FR 2970781 A1 20120727 FR 1150586 A 20110125 1 PROCEDE DE FABRICATION D'UN SUPPORT D'ANALYSE ET UTILISATION POUR LA DETECTION DE TOXINES DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'un dispositif d'analyse comprenant des fragments de membranes de Torpilles immobilisés à sa surface, au dispositif d'analyse obtenu et à l'utilisation dudit dispositif pour la détection et caractérisation de molécules, en particulier ligands compétitifs des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. La présente invention trouve notamment des applications dans le domaine de la surveillance alimentaire de fruits de mer, dans le domaine de la surveillance des réserves d'eau douce, dans le domaine de la recherche médicale, dans le domaine de l'analyse biologique et de la caractérisation de molécules Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Selon des directives européennes récentes (86-609), le «Test souris», qui est actuellement le seul test officiel utilisé pour la surveillance de toxines marines, doit être remplacé par des méthodes fonctionnelles préalablement validées. Les efflorescences de dinoflagellés marins lorsqu'elles sont dominées par une espèce toxique représentent un danger pour l'écosystème marin, les activités commerciales et la santé publique. En effet, les phycotoxines des dinoflagellés peuvent être accumulées par des mollusques et des poissons et par transport vectoriel peuvent 2 atteindre l'homme. En 2005, le Réseau de Surveillance Phytoplanctonique a détecté grâce au « Test souris » des mollusques contaminés avec des neurotoxines inconnues à partir des échantillons du bassin d'Arcachon. En conséquence l'Etat Français a décrété l'interdiction de la consommation d'huîtres et de coquillages du bassin d'Arcachon et a dû débloquer 2,5 millions d'euros d'aide en faveur de l'Industrie Conchylicole de la Région d'Arcachon, FRANCE. Plus tard, du spirolide A et du 13-desméthyl spirolide-C, toxines produites par le dinoflagellé Alexandrium ostenfeldii, ont été détectées dans des huîtres et des moules du bassin d'Arcachon. Dans le cadre du programme ANR "NEUROSPIROIMINE" le mécanisme d'action des imines cycliques de la famille des spirolides et des gymnodimines a été établie. Les neurotoxines de la famille des spirolides et gymnodimines sont des puissants antagonistes des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (RnACh) de type musculaire et neuronal possédant des affinités dans l'ordre picomolaire et nanomolaire. Les procédés actuels de détection des toxines dans l'industrie conchylicole, c'est-à-dire de phycotoxines marines sont principalement : - le « Test souris » qui doit, de part l'évolution des règlements européen, être remplacé par un test n'utilisant pas d'animaux. De plus ce test est difficile à mettre en oeuvre et nécessite des infrastructures importantes (i.e. animalerie) pour sa mise en oeuvre. En outre, les professionnels de la conchyliculture remettent en cause de la validité de ce test et contestent les résultats obtenus. - la chromatographie liquide de haute performance (« High Performance Liquid Chromatography» (HPLC)). Cette méthode est onéreuse nécessitant des appareils importants et couteux et peu sensible. - HPLC couplée à la Spectrométrie de Masse (LC-MS). Cette méthode est onéreuse nécessitant des appareils importants et couteux et des personnels qualifiés afin de les utiliser. Malgré sa haute sensibilité, cette méthode nécessite des toxines standards pour calibrer l'appareil pour leur détection. En plus, la méthode LC-MS est d'utilisation limité dans le cadre de la détection des toxines non-connues. Depuis 2010, la LC-MS est la méthode officielle pour la détection de phycotoxines marines connues et sujet à réglementation en France, déplaçant ainsi le Test souris. Toutefois, la méthode LC-MS ne permet pas et ne peut pas être appliquée pour la détection des nouvelles toxines. Il existe donc un réel besoin de trouver un procédé et/ou un dispositif simple et peu onéreux, par exemple un test fonctionnel permettant la détection de toxines, en particulier de neurotoxines, par exemple des phycotoxines de la famille des imines cyclisées, par exemple des gymnodimines, spirolides, pinnatoxines, pteriatoxines, prorocentrolides et spiro-prorocentrimine ou de nouvelles toxines, par exemple la pinnamine, agissant sur les RnACh, par exemple pour la surveillance de phytoplancton neurotoxique pour l'industrie conchylicole ou la qualité des eaux de baignade dans les plages pour le tourisme, ainsi que pour la surveillance de fruits de mer contaminés De même, la prolifération de cyanobactéries dans les réserves d'eau douce constitue un danger potentiel pour la santé publique. En effet, des espèces de cyanobactéries peuvent produire des neurotoxines, il peut s'agir par exemple des espèces toxiques du genre Anabaena, Oscillatoria ou autres produisant de l'anatoxine-a ou homoanatoxin-a. Certes, de nombreux épisodes d'envenimement de chiens ayant bu de l'eau à fort contenu en cyanobactéries produisant de l'anatoxine-a et de I'homoanatoxine-a, puissants agonistes des RnACh, se sont produits en France dans des fleuves-comme La Loue (2003) et Le Tarn (2002, 2003 et 2005). Les procédés actuels de détection des neurotoxines de cyanobactéries sont principalement : - HPLC : cette méthode est onéreuse nécessitant des appareils importants et couteux et peu sensible. 4 - HPLC couplée à la Spectrométrie de Masse (LC-MS). Cette méthode est onéreuse et nécessite des appareils importants et couteux ainsi que des personnels qualifiés afin de les utiliser. Il existe donc un réel besoin de trouver un procédé et/ou un dispositif, par exemple un test fonctionnel, permettant d'identifier des toxines de cyanobactéries agissant sur les RnACh, par exemple afin de contrôler la qualité des eaux de reserves d'eau douce, la surveillance des suppléments alimentaires à base de cyanobactéries, la qualité des eaux de baignade, permettant de réduire les coûts, le temps de mise en oeuvre et d'améliorer la fiabilité des résultats obtenus. Description de l'invention La présente invention permet de résoudre et de surmonter les obstacles et inconvénients de l'art antérieur précités en fournissant un procédé de fabrication d'un dispositif d'analyse comprenant des fragments de membranes de Torpilles immobilisés à sa surface comprenant les étapes de : a. Isolement des membranes de cellules électrocytes de Torpille, b. Fragmentation desdites membranes isolées, c. Incorporation des fragments membranaires obtenus à l'étape b) dans une solution de pH compris de 6,5 à 10 d. Fixation desdits fragments membranaires à la surface du dispositif. Selon l'invention, par cellules électrocytes on entend des cellules musculaires modifiées ayant perdu leur capacité de contraction et qui se sont spécialisées à générer de l'électricité. Les électrocytes peuvent être issues de l'organe électrique de poissons électriques, par exemple des espèces de la famille Torpedinidae comme les Torpilles, ou de la famille Electrophoridae comme l'anguille électrique (Electrophorus electricus). Selon l'invention, les cellules peuvent être des cellules issues de l'organe électrique de Torpilles. Par exemple des electrocytes de Torpilles choisies dans le groupe comprenant Torpedo adenensis, Torpedo alexandrinsis ou Torpille alexandrine, Torpedo andersoni ou Torpille de Floride, Torpedo bauchotae, Torpedo californica ou Raie électrique du Pacifique, Torpedo fairchildi, Torpedo fuscomaculata, Torpedo mackayana, Torpedo macnei//i, Torpedo marmorata ou Raie électrique marbrée ou Torpille marbrée, Torpedo microdiscus, Torpedo nobiliana ou Raie électrique de l'Atlantique, Torpedo panthera ou Torpille panthère, Torpedo i o peruana, Torpedo semipelagica, Torpedo sinuspersici, Torpedo suessii, Torpedo tokionis, Torpedo torpedo ou Torpille commune, Torpedo tremens. De préférence les cellules utilisées sont des cellules de Torpedo marmorate ou Torpedo californica. Selon l'invention l'étape d'isolement des membranes peut 15 comprendre en outre une étape a'), préalable à l'étape a) de prélèvement du tissu électrique de Torpille. Cette étape de prélèvement du tissu électrique de Torpille peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut s'agir, par exemple, du procédé décrit dans le document Morel et al. (1985) [1]. Il peut s'agir d'un procédé comprenant, une fois la 20 Torpille endormie sur une couche de glace, par exemple en déposant le poisson sur ladite couche pendant environ 20 min, deux incisions au niveau des zones latérales au crâne sont pratiqués à l'aide d'un bistouri pour couper les 4 nerfs principaux qui relient chaque organe électrique avec le /obus electricus situé en derrière le cerebellum du poisson. Les 25 deux organes électriques, une fois prélevés sont trempés dans une dans une solution tampon, comprenant par exemple 280 mM de Chlorure de Sodium (NaCI), 3 mM de chlorure de potassium (KCI), 1,8 mM de chlorure de Magnésium (MgCl2), 3,4 mM de chlorure de calcium (CaCl2), 5 mM de bicarbonate de sodium NaHCO3, 1,2 mM de tampon phosphate, 5,5 mM 30 de glucose, 300 mM d'urée et 100 mM de sucrose. Selon l'invention le procédé peut comprendre en outre une étape a"), préalable à l'étape a) de préparation du tissu électrique de Torpille obtenu à l'étape a'). Selon l'invention, la préparation peut être réalisée, par exemple par immersion du tissu électrique prélevé dans une solution d'extraction, par exemple un tampon d'extraction de membranes d'électrocytes (TEME) comprenant 50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 3 mM de EDTA, 1 mM d'acide tétraacétique d'éthylène glycole (EGTA) et des inhibiteurs de protéases. Le tissu peut être ensuite découpé finement, par exemple à une épaisseur de 1 à 5 mm à l'aide d'un bistouri et immergé dans une solution fraichement préparée, par exemple le tampon TEME comprenant 50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 3 mM de EDTA, 1 mM d'acide tétraacétique d'éthylène glycole (EGTA) et des inhibiteurs de protéases. Selon l'invention, la solution d'immersion peut être préparée extemporanément, par exemple dans la journée, par exemple 10 heures avant, par exemple 5 heures avant, par exemple 2 heures avant. Selon l'invention, l'étape d'isolement de membranes à partir des organes électrique prélevés et préparés comme décrit préalablement peut être réalisée par sédimentation, par exemple dans un gradient discontinu de sucrose, par exemple selon le procédé décrit dans le document Hill et coll. (1991) ou Vilarino et coll. (2009) [2,3]. Par exemple un tissue préparé, par exemple tel que décrit dans l'étape a"), est homogénéisé dans un tampon, par exemple du TEME tel que défini précédemment à l'aide d'un broyeur à couteaux, puis la fraction membranaire totale est précipitée par centrifugation, par exemple à 20,000 tours par minute et reprise dans un tampon, par exemple du TEME, contenant 10 à 450/0 de sucrose, de préférence 350/0 de sucrose. Le gradient discontinu de sucrose peut être réalisé, par exemple avec, par exemple deux solutions de sucrose de 60 à 100/0 préparées dans le tampon TEME en poids par rapport au poids total de la solution, par exemple de solution à 60 et 200/0, à 30 et 50 %, à 35 et 45 % de sucrose. Selon l'invention, une des solutions de sucrose peut comprendre les membranes totales d'électrocytes de Torpille. Par exemple, il peut s'agir de deux solutions de sucrose à 350/0 et à 450/0, la solution à 350/0 de sucrose contenant les membranes totales d'électrocytes de Torpille. Après ultracentrifugation, les membranes d'électrocytes sédimentent à l'interphase entre les solutions de sucrose à 350/0 et à 450/0 d'où elles sont récupérées et lavées par ultracentrifugation, par exemple de 20,000 à 40,000, de préférence à 40,000 tours par minute dans du tampon glycine 5 mM. Selon l'invention les membranes de Torpilles peuvent être des i o membranes de cellules électrocytes, de préférence sont préparées à partir de cellules électrocytes de Torpilles indiquées précédemment. Les membranes d'électrocyte de Torpille sont des membranes comprenant des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (RnACh), en particulier des récepteurs de type musculaire qui sont constitués par deux 15 sous-unités alpha 1, une sous-unité beta 1, une sous-unité gamma et une sous-unité delta (al 213y6) (Changeux JP (2010). Allosteric receptors: from electric organ to cognition. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 50, 1-38 [4]). Les membranes d'électrocyte de Torpille sont riches en RnACh, représentant de 10 à 60 %, de 20 à 600/0, de préférence de 20 à 400/0 de la 20 concentration totale de protéines. Selon l'invention la fragmentation des membranes d'electrocyte peut être réalisée par fragmentation mécanique, par exemple à l'aide d'un broyeur, par exemple un broyeur en verre, par exemple un broyeur en verre de borosilicate de type Potter-Elvehjem avec piston en Téflon, par 25 fragmentation aux ultrasons, par exemple par sonication. De préférence, le broyeur est un broyeur en verre de borosilicate de type Potter Elvehjem avec un piston en Téflon, par exemple dans du tampon glycine de 1 à 10 mM, de préférence 5 mM glycine. Avantageusement l'utilisation d'un broyeur verre/ téflon permet de préserver la fonctionnalité des RnACh. 30 Selon l'invention la préparation des solutions stock des fragments membranaires peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier, il peut s'agir par exemple d'une mise en solution des fragments isolées selon le procédé décrit précédemment, par exemple avec un Potter-Elvehjem, dans une solution comprenant de 1 à 10 mM de glycine, de préférence 5 mM glycine. Selon l'invention, la concentration en protéine de la solution stock des fragments membranaire d'électrocyte de Torpille peut être par exemple de 0,5 à 10 mg/ml. Selon l'invention, la concentration de protéine totale des membranes de Torpille peut être ajustée par exemple à une concentration de 0,5 à 5, de 1 à 4, de 1,5 à 3,5, de préférence de 2,5 à 3.5 mg/ml de protéine. Selon l'invention la solution comprenant les fragments membranaires pour le recouvrement (« coating ») des plaques, peut être une solution de pH compris entre 6,5 à 10, cette solution correspond à la solution dans laquelle sont incorporés les fragments membranaires. Il peut s'agir par exemple d'une solution tampon tris salin (TBS) comprenant 150 mM chlorure de sodium, 50 mM Tris-HCI ou Tris, pH 7,5, d'une solution tampon phosphate salin (PBS) comprenant 130 mM chlorure de sodium, 10 mM sodium phosphate, pH 7,0 ou une solution tampon carbonate/bicarbonate comprenant 150 mM chlorure de sodium, 100 mM sodium carbonate, pH 9,5. Selon l'invention la concentration de protéine totale dans ladite solution de recouvrement de pH compris de 6,5 à 10 peut être comprise entre 5 à 200 pg/ml. Selon l'invention, la fixation des fragments de membranes peut être réalisée par exemple par interaction non-covalente et non-ionique entre les fragments membranaires et la surface. Selon l'invention, le procédé de l'invention peut comprendre préalablement à l'étape d) de fixation une étape c') de dilution des fragments membranaires dans une solution. Selon l'invention la dilution peut être réalisée par exemple dans une solution physiologique, par exemple une solution saline, par exemple d'une solution tampon tris salin (TBS) comprenant 150 mM chlorure de sodium, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, d'une solution tampon phosphate salin (PBS) comprenant 130 mM chlorure de sodium, 10 mM sodium phosphate, pH 7,0 ou une solution tampon carbonate/bicarbonate comprenant 150 mM chlorure de sodium, 100 mM sodium carbonate, pH 9,5. Selon l'invention, le dispositif peut être tout dispositif connu de l'homme du métier pour la fixation de molécules biologiques, par exemple, il peut s'agir d'un dispositif dont la surface est en plastique. Il peut s'agir, par exemple d'une plaque multipuits, par exemple une plaque de 6, 12, 24, 48, 96, 384 puits, de préférence 96 ou 384 puits ou des barrettes à 6, 8 ou 12 puits. Il peut s'agir, par exemple, d'une plaque ELISA, une plaque de haute adhérence pour les molécules polaires, par exemple des plaques de type NUNC PolysorpTM (marque de commerce), MedisorpTM (marque de commerce), MaxisorpTM (marque de commerce), ou MultisorpTM (marque de commerce). Il peut s'agir par exemple de plaques à haute adhérence pour des glycoprotéines (la liste de microplaques n'est pas limitative). De préférence, la plaque est une plaque MaxisorpTM (marque de commerce). Avantageusement la plaque MaxisorpTM (marque de commerce) dispose en plus de groupes hydrophobes, de beaucoup groupes hydrophyles augmentant sa capacité à établir des liaisons d'hydrogène en plus des interactions de type van der Waals. Selon l'invention, lorsque qu'une plaque multipuits est utilisée, la quantité de protéine des fragments membranaires peut être de 0,5 à 5 pg de protéine par puits, par exemple de 1 à 2 pg de protéine par puits, de 1 à 1,5 pg de protéine par puits. Selon l'invention, le procédé peut être mis en oeuvre, par exemple avec des solutions stock de membranes d'électrocyte de Torpille. Selon l'invention, le procédé peut être mis en oeuvre avec des solutions stock préalablement obtenues par exemple, par mise en oeuvre des étapes a) à c) du procédé de l'invention. Selon l'invention la solution stock peut être toute solution connue de l'homme du métier adaptée à la conservation de fragment de membrane, de par exemple une solution physiologique, par exemple du TBS, du PBS, une solution de glycine, par exemple une solution de glycine à une concentration de 1 mM à 10 mM, de 3 à 8 mM, de préférence 5 mM. Dans ce cas, le procédé de l'invention comprend l'étape d) de fixation des membranes à partir de solutions stocks. Selon l'invention les solutions stock peuvent être préalablement aliquotées, par exemple il peut s'agir de solutions de volume de 10 pl à 1 i o ml, par exemple de 100 pl à 500 pl, de préférence de 500 pl. Selon l'invention la concentration de protéines dans la solution stock peut être comprise entre 0,5 à 5, de 1 à 4, de 1,5 à 3,5 mg/ml, de préférence de 2,5 à 3.5 mg/ml de protéine. Avantageusement la concentration de protéine permet d'éviter 15 notamment la décongélation/ congélation répétitive des échantillons membranaires et ainsi préserve la fonctionnalité des RnACh. Selon l'invention, lorsqu'une solution stock est utilisée dans le procédé de l'invention, il peut comprendre l'étape c') de dilution de la solution stock. 20 Selon l'invention la dilution de la solution stock peut être de 50 à 500 fois, de préférence de 100 à 300 fois, de manière encore plus préférée de 200-fois à 250-fois. Selon l'invention la dilution de la solution peut permettre d'obtenir par exemple une concentration de protéines totale dans les fragments de 25 membrane d'électrocyte de Torpille de 5 pg/ml à 200 pg/ml, de préférence de 10 pg/ml à 20 pg/ml de protéines total par puits. De préférence lorsque le procédé est mis en oeuvre avec des solutions stock de membranes d'électrocyte de Torpille, il peut s'agir de solutions stocks diluées comme indiqué précédemment. 3o La présente invention à également pour objet un dispositif d'analyse obtenu par le procédé selon l'invention. 2970781 Il La présente invention à également pour objet l'utilisation d'un dispositif d'analyse selon l'invention pour la détection et la quantification de toxines, par exemple des neurotoxines. Selon l'invention les neurotoxines peuvent être toute neurotoxines 5 connues de l'homme du métier, par exemple, il peut s'agir de neurotoxines agissant, par exemple sur les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, de neurotoxines produites par du phytoplankton marin comme certains membres du genre Alexandrium, par exemple Alexandrium ostenfeldii, produisant par exemple du spirolide, des membres du genre Karenia, par exemple Karenia selliformis, produisant par exemple de la gymnodimine, des phycotoxins de la famille des spiroimines par exemple les pinnatoxines, les ptériatoxines, les prorocentrolide ou le spiroprorocentrimine susceptibles d'être produites par des différents espèces de phytoplancton. Il peut s'agir aussi de neurotoxines des cyanobactéries, par exemple l'anatoxine-a, I'homoanatoxine-a, produites par exemple par des membres des genres Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermum, Microcystis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix et Raphidiopsis, ou de pinnamine, toxine marine avec une structure chimique très proche de l'anatoxine-a et ou de toute toxine susceptible d'agir sur des RnACh. La présente invention à également pour objet l'utilisation d'un dispositif d'analyse selon l'invention pour la détection et la quantification de ligands de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. La présente invention à également pour objet l'utilisation d'un dispositif d'analyse selon l'invention pour le criblage à haut débit de ligands de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. La présente invention permet avantageusement d'augmenter l'efficacité du recouvrement de fragments membranaires de Torpille sur des surfaces, par exemple des microplaques et/ou des barrettes de part, par exemple le choix du pH desdites solutions et/ou le choix des solutions d'incorporations. En outre la présente invention tire profit du développement de la chimie de surface cherchant à maximiser le taux de 12 fixation de protéines par des microplaques en plastique (Esser P (2010). Principles in Adsorption to Polystyrene. Technical Bulletin: 06a. Thermo Fisher Scientific Inc. [5]). En outre, l'augmentation de la fixation, par exemple sur des plaques MaxisorpTM peut impliquer la chimie des surfaces des dites plaques et la nature macromoléculaire des membranes de Torpille. En effet, les fragments membranaires d'électrocytes de Torpille sont des mélanges de lipides (membranes) et de protéines, dont le RnACh peut représenter jusqu'à 400/0 de la concentration totale de protéine. En plus, les RnACh sont des protéines fortement glycosylées (7,50/0) (da Costa CJB, Kaiser DEE, Baenziger JE (2005). Role of Glycosylation and Membrane Environment in Nicotinic Acetylcholine Receptor Stability. Biophys J, 88, 1755-1764.) [6], ce qui renforce ainsi l'efficacité de la fixation et du recouvrement de la surface, par exemple de plaques MaxisorpTM de part les interactions non-covalentes et la formation de pont d'hydrogène entre les membranes d'électrocyte riche en RnACh et la surface. Avantageusement, dans la présente invention, la fixation de membranes de cellules électrocytes riches en RnACh permet la détection de quantités faibles, par exemple de l'ordre du nanogramme voir du picogramme, de substances, par exemple de neurotoxines telles qu'indiquées précédemment. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures - La figure 1 représente un schéma de l'essai de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA. Le schéma représente les différentes étapes du procédé : (1) recouvrement des puits de microplaque avec des membranes d'électrocytes de Torpille riches en récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (RnACh), (2) blocage des 13 surfaces plastique non liées, (3) incubation des membranes de Torpille immobilisées sur la paroi des puits avec une solution test (soit de la toxine standard ou soit de l'extrait des fruits de mer) (4) Déplacement compétitive du ligand lié au récepteur par de la Biotine-a-bungarotoxine (Biotine-a- BgTx). (5) lavage. (6) Incubation avec la streptavidine couplée à la peroxydase de raifort (HRP-streptavidine), (7) lavage, (8) détection colorimétrique du complexe HRP-streptavidine - Biotine-a-BgTx - RnACh. 9) lecture de la plaque ELISA et analyse des données. Abréviations : R = RnACh, SPX = 13-desméthyl spirolide C/ 13-19 didesméthyl spitolide C, GYM = gymnodimine A, Biotine-a-BgTx = biotine-a-bungarotoxine, E _ HRP-streptavidine. - La figure 2 représente des courbes de standardisation de l'essai de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA. - La figure 2 A représente des courbes de saturation de la liaison entre de la Biotine-a-BgTx et les RnACh d'électrocytes de Torpille en employant des solutions 500-fois diluées de membrane 200-fois diluées de membrane (-44 100-fois diluées de membrane (-.-) et 50-fois diluées de membrane (+). Chaque dilution a été réalisée dans du tampon salin Tris (TBS). Les membranes ont été incubées pendant une nuit avec différentes concentrations de Biotine-a-BgTx (5 x 10-12 M to 5 x 10-6 M) afin de déterminer la constante d'affinité de la Biotine-a-BgTx pour le RnACh de Torpille. - La figure 2 B est un diagramme représentant la détermination de la concentration de traceur (biotine-a-BgTx) pour la méthode. Les puits de microplaques ayant été recouverts avec une solution de membranes d'électrocytes de Torpille diluées 200 fois dans du tampon TBS ont été incubé avec différentes concentrations de biotine-a-BgTx: 2 x 10-9 M (---V--), 6 x 10-9 M 1 x 10-$ M (-f-), 4 x 10-$ M (-e-), 8 x 10-$ M (-+-) et 2 x 10- ' M (-e-) pendant 0, 0,5, 1, 1,5 et 2 h. L'abscisse représente le temps d'incubation en heures (h) et l'ordonnée la densité optique mesurée à une longueur d'onde de 492nm (DO492nm). - La figure 2 C est un diagramme représentant la détermination de la dilution de membranes d'électrocyte de Torpille pour l'essai de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA. Différentes dilutions de membrane d'électrocyte de Torpille (10 à 5000 fois diluées) ont été incubées pendant la nuit avec 8 x 10-$ M de biotine-a-BgTx. L'abscisse représente la dilution des membranes (1/X) et l'ordonnée la densité optique mesurée à une longueur d'onde de 492nm (DO492nm). Toutes les expériences ont été réalisées au moins deux fois. Chaque point de la courbe représente la valeur moyenne ± écart moyen (n = 3). - La figure 3 représente l'inhibition compétitive de la liaison biotine-a-BgTx avec le RnACh de Torpille par de l'a-bungarotoxine et des phycotoxines portant des imines cyclisées. - La figure 3 A est une photographie d'une microplaque montrant l'inhibition compétitive dose dépendante de la liaison biotine-a-BgTx avec des RnACh de Torpille par de la a-BgTx standard et par la phycotoxine 13-desméthyle spirolide C. Chaque dose a été testée en triplicate. Sur la partie gauche est représentée la concentration de a-BgTx / (puits): 3,3 x 10-6 (A1-A3), 1,1 x 10-6 (B1-B3), 3,7 x 10-' (C1-C3), 1,2 x 10-' (D1-D3), 4.1 x 10-$ (E1-E3), 1,4 x 10-$ (F1-F3), 4,6 x 10-9 (G1-G3), 1,5 x 10-9 (A4-A6), 5,1 x 10-10 (B4-B6), 1,7 x 10-10 (C4-C6), 5,7 x 10-11 (D4-D6), 1,9 x 10-11 (E4-E6), 6,2 x 10-12 (F4-F6) et 2,09 x 10-12 M a-BgTx. (G4-G6). Sur la partie droite: concentration de 13-desméthyle SPX C / (puits) : 3,3 x 10-' (A7-A9), 1,1 x 10-' (B7-B9), 3,7 x 10-$ (C7-C9), 1,2 x 10-$ (D7-D9), 4,1 x 10-9 (E7-E9), 1,4 x 10-9 (F7-F9), 4,6 x 10-10 (G7-G9), 1,5 x 10-10 (A10-Al2), 5,1 x 10- 11 (B10-B12), 1,7 x 10-" (C10-C12), 5,7 x 10-12 (D10-D12), 1,9 x 10-12 (E10-E12), 6,2 x 1013 (F10-F12) et 2,1 x 1013 M 13-desméthyle SPX C (G10-G12). La a-BgTx et 13-desméthyle SPX C inhibent de façon compétitive et dose dépendante, mais dans une ampleur différente, la liaison de la biotine-a-BgTx au RnACh des membranes de Torpille immobilisées. Le signal plaque est le contrôle négatif : puits sans recouvrement par les membranes. 1000/0 signal est le contrôle positif: il 15 s'agit de puits dans lesquels des membranes de Torpille ont été mises en absence de toxines ou d'échantillons d'extrait. - La figure 3 B est un diagramme représentant l'inhibition dose-dépendante de la liaison biotine-a-BgTx avec des RnACh de Torpille immobilisées en utilisant l'essai de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA par l' a-BgTx (-44 le 13-19-didesméthyle spirolide C (-e-),le 13-desméthyle spirolide C (-.-) et par la gymnodimine A (-e-). Des expériences indépendantes ont été réalisées au moins trois fois. Chaque point représente la valeur moyenne ± écart moyen (n = 3). L'abscisse représente la concentration de toxine (M) et l'ordonnée le pourcentage d'inhibition. - La figure 4 représente l'inhibition compétitive de la liaison biotine-a-BgTx avec le RnACh de Torpille par des phycotoxines portant des imines cyclisées et des extraits de fruits de mer témoins et contaminés. - La figure 4 A est une photographie d'une microplaque montrant l'inhibition compétitive dose dépendante de la liaison biotine-a-BgTx avec des RnACh de Torpille par du 13-desméthyle SPX C et des extraits de fruit de mer contaminés avec ladite toxine et des extraits témoins. Chaque dose a été testée en triplicate. Sur la partie gauche : concentration de 13- desméthyle spirolide (puits) : 1,7 x 10-5: (A1-A3), 5,6 x 10-6: (B1-B3), 1,9 x 10-6: (C1-C3), 6,2 x 10-7: (D1-D3), 2,1 x 10-7: (E1-E3), 6,9 x 10-$: (F1-F3), 2,3 x 10-$: (G1-G3), 7,6 x 10-9: (A4-A6), 2,5 x 10-9: (B4-B6), 8,5 x 10-10: (C4-C6), 2,8 x 101°: (D4-D6), 9,4 x 10-": (E4-E6), 3,1 x 10-": (F4-F6) et 1,0 x 10-" M 13-SPX-C: (G4-G6). Sur la partie droite est représentée la concentration de 13-desméthyle spirolide de 3,5 x 10-12 M (A7-A9) et les extraits de fruits de mer. Extraits de fruit de mer dopés avec du 13-desméthyl spirolide C-dilution : (puits) . Amandes-D200: (B7-B9), amandes-D400: (C7-C9), huitres-D200: (D7-D9), huitres-D400: (E7-E9), moules-D200: (F7-F9), moules-D400: (G7-G9), coquilles Saint-Jacques-D200: (A10-Al2) et coquilles Saint-Jacques-D400: (B10-B12). Extraits témoins de fruit de mer-dilution: (puits). Amandes témoins-D200: (C10-C12), huitres témoins-D2oo: 16 (D10-D12), moules témoins-D200: (E10-E12), coquillles Saint-Jacques témoins-D200: (F10-F12) et coquillles Saint-Jacques témoins-D400: (G10-G12). Signal plaque: puits contrôles négatifs incubées sans recouvrement par une membrane (H1-H3); signal 100%: puits contrôles positifs dans lesquels des membranes de Torpilles ont été incubées sans toxines ou sans extrait (H4-H9); 1000/0 inhibition : puits comprenant des membranes de Torpilles incubés avec 1 x 10-5 M de a-BgTx (H10-H12). - La figure 4 B est une photographie d'une microplaque montrant l'inhibition compétitive dose dépendante de la liaison biotine-a-BgTx avec i o des RnACh de Torpille par de la gymnodimine-A, des extraits de fruit de mer contaminés avec ladite toxine et des extraits témoins. Chaque dose a été testée en triplicate. Sur la partie gauche : concentration de gymnodimine-A (puits) : 1,7 x 10-5: (A1-A3), 5,6 x 10-6: (B1-B3), 1,9 x 10-6: (C1-C3), 6,2 x 10-7: (D1-D3), 2,1 x 10-7: (E1-E3), 6,9 x 10-$: (F1-F3), 2,3 x 15 10-$: (G1-G3), 7,6 x 10-9: (A4-A6), 2,5 x 10-9: (B4-B6), 8,5 x 10-10: (C4-C6), 2,8 x 10-10: (D4-D6), 9,4 x 10-": (E4-E6) et 3,1 x 10" M GYM-A: (F4-F6). Extraits d'amandes dopées avec de la GYM A-Dilution: (puits). Amandes-D200: (G4-G6). Coté droit: extraits de fruits de mer dopés avec de la GYM A-Dilution: (puits). Amandes-D400: (A7-A9), huitres-D200: (B7-B9), huitres- 20 D400: (C7-C9), moules-D200: (D7-D9), moules-D400: (E7-E9), coquilles Saint-Jacques-D200: (F7-F9) et coquilles Saint-Jacques-D400: (G7-G9). Extraits témoins de fruit de mer-dilution: (puits). Amandes témoins-D200: (H7-H9), amandes témoins-D400: (A10-Al2), huitres témoins-D200: (B10-B12), huitres témoins-D400: (C10-C12), moules témoins-D200: (D10-D12), moules 25 témoins-D400: (E10-E12), coquilles Saint-Jacques témoins-D200: (F10-F12) et coquilles Saint-Jacques témoins-D400: (G10-G12). Signal plaque: (H1-H3); signa1100%: (H4-H6); 1000/0 inhibition : (H10-H12). - La figure 4 C est une photographie d'une microplaque montrant l'inhibition compétitive dose dépendante de la liaison biotine-a-BgTx avec 30 des RnACh de Torpille par du 13-19 didesméthyl spirolide C, des extraits de fruit de mer contaminés avec ladite toxine et des extraits témoins. Chaque dose a été testée en triplicate. Sur la partie gauche : Concentration 13-19 didesméthyl spirolide C (puits) : 3,3 x 10-' M (A1-A3), 1,1 x 10-' M (B1-B3), 3,7 x 10-$ M (C1-C3), 1,2 x 10-$ M (D1-D3), 4,1 x 10-9 M (E1-E3), 1,4 x 10-9 M (F1-F3), 4,6 x 10-10 M (G1-G3), 1,5 x 10-10 M (A4- A6), 5,1 x 1011 M (B4-B6), 1,7 x 10-11 M (C4-C6), 5,7 x 10-12 M (D4-D6), 1,9 x 10-12 M (E4-E6), 6,2 x 10-13 M (F4-F6) et 2,1 x 10-13 M 13-19-SPX C (G4-G6). Coté droit: Extraits de fruits de mer dopés avec du 13-19 didesméthyl spirolide C-Dilution: (puits). Amandes-D2oo : (A7-A9), amandes-D400 : (B7-B9), moules-D2oo : (C7-C9), moules-D400 : (D7-D9), huitres-D2oo : (E7-E9), huitres-D400 : (F7-F9), coquilles Saint Jacques-D2oo : (G7-G9) et coquilles Saint Jacques-D400 : (A10-Al2). Extraits témoins de fruit de mer-dilution: (puits). Amandes témoins-D2oo: (B10-B12), huitres témoins-D2oo: (C10-C12), moules témoins-D2oo: (D10-D12), coquilles Saint-Jacques témoins-D2oo: (E10-E12). Extraits des cyanobactéries-Dilution: (puits). PCC 6506-D1oo : (F10-F12) et PCC 10111-D1oo: (G10-G12). Signal plaque: (H1-H3); signal 1000/0: (H4-H9); 1000/0 inhibition: (H10-H12). - La figure 4D est un diagramme en bâton représentant l'effet matrice. Des homogénats de fruits de mer (amandes = A; huitres = H; moules = M et coquilles St Jacques = S) ont été dopés avec du 13-19-didesméthyl spirolide C, 13-desméthyl spirolide C et gymnodimine A. Les résultats ont été obtenus avec l'essai de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA. Les bâtons représentent la valeur moyenne ± erreur type sur la moyenne (n = 3 pour les échantillons dopés et n=9 pour les échantillons de fruit de mer témoins). L'abscisse représente les échantillons testés et l'ordonnée le pourcentage d'inhibition. 13-19-SPX C = 13-19-didesméthyl spirolide C, 13-SPX C = 13-desméthyl spirolide C, GYM = gymnodimine A. - La figure 5 représente le criblage des toxines/ligands compétitifs des RnACh à partir des extraits de cyanobactéries marines en employant l'essai de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA avec le pipeteur manuel à 96 cônes. 18 - La figure 5 A est une photographie du pipeteur manuel à 96 cônes montrant les zones de charge et pipetage. - La figure 5 B représente le plan de plaque pour le criblage de toxines/ligands compétitifs des RnACh à partir des extraits de cyanobactéries marines 1 à VII, en employant comme control positif le 13-19-SPX C (VIII). SP (signal de plaque), 1000/0 (Signal 1000/0). BgTx (1 x 10-6 M a-bungarotoxine : 1000/0 inhibition). - La figure 5 C est une photographie d'une microplaque montrant le criblage de toxines/ligands compétitifs des RnACh à partir des extraits de 1 o cyanobactéries marines 1 à VII testés à trois dilutions: D10 : première rangé, D1oo : deuxième rangé et D1000 troisième rangé. Le rectangle VIII montre sur la même plaque l'inhibition compétitive dose dépendante de la liaison biotine-a-BgTx avec des RnACh de Torpille par du 13-19 didesméthyl spirolide C : première rangé : 5 X 10-' M, deuxième rangé : 5 15 X 10-$ M, troisième rangé : 5 X 10-9 M, quatrième rangé : 5 X 10-10 M, cinquième rangé : 5 X 10-" M, sixième rangé : 5 X 10-12 M et septième rangé : 5 X 10-13 M. Signal plaque: (H1-H3); signal 1000/0: (H4-H9); 1000/0 inhibition : (H10-H12). 20 EXEMPLES Exemple 1 : Procédé de détection de l'interaction entre les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (RnACh) et des toxines Produits utilisées 25 Dans l'exemple ci-dessous, les produits, dispositifs utilisés étaient les suivants : Les plaques à fonds plats ELISA Maxisorp ont été achetées à la société NUNC (Kamstrupvej, Denmark). Le tampon de recouvrement était le suivant: tampon tris salin (TBS) 30 (150 mM chlorure de sodium, 50 mM Tris-HCI, pH 7.5) 19 Le tampon de lavage : du TBS contenant 0,10/0 Tween 20. Le tampon de blocage: du TBS contenant 0,50/0 albumine de sérum bovin (BSA) Une solution stock 10 fois concentrée de tampon TBS à pH 7 a été préparé et a été autoclavée et conservée à température ambiante, à savoir à 25°C pour préparer lesdits tampons La a-bungarotoxine biotinylée (Biotin-a-BgTx) a été acheté à la société Molecular Probes (Eugene, OR, USA) Le mélange d'inhibiteurs de protéase complet (« Protease inhibitors mix Complete ») a été acheté à la société Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). L'albumine de sérum bovin (BSA) provenait de la société Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). La streptavidine couplée à la péroxidase a été achetée à la société Sigma-Aldrich. Les tablettes o-Phénylènediamine dihydrochloride ont été achetées à la société DAKO (Glostrup, Dennmark). La a-bungarotoxine a été achetée à la société Sigma-Aldrich. Le 13-Desméthyle spirolide C a été acheté à la société NRC-CNRC (institut de biosciences marine, conseil national de la recherche, Halifax, NS, Canada). La Gymnodimine A a été achetée à la société NRC-CNRC Le 13-19-didesméthyle spirolide C a été acheté à la société CIFGA (Lugo, Spain). L'anatoxin-a provenait de la société TOCRIS (Ellisville, MO, USA) Protocole : La figure 1 représente les différentes étapes de mise en oeuvre du procédé. Recouvrement avec les membranes (« Coating ») Une plaque Elisa à fonds plats de 96 puits NUNC MaxisorpTM a été recouverte avec 100 pl par puits de membranes d'électrocyte de Torpille dont la concentration totale de protéine était de 13.5 pg/ml dans du tampon de recouvrement TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5 soit 1,35 pg 20 de protéine par puits). Les plaques ont été fermées et incubées à température ambiante (25°C) pendant 2 heures ou toute la nuit à 4°C. La solution stock de membranes a été dilué 200 fois dans du tampon TBS avant le recouvrement des plaques. Le recouvrement a été effectué avec une pipeteur électronique multicanaux eLINE (Biohit, Helsinki, Finlande) qui a permis d'accélérer le chargement des membranes. Trois puits ont été laissés sans recouvrement avec des membranes pour leur utilisation comme puits contrôle négatif (signal plaque). Blocage L'excès de membrane a été éliminé. Le tampon résiduel sur la plaque a été éliminé avec du papier absorbent. Sans lavage, les puits ont été remplis avec 250 pl de tampon de blocage (TBS, 0,5 % BSA) par puits. La plaque a été fermée et incubée pendant une heure à température ambiante, à savoir 25°C. Les plaques ont été stockées à 4°C pour utilisation ultérieure. Des expériences en parallèles ont été réalisées avec des plaques recouvertes six mois avant et avec des plaques recouvertes le jour précédent : aucune différence significative n'a été observé entre les différentes plaques pour les courbes dose réponse de liaison du ligand (résultats non représentés). Incubation avec les toxines/extraits Le tampon de blocage a été éliminé et le liquide résiduel sur le haut de la plaque a été absorbé avec un papier absorbant. Sans lavage, les plaques ont été chargées soit avec a) 100 pl de toxines standard préparées dans du tampon de blocage ou avec b) 100 pl de tampon de blocage contenant jusqu'à 100/0 d'extraits (volume/volume). Chaque concentration de toxine ou d'échantillon a été testée 3 fois. La plaque a été fermée et incubée pendant trois heures sous agitation constante à 21 température ambiante (25°C), ou sur la nuit à 4°C pour une sensibilité maximale. Six puits recouvert avec des membranes de Torpille ont été laissés libres de toxine ou d'extrait pour les utiliser comme contrôle négatifs (Signal 1000/0). En plus, trois puits recouvert avec des membranes de Torpille ont été laissés libres de toxine ou d'extrait pour les utiliser comme contrôle d'inhibition non-spécifique. Lesdits puits sont incubés avec de 1 pM a-bungarotoxine (1000/0 inhibition). La concentration de méthanol a été gardée inférieur à 10/0 afin 1 o d'éviter toute interférence avec la liaison du ligand au RnACh. Déplacement de la Biotine-BgTx: Sans enlever les toxines et/ou les extraits, 50 pl de Biotine-a-BgTx (8 x 10-$ M, concentration finale) a été ajouté dans chaque puits. La plaque 15 a été fermée et l'ensemble a été incubé pendant 30 minutes sous agitation constante à température ambiante (25°C). Les toxines, extraits ou Biotine-a-BgTx non liés ont été éliminés et les puits ont été lavés trois fois avec 250 pl de tampon de lavage (TBS, 0,10/0 Tween 20). Le tampon résiduel a été absorbé avec du papier 2o absorbant. Réaction Straptavidine-Biotine Une quantité de 100 pl de streptavidine couplée à la peroxydase (diluée 5000 fois, -220 ng/nl protéine, SIGMA) a été ajoutée à chacun des 25 puits avec un pipeteur électronique multicanaux eLINE (marque déposée) (Biohit). La plaque a été fermée et incubée pendant 30 minutes à température ambiante (25°C) sous agitation constante, c'est-à-dire une agitation d'environ 50 tours par minute. La pipeteur électronique multicanaux permet de minimiser les 3o différences dans les temps d'exposition à la réaction entre la partie biotine du traceur et la partie sptreptavidine de l'enzyme. Cependant, due au fait de la grande affinité entre la biotine et la streptavidine (Kd = 10-14 M), une réaction de 30 minutes assure un effet négligeable lié à la différence du temps d'exposition pour chaque rangé de puits. Le temps de réaction entre la Biotine-a-BgTx et la Streptavidine-péroxidase à été déterminé expérimentalement, à savoir des membranes d'electrocyte de Torpille immobilisées sur des puits de la microplaque MaxisorpTM ont été incubées avec 8 x 10-$ M biotin-a-BgTx pendant 30 minutes à 25°C. Après lavage, 100 pl de streptavidine couplée à la peroxydase (diluée 5000-fois) ont été ajouté à chaque puits. Le temps d'incubation a été de 0, 1, 2,5, 5, 10, 15 et 30 min. Les puits ont été lavés et l'activité peroxidase détecté comme décris ci-dessous. Détection colorimétrique L'excès de Streptavidine-péroxidase a été éliminé et les puits ont été lavés trois fois avec 250 pl de tampon de lavage (TBS, 0,10/0 Tween 20). Le tampon résiduel sur la plaque a été éliminé avec du papier absorbant. Une quantité de 100 pl de substrat de peroxydase OPD (DAKO, Glostrup, Dennmark) a été ajouté à chaque puits avec un pipeteur électronique multicanaux. Lorsqu'une couleur convenable s'est développée, c'est-à-dire après environ 5 minutes d'incubation, la réaction enzymatique a été stoppée en ajoutant 100 pl de 0,5 M H2SO4 à chaque puits avec un pipeteur électronique multicanaux. L'utilisation d'un pipeteur électronique multicanaux permet d'éviter les variations dans le développement de la couleur dues à la différence de temps d'exposition. La solution de stoppage a été ajoutée dans le même ordre que la solution de substrat de la péroxydase (OPD) a été ajoutée afin de minimiser les différences due au temps d'incubation. Le substrat de la peroxydase (OPD) a été préparé selon les recommandations du fournisseur. Quatre tablettes OPD ont été dissoutes dans 12 ml d'eau déionisée à température ambiante (25°C), suite à quoi après 5 pl de 300/0 de peroxyde d'hydrogène a été ajoutés. 23 La plaque a été enregistrée avec un lecteur ELISA (Genios Pro, Tecan), à une absorbance de 492 nm (figure 1). Le pourcentage d'inhibition a été calculé selon la formule suivante : Inhibition % _ [100 x (signal 1000/0 - signal de l'échantillon) / (signal 1000/0 - (inhibition 1000/0 - signal plaque)] Le signal 1000/0 a été obtenu dans des puits dans lesquels des membranes de Torpille ont été appliquées et incubées sans toxines/extraits; le signal plaque («plate signal ») a été obtenu des puits 1 o dans lesquels le recouvrement avec les membranes de Torpille a été omis. Des expériences indépendantes ont été réalisées au moins deux fois avec des triplicates. Les résultats ont montrées que des antagonistes des RnACh, a savoir : l'a-bungarotoxine, le 13-desméthyl spirolide C, le 13,19 15 didiesmethyl spiprolide C, la gymnodimine, le d-Tubocurarine (curare) et des agonistes des RnACh, à savoir : l'anatoxina-a et l'homoanatoxine-a, inhibent l'interaction entre de l'a-BgTx et le RnACh de Torpille de façon dépendante à leur concentration avec des affinités différentes (figures 3 A, 3 B, 4 A, 4 B et 4 C). 20 Ce système est aussi utilisable avec de la streptavidine couplé à la phosphatase alcaline en plus de la streptavidine couplé à la peroxydase de raifort, et, comme révélateurs des enzymes des substrats soit produisant une réaction colorimétrique (OPD, Nitro blue tetrazolium chloride), soit une substance décelable par chimioluminescence (ECL +) 25 [7]. La liste de révélateurs n'est pas limitative. Tableau 1. Sensibilité de l'essai non radioactif de déplacement de la liaison ligand-récepteur sur microplaque de type ELISA pour la détection de abungarotoxine (a-BgTx), 13 desméthyl spirolide C (13-SPX C), 13-19 3o didesméthyl spirolide C (13-19-SPX C), gymnodimine A (GYM A) et de l'anatoxine-a (ANTX) a-BgTx 13-SPX-C 13,19-SPX-C GYM-A ANTX IC50 (95% 0,27 (0,18- 6,84 (5,07- 3,10 (1,98- 74,23 (62,4- 68,81 (35,3- CI) 0,41) 9,22) 4,85) 88,3) 34,2) LOD (nM) 0,02 1 0,8 2 2 LOQ (nM) 0,20 4 2,0 20 30 IC90 (nM) 70 60 20 2000 2000 L'IC50 représente la concentration de neurotoxine à laquelle il y a 500/0 d'inhibition de la liaison entre la biotin-a-BgTx et les RnACh de Torpille ; le 950/0 Cl est l'intervalle de confiance à 950/0 de la valeur IC50 correspondante ; le LOD est la limite de détection de la méthode, le LOQ, est la limite de quantification de la méthode ; l'IC90 représente la concentration de neurotoxine nécessaire à inhiber 900/0 de la liaison entre la biotin-a-BgTx et les RnACh de Torpille. L'essai non radioactif de déplacement de la liaison ligand-récepteur 1 o sur microplaque de type ELISA est une méthode fonctionnelle basée sur le mécanisme d'action des ligands compétitifs des RnACh. Cette méthode permet de détecter des agonistes et antagonistes compétitifs des RnACh avec une grande sensibilité. La sensibilité de la méthode utilisant les dispositifs de la présente 15 invention a été comparée avec la Chromatographie Liquide Ultra Performante couplé à la Spectrométrie de Masse (UPLC-MS/MS) pour la détection de 13-SPX C, 13-19-SPX C et GYM A [Aràoz et coll., manuscrit en préparation]. Les valeurs de LOD et LOQ obtenus par UPLC-MS/MS montrent que la sensibilité de la méthode de déplacement non-radioactive 2o utilisant le dispositif de la présente invention est dans le même ordre de grandeur que celle de l'UPLC-MS/MS (Tableau 2). 25 Tableau 2. Sensibilité de l'UPLC-MS/MS pour la détection de 13-SPX C, 13-19-SPX C et GYM A 13-SPX-C 13,19-SPX-C GYM-A LOD (nM) 4,78 1,66 1,52 LOQ (nM) 13,1 5,55 4,17 Tel que démontré dans cet exemple, l'utilisation du dispositif obtenu par le procédé de l'invention permet de détecter l'interaction entre les RnAch et des ligands avec une sensibilité aussi grande que les techniques les plus précises de l'état de la technique sans utilisation d'un dispositif complexe et/ou couteux et cela parallèlement sur un grand nombre d'échantillons (96) pour la détection simultanée des plusieurs ligands/agonistes/antagonistes des RnACh à savoir les spirolides, gymnodimines, pinnatoxines, anatoxines, curare, ...(la liste n'est pas limitative). Exemple 2 : Procédé de détection du 13 desméthyle spirolide C, du 13,19 didesméthyl spirolide C et de la gymnodimine A à partir des extrais des fruits de mer et de l'anatoxin-a à partir des extraits de cyanobactéries Dans cet exemple, les solutions et protocoles suivants ont été utilisés : - Tampon de recouvrement (« coating »): TBS (150 mM chlorure de sodium, 50 mM Tris-NOL pH 7,5). - Dilution des membranes: 200 fois. Un volume de 50 pl de membrane de Torpille (2.7 mg mrl de protéine dans 5 mM de glycine) a été dilué dans 10 ml TBS. - Support: plaques ELISA à fonds plats Maxisorp (NUNC). - Volume de recouvrement (« coating »): 100 pl de membranes de Torpille diluées 200 fois - Température et temps de recouvrement (« coating »): température ambiante (25°C) pendant 2 heures ou 4°C sur la nuit. ^ Extraits de fruits de mer (amandes, huitres, moules et coquilles Saint-Jacques) témoins et dopés avec 13 desméthyl spirolide C, 13,19 didesméthyl spirolide C et gymnodimine A - Extraits de cyanobactéries productrices d'anatoxin-a et homoanatoxin-a i o Une plaque ELISA 96 puits à fonds plats Maxisorp (NUNC) a été recouverte avec 100 pl par puits d'une solution de membranes d'électrocyte de Torpille (13,5 pg/ml protéine total, soit 1,35 pg de protéine membranaire par puits) dans du tampon TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5) à l'aide d'un pipeteur multicanaux. La plaque a été fermée et 15 incubée à température ambiante (25°C) pendant 2 heures ou à 4°C sur la nuit. Détection des phycotoxines dans des extraits de fruits de mer Extraction des toxines lipophiliques à partir de fruits de mer : La préparation des extraits bruts à partir d'échantillons de fruits de 20 mer a été réalisée comme suit : de la chaire d'amandes, huitres, moules ou coquilles Saint-Jacques (100g) a été homogénéisé dans un broyeur à couteaux à puissance maximale et divisée en 10 aliquotes et gardé à - 80°C. 50 pl de 13 desméthyl spirolide C standard, 50 pl de 13,19 25 didesméthyl spirolide C standard ou 50 pl de gymnodimine A standard, à une concentration de 10 pM tout les trois ; ont été ajouté séparément sur 1 g de chaque homogénat de fruit de mer. Pour extraire ces phycotoxines lipophiliques, 4 ml d'acétone a été ajouté sur chacun d'homogénats dopés. Les mélanges ont été vortéxés pendant 10 secondes et mélangés sur un agitateur mécanique rotatif pendant 15 minutes à température ambiante (25°C). Ensuite, les homogénats ont été centrifugé à 3500 g pendant 15 minutes à 4°C et les surnageants ont été récupérés tandis que les culots ont été re-extrait deux fois avec 4 ml d'acétone comme il vient d'être décrit. Les pools de surnageants ont été évaporés et les résidus ont été resuspendus dans 4 ml d'eau. Sur les extraits aqueux, 4 ml d'hexane ont été ajoutés et laissé pendant 30 min à température ambiant (25°C) pour que la partition chimique ait lieu. Les phases aqueuses ont été extraites trois fois avec du chloroforme (1:1,5 v/v). Les couches de chloroforme ont été regroupées et évaporées. Les résidus obtenus ont été resuspendus dans 100 pl de méthanol et conservés à -80°C jusqu'à leur utilisation. 1 g d'homogénat de chaque bivalve (amandes, huitres, moules et coquilles St-Jacques) ont été soumis au même traitement pour servir comme témoins. Préparation des plaques : Des dilutions sérielles de toxines standards, c'est-à-dire de 13 desméthyl spirolide C (1,7 x 10-5 - 3,5 x 10-12 M), 13,19 didesméthyl spirolide C (3,3 x 10-' - 2,1 x 10-13 M) et gymnodimine A (1,7 x 10-5 - 3,1 x 10-" M), (350 pl) ont été préparés avec du tampon de blocage (TBS, 0,50/0 BSA). De la même manière, chaque extrait de fruit de mer, témoins ou dopés avec lesdites toxines, ont été dilués 100-fois et 200-fois (350 pl) dans du tampon de blocage (TBS, 0,50/0 BSA). Chaque dose a été analysée en triplicate (100 pl par puits). Le 13-desméthyle spirolide C, le 13-19-didesméthyle spirolide C et la gymnodimine A sont distribués dans le commerce dans du méthanol. 28 Les concentrations de méthanol ont été conservées à un niveau inférieur à 1 % pour éviter toute interférence avec la méthode Préparation des extrais de cyanobactéries Les d'extraits brut de cyanobactéries productrices d'anatoxin-a ont été préparés comme suit : Le matériel biologique, c'est-à-dire des filaments de cyanobactéries, ont été récoltés par centrifugation (3000 tours par minute à 15°C pendant 10 minutes à partir d'une culture de cyanobactéries. Le culot de cyanobactéries a été resuspendu dans de l'eau distillé et re-centrifugé dans les mêmes conditions et lyophilisés. Les cellules lyophilisées ont été resuspendus dans 50 mM d'acide acétique (10 mg : 2 ml) et lysées par sonification (5 cycles de 1 minute avec des intervalles de 3 minutes dans la glace) avec un Sonifier Branson 250. L'homogénat obtenu a été agité pendant 4 heures protégé de la lumière et ensuite centrifugé à 10 000 tours par minute pendant 30 minutes à 15 °C. Le surnageant a été collecté puis passé à travers une unité de filtration (0,45 pm de pore) et stocké à - 20°C jusqu'à utilisation. La figure 4 A montre sur la même microplaque, l'inhibition dose-dépendante de la liaison biotin-a-BgTx-RnACh par des dilutions sérielles du 13 desméthyl spirolide C et par des extraits de fruit de mer dopés avec la même toxine et des extraits témoins. La figure 4 B montre l'inhibition de la liaison biotin-a-BgTx-RnACh par des dilutions sérielles de gymnodimine A et des extraits de fruits de mer dopés avec de la gymnodimine A, ainsi que par des extraits de fruit de mer témoins testés à deux concentrations (100-fois et 200-fois dilués). D'autre part, la figure 4 C montre l'inhibition de la liaison biotin-a-BgTx-RnACh par des dilutions sérielles de 13,19 didesméthyl spirolide et des extraits de fruits de mer dopés avec la même toxine, ainsi que par des extraits de fruit de mer témoins. En même temps l'effet des extraits obtenus des cyanobactéries neurotoxiques d'Oscillatoria, souche PCC 29 6506 (productrice d'anatoxine-a) et souche PCC 10111 (productrice d'homoanatoxine-a), sur la liaison biotin-a-BgTx-RnACh sont montrés. Les données d'absorption (OD492nm) ont été exprimés en pourcentage d'inhibition en employant la formule suivante : Inhibition % _ 100 x [(signal 1000/0 - signal de l'échantillon) / (signal 1000/0 - (inhibition 1000/0 - signal plaque))]. A partir des données d'inhibition obtenues, une courbe d'inhibition pour chacune des toxines testées a été construit (fig. 3 B). Le paramètre d'inhibition IC50 (inhibition 50: 500/0 de RnACh sont occupés par la toxine empêchant la liaison biotin-a-BgTx-RnACh) a été calculé. La limite de détection (LOD) et à la limite de quantification (LOQ) de la méthode ont été aussi calculées (voir tableau 1). Les résultats obtenus démontrent que la méthode non-radioactive de déplacement de la biotin-a-bungarotoxine est applicable pour la détection et quantification des phycotoxines marines, à savoir par exemple la 13 desméthyl spirolide C, 13,19 didesméthyl spirolide C et gymnodimine A à partir d'échantillons de fruits de mer contaminés (figure 4 A, 4 B, 4 C et 4 D) et des neurotoxines de cyanobactéries d'eau douce, a savoir de l'anatoxine-a ou de l'homoanatoxine-a (Tableau 1). La sensitivité de la méthode dépend de l'affinité de la toxine pour le récepteur. Comme démontré dans cette exemple, le seuil de détection de cette méthode non-radioactive est très bas, par exemple 54 picogrammes de 13,19 didesméthyl spirolide C ; 69 picogrammes de 13 desméthyl spirolide C et 101 picogrammes de gymnodimine A. De plus, la méthode nécessite une très faible quantité de membrane électrocyte, par exemple de 1 à 2 pg de protéines de membranes d'électrocyte de Torpille par puits dans cet exemple (figure 2 A, 2 B et 2 C). C'est à dire, une consommation très réduite de membranes d'électrocyte de Torpille. En plus, lorsque les membranes d'électrocyte de Torpille sont conservées adéquatement, par exemple des aliquotes de 0,5 ml à -80°C, elles sont stables pendant plusieurs années. Très important : des microplaques recouvertes « coatés » avec des membranes d'électrocyte de Torpille, lorsqu'elles sont conservées à 4°C dans 200 pl de tampon de blocage (TBS, 0,50/0 BSA, pH 7,5), peuvent être utilisées jusqu'à six mois après leur fabrication. Il n'y a pas de différence significative entre des plaques recouvertes (« coatés ») la veille ou des plaques recouvertes (« coatés ») six mois auparavant pour la détection de ligands des RnACh. Cette preuve de principe est très utile pour concevoir la fabrication de plaques préalablement recouvertes « pre-coatés » avec des membranes d'électrocyte de Torpille prêtes à l'emploie. i o Les plaques obtenues dans cet exemple sont désignés par Torpedo-MicroReceptorPlaque. Tel que démontré dans cet exemple, l'utilisation du dispositif obtenu par le procédé de l'invention permet de détecter l'interaction entre les RnAch et des ligands compétitifs directement sur des extraits 15 méthanoliques des fruits de mer et des extraits aqueux des filaments de cyanobactéries. En outre les dispositifs de la présente invention à savoir les plaques préalablement recouvertes « pre-coatés » avec des membranes d'électrocyte de Torpille prêtes à l'emploie pourraient être transportées et distribuées par la poste pour leur utilisation dans d'autres 20 pays/continents pour la détection des ligands compétitifs des RnACh. Exemple 3 : criblage à haut débit des toxines/ligands compétitifs des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. Les microplaques recouvertes avec des membranes d'électrocyte 25 de Torpille qui sont conservées à 4°C obtenus à l'exemple 1 sont adaptés à des méthodes de haut-débit. A/ Utilisation du pipeteur manuel à 96 cônes Liquidator 96TM (Rainin) : a) Plaques à 96-tubes à préparer avant de commencer la méthode de 30 détection : 31 Préalablement, un plan de plaque est préparé tel que représenté dans la figure 5 B : Sept extraits de cyanobactéries environnementales testées par triplicate à trois dilutions (10-, 100- et 1000-fois) et des dilutions en série de 13,19 didesméthyl spirolide C allant de 5 X 10-' a 5 X 10-13 M en plus des témoins négatifs (control plaque, 3 puits), témoins 1000/0 signal (6 puits) et 1000/0 inhibition (1 X 10-5 M BgTx, 3 puits) ont été essayé par la méthode. La Plaque de la figure 6C montre en rectangles la distribution des sept extraits de cyanobactérie marines et du 13,19 didesméthyl spirolide C. Rectangle 1 [A1-C3], CYA01 ; Rectangle II [D1-F3], CYA02 ; Rectangles III G1-G3 and [A4-B6], CYA03 ; Rectangle IV [C4-E6], CYA04 ; Rectangles V [F4-G6] and A7-A9, CYA 05 ; Rectangle VI [B7-D9], CYA06 ; Rectangle VII [E7-G9], CYA07 ; Rectangle VIII [A10-G12], 13,19 didesméthyl spirolide C. Selon le plan de plaque, des solutions de toxine où d'extrait dans du tampon de bloquage identique à celui de l'exemple 2 précité sont préparées et distribuées dans des plaques à 96 tubes capables de contenir jusqu'à 1 m1 de solution par tube : « PLAQUE TOXINE/EXTRAITS ». Pour chaque toxine standard ou échantillon à tester par triplicate, le volume minimum à préparer est de 350 p1 par tube. Une deuxième plaque de 96 puits contenant une solution de 2,4 x 10-' M de biotine-a-BgTx dans du tampon de bloquage (TBS, 0,5 % BSA) « PLAQUE BIOTIN-a-BgTx » est préparée. Le volume à préparer est dépendant du nombre de plaques à tester (1 microplaque à 96 puits consomme 50 pl x 96 = 4,8 ml). Cette solution est fraichement préparée. Une troisième plaque à 96 tubes « PLAQUE PEROXIDASE » contenant streptavidine couplée à la péroxidase (D5000 -220 ng/nl protéine dans du tampon de blocage) est préparée. Cette solution est fraichement préparée. Le volume à préparer est dépendant du nombre de plaques à tester (1 microplaque à 96 puits consomme 100 pl x 96 = 9,6 ml). Une quatrième plaque de préparation à 96 tubes indiquée « PLAQUE OPD » contenant le substrat commercial OPD, au moins 120 pl par puits, pour développer un dispositif de criblage est préparée. Cette solution est fraichement preparée et doit être protégée de la lumière. Le volume à préparer est dépendant du nombre de plaques à tester (1 microplaque à 96 puits consomme 100 pl x 96 = 9,6 ml). La solution OPD est préparée selon le protocole du fournisseur : 4 tablettes OPD sont dissoutes dans 12 ml d'eau déionisée, dans laquelle 5 pl de peroxyde d'hydrogène (H2O2) à 30% est ajoutée. 50 ml de solution « stop » de la réaction peroxydase (0,5 M H2SO4) est préparée dans une boite rectangulaire adapté au pipeteur manuel à 96 canaux « PLAQUE STOP ». b) Procédure Le dispositif de criblage préalablement recouvert « pre-coatés » obtenu selon le procédé décrit dans l'exemple 1, indiqué Torpedo-MicroReceptorPlaque ci après, est sorti du réfrigérateur. La plaque est laissée sur un agitateur à température ambiante (25°C) pendant 30 min. Une fois que le dispositif de criblage est à température, le film adhésif est retiré, le tampon de blocage est éliminé et après avoir séché sa surface, la plaque est placée sur la zone de pipetage. Incubations avec des toxines/extraits : Le pipeteur manuel à 96 canaux est chargé avec des cônes neufs et réglé sur 100 pl, et la « PLAQUE TOXINE/EXTRAITS » est placée sur une zone de « charge ». 100 pl de la « PLAQUE TOXINE/EXTRAITS » contenant des standards de toxines, des échantillons, des extraits, des produits de synthèse ou des témoins négatifs et positifs sont prélevés et versés dans la Torpedo-MicroReceptorPlaque placée dans la zone de pipetage. 33 Le dispositif de criblage est scellé à l'aide d'un film adhésif (Sealing tape, Costar) et laissé incuber les membranes d'électrocyte de Torpille immobilisées avec les échantillons à tester pendant 3 h avec agitation. De préférence, l'incubation se fait sur la nuit à 4°C. Lorsque l'incubation est faite à 4°C, la Torpedo-MicroReceptorPlaque est placée sur un agitateur à température ambiante (25°C) pendant 30 min avant d'être replacée dans la zone de pipetage du Liquidator 96TM. Incubation avec le traceur biotin-a-BgTx Des pointes neuves sont chargées et le pipeteur réglé sur 50 pl et la boite « PLAQUE BIOTIN-a-BgTx » placée sur la zone de « charge ». 50 pl de chaque tube de la « PLAQUE BIOTIN-a-BgTx » est prélevé et versé directement sur la Torpedo-MicroReceptorPlaque. La plaque ainsi obtenue correspond au dispositif de criblage et est incubée pendant 30 min sur un agitateur à température ambiante (25°C) après quoi la solution est éliminée et plaque replacée dans la zone de pipetage. Lavage Des pointes neuves sont chargées et 200 pl de solution de lavage (TBS, 0,10/0 Tween 20) sont prélevés et versés dans les puits de Torpedo-MicroReceptorPlaque. La solution de lavage est éliminée et la Torpedo- 2 o MicroReceptorPlaque replacée dans la zone de pipetage. Cette étape est répétée trois fois. Incubation avec Streptavidine-HRP/ Lavage 100 pl de chaque tube de la « PLAQUE PEROXIDASE » sont prélevés et versés directement sur le dispositif de criblage. La plaque est incubée 25 pendant 30 min sur un agitateur à température ambiante (25°C). La Torpedo-MicroReceptorPlaque est lavée comme décrit précédemment et est replacée dans la zone de pipetage. Développement de la réaction peroxidase & stoppage de la réaction 100 pl de chaque puits de la « PLAQUE OPD » sont prélevés et versés sur le dispositif de criblage. La Torpedo-MicroReceptorPlaque est incubée jusqu'à ce qu'une coloration optimale soit obtenue, soit environ 5 minutes et 50 pl de la solution « stop » (0,5 M H2SO4) est versée à l'aide du pipeteur à 96 pointes. Lecture & analyse des données La Torpedo-MicroReceptorPlaque est lue sur le lecteur ELISA (GeniosPro, Tecan) et les résultats analysés. Les résultats sont montrés dans la figure 5. Les témoins plaque, signal 1000/0 et inhibition non-spécifique 1000/0 montrent le bon fonctionnement et la répétitivité du dispositif d'analyse. Dans les sept extraits de cyanobactéries environnementales d'origine marine qui ont été testés à trois dilutions (10 fois : D10 : première rangé, 100 fois D1oo : deuxième rangé et 1000 fois D1000 troisième rangé) aucun ligands des RnACh n'a été détecté. Sur la même plaque, le 13,19 didesméthyl spirolide C a été testé; première rangé : 5 X 10-' M, deuxième rangé : 5 X 10-$ M, troisième rangé : 5 X 10-9 M, quatrième rangé : 5 X 10-10 M, cinquième rangé : 5 X 10-" M, sixième rangé : 5 X 10-12 M et septième rangé : 5 X 10-13 M. L'inhibition de la liaison biotin-a-BgTx-RnACh par du 13,19 didesméthyl spirolide C est dose-dépendante et confirme les résultats préalablement obtenus pour cette toxine. L'utilisation du pipeteur à 96-pointes accélère le débit de l'analyse (10 microplaques par jour : 960 analyses possibles). En même temps, l'ajout des solutions contenant soit les toxines/extraits soit le traceur, soit la streptavidine-peroxidase, soit le substrat OPD ou la solution stop, est simultanée permettant un control plus exact du temps de réaction ou incubation. B/ Utilisation d'un robot de pipetage. Les solutions « SOLUTION TOXINE/EXTRAITS », « SOLUTION BIOTIN-a-BgTx », « SOLUTION PEROXIDASE », « SOLUTION OPD » et « SOLUTION STOP » sont préparées comme indiqué précédemment. Une « plaque modèle » à 96 puits est préparé pour les échantillons de toxines/extraits/ témoins selon plan de plaque à tester. Le robot de pipetage est capable d'automatiser la préparation des dilutions des toxines/échantillons, pour la « plaque modèle ». Les étapes sont similaires aux étapes précitées. i o Exemple 4 : procédé de fabrication de dispositifs de d'analyse Les solutions, membranes et conditions expérimentales sont identiques à celles de l'exemple 2 précité. Une dilution de la solution stock de membrane, 2,7 mg de protéines par ml, préparée selon le procédé décrit dans l'exemple 1-4 précités a été 15 diluée 200 fois dans du tampon TBS à un pH de 7,5. 100 pl de la solution de membranes de Torpille diluée 200-fois :13,5 pg ml-' protéine total, soit 1,35 pg de protéine membranaire par puits, a été distribuée dans les puits d'une microplaque à fonds plats Maxisorp (marque déposée), NUNC, comme représenté sur les figures 3, 4 et 5. 20 Un film adhésif a été placé sur ladite plaque et la plaque a été incubé à 4°C pendant la nuit ; soit 12-18 heures. L'excès de membranes a été éliminé par inversion manuel de la plaque et les bords des puits ont été nettoyés avec un papier absorbant. Enfin 200 pl de solution de blocage TBS, 0,5 % BSA a été versée 25 dans chaque puits. Un film adhésif a été déposé sur la plaque dite Torpedo-MicroReceptorPlaque et conservée à 4°C jusqu'à son utilisation. Le dispositif d'analysé ainsi préparé est prêt à l'emploi et notamment prêt pour le transport. 36 Listes des références 1. Morel N, Marsal J, Manaranche R, Lazereg S, Mazie JC, Israel M (1985). Large-scale purification of presynaptic plasma membranes from Torpedo marmorata electric organ. J Oeil BioI.,101: 1757-1762. 2. Hill JA, Nghiém H-O & Changeux J-P (1991). Serine-specific phosphorylation of nicotinic receptor associated 43K protein. Biochemistry, 30, 5579-5585. 3. Vilarino N, Fonfria ES, Moly) J, Arâoz R, Botana LM (2009). Detection of Gymnodimine-A and 13-Desmethyl C Spirolide Phycotoxins by Fluorescence Polarization. Analytical Chemistry, 81, 2708-2714. 4. Changeux JP (2010). Allosteric receptors: from electric organ to cognition. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 50, 1-38. 5. Esser P (2010). Principles in Adsorption to Polystyrene. Technical Bulletin: 06a. Thermo Fisher Scientific Inc. 6. da Costa CJB, Kaiser DEE, Baenziger JE (2005). Role of Glycosylation and Membrane Environment in Nicotinic Acetylcholine Receptor Stability. Biophys J, 88, 1755-1764. 7. Arâoz R, Herdman M, Rippka R, Ledreux A, Moly) J, Changeux JP, Tandeau de Marsac N, Nghiém HO. (2008). A non-radioactive ligand-binding assay for detection of cyanobacterial anatoxins using Torpedo electrocyte membranes. Toxicon 52(1):163-174. REVENDICATIONS1 Procédé de fabrication d'un dispositif d'analyse comprenant des fragments de membranes de Torpilles immobilisés à sa surface comprenant les étapes de : a. Isolement des membranes de cellules électrocytes de Torpille, b. Fragmentation desdites membranes isolées, c. l'incorporation des fragments membranaires obtenus à l'étape b) dans une solution de pH compris de 6,5 à 10 d. Fixation desdits fragments membranaires à la surface du dispositif. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le procédé comprend avant l'étape d) d'immobilisation de membranes sur le dispositif, une étape c') de dilution des fragments membranaires 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la surface du dispositif est en plastique. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel la concentration de protéine totale dans ladite solution de pH compris de 6,5 à 10 est comprise entre 5 à 200 pg/ml. 25 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel la solution pour l'incorporation est une solution choisie parmi un tampon tris salin (TBS) comprenant 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, ou un tampon phosphate salin (PBS) comprenant 130 mM chlorure de sodium, 10 mM sodium 30 phosphate, pH 7,0 ou un tampon carbonate/bicarbonate20comprenant 150 mM chlorure de sodium, 100 mM sodium carbonate, pH 9,5. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans lequel la Torpille est Torpedo marmorate ou Torpedo califomica. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel les membranes sont des membranes plasmiques de cellules électrocytes. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la surface est une surface de puits de microplaques et/ou de barrettes 15 9. Dispositif d'analyse obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10. Dispositif selon la revendication 9 dans lequel les fragments membranaires sont fixés à la surface de puits. 11. Dispositif selon la revendication 9 ou 10 dans lequel le dispositif est une plaque ELISA à 96 ou 384 puits ou des barrettes à 6; 8 ou 12 puits. 25 12. Utilisation d'un dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 pour la détection et la quantification de neurotoxines 13. Utilisation d'un dispositif d'analyse selon la revendication 12 dans 30 laquelle les neurotoxines agissent sur les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. 20 5 14. Utilisation d'un dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 pour la détection et la quantification de ligands de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. 15. Utilisation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 pour le criblage à haut débit de ligands de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine.