FR 2998800 A1 20140606 FR 1203276 A 20121203 - 1 - «Composition pharmaceutique ou diététique pour inhiber l'action des médiateurs de la douleur, de l'inflammation et de la dépression utilisable comme médicament analgésique, anti-inflammatoire, antidépresseur et antitussif.» La présente invention concerne une nouvelle application thérapeutique ou diététique de Meiocarpidium lepidotum (Oliv.) Engl. & Diels On sait que le Meiocarpidium lepidotum, fait partie de la famille des Annonacées que l'on retrouve principalement au Cameroun, Gabon, Guinée équatoriale, République du Congo, République Centrafricaine. Le déposant a constaté, de façon surprenante, qu'un extrait aqueux de l'écore du tronc, de racine était utilisables en tant que composition pharmaceutique ou diététique à base de plante pour inhiber ou bloquer les neurotransmetteurs de la douleur et notamment: en tant que médicament analgésique c'est-à-dire pour lutter contre la douleur, en tant que médicament anti-inflammatoire c'est-à-dire pour lutter contre les inflammations et les maladies inflammatoires comme par exemple les inflammations de la gorge et du larynx, le rhumatisme et les oedèmes articulaires, en tant que médicament antidépresseur, c'est-à-dire contre les dépressions 20 nerveuses et les maladies qui y sont associées, en tant que médicament anxiolytique, c'est-à-dire l'anxiété et les maladies qui y sont associées, en tant que médicament antispasmodique, c'est-à-dire contre les coliques intestinales et les dyspepsies fonctionnelles du tube digestif et les maladies 25 inflammatoires qui y sont associés comme le syndrome de l'intestin irrité. - 2 - en tant que médicament myorelaxant c'est-à-dire pour relâcher les muscles lisses et striés notamment au cours des lombalgies, les déplacements des vertèbres des os et des disques de la colonne vertébrale et du cou et également pour relâcher les muscles au cours des opérations chirurgicales, en tant que médicament ou produit diététique à base de plante pour lutter contre les courbatures qui accompagnent les états de fièvre ou des activités musculaires notamment des états grippaux, en tant que médicament ou produit diététique à base des plantes pour soigner ou calmer les quintes de toux sèches ou pas sèches accompagnés ou pas par l'irritation ou l'inflammation de la gorge et/ou des voies respiratoires. Cependant, l'application préférée de l'extrait aqueux de Meiocarpidium lepidotum est le traitement de la toux sèche et des inflammations de la gorge et du larynx. L'extrait aqueux de Meiocarpidium lepidotum, selon l'invention, peut ou ne pas renfermer en outre une autre un extrait aqueux d'au moins une deuxième plante suivant: polyalthia oliveti Engl, Pachypodanthium Confine Engl, Isolona campanulata Engl et Diels, Anona muricata, Annodium manu, dans l'une ou l'autre espèce. Les extraits aqueux de toutes les plantes utilisées selon l'invention contiennent 20 des terpènes et des dérivés tri terpénique dans des proportions de 0.1% à 99% du poids total de l'extrait de la plante. La composition pharmaceutique selon l'invention peut être présentée sous forme de médicament administrable par voie orale, anale ou toute autre voie d'administration des médicaments connue de l'homme de métier. 25 -3 Les médiateurs de la douleur Les médiateurs de la douleur, de l'inflammation et de la dépression sont des substances chimiques fabriquées par notre organisme ou non et dont certains servent comme des neurotransmetteurs. Parmi ces médiateurs de la douleur, 5 de l'inflammation et la dépression ont peut citer d'une manière non exhaustive : les anaphylatoxines, les bradykinines, les cyclooxygénase, les cytokines, l'histamine, les kinines, le facteur C3, les leucotriènes, le N-méthyl-D-aspartate, le PAF, les prostacyclines, la substance, les prostaglandines, la sérotonine, les thromboxanes et autres prostanoïdes, TNF-a, IL-1p. Les médiateurs de la 10 dépression sont entre autres: dopamine, monoamine oxydase, noradrénaline, sérotonine. Toux, allergie. Certains de ces médiateurs de la douleur peuvent être impliqués dans les mécanismes de la toux et des allergies comme l'histamine. Les antitussifs et les 15 produits pour soigner les allergies peuvent être des inhibiteurs de ces médiateurs de la douleur et de l'inflammation. Contraction musculaires et les myorelaxants Beaucoup des médiateurs de douleurs peuvent provoques des contractions des muscles lisses et striés. Il en est le cas de la sérotonine et de l'histamine qui 20 entrainent la contraction des muscles lisses intestinaux. Inhiber leur action avec des les antispasmodiques permet d'induire la myorelaxation des muscles. Les myorelaxants permettent de provoquer le relâchement des muscles contractés, ce relâchement est important pour les lombalgies et le mal du dos dûs à la contraction excessive des muscles. 25 Le processus inflammatoire qui atteint un tissu comprend une cascade d'événements qui sont liés les uns aux autres et qui ont pour but final d'éliminer l'agent inflammatoire au bout d'un certain temps par des processus de réparations, ou de modifier les tissus environnants dans le cas de l'inflammation - 4 - chronique. La persistance anormale du processus inflammatoire aura des conséquences indésirables sur les fonctions des organes touchés et sur tout l'organisme. C'est dans ces types de pathologies (rhumatismes, oedème articulaire) que les anti-inflammatoires trouvent tout leur sens. Le processus inflammatoire. Le processus inflammatoire débute le plus souvent par une phase vasculaire presque immédiatement après contact avec l'agent phlogistique et, caractérisé par l'augmentation de la perméabilité vasculaire entraînant une vasodilatation prolongée (rougeur et gonflement). Cette vasodilatation est à la fois initiée et entretenue par des médiateurs chimiques comme l'histamine ou la sérotonine, libérés par des mastocytes et des polynucléaires. Cette vasodilatation est maintenue par des substances à action plus lente ou plus prolongée comme les kinines, et certaines fractions du complément. Le complément, et plus particulièrement le facteur C3, va interagir dans 15 l'enchaînement des processus inflammatoires. L'activation du complément libère des anaphylatoxines, qui provoquent à leur tour la libération de l'histamine. Ces médiateurs chimiques ont pour rôle d'attirer différentes cellules par chimiotactisme (polynucléaires, macrophages, phagocytes), sur les lieux de 20 l'inflammation où elles libèrent elles aussi des médiateurs chimiques (histamine, leucotriènes, PAF acéther). La production de radicaux libres intervient également lors de la synthèse des prostaglandines à partir de l'acide arachidonique, par l'intervention d'enzymes comme la peroxydase. Or les membranes cellulaires, riches en lipides 25 insaturés, vont être une cible de choix pour les radicaux libres oxygénés. Une cascade de réactions oxydatives conduira à la désorganisation de la membrane avec libération d'hydroperoxydes lipidiques ROOH* et de radicaux alcoperoxy R02. - 5 - L'enzyme cyclooxygénase (COX) catalyse la biotransformation de l'acide arachidonique en prostaglandine G2. L'acide arachidonique sert de précurseur pour la synthèse des prostaglandines, prostacyclines et thromboxanes qui sont collectivement appelés prostanoïdes. L'activité de l'enzyme cyclooxygénase est le site d'action des AINS. Cependant, l'inhibition de biosynthèse des prostanoïdes est associée à des effets secondaires tels que l'ulcération et l'altération des fonctions rénales. Les dégâts gastro-intestinaux des AINS sont généralement attribués à deux acteurs, à savoir une irritation locale par le groupement acide carboxylique commun à la plupart des AINS (effet topique), et diminution de la protection des tissus par les prostaglandines. Il a été bien établi que les cellules expriment deux isoformes de la cyclooxygénases, à savoir cyclooxygénase-1 (COX-1) et de la cyclooxygénase-2 (COX-2). La COX1 est exprimée dans de nombreux tissus normaux et est la forme majeure présente dans les plaquettes, les reins, les voies gastrique interne et jouent un rôle clé dans les processus physiologiques, tandis que la COX-2 est une forme inductible par de nombreux cytokines pro-inflammatoires et les mitogènes. La COX-2 n'est généralement pas détectable dans les tissus normaux, mais il est élevé dans un état inflammatoire et est également impliqués dans les cancers du côlon, et la maladie d'Alzheimer. La COX-2 est également constitutivement exprimé dans les reins, cerveau, de la moelle épinière et dans la muqueuse de I' l'estomac. Comme la plupart des AINS inhibent à la fois les deux isoformes de l'enzyme COX. Actuellement le principal objet de la recherche est de découvrir des agents, qui inhibent collectivement la COX-2 inductible avec peu ou pas d'effet sur la COX-1. La douleur Le message nociceptif périphérique est véhiculé par différentes fibres nerveuses ou nocicepteurs polymodaux, fibres A delta et C de petit calibre, activées par des stimulations mécaniques, thermiques et chimiques. De nombreuses substances chimiques participent à la genèse des messages nociceptifs (histamine, sérotonine, prostaglandines.). Par ailleurs, des neuropeptides, comme le peptide lié au gène de la calcitonine et surtout la substance P, ont vu leur rôle clairement démontré dans l'activation de - 6 - l'inflammation neurogène précoce. D'autres substances (bradykinine, cytokines.) sont impliquées dans la persistance du processus douloureux, ainsi que le facteur de croissance neuronale, qui accroît l'excitabilité cellulaire des nocicepteurs et favorise l'action du système sympathique qui joue un rôle majeur dans le contrôle de la douleur. Du fait de la diversité de ces substances interagissant toutes entre elles, l'approche pharmaco thérapeutique est extrêmement complexe. Cependant, de nouvelles voies thérapeutiques ont ouvert des perspectives intéressantes, notamment la recherche d'inhibiteurs spécifiques de la cyclooxygénase (COX2), induite par le processus inflammatoire, qui respecteraient la COX1, constitutive et physiologique, offrant ainsi une meilleure tolérance que les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) actuels qui agissent sur les deux COX. La synthèse d'antagonistes de la bradykinine, de la substance P et des récepteurs au N-méthyl-D-aspartate constitue un des axes de recherche majeurs pour la mise au point d'analgésiques. La notion de centre unique de la douleur est remise en cause par le fait que, aux différents niveaux du circuit de la douleur, le transfert de l'information nociceptive est constamment modulé par différents systèmes de contrôle. Ainsi, au niveau segmentaire, l'activation des fibres cutanées de gros calibre (Aa et b bloque les stimuli douloureux véhiculés par les fibres de petit calibre. Ce mécanisme de gate control de la corne postérieure de la moelle est utilisé en thérapeutique par les techniques de neurostimulation électrique. Les aspects pharmacologiques sont moins bien connus et dépendent pour partie des systèmes gabaergique et endomorphinique. Les contrôles d'origine supraspinale passent par les voies descendantes inhibitrices et sont très complexes. Ils mettent en jeu les voies bulbospinales sérotoninergiques et les voies noradrénergiques dont les effets s'exercent par la stimulation des récepteurs a2-noradrénergiques. La mise en évidence de ces systèmes offre de nouvelles perspectives dans la lutte contre la douleur.30 Dépression Il existe plusieurs définitions de la dépression, traduisant la complexité du tableau clinique. Cependant, la DSIVI-IV (Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 4ème éditions) et la CIM - 10 Classification internationale des 5 maladies, version 10, constituent les références au niveau international. Selon le DSM-IV un épisode dépressif majeur (EDM) se caractérise par une humeur dépressive ou une perte d'intérêt ou de plaisir généralisée pendant au moins deux semaines consécutives, et ce pratiquement toute la journée et presque chaque jour. Alors que les versions précédentes du DSM 10 caractérisaient la pathologie uniquement sur une symptomatologie clinique, la notion de retentissement des symptômes sur les activités de la vie quotidienne est devenue un critère nécessaire dans le DSM-IV. Selon la définition de Guelfi, «l'état dépressif est un syndrome habituellement constitué de deux symptômes fondamentaux, une humeur triste et une perte de 15 l'élan vital (ou ralentissement idéo-moteur) et de symptômes associés tels qu'une anxiété, des troubles instinctuels et des troubles de la libido». Physiopathologie : importance de la voie monoaminergique. La voie monoaminergique (qui implique la sérotonine, la noradrénaline et la dopamine) joue un rôle crucial dans le contrôle de l'humeur et de la cognition, 20 ainsi que dans les sécrétions endocrines et les rythmes chronobiotiques. Étant donné que ceux-ci sont tous perturbés dans les états dépressifs, il était logique d'imaginer une perturbation de la transmission monoaminergique dans l'étiologie des troubles dépressifs. Cela a été confirmé par la découverte d'un déficit en monoamines chez les patients souffrant de dépression, confirmant 25 l'importance de voies monoaminergiques compétentes pour combattre la dépression. Bien que la nature précise du déficit reste à discuter, il est clair que la transmission monoaminergique est perturbée dans les états dépressifs. - 8 - Le traitement de la dépression est basé sur une approche médicamenteuse et psychothérapeutique. Les classes des antidépresseurs sont : Les imipraminiques ou tricycliques. Les tricycliques agissent par blocage combiné de la recapture présynaptique de sérotonine, de noradrénaline et de dopamine dans les structures cortico-limbiques, d'où une augmentation de leurs concentrations extracellulaires. Les propriétés antagonistes auxiliaires des tricycliques sur différentes classes de récepteurs de sérotonine (incluant le blocage du récepteur 5HT2A/2C) pourraient contribuer à leurs actions bénéfiques. Les inhibiteurs de la monoamine oxydase: En bloquant l'enzyme clé de la voie catabolique de la sérotonine et de la noradrénaline et de la dopamine, la monoamine oxydase (MAO), les inhibiteurs des MAO (IMAO) augmentent la concentration synaptique de l'ensemble des monoamines. Les IMAO sélectifs de type A inhibent sélectivement la monoamine oxydase de type A, métabolisant surtout la sérotonine et la noradrénaline. Alors que les IMAO non sélectifs inhibent la monoamine oxydase de type A et de type B (métabolisant surtout la dopamine). Les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine: La conviction qu'une transmission sérotoninergique (SRS) compromise serait le déficit clé à la base des états dépressifs a promu le développement des ISRS, médicaments qui interagissent de façon «sélective» avec les transporteurs sérotoninergiques. Les ISRS ont été développés dans le but de conserver les propriétés thérapeutiques des tricycliques sans leurs effets indésirables. Ces molécules inhibent de façon sélective la recapture présynaptique de la sérotonine. Ce sont les antidépresseurs les plus prescrits actuellement. Les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline : Ils agissent à la fois au niveau de la sérotonine et de la noradrénaline. Antidépresseurs divers: Miansérine et mirtazapine, Tianeptine: La tianeptine, antidépresseur inducteur de la recapture présynaptique de la sérotonine (à l'opposé des antidépresseurs sérotoninergiques), paraît aussi efficace que 2 9 9 8 8 0 0 - 9 - l'imipramine dans les états dépressifs modérés. Composition pharmaceutique et/ou diététique renfermant au moins un extrait aqueux de Meiocarpidium lepidotum (écorce, racine, feuille) mélangé éventuellement avec un extrait aqueux de polyalthia olive ri, ou de 5 Pachypodanthium Confine, ou de Isolona campanulata, ou de Anona muticata, Annodium manll. Les études sur les animaux de laboratoire vivants ont montré que la composition pharmaceutique selon la présente invention a des effets anti-inflammatoires, analgésiques, antidépresseurs, antispasmodiques et/ou 10 myorelaxants. Le document suivant décrit les expérimentations réalisées en laboratoire et qui seront publiés en langue anglaise après dépôt du brevet d'invention. Les figures suivantes sont : Figure 1: Spectre d'absorption ultra violet du triterpene identifié dans l'extrait 15 aqueux ce ML et ceci après chauffage pendant 45 min avec l'acide chloridrique. Spectre obtenu entre 200-800 nm. Le pic (1) a été enregistré à 265 nm. Figure 2: Variation du poids corporel des souris après 14 jours de traitement avec l'extrait aqueux de ML (2g/kg) set sous la surveillance régulière. La figure montre qu'il n'ya pas eu de variation dans la prise de poids entre les animaux 20 traités et les témoins. Figure 3: Effet de ML sur l'inflammation induite par X- carragénine dans la pale de la souris. Le résultat est représenté sous forme de pourcentage d'inhibition par rapport aux animaux témoins. La différence entre les témoins et les traités a été réalisée par l'analyse de variance à deux voies suivi du test de Bonferroni 25 ou P Figure 5: Inhibition de la douleur induite par l'injection intra-péritonéale de l'acide acétique à la souris (writhing test). Cette figure montre que l'effet analgésique de ML à 1 mg/kg est équivalente de à celui que l'on obtient avec 150 mg/kg de l'acide Acétylsalicylique (ASA). Test ANOVA à une voie suivi du test de Dunnett pour montrer la différence entre les traitements. P RÉSUMÉ Rappels : Le phytomédicament traditionnelle : Meiocarpidium lepidotum (Oliv.) Engl. & Diels (Annonaceae) est utilisé dans la communauté Fang pour traiter diverses maladies. But : Cette étude avait pour objectif de vérifier l'effet antidépresseur, antinociceptive, anti-inflammatoires et la toxicité aigüe de l'extrait de Meiocarpidium lepidotum (ML) chez les souris et les rats. Matériels et méthodes : L'extrait aqueux total de plante contenant de tri-terpène a été utilisé dans différentes études. Les études phytochimique io qualitatives ont été réalisées par les méthodes classiques et l'UV. L'activité analgésique a été évaluée en utilisant des modèles différents d'étude de la douleur, tels que les tests de flick pour l'effet du niveau central, de l'acide acétique pour l'effet périphérique, l'hyperalgésie induite par le carragénine (modèle d'inflammation) chez la souris. Chez le rat, l'activité antidépressive a 15 été évaluée par le test de natation. L'effet antispasmodique intestinal chez le rat a été évalué à l'aide d'un microdynamomètre isométrique. Résultats : Notre étude a démontré que l'extrait total aqueux extrait de ML contenant tri-terpène n'est pas toxique, et est capable d'empêcher la nociception, l'inflammation et la dépression à une concentration de 1 mg/kg de 20 poids corporel. Chez les souris, ML a induit une réduction de l'oedème de la patte. Cet effet anti-inflammatoire est similaire à celui obtenu avec 150 mg d'acide acétylsalicylique (ASA) et avec 10 mg d'indométacine pendant 3 heures. Cet effet anti-inflammatoire réduit de manière significative après 4 heures (p Mots clés: Carragénine tau flick, antinociception, anti-inflammatoire, antidépresseur, Meiocarpidium lepidotum, forêts du bassin du Congo. 1. INTRODUCTION Meiocarpidium lepidotum (Oliv.) Engl. & Diels (Annonaceae) est utilisé comme 10 phytomédicament dans la communauté Fang. Cette espèce a été retrouvée seulement dans la forêt du bassin du Congo, principalement au Cameroun, Gabon, Guinée équatoriale, le Congo et la république centrafricaine. Il n'existe pas de données disponibles de l'usage traditionnel du Meiocarpidium lepidotum (ML). Seule l'utilisation traditionnelle du bois pour fabriquer des ustensiles 15 divers a été signalé [1]. Quelques études phytochimiques ont été effectuées sur ML par rapport aux autre Annonaceae. De l'écorce de racine et la tige de ML, deux alcaloïdes ont été isolés à savoir le methoxyatherosperminine, le methoxyatherosperminine N-oxy [1], un tri-terpène (le polycarpol) et une lignane (meiocarpin) [2]. Mais le premier tri phytochimique de l'extrait aqueux n'a pas 20 montré la présence des flavonoïdes, des lignanes et des alcaloïdes, ce qui suggère que l'effet biologique obtenu n'est pas dû à l'action de ces composés. Cette étude avait pour but de vérifier l'effet anti nociceptif, antidépresseur et anti-inflammatoire et la toxicité aiguë du ML chez le rat et la souris. Les résultats montrent que l'extrait aqueux du ML a un effet antidépresseur, 25 analgésique et anti-inflammatoire et qu'il contient un tri-terpène. Cette étude valide l'usage traditionnel du ML contre dans la médecine traditionnelle contre la toux sèche et inflammation de la gorge. - 13 - 2. LES MATÉRIAUX ET MÉTHODES 2.1. Produits chimiques Tous les réactifs utilisés ont été achetés uniquement à des fins de recherche : Fluoxetine, acide acétylsalicylique, indométacine, morphine, acide acétique, X5 carragénine (Sigma-Aldrich, St-Quentin Fallavier, France). 2.2. Planter des ressources et la préparation d'extrait brut L'infusion de la plante a été préparée selon les méthodes recommandées traditionnellement, pour l'administration par voie orale. L'écorce de la tige de Meiocarpidium lepidotum (ML) a été de prélevés en juillet 2012 par Prof Bruno 10 ETO à Mekomo-Ambam, région du Sud Cameroun dans la Vallée du Ntem, a été identifié par l'Herbier National de Yaoundé, Cameroun et authentifié le numéro Voucher (N° 26084). À l'Herbier National de Libreville (Gabon), le numéro Voucher est Breteler, F.J. 13847 (WAG). Extrait total a été obtenue par une macération pendant 24 h de plante sèche (500 g) dans de l'eau distillée 15 bouillante avec agitation. Le macérer a ensuite été filtrée et lyophilisés, pour obtention de rendement de 13 % de poudre brune, et conservés à 4 ° C jusqu'à l'utilisation. 2.3. Étude phytochimique et 'analyse qualitative des principes actifs Analyse qualitative de LM pour mettre en évidence la présence de divers 20 composés phytochimiques actives a été réalisée en utilisant les mêmes méthodes standards déjà décrites [3] pour mettre en évidence la présence des flavonoïdes, tanins, saponosids, alcaloïdes et anthracénosides. Test de mise en évidence de la présence des saponosides A partir de 0,5 g de l'extrait de ML, on ajoute 5 ml d'eau distillée dans une 25 éprouvette. La solution est ensuite secouée vigoureusement et observée pour voir la présence d'une mousse stable et persistante. La mousse est ensuite mélangée avec 3 gouttes d'huile d'olive et secouée vigoureusement pour voir une formation éventuelle d'émulsion. La formation d'émulsions permet de mettre en évidence la présence des saponosides. - 14 - Test de mise en évidence de la présence des flavonoïdes Réaction d'hydrolyse : Ajouter dans 20 ml HCL (2N) dilué une partie d'un filtrat aqueuse de l'extrait (19 mg) et chauffée pendant 40 min avant et laisser refroidir à la température ambiante. Une coloration rose indique la présence de flavonoïdes. Extraction de génine : Ajouter dans 20 ml de dichloro méthane (CH2Cl2) une quantité de 20 ml de l'extrait de ML. Après avoir agité le mélange, sa décantation induit deux phases avec la présence de la phase organique (contenant de génine) au fond du tube. Caractérisation des flavonoïdes: La phase organique est mélangée et secouée avec 1 ml de solution d'ammoniaque diluée. Une coloration jaune indique la présence de flavonoïdes. Test de mise en évidence de la présence des terpénoides Réaction d'hydrolyse : Ajouter dans 20 ml HCL (2N) dilué une partie d'un filtrat aqueuse de l'extrait (19 mg) et chauffée pendant 45 min avant et laisser refroidir à la température ambiante. La présence de la couleur bleu violet au rouge violette fluorescente sous la lumière visible au UV à 365 nm indique la présence des terpénoïdes [4, 5]. Test de mise en évidence de la présence des alcaloïdes Diluer 0,5 g de l'extrait de ML dans 10 ml d'acide sulfurique aqueux à 2 % et filtrer. Ajouter à 5 ml du filtrat 3-4 gouttes de réactif de Mayer. L'apparition d'un précipité blanc indique une réaction positive. Dans la deuxième partie du test, 3 ou 4 gouttes de réactif de Draggendorff sont ajoutés au filtrat. La formation d'un précipité brun ou crème rougeâtre indique la présence d'alcaloïdes. Test de mise en évidence de la présence de tanins On fait bouillir environ 0,5 g de l'extrait de ML dans 10 ml d'eau dans un tube à essai suivi d'une filtration. On ajoute ensuite 10 ml d'HCI (2N) puis on fait - 15 - chauffer la préparation pendant 15 min. L'apparition de la coloration rouge indiquant la présence de tannins. Test de mise en évidence de la présence des anthracènosides Ajouter à 0,5 g de l'extrait de ML 10 ml d'HCI (2N) puis porter à ébullition pendant 10 min et filtré à chaud. Le filtrat est ensuite agité après mélange avec 10 ml de toluène. La phase contenant du toluène (1 ml) est ensuite transféré dans un autre tube à essai, puis on ajoute 1 ml de NaOH (1N). L'apparition de la couleur rouge violacé indique l'apparition des anthracènosides. 2.3. Les animaux Les rats mâles Wistar de 150-200 g, et les souris mâles albinos suisses de 2030 g (animalerie du laboratoire de la faculté de médecine et de pharmacie, Université Mohammed V Souissi, Rabat, Maroc) ont été gardés dans des cages, dans des conditions standards de laboratoire, avec l'eau et la nourriture standard de rat ad libitum, en un cycle de 12-h/12 h de lumière/obscurité, à la température de 21-23 ° C. L'étude a été réalisée conformément aux principes reconnus énoncés dans le « Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoires», selon les recommandations de l'académie de Sciences et publié par le l'institut national de la santé. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale et le nombre d'animaux utilisés. L'approbation éthique a été obtenue de l'université Mohammed V-Souissi, Faculté de médecine et de pharmacie, Rabat, Maroc. 2.3 Test de toxicité aigüe. L'étude de toxicité aiguë chez la souris a été réalisée selon les principes directeurs de l'OCDE pour les essais de produits chimiques [6]. Les souris Swiss mâles ont été réparties aléatoirement en deux groupes (10 souris par groupe). Les souris ont reçu l'extrait de ML (2 g/kg) par voie orale puis nourris dans les conditions standards (eau et nourriture), puis mis sous observation régulière pendant 14 jours. Les changements de comportements observés étaient l'hyperactivité, tremblements, ataxie, convulsions, la salivation, diarrhée, léthargie, sommeil, coma et éventuellement la mort. - 16 - 2.5. Test de natation forcé Le test de natation forcé ou forced swimming test (FS) a été utilisé [7]. La procédure utilisée a déjà été décrite par Detke et al. [8]. Les animaux (rats) ont été forcés de nager à l'intérieur d'un cylindre rempli d'eau et sans possibilité pour les animaux de sortir. L'anxiété qui en résulte provoque une nage vigoureuse, comme si l'animal voulait s'échapper de l'enceinte avec tentative de monter sur les parois de l'enceinte sans succès. Lorsque les arrêtent de se débattre, à l'exception de ceux qui gardent un comportement de survie (en gardant la tête hors de l'eau), le comportement est jugé immobile et classé io comme dépression induite. Le premier jour (test de pré-session), les rats sont obligés de nager pendant 15 minutes dans un cylindre acrylique contenant de l'eau à 23 ± 1 ° C (diamètre de 30 cm x 50 cm de hauteur et 40 cm de profondeur). L'eau est changée après chaque test de natation afin d'éliminer les excréments, l'urine et les poils. Après la séance de natation, les rats ont été 15 retirés du bac de natation, séchés avec des serviettes et placés sous une ampoule (32 ° C) pendant 15 à 30 minutes pour se réchauffer. La séance d'examen : animaux reçoivent une dose de leurs médicaments respectifs 1 heure (s) avant la session de test et suite ensuite testés dans les mêmes conditions pendant 6 minutes. L'immobilité et le nombre de fois où que 20 les rats s'arrêtent de nager (nombre d'arrêt) ont été enregistrés. Immobilité est classée comme l'absence de mouvement, avec le corps incliné en avant et flottant passivement et avec les pattes immobiles. L'activité de natation est enregistrée lorsque l'animal fait des grands mouvements de patte, se déplaçant autour du cylindre à une fréquence plus que nécessaire tout en gardant la tête 25 hors de l'eau. L'escalade de la paroi de l'enceinte est enregistrée lorsque le rat commence à réaliser des mouvements vigoureux avec les pattes de devant dans et hors de l'eau, généralement contre la paroi du bac de natation. 2.6. Réponse induite par l'acide acétique. Le test de douleur (l'animal se tord de douleur avec des spasmes) chez la 30 souris a été réalisé selon la méthode de Koster et al. [9]. Les contractions ont été induites par l'injection intra péritonéale d'acide acétique de 1,2 % (v/v, 0,15 - 17 - ml /20 g de poids corporel). Trois différentes doses ont été utilisées (1, 10 et 100 mg/kg) de ML administrée par voie orale pour chaque groupes de souris, 60 min avant la stimulation chimique. L'acide acétylsalicylique et la solution physiologique, ont été utilisés comme contrôles positifs et négatifs, administrait 30 min avant l'injection de l'acide acétique. Le nombre de contractions musculaires a été compté sur une période de 5 min après l'injection de l'acide acétique. Les données représentent le nombre total de contraction musculaire observée durant une période de 10 min. 2.7. OEdème de patte de souris induite par la A- carragénine. L'activité anti-inflammatoire de ML a été déterminée par le test de l'oedème de la patte induit par la carragénine chez la souris. Le test a été réalisé selon la méthode de Vinegar et al [10]. Le volume basal de la patte arrière droite a été déterminé avant l'administration d'un médicament. Puis 50 pL de 2,5 % de Àcarragénine en suspension dans une solution saline (0,9 %) a été injecté dans la face plantaire de la patte arrière droite. Le volume de la patte a été ensuite mesuré tous les heures après l'injection la carragénine à l'aide d'un plethysmometer LE 7500 (Panlab, Espagne). Le degré de gonflement a été évalué par la différence delta (a-b), où « a » représente le volume de la bonne patte après le traitement chimique et « b » le volume avant le traitement, ou [(a- b)/b] x 100, exprimée en pourcentage. L'indométacine (10 mg/kg) a été administré en intra-péritonéale, tandis que 150 mg d'acide acétylsalicylique (ASA) administré par voie orale de 30 min avant l'injection de carragénine. LM (1, 10 et 100 mg/kg) a été administré par voie orale 60 min avant l'injection de carragénine. Le contrôle (solution saline 0,9%) a été donné à un volume égal de solution saline. 2.8. Évaluation d'une activité analgésique centrale par méthode de Tall flick. L'activité analgésique centrale de LM a été étudiée dans l'essai de retrait de queue, tel que décrit par d'amour et Smith [111. La chaleur radiante a été appliquée à la base de la queue à l'aide d'un compteur de temps de radiation de la queue LE 7106 PANLAB (Harvard Bioscience, Espagne). Le temps de latence pour le retrait de la queue de la stimulation a été enregistré. L'intensité - 18 - du stimulus thermique a été créée pour susciter le retrait de la queue entre 1012 s. Une coupure automatique de la stimulation a été prévue après 20 secondes pour prévenir brulures et les dommages des tissus par une chaleur forte. Les souris de 20 à 30 g ont été répartis aléatoirement en 5 groupes de 6 animaux de chaque. Après l'enregistrement du temps de latence de base (0 h), les groupes II à IV reçoivent l'extrait ML à raison de 1, 10 et 100 mg/kg. Groupe I (groupe témoin) a reçu un volume comparable du solvant (isotonique de NaCI 0,9 %). Groupe V a reçu le chlorhydrate de morphine standard (0,1 mg/kg de poids corporel en i.p.). Les temps de latences de retrait de la queue 10 ont été mesurés à 0, 30, 60, 90 et 120 min, après l'administration de drogues. 2.9. Effet antispasmodique de ML ( jéjunum de rat isolé) Des rats mâles adultes à jeun depuis 16 h avec eau ad libitum. Animaux ont été tués par la dislocation vertébrale. Le jéjunum prélevé et rincé avec du de la solution de Tyrode frais. Le mésentère a été soigneusement retiré à l'aide de 15 pinces. Des morceaux de jéjunum environ 2,0 cm de long ont découpés et placés dans du Tyrode frais ayant une composition suivante en milli moles (mM): NaCI(136,9), KCI (2.7), CaCl2 (1.8), NaHCO3 (11.09) ; MgC12 (1,05), NaH2PO4 (0,42), glucose (5.5) à pH 7,4. Le tissu a été ensuite monté dans une chambre à organe isolé de 5 mL contenant une solution de Tyrode maintenue à 20 37 °C± 0,5 et oxygénée avec du carbogène 95 % 02 et 5 % CO2. Une tension initiale de 1 g a été appliquée au tissu et la contraction musculaire spontanée a été enregistrée à l'aide d'un microdynamomètre isométrique BioOrga® (TBC Biomécatronics, France). Le ML à différentes concentration et à dose cumulative a été ajouté directement à la chambre pour organe isolé dans des 25 volumes n'excédant ne pas 1 % du volume total de bain (5m1) et ceci après une période de stabilisation de la préparation (45 min). L'effet maximal de chaque concentration a été enregistré. 2.10. Analyse statistique L'ensemble des données sont exprimées en terme moyenne ± écart type de la 30 moyenne (S.E.M., n = nombre d'expériences). Les analyses statistiques ont été obtenues après analyse de variance à une voie (ANOVA), suivie par le test de Dunnett ou de Bonferroni. P Examen du spectre UV de l'extrait de ML après chauffage pendant 45 min dans HCI (2N) a montré un spectre proche du polycarpol un tri-terpène tétra cycliques connus (fig. 1), l'un de le triterpene identifier dans l'écorce de ML et dans quelques familles annonaceae [12, 13]. 3.2. Toxicité aiguë Au cours de l'évaluation de la toxicité aiguë de l'extrait de ML, une dose de 2,0 g/kg administrée par voie orale n'a entraîné ni la mort des souris ni les modifications de comportement. Ce qui indique que l'extrait n'a pas / ou a une faible toxicité. L'analyse histopathologique a confirmé ce résultat. D'autre part, il n'existe pas de différence de poids corporel entre les animaux traités et les témoins (Fig. 2). D'autres études seront effectuées pour confirmer l'absence de toxicité chronique, par le biais des paramètres hématologiques et biochimiques sanguins. 3.3. Activité anti-inflammatoire par test à la carragénine. L'activité anti-inflammatoire de ML a été évaluée par le test de l'oedème de la patte des souris induit par la carragénine. Les résultats sont représentés dans la Fig. 3. Les résultats montrent que l'effet de ML (1 mg/kg) est similaire à celle de l'ASA (150 mg/kg) et l'indométacine (Indo 10 mg/kg) sur la réduction de l'inflammation (c'est-à-dire l'inhibition de rcedème de la patte de souris) pendant - 20 - 3 h. Après 3 h, cet effet protecteur de ML décline (P Springer-Verlag. 1956: Berlin. 4. Wagner, H., S. Bladt, and E.M. Zgainski, eds. Plant drug analysis. Thin layer chromatography atlas. 2nd ed., ed. Springer-vera. 1984: Berlin. 299-304. 5. Rabyah, B., et al., Hypoglycemic and anti-hyperglycemic study of Phaleria macrocarpa fruits pericarp. Journal of Medicinal Plants Research 2012. 6(10): p. 1982-1990. 6. OECD, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Acute Oral Toxicity - Fixed Dose Procedure., OECD, Editor. 2002: Paris. 7. Porsolt, R.D., A. Bertin, and M. Jalfre, Behavioral despair in mice: a primary screening test for antidepressants. Arch Int Pharmacodyn Ther, 1977. 229(2): p. 327-36. 8. Detke, M.J., M. Rickels, and I. Lucki, Active behaviors in the rat forced swimming test differentially produced by serotonergic and noradrenergic antidepressants. Psychopharmacology (Berl), 1995. 121(1): p. 66-72. 9. Koster, R., M. Anderson, and and E. J. Beer, Acetic acid for analgesic 25 screening. Federation Proceeds, 1959. 18: p. 412-416. 10. Vinegar, R., W. Schreiber, and R. Hugo, Biphasic development of carrageenin edema in rats. J Pharmacol Exp Ther, 1969. 166(1): p. 96-103. - 26 - 11. D'Amour, G.E. and D.L. Smith, A method for determining loss of pain sensation. J Pharmacol Exp Ther, 1941. 72: p. 74-78. 12. Ngantchou, I., et al., Antitrypanosomal activity of polycarpol from Piptostigma preussi (Annonaceae). Fitoterapia, 2009. 80(3): p. 188-91. 13. Murphy, B.T., et al., Antiproliferative compounds of Artabotrys madagascariensis from the Madagascar rainforest.Nat Prod Res, 2008. 22(13): p. 1169-75. 14. Leboeuf, M., et al., Plantes médicinales et phytothéraoie.0 R Acad Sci., 1977. tome X1(4): p. 284-288. 15. Quevauviller, A. and M. Hamonniere, [Activity of the principal alkaloids of Polyalthia oliveri Engler (Annonaceac) on the central nervous system and the cardiovascular system]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D, 1977. 284(1): p. 93-6. 16. Bevalot, F., et al., [Annonacea alkaloids: alkaloids from the bark of the 15 stem and roots of Pachypodanthium confine Engl. and Diels].Ann Pharm Fr, 1977. 35(1-2): p. 65-72. 17. Hocquemiller, R., et al., Alcaloides des Annonacees XLIX1: alcaloides d'Isolona hexaloba, I zenkeri et I. pilosa.Planta Med, 1984. 50(1): p. 23-5. 18. Chang, C.W., et al., Analgesic and Anti-lnflammatory Activities of 20 Methanol Extract of Cissus repens in Mice. Evid Based Complement Alternat Med. 2012: p. 135379. 19. Seibert, K., et al., Pharrnacological and biochemical demonstration of the role of cyclooxygenase 2 in inflammation and pain. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91(25): p. 12013-7. 25 20. Bogdan, C., Nitric oxide and the immune response. Nat Immunol, 2001. 2(10): p. 907-16. - 27 - 21. Poleszak, E., et al., A complex interaction between glycine/NMDA receptors and serotonergic/noradrenergic antidepressants in the forced swim test in mice. J Neural Transm. 118(11): p. 1535-46. 22. Porsolt, R.D., et al., Behavioural despair in rats: a new model sensitive to 5 antidepressant treatments. Eur J Pharmacol, 1978. 47(4): P. 379-91. 23. Lopez-Rubalcava, C. and I. Lucki, Strain differences in the behavioral effects of antidepressant drugs in the rat forced swimming test. Neuropsychopharmacology, 2000. 22(2): p. 191-9. 24. Page, M.E., et al., Serotonergic mediation of the effects of fluoxetine, but 10 not desipramine, in the rat forced swimming test. Psychopharmacology (Berl), 1999. 147(2): p. 162-7. 25. Reneric, J.P., M. Bouvard, and L. Stinus, Idazoxan and 8-0H-DPAT modify the behavioral effects induced by either NA, or 5-HT, or dual NA/5-HT reuptake inhibition in the rat forced swimming test. Neuropsychopharmacology, 15 2001. 24(4): p. 379-90. 26. Haenisch, B. and H. Bonisch, Depression and antidepressants: insights from knockout of dopamine, serotonin or noradrenaline re-uptake transporters.Pharmacol Ther. 129(3): p. 352-68. 20 REVENDICATIONS1. Composition comprenant un extrait de Meiocarpidium lepidotum pour son utilisation pour inhiber l'action des médiateurs de la douleur, de l'inflammation et de la dépression. 2. Composition comprenant un extrait de Meiocarpidium lepidotum pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un extrait d'au moins une deuxième plante issue de la famille des Annonacées suivant : polyalthia olive ri Engl, Pachypodanthium confine En g!, Isolons campanulata Engl et Diels, Anona muricata, Annodium manu. 3. Composition comprenant un extrait de Meiocarpidium lepidotum pour son utilisation selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que l'extrait comprend entre 0,1 % et 99% de terpènes et dérivés terpéniques par rapport au poids total de ladite composition. 4. Composition comprenant un extrait de Meiocarpidium lepidotum pour son 15 utilisation selon les revendications 1 et 2, en tant que médicament analgésique pour inhiber la douleur et l'inflammation. 5. Composition comprenant un extrait de Meiocarpidium lepidotum pour son utilisation selon les revendications 1 et 2, en tant que médicament antidépresseur. 20 6. Composition comprenant un extrait de Meiocarpidium lepidotum pour son utilisation selon les revendications 1 et 2, en tant que médicament antitussif. 7. Composition comprenant un extrait de Meiocarpidium lepidotum pour son utilisation selon les revendications 1 et 2, en tant que médicament antispasmodique. 25 8. Composition comprenant un extrait de Meiocarpidium lepidotum pour son utilisation selon les revendications 1 et 2, en tant que médicament myorelaxant.- 29 - 9. Composition comprenant un extrait de Meiocarpidium lepidotum pour son utilisation selon les revendications 1 et 2, en tant que médicament contre l'inflammation et les irritations de la gorge et du larynx. 10. Composition comprenant un extrait de Meiocarpidium lepidotum pour son utilisation selon les revendications 1 et 2, en tant que produit diététique contre l'inflammation et les irritations de la gorge et du larynx et la toux sèche. 11. Composition comprenant un extrait de Meiocarpidium lepidotum pour son utilisation selon les revendications 1 et 2, en tant que médicament contre les allergies des voies respiratoires. 12. Composition comprenant un extrait de Meiocarpidium lepidotum pour son utilisation selon les revendications 1 et 2, en tant que produit diététique contre les allergies des voies respiratoires. 13 Composition comprenant un extrait aqueux de Meiocarpidium lepidotum selon la revendication 1-12, pour son utilisation pour inhiber la douleur, l'inflammation, la dépression, la contraction des muscles lisses au cours d'études expérimentales, fondamentales ou appliquées.