FR 2951738 A1 20110429 FR 0905120 A 20091026 DESCRIPTION TITRE SUBSTRATS MATRICIELS CARBONES POUR L'OBTENTION DE BACTERIES BIOFERTILISANTES ÉTAT DE LA TECHNIQUE ET PROBLEMATIQUE Endogénécité et agro-pédo-climats (APC) L'endogénécité des biomasses microbiennes réintroduites dans un sol donné est déterminante pour l'efficacité relative de ces biomasses. En effet, et malgré un certain vague entourant la biogéographie microbienne des sols (Curtis et al. 2002 ; Fierer et Jackson 2006 ; Cho et Tiedje 2000), l'importance de cibler la (ré)introduction de biomasses microbienne biofertilisantes demeure. Ce ciblage peut contribuer à leurs plus grandes efficacités, et/ou simplifier grandement les aspects réglementaires entourant leurs réintroductions dans leurs milieux d'origines. Cette endogénécité implique une concordance entre les milieux (sols) d'origines et ciblés, i.e. une certaine similarité entre son APC d'origine et de réintroduction. Il sera ainsi possible de situer la parcelle dans un APC ; la souche/biomasse (azoto)bactérienne provenant de cet APC sera donc nécessairement « endogène » lorsque réintroduite par biofertilisation. Donc, par APC nous voulons dire ici un ensemble d'unités cartographiques et/ou de pédons dont les principales caractéristiques physico-chimiques (pH, C-organiques, P, K, texture, etc.) permettent de les assembler û avantageusement par voie d'analyse multi-variées telle que l'analyse par composantes principales, ou ACP, avec d'autre unités cartographiques jugées ainsi suffisamment similaires. En ce sens, j'ai cherché dans le passé à concevoir des cultures mères de bactéries telluriques au sens de FR0115542, et cela afin de reproduire in vitro l'essentiel de ces caractéristiques physico-chimiques d'un sol appartenant à un APC, tout en permettant la mise en culture de biomasses bactériennes pouvant être produites industriellement par la suite. J'ai pu démontrer que ces biomasses ainsi obtenues une fois réintroduites dans leurs APC d'origines furent effectivement plus performantes que leurs consoeurs obtenues plus conventionnellement et/ou réintroduites dans un APC autre. Afin de mieux exploiter en agronomie ce phénomène de concordance APC-spécifique et d'endogénicité des biomasses microbiennes réintroduites les plus efficaces, il eut été nécessaire, d'une part de caractériser û de segmenter, plus systématiquement la SAU (surface agricole utiles) û française ici notamment, en parcelle APC repérables et, d'autre part d'inventer un protocole d'obtention (rétention) de biomasses microbienne APC-spécifiques plus performant de façon à pourvoir le reproduite ponctuellement pour chaque parcelles agronomique ciblés. En effet, le protocole décrit dans FR0115542 rends cette réitération de l'obtention difficilement reproductible pour chacune des quelques 330 000 exploitations agricoles en France. En réponse à ce souci technique, il est aussi possible d'établir sur la base d'une série de catégories d'argile - paramètre pédologique le plus apte à structurer les communautés bactériennes du sol du fait leur forte interaction avec les complexes argilo-humique, un certai nombre de tels APC putatifs. II s'agit en sorte de répartir la SAU û française dans ce cas-ci, en groupes de parcelles (agronomiques) homogènes (similaires). Pour établir ce degré de similarité et effectuer ce regroupement il est loisible de procéder par analyses par composante principale (ACP) des données édaphiques û notamment celles répertoriée exhaustivement pour la France par le GISSOLTM (www.gissol.fr), les plus conséquente et/ou renseignées ; eg. pH, Corganique, granulométrie (ALS), cations (Mg, Ca et K), la CEC et son degré de saturation, etc. Sur la base de catégories d'argiles préétablies et progressivement de plus en plus riches, les paramètres édaphiques û notamment ici le pH et le Corganique, les mieux corrélés avec l'une ou l'autre des deux première composante principales permettent d'établir à quel groupe homogène (APC) appartiennent un échantillon de d'une parcelle donnée. Ce protocole de regroupement et d'attribution d'APC est décrit succinctement sur le site de Polyor SARL ; www.polvor- agro.com). A noter que les APC ainsi formés ne sont pas (nécessairement) composés de parcelles agronomiques contigües géographiquement ; cette non-contigüité étant ici particulièrement révélatrice de la biogéographie des communautés bactériennes du sol (Fierer et Jackson 2006). Adaptation des bactéries du sol aux biofilms telluriques et à l'oligotrophie ambiante La formation de pellicules biologiques ou biofilms, par des bactéries du sol est cruciale pour leur adaptation à la vie dans cet environnement. La vie bactérienne dans les sols est 35 essentiellement « nichée » en proximité des complexes argilo-humiques (CAH) qui dans les faits abritent des biofilms à leurs surfaces (i.e. des zones hydratées plus ou moins épaisses selon la nature de CAH). La composition des microflores des CAH û et donc accessoirement des sols, et des biofims sont donc apriori plutôt similaires. Cependant, cette habilité qu'ont les bactéries du sol les mieux adaptées n'est pas sous le contrôle d'éléments et/ou même de30 programmes génétiques compréhensibles, voire simples (Klausen et al 2006, Sauer 2003). Le profilage génomique (génotypage) et/ou métabolique des souches BFCP les plus adaptées à la vie dans les sols reste, pour l'essentiel, à accomplir. Pire, cette caractérisation s'avérerait vraisemblablement complexe et pourrait prendre surtout la forme d'un vague profil génomique (eg. Rüberg et al. 2003) sans pour autant identifier précisément les quelques mécanismes biomoléculaires les plus déterminants pour l'adaptation à la vie dans les sols (arables). II semble que la compétence édaphique n'est pas synonyme et/ou régit par un ou des programme génétiques (génomiques) compréhensibles, simples et manipulables. Le degré d'adaptation à la vie dans les sols demeure donc aujourd'hui, d'un point de vue génomique, un concept abstrait et mal défini (Klausen et al. 2006). En effet, il est tentant, d'un point de vue stratégique et méthodologique de vouloir réduire (ramener) l'adaptation à la vie dans les sols à quelques mécanismes simples, notamment les mécanismes d'adhésion des bactéries aux surfaces solide et abiotique. En effet, et malgré les prétentions de Syn et al. 2004 qui laissent entendre avoir pu ramener le phénomène de l'oligotrophie rustique des Pseudomonas in situ à quelques gènes, trois pour être exacte, Tao et al. 1999 révèlent clairement que l'espression de près de 10% des quelques 4000 gênes d'E.coli est modulée en réponse à une oligotrophie imposée. Donc, entre les quelques gênes de Syn et al. 2004, et les quels centaines de Tao et al. 1999, le débat reste ouvert, pour le moins dire. Pourtant, à première vue, les sols et les biofilms sont des niches écologiques assez différentes. La sélection et l'isolement de souches bactériennes du sol les mieux adaptées à la vie dans les sols (AVS) pour la fabrication d'inocula de bactéries favorisant la croissance des plantes (BFCP) est donc problématique puisque l'indentification de génotypes stables de telles BFCP adaptées à la vie dans les sols (« fit in soit » cf. Mirleau et al. 1999) est difficilement contrôlable. Nb. Par adaptation à la vie dans les sols je veux dire la qualité qu'on les souches BFCP candidates à persister activement dans les sols arables, avantageusement en proximité des résidus de culture enfouis et/ou des racines suffisamment longtemps et en quantité (nombre) suffisant pur avoir un effet phytogène facilement détectable. Cela dit, ces bactéries les plus adaptées en ce sens mettent en oeuvre des mécanismes favorisant l'adhérence et la formation de micro û colonies, ainsi que la communication (cf. signalisation intercellulaire) contribuant à l'organisation « sociale » de ces population en biofilms (Klausen et a12006 ; Sauer 2003). Faute de programmes génétiques compréhensibles et/ou de « profil d'expression génomiques » reproductibles, ces quelques mécanismes, et les composantes génétiques qui les sous-tendent, peuvent en principe servir de critères de sélection. Faut-il encore pouvoir cibler les bonnes populations de cellules bactériennes. Cette dominance numérique de souches copiotrophes au dépends de souches génétiquement distincte qui le sont moins est connue (Dunbar et al 1997), et a depuis fais l'objet de -4 nombreuses études et essais sensés y remédier (Bastians et al. 2000 ; Ferrari et al. 2006 et 2005 ; Zengler et al. 2002 ; Janssen et al. 2002 ; Simu et Hagstrôm 2004 ; Stevenson et al 2004 ; Cho et Giovannoni 2004 ; Tamaki et al. 2005 ; Connan et Giovannoni 2002 ; Shimonura et al. 2006). Cependant, ce phénomène de domination numérique de souches copiotrophes, par fois dit « enrichement bias » (Dunbar et a11997) n'a jamais été expressément cité comme responsable de la relative inefficacité des inocula BFCP, notamment de ceux destinés aux cultures non-légumineuses. De plus, et paradoxalement, ces approches, bien que réussies en terme de mise en culture de cellules bactériennes plutôt oligotrophes, et donc vraisemblablement rustiques et donc potentiellement bien adaptées à la vie dans les sols, sont par contre difficilement applicables à des bioprocédés conventionnels. En effet, les susdites méthodes d'isolement sont trop biaisées vers la sélection de bactéries strictement oligotrophes. II en résulte la sélection et la mise en culture de cellules normalement incultivables in vitro, mais dont les taux de croissance in vitro sont trop faibles pour assurer la rentabilité de la production industrielle. Ces méthodes de mise en culture de bactéries telluriques récalcitrantes publiées depuis le dépôt de la demande FR0115542 (Ferrari et al. 2006 et 2005 ; Zengler et al. 2002 ; Janssen et al. 2002 ; Simu et Hagstrôm 2004 ; Stevenson et a12004 ; Cho et Giovannoni 2004 ; Tamaki et al. 2005 ; Connan et Giovannoni 2002 ; Shimonura et al. 2006) cherchent surtout à démonter que certains spécimens peuvent, malgré leurs rusticité et/ou leurs oligotrophie, être cultivés in vitro. Ces méthodes ne démontrent pas que ces spécimens, du fait d'un haut degré d'AVS, sont nécessairement plus phytogènes et/ou productibles in vitro, voire industriellement, du fait de leurs relatives copiotrophies par rapport à leurs congénères les plus rustiques. Enfin, les Azotobacteraceae les plus adaptées à la vie dans les sols seront, en principe, sauront le plus facilement s'organiser en biofilms du fait d'une meilleure communication intercellulaire via la synthèse et l'excrétion desdits facteurs d'auto-induction. En effet, selon Ganter et al. 2006 les cellules bactérienne individuellement impliquées dans la formation de telles pellicules biologiques ont en théorie intérêts à percevoir de faibles concentrations de tels facteurs, et plus particulièrement les maintenant fameux homo-sérine-lactones n-acétylés (ou ici, nHSL). De telles molécules étant impliquées dans l'organisation coloniale des cellules bactériennes dites « pionnières » lors de la formation de biofilms, cette sensibilité leur permet de facto d'être particulièrement bien adaptées à la vie dans les sols, lesdits biofilms étant une partie intégrante de l'environnement immédiat des complexes argilo-humique de sol. Du coup, il est raisonnable de croire que les cellules (sur)produisant le plus d'nHSL sont elles les plus aptes à être « entendues » lors de ces première stade de formation des biofilms. Localement, une dominance microbiologique de telles cellules (azoto)bactériennes (sur)productrices d'nHSL ne peut que favoriser la formation des dits biofilms et le degré d'adaptation à la vie dans les sols de telles cellules une fois réintroduites. -5 Les BFCP les plus prometteuses sont difficilement extractibles du sol du fait qu'elles sont avantageusement copio û et oligotrophes Les BFCP, les plus adaptées à la vie dans les sols sont difficilement maintenues actives in vitro (Barer et Harwood 1999) du fait qu'elles sont oligotrophes, rustiques et donc incapables de dominer numériquement les autres cellules introduites in vitro. Cette rusticité des bactéries les plus adaptées à la vie dans les sols fait qu'elles n'intègrent pas de façons prévisibles et manipulables les contingents bactériens d'origine tellurique facilement isolables. Du coup, les isolats bactériens les plus dominants en milieux de culture in vitro sont peu ou pas apparentés à l'essentiel de la microflore bactérienne du sol (Torsvik et al. 1990a et b ; Ward et al. 1990). Et pourtant, le compromis oligo / copiotrophie évoquer dans FR0115542 est défendable, d'un point de vue bioindustriel afin de permettre la production de souches rustiques, mais aussi d'un point de vue d'écologie microbienne. Selon Kreft 2004, ce compromis s'apparente à une forme d'altruisme caractéristique des cellules bactériennes qui le réalise. Or, ces altruistes à caractère oligotrophe, bien que très présentes sur biofilms ne peuvent le dominer et à terme le seront par des cellules plus copiotrophes. C'est pourquoi, Kreft 2004 mention une étape de purification au profit desdites altruistes. De plus, l'essentiel des bactéries en sols arables sont intimement associées aux fines particules du sol, et en particulier aux complexes argilo- humiques qu'elles abritent (Mills 2003 ; Baiser et al. 2002 ; Chappell et Evangelou 2002). Sonder les CAH à l'aide l'oligo-nucléotides afin d'identifier les BFCP les plus adaptées à la vie dans les sols sans recourir à des pré-cultures aqueuses est aujourd'hui physiquement impossible. Sonder une suspension aqueuse de ces particules de sol est toute aussi inefficace puisque l'essentiel des BFCP les plus adaptées à la vie dans les sols sont associées aux fines particules de sols et aux CAH ; elles seront nécessairement exclues de cette suspension, surtout si elle est diluée pour fin d'isolement d'unités formatrices de colonies (UFC) bactériennes. Enfin, l'inoculation de milieux de culture très pauvres en substrats carbonés (Janssen et al. 2002), sans pour autant relâcher les liens qui unissent les BFCP les plus AVS aux CAH, ne fera que favoriser la rétention et la mise en culture de souches rustiques, mais du coup excessivement oligotrophes et difficilement productibles industriellement. L'oligotrophie des BFCP est donc à la fois caractéristique d'un haut niveau d'adaptation à la vie dans les sols (in situ), et d'une certaine inadaptation à la vie in vitro. Par exemple, l'oligotrophie des BFCP rustique in situ est associée à la surproduction d'exopolysaccharides (Roberson et al. 1993 ; Deflaun et al. 1990). En effet, cette surproduction nui à la prolifération in vitro desdites BFCP, bien qu'elle leurs profitent in situ. En ce sens, Bushby et Marshall (1977) ont noté que les Rhizobiacea les plus prolifiques sont relativement moins persistantes in situ. -6 Selon Van Gestel et al. (1993) il existe une différence entre les cellules rustiques dites « autochtones » et les cellules plus copiotrophes dites « zymogènes » (sensu Ponchon 1958) en ce qui concerne leurs niveaux d'activités métaboliques et d'AVS. Selon ces auteurs, les bactéries zymogènes moins rustiques proviennent surtout des familles Pseudomonacea,, Azotobacteraceae et Rhizobiacea, tandis les bactéries autochtones plus rustiques elles sont surtout membre des familles Arthobacter (Micrococcaceae). Par exemple, Boylen (1973) affirme que la stratégie des bactéries coryniformes pour mieux survivre dans les sols consiste surtout à « hiberner » en réduisant leur taux de métabolisme, tout en faisant apparaître d'épaisses couches (« manteaux ») de peptidoglycans. Les bactéries plus zymogènes, elles, miseraient surtout sur une production plus ponctuelle d'EPS et d'LPS (i.e. lipo - polysaccharides), l'adaptation d'un mode de vie plus benthique, et éventuellement l'enkystement de leurs cellules. Dans les faits, et selon Lynch (1984 ; Plant and Soil, 76 : 307-318) des microorganismes réintroduits véritables phytogènes seront tant autochtones (oligotrophes) que zymogènes (copiotrophes). Pratiquement, ces souches incarnent un compromis avantageux entre une oligotrophie rustique, caractéristique des espèces Arthrobacterdu sol par exemple, et une copiotrophie zymongène, caractéristiques de beaucoup de souches bactériennes Pseudomondaceae, y compris donc les Azotobacteraceae. Ces souches sont donc robustes mais aussi relativement productibles in vitro ; elles sont les membres de consortia les plus copiotrophes de contingents oligotrophes. « Diauxie » et compromis oligo / copiotrophes ; une spécificité des Azotobacteraceae La matière organique du sol étant en partie composée d'acides phénoliques condensées, la teneur des sols en acides phénoliques est nécessairement de l'ordre de 10' g / ha (en surface sur 10 cm de profondeur). Or, l'équivalent de 1% de celles-ci sont effectivement en solution, soit environ 10' à 105 g /ha (idem). La teneur en oses de cette matière organique est elle au moins un ordre de grandeur plus faible que celle des acides phénoliques ; cf. Figure 1 pour une représentation schématique des ces proportions. A noter que pour ce qui concerne les oses, seulement 1% de ceux-ci sont effectivement en solution, soit au plus 10 à 20 kg d'oses en solution du sol par hectare (idem ; voir les données d'Itch et al. 2007 à titre d'exemple). II existe donc vraisemblablement un certain rapport entre les teneurs en Corganique soluble du sol et celle des composés phénoliques, plus particulièrement le susdit pHBA, rapport favorable au développement rapide des Azotobacteraceae les plus utiles au sens entendu. Plus précisément, il est convenu que, même faibles, les teneurs en pHBA de la plupart des sols arables est supérieure à celles des simples oses, notamment le glucose (Figure 2). La dilution d'un échantillon de sol abaissera cette teneur en pHBA, mais aussi et dans une même proportion celles des susdits oses, et cela en dessous d'un certain seuil d'environ 74 à uM. Les cinétiques des populations bactériennes sont elles surtout influencées par ces teneurs en acides phénoliques et/ou oses de la solution du sol. Plus précisément û et pour ce qui concerne les Azotobacteraceae, les ratios de ces quelques dizaines de kg d'acide phénoliques par rapport au quelques kg d'oses en solution par hectare est d'autant plus conséquent. Plus exactement, c'est la teneur relative d'une des acides phénolique en particulier û l'acide parahydroxy-benzoïque (pHBA), en présence d'oses solubles qui affectera la mise en marche de la diazotrophie azotobactérienne (Moreno et Garcia-Vargas 1995). Les bactéries du sol pouvant réaliser cet avantageux compromis oligo / copiotrophie pourraient effectivement faire appelle à deux (2) types de substrats ; (i) dans un premier temps au cour de la phase oligotrophe un substrat non glucidique plus récalcitrant, et (2) dans un deuxième temps au cours de la phase copiotrophe un substrat glucidique, voire même de simples oses, plus facilement métabolisables. Or, ce type de croissance bi-phasique est caractéristique de microorganismes dont la croissance s'effectue en présence de deux substrats carbonés, et donc l'utilisation de l'un d'eux est préférentiel, l'utilisation du deuxième ne commençant vraiment qu'après l'épuisement du premier. Ce type de croissance bi-phasique est aussi appelée « croissance auxique » (Moreno et Vargas-Garcia 1995). Ce phénomène est particulièrement applicable aux Azotobacteraceae en présence de pHBA et de glucose (Moreno et Vargas-Garcia 1995), l'utilisation du glucose étant ici préféré dans un premier temps à celle du pHBA plus récalcitrant. Or, en sols arables û contrairement au mode opératoire in vitro proposé par Moreno et Vargas-Garcia 1995, les teneurs de pHBA et d'autres acides phénoliques sont largement supérieures à celles du glucose, la croissance oligotrophique à base de pHBA devrait donc in situ et en principe précéder la croissance copiotrophique du fait d'un enrichissement progressif et très relatif en glucose (oses) de la solution du sol, par exemple suite à l'enfouissement et la dégradation des résidus de culture pailleux. C'est en ce sens que cette diauxie pHBA / glucose est ici vraisemblablement à l'orgine de ce compromis oligo / copiotrophie des Azotobacteraceae tant recherché. Revue de quelques protocoles d'obtention de bactéries telluriques rustiques Au risque de généraliser grossièrement, il existe trois type de protocoles de mise en culture de bactéries récalcitrantes à la culture in vitro ; i) par dilution successive d'un quelconque milieu de culture enrichi de façon à établir des conditions de mise en culture franchement oligotrophiques ii) par diffusion d'une « calque » de la composition nutritionnelle et oligoélémentaire vers un support de culture inerte, généralement une membrane microporeuse, avantageusement en polycarbonate iii) par formation in vitro d'un biofilm, généralement d'origine aquatique (marin, sédiments, eaux potables, etc.) Les travaux de Janssen et al. (2002) ainsi qu'un récent brevet (WO 2003/042351) mentionnent la mise en culture in vitro de bactéries dites à croissance lente (« slow growing ») et cela malgré la présence et la forte concurrence des bactéries dites à croissance rapide (« fast growing »), ou « copiotrophes ». Ce brevet concerne surtout la mise en culture de bactéries oligotrophes provenant d'échantillons d'eau. Les travaux de Janssen et al. (2002) déjà mentionnés ci-dessus eux concernent plus explicitement la mise en culture de bactéries de sols arables. Pour effectuer cette sélection, il faudrait recourir à des techniques telles que les dilutions au 100ième voire au 1000ième des substrats carbonés normalement présents en milieux enrichis. Or, les souches obtenues avec ces approches (Janssen et al. 2003 ; WO 2003/042351) sont bioindustriellement peu ou pas conséquents puisque les cellules bactériennes ainsi obtenues sont si peu copiotrophes qu'elles ne peuvent être produites économiquement. Bastiaens et al. (2002) utilisent une surface solide immergée dans un milieu de culture riche conventionnel. Cependant, et contrairement à FR0115542, ladite surface solide est une membrane hydrophobique imprégnée d'hydrocarbures ; la membrane n'est pas conçue comme l'analogue de l'environnement édaphique, et encore moins comme celui de son CAH. II existe aussi quelques méthodes, à base de membranes carbonées, à la différence des cultures mère à base de gel siliciques selon FR0115542, permettant la mise en contacte d'une solution saline extraite du sol et donc calquée sur celui-ci, et de bactéries supposément oligotrophes (Ferrai et al. 2005, 2006). Bien que ces méthodes, dites « SSMS » (soit slurry membrance systems), permettent de mettre en culture des isolats distincts, variés et précédemment dits « incultivable » in vitro, rien ne laisse croire que ces isolats sont particulièrement AVS et productibles au sens entendu ci-dessus. De plus, les dites SSMS ressemblent étrangement au procédé décrit dans le brevet allemand DE 2158827 décrivant une méthode pour la conservation et l'utilisation de bactéries qui consiste à mettre en contacte un milieux de culture adapté et une membrane microporeuses. Aagot et al. (2001) mentionnèrent l'importance de ne pas enrichir excessivement les milieux de culture in vitro devant servir à l'isolement de bactéries AVS. Or, Aagot et al. (2001) ne cherchent qu'à établir le seuil de dilution d'une des composantes d'un milieu de culture conventionnel, i.e. l'acide casaminique, au-delà du quel les cellules plutôt oligotrophes peuvent croître au dépends des cellules copiotrophes. La caractérisation des divers isolats ainsi obtenus à l'aide d'oligosondes, notamment via la technique dite de REP-PCR, ne sert qu'à démontrer que les souches isolées en milieux de culture dilués sont différentes de celles isolées en milieux de culture non û dilués, sans pour autant affirmer qu'elles sont du coup plus rustiques et adaptées à la vie dans les sols. Accessoirement, les travaux d'Aagot et al. (2001) démontrèrent l'inutilité de la technique d'isolement, dite parfois de la « terre moulée » (cf. Pochon 1954), pour l'obtention de souches BFCP véritablement rustiques et bien adaptées à la vie dans les sols. En effet, l'enrichissement outre mesure du milieu d'origine, d'un sol reconstitué avec du glucose par exemple, afin de faire proliférer une composante de la flore bactérienne, notamment les Azotobacteraceae, ne favorise pas l'obtention de souches BFCP résistantes à divers stresses, osmotique, alcaline, etc., caractéristique de la vie dans les sols. Au contraire, Van Overbeek et al. (1995) avaient déjà confirmé qu'affamer des cellules bactériennes telluriques avant de les réintroduire dans les sols pouvait en augmenter les taux de survies une fois réintroduites, bien qu'ils ne purent démontrer que ces isolats furent du coup et pour autant constitutivement plus rustiques et adaptées à la vie dans les sols. Favoriser le repérage de souches édaphiquement compétentes à partir d'échantillons de sols via la méthode de la « terre moulée » est donc inefficace parce qu'elle favorise la prolifération de cellules bactériennes plutôt copiotrophes (zymogènes), opportunistes à l'égard de ce type de substrats carbonés apportés massivement. La notion de disposition stratégique des Azotobacteraceae en proximité des résidus de culture est proche de celle des « micro-habitats » (Grundmann et al. 2001). Il en découle qu'au moment de l'obtention des bactéries du sol, la perturbation desdits micro-habitats abolira la compétition qui pèse normalement sur celles-ci. Cette abolition permettra à des bactéries normalement très discrètes in situ de croître librement in vitro au dépends des bactéries plus représentatives et mieux adaptées à la vie dans les sols. Afin de tenir compte de l'aspect discontinu de ces micro-habitats bactériens, Grundmann et al. 2001 proposent une « micro-fragmentation » et un « micro - échantillonnage » du sol. Cette micro - fragmentation des micro-habitats intactes évite de mettre en concurrence des microorganismes qui, à l'échelle microscopique du moins, n'interagiraient peu ou pas directement ; cette ségrégation spatiale peut favoriser la croissance in vitro de microorganismes autrement peu ou pas enclins à le faire étant donné la susdite concurrence. Cela dit, cette méthode est difficilement transposable à la bioindustrie du fait de sa technicité capricieuse. De plus, la rusticité et/ou le caractère BFCP des souches ainsi obtenues n'est pas pour autant confirmable a priori. L'utilisation de oligosondes destinées à la détection spécifique de genre et d'espèce de BFCP n'est pas en soi nouvelle. En effet, selon la technique décrite dans EP 1130115 il est aujourd'hui possible de puiser directement à même la diversité bactériologique du sol et d'y retrouver spécifiquement des Azospirillum, et Herbaspirillum, etc. Cependant, cette sélection, faute d'avoir aujourd'hui en main une caractérisation suffisamment poussée des mécanismes qui sous-tendent l'adaptation à la vie dans les sols ne peut pas en soi qarantir (assurer) que les - 10- souches ainsi détectées seront suffisamment rustiques pour constituer des inocula BFCP efficaces, d'où la nécessité de produire les susdites pré-cultures. II y a aussi la technique dite CARD-FISH (Ferrari et al. 2005, 2006) principalement destinée à l'isolement de bactérioplanctons oligotrophes, mais aussi en principe applicable aux bactéries telluriques. Celle-ci, telle qu'appliquée par Ferrari et al. (2005, 2006) consiste à repérer sur des SSMS (soit slurry membrane systems), homologues en sorte des CAH et des CMBT tel que proposé dans FR0115542, les cellules rustiques et oligotrophes et tenter de progressivement mettre en culture un nombre de celles-ci. Cependant, et encore une fois, la formation des SSMS imprégnées d'extrais de sol arables implique la destruction partiale du CAH afin de mettre en suspension les cellules bactériennes, procédé de destruction biaisé à l'avantage des cellules bactériennes probablement les moins intimement associées aux CAH. Enfin, il existe quelques rapports de mise en culture (en milieux riches et donc normalement réservés aux cellules copiotrophes) de bactéries et bactérioplanctons d'origine marine (eg. Simu et Hagstrbm 2004 ; Cho et Giovannoni 2004). Ces protocoles ne permettent cependant pas l'obtention des cellules les plus « compétentes » (fit en anglais) dans leurs environnements d'origines, ou encore la fabrication de facto d'une culture d'amorçage pour la production industrielle d'inocula BFCP destinés au sols arables. II existe aussi des brevets concernant des « supports de récupération » (WO 99/02649), des « méthodes de sélection » (EP 0106504 A2) ou encore des « procédés favorisant la croissance des microorganismes des sols » (WO 99/09834) toutes aussi inadaptées à la production des susdits inocula BFCP. Donc, hormis le procédé décrit dans FR0115542 (voir ci-dessous), l'état de la technique ne comprend pas de procédés pour l'obtention de cellules bactériennes expressément adaptées à la vie dans les sols au sens défini ci-dessus. Généralement, le but de ces protocoles est d'augmenter le nombre, la diversité, voire la rapidité d'isolement de souches bactériennes d'origine tellurique pouvant être éventuellement cultivées in vitro ; ce n'est qu'accessoirement que ces cellules pourraient être parfois adaptées à la vie dans les sols. Il faut retenir qu'isoler à partir de milieux de cultures ou d'échantillons de sols enrichis est inefficace parce que cela ne fait que favoriser la dominance de cellules bactériennes copiotrophes peu ou pas AVS au dépends de celles qui le sont. Or, appauvrir ces mêmes milieux de culture est tout aussi inefficace puisque cette approche favorise la mise en culture d'organismes trop oligotrophes et donc peu ou pas productibles. FR0115542 : une avancée technique majeure, mais imparfaite J'ai précédemment mis au point un protocole d'obtention de telles souches BFCP en principe adaptées à la vie dans les sols (FR0115542) consistant en la formation d'un biofilm analogue de la zone hydratée adjointe aux complexes argilo- humiques des sols. Ce biofilm, une sorte -11- de « culture mère de bactéries telluriques » (CMBT), abrite vraisemblablement des populations bactériennes majoritairement les mieux adaptées en ce sens. Les BFCP issues de ces populations, avantageusement Azotobacteraceae, Pseudomanceae et/ou Rhizobiaceae, sont plus efficaces (i.e. plus phytogènes) par rapport à l'ensemble des souches témoins telles que définies dans FR0115542. FR0115542 représente en ce sens une avancée notable puisqu'elle permet de sélectionner parmi les cellules bactériennes telluriques retenues à la surface des CMBT des cellules BFCP vraisemblablement rustiques mais aussi suffisamment copiotrophes pour croître activement en milieux de culture in vitro enrichit. Malgré la plus grande hydrophobicité de la matière organique des sols sableux (Capriel et al 1995), les particules de sol n'adhèrent pas pour autant plus aux gels siliciques lors de la constitution des CMBT. Cela est vraisemblablement dû à une plus forte répulsion interparticulaire qui nuit à l'intégrité du biofilm ainsi constitué à la surface des gels siliciques. De plus et enfin, une des étapes des ce procédé d'obtention (FR0115542) implique la restauration réitérative en eau de la pellicule biologique (biofilm) à la surface des gels silicique. Or, cette restauration est fastidieuse et en quelque sorte arbitraire. De plus elle ne permet pas en soi de simuler un enrichissement progressif en ose de la solution du sol du fait d'une dégradation in situ des résidus de culture pailleux. Cependant, étant donné que les CMBT n'abritent vraisemblablement pas que, des souches bactériennes adaptées à la vie dans les sols ce processus de sélection définitive par comparaison de leurs activités phytogènes à celles des susdites souches témoins, bien qu'efficace en soi, reste néanmoins fastidieux. En effet, les quelques souches non û adaptées plutôt copiotrophes, présentes initialement dans les aliquotes provenant des CMBT(Figure 2) peuvent déplacer (i.e. dominer numériquement) les souches plus adaptées lors de la réalisation de cultures liquides en milieux enrichis Afin de minimiser ce déplacement des souches adaptées à la vie dans les sols initialement dominantes au sein des CMBT, j'ai mis au point (j'ai prévu) une manipulation décrite sciemment dans FR0115542 ; or cette manipulation est elle aussi imparfaite et donc améliorable. Cela dit, l'assurance que les cellules retenues sont effectivement les plus AVS laisse à désirer, ce qui constitue en soi un certain risque technique préjudiciable à l'invention. En effet, FR0115542 préconise la réitération de nombreuses pré û cultures en milieux culture électifs par voie de restaurations de ces milieux avec des aliquotes provenant des CMBT, et cela au risque de voir apparaître à tout moment des cellules bactériennes plus copiotrophes pouvant contaminer la préparation. Pire, l'AVS étant à ce jour mal expliquée (cf. ci-dessus), FR0115542 ne peut servir directement au contrôle de la qualité des inocula BFCP ainsi produits ; l'efficacité relative de ces inocula BFCP est donc confirmée qu'en fin de parcours à l'aide d'essais phytogène par rapport à une gamme de souches témoins produites selon FR01/15542 et en principe moins AVS. Il semble que l'oligotrophie caractéristique des BFCP candidates présentes dans la phase aqueuse surnageant les CMBT 2951738 -12- conçues selon FR0115542 ne soit pas toujours nécessairement conservée au cours des susdites précultures réitératives. Ce faisant, le fragile compromis avantageux entre l'oligo- et copiotrophie des souches candidates, définition même de l'adaptation à la vie dans les sols au sens de FR0115542, ce défait, et des souches BFCP moins adaptées en ce sens risquent 5 d'être retenues. Cela dit, les inocula BFCP prototypes préparés à l'aide de FR0115542 se sont avérés efficaces in situ (Claude et Fillion 2004, Claude et Giroux 2006). DIVULGATION DE L'INVENTION 10 Problème technique D'une part le problème technique provient du fait que les Azotobacteraceae sont û bien que quasi universellement présentes, très minoritaires en sols arables û de l'ordre d'une Azotobacteraceae pour 1 million ses congénères non-Azotobacteraceae. D'autre part, les 15 cellules (azoto)bactériennes du soldes mieux adaptées à la vie dans les sols arables recevant régulièrement des apports agronomiques de résidus de culture pailleux sont aussi métaboliquement très réactives dès l'apparition de quelques dizaines û 50 à 100, umoles de glucose par litre de solution du sol. Or, bien qu'il est en principe relativement facile de favoriser la dominance microbiologique d'une certaine, ou de certaines populations azotobactériennes, in 20 vitro en éliminant a priori toutes formes de N immédiatement assimilable, ce micro- (nano- ?) dosage d'oses est plus problématique du fait qu'il est difficile de déterminer précisément la teneur en ose de la solution du sol à un moment précis, la « durée de vie » (temps de résidence) du (gluc)ose dans le sol étant très courte, soit de l'ordre de quelques dizaines minutes au plus. En ce sens, l'apport de micro-doses à une solution nutritive sans N inoculée à 25 partir d'un aliquote de sol ne permettra pas d'assurer le non - dépassement de ces seuils û somme tout très faible (de l'ordre de 50 à 100 uM), permettant aux souches Azotobacteraceae les plus compétentes au sens entendu de démarrer métaboliquement les premières. Bien que l'essentiel des bactéries les mieux adaptées à la vie dans les sols sont associées aux 30 fines particules de sols et aux CAH, il est difficile de les séparer, mécaniquement et/ou chimiquement. De plus, le haut niveau d'adaptation à la vie dans les sols attribuable à la rusticité des BFCP candidates est métaboliquement trop complexe pour servir de base à un profilage génomique définitif de ces BFCP oligotrophes que nous devons extraire des complexes argilo - humiques, voire avantageusement des CMBT. 35 Enfin, l'état de la technique ne procure aucune assurance en ce qui a trait à la rusticité des cellules bactériennes d'origine tellurique et/ou leurs efficacités éventuelles entant que BFCP. Pour faire simple, disons que les méthodes d'obtention de souches telluriques rustiques proposées à ce jour visent surtout le caractère oligotrophe des BFCP les plus rustiques ; ce - 13 - faisant, les cellules bactériennes ainsi isolées sont trop souvent excessivement oligotrophes et donc difficilement productibles économiquement par bioprocédés conventionnels, et donc de mauvaises candidates pour servir de base à la fabrication industriel d'inocula BFCP, fabrication qui suppose malgré tout une certaine prolifération in vitro de ces isolats. Bien que FR0115542 représente une avancée technique majeure puisqu'elle permet de retenir en suspension des BFCP candidates pourtant étroitement associées à un analogue in vitro du CAH du sol du quel elles sont originaires, cette mise en culture nécessite néanmoins la production de pré - cultures réitératives sources potentielles de contaminations. De plus, FR0115542 ne permet pas de micro-doser l'apparition progressive du glucose û ou d'oses plus généralement, le substrat matriciel sur le quel ce développe le biofilm étant à base de silice ; à terme le milieu surnageant ce gel silicique revient de plus en plus oligotrophe entrainant la dominance microbiologique de souche qui le sont aussi, à l'excès à terme. Les souches (azoto)bactériennes les plus réactives à de (très) faibles (uM) concentration d'oses û pourtant en principe très recherchées (voir supra) risquent de ne pas pouvoir dominer le moment venu un milieu de culture riche sensé en favoriser la multiplication ; ces quelques souches les plus recherchées seront ainsi déplacées (dominées) par un ensemble de souches soit purement copiotrophes (des contaminants), soit par une population plus importantes de souche (trop) oligotrophes trop rustiques pour afficher cet avantageux compromis entre copio- / oligotrophie caractéristiques des souches les plus adaptées la vie dans les sol au sens entendu ici et donc aussi les meilleures candidates pour la constitution d'inocula biofertilisants. La fabrication d'inocula BFCP destinés à l'agriculture, et plus particulièrement à la biofertilisation des grandes cultures à l'aide de microorganismes sont donc aujourd'hui sérieusement compromises. Les alternatives qu'auraient pu être, i) l'identification directe des BFCP les plus adaptées à la vie dans les sols sans avoir à s'appuyer a priori surtout sur leur caractère oligotrophe au dépends d'une certaine copiotrophie utiles à leur production bioindustrielle, et/ou ii) l'utilisation d'une profilage génomique et/ou métabolique bien défini de leurs rusticité, sont aujourd'hui impraticables étant l'apparente complexité du phénomène qu'est l'adaptation à la vie dans les sols tel définit ci-dessus. Schématiquement, le problème technique est le suivant (Figure 2) ; comment éviter simplement la rétention des bactéries soit excessivement copiotrophes (azb, Azb) et excessivement oligotrophes (eg. Arthrobacter), et retenir que les souches û dites « AZB » qui incarnent le mieux un compromis avantageux entre ces deux extrêmes ? A noter que cette dimension du problème technique à déjà été implicitement rapportée par Lynch 1984 (Plant and Soil, 76(1-3) : 307). Il s'agit d'épurer, en sorte, un éventuel contingent de souches composé majoritairement d'AZB obtenues selon FR0115542 mais contenant immanquablement les quelles que souches - 14 - contaminantes moins avantageuses - Azb par exemple. Or, ces contaminants Azb pourraient, du fait de plus grandes copiotrophie, dominer une éventuelle culture d'enrichissement. Solution technique proposée La solution technique a comme prémisse le constat que les teneurs en acide phénoliques û y compris donc celles de pHBA, de la solution du sol sont nécessairement plus faibles que celles des oses / osides. Du coup, la dilution au 5ième ou au 101eme d'un échantillon de sol sera immanquablement et essentiellement dépourvu d'ose û ou du moins d'une molarité suffisamment faible et en dessous des susdits 50 à 100 uM équivalents glucose. En de telles situations, les Azotobacteraceae pourront très avantageusement croître en mode diazotrophique étant donné la présence d'un minimum de pHBA ; une fois un minimum de glucose en solution û à hauteur des susdits quelques 50 à 100 uM, elles seront majoritairement les premières à pouvoir se manifester comme particulièrement réceptives à d'aussi faibles teneurs en oses û i.e. particulièrement adaptées à la vie dans les sols au sens entendu. Plusieurs constats ont donc permit la formulation de la solution technique proposée ici. Premièrement, il faut constater que les membres de la famille Azotobacteraceaea sont, parmi l'ensemble des bactéries diazotrophes du sol, sont les seules véritablement capables de réconcilier un métabolisme essentiellement aérobic et un haut taux de rendement du complexe nitrogenase (Nif) responsable de la réduction biologique de l'azote diatomique, processus enzymatique essentiellement anaérobique très sensible à la présence d'oxygène. Du coup, ce fonctionnement de Nif chez les Azotobacteraceae nécessite l'existence de mécanismes compensatoires pouvant de facto exclure la mise en contacte de Nif et de l'oxygène ; plusieurs théories ont été avancées en ce sens û la surconsommation d'oxygène par la cellule avant qu'il n'atteigne Nif, une protection physique de Nif, voire encore l'existence de superoxide dismutases capables de réduire l'impacte de l'oxygène sur Nif. Deuxièmement, la présence de para-hydroxy benzoate (pHBA ; ne pas confondre avec le poly- hydroxy-butyrate, ou PHB) est nécessaire au fonctionnement in situ de Nif chez les Azotobacteraceae. Plus généralement, il est connu que la composition en acides phénoliques de la solution du sol affecte la composition et la taille des populations bactériennes de la résidusphère et du sol (eg. Blum et al. 2000). Cette effet des acides phénoliques, y compris donc de pHBA, peut apparaître en présence de concentrations ouvent bien en dessous de 0,1 umol par g de sol, soit de l'ordre d'une dizaine (10) kg par hectare en surface sur 10 cm. Étant donné la spécificité du rôle de pHBA vis-à-vis les Azotobacteraceae in situ (Moreno et Garcia-Vargas 1995) et les quantités concernées û ici donc de l'ordre de quelques kg par hectare, la manipulation de ces centration est envisageable d'un point vue agronomique. -15- Troisièmement, le phénomène dit de « déclenchage métabolique » (metabolic triggering ; De Nobili et al. 2001) est distincte de celui dit de « d'amorçage métabolique » (metabolic priming ; Kuzyakovetal et al. 2002) et permet à certaines bactéries du sol de réagir fortement (rapidement) à teneur en oses de l'ordre des centaines de ug par kg de sol. Plus précisément, Nguyen et Guckert 2001 ont établit que le Km pour l'utilisation du glucose par les microorganismes du sol û voir Coody et al. 1986 pour une revue de ce concept a priori enzymologique mais depuis appliqué à la bactériologie, y compris et plus particulièrement les (azoto)bactéries, est d'environ 74 uM, soit en termes pondéreux l'équivalent de quelques kg - deux pour être exacte, de glucose par hectare de sol en surface sur 10 cm, soit une bonne ordre de grandeur plus faible que le Km pour l'utilisation du glucose par des racines de maïs. A comparer ici ces quelques kg de glucose aux quelques dizaines kg de PHBA (voir supra). L'invention consiste à combiner ces trois concepts afin d'assurer d'autant plus cette avantageux compromis entre autochtonie (oligotrophie) et zymogénie (copiotrophie) des biomasses Azotobacteraceae biofertilisantes recherchées. En effet, les biomasses plutôt autochtones ont une préférence pour les fractions les plus stables de la matière organique du sol û acides humiques et/ou fulviques, et/ou l'humine ; les Azotobacteraceae sont particulièrement notables en ce sens. Les taux de croissance de ces biomasses sont ainsi relativement faibles mais assurés du fait de l'abondance et l'omniprésence de ces fractions. Par opposition aux biomasses plutôt autochtones, on supposa traditionnellement des biomasses plutôt zymogènes, beaucoup plus « opportunistes » au moment de l'apport de substrats carbonés û résidus de culture pailleux par exemple, et donc capable de dominer temporairement leurs consoeurs plus autochtones. Pourtant, il semble que les bactéries les plus adaptées à la vie dans les sols sont autant zymogènes qu'autochtones au sens entendus ; en d'autres mots, ces bactéries sont capables d'utiliser des fractions stables de la matière organique en temps de disette, toutes en étant aussi très, voire les plus réactives dès l'apparition de très petites quantités de biomolécules les plus labiles telles que des oses et/ou certaines acides aminées. Or, depuis, cette supposée dichotomie autochtone / zymogène û d'une part, et d'autre part cette forte réactivité des bactéries en état de veille métabolique pouvant être déclanchées (triggered) en présence de quelques centaines de ug d'oses par kg de sol ont déjà été valorisé ; voir en ce sens FR0115542 et FR0900426. Nous proposons aujourd'hui d'intégrer ces deux inventions à une troisième û FR0600014, afin de développer de facto un processus de fermentation à l'état solide (Fes) simple pouvant assurer un avantageux compromis entre la sélection de biomasses Azotobacteraceae autochtones et relativement copiotrophes dès la première apparition d'oses issus de la dégradation des résidus de culture pailleux, soit par définition un inocula Azotobacteraceae biofertilisant des plus efficace. -16- Concrètement, l'invention consiste en un procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes édaphiques comprenant les étapes de ; (i) mise en contacte d'un échantillon de sol avec un substrat matriciel de manière à former une zone à la surface du substrat analogue à celle adjointe au complexe argilo-humique (CAH) du sol abritant l'essentiel de la composante bactérienne autochtone (du sol), afin de retenir à la surface ou dans le substrat matriciel l'essentiel de la microflore bactérienne endogène aux milieux édaphique (APC) d'origine, (ii) maturation de cette zone en conditions oligotrophiques permettant aux cellules les plus constitutives du CAH qui ont coloniser ce substrat matriciel de migrer éventuellement vers la phase liquide le surnageant, (iii) récupération et culture des souches bactériennes les plus prolifiques en milieux de cultures liquides riches, à caractères autochtone (oligotrophes), rustiques et persistantes in situ, le substrat matriciel étant ici carboné et semi-solide. Par APC ici je veux dire un groupe homogène d'unités cartographiques représentatives d'au moins une parcelle agronomique chacune suffisamment similaires en termes de leurs principales caractéristiques pédologiques dont la genèse est susceptibles d'avoir été influence par l'évolution du climat environnant. Ces groupes homogènes peuvent être établit à l'aide d'analyses par composantes principale, - entre autres, et/ou divers types d'analyses multi û dimensionnelles. Il existe une certaine base de connaissance à ce sujet. Afin d'obtenir ce substrat matriciel carboné semi-solide il est loisible d'imprégner d'eau déminéralisée et stérile une matrice cellulosique û un filtre dit « DurieuxTM » non-bactéricide par exemple, et de le placer au fond d'une boîte de Petri stérile. Initialement, la quantité d'eau et de matrice sont avantageusement les mêmes, ce qui permet donc de constituer une matrice semisolide contenant initialement 50% de matière sèche (solide) et 50% d'eau (liquide). A mesure que progressera la période d'incubation ce substrat deviendra de plus en plus solide que liquide et pourra être éventuellement ré-imprégner afin de prolonger cette période d'incubation, incubation dans les faits assimilable ici à une sorte de fermentation à l'état solide. Le substrat matriciel carboné semi-solide est a priori dépourvu d'oses et d'osides libres assimilables par les (azoto)bactéries du sol ; il en libère progressivement lors de sa dégradation. Au cour de cette fermentation à l'état solide, la microflore d'origine tellurique apportée via l'échantillon de sol assurera la plus part du temps la dégradation enzymatique et/ou fongique de la matrice cellulosique. Cette dégradation libera nécessairement û et surtout progressivement, des oses et/ou osides nécessaire au déclencheage métabolique des Azotobacteraceae les mieux adaptées à la vie dans les sols au sens entendu (voir supra). L'échantillon de sol est préparé de façon à retenir que les fines particules de sols aux quelles adhèrent les bactéries les mieux adaptées à la vie dans les sols. Par adaptation à la vie dans les sols nous voulons dire ici qu'il y a une certaine concordance (similarité) entre les milieux 2951738 -17- d'origine et de réintroduction des biomasses (azoto)bactériennes ù d'une part, et d'autre part que ces biomasses établissent un avantageux compromis entre leurs caractères oligotrophiques et copiotrophiques, i.e. qu'elles sont très réactives à de très faibles teneurs en substrats carbonés assimilables. Cette définition est semblable à celle déjà énoncée dans 5 FR0115542, toute en intégrant ici cette notion de réactivité propre à la théorie dites des « trigger molecules » (De Nobili et al. 2001). La granulométrie de ces fines particules de sols est d'environ 500 um, plus particulièrement d'au plus 270 um, et avantageusement d'environ 70 à 170 um. Ces fines particules de sols 10 peuvent être obtenues à partir d'un sol ù avantageusement comme de raison appartenant à l'APC d'origine, séchés passivement à l'aire libre par tamisage. Étant donnée que la majorité des bactéries du sols son intimement associées à particules plutôt fines du sol, ce fractionnement par tamisage à le double avantage de favoriser l'inoculation du substrat semisolide, et du coup d'en faciliter le saupoudrage. 15 Il est important de s'assurer que les proportions substrat matriciel carboné semi-solide : échantillon de sol soient comprises entre 25 et 1, plus particulièrement entre 10 et 3, et avantageusement d'environ 5. Cette proportion avantageuse suppose que les teneurs de la solution du sol en ose ù en glucose notamment, n'excède pas 10 kg par hectare, soit pour 109 g 20 de sol sur 10 cm de profondeur en surface ; si la teneur de la solution du sol en ose et en ce sens supérieure, la proportion substrat semi ù solide : sol est majorée conséquemment à hauteur de 25:1. Enfin, le substrat matriciel carbonés semi-solide ainsi mis en contacte avec lesdits échantillons 25 de sol est incubé suffisamment longtemps pour permettre le développement in situ de populations Azotobacteraceae. Tel que déjà mentionné, les substrats matriciels carbonés sont périodiquement ré-humidifiés par aspersion de façon à maintenir les susdites proportions à peu près constante en dépit d'une nécessaire évaporation. 30 Les biomasses Azotobacteraceae ainsi obtenues peuvent maintenant être réintroduites dans leur APC d'origine par pulvérisation liquide des résidus de culture au sol. Cette réintroduction peut avantageusement ce faire selon Claude et Fillion 2004, ou encore dans le cas de mélanges ou d'engrais organo-minéraux selon Claude et Giroux 2006. 35 Concrètement, il s'agit donc de permettre la dilution d'un échantillon de sol dans une substrat matriciel carboné temporairement inerte de façon à assurer la diminution des teneurs (concentrations) en glucoses (oses) en dessous de seuils assurant ainsi que les pHBA deviennent de facto le seuil et/ou principal substrat carboné pour les Azotobacteraceae. Pendant la période d'inertie du susdit substrat carboné, les Azotobacteraceae, et seulement les 2951738 -18- Azotobacteraceae pourront croître en mode diazotrophe au dépends de ce pHBA ; une fois l'inertie des substrats avantageusement cellulosiques rompue, ces populations azotobactériennes maintenant plus dominantes au sein de ces résidusphères pourront véritablement s'imposées, voire être facilement isolables entant que-t-elles, de ces 5 résdusphères suffisamment peuplées par de telles Azotobacteraceae ; à terme, ces résidusphères peuvent elles même faire office de préparation inoculantes. En ce sens, la présente invention permet de renverser l'habituelle diauxie (voir supra) imposée aux Azotobacteraceae lors de leur obtention par voie d'isolement et de rétention in vitro, obligeant celles-ci à utiliser préférentiellement des oses (sucrose ou glucose) dans un premier temps, et 10 des acides phénoliques û notamment pHBA, dans un deuxième temps. La présente invention permet aussi de tenir compte d'un certain Km bactériologique pour le glucose, sans pour autant imposer de facto aux Azotobacteraceae indigènes des sols un milieu de croissance aqueux très différent de leur habitat in situ au contacte des CAH et/ou des résidusphères, matrices foncièrement solides, elles. 15 Pour faire simple, la solution technique proposée ici consiste à établir une fermentation à l'état solide (Fes) à base de substrats cellulosiques et de (fines) particules de sols arables de façon à établir û du moins initialement au début de cette période de fermentation à l'état solide, un certain équilibre (rapport) entre la disponibilité des oses et de certains acides phénoliques 20 présents dans les sols favorables à l'établissement in vitro d'une dominance microbiologique des Azotobacteraceae les plus adaptées à la vie dans les sols au sens entendu ici. Avantages apportés 25 L'invention comporte de nombreux avantages par rapport à l'état de la technique. Par exemple, il n'est plus nécessaire de faire des dilutions extrêmes des substrats carbonés selon Janssen et al. (2003) au risque d'obtenir des cellules dont la principale caractéristique serait d'être de strictes oligotrophes au dépends d'une certaine copiotrophie pourtant utile, voire nécessaire, à leurs valorisations agronomique et bioindustrielle. L'invention permet aussi de mieux assurer le 30 maintient du caractère véritablement édaphique des BFCP candidates retenues in vitro. Les souches BFCP ainsi obtenues sont du coup particulièrement bien adaptées à la fermentation à l'état solide, avantageusement selon le protocole décrit dans notre précédente demande de brevet FR0600014, ou encore selon EP 0 406 103 Al. 35 Enfin, du fait qu'elle ne nécessite pas la fabrication d'un gel silicique, et/ou û surtout la restauration réitérative d'une phase aqueuse à sa surface, la mise en oeuvre de l'invention est beaucoup plus simple que celle décrite dans FR0115542. -19-BREVE DESCRIPTION DES DESSINS ET FIGURES Figure 2 : Disposition sur une échelle logarithmique des équivalent g-C glucose par hectare des diverses fractions organo-minérales du sol, et ù à titre de repères, des apports de substrats proposés par les méthodes de « profilage métabolique » des populations microbiennes du sol (i.e. MicroRespTM, CLPP, etc.) ainsi que des quantités de C glucose qu'implique le Km des bactéries du sol pour le glucose (i.e. 74 uM selon Nguyen et Gurcker 2001). A noter que, en réduisant par « dissolution solide-solide » au sens de la présente invention les concentration de pHBA, les concentrations de C glucose sont elles aussi réduites et ici portées en dessous des susdits 74 uM. Figure 2 : Représentation schématique du compromis avantageux entre productibilité in vitro et rusticité in situ de bactéries du sol, et plus particulièrement des BFCP candidates retenues sur cultures mères de bactéries telluriques (CMBT) selon FR0115542. Figure 3 : Dispositif expérimental en carré latin avec sous-unités imbriquées au sein d'unités expérimentales. Pour le premier essai comportant les quatre modalités de fermentation à l'état solide A, B et C plus un témoin non-inoculé, chaque unité expérimentale sera composée d'une des modalités sans (-) et avec (+) l'apport de l'équivalent des 3,5 mmoles de Mo par L aux 100 ml de la phase aqueuse de cette fermentation à l'état solide. Pour le deuxième essai (représenté ici) comportant les inocula ainsi préparés, chaque unité expérimentale sera composée d'une de ces quatre modalités intégrée à l'un et l'autre des deux types de sol, gewn étant ici le sol d'origine ; les Azotobacteraceae ainsi réintroduites sont endogènes à gewn et exogène à se13. Figure 4 : Dynamique de production de molécules d'auto-induction, notamment les HSL, en fonction de la densité cellulaire (optique) d'un milieu de culture enrichi et inoculé avec des Azotobacteraceae obtenues selon les Modalités A et B au sens de la présente invention, et ù en guise de témoin, A. chroococcum CIP 76.116. Le signal chromatographique spécifique aux homosérine lactones octanoyl (oHSL) est rapporté en fonction de la densité optique de la culture (azoto)bactérienne. MEILLEURE MODE DE REALISATION DE L'INVENTION Principe de l'invention et établissement des APC L'invention permet de facilement obtenir à partir d'un échantillon de sol une population Azotobacteraceae. Du fait que cette population provient nécessairement, ou du moins vraisemblablement des fines particules de sol, celle-ci comporte en principe des cellules particulièrement bien adaptées à la vie en proximité immédiate du CAH propre à cet échantillon. 2951738 - 20 - Dans le mesure où cet échantillon est représentatif d'un agro-pédo-climat (APC), la susdite population Azotobacteraceae pourra être considérée comme endogène à ce même APC. A partir d'un jeu de données des valeurs moyennes sur une base cantonale pour l'ensemble de 5 la SAU française nous avons pu établir pour la France 48 APC suffisamment distincts et repérables au niveau d'une parcelle agronomique, soit comprenant des superficies de l'ordre de 100 à 150 hectares. A la Figure 1 est représentée ù toujours sur une base cantonale à ce stade, l'APC dominant. Il va sans dire qu'à l'intérieur d'un canton donné ù voire au sein d'une parcelle agronomique, il existera d'autres, voire plusieurs APC. 10 Selon le type de sol et sa teneur en pHBA, un aliquote plus ou moins dilué sera ajouté à une simple FeS de façon à assurer (approcher) un rapport pHBA / oses d'environs 3 à 4, et cela tout en assurant que la teneur en oses de cette FeS soit initialement inférieure à 70 ù 100 uM. Initialement - le temps pour les résidus de culture pailleux et/ou tout autre substrat carboné 15 équivalent d'être dégradés et métabolisés par une certaine flore fongique, ce rapport favorisera le plus les Azotobacteraceae les plus susceptibles d'être induites par ce déclenchage métabolique (DM) à base d'oses et d'acides phénoliques particulières. Ces conditions particulières permettent de réconcilier au sien d'une même FeS ; 20 - un milieu de culture suffisamment pauvre en ose pour assurer le DM que des souches les plus réactives en ce sens, et donc les plus adaptées à la vie dans le sols arables transitoirement fournis en quantités agronomiques de résidus pailleux ; un milieu de culture suffisamment riche en pHBA pour assurer la croissance en 25 absence d'azote apporté des Azotobacteraceae les plus autochtones, i.e. adaptées à la vie dans les sols arables. II y a donc aussi une dynamique temporelle partie intégrante de la présente invention ; la mise en oeuvre de cette dynamique est assurée par la présente invention ; 30 première période : relative abondance du pHBA par rapport aux oses favorisant la prolifération des Azotobacteraceae autochtones ; - deuxième période : à partir du moment où il y a une certaine dominance des Azotobacteraceae, les oses ainsi libérés par la dégradation fongique des résidus de 35 culture pailleux favorisera la production en masse de telles biomasses ; - troisième période : croissance quasi exponentielle des populations Azotobacteraceae par fermentation à l'état solide, avantageusement modulaire et enrichie de Mo. En ce sens, à très faibles teneurs en oses ù soit de l'ordre de quelques mg par kg de mélanges FeS au sens de FR06/00014, les Azotobacteraceae vont plutôt stocker les glucides au lieu de -21 - les consommer pour fin de structuration (i.e. lièfe période). A mesure que les résidus de culture pailleux sont dégradées, les teneurs en oses vont augmenter progressivement, et cela beaucup plus rapidement que celles des acides phénoliques y compris celle de PHBA (i.e. 2ième période). Cela dit, la prépondérance du pHBA par rapport aux autres acides phénoliques dont les concentrations relatives et absolues régressent (voir Martens 2002b) favorisera la dominance de plus en plus marquée des Azotobacteraceae. A la fin de cette 3ième période ù où le rapport pHBA / oses est maintenant d'environs 0,25, ladite FeS sera principalement constituée de souches AZB dont les stockes de glucides sont important, assurant à celles-ci un bon niveau de robustesse une fois (ré)introduites dans leurs APC d'origine. Production des inocula, avantageusement par fermentation à l'état solide Un échantillon de terre provenant d'un APC particulier est séché passivement à température ambiante de façon à maintenir en vie l'essentielle de la flore Azotobacteraceaea. La fraction plutôt fine de cet échantillon, soit d'au plus environ 500 um et avantageusement entre 70 et 170 um, est obtenue par tamisage. Cette fraction de fines particules de sol sera intégrée à un substrat cellulosique afin de constituer une fermentation à l'état solide au sens de la présente invention. Ce substrat cellulosique peut être en principe de simples résidus de culture pailleux séchés passivement à température ambiante et hachés et tamisés à 2 mm. Cela dit, ces pailles peuvent aussi abriter certains pathogènes tels que et par exemple G. graminis var. triticii ù agents pathogène de la maladie des céréales communément appelée piétin verse. Afin d'éviter ce risque phytosanitaire, nous proposons qu'à la fin du susdits processus de fermentation à l'état solide ce pré-mélange contenant une abondance d'Azotobacteraceae soit traité avec une dose convenable de fongicide capable d'éliminer toutes les propagules vivantes de telles agents pathogènes. A noter que jusqu'à ce stade d'application en fin de parcours du fongicide, cette flore fongique ù pour l'essentielle cellulolytique, a effectuer la dégradation du substrat cellulosique et la libération subséquente des métabolites pouvant diminuer la croissance des populations Azotobacteraceae. Or, la teneur en oses de tels résidus pailleux est a priori inconnue, et ù le cas échéant, pourrait rompre cette équilibre pHBA / oses au sens de la présente invention. Pour éviter cela, nous proposons d'utiliser au lieu de la cellulose pure tout aussi attaquable par la susdite flore fongique, mais dans ce cas ù initialement du moins, dépourvue d'oses ; à ce mélange 1/5 de fines particules de sol et de cellulose pure, nous pouvons ajouter un extrait aqueux ù disons au 25ième de façon a éviter justement l'apport d'oses, des susdits résidus de culture pailleux. Cela suffira à inoculer cette cellulose avec des propagules fongiques cellulolytiques qu'abrite nécessairement de telles pailles, et aussi avec les quelques Azotobacteraceae qu'elles pourraient aussi contenir. Cela dit ù et en principe (voir supra), les meilleures candidates à ce post ce trouvent vraisemblablement sur les fines particules de sols. À terme, un inocula 2951738 -22- fongique cellulolytique peut aussi être utilisé, notamment si celui-ci est obtenu directement et depuis de tels résidus de culture pailleux. Concrètement et par exemple, 2,5 g de cellulse pure peut être mélangé à 0,5 g de fines 5 particules de sol. On ajoute ensuite 2,5 ml d'eau ù avantageusement déminéralisée mais contenant en plus du susdit extrait aqueux une solution nutritive diluée adaptée à une telle fermentation à l'état solide (voir infra). A noter que le cellulose étant à ce stade insoluble, les fines particules de sol sont effectivement « diluées » au 51ème en solution ù ou plutôt en suspension, aqueuse. Au fur et à mesure que cette fermentation progresse, cette eau sera 10 consommée et/ou évaporée, tandis que la cellulose elle sera dégradée en métabolites plus soluble ; du coup les fines particules de sol demeureront toujours en présence de 5 fois plus de ce volume réactionnel, soit en accord avec une des prémisse de la présente invention. La susdite solution nutritive pourra avantageusement contenir un minimum de Mo en accord 15 avec notre précédente invention FR0901062. La présence de ce minimum de Mo favorisera la sur - accumulation de Mo par les Azotobacteraceae de façon à ce que celles-ci deviennent des vecteurs de ce Mo, tant vers les populations Azotobacteraceae in situ que vers ù éventuellement la culture en place (FR0901062). 20 Enfin, ce procédé de fermentation à l'état solide ainsi que les inocula qui en résultent, peuvent avantageusement être conditionnés « modulairement » selon les principes de nos précédentes inventions rapportées dans FR0505753 et FR0600014. Cette modularité favorisera tant la production, la manutention, la conservation et l'utilisation par le client de ces préparations. 25 Méthodes d'analyses et dispositifs expérimentaux Dispositifs expérimentaux et analyses statistiques Pour ce qui concerne les dispositifs expérimentaux et les analyses de variance subséquentes ; 30 pour les deux essais nous disposerons les unités expérimentales en carrés latins 4 x 4. Pour le premier essai comportant les quatre modalités de fermentation à l'état solide A, B et C plus un témoin non-inoculé, chaque unité expérimentale sera composée d'une des modalités sans (-) et avec (+) l'apport de l'équivalent des 3,5 mmoles de Mo par L aux 100 ml de la phase aqueuse de cette fermentation à l'état solide (voir supra). Pour le deuxième essai comportant les 35 préparation inoculantes issues de ces fermentations à l'état solide, chaque unité expérimentale sera composée d'une de ces quatre modalités intégrée à l'un et l'autre des deux types de sol ù gewn et se13, gewn étant ici le sol d'origine des fines particules de sols ; en principe donc les Azotobacteraceae ainsi réintroduites seront endogènes à gewn mais non à se13. - 23 - Une telle disposition des unités expérimentales appariant soit les modalités de fermentation à l'état solide sans et avec (-/+) Mo lors du premier essai, soit les inocula issue de ces modalités (avec Mo) sur ou hors du sol d'origine (i.e. gewn) lors du deuxième essai (Figure 3), permet d'apprécier les différences entre Modalités A, B, C et leur témoin non-inoculé, soit en terme absolu (i.e. %N des fermentation à l'état solide et/ou MSPA et MOB-élémentaire de Lolium), soit en terme relatif (i.e. le rapport entre les deux élément apparié de chacune des unités expérimentales). En ce sens, il s'agit ici d'un dispositif avec parcelles imbriquées au sein d'une même unité expérimentale, cette dernière étant répétée quatre fois et disposée en carré latin. Dosage et caractérisation microbiologique des Fes APC-spécifiques La dominance et le peuplement azotobactérien des Fes-APC spécifiques peuvent être facilement établis à l'aide de milieux de culture sélectifs pour Azotobacteraceae (eg. Kumar et Narula 1998), Il est aussi possible de déterminer ù par rapport à un substrat matriciel cellulosique avec lesdites fines particules de sol ù seule source d'azote a priori) non-incubé la teneur en Ntota, de cette fermentation à l'état solide à termes (i.e. ici de 3 à 4 semaines à titre expérimental, mais dans les faits facilement ramenée à quelque jours en situation bioindustrielle plus réaliste et optimisée ; eg. Zhang et al. 2004) ù toute augmentation en Ntota, étant ici nécessairement attribuable à une forme ou une autre de diazotrophie azotobactérienne. Évaluation de l'effet phytoqène : Les biomasses azotobactériennes ont été apportés au sol via la bactérisation de résidus de cultures à hauteurs de 1% p/p enduits de l'équivalent d'environ 1e13 cellules / ha, soit ù 1 million de cellules par g de résidus de culture, dose-hectare est comparable à celle de Claude et Fillion (2004) et Claude et Giroux (2006). Dans un premier temps, l'accumulation, en mg par pot de 2 L, sur une période de 30 jours de la matière sèche des parties aériennes de plantules d'avoine (Avena sativa L.) a servit à établir l'activité phytogène des différents consortia de souches BFCP. Nous avons aussi évalué la repousse de plantules de ray-grass (Lolium multiflorum Lam.) à 10 jours d'intervalle sur une période de 64 jours, la première coupe (C,) intervenant à environs 28 jours post-semis. La production de la matière sèche par les parties aériennes (MSPA) ainsi produites sont, une fois l'activité photosynthétique résolue, remobilisées, « trans-localisées » vers les divers organes de stockages dont le poids est généralement déterminant pour les rendements. Les cultures fourragères, ici le Lolium multiflorum Lam., du fait de situation de leur méristem apical sous la barre de coupe, peuvent repousser et produire ainsi de la MSPA sur une période de temps appréciable. Les matières fraîches sont ainsi récoltées et étuvées à 65 degré C pour 48 2951738 - 24 - heures afin de déterminer leur teneur en humidité. Enfin, le dosage des teneurs en N, P, K, Ca, Mg et oligoéléments permet par la suite de déterminer la mobilisation végétale de ces éléments. Indices du degré d'adaptation à la vie dans les sols : i) essai phytogène endo- et exo-géniques : Afin de démontrer que les biomasses Azotobacteraceae réintroduites dans leurs APC d'origine û ici le sol dit gewn (APC no. 40 ; Tableau 1), sont ainsi plus efficaces (phytogènes) entant que 10 biofertilisants que de telles biomasses « exogènes » introduites dans un APC différent de leur APC d'origine, - ici le sol dit se13 (APC no. 29 ; Tableau 1), j'ai installé en serre un dispositif expérimental en ce sens ; voir infra en sens un exemple d'application de la présente invention. A noter que le principal facteur structurant la répartition de la SAU û française dans ce cas-ci, étant l'argile, ce carbone organique (Cors) et le pH, il n'est donc pas surprenant que les 15 Azotobacteraceae devront nécessairement cohabiter au sein des complexes argilo-humique û complexe dont la formation est effectivement fonction de la teneur en Corg et le pH des sol environnants, soient spécifiquement mieux adaptées à la vie dans leurs APC d'orgine. ii) dosage de la (sur) production de facteurs d'auto-induction : 20 En principe, les Azotobacteraceae les mieux adaptées à la vie dans les sols arables ont certaines caractéristiques. Les teneurs en facteurs d'auto-induction û notamment ici les homosérine lactones n-acétylés (nHSL), responsables en partie de la rusticité et de la formation de biofilms par les cellules les mieux adaptées à la vie dans les sols, peuvent être déterminées 25 selon Huang et al. (2003), Leadbetter et Greenberg (2000), voire Flagan et al. (2003) et rapportées graphiquement par rapport à la densité cellulaire, évaluée grossièrement selon sa densité optique à 600 nm. Il est aussi possible d'utiliser une méthode avec injecteur APSTM permettant l'introduction directe dans le chromatographe d'échantillons solides (eg. les matrices cellulosiques), liquides (eg. les surnageants des milieux de culture liquide des biomasses 30 azotobactériennes ainsi obtenues), voire pâteux (eg. les culots de centrifugation des ces milieux de culture contenant donc que lesdites biomasses azotobactériennes). Les échantillons sont analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en mode impact électronique. 35 APPLICATION INDUSTRIELLE ET AGRONOMIQUE Afin de démontrer que la présente invention est susceptible d'être appliquée en agronomie, nous avons mené trois (3) expérimentations ; 5 -25- (i) une concernant la production par fermentation à l'état solide d'une série de préparations inoculantes à base de substrats cellulosiques afin de démontrer la plus grande activité des Azotobacteraceae, et donc du coup de l'accumulation de l'azote d'origine diazotrophiques dans ces préparations ; (ii) l'autre afin de démontrer la plus grande efficacité relative des inocula ainsi produits si ils sont réintroduits dans leurs APC d'origine d'où proviennent les fines particules de sols ayant servies à leurs fabrications. (iii) une troisième démontrant cette fois-ci une certaine (sur)production de facteurs d'auto-induction - plus particulièrement ici d'homosérines lactones (HSL) et plus précisément encore d'octanoyl-HSL (oHSL), par les biomasses azotobactériennes obtenues selon la présente invention par rapport à une souche référence de l'institut Pasteur (A. chroococcum CIP 76.116) obtenue plus conventionnellement. (i) Fabrication des préparations inoculantes : A des substrats cellulosiques nous avons ajouté l'équivalent de 20% p/p de fines particules de l'un des deux sols alsaciens (Tableau 1) dit « gewn ». Tableau 1 : Caractérisation physico-chimique des sols utilisés. Paramètre Unité se13 gewn Argile % 21,1 27,0 LF/LG Na 1,10 1,72 Sables fins % 4,8 18,1 pH (eau) Na 6,6 5.7 Matière organique g/kg-sol 21,5 55,5 CEC mÉq/kg-sol 128 101 Saturation CEC % 100 56 P205 assimilable mg/kg-sol 200 37 K20 échangeable mg/kg-sol 110 80 MgO échangeable mg/kg-sol 140 200 CaO échangeable mg/kg-sol 3140 1850 Zn-DTPA ug/kg-sol 1400 700 Agro-pédo-climat (APC) No ; 29 40 Plus spécifiquement nous avons ajouté 0,5 g de ces fines particules de sol ù tamisées à sec à 270 um, à 2,5 g d'une matrice cellulosique, ici de simples filtres de cellulose (dit « Durieux »). Nous avons simplement saupoudrer à la surface de ces filtre hydratés à l'aide de quelques 2,5 ml d'eau déminéralisée il est aussi possible d'utiliser ici une solution nutritive faiblement dosée 25 dépourvue d'azote, et contenant une fois sur deux (voir infra) une dose de Mo équivalente à 1 g de Mo par hectare (i.e. un nanograme (ng) de Mo par g de sol), apportée ici via les susdits 2,5 mL (g) de milieu aqueux dosée à 3,5 mM de Mo. Afin de favoriser le déclenchage métabolique ù et cela au sens de notre précédente invention 30 dites « OSE » (FR 09/00428), des Azotobacteraceae les plus adaptées à la vie dans les sols en proximité des résidusphères, nous avons dosé en glucose la susdites solution nutritive à 20 -26- hauteur de 74 uM (cf. Nguyen et Guckert 2001 ; op cit FR 09/00428) pour la modalité B, 0 uM pour la modalité A, et 740 uM pour la modalité C. Nous avons donc trois (3) modalités û A, B et C, avec et sans la susdite nano-dose de Mo sensée favoriser le développement et la dominance des Azotobacteraceae en de telles situations où le rapport C/N des substrats cellulosiques sont très élevés ; Modalités A : cellulose avec 0 uM glucose et +/- Mo Modalités B : cellulose avec 74 uM glucose +/- Mo Modalités C : substrat cellulosique avec 740 uM glucose +/- Mo Ces mélanges à base substrats cellulosiques, de fines particules de sols, de glucose et de Mo contiennent maintenant 3 g de solides (cellulose ou résidus pailleux et fines particules de sol) et 3 ml (g) d'une phase aqueuse plus ou moins enrichie de glucose et/ou de Mo. Une fois la fermentation à l'état solide menée à terme, plus de 75-80% de l'eau aura été consommée et/ou évaporée, ainsi qu'une partie des substrats cellulosiques minéralisée et réorganisée en biomasses Azotobacteraceae ; le poids final de la préparation inoculante ainsi préparée sera donc de l'ordre d'environ 3 g, soit ici plus qu'amplement de quoi inoculer - pour fin d'expérimentation à ce stade, les 3,5 g de résidus de culture pailleux intégrés à 350 g de deux types de sols différents (Tableau 1) secs reconstitués. Cela dit, les susdits 12 à 15 g de préparation inoculante seront re-suspendus dans 150 mL d'eau déminéralisée (dilution 10-1), tandis que seulement 1 mL de cette suspension d'un litre (apport de 10-3) sera utilisée pour utilisé pour inoculer les susdit 3,5 g de résidus de culture pailleux (i.e. 1 / 3,5) ; le facteur de dilution de la préparation inoculante par rapport aux résidus de culture pailleux ciblés est donc de 3,5 x 10-4. Or, il faut envisager de traiter 10' g de résidus de culture pailleux au sol par hectare in situ ; la préparation inoculante éventuelle produite bioindustriellement devra donc permettre une augmentation du titre par g des biomasses Azotobacteraceae par un facteur de 100 par rapport à une certaine préparation inoculante prototype telle que préparé ici. Cette augmentation est parfaitement envisageable techniquement étant donnée l'état de la technique (eg. Zhang et al. 2004). Les populations Azotobacteaceae par g de substrat cellulosique selon les différentes modalités (A, B ou C) sont à peu près comparables û soit de l'ordre de 109 cellules par g, et nettement plus grandes û par un facteur de 4 à 5 fois, en présence de Mo. Pour le moment, rien de surprenant étant donné le rôle de cofacteur enzymatique que joue cet oligoélément au sein de la nitrogenase azotobactérienne. A titre indicatif de l'activité de cette nitrogenase azotobactérienne au sein des différentes matrices cellulosiques, j'ai aussi dosé l'azote total (Ntota,) de ces préparations inoculantes avant 2951738 - 27 - leurs dilutions pour fin d'ensemencement des résidus de culture pailleux (voir infra). Encore une fois, il n'y a pas de grandes différences à ce stade entre les différentes modalités appliquées à chacun des sols ; elles affichent toute environ 0,10% d'Ntota, par g de préparation inoculant (i.e. de matrice cellulosique incubée avant dilution), et environ deux fois plus en 5 présence de Mo. A noter donc, qu'un éventuel effet phytogène des ces différentes modalités (A, B ou C) avec Mo (voir infra) ne pourra pas être attribué à une différence de titre cellulaire et/ou d'azote réduite apporté au début de l'essai au moment de l'inoculation. (ii) essai phytogène des préparations inoculantes 10 La présence de Mo au sein des fermentations à l'état solide favorise le développement de la flore azotobactérienne de ces mélanges. Au sens de OSE (FR0900428) et de la présente invention, c'est ici avec la modalité B (matrice cellulosique + 74 uM glucose et micro-dose Mo) que la flore azotobactérienne semble être la plus phytogène, voire la adaptée à la vie dans les 15 sols en proximité des résidusphère, i.e. capable d'une certaine oligotrophie toute en étant très réactive à des apparitions transitoires de très faibles molarité d'oses. De plus û fait notable, cette adaptation à la vie dans les sols est surtout appréciable si le sol ciblé est similaire û voire identique, au sol d'origine d'où proviennent les susdites fines 20 particules de sol partie intégrante de la susdite fermentation à l'état solide. En effet, pour vérifier cette double hypothèse û (i) la supériorité de la modalité C par rapport aux modalités A, B, et C, et (ii) sa plus grande efficacité relative sur sol gewn d'où proviennent les susdites fines particules de sol par rapport à un autre type de sol, par exemple ici se13 (Tableau 1), nous avons installé l'essai en serre suivant. 25 Les modalités A, B et C avec Mo et appliquées au sol gewn, ainsi qu'un témoin sans inoculation, ont été re-suspendues û les quatre répétitions de l'essai (i) étant ici combinées) dans 4 L d'eau déminéralisée (i.e. 15 g de préparation inoculante pour 150 mL d'eau), soit une dilution de 10-1 ; 1 mL de cette suspension servant la suite à inoculer 3,5 g de résidus de culture 30 pailleux (blé). Tel que déjà mentionné, en ordre de grandeur et en supposant une dose-hectare d'un kg de préparation inoculante, ce taux expérimental d'inoculation pratiqué ici équivaut à l'inoculation in situ de 3,5 x 105 g de résidus de culture pailleux au sol par hectare, soit entre 15 et 25 fois moins qu'en situations agronomiques où les retours de pailles et/ou de chaumes sont de l'ordre de 5 à 8 x 106 g par hectare. Or, cette disproportion sera en pratique et selon l'état 35 de la technique dans le secteur des fermentations à l'état solide facilement corrigée. En effet, les titres cellulaires de ce type de fermentation à l'état solide peut facilement atteindre 1010 cellules Azotobacteraceae par gramme (eg. Zhang et al. 2004). 2951738 - 28 - Les susdits 3,5 g de résidus de culture pailleux ainsi inoculés avec chacune desdites modalités A, B et C (avec Mo) et la préparation témoin non-inoculante sont intégrés par malaxage à 350 g de sol sec et reconstitué par tamisage à 4 mm. Deux (2) type de sols de deux APC différentes - « gewn » (APC no. 29) et « se13 » (APC no. 40) (Tableau 1), le sol gewn étant ici le sol 5 d'origine d'où proviennent les susdites fines particules de sol intégrées aux fermentations à l'état solide selon les modalités A, B et C. Une fois intégrés au sol, les mélanges sol / résidus de culture pailleux inoculés sont placés dans des pots de 0,5 L ; 4 répétitions (Figure 3) pour chacune des modalités essayées sur sol gewn et se13 sont installées. Une quarantaine de graines de Lolium multiflorum - soit pondéralement 0,20 g, sont répandues à la surface de 10 chaque pot, et recouvertes d'une certaine quantité de sables siliceux inerte. Les pots sont irrigués avec une solution nutritive contenant cette fois-ci un minimum d'azote minéral (12 mg-NNO3NH4 par kg de sol) de façon à éviter aux plantules des carences en N, mais sans pour autant nuire au démarrage de la diazotrophie des Azotobacteraceae. Cette solution 15 contient aussi un complément de Mo destiné à la plante, l'alimentation en Mo des Azotobacteraceae étant elle assurée par la Mo apporté pendant la fermentation à l'état solide. Les MSPA du Lolium sont récoltées 28 et 56 jours post-semis, séchées à 55-60 degrés C, pesées et analysées pour leurs teneurs en N, P, K et Zn afin d'en déterminer la mobilisation par 20 plantule. Le dosage élémentaire sont effectués par le laboratoire d'analyse de la Sadef (www.sadef.fr) selon les normes Afnor adoptées à le Cofrac. Tel qu'attendu, et comme nous pouvons le voir au Tableau 2, les MSPA et leurs mobilisation d'N, P, Mg et Zn sont supérieures - par rapport au témoin, en présence de biomasses Azotobacteraceae obtenues via les Modalités A, B ou C - notamment via la Modalité B, et cela d'autant plus si elles sont 25 réintroduites dans leurs APC d'origine (gewn) qu'autrement dans un autre APC (se13). Tableau 2 : Production de matière sèche des parties aériennes (MSPA) par plant de Lolium multiflorum Lam. et sa mobilisation de N, P, Mg et Zn 25 et 56 jours post-semis selon le type de (azoto)bactérisation des résidus de culture pailleux, i.e. soit endo- (sur sol gewn) soit exogène 30 (sur sol sel 3) et la modalité de préparation des biomasses Azotobacteraceae. mg-MSPA / plant ug-N / plant ug-P / plant ug-Mg / plant ug-Zn / plant gewn se13 gewn se13 gewn se13 gewn se13 gewn se13 32 31 264 266 88 84 40 69 3,33 2,98 41 32 265 267 91 89 40 37 3,21 3,04 47 40 325 298 102 96 48 38 3,89 3,24 38 33 274 371 95 94 42 34 3,24 3,17 11,6 10,6 97,5 93,4 31,5 28,3 14,5 23,8 1,26 1,09 13,7 11,1 100,1 93,6 33,0 32,2 13,6 14,0 1,13 1,11 15,9 14,2 117,4 99,4 34,2 32,6 18,0 13,6 1,32 1,12 13,4 11,2 95,6 140,6 35,1 34,9 15,8 11,2 1,11 1,19 28 jours post-semis témoin sans inoculation inoculation via Fes Modalité A inoculation via Fes Modalité B inoculation via Fes Modalité C 56 jours post-semis témoin sans inoculation inoculation via Fes Modalité A inoculation via Fes Modalité B inoculation via Fes Modalité C -29- (ii) (sur)production de facteurs d'auto induction (nHSL) En raison d'une plus grande efficacité relative des inocula préparé selon la Modalité B û i.e. incubée initialement en présence 74 uM-glucose, sur sol gewn représentatif de l'APC d'origine de ces biomasses Azotobacteraceae que sur sol sel 3 représentatif d'un autre APC, j'ai voulu démontrer plus directement la plus grande adaptation à la vie dans les sols de ces biomasses par rapport à des biomasses azotobactériennes obtenues plus conventionnellement. Pour ce faire, j'ai comparé la production d'nHSL û et plus exactement d'n-octanoyl HSL par les biomasses produites selon les modalités A et B à celle d'une souche de référence de la collection de l'institut Pasteur (CIP) ; 71.116 (A. chroococcum). La présence de facteurs d'auto-induction n'est détectée que dans les surnageants des milieux de culture liquides d'enrichissement ; les matrices cellulosiques et/ou les biomasses en elles mêmes en sont dépourvue. Cela démontre clairement que ces facteurs d'auto-induction sont produits par les cellules après leurs multiplication par fermentation à l'état solide ; elles pourront vraisemblablement l'être aussi in situ une fois ces biomasses réintroduites dans leur APC d'origine. En principe, nous nous attendions que les souches supposément les mieux adaptées à la vie dans les sols produisent le plus de tels facteurs d'auto-induction en début de culture, notamment ici des N-octanoy/-homosérine-lactones (Figure 5). Nous avons simplement dosé (voir supra) les oHSL d'un milieu de culture d'enrichissement en Azotobacteraceae à t = 1, 2, 3, 4 et 6 heures. La recherche spécifique de l'ion m/z 143 permet de mettre en évidence la présence de oHSL dans tous les surnageants provenant des milieux de culture CIP 76.116, Modalité A et Modalité B ; la concentration la plus élevée est observée dans le surnageant de la Modalité B ; de plus une trace de N-hexanoyl homoserine lactone (hHSL) est également détectée. La mesure des aires de l'ion m/z 143 permet d'estimer la proportion de oHSL dans chaque surnageant en fonction du temps. Les aires des signaux sont rassemblées dans le Tableau 3 ; Tableau 3 : Evolution des aires du signal m/z 143 caractéristique de l'octanoyl homosérine lactone (oHSL) en fonction du temps d'incubation des diverses biomasses azotobactérienne en milieux d'enrichissement (dépourvu a priori d'azote minéral). temps (t =) CIP 76,116 Modalité A Modalité B 1 0,1079 0,1266 29,1125 2 0,0311 0,0136 0,0145 3 0,0049 0,0064 0,0000 4 0,0065 0,0091 0,0093 6 0,0000 0,0082 0,0000 Moyenne 0,0301 0,0328 5,8273 log (moyenne) -1,5217 -1,4844 0,7655 Selon le mode opératoire décrit, ces cellules bactériennes obtenues au sens de la présente 35 invention seraient plus adaptées à la vie dans les sols que les cellules issues de 76.116, et - 30 - devraient donc (sur)produire plus d'nHSL ; voire en ce sens supra Ganter et al. 2006. Or, c'est précisément ce que j'ai pu observer (Figure 5). En effet, à noter que pour de faible densité optiques ù indice plus ou moins approprié de la densité cellulaire, déjà les cellules bactériennes obtenues selon la présente invention (sur)produisent nettement plus de nHSL que les cellules de référence issus de 76.116. De plus, et bien que non-significatif à ce stade, les cellules issues de la modalité B (i.e. incubés initialement en présence de 74 uM-glucose) (sur)produisent encore plus d'nHSL que celles issues de la modalité A (i.e. incubés initialement en présence de 0 uM-glucose). Cette (sur)production d'nHSL à faible DO (densité de populations azotobactériennes) ne peu que réduire d'autant plus la fameuse calling distance (Ganter et al. 2006) et augmenter ainsi le degré d'adaptation à la vie dans les sols arables de ces cellules (azoto)bactériennes.. Références bibliographiques Aagot, Nina Ole Nybroe, Preben Nielsen, et Kaare Johnsen. (2001). 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Procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes édaphiques comprenant les étapes de ; (i) mise en contacte d'un échantillon de sol avec un substrat matriciel de manière à former une zone à la surface du substrat analogue à celle adjointe au complexe argilohumique (CAH) afin de retenir à la surface ou dans le substrat matriciel l'essentiel de la microflore bactérienne endogène aux milieux édaphiques d'origine, (ii) maturation de cette zone en conditions oligotrophiques permettant aux cellules les plus constitutives du CAH qui ont colonisées ce substrat matriciel de migrer éventuellement vers la phase liquide le surnageant, (iii) récupération et culture des souches bactériennes les plus prolifiques en milieux de cultures liquides riches, à caractères autochtone, rustiques et persistantes in situ, caractérisé en ce que le substrat matriciel est carboné et semi-solide. 2. Procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes édaphiques selon la revendication 1 caractérisé en ce que le substrat matriciel carboné semi-solide est constitué d'une matrice cellulosique non-bactéricide imprégnée d'eau déminéralisée et stérile, la quantité d'eau et de matrice étant avantageusement les mêmes afin de constituer une matrice semi-solide contenant initialement 50% de matière sèche (solide) et 50% d'eau (liquide). 3. Procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes édaphiques selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que - selon le type de sol et sa teneur en pHBA, un aliquote dilué sera ajouté de façon à assurer un rapport pHBA / oses d'environs 3 à 4, tout en assurant que la teneur en oses soit initialement inférieure à 70 û 100 uM. 4. Procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes édaphiques selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le substrat matriciel carboné est a priori dépourvu d'oses et d'osides libres assimilables par les (azoto)bactéries du sol. 5. Procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes édaphiques selon la revendication précédente caractérisé en ce que le substrat matriciel carboné semi-solide a priori dépourvu d'oses et d'osides libres assimilables par les (azoto)bactéries du sol en libère progressivement lors de sa dégradation au cour de cette fermentation à l'état solide, la microflore d'origine tellurique apportée via l'échantillon de sol assurant ainsi la dégradation enzymatique et/ou fongique de la matrice cellulosique. 6. Procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes édaphiques selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'échantillon de sol est préparé de façon à retenir que les fines particules de sols aux quelles adhèrent les bactéries. 7. Procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes édaphiques selon la revendication précédente caractérisé en ce que la granulométrie des fines particules de sols est d'environ 500 um, plus particulièrement d'au plus 270 um, et avantageusement d'environ 70 à 170 um. 8. Procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes édaphiques selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les proportions substrat matriciel- 35 - carboné semi-solide : échantillon de sol sont comprises entre 25 et 1, plus particulièrement entre 10 et 3, avantageusement d'environ 5. 9. Procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes édaphiques selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le substrat carboné semi-solide ainsi mis en contacte avec lesdits échantillons de sol est incubé suffisamment longtemps pour permettre le développement in situ de populations Azotobacteraceae. 10. Biomasses Azotobacteraceae réintroduites dans leur APC d'origine par pulvérisation liquide des résidus de culture au sol et obtenues selon une quelconque des revendications précédentes.