FR 2970179 A1 20120713 FR 1150208 A 20110111 Moyens pour réduire ou éradiquer le pouvoir tumoral de cellules souches cancéreuses et/ou métastasiques L'invention a pour objet des molécules pour réduire, voire éradiquer des cellules souches cancéreuses et/ou métastasiques ainsi que des lignées de cellules souches métastasiques permettant la formation de tumeurs sur des modèles animaux constituant des outils de criblage pour ces molécules. Les cellules souches cancéreuses (CSC en abrégé) sont des cellules capables d'initier des tumeurs et de former des colonies ou des sphères en milieu semi-solide. Elles sont à l'origine de nombreuses tumeurs et récidives. Plusieurs types de CSC ont été isolés grâce à des marqueurs de surface ou des enzymes spécifiques à partir de différentes tumeurs. Peu nombreuses, mais très agressives, elles peuvent survivre aux traitements anticancéreux, dont la chimiothérapie, et reformer une tumeur ou des métastases une fois le traitement arrêté. En effet, les chimiothérapies conventionnelles proposées à ce jour s'attaquent à toute la population tumorale. Il s'ensuit que les réductions de taille des tumeurs résultent principalement de l'élimination des cellules qui ne portent pas le pouvoir tumoral. Il est donc important de valider de nouvelles thérapies qui s'attaquent spécifiquement à la population de CSC pour proposer des traitements efficaces pour soigner les cancers et empêcher leurs récidives. Les travaux des inventeurs dans ce domaine ont conduit à élaborer un modèle animal permettant d'isoler et de caractériser des CSC exprimant des gènes indispensables à leur autorenouvellement. Le pouvoir antitumoral de composés à tester a été évalué sur des lignées de CSC isolées et sur les populations cellulaires totales provenant des mêmes tumeurs, ce qui a permis aux inventeurs de mettre en évidence l'efficacité de composés tels que des antiprotéases (IP) pour réduire la prolifération et la survie de populations spécifiques de CSC responsables du pouvoir tumoral et des récidives. Selon un aspect de grand intérêt, cet effet est obtenu en utilisant ces antiprotéases à des doses plus faibles que celles efficaces pour traiter la population cellulaire issue de la tumeur totale. L'invention a donc pour but de fournir une nouvelle application thérapeutique de médicaments à activité anticancéreuse. Elle a également pour but de fournir des moyens pour mesurer l'efficacité de traitements anticancéreux sur la population responsable du pouvoir tumoral et permettre ainsi de développer de nouvelles stratégies de traitements anticancéreux. L'invention vise de plus à fournir des formulations de compositions pharmaceutiques les renfermant à faible dose. Selon encore un autre but, l'invention vise à fournir de nouvelles lignées de CSC capables de former des métastases et leur utilisation pour tester des nouvelles molécules anti-cancéreuses. 5 Selon un premier aspect, l'invention vise ainsi des molécules à activité anti-protéases pour cibler préférentiellement, dans une tumeur, la population des cellules souches cancéreuses, exprimant des marqueurs de cellules souches embryonnaires, dont Oct-4, et/ou Nanog et/ou Sox2, afin de réduire le pouvoir tumoral de ladite population, voire de l'éradiquer. Il s'agit 10 donc de molécules actives sur les cellules directement responsables du pouvoir tumoral. Lesdites CSC peuvent exprimer en outre d'autres marqueurs de cellules souches dont CXCR4 et/ou CD44 et/ou CD133, cette énumération ne présentant pas de caractère limitatif. 15 Lesdites molécules sont plus spécialement des inhibiteurs de protéases et/ou sont capables d'induire un stress du réticulum endoplasmique ou un arrêt du cycle cellulaire ou encore d'induire une autophagie. Ces molécules diminuent la prolifération in vitro de ladite population de CSC avec une IC50 20 inférieure d'au moins un facteur 5 par rapport à l'ICSO vis-à-vis de la population tumorale totale. Il s'agit avantageusement de molécules capables d'inhiber la prolifération cellulaire des CSC et/ou d'induire leur mort par apoptose ou nécrose, ou d'inhiber l'expression de molécules 25 anti- apoptotiques, à des doses n'affectant pas la population tumorale totale. De plus, elles s'avèrent capables de réduire in vivo la formation d'allogreffes ou de xénogreffes après injection de CSC dans des souris immunodéficientes. Des inhibiteurs de protéases de grand intérêt comprennent des inhibiteurs de la protéase du 30 VIH. On citera plus particulièrement les inhibiteurs du groupe comprenant le lopinavir, le ritonavir, le nelfinavir, le saquinavir, seuls ou en co-administration. Ces composés répondent aux formules (I) à (IV) ci-dessous : Formule I Formule II Nei:nav I r Formule III Formule IV Selon un deuxième aspect, l'invention vise des compositions pharmaceutiques renfermant un ou plusieurs principes actifs en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dont les concentrations thérapeutiques susvisées sur les CSC (sans lien obligatoire avec les concentrations thérapeutiques de l'activité antiprotéasique) sont plus faibles d'un facteur 5 au moins à la concentration du ou des principes actifs nécessaires pour avoir un effet sur la population cellulaire totale de la tumeur. Les doses de médicaments seront adaptées selon l'âge et l'état du patient. Les compositions pharmaceutiques se présentent sous toute forme appropriée, en particulier 15 pour une administration par voie orale ou injectable. Lesdites molécules ou compositions pharmaceutiques sont de grand intérêt pour le traitement de tumeurs issues des cellules germinales, des tumeurs de haut grade et de mauvais pronostic et/ou de leurs récidives métastasiques. 20 Elles peuvent être utilisées en combinaison avec les traitements classiques de chirurgie ou de radiothérapie ou d'autres traitements de chimiothérapie, ou encore des traitements visant à réduire l'expression des gènes responsables de leur pouvoir tumoral et/ou métastasique comme l'ARNi, en utilisant par exemple des siRNA ou des shRNA dirigés contre les marqueurs de cellules souches embryonnaires tels que Oct-4, Nanog ou CXCR4 ou CD44. On notera que les gènes d' autorenouvellement des cellules souches embryonnaires dont le gène Oct-4, sont exprimés dans de nombreux types de cancers tels que les tumeurs solides (sarcomes ou adénocarcinomes) comme les cancers issus de cellules souches germinales, sarcomes d'Ewing, ostéosarcomes, glioblastomes de haut grade, adénocarcinomes, mélanomes, cancers du sein, du colon, de la vessie, du rein et du poumon. L'invention peut donc être mise en oeuvre dans le traitement de plusieurs types de tumeurs primaires et/ou de leurs récidives. De manière avantageuse, un modèle murin est utilisé pour isoler et caractériser, à partir de tumeurs d'origines différentes, des CSC exprimant les gènes impliqués dans l'autorenouvellement des cellules souches embryonnaires dont le gène Oct-4 indispensable à l'autorenouvellement des cellules souches embryonnaires murines ou humaines. Les souris utilisées sont invalidées pour le gène suppresseur de tumeur p53 et expriment un transgéne permettant l'expression de la GFP et un gène de résistance à la puromycine sous le contrôle du promoteur d'Oct-4. Elles développent des tumeurs spontanément dans différents organes. De manière avantageuse, ce modèle reflète une grande partie des tumeurs humaines. Les mutations du gène p53 sont en effet à l'origine d'environ la moitié des cancers retrouvés chez l'Homme. Les cellules exprimant Oct-4 dans ces tumeurs sont détectées avec par exemple un gène rapporteur comme la Green Fluorescent Protein (GFP en abrégé) et possèdent un gène de 25 résistance permettant leur sélection comme celui à la puromycine. Les cellules détectées sont isolées, sélectionnées par la puromycine et amplifiées. Ces CSC peuvent induire des allogreffes après injection sous-cutanée ou des métastases par injection intrapéritonéale ou par voie systémique dans des souris immunodéficientes. 30 Les cellules souches cancéreuses, telles qu'isolées et amplifiées à partir de tumeurs d'origines différentes comme défini ci-dessus, constituent des outils de grand intérêt pour le criblage de molécules capables de cibler préférentiellement dans une tumeur la population des CSC exprimant des marqueurs de cellules souches embryonnaires dont Oct-4 et/ou Nanog et/ou Sox2. Comme types de tumeur, on citera des tumeurs mésenchymateuses sous-cutanées des adénocarcinomes sous-cutanés, des tumeurs de l'intestin et des tumeurs pulmonaires. Ces cellules sont caractérisées en ce que - elles expriment Oct-4 et/ou Nanog et/ou Sox2, ainsi que d'autres gènes présents dans les cellules souches embryonnaires, mais à des niveaux très bas par rapport aux cellules souches embryonnaires, et aussi le récepteur CXCR4 impliqué dans la migration des cellules souches cancéreuses, ainsi que d'autres marqueurs de cellules souches tumorales comme le CD44 ou le CD133; - leur pouvoir tumoral mesuré par la formation d'allogreffes dans des souris immunodéficientes est de 25 à 250 fois plus important que celui de la population tumorale totale. Elles forment des tumeurs transplantables en série chez l'animal. - ces cellules sont capables de s'autorenouveler et de se différencier en ostéoblastes in vitro. - les tumeurs obtenues in vivo contiennent toutes des zones avec des cellules osseuses immatures - une régression du développement des allogreffes est observée si on diminue l'expression d'Oct-4 par ARNi avec des siRNA - lorsqu'elles sont injectées en intrapéritonéal ou dans la circulation sanguine de souris immunodéficientes, des métastases sont formées. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent aux fins d'illustration de l'invention. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 6, qui représentent respectivement, - l'effet, sur la prolifération des cellules tumorales issues d'un adénocarcinome, du lopinavir seul (Figure 1A) et d'un mélange lopinavir + ritonavir (Figure 1B), - l'effet, sur des cellules tumorales d'une tumeur intestinale, du lopinavir seul (FigurelC) et d'un mélange de lopinavir + ritonavir (Figure 1D); - l'effet, sur la prolifération des cellules tumorales issues d'un adénocarcinome, du nelfinavir (Figure 2A), du saquinavir (Figure 2B) et du ritonavir (Figure 2C) ; - l'effet, sur la prolifération des cellules tumorales issues d'un adénocarcinome, de la salinomycine, une molécule déjà décrite pour diminuer la prolifération de CSC isolées à partir de tumeur du sein en utilisant d'autres critères. (Figure 3) ; - l'induction de la mort cellulaire par les IP dans les CSC : Figures 4A à 4D chez un adénocarcinome ; Figures 4E à 4H chez une tumeur intestinale ; - l'analyse dans des souris contrôles ou traitées 2 fois par jour par du Kaletra® de la progression tumorale induite par les CSC d'un adénocarcinome (Figures 5A à 5D) et d'une tumeur intestinale (Figures 5E à 5H) ; - l'effet du lopinavir sur la clonogénécité des CSC d'un adénocarcinome (Figure 6). Exemple 1 : Etude de l'effet des IP sur la prolifération de la population des CSC par rapport à la population tumorale totale de la tumeur d'origine. Les cellules ont été ensemencées dans le milieu de culture approprié en présence de 10% de sérum de veau foetal et cultivées à 37°C dans une atmosphère humide contenant 5% de COz. Après 24 heures de culture permettant l'adhésion de cellules aux parois des boîtes de culture, les inhibiteurs de la protéase du VIH sont ajoutés dans le milieu de culture aux concentrations indiquées et les cellules sont cultivées pendant 72 heures supplémentaires. Les cellules sont ensuite dissociées par de la trypsine et dénombrées grâce à un compteur Coulter Beckman Z1. Les graphes des figures 1, 2, 3 représentent le pourcentage de cellules adhérentes dans la boîte de culture comparé à celui obtenu pour des cellules qui n'ont pas été traitées par les IP. Les IP utilisées sont les suivantes, lopinavir (LPV), ritonavir (RTV), nelfinavir (NVF), saquinavir (SQV) et un mélange de lopinavir/ritonavir dans les proportions (4/1 (p/p)) correspondant à la spécialité pharmaceutique Kaletra®, une des spécialités les plus prescrites dans l'infection du VIH. L'examen de la Figure 1 montre que le lopinavir inhibe préférentiellement la prolifération des CSC issues de deux tumeurs d'origines différentes. Les IC50 pour cet effet sont de 0,2 µg/ml, c'est-à-dire 0,3 µM, et ne différent pas selon 30 l'origine de la tumeur. En revanche les concentrations nécessaires pour inhiber la prolifération de la population cellulaire totale sont plus élevées et sont comprises entre 5 et 12 µg/ml (soit entre 8 et 20 µM) selon la tumeur. Un résultat analogue est obtenu si un mélange lopinavir/ritonavir (4/1(p/p)) est utilisé. Dans ce dernier cas, le ritonavir n'augmente pas les effets du lopinavir in vitro. Les concentrations de lopinavir présentes dans le sérum de patients traités sont de 10 l'ordre de 2 à 12 µg/ml et sont indiquées sur les différents graphes de la figure 1 en gris. Elles sont supérieures aux concentrations efficaces pour diminuer la prolifération des CSC, ce qui indique que les doses administrées à l'homme sont compatibles avec un traitement visant les CSC. 15 La Figure 2 montre que le ritonavir seul cible préférentiellement la population de CSC. L'IC50 obtenue sur la population des CSC est de 2 µg/ml, soit 2,7 µM, et de 12 µg/ml soit 16,6 µM, sur la population tumorale totale. Le nelfinavir et le saquinavir ciblent les populations de CSC avec des IC50 du même ordre de grandeur que celle du ritonavir (2 et 3 µM respectivement). Les inhibiteurs de la protéase du VIH utilisés dans ces expériences sont des IC50 du 25 même ordre de grandeur sur la population tumorale totale (comprises entre 8 et 20 µM). Les doses d'IP efficaces sur les cellules tumorales d'origines diverses sont généralement comprises entre 20 et 50 µM, donc du même ordre de grandeur que celles efficaces sur les populations tumorales totales étudiées. 30 Comme pour le lopinavir, les doses de nelfinavir efficaces pour diminuer la prolifération des CSC sont du même ordre de grandeur que les concentrations mesurées dans le sang des patients traités. 20 La Figure 3 montre que la salinomycine, une molécule identifiée comme étant efficace pour diminuer la prolifération de cellules souches de cancer de sein (WO 2009/126310 de Gupta et al.), ne cible pas spécifiquement les CSC qui expriment des marqueurs de cellules souches embryonnaires. Les effets de cette molécule ont été étudiés sur la prolifération des CSC et de la population tumorale totale isolée à partir de l' adénocarcinome. La Figure 3 montre que la salinomycine bloque la prolifération des CSC avec une ICso de 0,2 µM, et son efficacité est du même ordre de grandeur sur la population tumorale totale (ICso = 0,1 µM). Ce résultat indique que les différents types de CSC ont des sensibilités différentes vis-à-vis des molécules à potentiel thérapeutique, et que les traitements efficaces pour éliminer les unes peuvent être moins efficaces pour les autres. La diminution de la prolifération cellulaire s'accompagne d'une diminution de l'aptitude des cellules à proliférer à l'état clonal. La figure 6 montre que lorsque les CSC d'un adénocarcinome sont cultivées en milieu semi solide, le lopinavir diminue la formation de colonies de manière dose-dépendante pour des concentrations similaires à celles inhibant la prolifération des CSC. Exemple 2 : Mesure de l'induction de la mort cellulaire par les IP dans la population de CSC. L'induction de la mort cellulaire a été mesurée par marquage avec de l'annexine V qui se fixe sur les phosphatidyl-serines de la membrane plasmique lorsque celle-ci est désorganisée et avec de l'iodure de propidium, un intercalant de l'ADN qui pénètre dans les cellules très endommagées. Après 24 heures de culture, les inhibiteurs de la protéase du VIH sont ajoutés dans le milieu de culture aux concentrations indiquées et les cellules sont cultivées pendant 48 heures supplémentaires. Les cellules sont ensuite dissociées par de la trypsine et analysées par cytométrie en flux. La Figure 4 montre les effets des IP sur la population de CSC pour deux tumeurs différentes. Le marquage de l'annexine V est reporté en abscisse, celui de l'iodure de propidium en ordonnées. Les résultats obtenus indiquent que les inhibiteurs de la protéase du VIH induisent une apoptose des cellules souches cancéreuses à des concentrations comparables avec celles qui inhibent la prolifération. Ces concentrations n'induisent pas d'apoptose dans la population tumorale totale. Comme pour la prolifération, le lopinavir est l'un des IP les plus efficaces pour induire la mort cellulaire des CSC. Exemple 3 : In vivo, le lopinavir induit une régression du développement d'allogreffes induites par les CSC isolées à partir d'un adénocarcinome ou d'une tumeur intestinale. Pour analyser l'effet du lopinavir sur la progression tumorale in vivo, les cellules ont été modifiées en leur conférant la capacité à exprimer de la luciférase pour pouvoir les repérer in situ dans les souris vivantes. En présence de substrat : la luciférine injectée en intrapéritonéal à raison de 150 mg/kg, seules les cellules exprimant la luciférase pourront émmettre de la lumière qui sera enregistrée grâce à un appareillage approprié (XENOGEN IVIS0100, Xenogen Biosciences, Cranbury NJ). L'enregistrement est effectué sur des souris anesthésiées avec un mélange isofurane/air 1,5% (v/v). Le signal émis par les cellules est enregistré, analysé, puis restitué sur une échelle proportionnellement à la quantité de lumière émise. Ces expériences ont été réalisées dans des locaux agréés par la Direction des Services Vétérinaires (A 06-088-11) et conduites sous la direction et par des expérimentateurs titulaires d'une autorisation d'expérimenter sur des animaux vertébrés vivants en cours de validité (06-044 et 06-177) selon la réglementation en vigueur. Les souris ont reçu une injection de 250 000 cellules dans du matrigel® en sous-cutané dans le dos. Elles ont été traitées (T) par deux injections quotidiennes de Kalétra® qui correspondent aux concentrations suivantes : LPV : 0,4 mg/souris/injection & RTV : 0, lmg/souris/injection. Le lot contrôle (C) reçoit une quantité équivalente de sérum glucosé (5% p/v). La présence de cellules souches est analysée après différents jours de traitement grâce à l'émission de lumière. 9 Après 55 jours de traitement, les souris sont sacrifiées et les tumeurs sont pesées. Les résultats obtenus indiquent, qu'après 7 jours de traitement, il n'y a pas de différence significative entre le développement des tumeurs dans les souris contrôles ou traitées. On note une diminution de la croissance tumorale à partir de 21 jours si les cellules sont issues de l'adénocarcinome et de 34 jours de traitement si les cellules sont issues de la tumeur intestinale. Après 55 jours de traitement, le développement tumoral est inhibé dans 3 souris sur 4 et diminué pour une seule souris traitée. Le poids des tumeurs est moins important dans les souris ayant reçu un traitement par rapport aux souris contrôles. Ces résultats indiquent que le traitement des souris par le Kaletra® est efficace pour réduire le développement tumoral induit par des cellules souches cancéreuses exprimant des marqueurs de cellules souches embryonnaires in vivo. REVENDICATIONS1- Molécules à activité anti-protéases pour cibler préférentiellement, dans une tumeur ou un modèle murin, la population des cellules souches cancéreuses, ou CSC, et/ou les cellules souches métastasiques, exprimant des marqueurs de cellules souches embryonnaires, dont Oct-4 et/ou Nanog et/ou Sox2, afin de réduire le pouvoir tumoral ou métastasique de ladite population, voire de l'éradiquer. 2 - Molécules selon la revendication 1, caractérisées en ce que lesdites cellules souches cancéreuses ou métastasiques expriment en outre d'autres marqueurs de cellules souches dont CD44, et/ou CD 133 et/ou CXCR4. 3 - Molécules selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'il s'agit d'inhibiteurs de protéases ayant une IC50, vis-à-vis de ladite population de CSC ou des cellules souches métastasiques, inférieure d'au moins un facteur 5 par rapport à l'IC50 vis-à-vis de la population tumorale totale. 4 - Molécules selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles inhibent la prolifération cellulaire des CSC et/ou induisent la mort cellulaire des 2 0 CSC par un mécanisme d'apoptose, ou de nécrose ou qu'elles inhibent l'expression de molécules anti apoptotiques à des doses n'affectant pas celle de la population tumorale totale et qu'elles réduisent in vivo la formation d'allogreffes ou de xenogreffes après injection des CSC dans des souris immunodéficientes. 25 5 - Molécules selon la revendication 3 ou 4, caractérisées en ce qu'il s'agit d'inhibiteurs de la protéase du VIH. 6 - Molécules selon la revendication 4, caractérisées en ce que lesdits inhibiteurs sont 30 choisis parmi le lopinavir, le ritonavir, le nelfinavir, le saquinavir, seuls ou en coadministration. 7 - Molécules selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que la tumeur a été développée dans les organes d'un modèle murin par injection par voie sous-cutanée ou par voie systémique de lignées de cellules souches cancéreuses métastasiques isolées selon l'expression de marqueurs de cellules souches embryonnaires dont Oct-4. 8 - Compositions pharmaceutiques renfermant une quantité thérapeutiquement efficace sur les CSC, sans lien obligatoire avec les concentrations thérapeutiques nécessaires à l'activité antiprotéasique, d'au moins une molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, la concentration de la ou des molécules étant plus faible que celle efficace sur la population cellulaire totale de la tumeur par un facteur d'au moins 5. 9 - Compositions phamaceutiques selon la revendication 8, pour le traitement de 15 tumeurs issues des cellules germinales et des tumeurs de haut grade et de mauvais pronostic et de tumeurs formant des métastases. 10 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 9 caractérisées en ce qu'elles sont utilisées en combinaison avec de la chirurgie ou de la radiothérapie ou avec 20 d'autres traitements de chimiothérapie ou encore avec des traitements visant à réduire l'expression des gènes responsables de leur pouvoir tumoral et/ou métastasique comme l'ARNi en utilisant par exemple des siRNA ou des shRNA dirigés contre les marqueurs de cellules souches embryonnaires comme Oct-4, Nanog, ou Sox2, ou CXCR4 ou CD44. 25 11 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 9 ou 10, caractérisées en ce que les populations de CSC exprimant des marqueurs de cellules souches embryonnaires dont Oct-4 sont présentes dans des tumeurs solides (sarcomes ou adénocarcinomes d'origines tissulaires différentes) comme les cancers de cellules 30 souches germinales, sarcomes d'Ewing, ostéosarcomes, glioblastomes de haut grade, mélanomes, adénocarcinomes et cancers du sein, du colon, du rein, de la vessie et du poumon.