FR 2966164 A1 20120420 FR 1058505 A 20101019 PROCEDE DE DETECTION DE DOMMAGES IRREVERSIBLES DE L'ADN ET MESURE DES EFFETS GENOTOXIQUES D'AGENTS SUR DES STADES PRECOCES DE DEVELOPPEMENT D'ORGANISMES ENTIERS La présente invention se rapporte à un procédé permettant de détecter des lésions de l'ADN ainsi qu'à un procédé de mesure des effets génotoxiques induits par des agents chimiques, biologiques ou physiques. L'invention vise également l'utilisation de ces procédés notamment pour la détection, l'analyse et/ou l'étude de la génotoxicité de composés pour l'homme ou l'environnement, ou pour l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de composés, en particulier pour l'évaluation de l'efficacité de substances chimiothérapeutiques ou de substances anti-cancéreuses, ou encore pour l'évaluation de l'efficacité de procédés de traitement de l'eau et des boues. L'identification et la surveillance de substances et facteurs environnementaux susceptibles d'interagir avec le patrimoine génétique des cellules est devenue essentielle. Dans cette perspective, plusieurs tests de génotoxicité ont été établis en vue de détecter de nouveaux agents génotoxiques, caractériser leurs propriétés et prévenir les conséquences des altérations de l'ADN qu'ils induisent. Parmi ces tests, on connaît notamment le test du micronoyau, décrit pour la première fois par Fenech et Morley (1985). Les micronoyaux se définissent comme des fragments de chromosomes ou des chromosomes entiers perdus par le noyau cellulaire au cours de la mitose et formant de petites entités bien individualisées dans le cytoplasme des cellules en interphase. Ils sont générés au cours d'une division cellulaire et proviennent de cassures chromosomiques induites par des agents dits clastogènes, ou d'anomalies du fuseau mitotique induites par des agents dits aneugènes. Ils résultent d'un effet génotoxique direct ou de modifications épigénétiques qui aboutissent à l'apparition de mutations chromosomiques stables. La formation de micronoyaux est donc une empreinte de dommages irréversibles de l'ADN, dommages qui peuvent déclencher une cascade d'effets biologiques néfastes pour les cellules, les organes, les organismes entiers, voire les populations. Le test de numération des micronoyaux ou test du micronoyau est utilisé depuis de nombreuses années pour évaluer la génotoxicité de composés chez les organismes supérieurs. C'est un test de mutagénéicité qui permet d'identifier les agents physiques ou chimiques clastogènes ou aneugènes. Il est largement validé et fait l'objet d'une ligne directrice OCDE (N°487). La présence de micronoyaux est notamment considérée comme un biomarqueur d'effets génotoxiques. Des études sur des poissons ou des amphibiens ont mis en évidence la présence de micronoyaux dans des cas de pollution avérée aux métaux lourds ou aux hydrocarbures. Chez l'homme on sait que les micronoyaux peuvent permettre de mettre en évidence des dommages chromosomiques induits par des agents mutagènes ou cancérogènes. Les tests in vitro de génotoxicité existants consistent à mettre un seul type de cellules isolées en présence de composés potentiellement génotoxiques de manière directe ou indirecte, leur faire subir au moins une division cellulaire, et comparer le nombre de micronoyaux dans les cellules à celui obtenu avec des cellules contrôles n'ayant pas été exposées aux composés. On peut citer à titre d'exemple la demande de brevet WO-02/14859 qui décrit notamment un tel procédé. Toutefois ce type de procédé, s'il peut être un bon indicateur, ne reflète pas la réalité, car dans la nature les composés ne sont pas directement mis en contact avec les cellules isolées. Ces tests in vitro ne prennent pas en compte le devenir de la substances dans l'organisme entier. Ils donnent donc une indication du potentiel génotoxique de la substance mais ne prennent pas en compte la toxico-cinétique de ladite substance. En outre, ces tests in vitro ne sont pas adaptés pour tester la génotoxicité de substances hydrophobes telles que les HAP, PCB, pesticides organochlorés, solvants, etc., et extraits organiques, en raison de la faible solubilité de ces substances dans l'eau Pour éviter ces limites, des tests de génotoxicité ont également été développés sur des cellules d'organismes pluricellulaires. Ces tests sont mis en oeuvre à partir de cellules isolées prélevées sur des organismes entiers après exposition à la substance étudiée. Il s'agit généralement de cellules provenant de tissus conjonctifs, en particulier des lymphocytes ou des érythrocytes. La demande de brevet WO-2007/038664 par exemple décrit l'application du test des micronoyaux pour l'analyse de cellules de moelle osseuse ou du sang périphérique de souris. Le test a également été appliqué à des érythrocytes d'amphibiens pleurodèles (Jaylet et al., « A new micronucleus test using peripheral blood erythrocytes of to newt Pleurodeles waiti to detect mutagens in fresh-water pollution » Mutation Research vo/164 issue 4 (august1986) p245-257), de poissons (Bahari et al., « Micronucleated erythrocytes as an assay to assess actions by physical and chemical genotoxic agents in Clarias gariepinus » Mutation Research, 313 :1-5 (1994)), ou sur l'hémolymphe des bivalves tels que des huîtres (8urgeot et « The micronucleus assay in Crassostrea gigas for the detection of seawater geno toxici ty » Mutation Res. - bene tic Toxico%gy 342: 125-140 (1995». Toutefois ces procédés présentent eux aussi plusieurs inconvénients. Tout d'abord ces tests ont recours à des animaux. Or, la sensibilité du public et la règlementation actuelle, notamment européenne, imposent que l'on limite l'expérimentation sur animaux juvéniles ou adultes dans le cadre des tests de toxicologie. En outre, ces procédés sont très coûteux et ne permettent pas toujours de réaliser des études d'innocuité. La quantification des micronoyaux est le plus souvent réalisée sur des cellules isolées accessibles au prélèvement et non sur l'organe ou le tissu cible susceptible de subir des dommages d'où une tendance à minimiser les effets produits par la substance. Il subsiste donc un besoin pour un outil complet de détection d'altérations irréversibles de l'ADN, palliant les inconvénients des procédés de l'art antérieur. Pour y répondre, l'invention propose d'utiliser des organismes pluricellulaires, à savoir des organismes entiers à des stades précoces de développement. En particulier l'invention vise un procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN à partir d'embryons ou de larves d'amphibiens, de mollusques, de poissons ou d'annélides, ou à partir d'embryons de mammifères animaux, comprenant notamment les étapes suivantes : - obtention d'une suspension de cellules isolées par dissociation physique et enzymatique dudit système pluricellulaire, - récupération et traitement des cellules, et - mesure du taux de micronoyaux formés dans les cellules. Par « système pluricellulaire » au sens de l'invention, on entend donc tout système constitué d'au moins deux types cellulaires, système choisi parmi : - tout amphibien, tout mollusque, tout poisson ou tout annélide, à un stade embryo-larvaire ou larvaire, - tout embryon de mammifère animal, par exemple des embryons de rats ou de souris. Par mammifère animal on entend tout mammifère à l'exception des êtres humains. Préférentiellement on choisira le système pluricellulaire parmi les embryons ou les larves d'amphibiens, de poissons, de mollusques ou d'annélides. Par « stade embryo-larvaire » ou « embryo-larve », on entend toute pro-larve ou embryon c'est à dire tout embryon destiné à donner une larve, avant éclosion de ladite larve. L'invention vise aussi un procédé de mesure du potentiel génotoxique d'agents 5 chimiques, biologiques ou physiques, comprenant notamment les étapes suivantes : - mise en contact d'au moins un organisme entier d'amphibien, de mollusque, d'annélide ou de poisson à un stade embryo-larvaire, avec au moins un agent dont la génotoxicité doit être évaluée, 10 - récupération de l'organisme entier à un stade embryonnaire plus avancé ou après éclosion à un stade larvaire, et - dissociation physique et enzymatique de l'organisme récupéré de façon à obtenir une suspension de cellules isolées, - récupération et traitement des cellules, et 15 - mesure du taux de micronoyaux formés. Par «agent» au sens de l'invention, on entend tout agent chimique et/ou biologique, pur ou au sein d'une composition, ou tout agent physique dont on souhaite évaluer les effets génotoxiques. Cela peut être par exemple : - des polluants progénotoxiques que l'on est susceptible de trouver dans 20 l'environnement, comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques, certains pesticides et solvants organochlorés, les amines aromatiques, - des polluants génotoxiques directs que l'on est susceptible de trouver dans l'environnement, comme des hydrocarbures aromatiques polycycliques nitrés, des nitrosoalkylurée, certains métaux, 25 - des anticancéreux (bléomycine, cisplatine, carboplatine, etc.), ou encore - des radiations, ionisantes ou non ionisantes. Avantageusement, le procédé de détection d'altérations irréversibles de l'ADN selon l'invention est économique et permet d'analyser un grand nombre de molécules en un minimum de temps. Il permet de renseigner sur des effets à plus long terme comme l'instabilité génétique et le cancer. Il présente une grande spécificité et sensibilité de réponse. L'exposition à un stade très précoce du développement des organismes, le stade embryonnaire, permet d'évaluer les effets génotoxiques de polluants au moment où la croissance cellulaire est à son maximum et les systèmes de réparation de l'ADN sont inopérants. Le procédé selon l'invention peut être utilisé dans différents domaines, en particulier pour l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de composés ou pour la détection, l'évaluation de la génotoxicité et/ou l'étude de contaminants environnementaux ou encore l'évaluation de l'impact potentiel de ces polluants pour la santé humaine ou l'environnement. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre. Selon un premier objet, l'invention vise donc un procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN à partir d'un système ou organisme pluricellulaire choisi parmi les organismes entiers d'amphibiens, de mollusques, d'annélides ou de poissons, à un stade larvaire ou embryo-larvaire, et les embryons de mammifères animaux, comprenant les étapes suivantes : - obtention d'une suspension de cellules isolées par dissociation physique et enzymatique dudit système pluricellulaire, - récupération et traitement des cellules, et - mesure du taux de micronoyaux formés dans les cellules. Préférentiellement, la suspension de cellules est obtenue en réalisant sur le système pluricellulaire, au moins deux dissociations successives : une dissociation mécanique (dissociation physique) suivie d'au moins une dissociation enzymatique. Encore plus préférentiellement la suspension de cellules est obtenue en réalisant sur le système pluricellulaire, trois dissociations successives : une dissociation mécanique suivie de deux dissociations enzymatiques. Par dissociation enzymatique, on entend une dissociation comprenant l'utilisation 5 d'au moins une enzyme. La dissociation enzymatique peut éventuellement comprendre des sous-étapes de traitement mécanique. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l'obtention de la suspension de cellules isolées est réalisée par la mise en oeuvre des étapes suivantes : 10 - dissociation mécanique du système pluricellulaire, - dissociation par digestion enzymatique à la collagénase, et - dissociation des amas cellulaires non dissociés par la collagénase, avec de la trypsine. Préférentiellement, l'étape de dissociation mécanique comprend au moins la mise 15 en oeuvre des sous-étapes suivantes : - découper le système pluricellulaire (embryon ou larve) à l'aide de lames, par exemple des lames de rasoir ou un scalpel à lames très fines, - placer le matériel découpé dans un milieu de culture adapté en fonction du système pluricellulaire utilisé, 20 - centrifuger entre 5 et 30 minutes, et - enlever le milieu de culture. La dissociation enzymatique réalisée ensuite comprend préférentiellement la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes : - placer le matériel issu de la dissociation mécanique dans un milieu 25 contenant de la collagénase, - incuber, préférentiellement à 37°C sous agitation douce, puis centrifuger, préférentiellement entre 5 et 30 minutes, et - enlever le milieu de culture avec la collagénase. La collagénase est la collagénase IV. De façon préférée la collagénase est issue de C/ostridium histo/yticum. Pour un meilleur résultat, la collagénase est utilisée à une concentration comprise entre 0,2 et 2 mg/ml de milieu de culture, en particulier entre 0,5 et 1,8 mg/ml. Cette dissociation à la collagénase est très préférentiellement suivie d'une seconde dissociation enzymatique. Cette seconde dissociation enzymatique comprend préférentiellement au moins la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes : - placer le matériel issu de la première dissociation enzymatique en contact avec de la trypsine, - incuber, préférentiellement à 37°C sous agitation douce, - rincer avec du milieu de culture et dissocier mécaniquement le culot cellulaire, notamment avec un mouvement de va et vient, - éventuellement filtrer la suspension cellulaire sur un tamis de diamètre compris entre 50 et 200 microns, dans un but d'automatisation du test, - centrifuger, préférentiellement entre 5 et 30 minutes, et - renouveler l'opération une fois. On obtient ainsi une suspension de cellules hétérogènes isolées. Avantageusement, ce procédé permet d'obtenir un grand nombre de cellules dissociées pour une petite quantité d'embryons, de pro-larves ou de larves. De plus la suspension de cellules comporte plusieurs types cellulaires. Les cellules isolées sont ensuite récupérées et traitées. De façon particulièrement adaptée, cette étape comprend au moins la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes : - faire subir aux cellules un choc hypotonique, afin de faire gonfler les cellules pour mieux détecter les éléments recherchés au microscope, - centrifuger au moins une fois la suspension cellulaire et la mettre en contact avec un fixateur, - prélever le surnageant, - procéder à une coloration des cellules. Pour réaliser le choc hypotonique, les cellules peuvent être baignées dans une solution de Chlorure de Potassium. Le potassium joue un rôle dans la régulation du volume cellulaire : lors d'une augmentation du volume d'une cellule, les canaux potassiques sont ouverts permettant alors le passage d'eau contenant ces ions du milieu le plus concentré vers le moins concentré. Une plus grande concentration en ion potassium dans le milieu extérieur permet une absorption d'eau et d'ions par la cellule, et donc l'augmentation du volume de celle-ci. Après le choc hypotonique, les cellules sont centrifugées et fixées. Il peut y avoir alternativement plusieurs répétitions : centrifugation de la suspension cellulaire puis fixation. Le fixateur est préférentiellement une solution de Carnoy ou une solution de Carnoy modifiée, contenant notamment de l'acide acétique et du méthanol. Le ratio acide acétique/méthanol est préférentiellement compris entre 2/1 et 5/1. L'acide acétique créé des liaisons hydrogènes avec les têtes polaires des phospholipides, permettant ainsi une stabilisation de la structure cellulaire. Le méthanol quant à lui permet aux molécules d'eau du milieu de solubiliser les protéines, en faisant gonfler les structures tridimensionnelles de ces protéines. Après la dernière centrifugation, le surnageant est prélevé et on dispose les cellules par spot sur des lames dégraissées. Les lames sont ensuite séchées puis colorées. En effet, avant de pouvoir mesurer le taux de micronoyaux formés notamment par acquisition et analyse d'images au microscope, les cellules sont colorées. Elles peuvent notamment être colorées par une coloration Wright stain ou May-Grünwald Giemsa, ou une coloration Wright stain ou May-Grünwald Giemsa modifiée. Après coloration, on procède à la détection qualitative et/ou quantitative de la présence de micronoyaux dans les cellules. La population cellulaire est composée de différentes sortes de cellules, le système de départ étant multicellulaire. Toutes les cellules présentes sur les lames sont au stade mononuclée. La procédure de lecture des cellules et de recherche des micronoyaux tient compte de trois types d'objets distincts : les cellules, les noyaux et les micronoyaux. Les lames sont préférentiellement lues au microscope à l'ceil nu ou grâce à un dispositif automatisé. Les lames peuvent être lues avec un microscope optique. Il convient ensuite de comptabiliser le nombre de cellules mononuclées avec un ou plusieurs micronoyaux. Les critères de reconnaissance des noyaux sont notamment les suivants : - le noyau doit être contenu dans le cytoplasme, - le noyau doit avoir une forme ronde ou ovale, - les courbures maximales admissibles pour les noyaux en forme de haricot doivent être nettes. Les critères de reconnaissance des micronoyaux sont notamment les suivants : - le micronoyau doit être rond ou ovale avec des bords lisses, - le micronoyau peut être légèrement connecté au noyau principal et le chevaucher, - le micronoyau n'est pas réfringent et peut se distinguer d'artéfacts, - le micronoyau doit avoir la même coloration que les noyaux principaux, - le micronoyau doit avoir approximativement la même intensité de coloration que les noyaux principaux, - le diamètre des micronoyaux varie entre 1/10 et 1/3 de l'aire du noyau principal. La présence de micronoyaux indique une altération d'ADN irréversible. Le procédé selon l'invention est ainsi utile comme biomarqueur d'atteintes génotoxiques. Avantageusement, le procédé selon l'invention peut donc être utilisé pour détecter des lésions irréversibles de l'ADN. D'une manière générale, le procédé de détection de lésions irréversibles de l'ADN selon l'invention peut être utilisé pour mesurer les effets génotoxiques de divers agents ou composés. C'est pourquoi, l'invention vise donc également un procédé particulier de mesure des effets génotoxiques d'agents chimiques, biologiques ou physiques. Le procédé comprend au moins les étapes suivantes : - mise en contact d'un organisme entier de type amphibien, mollusque, annélide ou poisson à un stade embryo-larvaire ou mammifère animal à un stade embryonnaire, avec au moins un agent dont la génotoxicité doit être évaluée, - récupération de l'organisme entier à un stade embryonnaire plus avancé ou après éclosion à un stade larvaire, et - détection de la présence de dommages irréversibles de l'ADN par la mise en oeuvre du procédé décrit précédemment, comprenant notamment les 20 étapes suivantes : - obtention d'une suspension de cellules isolées par dissociation physique et enzymatique dudit système pluricellulaire, - récupération et traitement des cellules, et 25 - mesure du taux de micronoyaux formés dans les cellules. Selon l'invention, les embryons sont donc mis en contact avec un composé potentiellement toxique, à un stade très précoce du développement où le taux de division cellulaire est très élevé. Le procédé selon l'invention permet ainsi d'évaluer efficacement si les systèmes de réparation cellulaire sont suffisants pour protéger l'organisme de l'impact sur l'ADN du composé testé. De plus, les embryons de mammifères animaux, de poissons, de mollusques, d'annélides et d'amphibiens respectent les nouvelles règles bioéthiques concernant l'expérimentation animale. Parmi les mollusques, on peut notamment choisir parmi les gastéropodes et les bivalves, en particulier l'escargot petit-gris (He/ix aspersa) et l'Huitre creuse (Crassostrea gigas). Parmi les poissons, on peut notamment choisir parmi les poissons téléostéens, en particulier le Poisson Zèbre (Danio rerio) ou le Medaka japonais (Oryzias /atipes). Parmi les annélides on peut notamment choisir parmi les lombrics (Lombricidae), en particulier le vers du fumier (Eisenia fetida). Parmi les amphibiens on peut notamment choisir parmi le xénope (Xenopus /aevis) ou la pleurodèle (P/eurode/es wa/t/ii). De façon préférée, on utilise des embryo-larves de téléostéens, notamment de Poisson Zèbre (Danio rerio) ou de Medaka japonais (Oryzias /atipes). Très préférentiellement on utilise des embryo-larves de Medaka. Le Medaka est un petit poisson d'eau douce originaire d'Asie du sud-est. Il est utilisé comme modèle en génétique depuis de nombreuses années. C'est un modèle biologique vertébré reconnu au niveau international en toxicologie et fait partie d'une des espèces de poisson d'eau douce préconisée par l'OCDE pour l'évaluation des dangers et des risques des substances chimiques. Après fertilisation des oeufs de poissons, de mollusques, d'annélides ou d'amphibiens, les embryons sont récoltés. Ils sont ensuite maintenus dans un milieu approprié à leur développement, par exemple un milieu ERS (« Egg Rearing Solution, solution pour l'élevage d'ceufs»), ou sur sédiments jusqu'à éclosion. Selon une variante, les embryons peuvent être préalablement déchorionisés, par exemple avec de l'EEE (Enzyme d'Eclosion des Embryons) pour permettre une meilleure pénétration du composé à tester et accroître la sensibilité du test. Les embryons sont mis en contact avec l'agent dont on souhaite évaluer la génotoxicité, entre 1 heure et 10 jours après fertilisation des oeufs. Le traitement peut être aigu ou subaigu par balnéation, dépôt topique à la surface de l'ceuf, sédiment-contact ou microinjection dans l'ceuf. De façon préférentielle, si la substance étudiée est hydrosoluble elle est solubilisée dans le milieu de culture des embryons et si la substance est hydrophobe, elle est déposée à la surface de l'embryon, microin jectée dans l'ceuf ou enrobée sur un sédiment ou un sol sur lequel sont incubés les oeufs. Pour la première variante, les embryo-larves peuvent par exemple être exposés à différentes concentrations de l'agent ou composé à tester (notamment composés hydrosolubles et certains sels métalliques) dilué dans le milieu de culture. Au bout de 24 à 48 heures d'exposition, les embryons sont rincés et remis dans du milieu propre jusqu'à éclosion. Une autre alternative est une exposition chronique à faibles doses pendant toute la durée du développement embryonnaire. Pour la seconde variante, les embryons fécondés sont disposés sur du sédiment ou un sol préalablement enrobé avec le composé à tester (composés hydrophobes et certains métaux lourds) à différentes concentrations. Les embryons restent ensuite en contact avec ce sédiment ou le sol pendant 24h ou pendant toute la durée de leur développement embryonnaire. Après éclosion les larves sont placées dans de l'eau de mélange (eau osmosée et eau du robinet) dans des conditions d'élevage appropriées. On les récolte entre 0 et 15 jours après éclosion, préférentiellement entre 1 et 10 jours après éclosion, quoiqu'il en soit toujours avant que la larve n'ait terminé son développement (avant métamorphose complète). Au moment de la récolte, préalablement à la phase de dissociation des larves, il est préférable de plonger les larves dans l'eau entre 0 et 4°C, éventuellement à plusieurs reprises, afin de les anesthésier. On peut également les rincer avec un milieu de culture cellulaire stérile contant des antibiotiques. Il convient ensuite de mettre en oeuvre les étapes de dissociation des larves, de récupération et traitement des cellules isolées obtenues, et enfin de mesure du 5 taux de micronoyaux formés. L'étape de mesure du taux de micronoyaux formé dans les cellules comprend préférentiellement une étape de comparaison avec les résultats obtenus avec des embryo-larves n'ayant pas été mises en contact avec le composé, l'agent dont la génotoxicité doit être évaluée. 10 Un tel procédé constitue un bioessai pour la mesure de la génotoxicité d'agents physiques, chimiques ou biologiques seuls ou intégrés dans des compositions, rapide, simple à mettre en oeuvre, économique et très efficace. Le procédé de mesure des effets génotoxiques d'agents chimiques, biologiques ou physiques selon l'invention peut être utilisé en écotoxicologie pour étudier 15 l'impact de contaminants environnementaux contenus dans diverses matrices, par exemple l'eau, les sédiments, les matières en suspension, les sols, etc. Le procédé selon l'invention peut donc être utilisé pour la détection, l'analyse et/ou l'étude de contaminants environnementaux et l'étude de la qualité de l'environnement. Il peut par exemple être utilisé pour l'évaluation de la toxicité d'effluents 20 urbains ou industriels, de boues de dragage ou de stations d'épuration. A titre d'exemple spécifique, il peut être utilisé pour le contrôle de la qualité de l'eau ou d'une boue après traitement dans les stations d'épuration ou l'évaluation de l'efficacité d'un procédé de potabilisation de l'eau ou d'épuration de l'eau ou des boues ou encore pour contrôler la dépollution des sols. 25 L'invention vise aussi l'utilisation du procédé de mesure des effets génotoxiques d'agents chimiques, biologiques ou physiques, pour la détection, l'analyse et/ou l'étude de la génotoxicité de composés pour l'homme, notamment en cosmétologie, en agrochimie, agroalimentaire et en pharmacie. Le procédé peut également être utile pour évaluer l'efficacité thérapeutique de composés, en particulier de substances chimiothérapeutiques ou de substances anticancéreuses. D'une manière générale, le procédé selon l'invention peut donc constituer un test prédictif ou diagnostic en biosurveillance sanitaire et/ou environnementale. Son utilisation peut permettre de démontrer la pollution d'un milieu donné. De façon avantageuse, le procédé selon l'invention est très sensible et permet de démontrer la génotoxicité de composés présents en très faibles concentrations dans un milieu donné. Appliqué sur organisme entier (embryons ou larves), il peut aussi permettre de révéler ou confirmer la bio-disponibilité de substances en démontrant qu'elles sont capables de pénétrer dans les organismes, qu'elles ont été distribuées dans leurs tissus, y ont été métabolisées, transformées et y ont induit des effets biologiques. L'invention est à présent illustrée par un exemple non limitatif de mise en oeuvre de l'invention. Cet exemple consiste à tester sur des embryo-larves de Medaka, trois agents : le Cadmium et deux hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), le Benzo[a]pyrène (BaP) et le Fluoranthène. Le Cadmium est connu pour sa toxicité depuis plus de 50 ans. Il est bioaccumulé dans les organismes et bioamplifié tout au long de la chaîne trophique. Il est toxique sous toutes ses formes (sel, métal, vapeur, composés organiques) et il est reconnu comme étant un CMR (cancérogène, mutagène, reprotoxique). Le BaP (C20H12) est l'un des HAP les plus connus et étudiés. C'est aussi l'un des plus toxiques. Il est mutagène et fortement cancérogène car après bioactivation en benzo[a]pyrène diol époxyde il forme des interactions covalentes fortes avec certaines bases de l'ADN. Il est formé lors de la combustion incomplète de matières organiques, d'où son importante représentation dans l'environnement. Le fluoranthène est un hydrocarbure aromatique polycyclique très répandu dans l'environnement. Il est le produit d'une combustion incomplète de la matière organique. Ses effets sont mal connus et de nombreuses études tendent à montrer qu'il n'est pas génotoxique. L'étude est réalisée sur des embryo-larves de Medaka. Les poissons adultes sont élevés dans des aquariums (2/3 d'eau osmosée et 1/3 d'eau du robinet) avec un ratio de 2 mâles pour une femelle. La température est maintenue à 24°C et la photopériode correspond à la photopériode naturelle. Les poissons sont nourris deux fois par jour et l'eau est renouvelée deux fois par semaine pour au moins 1/5 du volume. Le protocole opératoire est décrit en suivant. 1 - CONTAMINATION Après fertilisation des oeufs, les embryons sont récoltés. - Pour le BaP ou le Cadmium Les embryons sont disposés dans un tampon ERS composé de [NaCI (1g), KCI (0,03g), CaCl2 (0,04g), MgSO4 (0,163g)]. Entre le jour 3 et le jour 4 après fécondation, les embryons sont exposés pendant 24 heures à différentes concentrations de contaminant (0,1 pM, 1 pM et 10 pM) dilué dans l'ERS. Au bout de 24 heures, les embryons sont rincés et remis dans de l'ERS jusqu'à leur éclosion. - Pour le Fluoranthène Les embryons sont disposés sur du sédiment préalablement enrobé de fluoranthène à différentes concentrations (0,22pg/g, 0,44pg/g et 1,72pg/g). Afin de calquer les conditions naturelles, les embryons restent en contact avec ce sédiment jusqu'à leur éclosion. Le sédiment n'est pas renouvelé au cours de l'expérience. Les embryons sont recouverts de milieu de culture (tampon ERS). Un contrôle négatif sans contaminant est réalisé en parallèle. Après l'éclosion, quel que soit le type de contamination, les larves sont placées dans de l'eau de mélange pendant 10 jours, afin de permettre la fixation des dommages primaires sous forme de mutations et de pouvoir disposer de suffisamment de cellules. Les larves sont ensuite placées dans des microtubes qui sont plongés au moins 5 minutes dans l'eau avec de la glace fondue afin de les anesthésier. Les larves sont ensuite rincées avec du milieu de culture cellulaire stérile contenant des antibiotiques. Cette opération est renouvelée une fois. 2 - DISSOCIATION Les larves sont ensuite dissociées en trois étapes successives : une dissociation mécanique et deux dissociations enzymatiques. a- Dissociation mécanique La dissociation mécanique est réalisée comme suit : - une quinzaine de larves sont récupérées à l'aide d'une pipette et 15 sont placées dans une boîte de Pétri, - les larves sont découpées finement avec une lame de rasoir stérile, - le matériel est récupéré dans des tubes eppendorf contenant du milieu de culture, qui est ensuite mis dans de la glace, 20 - le matériel est ensuite centrifugé entre 5 et 30 minutes, puis - le milieu de culture est enlevé. b-lère dissociation enzymatique De la collagénase issue de C/ostridium histo/yticum type IV est introduite dans du milieu de culture, à une concentration d'environ 1mg/ml. 25 La dissociation est ensuite réalisée comme suit : - le milieu de culture contenant de la collagénase est introduit dans les tubes contenant le matériel issu de la dissociation mécanique, - les tubes sont placés dans un incubateur à 37°C sous agitation douce pendant entre 30 et 60 minutes, puis centrifugés pendant entre 5 et 30 minutes, et - le milieu de culture contenant la collagénase est enlevé. c- 2nde dissociation enzymatique Eventuellement, une seconde dissociation enzymatique peut être mise en oeuvre. Il s'agit d'une désagrégation à la trypsine. Cette étape comprend une sous-étape de dissociation mécanique. Elle est réalisée par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - ajouter de la trypsine dans les tubes, - placer les tubes dans l'incubateur à 37°C sous agitation douce entre 5 et 20 minutes, - rincer la suspension cellulaire avec du milieu de culture, - dissocier mécaniquement le culot cellulaire avec un mouvement de flux et reflux à l'aide d'une micropipette, - éventuellement filtrer la suspension cellulaire sur un tamis de diamètre compris entre 50 et 200 microns, - centrifuger pendant entre 5 et 30 minutes, et - renouveler l'opération une fois en laissant la suspension cellulaire reposer dans ce milieu entre 2 et 10°C. 3 - RECOLTE ET TRAITEMENT DES CELLULES Après dissociation, les cellules sont baignées dans une solution de KCI. La suspension cellulaire est ensuite centrifugée entre 5 et 18 minutes, puis le culot est repris dans un fixateur composé de méthanol et d'acide acétique dans un ratio 4/1 entre 5 et 30 minutes. L'opération est renouvelée une fois et la suspension suit une dernière centrifugation. Le surnageant est prélevé, et les cellules sont déposées par spot sur des lames. On procède ensuite à la coloration. Les lames sont colorées avec du colorant de Wright stain. Le procédé de coloration est le suivant : - préparer une solution mère de colorant comprenant du méthanol 5 dilué avec du PBS et de l'eau distillée, - plonger les lames dans du colorant dilué pendant quelques minutes, - rincer les lames à l'eau courante, et - laisser sécher les lames. 4 - LECTURE DES LAMES 10 Les lames sont lues avec un microscope optique au grossissement X400. Mille cellules sont dénombrées en moyenne sur une lame. Les résultats obtenus en nombre moyen de cellules présentant des micronoyaux pour 1000 cellules sont présentés dans le tableau ci-dessous : Nombre moyen de micronoyaux pour 1000 cellules Témoin 10,36 1pM 18,1 Cadmium 10pM 24,96 100pM 33,48 Témoin 9,73 BaP 0,1pM 18,99 1pM 30,60 Témoin 11,82 0,22pg/g 11,93 Fluoranthène 0,44pg/g 11,35 1,72pg/g 10,27 Les résultats obtenus pour le Cadmium et le BaP, connus pour leur génotoxicité, révèlent la présence de micronoyaux en plus grand nombre que pour les témoins non traités. Cela confirme que le procédé selon l'invention permet de révéler de façon dose-dépendante la génotoxicité de composés génotoxiques. On constate par ailleurs qu'avec le procédé selon l'invention, le Fluoranthène n'induit pas de génotoxicité, ce qui confirme un certain nombre d'autres études menées sur le sujet. REVENDICATIONS, 1. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN à partir d'un système pluricellulaire choisi parmi les organismes entiers d'amphibiens, de mollusques, d'annélides ou de poissons, à un stade larvaire ou embryo-larvaire, et les embryons de mammifères animaux à l'exception des êtres humains, comprenant les étapes suivantes : - obtention d'une suspension de cellules hétérogènes isolées par dissociation physique et enzymatique dudit système pluricellulaire, - récupération et traitement des cellules, et - mesure du taux de micronoyaux formés dans les cellules. 2. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'obtention de la suspension de cellules isolées est réalisée par la mise en oeuvre d'au moins deux dissociations successives du système pluricellulaire : une dissociation mécanique suivie d'au moins une dissociation enzymatique. 3. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'obtention de la suspension de cellules isolées est réalisée par la mise en oeuvre de trois dissociations successives du système pluricellulaire : une dissociation mécanique suivie de deux dissociations enzymatiques. 4. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'obtention de la suspension de cellules isolées est réalisée par la mise en ceuvre des étapes suivantes : dissociation mécanique du système pluricellulaire, - dissociation par digestion enzymatique à la collagénase, et- dissociation des amas cellulaires non dissociés par la collagénase, avec de la trypsine. 5. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que l'étape de dissociation 5 mécanique comprend au moins la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes : - découper le système pluricellulaire à l'aide de lames, - placer le matériel découpé dans un milieu de culture adapté, - centrifuger, et - enlever le milieu de culture. 10 6. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que la première dissociation enzymatique comprend au moins la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes : - placer le matériel issu de la dissociation mécanique dans un milieu de culture contenant de la collagénase, 15 - incuber puis centrifuger, et -enlever le milieu de culture. 7. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que la seconde dissociation enzymatique comprend au moins la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes : 20 - placer le matériel issu de la première dissociation enzymatique en contact avec de la trypsine, - incuber, rincer avec du milieu de culture et dissocier mécaniquement le culot cellulaire, - éventuellement filtrer la suspension cellulaire sur un tamis de 25 diamètre compris entre 50 et 200 microns, - centrifuger, et - renouveler l'opération une fois. 8. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'étape de récupération et de traitement des cellules de la suspension comprend au moins la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes : - faire subir aux cellules un choc hypotonique, - centrifuger au moins une fois la suspension cellulaire et la mettre en contact avec un fixateur, - prélever le surnageant, - procéder à une coloration des cellules. 9. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le traitement des cellules avant mesure du taux de micronoyaux formés, consiste notamment à procéder à une coloration Wright stain ou May-Grünwald Giemsa. 10. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'étape de mesure du taux de micronoyaux formés dans les cellules, se fait à l'aide d'un microscope à l'oeil nu ou grâce à un dispositif automatisé. 11. Utilisation d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, pour mesurer les effets génotoxiques d'agents chimiques, biologiques ou physiques. 12. Procédé de mesure des effets génotoxiques d'agents chimiques, biologiques ou physiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en contact d'un organisme entier de type amphibien, mollusque, annélide ou poisson à un stade embryo-larvaire ou mammifère animal à un stade embryonnaire à l'exception des êtres humains, avec au moins un agent dont la génotoxicité doit être évaluée, - récupération de l'organisme entier à un stade embryo-larvaire plus avancé ou après éclosion à un stade larvaire, et- détection de la présence de dommages irréversibles de l'ADN par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 10. 13. Procédé de mesure des effets génotoxiques d'agents selon (a revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - après fertilisation d'oeufs d'amphibiens, de mollusques, d'annélides ou de poissons, récolte des embryo-larves, - mettre les embryo-larves en contact avec l'agent dont la génotoxicité doit être évaluée et maintenir les embryo-larves dans un milieu approprié à leur développement jusqu'à éclosion, - après éclosion utilisation des larves pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 10. 14. Procédé de mesure des effets génotoxiques d'agents selon la revendication 13, caractérisé en ce que les larves sont utilisées pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 10, entre 0 et 15 jours après éclosion. 15. Procédé de mesure des effets génotoxiques d'agents selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que l'étape de mesure du taux de micronoyaux formé dans les cellules comprend une étape de comparaison avec les résultats obtenus avec des embryo-larves n'ayant pas été mises en contact avec l'agent dont la génotoxicité doit être évaluée. 16. Utilisation d'un procédé selon l'une des revendications 12 à 15, pour : - la détection, l'analyse et/ou l'étude de la génotoxicité de composés pour l'homme, ou - l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de composés, l'évaluation 25 de l'efficacité de substances chimiothérapeutiques ou de substances anticancéreuses,ou - la détection, l'analyse et/ou l'étude de contaminants environnementaux et l'étude de la qualité de l'environnement, ou- le contrôle de la qualité de l'eau ou d'une boue après traitement dans les stations d'épuration ou l'évaluation de l'efficacité d'un procédé de potabilisation de l'eau ou d'épuration de l'eau ou des boues ou le contrôle de dépollution des sols.5