FR 2960549 A1 20111202 FR 1002180 A 20100525 PROCEDE DE CULTURE D'ADIPOCYTES Domaine de l'invention L'invention concerne un procédé de culture d'adipocytes, une culture d'adipocytes, et son utilisation pour le criblage de composés modulant le métabolisme adipocytaire. Arrière-plan technique La prévalence de l'obésité, liée à une hypertrophie du tissu adipeux blanc, est en augmentation constante dans la population générale. Ainsi, la proportion des personnes en surpoids ou obèses a progressé de 36,7% à 41,6% entre 1997 et 2003 en France, en outre, la prévalence de l'obésité (définie par un index de masse corporelle (IMC) supérieur 30 kg/m2) y est de 14,5% en 2009. Par ailleurs, l'obésité est un facteur de risque pour de nombreux troubles pathologiques, dont notamment les accidents cardiovasculaires, rendant d'autant plus urgente sa prise en charge thérapeutique. Si les principaux axes de lutte contre cette épidémie restent l'amélioration de l'alimentation et l'augmentation de la dépense physique des individus obèses, d'autres approches, notamment chirurgicales et médicamenteuses sont également explorées. Les approches médicamenteuses actuelles visent principalement à réduire les apports énergétiques, par exemple en limitant l'absorption intestinale de lipides (orlistat), ou en diminuant l'appétit, soit en favorisant la sensation de satiété (sibutramine), soit en diminuant le plaisir associé à la prise alimentaire (rimonabant). Toutefois, l'efficacité limitée de ces méthodes ou leurs effets secondaires - il a ainsi été rapporté que le rimonabant pouvait provoquer des troubles dépressifs sévères - ont notamment conduit au retrait de la sibutramine et du rimonabant du marché, laissant des options thérapeutiques très limitées et rendant nécessaires l'exploration d'autres voies, permettant par exemple de moduler le métabolisme des cellules adipocytaires pour limiter le stockage des lipides ou au contraire favoriser leur utilisation. Cette dernière voie est cependant rendue difficile d'approche par l'absence de modèles in vitro ou animaux d'étude du métabolisme adipocytaire véritablement représentatifs de la situation in vivo chez l'homme. En effet, s'agissant des modèles in vitro, les cellules adipocytaires matures, notamment caractérisées par la présence d'une vacuole lipidique unique, qui forment le tissu adipeux blanc, sont particulièrement fragiles et, de fait, ces cellules perdent généralement en moins de 48 h leurs propriétés métaboliques et sécrétoires en culture. Plusieurs systèmes de culture ont ainsi été proposés pour surmonter ces difficultés. Toutefois, ces cultures comprennent des types cellulaires additionnels en plus des adipocytes, tels que des pré-adipocytes ou des cellules endothéliales (Sonda et al. (2008) Endocrinology 149:4794-4798) ou se font généralement à l'aide d'adipocytes différenciés in vitro à partir de cellules souches (Choi et al. (2010) Tissue Engineering. Part C, Kang et al. (2007) Biomaterials 28:450-458) ou de pré- adipocytes (Daya et al. (2007) Differentiation 75:360-370, WO 2007/113591, Stacey et al. (2009) Tissue Engineering: Part A 15:3389-3399), dont le phénotype est relativement éloigné de celui des adipocytes matures isolés de tissu adipeux (voir les Figures 1 à 3). Ainsi, ces systèmes n'apparaissent pas être spécifiquement et directement 20 représentatifs du métabolisme d'adipocytes matures isolés du tissu adipeux. C'est donc un objet de la présente invention que de fournir un tel système de culture, proche de la physiologie, notamment humaine. Résumé de l'invention 25 La présente invention résulte de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, que des adipocytes matures isolés de tissu adipeux pouvaient être cultivés, en l'absence d'autres types cellulaires, à l'aide d'un support de culture tridimensionnel et que les adipocytes ainsi cultivés conservent pendant au moins 48 h un phénotype semblable à celui d'adipocytes matures fraichement isolés. 30 La présente invention concerne ainsi un procédé de culture d'adipocytes, dans lequel une population homogène d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux est cultivée sur un support de culture tridimensionnel. La présente invention concerne également une culture d'adipocyte, comprenant une monoculture d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux au contact d'un support de culture tridimensionnel. L'invention concerne également l'utilisation d'une culture d'adipocytes selon l'invention, pour le criblage de composés modulant le métabolisme adipocytaire. L'invention concerne également une méthode de criblage de composés modulant le métabolisme adipocytaire, dans laquelle : on met en contact un composé à cribler avec une culture d'adipocytes selon l'invention ; on détermine si au moins un paramètre représentatif du métabolisme adipocytaire de la culture d'adipocytes est modifié par rapport à une culture d'adipocytes selon l'invention n'ayant pas été mise en contact avec le composé à cribler ; on sélectionne le composé s'il modifie au moins paramètre représentatif du métabolisme adipocytaire. Description détaillée de l'invention Comme on l'entend ici l'expression « adipocytes matures » représente des adipocytes différenciés. Les adipocytes matures peuvent être aisément identifiés par l'homme du métier. En particulier, un adipocyte mature selon l'invention présente habituellement une vacuole lipidique unique, une activité lipolytique, notamment inductible par des agents 13-adrénergiques, tels que l'adrénaline et la noradrénaline, ainsi qu'une sensibilité à l'insuline, en particulier définie par un transport inductible par l'insuline, depuis le milieu extracellulaire vers le milieu intracellulaires, de glucose et d'acides gras, lequel transport est notamment lié à la translocation insulino-dépendante, au sein de la membrane plasmique des adipocytes matures, des transporteurs GLUT-4 et CD36 respectivement. Les adipocytes matures selon l'invention se distinguent en particulier des pré-adipocytes, notamment en ce que l'expression du marqueur spécifique des pré-adipocytes De1K1/Prefl, bien connu de l'homme du métier, qui peut être mesurée par PCR en temps réelle, est essentiellement absente dans les adipocytes matures selon l'invention. Les adipocytes matures selon l'invention sont isolés de tissu adipeux. Ainsi, les adipocytes matures selon l'invention sont notamment tels qu'ils ne proviennent pas de la différenciation in vitro de précurseurs adipocytaires, tels que les préadipocytes ou les cellules souches, totipotentes, multipotentes, ou pluripotentes. S'agissant du tissu adipeux selon l'invention, il peut provenir de n'importe quelle espèce animale. Toutefois, on préfère que le tissu adipeux selon l'invention ait été prélevé chez un ou plusieurs individus humains. Les adipocytes matures peuvent être isolés à partir de tissu adipeux par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier, prenant notamment avantage de la faible densité des adipocytes matures. En particulier, le tissu adipeux peut être traité à la collagénase, puis après digestion, être filtré sur de la gaze de coton tissé ; le filtrat est laissé à décanter dans un milieu aqueux et une population homogène d'adipocytes matures selon l'invention peut être récupérée en récoltant les cellules flottantes. Comme on l'entend ici, « une population homogène d'adipocytes matures » est notamment telle qu'elle est essentiellement exempte d'autres types cellulaires, notamment de cellules endothéliales ou de pré-adipocytes. En particulier, une population homogène d'adipocytes matures selon l'invention comprend moins de 10%, plus particulièrement moins de 5% de cellules autres que des adipocytes matures, notamment de pré-adipocytes. La quantité de pré-adipocytes dans une population homogène d'adipocytes matures peut être déterminée en quantifiant le nombre de cellules exprimant un marqueur spécifique des pré-adipocytes, tel que DelKl/Prefl par exemple. Comme on l'entend ici, une « monoculture d'adipocytes mature » est une 25 culture d'une population homogène d'adipocytes matures. Une population homogène d'adipocytes matures est dite « cultivée » ou en « culture » lorsqu'elle est incubée dans des conditions permettant la survie des cellules constituant la population. De telles conditions ainsi que les milieux de culture adéquats sont bien connus de l'homme du métier. A titre d'exemple, la 30 population peut être incubée dans un milieu DMEM/F12, 1% Penicilline- Streptomycine, 50 nM Insuline, sous agitation, à 37°C et dans une atmosphère à 5% CO2, le milieu étant régulièrement renouvelé. De manière avantageuse, les milieux de culture des adipocytes matures selon l'invention peuvent comprendre des composés destiné à moduler l'activité métabolique des adipocytes matures, tels que la forskoline et la dexaméthasone, par exemple. Selon l'invention, les adipocytes matures sont « cultivés sur un support de culture tridimensionnel » lorsque les adipocytes sont au contact du support, c'est dire qu'ils reposent sur le support ou qu'ils adhèrent au support. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de culture d'adipocytes selon l'invention comprend les étapes suivantes : - mettre en contact une population homogène d'adipocytes avec un support de culture tridimensionnel ; - incuber les adipocytes matures en contact avec le support de culture, en particulier dans des conditions permettant la survie des cellules, notamment pendant au moins 48 h. Un « support de culture tridimensionnel » selon l'invention est constitué d'un matériau, notamment biocompatible, adapté à l'obtention d'une culture tridimensionnelle de cellules ; autrement dit, le support de culture tridimensionnel est adapté, en particulier, à l'obtention de plusieurs couches de cellules superposées. Ainsi, un support de culture ne permettant que la culture d'un tapis cellulaire bidimensionnel, à savoir une monocouche de cellules, n'est pas un support de culture tridimensionnel selon l'invention. De préférence, le support de culture tridimensionnel selon l'invention est un hydrogel. Plus préférablement, le support de culture tridimensionnel selon l'invention est un hydrogel formé de l'association non covalente de peptides comprenant de 10 à 30 résidus, tels que des peptides comprenant une répétition de la séquence R-A-D-A, et notamment une séquence R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-R-AD-A (SEQ ID NO : 11). Les peptides formant l'hydrogel peuvent être modifiés, par exemple par l'adjonction de groupements acétyles sur l'extrémité N-terminale des peptides et par l'adjonction d'un groupement -NH2 à l'extrémité C-terminale des peptides. Ainsi, les peptides peuvent être représentés par la séquence : Ac-R-A-D-A- R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-CONH2. De manière particulièrement préférée, le support de culture tridimensionnel selon l'invention est l'hydrogel PuraMatrixTM (3DM, Inc.). Les composés susceptibles d'être criblés selon l'invention peuvent être de tout type. En particulier, il peut s'agir de composés issus de chimiothèques. Par ailleurs, la culture d'adipocytes selon l'invention peut être utilisée pour cribler des composés activant la lipolyse, ou des composés activant le facteur de transcription PPARy2 ; ou des composés modulant la sensibilité à l'insuline. Comme on l'entend ici, la lipolyse (ou activité lipolytique), la sensibilité à l'insuline, ou l'activité du facteur de transcription PPAR72, sont des paramètres représentatifs du métabolisme adipocytaire. La détermination de la lipolyse peut être mise en oeuvre par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'activité lipolytique peut être déterminée en mesurant la quantité de glycérol et d'acides gras libres libérée par une culture d'adipocytes selon l'invention, notamment par spectrophotométrie comme cela est décrit dans Lacasa et al. (1991) Endocrinology 128:747-753. La sensibilité à l'insuline des adipocytes peut être évaluée d'après la mesure du transport du glucose dans l'adipocyte comme cela est décrit dans Wood et al. (2007) Biochem.Biophys. Res. Commun. 361:468-473. L'activité du facteur de transcription PPAR72 peut être mesurée en déterminant la quantité d'ARNm le codant dans une cellule, par exemple par RT-PCR ou par mesure directe de l'activité de liaison à ses sites spécifiques de l'ADN comme cela est notamment décrit dans Keophiphath et al. (2009) J. Nutr. 139 : 2055-2060. Description des figures Figures 1, 2 et 3 Les figures 1 à 3 représentent respectivement le niveau d'expression relative (axe des ordonnées, unités arbitraires) mesuré par PCR en temps réel de trois marqueurs spécifiques des adipocytes matures, à savoir PPARy2, FABP4 (un transporteur d'acide gras dont le gène est une cible de PPARy2), et une adipokine, l'adiponectine, dans des adipocytes matures fraichement isolés de tissu adipeux d'une part (barre noires) et dans des adipocytes obtenus par différenciation in vitro de pré-adipocytes comme cela est décrit dans Lacasa et al Endocrinology 148:868-877, d'autre part (barre blanches). Figure 4 La figure 4 représente un gel d'immunoélectrophorèse de lysats cellulaires préparés à partir d'adipocytes matures maintenus en culture sur le support tridimensionnel pendant 48 heures (3D) et d'adipocytes matures fraichement isolés (JO) puis marqués à l'aide d'un anticorps dirigé contre le marqueur adipocytaire aP2/FABP4 et d'un anticorps dirigé contre un témoin positif (actine). Figures 5 et 6 Les figures 5 et 6 représentent respectivement les niveaux d'activité lipolytique (axe des ordonnées, en unités arbitraires) basale et stimulée par la forskoline (FK) d'adipocytes matures cultivés (i) dans le support de culture tridimensionnel (3D) en l'absence (barres blanches) et en présence de dexaméthasone (Dex) (barres noires), et (ii) en monocouches (2D) (barres grisées), en fonction de la durée de culture (axe des abscisses, en jours). L'expérience présentée est représentative d'un ensemble de trois expériences repliquées. Figures 7 et 8 Les figures 7 et 8 représentent respectivement les quantités de leptine et d'adiponectine secrétées (axe des ordonnées, en pg/ml/24h) par des adipocytes mature cultivés dans le support de culture tridimensionnel (3D) en l'absence (barres blanches) et en présence de dexaméthasone (Dex) (barres noires). L'expérience présentée est représentative d'un ensemble de trois expériences répliquées. Figure 9 La figure 9 représente l'expression génique relative de marqueurs adipocytaires (axes des ordonnées, unités arbitraires) mesurée par PCR en temps réel à partir d'extraits d'adipocytes matures fraichement isolés (barres noires) et d'adipocytes mature maintenus 48h en culture dans le support de culture tridimensionnel (barres blanches). Exemples A. Matériels et Méthodes 1. Matériels L'hydrogel peptidique BDTM PuramatrixTM est obtenu de BD Biosciences (Two oak Park, Bedford, MA, USA). Les anticorps primaires anti cavéoline-1 (N-20, SC-894) et antiCD36 (1.BB.3414, CS-70642) utilisés proviennent de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Les anticorps correspondants couplés à Cy3 sont obtenus auprès de GE healthcare (Little Chalfont, UK). 2. Préparation des adipocytes matures isolés Les adipocytes matures sont isolés par traitement à la collagénase de tissu adipeux humain. Le tissu adipeux humain sous-cutané de femmes jeunes ( 5. Mesure de la sécrétion des adipokines Le milieu DMI est prélevé 24 heures après le dernier changement de milieu. Le dosage des adipokines (leptine, adiponectine) est réalisé directement sur ce milieu (100 µl) par la technique ELISA (Duoset, R&D Systems, Minneapolis, MN USA) comme décrit par le fabricant. 6. Mesure de l'expression génique Le milieu DMI est rapidement éliminé des puits et l'ensemble gel/adipocytes est homogénéisé par le tampon de lyse dans la proportion de 1m1 de tampon de lyse/lml d'ensemble gel/adipocytes. Les ARN sont ensuite extraits avec au préalable un traitement délipidant par le chloroforme en utilisant le kit d'extraction RNeasy (Qiagen, Courtaboeuf, France) comme décrit dans Lacasa et al. (2007) Endocrinology 148:868-877. Les ARNs totaux (1 µg) sont ensuite transcrits en ADNc comme décrits dans Lacasa et al. (2007) Endocrinology 148:868-877. La liste des amorces utilisées est indiquée dans le tableau 1. Les essais de PCR en temps réel sont effectués avec 25ng d'ADNc et les amorces sens et antisens en utilisant le mélange PCR universel Sybergreen (Applied Biosystems, Minneapolis, MN USA) et mesurés dans un appareil de détection (Applied Biosystems). Toutes les valeurs sont normalisées par rapport à l'expression de la protéine ribosomale RPLPO. Gène Sens Antisens Adiponectine TGTGATCTTGGCTCACTGTC CAGCTACTTGGGAGGCTGA (SEQ ID NO : 1) (SEQ ID NO : 2) aP2/FABP4 CCTTTAAAAATACTGAGATTTCCTTCA GGACACCCCCATCTAAGGTT (SEQ ID NO : 3) (SEQ ID NO : 4) Leptine AGAAAGTCCAGGATGACACC GACTGCGTGTGTGAAATGTC (SEQ ID NO : 5) (SEQ ID NO : 6) PPARy CAGGAAAGACAACAGACAAATCA GGGGTGATGTGTTTGAACTTG (SEQ ID NO : 7) (SEQ ID NO : 8) LPL ATGTGGCCCGGTTTATCA CTGTATCCCAAGAGATGGACA (SEQ ID NO : 9) (SEQ ID NO : 10) Tableau 1 : Amorces utilisées 7. Techniques d'immunofluorescence Après élimination du milieu DMI et lavage par du PBS, l'ensemble gel/adipocytes est déposé dans des puits de plaques à 96 puits et fixé par 4% paraformaldéhyde (PAF) pendant 1 heure. Après inactivation du PAF par traitement par un tampon PBS/Glycine 0,1M, les cellules sont perméabilisées 5 minutes à température ambiante par 0,1% Triton X-100 dans du PBS/3% albumine. Les sites non spécifiques sont bloqués par le tampon PBS/3% albumine pendant 4 heures à température ambiante puis les anticorps primaires sont ajoutés et l'incubation se poursuit pendant 14 heures à 4°C. Après 6 lavages (1 heure), l'ensemble gel/adipocytes est incubé avec les anticorps secondaires pendant 4 heures à température ambiante dans l'obscurité. L'ensemble gel/adipocytes est ensuite lavé (1 heure) et des fragments de ce gel sont déposés dans du milieu de montage (Fluomount, Birmingham, Alabama, USA) entre lame et lamelles. Les lames sont examinées en fluorescence après 24 heures. 8. Techniques d'immun-électrophorèse Après élimination du milieu DMI et lavage par du PBS, l'ensemble gel/adipocytes est rapidement lysé par un volume de tampon de lyse (PBS, 2% IGEPAL, 0,2% SDS, 1% desoxycholate de sodium) contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Complete mini et Phosphostop, Roche diagnostics). L'homogénat est ensuite gardé 15 minutes à 4°C puis centrifugé 10 minutes à 5000g. Le lysat cellulaire est ensuite collecté et dilué dans du tampon de Laemmli et soumis à une électrophorèse comme décrit dans Lacasa et al. (2007) Endocrinology 148:868-877. Après transfert des protéines sur membrane de cellulose, une coloration au rouge Ponceau permet de vérifier la charge et la qualité du transfert. Les membranes sont ensuite incubées avec les anticorps primaires à 4°C pendant 14 heures. Puis, après lavages, les membranes sont incubées avec les anticorps secondaires (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Les signaux sont détectés par chimioluminescence (Detection ECL, GE Healthcare) et quantifiés par densitométrie. B. Résultats 1. Homogénéité de la population adipocytaire mature La proportion de pré-adipocytes contaminants présent dans la population d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux utilisée pour la culture a été déterminée en mesurant l'expression par PCR en temps réel du marqueur De1K1/Prefl spécifique des pré-adipocytes. Cette mesure montre que la population d'adipocytes matures utilisée est essentiellement homogène, dans la mesure où elle comprend moins de 5% de préadipocytes (environ 4%).30 2. Détection des protéines adipocytaires Les adipocytes matures cultivés dans le support tridimensionnel formé par l'hydrogel présentent bien un aspect uniloculaire après marquage par immunofluorescence des protéines membranaires CD36 et cavéoline-1, ce qui démontre la possibilité de détecter des protéines adipocytaires membranaires. Par ailleurs, les lysats adipocytaires peuvent être analysés par immuno-électrophorèse comme le montre la détection de la protéine cytosolique adipocytaire aP2/FABP4 et de l'actine (Figure 4), 3. Activité lipolytique L'activité lipolytique est mesurée en conditions basales et en conditions stimulées par 10 µM de forskoline sur les adipocytes matures maintenus dans l'hydrogel pendant 7 jours. Cette activité est également comparée à celle des mêmes cellules fraichement isolées. Les résultats présentés dans les Figures 5 et 6 montrent que l'activité lipolytique basale (Figure 5) et stimulée par la forskoline (Figure 6) est du même ordre que celle des adipocytes fraichement isolés et reste constante pendant 5-7 jours. Par ailleurs, la présence de dexaméthasone (glucocorticoïde de synthèse) dans le milieu de culture ne modifie pas les activités basales et stimulées. 4. Sécrétion des adipokines : adiponectine et leptine La sécrétion d'adiponectine (Figure 7) et de leptine (Figure 8) est mesurée jusqu'à 7 jours de maintien des adipocytes matures dans l'hydrogel en présence ou non de dexaméthasone (glucocorticoïde de synthèse). Par ailleurs, comme le montre la Figure 7, la sécrétion de leptine diminue au cours de la culture en l'absence de dexaméthasone alors que cette sécrétion augmente en présence du glucocorticoïde démontrant ainsi que la réponse à ces hormones reste fonctionnelle dans les adipocytes en culture. La sécrétion d'adiponectine reste quant à elle constante pendant 7 jours (Figure 8).30 5. Expression génique des adipocytes : L'expression de gènes adipocytaires est comparée entre des adipocytes matures fraichement isolés et les mêmes cellules maintenues pendant 2 jours en hydrogel. La Figure 9 montre que l'expression des adipokines (leptine et adiponectine), du facteur de transcription majeur adipocytaire PPARy2 et de ses gènes cibles aP2/FABP4 et LPL reste constante. Conclusions Les adipocytes matures maintenus dans un support de culture tridimensionnel d'hydrogel avec un milieu d'incubation, qui peut être supplémenté avec des glucocorticoïdes et des thiazolinidinediones, présentent une activité lipolytique et de sécrétion des adipokines (leptine et adiponectine) comparable à celles d'adipocytes fraichement isolés. De plus, les adipocytes matures maintenus dans l'hydrogel conservent pendant au moins 7 jours la capacité de réponse aux glucocorticoïdes, hormones cruciales pour le métabolisme et le développement adipocytaires (Macfarlane et al. (2008) J. Endocrinol. 197:189-204). Ainsi, ce système peut être utilisé pour le criblage de composés pharmacologiques présentant des activités lipolytiques ou d'activation du facteur de transcription adipo-spécifiques PPARy2, par exemple. REVENDICATIONS1. Procédé de culture d'adipocytes, dans lequel une population homogène d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux est cultivée sur un support de culture tridimensionnel. 2. Procédé de culture d'adipocytes selon la revendication 1, dans lequel le support de culture tridimensionnel est un hydrogel. 3. Procédé de culture d'adipocytes selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le support de culture tridimensionnel est un hydrogel formé de l'association non covalente de peptides comprenant de 10 à 30 résidus. 4. Procédé de culture d'adipocytes selon la revendication 3, dans lequel les peptides 15 comprennent la séquence R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A (SEQ ID NO : 11). 5. Procédé de culture d'adipocytes selon la revendication 1, dans lequel le tissu adipeux a été prélevé chez un ou plusieurs individus humains. 6. Culture d'adipocytes, comprenant une monoculture d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux au contact d'un support de culture tridimensionnel tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3. 25 7. Culture d'adipocytes selon la revendication 6, dans laquelle le tissu adipeux a été prélevé chez un ou plusieurs individus humains. 8. Utilisation d'une culture d'adipocytes telle que définie dans la revendication 6 ou 7, pour le criblage de composés modulant le métabolisme adipocytaire. 9. Utilisation d'une culture d'adipocytes selon la revendication 8, pour le criblage de composés activant la lipolyse. 20 30 10. Utilisation d'une culture d'adipocytes selon la revendication 8, pour le criblage de composés activant le facteur de transcription PPARy2.5