FR 2957355 A1 20110916 FR 1051754 A 20100311 -1- L'invention a pour objet un procédé de production de cellules adhérentes à des microporteurs selon lequel on introduit des cellules adhérentes dans un récipient de culture qui contient des microporteurs dans un milieu de culture et on effectue plusieurs passages cellulaires successifs dans ce même récipient en utilisant à chaque fois la population cellulaire du passage cellulaire précédent pour réaliser le passage cellulaire suivant. Elle concerne également la mise en oeuvre de ce procédé pour la production d'agents biologiques, servant notamment à la préparation de vaccins ou de médicaments. Dans les années 80, le développement de la technologie de culture cellulaire sur microporteurs a facilité la production à grande échelle de cellules adhérentes et par voie de conséquence la production d'agents biologiques. La production de cellules adhérentes destinées à la production d'agents biologiques pour un usage pharmaceutique doit respecter néanmoins un certain nombre de contraintes réglementaires parmi lesquelles : celle de proscrire l'utilisation de cellules adhérentes au-delà d'un certain nombre de «passages cellulaires » car il existe un risque de transformation morphologique et/ou biologique des cellules. C'est le cas notamment des cellules de la lignée Vero. US 4,664,912 décrit le procédé de choix pour produire un lot industriel de cellules à partir d'une semence de cellules provenant d'une banque cellulaire de travail. I1 repose sur une succession de passages cellulaires qui ont lieu à chaque fois dans des bioréacteurs différents dont les volumes utiles augmentent au cours des passages cellulaires successifs. Cela permet d'augmenter à chaque fois la quantité de microporteurs tout en maintenant la concentration de microporteurs dans le milieu de culture dans une gamme de concentration optimale qui est comprise entre 1 et 5g/1. La biomasse cellulaire augmente ainsi au cours des passages cellulaires successifs jusqu'à obtenir le lot industriel de cellules désiré. Le transfert des cellules d'un bioréacteur à un autre bioréacteur est réalisé après avoir décroché la plus grande partie des cellules de leur microporteurs au moyen d'un traitement à la trypsine puis en bloquant l'action de l'enzyme en introduisant des protéines sériques ou du sérum dans le milieu pour conserver l'intégrité des cellules. La suspension de cellules obtenue est alors transférée (en présence ou en l'absence des microporteurs usagés) dans un bioréacteur plus grand qui contient une quantité plus importante de -2- nouveaux microporteurs. Cette méthode de production industrielle de cellules adhérentes requiert cependant l'utilisation et la manipulation d'un matériel important ce qui a une incidence sur les coûts de production des agents biologiques. Pour diminuer les coûts de production de cellules adhérentes destinées à la production d'agents biologiques, EP 1060241 propose une méthode plus rapide qui ne nécessite plus à chaque fois que l'on veut obtenir un lot industriel de cellules de redémarrer la production à partir d'une semence de cellules provenant d'une banque de travail. La méthode consiste à transférer, après chaque passage cellulaire, la plus grande partie des cellules (80 à 90% de la biomasse cellulaire) dans un ou plusieurs autres bioréacteurs pour continuer à amplifier la biomasse cellulaire et constituer un lot de production industriel de cellules tandis que les 10 à 20 % de cellules restantes sont entretenues pour maintenir un stock « de cellules nourricières » à partir desquelles on peut produire de nouveaux lots de cellules. Cette méthode a néanmoins les inconvénients suivants : - les lots de cellules produits présentent une certaine hétérogénéité dans la mesure où ils n'ont pas tous le même nombre de passages cellulaires. - Le maintien d'un stock de cellules «nourricières» en culture lors de chaque opération de transfert entraine inévitablement un « vieillissement » des cellules qui est directement lié au nombre de passages cellulaires effectués et ne peut donc être utilisé que pendant une période de temps limité pour les raisons réglementaires déjà évoquées. Il existe toujours le besoin d'optimiser les méthodes de production à grande échelle de cellules adhérentes ainsi que la production d'agents biologiques qui en dérivent de façon à diminuer les coûts de production. A cet effet, la présente invention a pour objet : Un procédé de production de cellules adhérentes à des microporteurs selon lequel : a. on introduit des cellules adhérentes dans un récipient de culture qui contient des microporteurs dans un milieu de culture ; -3- b. on amplifie les cellules en effectuant dans ce même récipient de culture plusieurs passages cellulaires successifs en utilisant à chaque fois la population cellulaire produite lors du passage cellulaire précédent et en augmentant à chaque fois la quantité de microporteurs que l'on ajoute au milieu de culture; et c. On recueille la population cellulaire produite lors du dernier passage cellulaire. Elle a également pour objet : Un procédé de production d'un agent biologique produit par des cellules adhérentes à des microporteurs selon lequel : a. on introduit des cellules adhérentes dans un récipient de culture qui contient des microporteurs dans un milieu de culture ; b. on amplifie les cellules en effectuant dans ce même récipient de culture plusieurs passages cellulaires successifs en utilisant à chaque fois la population cellulaire produite lors du passage cellulaire précédent et en augmentant à chaque fois la quantité de microporteurs que l'on ajoute au milieu de culture; c. on traite la population cellulaire produite lors du dernier passage cellulaire pour qu'elle produise l'agent biologique, la dite étape c) étant réalisée dans le même récipient de culture que celui qui a été utilisé pour réaliser les étapes a) et b) et ; d. on recueille l'agent biologique. Selon un aspect du procédé production de l'agent biologique, l'agent biologique est un agent infectieux et le traitement de la population cellulaire est effectué en infectant la population cellulaire produite lors du dernier passage cellulaire avec ledit agent infectieux dans un milieu d'infection. Selon un aspect particulier, l'agent infectieux est le virus rabique et le milieu d'infection virale est dépourvu de tout produit d'origine animale. 2957355 -4 Généralement le nombre de passages cellulaires successifs effectués dans le même récipient de culture est 2, 3 ou 4. 5 De façon préférée, la concentration en microporteurs dans le milieu de culture pendant le premier passage cellulaire est De façon très préférée, à la fin de chaque passage cellulaire, les cellules sont décrochées de leurs microporteurs au moyen d'une solution contenant une 10 enzyme protéolytique. Selon un autre aspect du procédé selon l'invention, on augmente le volume du milieu de culture à chaque passage cellulaire. 15 De façon préférée, le premier passage cellulaire est effectué dans un milieu de culture dont le volume représente entre le 1/5 et la moitié du volume utile du récipient de culture. Dans un autre mode du procédé selon l'invention, le milieu de culture ne contient 20 pas de sérum d'origine animale De façon préférée, le milieu de culture ne contient pas de produit d'origine animale. 25 Selon un autre aspect, la concentration en protéines dans le milieu de culture est Selon encore un autre aspect, le milieu de culture contient en outre un agent protecteur cellulaire. 30 De façon préférée, l'agent protecteur cellulaire est la polyvinyl pyrrolidone. -5- Selon encore un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, le récipient de culture est un bioréacteur ayant un volume utile compris entre 3 et 3000 litres, de façon préférée entre 20 et 1000 litres et de façon particulièrement préférée entre 20 et 500 litres. Dans un aspect particulier du procédé selon l'invention, les cellules adhérentes sont des cellules Vero. De façon générale, la population cellulaire qui est produite selon le procédé de 10 l'invention contient un nombre de cellules qui est au moins 60 fois plus important que le nombre de cellules qui ont été initialement introduites dans le récipient de culture. Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé de production de cellules 15 adhérentes à des microporteurs selon lequel : a. on décongèle un stock de cellules adhérentes, puis b. on applique les modalités du procédé de l'invention aux cellules décongelées. 20 Dans encore un autre aspect, l'invention concerne un procédé de production de cellules adhérentes à des microporteurs selon lequel après avoir recueilli la population cellulaire produite lors du dernier passage cellulaire effectué dans un premier récipient de culture on la transfère dans un second récipient de culture ayant un volume utile plus important et qui contient des microporteurs dans un 25 milieu de culture en quantité plus importante que la quantité de microporteurs qui existait lors du dernier passage cellulaire effectué dans le premier récipient de culture et on applique à nouveau le procédé de l'invention aux cellules transférées dans le second récipient de culture. 30 L'invention concerne également l'utilisation des cellules qui ont été produites selon le procédé de l'invention pour la production d'agents biologiques.5 -6- Elle concerne également un procédé de production de cellules adhérentes à des microporteurs dans un milieu de culture, selon lequel on augmente la quantité de cellules produites d'un facteur > 60 en utilisant un seul et même récipient de culture. De façon préférée, le récipient de culture qui est utilisé est un bioréacteur ayant un volume utile d'au moins 20 litres. Selon un mode de réalisation du procédé, le milieu de culture est dépourvu de 10 sérum d'origine animale. Description détaillée de l'invention 15 L'invention concerne un procédé de production de cellules adhérentes à des microporteurs selon lequel pour amplifier des cellules et constituer des lots importants de cellules on effectue plusieurs passages cellulaires successifs dans un seul et même récipient de culture cellulaire. Grâce à ce procédé on réduit le nombre de récipients de culture à utiliser et les lots de cellules produits sont homogènes 20 puisqu'ils ont tous le même nombre de passages cellulaires. Ce procédé sert également à la production d'agents biologiques. Un « passage cellulaire » au sens de la présente invention débute au moment où des cellules adhérentes en suspension dans un milieu de culture sont mises en contact 25 avec des microporteurs et se termine habituellement au moment où les cellules adhérentes sont décrochées de leurs microporteurs par traitement enzymatique et se trouvent à nouveau sous la forme d'une suspension dans le milieu de culture. Un passage cellulaire comprend habituellement les phases suivantes : - une phase de colonisation des microporteurs qui correspond à la période de 30 temps pendant laquelle les cellules qui ont été mises en contact avec les microporteurs adhèrent effectivement aux microporteurs ; - une phase d'amplification des cellules adhérentes sur microporteurs qui correspond à la période de temps où les cellules se multiplient sur les microporteurs jusqu'à ce que la surface disponible des microporteurs colonisés5 -7- soit recouverte à plus de 70% et de façon préférée à plus de 80% par les cellules. A partir du moment où les cellules ont recouvert plus de 70% de la surface disponible des microporteurs colonisés, on considère que les cellules adhérentes sont « substantiellement confluentes » ou ont atteint le « stade de confluence » ; et - une phase de décrochement des cellules substantiellement confluentes de leur support par traitement enzymatique de sorte qu'un maximum de cellules soient décrochées de leur support (en général plus de 70% et de façon préférée plus de 80%) dans un espace de temps court (en général en moins de 30 minutes et souvent dans une période de temps inférieure à 20 minutes). La population de cellules est alors essentiellement sous la forme d'une suspension de cellules libérées de leurs microporteurs. Dans le cas de la présente invention, en fonction de l'utilisation des cellules adhérentes qui sont produites, le dernier passage cellulaire effectué dans le récipient de culture comprend ou ne comprend pas la phase de décrochement. Dans le cadre de la présente invention, les passages cellulaires successifs sont réalisés dans le même récipient de culture en utilisant la population cellulaire obtenue lors du passage cellulaire précédent pour réaliser le passage cellulaire suivant. On utilise en général au moins 80 % de la population cellulaire obtenue lors du passage cellulaire précédent pour réaliser le passage cellulaire suivant. De façon préférée, pour produire une quantité maximale de cellules, on effectue les passages cellulaires successifs en utilisant à chaque fois toute la population cellulaire obtenue lors du passage cellulaire précédent pour réaliser le passage cellulaire suivant. Il n'y a donc pas après chaque passage cellulaire de transfert de la biomasse cellulaire dans un ou plusieurs autres récipients de culture cellulaire pour continuer à amplifier la biomasse cellulaire. Dans le cas de la présente invention, l'amplification de la biomasse cellulaire est réalisée dans un seul récipient de culture dans lequel on effectue plusieurs passages cellulaires successifs. Au démarrage de chaque nouveau passage cellulaire qui est effectué dans le récipient de culture on introduit une quantité de microporteurs plus importante que la quantité de microporteurs qui a été introduite lors du passage cellulaire précédent de façon à augmenter la surface du support cellulaire disponible. Même si généralement on -8- augmente de façon concomitante le volume de milieu de culture à chaque nouveau passage cellulaire, l'augmentation de la quantité de microporteurs est proportionnellement plus importante que l'augmentation de volume de milieu ce qui se traduit généralement par une augmentation progressive de la concentration en microporteurs dans le milieu de culture au cours des passages cellulaires successifs. La concentration en microporteurs lors du dernier passage cellulaire réalisé dans le récipient de culture est généralement comprise entre 1 et 7g/1 mais peut atteindre 10 à 15g/1. Le procédé de l'invention selon lequel on augmente la biomasse cellulaire par passages successifs dans le même récipient de culture est également dénommé de procédé « all in one » puisque les amplifications cellulaires successives sont réalisées dans un seul et même récipient de culture (Voir figure 1). Dans l'art antérieur, les passages cellulaires successifs (identifiés X, X+l, X+2, X+3, etc ) sont réalisés à chaque fois dans des récipients de culture différents. Dans le cas de la présente invention, les cellules adhérentes qui sont par exemple au passage cellulaire X lorsqu'elles sont introduites dans le récipient de culture sont au minimum au passage cellulaire X+2 lorsqu'on recueille la population de cellules qui a été produite dans le même récipient. De façon préférée, la population de cellules que l'on recueille se trouve au passage X+2, X+3, ou X+4, ce qui indique que 2 passages, 3 passages ou 4 passages successifs ont été effectués dans le même récipient de culture. En fonction de l'utilisation ultérieure qui en est faite, la population de cellules que l'on recueille à la fin de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention est soit, sous la forme d'une suspension de cellules libérées de leur microporteur (dans ce cas, le dernier passage cellulaire a été effectué en incluant l'étape de décrochement cellulaire) soit, sous la forme d'une suspension de cellules adhérentes aux microporteurs (dans ce cas le dernier passage cellulaire a été effectué en omettant l'étape de décrochement cellulaire) û voir exemple 5 -. Lorsque la population de cellules que l'on recueille à la fin de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention sert à constituer un stock de cellules le dernier passage cellulaire comprend généralement une étape de décrochement cellulaire. La population cellulaire que l'on recueille est alors essentiellement sous la forme d'une suspension de cellules libérées de leurs microporteurs. -9- Lorsque la population de cellules sert à la production d'un agent biologique, le dernier passage cellulaire peut être effectué sans inclure d'étape de décrochement cellulaire. La population de cellules produite lors du dernier passage cellulaire, sous la forme d'une suspension de cellules adhérentes aux microporteurs, est alors traitée directement dans le même récipient de culture pour qu'elle produise l'agent biologique d'intérêt. Par agents biologiques on entend toute substance ou organisme qui peut être produit par les cellules adhérentes. Il s'agit notamment de virus, ou de protéines (anticorps, antigènes enzymes,....). Lorsqu'il s'agit d'une protéine recombinante, comme par exemple une cytokine, un anticorps, une protéine vaccinale, la suspension cellulaire est placée dans des conditions de culture qui favorise la production de cette protéine en utilisant des milieux de production adaptés. On cite à titre d'exemple les milieux décrits dans EP 0354129 pour la production de protéines recombinantes par les CHO et les cellules Vero. Lorsque l'agent biologique est un agent infectieux on infecte la suspension de cellules adhérentes aux microporteurs en introduisant l'agent infectieux (bactéries, virus, parasites,...) dans le récipient de culture et en remplaçant généralement le milieu de culture par un milieu d'infection qui favorise la production de l'agent infectieux. L'agent biologique infectieux peut être notamment un virus recombinant (poxvirus recombinants, adénovirus recombinants) ou des virus comme par exemple le virus de la rage, de la grippe, de la polio, etc... On recueille habituellement l'agent biologique en prélevant le surnageant de culture en une ou plusieurs fois û voir exemple 5 -. Lorsque l'agent biologique est plutôt intracellulaire comme dans le cas des virus non lytiques, il est souvent avantageux de recueillir le surnageant et les cellules que l'on traite ensuite avec des agents lytiques. Les milieux utilisés pour la production d'agents biologiques, notamment les milieux d'infection qui servent à la production de virus comme le virus rabique peuvent être avantageusement dépourvus de sérum d'origine animale, de protéine d'origine animale, ou même de tout produit d'origine animale. Dans le cadre de la présente invention, la concentration en microporteurs pendant le premier passage cellulaire est généralement abaissée à une concentration La quantité initiale de cellules qui est introduite dans le récipient de culture est choisie de telle sorte que plus de 80% des microporteurs soient colonisés par les cellules. Pour obtenir ce taux de colonisation, on introduit classiquement dans le récipient de culture une quantité initiale de cellules qui est au minimum 5 à 10 fois plus importante que la quantité de microporteurs qui est présente dans le milieu de culture. Par exemple dans le cas d'une production de cellules Vero, la quantité initiale de cellules qui est introduite dans le récipient de culture est généralement comprise entre 5x103 et 3 x104 cellules/cm2 de microporteurs de cytodex 1® ce qui représente approximativement entre 5 cellules et 30 cellules par microporteur. En définitive, puisque la concentration en microporteurs dans le milieu de culture lors du premier passage cellulaire est plus faible que celle qui est classiquement utilisée dans l'état de l'art, il en résulte par conséquent que la concentration cellulaire initiale est également plus faible. A la fin de chaque passage cellulaire, les cellules sont décrochées des microporteurs dans un intervalle de temps court (en général inférieur à 30 minutes et de façon préférée inférieur à 15 minutes) en traitant les cellules avec une solution enzymatique ayant une activité protéolytique (protéase). Dans le cadre de l'invention, on décroche habituellement les cellules des microporteurs dans le récipient de culture qui est utilisé pour effectuer les passages cellulaires successifs si bien qu'habituellement toutes les phases de culture cellulaire et tous les traitements qui sont effectués sur les cellules au cours des passages successifs sont réalisés dans un seul et même récipient de culture. Une méthode alternative pour décrocher les cellules des microporteurs consiste à transférer les cellules dans un récipient annexe où a lieu le traitement enzymatique puis à réintroduire la suspension de cellules obtenue dans le récipient de culture unique où sont effectuées les amplifications -11- cellulaires successives. Cette méthode alternative n'est pas avantageuse car elle entraîne généralement une perte en cellules pendant les opérations de transfert. La solution enzymatique renferme habituellement une sérine protéase telle que la trypsine, la pronasé ou la dispasé . On peut également utiliser de la collagénase lorsque les microporteurs utilisés sont des microbilles de cytodex 3. Généralement on utilise une solution de trypsine. De façon préférée, la protéase est d'origine non animale ce qui indique qu'elle a été fabriquée en utilisant un procédé qui n'utilise pas de matière d'origine animale. Elle est fabriquée, par exemple, en utilisant une matière végétale, par synthèse chimique ou par recombinaison génétique en utilisant des bactéries, des levures, des champignons ou des plantes. Pour faciliter le décrochement des cellules on peut ajouter à la solution d'enzyme un agent chélatant qui fixe les ions calcium comme par exemple 1'EDTA, 1'EGTA ou le citrate ou éventuellement en prétraitant les cellules adhérentes avec un agent chélatant. La concentration en protéase et éventuellement en agent chélatant dans le milieu ainsi que la température du traitement enzymatique des cellules (habituellement entre 20 et 38°C) sont fixées de telle sorte que plus de 80% des cellules sont décrochées de leur support dans un intervalle de temps court ( La suspension de cellules ainsi obtenue est utilisée pour initier un nouveau passage cellulaire dans le même récipient. Pour augmenter la biomasse cellulaire lors de chaque passage cellulaire, il faut ajouter à chaque fois une quantité de microporteurs plus importante. Si on conserve le même volume de milieu de culture lors des passages cellulaires successifs il faut alors augmenter la concentration en microporteurs à chaque nouveau passage cellulaire. Par contre, on peut maintenir la même concentration en microporteurs lors des passages cellulaires successifs si on augmente dans la même proportion le volume de milieu de culture à chaque nouveau passage cellulaire. De façon très préférée, à chaque nouveau passage cellulaire on augmente à la fois le volume de milieu de culture et la concentration en microporteurs dans le récipient de culture pour amplifier de façon maximale l'expansion des cellules. A titre indicatif, à chaque nouveau passage cellulaire, les cellules sont cultivées dans un milieu de culture dont le volume est entre 1,2 et 3 fois plus important que le volume dans lequel elles se trouvaient lors du passage précédent. De la même façon, à chaque nouveau passage cellulaire, la concentration en microporteurs neufs dans le milieu de culture est entre 2 et 10 fois plus importante que celle qui existait lors du passage cellulaire précédent. Il n'est pas utile en général de retirer à chaque passage les anciens microporteurs (microporteurs ayant déjà été colonisés lors des passages précédents) qui peuvent être éventuellement recolonisés par les cellules. On ne tient généralement pas compte de la quantité résiduelle des anciens microporteurs provenant des passages cellulaires précédents pour le calcul de la quantité de microporteurs neufs à ajouter à chaque nouveau passage. La phase d'adhésion des cellules aux microporteurs dure généralement entre 1 et 6 heures en fonction du type cellulaire. Après la phase d'adhésion, il peut être avantageux d'éliminer tout ou en partie le milieu de culture après avoir laissé décanter les microporteurs et de le remplacer par du milieu neuf pour accélérer la croissance cellulaire. Habituellement, on utilise le même milieu de culture pour effectuer les passages cellulaires successifs même si au besoin il peut s'avérer utile au cours des passages cellulaires successifs d'apporter des suppléments nutritifs. Ceci est évalué au moyen de méthodes classiques de contrôle à la disposition de l'homme du métier, - 13 - telles que la mesure du taux de glucose, de glutamine, de lactates, d'ions ammonium. Cela permet d'assurer le bon déroulement de la phase d'amplification cellulaire. Les microporteurs convenant à l'objet de l'invention sont habituellement sous la forme de microbilles, de préférence non poreuses pour faciliter l'action des enzymes. Elles ont un diamètre généralement compris entre 100 et 250 µm. Leur densité est légèrement supérieure à celle du milieu de culture pour faciliter leur récupération par simple décantation mais en même temps elle ne doit pas être trop élevée pour obtenir une remise en suspension complète des microbilles dans le milieu lorsqu'il est soumis à une agitation modérée. Dans des conditions de culture standard, la densité des microporteurs se situe habituellement entre 1,030 et 1,050 g/ml. La surface des microbilles est choisie pour faciliter l'adhérence des cellules tandis que leur matrice est de préférence non rigide pour mieux préserver les cellules lorsque des collisions entre microbilles se produisent. Ces caractéristiques se retrouvent notamment pour les microbilles à base de dextran commercialisées sous le nom de cytodeX (cytodex 1, cytodex 2, cytodex 3), les microbilles à base de polystyrène commercialisées sous le nom de Biosilon ou éventuellement les microbilles en verre commercialisées par Sigma Aldrich. On peut utiliser des milieux de culture de cellules classiques supplémentés en sérum d'origine animale pour produire les cellules adhérentes selon le procédé de l'invention. Avantageusement, les milieux de culture contiennent ni sérum, ni protéine sérique. Les milieux de culture peuvent être notamment dépourvus de toute protéine d'origine animale ou même de tout produit d'origine animale. Par «protéine ou produit d'origine animale », on entend une protéine ou un produit dont le procédé de fabrication comprend au moins une étape où on utilise une matière provenant de l'animal ou de l'homme. De façon particulièrement avantageuse, les milieux servant à la culture des cellules sont dépourvus de protéine ou contiennent de très faibles quantités de protéines sous forme de protéines recombinantes ou extraites de végétaux (soja, riz,...) ou de levures. Ils renferment le plus souvent des protéines de bas poids moléculaire ( Lorsque le milieu de culture ne contient pas de protéine ou a une concentration en protéines totales Le volume du milieu de culture lors du premier passage cellulaire représente habituellement entre la moitié et 1/5 du volume utile du récipient de culture. Dans le cas des récipients de culture de grande capacité (bioréacteurs de plus de 100 litres) dont la configuration particulière permet la culture de cellules adhérentes sur microporteurs dans un petit volume (comme par exemple un bioréacteur équipé d'une zone de sédimentation à fond conique), le volume du milieu de culture peut être beaucoup plus faible et représenter jusqu'à 1/20, et plus généralement entre 1/6 et 1/10 du volume utile du bioréacteur. Au cours des passages cellulaires successifs, les volumes de milieu de culture augmentent généralement jusqu'à occuper habituellement tout le volume utile du récipient lors du dernier passage cellulaire. En fonction des besoins des cellules, on peut être amené pendant les phases d'amplification cellulaire à renouveler tout ou partie du milieu de culture ou à supplémenter le milieu existant avec des nutriments tels que le glucose et/ou la glutamine en utilisant des techniques bien connues de l'homme du métier. -16- Le récipient de culture est équipé d'un système d'agitation (mécanique, par courant d'air,...) permettant de maintenir les microporteurs en suspension dans le milieu de culture, et dispose de moyens qui permettent de renouveler les milieux en fonction des besoins de la culture et/ou de moyens de contrôles et de régulation de la température, du pH, de la pression en oxygène, du gazage éventuellement en azote ou en air, et des métabolites ou nutriments (lactates, glucose, glutamine, ions ammonium...). Ces dispositifs sont bien connus de l'homme du métier qui sait les mettre en oeuvre en fonction de la taille et la configuration du récipient utilisé. A titre d'exemple, le récipient de culture selon l'invention peut être sous la forme de flacons agités (Spinner), ou de bioréacteur. Lorsque le volume utile du récipient est > 2 litres on utilise habituellement un bioréacteur qui peut être classiquement sous la forme de cuve métallique réutilisable ou éventuellement sous la forme de « poche à usage unique » commercialisé notamment par P.Guerin sous la dénomination de Nucleo PG-ATMI TM. On peut également utiliser le système Biowave (Wave Bioreactor TM) commercialisé par Général Electrics, le système STR diposable Bioreactor TM (Sartorius) ou le système SUB TM (Hyclone). Dans le cadre du procédé selon l'invention qui a pour objectif principal de produire des lots de cellules à l'échelle industrielle, on utilise de façon préférée un bioréacteur dont le volume utile est compris entre 3 litres et 1000 litres et plus généralement entre 20 litres et 500 litres. Les « cellules adhérentes » , au sens de l'invention, sont des cellules établies en lignées ou des cellules issues directement de l'extraction de tissus animaux ou humains sains ou tumoraux qui, dans les conditions de culture utilisées, ont besoin d'un support solide pour se multiplier et se développer normalement. Une caractéristique essentielle des cellules adhérentes est de former une couche unicellulaire sur leur support dû au phénomène d'inhibition de contact. On exclut donc de fait les cellules qui, dans les conditions de culture utilisées, n'ont pas besoin de support solide pour se multiplier et qui poussent en suspension dans le milieu de culture. Les lignées de cellules adhérentes peuvent être issues de cultures primaires de cellules saines ou tumorales mais également peuvent être obtenues par transformation de cellules à l'aide d'agents immortalisants comme la lignée PER.C6. Comme exemple de lignées de cellules adhérentes convenant à l'objet de l'invention, on cite les lignées de cellules murines comme la lignée 3T3, NTCT, WEHI, les lignées de - 17 - cellules de hamster comme la lignée BHK ( notamment la lignée BHK21) ou CHO, les lignées de cellules canines comme la lignée MDCK, les lignées de cellules porcines comme la lignée PK15, les lignées de cellules bovines comme la lignée MDBK, les lignées de cellules simiennes comme la lignée Vero, LLC-MK2, FRHL2 les lignées humaines comme la lignée MRC5, 293, PER.C6 Hela, ECV ou A 431. Ces lignées de cellules adhérentes peuvent être également sous la forme de lignées transfectées avec un vector recombinant (plasmide, virus,...) lorsqu'elles sont destinées à la production de protéines recombinantes. Grâce au procédé selon l'invention on augmente la population de cellules adhérentes d'un facteur d'au moins 40, de façon préférée d'au moins 60 et de façon particulièrement préférée d'au moins 100 en utilisant un seul et même récipient de culture. Ceci est réalisable car le procédé selon l'invention permet d'augmenter entre 5 et 40 fois, de façon préférée entre 10 et 30 fois la surface du support cellulaire au cours des passages cellulaires successifs qui sont réalisés dans un seul et même récipient. Dans les méthodes de l'art antérieur une amplification cellulaire de cet ordre est observée en utilisant au moins deux récipients, mais plus généralement trois récipients de culture de tailles différentes (voir exemple 3). Le procédé selon l'invention est très avantageux car on produit également dans les mêmes délais les mêmes quantités de cellules que celles que l'on obtient avec les méthodes de l'art antérieur tout en réduisant les coûts liés à l'utilisation et l'entretien de récipients de culture. Le procédé de production de cellules adhérentes selon l'invention peut être avantageusement mis en oeuvre en introduisant directement dans le récipient de culture des cellules qui viennent d'être décongelées sans recourir à une période transitoire pendant laquelle les cellules suivent un ou plusieurs passages cellulaires « d'adaptation » (avec transfert après chaque passage dans un nouveau récipient de culture) pour « adapter » les cellules à des conditions de culture plus difficiles telles que la culture en présence de microporteurs à faible concentration dans le milieu de culture et/ou ou la culture dans des milieux qui ne contiennent pas de sérum ou qui contiennent très peu protéines ( Lorsque le stock de cellules qui a été produit en utilisant le procédé de l'invention n'est 20 pas suffisant, on peut encore augmenter la biomasse cellulaire : o en transférant le stock de cellules obtenu dans un ou plusieurs récipients de culture à partir desquels on réalise des passages cellulaires successifs de manière classique, en transférant après chaque passage cellulaire la biomasse cellulaire obtenue dans un autre récipient de culture plus grand; 25 ou avantageusement, o en transférant directement le stock de cellules dans un second récipient de culture ayant un volume utile beaucoup plus grand (généralement au moins 10 fois plus grand, le plus souvent entre 10 et 50 fois plus grand que le premier récipient) et en répétant le procédé selon l'invention aux 30 cellules qui ont été transférées dans ce second récipient. En opérant ainsi, on réduit encore plus significativement le nombre de récipients de culture à utiliser pour produire des lots industriels de cellules. - 19 - Pour évaluer l'intérêt économique de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention dans le cadre d'une production de cellules adhérentes à l'échelle industrielle, on peut se référer au schéma classique de production industrielle de cellules Vero destinées à la production du virus polio tel que décrit dans Reviews of Infectious Diseases, vol 6, supplément 2, S341-S344 (1984). Le schéma classique comprend 5 passages cellulaires successifs le premier étant réalisé dans un bioréacteur de 1 litre, le deuxième dans un bioréacteur de 5 litres, le troisième dans un bioréacteur de 20 litres, le quatrième dans un bioréacteur de 150 litres et enfin le cinquième dans un bioréacteur de 1000 litres. Grâce au procédé selon l'invention, on peut effectuer les trois premiers passages cellulaires dans un seul bioréacteur de 20 litres, puis effectuer les deux derniers passages de façon classique en transférant les cellules dans un bioréacteur de 150 litres puis dans un bioréacteur de 1000 litres. On peut également répéter deux fois le procédé selon l'invention en effectuant les trois premiers passages cellulaires dans un seul bioréacteur de 20 litres puis en transférant les cellules obtenues directement dans un seul bioréacteur de 1000 litres où on effectue les deux derniers passages cellulaires. Dans les deux cas, on produit dans les mêmes délais une quantité de cellules qui est du même ordre que celle qu'on obtient lorsqu'on applique le schéma classique mais dans le premier cas on fait l'économie de 2 bioréacteurs (1 litre et 5 litres) et dans le deuxième cas une économie de 3 bioréacteurs (1 litre, 5 litres et 150 litres) (cf exemple III). Un procédé de production de cellules adhérentes particulièrement avantageux sur le plan économique consiste à répéter le procédé selon l'invention. A cet effet, l'invention a donc pour objet : Un procédé de production de cellules adhérentes à des microporteurs selon lequel : a. on introduit des cellules adhérentes dans un premier récipient de culture qui contient des microporteurs dans un milieu de culture ; b. on amplifie les cellules en effectuant dans ce premier récipient de culture plusieurs passages cellulaires successifs en utilisant à chaque fois au moins 80% de la population cellulaire qui a été obtenue lors du passage cellulaire précédent, de façon préférée toute la population cellulaire qui a été obtenue lors du passage cellulaire précédent, pour réaliser le passage cellulaire suivant et en augmentant à chaque fois la quantité de microporteurs que l'on ajoute au milieu de culture ; 30 -20- c. On recueille la population cellulaire obtenue lors du dernier passage cellulaire réalisée dans ce premier récipient de culture (qui est essentiellement sous la forme d'une suspension de cellules libérées de leurs microporteurs), d. On transfère la population cellulaire recueillie dans un deuxième récipient de culture ayant un volume utile plus important et qui contient des microporteurs dans un milieu de culture en quantité plus importante que la quantité de microporteurs qui existait lors du dernier passage cellulaire effectué dans le premier récipient de culture ; e. on amplifie les cellules en effectuant dans ce deuxième récipient de culture plusieurs passages cellulaires successifs en utilisant à chaque fois au moins 80% de la population cellulaire qui a été obtenue lors du passage cellulaire précédent, de façon préférée toute la population cellulaire qui a été obtenue lors du passage cellulaire précédent, pour réaliser le passage cellulaire suivant et en augmentant à chaque fois la quantité de microporteurs que l'on ajoute au milieu de culture ; f. On recueille la population cellulaire obtenue lors du dernier passage cellulaire réalisée dans ce second récipient de culture, et éventuellement g. On répète encore les étapes d à f dans un troisième récipient de culture ayant un volume utile encore plus important. Et de façon particulièrement avantageuse : Un procédé de production de cellules adhérentes selon lequel : a. On décongèle un stock de cellules adhérentes ; b. on introduit les cellules décongelées dans un premier récipient de culture qui contient des microporteurs dans un milieu de culture ; c. on amplifie les cellules décongelées en effectuant dans ce premier récipient de culture plusieurs passages cellulaires successifs en utilisant à chaque fois au moins 80% de la population cellulaire qui a été obtenue lors du passage cellulaire précédent, de façon préférée toute la population cellulaire qui a été obtenue lors du passage cellulaire précédent, pour - 21 - réaliser le passage cellulaire suivant et en augmentant à chaque fois la quantité de microporteurs que l'on ajoute au milieu de culture ; d. On recueille la population cellulaire obtenue lors du dernier passage cellulaire réalisée dans ce premier récipient de culture (qui est essentiellement sous la forme d'une suspension de cellules libérées de leurs microporteurs), e. On transfère la population cellulaire recueillie dans un deuxième récipient de culture ayant un volume utile plus important et qui contient des microporteurs dans un milieu de culture en quantité plus importante que la quantité de microporteurs qui existait lors du dernier passage cellulaire effectué dans le premier récipient de culture ; f. on amplifie les cellules en effectuant dans ce deuxième récipient de culture plusieurs passages cellulaires successifs en utilisant à chaque fois au moins 80% de la population cellulaire qui a été obtenue lors du passage cellulaire précédent, de façon préférée toute la population cellulaire qui a été obtenue lors du passage cellulaire précédent, pour réaliser le passage cellulaire suivant et en augmentant à chaque fois la quantité de microporteurs que l'on ajoute au milieu de culture ; g. On recueille la population cellulaire obtenue lors du dernier passage cellulaire réalisée dans ce second récipient de culture, et éventuellement h. On répète encore les étapes d à f dans un troisième récipient de culture ayant un volume utile encore plus important. La répétition du procédé selon l'invention peut être également mise en oeuvre pour 25 produire un agent biologique. A cet effet, l'invention a donc pour objet : Un procédé de production d'un agent biologique produit par des cellules adhérentes à des microporteurs selon lequel : a. on introduit des cellules adhérentes dans un premier récipient de culture qui contient des microporteurs dans un milieu de culture ; 30 b. on amplifie les cellules en effectuant dans ce premier récipient de culture plusieurs passages cellulaires successifs en utilisant à chaque fois au moins 80% de la population cellulaire qui a été obtenue lors du passage cellulaire précédent, de façon préférée toute la population cellulaire qui a 10 15 20 - 22 - été obtenue lors du passage cellulaire précédent, pour réaliser le passage cellulaire suivant et en augmentant à chaque fois la quantité de microporteurs que l'on ajoute au milieu de culture ; c. On recueille la population cellulaire obtenue lors du dernier passage cellulaire réalisée dans ce premier récipient de culture (qui est essentiellement sous la forme d'une suspension de cellules libérées de leurs microporteurs), d. On transfère la population cellulaire recueillie dans un deuxième récipient de culture ayant un volume utile plus important et qui contient des microporteurs dans un milieu de culture en quantité plus importante que la quantité de microporteurs qui existait lors du dernier passage cellulaire effectué dans le premier récipient de culture, ; e. on amplifie les cellules en effectuant dans ce deuxième récipient de culture plusieurs passages cellulaires successifs en utilisant à chaque fois au moins 80% de la population cellulaire qui a été obtenue lors du passage cellulaire précédent, de façon préférée toute la population cellulaire qui a été obtenue lors du passage cellulaire précédent, pour réaliser le passage cellulaire suivant et en augmentant à chaque fois la quantité de microporteurs que l'on ajoute au milieu de culture ; f. On traite la population cellulaire produite lors du dernier passage cellulaire réalisé dans le second récipient de culture pour qu'elle produise l'agent biologique, la dite étape c) étant réalisée dans le même récipient de culture que celui qui a été utilisé pour réaliser les étapes a) et b) et ; g. on recueille l'agent biologique. Comme indiqué précédemment, l'agent biologique qui est produit peut être par exemple une protéine recombinante ou un virus tel que le virus de la rage. L'invention a également pour objet l'utilisation des cellules qui ont été produites au moyen de l'un des procédés selon l'invention pour la production « d'agents biologiques ». Elle concerne enfin un procédé de production de cellules adhérentes à des microporteurs dans un milieu de culture selon lequel on utilise un seul et même - 23 - récipient de culture pour augmenter la population de cellules d'un facteur > 40, de façon préférée d'un facteur > 60 et de façon particulièrement préférée d'un facteur > 120. Le récipient de culture utilisé est de façon préférée un bioréacteur ayant un volume utile d'au moins 20 litres. Le milieu de culture comme il a été indiqué dans le cadre de l'invention peut être un milieu classique supplémenté en sérum mais de façon préférée le milieu est dépourvu de sérum d'origine animale. De façon particulièrement préférée on utilise un milieu dépourvu de tout produit d'origine animale et dont la concentration en protéines est La figure 1 représente deux procédés d'amplification de cellules adhérentes sur microporteurs : a) selon le procédé classique en effectuant des passages cellulaires successifs dans des récipients de culture différents et de volumes utiles croissants et b) selon le procédé selon l'invention (procédé all in one) où les passages cellulaires successifs sont réalisés dans un seul et même récipient de culture. Dans le cas de la figure 1, les cellules sont sous forme congelées au stade 0. L'étape 0ù*1 correspond au transfert des cellules décongelées dans un bioréacteur. L'étape 1 correspond au premier passage cellulaire. L'étape 1ù2 correspond au transfert de la population cellulaire obtenue à la fin du premier passage cellulaire soit dans le cas du procédé a) dans un deuxième bioréacteur ayant un volume utile plus important soit dans le cas du procédé b) dans le même récipient de culture. L'étape 2 correspond au deuxième passage cellulaire. Dans le cas du procédé b) le deuxième passage cellulaire est réalisé généralement dans un volume de milieu de culture plus important et en présence d'une concentration en microporteurs plus importante. L'étape 2ù3 correspond au transfert de la population cellulaire obtenue à la fin du deuxième passage cellulaire soit dans le cas du procédé a) dans un troisième bioréacteur ayant un volume utile plus important soit dans le cas du procédé b) dans le même récipient de culture. L'étape 3 correspond au troisième passage cellulaire. Dans le cas du procédé b) le troisième passage cellulaire est réalisé généralement dans un volume de milieu de culture plus important et en présence d'une concentration en microporteurs plus importante que lors du second passage cellulaire. - 24 - La présente invention sera mieux comprise à la lumière des exemples suivants qui servent à illustrer l'invention sans pour autant en limiter le contenu. Exemple I : Amplification de cellules Vero en réalisant 2 passages cellulaires successifs dans un seul et même bioréacteur de 20 litres 1.1) Mode opératoire 1.1.1) Matériel utilisé Bioréacteur : On a utilisé un bioréacteur de 20 litres sous la forme d'une poche à usage unique commercialisé par ATMI sous le nom de Nucleo-20. Les sondes de pH, de pO2 et de température après avoir été étalonnées puis stérilisées par autoclavage grâce aux poches «probe holder» ont été installées sur la poche selon le protocole standard ATMI : les connexions Kleenpack® situés sur la poche d'une part et sur le «probe- holder » d'autre part ont été connectées, puis la sonde a été introduite à l'intérieur du bioréacteur à travers la connexion ainsi créée. Microporteurs : On a utilisé des microbilles de cytodex 1 fournies par GE Healthcare Les microbilles ont été hydratés pendant 24 heures dans une solution d'un tampon phosphate, pHz7,4 après avoir prélevé la quantité nécessaire pour réaliser chaque passage cellulaire. Elles ont été ensuite rincées 3 fois dans le même tampon puis stérilisés par autoclavage. Juste avant l'introduction dans le bioréacteur on a remplacé le tampon de stérilisation par un volume équivalent de milieu de culture après décantation des microbilles. Milieu de culture VPSFM/K30 : Le Milieu de culture qui a été utilisé est le milieu VPSFM (Invitrogen), sans sérum et sans produit d'origine animale, additionné de 0,1% p/v de polyvinylpyrrolidone (PVP) K30 fourni par ISP30 - 25 - Cellules : Cellules Vero provenant d'une banque de cellules conservées sous forme congelée à raison de 50x106 cellules/ml dans un milieu sans sérum contenant 10% de diméthylsulfoxyde dans des tubes à congélation de cellules (tube Nunc réf. : 430663 de 5m1). 1.2) Protocole opératoire Dans le Nucléo-20, on a introduit 6 litres de milieu de culture VPSFM/K30 puis on a ajouté 1 litre d'une suspension de microbilles contenant 4g de cytodex 1 (ce qui représente une surface de 17600 cm et une concentration initiale en microbilles de 0,5g/l après l'ajout des cellules). Après avoir ajusté les paramètres de régulation à l'intérieur du nucléo-20, tels que la température à 37°C, le pH à 7,2 -7,4, la pO2 à z25%, et soumis le milieu à une agitation modérée pour remettre les microbilles en suspension dans le milieu de culture, on a introduit dans le nucléo 500x106 cellules après décongélation et reprise dans 1 litre de milieu de culture VPSFM/K30. Au Jour J2 (2 jours après la mise en culture), on a remplacé le milieu par du milieu VPSFM/K30 neuf. Au jour J5, les cellules ont été trypsinées selon le protocole suivant : On a stoppé l'agitation, les régulations de pH et de pO2. Seule la régulation de température a été maintenue. Après décantation des microbilles, on a laissé dans le bioréacteur 3L de milieu de culture VPSFM/K30 puis on a rajouté 3 litres d'une solution de citrate de sodium 0,025M contenant 600 mg de trypsine recombinante (réf. : Roche 04618734) en tampon phosphate sans Calcium et sans Magnésium. Le milieu a été ensuite à nouveau agité de façon modérée. Après avoir vérifié que le décollement des cellules était bien réalisé au moyen d'un prélèvement de contrôle (en général il est réalisé dans un intervalle de 15 et 30 minutes), on a stoppé l'action de la trypsine en rajoutant 3 litres d'une solution de VPSFM/K30 contenant lmg/ml d'inhibiteur de trypsine (réf : Sigma T6522). On a ensuite rajouté la suspension de microbilles contenant 28 g de cytodex 1 (ce qui représente une surface de 123200 cm et une concentration en microbilles d'environ 1,4g/1 dans le milieu) aux 9 litres de culture de cellules résultant de l'étape de trypsination puis on a ajusté le volume total de travail à 20 litres avec le milieu de culture VPSFM/K30. On a ensuite ajusté à nouveau les paramètres de régulations à l'intérieur du nucléo-20 - 26 - comme lors du premier passage cellulaire. Après avoir vérifié que l'adhésion des cellules sur les microporteurs était bien effective au moyen d'un prélèvement de contrôle (elle a lieu généralement entre 4 et 6 heures après l'introduction des microbilles), on a remplacé le milieu par du milieu de culture neuf. Un deuxième remplacement du milieu de culture par du milieu de culture neuf a été réalisé à J7. A J9, les cellules sont substantiellement confluentes. Elles ont été ensuite trypsinées selon le même protocole que celui utilisé à J5. La suspension cellulaire obtenue permet de mesurer le taux d'amplification cellulaire obtenu après 2 passages cellulaires effectués dans le même bioréacteur. 1.3) Résultats Pour mesurer le taux d'amplification cellulaire obtenu, on a mesuré à intervalles réguliers la concentration cellulaire avec le système de numération Nucleocounter (Chemometec®) Les quantités et concentrations cellulaires observées au cours de la culture sont représentées dans le tableau I ci-dessous 2957355 -27- Jour de culture Volume de Concentration Concentration Quantité culture cellulaire dans le cellulaire sur le de cellules milieu (cell./ml) support (cell/cm2 x106 de microbilles JO 8L 48100 21875 385* JO (après 8L 57000 25900 456 adhésion des cellules) J1 8L 73500 33400 588 J2 8L 79500 36136 636 J2 (après ajout de 8L 46500 42272 744 8 litres) J5 (avant 8L 235000 213600 3760 trypsination) J5 (après 20L 145500 23600 2910 adhésion des cellules) J6 20L 195000 31650 3900 J7 20L 474000 76950 9480 J8 20L 807000 131000 16140 J9 (après 20L 1313000 213000 26260 trypsination) * : représente la quantité initiale de cellules viables ensemencées 5 Après deux passages cellulaires successifs de cellules Vero réalisés dans un même bioréacteur de 20 litres la population cellulaire a augmenté d'un facteur 68 au bout de 9 jours de culture tandis que la surface du support cellulaire a été augmentée d'un facteur 7. - 28 - Exemple II : Amplification de cellules Vero en réalisant 3 passages cellulaires successifs dans un seul et même bioréacteur de 20 litres 2.1) Matériel utilisé Le matériel qui a été utilisé est identique au matériel décrit dans le mode opératoire de l'exemple 1. 2.2) Protocole opératoire Dans le Nucléo-20, on a introduit 6 litres de milieu de culture VPSFM/K30 puis on a ajouté 1 litre d'une suspension de microbilles contenant 2g de cytodex 1 (ce qui représente une surface de 8800 cm et une concentration initiale en microbilles de 0,25g/1 après l'ajout des cellules). Après avoir ajusté les paramètres de régulations à l'intérieur du nucléo-20, tels que régler la température à 37°C, le pH à 7,2 -7,4, la pO2 à z25 et soumis le milieu à une agitation modérée, on a introduit dans le nucléo 250x106 cellules reprises dans 1 litre de milieu de culture VPSFM/K30. Au Jour J2 (2 jours après la mise en culture), on a remplacé le milieu de culture par du milieu de culture neuf. Au jour J5, les cellules ont été trypsinées selon le même protocole que celui qui est décrit dans l'exemple 1. On a ensuite rajouté la suspension de microbilles contenant 14 g de cytodex 1 (ce qui représente une surface de 61600 cm2 et une concentration en microbilles d'environ 1.07 g/1 dans le milieu) aux 9 litres de culture de cellules résultant de l'étape de trypsination puis on a ajusté le volume total de travail à 13 litres avec le milieu de culture VPSFM/K30. On a ensuite ajusté à nouveau les paramètres de régulations à l'intérieur du nucléo-20 comme lors du premier passage cellulaire, et soumis le milieu de culture à une agitation modérée. Après avoir vérifié que l'adhésion des cellules sur les microporteurs était bien effective au moyen d'un prélèvement de contrôle (elle a lieu généralement entre 4 et 6 heures après l'introduction des microbilles), on a remplacé le milieu par du milieu de culture neuf VPSFM/K30. Un deuxième remplacement du milieu de culture par du milieu de culture neuf a été effectué à J7. A J9, les cellules sont substantiellement confluentes. Elles ont été ensuite trypsinées selon le même protocole que celui utilisé à J5. On a ensuite ajouté une suspension de microbilles contenant 60 g de cytodex 1 (ce qui représente une surface de 264000 cm2 et une concentration en microbilles d'environ - 29 - 3 g/1 dans le milieu) aux 9 litres de culture de cellules résultant de l'étape de trypsination puis on a ajusté le volume total de travail à 20 litres avec le milieu de culture VPSFM/K30. On a ensuite contrôlé les paramètres de régulations à l'intérieur du nucléo-20 comme lors des passages cellulaires précédents Après avoir vérifié que l'adhésion des cellules sur les microporteurs était bien effective au moyen d'un prélèvement de contrôle (elle a lieu généralement entre 4 et 6 heures après l'introduction des microbilles), on a remplacé le milieu par du milieu de culture neuf VPSFM/K30. A J12, les cellules sont substantiellement confluentes. Elles ont été ensuite trypsinées selon le même protocole que celui utilisé à J5. La suspension cellulaire finale obtenue permet de mesurer le taux d'amplification cellulaire obtenu après 3 passages cellulaires effectués dans le même bioréacteur. Les quantités et concentrations cellulaires observées au cours de la culture sont représentées dans le tableau ci-après : 2957355 -30- Jour de culture Volume de Concentration Concentration Quantité culture cellulaire dans le cellulaire sur le de cellules milieu (106 support (cell/cm2 x109 cell./ml) de microbilles JO 8 0.038 30230 0.26 JO (après 8 Non disponible Non disponible Non adhésion des disponible cellules) Jl 8 0.026 20684 0.18 J2 8 0.051 40572 0.36 J3 8 Non disponible Non disponible Non disponible J4 8 Non disponible Non disponible Non disponible J5 (avant 8 0.12 95465 0.84 trypsination) J5 (après 13 0.072 11688 0.93 adhésion des cellules) J6 13 0.143 23214 1.85 J7 13 0.241 39123 3.13 J8 13 0.414 67207 5.38 J9 (avant 13 0.743 120616 9.65 trypsination) J9 (après 20 0.346 25064 7.72 trypsination)* J10 20 0.537 34870 10.74 J11 20 1.016 65974 20.32 J12 20 1.649 107077 32.98 Après trois passages cellulaires successifs de cellules Vero réalisés dans un même bioréacteur de 20 litres la population cellulaire a augmenté d'un facteur 126 au bout -31- de 12 jours de culture tandis que la surface du support cellulaire a été augmentée d'un facteur 30. Exemple III : Comparaison de la production de cellules Vero en utilisant soit le procédé selon l'invention (les passages cellulaires successifs sont réalisés dans un seul et même bioréacteur) ou soit le procédé classique d'expansion cellulaire (les passages cellulaires successifs sont réalisés à chaque fois dans des bioréacteurs différents et de taille plus importante). 3.1) protocole On a étudié et comparé la production de cellules Vero en effectuant soit 3 passages cellulaires successifs dans un seul bioréacteur de 20 litres selon le protocole décrit dans l'exemple II et en utilisant une quantité initiale de 250x106 cellules provenant directement d'une banque de cellules congelées, soit 3 passages cellulaires successifs dans des bioréacteurs en inox différents, le premier dans un bioréacteur de 2 litres, le second dans un bioréacteur de 7 litres et le troisième dans un bioréacteur de 28 litres. Les conditions expérimentales du procédé classique qui ont été utilisées sont les suivantes: Les cellules Vero après décongélation, ont été tout d'abord adaptées à leurs conditions de culture en effectuant un passage initial dans des Cell Factory (CF10) en introduisant 40x103 cellules par cm' de surface dans 2 litres de milieu culture VPSFM/K30. Après environ 5 jours de culture, la population cellulaire obtenue a été recueillie après une étape de trypsination. La population cellulaire recueillie est utilisée pour ensemencer un bioréacteur de 2 litres de volume utile contenant une suspension de 2g de microbilles cytodex 1 dans 2 litres de milieu de culture VPSFM/K30 (concentration lg/1). Après avoir contrôlé et ajusté les paramètres de régulation tels que la température à 37°C, le pH à 7,2-7,4 et la pO2 à z25 %, et soumis le milieu à une agitation modérée, on a ensemencé le bioréacteur de 2 litres avec en moyenne de 220x106 cellules. A J3, on a remplacé le milieu de culture par du milieu de culture neuf. A J4, les cellules substantiellement confluentes ont été trypsinées puis transférées avec les microporteurs usagés dans un bioréacteur de 7 litres contenant 7 litres de milieu de culture VPSFM/K30 auquel on a préalablement ajouté 14 g de microbilles cytodex 1 ce qui représente une - 32 - concentration en microbilles d'environ 2g/1. A J6, on a remplacé le milieu de culture par du milieu de culture neuf. A J8, les cellules substantiellement confluentes ont été trypsinées puis transférées de la même façon dans un bioréacteur de 28 litres contenant 28 litres de milieu de culture VPSFM/K30 auquel on a préalablement ajouté 70 g de microbilles cytodex 1 ce qui représente une concentration en microbilles d'environ 2,5g/1. A J10 on a remplacé le milieu de culture par du milieu de culture neuf. A J11 les cellules substantiellement confluentes ont été trypsinées puis récoltées et dénombrées. 3.2) Résultats Pour suivre la croissance cellulaire au cours des deux procédés testés, on a mesuré à intervalles réguliers la concentration cellulaire avec le système de numération Nucleocounter (Chemometec®). Les quantités de cellules et les taux d'amplification observés au cours de la culture sont rassemblés dans le tableau ci-dessous Procédé « ail in one » Procédé classique 1 seul bioréacteur de 20 litres 3 Bioréacteurs (4, 7 et 28 litres) Jour Quantité de Taux Quantité de Taux cellules x 106* d'amplification cellules x106** d'amplification JO 253 220 Jl 162 0,64 446 2,03 J2 300 1,18 874 3,97 J4 832 3,29 2017 9,17 J5 1024 4,05 1499 6,59 J6 1426 5,64 2763 12,56 J7 2448 9,68 4494 20,43 J8 4242 16,77 7251 32,96 J10 10740 42,45 16567 75,30 Jl l 20320 80,32 32056 145,71 J12 29140 115,18 *: les quantités exprimées sont les valeurs moyennes obtenues sur 8 essais différents qui ont été réalisés. - 33 - ** . les quantités exprimées sont les valeurs moyennes obtenues sur 3 essais différents qui ont été réalisés. En utilisant le procédé «all in one » on obtient en moyenne plus de 29 Milliards de cellules au bout de 12 jours de culture après avoir introduit en moyenne 253 millions de cellules directement décongelés dans un bioréacteur de 20 litres, soit un taux d'amplification cellulaire moyen de 115. En utilisant le procédé classique, on obtient en moyenne 32 Milliards de cellules au bout de 11 jours de culture après avoir initialement introduit en moyenne 220 millions dans un bioréacteur de 2 litres, soit un taux d'amplification cellulaire moyen de 145. La surface du support cellulaire disponible a été augmentée d'un facteur 30 dans les deux procédés mais a nécessité l'utilisation de 3 bioréacteurs dans le cas du procédé classique. La quantité de cellules obtenue avec le procédé classique est légèrement plus importante. Cela provient du fait que les cellules qui ont été utilisées pour mettre en oeuvre le procédé « all in one » et le procédé classique n'étaient pas dans les mêmes conditions physiologiques. Les cellules qui ont servi à ensemencer le bioréacteur de 20 litres dans le cas du procédé « all in one » venaient juste d'être décongelées tandis que les cellules utilisées pour ensemencer le bioréacteur de 2 litres étaient beaucoup plus vigoureuses puisqu'elles avaient été préalablement cultivées en Cell factory. Les résultats à Jl le montrent très clairement ; dans le procédé all in one, la diminution de près de 40% du nombre de cellules à Jl résulte du phénomène classique de « latence post décongélation ». Dans le même temps les cellules qui avaient été préalablement cultivées en Cell factory se sont multipliées dans le procédé classique (la population cellulaire a doublé). Malgré les conditions initiales de culture nettement défavorables dans le procédé « all in one », on constate qu'à la fin de la culture il y a finalement très peu d'écart entre les quantités de cellules recueillies dans les deux procédés. On conclut que si les conditions initiales de culture avaient été les mêmes dans les deux procédés testés on aurait obtenu les mêmes quantités et les mêmes taux d'amplification de cellules. Le procédé « all in one » est donc très avantageux par rapport au procédé classique puisqu'on produit dans le même délai la même quantité de cellules en faisant des économies de moyens. - 34 - Exemple IV : amplification de cellules vero en réalisant 3 passages cellulaires successifs dans un seul et même bioréacteur de 200 litres 4.1) Matériel utilisé A l'exception du bioréacteur qui est dans le cas présent une poche à usage unique de 200 litres commercialisé par ATMI sous le nom de Nucleo-200, le matériel qui a été utilisé est le même que celui qui est décrit dans l'exemple 1. 4.2) Protocole opératoire Le protocole opératoire utilisé est similaire à celui qui est décrit dans l'exemple 1 avec les modifications suivantes : Les cellules Vero après avoir été décongelées ont été préalablement mises en culture dans 2 Cell Factory (CF10) à raison de 40x103 cellules par cm et 2 litres de milieu de culture par CF10. Après 5 jours de culture, la population cellulaire a été recueillie après une étape de trypsination et a servi ensuite à ensemencer le Nucleo-200. Le premier passage cellulaire dans le Nucleo-200 a été réalisé en utilisant les conditions d'ensemencement suivantes : la concentration initiale en microbilles dans le milieu de culture était de 0,5g/l soit une quantité totale de microbilles de 25 grammes, la concentration initiale en cellules dans le milieu de culture était 20x103 cellules par cm' de microbilles et le volume de milieu de culture était de 50 litres de VPSFM/K30. Au Jour J3 on a remplacé le milieu de culture par du milieu de culture neuf. Au jour J4, les cellules ont été trypsinées selon le protocole de l'exemple 1 en laissant 20 litres de milieu dans le Nucleo puis on a rajouté 20 litres d'une solution de citrate de sodium 0,025M contenant 3000 mg de tryspsine recombinante dans un tampon phosphate contenant ni Calcium ni Magnésium. Après le décollement des cellules, on a stoppé l'action de la trypsine en rajoutant 20 litres d'une solution de VPSFM/K30 contenant lmg/ml d'inhibiteur de trypsine. Le second passage cellulaire a été réalisé dans le même nucléo-200 en rajoutant à toute la population cellulaire obtenue une suspension de microbilles contenant 130g de cytodex 1 (ce qui représente une surface de 572000 cm et une concentration en microbilles dans le milieu d'environ lg/1) et ajusté le volume total du milieu à 130 litres avec le milieu de culture VPSFM/K30. On a également effectué deux remplacements de milieu de culture: le premier juste après l'adhésion des cellules - 35 - aux microbilles, le second à J6. Au jour J7, les cellules ont été à nouveau trypsinées selon le même protocole que celui utilisé à J4. Le troisième passage cellulaire dans le même nucléo- 200 a été réalisé en rajoutant à la population cellulaire obtenue une suspension de microbilles contenant 450g de cytodex 1 (ce qui représente une surface de 1980000 cm et une concentration en microbilles dans le milieu d'environ 2,5 g/1) et ajusté le volume total du milieu à 180 litres avec le milieu de culture VPSFM/K30. La concentration initiale en cellules dans le milieu de culture était 20x103 cellules par cm de microbilles De la même façon, on a également effectué deux remplacements de milieu de culture: le premier juste après l'adhésion des cellules aux microbilles, le second à J10. Au jour J11, les cellules ont été à nouveau trypsinées. La population de cellules obtenue après les 3 passages cellulaires successifs effectués dans le même bioréacteur a été ensuite quantifiée. On peut mesurer ainsi le taux d'amplification cellulaire. Les quantités et concentrations cellulaires observées au cours de la culture sont représentées dans le tableau ci-dessous 5 2957355 -36- Jour de culture Volume de Concentration Concentration Quantité culture cellulaire dans le cellulaire sur le de cellules milieu (106 cell./ml) support (cell/cm2 x109 de microbilles JO 50L 0.038 17580 1.93 JO (après 50L Non disponible Non disponible Non adhésion des disponible cellules) Jl 50L 0.034 15455 1.71 J2 50L 0.07 31818 3.50 J3 50L 0.147 66818 7.35 J4 (avant 50L 0.162 103000 11.34 trypsination) J4 (après 130L 0.114 25900 14.81 adhésion des cellules) J5 130L 0.135 30600 17.55 J6 130L 0.275 62500 35.75 J7 (avant 130L 0.552 125455 71.76 trypsination) J7 (après 180L* 0.212* 19273* 38.16* trypsination)* J8 180L 0.329 29900 59.22 J9 180L 0.646 58727 116.28 J10 180L 1.1 100000 198 J11 180L 1.5 136364 270 *ajustement de la population cellulaire afin d'avoir une concentration théorique en cellules à 20000 celUcm2. Après trois passages cellulaires successifs de cellules Vero réalisés dans un même bioréacteur de 200 litres la population cellulaire a augmenté d'un facteur 140 au bout -37- de 11 jours de culture tandis que la surface du support cellulaire a été augmentée d'un facteur 18. Exemple V : Production du virus rabique à partir d'un lot de cellules qui a été obtenu en réalisant 3 passages cellulaires successifs dans un seul et même bioréacteur de 200 litres. Le lot de cellules a été produit en utilisant le même protocole que celui qui a été décrit dans l'exemple IV. Au jour J11, on a remplacé le milieu de culture par un milieu d'infection virale à base de VPSFM puis on a infecté les cellules avec la souche Pitman Moore du virus rabique provenant de l'institut Wistar à une multiplicité d'infection de 0,01. Les paramètres de régulation de la température, du pH, de la pO2 et d'agitation modérée utilisés pour la culture cellulaire ont été conservés ajustés pour la production de virus. On a renouvelé le milieu d'infection virale au Jour J3 après l'infection virale, puis on a récolté les surnageants de culture pour mesurer les titres infectieux au jour J7, J10 et J14 après l'infection virale. Après chaque récolte virale, on a remis du milieu d'infection virale neuf. Les titres infectieux dans les surnageants de culture ont été mesurés au moyen d'un test classique d'immunofluorescence sur cellules BHK21. On a réalisé une série de dilutions pour chacun des surnageants de culture testés puis chaque dilution a été transférée dans 10 puits d'une microplaque 96 puits. Deux séries de tests ont été réalisés en parallèle. On a rajouté ensuite une suspension de cellules BHK21 dans chacun des puits. Les cellules ont été incubées pendant 48 heures à 37°C sous 5% de CO2. Au bout de 48 heures les puits étaient recouverts d'un tapis cellulaire que l'on a fixé à l'acétone. Après avoir éliminé l'acétone et sécher les microplaques, on a rajouté 50 gl d'une dilution au 1/70ème d'un anticorps monoclonal dirigé contre le virus rabique (FDI Fujirebio Diagnostics-Ref 800092). Après une incubation d'une heure suivie de plusieurs rinçages on a analysé les microplaques au microscope à flurorescence. Un puits est considéré comme positif dès lors que l'on observe une fluorescence spécifique dans au moins une cellule. Comme contrôle négatif on a utilisé les cellules BHK21 cultivées en l'absence de virus rabique et comme contrôle positif, les cellules BHK21 cultivées en présence - 38 - d'une souche de virus rabique de référence. Les titres infectieux en virus rabiques contenus dans les surnageants de culture testés ont été déterminés selon la méthode de Spearman et Karber et exprimés en unités log 10 de dose infectieuse en culture de cellules 50% (DICC 50). Les titres infectieux obtenus dans les surnageants de culture qui ont été observés se situaient aux environs de 7,0 logl0 DICC 50. REVENDICATIONS1 Un procédé de production de cellules adhérentes à des microporteurs selon lequel : a. on introduit des cellules adhérentes dans un récipient de culture qui contient des microporteurs dans un milieu de culture ; b. on amplifie les cellules en effectuant dans ce même récipient de culture plusieurs passages cellulaires successifs en utilisant à chaque fois la population cellulaire produite lors du passage cellulaire précédent et en augmentant à chaque fois la quantité de microporteurs que l'on ajoute au milieu de culture; et c. On recueille la population cellulaire produite lors du dernier passage cellulaire. 2. Un procédé de production d'un agent biologique produit par des cellules adhérentes à des microporteurs selon lequel : a. on introduit des cellules adhérentes dans un récipient de culture qui contient des microporteurs dans un milieu de culture ; b. on amplifie les cellules en effectuant dans ce même récipient de culture plusieurs passages cellulaires successifs en utilisant à chaque fois la population cellulaire produite lors du passage cellulaire précédent et en augmentant à chaque fois la quantité de microporteurs que l'on ajoute au milieu de culture; c. on traite la population cellulaire produite lors du dernier passage cellulaire de manière à ce qu'elle produise l'agent biologique, la dite étape c) étant réalisée dans le même récipient de culture que celui qui a été utilisé pour réaliser les étapes a) et b) et ; d. on recueille l'agent biologique. 3. Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent biologique est un agent infectieux et en ce que l'étape c) est effectuée en infectant la population cellulaire produite lors du dernier passage cellulaire avec ledit agent infectieux dans un milieu d'infection. 4. Un procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent infectieux est le virus rabique et le milieu d'infection virale est dépourvu de tout produit d'origine animale. 2957355 - 40 - 5. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le nombre de passages cellulaires successifs effectués dans le même récipient de culture est 2, 3 ou 4. 5 6. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la concentration en microporteurs dans le milieu de culture pendant le premier passage cellulaire est 7. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 6, selon lequel à la fin de chaque 10 passage cellulaire, les cellules sont décrochées de leurs microporteurs au moyen d'une solution contenant une enzyme protéolytique. 8. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 7, selon lequel on augmente le volume du milieu de culture à chaque passage cellulaire. 9. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on effectue le premier passage cellulaire dans un milieu de culture dont le volume représente entre le 1/5 et la moitié du volume utile du récipient de culture. 20 10. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le milieu de culture ne contient pas de sérum d'origine animale. 11. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le milieu de culture ne contient pas de produit d'origine animale. 12. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la concentration en protéines dans le milieu de culture est 13. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le milieu de 30 culture contient en outre un agent protecteur cellulaire. 14. Un procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'agent protecteur cellulaire est une polyvinyl pyrrolidone. 35 15. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le récipient de culture est un bioréacteur ayant un volume utile compris entre 3 et 3000 litres, 15 25de façon préférée entre 20 et 1000 litres, et de façon particulièrement préférée entre 20 et 500 litres. 16. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 15, selon lequel les cellules adhérentes sont des cellules Vero. 17. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 16, selon lequel la population cellulaire qui est produite contient un nombre de cellules qui est au moins 60 fois plus important que le nombre de cellules qui ont été initialement introduites à l'étape a) du procédé. 18. Un procédé de production de cellules adhérentes à des microporteurs selon lequel : a. on décongèle un stock de cellules adhérentes, puis b. on applique le procédé tel que revendiqué selon l'une des revendications 1 et 5 à 17 aux cellules décongelées. 19. Un procédé de production de cellules adhérentes à des microporteurs selon l'une des revendications 1 et 5 à 18 selon lequel après avoir recueilli la population cellulaire produite lors du dernier passage cellulaire effectué dans un premier récipient de culture on la transfère dans un second récipient de culture ayant un volume utile plus important et qui contient des microporteurs dans un milieu de culture en quantité plus importante que la quantité de microporteurs qui existait lors du dernier passage cellulaire effectué dans le premier récipient de culture et on applique à nouveau le procédé tel que revendiqué selon l'une des revendications 1 et 5 à 18 aux cellules transférées dans le second récipient de culture. 20. Utilisation des cellules qui ont été produites selon le procédé de l'une des revendications 1 et 5 à 19 pour la production d'agents biologiques.