FR 3084085 A1 20200124 FR 1856722 A 20180719 Méthode de biocontrôle de la fusariose des céréales La présente invention se rapporte à une méthode de biocontrôle de la fusariose des céréales, et notamment de la fusariose de l'épi de blé, par l'utilisation de souches du champignon antagoniste, Trichoderma sp. Le biocontrôle est défini comme une méthode de protection des cultures basée sur le recours à des macroor2anismes, des microorganismes, des substances naturelles et des médiateurs chimiques (comme les phéromones). La volonté de réduire la dépendance de l'agriculture aux pesticides de synthèse stimule de façon croissante l'innovation dans le domaine du biocontrôle. Les fusarioscs sont des maladies fongiques courantes des céréales, notamment causées par certains champignons des genres Fusarium et Microdochium. Le développement de ces maladies dans les cultures de céréales varie beaucoup selon les espèces et variétés considérées et selon les conditions climatiques au moment de l'épiaison et début de floraison. La fusariose de l'épi de blé peut occasionner des pertes importantes de rendement, (entre 20 et 40% du rendement en agriculture intensive) mais surtout elle peut provoquer une contamination des grains par la production de mycotoxines (telles que la mycotoxine « déoxynivalénol » ou «DON ») et donc une dégradation de la qualité sanitaire du grain de blé. Des études concernant l'utilisation de Trichoderma pour protéger les cultures de blé à l'encontre de la fusariose de l'épi de blé (« FHB » acronyme anglais de « Fusarium Head Blight »), causée par un complexe d'espèces telles que Fusarium graminearum et Microdochium nivale (M. nivale nivale et M. nivale malus) ont déjà été décrites dans la littérature. Ainsi une application sur l'épi de blé en préventif par Trichoderma harzianum a été réalisée par l'équipe indienne de Panwar at al. (2014). Les auteurs arrivent à observer une certaine protection à l'encontre de la fusariose de l'épi et proposent une combinaison de deux espèces de Trichoderma. Cependant, la combinaison de deux espèces est difficilement envisageable sur le plan industriel étant donné les difficultés à standardiser la production de plusieurs microorganismes vivants au sein d'une même préparation. En outre les souches de Trichoderma sont indiennes et les recommandations actuelles en matière de 2 règlementation européenne sont d'utiliser des souches issues du pays d'origine (souches indigènes), en l'occurrence des souches provenant de pays européens. ll est en effet important de pouvoir disposer de souches indigènes afin de limiter la prolifération d'organismes non désirés. 5 Dans la publication de Mahmoud (2016)2 il est décrit l'utilisation de Trichoderma harzianum et de Ba.cillus subi-dis à l'encontre de la fusariose de l'épi de blé. Là encore, les souches isolées sont égyptiennes, ce qui compromet une mise en oeuvre européenne. En outre le dispositif expérimental décrit dans Mahmoud (2016) est éloigné de la réalité agronomique puisque l'antagoniste (T. harzianum et/ou B. subtdis) 10 est inoculé en même temps que le pathogène Fusarium (contamination artificielle) ce qui n'est jamais le cas en culture du blé puisque les deux microorganismes ont une biologie propre et seront appliqués sur les épis à des temps différents. Enfin, il est décrit dans la publication italienne de Sirocco et al. (2013)3 l'utilisation de Trichoderma gamsii à l'encontre de la fusariose de l'épi de blé. 15 L'espèce T. garnsii possède cependant un handicap majeur : sa sporulation est insuffisante pour permettre d'envisager des applications aériennes en plein champ. Ainsi, seule une incorporation au sol est aujourd'hui envisagée en Italie pour lutter contre les attaques précoces de Fusarium. 20 Il existe donc toujours à ce jour le besoin de développer de nouvelles souches de Trichoderma sp. permettant de lutter contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariosc de l'épi de blé. Un des buts de l'invention est d'isoler de nouvelles souches du champignon antagoniste, Trichoderma sp., qui ont pour origine géographique l'Europe, et de 25 préférence la France, et qui permettent notamment de lutter contre la fusariose de l'épi de blé. Un autre but de l'invention est d'isoler de nouvelles souches de Trichoderma sp. qui puissent être appliquées de façon aérienne (par opposition au sol) sur les cultures de céréales, et notamment les cultures de blé. 30 Encore un autre but de l'invention est d'isoler de nouvelles souches de Trichoderma sp. qui puissent se substituer (au moins partiellement) aux produits chimiques fongicides du type azole actuellement utilisés sur le marché pour lutter contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariose de l'épi de blé. 3 Un autre but de l'invention est d'isoler de nouvelles souches de Trichoderma sp. qui puissent être utilisées en association avec les fongicides du type azote, dans le but de réduire significativement la dose homologuée préconisée de fongicide pour une action efficace dans la lutte contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariose 5 de l'épi de blé. De façon générale, l'invention a pour but de trouver une nouvelle méthode de biocontrôle de la fusariose des céréales, et notamment de la fusariose de l'épi de blé, qui soit une méthode alternative ou complémentaire aux méthodes de lutte contre la fusariose qui emploient principalement des fongicides du type azole. 10 Après d'intenses recherches menées par les Inventeurs sur le champignon Trichoderma sp, ces derniers ont réussi à isoler à partir de sols de cultures de blés en France des souches de Trichoderma présentant une action efficace dans la lutte contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariose de l'épi de blé. 15 Ces souches pourront encore avantageusement être utilisées avec des fongicides de type azole. Un premier objet de l'invention réside dans de nouvelles souches de Trichodernu .sp. 20 Un deuxième objet de l'invention est l'utilisation de ces nouvelles souches de Trichoderma sp. pour lutter contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariose de l'épi de blé. Un autre objet de l'invention réside dans un procédé de lutte contre la fusariose des céréales, et notamment contre la fusariose de l'épi de blé, caractérisé en ce qu'il 25 comporte une étape de mise en contact d'au moins une des nouvelles souches de Trichoderma sp. avec les céréales. Un autre objet de l'invention réside dans une composition permettant de lutter contre la fusariose des céréales, ladite composition comprenant une ou plusieurs souches Trichoderma sp. de l'invention, un agent de formulation et/ou un agent 30 adjuvant, et éventuellement un agent fongicide du type azole. Un autre objet de l'invention réside dans un kit comprenant de façon séparée une ou plusieurs souches Trichoderma sp. de l'invention et un agent fongicide du type azole. 4 Les nouvelles souches Trichoderma de l'invention sont plus particulièrement : - la souche Trichoderma harzianum déposée le 12 juin 2018 auprès de l'Institut Pasteur sous le numéro CNCM I-5326, - la souche Trichoderma harzianum déposée le 12 juin 2018 auprès de l'Institut 5 Pasteur sous le numéro CNCM I-5327, - la souche Trichoderma longibrachiatum déposée le 12 juin 2018 auprès de l'Institut Pasteur sous le numéro CNCM 1-5328. Dans un but de concision, ces souches seront respectivement dénommées dans ce 10 qui suit : - «Tr A » pour la souche déposée le 12/06/18 sous le numéro CNCM I-5326, - «Tr B » pour la souche déposée le 12/06/18 sous le numéro CNCM I-5327 et, - «Tr C » pour la souche déposée le 12/06/18 sous le numéro CNCM I-5328. 15 L'expression « souche » dans la présente demande désigne plus particulièrement une « souche de champignon filamenteux ». On entend par « souche de champignon filamenteux » un individu d'une espèce donnée composé de noyaux identiques au sein d'un même cytoplasme. Ces noyaux identiques confèrent à la souche des propriétés morphologiques, physiologiques et écologiques identiques et stables. La souche est 20 obtenue après régénération d'une spore. Si cette spore est uninucléée, cc qui est le cas chez Trichoderma, on parle alors de clone. La présente invention a encore pour objet l'utilisation d'au moins une souche Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C pour lutter contre la fusariose de céréales choisies 25 dans le groupe comprenant le blé, Brachypodium distachyott, le triticale, l'avoine, le seigle et le maïs, et de préférence le blé. Le blé, Brachypodium distachyon, le triticale, l'avoine, le seigle, et le maïs sont des céréales de la famille des Poaceae (Poacées). Lc blé ci-dessus cité désigne aussi bien le blé tendre que le blé dur. A titre 30 d'exemples de variétés de blé tendre, on pourra citer des variétés de blé tendre d'hiver telles que Rubisko, Cellule, Apache et Boregar. A titre d'exemples de variétés de blé dur, on pourra citer des variétés telles que Babylone, Miradoux et Sculptur. 5 Selon l'invention, on entend par « lutter contre » une méthode de prévention et/ou de traitement de la fusariose des céréales, et dc préférence une méthode dc prévention de la fusariose du blé. On entend par « méthode de prévention » au sens de l'invention, une prévention 5 totale ou partielle. Une prévention totale permettra d'éviter que les céréales soient contaminées par la fusariose une fois que la souche Trichoderma de l'invention aura été appliquée sur les céréales. Une prévention partielle n'empêchera pas la fusariose de se déclarer mais néanmoins les symptômes provoqués par la fusariose seront moins sévères et/ou moins d'épis seront contaminés par la fusariose. 10 Les souches Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C de l'invention sont particulièrement efficaces pour lutter contre la fusariose causée par un phytopathogène fongique du genre Fusarium et/ou Microdochium. A titre d'exemples d'agent phytotopathogène du genre Fusarium, on pourra citer 15 ceux choisis dans le groupe comprenant Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides, Fusarium equiseti et leurs mélanges. A titre d'exemples d'agent phytopathogène du genre Microdochium, on pourra citer Microdochium nivale, et plus particulièrement les deux sous espèces M. nivale malus et M. nivale nivale. 20 Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les souches Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C sont particulièrement efficaces pour lutter contre la fusariose de l'épi de blé. 25 Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les souches de Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C sont particulièrement efficaces pour diminuer la teneur en mycotoxines présentes dans le Hé, lesdites mycotoxines étant notamment le déoxynivalénol (DON). En effet, certains agents phytopathogènes du genre Fusarium comme par exemple 30 F. gratninearunt sont responsables de la production de mycotoxincs telles que DON. Dans l'Union européenne les valeurs maximales autorisées concernant les mycotoxines les plus courantes, comme le DON, dans les produits agricoles et alimentaires, ont été fixées par le Règlement 1881/2006. 6 Ainsi par voie de conséquence, les souches Trichoderma de l'invention permettent donc également de lutter contre la fusariosc de l'épi de blé en diminuant la teneur en mycotoxines DON présentes dans le blé. 5 Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'application d'au moins une souche Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C sera effectuée au niveau de l'épi de la céréale, et de préférence l'épi de blé. Plus particulièrement selon l'invention, l'application d'au moins une souche 10 Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C sera de préférence effectuée à partir du début de la floraison des céréales et jusqu'à la pleine floraison des céréales. Autrement dit, l'application d'au moins une souche Trichoderma sera avantageusement effectuée à partir du stade BBCH 61 et jusqu'au stade BBCH 65. 15 L'échelle « BBCH » (« BBCH » acronyme allemand de « Biolo2ische Bundesanstalt Bundessortenamt und CHemische Industrie ») des céréales décrit le développement phénologique des céréales à l'aide du code BBCH. Le stade « BBCH 61 » correspond au début de la floraison, les premières anthères sont visibles. 20 Le stade « BBCH 65 » correspond à la pleine floraison, 50% des anthères sont sorties. Pour une céréale telle que le blé, le risque principal d'épidémie causée par le phytopathogène Fusarium ou Microdoch um se situe à la pleine floraison des céréales, au stade BBCH 65. 25 Cependant les épidémies ne sont pas toujours synchrones et peuvent être étalées dans le temps. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, au moins une souche Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C est appliquée dès le début de la floraison des 30 céréales, plusieurs jours avant le stade BBCH 65. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, au moins une souche Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C est appliquée sur les céréales, à une 7 concentration de spores allant de 106 à 109 spores/ml dans un volume de 100 à 200 litres par hectare. El est également possible selon l'invention d'utiliser au moins une souche 5 Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C en association avec un fongicide du type azole choisi dans le groupe comprenant le prothioconazole, le tébuconazole le métconazole, le méfentrilluconazole et leurs mélanges. L'invention a ainsi encore pour objet une utilisation d'au moins une souche Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C pour une administration séparée ou séquentielle 10 avec ledit fongicide du type azole. Selon l'invention le fongicide sera appliqué de préférence après l'application de Trichoderma sur les épis. A titre d'exemple, une souche Trichoderma de l'invention pourra être appliquée dans un premier temps sur l'épi de blé au stade BBCH 61, puis un fongicide du type 15 azole pourra être appliqué dans un second temps sur l'épi de blé au stade BBCH 65. Selon un mode de réalisation de l'invention, lorsque au moins une souche Trichoderma de l'invention est utilisée en association avec le fongicide du type azole, alors la quantité de fongicide est de 10% à 60%, et de préférence de 15% à 35% de la 20 dose préconisée pour une action efficace dans la lutte contre la fusariosc. En d'autres termes, cela signifie que lorsque le fongicide du type azole est associé avec au moins une souche de l'invention, alors sa quantité préconisée pour une action efficace dans la lutte contre la fusariose peut être diminuée de 40% à 90% pour une action au moins aussi efficace, voire supérieure, que si le fongicide avait été utilisé à la 25 dose préconisée. On entend par « dose préconisée » la dose habituellement mise en oeuvre dans la pratique agricole. Ainsi les spécialités commerciales à base de tébuconazole sont homologuées à 1 1/ha (litre par hectare) mais les doses préconisées se situent plutôt à 0,8 1/ha, voire à 0,75 1/ha. 30 La dose homologuée est la dose maximale autorisée par traitement pour un produit phytosanitaire (en l'occurrence le fongicide) sur une culture et pour un organisme cible (par exemple un parasite ou un rongeur). 8 L'association d'au moins une souche de l'invention avec le fongicide du type azole est donc particulièrement avantageuse car elle permet de diminuer sensiblement les quantités de fongicide préconisées pour une action efficace. Trouver de nouveaux moyens de réduire les doses de pesticides en les associant à 5 d'autres produits répond notamment à la stratégie thématique de l'Union Européenne de 2006 (http://data.europa.eu/eli/dir/2009/128/oj) sur l'utilisation durable des pesticides. La présente invention concerne également une composition permettant de lutter contre la fusariose des céréales caractérisée en ce qu'elle comprend : 10 - une ou plusieurs souches de Trichoderma Tr A, TrB et/ou Tr C, et - un agent de formulation et/ou un agent adjuvant. L'agent de formulation et/ou agent adjuvant est un de ceux habituellement utilisé(s) dans des compositions destinées à un usage agricole. 15 La composition ci-dessus décrite peut être définie comme une composition de protection des cultures basée sur le recours à des organismes vivants et répond ainsi à la volonté de réduire la dépendance de l'agriculture aux pesticides de synthèse. L'invention a encore pour objet un kit caractérisé en cc qu'il comprend, de façon 20 séparée : - au moins une souche Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C, - un fongicide du type azole choisi dans le groupe comprenant le prothioconazole, le tébuconazole, le metconazole, le méfentrifluconazole et leurs mélanges. 25 La présente invention a encore pour objet un procédé de lutte contre la fusariose des céréales, et de préférence la fusariose de l'épi de blé, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte une étape de mise en contact d'au moins une souche Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C avec les céréales. Comme indiqué précédemment, ledit contact entre au moins une souche 30 Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C et les céréales a lieu au niveau de l'épi des céréales, et de préférence de l'épi de blé. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, dans le procédé de lutte contre la fusariose des céréales, l'étape de mise en contact d'au moins une souche 9 Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C avec les céréales est effectuée à partir du début de la floraison des céréales et jusqu'à la pleine floraison des céréales, soit à partir du stade BBCH 61 et jusqu'au stade BBCH 65. 5 Le procédé de lutte contre la fusariose des céréales, et de préférence la fusariose de l'épi de blé, est encore caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de mise en contact des céréales avec un fongicide de type affole tel que défini ci-dessus, ledit fongicide étant appliqué de façon séparée ou séquentielle avec au moins une souche Trichoderma Tr A, Tr B et/ou Tr C. 10 Selon ledit procédé le fongicide sera appliqué de préférence après l'application de Trichoderma sur les épis. L'invention a également pour objet un procédé de lutte contre la fusariose des céréales, et de préférence la fusariose de l'épi de blé, ledit procédé étant caractérisé en 15 ce qu'il comporte une étape de mise en contact. avec les céréales d'une composition comprenant : - une ou plusieurs souches de Trichoderma Tr A, TrB et/ou Tr C, et - un agent de formulation et/ou un agent adjuvant. 20 L'invention sera mieux comprise à la lumière des exemples non limitatifs et purement illustrants suivants. Les figures 1 à 4 permettent d'illustrer lesdits exemples ci-dessous. La figure 1 est une échelle de notation des symptômes (scores 0, 1, 2, 3 ou 4) sur épis de Brachypodium distachyon (écotype sauvage Bd21-3) inoculés avec la souche 25 PH-1 de Fusarium gramhzearutn. La figure 2 est une comparaison des scores observés 14 jours après inoculation de la souche PH-1 de Fusarium graminearum sur Brachypodium distachyon (écotype sauvage Bd21-3) traités ou non avec Trichoderma sp. (Tr A, Tr B, Tr C). Les figures 3 et 4 représentent le pourcentage d'épillets symptomatiques sur la 30 variété Apogee de blé tendre respectivement 7 jours (fig. 3) et 14 jours (fig. 4) après contamination par la souche PH-1 de Fusarium graminearum. 10 Tween est le témoin non infecté, Tr B est la souche Trichoderma de l'invention et Horizon@ est une spécialité commerciale de Bayer CropScicncc, dont la matière active est le tébuconazole 250 g/1 à la dose homologuée (dose «N »). Les histogrammes blancs représentent. l'infection par spray et les histogrammes 5 noirs l'infection ponctuelle. Les souches isolées et étudiées dans les exemples ci-dessous sont les trois souches Trichoderma Tr A (T. harzianunt), Tr B (71 harzianunt) et Tr C (T. longibrachimunt) telles que définies ci-dessus. 10 La souche de Fusariutn grantinearum utilisée dans les exemples 2 et 3 est la souche PH-1. Cette PH-1 a été sélectionnée pour son agressivité sur blé tendre, sa production de mycotoxines et son chémotype de type DON/15-acétyldéoxynivalénol (15 - ADON, seulement 17% de forme acétyléc sur blé, Goswami et Kisticr, 2005). 15 Exemple 1 Isolement et caractérisation des souches de Trichoderma Tr A, Tr B et Tr C Différents sols cultivés avec des blés tendres ou des blés durs ont été prélevés au cours de l'été 2015 dans le département de l'Hérault. Des carottages de petits diamètres 20 (5 cm) sont réalisés dans une même parcelle, et selon une profondeur variable de 1 à 30 cm. L'isolement et la purification de plusieurs souches du genre Trichoderma ont été réalisés sur milieux sélectifs en laboratoire dans le but de générer une collection de différentes souches issues de blé et provenant du territoire français. 25 Prélèvements et isolements des Trichoderma. Une faible quantité de terre contenant des résidus organiques est saupoudrée et immédiatement dispersée dans un milieu sélectif d'isolement « généraliste » comme. le Potato Dextrose Agar (PDA) maintenu en surfusion en boîtes de Pétri (37 à 40°C) par 30 agitation jusqu'à solidification. Dans le cas des matières organiques du sol obtenues après mise en suspension dans l'eau puis tamisage, la technique des suspensions-dilutions employée est la suivante : différentes dilutions successives de la suspension obtenue sont. incorporées 11 dans le milieu d'isolement. Pour ce faire, 10 ml de chacune des dilutions sont versés dans un erlcnmcycr contenant 90 ml de milieu sélectif d'isolement maintenu en surfusion au bain-marie (entre 37°C et 40°C). Après homogénéisation, les 100 ml sont répartis dans des boîtes de Petri placées dans les conditions optimales d'isolement des 5 Trichoderma. Après un temps d'incubation de 3 à 7 jours, la dilution présentant un nombre de colonies suffisant mais sans confluence est repérée. La dilution étant choisie, l'isolement des colonies peut être effectué. Les milieux nutritifs sélectifs pour les Trichodenna sont décrits ci-après. Milieu TME de Papavizas (1982) : un mélange de glucose (1 g), gélose (20 g) et 10 d'eau distillée (800 ml), est autoclave. 200 ml de jus de légumes (V8® Vegetable and Fruit luices - Campbell Soup) sont ajoutés. Le pH doit être compris entre 3,8 et 4. Du sulfate de néomycine (100 mg), de la bacitracine (100 mg), de la pénicilline G (100 mg), du chloronebe (100 mg), de la nystatine (20 mg), de la chlortétracycline HC1 (25 mg) et du propionate de sodium (500 mg) sont ajoutés au milieu encore tiède. 15 Milieu TSM d'Elad et al. (1981) : ce milieu est constitué de MgSO4, 7H20 (0,2 2) ; K2HPO4 (0,9 g) ; KCl (150 mg) ; NH4NO3 (1 g) ; glucose (3 g) ; chloramphénicol (250 mg) ; fénaminosulf (300 mg) ; quintozène (200 mg) ; rose bengale (150 mg) ; gélose (20 g) ; eau distillée (1000 ml). Milieu de Davct (1979) : Ca(NO3)2 (1g), CaCl2, 2H20 (1 g) ; KNO3 (250 mg) ; 20 MgSO4, 7H20 (250 mg) ; KH2PO4 (125 mg) ; saccharose (2 g); acide citrique (50 mg) ; gélose (25 g); eau distillée (1000 ml). Après autoclavage, le pH est ajusté à 4,5 avec du HC1 1N et du sulfate de streptomycine (30 mg), de la vinchlozolinc (2,5 mg) et de l'alcool allylique (0,5 ml) est ajouté au milieu tiède. L'isolement des populations de Trichodermca est réalisé après croissance des 25 colonies en boîte de Petri à 24°C, à la lumière pendant 3 à 7 jours. La purification est effectuée par isolement monospore de chacune des colonies (obtention de clones). Pour chaque colonie, les spores sont prélevées, puis mises en suspension dans de l'eau stérile afin de les dissocier. On réalise une culture séparée pour chaque spore 30 dissociée (au microscope) sur un milieu gélose riche tel que le PDA ou les flocons d'avoines en boîte de Pétri. 12 Par la suite, l'aspect morphologique de ces souches lors des croissances sur divers milieux de cultures est à identifier afin de déterminer un premier classement des souches isolées. Les caractéristiques observées sont l'évolution de la couleur des colonies en 5 fonction du temps, l'aspect morphologique du thalle (agrégats, revers, etc...) et des conidies (forme, taille, granulométrie ou lisse, groupées ou non, etc...). L'observation microscopique à faible grossissement (x40) révèle le type d'arborescences et leurs formes de résistances (chlamydospores ou autres). A plus fort grossissement, l'organisation des structures conidiogènes est étudiée 10 (ramifications, conidiophore, phialides, conidiospores). La température de croissance optimale des clones de Trichoderma est déterminée sur milieux classiques comme le malt-agar, le PDA, la pulpe de betterave, les flocons d'avoine, avec un pH compris entre 4 et 7. 15 Caractérisation moléculaire des souches Trichoderma. Chaque souche a été cultivée en milieu liquide Potato Dextrose (PD, voir composition ci-dessous). 20 mL de milieu PD ont été inoculés dans un erlen de 100 mL par 1 implant mycélien de 5 mm de diamètre issu d'une culture de la souche sur boîte de Petri de milieu Potato Dextrose Agar (PDA, voir composition ci-dessous) âgée de 7 20 jours (croissance à 26°C). Chaque culture a été incubée pendant 48h à 20°C sous agitation (120 rpm). A l'issue de cette culture, le mycélium est récolté par filtration sur Miracloth (Calbiochcm, Toulouse) stérile, séché dans du papier filtre stérile puis congelé à l'azote liquide et stocké à -80°C jusqu'à utilisation. Chaque mycélium congelé est broyé en une poudre fine à l'azote liquide puis 25 l'ADN génomique est extrait selon le protocole décrit par Atoui et al. (2012). L'ADN génomique obtenu est dosé par spectrophotométrie (NanoDrop, Thermo Scientific) à 260 nm. Des réactions d'amplification par PCR sont ensuite réalisées à partir de 10 ng d'ADN génomique de chaque souche de Trichoderma à l'aide de deux couples 30 d'amorces spécifiques : le premier est spécifique du gène EF1, gène unique codant un facteur d'élongation de la traduction et le second d'une région de l'ADN ribosomique, ris 1 (Internai Transcribed Spacer). Le protocole utilisé est celui décrit par Al-Sadi et al. (2015)5. 13 La séquence nucléotidique des amorces est indiquée dans le tableau ci-dessous : Nom de Séquence nucléotique Référence l'amorce ITS1-F 5' -TACAACTCCCAAACCCAATGTGA-3' Notre étude ITS1-F 5' -CCGTTGTTGA A AGTTTTGATTCATTT-3' Notre étude EF1-728F 5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3' (Carbone and Kohn, 1999)6 EF1-986R 5'-TACTTGA AGGA ACCCTT ACC-3' (Carbone and Kohn, 1999) Les produits d'amplification sont ensuite déposés sur gel d'agarose (Tris Borate EDTA 0,5X - agarose 1,5%), purifiés à l'aide du kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean- 5 up kit (Macherey-Nagel) et ligués dans le plasmide pGEM-T Easy (Promega, France), selon les recommandations des fournisseurs. Les produits de ligation sont introduits par la méthode du choc thermique dans des cellules bactériennes thermocompétentes de la souche DH5a d'Escherichia coli sélectionnées sur boîtes de Petri de milieu « Luria Bertani Agar » (« LBA », ThermoFischer Scientifics, France) additionné d'ampicilline à 10 une concentration finale de 100 pg/mL 5 clones résistants à l'ampicilline indépendants sont sélectionnés par réaction d'amplification. Après une croissance sous agitation (250 rpm) à 37°C pendant une nuit dans 5 mL de milieu Luria Bertani (LB, ThermoFischer Scientifics, France) + ampicilline (100 pg/mL) les cultures sont culottées puis l'ADN plasmidique de chaque 15 culture est extrait à l'aide du kit NucleoSpin® Pl asmid (Machercy-Nagel). La séquence du produit de PCR est ensuite déterminée par envoi des plasmides pour séquençage (Eurofins Gcnomics, Allemagne). L'identité des séquences nucléotidiques des 5 clones issus du même produit d'amplification est vérifiée, elle garantit la pureté des souches (contrôle qualité de 20 l'étape de purification : dans le cas de produits d'amplification de séquences différentes, le processus est repris à partir de l'étape de purification). Afin de déterminer l'espèce de chaque souche de Trichoderma, les séquences des produits d'amplification spécifiques du gène EF1 et de la région 1TS1 sont utilisées comme appâts pour la recherche de séquences identiques ou très proches dans les hases de données NCB I 25 (https://blast.ncbi.nlm.nih.2ov/) et TrichoKEY (http://w w w.isth.info/tools/molkey/), respectivement. 14 Milieu PD : 1 litre d'eau du robinet contenant 200 g de pommes de terre coupées en morceaux est porté à ébullition. L'ensemble est filtré sur coton cardé et complémenté de 20 g de glucose. Le volume est ajusté à 1 litre avant d'autoclaver 20 minutes à 120°C. 5 Milieu PDA : même composition que le milieu PD avec addition de 20 g/L d'agir. Exemple 2 Efficacité de Trichodertna sur le pathosystème Fusariu n I Brachypodium 10 distachyon en conditions contrôlées Brachypodium distachyon (B. distachyon), étudié dans cet exemple, est une espèce monocotylédone de la famille des Poaceae, sous-famille des Pooideae. Son génome relativement petit pour une graminée, sa petite taille, son cycle court et sa 15 proximité taxinomique avec des céréales majeures ont déterminé son choix comme organisme modèle en génomique des graminées. I. Méthodologie Matériel biologique (plantes et champignons) 20 Les semences de B. distachyon de l'écotype sauvage Bd21-3 sont stérilisées dix minutes dans de l'hypochlorite de sodium 0,6% sous agitation douce puis rincées trois fois à l'eau milli-Q a stérile dans les mêmes conditions. Les semences sont ensuite placées à 4°C durant 4 jours, dans l'obscurité et dans de l'eau milli-Q ® stérile. Le semis a lieu sur un mélange 2/1 (v/v) de terreau et de 25 perlite, dans des pots de 13 cm de diamètre avec une densité de 5 graines par pot. La croissance se déroule dans les conditions suivantes : 20 h de lumière à 24°C et 4h d'obscurité à 20°C afin de s'affranchir de la vernalisation et de synchroniser la floraison. Les souches (Trichoderma et PH-1) sont cultivées sur milieu Potato Dextrose 30 Agar (PDA) additionné d'ampicilline et de kanamycine à une concentration finale de 100 et 50 pg/1, respectivement, dans une étuve à 26°C et sont repiquées toutes les 2 à 3 semaines. 15 A partir d'une culture âgée de F. grantinearum (souche PH-1) de 15 jours sur milieu PDA, 30 ml dc milieu Mung Bcan dans un erlenmeyer de 150 ml sont inoculés avec 10 implants mycéliens d'environ 5 mm2 chacun. Le milieu est incubé 7 jours à température ambiante et sous agitation (130 rpm). A l'issue de cette incubation, un 5 nouveau volume de Mung Bean est inoculé avec 1/10 de volume de la première suspension de conidiospores et est à nouveau incubé 7 jours à température ambiante sous agitation. La suspension de spores est filtrée sur Miracloth stérile et les conidiospores sont dénombrées sur cellule de Thoma puis resuspendues dans du Tween 20 (surfactant) à 0,01% à une concentration finale de 105 conidiospores/mL. 10 Des suspensions de spores de chacune des trois souches de Trichoderma sont préparées séparément à partir d'une culture sur milieu PDA de 7 jours. Les spores sont récupérées à l'aide d'un scalpel à bout rond puis déposées dans 1 ml de Tween 20 à 0,01%. Des dilutions successives sont réalisées afin de pouvoir faire un comptage de la concentration en spores à la cellule de Thoma. Chaque suspension de spores Tr A, Tr B 15 et Tr C est ensuite ajustée à 107 sp/ml dans du Tween 20 à 0,01%. Technique d'inoculation L'efficacité des trois souches de Trichoderma sp. in planta contre la fusariose des épis a été visualisée en pulvérisant jusqu'à ruissellement sur l'ensemble des épis de B. 20 distachyon une suspension dc sports à 107 spiral 48h avant l'inoculation ponctuelle de F. graminearum réalisée, elle, au stade BBCH 65 sur la plante modèle B. distachyon. 48h après la pulvérisation de Trichoderma, l'inoculation ponctuelle de la souche PH-1 de Fusarium gramineartun s'effectue sur le 2ème épillet en partant du haut de l'épi concerné. Il est inséré 3p1 de la suspension de spores de PH-1 à une concentration 25 de 105 spores/ml, entre les glumelles inférieure et supérieure d'une fleur située au milieu de l'épillet, afin de synchroniser les symptômes. Les plantes inoculées sont ensuite placées en conditions contrôlées suivantes : température 20°C, hygrométrie de 65% et un cycle de jours courts (8h de jour et 16h d'obscurité). 30 Une notation des symptômes est effectuée à 7, 10 et 14 jours après inoculation de PH-1 suivant une échelle de notation des symptômes (voir Figure 1). 16 Les photos de la figure 1 illustrent la correspondance « symptômes/score » d'épis de B. distachyon (écotype sauvage Bd21-3) inoculés par la souche PH-1 de F. graminearum. 5 2. Résultats Les résultats des scores obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous et à la Figure 2. Tableau 1 : Evaluation in planta de l'efficacité des 3 souches Trichoderma .sp. (Tr A, Tr B et Tr C) à l'encontre de la souche PH-1 de F. gramineartun. Souches Témoin* TrA TrB TrC Moyenne des scores' 2,89 +/- 0,68 2,16 +/- 0,75 1,85 +/- 0,65 2,47 +/- 0,57 Erreur standard 0,06 0,07 0,06 0,05 p valueb 30 dans chaque modalité) 15 % efficacité = ((score moyen Témoin - score moyen souche) / score moyen Témoin) x 100 3. Discussion Les différents tests réalisés montrent une diminution significative de la fusariose 20 après une application préventive des 3 souches Trichoderma Tr A, Tr B et Tr C de l'invention (voir Tab. 1, Fig. 2). Les souches indigènes Tr A et Tr B, dont l'analyse moléculaire a montré qu'elles appartiennent à l'espèce Trichoderma harzianum et qui ont été isolées à partir de sol de champs de blé montrent une efficacité supérieure à 20%. 25 De plus, les symptômes à 14 jours sont significativement plus faibles sur les plantes pré-traitées par ces deux souches par rapport à celle non traitées. 17 Les souches Trichoderma de l'invention sont particulièrement avantageuses de par leur origine (puisqu'elles sont issues de sol de blé français) mais également de par leur criblage sur la céréale modèle, Brachypodium distachyon. En effet, le criblage de souches Trichodertna d'intérêt in planta est une avancée 5 majeure car la totalité des travaux décrits dans la littérature concerne des sélections in vitro et pas in planta. Les mécanismes d'action de Trichoderma sont complexes (métabolites secondaires, enzymes, stimulation de défense des plantes, compétitivité) et sont en faveur d'une sélection in planta des souches, difficiles à mettre en oeuvre sur Né (trop long et complexe). 10 Les Inventeurs ont avantageusement réussi à valider l'utilisation de la céréale modèle B. distachyon comme un moyen de sélectionner les meilleurs candidats à tester sur blé. Ces résultats confirment l'intérêt des souches Trichoderma de l'invention pour lutter contre la fusariose des céréales, et notamment la fusariose de l'épi de blé. 15 Exemple 3 Tests d'efficacité in planta de la souche Trichoderma. Tr B contre le développement de la fusariose de l'épi sur blé de printemps, variété « Apogee » 20 Méthodologie Les semences de blé variété de printemps Apogee sont stérilisées et ensemencées dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 2. De même, les souches (Trichoderma et PH-1) sont cultivées dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 2. 25 Test in planta Le test in planta est basé sur une inoculation préventive des épis par Trichoderma Tr B, 48 h avant le stade BBCH 65. Trichoderma est inoculé par pulvérisation jusqu'à ruissellement sur épis de blé à l'aide d'une suspension de spores calibrée à 10' 30 spores/mL. Deux jours (48 h) après l'apport de Trichoderma Tr B, une infection par PH-1 est réalisée. Deux techniques d'infection ont été testées : 18 (1) une infection ponctuelle de PH-1 est réalisée entre les glumelles inférieures et supérieures d'une fleur du Têtue épillet, afin de synchroniser les symptômes ; (2) une infection par spray (pulvérisation) permet de pulvériser une suspension de spore titrée sur l'ensemble de l'épi. 5 Les plantes sont incubées en chambre climatique dans les conditions suivantes : 16h de lumière à 24°C +/- 5°C sous lampe fluorescente (265pE x 111-2 x s-1) au niveau du sol). Les lectures de symptômes sont faites en fonction du temps à l'aide d'une échelle de notation par dénombrement des épillets symptomatiques sur le nombre total 10 d'épillets de chaque épi (soit le pourcentage d'épillets symptomatiques). Les résultats sont présentés dans les figures 3 et 4. Discussion et conclusion 15 Les différents tests réalisés montrent une protection de l'épi à l'encontre de la fusariose par la souche Trichoderma Tr B de l'invention, que ce soit par apport ponctuel du Fusarium dans une fleur de chaque épi ou par pulvérisation du Fusariwn sur l'ensemble des épis. A 7 jours (fig. 3), le pourcentage d'infection des épis par PH-1 est de moins de 20 50% (contre 100% pour le témoin Tween) avec TrB seul. La souche TrB est capable d'apporter une protection significative contre la fusariose dans les conditions expérimentales décrites, et ce quel que soit le mode de contamination de Fusarium. 25 La dose de fongicide Horizon® utilisée est la dose homologuée (dose « N ») (qui est de 250 2/1 de tébuconazole). La dose N utilisée dans les conditions contrôlées apporte une protection de façon satisfaisante à 7 j (fig. 3) et 14 jours (fig. 4) à l'encontre de la fusariose. La dose N/5 est cependant nettement moins efficace puisque on observe : 30 - plus de 20% d'infection à 7 jours pour N/5 (contre moins de 5% pour N) (fig. 3), - environ 40% d'infection à 14 jours pour N/5 (contre moins de 10% d'infection pour N) (fig. 4). 19 Ainsi, si on envisage, pour des contraintes économiques et écologiques de diminuer le recours aux fongicides de synthèse, on comprend aisément l'intérêt de développer des solutions alternatives et/ou complémentaires telles que celles proposées dans l'invention afin d'obtenir une protection satisfaisante des cultures, et notamment 5 contre la fusariose du blé. 20 Références bibliographiques (1) Panwar V., Aggarwal A, Singh G., Verma A., Sharma I., and Mahender Singh 5 Saharan., 2014. Efficacy of foliar spray of Trichoderma isolates against Fusarium graminearum causing head blight of wheat. Journal of Wheat Research, 6(1), 59-63. (2) Mahmoud A.F., 2016. 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(7) Goswami RS, Kistler HC (2005) Pathogenicity and in planta mycotoxin accumulation among members of the Fusarium graminearum species complex. 25 Phytopathology 95: REVENDICATIONSI. Souche derma harzianunr déposée le 12 juin 2018 auprès de la Collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) e du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, sous le numéro CNCM 1-5327. 2. Utilisation de la souche Trichodenna harzianum selon la. revendication I, pour lutter contre la fusariose de céréales choisies dans le groupe comprenant le blé, Brachypodium distachyon, le triticale, l'avoine, le seigle et le maïs, et de préférence le blé 3. Utilisation selon la revendication 2, dans laquelle la fusariose est causée par un phytopathogéne fongique du genre FUSCITilil -TIOU Microdochhan. 4. Utilisation selon la revendication 2 ou la. revendication 3, pour lutter contre la fusariose de l'épi de blé. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, pour diminuer la teneur en mycotoxines présentes dans le blé, lesdites mycotoxines étant notamment le déoxynivalenol (DON). 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans laqueliela souche Trichoderma harzianum est appliquée au niveau de l'épi de la céréale, et de préférence l'épi de blé. 7. Uilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans laqueliela souche Trichoderma harzumum est appliquée à partir du début de la floraison des céréales et jusqu'à la pleine floraison des céréales. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, dans laquelle la souche 30 Trichoderma harzianum est appliquée sur les céréales, à une concentration de spores allant de 10b à I a.esiml dans un volume de 100 à 200 litres par hectare. 10 20 22 Notif INRi Nov18 FRIS 56721 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 8 dans laquelle la souche Trichtxtlerma harzicatitm est associée avec un fongicide du type azote choisi dans le groupe comprenant le prothioconazole, le téhuconazole, le métconazole' le méfentritiaconazole et leurs mélanges. 10. Utilisation selon a revendication 9, pour une administration séparée ou séquentiel) avec ledit fongicide. 11. Utilisation selon la revendication 9 ou 10, dans laquelle la quantité de fongicide est 10 de 10% à 60%, et de préférence de 15% à 35% de la dose préconisée pour une action efficace dans la lutte contre la fusariose. 12. Composition permettant de lutter contre la fusariose des céréales caractérisée en ce qu'elle comprend : - une souche D-ichoderma harziamun telle que définie dia revendication 1, et - un agent de formulation etiou un agent adjuvant. 13. Kit caractérisé en ce qu'il comprend, de façon séparée : - une souche Trichoderma harziaimm telle que définie à la revendication 1, 20 n fongicide du type azote choisi dans le groupe comprenant le prothioconazole, le tébuconazole, le métcona.zole, le méfentrifuconazole et leurs mélanges.