FR 2964981 A1 20120323 FR 1057393 A 20100916 -1- « Procédé de traitement de cellules en vue de leur cryogénisation et procédé de cryopréservation de cellules mettant en oeuvre un tel procédé » La présente invention concerne un procédé de traitement de cellules en vue de leur cryogénisation. Elle concerne également un procédé de cryopréservation de cellules mettant en oeuvre un tel procédé. Le domaine de l'invention est le domaine de la cryopréservation de cellules humaines ou animales en vue de leur réutilisation sur le même sujet ou sur un sujet différent. Le processus menant à une greffe d'organes, de tissus ou de cellules comporte plusieurs étapes plus ou moins complexes dont une étape de conservation de durée plus ou moins longue. La cryopréservation en froid profond reste la technique de choix pour la conservation à long terme, par exemple plusieurs années, de la viabilité des cellules. La cryopréservation fait appel à des substances, appelées cryoprotectants, qui protègent les cellules des effets indésirables liés à la congélation et à la décongélation. L'objectif principal des techniques de cryopréservation est d'obtenir après décongélation le plus grand nombre de cellules viables. Lorsque l'échantillon initial est composé de populations hétérogènes de cellules, l'objectif secondaire est de préserver la viabilité des différentes sous-populations cellulaires et en particulier celles qui sont les moins représentées. Un but de la présente invention est de proposer un procédé de traitement de cellules humaines ou animales en -2- vue de leur cryopréservation permettant d'améliorer la cryopréservation. Un autre but de l'invention est de proposer un procédé de traitement de cellules humaines ou animales permettant d'obtenir un plus grand nombre de cellules vivantes après cryogénisation par rapport à l'état de la technique. Enfin, il est également un but de la présente invention de proposer un procédé de traitement de cellules humaines ou animales permettant de mieux préserver la viabilité des différentes sous-populations cellulaires et en particulier celles qui sont les moins représentées lors d'une cryopréservation. L'invention permet d'atteindre au moins l'un de ces buts par un procédé de traitement de cellules en vue de la cryopréservation desdites cellules, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - addition audites cellules d'au moins une substance améliorant l'oxygénation des cellules avant la 20 congélation et après la décongélation, - addition audites cellules d'une combinaison de cryoprotectants de haut et de bas poids moléculaires réduisant la formation de cristaux de glace dans les compartiments extra et intra cellulaires, et 25 -addition audites cellules au moins une substance d'origine végétale pour la protection des cellules pendant les phases de congélation et de décongélation. 30 Le procédé selon l'invention permet de préparer les cellules pour mieux les protéger lors d'une cryopréservation et permet d'obtenir un plus grand nombre de cellules vivantes après cryopréservation. Le procédé selon l'invention permet également d'améliorer la viabilité -3- des différentes sous-populations cellulaires et en particulier celles qui sont les moins représentées. En effet, l'utilisation de plusieurs cryoprotectants permet de diminuer la toxicité cellulaire tout en conservant les propriétés cryoprotectrices. La combinaison de cryoprotectants de haut et de bas poids moléculaires permet de réduire les formations de cristaux de glace dans les compartiments extra et intra cellulaire et donc de protéger les cellules pendant la phase où elles sont congelées. Par ailleurs, la substance végétale protégeant les cellules lors des phases de congélation et de décongélation apporte une protection mécanique pour les cellules contre les contraintes mécaniques créées par la formation de cristaux de glace dans le milieu extracellulaire et pouvant entrainer des déformations irréversibles sur les cellules. De plus, la substance améliorant l'oxygénation des cellules avant et après la congélation permet de préserver un grand nombre de cellules vivantes pendant les phases précédant et suivant la cryogénisation. Ainsi, le procédé selon l'invention permet d'apporter une protection avant, entre et après les phases de congélation et de décongélation des cellules lors d'une cryopréservation des cellules et permettant ainsi d'améliorer la cryopréservation de cellules. Avantageusement, la substance d'origine végétale peut être un gel d'origine végétale, par exemple un gel d'agarose à faible température de gélification, par exemple entre 2 et 25°C, ou de l'alginate. Aux températures proches de 0°C, la formation de cristaux de glace dans le milieu extracellulaire entraine des contraintes mécaniques sur les cellules en suspension et par conséquent des déformations qui peuvent être irréversibles. L'utilisation d'un gel -4- d'origine végétale prodigue une protection mécanique pour les cellules. Avantageusement, la substance améliorant l'oxygénation 5 des cellules peut être un transporteur d'oxygène (02) saturé. Selon un mode de réalisation de la composition selon l'invention, la substance améliorant l'oxygénation des 10 cellules peut comprendre de l'hémoglobine humaine ou animale. Selon une autre version du procédé l'invention, la substance améliorant l'oxygénation des cellules peut 15 comprendre un substitut de l'hémoglobine humaine ou animale. Par exemple, un tel substitut de l'hémoglobine peut être choisi dans la famille des fluorocarbones qui sont du transporteur d'oxygène particulièrement efficaces. 20 Avantageusement, la combinaison de cryoprotectants peut comprendre : - un premier cryoprotectant, - un deuxième cryoprotectant présentant une 25 toxicité plus faible que la toxicité dudit premier cryoprotectant, - un troisième cryoprotectant présentant une propriété oncotique qui protège les cellules de l'oedème ; 30 l'étape d'addition de la combinaison de cryoprotectant comprenant les sous étapes suivantes : - ajout du troisième cryoprotectant, - ajout du deuxième cryoprotectant après ajout du troisième cryoprotectant, et -5- - ajout du premier cryoprotectant après ajout du deuxième cryoprotectant. Ainsi, la toxicité globale de la combinaison de cryoprotectants est plus faible que dans le cas où un seul 5 cryoprotectant est utilisé. Selon une version avantageuse de l'invention, l'étape d'addition de la substance d'origine végétale peut être réalisée avant ou pendant l'ajout du premier cryoprotectant 10 et après ajout du troisième cryoprotectant. Selon un mode de réalisation particulier, la combinaison de cryoprotectants peut comprendre les cryoprotectants suivants : - diméthylsulfoxyde (DMSO), par exemple en tant que premier cryoprotectant - Tréhalose, par exemple en tant que deuxième cryoprotectant et - Polyéthylène glycol (PEG) de masse moléculaire comprise entre 10 et 30 kDa, par exemple en tant que troisième cryoprotectant. Le DMSO est un cryoprotectant largement utilisé mais qui présente une toxicité cellulaire significative. Cette toxicité augmente avec la concentration du DMSO mais 25 diminue lorsque la température baisse. En pratique le DMSO est additionné aux cellules à une température proche de 4°C et le temps de contact avant congélation doit être le plus court possible. L'addition du tréhalose, qui présente des effets 30 cytotoxiques plus faibles que le DMSO, permet d'utiliser une concentration de DMSO plus faible, donc moins cytotoxique, en conservant un effet cryoprotecteur de même nature. Ainsi, la combinaison de cryoprotectants présente une faible toxicité. 15 20 -6- Outre sa propriété cryoprotectante, le PEG possède un pouvoir oncotique en solution qui protège les cellules de l'oedème. Selon un exemple de réalisation, la concentration des différents cryoprotectants peut être comme suit : - la concentration de diméthylsulfoxyde est comprise entre 1 et 5% en volume, - la concentration de Tréhalose est comprise entre 10 0.05 et 1.5 moles, et - la concentration de Polyéthylène glycol est comprise entre 5 et 30g/L. Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre 15 une étape d'incubation des cellules pendant une durée proportionnelle au volume final à cryopréserver. Une telle étape d'incubation permet l'équilibre de la concentration intra et extracellulaire du/des cryoprotectant(s) (de type intracellulaire) 20 Selon un autre aspect de l'invention, il est proposé un procédé de cryopréservation de cellules, caractérisé en ce qu'il comprend une phase de cryogénisation comprenant les étapes suivantes 25 - traitement des cellules conformément au procédé de traitement selon l'invention, - congélation desdits cellules traitées jusqu'à cryogénisation. 30 Avantageusement, l'étape de congélation peut comprendre : - une étape de refroidissement lente jusqu'à une température comprise entre -30 et -50 °C, par exemple de 0.5 à 3 °C par minute), et -7- - une étape de refroidissement plus rapide jusqu'à une température de -130°C, par exemple de 5 à 10°C par minute). Les cellules cryogénisées ainsi obtenues peuvent ensuite être transférées dans une enceinte cryogénique contrôlée en température. Le procédé de cryopréservation selon l'invention peut en outre comprendre une phase de décongélation des cellules cryogénisées, ladite phase de décongélation comprenant : - une étape de décongélation lente jusqu'à une température comprise entre -80 et -100 °C, par exemple de 5 à 10 °C par minute, et - une étape de décongélation rapide plus rapide jusqu'à une température de l'ordre de 20°C, par exemple de 10 à 20 °C par minute. Selon un mode de mise en oeuvre particulier du procédé de cryopréservation selon l'invention, l'étape de décongélation rapide peut être réalisée dans un bain marie à une température comprise entre 36-42°C. Le procédé de cryopréservation selon l'invention peut 25 également comprendre une étape de lavage des cellules décongelées avec une solution de lavage cellulaire. D'autres avantages et caractéristiques apparaîtront à l'examen de la description détaillée d'un mode de 30 réalisation nullement limitatif. -8- L'exemple qui sera décrit dans la suite de la demande concerne le traitement et la cryopréservation de cellules lymphocytaires humaines. Les cellules lymphocytaires humaines sont traitées selon un procédé de traitement en vue leur cryopréservation. Ce procédé de traitement comprend les étapes suivantes . - addition d'un transporteur d'oxygène, par exemple un perfluorocarbone de type perfluorodecalin, préalablement chargé en oxygène à une dose entre 1 et 10% en volume à une température entre 20 et 25°C, - addition de Poly Ethylène Glycol par exemple de poids moléculaire PM 20 000 entre 10 et 20 g/L en final à une température entre 20 et 25°C, - addition progressive de tréhalose pour atteindre une concentration finale comprise entre 0.1 et 0.5 M en 30 minutes à une température entre 20 et 25°C, - addition progressive d'une gel, par exemple un gel d'agarose à très faible température de gélification, à une concentration comprise entre 0.2 et 0.8% dans la solution finale à une température entre 20 et 25°C, - addition progressive de DMSO à une concentration finale comprise entre 1 et 5%, et -incubation à +4°C pendant une durée proportionnelle au volume final du produit à cryopréserver, par exemple 4 minutes pour une poche de 100ml. La séquence d'addition des différents composants sont 30 réalisées sous agitation douce et constante. Les différents composants sont ajoutés aux cellules sous forme de solution liquide. 2964981 -9- Après traitement des cellules, ces dernières mélangées à tous les composants qui ont été ajoutés lors du procédé de traitement sont cryogénisées selon un procédé de cryopréservation. Ce procédé de cryopréservation comprend 5 une étape de congélation des cellules réalisant une descente en température contrôlée pour amener les cellules traitées à une température de l'ordre de -130°C. Avant la congélation, les cellules et la solution dans laquelle se trouvent les cellules sont dans une cuve. La 10 cuve et les cellules sont à +4°C. La congélation comprend une première phase de refroidissement lente entre 0.5 et 3°C par minute jusqu'à une température entre -30 et -50°C puis une deuxième phase de refroidissement rapide, entre 5 à 10°C par 15 minute jusqu'à, à une température de l'ordre de -130°C. Les cellules ainsi cryogénisées sont transférées dans une enceinte cryogénique contrôlée en température. Le procédé de cryopréservation comprend également une 20 étape de décongélation avant la réutilisation de cellules. L'étape de décongélation est réalisée en plusieurs phases : - une phase de décongélation lente jusqu'à une température comprise entre -100 et -80°C, et - une phase de décongélation rapide dans un bain marie 25 à 38-40°C jusqu'à une température proche de 20°C. Après la phase de décongélation rapide, le procédé de cryopréservation de cellules comprend également une étape d'addition progressive d'une solution de lavage cellulaire, telle qu'une solution tamponnée et contenant du glucose par exemple à base de solution Ringer. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits. REVENDICATIONS1. Procédé de traitement de cellules en vue de la cryopréservation desdites cellules, caractérisé en ce qu'il 5 comprend les étapes suivantes : - addition audites cellules d'au moins une substance améliorant l'oxygénation des cellules avant la congélation et après la décongélation, - addition audites cellules d'une combinaison de 10 cryoprotectants de haut et de bas poids moléculaires réduisant la formation de cristaux de glace dans les compartiments extra et intra cellulaires, et - addition audites cellules au moins une substance 15 d'origine végétale pour la protection des cellules pendant les phases de congélation et de décongélation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 20 la substance d'origine végétale est un gel d'origine végétale. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la substance améliorant 25 l'oxygénation des cellules est un transporteur d'oxygène saturé. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la substance améliorant 30 l'oxygénation des cellules comprend de l'hémoglobine humaine ou animale. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la substance améliorant-11- l'oxygénation des cellules comprend un substitut de l'hémoglobine humaine ou animale. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que 5 le substitut de l'hémoglobine est choisi dans la famille des fluorocarbones. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la combinaison de 10 cryoprotectants comprend : - un premier cryoprotectant, - un deuxième cryoprotectant présentant une toxicité plus faible que la toxicité dudit premier cryoprotectant, - un troisième cryoprotectant présentant une propriété oncotique qui protège les cellules de l'oedème. l'étape d'addition de la combinaison de cryoprotectant comprenant les sous étapes suivantes - ajout du troisième cryoprotectant, - ajout du deuxième cryoprotectant après ajout du troisième cryoprotectant, et - ajout du premier cryoprotectant après ajout du deuxième cryoprotectant. 14. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape d'addition de la substance d'origine végétale est réalisée avant ou pendant l'ajout du premier cryoprotectant et après ajout du troisième cryoprotectant. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la combinaison de cryoprotectants comprend les cryoprotectants suivants : 15 20 25 30-12- - diméthylsulfoxyde (DMSO), - Tréhalose, et - Polyéthylène glycol (PEG) de masse moléculaire comprise entre 10 et 30 kDa. 10.Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que : - la concentration de diméthylsulfoxyde est comprise entre 1 et 5% en volume, - la concentration de Tréhalose est comprise entre 0.05 et 2 moles, et - la concentration de Polyéthylène glycol est comprise entre 5 et 30g/L. 15 11.Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'incubation des cellules pendant une durée proportionnelle au volume final à cryopréserver. 20 12.Procédé de cryopréservation de cellules, caractérisé en ce qu'il comprend une phase de cryogénisation comprenant les étapes suivantes . - traitement des cellules conformément au procédé selon l'une quelconque des revendications 25 précédentes, - congélation desdits cellules traitées jusqu'à cryogénisation. 13.Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que 30 l'étape de congélation comprend : - une étape de refroidissement lente jusqu'à une température comprise entre -30 et -50 °C, (0.5-3 °C/minute), et 10-13- - une étape de refroidissement plus rapide jusqu'à une température de -130°C (5-10°C /minute). 14.Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une phase de décongélation des cellules cryogénisées, ladite étape de décongélation comprenant : - une étape de décongélation lente jusqu'à une température comprise entre -80 et -100 °C, et - une étape de décongélation rapide plus rapide jusqu'à une température de l'ordre de 20°C. 15.Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de lavage des cellules décongelées 15 avec une solution de lavage cellulaire.