FR 2962126 A1 20120106 FR 1002762 A 20100701 DES OLIGONUCLEOTIDES ANTICANCEREUX La présente invention relève du domaine de la thérapie génique au sens large, c'est à dire qu'elle concerne la synthèse et l'utilisation de composés chimiques 5 apparentés aux acides nucléiques, dont l'administration provoque des effets thérapeutiques sur les cellules qui portent un gène particulier ou bien qui portent une séquence génique particulière. I Etat de la technique 10 Les cancers sont causés par une prolifération anarchique des cellules. Le caractère malin de beaucoup de cancers est dû à la capacité des cellules cancéreuses de pouvoir migrer dans l'organisme en se laissant porter par le flux sanguin ou bien en suivant le circuit lymphatique, et ensuite de faire souche dans une région éloignée du 15 corps. On appelle ce phénomène une métastase. La prolifération cellulaire désordonnée est en général provoquée par une modification du patrimoine génétique de la cellule. Cette modification peut être causée par une ou plusieurs mutations ponctuelles, ou plus habituellement, cette modification peut constituer en un ou plusieurs réarrangements des chromosomes, associés ou non à 20 des mutations ponctuelles. Les délétions ou les translocations sont des exemples habituels de réarrangements chromosomiques. Dans ces cas, ce sont des parties du génome normalement éloignées qui se trouvent rapprochées. La figure 1 montre le schéma de deux chromosomes A (1) et B (2) qui ont échangé une partie de leur ADN, pour donner deux chromosomes modifiés (3) et (4). On appelle un tel échange une 25 translocation, mais il existe de nombreux types d'aberrations chromosomiques produites par un réarrangement de la séquence entre deux chromosomes. Certains réarrangements, comme par exemple ceux donnant naissance à des chromosomes annulaires, ont lieu au sein d'un même chromosome. Dans tous les cas, des séquences d'ADN habituellement éloignées se retrouvent rapprochées. 30 Les cellules cancéreuses se multiplient plus vite que les cellules normales. Les traitements anticancéreux de l'art antérieur vont donc chercher, soit à diminuer le taux de multiplication, soit à tuer les cellules en multiplication. Dans les deux cas, malheureusement, la spécificité des agents anticancéreux est faible : on touche à la fois les cellules normales et les cellules cancéreuses. Les tissus dont les cellules se 35 reproduisent le plus rapidement, comme les muqueuses du tube digestif, la peau et les phanères, les cellules sexuelles et les cellules souches de la moelle osseuse sont les premières touchées, avec les cellules cancéreuses. Dans certains cas, on arrive à cibler un tissu particulier, voire les cellules cancéreuses en particulier, mais ce ciblage est toujours partiel. II arrive que le traitement cause la mort du patient, habituellement par aplasie médullaire. D'autre part, les traitements anticancéreux sont pour la plupart des traitements mutagènes. Les radiations, les analogues de bases nucléiques, les complexes platinés et les autres traitements provoquent des mutations qui seront la source de cancers à long terme. Certains patients vont guérir de la tumeur primaire, au prix de nouveaux cancers dans le futur. Un grand espoir a été soulevé avec la mise au point de médicaments constitués d'un anticorps monoclonal lié de façon covalente avec une puissante toxine, comme par exemple la ricine. L'anticorps monoclonal utilisé est dirigé contre un marqueur considéré comme spécifique des cellules cancéreuses. Malheureusement, les espoirs placés dans ces « Magie Bullets » (balles magiques) ont été déçus en grande partie. La spécificité de ces médicaments dépend de marqueurs protéiques exprimés à la surface des cellules cancéreuses. Il existe effectivement, au sein d'un même tissu, des différences entre les marqueurs exprimés sur la surface des cellules saines et ceux portés par les cellules cancéreuses, mais ces différences reposent habituellement sur des variations des pourcentages d'expression. Il n'existe pas de marqueur protéique spécifique à cent pour cent, ce qui fait que les toxines conjuguées restent d'un usage délicat. Les traitements destinés à empêcher la vascularisation des tumeurs ont aussi été beaucoup étudiés, et certains sont utilisés en clinique, mais leur spécificité n'est pas totale, et un grand nombre d'organes dépendent d'une vascularisation parfaite, notamment le coeur et le cerveau. Interférer avec les processus de vascularisation n'est pas forcément une entreprise sans risques. Un traitement du cancer devrait donc être parfaitement sans risque pour les cellules normales et strictement spécifique des cellules cancéreuses. Il faut donc utiliser comme cible et comme élément discriminant la source même des changements qui conduisent à la transformation d'une cellule en cellule cancéreuse, ou bien les modifications qui font suite à cette transformation : il s'agit de modifications de l'ADN. II. Description de l'invention La présente invention utilise une technique d'amplification des acides nucléiques spécifique et pouvant être mise en oeuvre dans les cellules vivantes. Le résultat de cette réaction d'amplification est l'apparition d'une grande quantité d'ADN, ce qui entraîne la mort de la cellule par le phénomène de l'apoptose. Dans le cas où l'apoptose ne se déclenche pas parce que la cellule à perdu cette capacité à cause d'une mutation, la présence d'une grande quantité d'ADN de haut poids moléculaire dans la cellule va diminuer ou bien va supprimer la capacité de la cellule à se diviser. Cette diminution de la capacité de division des cellules va notamment s'exercer par le détournement du stock de deoxynucléotides triphosphates servant à la réplication de l'ADN. Cette réaction d'amplification est spécifique, ce qui veut dire qu'elle n'aura pas lieu si les deux séquences cibles sont placées à leur position normale dans le génome, c'est à dire si elle sont séparées par une distance génétique suffisante, ou bien si elles se trouvent sur deux chromosomes différents. Dans les cellules cancéreuses, on observe de façon habituelle des réarrangements de l'ADN. Ces réarrangements rapprochent des parties du génome habituellement éloignées. En choisissant convenablement les séquences cibles, la réaction d'amplification de l'ADN n'aura lieu que dans les cellules cancéreuses. Seules celles-ci seront affectées. Si la modification du génome rapprochant deux séquences lointaines est aussi présente sur un acide ribonucléique résultant de la transcription du génome (ARNm, ARN t, autres ARN) l'ARN concerné peut lui aussi servir de cible à la réaction d'amplification, ceci dans les cellules qui expriment des transcriptases inverses. (cellules hépatiques, cellules infectées par des virus, cellules spécialement transfectées avec un vecteur d'expression pourtant un gène de transcriptase inverse, etc...) La mise en oeuvre de cette méthode implique de connaître précisément la modification génétique des cellules cancéreuses destinées à servir de cible. Cette détermination doit être effectuée pour chaque nouveau patient. Il s'agit donc d'une médecine personnalisée. Un tel objectif était hors de portée il y a seulement quelques années. Ce n'est plus le cas à l'heure actuelle : la technique des « microarrays » et des « puces génétiques » permet d'explorer rapidement le génome d'une lignée tumorale, et de définir les zones où l'ADN a été modifié, par exemple par une recombinaison ou bien une translocation chromosomique. Une fois cette zone repérée, il est aisé et rapide de séquencer les quelques centaines de paires de bases qui la bordent. Ces techniques sont parfaitement connues de l'art antérieur. Elles peuvent être mise en oeuvre de façon à obtenir les résultats recherchés en quelques jours, voire en quelques heures. A. Conception, fabrication et utilisation des composés anticancéreux constituant l'invention. A.1) Détermination de la cible. La première étape de la fabrication des composés anticancéreux est la détermination de la cible. Il s'agit de trouver dans le génome des cellules cancéreuses deux séquences d'ADN qui sont éloignées dans les cellules saines, et qui sont situées à proximité l'une de l'autre dans les cellules cancéreuses. Cette recherche s'effectue à l'aide de techniques de l'art antérieur : plusieurs compagnies commercialisent des automates utilisant des « puces à ADN » et qui permettent de déterminer les zones de remaniement génétique à l'aide de techniques d'hybridation de l'ADN. a) Prélèvement des cellules Il convient d'isoler les cellules cancéreuses par biopsie, ponction ou bien prise de sang. Dans un certain nombre de cas, notamment dans le cas des leucémies, il suffira d'effectuer une simple prise de sang suivie d'une purification des cellules cancéreuses par cytométrie de flux couplée à un cytotriage. En effet, les cellules cancéreuses circulantes sont dans ce cas très nombreuses. Dans beaucoup de cas, les cellules circulantes pouvant donner des métastases sont relativement nombreuses, particulièrement dans les ganglions. Une simple ponction ganglionnaire fournira de nombreuses cellules pouvant être mises en culture, pour en augmenter encore le nombre et les purifier avant une étude génétique à l'aide de « puces à ADN ». Et cette méthode pourrait encore être mise en oeuvre si la concentration relative des cellules malignes par rapport aux lymphocytes est de l'ordre de la partie par million. Pour mémoire, si l'on table sur 15000 leucocytes par mm3, on aura 5 cellules cancéreuses par cm3, et donc 5000 par litre. Une poche de 500 ml contiendra donc 2500 cellules, soit largement assez pour débuter une culture. Dans le cas de beaucoup de leucémies, l'étape de culture cellulaire sera probablement facultative. Dans le cas le plus usuel, on pourra faire une centrifugation extracorporelle du sang du patient, puis on réinjectera les hématies et les plaquettes, et on effectuera un cytotriage sur la fraction leucocytes et cellules, après re-suspension dans un milieu convenable. On pourra faire une incubation en présence d'analogues de bases fluorescentes, de façon à discriminer les cellules en division rapide, ou bien utiliser le marqueur tumoral ad hoc. On pourra aussi concentrer les cellules cancéreuses sans utiliser d'appareil appelé cytotrieur, en utilisant leurs propriétés d'adhésion spécifiques sur certains supports. On pourra réaliser des supports constitués de surfaces recouvertes d'anticorps monoclonaux dirigés contre des marqueurs tumoraux, par exemple. b) Isolation Si celles-ci ne sont pas en nombre suffisant, il faut ensuite mettre les cellules cancéreuses en culture, de façon à travailler sur de l'ADN spécifique des cellules malades. Dans certain cas, lorsque la biopsie aura permis d'obtenir directement des cellules tumorales, on pourra se passer de l'étape d'isolation par culture. Cependant, il faut remarquer que la culture des cellules cancéreuses est habituellement extrêmement facile. Cette étape d'isolement et de culture ne doit pas prendre plus d'une semaine dans la plupart des cas. c) Extraction de l'ADN L'ADN des cellules est ensuite extrait par les méthodes de l'art antérieur adaptées à la technique des « microarrays » et des « puces à ADN ». d) Détection des changements dans le génome par la technique des « microarrays » ou des « puces à ADN ». On trouve sur le marché plusieurs fournisseurs de supports sur lesquels ont été disposés des quadrillages composés de taches formées de brins d'ADN spécifiques fixés sur le support. L'ADN marqué est incubé en présence de ces supports. Les supports sont habituellement constitués de lames de verre du format utilisé par les microscopistes. Il est possible que d'autres standards s'imposent sur le marché dans un proche avenir. II existe des automates spécialisés dans le traitement de ces lames, appelées microarrays. Ces appareils effectuent automatiquement et successivement toutes les étapes permettant d'obtenir des informations précieuses sur le génome à l'aide de ces lames : hybridation avec l'ADN génomique, lavages, lecture optique. Les données issues de la lecture optique de ces lames sont traitées par un système informatique, et les résultats sont édités sous forme graphique. On obtient une représentation des changements subis par les chromosomes : remaniements, délétions, circularisation, translocations, etc... Cette information était jusqu'à présent d'un intérêt principalement théorique. Grâce à la présente invention, les données fournies par les microarrays auront une 5 application thérapeutique immédiate. A.2) Elaboration des amorces d'amplification. A l'aide de la technique des microarrays, ou « puces à ADN », on déterminera la partie du génome ayant subi un réarrangement chromosomique. Cette étape est 10 connue de l'art antérieur. Par les techniques de l'art antérieur, on déterminera la séquence de cette région. Cela ne représente pas de difficulté majeure, étant donné de l'on possède, grâce aux microarrays, la séquence d'une sonde nucléique proche de cette région de réarrangement. (on connaît la liste des sondes utilisées pour construire le microarray, 15 ainsi que leur séquence) On réalisera donc la séquence précise de cette région contenant le site de réarrangement chromosomique, sur quelques centaines de bases de chaque coté, en vue de la détermination et de la synthèse des amorces spécifiques de la réaction de Polymérisation des Acides Nucléiques pour Apoptose Controlée. (PAN-AC) 20 On appelle « amorces » des molécules oligonucléotidiques synthétisées par les techniques connues, lesdites amorces possédant les caractéristiques nouvelles suivantes : nos amorces seront constituées d'une partie palindromique (5) et d'une partie spécifique (6) d'une séquence (7) située à quelques dizaines de paires de bases du site de réarrangement chromosomique. (Figure 2) 25 Cette amorce pourra donc se fixer sur la séquence (7) qui lui est complémentaire dans le génome. La partie palindromique (5) comporte une séquence artificielle déterminée au hasard, et on aura vérifié qu'elle ne présente aucune homologie avec aucune séquence du génome de l'ADN humain. (ou bien avec l'ADN de l'animal ou du végétal 30 traité) Cette vérification s'effectuera de préférence par l'expérience, en utilisant les techniques classiques d'hybridation ou bien de PCR. La partie spécifique (6) pourra reconnaître l'ADN complémentaire (7) et s'y fixer, et la partie palindromique pourra se replier sur elle-même pour donner une forme fibulaire (en épingle à cheveux) (5) (Figure 3) 35 L'extrémité dite « 3' » de l'oligonucléotide est situé du coté spécifique (6) de l'oligonucléotide, et l'extrémité dite « 5' » est située du coté palindromique (5). On verra plus loin l'intérêt de cette structure réunissant une partie spécifique et une partie aspécifique palindromique. Les amorces seront utilisées par couple. (figure 4) Dans chaque couple d'amorces, une amorce (11) comporte une partie (9) spécifique d'une séquence du chromosome B et l'autre amorce (10) comporte une partie (6) spécifique d'une séquence (7) du chromosome A. (Les chromosomes A et B pouvant être respectivement n'importe lesquels des chromosomes humains) Dans les cellules normales ces deux séquences sont portées par des chromosomes différents, mais dans les cellules cancéreuses, ces séquences seront contigües sur le chromosome ayant subit un réarrangement. Les séquences palindromiques (8) et (5) situées respectivement sur les amorces (11) et (10) seront chacune déterminées par tirage au sort. On s'assurera qu'elles ne sont complémentaires d'aucune partie du génome humain. Sur la figure 4, la flèche (12) désigne la partie du chromosome modifié provenant du chromosome A, et la flèche (13) désigne la partie du chromosome modifié provenant du chromosome B. A.3) Sélection des amorces d'amplification On synthétisera une dizaine de couples d'amorces, avec une partie spécifique et une partie palindromique plus ou moins longue. Le but de cette étape est de déterminer le couple d'amorces qui est le plus efficace à la température de 37.5°C. En effet, pour pouvoir être actives à la température du corps humain, les amorces devront pouvoir reconnaître l'ADN complémentaire (7) et s'y fixer par leur partie spécifique (6), et la partie palindromique devra pouvoir se replier sur elle-même pour donner une forme fibulaire (en épingle à cheveux) (5) , mais il ne faut pas que la formation de cette épingle à cheveux soit irréversible (Figure 3) Un équilibre entre la forme linéaire et la forme fibulaire doit être possible à 37.5°C. Il n'existe pas à l'heure actuelle de programme informatique capable de calculer à priori la séquence d'une amorce pouvant fonctionner parfaitement à la température du corps humain. Il faudra donc sélectionner les amorces de façon empirique. Pour déterminer le meilleur couple d'amorces, on utilisera un incubateur à gradient de température. (Figure 5) Ce type d'appareil existe dans le commerce, mais il sera avantageux d'en réaliser qui seront spécifiquement conçus dans le but que nous nous fixons. Un incubateur à gradient de température comporte des séries de trous (puits)(14) pouvant accueillir des microtubes réactionnels en plastique. (16) Certains tubes sont placés dans la zone de haute température, et les autres sont disposés selon le gradient, vers la zone de plus basse température. Chacun des couples d'amorces sera testé en présence de l'ADN extrait des cellules du patient, des 4 désoxyribonucléotides triphosphates, dATP, dTTP, dGTP, dCTP, d'une ADN polymérase, dans le tampon ad hoc comportant une concentration suffisante de sels de magnésium. (Le tampon sera constitué de façon à imiter au mieux les conditions intracellulaires régnant dans les cellules cibles.) Le mélange réactionnel est aliquoté dans une quinzaine de tubes qui sont placés dans les puits (14) du banc d'incubation à gradient. (figure 5) Selon le type de banc à gradient, on peut tester un ou plusieurs couples d'amorces en même temps, selon que le banc comporte une seule ligne de puits, ou bien plusieurs lignes. Un banc d'incubation à gradient est typiquement constitué d'une barre métallique (15) chauffée à une extrémité par une résistance à coefficient de température positif. (RCTP)(17) La température de la résistance ne dépend que de la tension à ses bornes, et se stabilise automatiquement. Au bout d'un certain temps, un gradient de température s'établit le long de la barre métallique. On choisira la tension aux bornes de la résistance CTP pour que les puits correspondant à la température de 37.5°C se trouvent aux alentours du milieu de la barre métallique. La figure 6 montre un exemple de gradient de température obtenu à l'aide d'un tel appareil : en abscisse on a fait figurer le numéro des puits, et en ordonnée on a indiqué la température. Les trois courbes ont été réalisés à des moments différents, de façon à vérifier que le gradient de température est stable et reproductible. On laissera le mélange réactionnel incuber un certain temps (de l'ordre de l'heure) puis on déterminera les tubes dans lesquels la réaction a eu lieu avec la plus grande vigueur. Cette détermination se fera par électrophorèse des produits de réaction sur gel d'agarose, ou par toute méthode de l'art antérieur, par exemple par électrophorèse capillaire ou bien encore à l'aide de l'utilisation de « molecular beacons ». (un « molecular beacon » ou « balise moléculaire » est une molécule composée d'oligonucléotides et qui présente une forte fluorescence en présence de la séquence d'ADN ou d'ARN qui lui est complémentaire.) On pourra aussi construire des incubateurs dans lesquels un système optique permet d'enregistrer la fluorescence des produits de la réaction pendant que celle-ci se déroule (Sur le modèle des appareils utilisés dans les techniques de « PCR Quantitative) Les appareils de PCR quantitatives proposés dans le commerce sont utilisables. Remarquons que si l'on ajoute une certaine quantité d'un composé chimique fluorescent ayant la propriété de s'intercaler entre les bases de l'ADN (par exemple du bromure d'éthidium), dans ce cas, la fluorescence est proportionnelle à la concentration de l'ADN double brin présent Dans tous les cas, on déterminera le couple d'amorces pour lequel l'optimum de température de la réaction est situé aux alentours de 37,5°C. Les composés dotés d'une action anticancéreuse constituant la présente invention sont donc constitués par ce couple d'amorces nucléotidiques caractérisées en ce qu'elles comportent chacune une partie spécifique du génome d'une espèce vivante (l'homme, dans le cas le plus habituel) et une partie palindromique, les parties spécifiques étant complémentaires de deux parties du génome éloignées dans les cellules saines, lesdites parties du génome se trouvant rapprochées dans les cellules malades. A.4) Détail de la réaction : Dans les tubes placés dans la zone de température idéale, la réaction suivante a lieu : 1)A 37.5°C, la majorité de l'ADN est sous forme d'un double brin (18) dont les bases sont toutes appariées. (Figure 7) Néanmoins, du fait de l'agitation thermique, des petites parties des molécules d'ADN s'ouvrent et se referment brièvement. (formes 19, 21, 23 par exemple) C'est ce qui permet à la réplication et à la transcription de l'ADN d'avoir lieu dans les cellules. (Bien entendu, dans les cellules vivantes, il existe aussi des cofacteurs, notamment des cofacteurs protéiques, qui vont stabiliser les zones simple brin de l'ADN, catalyser l'ouverture de la double hélice, et éliminer les contraintes topologiques générées par l'ouverture.) (Topoisomérases, hélicases, etc...) 2)Sur la figure 8, on voit que lorsque l'ouverture spontanée de la double hélice s'effectue à l'endroit d'une séquence complémentaire (24) de nos amorces palindromiques, (11) ou (10) celles-ci peuvent se fixer sur l'ADN. (Fig. 8a) C'est la première étape lente de la réaction. Sa probabilité est faible, mais elle se produit tôt ou tard. 3)Une molécule d'ADN polymérase (25) peut reconnaître le complexe formé entre l'amorce et l'ADN, et s'y fixer, et débuter la réplication de cette molécule. (Fig. 8 b) 4) L'ADN polymérase (25) va recopier le brin d'ADN (27) en synthétisant un nouveau brin, (26) et atteindre la position de la séquence complémentaire de la deuxième amorce, et éventuellement dépasser cette séquence. (Fig. 8 c) 5)De la même façon, des zones très courtes d'ADN simple brin (28) vont apparaître sur la double hélice qui vient de se créer. Il arrive aussi que l'enzyme se détache. Dans ce cas, la probabilité d'ouverture transitoire de la double hélice devient importante. (Fig. 8 d) 6)Si cette ouverture (28) se produit au niveau de la séquence complémentaire de notre deuxième amorce, celle-ci va pouvoir se fixer sur le brin néosynthétisé. (26) C'est la deuxième étape lente de la réaction. Sa probabilité est faible, mais elle se produit tôt ou tard. Une fois que les deux étapes lentes ont eut lieu, la réaction s'emballe de façon irréversible : L'ADN polymérase pourra se fixer sur le complexe ainsi formé, et la réplication débutera dans l'autre sens. (Fig. 8 e) 7) L'ADN polymérase va donc copier le brin néoformé et celui-ci va finir par se détacher. 15 (Fig. 8 f) 8)L'ADN polymérase va finir de recopier le brin qui vient de se détacher (Fig. 8 g et Fig. 8 h) 20 9)L'extrémité de ce brin néoformé peut se réarranger pour former une extrémité bifibulaire (en forme de double épingle à cheveux) (30 et 31) En effet, l'extrémité de ce brin néoformé comporte une partie palindromique. (29) (Fig. 8 i) Une des parties en épingle à cheveux (31) présente une extrémité 3' libre, et elle peut donc agir comme une amorce pour la synthèse d'un nouveau brin par l'ADN 25 polymérase. (25) 10) Sur la figure 8 j, on voit que l'ADN polymérase va recopier le brin d'ADN, en synthétisant un long brin en forme d'épingle à cheveux. (33) 30 11)A la fin de cette étape, un brin monocaténaire d'ADN est libéré. (32) Ce brin (32) comporte une partie en épingle à cheveux. (Fig. 8 k) 12) Et ce brin va tout de suite servir de cible pour la fixation d'une amorce, (10) (Fig. 8 I) et un cycle très rapide va s'enclencher : 35 13) L'enzyme ADN polymérase va copier ce brin d'ADN libre. (Fig. 8 g) II est important de noter que nous retrouvons exactement la même forme moléculaire (26) qui provenait de l'étape de polymérisation décrite à la figure 8 f. 14) Une fois le brin copié, l'enzyme se détache. (Fig. 8 h) 15) A ce moment, le double brin d'ADN qui vient d'être synthétisé peut changer de conformation : on voit bien que nous avons un équilibre entre la forme linéaire (29) et la forme en double épingle à cheveux. (forme bifibulaire) Ce changement de forme est spontané, et extrêmement rapide. Bien sûr, la forme linéaire est plus stable, mais ceci n'empêche pas la réaction de changement de conformation d'avoir lieu, de façon réversible, rapide et spontanée. Il est important de noter que la forme bifibulaire comporte une partie (31) pouvant servir d'amorce à une ADN polymérase, permettant une auto-initiation de la réplication. Cette auto-initiation est donc extrêmement rapide. (Fig. 8 i) 16) L'ADN polymérase va recopier l'ADN, déplaçant l'autre brin. (32) (Fig. 8 j) 17) Celui-ci fini par être libéré : nous voyons qu'il s'agit d'un brin strictement semblable au 20 brin (32) qui a initié le cycle que nous venons de décrire. Un nouveau cycle va donc pouvoir débuter, par fixation d'une nouvelle amorce sur ce brin. (Fig. 8 I) Remarquons une chose importante : même si l'enzyme ne recopie pas totalement l'ADN, cela n'a aucune importance, puisque c'est toujours le même brin qui sert de 25 matrice. De la même façon, une erreur éventuelle dans la transcription ne sera pas reproduite. C'est le brin initial qui sert de matrice à chaque cycle. Nous verrons plus loin qu'il existe d'autres mécanismes qui font qu'une réplication partielle n'entrave pas le déroulement de la réaction. A chaque cycle, le brin initial est régénéré, et il est produit 30 un brin d'ADN (33) en épingle à cheveux. La concentration de l'ADN augmente donc selon une progression arithmétique. 18) Et cet autre brin, (33) que devient-il ? Il s'agit d'un brin d'ADN totalement palindromique, et même doublement palindromique, puisque son extrémité (34) peut, 35 elle aussi, subir un changement de conformation entre la forme linéaire et la forme bifibulaire. (Fig. 9 a) La forme bifibulaire peut fixer une DNA polymérase (25) sur la partie présentant une extrémité 3' libre (35). (Fig. 9 b) 19) Une fois la DNA polymérise fixée, l'élongation débute. (Fig. 9 c) 20) L'enzyme recopie l'ADN en déplaçant l'autre brin. (Fig. 9 c) 5 21) On obtient un brin d'ADN palindromique de longueur double. (Fig. 9 d) 22) L'extrémité de ce brin d'ADN subit elle aussi la transition de conformation entre la forme linéaire et la forme bifibulaire, et une nouvelle enzyme (25) se fixe en (36), et 10 commence à recopier l'ADN. (Fig. 9 e) 23) On obtient un ADN palindromique de longueur double, et ainsi de suite. (Fig. 9 f) II faut remarquer que cette réaction de doublement de taille est extrêmement rapide, car la génération de la forme bifibulaire est une réaction intra-moléculaire, et que la vitesse 15 d'élongation est de l'ordre de plusieurs dizaines de paires de bases par seconde à 37°C. La taille de la molécule double à chaque étape : la concentration de l'ADN augmente cette fois-ci selon une loi géométrique. 24) En pratique, l'expérience montre que l'on obtient in vitro de l'ADN de très haut poids 20 moléculaire. En effet, il ne faut pas oublier que les amorces encore présentes dans le milieu peuvent se fixer à tout moment sur les brins néosynthétisés, et ré-initier de nouveau cycles de réaction. Le taux d'accroissement de la quantité d'ADN présent dans le milieu réactionnel est donc théoriquement supérieur à l'accroissement géométrique. De plus, si l'ADN n'est pas copié jusqu'au bout, ce qui pourrait conduire à 25 l'extinction de la réaction, dans ce cas, la fixation des amorces (5) et (11) sur les brins néosynthétisés régénère la forme (32). La figure 10 montre une électrophorèse sur gel d'agarose des produits de la réaction. Dans cette application particulière, la cible est un gène du virus HIV, lequel gène est 30 inséré dans un plasmide dilué dans du sérum humain. Le puits numéro 1 contient des brins d'ADN de taille décroissante (marqueur Mark Vil fourni par la société Boehringer). Le puits numéro 10 contient des brins d'ADN de taille décroissante (marqueur Raoul 35 fourni par la société Appligène). Les puits numéro 3, 4, 5, 6 et 7 contiennent du sérum humain provenant d'individus séronégatifs. Les puits 2, 8 et 9 contiennent du sérum humain contenant un plasmide portant le gène cible du virus HIV. On a réalisé la réaction à température isotherme avant de charger les échantillons dans les puits. On voit que dans les tubes dont le contenu a été déposé dans les puits 2, 8, et 9, il est apparu un ADN de haut poids moléculaire. Dans le puits numéro 2, une grande partie de cet ADN n'arrive pas à pénétrer dans le gel pendant l'électrophorèse, et il reste bloqué en haut du puits du fait de sa taille. Les produits d'amplification sont mis en évidence en les colorant avec un composé fluorescent s'intercalant entre les bases de l'ADN. Ce composé est du Bromure d'Ethidium dans cette application particulière, mais on peut utiliser n'importe quel colorant de l'art antérieur. L'aspect « en traînée » des produits d'amplification est dû à la migration des produits de dégradation de l'ADN de haut poids moléculaire formé. On sait que l'ADN de haut poids moléculaire est particulièrement fragile, et que des brins de taille supérieure à 100 000 bases se clivent spontanément sous l'effet du mouvement brownien des molécules. On peu contrer cet effet en gélifiant le milieu en ajoutant un composé qui augmente la viscosité. (Agarose, par exemple) In vivo, la viscosité élevée du cytoplasme va diminuer cet effet. En résumé, même si les deux premières étapes de la réaction sont lentes et peu probables, une fois amorcée, la réaction se poursuit de manière rapide et exponentielle. II est extrêmement important de remarquer que le rythme d'accroissement des produits de réaction n'est pas donné par la fréquence d'un thermocycleur, comme dans les réactions de type PCR. Le rythme est donné par la vitesse de polymérisation de l'ADN polymérase, qui est de l'ordre de la centaine de bases à la seconde à 37°C. On remarque que lors d'une réaction classique d'amplification de l'ADN, il est possible de classer les diverses étapes successives en trois catégories : - étapes rapides ; - étapes moins rapides - étapes lentes Les étapes rapides sont : -Réplication de la molécule d'ADN. L'élongation de la molécule néo synthétisée se fait à une vitesse de l'ordre de plusieurs dizaines de bases par seconde. Les étapes moins rapides sont : -Positionnement et fixation des amorces et de l'ADN polymérase sur les substrats, au rythme de l'agitation thermique des molécules. L' étape lente est déterminée par la fréquence du thermocycleur, qui est de l'ordre de 3 minutes. Cette étape est limitante pour la réaction. On voit que l'étape lente est supprimée dans la présente méthode, et que les étapes moins rapides sont fortement diminuées, puisque les amorces se reconstituent par repliement intramoléculaire de la partie palindromique. A.5) Sélection finale des amorces. Les amorces donnant les meilleurs résultats ayant été sélectionnées in vitro sur le banc à gradient de température, on va maintenant les tester sur des cellules cancéreuses du patient en culture à 37°C, et aussi sur des cellules saines. On vérifiera qu'elles donnent lieu à une réaction d'amplification sur les cellules cancéreuses, et non sur les cellules saines. (On pourra en particulier faire un essai sur des cellules de moelle osseuse, obtenues par ponction, sur des cellules sanguines et sur des cellules épithéliales.) Si aucune réaction d'amplification parasite n'apparaît sur les cellules saines, et si les cellules cancéreuses sont tuées en culture par la réaction d'amplification, on pourra passer à l'étape de traitement. NB : les amorces peuvent être synthétisées à l'aide de nucléotides triphosphates classiques, ou bien à l'aide d'analogue de nucléotides triphosphates, ou à l'aide d'analogues de bases. La pénétration à travers les membranes étant d'autant plus rapide que la charge électrique des amorces sera faible, ont pourra synthétiser les amorces sous forme de PNA (Peptides Nucleic Acids), c'est-à dire des analogues peptidiques des acides nucléiques. Les couples d'amorces utilisés seront caractérisées en ce que un certain nombre de déoxynucléotides ont été remplacés lors de la synthèse desdites amorces par des analogues chimiques appelés « acides nucléiques peptidiques». Ou pourra aussi utiliser tous les analogues d'acides nucléiques connus de l'art antérieur, pourvu qu'ils puissent s'hybrider à la séquence cible, et servir de substrat à une ADN polymérase. On pourra notamment utiliser des couples d'amorces caractérisées en ce que la charge négative des groupes phosphate à été modifiée par les techniques de l'art antérieur pour permettre à ces amorces de traverser plus facilement la membrane des cellules. L'utilisation d'analogues d'acides nucléiques est avantageuse en ceci que les amorces préparées à l'aide de ceux-ci seront plus résistantes aux nucléases présentes dans l'organisme, que ce soit dans le sang, dans le milieu intracellulaire ou dans le milieu extracellulaire. On pourra aussi administrer les amorces (10) sous une forme complexée (hybridée) avec un oligonucléotide (37) spécifique de la partie palindromique. (figure 11) Cet oligonucléotide étant lié chimiquement avec un composé fortement absorbé par les cellules, par exemple la biotine, (38) la vitamine B12, ou un autre composé fortement recherché par les cellules, choisi parmi ceux qui sont connus de l'art antérieur. Dans ce cas, l'internalisation des amorces dans les cellules va être accélérée. L'oligonucléotide portant la biotine ou portant le composé remplissant le même rôle sera ensuite déplacé lors des étapes suivantes de la réaction d'amplification. Il ne sert qu'à augmenter la vitesse d'entrée des amorces dans les cellules, mais il peut aussi avoir un rôle protecteur contre les nucléases. Pour augmenter le rôle protecteur contre les nucléases, une manière particulière de réaliser l'invention consistera à utiliser un oligonucléotide (39) lié à une molécule biologique fortement absorbée par la cellule (molécule M de la figure 12) lequel oligonucléotide est à la fois spécifique d'une partie de la séquence palindromique (5) et de la partie spécifique (6) d'une amorce (10). Les extrémités 5' et 3' de l'amorce seront ainsi protégées des exonucléases. La molécule M est une molécule quelconque connue de l'art antérieur pour sa capacité à entrer efficacement dans les cellules. Dans une autre manière de réaliser l'invention, on pourra aussi utiliser un couple d'amorces caractérisées en ce celle-ci sont complexées (hybridées) avec un oligonucléotide, lequel oligonucléotide sera lié chimiquement avec une molécule biologique de type hormonal, absorbée spécifiquement par un tissu particulier de l'organisme. On pourra avec profit inclure les amorces dans des vésicules lipidiques appelées liposomes, celles-ci pouvant contenir des lipides spéciaux, par exemple des lipides à groupement polaire cationique. Les couples d'amorces utilisés seront caractérisés en ce qu'ils sont placés à l'intérieur de ces liposomes. On pourra aussi marquer ces liposomes avec des facteurs protéiques reconnaissant des protéines de surface des cellules, cette reconnaissance provoquant un processus d'internalisation active. Ces techniques sont connues de l'art antérieur pour d'autres applications. On pourra utiliser aussi des couples d'amorces caractérisés en ce qu'ils sont placés à l'intérieur de vésicules lipidiques appelées liposomes, ces liposomes étant recouverts de molécules non protéiques complémentaires de récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules ciblées, ce couple de molécules et de récepteur étant décrit par l'art antérieur. Il a été démontré que des liposomes comportant des lipides cationiques étaient plus facilement internalisés dans les cellules. Il sera donc avantageux d'utiliser des couples d'amorces caractérisés en ce qu'ils sont placées à l'intérieur de liposomes, ces liposomes étant préparés à l'aide d'un certain pourcentage de lipides cationiques. A.6) Exemple de traitement des patients avec les composés à action anticancéreuse constituant la présente invention. En environnement hospitalier, on injecte les amorces par voie intraveineuse, après les avoir soigneusement dialysées avec du sérum physiologique apyrogène, et resuspendues dans une solution isotonique. Remarquons que les brins d'ADN sont constitués de molécules biologiques dénuées de toute toxicité pour les être humains et les animaux, y compris lorsqu'elles sont injectées à haute dose. Quelques amorces vont réussir à rentrer dans les cellules cancéreuses et la réaction d'amplification va s'y enclencher. En effet, les cellules cancéreuses seront les seules cellules dans lesquelles les deux séquences d'amorçage se trouveront contigües. Des molécules d'ADN de haut poids moléculaire vont envahir le noyau et le cytoplasme de ces cellules. La réplication des cellules va être stoppée, et dans le cas idéal les cellules vont entrer en apoptose. Dans tous les autres cas, les cellules cancéreuses vont voir leur vitalité diminuer, de même que leur taux de multiplication, permettant aux moyens de défense de l'organisme de reprendre le dessus et de les éliminer. Cette diminution de la vitalité cellulaire sera notamment provoquée par le détournement du stock de déoxynucléotides triphosphates de la cellule par la réaction d'amplification. Le résultat sera une régression des tumeurs, sans effets secondaires sur les cellules saines. Pour soigner les affections cutanées, ou bien les cancers des muqueuses, les amorces peuvent être appliquées sous forme de gel ou de lotion sur les parties à traiter. Dans certains cas, on pourra diriger les amorces par ionophorèse, par exemple pour traiter des tumeurs osseuses. La solution concentrée contenant les amorces sera placée dans un pansement, éventuellement sous forme gélifiée par de l'agarose ou un autre polymère. Le membre ou l'organe malade sera placé entre deux électrodes en métal inoxydable ou en carbone, et on fera passer un courant électrique continu entre celles-ci. Les amorces étant chargées négativement, elles se dirigeront vers l'anode en traversant les cellules tumorales. Au cours de la traversée, un certain nombre de ces amorces vont induire la réaction d'amplification de l'ADN. A.7) Utilisation des amorces constituant l'invention pour la détection des cellules cancéreuses et pour le suivi du traitement. Pour détecter les cellules cancéreuses, afin de repérer précocement des récidives, ou bien pour suivre en temps réel l'efficacité d'un traitement anticancéreux, il est possible de mettre en oeuvre l'invention de la manière suivante : on travaillera sur des ponctions veineuses ou sur des ponctions de moelle ou d'ascite, ou sur des biopsies. Les biopsies seront incluses dans de la paraffine, et les coupes réalisées au microtome seront déposées sur des lames de microscope, puis fixées et préparées comme pour une coloration classique. Dans une enceinte convenablement humidifiée, dont la température est maintenue aux alentours de 37°, on déposera sur la coupe fixée un goutte d'une solution contenant les amorces, une ADN polymérase et les 4 déoxynucléotides triphosphates. (On pourra aussi utiliser des analogues de déoxynucléotides fluorescents, un agent intercalant dissous dans la solution, ou bien une « balise moléculaire ») La réaction d'amplification isotherme de l'ADN s'enclenche dans les cellules cancéreuses, et celles-ci apparaitront fortement fluorescentes à l'observation au microscope sous éclairage UV. Même si il existe très peu de cellules cancéreuses, elles apparaitront de façon très visible pour le technicien microscopiste ou pour l'anatomo-pathologiste. Contrairement aux réactions de PCR « in situ », il n'est pas besoin de chauffer et de refroidir les lames de microscope de nombreuses fois, et l'aspect des cellules est parfaitement préservé, permettant aux anatomopathologistes d'effectuer leur diagnostic dans les meilleures conditions. Contrairement aux réactions de PCR « in situ », les produits de réaction (amplifiats) sont constitués de molécules de haut poids moléculaire : ils ne diffusent pas hors des cellules dans lesquelles la réaction d'amplification a eu lieu. Au contraire, ils restent piégés dans le noyau et le cytoplasme. La fluorescence de ces cellules est donc augmentée, et la fluorescence du milieu adjacent (bruit de fond) est diminuée, ce qui augmente fortement le contraste. On pourra donc détecter quelques cellules isolées, et observer la variation de leur nombre dans les tissus au cours du temps, ce qui permettra de repérer rapidement toute rechute ou toute métastase. Dans une autre façon de réaliser l'invention, on travaillera en phase liquide et on utilisera un cytomètre de flux, par exemple pour rechercher des cellules tumorales dans le sang, la moelle osseuse ou les ponctions d'ascites. Les biopsies pourront être traitées par une enzyme capable de séparer les cellules, de façon à obtenir des suspensions homogènes après une centrifugation rapide. On traitera ensuite cette suspension de cellules comme des cellules sanguines ou des cellules de moelle : on ajoutera les amorces spécifiques de la réaction, et éventuellement des déoxynucléotides triphosphates de façon à suppléer le stock cellulaire. On pourra ajouter un composé intercalant fluorescent dans la solution. Les cellules cancéreuses se rempliront d'ADN de haut poids moléculaire, et leur aspect sera suffisamment modifié pour qu'elles apparaissent de façon extrêmement évidente sur les diagrammes fournis par le cytomètre de flux. II est possible d'utiliser des cytomètres expérimentaux dédiés à cette application, mais aussi des appareils plus classiques du type « Coulter » (marque déposée) ou « Cell-Dyn » (marque déposée par la société Abbott) ou bien tout autre cytomètre utilisé dans les laboratoires d'analyses médicales pour effectuer des numérations et des formules sanguines. Les composés faisant l'objet du présent brevet pourraient donc, en plus de leurs applications thérapeutiques, permettre aux laboratoires de ville de suivre l'effet d'un traitement anticancéreux sur les patients, puis ensuite de détecter précocement toute récidive. Références : David, F., Turlotte, G., Comptes Rendus de I' Académie des Sciences. Paris, Sciences de la Vie/Life Sciences 1998, 321, 909-914 David F. Brevet FP n° 2721945 David F. PCT n° FR 95/00891 35 REVENDICATIONS1-Procédé d'amplification du matériel génétique caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un couple d'amorces oligonucléotidiques comportant chacune une partie spécifique du génome d'une espèce vivante et une partie palindromique non spécifique, les parties spécifiques étant complémentaires de deux parties du génome, lesdites parties étant éloignées dans les cellules saines, et se trouvant rapprochées dans les cellules malades 10 2-Procédé d'amplification du matériel génétique selon la revendication 1 caractérisé en ce que un certain nombre de déoxynucléotides des couples d'amorces oligonucléotidiques utilisés ont été remplacés lors de la synthèse desdites amorces oligonucléotidiques par des analogues chimiques appelés « acides nucléiques 15 peptidiques». 3-Procédé d'amplification du matériel génétique selon la revendication 1 caractérisé en ce que la charge négative des groupes phosphate des couples d'amorces oligonucléotidiques utilisés à été modifiée par les techniques de l'art antérieur pour 20 permettre à ces amorces de traverser plus facilement la membrane des cellules. 4-Procédé d'amplification du matériel génétique selon la revendication 1 caractérisé en ce que les couples d'amorces oligonucléotidiques utilisés sont placés à l'intérieur de vésicules lipidiques appelées liposomes. 25 5-Procédé d'amplification du matériel génétique selon la revendication 1 caractérisé en ce que les couples d'amorces oligonucléotidiques sont placés à l'intérieur de vésicules lipidiques appelées liposomes, ces liposomes étant recouverts de molécules complémentaires de récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules ciblées, ce 30 couple de molécules et de récepteur étant décrit par l'art antérieur. 6-Procédé d'amplification du matériel génétique selon la revendication 1 caractérisé en ce que les couples d'amorces oligonucléotidiques sont placés à l'intérieur de liposomes, ces liposomes étant préparés à l'aide d'un certain pourcentage de lipides cationiques. 7-Procédé d'amplification du matériel génétique utilisant un couple d'oligonucléotides et un troisième oligonucléotide, caractérisé en ce que celui-ci est lié chimiquement avec un 35composé biologique fortement recherché par les cellules de l'organisme, et fortement absorbé par celles-ci (par exemple la biotine ou bien la vitamine B12), ledit oligonucléotide pouvant s'hybrider respectivement avec la partie palindromique, ou avec la partie spécifique, ou avec ces deux parties de chacune des deux amorces caractérisées selon la revendication 1 8-Procédé d'amplification du matériel génétique selon la revendication 1 mettant en oeuvre un couple d'oligonucléotides et un troisième oligonucléotide selon la revendication 7 caractérisé en ce que le troisième oligonucléotide est lié chimiquement avec une molécule biologique de type hormonal, absorbée spécifiquement par un tissu particulier de l'organisme.15