FR 2975008 A1 20121116 FR 1154172 A 20110513 Utilisation de composés et composition pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) L'invention concerne l'utilisation de composés et d'une composition pour prévenir les affections de la rétine provoquées par une exposition prolongée et répétée aux rayonnements bleus et également pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). L'invention a pour but d'améliorer la vision des individus atteint de cette maladie ou au moins de stabiliser l'évolution de la maladie. La DMLA est une maladie dégénérative rétinienne chronique, évolutive et invalidante, qui touche le sujet âgé et dont l'origine est multifactorielle (Bellmann et Sahel, 2007). En France, c'est la première cause de malvoyance après 50 ans et on estime à un million le nombre de personnes concernées. Maladie à prédisposition génétique (Fajnkuchen et Cohen, 2008), elle est responsable d'un nombre croissant de cas de mal vision, proportionnel à l'augmentation de l'espérance de vie. Cette maladie atteint une petite partie de la rétine, la macula, zone qui sert à fixer les objets, à lire, à reconnaître les visages et à discerner les couleurs. La DMLA est très certainement polygénique avec l'intervention de facteurs de risque comme l'exposition prolongée à la lumière, l'hypertension artérielle, l'hypercholestérolémie et le tabagisme. Il existe deux formes de DMLA, la forme sèche ou atrophique qui représente 80% des cas, et la forme humide ou exsudative. Seule cette dernière, caractérisée par l'apparition de néovaisseaux derrière la rétine, peut désormais bénéficier de traitements. Les mécanismes physiopathologiques de la DMLA sont encore peu connus, mais l'implication de processus d'intoxication aboutissant à la mort des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) a été établie ces dernières années. En effet, au cours du vieillissement, ces cellules peuvent présenter des troubles de fonctionnement liés à l'accumulation dans des lysosomes de complexes protéo-lipidiques appelés granules de lipofuscine. Ces granules se forment progressivement par une accumulation de protéines et lipides non dégradés issus des segments externes des photorécepteurs phagocytés par I'EPR (Finnemann et al., 2002). La lipofuscine contient aussi des composés cytotoxiques dérivés du cycle visuel, tel l'A2E, qui est formé par addition de deux molécules de trans-rétinal avec une molécule d'éthanolamine. Sous l'effet de la lumière bleue, l'A2E s'oxyde et induit des oxydations protéiques, lipidiques et de l'ADN, provoquant ainsi un stress oxydatif important dans les cellules d'EPR en cours de vieillissement (Kim et al., 2006). Les tentatives de prévention ou de traitement de la forme sèche de la DMLA reposent sur une complémentation nutritionnelle avec des substances susceptibles de réduire l'accumulation et/ou les effets délétères de l'A2E (Dubernard et al., 2006 ; Souied et al., 2007 ; Dutot et al., 2008 ; Lecerf, 2009 ; Cohen et al., 2010 ; Lecerf et Desmettre, 2010). Compte tenu du rôle très probable de ce mécanisme dans le développement de la DMLA, les inventeurs ont utilisé un modèle cellulaire de phototoxicité induite par l'association d'un traitement par l'A2E et d'une illumination par la lumière bleue sur des cultures primaires d'EPR dans lequel a été mesurée la survie cellulaire. Ce modèle, mis au point par l'Institut de la Vision, permet ainsi de réaliser le criblage de molécules visant à la découverte de nouveaux candidats pour un traitement de la forme sèche de la DMLA. Ce modèle original est plus proche de la situation « physiologique » que les lignées cellulaires couramment utilisées dans d'autres laboratoires (Dunn et al., 1996), car les cellules utilisées contiennent des substances protectrices apportées par l'alimentation de l'animal et ne sont donc pas en situation de « carence », et leur perturbation est provoquée par l'apport d'A2E. L'invention prévoit ainsi de trouver un traitement alternatif à ceux déjà existants. Plus précisément, les inventeurs ont découvert que leur incubation préalable avec certaines molécules permettait de diminuer fortement la mort cellulaire provoquée par une illumination avec des rayonnements bleus de cellules de l'EPR prétraitées avec l'A2E. Selon l'invention, ces molécules sont présentes dans un extrait d'urucum, ou bien issues de dérivés de l'acide gallique ou de composés de la famille des anthocyanidines. Par le biais de ces molécules, l'invention prévoit donc de limiter l'évolution de la maladie. L'invention a donc pour objet une utilisation d'un extrait d'urucum, d'un dérivé de l'acide gallique ou d'un composé de la famille des anthocyanidines pour prévenir les dommages susceptibles d'être causés à la rétine par l'exposition aux rayonnements bleus. Par rayonnements bleus on entend les rayonnements correspondant à la bande bleue du spectre de la lumière visible, soit de longueur d'onde comprise entre 435 et 490 nm. L'invention a également pour objet une utilisation d'un extrait d'urucum, d'un dérivé de l'acide gallique ou d'un composé de la famille des anthocyanidines pour la préparation d'une composition destinée à traiter la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) chez le mammifère. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'extrait d'urucum est enrichi en bixine et/ou norbixine. L'extrait enrichi est obtenu par des techniques bien connues de l'homme du métier. La présence de cet extrait induit une diminution de la mortalité cellulaire en présence de rayonnements bleus. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le composé peut être de l'acide ellagique, qui appartient aux dérivés de l'acide gallique. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le composé peut être aussi de la cyanidine. Cette molécule appartient aux anthocyanidines, qui sont présentes naturellement sous des formes diversement glycosylées (les anthocyanines), et que l'on peut préparer à partir de ces dernières. Les inventeurs ont constaté que les anthocyanidines sont beaucoup plus efficaces dans leur modèle que les anthocyanines naturelles. L'extrait et les deux autres composés peuvent être associés les uns avec les autres ou indépendamment les uns par rapport aux autres. Selon l'invention, le composé est également destiné à traiter la maladie de Stargardt et/ou la rétinopathie pigmentaire. Selon l'invention, la composition peut être utilisée sous la forme d'un aliment, d'un complément alimentaire ou d'un médicament. Par aliment on entend substance à avaler que l'on retrouve dans l'alimentation d'un mammifère. Par exemple, par aliment on entend fruits ou légumes contenant le composé présentant des effets bénéfiques sur la rétine. Par aliment on entend tout aliment contenant naturellement ou par enrichissement le composé et présentant des effets bénéfiques sur la rétine. Par complément alimentaire on entend produit renfermant ledit composé ou ledit extrait ou enrichi en ledit composé ledit extrait ayant pour objet de compléter l'alimentation en apportant des nutriments bénéfiques pour la santé selon la définition donnée par la directive européenne 2002/46/EC. Par exemple, un complément alimentaire peut être une gélule ou comprimé à avaler ou une poudre ou petite ampoule à mélanger à un aliment et présentant des effets bénéfiques sur la rétine. Par médicament on entend produit contenant une dose précise dudit composé ou dudit extrait selon la définition donnée par la directive européenne 65/65/CE à savoir toute substance ou composition présentée comme possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines ou animales. Par exemple, le médicament contenant le composé aux doses thérapeutiques peut-être administré par voie orale sous forme de gélule ou comprimé ou injecté par voie intra-vitréenne ou tout autre voie permettant de conférer des effets bénéfiques sur la rétine. Par composition on entend aliment complément alimentaire ou médicament. Selon l'invention, le dérivé de l'acide gallique peut être issu d'un extrait de grenade. En effet, la grenade contient de l'acide ellagique en quantité importante (Panichayupakarananta et al., 2010). Selon l'invention, le composé de la famille des anthocyanidines peut être issu d'un extrait d'açaï. Cette plante contient en effet des glycosides de cyanidine. L'invention a aussi pour objet une composition pour prévenir les dommages susceptibles d'être causés à la rétine par une exposition aux rayonnements bleus, caractérisée en ce qu'elle comprend, dans un support acceptable pour être ingéré, ou injecté dans l'oeil ou injecté dans le sang un extrait d'urucum enrichi en bixine et/ou en norbixine, et/ou un dérivé de l'acide gallique et/ou un composé de la famille des anthocyanidines. L'extrait d'urucum enrichi, les dérivés de l'acide gallique et le composé de la famille des anthocyanidines peuvent être utilisés seuls ou associés les uns avec les autres, deux par deux ou les trois ensemble, voire en association avec d'autres molécules. Dans un mode de réalisation de l'invention, cette dernière composition est destinée à traiter la maladie de Stargardt et/ou la rétinopathie pigmentaire. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les composés sont l'acide ellagique, purifié ou apporté sous forme d'un extrait de grenade enrichi et/ou la cyanidine, purifiée ou apportée sous forme d'un extrait enrichi d'Açaï ou d'Hibiscus (par exemple). Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la composition se présente comme médicament ou complément alimentaire ou aliment. L'invention a pour objet une composition destinée à traiter la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) chez le mammifère, caractérisée en ce qu'elle comporte dans un support acceptable pour être ingéré, un extrait d'urucum enrichi en bixine et/ou en norbixine, et/ou un dérivé de l'acide gallique et/ou un composé de la famille des anthocyanidines. De la même manière que précédemment, l'extrait d'urucum enrichi, le dérivé de l'acide gallique et le composé de la famille des anthocyanidines peuvent être utilisés seuls ou associés les uns avec les autres, deux par deux ou les trois ensemble. Dans un mode de réalisation de l'invention, cette autre dernière composition est destinée à traiter la maladie de Stargardt et/ou la rétinopathie pigmentaire. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les composés sont l'acide ellagique, purifié ou apporté sous forme d'un extrait de grenade enrichi et/ou la cyanidine, purifiée ou apportée sous forme d'un extrait d'Açaï (ou d'Hibiscus, ...) enrichi. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la composition se présente comme médicament ou complément alimentaire ou aliment. Brève description des figures La figure 1 illustre l'effet d'un extrait d'urucum (Bixilia®), de la bixine et de la norbixine sur la protection de l'EPR soumis au test de phototoxité. La figure 2 illustre l'effet de l'acide chlorogénique, de la rutine et de l'acide ellagique sur la protection de l'EPR soumis au test de phototoxité. La figure 3 illustre l'effet de la cyanidine, de la cyanidine-3-glucoside, de la delphinidine-3-sambubioside et de la 20-hydroxyecdysone sur la protection de l'EPR soumis au test de phototoxité. 1. Matériels et Méthodes Les inventeurs ont testé 15 substances naturelles et un extrait naturel d'urucum (Bixilia®) sur un modèle cellulaire de phototoxicité de l'EPR décrit ci-après. 6 Type Nom du composé Source (exemple) Lutéine Epinard Zéaxanthine Maïs Témoins positifs Resvératrol Raisin Bixine Urucum Norbixine " " Caroténoïdes Bixilia® Crocétine Safran Acide phénolique Acide chlorogénique Maté Flavone Orientine Açaï Flavonol Rutine Sarrasin Flavanone Naringénine Citron Benzypyrane Acide ellagique Grenade Cyanidine 3-glucoside Açaï Anthocyanines Delphinidine 3-sambubioside Hibiscus Anthocyanidine Cyanidine* Açaï* Stéroïde 20-Hydroxyecdysone Quinoa * La cyanidine est préparée après hydrolyse acide de ses formes glycosylées Bixilia® est un extrait naturel d'urucum qui a été enrichi en bixine. Dans un exemple utilisé pour l'expérience, cet extrait contient 16 % de bixine et, dans ce qui suit, la concentration de l'extrait est exprimée en équivalentsbixine. Afin de tester l'effet photoprotecteur des molécules, les inventeurs ont utilisé un modèle cellulaire de phototoxicité induite par traitement par A2E suivi d'une illumination aux rayonnements bleus. Ce modèle a été réalisé à partir de cultures primaires d'EPR de porc adulte. La survie cellulaire a été déterminée par le rapport entre le nombre de cellules vivantes et le nombre total de cellules (vivantes + mortes, quantifiées respectivement à l'aide de colorations spécifiques). L'acquisition des images a été réalisée à l'aide d'un microscope à fluorescence piloté par le logiciel Metamorph et les quantifications ont été faites par traitement des images acquises par un programme de quantification dédié. Les expériences ont été réalisées dans des microplaques de 96 puits en quadruplicate et l'expérience a été reproduite au minimum quatre fois. Les cellules ont été traitées pendant 48 heures avec ces composés dont les dernières 24 heures en présence d'A2E, avant induction de la phototoxicité. Trois concentrations (0,1, 1 et 10 µM) ont été testées pour chaque composé. Certains composés ont fait l'objet de tests supplémentaires à 20 µM afin de réaliser une gamme de concentrations. II. Résultats Les résultats, présentés sous forme de moyennes et écart-types, sont exprimés en pourcentage de survie par rapport au contrôle sans A2E. Les expériences n'ont pas montré d'effet protecteur des 15 composés ni de l'extrait aux concentrations de 0,1 et 1 µM (résultats non illustrés pour la lutéine, la zéaxanthine, le resvératrol, la crocétine, la naringénine et l'orientine et résultats illustrés pour l'extrait d'urucum, la cyanidine et l'acide ellagique figures 1 à 3). Dans une série de tests (n=5), l'extrait naturel d'urucum (Bixilia®) a permis d'observer une protection importante, avec une survie cellulaire à 20 µM de l'ordre de 93% de celle du contrôle sans A2E, à comparer avec celle du contrôle + A2E, qui n'est que de 45% (Figure 1). Parmi les 15 composés testés à 10 µM, deux apportent une protection cellulaire contre la phototoxicité. Notamment, à 10 µM, la cyanidine apporte une protection de l'ordre 20 de 87% comparée au contrôle sans A2E. A 20 µM, ce même composé apporte une protection quasi-totale (Figure 2). L'acide ellagique apporte également une protection de l'ordre de 68% comparée au contrôle sans A2E. A 20 µM, ce composé apporte une protection du même ordre que celle mesurée à 10 µM, mais avec une 25 meilleure reproductibilité (Figure 3). Les effets photoprotecteurs attendus pour la lutéine, la zéaxanthine et le resvératrol (« témoins positifs ») n'ont pas été observés dans ces conditions d'expérimentation. Références Bellmann C, Sahel J-A. 2007. Aspects pathogéniques de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). J. Fr. Ophtalmol. 30 (hors-série 1), 1511-1516. Cohen SY, Mauget-Faysse M, Oubraham H, Algan, M, Conrath J, Roquet W. 2010. Impact des habitudes nutritionnelles sur la pathologie maculaire évalué par mesure de la densité optique du pigment maculaire. J. Fr. Ophtalmol. 33, 234-240. Dubernard G, Adam R, Proenca J, Offret H, Labetoulle M. 2006. Alimentation et dégénérescence maculaire l'iée à l'âge. NPG 6(33), 19-21. Dunn KC, Aotaki-Keen AE, Putkey FR, Hjelmeland LM. 1996. ARPE-19, a human rétinal pigment épithélial cell line with differentiated properties. Exp. Eye Res. 62, 155-169. Dutot M, Rambaux L, Warnet JM, Rat P. 2008. Modulation du stress oxydant par la myrtille riche en polyphénols sur un modèle de cellules humaines de rétine. J. Fr. Ophthalmol. 31(10), 975-980. Fajnkuchen F, Cohen SY. Dégénérescence maculaire liée à l'âge et génétique : données actuelles. J. Fr. 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Vers la prévention de la dégénérescence maculaire liée à l'âge. J. Fr. Ophtalmol. 30(5), 449-455. REVENDICATIONS1 - Utilisation d'un extrait d'urucum pour la préparation d'une composition destinée à prévenir les dommages à la rétine susceptibles d'être 5 causés par l'exposition aux rayonnements bleus. 2 - Utilisation d'un extrait d'urucum pour la préparation d'une composition destinée à traiter la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) chez le mammifère. 10 3 - Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle l'extrait d'urucum est enrichi en bixine et/ou norbixine. 4 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce 15 que la composition est destinée à traiter la maladie de Stargardt et/ou la rétinopathie pigmentaire. - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle la composition est un aliment, un complément alimentaire ou un médicament. 20 6 - Composition pour prévenir les dommages à la rétine susceptibles d'être causés par l'exposition aux rayonnements bleus, caractérisée en ce qu'elle comprend, dans un support acceptable pour être ingéré ou injecté dans l'ceil ou injecté dans le sang, un extrait d'urucum enrichi en bixine et/ou 25 en norbixine. 7 - Composition destinée à traiter la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) chez le mammifère, caractérisée en ce qu'elle comporte dans un support acceptable pour être ingéré, un extrait d'urucum enrichi en bixine 30 et/ou en norbixine. 8 - Composition selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle est destinée à traiter la maladie de Stargardt et/ou la rétinopathie pigmentaire. 359 - Composition selon l'une des revendications 6 à 8, comprenant en outre un dérivé de l'acide gallique et/ou un composé de la famille des anthocyanidines. 10 - Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que le dérivé de l'acide gallique est l'acide ellagique, purifié ou apporté sous forme d'un extrait de grenade enrichi. 11 - Composition selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que le composé de la famille des anthocyanidines est la cyanidine, purifiée ou apportée sous forme d'un extrait d'açaï enrichi. 12 - Composition selon l'une des revendications 6 à 11 en tant que 15 médicament ou complément alimentaire ou aliment.