FR 2967498 A1 20120518 FR 1004444 A 20101116 Utilisation de dérivés de quinolinone comme outil de recherche La présente invention se rapporte l'utilisation de dérivés de quinolinone de formule générale (I), ligands du récepteur Smo ou de récepteurs apparentés qui ciblent un site de liaison du récepteur différent des sites de liaison des ligands connus, comme outils de recherche pour l'identification de modulateurs du récepteur Smo ou de récepteurs apparentés, la caractérisation de la voie de signalisation Hedgehog et le diagnostic ; l'invention se rapporte également à des kits contenant lesdits dérivés de formule générale (1). Les composés modulateurs de la voie Hedgehog, voie privilégiée de différenciation cellulaire, présentent l'intérêt de pouvoir être utilisés pour favoriser la différenciation de cellules souches d'origine embryonnaire ou adulte ou des cellules multipotentes. La réparation de tissus lésés suite à une maladie, un traumatisme ou l'âge utilise de plus en plus des cellules souches ou de progéniteurs qui conservent la capacité de se différencier vers différents types cellulaires. Ces cellules constituent un réservoir capable de renouveler les tissus afin de restaurer les fonctions biologiques. Les cellules souches mésenchymateuses, par exemple, peuvent donner des ostéoblastes, des chondrocytes, des adipocytes, ou des cellules stromales support de l'hématopoïèse. Les techniques permettant d'orienter ces cellules vers un phénotype choisi sont généralement lourdes (transformation de cellules à l'aide de vecteurs d'expression et nécessité d'exprimer plusieurs gènes) et des solutions alternatives telles que l'utilisation de petites molécules de synthèse inductrices de différenciation constituerait une piste prometteuse. La molécule de signalisation Hedgehog (Hh) est une protéine sécrétée qui active une voie de signalisation qui joue un rôle fondamental dans la morphogenèse de nombreux tissus, le développement du cerveau, ainsi que dans la prolifération cellulaire, et serait impliquée dans le maintien et la réparation tissulaire chez l'adulte (Ingham and McMahon 2001; Wechsler-Reya and Scott 2001; Marti and Bovolenta 2002; Lum and Beachy 2004; Varjosalo and Taipale 2008). Les protéines Hh sont synthétisées sous la forme de précurseurs immatures d'environ 45 kDa qui sont soumis à un clivage intramoléculaire catalysé par la région C-terminale du précurseur. Ce clivage produit un fragment C-terminal de 25 kDa sans fonction supplémentaire connue et un fragment amino-terminal actif de 19 kDa possédant une molécule de cholestérol liée à son extrémité C-terminale. Ce fragment N-terminal possède toutes les activités de signalisation connues des protéines Hh. La voie de signalisation des protéines Hh comprend trois composants principaux ; le ligand de Hh, un circuit de récepteur transmembranaire, composé du régulateur négatif Patched (Ptc) et de l'activateur Smoothened (par la suite, désigné indifféremment Smo ou Smoothened) et un complexe cytoplasmique qui régule les effecteurs transcriptionnels. Chez les mammifères, il existe deux gènes Ptc codant respectivement pour Ptcl et Ptc2, des glycoprotéines à 12 domaines transmembranaires, homologues à des transporteurs bactériens. Le produit du gène Smo qui code pour une protéine de la famille des récepteurs couplés aux protéines G, ne possède aucun ligand endogène connu. Le mécanisme exact de la régulation de la voie Hedgehog n'est pas encore complètement élucidé. En l'absence de Hh, Ptc bloquerait l'activité constitutive de Smo. La liaison de Hh à Ptc lèverait cette inhibition et permettrait la transduction du signal par l'intermédiaire de Smo. Le mécanisme de régulation de l'activité de Smo par Ptc, pourrait faire intervenir une molécule transportée par Ptc et interagissant avec Smo (Taipale et al. 2002). L'activation des facteurs de transcription Gli est impliquée dans la cascade d'évènements résultant de l'activité de Smo. La protéine transmembranaire de type I, HIP (Hedgehog Interacting Protein), constitue un autre récepteur des molécules Hh et constitue un régulateur négatif de la voie (Ho and Scott 2002). D'autres gènes comme dispatched (DispA), notamment, seraient impliqués dans le relargage et l'accumulation dans le milieu extracellulaire des protéines Hh sous forme soluble (Ma et al. 2002). Plus récemment, d'autres protéines membranaires comme Cdo et Boc ont été décrites comme capables de se lier à Shh et de potentialiser son effet (Ma et al. 2008). La protéine Hh et la voie de transduction associée, initialement mises en évidence chez la drosophile, sont conservées chez les vertébrés et les invertébrés. Un seul homologue de Hh est présent chez la Drosophile, alors que trois homologues de Hh : Sonic (Shh), Indian (Ihh) et Desert (Dhh) sont présents chez les mammifères. Parmi ces trois homologues, Shh a été la plus étudiée du fait de son profil d'expression étendu durant le développement. Shh participe à la ventralisation du tube neural en spécifiant le phénotype précoce de plusieurs types neuronaux le long de la ligne médiane ventrale (motoneurones de la moelle épinière, neurones dopaminergiques ou cholinergiques) et en induisant la génération des précurseurs oligodendrocytaires à partir de la moelle épinière ventrale (McMahon et al. 2003). Par ailleurs, Shh induit la survie des neurones gabaergiques et dopaminergiques, oriente le devenir des précurseurs sérotoninergiques et prévient la mort des neurones dopaminergiques provoquée par la toxine MPP. Il induit enfin la prolifération des précurseurs des cellules granulaires dans le cervelet post-natal précoce. Les autres membres de la famille Hh, participent quant à eux, respectivement au développement du tissu osseux (Ihh), des testicules et des nerfs périphériques (Dhh). En outre, les résultats obtenus avec Shh s'appliquent également à Dhh et Ihh. Le rôle régulateur de la voie de signalisation des protéines Hedgehog durant le développement embryonnaire a été largement étudié : Hh a été associée aux processus de maintien et de réparation du tissu normal, à la régulation spatiotemporelle de la prolifération et de la différenciation, permettant ainsi aux tissus en développement d'atteindre leur taille correcte avec les types cellulaires appropriés et des degrés appropriés de vascularisation et d'innervation. Le rôle essentiel de la fonction de Hh est démontré par les conséquences dramatiques des défauts dans cette voie de signalisation chez le foetus humain, comme l'holoprosencéphalie observée avec les mutants de Shh (Traiffort et al. 2004). La voie Shh a été identifiée dans la moelle et le cerveau adulte, où la forme active amino-terminale de la molécule est exprimée dans de nombreuses régions, à un niveau plus élevé que celui rencontré au cours de la période post-natale précoce (Traiffort et al. 1999; Traiffort et al. 2001; Coulombe et al. 2004). Bien que les rôles de Shh chez l'adulte ne soient pas complètement élucidés, son implication dans le maintien et le renouvellement des cellules souches est de plus en plus étudié (Charytoniuk et al. 2002; Ahn and Joyner 2005; Stecca and Ruiz i Altaba 2009). Ces cellules souches ont été identifiées dans plusieurs régions du cerveau adulte incluant la zone sous ventriculaire (SVZ) et la zone sous granulaire de l'hippocampe (ZSG). Elles fournissent de nouveaux précurseurs tout au long de la vie qui ont la capacité de migrer respectivement vers le bulbe olfactif et la couche des cellules granulaires. Dans des conditions pathologiques définies ces cellules peuvent dévier de leur trajet vers la zone lésée. De plus, Shh possède une activité chimioattractive sur les précurseurs neuraux de la SVZ, un effet bloqué par un inhibiteur de Smo (Angot et al. 2008). Shh stimule également la prolifération des progéniteurs neuraux dans la ZSG (Lai et al. 2003) mais les résultats demeurent controversés pour ceux de la SVZ. Par ailleurs, Shh injecté dans le ventricule latéral de souris permet également d'augmenter le nombre de précurseurs oligodendrogliaux dans le cortex suggérant qu'une activation de la voie pourrait être d'un intérêt thérapeutique dans les maladies démyélinisantes (Loulier et al. 2006). Enfin, dans des conditions pathologiques, telles que celles observées dans un modèle de la maladie de Parkinson ou un modèle de neuropathie périphérique, Shh est capable de préserver les projections axonales des neurones dopaminergiques dans le striatum ou de réduire le temps nécessaire à la récupération motrice consécutive à l'écrasement du nerf sciatique (Pepinsky et al. 2002; Tsuboi and Shults 2002). Des dysfonctionnements de la voie de signalisation Shh ont été associés à de nombreux cancers, plus particulièrement à des carcinomes basocellulaires au niveau cutané et à des médulloblastomes, au niveau cérébral. Ces tumeurs sont le plus souvent reliées à des mutations de différents acteurs de la voie Hedgehog entrainant une suractivation de celle-ci (Beachy et al. 2004; Scales and de Sauvage 2009). Plus généralement, la localisation de ces tumeurs est étroitement corrélée aux sites d'expression des composantes de la voie au cours du développement embryonnaire. A titre d'exemple non-limitatif, on peut citer : des cancers du sein, des méningiomes, des glioblastomes, des cancers gastro-intestinaux (notamment de l'estomac), des cancers de la prostate, des fibromes et des dermoïdes ovariens, des rhabdomyosarcomes, des cancers du poumon à petites cellules, des carcinomes oraux à cellules squameuses. Récemment, Shh a été associée au psoriasis. Du fait du rôle crucial de la voie de signalisation des protéines Hh dans de nombreux processus physiologiques et par conséquent de l'importance des pathologies liées à son dysfonctionnement, les composantes de cette voie représentent des cibles pour la mise au point de nouvelles molécules capables de moduler, c'est-à-dire d'activer ou d'inhiber, cette voie et donc de réguler positivement ou négativement le développement, incluant la prolifération, la différenciation, la migration et la survie (apoptose) et/ou l'activité de cellules différenciées et de cellules souches, in vitro et/ou in vivo chez l'embryon ou chez l'adulte. De telles molécules, en particulier inhibitrices, sont utiles dans le traitement des tumeurs associées à une hyperactivation de la voie Hedgehog : les tumeurs du tissu nerveux (médulloblastomes, tumeurs primitives neuroectodermiques, glioblastomes, méningiomes et oligodendrogliomes), les tumeurs cutanées (carcinomes basocellulaires, trichoépithéliomes), les tumeurs des tissus musculaires et osseux (rhabdomyosarcomes, ostéosarcomes) et les tumeurs d'autres tissus (rein, vessie). De telles molécules, en particulier stimulatrices, sont également utiles dans le traitement des pathologies de type neuro-dégénératif impliquant la voie Hh (maladie de Parkinson, Chorée de Huntington, maladie d'Alzheimer, sclérose en plaques, maladie du motoneurone), et des maladies dans lesquelles la modulation de la voie de signalisation Hh pourrait être bénéfique comme le diabète. De telles molécules sont également utiles dans le traitement médical ou chirurgical (chirurgie plastique ou réparatrice, greffe de tissus ou d'organes) de nombreuses pathologies aiguës, subaiguës ou chroniques, génétiques ou acquises -impliquant un dysfonctionnement tissulaire lié à une dérégulation de la voie Hh-, pour induire la formation, la régénération, la réparation et/ou l'augmentation de l'activité de tissus tels que de manière non-limitative : le tissu nerveux [système nerveux central (cerveau) et périphérique (neurones sensoriels, moteurs, sympathiques)], l'os, le cartilage, les testicules, le foie, la rate, l'intestin, le pancréas, les reins, les muscles lisses et squelettiques, le coeur, les poumons, la peau et le système pileux, les muqueuses, les cellules sanguines et les cellules du système immunitaire. A titre d'exemple non-limitatif de ces pathologies, on peut citer notamment les neuropathies et les maladies neuromusculaires associées, le diabète, l'alopécie, les brûlures, les ulcérations (peau et muqueuse) et les troubles de la spermatogenèse. Différentes molécules, capables de moduler l'activité de la voie Hedgehog, ont été identifiées (les structures de certaines de ces molécules sont représentées ci-après) : - Les protéines Hh et des polypeptides dérivés qui stimulent la voie en agissant sur la protéine Ptc ; - Des agonistes dérivés des oxystérols (Corcoran and Scott 2006) et des molécules organiques de plus petites taille comme le SAG (Chen et al. 2002) ; les molécules Hh Ag1.2 (Frank-Kamenetsky et al. 2002) ou bien la Purmorphamine (Sinha and Chen 2006) dont l'activité sur le récepteur Smo a été avérée. Récemment, des dérivés plus actifs des Ag1.2 ont été décrits (Brunton et al. 2009) ; Des molécules organiques hétérocycliques azotées ou non inhibant la voie Hedgehog (voir les demande internationales WO 2007/054623, WO 2007/059157, WO 01/74344, WO 01/19800, WO 01/26644, WO 02/30421, WO 2005/033288, WO 2005/042700, WO 2008/014291 et WO 2007/120827) ; un composé de ce type est actuellement en test clinique (le GDC-0449 décrit dans WO 2006/028958) ; Des dérivés de benzamidazole (WO 2008/075196) ; - Des stéroïdes végétaux extraits de Veratrum spp (cyclopamine, jervine,..) et leurs dérivés inhibant la voie (voir les brevets et demandes internationales US 6,432,970, WO 99/52534, WO 01/27135, US 6,291,516, WO 00/41545, WO 02/30462 et Taipale et al., 2000 et Berman et al. 2002). Toutefois, la cyclopamine est un agent tératogène à l'origine d'holoprosencéphalie et de cyclopie pour l'embryon chez les mammifères et l'absence de toxicité, pour les mammifères, des autres composés dérivés de stéroïdes végétaux n'a pas encore été démontrée ; - La mifepristone (17(3-hydroxy 11(3-(4-diméthylamino phényl) 17a-(prop-l-ynyl)estra-4,9-dien 3-one), également dénommée RU-486 ou RU-38486 (voir la demande FR 03/00646) pour laquelle une activité inhibitrice de l'activité de la voie de signalisation des protéines Hh a été démontrée ; - Des molécules N-acylthiourées et N-acylurées inhibiteurs de la voie de signalisation des protéines Hedgehog (voir la demande FR 08/02302). CI SO2Me HO Cyclopamine Cur61414 GDC-0449 OMe O OMe OMe H MeO MeO MeO MeO NH Me SAG MeO MeO MRT-14 N H N H Structure de composés modulateurs de la voie Hedgehog : Le composé SAG est un agoniste de la voie alors que les composés Cyclopamine, Cur61414, GDC-0449, SANT-1, MRT-14, MRT-79 et MRT-81 sont des antagonistes ; tous ces composés se lient au récepteur Smo. Les molécules modulatrices de la voie Hedgehog agissent majoritairement sur la protéine Smoothened comme cela a pu être montré par des expériences de liaison, en compétition ou non avec un composé connu ; de nombreuses publications récentes ont apporté des preuves de modifications conformationelles du récepteur Smo et certains de ces modulateurs semblent agir préférentiellement sur l'une ou l'autre de ces conformations. La transmission du signal Hh par le récepteur Smo et l'activation des gènes cibles semblent associées à un adressage de ce récepteur au cil primaire. Cet adressage peut être stimulé par l'action de Hh lui même mais aussi de petites molécules stimulatrices comme le SAG (Rohatgi et al. 2007) ou même inhibitrices comme la Cyclopamine. A l'inverse, d'autres inhibiteurs empêchent la translocation au cil du récepteur (Rohatgi et al. 2009; Wang et al. 2009; Wilson et al. 2009). Ces derniers auteurs ont suggéré que le récepteur exprimé au cil proviendrait essentiellement de sources intracellulaires via un système de transport de type intraflagellaire (« IFT transport ») (Wang et al. 2009). Ces données utilisant de petites molécules ont amené Rohatgi et al. à proposer un modèle en deux étapes : une étape de translocation au cil puis une seconde étape d'activation du récepteur. Ces deux étapes peuvent être différenciées pharmacologiquement car différents antagonistes peuvent bloquer différentiellement chaque étape (Rohatgi et al. 2009). De même, Wilson et al. suggèrent que Smo existe sous plusieurs conformations actives ou inactives qui influencent sa localisation et son transport vers le cil (Wilson et al. 2009). Du point de vue moléculaire, Zhao et al. ont montré que la forme inactive de Smo est maintenue par des interactions électrostatiques moléculaires maintenues par des clusters d'arginines dans la queue cytoplasmique. Suite à l'action de Hh le récepteur est phosphorylé et ces interactions sont perturbées. Le changement de conformation intervient alors et induit la dimérisation des queues cytoplasmiques nécessaires à l'activation de Smo (Zhao et al. 2007). Ces auteurs suggèrent qu'en fonction du nombre de clusters Arginine inhibés par une phosphorylation différentielle, le récepteur Smo pourrait fonctionner 25 comme un rhéostat moléculaire de la signalisation Hh. La conformation du récepteur Smo semble particulièrement reliée à l'action de composés pharmacologiques. Il a été montré récemment que deux antagonistes connus du récepteur : les SANT-1 et 2 agissaient de façon allostérique sur des sites distincts du récepteur (Rominger et al. 2009). Par ailleurs, il a été publié que le simple 30 changement d'un méthyl en propyl ou allyl sur l'agoniste SAG permettait de transformer cette molécule en antagonistes puissants (IC50=20-70nM, SANT75, SANT74) et ceci en régulant la conformation du récepteur Smo (Yang et al. 2009). Les inventeurs ont identifié de nouveaux composés dérivés de quinoline activateurs de la différenciation ; l'activité biologique induite par ces composés est inhibée par des antagonistes de Smo avec des caractéristiques pharmacologiques différentes par rapport à SAG, agoniste de Smo, démontrant que ces composés agissent sur un site de liaison différent de celui de SAG. Ces composés sont définis par la formule générale (I) suivante : dans laquelle : - X, positionné en ortho, méta ou para, représente -H, -OH, -NH2, un atome d'halogène, de préférence le chlore ou le brome, un radical alkyle consistant en une chaine carbonée de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifiée, un radical alcoxy (de formule -0-alkyle où le groupe alkyle du radical alcoxy est tel que défini précédemment), un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbone ou un groupement aryle ; - R8 positionné en ortho, méta ou para, sur un carbone différent de celui qui porte le radical X, représente : -(C=O)-NH-RI, -(C=0)-O-RI ou -NH-(C=O)-Rl ; - W représente -H, -OH, -NH2 ou un atome d'halogène, de préférence, le chlore ou le brome ; - RI, R2 et R3 identiques ou différents et indépendamment les uns des autres, représentent : - un atome d'hydrogène ; ou - un groupe alkyle consistant en une chaine carbonée de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifiée, éventuellement insaturée par une ou plusieurs double ou triple liaisons, éventuellement substituée par un ou plusieurs hétéroatomes tels que O et S, par un ou plusieurs atomes d'halogènes ou par un ou plusieurs groupements aryles ou hétéroaryles, de préférence, un groupement pyridine ; ou - un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbones éventuellement substitué par un radical alkyle consistant en une chaine carbonée de 1 à 10 atomes (I) de carbones, linéaire ou ramifiée ou un radical alcoxy (de formule -O-alkyle où le groupe alkyle est tel que défini précédemment) ; - R4, R5, R6 et R7 identiques ou différents et indépendamment les uns des autres, sont choisis parmi -H, -Cl, -Br, -I, -CN, -NO2, un radical alkyle consistant en une chaine carbonée de 1 à 10 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée, un radical alcoxy (de formule -O-alkyle où le groupe alkyle est tel que défini précédemment) ou un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbone, par exemple un cyclopropyle, un cyclopentyle, un cyclohexyle ; étant entendu que R3 et R4 peuvent être fusionnés pour former, avec les atomes de carbone et d'azote adjacent du cycle quinoline qui les porte, un cycle à 5 ou 6 chaînons. Au sens de la présente invention, on entend par alkyle un groupement aliphatique hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 3 à 8 atomes de carbone. Le terme "ramifié" signifie qu'au moins un groupe alkyle inférieur de 1 à 15 6 atomes de carbones, tel qu'un méthyle ou un éthyle, est porté par une chaîne alkyle linéaire. De préférence, les composés de formule générale (I) sont tels que le radical R3 est un radical alkyle de 3 à 8 atomes de carbones tel que le radical hexyle ; le radical R2 est un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de 1 à 3 atomes de carbone ; que 20 les radicaux R4, R5, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de 1 à 3 atomes de carbone. Par atome d'halogène, on entend un atome de brome, de chlore, d'iode ou de fluore ; les désignations brome et chlore étant préférées. Par groupement aryle, on entend tout groupe fonctionnel ou substituant 25 dérivé d'au moins un cycle aromatique ; on peut mentionner les groupes phényle, benzylcyclobutène, pentalène, naphthalène, benzylphényle, et anthracène. Par groupement hétéroaryle, on entend tout groupe fonctionnel ou substituant dérivé d'au moins un cycle aromatique tel que défini ci-dessus et contenant au moins un hétéroatome choisi parmi P, S, O et N ; parmi les groupes hétéroaryle, on peut 30 mentionner les groupes furane, pyridine, pyrrole, thiophène, imidazole, pyrazole, oxazole, isoxazole, thiazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, benzofurane, isobenzofurane, indole, isoindole, benzothiophène, benzo[c]thiophène, benzimidazole, indazole, benzoxazole, benzisoxazole, benzothiazole, quinoléine, isoquinoléine, quinoxaline, quinazoline, cinnoline, purine, et acridine. A titre de composés de formulé générale (I), on peut en particulier citer de façon non limitative : - le propyl 4-(1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3-5 carboxamido)-benzoate (composé 1) : 10 l'éthyle 4-(1-benzyle-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3- carboxamido)-benzoate (composé 2) : O OH O 15 20 l'éthyle 4-(1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3- carboxamido)-benzoate (composé 3) : O OH O O~ 25 30 - l'acide 4-(1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)-benzoique (composé 4) : O OH 0 OH - le butyl 4-(1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)-benzoate (composé 5) : - le tert-butyl 4-(1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3-10 carboxamido)-benzoate (composé 6) : 15 - le benzyle 4-(1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)-benzoate (composé 7) : 20 25 le N-(4-(butylcarbamoyl)phényl)- 1 -hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2- dihydroquinoline-3-carboxamide (composé 8) : O 30 1' i soprop yl-4- ( 1 -hexyl-4 -hydroxy-2-oxo-1 ,2-dihydroquinoline-3 - carboxamido)-benzoate (composé 9) : Les composés de formule générale (I) conformes à l'invention peuvent 10 être préparés selon le schéma de synthèse représenté à la Figure 1. Conformément au schéma de synthèse de la Figure 1, dans une première étape, une aniline est condensée avec le triéthyl méthane tricarboxylate sous irradiation micro-ondes pour obtenir des quinolinones carboxylates ; ensuite, les quinolones sont condensées avec la 4-tert-butyl-aniline sous irradiation micro-ondes pour donner des esters 15 carboxamido-quinolinones ; l'étape suivante consiste à saponifier la fonction ester de ces composés pour conduire à un acide point de départ pour différentes modifications telles qu'illustré dans les exemples expérimentaux. Dans ce qui suit, le site du récepteur Smo sur lequel se lie SAG est dénommé Smo1 et celui sur lequel se lient les composés de formule générale (I) est 20 dénommé Smo2. En outre, ces composés de formule générale (I) peuvent agir sur la voie de signalisation des protéines Hh ou sur d'autres voies impliquées dans la maintenance ou la différenciation des cellules multipotentes ou totipotentes : voies Wnt, Nocht, TGF-13 ou BMP par exemple. 25 Ces composés s'avèrent donc être d'une grande utilité aussi bien comme outils pour la découverte de nouveaux modulateurs de ces voies de signalisation que pour déceler différentes formes du récepteur Smo ou de récepteurs apparentés et identifier des molécules capables de moduler ces différentes formes. Diverses méthodes de criblage de modulateurs de la voie hedgehog sont 30 connues : - méthodes utilisant des réponses cellulaires de lignées ou cultures primaires : différenciation cellulaire (C3H10T1/2), prolifération cellulaire (cellules primaires granulaires du cervelet) (voir les exemples mis en oeuvres ci-après) ; - méthodes utilisant une compétition avec un composé fluorescent agissant sur les domaines transmembranaires du récepteur ciblé (Bodipycyclopamine) (US 2007/0218775) ; - méthodes utilisant un gène rapporteur de la voie impliquée (Taipale et al, 2000, Nature, 406, 1005-9) ; - un essai détectant une activité Hh en mesurant les interactions Ptc-Hh en présence ou non de composé à tester (US 2005/0282231) ; - un essai utilisant des cellules défectives pour Sufu et un rapporteur pour identifier des inhibiteurs de la voie Hh agissant en aval de Smo (WO 2006/080894). La présente invention se rapporte ainsi à l'utilisation d'au moins un composé de formule générale (I) comme outil de recherche, notamment pour l'identification de molécules capables d'interagir avec le Smoothened en se liant sur le site de liaison Smo2. En particulier, la présente invention se rapporte à une méthode de criblage et/ou d'identification de ligands du site de liaison Smo2 du récepteur Smoothened comprenant les étapes de : a) mise en contact du récepteur Smoothened et d'au moins un composée de formule générale (I) pour l'obtention d'un complexe [Smo-composé de formule générale (1)] ; b) mise en contact du récepteur Smoothened, dudit composée de formule générale (I) et d'une molécule à tester ; c) détection d'une interaction entre ledit récepteur Smoothened et lesdites molécules à tester par comparaison du récepteur Smoothened récupéré à l'étape b) avec le complexe [Smo-composé de formule générale (I)] ; et d) sélection desdites molécules à tester pour lesquelles une interaction avec le récepteur Smoothened est mesurée. L'étape a) peut être mise en oeuvre avec des cellules exprimant le récepteur Smoothened ou avec des extraits de membranes comprenant le récepteur Smoothened fonctionnel, il peut notamment s'agir d'extraits de membranes de levures portant le récepteur humain Smoothened fonctionnel susceptibles d'être obtenus avec le procédé décrit par de Rivoyre et al. (FEBS Letters 579, 2005, 1529-1533). Lorsque l'étape a) est mise en oeuvre avec des cellules exprimant le récepteur Smoothened, l'expression dudit récepteur est soit constitutive (le récepteur est naturellement exprimé par la cellule) ou bien elle résulte de la transformation d'une cellule afin qu'elle exprime ou sur-exprime un récepteur Smoothened de la même espèce ou d'une espèce différente. Ce récepteur Smoothened peut aussi porter une mutation qui lui confère des propriétés biochimiques ou pharmacologiques différentes du récepteur sauvage. Tout composé de formule générale (I) peut être utilisé pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention ; il pourra toutefois être choisi par l'homme du métier notamment en fonction de son affinité pour le récepteur Smoothened. L'étape a) peut être mise en oeuvre en phase liquide ou sur un support solide convenable ; l'homme du métier choisira et adaptera ces modalités de mise en oeuvre par exemple selon qu'il utilise le récepteur Smoothened sous la forme d'extraits de membranes ou sous la forme de protéine purifiée. Lorsque l'étape a) est mise en oeuvre en phase liquide, la méthode de criblage en phase liquide peut être mis ne oeuvre selon les étapes suivantes : a) mise en contact du récepteur Smoothened et d'au moins un composé de formule générale (1) pour l'obtention d'un complexe [Smo-composé de formule générale (1)] ; b) mise en contact du récepteur Smoothened, dudit composée de formule générale (1) et d'une molécule à tester ; c) récupération dudit récepteur Smoothened éventuellement lié à une ou plusieurs molécules à tester et/ou audit composé de formule générale (1) ; d) détection d'une interaction entre ledit récepteur Smoothened et lesdites molécules à tester par comparaison du récepteur Smoothened récupéré à l'étape c) avec le complexe [Smo-composé de formule générale (I)] ; et e) sélection desdites molécules à tester pour lesquelles une interaction est mesurée. L'étape a) peut être mise en oeuvre avec des extraits membranaires comprenant le récepteur Smoothened qui sont alors incubés avec le composé de formule générale (I) et les molécules à tester ; le mélange est ensuite centrifugé ; le culot obtenu après centrifugation est resuspendu dans du tampon puis est centrifugé à nouveau pour éliminer les interactions non spécifiques. La fixation de molécule à tester au récepteur Smoothened est alors analysée soit par mesure de fluorescence, soit par mesure de radioactivité suivant le marquage du composé de formule générale (I) : - selon une variante de la méthode de criblage en phase liquide, ledit composé de formule générale (I) est préalablement marqué. Le marquage peut être radioactif par incorporation d'isotopes radioactifs tels que 3H, 11C, 14C, 32p, 35S, 1251, 99-Tc, 18F, 64Cu, 76Br, 1241, 13N, 150 ou encore 1231 selon les méthodes classiques de l'état de la technique. Le marquage du composé de formule générale (1) peut aussi consister en la fixation d'un fluorophore sur ledit composé selon les méthodes connues de l'homme du métier ; la détection du marquage peut se faire classiquement à l'aide de radio imageurs sélectionnés en fonction de l'atome radioactif à détecter, ou par mesure de la fluorescence. Alors, l'étape d) de détection de l'interaction entre le récepteur Smoothened et une ou plusieurs des molécules à tester se fait par comparaison du marquage (par radioactivité ou fluorescence) des récepteurs Smoothened récupérés à l'étape c) avec celui du complexe [Smo-composé de formule générale (1)] ; les molécules sélectionnées sont celles pour lesquelles le marquage des récepteurs Smoothened récupérés à l'étape c) est plus faible que celui du complexe [Smo-composé de formule générale (I)] ; - selon une autre variante de la méthode de criblage en phase liquide, la détection de l'interaction se fait par chromatographie en comparant la position du complexe [Smo-composé de formule générale (1)] avec celle du récepteur Smoothened récupéré à l'étape c), si la position est identique alors il n'y a pas d'interaction entre le récepteur Smoothened et la molécule à tester ; a contratio, une différence de position indique une interaction, il convient ensuite de confirmer que l'interaction entre la molécule à tester et le récepteur Smoothened se produit bien sur le site de liaison Smog. L'étape a) de la méthode de criblage selon l'invention peut alternativement être mise en oeuvre sur un support solide convenable. Par support solide, on entend en particulier un biocapteur constitué d'une membrane qui comprend une espèce biologique, telle qu'une enzyme, un anticorps, un peptide, un micro-organisme, un tissu biologique, un lipide, un acide nucléique..., permettant la liaison avec une molécule à tester et un transducteur permettant de transformer le signal biologique, tel que la fixation d'un ligand sur un récepteur protéique, en un signal physique mesurable, par exemple électrochimique (ampérométrique, potentiométrique, conductimétrique), optique (lumineux), piézoélectrique ou calorimétrique. Dans le cas présent, l'espèce biologique fixée sur la membrane est le récepteur Smoothened ; dans deux expériences conduites en parallèle, le récepteur Smoothened sur support solide est mis en contact avec un composé de formule générale (1) et avec le mélange dudit composé de formule générale (I) et d'une molécule à tester, les signaux obtenus dans chacune de ces expériences sont comparés ; sont sélectionnées les molécules qui induisent une modification du signal. A titre d'exemple, le support solide est un biocapteur de détection d'une liaison par résonance plasmonique dont l'utilisation permet de visualiser et de caractériser (constantes d'affinité, d'association et de dissociation) des interactions entre une protéine et son ligand par changement de masse à la surface du biocapteur. Ce changement de masse se mesure par des variations de l'angle de résonance plasmonique à la surface du biocapteur et ne nécessite pas de ligand radiomarqué ou fluorescent. Lorsque la méthode de criblage sur support solide est mise en oeuvre avec des extraits de membranes comprenant le récepteur Smoothened, ces extraits peuvent être fixés par injection sur un biocapteur lipophile. Lorsqu'un biocapteur lipophile est utilisé, les extraits membranaires se fixent aux groupements lipophiles liés par des liaisons covalentes au dextran, ce qui permet de suivre l'interaction entre récepteurs membranaires et ligands (Pourshafie MR, Marklund B-I and Ohlson S (2004) Binding interactions of Escherichia coli with globotetraosylceramide (globoside) using a surface plasmon resonance biosensor. J. Microbiol. Meth., 58, 313-320; Wikstrom A and Deinum J (2007) Probing the interaction of coagulation factors with phosphohpid vesicle surface plasma resonance. Anal. Biochem. 362, 98-107). Ainsi selon une variante de l'invention, le biocapteur de détection d'une liaison par résonance plasmonique est un biocapteur lipophile tel qu'un biocapteur hydrophobe « sensorchip L1 » de Biacore (GE Healthcare) sur lequel est fixée par injection une préparation de membranes contenant le récepteur Smoothened. Lorsque la méthode de criblage sur support solide est mise en oeuvre avec le récepteur Smoothened purifié, ledit récepteur peut également être fixé sur un biocapteur permettant une mesure de résonance plasmonique de surface qui consiste à détecter une variation de l'indice de l'interface sur laquelle est fixé le récepteur lorsqu'un ligand s'y fixe. Selon une variante de mode de réalisation, la méthode de criblage sur support solide permet également d'identifier des ligands du récepteur Smoothened qui ne se lient pas au site de liaison Smo2 ; l'action activatrice ou inhibitrice de ces ligands peut être caractérisée par les méthodes qui suivent. La présente invention se rapporte aussi à une méthode d'identification d'agonistes du récepteur Smoothened, notamment ceux se liant sur le site de liaison Smo2, qui, en plus des étapes décrites pour la méthode d'identification de ligand, comprend les étapes additionnelles de mise en contact du ligand identifié avec une cellule qui présente une réponse cellulaire suite à l'activation du récepteur Smoothened et de sélection des molécules agonistes capables d'induire ladite réponse cellulaire de ladite cellule. Les cellules qui présentent une réponse cellulaire suite à l'activation du récepteur Smoothened sont choisies parmi les lignées ou cultures primaires : cellules mésenchymateuses (par exemple, C3H10T1/2) répondant à une activation du récepteur Smoothened par la différenciation cellulaire mesurable par l'activité de la phosphatase alcaline ; cellules primaires granulaires du cervelet répondant à une activation du récepteur Smoothened par une prolifération cellulaire ; cellules souches du cerveau adulte ou des progéniteurs neuraux ou encore des cellules progénitrices présentes dans les tissus au cours du développement ou chez l'adulte pour lesquelles la réponse cellulaire peut, par exemple, consister en l'induction de gènes tels que ceux codants pour les facteurs de transcription de la famille des Gli, ou encore pour Patched ou Hip, gènes activés par la voie Hedgehog. La présente invention se rapporte également à une méthode d'identification d'une molécule antagoniste du récepteur Smoothened comprenant les étapes suivantes : a) mise en culture de cellules qui présentent une réponse cellulaire suite à l'activation du récepteur Smoothened avec au moins un composé de formule générale (I) de façon à induire ladite réponse cellulaire ; b) mise en contact des cellules obtenues à l'issue de l'étape a) avec une molécule à tester ; c) sélection des molécules induisant une inhibition de ladite réponse cellulaire desdites cellules. Un exemple de cette méthode est illustré dans la partie expérimentale (exemple II) qui suit. La molécule dont on veut tester l'activité antagoniste du récepteur Smoothened peut notamment être est un ligand se liant sur le site de liaison Smo2 de Smoothened identifié par l'une quelconque des méthodes précédentes d'identification de ligand selon l'invention. Cette même méthode peut également être utilisée pour identifier des molécules capables d'induire une potentialisation de l'activation du récepteur Smoothened induite par le composé de formule générale (I) ; par potentialisation, on entend la capacité d'une molécule à augmenter le degré d'activation induit par le composé de formule générale (1). Seront alors sélectionnées les molécules qui induisent une augmentation de la réponse cellulaire des cellules qui présentent une réponse cellulaire suite à l'activation du récepteur Smoothened. La présente invention se rapporte encore à un kit permettant la mise en oeuvre des méthodes selon l'invention comprenant au moins le récepteur Smoothened fonctionnel et au moins un composé de formule générale (I). Le récepteur Smoothened fonctionnel est soit présent sous forme d'extrait membranaire soit dans des cellules qui présentent une réponse cellulaire suite à l'activation du récepteur Smoothened. Les expériences de liaison entre le récepteur Smoothened et un composé de formule générale (I) peuvent également être utilisées pour caractériser et identifier : - de nouveaux types cellulaires exprimant le récepteur Smoothened dans une conformation où le site de liaison Smo2 est actif ; - ou encore, des récepteurs impliqués dans la différenciation tels que des récepteurs apparentés au récepteur Smoothened. L'invention se rapporte alors à une méthode d'identification de cellules, 20 telles que des cellules tumorales, exprimant le récepteur Smoothened comprenant les étapes de : a) mise en contact de cellule à tester avec un composé de formule générale (I) marqué ; b) nettoyage des cellules afin d'éliminer ledit composé de formule 25 générale (I) marqué qui ne se serait lié à aucun récepteur de ladite cellule à tester ; c) détections des cellules marquées. Les composés peuvent également servir à l'identification et à la caractérisation de nouveaux récepteurs ou de nouvelles formes de récepteurs impliqués 30 dans la différenciation cellulaire, la prolifération, la mort cellulaire, la migration, la survie cellulaire ou encore permettant à la cellule d'acquérir une propriété ou un état qu'elle n'a pas encore atteint. Selon une autre variante de l'invention, les composés de formule générale (I) sont utilisés comme outil de recherche pour étudier les conséquences de l'activation du récepteur Smoothened sur le site de liaison Smo2. De telles études peuvent par exemple consister à comparer le profil d'expression des ARN messagers et/ou de protéines par des cellules avant et après activation par mise en contact avec un composé de formule générale (1) ; l'étude pourra encore consister en la comparaison des profils d'expression des ARN messagers et/ou de protéines de deux groupes de cellules issues d'un même type cellulaire, un groupe de cellules ayant été activé par un composé de formule générale (1), l'autre par un agoniste Smo connu pour se fixer sur un autre site de liaison que Smo 1. Les méthodes de quantification des ARNm pourront être celles permettant l'analyse de patrons d'expression d'une famille de gènes, ou encore l'ensemble des gènes exprimés par la cellule ; La modification de la transcription de microARN pourra aussi être analysée. Cette caractérisation biochimique ou moléculaire de cellules pourrait servir à identifier des cellules tumorales sensibles aux composés de formule générale (I) et, à un stade ultérieur, à la mise au point d'une méthode de diagnostic de tumeurs sensibles aux composés de formule générale (1). Les composés de formule générale (I) peuvent encore servir à caractériser la fonction biologique de mutant du récepteur Smo ; cette caractérisation peut se faire par la transformation de cellules avec un vecteur d'expression d'un mutant de Smo et l'observation de l'effet d'un composé de formule générale (I) sur ladite cellule exprimant le mutant de Smo. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de démonstrations des propriétés pharmacologiques des composés de formule générale (I) selon la présente invention, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - Figure 1 représente le schéma de synthèse des composés de formule générale (I). - Figure 2 : Activité stimulatrice des composés de formule générale (I). Courbe dose réponse du composé 1 et du SAG sur la différenciation ostéogénique des cellules C3H10T1/2. L'activité de la phosphatase alcaline, exprimée en DO à 415 nm, reflète la différenciation. Une expérience sur 3-5 réalisées. - Figure 3 : Activité du composé 1 est inhibée par des antagonistes de Smo. Les cellules C3H10T1/2 ont été incubées pendant 6 jours en présence du composé 1 (1 µM) et de concentrations croissantes des antagonistes de la voie Hh indiqués. - Figure 4 : Activité du composé 6 est inhibée par des antagonistes de Smo. L'activité du composé 6 (3µM) a été inhibée par les antagonistes comme indiqué dans la Figure 2. - Figure 5 : Inhibition de l'activité du SAG par les antagonistes de Smo. L'activité du SAG (0,1 µM) a été inhibée par les antagonistes comme indiqué dans la Figure 2. Le composé SAG se lie sur le site de liaison Smol. - Figure 6 : La Forskoline potentialise la réponse au composé 1 qui stimule les sites Smo2 et diminue celle du SAG qui stimule le site Smol. Les cellules souches mésenchymateuses C3H10T1/2 ont été traitées par le composé 1 à 1 µM (A) ou le SAG à 0.3 gM (B) en présence de 0.3, 3 ou 10 µM de Forskoline (Fsk). L'activité enzymatique de la phosphatase alcaline est exprimée en DO. Une expérience représentative sur 3 réalisées. Moyenne ± SEM de quadruplicats. - Figure 7 : Le composé IWR1 inhibe l'activité du composé 1 et n'affecte pas celle du SAG. Les cellules souches mésenchymateuses C3HlOT1/2 ont été traitées par le composé 1 à 1µM ou le SAG à 0.1 µM en présence (barres blanches) ou non (barres grises) de 10 µM d'IWR1. L'activité enzymatique de la phosphatase alcaline est exprimée en DO. Une expérience représentative sur 3 réalisées indépendamment. Moyenne ± SEM de quadruplicats. EXEMPLE 1 : SYNTHÈSE DE DIFFÉRENTS COMPOSÉS DE FORMULE GENERALE (I) Préparation de l'éthyl 1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3-25 carboxylate 0 H O Dans un ballon équipé d'un condenseur, du N-hexylaniline (355 mg, 2 mmol) est ajouté à une solution d'acide triéthylester methanetricarboxylique (1,35 ml, 5 10 6,4 mmol). Le mélange réactionnel résultant est placé dans un four à micro-ondes CEM Discovery et irradié dans le ballon ouvert puis l'éthanol formé est distillé (les paramètres sont les suivants : puissance = 250 W, température = 225°C, temps d'exécution = 5 min, temps de maintien 15 min). Après chauffage aux micro-ondes, le brut réactionnel est purifié sur colonne chromatographique, avec de l'éther de pétrole : acétate d'éthyle à 4:1. Le produit cristallin obtenu est séché pour donner le composé : rendement = 430 mg (69%). 1H NMR (CDC13): a 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 7.64 (m, 1H), 7.27-7.19 (m, 2H), 4.48 (q, J= 8Hz, 2H), 4.18 (t, J=8Hz, 2H), 1.72-0.86 (m, 14H). I.A. tert-Butyl 4-(1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)-benzoate (composé 6) OH O N H Du 1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoléine-3-carboxylate d'éthyle (159 mg, 0,5 mmol) et du tert-butyle 4-aminobenzoate (193 mg, 1 mmol) sont mis 15 en suspension dans du toluène anhydre (4 ml) et sont chauffés au micro-onde récipient ouvert (les paramètres sont les suivants : puissance = 200 W, la température = 120°C, temps d'exécution = 7 min, temps de maintien = 10 min). A la fin de la réaction, 2 / 3 du solvant sont évaporés sans condensateur. Le brut réactionnel est purifié par colonne chromatographique, utilisant de l'éther de 20 pétrole 4:1: acétate d'éthyle. Le produit cristallin obtenu est séché pour donner le composé du titre: rendement = 195 mg (84%). 1H NMR (DMSO): ô 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 7.90-7.75 (m, 6H), 7.38 (m, 1H), 4.25 (bs, 2H), 1.60 (bs, 2H), 1.52 (s, 9H), 1.39 (bs, 2H), 1.28 (bs, 5H), 0.84 (bs, 2H). 10 I.B. Acide 4-(1-Hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3- carboxamido)-benzoique (composé 4) o A une solution d'acide trifluoroacétique (TFA) refroidi à 0°C, est ajouté du tert-butyle 4-(1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoléine-3-carboxamido) benzoate (83 mg, 0,18 mmol) de façon fractionnée ; le mélange est laissé à réagir pendant 3 heures. Le produit brut obtenu est lavé avec de l'éther éthylique jusqu'à la formation d'un solide cristallin blanc. Le produit est séché pour donner un rendement de 61 mg (83%). 1H NMR (DMSO): a 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 7.96-7.65 (m, 6H), 7.38 (m, 1H), 4.27 (bs, 2H), 1.59 (bs, 2H), 1.39 (bs, 2H), 1.28 (bs, 5H), 0.84 (bs, 2H). I.C. Benzyle 4-(1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3- carboxamido)-benzoate (composé 7) OH O N H Une solution d'acide 4-( 1 -hexyl-4-hydroxy-2-oxo -1,2- 15 dihydroquinoléine-3-carboxamido) benzoïque (41 mg, 0,1 mmol) dans du THF est refroidie à 0°C, et de l'alcool benzyique (21 mg, 20 µl, 0,2 mmol) est ajouté, ainsi que de l'EDCI (19 mg, 0,1 mmol) et de la diméthylamino pyridine (3 mg, 0,02 mmol). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation pendant une nuit. La phase organique est lavée avec de l'eau et évaporée sous pression réduite. Le produit brut est purifié par 20 chromatographie sur colonne, en utilisant l'éther de pétrole 4:1: acétate d'éthyle, avec un rendement de 30 mg (60%). 1H NMR (DMSO): a 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 8.04 (d, J=8Hz, 2H), 7.83 (d, J=8Hz, 3H), 7.68 (d, J=8Hz, 1H), 7.46-7.25 (m, 6H), 7.38 (m, 1H), 5.30 (s, 2H), 4.28 (bs, 2H), 1.59 (bs, 2H), 1.41-1.15 (m, 6H), 0.84 (bs, 3H). EXEMPLE II - Mise en évidence de la liaison des composés de formule générale (I) sur un site de liaison spécifique (Smog) différent de celui sur lequel agit le composé SAG (Smol) L'effet des composés de formule générale (I) selon l'invention sur la 5 stimulation de la différenciation a été déterminé in vitro par analyse de la lignée de cellules fibroblastiques pluripotentes C3 H l OT 1 /2. Cette activation peut être inhibée par des composés précédemment décrits comme antagonistes de la voie Hh et plus spécifiquement du récepteur Smo. Par ailleurs, ces agents pharmacologiques présentent un mode de transmission du signal distinct de celui 10 employé par le SAG, un agoniste de la voie Hh (Chen et al. 2002). 1) Matériels et méthodes Activation de la différenciation par les composés de formule générale (I) Les composés de formule générale (I) testés sont les composés 1 et 6 : 1 6 15 ils ont été dissous dans le diméthylsulfoxyde jusqu'à une concentration de 2,5 mM, puis stockés à une température de -20°C jusqu'à utilisation. La lignée de cellules fibroblastiques pluripotentes C3H10T1/2 (ATCC) a été cultivée dans les conditions recommandées par l'ATCC. La stimulation de la différenciation de ces cellules a été réalisée en utilisant des concentrations croissantes de 20 composés selon les méthodes décrites par Chen et al. et Frank-Kamenetsky et al. (Chen et al. 2002; Frank-Kamenetsky et al. 2002). L'activation par les composés de formule générale (I) provoque la différenciation de la lignée cellulaire et leur permet d'exprimer la phosphatase alcaline. On a ainsi pu mesurer l'activité des composés via la mesure de l'activité phosphatase alcaline. A titre comparatif, l'activité du composé SAG (Chen et al. 25 2002), activateur de Smo a été testé dans les mêmes conditions que celles utilisées pour tester les composés de formule générale (I). Les cellules C3HIOT1/2 ont été ensemencées sur des plaques de 96 puits à une densité de 5.103 cellules par puits, 24 heures avant l'addition des composés à tester à une concentration variant de 10 nM à 10 µM dans le milieu de culture DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal. Les essais ont été réalisés en quadruplicats. Les plaques ont ensuite été incubées pendant 5-6 jours à une température de 37°C sous atmosphère à 5% de COZ. Les cellules ont ensuite été lavées dans du tampon phosphate froid ("Phosphate Buffer Saline" : PBS) puis lysées par sonication à 4°C dans 50 µl d'une solution contenant 0,9 % de NaCl et 0,2 % de Triton X-100. La mesure de l'activité phosphatase alcaline dans les lysats ainsi obtenus a été ensuite réalisée selon la méthode décrite par Pepinsky et al. (Pepinsky et al. 1998). Après addition de 100 µl de tampon réactionnel (200 mM Tris-HCl ; pH 10,5 ; 0,4 M de 2- amino-2-méthyl propanol et 8 mM de MgC12) et de 50 µl de substrat (4 mM de p-Nitrophényl phosphate disodium), les lysats ont été incubés à 37°C pendant 30-60 min, puis la densité optique a été lue à une longueur d'onde de 415 nm. Inhibition par de la différenciation par des antagonistes de la voie Hedgehog Pour les expériences d'inhibition, le composé 1 (1µM), 6 (3µM) ou le SAG (0.111M) ont été utilisés pour stimuler la différenciation en présence de concentrations croissantes (de 0.1 nM à 30µM) d'inhibiteurs de Smo précédemment décrits comme le Cur61414 (Frank-Kamenetsky et al. 2002), la Cyclopamine (Incardona et al. 1998), le GDC-0449 (Romer et al. 2004) ainsi que les molécules MRT-14, MRT-79, MRT-80 et MRT-81 (Demande de Brevet FR 08/02302). Ces composés ont été dissous dans l'éthanol 100% (Cur61414, Cyclopamine) ou le diméthylsulfoxyde (composés MRT-14, MRT-79, MRT-80, MRT-81 et GDC-0449) puis conservés à -20°C. Activité de la Forskoline et de l'IWR1 Pour les expériences en présence de forskoline, le composé 1 (1µM) et le SAG (0,3 µM) ont été utilisés pour stimuler la différenciation en présence de concentrations croissantes (1, 3 et 10 µM) de Forskoline (Sigma). Le composé IWR1 (Sigma), quant à lui, a été utilisé à 10µM sur une activation par le composé 1 à 1 µM ou le SAG à 0,1 µM. L'activité de la phosphatase alcaline a été mesurée comme précédemment. 2) Résultats 2-1. Activation de la différenciation par les composés 1 et 6 Il a été démontré que les composés 1 et 6 ont la capacité de stimuler l'ostéogenèse dans les cellules pluripotentes C3H10T1/2. Cette différenciation est reliée à l'induction de la phosphatase alcaline (PA) après 6 jours de différenciation. La Figure 2 représente les courbes dose réponse du composé 1 et du SAG réalisées en parallèle sur la stimulation des cellules C3H10T1/2. Le composé 1 permet d'obtenir un maximum de stimulation supérieur à celui de l'agoniste de Smo, SAG, et ceci avec une affinité similaire. 2-2. Inhibition de l'activité des composés 1 et 6 par des antagonistes de Smoothened. L'activité du composé 1 peut être inhibée par des antagonistes du récepteur Smo (Figure 3). Ceci se traduit par une inhibition progressive de l'activité phosphatase alcaline induite par le composé 1 en présence de concentrations croissantes d'antagonistes connus comme la Cyclopamine, le Cur61414, le GDC-0449 ou les composés MRT-14 et MRT-81. Le composé 6 possède également la caractéristique de pouvoir être inhibé par les antagonistes de Smo (Figure 4). Quand on compare les activités des antagonistes testés sur les deux composés 1 et 6, on peut noter une grande similitude de pharmacologie pour ces deux agents stimulateurs de l'ostéogenèse. Cela suggère un même mode d'action pour ces composés. Les affinités des antagonistes de Smo pour les deux composés 1 et 6 ont été déterminées et sont reportées dans le Tableau I. Elles sont exprimées en CI50 qui correspond à la concentration permettant d'inhiber 50% de la réponse biologique induite par le composé agoniste. Les composés MRT-14 et MRT-81 présentent une bonne affinité pour la réponse avec des valeurs extrêmement proches pour les deux composés. Les affinités du MRT-14 sont respectivement de 0,32 et 0,4 µM pour les composés 1 et 6 alors que celle du MRT-81 est 0,06 µM pour les deux composés. A l'inverse, la Cyclopamine, le Cur61414 et le GDC-449 sont peu affins sur ces composés (IC50 = 2-10 µM). C150, pM, C3H10T1/2 Composé 1 Composé 6 0.32±0.02 0.4±0.1 0.06 ± 0.02 0.06 ± 0.03 6.6 ± 3.1 12 ±7 5.7±1.6 7±1 3.4 ± 1.4 2 ± 1 Tableau I : Affinité d'antagonistes de la voie Hedgehog vis-à-vis des sites Smo2. La différenciation des cellules C3HIOT1/2 est mesurée par l'activité de la phosphatase alcaline induite par les composés 1 (1 ,uM) et 6 (3 ,uM). Les CI50 sont issues des courbes Antagoniste MRT-14 MRT-81 Cyclopamine Cur61414 GDC-0449 d'inhibition telles que montrées sur les Figures 3 et 4. Moyenne ± SEM de 2 à 6 expériences indépendantes en quadruplicats. Les composés 1 et 6 se lient sur des sites de liaison Smo2 et leur liaison est bloquée par des antagonistes de la voie Hedgehog avec la même affinité. 2-3. Comparaison des activités des antagonistes de Smoothened vis-à-vis des sites Smol et Smo2. Des courbes dose-réponse aux antagonistes ont également été réalisées en présence de 0,1 pM de SAG (Figure 5) en parallèle de celles effectuées sur le composé 1. Le composé SAG agit sur un site de liaison appelé Smo 1. La comparaison de la pharmacologie des antagonistes vis-à-vis de ces deux composés est présentée dans le Tableau II. Quand on compare les activités des antagonistes de Smo vis-à-vis de la stimulation par le SAG ou par le composé 1, des différences importantes existent tant au niveau des maximum d'inhibition obtenus que des affinités (CI50). La première différence notable est la plus faible inhibition de la Cyclopamine, du Cur61414 et du GDC-0449 observée à 10 µM pour le composé 1 alors que ces composés permettent une inhibition complète en présence de SAG. Smol IC50, pM Inhibition 10pM M RT-79 0.14 ± 0.06 95 MRT-81 0.06 ± 0.02 100 SANT-1 0.04 ± 0.01 100 MRT-14 0.13 ± 0.05 100 Cyclopamine 0.62 ± 0.03 98 CUR61414 0.33 ± 0.06 100 GDC-0449 0.011 ± 0.001 100 Tableau H: Comparaison de l'activité des antagonistes de la voie Hedgehog vis-à-vis des sites Smol et Smog. La réponse mesurant la différenciation cellulaire des cellules souches mésenchymateuses induite par les composés 1 et SAG sur les cellules C3H10T1/2 est mesurée par l'activité de la phosphatase alcaline induite par les composés 1 (1 ,uM) et SAG (0,1 ,uM). Les CI50 sont issues des courbes d'inhibition telles que montrées sur les Figures 3 et 5 (moyenne ± SEM de 2 à 6 expériences indépendantes en quadruplicats). Smo2 IC50, pM Inhibition, 10pM 0.011 ± 0.005 100 0.06 ± 0.02 100 0.06 ± 0.02 71 0.32 ± 0.02 95 6.6 ± 3.1 48 5.7 ± 1.6 60 3.4 ± 1.4 77 Les composés SAG et 1 se lient respectivement sur les sites de liaison Smol et Smo2. Leur liaison est bloquée par des antagonistes de la voie Hedgehog (Moyenne ± SEM de 2 à 6 expériences indépendantes en quadruplicats). Les composés MRT-14 et MRT-81 ainsi que le composé SANT-1 présentent des affinités comparables pour le site Smo1 (stimulés par le SAG) et le site Smo2 (stimulés par le composé 1) avec des valeurs proches. En revanche, d'autres antagonistes de la voie Hedgehog sont bien plus sélectifs vis-à-vis des sites Smol que des sites Smo2 (Cur61414, GDC-0449). A l'inverse, les composés MRT-81 et MRT-79 sont plus sélectifs vis-à-vis des sites Smo2 que des sites Smol. Ceci est explicité lorsque l'on calcule le rapport entre les CI50 des composés obtenus avec le SAG et le composé 1 (Tableau III). Différenciation des cellules C3H10T1/2 C150 Smo1/ CI50 Smo2 0.08 0.4 0.9 1.5 2.5 11 17 310 Tableau III: Sélectivité des antagonistes de la voie Hedgehog vis-à-vis des sites Smol et Smo2. Les CI50 des antagonistes vis-à-vis des sites Smol (stimulés par le SAG, 0,1 ,uM) et les sites Smo2 (stimulés par le composé 1, I ,uM) ont été évalué comme dans les Tableaux I et H (rapport des moyennes des CI50 obtenues dans 2 à 6 expériences). Une sélectivité de plus de 300 fois est observée avec le GDC-0449 et de 17 fois pour le Cur61414 pour le site Smol par rapport au site Smo2, alors que le SANT-1 maintient une activité proche pour les sites Smol et Smo2. A l'opposé, les composés MRT-81, MRT-55 et MRT-79 sont respectivement de 1.3, 2.5 à 12.5 fois plus sélectifs vis- à-vis des sites Smo2. Cette spécificité des composés est significative et démontre une différence pharmacologique importante au niveau des sites de liaison Smol et Smo2. Antagoniste MRT-79 MRT-55 MRT-81 SANT-1 MRT-14 Cyclopamine CUR61414 GDC-0449 2-4. Les sites Smol et Smo2 présentent des mécanismes d'activation différents. Modulation de l'activité du composé 1 et du SAG par la forskoline. Les composés de formule générale (I) et le SAG agissent par des voies distinctes. En effet, il est connu que la forskoline est un inhibiteur de l'ostéogénèse induite par la voie Hh dans les cellules souches mésenchymateuses (Wu et al. 2004). Le but des essais qui suivent est de savoir si cette caractéristique s'appliquait également aux composés de formule générale (1). La différenciation des cellules C3HT10T1/2 a été stimulée par le composé 1 en présence de forskoline. Comme démontré sur la Figure 6, panneau (A), il apparait que la forskoline a un effet potentialisateur de la réponse au composé 1 alors qu'elle inhibe l'activité du composé SAG (B). Ces deux agents stimulateurs de l'ostéogenèse agissent donc via des voies distinctes. Cet effet de la forskoline a été retrouvé pour d'autres composés de formule générale (1). Modulation de l'activité du composé 1 et du SAG par le composé IWR1, un antagoniste de la voie des Wnt. La différence d'activité de la forskoline sur le composé 1 et le SAG a conduit à rechercher d'autres voies intracellulaires impliquées dans l'activité des composés de formule générale (I). Outre la voie Hh, la différentiation des cellules C3H10T1/2 peut être stimulée par des voies de signalisation telles que les voies Wnt, Nocht, TGF-13 ou BMP par exemple. Concernant la voie des Wnt, l'activation de la voie canonique induit une activation de la (3-catenine qui participe à l'activation de la transcription des gènes TCF/LEF. En absence des ligands Wnt, la (3-catenin est phosphorylée, puis dégradée. Récemment, une molécule IWR1 stabilisant l'axine 2 et entrainant la destruction des beta- catenines a été découverte (Chen et al. 2009). Cet inhibiteur a été utilisé pour déterminer si l'axine 2 et/ou les (3-catenines pouvaient être impliquées dans la transduction du signal induit par le composé 1. L'IWR1 permet de diminuer de 60% l'activité du composé 1 utilisé à une concentration de 1 µM alors qu'il ne modifie pas celle du SAG (Figure 7). Une courbe dose-réponse du composé 1 par le composé IWR1 a permis de déduire une CI50= 2.5µM vis-à-vis de l'inhibition de la phosphatase alcaline. Cette valeur est en accord avec l'affinité de l' IWR 1 déterminée par un test mesurant son inhibition de la voie des morphogènes Wnt (test d'induction utilisant un gène rapporteur TCF/luciferase) (Chen et al, Nat Chem Biol, 2009). Cette expérience indique que l'action des composés de formule générale (I) met en jeu les protéines axines 2. Le rôle des protéines axines 2 dans le contrôle de l'activité de la (3-catenine suggère que l'activité biologique induite par ces composés pourrait impliquer la voie des (3-catenines. Cette voie est associée à de multiples pathologies telles que des cancers colorectaux par exemples. D'une manière plus générale, elle est impliquée dans le maintien des cellules souches dans les tissus chez l'embryon et l'adulte, elle module la neurogenèse ou est responsable de maladies génétiques (voir revue 2010 de Freese et al.). L'identification de composés sélectifs permettant de bloquer les sites de liaison Smo2 présentent donc un grand intérêt. Conclusions Ces expériences démontrent que les composés de formule générale (I) peuvent être utilisées afin d'identifier et de sélectionner des antagonistes de la différenciation cellulaire présentant des structures particulières agissant sur l'un ou l'autre des sites Smol ou Smo2, ou alternativement sur les deux sites. L'identification d'autres réponses biologiques (prolifération, migration, apoptose, induction génique...) induites par les composés de formule (I) permettront le développement de tests permettant l'identification de composés modulants ces sites de liaisons Smo2. Ces nouveaux composés pourront permettre de moduler ces différentes réponses chez l'individu sain ou atteint de pathologies. REFERENCES Ahn, S. and A. L. Joyner (2005). "In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to Sonic hedgehog." Nature 437(7060): 894-7. Angot, E., K. Loulier, et al. (2008). "Chemoattractive activity of sonic hedgehog in the adult subventricular zone modulates the number of neural precursors reaching the olfactory bulb." Stem Cells 26(9): 2311-20. Beachy, P. A., S. S. Karhadkar, et al. (2004). "Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis." Nature 432(7015): 324-31. Berman, D. M., S. S. Karhadkar, et al. (2002). "Medulloblastoma growth inhibition by hedgehog pathway blockade." 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