FR 2972639 A1 20120921 FR 1152261 A 20110318 COMPOSITION PHARMACEUTIQUE ANTI-INFLAMMATOIRE La présente invention concerne le domaine pharmaceutique et plus particulièrement une composition pharmaceutique destinée au traitement anti-inflammatoire des muqueuses, plus particulièrement des muqueuses de la sphère de l'oropharynx et plus généralement ORE Ainsi la nouvelle composition thérapeutique selon la présente invention comprend l'association d'une activité enzymatique amylasique avec une activité enzymatique protéolytique. Les alfa-amylases sont connues depuis longtemps pour leurs propriétés anti-inflammatoires et anti-oedémateuses et sont appliquées au traitement d'appoint des états congestifs de l'oropharynx et plus particulièrement en cas d'inflammation de la gorge. Elles sont aussi suspectées de posséder des propriétés antibactériennes et antivirales. Des travaux ont en effet démontré que grâce à leurs propriétés amylolytiques, les enzymes de cette famille provoquaient la dégradation de la paroi cellulaire et de la membrane de nombreuses bactéries qui sont riches en hydrates de carbone. De la même manière, l'alfa-amylase dégrade les constituants glucidiques présents dans l'enveloppe cellulaire des parti- cules virales. Il est connu dans l'art antérieur d'utiliser de tels composés anti-inflammatoires pour traiter les affections inflammatoires des voies respiratoires et ce par administration orale sous la forme de sirop ou de comprimés enrobés à avaler ou à sucer. Cependant de tels composés, de nature protéique, sont dégradés par les enzymes protéolytiques du tractus intestinal et leur absorption ainsi que leur action systémique est limitée. Les thérapeutiques enzymatiques mettent à profit les propriétés de différentes enzymes dans un but de traitement d'une pathologie. Par exemple, WO 00/54799 décrit l'utilisation de mélange d'enzymes lipolytique, protéolytique, et amylolytique dans le traitement de diabète de type I et II. WO 02/060474 décrit quant à lui l'utilisation de certaines lipases, protéases et amylases dans le traitement de problèmes digestifs. Lors des affections respiratoires telles que rhinites, chroniques, saisonnières ou allergiques, on assiste à une inflammation et une irritation aigüe ou chronique des muqueuses de l'oropharynx et plus particulièrement de la muqueuse de la cavité nasale et retro-nasale. Les rhinites peuvent être allergiques ou chroniques et elles affectent fortement la qualité de vie des personnes qui en sont victimes. La rhinite est souvent accompagnée d'autres troubles tels que l'asthme et/ou la sinusite et c'est une cause d'insomnie et de fatigue. 50 % des patients souffrant de rhinite présentent une hyperréactivité bronchique non spécifique, et donc un risque accru d'asthme. La rhinite, quelque soit son origine, s'accompagne d'écoulement nasal et de congestion na-sale, d'irritation des muqueuses du nez, de prurit et/ou de lésions voire dans certains cas d'irritations des yeux et plus communément d'irritation et d'inflammation de la gorge et des oreilles. La rhinite allergique est principalement saisonnière mais peut être chronique et constitue un des symptômes allergiques commun et fréquent. Elle est due à une réaction immunologique induite par un allergène inhalé. Lorsqu'elle est saisonnière, les pollens ou d'autres substances sécrétées ou re-larguées par des espèces animales ou végétales, voire fongiques, sont responsables de cette réaction. Lorsqu'elle est chronique, la réaction est due à des facteurs allergènes présents dans l'environnement immédiat du patient tel que l'habitat ou l'environnement professionnel, par exemple. Le rhume est une infection très fréquente du nez, ou plus précisément des fosses et mu- queuses nasales et de la gorge, causé par un virus. Aussi appelé rhinite virale ou aiguë, il provoque un mal de gorge, des éternuements et une congestion nasale. L'atteinte virale déclencherait une inflammation d'origine neurogène dont la médiation ferait appel à des cytokines pro-inflammatoires et chimiotactiques pour les neutrophiles. Une rhinite aigüe de nature non-allergique peut aussi se manifester classiquement lors d'infections virales ou bactériennes voire dans le cas d'abus de certains médicaments. Dans le cas de rhinites allergiques saisonnières, un traitement préventif et curatif par antihistaminiques peut être prescrit : souvent un tel traitement permettra d'éviter l'apparition des symptômes, et dans tous les cas, il les diminuera de façon importante. Pour les rhinites per annuelles, il faudra prendre en charge l'environnement : éviter mo-5 quette, acariens et les animaux par exemple. Quel que soit le type de rhinite, le traitement médicamenteux symptomatique fait appel à des cures d'antihistaminiques et/ou des corticoïdes en pulvérisation par voie nasale. Ces traitements, antihistaminiques ou corticoïdes, présentent cependant des effets secondaires tels que somnolence pour les premiers et saignement nasal ou hypertension pour 10 les seconds. Il apparaît ainsi qu'il existe un besoin en un médicament destiné au traitement anti-inflammatoire des affections de l'oropharynx, plus particulièrement au traitement de l'inflammation des muqueuses, particulièrement oro-pharyngées. Ainsi la présente invention concerne une composition pharmaceutique anti-inflammatoire 15 comprenant à titre de principe actifs, au moins une enzyme à activité amylasique et au moins une enzyme à activité protéolytique. De façon préférée, la présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actifs, une enzyme à activité amylasique et une enzyme à activité protéolytique, pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir et/ou traiter 20 une réaction inflammatoire des muqueuses. Dans le reste de la description, on parlera indifféremment d'activité amylasique ou d'activité amylolytique, les deux expressions étant synonymes. Dans une forme de réalisation de la présente invention, les muqueuses sont choisies dans le groupe comprenant la muqueuse oropharyngée, en particulier la muqueuse nasale, la mu-25 queuse de l'arrière gorge, la muqueuse retro-nasale, la muqueuse laryngée. Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actifs, une enzyme à activité amylasique et une enzyme à activité protéolytique, pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir et/ou traiter une réaction inflammatoire des muqueuses provoquée par une surexpression et/ou une sur- activation de cytokines, particulièrement de cytokines TNF-alpha. De manière particulièrement préférée, ladite composition est d'application topique au ni-veau de la ou des muqueuses. On entend par " application topique " une application directement sur la muqueuse. De préférence, la présente invention concerne une composition pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir et/ou traiter les affections des voies respiratoires, plus particulièrement des muqueuses oropharyngées, plus particulièrement encore la muqueuse na-sale. Les affections des voies respiratoires concernées par la présente invention comprennent les affections telles que les rhinites, rhinites virales, rhinites allergiques, rhinites saisonnières, rhinites chroniques. Dans une forme particulière la composition selon la présente invention est utilisée comme médicament pour le traitement des affections inflammatoire de l'oreille externe, en particulier pour les otites externes. Ainsi, avantageusement, la présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actifs, une enzyme à activité amylasique et une enzyme à activité protéolytique, pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir et/ou traiter une pathologie choisie dans le groupe constitué par la rhinite, la rhinite virale, la rhinite allergique, la rhinite saisonnière, le rhume des foins, la pharyngite, la trachéite, l'angine, la laryngite, l'otite, l'otite externe, en particulier l'otite virale. La présente invention repose en effet sur la découverte surprenante que l'association d'une 25 activité protéolytique permet d'inhiber fortement les cytokines inflammatoires présentes au niveau des muqueuses oropharyngées lors des affections respiratoires. En particulier il s'agit de l'inhibition des cytokines TNF-alpha. Dans les phénomènes allergiques, allergies modérément sévères à sévères, les affections virales, les organes et les tissus cibles (voies respiratoires et sphère oropharyngée notamment) sont affectés par une inflammation subaiguë ou chronique. Les médiateurs libérés par les cellules inflammatoires jouent un rôle dans cette inflammation, et les principaux facteurs en cause sont les cytokines produites par les cellules inflammatoires elles-mêmes (mastocytes et éosinophiles, macrophages, lymphocytes T, etc.), ainsi que par les cellules constitutives des organes et tissus cibles (cellules endothéliales et épithéliales, fibroblastes, par exemple). De nombreux travaux concernent les relations entre cytokines et inflammation virales et/ou allergique. Chez les allergiques ainsi que chez les personnes souffrant d'affections virales, la production des cytokines, qui exercent de puissants effets promoteurs sur la prolifération et la différenciation, le recrutement et l'activation des cellules inflammatoires, est induite par les stimulations allergéniques et virales répétées. Il a ainsi été suggéré en particulier dans les infections rhino-pharyngées telles que les rhumes et rhinites que les symptômes sont principalement dus à la réponse de l'hôte, marquée par une réaction inflammatoire caractérisée par la présence de médiateurs inflammatoires et de cytokines pro inflammatoires dans les sécrétions nasales. Par exemple la bradykinine tiendrait une place importante et des taux élevés de cette cytokine dans les sécrétions nasales de patients atteints de rhinite aiguë ont été rapportés. Il a en outre été montré que dans les sécrétions nasales d'enfants atteints de rhinite aiguë une élévation significative des ILlbêta, de l'IL8, de l'IL6 ainsi que du TNF-alpha (tumor necrosis factor-alpha) était observée. En outre le TNF-Alpha a été identifié comme médiateur libéré ou dont l'expression est accrue lors de phénomènes de rhinites saisonnières, virales ou péri annuelles (« La rhinite allergique », Pascal Demoly et Jean Bousquet. John Libbey, Paris, 2002). La présente invention repose donc sur le fait qu'une activité protéolytique était de nature à augmenter considérablement l'effet anti-inflammatoire d'une composition amylolytique via l'inhibition ou la dégradation des cytokines pro-inflammatoires, plus particulièrement les cytokines TNF-alpha. La composition selon l'invention contient donc, en combinaison avec une enzyme à activité 30 protéolytique, une enzyme à activité amylolytique. Cette enzyme à activité amylolytique est de préférence une (1, 4)-a-D-glucan-glucanohydrolase, communément appelée "alpha-amylase", ou "alfa-amylase" selon la Dénomination Commune Internationale préconisée par l'Organisation Mondiale de la Santé pour les substances pharmaceutiques. Le mécanisme par lequel l'alpha-amylase dégrade les composés polysaccharidiques est une réaction d'hydrolyse où l'enzyme joue le rôle de catalyseur. Celle-ci attaque au hasard les liaisons 0-(l, 4) de l'amidon libérant du glucose et du maltose (le maltose est un disaccharide composé de deux monomères glucoses). Les parois cellulaires sont endommagées par cette hydrolyse, ce qui conduit à une perte de virulence et à l'arrêt de la prolifération des agents infectieux dans l'organisme. Dans un mode de réalisation particulier, on utilise l'alpha-amylase sécrétée naturellement par un micro-organisme bactérien, de préférence par Bacillus amyloliquefaciens. Cette bactérie, reconnue comme espèce à part entière en 1987, était considérée antérieurement comme un représentant atypique de l'espèce Bacillus subtilis (Priest et al., Int. J. Syst. Bac- teriol. 37 : 69 1987). L'alpha-amylase produite naturellement par B. amyloliquefaciens est une protéine d'environ 58 kDa, dont les dix premiers acides aminés, déterminés par séquençage sont : Val-Asn-Gly-Thr-Leu-Met-Gln-Tyr-Phe-Glu. L'alpha-amylase utilisée dans la composition selon l'invention peut être produite par tout procédé de culture microbiologique mettant en oeuvre un micro-organisme compétent pour la production et l'excrétion de ladite alpha- amylase, qu'il soit transformé par génie génétique ou non. De manière préférée, l'alpha-amylase bactérienne est obtenue par fermentation en réacteur de B. amyloliquefaciens. Les procédés de production d'enzymes par fermentation microbiologique et de purification sont bien connus de l'homme du métier et sont mis en oeuvre par des entreprises spécialisées dans le domaine correspondant. En particulier, l'alpha-amylase entrant dans la composition revendiquée peut être produite par un procédé la mettant à l'abri d'une contamination par l'E.S.B. (Encéphalopathie Spon- giforme Bovine). En effet, aucune matière première utilisée dans l'ensemble du cycle de production (fermentation, extraction, finition) n'est d'origine bovine ou ovine. D'autre part, toutes les matières premières utilisées en fermentation (source de carbone et de protéines, azote, sel minéraux) sont stérilisés à 125° C pendant 30 minutes ce qui permet d'assurer la conformité de la composition vis-à-vis des normes des agences sanitaires en ce qui concerne la sécurité virale. L'alpha-amylase ainsi produite se présente comme une poudre fine de couleur crème à beige ne présentant aucune matière étrangère, soluble dans l'eau et conforme aux normes de qualité et de sécurité exigées pour les produits à usage pharmaceutique (absence de mé- taux lourds, conforme aux exigences de la pharmacopée européenne concernant le dénombrement microbien). Elle est commercialisée, sous forme de spécialité pharmaceutique, en France et dans de nombreux pays, par la Société Top Pharm (Revel, France), par exemple Megamylase®, alpha-amylase (Biogaran), Supramylase®. La quantité d'alpha-amylase incorporée à la composition selon la présente invention est dé- finie par son niveau d'activité enzymatique exprimée en unité internationale CEIP, notée "U.CEIP", la valeur d'une unité U.CEIP étant égale à 0,7143 unité de la pharmacopée européenne. Elle pourra être comprise entre 100 et 1000 U.CEIP par ml de composition, plus particulièrement entre 250 et 750 U.CEIP par ml de composition et plus particulièrement encore aux environs de 500 U.CEIP par ml de composition. L'activité amylasique peut être mesurée via la dégradation d'amidon selon un protocole standard indiqué dans la partie expérimentale. Cette méthode offre l'avantage d'être très facile d'utilisation et d'avoir une bonne fiabilité. En ce qui concerne l'activité protéolytique de la composition selon la présente invention, celle-ci est exprimée en UA (Unité Anson)/g de poudre de composition sur la base d'un test enzymatique sur de l'hémoglobine. Le test à l'hémoglobine, plus connu sous le nom de Test d'Anson, présente l'avantage de mettre en évidence un large spectre d'activité protéolytique et n'est pas spécifique d'une classe de protéases particulière. Le test à l'hémoglobine mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention est décrit dans la partie expérimentale. Ce test colorimétrique est basé sur l'hydrolyse de l'hémoglobine à 25°C à pH 7,5. L'activité est déterminée quantitativement, par comparaison à une protéase (Protease from Bacillus amyloliquefaciens Sigma #P1236) d'activité protéolytique connue. 725 Cette méthode d'évaluation de l'activité protéolytique permet ainsi de mettre en évidence tout type d'activité protéolytique de la composition pharmaceutique selon la présente invention. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, l'expression « enzyme à activité protéolytique» s'entend d'une ou plusieurs enzymes présentant une activité protéolytique telle que mesurée par le test à l'hémoglobine. Les protéases ou enzymes protéolytiques sont des enzymes qui brisent les liaisons peptidiques des protéines. On parle alors de coupure protéolytique ou de protéolyse. Ce processus 10 implique l'utilisation d'une molécule d'eau ce qui les classe parmi les hydrolases. Plusieurs mécanismes d'action ont été décrits pour les protéases, ce qui permet de les regrouper en grandes familles mécanistiques, en fonction de la nature du ou des acides ami-nés du site actif impliqué dans la catalyse. On distingue ainsi : - Les protéases à sérine qui possèdent une triade catalytique caractéristique compre-15 nant une sérine (d'où leur nom), une histidine et un aspartate. Parmi les protéases à sérine, on peut citer : o la trypsine du pancréas (EC 3.2.21.4), spécifique des liaisons peptidiques dans lesquelles l'acide aminé engagé par son carboxyle est une lysine ou une arginine. 20 0 la chymotrypsine (EC 3.4.21.1) du pancréas s'attaque à des liaisons peptidiques où le carboxyle engagé est un acide aminé hydrophobe ou aromatique. o la thrombine qui clive le fibrinogène en fibrine lors de la coagulation sanguine. - Les protéases à thiol qui possèdent une cystéine dans leur site actif. Parmi les pro-25 téases à thiol, on peut citer : o la papaïne (EC 3.4.22.2) protéine végétale. Spécifique des liaisons peptidiques dans lesquelles l'acide aminé engagé par son carboxyle est un acide aminé basique, aromatique ou apolaire. o les caspases, protéases qui interviennent dans le processus d'apoptose ou 30 mort cellulaire programmée. - Les protéases acides agissent à pH acide et possèdent un acide aspartique sur leur site actif. Par exemple : o la pepsine : spécifique des liaisons peptidiques dans lesquelles est engagé un acide aminé aromatique (fonction amine). o la protéase du VIH-1. - Les métalloprotéases qui possèdent un cation métallique, en général un atome de zinc, fixé fortement à la protéine par les chaînes latérales de plusieurs acides ami-nés. Par exemple : o la thermolysine o les protéases de la matrice extracellulaire. - Les protéases à thréonine (ou Thréonine protéases). - Les protéases à acide glutamique. L'activité protéolytique contenue dans la composition pharmaceutique selon la présente invention pourra appartenir à tout type de protéases. La quantité d'enzyme protéolytique présente dans la composition selon la présente invention est définie par son niveau d'activité enzymatique exprimée en unité protéolytique mesurée avec le test à l'hémoglobine (voir plus avant). Elle pourra être comprise entre 2*10-3 et 40* 10-3 UA par ml de composition, plus particulièrement entre 2* 10-3 et 20* 10-3 UA par ml de composition et plus particulièrement encore entre 2*10-3 et 10*10-3 UA par ml de composition, voire encore plus particulièrement aux environs de 4*10-3 à 6*10-3 UA par ml, plus particulièrement encore aux environs de 5 * 10-3 UA par ml de composition. La composition pharmaceutique selon la présente invention comprend ainsi à titre de principe actif, au moins une enzyme à activité amylolytique et au moins une enzyme à activité protéolytique. De manière préférée, l'enzyme protéolytique et l'enzyme amylolytique sont les seuls principes actifs de la composition selon la présente invention. En plus de ces deux principes actifs, pourront être ajoutés différentes substances utilisées pour la formulation des compositions à usage pharmaceutique. Un excipient peut ainsi être choisi parmi tout composé à la disposition de l'homme du métier, compatible avec une prise ou l'application orale de la composition selon l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux, un excipient conférant un goût sucré est ajouté, tel que le saccharose ou le glucose. Un excipient apportant une certaine viscosité à la composition pourra aussi être envisagé, tel que par exemple le glycérol. Une composition dite "sans sucre" peut également être préparée en employant un excipient édulcorant succédané du sucre, comme le fructose ou l'Aspartame. Tout arôme pharmaceutiquement acceptable pourra être envisagé, tel menthol, eucalyptol, framboise ou encore fraise par exemple. La formulation de telles formes galéniques est à la porté de l'homme du métier. Dans une forme particulière de l'invention, les excipients seront choisis de manière à rendre possible ou à faciliter l'application topique de la présente composition au niveau des muqueuses. Dans le cas particulier de l'application topique au niveau de la muqueuse na-sale de la composition pharmaceutique selon la présente invention, la formulation pourra comprendre un milieu tamponné à pH compris entre 6 et 7, particulièrement aux environs de 6,5, plus particulièrement encore 6,6. Un tampon convenable pour la formulation de la composition pharmaceutique selon la pré- sente invention pourra être aisément choisi par l'homme du métier. Avantageusement il pourra s'agir d'un tampon phosphate, par exemple. Cependant tout tampon physiologiquement compatible avec une administration orale ou topique conviendra pourvu qu'il permettre l'obtention d'un pH compris entre 6 et 7, particulièrement aux environs de 6,5, plus particulièrement encore 6,6. La composition pharmaceutique selon l'invention pourra comprendre des sels et minéraux destinés, entre autre, à assurer la stabilité des enzymes au sein de ladite formulation liquide destinée à l'administration au patient, en particulier l'application topique. Ainsi un sel convenable pourra être le NaCl, par exemple, à la concentration comprise entre 5 et 10 g/1, particulièrement entre 7,5 et 10 g/1, plus particulièrement encore aux environs de 9 g/1, par exemple. De préférence, la composition selon l'invention est formulée pour être administrée par voie topique. Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées selon le mode d'administration retenu. Le support peut être de nature diverse selon le type de composition considérée. En ce qui concerne plus particulièrement les compositions destinées à une administration par voie topique, il peut s'agir de solutions aqueuses, de dispersions du type des solutions ou dispersions, de microcapsules, de microparticules ou micropoudres solubles. Dans le cas d'une formulation de la composition pharmaceutique destinée à une application topique au niveau des muqueuses de l'oropharynx, une formulation sous la forme convenable pour vaporisation ou nébulisation est particulièrement adaptée. Aussi, afin de préserver les activités enzymatiques pendant un stockage plus ou moins prolongé, la formulation pharmaceutique selon l'invention pourra se présenter sous la forme d'un kit corn- prenant d'une part, un mélange pulvérulent contenant au moins une enzyme amylolytique et au moins une enzyme protéolytique ainsi qu'un tampon et d'autre part, un mélange liquide excipiendaire adéquat pour reconstitution extemporanée. Le choix du mélange liquide excipiendaire pourra être choisi aisément par l'homme du métier afin d'assurer d'une part la stabilité des activités enzymatiques et d'autre part la compatibilité avec la muqueuse sur laquelle la composition est appliquée. Ainsi lors de l'utilisation, la poudre pourra être dissoute dans la phase liquide excipiendaire et administrée au patient selon la posologie et le mode d'administration désiré. Dans un mode particulier, l'administration pourra se faire par vaporisation et la composition pourra être contenue dans un dispositif vaporisateur à pression, à pompe ou tout autre dispositif permettant l'obtention d'un nuage facilitant la mise en contact de la solution selon l'invention avec la muqueuse oropharyngée, plus particulièrement la muqueuse nasale. La présente invention est illustrée dans les exemples suivants de manière à donner une représentation particulière ainsi que ses avantages, mais n'en constitue en aucun cas un mode restrictif et limitatif. EXEMPLE 1- COMPOSITION AMYLASIOUE ET PROTEOLYTIOUE Une composition contenant une activité enzymatique amylasique et une activité protéolytique est obtenue par fermentation à partir de Bacillus amyloliquefaciens. Une telle composition pulvérulente est fabriquée par la société DSM (Pays-Bas). Sa caractérisation enzymatique est la suivante : Activité amylolytique : 209 892 U.CEIP/g de poudre Activité protéolytique : 1,60 UA /g de poudre A titre de comparaison, dans la suite des expériences, seront utilisées des compositions ne contenant qu'une activité amylolytique ou ne contenant qu'une activité protéolytique. Ain-si une composition commercialisée sous la dénomination AMYLYVE® et une autre sous la dénomination PROLYVE® seront utilisées à titre de témoin. PROLYVE® est une composition protéolytique obtenue à partir de fermentation de Bacillus subtilis. AMYLYVE® est une composition amylolytique commercialisée par la société LYVEN. AMYLYVE® contient 50941 U.CEIP/g de poudre et 0,007 UA /g de poudre et quant à PROLYVE® elle contient 19,07 UA /g de poudre et aucune activité amylolytique n'a pu être détectée. EXEMPLE 2 - EFFET DE LA COMPOSITION AMYLASIOUE ET 15 PROTEOLYTIOUE SUR LE TNF-alpha Une solution de 25 000 pg/ml de TNF-alpha est mise en contact pendant 24h à 37°C en présence d'une composition selon l'invention. Les solutions standards de cytokines recombinantes sont préparées en diluant la poudre dans un milieu PBS à une concentration de 10 ^g/ml. La solution est ensuite diluée 400 fois 20 dans du milieu RPMI additionné de Peniciline-streptomycine. La solution d'amylase est préparée telle que 3000 UCEIP de poudre sont dissoute dans 1 ml de milieu RPMI+antibiotique, puis diluée 100 fois dans la solution contenant la cytokine. Par comparaison l'échantillon est traité avec une préparation de PROLYVE® d'un coté et 25 d'AMYLYVE® de l'autre. Les compositions selon la présente invention et AMYLYVE® ont été normalisées à la même activité de 3000 U.CEIP/L. Le produit PROLYVE® est utilisé à des concentrations de l Omg/ml, 1 mg/ml, 0,1 mg/ml et 0,01 mg/ml. Les résultats sont représentés dans le Tableau 1. Au temps zéro, la quantité de TNF-alpha s'échelonne pour tous les échantillons entre 5 22763 pg/ml et 30194 pg/ml. Dans le cas de l'échantillon traité avec enzyme protéolytique seule PROLYVE®, la quanti-té de TNF-alpha n'est pas modifiée pour les concentrations de 0,1 mg/ml et 0,01 mg/ml. La quantité de TNF-alpha chute à 7948 pg/ml et 4721 pg/ml lors du traitement avec enzyme protéolytique seule PROLYVE® à des concentrations de 1 et de 10 mg/ml, respective- 10 ment. En ce qui concerne le traitement de l'échantillon par enzyme amylolytique seule AMYLYVE®, la quantité de TNF-alpha n'est pas affectée. Enfin dans le cas du traitement de l'échantillon avec la composition selon la présente invention, la quantité de TNF-alpha chute à 3 540 pg/ml. 15 Le TNF-alpha est mesuré par méthode ELISA (selon kitDY210 commercialisé par RD Systems, 59800 Lille). TABLEAU 1. QUANTITE DE TNF-alpha à TO et à T24h d'un traitement avec PROLYVE, AMYLYVE et avec la composition selon l'invention. PROLYVE® PROLYVE® PROLYVE ® PROLYVE® (10 mg/ml) (1 mg/ml) (0,1 mg/ml) (0,01 mg/ml) TO 30194 27807 25381 24682 T24h 4721 7948 24737 24774 COMPOSITION AMYLYVE® SELON L'INVENTION TO 22763 23762 T24h 3540 24737 On constate ainsi que la composition selon la présente invention entraîne une diminution de la quantité de TNF-alpha mesurée. La diminution de TNF-alpha est même bien plus forte avec la composition selon l'invention qu'avec une composition protéolytique présentant une activité protéolytique 10 fois plus importante. On constate aussi que le traitement de l'échantillon par l' amylase seule n' entraine aucun changement en ce qui concerne le TNF-alpha. Il est ainsi démontré qu'une composition selon l'invention comprenant l'association d'une 10 activité enzymatique protéolytique et d'une activité enzymatique amylolytique permet de réduire considérablement et de manière surprenante le TNF-alpha. MESURE DE L'ACTIVITE PROTEOLYTIOUE SUR HEMOGLOBINE Réactifs NaOH 1.0M HCl 1.0M KHzPO41.0M NaOH 0,5 M CaClz 0,02M TCA 0,3 M Réactif phénol de Folin & Ciocalteu Phenol de Folin & Ciocalteu (densité 1,22g/ml, Merck 9001) : 1 part Eau Déminéralisée : 2 parts. Substrat Hemoglobine : Urée : 354 g/kg NaOH 1.0M : 73,7 g/kg Hemoglobine : 19,5 g/kg KH2PO4 1.0M : 96,8 g/kg pH ajusté à 7,5 grâce à HCl 1,0 M. Mode Opératoire Une solution de Protéase (Novozyme AIS), commercialisée par Sigma (#P1236) est utili- sée comme standard protéolytique. Le substrat hemoglobine est préchauffé à 25°C. 2 ml de substrat hémoglobine est mis dans un tube à essai et 1 ml de la solution enzymatique à tester est ajouté (Temps TO). Après mélange vigoureux, le tube est placé dans un bain thermostatique à 25°C. A TO + 10 minutes, 5 ml de TCA sont ajoutés. Le tube est agi- té vigoureusement et remis dans le bain thermostatique à 25°C. à 30 minutes plus tard, l'échantillon précipité est mélangé et filtré à travers un filtre Munktell 1F. La fraction soluble du filtrat ainsi récupérée est analysée en utilisant le réactif phénol de Folin & Ciocalteu. Un témoin est réalisé par ajout de 5 ml de TCA en préalable à l'ajout des 2 ml 10 d'hemoglobine et 1ml de CaClz. Cet échantillon témoin est aussi filtré à travers un filtre Munktell 1 F et la fraction soluble filtrée est analysée à l'aide du réactif phénol de Folin & Ciocalteu. Réaction colorée Pour chaque échantillon, une quantité d'environ 2,8 g de NaOH 0,5M permettant l'obtention d'un pH compris entre 11.4 et 11.6 est ajouté à 1,5 ml de filtrat et 1,0 ml de ré-actif phénol de Folin Ciocalteu (la quantité de NaOH est déterminée selon les lots). Environ 6 à 10 minutes après, la différence d'absorbance entre témoin et échantillons est mesurée à 750 nm. Calcul L'activité de chaque échantillon est calculée relativement à une gamme standard de protéase standard. Une courbe standard de Protéase est réalisée dans les mêmes conditions et une absorbance d'environ 0,41 est obtenue pour une activité de 0,57 AU. /1. MESURE DE L'ACTIVITE AMYLOLYTIOUE La méthode cinétique de dosage amylasique consiste à doser l'amidon non consommé par l'enzyme en utilisant une solution KI/I2. L'iode est pris au piège dans les chaînes glucosidiques de l'amidon ce qui le colore en bleu. Des mesures de DO à 620 nm sont effectuées pour suivre l'avancement de l'hydrolyse de l'amidon par l'-amylase Préparation des réactifs employés pour la procédure de contrôle analytique Préparation du tampon phosphate pH 6,6 Peser 5,350 g de phosphate de potassium anhydre (KH2PO4) et 5,350 g de phosphate dipotassique (K2HPO4, 3 H20) et mettre à dissoudre sous agitation magnétique dans un bêcher 5 de 500 mL rempli d'eau distillée. Ajuster le pH entre 6,55 et 6,65 avec de l'acide phosphorique (H2PO4) ou de l'hydroxyde de sodium (NaOH) Ajuster le volume à 500 mL en utilisant une fiole jaugée de 500 mL 10 Préparation de la solution d'amidon (substrat de l'enzyme) Peser 10,0 g d'amidon ((C6H10O5)n). Verser l'amidon dans un bêcher de 500 mL à parois épaisses. 1 Ajouter environ 50 mL d'eau distillée et placer sous agitation magnétique jusqu'à obtenir une suspension homogène. 15 Ajouter 400 mL d'eau distillée bouillante et augmenter la vitesse d'agitation. Faire chauffer et porter à ébullition la solution d'amidon obtenue pendant 2 minutes.) Laisser refroidir à température ambiante. Ajouter 10 mL de tampon phosphate pH 6,60 Ajuster le pH à 6,60 +/- 0,03 avec de l'acide phosphorique (H2PO4) ou de l'hydroxyde de 20 sodium (NaOH) Verser la solution dans une fiole jaugée de 500 mL et ajuster le volume au trait de jauge. Préparation de la solution de chlorure de sodium Peser 20,0 g de chlorure de sodium (NaCl) Dissoudre le chlorure de sodium dans une fiole jaugée de 2 L avec 800 mL d'eau distillée 25 par agitation manuelle ajouter 40 mL de tampon phosphate pH 6,60. Agiter manuellement et compléter au trait de jauge. Préparation des solutions d'iode - Préparation de la solution mère d'iode 30 Dans un bêcher peser 1,1 g d'iode (I2) et 2,2 g d'iodure de potassium (KI) Verser 30 mL d'eau distillée. Laisser sous agitation magnétique jusqu'à dissolution complète de l'iode. Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 50 mL et compléter avec de l'eau distillée. - Préparation de la solution d'iode pour essai Peser 20 g d'iodure de potassium (KI) Dissoudre sous agitation magnétique les 20 g de KI. Verser la solution dans une fiole jaugée de 500 mL et ajouter 2 mL de la solution mère 5 d'iode. Compléter au trait de jauge. Stocker la solution obtenue dans un flacon brun à température ambiante pendant 1 jour. Préparation des échantillons à doser 10 Les échantillons à tester sont préparés dans la solution de chlorure de sodium. - Préparation de la solution standard d'alpha-amylase On utilise une solution étalon d'alpha-amylase dont une activité standard a été attribuée par la méthode pharmacopée européenne de dosage de l'activité amylasique. L'activité de l'étalon est précisée sur le flacon utilisé (soit environ 200 000 U CEIP/g de 15 poudre). Peser 0,1 g d'alpha-amylase standard et l'introduire dans une fiole jaugée de 100 mL. Verser 40 mL de solution de NaCl et placer sous agitation magnétique jusqu'à dissolution complète de la poudre. Compléter au trait de jauge. 20 Faire une dilution au 1/200 - Préparation des solutions à base de la matière première La matière première est préparée suivant le protocole défini pour la solution d'-amylase standard 25 - Préparation des solutions à base des spécialités pharmaceutiques Les solutions sont préparées de façon à ce que l'activité dans la solution correspondent à environ à 1 UCEIP/ml. Procédure analytique 30 Les réactions du dosage doivent se faire au bain-marie à 30°C. Mettre à thermostater au bain-marie pendant 15 minutes : La solution d'alpha-amylase à doser ; 4 Flacons contenant 20 mL de solution d'amidon (milieu réactionnel); Une série de tubes contenant 5 mL de solution d'iode pour essai. Pendant les 15 minutes : Allumer le spectrophotomètre ; Régler la longueur d'onde à 620 nm ; Faire le blanc sur l'air. A temps zéro : Prélever 10 mL de solution d'alpha-amylase à doser ; Introduire les 10 mL dans le flacon contenant les 20 mL d'amidon ; déclencher le chronomètre lorsque la moitié 5 des 10 mL sont versés ; Agiter manuellement par rotation et remettre en incubation. Après 7 à 8 minutes d'incubation, commencer les mesures de DO à 620 nm : Prélever 1 mL du milieu réactionnel 5 secondes avant le temps de mesure ; Les verser dans un tube contenant 5 mL de solution d'iode ; Mesurer immédiatement le DO à 620 nm. 10 Si la DO à 620 nm est aux environ de 3,000 : Recommencer l'opération décrite ci-dessus toutes les trente secondes jusqu'à mesurer une DO à 620 nm d'environ 2,000 ; Puis, espacer les prélèvements toutes les minutes jusqu'à mesurer une DO à 620 nm d'environ 0,500. Relever le temps et la valeur de la DO à 620 nm correspondante. 15 Tracer la courbe enzymatique : Axe des Y : DO à 620 nm ; Axe des X : Temps en minutes. La disparition de l'amidon, mesurée par la lecture de la DO à 620 nm est directement corrélée à l' activité amylasique. Calculs de l'activité amylasique 20 La courbe enzymatique tracée présente une partie linéaire où le substrat est en excès par rapport à l'enzyme et une partie non linéaire. Tracer le prolongement de la partie linéaire Tracer la droite DO à 620 nm = 0,4800 Lire le temps d'incubation T correspondant à l'abscisse du point d'intersection de ces deux 25 droites. Calcul de A A représente la quantité d'amidon anhydre consommée par minute par la solution enzymatique. Il s'exprime : A =(Masse d'amidon (mg)x 20 x Taux de matière sèche)/(500 x Temps d'incubation (minutes)) 30 500 = Volume de la solution d'amidon en mL, 20 = Volume d'amidon durant la prise d'essai en mL. Le taux de matière sèche est compris entre 0 et 1. Calcul du coefficient de correction L'activité de la solution standard d'alpha-amylase mesurée par la méthode décrite ci-dessus est comparée à l'activité amylasique définie préalablement comme la valeur vrai grâce à la méthode de dosage de la pharmacopée européenne. Le rapport de ces deux va-leurs constitue le coefficient de correction. Activité réelle de l'étalon = (A x 200 x 100)/(Masse de poudre (g)x 1 x 10 x 2) A = quantité d'amidon anhydre consommée par minutes par la solution enzymatique, 200 = Volume de la solution à tester en mL, 100 = Volume de la solution mère en mL, 1 = Volume de solution mère employée pour préparer la solution à tester en mL, 10 = Prise d'essai de la solution à doser en mL, 2 = Facteur de conversion RAU 0 Flèche CEIP. Ce coefficient est généralement compris entre 0,70 et 0,9. Coefficient de correction = Activité théorique de l'étalon (U CEIP/g) / Activité réelle Calcul de l'activité enzymatique des échantillons - Calcul de l'activité enzymatique de la matière première Activité enzymatique (U CEIP/g) = (A x 200 x 100 x Coefficient de correction) / (Masse de poudre (g) x 1 x 10 x 2) A = quantité d'amidon anhydre consommée par minutes par la solution enzymatique 200 = Volume de la solution à tester en mL, 100 = Volume de la solution mère en mL, 1 = Volume de solution mère employée pour préparer la solution à tester en mL, 10 = Prise d'essai de la solution à doser en mL, 2 = Facteur de conversion RAU 0 CEIP. - Calcul de l'activité enzymatique des spécialités pharmaceutiques Activité enzymatique (U CEIP/ mL) = (A x d x Coefficient de correction) / (1 x 10 x 2) 10 A = quantité d'amidon anhydre consommée par minutes par la solution enzymatique, d = dilution de la composition liquide à doser 10 = Prise d'essai de la solution à doser en mL, 2 = Facteur de conversion RAU D CEIP. 15 EXEMPLE 3 - EFFET DE LA COMPOSITION SELON L'INVENTION SUR LA PRODUCTION DE TNF-alpha PAR DES MONOCYTES HUMAINS L'objectif de cet exemple consiste à tester l'effet d'une composition selon la présente invention sur la production de TNF^par les monocytes humains chez des sujets sains. Protocoles 20 Matériels et Méthodes Préparation des monocytes Les monocytes humains sont purifiés avec la technique de séparation par ficoll à partir d'une poche de sang de « buffy coat » de sujet sain. Les cellules sont lavées et mises en culture en milieu SFM pendant 2h à 37°c sous 5% CO2. A l'issue des 2 heures les cellules 25 sont lavées avec du PBS. Les cellules adhérentes sont les monocytes. Les monocytes sont mis en culture et stimulés ou non avec du lipopolysaccharide LPS (1 ug), en présence ou non de composition selon la présente invention (telle que définie plus avant). Après 24h, les surnageants sont prélevés et stockés à -20°c. 30 ELISA TNF^ Nous avons utilisé le kit ELISA dosage du TNF ^ humain (BD Biosciences, TNF-alpha5 ELISA kit, OptEIATM) Grâce à la gamme étalon nous avons pu déterminer la concentration des échantillons. Bioassay TNF humain Afin de mesurer l'activité de l'alpha-amylase sur le TNF q nous avons utilisé un «bioassay» avec la lignée L929 sensible au TNF ^ humain. Il s'agit d'une lignée murine fibroblastique murine. Les cellules de la lignée L929 sont mises en culture en plaque 96 puits, 100uL/puits à 4X105 cellules/ml en mileu RPMI complet pendant une nuit. Le lendemain, on enlève le milieu de culture et on dépose des dilutions (facteur 2) des sur-10 nageants de culture des monocytes dans un volume final de 50u1. Le premier puits de chaque ligne ne contient que du milieu de culture, il servira de référence pour le calcul de la cytotoxicité. On ajoute 50u1 par puits d'actinomycine D à 8ug/ml. Incubation toute la nuit à 37°c sous 5% CO2. Les puits sont lavés une fois avec du PBS 1X, puis ajout de 50uL de cristal violet (0,05% 15 crystal de violet dans 20% d'éthanol). Incubation 10 minutes à température ambiante. Les puits sont rincés à l'eau et on laisse sécher la plaque toute la nuit. La lecture du test se fait par lecture de la DO à 595nm. L'activité du TNF ^ est exprimée en pourcentage de cytotoxicité suivant la formule: % de cytotoxicité = (A-B)/AX100 20 A représente la DO des cellules L929 avec seulement le milieu de culture (le puits référence). B représente la DO des cellules L929 avec les échantillons à tester. Pour pouvoir étudier l'activité de l'alpha-amylase, les monocytes humains sont mis en culture et stimulés ou non avec du LPS, en présence ou non de la composition selon la pré-sente invention (activité amylasique et activité protéolytique). 25 Après 24h, les surnageants de culture sont prélevés et stockés. Le TNF^ est dosé dans les surnageants par 2 techniques : l'ELISA permettant de doser précisément la quantité de TNF^ et un bioassay du TNF permettant d'avoir une information sur l'activité biologique du TNF produit. Etudes préliminaires 30 Nous avons effectué des tests pour déterminer le milieu le plus adapté pour favoriser l'adhésion et la culture des monocytes sans entrainer une production de TNF^ Le milieu SFM (Gibco,UK) a été préféré au milieu RPMI (Gibco,UK) supplémenté de 1% SVF puisqu'il n'entraine pas de production de TNF ^par les monocytes à leur état basal. Pour obtenir une stimulation des monocytes et la production de TNF q nous avons déterminé la quantité de LPS nécessaire pour stimuler au mieux les monocytes pendant 24h, in- duisant entre autres une production de TNF ^ Nous avons donc testé les concentrations 10 ug, 1 ug, 100ng, long de LPS sur les monocytes humains pendant 24h à 37°c. Nous avons ensuite dosé la quantité de TNF ^ produite dans les surnageants de culture par ELISA. La concentration de 1 ug/ml de LPS permet d'obtenir une production de TNF ^ très marquée chez tous les individus testés (n=4). Résultats Dosage de TNF^ dans les surnageants de culture par ELISA Nous avons purifié les monocytes de deux sujets sains. Ces cellules ont été cultivées sans stimuli ou ont été stimulées par du LPS, par la composition selon la présente invention, ou les deux pendant 24h à 37°c. A l'issue des 24h, nous avons dosé par ELISA le TNF ^ dans les surnageants de culture. Résultats : Dans nos conditions de culture les monocytes ne produisent pas de TNF ^ en l'absence de stimulation, la quantité étant inférieure au seuil de détection «7,81 pg/ml). La stimulation par le LPS entraine une production élevée de TNF^par les monocytes, variable d'un sujet à l'autre. Les monocytes stimulés par la composition selon l'invention seule ne produisent que peu ou pas de TNF Fait important, la composition selon l'invention ne modifie pas la quantité de TNF ^ pro-duite par des monocytes stimulés par 1 ug/ml de LPS chez ces 2 sujets. Bioassay (cf Matériel et méthodel Parallèlement à ce dosage ELISA, nous avons réalisé un «bioassay» du TNF pour mesurer l'activité de l'alpha-amylase vis à vis de l'effet biologique du TNF Ces «bioassays» ont été réalisés sur les surnageants de culture des monocytes de deux su-jets avec les 4 conditions de culture décrites ci-dessus. Sur une plaque de culture, nous effectuons des dilutions de facteur 2 des surnageants de culture (duplicat) et une gamme « étalon » de TNF ^ recombinant humain (triplicat). Pour la gamme étalon le facteur de dilution est de 4 ; la gamme couvre les concentrations de ,87 pg/ml à 2ug/ml. Le Bioassay et gamme étalon pour le premier sujet G ont permis de déterminer que 50% de cytotoxicité correspond à une concentration de 78,6 pg/ml de TNF ^recombinant humain. Le Bioassay et la gamme étalon etablis pour le sujet H nous permettent de déterminer que 5 50% de cytoxicité correspond à une concentration de 460 pg/ml de TNF ^ recombinant humain. Ainsi pour le sujet H, 50% de cytotoxicité correspond à une dilution comprise entre 1/1024 et 1/2048 des surnageants des monocytes stimulés avec du LPS et entre 1/8 et 1/16 pour la stimulation LPS+composition selon l'invention. 10 De même que pour le sujet G, les surnageants de culture des monocytes non stimulés et stimulés avec la composition selon la présente invention seule ne présente pas d'effet cytotoxique significatif. Bioassay TNF: effet de l'alpha-amylase sur la gamme de TNF^humain recombinant. Nous avons effectué ce même bioassay sur une gamme de TNF ^ humain recombinant avec ou 15 sans incubation du TNF ^ avec la composition selon la présent invention. La composition selon la présente invention a été mise à la concentration de 3000 UCEIP/L (tel qu'indiqué dans l'exemple 1) en présence du TNF^pendant 24h à 37°c sous 5% CO2. 50% de cytotoxicité correspondent à 4,9pg/ml pour le TNF ^ recombinant humain et 158pg/ml pour le TNF ^ avec alpha- amylase. Conclusion Au total, nos résultats indiquent que la composition selon la présente invention composée d'enzyme amylolytique et d'enzyme protéolytique, a un effet marqué sur la production de TNF ^par les monocytes. Cet effet est détectable dans le bioassay et réduit de 50 à 100 fois 25 l'effet biologique du TNF El Cet effet n'est pas détecté dans les tests ELISA, possiblement parce qu'une quantité massive de TNF ^ est produite avec la seule concentration testée de LPS. Un tel résultat permet de conclure que l'application de la présente invention au traitement, en particulier par application topique locale, préventif et curatif des phénomènes inflamma- 30 toires impliquant le TNF-alpha tels que les affections de la sphère oropharyngée et plus particulièrement les rhinites permet de réduire les symptômes de congestion et d'irritation 24 20 traditionnellement associés à ces pathologies. EXEMPLE 4 - FORMULATION POUR APPLICATION TOPIQUE NASALE. La formulation suivante est réalisée : Une solution tamponnée à pH 6,6 contenant 500 U.CEIP/ml d'alfa-amylase, et 5*10-3 UA /ml et contenant 9 g/1 de NaCl est préparée. La formulation liquide ainsi obtenue est conditionnée dans un vaporisateur nasal à pompe. Le protocole d'administration est le suivant : 1 pulvérisation dans chaque narine 3 fois/jour pendant 4 jours. Chaque pulvérisation délivre environ 1 ml de solution. Apres 4 jours de traitement sur 9 volontaires, seuls quelques démangeaisons et sensation d'humidité nasale ont pu être notées, mais aucune intolérance n'a été rapportée. L'effet décongestionnant et anti-inflammatoire au niveau de la muqueuse nasale a été rapporté par les utilisateurs.15 REVENDICATIONS1- Composition pharmaceutique anti-inflammatoire comprenant à titre de principe actifs, 5 une alpha-amylase et au moins une enzyme à activité protéolytique. 2- Composition pharmaceutique selon la revendication 1 pour son utilisation en tant que médicament destiné à prévenir et/ou traiter une réaction inflammatoire des muqueuses. 10 3- Composition pharmaceutique selon la revendication 2 pour son utilisation en tant que médicament pour application topique au niveau des muqueuses. 4- Composition pharmaceutique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la réaction inflammatoire des muqueuses est provoquée par une surexpression et/ou une suracti-15 vation de cytokines, particulièrement de cytokines TNF-alpha. 5- Composition selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est destinée à une application topique au niveau des muqueuses. 20 6- Composition selon l'une des revendications 1 à 5 pour utilisation comme médicament anti-inflammatoire de la muqueuse oropharyngée. 7- Composition selon l'une des revendications 1 à 6 pour utilisation comme médicament pour le traitement des rhinites, rhinites virales, rhinites allergiques, rhinites saisonnières, 25 rhinites chroniques, le rhume des foins, la pharyngite, la trachéite, l'angine, la laryngite, l' otite. 8- Composition selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que l'activité amylasique est comprise entre 100 et 1000 U. CEIP par ml de composition, plus particulière- 30 ment entre 250 et 750 U. CEIP par ml de composition et plus particulièrement encore aux environs de 500 U.CEIP par ml de composition. 9- Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'activité protéolytique est comprise entre 2* 10-3 et 40* 10"3 UA par ml de composition, plus particuliè- 35 rement entre 2* 10-3 et 20* 10-3 UA par ml de composition et plus particulièrement encore entre 2* 10-3 et 10* 10-3 UA par ml de composition, voire encore plus particulièrement aux environs de 4* 10-3 à 6* 10-3 UA par ml, plus particulièrement encore aux environs de 5 * 10" 3 UA par ml de composition. 1010- Composition selon l'un des revendications 1 à 9 caractérisée en ce qu'il s'agit une composition aqueuse comprenant un tampon pH assurant un pH compris entre 6 et 7, du NaCl, de l'alpha-amylase dans une quantité de 250 à 750 U.CEIP/ml. 11- Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 10 se présentant sous la forme d'un kit comprenant d'une part, un mélange pulvérulent contenant au moins une enzyme amylolytique et au moins une enzyme protéolytique et d'autre part, un mélange liquide excipiendaire adéquat pour reconstitution extemporanée. 12- Association d'amylase et de protéase comme médicament pour utilisation dans le traitement topique de l'inflammation de la muqueuse nasale.