FR 2944957 A1 20101105 FR 0952932 A 20090430 SUPPORT CELLULOSIQUE CONTENANT DES DERIVES DE MANNOSE APTES A FIXER LES BACTERIES DOTEES DE PILIS DE TYPE 1, APPLICATION AUX LINGETTES DESINFECTANTES NOTAMMENT L'invention a pour objet un support cellulosique dont la surface est traitée avec des dérivés de mannose aptes à fixer les bactéries dotées de pilis de type 1. Elle concerne également un nouveau concept de lingette désinfectante mettant en oeuvre ledit support. Dans la suite de la description, l'invention est plus particulièrement décrite en application avec des lingettes présentant un pouvoir désinfectant, en particulier vis-à-vis de la bactérie Escherichia coli dotée de pilis de type 1. Cette bactérie est plus particulièrement impliquée dans les infections du tractus urinaire, majoritairement chez la femme. Bien entendu, toutes les bactéries présentant à leur surface des pilis de type 1 telles que Salmonella, Shigella, Klebsiella, Entérobactère et Protéus, constituent également des cibles potentielles pour les lingettes de l'invention et plus généralement tout support traité avec le dérivé de mannose de l'invention. Il est dorénavant établi que les glycoconjugués terminés par un motif mannose présents sur la surface des cellules du tractus urogénital constituent des sites de liaison majeurs des bactéries Escherichia coli dotées de pilis de type 1. A partir de ce constat, il a été proposé d'incorporer des polymères dérivés de mannose dans des lingettes, pour les rendre désinfectantes. Ainsi par exemple, le document US 5,718,909 décrit des supports non tissés contenant un copolymère obtenu par copolymérisation du 4-acryloylamido-phényl-a-D-mannopyranoside avec de l'acrylamide. En pratique, le copolymère est mélangé avec les fibres avant formation de la feuille et à chaud. Les inconvénients majeurs de cette solution sont au moins au nombre de deux. Tout d'abord, le 4-acryloylamido-phényl-a-D-mannopyranoside nécessite un nombre important d'étapes de synthèse. En outre, la fixation du dérivé de mannose sur les fibres de cellulose ne semble pas optimale puisque l'on peut assister à un relargage du copolymère, ce qui rend inefficace l'effet désinfectant du support. En d'autres termes, le problème que se propose de résoudre l'invention est de mettre au point un support cellulosique, en particulier une lingette, traité avec des dérivés de mannose, c'est-à-dire en reprenant un principe identique à celui proposé dans l'art antérieur ne présentant pas les inconvénients précités, à savoir notamment difficulté de synthèse du dérivé de sucre et amélioration de la fixation de celui-ci à la surface du support. Le Demandeur a donc axé ses recherches sur la nature même d'une part, du dérivé de mannose et d'autre part, de la fixation dudit dérivé sur les fibres de cellulose. Moyennant cette approche, le Demandeur a découvert que les dérivés alcenyle de mannose, en particulier l'allyl-a-D-mannopyranoside présentaient une capacité de liaison aux bactéries Escherichia coli dotées de pilis de type 1 particulièrement avantageuse au regard des autres dérivés de mannose, en particulier les dérivés alkyle saturés. En outre, le Demandeur a également constaté que la copolymerisation de ce dérivé de mannose sous la forme d'un terpolymère à base d'acrylamide dont un monomère était constitué d'un monomère cationique, permettait de fixer efficacement le dérivé sur de la cellulose tout en maintenant l'activité de liaison du sucre à Escherichia coli. En effet, la présence de monomères cationiques et de monomères acrylamide engendrerait la formation de liaisons ioniques avec la cellulose, renforçant ainsi le phénomène de fixation. Comme il sera vu par la suite, l'immobilisation du dérivé de mannose sur le support cellulosique permet au sucre d'entrer en compétition avec les molécules de mannose présentes à la surface des cellules du tractus urogénital grâce à son pouvoir de liaison aux bactéries Escherichia coli dotées de pilis de type 1, supérieur. En d'autres termes, l'invention a pour objet un support tissé ou non tissé, destiné à fixer les bactéries dotées de pilis de type 1, comprenant des fibres de cellulose et/ou de cellulose régénérée sur lesquelles est fixé un dérivé de mannose. Ce support se caractérise en ce que le dérivé de mannose se présente sous la forme d'un terpolymère obtenu par copolymerisation : - d'un monomère dérivé d'alcényl-a-D-mannopyranoside modifié avec une fonction apte à réagir avec un monomère acrylamide, en particulier une fonction acrylamide, acrylique, vinylique, maléique, fumarique, allylique, - d'un monomère cationique, - d'un monomère acrylamide.35 Le Demandeur a obtenu des résultats particulièrement avantageux lorsque le monomère dérivé d'alcényl-a-D-mannopyranoside était un monomère dérivé d'allyl-a-D-mannopyranoside de formule suivante : Par ailleurs et toujours selon l'invention, le monomère dérivé d'allyl-a-D-mannopyranoside est avantageusement un monomère dérivé de 3-(2-aminoéthylthio)propyl a-D-mannopyranoside de formule suivante : 10 Il s'ensuit que le 3-(2-aminoéthylthio)propyl a-D-mannopyranoside modifié avec une fonction apte à réagir avec un monomère acrylamide, en pratique une fonction acrylamide est un monomère de la formule suivante : H O S'agissant du monomère cationique, tout monomère cationique connu peut être mis en oeuvre, tels que notamment des monomères vinyliques et plus particulièrement 2-(triméthylamoniumchloride)éthyl métacrylate (TMAEM). 20 Selon une autre caractéristique, le terpolymère contient : - entre 0.25 et 20 % molaire d'un monomère dérivé d'alcényl-a-D-mannopyranoside modifié avec une fonction apte à réagir avec un monomère acrylamide, - entre 70 et 90 % molaire d'acrylamide, - entre 5 et 20 % molaire de monomère cationique. 15 Dans un mode de réalisation préféré, le terpolymère de l'invention a la formule suivante : OH O~HO HO HO NH2 CO O CO avec : 0.025 S'agissant du support, celui-ci contient, comme déjà dit, des fibres de cellulose et/ou des fibres de cellulose régénérées, c'est-à-dire dans ce dernier cas, de la viscose. Néanmoins, le support peut également contenir des fibres synthétiques, telles que par exemple des fibres de polyester, de polypropylène, de polyamide, de polyacrylique, d'alcool polyvinylique, de polyéthylène seules ou en mélange. Il peut s'agir d'un support tissé ou non tissé. Le support peut être utilisé comme lingette humide ou sèche, en particulier pour la désinfection des régions périurétrales de la femme, mais également comme lingette désinfectante pour toute autre application, telle que par exemple le nettoyage des mains ou encore de surfaces inertes, telles que par exemple le réfrigérateur.25 Les procédés de fabrication des lingettes sont bien connus de l'homme du métier et ne nécessitent pas d'être décrits dans la présente demande plus en détail. Du fait de sa solubilité dans l'eau, le copolymère peut être appliqué à la surface du support 5 cellulosique par size press. En d'autres termes, l'invention a également pour objet un procédé de traitement du support cellulosique précédemment décrit consistant, après formation de la feuille, à appliquer le polymère à la surface de la feuille par size press. 10 L'invention a également pour objet un procédé de désinfection d'une surface inerte ou vivante colonisée par des bactéries présentant des pilis de type 1, consistant à mettre en contact lesdites bactéries avec un substrat constitué par 1'allyl -a-D-mannopyranoside. Selon ce procédé, le substrat est modifié chimiquement afin d'être copolymérisé, le 15 terpolymère obtenu précédemment décrit étant lié ioniquement à un support cellulosique. L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront bien des exemples de réalisation suivants à l'appui des figures annexées. 20 La figure 1 unique est un graphe représentant le pouvoir liant du terpolymère dérivé d'allyl -a-D-mannopyranoside à Escherichia cati lorsque ledit polymère est appliqué sur une lingette. I/ Efficacité bactériologique de l'allyl-a-D-mannopvranoside Dans cette partie, on teste l'efficacité bactériologique de différents dérivés de mannose, avant copolymérisation et incorporation dans le support cellulosique. Les molécules testées sont les suivantes : 25 30 H oH Ho o 6 ln OH HO oH t7H HO OH OH s Mec y cl- mannoDy.arc0side Ethyl -thio-r-d-[nannOpysanoside d-mannose. (4) : 2-[(2-hydroxy-)ethoxy-]-ethyl a-D-mannopyranoside (7) : 2-[(2-methoxy-)ethoxy-]ethyl a-D-mannopyranoside (10) : Benzyl-a-D-mannopyranoside (12) : p-Aminophenyl-a-D-mannopyranoside (15) : p-Nitrophenyl 3-O-a-D-mannopyranosyl-a-D-mannopyranoside (8) : Allyl a-D-mannopyranoside 1. Protocole de test Le test bactériologique mis en oeuvre est un test d'agglutination de levure. En effet, les bactéries Escherichia cati dotées de pilis de type 1 ont la capacité d'agglutiner les levures. Cette agglutination peut être inhibée par les dérivés de mannose. On utilise la souche 382 d'Escherichia cati obtenue auprès du laboratoire bactériologique national de Stockholm, laquelle exprime de manière stable les pilis de type 1. L'expression des pilis peut être améliorée en faisant pousser les bactéries par le biais de trois sous-cultures dans un milieu nutritionnel (NB, oxiod). A l'issue de la culture, les bactéries sont centrifugées et remises en suspension dans le même volume de solution salée tamponnée de phosphate (PBS pH : 7,2). On obtient une concentration de bactéries égale à 2 - 3.109 bactéries/ml. Les levures de boulanger sont mises en suspension dans du PBS à une concentration finale de 5.108 cellules/ml. Les différents dérivés de mannose sont dilués d'une concentration initiale d'un maximum de 20 mg/ml en deux étapes dans du PBS. A 50 �l de chacun des sucres dilués, on ajoute 50 �l d'Escherichia coli et on incube à température ambiante pendant 15 mn pour permettre une interaction. On ajoute enfin 50 �l de levure dans chaque puits. Après incubation de 15 mn supplémentaires à température ambiante et une nuit à 4°C, on évalue l'agglutination, c'est-à-dire l'interaction entre les bactéries et les levures. 2. Résultats Les résultats figurent dans le tableau suivant : Composés Activité inhibitrice en % D-Mannose 100 Methyl-a-D-Mannoside 45 2-[(2-hydroxy-)ethoxy-]-ehyl a-D-mannopyranoside (4) 24 2-[(2-methoxy-)ethoxy-]ehyl a-D-mannopyranoside (7) 24 Benzyl-a-D-mannopyranoside (10) 24 Ethyl 1-thio-a-D-mannopyranoside 18 p-Aminophenyl-a-D-mannopyranoside (12) 0.93 p-Nitrophenyl 3-O-a-D-mannopyranosyl-a-D-mannopyranoside (15) 0.70 Allyl a-D-mannopyranoside (8) 0.12 L'activité inhibitrice est obtenue en divisant la concentration inhibitrice minimum (en mg/ml) pour chaque produit avec la concentration inhibitrice du produit de référence : le D-mannose, et on multiplie par 100. Ces résultats montrent d'une part l'importance de la présence d'une partie aglycone hydrophobe au regard d'une partie aglycone hydrophile (produits 4 et 7 contre produit 8). On observe également que les alcényl-a-D-mannopyranoside, en particulier l'allyl a-D-mannopyranoside présente une affinité particulièrement forte. II/ Pouvoir désinfectant d'un support traité avec un dérivé d'allyl a-D-mannopyranoside Dans cette partie, on démontre l'effet désinfectant d'un support traité avec un copolymère 25 dérivé d'allyl a-D-mannopyranoside 15 20 1. Synthèse de l'allyl a-D-mannopyranoside Le dérivé de mannose est synthétisé selon le schéma réactionnel suivant par glycolysation 5 de Fischer du 1,2,3,4,6-penta-O-acétyl a-D-mannopyranoside en présence d'un allyl alcool, puis déprotection des fonctions acétylés. vas Ace -r AcO OAu 10 22 On dissout 4.9 g de 1,2,3,4,6-penta-O-acétyl a-D-mannopyranoside dans du DCM anhydre sous atmosphère d'azote. On ajoute 3.43 ml d' allyl alcool suivi de l'addition 15 goutte à goutte de 7.91 ml de trifluorure diethyl etherate de bore. On remue le mélange sous azote à température ambiante pendant 5h puis on chauffe à 40°C pendant une nuit. On sature ensuite le mélange avec une solution de NaHCO3. La solution est ensuite de nouveau diluée dans un même volume de DCM. On obtient l'allyl 2,3,4,6 tetra-O-acetyla-D-mannopyranoside qui est purifié par chromatographie sur colonne. L'allyl 2,3,4,6 20 tetra-O-acetyl- a-D-mannopyranoside est dissous dans 50 ml de methanol. On ajoute ensuite 1 ml d'une solution de methoxide de sodium methanolique. Après 3h, on ajoute de la résine amberlite pour neutraliser et la solution est filtrée puis concentrée. 2. Synthèse du 3-(2-aminoethylthio)propyl a-D-mannopyranoside à partir de l'allyl 25 a-D-mannopyranoside La réaction consiste en élongation du groupe alcyne de l'allyl a-D-mannopyranoside par addition de 2-aminoethanethiol selon le schéma réactionnel suivant : OH OH NH. 22 30 1,2153 g d'allyl a-D-mannopyranoside sont dissous dans l'eau en présence de 570 mg d'hydrochlorure de cystéamine. La solution est ensuite irradiée sous UV pendant 17 heures. La solution est lyophilisée et les résidus d'huile sont purifiés par chromatographie sur gel de silice en utilisant le méthanol comme diluant. 3. Synthèse du 3-(2-aminoethylthio)propyl a-D-mannopyranoside modifié avec une fonction acrylamide Le principe de la réaction est une conversion du 3-(2-aminoethylthio)propyl a-D-10 mannopyranoside en acrylamide glycosidique correspondant selon le schéma réactionnel suivant : 24 15 1g de 3-(2-aminoethylthio)propyl a-D-mannopyranoside est solubilisé dans 15 ml d'un mélange eau/éthanol (rapport 1/1) en présence de 1,54g de carbonate de sodium. Le 20 mélange est ensuite refroidi à 0°C sous agitation puis 1,546 ml d'une solution de chlorure acryloyle dans 7 ml de tétrahydrofurane sont ajoutés goutte à goutte pendant 5 mn. La réaction est suivie par TLC (chloroforme-méthanol). Après une heure de réaction, la solution est filtrée et concentrée. Le produit est purifié par chromatographie successive. 4. Synthèse du terpolymère comprenant monomère acrylamide 3-(2- aminoethylthio)propyl a-D-mannopyranoside, monomère cationique (2- ( trimethylammoniumchloride)ethyl methacrylate (TMAEM)) et monomère acrylamide 30 Le terpolymère est obtenu par terpolymérisation radicalaire libre des trois monomères précités dans un ratio molaire 10/10/80. Pour rappel, le terpolymère obtenu à la formule suivante : 25 35 OH 10 On utilise dans la réaction de terpolymérisation, 12,5% en poids de monomère dans le 15 ratio précité et 3% en poids d'azobisisobutyronitrile (AIBN). Plus spécifiquement, on dissout dans 17,5 ml d'éthanol à 0°C, 613 mg de 3-(2-acryloaminoethylthio)propyl a-D-mannopyranoside, 359 mg de TMAEM, 992 mg d'acrylamide et 60 mg d'AIBN. Le mélange est ensuite polymérisé sous agitation à 50°C pendant 19 heures sous azote. La solution est ensuite concentrée à 2 ml et le polymère est précipité dans 100 ml d'un 20 mélange froid d'acétone/éther (1/1, volume/volume), filtré puis séché à l'air. 5. Traitement des supports 5.1 Traitement avec le copolymère 25 Le support utilisé est un non tissé de 45 g/m2 composée de 100% de fibres lyocell provenant de cellulose de pulpe de bois. On applique le dérivé de mannose à trois concentrations différentes. Exprimées en mole 30 de D-mannose, les trois concentrations sont les suivantes : - 10-7 moUm2 - 10-6 moUm2 - 10-s moUm2 35 Les échantillons de support sont soumis à un traitement par size press de la marque MATHIS� à une vitesse de 4,7 min sous une pression de 2 bars. Les échantillons sont récupérés et directement pesés. Les échantillons sont ensuite séchés sur glaceuse (séchage par contact) à 110°C pendant quelques minutes. 5.2 Efficacité bactériologique des supports traités Selon le protocole mis en oeuvre, deux souches bactériennes d'Escherichia coli 395 (exprimant peu ou pas les pilis de type 1) et Escherichia coli 382 (exprimant fortement les pilis de type 1) sont incubés dans 5 ml d'un média nutritionnel standard (LB-BROTH) et 20 �l de thymidine tritiée pendant 2 heures à 36°C. Les bactéries sont ensuite remises en suspension dans le même volume de PBS. On découpe des pièces dans les échantillons de support traités. 200 �l de bactéries en suspension sont appliquées sur chaque pièce et incubées à 36°C pendant 20 minutes. Les pièces sont ensuite lavées au PBS et la radioactivité est mesurée. Les résultats sont exprimés en CPM et ensuite convertis en nombre de bactéries immobilisées, étant rappelé que 1 CPM correspond approximativement à 20 000 bactéries. La taille des supports découpés est de 0,55 cm. 5.3 Résultats 70 Avant tout, on teste l'efficacité bactériologique du terpolymère directement sur les 20 souches d'Escherichia coli par test d'agglutination. Les résultats figurent dans le tableau suivant : Composé Activité inhibitrice D mannose 100 Terpolymère 0.48% Ces résultats montrent une forte affinité du terpolymère à l'encontre des bactéries 25 Escherichia coli. Ce degré d'activité est comparable à celui obtenu avec l'allyl a-D-mannoside, tel que précédemment illustré, lorsqu'il est utilisé tel quel. O Les résultats bactériologiques obtenus à l'issue du traitement des supports par le terpolymère apparaissent sur la figure 1. Il apparaît que plus la densité de mannoside est 30 importante et plus la liaison aux bactéries Escherichia coli 382 est importante. Néanmoins, ces résultats montrent clairement la liaison spécifique des bactéries dotés de pilis de type 1 sur le sucre par rapport au témoin négatif, représenté par la souche d'Escherichia coli 395 exprimant faiblement les pilis de type 1. L'invention et les avantages qui en découlent ressortent bien de la description. On note en particulier une efficacité désinfectante des alcényl a-D-mannopyranosides, en particulier de l'allyl a-D-mannopyranoside particulièrement prononcée vis-à-vis des bactéries dotées de pilis de type 1. On souligne par ailleurs que cette efficacité reste quasiment inchangée lorsque le dérivé de sucre est synthétisé sous la forme d'un terpolymère cationique, ce qui permet en outre d'assurer une fixation optimale du sucre sur le support cellulosique par liaisons ioniques. REVENDICATIONS1/ Support destiné à fixer les bactéries dotées de pilis de type 1 comprenant des fibres de cellulose et/ou de cellulose régénérée sur lesquelles est fixé un dérivé de mannose, caractérisé en ce que le dérivé de mannose se présente sous la forme d'un terpolymère obtenu par copolymerisation : - d'un monomère dérivé d'alcényl-a-D-mannopyranoside modifié avec une fonction apte à réagir avec un monomère acrylamide, - d'un monomère cationique, - d'un monomère acrylamide. 2/ Support selon la revendication 1, caractérisé en ce que le monomère dérivé d'alcényl-a-D-mannopyranoside est un monomère dérivé d'allyl-a-D-mannopyranoside. 3/ Support selon la revendication 2, caractérisé en ce que le monomère dérivé d'allyl-a-D-mannopyranoside est un monomère dérivé de 3-(2-aminoéthylthio)propyl a-D-mannopyranoside de formule suivante : 23 25 4/ Support selon la revendication 3, caractérisé en ce que le monomère dérivé de 3-(2-aminoéthylthio)propyl a-D-mannopyranoside est modifié avec une fonction acrylamide, et a la formule suivante : H O 5/ Support selon la revendication 1, caractérisé en ce que le monomère cationique est le 2-(triméthylamoniumchloride)éthyl métacrylate (TMAEM). 306/ Support selon la revendication 1, caractérisé en ce que le copolymère a la formule suivante : avec : 0.025