FR 2968766 A1 20120615 FR 1060370 A 20101210 SYSTEME ET PROCEDE DE DETECTION D'ESPECES BIOLOGIQUES OU CHIMIQUES BASES SUR UN QCM STRUCTURE DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION [0001] L'invention se rapporte au domaine de détection d'espèces biologiques ou chimiques. Plus particulièrement l'invention se rapporte à un système de détection multiple et séquentielle d'espèces biologiques ou chimiques en utilisant la technique de la balance à quartz ainsi qu'un procédé de détection d'espèces biologiques ou chimiques utilisant ledit système de détection. ETAT DE LA TECHNIQUE DE L'INVENTION [0002] Le développement des structures intégrées 'lab on chip' est en plein essor. La fabrication de tels dispositifs est encore à l'état de développement et leur coût de fabrication représente un frein. Le « lab on chip » fait appel à plusieurs technologies différentes liées aux différentes parties du dispositif (capteur, guidage du fluide, électronique associée). Cette complexité rend la mise au point d'une telle technologie longue et coûteuse. De ce fait, les capteurs actuels sont en général unitaires et la multi-détection, qu'elle utilise des méthodes optique, acoustique ou électrochimique, est réalisée par multiplexage électronique. Un exemple de multiplexage concernant les microbalances à quartz QCM (est le Lot Oriel Q-Sense E4 qui permet de faire quatre mesures en simultané. Outre son prix prohibitif, cette technique ne permet de faire qu'un nombre très restreint de mesures. [0003] L'article de C.K. O'Sullivan, G.G. Guilbault *, Review, Commercial quartz crystal microbalances - theory and Applications, Biosensors & Bioelectronics 14 (1999) 663-670 présente le principe du QCM et son application dans le domaine des biocapteurs. [0004] L'article « A survey of the 2001 to 2005 quartz crystal microbalance biosensor literature: applications of acoustic physics to the analysis of biomolecular interactions » par Matthew A. Cooper *, Victoria T. Singleton dans le JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION, J. Mol. Recognit. 2007; 20: 154-184 Published online in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com) DOI:10.1002/jmr.826 complète l'article précédent sur une période postérieure. [0005] L'article de Sz-Hau Chen, Yao-Chen Chuang, Yi-Chen Lu, Hsiu-Chao Lin A method of layer-by-layer gold nanoparticle hybridization in a quartz crystal microbalance DNA sensing system used to detect dengue virus, Nanotechnology 20 (2009) 215501 (10pp) doi:10.1088/0957- 4484/20/21/215501 décrit l'utilisation du QCM pour la détection des virus de la dengue mais ne traite pas de la multi-détection. [0006] L'article de Yi Wana,b, Dun Zhanga,, Baorong Floua, « Determination of sulphate-reducing bacteria based on vancomycin-functionalised magnetic nanoparticles using a modification-free quartz crystal microbalance », Biosensors and Bioelectronics 25 (2010) 1847-1850 concerne l'utilisation du QCM pour la détection des bactéries mais n'introduit pas le concept de multidétection. [0007] L'article de Yildiz Uludag, Ibtisam E. Tothill, « Development of a sensitive detection method of cancer biomarkers in human serum (75%) using a quartz crystal microbalance sensor and nano particles amplification system, » Talanta 82 (2010) 277-282 divulgue l'utilisation de nano-particules pour augmenter la sensibilité du système de détection mais n'introduit pas le concept de multi-détection. [0008] Le brevet US 4,596,697 décrit un assemblage de QCMs sur un même substrat , mais sans notion de multi-détection. [0009] Le brevet US 6,006,589 décrit une amélioration de la gestion électrique du quartz. [0010] La demande internationale WO/1999/040397, « Device at Piezoelectric crystal oscillator », décrit un multiplexage en fréquence d'un QCM comportant plusieurs oscillateurs individuels que l'on peut sélectionner facilement et pour lesquels on mesure la fréquence propre de résonance et sa variation. Il n'introduit pas de QCM nano structuré. [0011] Le brevet US 4,236,893 décrit le principe de la détection d'un anticorps par un oscillateur à quartz. Il n'introduit pas de nano structuration de surfaces ni de multi détection. [0012]Le document WO/1999/030159, «Sensor for detecting biological matter », décrit le principe de la détection d'un anticorps par un oscillateur à quartz, par mesure de la dissipation (inverse du facteur de qualité) ou de ses variations en plus de celle de la fréquence et de ses variations. Il ne décrit pas de multi détection ni de nano structuration de surface. [0013] Le brevet WO/2009/153189, décrit un système de multi-détection utilisant différents capteurs fonctionnalisés et comportant une sonde spécifique, sur un substrat. La solution à tester est mise en contact simultanément avec chacun des capteurs. Chaque capteur peut être ensuite interrogé individuellement. Dans ce système la fréquence de chaque capteur est mesurée, il n'y a pas de notion de fréquence globale du substrat. [0014] La mesure de plusieurs paramètres en simultané est un avantage certain en biologie mais également dans le domaine du contrôle. Il est fréquent de nos jours de vouloir dépister plusieurs pathologies dans un échantillon sanguin, ou bien de déterminer quels sont les polluants dans un cours d'eau. Actuellement cela est possible uniquement par de multiples prélèvements et analyses. EXPOSE DE L'INVENTION [0015] L'invention vise à remédier aux inconvénients de l'état de la technique et notamment à proposer un système de détection multiple et séquentielle d'espèces biologiques ou chimique en solution. La technique proposée par la présente demande est basée sur la variation de fréquence du cristal à quartz d'un QCM (Quartz Cristal Microbalance) lors de la détection d'une espèce chimique ou biologique, la variation de fréquence du cristal à quartz d'un QCM étant liée à la variation de masse déposée à sa surface. Dans le domaine de la biologie, la détection est généralement basée (par exemple) sur des méthodes optiques utilisant un anticorps, un antigène et un fluorophore de sorte que, lorsque l'anticorps et l'antigène sont en contact, des photons sont émis en quantité proportionnelle à la concentration d'analyse (habituellement l'antigène). Cette technique nécessite pour chaque détection une chimie particulière permettant l'émission de photons. [0016] La détection par méthode acoustique de type QCM est avantageuse car elle s'affranchit de cette chimie spécifique. En effet, la variation de masse liée à l'accrochage de l'antigène sur l'anticorps sur la surface du cristal suffit à provoquer une variation de fréquence mesurable. Le principe de fonctionnement est donc dans ce cas, la fonctionnalisation de surface du QCM, la mise en contact avec le fluide à tester et le rinçage afin de ne conserver que l'espèce à mesurer, mais cette technique connue ne permet pas de faire de détection multiple sur le même cristal à quartz. La présente invention propose une méthode et un dispositif permettant de faire une multi- détection par le biais d'une structuration d'un cristal à quartz d'un QCM. [0017] Pour ce faire est proposé un système de détection d'espèces biologiques ou chimiques, en solution, comprenant un substrat caractérisé par le fait que ledit système permet une détection acoustique multiple et séquentielle d'au moins d'une espèce, en ce que ledit substrat est micro ou nano structuré et peut être régénéré pour permettre une réutilisation, et en ce que le système comprend en outre des moyens pour déposer au moins une (bio)espèce « sonde » sur au moins une micro ou nano structure constitutive du substrat, ladite espèce étant adaptée à une détection sélective d'une d'espèce biologique donnée, des moyens pour déposer séquentiellement ladite solution contenant au moins une bio espèce complémentaire de ladite bio sonde, sur desdites micro ou nano structures du substrat, des moyens pour mesurer la variation de fréquence globale dudit substrat structuré, cette variation de fréquence étant générée lorsque au moins une (bio)espèce « sonde » interagit avec ladite (bio)espèce « sonde » complémentaire, et des moyens pour enregistrer ladite fréquence. [0018] Selon une forme préférée de l'invention le substrat est un cristal à quartz de QCM, la structuration est une structuration du cristal à quartz de QCM et/ou unes structuration d'une couche de métal précieux présente à sa surface, ladite structuration étant apte à augmenter la zone d'interaction avec la solution à tester et permettant de repérer spatialement les zones où a lieu un dépôt de (bio)espèce « sondes ». [0019]En outre, selon un mode de réalisation de l'invention, la structuration est effectuée sur la couche de métal précieux située en surface du cristal à quartz par une technique de type microélectronique ; ou bien par l'ajout dune deuxième couche de métal précieux sur la couche de métal précieux du cristal à quartz, par une technique de synthèse et de croissance chimique. [0020]Conformément à une autre possibilité, la structuration de la couche de métal précieux du cristal à quartz est une structuration du type microcanal comportant des canaux fluidiques obtenus par une attaque de ladite couche par une méthode de gravure photochimique ou électrochimique, ladite structuration permettant de confiner la solution à tester sur une pluralité de zones fonctionnalisées, aptes à fonctionner séquentiellement. [0021] Conformément à une autre possibilité, la structuration est effectuée dans le silicium du cristal à quartz en lui-même par une technique de structuration de type microelectronique ; le silicium étant recouvert par une couche de métal précieux, ladite couche de métal précieux permettant l'accrochage des (bio)espèces « sondes ». [0022] L'invention concerne en outre un procédé de détection d'espèces biologiques ou chimique en solution mis en oeuvre par le système décrit ci- dessus et caractérisé par la fonctionnalisation de la surface de métal précieux du cristal à quartz. Selon l'invention : on dépose au moins une première biomolécule sur la surface de métal précieux d'un cristal à quartz de QCM structuré, sur des zones spécifiques non juxtaposées à l'échelle micro-/nanométrique, puis on dépose une solution contenant au moins une deuxième biomolécule sur la surface dudit cristal à quartz structuré de telle sorte que ledit dépôt conduit à une réaction d'affinités biologiques entre la première et la deuxième biomolécules. [0023] En outre, selon un mode de réalisation de l'invention, le dépôt desdites première et deuxième biomolécules sur la surface de métal précieux dudit cristal à quartz structuré est effectué par un dépôt de micros gouttes ou nano gouttes à l'aide d'une micropipette ou d'une nano pipette. [0024] De préférence, le dépôt desdites première et deuxième biomolécules sur la surface de métal précieux dudit cristal à quartz structuré est effectué par le biais d'une pointe AFM en mode contact. [0025]De façon intéressante, le dépôt desdites première et deuxième biomolécules sur la surface de métal précieux dudit cristal à quartz structuré est effectué par le biais d'une tête d'écriture d'imprimante à jet d'encre. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES [0026] D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description qui suit, en référence aux figures annexées, qui illustrent : - la figurel : est une perspective montrant un exemple de structuration de surface permettant d'augmenter la surface d'interaction ; - la figure 2 : Vue de dessus d'un cristal à quartz avec une 1er structuration ; - la figure 3 : est un schéma montrant le dépôt de microgouttes à l'aide d'une micropipette sur le cristal à quartz d'un QCM selon l'invention; - la figure 4 : Vue de dessus d'un cristal à quartz avec une 2ème structuration ; - la figure 5 : est un schéma illustrant une micropipette distribuant des gouttes sur un cristal à quartz central structuré ; - les figures 6A, 6B, 6C : Dépôts de Micro gouttes de biomolécules telles que d'albumine de sérum bovin (BSA) ; et - la figure 7: Courbe de variations fréquence de 3 gouttes de biomolécules de différentes tailles. DESCRIPTION DE L'INVENTION [0027] La surface d'un cristal à quartz de QCM est compatible avec une structuration de surface dans le but de réaliser des capteurs ou autres fonctions. Les procédures dans ce cas sont celles de la microélectronique. [0028] Suivant l'objectif visé la structuration peut être différente, néanmoins toutes les structurations utilisant des résines photosensibles, le nano-imprint ainsi que les techniques utilisant les stencils sont utilisables. Il est donc possible par exemple, de réaliser des nanostructures par lithographie électronique ce qui permet de réaliser presque toutes les topologies possibles lorsqu' elle est associée à des techniques de dépôt et de gravure (Évaporation, pulvérisation, RIE (Reactive Ion Etching), IBE (Ion beam Etching)). C'est ainsi qu'il est facilement réalisable de déposer par évaporation une structuration de métal en utilisant une grille TEM (stencil). [0029] Une autre structuration possible consiste à réaliser des nanotours de silicium. L'ensemble de la surface de silicium est ensuite recouvert d'une couche de métal précieux servant de support pour des espèces biologiques. Cette configuration permet d'isoler spatialement différents capteurs biologiques mais également d'augmenter la surface utile d'interaction. Cette structuration du silicium peut également être complétée par une structuration microfluidique afin de pouvoir gérer différents fluides sur le QCM. [0030] Le cristal à quartz peut être structuré de deux façons, la première structuration est une structuration de surface dudit cristal permettant d'augmenter la zone d'interaction avec la solution à tester déposée dessus. La figure 1 illustre un exemple d'une telle structuration. Cette structuration peut être réalisée par une approche top down (technique de structuration de la microélectronique). Mais également une approche bottom up (synthèse de croissance chimique) en réalisant différentes formes (étoile, cylindre, carré, etc...) de structures et différentes dimensions du micrométre au nanomètre. [0031] L'approche top down consiste à miniaturiser des dispositifs ou des structures. Pour réaliser un circuit électronique par exemple, on passe par des motifs qui sont dessinés à grande échelle, puis réduits par des procédés photographiques, et enfin, fabriqués par des procédés de photolithographie et de gravure. On va toujours du plus grand vers le plus petit. C'est la méthode utilisée jusqu'à aujourd'hui, en particulier dans le domaine de l'électronique où la miniaturisation est prépondérante. Un matériau massif (ex : un cristal de silicium de plusieurs centaines de kilos) est découpé en fines tranches ; chacune d'entre elles servira à la fabrication collective de plusieurs centaines de puces par tranche et chaque puce est elle-même faite de plusieurs centaines de millions de composants élémentaires. [0032] L'approche "bottom up" ou démarche du bas vers le haut est en quelque sorte l'inverse de l'approche "top-down". On cherche à disposer des briques élémentaires et à trouver le moyen de les assembler pour fabriquer des structures plus complexes. On peut fabriquer par synthèse chimique des "briques élémentaires" contenant de nombreux atomes qui sont aptes à réaliser une fonction complexe. Exemples : une molécule ayant les mêmes fonctions qu'un transistor, une molécule pouvant servir de point mémoire, etc. [0033] La figure 2 illustre une vue d'un QCM 1 avec un premier exemple de structuration de surface de son cristal. Le procédé de détection consiste dans une première étape à déposer des sondes sur une surface du QCM 1 sur des zones spécifiques 2 dites zone de détection. Lesdites zones spécifiques 2 sont spatialement différentes, non juxtaposées à l'échelle nanométrique ou micro métriques. Les sondes sont préférentiellement des biomolécules de type anticorps, antigènes ou brin d'ADN/ARN. Le procédé consiste ensuite à déposer la solution à tester sur la surface dudit cristal QCM. Ladite solution contient des espèces biologiques 3 différentes des sondes. En effet, lesdites espèces biologiques sont des biomolécules complémentaires de type antigènes, anticorps ou ADN/ARN. Le dépôt de la solution sur la surface structurée du cristal QCM 1, conduit à une réaction d'affinité biologique entre les sondes déposées précédemment et les biomolécules complémentaires contenues dans la solution déposée ensuite. Ainsi le cristal structuré de QCM 1 permet d'isoler différents capteurs de sorte à isoler les différentes espèces à détecter. De plus la structuration de surface du cristal 1 permet de mieux contrôler la bio fonctionnalisation spatiale des zones spécifiques de la surface et permet également de savoir où les sondes 2 ont été déposées avant analyse. Cela facilite le repositionnement des biomolécules sur les zones spécifiques fonctionnalisées 2. [0034] Par "L'affinité en biologie" on entend une relation entre espèces d'origines communes. En effet l'affinité est l'attraction sélective ou plutôt spécifique entre un anticorps et un antigène par exemple. L'affinité est variable selon les couples anticorps/ antigène, et les conditions du milieu (température, pH, ...). [0035] La figure 3 montre le dépôt des sondes ou des biomolécules ainsi que la solution contenant des biomolécules complémentaires sur la surface du QCM 1 . Le dépôt peut être fait de plusieurs manières : Il est possible de déposer des micro ou nano gouttes 4 avec une micro ou nano pipette 5. L'utilisation de nano pipettes (NANONICS) permet de déposer très précisément sur la surface du cristal du QCM 1 des nano gouttes 4 contenant des biomolécules différentes. [0036] Il est aussi possible de déposer des biomolécules de façon très précise par le biais d'une pointe AFM (Atomique Force Microscopy) en trempant ladite pointe dans une solution contenant des anticorps (par exemple) puis en les déposant sur la surface du QCM 1 par contact. [0037] Le microscope à force atomique (ou AFM pour atomic force microscope) est un type de microscope à sonde locale qui sert à visualiser la topographie de la surface d'un échantillon. Le principe se base sur les interactions entre l'échantillon et une pointe montée sur un microlevier. La pointe balaie (scanne) la surface à représenter, et l'on agit sur sa hauteur selon un paramètre de rétroaction. Un ordinateur enregistre cette hauteur et peut ainsi reconstituer une image de la surface. Les atomes ont souvent tendance à s'attirer ; lorsque l'affinité des atomes est grande, ils se lient pour former une molécule ou un cristal, mais dans la plupart des cas, cette attraction est très faible et n'est perceptible qu'à très faible distance. À l'inverse, lorsqu'ils sont très proches, les atomes se repoussent du fait de la soumission des électrons du cortège électronique à la répulsion électrostatique. Si les atomes s'éloignent, une force les rappelle, et s'ils se rapprochent, une force les repousse. [0038] On utilise donc cette attraction/répulsion entre les atomes surfaciques et la pointe sondeuse. La pointe est montée sur un levier très flexible ; la mesure de la flexion du levier (dans un sens ou dans l'autre) donne une mesure directe de la force d'interaction entre la surface sondée et la pointe. Il existe plusieurs modes d'utilisation de l'AFM que l'on peut regrouper en deux catégories: le mode contact (statique) et les modes dynamiques. Le mode contact utilisé dans la présente structuration consiste à utiliser les forces répulsives : la pointe appuie sur la surface, elle est donc repoussée du fait du principe de Pauli, et le levier est dévié. La rétroaction s'effectue sur la mesure de la direction de la déviation. [0039] Une troisième méthode selon l'invention est, moins onéreuse et plus adaptée aux techniques industrielles. Elle consiste à utiliser la tête d'écriture des imprimantes de type jet d'encre pour déposer sur la surface structurée du cristal QCM 1, sur des zones délimitées 2, un fluide contenant différentes biomolécules. [0040] Dans les cas où on utilise des nano pipettes ou des têtes d'écriture d'imprimantes de type jet d'encre, le fluide contenant des biomolécules peut s'immiscer dans une structuration de surface et par séchage, y déposer des biomolécules sur des structures telles qu'illustrées sur la figure 1. Ceci permet d'augmenter leur densité par unité de surface. [0041] Le fonctionnement spécifique des différents capteurs ou bien des zones fonctionnalisées 2 du cristal QCM structuré est dit séquentiel parce que l'on vient déposer séquentiellement la solution à tester sur les capteurs 2 (sur lesdites zones fonctionnalisées). Par contre la mesure de la fréquence ou de ses variations est globale. C'est celle du cristal QCM structurée et pas celle propre à chaque capteur 2 qui est mesurée. Chaque capteur 2 permet ainsi d'identifier la présence ou non de l'espèce recherchée dans le fluide. [0042] L'aspect pratique de l'invention réside dans le fait que l'espèce biologique est dispensée sur le premier capteur à l'aide d'une micro ou nano pipette 5. Une fois l'interaction entre la solution contenant des biomolécules et le capteur achevée puis la mesure de fréquence réalisée, la solution peut être aspirée par la même pipette et lavée avec des solutions tampons pour éviter toute accroche non spécifique de sorte qu'un un nouveau test est possible. [0043]Les zones de détection 2 sont ainsi confinées. Ledit confinement des zones de détection permet une stabilisation rapide du cristal QCM (quelques secondes en version cristal micro-/nanostructurée en comparaison avec le modèle classique de quartz qui nécessite quelques minutes pour la stabilisation de fréquence) ce qui a pour avantage une vitesse de détection accrue. De plus cette rapidité de détection permet d'éviter l'influence de la température sur le cristal qui se traduit par une variation parasite de fréquence. Cette variation causée par la température et pas par la masse rapportée représente un désavantage majeur pour que cette technique soit utilisée couramment dans les hôpitaux ou les laboratoires d'analyses. [0044] La figure 4 illustre une vue de dessus d'un cristal quartz QCM 11 avec un 2ème exemple de structuration réalisée par des techniques propres à la microélectronique et la microfluidique afin de guider une quantité déterminée de fluide à tester sur une zone fonctionnalisée. Cette structuration de la surface permet de placer sur la surface du cristal QCM 11 une pluralité de fonctionnalisations différentes 12 et donc de capteurs. La structuration est ici une structuration simple du type microcanal comportant des canaux fluidiques 14. La structuration peut être obtenue à l'aide d'une résine photosensible ou électrosensible, positive ou négative, avec éventuellement une obturation 13 permettant de confiner le fluide contenant des biomolécules sur une pluralité de zones fonctionnalisées 12 dite zones de détections. Le fonctionnement desdites zones ou capteurs 12 est alors séquentiel et chaque capteur 12 permet d'identifier la présence ou non de l'espèce recherchée dans le fluide. [0045] Selon la figure 5, des mesures ont été réalisées sur un appareillage de type "Stanford Research Systems QCM200" démontrant le fonctionnement avec des micro-gouttes 24. La surface du cristal à quartz de QCM 1 a été préalablement structurée par évaporation e-beam, les gouttes 24 ont été déposées à l'aide de micropipettes 25. La mesure a alors été démontrée par le dépôt de protéines sur la surface dudit cristal QCM structuré. [0046]Les figures 6A, 6B et 6C montrent des microgouttes d'albumine de sérum bovin (BSA) 100 pg/ml, présentant différents diamètres, déposées sur la surface d'un cristal à quartz d'un QCM structuré 1. [0047] La figure 7 représente la variation de fréquence mesurée sur un cristal à quartz du QCM 1 au fur et à mesure où de telles gouttes d'albumine 24 sont déposées. On note que chaque dépôt de goutte sur la surface du cristal QCM se traduit par une variation du signal et que l'amplitude de la variation est d'autant plus grande que le volume de la goutte est grand. Ceci valide la capacité à réaliser une détection séquentielle sur le cristal QCM ainsi structuré et à quantifier la quantité déposée, par la mesure de la variation du signal. Ces mesures permettent de détecter des masses de l'ordre de quelques nano grammes. Les mesures effectuées montrent une bonne reproductibilité et le nettoyage de la surface structurée permet une réutilisation du cristal structuré, si la sonde est absorbée à sa surface. La réutilisation du cristal structuré est plus difficile si la liaison avec le cristal a été assurée par une fonctionnalisation conduisant à une liaison covalente (par exemple par la chimie des thiols sur la surface en or du cristal QCM). [0048] Comme on dépose des micro ou nano gouttes, elles sèchent rapidement (on peut aussi les aspirer avec la pipette de dépôt). S'il n'y a pas d'interaction entre l'une des espèces biologiques et la sonde testée, la ligne de mesure revient à la ligne de base où le système retrouve sa fréquence originelle de résonance après le lavage de la surface. S'il y a interaction parce qu'une des espèces biologiques présente dans la solution correspond à la sonde déposée, après évaporation de la goutte, il y aura un décalage de fréquence proportionnel à la concentration de l'espèce biologique ayant réagi (Figure 7). On passe ensuite à la micro ou nano structure suivante et on recommence l'expérience autant de fois qu'il y a de sondes. Comme on connaît la distribution et le positionnement des sondes sur la micro ou nano structure, on peut identifier l'espèce et comme on a mesuré le décalage de fréquence, on connaît sa concentration. On peut aussi facilement connaître grâce à la structuration la localisation précise des sondes. [0049] De nombreuses structurations du QCM peuvent être envisagées sans sortir du cadre de l'invention (triangle, carré, cylindres, etc) ; l'homme de métier choisira l'une ou l'autre en fonction des contraintes économiques ou autres qu'il devra respecter.