FR 2967914 A1 20120601 FR 1004627 A 20101129 i Composés inhibiteurs d'interactions proteine-proteine ciblant les protéines-kinases et leurs applications bioloqiques L'invention a pour objet des composés inhibiteurs d'interactions protéine-protéine ciblant les protéines kinases. Elle vise plus particulièrement l'utilisation de dérivés d'androstane pour inhiber les interactions entre p25 et CDK5, ainsi que les applications biologiques d'une telle utilisation. CDK5 est une kinase appartenant à la famille des CDKs (sérine/thréonine protéines kinases). CDK5 est inactive sous forme monomérique. Elle devient active lorsqu'elle s'associe à une sous-unité régulatrice correspondant soit à p35, soit à p39. Dans des conditions pathologiques, ces sous-unités régulatrices vont être tronquées, par protéolyse partielle, conduisant à des sous-unités, respectivement, p25 et p29. La présence de ces sous-unités engendre des dysfonctionnements de l'activité enzymatique des CDK5, qui n'est plus régulée, ainsi qu'une modification de son spectre de substrats cellulaires. L'implication de CDK51p25 dans différentes pathologies a été rapportée par divers auteurs. Ainsi, des changements de niveaux de phosphorylation dans la maladie d'Alzheimer ont été reliés aux variations de p25. Des études plus récentes indiquent en outre que CDK5 est également impliquée dans la migration et le potentiel métastatique de cellules tumorales. Les travaux des inventeurs ont porté sur l'étude de CDK5 comme cible thérapeutique et la recherche d'inhibiteurs de grande sélectivité. La plupart des inhibiteurs de CDK5 caractérisés jusqu'à présent agissent en mimant l'ATP, et ainsi empêchent sa fixation au niveau de la poche catalytique de l'enzyme. Par conséquent, ces inhibiteurs sont susceptibles d'interagir avec une ou plusieurs autres protéines kinases parmi celles potentiellement codées par le génome humain (plus de 500) ou encore avec une ou plusieurs autres protéines pouvant fixer l'ATP (plus de 1500). Le manque de sélectivité de ces inhibiteurs constitue donc une limitation à leur utilisation en thérapie chez l'homme ou l'animal et nécessite la mise en oeuvre d'analyses approfondies. L'invention vise à résoudre au moins en partie ce problème en utilisant des inhibiteurs qui agissent au niveau du site d'interaction entre la CDK et la sous-unité activatrice. De tels résultats indiquent que ces molécules se distinguent des inhibiteurs mimétiques de l'ATP par leur mode d'action, ce qui doit leur conférer une sélectivité améliorée, permettant de limiter les effets secondaires lors d'une application en thérapie humaine ou animale. L'utilisation par les inventeurs d'une méthode de criblage cellulaire, faisant intervenir la technique BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), basée sur le transfert d'énergie par résonance, et d'un système cellulaire, lo la levure de boulangerie (Saccharomyces cerevisiae), a permis de sélectionner des composés capables d'empêcher de manière sélective la formation du couple CDK5ip25. L'inhibition du transfert d'énergie entre une protéine luminescente et une protéine fluorescente appropriées, fusionnées respectivement à p25 et CDK5, 15 permet, en effectuant un suivi de la fluorescence, de caractériser l'interaction entre les protéines. L'invention a donc pour but de fournir une nouvelle génération de molécules inhibitrices de CDK51p25. L'invention concerne ainsi les premiers inhibiteurs chimiques de l'interaction entre CDK5 et p25. Ils présentent une 20 sélectivité élevée par rapport à cette réaction. En outre les résultats indiquent qu'ils inhibent également l'interaction entre CDK5 et p35. Elle vise également les applications thérapeutiques de ces inhibiteurs. L'invention vise ainsi, pour une utilisation comme inhibiteurs des interactions entre les protéines CDK5 et p25, les dérivés d'androstane de formule 25 (1), R (1) 30 dans laquelle 35 - R1 représente un groupe - NH2 - NH-(R3); -N(R3)2 ou -N+(R3)3 ,; -NH-COR3 ; -N(R3)- CO-R3 ; -OH ; = 0 ; tetrazolyle ; -0-00-R3, R2 représente , - CO-R3; -CH2-OH ; -C(R3) =N-OH ; -C(R3) = N - NH -C (=NH)- NH2; -C - (R3)= N-NH2; alkyle en C1-C8 linéaire ou branché; - CH(OH)-R3; =CH-R3; - CH(R3) -NH-R3 ,; - OH ; - CH - (R3) -NH-CO-R3 ; - CH(R3) -N (R3)2 ; -CH (R3) - NH2 ; - CH (R3) - N (R3)-CO-R3 ; - CH (R3) -N «R3)3) ; -CH(R3) -NH-CO- R3; oxazolonyle; H ; - (CH2)n P- (C6H5)3; une chaîne de type polyalkylène glycol avec un groupement terminal, tel que -NH2, capable d'établir une liaison sur des billes de Sépharose activées ; ou un groupe biotinyle ; avec R3 représentant un radical alkyle linéaire ou branché en C1-C3 ou H, les significations pouvant différer lorsque plusieurs R3 sont présents ; et leurs sels pharmacologiquement acceptables. L'invention couvre les racémiques des dérivés ci-dessus ainsi que les isomères géométriques et optiques. Dans un groupe préféré, - R1 représente un groupe - NH2, et - R2 représente H ou un groupe alkyle en C1-C2 linéaire. Des sels préférés de ces dérivés correspondent à des sels avec des acides minéraux comme les chlorhydrates ou bromhydrates, ou à des sels avec des acides organiques comme les tartrates, les acétates ou les salicylates. L'invention vise plus spécialement, pour cette utilisation comme inhibiteur d'interactions entre les protéines CDK5/p25, le 3a-amino-5a-androstane (également désigné par composé Al ci-après) répondant à la formule (1) dans laquelle R1 représente un groupe -NH 2 et R2 représente H. Ce composé répond à la formule (II) ci-dessous 30 De manière avantageuse, l'inhibition de l'interaction entre CDK5 et p25 est ainsi 40 obtenue à l'aide de molécules de petite taille, dont la synthèse est réalisable à l'échelle industrielle. Comme illustré par les exemples, on observe une inhibition de l'activité kinase du complexe. Cette inhibition de l'interaction a été également confirmée biochimiquement par GST pulldown. A la différence des inhibiteurs classiques de l'activité kinasique de CDK5 qui agissent par mimétisme avec l'ATP, les inhibiteurs de l'invention visent une surface cellulaire beaucoup moins conservée que la poche à ATP contenue dans les protéines kinases. La sélectivité cellulaire (nombre de protéines qui sont capables d'interagir avec la molécule inhibitrice) des composés de l'invention est potentiellement meilleure. De plus, leurs propriétés thérapeutiques sont potentiellement plus intéressantes que celles des autres inhibiteurs actuellement en cours de développement car moins d'effets secondaires sont attendus lors des l0 traitements chez l'homme ou l'animal. L'invention vise donc également les dérivés d'androstane définis ci-dessus, tout spécialement le composé Al, pour une utilisation en thérapie humaine ou animale pour le traitement des troubles impliquant CDK51p25. L'invention vise ainsi, en particulier, le traitement des troubles affectant le système nerveux central, 15 tels que les accidents vasculaires cérébraux, les maladies d'Alzheimer, de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, la perception de la douleur ; le traitement de cancers, notamment du pancréas et des glioblastomes ; du diabète et de l'insulinorésistance ; ou encore pour les traitements antiviraux, visant notamment le virus de l'herpès (herpès simplex virus type 1, HSV-1). 20 Les doses et voies d'administration pour un traitement donné seront aisément choisies par l'homme du métier en tenant compte de l'état du patient. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent qui font référence aux figures 1 à 6. Ces figures représentent, respectivement : 25 - la Figure 1, le principe de la méthode BRET (dans le cadre de l'invention, la protéine A correspond à p25 et la protéine B à CDK5) ; - la Figure 2, l'interaction entre CDK5 et p25, visualisable par BRET chez Saccharomyces cerevisiae ; - la Figure 3, le suivi en BRET dans le modèle levure d'une inhibition 30 d'interactions protéine-protéine par la Nutlin 3 ; - la Figure 4, la méthode KinaBret pour identifier des inhibiteurs d'interactions protéine-protéine ; - la Figure 5, l'inhibition de l'interaction entre CDK5 et p25 par le 3aamino-5a-androstane, 35 - la Figure 6, la validation biochimique de l'inhibition de l'interaction entre CDK5 et p25 par le 3a-amino-5a-androstane par GST pulldown. Matériels et méthodes Technique BRET Cette technique a été décrite pour la première fois en 1999 (Yu, Y. et al., Réf. 1) et permet de suivre in vivo, ex vivo ou in vitro l'interaction entre deux protéines. Le principe de cette technique réside dans le transfert d'énergie entre deux protéines appropriées, la Renilla Luciférase et la YFP (Fig.1) (Yellow Fluorescent Protein), un variant de la GFP (Green Fluorescent Protein) (Réf.2), fusionnées aux; protéines d'intérêt (p25 et CDK5 respectivement). Si les protéines luminescente et fluorescente sont proches spatialement, la protéine luminescente (RLuc) à l'état excité cède, par un phénomène de résonance, une part de son surcroît d'énergie à la protéine acceptrice fluorescente (YFP)(Fig.1). Cette dernière se désexcitera en émettant un photon de fluorescence. Ce transfert d'énergie ne pourra se faire que dans le cas où il y a proximité spatiale entre la Rluc et la YFP. Ce suivi de la fluorescence émise caractérisera donc l'interaction entre les protéines de fusion. Exemples de dérivés d'androstane criblés selon la méthode BRET Dans le tableau donné ci-après, on rapporte des exemples de dérivés d'androstane, illustrés par leur formule, étudiés selon la technoloqie BRET chez la levure de boulanqerie. Leur poids moléculaire est éqalement précisé. N° Structure Poids moléculaire 1 O CH3 _ 317, 5192 CH3 CH3 HZN. ~~ 0 CH3 H3 2 H, 396,06144 H,C,N. CÎ H3C \CH3 H s 3 "'" H 0 467,60802 44444 H CH, ~OH HO OH O 4 O 353,98017 ~ CHI CH, HzNFi CIH O 331,54629 CH3 CH3 CH3 H3C, ,,. H 6 0 345,57338 ~ CH3 CH3 - ' Hic ,N.~, H CH3 7 HO 347,54569 CH3 H CH3 0 H3C~N H H3C~, l,oH CH3 CH3 8 332,53387 ~N H 9 ///ffJJ~NH~ 410, 0506 CIH --N HM H NH, H3C , N/ 10 H 331,54914 3 ee Ôe HZNH 11 HZN "" CH3 CH3 CH3 303, 53574 H 12 CH3 398,07738 CH3 OH 'H CH3 H3C N - H C \CH3 H CI a CH3 Ha OH CH3 -H 13 347, 58932 H3C-N' H CH3 14 CIH 370,0232 CH3 CH3 OH "H CH3 H3C-N" H /CH3 CH3 CH 15 301, 5198 H HZN" H 16 HO CH 361,57278 Ha H H NH H3C ~0 17 CH3 HO CH3 347,58932 CH3 H "H H3C-N'H~ CH3 H CH3 CH3 CH3 18 CH3 333, 56223 HOC H CH3 CH3 OH - 19 291,48096 H2N ,, H CH3 CH3 CH3 0 20 CH3 361,57278 HOeW H CH3 CH3 CH3 21 331,54629 H H3C CH3 CH3 ""N \ CH3 CH3 22 347, 58932 HOe. H ro '- i ~ - z 23 639,07028 H3C CH3 N~ cH3 24 H 359,55684 25 = (II) Ae '_® H 275,2613 H2N' H cHa CH, "\ ~C CHj Î 26 e 658,53769 CH, HaC` ÇHa H3c'N CHa CHa H 27 c' 475,63489 cl HsC H HaOH3C G HaC iry .CHa CHa C ÇHa 28 G 475,63489 HaC-N "C~CHa H Ha ,CH, Fla N /- CHa Ha 29 HaC, 402,66932 HHaC~O H3 CH3 CH3 ô CH3 30388,64223 i CH3 31 H3C CH3 374,61514 ,N 3 »C ÇH3 H30 HZN" H 32 G-H H3 CH3 419,52653 CI-H CH3 ,...N CH, - Hz H 1 0 33 ,. 374, 52503 H *Ô. HO 34 CH, CH3 276,46629 HO - H 35 ÇH3 CH, ' CH3 319, 53514 N OH 1 0 3 36 '- 374, 52503 ,/ 'H HO H 37 O CH3 317,5192 CH3 CH3 HZN\ H H3C H C, 38 H A_. 388,68301 HO $0 H 39 H,C 456, 72096 CH3 CH3 , H3C N~N N-N 40 H3C 386,66707 CH3 H3C, H 0 /, ® Br ?k CI NP ('~( ® 41 ,®O- 715,80237 v O O H 0 0 42 -H0H / 390, 52443 cH, 0- $0 OH HO H Obtention des composés Al et B La synthèse du composé Al est notamment rapportée dans Réf. 3. Le composé Al peut également être obtenu par synthèse, par exemple, à partir de la funtumine (alcaloïde terpénique isolé de plantes de la famille des Apocynaceae, comme Funtumia latifolia). Le 3a-amino-17(3-hydroxy-5a-androstane est obtenu en trois étapes, comme indiqué dans réf. 4. La synthèse à partir du 3a-amino-17[3-hydroxy-5aandrostane, en deux étapes est indiquée dans réf. 5. Les rendements décrits sont très élevés. 100 g de funtumine conduisent à 78 g de N-acétylfuntumine. 2 g de N-acétylfuntumine conduisent à 1,7 g de 3a-acétamido-1713-acétoxy-5a-androstane, 11 g de 3a-acétamido-17[3-acétoxy-5a-androstane fournissent 8 g de 3a-amino-17[3-hydroxy-5a-androstane, comme décrit dans réf. 1. Puis 10 g de 3a-amino-1713-hydroxy-5a-androstane produisent 9 g de 3a-amino-17-oxo-5a-androstane, et 5 g de 3a-amino-17-oxo-5a-androstane conduisent à 4 g de 3a-amino-5a-androstane. Formule chimique : C19H33N PM : 275, 4720 m/z : 275, 2613 (100 %), 276, 2647 (20,5 %), 277, 2680 (2,0 %) Analyse élémentaire : C, 82,84 ; H, 12,07 ; N, 5,08. Ce composé a été purifié par HPLC préparatrice [colonne : SunFire Prep OBD 5 pm (19 x 250 mm) ; éluant : H2O + 0,1 % HCOOH - McCN + 0,1 % HCOOH] : [(lb + 5,14 (c 0,25, McOH) ; I R v 2928, 2863, 1643, 1574, 1454, 1371, 1342, 769 cm-1 ; Le spectre RMN de Al est donné à la Figure 7. RMN 1H [500 MHz, CD3OD] S 3,51 [brs, 1H], 1,97-1,90 [m, 1H], 1,77-0,93 [m, 22H], 0,87 [s, 3H], 0,88-0,83 [m, 1H], 0,73 [s, 3H] ; RMN 13C (75 MHz, CD3OD) 8 55,99, 55,68, 48,74, 42,05, 41,62, 40,46, 40,12, 37,31, 37,24, 33,49, 32,89, 32,27, 29,51, 26,61, 25,51, 22,01, 21,50, 18,06, 11,83 ; SM (ESI) m/z 276 [M+H]+ ; RHMS calc. pour C19H34N (M+H) 276, 2691, trouvé 276, 2679. Le 313-amino-5a-androstane (composé B) répond à la formule (III). 35 Ce composé correspond à l'épimère C3 du 3a-amino-5a-androstane Interaction entre CDK5 et p25 visualisable par BRET chez la levure de boulanqerie Les résultats sont rapportés sur les Figures 2A et 2C A : Dans le système mis en place, la protéine p25, fusionnée à la luciférase de Renilla reniformis, est produite de façon inductible (expression placée sous le contrôle d'un promoteur inductible au galactose). L'expression est satisfaisante au bout de 4 h d'induction. B : Le dimère CDK5/p25 produit en levure possède une activité kinase : phosphorylation du substrat Histone H1. C : Un signal BRET d'environ 200 mBRET caractérise l'association de CDK5 à p25, ce qui est significativement différent d'un signal BRET aspécifique (ex : p25-Rluc vs p25-YFP, signal de 15 mBRET). Détection en BRET de l'inhibition d'une interaction protéine-protéine par un petit 15 composé chimique Une preuve de concept est obtenue en utilisant l'interaction p53/HDM2. Les résultats sont donnés sur la Figure 3. Le signal BRET obtenu en levure décroît de façon dose dépendante en utilisant la Nutlin-3 (inhibiteur chimique de l'interaction entre HDM2 et p53 déjà décrit dans Vassilev et al., 2004, Science, 303, 844-848). 20 Méthode KinaBret basée sur la technique BRET et permettant d'identifier en cellules de levure des inhibiteurs d'interactions protéine-protéine Cette méthode de criblage cellulaire (voir Figure 4) se réalise sur deux jours et a été utilisée avec un débit d'analyse de 480 composés/jour. Elle nécessite 25 l'utilisation de deux souches de levure. Une souche est utilisée pour le calcul du ratio du bruit de fond BRET (souche contrôle) et l'autre va contenir les deux protéines de fusion et sera donc utilisée dans la mesure de l'interaction (souche BRET). Afin de ne pas travailler sur des complexes préformés, un des deux partenaires est placé sous le contrôle d'un promoteur inductible au galactose (p25- 3 0 Rluc). Au bout d'une nuit de croissance à 29°C, les levures sont réparties en plaques de 96 puits. Ensuite, et de façon séquentielle, sont ajoutés dans chaque puits, le composé chimique à tester ainsi que le galactose. L'induction de l'expression de p25-Rluc se fait pendant 4 h à 29°C (ce temps est à adapter en fonction du couple étudié, ici il est optimisé pour l'expression de p25-Rluc). Ensuite, 35 un simple ajout de substrat de la Rluc (Coelentérazine h) permet de déclencher le transfert d'énergie. La lecture se fait en utilisant des lecteurs pouvant lire à deux longueurs d'ondes d'émission à la fois (émissions de la Rluc à 480 nm et de la YFP à 530 nm). Une fonction liée au programme d'acquisition permet immédiatement d'obtenir les valeurs en mBRET. En présence d'un inhibiteur de l'interaction CDK51p25, le signal BRET est diminué de façon significative. Inhibition de l'interaction entre CDK5 et p25 par le 3a-amino-5a-androstane (composé A1) Les résultats sont donnés sur les Figures 5A-D : A : Le signal BRET détecté chez la levure est diminué en présence de 20 pM de composé Al. La synthèse d'un dérivé de structure proche le 36-amino-5aandrostane (soit composé B) indique que l'orientation du groupement amine primaire est importante dans le maintien de l'activité biologique. B : l'inhibition dose-dépendante du signal BRET est observée avec le composé Al, IC50(BRET)= 4 pM. C : l'activité kinase de CDK51p25 est diminuée in vitro en présence des molécules. IC50 (Essai Kinase) = 40 pM. Le composé B est lui inactif (IC50 > 100 pM). II est à noter que, lorsque la molécule est placée en présence du dimère CDK51p25 déjà formé, l'activité kinase est beaucoup moins affectée (histogramme dimère+composé A1). Validation biochimique de l'inhibition de l'interaction entre CDK5 et p25 par le composé Al Les résultats sont donnés sur la Figure 6. In vitro, des quantités croissantes du composé Al inhibent la fixation de p25 à une matrice d'affinité recouverte de CDK5 fusionnée à la GST. Les protéines ont été produites en bactéries (E. col!). II est à noter que, lorsque la matrice est uniquement recouverte de GST (premier puits à gauche), la quantité de p25 fixée en l'absence de composé Al correspond au bruit de fond de l'expérience. Le résultat obtenu en utilisant le composé B confirme les données obtenues en utilisant les tests BRET et kinase (in vitro) : absence d'activité biologique. Il ne peut rentrer en compétition avec p25 pour la fixation à CDK5. Les protéines fixées sur la matrice sont analysées par migration en gel d'électrophorèse suivie d'immuno-détection de p25 et CDK5 avec des anticorps spécifiques (l'anti-GST permettant de détecter CDK5 via son étiquette GST). Une quantification de l'intensité des bandes indique que 20 pM de composé Al sont nécessaires pour empêcher la fixation de 50 % de 6His-p25 à GST-CDK5. Références bibliographiques 1. Yu, Y. et al., 1999, P.N.A.S., 96,151-156 2. Inouye et Tsuji, 1994, FERS Letters, 351, 211-214 3. Cowell D. B. et al., J. Chem. Soc., Perkin I, 1974 (13), 1505-1513 4. Janot et al., Bull. Soc. Chim., Fr., 1960, 1640-1643. 5. Brevet beige n° 702699.10 REVENDICATIONS1 - Dérivés d'androstane pour une utilisation pour le traitement de troubles du 5 système nerveux central par inhibition des interactions entre les protéines CDK5 et p25, ces dérivés répondant à la formule (1), 10 15 R (I) R1 représente un groupe - NH2 - NH-(R3); -N(R3)2 ou -N+(R3)3 ,; -NH-CO-20 R3 ; -N(R3)- C0-R3 ; -OH ; = 0 ; tetrazolyle ; -0-00-R3, R2 représente , CO-R3; -CH2-OH ; -C(R3) -N-OH ; -C(R3) = N - NH -C (=NH)- NH2; -C '- (R3)= N-NH2; alkyle en C1-C8 linéaire ou branché; - CH(OH)-R3; =CH-R3; - CH(R3) -NH-R3 ; - OH ; CH - (R3) -NH-CO-R3 ; - 25 CH(R3) -N (R3)2 ; -CH (R3) -- NH2; - CH (R3) - N (R3)-CO-R3 ; - CH (R3) - N +(R3)3) ; -CH(R3) -NH-CO- R3; oxazolonyie; H ; - (CH2)'-P- (C61-15)3; une chaîne de type polyalkylène glycol avec un groupement terminal, tel que - NH2, capable d'établir une liaison sur des billes de Sépharose activées ; ou un groupe biotinyié ; 30 avec R3 représentant un radical alkyle linéaire ou branché en C1-C3 ou H, les significations pouvant différer lorsque plusieurs R3 sont présents ; et leurs sels pharmacologiquement acceptables. 35 17 2- Les dérivés d'androstane selon ta revendication 1, dans lesquels - R1 représente un groupe - NH2, et - R2 représente H ou un groupe alkyle en C1-C2 linéaire. 3 - Les sels des dérivés selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'il s'agit des sels avec des acides minéraux comme les chlorhydrates ou bromhydrates, ou des sels avec des acides organiques comme les tartrates, les acétates ou les salicylates. 4 - Les racémiques des dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ainsi que les Isomères géométriques et optiques. 5 - Le 3a-amino-5a-androstane pour une utilisation pour le traitement de troubles du système nerveux central par inhibition des interactions entre les protéines CDK5 - 15 et p25, ce composé répondant à la formule (II) ci-dessous 20 30 6 Dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour utilisation en thérapie humaine ou animale pour le traitement des troubles impliquant CDK51p25. 35 7 - Dérivés selon la revendication 6, pour le traitement des troubles affectant le système nerveux centrai, tels que les accidents vasculaires cérébraux, les maladies d'Alzheimer, de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, la perception de la douleur ; le traitement de cancers, notamment du pancréas et des glioblastomes ; du diabète et de l'insulinorésistance ou encore pour les traitements antiviraux, 40 visant notamment le virus de l'herpès (herpès simplex virus type 1, HSV 1).