FR 2962739 A1 20120120 FR 1055716 A 20100713 Souches virales modifiées et procédé pour améliorer la production de semences vaccinales de virus influenza La présente invention se rapporte à des virus influenza A/PR/8/34 modifiés portant un gène PB1 modifié ainsi qu'à des procédés mettant en oeuvre des virus réassortants ayant le fond génétique des virus A/PR/8/34 modifiés pour la production de semences vaccinales de virus influenza. La grippe est une infection respiratoire virale fréquente, observée partout dans le monde, évoluant par bouffées épidémiques hivernales dans les régions tempérées, due aux virus influenza. Elle reste de nos jours la deuxième cause de mortalité infectieuse après les pneumonies. Les virus influenza responsables de pathologie chez l'homme sont les virus influenza de typa A et B. Alors que les virus influenza de type B circulent sous forme de lignage, les virus influenza de type A sont classés en sous types viraux en fonction des propriétés antigéniques des deux glycoprotéines majeures de surface, l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). Les virus influenza présentent entre 300 et 700 glycoprotéines à leur surface associée à un ratio théorique NA/HA de un pour dix. Les virus circulants chez l'homme et responsables des épidémies saisonnières sont les virus A (H1Nl) et A (H3N2). Le principal réservoir des virus influenza étant le réservoir animal (aviaire et porcin), des virus animaux peuvent franchir la barrière d'espèce et infecter l'homme. Des virus comme le virus aviaire hautement pathogène A (H5N1) et le virus A (H1Nl) pandémique peuvent entrainer de graves problèmes de santé publique. La vaccination est, pour l'instant, le seul moyen efficace pour protéger les populations des virus influenza. Le vaccin dit saisonnier permet d'acquérir une immunité contre les virus circulants saisonniers A (H1Nl), A (H3N2) et les virus B. Il est défini chaque année par l'OMS à partir des souches prototypes de l'année antérieure. La réponse immunitaire de l'hôte est principalement de type humorale avec synthèse d'anticorps neutralisants qui sont dirigés contre les protéines HA et NA. En raison d'une dérive antigénique importante de ces deux protéines, en particuliers pour les virus de type A, la composition vaccinale doit être réévaluée annuellement. Le processus classique de production de vaccin repose dans un premier temps sur l'obtention par réassortiment génétique avec la souche A/PR8/34 (H1Nl), de semences vaccinales sur oeuf, pour chacune des 3 souches prototypes déterminées par l'OMS. La plupart des fabricants de vaccin utilisent de manière usuelle ces virus réassortants dérivant principalement du virus parental A/PR/8/34. Ainsi, chaque semence vaccinale est issue d'un processus de réassortiment génétique entre la souche prototype et le virus A/PR8/34 (H1Nl) qui possède des capacités réplicatives optimales en oeuf. La particule virale contient huit gènes distincts constitués d'une chaîne unique d'ARN, chacun des gènes codant une à trois protéines déterminées du virus : HA, NA, Ml, M2, NP, NS1, NS2, PB1, PB1F2, PB1N40, PB2 et PA. Par conséquent, un long processus de sélection permet l'obtention du réassortant vaccinal, comportant au minimum les segments de gènes codant pour HA et NA de la souche prototype sur le fond génétique du virus PR8 (composition « 6+2 »). Les 3 réassortant vaccinaux, issus du réassortiment génétique entre les 3 souches prototypes et la souche parentale A/PR/8/34 sont ensuite amplifiées sur oeuf. Les antigènes HA et NA sont purifiés à partir des productions allantoïques, associés ou non avec des adjuvants afin de produire les doses vaccinales. Ce processus industriel pour la fabrication des doses vaccinales est long (4 à 6 mois). Des stratégies alternatives pour l'obtention des doses vaccinales se sont développées ces dernières années. En effet, l'utilisation de lignée cellulaire pour l'amplification des reassortants vaccinaux permet entre autre de ne plus être dépendant du système « oeuf » (quantité d'oeuf pas suffisante pour la gestion d'une pandémie), réduit les modifications des antigènes de surface régulièrement observées dans la production allantoïque et n'entraine pas d'allergies. Cependant, à l'heure actuelle, peu d'industriels ont choisis ce nouveau mode de production car le processus industriel est loin d'etre aussi performant que les oeufs pour l'instant. Afin de réduire au minimum le temps de production des doses vaccinales et avec l'objectif d'avoir un niveau de rendement équivalent, en terme de nombre de dose, l'obtention des semences vaccinales peut être réalisée par l'utilisation des techniques de génétique inverse, permettant d'obtenir rapidement le réassortant vaccinal de composition "6+2", éliminant ainsi toutes les étapes de sélection. La production de virus recombinés par génétique inverse présente l'alternative la plus réaliste pour répondre efficacement à la demande de vaccins. La production de virus recombinés par génétique inverse donne la possibilité, dans un deuxième temps, de produire un virus PR8 « optimisé » permettant, lorsqu'il sera utilisé par un processus de réassortiment génétique avec des souches prototypes, de produire des reassortants vaccinaux présentant des caractéristiques virales optimisées pour la production de dose vaccinale en oeuf ou en cellule. Dans le contexte actuel de 1' émergence d'un virus pathogène pandémique l'infection grippale pourrait entrainer 1,3 à 2 millions d'hospitalisations et de 280 000 à 30 650 000 décès dans les seuls pays industrialisés (données OMS). La dose vaccinale est définie par une quantité d'antigène HA fixe (15 microgramme /sous-type viral/dose). Une détection positive de l'antigène NA est nécessaire pour la validation des lots vaccinaux. Un des enjeux économiques majeurs est de pouvoir réduire le coût de fabrication d'une dose vaccinale (plus de doses par production et/ou réduction du 35 temps d'obtention de la même quantité de doses). Wanitchang et al. décrivent l'amélioration de la croissance et l'augmentation de l'activité NA de virus réassortant exprimant les glycoprotéines HA/NA du virus H1Nl (S-01V) lorsque le gène PB 1 du virus A/PR/8/34 réassortant (« 5+3 ») est remplacé par le gène PB1 du virus S-01V. L'amélioration de la croisssance et l'augmentation de l'activité NA sont cependant spécifiques des glycoprotéines HA/NA de S-01V. En outre, l'amélioration de croissance et l'augmentation de l'activité NA ne sont pas détectées chez un virus A/PR/8/34 réassortant (« 7+1 ») portant le gène PB1 de S-01V. La présente invention concerne des souches virales (réassortants vaccinaux) produisant plus de glycoprotéines de surface et des procédés pour améliorer la production des glycoprotéines de surface HA/NA. L'invention consiste notamment en la modification de virus PR8 usuellement utilisés pour la production des semences vaccinales du virus de la grippe. Cette modification consiste en la modification de certains acides aminés de la protéine PB 1 afin d'obtenir des réassortants vaccinaux présentant une plus grande quantité de glycoprotéines de surface (HA et NA) et un ratio HA/NA différent en faveur de la NA. Celles-ci constituent les antigènes des doses vaccinales anti-influenza. L'invention permet d'optimiser quantitativement et qualitativement les semences vaccinales des virus influenza de type A et B. Un des avantages de l'invention est d'augmenter l'immunogénicité des doses vaccinales par surexpression de NA par rapport à une quantité donnée de HA produite. Un autre avantage est de disposer d'un système qui permettra d'augmenter le nombre de doses vaccinales produites sur oeuf ou cellule par l'augmentation de l'expression des glycoprotéines de surface. RESUME DE L'INVENTION L'invention concerne des virus influenza A/PR/8/34 modifiés comprenant un gène PB1 modifié et dont la quantité de glycoprotéines HA-NA (hémagglutinine et neuraminidase) à la surface dudit virus influenza A/PR/8/34 portant ledit gène PB1 modifié est augmentée par rapport à la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface d'un virus A/PR/8/34 ne portant pas de gène PB 1 modifié. De préférence, la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface dudit virus A/PR/8/34 portant un gène PB1 modifié est supérieur à 550 glycoprotéines pour un virion 30 de 100 nm de diamètre. Dans des modes de réalisation préférés, le virus influenza A/PR/8/34 modifié porte un gène PB1 modifié codant pour une protéine PB1 portant au moins les modifications 188 (K-*E), 205 (M-*I), 212 (L-*V), 216 (S-*G), 398 (E-*D), 486 (R-*K), 563 (I-*R), 576 (I-*L), 581 (E-*D), 584 (R-*Q), 586 (K-*R), 617 (D-*N), 621 (Q-*R), 682 (V-*I) et 35 691 (R-*K). Dans un autre mode de réalisation avantageux, le virus influenza A/PR/8/34 modifié comprend le gène PB1 d'une autre souche de virus influenza de type A dont la quantité de glycoprotéines de surface HA-NA est supérieur à 550 glycoprotéines pour un virion de 100 nm de diamètre. De préférence, le virus influenza A/PR/8/34 modifié comprend le gène PB1 d'un virus influenza H3N2 ayant la séquence de la SEQ ID No. 2. De préférence, le virus influenza A/PR/8/34 modifié est un virus réassortant comprenant les gènes HA et NA d'un autre virus influenza. Préférentiellement, les gènes HA et NA sont les gènes d'un virus influenza choisi parmi les virus ayant les sous types H3N2, H2N2, H1N2, H5N2, H5N1, H7N7, H9N2 et H3N1. Un autre objet de l'invention est un procédé pour produire des glycoprotéines HA-NA vaccinales de virus influenza danslequel on amplifie sur oeuf un virus influenza modifié selon l'invention et comprenant les gènes HA et NA codant pour lesdites glycoprotéines HA-NA vaccinales. De préférence, les glycoprotéines HA-NA vaccinales sont choisies parmi les glycoprotéines H3N2, H2N2, H1N2, H5N2, H5N1, H7N7, H9N2 et H3N1. L'invention a également pour objet des procédés pour accroître la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface d'un virus influenza A/PR/8/34 comprenant la modification du gène PB1 dudit virus. De préférence, ces procédés comprennent la modification du gène PB1 dudit virus influenza A/PR/8/34 pour introduire dans la protéine PB1 codé par ledit gène PB1 au moins les modifications ponctuelles d'acides aminés 188 (K-*E), 205 (M-*I), 212 (L-*V), 216 (S-*G), 398 (E-*D), 486 (R-*K), 563 (I-*R), 576 (I-*L), 581 (E-*D), 584 (R-*Q), 586 (K-*R), 617 (D-*N), 621 (Q-*R), 682 (V-*I) et 691 (R-*K). Préférentiellement, le virus A/PR/8/34 est un virus réassortant comprenant les 25 gènes HA et NA d'un autre virus influenza. Plus préférentiellement, le virus A/PR/8/34 est un virus réassortant comprenant les gènes HA et NA d'un virus influenza choisi parmi les virus ayant les sous types H3N2, H2N2, H1N2, H5N2, H5N1, H7N7, H9N2 et H3N1. Un autre objet de l'invention est un procédé pour améliorer le rendement de la 30 production de glycoprotéines HA-NA vaccinales de virus influenza par amplification dans des oeufs de virus réassortants ayant un fond génétique A/PR/8/34 caractérisé en ce que l'on accroît la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface dudit virus réassortant par la modification du gène PB1 de A/PR/8/34. Un autre objet de l'invention est un procédé pour préparer un virus réassortant pour 35 la production de glycoprotéines HA-NA vaccinales dans lequel on combine 6 gènes d'un virus A/PR/8/34 modifié selon l'invention avec deux gènes codant pour les glycoprotéines vaccinales HA et NA d'un virus influenza prototype. Enfin, l'invention se rapporte à un procédé pour accroître l'immunogénicité d'une dose vaccinale comprenant des glycoprotéines HA-NA de virus influenza en élevant le rapport NA/HA des glycoprotéines produites dans lequel les glycoprotéines sont produites par amplification sur oeufs d'un virus réassortant ayant le fond génétique d'un virus A/PR/8/34 modifié selon l'invention.. LISTAGE DE SEQUENCES SEQ ID No.l : Séquence protéique de PB1 de virus influenza A/PR8/8/34 A(H1N1) SEQ ID No.2 : Séquence protéique de PB1 de virus influenza Moscow/10/99 A(H3N2) DESCRIPTION DE L'INVENTION L'invention repose sur l'observation inattendue que différentes souches de virus influenza n'ont pas la même quantité de glycoprotéines HA et NA à leur surface. En particulier, il s'est avéré que les virus influenza ayant le fond génétique de la souche mère A/PR/8/34, utilisé par les industriels pour l'amplification virale par injection dans des oeufs fertilisés de poulet, expriment une plus faible quantité de glycoprotéines HA et NA à leur surface que d'autres souches de virus influenza. Cette constatation a une grande importance car des virus réassortants ayant un fond génétique A/PR/8/34 et exprimant des glycoprotéines HA et NA vaccinales sont classiquement utilisés pour la production de vaccins antigrippaux. Une dose vaccinale étant définie par une quantité d'antigène HA fixe de 15 µg/sous-type viral/dose. L'augmentation de la quantité de glycoprotéines produites par les virus influenza ayant un fond génétique A/PR/8/34 est un enjeu majeur pour améliorer le rendement de la production de doses vaccinales et diminuer le coût de fabrication de ces doses vaccinales. Au vu de ces résultats, il a maintenant été trouvé de façon inattendue que la quantité de glycoprotéines HA-NA produites par un virus ayant un fond génétique A/PR/8/34 peut être accrue par la modification génétique du gène PB1 de ce virus. La présente invention se rapporte ainsi à des virus modifiés ayant un fond génétique A/PR/8/34 produisant une quantité plus importante de glycoprotéines HA-NA de souches prototypes ainsi qu'à des procédés pour accroître le rendement de la production de glycoprotéines vaccinales HA-NA et à des procédés pour accroître la quantité de glycoprotéines produites par un virus A/PR/8/34. La présente invention se rapporte aussi à des virus modifiés ayant un fond génétique A/PR/8/34 ayant un ratio HA/NA différent en faveur de NA. L'invention se rapporte en particulier à des virus A/PR/8/34 modifiés comprenant un gène PB1 modifié ainsi qu'à des virus A/PR/8/34 modifiés réassortants comprenant un gène PB1 modifié et les gènes HA et NA d'un autre virus et notamment d'un virus prototype pour la production d'antigènes HA/NA vaccinaux. L'invention concerne également des procédés pour produire des glycoprotéines HA-NA comprenant l'amplification sur oeufs des virus modifiés ou des virus réassortants selon l'invention. Enfin, l'invention a aussi pour objet des procédés pour accroître significativement la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface d'un virus A/PR/8/34 ou d'un virus réassortant ayant un fond génétique A/PR/8/34. Ces procédés permettent d'améliorer le rendement de la production de glycoprotéines HA-NA. Par « virus influenza A/PR/8/34 », on entend des virus apparentés à la souche A/PR/8/34. La souche A/PR/8/34 résulte de l'adaptation à la culture sur oeufs de virus influenza, prélevés sur un patient à Puerto Rico en 1934,. Différents clones de la souche A/PR/8/34 ont été développés et sont bien connus de l'homme du métier. La souche A/PR/8/34, ainsi que différents clones dérivés de cette souche, ont fait l'objet de dépôts à 1'ATCC. Il s'agit notamment des dépôts ATCC VR-95 et VR-1469. Cette souche A/PR/8/34 est utilisée comme souche mère pour la préparation de virus réassortants ayant un haut potentiel de multiplication sur oeufs pour la production vaccinale. Différents clones de la souche A/PR/8/34 sont utilisés par les industriels mais ces clones demeurent génétiquement très proches et sont caractérisés par une forte capacité de croissance sur oeufs pour la production de vaccin. Les sequences des 8 segments de genes du virus A/PR/8/34 sont disponibles dans GENBANK sous les numéros suivants (HA : FJ888348.1, NA : CY038905.1, PB2 : CY040177.1, PA : CY038908.1, NS : CY040174.1, PB1 : CY040176.1, NP : CY040173.1 et M : CY040171.1). Par « virus influenza A/PR/8/34 modifié », on entend un virus apparenté à la souche A/PR/8/34 dont le gène PB1 est modifié. Les virus influenza de type A comprennent huit gènes dont notamment les gènes 25 PB1, HA et NA. Par « virus réassortant ayant le fond génétique du virus A/PR/8/34 modifié », on entend un virus réassortant possédant 6 gènes du virus A/PR/8/34 modifié, y compris le gène PB1 modifié, et les gènes codant pour les glycoprotéines HA et NA d'une autre souche de virus influenza. Les gènes codant pour les glycoprotéines HA et NA proviennent 30 en général de virus grippaux de type sauvage (ou virus prototype) qui ont été sélectionnés comme étant représentatifs de groupes importants de virus grippaux sur la base d'études antigéniques et génétiques approfondies (par les laboratoires associés à L'OMS). Ces virus grippaux de type sauvage (virus prototype) sont cultivés directement à partir d'échantillons cliniques. Chaque année l'OMS recommande ainsi de préparer un vaccin antigrippal à 35 partir de certains virus grippaux de type sauvage. Les virus réassortants correspondants ayant le fond génétique du virus A/PR/8/34 modifié ont une forte capacité de croissance sur oeufs (caractéristique de la souche A/PR/8/34) et expriment des glycoprotéines HA et NA pour la production vaccinale. Les termes « virus réassorants » et « réassortiment génétique» font référence à un processus par lequel les gènes de deux ou plusieurs virus grippaux se retrouvent dans des combinaisons différentes, pour donner des virus hybrides possédant des gènes de chacun des virus parentaux. Ce réassortiment génétique peut se produire naturellement ou être obtenu en laboratoire. Les virus influenza A/PR/8/34 modifiés selon l'invention comprennent un gène PB1 (protéine basique 1) modifié. Le gène PB1 des virus influenza de type A est bien connu de l'homme du métier. La séquence du gène PB1 de A/PR/8/34 est par exemple disponible dans GENBANK sous les numéros ( CY040176.1, CY038909.1, CY038901.1, EF190980.1, EF190972.1). Les gènes PB1 de différents clones de virus influenza A/PR/8/34 pourront présenter un petit nombre de divergences de séquence même si la dérive génétique pour le gène PB1 est faible. Dans un mode de réalisation particulier, le gène PB1 du virus influenza A/PR/8/34 code pour la protéine PB1 de la SEQ ID No.l. Par « gène PB1 modifié », on entend un gène PB1 portant des modifications au niveau de sa séquence entrainant une différence dans les séquence d'acides aminés des protéines codées par ce segment. Le gene PB1 code pour 3 protéines (PB1, PB1F2 et PB 1 N40), la protéine PB1 est bien connue et joue un rôle central dans la réplication/transcription du virus (sans cette protéine, pas de réplication). Les autres protéines sont dites auxiliaires et sont mal connues. La protéine PB1F2 semble joue un rôle in vivo tandis qu'une seule étude décrit un role putatif de la protéine PB1N40 dans la transcription. De plus, tous les segments de gènes PB1 des virus circulants ne codent pas tous pour la protéine PB1F2. L'homme du métier comprendra que des modifications du gène PB1 peuvent donc entraîner des modifications dans les protéines PB1, PB1F2 et /ou PB 1N40. Des virus A/PR/8/34 comprenant un gène PB1 modifié sont obtenus par mutagénèse du gène PB 1 de A/PR/8/34 et notamment par l'introduction de mutations dans la séquence du gène PB1 ou par le remplacement du gène PB1 de A/PR/8/34 par le gène PB1 d'une autre souche de virus influenza. Les termes « glycoprotéines HA-NA » réfèrent aux glycoprotéines hémagglutinine (HA) et aux glycoprotéines neuraminidase (NA). Il s'agit des protéines antigéniques spécifiques à la surface des virus influenza de type A pouvant induire la production d'anticorps neutralisants. Les virus influenza de type A se subdivisent en fonction de leur association d'hémagglutinine et de neuraminidase, il existe 16 sous-types HA et 9 sous- types NA. Grâce à la modification de leur gène PB1, les virus influenza A/PR/8/34 modifiés ainsi que les virus influenza réassortants vaccinaux comportant un fond génétique du virus A/PR/8/34 modifié de la présente invention ont une quantité de glycoprotéines HA-NA accrue à leur surface, par rapport à la quantité de glycoprotéines HA-NA habituellement présente à la surface des virus A/PR/8/34 ne portant pas de gène PB1 modifié. De préférence, la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface des virus A/PR/8/34 portant un gène PB1 modifié est supérieur à 550, 600 et plus préférentiellement 650 glycoprotéines pour un virion de 100 nm de diamètre. La quantité de glycoprotéines de surface (HA+NA) est déterminée en mesurant la distance entre 4 pieds de glycoprotéines puis est rapportée à la surface d'un virus de 100 nm de diamètre. La mesure de la distance entre 4 pieds de glycoprotéines est réalisée par cryo-microscopie. Dans des modes de réalisation préférés, le gène PB 1 de la souche A/PR/8/34 porte des modifications entrainant des modifications ponctuelles d'acides aminés dans la protéine PB1. De préférence, la modification du gène PB1 s'accompagne de la modification ponctuelle de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 acides aminés de la protéine PB1 de la souche A/PR/3/84. De préférence, le gène PB1 modifié code pour une protéine PB1 portant au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1l, 12, 13, 14 ou 15 modifications choisies parmi 188 (K-*E), 205 (M-*I), 212 (L-*V), 216 (S-*G), 398 (E-*D), 486 (R-*K), 563 (I-*R), 576 (I-*L), 581 (E-*D), 584 (R-*Q), 586 (K-*R), 617 (D-*N), 621 (Q-*R), 682 (V-*I) et 691 (R-*K). Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le gène PB1 modifié code pour une protéine PB1 portant au moins les modifications 188 (K-*E), 205 (M-*I), 212 (L-*V), 216 (S-*G), 398 (E-*D), 486 (R-*K), 563 (I-*R), 576 (I-*L), 581 (E-*D), 584 (R-*Q), 586 (K-*R), 617 (D-*N), 621 (Q-*R), 682 (V-*I) et 691 (R-*K). Dans d'autres modes de réalisation, le gène PB1 du virus A/PR/8/34 est remplacé par le gène PB1 d'une autre souche de virus influenza dont la quantité de glycoprotéines de surface HA-NA est supérieur à 550, 600 ou 650 glycoprotéines pour un virion de 100 nm de diamètre. Dans un mode de réalisation avantageux, le gène PB1 du virus A/PR/8/34 est remplacé par un gène codant pour la protéine PB 1 de la SEQ ID No. 2. L'invention se rapporte aussi à des virus influenza réassortants ayant le fond génétique d'un virus influenza A/PR/8/34 modifié selon l'invention et comprenant les gènes HA et NA d'un autre virus influenza. Ces virus réassortants portent donc typiquement 6 gènes du virus A/PR/8/34 modifié (dont le gène PB 1 modifié) et deux gènes, les gènes codant pour les glycoprotéines HA et NA, d'une autre souche de virus influenza. Les virus réassortants de la présente invention ont une forte capacité de croissance sur oeufs comme les virus de la souche A/PR/8/34 tout en produisant plus de glycoprotéines HA et NA à leur surface. Ainsi, avec une même quantité de virus réassortant produit, il est possible de produire plus de doses vaccinales. De préférence, les gènes codant pour les glycoprotéines HA et NA proviennent de virus de type A et avantageusement de virus influenza sauvages (virus prototype). Avantageusement, les gènes codant pour les glycoprotéines HA et NA proviennent de virus influenza circulants humains ou d'origines animales quelque soit le sous type viral. Dans des modes de réalisation préférés, les gènes codant pour les glycoprotéines HA et NA proviennet de virus influenza choisis parmi les virus ayant le sous type H3N2, H2N2, H1N2, H5N2, H5N1, H7N7, H9N2 et H3N1. Dans certains modes de réalisation, l'invention se rapporte à des virus influenza réassortis portant 5 gènes du virus A/PR/8/34 et des gènes PB1, HA et NA provenant d'une ou plusieurs autres souches de virus influenza. De préférence, le gène PB 1 du virus A/PR/8/34 est remplacé par le gène PB1 d'une autre souche de virus influenza dont la quantité de glycoprotéines de surface HA-NA est supérieur à 550, 600 ou 650 glycoprotéines pour un virion de 100 nm de diamètre. Avantageusement, le gène PB1 du virus A/PR/8/34 est remplacé par un gène codant pour la protéine PB1 de la SEQ ID No. 2. L'invention se rapporte aussi à des procédés mettant en oeuvre des virus A/PR/8/34 modifiés et des virus réassortants ayant le fond génétique du virus A/PR/8/34 modifié pour la production de glycoprotéines HA- NA. Les virus A/PR/8/34 modifiés selon l'invention et les virus réassortants obtenues avec les virus A/PR/8/34 modifiés sont particulièrement adaptés pour la production de semences vaccinales par amplification sur oeufs de poule fertilisés ou sur cellules. Les virus réassortants ayant le fond génétique du virus A/PR/8/34 (6 gènes de A/PR/8/34 dont le gène PB1 modifié) et les gènes HA et NA d'un virus de type sauvage (ou virus prototype) sont particulièrement adaptés pour la production de glycoprotéines HA-NA vaccinales. Les virus réassortants sont amplifiés sur oeuf de poule fertilisé ou sur cellules selon des techniques classiques. Dans des modes de réalisation avantageux, l'invention se rapporte à des procédés pour produire des glycoprotéines HA-NA vaccinales de virus influenza dans lesquels on amplifie sur oeuf ou sur cellule un virus réassortant ayant le fond génétique d'un virus influenza A/PR/8/34 modifié selon l'invention et comprenant les gènes HA et NA codant pour les dites glycoprotéines HA-NA vaccinales. De préférence, les glycoprotéines HA-NA vaccinales sont choisies parmi les glycoprotéines HA-NA de virus influenza de type A et plus particulièrement parmi les glycoprotéines HA-NA de virus influenza circulants humains ou d'origines animales quelque soit le sous type viral. Dans des modes de réalisation préférés, les glycoprotéines HA et NA vaccinales sont choisies parmi les soustypes H3N2, H2N2, H1N2, H5N2, H5N1, H7N7, H9N2 et H3N1. L'invention se rapporte aussi aux glycoprotéines HA-NA obtenues par ces procédés. L'invention se rapporte aussi à des procédés pour accroître la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface d'un virus influenza A/PR/8/34 ou d'un virus réassortant A/PR/8/34 comprenant la modification du gène PB1 de ce virus. Ces modifications du gène PB1 sont décrites ci-dessus. L'accroissement de la quantité de glycoprotéines HA-NA est mesuré par rapport à la quantité de glycoprotéines présentes à la surface d'un virus A/PR/8/34 ou d'un virus réassortant A/PR/8/34 ne portant pas de gène PB1 modifié. Dans des modes de réalisation avantageux, cet accroissement permet d'obtenir des virus A/PR/8/34 ou des virus A/PR/8/34 réassortants dont la quantité de glycoprotéines de surface HA-NA est supérieur à 550, 600 ou 650 glycoprotéines pour un virion de 100 nm de diamètre. De préférence, cette modification comprend la modification du gène PB1 dudit virus influenza A/PR/8/34 ou dudit virus influenza A/PR/8/34 réassortant pour introduire dans la protéine PB1 codé par ledit gène PB1 au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1l, 12, 13, 14 ou 15 modifications ponctuelles d'acides aminés. Plus préférentiellement, cette modification comprend la modification du gène PB 1 dudit virus influenza A/PR/8/34 ou dudit virus influenza A/PR/8/34 réassortant pour introduire dans la protéine PB1 codé par ledit gène PB1 au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 modifications ponctuelles d'acides aminés choisies parmi 188 (K-*E), 205 (M-*I), 212 (L-*V), 216 (S-*G), 398 (E-*D), 486 (R-*K), 563 (I-*R), 576 (I-*L), 581 (E-*D), 584 (R-*Q), 586 (K-*R), 617 (D-*N), 621 (Q-*R), 682 (V-*I) et 691 (R-*K). Avantageusement, cette modification comprend la modification du gène PB1 dudit virus influenza A/PR/8/34 ou dudit virus influenza A/PR/8/34 réassortant pour introduire dans la protéine PB1 codée par ledit gène PB1 au moins les modifications ponctuelles d'acides aminés 188 (K-*E), 205 (M-*I), 212 (L-*V), 216 (S-*G), 398 (E-*D), 486 (R-*K), 563 (I-*R), 576 (I-*L), 581 (E-*D), 584 (R-*Q), 586 (K-*R), 617 (D-*N), 621 (Q-*R), 682 (V-*I) et 691 (R-*K). Dans d'autres modes de réalisation, la modification du gène PB1 dudit virus influenza A/PR/8/34 ou dudit virus influenza A/PR/8/34 réassortant comprend le remplacement du gène PB1 du virus influenza A/PR/8/34 par le gène PB1 d'un autre virus influenza dont la quantité de glycoprotéines de surface HA-NA est supérieur à 550, 600 ou 650 glycoprotéines pour un virion de 100 nm de diamètre. De préférence, la modification du gène PB1 dudit virus influenza A/PR/8/34 ou 35 dudit virus influenza A/PR/8/34 réassortant comprend le remplacement du gène PB1 du virus influenza A/PR/8/34 par le gène PB 1 de la SEQ ID No.2. L'invention se rapporte aussi à des procédés pour améliorer le rendement de la production de glycoprotéines HA-NA vaccinales de virus influenza par amplification dans des oeufs ou sur cellule de virus réassortant vaccinaux ayant un fond génétique A/PR/8/34 dans lesquels on accroît la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface dudit virus réassorti par la modification du gène PB1 de A/PR/8/34. L'invention se rapporte aussi à un procédé pour préparer un virus réassortant vaccinal pour la production de glycoprotéines HA-NA vaccinales dans lequel on combine 6 gènes d'un virus A/PR/8/34 modifié selon l'invention avec deux gènes codant pour les glycoprotéines vaccinales HA et NA d'un virus influenza prototype (virus de type sauvage). Un des avantages de l'invention est d'augmenter l'immunogénicité des doses vaccinales par surexpression de NA par rapport à une quantité fixe de HA produite. Ainsi, l'invention concerne aussi un procédé pour accroître l'immunogénicité d'une dose vaccinale comprenant des glycoprotéines HA-NA de virus influenza en élevant le rapport NA/HA des glycoprotéines produites dans lequel les glycoprotéines sont produites par amplification sur oeufs ou sur cellule d'un virus réassortants ayant le fond génétique d'un virus A/PR/8/34 modifié selon l'invention. FIGURES Figure lA : Quantité de glycoprotéines (GP) déterminée par cryo-microscopie électronique à la surface des virus recombinés (virus circulaire de 100 nm de diamètre) Figure lB : Virus A et B en cryomicroscopie Figure 2 : Activité neuraminidasique NA (RFUs pour 10E5 virus) des virus recombinés 25 EXEMPLES Exemple 1 : Production de virus recombinés par génétique inverse 30 Nous avons produits 4 virus recombinés par génétique inverse selon le protocole développé dans notre laboratoire. Les compositions génomiques des virus recombinés sont les suivantes : - Virus H3N2 A/Moscow/10/99 (MO) 35 -Virus H1Nl A/PR/8/34 (PR8) - Virus A réassortant vaccinal PR8 "classique" comprenant les segment de gene HA et NA de MO sur le fond génétique du virus PR820 - Virus B réassortant vaccinal PR8 comprenant les segment de gene HA, NA et PB1 de MO sur le fond génétique du virus PR8. La production de virus recombiné in vitro repose sur la transfection de cellules 293T par 8 plasmides comportant chacun un segment de gène. La production des virus a été réalisée au laboratoire avec ces propres outils moléculaires et cellulaires. Les rendements de production obtenus pour les 4 virus recombinés sont similaires sur cellules et conformes à une production normale de virus recombinés. Exemple 2 : Analyse comparative de la densité des glycoprotéines HA-NA à la surface des virus recombinés par cryo-microscopie (Figure lA et lB) Les différents virus produits par génétique inverse sont amplifiés et purifiés sur coussin de sucrose. Les virus purifiés déposés sur grille sont congelés a très basse température et 15 observés par microscopie électronique à basse température. La densité des glycoprotéines de surface (GP) est déterminée par mesure de la distance entre 4 pieds de glycoprotéines (logiciel d'analyse d'image ImageJ) et rapportée à la surface d'un virus de 100 nm de diamètre selon la formule suivante (4piR2 avec R=50 nm). Résultats : 20 Virus PR8 : 500 GPs à la surface d'un virus de 100 nm de diametre. Virus MO : 689 GPs à la surface d'un virus de 100 nm de diametre. Virus A : 500 GPs à la surface d'un virus de 100 nm de diametre. Virus B : 700 GPs à la surface d'un virus de 100 nm de diametre. 25 Il y a une différence significative en termes de quantité de glycoprotéines entre le virus recombiné PR8 H1Nl et le virus recombiné MO H3N2 (+ 35% pour le virus H3N2). Le virus recombiné A, correspondant à une composition vaccinale classique, présente une quantité de GP similaire au virus PR8. Le virus recombiné B (comportant le gene PB 1 de MO) présentent une quantité de GP à 30 leur surface identique à celle observée pour le virus MO. Le gène PB1 permet d'obtenir des virus recombinés vaccinaux comportant une quantité de GP égale à 700 GP/virions de 100 nm de diamètre Exemple 3 : Détermination et comparaison de l'activité neuraminidase (NA) des virus 35 recombinés (Figure 2). La détermination de l'activité NA a été réalisée avec un protocole expérimental développé par le laboratoire (Ferraris et al. Vaccine 2006). L'activité NA étant déterminée pour une quantité de virus donnée (RFUs pourl0E5 virus), les variations observées reflètent la quantité de protéines NA à la surface des virus (pour une NA identique). Les variations des activités NA RFUs (pour les virus comportant la neuraminidase N2) sont indiquées ci-dessous : MO : 29340 RFUs pour 10E5 virus Virus A : 14600 RFUs pour 10E5 virus Virus B : 58000 RFUs pour 10E5 virus Une augmentation de la quantité de NA est observée pour le virus recombiné B par rapport 10 au virus recombiné A qui est le virus réassortant vaccinal classique. Le virus réassortant vaccinal classique comportant le gène PB1 du virus MO présente une activité enzymatique NA supérieure à celle mesurée pour le reassortant vaccinal classique (virus A). 15 En conclusion, l'introduction du gène PB1 du virus MO dans le fond génétique du virus réassortant vaccinal classique (virus A) permet : - une augmentation du nombre de GP à la surface des virus (+35%) - une augmentation du nombre de NA à la surface des virus (augmentation de l'activité NA). 20 Exemple 4 : Détermination des séquences spécifiques de PB 1 H3N2 responsables des propriétés présentées ci-dessus, par comparaison de séquences en acides aminés entre les virus H1Nl PR8 et H3N2 MO 25 L'alignement des séquences protéiques des protéines PB1 montre 30 acides aminés différents entre PR8 et MO. Une stratégie de mutagénèse dirigée permettant de modifier la séquence protéique de la protéine PB1 PR8 pour obtenir la séquence protéique de la protéine PB1 MO a permis de mettre en évidence une liste de mutations qui fait l'objet de cette demande de brevet. 30 Liste des mutations : 188 (K-*E), 205 (M-*I), 212 (L-*V), 216 (S-*G), 398 (E-*D), 486 (R-*K), 563 (I-*R), 576 (I-*L), 581 (E-*D), 584 (R-*Q), 586 (K-*R), 617 (D-*N), 621 (Q-*R), 682 (V-*I) et 691 (R-*K). Les virus comportant les mutations ci-dessus sur le segment de gène PB 1 ont été produits par génétique inverse. Les virus mutants ont été caractérisés au niveau de leur capacités 35 réplicatives, leur quantité de GP à leur surface (cryo-microscopie) et l'augmentation de l'activité NA. REFERENCES Ferraris, Kessler' N., Valette, 1 1o, Lina, 2006. Evolution of the susceptibility to antiviral drags of Ail-13N2 influenza viruses isolated in France fient_ 2002 to 2005. Vaccine 24, 6656-6659 Wanitchang et al., Viras Research, 147, 145-148, 2010 14 REVENDICATIONS1. Virus influenza A/PR/8/34 modifié caractérisé en ce qu'il comprend un gène PB1 muté et en ce que la quantité de glycoprotéines HA-NA (hémagglutinine et neuraminidase) à la surface dudit virus influenza A/PR/8/34 portant ledit gène PB1 muté est supérieure à 550 glycoprotéines pour un virion de 100 nm de diamètre. 2. Virus influenza A/PR/8/34 modifié selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il porte un gène PB1 muté de la souche AIPR/8/34 codant pour une protéine PB1 portant au moins les modifications 188 (K->E), 205 (M-*I), 212 (L-+V), 216 (S-+G), 398 (E-*D), 486 (R-*K), 563 (I-*R), 576 (I-*L), 581 (END), 584 (R->Q), 586 (K->R), 617 (D-*N), 621 (Q-*R), 682 (V-+1) et 691 (R-+K). 3. Virus influenza A/PR/8/34 modifié selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend le gène PB1 d'une autre souche de virus influenza de type A dont la quantité de glycoprotéines de surface HA-NA est supérieur à 550 glycoprotéines pour un virion de 100 nm de diamètre. 4. Virus influenza A/PR/8/34 modifié selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il comprend le gène PB1 d'un virus influenza H3N2 ayant la séquence de la SEQ ID No. 2. 5. Virus influenza A/PR/8/34 modifié selon l'une des revendications 1-4 caractérisé en ce qu'il est réassortant comprenant les gènes HA et NA d'un autre virus influenza. 6. Virus influenza AIPR/8/34 modifié selon la revendication 5 comprenant les gènes HA et NA d'un virus influenza choisi parmi les virus ayant les sous types H3N2, H2N2, H1N2, H5N2, H5N1, H7N7, H9N2 et H3N1. 7. Procédé pour produire des glycoprotéines HA-NA vaccinales de virus influenza caractérisé en ce que l'on amplifie sur oeuf ou cellule un virus influenza modifié selon l'une des revendications 1-4 et comprenant les gènes HA et NA codant pour lesdites glycoprotéines HA-NA vaccinales. 8. Procédé pour produire des glycoprotéines HA-NA vaccinales de virus influenza selon la revendication 7 dans lequel les glycoprotéines HA-NA vaccinales sont 35 choisies parmi les glycoprotéines des virus ayant les sous-types H3N2, H2N2, H1N2, H5N2, H5N1, H7N7, H9N2 et H3N1. 9. Procédé pour accroître la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface d'un virus influenza A/PR/8/34 caractérisé en ce qu'il comprend la mutation du gène PB1 dudit virus. 10. Procédé pour accroître la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface d'un virus influenza A/PR/8/34 selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il comprend la modification du gène PB 1 dudit virus influenza A/PR/8/34 pour introduire dans la protéine PB 1 codé par ledit gène PB 1 au moins les modifications ponctuelles d'acides aminés 188 (K-*E), 205 (M-+I), 212 (L-*V), 216 (S->G), 398 (E->D), 486 (R-+K), 563 (I-R), 576 (I-÷L), 581 (E-*D), 584 (R-*Q), 586 (K- >R), 617 (D->N), 621 (Q-*R), 682 (V-+1) et 691 (R-*K). 11. Procédé pour accroître la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface d'un virus influenza A/PR/8/34 selon l'une des revendications 9-10 caractérisé en ce que le virus A/PR/8/34 est un virus réassortant comprenant les gènes HA et NA d'un autre virus influenza. 12. Procédé pour accroître la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface d'un virus influenza A/PR/8/34 selon la revendication 11 caractérisé en ce que le virus A/PR/8/34 est un virus réassortant comprenant les gènes HA et NA d'un virus influenza choisi parmi les virus ayant les sous types H3N2, H2N2, H1N2, H5N2, H5N1, H7N7, H9N2 et H3N1. 13. Procédé pour améliorer le rendement de la production de glycoprotéines HA-NA vaccinales de virus influenza par amplification dans des oeufs ou cellules de virus réassortants ayant un fond génétique A/PR/8/34 caractérisé en ce que l'on accroît la quantité de glycoprotéines HA-NA à la surface dudit virus réassortant par la mutation du gène PB1 de A/PR/8/34. 14. Procédé pour préparer un virus réassortant pour la production de glycoprotéines HA-NA vaccinales caractérisé en ce que l'on combine 6 gènes d'un virus A/PR/8/34 modifié selon l'une des revendications 1-4 avec deux gènes codant pour les glycoprotéines vaccinales HA et NA d'un virus influenza prototype. 15. Procédé pour accroître l'immunogénicité d'une dose vaccinale comprenant des glycoprotéines HA-NA de virus influenza en élevant le rapport NA/HA des glycoprotéines produites dans lequel les glycoprotéines sont produites par amplification sur oeufs ou cellules d'un virus réassortant ayant le fond génétique d'un virus A/PR/8/34 modifié selon l'une des revendications 1-4.