FR 2985908 A1 20130726 FR 1250689 A 20120124 La présente invention concerne le domaine technique des substrats adaptés à la constitution d'implant pour prothèse médicale ou chirurgicale. Un problème majeur dans la pose d'implants médicaux ou chirurgicaux est lié aux risques d'infection. Actuellement, les risques d'infection post opératoires sont limités par la veille scrupuleuse du respect de conditions opératoires stériles et éventuellement par des prescriptions médicamenteuses du type antibiotique et/ou antiseptique. Cependant, les patients à risque, tels que les diabétiques, les porteurs de greffes ou les porteurs du virus HIV, restent à ce jour exclus de ce type de soin. Afin de tenter de remédier à de tels problèmes, différentes solutions ont déjà été envisagées dans l'art antérieur. Par exemple, il a été proposé de recouvrir la surface d'implants dentaires avec un peptide présentant une activité antimicrobienne dans la demande US 2010/0150985. Ce document concerne exclusivement l'immobilisation de peptides, ce qui limite fortement les spectres d'activités obtenus. Le document WO 2004/084966, quant à lui, propose de recouvrir la surface d'implants dentaires avec un revêtement constitué d'un polymère à base de P et de N, par liaison covalente. Dans ce document, la liaison entre le polymère et la surface est réalisée grâce un aminosilane ou à un acide alkylphosphonique. Aucune étude de stabilité en milieu salivaire n'est menée et, les inventeurs de la présente invention, considèrent que vraisemblablement compte tenu des liaisons mises en jeu entre le groupe amino et le polymère, le lien covalent utilisé ne permet pas de maintenir durablement le polymère immobilisé sur l'implant dans un milieu aqueux acide telle que la salive. On peut également citer le brevet US 6 129 956 décrit un procédé d'immobilisation de l'acide hyaluronique ou de polymères présentant des groupements COOH sur un substrat. Deux procédés sont décrits : l'un utilise une solution aqueuse d'alcoxyde de silicium, d'APTES et d'acide hyaluronique qui est déposée sur le substrat de titane. Compte tenu de l'encombrement stérique du polymère et du fait que l'alcoxyde de silicium est « noyé » dans le polymère, la liaison entre l'alcoxysilane et le substrat est 2 9 85 908 2 vraisemblablement faible. Par ailleurs, il est connu qu'en milieu aqueux, les alcoxydes de silicium s'hydrolysent et condensent pour former des liaisons SiO-Si qui ne sont plus réactives vis à vis du substrat. Pour ces deux raisons, le taux de greffage du polymère à la surface du substrat est très certainement 5 très faible et donc peu efficace. L'autre procédé utilise la PolyEthylenelmine (PEI) pour lier le polymère au substrat. Or, il est connu que le PEI est immobilisé sur le substrat selon des liaisons électrostatiques. Outre le fait que ces liaisons sont faibles, facilement clivables et ne résistent pas aux agressions buccales, il a, par ailleurs, été démontré que le PEI est toxique 10 vis-à-vis des cellules buccales (ostéoblastes et fibroblastes) (C. Brunot, et al. Biomaterials, 28 (2007) 632-640). Dans le cadre de l'invention, les inventeurs se sont plus précisément intéressés à l'immobilisation, du chitosane et du collagène qui présentent des propriétés biologiques intéressantes, sur des substrats à base de titane le 15 plus souvent utilisés dans le domaine des implants dentaires. Le chitosane est notamment connu pour ses propriétés antibactériennes et le collagène facilite la cicatrisation. Plusieurs méthodes de dépôt du chitosane sur des substrats, et notamment sur des substrats à base de titane, ont été décrites dans l'art 20 antérieur. La première méthode, de loin la plus simple, consiste à déposer simplement (par « dip » ou « spin coating ») une solution aqueuse de chitosane sur un substrat. Dans ce cas, aucune liaison n'existe entre le substrat et le chitosane. Cette méthode est utilisée dans la littérature lorsqu'il est souhaité une restitution rapide et totale du polymère. 25 D'autres méthodes permettant de former une liaison covalente entre le chitosane et le titane ont également été décrites. Une de ces méthodes utilise comme intermédiaires de liaison de la dopamine et du glutaraldéhyde (T. Y. Lim et al. J. Mater. Sci., 2009 (20), 1-10), une autre consiste à utiliser de l'APTES (AminoPropylTriEthoxySilane) ou de l'ICPTES 30 (Isocyantopropyltriethoxysilane) (H. J. Martin et al., Thin Solid Films, 2008 (516), 6277-628et Y. Yuan, et al. J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater, 2008 (86B), 245-252) et du glutaraldéhyde, et enfin, une dernière, utilise du TESBA (TriEthoxSilylButyrAldehyde) (H. J. Martin et al., Thin Solid Films, 2008 (516), 6277-628 et H. J. Martin, et al. Applied Surface Science, 2008 (254), 4599-4605), La méthode utilisant la dopamine et le glutaraldéhyde (T. Y. Lim et al. J. Mater. Sci., 2009 (20), 1-10) consiste à créer deux liaisons covalentes entre la dopamine et les groupements hydroxy comme présenté sur le SCHEMA 1 ci-dessous, puis à faire réagir le glutaraldéhyde pour obtenir une fonction aldéhyde en fin de chaine. Celle-ci permet ensuite de créer une liaison avec la fonction amine du chitosane. SCHEMA 1 -Ti-OH HO -T1-0 -Ti-0 -----U1 -Ti-OH HO N% 0 NH, -Ti-0 "H' j' -Ti-0 O o dopamine OH O H 04, NH, Chitosan glutaraldéhyde -Ti-O OH -Ti-O La méthode utilisant l'APTES et le glutaraldéhyde (H. J. Martin et al., Thin Solid Films, 2008 (516), 6277-628) consiste à faire réagir I'APTES sur la surface de titane traitée pour obtenir une liaison Ti-O-Si-(CH2)3-NE-12 (SCHEMA 2 ci-après), Comme pour le procédé avec la dopamine, c'est ensuite la fonction amine qui réagit avec le glutaraldéhyde, donnant une fonction imine, niais surtout une fonction aldéhyde en fin de chaîne. SCHEMA 2 4 Lo L H ririz p1 i ro Ti O rÔ rO APTES 0 glutaraldéhyde OH H Chitosan Oh Contrairement aux deux autres procédés, la méthode utilisant du TESBA (H. J. Martin et al., Thin Solid Films, 2008 (516), 6277-628 et H. J. Martin, et al. Applied Surface Science, 2008 (254), 4599-4605) a l'avantage de ne comporter que deux étapes. Mais, contrairement au procédé utilisant la dopamine, le TESBA ne s'attache au titane que par le biais d'une unique liaison covalente comme illustré sur le SCHEMA 3 ci-dessous. Comme l'APTES, le TESBA est un alcoxysilane fonctionnalisé, mais il possède directement la fonction aldéhyde en fin de chaine. Ceci permet d'économiser l'étape du glutaraldéhyde, permettant d'obtenir cette fonction en bout de chaine. SCHEMA 3 OH O Lo NH, Chitosan OH F-TI-OH hTi-0 r-2s1^-^y O H r° TESBA Toutes ces méthodes mettent en oeuvre une liaison de type imine connue de la littérature comme peu stable en milieu acide comme cela a été confirmé par les inventeurs de la présente demande de brevet et comme l'attestent les exemples comparatifs donnés dans la suite de la description. Le document EP 1 308 177 propose également l'utilisation d'un film de chitosane en surface d'implant, afin d'augmenter l'adhérence des cellules. La méthode décrite qui consiste à immerger un implant en titane dans une solution de chitosane en présence d'acide acétique, conduit à une immobilisation instable du chitosane en milieu aqueux acide telle que la salive. Enfin, il convient de noter que le document WO 2005/089829, souligne que l'utilisation de liaison covalente entre un substrat et une protéine active affecte l'activité de la protéine et préconise de ce fait une immobilisation sans liaison covalente. La présente invention vise à remédier aux inconvénients ci-dessus, en termes de stabilité de la liaison substrat-polymère. Dans ce contexte, la présente invention propose de réaliser des substrats adaptés à la réalisation d'implants revêtus d'un polymère présentant une activité biologique choisi parmi le chitosane, le collagène et leurs dérivés, qui présentent une stabilité satisfaisante dans un milieu aqueux de pH proche de 5 notamment, simulant des milieux physiologiques, tels que la salive. La solution proposée se doit de permettre le maintien de propriétés biologiques satisfaisantes pour le polymère immobilisé. Ainsi, la présente invention a pour objet un substrat composé d'une matière choisie parmi le titane ou un de ses alliages sur lequel au moins un polymère présentant une activité biologique, choisi parmi le chitosane, le collagène et leurs dérivés, est immobilisé de manière covalente grâce à une entité de liaison EL établissant une liaison peptidique : -CO-NH-, urée :-NH-C(0)-NH- ou thio-urée : -NH-C(S)-NH- sur les fonctions -NH2 présentes sur le polymère avant son greffage et qui correspondent à des fonctions -NH2 présentes sur le chitosane ou le collagène à l'état naturel, ou, dans le cas du chitosane et de ses dérivés, établissant une liaison uréthane : -NH-C(0)-0- ou thio-uréthane : -NH-C(S)-0- sur les fonctions -OH présentes sur le polymère avant son greffage et qui correspondent à des fonctions -OH présentes sur le chitosane à l'état naturel. La présente invention a également pour objet les procédés de préparation de tels substrats tels que décrits ci-après. Le collagène et le chitosane sont des polymères naturels. Par dérivés de ces derniers, on entend des polymères correspondant au collagène ou au chitosane et qui présentent une ou plusieurs substitutions qui n'altère(nt) pas l'activité biologique recherchée. Les dérivés du collagène utilisés comportent, avant liaison au substrat, des foncions -NH2 présentes sur les formes naturelles du collagène. Les dérivés du chitosane utilisés comportent, avant liaison au substrat, des foncions -NH2 et/ou des fonctions -OH présentes sur les formes naturelles du chitosane, qui vont servir pour l'immobilisation de ces derniers selon les liaisons covalentes stables envisagées dans le cadre de l'invention. Le chitosane peut être défini comme un polyoside d'unités Dglucosamine et d'unités N-acétyl-D-glucosamine liées en B-(1-4), le plus souvent réparties selon une distribution aléatoire. Le chitosane est produit par désacétylation chimique (en milieu alcalin) ou enzymatique de la chitine. Les sources principales de chitine sont les exosquelettes des arthropodes (crustacés) et les endosquelettes des céphalopodes (calamars...). Le degré d'acétylation (DA) du chitosane qui correspond au pourcentage d'unités acétylées par rapport au nombre d'unités totales, est inférieur à 50%. Le chitosane est soluble en milieu acide contrairement à la chitine qui est insoluble. Les unités desacétylées incluent des fonctions NH2 qui sont utilisées dans le cadre de l'invention pour réaliser des liaisons de type peptidique, urée, ou thio-urée permettant d'immobiliser, de manière covalente, le polymère sur le substrat. Le chitosane inclut également des fonctions OH qui sont utilisées dans le cadre de l'invention pour réaliser des liaisons de type uréthane ou thiouréthane permettant d'immobiliser, de manière covalente, le polymère sur le substrat. Dans le cadre de l'invention, tout type de chitosane peut être utilisé. II est notamment possible d'immobiliser de manière covalente un chitosane présentant, par exemple, un degré d'acétylation (DA) de 15 à 25% et un bas poids moléculaire, notamment de masse Mw inférieure à 6000g.mo1-1 . Dans le cas du collagène, ce sont les fonctions NI-12 libres présentes sur certains des acides aminés constitutifs du collagène qui vont permettre de former les liaisons de type peptidique, urée ou thio-urée. Dans le cadre de l'invention, il est possible d'immobiliser sur le substrat 10 un seul type de polymère ou différents polymères, par exemple deux ou trois polymères différents, de manière à obtenir simultanément différents effets biologiques souhaités ou un effet biologique plus performant. Selon l'invention, du fait de leurs propriétés spécifiques, le ou les polymères choisis parmi le chitosane, le collagène et leurs dérivés, 15 immobilisés sur des revêtements implantaires, permettra d'accélérer l'ensemble des étapes du processus de cicatrisation en favorisant l'hémostase, la stimulation des macrophages et la prolifération des fibroblastes. Parallèlement, les propriétés bactériostatiques et fongistatiques du chitosane vis-à-vis d'un large spectre de bactéries et de champignons 20 permettront de limiter la contamination bactérienne et les risques de mycoses. Le substrat est composé de titane ou d'un alliage de titane, notamment utilisé dans la conception d'implant pour prothèse. En particulier, le substrat peut être composé d'une matière choisie parmi le titane, les alliages de titane 25 avec le nickel, notamment dans un rapport atomique Ni/Ti de 40/60 à 60/40 et plus particulièrement de 50/50, et les alliages de titane avec le zirconium, le fer, le niobium, l'aluminium, le molybdène et/ou le vanadium, notamment dans un rapport atomique M/Ti inférieur à 40/60, M représentant le zirconium, le fer, le niobium, l'aluminium, le molybdène, le vanadium ou un 30 de leur mélange. De manière avantageuse, le substrat aura pu être préalablement préparé, avant le greffage du polymère, de manière à présenter une rugosité 2 9 85 908 8 moyenne appartenant à la gamme allant de 2 nm à 100 pm. La rugosité moyenne du substrat pourra être déterminée par Analyse à Force Atomique. Une telle rugosité moyenne permet par la suite d'accroitre la surface sur laquelle le polymère va pouvoir être greffé. De manière avantageuse, Le 5 taux de greffage pourrait être de 1 à 15 molécules de polymère / nm2. Pour calculer ce taux de greffage, il est possible d'utiliser des analyses par ATG ou des dosages chimiques. L'obtention d'une telle surface spécifique peut notamment être obtenue selon deux voies différentes : (i) un traitement électrochimique du substrat par anodisation. Dans ce cas, la surface spécifique donnée ci-dessus correspond à la surface spécifique du substrat en titane ou en un alliage de titane, en tant que tel ; (ii) un dépôt d'une couche de silice poreuse sur le substrat. Une telle couche de silice peut être obtenue par procédé sol-gel, suivi d'un traitement thermique à une température appartenant à la gamme allant de 100 à 700°C, et en particulier à une température de l'ordre de 300°C. Dans ce cas, la surface spécifique donnée ci-dessus correspond à la surface spécifique de la couche de silice poreuse déposée sur le substrat en titane ou en un alliage de titane. Une anodisation en solution aqueuse permet de créer une microrugosité ou une microstructuration de la surface du substrat. Il est possible d'utiliser notamment une anodisation en présence d'acide sulfurique, notamment à une concentration molaire (comme décrit notamment par D. Capek, et al. Surface and Coating Tech, 2008, 202, 1379-1384), ou en présence d'un mélange de fluorure d'ammonium et de sulfate d'ammonium (comme décrit notamment par Z. Lockman, et al. J. of Alloys and Compounds, 2010, 503, 359-364), ou encore en présence d'un mélange de fluorure d'ammonium et d'éthylène glycol (comme décrit notamment par S. Li, et al. J. Phys. Chem. C, 2009, 113, 12759-12765). Dans le cadre de l'invention, l'entité de liaison EL correspond, de préférence, à l'enchainement suivant : -M-(F1)n-(0-X)-F2 dans lequel : - M représente un atome de titane du substrat, - FI. représente une couche de silice poreuse liée à M par une liaison - M-0-Si et à 0-X par une liaison Si-O-X, n est égal à 0 ou 1, X représente un atome de silicium ou de phosphore, - F2 représente -(CH2)m-[Yi(0-12)p]crY2, avec m qui est égal à 1, 2, 3, 4,5 ou 6 ; p qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ; q qui est égal à 0 ou 1 ; et Yi et Y2 qui sont définis comme suit : o soit Y2 représente -(C0)-NH- et Yi représente -NH-C(0)- O soit Y2 et Yi sont identiques et représentent -NH-C(Z)-NH avec Z = ou S, o soit Y2 représente -NH-C(Z)-0- et Yi représente -NH-C(Z)-NH avec Z = 0 ou S. Dans les définitions données ci-dessus, la lecture des substituants se fait toujours de la gauche vers la droite. Selon des modes de réalisation particuliers, q=0 et/ou X représente un atome de silicium et/ou -F2 représente -(CH2)3-CO-NH-. Dans la définition de X, bien entendu lorsque X est un atome de silicium, ce dernier n'est pas lié uniquement à l'atome d'oxygène et à F2 représenté dans la définition de EL, mais à d'autres atomes non représentés pour avoir la valence souhaitée. De manière plus précise, on pourrait indiquer X=SiZ1Z2 avec Zi et Z2 qui sont deux atomes choisis parmi les atomes d'oxygène et de carbone, l'atome de silicium provenant de la réaction d'un alcoxysilane, d'un hydroxysilane ou d'un hydroxyalconfsilane sur les fonctions OH de surface comme expliqué dans la description qui va suivre, en relation avec le procédé d'obtention des substrats. De même, lorsque X est un atome de phosphore, ce dernier n'est pas lié uniquement à l'atome d'oxygène et à F2 représenté dans la définition de EL, mais à d'autres atomes non représentés pour avoir la valence souhaitée. De manière plus précise, on pourrait indiquer que X=P(0)Zii avec qui est un atome choisi parmi les atomes d'oxygène et de carbone, l'atome de phosphore provenant de la réaction d'un phosphonate sur les fonctions OH de surface comme expliqué dans la description qui va suivre, en relation avec le procédé d'obtention des substrats. Les substrats selon l'invention sont stables en milieu aqueux acide et sont parfaitement adaptés à la fabrication d'implant dentaire. Dans le cadre de l'invention, à titre de référence, la stabilité en milieu aqueux acide et la stabilité à l'hydrolyse en milieu acide pourra être mise en évidence en immergeant à 22°C le substrat dans un milieu aqueux de pH=5 décrit par Fusayama (M. Simon et al., "Corrosion resistance and biocompatibility of a new porous surface for titanium implants", Eur. J. Oral Sci. 113 (2005) : 537545) dont la composition exacte est donnée dans les exemples qui vont suivre. En particulier, les liens covalents mis en oeuvre sont considérés comme stables, car dans ces conditions, avec les substrats selon l'invention, on observe toujours après 24 heures, voire même après 48 heures, la présence de polymère bioactif, par analyse infra-rouge du substrat ou par analyse chimique par spectroscopie de photoélectron X. De plus, des propriétés biologiques du polymère greffé sont conservées, le greffage chimique n'entrainant pas une perte de propriétés. Selon un premier mode de réalisation des substrats selon l'invention, n=0. Dans ce cas, l'entité de liaison EL peut être obtenue par réaction sur des fonctions -OH présentes en surface du substrat : dans le cas où q=0, d'un alcoxysilane, d'un hydroxysilane, d'un hydroxyalcoxysilane ou d'un phosphonate porteur d'une fonction acide carboxylique (1), anhydride (2), ester (3), halogénure d'acide (4), isocyanate :-N=C=0 (5) ou thiocyanate : -N=C=S (6), suivie, dans le cas des fonctions (1) à (6) d'un couplage avec le polymère par réaction avec une fonction -NH2 présente sur le polymère, ou dans le cas des fonctions (5) et (6) d'un couplage avec le chitosane ou un de ses dérivés par réaction avec une fonction -OH présente sur ledit polymère. dans le cas où q=1, d'un alcoxysilane, d'un hydroxysilane, d'un hydroxyalcoxysilane ou d'un phosphonate porteur d'un groupement - (CH2),,,-NH2 avec ni qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 , suivi d'un couplage avec un réactif Y3-(CH2)p-Y3 avec p qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 et Y3 qui est choisi parmi les fonctions acide carboxylique (1), anhydride (2), ester (3), halogénure d'acide (4), isocyanate :- N=C=0 (5) ou thiocyanate : -N=C=S (6), en présence du polymère à immobiliser. L'une des fonctions Y3 va alors réagir sur une fonction - NH2 présente en surface du substrat et l'autre sur une fonction présente sur le polymère qui correspond soit à une fonction -N1-12 dans le cas des fonctions (1) à (6), soit dans le cas des fonctions (5) et (6) à une fonction -0H présente sur le chitosane ou son dérivé. Les fonctions halogénure d'acide peuvent notamment correspondre à un chlorure d'acide (-C(0)C1). Les fonctions anhydride -C(0)-0-C(0) 15 peuvent notamment correspondre à des groupements tels que : Nr° 0 0 R R =Mou CH3 A titre d'exemple de fonctions esters, on peut citer -C(0)0R1 avec R' = 20 méthyle ou éthyle. Afin de présenter en surface des fonctions Ti-OH réactives, le substrat en titane ou en un alliage de titane sera, le plus souvent, soumis à un traitement chimique oxydant préalable, par action d'un mélange d'acide et d'agent oxydant tel qu'un mélange d'acide sulfurique et d'eau oxygénée, ou 25 par une passivation, par action du réactif de Kroll (acide nitrique), ou par traitement chimique dans un mélange NaOH + alcool. Lorsque le substrat est également soumis à une réaction d'anodisation, celle-ci sera, de préférence, réalisée préalablement à ce traitement oxydant. Selon un deuxième mode de réalisation des substrats selon l'invention, 30 n est égal à 1, ce qui signifie que EL est un lien covalent établi par l'intermédiaire d'une couche de silice poreuse déposée sur le substrat et sur laquelle le polymère est greffé. Dans ce cas, la couche de silice est avantageusement obtenue par procédé sol-gel, suivi d'un traitement thermique à une température appartenant à la gamme allant de 100°C à 700°C. L'entité de liaison EL peut alors être complétée, par réaction sur des fonctions -OH présentes en surface de la couche de silice : dans le cas où q=0, d'un alcoxysilane, d'un hydroxysilane, d'un hydroxyalcoxysilane ou d'un phosphonate porteur d'une fonction acide carboxylique (1), anhydride (2), ester (3), halogénure d'acide (4), isocyanate :-N=C=O (5) ou thiocyanate : -N=C=S (6), suivie, dans le cas des fonctions (1) à (6) d'un couplage avec le polymère par réaction avec une fonction -NH2 présente sur le polymère, ou dans le cas des fonctions (5) et (6) d'un couplage avec le chitosane ou un de ses dérivés par réaction avec une fonction -0H présente sur ledit polymère. dans le cas où q=1, d'un alcoxysilane, d'un hydroxysilane, d'un hydroxyalcoxysilane ou d'un phosphonate porteur d'un groupement -(CH2),n-NH2 avec ni qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 , suivi d'un couplage avec un réactif Y3-(CH2)p-Y3 avec p qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 et Y3 qui est choisi parmi les fonctions acide carboxylique (1), anhydride (2), ester (3), halogénure d'acide (4), isocyanate :-N=C=0 (5) ou thiocyanate : -N=C=S (6), en présence du polymère à immobiliser. L'une des fonctions Y3 va alors réagir sur une fonction -NH2 présente en surface de la couche de silice et l'autre sur une fonction présente sur le polymère qui correspond soit à une fonction -NH2 dans le cas des fonctions (1) à (6), soit dans le cas des fonctions (5) et (6) à une fonction -0H présente sur le chitosane ou son dérivé. La couche de silice poreuse intermédiaire recouvrant le substrat présente des fonctions 01-I résiduelles, du fait notamment de la mise en oeuvre du procédé sol-gel. Les procédés sol-gel sont bien connus de l'homme du métier. Néanmoins, pour plus de détails sur le procédé sol-gel qui peut être mis en oeuvre, on pourra se référer à 1)- Techniques de l'ingénieur : 2 9 85 908 13 Procédé sol-gel de polymérisation, Référence J5820, Date de publication : 10 déc. 2005, Pierre AUDEBERT, Fabien MIOMANDRE ou 2) Cahier Technologique sol-gel, CERTECH asbl (CEntre de Ressources TEchnologiques en CHimie). Par ailleurs, il est connu que la couche de silice obtenue après 5 un traitement thermique, notamment sous air, à une température appartenant à la gamme allant de 100 à 700°C est robuste est stable en milieu aqueux acide. Il s'établit des liaisons covalentes Ti-O-Si entre le substrat et la couche de silice. La couche de silice intermédiaire, présente, par exemple, une épaisseur pouvant aller jusqu'à 10 pm. 10 Quel que soit le procédé mis en oeuvre, il est possible d'utiliser un alcoxysilane, hydroxysilane ou phosphonate répondant à l'une des formules ci-après (Ra0)3Si-Rb, (Ra0)2Si(Rb)2, (RaO)Si(R03, (Ra0)2P(0)(Rb) ou (RaO)P(0)(Rb)2 avec Ra qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle de 1 15 à 4 atomes de carbone, et par exemple un groupe méthyle ou éthyle, et Rb qui représente : - dans le cas où q=0, -(CH2)n,Y2, avec m qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 et Y2 qui est une fonction réactive choisie parmi les fonctions anhydride, comme par exemple 20 o o R R =Hou CH3 acide carboxylique, ester, halogénure d'acide, isocyanate (-N=C=0) ou 25 thiocyanate (-N=C=S), - dans le cas où q=1, -(CH2)n,-NH2avec m qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. La partie ORa va réagir avec une fonction -OH présente en surface du substrat ou de la couche de silice intermédiaire, alors que : 30 - dans le cas où q=0, la fonction Y2 va réagir avec une fonction réactive -NH2 ou -OH, en fonction des cas, présente sur le polymère bioactif à greffer, afin de former un lien peptidique, urée, thio-urée, uréthane ou thio-uréthane. dans le cas où q=1, la fonction -NH2 de Y2 va réagir avec un réactif intermédiaire Y3-(CH2)p-Y3 tel que précédemment défini : une fonction réactive Y3 va réagir avec une fonction réactive -NH2 présente en surface du substrat ou de la couche de silice intermédiaire et l'autre fonction Y3 va réagir avec une fonction réactive -NH2 ou -OH, en fonction des cas, présente sur le polymère bioactif à greffer, afin de former un lien peptidique, urée, thio-urée, uréthane ou thio-uréthane. De telles réactions pourront être menées dans les conditions suivantes : Réaction dans solvant apolaire (par exemple, toluène, hexane, éther diéthylique par exemple) pour le greffage de l'alcoxysilane, l'hydroxysilane, l'hydroxyalcoxysilane ou du phosphonate à température ambiante, puis rinçage avec un milieu polaire (par exemple, DMF, Eau, THF, acétonitrile...). Pour le couplage du polymère, ce dernier pourra être solubilisé en milieu légèrement acide (par exemple dans un mélange eau / acide acétique). Le greffage du polymère sur le substrat peut ensuite être réalisé à température ambiante et éventuellement catalysé par un réactif du type DMAP. Ensuite, le substrat pourra être rincé et séché selon toute technique bien connue de l'homme de l'art. Un séchage est ensuite généralement réalisé à des températures entre 50 et 120°C. De manière préférée, le polymère forme un revêtement homogène. Les substrats selon l'invention peuvent être utilisés pour la fabrication de tout type d'implant pour prothèse médicale ou chirurgicale, et notamment d'implant dentaire ou d'implant orthopédique. Aussi, selon des modes de réalisation particuliers, le substrat selon l'invention se présente sous la forme d'un implant pour prothèse, et 30 notamment d'un implant pour prothèse dentaire ou prothèse orthopédique. La forme de l'implant peut être plus ou moins complexe. Dans ce cas, le substrat porteur du polymère bioactif sera stérilisé, avant implantation dans l'organisme, selon une technique de stérilisation n'affectant pas l'intégrité du polymère bioactif. Notamment, une stérilisation autoclave, par rayons gamma, ou avec de l'oxyde d'éthylène pourra être 5 mise en oeuvre. La présente invention est particulièrement adaptée au greffage du chitosane sur des substrats constitués de titane ou d'un alliage de titane, se présentant notamment sous la forme d'un implant pour prothèse dentaire. Dans le cadre de l'invention, du fait de l'immobilisation du polymère 10 bioactif sur le substrat, par un lien covalent qui met en jeu au moins une liaison peptidique -C(0)-NH-, une liaison urée -NH-C(0)-NH- ou thio-uréeNH-C(0)-NH, ou encore une liaison uréthane -NH-C(0)-0- ou thio-uréthane -NH-C(S)-0- (ces liaisons intervenant du substrat vers le polymère), qui est stable à l'hydrolyse en milieu acide, il est possible d'envisager la possibilité de 15 conserver le polymère bioactif sur l'implant même en milieu acide, notamment à un pH de 5, ce qui correspond notamment au milieu salivaire. Il est ainsi possible de limiter les complications post opératoires, tels que les risques d'infection ou d'inflammation, suite à la pose d'implants pour prothèse constitués avec un substrat selon l'invention. L'invention ouvre donc 20 l'accès à la pose d'implants, et notamment à une thérapeutique implantaire dans le cas des implants dentaires, pour des patients à risque (diabétiques, greffés, porteurs HIV...) ne pouvant à ce jour pas en bénéficier. En effet, il a été démontré, dans le cadre de l'invention, que malgré la liaison covalente permettant d'immobiliser le polymère bioactif, il est possible 25 de conserver une activité biologique du polymère initial, et ce de manière prolongée. L'invention rend donc possible, par la seule pose de l'implant, l'obtention d'un effet biologique à proximité de l'implant, sans traitement thérapeutique additionnel. En particulier, les propriétés biologiques du revêtement sur le substrat, de type antibactériennes et/ou cicatrisantes et/ou 30 antifongiques obtenues notamment avec le chitosane ou les autres polymères envisagés, permettront in vivo de ralentir ou de supprimer la croissance de bactéries pathogènes et donc de prévenir des complications 2 9 85 908 16 inflammatoires d'origine infectieuse, et/ou de favoriser la prolifération et la migration cellulaire et donc la cicatrisation tissulaire. Les exemples ci-après, en référence aux figures annexées, permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif. La Figure 1 présente le Spectre Infra-Rouge (IR) de la surface du susbtrat préparé conformément à l'exemple 1, après 24 heures en milieu salivaire. La Figure 2 est une photographie MEB de la couche de chitosane présente à la surface du substrat de l'exemple 1, après 24h en milieu 10 salivaire. La Figure 3 représente une image de microscopie optique du substrat de l'exemple 2 recouvert par du chitosane dans les conditions de peel-test. La Figure 4 présente un diagramme représentant le % de réduction de la resazurine pour le substrat de l'exemple 4, avec et sans chitosane 15 immobilisé en surface après 2, 4 et 7 jours pour une culture de fibroblastes NIH3T3. Les données présentent la moyenne ± l'écart type. Les Figure 5A et 5B montrent les effets d'un substrat en Ti sur lequel du chitosane est immobilisé, conformément à l'invention sur Porphyromonas gingivalis (Figure 5A) et sur Actinomyces naeslundii (Figure 5B) en milieu 20 liquide pendant 32 heures. Les données sont exprimées en pourcentage de bactéries en contact avec l'échantillon selon l'invention, par rapport aux bactéries en contact avec l'échantillon contrôle en titane. Les données correspondent à la moyenne ± l'écart type pour 3 expérimentations différentes. 25 Les Figures 6A à 6C présentent les spectres IR de la surface anodisée revêtue obtenue à l'exemple 4, avant (Figure 6A) et après immersion en milieu salivaire à pH 5 (Figure 6B) ou 3 (Figure 6C). La Figure 7 présente les images MEB d'un substrat Ti (a)- anodisé + chitosane greffé de manière covalente conformément à l'exemple 4, (b)30 idem + salive pH5 24h, (c)- idem + salive pH3, 24h et (d)- anodisé de référence. La Figure 8 présente le spectre infra-rouge de la surface obtenue à l'exemple comparatif 1 avant exposition au milieu salivaire (courbe démarrant à environ 99°h) et après 24h en milieu salivaire (courbe démarrant à environ 97%). La Figure 9 présente le spectre infra-rouge de la surface obtenue à l'exemple comparatif 2 avant exposition au milieu salivaire (courbe démarrant à environ 81%) et après 24h en milieu salivaire (courbe démarrant à environ 61%). La Figure 10 présente une image MEB de la surface de l'exemple comparatif 3 avant exposition à la salive (a) et après exposition à la salive (b). Exemple 1 Revêtement Les substrats de titane pur lisses (TIMET) sont placés 30 minutes aux ultrasons dans un bain d'isopropanol. Ils sont ensuite plongés 15 minutes dans une solution Piranha (acide sulfurique concentré /eau oxygénée 30% (Sigma-Aldrich) 70 :30 v/v). Après rinçage à l'eau distillée (ED) et séchage les échantillons sont plongés 24h dans une solution de TESPSA (anhydride triéthoxysilylpropyl succinique, ABCR) à 10% volumique dans du toluène extra-dry (Sigma-Aldrich). Ils sont ensuite introduits dans une solution de toluène propre, qui sera mise 30 minutes dans un bain à ultrasons. Cette opération est renouvelée avec du DMF puis avec de l'eau distillée, pour obtenir une durée de 90 minutes au total dans le bain à ultrasons. Le substrat est finalement rincé à l'éthanol et séché à température ambiante. Il est ensuite recouvert par immersion (en anglais « dip ») avec une solution de chitosane de bas poids moléculaire ( 0 ) 0 0 0 ---,,,,,,/,,,,,rr,NH Ti-OH -----s Exemple 3 : Les échantillons sont préparés de la même façon que dans l'exemple 1. Test en milieu salivaire acide Le substrat obtenu a ensuite été testé en milieu salivaire à pH5 et pH3. La salive artificielle est préparée selon la méthode de Fusayama avec ajout d'acide acétique jusq'au pH désiré comme précédemment décrit. Les échantillons ont été analysés en Tof-SIMS (Tof-SIMS V instrument IONTOF GmbH, Allemagne) en trois points différents pris au hasard. Résultats 6 fragments spécifiques du chitosane ont été identifiés et quantifiés grâce à l'analyse d'une solution de chitosane pur déposée sur de l'aluminium. Ces 6 fragments, ainsi que celui correspondant au titane, ont été quantifiés, ensuite sur les pastilles avant et après salive. La proportion relative de chaque fragment est calculée et présentée dans le Tableau 4 ci-dessous. Tableau 4: Proportion des fragments spécifiques de chitosane mesurée dans le chitosane pur et sur la surface greffée avant et après salive C2H502 C5H6NO C5H502 C4H6NO2 C5H6NO2 C6H10NO3 Ti (substrat) - , Solution 18,4 ± 1,6 34,05 ± 14,6 ± 0,3 7,0 ± 0,1 8,3 ± 0,1 17,8 ± 1,3 ----- de 0,4 r-.-, Chitosane/ - Alu Chitosane greffé 17,5 ± 1,1 28,5 ± 0,7 18,1 ± 0,1 7,5 ±0,1 11,1 ± 0,7 17,4 ± 0,5 ' i Chit. + 17,8 ± 0,3 28,3 ± 0,2 18,9 ± 0,1 7,6 ± 0,1 11,6 ± 0,1 15,4 ± 0,2 0,38 ± salive pH 0,02 Chit. + 22,56 ± 4,5 ± 0,2 3,5 ± 0,1 1,2 ± 0,1 1,2 ± 0,1 1,6 ± 0,1 65,4 ± salive pH 1,0 1,3 3 5 La présence des fragments caractéristiques sur la surface greffée, après salive pH5 et après salive PH3 montre qu'il y a bien du chitosane restant à la surface. Cela prouve bien que le greffage résiste aux conditions acides (pH5) voire même très acides (pH3). De plus les faibles écarts types entre les 10 mesures montrent que le recouvrement est homogène dans chaque cas. Exemple 4: Les échantillons sont préparés de la même façon que dans l'exemple 1. 15 Stérilisation Les échantillons sont placés sous lampe UV 254nm à 15cm de la lampe. Chaque côté de l'échantillon est exposé 20 minutes aux UV. 2 9 85 908 22 Culture cellulaire Les cellules utilisées sont des fibroblastes HGF-1 fournies par American Type Culture (ATCC). Elles sont cultivées dans le milieu de culture DMEM 5 (PAA) avec 10% de sérum de veau foetal et 1% de pénicilline/streptomycine. Les cellules sont incubées à 37°C avec 5% de CO2. Afin de conserver et multiplier les cellules un passage est effectué tous les 3 jours. Test de viabilité La viabilité est évaluée grâce au test à la résazurine après 2, 4 et 7 jours de culture en présence des substrats. 10 pl d'une solution de résazurine (Sigma-Aldrich) à 0,1 mg/m1 dans du PBS (PAA) sont ajoutés au milieu de culture (1m1). Après incubation des cellules pendant 4h à 37 °C, 200 pl de surnageant sont prélevés et placés dans une plaque 96 puits. La densité optique de chaque puits est mesurée grâce à un lecteur de plaques Microplate Reader EL 308; Bio-Teck Instrument à 570 et 630 nm. Il faut ensuite appliquer une formule qui donne le pourcentage de réduction de la résazurine: [(34,798xD0570ech)-(80,586xD0630ech)] x100 [(155,677xD0630ref)-(5,494xD0570ref1 où "ech" est une condition à mesurer et "ref' est celle du milieu de culture sans contact avec les cellules. Le surnageant est ensuite aspiré des puits, puis après rinçage au PBS, du milieu neuf est ajouté pour la prochaine mesure. Analyse statistique 5 échantillons par temps, états de surface et tests sont réalisés pour le test de viabilité (n=5) et chacun est réalisé en duplicata. Une analyse de variance (ANOVA) et un test t de Student non apparié sont effectués pour préciser la validité statistique des résultats. Le résultat est déclaré significatif lorsque la valeur p de la probabilité est inférieure au seuil fixé à 5 %. 2 985 908 23 - Si p> 0,05 _ pas de différence significative - Si p Tableau 4 ; Conditions d'anodisation Les réactifs sont fournis par Sigma-aldrich. Les substrats sont ensuite placés 30 minutes aux ultrasons dans un bain d'eau/acétone (50:50, v:v). Revêtement Les substrats sont ensuite plongés 15 minutes dans une solution Piranha (acide sulfurique concentré /eau oxygénée 30% (Sigma-aldrich) 70 :30 v/v). Après rinçage à l'eau distillée (ED) et séchage, les échantillons sont plongés 24h dans une solution de TESPSA (anhydride Solution électrolytique Potentiostat Durée Tétraéthylène glycol + 0,25% wt NH4F + 1%vol H2O 16V 24h 2 9 85 908 26 triéthoxysilylpropyl succinique, ABCR) à 10% volumique dans du toluène extra-dry (Sigma-aldrich). Ils sont ensuite introduits dans une solution de toluène propre, qui sera mise 30 minutes dans un bain à ultrasons. Cette opération est renouvelée avec du DMF puis avec de l'eau distillée, pour 5 obtenir une durée de 90 minutes au total dans le bain à ultrasons. Le substrat est finalement rincé à l'éthanol et séché à température ambiante. Il est ensuite recouvert par trempage (en anglais « dip ») avec une solution de chitosane de bas poids moléculaire (Mw L'analyse infrarouge montre qu'aucune bande caractéristique du chitosane n'est présente après trempage pendant 24h en milieu salivaire. Ce greffage covalent n'est donc pas résistant en milieu acide, contrairement à celui de l'invention. Exemple comparatif 4 : Utilisation d'APTES et de glutaraldehyde Revêtement Les substrats titane pur lisses (TIMET) sont placés 30rninutes aux ultrasons dans un bain d'isopropanol. Ils sont ensuite plongés 15 minutes dans une solution Piranha (acide sulfurique concentré /eau oxygénée 30% (Sigma-aldrich) 70 :30 v/v). Après rinçage à l'eau distillée (ED) et séchage, les échantillons sont plongés 24h dans une solution d'APTES (3- aminopropyltriéthoxysilane, ABCR) à 3% en volume dans du toluène extra sec. Ils sont ensuite introduits dans une solution de toluène anhydre propre, qui est ensuite mise 30 minutes dans un bain à ultrasons. Cette opération est renouvelée deux fois avec du toluène anhydre propre, pour obtenir une durée de 90 minutes au total dans le bain à ultrasons. Les substrats sont finalement rincés à l'éthanol et séchés à température ambiante. Les substrats sont ensuite introduits dans une solution de glutaraldéhyde à 3% en volume pendant 24 heures. Enfin, les substrats sont abondamment rincés à l'eau déionisée et séchés à température ambiante, puis recouverts par une solution de chitosane de bas poids moléculaire à 4% massique (Sigma- aldrich) dissous dans une solution acide (acide acétique 3%+ ED, pH = 4). Après le recouvrement, l'échantillon est séché à 80°C pendant 4h. Test en milieu salivaire acide Les substrats obtenus ont ensuite été testés en milieu salivaire pH5. Cette salive artificielle est préparée selon la méthode de Fusayama. Les échantillons sont laissés 24h dans ce milieu, puis retirés et rincés avec de l'ED. Les échantillons sont ensuite analysés en IR. L'analyse infrarouge montre qu'aucune bande caractéristique du 10 chitosane n'est présente après trempage pendant 24h en milieu salivaire. Ce greffage covalent n'est donc pas résistant en milieu acide, contrairement à celui décrit dans le cadre de l'invention.