FR 2980110 A1 20130322 FR 1158344 A 20110920 Combinaison d'anticorps anti-CD20 et de bendamustine L'invention concerne la combinaison d'anticorps anti-CD20 et de bendamustine, et les applications thérapeutiques d'une telle combinaison. L'antigène CD20 est une protéine transmembranaire présente sur les lymphocytes pré-B ainsi que sur les lymphocytes B matures. L'antigène CD20 est présent à la surface de plus de 90% des lymphocytes B périphériques et des organes lymphoïdes. On le retrouve sur les lymphocytes B normaux et tumoraux. Plus particulièrement, l'antigène CD20 est exprimé sur plus de 90% des lymphomes non-hodgkinien et est absent des cellules souches hématopoïétiques, des lymphocytes pro-B, des plasmocytes ou des autres tissus sains. L'antigène CD20 jouerait un rôle dans la prolifération et/ou la différenciation des lymphocytes B mais celui-ci est mal connu. Cependant il représente une cible intéressante de thérapie ciblée pour contrôler et tuer les lymphocytes B impliqués dans des cancers ou des maladies auto-immunes. IDEC Pharmaceuticals Corporation, U.S a développé un anticorps monoclonal anti-CD20 chimérique, le Rituximab, commercialisé sous le nom de Rituxan® ou MabThera®. Cet anticorps est maintenant utilisé dans le traitement des leucémie lymphoïde chronique et a de nombreuses applications dans le traitement des maladies immunologiques médiées par les lymphocytes B, comme par exemple les tumeurs malignes, telles que la lymphomes nonhodgkiniens, certaines maladies auto-immunes comme l'anémie hémolytique auto-immune, le purpura thrombocytopénique idiopathique et les maladies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïde ou la sclérose en plaques. Plusieurs autres anticorps monoclonaux anti-CD20 ont été développés, parmi lesquels l'anticorps EMAB603 tel que décrit dans la demande de brevet W02006/064121. Cet anticorps est produit par le clone R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). La bendamustine, qui est l'acide (4- {5-[Bis(2-chloroethyl)amino]-1-methy1-2- benzimidazoly1} butyrique, a été synthétisée initialement dans les années soixante en République Démocratique Allemande (DDR), puis était disponible de 1971 à 1992 sous le 30 nom de Cytostasan®. Elle a été ensuite commercialisée en Allemagne sous le nom de Ribomustine® pour le traitement de la leucémie lymphocytique chronique (LLC), du lymphomes non-hodgkiniens, du myélomes, et du cancer du sein. La bendamustine est commercialisée aux Etats-Unis sous la marque Treanda®, par Cephalon. Des combinaisons d'anticorps anti-CD20 et de bendamustine ont été proposées 5 (W02010/083365 et W02011/018224). Résumé de l'invention Un objet de l'invention est un anticorps anti-CD20, pour une utilisation dans le traitement d'une tumeur, en combinaison avec de la bendamustine, ledit anticorps anti-CD20 étant un anticorps monoclonal dont la chaîne légère comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID 10 NO :7 et la chaîne lourde comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID NO :8. De préférence l'anticorps est produit par le clone R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps comprenant la séquence de chaîne légère SEQ 15 ID NO :7 et la séquence de chaîne lourde SEQ ID NO :8 est un anticorps recombinant produit par transgénèse animale, de préférence dans le lait d'une chèvre transgénique. L'anticorps et la bendamustine sont destinés à une administration séparée, simultanée ou séquentielle. L'anticorps et la bendamustine peuvent être combinés au sein de la même composition 20 pharmaceutique. L'invention fournit alors une composition pharmaceutique comprenant de la bendamustine et un anticorps anti-CD20, ledit anticorps anti-CD20 étant un anticorps monoclonal comprenant la séquence de chaîne légère SEQ ID NO :7 et la séquence de chaîne lourde SEQ ID NO :8, de préférence produit par le clone R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro 25 d'enregistrement CNCM 1-3529. De préférence la composition pharmaceutique est destinée à une administration par voie intraveineuse ou intrapéritonéale. La combinaison de l'invention est utile dans le traitement d'une tumeur, de préférence une tumeur maligne exprimant l'antigène CD20, telle qu'un lymphome ou une leucémie. Selon un mode de réalisation particulier, la tumeur est un lymphome non-hodgkinien. Légende des figures La Figure 1 est un graphe qui représente le volume tumoral chez des souris portant des xénogreffes d'une lignée tumorale issue d'un lymphome folliculaire humain RL, traités avec un anticorps anti-CD20 (rituximab ou R603) et bendamustine, seuls ou en combinaison. Les cellules tumorales sont injectées au jour 1. Les flèches indiquent les jours de l'administration du traitement. Les étoiles indiquent une différence significative, en terme de volume des 10 tumeurs, de p De préférence, l'anticorps possède deux chaînes légères dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 et la région constante humaine est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO: 4, et deux chaînes lourdes dont le domaine variable est code par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2 et la région constante est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3. Chacune des chaînes légères de l'anticorps est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6. La séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 7 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps. La séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6 codant pour chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3 codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps. La séquence peptidique de chacune des chaînes légères, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 5, est la séquence SEQ ID NO : 7 et la séquence peptidique de chacune des chaînes lourdes, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 6, est la séquence SEQ ID NO : 8. L'acide aminé situé en position 106 est une lysine (K) dans la séquence SEQ ID NO : 7. L'anticorps utilisé dans l'invention peut être produit par toute technique connue de l'homme du métier. Dans un premier mode de réalisation, l'anticorps est un anticorps monoclonal produit par le clone R603, déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529. Il présente alors une fucosylation d'une teneur d'environ 50%. Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps est un anticorps recombinant, obtenu par génie 30 génétique. Il peut ainsi être produit par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par recombinaison dans une cellule hôte, transformée avec un ou des vecteur(s) qui permettent l'expression et/ou la sécrétion des séquences nucléotidiques codant pour la chaîne lourde et/ou la chaîne légère de l'anticorps. Le vecteur comporte généralement un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il est maintenu de façon stable dans la cellule hôte et peut éventuellement posséder des signaux particuliers qui spécifient la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents éléments sont choisis et optimisés par l'homme du métier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que la lipofection, l'électroporation, l'utilisation d'agents polycationiques, le choc thermique, ou des méthodes chimiques. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. Les cellules de mammifère préférées pour la production de l'anticorps monoclonal sont la lignée de rat YB2/0, la lignée de hamster CHO, en particulier les lignées CHO dhfr- et CHO Lecl3, PER.C6TM (Crucell), 293, K562, NSO, SP2/0, BHK ou COS. On peut également utiliser des cellules d'insectes. Un autre mode de production est l'expression de l'anticorps recombinant dans des organismes transgéniques, par exemple dans les plantes (Ayala M, Gavilondo J, Rodriguez M, Fuentes A, Enriquez G, Pérez L, Cremata J, Pujol M. Production of plantibodies in Nicotiana plants. Methods Mol Biol. 2009;483:103-34.) ou surtout dans le lait d'animaux transgéniques tels que la lapine, la chèvre ou le porc (Pollock, D.P., J.P. Kutzko, E. Birck-Wilson, J.L. Williams, Y. Echelard and H.M. Meade. (1999). Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. Journal of Immunological Methods. 231: 147-157). Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps est produit dans le lait de mammifères transgéniques non humains, modifiés génétiquement pour produire cette glycoprotéine. De préférence, il s'agit du lait d'une lapine ou d'une chèvre transgénique, de préférence dans le lait d'une chèvre transgénique. La sécrétion de l'anticorps par les glandes mammaires, permettant sa présence dans le lait du mammifère transgénique, implique le contrôle de l'expression de l'anticorps de manière tissu-dépendante. De telles méthodes de contrôle sont bien connues de l'homme du métier. Le contrôle de l'expression est effectué grâce à des séquences permettant l'expression de la glycoprotéine dans un tissu particulier de l'animal. Il s'agit notamment des séquences promotrices de type « WAP », « I3-caséine », « 13-lactoglobuline » et éventuellement des séquences de type peptide signal. De préférence, on produit l'anticorps dans les glandes 5 mammaires d'une chèvre transgénique, en utilisant un vecteur d'expression comprenant la séquence des deux chaînes, sous le contrôle d'un promoteur 5' I3-caséine. Un procédé d'extraction de protéines d'intérêt à partir du lait d'animaux transgénique est décrit dans le brevet EP 0 264 166. De manière avantageuse, l'anticorps produit par transgénèse animale, en particulier dans les 10 glandes mammaires d'une chèvre transgénique, présente une glycosylation avec un taux de galactosylation élevé, par exemple supérieur 70%. Le terme « tumeur » inclut de préférence les tumeurs malignes, à savoir les cancers. Les cancers incluent les lymphomes, la maladie de Hodgkin, les leucémies, le cancer du poumon, du poumon non à petites cellules (NSCL), le cancer du poumon bronchiooalvéolaire, le 15 cancer des os, le cancer du pancréas, le cancer de la peau, le cancer de la tête et du cou, le mélanome cutané ou intra-oculaire, le cancer de l'utérus, le cancer de l'ovaire, le cancer du rectum, le cancer de la marge anale, le cancer de l'estomac, le cancer du duodenum, le cancer du côlon, le cancer du sein, le cancer de l'utérus, le carcinome des trompes de Fallope, le cancer de l'endomètre, le cancer du col de l'utérus, le carcinome du vagin, le carcinome de la 20 vulve, le cancer de l'oesophage, les cancers de l'intestin grêle, le cancer du système endocrinien, le cancer de la glande thyroïde, le cancer de la glande parathyroïde, le cancer de la glande surrénale, le sarcome des tissus mous , le cancer de l'urètre, le cancer du pénis, le cancer de la prostate, le cancer de la vessie, le cancer du rein ou l'uretère, le carcinome des cellules rénales, le carcinome du bassinet, le mésothéliome, le cancer hépatocellulaire, le 25 cancer des voies biliaires, les tumeurs du système nerveux central (SNC), les tumeurs de l'axe spinal, le gliome du tronc cérébral, le glioblastome multiforme, les astrocytomes, schwanomes, ependymones, médulloblastomes, méningiomes, l'adénome hypophysaire, y compris les versions réfractaires de tous les cancers ci-dessus, ou une combinaison d'un ou plusieurs des cancers les plus haut. 30 Les tumeurs exprimant l'antigène CD20 sont préférées, c'est-à-dire les tumeurs dans lesquelles on observe un niveau significatif de l'expression de l'antigène CD20 dans une cellule, de préférence sur la surface des cellules T ou cellules B, de préférence une cellule B, d'une tumeur ou un cancer, de préférence une tumeur non solide. Les patients ayant une tumeur exprimant CD20 peuvent être déterminés par des essais standard connues dans l'art. Par exemple, l'expression des antigènes CD20 peut être mesurée à l'aide de test d'immunohistochimie (IHC), de cytométrie de flux (FACS) ou par PCR basée sur la détection de l'ARNm correspondant. Les « tumeurs ou cancers exprimant l'antigène CD20 » se réfèrent à toutes les tumeurs ou à tous les cancers dans lesquels les cellules cancéreuses montrent une expression de l'antigène CD20. Sont inclus notamment des lymphomes (de préférence lymphomes non hodgkinien à cellules B (LNH)) et les leucémies (de préférence les leucémies lymphoïdes chroniques et les lymphoblastomes à cellules B). Ces lymphomes et les leucémies comprennent par exemple a) les lymphomes folliculaires, b) Les lymphome de Burkitt (dont le lymphome endémique de Burkitt, le lymphome sporadique de Burkitt et le lymphome non-Burkitt) c) les lymphomes de la zone marginale (y compris lymphome à cellules B de la zone marginale extraganglionnaire, lymphome du tissu lymphatique associé aux muqueuses, (MALT), lymphome à cellules B de la zone marginale ganglionnaire, le lymphome de la zone marginale splénique), d) un lymphome des cellules du manteau (MCL), e) les lymphomes à grandes cellules (y compris lymphome B diffus à grandes cellules (DLCL), lymphome diffus à cellules mixtes, Lymphome immunoblastique, lymphome primitif du médiastin à cellules B, f) la leucémie à tricholeucocytes, g) le lymphome lymphoblastique à cellules B, h) la maladie de Waldenstrôm, i) la leucémie aiguë lymphoblastique (LAL), leucémie lymphoïde chronique (LLC) / lymphome lymphocytique (SLL), leucémie prolymphocytaire B, j), le myélome multiple, le plasmocytome j) la maladie de Hodgkin. Dans un autre mode de réalisation, il s'agit d'un lymphome à cellules B non-hodgkinien (LNH). Dans un autre mode de réalisation, il s'agit d'un lymphome des cellules du manteau (LCM), une leucémie aiguë lymphoblastique (LAL), leucémie lymphoïde chronique (LLC), lymphome à cellules B diffus à grandes cellules (DLCL), un lymphome de Burkitt, une leucémie à tricho leucocytes, lymphome folliculaire, myélome multiple, le lymphome de la zone marginale, syndromes lymphoprolifératifs post-greffe (SLP), un lymphome associé au VIH, une maladie de Waldenstrôm, ou un lymphome primitif du SNC. Selon l'invention, le terme « traitement » signifie traitement curatif ou prophylactique d'une maladie, et inclut l'amélioration des symptômes de la maladie, et la diminution du risque de rechute, et du risque de métastases. L'anticorps anti-CD20 et la bendamustine, peuvent être combinés au sein d'une même composition pharmaceutique, ou être utilisés sous forme de compositions pharmaceutiques séparées, administrables de manière simultanée ou séquentielle. En particulier ils peuvent être administrés séparément, à savoir soit concomitamment, soit indépendamment, par exemple, avec un décalage dans le temps. Conformément à l'invention, les deux agents thérapeutiques sont utilisés en combinaison afin de potentialiser les effets antiprolifératifs de l'un et de l'autre. De la même manière, les deux agents thérapeutiques sont utilisés en combinaison afin de potentialiser les effets cytotoxiques de l'un et de l'autre. Les compositions selon l'invention peuvent être administrées par toute voie d'administration appropriée, par exemple par voie parentérale, orale, sublinguale, vaginale, rectale, transdermale, de préférence par injection intraveineuse, sous-cutanée ou intradermique. Une injection intramusculaire, intrapéritonéale, intrasynoviale, intrathécale ou intratumorale est aussi possible. Les injections peuvent être réalisées sous forme de bolus, ou par perfusion continue. Lorsque la composition d'anticorps anti-CD20 et la composition de bendamustine sont administrées séparément, ces compositions peuvent être sous une forme d'administration identique ou différente. Les compositions de l'invention peuvent comprendre ou être associées à d'autres agents chimiothérapeutiques ou cytotoxiques, mais cela de manière non préférée. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention comprennent avantageusement un ou plusieurs excipients ou véhicules, acceptables sur le plan pharmaceutique. On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales, l'acacia, etc. Les compositions peuvent être formulées sous forme de suspensions injectables, gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons. Une composition pharmaceutique utile dans l'invention comprend par exemple un anticorps anti-CD20, un polysorbate, un tampon et du mannitol et/ou de la glycine et possède un pH compris entre 5,0 et 7,0. Les termes « combinaison », ou «co-administration» se rapportent à l'administration de l'anticorps anti-CD20 et de la bendamustine sous la forme d'une formulation unique ou comme deux formulations distinctes. L'administration peut être simultanée ou séquentielle, dans n'importe quel ordre. Les deux agents thérapeutiques peuvent être administrés simultanément (dans le même temps) ou successivement, par exemple via une injection intraveineuse (iv) par une perfusion continue (une pour l'anticorps anti-CD20 et éventuellement une pour la bendamustine). Avantageusement, l'anticorps anti-CD20 est administré avant la bendamustine. Lorsque les deux agents thérapeutiques sont administrés de façon séquentielle, la dose est administrée soit le même jour, par au moins deux administrations distinctes, ou alors l'un des agents est administré le premier jour et le second le jour suivant, ou le jour d'après par exemple. Dans un protocole particulier, la bendamustine peut être administrée deux fois par semaine et l'anticorps une fois par semaine. Dans un autre protocole particulier, la bendamustine peut être administrée pendant deux jours, tous les vingt huit jours. Selon le type et la sévérité de la maladie, on peut proposer une posologie d'environ 50 à 5000 mg/jour, ou d'environ 50 à 2000 mg/jour, avantageusement d'environ 100 à 500 mg/jour (par exemple 300mg/jour) d'anticorps anti-CD20 et 10 à 500 mg/m2/jour, ou d'environ 50 à 200 mg/m2/jour, (par exemple 300 mg/m2/jour) de bendamustine, pour l'administration concomitante des deux médicaments pour le patient. Dans un mode de réalisation préféré, le dosage de l'anticorps est dans la gamme d'environ 0.05mg/kg à environ 80mg/kg de poids corporel, soit d'environ 0.5mg à environ 8g par jour. Dans un mode de réalisation préféré, le dosage de bendamustine est dans la gamme allant de 0,01 mg / kg à environ 500 mg / kg, par exemple 0,1 mg / kg à 300mg / kg, soit d'environ 0.lmg à 20 g par jour. En variante, une dose de charge initiale plus élevée, suivie par une ou plusieurs doses inférieures peuvent aussi être administrées. En autre variante, une dose de charge initiale moins élevée, suivie par une ou plusieurs doses supérieures peuvent aussi être administrées. Dans un mode de réalisation particulier, on peut utiliser l'anticorps anti-CD20 et la bendamustine dans un rapport anticorps/bendamustine de 3/1 à 1/1. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLES : Exemple 1 : Activité antitumorale sur un modèle de lymphome folliculaire humain (lymphome non Hodgkin) : Protocole : On a injecté à des souris (souris SCID CB17 âgées de 6 semaines) une dose sous-cutanée de 2.106 cellules de la lignée RL issue d'un lymphome folliculaire humain en croissance exponentielle, dans un volume de 200gt de milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum de veau fétal. Quand les tumeurs devenaient palpables (volume médian de 100 mm2), les souris étaient réparties au hasard en groupes de dix souris. Tableau 1 : Protocole de l'étude Groupe composé Dosage Nombre de souris Voie Nombre de Dose cumulée (mg/kg) d'administration traitements (mg/kg) 1 Véhicule (PBS) - 10 i.p., q7d 4 - / - 2 R603 (LFB) 60 10 i.v., q7d 4 240 3 Rituximab (Roche) 60 10 i.v., q7d 4 240 4 Bendamustine 30 10 i.p., q7d 4 120 (Pro Bio Sint) 4 240 R603 60 10 i.v., q7d Bendamustine 30 i.p., q7d 4 120 4 240 6 Rituximab 60 10 i.v., q7d Bendamustine 30 i.p., q7d 4 120 i.v : intraveineuse i.p. : intrapéritonéale q7d : 1 injection par semaine Les traitements ont commencé 21 jours après la transplantation des cellules de lymphome. 5 L'anticorps anti-CD20 (R603 ou rituximab) et le véhicule sont administrés par voie i.v. une fois par semaine. La bendamustine est administrée par voie intrapéritonéale une fois par semaine, le même jour que l'anticorps. L'étude visait à comparer l'évolution des volumes des tumeurs en fonction des différents traitements. Résultats : L'inhibition de la croissance tumorale a été calculée en comparant les groupes traités au groupe contrôle. Le tableau 2 ci-dessous montre que la combinaison de l'anticorps R603 avec la bendamustine offre 100% d'inhibition au 31ème jour. Tableau 2 : Inhibition de la croissance tumorale au 31ème jour Traitement Dose (mg/kg) Inhibition de la croissance tumorale R603 60 87% Rituximab 60 82% bendamustine 30 77% R603 + 60+30 100% bendamustine Rituximab + 60+30 100% bendamustine En outre, la Figure 1 montre que l'anticorps R603 présente une plus grande activité vis-à-vis des xénogreffes de tissu cancéreux, par rapport au rituximab, en combinaison avec la bendamustine. La figure montre qu'un délai de 7 jours sur la croissance tumorale est observé entre les deux anticorps en combinaison avec la bendamustine.