FR 2980711 A1 20130405 FR 1158923 A 20111003 MODULATION DU SYSTEME IMMUNITAIRE ET DES CELLULES STROMALES VIA RANK DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à une composition pour son utilisation comme médicament destiné à moduler le système immunitaire, ainsi qu'à un procédé in vitro d'identification d'une molécule capable de moduler le système immunitaire. La présente invention trouve des applications notamment dans le domaine de la médecine, notamment dans le traitement des maladies du système immunitaire, par exemple l'immunodéficience, la neutropénie, la lymphopénie, le SIDA, les maladies auto-immunes, les tumeurs ou les maladies dues à un système immunitaire hyperactif. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets (11) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Le système immunitaire possède une importante capacité à s'adapter aux changements environnementaux, en vue de fournir la meilleure réponse possible à une situation immunitaire. Toutefois, le système immunitaire présente parfois des défaillances, qui peuvent être classées en 3 catégories : l'hypersensibilité, l'immunodéficience et l'auto-immunité. Les deux premières correspondent schématiquement à une réponse immunitaire trop intense ou insuffisante. L'auto-immunité correspond à un dysfonctionnement de la reconnaissance des constituants du soi et non-soi par le système immunitaire spécifique. Le nombre de personnes présentant de telles défaillances de leur système immunitaire étant en constante augmentation dans le monde, la recherche d'outils 2 980 711 2 thérapeutiques palliant ces défaillances est devenue d'un intérêt majeur pour la médecine. Les organes lymphoïdes secondaires (SLO pour « secondary lymphoid organs »), tels que les ganglions lymphatiques (LNs pour « lymph 5 nodes »), jouent un rôle important dans l'adaptation du système immunitaire aux changements environnementaux. En effet, ils sont les sites anatomiques dans lesquels l'information en provenance des tissus est intégrée par les cellules immunitaires. Au cours des dernières années, il est apparu que les cellules stromales non hématopoïétiques qui 10 supportent le parenchyme des organes lymphoïdes secondaires jouent un rôle clé dans l'orchestration de la réponse immunitaire (Junt, T. et al. 2008. Form follows function: lymphoid tissue microarchitecture in antimicrobial immune defence. Nat. Rev. Immunol. 8:764-775, [1] ; Mueller, S. N. et al. 2009. Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the 15 immune system. Nat. Rev. Immunol. 9:618-629, [2]). Le stroma comprend les cellules vasculaires sanguines (BEC pour « blood endothelial cell ») et les cellules endothéliales lymphatiques (LEC pour « lymph endothelial cells »), ainsi que les cellules réticulaires fibroblastiques (FRC pour « fibroblastic reticular cells »), qui sont interconnectées par un système de 20 micro-conduits (Lammermann, T., and M. Sixt. 2008. The microanatomy of T-cell responses. Immunol. Rev. 221:26-43, [3]). Les cellules réticulaires fibroblastiques sont constituées de cellules réticulaires de la zone des cellules T (TRC pour « T zone reticular cells »), la zone des sinus marginaux (MRC pou « Marginal Reticular Cell ») et les follicules de 25 cellules B, des cellules dendritiques folliculaires (FDC pour « follicular dendritic cell ») (Roozendaal, R., and R. E. Mebius. 2011. Stromal cellimmune cell interactions. Annu. Rev. Immunol. 29:23-43, [4]; Fletcher, A. L., D. Malhotra, and S. J. Turley. 2011. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends Immunol. 32:12-18, [5] ; Luther, S. 30 A., T. K. Vogt, and S. Siegert. 2011. Guiding blind T cells and dendritic cells: A Gloser look at fibroblastic reticular cells found within lymph node T zones. Immunol. Lett.:in press, [6] ; Katakai, T. et al. 2008. Organizer-like reticular stromal cell layer common to adult secondary lymphoid organs. J. Immunol. 181:6189-6200, [7]). Les cellules vasculaires régulent l'entrée et la sortie des lymphocytes (Palframan, R. T. et al. 2001. Inflammatory chemokine transport and presentation in HEV: a remote control mechanism for monocyte recruitment to lymph nodes in inflamed tissues. J. Exp. Med. 194:1361-1373, [8] ; Browning, J. L. et al. 2005. Lymphotoxinbeta receptor signaling is required for the homeostatic control of HEV differentiation and function. Immunity 23:539-550, [9] ; Pham, T. H. et al. 2009. Lymphatic endothelial cell sphingosine kinase activity is required for lymphocyte egress and lymphatic patterning. J. Exp. Med. 207:17-27, [10] ; Schwab, S. R., and J. G. Cyster. 2007. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nat. Immunol. 8:1295-1301, [11]), la fonction des cellules réticulaires fibroblastiques dans l'homéostasie des cellules T et des cellules B (Link, A. et al. 2007. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nat. Immunol. 8:1255-1265, [12] ; Kosco, M. H. et al. 1992. Follicular dendritic celldependent adhesion and proliferation of B cells in vitro. J. Immunol. 148:2331-2339, [13]) et, ensemble, ils fournissent le cadre structurel 2 0 nécessaire pour la rencontre des cellules immunitaires et leur activation ([2], [3], [12]). Lors d'une réponse immunitaire, les cellules stromales doivent s'adapter à l'expansion rapide des organes lymphoïdes secondaires et à l'augmentation massive du nombre de lymphocytes ([7] ; Kumar, V. et al. 25 2011. Global lymphoid tissue remodeling during a viral infection is orchestrated by a B cell-lymphotoxin-dependent pathway. Blood 115:47254733, [14]), démontrant ainsi une énorme plasticité. Cependant, les questions de savoir comment les organes lymphoïdes secondaires accomplissent leur augmentation de taille, et si ce mécanisme implique les 30 cellules stromales, ne sont pas résolues. 2 980 711 4 Durant l'embryogenèse, les cellules stromales interagissent avec les cellules inductrices de tissus lymphoides (LTi pour « lymphoid tissue inducer ») et orchestrent le développement de organes lymphoïdes secondaires par la production de chémokines et de molécules d'adhésion 5 (Cupedo, T., and R. E. Mebius. 2005. Cellular interactions in lymph node development. J. Immunol. 174:21-25, [15] ; Honda, K. et al. 2001. Molecular basis for hematopoietic/mesenchymal interaction during initiation of Peyer's patch organogenesis. J. Exp. Med. 193:621-630, [16] ; Cupedo, T. et al. 2004. Presumptive lymph node organizers are differentially 10 represented in developing mesenteric and peripheral nodes. J. Immunol. 173:2968-2975, [17] ; White, A. et al. 2007. Lymphotoxin a-dependent and -independent signais regulate stromal organizer cell homeostasis during lymph node organogenesis. Blood 110:1950-1959, [18] ; Coles, M. C. et al. 2006. Role of T and NK cells and IL7/1L7r interactions during neonatal 15 maturation of lymph nodes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:13457-13462, [19]). Elles expriment la lymphotoxine (LT) p. R (LT(3R), qui est une molécule clé dans ce processus (Tumanov, A. V. et al. 2003. The role of lymphotoxin in development and maintenance of secondary lymphoid tissues. Cytokine. Growth. Factor. Rev. 14:275-288, [20] ; Browning, J. L. 2008. Inhibition of the lymphotoxin pathway as a therapy for autoimmune disease. Immunol. Rev. 223:202-220, [21 ]). Comme la LTI3R, RANK (receptor activator of NF-KB) est un membre de la superfamille des récepteurs du TNF (TNFRSF11a), qui intervient également dans le signal via les voies de signalisations classiques et alternatives NF-KB (Wada, T. et al. 2006. RANKL-RANK signaling in osteoclastogenesis and bone disease. Trends Mol. Med. 12:17-25, [22] ; Dejardin, E. et al. 2002. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity 17:525-535, [23]). RANK est activé par RANKL (« Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand » également appelé TNFSF11 et TRANCE), qui est bloqué par le récepteur soluble leurre ostéoprotégérine (OPG) ([22] ; Walsh, M. C., and Y. Choi. 2003. Biology of the TRANCE axis. Cytokine Growth Factor Rev. 14:251-263, [24]). RANKL est une cytokine de la superfamille du TNF. Il s'agit d'une protéine transmembranaire de type II (partie N-termilane intracellulaire) qui est surtout présente dans les organes lymphoïdes (cellules stromales et lymphocytes T activés) et le tissu osseux où elle est exprimée à la surface des ostéoblastes sous la forme d'un homotrimère. Il existe deux sortes de RANKL (d'environ 40-45 kDa chacune) ainsi qu'une forme soluble (d'environ 30 kDa), cette dernière pouvant provenir d'un épissage alternatif ou d'un clivage protéolytique des formes membranaires par des protéases telles que TAGE, MT1-MMP, MMP-7 et MMP-14. L'ostéoprotégérine est exprimée par les ostéoblastes et joue un rôle de récepteur leurre en interagissant avec RANKL. Les souris déficientes en RANK ont un déficit de la majorité des ganglions lymphatiques (Kong, Y. Y. et al. 1999. OPGL is a key regulator of osteoclastogenesis, lymphocyte development and lymph-node organogenesis. Nature 397:315-323, [25] ; Dougall, W. C. et al. 1999. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes. Dev. 13:2412-2424, [26] ; Kim, D. et al. 2000. Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE. J. Exp. Med. 192:1467-1478, [27]), ce qui a entravé l'élucidation de son rôle dans le développement des ganglions lymphatiques et son homéostasie immunitaire. Les cellules LTi expriment RANK et RANKL et leur formation en cluster est réduite chez les souris déficientes en RANKL « KO RANKL » ([27]). En outre, RANK stimule l'expression de LTa1132 par les cellules LTi, le ligand de LT13R (Yoshida, H. et al. 2002. Different cytokines induce surface lymphotoxin-alphabeta on IL-7 receptor-alpha cells that differentially engender lymph nodes and Peyer's patches. Immunity 17:823-833, [28]). Cela a conduit à l'hypothèse que le signal paracrine RANK-RANKL dans les cellules LTi résulte en l'activation de LTI3R sur des cellules stromales et en la formation subséquente d'organes 2 980 711 6 lymphoïdes secondaires. Toutefois, le sauvetage de l'organogenèse des ganglions lymphatiques dans les souris Rank/I- par l'expression transgénique de RANKL dans les cellules B ou T ne restaure pas le nombre de cellules LTi à des niveaux normaux, et l'engagement des LT13R 5 des cellules stromales par un anticorps agoniste semble incapable de normaliser la formation de LNs ([27]). Par ailleurs, les plaques de Peyer et les LNs mésentériques sauvés des souris Rank/I- sont plus petits ([25] ; [27]) et montrent des follicules de cellules B désorganisés ([27] ; Knoop, K. A. et al. 2009. RANKL is necessary and sufficient to initiate development of 10 antigen-sampling M cells in the intestinal epithelium. J. Immunol. 183:5738- 5747, [29]). Les LNs de souris déficients en TRAF6 (Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6) TRAF6--, une molécule adaptatrice dans la voie de signalisation de RANK, mais dont les LNs ont été sauvés par la surexpression de l'IL-7, manquent de follicules de cellules B clairement 15 définis ([28]). Ces résultats soulignent la connaissance actuelle incomplète des fonctions pré- et post-natales de RANK dans la formation des organes lymphoïdes secondaires et l'homéostasie. Le follicule pileux (HF pour « hair follicle), une des caractéristiques déterminantes des mammifères, est un mini-organe de la peau, qui se 20 régénère périodiquement par des cycles répétitifs de croissance (anagène), de régression (catagène) et de relative quiescence (télogène) (Schneider, M. R. et al. 2009. The hair follicle as a dynamic miniorgan. Curr. Biol. 19:R132-142, [30]). Il a une association spécifique avec le système immunitaire car il bénéficie d'un relatif privilège immunitaire 25 (Paus, R. et al. 2005. A 'hairy' privilege. Trends Immunol. 26:32-40, [31]) et partage des produits géniques avec le thymus, le plus souvent illustré par la souris nude Foxn-11-, qui a la particularité de manquer de pilosité et de thymus. RANK et RANKL sont exprimés dans le thymus et fonctionnent dans le cadre de la formation des cellules épithéliales thymiques 30 médullaires (Rossi, S. W. et al. 2007. RANK signais from CD4+3- inducer cells regulate development of Aire-expressing epithelial cells in the thymic medulla. J. Exp. Med. 14:14, [32] ; Akiyama, T. et al. 2008. The tumor necrosis factor family receptors RANK and CD40 cooperatively establish the thymic medullary microenvironment and self-tolerance. Immunity 29:423-437, [33] ; White, A. J. et al. 2008. Sequential phases in the development of Aire-expressing medullary thymic epithelial cells involve distinct cellular input. Eur. J. Immunol. 38:942-947, [34] ; Hikosaka, Y. et al. 2008. The cytokine RANKL produced by positively selected thymocytes fosters medullary thymic epithelial cells that express autoimmune regulator. Immunity 29:438-450, [35] ; Mouri, Y. et al. 2011. Lymphotoxin Signal Promotes Thymic Organogenesis by Eliciting RANK Expression in the Embryonic Thymic Stroma. J. Immunol. 186:5047-505732-36), [36]). La peau est la plus grande surface épithéliale et son unité épidermopilo-sébacées comprend l'épiderme, le follicule pileux et la glande sébacée. Le follicule pileux a donc la particularité de subir des cycles de croissance (anagène), de régression (catagène) et de quiescence relative (télogène), ce qui en fait un excellent système pour l'étude des cellules, notamment des cellules souches, de l'épiderme, et du remodelage d'organes. Or, RANK joue un rôle important pour le follicule pileux, car la stimulation de RANK des cellules souches de follicules pileux est requise pour l'entrée dans l'anagène, qui produit à son tour RANKL soluble (Duheron, V. et al. 2011. Receptor Activator of NF-kB (RANK) stimulates the proliferation of epithelial cells of the epidermo-pilosebaceous unit. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 108:5342-5347, [37]). En dépit de l'existence de nombreux outils thérapeutiques pour le traitement des pathologies du système immunitaire, il existe encore un réel besoin de nouveaux produits d'immunothérapie, palliant les défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier des produits thérapeutiques sur le marché. Description de l'invention C'est pourquoi la Demanderesse a réalisé d'importantes études d'analyse d'une souris transgénique (Tg) pour RANK sous le contrôle du promoteur S100A8, actif dans les cellules souches de HF ([37]) et dans les macrophages (Lagasse, E., and I. L. Weissman. 1997. Enforced expression of BcI-2 in monocytes rescues macrophages and partially reverses osteopetrosis in op/op mice. Cell 89:1021-1031, [38]). La Demanderesse est parvenue à mettre en évidence de manière tout à fait inattendue une expansion post-natale massive de ganglions lymphatiques drainant de la peau de la souris montre, avec une augmentation dans les petits follicules de cellules B. De plus, elle a mis en évidence que les proportions et l'organisation des populations de cellules hématopoïétiques et stromales sont maintenues, à l'exception d'une augmentation des petits follicules de cellules B. Elle a également mis en évidence de manière tout à fait inattendue que les cellules immunitaires ne sont pas activées et répondent rapidement à l'immunisation. A l'issue d'importantes recherches au moyen de transferts de BM (moelle osseuse), transplantation de peau et expériences de sauvetage génétique, la Demanderesse est ainsi parvenue à démontrer que l'expression de RANK transgénique dans les follicules pileux est responsable de la croissance des ganglions lymphatiques. Elle est parvenue à démontrer que, de manière étonnante, RANKL est surproduit par les follicules pileux transgéniques et est responsable de la croissance des ganglions lymphatiques puisque la neutralisation de RANKL restaure la taille normale de l'organe. La Demanderesse a aussi mis en évidence de manière inattendue que les cellules vasculaires et réticulaires fibroblastiques expriment RANK et subissent une hyperprolifération, qui est abrogée par la neutralisation de RANKL. Par ailleurs, elle a réussi à démontrer au terme de ces recherches longues et difficiles que les cellules stromales montrent une transcription accrue des chémokines et des molécules d'adhésion cellulaire, ce qui contribuerait à la croissance des LNs. Les résultats de la Demanderesse démontrent ainsi qu'un ligand de RANK, par exemple RANKL, agit dans l'homéostasie des SLO en stimulant une prolifération équilibrée de tous les sous-ensembles de cellules stromales, de manière concomitante avec une augmentation du recrutement des lymphocytes. La présente invention se rapporte donc à une composition comprenant un agoniste ou un antagoniste de RANK pour son utilisation comme médicament destiné à moduler le système immunitaire. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une composition comprenant un agoniste ou un antagoniste de RANK pour la préparation d'un médicament destiné à moduler le système immunitaire. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une composition comprenant un agoniste ou un antagoniste de RANK pour la modulation du système immunitaire. On entend par « moduler le système immunitaire », au sens de la présente invention, toute modification de la réponse immunitaire ou de toute activité biologique impliquée dans la réponse immunitaire en comparaison avec l'état du système immunitaire antérieurement à l'administration de la composition de l'invention. La modulation du système immunitaire peut être une augmentation ou une diminution de la réponse immunitaire ou de toute activité biologique impliquée dans la réponse immunitaire. Par exemple, la composition utilisée dans l'invention peut moduler le nombre de cellules stromales du système immunitaire, ou moduler le nombre des lymphocytes, ou moduler le nombre des ganglions lymphatiques, ou moduler la production de chémokines ou de molécules d'adhésion exprimées par les cellules stromales, ou avoir plusieurs de ces effets. Tout procédé approprié connu de l'homme du métier peut être utilisé pour mesurer l'augmentation ou la diminution de la réponse immunitaire, comme par exemple le tri cellulaire, la cytométrie en flux, l'immunofluoresence et l'histochimie, cette liste n'étant pas limitative. Les cellules stromales du système immunitaire peuvent par exemple être des cellules mésenchymateuses, des cellules endothéliales des vaisseaux sanguines ou des vaisseaux lymphatiques de ganglions lymphatiques. On entend par « agoniste », au sens de la présente invention, toute substance, naturelle ou synthétique, induisant ou stimulant l'activité biologique naturelle de RANK. Avantageusement, l'activité biologique de RANK en présence de l'agoniste est supérieure ou égale à l'activité biologique de RANK en absence de l'agoniste et dans des conditions expérimentales par ailleurs équivalentes. L'induction ou la stimulation de l'activité biologique de RANK peut être due à tout type de relation entre RANK et l'agoniste, par exemple une interaction physique entre RANK et l'agoniste, ou le blocage d'un effet antagoniste d'une autre molécule. L'agoniste peut être choisi parmi RANKL, notamment ses isoformes de 40- 45 kDa ou sa forme soluble, un analogue de RANKL, comme par exemple une cytokine de la superfamille du TNF activant RANK, un fragment de RANKL ou un anticorps anti-RANK agoniste pour induire la signalisation de RANK, par exemple celui de R&D Systems (http://www.rndsystems.com/pdf/af692.pdf). On entend par « antagoniste », au sens de la présente invention, toute substance, naturelle ou synthétique, diminuant ou neutralisant totalement l'activité biologique naturelle de RANK. Avantageusement, l'activité biologique de RANK en présence de l'antagoniste est strictement inférieure à l'activité biologique de RANK en absence de l'antagoniste et dans des conditions expérimentales par ailleurs équivalentes. La diminution ou la neutralisation de l'activité biologique de RANK peut être due à tout type de relation entre RANK et l'antagoniste, par exemple une interaction physique entre RANK et l'antagoniste, ou le blocage d'un effet agoniste d'une autre molécule. L'antagoniste de RANK peut être choisi parmi un anticorps anti-RANKL, par exemple le Denosumab d'Amgen, un peptide bloqueur de RANK, par exemple celui décrit par Kamijo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 347: 124-132, 2006 ([69]), des peptides antagonistes de la signalisation de RANK, comme par exemple ceux décrits par Ye et al., Nature, 418 :443-7, 2002 ([70]), ou l'OPG. Quelle que soit la substance utilisée, à savoir un agoniste ou un antagoniste, il est possible de mesurer l'activité biologique de RANK par tout moyen approprié connu de l'homme du métier, comme par exemple en mesurant la transduction du signal et/ou l'induction de l'activité biologique, par exemple au moyen d'induction de la formation d'ostéoclastes (Hsu, H. et al., 1999. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:3540-3545, [71]), ou encore en mesurant la la taille ganglionnaire, ou encore en mesurant la composition cellulaire, ou encore en mesurant le nombre de lymphocytes, ou encore en mesurant la présence et/ou la prolifération des cellules stromales. Dans un mode de réalisation de l'invention, le médicament est un médicament destiné à traiter des maladies du système immunitaire. On entend par « maladie du système immunitaire », au sens de la présente invention, tout état physiologique d'un individu présentant un symptôme lié à un état du système immunitaire différent par rapport à celui d'un individu ne présentant pas ce symptôme. Dans le cas où la composition de l'invention comprend un agoniste de RANK, la maladie du système immunitaire traitée peut être une maladie de déficience du système immunitaire, notamment choisie parmi l'immunodéficience, la neutropénie, la lymphopénie et le SIDA (« Syndrome d'immunodéficience acquise »). Dans le cas où la composition de l'invention comprend un antagoniste de RANK, la maladie du système immunitaire traitée peut être une maladie due à une surabondance de cellules immunitaires néfastes à la santé, notamment choisie parmi les maladies auto-immunes, les tumeurs et les maladies dues à un système immunitaire hyperactif, comme par exemple la polyarthrite rhumatoïde, le lupus, le diabète juvénile, la sclérose en plaques ou le psoriasis. On entend par « traiter », au sens de la présente invention, une amélioration de tout ou partie des symptômes, ou une disparition totale de tout ou partie des symptômes. Un autre objet de l'invention se rapporte à un procédé d'identification d'une molécule capable de moduler le système immunitaire comprenant les étapes suivantes : - préparation d'au moins une cellule ou d'un échantillon tissulaire exprimant RANK, - mise en contact de ladite au moins une cellule ou dudit échantillon tissulaire avec une molécule test, - détermination de l'activité de RANK, où une modulation de l'expression ou de l'activité de RANK en présence de la molécule test par rapport à l'activité en l'absence de ladite molécule test indique que la molécule test est une molécule capable de moduler le système immunitaire. Le procédé de l'invention peut être un procédé in vivo ou in vitro. Dans le cas où le procédé est un procédé in vitro, il peut être réalisé au moyen de cellules isolées ou d'échantillons de cellules. Dans le cas où le procédé est un procédé in vivo, il peut être réalisé au moyen d'un animal non humain. On entend par « au moins une cellule », au sens de la présente invention, une ou plusieurs cellules. L'au moins une cellule peut être une cellule isolée, ou un échantillon cellulaire, ou un animal non-humain, par exemple une souris, un singe, un chien, cette liste n'étant pas limitative. On entend par « échantillon tissulaire », au sens de la présente invention, toute section de tissu ou d'organe, naturel ou synthétique. Il peut s'agir par exemple d'une section de peau d'un mammifère, humain ou non- humain, ou d'une section de ganglions lymphatiques. La préparation de l'au moins une cellule ou de l'échantillon tissulaire peut être réalisée par n'importe quel moyen approprié connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple de cellule ou échantillon exprimant RANK de manière naturelle, ou ayant été transfecté pour exprimer RANK, ou d'un animal non-humain transgénique pour RANK, cette liste n'étant pas limitative. La mise en contact de ladite au moins une cellule ou dudit échantillon tissulaire avec une molécule test peut être réalisée par tout moyen approprié connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'ajout de molécule test dans le surnageant de culture, d'injection, par exemple sous-cutanée ou d'application topique, par exemple sur l'épiderme dans une formulation permettant une pénétrance des couches suprabasales, de la molécule test, ou, dans le cas où le procédé est réalisé au moyen d'un animal transgénique, par administration, par exemple par voie sous- cutanée, de la molécule test. On entend par « activité de RANK », au sens de la présente invention, toute action biologique directe ou indirecte de RANK sur son environnement de la mesure de la taille ganglionnaire dans le cas où le procédé est réalisé au moyen d'un animal transgénique, ou de la mesure de la composition cellulaire, ou de la mesure du nombre de lymphocytes, ou de la mesure de la présence et de la prolifération des cellules stromales. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, données à titre indicatif. Brève description des figures - La figure 1 représente l'hyperplasie post-natale des cLN (ganglions lymphatiques cutanés) dans les souris Rank-Tg. La partie A est la photographie représentative des cLNs (gauche à droite: inguinal [i], axial, brachial and parotide superficiel) et un LN mésenterique (m) de souris sauvage (WT) et Rank-Tg âgées de 12-semaines. La partie B représente la différence en nombre cellulaire des cLNs, mLNs, rate, thymus, sang et moelle osseuse de souris sauvage (WT) et Rank-Tg âgées de 12-semaines. La partie C représente le nombre cellulaire des cLN de la semaine 1 à la semaine 16 chez des souris sauvage (WT) et Rank-Tg. La partie D représente la mesure de surface de ganglion lymphatique inguinal par ultrason chez des souris sauvage (WT) et Rank-Tg du jour postnatal 4 au jour postnatal 58. Les insères montrent une image ultrason des souris âgées de 12-semaines. - La figure 2 représente la composition cellulaire et l'architecture sont bien conservées dans les cLNs hyperplasiques. La partie A représente les proportions des cellules d'origine granulo- myéloïde (CD11b+), des cellules B (B220+) et des cellules T (CD3+) dans les cLN, mLN et dans la rate, qui ont été mesurées par cytométrie en flux (n=11/ génotype). La partie B représente les images représentatives de l'organisation en zone B et T (marquage CD3 et B220) ainsi que de la présence de FDCs (marquage CD35) dans les cLNs de souris WT et Rank-Tg. (barre d'échelle 100pm). La partie C représente l'identification par cytométrie en flux des différents sous-types de cellules stromales CD45- (FRC, LEC et BEC) grâce aux marqueurs de surface podoplanine et CD31. Le graphique présente les proportions de ces sous-types dans les cLNs des souris Rank-Tg par rapport aux souris WT. Ces données sont le résultat de 4 expériences différentes réalisées sur un total de 11 à 14 souris. La partie D représente les images représentatives présentant la distribution des BECs/ FRCs (marquage CD31/ podoplanine) et LECs/ cellules B (marquage Lyve1/ B220) sur des coupes de 2 980 711 15 cLNs (barre d'échelle 100pm ; toutes ces valeurs sont des moyennes ± écart type, "P Ces données sont représentatives des 5 souris par groupe. La partie C représente l'analyse par RT-PCR de l'expression de Rank transgénique et GAPDH dans les ARNm des cLNs totaux de chimères, 3 mois après les transferts adoptifs de moelle osseuse. La partie D représente la mesure par qRT-PCR de l'expression de l'ARNm de Rank transgénique dans la peau de souris Rank-Tg âgées de 7 à 50 jours. Le niveau d'expression est exprimé comme la différence relative par rapport à la valeur observée à 7 jours et est la moyenne de 3 souris par âge. La morphogenèse et le cycle du HF sont indiqués sous le graphique. - La figure 8 représente la sécrétion de RANKL et OPG par la peau, vérification de l'effet du traitement bloquant RANKL sur le nombre de cellules dans la rate et sur l'activation des cellules immunes des cLNs, et analyse de la viabilité des cellules stromales. Les taux de RANKL (partie A) et OPG (partie B) solubles ont été déterminés par ELISA après 24h de culture de la peau de souris WT et Rank-Tg aux âges indiqués. Les valeurs représentent la moyenne ± l'écart type (au moins 5 souris par groupe) et ont été normalisées par rapport au poids de la peau mise en culture. La partie C représente le nombre de cellules dans la rate, normalisé par rapport au poids corporel, qui a été déterminé pour les souris WT, Rank-Tg traitées avec un anticorps contrôle et Rank-Tg traitées avec l'anticorps monoclonal bloquant RANKL. Le graphique représente la moyenne ± l'écart standard à la moyenne de 6 animaux par groupe obtenue au cours de 3 expériences différentes. Les parties D et E représentent les pourcentages de plasmocytes (D) et de cellules T mémoire (E) dans les cLNs de souris WT, Rank-Tg traitées avec l'anticorps contrôle et Rank-Tg traitées avec l'anticorps monoclonal bloquant RANKL, déterminés par cytométrie en flux. Les données représentent la moyenne ± l'écart standard à la moyenne de 6 animaux par groupe obtenue au cours de 3 expériences. La partie F représente le pourcentage d'incorporation de BrdU par les différents sous-type de cellules stromales (FRC, LEC et BEC) de souris WT et Rank- Tg déterminés par cytométrie en flux en utilisant les marqueurs podoplanin et CD31. Le BrdU a été administré pendant 6 jours et les souris sacrifiées 1, 3 et 9 semaines après. Les données représentent la moyenne ± l'écart standard à la moyenne de 6 souris par groupe obtenue au cours de 3 expériences. *P EXEMPLES Exemple 1 : Matériel et méthodes Animaux Les souris ont été maintenues dans un établissement exempt d'agents pathogènes, et l'expérimentation a été réalisée conformément aux directives de la faculté et à son accord de bioéthique animale (approbation N°AL/01/20/11/08). Tous les mutants ont été identifiés par PCR (Tableau 1), excepté pour les souris CD45.1, qui ont été phénotypées par cytométrie en flux pour l'isoforme CD45. Tableau 1 : amorces de PCR pour génotypage Amorce Séquence (5' à 3') Rank-Tg Sens : atggactacaaagacgatgacgaca(SEQ ID NO : 38) Antisens : tgccaggaatccaccgccaccag (264 bp) (SEQ ID NO : 39) Msx-2 lacZ/lacZ Sens : 5' gtcttcgcttgagagttgcca (SEQ ID NO : 40) Antisens : 3' gtcggacatgagcgcctc (WT 225 bp) (SEQ ID NO : 41) Antisens : 3' ggcaaagcgccattcgccattcaggc (LacZ) (Mutant 300 bp) (SEQ ID NO : 42) Pour toutes les expériences, des souris âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées, sauf mention expresse. La biomicroscopie par ultrasons a été réalisée avec un système à ultrason de 24 et 47,8 MHz sur des souris anesthésiées (Bosisio, M. R. et al. 2009. Ultrasound biomicroscopy: A powerful tool probing murine lymph node size in vivo. Ultrasound Med. Biol. 35:1209-1216, [39]). Pour le transfert adoptif de moelle osseuse (BM), des souris âgées de 3 semaines ont été mortellement irradiées avec 10 Gy de rayons X (accélérateur de particules, Saturne 41, General Electrics), et, après 24 heures, elles ont reçu en intraveineuse 2x106 cellules BM récoltées sur des souris congéniques CD45.1+ WT (wild type) ou CD45.2+ transgéniques. Le chimérisme a été vérifié tous les mois en évaluant le pourcentage de leucocytes de sang de donneurs. Pour la transplantation de peau, une peau de souris du même âge a été transplantée sur le dos, en dessous du cou, de souris nude âgées de 3 semaines. Un spray de soin a été appliqué et les souris ont été tuées 4 semaines après. Le transgène RANK a été rétrocroisé sur des souris Msx21acZ/lacZ CD1 sur plus de huit générations, ce qui a maintenu une hyperplasie de cLN (« c » signifiant « cutané »), quoique moins prononcée. Le nombre de cellules LN a été déterminé à l'âge de 3 mois. Pour bloquer l'interaction in vivo RANK-RANKL, des anticorps neutralisants anti-RANKL IK22-5 (Kamijo, S. et al. 2006. Amelioration of bone loss in collageninduced arthritis by neutralizing anti-RANKL monoclonal antibody. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347:124-132, [40]) ont été injectés par voie sous-cutanée chez les souris transgéniques RANK tous les 3 jours (10 pg le 10ème jour, 25 pg du 13ème au 28ème jour, et 50 ug du 31ème au 45ème jour). Isolation des cellules stromales et des lymphocytes Les cellules stromales ont été isolées et identifiées en utilisant les marqueurs CD31 et podoplanine, comme décrit dans l'art antérieur (Link, A. et al. 2007. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nat. Immunol. 8:1255-1265, [72]). Brièvement, les ganglions lymphatiques ont été collectés, des capsules ont été ouvertes et mises à incuber pendant 30 minutes à 37° C dans du RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute medium, Lonza) contenant 2% de sérum de veau fétal (FCS) (vol / vol, Lonza), Dispase, Collagenase D (tous deux de Roche, 1 mg / ml) et DNase (Sigma Aldrich 40 pg / ml). Le millieu contenant des enzymes a ensuite été enlevé et renouvelé pour une autre étape d'incubation de 20 minutes. Toutes les 10 minutes, la digestion a été délicatement pipetée pour briser les agrégats jusqu'à ce qu'aucun fragment resté visible ne reste ; le pipetage final a été effectué en présence de 5 mM d'EDTA (acide éthylène diamine tétracétique). Les cellules ont ensuite été passées à travers une maille de 40 pm et lavées deux fois dans du RPMI 10% FCS (vol / vol). Les cellules dendritiques (DCs,) ont été enrichies par un gradient d'Optiprep (Sigma Aldrich) (Ruedl, C. et al. 2000. Anatomical origin of dendritic cells determines their life span in peripheral lymph nodes. J. Immunol. 165:4910-4916, [41]), après une digestion des LN par la Collagénase D (1 mg / ml) effectuée pendant 45 minutes sous agitation. Cytométrie en flux et séparation des cellules Les suspensions de cellules isolées obtenues à partir de différents organes ont été marquées avec des anticorps (Tableau 2) et analysées par FACSCalibur (Becton Dickinson) en utilisant les logiciels CellQuest et FlowJo. Les cellules ont été triées sur un SE FACSVantage (Becton Dickinson). Les cellules T régulatrices ont été marquées pour Foxp3 en suivant les recommandations du fabricant (eBioscience). Tableau 2 : anticorps primaires Cible Espèce Clone or Conjugati Applicati on Distributeur Dilution désignation on BrdU souris IgG1 B44 FITC CFrt Becton Dickinson 1/10 CD3 hamster IgG1 145-2C11 PerCP CF BD- 1/200 Pha rmingen CD3 Second lapin IgG polyclonal/A 0452 Non- conjugé IHCrt Dako 1/50 Molecular 1/500 ary Ab chèvre IgG polyclonal/A 11070 A488 Probes CD4 rat IgG2a RM4-5 PE and PerCP - Cy5.5 CF BD- 1/200 Pha rmingen CD11b rat IgG2b M1/70 APC CF BD- 1/1000 Pha rmingen CD11c hamster IgG1 HL3 Biotine Streptavidi n PerCP CF BD- 1/400 Pharmingen 1/300 CD31 rat IgG2a 390 PE CF, IHC Biolegend 1/1000 CD35 rat IgG2a 8C12 Biotine TSA* (A546) IHC BD- 1/100 Pharmingen Perkin Elmer CD44 rat IgG2b IM7 FITC and APC CF BD- 1/400 Pharmingen CD45 rat IgG2b 30-F11 APC CF BD- 1/1000 Pha rmingen CD45.1 souris A20 Biotine Streptavid CF e-Bioscience D-Pharmingen 1/500 IgG2a in 1/300 PerCP CD45.2 souris IgG2a 104 FITC CF e-Bioscience 1/500 CD45R rat IgG2a RA3-6B2 FITC and APC CF BD 1/300 Pharmingen CD45R rat IgG2a RA3-6B2 Biotine Streptavid IHC BD- 1/100 in Pharmingen Molecular 1/500 A546 Probes CD62L rat IgG2a MEL-14 PE et APC CF BD- 1/400 Pharmingen CD69 hamster IgG1 H1-2F3 PE CF BD- 1/400 Pharmingen CD86 rat IgG2a GL1 PE CF BD- 1/200 Pharmingen CD138 rat IgG2a 281.2 APC CF BD- 1/400 Pha rmingen Gr-1 rat IgG2b RB6-8C5 PE CF BD- 1/1000 Pharmingen I-A I-E rat IgG2a 2G9 PE CF BD- 1/1000 Pha rmingen Lyve-1 rat IgG1 ALY7 A488 IHC e-Bioscience 1/100 Foxp3 rat IgG2a FJK-16s APC CF e-Bioscience 1/200 Podopl anin hamster IgG 8.1.1 Non- CF, IHC Biolegend Jackson IR 1/100 polyclona1/1 . 1/300 conjugé Second ary Ab chèvre IgG 07065142 Biotine avidin A488 Molecular Probes 1/500 RANK chèvre IgG âne IgG F462polyclonal/A Non- conjugé Biotine dine PerCP CF R&D Systems Jackson IR D-Pharmingen 1/100 Second 05065147/7 1/100/300 ary Ab 1/300 tt CF: Cytométrie en flux, IHC: Immuno-histochimie Renforcement du signal avec le kit Tyramide Signal Amplification System (TSA; Perkin Elmer) Immunofluoresence et histochimie Les ganglions lymphatiques ont été gelés dans du Tissue-Tek O.C.T. (EMS, Electron Microscopie sciences) et des sections ont été préparées. Après fixation dans l'acétone froide, et blocage avec du sérum de chèvre (Sigma-Aldrich), elles ont été incubées avec un anticorps primaire et, si nécessaire, ensuite par un anticorps de détection secondaire (Tableau 2). Des images ont été acquises avec un microscope Zeiss, Axiovert 200M et le logiciel AxioVision Re1.4.8. La quantification de la zone et du nombre de follicules de cellules B a été effectuée sur des images en utilisant le logiciel ImageJ. L'activité beta-galactosidase a été révélée comme décrit dans l'art antierieur (Aioub, M. et al. 2007. Msx2 -/- transgenic mice develop compound amelogenesis imperfecta, dentinogenesis imperfecta and periodental osteopetrosis. Bone 41:851-859, [42]). RT-PCR L'ARN a été extrait de ganglions lymphatiques rapidement congélés et étalé avec le réactif Ambion TRI (Applied Biosystems) et lavé avec le kit RNeasy Mini (Qiagen). L'ARN de sous-population stromales triées, a été extrait avec le kit Rneasy Micro(Qiagen). L'ADNc a été synthétisé à partir d'amorces oligo(dT)15 et ImProm-Il RT (Promega). Les PCR ont été réalisées en utilisant un mélange pour amplification de Promega GoTaq et Eurogentec qPCR MasterMix Plus Low ROX. Les amorces spécifiques des gènes utilisées sont énumérées dans le tableau 5. Tableau 5. Amorces pour RT-(q)PCR Gène Amorce Application Beta- Sens: atgagctgcctgacggccaggtcatc (SEQ ID NO : 1) Antisens : tggtaccaccagacagcactgtgttg (192 pb) (SEQ ID NO : 2) RT-qPCR actine GAPDH Sens: tgacgtgccgc tggagaaa (SEQ ID NO : 3) RT-qPCR / RT-PCR Antisens : agtgtagcccaagatgcccttcag (98 pb) (SEQ ID NO : 4) HPRT Sens: cttgctggtgaaaaggacctct (SEQ ID NO : 4) RT-qPCR Antisens : aagtactcattatagtcaagggcat (111 pb) (SEQ ID NO : 5) CCL19 a Sens: ctgcctcagattatctgccat (SEQ ID NO : 6) RT-qPCR Antisens : tcattagcaccccccagagt (105 pb) (SEQ ID NO : 7) CCL21 a Sens: ccctggacccaaggcagt (SEQ ID NO : 8) RT-qPCR Antisens : aggcttagagtgcttccggg (162 pb) (SEQ ID NO : 9) CXCL13 a Sens: gtattctggaagcccattacac (SEQ ID NO : 10) RT-qPCR Antisens : aacttgcgagcagcacgatttag (184 pb) (SEQ ID NO: 11) ICAM-1 a Sens: cactgccttggtagaggtgactga (SEQ ID NO : 12) RT-qPCR Antisens : gttacttggctcccttccgagac (171 pb) (SEQ ID NO : 13) IL-7 a Sens: cgatgaattggacaaaatgacagg (SEQ ID NO : 14) Antisens : aacttgcgagcagcacgatttag (126 pb) (SEQ ID NO: 15) RT-qPCR sNio sep sed/(1-snos sel suep uo!ssexIxe-ans Jnod selsel seue9 , 10d-11/ (Le : ON 01 02s) (qd 1,£1,)1101601eafflai6p6e : suasRuy (9£ : ON C1102S)110161a6eafflualeie :suas 61->1NVI 10d b-11 10d-11 (ge J&L : ON 01 oes) (qd £917) 161616eaanaaîeeea66 : suasRuy (17£ : ON 01 02s) a6ee6leaaa61111e6ne :suas 10d-11 (ee euelvm : ON 01 oes) (qd UZ) 666aemee666n6a6e66 :OSJanal (Ze : ON 01 02s) 666ea6aa66e6ee6p6ia :suas 10c1b-ii (6e : ON 01 02s) (qd 9e1,) eapeaea66aeaea661 :OsaOAal (0e : ON 01 02s) e0166eaaa6e666eeaa :suas 2IPUe 10db-11 (6 : ON 01 02s) (qd 8L I.) ei6aaa6ea6ane6166 : suasRuy I-V\IVOA (9Z : ON 0102s) e6i6m6ieee6nae6e6ea6e :suas 1Odb-11 (LZ e 1>INVI : ON 41 O2s) (qd £L) e61a110161a6i6e6i6ea6 : suasRuY (9Z : ON 4102S)16100116pealea6ea :suas 10db-11 (9Z e >INVI : ON 01 oes) (qd 99) leeleap6m6e6aaffloae : suasRuY (17Z : ON 01 02s) e00116aia6p6i6a61 :suas 10db-11 (eZ : ON eau ai oes) (qd gzi,) eane6effleaa6naa6166e6 : suasRuy lueldopod ' (ZZ : ON 01 025) 6m6a6e66661111666 :suas 10db-11 (1.Z e OdO : ON 01 025) (qd eL) 161e6weaneaai6116661 : suasRuy (OZ : ON 01 025) 616eeaee6ieeaeaae66e6a :suas 10db-11 (61. e : ON 01 025) (qd 91,) a6pe6e6616eaaa6e6i : suasRuv (8 1, : ON 0102S) effleaane6e66eee6eleaaae6 :suas VW0PVV\I 10db-11 (LI. e yîi-±-1 : ON 01 MS) (qd 9170 16e6ea6e6p6aa6166 : suasRuY (96 : ON 01 02S) e66eaa6e6eaaaaaieee :suas 9Z TIL086Z La qRT-PCR a été effectuée sur un thermocycleur Stratagene MX4000 et les valeurs Cycle Threshold des gènes cibles ont été normalisées avec GAPDH (glycéraldéhyde\-3\-phosphate déshydrogénase), HPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) et / ou [3-actine. Le facteur d'expression a été calculé en utilisant le logiciel Relative Expression Sowftware Tool (REST; http://mmm.gene-quantification.de/rest.html). Test d'incorporation de BrdU Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de 0,5 mg de BrdU (Sigma-Aldrich) dilué dans du PBS (Phosphate Buffered Saline) et du BrdU dans leur eau de boisson (0,8 mg / ml). Les cellules CD45 et CD45+ ont été isolées à partir des ganglions lymphatiques, et l'incorporation de BrdU a été mesurée par cytométrie en flux en utilisant le BrdU flow kit (BD Pharmingen). Les sous-populations stromales ont en outre été identifiés à l'aide des marqueurs CD31 et podoplanine. Immunisation Des souris âgées de douze semaines, ont reçu par voie sous- cutanée des injections de 200 pg d'ovalbumine (OVA) de poulet avec soit 5 ug de LPS (Lipopolysaccharides) (Sigma-Aldrich), l'adjuvant incomplet de Freund ou 25 pg de CpG (Invivogen). Un rappel a été administré deux semaines plus tard. Avant et tous les 5 jours après, les IgG sériques réactives à l'OVA de poulet ont été mesurées par des tests d'ELISA direct. Pour des mesures d'affinité par anticorps, les souris ont reçu des injections sous-cutanées de 50 pg NP30-KLH (Biosearch Technologies) dans 5 ug / ml de LPS (Sigma-Aldrich). Un rappel a été administré au 1 Oème jour. Les IgG sériques anti-NP (4-hydroxy-3-nitrophenyl-acetyl) ont été déterminée touts 5 jours par des tests d'ELISA direct sur des plaques enduites de NP3-BSA ou NP30-BSA (Biosearch Technologies). Les titres ont été déterminés comme dilution du sérum la plus élevée, donnant une valeur de 3 SD au dessus de la moyenne de lecture des contrôles secondaires. L'affinité relative a été déterminée comme le titrage de NP3 / le titrage de NP30 (Matsumoto, M. et al. 1996. Affinity maturation without germinal centres in lymphotoxin-alpha-deficient mice. Nature. 382:462-466, [43]). Analyses statistiques Un t-test non apparié bilatéral de Student a été utilisé pour déterminer les différences statistiquement significatives. Les valeurs P inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. La version 5 de GraphPad Prism pour Windows (GraphPad Software) a été utilisée pour l'analyse des données statistiques. Exemple 2 : Les souris transgéniques pour Rank montrent une croissance post-natale importante des ganglions lymphatiques Les souris surexprimant Rank murin sous le contrôle du promoteur S100A8, montrent une hyperplasie massive de LNs drainant la peau (inguinale, axiale, brachiale et parotide superficielle), tandis que les LNs internes (mésentérique ou para-aortiques), la rate ou le thymus n'ont pas montré une telle croissance (figure 1A). Le comptage cellulaire a révélé une augmentation de 8 à 10 fois du nombre de cellules hématopoïétiques des LNs cutanés (c), tandis que les comptages pour les LNs mésentériques, la rate, le thymus, le sang et la moelle osseuse ont été inchangées ou même légèrement diminués (Figure 1B et tableau 3). Tableau 3 : nombre absolu de cellules dans les organes Nombre de cellules (106) LNs cutanés LNs mésen- tériques rate Thymus sang moelle osseuse 5.6 ± 5.6 ± Rank-Tg 196 ± 39 6.3 ± 3.1 76 ± 14 96 ± 44 (n=11) 4.8 4.8 WT (n=8) 22 ± 3 7.2± 1.6 105 ± 20 125 ± 44 6.2 ± 6.2 ± 4.0 4.0 P Les numerations cellulaires des suspensions de cellules organiques et sanguines d'animaux ages de 12 semaines WT et Tg ont été comptés dans un hémacytomètre. Les données sont la moyenne ± SD. NS = non significatif. Pour savoir si l'hyperplasie des SLO a été acquise après la naissance, le nombre de cellules cLN a été évalué une semaine après la naissance et à différents moments par la suite. La croissance a commencé après la 2nd semaine post-natale et atteint un plateau à la 13ème semaine (Figure 1C). Pour déterminer son apparition plus précisément, l'imagerie par ultrasons in vivo a été utilisée, qui mesure la taille des LN chez les jeunes souris avec plus de précision que le comptage de cellules ou le pesage d'organes ([39]). Cela a permis de fixer le début de la croissance LN inguinale au 24ème jours (P) post-natal (Figure 1D). Ainsi, les souris transgéniques pour Rank montrent une importante croissance post- natale de leur cLNs. Exemple 3: Conservation de l'architecture des ganglions lymphatiques avec une croissance notable des petits follicules B Pour étudier si l'hyperplasie des cLN était accompagnée par une anomalie de surreprésentation d'une lignée de cellules hématopoïétiques, la proportion de la lignée granulo-myéloïde CD11 b+, ainsi que celles des cellules B B220+ et cellules T CD3+ a été déterminée par cytométrie en flux, dans les cLNs, mLNs et la rate d'animaux transgéniques et d'animaux contrôle. Il y avait une augmentation significative dans les cellules CD11 b+ dans les deux types de LN et dans la rate de souris mutantes (Figure 2A). Une surreprésentation de ces cellules a également été notée dans la BM (Castaneda, B. et al. 2010. Bone resorption control of tooth eruption and root morphogenesis: involvement of the receptor activator of NF-kappaB (RANK). J. Cell. Physiol. 226:74-85, [44]) et est le plus probablement secondaire à l'expression du transgène dans cette lignée ([44] ; Lagasse, E., and I. L. Weissman. 1992. Mouse MRP8 and MRP14, two intracellular calcium-binding proteins associated with the development of the myeloid lineage. Blood 79:1907-1915, [45]) (données non présentées). Plus en particulier, il y avait une augmentation de la proportion de cellules B et une réduction des cellules T dans les cLNs, mais pas dans les mLNs ou la rate. Les cellules B n'expriment pas le transgène ([45] et données non présentées), suggérant que le changement dans les proportions de cellules B/T est le résultat de la taille anormale des LN. Il y avait peu de changement dans l'hématopoïèse des cellules B, car le nombre de cellules B spléniques transitoires de type 1 et 2 est demeuré relativement stable en comparaison d'une forte réduction des cellules B matures (cf. Tableau 4), suggérant un recrutement renforcé de.cellules B matures par cLNs. 32 Tableau 4. Nombre absolu des cellules hématopoïétiques Nombre (106) Organe Cellules T Macrophages Cellules B Cellules B Cellules B T2 Cellules B T1/MZ CD3+ CD11b+ B220, matures IgDnIgM"' , ,., IgDm°dIgMm°d IgD1gM-I Rank-Tg (n=11) 53.9 ± 17.7 2.7 ± 1.2 65.4 ± 30 WT (n=8) cLNsa 8.5 ± 3.1 0.2 ± 0.06 5.6 ± 2.3 p Le nombre des cellules des organes et du sang a été compté à l'aide d'un hémacytomètre et analysé pour cellules T, B et macrophages par cytométrie en flux. Le nombre total a été déterminé en utilisant la composition en pourcentage des différents types de cellules. Les data sont la moyenne ± dérivation standard par le Student's t-test, NS = non significative. L'organisation des cellules B a donc été examinée visuellement dans les cLNs par coloration de sections pour leur marqueur B220. Une organisation normale des cellules B dans les follicules du paracortex a été observée, clairement délimitée de la région riche en cellule T, mais il a été noté une augmentation de petits follicules de cellules B (figure 2B, voir aussi Figure 5C). Tous les follicules de cellules B comprennent des stromales CD35+ FDC (figure 2B). Afin d'évaluer si l'hyperplasie des cLNs conduit à des changements dans les proportions des sous-populations de cellules stromales, étant donné leur rôle central dans le développement et l'organisation des SLO ([2] ; [4] ; Mebius, R. E. 2003. Organogenesis of lymphoid tissues. Nat. Rev. Immunol. 3:292-303, [46]), le pourcentage et la distribution de FRCS, BEC et de ESL a été comparé dans les cLNs d'animaux transgéniques (Tg) et d'animaux wild type (WT). Les cellules ont été identifiées sur la base de l'expression des marqueurs de podoplanine et CD31 après gating sur cellules CD45- ([12]). Les FRC et les BEC ont été trouvées dans des proportions normales mais le pourcentage de LECs a montré une légère baisse (figure 2C). Toutes les sous-populations du stroma étaient distribuées normalement, avec les FRCs dispersés autour des BEC corticales, et les LEC juxtaposées aux follicules de cellules B (Figure 2D). Ainsi, la composition cellulaire des cLNs et leur architecture ont montré remarquablement peu d'altération après une croissance aussi importante, excepté l'augmentation du nombre des cellules B et leurs follicules. Exemple 4 : Non activation du compartiment immun des cLNs et sa réponse à l'immunisation Pour répondre à la question de savoir si les cellules hématopoïétiques des cLNs de la souris transgénique étaient dysfonctionnelles, sa réponse immunitaire cutanée a été étudiée. Des cellules dendritiques dérivées de peau et de sang, ont été purifiées à partir des LNs brachiaux et axiaux et ont été identifiées sur la base de l'expression d'I-N CD11c ([41] ; Jakubzick, C. et al. 2008. Lymph- migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205:2839-2850, [47]), montrant de faibles niveaux de CD86, ce marqueur d'activation étant normalement régulé à la hausse en réponse à une injection sous-cutanée de CpG (figure 3A). Les cellules T des cLNs, mLN ou de la rate étaient au repos mais ont répondu au CpG par la perte de CD62L et la régulation à la hausse de CD44 (figure 3B). En outre, les cellules B ne présentaient aucun signe d'activation chez la souris non immunisée transgénique (Figure 3C), et une immunisation sous-cutanée par OVA avec LPS, CpG ou IFA a provoqué une réponse immunitaire humorale efficace (Figure 3D). La maturation d'affinité des anticorps, en réponse à l'immunisation avec le 4-hydroxy-3- nitrophényl-acétyl (NP)-KLH dans du LPS, a été atteinte plus rapidement chez les animaux transgéniques que chez les souris contrôle (Figure 3E). Pour tester une éventuelle rupture de la tolérance au soi, la présence d'auto-anticorps de sérum dirigés contre l'actine, le facteur rhumatoïde et de l'ADN chez les souris transgéniques non-immunisées et immunisées a été évaluée. Cependant, aucun de ces anticorps n'a été détecté (données non présentées). De plus, il n'y avait aucune différence significative entre les animaux au niveau du nombre des cellules B dans les glandes salivaires ayant une sensibilité auto-immune (WT 30±12x103 vs Tg 35±9x103, n = 8). En accord avec ces résultats, la proportion de cellules T régulatrices FoxP3+ n'est pas nettement altérée dans les cLNs, mLNs ou la 2 980 711 rate des souris Tg par rapport aux souris WT (données non présentées). Etant donné que les cellules stromales peuvent contribuer à la tolérance périphérique par l'expression d'antigènes tissulaires périphériques restreint aux tissus (PTA) par la protéine Aire ([5] ; Gardner, J. M. et al. 2008. 5 Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science 321:843-847, [48] ; Cohen, J. N. et al. 2010. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aireindependent direct antigen presentation. J. Exp. Med. 207:681-688, [49] ; Fletcher, A. L. et al. 2010. Lymph node fibroblastic reticular cells directly 10 present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. J. Exp. Med. 207:689-697, [50]), qui est sous contrôle positif de RANK dans le thymus ([32]-[35]), la contribution des cellules stromales à la tolérance par la régulation positive de la protéine Aire dans les cLNs de souris Tg a été évaluée. L'ARNm de Aire a été mesuré par RT-PCR 15 quantitative (q) de l'ARN de cLN entier. Aucune différence dans l'expression d'Aire entre les souris Tg et WT n'a été observée (données non présentées), et l'expression restreinte à la sous-population du stroma de Mlana et de la tyrosinase PTAs ([49] ; [50]) a également été conservée (données non présentées). Par conséquent, la croissance post-natale des 20 LNs n'a aucune influence négative discernable sur ses cellules immunitaires et les mécanismes de tolérance périphérique n'ont pas besoin d'être renforcés pour assurer la tolérance au soi. Exemple 5 : La croissance des LN est associée au HF transgénique 25 Pour comprendre les mécanismes de l'expansion organisée des cLNs, la contribution du transgène Rank dans la lignée cellulaire granulomyéloïde CD11b+ a été observée en effectuant des transferts adoptifs de moelle osseuse. Les souris Tg âgées de 3 semaines ayant reçu une dose d'irradiation létale, ont été greffées avec la moelle osseuse de souris 30 congéniques CD45.1+ C57BL/6. Le transfert réciproque a aussi été fait. Trois mois plus tard, le nombre de cellules cLN a été déterminé. Les transferts de moelle osseuse étaient complets, car toutes les cellules hématopoïétiques, y compris la lignée CD11b+, étaient de l'origine du donneur (figure 7A et 7B), mais les chimères WT> Tg (c'est-à-dire les souris Tg qui ont reçu de la moelle WT) ont développé une hyperplasie des LNs dans la même mesure que le contrôle des Tg> animaux Tg (Figure 4A). Réciproquement, la moelle osseuse Tg ne pouvait pas transférer la croissance des LN à des souris WT. Ces résultats démontrent que l'expression du transgène Rank par la lignée cellulaire granulo-myéloïde n'est pas responsable de la croissance cLN. La question de savoir si les cellules stromales radio-résistantes expriment le transgène Rank a été étudiée, en effectuant une RT-PCR sur les cLNs récupérés des chimères WT> Tg. Le transgène n'était plus exprimé, démontrant que le stroma de cLN n'est pas transgénique pour Rank (figure 7C). La possibilité que la croissance des cLNs soit véhiculée par expression du transgène Rank dans l'HF ([37]) a alors été examinée. Pour répondre à cette question, de la peau de donneur Tg ou WT âgés de 3 semaines a été transplantée sur le dos de souris nude du même âge. Sept semaines plus tard, les nombres de cellules LNs brachiales, axiales et inguinales ont été déterminés. Comme les LNs inguinaux n'étaient pas pressentis pour drainer à partir de la greffe, leur numération cellulaire a servi de contrôle interne pour la taille naturelle des LNs et les variations inter-expérimentales. Bien qu'il y ait seulement une petite différence, vraisemblablement en raison de la taille limitée des greffons, une augmentation significative pour les receveurs de la peau Tg par rapport à la peau WT a été observée, ceci indiquant que la croissance LNs est associée à l'expression du transgène Rank dans les HFs (figure 4B). Cette conclusion a été vérifiée en réduisant l'expression du transgène dans les HFs. Cela a été fait en croisant le transgène sur des souris Msx-21acZ/lacZ, qui ont une phase anagène raccourcie (Ma, L. et al. 2003. 'Cyclic alopecia' in Msx2 mutants: defects in hair cycling and hair shaft differentiation. Development 130:379-389, [51]), et sont donc appelées à exprimer des niveaux inférieurs du transgène Rank (figure 7D). Cette combinaison du gène mutant a entraîné une croissance du cLN fortement réduite (figure 4C). Pour exclure la possibilité que les Msx-2 affectent la taille des organes grâce à une expression locale, les LNs brachiaux des animaux Rank Tg x Msx-2Iacz/+ ont été colorés pour la R- galactosidase. L'activité du gène lacZ n'a pas été détectée dans les LNs, alors que, comme attendu ([51]), il a été trouvé à la base des HFs (figure 4D). Pris ensemble, ces résultats soutiennent la conclusion que l'expression du transgène Rank dans le HF est nécessaire et suffisante pour l'hyperplasie de LNs drainant la peau. Exemple 6 : RANKL induit la croissance de cLN Pour identifier le signal véhiculé par le HF anagène et responsable de la croissance des cLNs, RANKL a été considéré ici comme un candidat probable car (i) le HF anagène est une source importante de RANKL soluble ([37]), (ii) RANKL soluble est une petite protéine globulaire (> 10 kDa), qui peut être suspectée avoir un accès direct au stroma du LN grâce à son système de conduit ([3] ; Gretz, J. E. et al. 2000. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. J. Exp. Med. 192:1425-1440, [52] ; Roozendaal, R. et al. 2009. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity 30:264-276, [53]), et (iii) RANKL est connue pour jouer un rôle essentiel dans la formation des SLO ([25]- [27]). Pour vérifier si les niveaux de RANKL concordent avec cette idée, RANKL soluble et la libération d'OPG des peaux Tg et WT ont été mesurés à différents moments durant la morphogenèse d'HF et le cycle cellulaire. Il a ainsi été confirmé ici que RANKL était le plus élevé lors de l'anagène alors que les niveaux d'OPG étaient faibles ([37]), et il a été mis en évidence l'existence de niveaux significativement plus élevés de RANKL libéré par la peau Tg à P14 et pendant l'anagène par rapport à la peau WT (figure 8A et 8B). Le rôle de RANKL a ensuite été testé directement par l'administration par voie sous-cutanée d'un anticorps monoclonal bloquant RANKL à des souris Tg à partir de P10 jusqu'à 6 semaines. Les souris contrôle ont reçu des anticorps contrôle. Les LNs cutanés et la rate ont été pesés, le nombre de cellules déterminé, et la proportion de cellules B/T évaluée. Comme hypothèse, les anticorps monoclonaux neutralisant RANKL ont restauré le poids des cLNs et le nombre de cellules à des niveaux proches de ceux d'une souris WT (figure 5A), et l'augmentation de la proportion de cellules B a été inversée (Figure 5B). En outre, le nombre de follicules de cellules B a été réduit et leur taille restaurée (figure 5C). La neutralisation de RANKL n'a pas conduit à une perte du nombre de cellules dans la rate (figure 8C), ni à l'activation de cellules B ou T, comme estimé par les proportions des plasmocytes et des lymphocytes T mémoire (figures 8D et 8E). Le traitement anti-RANKL a provoqué une diminution du poids corporel (WT 17,7±0,5 g, Tg 18,7±1,1 g, Tg traitée 12,1±1,6 g, n = 12), le plus probablement attribuable à la perturbation de l'homéostasie osseuse ([25] ; [26]). Ces données montrent que RANKL induit une croissance des LNs, et l'augmentation inclusive de petits follicules de cellules B. Exemple 7: RANKL active la synthèse de chémokines et la prolifération du stroma des organes lymphoïdes secondaires Compte tenu de leur rôle central dans la coordination de la croissance des organes lymphoïdes durant le développement ([2] ; [4][6]), il a été considéré ici que les cellules stromales des ganglions lymphatiques étaient aussi susceptibles d'être une cible cellulaire de RANKL. Pour examiner cette possibilité, il a été déterminé ici si Rank était exprimé par les cellules stromales en effectuant une RT-PCR sur l'ARN à partir des FRCs, des LECs et des BECs, qui ont été triés par une cytométrie en flux à partir d'animaux WT et Tg en utilisant la podoplanine et le CD31 comme marqueurs. Rank était transcriptionnellement actif dans toutes les sous-populations du stroma (Figure 6A), suggérant que RANKL dérivé de la peau peut directement activer le stroma des ganglions lymphatiques cutanés. Puisque les chémokines et les molécules d'adhésion cellulaire sont exprimées par le stroma et jouent un rôle important dans la croissance des organes lymphoïdes secondaires ([9] ; [46]), il a été testé ici si ces types de molécules étaient surexprimées dans les cellules stromales. Une qRT-PCR quantitative a été effectuée sur les cellules stromales triées, regroupées à partir de ganglions lymphatiques cutanés d'animaux WT et Tg âgés de 6 semaines. Parmi les différents gènes testés (tableau 1), il a été démontré ici que dans les souris Tg, les FRCs transcrivent plus d'ARNm CXCL13, et que les BECs et les LECs augmentent la synthèse de l'ARNm de CCL19, MAdCAM-1 et VCAM-1 (figure 6B). Cela suggère que la croissance des cLNs est la conséquence de la stimulation par RANK de l'expression des chémokines et de molécules d'adhésion cellulaire. Au vu de la proportion de cellules stromales presque inchangée dans les cLNs élargis, ainsi qu'avec la constatation que RANKL induit la prolifération des cellules épithéliales thymiques médullaires ([35]), la question suivante était de savoir si les cellules stromales avaient proliféré en réponse à la stimulation de RANK. À cette fin, la division de cellules stromales a été mesurée par incorporation de BrdU dans les souris WT et Tg âgées de 6 semaines, qui étaient soit non traitées ou qui avaient reçu de l'anticorps monoclonal anti-RANKL. Les souris ont reçu l'analogue nucléotidique pendant 6 jours, et l'incorporation de BrdU dans l'ADN de cellules stromales a été mesurée par cytométrie en flux. Comme déjà mentionné ci-avant, les cellules WT non-hématopoïétiques avaient un taux de prolifération raisonnable, mais, chez les souris Tg, il était considérablement augmenté. Étonnamment, lorsque RANKL a été neutralisée, la proportion de BrdU+ dans le stroma des souris Tg est tombée à des niveaux identiques à ceux de la souris WT (Figure 6C). En revanche, la proportion de BrdU+ des cellules hématopoïétiques a été similaire entre WT et les animaux Tg et il n'y avait aucun changement après l'administration de l'anticorps monoclonal bloquant RANKL. Les FRCs, les LECs et les BECs ont ensuite été analysées séparément. Toutes les 3 sous-populations de cellules stromales ont proliféré plus vite chez les souris Tg, et encore une fois, l'incorporation de BrdU a été abrogée lorsque RANKL a été neutralisé (Figure 6D). Pour répondre à la question de savoir si le RANKL affectait également la viabilité des cellules stromales, des expériences « pulse-chase » ont ensuite été effectuées. Le taux de renouvellement des cellules a été suivi en mesurant le pourcentage de cellules BrdU+ à 2 et 9 semaines après la période de marquage au BrdU. Il a ainsi été constaté que la perte du marquage BrdU des sous-populations stromales n'a pas été retardée chez les souris Tg, ce qui indique que RANKL a stimulé la division des cellules stromales, sans altérer leur viabilité (figure 8F). Cela montre que RANKL provoque la croissance des ganglions lymphatiques cutanés en induisant la prolifération de ses cellules stromales vasculaires et cellules stromales réticulaires fibroblastiques. Exemple 8 : Conclusions Les importantes recherches et expérimentations menées par la Demanderesse ont permis de démontrer que la stimulation de RANK a pour effet la prolifération des sous-populations des cellules stromales des ganglions lymphatiques et leur expression de chémokines et de molécules d'adhérence, aboutissant à la croissance des ganglions lymphatiques. L'organisation des ganglions lymphatiques a été conservée, avec une augmentation notable des petits follicules de cellules B. La stimulation de RANK n'a pas provoqué une activation immunitaire; aucune auto-réactivité n'a pu être détectée et les cellules immunitaires ont réagi rapidement et fortement à l'immunisation par des antigènes étrangers. Bien qu'étant reconnu comme un régulateur important de l'immunité, le manque de presque tous les organes lymphoïdes secondaires chez les souris KO pour Rank ou Rankl a entravé l'élucidation de la fonction de 2 980 711 41 RANK dans le développement et l'homéostasie du système immunitaire. Il a donc été étudié ici une souris Rank-Tg, qui montre des LNs drainant la peau fortement surdimensionnés, tandis que d'autres SLOs, la rate, le thymus ou les BM étaient normaux. La croissance des LNs survient après 5 la naissance et, à son plateau, leur nombre de lymphocytes combiné dépasse largement celui de la rate. Par ailleurs, aucune autre anomalie majeure du système immunitaire n'a été détectée, à l'exception d'une surreprésentation générale de cellules CD11 b+ Rank-Tg, vraisemblablement attribuable à l'action de survie cellulaire de RANK 10 (Anderson, D. M. et al. 1997. A homologue of the TNF receptor and its ligand enhance T-cell growth and dendritic-cell function. Nature 390:175179, [54] ; Wong, B. R. et al. 1997. TRANCE (tumor necrosis factor [TNF]- related activation-induced cytokine), a new TNF family member predominantly expressed in T cells, is a dendritic cell-specific survival 15 factor. J. Exp. Med. 186:2075-2080, [55] ; Cremer, I. et al. 2002. Long- lived immature dendritic cells mediated by TRANCE-RANK interaction. Blood 100:3646-3655, [56]). Un état qui ressemble à ce phénotype peut être trouvé dans une souris Tg pour l'IL-7 (Meier, D. et al. Ectopic lymphoid-organ development occurs through interleukin 7-mediated 20 enhanced survival of lymphoid-tissue-inducer cells. lmmunity 26:643-654, [57]). Là, l'augmentation du nombre de cellules LTi conduit à la croissance des SLO et aux formations SLO ectopiques. Contrairement au modèle de souris Tg IL-7, cependant, l'expansion des SLO décrite ici est apparue beaucoup plus importante et aucune SLO ectopique n'a pu être observée. 25 En dépit de l'expansion massive de la taille des cLNs des souris Tg-Rank, la composition des cellules hématopoïétiques et stromales des cLNs et leur organisation a été remarquablement bien conservée. La seule modification notable a été l'augmentation du nombre de petits follicules de cellules B et une augmentation de la proportion de cellules B. Ces 30 observations concordent avec les résultats selon lesquels les petits follicules de cellules B sont plus fréquents dans de grands LNs ([14]). Le support pour un rôle de signalisation de RANK dans la régulation du nombre de cellules immunitaires périphériques découle d'une étude des souris Opg-/-, dans laquelle le nombre de LNs, de cellules T et B a été également augmenté (Yun, T. J. et al. 2001. Osteoprotegerin, a crucial regulator of bone metabolism, also regulates B cell development and function. J. Immunol. 166:1482-1491, [58]). Chez les souris Opgi-, le compartiment des cellules B a été particulièrement stimulé dans la rate, ce qui a attribué à un développement accéléré des cellules B ([58]). Aucune augmentation importante n'a été observée dans la transition splénique de cellules B de type 1 ou 2, écartant la possibilité que les cellules B supplémentaires des cLNs proviennent de l'accélération de l'hématopoïèse des cellules B. Au lieu de cela, la proportion élevée de cellules B est probablement due à un recrutement renforcé de cellules B matures. La grande expansion de la taille des SLO aurait pu être la conséquence d'un compartiment cellulaire hématopoïétique dysfonctionnel. Cependant, les cellules T, les cellules B et les cellules dendritiques (DCs) n'ont montré aucun signe d'activation et aucune réactivité auto-antigénique n'a pu être détectée. Par ailleurs, les cellules T des LNs purifiés n'ont pas spontanément proliférés en culture, comme cela a été décrit pour un modèle différent d'hyperplasie de SLO (Willerford, D. M. et al. 1995. Interleukin-2 receptor alpha chain regulates the size and content of the peripheral lymphoid compartment. Immunity 3:521-530, [59]), et le transfert de cellules T CD4+ des cLNs chez des souris Rag-2 KO n'a pas abouti à une expansion anormale (données non représentées). Les cellules immunitaire cLNs des animaux Rank-Tg n'étaient pas anergiques, puisqu'elles ont répondu à l'immunisation avec des antigènes étrangers et de l'adjuvant. Les réponses immunitaires induites chez les souris Tg n'étaient pas très supérieures à celles des souris WT, bien qu'une maturation d'affinité plus rapide des anticorps ait été détectée, ce qui reflète peut-être une plus grande disponibilité des cellules T et B ou un réseau FDCs plus accessible. Compte tenu de la relation positive entre l'expression de RANKL et Aire dans le thymus ([32]- ([35]), et bien qu'Aire des LNs semble contribuer à la tolérance des cellules T périphériques ([50] ; Lee, J. W. et al. 2007. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat. Immunol. 8:181- 190, [60]), l'ARNm d'Aire a été mesurée dans ensemble des LNs. En effectuant le transfert de BM, la transplantation de la peau et des expériences de « sauvetage » génétique, il a été déterminé ici que le signal de croissance des SLO provenait des HF Rank-Tg. Cette découverte fournit une explication à la question de savoir pourquoi seules les LNs drainant la peau sont affectés, et est en accord avec l'initiation de la croissance des LNs au début de la phase anagène de HF au P24. De plus, le plateau de croissance est vraisemblablement dû à la perte de l'expression du transgène HF, étant donné que la souris développe une alopécie ([37]). Il est intéressant de noter que la période post-natale, au cours de laquelle l'expansion des ganglions lymphatiques drainant la peau surpasse la croissance du corps, se produit durant la morphogénèse du HF et la première phase anagène de HF ([39]). Cela suggère un lien naturel entre le développement du HF et le renouvellement du HF et la croissance des cLNs, une association qui semble être amplifiée chez la souris Tg. La possibilité que les DCs médient la liaison HF-LN a été étudiée, cependant, par analogie avec la lymphadénopathie dermatopathique (Shamoto, M. et al. 1999. Paracortical hyperplasia of superficial lymph nodes in a new mutant strain of hairless rats (ISh): a lesion similar to human dermatopathic lymphadenopathy. Pathol. Int. 49:305-309, [61]), des DCs à longue vie ou matures devraient principalement conduire à un élargissement de la zone de cellules T. Cela n'a pas été observé, et la proportion de DCs et leur état de maturation est resté inchangé. Depuis le raccourcissement de l'anagène par la perte de la croissance de LNs abrogée par Msx-2, il en a été déduit ici que le signal se produit lors de la phase anagène du cycle pilaire. Les niveaux élevés de RANKL soluble produits par le HF Tg en anagène a incité à proposer ici le concept selon lequel le RANKL du HF traduit la croissance des cLNs. En fait, non seulement le niveau de RANKL du HF est plus élevé chez l'animal mutant, mais en plus la peau subit également des phases anagènes supplémentaires, conduisant à une libération prolongée de RANKL. La raison sous-jacente à l'augmentation de RANKL du HF pourrait être expliquée par l'existence d'une boucle auto-amplificatrice de RANK-RANKL, semblable à ce qui a été vu pour les cellules épithéliales thymiques ([36]). Les phases anagènes précoces résultent de l'activation médiée par RANK des cellules souches du HF, qui contrôlent le cycle du HF ([37]). Un autre argument en faveur de RANKL en tant que médiateur de la croissance des SLO est que RANKL est une petite protéine globulaire, qui est censée avoir des accès dégagés à toutes les cellules stromales par leurs conduits ([3]). En effet, la neutralisation de RANKL par un anticorps monoclonal bloquant restaure la taille normale des LNs, le ratio cellulaire B/T et l'aire et le nombre des follicules. Il n'est pas possible d'exclure la possibilité que le blocage de RANKL par d'autres sources ait contribué à la normalisation, bien que le RANKL de peau ait été assurément affecté, puisqu'un cycle anormal HF et une dysplasie épidermique ont été corrigés ([37]). La perte observée des cellules B et la réduction de la prolifération des FRCs au delà des niveaux WT chez les souris Tg traitée avec l'anticorps anti-RANKL est probablement dû au RANKL bloquant produit par les MRCs ([7]). Parmi les autres sources potentielles de RANKL de SLO, les cellules T peuvent être exclues, qui synthétisent RANKL uniquement lorsqu'elles sont activées ([55]), car elles étaient au repos. La question de savoir si les cellules T régulatrices de LN produisent de manière constitutive RANKL cela n'est pas élucidée. Bien que les anticorps monoclonaux ont été administrés par voie sous-cutanée, l'homéostasie osseuse a été affectée, puisque les souris traitées ont montré un retard de croissance. Toutefois, une perturbation du rendement des cellules 2 980 711 45 hématopoïétiques affectée par la réduction des niches BM (Kollet, O. et al. 2006. Osteoclasts degrade endosteal components and promote mobilization of hematopoietic progenitor cells. Nat. Med. 12:657-664, [62]) n'a pas été observée puisque le nombre de cellules spléniques n'a pas 5 diminué. Pour identifier la cible cellulaire de RANKL, les cellules LTi et les cellules stromales ont été envisagées ici comme candidates. Les cellules LTi expriment RANK ([27] ; Schmutz, S. et al. Cutting edge: IL-7 regulates the peripheral pool of adult ROR gamma+ lymphoid tissue inducer cells. J. 10 Immunol. 183:2217-2221, [63]) et l'augmentation de leur nombre par de l'IL-7 a conduit à l'expansion des SLOs ([57]). Toutefois, la proportion de cellules LTi n'a pas été modifiée dans les cLNs et aucune augmentation de la synthèse d'IL-7 par les FRCs, la principale source d'IL-7 dans le SLOs ([12]) (données non présentées), n'a pu être observée. Les cellules LTi 15 des souris Tg ne surexpriment pas RANK (données non présentées), et l'expression du transgène Rank par les cellules stromales radio-résistantes peut également être exclue, étant donné que son ARN n'était plus détectable dans les cLNs après le transfert de BM WT>Tg. Cependant, toutes les sous-populations stromales expriment un RANK endogène. Il est 20 connu que les cellules endothéliales (Collin-Osdoby, P. et al. 2001. Receptor activator of NF-kappa B and osteoprotegerin expression by human microvascular endothelial cells, regulation by inflammatory cytokines, and role in human osteoclastogenesis. J. Biol. Chem. 276:20659-20672, [64] ; Kim, H. H. et al. 2003. RANKL regulates 25 endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Faseb J. 17:2163-2165, [65] ; Min, J. K. et al. 2003. Vascular endothelial growth factor up-regulates expression of receptor activator of NF-kappa B (RANK) in endothelial cells. Concomitant increase of angiogenic responses to RANK ligand. J. Biol. Chem. 30 278:39548-39557, [66]) et les cellules mésenchymateuses ([54] ; Rifas, L., S. Arackal, and M. N. Weitzmann. 2003. Inflammatory T cells rapidly induce differentiation of human bone marrow stromal cells into mature osteoblasts. J. Cell. Biochem. 88:650-659, [67]) peuvent exprimer RANK, mais la question de savoir si leur homologue SLO peut également exprimer RANK n'a pas été étudiée. Le stroma du LN stimulé par RANKL régule à la hausse les chémokines et les molécules d'adhésion cellulaire, mais plus étonnamment, les FRCs, LECs et BECs montrent une hyper-prolifération spectaculaire chez la souris Tg, qui a été totalement abolie par la neutralisation de RANKL. Grâce à la co-expression de podoplanine, il n'était pas possible de différencier les TRCs des MRCs au sein de la population des FRC par cette méthode. Les résultats obtenus ici soulignent l'importance des indices environnementaux pour la régulation du système immunitaire ([68]) en identifiant le rôle de RANKL dérivé du follicule pileux dans la croissance des ganglions lymphatiques par la stimulation du stroma. Listes des références 1. Junt, T., E. Scandella, and B. Ludewig. 2008. Form follows function: Iymphoid tissue microarchitecture in antimicrobial immune defence. Nat. Rev. Immunol. 8:764-775. 2. Mueller, S. N., and R. N. Germain. 2009. Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9:618-629. 3. Lammermann, T., and M. Sixt. 2008. The microanatomy of T-cell responses. Immunol. Rev. 221:26-43. 4. Roozendaal, R., and R. E. Mebius. 2011. Stromal cell-immune cell interactions. Annu. Rev. Immunol. 29:23-43. 5. Fletcher, A. L., D. Malhotra, and S. J. Turley. 2011. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends Immunol. 32:12-18. 6. Luther, S. A., T. K. Vogt, and S. Siegert. 2011. Guiding blind T cells and dendritic cells: A Gloser look at fibroblastic reticular cells found within lymph node T zones. Immunol. Lett.:in press. 7. Katakai, T., H. Suto, M. Sugai, H. Gonda, A. Togawa, S. Suematsu, Y. Ebisuno, K. Katagiri, T. Kinashi, and A. Shimizu. 2008. Organizer-like reticular stromal celI layer common to adult secondary lymphoid organs. J. Immunol. 181:6189-6200. 8. Palframan, R. T., S. Jung, G. Cheng, W. Weninger, Y. Luo, M. Dorf, D. R. Littman, B. J. Rollins, H. Zweerink, A. Rot, and U. H. von Andrian. 2001. Inflammatory chemokine transport and presentation in HEV: a remote control mechanism for monocyte recruitment to lymph nodes in inflamed tissues. J. Exp. Med. 194:1361-1373. 9. Browning, J. L., N. Allaire, A. Ngam-Ek, E. Notidis, J. Hunt, S. Perrin, and R. A. Fava. 2005. Lymphotoxin-beta receptor signaling is required for the homeostatic control of HEV differentiation and function. Immunity 23:539-550. 10. Pham, T. H., P. Baluk, Y. Xu, I. Grigorova, A. J. Bankovich, R. Pappu, S. R. Coughlin, D. M. McDonald, S. R. Schwab, and J. G. Cyster. 2009. Lymphatic endothelial cell sphingosine kinase activity is required for lymphocyte egress and lymphatic patterning. J. Exp. Med. 207:17-27. 11. Schwab, S. R., and J. G. Cyster. 2007. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nat. Immunol. 8:1295-1301. 12. Link, A., T. K. Vogt, S. Favre, M. R. Britschgi, H. Acha-Orbea, B. Hinz, J. G. Cyster, and S. A. Luther. 2007. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nat. Immunol. 8:1255-1265. 13. Kosco, M. H., E. Pflugfelder, and D. Gray. 1992. Follicular dendritic cell-dependent adhesion and proliferation of B cells in vitro. J. Immunol. 148:2331-2339. 14. Kumar, V., E. Scandella, R. Danuser, L. Onder, M. Nitschke, Y. Fukui, C. Halin, B. Ludewig, and J. V. Stein. 2011. Global lymphoid tissue remodeling during a viral infection is orchestrated by a B celllymphotoxin-dependent pathway. Blood 115:4725-4733. 15. Cupedo, T., and R. E. Mebius. 2005. Cellular interactions in lymph node development. J. Immunol. 174:21-25. 16. Honda, K., H. Nakano, H. Yoshida, S. Nishikawa, P. Rennert, K. Ikuta, M. Tamechika, K. Yamaguchi, T. Fukumoto, T. Chiba, and S. I. Nishikawa. 2001. Molecular basis for hematopoietic/mesenchymal interaction during initiation of Peyer's patch organogenesis. J. Exp. Med. 193:621-630. 17. Cupedo, T., M. F. Vondenhoff, E. J. Heeregrave, A. E. De Weerd, W. Jansen, D. G. Jackson, G. Kraal, and R. E. Mebius. 2004. Presumptive lymph node organizers are differentially represented in developing mesenteric and peripheral nodes. J. Immunol. 173:2968-2975. 18. White, A., D. Carragher, S. Parnell, A. Msaki, N. Perkins, P. Lane, E. Jenkinson, G. Anderson, and J. H. Caamano. 2007. Lymphotoxin a- 2 9 8 0 7 1 1 49 dependent and -independent signais regulate stroma) organizer cell homeostasis during lymph node organogenesis. Blood 110:1950-1959. 19. Cotes, M. C., H. Veiga-Fernandes, K. E. Foster, T. Norton, S. N. Pagakis, B. Seddon, and D. Kioussis. 2006. Rote of T and NK cells and 5 IL7/1L7r interactions during neonatal maturation of lymph nodes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:13457-13462. 20. Tumanov, A. V., D. V. Kuprash, and S. A. Nedospasov. 2003. The rote of lymphotoxin in development and maintenance of secondary lymphoid tissues. Cytokine. Growth. Factor. Rev. 14:275-288. 10 21. Browning, J. L. 2008. Inhibition of the lymphotoxin pathway as a therapy for autoimmune disease. Immunol. Rev. 223:202-220. 22. Wada, T., T. Nakashima, N. Hiroshi, and J. M. Penninger. 2006. RANKL-RANK signaling in osteoclastogenesis and bone disease. Trends Mol. Med. 12:17-25. 15 23. Dejardin, E., N. M. Droin, M. Delhase, E. Haas, Y. Cao, C. Makris, Z. W. Li, M. Karin, C. F. Ware, and D. R. Green. 2002. The lymphotoxinbeta receptor induces different patterns of gene expression via two NFkappaB pathways. Immunity 17:525-535. 24. Walsh, M. C., and Y. Choi. 2003. Biology of the TRANCE axis. 20 Cytokine Growth Factor Rev. 14:251-263. 25. Kong, Y. Y., H. Yoshida, I. Sarosi, H. L. Tan, E. Timms, C. Capparelli, S. Morony, A. J. Oliveira-dos-Santos, G. Van, A. Rie, W. Khoo, A. Wakeham, C. R. Dunstan, D. L. Lacey, T. W. Mak, W. J. Boyle, and J. M. Penninger. 1999. OPGL is a key regulator of osteoclastogenesis, 25 lymphocyte development and lymph-node organogenesis. Nature 397:315- 323. 26. Dougall, W. C., M. Glaccum, K. Charrier, K. Rohrbach, K. Brase), T. De Smedt, E. Daro, J. Smith, M. E. Tometsko, C. R. Maliszewski, A. Armstrong, V. Shen, S. Bain, D. Cosman, D. Anderson, P. J. Morrissey, J. 30 J. Peschon, and J. Schuh. 1999. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes. Dev. 13:2412-2424. 27. Kim, D., R. E. Mebius, J. D. MacMicking, S. Jung, T. Cupedo, Y. Castellanos, J. Rho, B. R. Wong, R. Josien, N. Kim, P. D. Rennert, and Y. Choi. 2000. Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE. J. Exp. Med. 192:1467-1478. 28. Yoshida, H., A. Naito, J. (noue, M. Satoh, S. M. Santee-Cooper, C. F. Ware, A. Togawa, and S. Nishikawa. 2002. Different cytokines induce surface lymphotoxin-alphabeta on IL-7 receptor-alpha cells that differentially engender lymph nodes and Peyer's patches. Immunity 17:823-833. 29. Knoop, K. A., N. Kumar, B. R. Butler, S. K. Sakthivel, R. T. Taylor, T. Nochi, H. Akiba, H. Yagita, H. Kiyono, and I. R. Williams. 2009. RANKL is necessary and sufficient to initiate development of antigen-sampling M cells in the intestinal epithelium. J. Immunol. 183:5738-5747. 30. Schneider, M. R., R. Schmidt-Ullrich, and R. Paus. 2009. The hair follicle as a dynamic miniorgan. Curr. Biot. 19:R132-142. 31. Paus, R., B. J. Nickoloff, and T. Ito. 2005. A 'hairy' privilege. Trends Immunol. 26:32-40. 32. Rossi, S. W., M. Y. Kim, A. Leibbrandt, S. M. Parnell, W. E. Jenkinson, S. H. Glanville, F. M. McConnell, H. S. Scott, J. M. Penninger, E. J. Jenkinson, P. J. Lane, and G. Anderson. 2007. RANK signais from CD4+3- inducer cells regulate development of Aire-expressing epithelial cells in the thymic medulla. J. Exp. Med. 14:14. 33. Akiyama, T., Y. Shimo, H. Yanai, J. Qin, D. Ohshima, Y. Maruyama, Y. Asaumi, J. Kitazawa, H. Takayanagi, J. M. Penninger, M. Matsumoto, T. Nitta, Y. Takahama, and J. (noue. 2008. The tumor necrosis factor family receptors RANK and CD40 cooperatively establish the thymic medullary microenvironment and self-tolerance. Immunity 29:423-437. 34. White, A. J., D. R. Withers, S. M. Parnell, H. S. Scott, D. Finke, P. J. Lane, E. J. Jenkinson, and G. Anderson. 2008. Sequential phases in the development of Aire-expressing medullary thymic epithelial cells involve distinct cellular input. Eur. J. Immunol. 38:942-947. 35. Hikosaka, Y., T. Nitta, I. Ohigashi, K. Yano, N. Ishimaru, Y. Hayashi, M. Matsumoto, K. Matsuo, J. M. Penninger, H. Takayanagi, Y. Yokota, H. Yamada, Y. Yoshikai, J. (noue, T. Akiyama, and Y. Takahama. 2008. The cytokine RANKL produced by positively selected thymocytes fosters medullary thymic epithelial cells that express autoimmune regulator. Immunity 29:438-450. 36. Mouri, Y., M. Yano, M. Shinzawa, Y. Shimo, F. Hirota, Y. Nishikawa, T. Nii, H. Kiyonari, T. Abe, H. Uehara, K. Izumi, K. Tamada, L. Chen, J. M. Penninger, J. I. (noue, T. Akiyama, and M. Matsumoto. 2011. Lymphotoxin Signal Promotes Thymic Organogenesis by Eliciting RANK Expression in the Embryonic Thymic Stroma. J. Immunol. 186:5047-5057. 37. Duheron, V., E. Hess, M. Duval, M. Decossas, B. Castaneda, J. E. Klôpper, L. Amoasii, J. B. Barbaroux, I. R. Williams, H. Yagita, J. M. Penninger, Y. Choi, F. Lezot, R. Groves, R. Paus, and C. G. Mueller. 2011. Receptor Activator of NF-kB (RANK) stimulates the proliferation of epithelial cells of the epidermo-pilosebaceous unit. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 108:5342-5347. 38. Lagasse, E., and I. L. Weissman. 1997. Enforced expression of Bc1- 2 in monocytes rescues macrophages and partially reverses osteopetrosis in op/op mice. Cell 89:1021-1031. 39. Bosisio, M. R., C. Maisonneuve, S. Gregoire, A. Kettaneh, C. G. Mueller, and S. L. Bridai. 2009. Ultrasound biomicroscopy: A powerful tool probing murine lymph node size in vivo. Ultrasound Med. Biol. 35:12091216. 40. Kamijo, S., A. Nakajima, K. Ikeda, K. Aoki, K. Ohya, H. Akiba, H. Yagita, and K. Okumura. 2006. Amelioration of bone loss in collageninduced arthritis by neutralizing anti-RANKL monoclonal antibody. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347:124-132. 41. Ruedl, C., P. Koebel, M. Bachmann, M. Hess, and K. Karjalainen. 2000. Anatomical origin of dendritic cells determines their life span in peripheral lymph nodes. J. Immunol. 165:4910-4916. 2 980 711 52 42. Aioub, M., F. Lezot, M. Molla, B. Castaneda, B. Robert, G. Goubin, J. R. Nefussi, and A. Berdal. 2007. Msx2 -/- transgenic mice develop compound amelogenesis imperfecta, dentinogenesis imperfecta and periodental osteopetrosis. Bone 41:851-859. 5 43. Matsumoto, M., S. F. Lo, C. J. Carruthers, J. Min, S. Mariathasan, G. Huang, D. R. Plas, S. M. Martin, R. S. Geha, M. H. Nahm, and D. D. Chaplin. 1996. Affinity maturation without germinal centres in lymphotoxinalpha-deficient mice. Nature. 382:462-466. 44. Castaneda, B., Y. Simon, J. Jacques, E. Hess, Y. W. Choi, C. Blin- 10 Wakkach, C. Mueller, A. Berdal, and F. Lezot. 2010. Bone resorption control of tooth eruption and root morphogenesis: involvement of the receptor activator of NF-kappaB (RANK). J. Cell. Physiol. 226:74-85. 45. Lagasse, E., and I. L. Weissman. 1992. Mouse MRP8 and MRP14, two intracellular calcium-binding proteins associated with the development 15 of the myeloid lineage. Blood 79:1907-1915. 46. Mebius, R. E. 2003. Organogenesis of lymphoid tissues. Nat. Rev. Immunol. 3:292-303. 47. Jakubzick, C., M. Bogunovic, A. J. Bonito, E. L. Kuan, M. Merad, and G. J. Randolph. 2008. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells 20 are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205:2839-2850. 48. Gardner, J. M., J. J. Devoss, R. S. Friedman, D. J. Wong, Y. X. Tan, X. Zhou, K. P. Johannes, M. A. Su, H. Y. Chang, M. F. Krummel, and M. S. Anderson. 2008. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire- 25 expressing cells. Science 321:843-847. 49. Cohen, J. N., C. J. Guidi, E. F. Tewalt, H. Qiao, S. J. Rouhani, A. Ruddell, A. G. Farr, K. S. Tung, and V. H. Engelhard. 2010. Lymph noderesident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aireindependent direct antigen presentation. J. Exp. Med. 207:681-688. 30 50. Fletcher, A. L., V. Lukacs-Kornek, E. D. Reynoso, S. E. Pinner, A. Bellemare-Pelletier, M. S. Curry, A. R. Collier, R. L. Boyd, and S. J. Turley. 2010. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. J. Exp. Med. 207:689-697. 51. Ma, L., J. Liu, T. Wu, M. Plikus, T. X. Jiang, Q. Bi, Y. H. Liu, S. Muller-Rover, H. Peters, J. P. Sundberg, R. Maxson, R. L. Maas, and C. M. Chuong. 2003. 'Cyclic alopecia' in Msx2 mutants: defects in hair cycling and hair shaft differentiation. Development 130:379-389. 52. Gretz, J. E., C. C. Norbury, A. O. Anderson, A. E. Proudfoot, and S. Shaw. 2000. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. J. Exp. Med. 192:1425-1440. 53. Roozendaal, R., T. R. Mempel, L. A. Pitcher, S. F. Gonzalez, A. Verschoor, R. E. Mebius, U. H. von Andrian, and M. C. Carroll. 2009. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity 30:264-276. 54. Anderson, D. M., E. Maraskovsky, W. L. Billingsley, W. C. Dougall, M. E. Tometsko, E. R. Roux, M. C. Teepe, R. F. DuBose, D. Cosman, and L. Galibert. 1997. A homologue of the TNF receptor and its ligand enhance T-cell growth and dendritic-cell function. Nature 390:175-179. 55. Wong, B. R., R. Josien, S. Y. Lee, B. Sauter, H. L. Li, R. M. Steinman, and Y. Choi. 1997. TRANCE (tumor necrosis factor [TNF]- related activation-induced cytokine), a new TNF family member predominantly expressed in T cells, is a dendritic cell-specific survival factor. J. Exp. Med. 186:2075-2080. 56. Cremer, I., M. C. Dieu-Nosjean, S. Marechal, C. DezutterDambuyant, S. Goddard, D. Adams, N. Winter, C. Menetrier-Caux, C. Sautes-Fridman, W. H. Fridman, and C. G. Mueller. 2002. Long-lived immature dendritic cells mediated by TRANCE-RANK interaction. Blood 100:3646-3655. 57. Meier, D., C. Bornmann, S. Chappaz, S. Schmutz, L. A. Otten, R. Ceredig, H. Acha-Orbea, and D. Finke. 2007. Ectopic lymphoid-organ development occurs through interleukin 7-mediated enhanced survival of lymphoid-tissue-inducer cells. Immunity 26:643-654. 58. Yun, T. J., M. D. Tallquist, A. Aicher, K. L. Rafferty, A. J. Marshall, J. J. Moon, M. E. Ewings, M. Mohaupt, S. W. Herring, and E. A. Clark. 2001. Osteoprotegerin, a crucial regulator of bone metabolism, also regulates B cell development and function. J. Immunol. 166:1482-1491. 59. Willerford, D. M., J. Chen, J. A. Ferry, L. Davidson, A. Ma, and F. W. Alt. 1995. Interleukin-2 receptor alpha chain regulates the size and content of the peripheral lymphoid compartment. Immunity 3:521-530. 60. Lee, J. W., M. Epardaud, J. Sun, J. E. Becker, A. C. Cheng, A. R. Yonekura, J. K. Heath, and S. J. Turley. 2007. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat. Immunol. 8:181-190. 61. Shamoto, M., M. Shinzato, B. Qian, S. Hosokawa, and M. Ishibashi. 1999. Paracortical hyperplasia of superficial lymph nodes in a new mutant strain of hairless rats (ISh): a lesion similar to human dermatopathic lymphadenopathy. Pathol. Int. 49:305-309. 62. Kollet, O., A. Dar, S. Shivtiel, A. Kalinkovich, K. Lapid, Y. Sztainberg, M. Tesio, R. M. Samstein, P. Goichberg, A. Spiegel, A. Elson, and T. Lapidot. 2006. Osteoclasts degrade endosteal components and promote mobilization of hematopoietic progenitor cells. Nat. Med. 12:657664. 63. Schmutz, S., N. Bosco, S. Chappaz, O. Boyman, H. Acha-Orbea, R. Ceredig, A. G. Rolink, and D. Finke. 2009. Cutting edge: IL-7 regulates the peripheral pool of adult ROR gamma+ lymphoid tissue inducer cells. J. Immunol. 183:2217-2221. 64. Collin-Osdoby, P., L. Rothe, F. Anderson, M. Nelson, W. Maloney, and P. Osdoby. 2001. Receptor activator of NF-kappa B and osteoprotegerin expression by human microvascular endothelial cells, 2 980 711 55 regulation by inflammatory cytokines, and role in human osteoclastogenesis. J. Biol. Chem. 276:20659-20672. 65. Kim, H. H., H. S. Shin, H. J. Kwak, K. Y. Ahn, J. H. Kim, H. J. Lee, M. S. Lee, Z. H. Lee, and G. Y. Koh. 2003. RANKL regulates endothelial 5 cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Faseb J. 17:2163-2165. 66. Min, J. K., Y. M. Kim, E. C. Kim, Y. S. Gho, I. J. Kang, S. Y. Lee, Y. Y. Kong, and Y. G. Kwon. 2003. Vascular endothelial growth factor upregulates expression of receptor activator of NF-kappa B (RANK) in 10 endothelial cells. Concomitant increase of angiogenic responses to RANK ligand. J. Biol. Chem. 278:39548-39557. 67. Rifas, L., S. Arackal, and M. N. Weitzmann. 2003. Inflammatory T cells rapidly induce differentiation of human bone marrow stromal cells into mature osteoblasts. J. Cell. Biochem. 88:650-659. 15 68. Matzinger, P., and T. Kamala. 2011. Tissue-based class control: the other side of tolerance. Nat. Rev. Immunol. 11:221-230. 69. Kamijo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 347: 124-132, 2006 70. Ye et al., Nature, 418 :443-7, 2002. 20 71. Hsu, H., D. L. Lacey, C. R. Dunstan, I. Solovyev, A. Colombero, E. Timms, H. L. Tan, G. Elliott, M. J. Kelley, I. Sarosi, L. Wang, X. Z. Xia, R. Elliott, L. Chiu, T. Black, S. Scully, C. Capparelli, S. Morony, G. Shimamoto, M. B. Bass, and W. J. Boyle. 1999. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and 25 activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3540-3545. 72. Link, A., T. K. Vogt, S. Favre, M. R. Britschgi, H. Acha-Orbea, B. Hinz, J. G. Cyster, and S. A. Luther. 2007. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nat. Immunol. 30 8:1255-1265.