FR 2950145 A1 20110318 FR 0904365 A 20090914 10 La présente invention concerne le domaine de la chromatographie, et plus particulièrement l'analyse automatique de chromatogrammes. La chromatographie est une technique d'analyse qualitative et quantitative de la chimie analytique dans laquelle un échantillon contenant une ou plusieurs espèces est entraîné par un courant de phase mobile (liquide, gaz ou fluide supercritique) le long d'une phase 15 stationnaire (papier, gélatine, silice, polymère, silice greffée etc.). Chaque espèce se déplace à une vitesse propre dépendant de ses caractéristiques et de celles des deux phases. Un détecteur est utilisé pour mesurer différentes propriétés physique du mélange (phase mobile et échantillon analysé) sous forme d'une intensité en fonction du temps, au cours de l'élution des solutés (espèces présentes dans l'échantillon). Ce signal, nommé 20 chromatogramme ou signal chromatographique, comporte un ensemble de pics, caractéristique de chaque espèce, dont la forme est fonction de l'intensité de la propriété mesurée. Chaque pic est nommé « pic d'élution » ou encore « pic chromatographique ». Le maximum de l'intensité correspondant à un pic est appelé temps de rétention. Ce temps de rétention correspond au temps qui s'écoule entre l'injection de l'échantillon et l'apparition 25 d'un pic de soluté sur le détecteur d'une colonne chromatographique. Le signal ainsi enregistré peut être de différente nature en fonction du détecteur utilisé. Les détecteurs (TCD, FID, SCD, NCD...) sont choisis en fonction du type d'application par l'homme de l'art. Certains détecteurs permettent de détecter quelques ppm (parties par million) d'une espèce. Un chromatogramme comporte un ensemble de pic, comme l'illustre la figure 2, où 30 l'axe des abscisses correspond au temps (x), et l'axe des ordonnées correspond à l'intensité (f(x)) enregistrée par le détecteur. Chaque pic correspond à une espèce, que l'on sait identifier en fonction du temps de rétention du pic. L'aire formée sous chaque pic est 1 proportionnelle à la concentration de l'espèce dans l'échantillon analysé. L'analyse de ce type de signal consiste donc à déterminer l'aire formée sous chaque pic. L'analyse d'un chromatogramme doit donc permettre de déterminer : le temps de rétention (temps d'apparition) de chaque pic, pour identifier l'espèce à l'origine du pic ; le temps de début et le temps de fin de chaque pic, pour déterminer la concentration de l'espèce identifiée. Pour y parvenir, il faut pouvoir détecter automatiquement les pics présents dans le signal, ces pics pouvant se chevaucher lorsque les espèces auxquelles ils correspondent sont élués sensiblement en même temps (on parle d'espèces sensiblement coéluées), et détecter les débuts et les fins de ces pics. On connaît des méthodes pour réaliser ce type détection, notamment en analysant les dérivés première, seconde, et troisième du signal de l'échantillon à analyser. Ces méthodes sont décrites dans les documents suivants : Savitzky, M.J.E. Golay, 1967, Anal. Chem. 36 (1964) 1627. - G. Vivo-Truyols et al., 2005, Automatic program for peak detection and deconvolution of multi-overlapped chromatographic signais. Part I: Peak detection.", J. of Chromatography A, 1096 (2005) 133-145. Ces méthodes comportent deux étapes: - un lissage par fenêtre glissante du signal initial par un polynôme, et un calcul des dérivés première et seconde. Le lissage est réalisé, pour chaque point, à partir du calcul d'un polynôme estimant au mieux le signal initial au sens des moindres carrés sur un voisinage 25 du point (fenêtre glissante). II est donc nécessaire de fixer le degré du polynôme et la taille de la fenêtre glissante. - une détection des pics par analyse des dérivés première et seconde. Les pics correspondent au zéro de la dérivé première (en pratique, valeur minimale aux alentours de zéros fixée par un seuil pour limiter les fausses détections dues au bruit) et minima négatif 30 de la dérivé seconde (en pratique, valeur absolue minimale de la dérivée seconde supérieure à un seuil pour limiter les fausses détections dues au bruit).20 Ainsi, selon ces méthodes, il est nécessaire de fixer des seuils non intuitifs qui ne dépendent pas directement de la forme du signal ou de la forme des pics recherchés : • calcul de la quantité de bruit dans le signal v v = medianl ûY,' û 2 Yr • seuil sur la pente de dérivé lère : présence pic si pente > cstel * v(dérivée lère) • seuil sur la dérive 2nd : présence pic si dérivée 2nde La méthode selon l'invention L'invention concerne une méthode d'analyse d'un signal chromatographique f, représentant une intensité d'un détecteur chromatographique en fonction du temps x, dans laquelle on détecte de façon automatique des pics d'élution, et l'on détermine des temps de rétention desdits pics d'élution, des temps de début et des temps de fin desdits pics d'élution, en réalisant les étapes suivantes : on détermine les temps de rétention de pics d'élution d'intensité maximale h au moyen d'un filtre morphologique grec, lesdits temps de rétention correspondant à des temps x vérifiant : f(x)ù yrec(f(x),f(x)ùh)? h - on détermine les temps de début et les temps de fin desdits pics d'élution, en déterminant les positions des minima locaux du signal chromatographique compris entre chaque position des pics d'élution d'intensité maximale h. rec Selon l'invention, le filtre morphologique y peut être une ouverture morphologique, définie de la façon suivante : yrec(f,f ùl7) {sfn) (f ùh),n > 0} avec : sf,n(g)=s(fn)(g)=sf(sf...(sf(g))) n fois sf(g)= inf(g+B, f) avec B boule unitaire On peut déterminer les temps de début desdits pics d'élution à partir de la règle suivante, x x{[xninpz]f (x) où xplet xp2 correspondent à deux pics d'élution voisins, et on peut déterminer les temps de fin desdits pics d'élution à partir de la règle suivante, min ] f (x) xE xp2;xp; où xp2et xp3 correspondent à deux pics d'élution voisins. Selon l'invention, on peut également déterminer les temps de début et de fin desdits rec pics d'élution, au moyen d'un filtre morphologique q' défini par une fermeture morphologique et un paramètre j correspondant à une intensité minimale locale que l'on 25 cherche à détecter, les temps de début et de fin desdits pics d'élution aux temps x vérifiant : q'rec(f,f +j)(x)ùJ (x)> Dans ce cas, la fermeture morphologique peut être définie ainsi : x 20 çorec( f'J +.%)={£f)(f+j),n>0 } avec : £f.n(g)-£f )(g)-£f(£f...(£f(g))) n fois £ f (g) = sup(g - B, f) avec B boule unitaire Selon un mode de réalisation, on peut détecter et séparer des pics d'élution correspondant à des espèces sensiblement coéluées, en détectant des maxima locaux négatifs et des minima locaux positifs d'une dérivée première du signal chromatographique. Les séparations peuvent être réalisées au moyen d'un filtre morphologique de détection des maxima locaux par résidus de l'ouverture de contraste avec un décalage h, et d'un filtre morphologique de détection des minima locaux par résidus de la fermeture de contraste avec un décalage j. La séparation entre un pic d'élution et un pic d'élution correspondant à une espèce sensiblement coéluée peut être obtenue en prenant l'hypothèse que le pic correspondant à une espèce sensiblement coéluée possède une aire symétrique. Selon un mode préféré de l'invention, on réduit un bruit présent dans le signal chromatographique préalablement à toute analyse, au moyen d'un filtrage, tel qu'un filtre Gaussien récursif. Enfin, on peut identifier des espèces présentes dans un échantillon analysé et produisant le signal chromatographique, à partir des temps de rétention, et on peut déterminer la concentration pour chacune des espèces identifiées à partir des temps de début et de fin de chaque pic d'élution. D'autres caractéristiques et avantages de la méthode selon l'invention, apparaîtront à la lecture de la description ci-après d'exemples non limitatifs de réalisations, en se référant 25 aux figures annexées et décrites ci-après. Présentation succincte des figures La figure 1 illustre le principe général de la méthode de détection automatique de pics d'élution sur un chromatogramme. 30 - La figure 2 : Exemple de chromatogramme en chromatographie liquide. - La figure 3 : Détection de la position des maxima locaux d'une fonction f par les résidus de hauteur h (pointillés) de l'ouverture morphologique de contraste par un décalage h. La figure 4 : Exemple de détection de la position d'un pic sensiblement coélué (pointillé) par la détection d'un minima local positif de la dérivé première (f(x)) du chromatogramme (f(x)). - La figure 5 : Exemple de détection de la position d'un pic correspondant à une espèce sensiblement coéluée (pointillé) par la détection d'un maxima local négatif de la dérivé première (f(x)) du chromatogramme (f(x)). La figure 6 : Exemple de détection des positions des pics (pointillés fins), des débuts et fins des pics (traits pleins), d'un pic « coélué » (tirets), et de la séparation entre pics «coélués » (pointillés épais). Description détaillée de la méthode La figure 1 illustre le principe générale de la méthode de détection automatique des d'élution, y compris les pics correspondant à des espèces sensiblement coélués. La méthode comporte les étapes suivantes : 1. Réduction du bruit par filtrage (RBF) 2. Détection et localisation des pics d'élution (LOC) 3. Détermination des débuts et fins des pics d'élution (DF) 4. Détection et séparation des pics d'espèces sensiblement coéluées (COE) 1. Réduction du bruit par filtraqe (RBF) De préférence, on diminue le bruit du signal chromatographique (chromatogramme), en appliquant un filtrage à ce signal. Selon un mode de réalisation préférentiel, on utilise un filtre Gaussien récursif. Un tel filtre est décrit par exemple dans les documents suivants : R. Deriche, 1993, « Recursively implementing the Gaussian and its derivative », Rapport de recherche n° 1893, Programme 4 Robotique, Image et Vision, INRIA. - G. Farneback, C.F. Westin, 2006, "Improving deriche-style Recursive Gaussien Filters", Journal of Mathematical Imaging and Vision, volume 26, Issue 3, 293-299. L'intérêt de ce filtre est son paramétrage intuitif basé sur l'écart type de la fonction Gaussienne utilisée pour le lissage. Plus le bruit dans le signal est important, plus l'écart type de la fonction Gaussienne doit être élevé. Selon d'autres modes de réalisation, différents filtres peuvent être utilisés comme par exemple un filtre de Savitzky Golay, décrit dans le document suivant : - Savitzky, M.J.E. Golay, 1967, Anal. Chem. 36 (1964) 1627. 2. Détection et localisation des pics d'élution (LOC) A partir du signal chromatographique, de préférence filtré pour augmenter le rapport signal sur bruit, la détection et la localisation des pics sont réalisées à l'aide d'un filtre morphologique. En traitement linéaire du signal, filtrer consiste à éliminer certaines composantes fréquentielles du signal. Ainsi, un filtrage est une convolution. En morphologie mathématique, filtrer consiste à simplifier le signal en supprimant certaines structures géométriques (en général implicitement définies par un ou plusieurs éléments structurants). Le filtre morphologique simplifie le signal en préservant la structure, mais il perd en général de l'information (croissance). Le filtre morphologique est stable et possède une classe d'invariance connue (idempotence). Un filtre morphologique est un opérateur y croissant et idempotent tel que : si x y, alors tp (x) ≤y(y) (tU (x)) = (x)(croissance) (idempotence) Selon l'invention le filtre utilisé est une ouverture morphologique de contraste avec un décalage h. Un tel filtre est décrit dans le document suivant : J. Serra, "Image Analysis and Mathematical Morphology", Vol. I, Ac. Press, London (1982). Cette ouverture est notée yY c Elle est définie de la façon suivante : avec : yrec(f,f -h)= 5 (f-h),n>0} - f intensité du détecteur chromatographique - h hauteur minimale des pics que l'on cherche à détecter - sf,n(g)= S(fn) (g) = 5f(sf...(sf(g))) n fois - Sf(g)=inf(g+B,f) avec B boule unitaire La figure 3 illustre un tel filtre. Le paramètre h correspond à la hauteur minimale des pics que l'on cherche à détecter. Les positions x des maxima locaux de hauteur minimale h du signal f correspondant aux positions des pics de hauteur minimale h sont donc obtenues pour les points x vérifiant : x f(x) ù y'« J (x),f(x)-h) h L'opérateur d'ouverture par reconstruction yrec, utilisé dans la méthode selon l'invention, peut être implémenté de manière efficace en utilisant un algorithme à base de file d'attente, tel que décrit dans le document suivant : L. Vincent, "Morphological Grayscale Reconstruction in Image Analysis : Applications and Efficient Algorithms", IEEE Transactions on Image Processing, Vol 2, N° 2, p 176-201, 1993. Cette méthode de détection, couplée à un pré filtrage du bruit, a deux principaux avantages : d'une part, elle est très robuste au bruit car non basée sur le calcul de dérivés numériques, d'autre part, elle est intuitive à paramétrer même pour un non spécialiste du traitement du signal, car elle est basée sur des notions de quantité de bruit (écart type du filtre Gaussien récursif) et de hauteur minimale des pics à détecter (paramètre h du filtre morphologique). 3. Détermination des débuts et fins des pics d'élution (DF) Les positions des débuts et fins de pics d'élution du signal chromatographique f sont obtenus, en déterminant les positions des minima locaux du signal chromatographique compris entre chaque positions des maxima locaux de hauteur minimale h du signal f correspondant aux positions des pics de hauteur minimale h. Soient trois pics localisés par le filtre morphologique, aux points xp1, xp2et xp3. Selon un mode de réalisation, la position du début du pic d'élution localisé en xp2 est donnée par: x xExl; p2,/ (x) xet la position de la fin du pic d'élution localisé en xp3 est donnée par: l min , f (x) xElxp2;xp3 Selon un autre mode de réalisation, la détection et les positions des débuts et fins des pics d'élution peuvent être obtenues à l'aide d'un filtre morphologique de détection des minima locaux par résidus de la fermeture de contraste avec un décalage h. II s'agit d'un filtre morphologique défini non par une ouverture morphologique, mais par une fermeture morphologique. Un tel filtre est décrit dans le document suivant : J. Serra, "Image Analysis and Mathematical Morphology", Vol. I, Ac. Press, London (1982). Cette fermeture est notée ço ' Elle est définie de la façon suivante : 9rec(f f+h)={e(fn)(f+h),n>0} avec : - f intensité du détecteur chromatographique h profondeur minimale des vallées que l'on cherche à détecter ef.n(g)ùef) (g)=e cf (cf ...(ef (g») n fois ef(g)=sup(g-B,f) avec B boule unitaire Le paramètre h correspond à la profondeur minimale des vallées que l'on cherche à détecter. Les positions x des minima locaux de profondeur minimale h du signal f correspondant aux positions des vallées de profondeur minimale h sont donc obtenus pour les points x vérifiant : xlp (f,f +h)(x)ùf(x)h 4. Détection et séparation des pics d'espèces sensiblement coéluées (COE) De façon préférentielle, la méthode comporte une étape pour détecter et séparer les pics correspondant à des espèces sensiblement coéluées. La méthode consiste à détecter les maxima locaux négatifs et les minima locaux positifs de la dérivé première du signal chromatographique initial f La figure 4 illustre un exemple de détection de la position d'un pic sensiblement coélué (pointillé) par la détection d'un minima local positif de la dérivé première (f'(x)) du chromatogramme (f(x)). Leurs positions correspondent aux positions de pics d'élution se chevauchant, et correspondant à des espèces sensiblement coéluées. 4.1. Calcul de la dérivée première du siqnal chromatographique (DER) Le pré filtrage et la dérivée première peuvent être calculés en une même opération à l'aide d'un filtre Gaussien dérivatif récursif. L'intérêt de ce filtre est son paramétrage intuitif basé sur l'écart type de la fonction Gaussienne. Plus le bruit dans le signal est important, plus l'écart type de la fonction Gaussienne doit être élevé. D'autre méthodes peuvent être utilisées comme par exemple le calcul de la dérivé première par un filtre de Savitzky Golay. 4.2. Détection et localisation des pics (LOCO) La détection et la localisation des pics correspondant à des espèces sensiblement coéluées, sont réalisées à l'aide d'un filtre morphologique de détection des maxima locaux par résidus de l'ouverture de contraste avec un décalage h, et d'un filtre morphologique de détection des minima locaux par résidus de la fermeture de contraste avec un décalage h. De tels filtres sont décrits dans les étapes 2 et 3. Le paramètre h correspond à une sensibilité concernant les pics liés à des espèces sensiblement coéluées que l'on cherche à détecter. Les positions des maxima locaux de hauteur minimale h et des minima locaux de profondeur minimale h de la dérivée première f du signal f correspondant aux positions des pics recherchés sont donc obtenues pour les points x vérifiant (figure 5) : (f(x)_,' (f', f'-h)(x)>ù h et f(x) ù h et f(x)> o) 4.3. Localisation de la séparation des pics (SEP) La localisation de la séparation entre un pic d'élution et un pic d'élution correspondant à une espèce sensiblement coéluée peut être obtenue en prenant l'hypothèse que le pic correspondant à une espèce sensiblement coéluée possède une aire symétrique, c'est à dire 25 que l'aire sous la courbe entre la position du début du pic et la position du maxima du pic est égale à l'aire sous la courbe entre la position du maxima du pic et la position de la fin du pic. Soient un signal f un pic "i" localisé en xi de début et fin respectivement localisés en xideb et xifin, et un pic "icol" correspondant à une espèce sensiblement coéluée avec l'espèce du pic "i" localisé en xic01. La position de la séparation xsepa entre les deux pics "i" et "icol" est 30 obtenue par la méthode suivante: x20 x xfrrt xsepa = min (x f f (x)dx > J f (x)dx si xieol f E Lxideb, xifrn ]et xicol ~ xi XE[X,,i,xi xioot xideb xmot xfr~ max j(x f f (x)dx J f (x)dx si xieol [Xideb xifin ]et xicol > xi xE[x; ; xi,oi La figure 6 illustre un résultat de l'invention. II s'agit d'un exemple de détection des positions des pics (pointillés fins), des débuts et fins des pics (traits pleins), d'un pic «coélué» (tirets), et de la séparation entre pics « coélués » (pointillés épais). x xmoi REVENDICATIONS1. Méthode d'analyse d'un signal chromatographique f représentant une intensité d'un détecteur chromatographique en fonction du temps x, dans laquelle on détecte de façon automatique des pics d'élution, et l'on détermine des temps de rétention desdits pics d'élution, des temps de début et des temps de fin desdits pics d'élution, en réalisant les étapes suivantes : on détermine les temps de rétention de pics d'élution d'intensité maximale h au moyen d'un filtre morphologique y'eO, lesdits temps de rétention correspondant à des temps x vérifiant : f(x)-grec( f(x),f(x)-h)h on détermine les temps de début et les temps de fin desdits pics d'élution, en déterminant les positions des minima locaux du signal chromatographique compris entre chaque position des pics d'élution d'intensité maximale h. 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le filtre morphologique yYec est une ouverture morphologique, définie de la façon suivante : yrec(f f-h)=I(5S' (f-h),n>o} avec : 8f,n(g)=6fn)(g)ù8f(8f...(8f(g))) n fois - 8f(g)= inf(g+B, f) avec B boule unitaire 3. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle on détermine les temps de début desdits pics d'élution à partir de la règle suivante, xl ,min ,f(x) xE x~i;xPz où xp,et xp2 correspondent à deux pics d'élution voisins, et on détermine les temps de fin desdits pics d'élution à partir de la règle suivante, min f (x) xn[xpz;xp3] où xp2et xp3 correspondent à deux pics d'élution voisins. x 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 2, dans laquelle on détermine les temps de début et de fin desdits pics d'élution, au moyen d'un filtre morphologique grec défini par une fermeture morphologique et un paramètre j correspondant à une intensité minimale locale que l'on cherche à détecter, les temps de début et de fin desdits pics d'élution aux temps x vérifiant : 'nrec( f' ,f j)(x)ùJ (x)? / 5. Méthode selon la revendication 4, dans laquelle la fermeture morphologique est ainsi définie : çorec( f'J +j)-{e(fn)(f+i),ni0 } avec : Ef n(g)-Ef )(g)=sf(ef...(ef(g))) n fois - ef(g)= sup(g -B, f) avec B boule unitaire 6. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle on détecte et l'on sépare des pics d'élution correspondant à des espèces sensiblement coéluées, en détectant des maxima locaux négatifs et des minima locaux positifs d'une dérivée première dudit signal chromatographique. 7. Méthode selon la revendication 6, dans laquelle lesdites séparations sont réalisées au moyen d'un filtre morphologique de détection des maxima locaux par résidus de l'ouverture de contraste avec un décalage h, et d'un filtre morphologique de détection des minima locaux par résidus de la fermeture de contraste avec un décalage j. 8. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la séparation entre un pic d'élution et un pic d'élution correspondant à une espèce sensiblement coéluée est obtenue en prenant l'hypothèse que ledit pic correspondant à une espèce sensiblement coéluée possède une aire symétrique. 9. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle on réduit un bruit présent dans ledit signal chromatographique préalablement à toute analyse, au moyen d'un filtrage, tel qu'un filtre Gaussien récursif. 10. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle on identifie des espèces présentes dans un échantillon analysé et produisant ledit signal chromatographique, à partir desdits temps de rétention, et on détermine uneconcentration pour chacune desdites espèces identifiées à partir desdits temps de début et de fin de chaque pic d'élution.