FR 2961825 A1 20111230 FR 1055209 A 20100629 1 Nouveau procédé de régénération enzymatique continue de NADH et de détection de NAD+ et système pour sa mise en oeuvre Une large gamme d'enzymes nécessite l'emploi de cofacteurs pour la synthèse de biomolécules à haute valeur ajoutée. Les enzymes de la famille des déshydrogénases sont notamment employées pour produire des molécules optiquement pures et actives, lesdites molécules constituant des blocs de synthèse utilisés en chimie fine de spécialité et en agro-alimentaire. Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NAD) et le Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate (NADP) (respectivement nommés NAD+/NADP+ pour les formes oxydées et NADH/NADPH pour les formes réduites) sont des cofacteurs utilisés dans de nombreuses réactions d'oxydo-réductions catalysées par des enzymes. Ainsi, une large gamme d'enzymes nécessite le couple NAD+/NADH. Néanmoins, le coût élevé du cofacteur NADH limite son emploi en quantité stoechiométrique et nécessite sa régénération in situ en continu au cours de la synthèse. La régénération du cofacteur NADH à partir de NAD+ a fait l'objet de nombreuses publications. En général, le cofacteur peut être recyclé en couplant la réaction enzymatique de transformation du substrat en le produit désiré avec une deuxième réaction chimique, enzymatique ou électrochimique. Une réaction couramment utilisée pour ce recyclage est la réaction avec le formate (HCO2) catalysée par une enzyme de la famille des formates déshydrogénases (FDH), (éq.1). Les enzymes formates déshydrogénases (FDH) utilisent le formate (HCO2) pour effectuer cette régénération de NADH selon la réaction : NAD+ + HCOO- FDH > NADH + CO2 éq.1 Tandis que la réaction de consommation de NADH s'écrit schématiquement: Substrat(S) + NADH enzyme > Produit(P) + NAD+ éq.2 Cependant, la grande sensibilité des FDH aux conditions physico-chimiques telles que pH, température, concentration des espèces, etc., et à la nature des solvants organiques restreint souvent son emploi à des procédés en solution aqueuse où l'enzyme est d'une part, relativement concentrée et, d'autre part, rapidement désactivée. Le coût élevé des FDH incite donc à rechercher de nouvelles voies de mise en oeuvre de l'enzyme pour la régénération de NADH. Par ailleurs, WO 2007/056666 décrit la modification du chitosan par le greffage de chaînes alkyle pour créer une matrice d'immobilisation d'enzymes en vue de réaliser des biopiles à combustible. Néanmoins, le système décrit a pour fonction de générer de l'énergie électrique en oxydant un substrat organique tel que le glucose ou l'éthanol, et ne 2 décrit ni ne suggère un système de synthèse enzymatique basé sur la régénération continue et pérenne du NADH. De plus, l'enzyme est dispersée de manière homogène dans l'ensemble de la matrice. Il est donc économiquement intéressant de concevoir un nouveau procédé permettant des synthèses enzymatiques au moyen de NADH (éq.2), d'une part, et sa régénération continue in situ (éq.1), d'autre part. Selon un premier objet, la présente invention concerne un procédé de régénération continue de NADH à partir de NAD+ au moyen d'une enzyme formate déshydrogénase FDH et de formate (HCO2) (éq.1), caractérisé en ce que FDH est immobilisée entre deux couches d'un polymère greffé. Le procédé de régénération continue de NADH à partir de NAD+ au moyen d'une enzyme formate déshydrogénase FDH et de formate (HCO2) est représenté par l'équation 1 ci-dessus. On entend ici par « régénération » la réaction permettant de former NADH à partir de NAD+ (éq.1). Ledit polymère greffé est de préférence poreux et est avantageusement choisi parmi les polysaccharides modifiés hydrophobes, lesdits polysaccharides étant choisis parmi le chitosan, la cellulose, la chitine, l'amidon, l'amylose, l'alginate et leurs combinaisons, plus préférentiellement le chitosan. Le chitosan est généralement préparé par déacétylation de la chitine. Le chitosan commercial a un taux de déacétylation d'environ 85% et peut être avantageusement déacétylé de façon supplémentaire, typiquement jusqu'à 100%, par exemple en présence de soude, pour améliorer le greffage. Le greffage est avantageusement réalisé par un ou plusieurs groupes alkyle de 1 à 24 atomes de carbone, comprenant éventuellement des fonction alkyles, aryles, carbonyles ou fluorées ; de préférence des alkyles en C1-C4, et plus particulièrement méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tert-butyle ; de préférence butyle. Par ce greffage, le polymère de structure poreuse est activé chimiquement afin de générer une distribution de taille de pores permettant la diffusion des réactifs et produits impliqués, tout en assurant la rétention de l'enzyme FDH. L'immobilisation de FDH au sein dudit polymère est de préférence réalisée par inclusion de l'enzyme entre deux couches dudit polymère. Cette inclusion peut être réalisée au moyen d'un motif empilable ou intercalable dans un support poreux composé d'une couche d'enzyme entre deux couches dudit polymère. Ce mode de réalisation permet d'utiliser de façon optimale la majorité de l'enzyme mise en oeuvre. De plus, FDH ainsi immobilisée entre 2 couches de polymère s'en trouve stabilisée pendant au moins 3 semaines et conserve son activité enzymatique. En effet, ces enzymes sont bien connues pour leur grande sensibilité thermique et chimique, notamment vis-à-vis des molécules organiques que constituent les substrats à transformer, les produits résultant, voire l'oxygène de l'air. Le procédé selon l'invention est particulièrement avantageux en ce qu'il permet une mise en production continue de FDH pendant des durées bien supérieures à celles des techniques habituellement utilisées : ainsi par exemple, WO2004/085662 décrit une mise en production continue de FDH de deux jours avant désactivation. L'immobilisation au sein du polymère permet l'utilisation de FDH en continu pendant une longue durée avec un faible taux de désactivation. Ainsi, typiquement, une enzyme FDH peut être utilisée jusqu'à 3 semaines et jusqu'à 2 semaines avec des taux de désactivation inférieurs à 50%. Cette faible désactivation au cours du temps permet d'effectuer un nombre de cycles catalytiques élevé, ce qui confère au procédé selon l'invention un intérêt économique remarquable. L'immobilisation au sein de deux couches de polymère se distingue donc d'une immobilisation par répartition uniforme de l'enzyme au sein du polymère greffé. Ainsi, cette répartition présente notamment l'avantage d'assurer une meilleure rétention de l'enzyme et de conduire à des matrices de polymère plus résistantes aux contraintes mécaniques et à l'érosion hydrodynamique. Le taux de régénération de NADH (éq.1) peut être augmenté, soit en réinjectant en entrée les fluides obtenus en sortie (c'est-à-dire, par recyclage continu) soit en assemblant plusieurs réacteurs en série, soit en augmentant le temps de séjour des solutions dans le réacteur. De plus, l'ajout du 2nd système enzymatique in situ permet de consommer au fur et à mesure le NADH formé ce qui favorise sa régénération. Le taux de recyclage selon l'invention est inférieur ou égal à 10, avantageusement inférieur ou égal à 5. Les deux couches de polymère greffé ont généralement chacune une épaisseur comprise entre 100 et 500 pm. Le motif élémentaire comporte donc trois couches : Polymère greffé/FDH/polymère greffé. Il est en outre possible de mettre en oeuvre plusieurs motifs élémentaires empilés par dépôts successifs sur un support solide et éventuellement montés dans un réacteur filtre presse. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de régénération continue (éq.1) est réalisé in situ, c'est-à-dire simultanément à la réaction de consommation de NADH (éq.2) et de formation consécutive d'un produit chiral à partir de son substrat. Selon un autre objet, la présente invention concerne un procédé de synthèse enzymatique comprenant : - la transformation d'un substrat en un produit chiral désiré, par catalyse enzymatique et consommation de NADH (éq.2); et - la régénération continue in situ de NADH à partir de NAD+ (éq.1) selon l'invention. La transformation d'un substrat en un produit chiral désiré, par catalyse enzymatique et consommation de NADH sont représentées par l'équation 2 ci-dessus. La régénération (réduction du NAD+ ainsi formé) continue in situ de NADH à partir de NAD+ est représentée par l'équation 1 ci-dessus. La catalyse enzymatique de la transformation du substrat (éq.2) est réalisée par une enzyme appropriée à la synthèse désirée ; ladite enzyme est présente en solution. Les réactions employant le cofacteur NADH peuvent ainsi être réalisées dans un réacteur continu, tout en le régénérant in situ, sans ajout d'enzyme FDH en solution. La réaction de transformation dudit substrat en ledit produit désiré (éq.2) est préférentiellement une réaction de déshydrogénation stéréosélective. On peut ainsi citer à titre illustratif la réaction de déshydrogénation du pyruvate en L-lactate. La présente invention concerne également un système de régénération continue enzymatique de NAD+ en NADH comprenant : - un polymère greffé au sein duquel est immobilisée une enzyme FDH ; - une solution d'ions formates - une solution de NAD+. Généralement, la concentration de la solution en ions formates est comprise entre 0.01 et 1 mol.L-1, typiquement 0.1 mol.L-' . Généralement, la concentration de la solution en NAD+ est comprise entre 0.1 mmol.L-' et 10 mmol.L-1. Généralement, la concentration surfacique du chitosan est comprise entre 10 et 20 g.m-2 et par couche et celle de l'enzyme FDH est comprise entre 100 et 1000 U.m-2. Généralement, le système est thermostaté entre 25 et 45°C, typiquement environ 38°C. L'immobilisation de FDH au sein dudit polymère est de préférence réalisée par inclusion de l'enzyme entre deux couches dudit polymère. Ce système de régénération continue de NADH à partir de NAD+ (éq.1) peut également être appliqué à la conception de dispositifs de détection : une couche polymérique incluant l'enzyme, déposée sur une surface électriquement conductrice pour une détection électrochimique, ou sur une surface transparente pour une détection spectrophotométrique, est facilement réalisable et offre l'activité enzymatique adéquate. En effet, la grande sélectivité des enzymes peut être mise à profit afin de détecter soit des substrats spécifiques soit le cofacteur lui même. A titre illustratif et non limitatif, les substrats suivants pourraient être détectés : a-ketoglutarate, cyclohexanone, acétophénone, benzoylformate, pyruvate. Dans le cas des enzymes NAD-dépendantes, le couple NAD+/NADH est communément employé afin de détecter la présence de réaction enzymatique et donc, de substrats. En effet, NADH absorbe fortement en UV-vis à 340 nm contrairement à sa forme oxydée, NAD+ qui n'absorbe pas, ce qui permet une quantification aisée des conversions enzymatiques. Ainsi, des bandelettes consommables sur lesquelles seraient immobilisé une enzyme FDH selon l'invention, pourraient être employées pour mettre en évidence soit la présence de NAD+ (avec ajout de formate), soit la présence de formate (avec ajout de NAD+). La détection, et/ou la quantification elle(s)-même(s) se faisant soit par la mesure de l'absorbance à 340 nm, soit par électrochimie, avec ou sans médiateur rédox. La présente invention permet donc la détection de NAD+ et/ou de l'ion formate HCO2 au moyen d'une enzyme de la famille des formates déshydrogénases FDH tel que FDH est immobilisée au sein d'un polymère greffé sur un support couplé à un dosage par spectroscopie UV-vis à 340 nm ou par électrochimie, avec ou sans médiateur rédox. Le support est de préférence, jetable. Selon un autre objet, la présente invention concerne donc également un Procédé de détection de NAD+ et/ou de l'ion formate HCO2 au moyen d'une enzyme de la famille des formates déshydrogénases FDH comprenant : - la régénération de NADH à partir de NAD+ au moyen d'une enzyme de la famille des formates déshydrogénases FDH et de formate (HCO2 ), selon le procédé selon l'invention; et - un dosage par spectroscopie UV-vis ou par électrochimie du NADH ainsi formé. 5 Selon un autre objet, la présente invention concerne également le réacteur comprenant le système de régénération selon l'invention. Le réacteur employé présente un grand rapport surface d'interface fonctionnalisée/volume du compartiment. Ce rapport est compris entre 10 et 500 cm-1, 10 généralement environ 100 cm-1. Pour mémoire, les réacteurs hétérogènes classiques présentent un rapport surface/volume du compartiment compris entre 0,1 et 10 cm-1. Cette propriété permet aux réacteurs selon l'invention d'assurer un contact optimum entre les solutions de NAD+ et de formate, et l'enzyme FDH immobilisée à la surface des deux plaques et ainsi, de mener la réaction avec une vitesse satisfaisante. Le réacteur peut 15 généralement être dimensionné pour atteindre une conversion de substrat optimale. De tels dimensionnements sont à la portée de l'homme du métier. Un tel réacteur, parfois appelé microréacteur, convenant à l'invention est notamment décrit dans WO 2006/053962. Généralement, le microréacteur selon l'invention peut être constitué de deux 20 plaques métalliques aptes à jouer le rôle d'interface réactive, montées en vis-à-vis dans une structure filtre-presse. Le polymère greffé est déposé sur chaque plaque et l'enzyme est confinée entre les deux couches de polymère greffé. Sur chaque plaque, deux canaux distributeur (de substrat et de NADH) et collecteur (de produit désiré et de NAD+) permettent d'alimenter des microcanaux et d'évacuer le mélange réactionnel. 25 Le contrôle du débit et donc du temps de séjour des solutions à traiter permet, grâce à un bilan de matière tenant compte de la cinétique enzymatique, l'optimisation du taux de conversion du réactif considéré (éq.2). Cette optimisation peut être éventuellement complétée par une mise en série aisée de plusieurs réacteurs selon l'invention. 30 Le faible volume réactionnel permet un bon contrôle thermique, évitant ainsi les points chauds, et limite les problèmes de diffusion. Les supports d'immobilisation pouvant être des plaques généralement conductrices, ce procédé est également applicable dans le cas d'utilisation de cofacteurs ou de médiateurs électro-générés, autres que le système formate/CO2, tels que les flavines, complexes de rhodium, méthyle-viologène. 35 Le réacteur selon l'invention permet de s'affranchir des problèmes liés au scale- up. Une fois les paramètres de la réaction souhaitée optimisés (température, concentration, débit) à l'échelle du laboratoire, le passage à l'échelle industrielle est très aisé puisqu'il suffit de multiplier le nombre de réacteurs selon l'invention (empilement ou disposition parallèle), jusqu'à la production désirée. Le réacteur selon l'invention est tel que les dites plaques qui le constituent peuvent être aptes à jouer le rôle d'interfaces polarisables et réactives pour la synthèse d'espèces électro générées. Figure : La figure 1 présente la concentration de NADH, généré à partir de NAD+ (éq.1), en sortie du réacteur. Le réacteur comprend deux plaques supports sur lesquelles est déposé un polymère greffé au sein duquel est immobilisée FDH, selon l'invention. Les conditions opératoires sont les suivantes : la solution en entrée du réacteur est une solution de tampon phosphate contenant NAD+ à 0.05 mmol/L-' et l'ion formate à 0.1 mol.L-1. Le réacteur est thermostaté à 38°C et le débit est fixé à 0.063 ml.min-l. La solution en sortie est analysée par spectroscopie UV-vis à 340 nm et l'expérience est poursuive sans interruption pendant 21 jours. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention. Exemple 1 : Synthèse de la matrice de polymère (chitosan) : 1) Désacétylation du chitosan : Le chitosan commercial est désacétylé à environ 85%. Les groupements acétyle restant doivent être remplacés par un proton pour augmenter l'efficacité de la greffe de chaîne alkyle. - Préparer 100 ml de solution de NaOH à 45% massique. - Dans un flacon autoclavable de 250 ml, ajouter la solution de NaOH et 6.7 g de chitosan. - Agiter fortement pendant 10 min. - Passer le flacon à l'autoclave à 121 °C pendant 20 min. - Filtrer la suspension sur Buchner et rincer à l'eau ultra pure jusqu'à pH 7. - Sécher 24 heures au dessiccateur à vide.25 2) Greffage de chaîne alkyle, modification hydrophobe du chitosan : - Dans un erlenmeyer de 250 ml, ajouter 0.5 g de chitosan désacétylé, 15 ml de méthanol et 15 ml de solution d'acide acétique à 1% volumique. - Agiter fortement pendant 10 min. - Ajouter 15 ml d'aldéhyde (de taille variable, selon la taille de pore souhaitée). - Ajouter 0,7 g de cyanoborohydrure de sodium. - Agiter fortement pendant 10 min. - Filtrer la suspension sur Buchner et rincer avec 5 fois 25 ml de méthanol. - Sécher 24h au dessiccateur à vide. 10 Exemple 2 : Immobilisation de l'enzyme - Préparer une suspension de chitosan modifié à 1% massique dans le chloroforme. - Agiter très fortement la suspension à l'aide d'un ultraturax (7000 rpm) pendant 30 15 secondes. - Immédiatement après, déposer 0,12 ml.cm-2 de suspension sur le support d'immobilisation et laisser sécher. - Déposer 0,06 ml.cm-2 de solution d'enzyme formate déshydrogénase à 660 U.L-' sur la première couche de chitosan. Laisser sécher. 20 - Déposer une autre couche de chitosan comme précédemment. Laisser sécher. Exemple 3 : Synthèse enzymatique de L-lactate à partir de pyruvate au moyen de l'enzyme L-lactate déshydrogénase et régénération continue in situ de NADH La conversion du pyruvate en L-lactate a été effectuée dans les conditions 25 suivantes : Solution initiale : tampon phosphate pH=7, [NAD+]=0,5 mM, [HCO2 ]=0,1 M, [LDH]= 5 U.ml-1, T=38°C, débit de 0,063 ml.min-l. 3 passages dans le microréacteur. Les taux de conversion sont résumés dans le tableau suivant : 30 Conversion du pyruvate (%) 1 er 2nd Sème [pyruvate] initiale mM passage passage passage 1 16 26 33 0.5 27 44 59 REVENDICATIONS1. Procédé de régénération en continu de NADH à partir de NAD+ au moyen d'une enzyme de la famille des formates déshydrogénases FDH et de formate (HCO2 ), caractérisé en ce que FDH est immobilisée entre deux couches d'un polymère greffé. 2. Procédé selon la revendication 1 tel que ledit polymère greffé est choisi parmi les polysaccharides modifiés hydrophobes. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 tel que ledit polymère greffé est le chitosan greffé par un ou plusieurs groupes alkyle de 1 à 24 atomes de carbone comprenant éventuellement des fonction alkyles, aryles, carbonyles ou fluorées . 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes tel que l'immobilisation d'une FDH au sein dudit polymère est réalisée par inclusion de l'enzyme entre deux couches dudit polymère. 5. Procédé de synthèse enzymatique comprenant : - la transformation d'un substrat en un produit chiral désiré, par catalyse 20 enzymatique et consommation de NADH; et - la régénération in situ de NADH à partir de NAD+ selon l'une quelconque des revendications précédentes. 6. Procédé selon la revendication 5 tel que ladite réaction de transformation dudit 25 substrat en ledit produit désiré est une réaction de déshydrogénation stéréosélective. 7. Système de régénération continue de NADH à partir de NAD+ comprenant : - un polymère greffé au sein duquel est immobilisée une enzyme FDH ; - une solution d'ions formates; et 30 - une solution de NAD+. 8. Système selon la revendication 7, tel que HCO2 a une concentration comprise entre 0.01 et 1 mol.L-1, NAD+ a une concentration comprise entre 0.1 mmol.L-' et 10 mmol.L-1. 35 9. Réacteur comprenant le système de régénération selon l'une quelconque des revendications 7 à 8. 10. Réacteur selon la revendication 9 comprenant deux plaques tel que le système 5 de régénération est confiné entre les dites plaques montées en vis-à-vis dans une structure filtre presse. 11. Réacteur selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10 tel que le rapport surface de l'enzyme/volume du compartiment du réacteur est compris entre 1 et 500 cm-1. 12. Réacteur selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 tel que les dites plaques sont aptes à jouer le rôle d'interfaces polarisables et réactives pour la synthèse d'espèces électro générées. 13. Procédé de détection de NAD+ et/ou de l'ion formate HCO2 au moyen d'une 15 enzyme de la famille des formates déshydrogénases FDH comprenant : - la régénération de NADH à partir de NAD+ au moyen d'une enzyme de la famille des formates déshydrogénases FDH et de formate (HCO2), selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ; et - un dosage par spectroscopie UV-vis ou par électrochimie du NADH ainsi formé. 10 20