FR 2967594 A1 20120525 FR 1059529 A 20101119 1 PROCEDE ET APPAREIL DE CONCENTRATION DE PARTICULES DANS UN LIQUIDE DESCRIPTION L'invention présente est relative à un 5 procédé et à un appareil de concentration de particules dans un liquide. Elle est notamment applicable à des échantillons biologiques pouvant être présents en petites quantités dans un liquide et que l'on cherche à 10 concentrer dans un échantillon de volume plus réduit avant de les analyser ou de les traiter d'une autre façon. La nature des particules n'est pas importante pour la mise en oeuvre de l'invention, et il peut s'agir de biomolécules, de cellules, de virus ou de parasites, 15 etc., à condition toutefois que ces particules puissent être fixées sur des billes magnétiques versées dans le liquide. Ces techniques de fixation sur des billes magnétiques sont déjà employées, et l'agent de fixation sur les billes peut consister en des anticorps qui 20 capturent des protéines, des bactéries ou des virus. Il est alors classique d'attirer les billes dans une région déterminée du volume liquide en approchant un aimant. Le reste du volume liquide est retiré, de sorte qu'une concentration des particules 25 dans l'échantillon a été obtenue. Une remise en suspension des billes dans l'échantillon peut encore être réalisée, de même qu'une élution détachant les particules des billes avant de retirer celles-ci de manière à laisser seulement les particules dans le 30 liquide. 2 Les procédés connus conformes à cette description souffrent d'insuffisances. Quand ils sont accomplis manuellement, ils sont évidemment imprécis et peu reproductibles ; mais même quand ils le sont par une machine, le volume d'échantillon concentré ne peut pas être réduit autant que l'on souhaiterait, notamment à cause de la difficulté de bien attirer toutes les particules dans un volume très petit. A partir d'un volume initial de 1,5ml, une machine connue permet ainsi une concentration à un volume de 25pl à 110p'. La recherche d'une concentration plus grande serait malaisée puisque l'aimant, devant rassembler les billes dans un volume plus petit, devrait être lui aussi plus petit, exercerait des forces moins importantes et serait ainsi moins efficace, laissant échapper un plus grand nombre de billes. Or une concentration à des volumes compris entre 100n1 et 10pl, c'est-à-dire d'environ un ordre de grandeur plus petit, serait souhaitée pour certaines applications comme la recherche de molécules d'ADN. Un but de l'invention est de supprimer cette insuffisance de l'art antérieur et d'améliorer la capacité de concentration de particules fixées sur des billes magnétiques dans des volumes liquides par un meilleur emploi des forces d'aimantation attirant ces billes dans une portion réduite du volume liquide. Sous une forme générale, elle concerne un procédé de concentration de particules dans un liquide, comprenant les étapes suivantes : 3 A) ajout d'un premier liquide dans un récipient, le premier liquide comprenant des billes magnétiques liées à des particules ; - attraction des billes magnétiques par un premier aimant, activé selon une première position, en dehors du récipient et en regard d'une paroi du récipient, le premier liquide s'écoulant le long de ladite paroi; B) retrait de tout ou partie du premier liquide en dehors du récipient, les billes magnétiques étant maintenues sur la paroi du récipient en regard du premier aimant activé; C) remise en suspension des billes dans un deuxième liquide en relâchant l'attraction par le 15 premier aimant ; D) attraction des billes par un deuxième aimant activé selon une deuxième position, hors du récipient, en regard d'une paroi du récipient, de telle sorte que lorsque le deuxième 20 aimant est activé selon la deuxième position, la surface d'aimant en regard de la paroi du récipient est inférieure à la surface d'aimant en regard de la paroi du récipient lorsque le premier aimant est activé selon la première position. 25 Une caractéristique essentielle du nouveau procédé est que la concentration s'effectue en activant des aimants à des positions successives différentes sur la paroi latérale du récipient contenant le volume liquide, ses surfaces étant à chaque fois plus réduites 30 de manière à exercer une concentration toujours plus grande des billes sans risque d'en laisser s'échapper 4 beaucoup, de sorte que presque tout l'échantillon à recueillir finit par aboutir dans un volume très réduit du liquide. Les étapes B et D, voire l'étape C, sont avantageusement répétées plusieurs fois, avec l'effet que le risque que des billes n'échappent à l'attraction des aimants est encore réduit. Il est souvent préférable que les billes soient remises en suspension dans le volume liquide après chacune des concentrations, afin de réduire les risques qu'elles n'adhèrent à la paroi du récipient et ici encore qu'elles n'échappent à l'attraction des aimants à mesure qu'ils sont activés à des positions de surface plus réduite. Il est avantageux que les aimants utilisés pour accomplir progressivement la concentration, et notamment le premier aimant et le deuxième aimant susmentionnés, soient en réalité un aimant unique. La création de positions d'activation dont la surface en regard de la paroi du récipient est de plus en plus réduite peut alors être remplie en descendant progressivement l'aimant le long de la paroi latérale du récipient contenant le volume liquide, de sorte que l'échantillon à recueillir s'accumule progressivement vers le fond du récipient. Des mouvements de rotation de l'aimant peuvent aussi être appliqués à cette fin. En descendant progressivement l'échantillon dans le récipient, il est possible d'utiliser des volumes liquides de remise en suspension du liquide de hauteur de plus en plus réduite pour immerger complètement l'échantillon rassemblé sur la paroi, ce qui garantit l'accroissement de la concentration sans risquer de perdre beaucoup de billes de l'échantillon, grâce à l'immersion complète de celui-ci. L'activation de l'aimant peut s'accomplir 5 en l'approchant de la paroi du récipient, surtout s'il s'agit d'un aimant statique, en le mettant en marche quand il s'agit d'un électro-aimant, ou en escamotant un écran imperméable aux rayonnements électromagnétiques. La remise en suspension peut être faite par une application d'ultrasons par des moyens magnétiques ou mécaniques. L'invention est encore relative à un appareil de concentration de particules dans un liquide, comprenant un récipient, des moyens permettant d'ajouter et de retirer un liquide dans le récipient et un aimant placé hors du récipient et devant une paroi latérale verticale du récipient, caractérisé en ce qu'il comprend un moyen de translation de l'aimant en direction verticale le long de la paroi latérale. L'aimant mobile en translation vertical le long de la paroi descend peu à peu les billes magnétiques au fond du récipient et dans le volume liquide subsistant. Dans une construction favorable, l'aimant a une extrémité amincie dirigée vers la paroi qui s'étend en direction verticale le long de la paroi latérale. La concentration du champ magnétique le long d'une ligne verticale dont la hauteur diminue progressivement favorise une concentration à la fois efficace et progressive des particules dans un échantillon de volume de plus en plus réduit. 6 Une subtilité possible avec un tel aimant consiste à le faire tourner autour d'un axe horizontal traversant le récipient, de sorte que l'échantillon subsistant à la fin du procédé peut être de hauteur très réduite, analogue à la largeur de l'aimant. Le récipient peut avantageusement être cylindrique avec une hauteur beaucoup plus grande que son diamètre, de l'ordre de cinq fois, dix fois, voire plus, afin de permettre une concentration plus grande. L'invention sera maintenant décrite plus en détail mais à titre purement illustratif en liaison aux figures suivantes . - la figure 1 est une vue de l'appareil, - les figures 2 et 3, des vues de détail de l'aimant, - la figure 4, une vue de l'appareil en cours d'utilisation, - les figures 5a à 5h illustrent les étapes du procédé, - et les figures 6 et 7, deux variantes de réalisation de l'appareil. On se reporte à la figure 1. L'échantillon à concentrer a été versé dans un récipient (1) cylindrique allongé, pouvant avoir 2,5cm de hauteur et 2,5mm de diamètre. Le récipient (1) est ouvert au sommet, et une aiguille (2) de seringue s'étend au-dessus de lui ; elle dépend d'un appareil (3) non représenté en détail d'injection ou d'aspiration de liquide, qui permet aussi de la descendre à n'importe quelle profondeur dans le récipient (1). Le récipient (1) peut être complété par un autre, de volume beaucoup 7 plus grand, communiquant avec lui et s'étendant au-dessus de lui. Ce récipient supérieur n'est pas représenté sur les figures et il est d'ailleurs vide quand l'invention est mise en oeuvre, mais il peut servir ensuite à recevoir d'autres liquides, notamment pour l'analyse de l'échantillon quand il a été concentré. L'appareil comprend encore un aimant (4) dépendant d'un dispositif moteur (5), auquel il est relié par un axe (6) à l'arrière. Le dispositif moteur (5) comprend par exemple des chariots montés sur des glissières et des moteurs qui leur sont respectivement associés de manière à déplacer l'axe (6) et l'aimant (4) en direction verticale, en direction horizontale vers le récipient (1), et à faire pivoter l'axe (6) ainsi que l'aimant (4). L'aimant est représenté aux figures 2 et 3. Il est aminci en biseau à une région antérieure (7), et finit sur une face d'extrémité étroite, en forme de lame (8) allongée et s'étendant en général en direction verticale. Il peut avoir 20x20x8mm3 de dimensions à une partie principale parallépipédique, 4mm de profondeur pour la région antérieure (7), et la lame (8) peut avoir 0, 5mm de largeur. Sa matière peut être du NdFe B fritté N48, de rémanence Br = 1,4 T. Un module d'application d'ultrasons (10) complète le dispositif. Un échantillon contenant des billes magnétiques sur lequel les particules à recueillir se sont fixées a été versé par l'aiguille (2) dans le récipient (1). L'aimant (4) peut être approché du 8 récipient (1) selon une première position pour réaliser une attraction des billes afin de les collecter, ce que représente la figure 4 : la lame (8) est tangente à une génératrice de la paroi latérale cylindrique verticale du récipient (1) et attire donc l'essentiel des billes sur cette génératrice. C'est ce que l'on représente à la figure 5a, les billes portant la référence (9). Des injections et des aspirations alternées de l'échantillon par l'aiguille (2) sont possibles pendant cette période, la plupart des billes s'accumulant près de l'aimant (4), jusqu'à ce que tout l'échantillon ait été introduit dans le récipient (1). De façon alternative, le liquide de l'échantillon, ou premier liquide, s'écoule en continu dans le récipient, le long de la paroi placée en vis-à-vis de l'aimant (4). Cette phase permet de collecter le plus grand nombre possible de particules le long de la paroi placée en vis-à-vis de l'aimant. Le liquide de l'échantillon peut être retiré complètement et remplacé par un autre liquide, dit deuxième liquide, pour les besoins de la concentration, les billes restant adhérentes à la paroi du récipient (1). La figure 5b montre la situation où le liquide a été retiré du récipient (1), et la figure 5c celle qui suit l'injection du deuxième liquide, remplaçant le premier. La figure 5d montre l'étape suivante : l'aimant (4) est retiré, et le module d'application d'ultrasons (10) est mis en marche pour remettre les billes (9) en suspension dans le liquide et éviter donc leur adhérence à la paroi du récipient (1). L'agitation 9 peut être réalisée par d'autres moyens adéquats, par exemple des moyens magnétiques ou mécaniques. L'aimant (4) revient contre la paroi latérale du récipient (1) à l'étape suivante de la figure 5e, mais il a été abaissé, et un volume (11) de liquide surnageant apparaît au-dessus de lui. Autrement dit, l'aimant (4) est disposé selon une deuxième position. De préférence, on fait en sorte que le liquide contenu dans le récipient recouvre la surface de la paroi placée en vis-à-vis de l'aimant lorsque ce dernier est disposé selon sa première position. Les billes (9) quittent ce volume surnageant (11) pour s'accumuler à hauteur de l'aimant (4), avec une concentration plus grande qu'auparavant. En effet, selon cette seconde position, la surface de l'aimant disposée en vis-à-vis de la paroi est inférieure à ce qu'elle est lorsque l'aimant est disposé selon sa première position. Cela est dû à la translation de l'aimant entre la première et la deuxième position. On collecte alors une même quantité de billes, mais sur une surface plus faible, d'où un effet de concentration. L'étape suivante, représentée à la figure 5f, consiste en une aspiration du volume surnageant par l'aiguille (2) ; et celle de la figure 5g, analogue à la figure 5d, en une remise en suspension des billes (9) dans le volume subsistant après que l'on a retiré l'aimant (4). Il est également possible de retirer la totalité du second liquide, tout en maintenant l'aimant appliqué contre la paroi du récipient, et d'injecter alors un troisième liquide, dont le volume est 10 inférieur au second liquide. On fera en sorte que le volume du troisième liquide soit tel qu'il baigne la paroi du tube placée en vis-à-vis de l'aimant lorsque ce dernier se trouve selon sa seconde position. Les étapes précédentes sont répétées en rapprochant plusieurs fois l'aimant (4) après l'avoir abaissé à chaque fois, de sorte que le volume liquide occupé par les billes (9), qui suivent les mouvements de l'aimant (4) en quittant le volume surnageant, diminue constamment. Chaque descente de l'aimant (4) peut être de quelques millimètres. Dans une étape finale, l'aimant (4) peut être tourné pour placer la lame (8) horizontalement et attirer donc les billes (9) sur une toute petite hauteur, avantageusement au fond du récipient (1) ; elles sont alors concentrées de façon extrême (figure 5h). Ainsi, au cours de deux positions successives, l'aimant peut être translaté ou tourné. Le module d'application des ultrasons (11) est utilisé une dernière fois, l'aimant (4) est retiré, et les billes (9) sont remises en suspension dans le liquide subsistant, qui peut être aspiré par l'aiguille (2) ou utilisé d'une autre manière. Ainsi, d'une façon générale : A) on ajoute un premier liquide dans un récipient, ledit premier liquide contenant des billes magnétiques. On collecte des billes magnétiques, contenues dans le premier liquide, le long d'une paroi du récipient alors que l'aimant est activé selon une position donnée, dite première position. De cette 11 façon, une quantité de billes est maintenue contre la paroi du récipient située en vis-à-vis de l'aimant ; B) on retire tout ou partie du premier liquide, l'aimant étant toujours activé, de façon à maintenir les billes collectées contre la paroi C) on ajoute un deuxième liquide, l'aimant étant alors désactivé, de telle sorte que les billes baignent dans le liquide. De préférence, le deuxième liquide s'étend sur la totalité de la surface située en vis-à-vis de l'aimant lorsque ce dernier est activé selon la première position. Cela permet que l'ensemble des billes collectées contre la paroi du récipient puisse baigner dans le deuxième liquide. De préférence, les particules sont remises en suspension par un moyen externe, précédemment évoqué ; D) On active l'aimant, face à la paroi externe du récipient, selon une deuxième position, de telle sorte que lorsque l'aimant est ainsi activé, la surface d'aimant en regard de la paroi du récipient est inférieure à la surface d'aimant en regard de la paroi du récipient lorsque l'aimant aimant était activé selon la première position. Entre lesdites première et deuxième position, l'aimant peut avoir effectué un mouvement, comprenant par exemple une translation et/ou une rotation. Les étapes B) à D) peuvent être réitérées, l'aimant passant d'une position n à une position n+1 entre l'étape D) d'une itération i à l'étape D de l'itération suivante. Ce procédé peut s'achever par une étape (E) au cours de laquelle on ajoute un dernier liquide, de 12 telle sorte que le dernier liquide soit en contact avec la surface située en vis-à-vis de l'aimant lorsque ce dernier est activé selon l'étape D précédente. Par aimant activé, on entend que l'aimant est disposé de façon à exercer une force d'attraction sur les particules magnétiques disposées dans le liquide. Ainsi, l'activation peut comprendre : - le rapprochement de l'aimant de la surface externe du récipient ; - le retrait d'un écran, situé entre l'aimant et la surface externe du récipient ; - l'activation d'un électro-aimant, lorsque l'aimant est un électro-aimant. Bien que l'exemple décrit ci-dessus se limite à l'utilisation d'un seul aimant, l'utilisation de plusieurs aimants distincts fait partie de l'invention. Ainsi, dans les étapes A) et B) précédemment décrites, on active un premier aimant ; parallèlement, dans l'étape D), on active un deuxième aimant. Selon l'exemple de réalisation décrit en relation avec les figures 5a à 5h, le premier et le second aimant sont confondus. Les figures 6 et 7 illustrent deux variantes de réalisation possible pour l'appareil. Celle de la figure 6 représente un deuxième aimant (12) qui peut être mis en face de la paroi du récipient (1) tout comme l'aimant (4) précédemment mentionné. Le deuxième aimant (12) est activé à une seconde position en regard de la paroi du récipient (1), dont la superficie est plus réduite que celle du premier aimant 13 (4), c'est-à-dire qu'il est utilisé dans une étape ultérieure de la concentration, correspondant par exemple à l'étape de la figure 5e. Les aimants ne sont pas mis en action en même temps. S'ils sont statiques, ils peuvent être retirés à l'aide de dispositif moteur analogue à celui de la figure 1, si ce n'est qu'il est alors inutile de les pourvoir de translation verticale dans l'axe du récipient (1) ; s'il s'agit d'électro-aimants, ils sont mis en marche à des moments différents ; on peut aussi utiliser des écrans imperméables au champs magnétique comme dans la réalisation suivante, qui seront ici associés à chacun à un des aimants et actionnés séparément. Les aimants (4 et 12) sont ici placés à des secteurs angulaires différents du récipient (1) ; il serait possible d'en disposer d'autres pour multiplier les étapes de concentration. La réalisation de la figure 7 comprend l'aimant (4) déjà rencontré, mais qui est ici supposé immobile, et dont l'actionnement est réglé par un écran (13) imperméable aux radiations électro-magnétiques et qui est disposé entre sa région antérieure (7) et la paroi du récipient (1). L'attraction par l'aimant (4) se produit quand l'écran (13) est escamoté, ce qui peut être fait par un dispositif moteur (14) partiellement représenté. Il est à noter que si le mouvement de l'écran (13) est vertical, il est possible de lui faire masquer seulement une portion supérieure de l'aimant (4) et reproduire ainsi des étapes progressives de concentration comme dans la réalisation de la figure 5, 14 en masquant à chaque fois une portion supérieure plus grande de l'aimant (4). REVENDICATIONS1. Procédé de concentration de particules dans un liquide, comprenant les étapes suivantes : B) ajout d'un premier liquide dans un récipient, le premier liquide comprenant des billes (9) magnétiques liées à des particules ; - attraction des billes magnétiques par un premier aimant (4), activé selon une première position, en dehors du récipient et en regard d'une paroi du récipient, le premier liquide s'écoulant le long de ladite paroi; B) retrait de tout ou partie du premier liquide en dehors du récipient, les billes magnétiques étant maintenues sur la paroi du récipient en regard du premier aimant activé; C) remise en suspension des billes dans un deuxième liquide en relâchant l'attraction par le premier aimant D) attraction des billes par un deuxième aimant (5) activé selon une deuxième position, hors du récipient, en regard d'une paroi du récipient, de telle sorte que lorsque le deuxième aimant est activé selon la deuxième position, la surface d'aimant en regard de la paroi du récipient est inférieure à la surface d'aimant en regard de la paroi du récipient lorsque le premier aimant est activé selon la première position. 16 2. Procédé de concentration suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le deuxième aimant et le premier aimant sont un unique aimant. 3. Procédé de concentration suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la deuxième position correspond à une rotation ou à une translation de l'aimant par rapport à la première position. 4. Procédé de concentration suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lors de la remise en suspension des billes, le second liquide s'étend le long de la paroi en vis-à-vis du premier aimant lorsque ledit premier aimant est activé selon la première position. 5. Procédé de concentration suivant l'une quelconque des revendications précédentes, comportant en plus les étapes: - de retirer tout ou partie du second liquide, - de remettre en suspension des billes dans un troisième liquide, le troisième liquide s'étendant le long de la paroi en vis-à-vis du deuxième aimant lorsque le deuxième aimant est activé selon la deuxième position. 6. Procédé de concentration suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les étapes B et D sont répétées plusieurs fois, en activant à chaquefois un aimant ayant une surface en regard de la paroi du récipient qui est plus réduite. 7. Procédé de concentration suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape r' est répétée après chacune des aspirations. 8. Procédé de concentration suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé 10 en ce que la remise en suspension est faite par une application d'ultrasons. 9. Appareil de concentration de particules dans un liquide, comprenant un récipient (1), des 15 moyens permettant l'ajout et le retrait d'un liquide dans le récipient, un aimant (4), placé hors du récipient et devant une paroi latérale verticale du récipient, caractérisé en ce qu'il comprend un moyen (5) de translation de l'aimant en direction verticale 20 le long de la paroi latérale. 10. Appareil de concentration suivant la revendication 9, caractérisé en ce que l'aimant a une extrémité amincie (7, 8) dirigée vers la paroi qui 25 s'étend en direction verticale le long de la paroi latérale. ï1. Appareil de concentration suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend 30 aussi un moyen (5) de rotation de l'aimant autour d'un axe (6) horizontal traversant le récipient.r 18 12. Appareil de concentration suivant l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que le récipient est cylindrique d'une hauteur au moins cinq {ois supérieure au diamètre.5