FR 2964103 A1 20120302 FR 1003472 A 20100830 ANTICORPS SE LIANT A L'ADRENOMEDULLINE ET AUX RECEPTEURS DE L'ADRENOMEDULLINE ET LEURS UTILISATIONS COMME MEDICAMENT La présente invention concerne le domaine des anticorps dirigés contre 5 les récepteurs de l'adrénomédulline et utilisés comme médicament, destiné notamment au traitement des cancers. L' adrénomédulline (AM) est un peptide vasoactif de 52 acides aminés (représenté en tant que séquence SEQ ID NO : 1) qui agit localement comme une hormone autocrine/paracrine et exerce de multiples actions biologiques (HINSON et al., Endocr 10 Rev., 2000, 21:138-67 ; CARON and SMITHIES, Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:615-619 ; SHINDO et al., Circulation, 2001, 104:1964-1971). Des récepteurs de l'adrénomédulline sont présents non seulement dans les cellules de la plupart des tissus, tels que le coeur, le rein, le cerveau, le poumon et la glande surrénale, mais aussi dans les cellules du stroma des tumeurs. 15 L'adrénomédulline joue un rôle positif dans la régulation de l'angiogenèse lors du remodelage vasculaire en réponse à l'ischémie, dans l'appareil reproducteur de la femme durant le développement vasculaire embryonnaire, et lors du développement et de la vascularisation du placenta. Plusieurs équipes ont mis en évidence un rôle de ce peptide sur la prolifération, la migration et l'invasion des cellules 20 endothéliales (OUAFIK et al., Am J Pathol., 2002, 160:1279-92 ; KIM et al., FASEB J., 2003, 17:1937-9 ; FERNANDEZ-SAUZE et al., Int J Cancer, 2004, 108:797-804). Il a aussi été montré que l'adrénomédulline agit sur une des dernières étapes de la néovascularisation qui consiste en la réorganisation des cellules endothéliales en tubules et ce, indépendamment du VEGF (FERNANDEZ-SAUZE et al., 2004, cité ci-dessus). 25 Il a par ailleurs été mis en évidence un rôle de l'adrénomédulline dans la croissance tumorale (OUAFIK et al., Am J Pathol., 2002, 160:1279-92 ; MARTINEZ et al., JNatl Cancer Inst., 2002, 94:1226-37 ; OEHLER et al., Oncogene, 2001, 20:2937-45 ; ISHIKAWA et al., Oncogene, 2003, 22:1238-1242). Plusieurs études démontrent que l'adrénomédulline possède des propriétés angiogéniques dans la plupart des tumeurs (sein, 30 prostate, colon, poumon, rein, voies respiratoires, vessie) (OUAFIK et al., 2002, cité ci-dessus; FERNANDEZ-SAUZE et al., 2004, cité ci-dessus ; NIKITENKO et al., Br J Cancer, 2006, 94:1-7). Par exemple, chez des souris hétérozygotes adrénomédulline +/-, le volume tumoral diminue par rapport aux souris sauvages (IIMURO et al., Circ. Res., 2004, 95:415-423). Cet effet est associé à une réduction de la néo-vascularisation. Le blocage de l'action de l'adrénomédulline par un antagoniste (adrénomédulline22.52) inhibe la croissance de tumeurs pancréatiques xénogreffées en déstabilisant la vascularisation des tumeurs (ISHIKAWA et al., Oncogene, 2003, 22:1238-1242). Des effets similaires ont été observés dans des xénogreffes développées à partir des cellules gliales tumorales (OUAFIK et al., 2002, cité ci-dessus). Les récepteurs de l'adrénomédulline (AMR) sont des complexes multiprotéiques composés de l'association d'au moins deux protéines, le CRLR (« Calcitonin Receptor Like Receptor ») et une protéine RAMP (« Receptor Activity- Modifying Protein ») (McLATCHIE et al., Nature, 1998, 6683:333-9). Le récepteur CLR (CRLR) a été isolé en 1993 (NJUKI et al., Clin Sci., 1993 4:385-8 ; CHANG et al., Neuron., 1993, 6:1187-95). Il comporte sept domaines transmembranaires couplés à une protéine G. La séquence peptidique du CLR fut établie chez l'Homme en 1996 (AIYAR et al., J Biol Chem., 1996, 19:11325-9) et chez le porc en 1998 (ELSHOURBAGY et al., Endocrinology, 1998, 4:1678-83). Le CLR appartient à la classe II des RCPG (« G protein-coupled receptors »), classe qui regroupe des récepteurs de peptides tels que le glucagon et les peptides apparentés au glucagon (GLP), la sécrétine, la parathormone ou la calcitonine. Les RCPG sont de nature polypeptidique et comportent une partie extracellulaire portant le site de liaison du ligand, une partie transmembranaire à sept hélices et une partie intracellulaire en contact avec les protéines G qui assurent le transfert et l'amplification du signal reçu par le récepteur. Les RCPG présentent trois boucles extracellulaires (nommées El, E2 et E3) et trois boucles intracellulaires (Il, 12 et I3) (BOCKAERT and PIN, Embo J., 1999, 18:1723-1729). Ces protéines peuvent être sujettes à des modifications post-traductionnelles, de type N-glycosylation, acétylation par des composés lipidiques formant parfois une pseudo-quatrième boucle intracellulaire (14) (ASSIE et al., EMC-Endocrinologie, 2004, 1:169-199). En 1998, McLATCHIE et ses collaborateurs (référence citée ci-dessus) ont démontré que le récepteur CLR peut générer deux récepteurs pharmacologiquement distincts par association à une famille de protéines, de 160 acides aminés (14-21 kDa), à un seul domaine transmembranaire, nommées RAMPs. Le CLR n'est correctement fonctionnel qu'à l'état de dimère avec une protéine RAMP. Il existe trois isoformes protéiques de RAMPs : RAMP1, 2 et 3. Ces protéines ont moins de 30% d'identité entre elles, mais présentent des similitudes d'organisation structurale. Chez l'Homme, les gènes codant RAMP1, RAMP2 et RAMP3 sont portés respectivement par les chromosomes 2, 17 et 7. Les protéines RAMPs sont constituées d'un seul domaine transmembranaire ; l'extrémité N-terminale extracellulaire est relativement longue et joue un rôle important dans la spécialisation et la fonctionnalité du récepteur (CGRP ou adrénomédulline) (KUWASAKO et al., J Biol Chem., 2001, 275:29602-9). Deux fonctions essentielles sont attribuées aux protéines RAMPs : - la détermination du récepteur : le rôle fondamental des protéines RAMPs est de définir la spécificité du ligand qui interagit directement à la surface cellulaire. RAMP1 présente le CLR comme une glycoprotéine mature pour former le récepteur du CGRP (« calcitonin gene-related peptide »). De même RAMP2 et RAMP3 présentent le CLR comme une glycoprotéine mature pour former les récepteurs de l'adrénomédulline. Ainsi la nature des protéines RAMPs présentes dans un type cellulaire, les interactions protéiques qui s'établissent entre les différents partenaires (CLR, RAMP1, RAMP2, RAMP3) et la proportion de chacune des protéines permettent aux cellules de répondre spécifiquement à différents neuropeptides (BÜHLMANN et al., FEBS Lett., 2000, 486:320-4 ; CHAKRAVARTY et al., Br JPharmacol., 2000, 130:189-95) ; - le transport intracellulaire : le CLR nécessite la co-expression des protéines RAMPs pour son transport vers la membrane cytoplasmique (SEXTON et al., Cell Signal, 2001, 13:73-83). La réciproque est vraie : les protéines RAMPs ont besoin du CLR pour leur translocation à la surface cellulaire (FLAHAUT et al., J Biol Chem., 2002, 277:14731-7). Certains des Inventeurs ont déjà montré (Demande Internationale WO 2010/012911) qu'un mélange d'au moins trois anticorps se liant à trois protéines différentes formant les récepteurs de l'adrénomédulline, plus particulièrement les protéines hCLR, hRAMP2 et hRAMP3, présentait une efficacité anti-tumorale in vitro et in vivo significativement plus importante par rapport à l'utilisation d'un seul anticorps anti-CLR, anti-RAMP2 ou anti-RAMP3, ou même par rapport à l'utilisation d'un mélange de deux anticorps anti-CLR/anti-RAMP2 ou anti-CLR/anti-RAMP3. Cependant, il existe toujours un besoin d'améliorer les traitements des maladies dans lesquelles l'angiogenèse doit être inhibée, notamment le cancer. Les Inventeurs ont maintenant synthétisé un polypeptide chimère constitué de 4 séquences peptidiques dérivées respectivement de l'adrénomédulline et des récepteurs de l'adrénomédulline humains hRCLR, hRAMP2 et hRAMP3. Ils ont obtenu, chez le lapin, des anticorps polyclonaux dirigés contre ce polypeptide chimère, qui se lient à l'adrénomédulline, hCLR, hRAMP2 et hRAMP3. Ils ont alors montré que ces anticorps polyclonaux présentaient une efficacité anti-tumorale in vitro. Ils ont aussi montré, in vivo chez la souris, que l'administration intra-péritonéale d'anticorps anti-polypeptide chimère induit une inhibition de la croissance tumorale des glioblastomes (U87) de 70% à 75% après 11 jours et jusqu'à 31 jours de traitement. La présente invention a donc pour objet un mélange d'au moins 4 anticorps et/ou fragments desdits anticorps se liant respectivement à l'adrénomédulline et 10 aux protéines CLR, RAMP2 et RAMP3. La présente invention a aussi pour objet ledit mélange d'anticorps et/ou fragments desdits anticorps pour son utilisation comme médicament ou pour le traitement préventif ou curatif d'une maladie dans laquelle l'angiogenèse doit être inhibée, de préférence choisie parmi le cancer, les maladies inflammatoires, le psoriasis, 15 l'athérosclérose et la dégénérescence maculaire, de préférence encore le cancer. Avantageusement, ledit médicament est destiné au traitement préventif ou curatif de tumeurs, préférentiellement celles dont la vascularisation est nécessaire à leur croissance, plus particulièrement aux tumeurs solides. Selon un mode de réalisation préférée de la présente invention, 20 l'adrénomédulline et lesdites protéines CLR, RAMP2 et RAMP3 sont celles d'un mammifère, et de préférence encore sont d'origine humaine. Les séquences d'acides aminés des protéines CLR, RAMP2 et RAMP3 d'origine humaine sont bien connues et sont respectivement disponibles sous les numéros d'accès giI5031621, gi1118572585 et gi15032023 dans la base de données GENBANK. 25 Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de la présente invention, lesdits anticorps et fragments d'anticorps se lient à un domaine extracellulaire des protéines CLR, RAMP2 et RAMP3, et plus particulièrement aux peptides de séquences SEQ ID NO: 3 ou 4 pour les anticorps anti-CLR, aux peptides de séquences SEQ ID NO: 5 ou 6 pour les anticorps anti-RAMP2 et aux peptides de séquences SEQ ID NO: 7, 8 ou 9 30 pour les anticorps anti-RAMP3. L'invention englobe les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, naturels, recombinants ou synthétiques, les anticorps chimériques tels que les anticorps humanisés, ainsi que leurs fragments (par exemple : Fab'2, Fab, Fv, scFv) ayant conservé leur capacité À de liaison à l'adrénomédulline, CLR, RAMP2 ou RAMP3. Par « anticorps recombinant » on entend un anticorps produit par génie génétique, par exemple par clonage et amplification génique. Par « anticorps synthétique » on entend un anticorps produit par synthèse 5 enzymatique et/ou chimique. La détermination de la liaison d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps selon la présente invention à l'adrénomédulline, CLR, RAMP2 et RAMP3 peut s'effectuer en mettant en oeuvre une méthode immunologique appropriée, par exemple par ELISA, RIA, immunofluorescence ou immunohistochimie. 10 Lesdits anticorps ou fragments d'anticorps anti-CLR, -RAMP2 et -RAMP3 sont des antagonistes des récepteurs de l'adrénomédulline, c'est-à-dire qu'ils bloquent (ou inhibent) d'une façon dose-dépendante la liaison de l'adrénomédulline à ces récepteurs. Lesdits anticorps ou fragments d'anticorps anti-adrénomédulline bloquent 15 (ou inhibent) d'une façon dose-dépendante la liaison de l'adrénomédulline à ces récepteurs. L'obtention d'anticorps anti-AM, -CLR, -RAMP2 ou -RAMP3 est connue de l'Homme du métier. Elle est décrite, par exemple, dans OUAFIK et al. (Am J Pathol., 2002, 160:1279-92), Fernandez-Sauze et al. (Int J Cancer, 2004, 108:797-804) et les Demandes Internationales WO 2007/045927 et WO 2010/012911. 20 Avantageusement, les anticorps selon la présente invention sont susceptibles d'être obtenus par immunisation d'un animal avec un polypeptide chimère comprenant ou constitué de quatre peptides d'au moins 6 acides aminés contigus dérivés respectivement de l'adrénomédulline et des protéines CLR, RAMP2 et RAMP3, ledit polypeptide chimère étant capable d'induire, chez ledit animal immunisé avec ledit 25 polypeptide chimère, la production d'anticorps polyclonaux se liant à l'adrénomédulline, CLR, RAMP2 et RAMP3. De préférence, l'animal immunisé est un mammifère, tel que par exemple le cheval, la chèvre, le lapin, le rat et la souris, et de préférence encore le lapin ou la souris. On entend par « peptide d'au moins 6 acides aminés contigus dérivé de 30 l'adrénomédulline ou des récepteurs de l'adrénomédulline CLR, RAMP2 ou RAMP3 », un fragment de l'adrénomédulline ou desdits récepteurs de l'adrénomédulline dans lequel un ou plusieurs résidus d'acides aminés a(ont) été délété(s), et/ou un ou plusieurs résidus d'acides aminés a(ont) été substitué(s) par un résidu d'acide aminé naturel ou non naturel ou de configuration de type D ou beta, et/ou un ou plusieurs résidus d'acides aminés naturel(s) ou non-naturel(s) y a(ont) été inséré(s), et/ou une ou plusieurs liaisons amides a(ont) été modifiée(s), étant entendu que ledit peptide dérivé de l'adrénomédulline ou desdits récepteurs de l'adrénomédulline comprend ou est constitué d'au moins 6 acides aminés contigus de l'adrénomédulline ou desdits récepteurs de l'adrénomédulline. De manière avantageuse, lesdits peptides sont constitués de 20 à 35 acides aminés. De manière avantageuse encore, lesdits peptides dérivés des protéines CLR, RAMP2 ou RAMP3 sont dérivés d'un domaine extracellulaire de ces protéines. De manière avantageuse encore, chacun des peptides suivants peut être utilisé pour obtenir un polypeptide chimère selon la présente invention : - peptide dérivé de l'adrénomédulline, constitué de la concaténation des fragments R12-F14, R17-G19, K25-A27 et T34-P49 de l'adrénomédulline RSFRFGKLATDKDKDNVAPRSKIS (SEQ ID NO : 2) - peptides dérivés des fragments S27-K51 (SEQ ID NO : 3) ou P89-R119 (SEQ ID NO : 4) de la protéine hCLR : SPEDSIQLGVTRNKIMTAQYEAYQK (SEQ ID NO : 3), PDYFQDFDPSEKVTKIADQDGNWFRHPASNR (SEQ ID NO : 4), - peptides dérivés des fragments K59-K81 (SEQ ID NO : 5) ou R91- R118 (SEQ ID NO : 6) de la protéine hRAMP2 : KNYETAVQFAWNHYKDQMDPIEK (SEQ ID NO : 5), RPYSTLRDALEHFAELFDLGFPNPLAER (SEQ ID NO : 6), - peptides dérivés des fragments K49-K55 (SEQ ID NO : 7), L34-K55 (SEQ ID NO : 8) ou G91-E112 (SEQ ID NO : 9) de la protéine hRAMP3 : KVDVWK (SEQ ID NO : 7), LERLPLAGKAFADMMGKVDVWK (SEQ ID NO : 8), GFITGIHRQFFSNATVDRVHLE (SEQ ID NO : 9). Le résidu d'acide aminé noté « A » correspond à un résidu alanine obtenu par substitution d'un résidu cystéine présent dans la séquence peptidique des protéines hCLR, hRAMP2 ou hRAMP3 naturelles. Le fait de substituer le résidu cystéine par une alanine permet d'obtenir une séquence peptidique linéaire bien caractérisée et évite d'obtenir des mélanges de peptides comprenant des dimères (par formation de ponts disulfures interchaînes). L'ordre des différents peptides dans le polypeptide chimère selon la présente invention peut être aléatoire. Cependant, on préférera un polypeptide chimère comprenant ou constitué, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, d'un peptide dérivé de l'adrénomédulline, d'un peptide dérivé de CLR, d'un peptide dérivé de RAMP3 et d'un peptide dérivé de RAMP2, tels que définis ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit polypeptide chimère présente la séquence SEQ ID NO : 10 (dénommé ch2) : RSFRFGKLATDKDKDNVAPRSKISPDYFQDFDPSEKVTKIADQDGNWFRKVDVW KKNYETAVQFAWNHYKDQMDPIEK. La présente invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'anticorps polyclonaux se liant à l'adrénomédulline ou aux protéines CLR, RAMP2 ou RAMP3, comprenant une étape d'immunisation d'un animal tel que défini ci-dessus avec un polypeptide chimère tel que défini ci-dessus, de préférence le polypeptide chimère de séquence SEQ ID NO : 10. La présente invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux se liant à l'adrénomédulline, comprenant une étape d'immunisation d'un animal tel que défini ci-dessus avec le polypeptide de séquence SEQ ID NO : 2. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins un mélange d'anticorps et/ou fragments desdits anticorps tel que défini ci-dessus, et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. A titre d'exemples non limitatifs de véhicule pharmaceutiquement acceptable, on peut citer les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des véhicules pharmaceutiquement acceptables utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales ou animales, l'acacia, etc. Ledit médicament ou ladite composition pharmaceutique peut se présenter sous la forme d'une solution saline, physiologique, isotonique et tamponnée, compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'Homme du métier. Ledit médicament ou ladite composition pharmaceutique peut être formulé sous toute forme pharmaceutiquement acceptable, comme par exemple sous la forme de suspension injectable, de gels, huiles, comprimés, suppositoires, gélules, capsules, etc., éventuellement utilisé au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons. Il est possible que le mélange d'anticorps et/ou fragments d'anticorps selon la présente invention comprenne à la fois des anticorps polyclonaux et des anticorps monoclonaux tels que définis ci-dessus. Dans ledit mélange, lesdits anticorps et/ou fragments d'anticorps peuvent être présents en tout rapport de l'un vers les autres, comme par exemple un rapport compris entre 0,1 et 10. Un rapport préférentiel est un rapport de 1. La quantité d'anticorps ou de fragment d'anticorps utilisés à titre de médicament selon l'invention ou présente dans la composition pharmaceutique selon l'invention peut être modulée de façon à obtenir un taux circulant de principe actif (dans un liquide physiologique tel que le sang) nécessaire à l'obtention de l'effet thérapeutique désiré pour un sujet particulier. La quantité choisie dépendra de multiples facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée d'administration, du moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du composé, du ou des différents produits utilisés en combinaison avec ledit médicament ou ladite composition pharmaceutique, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient, ainsi que de son histoire médicale, et de toutes autres informations connues en médecine. La prescription du médecin traitant pourra commencer à des doses inférieures à celles généralement utilisées pour des anticorps, puis ces doses seront progressivement augmentées afin de mieux maîtriser l'apparition d'éventuels effets secondaires. En général la dose journalière du composé sera la dose minimum pour obtenir l'effet thérapeutique. Cette dose dépendra des différents facteurs cités auparavant. Les doses seront en général comprises entre 0,1 et 100 mg par kg par jour pour l'Homme, et préférentiellement entre 4 et 25 mg par kg et par jour et encore plus avantageusement entre 7 et 14 mg par kg et par jour. Si nécessaire, la dose journalière peut être administrée en deux, trois, quatre, cinq, six ou plus prises par jour ou par sous-doses multiples administrées par intervalles appropriés pendant la journée. De manière avantageuse, la composition selon la présente invention est administrée de préférence par voie parentérale ou directement, si cela est possible, dans la tumeur (administration intratumorale). Le médicament ou la composition pharmaceutique selon la présente invention peut être utilisé seul ou en association avec au moins un autre composé thérapeutiquement actif, tel que par exemple un composé anticancéreux. L'utilisation dudit médicament ou de ladite composition pharmaceutique, et dudit composé thérapeutiquement actif peut être simultanée, séparée ou étalée dans le temps, notamment lors d'un traitement d'un sujet atteint d'un cancer. D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non 10 limitatifs, ainsi que des figures annexées : - Figure 1 : Mise en évidence de la spécificité des anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 (anticorps anti-ch2) par Western Blot. 750 ng de peptide/protéine adrénomédulline (AM) et hRAMP3, 500 ng de protéine hCLR (dénommé CRLR) et hRAMP2 et 20 ng de polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3- 15 RAMP2 (dénommé ch2) ont été séparés par SDS-PAGE sur gel d'acrylamide 17%, puis révélés avec les anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 (Figure 1A) ou avec le sérum non-réactif (NRS) (Figure 1B), utilisés au 1/250. La Figure 1C représente la même expérience mais réalisée avec 20 µg d'extraits protéiques préparés à partir de cellules tumorales gliales U87, séparés par SDS-PAGE sur gel 20 d'acrylamide 12%. - Figure 2 : Effet des anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 (anti-ch2) sur la croissance des cellules tumorales gliales U87 in vitro : 2000 cellules par puits ont été ensemencées dans des plaques 24 puits, puis traitées pendant 6 jours avec les anticorps anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3- 25 RAMP2 ou le sérum pré-immun (NRS) en milieu 2% sérum (2% de sérum foetal de boeuf dans 100 ml de milieu de culture). Un test de prolifération cellulaire MTT ([3,(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]) a ensuite été utilisé pour évaluer la quantité de cellules à la fin du traitement. - Figure 3 : Western Blot réalisé à partir d'extraits protéiques des cellules 30 tumorales gliales U87. 20 µg de protéines totales ont été séparés par SDS-PAGE sur gel de polyacrylamide 12% puis révélées avec les anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 utilisés au 1/250 ou au 1/10000 (Figure 3A), ou utilisés au 1/50000 (Figure 3B) et pré-incubés 30 min avec 0,7 µg/mL d'adrénomédulline (AM), hCLR (CLR), hRAMP2 (R2) ou hRAMP3 (R3) ou 1,4 µg/mL de complexes protéiques hCLR/hRAMP2 (CLR+R2), hCLR/hRAMP3 (CLR+R3) ou hRAMP2/hRAMP3 (R2+R3) ou 2,1 µ.g/mL de complexe protéique hCLR/hRAMP2/hRAMP3 (CLR+R2+R3) ou 0,7 µg/mL de polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 (ch2) (Figure 3B). La bande à 73 kDa correspond au complexe hCLR/hRAMP2 ou hCLR/hRAMP3, la bande à 50-52 kDa correspond aux homodimères hRAMP2 ou hRAMP3, la bande à 48 kDa correspond à hCLR et la bande à 31 kDa correspond à hRAMP2 glycosylée. - Figure 4 : Effet in vitro des anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 sur la croissance des cellules U87. Des cellules tumorales gliales U87 ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits (2000 cellules/puits) puis traitées pendant 6 jours avec les anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 (dénommé ch2) à une concentration de 30 ou 70 mg/ml ou avec le sérum non-réactif (sérum pré-immun, NRS) à une concentration de 30 ou 70 mg/ml ou en milieu 2% sérum (cont2%). Un test MTT a ensuite été utilisé pour évaluer la quantité de cellules à la fin du traitement. Les chiffres « en - Figure 5 : Effet in vitro des anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 sur la migration des cellules tumorales gliales U87. 20 000 cellules tumorales gliales U87 ont été ensemencées dans des chambres de Boyden en milieu 2% sérum après avoir été prétraitées (ch2) ou non (contAM) avec les anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 ou avec le sérum non-réactif (NRS), puis ont été soumises pendant 4h à l'effet chimioattractant de l'adrénomédulline (10-7 M) située dans le compartiment inférieur de la chambre de Boyden. Un contrôle négatif a été effectué en omettant l'adrénomédulline dans le compartiment inférieur de la chambre de Boyden (cont). L'évaluation du nombre de cellules ayant migré a été effectué par comptage au microscope après un marquage au Dapi. - Figure 6 : Graphique montrant l'inhibition de la croissance tumorale des xénogreffes U87 chez la souris après traitement avec des anticorps anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2. 2 millions de cellules U87 ont été injectées à des souris par voie sous cutanée. 24 jours après l'injection, les tumeurs atteignant 600 à 800 mm3, les souris ont alors été séparées en deux groupes : le groupe contrôle recevant le sérum pré-immun NRS et le second groupe traité par voie intrapéritonéale avec les anticorps anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2. Au bout de deux semaines de traitements à raison de 3 injections par semaine de 350 ug par injection d'anticorps, une diminution de 70% du volume tumoral a été observée. EXEMPLE I : MATERIEL ET METHODES I.1. Synthèse par voie chimique du polypeptide chimère de séquence SEQ ID NO : 10, dénommé polypeptide AM-CLR-RAMP3-RAMP2 (ou « ch2 ») La synthèse du polypeptide de séquence SEQ ID NO : 10 en phase solide a été réalisée selon la méthode de Merrifield (MERRIFIELD, Science, 1986, 232:341-347). La méthode est basée sur l'utilisation d'un support solide (résine) sur lequel est ancré le polypeptide en voie d'élongation, et d'une phase liquide contenant les réactifs et solvants. L'assemblage du polypeptide est réalisé directement sur la matrice insoluble contenue dans un vase réactionnel, par incrémentation de la chaîne l'extrémité C-terminale jusqu'à l'extrémité N-terminale, suivant une série de réactions chimiques correspondant au cycle d'incorporation d'un acide aminé. Les divers acides aminés constitutifs du peptide sont donc couplés séquentiellement dans la chaîne polypeptidique suivant ce cycle répétitif, en fonction de la structure primaire de la molécule désirée. A chaque étape du cycle de synthèse, de simples filtrations et lavages permettent l'élimination des réactifs à travers la paroi filtrante du vase à réaction. En fin d'assemblage, un clivage chimique permet le "relargage" du polypeptide brut dans la phase liquide (MABROUK et al., Biochim. Biophys.Acta, 2007, 528:2528-2540). Après purification, les peptides ont été caractérisés par spectrométrie de masse et par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) analytique (colonne phase inversée C8). I.2. Obtention d'anticorps anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 25 Immunisations Des anticorps polyclonaux ont été obtenus par injection, chez le lapin, du polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 (ch2 ; SEQ ID NO : 10). Les animaux ont été immunisés avec le polypeptide chimère AM-CLRRAMP3-RAMP2 complété avec l'adjuvant de Freund. Des rappels d'immunisation ont 30 ensuite été réalisés toutes les 3 semaines. Les sérums non immuns (NRS), servant de contrôle (pré-immun), ont été prélevés chez les mêmes animaux avant l'immunisation. Purification des immunoglobulines (IgG) et dosage de l'endotoxine Les anticorps polyclonaux ont été purifiés par passage sur gel de billes de sépharose couplées à la protéine A (GE Healthcare) et élués à l'aide de glycine 100 mM / pH 3. La présence d'endotoxine a été vérifiée à l'aide du test LAL (Limulus Amebocyte Lysate, Chambrex). Les résultats montrent un niveau tolérable de l'endotoxine ( Les milieux ont été renouvelés tous les deux jours. Lorsque les cellules ont atteint 90% de confluence, elles ont été détachées avec une solution de Trypsine (0,25%) en tampon Tris (Gibco) pendant quelques minutes à 37°C. L'action de l'enzyme a été arrêtée par addition de milieu contenant du sérum. Les cellules ont été ensemencées soit dans des tubes de 75 cm2 soit dans des plaques multipuits dans leurs milieux appropriés. I.4. Mise en évidence de la spécificité de liaison des anticorps anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 a) 750 ng d'adrénomédulline (AM), 750 ng de protéine hRAMP3, 500 ng de protéine hCLR, 500 ng de protéine hRAMP2 et 20 ng de polypeptide chimère AM- CLR-RAMP3-RAMP2 ont été séparés par SDS-PAGE sur gel d'acrylamide 17%, puis révélés avec les anticorps anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 ou avec le sérum non-réactif (NRS), utilisés au 1/250. b) 20 µg d'extraits protéiques préparés à partir de cellules tumorales gliales U87 ont été séparés par SDS-PAGE sur gel d'acrylamide 12%, puis révélés avec les anticorps anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 ou avec le sérum non-réactif (NRS), utilisés au 1/250. I.5.Etudes in vitro Etude in vitro de l'effet des anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 sur la croissance des cellules tumorales gliales U87 Les cellules tumorales gliales U87 ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits (2000 cellules/puits) dans du milieu DMEM en présence de 2% de sérum (2% de sérum foetal de boeuf dans 100 ml de milieu de culture) puis traitées pendant 6 jours avec les anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 ou avec le sérum non-réactif (NRS) en milieu 2% sérum. Un test MTT (OUAFIK et al., Am J Pathol., 2002, 160:1279-92 ; KAAFARANI et al., FASEB J., 2009, 23:3424-35) a ensuite été utilisé pour évaluer la quantité de cellules à la fin du traitement. Etude in vitro de l 'effet des anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 sur la migration des cellules tumorales gliales U87 20 000 cellules tumorales gliales U87 ont été ensemencées dans des chambres de Boyden en milieu 2% sérum après avoir été prétraitées ou non (contAM) avec les anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 ou avec le sérum non-réactif (NRS), puis ont été soumises pendant 4h à l'effet chimioattractant de l'adrénomédulline (10-7 M) située dans le compartiment inférieur de la chambre de Boyden. Un contrôle négatif a été effectué en omettant l'adrénomédulline dans le compartiment inférieur de la chambre de Boyden (cont-). L'évaluation du nombre de cellules ayant migré a été effectuée par comptage au microscope après un marquage au Dapi (4',6'-diamidino-2-pheylindol). I.6. Analyses par Western blot. Préparation des extraits protéiques Les culots cellulaires provenant de cellules tumorales gliales U87 ou les homogénats obtenus à partir de tumeurs gliales xénogreffées chez les souris nudes ont été repris dans un tampon de lyse (20 mM HEPES pH 7,9, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 10% glycérol, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 1% inhibiteurs des protéases et 0,35% de TritonX-100) et homogénéisés à 4°C. Après centrifugation à 12 000 x g pendant 10 minutes, le surnageant contenant les protéines a été récupéré et les protéines quantifiées par la méthode de Pierce. Western blot Les lysats cellulaires (50 µg) ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12% en conditions dénaturantes et réductrices. A l'issue de la migration dans un tampon Tris-base 0,25 M, Glycine 1,92 M, SDS 1%, les protéines ont été transférées sur membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) à 1 mA/cm2 pendant 1h30. Les membranes ont été saturées 1h à température ambiante dans du PBS-5% de lait écrémé. Après 2 lavages (PBS 0,2% - Tween 20), les membranes ont été incubées sous agitation pendant une nuit à 4°C en présence des anticorps anti-polypeptide chimère AMCLR-RAMP3-RAMP2 dilués à 1/400 dans du PBS-1% lait écrémé. Après 3 lavages (PBS 0,2% - Tween 20), les membranes ont été incubées pendant 1h30 à température ambiante avec l'anticorps secondaire marqué à la peroxydase (ECL kit, GE Healthcare, Amersham). Le signal a été révélé en utilisant le kit de chimioluminescence (ECL kit, GE Healthcare, Amersham). 20 µg d'extraits protéiques préparés à partir de cellules tumorales gliales U87 ont été séparés par SDS-PAGE sur gel de polyacrylamide 12% puis révélées avec les anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 utilisés au 1/250 ou au 1/10000, ou utilisés au 1/50000 et pré-incubés 30 min avec 0,7 µg/mL d'adrénomédulline (AM), hCLR, hRAMP2 ou hRAMP3 ou 1,4 µg/mL de complexes protéiques hCLRIhRAMP2, hCLRIhRAMP3 ou hRAMP2/hRAMP3 ou 2,1 µg/mL de complexe protéique hCLR/hRAMP2/hRAMP3 ou 0,7 µg/mL de polypeptide chimère AMCLR-RAMP3-RAMP2. I.7. Etudes in vivo Modèles animaux Des souris femelles Balb/C athymique (nu/nu) et des souris C57BL/6 (Harlan, France) âgées de 4-5 semaines ont été utilisées. Elles ont été maintenues dans des conditions stériles, à une température stable et ont reçu une alimentation adaptée. Les expériences in vivo ne commencent qu'après une période d'adaptation des animaux à leur nouvel environnement (10-15 jours après la réception). Développement des xénogreffes et traitements des animaux Des cellules de la lignée tumorales U87 ont été injectées par voie sous-cutané dans le flanc de souris athymiques (nu/nu) à raison de 2,5x106 cellules par animal. Les animaux ont été pesés régulièrement et le volume tumoral a été mesuré 3 fois par semaine et calculé selon la formule de l'ellipsoïde V= Longueur x largueur x épaisseur x 0,5236 mm3. Lorsque les tumeurs ont atteint un volume tumoral de 500-1000 mm3 (12-15 jours après injection des cellules), les animaux ont été traités par voie intra- tumorale ou intrapéritonéale avec les anticorps anti-polypeptide chimère AM-CLRRAMP3-RAMP2 (voir paragraphe I.2 ci-dessus) dont la concentration finale était de 350 µg/animal et ce à raison de 3 injections/semaine. Les groupes d'animaux servant de contrôle ont été traités de la même manière mais avec un sérum pré-immun (NRS). Des animaux ont été sacrifiés à des temps variables au cours du traitement (j2, j7, jll, j16, et j21). Les tumeurs ont été immédiatement prélevées et fixées dans le formol. Elles ont ensuite été incluses dans de la paraffine pour les études immunohistochimiques. Un groupe d'animaux traités pendant 21 jours, a reçu une injection de lectine biotinylée (Biotinylated-lycopersicon Esculentum (tomato) lectin, CliniSciences) sous anesthésie. Les animaux ont été perfusés avec une solution de paraformaldéhyde 4% qui permet la fixation des tissus in vivo. Les tumeurs et plusieurs organes (cerveau, poumon, coeur et rein) ont été prélevés et congelés dans l'azote liquide pour des études d'histologie et d' immunohistochimie. II : RESULTATS II.1. Mise en évidence de la spécificité des anticorps anti-polypeptide chimère AMCLR-RAMP3-RAMP2 Les résultats du Western-Blot sont représentés à la Figure 1. Ces résultats montrent que les anticorps polyclonaux anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3- RAMP2 (dénommé ch2) se lient à l'adrénomédulline (AM), hCRL (CLR), hRAMP2 (R2) et hRAMP3 (R3), ainsi qu'aux complexes hCLR/hRAMP2, hCLR/hRAMP3, hRAMP2/hRAMP3 et hCLR/hRAMP2/hRAMP3, alors que les sérums non-réactifs (NRS) ne se lient pas à ces protéines ou complexes protéiques (voir Figures lA et 1B). II.2. Efficacité anti-tumorale in vitro L'analyse par la technique Western-Blot montre que les anticorps antipolypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 sont capables de reconnaître les peptides AM, RAMP2 et CLR. D'une façon très avantageuse ils reconnaissent les complexes formés par l'interaction CLR/RAMP2 et CLRIRAMP3 qui présentent un poids moléculaire de 73 kDa. Ces anticorps sont capables de reconnaitre, à la fois, la protéine CLR de 48 kDa, les homodimères RAMP2 ou RAMP3 présentant une taille de 50-52 kDa, deux formes monomériques RAMP2 glycolsylées présentant respectivement une taille de 22 ou 31 kDa et une forme monomérique RAMP3 glycosylée présentant une taille de 27 kDa (voir Figures 1C et 3). L'incubation des cellules tumorales gliales U87 avec les anticorps antipolypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 démontre une inhibition de la prolifération de ces cellules d'une façon dose-dépendante (voir Figures 2 et 4). Ces expériences d'inhibition mettent aussi en évidence la présence d'une boucle autocrine et/ou paracrine faisant intervenir l'adrénomédulline et ses récepteurs CLR, RAMP2 et RAMP3 dans la prolifération des cellules tumorales. De plus ces anticorps anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 présentent une capacité à inhiber la migration des cellules U87 induite par l'AM d'une façon dose-dépendante (voir Figure 5). Cependant, aucun effet d'inhibition n'a été observé sur les cellules pré-incubées avec le NRS (voir Figure 5). II.3. Efficacité anti-tumorale in vivo Les tumeurs développées chez les souris athymiques après injection par voie sous-cutané de cellules de la lignée cellulaire U87 représentent un modèle expérimental qui prend en compte toutes les composantes du micro-environnement 15 tumoral. Administration des anticorps par voie intra-péritonéale L'administration par voie intra-péritonéale des anticorps anti-polypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 induit une inhibition de la croissance tumorale des xénogreffes de 50% à 70% après 20 jours de traitement (voir Figure 6). Après 16 jours de 20 traitement, il a été observé que les tumeurs d'animaux traités avec les anticorps antipolypeptide chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 apparaissaient pâles, translucides et moins vascularisées. A l'opposé, les animaux contrôles présentaient des tumeurs larges très vascularisées. Ces effets importants observés in vivo laissent penser que, outre une action sur la prolifération des cellules tumorales, le traitement avec les anticorps anti-polypeptide 25 chimère AM-CLR-RAMP3-RAMP2 perturbe un mécanisme fondamental indispensable à la croissance tumorale. REVENDICATIONS1 °) Mélange d'au moins 4 anticorps et/ou fragments desdits anticorps, caractérisé en ce que lesdits anticorps et fragments se lient respectivement à l'adrénomédulline et aux protéines CLR, RAMP2 et RAMP3. 2°) Mélange selon la revendication 1, pour son utilisation comme médicament. 3°) Mélange selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit médicament est destiné au traitement préventif ou curatif d'une maladie dans laquelle 1'angiogenèse doit être inhibée. 4°) Mélange selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé, en ce que l'adrénomédulline et les protéines CLR, RAMP2 et RAMP3 sont d'origine humaine. 5°) Mélange selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdits anticorps et fragments se liant aux protéines CLR, RAMP2 et RAMP3 se lient à un domaine extracellulaire de ces protéines. 6°) Mélange selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdits anticorps sont des anticorps polyclonaux. 7°) Mélange selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que lesdits anticorps sont susceptibles d'être obtenus par immunisation d'un animal avec un polypeptide chimère comprenant ou constitué de quatre peptides d'au moins 6 acides aminés contigus dérivés respectivement de l'adrénomédulline et des protéines CLR, RAMP2 et RAMP3, ledit polypeptide chimère étant capable d'induire, chez ledit animal immunisé avec ledit polypeptide chimère, la production d'anticorps polyclonaux se liant à l'adrénomédulline, CLR, RAMP2 et RAMP3. 8°) Mélange selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit polypeptide chimère présente la séquence SEQ ID NO : 10. 9°) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un mélange d'anticorps et/ou fragments desdits anticorps tel que défini aux revendications 1 à 8, et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 10°) Polypeptide chimère comprenant ou constitué de quatre peptides d'au moins 6 acides aminés contigus dérivés respectivement de l'adrénomédulline et des protéines CLR, RAMP2 et RAMP3, ledit polypeptide chimère étant capable d'induire, chez ledit animal immunisé avec ledit polypeptide chimère, la production d'anticorpspolyclonaux se liant à l'adrénomédulline, CLR, RAMP2 et RAMP3. 11 °) Polypeptide chimère selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO : 10. 12°) Procédé d'obtention d'anticorps polyclonaux se liant à l'adrénomédulline ou aux protéines CLR, RAMP2 ou RAMP3, comprenant une étape d'immunisation d'un animal avec un polypeptide chimère tel que défini aux revendications 10 ou 11. 13°) Procédé d'obtention d'anticorps se liant à l'adrénomédulline, comprenant une étape d'immunisation d'un animal avec le polypeptide de séquence SEQ 10 ID NO : 2. 14°) Polypeptide présentant la séquence SEQ ID NO : 2.