FR 3085687 A1 20200313 FR 1871008 A 20180907 Description Titre de l'invention : Composition et procédé de conservation [0001] L'invention concerne une composition et un procédé de conservation de microor- ganismes. [0002] Les microorganismes sont utilisés dans divers domaines d'activité selon leurs propriétés particulières. Ainsi, certains champignons sont utilisés en brasserie pour la fermentation du houblon ou encore en fromagerie. Certaines bactéries sont utilisées en tant que ferments lactiques en agroalimentaire pour la fabrication de yaourts, d'autres produisent des toxines pouvant être utilisées en médecine. Parmi ces micro-organismes, on trouve des bactéries qui ont la possibilité de sporuler, la spore étant une structure de survie sous la forme de laquelle les bactéries ont une activité réduite. Cet état offre aux bactéries une stabilité et une résistance aux agressions physiques et chimiques bien plus importante que l'état végétatif. Cependant, dès que les spores se retrouvent dans un milieu favorable (en termes d'humidité, de température, d'apports nutritifs...), elles peuvent retrouver une forme végétative par germination et. perdre cette stabilité. Selon la galénique des produits bactériens, il est donc plus ou moins facile de conserver les spores. Ainsi, la forme sèche, sous la forme d'une poudre, permet une meilleure stabilité. En revanche, si une forme liquide de type solution prête à l'emploi favorise des applications via l'eau de boisson ou par pulvérisation sur un aliment par exemple, elle favorise également la germination des spores. Obtenir une solution liquide et stable de spores devient alors intéressant pour pouvoir conserver les souches bactériennes avant utilisation. [0003] Des exemples de conservation des spores de bactéries ont déjà été proposés dans l'art antérieur. Par exemple le brevet US 5,215,747 décrit une composition de prémélange stable au stockage contenant des endospores de Bacillus subtilis et au moins un composant chimique fongicide. Ces prémélanges peuvent être sous forme liquide, mais malheureusement contiennent toutefois des solvants organiques tels que le xylène ou le méthanol qui, dans certains cas, peut être toxique pour la spore. [0004] Aussi, est-il important de proposer des compositions de conservation des spores de bactéries, qui n'affectent pas la viabilité de celles-ci et qui n'allèrent pas leurs propriétés. [0005] Un des buts de l'invention est de pallier les inconvénients de l'art antérieur. [0006] Un autre but de l'invention est de fournir unc méthode de conservation des spores de bactéries qui soit simple, rapide et économiquement peu onéreuse, mais surtout respectueuse de l'environnement. [0007] Encore un autre but der invention est de proposer des compositions qui peuvent di- rectement être utilisées en alimentation. I [0008] Aussi l'invention concerne un procédé de conservation de spore de bactérie, comprenant une étape de mise en contact d'au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0009] - de plus de 14% de propylène glycol, et [0010] - moins de 86% d'eau, [0011] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. [0012] L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que la simple utilisation de propylène glycol, éventuellement en présence d'eau, a un effet conservateur sur les spores de bactéries (concentration stable en spores viables pouvant germer), sans qu'il soit nécessaire de prendre des précautions particulières de stockage, de température ou de luminosité. En outre, le procédé selon l'invention permet de maintenir les spores de bactéries dans des conditions où elles ne germeront pas (tant qu'elles sont dans le liquide de conservation). En outre, la composition liquide susmentionnée permet de maintenir les spores dans un milieu où aucune contamination bactérienne ou fongique ne pourra se développer. [0013] Dans le procédé selon l'invention, la composition liquide comprend donc soit du propylène glycol seul, dans lequel se retrouve la ou les spores de bactéries, soit un mélange de propylène glycol et d'eau (ou du propylène glycol dilué dans l'eau). [0014] Dans un aspect avantageux, l'invention concerne un procédé de conservation de spore de bactérie, comprenant une étape de mise en contact d'au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide comprenant, ou étant essentiellement constituée : [0015] - de plus de 14% de propylène glycol, et [0016] - moins de 86% d'eau, [0017] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, ladite composition liquide étant dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. Dans cet aspect, la composition liquide peut contenir d'autres composés, tel que des sels, des minéraux, ou tout autre composé n'ayant aucun effet intrinsèque conservateur des spores de bactéries. [0018] La composition liquide susmentionnée contient du propylène glycol (PG) également appelé propane-1,2-diol, 1,2-dihydroxypropane, méthyl glycol, alphapropylène-glycol, 1,2-propanediol, dl-propylène-glycol. Il s'agit d'un diol à l'état liquide utilisé dans de nombreux usages industriels et pharmaceutiques ou agropharma- 3 ccutiques (solvant de pesticides). Le propylène glycol peut également, à faible dose, être utilisé comme additif alimentaire. Il est issu de la carbochimie, et généralement de la pétrochimie. Le propylène-glycol est obtenu à partir de la réaction de l'oxyde de propylène avec l'eau pour former du monopropylène glycol (PG) et est identifié par son numéro CAS : 57-55-6. [0019] Dans le procédé selon l'invention, la composition comprend plus de 14% en volume de polypropylène glycol. Cela signifie que la composition contient de 14% à 100% de propylène glycol, la valeur de 14% en volume de propylène glycol étant exclue. En effet, comme cela est démontré dans les exemples, les inventeurs ont démontré qu'une composition constituée de 86% d'eau et de 14% de propylène glycol ne permettait pas de limiter la prolifération de bactéries ou de champignons, et donc ne remplissait pas l'un des critères de la composition liquide telle que décrite ci-dessus. [0020] Comme la composition liquide susmentionnée comprend plus de 14% de propylène glycol en volume, le complément consiste en de l'eau. Aussi, le tableau suivant résume-t-il les différentes compositions liquides possibles. [0021] [Tableauxl] Propylène glycol Eau Sol #9 14,5% 85,5% Sol #10 15% 85% Sol #1 1 15,5% 84,5% Sol #12 16% 84% Sol #13 16,5% 83,5% Sol #14 17% 83% Sol #15 17,5% 82,5% Sol #16 18% 82% Sol #17 18,5% 81,5% Sol #18 19% 81% Sol #19 19,5% 80,5% Sol #20 20% 80% Sol #21 20,5% 79,5% Sol #22 21% 79% Sol #23 21,5% 78,5% Sol #24 22% 78% Sol #25 22,5% 77,5% Sol #26 23% 77% Sol #27 23,5% 76,5% Sol #28 24% 76% Sol #29 24,5% 75,5% Sol #30 25% 75% Sol #31 25,5% 74,5% Sol #32 26% 74% Sol #33 26,5% 73,5% Sol #34 27% 73% Sol #35 27,5% 72,5% Sol #36 28% 72% 4 Sol #37 28,5% 71,5% Sol #38 29% 71% Sol #39 29,5% 70,5% Sol #40 30% 70% Sol #41 30,5% 69,5% Sol #42 31% 69% Sol #43 31,5% 68,5% Sol #44 32% 68% Sol #45 32,5% 67,5% Sol #46 33% 67% Sol #47 33,5% 66,5% Sol #48 34% 66% Sol #49 34,5% 65,5% Sol #50 35% 65% Sol #51 35,5% 64,5% Sol #52 36% 64% Sol #53 36,5% 63,5% Sol #54 37% 63% Sol #55 37,5% 62,5% Sol #56 38% 62% Sol #57 38,5% 61,5% Sol #58 39% 61% Sol #59 39,5%. 60,5% Sol #60 40% 60% Sol #61 40,5% 59,5% Sol #62 41% 59% Sol #63 41,5% 58,5% Sol #64 42% 58% Sol #65 42,5% 57,5% Sol #66 43% 57% Sol #67 43,5% 56,5% Sol #68 44% 56% Sol #69 44,5% 55,5% Sol #70 45% 55% Sol #71 45,5% 54,5% Sol #72 46% 54% Sol #73 46,5% 53,5% Sol #74 47% 53% Sol #75 47,5% 52,5% Sol #76 48% 52% Sol #77 48,5% 51,5% Sol #78 49% 51% Sol #79 49,5% 50,5% Sol #80 50% 50% Sol #81 50,5% 49,5% Sol #82 51% 49% Sol #83 51,5% 48,5% Sol #84 52% 48% Sol #85 52,5% 47,5% Sol #86 53% 47% Sol #87 53,5% 46,5% Sol #88 54% 46% Sol #89 54,5% 45,5% Sol #90 55%. 45% Sol #91 55,5% 44,5% Sol #92 56% 44% Sol #93 56,5% 43,5% Sol #94 57% 43% Sol #95 57,5% 42,5% Sol #96 58% 42% Sol #97 58,5% 41,5% Sol #98 59%. 41% 6 °A Ç'SZ %Ç'tt 6ZI# IoS %9Z %tL 8Z1# loS ()/±9§'9Z 'M'EL LZ1# loS % LI %EL 9Z1# loS °G).S`LZ %St SZ Tif 1°S °/98Z bZL tZT# IoS bS`8Z %SIL EZT# ToS °X;EZ ?RTL ZZI# loS g/3.g- 6Z .%011L 1Z1# loS *0£ bOL OZ T# ToS To§'OE (M`69 61 l# loS °AIE *69 811# 1°S ()/±9§'IE bÇ'89 LI I# loS %Z£ *89 911# 1°S °A Ç-Z£ %Ç'L.9 ST T# IoS ME %L9 PT T# IoS (2/iS££ c?!9Ç'99 ET T# ToS ti7E b99 Z11# loS °/3.g.'17£ M`59 111# loS ')/±9§E %Ç9 011# loS GX9S`g£ bg`t9 60 T# 1°S %9£ bt9 80T# 1°S bS`9£ bg`£9 LOT# TAS %L£ M.9 9014 ToS °A Ç'L£ .3:;Ç"Z9 ÇOI# IoS %SE %Z9 1701#10S °%S`8£ .3_-`1.9 £01# ToS eb6E *19 Z01# loS °G)S46£ *5`09 TOT# 1°S °/±9017 *09 001# loS %Stil?' b5`65 66# T°S L Sol #130 75% 25% Sol #131 75,5% 24,5% Sol #132 76% 24% Sol #133 76,5% 23,5% Sol #134 77% 23% Sol #135 77,5% 22,5% Sol #136 78% 22% Sol #137 78,5% 21,5% Sol #138 79% 21% Sol #139 79,5% 20,5% Sol #140 80% 20% Sol #141 80,5% 19,5% Sol #142 81% 19% Sol #143 81,5% 18,5% Sol #144 82% 18% Sol #145 82,5% 17,5% Sol #146 83% 17% Sol #147 83,5% 16,5% Sol #148 84% 16% Sol #149 84,5% 15,5% Sol #150 85% 15% Sol #151 85,5% 14,5% Sol #152 86% 14% Sol #153 86,5% 13,5% Sol #154 87% 13% Sol #155 87,5% 12,5% Sol #156 88% 12% Sol #157 88,5% 11,5% Sol #158 89% 11% Sol #159 89,5% 10,5% Sol #160 90% 10% 8 9 Sol #161 90,5% 9,5% Sol #162 91% 9% Sol #163 91,5% 8,5% Sol #164 92% 8% Sol #165 92,5% 7,5% Sol #166 93% 7% Sol #167 93,5% 6,5% Sol #168 94% 6% Sol #169 94,5% 5,5% Sol #170 95% 5% Sol #171 95,5% 4,5% Sol #172 96% 4% Sol #173 96,5% 3,5% Sol #174 97% 3% Sol #175 97,5% 2,5% Sol #176 98% 2% Sol #177 98,5% 1,5% Sol #178 99% 1% Sol #179 99,5% 0,5% Sol #180 100% 0% [0022] Le procédé selon l'invention est do ic adapté à la conservation des spores de bactéries, c'est-à-dire des spores de bactéries capables de sporulation. [0023] Une spore est une cellule ou plus rarement une formation pluricellulaire reproductive qui constitue une des étapes du cycle de vie de nombreuses bactéries, plantes, algues, champignons, voire de certains protozoaires. [0024] Les spores (mitospores ou méiospores) donnent naissance par mitoses à un nouvel individu sans fécondation, ce qui les distingue des gamètes. Certaines spores, notamment celles de bactéries ou de champignons, présentent des caractéristiques remarquables de résistance : elles peuvent survivre pendant plusieurs milliers d'années, même dans des conditions défavorables, et permettre ainsi la dispersion de l'espèce, parfois à une grande distance de son point d'origine, ou longtemps après la disparition du « parent ». [0025] Lorsque les conditions redeviennent favorables, la spore, qui est la forme de ré- sistance de la bactérie, peut redonner une forme végétative : c'est la germination. [0026] Les spores sont sensibles aux produits sporicides. [0027] Concernant les spores de bactéries, seuls trois genres bactériens sont capables de sporuler : le genre Bacillus (bactéries aérobies à bacilles Gram -F), le genre Clostridium (bactéries anaérobies à bacilles Gram +), et le genre Sporosarcina (bactéries non pathogènes, présentes dans les sols). [0028] Aussi, dans l'invention, les spores de bactéries sont des spores de Bacillus, des spores de Clostridium ou des spores de Sporosarcina. Les bactéries les plus avantageuses, pour lesquelles la conservation des spores est recherchée sont les spores de [0029] En particulier, il est avantageux de conserver les spores de bactéries du genre Bacillas notamment des espèces Bacillus agri, Bacillus aizawai, Bacillus abattais, Bacillus allitudinis, Bradas wnyloliquefaciens, Bacillus atrophaetts, Bacillus butanolivorans, Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bradas endoparasiticus, Bacillus endorhyanro.s, Radias firmus, Radias Plexus, Bacillus fusiforznis, Bacillas kurstaki, Bacillus larder*, Bacillas lactimorbus, &ailla lards, Bacillus laterosporus, Bacillas lentimorbus, Bacilhts lattas, Bacilluslichetziformis, Baillas megaterium, Bacillus medusa, Braillas metiens, Bacillus mojavensis, Bacillus myeades, Bacillas natio, &aillas nigrificans, Bacillus popzllae, Bacillus putains, Bacillus siamensis, floculas simplex, Bacillus sphaericus, Bacillas spp., &teillas subtilis, Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacillus unifagellatus, Bacillus vallismortis, Geobacillus stearothermophilus.. [0030] Il est d'autant plus avantageux de conserver les spores de bactéries des espèces Bacillus subtilis, Bacilluslicheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Raclais clausii, Bacillus coagulons, Bacillus jlexus, Bacillus Bacillus lentus, Bacillus megaterium, Bacillus mojavensis, Bacillus pandits, Bacillus smithii, Bacillus vallismortis, Geobacillus stearothermophilus. [0031] Comme expliqué plus haut, il est important que la composition liquide soit dépourvue de tous composés sporicides, sans quoi la conservation ne sera pas possible puisque les spores seront détruites. [0032] La composition liquide doit en outre être dépourvue de composés biocides. Par composé biocide, conformément au Règlement européen n° 528/2012, on entend dans l'invention toute substance ou tout mélange, constitué d'une ou plusieurs substances actives, en contenant ou en générant, qui est destiné à détruire, repousser ou rendre inoffensifs les organismes nuisibles, à en prévenir l'action ou à les combattre de toute autre manière par une action autre qu'une simple action physique ou mécanique. Dans cette définition, on entend par « substance active », toute substance ou tout microorganisme qui exerce une action sur ou contre les organismes nuisibles ; 11 et par « microorganisme », toute entité microhiologique, cellulaire ou non cellulaire, capable de se répliquer ou de transférer du matériel génétique, y compris les champignons inférieurs, les virus, les bactéries, les levures, les moisissures, les algues, les protozoaires et les helminthes parasites microscopiques. Notamment, la composition liquide ne contient pas de Proxcl GXL un agent biocide disponible chez Auch Chcmical of Norwalk, Connecticut USA. [0033] La composition liquide doit en outre être dépourvue de composés tels que des agents de germination. Par agent de germination, on entend dans l'invention toute substance ou tout mélange, constitué d'une ou plusieurs substances actives, en contenant ou en générant qui a la propriété de favoriser la germination des spores. Notamment, la composition liquide ne contient aucun des agents de germination suivants ou aucun de leurs mélanges : un acide aminé dont la L-alanine, la L-arginine, la L-aspartate, la L-glutamate, la L-histidinc, la L-isoleucinc, la L-lysine, la L-méthionine, la L-scrine, la L-tryptophan, la L-tyrosine, la L-valine, la L-prolinc, la L-leucine, la L-cystéine, la L-thréonine, la L-glutaminc, la L-asparaginc, la L-phénylalanine, et tous leurs dérivés_ une purine nucléoside dont r inosinc et l'adénosine, un lactate, un acide carboxylique, un ribosidc... [0034] Avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, où ledit propylène glycol représente de 15% à 40 % en volume par rapport au volume total de la composition liquide, notamment de 20 à 30% en volume par rapport au volume total de la composition liquide. [0035] En référence au tableau 1 ci-dessus, le procédé dans cet aspect avantageux peut comprendre l'une quelconque des solutions Sol#10 à Sol#60, et encore plus avantageusement l'une quelconque des solutions Sol#20 à Sol#40 susmentionnées. [0036] En d'autres termes, l'invention concerne avantageusement un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant une étape de mise en contact d'au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0037] - de 15% à 40% de propylène glycol, et [0038] - de 60% à 85% d'eau, [0039] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. [0040] Encore plus avantageusement, l'invention concerne un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant une étape de mise en contact d'au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : 12 [0041] - de 20% à 30% de propylène glycol, et [0042] - de 70% à 80% d'eau, [0043] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. [0044] Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne le procédé sus- mentionné, comprenant en outre une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide. [0045] Lc procédé selon l'invention permet donc de conserver dans un état sporulé une spore de bactérie, notamment de Bacillus, dans des conditions de température, de pression et de luminosité non contraignantes. Aussi, une spore de bactérie, notamment de Bacillus, peut être conservée pendant plusieurs mois, voire plusieurs années, à une pression atmosphérique variant de la pression au niveau de la mer à une pression réduite en altitude, à des températures variant de 4°C à 40°C, notamment de 10°C à 30°C, et sans particulièrement faire attention à l'exposition à la lumière, notamment la lumière du soleil, en particulier la lumière directe du soleil. [0046] En d'autres termes, l'invention concerne avantageusement un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant [0047] une étape de mise en contact d'au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0048] - de plus de 14% de propylène glycol, et [0049] - de moins de 86% d'eau, [0050] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, et [0051] une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide, [0052] ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. [0053] En d'autres termes, l'invention concerne avantageusement un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant [0054] une étape de mise en contact d'au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0055] - de 15% à 40% de propylène glycol, et [0056] - de 60% à 85% d'eau, [0057] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la coin- 13 position liquide, [0058] une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide, [0059] ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. [0060] Encore plus avantageusement, l'invention concerne un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant [0061] une étape de mise en contact d'au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0062] - de 20% à 30% dc propylène glycol, et [0063] - de 70% à 80% d'eau, [0064] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, [0065] une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide, [0066] ladite composition liquide étant dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. [0067] Dans un autre aspect avantageux, l'invention concerne le procédé susmentionné, comprenant une étape de mise en contact d'au moins une spore jusqu'à 1014 spores dc bactéries par mL de composition totale, avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0068] - de plus de 14% de propylène glycol, et [0069] - moins de 86% d'eau, [0070] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide. [0071] Dans l'invention, on entend par « d'au moins une spore à 10'4 spores par mL», une quantité de spores de bactéries variant de 1 spore dans la composition totale jusqu'à 10 14 spores dans un mL de la composition totale, et en particulier 1 spores, une spore par int, 1 10' spores par mi-, 5.10' spores par mL, 1.102 spores par mL, 5 10' spores par int, 1 103 spores par mL, 5.10' spores par mL, 1.104 spores par mL, 5 104 spores par int, 1 105 spores par mL, 5.10' spores par mL, 1.106 spores par mL, 5 106 spores par int, 1 107 spores par mL, 5.107 spores par mL, 1.10' spores par mL, 5 10' spores par int, 1 109 spores par mL, 5.109 spores par mL, 1.101° spores par mL, 5 101° spores par int, 1 10" spores par mL, 5.10" spores par int, 1.1012 spores par mL, 5.10'2 spores par int, 1 1013 spores par mL, 5.1013 et 1.1014 spores par mL [0072] En d'autres termes, l'invention concerne avantageusement un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant 14 [0073] une étape de mise en contact d'au moins une spore à 1014 spores de bactéries par mL de la composition totale avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0074] - de plus de 14% de propylène glycol, et [0075] - de moins de 86% d'eau, [0076] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, et possiblement [0077] une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide, [0078] ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. [0079] En d'autres termes, l'invention concerne avantageusement un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant [0080] une étape de mise en contact d'au moins une spore à 1014 spores de bactéries par mL de la composition totale avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0081] - de 15% à 40% de propylène glycol, et [0082] - de 60% à 85% d'eau, [0083] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, et possiblement [0084] une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide, [0085] ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. [0086] Encore plus avantageusement, l'invention concerne un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant [0087] une étape de mise en contact d'au moins une spore à 1014 spores de bactéries par mL de la composition totale avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0088] - de 20% à 30% de propylène glycol, et [0089] - de 70% à 80% d'eau, [0090] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, et possiblement [0091] une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide, [0092] ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. [0093] Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une composition liquide pour la conservation à l'abri de contaminations fongique et bactérienne, à température ambiante, d'au moins une spore de bactérie, [0094] ladite composition liquide, telle que définie ci-dessus, étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0095] - de plus de 14% de propylène glycol, et [0096] - moins de 86% d'eau, [0097] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. [0098] Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée d'une com- position liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0099] - de 15% à 40% de propylène glycol, et [0100] - de 60% à 85% d'eau, [0101] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide. [0102] Encore plus avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, d'une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0103] - de 20% à 30% de propylène glycol, et [0104] - de 70% à 80% d'eau, [0105] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide. [0106] L'invention concerne avantageusement l'utilisation susmentionnée, pour la conservation d'au moins une spore à 1014 spores de bactéries par mL de composition totale, telle que définie ci-dessus. [0107] L'invention concerne en outre un additif, notamment alimentaire, comprenant au moins une spore de bactérie et une composition liquide, ladite au moins une spore de bactérie étant dispersée dans ladite composition liquide, [0108] ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0109] - de plus de 14% de propylène glycol, et [0110] - moins de 86% d'eau, [0111] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, [0112] ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. [0113] Un des aspects de l'invention concerne donc un additif qui peut être associé à un 16 aliment, une composition alimentaire ou à une boisson, de sorte que ladite au moins une spore de bactérie soit consommable directement avec l'aliment ou via l'eau de boisson. [0114] Par additif alimentaire, on entend toute substance qui n'est pas normalement consommée en tant que denrée alimentaire, ni utilisée normalement comme ingrédient caractéristique d'une denrée alimentaire, qu'elle ait ou non une valeur nutritive, et dont l'addition intentionnelle à une denrée alimentaire dans un but technologique (y compris organoleptique) à une étape quelconque de la fabrication, de la transformation, de la préparation, du traitement, du conditionnement, de l'emballage, du transport ou de l'entreposage de ladite denrée entraîne, ou peut, selon toute vraisemblance, entraîner (directement ou indirectement) son incorporation ou celle de ses dérivés dans cette denrée ou en affecter d'une autre façon les caractéristiques. Cette expression ne s'applique ni aux contaminants, ni aux substances ajoutées aux denrées alimentaires pour en préserver ou en améliorer les propriétés nutritionnelles. [0115] L'additif selon l'invention sera utilisé dans des quantités déterminées par l'homme du métier selon les principes usuels en nutrition animale, et tenant compte des limites technologiques et des propriétés recherchées dudit additif. [0116] A titre d'exemple, il est avantageux de donner de l'additif susmentionné aux porcs, dans leur alimentation ou leur eau de boisson, de sorte qu'ils ingèrent l'équivalent de 25 mL dudit additif (contenant environ 3.10" spores par mL) par jour. [0117] Les aliments envisagés sont des aliments solides en granulé, fourrage, poudre, se- moulette avec lesquels ledit additif pourra être mélangé ou sur lesquels ledit additif pourra être pulvérisé. Ledit additif pourra également être ajouté à des aliments liquides, des aliments en soupe ou encore à des boissons, dont notamment de l'eau de boisson. [0118] La spore pourra germer quand elle retrouvera des conditions favorables donc notamment lorsqu'elle ne sera plus dans sa solution de conservation, et notamment lorsque le propylène glycol sera à une concentration inférieure ou égale à 14% en volume par rapport au poids de l'additif mélangé dans un aliment ou dispersé sur un aliment, ou encore inférieure ou égale à 14% en volume par rapport au volume total d'une boisson dans laquelle est dilué ledit additif. Ces conditions seront notamment observées après ingestion de l'aliment, après mélange dans certains aliments humides comme des soupes, ou après dilution dans des boissons, notamment dans de l'eau de boisson. [0119] Avantageusement, l'invention concerne l'additif susmentionné, où ledit propylène glycol représente de 15% à 40 % en volume pal- rapport au volume total de ladite composition liquide, notamment de 20 à 30% en volume par rapport au volume total de ladite composition liquide. [0120] En d'autres termes, avantageusement l'invention concerne l'additif susmentionné, où 17 ladite composition liquide est essentiellement constituée, ou est constituée : [0121] - de 15% à 40% dc propylène glycol, et [0122] - de 60% à 85% d'eau, [0123] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total dc la com- position liquide, [0124] ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent hiocide et ou d'agent de germination. [0125] Avantageusement l'invention concerne l'additif susmentionné, où ladite composition liquide est essentiellement constituée, ou est constituée : [0126] - de 20% à 30% de propylène glycol, et [0127] - de 70% à 80% d'eau, [0128] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, [0129] ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent hiocide et ou d'agent de germination. [0130] Un autre aspect de l'invention concerne un additif tel que mentionné précédemment, pour une utilisation dans le cadre de la prophylaxie des infections virales et bactériennes des animaux d'élevage. [0131] Les pathologies ou infections virales qui peuvent être prévenues par l'utilisation de l'additif selon l'invention sont les suivantes : les pathologies digestives notamment les diarrhées, les entérites, la salmonellose, la collibacilose, l'iléite ; les infections respiratoires et en particulier la rhinite, la pasteurellose, la bordetellose ; les infections cutanées et en particulier les ulcères, les épidermites, les nécroses ; et les infections au niveau du système locomoteur notamment les boiteries infectieuses, et les arthrites. [0132] Par l'utilisation de l'additif, notamment associé à un ou plusieurs aliments, ou à une boisson, permet donc d'utiliser des spores de bactéries qui ont été conservées à long terme dans des conditions très simples, et dont l'efficacité sera la même ou très proche de l'efficacité de spores fraiches, c'est-à-dire obtenues dans un délai très courts (quelques heures à quelques jours) après la sporulation des bactéries. [0133] Un tel additif est utilisable pour les animaux d'élevages notamment les oiseaux et les volailles, les bovins, les ovins, les porcins, les crustacés, les poissons et les mollusques ainsi que les animaux de compagnie, y compris les nouveaux animaux de compagnie. [0134] Encore un autre aspect de l'invention concerne un produit liquide constitué essen- tiellement de, ou constitué de [0135] au moins une spore de bactérie, et [0136] une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : [0137] - de plus de 14% de propylène glycol, et 18 101381 - moins de 86% d'eau, [0139] les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la com- position liquide, [0140] ladite composition liquide étant notamment dépourvue d'agent biocide, ou dépourvue d'agent de germination, ou dépourvue d'agent biocide et d'agent de germination. [0141] Lc produit liquide selon l'invention comprend comme éléments essentiels, pour conférer ses propriétés de conservation des spores, au moins une spore et la composition liquide. [0142] Lc produit liquide peut en outre contenir des sels, des adjuvants, des surfactants ou tout autre composé visant à compléter le produit, mais ces composés n'ont aucun effet sur la conservation des spores. [0143] Par contre comme mentionné ci-dessus, le produit liquide est dépourvu d'agents biocides, tels qu'ils ont été définis ci-dessus, ou encore d'agent de germination, tels qu'ils ont été définis ci-dessus. [0144] Notamment, dans le cadre du produit liquide susmentionné, ladite composition liquide est constituée essentiellement de, ou constituée de [0145] - de 15% à 40% de propylène glycol, et [0146] - de 60% à 85% d'eau, [0147] et en particulier, [0148] - de 20% à 30% de propylène glycol, et [0149] - de 70% à 80% d'eau. [0150] L'invention sera détaillée dans les exemples qui suivent. EXEMPLES [0151] INGREDIENTS et CONCENTRATIONS TESTES pour tous les exemples présentés ci-après [0152] Dans les exemples ci-après, les compositions testées seront nommées de Fl à F16 en fonction de l'ingrédient I utilisé et de sa concentration dans la composition finale : [0153] 19 [Tableaux2] Concentration dans la composition testée Propylène glycol (PG) Glycérol Vinaigre de vin Chlorure de potassium (KCI) 0,30% Il0 0,50% 111 1% 112 1,50% 113 2% 114 2,50% 115 3% 116 10% Il 17 11,25% 14 12% 117 14% 118 16% 119 18% 120 20% 12 18 22,50% 15 30% 13 19 33,75% 16 [0154] Les compositions témoins seront nommées F0. [0155] Les compositions réalisées à partir de l'ingrédient Il seront nommées Fl, les com- positions réalisées à partir de l'ingrédient 12 seront nommées F2, et ainsi de suite. [0156] EXEMPLE 1 - STABILITE DES SPORES BACILLUS à 1 et 2 MOIS des ingrédients Il à 116 I - PROBLEMA TIQUE [0157] L'objectif de cette analyse est d'évaluer la stabilité des spores de Bacillussubtilis et B. lichenifonnis conservées dans différentes compositions liquides, à température ambiante, pendant 1 et 2 mois de conservation. II - MATERIEL ET METHODE IL 1 - Protocole [0158] Composition témoin (F0) : Cette composition comprend 101591 - 50% d'une solution de bactéries dans l'eau. Cette solution de bactéries comprend 20% en masse par rapport au volume total de solution de bactéries d'une poudre bactérienne. La poudre bactérienne est constituée de poudre de spores de Bacillus subtilis et de Bacillus lichetufbrmis (ratio 1 :1), concentrées à 3.2x1012 spores par gramme de poudre, et d'un support. [0160] - eau jusqu'à 100% [0161] Compositions testées (F1 à F16) : ces compositions correspondent à la composition témoin dans laquelle est ajouté l'un des ingrédients Il à 116, où le volume d'eau est adapté jusqu'à 100%. [0162] 1- Distribuer 100 mL de chacune de ces compositions de FO à F16 par pot, dans 3 pots de 180 mL de type collecteur d'échantillon droit avec bouchon à vis [0163] 2- Stocker les 51 pots à température ambiante (effectuer un suivi de la température de la pièce) 11.2 - Analyse [0164] Observation macroscopique : A I mois et 2 mois de conservation, évaluer l'aspect de la formulation (couleur, dépôt, trouble, consistance, développement de moisissures...) et la remise en suspension (floculation...) [0165] Analyse microbiologique : à JO, uniquement pour le témoin FO ; à 1 mois et 2 mois de conservation, pour tous les pots de FO à F16. [0166] Pour chaque point d'analyse, réaliser unc énumération par dénombrement en ma- crométhode sur tous les pots. La macrométhode est un dénombrement sur des boîtes de culture de grande taille, en opposition à la microméthode, qui est un dénombrement en plaques avec puits [0167] Pour chaque pot, réaliser les dilutions en double avec unc solution de peptone-sel jusqu'à la dilution 106 ; bien agiter minimum lOs au Vortex avant de prélever ; déposer 0.5mL de la dilution 10 6 dans 2 boîtes de Petri (facteur de dilution = 2.106) [0168] Le peptone-sel est un diluant isotonique pour une récupération optimale des microor- ganismes (ISO/DIS 6649), à base de peptone et de chlorure de sodium. [0169] Couler environ 18mL de gélose PCA (Plate Count Agar) en surfusion à 46-50°C dans chaque boîte de Pétri [0170] La gélose PCA est un milieu recommandé pour le dénombrement standardisé des bactéries dans l'eau. [0171] Incuber 24h +/-6h à 37°C [0172] Après incubation, compter les colonies sur chaque boîte 11.3 - Interprétation des résultats [0173] Une diminution significative (>0.3log) du niveau de la population dans un pot par rapport au témoin à JO devra être confirmée par une seconde énumération ; si ce 21 résultat est confirmé, l'analyse est stoppée ; la formulation sera considérée comme instable à partir du précédent point. [0174] Une augmentation significative (>0.31og) du niveau de la population dans un pot par rapport au témoin à JO devra être confirmée par une seconde énumération ; si ce résultat est confirmé, l'analyse est stoppée. Cela signifiera une croissance bactérienne (soit d'une contamination, soit d'une germination d'une spore) ; la formulation sera considérée comme instable. [0175] Une évolution de l'aspect de la formulation (ex : développement de moisissures) ou une mauvaise remise en suspension des spores entraîne l'arrêt de l'analyse ; la formulation sera considérée comme instable. III - RESULTATS [0176] Les résultats sont compilés dans le tableau 3 suivant : [0177] [Tablcaux3] Formule ANALYSE A 1 MOIS ANALYSE A 2 MOIS ACCEPTABLE Fl 10%PG bacille à l'observation microscopique / NON F2 20%PG -0,04 log -0,05 log OUI F3 30%PG -0,01 log -0,04 log OUI F4 à F6 11,25% à 33,75% glycérol Développement ma- croscopique / NON F7 10% vinaigre -0,08 log -0,10 log OUI F8 20% vinaigre -0,08 log -0,15 log OUI F9 30% vinaigre -0,14 log -0,17 log OUI F10 à F16 0,3 à 3% KCL Développement de biofilm / NON 101781 *Tolérance : écart 0.3log) de la population de spores sur 30 jours. III - RESULTATS [02051 [Tableaux5] Formule ANALYSE A I MOIS (J30) Observation macro- scopique Ecart FS fi JO Ecart FT il JO F2 20%PG R.A.S. -0,09 log +0,02 log F3 30%PG R.A.S. -0,08 log +0,04 log F7 10% vinaigre Développement d'un biofilm / / F8 20% vinaigre Développement d'un biofilm / / F9 30% vinaigre Développement d'un biofilm / / [0206] "Tolérance : écart 0.3log) de la population bactérienne sur 7 jours. III - RESULTATS [0228] [Tableaux6] Formule ANALYSE A 1 SEMAINE (J7) Observations macroscopiques Ecart FT // JO Isolement F2 20%PG R.A.S. diminution > 2 logs présence des 3 bactéries (Lacto>Staph>E.coli) F3 30%PG R.A.S. diminution > 2 logs présence des 2 bactéries (Lacto>Staph) F7 10% vinaigre développement d' un biofilm diminution > 2 logs présence des 2 bactéries (E.coli>Lacto) F8 20% vinaigre développement d' un biofilm diminution > 2 logs absence de bactéries F9 30% vinaigre développement d' un biofilm diminution > 2 logs absence de bactéries [0229] *Tolérance : augmentation 0.3log) entre la flore totale et la flore sporulée à J6. III - RESULTATS [0257] [Tableaux8[ Formule Observation macroscopique ANALYSE A J6 J2 J5 J8 log(FT) - log(FS) FI Trouble, développement biofilm dans les 3 pots / / / 10%PG F17 12% PG Trouble dans les 3 pots- Confirmation de la présence de bacilles végétatifs par observation microscopique / / / F18 14% PG R.A.S. Trouble dans les 3 potsConfirmation de la présence de bacilles végétatifs par observation microscopique / / F19 16% PG R.A.S. R.A.S. R.A.S. -0,04 log F20 18% PG R.A.S. R.A.S. R.A.S. -0,01 log F2 20% PG R.A.S. R.A.S. R.A.S. -0,01 log [0258] *Tolérance : écart