FR 2949787 A1 20110311 FR 0904301 A 20090909 Molécules capables de perforer la mitochondrie et leurs applications L'invention a pour objet l'utilisation de peptides pour perforer la mitochondrie et ses applications biologiques. En plus de fournir l'énergie indispensable à la survie cellulaire, la mitochondrie exerce des fonctions essentielles dans le contrôle de l'apoptose chez les vertébrés. La voie mitochondriale d'apoptose est définie par un événement majeur : la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe, qui conduit à la libération dans le cytoplasme de protéines toxiques (comme par exemple le cytochrome c) normalement contenues dans l'espace intermembranaire. L'intégrité de cette membrane est sous le contrôle des protéines de la famille Bd-2. Les protéines de cette famille, qui sont soit pro-apoptotiques (comme Bax et Bid) soit antiapoptotiques (comme Bd-2 et Bcl-xL), forment des homo- et des hétérodimères, l'ensemble de ces interactions protéine-protéine participant à la régulation de l'apoptose. On sait cependant que l'interaction des protéines de la famille Bd-2 avec les membranes intracellulaires est cruciale pour leur fonction. Ainsi, à la fois les protéines pro- (comme Bax et Bid) et anti-apoptotiques (comme Bd-2 et Bcl-xL) de la famille Bel-2 peuvent former des pores in vitro dans des membranes artificielles. Des expériences indiquent également que des canaux composites formés au niveau de la membrane mitochondriale externe par des oligomères des protéines pro-apoptotiques Bax et Bak (seuls ou en association avec d'autres protéines) autoriseraient le passage de solutés comme le cytochrome c. Les protéines homologues à Bd-2 partagent une structure globulaire (rappelant celle de certaines toxines bactériennes formant des pores membranaires) comportant entre 6 et 9 hélice-alpha amphipathiques. Les études structurales ont montré que l'un des sites fonctionnels cruciaux dans ces protéines était un motif supersecondaire (� hélice-coude- hélice �) composé de deux hélices-alpha anti-parallèles en � épingle à cheveux � (alpha5- alpha6 dans Bax), capables de s'insérer dans les membranes biologiques et de former des pores. La structure 3D de Bax est donnée sur la Figure 1. Chaque hélice du motif présente une taille d'environ 15-20 acides aminés (ordre de grandeur pour une hélice-alpha susceptible de traverser une bicouche lipidique), séparés par un coude formé de 3-4 résidus. Il a été rapporté dans la littérature que des peptides correspondant aux hélices centrales d'insertion membranaire (alpha5 et alpha6) de Bax étaient capables d'induire à eux seuls la libération de molécules contenues dans des liposomes. De plus, une étude structurale récente a montré qu'un peptide correspondant à l'hélice alpha5 de Bax formait un pore lipidique. Il est vraisemblable que les régions d'insertion membranaire des protéines de la famille Bel-2 aient été sélectionnées par l'évolution pour s'intégrer de manière spécifique dans les membranes mitochondriales des cellules animales. Les travaux des inventeurs ont porté sur l'étude de peptides issus de ces régions afin de déterminer s'ils peuvent à eux seuls cibler les membranes mitochondriales et provoquer une mort cellulaire par apoptose. Les résultats obtenus ont permis d'identifier des déterminants structuraux minimums régissant l'interaction des protéines de la famille Bel-2 avec les membranes. De manière avantageuse, certaines régions se sont révélées d'un grand intérêt pour cibler la mitochondrie et déstabiliser les membranes mitochondriales. A partir de ces régions, des peptides bioactifs ont été développés ouvrant une voie d'accès à de nouvelles molécules utilisables en thérapeutique. Ces nouvelles molécules ont été désignées par le terme �poropeptides � (du mot grec Poros IIOPOE: trou ou passage maritime; au figuré : moyen efficace de contourner une difficulté), un poropeptide désignant un peptide présentant la faculté de former des pores dans des membranes lipidiques ou de déstabiliser des membranes biologiques telles que les membranes mitochondriales. Des poropeptides, conçus à partir des régions d'insertion membranaire des protéines de la famille Bel-2, se sont ainsi révélés capables d'induire l'apoptose de cellules nuisibles, comme par exemple des cellules tumorales. L'invention a donc pour but l'utilisation d'acides nucléiques des régions d'insertion membranaire des protéines de la famille Bd-2 et des peptides codés correspondants pour perforer la mitochondrie. Elle vise également à fournir de nouvelles molécules d'acides nucléiques et de peptides développés à partir de ces régions. L'invention vise aussi à fournir, avec ces différentes molécules, des moyens de grande efficacité pour restaurer un processus d'apoptose dans les cellules cancéreuses tout en limitant au maximum les répercussions sur les cellules saines environnantes. Comme l'ensemble des cellules vivantes de l'organisme (saines ou pathologiques) sont dotées de mitochondries, les poropeptides induisant la rupture de la perméabilité mitochondriale peuvent être utilisés pour induire la mort de nombreux types cellulaires. L'invention porte ainsi sur l'utilisation de dérivés des hélices d'insertion membranaire des protéines de la famille Bel-2 pour perforer la mitochondrie, caractérisée en ce qu'il s'agit d'acides nucléiques codant pour les régions a5 et/ou a6 de la protéine Bax ou pour les régions équivalentes présentes dans les autres protéines de la famille Bd-2. L'invention porte en outre sur des dérivés, variantes, mutants ou fragments des peptides et acides nucléiques susmentionnés. Plus particulièrement, ces acides nucléiques codent pour les régions correspondant aux acides aminés en position 106-134, 130-150 et 102-150 de la protéine Bax. L'invention vise également l'utilisation de vecteurs d'expression comprenant un insert d'au moins un acide nucléique tel que défini ci-dessus pour perforer la mitochondrie. L'utilisation des peptides codés par les acides nucléiques ou les vecteurs décrits ci-dessus 30 pour déclencher un processus apoptotique en agissant sur la mitochondrie est également visée par l'invention. L'invention vise en outre des poropeptides dérivés des régulateurs d'apoptose de la famille Bel-2. Ces poropeptides sont dérivés des régions d'insertion membranaire des protéines de la25 famille Bel-2, plus spécialement des hélices a5 et a6 de la protéine Bax ou des régions équivalentes présentes dans les autres protéines de la famille Bel-2. Des peptides synthétiques dérivés de ceux définis ci-dessus comportent par exemple des 5 moyens permettant la pénétration cellulaire ou la reconnaissance d'un type cellulaire particulier. Des moyens avantageux correspondent à un motif de transduction permettant leur internalisation dans la cellule ciblée. Il s'agit notamment d'un motif polyarginine, comportant 10 avantageusement 8 résidus arginine. D'autres modifications, correspondent à des délétions et/ou des substitutions d'un ou plusieurs acides aminés. Ainsi un ou plusieurs résidus Cystéine des dites régions peuvent être remplacés par des motifs Serine ou Glycine. L'invention concerne également des conjugués qui contiennent un peptide dérivé de ceux 15 définis ci-dessus et une molécule d'adressage, comme des molécules reconnaissant l'endothélium, permettant de cibler un tissu ou un type cellulaire particulier, tel que certaines cellules tumorales ou des cellules endothéliales angiogéniques. L'invention concerne aussi des équivalents fonctionnels des peptides définis ci-dessus, tels 20 que des peptides comprenant des modifications issues de processus post-traductionnels comme la glycosylation ou de modifications chimiques telles que le couplage avec des lipides, sucres, séquences de nucléotides ou d'acides aminés dès lors que ces modifications ne modifient pas l'activité pro-apoptotique desdits peptides conformément aux tests donnés dans la partie expérimentale ci-après. Les équivalents fonctionnels comprennent aussi des peptides 25 dont un ou plusieurs acides aminés sont des acides aminés de conformation D. L'invention couvre également les rétro- peptides et les rétro-inverso-peptides. L'invention vise à titre en particulier les peptides dérivés des régions a5 et a6, à titre d'exemple, le peptide NH2-NWGRVVALFYFASKLVLKALSTKVPELIR-COOH, 30 comportant SEQ ID N°1 : NWGRVVALFYFASKLVLKALSTKVPELIR. Après internalisation, ces composés � mitochondrio-toxiques � sont capables de déclencher l'apoptose en déstabilisant les membranes mitochondriales, notamment la membrane mitochondriale externe. De manière avantageuse, ils induisent le relargage de multiples molécules toxiques contenues dans l'espace inter-membranaire des mitochondries, notamment du cytochrome c. Comme illustré par les exemples, leur activité cytotoxique a été démontrée in cellulo. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention vise l'utilisation des acides nucléiques et peptides définis ci-dessus comme médicaments. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles 10 comprennent une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un acide nucléique ou un peptide tels que définis ci-dessus en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant 15 comme principe actif au moins un peptide tel que défini précédemment associé dans ladite composition avec un ou plusieurs véhicules, diluants ou excipients pharmaceutiquement acceptable. L'administration de composition pharmaceutique selon l'invention peut être réalisée selon les 20 techniques connues par l'homme de métier par l'un quelconque des modes d'administration acceptés pour les agents thérapeutiques. Ces procédés comprennent l'administration systémique, topique, orale ou encore centrale, par exemple par voie chirurgicale ou encore par administration infra-oculaire. On peut citer aussi l'implantation sous- cutanée d'implants biodégradable. 25 La posologie pour l'administration des peptides selon l'invention est choisie en fonction de nombreux facteurs y compris le type, l'espèce, l'âge, le poids, le sexe et l'état médical du sujet; la gravité de l'état à traiter ; la voie d'administration ; l'état des fonctions rénale et hépatique du sujet et la nature du composé particulier, ou sel, employé. L'homme de métier 30 normalement expérimenté déterminera et prescrira la quantité efficace pour prévenir, contrarier ou stopper le progrès de l'état médical à traiter.5 Grâce à leur effet direct sur la perméabilité mitochondriale, les composés ci-dessus sont particulièrement avantageux pour déclencher un processus apoptotique après internalisation dans des cellules tumorales ou des cellules des néo-vaisseaux irriguant les tumeurs. Du fait de leur capacité à cibler les mitochondries, l'invention a également pour objet l'utilisation des peptides susmentionnés comme molécules d'adressage mitochondrial permettant de délivrer un composé ou un polypeptide au niveau des membranes mitochondriales afin d'induire l'apoptose. Ils sont utilisables de manière générale dans des situations avec une augmentation de la néovascularisation, comme l'arthrite rhumatoïde ou l'obésité. En effet, une angiogénèse soutenue caractérise les formes sévères d'arthrite et le maintien de la masse adipeuse au cours de l'obésité. Une angiogénèse pathologique est également retrouvée dans le psoriasis et certaines formes de diabète. Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits poropeptides, ils sont utilisés pour contrer certains autres types de cellules nuisibles, comme les cellules immunitaires reconnaissant le soi et provoquant des maladies auto-immunes. Les poropeptides tels que définis ci-dessus présentent toutes les caractéristiques de peptides antimicrobiens: caractère amphipathique, cationique, déstabilisation des membranes lipidiques. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation des peptides tels que définis ci-dessus pour la préparation d'une molécule aux propriétés antibiotiques capables de tuer des bactéries résistantes. D'une manière générale, les peptides thérapeutiques sont généralement métabolisés et s'éliminent plus facilement que les drogues conventionnelles, permettant de donner au patient de meilleures chances de guérison tout en minimisant les complications associées aux thérapies standards. De plus les poropeptides peuvent être utilisés, conformément à l'invention, comme adjuvants venant en complément des drogues conventionnelles, permettant ainsi de diminuer les doses et les effets secondaires de ces dernières.30 Selon un autre aspect, l'invention vise des compositions cosmétiques renfermant dans leur principe actif au moins un peptide tel que défini ci-dessus en association avec un véhicule acceptable en cosmétologie. De manière avantageuse, les peptides de l'invention présentent des propriétés stabilisantes pour ces compositions. Selon un autre aspect, l'invention vise en outre des compositions agronomiques ou agro-alimentaires renfermant dans leur principe actif au moins un peptide tel que défini ci-dessus, 10 en association avec un véhicule acceptable en agronomie et dans le domaine alimentaire. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 11 qui représentent, respectivement, 15 - Figure 1, A) le domaine � canal � de la colicine A; B) la structure 3D de Bax ; C) le motif a- hélical en épingle à cheveux des protéines de la famille Bd-2 (alpha5-alpha6 dans Bax) ; - Figure 2, des constructions codant pour des fusions entre la GFP (protéine fluorescente verte) et les différentes régions d'ancrage ou d'insertion membranaire de la 20 protéine pro-apoptotique Bax ; - Figure 3, des résultats d'analyse de l'expression de régions de Bax par Western Blot ; - Figure 4, la localisation cellulaire de la GFP par rapport aux dites régions ; - Figure 5, le taux de mort de cellules exprimant la GFP ou la GFP fusionnée aux peptides utilisés selon l'invention ; 25 - Figure 6, le taux d'apoptose de fibroblastes embryonnaires murins sauvages (MEF) ou déficients en Bax et Bak (MEF-DKO) ; - Figure 7, la projection en roue hélicoïdale d'un peptide de l'invention ; - Figure 8, l'effet d'un poropeptide de l'invention sur des mitochondries isolées ; - Figures 9 et 10, l'effet de la micro-injection de fragments peptidiques de Bax sur la 30 viabilité et la morphologie embryonnaire (Fig.9) et cellulaire (Fig.10) ; et -Figure Il, l'effet pro-apoptotique d'un poropeptide de l'invention. Constructions plasmidiques comportant des inserts correspondant aux acides nucléiques codant pour une ou plusieurs régions de Bax fusionnées à la GFP : aminoacides 1-192 (protéine Bax entière : al-a2-a3-a4-a5-a6-a6'-a7-a8-a9), 20-37 (al), 106-134 (a5), 130-150 (a6), 102-150 (a5-a6), 102-192 (a5-a6-a6'-a7-a8-a9 ou a5-a9), 169-192 (a9). Les acides nucléiques codant pour les différentes régions d'ancrage ou d'insertion 5 membranaire présentes sur la protéine pro-apoptotique Bax ont été clonés dans le plasmide pEGFP-C 1. Les séquences insérées sont données sur la Figure 2. Les plasmides recombinants ont été vérifiés par séquençage moléculaire. L'analyse de l'expression des inserts de Bax effectuée par Western Blot est rapportée sur la Figure 3 : la 10 partie supérieure correspond à l'analyse par Western Blot, en utilisant un anticorps anti-GFP, de lysats de cellules MEF-DKO transfectées de manière transitoire par les constructions plasmidiques ci-dessus ; la partie médiane donne l'immuno-empreinte obtenue à l'aide d'un anticorps reconnaissant le fragment de clivage apoptotique de PARP ; la partie inférieure donne l'immuno-empreinte obtenue à l'aide d'un anticorps reconnaissant la forme activée de 15 la caspase-3. Les différentes constructions ont été transfectées dans des cellules humaines cultivées in vitro (HT-1080 et SK-MEL-28), puis la localisation subcellulaire et la cytotoxicité induite par les fragments d'insertion membranaire de Bax fusionnés à la GFP ont été déterminées. 20 La Figure 4 montre la localisation subcellulaire de la protéine GFP complète par rapport à celle des inserts composés de fragments d'insertion membranaire de Bax fusionnés à la GFP. Des cellules SK-MEL-28 ont été co-transfectées avec les plasmides pEGFP-C 1 codant les différents inserts de Bax et le vecteur MitoDsRed. On observe que des peptides correspondant 25 ou comprenant les hélices d'insertion membranaire de Bax et/ou le domaine TM sont suffisants pour adresser la GFP (en vert) aux membranes mitochondriales (marquées en rouge grâce à la protéine MitoDsRed, comportant la séquence d'adressage mitochondrial CoxVIII). Ces résultats de microscopie confocale indiquent que de courts fragments de la protéine Bax (en particulier les régions correspondant aux acides aminés 106-134, 130-150 et 169-172) 30 contiennent les déterminants nécessaires à leur adressage spécifique à la mitochondrie. La Figure 5 montre la toxicité cellulaire induite par l'expression des différentes constructions. Cette figure donne le taux de mort (apoptose/nécrose) de cellules SK-MEL-28 et HT-1080 exprimant la GFP seule ou en fusion avec différents fragments d'insertion membranaire de la protéine de mort Bax. Les cellules ont été traitées (bas) ou non (haut) avec l'inhibiteur général de caspases zVAD.fmk (1001.tM). La mort cellulaire a été quantifiée 24 h après transfection en comptant le nombre de cellules vertes (exprimant la GFP) au microscope à épifluorescence. Le type de mort cellulaire (apoptose et nécrose) a été déterminé par la perméabilité membranaire à l'iodure de propidium (nécrose) et la morphologie nucléaire (noyaux condensés ou fragmentés) après coloration au Hoechst 33342 (apoptose). Les cellules vertes négatives pour l'iodure de propidium et présentant un noyau pycnotique ont été comptées comme étant en apoptose. Les résultats représentent les valeurs moyennes (avec les écart-types) de trois expériences. Dans le test utilisé, les cellules vertes (exprimant la construction) présentant un noyau pycnotique sont apoptose, celles colorées en rouge par l'iodure de propidium sont en nécrose. On observe que les constructions codant les hélices centrales de Bax (GFP-Bax-a5a6, GFP- Bax-a5 et GFP-Bax-a6) sont fortement cytotoxique et induisent une mort cellulaire principalement de type apoptotique. Le caractère apoptotique de la mort cellulaire provoquée par l'expression des fragments d'insertion membranaire de Bax est confirmé par le clivage de la protéine PARP et l'activation de la caspase-3, mises en évidence par la technique du western blot (Fig.4) à l'aide d'anticorps spécifiques, et par blocage de l'apoptose par un inhibiteur de caspases à large spectre(zVAD.fmk) (Fig.5). La Figure 6 montre que les protéines toxiques codées par les inserts n'agissent pas par l'intermédiaire des protéines pro-apoptiques Bax et Bak endogènes, car des fibroblastes murins déficients en Bax et Bak (MEF-DKO) ne sont pas résistants au stress induit par leur expression (voir également Fig.3) Les résultats obtenus montrent que les régions de la protéine pro-apoptique Bax correspondant aux acides aminés 106-104 et 130-150 sont capables de cibler les membranes mitochondriales er d'induire le suicide cellulaire par apoptose. Ces régions sont structurées en hélices-alpha au sein de la protéine Bax complète (Suzuki et al. 2000, Cell, 103, 645-654) et présentent un caractère amphipatique favorable à la déstabilisation des membranes biologiques. Poropeptide de séquence SEQ ID N°1 Il s'agit d'un peptide amphipatique (voir Fig.7), plus long que l'hélice a5 déduite à partir de la structure 3D de la protéine Bax en solution (Suzuki et al. 2000). Il comporte un résidu Sérine incorporé en position 126 en lieu et place du résidu naturel Cystéine afin de limiter la formation de ponts disulfure. • Caractérisation de son mode d'action par incubation avec des mitochondries isolées. L'activité ex cellulo du poropeptide-Bax (106-134) a été testée en déterminant sa capacité à promouvoir la libération de cytochrome c de l'espace inter-membranaire de mitochondries isolées. Les résultats obtenus sont illustrés par la Figure 8. Le peptide est incubé avec les mitochondries pendant 5,15, 30 ou 60 min, et la libération mitochondriale de cytochrome c dans le surnageant (SN) est mesurée par Western Blot. Les fractions mitochondriales (Mito) sont calibrées à l'aide d'un anticorps dirigé contre les protéines mitochondriales HSP70 ou ATPase (sous-unité 6). Avec le poropeptide-Bax (106-134), le cytochrome c est libéré de l'espace inter-membranaire de la mitochondrie à 10 �M et en 5 min d'incubation. Aucun relargage n'est observé lorsqu'un peptide antimicrobien (KLAK) de séquence SEQ ID N°2 KLAKLAKKLAKLAK, issu d'antibiotiques naturels à hélice-alpha connus pour cibler la membrane bactérienne chargée négativement, est utilisé. A 10 �M, ce qui correspond à la concentration minimale pour laquelle un relargage est observé avec le poropeptide-Bax (106-134), aucune libération n'est observée pour le peptide Bax-BH3 (domaine de mort BH3 de Bax correspondant à l'hélice a2, située une trentaine de résidus an amont de l'hélice a5). Le cytochrome c est libéré de l'espace inter-membranaire mitochondrial à partir de 251.tM en utilisant des mitochondries isolées de cellules HEK293T et n'est jamais libéré avec des cellules SK-MEL-28. Le poropeptide-Bax (106-134) est donc plus actif que le Bax-BH3 pour libérer le cytochrome c de l'espace inter-membranaire de la mitochondrie. De plus, il est plus efficace, puisqu'il permet une libération dès les 5 premières minutes, alors qu'il faut attendre 30 min pour le peptide BH3 dans les cellules HEK293T. Ces expériences montrent que le poropeptide-Bax [106-134], de séquence SEQ ID N°1, possède une forte capacité à induire la perméabilisation des membranes mitochondriales. 10 • mesures de cytotoxicité induite - Administration de manière endogène du peptide (par micro-injection). Le poropeptide-Bax [106-134] a été micro-injecté in vivo. Le modèle du zebrafish (Danio rerio) a été utilisé car (i) la machinerie d'apoptose est conservée entre les cellules humaines et de poissons ; (ii) l'oeuf correspond à un système cellulaire intégré par rapport aux mitochondries isolées ; (ii) les oeufs de poisson-zèbre sont facilement injectables en routine. Les résultats obtenus sont illustrés sur la Figure 9 : (A) Des oeufs de zebrafish ont été micro-injectés au stade 1-2 cellule(s) avec des concentrations croissantes de poropeptide-Bax [106-134], de peptide Bax-BH3 ou avec de 15 l'eau ultra pure (`mock'). Une concentration de 100 �M à l'intérieur du capillaire de micro-injection correspond environ à 6x1012 molécules de peptide par oeuf. Les histogrammes représentent le pourcentage de mortalité 24 h après fertilisation (panel de gauche) et le pourcentage d'embryons survivants présentant de sévères malformations (droite). Les données présentées sont représentatives de 2 expériences indépendantes donnant les mêmes 20 résultats. (B) Morphologie embryonnaire 24 h après micro-injection (100 �M de peptide). De sévères malformations sont observables dans le groupe de poissons injectés avec le poropeptide-Bax [106-134] par rapport au groupe injecté avec le peptide BH3. Le poropeptide-Bax [106-134] a ensuite été mélangé à une solution de dextran-fluorescéine (pour permettre sa visualisation en microscopie à épifluorescence), puis micro-injecté à l'intérieur de cellules de mélanome humain SK-MEL-28. La viabilité cellulaire a ensuite été suivie et quantifiée 12 heures après micro-injection. La Figure 10 donne les résultats obtenus : (A) Microphotographies montrant des cellules humaines de mélanome SK-MEL-28 injectées avec du traceur fluorescent Dextran-FITC seul (`mock') ou mélangé au poropeptide-Bax 11 10 25 30 [106-134]. Les cellules ont été photographiées 12 h après micro-injection. Les cellules micro-injectées avec le poropeptide- Bax [106-134] présentent des manifestations morphologiques caractéristiques de l'apoptose (bourgeonnement cytoplasmique, rétractation et arrondissement cellulaire). Grossissement x 800. (B) Viabilité cellulaire après micro-injection de poropeptide- Bax [106-134] ou de peptide Bax-BH3. Les cellules micro-injectées ont été visualisées à l'aide du traceur Dextran-FITC. La mort cellulaire a été estimée 12h après micro-injection en comptant le nombre de cellules micro-injectées présentant des manifestations morphologiques typiques de l'apoptose. Les données présentées sont représentatives de 2 expériences indépendantes donnant les mêmes résultats. Les résultats montrent donc que la micro-injection du poropeptide-Bax [106-134] induit une mort cellulaire substantielle, alors que les cellules micro-injectées par Bax-BH3 présentent des taux de viabilité comparables au contrôle (micro-injection d'eau ultra-pure additionnée de dextran-fluorescéine), ce qui démontre que le poropeptide-Bax [106-134] exerce des effets cytotoxiques dépendant de la dose après introduction dans des oeufs de zebrafish ou dans des cellules tumorales cultivées in vitro. - Administration de manière exogène (par couplage avec peptide transducteur de type polyarginine). Le poropeptide de séquence SEQ ID N°1 a été utilisé. Un groupement isothiocyanate de fluorescéine (FITC) a été ajouté en position C-terminale de manière à permettre sa visualisation par microscopie à épifluorescence. Le peptide R8-Scr-FITC est une séquence � scramble � de la séquence présente dans le peptide R8- Bax [106-134]- FITC, c'est-à-dire une séquence contrôle dans laquelle les acides aminés (leur ordre dans la séquence) ont été mélangés. La figure 11 montre les résultats obtenus : (A) Des cellules HeLa ont été incubées pendant 6 h en présence de 10 �M de poropeptide FITC-R8-Bax [106-134] ou de peptide contrôle R8-Bax [Scr] (version � scramble � du poropeptide), puis observées au microscope à épifluorescence. Les cellules incubées en présence des peptides fluorescents présentent un fort marquage cytoplasmique (visible dès 1h d'incubation). Echelle 10 �m. (B) Le poropeptide R8-Bax [106-134] induit une perte de viabilité cellulaire dépendante de la dose et du temps d'incubation. Des cellules HeLa ont été traitées avec des concentrations croissantes (5, 10, 25 et 50 �M) de peptide R8-Bax [106-134] ou R8-Bax [106-134]. La cytotoxicité a été déterminée en mesurant la libération cellulaire de lactate déshydrogénase (LDH) après 3, 6 ou 24 h d'incubation (n=4). Le peptide R8-Bax [Scr] n'induit pas de fuite significative de LDH aux concentrations testées. Les résultats sont donnés en moyennes et écart-types. (C) L'inhibiteur général de caspases zVAD.fmk réduit la mort cellulaire induite par poropeptide R8-Bax [106-134] (25�M). La cytotoxicité a été déterminée en mesurant la libération cellulaire de lactate déshydrogénase (LDH) après 24 h d'incubation en présence de 100 �M de zVAD.fmk ou de tampon seul (`DMSO' ). Les résultats sont donnés en moyennes et écart-types. (D) Taux de mort (apoptose/nécrose) de cellules HeLa traitées avec le poropeptide R8-Bax [106-134]. Le type de mort cellulaire a été déterminé 24 h après transfection par observation de la perméabilité cellulaire à l'iodure de propidium (nécrose) ou de la morphologie nucléaire après coloration de l'ADN par le Hoechst 33342 (apoptose). Les cellules vertes (exprimant la GFP) ont été visualisées par microscopie à épifluorescence. Environ 300 cellules ont été dénombrées par expérience. Les résultats sont une moyenne de trois expériences indépendantes (l'écart-type est également représenté). Ainsi les deux peptides (poropeptide FITC-R8-Bax [106-134] et peptide contrôle � scramble � R8-Bax [Scr]) sont rapidement internalisés (en moins d'une heure) par des cellules HeLa en culture in vitro (Fig. 11A). A la différence du peptide contrôle, le poropeptide R8-Bax [106-134]-FITC inhibe la viabilité des cellules HeLa de manière dépendante de la dose et du temps d'incubation (Fig.B). Un inhibiteur pan-caspase, le zVAD.fmk, ajouté in vitro inhibe significativement la mort cellulaire induite par R8-Bax [106-134]-FITC (Fig.11C), indiquant la participation des caspases dans son activité proapoptotique (Fig.11 D). 14