FR 2957608 A1 20110923 FR 1052010 A 20100319 -1- PROCEDE D'ESTIMATION DU NOMBRE DE MICROORGANISMES DANS UN ECHANTILLON ET DISPOSITIF POUR METTRE EN OUVRE LEDIT PROCEDE DOMAINE DE L'INVENTION L'invention a trait au domaine du dénombrement de microorganismes, tels que des bactéries et/ou des champignons, présents dans un échantillon biologique. ETAT DE LA TECHNIQUE Le dénombrement de microorganismes présents dans un échantillon biologique revêt une importance particulière dans nombre de domaines, et plus particulièrement dans celui de la sécurité alimentaire. 15 La mise sur le marché d'un produit alimentaire est soumise, pour des raisons évidentes de sécurité, à une réglementation stricte concernant la charge bactérienne maximale acceptable que doit contenir le produit. Des contrôles de qualité sont ainsi mis en oeuvre pour savoir si le produit alimentaire en question est propre à la consommation et peut 20 donc être commercialisé. Les contrôles de qualité usuels consistent essentiellement en une première étape de préparation d'un échantillon biologique à partir du produit à tester, suivie d'une deuxième étape d'énumération des microorganismes présents dans cet échantillon après incubation. 25 Dès lors que le nombre de microorganismes compté excède un seuil prédéterminé, le produit testé est alors considéré comme impropre, et donc non commercialisé, ou bien, le cas échéant, retiré du marché s'il était déjà commercialisé. Toutefois, quelle que soit la méthode de comptage employée, il convient de soumettre 30 l'échantillon à une incubation plus ou moins longue en fonction du produit testé et du milieu de culture utilisé. En effet, selon la méthode mise en oeuvre, le temps d'incubation nécessaire pour obtenir un dénombrement de microorganismes peut varier de 24h jusqu'à 5 jours. Dans le cas du dénombrement de la flore totale d'un échantillon, le temps d'incubation est au minimum de 48 h à 35°C, voire de 72h à 30°C. Ainsi, pour un produit 35 alimentaire cru, seul le dénombrement après un minimum de 40 heures d'incubation, et plus particulièrement au moins 48 heures dans le cas d'une viande crue, est considéré comme fiable. 10 2957608 -2- Toutefois, une quarantaine d'heures est une durée excessivement longue au regard de la durée de vie de certains produits. En effet par exemple, la durée de vie d'une viande crue n'excède pas quelques jours. Alors même que le processus de mise sur le marché est généralement déjà engagé pour qu'un produit se retrouve au plus tôt commercialisé dès 5 que les tests de qualité sont positifs, un résultat finalement négatif interdit cette commercialisation, ce qui entraine une perte économique importante. On conçoit donc aisément l'utilité d'un procédé de comptage qui raccourcit grandement le temps d'incubation tout en produisant un comptage sensiblement aussi fiable qui celui 10 obtenu après un temps d'incubation important. EXPOSE DE L'INVENTION Le but de l'invention est de proposer un procédé et un dispositif qui obtiennent un tel 15 résultat. A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de dénombrement de microorganismes présents dans un échantillon biologique en contact avec un milieu de culture adapté à la croissance desdits microorganismes. Selon l'invention, le procédé comprend les étapes consistant à : - déterminer à un stade antérieur le nombre NsA de microorganismes présents dans l'échantillon - calculer le nombre Nsu de microorganismes présents à un stade ultérieur en fonction 25 du nombre NsA, le calcul se fondant sur un modèle de croissance des microorganismes dans le milieu de culture selon la relation : log(NN, )=axlog(NsA)ûR xlog(CsA)+y 30 où log est le logarithme décimal, Nsu est le nombre de microorganismes calculé, NsA est le nombre de microorganismes au stade antérieur, CsA le nombre de microorganismes au stade antérieur divisé par le volume de l'échantillon, et a , 13 et y sont des paramètres prédéterminés dépendants des microorganismes, du milieu de culture et de la durée séparant le stade ultérieur du stade antérieur, a et 13 étant 35 positifs. 20 2957608 -3- Selon l'invention, il convient de comprendre l'expression «nombre de microorganismes » au sens large. Il peut ainsi s'agir du nombre réel de microorganismes ou du nombre de colonies de microorganismes (par exemple en Unité Formant Colonie). 5 Par « se fondant sur un modèle», il faut ici comprendre tout calcul utilisant ledit modèle, que ce soit directement sous la forme mathématique exposée ci-dessus ou sous une forme mathématique équivalente. En d'autres termes, grâce au modèle utilisé, le nombre de microorganismes, bactéries et/ou champignons, présents dans l'échantillon biologique après une durée d'incubation normalement nécessaire, est extrapolé de manière fiable à partir d'un nombre de microorganismes compté après une durée d'incubation réelle plus courte. Il est ainsi obtenu un gain de temps égal à la différence entre ces durées d'incubation normalement nécessaire et réelle. Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé comporte la détermination du nombre de microorganismes au stade antérieur, ladite estimation au stade antérieure comportant : ^ la division de l'échantillon entre plusieurs ensembles identiques de volume 20 identique ou d'au moins deux volumes différents, selon un rapport de proportionnalité prédéterminé ; ^ l'application de conditions de culture auxdits volumes, notamment une incubation à une température prédéterminée pendant une durée prédéterminée, afin de faire croitre le nombre de microorganismes dans ces volumes ; 25 la détection de la présence ou de l'absence de microorganismes dans les volumes après l'application des conditions de culture ; et ^ le calcul du nombre de microorganismes dans l'échantillon par la méthode du Nombre le Plus Probable (NPP). 30 Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé comporte une étape de préparation de l'échantillon biologique à partir d'une portion de produit alimentaire. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention dans lequel on dénombre la flore totale dans une produit frais avec un milieu de culture adéquate au moyen de l'instrument 35 TEMPO® commercialisé par la demanderesse, le stade antérieur correspond à environ 24 heures après la préparation de l'échantillon, et le stade ultérieur correspond à environ 48 heures après la préparation de l'échantillon. 2957608 -4- L'invention a également pour objet un dispositif pour le dénombrement de microorganismes présents dans un échantillon biologique en contact avec un milieu de culture adapté à la croissance desdits microorganismes, comportant des moyens formant réceptacle pour échantillon, et des moyens de mesure ou d'estimation du nombre de 5 microorganismes présents dans un échantillon disposé dans le réceptacle pour échantillon. Selon l'invention, le dispositif comporte en outre des moyens de calcul du nombre de microorganismes présents dans l'échantillon en fonction du nombre de microorganismes 10 mesuré ou estimé par les moyens de mesure ou d'estimation, en se fondant sur un modèle de croissance des microorganismes selon la relation : log(NsU)=axlog(NsA)û f xlog(CsA)+y 15 où log est le logarithme décimal, NsU est le nombre de microorganismes calculé au stade ultérieur, NsA est le nombre de microorganismes déterminé au stade antérieur, CsA le nombre de microorganismes au stade antérieur divisé par le volume de l'échantillon, et a, /3 et y sont des paramètres prédéterminés dépendants de l'échantillon, , a et f étant positifs. L'invention a également pour objet un produit programme d'ordinateur comprenant des instructions, stockées sur un support d'enregistrement lisible par ordinateur, pour mettre en oeuvre le procédé du type précité lorsque le programme est exécuté par un ordinateur. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple, et faite en relation avec les dessins annexés, dans lesquels : ^ la figure 1 est un organigramme d'un procédé selon l'invention ; et ^ la figure 2 est un tracé d'expériences avec pour abscisses des comptages de colonies effectués après 48 heures d'incubation de différents échantillons biologiques issus de viandes crues, et pour ordonnées le comptage estimé d'après l'invention. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION En se référant à la figure 1, un procédé selon l'invention comporte une première étape 10 de préparation d'un échantillon biologique à partir d'un produit à tester. Par exemple, pour dénombrer les microorganismes présents dans une viande crue, essentiellement des bactéries, une masse prédéterminée de cette viande est disposée dans un sac Stomacher avec un volume d'eau peptonnée. Une homogénéisation de l'ensemble est réalisée dans le sac pendant plusieurs minutes. Le liquide obtenu subit alors une dilution supplémentaire en transférant un volume du liquide contenu dans le sac Stomacher dans un flacon contenant un volume de milieu de culture. Un échantillon biologique liquide est alors obtenu, cet échantillon étant soumis au comptage selon l'invention. De façon classique, le milieu de culture est choisi en fonction du type de microorganismes dont on cherche à savoir s'ils sont ou non présents dans l'échantillon biologique, et dont on cherche à connaître le nombre après une durée donnée d'incubation. Le milieu de culture est à large spectre, c'est-à-dire adapté à la croissance d'un grand nombre de microorganismes de types différents susceptibles d'être présents dans le produit testé, ou est sélectionné pour convenir à la croissance d'un nombre restreint de types de microorganismes, voire pour un seul type de microorganisme. Le choix du milieu de culture dépend de l'application visée, comme cela est connu en soi de l'état de la technique. Par exemple, dans le cas d'une viande crue, un milieu de culture à large spectre est privilégié. Une fois l'échantillon biologique obtenu, celui-ci est alors préparé, en 12, pour être soumis à un comptage d'Unités Formant Colonie par gramme (UFC/g) en utilisant la méthode du nombre le plus probable (ou méthode « NPP »). Plus particulièrement, l'échantillon est distribué entre plusieurs ensembles identiques de N cavités transparentes, isolées, de volumes proportionnels, et formées dans une carte d'analyse. Classiquement, chaque ensemble présente trois cavités, le volume de la grande cavité étant 10 fois supérieur au volume de la cavité moyenne, elle-même de volume 10 fois supérieur au volume de la petite cavité. De préférence, la distribution de l'échantillon biologique est réalisée au moyen d'une carte d'analyse telle que décrite dans le document EP 1 105 457 qui a l'avantage d'automatiser de façon fiable la distribution de l'échantillon entre plusieurs cavités transparentes, tout en isolant celles-ci les unes par rapport aux autres. -5- 2957608 -6- La carte d'analyse est alors soumise, en 14, pendant une durée prédéterminée à des conditions favorables pour la croissance des microorganismes que l'on souhaite dénombrer, notamment une incubation à une température donnée, par exemple entre 5 30°C et 35°C pour des microorganismes contenus dans des produits alimentaires. Une fois la durée d'incubation terminée, le procédé se poursuit, en 16, par la détection optique de la présence ou l'absence de microorganismes dans chacune des cavités de la carte d'analyse. En fonction du milieu de culture choisi, il est en effet possible de faire 10 croître certains microorganismes. Or, la croissance des microorganismes a pour effet de modifier la densité optique ou la coloration du contenu d'une cavité (par exemple dans le cas d'utilisation de marqueurs fluorescents ou chromogènes dans le milieu de culture), comme cela est connu en soi de l'état de la technique. Une modification mesurable des propriétés optiques d'une cavité signifie ainsi un développement microbien dans celle-ci, 15 ou sinon une absence de développement microbien. De préférence, dans le cas de l'analyse d'un produit frais, une incubation d'une durée comprise entre 20 et 40 heures permet d'obtenir une estimation fiable du nombre de microorganismes entre 40 et 76 heures, au regard de la détection optique mise en oeuvre 20 et de la méthode NPP. En particulier, dans le cas d'une analyse de viande crue au moyen du système de détection TEMPO® TVC vendu par la société bioMérieux, on peut obtenir, entre 20 et 36 heures, une estimation du nombre de microorganismes entre 40 et 48 heures. 25 Une fois déterminée la présence ou l'absence de développement de microorganismes dans chacune des cavités de la carte d'analyse, un comptage d'unités formant colonie par gramme est réalisé, en 18, en utilisant la méthode NPP, préférentiellement celle de J.C. De Man. On se référera par exemple au document EP 1 105 457 pour plus de détails sur cette méthode. 30 Il est ainsi obtenu un nombre d'unités formant colonie par gramme de produit testé, et donc le nombre d'unités formant colonie présentes dans l'échantillon biologique. Ce dernier nombre diffère du premier nombre par un facteur de proportionnalité tenant compte des diverses dilutions réalisées pour préparer l'échantillon et des volumes 35 d'échantillon prélevé initialement. Le procédé se poursuit alors, en 20, en estimant par calcul le nombre d'unités formant colonie qui seraient obtenues par une incubation normalement nécessaire plus longue de 2957608 -7- l'échantillon biologique, par exemple 48 heures pour les viandes crues, en fonction du nombre d'unités formant colonie présentes dans l'échantillon compté suite à l'incubation réelle, selon la relation : 5 log(NN, )=axlog(NsA)û(3 xlog(CsA)+y où log est le logarithme décimal, Nsu est le nombre estimé pour l'incubation normalement nécessaire, NsA est le nombre d'unités formant colonie dans l'échantillon compté suite à l'incubation réelle, CsA est ce même nombre divisé par le volume de 10 l'échantillon biologique, et a , 13 et y sont des paramètres positifs prédéterminés dépendants des microorganismes, du milieu de culture et de la durée séparant l'incubation normalement nécessaire de l'incubation réelle. On notera ici que ce calcul peut être effectué alors même que l'incubation se poursuit, la 15 carte d'analyse étant par exemple disposée dans une chambre d'incubation pourvue de moyens optiques de détection raccordés à une unité de traitement d'informations mettant en oeuvre la méthode NPP et le comptage selon l'invention. Les paramètres c , 13 et y sont déterminés a priori, par exemple selon la procédure 20 suivante : a) préparer un nombre statistiquement significatif d'échantillons biologiques à partir d'un type de produit à tester à un stade ultérieur (par exemple de la viande crue différents stades de contamination ; b) incuber lesdits échantillons pendant la durée d'incubation qui sera utilisée pour le 25 comptage sur lequel se base l'estimation, et compter le nombre de microorganismes dans lesdits échantillons après incubation ; c) poursuivre l'incubation des échantillons jusqu'au stade ultérieur désiré pour l'estimation, et compter le nombre de microorganismes dans les échantillons après cette incubation supplémentaire ; et 30 d) identifier par une méthode statistique les paramètres du modèle, par exemple au moyen d'une ajustement dans l'espace des logarithmes. Le procédé est préférentiellement mis en oeuvre au moyen du système de diagnostic TEMPO®, ce système de diagnostic utilisant les cartes d'analyse décrites au document 35 EP 1 105 457. Le système TEMPO® comprend une unité de traitement d'informations, par exemple un microcontrôleur, raccordée au circuit de détection optique pour mettre en oeuvre le 2957608 -8- comptage selon la méthode NPP à partir des résultats de la détection. Selon l'invention, ce dispositif est modifié pour que l'unité de traitement d'informations soit en outre apte à mettre en oeuvre l'estimation selon l'invention. 5 De manière avantageuse, l'unité de traitement d'informations mémorise différents ensembles de paramètres c , 13 et y , et l'utilisateur peut sélectionner, à l'aide d'une interface raccordée à l'unité de traitement d'informations, l'ensemble approprié pour l'échantillon biologique dans la carte d'analyse et la durée d'incubation pour lequel l'estimation est réalisée. Le cas échéant, la durée de l'incubation réelle est réglable et 10 l'ensemble de paramètres également sélectionné en fonction de cette durée. Un exemple de dénombrement de microorganismes dans de la viande crue mis en oeuvre au moyen du système TEMPO® est décrit ci-après. 15 Un échantillon biologique est tout d'abord préparé. Une dilution primaire au dixième est préparée en mélangeant 10g de l'échantillon avec un volume de 90 millilitres (mL) de diluant primaire, telle que de l'eau peptonée, dans un sac Stomacher. Une homogénéisation de l'ensemble est réalisée dans le sac pendant 1 à 2 minutes. 20 Ensuite, des cartes TEMPO® sont préparées avec le milieu de culture. Le milieu de culture TEMPO® TVC est reconstitué en distribuant 3 mL de diluant secondaire, par exemple de l'eau distillée, dans un flacon TEMPO® TVC. 25 A l'aide d'une pipette stérile, 1 mL est alors prélevé dans le compartiment filtré du sac Stomacher et est transféré dans le flacon TEMPO® TVC contenant le milieu de culture reconstitué, afin d'ensemencer ce dernier. Le tout est homogénéisé à l'aide d'un agitateur de type vortex durant environ 3 secondes. Les 4 mL de milieu ensemencé obtenus correspondent donc à une dilution au 1/40 de l'échantillon. 30 Le flacon contenant le milieu ensemencé est placé sur un portoir de remplissage. La carte TEMPO® correspondante est placée sur le portoir en face du flacon, avec le tube de transfert de la carte plongé dans le flacon. 35 Le portoir contenant les flacons et les cartes, en connexion fluide, est placé dans le TEMPO® Filler. Le cycle de remplissage est alors lancé. Le milieu ensemencé est aspiré en totalité dans la carte. Après remplissage des cartes, ces dernières sont isolées de l'environnement extérieur par coupure et scellage des tubes de transfert. 2957608 -9- Le portoir de remplissage est sorti du TEMPO® Filler. Les cartes sont retirées du portoir et transférées sur des portoirs d'incubation. 5 Les cartes sont alors incubées à température de 35°C pour l'énumération de la flore totale. Le procédé se poursuit alors par la lecture des cartes. 10 Après 24h d'incubation, les portoirs de lecture sont placés dans le lecteur TEMPO® Reader. La lecture préliminaire est alors automatiquement réalisée. Pour chacun des puits de la carte, le système défini la positivité, puis transforme cela en une combinaison NPP. 15 A partir de la combinaison obtenue et du facteur de dilution appliqué, le système calcule automatiquement la concentration en micro-organismes dans l'échantillon. Le modèle mathématique défini est alors appliqué afin d'obtenir le résultat final estimé. Il a été estimé le nombre de microorganismes, qui seraient présents dans les échantillons 20 après 48 heures d'incubation à 35°C à partir d'un comptage réalisé après 24 heures d'incubation à 35°C, à l'aide du modèle : log(Ns,) =1.072x log(NsA )û 0,232 xlog(CsA )+ 0.94 25 Les résultats d'expérience sont présentés sur le tracé de la figure 2. Les abscisses de cette figure représentent le nombre compté de microorganismes dans les échantillons après une incubation réelle de 48 heures à 35°C. Les ordonnées représentent quant à elles les nombres estimés correspondants de microorganismes dans les échantillons sur la base des nombres de microorganismes comptés après une incubation réelle de 24 heures. 30 Comme il est possible de le constater, on observe une corrélation très forte entre la mesure réelle du nombre de microorganismes à 48 heures et l'estimation de ce même nombre, ces deux nombres différant de moins de 0.5 log. 35 Il est ainsi possible à l'aide l'estimation selon l'invention d'obtenir un résultat fiable à 24 heures de ce que sera le nombre de microorganismes à 48 heures. Ainsi, 24 heures à l'avance, il est possible de prendre les mesures adéquates dans le cas où le nombre estimé à 48 heures serait non-conforme aux exigences de sécurité alimentaire. 2957608 -10- Bien que la méthode NPP ait été décrite pour réaliser le comptage, d'autres méthodes peuvent être utilisées. La méthode NPP a cependant l'avantage de pouvoir être automatisée, seule la préparation de l'échantillon biologique étant alors réalisée 5 éventuellement de manière manuelle. Bien entendu, l'estimation du nombre de microorganismes selon l'invention peut également être réalisée en fonction d'un comptage manuel de colonies présentes sur une boite de Pétri après une durée d'incubation donnée. 10 Bien qu'il ait été décrit une application au dénombrement de microorganismes dans un produit alimentaire, notamment les viandes crues, d'autres produits peuvent être testés, comme par exemple les végétaux, les poissons ou tout autre produit à faible dure de vie. REVENDICATIONS1. Procédé de dénombrement de microorganismes présents dans un échantillon biologique en contact avec un milieu de culture adapté à la croissance desdits microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - déterminer à un stade antérieur le nombre NsA de microorganismes présents dans l'échantillon - calculer (20) le nombre Nsu de microorganismes présents à un stade ultérieur en fonction du nombre NsA , le calcul se fondant sur un modèle de croissance des microorganismes dans le milieu de culture selon la relation : log(NN, )=axlog(NsA)ùR xlog(CsA)+y où log est le logarithme décimal, Nsu est le nombre de microorganismes calculé, NsA est le nombre de microorganismes au stade antérieur, CsA le nombre de microorganismes au stade antérieur divisé par le volume de l'échantillon, et a , 13 et y sont des paramètres prédéterminés dépendants des microorganismes, du milieu de culture et de la durée séparant le stade ultérieur du stade antérieur, c et 13 étant positifs. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte la détermination du nombre de microorganismes au stade antérieur (12-18), ladite estimation au stade antérieure comportant : ^ la division (12) de l'échantillon entre plusieurs ensembles identiques de volume identique ou d'au moins deux volumes différents selon un rapport de proportionnalité prédéterminé ; ^ l'application (14) de conditions de culture auxdits volumes, notamment une incubation à une température prédéterminée pendant une durée prédéterminée, afin de faire croitre le nombre de microorganismes dans ces volumes ; ^ la détection (16) de la présence ou de l'absence de microorganismes dans les volumes après l'application des conditions de culture ; et ^ le calcul (18) du nombre de microorganismes dans l'échantillon par la méthode du Nombre le Plus Probable. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de préparation (10) de l'échantillon biologique à partir d'une portion de produit alimentaire. 2957608 -12- 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le stade antérieur correspond à environ 24 heures après la préparation de l'échantillon, et en ce que le stade ultérieur correspond à environ 48 heures après la préparation de l'échantillon. 5 5. Dispositif pour le dénombrement de microorganismes présents dans un échantillon biologique en contact avec un milieu de culture adapté à la croissance desdits microorganismes, comportant des moyens formant réceptacle pour échantillon, et des moyens de mesure ou d'estimation du nombre de microorganismes présents 10 dans un échantillon disposé dans le réceptacle pour échantillon, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens de calcul du nombre de microorganismes présents dans l'échantillon en fonction du nombre de microorganismes mesuré ou estimé par les moyens de mesure ou d'estimation, en se fondant sur un profil de croissance des microorganismes selon la relation : 15 log(NN, )=axlog(NsA)ùR xlog(CsA)+y où log est le logarithme décimal, Nsu est le nombre de microorganismes calculé, NsA est le nombre de microorganismes mesuré ou estimé, CsA le nombre de 20 microorganismes au stade antérieur divisé par le volume de l'échantillon, et a , 13 et y sont des paramètres prédéterminés dépendants de l'échantillon, du milieu de culture et de la durée séparant le stade ultérieur du stade antérieur, a et 13 étant positifs. 25 6. Produit programme d'ordinateur comprenant des instructions, stockées sur un support d'enregistrement lisible par ordinateur, pour mettre en oeuvre le procédé de la revendication 1 lorsque le programme est exécuté par un ordinateur.