FR 2952648 A1 20110520 FR 0905511 A 20091117 Procédé de poration de cellules comprises dans un substrat comportant l'utilisation de nanotubes comme récepteur hyperfréquences L'invention se situe dans le domaine des technologies nanométriques et hyperfréquence appliquées à la biologie et à la médecine et notamment à la diffusion de médicaments au travers de membranes cellulaires. Il est rappelé de manière générale que l'administration de ~o médicaments peut être effectuée par différentes méthodes. On distingue l'administration systémique (par voie générale) et l'application topique (locale). Les formes d'administration systémiques agissent sur tout l'organisme, les formes d'application topiques seulement à l'endroit où le médicament est appliqué, notamment sur la peau. 15 Les formes d'administration systémiques : les médicaments peuvent être absorbés par la bouche. Au niveau du tractus gastro-intestinal, les substances actives pénètrent dans le sang, qui les transporte vers l'organe où elles doivent agir. Dans le cas de l'administration rectale, les substances actives diffusées par les suppositoires sont absorbées par la muqueuse du 20 rectum. Il existe aussi une administration parentérale, c'est-à-dire par une voie autre que l'appareil digestif. Il s'agit habituellement d'une injection. On peut injecter une substance par voie intraveineuse (dans les veines), intramusculaire (dans le muscle) ou sous-cutanée (sous la peau). Lorsqu'une 25 solution est administrée par voie intraveineuse pendant un temps prolongé, on parle de perfusion. Les formes galéniques, telles que les aérosols, les vapeurs ou les gaz, sont employées en inhalation. Le système transdermique est une sorte de timbre - ou «patch» - contenant une certaine quantité de substance active qui diffuse dans l'organisme de façon continue. 30 Les formes d'administration topiques : dans le cas d'une application cutanée, le médicament - une pommade, par exemple - est appliqué sur la peau. Actuellement, les procédés physiques de transfert de gènes (et/ou de médicaments) permettent la pénétration directe, dans les cellules, de 35 molécules non perméables, tant petites que grandes, qui autrement ne peuvent diffuser à travers la membrane plasmatique ou être activement transportées à travers la membrane plasmatique. Il existe de nombreux procédés de transfert de gènes ou de médicaments in vivo, par exemple la biolistique, l'injection-jet, l'injection hydrodynamique, les ultrasons, le champ magnétique et l'électroperméabilisation (Villemejane, J. et Mir, L. Physical methods of nucleic acid transfer: general concept and applications, British Journal of Pharmacology 157, 207-219, 2009). L'électroperméabilisation (ou électroporation) est une technique utilisée pour introduire des macromolécules (transfection cellulaire), notamment de l'ADN, de l'ARN, des gènes et des protéines, et des médicaments en général, dans des cellules (Neumann, E. et al.,.Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes, Bioelectrochem. Bioenerg. 48, 3û16, 1999) par application de champs électriques, généralement pulsés, ayant une intensité et une durée suffisantes pour induire une augmentation temporaire de la perméabilité de la membrane cellulaire. Les potentiels transmembranaires élevés induits de cette manière provoquent la formation de très petits pores (de 20-120 nm de diamètre). Les macromolécules introduites à travers la membrane cellulaire passent à travers les pores, par électrophorèse dans le cas des molécules chargées (Neumann, E. et al., Calcium-mediated DNA adsorption to yeast cells and kinetics of cet/ transformation by electroporation, Biophys. J. 71, 868û877,1996), et par diffusion passive dans le cas des molécules neutres (Neumann, E. et al. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells, Biophys. J. 74, 98û108, 1998). Actuellement, pour une électroporation in vivo, le champ électrique pulsé est transmis par des électrodes-aiguilles implantées dans le tissu à traiter, ou par des électrodes plates appliquées en contact superficiel avec le tissu. Des électrodes et des réseaux d'électrodes, pour libérer des impulsions électriques dans le but de parvenir à des effets thérapeutiques, sont décrits par exemple dans la demande de brevet WO 98/47 562. Alors que le procédé basé sur l'utilisation d'électrodes-aiguilles est invasif, celui qui basé sur l'utilisation d'électrodes plates ne l'est pas, et est donc en principe préférable. Cependant, il est limité uniquement à une application en surface sur de petites zones. Ceci est corrélé avec les données scientifiques disponibles concernant l'intensité des champs électriques et la durée nécessaires pour une électroporation efficace des cellules, comme décrit dans "Guidelines for the limitation of the exposure to electric and magnetic fields that vary in time and to electromagnetic fields (up to 300 GHz)" de la Commission Internationale sur la Radioprotection non ionisante (ICNIRP). Ainsi, si les valeurs seuils recommandées par ces instructions sont observées, la profondeur de traitement (c'est-à-dire la distance entre les électrodes-plates, ou à partir de l'électrode-plate) n'est que de quelques millimètres, ce qui signifie que le procédé n'est efficace in vivo 1 o que dans les zones proches de la surface corporelle (par exemple l'épiderme et le derme). D'autres procédés d'électroporation sont bien établis, qui font usage de "médiateurs", y compris et en particulier les nanotubes de carbone (NTC). Les nanotubes de carbone sont des structures tubulaires très minces 15 formées par un ou plusieurs feuillets de graphite enroulés sur eux-mêmes. Les nanotubes de carbone, produits par une décharge d'arc entre deux électrodes de graphite, ont été découverts et décrits pour la première fois par Sumio lijima ("Helical Microtubules of Graphitic Carbon", Nature, Vol. 354, Nov. 7, 1991, pages 56 58). En général, les nanotubes de carbone sont 20 classés en deux catégories : les nanotubes monofeuillets, ou SWNT, composés d'une structure tubulaire formée d'un feuillet de graphite enroulé sur lui-même et fermé aux deux extrémités par deux calottes hémisphériques, et qui se distinguent des nanotubes multifeuillets ou MWNT, qui peuvent être considérés comme formés de plusieurs nanotubes SWNT 25 concentriques. L'utilisation des NTC en tant que médiateurs d'électroporation a déjà été proposée pour réduire les tensions exigées pour une électroporation irréversible, dans le but de développer un microlaboratoire (lab-on-a-chip) portatif à faible consommation d'énergie (Yantzi J. D. et al., Carbon 30 Nanotube Enhanced Pulsed Electric Field Electroporation for Biomedical Applications, Proceedings of the IEEE International Conference on Mechatronics & Automation Niagara Falls, Canada, 2005), ou de provoquer la perméabilisation réversible de cellules bactériennes par exposition à des micro-ondes des cellules mises en contact avec les NTC (Rojas-Chapana 35 J.A. et al., Enhanced Introduction of Gold Nanoparticles into Vital Acidothiobacillus ferrooxidans by Carbon Nanotube-based Microwave Electroporation, Nano Letters, vol. 4, no. 5, pages 985-988, 2004), ou pour une électroporation réversible par exploitation des propriétés diélectriques des NTC (PCT/IB 2007/05 47 54, 22 novembre 2007). II convient aussi de mentionner les brevets décrivant un dispositif qui exploite la propriété des SWCNT à dégager de la chaleur dans un champ radio fréquence (RF) dans le but de produire une ablation thermique de cellules malignes (brevets US n° US 2006/01 90 063 Al, US 2005/02 51 12 33 Al, et US 2005/02 51 234 Al et demande internationale WO 2007/02 76 14). Dans ce contexte, la présente invention propose un nouveau procédé de perméabilisation cellulaire, qui se fonde sur l'application d'un champ électromagnétique au voisinage de nano-antennes constituées par des nanotubes, et ce afin de réaliser une électroporation d'une membrane cellulaire. Cette action a pour but de permettre notamment l'introduction dans l'organisme de nanotubes enrobés d'une substance contenant un ou plusieurs type de macro-molécules, il peut s'agir par exemple d'agent thérapeutique, puis d'activer ces nanotubes à l'aide d'un champ électromagnétique localisé permettant la pénétration dans la cellule puis la libération desdits agents afin de générer un traitement localisé. Ainsi ce type de procédé ouvre des possibilités en terme de lutte contre des maladies telles que le cancer en limitant le traitement à la zone contaminée. Ce procédé permet notamment de transférer un gène et/ou un médicament à l'intérieur du cytoplasme des cellules cibles. Le procédé s'applique à des applications tant in vitro qu'in vivo et permet une poration réversible des cellules sans dégradation des cellules impliquées par le traitement. Plus précisément la présente invention a pour objet un procédé de poration de cellules contenues dans un substrat, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en présence du substrat, avec des nanotubes assurant une fonction de récepteur hyperfréquences et avec des macro-molécules pouvant être de type médicament y compris les acides nucléiques et transférables dans des cellules; l'application d'un champ électromagnétique permettant de générer une excitation électromagnétique absorbée par lesdits nanotubes générant la poration desdites cellules par circulation d'électrons au sein desdits nanotubes. Selon une variante de l'invention, le champ électromagnétique émet dans la bande de fréquence des Gigahertz. Selon une variante de l'invention, le champ électromagnétique est ~o appliqué en continu. Selon une variante de l'invention, le champ électromagnétique est appliqué de manière pulsée. Selon une variante de l'invention, les nanotubes sont utilisés en solution à une concentration comprise entre environ 0,5 tag/ml et 500 pg/mI. 15 Selon une variante de l'invention, les nanotubes sont mis en contact direct avec le substrat par mélange direct. Selon une variante de l'invention, les nanotubes sont mis en contact avec le substrat par administration systémique. Selon une variante de l'invention, les nanotubes sont mis en 20 contact avec le substrat par injection parenthéale pouvant être par intraveineuse. Selon une variante de l'invention, les nanotubes sont enrobés par un liant contenant des macro-molécules transférables dans des cellules. Selon une variante de l'invention, le procédé comprend une 25 opération de fonctionnalisation des nanotubes avec un agent tensio-actif. L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre donnée à titre non limitatif et grâce aux figures annexées parmi lesquelles : la figure 1 illustre les structures de nanotubes ; les figures 2a et 2b illustrent la structure de NTC fonctionnalisés utilisés dans l'invention et leur comportement en tant que nano-antennes; les figures 3a et 3b illustrent I"efficacité du transfert de gènes dans des cellules bactériennes exposées à un champ 30 35 électromagnétique pour différentes puissances et différentes augmentations de température du substrat (durée d'exposition 30 secondes), b) efficacité du transfert de gènes dans des cellules bactériennes exposées à un CEM à une puissance de 5 W (durées d'exposition 30 secondes et 5 secondes); les figures 4a à 4c illustrent l'augmentation de température linéaire (R2 = 0,9992) en fonction de la puissance (a) qui est due à l'échauffement de l'eau (b) et est indépendante de la concentration des nano-antennes (c). De manière générale, les définitions ci-après sont utilisées dans la description qui suit : Un substrat : tout matériau contenant des cellules vivantes, en particulier une partie d'un être vivant (végétal, humain ou animal), ou un substrat séparé de l'être vivant et contenu dans un récipient (par exemple une culture de cellules animales, végétales ou fongiques). Un champ électromagnétique EM champ physique produit par des objets électriquement chargés. Il est caractérisé par son amplitude, sa 20 fréquence (Hz) et sa puissance (W). Un médicament : toute molécule devant être transférée dans des cellules, y compris les acides nucléiques. Le fonctionnement hyperfréquence sur lequel se base la présente 25 invention est décrit ci-après : Premier principe utilisé : l'antenne filaire Le principe d'une antenne filaire consiste à faire résonner une onde électromagnetique dans un conducteur métallique linéaire soumis à un champ EM à une fréquence donnée. De même que pour les principes de 30 résonance acoustique, la résonance d'une onde EM est soumise aux dimensions de l'élément métallique servant de support à l'onde EM. La longueur d'onde associée doit être de dimension adaptée à la longueur de l'élément métallique. La conséquence directe est que si l'on place une barre métallique de longueur égale à ou T,/2 (À. la longueur d'onde définie par Â f , c la vitesse de propagation de l'onde et f la fréquence de cette onde) alors on obtient une résonance EM dans le conducteur métallique. La conséquence de cette résonance dans le conducteur métallique linéaire est l'apparition d'un courant alternatif dans ce conducteur. Cette énergie est en partie dissipée par effet Joule (en fonction de la résistivité du conducteur) et en partie ré-émise dans le milieu. Second principe utilisé : les Nanotubes de Carbone (NTC) ~o Les CNT sont des éléments de taille nanométrique (typiquement leur diamètre, la longueur d'un NTC pouvant atteindre quelque centimètres.) constitués d'atome de carbone. Ces derniers sont organisés comme une feuille de graphène (a) enroulé sur elle même afin de former un tube mono-couche (b) (SWNT) mais 15 peut aussi se retrouver en éléments concentrique (c) (MWNT) comme illustré en figure 1. Les propriétés électromagnétiques de ces NTC sont très différentes de celles d'un fil métallique de taille macroscopique. Du fait de leur structure, la vitesse de propagation d'une onde est beaucoup plus faible (de l'ordre de 20 1/50 à 1/1 oo) mais leur résistance beaucoup importante. Tout cela est principalement dû à leur taille d'échelle atomique. Ils restent malgré tout bien plus intéressants que des nanofils de métal dont la conductivité à ces dimensions peut être considérée comme quasi nulle. Suivant les principes d'électroporation exposés plus haut, un des 25 buts de la présente invention est de permettre l'introduction des NTC sélectivement dans une zone de l'organisme sur laquelle on souhaite travailler puis d'exposer cette zone à des micro-ondes afin de générer l'électroporation des membranes cellulaire dans cette zone. Selon une variante de l'invention, les NTC peuvent avantageusement 3o être des intermédiaires enrobés d'une substance servant à fixer les molécules que l'on souhaite faire passer dans les cellules. Les figures 2a et 2b illustrent à cet effet, des nanotubes fonctionnalisés et se comportant comme des nano-antennes. Les NTC sont ainsi utilisés comme nano-antennes réceptrices qui sous l'influence d'un champ EM vont à la fois créer l'électroporation nécessaire pour permettre le passage de macro-molécule à travers la membrane cellulaire et la libération de cesdites macro-molécules de la couche qui enrobe les NTC pour les besoins du transport de ces macro-molécules. Suivant des principes démontrés par expériences, les NTC agissent comme récepteurs hyperfréquence ayant une longueur appropriée à la longueur d'onde utilisée pour les exciter (ou bien les harmoniques). Ils réceptionnent ainsi l'énergie de cette onde hyperfréquence qui génère dans chacun d'eux une circulation d'électrons. Les nanotubes présentant un facteur d'absorption relativement élevé en dessous de 100 GHz, la très grande partie de cette énergie reçue est ainsi dissipée en générant l'électroporation d'une part et en chaleur d'autre part, libérant la couche d'enrobage et les macro-molécules qu'elle contient. Selon l'invention, la fonction des médiateurs de poration cellulaire, remplie par la NTC, est réalisée par exploitation de leurs propriétés d'antenne. Cela se produit quand les NTC sont placés près des cellules-cibles. Par exposition du substrat au champ électromagnétique, les nanotubes induisent le phénomène de perméabilisation de la membrane cellulaire, en permettant l'administration intracellulaire de molécules thérapeutiques. Dans la production à grande échelle de NTC, le produit natif (tel que préparé) existe sous forme d'agglomérats ayant une taille allant jusqu'à cent micromètres. Ces NTC vierges sont entièrement hydrophobes et ne peuvent donc être utilisés à des fins biologiques. Pour toute application biomédicale, il est donc essentiel que les NTC soient traités, de façon à leur permettre de subir une dispersion dans l'eau. La solution/dispersion de NTC utilisée dans le procédé décrit par la présente invention est réalisée par des modes opératoires bien établis dans le domaine, par exemple ceux qui sont décrits dans T. Saito et al., Chemical treatment and modification of multi-walled carbon nanotubes, Physica B 323:280-283, 2002. Le but du traitement est de produire une solution cytocompatible de nanotubes revêtus/enveloppés de polymères, de tensioactifs, etc. Le mécanisme d'enveloppement peut être ionique, non ionique, 35 covalent, etc. Ces nanotubes fonctionnalisés (NTC-f) sont utilisés à des concentrations variant de 0,1 à 500 pg/mI. Les concentrations préférées sont comprises dans la plage de 1 à 10 pg/ml. Exemple de réalisation de fonctionnalisation de nanotubes Selon un exemple de l'invention, les nanotubes de carbone de type MWNT pour « multi-wall nanotube » sont fabriqués de manière connue selon un procédé classique de croissance par dépôt chimique en phase vapeur encore couramment dénommé « CCVD » pour « catalytic chemical vapor deposition » ou « CVD » pour « chemical vapor deposition » en utilisant des sources d'hydrocarbones déposées sur un substrat d'oxyde de type AI2O3 imprégné de catalyseur métallique à base de fer comme décrit dans l'article de Kouravelou KB, Sotirchos SV, Verykios XE. Catalytic effects of production of carbon nanotubes in a thermogravimetric CVD reactor. Surf Coat Technol 2007;201:9226û31. On effectue l'enrobage des nanotubes de carbone de la façon suivante dans un second temps, en réalisant une fonctionnalisation des nanotubes avec un agent tensio-actif de type Pluronic F127 correspondant à un copolymère bloc de polyoxyethyleneûpolyoxypropylene block commercialisé par la société Sigma, St. Louis, MO. Plus précisément, les nanotubes sont dispersés dans une solution de tensio-actif soluble dans l'eau, de poids moléculaire égal à 12 600. Typiquement 5 mg de nanotubes sont mélangés avec 10 ml de solution comportant du Plutonic F127, dans une solution tamponnée de phosphate. Le mélange est disposé sur une plaque chauffée à 70°C sous une agitation magnétique durant 4 heures, puis passé aux ultrasons avec un appareil à ultrasons de type Branson 2510 (commercialisé par la société Brasonoc, CT, USA) à 20 W pendant 12 heures. Le mélange est finalement centrifugé. Les nanotubes ainsi traités conservent leurs propriétés électroniques initiales comme décrit dans l'article de Zhang J, Zou H, Qing Q, Yang Y, Li Q, Liu Z, et al. Effect of chemical oxidation on the structure of single-walled carbon nanotubes. J Phys Chem B 2003;107:3712. II est à noter que le Pluronic en faible concentration comme dans le présent cas, ne présente pas de problème particulier de toxicité comme décrit dans l'article de Monteiro-Riviere NA, Inman AO, Wang YY, Nemanich RJ. Surfactant effects on carbon nanotube interactions with human keratinocytes. Nanomed: Nanotechnol Biol Med 2005;1:293-9. Les nanotubes MWNT ainsi obtenus sont traités avec de l'acide nitrique pour obtenir des nanotubes de type COOH-MWNT. Les nanotubes sont passés aux ultrasons pendant 10 minutes dans de l'acide HNO3 à raison de 65 %. La solution est agitée à 220°C pendant 20 minutes, refroidie à température, filtrée puis finalement séchée à température ambiante durant quelques heures. 100 pg de COOH-MWNT sont dispersés dans 20m1 d'un mélange anhydride de dimethylformamide (DMFA) / anhydride de dichlorométhane (DCM) dans le ratio 1 : 2 et refroidi. A cette solution, 2ml d'hydroxybenzotriazole (HOBt) dans le DMFA (125 pg/ml, 37 eqv) sont ajoutés et le mélange est agité 10 minutes. 1ml of 1-Ethyl-3-(3-d imethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDAC) dans du DMFA (100 pg/l ml, 10egv) sont ajoutés lentement pour réagir puis être agités durant 30 minutes à une température de 0°C, puis durant 3heures à température ambiante. Ainsi des nanotubes actifs sont obtenus par filtration à travers une 20 membrane de Nylon 66 (avec des pores de 0.45pm de diamètre). La solution recueillie est lavée dans 200m1 de DCM anhydride et remise en excès dans du EDAC et du HOBt. Les nanotubes sont alors dispersés dans 10 ml de DCM anhydride et ajoutés doucement à une solution de PEI (MW = 25000gmol"1, 1.0g) dans 25 40m1 de DCM anhydre à une température de 0°C. La réaction est obtenue sous agitation durant 30 minutes à 0°C puis, une nuit à température ambiante. Les nanotubes résultants sont filtrés à travers une membrane de Nylon 66 puis lavée dans 30 ml de DCM anhydride, 50 ml d'éthanol, 100 ml 30 d'eau et 20 ml de EtOH. Après séchage sous vide, on obtient 88,5 mg de nanotubes fonctionnalisés. La solution de NTC préalablement obtenue, peut être mise en contact avec les cellules et le substrat, de différentes manières en fonction 35 de l'administration, par exemple par simple mélange, administration systémique ou injection intraveineuse, intramusculaire ou directe dans les tissus lésés. Exemple de réalisation du procédé de l'invention : Les résultats d'essais expérimentaux effectués sur des cellules bactériennes de E.coli sont décrits ci-dessous et illustrés sur les figures 3a-3b et 4a-4c. Dans le protocole orthodoxe existant de transfection bactérienne, les cellules bactériennes viables sont placées sur de la glace avec de l'ADN, ~o puis soumises brièvement à un choc thermique (par exemple 42°C pendant 30 secondes), ce qui amène l'ADN à pénétrer dans la cellule. Dans les expériences décrites, des cellules bactériennes sont incubées sur de la glace pendant 30 minutes avec une solution préparée par mélange de 2 pg d'ADN plasmidique à 0,25 pg de nanotubes fonctionnalosés NTC-f (complexe NTC- 15 f:ADNp). Cette solution est ensuite exposée à une énergie électromagnétique (longueur d'onde environ 3 cm, gamme de puissances 0,1-5 Watt, fréquence 10 GHz et durée d'exposition 5-60 secondes à la température ambiante). Dans ces expériences, le squelette plasmidique contient un 20 promoteur bactérien exprimant la résistance à la kanamycine dans E. coll. Ainsi, les plasmides utilisés dans ces expériences de transfection contiennent un gène conférant une résistance à l'antibiotique kanamycine. Après la transfection effectuée par cette nouvelle technique, on identifie les cellules bactériennes qui ont acquis l'ADNp, en plaquant une boîte de Petri 25 pré-traitée avec 30 pg/ml de kanamycine, car seules les bactéries transfectées avec le gène de la résistance à la kanamycine sont à même de croître en présence de cet antibiotique, alors que les cellules bactériennes non transfectées ne subissent aucune croissance. Tous les essais sont effectués dans un tube Eppendorf avec un 30 volume d'échantillon de 50 pl. La température pendant l'exposition au rayonnement de champ électromagnétique est suivie à l'aide d'un thermocouple type k (sensibilité 0,1°C). En l'absence d'application du champ électromagnétique, le nombre de colonies croissant dans les boîtes de Petri est d'environ 50 (essai témoin). 35 On applique ainsi différentes puissances pendant 30 secondes, tout en surveillant l'augmentation correspondante de température et le nombre de colonies ayant subi une croissance. Comme on le voit sur la figure 3a, l'efficacité optimale de transfection de cellules bactériennes de E. Coli est réalisée avec 1 W. L'augmentation de la transfection des bactéries est, en présence de la nano-antenne (NTC-f:ADN) beaucoup plus grande qu'en présence de l'ADN seul (ou du f:ADNp, données non représentées). L'efficacité observée de la transsection diminue avec une augmentation ou une diminution de la puissance au-delà ou en dessous de 1,0 W. A 0,1 W (augmentation de température : 2,5°C), le nombre de colonies est de 50 (analogue au témoin) et de 100, pour des cellules respectivement en contact avec l'ADN et le NTC-f:ADN. A 0,5 W (augmentation de température : 4,5°C), le nombre de colonies est de 100 et de 400, pour les cellules respectivement en contact avec l'ADN et le NTC- f:ADN. A 1 W (augmentation de température : 7°C), le nombre de colonies est de 350 et de 800 pour les cellules respectivement en contact avec l'ADN et le NTC-f:ADN. A 5 W (augmentation de température: 35°C), toutes les cellules sont tuées à cause de l'effet d'échauffement. Les données expérimentales montrent que les résultats réalisés à 1 W pendant 30 secondes sont très analogues à ceux obtenus à 5 W pendant 5 secondes (figure 3b), ce qui révèle que l'efficacité de la transfection dépend de l'énergie libérée, plutôt que de la puissance appliquée. On observe aussi que l'augmentation de la température est linéaire (R2 = 0,9992) en fonction de la puissance. Cette augmentation résulte de l'échauffement de l'eau et est indépendante de la concentration des nanotubes comme illustré en figures 4a-4c. Toutes les données expérimentales sont en accord avec la théorie selon laquelle les nanotubes fonctionnent comme une antenne réceptrice, capable d'induire une augmentation locale de la perméabilisation de la membrane cellulaire. La poration cellulaire de la présente invention convient aux applications tant in vitro qu'in vivo, et les moyens permettant de transposer le procédé dans la pratique vont varier en fonction de l'objectif prévu pour la poration cellulaire. Par exemple, s'il s'agit d'une culture de cellules fixées dans une boîte de culture de cellules, on peut l'exposer au rayonnement émis par une source appropriée. Dans le cas de petits animaux (par exemple le rat ou la souris), la partie de l'animal (par exemple la tête, un membre, etc.) peut être placée dans le trou foré dans un tube métallique directement raccordé au générateur d'ondes. Si la poration cellulaire doit impliquer des parties plus importantes des animaux, ou une partie du corps humain, une chambre métallique appropriée pourrait être développée. Le procédé de poration cellulaire selon la présente invention peut être utilisé pour (i) la recherche et les investigations et (ii) des applications thérapeutiques cliniques, par exemple l'administration ciblée de médicaments, y compris l'électrochimiothérapie des tumeurs, et la thérapie génique pour toute une gamme de troubles cliniques. Grâce à ce procédé, on peut introduire dans des cellules/des tissus cibles, en utilisant aussi, si nécessaire, une nanoparticule fonctionnalisée par des substances ou des molécules du type décrit ci-dessus, des molécules bioactives en général, des acides nucléiques et un matériel génétique, des protéines, des substances ayant des propriétés pharmacologiques et des agents chimiothérapeutiques, des neurorégénérateurs, etc. Un avantage important du procédé de poration cellulaire selon la présente invention réside dans le fait que l'utilisation des nanotubes, en tant que traitement localisé, permet une poration ciblée et sélective, seulement des cellules traitées par des NTC, ce qui évite une perméabilisation involontaire ou indésirable des tissus environnants, perméabilisation qui se produit avec les procédés d'électroporation existants. Le procédé décrit par la présente invention peut aussi être appliqué à la mise en oeuvre d'une lyse cellulaire par une poration (ou une ablation) irréversible des cellules, par une augmentation de la puissance appliquée (par exemple pour le traitement du cancer).30 REVENDICATIONS1. Procédé technique de poration in vitro de cellules contenues 5 dans un substrat, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en présence du substrat, avec des nanotubes assurant une fonction de récepteur hyperfréquences et avec des macro-molécules pouvant être de type médicament y compris les acides nucléiques et transférables dans des cellules ; 10 - l'application d'un champ électromagnétique permettant de générer une excitation électromagnétique absorbée par lesdits nanotubes générant la poration desdites cellules par circulation d'électrons au sein desdits nanotubes. 15 2. Procédé technique de poration in vitro selon la revendication 1, caractérisé en ce que le champ électromagnétique émet dans la bande de fréquence des Gigahertz. 3. Procédé technique de poration in vitro selon l'une des 20 revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le champ électromagnétique es appliqué en continu. 4. Procédé technique de poration selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le champ électromagnétique est appliqué de 25 manière pulsée. 5. Procédé technique de poration in vitro selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les nanotubes sont utilisés en solution à une concentration comprise entre environ 0,5 tag/ml et 500 tag/ml. 6. Procédé technique de poration in vitro selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les nanotubes sont mis en contact direct avec le substrat par mélange direct. 30 7. Procédé technique de poration in vitro selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les nanotubes sont enrobés par un liant contenant les macro-molécules transférables. 8. Procédé technique de poration in vitro selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend une opération de fonctionnalisation des nanotubes avec un agent tensio-actif. 10 9. Utilisation de nanotubes pour la préparation d'un support pour l'électroporation enrobé d'une composition pharmaceutique susceptible d'être introduite par électroporation au travers d'une membrane cellulaire. 10. Utilisation de nanotubes pour la préparation d'un support pour 15 l'électroporation enrobé d'une composition pharmaceutique susceptible d'être introduite par électroporation au travers d'une membrane cellulaire, les nanotubes étant enrobés par un liant contenant des macro-molécules transférables. 20