FR 3082524 A1 20191220 FR 1855342 A 20180618 Résumé de l'invention La présente demande décrit et revendique une nouvelle méthode pour identifier et stratifier le risque de développer une néphropathie à BK-virus (ci-après « Nx BK-v ») chez les patients ayant subi une transplantation rénale. Cette méthode utilise un index combinant au moins trois biomarqueurs : i) l'intensité de la réponse lymphocytaire T mémoire anti-BK-v (lymphocytes T mémoires spécifiques du BK-v, ci-après « LTm anti-BK-v »), ii) le nombre d'incompatibilités au niveau des allèles HLA de classe I et de classe II entre le donneur et le receveur du greffon, en tenant compte de iii) la charge virale du virus BK-v dans le sang total du patient. La présente méthode permet d'évaluer très précisément le risque de développer une Nx BK-v dans les mois suivant le test, dans le but d'optimiser le traitement immunosuppresseur, pour mieux préserver le rein greffé. Description de l'art antérieur Les abréviations suivantes ont été utilisées dans la présente demande : - BK-v : Polyomavirus BK humain - CF SE: Car boxyfluoresce in succiuimiaryl ester, marqueur de prolifération lymphocytaire - HLA : Human Leukocyte Antigens - JC-v : Polyomavirus JC humain - LTm anti-BK-v : lymphocytes T mémoires spécifiques du BK-v - Nx BK-v : néphropathie à BK-virus - Réponse LTm anti-BK-v : réponse lymphocytaire T mémoire spécifique du BK25 1 L'insuffisance rénale chronique terminale et ses traitements de suppléance 2 L'insuffisance rénale chronique terminale représente l'altération complète et définitive de la fonction rénale nécessitant le recours à un traitement de suppléance rénale (par dialyse ou transplantation) En France, pour l'année 2015, la prévalence de l'insuffisance rénale chronique terminale était de 82 295 patients, soit 1 232 pmh. 5 La transplantation rénale constitue actuellement le traitement le plus efficace de l'insuffisance rénale chronique terminale. Comparée au maintien en dialyse, la transplantation rénale améliore la survie et la qualité de vie des patients, avec un coût financier moindre. Il s'agit de la plus grande activité de transplantation d'organe solide dans le monde. 10 En 2014, l'observatoire global pour le don d'organe et la transplantation (GODT, organisme émanant de l'Organisation Mondial de la Santé) recensait 119 873 patients transplantés au niveau mondial, dont 79 948 (67%) patients transplantés rénaux. En France, en 2015, le nombre estimé de patients porteurs d'un greffon rénal fonctionnel était de 36 729, soit une prévalence de 552,4 cas par million d'habitants, représentant 15 ainsi 44,6 % des 82 295 patients traités pour insuffisance rénale chronique terminale. Du fait de la pénurie actuelle d'organe pour satisfaire l'ensemble des besoins en transplantation rénale (1 greffon rénal disponible pour 4,7 personnes en attente avec un délai médian d'attente de 18,5 mois), il est indispensable d'accroitre la durée de vie des greffons rénaux actuellement estimée à 13 ans ([1], [2]). Dans ce but, les patients 20 transplantés sont systématiquement soumis à une immunosuppression thérapeutique. Cette mesure est en effet indispensable pour contrôler la réponse immune allogénique et augmenter la survie du greffon. Cependant, l'immunosuppression thérapeutique peut être associée à des complications, en particulier infectieuses, pouvant être délétères pour le greffon. Ces infections peuvent conduire à la perte du rein transplanté, imposant alors au patient un retour en dialyse (avec toutes les conséquences néfastes en découlant) et entrainant une augmentation du nombre de malades en attente de greffe rénale. Réactivation des Polyomavirus BIS et IC en transplantation rénale Les réactivations virales sont des complications très fréquentes chez les patients immunodéprimés. Notamment, la réactivation de certains Polyomavirus est 3 particulièrement préoccupante. Chez l'homme, 13 espèces de Polyomarirms sont actuellement connues. Il s'agit de virus ubiquitaires, infectant de nombreuses espèces animales avec une spécificité d'espèce. La séroprévalence de ces infections virales est très élevée au niveau mondial (80 - 90 % à l'âge adulte), indiquant une exposition virale 5 précoce et large. Les deux principaux représentants sont les virus BK (BK-v) et JC (JC- v). La caractéristique commune de ces virus est leur capacité à persister au long cours de manière asymptomatique dans l'organisme, et à devenir pathogènes en situation d'immunosuppression ([3], [4]). Après transplantation, le BK-v est connu pour infecter les cellules épithéliales du tractus 10 urinaire et le parenchyme rénal du rein transplanté. Chez les transplantés rénaux, la réactivation du virus BK peut mener à une charge virale détectable dans le sang (> 200 copies/mL) Ainsi, dans le cadre de la transplantation rénale, le BK-v est responsable de néphropathies (ci-après Nx BK-v), d'insuffisance rénale ou de sténoses urétérales ([4]). 15 Dans le cadre des greffes de cellules souches hématopoïétiques, le BK-v est quant à lui responsable de cystites hémorragiques ([4]). Plusieurs niveaux de réactivations à BK-v sont observés chez les patients ayant subi une transplantation rénale (figure 1). Les patients peuvent présenter : 20 - 1- Une « virurie à BK-v» sans virémie ni atteinte rénale détectable. Chez ces patients, le BK-v réplique dans le tractus urinaire. Une virurie est observée chez près de 40% des patients transplantés rénaux, et survient classiquement dans les 3 à 6 premiers mois post-greffe. - 2- Une « virémie à BK-v isolée » sans atteinte rénale spécifique détectable du greffon 25 rénal. Une telle virémie est observée chez près de 24% des patients transplantés rénaux et survient classiquement dans les 12 premiers mois de la transplantation rénale. - 3- Une Nx BK-v. Chez ces patients, il est observé non seulement une virémie et une virurie mais aussi une réplication virale au niveau du greffon rénal, responsable d'une 4 atteinte rénale spécifique. Le diagnostic est actuellement histologique et met en évidence des inclusions virales nucléaires (antigènes T de SV40 positif), des dystrophies nucléaires, une infiltration cellulaire polymorphe et une fibrose rénale. Cette grave complication est diagnostiquée chez près de 10% des patients transplantés 5 rénaux et survient classiquement dans les 24 premiers mois de la transplantation rénale ([5]-[6]). L'évolution d'une Nx BK-v dépend de l'étendue des lésions du parenchyme rénal, elle-même liée à l'intensité de la charge virale (cf tableau 8 de Hirsch et al, 2014 [7]). L'évolution est favorable chez les patients dont le système immunitaire réussit à contrôler la réplication intra-parenchymateuse du BK-v. En revanche, la persistance d'une réplication virale intra-parenchymateuse intense et prolongée du BK-v mène à des lésions irréversibles du parenchyme rénal, entraînant une dysfonction chronique, une insuffisance rénale et aboutissant à une perte de greffon dans plus de 50% des cas. Le tableau 8 de Hirsch et al, Clinical Microbiology and Infection 2014 [7] montre les différents stades histologiques de la Nx BK-v, ainsi que le pronostic rénal associé à 15 l'atteinte histologique. La figure 2 montre l'évaluation de la fonction rénale (par mesure du débit de filtration glomérulaire - partie a) et le taux de survie des greffons rénaux (partie b) à 3 ans post-greffe chez des patients avec ou sans Nx BK-v. Ces données sont issues de l'étude de cohorte ayant permis de développer la présente invention. Cette étude observationnelle 20 (non interventionnelle) a été menée par les présents inventeurs de novembre 2014 à novembre 2017 sur une cohorte de 94 patients transplantés rénaux répartis en 4 groupes selon leur niveau de réactivation BK-v : un groupe sans réactivation BK-v (n=25), un groupe avec virurie BK-v isolée (n=25), un groupe avec virémie BK-v isolée sans Nx BK-v prouvée histologiquement (n=22) et un groupe avec Nx BK-v prouvée 25 histologiquement (n=22). La figure 2 démontre que les patients présentant une Nx BK- v ont une dysfonction sévère du greffon rénal. Cette dysfonction est présente dès le diagnostic de Nx BK-v et s'aggrave progressivement, avec une perte de greffon dans près de 50% des cas après 3 ans de suivi. 11 est donc essentiel de détecter précocement la Nx BK-v chez les patients transplantés rénaux, voire de l'anticiper, pour mieux tenter de l'enrayer. 5 Facteurs de risques et démarches diagnostiques et thérapeutiques actuelles de la Nx BK- Il est connu que la réplication du BK-v est favorisée par différents facteurs dont la nature et l'intensité du traitement immunosuppresseur et l'altération de la réponse immune 5 spécifique du BK-v ([8]). Plus précisément, le risque de développer une Nx BK-v est significativement associé à l'intensité du traitement immunosuppresseur, à l'association tacrolimus-mycophénolate mofétil (traitement de référence actuel en greffe rénale), ainsi qu'à une exposition cumulée importante aux corticostéroïdes (> 3000 mg de corticostéroïdes dans les 6 mois précédents la virémie BK-v). D'autres facteurs de 10 risques non liés aux traitements immunosuppresseurs ont également été identifiés tels que l'âge du donneur et du receveur, le sexe du receveur ou des caractéristiques propres au greffon telles que les lésions d'ischémie-reperfusion ([7]). fi n'existe à ce jour aucune thérapie antivirale spécifique contre ce virus. Les traitements tels que le Cidofovir sont responsables d'une toxicité importante pour le rein transplanté 15 et sont contre-indiqués en cas de dysfonction sévère du greffon. Par ailleurs, le Léflunomide ou les fluoroquinolones ont pu se révéler efficaces dans certains cas isolés. Cependant, l'efficacité inconstante et les effectifs insuffisants de ces rares cas ne permettent pas de recommander actuellement l'utilisation en pratique courante de ces molécules [24]). 20 Le seul traitement actuellement reconnu pour traiter la Nx BK-v est l'allègement de l'immunosuppression thérapeutique à laquelle le patient receveur du greffon est soumis ([7], [24]). En effet, la réactivation du BK-v survient lorsque l'activité du système immunitaire est réduite par le traitement immunosuppresseur. Lorsqu'une Nx BK-v est détectée, le premier réflexe thérapeutique est de réduire l'immunosuppression. Cet 25 ajustement thérapeutique est cependant fait de façon empirique, sans limite quantitative, exposant alors le patient à un risque de rejet allogénique et de perte de greffon. Il est donc important de n'avoir recours à cette approche thérapeutique que dans les cas où le patient souffre effectivement d'une Nx BK-v ou est considéré à très haut risque d'en développer une, et ce de manière progressive et contrôlée. Le traitement 30 immunosuppresseur devra ensuite être ré-augmenté pour ne pas accroitre les risques de 6 rejet du greffon. Il est important également de ne pas réduire l'immunosuppression chez des patients souffrant simplement de virémie ou de virurie isolées à BK-v, car cette diminution mettrait en péril le greffon, alors que celui-ci n'est pas infecté par le BK-v. Une infection à BK-v peut être facilement détectée par PCR quantitative sur un 5 échantillon d'urine ou de sang. Cependant, comme expliqué ci-dessus, la détection de BK-v dans le sang ou les urines des patients transplantés n'est pas nécessairement associée à un mauvais pronostic pour le greffon, puisqu'un grand nombre de patients virémiques ou viruriques ne développeront pas de Nx BK-v (la réactivation virale n'atteignant pas toujours le greffon lui-même). En effet, si une charge virale du BK-v > 10 104 copies/mL de sang est associé à une sensibilité de plus de 9094, ce test n'est pas suffisamment performant pour le diagnostic de Nx BK-v, sa valeur prédictive positive ne dépassant pas 55% ([1], [25], [26]). A ce jour, la diminution du traitement immunosuppresseur est réalisée en cas de Nx BK-v prouvée ou suspectée (PCR BK-v positive pendant au moins 4 semaines et > 104 15 copies/mL de sang). Cependant, cette solution n'est pas optimale puisque seront considérés « à risque » des patients présentant une simple virémie isolée, sans atteinte du greffon rénal. La figure 3 illustre cette problématique. L'analyse histologique du parenchyme rénal après biopsie du greffon rénal constitue aujourd'hui la seule méthode fiable pour diagnostiquer une Nx BK-v. Cependant, il 20 s'agit d'un acte invasif à risque de complications hémorragiques et pouvant être faussement négatif dans 10 à 30 % des cas, en particulier durant les stades précoces de Nx BK-v. En outre, en l'absence de dégradation de la fonction du greffon rénal, il n'est pas recommandé de faire subir à ces patients des biopsies répétées pour détecter ou confirmer la présence de lésions produites par le BK-v ([7]). Ainsi, la démarche 25 diagnostique de la Nx BK-v actuellement recommandée repose sur le suivi longitudinal de la charge virale du BK-v dans le sang du patient, et la réalisation d'une biopsie du greffon rénal en cas de dégradation de la fonction du greffon et/ou d'une charge virale BK-v > 104 copies/mL de sang pendant au moins 4 semaines consécutives. Cependant, l'altération de la fonction du greffon évaluée par le débit de filtration glomérulaire est 30 dans le cas du diagnostic de la Nx BK-v un marqueur tardif, associé à une extension 7 déjà importante des lésions fibrosantes. Ces atteintes irréversibles sont associées à un risque important de perte de greffon (cf tableau 8 de Hirsch et al, 2014 [7] et figure 2). Ainsi, la stratégie actuelle est à l'origine de retards et de difficultés diagnostiques alors que la prise en charge thérapeutique de cette complication doit être la plus précoce 5 possible afin d'éviter la survenue de lésions irréversibles. D'autres tests diagnostiques de la Nx BK-v ont été proposés par le passé. Parmi eux, le monitorage immunovirologique est basé sur l'étude des capacités fonctionnelles des lymphocytes T totaux ou anti-viraux et vise à identifier les patients les plus à risque de complications virales ([12]). Certains auteurs ont étudié la réponse immune spécifique 10 anti BK-v pour identifier les patients à risque de Nx BK-v ([8], [9]), [27]). Une faible réponse immune spécifique anti BK-v, évaluée par les capacités de sécrétion d'Interféron-y des lymphocytes T stimulés par des antigènes du BK-v (tests de type ELISA ou ELISPOT), a été retrouvée chez les patients avec réactivation sanguine BKv ([22], [23]). D'autres ont utilisé des tests d'évaluation globale de la réponse immune 15 lymphocytaire tel que le « Cylex ImmunKnow Test » dans le cadre de réactivations sanguines et urinaires du BK-v ([20]). Dans cette étude, les auteurs [20] ne mettaient pas en évidence d'association entre la réponse lymphocytaire globale et la Nx BK-v mais uniquement avec la virémie. Cependant, ces méthodes n'ont jamais permis ni de diagnostiquer la Nx BK-v ni d'identifier de manière fiable les patients à risque de 20 développer une Nx BK-v. La recherche de meilleurs paramètres est toujours en cours ([21]). A ce jour, seule une histologie réalisée sur une biopsie rénale permet de diagnostiquer objectivement une Nx BK-v ([7], [9]). Ainsi, il existe un besoin urgent de diagnostiquer de manière fiable, précoce et non invasive les patients atteints de Nx BK-v, ainsi que de stratifier le risque de développer 25 cette complication chez les patients ayant subi une transplantation rénale. Ces méthodes diagnostiques et pronostiques devront idéalement discriminer les patients à risque de développer une Nx BK-v de ceux ayant une virémie isolée du BK-v, sans atteinte du greffon ni risque ultérieur de complication de ce type. Description de l'invention 8 La présente invention répond à ce besoin, en fournissant une méthode non invasive et précoce d'évaluation personnalisée du risque de Nx BK-v. L'originalité de la méthode de l'invention est basée sur la prise en compte d'une combinaison de trois paramètres spécifiques au patient, qui sont i) un paramètre virologique évalué par la charge virale 5 du BK-v dans le sang du patient, ii) un paramètre immunologique évalué par l'intensité de la réponse lymphocytaire T mémoire anti-BK-v (réponse LTm anti-BK-v) chez le patient, et iii) le nombre d'incompatibilités BILA dans le couple [donneur/receveur] (figure 4). Ces paramètres doivent être combinés pour obtenir un index complet, fiable et reproductible, permettant un suivi individualisé, à un moment t donné, des patients transplantés rénaux. Cette méthode est plus fiable que les tests de l'art antérieur, puisque les patients souffrant d'une virémie isolée à BK-v ne seront pas classés « à risque » (sur 27 patients testés, sa valeur prédictive positive est de 100% et le taux de faux positif est nul, cf les exemples ci-dessous). De plus, l'utilisation du marqueur lié aux lymphocytes T mémoires anti-BK-v (LTm anti-BK-v) permet une évaluation précoce du risque de 15 Nx BK-v, avant l'apparition de lésions irréversibles du parenchyme rénal. Par-dessus tout, cette méthode est peu invasive (de simples prises de sang sont requises), et peut donc être reproduite à différents moments après la greffe, sans risque pour le patient. Grâce à cette répétabilité potentielle, la méthode de l'invention permet de mieux évaluer la réponse à la prise en charge thérapeutique et in fine aider à moduler 20 l'immunosuppression thérapeutique ou tout autre traitement qui permettrait de juguler la réactivation BK-v, le tout sans avoir recours à une biopsie du greffon rénal. Description détaillée de l'invention La méthode de l'invention est basée sur la prise en compte de trois facteurs, un 25 paramètre virologique, un paramètre immunologique et un paramètre génétique, qui doivent être combinés entre eux. Ceci permet d'obtenir un index complet, fiable et précoce du risque de développer une Nx BK-v pour un patient donné. Ces facteurs sont i) la charge virale du virus BK-v dans le sang du patient à un temps donné, ii) l'intensité de la réponse LTm anti-BK-v de ce même patient au même temps, 9 iii) le nombre d'incompatibilités des molécules HLA entre le donneur du greffon et le patient / receveur, déterminé au moment de la greffe de rein. La figure 4 illustre la méthode de l'invention basée sur la combinaison de ces trois paramètres. 5 La combinaison de ces marqueurs permet d'évaluer individuellement, à un temps t donné, le risque de survenue d'une Nx BK-v pour le patient testé. Cette méthode permet ainsi un suivi individualisé des patients transplantés rénaux. La présente méthode dispose des avantages suivants par rapports aux analyses 10 proposées dans l'art antérieur : Multiparamétrique, elle intègre la charge virale BK-v, l'intensité de la réponse LTm anti-BK-v et les différences d'allèles HLA au sein du couple donneur/receveur et permet ainsi une évaluation plus complète de la situation immuno-virologique de chaque patient. 15 k Elle est rapide, peu couteuse, standardisable et fiable, permettant un suivi prospectif du patient, pouvant être répété à intervalle de temps régulier en fonction de l'état du patient, du traitement administré, et des résultats précédemment obtenus 20 k Elle est non-invasive puisqu'elle ne requiert qu'un échantillon de 15m1 de sang du patient. Elle permet de détecter les patients à risque de Nx BK-v de manière plus précoce que les méthodes de l'art antérieur, notamment celles basées sur la sécrétion 25 cytokinique des lymphocytes T spécifiques du BK-v. r Son résultat est une valeur absolue, normée, qui peut être comparée entre les patients et au cours de la vie d'un même patient. 10 Dans un premier aspect, la présente invention concerne donc une méthode pour évaluer le risque de développer une Nx BK-v pour un patient ayant subi une transplantation rénale, ladite méthode comprenant les étapes suivantes a) mesurer la charge virale de BK-v dans un échantillon biologique dudit patient, 5 b) mesurer l'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v (par exemple, sur la base de la prolifération spécifique des lymphocytes T CD4+ et/ou CD8+ mémoires vis-à-vis des peptides BK-v) dans un échantillon biologique dudit patient, c) déterminer le nombre d'incompatibilités entre les HLA de classes I et 11 du donneur de rein et ledit patient. 10 Cette méthode permet, une fois que l'ensemble des paramètres a), b) et c) mentionnés ci-dessus ont été collectés et combinés, d'aider à diagnostiquer la Nx BK-v ou à stratifier le risque de développer une Nx BK-v. Ces étapes peuvent être effectuées dans n'importe quel ordre. Ceci étant dit, l'étape c) a été réalisée au préalable des étapes a) et b), le nombre d'incompatibilités HLA étant connu au moment de la transplantation 15 rénale. L'échantillon biologique utilisé dans l'étape a) est par exemple un échantillon de sang total ou de plasma tandis que l'échantillon biologique utilisé dans l'étape b) est de préférence un échantillon de sang total. Dans un mode de réalisation où les étapes a) et b) sont réalisées par deux laboratoires indépendants, deux échantillons distincts peuvent 20 être utilisés pour les mesures des étapes a) et b), par exemple deux échantillons de sang prélevés indépendamment l'un de l'autre. Dans le cas où deux échantillons distincts sont utilisés, ceux-ci ont été prélevés de préférence à faible intervalle de temps, typiquement dans la même journée, par exemple à quelques heures d'intervalle (entre lh et 4h), voire dans la même heure. 25 Dans un mode de réalisation préféré, les étapes a) et b) sont réalisées par le même laboratoire, avec un même échantillon biologique utilisé pour les mesures des étapes a) et b). Dans un mode de réalisation encore plus préféré, cet échantillon est un échantillon de sang, prélevé de manière non invasive, indolore, par prise de sang intraveineuse 11 classique. Cet échantillon de sang peut être analysé directement ou traité comme proposé ci-après au regard de la nature des mesures à effectuer. La quantification de la virémie BK-v (exprimée en nombre de copies/mL de sang) peut se faire par PCR quantitative à partir du sang total ou sur du plasma obtenu par centrifugation à partir du 5 sang du patient. Les cellules mononuclées du sang total, comprenant les LTm anti-BK- v, peuvent quant à elles être isolées par gradient de Ficoll à partir de l'échantillon sanguin du patient. Le « patient » est, dans le cadre de la présente demande, un individu, humain ou animal, ayant eu une transplantation rénale au cours de son existence. Dans un mode de 10 réalisation préféré, ladite transplantation a eu lieu dans les 5 dernières années précédant le prélèvement des échantillons. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, ladite transplantation a eu lieu dans les 3 dernières années précédant le prélèvement des échantillons. Dans un mode de réalisation préféré entre tous, ladite transplantation a eu lieu dans les 24 mois précédant le prélèvement des échantillons. 15 Dans un mode de réalisation préféré, la méthode de l'invention est utilisée pour diagnostiquer ou pronostiquer une Nx BK-v chez un patient faisant une réactivation sanguine à BK-v. De manière préférentielle, la méthode de l'invention s'applique à des patients dont la charge virale de BK-v est supérieure à 200 copies/mL dans le sang. En ne considérant dans un premier temps que les patients transplantés rénaux avec 20 virémie BK-v, cela représente près de 840 patients par an en France (pour près de 3500 nouvelles transplantations rénales annuelles) et 7200 patients par an en Europe et aux USA (pour plus de 30000 nouvelles transplantations rénales annuelles). La méthode de l'invention peut également s'appliquer aux patients traités pour des rejets de greffes et/ou à risque de développer ultérieurement une Nx BK-v (entre 15 et 25 20% de l'ensemble des patients transplantés rénaux, soit entre 5500 patients en France et 12000 en Europe et aux USA), ainsi qu'à ceux présentant une virémie BK-v et/ou une dégradation inexpliquée de la fonction rénale au-delà de la l' année de transplantation. 12 Ainsi, près de 6340 patients transplantés rénaux en France et plus de 19200 en Europe et aux USA pourraient être concernés chaque année par la méthode. La présente méthode pourra aussi être reproduite périodiquement pour le suivi d'un même patient. 13 Les trois étapes de la méthode de l'invention sont détaillées ci-après. a) Etape a : Mesure de la charge virale BK-v dans le sang du patient Cette étape consiste à mesurer, à partir d'un échantillon de sang total ou de plasma du patient, le nombre de copies de BK-v par mL de sang. Ce nombre de copies de BK-v 5 peut être quantifié selon les méthodes classiques décrites dans l'art. Typiquement, cette mesure peut être obtenue en utilisant des techniques de PCR, telles que la PCR quantitative. - Evaluation de la charge virale BK-v La mesure de la charge virale BK-v par ml de sang et/ou d'urine d'un patient est réalisée 10 de manière systématique pour l'ensemble des patients transplantés rénaux selon les recommandations internationales. Néanmoins, il est important de rappeler qu'une mesure isolée de la charge virale BK-v dans le sang et/ou dans les urines d'un patient ne saurait être, à elle seule, le marqueur diagnostique d'une Nx BK-v, puisque de nombreux patients souffrant de virémie ou de virurie à BIC-y n'ont pas de Nx BIC-v 15 (figure 1, [9]). Ainsi, cette mesure n'a pas pour vocation d'être utilisée, en tant que telle, comme marqueur diagnostique de Nx BK-v, comme certaines équipes ont pu le proposer ([10]). Cette dernière étude ([10]), réalisée sur un faible nombre de patients, n'a pas été confirmée sur une population plus large. De plus, la charge virale BK-v sanguine ne permet pas de distinguer de façon fiable les patients souffrant de Nx BK-v 20 de ceux souffrant de virémie à BK-v isolée. En effet, une récente méta-analyse a mis en évidence qu'une charge virale de BK-y > 104 copies/mL de sang était associée à une valeur prédictive positive de 55% pour le diagnostic de Nx BK-v ([26]). La figure 5 illustre cette notion en montrant les différents niveaux de charges virales sanguines et urinaires du BIC-v mis en évidence par les inventeurs pour élaborer la présente méthode. 25 De plus, en accord avec l'état de l'art antérieur, il est important de noter que si une charge virale sanguine du BK-v > 105 peut être associé à une Nx BIC-v avec une sensibilité de près de 100% ([26]), ce paramètre est tardif car déjà associé à des lésions du parenchyme rénal et à une dysfonction chronique sévère du greffon au moment du diagnostic de Nx BK-v (figure 2a). Par ailleurs, du fait de l'absence de différence 14 significative entre les patients avec virémie BK-v isolée et Nx BK-v, la charge virale BK-v urinaire n'a pas été prise en compte dans l'élaboration de l'invention (figure Sb) Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon biologique utilisé pour l'étape a) est un échantillon de sang total (incluant le plasma et les éléments figurés du sang, à savoir 5 les globules rouges, les leucocytes et les plaquettes) ou un échantillon de plasma. Cet échantillon de sang total ou de plasma peut être traité selon les techniques classiques dans l'art. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la charge virale de BK-v est mesurée à l'étape a) par PCR quantitative à partir d'un échantillon biologique (par exemple de sang total ou de plasma) dudit patient. - Normalisation de la charge virale BK-v sanguine Dans le cadre de l'invention, la mesure de la charge virale BK-v sanguine permet uniquement de quantifier la quantité de virus circulant dans le sang du patient à l'instant de la réalisation du test de l'invention. Cette valeur de charge virale mesurée à l'étape 15 a) permet de normaliser l'intensité de la réponse LTm anti-BK-v obtenue à l'étape b) afin d'obtenir un index indépendant et comparable entre individus. Les inventeurs ne l'utilisent pas comme marqueur pronostic, comme proposé dans l'art antérieur, en comparant la charge virale à un seuil (par exemple, 4logio copies d'ADN/mL pendant au minimum 4 semaines) ([9]). 20 Plus précisément, cette étape permet de révéler si l'infection virale est absente, présente ou anormalement élevée dans le sang du patient, de sorte à pondérer les résultats obtenus à l'étape b) concernant l'intensité de la réponse LTm anti-BK-v chez ledit patient, au moment du prélèvement. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, il est possible de normaliser le 25 paramètre b) de la méthode de l'invention pour une valeur fixe de copies de BK-v par mL de sang. A partir des résultats ayant permis l'élaboration de la présente méthode, la valeur fixe de normalisation de 103 copies de BK-v par mL de sang a été intégrée comme 15 paramètre virologique dans le calcul de la méthode de l'invention. Cette valeur de normalisation de 103 copies de BK-v a été définie afin de permettre une évaluation du risque de Nx BK-v la plus précoce possible et ce, dès le stade de virémie à BK-v isolée (figure 5a). Les seuils plus élevés de copies de BK-v étaient plus tardifs, associés à des 5 diagnostics de Nx BK-v (figures Sa) et à des lésions du parenchyme rénal (figures 2a). Néanmoins, ce seuil n'étant qu'un seuil de normalisation fixé par les inventeurs, d'autres valeurs peuvent être utilisées pour normaliser le paramètre b), en fonction du patient, du groupe de patient, etc. La valeur seuil de positivité de la charge virale BK-v est fixée à 200 copies/mL de sang 10 et on peut, par exemple, utiliser comme seuil de normalisation 3.7logio, 4logio ou 4.2log 0 (seuils précédemment proposés dans la littérature ([261). Une fois normalisé, le résultat obtenu à la mesure de l'étape b) pourra ainsi être comparé entre individus, ou, à différents intervalles de temps pour un même individu. Cette comparaison inter-individuelle permettra de classer le patient suivant le niveau de risque 15 de son groupe tandis que la comparaison intra-individu permettra de suivre l'évolution au cours du temps du niveau de risque de développer une Nx BK-v chez un même patient. 16 b) Etape b : Evaluation de l'intensité normalisée de la réponse lymphocytaire T mémoire anti-BK-v Cette étape consiste à évaluer, à partir d'un échantillon de sang périphérique, la réponse LTm anti-BK-v à un temps t donné en mesurant la capacité de prolifération 5 lymphocytaire en réponse à une stimulation par des peptides spécifiques du BK-v. La normalisation de cette réponse immune spécifique par rapport à la charge virale BKv dans le sang permet d'obtenir l'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v, permettant ainsi des comparaisons intra et inter individus. - Evaluation de la réponse LTm anti-BK-v 10 Les lymphocytes T mémoires anti-BK-v (LTm anti-BK-v) sont des lymphocytes T possédant des immunorécepteurs (TCR) spécifiques d'antigènes du BK-v et ayant été activés au préalable par un contact antérieur avec le BK-v. Ces lymphocytes gardent la « mémoire » de leur rencontre avec ce virus au cours de la primo-infection virale. Cette mémoire leur permet de mieux réagir lors d'un nouveau contact avec ce virus, en 15 développant une réponse secondaire rapide et efficace. Il est important de noter que la séroprévalence des polyomavirus humains est très élevée au niveau mondial (80 - 90 06 à l'âge adulte pour le BK-v et le JC-v), témoignant d'une exposition précoce et large à ces virus. Les performances de cette réponse secondaire ne sont pas simplement le fait d'une 20 augmentation quantitative des LTm anti-BK-v. A la plus grande fréquence des clones spécifiques immédiatement recrutables au moment d'un nouveau contact antigénique, s'ajoute une meilleure fonctionnalité des cellules « mémoires » quand on les compare à celles de cellules naïves, en termes de capacités prolifératives, de sécrétion de cytokines et de cytotoxicité. Ces performances accrues des lymphocytes T mémoires sont liées à 25 des modifications épigénétiques au niveau des promoteurs des gènes impliqués dans la réponse immune. L'étape b) de la méthode de l'invention consiste donc à évaluer l'intensité de la réponse LTm anti-BK-v présents dans l'échantillon biologique du patient testé en mesurant la capacité de prolifération des LTm anti-BK-v en réponse à une stimulation par des 17 peptides spécifiques du BK-v et en normalisant cette réponse à une charge virale fixe de BK-v (intensité normalisée). La capacité proliférative est un élément pivot de la polyfonctionnalité des réponses lymphocytaires T CD4 et T CD8 mémoires et une des premières fonctionnalités perdues 5 au cours des dysfonctionnements immuns lors des infections virales chroniques. La capacité proliférative traduit la richesse des populations T CD8 mémoires en cellules de type Tcm et Tscm (cellules T centrales mémoires et cellules souches mémoires). Ces cellules ont des capacités élevées de prolifération, d'auto-renouvellement et de différentiation en cellules effectrices. Par ailleurs elles fournissent des signaux d'aide indispensables à une fonctionnalité optimale des cellules effectrices. Il ne s'agit pas, comme proposé dans l'art antérieur, de mesurer la sécrétion cytokinique des lymphocytes T contenus dans le sang des patients, en présence de peptides du BKv ([9]). Plus précisément, il ne s'agit pas non plus de mesurer la sécrétion d'interféron gamma en réponse à une stimulation peptidique d'antigènes du BK-v par des techniques 15 de type ELISA ou ELISPOT, comme proposé dans [22], et encore moins avant et après la greffe comme proposé dans [23]. Ces techniques de l'art antérieur ne permettent pas une évaluation précise des capacités de reconstitution de l'immunité mémoire. En effet, la capacité de sécrétion d'Interféron-y permet d'étudier préférentiellement des sous-populations lymphocytaires mémoires dites « terminales » de type effecteurs mémoires 20 ou effecteurs terminaux. Ces sous-populations lymphocytaires très différenciées sont peu, voire non dotées de capacités d'auto-renouvellement, de prolifération et de différentiation lymphocytaire et ne permettent donc pas d'évaluer de façon optimale les capacités de reconstitution de l'immunité mémoire antivirale ([13], [14]). En se basant sur les résultats ayant permis l'élaboration de la présente méthode, les inventeurs ont pu 25 démontrer que l'évaluation seule de la sécrétion cytokinique d'Interféron-7 n'est pas le paramètre de fonctionnalité lymphocytaire le plus pertinent pour discriminer de manière fiable et reproductible les patients avec virémie BK-v des patients avec Nx BK-v (figure 6/1a). La prolifération lymphocytaire est la méthode d'évaluation la plus discriminante (figure 30 6/lb) En effet, la réponse proliférative était significativement plus faible chez les 18 patients avec Nx BK-v par rapport aux 3 autres groupes de patients (sans réactivation BK-v, virurie BK-v et virémie BK-v isolée (figures 6/1b)). Ceci n'était pas le cas en évaluant la sécrétion d'interféron-7, où la réponse cytokinique était significativement plus faible entre les patients avec Nx BK-v et virurie BK-v, mais pas entre les patients 5 avec Nx BK-v et virémie BK-v (figures 6/1a) Par ailleurs, l'intensité de la réponse proliférative des LTm anti-BK-v (évaluée par le nombre de lymphocytes T CF SE1°"" (cf infra)) était négativement corrélée à la charge virale de BK-v dans le sang (figure 7). Les présents inventeurs ont donc privilégié l'évaluation de la prolifération lymphocytaire par rapport aux autres techniques précédemment employées pour évaluer 10 les capacités de reconstitution de l'immunité mémoire spécifique du BK-v et élaborer la méthode de l'invention. - Identification de la réponse LTm anti-BK-v Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon biologique utilisé dans l'étape b) est un échantillon de sang total. Ledit échantillon biologique est, de manière encore plus 15 préférée, un échantillon de sang total prélevé sur le patient de manière indolore par ponction intraveineuse périphérique. Comme expliqué ci-dessus, les lymphocytes T mémoires sont naturellement présents dans ce type d'échantillon biologique si le patient a été infecté par le vins BK-v. Ces lymphocytes mémoires vont réagir rapidement lorsqu'ils sont (re)mis en contact avec 20 des antigènes du virus BK-v. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules mononucléées présentes dans l'échantillon biologique sont isolées selon les méthodes classiques de purification cellulaire. Elles sont séparées des autres composantes de l'échantillon par leur densité, en utilisant des gradients de Ficoll-Hypaque (ou équivalents). Après centrifugation, les 25 cellules de faible densité (lymphocytes, monocytes/macrophages, cellules dendritiques et autres cellules présentatrices d'antigènes) sont en suspension au-dessus du Ficoll alors que toutes les autres composantes de l'échantillon forment un culot. Les cellules mononuclées peuvent alors être récupérées à l'aide d'une pipette. 19 Dans un mode de réalisation plus particulier, les cellules mononuclées du sang total sont ensuite stimulées par un mélange d'antigènes de virus BK-v (par exemple Peptivator® BKV VP1 ou Peptivator® BKV LT commercialisés par Myltenyi Biotec®, ou équivalents, à la concentration finale de 1 ttg/mL/peptide). De préférence, des mélanges 5 de peptides BK-v chevauchants sont utilisés afin de s'affranchir des différences HLA entre patients. Les LTm anti-BK-v présents dans l'échantillon vont alors proliférer activement au contact de ces antigènes. Cette stimulation peut durer quelques jours (typiquement de 4 à 7 jours, de préférence 5 jours). Ainsi, la réponse LTm anti-BK-v CD4+ ou CD8+ mesurée à l'étape b) de la méthode de 10 l'invention est déterminée de préférence en mettant en contact des cellules mononuclées du sang périphérique dudit patient avec des peptides du virus BK-v, et en évaluant la prolifération des lymphocytes T présents dans lesdites cellules mononuclées après quelques jours de culture (typiquement de 4 à 7 jours, de préférence 5 jours de culture). Cette prolifération peut être mesurée en détectant l'expression d'un marqueur de 15 division cellulaire (type CFSE ou équivalent) dont l'intensité diminue au cours des divisions cellulaires, chaque cellule fille contenant la moitié du marqueur contenu dans la cellule mère. Afin d'identifier spécifiquement les LTm anti-BK-v ayant activement proliféré, cette prolifération lymphocytaire est soustraite à la prolifération spontanée des lymphocytes T dudit patient (lymphocytes T ayant été mis en culture dans les 20 mêmes conditions, pendant la même durée mais sans les peptides du BK-v). De manière encore plus préférée, ladite prolifération spécifique des LTm anti-BK-v est mesurée en déterminant la proportion de lymphocytes T CD4+ ou CD8+ ayant dilué le CF SE (ou un marqueur de division cellulaire équivalent), présents après quelques jours de culture en présence desdits peptides (typiquement de 4 à 7 jours, de préférence 5 25 jours de culture), et en lui soustrayant la proportion de lymphocytes T CD4+ ou CDS+ ayant dilué le CFSE (ou un marqueur de division cellulaire équivalent), pendant le même temps, mais en l'absence desdits peptides. De manière encore plus préférée, ladite prolifération spécifique des LTm anti-BK-v CD4- est mesurée en comparant la proportion de lymphocytes T CD4- ayant dilué le 30 CFSE (ou un marqueur de division cellulaire équivalent) dans la culture en présence 20 des peptides, avec la proportion desdits lymphocytes ayant dilués le même marqueur et cultivés dans les mêmes conditions de culture, mais sans lesdits peptides. De manière encore plus préférée, ladite prolifération spécifique des LTm anti-BK-v CD8- est mesurée en comparant la proportion de lymphocytes T CD8- ayant dilué le 5 CFSE (ou un marqueur de division cellulaire équivalent) dans la culture en présence des peptides, avec la proportion desdits lymphocytes ayant dilués le même marqueur et cultivés dans les mêmes conditions de culture, mais sans lesdits peptides. L'intensité de la réponse LTm anti-BK-v peut être mesurée en utilisant n'importe quel marqueur de prolifération cellulaire classiquement utilisé (CFSE, 'TH, BRDU ou 10 équivalent, etc). Les lymphocytes T CD4il et CD8- peuvent ensuite être identifiés par cytométrie de flux à l'aide d'anticorps anti-CD4 et anti-CD8 commerciaux. Dans un mode de réalisation préféré, l'étape b) utilise des cellules mononuclées du sang périphérique purifiées selon toute méthode classique connue dans l'art (par exemple en 15 utilisant le milieu de séparation des cellules sanguines de PAN BIOTECH, ref. PO4- 60505). Les lymphocytes T CD4il et/ou CD8il ayant proliféré suite à la stimulation antigénique BK-v spécifique peuvent être qualifiés de lymphocytes mémoires « répondeurs » ou de « fonctionnels », puisqu'ils répondent à la stimulation antigénique spécifique et 20 présentent une cinétique de prolifération typique de lymphocytes mémoires. Après quelques jours de culture (typiquement de 4 à 7 jours, de préférence 5 jours de culture) en présence de peptides spécifiques du BK-v, le test de prolifération renseigne sur le nombre de lymphocytes T mémoires CD4- ou CDS' anti-BK-v initialement présents dans l'échantillon du patient. 25 Après stimulation peptidique spécifique, la proportion de LT ayant dilué le CFSE (LT CFSEI") est liée à la présence des LTm anti-BK-v fonctionnels initialement présents dans l'échantillon. La proportion de LT CFSEI'" mesurée en présence de stimulation 21 peptidique est corrigée par soustraction de la proportion de LT CFSE1°"" obtenue en l'absence des peptides BK-v. La figure 8/1 illustre le protocole d'identification de la réponse LTm anti-BK-v, via l'analyse de la prolifération des LTm anti-BK-v en réponse à un pool de peptides 5 spécifique du BK-v (proportion de LT CF SE1'). - Evaluation de l'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v A partir de la proportion des LTm anti-BK-v CFSE1°" obtenue plus haut, l'intensité de la réponse LTm anti-BK-v peut être quantifiée en « unité de mesure d'intensité normalisée » Une « unité de mesure d'intensité normalisée » est ici définie comme étant la proportion de LTm anti-BK-v CFSE1", exprimée pour 106 lymphocytes T totaux et normalisée pour 103 copies de BK-v par mL de sang. En pratique, on obtient cette « unité de mesure d'intensité normalisée » en multipliant la proportion des LTm anti-BK-v obtenue plus haut par 10 000, puis en normalisant le 15 chiffre ainsi obtenu pour 10' copies de BK-v par mL de sang (en tenant compte de la charge virale réelle du patient testé, telle que mesurée à l'étape a). Plus explicitement, cette proportion des LTm anti-BK-v CFSEk" (exprimée pour 106 lymphocytes T totaux) est normalisée à un nombre fixe de copies de BK-v par mL de sang et reflète ainsi l'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v pour une charge 20 virale donnée. Cette normalisation de l'intensité de la réponse LTm anti-BK-v permet une comparaison infra et inter-individus. La figure 8/2 est un exemple d'évaluation de l'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v. Par exemple, 25 - si la proportion de LTm anti-BK-v CFSE16", mesurée par prolifération lymphocytaire, est de 3,12 % (proportion de LT CFSElmy = 3,20 'vo après 22 stimulation par les peptides BK-v - 0,08 % sans lesdits peptides - figures 8/1e et 8/2a : exemple « Virémie BK-v »). Ainsi, cette proportion de lymphocytes T CFSE1" exprimée pour 106 lymphocytes T 5 totaux est de 31 200 (3,12*10000) (figure 8/2b - exemple « Virémie BK-v ») - et si la charge virale du patient testé est de 2.104 copies de BK-v par mL de sang (figure 8/2c - exemple « Virémie BK-v »), - alors, l'unité de mesure d'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v est de 10 [31 200*1.10]/2,0.104 = 1 560 (figure 8/2d - exemple « Virémie BK-v »). Cette mesure de l'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v propre à chaque individu est ensuite comparée à une valeur seuil. A partir des résultats ayant permis l'élaboration de la présente méthode, la valeur seuil de 102 a été intégrée comme paramètre immunologique dans le calcul de la présente méthode. Cette valeur seuil de 15 102 a été définie en fonction de l'étendue de la distribution de l'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v dans le groupe des patients avec Nx BK-v (figure 9). Plus explicitement, les patients avec Nx BK-v présentaient une intensité normalisée de réponse LTm anti-BK-v plus faible par rapport aux patients avec virémie BK-v isolée (figure 9). La valeur seuil de 102 a été définie dans le groupe des patients avec Nx BK- 20 y en fonction de l'étendue de la distribution non gaussienne de l'intensité de cette réponse afin de prendre en compte jusqu'au 90é°" percentile des valeurs de LTm antiBK-v normalisées (figure 9). Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, seule la prolifération des lymphocytes T CD814 est mesurée à l'étape b). Sans que cela ne soit limitant, les 25 inventeurs ont pu montrer une meilleure discrimination des patients avec Nx BK-v en se basant sur les lymphocytes T CD811 par rapport aux lymphocytes T CD411 (figure 10). 11 est possible que cet effet amélioré soit dû à l'importance de l'action directe médiée par les lymphocytes T CD8- dans le contrôle de la réplication intra-parenchymateuse du BK-v (d'un point de vue immunologique, si les lymphocytes T CD4+ contribuent à 23 l'élaboration et au maintien d'une réponse CD8- efficace, ce sont en effet les lymphocytes T CD8+ qui vont infiltrer le greffon et détruire les cellules infectées par le BK-v). Dans ce mode de réalisation, la proportion de lymphocytes T CD8- CFSE1' [mesurée 5 à l'étape b) et exprimée pour 106 lymphocytes T CD8+ totaux] est ainsi normalisée pour 103 copies de BK-v par mL de sang puis comparé au seuil de 102 afin de permettre la classification des patients en fonction du niveau de risque de Nx BK-v, comme expliqué dans la caractérisation de l'index de l'invention ci-dessous. L'évaluation de la proportion de LTm anti-BK-v CFSEl" ainsi que la mesure de la lo charge virale BK-v seront de préférence répétées au cours de la vie du patient, du fait du caractère évolutif des valeurs de ces paramètres après la transplantation. 24 c) Etape c : Mesure du nombre d'incompatibilités HLA entre le donneur et le receveur Cette étape consiste à mesurer le nombre d'incompatibilités HLA entre le donneur et le receveur du greffon rénal. 5 - Evaluation du nombre d'incompatibilités HLA entre le donneur et le receveur Le HLA (Humait Leukocyte Antigens, antigènes des leucocytes humains) correspond au complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Il désigne des protéines spécialisées (antigènes) présentes sur la surface de toutes les cellules (dont les leucocytes) et les gènes qui codent pour celles-ci. Le CMH assure la fonction de présentation de 10 l'antigène afin de permettre sa reconnaissance par le lymphocyte T par l'intermédiaire de son récepteur spécifique pour l'antigène (TCR). L'extrême diversité (polymorphisme génétique) du CMH en fait un déterminant principal de l'acceptation ou du rejet de la transplantation d'organes entre individus. Le typage HLA identifie les gènes HLA majeurs de l'individu et les antigènes 15 correspondants qui sont présents sur la surface cellulaire. Ce typage peut être réalisé par des techniques sérologiques ou moléculaires (par PCR). Pour chaque couple donneur-receveur de greffe, un « nombre d'incompatibilité HLA » est déterminé au moment de la transplantation selon les méthodes classiques décrites dans l'art. 20 Ce nombre d'incompatibilité est le nombre d'antigènes HLA (FILA-A, -B, -DR, -DQ) différents du donneur par rapport au receveur. Elle est impérativement effectuée lors de la transplantation rénale, car elle garantit en grande partie la réussite de la transplantation. Pour que le risque de rejet de greffe soit minimal, il est important que les antigènes FILA du donneur et du receveur soient les plus proches possible. C'est 25 pourquoi sur l'ensemble des transplantations rénales réalisées en 2016 à partir de donneur décédé, plus de 90% des receveurs avaient moins de 6 incompatibilités FILA avec le donneur [28]. 25 Les règles de calcul des compatibilités FILA sont bien connues. Par exemple, si le donneur est de type FILA-A3 et -A33 et que le receveur est de type HLA-A33 et -A33, le couple donneur / receveur présente 1 incompatibilité dans le HLA-A. Si, par contre, le donneur est de type HLA-A33 et -A33 et que le receveur est de type HLA-A3 et - 5 A33, aucune incompatibilité dans le FILA-A n'est comptabilisée. Cette méthode de calcul des incompatibilités FILA est bien décrite dans la littérature scientifique. L'évaluation des incompatibilités FILA est généralement réalisée au moment de la transplantation rénale. Il s'agit d'une évaluation fixe (i.e. non évolutive). L'effet potentiel des incompatibilités HLA sur la réactivation du virus BK-v et le 10 développement des Nx BK-v a été décrit dans quelques études dont les résultats sont discordants. Ceci est probablement expliqué par l'hétérogénéité des définitions concernant les différentes réactivations du BK-v dans la littérature (distinction entre les viruries, virémies et Nx BK-v). Si les incompatibilités FILA sont associées à une réplication plasmatique du BK-v ([16], [18]), leur impact sur le développement des Nx 15 BK-v reste peu connu. L'une d'entre elles, Awadalla Y et al ([11]) a montré en 2004 que ces néphropathies sont associées à un taux élevé d'incompatibilité HLA. Ces auteurs ont donc suggéré qu'une diminution du nombre d'incompatibilité HLA réduirait le risque de développer ces néphropathies. Une remarque importante concernant cette étude est que cette association a été mise en évidence chez des patients avec Nx BK-v 20 comparé à des patients sans Nx BK-v, sans préciser la présence d'une éventuelle virémie ou virurie chez les patients sans Nx BK-v. A l'inverse, des études plus récentes font état de la survenue de Nx BK-v également dans un contexte de bonne compatibilité FILA entre le donneur et le receveur ([17] ; [19]). Enfin, d'autres auteurs ont retrouvé chez des patients avec Nx BK-v une relation inverse entre un faible niveau 25 d'incompatibilité FILA et une plus grande fréquence de pertes de greffon ([15]). Basé sur les résultats ayant permis l'élaboration de la présente méthode, les inventeurs ont mis en évidence un nombre plus faible d'incompatibilité FILA chez les patients avec Nx BK-v. Les patients avec Nx BK-v présentaient un nombre total d'incompatibilité HLA [HLA-A, -B, -DR, -DQ] moindre par rapport aux patients avec virémie BK-v 26 isolée (figure 11a) Par ailleurs, ce nombre d'incompatibilité HLA était négativement corrélé à la charge virale BK-v (figure 1 lb). A partir de ces résultats, la valeur seuil de 5 incompatibilités dans les HLA-A, -B, -DR et -DQ a été intégré comme paramètre génétique dans le calcul de la présente méthode. 5 Cette valeur seuil de 5 a été définie en fonction de l'étendue de la distribution non gaussienne du nombre d'incompatibilités HLA afin de prendre en compte jusqu'au 75c'" percentile des valeurs d'incompatibilités HLA dans le groupe des patients avec virémie BK-v (figure 11a). 10 Compilation des résultats pour calculer l'index diagnostic de l'invention Les trois paramètres a), b) et c) décrits ci-dessus sont ensuite compilés pour créer un index de stratification du risque que le patient développe - ou non - une Nx BK-v. Ainsi, les présents inventeurs ne proposent pas d'utiliser les trois paramètres a), b) et c) 15 isolément, mais de les combiner les uns aux autres afin de créer la méthode de l'invention et d'évaluer le risque de développer une Nx BK-v. La figure 12 représente l'ensemble des étapes décisionnelles menant à évaluer ce risque de Nx BK-v selon la méthode de l'invention. En effet, comme décrit dans les exemples ci-dessous et sur les figures 12 et 13, il existe 20 des valeurs seuils, définies à partir des combinaisons des 3 paramètres de l'invention, qui permettent de distinguer les patients ayant un risque élevé de développer une Nx BK-v de ceux qui n'en développeront pas. Basé sur la cohorte utilisée dans les exemples de la présente demande, ces seuils sont de : 25 - 5 pour le nombre d'incompatibilité HLA, et de - 10' unités de mesure d'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v. 27 Les présents inventeurs ont ainsi démontré qu'une intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v inférieure ou égale à (1 10' associé à un nombre total d'incompatibilités HLA inférieur ou égal à ( ) 10' associé à un nombre total d'incompatibilités HLA strictement supérieur à (>) 5 traduit un risque très faible que le patient receveur de la greffe développe une Nx BK-v à court, moyen ou long terme (figure 13 - cadran blanc). 10 En analyse transversale de la cohorte utilisée dans les exemples de la présente demande, 100% des patients ayant une intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v 102 et un nombre total d'incompatibilités HLA > 5 n'avaient de Nx BK-v 15 (figure 13, cadran blanc). Ces seuils (5 pour le nombre d'incompatibilité HLA et 10- pour les unités de mesure d'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v) ont été établis à partir du cas particulier de la cohorte étudiée pour élaborer la présente invention. Ces seuils pourront être amener à évoluer et/ou être affiner selon les résultats d'une cohorte plus 20 conséquente suivie de manière longitudinale. Les présents inventeurs pourront plus généralement adapter la méthode de l'invention afin de tenir compte des spécificités d'une telle population. Notamment, pour obtenir l'index de l'invention, il sera possible aux présents inventeurs d'étudier les valeurs des trois paramètres a), b) c) mentionnés ci-dessus, de les combiner et d'identifier les seuils adaptés et les valeurs de 25 normalisation adéquates en fonction des résultats et des méthodes graphiques obtenus à partir de l'analyse d'une telle population (méthode graphique sur le format des figures 12 et 13). Dans le cas particulier de la cohorte étudiée, trois niveaux de risque ont été identifiés par les inventeurs sur la base de leurs analyses, réalisées sur plus de 27 patients 28 transplantés rénaux (dont 11 patients avec 'frémie BK-N, et 16 patients avec Nx BK-v) - Un niveau de risque élevé de Nx BK-v dans le cas d'une intensité normalisée de réponse LTm anti-BK-v 5 (figure 13 - cadran gris clair inférieur droit) ou en présence d'une intensité normalisée de réponse LTm anti-BK-v > 102 et d'un nombre total d'incompatibilités HLA 102 et d'un nombre total d'incompatibilités HLA > 5 (figure 13 - cadran blanc). Ce niveau de risque est en faveur d'un faible risque de Nx BK-v. Dans cette situation, une surveillance de la charge virale et de la fonction rénale doit être préconisée. L'immunosuppression peut être maintenue ou légèrement allégée. 20 Dans le cas particulier de la cohorte étudiée, cet index a démontré les excellentes caractéristiques techniques suivantes : - une valeur prédictive positive de 100 % (probabilité de Nx BK-v si le test est positif) lorsque le résultat de la méthode est un niveau de risque élevé de Nx BK-v, - une valeur prédictive négative de 100 % (probabilité d'absence de Nx BK-v si 25 le test est négatif) lorsque le résultat de la méthode est un niveau de risque faible de Nx BK-v, 29 - une sensibilité de plus de 60 % (probabilité de test positif en cas de Nx BK-v) lorsque le résultat de la méthode est un niveau de risque intermédiaire de Nx BK-v, - Un taux nul de faux positif (un test positif étant défini par une intensité normalisée de réponse LTm anti-BK-v 104 copies/mL 54.5 100 Godinho Pinto et al. [26] (meto-onalysis) PCR BK-v plasmatique > 4.2 logio 50 100 Godinho Pinto et al. [26] (mets-onalysis) PCR BK-v plasmatique 3.7 logio 29 100 15 La méthode de l'invention se caractérise donc de préférence en ce qu'un risque élevé de développer une néphropathie à BK virus (BK-v) est diagnostiqué si : a) ramené à une charge virale de 103 copies de virus BK-v par mL de sang, 30 b) l'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v CD4+ ou CDS' est inférieure ou égale à 100 unités de mesure d'intensité, et c) le nombre d'incompatibilité entre ledit patient et le donneur du rein greffé est inférieur ou égal à 5. 5 La méthode de l'invention se caractérise également de préférence en ce qu'un risque faible de développer une néphropathie à BK virus (BK-v) est diagnostiqué si : a) ramené à une charge virale de 103 copies de virus BK-v par mL de sang, b) l'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v CDzr ou CD8+ est strictement supérieure à 100 unités de mesure d'intensité, et 10 c) le nombre d'incompatibilité FILA entre ledit patient et le donneur de greffe est strictement supérieur à 5 Utilisations diagnostique et pronostique de l'index de l'invention N'étant pas invasive, la méthode de l'invention pourra être reproduite autant de fois que 15 nécessaire chez les patients à risque (typiquement, les patients ayant subi une transplantation rénale). Sa fréquence pourra être personnalisée selon le profil de chaque patient, ou au vu des résultats des tests précédents. En outre, il sera possible de d'adapter la dose des traitements immunosuppresseurs de manière personnalisée, à la hausse ou à la baisse, à l'aide du résultat de cet index. La diminution du traitement sera prescrite 20 uniquement pour les patients souffrant de Nx BK-v ou ceux dont le risque d'en développer est élevé. Les patients pour lesquels cette diminution serait sans bénéfice voire néfaste pour le greffon (typiquement les patients présentant une virémie isolée du virus BK-v sans atteinte du greffon rénal) seront identifiés et le traitement initialement prescrit pourra être maintenu. 31 - Il est recommandé de réaliser la méthode de l'invention pour chaque patient ayant subi une transplantation rénale, et ce à intervalle de temps régulier. Cette récurrence pourrait en effet permettre : r D'aider au diagnostic de Nx BK-v 5 'fr> De préciser individuellement le niveau de risque de développer une Nx BK-v afin de prévenir la survenue d'une telle complication. r D'évaluer l'immunosuppression thérapeutique du patient, et, en particulier, de guider l'adaptation du traitement immunosuppresseur afin d'éviter tout défaut ou excès d' immunosuppression thérapeutique. 10 Dans un mode de réalisation préféré, la méthode de l'invention est réalisée en même temps que le dosage des traitements immunosuppresseurs à administrer audit patient. Un test concluant à un risque élevé de Nx BK-v serait en faveur d'une diminution du traitement immunosuppresseur afin de prévenir sa survenue. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la méthode de l'invention est répétée 15 plusieurs fois au cours du traitement post-transplantation, par exemple tous les 3 à 6 mois dans la population des patients à risque de développer une Nx BK-v (patients avec virémie et/ou ayant eu un traitement de rejet de greffe et/ou ayant une dégradation inexpliquée de la fonction du greffon rénal). En plus de la réalisation systématique chez tous patients présentant une virémie BK-v, 20 il est recommandé de réaliser la méthode de l'invention dans les situations suivantes : o Lors de l'intensification du traitement immunosuppresseur dans le cadre du traitement curatif d'un rejet de greffe, afin d'évaluer le risque ultérieur de survenue de Nx BK-v, o Lors de l'allègement de l'immunosuppression après un premier test 25 positif afin d'évaluer l'impact de cet allègement sur la réponse LTm anti-BK-v, 32 o En cas de dégradation inexpliquée de la fonction du greffon rénal afin d'évaluer le risque et/ou d'aider au diagnostic de Nx BK-v. La méthode de l'invention pourrait être réalisée 2 à 3 mois après la modification du traitement immunosuppresseur. Le résultat de la méthode de l'invention pourrait 5 permettre de définir chez un malade le moment de ré-augmentation du traitement immunosuppresseur, si une réponse immune se développe. La figure 14 montre les différentes indications de la méthode de l'invention ainsi que le délai de répétition de ladite méthode. Ainsi, la figure 15 illustre l'approche proposée pour évaluer le risque de Nx BK-v. Cette 10 nouvelle approche se base initialement sur le suivi longitudinal de la charge virale du BK-v dans le sang du patient, et ce dès le seuil de positivité de la charge virale BK-v (>200 copies/mL de sang). A la différence de l'approche habituelle de la Nx BK-v (figure 3), cette nouvelle approche n'est pas conditionnée par la réalisation d'une biopsie du greffon rénal mais par l'utilisation de la méthode de l'invention. 15 L'application de la présente méthode permet de stratifier le niveau de risque de Nx BK- v chez les patients transplantés rénaux avec réactivation BK-v sanguine. Sans que cela ne soit limitant, seuls les patients avec un risque de Nx BK-v évalué comme intermédiaire à élevé auront effectivement une minimisation du traitement immunosuppresseur. Les patients avec un risque faible de Nx BK-v n'auront pas de 20 minimisation du traitement immunosuppresseur. Dans tous les cas, une surveillance régulière de la charge virale BK-v et la répétition de la dite-méthode seront également préconisées. La présente invention permet une évaluation du risque de Nx BK-v avant la dysfonction du greffon rénal. Elle permet un gain de temps et une stratification efficace du risque de Nx BK-v, permettant à terme de guider l'immunosuppression 25 thérapeutique (figure 15). La présente demande vise également une méthode in vitro d'évaluation de la réponse d'un patient greffé rénal à une réplication sanguine du BK-v après modification du traitement immunosuppresseur, caractérisée en ce que la méthode définie ci-dessus (index de l'invention) est répétée à intervalle de temps régulier après la transplantation. 33 De préférence, la méthode de l'invention est répétée avant et après chaque modification de traitement. De préférence, la méthode de l'invention est répétée tous les 3 à 6 mois environ, à une fréquence dépendant du niveau de la réactivation Bk-v plasmatique et/ou de la nécessité 5 de modifier le traitement immunosuppresseur dudit patient. Les traitements immunosuppresseurs couramment utilisés en transplantation rénale sont par exemple : - Au moment initial de la transplantation rénale, des traitements d'induction associant des corticostéroïdes à fortes doses et des anticorps polyclonaux anti- 10 lymphocytaires (immunoglobulines anti-thymocytes humains, Thymoglobulinesü- ou Grafalonü-) ou des anticorps monoclonaux anti-CD25 (Basiliximab, Simulect') ; - En relais des traitements d'induction, des traitements d'entretien associant o une corticothérapie à faible dose, 15 o un inhibiteur de la calcineurine (Tacrolimus, Prograf ou Ciclosporine, NéoraP) et un inhibiteur de la synthèse des bases puriques (Mycophénolate mofétil, Cellcept®), o ou encore d'autres molécules telles que des inhibiteurs de la voie mTor (Everolimus, Certican0) ou du CTLA4-Ig (Bélatacept, Nulojix®) [1]. 20 Si la méthode de l'invention détecte un risque important de développer une Nx BK-v, la prise en charge thérapeutique doit aboutir à un allégement de l'immunosuppression, ou éventuellement à un changement de traitement Légende des figures La figure 1 décrit la fréquence de réactivation du BK-v après transplantation rénale en termes de virurie à BK-v, de virémie à BK-v isolée, de Nx BK-v et de dysfonction chronique/perte de greffons rénaux [4,5,6,7] 5 La figure 2 décrit l'évolution à 3 ans du greffon rénal chez les patients avec ou sans Nx BK-v (a - fonction rénale évaluée par la mesure du débit de filtration glomérulaire (DFG) en ml/min/1.73m2, test de Kruskal-Wallis et b - survie des greffons rénaux, Kaplan-Meier et log-rank test). La figure 3 représente l'approche actuelle de la Nx BK-v, basée sur l'évaluation de la charge virale sanguine du BK-v et sur la biopsie du greffon rénal. La figure 4 décrit la méthode de l'invention basée sur la combinaison de trois paramètres : - i) un paramètre virologique évalué par la charge virale du BK-v dans le sang du patient, 15 - ii) un paramètre immunologique évalué par l'intensité de la réponse LTm anti- BK-v chez le patient, et - iii) un paramètre génétique évalué par le nombre d'incompatibilités HLA dans le couple [donneur/receveur] La figure 5 montre les niveaux de charges virales BK-v dans le sang (a) et l'urine (b) 20 des différents groupes de patients de la cohorte étudiée ici (test non paramétrique de Kruskal-Wallis). Le seuil utilisé dans la méthode de l'invention (10' copies/mL de BKv dans le sang) a été défini à partir de ces résultats afin de permettre une évaluation du risque la plus précoce possible. La figure 6 - partie 1 montre les différents tests de fonctionnalité lymphocytaire 25 réalisés après stimulation par des peptides spécifiques du BK-v. La sécrétion cytokini que (1 a) et la prolifération lymphocytaire (lb) ont été utilisées pour évaluer la 34 réponse LTm anti-BK-v dans les différents groupes de patients de la cohorte étudiée ici (LT : lymphocytes T ; test non paramétrique de Kruskal-Wallis). La figure 6 - partie 2 montre les différents tests de fonctionnalité lymphocytaire réalisés après stimulation par un mélange de peptides antiviraux (peptides couvrant les 5 virus Cytomégalovirus, Epstein-Barr et Influenza). La sécrétion cytokinique (2a) et la prolifération lymphocytaire (2b) ont été utilisées pour évaluer la réponse lymphocytaire T mémoire antivirale globale dans les différents groupes de patients de la cohorte étudiée ici (pas de différences significatives). La figure 7 montre la corrélation négative entre l'intensité de la réponse LTm anti-BK- 10 et la charge virale BK-v (copies /mL de sang) (test de corrélation non paramétrique de Spearman). La figure 8/1 illustre le protocole d'évaluation de la réponse LTm anti-BK-v, via l'analyse de la prolifération des LTm anti-BK-v en réponse à un pool de peptides spécifique du BK-v (proportion de lymphocytes T CFSEI°") La proportion des LTm 15 anti-BK-v ayant activement proliférés (proportion de LT CFSEI°"") est mesurée en soustrayant la proportion de LT CFSEI'" mesurée en absence de stimulation peptidique à la proportion de LT CF SEI" mesurée en présence des peptides spécifiques du BK-v. La figure 8/2 montre l'évaluation de l'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BKv. 20 L'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v est quantifiée en « unité de mesure d'intensité normalisée ». Une « unité de mesure d'intensité normalisée » est ici définie comme étant la proportion de LTm anti-BK-v CFSE'°", exprimée pour 106 lymphocytes T totaux et normalisée pour 103 copies de BK-v par mL de sang. Cette normalisation permet une comparaison intra et inter-individus [ici, comparaison inter-individus 25 (virémie BK-v isolée vs Nx BK-v)]. La figure 9 montre l'intensité normalisée de la réponse LTm anti-BK-v CDS' chez des patients souffrant de virémie à BK-v isolée (n=11) ou de Nx BK-v (n=16). Le seuil utilisé dans la méthode de l'invention (10' unités de mesure d'intensité normalisée) a été défini à partir de ces résultats afin de prendre en considération jusqu'au 90à1" 36 percentile des valeurs d'intensité de réponse mis en évidence chez les patients avec Nx BK-v. La figure 10 montre la comparaison de l'intensité normalisée de la réponse LTm antiBK-v dans les lymphocytes de type CD4 et CD8 chez des patients avec virémie BK-v 5 isolée (n=11) et des patients avec Nx BK-v (n=16) La figure lia montre un nombre plus faible d'incompatibilités FILA [fLA-A, -B, -DR, -DQ] entre le donneur et le receveur de greffe chez les patients avec Nx BK-v par rapport aux patients avec virémie BK-v isolée (Mann-Whitney test). Le seuil utilisé dans la méthode de l'invention (5 incompatibilités FILA [FILA-A, -B, -DR, -DQ] entre 10 le donneur et le receveur de greffe) a été défini à partir de ces résultats afin de prendre en compte jusqu'au 75è"" percentile des valeurs d'incompatibilités FILA chez les patients avec virémie BK-v isolée. La figure lib montre la corrélation négative entre le nombre d'incompatibilités FILA et la virémie BK-v (en nombre de copies /mL de sang) (test de corrélation non 15 paramétrique de Spearman). La figure 12 est un arbre de stratification du risque de Nx BK-v selon les 3 paramètres définis ci-dessus. La figure 13 décrit le niveau de risque de développer une Nx BK-v après transplantation rénale en cas de virémie BK-v en fonction des trois paramètres suivants : 20 - i. l'intensité de la réponse LTm anti-BK-v normalisée à, - ii. la charge virale BK-v sanguine (10' copies de BK-v par mL de sang), et - iii. le nombre d'incompatibilités FILA entre le donneur et le receveur. La figure 14 montre les différentes indications de la méthode de l'invention ainsi que le délai de répétition de ladite méthode. 25 La figure 15 montre l'approche proposée ici pour évaluer le risque de Nx BK-v, basée sur l'évaluation de la charge virale sanguine de BK-v et la méthode de l'invention. Exemples Matériel et méthodes : Afin de caractériser la réponse cellulaire spécifique du BK-v en post-transplantation rénale, les présents inventeurs ont conduit une étude observationnelle incluant 94 5 patients transplantés rénaux. Les patients inclus sont tous issus du service de Néphrologie de l'hôpital Bicêtre (Hôpitaux Universitaires Paris Sud). Au total, ce centre réalise plus de 130 greffes rénales par an, avec une file active de plus 2000 patients suivis avec un greffon rénal fonctionnel. Le CPP Ile de France a été consulté et n'a pas retrouvé d'obstacle éthique à la réalisation de cette étude. Une lettre d'information a été 10 donnée à l'ensemble des patients, leur consentement ayant été recueilli par écrit. Cette étude a débuté en Novembre 2014 avec une durée d'inclusion de 36 mois (inclusions finies au 01 Novembre 2017). Les critères d'inclusion ont été les suivants r- patients âgés de plus de 18 ans, 'fi- pas d'autre transplantation d'organe honnis celle rénale, 15 - pas d'infection VIIINFIB/VHC chronique active. Quatre groupes de réactivation du virus BK-v ont été définis chez ces patients transplantés rénaux selon les critères ci-dessous : > patients sans réactivation BK-v : 20 o charges virales BK-v plasmatique et urinaire indétectables pendant au moins 12 mois .4,- patients avec virurie BK-v o virurie BK-v positive (> 200 copies/ml) et o virémie BK-v indétectable pendant au moins 12 mois 25 - patients avec virémie BK-v isolée : o virémie BK-v positive (> 200 copies/ml) depuis au moins 6 mois et o absence de diagnostic histologique de Nx BK-v à la biopsie de greffon rénal > patients avec Nx BK-v 30 o diagnostic de Nx BK-v sur la biopsie de greffon rénal 37 38 o avec virémie BK-v positive (> 200 copies/mi). Afin de caractériser les LTm anti-BK-v dans les différents groupes de patients de cette cohorte, la présente étude a comporté un versant clinique (recueil exhaustif de données cliniques et biologiques sur un suivi prospectif de 36 mois) ainsi qu'un versant 5 immunologique (étude des cellules mononuclées du sang total (PBMC) sur prélèvement de sang périphérique). Concernant la partie clinique de l'étude, les données clinico-biologiques suivantes ont été recueillies dans le cadre d'un suivi longitudinal de 36 mois : Age, sexe, maladie rénale initiale, méthode et ancienneté de dialyse du receveur 10 - Caractéristiques de la transplantation rénale : o Ancienneté de la transplantation rénale o Type de donneur o Rang de transplantation (l ère greffe ou 2ème/3ème/... greffe), - Rejet de greffe d'organe 15 Y Réactivation du virus BK-v : o Charges virales BK-v sanguines et urinaires (exprimés en copies/mL) o Durée de réplication (exprimée en mois) Estimation du Débit de Filtration Glomérulaire selon la formule MDRD : o A 1 mois et 6 mois post-greffe 20 o Au diagnostic de Nx BK-v ou à 12 mois post-greffe o En fin de suivi 'ce Traitement immunosuppresseur : o Traitement d'induction et traitement d'entretien o Taux résiduel d'immunosuppresseurs 25 - au diagnostic de Nx BK-Y ou à 12 mois post-transplantation rénale o Modification du traitement immunosuppresseur dans les suites du diagnostic de Nx BK-v. 39 Le tableau 2 montre l'absence de différence en termes d'immunosuppression thérapeutique (nature et intensité du traitement immunosuppresseur) dans les différents groupes de patients transplantés rénaux (MS = non significatif). iraifementimmunosoppressear Saaz1e téattivat.oir a BEC-v ne 13K-9 lv'irein R ' 4K-v n 5 22 34 - Lek 4 . (. 4 11 99(.4474 Amicorps dépletants polyelonaux(n, aa) 11 47.82 6 (77.3 i 0) 17 (57.1) Anticorps monoclonal. anti-CD25 (n. %) 12 (52.2) 16 (77.21 11 (50) 9 (42.9) ;4 Tacrolimus. (n, 71/) 18 p2) 19 1 i6 15 6R 3 , (.(733 N.S' Taux résiduel de Taerolimus (agha. médiane avec imerquarfilé1 9.1 [8.1-11.41 9.1 18.4-10.41 9.1 (7.7-11.1- 8.6 [6.6-10.11 NS Annmetaholites(n. ',H 23 (92) 23(92) 15 (64.2) 18 (81 8) 1\18 (31(140ceniçoide7 (M2(:T 25 (100) 75)1002 22 100) 22 (100) NS 9T12AiT17.11,fe-.1- :D....9 Ro us de ehmocortiimides int ra- \panade 03.4 3 (01 51,0) 8 (36.4) 10 (455) Antieems déplétiails pol3c1omna (n. 113) : [4) 114) 3 (13.6) 1 (4.6) NS [changes plasma-tiquai (n, 41) 1 (4) 1 (163 5 (22.7) 4(182) (VS R1ThX1S1A1-3 (n. (15) 2 00 2 (8) 1 (1F.2) 2 (9. I 1 "VS o O 41 Concernant la partie immunologique de l'étude, un prélèvement sanguin unique de 15 ml de sang total (3 tubes héparinates de lithium de 5 ml) a été réalisé à l'inclusion des patients. Ce prélèvement est effectué lors des bilans biologiques réalisés pour le suivi habituel des patients. Dans les groupes avec virémie à BK-v isolée et Nx BK-v, un suivi 5 longitudinal a été également réalisé, avec la réalisation d'un nouveau prélèvement à 12 et 24 mois post-inclusion afin d'évaluer l'évolution de la réponse LTm anti-BK-v. A partir de 15 ml de sang total, 8 à 10 millions de PBMC ont été isolées en moyenne. Ceci témoigne de la lymphopénie relative des patients (entre 0,5 et 0,6 millions de PBMC/ml de sang). 10 La réponse LTm anti-BK-v a été caractérisée dans les différents groupes de patients. Une activation spécifique des LTm anti-BK-v a été réalisée par la mise en culture des PBMC avec un pool de peptides chevauchants recouvrant les protéines VP1 et LT-Ag du BK-v (PepTivator BKV, société Miltenyi® ou équivalents). Ces pools de peptides activent les lymphocytes T CD4 et CDS et couvrent les 2 cycles de réplication du BK- 15 v (LT-Ag pour la phase précoce et VP1 pour la phase tardive de la réplication du virus BK-v). Après activation par les peptides spécifiques du BK-v, la polyfonctionnalité lymphocytaire des LTm anti-BK-v a été évaluée par cytométrie de flux en termes de : Sécrétions cytokiniques : o incubation sur la nuit de 4 millions de PBMC (800.000 20 PBMC/condition) en présence de peptides spécifiques du BK-v et de Bréfeldine A (inhibiteur de sécrétion cytokinique) puis o étude des capacités de synthèse d'lL2, d'IFN-y et de TNF-a. Prolifération lymphocytaire : o mise en culture de 4 millions de PBMC marquées au CFSE (500.000 25 PBMC/condition) pendant 5 jours en présence de peptides spécifiques du BK-v puis o étude des capacités de prolifération par visualisation de la dilution du CF SE. Toutes les acquisitions en cytométrie de flux ont été faites sur un cytomètre 18 couleurs 30 (BD LSRFortessaTM ou équivalent) et les analyses ont été faites sur le logiciel d'analyse spécifique FlowJo. Méthodologie statistique utilisée : Les variables continues sont exprimées en médiane avec écart interquartiles [25-75] devant l'absence de distribution normale des données et des petits effectifs (n Patients avec virémie BK-v isolée (n=22) o charge virale BK-v plasmatique de 4,2.105 [1,1.103 - 1,2.104] copies/mL 15 o charge virale BK-v urinaire de 1,1.108 [6,2.106 -3,8.108] copies/mL o délai médian de réactivation respectif de 10,3 [5,6- 21,1] et 13,8 mois [9,3 - 27,1] o absence de diagnostic histologique de Nx BK-v à la biopsie de greffon rénal 20 > Patients avec Nx BK-v (n=22): o diagnostic histologique de Nx BK-v sur la biopsie de greffon rénal o charge virale BK-v plasmatique de 2,8.105 [3.104 - 6,3.105] copies/mL o charge virale BK-v urinaire de 1.109 [5,4.107 -1,8.101 copies/mL 25 o délai médian de réactivation respectif de 12,6 [5,2 - 24,7] et 13,8 mois [4 - 23,3]. La figure 5 montre les différents niveaux de charges virales sanguines et urinaires du BK-v dans les différents groupes de patients en fonction du niveau de réactivation BKv. En accord avec l'état de l'art antérieur, il est important de noter que si une charge 30 virale plasmatique du BK-v > 105 peut être associée avec une Nx BK-v (figure 5a), ce 45 46 paramètre est tardif car déjà associé à des lésions du parenchyme rénal et à une dysfonction chronique sévère du greffon au moment du diagnostic de Nx BK-v (figure 2a). Par ailleurs, devant l'absence de différence entre les charges virales urinaires du BK-v chez les patients avec virémie BK-v isolée et Nx BK-v, ce paramètre n'a pas été 5 considéré dans l'élaboration de la méthode de l'invention. Sur les données clinico-biologiques obtenues à ce jour, le délai moyen de greffe de l'ensemble de la cohorte étudiée était de 3,5 ans. Le délai médian de survenue de Nx BK-v était de 12 mois après transplantation rénale. Du fait d'une gestion standardisée monocentri que de l'immunosuppression, les groupes 10 étaient comparables en termes d'immunosuppression (nature et intensité du traitement immunosuppresseur - cf. tableau 2). Une dysfonction chronique sévère du greffon rénal était retrouvée dès le diagnostic de Nx BK-v (p 102 et un nombre total d'incompatibilités HLA > 5 n'avaient de Nx BK-v (figure 13, cadran blanc). 15 Références bibliographiques [1] Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Transplant Work Group. KDIGO clinical practice guideline for the care of kidney transplant recipients. Am J Transplant. 2009;9:S1-155. 5 [2] Agence de la Biomédecine. Rapport Annuel REIN (Réseau Epidémiologie et Information en Néphrologie) 2015. Disponible sur: https://www.agence-biomedecinefr [3] Maillart E, Taoufik Y, Gasnault J, Stankoff B. Leucoencéphalopathie multifocale progressive. EMC Neurol. 2017. [4] Dalianis T, Hirsch HH. Human polyomaviruses in disease and cancer. Virology. 10 2013;437:63-72. [5] Hirsch H, Vincenti F, Friman S, Tuncer M, Citterio F, Wiecek A, et al. Polyomavirus BK replication in de novo kidney transplant patients receiving tacrolimus or cyclosporine: a prospective, randomized, multicenter study. Am J Transplant. 2013;13:136-45. 15 [6] Hirsch H, Knowles W, Dickenmann M, Passweg J, Klimkait T, Mihatsch MJ, et al. Prospective study of polyomavirus type BK replication and nephropathy in renaltransplant recipients. N Engl J Med. 2002;347:488-96. [7] Hirsch H, Babel N, Comoli P, Friman V, Ginevri F, Jardine A, et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ 20 transplantation. Clin Microbiol Infect. 2014;20:74-88. [8] Dekeyser M, François H, Beaudreuil S, Durrbach A. Polyomavirus-Specific Cellular Immunity: From BK-Virus-Specific Cellular Immunity to BK-Virus-Associated Nephropathy? Front Immunol. 2015;6:307. [9] Sharma R., Tzetzo S., Patel S., Zachariah Mareena, Sharma S., Melendy T. BK 25 virus in Kidney Transplant: current Concepts, Recent Advances and Future Directions, Experimental and Clinical Transplantation (2016): 4:377-384 49 50 [10] Limaye AP, Jerome KR, Kuhr CS, Ferrenberg J, Huang ML, Davis CL, Corey L, Marsh CL. Quantitation of BK virus load in serum for the diagnosis of BK virus associated nephropathy in renal transplant recipients. J. Infect. Dis. 2001 [11] Awadalla Y., Randhawa P., Ruppert K., Zeevi A., Duquesnoy RJ. HLA 5 Mismatching Increases the Risk of BK Virus Nephropathy in Renal Transplant Recipients. Am. J. Transplant 2004 [12] Sester M, Leboeuf C, Schmidt T & Hirsch H. The 'ABC' of Virus-Specific T Cell lmmunity in Solid Organ Transplantation. Am. J. Transplant. (2016):16 :1697-1706. [13] Restifo, Nicholas P., et Luca Gattinoni. « Lineage Relationship of Effector and 10 Memory T Cells ». Current Opinion in lmmunology (2013) 25 (5):556-63. [14] Egli, A., Humar, A. & Kumar, D. State-of-the-art monitoring of cytomegalovirusspecific cell-mediated immunity after organ transplant: a primer for the clinician. Clin. Infect. Dis. (2012) 55, 1678-1689. [15] Drachenberg, Cinthia B , John C. Papadimitriou, Dean Mann, Hans H. Hirsch, 15 Ravinder Wali, et Emilio Ramos. 2005. « Negative Impact of Human Leukocyte Antigen Matching in the Outcome of Polyomavirus Nephropathy ». Transplantation 80 (2): 276-78. [16] Hâssig, A., M. Roos, A. Etter, W. Bossait, N. Müller, M. Schiesser, R. P. Wftthrich, et T. Fehr. 2014. « Association of BK Viremia with Human Leukocyte Antigen 20 Mismatches and Acute Rejection, but Not with Type of Calcineurin Inhibitor ». Transplant lnfectious Disease 16 (1): 44-54. [17] Helanterâ, Ilkka, Kaij a Salmela, Lauri Kyllônen, Anne Râisanen-Sokolowski, Eeva Auvinen, Laura Mannonen, Petri Koskinen, et Irmeli Lautenschlager. 2012. « BK Virus Viremia in a Well-HLA-Matched Kidney Transplant Population Mainly on Low-Dose 25 Cyclosporine-Based Immunosuppression ». Clinical Transplantation 26 (6): E596-601. [18] Thangaraju, Sobhana, Jagbir Gill, Allissa Wright, Jianghu Dong, Caren Rose, et John Gill. 2016. « Risk Factors for BK Polyoma Virus Treatment and Association of 51 Treatment With Kidney Transplant Failure: Insights From a Paired Kidney Analysis ». Transplantation 100 (4): 854-61. [19] Ramos E, Drachenberg CB, Papadimitriou JC, et al. Clinical course of polyoma virus nephropathy in 67 renal transplant patients. J Am Soc Nephrol 2002; 13: 2145. 5 [20] Batal I. et al, Measurments of Global Cell-Mediated Immunity in Renal Transplant Recipients With BK virus reactivation. Am. J. Clin. Palhol. 2008; 129:857-591 [21] Comoli P. et al, Polyomavirus-associated nephropathy : update on BK virusspecific immunity. Transpl. Infect. Dis. 2006:8:86-94 [22] Schachtner T. et al, BY virus-Specific Immunity Kinetics: A predictor of Recovery 10 From polyomavirus BK-associated nephropathy. Am. Journal. Of Transplantation, 2011; 11 :2443 -2452 [23] Schachtner T. et al, The Loss of BKV-specific immunity from Pretransplantation to Posttransplantation identifies Kidney Transplant Recipients at Increased Risk of BKV Replication. Am. Journal. Of Transplantation, 2015; 15:2159-2169 15 [24] Johnston, 0. et al. Treatment of polyomavirus infection in kidney transplant recipients: a systematic revievv-. Transplantation 89, 1057-1070 (2010). [25] Chung, B. 1-1. et al. Clinical usefulness of BK virus plasma quantitative PCR to prevent BK virus associated nephropathy. Transpl. Int. 25, 687-695 (2012). [26] Godinho Pinto, G., Poloni, J., Rotta, L., R. Razonable, R. & Pasqualotto, A. 20 Screening for BK virus nephropathy in kidney transplant recipients: comparison of diagnostic tests. J. Bras. Nefrol. 38, (2016) [27] Comoli, P. et al. Immunity to Polyomavirus BK Infection: Immune Monitoring to Regulate the Balance between Risk of BKV Nephropathy and Induction of Alloimmunity. Clin. Dev. Immunol. 2013, 256923 (2013). 25 [28] Agence de la Biomédecine. Le rapport médical et scientifique du prélèvement et de la greffe en France en 2016. (2W 6). 52 REVENDICATIONShode pour évaluer e risque de développer une néphropathie à 131(.' virus (BK-v z un patient ayant subi une transplantation rénale, ladite méthode comprenant p suivantes esurcr 1a charge virale de B dans un han o biologique dudit atien b) mesurer l'intensité normalisée de la réponse des lymphocytes T CD44 ou CDS ires spécifiques du virus 13K-v dans un échantillon biologique dudit patient, c) déterminer le nombre d'incompatibilité(s) entre les HLA I et II du donneur de rein et ledit pat e 10 2. Méthode scion la revendicatio 1, dans laquelle la charge virale de 13K-v est mesurée à l'étape a) par PCR quantitativ à partir d'un échantillon de sang total ou de plasma dudit patient 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle 'la réponse des lymphocytes T CD4+ ou CDS+ mémoires spécifiques de BK-v mesurée al'étape b) est détemtmee en 15 mettant en contact des cellules mononuelées du sang périphérique dudit patient avec des peptides du virus BK-v, et c n évaluant la prolifération des lymphocytes T présents dans lesdites cellules mononue ces après 4 à 7 jours de culture, ypiquement après 5 jours de cultura 4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle ladite prolifération est mesurée en 20 déterminant la Proportion de lymphocytes T CD44 ayant dilué un marqueur d prolifération tel le CFSE après 4 à 7 jours de culture en présence desdits peptides, typiquement après 5 jours de cultura S. Méthode selon lit revendication 3, dans laquelle ladite prohti atlnn st mesurée en déterninant la proportion de lymphocytes T CDS' ayant d ué un marqueur de 25 prolifération tel le CFSE après 4 à 7 jours de culture en prés let desdits peptides, typiquement après 5 jours de culture. 53 6 mde selon l'une des revendicationsa 5, dans laquelle on conclut sq e el vé de développer une néphropathie à BK virus (13K-v) lorsque:; ) ramenée à une chargevirale de 10J copies de virus BK-v pa de sang, b) l'intensité normalisée de réponse des lymphocytes T CD4± ou CD8l mémo spécifiques de 13K-vinférieure ou égale à 100 unités de mesure d'intensité, e o) le nombre d'incompatibilité entre ledit patient et e donneur du rein greffé est iférieur ou égal à 5. 7. Méthode selon l'une des revendications 5, dans ue e on conclut à un risque faible de développer une néphropathie à BK virus (BK-v) lorsque 10 a) ramenée à une charge irale de 103 copiësde virus BK-v par de sang b) l'intensité normalisée de la réponse des lymphoeytes T 1.D4+ ou CDS+ mémoires spéchfiques de BK-v est strictement supérieures â 109 unités mesure d'intensité, e) le nombre d'incompatibilité entre ledit patient et le donneur de greffe eststrictement supérieur à 5.