FR 3081328 A1 20191129 FR 1854412 A 20180524 Composition d'immunoglobulines humaines concentrées L'invention a trait à une composition d'immunoglobulines G humaines concentrée présentant une stabilité dans le temps améliorée. La composition selon l'invention est particulièrement adaptée pour une utilisation par voie sous-cutanée. De nombreuses pathologies sont actuellement traitées par des compositions d'immunoglobulines G (IgG). On peut citer par exemple les déficits immunitaires primitifs avec défaut de production d'anticorps, la maladie de Kawasaki, le purpura thrombopénique immunologique de l'enfant et de l'adulte, les déficits immunitaires secondaires avec défaut de production d'anticorps, en particulier la leucémie lymphoïde chronique ou myélome associés à des infections à répétition, l'infection de l'enfant par le VIH associé à des infections bactériennes, les neuropathies motrices multifocales, le syndrome de Guillain-Barré, les infections aiguës sévères ou chroniques à Parvovirus B19, l'immunodéficience acquise ou constitutionnelle, la dermatomyosite cortico-résistante, la myasthénie aiguë, la polyradiculonévrite chronique idiopathique, le purpura thrombopénique immunologique, par exemple associé à l'infection par le VIH, le syndrome de l'homme raide (Stiffman syndrome), la neutropénie auto-immune, l'érythroblastopénie auto-immune résistante, le syndrome d'anti-coagulation acquise par auto-anticorps, la polyarthrite rhumatoïde, les uvéites, etc. Pour le traitement de certaines pathologies, l'utilisation de compositions d'IgG aptes à l'administration sous-cutanée (IgSC) peut s'avérer particulièrement avantageuse. Cette voie d'administration offre en effet plus de flexibilité et d'indépendance aux patients, améliorant leur qualité de vie. A cette fin, des compositions d'immunoglobulines comprenant de fortes concentrations en IgG ont été développées. Cependant, il est connu que plus la concentration en IgG augmente, plus les problèmes de stabilité dans le temps augmentent. Notamment, on constate une formation plus importante d'oligomères et polymères dans de telles compositions. Les oligomères et polymères sont susceptibles d'activer le système du complément avec des risques associés de réactions anaphylactiques. Ces oligomères et polymères sont également susceptibles d'induire des phénomènes d'hypotension chez les patients traités. Ceci n'est pas souhaitable et est strictement contrôlé du point de vue règlementaire. De plus, la formation d'agrégats protéiques, due notamment à un stress thermique, mécanique ou chimique, participe à ces problèmes d'instabilité. De plus, il est 2 connu que la présence de certains détergents classiquement utilisés pour l'administration par voie intraveineuse peut induire une réaction locale lorsqu'ils sont administrés par voie sous-cutanée. A ce jour, les compositions d'IgG concentrées, c'est-à-dire comprenant au moins 16% d'IgG, 5 pour administration par voie sous-cutanée ne donnent pas entière satisfaction en termes de stabilité notamment et de tolérance locale. Dans ce contexte, les besoins en compositions d'IgG à des concentrations élevées, d'utilisation aisée, persistent. Résumé de l'invention : 10 En travaillant sur les problèmes de stabilité et de tolérance propres aux compositions d'IgG concentrées pour administration par voie sous-cutanée, la Demanderesse a mis en évidence qu'il est possible d'obtenir des compositions d'IgG concentrées présentant une très bonne tolérance locale après administration par voie sous-cutanée et avantageusement particulièrement stables dans le temps. Plus précisément, la Demanderesse a mis au point une 15 formulation combinant une concentration élevée d'IgG, à de la glycine et un détergent non- ionique, dans laquelle la glycine et le détergent non-ionique sont dans des concentrations particulièrement faibles, adaptée à une utilisation en sous-cutanée. La combinaison de détergent non-ionique et de glycine dans de telles proportions participent à une grande stabilité de ladite formulation dans le temps. De plus, la Demanderesse a mis en évidence 20 qu'une telle formulation est particulièrement bien tolérée par les patients lors d'une administration par voie sous-cutanée. De manière avantageuse, les compositions d'immunoglobulines concentrées selon l'invention présentent une osmolalité sensiblement physiologique. Avantageusement, aucun autre excipient que la glycine et le détergent non-ionique n'est nécessaire, et notamment pas d'acétate ni de mannitol ni d'albumine, pour 25 garantir une plus grande stabilité durant le stockage. Un objet de l'invention est donc une composition pharmaceutique comprenant : 200 g/L +/-5% d'immunoglobulines G (IgG) entre 200 et 250 mM de glycine entre 15 et 25 ppm de détergent non ionique 3 le pH de la composition étant compris entre 4,6 et 5,0. Dans un mode de réalisation particulier, la composition est seulement constituée d'eau, d'IgG, glycine et détergent non ionique. La composition selon l'invention comprend avantageusement 20% (200 g/L) d'IgG. D'une 5 manière générale, dans le contexte de l'invention, les concentrations en IgG s'entendent +1- 5% de la concentration en g/L. Selon un mode de réalisation préféré, les IgG sont des IgG humaines, notamment obtenues à partir de plasma ou de fractions plasmatiques. Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en glycine est de 215 mM, +/- 5%. 10 Une telle concentration en glycine est particulièrement adaptée pour les compositions d'IgG 20% pour une utilisation en sous-cutané. Dans un mode de réalisation particulier, le détergent non-ionique est choisi parmi les poloxamères, et notamment le Pluronic F68®, et les polysorbates, de préférence le polysorbate 20 ou le polysorbate 80, de manière encore préférée le polysorbate 80. 15 Préférentiellement le détergent non-ionique est à une concentration d'environ 20 ppm+/- 10%. L'invention a également pour objet une telle composition d'IgG pour son utilisation par voie sous-cutanée pour le traitement d'un dysfonctionnement du système immunitaire, une maladie auto-immune et/ou inflammatoire, une infection ou une maladie neurologique. 20 Description détaillée: Définitions On entend par « Immunoglobulines G » ou « IgG » dans le cadre de l'invention, des immunoglobulines polyvalentes qui sont essentiellement des IgG, incluant éventuellement des IgM. Il peut s'agir d'immunoglobulines entières, ou de fragments tels que F(ab')2 ou F(ab) 25 et toute fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des immunoglobulines polyvalentes. 4 Le terme « stabilité » correspond à la stabilité physique et/ou chimique des IgG. Le terme « stabilité physique » se réfère à la réduction ou l'absence de formation d'agrégats insolubles ou solubles des formes dimériques, oligomériques ou polymériques des Ig, ainsi qu'à la réduction ou l'absence de toute dénaturation structurale de la molécule. Le terme « stabilité 5 chimique » se réfère à la réduction ou l'absence de toute modification chimique des IgG pendant le stockage, à l'état solide ou sous forme dissoute, dans des conditions accélérées. Par exemple, les phénomènes d'hydrolyse, déamidation, et/ou oxydation sont évités ou retardés. L'oxydation des acides aminés contenant du soufre est limitée. La stabilité d'une composition d'IgG peut s'évaluer par inspection visuelle à l'aide notamment d'un dispositif 10 à fibre optique (opalescence, formation de particules), par mesure de la turbidité au moyen d'un spectrophotomètre mesurant l'absorbance ou densité optique à 400 nm, par exemple, et/ou par mesure de la lumière diffusée (« dynamic light scattering (DLS) ») permettant de mesurer les particules en solution de tailles comprises entre 1 nm et 1 p.m environ. Dans le contexte de l'invention, l'expression « compris entre x et y » signifie que les valeurs 15 x et y sont incluses. Formulations : De préférence, la concentration en IgG est de 200 g/L, +/- 5%. Dans le contexte de la présente invention, les concentrations s'entendent au niveau de la composition finale, prête à l'emploi. Les concentrations sont déterminées vis à vis des 20 compositions sous forme liquide, avant dessication, ou après reconstitution sous forme de préparation injectable. De manière particulièrement avantageuse, la Demanderesse a mis en évidence qu'il est possible d'obtenir des compositions comprenant 20% d'IgG particulièrement stables dans le temps en utilisant un minimum d'excipients. Ainsi, selon l'invention, les compositions d'IgG 25 20% comprennent avantageusement entre 200 et 250 mM de glycine, de manière préférée entre 200 et 230 mM, préférentiellement entre 210 et 220 mM. Dans un mode de réalisation particulier, la composition d'IgG 20% comprend 215 mM de glycine, +/- 5%. De même, les compositions d'IgG 20% comprennent entre 15 et 25 ppm de détergent non ionique. Dans un mode de réalisation particulier, la composition d'IgG 20% comprend 20 30 ppm de détergent non ionique, +/- 10%. 5 Dans un mode de réalisation, le détergent non ionique utilisé dans la composition selon l'invention est avantageusement choisi parmi les polysorbates et notamment parmi le polysorbate 80 (ou Tween®80 qui est du polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate), et le polysorbate 20 (ou Tween®20 qui est du polyoyéthylènesorbitanne-monolaurate). Dans un 5 autre mode de réalisation, le détergent non-ionique est choisi parmi les poloxamères, et notamment le Pluronic®F68 (polyéthylènepolypropylène glycol). Dans un autre mode de réalisation, le détergent non-ionique est choisi parmi le Triton® X 100 (octoxinol 10), les polyoxyéthylène alkyl éthers et les blocs copolymères d'éthylène/polypropylène. Les détergents non ioniques peuvent également être combinés entre eux. 10 Dans un mode de réalisation, la composition est dépourvue de mannitol et/ou albumine et/ou acétate. La Demanderesse a en effet montré que le mannitol et/ou l'acétate et/ou l'albumine ne sont pas nécessaires à la stabilisation d'une composition d'IgG 20%. Selon un mode de réalisation préféré, la composition ne contient ni mannitol ni albumine. Selon un autre mode de réalisation préféré, la composition ne contient pas d'acétate. Selon un 15 mode de réalisation particulièrement préféré, la composition selon l'invention ne contient ni mannitol, ni acétate, ni albumine. Dans un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, la composition ne contient pas de sucre. De manière avantageuse, la Demanderesse a mis en évidence que les compositions selon l'invention présentent une osmolalité particulièrement adaptée à l'administration par 20 injection, notamment sous-cutanée, et cela sans ajout en nombre et/ou quantités d'excipients. Ainsi, l'invention propose des compositions d'IgG 20% présentant une osmolalité mesurée comprise entre 300 et 400 mOsm/kg environ, ajustée par la glycine. Dans le contexte de l'invention, et sauf mention contraire, l'osmolalité de la composition s'entend de l'osmolalité mesurée dans ladite composition. 25 L'osmolalité est avantageusement mesurée à l'aide d'un osmomètre calibré avec des solutions étalons, et notamment selon la méthode préconisée par la Pharmacopée Européenne, (Pharmacopée Européenne 5.0 de 2005 -01/2005:2.2.35.). Bien entendu, toute autre méthode de mesure de l'osmolalité peut être utilisée. Dans un mode de réalisation préféré, les seuls excipients de la composition d'IgG 20% selon 30 l'invention sont la glycine et le détergent non-ionique. Une telle formulation permet une 6 bonne stabilisation des compositions d'immunoglobulines dans le temps et une réduction des durées et des coûts de préparation à l'échelle industrielle grâce à la présence d'un nombre et d'une quantité minimums efficaces d'excipients. Avantageusement, une telle composition présente une osmolalité compatible avec l'administration par injection, en particulier par voie 5 sous-cutanée. Dans un mode de réalisation particulier, la composition consiste essentiellement en des IgG, de la glycine, un détergent non-ionique et de l'eau, en ce sens que tout autre excipient qui pourrait être présent ne le serait qu'à l'état de trace. Selon l'invention, le pH final de la composition est avantageusement compris entre 4,6 et 5,0. 10 Préférentiellement, le pH est d'environ 4,8 +/- 0,1. Un pH de 4,8 +/- 0,1 donne en effet des résultats particulièrement satisfaisants en termes de stabilité dans le temps. Le pH final s'entend du pH de la composition après formulation, c'est-à-dire dans la composition prête à l'emploi. Sauf mention contraire, dans la présente description, le pH de la composition désigne le pH final. 15 Une composition d'IgG préférée selon l'invention comprend : - 200 g/L, +/- 5%, d'IgG - 200 à 250 mM de glycine, - 15 à 25 ppm de détergent non ionique, le pH de la composition étant compris entre 4,6 et 5,0. 20 Une autre composition d'IgG préférée selon l'invention comprend : 200 g/L, +/- 5% d'IgG 200 à 230 mM de glycine, 15 à 25 ppm de détergent non ionique, préférentiellement du polysorbate 80 ou du Pluronic F68® 25 le pH de la composition étant compris entre 4,6 et 5,0. Une composition d'IgG particulièrement préférée selon l'invention comprend : - 200 g/L, +/- 5% d'IgG 7 - 215 mM de glycine, +/- 5% - 20 ppm de détergent non ionique, +/- 10%, préférentiellement du polysorbate 80 ou du Pluronic F68g, le pH de la composition étant de 4,8 +/- 0,1. 5 Une autre composition d'IgG particulièrement préférée selon l'invention comprend : - 200 g/L d'IgG - environ 215 mM de glycine - environ 20 ppm de détergent non ionique, préférentiellement du polysorbate 80 ou du Pluronic F68g 10 le pH de la composition étant de 4,8. L'osmolalité mesurée de cette composition à 20% d'IgG est avantageusement d'environ 300400 mOsm/kg, +/- 2%, de manière préférée d'environ 340 mOsm/kg, +/- 2%. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la composition selon l'invention comprend 15 - 200 g/L d'IgG - environ 215 mM de glycine - environ 20 ppm de détergent non ionique, préférentiellement du polysorbate 80 ou du Pluronic F68g le pH de la composition étant de 4,8, et son osmolalité étant de 340 mOsm/kg, +/- 2%, ladite 20 composition étant dépourvue de sels d'acétate, de mannitol et d'albumine. De manière surprenante et avantageuse, la demanderesse a mis en évidence qu'une concentration en glycine d'environ 215 mM, +/- 5% combinée à une concentration en polysorbate 80 ou Pluronic F68g de 20 ppm, est suffisante pour maintenir la stabilité de la composition d'immunoglobulines 20% dans le temps, tout en maintenant une osmolalité 25 comprise entre 300 et 400 mOsm/kg dans la composition, alors que des concentrations supérieures auraient été attendues pour garantir la stabilité, augmentant parallèlement l'osmolalité desdites compositions. Or, une trop forte osmolalité peut être à l'origine d'une 8 déshydratation des cellules (sortie de l'eau intracellulaire vers le milieu extracellulaire) préjudiciable au patient. Par ailleurs, l'augmentation de la quantité des excipients, et notamment des détergents non ioniques, peut entrainer une diminution de la tolérance locale de la composition administrée par voie sous-cutanée. La composition mise au point par la 5 Demanderesse, dans laquelle le nombre et la quantité des excipients sont faibles, est donc particulièrement avantageuse pour une administration par voie sous-cutanée. Les compositions selon l'invention comprennent avantageusement des immunoglobulines G humaines. Les IgG humaines sont généralement obtenues par fractionnement du plasma sanguin humain, et présentées dans un milieu aqueux. Le milieu aqueux est composé d'eau 10 pour préparation injectable (eau PPI) pouvant contenir des excipients pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec les IgG. Les compositions d'IgG peuvent au préalable subir des étapes spécifiques d'inactivation/élimination de virus, tel qu'un traitement solvant détergent, une pasteurisation et/ou une nanofiltration. La composition selon l'invention comprend des IgG qui peuvent être polyclonales ou monoclonales. Les IgG peuvent être 15 isolées à partir du sang humain ou animal ou produites par d'autres moyens, par exemple par des techniques de biologie moléculaire, par exemple dans des systèmes cellulaires bien connus de l'homme du métier. La composition selon l'invention est particulièrement adaptée aux IgG hautement purifiées. Avantageusement, les IgG de la présente invention sont obtenues par fractionnement du plasma humain. Des méthodes de fractionnement préférées 20 du plasma humain sont décrites par Cohn et al (J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946), Kistler et al. (Vox Sang., 7, 1962, 414-424), ou Steinbuch et al (Rev. Franç. Et. Clin. et Biol., XIV, 1054, 1969). Une méthode de préparation d'une composition d'immunoglobulines G est également décrite dans la demande de brevet W02002/092632. Les compositions selon l'invention sont avantageusement sous forme liquide. 25 La composition d'IgG 20% selon l'invention, sous forme liquide et après un stockage durant une période de 6 mois à 25°C présente un taux de polymères bien inférieur au taux maximum autorisé fixés par la Pharmacopée Européenne (3%), avantageusement inférieur à environ 1%. Les compositions de l'invention sont des compositions pharmaceutiques, c'est-à-dire adaptées à un usage thérapeutique. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont ainsi utiles 30 comme médicaments, notamment pour le traitement d'un dysfonctionnement du système immunitaire, une maladie auto-immune et/ou inflammatoire, une infection ou une maladie 9 neurologique. Les composition selon l'invention sont notamment particulièrement adaptées au traitement de troubles tels que les déficits immunitaires primitifs avec défaut de production d'anticorps, la maladie de Kawasaki, le purpura thrombopénique immunologique de l'enfant et de l'adulte, les déficits immunitaires secondaires avec défaut de production d'anticorps, en 5 particulier la leucémie lymphoïde chronique ou myélome associés à des infections à répétition, l'infection de l'enfant par le VIH associé à des infections bactériennes, les neuropathies motrices multifocales, le syndrome de Guillain-Barré, les infections aiguës sévères ou chroniques à Parvovirus B19, l'immunodéficience acquise ou constitutionnelle, la dermatomyosite cortico-résistante, la myasthénie aiguë, la polyradiculonévrite chronique 10 idiopathique, le purpura thrombopénique immunologique, par exemple associé à l'infection par le VIH, le syndrome de l'homme raide (Stiffman syndrome), la neutropénie auto-immune, l'erythroblastopénie auto-immune résistante, le syndrome d'anti-coagulation acquise par auto-anticorps, la polyarthrite rhumatoïde, les uvéites. Une telle utilisation est avantageusement par injection en sous-cutané. 15 La composition selon l'invention est adaptée pour le traitement d'un sujet humain, quel que soit son âge, et plus particulièrement un sujet adulte, enfant ou nourrisson. Les compositions selon l'invention peuvent être avantageusement soumises à une méthode d'élimination ou d'inactivation des agents infectieux, par exemple par traitement solvant-détergent ou par nanofiltration. De telles méthodes d'élimination ou d'inactivation des agents 20 infectieux sont bien connues de l'homme du métier. Voies d'administration : La composition d'IgG 20% selon l'invention est utile en thérapie, et notamment sous forme injectable, en particulier, par voie sous-cutanée. La voie sous-cutanée pour le traitement de maladies auto-immunes chroniques présente 25 plusieurs avantages, comme l'amélioration du confort du patient et une diminution des effets secondaires. L'administration sous-cutanée ne nécessite pas d'accès veineux ce qui constitue, dans certains cas, un avantage décisif lorsque l'absence d'abord veineux bloque l'accès au traitement, notamment pour les jeunes enfants. 10 L'usage des immunoglobulines par voie sous-cutanée réduit également certains effets secondaires associés aux perfusions par voie intraveineuse, en particulier le risque de réactions systémiques. Les grandes variations de taux circulants observées par voie intraveineuse sont évitées, permettant une meilleure régulation du taux sérique dans la 5 fourchette physiologique entre les perfusions. En dépit d'une biodisponibilité naturellement plus faible par la voie sous-cutanée, les immunoglobulines administrées par voie sous-cutanée (IgSC) ont une efficacité au moins équivalente à celle des immunoglobulines administrées par voie intraveineuse (IgIV). Enfin, la disponibilité des IgSC pour le traitement à domicile constitue un avantage important 10 sinon décisif pour certains traitements. Elle offre plus de flexibilité et d'indépendance au patient, améliorant la qualité de vie des patients. L'accroissement de la concentration contribue au confort du patient en réduisant la fréquence d'injection. La concentration de l'IgSC est une caractéristique déterminante qui conditionne le volume d'injection et le nombre de sites d'injection et en conséquence la fréquence 15 d'administration. Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemples : Exemple 1 : Etude de stress accélérée de compositions d'immunoglobulines Une composition d'immunoglobulines G est préparée selon le procédé tel que décrit dans la 20 demande EP1385886. Le produit obtenu est ensuite concentré à 200 g/L par ultrafiltration sur membrane en cellulose Ultracel C (Millipore0) de seuil de coupure 30 kDa afin d'obtenir le produit prêt à formuler (PPF). Les produits concentrés à 200 g/L prêts à formuler sont additionnés de glycine, de polysorbate 80 ou de Pluronic F68® et ajustés au pH désiré afin d'obtenir les compositions suivantes : 25 11 Tableau 1: Compositions d'IgG Dénomination Concentration en glycine (mM) Concentration en détergent non ionique (ppm) pH Osmolalité (mOsmol/kg) Polysorbate 80 Pluronic F68 Fi 215 mM 0 0 4,9 335 F2 10 0 4,8 340 F3 0 10 4,9 342 F4 20 0 4,8 336 F5 0 20 4,8 346 F6 30 0 4,8 338 F7 0 30 4,8 348 Les compositions sont soumises à un stress d'agitation (stirring stress) sur plaque magnétique à 440 rpm pendant 6h, les différentes analyses effectuées ensuite sont les suivantes : 5 - Turbidité (DO à 400nm) : la turbidité est déterminée par mesure de l'absorbance à 400 nm. De l'eau pour injection est utilisée comme blanc. Les résultats obtenus sont les suivants : Tableau 2: Mesure de DO à 400 nm avant et après 2h, 4h et 6h de stress d'agitation Compositions TO T2h T4h T6h Fl 0,031 0,038 0,060 0,122 F2 0,030 0,036 0,041 0,085 F3 0,026 0,046 0,047 0,043 F4 0,030 0,037 0,034 0,067 F5 0,026 0,030 0,038 0,042 F6 0,030 0,037 0,038 0,066 F7 0,026 0,030 0,039 0,043 10 - DLS/SLS : cette technique suit l'état d'agrégation de la solution. La DLS (dynamic light scattering) donne la mesure de la taille (diamètre hydrodynamique) des objets en solution, approximativement entre mm et li.tm. Chaque population de taille est ainsi suivie. La SLS (static light scattering) suit le phénomène d'agrégation dans son 12 ensemble. La mesure est effectuée par ajout de 40 mM de NaC1 à la solution. La mesure est effectuée sur échantillon dilué à 80 g/L en eau pour injection. Les résultats obtenus sont les suivants : Tableau 3 : Intensité des monomères à 900 (/0) avant et après 2h, 4h et 6h de stress d'agitation. Formulations TO T2h T4h T6h Fl 97,5 92,9 77,8 65,1 F2 98,5 93,4 90,1 54,2 F3 92,5 75,1 76,6 68,7 F4 98,5 90,4 90,4 67,9 F5 95,8 73,7 82,8 84,5 F6 96,5 92,4 88,2 67,9 F7 94,1 83,1 81,2 65,5 5 Tableau 4: Intensité totale diffusée à 900 (u.a) avant et après 2h, 4h et 6h de stress d'agitation (stirring). Compositions TO T2h T4h T6h Fl 31,35 28,47 35,89 46,00 F2 29,53 34,68 36,33 42,22 F3 25,76 32,22 44,45 44,03 F4 31,55 34,44 35,98 43,97 F5 32,22 30,88 40,14 38,21 F6 30,66 35,98 36,64 43,97 F7 31,42 25,39 40,64 42,50 - Particules subvisibles (MFI) : les particules subvisibles supérieures à 2 pin, 10 i.tm et 10 25 i.tm sont comptées en utilisant la technique d'imagerie microfluidique. Les résultats obtenus sont les suivants : 13 Tableau 5 : Particules subvisibles mesurées par MFI avant et après 2h, 4h et 6h de stress d'agitation Compositions Particules (/mL) TO T2h T4h T8h Fi > 101.1111 27 2404 7642 39980 251.1111 2 201 362 2999 F2 > 101.1111 5 1435 3263 3221 > 25 iam 0 94 292 93 F3 > 101.1111 12 339 3991 3191 > 251.1111 3 93 233 1032 F4 > 101.1111 19 949 927 8043 > 25 iam 1 74 61 1322 F5 > 101.1111 22 101 936 3493 > 25 iam 2 17 30 10 F6 > 101.1111 7 477 1380 15908 > 25 iam 1 32 52 3496 F7 > 10 iam 19 134 208 161 > 25 iam 1 10 32 13 L'ensemble des résultats ci-dessus permettent d'évaluer la stabilité globale des compositions qui doivent présenter des résultats satisfaisants pour l'ensemble des paramètres étudiés. 5 Les résultats montrent que les compositions Fi, F2 et F3, avec 0 ou 10 ppm de tensioactif, présentent des résultats de stabilité globale non satisfaisants, en particulier sur la mesure de l'aggrégation (DLS) et des particules subvisibles (MFI), démontrant une faible stabilité de la composition. Les compositions F6 et F7 comprenant 30 ppm de tensioactif présentent des résultats non 10 satisfaisants, en particulier sur la mesure de l'aggrégation (DLS) et des particules subvisibles (MFI), démontrant une faible stabilité de la composition. A l'inverse les compositions selon l'invention F4 et F5 comprenant 20 ppm de tensioactif permettent d'obtenir une stabilité satisfaisante sur l'ensemble des critères évalués. Conclusion ; les résultats obtenus par différentes méthodes analytiques complémentaires 15 démontrent qu'une concentration de 20 ppm de polysorbate 80 ou de Pluronic F68® est efficace pour assurer la stabilité de la composition d'immunoglobulines à 200 g/L en présence de 215 mM de glycine à pH 4,8. 14 Exemple 2 : Compositions mises en stabilité long terme Une composition d'immunoglobulines G est préparée selon le procédé tel que décrit dans la demande EP1385886. Le produit obtenu est ensuite concentré à 200 g/L par ultrafiltration sur membrane en cellulose Ultracel C (Millipore0) de seuil de coupure 30 kDa afin d'obtenir le 5 produit prêt à formuler (PPF). Les produits concentrés à 200 g/L prêts à formuler sont additionnés de glycine, de polysorbate 80 ou de Pluronic F680 et ajustés au pH désiré afin d'obtenir les compositions suivantes pour mise en stabilité : Tableau 6 : Compositions d'IgG Dénomination Concentration en glycine (mM) Concentration en détergent pH Osmolalité (mOsmol/kg) non ionique (ppm) Polysorbate 80 Pluronic F68 Fi 215 mM 0 0 4,9 335 F2 10 0 4,8 340 F4 20 0 4,8 336 F5 0 20 4,8 346 10 Après filtration stérilisante sur filtre 0.221..tm (Sartopore), les compositions sont réparties aseptiquement en flacons verre (type I), qui sont ensuite bouchés et entreposés, dans une enceinte régulée à - 25°C ±2°C / humidité résiduelle 60% ±5%, ou 15 - 40°C ±2°C Les différentes analyses effectuées sont les suivantes : - Inspection visuelle : opalescence et formation de particules visibles sont déterminées par inspection visuelle effectuée avec une mireuse Pharmacopée Européenne - pH : l'évolution du pH peut être signe de la dégradation du produit. Le pH est mesuré 20 directement dans la solution 15 - Concentration en protéines totales : l'absorbance à 280nm permet selon la loi de BeerLambert de déterminer la concentration en protéines totales dans la formulation. L'essai est effectué en triplicate, dans des microcellules UV après dilution au 1/400 en eau pour injection par pesée des échantillons. Le coefficient d'extinction 5 moléculaire pour le produit est 1.4 L/g/cm. - Turbidité (DO à 400 nm) : la turbidité est déterminée par mesure de l'absorbance à 400 nm. De l'eau pour injection est utilisée comme blanc. - DLS/SLS : cette technique suit l'état d'agrégation de la solution. La DLS (dynamic light scattering) donne la mesure de la taille (diamètre hydrodynamique) des objets en 10 solution, approximativement entre 1 nm et 1 iim. Chaque population de taille est ainsi suivie. La SLS (static light scattering) suit le phénomène d'agrégation dans son ensemble. La mesure est effectuée par ajout de 40 mM de naC1 à la solution. La mesure est effectuée sur échantillon dilué à 80 g/L en eau pour injection. - Particules subvisibles (MFI) : les particules subvisibles supérieures à 2 pin, 10 i.tm et 15 25 i.tm sont comptées en utilisant la technique d'imagerie microfluidique. - HPSEC : la chromatographie par exclusion de taille haute performance est utilisée pour évaluer le niveau de fragmentation et d' aggrégation du produit. L'analyse du chromatogramme des mesures de densité optique à 208 nm détermine le % de monomères, dimères, polymères et fragments. 20 Les résultats obtenus sont les suivants : - Formulation Fi Tableau 7 : Résultats de stabilité à 25°C entre TO et T12mois pour la composition Fi Stabilité à +25°C Analyse TO T3mois T6mois T9mois T12mois Inspection visuelle Particules - Ph.Eur Particles Particles Particles Particles free free Opalescence - Ph.Eur Very Slightly Very Slightly opalescent slightly opalescent slightly opalescent opalescent MFI particules total! mL 1950 1517 34125 particules >10iim / mL 25 46 2168 particules >251.1m / mL 3 8 123 particules >101.1m / vial (vial 15-mL) 382 695 32514 particules >251.1m / vial (vial 15-mL) 52 122 1841 16 DLS / SLS (/0 de % de monomères - 94,5 90,8 89,0 monomères) population à 900 Intensité totale à 90° 32,6 32,8 31,7 (a.u) turbidité DO à 400 nm 0,023 0,044 0,057 Concentration DO à 280 nm 210,5 210,0 206,7 protéique pH 4,8 4,8 4,8 HPSEC % de monomères 98,0 % de dimères % de polymères 0,6 % de fragments 1,5 Tableau 8 : Résultats de stabilité à 40°C entre TO et T3mois pour la composition Fi Stabilité à +40°C Analyse TO Tlmois T2mois T3mois Inspection visuelle Particules - Ph.Eur Particles Particles Particles Particles free free free Opalescence - Ph.Eur Very Very Slightly Opalescent slightly slightly opalescent opalescent opalescent MFI particules total! mL 1950 29911 9131 748 particules >10um / mL 25 4706 251 68 particules >25um / mL 3 1836 27 21 particules >10um / vial 382 70558 3769 1025 (vial 15-mL) particules >25um / vial 52 27537 399 313 (vial 15-mL) DLS / SLS (/0 de % de monomères - 94,5 70,3 52,9 45,5 monomères) population à 90° Intensité totale à 90° (a.u) 32,6 45,6 53,5 68,2 Turbidité DO à 400 nm 0,023 0,059 0,076 0,086 Concentration DO à 280 nm 210,5 209,3 210,7 210,8 protéique pH 4,8 4,9 4,9 4,9 5 - Formulation F2 Tableau 9 : Résultats de stabilité à 25°C entre TO et T12mois pour la composition F2 Stabilité à +25°C Analyse TO T3mois T6mois T9mois T12mois Inspection visuelle Particules - Ph.Eur Particles Particles Few Particles free Few free free particle particles s Opalescence - Ph.Eur Very Slightly Very Very Very slightly opalescent slightly slightly slightly opalescen opalesce opalesce opalescent t nt nt 17 MFI particules total / mL 129 1755 1433 2090 particules >101,im / mL 15 84 146 137 particules >251,im / mL 0 2 13 17 particules >101,im / vial 226 1255 2188 2061 (vial 15-mL) particules >251,im / vial 0 24 191 258 (vial 15-mL) DLS / SLS (/0 de 'Vo de monomères - 97,3 98,3 97,7 85,0 monomères) population à 900 Intensité totale à 900 30,3 33,1 32,5 36,8 (a.u) turbidité DO à 400 nm 0,022 0,044 0,053 0,065 Concentration DO à 280 nm 204,3 208,5 206,9 210,7 protéique pH 4,8 4,8 4,8 4,8 HPSEC 'Vo de monomères 98,0 'Vo de dimères 'Vo de polymères 0,6 'Vo de fragments 1,5 Tableau 10 : Résultats de stabilité à 40°C entre TO et T3mois pour la composition F2 Stabilité à +40°C Analyse TO Tlmois T2mois T3mois Inspection visuelle Particules - Ph.Eur Particles Particles Particles Particles free free free free Opalescence - Ph.Eur Very Very Slightly Opalescent slightly slightly opalescent opalescent opalescent MFI particules total / mL 129 460 2653 1271 particules >101,im / mL 15 19 29 46 particules >251,im / mL 0 17 1 0 particules >101,im / vial 226 278 434 695 (vial 15-mL) particules >251,im / vial 0 17 17 0 (vial 15-mL) DLS / SLS (/0 de 'Vo de monomères - 97,3 70,2 53,2 42,9 monomères) population à 90° Intensité totale à 90° (a.u) 30,3 44,4 56,3 74,4 Turbidité DO à 400 nm 0,022 0,055 0,075 0,087 Concentration DO à 280 nm 204,3 207,9 211,6 206,7 protéique pH 4,8 4,9 4,9 4,9 18 - Formulation F4 Tableau 11: Résultats de stabilité à 25°C à TO entre T12mois pour la composition F4 Stabilité à +25°C Analyse TO T3mois T6mois T9mois T12mois Inspection visuelle Particules - Ph.Eur Particles free Particles free Particles Particles free Particles free free Opalescence - Ph.Eur Very Slightly Very Very li Very osplieetsley e opalesce slightly ospeetsley e nt slightly nt nt opalescent opalescent MFI particules total / mL 316 932 1040 1724 particules >101am / mL 9 34 37 59 particules >251,1m / mL 3 3 12 1 particules >101am / vial 139 504 556 886 (vial 15-mL) particules >251.1m / vial 52 52 174 17 (vial 15-mL) DLS / SLS (/0 de % de monomères - 97,2 94,8 95,6 82,6 monomères) population à 90° Intensité totale à 90° (a.u) 30,5 34,2 34,0 37,1 turbidité DO à 400 nm 0,022 0,043 0,052 0,066 Concentration DO à 280 nm 204,4 207,6 207,3 209,0 protéique pH 4,8 4,8 4,8 4,8 HPSEC % de monomères 98,0 °A de dimères % de polymères 0,6 % de fragments 1,5 Tableau 12 : Résultats de stabilité à 40°C entre TO et T3mois pour la composition F4 Stabilité à +40°C Analyse TO Tlmois T2mois T3mois Inspection visuelle Particules - Ph.Eur Particles Particles Particles Particles free free free free Opalescence - Ph.Eur Very Very Slightly Opalescent slightly slightly opalescent opalescent opalescent MFI particules total / mL 316 442 1527 1198 particules >101,1m / mL 9 69 25 10 particules >251,1m / mL 3 28 0 1 particules >101,1m / vial 139 1042 382 156 (vial 15-mL) particules >251,1m / vial 52 417 0 17 (vial 15-mL) DLS / SLS 0/0 de % de monomères - 97,2 66,4 52,1 44,2 monomères) population à 90° Intensité totale à 90° (a.u) 30,5 42,1 57,1 75,2 Turbidité DO à 400 nm 0,022 0,057 0,076 0,088 19 - Formulation F5 Tableau 13 : Résultats de stabilité à 25°C entre TO et T12mois pour la composition F5 Stabilité à +25°C Analyse TO T3mois T6mois T9mois T12mois Inspection visuelle Particules - Ph.Eur Particles Particles Particles Particles Particles free free free free free Opalescence - Ph.Eur Very Very Very Very Very slightly slightly slightly slightly slightly opalescent opalescent opalescent opalescent opalescent MFI particules total / mL 1300 506 729 1057 particules >101am / mL 20 15 45 98 particules >251am / mL 2 3 7 21 particules >101am / vial 295 226 677 1476 (vial 15-mL) particules >251am / vial 35 52 104 313 (vial 15-mL) DLS / SLS (/0 de % de monomères - 96,8 98,6 96,2 90,4 monomères) population à 90° Intensité totale à 90° 32,4 31,0 31,5 35,0 (a.u) turbidité DO à 400 nm 0,028 0,046 0,053 0,067 Concentration DO à 280 nm 210,3 208,6 209,9 212,5 protéique pH 4,8 4,9 4,9 4,9 HPSEC % de monomères 98,1 % de dimères % de polymères 0,5 % de fragments 1,4 Tableau 14 : Résultats de stabilité à 40°C entre TO et T3mois pour la composition F5 Stabilité à +40°C Analyse TO Tlmois T2mois T3mois Inspection visuelle Particules - Ph.Eur Particles Particles Particles Particles free free free Opalescence - Ph.Eur Very Very Slight Slight slightly slightly opalescent opalescent opalescent opalescent MFI particules total / mL 1300 1333 2304 867 particules >101am / mL 20 60 1035 36 particules >251am / mL 2 14 1 6 particules >101am / vial 295 903 15527 538 (vial 15-mL) Concentration protéique DO à 280 nm 209,0 204,4 207,5 210,8 4,9 4,9 4,9 4,8 pH 20 particules >251.1m / vial 35 208 17 87 (vial 15-mL) DLS / SLS (/0 de % de monomères - 96,8 73,5 56,9 47,2 monomères) population à 900 Intensité totale à 90° (a.u) 32,4 45,0 54,5 71,2 Turbidité DO à 400 nm 0,028 0,054 0,072 0,091 Concentration DO à 280 nm 210,3 209,4 211,8 210,7 protéique pH 4,8 4,9 5,0 4,9 Les tests à 40°C permettent d'accélérer les phénomènes observés lors de la mise en stabilité des compositions du fait du fort stress appliqué. Les méthodes utilisées montrent bien une évolution des critères suivis, confirmant la pertinence des méthodes sélectionnées pour 5 l'évaluation des formulations lors du suivi de stabilité. Les résultats de stabilité long terme montrent que les formulations Fi et F2 avec 0 ou 10 ppm de tensioactif ne permettent pas de maintenir une composition sans particules dès 25°C, démontrant que la stabilité de ces compositions n'est pas satisfaisante. En revanche, les formulations selon l'invention F4 et F5 avec 20 ppm de tensioactif 10 (Polysorbate REVENDICATIONS1. Composition pharmaceutique comprenant : - 200 g/L, +/- 5% d'immunoglobulines G (IgG) - entre 200 et 250 mM de glycine - entre 15 et 25 ppm de détergent non ionique le pH de la composition étant compris entre 4,6 et 5,0. 2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que les IgG sont des IgG humaines. 3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la concentration en glycine est comprise entre 200 et 230 mM, préférentiellement entre 210 et 220 mM. 4. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la concentration en glycine est de 215 mM, +/- 5%. 5. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la concentration en détergent non ionique est comprise entre 15 et 25 ppm. 6. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la concentration en détergent non ionique est de 20 ppm, +/- 10%. 7. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en-ce que le détergent non ionique est choisi parmi les polysorbates, de préférence le polysorbate 20 ou le polysorbate 80, de manière encore préférée le polysorbate 80, et les polyoxamères, de préférence le Pluronic F68. 8. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le pH est de 4,8 +/- 0,1. 9. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce que la composition est dépourvue de sels d'acétate et/ou de mannitol et/ou d'albumine. 22 10. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la composition comprend : - 200 g/L, +/- 5% d'IgG - 215 mM, +/- 5% de glycine - 20 ppm, +/- 10% de détergent non ionique le pH de la composition étant de 4,8 +/- 0,1. 11. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition est sous forme liquide. 13 Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition présente une osmolalité comprise entre 300 et 400 mOsm/kg. 14. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les IgG sont obtenues par fractionnement de plasma sanguin.