FR 2962134 A1 20120106 FR 1055433 A 20100705 1 Procédé de préparation d'un complexe macromoléculaire non séparé (totum), et utilisations dudit complexe dans la prévention de troubles arthritiques La présente invention concerne un procédé de préparation d'un totum comprenant un complexe macromoléculaire d'origine bactérienne ainsi que le totum issu dudit procédé de préparation. L'invention concerne également les utilisations dudit totum dans diverses industries telles que les industries pharmaceutiques ou agroalimentaires, afin de prévenir et/ou de traiter des troubles arthritiques, de réguler la flore intestinale et la translocation bactérienne, ou d'apporter un confort articulaire chez l'homme et l'animal. De nombreuses études scientifiques ont mis en évidence le rôle que joue la flore intestinale dans la pathogénèse des maladies inflammatoires rhumatismales chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante ou les rhumatismes post-infectieux. Par exemple, l'absence de signes d'arthrite est observée chez les animaux sans germes (rats ou souris transgéniques) alors que leurs confrères hébergeant une flore intestinale développent des signes d'arthrite (Rath HC,et al ; J.Clin.Invest ;98(4) ;945-953 ;1996 et Abdollahi-Roodsaz S . , et al ; J.Clin.Invest ;118 ;205-216 ;2008). Par ailleurs, chez l'être humain, des études ont montré que les patients dont la polyarthrite rhumatoïde était de diagnostic récent, hébergeaient peu de bifidobactéries, par rapport à des sujets témoins (Vaahtovuo J,et al ; J.Rheumatol ;35 ;690-693 ;2008) et lorsque l'équilibre de la flore intestinale était partiellement restauré par l'introduction d'une alimentation végétarienne, l'état du patient se trouvait être amélioré (Peltonen R, et al ; J.Rheumatol ;36 ;64- 2 68 ;1997). Enfin, il est bien connu que l'utilisation de certains antibiotiques qui modifient la composition de la flore intestinale améliore les signes de la polyarthrite rhumatoïde (Stone M. et al. ; J.Rheumatol ;30 ;2112- 2122 ;2003). Un des mécanismes expliquant l'implication de la flore intestinale dans la pathogénèse des maladies rhumatismales chroniques réside dans sa capacité à réguler la translocation bactérienne. Le mécanisme de translocation bactérienne est défini par le passage de la barrière intestinale de bactéries intestinales. Ces bactéries intestinales sont captées puis transportées par des cellules du système immunitaire intestinal telles que des cellules dendritiques ou les macrophages vers le site synovial provoquant un foyer inflammatoire douloureux de type rhumatismal au niveau des articulations. La composition de la flore intestinale influence ce processus. Ainsi, lorsque les bifidobactéries colonisent largement la partie basse de l'intestin, ces dernières montrent une capacité à réduire la translocation bactérienne (Romond MB, et al ; Anaerobe ; 14 ; 43-48 ; 2008). Par ailleurs, la composition de la flore intestinale influence également le niveau d'expression de gènes impliqués dans la réponse inflammatoire, telles que les galectines (Romond MB, et al ; Fems Immunol Med Microbiol ; 55 ; 85-92 ; 2009). Il existe à ce jour de nombreux produits capables de modifier la flore intestinale tels que les prébiotiques ou les probiotiques. En revanche, peu d'entre eux ont un impact positif sur la translocation bactérienne. Parmi les produits ayant une action bénéfique vis-à-vis de la translocation bactérienne, on trouve la macromolécule isolée de culture de Bifidobacterium breve. En effet, il a été démontré dans les documents WO 2004/093898 et 3 WO 2006/040485 que l'administration par voie orale de cette macromolécule entrainait une diminution de la translocation et de la dissémination bactérienne et que cette dernière présentait une activité préventive de l'arthrite induite par collagène chez la souris. Cependant, une activité pro-inflammatoire résiduelle est toujours observée avec l'utilisation de la macromolécule isolée de culture de Bifidobacterium breve, ce qui limite son utilisation dans le domaine des maladies inflammatoires. Il serait donc avantageux de disposer d'un procédé permettant de préparer un produit qui induirait une diminution de la translocation bactérienne et qui ne présenterait pas d'activité pro-inflammatoire résiduelle. De nos jours, il existe de nombreux procédés de fermentation de bactéries. Cependant, il existe très peu d'exemples dans la littérature concernant des procédés permettant la récupération de produits excrétés par les bactéries. Or, les inventeurs ont mis au point un procédé permettant d'obtenir un totum par fermentation d'une souche de Bifidobacterium longum dans un milieu de culture contenant des produits laitiers et non laitiers. Le produit excrété par lesdites bactéries permet ainsi de répondre aux exigences évoquées précédemment. Dans la présente invention, on entend par « totum » le produit résultant du procédé qui ne subit pas de séparation et comprenant à la fois le complexe macromoléculaire excrété par les bactéries et le milieu de culture. On utilisera donc par la suite indifféremment le terme de « totum » ou de « complexe macromoléculaire non séparé ». La présente invention a donc pour objet un procédé de préparation d'un totum comprenant un complexe macromoléculaire produit par la souche Bifidobacterium longum CBi0703, déposée sous le numéro CNCM I-3994, le 23 4 Mai 2008 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) tenue par l'Institut Pasteur, 25 rue du docteur Leroux à Paris, comportant les étapes suivantes . (i) préparation du milieu de culture comprenant - des protéines ou dérivés de protéines du lait et du lactose ou lactose hydrolysé, et leurs mélanges; - au moins un antioxydant ; -éventuellement au moins un régulateur de pH et/ou au moins un facteur de croissance (booster) (ii) l'ensemencement et l'incubation, à une température comprise entre 25 et 39°C environ, de préférence entre 33 et 37°C, plus préférentiellement encore entre 36 et 37°C d'une souche de Bifidobacterium longum I-3994; (iii) l'inactivation desdites bactéries issues de la souche de Bifidobacterium longum I-3994 présentes dans ledit milieu de culture; et (iv) la stabilisation dudit totum. Il est important de garder à l'esprit que le procédé décrit précédemment doit nécessairement être réalisé en conditions stériles. Ce procédé est non pas un procédé de culture de bactéries mais un procédé de récupération d'un complexe macromoléculaire excrété par lesdites bactéries. Le milieu de culture qui contient des protéines de lait ou leurs dérivés et du lactose ou lactose hydrolysé, est obtenu à partir de produits issus du lait choisis dans le groupe comprenant une fraction de lait écrémé natif ou hydrolysé, des ingrédients issus du cracking du lait, natifs ou hydrolysés. Par ailleurs, il est important de prévenir l'oxydation tout au long du procédé, d'où la nécessité d'introduire au moins un agent antioxydant choisi dans le groupe comprenant l'acide ascorbique, le chlorhydrate de cystéine, le 5 thioglycollate, et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation, un régulateur de pH est utilisé pendant le procédé. Ce régulateur peut être un sel inorganique, par exemple un tampon phosphate. On préfèrera utiliser un régulateur de pH non sodique. Afin d'initier la réaction, un facteur de croissance (booster) peut être utilisé. Il peut s'agir par exemple d'un extrait de levure. Selon un mode de réalisation, l'ensemencement des bifidobactéries dans ledit milieu de culture peut se faire à partir d'un concentré congelé ou d'une pré-culture de 16-48h, ou d'un lyophilisat ou tout autre forme de stockage connue de l'homme de l'art, qui permet la prolifération ultérieure des bactéries. Selon un autre mode de réalisation pouvant être 20 combiné avec le précédent, les bactéries sont ensemencées dans ledit milieu de culture à raison de 104-101, de préférence de 107-108 unités formant colonies par mL de milieu. Lorsque les bactéries sont ensemencées dans ledit 25 milieu selon une quantité inférieure à 104 unités formant colonies par mL de milieu, on obtient un rendement très faible. En revanche, lorsque cette quantité est supérieure à 1010 unités formant colonies par mL de milieu, lesdites bactéries n'ont plus assez de place pour proliférer dans le 30 milieu. Selon un mode de réalisation pouvant être combiné avec les précédents, le pH dudit milieu de culture n'est pas régulé pendant la période d'incubation mais ce dernier ne doit pas être inférieur à 3,8. 6 Selon un autre mode de réalisation, le pH dudit milieu de culture est maintenu entre 4 et 7, de préférence entre 5,8 et 6,5 pendant la durée de l'incubation. Le pH est ajusté à la valeur désirée à l'aide de tout agent alcalisant classiquement utilisé par l'homme du métier tel que par exemple la soude, la potasse, l'ammoniaque ou le gaz ammoniac. Selon l'invention, l'incubation est réalisée dans des réacteurs conventionnels permettant de travailler en anaérobie. L'incubation peut être conduite en continu ou en discontinu, éventuellement sous inertage à l'azote. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la durée d'incubation est comprise entre 6 et 60h, de préférence entre 16 et 30h. Des faibles temps d'incubation, tels que 6h, sont adaptés pour des milieux fortement concentrés. L'incubation peut dans ce cas être réalisée dans des petits réacteurs. Une durée d'incubation supérieure à 60h ne pose pas de problème technique, cette solution n'est simplement pas intéressante d'un point de vue économique. Selon le procédé de l'invention, l'inactivation des bactéries permet d'obtenir le totum qui renferme le complexe macromoléculaire. Selon un mode de réalisation, l'inactivation des bactéries est réalisée par séparation physique. Cette séparation est réalisée par microfiltration en utilisant des membranes présentant un seuil de coupure de 0,1 à 1,4 µm et/ou par ultracentrifugation. Selon un autre mode de réalisation, l'inactivation des bactéries peut être réalisée par traitement thermique statique ou dynamique. Le paramètre important à prendre en compte lors du traitement thermique est le couple température/durée. A titre d'exemple, le traitement thermique peut être effectué à une température comprise 7 entre 72 et 85°C et pendant une durée comprise entre 30 secondes et 15 minutes. L'homme du métier sera en mesure de choisir un couple température/durée approprié afin de ne pas dénaturer l'activité du totum. De façon surprenante, ce traitement thermique n'entraine pas la dégradation du complexe macromoléculaire qui reste donc actif et permet d'induire une activité antiarthritique. En effet, les tests effectués par la Demanderesse ont montré que l'administration dudit totum issu du procédé décrit précédemment induit une activité anti-arthritique chez la souris, dans un modèle d'arthrite induite au collagène. Selon le procédé, la stabilisation permet au totum de rester stable dans le temps et maintenir ainsi son activité. Cette stabilisation peut être réalisée sur un totum liquide ou solide. En effet, une filtration stérilisante ou une ultracentrifugation avec l'ajout d'agents conservateurs tels que des anti-oxydants afin d'éviter toute modification par contact avec les oxydants, dont l'oxygène, va permettre de stabiliser le totum sous une forme liquide. La congélation, la lyophilisation ou le séchage pur ou le co-séchage avec des agents de charge; notamment d'origine laitière, va permettre de stabiliser le totum sous forme solide. Lors de la stabilisation du totum sous forme solide et lors notamment du séchage, les oligosaccharides se polymérisent et forment des filaments. Il est donc nécessaire d'introduire des agents de charge qui ont pour rôle d'alourdir la masse et d'empêcher ainsi ce phénomène. Les agents de charge pouvant être utilisés dans l'invention sont de préférence d'origine laitière et peuvent notamment être la caséine. On peut également utiliser une maltodextrine. 8 Selon un mode de réalisation pouvant être combiné avec les précédents, les ingrédients formant le milieu de culture peuvent être apportés tout au long du processus de fermentation, le procédé est alors appelé procédé en continu. Selon un mode de réalisation pouvant être combiné avec les précédents, le totum peut être extrait en continu tout au long du processus ou à la fin du processus de fermentation/ incubation. Un autre objet de l'invention concerne le totum issu du procédé de préparation décrit précédemment. Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation dudit totum obtenu selon le procédé décrit précédemment dans des produits destinés à l'industrie pharmaceutique ou agroalimentaire. L'invention a également pour objet l'utilisation du totum obtenu par le procédé décrit précédemment chez l'homme ou animal, pour prévenir ou traiter les troubles arthritiques, pour la régulation de la flore intestinale et de la translocation bactérienne. L'invention a notamment pour objet une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant au moins ledit totum à titre de principe actif, et au moins un support pharmaceutiquement acceptable. Par pharmaceutiquement acceptable, on entend tout support qui permet non seulement de conserver les propriétés immunomodulatrices du complexe macromoléculaire obtenu selon le procédé décrit précédemment, mais aussi de véhiculer ledit complexe macromoléculaire. L'utilisation de la composition pharmaceutique ou vétérinaire permet de réguler la flore intestinale chez l'homme ou l'animal et la translocation bactérienne. Elle est par conséquent destinée à la prophylaxie et au 9 traitement des troubles arthritiques chez l'homme et l'animal. La composition pharmaceutique de la présente invention peut se présenter sous toute forme galénique souhaitée pour une administration par voie orale à l'homme ou à l'animal comme par exemple sous forme liquide (sirop, solution, spray) ou sous forme solide (poudre, comprimé, gélule, capsule, spray poudre , gomme, pâte, granulés, dans leurs formes diverses, à libération immédiate ou programmée). La composition pharmaceutique comprenant ledit complexe macromoléculaire peut être conservée à une température de - 70°C à +4°C pour les formes liquides et jusqu'à +40°C pour les formes solides pendant 3 ans. Par ailleurs, le complexe macromoléculaire non séparé 15 obtenu selon le procédé décrit précédemment peut également être incorporé dans des compositions alimentaires. Par conséquent, l'invention a également pour objet une composition alimentaire pour l'animal ou pour l'homme comprenant au moins ledit totum. 20 Une telle composition alimentaire peut notamment se trouver sous la forme de produits alimentaires (diététiques ou non, à usage hospitalier ou non) tels qu'une préparation lactée, des céréales, des solutés entériques, etc... Enfin, un autre objet de l'invention concerne un 25 complément alimentaire comprenant ledit totum. Un tel complément alimentaire peut se présenter sous la forme de comprimés, poudres, gélules, capsules, liquides tels que des boissons ou des émulsions. La composition alimentaire ou le complément 30 alimentaire peuvent être utilisés afin d'améliorer le confort articulaire de l'homme ou de l'animal. La présente invention sera illustrée par les exemples suivants. 10 EXEMPLES Exemple 1 : Production d'un totum renfermant le complexe macromoléculaire selon l'invention (pH régulé) Un milieu de culture contenant les ingrédients 5 suivants est préparé : - 90 L de lait écrémé - 0,3g d'acide ascorbique /L de milieu de culture Le lait écrémé est stérilisé en continu en traitement ultra haute température à 148°C pendant 30 secondes. 10 L'acide ascorbique est reconstitué dans l'eau et soumis à une stérilisation à 121°C pendant 30 minutes. La fermentation est de type discontinu à pH régulé pendant 24 heures. Le pH est ajusté à une valeur de 6,3 une fois les deux 15 solutions versées dans le fermenteur. Le milieu de culture est ensemencé avec 8% (v/v) d'un inoculum de 24h contenant 3 x 108 unités formant colonies (UFC) de bifidobactéries issues de la souche Bifidobacterium longum par mL de milieu de culture dans l'inoculum, soit dans le fermenteur une 20 population de départ (TO) de 2,4 x 10' UFC/ml. Les bactéries sont cultivées sous agitation, sans aération du milieu et à une température de 36°C. Le pH est maintenu à 6,3 par ajout de soude. La fermentation dure 24 heures et la population de 25 Bifidobacterium longum en fin de culture est de 1x108 UFC par mL de milieu de culture. En fin de culture, les bactéries sont inactivées par traitement thermique à 80°C pendant une minute ; le totum est ensuite co-séché, sur tour de séchage avec buse haute 30 pression, sur un support protéique d'origine laitière. Exemple 2 : Production d'un totum renfermant le complexe macromoléculaire selon l'invention (pH non régulé) La composition du milieu de culture et les étapes sont les mêmes que dans l'exemple 1 à l'exception que dans cet exemple le pH n'est pas régulé, l'étape 1 est ainsi remplacée par l'étape décrite ci-dessous. 1-Fermentation de type discontinu à pH non régulé : Le pH est ajusté à une valeur de 6,5 une fois les deux solutions versées dans le fermenteur. Le milieu de culture est ensemencé avec 8 % (v/v) d'un inoculum de 24h, 8 contenant 4x10 unités formant colonies (UFC) de bifidobactéries issues de la souche Bifidobacterium longum par mL de milieu de culture dans l'inoculum, soit dans le fermenteur une population de départ (TO) de 3.2x107 UFC / mL. Les bactéries sont cultivées sous agitation, sans aération du milieu et à une température de 37° C. Le pH n'est pas ajusté pendant la culture. La fermentation dure 24 heures et la population de Bifidobacterium longum en fin de culture est de 1x108 UFC par mL de milieu de culture. En fin de culture, les bactéries sont inactivées par traitement thermique à 80°C pendant une minute ; le totum est ensuite co-séché, sur tour de séchage avec buse haute pression, sur un support protéique d'origine laitière ou maltodextrine. Exemple 3 : composition analytique du totum avec le pH régulé Matière azotée totale (N x 6.38) : 37.5 % Carbohydrates :40.6% Matières grasses : 0.3% Cendres :14.2% Autres (bactéries, lactates, acides organiques...) : 7,4% Complexe macromoléculaire actif: 50-100 gg/g 12 Exemple 4 : Effet du totum obtenu à pH non régulé chez la souris à flore de patient arthritique Pour cette étude, des souris axéniques ont été associées à la flore de patient atteint de polyarthrite 5 évolutive. Le groupe témoin correspond à des souris alimentées sous eau. Le totum, issu d'une fermentation obtenue à pH non régulé et co-séché sur caséine à 50%, est reconstitué en 10 eau stérile à une concentration de 80 g/L et administré sous forme liquide ad libitum (les volumes sont notés journellement). La figure 1 représente l'évolution de Bifidobacterium longum chez les 5 souris traitées (MF1 à MF5) et chez les 6 15 souris témoins (TRI à TR6) pendant 15 jours d'administration et met en évidence une augmentation significative de Bifidobacterium longum lors du traitement par le totum issu de la fermentation à pH non régulé (test statistique ANOVA deux facteurs mesures répétées, p REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un complexe macromoléculaire non séparé (ou totum) produit par des bactéries appartenant à la souche Bifidobacterium longum I-3994, comportant les étapes suivantes : (i) préparation du milieu de culture comprenant - des protéines ou dérivés de protéines du lait et 10 du lactose ou lactose hydrolysé, et leurs mélanges; - au moins un antioxydant ; - éventuellement au moins un régulateur de pH et/ou au moins facteur de croissance ; 15 (ii) l'ensemencement et l'incubation, à une température comprise entre 25 et 39°C environ, de préférence entre 33 et 37°C, plus préférentiellement encore entre 36 et 37°C d'une souche de Bifidobacterium longum I-3994 ; 20 (iii) l'inactivation desdites bactéries issues de la souche Bifidobacterium longum I-3994 présentes dans ledit milieu de culture ; (iv) la stabilisation dudit totum. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par 25 le fait que l'ensemencement des bifidobactéries dans ledit milieu de culture se fait à partir d'une pré-culture de 16-48h, concentrée, sous forme congelée ou lyophilisée. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que les bactéries sont ensemencées 30 dans ledit milieu de culture à raison de 104-1010, de préférence 10"- 108 unités formant colonies par mL de milieu. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé par le fait que la durée de l'incubation est comprise entre 6 et 60h, de préférence entre 16 et 30 h. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 4, caractérisé par le fait que pendant l'étape d'incubation le pH est non régulé mais doit nécessairement ne pas être inférieur à 3,8. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que le pH dudit milieu de culture est régulé et maintenu à une valeur comprise entre 4 et 7, de préférence entre 5,8 et 6,5 pendant la durée de d'incubation. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'inactivation des bactéries est réalisée par séparation physique et/ou traitement thermique statique ou dynamique. 8. Utilisation du totum obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou traiter les troubles arthritiques, chez l'homme ou animal. 9. Utilisation du totum obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour l'obtention d'un médicament destiné à réguler la flore intestinale chez l'homme ou animal. 10. Utilisation du totum obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour l'obtention d'un médicament destiné à réguler la translocation bactérienne chez l'homme ou l'animal. 11. Composition pharmaceutique ou vétérinaire, caractérisée par le fait qu'elle comprend au moins le totum obtenu selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et au moins un support pharmaceutiquement acceptable. 12. Composition alimentaire pour l'homme ou l'animal caractérisée par le fait qu'elle contient au moins ledit totum obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 7.