FR 2966154 A1 20120420 FR 1058327 A 20101013 i « Procédé perfectionné d'hydrolyse enzymatique de la cellulose » La présente invention concerne un procédé d'hydrolyse enzymatique de la cellulose. s Le demandeur, CIMV, est une société spécialisée dans le traitement et la valorisation de la matière première végétale Iignocellulosique. A cet égard, le demandeur est le déposant et titulaire de différentes demandes de brevets et brevets concernant un io procédé de production de pâte à papier, lignines, sucres et acide acétique, par fractionnement de matière végétale Iignocellulosique en milieu acide formique/acide acétique (WO-A1-00/68494). Le demandeur est aussi le titulaire de demandes de brevets et/ou de brevets concernant un procédé de prétraitement ls d'une matière végétale Iignocellulosique en vue de la production de bioéthanol (WO-A2-2010/006840). Un tel procédé de prétraitement permet notamment d'obtenir, à partir de la matière première végétale Iignocellulosique (MPVL), dans des conditions économiques industrielles, 20 d'une part un substrat constitué essentiellement par de la cellulose défibrée présentant des conditions optimales pour son hydrolyse enzymatique ultérieure, et un deuxième substrat constitué par une mélasse sucrée provenant des hémicellulose dont les hydrolysats sont dépourvus de furfural. 25 Le demandeur a donc déjà proposé un procédé de production de bioéthanol à partir d'une matière première végétale Iignocellulosique comportant les étapes successives de prétraitement de la MPVL, d'hydrolyse enzymatique de la matière prétraitée et de fermentation alcoolique des produits issus de 30 l'étape d'hydrolyse. Ces inventions (Procédés CIMV) visent à améliorer les conditions industrielles de la production d'éthanol ou bioéthanol à 2 partir de MPVL, et notamment l'hydrolyse de la cellulose en sucres fermentescibles. D'une manière générale et de manière connue, les procédés de production de bioéthanol à partir de MPVL prennent s en compte plusieurs paramètres. Parmi ces paramètres, il a notamment été identifié que la lignine ne peut pas être fermentée en éthanol et que la matrice lignocellulosique doit être prétraitée pour rendre la cellulose et les hémicelluloses hydrolysables. io De par leur composition chimique, les polymères de lignines sont insolubles et très réactifs. De ce fait, la présence de lignines renforce les liaisons hydrogène qui relient le réseau cellulose - hémicelluloses et elles entravent la pénétration et l'action des enzymes, nécessitant la ls présence d'eau. L'hydrolyse enzymatique de la cellulose est une voie préconisée pour l'obtention de sucres fermentescibles pour diverses raisons, et notamment parce que les résultats des évaluations économiques sont en faveur de l'hydrolyse 20 enzymatique, lorsqu'elle est comparée à l'hydrolyse chimique. De plus, l'hydrolyse enzymatique génère peu d'effluents à traiter et pas de problèmes de corrosion. L'hydrolyse enzymatique proprement dite s'effectue par simple mise en contact de la matière première végétale prétraitée 25 avec une solution enzymatique en assurant l'homogénéité de la suspension et en maintenant des conditions optimales qui sont, par exemple pour les cellulases de T.reesei, une température comprise entre 45°C et 50°C et un pH de l'ordre de 4,8. Le temps d'action des enzymes est fonction de la quantité 30 d'enzymes utilisée et de l'activité spécifique des enzymes. Pendant l'hydrolyse enzymatique, les sucres réducteurs sont essentiellement libérés sous forme de glucose. 3 Les enzymes impliquées dans la dégradation de la cellulose, qui sont appelées communément cellulases, sont de différents types et de différentes origines et elles se caractérisent notamment par leur activité. s Le coût des cellulases est relativement élevé et constitue un facteur souvent estimé comme étant le plus onéreux dans la production de bioéthanol à partir de MPVL. De ce fait, des efforts importants ont été consacrés à la connaissance du mécanisme de la cellulolyse enzymatique en vue io de son amélioration, s'agissant d'un processus complexe d'action de protéines solubles sur un substrat insoluble et "récalcitrant". Un autre paramètre de l'efficacité et de la rentabilité d'un procédé d'hydrolyse enzymatique est le temps d'hydrolyse qui peut être relativement long, de 48 à 72 h. ls Une fois la cellulose hydrolysée en glucose par hydrolyse enzymatique, le glucose est fermenté de la même façon que par exemple le glucose issu de l'amidon. Il demeure des problèmes connus spécifiques à l'utilisation de MPVL comme substrat initial, tels que la présence éventuelle 20 de composés toxiques et inhibiteurs issus des hémicelluloses et la lignine, ainsi que la possibilité d'effectuer l'hydrolyse enzymatique et la fermentation en une seule étape. Les inhibiteurs présents dans les hydrolysats proviennent de la dégradation des sucres (en furfural), de groupements 25 présents dans les hémicelluloses, de la lignine. La présence des inhibiteurs dépend de la nature de la MPVL et des conditions de son prétraitement. Outre l'inhibition des enzymes par le furfural, on a constaté des effets conjugués des différents inhibiteurs. 30 S'agissant de la fermentation et de l'hydrolyse simultanées selon le procédé dit "SSF" ("Simultaneous Saccharification and Fermentation") qui consiste à effectuer l'hydrolyse enzymatique et la fermentation éthanolique en une seule étape, ses principaux 4 avantages sont la diminution des investissements en supprimant les opérations nécessaires à l'hydrolyse enzymatique effectuée au préalable et l'absence d'inhibition des cellulases par le glucose qui est consommé par les microorganismes fermentaires s au fur et à mesure de son apparition. Il en résulte une augmentation des taux et des vitesses d'hydrolyse et des productivités globales en éthanol ou bioéthanol. Par ailleurs, les risques de contamination microbienne de io I'hydrolysat riche en glucose sont amoindris. Il est cependant apparu que les gains apportés par le procédé SSF, notamment du point de vue économique, nécessitent d'optimiser certains aspects, notamment la concentration en matière sèche initiale pour obtenir des ls concentrations élevées d'éthanol. Afin de remédier à ces inconvénients, l'invention vise à proposer un procédé perfectionné d'hydrolyse enzymatique de la cellulose qui se caractérise tout d'abord par une élimination seulement partielle des lignines, préalablement à l'hydrolyse 20 enzymatique, de manière à obtenir un taux global résiduel T (exprimé en % massique) de lignines déterminé non nul compris entre deux valeurs bornes, c'est-à-dire un taux compris dans une plage déterminée. Pour le dosage du taux T des lignines, on ne prend pas en compte les lignines re-déposées, mais seulement 25 les lignines intrinsèques. En effet, de manière surprenante, il a été découvert que ce n'est pas l'élimination totale des lignines qui permet d'aboutir au meilleur rendement possible, c'est-à-dire à un taux T d'hydrolyse enzymatique égal à 1000/0. 30 Plus précisément, le procédé est caractérisé en ce qu'il comporte, préalablement à l'étape d'hydrolyse enzymatique, une étape d'élimination partielle des lignines de manière à obtenir un taux global résiduel de lignines (T), exprimé en pourcentage massique, qui est non nul et qui est compris dans une plage déterminée par une borne inférieure (Binf), et une borne supérieure (Bsup), respectivement égales à 0,300/0 et 40/0. De préférence, le taux global résiduel de lignines (T) est 5 compris dans une plage déterminée par une borne inférieure (Binf), et une borne supérieure (Bsup), respectivement égales à 0,350/0 et 3,50/0. De préférence encore, le taux global résiduel de lignines (T) est égal à environ 1,650/0. io Un tel traitement de la cellulose pour éliminer les lignines afin d'aboutir à un taux de lignines tel que préconisé ci-dessus est par exemple effectué au moyen d'une étape de traitement à la soude, suivie d'une étape de lavage destinée à éliminer la soude résiduelle avant l'étape d'hydrolyse enzymatique. 15 Selon une autre caractéristique du procédé selon l'invention, afin d'obtenir des conditions d'acidification avant l'hydrolyse enzymatique, et notamment un pH de l'ordre de 5, une « ré-acidification » du mélange est effectuée au moyen d'un acide de pKa déterminé, et notamment au moyen d'acides organiques 20 faibles tels que l'acide acétique et/ou l'acide formique, et/ou un autre acide faible tel que l'acide citrique. Plus précisément, afin d'obtenir des conditions d'acidification déterminées avant l'étape d'hydrolyse enzymatique, le procédé comporte une étape de ré-acidification du mélange qui 25 est effectuée au moyen d'un acide, ou d'un mélange d'acides, de pKa déterminé, et notamment au moyen d'acides organiques faibles tels que l'acide acétique et/ou l'acide formique. Après ladite étape de ré-acidification, le pH du mélange est de préférence compris entre 4 et 6, de préférence entre 4,5 et 30 5,5. De préférence encore, après ladite étape de ré- acidification, le pH du mélange est égal à 5. En effet, de manière surprenante, il a été démontré que l'utilisation de tels acides permet d'obtenir un taux d'hydrolyse maximal, contrairement par exemple à l'utilisation d'un acide fort tel que l'acide sulfurique. s De plus, dans le cadre des procédés CIMV mentionnés ci-dessus, une telle utilisation industrielle d'acide acétique et/ou formique est particulièrement avantageuse dans la mesure où ces acides sont déjà utilisés et présents dans le cycle industriel de production de la cellulose à partir de la MPVL. io Parmi les autres avantages de l'invention, on a démontré que l'efficacité globale du procédé de production d'éthanol ou bioéthanol est proche, ou quasi égale, à la production du taux maximal théorique d'éthanol à partir de la MPVL et que, de plus, cette efficacité était la même selon que le procédé global faisait ls appel d'abord à une étape d'hydrolyse enzymatique selon l'invention, puis à une étape de fermentation, ou bien selon que l'on mettait en oeuvre un procédé d'hydrolyse et de fermentation simultanés (procédé SSF). Une telle efficacité identique est due au fait que l'hydrolyse 20 enzymatique selon l'invention ne produit pas d'inhibiteurs de la fermentation. De plus, il a été démontré que les avantages du procédé selon l'invention (taux global de lignines et conditions particulières de la ré-acidification), ne sont pas modifiés, c'est-à- 25 dire sont de même nature et de mêmes valeurs, quelles que soient les cellulases utilisées, et notamment qu'il s'agisse de cellulases de plus ou moins grande efficacité. 7 A titre d'exemples de résultats d'essais : Exemple d'enzymes testées et leur activité : Activités en U/ml de solution enzymatique Cellulase Xylanase Béta-glucosidase Endo exo Cellic CTec 42 3827 11+-1-5 281+1-40 Accellerase 1500 7 392 12+1-6 66+1-9 AB (EL 2009060L) 8 32 1+1-05 13+1-2 AB (EL 2009096L) 0 77 2+1-1 25+1-3 s Enzyme utilisée pour les essais : Cellic Ctec et Cellic Ctec 2 (Enzyme dite de nouvelle génération avec une activité 40% supérieure à la 1 ère génération) Conditions d'hydrolyse : Température égale à 50°C, pH compris entre 4,5 et 5, concentration en enzymes égale à 42U/g. io Effet d'une extraction alcaline sur le taux d'hydrolyse de la cellulose : Voir Figure 1, dans laquelle : - Pâte brute : pâte dite « CIMV » après extraction, dé-lignification et lavage ; ls - Pâte après extraction alcaline : pâte brute traitée à pH 12 à 85°C pendant 1 heure. Effet du taux de lignine résiduelle sur l'hydrolyse d'une pâte cellulosique : Voir Figure 2 20 Effet du pKa de l'acide utilisé pour l'acidification (« ré-acidification) à pH 5 sur l'hydrolyse de la pâte cellulosique : Acide Acide acétique Acide Acide acétique + Acide formique formique Sulfurique % 95 80 78 45 d'hydrolyse après 24h REVENDICATIONS1. Procédé d'hydrolyse enzymatique de la cellulose, caractérisé en ce qu'il comporte, préalablement à l'étape d'hydrolyse enzymatique, une étape d'élimination partielle des s lignines de manière à obtenir un taux global résiduel de lignines (T), exprimé en pourcentage massique, qui est non nul et qui est compris dans une plage déterminée par une borne inférieure (Binf), et une borne supérieure (Bsup), respectivement égales à 0,30% et 4%. io 2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le taux global résiduel de lignines (T) est compris dans une plage déterminée par une borne inférieure (Binf), et une borne supérieure (Bsup), respectivement égales à 0,350/0 et 3,50/0. 3. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé ls en ce que le taux global résiduel de lignines (T) est égal à environ 1,650/0. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite étape d'élimination partielle des lignines est effectuée par un traitement à la soude, 20 suivi d'une étape de lavage destinée à éliminer la soude résiduelle avant l'étape d'hydrolyse enzymatique. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, afin d'obtenir des conditions d'acidification avant l'étape d'hydrolyse enzymatique, le procédé 25 comporte une étape de ré-acidification du mélange qui est effectuée au moyen d'un acide, ou d'un mélange d'acides, de pKa déterminé, et notamment au moyen d'acides organiques faibles tels que l'acide acétique et/ou l'acide formique et/ou de l'acide citrique. 30 6. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que, après ladite étape de ré-acidification, le pH du mélange est compris entre 4 et 6. 7. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que, après ladite étape de ré-acidification, le pH du mélange est compris entre 4,5 et 5,5. 8. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé s en ce que, après ladite étape de ré-acidification, le pH du mélange est égal à 5.