FR 2951176 A1 20110415 FR 0904866 A 20091009 La présente invention est relative à la sélection de ligands monovalents du récepteur CD28 humain, permettant de bloquer l'interaction CD28/B7 sans activer CD28, et à leurs utilisations. L'activation des lymphocytes T nécessite un signal activateur, induit par la reconnaissance par les récepteurs T (TCR) de l'antigène associé avec le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I ou II et présenté par les cellules présentatrices de l'antigène (CPAg). Cette activation n'entraîne cependant la prolifération des cellules T et la sécrétion de cytokines immunomodulatrices spécifiques (telles que l'interleukine 2, l'interféron gamma ou l'interleukine 4), que si d'autres systèmes de co-stimulation T sont également activés. L'un des systèmes les plus importants de régulation de l'activation des lymphocytes T est le système moléculaire B7/CD28/CTLA4. Ce système joue par exemple un rôle essentiel dans les mécanismes du rejet de greffe [WOODWARD et al., Transplantation, 66, 14-20, (1998)]. Les molécules B7.1 (CD80) et B7.2 (CD86), collectivement désignées ci-après sous le terme « B7 », qui sont portées par les CPAgs peuvent activer le récepteur CD28 ainsi que le récepteur CTLA4 des lymphocytes T. L'activation du CD28 délivre au lymphocyte T un signal positif stimulant la cellule ; en revanche, l'activation du CTLA4 délivre un signal négatif conduisant à une non-réponse (anergie) [FALLARINO et al., J. Exp. Med., 188, 205-210, (1998)]. Les lymphocytes T au repos expriment une quantité importante de CD28, et très peu de CTLA4. Lors d'un premier contact cognitif entre une CPAg et un lymphocyte T, l'interaction CD28/B7 est privilégiée, ce qui active la cellule. Ce n'est que plusieurs heures après l'initiation de l'activation, du fait de l'augmentation de l'expression membranaire de CTLA4 dont l'affinité pour B7 est 5 à 10 fois supérieure à celle du CD28, que l'interaction B7/CD28 se déplace au profit d'une interaction B7/CTLA4. L'inhibition sélective du signal agoniste délivré à la cellule T par le CD28 en laissant intact le système antagoniste constitué par le couple CTLA4/B7, par l'intermédiaire d'un blocage spécifique de l'interaction CD28/B7 peut permettre de prévenir l'activation des lymphocytes T, et ainsi favoriser l'induction de la tolérance dans le cas de transplantation d'organes, ainsi que dans le cadre du traitement de maladies auto-immunes. Cette inhibition sélective peut être obtenue en ciblant le récepteur CD28 des cellules T, notamment à l'aide d'un anticorps dirigé contre CD28. Cependant, tous les anticorps ne possèdent pas la même capacité à inhiber sélectivement l'interaction CD28/B7. En effet, une grande partie d'entre eux, lorsqu'ils sont utilisés sous leur forme native divalente, entrainent la dimérisation de CD28, qui provoque son activation, et s'ils sont utilisés sous forme de fragments monovalents, qui n'entrainent pas la dimérisation de CD28, ne présentent plus d'effet inhibiteur de l'interaction CD28/B7. D'autres anticorps anti-CD28, dénommés anticorps superagonistes, sont capables d'activer les lymphocytes T, même en l'absence des signaux d'activation induits par l'interaction TCR/CMH. Ces différentes propriétés des anticorps anti-CD28 ont été attribuées à leur capacité à reconnaitre différentes régions de CD28 (Int. Immunol., 5, 311-315, 1993 ; LUHDER et al., J Exp Med 197, 955-66 2003). Au cours de travaux précédent, l'équipe des Inventeurs a sélectionné parmi des anticorps monoclonaux anti-CD28 décrits par NUNES et al. (1993, précité), un,anticorps dénommé CD28.3 dont les fragments monovalents possèdent la capacité d'inhiber l'interaction CD28/B7. L'hybridome produisant l'anticorps CD28.3 a été déposé auprès de la CNCM sous le numéro I-2582, et est décrit dans la Demande PCT WO 02/051871. Les Inventeurs ont maintenant caractérisé l'épitope reconnu par l'anticorps CD28.3, ce qui permet de d'identifier, d'autres ligands monovalents de CD28 possédant les mêmes propriétés que les fragments monovalents issus de CD28.3. Cet épitope est un épitope conformationnel, localisé dans les domaines C, D, E, F de la molécule CD28. La séquence d'une portion du récepteur CD28 humain, contenant l'épitope reconnu par l'anticorps CD28.3, est représentée sur la Figure 1. Les différents domaines A, A' B, C, C' C " , E, F, G et G', tels que définis par EVANS et al. (Nat Immunol., 6(3):271-9, 2005) sont indiqués au dessus de la séquence. Les régions constituant l'épitope sont surlignées en gris. Cette séquence est également représentée dans la liste de séquences en annexe sous l'identifiant SEQ ID NO: 1. La présente invention a en conséquence pour objet un ligand monovalent du récepteur CD28 humain, capable de bloquer sélectivement l'interaction CD28/B7 sans activer le récepteur CD28, caractérisé en ce qu'il reconnait un épitope formé par les portions de la séquence SEQ ID NO: 1 ayant les séquences suivantes : SREFRASLHKGL (SEQ ID NO: 2) ; NCDGKL (SEQ ID NO: 3) ; VTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVM (SEQ ID NO: 4), à l'exception d'un ligand monovalent ayant les CDRs de la chaîne lourde et les CDRs de la chaîne légère de 20 l'immunoglobuline CD28.3. On définit ici comme « ligand monovalent » tout ligand du récepteur CD28 humain possédant un seul site de liaison audit récepteur CD28. Ledit ligand est de préférence une protéine ; il peut s'agir par exemple d'un fragment 25 monovalent d'un anticorps anti-CD28, ou bien d'une anticaline (SKERRA et al., FEBS J., 275(11),:2677-83, 2008). Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit ligand monovalent est une protéine comprenant les CDRs de la chaîne lourde et les CDRs de la chaîne légère 30 d'un anticorps anti-CD28 reconnaissant l'épitope défini ci-dessus. Il peut s'agir notamment d'un fragment monovalent (Fv, Fab ou scFv) dudit anticorps, ou d'une protéine recombinante associant ledit fragment monovalent avec un polypeptide hétérologue, comme décrit par exemple dans la Demande PCT WO 35 02/051871 pour les fragments monovalents de l'anticorps CD28.3. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'un ligand monovalent du récepteur CD28 humain capable de bloquer sélectivement l'interaction CD28/B7 sans activer le récepteur CD28, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en présence de ligands monovalents du récepteur CD28 humain avec un polypeptide ayant la séquence du récepteur CD28 humain ou d'un fragment de celui-ci comprenant les séquences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4, et la sélection des ligands reconnaissant un épitope formé par lesdites séquences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, et SEQ ID NO: 4. La présente invention a également pour objet toute molécule d'acide nucléique codant un ligand monovalent du récepteur CD28 humain conforme à l'invention, ainsi que tout vecteur recombinant, notamment tout vecteur d'expression, comprenant ladite molécule d'acide nucléique, et toute cellule-hôte transformée par ledit vecteur recombinant. Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent avantageusement comprendre, outre une séquence codant une protéine conforme à l'invention, une séquence codant un peptide signal permettant la sécrétion de ladite protéine ; elles peuvent aussi comprendre une ou plusieurs séquence(s) codant un ou plusieurs peptide(s) marqueur(s) permettant la détection et/ou facilitant la purification de ladite protéine. Des vecteurs d'expression conformes à l'invention comprennent au moins une séquence d'acide nucléique codant une protéine conforme à l'invention, associée à des éléments de contrôle de la transcription et de la traduction actifs dans la cellule-hôte choisie. Des vecteurs utilisables pour la construction de vecteurs d'expression conformes à l'invention sont connus en eux-mêmes, et seront choisis notamment en fonction de la cellule-hôte que l'on souhaite utiliser. Des cellules-hôtes utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être des cellules procaryotes ou eucaryotes. Parmi les cellules eucaryotes utilisables, on citera en particulier des cellules végétales, des cellules de levure, telles que Saccharomyces, des cellules d'insecte, telles que les cellules de Drosophila, ou de Spodoptera et des cellules de mammifères telles que les cellules HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, etc... La construction de vecteurs d'expression conformes à l'invention, et la transformation des cellules-hôtes peut être effectuée par les techniques classiques de biologie moléculaire. Des ligands monovalents du récepteur CD28 humain conformes à l'invention peuvent notamment être utilisées, de la même manière que les protéines monovalentes dérivées de CD28.3 décrites dans la Demande PCT WO 02/051871, pour l'obtention de médicaments immunosuppresseurs, bloquant sélectivement les phénomènes d'activation des cellules T impliquant le récepteur CD28. Ces médicaments sont utilisables dans toutes les 15 pathologies dépendantes des lymphocytes T. Il s'agit essentiellement du rejet de greffe, de la maladie du greffon contre l'hôte, des maladies auto-immunes à médiation lymphocytaire T, telles que le diabète de type I, ou la sclérose en plaques, et de l'hypersensibilité de type IV, 20 qui intervient dans les phénomènes allergiques ainsi que dans la pathogenèse de maladies inflammatoires chroniques suivant une infection par un agent pathogène (notamment lèpre, tuberculose, leishmaniose, listérose, etc.). Il peut s'agir également de maladies telles que le myélome, dans lesquelles 25 des lymphocytes connaissent une prolifération dérégulée et que celle-ci est dépendante d'un signal transmis par CD28 (BAHLIS et al., Blood., 109(11):5002-10, 2007). La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un 30 exemple illustrant l'identification de l'épitope reconnu par l'anticorps CD28.3. EXEMPLE : IDENTIFICATION DE L'EPITOPE RECONNU PAR L'ANTICORPS CD28.3. Pour la détermination de l'épitope reconnu par 35 l'anticorps CD28.3, des fragments Fab de CD28.3 ont été mis en présence de CD28 humain (R&D Systems, Lille, France) immobilisé sur Sepharose®. Les complexes immuns ont été réduits et alkylés par incubation pendant 1 heure en presence d'iodoacétamide (55mM), avant l'addition de chymotrypsine (1 mg/50mg d'anticorps lié) suivie d'incubation pendant 4h à 18-25°C. Le Sepharose® a ensuite été lavé avec 25mM de carbonate d'ammonium, puis 50mM glycine, pH 2,5. Les peptides élués ont ensuite été concentrés sur une matrice C18 et analysés par spectrométrie de masse MALDI-TOF/TOF, pour établir la carte peptidique massique. Les résultats de cette analyse montrent que les fragments protégés de la protéolyse par la chymotrypsine sont situés dans les boucles C-D-E-F des molecules CD28, et constituent donc un épitope conformationnel. La séquence de la région du récepteur CD28 où est localisé cet épitope est représentée sur la Figure 1, et les séquences des fragments peptidiques qui forment l'épitoge, ainsi que leur localisations par rapport aux domaines du CD28 humain sont listées dans le Tableau I ci-dessous. Tableau Domaine du CD28 humain Séquence du peptide protégé de la protéolyse. C SREFRASLHKGL (SEQ ID NO: 2) D NCDGKL (SEQ ID NO: 3) E/F VTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVM (SEQ ID NO: 4) REVENDICATIONS1) Ligand monovalent du récepteur CD28 humain capable de bloquer sélectivement l'interaction CD28/B7 sans activer le récepteur CD28, caractérisé en ce qu'il comprend les CDRs de la chaîne lourde et les CDRs de la chaîne légère d'un anticorps anti-CD28 reconnaissant un épitope formé par les portions de la séquence SEQ ID NO: 1 ayant les séquences suivantes : SREFRASLHKGL (SEQ ID NO: 2) ; NCDGKL (SEQ ID NO: 3) ; VTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVM (SEQ ID NO: 4), et en ce qu'il est choisi parmi : a) les fragments Fv, Fab, ou scFv dudit anticorps ; b) les protéines recombinantes comprenant un fragment a) et un polypeptide hétérologue ; à l'exception d'un ligand contenant les CDRs de la chaîne 15 lourde et les CDRs de la chaîne légère de l'immunoglobuline CD28.3. 2) Procédé de sélection d'un ligand monovalent du récepteur CD28 humain capable de bloquer sélectivement l'interaction CD28/B7 sans activer le récepteur CD28, 20 caractérisé en ce qu'il comprend la mise en présence de ligands monovalents du récepteur CD28 humain avec un polypeptide ayant la séquence du récepteur CD28 humain ou d'un fragment de celui-ci comprenant les séquences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4, et la sélection d'un ligand 25 reconnaissant un épitope formé par lesdites séquences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, et SEQ ID NO: 4. 3) Utilisation d'un ligand monovalent du récepteur CD28 humain selon la revendications 1 pour l'obtention d'un médicament. 30 4) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement d'une pathologie choisie parmi le rejet de greffe, la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies auto-immunes à médiation lymphocytaire T, les phénomènes allergiques, les 35 maladies inflammatoires chroniques.