FR 2949780 A1 20110311 FR 0904228 A 20090904 1 Procédure d'extraction rapide des hépatotoxines cellulaires de cyanobactéries toxiques L'invention concerne un réactif simple et robuste capable d'extraire très efficacement les hépatotoxines cellulaires de cyanobactéries toxiques. Le réactif est un mélange aqueux d'un solvant organique et d'un détergent non ionique maintenu à un pH acide contrôlé. L'invention est également relative à un procédé d'extraction d'hépatotoxines cellulaires de cyanobactéries toxiques utilisant ce réactif, en particulier par extraction directe en milieu liquide ou par extraction cellulaire sur filtre après une étape de concentration Ce procédé est adapté à la mise en oeuvre de contrôles rapides de la qualité de l'eau sur le terrain. Les cyanobactéries, anciennement connues sous le nom d'algues bleues, sont des bactéries photosynthétiques unicellulaires ou multicellulaires. Différents genres sont capables de synthétiser et d'excréter partiellement dans le milieu extérieur des substances toxiques. Ces organismes sont de plus en plus répandus de part le monde, et génèrent fréquemment des efflorescences caractéristiques à la surface des plans d'eau (� blooms �). Les microcystines constituent la classe de cyanotoxines la plus uniformément retrouvée. Les � blooms � de cyanobactéries contaminent essentiellement les eaux stagnantes comme les mares, les lacs (naturels ou de rétention), les eaux de baignades ainsi que les réservoirs; ces contaminations sont susceptibles de générer des problèmes aigus de santé, aussi bien chez l'homme que chez les animaux (Toxic cyanobacteria in water: A guide to their public Health Consequences, monitoring and management. Chapter 2. Cyanobacteria in the environment. Chapter 4. Human Health Aspects. Ingrid Chorus and Jamie Bartram eds. (www.who.int/) ; Evaluation of Analytical Methods for Detection & Quantification of Cyanotoxins in Relation to Australian Drinking Water Guidelines (2001), Brenton C. Nicholson and Michael D. Burch editors, (www.nhmrc.gov.au/publications)). Les hépatotoxines se classent actuellement en deux familles : les microcystines et les nodularines. Ces deux familles sont constituées de peptides cycliques très voisins, comprenant respectivement 7 ou 5 acides aminés, dont un résidu particulier. 11-C20 appelé Adda (acide 3-amino-9-méthoxy-2,6,8-triméthyl-10-phényldéca-4,6-diénoïque) : P H 5ou;7 H a.a., Adda. Plus spécifiquement, les microcystines possèdent une structure cyclique heptapeptidique de séquence cyclo(-D-Ala-L-X-D-érythro-f3-méthylisoAsp-L-Y- 10 Adda-o-iso-Glu-N-méthyldéhyrdoAla) où X et Y sont deux acides aminés variables en configuration L. On appelle par exemple microcystine-LR, une microcystine comportant une leucine en position X et une arginine en position Y. Les nodularines sont des pentapeptides constitués de Adda, d'acide D-érythro-f3-méthylaspartique, d'acide D-glutamique, de L-arginine, de N-méthyl-Z-15 déhydrobutyrine et d'un acide aminé variable. Ces toxines sont des inhibiteurs des phosphatases 1 et 2A des cellules eucaryotes (MacKintosh et al. (1990) FEBS Lett. 264, 187-192). Chez les vertébrés, elles sont rapidement séquestrées dans les hépatocytes et peuvent entraîner de graves dommages au foie (Nishiwaki-Matsushima et al. (1992) 20 J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1181, 420-424). Le relargage de ces toxines dans le milieu a surtout lieu durant la sénescence cellulaire, la fraction la plus importante des toxines restant associée aux cellules en conditions de croissance normales. Il est donc très important de surveiller à la fois les niveaux extra- et intra-cellulaires de toxines pour mettre en 25 oeuvre les stratégies les mieux adaptées à la protection de la santé. Différentes techniques de laboratoire plus ou moins sophistiquées ont été mises au point qui permettent une bonne extraction de ces toxines associées aux cyanobactéries, mais il n'existe pas actuellement de consensus pour une technique standard. 30 Dans le cas des microcystines, il est vraisemblable que la multiplicité des variants de ces toxines, du fait de méthylations et de nombreuses substitutions possibles d'acides aminés au niveau de deux sites variables, conduise à des caractéristiques de solubilité différentes des microcystines. En effet, plus de 70 3 variants de microcystines ont été identifiés (Mackintosh et al. (1990) FEBS Lett. 264, 187-192). Ward et al. (1997, FEMS Microbiology Letters 153, 465-473) ont décrit l'extraction des microcystines avec un mélange méthanol/eau (70/30 v/v) et une détection basée sur un test colorimétrique d'inhibition de la protéine phosphatase 1, la lecture étant effectuée à l'aide d'un spectrophotomètre. Fastner et al. (1998, Water Research, 31, 3177-3181) ont mis au point une méthode optimisée d'extraction de microcystines utilisant un mélange méthanol/eau (75/ v/v) ou une extraction séquentielle avec du méthanol puis de l'eau. Metcalf J.S. et Codd G.A. (2000, FEMS Microbiology Letters 184, 241-246) ont décrit une méthode d'extraction des microcystines et nodularines de cyanobactéries par incubation dans de l'eau en ébullition pendant 1 min ou par traitement aux micro-ondes. Ces deux méthodes d'extraction sont présentées comme des alternatives aux méthodes à base de solvants organiques qui sont susceptibles d'interférer ensuite avec les méthodes sensibles de détection des microcystines et nodularines, telles que les immunoessais. Lawton L.A. et Edwards C. (2001, J. Chromatography A 912, 191-209) ont plus tard passé en revue les différentes méthodes décrites dans l'état de la technique pour l'extraction des microcystines. Les solvants couramment utilisés pour une extraction globale de l'ensemble des variants de microcystines incluent le méthanol, l'eau et des mélanges de ceux-ci, ou l'acide acétique 5%. La purification et la quantification des microcystines sont ensuite réalisés en concentrant les échantillons extraits, puis en réalisant une séparation, par chromatographie d'exclusion de taille, chromatographie échangeuse d'ions, chromatographie en couche mince, chromatographie flash/colonne, ou encore HPLC préparative. Barco et al. (2005, J. Chromatography A 1074, 23-30) ont comparé l'efficacité d'extraction de microcystines, à partir de cellules de Microcystis aeruginosa lyophilisées, à l'aide d'un mélange butanol-méthanol-eau (1 :4 :15), d'acide acétique 5%, de méthanol aqueux 10-90%, de méthanol, de méthanol acidifié (0,1% acide trifluoroacétique, TFA), d'hydrogénocarbonate d'ammonium 0,1M, par différentes séquences d'extraction utilisant du méthanol et de l'eau, ou à 4 l'aide de Triton X-100 0,1% ou de Tween-20 0,1%. La plus grande efficacité d'extraction a été obtenue avec du méthanol acidifié à pHû1 (0,5% TFA) mais s'accompagne également d'une dégradation des microcystines après 48h, dégradation qui n'est plus observée avec un pH -2. La sonication du mélange d'extraction permet en outre de réduire le temps d'extraction de 45 min à 15 min. Une extraction presque complète des microcystines à partir de cyanobactéries lyophilisées a ainsi pu être réalisée en accomplissant trois cycles d'extraction successifs à l'aide de méthanol acidifié à pH -2 sous sonication. Parmi les techniques les plus efficaces pour extraire les toxines, on peut 10 citer: - la lyophilisation des cellules suivie d'une extraction en méthanol/eau (75%), une sonication pouvant être ajoutée à cette étape; - plusieurs cycles de congélation/ décongélation (classiquement 3). Une fois extraites, microcystines et nodularines peuvent être séparées par 15 HPLC et identifiées par leur spectre d'absorption UV (maximum caractéristique à 238 nm). La spectrométrie de masse doit ensuite être mise en oeuvre pour une caractérisation complète. Un point commun à toutes ces techniques d'analyse est le recourt à des équipements de laboratoire ce qui les rend incompatibles avec une détection et 20 une quantification sur le terrain des hépatotoxines. De plus, pour les méthodes d'extraction à base de solvants organiques, la nécessité d'utiliser du méthanol (notamment) à forte concentration oblige à des dilutions importantes avant de pratiquer des essais immunologiques, dilution particulièrement critique dans le cas des tests immuno-chromatographiques bien 25 adaptés aux essais rapides (� strips � ou bandelettes). A ce jour, aucune procédure d'extraction simple et efficace applicable sur le terrain n'a été décrite. Il y a donc à ce niveau un besoin clairement défini d'une technique qui puisse permettre de doser l'ensemble des hépatotoxines présentes dans des prélèvements d'eau, et qui soit compatible avec les techniques immuno- 30 chromatographiques. Un kit d'extraction a été récemment commercialisé par la Société Abraxis (QuickLyseTM Cell Lysis for Microcystins/Nodularins ELISA Microtiter Plate), mais la composition des réactifs d'extraction n'est pas détaillée. Ce kit a été utilisé dans une série complète d'essais comparatifs. Réactif d'extraction 5 L'invention est relative à un réactif d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries, en particulier de microcystines et/ou nodularines, qui comprend un mélange alcool / eau, un détergent et un acidifiant. Plus spécifiquement le réactif d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries est une composition comprenant : - 20 à 50 % (volume:volume (v:v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci ; 0,1 à 2 % (poids : volume (p :v)) d'au moins un détergent ; et de l'eau en quantité suffisante pour 100%. Cette composition est très efficace pour effectuer une extraction des hépatoxines des cyanobactéries les plus répandues, comme Microcystis aeruginosa. Cependant, certaines cyanobactéries nécessitent un pH acide pour que l'extraction des hépatoxines puisse être efficacement réalisée ; c'est le cas notamment pour le genre Planktothrix. Ainsi pour avoir un réactif d'extraction d'efficacité la plus large possible, la composition peut comprendre en outre un agent acidifiant, l'agent acidifiant étant présent en quantité suffisante pour que la composition, après dilution d'un facteur 2 avec de l'eau, ait un pH compris entre 1,8 et 2,5. La proportion de chacun des constituants a été l'objet d'une optimisation systématique, notamment en vue d'une utilisation du réactif d'extraction sur le terrain qui reste compatible avec une détection des hépatoxines par des méthodes immuno-chromatographiques (bandelettes). Ce réactif a été testé avec succès sur des cellules en culture de quatre espèces représentatives des quatre genres de cyanobactéries principales productrices d'hépatotoxines, ainsi que sur quatre prélèvements de terrain. Préférentiellement, la composition est constituée du mélange de 20 à 50 % (volume:volume (v:v)) d'alcool en C3, de 0,1 à 2% (poids :volume (p:v)) d'au moins un détergent, éventuellement d'un agent acidifiant, s'il est présent, en 6 quantité suffisante pour que la composition, après dilution d'un facteur 2 avec de l'eau, ait un pH compris entre 1,8 et 2,5, et d'eau q.s.p. 100%. L'alcool est un alcool aliphatique en C3, c'est à dire que l'alcool est sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol. L'utilisation d'un mélange de plusieurs alcools aliphatiques en C3 est possible. Un mélange 1 :1 de propanol et d'isopropanol a conduit par exemple à un rendement d'extraction sensiblement similaire au rendement obtenu avec le propanol ou l'isopropanol seul. De préférence, l'alcool est le propanol ou l'isopropanol, plus préférentiellement le propanol, ce dernier ayant généralement montré les meilleurs rendements d'extraction à partir de Microcystis aeruginosa qui est la cyanobactérie toxique de référence la plus répandue. L'utilisation d'alcools aliphatiques ayant une chaîne carbonée plus courte, méthanol ou éthanol, conduit à une baisse de l'efficacité du réactif d'extraction. Par ailleurs, comme il est souhaitable d'atteindre une teneur minimale en alcool de 20%, l'utilisation d'alcool aliphatique ayant une chaîne carbonée en C4 ou plus est extrêmement difficile en raison de problèmes de miscibilité des alcools avec l'eau, sauf à utiliser un mélange plus complexe. La teneur maximale en alcool dans le réactif a été fixée idéalement à 50% de manière à ce que la teneur finale dans le milieu d'extraction, après dilution de moitié avec un prélèvement d'eau à analyser, ne dépasse pas 25%. Des teneurs plus élevées en alcool sont possibles mais sont susceptibles d'interférer avec la mise en oeuvre, par la suite, de tests immunologiques pour détecter les hépatotoxines, ce qui imposerait alors de diluer les échantillons extraits avant analyse, de manière à diminuer leur teneur en alcool. De préférence, la composition comprend 20 à 40% (v :v), de préférence encore 30 à 40%, d'alcool aliphatique en C3. Le détergent peut être n'importe quel détergent usuel en biologie ou mélange de détergents. II peut s'agir par exemple d'un détergent zwitterionique, tel que le CHAPS, d'un détergent non-ionique, par exemple Nonidet P-40 (NP-40), la série des Triton, les tensioactifs glycosylés, la série des Tween, ou d'un détergent ionique tel que le SDS. Tous les détergents testés (CHAPS, Nonidet P40, Triton X100, n-Dodecyl-f3-D-Maltoside, et Tween 20) ont en effet conduit à une augmentation très significative de la quantité de microcystines extraites par 7 rapport au mélange alcool / eau non additionné de détergent. Le choix du détergent pourra cependant être dicté par la compatibilité du détergent avec la méthode de détection des hépatoxines ensuite utilisée. En particulier, le détergent sera préférentiellement compatible avec une détection directe des hépatoxines par des méthodes immunologiques : il s'agit de préférence d'un détergent zwitterionique ou non-ionique, par exemple le CHAPS, le NP-40 ou le Tween 20, les détergents ioniques étant généralement incompatibles avec les méthodes immunologiques, sauf à utiliser de fortes dilutions après extraction, comme cela peut être le cas pour les dosages EIA. Un détergent préféré est le Tween 20 puisque celui-ci est très classiquement utilisé dans les tests immunologiques. La proportion de détergent dans la composition selon l'invention est de préférence comprise entre 0,2 et 0,5% (p :v), de préférence encore entre 0,3 et 0,4% (p :v). L'agent acidifiant est préférentiellement un acide fort, habituellement utilisé pour les analyses biochimiques, comme par exemple l'acide chlorhydrique ou l'acide trifluoroacétique. De préférence, l'acidifiant est l'acide trifluoroacétique. L'acidification du milieu d'extraction (c'est-à-dire le mélange eau / propanol / Tween 20 dilué volume à volume avec un échantillon) par de l'acide trifluoroacétique 0,1% a en effet conduit à une augmentation plus forte du niveau d'extraction des microcystines à partir de l'espèce Planktothrix agardhii, comparativement à l'acide chlorhydrique 0,01N (pH final de 2,1 dans les deux cas). Le genre Planktothrix est un exemple de cyanobactéries pour lesquelles les rendements d'extraction des microcystines sont faibles lorsque l'extraction est effectuée en milieu neutre. Préférentiellement, la composition selon l'invention comprend entre 0,1 et 0,4% (volume :volume), de préférence 0,2% (v :v), d'acide trifluoroacétique. La composition peut aussi comprendre entre 0,01 et 0,04N, de préférence 0,02N, d'acide chlorhydrique. Selon des modes de réalisation particuliers, la composition comprend ou 30 est constituée de : - 20 à 50 % (v :v), de préférence 30 à 40% (v :v), de propanol ou isopropanol, 8 0,1 à 2% (p :v), de préférence 0,2 à 0,5% de préférence encore 0,3 à 0,4%, d'un détergent compatible avec les méthodes immunologiques, de préférence le CHAPS, le NP-40 ou le Tween 20, plus préférentiellement le Tween 20, - éventuellement 0,1 à 0,4% (v:v), de préférence 0,2% d'acide trifluoroacétique, et - d'eau q.s.p. 100%. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition comprend ou est constituée de 30-40% propanol (vol:vol), 0,3 à 0,4% (poids:vol) d'un détergent compatible avec les méthodes immunologiques tel que défini plus haut, de préférence le Tween 20, 0,1 à 0,4% (vol:vol) d'acide trifluoroacétique, et d'eau q.s.p. 100%. Kit d'extraction La composition ou réactif selon l'invention peut être fournie sous forme d'un kit de deux solutions car le réactif complet peut avoir une durée de conservation insuffisamment longue à température ambiante lorsque l'agent acidifiant est présent. Le kit comprend alors une première composition aqueuse comprenant l'alcool et le détergent et une seconde composition aqueuse comprenant l'agent acidifiant. Les teneurs respectives en alcool et détergent, d'une part, et en agent acidifiant d'autre part sont telles, que par mélange de x volume(s) de la première composition aqueuse avec y volume(s) de la seconde composition aqueuse, on reconstitue une composition aqueuse comprenant 20 à 50 % (v :v) d'un alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci, et 0,1 à 2 % (p :v) d'au moins un détergent. La définition générale du kit pourrait être la suivante: a) une première composition comprenant ou constituée de - 20*(x+y)/x à 50*(x+y)/x % (v :v), de préférence 30*(x+y)/x à 40*(x+y)/x % (v :v), d'un alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci, 9 - 0,1*(x+y)/x à 2*(x+y)/x %o (p :v), de préférence 0,2*(x+y)/x à 0,5*(x+y)/x % de préférence encore 0,3*(x+y)/x à 0,4*(x+y)/x %, d'au moins un détergent ; - et de l'eau q.s.p. 100% ; et b) une seconde composition comprenant ou constituée de : - 0,1*(x+y)/y à 0,4*(x+y)/y % (v :Ni), de préférence 0,2 *(x+y)/y % d'acide trifluoroacétique; et - de l'eau q.s.p 100% ; où x et y sont des nombres positifs, et y est préférentiellement compris entre x/2 et x/9. Idéalement, 9 volumes de la première composition sont mélangés à 1 volume de la seconde composition, alors x = 9 et y = 1. Dans ce cas, le kit comprend : a) une première composition comprenant ou constituée de : - environ 22,22 à environ 55,55 % (v :v), de préférence environ 33,33 à environ 44,44 % (v :v), d'un alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci, - environ 0,11 à 2,22% (p :v), de préférence 0,22 à 0,56 % de préférence encore 0,33 à 0,45%, d'au moins un détergent ; - et de l'eau q.s.p. 100% ; et b) une seconde composition comprenant ou constituée de : - 1 à 4 % (v :v), de préférence 2 % d'acide trifluoroacétique; et - de l'eau q.s.p. 100% ; Les première et seconde compositions sont stables à température ambiante. On peut toutefois préférer les conserver à 4t. Préférentiellement, le réactif d'extraction est reconstitué par mélange de la première composition et de la seconde composition le jour de l'analyse. Le kit peut comprendre en outre : - des instructions d'utilisation pour l'extraction des hépatotoxines de cyanobactéries, en particulier de microcystines et/ou nodularines. En particulier, le kit peut comprendre des instructions pour mélanger x volumes de ladite première composition avec y volumes de ladite seconde composition pour constituer un réactif d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries ; et/ou 10 - un ou plusieurs tubes en polypropylène ou verre, par exemple des tubes ependorf de 2 ml ou des tubes gradués de 13 ml à bouchon vissant et/ou une ou plusieurs seringues en polypropylène ; et/ou des moyens de filtration à maille mixte de 0,8 à 8 pm tel que décrits plus bas et/ou des bandelettes d'analyse des hépatotoxines et les réactifs appropriés. Les alcools, détergents et acidifiants entrant dans la composition du kit sont tels que définis dans le réactif d'extraction selon l'invention. Utilisation du réactif et méthode d'extraction L'invention concerne également l'utilisation du réactif d'extraction tel que défini plus haut, après dilution de moitié avec de l'eau ou un échantillon de prélèvement à analyser, pour l'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries, en particulier pour l'extraction de microcystines et/ou nodularines. L'utilisation de la composition ainsi préparée à partir du réactif d'extraction selon l'invention permet d'extraire les hépatotoxines associées aux cyanobactéries, et ainsi de quantifier les hépatotoxines associées et éventuellement les hépatotoxines totales d'un échantillon de liquide susceptible de contenir une suspension cellulaire de cyanobactéries, issu d'un prélèvement dans un lac, étang, mare ou autre. Par �hépatotoxines totales � on entend les hépatotoxines associées et libres présentes dans l'échantillon. Les teneurs des constituants du réactif d'extraction selon l'invention ont été fixées en vue d'une utilisation optimale basée sur un mélange volume à volume du réactif avec un échantillon de liquide contenant une suspension cellulaire de cyanobactéries. Dans le cas d'une faible concentration en cyanobactéries risquant de conduire à une teneur en hépatotoxines en dessous du seuil de sensibilité de la méthode choisie pour la détection des hépatotoxines, une concentration de l'échantillon peut être réalisée préalablement à l'extraction. L'invention concerne donc l'utilisation d'une composition comprenant ou constituée de : 11 - 10 à 25 % (volume :volume (v :v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci ; 0,05 à 1 % (poids :volume (p :v)) d'au moins un détergent ; éventuellement un agent acidifiant en quantité suffisante pour que la composition ait un pH compris entre 1,8 et 2,5 ; et - d'eau q.s.p. 100% ; pour l'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries, en particulier pour l'extraction de microcystines et/ou nodularines. L'invention concerne aussi une méthode d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries qui comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de cyanobactéries avec une composition comprenant ou constituée de : 10 à 25 % (volume:volume (v:v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci ; 0,05 à 1 % (poids:volume (p :v)) d'au moins un détergent ; éventuellement un agent acidifiant en quantité suffisante pour que la composition ait un pH compris entre 1,8 et 2,5 ; et - d'eau q.s.p. 100% ; b) incubation des cyanobactéries au contact de la composition pendant un temps suffisant pour obtenir l'extraction des hépatotoxines. Dans l'utilisation de la méthode d'extraction selon l'invention, la composition utilisée est obtenue par dilution de moitié du réactif d'extraction selon l'invention, soit par de l'eau, soit par une suspension cellulaire à analyser, comme expliqué ci-dessous. Les constituants susceptibles d'entrer dans la composition utilisée pour l'extraction, et en particulier les modes préférés de réalisation, sont donc tels que décrits plus haut dans la section � Réactif d'extraction �, à ceci près que les concentrations des différents constituants (hormis l'eau) indiquées en relation avec le réactif d'extraction sont divisées par deux s'agissant de composition mise en oeuvre dans la méthode d'extraction selon l'invention. Ainsi, par exemple, alors que le réactif d'extraction comprend de préférence 20 à 40% (v :v), de préférence encore 30 à 40%, d'alcool aliphatique 12 en C3, dans l'utilisation et la méthode d'extraction selon l'invention, la composition mise au contact des cyanobactéries comprendra de préférence 10 à 20% (v :v), de préférence encore 15 à 20%, d'alcool aliphatique en C3. Comme indiqué dans la section � Réactif d'extraction �, l'alcool est de préférence le propanol ou l'isopropanol. De manière similaire, pour l'utilisation et la méthode d'extraction selon l'invention, la composition comprend de préférence entre 0,1 et 0,25% (p :v), de préférence encore entre 0,15 et 0,2% (p :v) d'au moins un détergent, le détergent étant tel que défini précédemment. De manière à ce que le pH de la composition soit compris entre 1,8 et 2,5, la composition peut comprendre entre 0,05 et 0,2% (v :v), de préférence 0,1% (v :v), d'acide trifluoroacétique ; ou bien entre 0,005 et 0,02N, de préférence 0,01N d'acide chlorhydrique, à titre d'agent acidifiant. Pour réaliser l'extraction des hépatotoxines, la composition comprend ou est constituée ainsi préférentiellement: 10 à 25 % (v :v), de préférence 15 à 20% (v :v), de propanol ou isopropanol, - 0,05 à 1% (p :v), de préférence 0,1 à 0,25% de préférence encore 0,15 à 0,2%, d'un détergent compatible avec les méthodes immunologiques, de préférence le CHAPS, le NP-40 ou le Tween 20, plus préférentiellement le Tween 20, - éventuellement 0,05 à 0,2% (v :v), de préférence 0,1% d'acide trifluoroacétique, et - de l'eau en quantité suffisante pour 100%. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition d'extraction comprend ou est constituée 15-20% propanol (vol:vol), 0,15 à 0,2% (poids:vol) d'un détergent compatible avec les méthodes immunologiques tel que défini plus haut, par exemple le CHAPS, le NP-40 ou le Tween 20, de préférence le Tween 20, 0,05 à 0,2% (vol:vol) d'acide trifluoroacétique et de l'eau q.s.p. 100%. Selon un mode de réalisation, la méthode d'extraction selon l'invention est mise en oeuvre sur une suspension cellulaire susceptible de contenir des 13 cyanobactéries. La méthode s'applique alors directement au prélèvement liquide et comprend les étapes suivantes: a) mélange du réactif d'extraction selon l'invention avec une suspension cellulaire contenant des cyanobactéries ; et b) incubation du mélange de la suspension cellulaire contenant des cyanobactéries et du réactif d'extraction selon l'invention (soit le mélange d'extraction obtenu à l'étape a)) pendant un temps suffisant pour obtenir l'extraction des hépatotoxines. De préférence, le réactif d'extraction est mélangé volume à volume avec l'échantillon d'eau susceptible de contenir des cyanobactéries (la suspension cellulaire de cyanobactéries). Pour assurer un bon mélange du réactif d'extraction et de l'échantillon, le mélange est avantageusement agité pendant quelques secondes, par exemple pendant au moins 5 secondes, de préférence au moins 10 secondes, en particulier pendant 10 à 15 secondes. Le mélange peut être incubé par exemple au moins 3 minutes, de préférence au moins 5 minutes, par exemple entre 3 et 10 minutes. Les hépatotoxines de cyanobactéries extraites étant stables dans le milieu réactionnel, l'incubation peut être poursuivie aussi longtemps que désiré. Après l'étape d'incubation, la méthode peut comprendre avantageusement une étape de filtration de tout ou partie du mélange d'extraction (suspension cellulaire plus réactif), pour récolter ledit mélange d'extraction, ceci afin d'éliminer les cellules et particules pouvant interférer avec les dosages ultérieurs. Les tailles des cyanobactéries productrices d'hépatotoxines peuvent aller de 2,5 pm (Microcystis aeruginosa) à plusieurs dizaines de pm pour les pluricellulaires (Planktothrix et Nodularia). Le filtre utilisé doit donc de préférence présenter une porosité effective adaptée à la rétention de cellules de 2 pm de diamètre et de plus être inerte aux alcools en C3, aux détergents et aux acides. Un support inerte de porosité mixte de 0,8 à 8 pm peut par exemple être utilisé. Avantageusement, des filtres en fibres de verre borosilicaté et porosité mixte de 0,8 à 8 pm sont utilisés ; ces filtres ont une haute capacité et un fort débit. Des filtres à porosité plus étroite, avec un seuil supérieur ou égal à 1 pm peuvent également être utilisés pour les suspensions cellulaires de faible densité. 14 Le filtrat obtenu contenant les hépatotoxines totales (cellulaires et extra-cellulaires) peut être ajusté en pH par dilution dans un tampon approprié aux mesures immunologiques et analysé directement par exemple par essai immunoenzymatique ou bandelettes d'analyse des hépatotoxines. En particulier, ces méthodes peuvent avantageusement utiliser un anticorps monoclonal spécifique du résidu Adda des microcystines et nodularines, par exemple l'anticorps monoclonal MC-159 décrit par Kreich et al. (2009, Toxicon, 53, 551-559). L'extraction des hépatotoxines directement à partir d'un échantillon d'eau susceptible de contenir des cyanobactéries, permet ainsi de mesurer les hépatotoxines totales de l'échantillon. L'analyse directe d'un filtrat de la même suspension cellulaire non incubée avec le réactif permet d'accéder exclusivement à la teneur extracellulaire en hépatotoxines. Selon un deuxième mode de réalisation, la méthode d'extraction des hépatotoxines est mise en oeuvre à partir d'un dépôt concentré de cellules sur filtre, en utilisant le système de filtration décrit ci-dessus. Le filtrat, constitué uniquement du milieu extra-cellulaire, permet de mesurer les hépatotoxines libres. L'extraction directe des cellules immobilisées sur le filtre est effectuée en diluant le réactif d'extraction selon l'invention de moitié avec de l'eau. L'extraction directe des cellules immobilisées sur le filtre donne la teneur cellulaire en hépatotoxines, l'addition de cette teneur avec la teneur en hépatotoxines libres donnant la teneur totale en hépatotoxines. Par cette méthode, en ajustant le volume de suspension cellulaire filtré et le volume de réactif éluant, il est possible de générer un facteur de concentration d'un ou plusieurs ordres de grandeur, et donc d'augmenter d'autant la sensibilité des détections. Ainsi, dans la méthode d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries, dans l'étape a), les cyanobactéries mises en contact avec ladite composition peuvent être sous forme d'un retentât obtenu par filtration d'une suspension cellulaire contenant des cyanobactéries (en particulier un prélèvement à analyser). Selon ce deuxième mode de réalisation, la méthode d'extraction selon l'invention comprend les étapes consistant à : a) concentrer les cyanobactéries d'un échantillon à analyser par filtration ; 15 b) mettre en contact le retentât contenant les cyanobactéries obtenu par filtration à l'étape a) avec une composition comprenant ou constituée de : - 10 à 25 % (volume :volume (v :v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci ; 0,05 à 1 % (poids :volume (p :v)) d'au moins un détergent ; éventuellement un agent acidifiant en quantité suffisante pour que la composition ait un pH compris entre 1,8 et 2,5 ; et d'eau q.s.p. 100% ; c) incuber le retentât contenant les cyanobactéries au contact de ladite composition pendant un temps suffisant pour obtenir l'extraction des hépatotoxines. Comme décrit ci-dessus, la filtration est de préférence mise en oeuvre sur un support inerte de porosité mixte de 0,8 à 8 pm, par exemple sur des filtres en fibres de verre borosilicaté à porosité mixte de 0,8 à 8 pm. La composition pour l'extraction peut être préparée le jour même en mélangeant un volume d'eau avec un volume de réactif d'extraction, le réactif d'extraction ayant été reconstitué le jour même lui aussi. La mise en contact de la composition avec les cyanobactéries peut être effectuée en déposant la composition sur le filtre ayant servi à la filtration d'une suspension cellulaire contenant des cyanobactéries. Par exemple 2 ml de composition peuvent être utilisés pour 20 ml de prélèvement à analyser qui auront été concentrés. Une partie de la composition peut être initialement passée à travers le filtre de manière à assurer une mise en contact homogène de la composition avec les cyanobactéries concentrées. Le filtre sur lequel a été déposé la composition peut ensuite est incubé, par exemple au moins 3 minutes, de préférence au moins 5 minutes, par exemple entre 3 et 10 minutes, avant de faire passer le reste de la composition à travers le filtre. Le filtrat qui contient les hépatotoxines extraites est récolté. La mise en oeuvre de la méthode d'extraction selon l'invention peut être associée à une méthode de détection et/ou quantification d'hépatotoxines de cyanobactéries comprenant les étapes consistant à détecter et/ou quantifier les 16 hépatotoxines de cyanobactérie dans un extrait d'hépatotoxines obtenu par une méthode d'extraction selon l'invention. A titre d'exemple, l'homme du métier peut réaliser une analyse directe des hépatotoxines libres en prélevant un volume déterminé de liquide à analyser, par exemple 2 ml à l'aide d'une seringue en polypropylène. Le volume prélevé peut être filtré et le filtrat contenant les hépatotoxines libres soumis à analyse, par exemple par ELISA, bandelette, ou toute autre méthode appropriée (chromatographie, spectrométrie de masse...). Si une seringue a été utilisée pour prélever le volume à analyser, la filtration peut être aisément réalisée en ajustant sur la seringue une unité de filtration (par exemple porte-filtre et joint Swinnex, SX0001300 et SX0001301, diamètre 13 mm) disponibles auprès de la société Millipore, et filtre 0,8 / 8 pm en micro fibres de verre borosilicaté (Millipore, AP2501300)). La filtration est réalisée en goutte à goutte, en position verticale, de préférence sans dépasser 4/5 gouttes par seconde. Le filtrat peut être collecté dans un tube propylène de 2 ml (par exemple type ependorf) et soumis directement au dosage des hépatotoxines. L'homme du métier peut réaliser une analyse des hépatotoxines totales en mélangeant un volume du réactif d'extraction avec un volume du liquide à analyser, par exemple dans un récipient fermé en polypropylène ou en verre. Des tubes ependorf de 2ml peuvent être utilisés pour des petits volumes. II peut être plus pratique d'utiliser des tubes gradués de 13 ml avec bouchon vissant et des volumes de 2 à 5 ml. Le tube fermé hermétiquement peut être agité vigoureusement pendant environ 10 secondes et laissé à reposer pendant environ 5 minutes, avant d'agiter à nouveau pendant environ 10 secondes. 1,5 à 2 ml du liquide peuvent être prélevé à l'aide d'une seringue en polypropylène et filtré comme expliqué ci-dessus, sans dépasser de préférence 2/3 gouttes par seconde. Le filtrat est collecté par exemple dans un tube ependorf de 2 ml en polypropylène. On peut alors diluer N fois le volume d'extrait nécessaire dans un tampon adapté au dosage immunologique choisi pour la détection/quantification des hépatotoxines. Le facteur de dilution est aisément déterminé par l'opérateur en fonction de la méthode d'analyse utilisée. Pour l'utilisation de tests bandelettes, une dilution d'un facteur 2 au minimum est généralement nécessaire. Si une méthode de type ELISA est utilisée, des facteurs de dilution beaucoup plus 17 importants peuvent être adoptés. Pour les dosages immunoenzymatiques, un tampon de dilution approprié peut être le phosphate de sodium 100 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, sérum albumine bovine 0,1% (concentrations finales) (p :v). Pour les tests en bandelette, un tampon phosphate de sodium 75 mM pH 7,4, NaCl 30 mM, sérum albumine bovine 0,1%. avec addition de Tween 20 à 0,1% (p :v) peut être utilisé (concentrations finales). La concentration en hépatotoxines totales dans l'échantillon liquide est déterminée en multipliant par 2N le résultat d'analyse, pour corriger l'effet des dilutions successives. Une augmentation inégalée de la sensibilité d'un ordre de grandeur ou plus est possible grâce à la procédure très simple et rapide d'extraction d'un dépôt cellulaire concentré sur filtre comme détaillé ci-après. Ceci est particulièrement utile si l'analyse directe des hépatotoxines totales donne une valeur à la limite du seuil de détection de la méthode d'analyse utilisée. Seule sera mesurée dans ce cas la fraction de toxines associée aux cellules, généralement la plus importante quantitativement. A titre d'exemple, on considère qu'en phase de croissance de Microcystis aeruginosa, 80 à 90% des toxines sont associées aux cellules. Par exemple pour réaliser une concentration d'un facteur 10, il est possible de procéder comme suit: a) Prélever 20 ml de liquide à analyser à l'aide d'une seringue graduée ; b) Filtrer lentement en position verticale, par exemple sur cartouches à base de porte-filtre et joint Swinnex (SX0001300 et SX0001301) disponibles auprès de la société Millipore, et filtre 0,8 / 8 pm en micro fibres de verre borosilicaté (Millipore, AP2501300), de préférence sans dépasser 4/5 gouttes par seconde. La cartouche peut être purgée avec un peu d'air pour assurer une filtration complète. Le dépôt cellulaire obtenu est préférentiellement homogène. c) Diluer le réactif d'extraction volume à volume avec de l'eau et prélever 2 ml du mélange à l'aide d'une petite seringue en polypropylène. Passer la moitié du volume (1 ml) sur la cartouche, en position verticale, en récupérant le filtrat dans un tube polypropylène de 2 ml. De préférence, le flux de réactif d'extraction est rapide au tout début pour un mouillage homogène du filtre puis effectué ensuite au goutte à goutte (par exemple 2/3 gouttes par seconde). Il est préférable d'éviter de purger la cartouche avec de l'air, ce qui permet au filtre de rester en contact avec le réactif. Le filtre est laissé à incuber pendant environ 5 minutes et 18 l'extraction est terminée avec le restant du réactif. Le filtrat peut être récupéré avec la même seringue pour extraire le filtre une seconde fois en une seule étape. A titre indicatif, une filtration de 1 ml dure idéalement environ 20 secondes. d) Diluer le volume nécessaire de filtrat d'un facteur N dans le tampon approprié (par exemple un tampon phosphate salin : phosphate de sodium 100 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, sérum albumine bovine 0,1% ou de phosphate de sodium 75 mM pH 7,4, NaCl 30 mM, sérum albumine bovine 0,1%. avec addition de Tween 20 à 0,1% (p :v) pour les tests immuno-chromatographiques) et procéder au dosage. La concentration en hépatotoxines associées au cellules dans l'échantillon liquide est déterminée en multipliant la concentration mesurée par N/10, l'échantillon ayant été concentré 10 fois aux étapes b et c puis dilué N fois à l'étape d). Les différents protocoles décrits ont été élaborés dans l'optique d'une utilisation de terrain, en association avec une technique de test bandelettes, en particulier avec un système d'immuno-liposomes fluorescents récemment décrit dans la demande de brevet internationale WO 2009007858. Ces protocoles sont tout spécialement adaptés à la détection rapide des hépatotoxines dans la limite de 1 pg par litre recommandée pour l'eau de boisson par l'OMS. La limite de 10 pg par litre pour les eaux de baignade peut être facilement mesurée par la technique plus classique des bandelettes à l'or colloïdal. L'invention sera illustrée davantage au vu des figures et des exemples suivants. FIGURES La Fiqure 1 illustre le protocole d'extraction des hépatotoxines de cyanobactéries. La Figure 2 montre les rendements d'extraction des microcystines associées aux cellules de Microcystis aeruginosa obtenus avec les alcools suivants : M: méthanol, E: éthanol, P: propanol, isP: isopropanol and Pdi: propane-diol. 19 La Figure 3 illustre la potentialisation de l'extraction par le proponaol obtenue par addition de détergents. La Figure 4 illustre les effets de la concentration en propanol en présence de Tween 20 à 0,2% (poids:vol). La Figure 5 illustre les effets de l'acidification du milieu d'extraction sur les rendements d'extraction pour la souche Planktothrix agardhii. La Figure 6 montre les résultats d'extractions comparées sur différentes cultures de laboratoire des souches Anabaena flos-aquae PCC 9349 et Planktothrix agardhii en utilisant les procédures ToxXtract ou Abraxis. La Figure 7 montre les résultats d'analyse d'un prélèvement effectué dans le lac du Bourget (Savoie, France). EXEMPLES, Exemple 1 : Matériels et méthodes Souches de cyanobactéries utilisées Quatre souches productrices d'hépatotoxines de caractéristiques différentes ont été cultivées afin de valider la procédure d'extraction mise au point. Trois d'entre elles produisent différents variants de microcystines : il s'agit de Microcystis aeruginosa PCC (Pasteur Cyanobacteria Collection) 7820, Anabaena flos-aquae PCC 9349, et Planktothrix agardhii, une espèce filamenteuse originalement appelée Oscillatoria 223 mais maintenant assimilée à Planktothrix agardhii (don de K. Sivonen ; Luukkainen et al. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59, 2204-2209). Une autre souche multicellulaire, Nodularia PCC 7804, produit des nodularines qui sont des analogues des microcystines de moindre taille (peptides cycliques de 5 acides aminés à la place de 7). Par ailleurs, des prélèvements de blooms de différents lacs (de rétention et naturel, dons de M. J-F Humbert, Institut Pasteur, Paris) ont été également extraits avec le même protocole. Dosage des hépatotoxines extraites Des mesures immunologiques par compétition ont été mises en oeuvre pour doser les hépatotoxines extraites. La partie spécifique de la phase solide est 20 constituée d'un anticorps monoclonal de souris sélectionné comme reconnaissant le résidu Adda, acide aminé caractéristique commun à toutes les hépatotoxines. La compétition est réalisée avec un analogue de synthèse de ce résidu et les courbes standardisées avec de la microcystine-L-R (Khreich et al. (2009) Toxicon 53, 551-559) Protocoles d'extractions Réactif d'extractions (Réactif ToxXtract) 9 volumes de réactif A (44% propanol, 0,45% Tween 20 dans l'eau) sont 10 mélangés à 1 volume de réactif B (2% acide trifluoroacétique dans l'eau) pour former la solution ToxXtract. La solution obtenue est compatible avec le polypropylène. ToxXtract est préparé le jour des analyses. Les réactifs A et B sont stables à température ambiante; il est toutefois préférable de les conserver à 4`C. 15 Cartouches de Filtration : Les filtres et supports de filtration utilisés proviennent de la Société Millipore : cartouches réutilisables Swinnex, 13 mm de diamètre (porte-filtre 20 ref.SX0001300; et joints en silicone ref. SX0001301) - les filtres sont en micro fibres de verre borosilicaté (ref. AP2501300). Les cartouches et joints peuvent être réutilisés après un nettoyage minutieux. 25 Analyse directe des microcystines libres (protocole 1) Prélever 2 ml du liquide à analyser à l'aide d'une seringue en polypropylène. Mettre en place un joint silicone et un filtre en fibres de verre dans la cartouche porte-filtre. Pour plus de commodité, il est préférable de préparer à l'avance l'ensemble des cartouches nécessaires. Ajuster fermement la seringue 30 sur l'unité de filtration et filtrer goutte à goutte en position verticale (ne pas dépasser 4/5 gouttes par seconde). Collecter le filtrat dans un tube propylène de 2ml (type ependorf). 21 Procéder directement au dosage des microcystines par ELISA ou bandelettes. Analyse des microcystines totales (protocole 2) Préparer un volume approprié de ToxXtract pour tous les essais prévus. Ajouter 1 volume de ToxXtract à 1 volume du liquide à analyser dans un récipient fermé en polypropylène ou en verre. Des tubes ependorf de 2 ml peuvent être utilisés pour des petits volumes. II peut être plus pratique d'utiliser des tubes gradués de 13 ml avec bouchon vissant pour des volumes de 2 à 5 ml. Fermer hermétiquement le tube et agiter vigoureusement 10 secondes; laisser reposer 5 minutes. Agiter à nouveau 10 secondes puis prélever 1,5 à 2 ml du liquide à l'aide d'une seringue en polypropylène et ajuster fermement la seringue sur une unité de filtration et filtrer goutte à goutte en position verticale (ne pas dépasser 2/3 gouttes par seconde). Collecter le filtrat dans un tube ependorf de 2ml en polypropylène. Diluer N fois le volume d'extrait nécessaire dans le tampon adapté au dosage immunologique choisi pour l'étape finale. Pour l'utilisation de tests bandelettes, une dilution d'un facteur 2 au minimum est indispensable (pour les dosages EIA, un tampon approprié est le phosphate de sodium 100 mM pH 7,4, NaCl 150mM, sérum albumine bovine 0,1%; un tampon phosphate de sodium 75 mM pH 7,4, NaCI 30 mM, sérum albumine bovine 0,1%, Tween-20 0,1% est utilisé pour les immuno-chromatographies). Le résultat obtenu est multiplié par 2N pour corriger l'effet des dilutions successives. Analyse après une étape de concentration (protocole 3) Si l'analyse directe donne une valeur à la limite du seuil de détection, une confirmation peut être obtenue après une étape pratique de concentration d'un facteur 10 (ou plus). Seule la fraction de toxines associée aux cellules sera mesurée dans ce cas. Cette procédure complémentaire peut toutefois s'avérer difficile à appliquer aux suspensions cellulaires très concentrées. Par exemple, pour un facteur de concentration de 10: a) Prélever 20 ml du milieu à analyser à l'aide d'une seringue graduée. 22 b) Filtrer lentement en position verticale sur les mêmes cartouches que dans la procédure A (ne pas dépasser 4/5 gouttes par seconde). Purger la cartouche avec un peu d'air pour assurer une filtration complète. Le dépôt cellulaire doit être homogène. c) Diluer le réactif ToxXtract volume à volume avec de l'eau et prélever 2 ml du mélange à l'aide d'une petite seringue en polypropylène. Passer la moitié du volume (1 ml) sur la cartouche, en position verticale, en récupérant le filtrat dans un tube polypropylène de 2 ml. Le flux de réactif doit de préférence être rapide au tout début pour un mouillage homogène du filtre (contrôle visuel) puis effectué au goutte à goutte (2/3 gouttes par seconde). Ne pas purger la cartouche avec de l'air; le filtre doit rester en contact avec le réactif. Laisser le filtre incuber 5 minutes et terminer l'extraction avec le restant du réactif. Récupérer le filtrat avec la même seringue pour extraire le filtre une seconde fois en une seule étape. Pour indication, la filtration de 1 ml devrait durer environ 20 secondes. d) Diluer le volume nécessaire de filtrat d'un facteur N dans le tampon approprié (pour les dosages EIA, un tampon approprié est le phosphate de sodium 100 mM pH 7,4, NaCl 150mM, sérum albumine bovine 0,1%; un tampon phosphate de sodium 75 mM pH 7,4, NaCI 30 mM, sérum albumine bovine 0,1%, Tween-20 0,1% est utilisé pour les immuno-chromatographies) et procéder au dosage. Note 1 la concentration en microcystines cellulaires du milieu de départ sera la concentration mesurée x 10/N (concentration 10 fois aux étapes b / c; dilution N fois à l'étape d) Note 2 : en cas de concentration cellulaire trop forte, il peut se produire une saturation prématurée du filtre à l'étape b. Mesurer alors le volume réellement filtré et extraire le filtre avec 1/10 de ce volume de mélange ToxXtract (step c). II n'est pas recommandé d'utiliser moins de 1 ml à cette étape. Exemple 2 : Optimisations des paramètres d'extraction L'optimisation de la technique d'extraction a été réalisée sur la souche Microcystis aeruginosa, l'une des plus répandue dans les blooms naturels. Cette souche unicellulaire présente une bonne vitesse de croissance en cultures de laboratoire. 23 Les trois techniques d'extraction les plus courantes en laboratoire ont été systématiquement utilisées comme contrôles: i) lyophilisation suivie d'une extraction méthanolique acide avec sonication (méthanol:eau 75% (v:v), TFA 0,05% (v:v)); ii) incubation 3 minutes à mot; iii) congélations / décongélations répétées 3 fois. Le meilleur résultat pour chaque expérience a été retenu comme référence. Les valeurs dans les différents graphiques ci-dessous sont la moyenne systématique de trois expériences, chaque dosage immunologique étant lui-même dupliqué; la déviation standard moyenne n'excède pas 5%. La valeur des microcystines extra-cellulaires est mesurée en utilisant le protocole 1 et soustraite de la valeur des microcystines totales de manière à obtenir la fraction associée aux cellules. La concentration est donnée en équivalent de microcystine L-R. Les cultures pour les différents essais n'ont pas été nécessairement collectées à la même densité cellulaire, ce qui explique les différences dans les teneurs en microcystines. 2.1) Sélection du meilleur solvant Des mélanges alcool / eau ont été retenus sur la base de l'ensemble des travaux antérieurs qui utilisent souvent un pourcentage élevé de méthanol. La série d'alcools aliphatiques compatibles avec un mélange aqueux (jusqu'à 3 carbones) a été évaluée; une teneur de 20% en alcool a été considérée comme un maximum afin d'éviter une trop grande dilution ultérieure des extraits dans l'utilisation des techniques immuno-chromatographiques. Comme il était prévisible, les résultats montrent qu'une faible teneur en alcool entraîne une faible efficacité d'extraction des microcystines (les concentrations en méthanol sont classiquement de 75 à 80%). Par contre, l'efficacité augmente avec la longueur de la chaîne carbonée (Figure 2). Le propanol apparaît ainsi comme étant l'alcool le plus efficace pour l'extraction; il a été sélectionné pour la suite des essais. 24 2.2) Addition d'un détergent L'éventuel effet détergent dans le mélange alcool/eau a ensuite été étudié. Cinq détergents usuels en biologie ont été ajoutés au mélange alcool / eau à des concentrations finales de 0,2% (poids/vol): - le CHAPS qui est un détergent zwiterionique (cholamidopropyl-diméthylammonio propane sulfonate) - les autres détergents sont des détergents non-ioniques: Nonidet P40 et Triton X100 sont des octlyphenyl-polyéthylene glycol de longueur différente; f3DM et Tween 20 sont des dérivés d'une chaîne aliphatique en C12 (n-dodécyl- f3-D- maltoside et polyoxyéthylène sorbitan monolaurate respectivement). L'effet du détergent est spectaculaire puisqu'on obtient avec chacun des détergents un rendement d'extraction bien supérieur à la valeur de référence (Figure 3). Le Triton X100 donne l'effet le plus marqué, mais il n'est pas compatible avec les techniques immuno-chromatographiques impliquant des liposomes. Les quatre autres détergents ayant un effet équivalent, le Tween 20 a été sélectionné pour la suite des tests puisqu'il est classiquement utilisé dans beaucoup de réactions immunologiques. La concentration optimale de propanol a été ensuite contrôlée à nouveau en présence de 0,2% de Tween 20. Appliquée aux cellules de Microcystis aeruginosa, une teneur de 10% en propanol donne un effet quasi maximum, avec peu de différence significative aux concentrations supérieures (Figure 4). Cependant, un effet plus marqué jusqu'à 20% a été constaté avec la souche filamenteuse plus résistante Planktothrix agardhii. La concentration de 20% propanol a donc été adoptée pour la suite des essais. Cette concentration s'est d'ailleurs avérée également plus efficace pour les extractions directes sur filtre (protocole 3). 2.3) Acidification du milieu Comme il a été rapporté dans la littérature, certains variants de microcystines sont mieux extraits en milieu acide. Il a effectivement été remarqué que l'effet du pH est particulièrement marqué pour la souche Planktothrix agardhii, puisque le rendement d'extraction à partir de cette souche était très faible en milieu neutre (Figure 5). 25 L'acide trifluoroacétique (TFA) 0,1%, qui procure un pH final de 2,1 dans le milieu, a un effet plus marqué que le chlorure d'hydrogène (même pH) sur l'efficacité d'extraction; il est utilisé à cette concentration dans le mélange final. Exemple 3: Application du protocole d'extraction optimisé aux quatre souches témoins Les concentrations finales de réactifs dans le milieu d'extraction sont les suivantes: 20% propanol (vol:vol), 0,2% Tween 20 (poids:vol) et 0,1% TFA (vol:vol). Les hépatotoxines associées aux cellules ont été mesurées sur des cultures de laboratoire des quatre souches sélectionnées. Les deux techniques mises au point, extraction directe (protocole 2) et extraction sur filtre (protocole 3) ont été comparées au kit QuickLyseTM de la Société Abraxis (Abx). La valeur la plus élevée obtenue avec les techniques classiques (le plus souvent lyophilisation / extraction méthanolique) a été retenue comme référence 100%. Le Tableau 1 ci-dessous donne les valeurs moyennes pour 4 à 5 cultures différentes de chaque souche, la quantification immunologique étant elle-même dupliquée. Les résultats sont exprimés en % de la référence. Tableau 1 : comparaison du rendement d'extraction relatif des microcystines par les protocoles ToxXtract selon l'invention ou par le kit QuickLyseTM de la société Abraxis (Abx) Référence ToxXtract ToxXtract Abx protocole 2 protocole 3 Anabaena flos-aquae 100 168% � 26 100% � 25 136% � 32 PCC 9349 Microcystis aeruginosa 100 123%� 17 87%�4 88%� 15 PCC 7820 Nodularia PCC 7804 100 132% � 8 106% +/-14 110% � 20 Planktothrix agardhii 100 126% +/-15 79%� 5 46% � 6 L'extraction directe selon le protocole 2 donne des concentrations en 25 microcystines systématiquement supérieures à la meilleure des techniques 26 classiques, parfois dans une large mesure (voir Anabaena flos-aquae). Ces valeurs sont également supérieures à celles obtenues avec le kit QuickLyseTM de Abraxis; cette différence est notoirement importante pour Planktothrix agardhii, une souche filamenteuse résistante. La technique un peu moins efficace d'extraction sur filtre (protocole 3) donne 60 à 80 % des valeurs maximums obtenues avec la technique directe (protocole 2), mais néanmoins proches des valeurs de référence; ces valeurs doivent être considérées comme une limite inférieure et corroborées par une technique classique si nécessaire. La Figure 6 illustre la reproductibilité des procédures d'extraction ToxXtract (protocole 2) et Abraxis pour deux souches: Anabaena flos-aquae, pour laquelle les deux méthodes montrent des résultats comparables, et Planktothrix agardhi pour laquelle la procédure ToxXtract est de loin la meilleure méthode. Exemple 4 : Extractions de microcystines à partir de blooms naturels û comparaison avec la méthode de référence Le protocole 2 d'extraction a été utilisé pour effectuer des extractions directes de blooms naturels. Les modes opératoires et l'exploitation des résultats sont les mêmes que pour les cultures de laboratoire. Tableau 2: efficacités relatives d'extraction des microcystines par la méthode de référence ou par le protocole 2 ToxXtract Origine du bloom Valeur totale de ToxXtract protocole 2 microcystines de référence* Barrage de Villerest 100 128 (France) 13 sept. 2007 Barrage de Villerest 100 176 (France) 8-9 oct. 2007 Lac du Bourget (France) 100 180 Nov. 2007 Lac du Bourget (France) 100 118 Mars 2009 27 *La valeur la plus élevée obtenue avec les techniques classiques (le plus souvent lyophilisation / extraction méthanolique) a été retenue comme référence 100%. La nouvelle procédure d'extraction des hépatotoxines décrite dans la demande s'est avérée systématiquement plus efficace que les différentes techniques de laboratoire décrites dans l'état de la technique. Elle est également plus efficace que le procédé mis en oeuvre à l'aide du kit d'extraction QuickLyseTM de la Société Abraxis, récemment commercialisé pour le même usage. Cette efficacité s'est révélée particulièrement décisive pour la souche Planktothrix agardhii, une souche filamenteuse résistante couramment rencontrée dans les blooms et qui produit également d'autres toxines que les hépatotoxines (neurotoxines). Exemple 5 : Comparaison de l'analyse du bloom du lac du Bourget par le procédé ToxXtract et par le kit d'extraction QuickLyseTM de la Société Abraxis Le prélèvement effectué en mars 2009 dans le lac du Bourget a permis d'effectuer une comparaison avec le kit QuickLyseTM de la société Abraxis (Abx) qui n'était pas disponible lors des premiers essais terrains. L'efficacité de ce dernier s'est révélée extrêmement faible en comparaison des procédés ToxXtract décrits dans le document complet (Figure 7). Toutes les analyses quantitatives après extraction ont été effectuées par dosages enzymo-immunologiques via un anticorps monoclonal spécifique du résidu Adda commun à toutes les hépatotoxines (laboratoire SPI/LERI, Saclay). La concentration en toxines dans le milieu est mesurée directement après filtration appropriée pour éliminer l'ensemble des cellules présentes; cette valeur est déduite des valeurs globales obtenues avec les différentes procédures afin de comparer strictement l'efficacité de l'extraction des hépatotoxines cellulaires (sauf pour ToxXtract protocole 3, où le milieu est déjà éliminé avant l'extraction). La procédure d'extraction directe (ToxXtract protocole 2) s'effectue par simple mélange volume à volume du réactif avec le prélèvement. Elle s'est à nouveau montrée légèrement supérieure en efficacité à la technique de référence 28 la plus classiquement mise en oeuvre au laboratoire: lyophilisation de l'échantillon suivi d'une extraction en méthanol 75% sous sonication (Lyoph/MetOH). Ceci corrobore à nouveau l'ensemble des résultats de l'étude complète sur les souches de laboratoires et les quatre prélèvements précédents. De même la procédure de concentration sur filtre (ToxXtact protocole 3) s'avère quasiment équivalente à la procédure standard. Elle permet de valider des valeurs qui seraient à la limite de détection des tests terrain. Dans le cas présent, 2 ml de l'échantillon de départ sont dilués dans 20 ml d'eau (dilution artificielle d'un facteur 10); la suspension obtenue est filtrée et les cellules retenues sur le filtre sont extraites in situ par passage de 2 ml du réactif ToxXtract; ce qui apporte donc un facteur de concentration de 10 par rapport à la solution diluée et permet une comparaison directe avec la solution initiale Dans le cas présent, on s'attend donc à retrouver la valeur de l'extraction directe, ce qui est pratiquement le cas. Une analyse microscopique de l'échantillon a montré la présence d'une cyanobactérie multicellulaire filiforme du genre Planktothrix (productrice probable des microcystines détectées ci-dessus), mais également de deux diatomées en grand nombre: Asterionella, et Fragilaria crotonensis (indicateur de pollution). Cette analyse microscopique montre que la dominance d'autres espèces cellulaires dans le milieu n'affecte pas l'efficacité du procédé ToxXtract. La valeur trouvée ici, environ 200 pg/l, est bien au-dessus des seuils édictés par l'OMS (10 pg/l pour l'eau de baignade, 1 pg/l pour l'eau de consommation). Revendications1. Composition comprenant : - 20 à 50 % (volume:volume) d'un alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci, et - 0,1 à 2% (poids:volume) d'au moins un détergent ; - éventuellement un agent acidifiant présent en quantité suffisante pour que la composition, après dilution d'un facteur 2 avec de l'eau, ait un pH compris entre 1,8 et 2,5 ; et - de l'eau en quantité suffisante pour (q.s.p.) 100%. 2. Composition selon la revendication 1, comprenant : 30 à 40% (v:v) de propanol ou isopropanol, 0,2 à 0,5% (p:v) d'un détergent sélectionné dans le groupe constitué de CHAPS, NP-40 et Tween 20, 0,1 à 0,4% (v:v) d'acide trifluoroacétique, et - de l'eau en quantité suffisante pour 100%. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, qui est constituée de : - 30 à 40% (v :v) de propanol ou isopropanol, 0,2 à 0,5% (p :v) d'un détergent sélectionné dans le groupe constitué de CHAPS, NP-40 et Tween 20, - 0,1 à 0,4% (v :v) d'acide trifluoroacétique, et - de l'eau en quantité suffisante pour 100%. 4. Kit comprenant : a) une première composition comprenant ou constituée de : - 20*(x+y)/x à 50*(x+y)/x % (v :v), de préférence 30*(x+y)/x à 40*(x+y)/x (v :v), d'un alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci, - 0,1 *(x+y)/x à 2*(x+y)/x % (p :v), de préférence 0,2*(x+y)/x à 0,5*(x+y)/x % de préférence encore 0,3*(x+y)/x à 0,4*(x+y)/x %, d'au moins un détergent ; 30 - et de l'eau q.s.p. 100% ; et b) une seconde composition comprenant ou constituée de : - 0,1*(x+y)/y à 0,4*(x+y)/y % (v :v), de préférence 0,2 *(x+y)/y % d'acide trifluoroacétique; et de l'eau q.s.p 100% ; où x et y sont des nombres positifs, et y est préférentiellement compris entre x/2 et x/9. 5. Kit selon la revendication 4, qui comprend en outre des instructions pour mélanger x volumes de ladite première composition avec y volumes de ladite seconde composition pour constituer un réactif d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries. 6. Kit selon la revendication 4 ou 5 comprenant : a) une première composition comprenant : - environ 22,22 à environ 55,55 % (v :v), de préférence environ 33,33 à environ 44,44 % (v :v), d'un alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci, - environ 0,11 à 2,22 % (p:v), de préférence 0,22 à 0,56 % de préférence encore 0,33 à 0,45%, d'au moins un détergent ; - et de l'eau q.s.p. 100% ; et b) une seconde composition comprenant : - 1 à 4 % (v:v), de préférence 2 % d'acide trifluoroacétique; et - de l'eau q.s.p. 100%. 7. Utilisation d'une composition comprenant : - 10 à 25 % (volume:volume (v :v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci ; 0,05 à 1 % (poids:volume (p :v)) d'au moins un détergent ; éventuellement un agent acidifiant en quantité suffisante pour que la composition ait un pH compris entre 1,8 et 2,5 ; et de l'eau q.s.p. 100% ; 531 pour l'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries. 8. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle le détergent est un détergent compatible avec les méthodes immunologiques. 9. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle ladite composition comprend entre 0,05 et 0,2% (volume:volume) d'acide trifluoroacétique ou entre 0,005 et 0,02N d'acide chlorhydrique, à titre d'agent acidifiant. 10 10. Méthode d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact des cyanobactéries avec une composition comprenant : - 10 à 25 % (volume :volume (v :v)) d'alcool sélectionné dans le groupe 15 constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci ; 0,05 à 1 % (poids:volume (p :v)) d'au moins un détergent ; - éventuellement un agent acidifiant en quantité suffisante pour que la composition ait un pH compris entre 1,8 et 2,5 ; et 20 - de l'eau q.s.p. 100% ; b) incuber les cyanobactéries au contact de ladite composition pendant un temps suffisant pour obtenir l'extraction des hépatotoxines. 11. Méthode d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries selon la 25 revendication 10, comprenant les étapes consistant à : a) mélanger un volume de composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 avec un volume de suspension cellulaire contenant des cyanobactéries; et b) incuber le mélange d'extraction obtenu à l'étape a) pendant un temps 30 suffisant pour obtenir l'extraction des hépatotoxines. 32 12. Méthode selon la revendication 11, qui comprend en outre, après l'étape b), une étape consistant à filtrer tout ou partie du mélange d'extraction pour récolter le mélange d'extraction. 13. Méthode d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries selon la revendication 10, comprenant les étapes consistant à : ao) concentrer les cyanobactéries d'un échantillon à analyser par filtration ; a) mettre en contact le retentât contenant les cyanobactéries obtenu par filtration à l'étape ao) avec une composition comprenant : - 10 à 25 % (volume:volume (v :v)) d'alcool sélectionné dans le groupe constitué du propanol, de l'isopropanol, et du propanediol, ou d'un mélange de ceux-ci ; - 0,05 à 1 % (poids:volume (p :v)) d'au moins un détergent ; - éventuellement un agent acidifiant en quantité suffisante pour que la composition ait un pH compris entre 1,8 et 2,5 ; et - de l'eau q.s.p. 100% ; b) incuber le retentât contenant les cyanobactéries au contact de ladite composition pendant un temps suffisant pour obtenir l'extraction des hépatotoxines. 14. Méthode d'extraction d'hépatotoxines de cyanobactéries selon la revendication 13, dans laquelle la filtration est mise en oeuvre sur un support inerte de porosité mixte de 0,8 à 8 pm.25