FR 3081169 A1 20191122 FR 1854052 A 20180515 Substitution de la coiffe des ARN messagers par deux séquences d'ARN introduites à leur extrémité 5' Domaine La présente invention se rapporte au domaine des acides ribonucléiques, et plus particulièrement à la synthèse in vitro de l'acide ribonucléique messager (ARNnn), à sa stabilité et à sa traduction en polypeptide, notamment dans des cellules transfectées. Introduction L'ARNnn est une molécule essentielle dans la production des polypeptides à l'échelle industrielle. Sa stabilité et l'efficacité de sa transcription et traduction influent fortement sur le rendement des polypeptides en aval et donc sur leur coût. L'ARNnn est également une molécule de choix dans les compositions pharmaceutiques utilisées dans la thérapie génique et dans la vaccination génétique. En effet, l'intégration d'une molécule d'ARNnn dans le génome d'une cellule transfectée n'a jamais été démontrée, contrairement aux molécules d'ADN. Cependant, il est peu stable en solution car sensible à la dégradation par des ribonucléases. La synthèse des molécules d'ARN stables in vitro et in vivo est donc critique pour réduire les quantités d'ARNnn nécessaires pour une efficacité thérapeutique optimum et ainsi réduire leur coût. De plus, l'utilisation de plus faibles quantités d'ARNnn plus stable réduit le risque d'effets secondaires liés au traitement. La synthèse in vivo se fait par des cellules en culture, telles que des levures ou des bactéries. Cependant, cette méthode présente de nombreux désavantages. La purification de l'ARNnn d'intérêt intact est ainsi onéreuse et complexe, notamment du fait des problèmes de dégradation et de la présence d'autres ARN cellulaires. Elle génère de façon générale un rendement plus faible que celle obtenu par la transcription in vitro. De ce fait, le procédé de synthèse d'ARNnn à grande échelle couramment utilisé est un système acellulaire de transcription in vitro. Cette méthode n'utilise que quelques composés purifiés (i.e. un tampon de réaction, une molécule d'ADN portant un gène, une ARN polynnérase recombinante et quatre ribonucléotides triphosphates) ; et le seul ARN à être produit est l'ARNnn que l'on souhaite synthétiser. À la fin de la réaction, il n'y a pas de produits de dégradation de l'ARNnn du fait de l'absence de RNase dans le 2 mélange réactionnel. Il n'y a pas non plus d'autres espèces d'ARN, ce qui est un avantage majeur par rapport à la synthèse d'ARNnn par des cellules en culture. La purification de l'ARNnn est ainsi grandement simplifiée. Pour assurer sa stabilité dans des cellules eucaryotes, un ARNnn est doté d'une molécule 5 de coiffe à son extrémité 5', qui protège cette dernière des exoribonucléases. La coiffe est une molécule complexe composée de deux guanosines reliées par leur carbone 5' par une chaîne de trois groupements phosphate. La guanosine terminale est nnéthylée en position 7 de la guanine. L'ARNnn est stabilisé grâce à la résistance que lui procure la coiffe vis-à-vis d'une dégradation enzymatique progressive de 5' en 3' réalisée par 10 l'exoribonucléase Xrn1. En plus de son rôle dans la stabilisation de l'ARNnn, la coiffe exerce d'autres fonctions, dont notamment le recrutement des ribosomes (Cowling, 2010). Pour cela, la coiffe commence par recruter des facteurs d'initiation de la traduction, puis ceux-ci recrutent des ribosomes. Ces derniers traduisent ensuite l'ARNnn en protéines. 15 À l'échelle industrielle, pour améliorer la stabilité de l'ARNnn et permettre une traduction efficace de l'ARNnn en polypeptides dans les cellules transfectées, une molécule de coiffe doit être incorporée à l'extrémité 5'. Lors de la transcription in vitro, la molécule de coiffe peut être ajoutée lors d'une étape ultérieure à la transcription en utilisant un enzyme de coiffage, tel que le 2'-0-nnethyltransferase du 20 virus Vaccina (Martin et al., 1975). Cependant, cette étape supplémentaire augmente la complexité de la synthèse, nécessite la purification de l'enzyme de coiffage et n'est pas très efficace (Contreas et al., 1982). De plus, cet enzyme nécessite de la S-adénosyl-Lméthionine, qui est une molécule instable en solution aqueuse. Pour simplifier la transcription in vitro, des analogues de la coiffe ont été développés 25 dans l'art antérieur, qui ne sont toutefois pas satisfaisants. À titre d'exemple, on peut citer l'analogue P1-(5'-7-nnethyl-guanosyl) P3-(5'-(guanosyl))triphosphate) ou l'analogue P1-(5'-2,2,7-trinnethyl-guanosyl) P3-(5'-(guanosyl))triphosphate). Ces analogues permettent un coiffage co-transcriptionnel nnédié par une ARN polynnérase phagique, évitant ainsi l'étape supplémentaire de synthèse de la coiffe, et peuvent également 30 améliorer la stabilité de l'ARNnn. Cependant, selon le type d'analogue, jusqu'à 50% des molécules incorporées ont une orientation inversée, avec le nucléotide 7- nnéthylguanosine à proximité de la molécule d'ARN et non en position terminale, réduisant ainsi la stabilité et l'efficacité de la traduction de l'ARNnn (Pasquinelli et al., 1995). Des analogues de la coiffe de type - anti-reverse » (ARCA) ont ensuite été 3 développés, comme celui décrit dans US 7074596. Ces analogues empêchent l'incorporation inversée de la molécule. Cependant, ils restent insatisfaisants car leur utilisation induit une forte baisse du rendement de la synthèse in vitro de l'ARNnn. De plus, la synthèse de la molécule de coiffe et de ses nombreux analogues modifiés 5 chimiquement est onéreuse du fait de la complexité de ces composés. L'inclusion d'une de ces molécules dans le mélange réactionnel d'une transcription in vitro à l'échelle industrielle, augmente fortement le coût de la synthèse d'ARNnn. En effet, pour s'assurer d'une efficacité de coiffage élevée lors de la transcription in vitro, il est nécessaire de fournir un excès d'analogue de coiffe, contribuant ainsi au 10 coût élevé des matières premières. En effet, un ratio de 4 molécules d'analogue de coiffe est préconisé par molécule de GTP pour maximiser les chances que chaque molécule d'ARNnn ait une coiffe. Malgré cela, il est estimé que seulement 80% de l'ARNnn synthétisé sera coiffé. De plus, la concentration en GTP est diminuée de cinq fois par rapport aux trois autres ribonucléotides triphosphates, ce qui diminue le 15 rendement de la transcription de cinq fois. Pour réduire le coût élevé de la transcription in vitro, une solution consiste à réduire le coût de la production de l'ADN et/ou de l'ARN polynnérase utilisés dans cette méthode. Cependant, les baisses de coût obtenues restent relativement faibles. À titre alternatif, il est possible de synthétiser un ARNnn circulaire dépourvu de coiffe par transcription in 20 vitro dans un système acellulaire (WO 2014/186334 Ai). Cependant, les auteurs ont démontré que l'ARNnn circulaire est moins efficacement traduit dans une cellule transfectée qu'un ARNnn linéaire coiffé (voir par ex. les Figures 2 et 3 et paragraphes [00121] et [00131] de WO 2014/186334 Ai). Par conséquent, il existe toujours un besoin d'une molécule d'ARNnn ayant une stabilité 25 ainsi qu'une efficacité de traduction élevée, de préférence ayant une stabilité et une efficacité de traduction au moins aussi élevée qu'une molécule d'ARNnn coiffé. Il existe également un besoin d'une molécule d'ARN ayant une méthode de production simple et dont le coût de fabrication soit notablement réduit. Description 30 La présente invention a pour objet une molécule d'ARNnn stable pouvant être traduite avec une efficacité élevée et dépourvue de coiffe. Cet ARNnn est particulièrement avantageux car son coût de production est très inférieur à celui d'un ARNnn classique comprenant une molécule de coiffe ou un analogue de celle-ci. La présente invention a 4 également pour objet une molécule d'ARNnn dont le rendement de sa transcription in vitro est amélioré par rapport à celui d'un ARNnn classique comprenant une molécule de coiffe ou un analogue de celle-ci. En effet, l'ARNnn de l'invention est également avantageux car, malgré la baisse importante du coût de sa production et/ou 5 l'augmentation du rendement de sa synthèse, ledit ARNnn est au moins aussi performant qu'un ARNnn classique doté d'une coiffe lors de la transfection de cellules en culture et de tissus. En effet, les inventeurs ont démontré de façon très surprenante que les niveaux et durées d'expression obtenus après transfection in vivo sont au moins aussi élevés que ceux d'un ARNnn doté d'une coiffe. En particulier, la cinétique d'expression 10 dans les cellules Caco-2 d'une protéine rapporteuse est identique, que l'on transfecte l'ARNnn de l'invention ou un ARNnn coiffé témoin (Figures 2 et 3). De même, les inventeurs ont démontré de façon très surprenante que l'expression d'une protéine rapporteuse est 2 fois à environ 10 fois supérieure lorsqu'on transfecte l'ARNnn de l'invention in vivo, dans le derme ou le muscle d'une souris que lorsqu'on transfecte un 15 ARNnn coiffé témoin (Figure 5 et Figure 15). Cependant, la réaction est simplifiée car l'étape supplémentaire de coiffage n'est pas nécessaire. Il n'est pas non plus utile d'inclure de molécule d'analogue de la coiffe dans le mélange réactionnel lors de la transcription in vitro. La molécule d'ARNnn de l'invention est donc nettement avantageuse en termes de coûts réduits et de production facilitée par rapport à un 20 ARNnn de l'art antérieur, pour une expression au moins aussi élevée. Par - molécule d'ARNm » on entend au sens de la présente demande tout enchaînement linéaire de ribonucléotides. Dans la présente demande, ces enchaînements sont exprimés dans le sens 5' vers 3' en commençant par la région 5'-UTR. Par - ribonucléotide » on entend tout ribonucléotide naturel (e.g. guanine, cytidine, 25 uridine, adénosine), ainsi que des analogues de ces nucléotides ainsi que des nucléotides ayant des bases modifiées de façon chimique ou biologique (e.g. par nnéthylation, alkylation, acylation, thiolation, etc.), des bases intercalées, des groupements riboses modifiés et/ou des groupements phosphates modifiés. Les inventeurs ont démontré ici de façon surprenante que la coiffe à l'extrémité 5' 30 d'une molécule d'ARNnn peut être remplacée par au moins un exemplaire d'une séquence résistante à l'exoribonucléase Xrn1 (xrRNA), issue de la région 3'-UTR d'un virus du genre Flavivirus, de préférence accompagné d'une séquence interne d'entrée de ribosomes (IRES) par phase de lecture ouverte. De façon très avantageuse, le coût de la production par transcription in vitro d'une telle molécule d'ARNnn est diminué 5 d'environ 30 fois, par rapport à une molécule d'ARNnn coiffé, et son rendement est amélioré. De plus, la molécule d'ARNnn de l'invention est particulièrement stable dans des cellules transfectées, tout en étant traduite efficacement, alors même qu'elle ne possède pas de coiffe. 5 Par - coiffe » on entend le nucléoside 7-nnethylguanosine (N7-nnethyl guanosine or nn7G) ainsi que tout mutant, variant, analogue ou fragment de celle-ci qui peut être reliée au premier nucléotide transcrit d'un ARNnn par une liaison 5'-5' triphosphate. De façon non-limitatif, les analogues de la coiffe comprennent des analogues non-nnéthylés (e.g. P1- (Guanosyl) P3-(5'-(guanosyl)) triphosphate), nnononnéthylés (e.g. P1-(5'-7-nnéthyl- 10 guanosyl) P3-(5'-(guanosyl)) triphosphate), trinnéthylés (e.g. P1-(5'-2,2,7-trinnéthylguanosyl) P3-(5'-(guanosyl)) triphosphate), ou ayant une substitution du groupement 3'-OH de la moitié guanine ne par un groupement 3'-0-nnethyl (e.g. l'ARCA P1-(5'-(3'-0- nnéthyl)-7-nnéthyl-guanosyl) P3- (5'- (guanosyl))triphosphate). Selon un premier aspect, l'invention a donc pour objet une molécule d'acide 15 ribonucléique messager (ARNnn) dépourvue de molécule de coiffe comprenant : - une région 5'-UTR comprenant au moins un exemplaire d'une séquence consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112-19)UGCNRYCUG (xrRNA) ; - au moins un exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; et 20 - au moins une phase de lecture ouverte. De préférence, une séquence d'ARN IRES se trouve en amont de chaque phase de lecture ouverte. Selon un mode préférentiel, l'invention a pour objet une molécule d'acide ribonucléique messager (ARNnn) dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5' à 25 3': - une région 5'-UTR comprenant au moins un exemplaire d'une séquence consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112-19)UGCNRYCUG (xrRNA) ; - un exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; et - une phase de lecture ouverte. 30 De préférence, la molécule d'ARNnn comprend également une région 3'-UTR. 6 De préférence, la molécule d'ARNnn comprend également au moins un ARN aptannère favorisant la pénétration de la molécule d'ARNnn dans les cellules, de préférence dans des cellules musculaires. L'ARN aptannère peut notamment favoriser la pénétration directement ou indirectement via un peptide. 5 De préférence, la molécule d'ARNnn comprend en outre une tige-boucle à l'extrémité 5'. Dans un mode de réalisation préférentiel, l'invention a pour objet une molécule d'acide ribonucléique messager (ARNnn) dépourvue de molécule de coiffe consistant en, de 5' à 3' : 10 - une région 5'-UTR comprenant au moins un exemplaire d'une séquence consensus GUCAGRYC(N7.19)GCCA(N12-19)UGCNRYCUG (xrRNA) ; - un exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; et - une phase de lecture ouverte. 15 Il a été démontré dans l'art antérieur que la région non-traduite 3'-UTR des Flavivirus a la propriété de bloquer Xrn1 et de protéger ainsi la séquence en aval (Chapman et al., 2014). Cette région d'ARN est composée d'au moins une séquence qui se replie sur elle-même en formant une structure tridimensionnelle complexe, laquelle inhibe la progression de Xrn1 et donc la dégradation des ARN subgénonniques viraux. Cependant, 20 de telles séquences n'avaient jusqu'ici jamais été insérées en 5' d'un ARNnn. On pouvait en effet craindre que ces séquences puissent nécessiter d'être dans le contexte du 3'UTR du génome des Flavivirus pour exercer leur fonction. En particulier, ces structures tridimensionnelles pourraient ne pas se replier correctement lorsqu'elles ne sont plus entourées par les séquences de la région 3'UTR flavivirale. 25 Alors que l'art antérieur suggérait que les séquences xrRNA inhibent la traduction, les inventeurs ont cependant démontré ici de façon surprenante que les fonctions protectrice et d'initiation de la traduction de la coiffe peuvent être remplacées avec succès par au moins un exemplaire d'une séquence xrRNA et au moins un exemplaire d'une séquence IRES, de préférence du virus EMCV sans affecter l'efficacité de la 30 traduction. De façon très surprenante, l'utilisation des séquences xrRNA et IRES permet même d'améliorer l'efficacité de la traduction de façon très importante. Par - Flavivirus » on entend tout virus du genre Flavivirus, comprenant le virus de la fièvre jaune, de la dengue, du Nil occidental (WNV), du Zika, d'encéphalite japonaise, 7 de Rocio, de vallée de Murray, de Bagaza, de Kokobera, de Ntaya, de Kedougou, de Sepik, de Saint Louis, d'Usutu, d'Alfuy, de Wesselbron, d'Ilheus, de Bussuquara, de Tennbusu, de Chaoyang, de Yokose, de Donngang, ainsi de tout autre virus du genre Flavivirus. 5 L'invention a ainsi pour objet une molécule d'ARNnn stable comprenant au moins un exemplaire d'une séquence xrRNA dans la région 5' dudit ARNnn. Ledit ARNnn est efficacement traduit en protéine à des niveaux et durées semblables à ceux d'une molécule coiffée. Selon un mode préféré de l'invention, la molécule d'ARNnn comprend deux exemplaires de xrRNA. 10 Par - séquence d'ARN résistante à Xml » ou - xrRNA » on entend toute séquence polynucléotidique permettant de réduire, ralentir ou empêcher la dégradation d'un ARNnn par l'exoribonucléase Xrn1. De préférence, la séquence xrRNA comprend une séquence consensus. Par - séquence consensus » on entend toute séquence comprenant au moins la séquence 15 représentée par : 5'-GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112.19)UGCNRYCUG-3', dans laquelle chaque N peut représenter de façon indépendante un nucléotide sélectionné parmi A, C, T, G, et U ou un analogue d'un de ceux-ci. Chaque R représente une purine et chaque Y représente une pyrimidine. Le nombre de nucléotides N entre les bases conservées peuvent varier dans la séquence consensus, de 5' à 3', de 7 à 19 bases et de 12 à 19 20 bases, comme indiqué. Ladite séquence forme une structure tridimensionnelle de type tige-boucle. De préférence, la molécule d'ARNnn comprend au moins un exemplaire d'une séquence xrRNA choisie parmi les séquences représentées par : SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 44. Quand la molécule d'ARNnn comprend plus d'un exemplaire desdites séquences, ces 25 exemplaires peuvent être identiques ou différents. Ainsi de façon plus préférée, la molécule d'ARNnn comprend au moins un exemplaire d'une des séquences représentées par SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 26. De façon encore plus préférentielle, la molécule d'ARNnn comprend un exemplaire de la séquence représentée par SEQ ID NO: 11 et un exemplaire de la séquence représentée par SEQ ID NO : 26. 30 De préférence, quand il y a deux séquences xrRNA dans la région 5'UTR, elles sont séparées par une séquence d'espacement. De même, il pourrait y avoir une séquence d'espacement entre une séquence xrRNA et une séquence IRES. De façon préférentielle, la séquence d'espacement entre deux séquences de xrRNA correspond à SEQ ID NO : 47. 8 De façon préférentielle, la séquence d'espacement entre la séquence xrRNA et la séquence IRES correspond à SEQ ID NO : 48. Une séquence d'espacement peut aussi être présente entre deux phases de lecture ouvertes ou entre une phase de lecture ouverte et une séquence l'IRES, lorsque la molécule d'ARNnn comprend au moins deux phases de 5 lecture ouvertes. Par - séquence d'espacement » on entend toute séquence polynucléotidique non codante permettant de séparer physiquement la séquence en amont de ladite séquence d'espacement de la séquence en aval. La molécule d'ARNnn selon l'invention peut notamment comprendre une ou plusieurs séquences d'espacement. 10 Dans certains modes de réalisation, la séquence d'espacement peut être de 2 à 300 nucléotides en longueur. De préférence elle est comprise 2 et 10 nucléotides, encore plus préférentiellement entre 2 et 5 nucléotides. À titre alternative, elle peut être comprise entre 10 et 150 nucléotides et de façon encore plus préférentielle, entre 15 et 40 nucléotides. De préférence, la séquence d'espacement ne génère pas de structures 15 secondaires. L'ARNnn de l'invention comprend en outre au moins une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES). Par - internai ribosome entry site » ou « IRES » on entend toute séquence polynucléotidique qui permet d'initier la traduction d'une molécule d'ARNnn 20 indépendamment de la coiffe. Elles interagissent directement avec des facteurs d'initiation de la traduction, qui recrutent ensuite les ribosomes au niveau d'un codon d'initiation de la traduction. De nombreuses séquences IRES sont connues (Mokrej et al., 2010). L'homme du métier pourra donc identifier des séquences fonctionnant comme des IRES et choisir celles adaptées à la mise en oeuvre de l'invention. La 25 séquence IRES selon l'invention peut ainsi être d'origine eucaryote ou virale, par exemple issue du genre Picomavirus. De préférence elle est issue du virus de l'encéphalonnyocardite (EMCV) (Bornnan et a/.1995) ou de l'ARNnn humain elF4G. De façon encore plus préférentielle, la séquence ADN de l'IRES correspond à SEQ ID NO : 45. 30 Les séquences IRES sont habituellement localisées dans la région 5'-UTR. Elles peuvent aussi être situées entre deux phases de lecture ouverte, ce qui permet d'initier une traduction bi- ou polycistronique à partir d'un seul ARNnn. Dans un mode de réalisation préféré, l'ARNnn de l'invention comprend un seul exemplaire d'une séquence IRES dans 9 la région 5' dudit ARNnn. Selon un mode de réalisation préféré, un deuxième exemplaire d'une séquence IRES est situé entre deux phases de lecture ouverte. Selon encore un autre mode de réalisation préféré, l'ARNnn de l'invention comprend un exemplaire d'une séquence IRES dans la région 5' et un exemplaire d'une séquence IRES entre deux 5 phases de lecture ouverte. Avantageusement, ladite(s) séquence(s) IRES est/sont située(s) en aval de(s) séquence(s) xrRNA. Cette organisation permet, de façon avantageuse, de protéger ces séquences de l'exoribonucléase Xrnl. Lorsque la molécule d'ARNnn comprend au moins deux séquences IRES, lesdites séquences peuvent être identiques ou différentes. En particulier, une ou plusieurs séquences IRES peuvent être 10 sélectionnées selon leur efficacité d'initiation de la traduction. La sélection de deux séquences IRES différentes est particulièrement avantageuse lorsque la molécule d'ARNnn comprend au moins deux phases de lecture ouvertes différentes et que l'efficacité de traduction souhaitée pour la première phase de lecture ouverte diffère de celle souhaitée pour la deuxième. 15 Les éléments IRES ont également des structures tridimensionnelles complexes. De ce fait, une interférence réciproque entre séquences xrRNA et IRES est possible par la formation d'appariements entre des séquences d'ARN de chacune des deux régions. Une telle interférence pourrait empêcher la formation des structures correctes des séquences xrRNA et IRES respectivement. De plus, les structures xrRNA pourraient en 20 particulier empêcher le recrutement des facteurs d'initiation de la traduction et des ribosomes effectué par l'IRES. De façon encore plus inattendue, les inventeurs ont montré que la présence des séquences xrRNA et IRES permet d'obtenir des rendements d'expression protéique dans des cellules transfectées, qui sont au moins similaires à ceux obtenus avec une molécule d'ARNnn coiffée. Les séquences xrRNA et IRES 25 ensemble peuvent donc se substituer à une molécule de coiffe ou d'analogue de coiffe. Elles sont indispensables pour assurer la traduction d'une phase ouverte de lecture contenue dans l'ARNnn de l'invention et la stabilité de l'ARNnn. Dans des cellules transfectées, l'ARNnn de l'invention est ainsi au moins aussi stable qu'un ARNnn doté d'une coiffe, tout en étant au moins aussi efficacement traduit. De 30 plus, le coût de sa synthèse par transcription in vitro est fortement réduit par rapport à celui d'un ARNnn coiffé. Selon un mode de réalisation particulière, l'ARNnn de l'invention comprend en outre une tige-boucle dans la région 5'-UTR en amont de la séquence consensus GUCAGRYC(1\17. 10 19)GCCA(1112-19)UGCNRYCUG (xrRNA), de préférence à l'extrémité 5' de la molécule d'ARNnn. Par - tige-boucle » on entend toute séquence polynucléotidique formant une structure en forme de double hélice dans laquelle l'extrémité 5' d'un brin est physiquement liée à 5 l'extrémité 3' de l'autre brin à travers une boucle non appariée. Ainsi, la tige-boucle est constituée d'une tige double brin et d'une boucle simple brin non appariée. Ladite liaison physique peut être soit covalente soit non covalente. Préférentiellement, ledit lien physique est une liaison covalente. La taille de la boucle d'ARN peut être par exemple entre 3 et 30 nucléotides. La taille de la boucle est de préférence d'au moins 10 3 nucléotides, de préférence d'au moins 4 nucléotides. La longueur de la tige double brin peut être par exemple compris entre 5 et 50 nucléotides. La longueur de la tige est de préférence entre 5 et 50, 5 et 40, 5 et 30, 5 et 25, ou plus préférentiellement entre 5 et 10 nucléotides. Encore plus préférentiellement, la longueur de la tige est de 6, 7, ou 8 nucléotides. 15 Dans le cadre de la présente invention, une tige-boucle est préférentiellement formée à l'extrémité 5' de la molécule d'ARNnn. Selon un mode de réalisation préférentiel, la tige-boucle à la séquence de SEQ ID NO: 87. La tige-boucle est préférentiellement séparée de la séquence xrRNA par une séquence d'espacement. De préférence, ladite séquence d'espacement a une longueur égale ou inférieure à 5 nucléotides (i.e. de 5, 4, 3, ou 2 20 nucléotides). En effet, de façon très surprenante, les inventeurs ont démontré que l'ajout d'une structure tige-boucle à l'extrémité 5' de la molécule d'ARNnn (aussi appelée 5'-SL ici, pour - stem-loop » à l'extrémité 5') permet d'améliorer encore plus la traduction in vivo, lorsque celle-ci est à proximité de la séquence xrRNA (e.g. à 5 nucléotides ou moins). En effet, les inventeurs n'ont pas observé d'effet avantageux 25 lorsque la tige-boucle placée à l'extrémité 5' est séparée de la séquence xrRNA par une séquence d'espacement ayant une longueur d'environ 70 nucléotides (voir la Fig. 15). Sans être liée par la théorie, et de façon très surprenante, on pourrait penser que la séquence xrRNA masque l'extrémité 5' vis-à-vis des phosphatases et de Xrn1, au moins lorsque cette séquence est en forme de tige boucle et à proximité. 30 Dans un mode de réalisation préférentiel, l'invention a donc pour objet une molécule d'acide ribonucléique messager (ARNnn) dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5' à 3' : - une région 5'-UTR comprenant au moins un exemplaire d'une séquence consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112-19)UGCNRYCUG (xrRNA) ; 11 - un exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; et - une phase de lecture ouverte, comprenant en outre une tige-boucle à l'extrémité 5'. 5 La molécule d'ARNnn peut comprendre en outre une deuxième séquence IRES suivi par une deuxième phase de lecture ouverte. La molécule d'ARNnn peut comprendre en outre un ARN aptannère telle que défini ici, localisé entre la tige-boucle et la/les séquence(s) xrRNA ou, de préférence, entre la/les séquence(s) xrRNA et la séquence IRES. La molécule d'ARNnn peut comprendre en outre une région 3'-UTR telle que 10 définie ici. Dans un mode de réalisation préférentiel, l'invention a pour objet une molécule d'acide ribonucléique messager (ARNnn) dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5' à 3' : 15 - une région 5'-UTR comprenant une tige-boucle à l'extrémité 5' suivi par au moins un exemplaire d'une séquence consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112. 19)UGCNRYCUG (xrRNA) ; - optionnellennent, un ARN aptannère ; - un exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; et 20 - une phase de lecture ouverte. Dans un mode de réalisation préférentiel, l'invention a pour objet une molécule d'acide ribonucléique messager (ARNnn) dépourvue de molécule de coiffe consistant en, de 5' à 3' : 25 - une région 5'-UTR comprenant une tige-boucle à l'extrémité 5' suivi par au moins un exemplaire d'une séquence consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112. 19)UGCNRYCUG (xrRNA) ; - optionnellennent, un ARN aptannère ; - un exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; et 30 - une phase de lecture ouverte ; et - une région 3'-UTR. Par - aptamère » on entend tout acide nucléique présentant des propriétés de reconnaissance et de spécificité liées à sa capacité à adopter des structures 35 tridimensionnelles particulières, notamment semblables aux anticorps monoclonaux 12 (voir par exemple Dunn et al., 2017). Un aptannère peut être composé d'ADN, d'ARN et/ou d'ARN modifié, de préférence d'ARN. Ledit aptannère peut être composé de 6 à 50 nucléotides, tel que des ribonucléotides tels que définis ci-dessus. À titre d'exemple non-limitatif, l'aptannère peut être isolé selon différentes techniques qui sont bien 5 connues de l'homme de métier, telle que l'identification d'un aptannère in vitro par un ou plusieurs cycles de sélection in vitro ou à partir de banques combinatoires d'un grand nombre de composés de séquence aléatoire par une méthode de sélection itérative (technique - SEL EX »). L'identification d'un aptannère in vitro par sélection permet avantageusement d'obtenir des aptannères ayant un effet ou fonction précise, sans 10 toutefois avoir besoin de connaitre la cible contre laquelle ledit aptannère est dirigé. La fabrication ou la sélection d'aptannères est, e.g., décrit dans la demande de brevet européen EP0533838. Avantageusement, des ARN aptannères ont été identifiés dans le cadre de la présente invention selon leur capacité à pénétrer des cellules d'intérêt, plus particulièrement des cellules tissulaires, de préférence des cellules musculaires 15 (e.g. des cellules de fibres musculaires). Avantageusement, l'aptannère selon l'invention est capable de traverser une membrane cellulaire, plus préférablement la membrane plasmique et/ou la membrane endosonnale d'une cellule de mammifère. L'aptannère selon l'invention comprend avantageusement 6 à 50 nucléotides, plus avantageusement de 10 à 45 nucléotides, de 20 à 40 nucléotides, encore plus 20 avantageusement de 30 à 40 nucléotides. Avantageusement, l'aptannère est composé de ribonucléotides, tels que définis ci-dessus. Avantageusement, l'aptannère selon l'invention à au moins 70 % d'identité, plus avantageusement au moins 80 % d'identité, au moins 90 % d'identité, au moins 95 % d'identité, au moins 96 % d'identité, au moins 97 % d'identité, au moins 98 % d'identité, encore plus avantageusement au moins 99 % 25 d'identité avec l'aptannère A ayant la séquence de SEQ ID NO : 64, l'aptannère B ayant la séquence de SEQ ID NO : 65, ou l'aptannère C ayant la séquence de SEQ ID NO : 66. Les pourcentages d'identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l'exposé de la présente invention sont déterminés sur la base d'un alignement global des séquences à comparer, c'est-à-dire sur un alignement des séquences prises dans leur intégralité 30 sur toute la longueur en utilisant tout algorithme bien connu de l'homme du métier tel que l'algorithme de Needlennan et Wunsch, 1970. Cette comparaison de séquences peut être effectuée à l'aide de tout logiciel bien connu de l'homme du métier, par exemple le logiciel needle en utilisant le paramètre - Gap open » égal à 10.0, le paramètre - Gap extend » égal à 0.5 et une matrice - Blosum 62 ». 13 Avantageusement, l'aptannère selon l'invention est choisi parmi l'aptannère A ayant la séquence de SEQ ID NO : 64, l'aptannère B ayant la séquence de SEQ ID NO : 65, et l'aptannère C ayant la séquence de SEQ ID NO : 66, encore plus avantageusement, choisi parmi l'aptannère A ayant la séquence de SEQ ID NO : 64 et l'aptannère C ayant la 5 séquence de SEQ ID NO : 66. De préférence, la molécule d'ARNnn selon l'invention comprend au moins un exemplaire d'un aptannère capable de traverser une membrane, de préférence une membrane plasmique et/ou une membrane endosonnale de mammifère. Ainsi de façon avantageuse, lorsque la molécule d'ARN selon la présente invention comprend un 10 aptannère, ledit aptannère favorise sa pénétration dans des cellules, de préférence dans des cellules musculaires ou de la peau. De préférence, la molécule d'ARNnn selon l'invention comprend au moins un exemplaire de l'aptannère A ayant la séquence de SEQ ID NO : 64, de l'aptannère B ayant la séquence de SEQ ID NO : 65, et/ou l'aptannère C ayant la séquence de SEQ ID NO : 66. 15 L'aptannère favorisant la pénétration de la molécule d'ARNnn dans des cellules cibles, n'a pas nécessairement besoin d'être protégé de la dégradation par les exonucléases, qui a lieu nnajoritairennent dans le cytosol des cellules. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la molécule d'ARNnn comprend l'aptannère dans la région 5'-UTR en amont de l'une ou plusieurs séquence(s) consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112. 20 19)UGCNRYCUG (xrRNA). Selon un mode de réalisation alternatif, l'aptannère est placé dans la région 5'-UTR en aval de l'une ou plusieurs séquence(s) consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112-19)UGCNRYCUG (xrRNA) mais en amont des séquences IRES et des phases de lecture ouvertes. (Voir la Figure 1J et 1K pour des schémas représentatifs de ces deux possibilités.) Ainsi, selon un mode préféré, l'invention a pour objet une 25 molécule d'acide ribonucléique messager (ARNnn) dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5' à 3' : - une région 5'-UTR comprenant au moins un aptannère capable de traverser une membrane cellulaire, de préférence une membrane plasmique et/ou endosonnale, de préférence d'une cellule de mammifère, de préférence au moins 30 un aptannère choisi parmi les aptannères A, B, et C tels que décrits ici, et au moins un exemplaire d'une séquence consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112. 19)UGCNRYCUG (xrRNA) ; - un exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; et - une phase de lecture ouverte. 14 De préférence, la molécule d'ARNnn comprend l'aptannère dans la région 5'-UTR en amont de(s) séquence(s) consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112.19)UGCNRYCUG (xrRNA) (voir par exemple la Figure 1F). Toutefois, la molécule d'ARN peut également comprendre l'aptannère en aval de(s) séquence(s) consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112. 5 19)UGCNRYCUG (xrRNA), par exemple, entre la/les séquences(s) consensus xrRNA et la/les séquences(s) IRES. Ainsi, selon un mode préféré, l'invention a pour objet une molécule d'ARNnn dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5' à 3' : - une région 5'-UTR comprenant une tige-boucle à l'extrémité 5' suivi par au 10 moins un exemplaire d'une séquence consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112. 19)UGCNRYCUG (xrRNA) ; - au moins un aptannère capable de traverser une membrane cellulaire ; - un exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; et - une phase de lecture ouverte. 15 Alors que les aptannères B et C ont été sélectionnés pour leur capacité à pénétrer des cellules de fibres musculaires, l'aptannère A correspond à l'aptannère - shot47 », identifié par Tsuji et al., 2013. L'aptannère A se lie avantageusement à un motif peptidique de type poly-histidine avec une grande affinité. L'aptannère A peut ainsi fixer toute molécule (e.g. un peptide ou une protéine) comprenant une étiquette poly- 20 histidine (e.g. le motif HHHHHH). À titre d'exemple non-limitatif, la molécule d'ARNnn selon l'invention peut être liée par le biais de l'aptannère A à une molécule lui permettant de mieux pénétrer des cellules, tel qu'un - peptide pénétrant les cellules » ou - CPP, ledit CPP comprenant une étiquette poly-histidine. Par - peptide pénétrant les cellules » ou - CPP » on entend tout peptide, polypeptide, 25 ou protéine qui est capable de traverser une membrane cellulaire, plus préférablement la membrane plasmique et la membrane endosonnale, d'une cellule de mammifère. Avantageusement, le CPP conserve cette propriété lorsqu'il est lié à une autre molécule, notamment une molécule d'ARNnn, entrainant ainsi la traversée de la membrane par cette dernière. Dans le contexte de la présente invention, tout 30 mécanisme possible de la traversée de la membrane est envisagé comprenant, par exemple, des mécanismes de transport dépendant de l'énergie (c'est-à-dire actifs, par exemple l'endocytose) et des mécanismes de transport indépendant de l'énergie (par exemple la diffusion). De façon générale, les CPPs sont des peptides cationiques (Poillot et De Waard, 2011). À titre d'exemple non-limitatif, la molécule d'ARNnn peut être liée 15 de façon non covalente au vu de sa charge négative au CPP, en profitant des interactions électrostatiques et/ou de l'hydrophobicité. De façon alternative, la molécule d'ARNnn peut être liée de façon covalente au CPP. Les CPPs peuvent former des oligonnères constitués d'au moins deux molécules peptidiques identiques ou 5 différentes. Dans la cadre de la présente invention, un CPP se lie de préférence de façon non covalente sur un ARN aptannère. En effet, ce type de liaison est avantageux du fait de sa simplicité, par simple mélange des molécules CPP et ARNnn, de son faible coût et du fait que ces molécules sont entièrement biodégradables. En effet, aucun groupement 10 chimique non naturel et non biodégradable n'est nécessaire. La longueur des CPPs selon la présente invention est de préférence d'environ 8 résidus d'acides aminés à environ 60 résidus d'acides aminés. Plus préférablement, la longueur est de 8 à 40 résidus d'acides aminés, plus préférablement de 8 à 30 résidus d'acides 15 aminés, encore plus préférablement de 10 à 25 résidus d'acides aminés (par exemple, 13 ou de 20 résidus d'acides aminés). L'homme du métier reconnaîtra toutefois que la longueur des CPPs n'est pas nécessairement limitée à celles décrites ci-dessus. Des dérivés des CPPs décrits ici, ayant par exemple des longueurs différentes, peuvent notamment être créés par l'homme du métier au vu de ses connaissance générales. 20 À titre d'exemple non-limitatif, le CPP de l'invention peut être le CPP - M12 » tel que décrit par Gao X. et al., 2014, le CPP - CPP2 » ou - CPP3 » tel que décrit par Kannada et al. 2007, ou le CPP - CPP1 » tel que décrit par Lee et al., 2012, ainsi que tout variant ou dérivé de ceux-ci. Selon un mode préférentiel, ledit CPP comprend un motif polyhistidine (e.g. hexahistidine), préférentiellement lié audit CPP par un espaceur. 25 Avantageusement, l'espaceur est un espaceur hydrophile, avantageusement non structuré et non chargé, encore plus avantageusement constitué de glycines et de serines. Avantageusement, l'espaceur a une longueur d'environ 21 acides aminés, de préférence de 21 acides aminés. Avantageusement, les CPPs selon l'invention ont au moins 70 % d'identité, plus 30 avantageusement au moins 80 % d'identité, au moins 90 % d'identité, au moins 95 % d'identité, au moins 96 % d'identité, au moins 97 % d'identité, au moins 98 % d'identité, encore plus avantageusement au moins 99 % d'identité avec le peptide M12-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 75, le peptide CPP1-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 76, le peptide CPP2-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 77, ou le peptide CPP3-H6 ayant la 35 séquence de SEQ ID NO : 78. Selon un mode particulièrement préféré, le CPP selon 16 l'invention est choisi parmi : M12-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 75, CPP1-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 76, CPP2-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 77, et CPP3-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 78, encore plus préférentiellement choisi parmi : CPP1-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 76, CPP2-H6 ayant la séquence de 5 SEQ ID NO : 77, et CPP3-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 78. Avantageusement, le CPP est lié à la molécule d'ARNnn de façon non covalente ou covalente, de préférence non covalente. Avantageusement, le CPP est lié à un ARN aptannère compris dans la molécule d'ARNnn (i.e. l'aptannère A lorsque le CPP comprend une étiquette polyhistidine). 10 De préférence, les CPPs de la présente invention n'exercent pas d'effets cytotoxiques et / ou immunogènes significatifs sur leurs cellules cibles après avoir traversé la membrane plasmique, c'est-à-dire qu'ils n'interfèrent pas avec la viabilité cellulaire, transfection cellulaire et / ou pénétration. Par le terme - non significatif », tel qu'utilisé dans ce contexte, on entend que moins de 50 %, de préférence moins de 40 % ou 30 %, de 15 préférence moins de 20 % ou 10 % et en particulier moins de 5% des cellules cibles sont tués après que la molécule d'ARNnn liée au CPP a traversé la membrane plasmique, et a donc été internalisé par la cellule. L'homme du métier connaît bien les méthodes de détermination de la cytotoxicité d'un composé donné et / ou de la viabilité d'une cellule cible à laquelle un tel composé est appliqué (voir, par exemple, Ausubel et al., 20 2001). Des kits de dosage correspondants sont disponibles dans le commerce auprès de divers fournisseurs. Dans des modes de réalisation spécifiques, les effets cytotoxiques et / ou immunogènes intrinsèques potentiels d'un CPP de l'invention peuvent être - masqués » en introduisant une ou plusieurs modifications dans le peptide, par exemple au moyen de la synthèse chimique ou de l'ADN recombinant. De telles 25 modifications peuvent comprendre, par exemple, l'addition, l'élimination ou la substitution de groupes fonctionnels ou la variation des positions de ces groupes fonctionnels. L'homme du métier sait très bien comment un tel - masquage » peut être accompli pour un peptide donné. 30 Ainsi, selon un mode préféré, l'invention a pour objet une molécule d'ARNnn dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5' à 3' : - une région 5'-UTR comprenant au moins l'ARN aptannère A de SEQ ID NO: 64 et au moins un exemplaire d'une séquence consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112. 19)UGCNRYCUG (xrRNA) ; 35 - un exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; et 17 - une phase de lecture ouverte. selon laquelle ladite molécule d'ARNnn est liée à un peptide pénétrant les cellules (CPP) fusionné à une étiquette poly-histidine, ledit CPP étant choisi de préférence parmi : M12-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 75, CPP1-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 5 76, CPP2-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 77, et CPP3-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 78. De préférence, ledit CPP est lié de façon non covalente à l'aptannère. Par - phase de lecture ouverte » on entend toute séquence polynucléotidique qui peut être traduite en un polypeptide d'intérêt. Une phase de lecture ouverte est lue en blocs de trois nucléotides successifs, appelés codons, chaque codon représentant un acide 10 aminé. Lors de la traduction, le polypeptide est synthétisé par la traduction des codons de ladite phase de lecture ouverte par des ribosomes. Le premier acide aminé du polypeptide est généralement indiqué sur la molécule d'ARNnn par le codon AUG, lequel indique donc le début de la phase de lecture ouverte. D'autres codons de départ sont connus, tels que AUN, ou NUG, dans laquelle N 15 correspond à A, C, U ou G. La fin du polypeptide est indiquée sur la molécule d'ARNnn sous la forme d'un codon stop UAA, UGA ou UAG. Le codon stop indique la fin de la phase de lecture ouverte sur la molécule d'ARNnn. Les phases de lecture ouvertes selon l'invention sont plus particulièrement des phases de lecture ouvertes dont la traduction dans la cellule transfectée génère des produits 20 ayant un intérêt thérapeutique ou vaccinal pour des applications en médecine humaine ou vétérinaire. De préférence, les produits d'intérêt thérapeutique sont des protéines. Parmi les protéines d'intérêt thérapeutique, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc. (FR 92 03120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs 25 ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc., les apolipoprotéines : ApoAl, ApoAlV, ApoE, etc. (FR 93 05125), la dystrophine ou une nninidystrophine (FR 91 11947), les protéines suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, etc. (FR 93 04745), les facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, etc., les protéines pro- 30 apoptotiques : thymidine kinase, cytosine désanninase, etc. ; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc., voir par exemple WO 2011/089527), un ARN ligand (WO 91/19813), etc. 18 La protéine d'intérêt codée par l'ARNnn peut aussi être un antigène, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. Il peut s'agir notamment de protéines antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore 5 spécifiques de tumeurs (EP 259 212). Enfin, la protéine d'intérêt peut être une protéine adjuvante, qui stimule la réponse immunitaire, afin d'améliorer l'efficacité d'un vaccin. La protéine d'intérêt codée par l'ARNnn peut être une protéine qui a un effet favorable sur une molécule d'ARNnn dépourvu de coiffe ou la protéine exprimée par ladite molécule. Cet effet favorable pourrait résulter de différents mécanismes. À titre 10 d'exemple non-limitatif, une protéine codée par l'ARNnn dépourvu de coiffe peut augmenter la stabilité d'une molécule d'ARNnn dépourvu de coiffe en se liant à ladite molécule ou en dégradant au moins une protéine ayant une activité RNase. À titre d'exemple non-limitatif, une protéine codée par l'ARNnn dépourvu de coiffe peut augmenter la traduction de ladite molécule en favorisant le recrutement des facteurs 15 d'initiation ou en liant les ARNnn cellulaires coiffés afin d'inhiber leur traduction. À titre d'exemple non-limitatif, la protéine d'intérêt codée par l'ARNnn est la protéine 2Apro issue d'un picornavirus, tel que le rhinovirus humain de type 2 (HRV2). Sans être liée par la théorie, on peut penser que la protéine 2Apro augmente l'expression de l'ARNnn dépourvu de coiffe au vu de son activité protéase, clivant l'extrémité N-terminale du 20 facteur d'initiation elF4G et empêchant ainsi ledit facteur d'initiation de reconnaitre un ARNnn coiffé. Ce clivage pourrait permettre de réduire la compétition entre l'ARNnn de l'invention et les ARNnn coiffés in vivo. En effet, les inventeurs ont montré de façon surprenante que la co-transfection des cellules avec un premier ARNnn selon l'invention codant 2Apro et un deuxième ARNnn selon l'invention codant une protéine rapporteuse 25 permet d'augmenter l'expression de la protéine rapporteuse. La présence de la protéine 2Apro est donc particulièrement avantageuse car elle permet d'augmenter l'expression spécifique de la protéine codée par un ARNnn de l'invention dépourvu de coiffe (Figure 7). Selon un mode de réalisation préférentiel, l'ARNnn de l'invention code une protéine 30 2Apro, de préférence une protéine 2Apro issue d'un picornavirus, encore plus préférentiellement du virus HRV2. Selon un mode de réalisation particulier, la protéine 2Apro a la séquence de SEQ ID NO : 81 Selon un mode de réalisation particulier, la protéine 2Apro est codée par un ARNnn ayant la séquence de SEQ ID NO : 80. 19 La phase de lecture ouverte peut également coder un ARNnn thérapeutique. Celui-ci peut-être, par exemple, une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler la transcription ou la traduction d'ARNnn cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN 5 complémentaires d'ARNnn cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. De préférence, l'ARNnn de l'invention comprend, en outre la(les) séquence(s) xrRNA et la séquence IRES, une phase de lecture ouverte codant un polypeptide d'intérêt. De préférence, cette phase de lecture ouverte est située en aval de la(les) séquence(s) 10 xrRNA. L'homme du métier comprendra aisément que l'ARNnn peut comprendre plusieurs phases de lecture ouvertes. Ainsi, l'ARNnn peut être nnonocistronique, bicistronique ou polycistronique. L'ARNnn est nnonocistronique quand il ne comprend qu'une seule phase de lecture ouverte. Il est bicistronique quand il comprend deux phases de lecture ouvertes et polycistronique quand il comprend au moins deux phases 15 de lecture ouvertes. L'ARNnn de l'invention peut également comprendre une ou plusieurs régions non codantes. Ces régions non codantes peuvent notamment être des régions entre deux phases de lecture ouvertes. Dans ce cas, des séquences IRES sont avantageusement dans ces régions non codantes situées entre deux phases de lecture ouvertes. 20 Selon un mode de réalisation particulier, la molécule d'acide ribonucléique messager (ARNnn) dépourvue de molécule de coiffe ou d'analogue de coiffe comprend de 5' à 3' : - une région 5' -UTR comprenant au moins un exemplaire d'une séquence consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112.19)UGCNRYCUG (xrRNA), le ou lesdites exemplaires de ladite séquence étant suivis par un seul exemplaire d'une 25 séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; - une phase de lecture ouverte ; et - une région 3'-UTR comprenant une séquence poly(A). Avantageusement ladite molécule d'ARNnn comprend également au moins un ARN aptannère favorisant la pénétration de ladite molécule dans des cellules cibles, de 30 préférence des cellules musculaires. Avantageusement, ladite molécule d'ARNnn comprend au moins un aptannère choisi parmi l'aptannère A ayant la séquence de SEQ ID NO : 64, l'aptannère B ayant la séquence de SEQ ID NO : 65, et l'aptannère C ayant la séquence de SEQ ID NO : 66. 20 Selon un autre mode de réalisation particulier, la molécule d'acide ribonucléique messager (ARNnn) dépourvue de molécule de coiffe ou d'analogue de coiffe consiste en de 5' à 3' : - une région 5'-UTR comprenant au moins un exemplaire d'une séquence 5 consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112.19)UGCNRYCUG (xrRNA), le ou lesdites exemplaires de ladite séquence étant suivis par un seul exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; - une phase de lecture ouverte ; et - une région 3'-UTR comprenant une séquence poly(A). 10 Par - région 5'-UTR » on entend toute région d'acide nucléique qui se trouve en amont du codon d'initiation de la traduction. Cette région n'est pas codante mais peut comprendre des éléments régulant l'expression de l'ARNnn en aval. Outre les éléments xrRNA et IRES, cette région peut comprendre d'autres éléments tels que les - riboswitch » et/ou - T-box ». Dans certains modes de réalisation, la région 5'-UTR 15 peut être de 10 à 2000 nucléotides en longueur. De préférence elle est comprise entre 50 et 1500 nucléotides, et plus préférentiellement de 200 à 1000 nucléotides. Par - région 3'-UTR » on entend toute région d'acide nucléique qui se trouve en aval du codon de terminaison de la traduction. Cette région peut influencer l'expression et/ou la stabilité de l'ARNnn, sa localisation dans une cellule, ou contenir des sites de fixation 20 pour des protéines ou des petits ARN interférents ou les micro-ARN. Cette région peut comprendre, par exemple, des éléments tels qu'une queue polyadénylée (poly(A)), une structure tige-boucle d'histone, et/ou une région riche in pyrimidines ou purines. Il peut contenir des séquences codantes ou non codantes. Dans certains modes de réalisation, la région 3'-UTR peut être de 50 à 500 nucléotides en longueur. De 25 préférence elle est comprise entre 50 et 200 nucléotides, et plus préférentiellement de 50 à 100 nucléotides. Dans un mode de réalisation préféré, l'ARNnn comprend une queue polyadénylée (poly(A)), comprenant une séquence de nucléotides d'adénine ou d'un analogue ou variant de ceux-ci, de 10 à 300 nucléotides, et de préférence entre 50 et 100 nucléotides. 30 Selon un deuxième aspect, l'invention a pour objet une molécule d'acide désoxyribonucléique (ADN) comprenant un polynucléotide pouvant être transcrite en molécule d'ARNnn de l'invention. De préférence, la molécule d'ADN comprend la région 5'-UTR de SEQ ID NO : 50, 71, 72, 73, 85, ou 86. 21 De préférence, ladite molécule d'ADN est comprise en une cassette d'expression. Par - cassette d'expression », on entend ici un fragment d'ADN comprenant un polynucléotide d'intérêt, par exemple un polynucléotide pouvant être transcrit dans la molécule d'ARNnn de l'invention, lié de façon fonctionnelle à un ou plusieurs éléments 5 régulateurs contrôlant l'expression des séquences géniques, comme, par exemple, les séquences promotrices et les séquences - enhancers ». Un polynucléotide est - lié de façon fonctionnelle » à des éléments régulateurs quand ces différentes séquences d'acides nucléiques sont associées sur un seul fragment d'acide nucléique de telle façon que la fonction de l'une est affectée par les autres. 10 Par exemple, une séquence d'ADN régulatrice est - liée de façon fonctionnelle » à une séquence d'ADN codant un ARN ou une protéine si les deux séquences sont situées de telle façon que la séquence d'ADN régulatrice affecte l'expression de la séquence codante d'ADN (autrement dit, que la séquence codante d'ADN soit sous le contrôle transcriptionnel du promoteur). Les séquences codantes peuvent être liées de façon 15 fonctionnelle à des séquences régulatrices aussi bien dans une orientation sens que dans une orientation antisens. Préférablement, les séquences codantes de l'invention sont liées de façon fonctionnelle aux séquences régulatrices dans l'orientation sens. Par - séquences régulatrices » ou - éléments régulateurs », on entend ici des séquences polynucléotidiques qui sont nécessaires pour affecter l'expression et la maturation des 20 séquences codantes auxquelles elles sont ligaturées. De telles séquences régulatrices comprennent notamment les séquences d'initiation et de terminaison de la transcription, les séquences promotrices et les séquences - enhancer » ; les signaux de maturation efficace des ARN, comme les signaux d'épissage et de polyadénylation ; les séquences stabilisant les ARNnn cytoplasmiques ; les séquences améliorant l'efficacité 25 de la traduction (par exemple, les séquences de Kozak) ; les séquences qui augmentent la stabilité des protéines ; et, si nécessaire, des séquences qui augmentent la sécrétion des protéines. De préférence, les séquences régulatrices de l'invention comprennent des séquences promotrices, c'est-à-dire que le gène codant l'ARNnn de l'invention est de préférence 30 lié de façon fonctionnelle à un promoteur qui permet l'expression dudit ARNnn correspondant. Un gène codant l'ARNnn de l'invention est de préférence lié de façon fonctionnelle à un promoteur quand il est situé en aval de ce dernier, c'est-à-dire en 3' de celui-ci, formant ainsi une cassette d'expression. 22 On entend ici par - promoteur » une séquence nucléotidique, le plus souvent située en amont (5') de la séquence codante, qui est reconnue par l'ARN polyrnérase et les autres facteurs nécessaires pour la transcription, et ainsi contrôle l'expression de ladite séquence codante. Un - promoteur » tel qu'on l'entend ici comprend en particulier les 5 promoteurs minimaux, c'est-à-dire de courtes séquences d'ADN composées d'une boite TATA et d'autres séquences qui permettent de spécifier le site de démarrage de la transcription. Un - promoteur » au sens de l'invention comprend aussi des séquences nucléotidiques incluant un promoteur minimal et des éléments régulateurs capables de contrôler l'expression d'une séquence codante. Par exemple, les séquences promotrices 10 de l'invention peuvent contenir des séquences régulatrices comme des séquences - enhancer » pouvant influencer le niveau d'expression d'un gène. Avantageusement, les promoteurs selon l'invention sont ceux qui fonctionnent avec une ARN polyrnérase utilisée dans un système acellulaire de transcription. Par exemple, des promoteurs reconnus par les ARN polyrnérases des phages SP6 et T7 sont largement 15 connus de l'homme du métier. Ainsi les vecteurs pMBx-luc2 qui portent des promoteurs reconnus par l'ARN polyrnérase T7 (Rogé et Betton, 2005) ont été utilisés dans la partie expérimentale ci-après. Des vecteurs contenant de tels promoteurs sont par ailleurs disponibles commercialement. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention comprend une molécule d'ADN 20 codant l'ARNrn de l'invention qui est liée de façon fonctionnelle à au moins un élément régulateur. De préférence, la molécule d'ADN codant l'ARNrn de l'invention est liée de façon fonctionnelle à une séquence promotrice, située en amont, formant ainsi une cassette d'expression. Dans un autre mode de réalisation l'invention consiste en une molécule d'ADN codant l'ARNrn de l'invention qui est liée de façon fonctionnelle à une 25 séquence promotrice, située en amont, formant ainsi une cassette d'expression. De façon encore plus préférentielle, la molécule d'ADN de l'invention comprend : - un promoteur reconnu par l'ARN polyrnérase 17, ledit promoteur comprenant une séquence représentée par SEQ ID NO : 46; - une région 5'-UTR comprenant une séquence représentée par SEQ ID NO: 50, 71, 30 72, 73, 85, ou 86; - une phase de lecture ouverte ; et - une région 3'-UTR comprenant une séquence choisie parmi les séquences représentées par SEQ ID NOs : 53, 54, 55, et 56. 23 Avantageusement, les séquences régulatrices de l'invention comprennent des séquences ternninatrices de la transcription, c'est-à-dire que le gène codant l'ARNnn de l'invention est de préférence lié de façon fonctionnelle à un ternninateur de transcription. Le terme 5 « terminateur de transcription » désigne ici une séquence du génome qui marque la fin de la transcription d'un gène ou d'un opéron, en ARN messager. Le mécanisme de terminaison de la transcription est différent chez les procaryotes et chez les eucaryotes. L'homme du métier connait les signaux à utiliser en fonction des différents types cellulaires. Par exemple, s'il souhaite exprimer l'ARNnn de l'invention dans une 10 bactérie, il utilisera un ternninateur Rho-indépendant (séquence répétée inversée suivie d'une série de T (uraciles sur l'ARN transcrit) ou un ternninateur Rho-dépendant (constitués d'une séquence consensus reconnue par la protéine Rho). Un gène codant l'ARNnn de l'invention est de préférence lié de façon fonctionnelle à un ternninateur quand il est situé en amont de ce dernier, c'est-à-dire en 5' de celui-ci, formant ainsi 15 une cassette d'expression. Avantageusement, les ternninateurs selon l'invention sont ceux qui fonctionnent avec une ARN polynnérase utilisée dans un système acellulaire de transcription. Par exemple, des ternninateurs reconnus par les ARN polynnérases des phages SP6 et 17 sont largement connus de l'homme du métier. Des vecteurs contenant de tels ternninateurs 20 sont disponibles commercialement. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention comprend une molécule d'ADN codant l'ARNnn de l'invention qui est liée de façon fonctionnelle à au moins un élément régulateur et au moins un ternninateur de transcription. Dans un troisième aspect, l'invention vise également un vecteur comprenant au moins 25 la molécule d'ADN ou d'ARNnn selon l'invention. Le terme - vecteur », tel qu'utilisé ici, désigne une molécule d'acide nucléique capable de transporter un autre acide nucléique auquel elle a été liée. Un type de vecteur est un - plasmide », qui se réfère à une double boucle circulaire d'ADN simple brin dans laquelle des segments d'ADN supplémentaires peuvent être ligaturés. Un autre type de 30 vecteur est un vecteur viral, dans lequel des segments d'ADN supplémentaires peuvent être ligaturés dans le génome viral. À titre alternatif, le vecteur viral peut comprendre l'ARNnn dans un génome viral (comme par exemple les rétrovirus ou les virus à ARN). Certains vecteurs sont capables de réplication autonome dans une cellule hôte dans laquelle ils sont introduits (par exemple, des vecteurs bactériens ayant une origine 24 bactérienne de réplication et des vecteurs mammaliens épisonniques). D'autres vecteurs (comme par exemple des vecteurs de mammifères intégratifs) peuvent être intégrés dans le génome d'une cellule hôte lors de l'introduction dans la cellule hôte, et ainsi sont répliqués avec le génome de l'hôte. 5 De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus de l'homme du métier. Le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extra- 10 chromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte (par exemple, les plasmides sont de préférence introduits dans des cellules bactériennes, tandis que les YACs sont de préférence utilisés dans des levures). Ces vecteurs d'expression peuvent être des plasmides, des YACs, des cosnnides, des rétrovirus, des épisomes dérivés d'EBV, et tous les vecteurs que l'homme 15 du métier peut juger appropriés à l'expression desdites chaînes. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le vecteur utilisé pour coder l'ARNnn de l'invention est un vecteur pouvant être propagé chez la bactérie. De façon plus préférée, ce plasmide comprend un promoteur reconnu par une ARN polynnérase utilisée dans un système acellulaire de transcription, telle que celles des phages SP6 et T7. De façon 20 encore plus préférée, ce promoteur porté par ce plasmide est capable de diriger l'expression de l'ARNnn de l'invention en présence d'au moins ladite ARN polynnérase. De façon préférée, le vecteur de l'invention comprend une origine de réplication pour permettre la multiplication dudit vecteur dans la cellule hôte. Le terme - origine de réplication » (aussi appelée oh) est une séquence unique d'ADN permettant l'initiation 25 de la réplication. C'est à partir de cette séquence que débute une réplication unidirectionnelle ou bidirectionnelle. L'homme du métier sait que la structure de l'origine de réplication varie d'une espèce à l'autre ; elle est donc spécifique bien qu'elles aient toutes certaines caractéristiques. Un complexe protéique se forme au niveau de cette séquence et permet l'ouverture de l'ADN et le démarrage de la 30 réplication. Avantageusement, le vecteur contenant la cassette d'expression de l'invention comprend en outre un marqueur de sélection, afin de faciliter l'identification des cellules contenant ledit vecteur, notamment après transformation. Un - marqueur de sélection » selon l'invention est une séquence polynucléotidique portée par un vecteur, 25 qui permet l'identification et la sélection des cellules possédant ledit vecteur. Les marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme du métier. De manière préférée, il s'agit d'un gène codant une protéine conférant une résistance à un antibiotique. Les vecteurs de l'invention, comprenant le ou les acide(s) nucléique(s) d'intérêt de 5 l'invention, sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier. Les clones résultants peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards connues de l'homme du métier pour introduire des polynucléotides dans une cellule hôte. De telles méthodes peuvent être la transformation à l'aide de dextrane, la précipitation par du phosphate de calcium, la transfection à l'aide de 10 polybrène, la fusion de protoplastes, l'électroporation, l'encapsulation des polynucléotides dans des liposomes, l'injection biolistique et la micro-injection directe d'ADN dans le noyau. On peut également associer ladite séquence d'ADN ou d'ARNnn (isolée ou insérée dans un vecteur plasnnidique ou viral) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme 15 un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l'électroporation associée à des liposomes. Selon un mode préférentiel de l'invention, le vecteur de l'invention comprend une molécule d'ADN codant l'ARNnn de l'invention. De préférence, le vecteur de l'invention 20 est un plasmide. De façon encore plus préférentielle, le vecteur de l'invention comprend une cassette d'expression, un ternninateur de transcription, une origine de réplication, et un marqueur de sélection. Dans un autre mode préférentiel, le vecteur consiste en une cassette d'expression. Selon un autre mode préférentiel de l'invention, le vecteur comprend une molécule 25 d'ARNnn de l'invention. De préférence, le vecteur de l'invention est un virus ou un vecteur d'ARN synthétique. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une cellule hôte comprenant ledit vecteur. Le terme - cellule hôte », tel qu'utilisé ici, est destiné à se référer à une cellule dans laquelle un vecteur d'expression recombinant a été introduit afin 30 d'exprimer l'ARNnn de l'invention. Ce terme doit être compris comme englobant non seulement ladite cellule hôte particulière mais aussi la descendance de celle-ci. Il est bien entendu que certaines modifications peuvent se produire au cours des générations à cause de mutations ou d'influences environnementales. La descendance peut, de ce 26 fait, ne pas être exactement identique à la cellule mère, mais est néanmoins aussi incluse dans le terme - cellule hôte », tel qu'utilisé ici. L'ADN et/ou les vecteurs décrits plus haut sont particulièrement intéressants pour produire de grandes quantités de l'ARNnn de l'invention. 5 Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode de production de l'ARNnn de l'invention à l'aide de l'ADN ou du vecteur décrit plus haut. L'ARNnn peut ainsi être produit par toute méthode connue de l'homme du métier. Cela peut être fait, par exemple, par une synthèse chimique, par expression in vivo ou par expression in vitro. De façon préférée, l'ARNnn est exprimé in vitro, à l'aide d'un système acellulaire 10 d'expression d'ARNnn. Par - système acellulaire d'expression d'ARNm », on entend au sens de l'invention un système biochimique permettant la synthèse de l'ARNnn de l'invention en l'absence d'une cellule. Le système acellulaire a comme principe de base l'utilisation de la machinerie transcriptionnelle d'un organisme afin de produire à partir d'une information génétique exogène un ARNnn spécifique. Le système acellulaire 15 d'expression de l'ARNnn au sens de l'invention contient donc tous les éléments nécessaires pour la production d'ARNnn en l'absence d'une cellule. Les organismes à partir desquels cette machinerie est extraite sont multiples et variés, et proviennent d'organismes procaryotes et eucaryotes. En particulier, ce système comprend, entre autres, la machinerie transcriptionnelle 20 provenant de la cellule. Plus particulièrement, ce système comprend une ARN polynnérase capable de reconnaitre le promoteur de la cassette d'expression décrite plus haut. En présence des nucléotides appropriés et dans les conditions ioniques adéquates, cette ARN polynnérase est ainsi capable de diriger la transcription du gène codant l'ARNnn de l'invention. De tels systèmes sont bien connus de l'homme du métier 25 depuis plusieurs dizaines d'années (pour une revue, voir par exemple : Beckert et Masquida, 2011). De nombreuses méthodes sont disponibles pour transcrire des ADN en ARN dans des systèmes acellulaires. Il est aussi possible d'utiliser des kits proposés par de nombreuses sociétés : New England Biolabs, Sigma Aldrich, Thernno Scientific, Pronnega, Roche Diagnostics, Annbion, Invitrogen, etc. 30 Outre l'ARN polynnérase, le système acellulaire de transcription in vitro comprend un tampon de réaction. Avantageusement, ledit système comprend chacun des quatre ribonucléotides triphosphates. Très avantageusement, ces quatre ribonucléotides triphosphates sont présents à des concentrations identiques. Notamment, la 27 concentration du GTP est identique à celle des trois autres ribonucléotides triphosphates. Le rendement de la transcription in vitro de l'ARNnn de l'invention est ainsi beaucoup plus élevé que celui d'un ARNnn doté d'une coiffe issue d'une réaction in vitro, ce qui diminue fortement le coût de la synthèse de l'ARNnn. 5 De préférence, la méthode de production comprend une étape de purification dudit ARNnn. Dans un mode de réalisation préféré, de l'ADN plasnnidique, comprenant un promoteur reconnu par une ARN polynnérase phagique et suivie par une séquence ADN codant l'ARNnn d'intérêt, est mise en contact avec une ARN polynnérase de phage dans un 10 système acellulaire de transcription in vitro. L'ARNnn synthétisé par ladite méthode peut ensuite être purifié. De préférence, ledit ADN plasnnidique est linéarisé avant d'être mis en contact avec l'ARN polynnérase dans le système acellulaire de transcription in vitro. De façon plus préférentielle, ledit ADN est linéarisé par digestion enzymatique en aval de la région 3'-UTR. De façon encore plus préférentielle, ledit 15 ADN est linéarisé par digestion enzymatique par Sspl ou Eco53k1. De préférence, l'ARN polynnérase est l'ARN polynnérase du bactériophage T7. La molécule d'ARNnn est capable de diriger la production d'un polypeptide d'intérêt dans un organisme eucaryote dans lequel elle est introduite. De ce fait, elle est particulièrement appropriée pour la thérapie génique ou la vaccination génique. La 20 molécule d'ARNnn de la présente invention peut ainsi être utilisée en tant que médicament ou en tant que vaccin. Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet une composition pharmaceutique ou une composition vaccinale. Plus particulièrement, la présente invention vise donc une composition pharmaceutique 25 ou vaccinale comprenant l'ARNnn de l'invention. Les ARNnn compris dans la composition transfectent les cellules, qui peuvent les traduire ensuite en protéines. De préférence, ces protéines ont une activité prophylactique ou une activité thérapeutique. En effet, les inventeurs ont démontré de façon surprenante que l'ARNnn selon l'invention est plus performant qu'un ARNnn classique doté d'une coiffe lors de la 30 transfection de tissus. En effet, les inventeurs ont démontré de façon très surprenante que les niveaux et durées d'expression obtenus après transfection in vivo sont au moins aussi élevés que ceux d'un ARNnn doté d'une coiffe. En particulier, l'expression de 28 l'ARNnn de l'invention in vivo, dans le derme ou le muscle d'une souris, est supérieure à celle d'un ARNnn coiffé témoin (Figure 5, Figure 15). De plus, les inventeurs ont démontré de façon très surprenante que l'ARNnn selon l'invention persiste dans des cellules à long terme (i.e. plus de 7 semaines). Enfin, les inventeurs ont démontré de 5 façon surprenante que la co-transfection des cellules avec un premier ARNnn selon l'invention codant la protéine 2Apro et un deuxième ARNnn selon l'invention codant une deuxième protéine permet d'augmenter la traduction de cette deuxième protéine. Ainsi, selon un autre objet de l'invention, la composition pharmaceutique comprend la protéine 2Apro ou un ARNnn codant ladite protéine. De préférence, la protéine 2Apro a 10 la séquence de SEQ ID NO : 81. De préférence, l'ARNnn codant ladite protéine a la séquence de SEQ ID NO : 80. Selon un mode particulier de l'invention, la composition pharmaceutique comprend au moins deux molécules différentes d'acide ribonucléique messager (ARNnn) dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5' à 3' : - une région 5'-UTR comprenant au moins un exemplaire d'une séquence 15 consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112-19)UGCNRYCUG (xrRNA) ; - un exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; et - une phase de lecture ouverte, selon laquelle au moins une des molécules d'ARNnn comprend une phase de lecture ouverte codant la protéine 2Apro. 20 De préférence, ladite composition pharmaceutique comprend une première molécule d'ARNnn, ladite première molécule d'ARNnn comprenant une phrase de lecture codant la protéine 2Apro, et au moins une deuxième molécule d'ARNnn, ladite deuxième molécule d'ARNnn comprenant une phase de lecture ouverte codant une deuxième protéine d'intérêt. De façon plus préférée, ladite deuxième protéine d'intérêt n'est pas la 25 protéine 2Apro. De façon encore plus préférée, ladite deuxième molécule d'intérêt est un antigène ou une protéine thérapeutique tels que définis plus haut. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le rapport molaire entre le premier ARNnn et le deuxième ARNnn est compris entre 540/1 et 240/1, préférentiellement entre 540/1 et 315/1, encore plus préférentiellement de 465/1. 30 De préférence, ladite composition sera additionnée d'un excipient et/ou d'un véhicule pharnnaceutiquennent acceptable. Dans la présente description, on entend désigner par véhicule pharnnaceutiquennent acceptable, un composé ou une combinaison de composés entrant dans une composition pharmaceutique ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de l'administration du ou des 29 composés actifs, l'augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l'organisme, l'augmentation de sa solubilité en solution ou encore l'amélioration de sa conservation. Ces véhicules pharnnaceutiquennent acceptables sont bien connus et seront adaptés par l'homme de l'art en fonction de la nature et du mode 5 d'administration du ou des composés actifs choisis. Dans la présente description, on entend désigner par - excipient pharmaceutiquement acceptable », un composé ou une combinaison de composés entrant dans une composition pharmaceutique ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de l'administration du ou des composés actifs, l'augmentation de sa durée de vie et/ou de 10 son efficacité dans l'organisme, l'augmentation de sa solubilité en solution ou encore l'amélioration de sa conservation. Ledit excipient peut notamment être ajouté à la composition juste avant administration, par exemple si l'ARN est conservé sous la forme d'un lyophilisat. Les excipients/véhicules pharnnaceutiquennent acceptables sont bien connus et seront adaptés par l'homme de l'art en fonction de la nature et du mode 15 d'administration du ou des composés actifs choisis. Divers excipients sont notamment décrits dans The Science and Practice of Pharnnacy de Remington, 22nd éd., Pharnnaceutical Press, London, UK (2013). À titre d'exemple, la composition pharnnaceutiquennent acceptable comprend l'eau stérile et/ou la chloroquine en tant qu'excipient. L'excipient - chloroquine » comprend également tout variant ou analogue 20 de celle-ci, telle que la prinnaquine. En effet, les inventeurs ont démontré de façon surprenante que, dans certaines conditions, la co-injection de la chloroquine avec de l'ARNnn permet d'améliorer l'efficacité de la transfection. En particulier, l'efficacité de la transfection par un ARNnn complexé à un peptide de type - CPP » est améliorée (cf. Figure 10). 25 Selon un mode préféré, la composition pharmaceutique comprend en outre de la chloroquine. À titre d'exemple non-limitatif, la composition pharmaceutique comprend un ratio en poids compris entre 1 / 0,5 à 1 / 4 d'ARNnn / chloroquine, et plus particulièrement un ratio en poids de 1 / 1 d'ARNnn / chloroquine. À titre d'exemple non-limitatif, la composition pharmaceutique comprend en outre 5 pg d'ARN / 2,5 à 20 30 pg de chloroquine. Selon un mode préféré, la composition pharmaceutique comprend en outre au moins un CPP tel que décrit ici, liée de façon non covalente à la molécule d'ARNnn selon l'invention. Avantageusement, le CPP est sélectionné pour favoriser la pénétration de 30 l'ARNnn dans les cellules cibles (e.g. selon le type d'organe ou lignée cellulaire, par exemple des cellules musculaires, ou dermiques). De préférence, ces compositions seront administrées par voie intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou sous-cutanée, par voie respiratoire, ou par voie 5 topique. Ces compositions sont préférentiellement destinées à être injectées dans des tissus de mammifères, encore plus préférentiellement chez l'homme. Ces compositions sont préférentiellement destinées à être injectées par voie intramusculaire, intraveineuse, intradermique, intrapéritonéale ou sous-cutanée, selon les méthodes connues par l'homme de métier. La composition pharmaceutique de l'invention peut 10 être administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps. Son mode d'administration, sa posologie et sa forme galénique optimale peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires 15 constatés. Les formes adnninistrables par voie parentérale incluent les suspensions aqueuses, les solutions salines isotoniques ou les solutions stériles et injectables qui peuvent contenir des agents de dispersion et/ou des mouillants pharnnacologiquennent compatibles. Les formes adnninistrables par voie respiratoire incluent les aérosols. Les formes 20 adnninistrables par voie topique incluent les patchs, les gels, les crèmes, les pommades, les lotions, les sprays, les collyres. Des procédés pour préparer des composés adnninistrables par voie parentérale seront connus ou évidents pour l'homme du métier et sont décrits plus en détail dans, par exemple, Pharnnaceutical Sciences de Remington, 17e éd., Mack Publishing Company, 25 Easton, Pa. (1985), et le 18e et 19e éditions de ceux-ci. L'utilisation de milieux et d'agents pour des substances pharnnaceutiquennent actives est bien connue dans la technique. Pour générer une composition pharnnaceutiquennent acceptable appropriée pour administration, ladite composition comprendra une quantité suffisante de molécules d'ARNnn pour être thérapeutiquennent efficace. 30 La dose efficace d'un composé de l'invention varie en fonction de nombreux paramètres tels que, par exemple, la voie d'administration choisie, le poids, l'âge, le sexe, l'état d'avancement de la pathologie à traiter et la sensibilité de l'individu à traiter. 31 Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet ladite composition pour son utilisation dans la thérapie génique. La composition de la présente invention peut être utilisée dans le traitement ou la modulation d'une variété de maladies, à titre d'exemple : le cancer, les maladies génétiques (telles que l'hémophilie, la thalassénnie, 5 la déficience en adénosine-désanninase, la déficience en alpha-1 antitrypsine), le diabète, des troubles cérébraux tels que l'Alzheimer et la maladie de Parkinson, les allergies, les maladies auto-immunes, et les maladies cardiovasculaires. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet ladite composition pour son utilisation dans la vaccination génétique. À titre d'exemple, la composition de la présente 10 invention peut être utilisée dans la vaccination contre le cancer et la grippe, ainsi que d'autres pathogènes viraux et bactériens. La vaccination peut concerner l'homme ainsi que les animaux de compagnie et d'élevage. Les inventeurs ont notamment montré que l'ARNnn de la présente invention est stable in vivo. En effet, l'ARNnn de l'invention induit la synthèse d'une quantité de protéine in 15 vivo au moins aussi élevée que celle d'un ARNnn coiffé, indiquant que sa résistance à Xrn1 est au moins aussi efficace que celle d'un ARNnn coiffé. De plus, les inventeurs ont notamment montré que l'ARNnn de la présente invention persiste dans des cellules à long terme. Une telle molécule d'ARNnn est également très avantageuse car son coût de production est largement inférieur à celui des molécules d'ARNnn coiffés. Enfin, les 20 inventeurs ont montré que l'ARNnn comprenant un ARN aptannère pénétrant directement dans les cellules (e.g. ARN aptannère C) ou via un peptide CPP (e.g. ARN aptannère A), transfecte les cellules plus efficacement, ce qui permet, de façon avantageuse, d'améliorer la production d'une ou de plusieurs protéines d'intérêt. L'invention sera décrite plus précisément au moyen des exemples ci-dessous. 25 LEGENDES DES FIGURES Figure 1 : Schéma des ARN messagers. (A) L'ARNnn MB5-luc2 coiffé correspond à un ARN messager traditionnel codant la luciférase, doté d'un analogue de coiffe à son extrémité 5' et une région 3'-UTR comprenant une queue poly(A). (B) L'ARNnn MB5-luc2 est identique à (A), excepté qu'il 30 est dépourvu d'analogue de coiffe. (C) L'ARNnn MB7-luc2 est dépourvu de coiffe et doté à son extrémité 5' d'une tige-boucle et de la séquence interne d'entrée de ribosome (IRES) du virus EMCV. (D) L'ARNnn MB8-luc2 est dépourvu de coiffe et doté à la fois d'une tige-boucle, de deux séquences résistantes à Xrn1 (xrRNA1 et xrRNA2) provenant 32 du virus du Nil occidental (WNV) et de l'IRES du virus EMCV dans la région 5'UTR. (E) L'ARNnn MB9-luc2 est similaire à (D), excepté que le 3'UTR et le poly(A) de ce dernier ont été remplacés par le 3'UTR du virus Kunjin (KUN). (F) L'ARNnn MB11-luc2 sans coiffe est similaire à (D), excepté que l'aptannère A a été ajouté en 5', en amont des deux 5 séquences résistantes à Xrn1 (xrRNA1 et xrRNA2) provenant du virus du Nil occidental (WNV) et de l'IRES du virus EMCV et qu'il n'a pas de tige-boucle. Les ARNnn MB13-luc2 (G) et MB14-luc2 (H) ont cette même configuration, mais comprennent une tige boucle en 5' suivi par les ARN aptannères B et C, respectivement. (I) L'ARNnn MB15-luc2 coiffé est similaire à (A), excepté que l'aptannère A a été ajouté en 5' après la coiffe. (J) 10 L'ARNnn MB17-luc2 est similaire à (D), excepté que l'aptannère A a été ajouté en 5' entre la tige boucle et les séquences xrRNA. (K) L'ARNnn MB18-luc2 est similaire à (J), excepté que l'aptannère A est placé dans la région 5' en aval des séquences xrRNA et en amont de la séquence IRES. Figure 2 : Cinétique d'expression luciférase sur quatre jours dans des cellules Caco- 15 2. Des cellules Caco-2 confluentes ont été transfectées avec les ARNnn MB5-luc2 coiffé (losange) et dépourvu de coiffe (cercle), ainsi que les ARNnn MB7-luc2 (triangle) et MB8luc2 (carré). La cinétique d'expression a été suivie pendant quatre jours. Figure 3 : Cinétique d'expression luciférase sur dix jours dans des cellules Caco-2. 20 Des cellules Caco-2 confluentes ont été transfectées avec les ARNnn MB5-luc2 coiffé (losange), MB8-luc2 (carré) et MB9-luc2 (triangle). La cinétique d'expression a été suivie pendant dix jours. Figure 4 : Cinétique d'expression luciférase à long terme dans des cellules souche mésenchymateuses humaines. 25 Des cellules souches nnésenchynnateuses ont été transfectées avec 2 pg d'ARNnn MB8- luc2 complexé au peptide pepMB1 à un ratio de charge positive du peptide pepMB1 / charge négative de l'ARNnn d'environ 2,2 / 1 par puits dans des plaques de 48 puits pendant 1 heure. L'activité luciférase a ensuite été suivie pendant environ 48 jours. Figure 5 : Transfection du muscle et du derme de souris. 30 Le muscle et le derme de souris BALB/cByJ mâles ont été transfectés respectivement avec 10 pg et 5 pg de l'ARNnn MB8-luc2 dépourvu de coiffe ou de l'ARNnn MB5-luc2 33 coiffé. L'activité luciférase a été mesurée dans le muscle et dans la peau, 16 heures et 18 heures après les injections, respectivement. Figure 6: Étude de toxicologie de l'ARNm MB8-2Apro. Des cellules C2C12 ont été transfectées avec l'ARNm MB8-luc2 seul ou l'ARNm MB8-luc2 5 mélangé à l'ARNm MB8-2Apro à un ratio de 465/1 ou 9/1, afin d'évaluer l'effet cytotoxique de l'expression de la protéine 2Apro. La cytotoxicité a été déterminée par mesure de la lactate déshydrogénase (LDH) libérée dans le milieu extracellulaire. L'activité LDH est déterminée par mesure de l'absorbance à 490 nnn. Témoin négatif : Cellules non transfectées ou transfectées avec l'ARNm MB8-luc2 seul sans lyse. Témoin 10 positif : Cellules non transfectées lysées avec du Triton X-100. Figure 7: Effet de la protéine 2Apro sur l'expression luciférase en fonction du ratio molaire ARNm MB8-luc2 / ARNm MB8-2Apro. Des cellules C2C12 ont été transfectées avec l'ARNm MB8-luc2 en présence d'une quantité croissante d'ARNnn MB8-2Apro. Le ratio molaire ARNm MB8-luc2 / ARNm MB8- 15 2Apro est de 540/1 à 240/1. La quantité totale d'ARNnn transfecté était de 750 ng par puits. L'activité luciférase a été mesurée 18 heures après la transfection. Figure 8: Cinétique d'expression luciférase sur sept jours en présence ou non de l'ARNm MB8-2Apro. Des cellules C2C12 confluentes ont été transfectées avec les ARNm MB8-luc2 seul (ligne 20 noir) ou en combinaison avec l'ARNm MB8-2Apro (ligne gris pointillé). Le ratio molaire ARNm MB8-luc2 / ARNm MB8-2Apro est de 465/1. La cinétique d'expression, mesurée par le niveau d'activité luciférase, a été suivie pendant sept jours. Figure 9 : Effet de la protéine 2Apro sur l'expression luciférase de différents ARN messagers. 25 L'effet de la protéine 2Apro sur l'expression luciférase à partir de différents ARN messagers a été évalué. Dans chaque cas, l'ARNm codant la luciférase a été transfecté seul (-) ou co-transfecté avec un deuxième ARNm codant la protéine 2Apro (+) et ayant les mêmes caractéristiques au ratio molaire optimal de 465 / 1. (1) ARNm MB8-luc2 seul ; (2) co-transfection de l'ARNm MB8-luc2 avec l'ARNm MB8-2Apro ; (3) ARNm MB5- 30 luc2 coiffé seul ; (4) co-transfection de l'ARNm MB5-luc2 coiffé avec l'ARNm MB8- 2Apro non coiffé ; (5) ARNm MB5-luc2 dépourvu d'analogue de coiffe seul ; (6) co- 34 transfection de l'ARNm MB5-luc2 dépourvu d'analogue de coiffe avec l'ARNm MB8- 2Apro dépourvu d'analogue de coiffe ; (7) ARNm MB7-luc2 seul ; (8) co-transfection de l'ARNm MB7-luc2 avec l'ARNm MB8-2Apro. L'activité luciférase a été mesurée 18 heures après la transfection. 5 Figure 10: Effet de différents aptamères sur l'efficacité de la transfection dans le muscle d'une molécule d'ARNm dépourvue de coiffe. Le muscle de souris BALB/cByJ mâles a été transfecté avec : 5 pg d'ARNnn MB8-luc2, d'ARNnn MB13-luc2, d'ARNnn MB14-luc2, d'ARNnn MB11-luc2 complexé au peptide M12-H6, ou d'ARNnn MB11-luc2 complexé au peptide M12-H6 en présence de 5 pg de 10 chloroquine. L'activité luciférase a été mesurée 16 heures après les injections. Figure 11: Efficacité de la transfection dans le derme de l'ARNm selon le ratio molaire du peptide CPP3-H6 / ARNm MB11-luc2. Le derme de souris OF1 mâles a été transfecté avec 5,6 pg de l'ARNm MB11-luc2 complexé au peptide CPP3-H6 à des ratios molaires croissants (ratios molaires compris 15 entre 1/8 et 1,125/1 de CPP3-H6 / ARNm MB11-luc2). L'activité luciférase a été mesurée 18 heures après les injections. Le ratio molaire permettant une transfection optimale a été de 1 CPP3-H6 / 4 ARNm MB11-luc2. Figure 12 : Efficacité de la transfection dans le derme de l'ARNm selon le ratio molaire du peptide CPP1-H6 / ARNm MB11-luc2. 20 Le derme de souris OF1 mâles a été transfecté avec 5,6 pg de l'ARNm MB11-luc2 complexé au peptide CPP1-H6 à des ratios molaires croissants (ratios molaires compris entre 1/8 et 3/1 de CPP1-H6 / ARNm MB11-luc2). L'activité luciférase a été mesurée 18 heures après les injections. Le ratio molaire permettant une transfection optimale a été de 1 CPP1-H6 / 4 ARNm MB11-luc2. 25 Figure 13 : Efficacité de la transfection dans le derme de l'ARNm selon le ratio molaire du peptide CPP2-H6 / ARNm MB11-luc2. Le derme de souris OF1 mâles a été transfecté avec 5,6 pg de l'ARNm MB11-luc2 complexé au peptide CPP2-H6 à des ratios molaires croissants (ratios molaires compris entre 1/4 et 2,75/1 de CPP2-H6 / ARNm MB11-luc2). L'activité luciférase a été mesurée 30 18 heures après les injections. Le ratio molaire permettant une transfection optimale a été de 2 CPP2-H6 / 1 ARNm MB11-luc2. 35 Figure 14 : Effet de l'aptamère A sur l'efficacité de la transfection dans le derme d'une molécule d'ARNm coiffé. L'ARN aptannère A a été inséré dans le 5'UTR de l'ARNnn conventionnel MB5-luc2 coiffé pour générer l'ARNnn MB15-luc2 coiffé. Le derme de souris OF1 mâles a été transfecté 5 avec 5,6 pg de l'ARNnn MB15-luc2 coiffé complexé ou non au peptide CPP2-H6 au ratio molaire 2 CPP2-H6 / 1 ARNnn MB15-luc2, au vu des résultats obtenus auparavant (voir Fig. 12). La transfection n'a pas été améliorée avec cette construction, en présence ou absence de l'aptannère A ainsi que le peptide CPP2-H6. Figure 15 : Effet du 5'-SL sur l'efficacité de la transfection dans le derme d'une 10 molécule d'ARNm. L'effet d'une tige-boucle (ici - 5'-SL » ayant la séquence selon SEQ ID NO : 87) sur l'efficacité de la transfection lorsque la tige-boucle est suivie par la séquence xrRNA1, 5 nucléotides en aval (ARNnn MB8-luc2 et MB18-luc2), par rapport à un ARNnn dépourvu de tige-boucle (ARNnn MB11-luc2) et un ARNnn dont la tige-boucle se situe à plus de 70 15 nucléotides en amont de xrRNA1 (ARNnn MB17-luc2). L'ARNnn conventionnel MB5-luc2 coiffé sert de témoin à l'efficacité de 5'-SL suivi de deux séquences xrRNA. Le derme de souris OF1 mâles a été transfecté avec 5,6 pg de chacun des différents ARNnn et l'activité luciférase a été mesurée 18 heures après les injections. L'aptannère A de MB11-luc2 n'est pas lié à un peptide, et n'a donc pas d'effet sur l'efficacité de 20 transfection de cette ARNnn. EXEMPLES L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Ces enseignements comprennent des alternatives, des modifications et des équivalents, tels que pourront être apprécié par un homme de métier. 25 Exemple 1 : Construction des plasmides Les séquences d'ADN correspondant à des séquences 5' non codantes de SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 50, ou SEQ ID NO : 51 ont été synthétisées chimiquement, intégrées dans un vecteur d'ADN et séquencées par ProteoGenix. Les fragments d'ADN ont été excisés par des enzymes de restriction. Les plasmides de la série pMBx-luc2 ont été digérés avec les 30 mêmes enzymes de restriction et les fragments d'ADN ont été intégrés dans ces plasmides par l'action de l'ADN ligase T4. Ces plasmides contiennent le gène codant l'enzyme luciférase (SEQ ID NO : 62), inséré en aval du promoteur du bactériophage T7. 36 Une courte séquence 3'-UTR non codante suivie par une séquence de polyadénylation transcriptionnelle, selon SEQ ID NO : 53, se situent en aval du gène luciférase. Les différentes séquences 5'-UTR non codantes séparent le promoteur du gène luciférase. Les plasmides ainsi construits ont été amplifiés, vérifiés et linéarisés en aval de la 5 séquence de polyadénylation transcriptionnelle par une enzyme de restriction. Exemple 2: Linéarisation des plasmides et transcription in vitro des ARNm Un site de restriction Sspl se situe immédiatement en aval du poly(A) de chaque plasmide (cf. SEQ ID NO : 54). Dix nnicrogrannnnes de plasmide ont été digérés par vingt unités de l'enzyme de restriction Sspl-HF (New England Biolabs) dans du tampon 10 CutSnnart 1X, pendant quatre heures, à 37°C. Huit nnicrolitres de plasmide linéarisé par Sspl-HF ont ensuite été mélangés à deux nnicrolitres de tampon de réaction 10X de l'ARN polynnérase 17, deux nnicrolitres de chacun des quatre nucléotides triphosphates (ATP, GTP, CTP et UTP) et deux nnicrolitres de solution d'ARN polynnérase T7 (New England Biolabs). Un analogue de coiffe a été 15 inclut dans ce mélange réactionnel pour la synthèse d'ARNnn dotés d'une coiffe. Il en a été omis pour la synthèse d'ARNnn dépourvus de coiffe. La transcription a duré de trois à dix heures et a été effectuée dans un bain à sec à 37°C. Puis, un nnicrolitre de TURBO DNase (Thernno Fisher) a été ajouté pour dégrader le plasmide et le mélange a été incubé à 37°C pendant 15 minutes. 20 L'ARNnn MB5-luc2 est un ARNnn classique codant la luciférase. Il est doté d'une séquence 5' non codante (UTR) selon SEQ ID NO : 57, qui a été sélectionnée pour une initiation optimale de la traduction ainsi qu'une région 3'UTR comprenant une queue poly(A) selon SEQ ID NO : 60. Cet ARNnn a été synthétisé avec ou sans coiffe (cf. Figure 1 (A) et (B)). 25 L'ARNnn MB7-luc2 sans coiffe dispose à son extrémité 5', à la place du 5'-UTR de l'ARNnn MB5-luc2, d'une tige-boucle à l'extrémité 5', suivi de la séquence IRES du virus EMCV. Cette dernière lui permettrait ainsi de recruter efficacement des ribosomes, malgré l'absence de coiffe. Par contre, cet ARNnn serait sensible à l'enzyme Xrn1 (cf. Figure 1 (C)). La région 5'-UTR de l'ARNnn MB7-luc2 correspond à SEQ ID NO : 58 et la région 3'- 30 UTR à SEQ ID NO: 60. L'ARNnn MB8-luc2 sans coiffe dispose d'une tige-boucle à son extrémité 5', suivi, dans la région 5'UTR, de deux séquences successives résistantes à Xrn1, issue du 3'-UTR du 37 Flavivirus WNV, nommées xrRNA1 et xrRNA2 (Kieft et al., 2015). Ces séquences sont suivies par celle de l'IRES du virus EMCV, qui est par conséquent protégée par les deux séquences résistantes à Xrn1 (cf. Figure 1 (D)). La région 5'-UTR de l'ARNnn MB8-luc2 correspond à SEQ ID NO : 59 et la région 3'-UTR à SEQ ID NO : 60. Le coût de la 5 production de l'ARNnn MB8-luc2 sans coiffe est environ 30 fois moindre que le coût de la production d'un ARNnn avec coiffe. L'ARNnn MB9-luc2 sans coiffe ne diffère de l'ARNnn MB8-luc2 sans coiffe que par son extrémité 3'. En effet, le 3'UTR et la séquence poly(A) de MB8-luc2 ont été remplacés par la région 3'UTR du virus Kunjin. Cette région ne dispose pas d'une séquence poly(A) 10 (cf. Figure 1 (E)). La région 3'-UTR de l'ARNnn MB9-luc2 correspond à SEQ ID NO : 61. L'ARNnn MB11-luc2 sans coiffe ne diffère de l'ARNnn MB8-luc2 sans coiffe que par l'absence d'une tige-boucle à l'extrémité 5', et la présence d'un aptannère en région 5' en amont des deux séquences successives résistantes à Xrn1 (cf. Figure 1 (F)). L'ARNnn MB11-luc2 comprend l'aptannère A de SEQ ID NO : 64; la région 5'-UTR de l'ARNnn 15 MB11-luc2 correspond donc à SEQ ID NO : 67. Les ARNnn MB13-luc2, et MB14-luc2 sans coiffe ne diffère de l'ARNnn MB8-luc2 sans coiffe que par la présence d'un aptannère en région 5' en amont des deux séquences successives résistantes à Xrn1 (cf. Figure 1 (G, H)). L'ARNnn MB13-luc2 comprend l'aptannère B de SEQ ID NO : 65; la région 5'-UTR de l'ARNnn MB13-luc2 correspond donc 20 à SEQ ID NO : 68. L'ARNnn MB14-luc2 comprend l'aptannère C de SEQ ID NO: 66; la région 5'-UTR de l'ARNnn MB14-luc2 correspond donc à SEQ ID NO : 69. L'ARNnn MB15-luc2 correspond à l'ARNnn MB5-luc2 coiffé, dans lequel l'aptannère A (SEQ ID NO : 64) a été inséré dans la région 5'-UTR (cf. Figure 1 (I)) ; la région 5'-UTR de l'ARNnn MB15-luc2 correspond donc à SEQ ID NO : 70. 25 L'ARNnn MB17-luc2 ne diffère de l'ARNnn MB11-luc2 sans coiffe que par la présence d'une tige-boucle à l'extrémité 5' en amont de l'aptannère A (cf. Figure 1 (J)). L'ARNnn MB17-luc2 comprend l'aptannère A de SEQ ID NO: 64; la région 5'-UTR de l'ARNnn MB17-luc2 correspond donc à SEQ ID NO : 83. L'ARNnn MB18-luc2 sans coiffe ne diffère de l'ARNnn MB8-luc2 sans coiffe que par la 30 présence d'un aptannère en région 5' entre les deux séquences successives résistantes à Xrn1 et la séquence IRES (cf. Figure 1 (K)). L'ARNnn MB18-luc2 comprend l'aptannère A de SEQ ID NO : 64; la région 5'-UTR de l'ARNnn MB18-luc2 correspond donc à SEQ ID NO : 84. 38 Exemple 3: Purification des ARN messagers La purification des différents ARNnn luciférase a été réalisée à l'aide du kit MegaClear (Annbion). Soixante-dix-neuf pl d'Elution Solution, 350 pl de Binding Solution Concentrate et 250 pl d'éthanol 100% ont été ajoutés aux 21 pl du mélange précédent. 5 Ces 700 pl ont été déposés sur un Filter Cartridge et centrifugés à 10000 g, pendant une minute. Le filtre a retenu l'ARN messager. Deux lavages ont été effectués avec 500 pl de Wash Solution, en centrifugeant à 10000 g, pendant une minute. L'ARN a ensuite été élué du filtre en ajoutant, à deux reprises, 50 pl d'Elution Solution et en chauffant à 70°C, pendant dix minutes, dans un bain à sec. L'élution a été obtenue par 10 centrifugation à 10000 g, pendant une minute. Une seconde étape de purification a été effectuée par précipitation au chlorure de lithium. Soixante pl de LiCl Precipitation Solution ont été ajoutés aux 100 pl de l'éluât. Le mélange a été refroidi à -20°C pendant une heure, avant d'être centrifugé à vitesse maximale à quatre degrés, pendant 15 minutes. Le culot a été lavé avec 500 pl 15 d'éthanol 70% et une dernière centrifugation a été effectuée à vitesse maximale à quatre degrés, pendant 5 minutes. Le culot d'ARN messager, séché pendant quelques minutes à l'air, a été resuspendu dans de l'eau déminéralisée stérile. La concentration de la solution d'ARNnn a été déterminée par la mesure de l'absorbance à 260 nnn, à l'aide d'un spectrophotomètre. 20 Exemple 4 : Assemblage des complexes ARN messager / pepMB1 Le peptide cationique pepMB1 a été synthétisé, purifié et lyophilisé par ProteoGenix. Sa séquence en acides aminés est la suivante : CRRRRRRRRC. Le lyophilisat a été resuspendu dans de l'eau déminéralisée stérile. Cinq nnicrogrannnnes d'ARNnn luciférase ont été mélangés à cinq nnicrogrannnnes de 25 pepMB1 à une concentration finale en ARN de 20 pg/nnl. Les mélanges ont été incubés à température ambiante (20-25°C) pendant 15 minutes avant d'être congelés à -80°C. Les complexes ARNnn / pepMB1 ont ensuite été lyophilisés pendant environ 20 heures. Exemple 5 : Transfection des cellules Caco-2 ou C2C12 Matériels et Méthodes : 30 a) Culture et ensemencement des cellules de la lignée Caco-2 ou C2C12 39 Toutes les manipulations de cellules ont été réalisées sous une hotte à flux laminaire. La lignée cellulaire Caco-2 (ECACC) a été cultivée dans du DMEM (Gibco) additionné d'acides aminés non essentiels, d'un mélange d'antibiotiques et d'antinnycotique et de sérum de veau foetal (15% final). La culture a été effectuée à 37°C dans des flasques de 5 75 cnn2 (Corning). Lorsque le nombre de cellules nécessaire à l'ensemencement d'une plaque de 48 puits (Corning) a été atteint, les cellules ont été détachées du fond de la flasque à l'aide de 3 ml de TryPLE Select 1X (Gibco) à 37°C, pendant 5 minutes. 7 ml de DMEM ont été ajoutés, afin de neutraliser le TryPLE Select 1X. Les cellules ont été centrifugées à 100 10 g, pendant 10 minutes, à température ambiante. Le culot cellulaire a ensuite été resuspendu dans 10 ml de milieu de culture. 250 pl de cette suspension cellulaire ont été introduits dans chaque puits d'une plaque de 48 puits et cette dernière a été placée dans un incubateur à 37°C, contenant 5% de CO2. Les cellules C2C12 peuvent être conservées à confluence dans les puits d'une plaque de 15 48 puits que pendant une douzaine de jours après leur ensemencement. Au-delà de cette période, ces cellules se différentient en épithélium intestinal, ce qui affecte la traduction de l'ARNnn. En revanche, les cellules souche nnésenchynnateuses humaines peuvent être conservées en culture confluente pendant plus de 7 semaines. Les cellules souches nnésenchynnateuses (Millipore, Hunnan Mesenchynnal Stem Cell (Bone Marrow)) 20 ont donc été cultivées dans des plaques de 48 puits (Corning) dans un milieu prêt à l'emploi (Millipore, Mesenchynnal Stem Cell Expansion Medium) jusqu'à 48 jours. Pour les cellules qui seront lysées plus de cinq jours après la transfection, le milieu de culture a été changé trois fois par semaine. b) Transfection des cellules Caco-2 ou C2C12 25 Pour les cellules Caco-2, la transfection par chaque ARNnn a été réalisée dans cinq puits différents. Les lyophilisats de complexes ARNnn / pepMB1 (Proteogenix) ont été resuspendu dans 750 pl de tampon de transfection (20 nnM Hepes, 40 nnM KCl et 100 pM trifluoroacétate). Pour les cellules C2C12, la transfection par l'ARNnn-MB8 est réalisée comme indiquée ci- 30 dessous. Les complexes ARNnn MB8-luc2 / pepMB1 (Proteogenix) sont assemblés en incubant l'ARNnn en présence des peptides à un ratio de charge positif du peptide / charge négatif de l'ARNnn d'environ 2,2 pendant 30 min à température ambiante. La solution est ensuite diluée avec du DMEM 3X afin d'obtenir du DMEM 1X final. Dans les deux cas, les puits ont été vidés du milieu de culture qu'ils contenaient, afin d'introduire 150 pl de solution de complexe ARN / pepMB1 (correspondant à 1 pg d'ARNnn par puits pour les cellules Caco-2 et à 2 pg par puits pour les cellules C2C12). Les cellules ont été incubées pendant 30 minutes (cellules Caco-2) ou 1 heure (cellules 5 C2C12), à 37°C, dans un incubateur à CO2. La solution de complexe ARNnn / pepMB1 a ensuite été aspirée et remplacée par 250 pl de milieu de culture. Les cellules ont alors été incubées, pendant 6 heures à 48 jours en fonction du type cellulaire, à 37°C, dans un incubateur à CO2. c) Lyse des cellules Caco-2 ou C2C12 et mesure de l'activité luciférase 10 Six heures à 48 jours après la transfection, les cellules ont été lysées afin de réaliser des cinétiques d'expression de la protéine luciférase. Le milieu de culture a été aspiré et remplacé par 250 pl de tampon de lyse (Luciferase Assay System, Pronnega). 20 pl de chaque lysat cellulaire ont été introduits dans un tube adapté au lunninonnètre (Berthold Technologies). 100 pl de substrat de la luciférase (Pronnega) ont été ajoutés au lysat 15 cellulaire par le lunninonnètre. Ce dernier a ensuite mesuré la quantité de lumière émise par la réaction enzymatique catalysée par la luciférase. Les résultats s'expriment en unités relatives de lumière (RLU). La quantité de protéine luciférase, produite par les cellules Caco-2 ou les cellules C2C12, grâce à l'ARNnn luciférase, a été normalisée en dosant les protéines cellulaires totales avec le kit 660 nnn Protein Assay (Pierce). Pour 20 cela, 100 pl de lysat cellulaire ont été mélangés à 1,5 ml de réactif et l'absorbance a été mesurée à 660 nnn. Une gamme d'étalonnage a été réalisée à l'aide de solutions de sérum albumine bovine. L'activité luciférase s'exprime donc en RLU par milligramme de protéines. Résultats : 25 Les résultats sont illustrés dans les Figures 2, 3 et 4. L'ARNnn MB5-luc2 sans coiffe induit une faible et courte expression de la protéine luciférase dans les cellules Caco-2. En l'absence de coiffe, l'ARNnn est rarement traduit en protéine et est rapidement dégradé par Xrn1 (cf. Figure 2). L'ARNnn MB7-luc2 sans coiffe donne une expression plus forte et plus durable de la 30 protéine luciférase, dans les cellules Caco-2, que celle de l'ARNnn MB5-luc2 sans coiffe. La région IRES recrute des ribosomes, mais ne procure pas de résistance significative vis-à-vis de Xrn1 (cf. Figure 2). 41 L'ARNnn MB8-luc2 sans coiffe induit une cinétique d'expression luciférase similaire à celle obtenue avec l'ARNnn MB5-luc2 coiffé (cf. Figures 2 et 3). Cela signifie que l'ajout des deux séquences résistantes à Xrn1 du virus WNV, procure à l'ARNnn une résistance à Xrn1 similaire à celle de la coiffe de l'ARNnn MB5-luc2. L'ARNnn MB7-luc2, qui est 5 dépourvu de coiffe et de séquences résistantes à Xrn1, induit une expression luciférase intermédiaire entre celle de l'ARNnn MB8-luc2 sans coiffe et celle de l'ARNnn MB5-luc2 sans coiffe (cf. Figure 2). L'ARNnn MB9-luc2 se différentie de l'ARNnn MB8-luc2 par son extrémité 3'UTR dépourvue de poly(A). L'expression luciférase qu'il induit dans les cellules Caco-2 est notablement 10 moins élevée et moins durable que celle induite par l'ARNnn MB8-luc2 (cf. Figure 3). Dans les cellules souches nnésenchynnateuses humaines, l'ARNnn MB8-luc2 induit, de façon surprenante et avantageuse, une expression luciférase qui persiste à très long terme. En effet, même si l'expression diminue au cours du temps, elle reste toujours détectable même 48 jours après la transfection (cf. Figure 4). 15 Exemple 6 : Transfection du muscle et du derme de souris. Matériels et méthodes : a) Hébergement des animaux : Pour le muscle, des souris BALB/cByJ mâles, âgées de 8 semaines, ont été hébergées dans des cages ouvertes à cinq animaux par cage. Les cycles jour /nuit ont été gérés par 20 un automate (12h de jour / 12h de nuit). Elles ont été nourries et ont eu accès à de l'eau filtrée ad libitum. Pour la peau, des souris OF1 mâles, âgées de 6 semaines, ont été hébergées dans des cages ouvertes à quatre animaux par cage. b) Préparation extemporanée des échantillons d'ARNnn : Pour chaque injection intramusculaire, 100 pl d'une solution d'ARNnn nu contenant du 25 NaCl 230 nnM ont été préparés. Pour chaque injection intradermique, 17 pl d'une solution d'ARNnn nu contenant du NaCl 160 nnM ont été préparés. Lorsqu'un peptide CPP-H6 a été utilisé, celui-ci a été mélangé à l'ARNnn et incubé pendant 30 minutes à température ambiante en présence de 5 nnM d'Hepes pH 7,5 et de 30 0,7 nnM de MgCl2. 42 c) Injections intradermiques et intramusculaires des ARNnn : L'anesthésie des souris a été réalisée par l'utilisation d'isoflurane. Pour les injections intramusculaires, une analgésie a été pratiquée par l'injection de buprénorphine. Pour les injections intradermiques, la peau du dos a été tondue trois à quatre jours 5 auparavant (voir l'Exemple 10 pour plus de détails). 100 pl et 17 pl de solution d'ARNnn ont été injectés dans le biceps fennoris et dans la peau, respectivement. Les animaux ont été replacés dans leur cage jusqu'au lendemain matin. d) Prélèvements de peau et de muscle : 10 Pour le muscle, 16 heures après les injections, les souris ont été euthanasiées au CO2. Pour la peau, 18 heures après les injections, les souris ont été anesthésiées à l'isoflurane et euthanasiées par dislocation cervicale. Les sites d'injection au niveau de la peau et du muscle ont été prélevés. Ces biopsies ont été lavées avec du sérum physiologique, découpés en fins morceaux et introduits dans des tubes contenant du 15 tampon de lyse (Pronnega). Ces tubes ont été immédiatement congelés dans de l'azote liquide. e) Lyse des cellules des biopsies de peau et de muscle : Chaque biopsie de peau et de muscle a subi trois cycles de congélation / décongélation. En effet, les tubes contenant les biopsies et du tampon de lyse ont été congelés à -80°C 20 pendant 10 minutes. Puis, ils ont été décongelés dans un bain-marie à température ambiante pendant deux minutes et brièvement mélangés à l'aide d'un vortex. Les tubes ont ensuite été centrifugés à 5000 g, à 20°C, pendant 5 minutes, afin de précipiter les débris tissulaires et obtenir un surnageant clarifié de lysat cellulaire. f) Mesure de l'activité luciférase : 25 20 pl de chaque lysat cellulaire ont été utilisés pour la mesure de l'expression luciférase dans chaque biopsie. Un lunninonnètre à tubes a ajouté 100 pl de substrat de la luciférase (Pronnega) dans chaque échantillon et a mesuré la quantité de lumière émise pendant 10 secondes. Les résultats s'expriment en unités relatives de lumière ou RLU. Les lysats cellulaires ont ensuite été dilués de huit à vingt fois pour le dosage des 30 protéines, à l'aide du kit 660 nnn Protein Assay (Pierce). Cent pl de lysat cellulaire 43 dilués ont été mélangés à 1,5 ml de réactif pendant 6 minutes et l'absorbance a été mesurée à 660 nnn. Une gamme d'étalonnage a été réalisée avec de l'albumine sérique bovine de 0 à 750 pg/ml. Résultats : 5 Les résultats sont illustrés dans la Figure 5. L'ARNnn MB8-luc2 dépourvu de coiffe induit une expression luciférase, dans le muscle squelettique (A) et dans la peau (B), supérieur à l'ARNnn MB5-luc2 coiffé, 16 heures (pour le muscle) ou 18 heures (pour le derme) après leurs injections. Ces résultats indiquent que la présence des deux séquences xrRNA (ici du virus WNV) et l'IRES (ici d'EMCV) procure à l'ARNnn une résistance à Xrn1 10 et une efficacité de la traduction supérieures à celles de la coiffe de l'ARNnn MB5-luc2 in vivo. En effet, de façon très surprenante, la transfection de 10 pg d'ARNnn MB8-luc2 dans le tissue musculaire chez la souris, résulte en une expression luciférase 2,6 fois plus élevée que celle obtenue avec la même dose d'ARNnn MB5-luc2 doté d'une coiffe (cf. Figure 5A). De même, la transfection de 5 pg d'ARNnn MB8-luc2 dans la peau 15 résulte en une expression luciférase 9,3 fois plus élevée que celle obtenue avec la même dose d'ARNnn MB5-luc2 doté d'une coiffe (cf. Figure 5B). L'ARNnn MB8-luc2 peut donc pleinement se substituer à l'ARNnn MB5-luc2 coiffé, et serait même encore plus avantageux. Exemple 7: Toxicité cellulaire de l'ARNm MB8-2Apro 20 Matériels et méthodes : L'expression de la protéine 2Apro dans une cellule de mammifère peut induire une toxicité au point d'entraîner la mort cellulaire par apoptose ou par nécrose (Goldstaub et al., 2000). Au cours de ces processus, les cellules libèrent de la lactate déshydrogénase (LDH) dans le milieu extracellulaire. Cette activité LDH peut être 25 mesurée à l'aide d'un kit commercial, CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Pronnega. L'ARNnn MB8-2Apro (SEQ ID NO : 80) est un ARNnn codant la protéine non structurale 2A (2Apro, ayant la séquence de SEQ ID NO : 81) issu du génome du rhinovirus humain 2 (HRV2). Il est doté d'une séquence 5' non codante (UTR) selon SEQ ID NO : 57, qui est 30 identique à celle de l'ARNnn MB8-luc2, ainsi qu'une région 3'UTR comprenant une queue poly(A) selon SEQ ID NO : 60. 44 750 ng d'ARNnn MB8-luc2 seul ou d'un mélange d'ARNnn MB8-luc2 et d'ARNnn MB8-2Apro ont été complexés au peptide pepMB1, tel que décrit à l'Exemple 4. L'ARNnn MB8-luc2 seul ou l'ARNnn MB8-luc2 mélangé à l'ARNnn MB8-2Apro, à deux ratios molaires différents, ont été transfectés dans des cellules C2C12. Plus précisément, les 5 cellules C2C12 d'un puits d'une plaque de 48 puits ont été incubées pendant une heure avec les complexes ARNnn / pepMB1. 18 heures plus tard, l'activité luciférase a été mesurée (Figure 6). Des cellules C2C12 non transfectées et non lysées servent de témoin négatif alors que des cellules C2C12 non transfectées ont été lysées avec du Triton X-100, pour libérer la totalité de la LDH dans le milieu de culture, servent de 10 témoin positif. Résultats : Les mélanges d'ARNnn n'ont pas induit de cytotoxicité, même au ratio molaire le plus élevé (ratio ARNnn MB8-luc2 / l'ARNnn MB8-2Apro de 9 / 1). Cela signifie que l'expression de la protéase virale n'induit pas de cytotoxicité (Figure 9). 15 Exemple 8: Cinétique d'expression luciférase optimisée par la co-transfection d'ARNm MB8-luc2 et MB8-2Apro Matériels et méthodes : En l'absence de toxicité, les ARNnn MB8-luc2 et MB8-2Apro ont ensuite été cotransfectés dans des cellules C2C12 à des ratios différents, selon les méthodes décrites 20 ci-dessus. 18 heures plus tard, l'activité luciférase a été mesurée (Figure 7). Une cinétique a ensuite été réalisée de 6h à 7 jours post-transfection, afin de déterminer si l'amélioration de l'expression luciférase ne s'observe que 18h post-transfection, selon les méthodes décrites ci-dessus. Résultats : 25 De façon surprenante, la co-transfection des ARNnn MB8-luc2 et MB8-2Apro augmente l'expression luciférase de l'ARNnn MB8-luc2 d'au moins 2,5 fois dans les cellules C2C12 à tous les ratios testés. Le meilleur ratio molaire ARNnn MB8-luc2 / ARNnn MB8-2Apro est de 465 /1, et augmente l'expression luciférase de 3,4 fois. Une cinétique réalisée de 6h à 7 jours post-transfection démontre de façon surprenante 30 que l'amélioration de l'expression luciférase est observée pendant au moins une semaine. En effet, l'expression luciférase est en moyenne augmentée de 2,4 fois (Figure 7). Exemple 9: Effet d'ARN aptamères sur l'efficacité de la transfection d'ARNm dans le muscle 5 Afin d'améliorer l'internalisation de la molécule d'ARNnn selon l'invention, différents aptannères ont été incorporés dans la molécule d'ARN, telle que détaillé ci-dessous. L'effet de ces aptannères a ensuite été évalué in vivo, afin de déterminer si une amélioration de l'expression luciférase pouvait être observée. Matériels et méthodes : 10 Sélection d'aptamères Des aptannères pénétrant dans les cellules C2C12 ont été sélectionnés. Tout d'abord, de l'ADN double brin a été généré par l'hybridation d'une amorce en 5' suivie par l'extension d'ADN simple brin d'une bibliothèque d'ADN simple brin. L'ADN double brin ainsi obtenu a ensuite été précipité et purifié selon des méthodes bien connues de 15 l'homme du métier. Une bibliothèque d'ARN aptannères a ensuite été obtenue par transcription des fragments purifiés en utilisant le kit de transcription T7 DuraScribe (20 pl / run) suivi par la purification de l'ARN en utilisant un kit de purification de ssDNA et RNA. Enfin, la solution est traitée à la DNAse I afin d'éliminer l'ADN contaminant. Les aptannères sont 20 dissous dans du DMEM + ITS 1X à 8 pM d'ARN (1288 pg / 5 ml). Afin de sélectionner les aptannères, 5 ml de la solution DMEM / ITS / ARN est ajouté sur les cellules préalablement lavées 2 fois avec du DMEM sans antibiotiques ni sérum. Les cellules sont incubées à 37°C pendant 1 heure, en agitant brièvement la flasque contenant le mélange toutes les 15 minutes. La flasque contenant les cellules est ensuite placée sur 25 de la glace et les cellules sont lavées 5 fois avec 15 nnL de PBS lx froid afin d'éliminer les ARN aptannères n'ayant pas pénétré dans les cellules. Les cellules sont ensuite lysées avec du TRIzol (Invitrogen) et les ARN totaux extrait par la méthode - phénol-chloroforme ». Les ARN endogènes sont digérés avec de la RNAse A, et les ARN restants hybridés avec des amorces 3' et rétrotranscrits par l'enzyme Superscript III 30 (ThernnoFisher), avant amplification par PCR en présence de primer 5' (100 pM), primer 3' (100 pM), la polynnérase ADN - Q5 High Fidelity » (NEB) et le tampon Q5 High-Fidelity Master Mix correspondant à une concentration de 1X. L'ensemble de ces étapes 46 permettant d'obtenir une bibliothèque d'ARN aptannères est répété. Ainsi deux cycles de sélection des ARN aptannères pénétrant des cellules C2C12 sont effectués. Deux ARN aptannères (B et C) pénétrant dans les cellules C2C12 ont été sélectionnés et séquences (SEQ ID NO: 65 et 66, respectivement). Les ARN aptannères B et C ont 5 ensuite été insérés dans le 5'UTR de l'ARNnn MB8-luc2, en amont de xrRNA1, pour générer les ARNnn MB13-luc2 et MB14-luc2, respectivement. Aptamère fixant fortement le motif peptidique poly-histidine Une seconde stratégie visant à améliorer l'internalisation de l'ARNnn a consisté à insérer dans le 5'UTR de l'ARNnn MB8-luc2, en amont de xrRNA1, un autre ARN aptannère 10 (l'aptannère A) capable de fixer fortement le motif peptidique poly-histidine en présence de magnésium. L'ARNnn doté de l'ARN aptannère A a été nommé MB11-luc2. Un peptide pénétrant les fibres musculaires de souris, M12 (voir Gao et al., 2014), a été lié par l'intermédiaire d'un espaceur (ici comprenant les acides aminés glycine et serine) au motif hexahistidine. Différents espaceurs sont illustrés à titre d'exemple dans les 15 séquences de SEQ ID NO: 75 (RRQPPRSISSHPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGHHHHHH), SEQ ID NO: 76 (PQRDTVGGRTT PPSWGPAKAGGGGSGGGGSGGGGHHHHHH), SEQ ID NO: 77 (GPFHFYQFLFPPVGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSGHHHHHH) ou SEQ ID NO: 78(GSPWGLQHHPPRTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGHH HHHH) ; séquence espaceur soulignée). Le peptide ainsi formé a été nommé M12-H6 (SEQ ID NO : 75). L'ARNnn MB11 - 20 luc2 a été incubé pendant 30 minutes à température ambiante avec le peptide M12-H6, avant d'être injecté dans le biceps fennoris de souris. Transfection in vivo Le muscle biceps fennoris de souris BALB/cByJ mâles a été transfecté avec 5 pg d'ARNnn MB8-luc2, d'ARNnn MB13-luc2, d'ARNnn MB14-luc2, ou d'ARNnn MB11-luc2 complexé au 25 peptide M12-H6 en présence ou absence de 5 pg de chloroquine. L'activité luciférase a été mesurée 16 heures après les injections. Résultats : L'ARNnn MB13-luc2 transfecte le muscle aussi bien que l'ARNnn MB8-luc2 (Figure 10). De façon très avantageuse, l'ARNnn MB14-luc2 comprenant l'aptamère C transfecte le 30 biceps femoris 2,1 fois plus efficacement que l'ARNnn MB8-luc2. L'ARN aptamère C a donc amélioré l'internalisation dans les fibres musculaires de la molécule d'ARNnn dans lequel il a été inséré. 47 L'efficacité de la transfection de l'ARNnn MB11-luc2 a été modeste (Figure 10). De façon surprenante, la co-injection de 5 pg d'ARNnn MB11-luc2, du peptide M12-H6 et de 5 pg de chloroquine a toutefois amélioré l'efficacité de la transfection de 31 fois par rapport à l'ARNnn MB11-luc2 en présence du peptide, sans chloroquine. De plus, de façon très 5 avantageuse, l'expression luciférase obtenu avec l'ARNnn MB11-luc2 en présence de M12-H6 et la chloroquine a été 2,7 fois plus élevée que celle obtenue avec l'ARNnn MB8- luc2. Sans être liée par la théorie, on peut penser que l'efficacité importante de la transfection de l'ARNnn MB11-luc2 complexé au peptide M12-H6 et en présence de 10 chloroquine a été favorisée par un ralentissement de l'acidification de l'endosonne par la chloroquine suite à la pénétration de l'ARNnn dans les cellules. La chloroquine permettrait le ralentissement de la protonation de l'hexahistidine à pH acide et donc empêcherait la déstabilisation des complexes entre l'ARNnn MB11-luc2 et le peptide M12-H6. De ce fait, l'ARNnn s'échapperait de l'endosonne de façon améliorée, en 15 traversant sa membrane à l'aide de M12-H6 auquel il est toujours complexé, pour pénétrer dans le cytosol où l'ARNnn est ensuite traduit. Exemple 10: Protocole d'injection intradermique chez la souris a-Préparation des solutions Une solution de 60 pl contenant 20 pg d'ARN messager a été préparée pour chaque 20 souris. Pour cela, de l'eau déminéralisée, de l'Hepes 50 nnM (1/8 d'Hepes, 7/8 d'Hepes de sodium), du NaCl (160 nnM final), du MgCl2, un ARNnn et optionnellennent un peptide ont été mélangés. Une incubation de 30 minutes à température ambiante a permis au peptide de se fixer à l'ARN. Il n'y pas eu d'incubation lorsque l'ARNnn n'a pas été complexé à un peptide. Les solutions d'ARNnn ont été congelées à -80°C, afin de les 25 conserver jusqu'à ce qu'elles soient injectées. b-Injection intradermique et prélèvements de biopsies Des souris OF1 mâles de 6 semaines ont été utilisées (Charles River). Elles ont été tondues trois à quatre jours avant l'injection intradermique. Les anesthésies ont été réalisées à l'aide d'un masque. L'induction de l'anesthésie a été obtenue par 30 l'utilisation de 4% d'isoflurane (Pirannal Heathcare). Le maintien de l'anesthésie a été réalisé à un pourcentage d'isoflurane de 2%. Avant l'injection, la peau du dos préalablement tondue a été nettoyée avec une lingette imbibée d'alcool. Les solutions d'ARNnn ont été lentement décongelées à température ambiante, afin de remplir les seringues à insuline U-100 (30G) de 0,3 mm x 8 mm (Becton-Dickinson). Trois injections 48 d'environ 17 pl de solution d'ARN ont réalisées dans la peau du dos tondue de chaque souris. Des papules se sont formées avant de se résorber. Ces dernières ont été délimitées à l'aide d'un marqueur indélébile, afin de permettre le repérage de la zone de peau à biopsier le lendemain. Un marquage de la queue a été également réalisé à 5 l'aide d'un marqueur, afin de différencier les animaux de la même cage. 18 heures après les injections, des biopsies de peau ont été réalisées au niveau des zones injectées. Pour cela, les souris ont été anesthésiées, puis euthanasiées par dislocation cervicale. Les biopsies ont été découpées en petits morceaux à l'aide d'une paire de ciseaux, afin de faciliter la lyse des cellules, et introduits dans des tubes 10 contenant 500 pl de tampon de lyse 1X (Luciferase Cell Culture Lysis 5X (Pronnega), dilué dans de l'eau). Chaque tube a été congelé à -20°C jusqu'à l'étape suivante. c-Lyse des cellules, dosages de la luciférase et des protéines La lyse des tissus prélevés a été obtenue en effectuant trois cycles de congélation / décongélation : -80°C pendant 10 minutes, 3 minutes dans un bain-marie à température 15 ambiante et mélange à l'aide d'un agitateur-vortex pendant quelques secondes. Les tubes ont ensuite été centrifugés à 5 000 g pendant 5 minutes à 20°C pour sédinnenter les débris tissulaires. Le surnageant a été transvasé dans un autre tube. Le dosage luciférase a été réalisé à l'aide du kit Luciferase Assay System (Pronnega). 20 pl de chaque échantillon ont été introduits dans des tubes dédiés au lunninonnètre 20 (Berthold AutoLunnat Plus LB 953). L'appareil a injecté 100 pl de substrat et a mesuré la quantité de lumière émise (RLU). Le dosage des protéines a été effectué à l'aide du Kit Pierce 660nnn Protein Assay (Thernno scientific). Une gamme d'étalonnage a été préalablement réalisée avec de la Sérum Albumine Bovine (Thernno scientific) et du tampon de lyse 1X comme diluant. Elle 25 a couvert une gamme de 100 à 500 pg de protéines par millilitre. Le blanc a été obtenu en utilisant 100 pl de tampon de lyse 1X. Les lysats ont été dans certains cas dilués avec du tampon de lyse 1X. 100 pl de chaque échantillon ont été utilisés pour le dosage des protéines. 1,5 ml de réactif a été ajouté au blanc et aux échantillons. Après précisément 5 minutes d'incubation à température ambiante et dans l'obscurité, 30 l'absorbance à 660 nnn de chaque échantillon a été mesuré à l'aide d'un spectrophotomètre. Exemple 11: Effet des CPPs sur l'efficacité de transfection d'ARNm dans la peau 49 La stratégie visant à améliorer l'internalisation de l'ARNnn nu par la fixation d'un peptide pénétrant les cellules (CPP) à l'ARN aptannère A, n'est pas restreinte au muscle, tel que décrit à l'Exemple 9 ci-dessus. Cette stratégie a été appliquée ici à la peau de souris en utilisant différents CPP. 5 Matériels et méthodes : Trois CPPs ont été utilisés ici : CPP1, CPP2 et CPP3 (voir Kannada et al., 2007 et Lee et al., 2012). Ils ont été connectés à de l'hexahistidine par un espaceur constitué de glycines et de serines pour former les peptides CPP1-H6, CPP2-H6 et CPP3-H6 ayant les séquences de SEQ ID NO : 76, 77, et 78, respectivement. 10 L'ARNnn MB11-luc2 a été incubé avec des quantités croissantes de peptide CPP3-H6, CPP1-H6, ou CPP2-H6 pendant 30 minutes dans du tampon préalablement optimisé comprenant 160nnM NaCl, 0,7 nnM MgCl2 et 5 nnM Hepes. L'ARNnn MB11-luc2 seul et l'ARNnn MB8-luc2 dilué dans de l'eau déminéralisée, ultrapure et stérile, additionnée de 160 nnM de NaCl, ont également été injectés, et servent ici de témoins. 15 Une injection intradermique de 5,6 pg d'ARNnn MB8-luc2 ou de MB11-luc2 a été effectué chez la souris OF1 selon le protocole détaillé à l'exemple 10. La peau de souris a également été injectée avec un mélange d'ARNnn MB11-luc2 et ARNnn MB8-luc2 à un ratio de 1 /1, et la même quantité de CPP3-H6 que celle du ratio molaire de 0,5 afin de déterminer si le peptide CPP3-H6 peut se dissocier de l'ARN aptannère A, présent dans 20 l'ARNnn MB11-luc2, après l'injection intradermique. L'activité luciférase a été mesurée 18 heures après les injections. Résultats : Comme attendu, une injection d'ARNnn MB8-luc2 a abouti à une transfection efficace de la peau. La co-injection de CPP3-H6, de 0,7 nnM de MgCl2 et de 5 nnM d'Hepes à l'ARNnn 25 MB8-luc2 n'a pas affecté de manière significative l'efficacité de la transfection (Figure 11). La quantité optimale de peptide CPP3-H6, qui permet d'augmenter de façon avantageuse l'efficacité de la transfection de 9,2 fois par rapport à l'ARNnn MB11-luc2 seul, correspond à un ratio molaire de 1 peptide CPP3-H6 pour 2 ARNnn (Figure 11). De 30 plus, de façon très avantageuse, l'activité luciférase est 2,1 fois plus élevée que celle obtenue avec l'ARNnn MB8-luc2 et 19,5 fois plus élevée que celle obtenue avec l'ARNnn classique MB5-luc2 coiffé. Lorsqu'un ARNnn sur deux ne fixe pas le CPP3-H6, la transfection chute de 12,3 fois (Figure 11, 2,8 pg de chacun des ARNnn MB8-luc2 et MB11-luc2). Cela signifie que le peptide CPP3-H6 peut se dissocier de l'ARN aptannère A, présent dans l'ARNnn MB11- luc2, après l'injection intradermique. Si la moitié de l'ARNnn est dépourvue d'ARN 5 aptannère A (ARNnn MB8-luc2), CPP3-H6 ne peut plus améliorer aussi efficacement la transfection. L'ARNnn MB11-luc2 a également été incubé avec le peptide CPP1-H6 à différents ratios molaires. Le meilleur ratio molaire a été de 1 peptide CPP1-H6 pour 4 ARNnn MB11-luc2 (Figure 12). L'efficacité de la transfection a augmenté de 5,4 fois par rapport à l'ARNnn 10 MB11-luc2 seul. CPP1-H6 a donc donné un moins bon résultat que CPP3-H6. Cela peut s'expliquer par le nombre d'exemplaires du ou des récepteur(s) de chaque CPP présent(s) dans la membrane plasmique des cellules de la peau et de l'affinité de chaque CPP pour son ou ses récepteur(s). 15 Enfin, l'ARNnn MB11-luc2 a également été incubé avec CPP2-H6 à divers ratios molaires. Le meilleur ratio molaire a été de 2 peptides CPP2-H6 pour 1 ARNnn MB11-luc2 (Figure 13). L'efficacité de la transfection a augmenté de 10,6 fois par rapport à l'ARNnn MB11luc2 seul, et est également supérieure à celle obtenue avec le peptide CPP3-H6. L'expression luciférase est ainsi 22,8 fois plus élevée que celle obtenue avec l'ARNnn 20 classique MB5-luc2. Exemple 12: Effet d'un CPP-H6 sur l'efficacité de transfection d'un ARNm coiffé dans la peau Matériels et méthodes : 25 Afin d'évaluer l'effet d'un CPP (ici CPP2-H6) sur l'efficacité de transfection d'un ARNnn coiffé, l'aptannère A a été inséré dans le 5'UTR de l'ARNnn conventionnel MB5-luc2 coiffé pour générer l'ARNnn MB15-luc2 coiffé ayant la séquence de SEQ ID NO : 70. L'ARNnn MB15-luc2 a été incubé avec CPP2-H6 pendant 30 minutes dans du tampon comprenant 0,7 nnM MgCl2 et 5 nnM Hepes, comme décrit ci-dessus à l'exemple 11. 30 Une injection intradermique de 5,6 pg d'ARNnn MB15-luc2 a été effectuée chez la souris OF1 selon le protocole détaillé à l'exemple 10. L'activité luciférase a été mesurée 18 heures après les injections. 51 Résultats : En l'absence de peptide CPP2-H6, l'expression luciférase obtenue avec l'ARNnn MB15- luc2 coiffé est 1,68 fois plus faible que celle obtenue avec l'ARNnn MB5-luc2 coiffé. La co-injection de l'ARNnn MB15-luc2 coiffé et du peptide CPP2-H6, à un ratio molaire 5 de 2 peptides par ARNnn, n'a amélioré l'efficacité de la transfection que de 1,48 fois par rapport à l'ARNnn MB15-luc2 seul. Cela signifie que l'insertion de l'ARN aptannère A dans le 5'UTR d'un ARNnn classique coiffé et la fixation d'un peptide CPP-H6 à cet ARN aptannère n'améliore pas l'efficacité de la transfection par rapport à celle observée avec l'ARNnn dépourvu de coiffe, MB11-luc2 (10,6 fois). Quel que soit la molécule 10 d'ARNnn coiffé (avec ou sans aptannère, liée ou non au CPP CPP2-H6), l'efficacité de la transfection reste largement inférieure à celle observée pour les ARNnn MB8-luc2 et MB11-luc2. Il est donc très avantageux d'utiliser les molécules d'ARNnn de l'invention plutôt que des molécules d'ARNnn coiffés. Exemple 13 : Effet du 5'-SL sur l'expression luciférase in vivo dans la peau 15 Matériels et méthodes : Les ARNnn suivants : MB8-luc2, MB11-luc2, MB17-luc2, MB18-luc2, et MB5-luc2 coiffé ont été injectés dans la peau et l'activité luciférase mesurée 18 heures après injection, selon le protocole détaillé à l'Exemple 10 ci-dessus. Résultats : 20 Comme illustré à la Figure 15, l'ARNnn selon l'invention comprenant au moins une séquence xrRNA et une séquence IRES (MB11-luc2) augmente l'expression luciférase dans la peau d'environ 2 fois par rapport à l'ARNnn coiffé (MB5-luc2). De façon très surprenant, l'ajout d'une tige-boucle (ici la 5'-SL ayant la séquence de SEQ ID NO : 87) augmente l'expression luciférase dans la peau d'environ 4,3 fois supplémentaire par 25 rapport aux seules séquences xrRNA et IRES (MB11-luc2), lorsque la tige-boucle est localisée cinq nucléotides en amont de la séquence xrRNA1 (MB8-luc2 et MB18-luc2). Toutefois, lorsque la tige-boucle est localisée environ 70 nucléotides en amont de la séquence xrRNA, la tige-boucle n'améliore pas l'efficacité au-delà de ce qui est déjà observée en l'absence de la tige-boucle. En effet, l'efficacité de la traduction est 30 similaire pour les ARNnn MB11-luc2 et MB17-luc2. Le placement de l'aptannère A entre les séquences xrRNA et la séquence IRES (MB18-luc2) augmente l'efficacité de la traduction encore plus par rapport aux ARNnn MB11-luc2 et MB17-luc2 de façon très 52 surprenante. Les ARNnn MB8-luc2 et MB18-luc2 ont ainsi une efficacité de la traduction similaire. Conclusion : 5 Une molécule d'ARNnn selon l'invention a un coût de synthèse réduit d'environ 30 fois, par rapport à un molécule d'ARNnn coiffé, tout en ayant un rendement accru d'expression protéique d'au moins 2 fois, de préférence d'environ 10 fois. De plus, l'ARNnn de l'invention est au moins aussi stable qu'un ARNnn coiffé, et sa production par transcription in vitro est simplifiée par l'absence de molécule de coiffe ou d'un 10 analogue de celle-ci. Un ARNnn de l'invention codant pour la protéase 2A du HRV2 permet d'augmenter la traduction d'un ARNnn codant pour une protéine d'intérêt lorsque ces deux molécules sont co-transfectées. De plus, l'efficacité de la transfection dans un tissu, tel que le muscle ou la peau peut être améliorée par exemple par l'insertion dans la région 5'-UTR de la molécule d'ARNnn selon l'invention d'un ARN 15 aptannère pénétrant directement dans des cellules, d'un CPP (fixé à un ARN aptannère tel que décrit ci-dessus), et/ou par l'ajout d'une tige-boucle à l'extrémité 5' de la région 5'-UTR en amont de la/les séquences(s) xrRNA. 53 REFERENCES Ausubel et al., 2001, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Et Sons, Hoboken, N.J., USA. 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Tsuji S. et al., 2013, PLoS ONE 8(12): REVENDICATIONS1. Une molécule d'acide ribonucléique messager (ARNnn) dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5' à 3' : - une région 5'-UTR comprenant au moins un exemplaire d'une séquence consensus GUCAGRYC(1\17.19)GCCA(1\112-19)UGCNRYCUG (xrRNA) ; - un exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES) ; et - une phase de lecture ouverte. 2. La molécule d'ARNnn selon la revendication 1 comprenant deux exemplaires de xrRNA. 3. La molécule d'ARNnn selon la revendication 1 ou 2 comprenant au moins une SEQ ID NO parmi SEQ ID NO : 1 à 44, de préférence comprenant la SEQ ID NO : 11 et la SEQ ID NO : 26. 4. La molécule d'ARNnn selon l'une des revendications 1 à 3 comprenant la séquence IRES du virus de l'encéphalonnyocardite (EMCV). 5. La molécule d'ARNnn selon l'une des revendications 1 à 4 comprenant une tige- boucle, de préférence selon SEQ ID NO :87, ladite tige-boucle étant localisé à l'extrémité 5' de la région 5'-UTR. 6. La molécule d'ARNnn selon l'une des revendications 1 à 5 comprenant au moins un aptannère choisi parmi l'aptannère A ayant la séquence de SEQ ID NO : 64 et l'aptannère C ayant la séquence de SEQ ID NO : 66. 7. La molécule d'ARNnn comprenant l'aptannère A selon la revendication 6, selon laquelle ladite molécule d'ARNnn est liée à un peptide pénétrant les cellules (CPP) fusionné à une étiquette poly-histidine, ledit CPP étant choisi de préférence parmi : M12-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 75, CPP1-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 76, CPP2-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 77, et CPP3-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 78. 8. La molécule d'ARNnn selon l'une des revendications 1 à 7 selon laquelle une phase de lecture ouverte code la protéine 2Apro du virus HRV2. 55 9. Une molécule d'acide désoxyribonucléique (ADN) comprenant une séquence codant l'ARNnn telle que décrit dans l'une quelconque des revendications précédentes, de préférence comprenant 5 -un promoteur reconnu par l'ARN polynnérase T7, ledit promoteur comprenant une séquence représentée par SEQ ID NO : 46; -une région 5'-UTR comprenant une séquence représentée par SEQ ID NO : 50, 71, 72, 73, 85, ou 86; -une phase de lecture ouverte ; et 10 -une région 3'-UTR comprenant une séquence choisie parmi les séquences représentées par SEQ ID NOs : 53, 54, 55, et 56. 10. Un vecteur comprenant la molécule d'ARNnn telle que décrit dans l'une des revendications 1 à 5 ou d'ADN selon la revendication 9. 15 11. Une méthode de production in vitro d'au moins un ARNnn comprenant la mise en contact de la molécule d'ADN telle que décrite dans la revendication 9 avec au moins une ARN polynnérase. 20 12. La méthode de production selon la revendication 11 comprenant une étape de purification dudit ARNnn. 13. Une composition pharnnaceutiquennent acceptable comprenant l'ARNnn selon l'une des revendications 1 à 7 et un excipient et/ou un adjuvant physiologiquement 25 acceptable. 14. La composition selon la revendication 13 pour son utilisation dans la thérapie génique ou dans la vaccination génétique. 30 15. La composition selon l'une des revendications 13 ou 14 comprenant une deuxième molécule d'ARNnn telle que décrite dans l'une des revendications 1 à 7, selon laquelle une phase de lecture ouverte code la protéine 2Apro.