FR 2960784 A1 20111209 FR 1054404 A 20100604 La présente invention concerne le domaine général des substituts biodégradables, voire bioassimilables, et cellularisables pour application biomédicale. En particulier, l'invention concerne de nouveaux substituts vasculaires à base de polymères biodégradables que sont les polysaccharides et le collagène. Il existe actuellement plusieurs types de substituts vasculaires utilisables en conditions cliniques qui s'appuient sur deux technologies différentes : - les substituts artificiels (à base de PTFE expensé ou PET Dacron). - les greffons de veines ou d'artères humaines d'origine autologue ou allogène, Au delà des applications cliniques, il existe les substituts artificiels à l'étude, certains sont non biodégradables, d'autres sont biodégradables, comme par exemple ceux décrits dans le brevet EP 0850073, notamment à base de polymères naturels comme le collagène, carbohydrates de la famille des polysaccharides tels que le chitosane, la cellulose, les alginates ... Des travaux antérieurs de certains inventeurs de la présente demande de brevet ont porté sur l'élaboration de fibres creuses de polysaccharides et notamment de chitosane, travaux ayant fait l'objet de la demande de brevet WO 2009/044053. Les fibres creuses multi-membranaires, en particulier celles à base de chitosane, apparaissent d'excellents candidats pour l'élaboration de biomatériaux grâce à leur biocompatibilité, biodégradabilité, bioactivité et le coût modéré du chitosane. La demande de brevet WO 2009/04405 indique que les fibres creuses, en particulier les fibres creuses de chitosane peuvent servir de bioréacteurs pour l'ingénierie tissulaire puisque le système multi-membranaire est très bien adapté à la régénération de tissus multicouches à géométrie cylindrique comme les vaisseaux sanguins. Néanmoins, les inventeurs ont pu constater que les fibres creuses obtenues selon le procédé décrit dans la demande de brevet WO 2009/044053 ne présentaient pas des propriétés mécaniques suffisantes pour résister à la pression sanguine et pour être compatibles avec des opérations de suture sur les vaisseaux sanguins, opération requise pour l'implantation. Dans ce contexte, les inventeurs proposent, selon l'invention, de nouveaux substituts vasculaires biodégradables dont les propriétés mécaniques sont compatibles avec leur application, mais également dont le comportement vis-à-vis des cellules permet de régénérer un assemblage tissulaire tubulaire, et même selon certaines variantes de réalisation, un assemblage tissulaire tubulaire multicouche complexe. Aussi, la présente invention concerne un substitut vasculaire biodégradable comportant une structure tubulaire interne et une enveloppe externe, chacune constituée d'un hydrogel d'un polysaccharide, de collagène ou d'un mélange de tels polymères, caractérisé en ce que les deux hydrogels formant la structure tubulaire interne et l'enveloppe externe sont différents et présentent, notamment, des propriétés mécaniques et une vitesse de colonisation par des cellules, différentes. En particulier, un des hydrogels présente des propriétés de résistance mécanique supérieures à celles de l'autre hydrogel, mais l'autre hydrogel présente une vitesse de colonisation supérieure. Selon un mode de réalisation préféré, la structure tubulaire interne présente des propriétés de résistance mécaniques supérieures à celles de l'enveloppe externe. Selon un autre mode de réalisation préféré pouvant être combiné au précédent, l'hydrogel formant l'enveloppe externe présente une vitesse de colonisation par des cellules supérieure à celle de la structure tubulaire interne. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un tel substitut vasculaire comprenant les étapes suivantes : a) formation d'un tube, éventuellement multi-membranaire, constitué d'un hydrogel de polysaccharide, de collagène ou d'un mélange de ces polymères, par filage puis coagulation interrompue d'une solution hydro-alcoolique coagulable du polymère ou mélange de polymères sélectionné pour former le tube, Réponse notification d'irrégularités du 7 Juillet 20'20360784 3 b) formation sur la paroi interne ou externe du tube obtenu à l'étape a) d'une couche d'hydrogel d'un polysaccharide, de collagène ou d'un mélange de ces polymères à partir d'une solution aqueuse exempte d'alcool du polymère ou mélange de polymères sélectionné pour 5 former la couche. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, la couche est déposée sur la paroi externe du tube obtenu à l'étape a). Selon une autre mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, pouvant être combiné au précédent, l'étape a) est réalisée à partir d'une 10 solution hydro-alcoolique de chitosane, la coagulation étant réalisée en milieu alcalin. Selon une autre mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, pouvant être combiné aux précédents, l'étape b) est réalisé à partir d'une solution aqueuse de chitosane exempte d'alcool, qui après dépôt sur les 15 parois externes de la structure tubulaire interne est neutralisée. La description ci-après, en référence aux Figures annexées permet de mieux comprendre l invention. La Figure 1 est une vue schématique en perspective d'un exemple de substitut vasculaire conforme à l'invention. 20 Les Figures 2A et 2B respectivement sont des vues schématiques en perspective et en coupe selon B-B d'un autre exemple de substitut vasculaire conforme à l'invention. Les Figures 3A et 3B respectivement sont des vues schématiques en perspective et en coupe selon B-B d'un autre exemple de substitut vasculaire 25 conforme à l'invention. Les Figures 4A et 4B comparent les propriétés mécaniques de différents hydrogels de chitosane obtenus par voie aqueuse ou voie hydroalcoolique. Les Figures 5 et 6 sont des photographies partielles en microscopie 30 optique d'un exemple de substitut vasculaire selon l'invention recouvert dans la lumière interne par des cellules vivantes. Réponse notification d'irrégularités du 7 Juillet 2012960784 4 La Figure 7 est une photographie partielle en microscopie optique d'un exemple de substitut vasculaire selon l'invention habité dans un espace intermembranaire par des cellules vivantes. Par hydrogel, on entend un matériau visco-élastique comportant au 5 moins 80%, et de préférence, au moins 90% en masse d'eau. Dans le cadre de l'invention, la structure interne et l'enveloppe externe peuvent être constituées d'un hydrogel physique, ou d'un hydrogel chimique encore nommé hydrogel réticulé. Un hydrogel est dit physique, lorsque les interactions responsables de la réticulation inter-chaînes sont de type 10 physique, et sont notamment des liaisons hydrogène et/ou des interactions hydrophobes par opposition à un hydrogel dit chimique dans lequel les interactions inter-chaines sont de type liaison covalente. L'hydrogel constitutif de la structure interne, ainsi que l'hydrogel constitutif de l'enveloppe peuvent être à base d'un ou plusieurs 15 polysaccharides ou bien de collagène ou d'un mélange polysaccharide/collagène. Les polymères sélectionnés sont biodégradables, c'est-à-dire qu'ils sont aptes à subir, sous l'action d'un milieu vivant contenant divers réactifs comme l'eau, le monoxyde d'azote, et des enzymes, un processus de décomposition pour conduire à des composés de plus faible 20 masse qui sont excrétés ou métabolisés par l'organisme. A titre d'exemple de polysaccharides, on peut citer les glycosaminoglycanes, tels que la chitine, le chitosane, l'acide hyaluronique, les alginates et notamment les alginates de calcium, et la carboxyméthyl cellulose, ainsi que les polysaccharides polyanioniques tels que le sulfate de dextrane, le dermatane sulfate, le 25 kératane sulfate et l'héparine. Il existe également différentes formes de collagène, on peut notamment citer l'atélocollagène extrait par voie enzymatique, le collagène fibreux issu du tendon ou de peau. On distingue également de nombreux types de collagène qui ont une structure propre et que l'on retrouve dans des organes particuliers. Par exemple, les collagènes 30 de type 1, III et IV sont présents dans la paroi des vaisseaux sanguins, le collagène de type I est le plus fréquent et il est présent dans de nombreux tissus conjonctifs. La structure tubulaire interne sera, de préférence, en un Réponse notification d'irrégularités du 7 Juillet 20960784 5 hydrogel de chitosane, et notamment en un hydrogel physique. L'enveloppe externe pourra également être constituée d'un hydrogel de chitosane, et notamment d'un hydrogel physique. Le chitosane, est un dérivé partiellement voire totalement désacétylé de la chitine. Ses différentes formes sont 5 notamment caractérisées par leur degré d'acétylation (DA) et par leur masse molaire. Les propriétés mécaniques du substitut vasculaire selon l'invention sont importantes, car le substitut vasculaire doit d'une part résister à la pression sanguine physiologique (« burst pressure ») et d'autre part être suturable. 10 Conformément à L'Heureux N., et al., Nature 2007, Vol 4. n°7, 389-395 et Konig, G., et al, Biomaterials 2009, 30, 1542-1550, un substitut vasculaire doit, de préférence, résister à la pression sanguine physiologique avec un coefficient de sécurité au moins de l'ordre de 8, c'est-à-dire que le substitut vasculaire doit résister à une pression correspondant à au moins 8 fois la 15 pression physiologique maximale de l'ordre de 220 mm de mercure. Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont identifié qu'il est difficile de trouver un même hydrogel biodégradable, qui présente de telles propriétés mécaniques, mais également qui puisse être facilement colonisé de telle sorte que, lorsque le substitut vasculaire est implanté, il y ait reconstitution 20 d'un tissu de soutien avant dégradation du substitut et affaiblissement subséquent de ses propriétés mécaniques. C'est pourquoi, dans le cadre de l'invention, il est prévu d'utiliser un assemblage constitué d'au moins deux couches différentes d'hydrogels, en particulier des hydrogels physiques de chitosane (que l'on nomme dans la 25 suite de la description: structure tubulaire interne et enveloppe externe), chacune de ces couches présentant des propriétés différentes et complémentaires. La Figure 1 représente une telle structure I avec une structure tubulaire interne 1 et une enveloppe externe 2. Dans le cadre de l'invention, il est donc prévu d'associer deux tubes coaxiaux, chacun des 30 tubes étant formé d'un hydrogel différent d'un ou plusieurs polysaccharides ou bien d'un ou plusieurs collagènes ou d'un mélange polysaccharide/collagène. Chacun des deux tubes pourra présenter une Réponse notification d'irrégularités du 7 Juillet 2012960784 6 structure multi-membranaire. L'hydrogel constitutif de la structure tubulaire interne et l'hydrogel constitutif de l'enveloppe externe peuvent être de nature chimique différente, par exemple l'un constitué de collagène et l'autre de chitosane, ou bien de même nature chimique, par exemple, tous deux 5 constitués de chitosane, mais d'un chitosane différent en terme de degré d'acétylation (DA), masse molaire moyenne en masse Mw, et/ou porosité, de manière à posséder des propriétés de résistance mécanique et de vitesse de colonisation par des cellules différentes. Dans le cadre de l'invention, il est prévu d'utiliser deux hydrogels coaxiaux, l'un de résistance mécanique plus 10 élevé et l'autre de résistance mécanique plus faible mais de vitesse de colonisation par des cellules plus rapide. Selon un mode de réalisation préféré, c'est la structure tubulaire interne qui donne sa structure et ses propriétés de résistance mécanique au substitut selon l'invention et lui permet notamment d'être suturable et de ne 15 pas éclater sous la pression sanguine. En particulier, la structure tubulaire interne présente une contrainte à la rupture ar supérieure à 0,05 MPa, de préférence supérieure à 0,2 MPa. De préférence, la structure tubulaire interne présente également un module d'élasticité en traction E (module de Young) supérieur à 0,01 MPa, de préférence supérieur à 0,05 MPa et, par 20 exemple, de l'ordre de 0,1 MPa. L'évaluation des paramètres mécaniques est réalisée comme décrit dans les exemples ci-après. La contrainte à la rupture peut être comparée à la pression interne équivalente P= ar *(R1-R2)/R2 où R1 est le rayon externe et R2 est le rayon interne du tube. Pour une contrainte à rupture supérieure à 0,2 MPa, la pression interne dans un tube 25 de 10mm de diamètre externe et 5mm de diamètre interne est proche de 1500 mmHg, ce qui gst bien supérieur à la gamme de pressions physiologiques ( 50%) de chitosane de haute masse et bas DA, alors que l'enveloppe externe peut être composée d'une fraction majoritaire (>50%) de chitosane de DA plus élevé et de plus faible 30 masse. Il convient de noter que les DA et masse molaire Mw donnés précédemment pour les hydrogels constitutifs du substitut vasculaire Réponse notification d irrégularités du 7 Juillet 2012960784 13 correspondent sensiblement aux DA et masse molaire Mw du chitosane présent dans les solutions utilisées pour leur préparation. Selon le mode de réalisation préféré tel que détaillé précédemment, la structure tubulaire interne présente des propriétés de résistance mécanique 5 supérieures à celles de l'enveloppe externe. L'enveloppe externe, quant à elle présente une vitesse de colonisation par des cellules supérieure à celle de la structure tubulaire interne. Une configuration inversée, bien que non préférée, pourrait également être prévue. Dans ce cas, par exemple, la structure tubulaire interne pourrait être obtenue par filage puis coagulation 10 interrompue d'une solution aqueuse coagulable de chitosane et l'enveloppe externe, à partir d'une solution hydro-alcoolique de chitosane. Dans ce cas, l'enveloppe externe serait formée d'un hydrogel obtenu par voie hydroalcoolique, éventuellement multi-membranaire et la structure tubulaire interne d'un hydrogel obtenu par voie aqueuse sur lequel l'endothélium 15 pourrait se développer de façon plus efficace compte tenu de ses propriétés physico-mécaniques (module d'élasticité inférieur, porosité plus importante), alors qu'une capsule fibreuse se formerait autour de l'hydrogel de temps de résorption plus long.. Dans le substitut vasculaire selon l'invention, la structure tubulaire 20 interne et l'enveloppe externe sont, de préférence, solidarisées l'une à l'autre, notamment par enchevêtrement physique des hydrogels qui les constituent, au niveau de leur surface de contact 3 représentée sur la Figure 1. Un tel enchevêtrement est notamment obtenu par trempage de la structure tubulaire interne dans une solution aqueuse de polysaccharide ou 25 de collagène, éventuellement en mélange, et en particulier de chitosane, comme décrit précédemment, dans le cas où la structure interne présente des propriétés de résistance mécanique supérieures par rapport à l'enveloppe externe et est notamment formée d'un hydrogel obtenu par voie hydro-alcoolique. Il est également possible de procéder à un remplissage 30 d'une fibre creuse formée d'un hydrogel obtenu par voie hydro-alcoolique, avec une solution aqueuse de polysaccharide ou de collagène dans le cas où Réponse notification d'irrégularités du 7 Juillet 2012 960 784 14 la structure tubulaire interne présente des propriétés de résistance mécanique inférieures, par rapport à l'enveloppe externe. Par ailleurs, les substituts vasculaires selon l'invention ont l'avantage d'être totalement biodégradables, voire totalement bioassimilables dans le 5 cas où les polymères sélectionnés sont du chitosane, de l'acide hyaluronique ou du collagène. Par «bioassimilables», on entend qu'ils vont se dégrader dans le milieu vivant dans lequel ils vont être implantés, en l'occurrence le corps humain, et que les produits de dégradation vont être métabolisés par l'organisme. Les substituts vasculaires selon l'invention sont constitués de 10 biomatériaux et allient les avantages que présentent le chitosane, le collagène, l'acide hyaluronique, les alginates, en termes de biocompatibilité, biodégradabilité, voire de bioactivité et de coût modéré. Les substituts vasculaires selon l'invention pourront être élaborés avec différentes dimensions, notamment avec un diamètre interne de 1 à 15 mm, 15 en particulier de 2 à 6 mm, correspondant à des petites artères pour lesquelles la demande en nouveaux substituts vasculaires fonctionnels à long terme (au delà de 3 ans) est la plus forte. Avant leur implantation dans un organisme, les substituts vasculaires selon l'invention seront soumis à une opération de stérilisation, de préférence 20 réalisée en autoclave pendant 20 minutes à une température de 120°C. Les propriétés mécaniques et biologiques ne sont pas significativement affectées par la stérilisation. Une telle stérilisation sera effectuée avant toute fonctionnalisation du substitut vasculaire avec des cellules vivantes, comme détaillé ci-après. Il est aussi possible de réaliser l'élaboration à partir de 25 produits solides et liquides stérilisés, puis mis en forme en conditions stériles. Selon un mode de réalisation avantageux, les parois internes de la structure tubulaire interne sont tapissées (préalablement à leur implantation) de cellules endothéliales vivantes. De tels substituts vasculaires I dans lesquels la surface de la lumière interne de la structure tubulaire interne 1 30 est tapissée de cellules endothéliales 4 sont notamment illustrés Figures 2A et 2B. Les inventeurs ont mis en évidence que les parois internes d'un tube d'hydrogel physique de chitosane tel que précédemment défini pouvaient Réponse notification dlrrégularités du 7 Juillet 20e9 6 0 784 15 être tapissées de cellules endothéliales de différents types, tels que des cellules endothéliales extraites de la veine saphène humaine, de la veine du cordon ombilical humain, ou des cellules endothéliales issues de progéniteurs extraits du sang circulant, et que ces cellules ne se dé-différenciaient pas et 5 restaient intactes (établissement de jonctions endothéliales caractéristiques, expression de facteurs fonctionnels) après la constitution du tapis cellulaire. De préférence, les parois de la structure tubulaire interne seront tapissées de cellules endothéliales fonctionnelles, c`est-à-dire semblables aux cellules endothéliales des tissus natifs et présentant les marqueurs spécifiques de ces 10 tissus natifs, en exprimant des protéines comme la VE-Cadherine, CD31, le facteur de von Willbrand. La présence d'une telle couche de cellules endothéliales vivantes sur les parois de la structure tubulaire interne, notamment sous la forme d'un tapis du type monocouche cellulaire, permet d'éviter la formation d'un thrombus, qui aurait tendance à se former si le 15 substitut vasculaire était utilisé seul pour remplacer des vaisseaux sanguins de petit diamètre, en particulier de diamètre interne inférieur à 6 mm. De tels substituts peuvent être préparés en ensemençant des cellules endothéliales dans la lumière de la structure tubulaire interne, une fois que la structure tubulaire interne et l'enveloppe externe ont été formées. Selon un 20 mode de réalisation, la cellularisation de la structure tubulaire interne peut être réalisée de façon « statique » par injection d'une suspension de cellules endothéliales même à densité modérée, notamment avec de 50 000 à 100 000 cellules par cm2, afin d'obtenir une monocouche couche cellulaire confluente sur la paroi de la lumière du tube, en un temps qui peut 25 correspondre de quelques heures à 48h. Selon un autre mode de réalisation, la cellularisation de la structure tubulaire interne peut-être réalisée de façon «dynamique» par injection d'une suspension de cellules endothéliales à densité modérée et en faisant tourner lentement le tube à cellulariser autour de l'axe du tube interne. 30 Selon un autre mode de réalisation, il est également possible que les parois internes de la structure tubulaire interne soient revêtues d'un polysaccharide polyanionique, éventuellement sous la forme d'une Réponse notification d'irrégularités du 7 Juillet 2012960 784 16 association polyélectrolyte avec l'hydrogel formant la structure tubulaire interne. Un tel polysaccharide polyanionique a l'avantage d'être antithrombogène. A titre d'exemple de tels polysaccharides polyanioniques, on peut citer le sulfate de dextrane, le dermatane sulfate, le kératane sulfate 5 et l'héparine. Par ailleurs, les substituts vasculaires selon l'invention peuvent être mufti-compartimentés, afin de reconstituer un substitut vasculaire cellularisé multicouche dont la structure est similaire à celle d'un vaisseau sanguin natif. En particulier, la structure tubulaire interne peut être multi-membranaire, 10 c'est-à-dire formée de deux ou plusieurs membranes pouvant librement glisser les unes par rapport aux autres. De telles structures multi- membranaires peuvent, par exemple, être préparées en s'inspirant du procédé décrit dans la demande de brevet WO 2009/044053 mais en milieu hydro-alcoolique comme décrit plus haut, et en effectuant plusieurs cycles 15 successifs de coagulation partielle. Les conditions opératoires de chaque cycle de coagulation interrompue et leur conditions d'enchaînement détermineront la constitution de chaque membrane, notamment son épaisseur, et la taille de l'espace inter membranaire séparant deux membranes adjacentes. En particulier, selon une variante de réalisation, 20 l'invention concerne des substituts vasculaires tels que précédemment définis, dans lesquels la structure tubulaire interne comprend au moins deux membranes séparées par un espace inter-membranaire contenant des cellules vivantes d'un même type ou de types différents. Par exemple, il est possible que l'espace inter-membranaire contienne des cellules musculaires 25 lisses, ou un neo-tissu musculaire lisse constitué in vitro avant implantation. De tels substituts vasculaires sont notamment illustrés Figures 3A et 3B. La configuration présentée Figures 3A et 3B comporte une enveloppe externe 2, une structure tubulaire interne comportant deux membranes 11 et 12. L'espace inter-membranaire 5 entre les membrane 11 et 12 renferme des 30 cellules 6, par exemple, des cellules musculaires lisses, et les parois internes de la membrane 11, délimitant le tube interne de l'ensemble tubulaire creux, sont tapissées de cellules endothéliales 4. L'avantage d'introduire une couche Réponse notification d'irrégularités du 7 Juillet 2012)960 784 17 de cellules d'un type donné dans un espace inter-membranaire est de préserver l'intégrité d'une couche riche en cellules d'un type donné (par exemple, musculaires lisses) et d'ainsi favoriser le développement d'une couche de tissu spécifique (par exemple, du tissu musculaire lisse) dans la 5 paroi du tissu vasculaire en reconstruction jusqu'à la résorption de la structure interne. Les types cellulaires choisis pour leur introduction dans les espaces inter-membranaires de la structure interne peuvent apporter une fonctionnalité biologique pour le développement et le maintien fonctionnel du tissu en reconstruction, en particulier pour l'endothélium (les cellules en co- 10 culture séparées dans la structure rnulti-membranaire échangent des messages chimiques de part et d'autre d'une membrane d'hydrogel) ou apporter une fonction pour le substitut vasculaire implanté. Par exemple, un effet de renfort peut être apporté avec une couche de fibroblastes synthétisant un tissu riche en collagène. Il est également possible d'apporter 15 une fonctionnalité spécifique au tissu reconstruit, après dégradation de l'implant, notamment la contractilité avec une couche musculaire lisse. De préférence, les cellules sont prélevées chez le patient sur lequel le substitut est destiné à être implanté (cellules d'origine autologues). Si nécessaire, les cellules peuvent être mises en culture pour une période de multiplication 20 et/ou de différentiation pour ensuite, être injectées à l'aide d'une seringue à travers les membranes ou entre les membranes à l'extrémité d'un tube multimembranaire pour réaliser un substitut autologue. Il est possible de guérir un défaut résultant d'une injection à travers la paroi d'une membrane en le colmatant avec une solution aqueuse ou hydro-alcoolique du polymère 25 utilisé, et notamment de chitosane, puis en neutralisant cette solution par ajout de quelques gouttes de solution basique ou en trempant le matériau dans un tampon biologique (ou milieu de culture tamponné). Les ensembles tubulaires creux tels que précédemment définis ont été développés par les inventeurs, pour leur utilisation en tant que substituts 30 vasculaires. Les substituts vasculaires selon l'invention pourront être directement implantés chez l'homme ou, dans le cas où des cellules vivantes sont présentes sur ou dans la structure tubulaire interne, les substituts Réponse notification d'irrégularités du 7 Juillet 2012960784 18.. pourront être implantés après un temps de culture cellulaire in vitro pour développer un tissu dans les espaces inter-membranaires et /ou un tapis endothélial dans la lumière interne du tube. L'implantation peut avoir lieu notamment au niveau d'une artère ou d'un vaisseau sanguin à réparer, lors 5 d'opérations de chirurgie en remplacement ou en dérivation (pontage) d'un vaisseau lésé. En outre, les substituts selon l'invention pourront être utilisés en tant que dispositif à relargage de principe ou molécule actifs encapsulés ou insérés dans la structure de l'hydrogel constituant les membranes ou dans les chambres inter-membranaires. Les substituts vasculaires selon l'invention 10 pourront donc être destinés à la réparation des lésions du tissu vasculaire dans des situations cliniques comme pontage, ou angioplastie, et notamment inhiber les mécanismes impliqués dans la resténose d'un vaisseau sanguin. Ils pourront être utilisés pour réparer des vaisseaux artériels suite à la chirurgie de résection d'un anévrisme. 15 D'autres applications biomédicales peuvent également être envisagées, notamment en tant que fistule artério-veineuse chez les patients dialysés ne disposant plus de solutions pour l'accès vasculaire. Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif. 20 Préparation de la structure tubulaire interne a) Tube monomembrane Un tube de 5mm de diamètre externe et de 5cm de long est obtenu après extrusion par un pousse seringue d'un collodion hydroalcoolique 50/50 eau/1,2-propanediol, v/v, à la concentration en acétate de chitosane (DA= 25 1,5% et Mw=350 000 g/mol) de 2% g/g d'eau, et coagulation dans une solution aqueuse de soude 1M. La coagulation est interrompue par extraction du gel de forme tubulaire du bain de coagulation après 5 minutes et rinçage à l'eau. La fin de la neutralisation est ensuite réalisée dans un bain de soude de concentration 4M, ce qui conduit à la formation d'un coeur gélifié. 30 L'extraction du gel de coeur est effectuée manuellement puis un rinçage dans 5L d'eau permutée pendant 12h est réalisé pour enlever les sels et l'alcool résiduel. Réponse notification d'irrégularités du 7 Juillet 2012960784 19 L'intérêt de l'introduction d'un alcool (de préférence choisi dans le groupe 1,2- et 1,3-propane- diol, 1,2-, 1,3- et 1,4-butane-diol, 1,2,3-propane-triol (glycérol)) dans un collodion de polysaccharide (ex: chitosane) 5 pour obtenir un hydrogel de concentration 0,02g chitosane /g d'eau est illustré sur les Figures 4A, 4B et 4C. Ces Figures mettent en évidence les propriétés mécaniques comparées d'hydrogels physique de chitosane obtenus par neutralisation dans un bain de soude de concentration 1M, d'un collodion d'un chitosane de DA 1,5 % et de Mw 350 000 g/mol de 10 concentration 2%g/g et contenant dans le solvant 100% d'eau (H20), 50% eau et 50% 1,2 propane diol (H20/Propanediol), et 50% eau et 50% glycérol (H20/glycérol). Les hydrogels sont lavés après neutralisation et contiennent in fine pour l'analyse mécanique uniquement de l'eau et le polysaccharide (chitosane). 15 Les échantillons analysés peuvent être des tubes pleins de diamètre 2mm et d'une longueur de gauge de 1,2cm ou des tubes creux de diamètre plus important (3 à 6 mm). Les tests de traction sont réalisés sur une machine de traction (modèle Adamel-Lhomargy DY22) avec un capteur de force de capacité maximale de 5 N et des mors à ressorts adaptés à des 20 échantillons de faibles rigidité. Les échantillons sont extraits de leur eau de conservation et sont placés rapidement (en 1 minute) dans le dispositif de traction, et les essais sont assez courts afin de prévenir la déshydratation du gel. La surface de la fibre étant très lisse, deux bouts de scotch double face (scotch 3M 12mm de large, ref. 3M 34-8501-8644-5) sont collés aux 25 extrémités de la fibre, pour ainsi éviter le glissement au cours du test de traction. Les fibres sont placées entre des mors constituées de petites pinces à ressort ajustable, et bien adaptées pour ces échantillons de faible rigidité. Les essais consistent en un chargement simple à une vitesse de déplacement de traverse constante de 2 mm/min jusqu'à rupture. Il est également 30 possible de réaliser des cycles de chargement/déchargement pour apprécier la composante élastique et plastique de la déformation. Tous les essais ont été réalisés à température ambiante, et à l'air ambiant. La loi de Réponse notification d'irrégularités du 7 Juillet 2012960 784 20 comportement mécanique est obtenue en traçant la courbe de la contrainte (c =F/So; F est la force appliquée à l'échantillon, So est la section initiale de l'échantillon) en fonction de la déformation (s=eL/Lo; ou Lo est la longueur initiale de la partie utile de l'échantillon, iL est la variation de la longueur 5 utile de l'éprouvette). D'autre part, le module d'Young (E) est déterminé par régression linéaire de la loi de comportement mécanique dans la gamme des faibles déformations, c'est-à-dire dans le domaine de déformation élastique (déformation Préparation de l'enveloppe externe Le tube (mono ou multi-membranaire) de la structure interne est immergé, en bouchant ses extrémités, dans une solution aqueuse d'acétate de chitosane de DA 46,2% et de masse Mw 300 000 g/mol. avec une concentration en mase de 1,5%. Après immersion, l'hydrogel revêtu est neutralisé dans un bain de soude 1M pendant 15 minutes. Puis, l'assemblage ainsi obtenu est lavé dans de l'eau permutée et renouvelée 6 fois pendant 12 h. Avant toute expérimentation biologique, tous les échantillons d'hydrogels de chitosane obtenus sont stérilisés dans l'eau par autoclave pendant 20 minutes à une température de 120°C. Constitution d'un tapis de cellules endothéliales sur les parois internes de la structure tubulaire interne ou dans un espace intermembranaire Des cellules endothéliales progénitrices (EPC) sont isolées du sang circulant humain par récupération de la fraction cellulaire mononucléée sur gradient de densité puis mises en culture (Clinicell Treated - Laboratoires MABIO) dans un milieu spécifique pour la différenciation des EPC en cellules endothéliales matures (Milieu EGM2-MV - Clonetics). Les cellules endothéliales de veine saphène humaine sont isolées par traitement enzymatique et mises en culture selon le protocole décrit par 25 Fernandez et al. (Tissue Engineering, Volume 12 (1), 2006). A l'issue de leur caractérisation phénotypique (expression de vWF, VE-cadhérine et CD31 en particulier) les cellules endothéliales matures sont ensemencées à la surface d'un hydrogel, dans un hydrogel en forme de tube creux ou dans un hydrogel multimembranaire à la densité moyenne de 105 30 cellules/cm2 et dans leurs milieux de différenciation respectifs pendant au minimum 5h afin de former la monocouche cellulaire. Les cellules adhérentes à l'hydrogel sont maintenues en culture entre 24 heures et quelques jours sans modification de la qualité de la monocouche cellulaire (confluence et expression des marqueurs phénotypiques maintenus). La Figure 5 présente une photographie en microscopie optique, 24 heures après ensemencement et coloration Live-Dead, d'une culture cellulaire de cellules endothéliales issues de progéniteurs endothéliaux du sang circulant, et cultivées dans un tube d'hydrogel physique de chitosane tel que précédemment préparé. La mise au point est effectuée sur le fond du tube, ce qui met en évidence la formation du tapis endothélial. La Figure 6, quant à elle, présente une photographie avec une mise au point dans un plan supérieur, ce qui met en évidence la monocouche endothéliale sur les parois du tube. Culture de cellules musculaires lisses dans l'espace intermembranaire de la structure tubulaire interne Des cellules musculaires lisses (SMC) sont obtenues de la veine du cordon ombilical humain par traitement enzymatique (collagénase) et cultivées en milieu pour SMC (SMC-Media 2 - PromoCell). Les cellules sont caractérisées phénotypiquement en culture (expression de la Smooth-Muscle a-actine) puis injectées dans l'espace inter-membranaire de structures de chitosane. La construction est gardée en culture pendant quelques jours à plusieurs semaines (jusqu'à 50 jours) sans mort cellulaire (analysée par coloration Live-Dead) ni disparition du marqueur phénotypique des SMC (expression de la Smooth-Muscle a-actine). La Figure 7 présente une photographie en microscopie optique d'une culture de cellules musculaires lisses (hSMC-human Smooth muscle cens) après marquage de la a-actine et marquage des noyaux cellulaires. Les cellules on été disposées dans la chambre inter-membranaire la plus externe d'un hydrogel physique multi-membranaire de chitosane tel que précédemment préparé. En situation clinique, les EPC comme les SMC pourront être obtenues à partir d'un patient qui constitue alors une source autologue. REVENDICATIONS1 - Substitut vasculaire biodégradable comportant une structure tubulaire interne et une enveloppe externe, chacune formée d'un hydrogel d'un polysaccharide, de collagène ou d'un mélange de ces polymères caractérisé en ce que les deux hydrogels formant la structure tubulaire interne et l'enveloppe externe sont différents et présentent, notamment, des propriétés mécaniques et une vitesse de colonisation par des cellules différentes. 2 - Substitut vasculaire biodégradable selon la revendication 1 caractérisé en ce que la structure tubulaire interne présente des propriétés de résistance mécanique supérieures à celles de l'enveloppe externe. 3 - Substitut vasculaire biodégradable selon la revendication 2 caractérisé en ce que la structure tubulaire interne présente une contrainte à la rupture supérieure à 0,05 MPa, de préférence supérieure à 0,2 MPa. 4 - Substitut vasculaire biodégradable selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que la structure tubulaire interne présente un module d'élasticité de Young supérieur à 0,01 MPa, et de préférence supérieur à 0,05 MPa. 5 - Substitut vasculaire biodégradable selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'enveloppe externe présente une vitesse de colonisation par des cellules supérieure à celle de la structure tubulaire interne. 6 - Substitut vasculaire biodégradable selon la revendication 5 caractérisé en ce que la colonisation cellulaire de l'enveloppe externe par les cellules du tissu conjonctif au contact duquel le substitut vasculaire est destiné à être implanté intervient en moins de 10 jours. 7 - Substitut vasculaire biodégradable selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la structure tubulaire interne et l'enveloppe externe sont toutes deux formées d'un hydrogel physique de chitosane. 8 - Substitut vasculaire biodégradable selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la structure tubulaire interne est constituée d'un hydrogel physique de chitosane, comportant une fractionsignificative d'une forme cristalline anhydre, éventuellement en mélange avec une forme cristalline hydratée. 9 - Substitut vasculaire biodégradable selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la structure tubulaire interne est obtenue par filage puis coagulation interrompue d'une solution hydro-alcoolique coagulable de chitosane. - Substitut vasculaire biodégradable selon la revendication 9 caractérisé en ce que l'alcool est choisi parmi les 1,2- et 1,3-propanediol, les 1,2-, 1,3- et 1,4-butanediol et le 1,2,3-propanetriol. 10 11 - Substitut vasculaire biodégradable selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la structure tubulaire interne est constituée d'un hydrogel de chitosane de degré d'acétylation inférieur à 10% et de masse molaire moyenne en masse Mw supérieure à 300 000 g/mol. 12 - Substitut vasculaire biodégradable selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'enveloppe externe est constituée d'un mélange polysaccharide/polysaccharide, par exemple chitosane/acide hyaluronique ou chitosane de DA inférieur à 10 % chitosane de DA supérieur à 30 %, ou encore d'un mélange polysaccharide/collagène, et par exemple d'un mélange acide hyaluronique/collagène ou chitosane/collagène. 13 - Substitut vasculaire biodégradable selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que l'enveloppe externe est constituée d'un hydrogel physique de chitosane, présentant quasi-exclusivement une forme cristalline hydratée, et de préférence exempte de forme cristalline anhydre. 14 - Substitut vasculaire biodégradable selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que l'enveloppe externe est constituée d'un hydrogel de chitosane de degré d'acétylation supérieur à 30 % et de masse molaire moyenne en masse Mw inférieure à 300 000 g/mol. 15 - Substitut vasculaire biodégradable selon la revendication 13 ou 14 caractérisé en ce que l'enveloppe externe est obtenue à partir d'une solution aqueuse de chitosane exempte d'alcool, qui après dépôt sur les parois externes de la structure tubulaire interne est neutralisée.16 - Substitut vasculaire biodégradable selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la structure tubulaire interne et l'enveloppe externe sont liées l'une à l'autre, notamment par enchevêtrement physique des hydrogels qui les constituent, au niveau de leur surface de contact. 17 - Substitut vasculaire biodégradable selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les parois internes de la structure tubulaire interne sont tapissées de cellules endothéliales vivantes. 18 - Substitut vasculaire biodégradable selon la revendication 17 caractérisé en ce que les cellules endothéliales sont fonctionnelles, c'est-à-dire semblables aux cellules endothéliales des tissus natifs et présentant des marqueurs spécifiques de ces tissus natifs, en exprimant des protéines comme la VE-Cadherine, CD31, le facteur de von Willbrand. 19 - Substitut vasculaire biodégradable selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le la structure tubulaire interne est constituée d'au moins deux membranes séparées par un espace intermembranaire contenant des cellules vivantes. - Substitut vasculaire biodégradable selon la revendication 17 à 19 caractérisé en ce que les cellules proviennent du patient sur lequel le 20 substitut est destiné à être implanté. 21 - Substitut vasculaire biodégradable selon la revendication 19 ou 20 caractérisé en ce que les cellules confinées dans l'espace inter-membranaire sont des cellules musculaires lisses. 22 - Substitut vasculaire biodégradable selon la revendication 21 caractérisé en ce que les cellules confinées dans l'espace inter-membranaire sont des cellules musculaires lisses associées à des cellules fibroblastiques. 23 - Procédé de préparation d'un substitut vasculaire selon l'une des revendications 1 à 22 comprenant les étapes suivantes : a) formation d'un tube, éventuellement multi-membranaire, d'un hydrogel de polysaccharide, de collagène ou d'un mélange de ces polymères, par filage puis coagulation interrompue d'une solutionhydro-alcoolique coagulable du polymère ou mélange de polymères sélectionné pour former le tube, b) formation sur la paroi interne ou externe du tube obtenu à l'étape a) d'une couche d'hydrogel d'un polysaccharide, de collagène ou d'un mélange de ces polymères à partir d'une solution aqueuse exempte d'alcool du polymère ou mélange de polymères sélectionné pour former la couche. 24 - Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que la couche est déposée sur la paroi externe du tube obtenu à l'étape a). 25 - Procédé selon la revendication 23 ou 24, caractérisé en ce que l'étape a) est réalisée à partir d'une solution hydro-alccolique de chitosane, la coagulation étant réalisée en milieu alcalin. 26 - Procédé selon la revendications 25, caractérisé en ce que le chitosane de la solution hydro-alcoolique présente un degré d'acétylation inférieur à 10% et une masse molaire moyenne en masse Mw supérieure à 300 000 g/mol. 27 - Procédé selon l'une des revendications 23 à 26, caractérisé en ce que l'étape b) est réalisé à partir d'une solution aqueuse de chitosane exempte d'alcool, qui après dépôt sur les parois externes de la structure tubulaire interne est neutralisée. 28 - Procédé selon la revendications 27, caractérisé en ce que le chitosane de la solution aqueuse présente un degré d'acétylation supérieur à 30 % et une masse molaire moyenne en masse Mw inférieure à 300 000 g/mol. 29 - Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'étape b) est réalisé à partir d'une solution aqueuse d'acétate ou de chlorhydrate de chitosane à une concentration inférieure à 2% m/m. - Procédé selon l'une des revendications 23 à 28, caractérisé en ce que l'alcool est un poly-alcool, de préférence choisi parmi les 1,2- et 1,3- 30 propanediol, les 1,2-, 1,3- et 1,4-butanediol et le 1,2,3-propanetriol.