FR 2957922 A1 20110930 FR 1052249 A 20100326 NOUVELLES PROTÉINES DE FUSION CBH1-EG1 ET LEUR UTILISATION La présente invention a pour objet de nouvelles protéines de fusion comprenant des enzymes dégradant les parois cellulaires végétales, et leur utilisation dans un procédé de production d'éthanol à partir de biomasse lignocellulosique. La biomasse lignocellulosique représente une des ressources renouvelables les plus abondantes sur terre, et certainement une des moins coûteuses. Les substrats considérés sont très variés, puisqu'ils concernent à la fois les substrats ligneux (feuillus et résineux), les sous-produits de l'agriculture (paille) ou ceux des industries génératrices de déchets lignocellulosiques (industries agroalimentaires, papeteries). La biomasse lignocellulosique est composée de trois principaux polymères : la cellulose (35 à 50%), l'hémicellulose (20 à 30%) qui est un polysaccharide essentiellement constitué de pentoses et d'hexoses et la lignine (15 à 25%) qui est un polymère de structure complexe et de haut poids moléculaire, composé d'alcools aromatiques reliés par des liaisons éther. Ces différentes molécules sont responsables des propriétés intrinsèques de la paroi végétale et s'organisent en un enchevêtrement complexe. La cellulose et éventuellement les hémicelluloses sont les cibles de l'hydrolyse enzymatique mais ne sont pas directement accessibles aux enzymes. C'est la raison pour laquelle ces substrats doivent subir un prétraitement précédant l'étape d'hydrolyse enzymatique. Le prétraitement vise à modifier les propriétés physiques et physicochimiques du matériau lignocellulosique, en vue d'améliorer l'accessibilité de la cellulose engluée dans la matrice de lignine et d'hémicellulose. Il peut également libérer les sucres contenus dans les hémicelluloses sous forme de monomères, essentiellement des pentoses, comme le xylose et l'arabinose, et des hexoses, comme le galactose, le mannose et le glucose. Le prétraitement doit dans l'idéal être rapide et efficace, à fortes concentrations en substrats, et les pertes de matières doivent être minimales. De nombreuses technologies existent : on peut citer les cuissons acides, les cuissons alcalines, l'explosion à la vapeur (Pourquié, J. et Vandecasteele, J.P. (1993) Conversion de la biomasse lignocellulosique par hydrolyse enzymatique et fermentation. Biotechnologie, 4e édition, René Scriban, coordinateur Lavoisier TEC & DOC, Paris, 677-700.), les procédés Organosolv, ou encore les technologies bi-vis combinant des actions thermique, mécanique et chimique (Ogier J.-C. et al. (1999) Production d'éthanol à partir de biomasse lignocellulosique. Oil & Gas Science and Technology (54): 67-94). L'efficacité du prétraitement se mesure par la susceptibilité à l'hydrolyse du résidu cellulosique et le taux de récupération des hémicelluloses. D'un point de vue économique, il semble préférable que le prétraitement conduise à une hydrolyse totale des hémicelluloses, de façon à récupérer les pentoses et éventuellement les valoriser séparément de la fraction cellulosique. Les prétraitements acides en conditions douces et par explosion à la vapeur sont bien adaptés. Ils permettent une récupération importante des sucres issus des hémicelluloses et une bonne accessibilité de la cellulose à l'hydrolyse. Le résidu cellulosique obtenu est hydrolysé par voie enzymatique par l'utilisation d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. Des microorganismes, comme les champignons appartenant aux genres Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Schizophyllum, Chaetomium, Magnaporthe, Podospora, Neurospora, ou les bactéries anaérobies appartenant par exemple au genre Clostridium, produisent ces enzymes, contenant notamment les cellulases et les hémicellulases, adaptées à l'hydrolyse totale de la cellulose et des hémicelluloses. L'hydrolyse enzymatique s'effectue dans des conditions douces (température de l'ordre de 45-50°C et pH de 4,8) et est efficace. En revanche en termes de procédé, le coût des enzymes reste très élevé. De ce fait, beaucoup de travaux ont été conduits pour réduire ce coût : i) augmentation de la production d'enzymes d'abord, en sélectionnant des souches hyperproductrices et en améliorant les procédés de fermentation, ii) diminution de la quantité d'enzymes en hydrolyse ensuite, en optimisant la phase de prétraitement ou en améliorant l'activité spécifique de ces enzymes. Au cours de la dernière décennie, les principaux travaux se sont attachés à comprendre les mécanismes d'action des cellulases et d'expression des enzymes afin de faire excréter le complexe enzymatique le plus approprié à l'hydrolyse des substrats lignocellulosiques en modifiant les souches avec les outils de biologie moléculaire. Les champignons filamenteux, en tant qu'organismes cellulolytiques, présentent un grand intérêt pour les industriels puisqu'ils ont la capacité de produire des enzymes extracellulaires en très grande quantité. Le microorganisme le plus utilisé pour la production de cellulases est le champignon Trichoderma reesei. Ce champignon a la faculté de produire, en présence d'un substrat inducteur, la cellulose par exemple, un sécrétome (ensemble des protéines sécrétées) adapté à l'hydrolyse de la cellulose. Les enzymes du complexe enzymatique contiennent trois grands types d'activités : les endoglucanases, les exoglucanases et les f3-glucosidases. D'autres protéines possédant des propriétés indispensables à l'hydrolyse des matériaux lignocellulosiques sont également produites par Trichoderma reesei, les xylanases par exemple. La présence d'un substrat inducteur est indispensable à l'expression des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. La nature du substrat carboné a une forte influence sur la composition du complexe enzymatique. C'est le cas du xylose, qui, associé à un substrat carboné inducteur comme la cellulose ou le lactose, permet d'améliorer significativement l'activité dite xylanase. Les techniques de génétique classique par mutagenèse ont permis la sélection de souches de Trichoderma reesei hyperproductrices de cellulases telles que les souches MCG77 (Gallo - brevet US 4275 167), MCG 80 (Allen, A.L. et Andreotti, R.E., Biotechnol-Bioengi 1982, (12): 451-459), RUT C30 (Montenecourt, B.S. et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, (34): 777-782) et CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM « Génétique des microorganismes industriels ». Paris. H. HESLOT Ed, p. 39-50). Les améliorations ont permis d'obtenir des souches hyperproductrices, moins sensibles à la répression catabolique sur sucres monomères notamment, glucose par exemple, que les souches sauvages. La banalisation des techniques génétiques, visant à exprimer des gènes hétérologues au sein de ces souches fongiques, a aussi ouvert la voie vers l'utilisation de ces micro-organismes en tant qu'hôtes pour la production industrielle. Les nouvelles techniques d'études des profils enzymatiques, ont rendu possible la création de souches fongiques hôtes très efficaces pour la production d'enzymes recombinantes à l'échelle industrielle [Nevalainen, H. and Teo, V.J.S. (2003) Enzyme production in industrial fungi-molecular genetic strategies for integrated strain improvement. In Applied Mycology and Biotechnology (Vol. 3) Fungal Genomics (Arora, O.K. and Kchachatourians, G.G., eds), p. 241-259, Elsevier Science]. Un des exemples de ce type de modifications est la production de cellulases issues d'une souche de T. reesei [Harkki, A. et al. (1991) Genetic engineering of Trichoderma to produce strains with novel cellulase profiles. Enzyme Microb. Technol. (13): 227-233; Karhunen, T. et al. (1993) High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. 1. Endoglucanase 1 overproduction. Mol. Gen. Genet. (241): 515-522]. Un autre exemple est la production de protéines de fusion entre deux enzymes jouant des rôles complémentaires pour la dégradation de parois cellulaires végétales. WO07/115723, notamment, décrit une protéine de fusion entre une swollenine dépourvue d'activité hydrolytique (mais capable de casser les liaisons hydrogènes entre les chaînes de cellulose ou les microfibrilles de cellulose et les autres polymères de la paroi végétale), et une deuxième enzyme pourvue d'activité hydrolytique. D'autre part, il convient de citer dans le cadre de la présente invention, les protéines de fusion hétérologues exo-endocellulasiques. WO97/27306 décrit une protéine de fusion entre une exo-cellobiohydrolase CBH1 de champignon (laquelle exo-cellobiohydrolase comprend son peptide signal et sa région catalytique toutes deux séparées par une région charnière propre au dit champignon), et une endoglucanase El, E2, E4 ou E5 issue de la bactérie Thermobidifa fusca, ladite protéine de fusion étant par ailleurs dépourvue de CBM. De même, WO07/019949 décrit des protéines de fusion exo-endocellulasiques, l'une desquelles contient une exo-cellobiohydrolase CBH1 de champignon (dans laquelle le peptide signal est celui de la feruloyl esterase A d'Aspergillus niger), associée à une autre enzyme de dégradation des parois cellulaires, et éventuellement à un CBM. Enfin, EP1740700 décrit des protéines de fusion exo-endocellulasiques, qui peuvent contenir le domaine catalytique d'une exo-cellobiohydrolase telle que CBH1, une endoglucanase de nomenclature EC 3.2.1.4, éventuellement un CBM, et un peptide de liaison. Toutefois cette demande ne décrit spécifiquement que des endonucléases issues de la bactérie Acidothermus cellulolyticus. La présente invention résulte de la découverte faite par les Inventeurs que leurs protéines de fusion peuvent, lorsque mélangées dans des proportions particulières avec un cocktail enzymatique complet de Trichoderma reesei, dégrader des substrats cellulosiques et/ou lignocellulosiques plus efficacement que le seul dit cocktail enzymatique ou que les seules dites protéines de fusion de la présente invention, et ce en particulier lorsque le taux de matière sèche desdits substrats cellulosiques ou lignocellulosiques est élevé. Ce résultat s'avère particulièrement intéressant dans le cadre de procédés tels que celui de production de bioéthanol à partir de substrats cellulosiques et/ou lignocellulosiques, et des autres procédés dans lesquels la quantité d'eau nécessaire au fonctionnement des glycosides hydrolases telles que les cellobiohydrolases et les endoglucanases, est réduite. La présente invention a donc pour objet des protéines de fusion dégradant les parois cellulaires végétales, lesdites protéines comprenant : i) une enzyme qui est une protéine recombinante constituée de l'intégralité d'une cellulase ou d'une hémicellulase native de champignon, ou constituée d'un fragment fonctionnel de celle-ci, ou encore d'une forme mutée fonctionnelle de celle-ci, ii) une enzyme qui est une protéine recombinante constituée du domaine catalytique d'une cellulase fongique appartenant à la famille GH6 ou GH7, ou constituée d'une forme mutée fonctionnelle de celle-ci ayant une séquence présentant au moins 70% d'homologie ou d'identité avec la séquence dudit domaine catalytique, iii) un peptide signal, lequel est placé à l'extrémité N-terminale desdites protéines de fusion en amont des enzymes mentionnées en i) et ii), et ledit peptide signal étant issu de la cellulase ou de l'hémicellulase natives mentionnées en i), ou étant issu de la cellulase native de T. reesei mentionnée en ii), iv) un module de liaison aux polysaccharides issu de la cellulase ou de l'hémicellulase natives mentionnées en i), ou de la cellulase native de T. reesei 20 mentionnée en ii), et chacun des constituants i), ii) et iv) est relié à un ou deux autres des constituants i), ii) et iv) tout au plus, par au moins un peptide de liaison de séquences identiques ou différentes composées de 10 à 100 acides aminés. Par « cellulase » on entend une enzyme telle qu'une endoglucanase, une 25 exoglucanase, une cellobiohydrolase, ou une 13-glucosidase. Par « hémicellulase », on entend une enzyme hydrolysant les carbohydrates constituant les hémicelluloses, telle qu'une xylanase. Par « fragment fonctionnel » on entend une protéine ou une séquence peptidique obtenue après troncature de la protéine ou séquence peptidique originale, et 30 qui possède une activité catalytique sensiblement identique à l'activité catalytique de ladite protéine entière ou de ladite séquence peptidique originale. Le terme « fragment fonctionnel » comprend les « fragments » et « segments » de ladite protéine entière ou de ladite séquence peptidique originale. Dans la définition du fragment fonctionnel, les 10 15 termes « protéine » et « séquence peptidique » désignent une chaîne contiguë de plusieurs acides aminés reliés les uns aux autres par des liaisons peptidiques. Par « forme mutée fonctionnelle » on entend une protéine ou une séquence peptidique obtenue après modification de la protéine ou séquence peptidique originale, et qui possède une activité catalytique sensiblement identique à l'activité catalytique de ladite protéine entière ou de ladite séquence peptidique originale dont elle est issue. Ladite forme mutée fonctionnelle de la protéine entière ou de la séquence peptidique originale peut ou non contenir des modifications post-traductionnelles, telle qu'une glycosylation si une telle modification n'empêche pas l'activité biologique mentionnée. Dans la définition de la forme fonctionnelle mutée, les termes « protéine » et « séquence peptidique » désignent tout chaîne contiguë contenant plusieurs acides aminés, reliés par des liaisons peptidiques. Le terme « séquence peptidique » employé dans cette définition désigne aussi les chaînes courtes, communément appelées peptides, oligopeptides et oligomères. Ladite forme mutée fonctionnelle peut ou non contenir des acides aminés autres que les 20 acides aminés codés, comme par exemple l'hydroxyproline ou la sélénométhionine, ainsi que tout autre acide aminé non essentiel et non protéinogène. Lesdites formes mutées fonctionnelles comprennent celles qui sont modifiées par des processus naturels, tels que la maturation moléculaire et les autres modifications post-traductionnelles, mais aussi par des techniques de modification chimique. De telles modifications sont bien décrites dans la littérature et bien connues de l'homme de l'art. Dans la définition de la forme mutée fonctionnelle, un même type de modification peut être présent dans la même protéine ou dans la même séquence peptidique sur plusieurs sites de ladite protéine ou de ladite séquence peptidique, et à des degrés divers. Par ailleurs, ladite protéine ou séquence peptidique peut contenir différents types de modifications. Par « domaine catalytique d'une cellulase », on entend le module de la chaîne polypeptidique responsable de l'action hydrolytique sur le substrat cellulosique ou lignocellulosique. Par « famille GH6 ou GH7 », on désigne les familles de Glycosides Hydrolases (GH) n° 6 et 7 d'après la classification de la base de données CAZY (Carbohydrate Active enZYme database). La base CAZY est accessible en ligne (http://www.cazy.org/). Par « peptide signal » on entend le fragment de la protéine ou de la séquence peptidique de la cellulase ou de l'hémicellulase dont il est issu, et qui a pour fonction de diriger le transport de ladite protéine de fusion vers le milieu extracellulaire de l'hôte duquel est issu la protéine, et notamment la SEQ ID NO: 2 codée par la SEQ ID NO: 1. Par « module de liaison aux polysaccharides » (CBM, Carbohydrate Binding Module), on entend une séquence peptidique possédant une affinité suffisante avec la cellulose ou la lignocellulose pour ancrer la protéine native dont elle est issue sur ladite cellulose Il existe des CBM de type I, II ou III, qui sont des molécules bien connues de l'homme de l'art. Les CBM employés dans la présente invention sont préférentiellement de type I, notamment la séquence peptidique de SEQ ID NO: 8 codée par la SEQ ID NO: 7, correspondant au CBM de l'exo-cellobiohydrolase CBH1. Par « peptide de liaison », on entend une chaîne contiguë constituée de 10 à 100 acides aminés, et préférentiellement de 10 à 60 acides aminés. Des peptides de liaison peuvent être éventuellement utilisés pour relier les différents constituants des protéines de fusion mentionnés de i) à iv). Ainsi, le peptide signal mentionné en iii) ne peut être relié qu'à un seul constituant choisi parmi i), ii) et iv), et chacun des constituants i), ii) et iv) ne peut être relié qu'à un ou deux autres des constituants i), ii) et iv) tout au plus, par au moins un peptide de liaison de séquences identiques ou différentes composées de 10 à 100 acides aminés. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la forme mutée fonctionnelle de l'enzyme ii) a une séquence présentant au moins 75%, avantageusement au moins 80 % d'homologie ou d'identité, plus avantageusement au moins 85 % d'homologie ou d'identité, encore plus avantageusement au moins 90 % d'homologie ou d'identité, ou 95 % ou 99% d'homologie ou d'identité avec la séquence du domaine catalytique de ladite enzyme. Toutes les formes présentant les homologies ou identités susmentionnées conservent une activité catalytique sensiblement identique à l'activité catalytique de la protéine ou de la séquence peptidique originale dont elles sont issues. Dans un autre mode de réalisation préféré, aucun peptide de liaison n'est utilisé pour relier le peptide signal à l'un des constituants i), ii) ou iv). Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le module de liaison aux polysaccharides est inséré entre les deux enzymes mentionnées en i) et ii), et est relié à chacune d'elle par un peptide de liaison différent. Dans un mode de réalisation préféré, les peptides de liaisons sont choisis parmi les séquences de SEQ ID NOS: 6 et 10, codées respectivement par les SEQ ID NOS: 5 et 9, et correspondant aux peptides de liaison des exo-cellobiohydrolases CBH1 et CBH2 respectivement. Enfin, dans un autre mode de réalisation, les peptides de liaison utilisés sont hyperglycosylés. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les protéines de fusion sont des protéines dans lesquelles la cellulase fongique mentionnée en ii) appartient à Trichoderma reesei. Dans un autre mode de réalisation encore plus avantageux de l'invention, les protéines de fusion, sont des protéines de fusion dans lesquelles le champignon mentionné en i) appartient : aux ascomycètes, incluant les genres Aspergillus, Chaetomium, Magnaporthe, Podospora, Neurospora, et Trichoderma, ou aux basidiomycètes, incluant les genres Halocyphina, Phanerochaete et Pycnoporus. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux, le champignon mentionné en i) est choisi dans le groupe constitué de : Aspergillus fumigatus, Aspergillus piger, Aspergillus tubingensis, Chaetomium globosum, Halocyphina villosa, Magnaporthe grisea, Phanerochaete chrysosporium, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus, Trichoderma reesei. Dans un autre mode de réalisation encore plus avantageux de l'invention, les protéines de fusion sont des protéines de fusion dans lesquelles le domaine catalytique de la cellulase mentionnée en ii) a pour séquence la SEQ ID NO: 12 codée par la SEQ ID NO: 11, correspondant au domaine catalytique de l'Endoglucanase EG1 (EGl°t) de T. reesei. Dans un autre mode de réalisation encore plus avantageux de l'invention, les protéines de fusion selon l'une quelconque des définitions précédentes, sont des protéines de fusion dans lesquelles l'enzyme mentionnée en i) est processive. Par « processive », on entend une cellulase qui peut effectuer plusieurs clivages dans la cellulose ou dans la lignocellulo se avant de s'en détacher. Une enzyme «non processive » est définie dans le cadre de la présente invention comme une enzyme coupant aléatoirement au sein des régions non cristallines du polymère de cellulose. Dans un autre mode de réalisation, les protéines de fusion selon l'une quelconque des définitions précédentes, sont des protéines de fusion dans lesquelles l'enzyme mentionnée en i) a pour séquence la SEQ ID NO: 4 codée par la SEQ ID NO: 3, et correspondant au domaine catalytique de l'exo-cellobiohydrolase CBH1. Dans un encore autre mode de réalisation de l'invention toujours plus avantageux, les protéines de fusion sont des protéines de fusion dans lesquelles l'enzyme mentionnée en i) est processive, et l'enzyme mentionnée en ii) est non processive. Sans être tenu à cette explication, il semble que l'association de l'enzyme processive avec l'enzyme non processive rend les protéines de fusion plus actives sur des substrats à teneur en matière sèche élevée. Dans un autre mode de réalisation encore plus avantageux de l'invention, la protéine de fusion, a pour séquence complète la SEQ ID NO: 14 codée par la SEQ ID NO: 13, ou une forme mutée fonctionnelle de celle-ci. Cette séquence correspond à la protéine représentée dans la figure 1, qui est la protéine de fusion appelée « CBH1-EGlce » Un autre objet de la présente invention est un mélange pour dégrader les parois cellulaires végétales qui comprend une protéine de fusion selon l'une quelconque des définitions précédentes, et un cocktail enzymatique de T. reesei. Par « cocktail enzymatique de T. reesei », on entend le sécrétome de T. reesei ou un mélange commercial tel que l'Econase®. Cette combinaison s'est révélée particulièrement avantageuse pour la dégradation de substrat à teneur en matière sèche élevée, tel qu'illustré dans l'exemple 3. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la protéine de fusion représente entre 1 et 50 % en poids de la combinaison, encore plus avantageusement entre 10 et 50 %. Des acides nucléiques isolés codant pour une protéine de fusion selon l'une quelconque des définitions précédentes, constituent un autre objet de l'invention, notamment la SEQ ID NO: 13. De même, un vecteur d'expression comprenant la molécule d'acides nucléiques selon la définition précédente, constitue aussi un objet de l'invention. Encore un autre objet de la présente invention est une cellule hôte contenant le vecteur d'expression selon la définition précédente, ladite cellule hôte étant une cellule d'un champignon appartenant : aux ascomycètes, incluant les genres Aspergillus, Chaetomium, Magnaporthe, Podospora, Neurospora, et Trichoderma, ou aux basidiomycètes, incluant les genres Halocyphina, Phanerochaete et Pycnoporus. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux, la cellule hôte est une cellule d'un champignon choisi dans le groupe constitué de : Aspergillus fumigatus, Aspergillus piger, Aspergillus tubingensis, Chaetomium globosum, Halocyphina villosa, Magnaporthe grisea, Phanerochaete chrysosporium, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus, Trichoderma reesei. Encore un autre objet de la présente invention est un procédé de préparation d'une protéine de fusion selon l'une quelconque des définitions précédentes, comprenant : la culture in vitro de la cellule hôte selon la définition donnée ci-dessus, et la récupération, suivie éventuellement de la purification de la protéine de fusion produite par ladite cellule hôte. La présente invention a également pour objet l'utilisation des nouvelles protéines de fusion selon l'une quelconque des définitions précédentes, dans un procédé de production d'éthanol à partir de biomasse cellulosique et lignocellulosique. Ainsi, l'invention concerne un procédé de production d'éthanol à partir de matériaux cellulosiques ou lignocellulosiques comprenant : a) au moins une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique, b) au moins une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité puis, au moins une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu, dans lequel l'hydrolyse enzymatique est réalisée par le mélange d'un cocktail enzymatique de champignon sécrété par une souche de Trichoderma reesei, et d'une protéine de fusion constituée de deux enzymes dégradant les parois cellulaires végétales, ladite protéine de fusion représentant entre 1 de 50%, avantageusement entre 10 et 50 % en poids dudit cocktail enzymatique et comprenant : i) une enzyme qui est une protéine recombinante constituée de l'intégralité d'une cellulase ou d'une hémicellulase native de champignon, ou constituée d'un fragment fonctionnel de celle-ci, ou encore d'une forme mutée fonctionnelle de celle-ci, ii) une enzyme qui est une protéine recombinante constituée du domaine catalytique d'une cellulase fongique appartenant à la famille GH6 ou GH7, ou constituée d'une forme mutée fonctionnelle de celle-ci ayant une séquence présentant au moins 70% d'homologie avec la séquence dudit domaine catalytique, iii) un peptide signal, lequel est placé à l'extrémité N-terminale desdites protéines de fusion en amont des deux enzymes mentionnées en i) et ii), et ledit peptide signal étant issu de la cellulase ou de l'hémicellulase natives mentionnées en i), ou étant issu de la cellulase native de T. reesei mentionnée en ii), iv) un module de liaison aux polysaccharides issu de la cellulase ou de l'hémicellulase natives mentionnées en i), ou de la cellulase native de T. reesei mentionnée en ii), et 25 30 chacun des constituants i), ii) et iv) est relié à un ou deux autres des constituants i), ii) et iv) tout au plus, par au moins un peptide de liaison de séquences identiques ou différentes composées de 10 à 100 acides aminés. Dans un mode de réalisation avantageux du procédé, le cocktail enzymatique et la protéine de fusion dont sécrétés directement dans le milieu d'hydrolyse par T. reesei Des exemples de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques sont les suivants : les résidus agricoles et forestiers, les herbacées incluant les graminées, le bois, incluant le bois dur, le bois tendre ou résineux, les pulpes de légumes comme la pulpe de tomate ou de betterave, la biomasse de faible valeur comme les déchets municipaux solides (en particulier le papier recyclé), les cultures annuelles et les cultures dédiées. Le procédé se production de bioéthanol s'inscrit dans le cadre des procédés dits de 2ème génération. Les substrats cellulosiques ou lignocellulosiques employés sont des substrats obtenus à partir de ressources essentiellement non alimentaires. Dans un mode de réalisation plus avantageux de l'invention, le procédé de production d'éthanol tel que décrit ci-dessus est un procédé dans lequel la cellulase fongique mentionnée en ii) appartient à Trichoderma reesei. Dans un autre mode de réalisation plus avantageux de l'invention, l'enzyme du i) de la protéine de fusion mise en oeuvre dans le procédé de production d'éthanol selon l'une quelconque des définitions précédentes est issue d'un champignon appartenant : aux ascomycètes, incluant les genres Aspergillus, Chaetomium, Magnaporthe, Podospora, Neurospora, et Trichoderma, ou aux basidiomycètes, incluant les genres Halocyphina, Phanerochaete et Pycnoporus. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux, les champignon mentionnés en b) et en i) sont choisis indépendamment l'un de l'autre dans le groupe constitué de : Aspergillus fumigatus, Aspergillus piger, Aspergillus tubingensis, Chaetomium globosum, Halocyphina villosa, Magnaporthe grisea, Phanerochaete chrysosporium, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus, Trichoderma reesei. Dans un autre mode de réalisation toujours plus avantageux de l'invention, le procédé de production d'éthanol selon l'une quelconque des définitions précédentes est un procédé dans lequel le domaine catalytique de la cellulase mentionnée en ii) a pour séquence la SEQ ID NO: 12 codée par la SEQ ID NO: 1l, correspondant au domaine catalytique de l'Endoglucanase EG1 (EGl°t) de T. reesei. Dans un encore autre mode de réalisation plus avantageux de l'invention, le procédé de production d'éthanol selon l'une quelconque des définitions précédentes est un procédé dans lequel l'enzyme mentionnée en i) est processive. Dans un encore autre mode de réalisation toujours plus avantageux de l'invention, le procédé de production d'éthanol selon l'une quelconque des définitions précédentes, est un procédé dans lequel les matériaux cellulosiques ou lignocellulosiques ont une teneur en matière sèche comprise entre 3 et 30%, et de préférence entre 5 et 20%. Enfin, dans un encore autre mode de réalisation toujours plus avantageux de l'invention, le procédé de production d'éthanol selon l'une quelconque des définitions précédentes, est un procédé dans lequel la protéine de fusion utilisée à l'étape b) a pour séquence complète la SEQ ID NO: 14 codée par la SEQ ID NO: 13, ou une forme mutée fonctionnelle de celle-ci. Les exemples 1 à 3 et les figures 1 à 6 illustrent l'invention. La figure 1 illustre la structure de la protéine de fusion CBH1-EGl't telle que préparée selon l'exemple 1 ; cat = domaine catalytique ; CBM = module de liaison aux polysaccharides (Carbohydrates Binding Module). La figure 2 montre les résultats de l'électrophorèse de la protéine de fusion CBHl-EGl°t : gel marqué au Coomassie (colonnes 1-3) et analyse Western Blot avec les anticorps anti-EG1 (colonnes 4-6) et avec les anticorps anti-CBH1 (colonnes 7-9). Colonnes 1, 4 et 7 : CL847Acbhl (5 µg); colonnes 2, 3, 5 et 8 : CL847Acbhl exprimant 30 la protéine de fusion CBHl-EG1' t, colonne 6 : protéine EG1 purifiée (100 ng), colonne 9 : protéine CBH1 purifiée (200 ng). La figure 3A illustre le fractionnement de la protéine de fusion selon la technique décrite dans l'exemple 2. La figure 3B correspond à la fraction non retenue indiquant la fraction F4 déposé sur gel dans la figure 4. La figure 4 représente le gel SDS-PAGE du surnageant de CL847Acbhl exprimant la protéine de fusion CBH 1-EG 1 °t (A5 a SN) et des principales fractions collectées selon l'exemple 2 (fraction (F) 4, 5, 9 et 11). La figure 5 représente le gel SDS-PAGE de 10 µl de surnageant de culture (colonne 1), du marqueur moléculaire (colonne 2) de 10 µl de protéine de fusion purifiée CBH1-EG1 (colonne 3) et le Western Blot de la protéine de fusion purifiée avec l'anticorps anti-CBH1 (colonne 4) et avec l'anticorps anti-EG1 (colonne 5). Les figures 6A et 6B illustrent les rendements d'hydrolyse de paille de blé, explosée à la vapeur d'eau, par de l'Econase® seule ou mélangée avec des quantités croissantes d'enzyme de fusion. La figure 6A concerne une paille de blé ayant une teneur en matière sèche de 1%, et la figure 6B une paille de blé ayant une teneur en matière sèche de 5%. Les valeurs représentent la moyenne de deux échantillons. CBH1 : Cellobiohydrolase 1 ; EG1 : Endoglucanase 1. Exemple 1 : Construction de la protéine de fusion et son expression dans T. reesei. Le gène codant la protéine de fusion CBH1-EG1 a été cloné dans le vecteur pUT1040 sous le contrôle du promoteur de cbhl pour l'expression dans la souche T. reesei déficiente pour le gène cbhl (CL847Acbhl). La protéine de fusion CBH1-EG1 est constituée par l'enzyme CBH1 entière liée à la séquence codante du domaine catalytique de EG1 par l'intermédiaire du peptide de liaison de CBH2. La structure de la protéine de fusion est illustrée dans la figure 1. 2 clones ont été obtenus (CBH1-EG1_pUT1040) et après isolement un clone s'est avéré stable (souche A5a). Cette souche a été cultivée sur un milieu d'induction (2% Lactose/cellulose Solka-Floc® dans un tampon Tris-maleate à pH 6) pendant 3 jours. Le surnageant est concentré, lavé deux fois avec un tampon citrate et chargé sur un gel SDS-PAGE. Les résultats sont donnés dans la figure 2. On observe une bande claire à environ 160 kDa dans la souche transformée qui réagit à la fois avec les anticorps dirigés contre EG1 et ceux dirigés contre CBH1 et qui est absente de la souche parente. La bande foncée à environ 60 kDa dans le surnageant de la souche CL847Acbhl correspond au CBH2 qui réagit avec l'anticorps anti-EG1. Exemple 2 : Production de la protéine de fusion CBHl-EG1 't intégrée dans la souche A5a et purification par chromatographie d'échange d'ions La souche A5a est cultivée dans un fermenteur de 1,5 L à 27°C et à pH 4,8. La production de biomasse est réalisée à partir d'une solution de glucose à 15 g/1 comme source de carbone. Au bout de 30 heures on commence l'écoulement discontinu en ajoutant une solution de lactose à 250 g/1 à une vitesse de 2 ml/h. Au bout de 215 heures, la concentration en protéine a atteint 9,3 g/1 et le surnageant a une activité papier de 4,9 UPF/min. La culture est récoltée et centrifugée. Environ 150 ml de surnageant sont purifies par un protocole en deux étapes. Pour la purification préliminaire, les échantillons sont passés à travers une colonne de relarguage hi-trap® (5mL, Biorad) équilibrée avec un tampon acétate. La chromatographie est réalisée sur une colonne AKTA® (GE Healthcare) Mono Q équilibrée avec le même tampon. Les protéines fixées sont éluées par un gradient de pH en utilisant un tampon PB74 Polybuffer (GE Healthcare) à vitesse constante. Les résultats sont donnés dans la figure 3. Les fractions grisées sont analysées sur gel SDS gel et les résultats sont donnés dans la figure 4. La protéine de fusion est éluée sur plusieurs fractions, mais toujours en même temps que des protéines plus petites. Le nombre et l'intensité de ces bandes plus petites augmentent avec le processus d'élution. Finalement on obtient, après concentration, 35 ml de protéine purifiée à une concentration de 0,7 mg/ml (incluant le produit de dégradation). Pour déterminer l'identité du plus petit produit de 90 kDa qui est coélué avec la protéine de fusion à 160 kDa, la fraction F5 contenant la protéine de fusion CBHl-EG1°at a été analysée par Western blotting. Les résultats sont donnés dans la figure 5 qui montre que les deux protéines réagissent avec l'anticorps de CBH1, suggérant que la plus petite bande correspond au produit de dégradation. Cette plus petite protéine n'est pas reconnue par l'anticorps de EG1 (colonne 5) indiquant que le produit de dégradation a perdu son domaine catalytique EG1. Exemple 3 : Essais d'hydrolyse par des quantités croissants de la protéine de fusion CBHl-EG1 't Ces essais sont réalisés avec le produit de fusion obtenu à l'exemple 1. De la paille de blé explosée à la vapeur est suspendue dans un tampon citrate 50 mm à pH 4,8 à une concentration en matière sèche de 5 %. Après addition de 32 µl d'une solution de tétracycline à 10 g/1 pour éviter la contamination, les suspensions sont équilibrées à 45°C. 12,6 tl de Beta-glucosidase (à 25 UI/g de matière sèche) sont ajoutés ainsi qu'un cocktail enzymatique de T. reesei (Econase®, de chez Roal, Finlande) à 2,5 mg/g de matière sèche. Dans trois essais en parallèle, l'Econase® est remplacée par 10, 25 ou 50 % (p/p) d'enzyme de fusion. Les échantillons sont agités à 45°C et 175 rpm pendant 2 jours et des échantillons sont prélevés à 30 min, 1h, 3h, 6h, 24h et 48h. Environ 500 µl sont prélevés à chaque temps et les enzymes sont inactivées par ébullition pendant 5 minutes. Après centrifugation, le surnageant est filtré à travers un filtre de 0,2 tm et stocké à -20°C jusqu'à l'analyse. Les sucres réduits sont mesurés par un test DNS avec du glucose comme standard. Les résultats sont donnés dans les figures 6A et 6B. Au bout de 48 heures la quantité de sucres réduits est augmentée en présence d'un mélange de cocktail enzymatique et de protéines de fusion à 10, 25 ou 50 % (p/p) par rapport au cocktail enzymatique seul, ce résultat étant statistiquement significatif pour la paille de blé ayant une teneur en matière sèche de 5%. REVENDICATIONS1. Protéines de fusion dégradant les parois cellulaires végétales, lesdites protéines comprenant : i) une enzyme qui est une protéine recombinante constituée de l'intégralité d'une cellulase ou d'une hémicellulase native de champignon, ou constituée d'un fragment fonctionnel de celle-ci, ou encore d'une forme mutée fonctionnelle de celle-ci, ii) une enzyme qui est une protéine recombinante constituée du domaine catalytique d'une cellulase fongique appartenant à la famille GH6 ou GH7, ou constituée d'une forme mutée fonctionnelle de celle-ci ayant une séquence présentant au moins 70% d'homologie ou d'identité avec la séquence dudit domaine catalytique, iii) un peptide signal, lequel est placé à l'extrémité N-terminale desdites protéines de fusion en amont des deux enzymes mentionnées en i) et ii), et ledit peptide signal étant issu de la cellulase ou de l'hémicellulase natives mentionnées en i), ou étant issu de la cellulase native de T. reesei mentionnée en ii), iv) un module de liaison aux polysaccharides issu de la cellulase ou de l'hémicellulase natives mentionnées en i), ou de la cellulase native de T. reesei mentionnée en ii), et chacun des constituants i), ii) et iv) est relié à un ou deux autres des constituants i), ii) et iv) tout au plus, par au moins un peptide de liaison de séquences identiques ou différentes composées de 10 à 100 acides aminés. 2. Protéines de fusion selon la revendication 1, dans lesquelles la cellulase fongique mentionnée en ii) appartient à Trichoderma reesei. 3. Protéines de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lesquelles le champignon mentionné en i) appartient : aux ascomycètes, incluant les genres Aspergillus, Chaetomium, Magnaporthe, Podospora, Neurospora, et Trichoderma, ou aux basidiomycètes, incluant les genres Halocyphina, Phanerochaete et Pycnoporus. 4. Protéines de fusion dégradant les parois cellulaires végétales selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lesquelles le domaine catalytique de la cellulase mentionnée en ii) a pour séquence la SEQ ID NO 12 codée par la SEQ ID NO: 11, correspondant au domaine catalytique de l'Endoglucanase EG1 (EGl°t) de T. reesei. 5. Protéines de fusion dégradant les parois cellulaires végétales selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lesquelles l'enzyme mentionnée en i) est processive. 6. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ayant pour séquence complète la SEQ ID NO: 14 codée par la SEQ ID NO: 13, ou une forme mutée fonctionnelle de celle-ci. 15 7. Mélange pour dégrader les parois cellulaires végétales qui comprend une protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, et un cocktail enzymatique de T. reesei. 8. Acides nucléiques isolés codant pour une protéine de fusion selon l'une 20 quelconque des revendications 1 à 6. 9. Vecteur d'expression comprenant la molécule d'acides nucléiques selon la revendication 8, qui lui est fonctionnellement liée. 25 10. Cellule hôte contenant le vecteur d'expression selon la revendication 9, ladite cellule hôte étant une cellule d'un champignon appartenant : aux ascomycètes, incluant les genres Aspergillus, Chaetomium, Magnaporthe, Podospora, Neurospora, et Trichoderma, ou aux basidiomycètes, incluant les genres Halocyphina, Phanerochaete et 30 Pycnoporus. 11. Procédé de préparation d'une protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant : 10 15 20 25 30 la culture in vitro de la cellule hôte selon la revendication 10, et la récupération, suivie éventuellement de la purification de la protéine de fusion produite par ladite cellule hôte. 12. Procédé de production d'éthanol à partir de matériaux cellulosiques ou lignocellulosiques comprenant : a) au moins une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique, b) au moins une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité puis, au moins une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu, dans lequel l'hydrolyse enzymatique est réalisée par le mélange d'un cocktail enzymatique de champignon sécrété par une souche de Trichoderma reesei, et d'une protéine de fusion constituée de deux enzymes dégradant les parois cellulaires végétales, ladite protéine de fusion représentant entre 1 et 50% en poids dudit cocktail enzymatique et comprenant : i) une enzyme qui est une protéine recombinante constituée de l'intégralité d'une cellulase ou d'une hémicellulase native de champignon, ou constituée d'un fragment fonctionnel de celle-ci, ou encore d'une forme mutée fonctionnelle de celle-ci, ii) une enzyme qui est une protéine recombinante constituée du domaine catalytique d'une cellulase fongique appartenant à la famille GH6 ou GH7, ou constituée d'une forme mutée fonctionnelle de celle-ci ayant une séquence présentant au moins 70% d'homologie ou d'identité avec la séquence dudit domaine catalytique, iii) un peptide signal, lequel est placé à l'extrémité N-terminale desdites protéines de fusion en amont des deux enzymes mentionnées en i) et ii), et ledit peptide signal étant issu de la cellulase ou de l'hémicellulase natives mentionnées en i), ou étant issu de la cellulase native de T. reesei mentionnée en ii), iv) un module de liaison aux polysaccharides issu de la cellulase ou de l'hémicellulase natives mentionnées en i), ou de la cellulase native de T. reesei mentionnée en ii), et chacun des constituants i), ii) et iv) est relié à un ou deux autres des constituants i), ii) et iv) tout au plus, par au moins un peptide de liaison de séquences identiques ou différentes composées de 10 à 100 acides aminés. 13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel la cellulase fongique mentionnée en ii) appartient à Trichoderma reesei. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, dans lequel l'enzyme du i) de la protéine de fusion mise en oeuvre dans le procédé de production d'éthanol est issue d'un champignon appartenant : aux ascomycètes, incluant les genres Aspergillus, Chaetomium, Magnaporthe, Podospora, Neurospora, et Trichoderma, ou aux basidiomycètes, incluant les genres Halocyphina, Phanerochaete et Pycnoporus. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, dans lequel le domaine catalytique de la cellulase mentionnée en ii) a pour séquence la SEQ ID NO: 12 codée par la SEQ ID NO: 1l, correspondant au domaine catalytique de l'Endoglucanase EG1 (EGl°t) de T. reesei. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, dans lequel l'enzyme mentionnée en i) est processive. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, dans lequel les 25 matériaux cellulosiques ou lignocellulosiques ont une teneur en matière sèche comprise entre 3 et 30%, et de préférence entre 5 et 20%. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, dans lequel la protéine de fusion utilisée à l'étape b) a pour séquence complète la SEQ ID NO: 14 30 codée par la SEQ ID NO: 13, ou une forme mutée fonctionnelle de celle-ci.20