport de lumière. Les microorganismes 10 photosynthétiques pouvant être cultivés en mode autotrophe sont bien connus, en particulier choisis parmi les protistes, en particulier les microalgues et les cyanobactéries. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la source de carbone est le dioxyde de carbone et le procédé est mis en oeuvre en présence d'hydrogène. Ce procédé est mis en oeuvre en particulier pour des microorganismes capables de croitre dans des 15 conditions chemolithoautotrophes. Il s'agit en particulier de microorganismes qui ont une activité hydrogénase endogène ou hétérologue, comme les microorganismes de genre Cupriavidus ou Rhodococcus, Escherichia ou encore Saccharomyces génétiquement modifiés. L'hydrogène gazeux est ajouté pour une culture sous atmosphère contrôlée, par 20 exemple en contrôlant l'atmosphère au contact du milieu de culture, ou encore en faisant buller le gaz seul ou en mélange avec le dioxyde de carbone et d'autres éléments gazeux dans le milieu de culture. Pour les microorganismes capables de croitre sur une source de carbone organique comme seule source de carbone, comme les bactéries, les levures, les champignons et 25 certaines protistes, le milieu de culture peut également contenir une source de carbone organique et du dioxyde de carbone. La source de carbone organique est généralement dissoute dans le milieu de culture. En particulier, le milieu de culture peut comprendre une source de carbone organique simple comme source de carbone organique, telle le glucose, le galactose, le saccharose, 30 les mélasses, ou les sous-produits de ces sucres. Selon la présente invention, la source de carbone simple doit permettre la croissance normale du microorganisme d'intérêt. Il est également possible, dans certains cas, d'utiliser une source de carbone complexe, telle que de la biomasse lignocellulosique, de la paille de riz, ou de l'amidon. L'utilisation d'une source de carbone complexe nécessite généralement un prétraitement avant utilisation. 35 Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture contient au moins une source de carbone parmi les monosaccharides tels que le glucose, le xylose ou l'arabinose, les disaccharides tels que le saccharose, du glycérol. 20 La source de carbone organique peut être la principale source de carbone dans le milieu de culture, l'homme du métier pouvant déterminer le rapport carbone organique / dioxyde de carbone approprié à ses objectifs de croissance et de production de métabolites d'intérêt. 5 Certains microorganismes capables de croitre sur une source de carbone organique comme seule source de carbone peuvent aussi réagir à la lumière, comme certains organismes photosynthétiques qui sont également capables de croitre sur une source de carbone, sans lumière, en mode hétérotrophe. Pour ces microorganismes, il peut être avantageux de les cultiver en mode 10 mixotrophe, c'est à dire avec du dioxyde de carbone et une source de carbone organique, avec un apport de lumière. Que ce soit en mode autotrophe ou en mode mixotrophe, l'éclairage (apport de lumière) est fait sous forme continue ou discontinue, notamment avec une alternance de périodes d'éclairage et des périodes d'obscurité, l'alternance pouvant simuler une 15 alternance jour/nuit selon les cycles naturels ou de manière plus contrôlée avec des périodes d'éclairage et des périodes d'obscurité de durées contrôlées égales ou variables. La lumière peut être une lumière naturelle ou artificielle, dans un spectre large ou étroit dans le domaine visible, pouvant aller au proche IR et au proche UV. Les conditions d'apport de lumière en modes autotrophes et mixotrophes sont bien 20 connues de l'homme du métier qui saura les adapter aux microorganismes génétiquement modifiés selon l'invention. Les conditions de culture en modes autotrophe, chemolithoautotrophe, hétérotrophe et mixotrophe, notamment les conditions de température, les milieux de culture appropriés, les apports en nutriments, sont bien connus de l'homme du métier qui saura les adapter 25 aux microorganismes génétiquement modifiés selon l'invention. Selon l'invention, tout mode de culture permettant la production à l'échelle industrielle de molécules d'intérêt peut être envisagé. Avantageusement, la culture se fait en bioréacteurs, notamment en mode batch, fed-batch et/ou culture continue. Préférentiellement, la conduite de culture associée à la production de la molécule d'intérêt 30 est en mode fed-batch correspondant à une alimentation contrôlée en un ou plusieurs substrats, par exemple via l'ajout d'une solution concentrée en glucose dont la concentration peut être comprise entre 200 g.L-1 et 700 g.L-1 pour une culture en mode hétérotrophe ou mixotrophe. Une alimentation contrôlée en vitamines au cours du procédé peut également être bénéfique à la productivité (Alfenore et al., Appl Microbiol Biotechnol. 35 2002. 60:67-72). Il est également possible d'ajouter une solution de sels d'ammonium pour limiter l'apport azoté. La fermentation est généralement conduite en bioréacteurs, avec de possibles étapes 21 de précultures solides et/ou liquides en Erlenmeyers, avec un milieu de culture approprié contenant au moins une source de carbone simple. D'une manière générale, les conditions de culture des microorganismes selon l'invention sont aisément adaptables par l'homme du métier, en fonction du 5 microorganisme. L'invention concerne également la biomasse obtenue par le procédé de culture selon l'invention. La biomasse selon l'invention est constituée des microorganismes cultivés avec ou sans tout ou partie du milieu de culture, notamment constituée par le jus de fermentation en fin de culture. Les microorganismes qui la constituent peuvent être lyses, en partie ou 10 totalement. L'invention concerne également la molécule d'intérêt produite par le microorganisme selon l'invention. Ledit microorganisme peut produire cette molécule en intracellulaire, ou en extracellulaire, dans un procédé de fermentation comme décrit précédemment. Au terme de cette étape de fermentation, une étape de centrifugation est généralement nécessaire 15 afin de séparer la biomasse du surnageant de culture. Lorsque la molécule d'intérêt est produite en intracellulaire, une étape d'extraction de ladite molécule d'intérêt à partir de la biomasse cellulaire produite est nécessaire. La molécule d'intérêt ainsi extraite pourra également être purifiée. Lorsque la molécule d'intérêt est produite en extracellulaire, une étape de séparation de ladite molécule d'intérêt à partir du surnageant de culture est 20 nécessaire. La molécule d'intérêt ainsi séparée pourra également être purifiée. L'homme du métier connaît les méthodes d'extraction et de purification des molécules d'intérêt produites par fermentation et saura les adapter en fonction du microorganisme selon l'invention et de la molécule d'intérêt produite. 25 EXEMPLES Exemple 1 : Construction d'une souche de levure exprimant PRK, RuBisCO et mutée sur le gène SPT5 (A339P). Souche et constructions génétiques. Une souche de levure Saccharomyces cerevisiae, CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 leu2- 30 3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c) issue de la souche commerciale CEN.PK 113-7D (GenBank : JRIV00000000) a été ingéniérée pour exprimer le gène SPT5 endogène muté à la position 339 de sa séquence protéique, et caractériser l'effet de cette mutation sur l'activité de la RuBisCO de Synechococcus elongatus exprimée dans la souche. La construction de la souche SC0002 a été réalisée par recombinaison homologue selon 35 le protocole suivant : Une cassette d'insertion génomique linéaire a été construire à partir de produits PCR assemblés via le protocole NEBuilder® (New England Biolabs, Evry, France), puis amplifiée 22 par une dernière étape de PCR nichée : - Un premier produit PCR a été réalisé sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à partir d'un oligonucléotide sens 1 (SEQ ID NO 12: 5' GCGTCGTCAG GAGAGGAACA GATTC 3') localisé 499 paires de bases en amont du site de mutation 5 (position 1015 de la phase ouverte de lecture) et d'un oligonucléotide antisens 2 (SEQ ID NO 13: 5' GCTTAGGGGG TTCGATATAG ATTCTTCCTG TGTAATTATC 3') localisé au niveau de la position 1015, introduisant la mutation ponctuelle g1015c conduisant à la mutation faux-sens A339P sur la séquence protéique. - Un second produit PCR réalisé sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à 10 l'aide de l'oligonucléotide sens 3 (SEQ ID NO 14 : 5' GAATCTATAT CGAACCCCCT AAGCAATCCG TTATTGAAAA ATTTTG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 24 paires de bases avec l'extrémité 3' de la première PCR, et de l'oligonucléotide antisens 4 (SEQ ID NO 15: 5' CACATATGCA TACATACATA CATACGTATA TG 3') localisé 213 paires de bases en aval du codon STOP de la phase 15 ouverte de lecture du gène SPT5. - Un troisième produit PCR, présentant en 5' une zone de recouvrement de 32 paires de bases avec l'extrémité 3' de la seconde PCR permettant l'amplification de la cassette de résistance BIeMX, entourée de sites LoxP, sur le plasmide pUG66 (Gueldener, 2002) à l'aide des oligonucleotides sens 5 (SEQ ID NO 16 : 5' CATATACGTA TGTATGTATG 20 TATGCATATG TGCGTACGCT GCAGGTCGAC AACC 3') et antisens 6 (SEQ ID NO 17 : 5' CATAGGCCAC TAGTGGATCT GATATCAC 3'). - Un quatrième produit PCR présentant en 5' une zone de recouvrement de 26 paires de bases avec l'extrémité 3' de la troisième PCR, réalisé sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à partir d'un oligonucléotide sens 7 (SEQ ID NO 18: 5' 25 GATATCAGAT CCACTAGTGG CCTATGGCAT ATCTAAATGA AATATCAACT TTATTATGAG GGAG 3') localisé 222 paires de bases en aval du codon STOP de la phase ouverte de lecture du gène SPT5 et d'un oligonucléotide antisens 8 (SEQ ID NO 19 : 5' GATACGATCC TGTGGTGAAA CGGC 3') localisé 560 paires de bases en aval du codon STOP de la phase ouverte de lecture du gène SPT5. 30 Après assemblage via le protocole NEBuilder® (New England Biolabs, Evry, France), le produit final a été amplifié par PCR nichée à l'aide des oligonucléotides sens 9 (SEQ ID NO 20 : 5' CTTGGATATT GAAGCTGAGG TTAGTGATGA TG 3') et antisens 10 (SEQ ID NO 21 : 5' CGATCCTGTG GTGAAACGGC ATGTGCTTTT C 3'). Ce produit PCR a été vérifié par électrophorèse sur gel d'agarose puis nettoyé à l'aide du 35 kit d'extraction NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL SARL, Hoerdt, France). La souche CEN.PK 1605 a ensuite été transformée avec cet ADN linéaire selon le 23 protocole suivant : La souche a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (Yeast extract, Peptone, Dextrose) à 30°C jusqu'en phase exponentielle de croissance. Les cellules ont été centrifugées 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant 5 a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile puis centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500rpm à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 500 pl de solution PLTE (400 pl de Polyéthylène glycol 50%, 50 pl d'acétate de lithium 1 M, 2,5 pl d'Éthylène Diamine Tétra-Acétique 200mM, 5 pl de Tris 1 M pH 7.5, 42,5 pl d'eau). 10pL 10 d'ADN « porteur » (ADN de sperme de saumon dénaturé) à 5 mg/ml, 56 pl de diméthylsulfoxyde et 500 ng de la cassette d'insertion génomique ont été ajoutés sur le mélange réactionnel. Les cellules ont ensuite été mises à incuber 15 min à 30°C, puis 15 min à 42°C. Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de 15 YPD et mises à incuber une nuit à 30°C sous agitation (180 rpm). Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé, les cellules remises en suspension dans 100 pl d'eau physiologique stérile puis étalées sur un milieu de sélection YPD additionné de 80 pg/ml de phléomycine et mises à incuber 72 h à 30°C. 20 Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur ADN génomique et séquençage après amplification de la zone d'intérêt par PCR. Un de ces clones a été référencé SC0002 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c spt5A339P:BIeMX) La souche de levure SC0002 a ensuite été transformée pour exprimer les gènes PRK, RuBisCO (RbcL RbcS) et RbcX de Synechococcus elongatus PCC6301 et les gènes 25 GroES et GroEL de E. coll. La souche a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (Yeast extract, Peptone, Dextrose) à 30°C jusqu'en phase exponentielle de croissance. Les cellules ont été centrifugées 5 minutes à 250Orpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé, les cellules remises en suspension dans 25m1 d'eau stérile puis centrifugées 30 de nouveau pendant 5 minutes à 250Orpm à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 500p1 de solution PLTE. 10 pL d'ADN « porteur » à 5 mg/ml, 56p1 de diméthylsulfoxyde et 300ng de chacun des plasmides navettes suivants ont été ajoutés sur le mélange réactionnel: - P1 : pFL36_PTEF1-RbcX-Tpcm_PPGi1 -G ro ES-TCYCUPTDH3-GrOELTADH1 LEU2 35 - P2 : V51 V51-P-roila-RbcL-TADH1 -PTEFi -RbcS-Tpcm , U RA3 - P3 : pCM185_pCM185-Tet::Pcyci-PRK-TcYci ,TRP1 Les cellules ont ensuite été mises à incuber 15 min à 30°C, puis 15 min à 42°C. Les 24 cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé, les cellules remises en suspension dans 1m1 de YPD et mises à incuber 1 heure à 30°C. Les cellules ont ensuite été centrifugées (5000rpm, 1 min) et le surnageant éliminé. Elles ont ensuite été lavées dans 1m1 d'eau physiologique stérile, centrifugées de 5 nouveau (5000rpm, 1 min), reprises dans 100pld'eau physiologique stérile puis étalées sur un milieu de sélection YNB.D (Yeast Nitrogen base, Dextrose) et mises à incuber 72h à 30°C. Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur colonie et l'un d'eux a été référencé SC0003. 10 Afin de construire une souche contrôle pour l'activité RuBisCO Une souche de levure Saccharomyces cerevisiae, CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 Ieu2-3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c) issue de la souche commerciale CEN.PK 113-7D (GenBank : JRIV00000000) est ingéniérée pour exprimer les gènes PRK, RuBisCO (RbcL RbcS) et RbcX de Synechococcus elongatus PCC6301 et les gènes GroES et GroEL de E. coll. 15 La construction de la souche SC0001 est réalisée selon le protocole suivant : La souche a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (Yeast extract, Peptone, Dextrose) à 30°C jusqu'en phase exponentielle de croissance. Les cellules ont été centrifugées 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile puis 20 centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 500 pl de solution PLTE (400 pl de Polyéthylène glycol 50%, 50 pl d'acétate de lithium 1 M, 2,5 pl d'Éthylène Diamine Tétra-Acétique 200 mM, 5 pl de Tris 1 M pH 7.5, 42,5 pl d'eau). 10 pL d'ADN « porteur » (ADN de sperme de saumon dénaturé) à 5 mg/ml, 56 pl de 25 diméthylsulfoxyde et 300 ng de chacun des plasmides navettes suivants ont été ajoutés sur le mélange réactionnel: - P1 : pFL36_PTEF1-RbcX-Tpck1_Ppci1 _G ro ES-TCYCUPTDH3-GrOELTADH1 LEU2 - P2 : V51_V51-P-roH3-RbcL-TADH1 -PTEFi -RbcS-Tpcm , U RA3 - P3 : pCM185_pCM185-Tet::Pcyci-PRK-TcYci ,TRP1 30 Les cellules ont ensuite été mises à incuber 15 min à 30°C, puis 15 min à 42°C. Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé, les cellules remises en suspension dans 1 ml de YPD et mises à incuber 1 heure à 30°C. Les cellules ont ensuite été centrifugées (5000 rpm, 1 min) et le surnageant éliminé. Elles ont ensuite été lavées dans 1 ml d'eau physiologique stérile, centrifugées de 35 nouveau (500 Orpm, 1 min), reprises dans 100 pl d'eau physiologique stérile puis étalées sur un milieu de sélection YNB.D.CSM-LUW (Yeast Nitrogen Base, Dextrose, Complete Supplement Mixture sans leucine, uracile et tryptophane - MP BIOMEDICALS, Santa Ana, 25 United States) et mises à incuber 72h à 30°C. Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur colonies et l'un d'eux a été référencé SC0001. Exemple 2 : Construction d'une souche de levure exprimant PRK RuBisCO et 5 mutée sur le gène STD1 (Y86N). Souche et constructions génétiques. Deux souches de levure Saccharomyces cerevisiae, CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 leu2- 3.112 trp1-289 ura3-52 MAL.28c) et CEN.PK 1606 (Mat alpha HIS3 leu2-3.112 trp1-289 ura3-52 MAL.28c) issues de la souche commerciale CEN.PK 113-7D (GenBank : 10 JRIV00000000) ont été ingéniérées pour exprimer le gène STD1 endogène muté à la position 86 de sa séquence protéique, et caractériser l'effet de cette mutation sur l'activité de la RuBisCO de Synechococcus elongatus exprimée dans la souche. La construction des souches SC0004 et SC0005 a été réalisée par recombinaison homologue selon le protocole suivant : 15 Une cassette d'insertion génomique linéaire a été construire à partir de produits PCRs assemblés via le protocole NEBuilder® (New England Biolabs, Evry, France), puis amplifiée par une dernière étape de PCR nichée : - Un premier produit PCR réalisé sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à partir d'un oligonucléotide sens 11 (SEQ ID NO 22 : 5' CGTTACCATC GCGATTGTAG 20 GAG 3') localisé 328 paires de bases en amont du site de mutation (position 256 de la phase ouverte de lecture) et d'un oligonucléotide antisens 12 (SEQ ID NO 23: CTGCATTTTC TGGTGGTGTA GTAACAAAAT TGTTGTTG) localisé au niveau de la position 256, introduisant la mutation ponctuelle t256a conduisant à la mutation faux-sens Y86N sur la séquence protéique. 25 - Un second produit PCR réalisé sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à l'aide de l'oligonucléotide sens 13 (SEQ ID NO 24 : 5' CTACACCACC AGAAAATGCA GACAGGGCAA GAATAGAAAT CATAAAAAGG TTATTG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' de la première PCR et de l'oligonucléotide antisens 14 (SEQ ID NO 25 : 5' GTAAGCGTGA CATAACTAAT 30 TACATGATGA ATTCCTAGGA CATTCCATCA GGCTTCCAAT C 3') localisé au niveau de la fin de la phase ouverte de lecture du gène STD1 (y compris le codon STOP) et présentant une zone de recouvrement de 34 paires de bases avec l'extrémité 3' de la troisième PCR. - Un troisième produit PCR permettant l'amplification du promoteur Pcyci issu du gène 35 CYC1 de Saccharomyces cerevisiae (YJR048W, Cytochrome c, isoform 1), obtenu par synthèse de gène (Eurofins Genomics, Nantes, France) et cloné dans le plasmide P4 (pCM185_Tcyci , TRP1) à l'aide des oligonucléotides sens 15 (SEQ ID NO 26 : 5' 26 GAATTCATCA TGTAATTAGT TATGTCAC 3') et antisens 16 (SEQ ID NO 27 : 5' GCATTAAAGC CTTCGAGCGT CC 3'). Un quatrième produit PCR présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l'extrémité 3' de la troisième PCR et permettant l'amplification de la cassette 5 de résistance HphMX, entourée de sites LoxP, sur le plasmide pUG75 (Hegemann and Heick, 2011) à l'aide des oligonucleotides sens 17 (SEQ ID NO 28 : 5' GGACGCTCGA AGGCTTTAAT GCCGTACGCT GCAGGTCGAC AACC 3') et antisens 18 (SEQ ID NO 29 : 5' CATAGGCCAC TAGTGGATCT GATATCAC 3'). Un cinquième produit PCR présentant en 5' une zone de recouvrement de 26 paires de 10 bases avec l'extrémité 3' de la quatrième PCR, réalisée sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à partir d'un oligonucléotide sens 19 (SEQ ID NO 30: 5' GATATCAGAT CCACTAGTGG CCTATGTAAA TTTTTACAAC AACGCAAAAA CGAAATACCC CAC 3') localisé en aval du codon STOP de la phase ouverte de lecture du gène STD1 et d'un oligonucléotide antisens 20 (SEQ ID NO 31 : 5' ATTTGCATAC 15 GGGTAATACC GCGTTG 3') localisé 314 paires de bases en aval du codon STOP de la phase ouverte de lecture du gène STD1. Après assemblage via le protocole NEBuilder® (New England Biolabs, Evry, France), le produit final a été amplifié par PCR nichée à l'aide des oligonucléotides sens 21 (SEQ ID NO 32 : 5' CGATTGTAGG AGGTTTTGCA CTACTTAACA G 3') et antisens 22 (SEQ ID 20 NO 33 : 5' GGTAATACCG CGTTGATAAT AATGTAACAA TC 3'). Ce produit PCR a été vérifié par électrophorèse sur gel d'agarose puis nettoyé à l'aide du kit d'extraction NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL SARL, Hoerdt, France). Les souches CEN.PK 1605 et CEN.PK1606 ont ensuite été transformées avec ces 25 ADN linéaires selon le protocole suivant : Chaque souche a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (Yeast extract, Peptone, Dextrose) à 30°C jusqu'en phase exponentielle de croissance. Les cellules ont été centrifugées 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 25 ml d'eau 30 stérile puis centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 500 pl de solution PLTE (400 pl de Polyéthylène glycol 50%, 50 pl d'acétate de lithium 1 M, 2,5 pl d'Éthylène Diamine Tétra-Acétique 200 mM, 5 pl deTris 1 M pH 7.5, 42,5 pl d'eau). 10 pL d'ADN « porteur » (ADN de sperme de saumon dénaturé) à 5 mg/ml, 56 pl 35 de diméthylsulfoxyde et 500 ng de la cassette d'insertion génomique ont été ajoutés sur le mélange réactionnel. Les cellules ont ensuite été mises à incuber 15 min à 30°C, puis 15 min à 42°C. Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. 27 Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de YPD et mises à incuber une nuit à 30°C sous agitation (180 rpm). Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 100 pl d'eau physiologique stérile puis 5 étalées sur un milieu de sélection YPD additionné de 200 pg/ml d'hygromycine B et mises à incuber 72 h à 30°C. Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur ADN génomique et séquençage après amplification de la zone d'intérêt par PCR. Un de ces clones a été référencé SC0004 pour la souche issue de la transformation de CEN.PK1605 (Mat a HIS3 10 leu2-3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c std1Y86N:HphM) ou SC0005, pour la souche issue de la transformation de CEN.PK1606 (Mat alpha HIS3 leu2-3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c std1Y86N:HphM). La souche de levure SC0005 a ensuite été transformée pour exprimer les gènes PRK, RuBisCO (RbcL RbcS) et RbcX de Synechococcus elongatus PCC6301 et les gènes 15 GroES et GroEL de E. coll. La souche a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (Yeast extract, Peptone, Dextrose) à 30°C jusqu'en phase exponentielle de croissance. Les cellules ont été centrifugées 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé, cellules remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile puis centrifugées de 20 nouveau pendant 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 500 pl de solution. 10 pL d'ADN « porteur » à 5 mg/ml, 56 pl de diméthylsulfoxyde et 300 ng de chacun des plasmides navettes suivants ont été ajoutés sur le mélange réactionnel: - P1 : pFL36_PTEF1-RbcX-Tpcm_Ppci1 -G roES-Tcyci_PTDH3-GroELTADH1 LEU2 25 - P2 : V51_V51-P-roH3-RbcL-TADH1 -PTEFi -RbcS-Tpcm , U RA3 - P3 : pCM185_pCM185-Tet::Pcyci-PRK-TcYci ,TRP1 Les cellules ont ensuite été mises à incuber 15 min à 30°C, puis 15 min à 42°C. Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé, les cellules remises en suspension dans 1 ml de YPD et mises à incuber 1 30 heure à 30°C. Les cellules ont ensuite été centrifugées (5000 rpm, 1 min) et le surnageant éliminé. Elles ont ensuite été lavées dans 1 ml d'eau physiologique stérile, centrifugées de nouveau (5000 rpm, 1 min), reprises dans 100 pl d'eau physiologique stérile puis étalées sur un milieu de sélection YNB.D (Yeast Nitrogen base, Dextrose) et mises à incuber 72 h à 30°C. 35 Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur colonie et l'un d'eux a été référencé SC0006. 28 Exemple 3 : Construction d'une souche de levure exprimant PRK RuBisCO et mutée sur le gène PFK2 (Y611*). Souche et constructions génétiques. Une souche de levure Saccharomyces cerevisiae, CEN.PK 1606 (Mat alpha HIS3 5 leu2-3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c) issue de la souche commerciale CEN.PK 113-7D (GenBank : JRIV00000000) a été ingéniérée pour exprimer le gène PFK2 endogène tronquée dans sa séquence protéique en position 611 et caractériser l'effet de cette mutation sur l'activité de la RuBisCO de Synechococcus elongatus exprimée dans la souche. 10 La construction de la souche SC0007 a été réalisée par recombinaison homologue selon le protocole suivant : Une cassette d'insertion génomique linéaire a été construire à partir de produits PCR assemblés via le protocole NEBuilder® (New England Biolabs, Evry, France), puis amplifiée par une dernière étape de PCR nichée : 15 - Un premier produit PCR réalisée sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à partir d'un oligonucléotide sens 23 (SEQ ID NO 34 : 5' CTTGGCTACT TTACAAGGTC TTGAG 3') localisé 351 paires de bases en amont du site de mutation (position 1833 de la phase ouverte de lecture) et d'un oligonucléotide antisens 24 (SEQ ID NO 35 : 5' ACATTAAGTA GCCATCGAGT AGACGGCAGA G 3') localisé au niveau de la position 20 1833, introduisant la mutation ponctuelle c1833a conduisant à la mutation non-sens Y611* sur la séquence protéique. - Un second produit PCR réalisé sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à l'aide de l'oligonucléotide sens 25 (SEQ ID NO 36: GTCTACTCGATGGCTACTTAATGTATGTCCCAAG) présentant en 5' une zone de 25 recouvrement de 24 paires de bases avec l'extrémité 3' de la première PCR, et de l'oligonucléotide antisens 26 (SEQ ID NO 37: 5' GGTAGTACTTGTATTATTAAAAGAAAGGAACAAAAAATTCATTG 3') localisé 151 paires de bases en aval du codon STOP de la phase ouverte de lecture du gène PFK2. - Un troisième produit PCR, présentant en 5' une zone de recouvrement de 44 paires de 30 bases avec l'extrémité 3' de la seconde PCR permettant l'amplification de la cassette de résistance NatMX, entourée de sites LoxP, sur le plasmide pUG74 (Hegemann and Heick, 2011) à l'aide des oligonucleotides sens 27 (SEQ ID NO 38 : 5' CAATGAATTT TTTGTTCCTT TCTTTTAATA ATACAAGTAC TACCCGTACG CTGCAGGTCG ACAACC 3') et antisens 28 (SEQ ID NO 39: 5' CATAGGCCAC TAGTGGATCT 35 GATATCAC 3'). - Un quatrième produit PCR présentant en 5' une zone de recouvrement de 28 paires de bases avec l'extrémité 3' de la troisième PCR, réalisée sur l'ADN génomique de la 29 souche CEN.PK 1606 à partir d'un oligonucléotide sens 29 (SEQ ID NO 40: 5' GTGATATCAG ATCCACTAGT GGCCTATGCC ATGAAACCAA TATTATCATG CATTTTTATG AATGTC 3') localisé 152 paires de bases en aval du codon STOP de la phase ouverte de lecture du gène PFK2 et d'un oligonucléotide antisens 30 (SEQ ID 5 NO 41 : CATTCACTCT TTTTGTTTAC ATCTCCGTTC TTCG) localisé 451 paires de bases en aval du codon STOP de la phase ouverte de lecture du gène PFK2. Après assemblage via le protocole NEBuilder® (New England Biolabs, Evry, France), le produit final a été amplifié par PCR nichée à l'aide des oligonucléotides sens 31 (SEQ ID NO 42 : 5' GTCTTGAGGC CGTTAATGCC GTTTTGG 3') et antisens 32 (SEQ ID NO 43 : 10 5' GTTTACATCT CCGTTCTTCG TGATAAGTTC ATAG 3'). Ce produit PCR a été vérifié par électrophorèse sur gel d'agarose puis nettoyé à l'aide du kit d'extraction NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL SARL, Hoerdt, France). La souche CEN.PK 1606 a ensuite été transformée avec cet ADN linéaire selon le 15 protocole suivant : La souche a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPGE (Yeast extract, Peptone, Glycerol, Ethanol) à 30°C jusqu'en phase exponentielle de croissance. Les cellules ont été centrifugées 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 25 ml d'eau 20 stérile puis centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 500 pl de solution PLTE (400 pl de Polyéthylène glycol 50%, 50 pl d'acétate de lithium 1 M, 2,5 pl d'Éthylène Diamine Tétra-Acétique 200mM, 5pI de Tris 1M pH 7.5, 42.5p1 d'eau). 10 pL d'ADN « porteur » (ADN de sperme de saumon dénaturé) à 5 mg/ml, 56 pI de 25 diméthylsulfoxyde et 500 ng de la cassette d'insertion génomique ont été ajoutés sur le mélange réactionnel. Les cellules ont ensuite été mises à incuber 15 min à 30°C, puis 15 min à 42°C. Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de YPGE et mises à incuber une nuit à 30°C sous agitation (180 rpm). Les cellules ont été 30 centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 100 pI d'eau physiologique stérile puis étalées sur un milieu de sélection YPGE additionné de 50 pg/ml de nourseothricine et mises à incuber 72 h à 30°C. Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur ADN génomique et 35 séquençage après amplification de la zone d'intérêt par PCR. Un de ces clones a été référencé SC0007 (Mat alpha HIS3 leu2-3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c pfk2Y611*:NatMX) 30 La souche de levure SC0007 a ensuite été transformée pour exprimer les gènes PRK, RuBisCO (RbcL RbcS) et RbcX de Synechococcus elongatus PCC6301 et les gènes GroES et GroEL de E. coll. La souche a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPGE à 5 30°C jusqu'en phase exponentielle de croissance. Les cellules ont été centrifugées 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile puis centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 rpm min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 500 pl de solution PLTE. 10 10 pL d'ADN « porteur » à 5 mg/ml, 56 pl de diméthylsulfoxyde et 300 ng de chacun des plasmides navettes suivants ont été ajoutés sur le mélange réactionnel: - P1 : pFL36_PTEF1-RbcX-Tpck1_Ppci1 -G ro ES-TCYCUPTDH3-GrOEL-TADH1 LEU2 - P2 : V51 V51-P-roH3-RbcL-TADH1 -PTEFi -RbcS-Tpcm , U RA3 - P3 : pCM185_pCM185-Tet::Pcyci-PRK-TcYci ,TRP1 15 Les cellules ont ensuite été mises à incuber 15 min à 30°C, puis 15 min à 42°C. Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé, les cellules remises en suspension dans 1 ml de YPD et mises à incuber 1 heure à 30°C. Les cellules ont ensuite été centrifugées (5000 rpm, 1 min) et le surnageant éliminé. Elles ont ensuite été lavées dans 1 ml d'eau physiologique stérile, centrifugées de 20 nouveau (5000 rpm, 1 min), reprises dans 100 pl d'eau physiologique stérile puis étalées sur un milieu de sélection YNB.E.AAM-LUW (Yeast Nitrogen base, Ethanol, Amino-Acid Mix sans Leucine, Uracile et tryptophane : adénine 10 mg/1, alanine 76 mg/1, arginine 50 mg/1, asparagine 76 mg/1, acide aspartique 80 mg/1, cystéine 76 mg/1, acide glutamique 76 mg/1, glutamine 76 mg/1, glycine 76 mg/1, histidine 20 mg/1, isoleucine 50 mg/1, lysine 50 25 mg/1, méthionine 20 mg/1, phénylalanine 50 mg/1, proline 76 mg/1, serine 76 mg/1, thréonine 100 mg/1, tyrosine 50 mg/1, valine 140 mg/1) et mises à incuber 72 h à 30°C. Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur colonie et l'un d'eux a été référencé SC0008. Exemple 4 : Construction d'une souche de levure exprimant PRK RuBisCO et 30 mutée sur les gènes SPT5 (A339P) et STD1 (Y86N). Souche et constructions génétiques. Une souche de levure Saccharomyces cerevisiae, CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 leu2- 3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c) issue de la souche commerciale CEN.PK 113-7D (GenBank : JRIV00000000) a été ingéniérée pour exprimer le gène SPT5 endogène muté 35 à la position 339 de sa séquence protéique et de gène STD1 muté en position 86 de sa séquence protéique, et caractériser l'effet de ces mutations sur l'activité de la RuBisCO de Synechococcus elongatus exprimée dans la souche. 31 La construction de la souche SC0009 a été réalisée par recombinaison homologue selon le protocole suivant : Deux cassette d'insertion génomique linéaire ont été construites à partir de produits PCRs assemblés via le protocole NEBuilder® (New England Biolabs, Evry, France), puis 5 amplifiée par une dernière étape de PCR nichée. Cassette spt5A339P : - Un premier produit PCR réalisée sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à partir d'un oligonucléotide sens 1 (SEQ ID NO 12) localisé 499 paires de bases en amont du site de mutation (position 1015 de la phase ouverte de lecture) et d'un 10 oligonucléotide antisens 2 (SEQ ID NO 13') localisé au niveau de la position 1015, introduisant la mutation ponctuelle g1015c conduisant à la mutation faux-sens A339P sur la séquence protéique. - Un second produit PCR réalisé sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à l'aide de l'oligonucléotide sens 3 (SEQ ID NO 14) présentant en 5' une zone de 15 recouvrement de 24 paires de bases avec l'extrémité 3' de la première PCR, et de l'oligonucléotide antisens 4 (SEQ ID NO 15) localisé 213 paires de bases en aval du codon STOP de la phase ouverte de lecture du gène SPT5. - Un troisième produit PCR, présentant en 5' une zone de recouvrement de 32 paires de bases avec l'extrémité 3' de la seconde PCR permettant l'amplification de la cassette 20 de résistance BIeMX, entourée de sites LoxP sur le plasmide pUG66 (Gueldener, 2002) à l'aide des oligonucleotides sens 5 (SEQ ID NO 16). - Un quatrième produit PCR présentant en 5' une zone de recouvrement de 26 paires de bases avec l'extrémité 3' de la troisième PCR, réalisée sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à partir d'un oligonucléotide sens 7 (SEQ ID NO 18) localisé 222 25 paires de bases en aval du codon STOP de la phase ouverte de lecture du gène SPT5 et d'un oligonucléotide antisens 8 (SEQ ID NO 19) localisé 560 paires de bases en aval du codon STOP de la phase ouverte de lecture du gène SPT5. Après assemblage via le protocole NEBuilder® (New England Biolabs, Evry, France), le produit final a été amplifié par PCR nichée à l'aide des oligonucléotides sens 9 (SEQ ID 30 NO 20) et antisens 10 (SEQ ID NO 21). Ce produit PCR a été vérifié par électrophorèse sur gel d'agarose puis nettoyé à l'aide du kit d'extraction NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL SARL, Hoerdt, France). Cassette std1Y86N : 35 - Un premier produit PCR réalisée sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à partir d'un oligonucléotide sens 11 (SEQ ID NO 22) localisé 328 paires de bases en amont du site de mutation (position 256 de la phase ouverte de lecture) et d'un 32 oligonucléotide antisens 12 (SEQ ID NO 23) localisé au niveau de la position 256, introduisant la mutation ponctuelle t256a conduisant à la mutation faux-sens Y86N sur la séquence protéique. - Un second produit PCR réalisé sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à 5 l'aide de l'oligonucléotide sens 13 (SEQ ID NO 24) présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' de la première PCR, et de l'oligonucléotide antisens 14 (SEQ ID NO 25) localisé au niveau de la fin de la phase ouverte de lecture du gène STD1 (y compris le codon STOP) et présentant une zone de recouvrement de 34 paires de bases avec l'extrémité 3' de la troisième PCR. 10 - Un troisième produit PCR permettant l'amplification du promoteur Pcyci issu du gène CYC1 de Saccharomyces cerevisiae (YJR048W, Cytochrome c, isoforme 1), obtenu par synthèse de gène (Eurofins Genomics, Nantes, France) et cloné dans le plasmide P4 (pCM185_Tcyci , TRP1) à l'aide des oligonucleotides sens 15 (SEQ ID NO 26) et antisens 16 (SEQ ID NO 27). 15 - Un quatrième produit PCR présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l'extrémité 3' de la troisème PCR et permettant l'amplification de la cassette de résistance HphMX, entourée de sites LoxP, sur le plasmide pUG75 (Hegemann and Heick, 2011) à l'aide des oligonucleotides sens 17 (SEQ ID NO 28) et antisens 18 (SEQ ID NO 29). 20 - Un cinquième produit PCR présentant en 5' une zone de recouvrement de 26 paires de bases avec l'extrémité 3' de la quatrième PCR, réalisée sur l'ADN génomique de la souche CEN.PK 1605 à partir d'un oligonucléotide sens 19 (SEQ ID NO 30) localisé en aval du codon STOP de la phase ouverte de lecture du gène STD1 et d'un oligonucléotide antisens 20 (SEQ ID NO 31) localisé 314 paires de bases en aval du 25 codon STOP de la phase ouverte de lecture du gène STD1. Après assemblage via le protocole NEBuilder® (New England Biolabs, Evry, France), le produit final a été amplifié par PCR nichée à l'aide des oligonucléotides sens 21 (SEQ ID NO 32) et antisens 22 (SEQ ID NO 33). Ce produit PCR a été vérifié par électrophorèse sur gel d'agarose puis nettoyé à l'aide 30 du kit d'extraction NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL SARL, Hoerdt, France). La souche CEN.PK 1605 a ensuite été transformée avec ces ADN linéaires selon le protocole suivant : La souche a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD 35 (Yeast extract, Peptone, Dextrose) à 30°C C jusqu'en phase exponentielle de croissance. Les cellules ont été centrifugées 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 25 ml d'eau 33 stérile puis centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 500p1 de solution PLTE (400 pl de Polyéthylène glycol 50%, 50 pl d'acétate de lithium 1 M, 2,5 pI d'Éthylène Diamine Tétra-Acétique 200 mM, 5 pI de Tris 1 M pH 7.5, 42,5 pI 5 d'eau). 10 pL d'ADN « porteur » (ADN de sperme de saumon dénaturé) à 5 mg/ml, 56 pI de diméthylsulfoxyde et 500 ng de chacune des 2 cassettes d'insertion génomique ont été ajoutés sur le mélange réactionnel. Les cellules ont ensuite été mises à incuber 15 min à 30°C, puis 15 min à 42°C. Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en 10 suspension dans 1 ml de YPD et mises à incuber une nuit à 30°C sous agitation (180 rpm). Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 100 pI d'eau physiologique stérile puis étalées sur un milieu de sélection YPD additionné de 80 pg/ml de phléomycine et 200 pg/ml d'hygromycine B et mises à incuber 72 h à 30°C. 15 Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur ADN génomique et séquençage après amplification de la zone d'intérêt par PCR. Un de ces clones a été référencés SC0009 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c spt5A339P:BIeMX std1Y86N:HphMX) La souche de levure SC0009 a ensuite été transformée pour exprimer les gènes PRK, 20 RuBisCO (RbcL RbcS) et RbcX de Synechococcus elongatus PCC6301 et les gènes GroES et GroEL de E. coll. La souche a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (Yeast extract, Peptone, Dextrose) à 30°C jusqu'en phase exponentielle de croissance. Les cellules ont été centrifugées 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant 25 a été éliminé, les cellules remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile, puis centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 500 pI de solution PLTE. 10 pL d'ADN « porteur » à 5 mg/ml, 56 pI de diméthylsulfoxyde et 300 ng de chacun des plasmides navettes suivants ont été ajoutés sur le mélange réactionnel: 30 - P1 : pFL36_PTEF1-RbcX-Tpcm_Ppci1 _G ro ES-TCYCUPTDH3-GrOELTADH1 LEU2 - P2 : V51 V51-P-roH3-RbcL-TADH1 -PTEFi -RbcS-Tpcm , U RA3 - P3 : pCM185_pCM185-Tet::Pcyci-PRK-TcYci ,TRP1 Les cellules ont ensuite été mises à incuber 15 min à 30°C, puis 15 min à 42°C. Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant 35 a été éliminé, les cellules remises en suspension dans 1 ml de YPD et mises à incuber 1 heure à 30°C. Les cellules ont ensuite été centrifugées (5000 rpm, 1 min) et le surnageant éliminé. Elles ont été lavées dans 1 ml d'eau physiologique stérile, centrifugées de nouveau 34 (5000 rpm, 1 min), reprises dans 100 pl d'eau physiologique stérile puis étalées sur un milieu de sélection YNB.D (Yeast Nitrogen Base, Dextrose) et mises à incuber 72 h à 30°C. Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur colonie et l'un d'eux a été référencé SC0010. 5 Exemple 5 : Construction d'une souche de levure exprimant PRK RuBisCO et mutée sur les gènes SPT5 (A339P) et PFK2 (Y6111. Souche et constructions génétiques. Les souches de Saccharomyces cerevisiae, SC0002 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trp1- 289 ura3-52 MAL.28c spt5A339P:BIeMX) et SC0007 (Mat alpha HIS3 leu2-3.112 trp1-289 10 ura3-52 MAL.28c pfk2Y611*:NatMX) ont été croisées pour construire une souche coexprimant le gène SPT5 endogène, muté à la position 339 de sa séquence protéique et le gène PFK2 endogène, tronquée dans sa séquence protéique en position 611, et caractériser l'effet de ces mutations sur l'activité de la RuBisCO de Synechococcus elongatus exprimée dans la souche. 15 Le croisement a été réalisé comme suit : Croisement : Les deux souches haploïdes SC0002 et SC0007 de signes sexuels opposés ont été étalées sur milieu riche : YPD agar (Yeast extract Petone Dextrose) et YPGE agar (Yeast extract Peptone Glycérol Ethanol) respectivement, et mises à incuber une nuit à 30°C. Les 20 souches ont ensuite été mises en contact sur boite de milieu sélectif YPGE agar additionné de 80pg/m1 de phléomycine et 50pg/m1 de nourseothricine, et incubées deux jours à 30°C. Un clone isolé diploïde, issu de ce croisement, a ensuite été étalé sur ce même milieu de sélection et incubé une nuit à 30°C. Les cellules ont ensuite été étalées de nouveau sur milieu non sélectif YPGE agar, et incubées une nuit à 30°C. 25 Sporulation : Les cellules ont été récupérées sur la boite et mises en suspension dans 5m1 de milieu SM (Sporulation Medium: 1% de potassium acétate, 0.1% de yeast extract) additionné de leucine : 100 mg/ml, tryptophane : 50 mg/mi et uracile 20 mg/ml. Les cellules ont été mises à 30°C 5 jours afin de permettre la sporulation de chaque cellule diploïde en 30 4 cellules filles haploïdes (spores), rassemblées sous forme de tétrades. Analyse des spores en vrac : La suspension cellulaire a été centrifugée 5 min à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules lavées avec 5m1 d'eau stérile. La suspension a été centrifugée (5 min, 2500 rpm, température ambiante), le surnageant éliminé et les 35 cellules reprises dans 500 pI d'eau stérile. La paroi entourant les 4 spores a été dégradée par digestion enzymatique durant une nuit (30°C, sous agitation 180 rpm) dans le mélange réactionnel suivant : 250 pI de suspension cellulaire, 2,4 ml d'eau stérile, 125 pI de Lyticase 35 (Arthrobacter luteus, SIGMA-Aldrich, Saint-Louis, Etats-Unis) à 10 mg/ml, 5 pl de [3- mercaptoethanol. La suspension a été centrifugée (5 min, 2500 rpm, température ambiante), le surnageant éliminé et les cellules reprises dans 5 ml d'eau stérile. La suspension a été diluée (afin d'obtenir des clones isolés) et étalée sur milieu sélectif YPGE 5 additionné de 80 pg/ml de phléomycine et 50 pg/ml de nourseothricine, puis incubé 48 h à 30°C. Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur ADN génomique et séquençage après amplification des zones d'intérêts par PCR. Le signe sexuel des clones a également été testé par croisement avec des souches tectrices de signes sexuels mat a 10 ou mat alpha. Un de ces clones a été référencé SC0011 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trp1-289 ura3-52 MAL.28c spt5A339P:BIeMX pfk2Y611*:NatMX). La souche de levure SC0011 a ensuite été transformée pour exprimer les gènes PRK, RuBisCO (RbcL RbcS) et RbcX de Synechococcus elongatus PCC6301 et les gènes GroES et GroEL de E. coll. 15 La souche a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche YPGE à 30°C jusqu'en phase exponentielle de croissance. Les cellules ont été centrifugées 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé, les cellules remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile puis centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été 20 remises en suspension dans 500 pl de solution PLTE (400 pl de Polyéthylène glycol 50%, 50 pl d'acétate de lithium 1 M, 2,5p1 d'Éthylène Diamine Tétra-Acétique 200 mM, 5 pl de Tris 1 M pH 7.5, 42,5 pI d'eau). 10 pL d'ADN « porteur » (ADN de sperme de saumon dénaturé) à 5 mg/ml, 56 pI de diméthylsulfoxyde et 300 ng de chacun des plasmides navettes suivants ont été ajoutés sur le mélange réactionnel: 25 - P1 : PF1-36_PTEF1-RbcX-Tpcm_PPGi1-GroES-TcYc1_P-roHa-GroEL-TADH1,LEU2 - P2 : V51_V51-P-roH3-RbcL-TADH1 -PTEFi -RbcS-Tpcm , U RA3 - P3 : pCM185_pCM185-Tet::Pcyci-PRK-TcYci ,TRP1 Les cellules ont ensuite été mises à incuber 15 min à 30°C, puis 15 min à 42°C. Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant 30 a été éliminé, les cellules remises en suspension dans 1 ml de YPD et mises à incuber 1 heure à 30°C. Les cellules ont ensuite été centrifugées (5000 rpm, 1 min) et le surnageant éliminé. Elles ont ensuite été lavées dans 1 ml d'eau physiologique stérile, centrifugées de nouveau (5000rpm, 1 min), reprises dans 100 pI d'eau physiologique stérile puis étalées sur un milieu de sélection YNB.GE.AAM-LUW (Yeast Nitrogen base, Glycerol, Éthanol, 35 Amino-Acid Mix sans Leucine, Uracile et tryptophane : adénine 10 mg/I, alanine 76 mg/I, arginine 50 mg/I, asparagine 76 mg/I, acide aspartique 80 mg/I, cystéine 76 mg/I, acide glutamique 76 mg/I, glutamine 76 mg/I, glycine 76 mg/I, histidine 20 mg/I, isoleucine 50 mg/I, 36 lysine 50 mg/1, méthionine 20 mg/1, phénylalanine 50 mg/1, proline 76 mg/1, sérine 76 mg/1, thréonine 100 mg/1, tyrosine 50 mg/1, valine 140 mg/1) et mises à incuber 72 h à 30°C. Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur colonie et l'un d'eux a été référencé SC0012. 5 Exemple 6 : Construction d'une souche de levure exprimant PRK RuBisCO et mutée sur les gènes STD1 (Y86N) et PFK2 (Y611*). Souche et constructions génétiques. Les souches de Saccharomyces cerevisiae, SC0004 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trp1- 289 ura3-52 MAL.28c std1Y86N :HphMX) et SC0007 (Mat alpha HIS3 leu2-3.112 trpl-289 10 ura3-52 MAL.28c pfk2Y611*:NatMX) ont été croisées pour construire une souche coexprimant le gène STD1 endogène, muté à la position 86 de sa séquence protéique, et le gène PFK2 endogène, tronquée dans sa séquence protéique en position 611, et caractériser l'effet de ces mutations sur l'activité de la RuBisCO de Synechococcus elongatus exprimée dans la souche. 15 Le croisement a été réalisé comme suit : Croisement : Les deux souches haploïdes SC0004 et SC0007 de signe sexuel opposés ont été étalées sur milieu riche : YPD agar (Yeast extract Petone Dextrose) et YPGE agar (Yeast extract Peptone Glycérol Ethanol) respectivement, et mises à incuber une nuit à 30°C. Les 20 souches ont ensuite été mises en contact sur boite de milieu sélectif YPGE agar additionné de 200 pg/ml d'hygromycine B et 50 pg/ml de nourseothricine, et incubées deux jours à 30°C. Un clone isolé diploïde, issu de ce croisement, a ensuite été étalé sur ce même milieu de sélection et incubé une nuit à 30°C. Les cellules ont ensuite été étalées de nouveau sur milieu non sélectif YPGE agar, et incubée une nuit à 30°C. 25 Sporulation : Les cellules ont été récupérées sur la boite et mises en suspension dans 5m1 de milieu SM (Sporulation Medium: 1% de potassium acétate, 0.1% de yeast extract) additionné de leucine : 100 mg/ml, tryptophane : 50 mg/mi et uracile 20 mg/ml. Les cellules ont été mises à 30°C 5 jours afin de permettre la sporulation de chaque cellule diploïde en 30 4 cellules filles haploïdes (spores), rassemblées sous forme de tétrades. Analyse des spores en vrac : La suspension cellulaire a été centrifugée 5min à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules lavées avec 5 ml d'eau stérile. La suspension a été centrifugée (5 min, 2500 rpm, température ambiante), le surnageant éliminé et les 35 cellules reprises dans 500 pI d'eau stérile. La paroi entourant les 4 spores a été dégradée par digestion enzymatique durant une nuit (30°C, sous agitation 180 rpm) dans le mélange réactionnel suivant : 250 pI de suspension cellulaire, 2,4 ml d'eau stérile, 125 pI de Lyticase 37 (Arthrobacter luteus, SIGMA-Aldrich, Saint-Louis, Etats-Unis) à 10 mg/ml, 5 pl de [3- mercaptoethanol. La suspension a été centrifugée (5 min, 2500 rpm, température ambiante), le surnageant éliminé et les cellules reprisent dans 5 ml d'eau stérile. La suspension a été diluée (afin d'obtenir des clones isolés) et étalée sur milieu sélectif YPGE 5 additionné de 200 pg/ml d'hygromycine B et 50 pg/ml de nourseothricine, puis incubé 48 h à 30°C. Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur ADN génomique et séquençage après amplification des zones d'intérêts par PCR. Le signe sexuel des clones a également été testé par croisement avec des souches tectrices de signes sexuels mat a 10 ou mat alpha. Un de ces clones a été référencé SC0013 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trp1-289 ura3-52 MAL.28c std1Y86N:HphMX pfk2Y611*:NatMX). La souche de levure SC0013 a ensuite été transformée pour exprimer les gènes PRK, RuBisCO (RbcL RbcS) et RbcX de Synechococcus elongatus PCC6301 et les gènes GroES et GroEL de E. coll. 15 La souche a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche YPGE à 30°C jusqu'en phase exponentielle de croissance. Les cellules ont été centrifugées 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile puis centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules 20 ont été remises en suspension dans 500 pl de solution PLTE (400 pl de Polyéthylène glycol 50%, 50 pl d'acétate de lithium 1 M, 2,5p1 d'Éthylène Diamine Tétra-Acétique 200 mM, 5 pl de Tris 1 M pH 7.5, 42,5 pI d'eau). 10 pL d'ADN « porteur » (ADN de sperme de saumon dénaturé) à 5 mg/ml, 56 pI de diméthylsulfoxyde et 300 ng de chacun des plasmides navettes suivants ont été ajoutés sur le mélange réactionnel: 25 - P1 : PF1-36_PTEF1-RbcX-Tpcm_PPGi1-GroES-TcYc1_P-roHa-GroEL-TADH1,LEU2 - P2 : V51_V51-P-roH3-RbcL-TADH1 -PTEFi -RbcS-Tpcm , U RA3 - P3 : pCM185_pCM185-Tet::Pcyci-PRK-TcYci ,TRP1 Les cellules ont ensuite été mises à incuber 15 min à 30°C, puis 15 min à 42°C. Les cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000 rpm à température ambiante. Le surnageant 30 a été éliminé, les cellules remises en suspension dans 1 ml de YPD et mises à incuber 1 heure à 30°C. Les cellules ont ensuite été centrifugées (5000 rpm, 1 min) et le surnageant éliminé. Elles ont ensuite été lavées dans 1 ml d'eau physiologique stérile, centrifugées de nouveau (5000 rpm, 1 min), reprises dans 100 pI d'eau physiologique stérile puis étalées sur un milieu de sélection YNB.GE.AAM-LUW (Yeast Nitrogen base, Glycérol, Éthanol, 35 Amino-Acid Mix sans leucine, uracile et tryptophane : adénine 10 mg/I, alanine 76 mg/I, arginine 50 mg/I, asparagine 76 mg/I, acide aspartique 80 mg/I, cystéine 76 mg/I, acide glutamique 76 mg/I, glutamine 76 mg/I, glycine 76 mg/I, histidine 20 mg/I, isoleucine 50 mg/I, 38 lysine 50 mg/1, méthionine 20 mg/1, phénylalanine 50 mg/1, proline 76 mg/1, sérine 76 mg/1, thréonine 100 mg/1, tyrosine 50 mg/1, valine 140 mg/1) et mises à incuber 72 h à 30°C. Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur colonie et l'un d'eux a été référencé SC0014. 5 Exemple 7 : Construction d'une souche de levure exprimant PRK RuBisCO et mutée sur les gènes SPT5 (A339P), STD1 (Y86N) et PFK2 (Y611*). Souche et constructions génétiques. Les souches de Saccharomyces cerevisiae, SC0009 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trp1- 289 ura3-52 MAL.28c std1Y86N :HphMX spt5A339P :BIeMX) et SC0007 (Mat alpha HIS3 10 leu2-3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c pfk2Y611*:NatMX) ont été croisées pour construire une souche co-exprimant les gènes : STD1 endogène, muté à la position 86 de sa séquence protéique, SPT5 endogène, muté à la position 339 de sa séquence protéique et PFK2 endogène, tronquée dans sa séquence protéique en position 611, et caractériser l'effet de ces mutations sur l'activité de la RuBisCO de Synechococcus elongatus exprimée 15 dans la souche. Le croisement a été réalisé comme suit : Croisement : Les deux souches haploïdes SC0009 et SC0007 de signe sexuel opposés ont été étalées sur milieu riche : YPD agar (Yeast extract Petone Dextrose) et YPGE agar (Yeast 20 extract Peptone Glycérol Ethanol) respectivement, et mises à incuber une nuit à 30°C. Les souches ont ensuite été mises en contact sur boite de milieu sélectif YPGE agar additionné de 200pg/m1 d'hygromycine B et 50pg/m1 de nourseothricine, et incubées deux jours à 30°C. Un clone isolé diploïde, issu de ce croisement, a ensuite été étalé sur ce même milieu de sélection et incubé une nuit à 30°C. Les cellules ont ensuite été étalées de nouveau sur 25 milieu non sélectif YPGE agar, et incubées une nuit à 30°C. Sporulation : Les cellules ont été récupérées sur la boite et mises en suspension dans 5m1 de milieu SM (Sporulation Medium: 1% de potassium acétate, 0.1% de yeast extract) additionné de leucine : 100 mg/ml, tryptophane : 50 mg/mi et uracile 20 mg/ml. Les cellules 30 ont été mises à 30°C durant 5 jours afin de permettre la sporulation de chaque cellule diploïde en 4 cellules filles haploïdes (spores), rassemblées sous forme de tétrades. Analyse des spores en vrac : La suspension cellulaire a été centrifugée 5min à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules lavées avec 5 ml d'eau stérile. La suspension a 35 été centrifugée (5min, 2500 rpm, température ambiante), le surnageant éliminés et les cellules reprises dans 500p1 d'eau stérile. La paroi entourant les 4 spores a été dégradée par digestion enzymatique durant une nuit (30°C, sous agitation 18Orpm) dans le mélange 39 réactionnel suivant : 250 pl de suspension cellulaire, 2,4 ml d'eau stérile, 125 pl de Lyticase (Arthrobacter luteus, SIGMA-Aldrich, Saint-Louis, Etats-Unis) à 10 mg/ml, 5 pl de [3- mercaptoethanol. La suspension a été centrifugée (5 min, 2500 rpm, température ambiante), le surnageant éliminé et les cellules reprisent dans 5 ml d'eau stérile. La 5 suspension a été diluée (afin d'obtenir des clones isolés) et étalée sur milieu sélectif YPGE additionné de 200 pg/ml d'hygromycine B, 50 pg/ml de nourseothricine et 80 pg/ml de phléomycine, puis incubée 48h à 30°C. Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur ADN génomique et séquençage après amplification des zones d'intérêts par PCR. Le signe sexuel des clones 10 a également été testé par croisement avec des souches tectrices de signes sexuels mat a ou mat alpha. Un de ces clones a été référencé SC0015 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trp1-289 ura3-52 MAL.28c std1Y86N:HphMX spt5A339P:BIeMX pfk2Y611*:NatM). La souche de levure SC0013 a ensuite été transformée pour exprimer les gènes PRK, RuBisCO (RbcL RbcS) et RbcX de Synechococcus elongatus PCC6301 et les gènes 15 GroES et GroEL de E. coll. La souche a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche YPGE à 30°C jusqu'en phase exponentielle de croissance. Les cellules ont été centrifugées 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile puis centrifugées de nouveau pendant 5 20 minutes à 2500 rpm à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 500p1 de solution PLTE (400 pl de Polyéthylène glycol 50%, 50 pI d'acétate de lithium 1 M, 2,5 pI d'Éthylène Diamine Tétra-Acétique 200 mM, 5 pI de Tris 1 M pH 7,5, 42,5 pI d'eau). 10 pL d'ADN « porteur » à 5 mg/ml, 56 pI de diméthylsulfoxyde et 300 ng de chacun des plasmides navettes suivants ont été ajoutés sur 25 le mélange réactionnel: - P1 : pFL36_PTEF1-RbcX-Tpcm_Ppci1 -G roES-TCYCUPTDH3-GrOELTADH1 LEU2 - P2 : V51_V51-P-roH3-RbcL-TADH1 -PTEFi -RbcS-Tpcm , U RA3 - P3 : pCM185_pCM185-Tet::Pcyci-PRK-TcYci ,TRP1 Les cellules ont ensuite été mises à incuber 15 min à 30°C, puis 15 min à 42°C. Les 30 cellules ont été centrifugées 1 minute à 5000rpm à température ambiante. Le surnageant a été éliminé, les cellules remises en suspension dans 1 ml de YPD et mises à incuber 1 heure à 30°C. Les cellules ont ensuite été centrifugées (5000 rpm, 1 min) et le surnageant éliminé. Elles ont ensuite été lavées dans 1 ml d'eau physiologique stérile, centrifugées de nouveau (5000 rpm, 1 min), reprises dans 100 pI d'eau physiologique stérile puis étalées 35 sur un milieu de sélection YNB.GE.AAM-LUW (Yeast Nitrogen base, Glycérol, Éthanol, Amino-Acid Mix sans leucine, uracile et tryptophane : adénine 10 mg/I, alanine 76 mg/I, arginine 50 mg/I, asparagine 76 mg/I, acide aspartique 80 mg/I, cystéine 76 mg/I, acide glutamique 76 mg/1, glutamine 76 mg/1, glycine 76 mg/1, histidine 20 mg/I, isoleucine 50 mg/1, lysine 50 mg/1, méthionine 20 mg/1, phénylalanine 50 mg/1, proline 76 mg/1, sérine 76 mg/1, thréonine 100 mg/1, tyrosine 50 mg/1, valine 140 mg/1) et mises à incuber 72 h à 30°C. Les clones obtenus ont été validés par génotypage sur colonie et l'un d'eux a été 5 référencé SC0016. Exemple 8 : Caractérisation des souches de levure (SC0003, SC0006, SC0008, SC0010, SC0012, SC00014, SC00016) exprimant PRK RuBisCO et mutées au niveau des gènes SPT5 (A339P), STD1 (Y86N) et PFK2 (Y611*), de manière individuelle ou en combinaison. 10 Les 8 souches préparées dans les exemples précédents ont été mises en culture afin de caractériser l'effet des mutations SPT5 A339P, STD1 Y86N et PFK2 Y611*, individuellement ou en combinaison, sur l'activité de la RuBisCO de Synechococcus elongatus exprimée dans la souche. Milieux 15 Pour les précultures et cultures, le milieu A utilisé contient 6,7 g/L de Yeast Nitrogen Base avec sulfate d'ammonium (YNB w/ SA, MP biomedicals, 4027-532) et 20 g/L de glucose (Sigma, G7021), ajusté au pH 5,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium (1 M). Précultures 1 mL de chacune des souches SC0001, SC0003, SC0006, SC0008, SC0010, 20 SC0012, SC0014 et SC0016 conservées dans des cryotubes à -80°C (20% glycérol) a été inoculé avec 19 mL de milieu A dans un Erlenmeyer baflé de 250 mL. Ces précultures ont été cultivées à 30 °C et 120 tours par minute sous 10% de CO2 jusqu'à une densité optique (D0600,,) cible de 0,6 UA (Unité d'absorbance). Une deuxième étape de préculture a été menée en inoculant 50 mL de milieu A dans 25 un Erlenmeyer baflé de 250 mL à 0,05 UA à partir de la première préculture. Cette deuxième préculture a été cultivée à 30 °C et 120 tours par minute sous 10% de CO2 (jusqu'à une DO cible de 0,7 UA. Cette deuxième préculture a été utilisée pour inoculer l'étape de culture suivante. Culture en Erlens 30 Les cultures des souches SC0001, SC0003, SC0006, SC0008, SC0010, SC0012, SC0014 et SC0016 ont été réalisées chacune dans 100 mL de milieu A, en Erlenmeyer baflé de 500 mL en inoculant à 0,05 UA à partir des secondes précultures. Les conditions de cultures utilisées ont été les mêmes que pour les précultures (30°C, 120 tours par minutes, 10% CO2) à l'exception de la D0600,, cible de fin de culture de 0,5 UA. 35 Essai enzymatique Afin de doser les activités enzymatiques RuBisCO, le moût de fermentation a d'abord été centrifugé pendant 10 minutes à 3000 g et à 4°C. Le surnageant a ensuite été éliminé 41 et les culots cellulaires ont été repris dans 500 pL de tampon Tris-HCI à pH7,9. La suspension cellulaire a alors été transférée dans un tube FastPrep 2 mL (MP biomedicals, Lysing matrix Y, 6960-100) puis les cellules ont été lysées au FastPrep 96 (MP biomedicals, 16010500) par deux cycles de 30 secondes à 1800 tours par minute. Les tubes ont ensuite 5 été centrifugés à 4°C pendant 5 minutes à 13 000 tours par minute et 10 pg de protéines totales du lysat cellulaire (surnageant) ont été utilisés pour le dosage de l'activité enzymatique, en triplicat technique. La concentration en protéine totale du lysat cellulaire a été déterminée avec le kit QuantiPro TM BCA (Sigma, QPBCA-1KT). L'activité RuBisCO a été déterminée en utilisant le CO2 sous forme de carbonate 10 (NaHCO3, 50 mM) et le Ribulose-1,5-biphosphate (RuBP, 5 mM) comme substrats dans un tampon Tris-HCI 50 mM à pH 7,9 en présence de DTT (2 mM), KCI (30 mM) et MgC12 (10 mM). La réaction a été arrêtée après 80 min par ébullition (7 min à 95°C). Les produits de la réaction enzymatique et plus spécialement le 3-phosphoglycerate (3-PG), le 2- phosphoglycerate (2-PG) et le phosphoenolpyruvate (PEP) ont été quantifiés par 15 chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse UHPLC ultimate 3000 RS - MSQ plus (LC-MS) en utilisant une colonne Spheri-5 RP-18 100x2,1 mm, 5 pm (PerkinElmer, 0711-0016) avec une précolonne Newguard RP-18, 15x3,2 mm, 7 pm (PerkinElmer, 0711-0092). La température de la colonne était de 35°C et le débit était fixé à 1 mL/min. Le run a été réalisé avec deux phases mobiles (10 mM de tributylamine en voie 20 D et acétonitrile 100% en voie B) selon le gradient suivant : 3 min 100% voie D puis 15 min 95% voie D et 5% voie B, 2 min 65 % voie D et 35 % voie B, 4 min 100% voie B et enfin 2 min 100% voie D. Un volume de 30 pL a été injecté pour chaque échantillon. L'identification des composés a été basée sur leur masse moléculaire et par comparaison des temps de rétention avec les standards. La quantification est réalisée grâce à des courbes de 25 calibration des standards adéquates. L'activité de la RuBisCO sera donc exprimée en nmol de produits.min-'.mg-1 de protéine totale. Les produits étant la somme du 3- phosphoglycerate (3-PG), du 2-phosphoglycerate (2-PG) et du phosphoenolpyruvate (PEP) Résultat Les activités de la RuBisCO exprimée dans les souches modifiées sont résumées 30 dans le tableau ci-dessous en produits.min-'.mg-1 de protéine totale. Ces activités ont été comparées à l'activité de la RuBisCO exprimée dans la souche SC0001. La souche SC0001 représente l'activité RuBisCO de référence sans aucune autre mutation dans le génome. Dans la souche SC0001, la RuBisCO présente une activité de 10 ± 7 nmol de produits.min-l.mg-1 de protéine totale. 35 42 Tableau 5 : récapitulatif des activités RuBisCO exprimée dans les souches de levures modifiées Souche Mutation Activité (produits.min-'.mg Facteur de protéine totale) d'amélioration de l'activité SC0001 10 ± 7 SC0003 SPT5 A339P 67 ± 7 x7 SC0006 STD1 Y86N 16 ± 2 x2 SC0008 PFK2 Y611* 53 ± 5 x5 SC0010 SPT5 A339P ; 53 ± 12 x5 STD1 Y86N SC0012 SPT5 A339P ; 130 ± 16 x13 PFK2 Y611* SC0014 STD1 Y86N ; 92 ± 30 x9 PFK2 Y611* SC0016 SPT5 A339P ; 206 ± 71 x21 STD1 Y86N ; PFK2 Y611* Les résultats présentés dans le tableau ci-dessus montrent que : 5 - Muter le gène SPT5 endogène à la position 339 de sa séquence protéique permet d'améliorer l'activité de la RuBisCO d'un facteur 7 par rapport à une RuBisCO exprimée dans une souche de levure sans gène SPT5 muté. - Muter le gène STD1 endogène à la position 86 de sa séquence protéique permet d'améliorer l'activité de la RuBisCO d'un facteur 2 par rapport à une RuBisCO exprimée 10 dans une souche de levure sans gène STD1 muté. - Tronquer le gène PFK2 endogène à la position 611 de sa séquence protéique permet d'améliorer l'activité de la RuBisCO d'un facteur 5 par rapport à une RuBisCO exprimée dans une souche de levure sans gène PFK2 muté. Ces résultats montrent aussi que certaines mutations peuvent avoir un effet cumulatif 15 quand elles sont combinées entre elles, soit deux par deux, ou lorsque les trois mutations sont introduites. En effet, on peut noter que : - Muter le gène SPT5 endogène à la position 339 de sa séquence protéique et tronquer le gène PFK2 endogène à la position 611 de sa séquence protéique permet d'améliorer l'activité de la RuBisCO d'un facteur 13 par rapport à une RuBisCO exprimée dans une 20 souche de levure sans gène muté. La combinaison de ces mutations permet d'améliorer 43 l'activité RuBisCO d'un facteur supérieur à celui obtenu avec la mutation SPT5 A339P ou PFK2 Y611* seule. Tronquer le gène PFK2 endogène à la position 611 de sa séquence protéique et muter le gène STD1 endogène à la position 86 de sa séquence protéique permet d'améliorer 5 l'activité de la RuBisCO d'un facteur 9 par rapport à une RuBisCO exprimée dans une souche de levure sans gène muté. La combinaison de ces mutations permet d'améliorer l'activité RuBisCO d'un facteur supérieur à celui obtenu avec la mutation PFK2 Y611* ou STD1 Y86N seule. Muter le gène SPT5 endogène à la position 339 de sa séquence protéique, muter le 10 gène STD1 endogène à la position 86 de sa séquence protéique et tronquer le gène PFK2 endogène à la position 611 de sa séquence protéique permet d'améliorer l'activité de la RuBisCO d'un facteur 21 par rapport à une RuBisCO exprimée dans une souche de levure sans gène muté. La combinaison de ces trois mutations permet d'améliorer l'activité RuBisCO d'un facteur supérieur à celui obtenu avec la mutation SPT5 A339P, 15 STD1 Y86N ou PFK2 Y611* seule. 44 REFERENCES WO 2014/096391, WO 2014/129898, WO 2015/107496 et WO 2015/177800 Arvanitidis, A., Heinisch, J.J., 1994. Studies on the function of yeast phosphofructokinase subunits by in vitro mutagenesis. J. Biol. Chem. 269, 8911-8918. 5 Blythe, A.J., Yazar-Klosinski, B., Webster, M.W., Chen, E., Vandevenne, M., Bendak, K., Mackay, J.P., Hartzog, G.A., Vrielink, A., 2016. The yeast transcription elongation factor Spt4/5 is a sequence-specific RNA binding protein. Protein Sci. 25, 17101721. https://doi.org/10.1002/pro.2976 Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, 10 L.A., 2013. Multiplex Genome Engineering Using CRISPRNCas Systems. Science (80-. ). 339, 819-823. https://doi.org/10.1126/science.1231143.Multiplex Daboussi, F., Zaslavskiy, M., Poirot, L., Loperfido, M., Gouble, A., Guyot, V., Leduc, S., Galetto, R., Grizot, S., Oficjalska, D., Perez, C., Delacôte, F., Dupuy, A., ChionSotinel, I., Le Clerre, D., Lebuhotel, C., Danos, O., Lemaire, F., Oussedik, K., 15 Cédrone, F., Epinat, J.C., Smith, J., Yeez-Muhoz, R.J., Dickson, G., Popplewell, L., Koo, T., Vandendriessche, T., Chuah, M.K., Duclert, A., Duchateau, P., Pâques, F., 2012. Chromosomal context and epigenetic mechanisms control the efficacy of genome editing by rare-cutting designer endonucleases. Nucleic Acids Res. 40, 6367-6379. https://doi.org/10.1093/nar/gks268 20 Datsenko, K.A., Wanner, B.L., 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 66405. https://doi.org/10.1073/pnas.120163297 Gueldener, U., 2002. A second set of loxP marker cassettes for Cre-mediated multiple gene knockouts in budding yeast. Nucleic Acids Res. 30, 23e-23. 25 https://doi.org/10.1093/nar/30.6.e23 Hegemann, J.H., Heick, S.B., 2011. Delete and Repeat: A Comprehensive Toolkit for Sequential Gene Knockout in the Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae. Humana Press, pp. 189-206. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-197-0_12 Heinisch, J., 1986. Isolation and characterization of the two structural genes coding for 30 phosphofructokinase in yeast. Mol. Gen. Genet. 202, 75-82. Kim, Y.G., Cha, J., Chandrasegaran, S., 1996. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 1156-1160. https://doi.org/10.1073/pnas.93.3.1156 Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P., Baltimore, D., Darnell, J., 2000. 35 Recombination between Homologous DNA Sites. Mali Prashant, E.K. and C.G., 2013. Cas9 as a versatile tool for engeneering biology. Nat Methods 10, 957-963. https://doi.org/10.1038/nmeth.2649.Cas9 Ousterout, D.G., Gersbach, C.A., Carolina, N., States, U., Biology, C., Carolina, N., Carolina, N., 2016. The Development of TALE Nucleases for Biotechnology, Methods in Molecular Biology. Springer New York, New York, NY. https://doi. org/10.1007/978-1-4939-2932-0 5 Schmidt, M.C., McCartney, R.R., Zhang, X., Tillman, T.S., Solimeo, H., WôIfI, S., Almonte, C., VVatkins, S.C., 1999. Std1 and Mth1 Proteins lnteract with the Glucose Sensors To Control Glucose-Regulated Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 19, 4561-4571. https://doi.org/10.1128/MCB.19.7.4561 Thomas, K.R., Capecchi, M.R., 1987. Site-directed mutagenesis by gene targeting in 10 mouse embryo-derived stem cells. Cell 51, 503-512. https://doi.org/10.1016/0092- 8674(87)90646-5 Yakhnin, A. V, Babitzke, P., 2015. NusG / Spt5 : Are there Common Functions of this Ubiquitous 68-71. https://doi.org/10.1016/j.mib.2014.02.005.NusG/Spt5 REVENDICATIONS1. Microorganisme capable d'exprimer une RuBisCO fonctionnelle choisi parmi les bactéries, les levures, les champignons et les protistes , caractérisé en ce qu'il est génétiquement modifié pour exprimer une protéine NusG/SPT5 mutée par la transposition (substitution) d'au moins un acide aminé par un autre acide aminé pour améliorer l'activité de ladite RuBisCO fonctionnelle. 2. Microorganisme selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mutation est au niveau de l'extrémité C-terminale du feuillet f33 dans les éléments de structure 10 secondaire communs à NusG et au domaine NGN de SPT5, 3. Microorganisme selon la revendication 2, caractérisé en ce que la protéine NusG / SPT5 comprend une mutation dans une séquence correspondant à la séquence consensus de 9 acides aminés représentée sur la Figure 1. 4. Microorganisme selon la revendication 3, caractérisé en ce que, la mutation 15 consiste en une transposition du septième acide aminé (soit une Alanine soit une Serine soit une Méthionine soit une Isoleucine) de la séquence consensus en tout autre acide aminé. 5. Microorganisme selon la revendication 4, caractérisé en ce que la mutation consiste en une transposition du septième acide aminé de la séquence consensus (soit une 20 Alanine soit une Serine soit une Méthionine soit une Isoleucine) en Proline. 6. Microorganisme selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour la protéine SPT5 et la séquence consensus de 9 acides aminés est définie par la séquence consensus : GRIYIEAPK (SEQ ID NO 1). 7. Microorganisme selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il 25 comprend un gène codant pour la protéine NusG et la séquence consensus de 9 acides aminés est définie par la séquence consensus : GYVLVQMVM (SEQ ID NO 7). 8. Microorganisme selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il exprime une RuBisCO fonctionnelle native. 9. Microorganisme selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il 30 n'exprime pas de RuBisCO fonctionnelle native et est également modifié pour exprimer un ensemble de gènes hétérologues nécessaires à l'expression d'une RuBisCO fonctionnelle. 10. Procédé de culture d'un microorganisme défini selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend la culture du microorganisme sur un milieu de culture approprié en présence de dioxyde de carbone comme source de carbone. 35 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend également une source de carbone organique et/ou un apport d'énergie. 12. Procédé selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il 47 comprend une étape de récupération de la biomasse à partir du milieu de fermentation. 13. Biomasse obtenue par le procédé selon l'une des revendications 10 à 12. 14. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de récupération de métabolites d'intérêt à partir de la biomasse et/ou 5 du surnageant de culture obtenus.