FR 2955664 A1 20110729 FR 1000245 A 20100122 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 ETAT DE L'ART Domaine technique de l'invention La présente invention concerne une méthode pour la détection d'un signal optique non linéaire résonant et un dispositif pour la mise en oeuvre de ladite méthode. Elle s'applique notamment à la détection de signaux diffusés CARS. Etat de l'art Toutes les liaisons chimiques possèdent des fréquences de vibration qui leur sont propres. On appelle techniques optiques vibrationnelles des méthodes qui visent à utiliser l'interaction lumière/matière pour obtenir des informations sur ces vibrations moléculaires. La plus connue de ces techniques est la spectroscopie infrarouge (IR) qui observe les raies d'absorption spécifiques des liaisons chimiques présentes dans un échantillon. Découverte en 1928, la diffusion Raman (du nom du physicien Chandrasekhara Venkata Raman qui découvrit l'effet) permet d'utiliser la lumière visible pour accéder au spectre vibrationnel des molécules qui interagissent avec un faisceau lumineux. Dans un processus de diffusion Raman, une onde pompe de pulsation cop incidente sur une molécule est diffusée inélastiquement en une onde dite Stokes de pulsation cos (Figure 1A) et une onde dite anti-Stokes de pulsation wAS (Figure 1B). L'écart en fréquence entre les ondes générées et l'onde pompe dépend de la transition Raman moléculaire (de pulsation SÛR) de telle sorte que wp- o co as -co =1),R Dans une vision photonique du processus, les ondes Stokes et anti-Stokes correspondent à une absorption à partir respectivement du niveau vibrationnel fondamental ou excité. Le processus générant l'onde anti-Stokes, partant du niveau vibrationnel excité (B), est beaucoup moins probable que le processus créant l'onde Stokes, qui est la seule observée dans la pratique en spectroscopie Raman spontanée. Une étude fine de la répartition spectrale des ondes Stokes renseigne sur les densités de liaisons chimiques présentes dans l'échantillon. Ce processus spontané de diffusion inélastique est très peu efficace comparé à la -30 2 fluorescence (les sections efficaces Raman sont de l'ordre de 10 cm /molécule, à comparer -16 2 avec la section efficace d'absorption à 1 photon d'un fluorophore qui atteint 10 cm /molécule). La spectroscopie Raman stimulée CARS (pour Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) est un processus de mélange à quatre ondes qui permet d'adresser les liaisons vibrationnelles 1 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 présentes dans un échantillon. Ce processus est par exemple décrit dans R.W. Boyd, Nonlinear Optics (Academic Press, Boston, 1992). Il s'agit d'envoyer deux impulsions lasers de pulsations w et w (ou fréquences v et v) dont la différence de pulsations est rendue égale à la pulsation 12 p s p s du niveau vibrationnel que l'on veut adresser. Dans cette configuration de résonance wp-w= £1, le niveau vibrationnel de pulsation 12 est peuplé de manière stimulée et va pouvoir diffuser inélastiquement le faisceau de pulsation w dans un faisceau de pulsation co = 2 co -w (Figure p as p s 2A). La présence de cette nouvelle radiation was est la signature de la présence de la liaison vibrant à la pulsation 12 dans l'échantillon. Une première mise en oeuvre de CARS consiste à envoyer sur l'échantillon deux impulsions picoseconde fines spectralement dont la différence de pulsations n'adressera qu'une liaison vibrationnelle spécifique. Pour une identification optimale, on recherche l'ensemble des liaisons vibrationnelles présentes dans l'échantillon. Pour cela, on opère en mode dit « Multiplex CARS » (voir par exemple M.Muller et J.Schins, « Imaging the thermodynamic state of lipidic membranes with multiplex CARS spectroscopy », Physical Chemistry B 106, 3715-3723 (2002)) où l'on envoie sur l'échantillon une impulsion wp fine spectralement et une impulsion cos large spectralement (Figure 2B). On peut ainsi adresser l'ensemble des niveaux vibrationnels S2~ présents dans l'échantillon et obtenir un spectre du signal was généré. Du point de vue technique, le spectre étroit est par exemple issu d'un laser picoseconde et le spectre large, par exemple d'un laser femtoseconde, ou d'une fibre à cristal photonique générant un supercontinuum (SC). Sur la figure 3A, nous décrivons le processus de diffusion CARS résonant, exploité pour avoir accès à la signature des espèces moléculaires que l'on cherche à identifier. Il existe cependant une contribution CARS non résonante, représentée sur la figure 3B, qui provient d'une contribution électronique de l'échantillon. Cette contribution non résonante peut être importante lorsqu'on fait de la spectroscopie CARS sur un échantillon comportant une grande diversité de liaisons chimiques. Dans l'article « Focused field symmetries for background-free coherent anti-Stokes Raman spectroscopy », Physical Review A 77 (2008), au nom de D. Gachet et al., une méthode originale est présentée, permettant de s'affranchir de la contribution non résonante. Les figures 4 à 6 illustrent la méthode. La méthode consiste à effectuer une image différentielle CARS entre un objet et son symétrique par rapport à une interface transverse 43 entre un milieu résonant (référence 41 sur les figures 4A et 4B) et un milieu non résonant (référencé 42 sur les figures 4A, 4B). La susceptibilité non linéaire du 3ème ordre est définie dans le milieu résonant 41 par un 2 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 (3) (3) terme résonant x 1R et un terme non résonant x 1NR Dans le milieu non résonant 42, elle est (3) définie par le terme non résonant x 2NR. Sur les figures 4A et 4B, est représenté un volume actif CARS 45 (lieu de focalisation des faisceaux pompe et Stokes de pulsations cop et oh respectivement), localisé sur l'interface transverse 43 entre le milieu résonant et le milieu non résonant. Deux situations sont envisagées: le cas a où les faisceaux pompe et Stokes sont incidents du côté du milieu non résonant et le cas 13 où les faisceaux pompe et Stokes sont incidents du côté du milieu résonant. Il est démontré dans cet article que la différence des signaux CARS obtenus dans les cas a et R ne contient que la contribution résonante du milieu résonant. La figure 5 illustre les résultats d'un calcul numérique prenant en compte la nature vectorielle des faisceaux pompe et Stokes focalisés sur une interface transverse comme illustré sur les figures 4A et 4B. L'analyse consiste à étudier la différence AIFWd des signaux CARS émis dans les problèmes a (Ia(Fwd)) et R (Ip(Fwd)) en fonction du paramètre de décalage normalisé à la résonance Raman Ç=(cop-cos-OR)/F (où F est la largeur spectrale de la raie vibrationnelle étudiée). Il est démontré que la différence DIFWd suit exactement la partie imaginaire de x(3)1R qui est connue pour être le spectre Raman du milieu 1. Une mise en oeuvre expérimentale de la méthode est illustrée sur la figure 6B et des résultats expérimentaux sont présentés sur la figure 6A. La figure 6B représente un échantillon constitué d'une couche 61 de DMF (N,N-diméthylformamide) entre deux lames de verre 62, 63. La situation a correspond au cas où les faisceaux pompe et Stokes sont focalisés sur l'interface verre-DMF (interface entre 62 et 61), tandis que la situation (3 correspond au cas où les faisceaux d'excitation sont focalisés sur l'interface DMF-verre (interface entre 61 et 63). Sur la figure 6A, sont illustrés en fonction du décalage Raman respectivement par la courbe Cl, l'intensité CARS du DMF seul (lorsque les faisceaux d'excitation sont focalisés dans le milieu résonant, par la courbe C2, l'intensité Ia(Fwd), par la courbe C3, l'intensité Ip(Fwd), par la courbe C4, la différence DIFWd et par la courbe C5 le spectre Raman. Il apparaît, comme cela avait été démontré théoriquement, que la méthode permet de s'affranchir de la composante non résonante qui entache le signal diffusé CARS représenté par la courbe Cl . Cette méthode présente cependant un certain nombre d'inconvénients. Elle est notamment limitée à des échantillons symétriques, tels que celui représenté sur la figure 6B, ou réversibles, afin d'avoir accès aux interfaces résonant/non résonant d'une part et non résonant/résonant d'autre part. Cela présente une limitation dans le cas d'échantillons biologiques qui présentent 3 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 rarement ces propriétés. Par ailleurs, si elle permet les applications en spectroscopie, cette méthode est limitée pour des applications en microscopie. La présente invention propose un dispositif original de détection d'un signal optique non linéaire résonant, basé sur le principe de la détection aux interfaces transverses tel que décrit dans l'art antérieur, mais qui puisse s'appliquer à tout échantillon présentant une interface entre un milieu résonant et un milieu non résonant, à la fois pour des applications de spectroscopie et de microscopie. RESUME DE L'INVENTION Selon un premier aspect, l'invention concerne un dispositif pour détecter un signal optique non linéaire résonant induit dans un échantillon, l'échantillon comprenant un milieu résonant et un milieu non résonant formant une interface, le dispositif comprenant : une source d'émission d'au moins un premier faisceau lumineux d'excitation du milieu résonant, dit faisceau pompe, à une première pulsation cop donnée, ledit faisceau pompe étant incident sur l'échantillon selon un axe optique, et interceptant l'échantillon à une position donnée d'une interface transverse entre le milieu résonant et non résonant, un premier module optique de détection du signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux avec l'échantillon, des moyens de réflexion du ou desdits faisceaux d'excitation, le ou les faisceaux d'excitation ainsi réfléchis interceptant ladite interface transverse sensiblement à la même position que le ou les faisceaux d'excitation incidents, un deuxième module optique de détection du signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon, un module de traitement des signaux optiques détectés par lesdits premier et second modules de détection, comprenant le calcul d'une différence des signaux détectés, la différence étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. Selon une variante, la source d'émission permet l'émission d'un faisceau pompe de pulsation cop et d'un faisceau Stokes de pulsation cos, le signal optique non linéaire résultant de l'interaction desdits faisceaux pompe et stokes est un signal dit signal diffusé CARS, de pulsation coas = 2cop - cos et la différence des signaux détectés par le premier et le second module de détection est caractéristique d'une résonance Raman du milieu résonant. Selon une autre variante, le dispositif selon l'invention comprend un objectif de focalisation des faisceaux d'excitation incidents en un volume de focalisation commun, 4 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 permettant d'intercepter ladite interface entre le milieu résonant et le milieu non résonant et un objectif de collection du signal non linéaire résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation incidents avec l'échantillon, ledit objectif de collection étant identique à l'objectif de focalisation des faisceaux incidents et l'objectif de collection formant un objectif de focalisation des faisceaux d'excitation réfléchis et lobjectif de focalisation des faisceaux incidents formant un objectif de collection du signal non linéaire résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon. Selon une autre variante, chacun des modules de détection optique comprend un dispositif d'enregistrement d'images, le signal optique non linéaire étant collecté dans chacun des modules de détection optique respectivement dans des directions symétriques par rapport à l'axe optique, la différence étant effectuée pour chaque couple de signaux ainsi détectés. Selon une autre variante, un dispositif de balayage angulaire des faisceaux d'excitation permet aux faisceaux d'excitation d'intercepter l'échantillon à différentes positions de l'interface entre le milieu résonant et non résonant. Selon une autre variante, la source d'émission émet au moins un faisceau d'excitation à longueur d'onde variable, permettant d'obtenir un spectre des résonances vibrationnelles ou électroniques du milieu résonant. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne une méthode pour la détection d'un signal optique non linéaire résonant induit dans un échantillon, l'échantillon comprenant un milieu résonant et un milieu non résonant formant une interface, la méthode comprenant : l'émission d'au moins un premier faisceau lumineux d'excitation du milieu résonant, dit faisceau pompe, à une première pulsation wp donnée, ledit faisceau pompe étant incident sur l'échantillon selon un axe optique, et interceptant l'échantillon à une position donnée d'une interface transverse entre le milieu résonant et non résonant, la détection d'un premier signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux avec l'échantillon, la réflexion du ou desdits faisceaux d'excitation, le ou les faisceaux d'excitation ainsi réfléchis interceptant ladite interface transverse sensiblement à la même position que le ou les faisceaux d'excitation incidents, la détection d'un second signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon, le traitement des premier et second signaux optiques détectés, comprenant le calcul d'une différence des signaux détectés, la différence étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. 5 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 Selon une variante, la méthode comprend l'émission d'un faisceau pompe de pulsation wp et d'un faisceau Stokes de pulsation cos, le signal optique non linéaire résultant de l'interaction desdits faisceaux pompe et stokes étant un signal dit signal diffusé CARS, de pulsation was = 2wp - cos et la différence des premier et second signaux détectés étant caractéristique d'une résonance Raman du milieu résonant. Selon une autre variante, les premier et deuxième signaux optiques non linéaires sont détectés respectivement dans des directions symétriques par rapport à l'axe optique des faisceaux d'excitation incidents, la différence étant effectuée pour chaque couple de signaux ainsi détectés. Selon une autre variante, les faisceaux d'excitation subissent un balayage angulaire pour 10 intercepter l'échantillon à différentes positions de l'interface entre le milieu résonant et non résonant. Selon une autre variante, l'un au moins des faisceaux d'excitation présente une longueur d'onde d'émission variable, permettant d'obtenir un spectre des résonances vibrationnelles ou électroniques du milieu résonant. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description, illustrée par les figures suivantes : Figures lA et 1B (déjà décrites), principe de l'émission Stokes et anti-Stokes dans un 20 processus de diffusion Raman; Figure 2A et 2B (déjà décrites), principe de l'émission CARS dans deux modes différents ; Figures 3A et 3B (déjà décrites), illustrations des processus CARS résonant et non résonant ; 25 Figures 4A et 4B (déjà décrites), illustrations des situations a et pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'art antérieur ; Figure 5 (déjà décrite), simulations numériques de résultats obtenus avec la méthode selon l'art antérieur ; 6 15 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 Figures 6A et 6B (déjà décrites), résultats expérimentaux obtenus avec un échantillon symétrique, avec la méthode selon l'art antérieur ; Figures 7A, 7B, illustrations des situations a et [3 pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention ; Figures 8A et 8B, exemple de montage expérimental pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention ; Figure 9, résultats expérimentaux obtenus avec un échantillon du type de celui de la figure 8B ; Figures 10A à 10D, images obtenues par simulation numérique avec une bille de polystyrène diamètre 3 µm, immergée dans un liquide aqueux d'indice de réfraction n=1.33, avec la méthode selon l'invention ; Figure 11, exemple de montage expérimental pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention selon une variante; Figures 12A, 12B, illustrations des situations a et [3 pour la mise en oeuvre de la méthode dans l'exemple de la figure 11 ; Figure 13, schéma des conditions géométriques pour la mise en oeuvre de la diffusion CARS à une interface axiale entre milieux résonant et non résonant ; Figures 14A à 14E, illustration de la déviation du signal diffusé CARS en fonction de la position relative du lieu de focalisation des faisceaux d'excitation avec une interface axiale entre des milieux résonant et non résonant ; Figures 15A à 15C, courbes obtenues par simulation numérique, illustrant le décalage su signal diffusé CARS en fonction du paramètre. Ç=(C)pcoS SZR)/h (décalage normalisé à la résonance Raman) (figure 15A), les intensités lumineuses calculées respectivement dans l'espace des (kX>0) et (kX Dans cet exemple, Le passage du problème a au problème pour un échantillon donné s'effectue en retournant les faisceaux pompe et Stokes comme indiqué sur la figure 8A au moyen d'un miroir 813, dont le coefficient de réflexion est adapté aux longueurs d'onde des faisceaux d'excitation d'une part, et du signal diffusé CARS d'autre part, de telle sorte à réfléchir les faisceaux pompes et Stokes et transmettre le signal diffusé CARS résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation avec l'échantillon. Dans cette situation, lors du premier passage des impulsions incidentes, un premier signal CARS est émis vers l'avant et collecté par le détecteur 816 ; il s'agit alors de la situation a et le signal collecté est Ia(Fwd). Les impulsions pompes et Stokes sont alors réfléchies par le miroir pour être renvoyées sur l'échantillon, qui apparaît alors dans la situation (3, dans un deuxième module de détection optique généralement référencé 806 sur la figure 8A. Le deuxième module de détection optique 806 comprend en commun avec le premier module de détection optique, les objectifs 811 et 807, mais l'objectif 811 sert d'objectif de focalisation pour les faisceaux d'excitation renvoyés par le miroir 813 et l'objectif 807 sert d'objectif de collection pour le signal optique non linéaire résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon 805. Le deuxième module optique 806 comprend par ailleurs un détecteur 817, par exemple un détecteur ponctuel du même type que le détecteur 816, précédé d'une lentille de collection 819 et d'un filtre 820 pour couper les faisceaux d'excitation résiduels. Le signal collecté vers l'arrière par le détecteur 817 est alors Ip(Fwd). On opère en temps réel la différence des signaux Ia(Fwd) - Ip(Fwd), dont la déposante a montré qu'elle était proportionnelle au spectre Raman du milieu résonant, au moyen d'une unité de traitement notée 830 sur la figure 8A. Avantageusement, la lame réfléchissante 804 est une lame dichroïque, permettant de réfléchir les faisceaux d'excitation émis par la source laser 801 vers l'échantillon 805 (situation a) tout en transmettant le signal diffusé CARS dans la situation P. Avantageusement, les objectifs de focalisation 807 et de collection 811 sont identiques permettant d'obtenir un montage symétrique dans les situations a et 13. En pratique, une calibration des détecteurs 816, 817, est effectuée préalablement à la mesure. Par exemple, cette calibration est effectuée sur un échantillon ne comprenant que du solvant. 10 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 Comme cela apparaît sur la figure 8B, le dispositif selon l'invention permet aux même impulsions pompe et Stokes d'intercepter l'échantillon à la même position de l'interface transverse, respectivement dans les situations a et P. La méthode peut ainsi être utilisée avec n'importe quel type d'échantillon présentant une interface entre un milieu résonant et un milieu non résonant, et non plus seulement un échantillon symétrique ou réversible. Selon un exemple, le dispositif 800 comprend également un dispositif de balayage des faisceaux d'excitation dans le plan XY de l'échantillon (non représenté). Ce dispositif de balayage peut être utile à la fois dans une application en spectroscopie, pour ajuster le lieu de focalisation des faisceaux d'excitation sur une interface transverse des milieux résonant et non résonant formant l'échantillon, soit dans une application d'imagerie. Il peut s'agir d'un dispositif permettant le déplacement de l'échantillon, ou de manière préférée, d'un dispositif de balayage des faisceaux d'excitation. Avantageusement, on pourra utiliser un miroir de renvoi des faisceaux d'excitation 813 sphérique, de telle sorte à renvoyer les faisceaux d'excitation dans une direction parallèle opposée, ce qui permettra aux faisceaux d'excitation réfléchis (situation 13) d'intercepter l'échantillon à la même position que celle des faisceaux incidents (situation a). La figure 9 illustre des résultats expérimentaux obtenus avec le dispositif de la figure 8A et un échantillon du type de celui de la figure 8B, dans lequel une fine couche de DMF (N,N-dimethylformamide) fait office de milieu résonant entre deux lamelles de verre (qui font office ici de milieu non résonant). La longueur d'onde du faisceau de pompe est 730 nm, celui du faisceau d'excitation Stokes autour de 814 nm. L'ouverture numérique des objectifs 807, 811 de 0.6 dans l'air. Sur la figure 9, sont illustrés en fonction du décalage Raman respectivement par la courbe Dl, le signal diffusé CARS mesuré dans le DMF, par la courbe D2, l'intensité Ia(Fwd) mesurée dans la situation a (figure 6B), par la courbe D3, l'intensité Ip(Fwd) mesurée dans la situation 13, par la courbe D4, la différence DIFWd, par la courbe D5 (en pointillés) le spectre Raman, et par la courbe D6 le signal diffusé CARS mesuré dans le verre. La courbe Dl fait clairement apparaître l'effet de distorsion dû à la contribution non résonante du milieu résonant, tandis que la différence DIFWd se superpose exactement au spectre Raman du DMF (en pointillés). On peut ainsi apprécier la capacité de Dz-CARS à extraire le spectre Raman du milieu résonant sans aucune distorsion due à la partie non résonante du milieu résonant. Ces résultats expérimentaux démontrent la pertinence de l'approche Dz-CARS pour une spectroscopie CARS sans bruit non résonant, et avec une précision nettement améliorée 11 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 en comparaison de l'art antérieur, tel qu'illustré sur la figure 6A. Par ailleurs, la méthode selon l'invention permet de repérer parfaitement la position de l'interface sur laquelle on travaille, et de venir focaliser des impulsions d'excitation identiques, à la même position de l'interface dans les problèmes a et 13, permettant notamment des applications en microscopie. Les figures 10A à 10D présentent des simulations numériques obtenues avec la méthode selon l'invention, sur un autre type d'échantillon. Les images sont calculées en prenant pour échantillon une bille de 3 µm de diamètre dans un solvant de type aqueux (longueur d'onde pompe 730 nm, longueur d'onde Stokes 814 nm, ouverture numérique de l'objectif d'excitation 1.2 dans l'eau, ouverture numérique de l'objectif de collection 1.2 dans l'eau). L'image est calculée dans chacun des cas dans un plan XZ de la bille correspondant à un plan longitudinal contenant la direction d'incidence des faisceaux d'excitation. Les figures 10A et 10B représentent une image de la bille en détection classique, c'est-à-dire que seul le signal diffusé CARS en situation a est représenté. A la résonance (Figure 10A), le signal est plus intense qu'hors résonance (Figure 10B), mais la différence des contrastes est faible du fait des contributions non résonantes de la bille et de son environnement. Les figures 10C et 10D représentent des images de la bille à la résonance et hors résonance, mais calculées avec la méthode Dz-CARS selon l'invention, c'est-à-dire en soustrayant les signaux CARS diffusés dans les situations a et 13, avec un montage du type de celui de la figure 8A. Hors résonance (Figure 10D), le contraste est nul, car la différence des signaux qui ne contiennent qu'une contribution non résonante s'annule. Au contraire, dans la figure 10C, calculée à la résonance, le contraste aux interfaces transverses est maximal. Ces résultats établissent la faisabilité de Dz-CARS dans une configuration de microscopie. La figure 11 illustre un exemple de montage expérimental pour la mise en oeuvre de la détection selon l'invention selon une variante. Le montage est sensiblement identique à celui de la figure 8A, mais les détecteurs ponctuels 816, 817 sont remplacés par des détecteurs matriciels 901, 902, par exemple de type CCD, ou CMOS. Selon cette variante, on ne mesure plus, comme précédemment, la différence des signaux diffusés CARS intégrés respectivement pour les situations a et 13, dans tout l'espace des vecteurs d'onde i contenu dans l'ouverture numérique des objectifs de détection, mais on mesure la différence des signaux diffusés CARS dans des directions symétriques par rapport à l'axe optique des faisceaux d'excitation incidents sur l'échantillon, les signaux étant détectés pour le premier dans la situation a, pour le second dans la situation 13. 12 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 Ainsi, comme cela apparaît sur la figure 12A, dans la situation a, on mesure le signal diffusé CARS dans une direction représentée par le vecteur d'onde , de coordonnées kX, ky dans le plan de projection XY perpendiculaire à l'axe principal z, et dans la situation 13, on mesure le signal diffusé CARS dans une direction représentée par le vecteur d'onde " de coordonnées -kg, -ky dans le plan de projection XY. Ici, comme précédemment, la situation a correspond à la génération d'un signal diffusé CARS résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation incidents avec l'échantillon, alors que la situation f3 correspond à la génération d'un signal diffusé CARS résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon. La déposante a en effet démontré, à la fois théoriquement et expérimentalement, que cette méthode permettait outre la détection aux interfaces transverses de l'échantillon, une détection aux interfaces axiales de l'échantillon, c'est-à-dire présentant une composante non nulle selon l'axe optique des faisceaux d'excitation incidents. Dans la suite de la demande, la méthode est nommée D-CARS. Les figures 13 à 15 illustrent pour la meilleure compréhension de D-CARS l'approche ci-dessous nommée Dk-CARS de détection aux interfaces axiales (pour Differential imaging in K-space). La figure 13 représente un échantillon comprenant le milieu résonant 131, par exemple un milieu contenant le milieu à analyser, c'est-à-dire le milieu d'intérêt biologique, et le milieu non résonant 132, typiquement un milieu contenant le solvant. La susceptibilité non linéaire du (3) 38me ordre est définie dans le milieu résonant 131 par un terme résonant x 1R et un terme non (3) résonant x 1NR Dans le milieu non résonant 132, elle est définie par le terme non résonant (3) x 2NR Selon cet aspect de la méthode selon l'invention, les faisceaux d'excitation pompe de pulsation col, et sonde de pulsation cos, colinéaires, sont incidents sur l'échantillon dans un volume de focalisation 135, interceptant une interface axiale 133 de l'échantillon. Selon cet aspect de la méthode, comme cela est expliqué en détail par la suite, il est procédé à l'analyse de l'intensité lumineuse du faisceau optique non linéaire dans l'espace des vecteurs d'onde , c'est-à-dire dans l'espace des directions d'émission du signal émis par processus CARS, de part et d'autre de l'interface, cette intensité étant notée sur la figure 13 IFwd(k) et IFWd(k ') de part et 13 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 d'autre de l'interface respectivement, l'abréviation « Fwd » représentant le signal CARS diffusé vers l'avant, par opposition au signal dit «Epi », diffusé vers l'arrière. En effet, la déposante a démontré expérimentalement et théoriquement qu'à une interface axiale, le signal émis par processus CARS est dévié à la résonance. Les figures 14A à 14E représentent par une série de schémas la déviation du signal diffusé CARS en fonction de la position relative des faisceaux pompe et Stokes incidents avec l'interface. Sur les figues 14A à 14E est représenté le volume actif CARS 135 (lieu de focalisation des faisceaux pompe et Stokes) qui est déplacé à travers un objet CARS 140 (chaque vignette correspond à une position différente du volume actif dans l'objet). L'objet CARS est considéré comme résonant alors que le milieu entourant l'objet est considéré comme non résonant (il sera appelé dans la suite de la description « le solvant »). Il apparaît qu'aux interfaces entre l'objet CARS et le solvant, le signal diffusé CARS est affecté d'une déviation (ou tilt). La déposante a démontré que cette déviation relève d'un processus purement interférentiel entre l'objet CARS et le solvant et n'est en aucun cas imputable aux effets réfractifs. Sur les deux vignettes 1 (figures 14A et 14E), le volume CARS est focalisé dans le solvant et le signal diffusé CARS est émis dans la direction normale (parallèle à l'axe d'incidence des faisceaux pompe et Stokes, symbolisé par la flèche 141); sur la vignette 2 (figure 14B), le volume CARS est focalisé sur l'interface entre l'objet CARS et le solvant, le signal diffusé CARS est alors émis avec un angle a positif (par rapport à l'axe d'incidence des faisceaux pompe et Stokes), déviant ainsi le faisceau dans une direction définie par (kX>0) dans l'espace des vecteurs d'onde k . Sur la vignette 3 (figure 14C), le volume CARS est centré dans l'objet CARS, le signal CARS est alors intense et est dirigé dans la direction normale (parallèle à l'axe d'incidence des faisceaux pompe et Stokes). On retrouve ensuite une situation similaire sur les vignettes suivantes (vignette 4, figure 14D et vignette 1, figure 14E); il est cependant important de noter que sur la vignette 4, a est négatif et correspond à une déviation dans une direction définie par (kX 0) et (kX 0) et (kx 0) et (kX 25 numérique de l'objectif de collection 1.2 dans l'eau). La figure 16A représente le mode de détection XZ permettant une détection aux interfaces perpendiculaires à l'axe X et aux interfaces perpendiculaires à l'axe Z. Pour cela, on calcule la différence des signaux diffusés CARS respectivement dans les situations a et [3 en intégrant le signal CARS dans l'espace (kX>0) (problème a, Figure 7A) et dans l'espace (kX 30 étant celui de la direction des faisceaux d'excitation. Ainsi par exemple, en modifiant la position relative du lieu de focalisation des faisceaux pompe et Stokes, on obtient l'image de la Figure 16A dans un plan équatorial de la bille. La figure 16B représente le mode de détection YZ 15 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 permettant une détection aux interfaces perpendiculaires à l'axe Y et aux interfaces perpendiculaires à l'axe Z. Dans cet exemple, on calcule pour différentes positions la différence des intensités lumineuses intégrées dans l'espace (ky>O) (problème a, Figure 7A) et dans l'espace (ky L'image est calculée en faisant la différence deux à deux des intensités lumineuses Ia(kx, ky) et Ip(-kX,-ky) mesurées dans deux directions k (kx,k,,,kz) et k" (-kX,-k,,,kz) opposées, respectivement dans les situations a et (3, les directions étant contenues dans le cône angulaire dont l'angle d'ouverture est défini par l'ouverture numérique de collection du signal diffusé CARS (par exemple 1.2 dans l'eau). Là encore, les coordonnées des vecteurs d'onde k et k " sont exprimées dans les référentiels des faisceaux d'excitation propres respectivement aux situations a et P. Avantageusement, dans l'exemple de la figure 11, on pourra prévoir des moyens de balayage angulaire des faisceaux d'excitation, notamment pour les applications en microscopie. Avantageusement, comme dans l'exemple du dispositif de la figure 8A, on pourra choisir un miroir de renvoi des faisceaux d'excitation 813 sphérique. Par ailleurs, il est avantageux de positionner les caméras 901, 902 dans les pupilles de sortie respectivement des objectifs 811, 807, afin de garder la direction d'incidence des faisceaux d'excitation centrée sur la caméra dans chacune des situations a et P. Une calibration des caméras en solution est également possible pour repérer, dans chacune des situations a et (3, et pour chaque angle de balayage, la direction des faisceaux d'excitation par rapport à laquelle sera mesurée la déviation du signal diffusé CARS. La détection Dz-CARS ou D-CARS a été décrite au travers des exemples de mise en oeuvre des figures 8A et 11 dans une application deux couleurs, utilisant deux sources laser fines spectralement. Dans une application dite multiplexe, on pourra choisir une source d'émission du faisceau Stokes large spectralement, générée par exemple par une impulsion femtoseconde ou par un supercontinuum généré par une fibre optique ou un autre milieu dispersif. Le signal pompe reste lui fin spectralement. Dans cette application, il sera possible d'acquérir un spectre Raman en une seule impulsion, par exemple en utilisant deux spectromètres à fente ou un spectromètre unique équipé d'une caméra CCD dans lequel on injecte les deux signaux détectés dans les deux situations a et 13. Dans cette application, il s'agit d'acquérir les spectres dans chacune des situations (a ou (3) et de faire leur différence. Dans une application dite trois couleurs, on utilise trois longueurs d'ondes de pulsations associées ml, w2 et coi pour générer un signal CARS à la pulsation wl-c,32+(p3. Le signal 16 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 CARS peut être rendu sans bruit non résonant en détectant les signaux à la pulsation wl-w2+w3 dans les situations (a ou (3) et en faisant leur différence. Bien que la méthode de détection ait été décrite dans le cas de la diffusion CARS, elle s'applique aussi bien à d'autres processus non linéaires, du 2ème ou du 3ème ordre, à la fois pour des applications de spectroscopie ou pour des applications de microscopie par détection aux interfaces axiales, permettant ainsi de révéler des interfaces entre milieu résonant et non résonant. Dans chaque cas, on procède à une analyse du signal optique non linéaire résultant de l'interaction d'un ou plusieurs faisceaux d'excitation avec un échantillon présentant une interface entre un milieu résonant et un milieu non résonant. Cette analyse spatiale permet soit de révéler l'interface entre le milieu résonant et le milieu non résonant, soit de caractériser un spectre du milieu résonant. Selon un exemple, on peut utiliser un processus de génération de troisième harmonique résonant dans lequel la résonance est une résonance électronique, en excitant avec un faisceau d'excitation pompe unique, de pulsation wP, un échantillon comprenant une interface entre un milieu résonant et un milieu non-résonant. Par exemple on utilise une source laser picoseconde ou femtoseconde de type oscillateurs Ti : Saphir, Nd :verre, lasers fibrés dopés Ytterbium ou Erbium. Selon un autre exemple, on peut utiliser un processus de mélange à quatre ondes résonant dans lequel la résonance est une résonance électronique, en excitant avec un faisceau d'excitation pompe unique, de pulsation cop, un échantillon comprenant une interface entre un milieu résonant et un milieu non-résonant. Par exemple on utilise une source laser picoseconde ou femtoseconde de type oscillateurs Ti : Saphir, Nd :verre, lasers fibrés dopés Ytterbium ou Erbium. Les deux exemples décrits précédemment traitent de résonances électroniques. On les 25 trouve dans des atomes, de molécules, des cristaux semi-conducteurs, etc. Selon un autre exemple, on pourra exciter la seconde harmonique résonante avec un faisceau pompe unique, ou on pourra faire de la somme de fréquence avec un faisceau pompe et un faisceau sonde (effet non linéaire du 2ème ordre). Bien que décrits à travers un certain nombre d'exemples de réalisation détaillés, le 30 dispositif de détection et la méthode selon l'invention comprennent différentes variantes, modifications et perfectionnements qui apparaîtront de façon évidente à l'homme de l'art, étant 17 DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 entendu que ces différentes variantes, modifications et perfectionnements font partie de la portée de l'invention, telle que définie par les revendications qui suivent. 18 REVENDICATIONS1. Dispositif pour détecter un signal optique non linéaire résonant induit dans un échantillon (805), l'échantillon comprenant un milieu résonant (61) et un milieu non résonant (62, 63) formant une interface, le dispositif comprenant : une source d'émission (801) d'au moins un premier faisceau lumineux d'excitation du milieu résonant, dit faisceau pompe, à une première pulsation oh donnée, ledit faisceau pompe étant incident sur l'échantillon selon un axe optique, et interceptant l'échantillon à une position donnée d'une interface transverse entre le milieu résonant et non résonant, un premier module optique (803) de détection du signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux avec l'échantillon, des moyens de réflexion (813) du ou desdits faisceaux d'excitation, le ou les faisceaux d'excitation ainsi réfléchis interceptant ladite interface transverse sensiblement à la même position que le ou les faisceaux d'excitation incidents, un deuxième module optique (806) de détection du signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon, un module de traitement (830) des signaux optiques détectés par lesdits premier et second modules de détection, comprenant le calcul d'une différence des signaux détectés, la différence étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. 2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la source d'émission (801) permet l'émission d'au moins un deuxième faisceau d'excitation du milieu résonant, à au moins une deuxième pulsation cos différente de la première pulsation wp, l'ensemble des faisceaux d'excitation étant colinéaires, incidents sur l'échantillon selon l'axe optique et interceptant ladite interface transverse à ladite position en un volume de focalisation commun, les moyens de réflexion permettent de réfléchir l'ensemble des faisceaux d'excitation sur ladite interface transverse, à la même position de l'interface, la différence des signaux détectés par le premier et le second module de détection est caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant à une pulsation égale à une combinaison linéaire des pulsations des première et seconde pulsations. 19DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 3. Dispositif selon la revendication 2, dans lequel la source d'émission (801) permet l'émission d'un faisceau pompe de pulsation wp et d'un faisceau Stokes de pulsation o s, le signal optique non linéaire résultant de l'interaction desdits faisceaux pompe et stokes est un signal dit signal diffusé CARS, de pulsation was = 2wp - cos et la différence des signaux détectés par le premier et le second module de détection est caractéristique d'une résonance Raman du milieu résonant. 4. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les moyens de réflexion sont formés d'un miroir réfléchissant (813) permettant de réfléchir le ou les faisceaux d'excitation et de transmettre ledit signal optique non linéaire. 5. Dispositif selon la revendication 4, dans lequel le miroir réfléchissant (813) est sphérique. 6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre un objectif de focalisation (807) du ou desdits faisceaux d'excitation incidents en un volume de focalisation commun (71), permettant d'intercepter ladite interface entre le milieu résonant et le milieu non résonant et un objectif de collection du signal non linéaire résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation incidents avec l'échantillon, ledit objectif de collection étant identique à l'objectif de focalisation des faisceaux incidents et ledit objectif de collection formant un objectif de focalisation des faisceaux d'excitation réfléchis et ledit objectif de focalisation des faisceaux incidents formant un objectif de collection du signal non linéaire résultant de l'interaction des faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon. 7. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre une lame de séparation dichroïque (804) permettant d'envoyer le ou les faisceaux d'excitation émis par la source d'émission (801) vers l'échantillon et de laisser passer le signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou des faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon. 8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel chacun des modules de détection optique comprend un dispositif d'enregistrement d'images, le signal optique non linéaire étant collecté dans chacun des modules de détection optique 20DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 respectivement dans des directions symétriques par rapport à l'axe optique, la différence étant effectuée pour chaque couple de signaux ainsi détectés. 9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre un dispositif de balayage angulaire du ou des faisceaux d'excitation, permettant au ou à les faisceaux d'excitation d'intercepter l'échantillon à différentes positions de l'interface entre le milieu résonant et non résonant. 10. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la source d'émission émet au moins un faisceau d'excitation à longueur d'onde variable, permettant d'obtenir un spectre des résonances vibrationnelles ou électroniques du milieu résonant. 11. Méthode pour la détection d'un signal optique non linéaire résonant induit dans un échantillon (805), l'échantillon comprenant un milieu résonant (61) et un milieu non résonant (62, 63) formant une interface, la méthode comprenant : l'émission d'au moins un premier faisceau lumineux d'excitation du milieu résonant, dit faisceau pompe, à une première pulsation wp donnée, ledit faisceau pompe étant incident sur l'échantillon selon un axe optique, et interceptant l'échantillon à une position donnée d'une interface transverse entre le milieu résonant et non résonant, - la détection d'un premier signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux avec l'échantillon, la réflexion du ou desdits faisceaux d'excitation, le ou les faisceaux d'excitation ainsi réfléchis interceptant ladite interface transverse sensiblement à la même position que le ou les faisceaux d'excitation incidents, la détection d'un second signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux d'excitation réfléchis avec l'échantillon, - le traitement des premier et second signaux optiques détectés, comprenant le calcul d'une différence des signaux détectés, la différence étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. 12. Méthode selon la revendication 11, comprenant l'émission d'au moins un deuxième faisceau d'excitation du milieu résonant, à au moins une deuxième pulsation cos différente de la première pulsation (op, l'ensemble des faisceaux d'excitation étant colinéaires, et interceptant ladite interface transverse à ladite position en un volume de focalisation commun, 21DEMANDE DE BREVET REF 27658/002FR1 la différence des premier et second signaux détectés étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant à une pulsation égale à une combinaison linéaire des pulsations des première et seconde pulsations. 13. Méthode selon la revendication 12, comprenant l'émission d'un faisceau pompe de pulsation wp et d'un faisceau Stokes de pulsation ws, le signal optique non linéaire résultant de l'interaction desdits faisceaux pompe et stokes étant un signal dit signal diffusé CARS, de pulsation was = 2wp - cos et la différence des premier et second signaux détectés étant caractéristique d'une résonance Raman du milieu résonant. 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, dans laquelle lesdits premier et deuxième signaux optiques non linéaires sont détectés respectivement dans des directions symétriques par rapport à l'axe optique des faisceaux d'excitation incidents, la différence étant effectuée pour chaque couple de signaux ainsi détectés. 15. Méthode selon l'une des revendications 11 à 14, dans laquelle le ou les faisceaux d'excitation subissent un balayage angulaire pour intercepter l'échantillon à différentes positions de l'interface entre le milieu résonant et non résonant. 16. Méthode selon l'une des revendications 11 à 15, dans laquelle l'un au moins des faisceaux d'excitation présente une longueur d'onde d'émission variable, permettant d'obtenir un spectre des résonances vibrationnelles ou électroniques du milieu résonant. 22