FR 3079073 A1 20190920 FR 1852284 A 20180316 Bioélectrode nanostructurée pour l'oxydation du glucose à partir de composés aromatiques électrogénérés Domaine de l'invention La présente invention porte sur une bioélectrode nanostructurée à partir de composés aromatiques électrogénérés ainsi que sur l'utilisation de ces composés aromatiques électrogénérés comme médiateur particulièrement approprié pour le transfert d'électrons entre une enzyme de catalyse de l'oxydation du glucose telle que la Flavine Adénine Dinucléotide - Glucose DésHydrogénase (FAD-GDH) et une électrode. Art antérieur Le développement des biopiles (biofuel cells) utilisant des enzymes est largement décrit dans la littérature (Cf. US2002/0025469 et EP2375481A1). Ces piles à combustibles enzymatiques utilisent des biocatalyseurs, appelés enzymes, permettant d'effectuer une réaction d'oxydation d'un combustible (H2, alcools, glucose, ...) à l'anode et la réduction d'un oxydant (majoritairement 02) à la cathode. L'avantage de l'utilisation des enzymes pour la production d'énergie est leur grande sélectivité vis-à-vis du substrat. L'enzyme FAD-GDH présente les propriétés d'oxyder le glucose en acide gluconique. Cette enzyme possède un site actif à l'intérieur de sa structure : un transfert électronique direct est donc impossible et il est nécessaire d'utiliser un médiateur redox afin de transférer les électrons de l'enzyme à l'électrode. Plusieurs approches sont décrites pour l'immobilisation du médiateur redox au sein de l'électrode comme l'encapsulation, la polymérisation, le greffage covalent. Ces études présentent généralement l'immobilisation du médiateur dans un état d'ores et déjà actif. Barathi et al. (Barathi, P; Senthil Kumar, A. Electrochemical Conversion of Unreactive Pyrene to Highly Redox Active 1,2-Quinone Derivatives on a Carbon Nanotube-Modified Gold Electrode Surface and lts Selective Hydrogen Peroxide Sensing. Langmuir 2013, 29 (34), 10617-10623) décrit une méthode de dégradation du pyrène en un dérivé de quinone actif. Le composé est déposé sous 2 forme de pyrène inactif sur l'électrode puis activé (oxydé) par électrochimie. Barathi et al. décrit également l'utilisation d'une telle électrode sur laquelle est également déposé un cytochrome C et du cuivre (Cu2+). Cette électrode est utilisée en tant que cathode pour la réduction de l'eau oxygénée. 5 Les médiateurs redox doivent répondre à plusieurs critères. Le transfert électronique doit être rapide afin de ne pas limiter le processus catalytique. Le médiateur redox doit être peu, ou ne doit pas, être relargué en solution. Pour cela, les molécules employées dans cette étude sont des molécules aromatiques car 10 elles présentent des très bonnes interactions vis-à-vis des nanotubes de carbone. Les molécules sont physisorbées par interactions de type rr-rr. Le potentiel redox de la sonde doit être supérieur au potentiel redox du site actif de l'enzyme mais assez proche (>50mV) afin d'obtenir une force électromotrice élevée (f.e.m = potentiel de la cathode - potentiel de l'anode) dans les biopiles. 15 Description de l'invention La présente invention porte sur l'identification et l'utilisation d'un médiateur redox particulièrement adapté à la fabrication d'une bioanode pour biopile 20 enzymatique, en particulier une biopile enzymatique comprenant une FAD-GDH. Ce médiateur présente une bien meilleure stabilité au cours de temps par rapport aux médiateurs redox utilisés classiquement telle que la 1,4 naphtoquinone. Ainsi un aspect de l'invention est une bioélectrode comprenant un matériau 25 conducteur à la surface duquel sont déposés des nanotubes de carbone, un médiateur redox à base de pyrène, ou d'un de ses dérivés, oxydé in-situ et une enzyme apte à catalyser l'oxydation du glucose. Il est à noter que le terme glucose utilisé ici se rapporte en particulier à l'énantiomère D-(+)-glucose (dextrose) qui se trouve naturellement présent dans les organismes vivants. 30 L'électrode selon l'invention est de préférence de type multicouches et comprend avantageusement une couche de nanotubes de carbone, une couche de pyrène oxydé in-situ et une couche d'enzyme apte à catalyser l'oxydation du glucose. Les couches peuvent être déposées successivement sur un matériau 35 conducteur, qui peut constituer le support de ces couches ou être lui-même déposé sur un support inerte. 3 Le matériau conducteur peut être du carbone vitreux, du graphite pyrolytique (en particulier du HOPG « Highly Ordered Pyrolytic Graphite ») de l'or, du platine et/ou de l'oxyde d'indium et d'étain. De préférence le matériau est du carbone vitreux ou du graphite pyrolytique. 5 L'utilisation de nanotubes de carbone permet l'augmentation de la surface spécifique de l'électrode (porosité) et la formation d'un réseau 3D nanostructuré et permet également d'assurer la conductivité au sein du matériau avec son système u conjugué qui permet une forte interaction non-covalente avec les oligo-cycles 10 aromatiques. Le ratio surface spécifique/nombre de molécule redox est relativement élevé et permet l'absence de passivation lors de l'étape d'électrosynthèse. En effet il est classiquement admis que l'électro polymérisation de molécule organique sur des électrodes induit une passivation se traduisant par une diminution de la vitesse de transfert électronique. Les électrodes poreuses à 15 base de nanotubes de carbone (ONT) sont réalisées en utilisant des CNTs multi- paroi commerciaux, de préférence non fonctionnalisés. Plusieurs méthodes de fabrication sont adaptées, et permettent de former, entre autres, soit des feuilles (buckypapers), soit des pastilles, soit des dépôts sur le matériau conducteur support. Le matériau conducteur sur lequel les nanotubes de carbone sont déposés 20 peut également faire partie d'une électrode microporeuse à diffusion de gaz comprenant une couche GDL (GDL =Gas Diffusion Layer), couche qui comprend généralement des fibres de carbone. Les nanotubes de carbone sont des fullerènes composés d'un ou plusieurs 25 feuillets d'atomes de carbone enroulés sur eux-mêmes formant un tube. Le tube peut être fermé ou non à ses extrémités par une demi-sphère. Les nanotubes de carbone simple-feuillet (SVVNT ou SVVCNT, pour Single-VValled (Carbon) Nanotubes) et/ou multi-feuillets (MVVNT ou MVVCNT, pour Multi-VValled (Carbon) Nanotubes) peuvent être utilisés, bien que ces derniers soient préférés. 30 La combinaison du matériau conducteur et des nanotubes de carbone, qui peuvent avantageusement être déposés sur ledit matériau sous forme d'une couche, permet d'obtenir un support poreux apte à recevoir l'enzyme et son médiateur particulier (le pyrène oxydé in-situ). 35 Le pyrène, ainsi que ses dérivés, lorsque oxydés in situ forment des médiateurs particulièrement efficaces notamment de l'enzyme FAD-GDH. En 4 particulier, le terme « dérivé du pyrène » désigne une molécule comprise dans le groupe constitué par le pyrène où au moins un atome d'hydrogène présent sur la structure carbonée polycyclique aromatique du pyrène est substitué par au moins un groupement alkyle en 02-022, et en particulier par un groupement alkyle en 02- 5 04, tel que l'éthyle, le propyle ou le butyle. Il est également avantageux d'éviter d'utiliser les dérivés du pyrène comprenant des groupes amines ou hydroxyles, ou encore des atomes d'halogène. Le pyrène, ou un de ses dérivés, oxydé in-situ, est un composé organique 10 provenant de pyrène ou d'un de ses dérivés, qui a été déposé sur l'électrode. Une fois déposé sur la surface de l'électrode, l'oxydation du pyrène ou de son dérivé, peut être effectuée soit par voltampérométrie cyclique, soit par chronoampérométrie. Les composés formés sont un ou plusieurs type(s) d'oxyde(s) quinoïque(s) électroactif(s). Le pyrène, ou un de ses dérivés, oxydé in-situ agit 15 comme médiateur redox de l'enzyme qui fait partie de la bioélectrode selon l'invention. Le médiateur obtenu in-situ peut notamment être obtenu par chronoampérométrie et comprendre l'application à du pyrène, ou à un de ses 20 dérivés, déposé in-situ sur la surface de l'électrode, d'un potentiel de 1V à ladite électrode pendant un temps donné, de préférence allant de 10 secondes à 3 minutes, avantageusement allant de 30 secondes à 3 min. Alternativement ou en combinaison, le pyrène, ou un de ses dérivés, oxydé in- 25 situ peut être obtenu par voltampérométrie cyclique et comprend l'application à du pyrène, ou à un de ses dérivés, déposé in-situ sur la surface de l'électrode d'un potentiel variant de manière cyclique de -0.4V à 1V. De préférence le nombre de cycles appliqués lors de cette étape varie de 3 à 20. 30 L'application d'un tel signal engendre la formation de liaisons cétones sur le composé aromatique. Le mécanisme de formation n'est pas complétement résolu et donc la nature exacte du composé formé diffère selon les différents travaux de la littérature notamment sur le nombre de fonctions cétones crées. Cependant l'ensemble des travaux est en accord sur la nature quindique des produits de la 35 réaction. L'enzyme apte à catalyser l'oxydation du glucose est de préférence une 5 glucose DésHydrogénase (GDH) catalysant la réaction : D-glucose + accepteur -> D-glucono-1,5-lactone + accepteur réduit. L'accepteur, ou co-facteur, est généralement une coenzyme de type NAD+/NADP+ ou flavine, comme la FAD (Flavine Adénine Dinucléotide), ou la FMN (Flavine 5 mononucléotide) qui est lié à la GDH. Une glucose déshydrogénase particulièrement préférée est la Flavine Adénine Dinucléotide - Glucose DesHydrogénase (FAD-GDH) (EC 1.1.5.9). Le terme FAD-GDH s'étend aux protéines natives et à leurs dérivés, mutants et/ou équivalents fonctionnels. Ce terme s'étend en particulier aux protéines qui ne diffèrent pas de manière 10 substantielle au niveau de la structure et/ou de l'activité enzymatique. Ainsi on peut utiliser pour l'électrode selon l'invention, en association avec un cofacteur, une protéine enzymatique GDH présentant une séquence d'acides aminées possédant au moins 75%, de préférence 95%, et encore plus préférentiellement 99% d'identité avec la ou les séquences GDH telles que répertoriées dans les banques de 15 données (par exemple SVVISS PROT). Une FAD-GDH d'aspergillus sp. est particulièrement préférée et efficace mais d'autres FAD-GDH provenant de Glomerella cingulata (GcGDH), ou une forme recombinante exprimée dans Pichia pastoris (rGcGDH), pourraient également être utilisées. 20 Il est également possible de réaliser une électrode selon l'invention en utilisant une enzyme oxydo-réductase (EC 1.1.3.4) de type glucose oxydase (GOx, GOD) qui catalyse l'oxydation du glucose en peroxyde d'hydrogène et en D-glucono-15- lactone. Cette enzyme qui est une enzyme de référence pour les piles à glucose est également liée à un co-facteur comme le FAD (Flavine Adénine Dinucléotide). 25 Une glucose oxydase particulièrement préférée est la Flavine Adénine Dinucléotide - Glucose oxydase (FAD-GOx). Ce terme s'étend aux protéines natives et à leurs dérivés, mutants et/ou équivalents fonctionnels. Le terme FAD-GOx s'étend en particulier aux protéines qui ne diffèrent pas de manière substantielle au niveau de la structure et/ou de l'activité enzymatique. Ainsi on peut utiliser pour l'électrode 30 selon l'invention, en association avec un co-facteur, une protéine enzymatique GOx présentant une séquence d'acides aminées possédant au moins 75%, de préférence 95%, et encore plus préférentiellement 99% d'identité avec la ou les séquences GOx telles que répertoriées dans les banques de données (par exemple SVVISS PROT). Une FAD-GOx extraite d'aspergillus figer est particulièrement 35 préférée. La FAD-GDH présente une activité plus élevée que la glucose oxydase et donc 6 un courant catalytique plus élevé. Ceci est d'un grand intérêt afin d'augmenter les puissances générées dans les biopiles enzymatiques. Il est à noter que contrairement à la Glucose Oxydase, l'enzyme FAD-GDH ne produit pas de peroxyde d'hydrogène. Le peroxyde d'hydrogène en raison de ses propriétés 5 oxydantes peut présenter des inconvénients pour la stabilité des biopiles (membrane, stabilité des enzymes à la cathode,...). Un autre aspect de l'invention porte sur un procédé de fabrication d'une bioélectrode apte à l'oxydation du glucose, ladite méthode comprenant : a) une étape d'oxydation de pyrène, ou d'un de ses dérivés, ledit pyrène ou 10 ledit dérivé étant préalablement déposé sur la surface d'un matériau conducteur, matériau conducteur à la surface duquel sont également déposés des nanotubes de carbone, et b) une étape, de préférence subséquente à l'étape a), de dépôt d'une enzyme apte à catalyser l'oxydation du glucose à la surface de ladite électrode. 15 Les caractéristiques structurelles de la bioélectrode selon le procédé de l'invention sont avantageusement telles que décrites précédemment. Selon un aspect préféré du procédé selon l'invention, les nanotubes sont déposés 20 sur le matériau conducteur par une étape dite de dropcasting. Selon cette méthode, une solution, ou dispersion, homogène d'un produit est déposée sur un support, puis une étape d'évaporation du solvant est effectuée ce qui permet le dépôt d'une couche mince dudit produit sur ledit support. Généralement le 25 solvant est un solvant organique excepté pour l'enzyme. Ainsi pour le dépôt de nanotubes de carbone, le solvant choisi peut être du NMéthy1-2 Pyrrolidone (NMP). La concentration de la solution/dispersion de nanotubes peut varier de 1 à 10 mg.mL-1, de préférence aux environs de 5 mg.mL-1. Selon un 30 aspect du procédé l'électrode de matériau conducteur est orientée verticalement lors du dépôt des nanotubes. Selon un autre aspect préféré de l'invention l'étape d'oxydation du pyrène est effectuée par chronoampérométrie et peut comprendre l'application d'un potentiel de 35 1V à ladite surface pendant un temps donné, de préférence allant de 10 secondes à 3 minutes, avantageusement de 30 secondes à 3 min. 7 Alternativement ou en combinaison, l'étape d'oxydation du pyrène est effectuée par voltampérométrie cyclique et peut comprendre l'application d'un potentiel variant de manière cyclique de -0.4V à 1V à la surface de l'électrode. De préférence le nombre de 5 cycles appliqués varie de 3 à 20 pour une vitesse de balayage de 100mV.s-1. La solution électrolytique pouvant être utilisée pour l'étape de chronoampérométrie et/ou de voltampérométrie cyclique peut être une solution tampon, par exemple au phosphate. Le pH de la solution électrolytique est généralement de 6,5 10 à 7,5, de préférence aux alentours de 7, ceci du fait d'une activité enzymatique optimale aux alentours de 7. Selon un aspect préféré du procédé selon l'invention, le pyrène est déposé sur une surface de l'électrode comprenant des nanotubes de carbone également en utilisant 15 une étape de dropcasting. Dans ce cas le solvant est avantageusement le dichlorométhane. La concentration de la solution peut être choisie de 5 à 15 mM, en particulier aux environs de 10 mM. Selon un aspect préféré du procédé selon l'invention l'enzyme utilisée est une Flavine Adénine Dinucléotide - glucose déshydrogénase ou une Flavine Adénine Dinucléotide - glucose oxydase, telle que décrite précédemment. 20 Selon un autre aspect préféré du procédé selon l'invention, l'étape de dépôt de l'enzyme à la surface de la bioélectrode est également effectuée en utilisant une étape de dropcasting. Dans ce cas, le solvant est avantageusement une solution aqueuse, de préférence tamponnée à pH 7, La concentration de la solution peut-être de 1 à 10 mg.mL-1, de préférence de 5 mg.mL-1. Le dépôt et/ou l'évaporation du solvant peut 25 avantageusement se faire à pression atmosphérique et température ambiante. Le temps de séchage est généralement choisi de 2h à 4h. Bien évidement l'invention porte également sur une bioélectrode obtenue directement par le procédé selon l'invention tel que décrit précédemment ainsi que 30 dans les exemples de mise en oeuvre ci-dessous. L'invention porte également sur les applications et utilisations d'une telle électrode dans diverses technologies. Par exemple l'invention porte également sur l'utilisation d'une bioélectrode selon l'invention en tant que bioanode apte à la fabrication d'une biopile. Une telle biopile est avantageusement une biopile enzymatique à combustible. Une telle biopile comprend 8 en association avec au moins une électrode selon l'invention une biocathode. Cette biocathode peut par exemple comprendre une enzyme permettant de réduire l'oxygène, par exemple à base de bilirubine oxydase ou de Laccase. Elle peut comprendre comme matériau conducteur un matériau de type tel que décrit précédemment et 5 avantageusement des nanotubes de carbone modifiés par une protoporphyrine permettant un transfert électronique direct avec la bilirubine oxydase. Dans le cas où l'enzyme est la Laccase, ces nanotubes de carbone sont avantageusement modifiés avec un groupement hydrophobe comme l'adamantane, l'anthracène ou le pyrène. Un transfert électronique médié peut également être obtenu à partir de MVVCNT et la 10 molécule ABTS pour les deux enzymes. Une autre utilisation de l'électrode selon l'invention porte sur son utilisation dans un biocapteur à glucose. 15 Enfin, l'invention porte également sur l'utilisation d'un dérivé du pyrène tel que décrit ci-dessus, à la place de ou en combinaison avec le pyrène. Le dérivé du pyrène substitué peut être également oxydé in situ en utilisant les étapes décrites ci-dessus et les électrodes et piles et biocapteur à glucose, ainsi que leurs procédés de fabrication sont également un objet de l'invention. 20 Un mode de réalisation de l'invention donné à titre d'exemple non limitatif et qui inclus des Figures annexées sur lesquelles : - Figure 1 : (A) Voltampérogrammes d'une électrode de carbone vitreux/MVVCNT/pyrène avant (noir) et après chronoampérométrie de 1V vs. 25 Ag/AgCI pendant 30 secondes (tampon phosphate 0,2M pH = 7) (B) Réponse électrochimique de l'électrosynthèse d'une électrode de carbone vitreux/MVVCNT/pyrène (noir = r cycle / gris = cycle de 2 à 6) - Figure 2: (A) Voltampérogrammes d'une électrode de carbones vitreux/MVVCNT/pyrèneRedox différentes vitesses de balayage (tampon 30 phosphate 0,2 M pH = 7). (B) Représente les intensités des pics anodiques et cathodiques d'une électrode de carbone vitreux/MVVCNT/pyrèneRedox en fonction de la vitesse de balayage. - Figure 3: (A) Voltampérogrammes d'une électrode de carbone vitreux/MVVCNT/pyrèneRedox à différents pH (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) 35 (B) Représentation de l'évolution du potentiel standard en fonction du pH d'une électrode de carbone vitreux/MVVCNT/pyrèneRedox - Figure 4: (A) Réponse électrochimique de l'électrode modifiée 9 MVVCNT/pyrèneRedox/FAD-GDH en l'absence (courbe noire) et en présence de 200 mM glucose (courbe grise) (B) Chronoampérométrie à 0,2 V vs. Ag/AgC1 de l'électrode modifiée MVVCNT/pyrèneRedox/FAD-GDH lors d'injection de glucose (1, 2, 5, 10, 20, 50, 5 100, 200 mM glucose) (cf. insert) Représentation de l'évolution du courant catalytique en fonction de la concentration en glucose obtenue lors de chronoampérométrie à 0,2 V vs. Ag/AgC1 - Figure 5: (A) Réponse électrochimique de l'électrosynthèse d'une électrode de carbone vitreux/MVVCNT/anthracène 10 (B) Réponse électrochimique de l'électrosynthèse d'une électrode de carbone vitreux/MVVCNT/perylène - Figure 6: Réponse électrochimique de l'électrode modifiée MVVCNT/phénanthèneRedox/FAD-GDH en l'absence (courbe noire) et en présence de 200 mM glucose (gris). 15 - Figure 7 : comparaison du pyrènedione avec le 1,4 naphtoquinone par CV en termes de l'efficacité et la stabilité du transfert d'électrons (courants catalytiques, A et C) et en termes de la stabilité de l'activité redox après 100 cycles (courant non catalytique, B et D). 20 Réalisation d'une bioélectrode selon l'invention Une électrode de carbone vitreux de 0,071 cm2 commerciale (vendue par Bio-Logic, France) est modifiée par l'ajout de nanotubes de carbone (suspension à 5 mg.mL-1 en nanotubes de carbone). 25 Cette suspension est réalisée par addition de 10 mg de nanotubes de carbone multi- paroi non fonctionnalisés (MVVCNT NanocylTM, 97%) dans 2 mL de NMP (N-Méthy1-2- pyrrolidone). La dispersion est placée sous agitation ultrasonique pendant 2h. 20 pL de cette suspension de MVVCNT préalablement agitée sont ensuite déposés sur la surface de l'électrode de carbone vitreux. 30 L'électrode est alors placée sous vide dans un dessiccateur. L'électrode est alors retirée du dessiccateur lorsque le solvant est évaporé et que les nanotubes de carbone sont secs (en moyenne quelques heures, généralement de 3h à 5h). Fonctionnalisation des électrodes via dropcasting par du pyrène 35 Après fonctionnalisation de l'électrode par les nanotubes de carbone, celle-ci est modifiée par l'adjonction de 20 pL d'une solution concentrée à 10 mM de pyrène 10 dissous dans le dichlorométhane (conc. 5 mg/mL). Le solvant est ensuite évaporé à pression atmosphérique (env.100 kPa) et température ambiante (env. 250°). Electrosynthèse de l'électrode par chronoampérométrie et voltampérométrie 5 cyclique L'électrode modifiée par le pyrène est placée dans une solution électrolytique (tampon phosphate 0.2 M Na2HPO4 et 0.2M NaH2PO4 de pH 7) préalablement dégazée sous Argon. L'électrode est alors soumise par chronoampérométrie à un courant de 1V 10 en utilisant comme contre électrode une électrode de platine et une électrode de référence de type Ag/AgCI pendant 30 secondes. L'électrode est alors rincée à l'eau distillée afin de retirer toutes traces d'électrolyte support ou de molécules organiques. Il convient de noter que l'activation du pyrène a également été effectuée par des balayages successifs par voltampérométrie cyclique allant de -0.4V à 1V vs. Ag/AgCl. 15 Le nombre de cycles variant de 3 à 20 et l'électrode est ensuite rincée à l'eau distillée afin de retirer toutes traces d'électrolyte support ou de molécules organiques. Les résultats présentés ci-dessous ont été effectués en général en utilisant l'électrode obtenue par chronoampérométrie mais des résultats similaires ont été obtenus par voltampérométrie cyclique (par exemple Figure 1 (droite)) et ces deux électrodes sont 20 considérées comme étant de structures et de performances quasi-identiques. Fonctionnalisation de l'électrode via dropcasting du biocomposé La FAD-GDH utilisée dans cet exemple est une FAD-GDH d'aspergillus sp. 25 (SEKISUI DIAGNOSTICS, Lexington, MA, No. Catalogue GLDE - 70 - 1192) qui présente les caractéristiques suivantes : Aspect : poudre jaune lyophilisée. Activité : > 900 U/mg poudre 37°C. Solubilité : se dissout aisément dans l'eau à une concentration de : 10mg/mL. 30 Une unité d'activité : quantité d'enzyme qui va convertir une micromole de glucose par minute à 37°C. Poids moléculaire (Gel Filtration) 130KD. Poids moléculaire (SDS Page) : bande diffuse à 97 kD indicative d'une protéine glycosylée. 35 Point isoélectrique : 4,4. Valeur Km: 5.10-2 M (D-Glucose). Cette enzyme est spécifique. D'autres sucres que le D-Glucose ont été testés à une 11 concentration de 30 mM. Le 2-Déoxy-D-Glucose présente seulement 25% d'activité comparé à celle du D-Glucose. Le D-Xylose présente 11%, le D-Galactose 0,7%, le D-Mannose 0,4%, le DTrehalose 0,2% et le D-Fructose 0,1%, d'activité comparé à celle du D-Glucose. Le L5 Glucose, le D- Mannitol, le D-Lactose, le D-Sorbitol, le D-Ribose, le D-Maltose et le DSucrose présentent chacun moins de 0,1% d'activité comparée à celle du D-Glucose. Préalablement une solution à 5 mg.mL-1 de FAD-GDH est préparée dans une solution tampon (tampon phosphate 0.2 M Na2HPO4 et 0.2 NaH2PO4 pH 7) et stockée à 10 -20°C. Avant chaque dépôt, la solution est retirée du congélateur et décongelée. 20 pL de cette solution sont déposés par dropcasting sur l'électrode modifiée. Le solvant est ensuite évaporé à pression atmosphérique (env. 100 kPa) et température ambiante (env. 25°C). 15 Caractérisation de la bioélectrode La bioanode obtenue est utilisée dans une cellule électrolytique standard (avec une contre électrode de platine et une électrode de référence de type Ag/AgCI) pour constituer une cellule lorsque positionnée dans un milieu concentré en glucose. Cette 20 cellule est étudiée ci-dessous présente les caractéristiques suivantes : Caractérisation électrochimique 1.Electrosynthèse La Figure 1 (gauche) représente la réponse électrochimique d'une électrode de 25 carbone vitreux recouverte de nanotubes de carbone et de pyrène. La courbe noire représente la réponse électrochimique de l'électrode, seul un courant capacitif est observé correspondant à la contribution des nanotubes de carbone. La courbe grise a été enregistrée après avoir imposé un potentiel de 1V pendant 30 secondes. Un signal faradique est observé à un potentiel de -0,036 V vs. Ag/AgCl. L'application d'un 30 potentiel de 1V induit donc la synthèse d'une nouvelle espèce présentant des propriétés redox. L'expérience précédente a été réalisée en imposant un potentiel pendant un temps donné. Il est également possible d'électrogénérer la sonde redox par balayages successifs. Les différents cycles électrochimiques sont représentés sur la Figure 1 35 (droite). La courbe noire représente le premier cycle de balayage et les courbes en grise représentent les cycles suivants. On remarque lors du premier cycle l'absence de signal redox à -0,05V au cycle aller. Le pic redox apparait au cycle retour. Ce 12 comportement est similaire aux réactions d'électropolymérisation. Ici il ne s'agit pas de la formation d'un polymère redox mais d'électrosynthèse d'un système électroactif. A des potentiels proches de 1V une oxydation du composé se produit formant des liaisons cétones sur les composés aromatiques qui deviennent 5 alors électroactifs (schéma 1). Les molécules formées contiennent des fonctions quinones leur conférant des propriétés redox. o CV or CA Schéma 1 : Mécanisme supposé lors de l'oxydation du pyrène 10 2. Caractérisation du signal redox La réponse électrochimique de l'électrode redox électro générée est caractéristique d'une espèce immobilisée à une électrode i.e. AE proche de OmV (10 mV à 2mV.s-1) et intensité du pic d'oxydation et de réduction proportionnelle à la vitesse de balayage 15 (Figure 2). La nature de ce produit a également été étudiée en faisant varier le pH de la solution électrolytique (Figure 3). La variation du pH engendre une modulation du potentiel redox. La pente est de -0,056 soit proche de la valeur théorique -0,059 ceci indique qu'il s'agit d'un système redox mettant en jeu l'échange du même nombre de protons que 20 d'électrons. Il est fort probable qu'il s'agisse d'un échange de 2 électrons et de 2 protons comme de nombreuses sondes redox aromatiques (naphtoquinone, anthraquinone,...). On peut donc supposer que l'électrosynthèse engendre la formation de fonctions cétones sur les noyaux aromatiques. Dans le cas de cette électrode qui est fonctionnalisée par un motif pyrène, le produit formé supposé est le 1,6 pyrènedione 25 ou le 1,4 pyrènedione. Le couple redox électrogénérée est donc pyrènedione/dihydroxypyrène avec un échange à 2 électrons et 2 protons. Cependant la littérature (ex. P. Barathi, A. Senthil Kumar, Langmuir, 29 (2013) 10617-10623, suscité) diffère sur la nature exacte du composé formé et il n'est pas forcement possible de conclure sur le nombre de fonctions cétones formé. 30 Etude des propriétés catalytiques des bioélectrodes La Figure 4 représente la réponse électrochimique de la bioanode décrite ci-dessus 13 (MVVCNT/pyrèneRedox/ FAD-GDH) en l'absence et en présence de glucose. La courbe noire en l'absence de glucose présente uniquement la réponse électrochimique réversible de la sonde redox immobilisée. A l'inverse en présence d'une solution aqueuse de 200 mM de glucose, une vague d'oxydation est observée et caractéristique 5 d'une activité catalytique. Le courant catalytique se produit au niveau du potentiel de la sonde redox. Ceci montre que la sonde redox électrogénérée permet d'assurer un transfert électronique médié entre l'électrode et l'enzyme FAD-GDH. La Figure de droite montre l'évolution du courant lors d'ajout de quantités croissantes de glucose. Le courant maximal de catalyse de l'ordre de 1,3 mA (6,5 mA.cm-2) est atteint pour des 10 concentrations en glucose de 200 mM. Ceci est également observé par l'insert de la Figure de droite (4B) présentant l'évolution du courant en fonction de la concentration qui atteint un plateau pour des concentrations de 200 mM. La constante de MichaelisMenten apparente du système est de 39,8 mM. 15 Etudes comparatives d'autres composants polyaromatiques activés. De manière à établir les propriétés surprenantes de l'électrode enzymatique selon l'invention, plusieurs études comparatives ont été réalisées en utilisant d'autres matériaux de base que le pyrène. Les bioanodes ont été réalisées de la même 20 manière et selon les mêmes étapes, que pour l'électrode au pyrène activé décrit ci-dessus. La méthode d'activation choisie a été la voltampérométrie cyclique (figure 5A et 5B) et la chronoampérométrie (figure 6) qui engendre les mêmes comportements. La seule modification a été la nature du composé polycyclique. 25 Ainsi La Figure 5 (gauche) montre la réponse électrochimique du dérivé oxygéné d'anthracène après l'activation par voltampérométrie cyclique. La signature correspond exactement à celle d'anthraquinone, un produit commercial. La Figure à droite montre l'électrosynthèse d'un dérivé de perylène sous les mêmes conditions. Il s'agit très probablement d'un perylènequinone mais de tels dérivés ne sont pas commercialisés 30 ce qui ne permet pas de déterminer la structure exacte. Le potentiel de ces deux composants (-0.5 V pour l'anthraquinone et --0.2 pour le perylènequinone) ne permet pas un transfert d'électron avec la FAD-GDH. La figure 6 montre la réponse électrochimique du dérivé oxygéné de phénanthrène après l'activation par voltampérométrie cyclique. Celui-ci montre un transfert 35 d'électrons après électro-oxydation. La signature correspond exactement à celle de phénanthraquinone, un produit commercial. Le courant catalytique reste néanmoins faible (quelques dizaines de pA) comparé au pyrène électro-oxydé (plusieurs centaines 14 de pA). La figure 7 montre la comparaison d'une électrode au pyrènedione (selon l'invention) avec une électrode au 1,4 naphtoquinone par voltampérométrie cyclique en termes de l'efficacité et la stabilité du transfert d'électrons. Dans le cadre de la réalisation de 5 biopiles il est nécessaire d'éviter le relargage du médiateur redox en solution ce qui induit une diminution des performances au cours du temps ainsi qu'une possible pollution dans le cas de l'implantation de biopiles dans des organismes vivants. Après 100 cycles de voltamétrie cyclique de l'électrode en présence de 200mM de glucose, le courant catalytique diminue de 60% pour le dérivé pyrènedione tandis qu'il diminue de 10 plus de 93% dans le cas de l'électrode fonctionnalisée par le motif 1,4 naphtoquinone (Figure 2 A et C). Une diminution de 47% et 77% du signal faradique non catalytique est observée respectivement pour le pyrènedione et le 1,4 napthoquinone (Figure 2 B et D). Dans le cas du motif pyrène celui-ci présente certains avantages pour une utilisation 15 dans les bioanodes en tant que médiateur redox pour la FAD-GDH. Le produit est facilement électrosynthétisé et présente un transfert électronique rapide. Le potentiel redox du couple pyrène-quinone' pyrène-dihydroquinone a un potentiel proche du potentiel redox du site actif de l'enzyme. En présence de l'enzyme FAD-GDH et de glucose, un courant de catalyse est observé (Figure 7A). Dans notre exemple, les 20 courants catalytiques maximaux obtenus pour une électrode MVVCNT/ pyrène-quinone IFAD-GDH sont de 1,4 mA. Cette vague catalytique apparait à des potentiels proches du potentiel redox de la FAD- GDH et permet donc d'obtenir des potentiels de circuit ouvert (OCV) élevé dans le cas de l'intégration de cette bioanode dans un dispositif de type biopile. L'OCV REVENDICATIONS1. Bioélectrode comprenant un matériau conducteur à la surface duquel sont déposés des nanotubes de carbone, un médiateur redox à base de pyrène, ou d'un de ses dérivés, oxydé in-situ et une enzyme apte à catalyser l'oxydation du glucose. 2. La bioélectrode selon la revendication 1, où ladite enzyme est une Flavine Adénine Dinucléotide - Glucose DesHydrogénase ou une Flavine Adénine Dinucléotide - Glucose Oxydase. 3. La bioélectrode selon la revendication 1 ou 2, où ledit médiateur est obtenu par chronoampérométrie et comprend l'application à du pyrène, ou à un de ses dérivés, déposé in-situ sur ladite surface de ladite électrode, d'un potentiel de 1V à ladite électrode pendant un temps donné, de préférence allant de 30 secondes à 3 min. 4. La bioélectrode selon la revendication 1 ou 2, ou ledit médiateur oxydé in-situ est obtenu par voltampérométrie cyclique et comprend l'application à du pyrène, ou à un de ses dérivés, déposé in-situ sur ladite surface de ladite électrode d'un potentiel variant de manière cyclique de -0.4V à 1V, de préférence le nombre de cycles appliqués varie de 3 à 20. 5. Un procédé de fabrication d'une bioélectrode apte à l'oxydation du glucose, ladite méthode comprenant : a) une étape d'oxydation de pyrène, ou d'un de ses dérivés, ledit pyrène, ou ledit dérivé, étant préalablement déposé sur la surface d'un matériau conducteur, matériau conducteur à la surface duquel sont également déposés des nanotubes de carbone, et b) une étape, de préférence subséquente à l'étape a), de dépôt d'une enzyme apte à catalyser l'oxydation du glucose à la surface de ladite électrode. 6. Le procédé de fabrication selon la revendication 5, ou ladite étape d'oxydation de pyrène est effectuée par chronoampérométrie et comprend l'application d'un potentiel de 1V à ladite surface pendant un temps donné, de préférence allant de 30 secondes à 3 min. 16 7. Le procédé de fabrication selon la revendication 5, ou ladite étape d'oxydation est effectuée par voltampérométrie cyclique et comprend l'application d'un potentiel variant de manière cyclique de -0.4V à 1V à ladite surface, de préférence le nombre de cycles appliqués varie de 3 à 20. 8. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, ou ladite enzyme est une Flavine Adénine Dinucléotide - Glucose DésHydrogénase ou une Flavine Adénine Dinucléotide - Glucose Oxydase. 9. Une bioélectrode fabriquée par le procédé décrit aux revendications 5 à 8. 10. Utilisation de la bioélectrode décrite aux revendications 1 à 4 et 9 pour la fabrication d'une biopile ou d'un biocapteur à glucose.