FR 2943538 A1 20101001 FR 0901478 A 20090327 Formulation à action rapide d'insuline recombinante humaine La présente invention concerne une formulation à action rapide d'insuline recombinante humaine. Depuis la production d'insuline par génie génétique, au début des années 80, les patients diabétiques bénéficient d'insuline humaine pour se traiter. Ce produit a grandement amélioré cette thérapie puisque les risques immunologiques liés à l'utilisation d'insuline non humaine en particulier de porc se trouvent éliminés. Le génie génétique a permis une autre amélioration du traitement du diabète avec le développement d'insulines dites analogues. Ces insulines sont modifiées sur un ou deux acides aminés pour être plus rapidement distribuées dans le compartiment sanguin après une injection sous-cutanée. Ces insulines Lispro (Lilly), Novolog (Novo) et Apidra (Aventis) sont des solutions stables d'insuline avec une réponse hypoglycémiante s'approchant en terme de cinétique de la réponse physiologique générée par le début d'un repas. Dès lors, les patients traités avec une insuline rapide n'ont plus à anticiper leur heure de repas, mais peuvent procéder à l'injection au début du repas. Le principe des insulines analogues dites rapides est de former des hexamères à la concentration de 100 UI/mL pour assurer la stabilité de l'insuline dans le produit commercial tout en favorisant la dissociation très rapide des héxamères en monomères après injection afin d' obtenir une action rapide. L'insuline humaine telle que formulée sous sa forme commerciale, ne permet pas d'obtenir une réponse hypoglycémiante proche en terme de cinétique de la réponse physiologique générée par le début d'un repas, car à la concentration d'usage (100 Ul/mL), en présence de zinc et d'autres excipients tel que le phénol ou le crésol, elle s'assemble sous forme d'héxamère alors qu'elle est active sous forme de monomère et de dimère.. L'insuline humaine est préparée sous forme d'héxamères pour être stable près de 2 ans à 4°C car sous forme de monomères, elle a une très forte propension à s'agréger puis à fibriller ce qui lui fait perdre son activité. De plus sous cette forme agrégée, elle présente un risque immunologique pour le patient. Les dissociations des héxamères en dimères et des dimères en monomères retardent son action de près de 20 minutes comparativement à une insuline analogue rapide, Brange J., et al, Advanced Drug Delivery Review, 35,1999, 307-335 Le principal inconvénient de ces insulines est la modification de la structure primaire de l'insuline humaine. Cette modification entraîne des variations d'interaction avec les récepteurs de l'insuline présents sur un nombre très important de lignées cellulaires car il est connu que le rôle de l'insuline dans l'organisme n'est pas limité à son activité hypoglycémiante. Bien que de nombreuses recherches aient été effectuées dans ce domaine, on ne sait pas déterminer à ce jour si ces insulines analogues ont toutes les propriétés physiologiques de l'insuline humaine. La société Biodel a proposé une solution à ce problème avec une formulation d'insuline comprenant de l'EDTA et de l'acide citrique telle que décrite dans la demande de brevet US200839365. L'EDTA par sa capacité à complexer les atomes de zinc et l'acide citrique par ses interactions avec les parties cationiques sont décrits comme déstabilisant la forme hexamérique de l'insuline et réduisant ainsi son temps d'action. Cependant, une telle formulation présente plusieurs inconvénients 25 majeurs. Premièrement, l'injection d'une solution contenant de l'acide citrique peut provoquer des douleurs au site d'injection ce qui a été en effet, reporté au cours des différentes études cliniques réalisées par Biodel, 30 Business Wire (Sep 08, 2008). D'autre part, l'emploi d'un agent chélatant tel que l'EDTA, qui n'est pas spécifique de l'atome de zinc, peut entrainer des effets secondaires. En effet, l'EDTA est connu pour complexer également des ions Cal+ qui conduit à 35 une activité anticoagulante. L'utilisation de l'insuline rapide s'effectuant trois fois par jour pour les diabétiques de type I et de type Il, les douleurs associés à l'administration du produit ne sont pas acceptables pour les malades et les risques d'effets secondaires possibles dus aux excipients doivent être absolument évités. Il existe donc un besoin réel et non satisfait d'une formulation rapide d'insuline humaine plus efficace et plus sûre que les formulations actuelles sur le marché qui sont, soit des insulines analogues rapides, soit les insulines humaines qui ont un temps d'action trop long. 10 La présente invention permet de résoudre les différents problèmes ci-dessus exposés puisqu'elle permet de réaliser une formulation d'insuline humaine à un pH compris entre 6,0 et 7,5 en solution à 100 UI/mL, ladite formulation permettant d'atteindre, après administration, un niveau plasmatique 15 d'insuline et/ou une réduction du glucose plus rapidement qu'avec des formulations d'insuline humaine. L'invention consiste à former un complexe de l'insuline humaine avec un polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles. La formation de ce complexe peut de plus être réalisée par simple mélange d'une solution aqueuse d'insuline et d'une solution aqueuse de polysaccharide. 25 L'invention concerne également le complexe entre l'insuline humaine et un polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles. Elle concerne également l'utilisation de ce complexe pour préparer 30 des formulations d'insuline humaine permettant d'atteindre, après administration, un niveau plasmatique d'insuline et/ou une réduction du glucose plus rapidement que les formulations d'insuline humaine. Les formulations d'insuline humaine � rapide � sur le marché à une 35 concentration de 600 pM (100 Ul/mL) ont un délai d'action compris entre 30 et 60 minutes et un nadir glycémique compris entre 2 et 4 heures. 20 Les formulations d'insuline analogue � rapide � sur le marché à une concentration de 600 pM (100 UI/mL) ont un délai d'action compris entre 10 et 15 minutes et un nadir glycémique compris entre 60 et 90 minutes. Elle concerne plus particulièrement l'utilisation d'un complexe selon l'invention pour la préparation d'une formulation d'insuline dite rapide. L'invention concerne l'utilisation du complexe selon l'invention pour 10 préparer des formulations d'insuline humaine à une concentration voisine de 600 pM (100 UI/mL) dont le délai d'action est inférieur à 30 minutes, de préférence inférieur à 20 minutes, et encore de préférence inférieur à 15 minutes. 15 L'invention concerne l'utilisation du complexe selon l'invention pour préparer des formulations d'insuline humaine à une concentration voisine de 600 pM (100 UI/mL) dont le nadir glycémique est inférieur à 120 minutes, de préférence inférieur à 105 minutes, et encore de préférence inférieur à 90 minutes. 20 Dans un mode de réalisation, le polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles est choisi parmi des polysaccharides fonctionnalisés constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6) et dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de 25 liaisons glycosidiques de type (1,6) est un dextrane fonctionnalisé comportant des groupes fonctionnels carboxyles. Lesdits polysaccharides sont fonctionnalisés par au moins un dérivé de la phénylalanine, noté Phe : 30 - ledit dérivé de la phénylalanine étant greffé ou lié aux polysaccharides par couplage avec une fonction acide, ladite fonction acide étant une fonction acide portée par un bras de liaison R lié au polysaccharide par une fonction F, ladite fonction F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction ûOH du 35 polysaccharide,5 - F étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate ou éther, - R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que 0, N ou/et S, et ayant au moins une fonction carboxyle, - Phe étant un reste d'un dérivé de la phénylalanine, L ou D, produit du couplage entre l'amine de la phénylalanine et au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles. Selon l'invention les polysaccharides fonctionnalisés peuvent répondre aux formules générales suivantes : Polysaccharide Formule I • le polysaccharide étant un dextrane, 20 • F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction ùOH du polysaccharide et étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate ou éther, • R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, 25 tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction carboxyle, • Phe étant un reste d'un dérivé de la phénylalanine, L ou D, produit du couplage entre l'amine du dérivé de la phénylalanine et au moins un15 acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles, n représente la fraction molaire des R substitués par Phe et est comprise entre 0,05 et 0,5, de préférence entre 0,1 et 0,45, encore de 5 préférence entre 0,2 et 0,4, i représente la fraction molaire des groupements F-R-[Phe]n portés par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, - lorsque R n'est pas substitué par Phe, alors le ou les acides du 10 groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na' ou Kt Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants : F F OH OH OH 20 ou leurs sels de cations alcalins. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé de la phénylalanine est choisi dans le groupe constitué par la phénylalanine et ses sels de cation alcalin, le 25 phénylalaninol , le phénylalaninamide, l'éthyle benzyle amine. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé de la phénylalanine est choisi parmi les esters de la phénylalanine de formule II 15 F 30 Formule II OE E étant un groupement alkyle linéaire ou ramifié en Cl à C6. Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation compris entre 10 et 3000. Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation compris entre 10 et 400. Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation compris entre 10 et 200. Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation compris entre 10 et 50. Dans un mode de réalisation, l'insuline est une insuline humaine recombinante telle que décrite dans la Pharmacopée Européenne. Dans un mode de réalisation, les ratios molaires polymère/insuline sont compris entre 0,1 et 5. Dans un mode réalisation, ils sont compris entre 0,15 et 2. Dans un mode réalisation, ils sont compris entre 0,2 et 1. Dans un mode de réalisation, les ratios massiques polymère/insuline sont compris entre 0,2 et 10. Dans un mode réalisation, ils sont compris entre 0,5 et 8. Dans un mode réalisation, ils sont compris entre 1 et 4. De préférence cette composition est sous forme d'une solution injectable.30 Dans un mode de réalisation, la concentration en insuline des solutions est de 600 pM soit 100 Ul/mL. Dans un mode de réalisation, la concentration en insuline de 5 600 pM peut être réduite par simple dilution, en particulier pour les applications pédiatriques. L'invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par séchage etlou 10 lyophilisation. Dans le cas des libérations locale et systémique, les modes d'administration envisagés sont par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique, transdermique, intramusculaire, orale, nasale, vaginale, 15 oculaire, buccale, pulmonaire etc. L'invention concerne également l'utilisation d'un complexe selon l'invention pour la formulation d'une solution d'insuline humaine de concentration de 100 Ul/mL destinée aux pompes à insuline implantables ou 20 transportables. Exemple 1 : Solution d'insuline analogue rapide à 100 Ul/mL Cette solution est une solution commerciale de Novo vendue sous 25 le nom de Novolog. Ce produit est une insuline analogue rapide. Exemple 2 : Solution d'insuline humaine à 100 Ul/mL Cette solution est une solution commerciale de Novo vendue sous le nom d'Actrapid. Ce produit est une insuline humaine. Exemple 3 : Préparation d'une solution d'insuline humaine à 200 Ul/mL 60,4 g d'eau sont ajoutés à 884,7 mg d'insuline humaine 35 comprenant deux Zn2+ par hexamère, puis le pH est ajusté de 5,7 à 3 par ajout de 8 mL d'HCI 0,1 N. La solution est neutralisée à pH 7 par ajout de 10 mL de 30 NaOH 0,1 N La concentration est ensuite ajustée à 200 UI/mL par 43,08 mL d'eau. Le pH final de cette solution est de 7,02. La solution est enfin filtrée sur 0,22pm. Exemple 4 ; Préparation des excipients Préparation du tampon phosphate 200 mM à pH 7 Une solution A de phosphate monosodique est préparée comme suit : 1,2 g de NaH2PO4 (10 mmol) sont solubilisés dans 50 mL d'eau dans une 10 fiole jaugée. Une solution B de phosphate disodique est préparée comme suit : 1,42 g de Na2HPO4 (10 mmol) sont solubilisés dans 50 mL d'eau dans une fiole jaugée. Le tampon 200 mM phosphate à pH 7 est obtenu en mélangeant 15 3 mL de solution A à 7 mL de solution B. Préparation d'une solution de m-crésol 130 mM La solution de m-crésol est obtenue en solubilisant 0,281 g de m-crésol (2,6 mmol) dans 20 mL d'eau dans une fiole jaugée. Préparation d'une solution de Tween 20 à 0,8 mM La solution de Tween 20 est obtenue en solubilisant 98 mg de tween 20 (80 pmol) dans 100 mL d'eau dans une fiole jaugée. 25 Préparation d'une solution de Glycérine à 1,5 M La solution de Glycérine est obtenue en solubilisant 13,82 g de glycérine (150 mmol) dans 100 mL d'eau dans une fiole jaugée. Préparation des solutions de polysaccharides 30 Deux polysaccharides selon l'invention sont employés. Le polymère 1 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le sel de sodium de la L-phénylalanine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 10 kg/mol, soit un degré de polymérisation de 39 (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la 35 demande de brevet FR07.02316. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium, modifiés ou non par la phénylalanine, soit i dans la formule I, est de 20 1,06. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par la phénylalanine, soit n dans la formule I, est de 0,43. La solution de polymère 1 est obtenue en solubilisant 2,79 g de polymère 1 (teneur en eau = 10%) dans 25,3 mL d'eau dans un tube de 50 mL 5 (concentration en polymère 1 de 99,2 mg/mL). Le polymère 2 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester éthylique de la L-phénylalanine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol, soit un degré de 10 polymérisation de 154 (Pharmacosmos) selon un procédé similaire à celui décrit pour le polymère 1 dans la demande de brevet FR07.02316 en employant le chlorhydrate de l'ester éthylique de la L-phénylalanine. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium, modifiés ou non par la phénylalanine, soit i dans la formule I, est de 1,00. La fraction molaire de 15 méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester éthylique de la L-phénylalanine, soit n dans la formule I, est de 0,36. La solution de polymère 2 est obtenue en solubilisant 1,33 g de polymère 2 (teneur en eau = 10%) dans 16,83 mL d'eau dans un tube de 50 mL (concentration en polymère 2 de 71,0 mg/mL). 20 Exemple 5: Préparation d'une solution d'insuline humaine à 100 Ul/mL en présence de polymère 1 Pour un volume final de 50 mL de formulation avec un ratio molaire 25 [polymère 1]/[insuline] de 1,0, les différents réactifs sont mélangés en quantités précisées dans le tableau ci-dessous et dans l'ordre qui suit : Insuline humaine à 200 UI/mL 25 mL Polymère 1 à 99,2 mg/mL 3,61 mL Tampon phosphate 1 M pH 7 500 pL Tween 20 0,78 mM 516 pL Glycérine 1,5 M 621 pL m-crésol 130 mM 11,15 mL Eau (Volume pour dilution ù volume de soude) 8,55 mL Le pH final est de 7 � 0,3. 30 35 Cette solution limpide est filtrée sur 0,22 pm puis est placée à +4°C L'exemple 6 a été préparé selon le même mode opératoire en faisant varier le volume de solution de polymère 2 pour atteindre le ratio 5 massiques polymère/insuline indiqués dans le tableau. Les solutions finales ont un pH de 7, limpides et filtrées sur 0,22 pm. Exemple Polymère ratio massique Antibactériens Excipients Polymère/insuline (mM) 1 1,0 Crésol (29) 8 pM Tween, Glycérine 6 2 0,5 Crésol (29) 8 pM Tween, Glycérine Exemple 7 : Injectabilité des solutions Toutes ces solutions sont injectables avec les systèmes habituels d'injection d'insuline. Les solutions décrites dans les exemples 1, 2, 5 et 6 sont injectées toutes aussi facilement avec des seringues à insuline avec des aiguilles de 31 Gauge qu'avec des stylos à insuline de Novo, commercialisé sous le nom de Novopen, équipés d'aiguilles de 31 Gauge. Exemple 8 : Protocole de mesure de la Pharmacodynamie des solutions d'insuline 6 cochons domestiques d'environ 50 kg, préalablement cathétérisés au niveau de la jugulaire, sont mis à jeun 2 à 3 heures avant le début de l'expérience. Dans l'heure précédant l'injection d'insuline, 3 prélèvements sanguins sont réalisés afin de déterminer le niveau basal de glucose. L'injection d'insuline à la dose de 0.125 Ul/kg est réalisée en sous-cutané au niveau du cou, sous l'oreille de l'animal à l'aide du stylo à insuline 25 Novopen équipé d'une aiguille 31 G. Des prélèvements sanguins sont ensuite réalisés toutes les 10 minutes sur 3 heures puis toutes les 30 minutes jusqu'à 5 heures. Après chaque prélèvement, le cathéter est rincé avec une solution diluée d'héparine. Une goutte de sang est prélevée pour déterminer la glycémie au 30 moyen d'un glucomètre. Les courbes de pharmacodynamie du glucose sont ensuite tracées. Exemple 9: Résultats de Pharmacodynamie des solutions d'insuline Les résultats obtenus représentés sur les courbes de la figure 1 montrent que les deux formulations de complexe entre l'insuline humaine selon l'invention (courbe avec les croix correspondant à l'exemple 5 et courbe avec les carrés correspondant à l'exemple 6) permettent d'obtenir un délai d'action (onset of action) inférieur à celui d'une formulation commerciale d'insuline humaine (courbe avec les triangles correspondant à l'exemple 2).10 Revendications1. Complexe entre l'insuline humaine et un polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles, ledit polysaccharide étant choisi parmi les polysaccharides fonctionnalisés par au moins un dérivé de la phénylalanine, noté Phe : - ledit dérivé de la phénylalanine étant greffé ou lié aux polysaccharides par couplage avec une fonction acide, ladite fonction acide étant une fonction acide portée par un bras de liaison R lié au polysaccharide par une fonction F, ladite fonction F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction ûOH du polysaccharide, - F étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate ou éther, - R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction carboxyle, - Phe étant un reste d'un dérivé de la phénylalanine, L ou D, produit du couplage entre l'amine de la phénylalanine et au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles. 2. Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi les polysaccharides de formule 1 :25Formule I • le polysaccharide étant un dextrane, • F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction ûOH du polysaccharide et étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate ou éther, • R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction carboxyle, • Phe étant un reste d'un dérivé de la phénylalanine, L ou D, produit du couplage entre l'amine du dérivé de la phénylalanine et au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles, n représente la fraction molaire des R substitués par Phe et est comprise entre 0,05 et 0,5, de préférence entre 0,1 et 0,45, encore de préférence entre 0,2 et 0,4, i représente la fraction molaire des groupements F-R-[Phe], portés par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, - lorsque R n'est pas substitué par Phe, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na' ou K. 3. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther. Polysaccharide 15 4. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants : OH OH 5 F ou leurs sels de cations alcalins. 5. Complexe selon l'une quelconque des revendications 10 précédentes caractérisé en ce que le dérivé de la phénylalanine est choisi dans le groupe constitué par la phénylalanine et ses sels de cation alcalin, le phénylalaninol , le phénylalaninamide, l'éthyle benzyle amine. 6. Complexe selon l'une quelconque des revendications 15 précédentes caractérisé en ce que le dérivé de la phénylalanine est choisi parmi les esters de la phénylalanine de formule Il Formule Il OE 20 E étant un groupement pouvant être un alkyle linéaire ou ramifié en ci àC6. 7. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'insuline est une insuline humaine 25 recombinante telle que décrite dans la Pharmacopée Européenne. 8. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les ratios molaires polymère/insuline sont compris entre 0,1 et 5. 5 9. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que les ratios molaires polymère/insuline sont compris entre 0,15 et 2 et de préférence entre 0,2 et 1. 10. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que les ratios massiques polymère/insuline sont compris entre 0,2 et 10. 10 11. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que les ratios massiques polymère/insuline sont compris entre 0,5 et 8 et de préférence entre 1 et 4. 12. Composition pharmaceutique comprenant au moins un 15 complexe selonl'une quelconque des revendications 1 à 11. 13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'une solution injectable. 20 14. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 13 caractérisée en ce que la concentration en insuline des solutions est de 600pM soit 100 Ul/ml. 15. Utilisation d'un complexe selon l'une quelconque des 25 revendications 1 à 11 pour la préparation d'une formulation d'insuline humaine à une concentration voisine en insuline de 600 pM (100 UI/mL) dont le délai d'action est inférieur à 30 minutes, de préférence inférieur à 20 minutes, et encore de préférence inférieur à 15 minutes. 30 16. Utilisation d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour la préparation d'une formulation d'insuline humaine à une concentration en insuline voisine de 600 pM(100 UI/ml) dont le nadir glycémique est inférieur à 120 minutes, de préférence inférieur à 105 minutes, et encore de préférence inférieur à 90 minutes. 35 17. Utilisation d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la préparation d'une formulation d'insuline à 100 Ul/ml destinée aux pompes à injection.