FR 2942807 A1 20100910 FR 0951461 A 20090309 PROCÉDÉ DE DÉTECTION, D'IDENTIFICATION ET/OU DE QUANTIFICATION DE NANOTUBES DE CARBONE DESCRIPTION 5 DOMAINE TECHNIQUE La présente invention appartient au domaine des nanotechnologies et, notamment, au domaine des nano-objets tels que des nanotubes de carbone. En effet, la présente invention vise à 10 fournir un procédé permettant de détecter, d'identifier et/ou de quantifier des nanotubes de carbone. Le procédé selon l'invention est basé sur la fonctionnalisation des nanotubes par une séquence nucléotidique et sur une amplification biologique à 15 laquelle les nanotubes ainsi fonctionnalisés sont soumis. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir une limite de détection des nanotubes très basse et est facile à mettre en oeuvre sur le lieu de travail et pour la surveillance de l'environnement. 20 La présente invention propose également un kit pour la mise en oeuvre d'un tel procédé. ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE Grâce à leurs propriétés exceptionnelles, 25 les nanotubes de carbone (NTC) sont des nanomatériaux très étudiés aujourd'hui. Des milliers de publications scientifiques concernant les NTC sortent chaque année. Rappelons, tout d'abord, qu'un nanotube de carbone est défini comme un enroulement concentrique 30 d'une ou de plusieurs couches de graphène (pavage 2 d'hexagones de carbone). On parle d'un nanotube mono-paroi ou SWNT (acronyme anglais pour � Single Wall NanoTube �) lorsqu'il s'agit d'une seule couche de graphène et d'un nanotube multi-paroi ou MWNT (acronyme anglais pour � Multi Wall NanoTube �) dans le cas de plusieurs couches de graphène. De par leur structure unique et leurs dimensions caractérisées par un rapport longueur/diamètre élevé, les nanotubes présentent des propriétés mecaniques, électriques et thermiques exceptionnelles. Grâce à ces propriétés, de plus en plus d'applications utilisant les NTC sont transférées du laboratoire à un produit commercial. Ainsi, les NTC peuvent être déjà trouvés dans les raquettes de tennis, les vélos, les écrans de TV et les pneumatiques, tout comme dans des résines utilisées par l'industrie aérospatiale, la défense, la micro-électronique, etc.... La production de NTC augmentera sans doute de façon importante dans les prochaines années. Par exemple, Bayer, l'un des principaux fournisseurs de NTC, a annoncé une capacité de production de 3000 t de NTC par an en 2012. Dans ce contexte, l'exposition aux NTC, surtout pour les chercheurs dans les laboratoires et les ouvriers industriels, augmentera considérablement au cours des prochaines années. Les NTC pourront également très certainement être disséminés dans l'environnement avec donc des risques éventuels pour la population humaine mais également pour la faune et/ou la flore. En effet, actuellement, un débat intense existe au sujet de la toxicité des 3 NTC : pour certains, les NTC ne sont pas toxiques [1,2] alors que, pour d'autres, ils le sont [3-5]. Il est donc devenu important de mettre au point une technique pour détecter, quantifier et identifier les NTC sur le lieu de travail et dans l'environnement. La détection des NTC proprement dite est un domaine très peu développé qui n'a fait l'objet que de très peu d'études. En effet, à cause de leurs dimensions nanométriques, les NTC sont très difficilement détectables par des techniques classiques. Ainsi, par exemple, ils ne peuvent pas être détectés par la microscopie optique à contraste de phase, une technique standard pour la détection de fibres [6]. Toutefois, des scientifiques ont proposé la détection des NTC par d'autres méthodes microscopiques ou spectroscopiques [7]. Les techniques microscopiques, telles que la microscopie à effet tunnel ou STM (acronyme anglais pour � Scanning Tunneling Microscopy �), la microscopie électronique en transmission ou TEM (acronyme anglais pour � Transmission Electron Microscopy �), la microscopie électronique à balayage ou SEM (acronyme anglais pour � Scanning Electron Microscopy �) ou la microscopie à force atomique ou AFM (acronyme anglais pour � Atomic Force Microscopy �), sont des techniques qui peuvent être utilisées pour détecter des NTC. Toutefois, ces techniques ont des sensibilité et sélectivité relativement bonnes. Mais, les conditions d'utilisation de ces techniques sont très critiques pour des analyses de routine. En particulier, cela nécessite que l'on connaisse déjà avec exactitude la 4 localisation des nanotubes de carbone, les techniques précitées n'étant efficaces qu'à la confirmation de la présence dudit NTC. Egalement, elles ne peuvent être mises en oeuvre avec des dispositifs portables. Enfin, elles ne permettent pas une identification des nanotubes, ce qui peut être gênant en cas d'incident mais également pour gérer un procédé de production. Les techniques spectroscopiques, telles que les spectroscopies Raman et de fluorescence, peuvent être adaptées pour l'analyse de routine. Mais la spectroscopie Raman ne montre une sélectivité que pour certains NTC, en particulier les SWNT. Weisman et collaborateurs ont établi une méthode de détection des SWNT par fluorescence dans des organismes intacts [8]. Cette méthode sensible et sélective ne permet de détecter que des SWNT individuels (i.e. monodispersés). De plus, la nécessité d'intégrer des lasers avec différentes longueurs d'onde dans un dispositif pour détecter, identifier et éventuellement quantifier des NTC notamment lors des procédés de production augmente le prix de revient dudit dispositif et des NTC. Enfin, les techniques spectroscopiques ne rendent possible aucune discrimination entre les différents NTC. Il existe donc un réel besoin pour un procédé permettant de détecter, éventuellement d'identifier et éventuellement de quantifier un ou plusieurs NTC et ce avec une grande sélectivité et une grande sensibilité. EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention permet de résoudre des problèmes techniques et inconvénients précédemment listés. En effet, les inventeurs se sont intéressés à la détection des NTC par des techniques biochimiques classiques telles que des techniques d'amplification suite à la fonctionnalisation des NTC par des séquences nucléotidiques. Cette amplification permet d'atteindre des limites de détection très basses. Elle permet également de réaliser une détection en temps réel ou bien en fin de réaction. Elle permet aussi de quantifier les NTC. D'autre part, la fonctionnalisation des NTC par des séquences nucléotidiques permet une identification de ces NTC. En effet, les séquences nucléotidiques sont principalement constituées de nucléotides (A, T, C, G, U ou autres) pouvant être associés dans une infinité de positions constituant ainsi une séquence primaire pouvant être assimilée à un code barre. Par conséquent, la présente invention concerne un procédé pour détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier au moins un nanotube de carbone éventuellement présent dans un échantillon comprenant les étapes consistant à : (a) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification d'une séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique, 5 6 ledit nanotube de carbone éventuellement présent ayant été fonctionnalisé par ladite séquence nucléotidique préalablement à ladite étape (a), et (b) détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier le produit d'amplification éventuellement obtenu suite à l'étape (a). Dans une première forme de mise en oeuvre de la présente invention, le nanotube de carbone que l'échantillon est susceptible de contenir a été fonctionnalisé par une séquence nucléotidique préalablement au prélèvement d'un échantillon susceptible de contenir un tel nanotube de carbone et ce, notamment lors du procédé de préparation dudit nanotube de carbone. Ainsi, le procédé selon la présente invention comprend avantageusement les étapes successives suivantes consistant à : a1) préparer au moins un nanotube de carbone fonctionnalisé par au moins une séquence nucléotidique ; b1) prélever un échantillon susceptible de contenir ledit nanotube de carbone ; c1) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification de ladite séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique ; et d1) détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier le produit d'amplification éventuellement obtenu suite à l'étape (c1). Dans cette forme de mise en oeuvre, la fonctionnalisation permet de détecter et d'identifier 7 le nanotube de carbone présent dans un échantillon. En effet, lors de la préparation dudit nanotube, sa fonctionnalisation par une séquence nucléotidique particulière permet la traçabilité dudit nanotube. Cette forme de mise en oeuvre est particulièrement adaptée au contrôle qualité et à la vérification de la production des NTC. On peut envisager que, lors de leur préparation, différents lots de NTC répartis en fonction de critères tels que leur nature, leur site de production, leur procédé de préparation, leur classe de toxicité, la procédure d'élimination à suivre, leur éventuelle modification chimique, leur nombre de parois, leur longueur moyenne, leur largeur moyenne soient marqués par des séquences nucléotidiques particulières et spécifiques à chacun des lots. Ainsi, lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, un mélange d'amorces aptes à amplifier ces séquences nucléotidiques peut être utilisé lors de l'étape (b1) afin d'identifier avec précision les nanotubes présents dans l'échantillon. Dans une seconde forme de mise en oeuvre de la présente invention, le nanotube de carbone que l'échantillon est susceptible de contenir est fonctionnalisé par une séquence nucléotidique suite au prélèvement dudit échantillon. Ainsi, dans cette forme de mise en oeuvre, le procédé selon la présente invention comprend avantageusement les étapes successives suivantes consistant à : a2) mettre en contact ledit échantillon avec au moins une séquence nucléotidique dans des conditions 8 permettant la fonctionnalisation du (ou des) nanotube(s) éventuellement présent (s) par ladite séquence nucléotidique ; b2) éliminer toute séquence nucléotidique non impliquée dans la fonctionnalisation ; c2) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification de ladite séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique ; et d2) détecter et éventuellement quantifier le produit d'amplification éventuellement obtenu suite à l'étape (02). Tout ce qui suit comme les définitions et les variantes s'applique au procédé selon la présente invention et notamment à ces deux formes de mise en oeuvre, sauf indication contraire explicite. Dans le cadre de la présente invention, l'échantillon mis en oeuvre peut être tout échantillon, liquide ou solide, susceptible de contenir ou d'être contaminé par un (ou plusieurs) nanotube(s) de carbone. Avantageusement, ledit échantillon est choisi dans le groupe constitué par un échantillon biologique ; un échantillon d'eau de ville, de rivière, de mer, de lac, souterraine ou de tours aéro-réfrigérées ; un prélèvement aérien ; un échantillon de terre ; un échantillon obtenu sur un site industriel ou un de leurs mélanges. Par � échantillon biologique �, on entend dans le cadre de la présente invention un échantillon 9 obtenu à partir d'un organisme végétal ou animal tel qu'un humain, vivant ou mort. Cet échantillon biologique peut notamment être un échantillon obtenu à partir d'une plante entière ou d'une partie de plante comme la tige, les racines, les fleurs, les feuilles, les graines ou la sève. Cet échantillon biologique peut également être tout fluide naturellement sécrété ou excrété d'un corps humain ou animal ou tout fluide récupéré, à partir d'un corps humain ou animal tel que du sang, du sérum sanguin, du plasma sanguin, de la lymphe, de la salive, un crachat, des larmes, de la sueur, du sperme, de l'urine, des selles, du lait, du liquide céphalo-rachidien, du liquide interstitiel, un fluide isolé de moelle osseuse, un mucus ou fluide du tractus respiratoire, intestinal ou génito-urinaire, des extraits cellulaires, des extraits de tissus et des extraits d'organes. Par � échantillon obtenu sur un site industriel �, on entend, dans le cadre de la présente invention, un prélèvement obtenu sur tout site industriel et, en particulier, un site sur lequel sont produits, conditionnés et/ou stockés des nanotubes de carbone ou un site de rejets industriels. Ce prélèvement peut se présenter sous la forme de poussières notamment récupérées au sol, sur tout appareil de production ou sur tout filtre d'aération. L'échantillon mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention peut présenter un volume très variable et peut avoir été obtenu par toute technique connue de l'homme du métier telle qu'une extraction, une aspiration, un prélèvement ou un lavage. 10 De plus, avant la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, ledit échantillon peut subir un traitement préparatif tel qu'un traitement enzymatique, un broyage, une dilution, une solubilisation, une centrifugation et/ou une filtration. Un traitement enzymatique préféré consiste à soumettre ledit échantillon à l'action d'au moins une nucléase telle qu'une RNAse, une DNAse et/ou une endonucléase et ce afin d'éliminer toute séquence nucléotidique présente dans l'échantillon et susceptible de donner des � faux � positifs, étant entendu que l'enzyme employée est inactive vis-à-vis de l'extrémité par laquelle la séquence nucléotidique est fixée au NTC. Ce traitement par une (ou des) nucléase(s) est particulièrement adapté pour la seconde forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention. L'expression � séquence nucléotidique � utilisée dans la présente est équivalente aux termes et expressions suivants : � acide nucléique �, � polynucléotide �, � molécule nucléotidique �, � séquence polynucléotidique �. La séquence nucléotidique dans le cadre de la présente invention est avantageusement choisie dans le groupe constitué par un oligonucléotide, éventuellement modifié ; un acide désoxyribonucléique (ADN), éventuellement modifié, tel qu'un ADN, simple-brin ou double-brin, génomique, chromosomique, chloroplastique, plasmidique, mitochondrial, recombinant ou complémentaire ; un acide ribonucléique (ARN), éventuellement modifié, tel qu'un 11 ARN messager, ribosomal, de transfert ; une portion et un fragment de ceux-ci. Par � oligonucléotide (ou ADN ou ARN) modifié �, on entend, dans le cadre de la présente invention, un oligonucléotide (ou un ADN ou un ARN), naturel ou synthétique, modifié chimiquement notamment pour augmenter l'efficacité et la sélectivité lors de la fonctionnalisation des NTC. Ainsi, à titre d'exemple de modifications chimiques, on peut citer l'introduction d'une amine ou d'un thiol à l'extrémité 5'-terminale de la séquence nucléotidique. Avec ces fonctions, la séquence nucléotidique peut réagir avec des acides carboxyliques activés [9] ou des maléimides [10] qui ont été greffés sur les NTC. On a ainsi formation de liaison covalente entre le nanotube de carbone et la séquence nucléotidique. La séquence nucléotidique susceptible d'être utilisée dans le cadre de la présente invention peut être extraite d'organismes vivants tels qu'animaux, végétaux, levures, bactéries, champignons ou synthétisée chimiquement. Les techniques permettant d'extraire une séquence nucléotidique d'un organisme tout comme les techniques permettant de synthétiser une séquence nucléotidique sont bien connues de l'homme du métier. La séquence nucléotidique susceptible d'être utilisée dans le cadre de la présente invention comprend avantageusement de 20 à 3000 nucléotides, notamment de 20 à 1000 nucléotides, en particulier de 30 à 150 nucléotides et, plus particulièrement, de 40 à 120 nucléotides. 12 Dans le cadre de la seconde forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, la séquence nucléotidique peut avoir une taille identique ou comprendre, par exemple, avantageusement de 20 à 100 nucléotides, notamment de 30 à 80 nucléotides et, en particulier, de 40 à 60 nucléotides. Toute séquence génétique rencontrée dans la nature ou non est utilisable puisque cette forme de mise en oeuvre prévoit un traitement de l'échantillon visant à éliminer toute séquence nucléotidique présente dans ce dernier, préalablement à la fonctionnalisation à l'étape (a2) du procédé. De plus, il est possible de coder de l'information sur cette séquence nucléotidique et ce, notamment dans le cadre de la première forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Dans ce cas, ladite séquence nucléotidique associe plusieurs blocs, chaque bloc comprenant entre 10 et 20 bases. Le nombre de blocs peut être variable et l'état de l'art en synthèse d'oligonucléotides permet d'envisager des constructions comprenant jusqu'à 2 blocs externes (ci-après désignés blocs B) de 15 bases constituant les séquences reconnues par les amorces lors des étapes (a), (c1) et (c2) et 6 blocs internes de 15 bases, pour une longueur totale de 120 bases. Les deux blocs B peuvent être génériques, c'est-à-dire que les mêmes séquences consensus ont été choisies par tous les producteurs de NTC. Elles sont donc identiques quelle que soit l'origine des NTC et il y aura toujours amplification lors des étapes (a), (c1) et (c2), si des NTC sont effectivement présents dans l'échantillon testé. Ils 13 peuvent également être spécifiques et correspondre a priori à des informations plutôt générales telles que le site de production, chaque site étant défini par un couple d'amorces particulier. Les blocs internes principalement utilisés lors des étapes de détection et notamment pour l'hybridation sur microarray ou bien pour l'hybridation d'une sonde spécifique utilisée lors de la PCR en temps réel, peuvent avoir des séquences correspondant à différentes informations telles que la classe de toxicité du NTC, la procédure d'élimination à suivre, son éventuelle modification chimique, son nombre de parois, sa longueur moyenne ou sa largeur moyenne. Les séquences utilisées pour tous les blocs codant ne correspondent avantageusement à aucune séquence génétique rencontrée dans la nature pour ne pas avoir de � faux � positifs. Si cela ne s'avère pas possible, seuls les blocs B seront conçus pour ne coder pour aucune séquence rencontrée dans le monde du vivant ou au moins pour des espèces susceptibles d'être présentes et amplifiées par PCR lors de tests de routine, tels que des bactéries, des virus, des pollens, etc.... Ainsi, selon l'invention, la séquence nucléotidique présente sur les NTC peut être composée de blocs de compositions et de séquences différentes. La construction des polynucléotides pourra également comprendre une séquence espaceur. Par � séquence espaceur �, on entend, dans le cadre de la présente invention, une séquence d'une dizaine de bases qui espace la zone codante de la séquence nucléotidique du NTC fonctionnalisé. Cette séquence espaceur permet 14 de diminuer l'encombrement stérique dû au NTC qui peut diminuer le rendement d'amplification lors des étapes (a), (c1) et (02) La présente invention s'applique à tout type de nanotubes de carbone et ce quel que soit leur procédé de préparation. Ainsi, les nanotubes de carbone à détecter, éventuellement à identifier et éventuellement à quantifier via le procédé selon l'invention peuvent être des nanotubes à une seule couche de graphène (SWNT), des nanotubes à plusieurs couches de graphène (MWNT) ou un mélange de nanotubes SWNT et de nanotubes MWNT. Ces nanotubes peuvent présenter une longueur comprise entre 10 nm et 10 mm, notamment entre 100 nm et 10 �m, en particulier entre 500 nm et 3 �m. L'homme du métier connait différentes techniques permettant de préparer de tels nanotubes de carbone. A titre d'exemples, on peut citer les procédés physiques basés sur la sublimation du carbone tels que des méthodes d'arc électrique, d'ablation laser ou utilisant un four solaire et les procédés chimiques consistant à pyrolyser des sources carbonées sur des catalyseurs métalliques et s'apparentant au procédé de dépôt chimique en phase vapeur (CVD) tels que notamment le procédé de pyrolyse objet de la demande internationale WO 2004/000727 [11]. La présente invention nécessite la fonctionnalisation des nanotubes de carbone par une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s). Comme déjà 15 expliqué, cette fonctionnalisation peut avoir lieu avant le prélèvement de l'échantillon à tester (première forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention) ou après ledit prélèvement (seconde forme de mise en oeuvre). L'intervalle de temps séparant les étapes (a1) et (b1) ou le prélèvement préalable de l'échantillon et l'étape (a2) peut être de l'ordre de quelques minutes, quelques heures, plusieurs semaines, voire plusieurs mois. La fonctionnalisation des NTC par des biomolécules a été beaucoup étudiée pour des applications biologiques et biomédicales. Les méthodes de fonctionnalisation des NTC peuvent être divisées en deux catégories : les fonctionnalisations covalentes et les fonctionnalisations non covalentes telles que des physio-adsorptions. Par conséquent, dans une première variante, lors de la fonctionnalisation du (ou des) NTC par une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) dans le cadre du procédé selon l'invention et notamment dans le cadre des étapes (a1) et (a2), la séquence nucléotidique se lie de façon covalente au(x)dit(s) nanotube (s) . De même, plusieurs séquences nucléotidiques, identiques ou différentes, peuvent se fixer de façon covalente à un même NTC. De façon avantageuse, cette liaison covalente peut être indirecte. En effet, la fonctionnalisation des NTC par une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) se fait via un espaceur. Par � espaceur �, on entend dans le cadre de la 16 présente invention un composé chimique susceptible de se lier, de façon covalente, d'une part, à un NTC et, d'autre part, à une séquence nucléotidique. Un tel espaceur comprend donc deux fonctions chimiques distinctes et capables de former une liaison covalente, une avec un groupement porté par le NTC et l'autre avec un groupement porté par la séquence nucléotidique. Avantageusement, la liaison covalente et indirecte se fait via un espaceur présentant au moins deux fonctions chimiques distinctes, identiques ou différentes, choisies dans le groupe constitué par une fonction carboxyle (susceptible de réagir avec une fonction amine ou alcool), un groupe aryle (tel que le pyrène, le naphtalène ou les polyaromatiques), une entité radicalaire, une fonction hydroxyle ou une fonction alcool (susceptible de réagir avec une fonction carboxyle ou isocyanate), une fonction amine (susceptible de réagir avec une fonction ester), une fonction ester (susceptible de réagir avec une fonction amine), une fonction aldéhyde (susceptible de réagir avec une fonction hydrazide), une fonction hydrazide (susceptible de réagir avec une fonction aldéhyde), une fonction cétone (susceptible de réagir avec deux fonctions alcool, acetalysation), une fonction époxy (susceptible de réagir avec une fonction amine), une fonction isocyanate (susceptible de réagir avec une fonction hydroxyle), une fonction maléimide (susceptible de réagir avec une fonction thiol, une fonction amine ou un diène), un diène (susceptible de réagir avec une fonction maléimide) et une fonction 17 thiol (susceptible de réagir avec une fonction maléimide ou une autre fonction thiol). Par � groupe aryle �, on entend, dans le cadre de la présente invention, une structure carbonée aromatique ou hétéroaromatique, éventuellement mono- ou polysubstituée, de 3 à 30 atomes de carbone, constituée d'un (ou plusieurs) cycle(s) aromatique(s) ou hétéroaromatique(s) comportant chacun de 3 à 8 atomes, le (ou les) hétéroatome(s) pouvant être N, 0, P ou S. Le (ou les) substituant(s) peut(vent) contenir un ou plusieurs hétéroatome(s), tels que N, 0, F, Cl, P, Si, Br ou S ainsi que des groupes alkyles en Cl à c6. Par � aryle polyaromatique �, on entend un aryle tel que précédemment défini présentant de 2 à 10 cycle(s) aromatique(s) ou hétéroaromatique(s) et notamment de 2 à 5 cycle(s) aromatique(s) ou hétéroaromatique(s). L'état de la technique connaît différents espaceurs, disponibles commercialement, utilisables dans le cadre de la présente invention. Ledit espaceur peut être constitué d'un groupe alkyle présentant au moins deux fonctions chimiques distinctes, identiques ou différentes, telles que précédemment définies. Par � groupe alkyle �, on entend, dans le cadre de la présente invention un groupe alkyle linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué, de 1 à 16 atomes de carbone, notamment de 1 à 12 atomes de carbone, en particulier, de 1 à 8 atomes de carbone, tout particulièrement, de 1 à 6 atomes de carbone et, plus particulièrement, de 1 à 3 atomes de carbone. Le (ou les) substituant(s) peut(vent) contenir un ou plusieurs 18 hétéroatome(s), tels que N, 0, F, Cl, P, Si, Br ou S ainsi que des groupes alkyles en C1 à C6. Avantageusement, le groupe alkyle mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention est un groupe méthyle, un groupe éthyle, un groupe propyle, un groupe isopropyle ou un groupe cyclopropyle. A titre d'exemples d'espaceurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer, les espaceurs notamment décrits dans la demande internationale WO 03/053846 [12] le p-azidobenzoyl hydrazide, l'acide N-E-maleimidocaproïque, le sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidométhyl)-cyclohexane-1-carboxylate et le N-(p-maleimidophényl)-isocyanate. Comme les NTC sont très peu réactifs, la fonctionnalisation covalente des NTC par des biomolécules telles qu'une séquence nucléotidique se fait souvent en deux étapes : la génération de sites réactifs sur les NTC suivie de la réaction de ces sites avec les biomolécules ou les espaceurs. Ainsi, dans le cadre du procédé selon la présente invention, l'étape de fonctionnalisation comprend deux sous-étapes consistant à : (i) soumettre l'échantillon ou le(s)dit(s) nanotube(s) à des conditions permettant la formation d'au moins une entité réactive à la surface d'un nanotube de carbone, puis (ii) mettre en contact ledit échantillon ou le(s)dit(s) nanotube(s) avec au moins une séquence nucléotidique et éventuellement avec un espaceur tel que précédemment défini. 19 Avantageusement, l'entité réactive formée à la surface d'un NTC lors de l'étape (i) présente un groupement choisi dans le groupe constitué par une fonction carboxyle, un groupe aryle de type aryle polyaromatique, une entité radicalaire, une fonction hydroxyle, une fonction alcool, une fonction amine, une fonction ester, une fonction aldéhyde, une fonction hydrazide, une fonction cétone, une fonction époxy, une fonction isocyanate, une fonction maléimide, un diène et une fonction thiol ou un groupe alkyle tel que précédemment défini, substitué par un tel groupement. Concernant l'étape (i), il existe des revues dans la littérature sur la fonctionnalisation covalente des NTC [13]. On relève ici quelques exemples de méthodes susceptibles d'être mises en oeuvre lors de l'étape (i) car générant des entités réactives à la surface de NTC et permettant de greffer des biomolécules telles que des séquences nucléotidiques par la suite : - l'oxydation des NTC par des oxydants forts tels que HNO3/H2SO4 [14], H2O2 [15], KMnO4/H2SO4 [16], etc. Une telle oxydation en phase liquide permet de générer des fonctions oxygénées telles que des fonctions alcool, carboxyle et cétone sur les extrémités ou défauts des NTC ; - l'arylation des NTC par du diazonium [17] ; - la fonctionnalisation des NTC par cycloaddition 13-dipolaire [18] ; 20 - la fonctionnalisation des NTC par cycloaddition [2+1] [19]. Ces NTC porteurs d'une (ou plusieurs) entité(s) réactive(s) telle(s) que précédemment définie(s) peuvent ensuite réagir directement avec une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) ou avec un (ou plusieurs) espaceur(s) tels que précédemment défini(s). Lors de l'étape (ii) et dans le cas d'une réaction impliquant un espaceur, ce dernier peut réagir avec la séquence nucléotidique, avant, pendant ou après la réaction dudit espaceur avec le NTC. Dans une seconde variante du procédé selon la présente invention, lors de la fonctionnalisation du (ou des) NTC par une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) dans le cadre du procédé selon l'invention et notamment dans le cadre des étapes (a1) et (a2), la séquence nucléotidique se lie de façon non covalente au(x)dit(s) nanotube (s) . En effet, plusieurs séquences nucléotidiques, identiques ou différentes, peuvent se fixer de façon non covalente à un même NTC. Grâce à la surface aromatique hydrophobique des NTC, ces derniers peuvent être fonctionnalisés par des séquences nucléotidiques de façon non covalente à l'extérieur ou à l'intérieur des NTC. Par exemple, une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) peu(ven)t pénétrer dans la cavité d'un MWNT ouvert, et le transport de cette (ou ces) séquence(s) nucléotidique(s) à l'intérieur du MWNT peut être suivi par fluorescence [20]. L'immobilisation des séquences 21 nucléotidiques sur les NTC se fait alors par des interactions hydrophobiques et des interactions Van der Waal, l'interaction hydrophobique jouant un rôle plus important. L'avantage d'une fonctionnalisation non covalente réside dans le fait qu'elle conserve la structure des NTC. Il est, ainsi, possible de comparer les propriétés des NTC avant et après la fonctionnalisation, telles que les propriétés électroniques et spectroscopiques, ce qui peut être important pour certaines applications. De façon avantageuse, cette liaison non covalente peut être indirecte. En effet, la fonctionnalisation des NTC par une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) peut se faire via une molécule intermédiaire capable de se lier de façon non covalente audit NTC et de se lier, de façon covalente ou non covalente, à ladite séquence nucléotidique. Plus particulièrement, ladite molécule intermédiaire se lie de façon covalente à ladite séquence nucléotidique et ce via un groupement choisi dans le groupe constitué par une fonction carboxyle, un groupe aryle, une entité radicalaire, une fonction hydroxyle, une fonction alcool, une fonction amine, une fonction ester, une fonction aldéhyde, une fonction hydrazide, une fonction cétone, une fonction époxy, une fonction isocyanate, une fonction maléimide, un diène et une fonction thiol ou via un groupe alkyle tel que précédemment défini, substitué par un tel groupement. En effet, il est connu que le pyrène s'adsorbe fortement sur la surface des NTC par � nùn 22 stacking �. A titre d'exemple de molécules intermédiaires, on peut donc citer un dérivé de pyrène présentant au moins un groupement tel que précédemment défini et, notamment, l'ester de l'acide 1- pyrènebutyrique et du N-hydroxysuccinimide capable de réagir avec une fonction amine portée par ladite séquence nucléotidique. Dans le cadre de la seconde forme de mise en oeuvre de la présente invention, l'étape (b2) consiste à éliminer toute séquence nucléotidique n'ayant pas fonctionnalisé un NTC et ce, pour éviter des � faux � positifs dus à des séquences nucléotidiques libres. L'homme du métier connaît différentes techniques susceptibles d'être utilisées pour cette élimination. Avantageusement, l'étape (b2) peut comprendre au moins un lavage, au moins une centrifugation et/ou au moins une filtration, ou tout autre moyen à la portée de l'homme du métier dans sa pratique courante tel que la dialyse ou l'ultrafiltration. L'homme du métier saura choisir un tampon pour le (ou les) lavage(s) adéquat en fonction du type de fonctionnalisation mise en oeuvre (covalente ou non covalente). A titre d'exemples, ce tampon peut être de l'eau ou du PBS. Les méthodes d'amplification d'une séquence nucléotidique sont bien connues aujourd'hui et reposent sur l'utilisation d'une enzyme de type polymérase qui a la propriété de recopier fidèlement une séquence génétique d'un polynucléotide à partir d'une zone 23 amorce (zone double brin). Aussi, dans le cadre de la présente invention, l'amplification mise en oeuvre aux étapes (a), (c1) ou (c2) peut aussi bien être une amplification par réaction en chaîne par polymérase ou PCR (acronyme anglais pour � Polymerase Chain Reaction �) classique que toute variante de PCR connue de l'homme du métier telle qu'une PCR asymétrique, une PCR asymétrique thermique entrelacée, une PCR en gradient de température, une PCR en point final, une PCR multiplexe, une PCR en temps réel (ou quantitative), une RT-PCR (acronyme anglais pour � Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction �), une RT-PCR multiplexe, une NASBA (acronyme anglais pour � Nucleic Acid Sequence Based Amplification �), une LCR (acronyme anglais pour � Ligase Chain Reaction �) ou une TMA (acronyme anglais pour � Transcription Mediated Amplification �). La méthode d'amplification mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention peut également comprendre des améliorations telles que les techniques � Hot start �, � Touchdown � ou l'utilisation de dUTP à la place des dTTP pour la décontamination par l'UNG (acronyme anglais pour � Uracil-DNA glycosylase �) de tout nouvel échantillon. Par � RT-PCR �, on entend une transcription inverse suivie d'une amplification en chaîne par polymérase. Une RT-PCR comporte donc deux étapes : une étape de transcription inverse, i.e. de synthèse d'un ADN simple brin complémentaire d'une séquence d'ARN, mettant en oeuvre une transcriptase inverse suivie d'une étape d'amplification en chaîne par polymérase. 24 Par � PCR multiplexe �, on entend une méthode d'amplification visant à amplifier plus d'un amplicon à la fois. Cette technique utilise un ensemble de paires d'amorces d'amplification, chaque paire d'amorces étant conçue ou adaptée pour amplifier une séquence nucléotidique différente. Par � RT-PCR multiplexe �, on entend une PCR multiplexe telle que précédemment définie précédée d'une transcription inverse telle que précédemment définie. Par � PCR en temps réel �, on entend une méthode d'amplification qui permet de détecter et/ou de quantifier la présence des amplicons durant les cycles de PCR notamment grâce à un marqueur fluorescent. L'augmentation des amplicons ou du signal lié à la quantité d'amplicons formés durant les cycles de PCR est utilisée pour la détection et/ou la quantification d'une séquence nucléotidique donnée dans la solution soumise à la PCR. Par � NASBA �, on entend une méthode d'amplification d'ARN sans changement de température en employant une amorce promoteur pour la T7-ARN polymérase, une transcriptase inverse, des dNTP (désoxyribonucléotide triphosphate) et des NTP (ribonucléotides triphosphates), ainsi qu'une RNAse-H. Par � LCR �, on entend une méthode d'amplification mettant en oeuvre une ADN ligase et deux amorces complémentaires de l'ADN cible et adjacentes qui sont liées ensemble par l'ADN ligase. Par � TMA �, on entend une méthode isotherme d'amplification d'ARN nécessitant deux 25 enzymes que sont une transcriptase inverse et une ARN polymérase et deux amorces avec une amorce contenant une séquence promotrice pour l'ARN polymérase et l'autre amorce capable de se lier à la séquence d'ADN néosynthétisée. Les conditions mises en oeuvre aux étapes (a), (c1) et (c2) comprennent notamment la présence d'un milieu réactionnel et des conditions de température. Le mélange réactionnel mis en oeuvre lors des étapes (a), (c1) et (c2) peut être tout mélange de réactifs pour PCR ou toute variante de PCR, disponible dans le commerce tel que les kits vendus par les sociétés Roche Applied Science ou Applied Biosystems. En variante, le mélange réactionnel mis en oeuvre lors de l'amplification des étapes (a), (c1) et (c2) peut avoir n'importe quelle composition parmi tous les mélanges réactionnels décrits dans l'état de l'art pour la PCR ou toute variante de PCR. L'homme du métier saura préparer un tel mélange réactionnel en fonction du type de PCR mis en oeuvre lors des étapes (a), (c1) et (c2) selon l'invention. Le mélange réactionnel comprend un (ou plusieurs) élément (s) choisi (s) parmi au moins une enzyme choisie dans le groupe constitué par une ADN ou ARN polymérase telle que la Taq polymérase ou la T7-ARN polymérase, une transcriptase inverse, une RNAse-H et une ADN ligase ; un sel tel que du TRIS (pour � trishydroxyméthylaminométhane �), du KC1, du NaCl ou du MgC12 ; des déoxyribonucléotides triphosphates éventuellement marqués tels que dATP, dGTP, dTTP, dCTP 26 et éventuellement dUTP ; des ribonucléotides triphosphates éventuellement marqués tels que ATP, GTP, TTP, UTP, CTP ; au moins une paire d'amorces, spécifique ou dégénérée, pouvant comprendre de 10 à 100 paires de base, notamment de 15 à 50 paires de base et, en particulier, de 15 à 35 paires de base ; et une amorce oligo-dT ou spécifique notamment utile pour la transcription inverse ou pour la T7-ARN polymérase. En outre, le mélange réactionnel peut contenir d'autres additifs et notamment des additifs connus pour améliorer l'efficacité d'une PCR tels que de la BSA (pour � Bovine Serum Albumin �), de la bétaine, du formamide, du diméthylsulfoxyde, de la gélatine, du glycerol, de la spermidine, du sulfate d'ammonium, de l'Acetamide ou Amide C2, du Tween-20, du polyéthylène glycol (PEG) 6000, des protéines telles que la � Single Strand binding protein from E. Coli � commercialisée par Sigma Aldrich (augmentation de la spécificité de la réaction), ou la � T4 Gene32 Protein from E. Coli B infected with phage T4am134/amBL292/amE219 � commercialisée par Roche Applied Science (augmentation du rendement de production des longs produits de PCR, ou le rendement de la réaction en présence d'inhibiteurs tels que l'acide humique), des inhibiteurs de RNases tels que le � Ribonuclease Inhibitor � ou le Diéthyl pyrocarbonate qui améliorent le rendement de l'étape de transcription inverse lors d'une RT-PCR. Ce mélange réactionnel peut contenir, lorsque l'amplification des étapes (a), (c1) et (c2) est 27 une RT-PCR multiplexe ou une PCR multiplexe, de 2 à 100 paires d'amorces différentes, chaque paire d'amorces étant spécifique ou dégénérée et pouvant comprendre de 10 à 100 paires de base, notamment de 15 à 50 paires de base et, en particulier, de 15 à 35 paires de base. Un exemple de mélange réactionnel utilisable pour une amplification par PCR lors des étapes (a), (c1) et (c2) de l'invention comprend entre 50 et 100 mM de Tris, entre 10 et 100 mM et, avantageusement, 50 mM de KC1 (ou de NaCl), entre 1 et 5 mM de MgC12, entre 20 pM et 1 mM d'un mélange de dNTP contenant des dCTP, dATP, dTTP, dGTP et éventuellement dUTP, entre 0,01 et 0,2 U/pl de la Taq Polymérase hot start ou non, des amorces comprenant de 10 à 100 paires de base, notamment de 15 à 50 paires de base et, en particulier, de 15 à 35 paires de base et pouvant être spécifiques ou dégénérés. Chaque amorce est avantageusement présente, dans ce mélange réactionnel, à une concentration comprise entre 1 et 200 nM et, en particulier, entre 10 et 100 nM. Si l'amplification lors des étapes (a), (c1) et (c2) met en oeuvre une transcription inverse, cette dernière peut durer de 5 à 90 min, typiquement 30 min, et s'effectue à une température comprise entre 25 et 60°C. Lorsque l'amplification mise en oeuvre aux étapes (a), (c1) et (c2) n'est pas une amplification isotherme, des cycles thermiques sont nécessaires. Toutes conditions de température et de durée pour les différents cycles (dénaturation, hybridation et élongation), connues de l'homme du métier et 28 appropriées au type de PCR utilisé lors de ces étapes, sont utilisables. Ainsi, l'amplification lors des étapes (a), (c1) et (c2) et notamment la PCR peut : - comprendre deux températures avec un palier d'hybridationûélongation compris entre 50 et 70°C, avantageusement 60°C, maintenu pendant 5 à 300 secondes et un palier de dénaturation à 95°C maintenu pendant 1 à 30 secondes ; - comprendre trois températures avec un palier d'hybridation compris entre 50 et 65°C, avantageusement de 60°C, maintenu pendant 5 à 300 secondes, un palier d'élongation entre 65°C et 75°C, avantageusement de 72°C, maintenu pendant 5 à 300 15 secondes et un palier de dénaturation à 95°C maintenu pendant 1 à 30 secondes ; ou être des cycles � touch clown � consistant à diminuer progressivement la température d'hybridation de 1°C par cycle par exemple. 20 La réaction lors des étapes (a), (c1) et (c2) peut être conduite dans des tubes plastiques standards du commerce et notamment avec n'importe quel thermocycleur. Les volumes de réaction sont dans ce cas 25 compris entre 5 et 100 pl. La réaction lors des étapes (a), (c1) et (c2) peut être conduite en utilisant un microsystème adapté pour la PCR ou la RT-PCR tel qu'une � PCR chip �. Dans ce cas, les volumes réactionnels sont 30 beaucoup plus petits et compris typiquement entre 10 nl et 1 pl. De plus, de tels microsystèmes ont l'avantage 10 29 d'être très petits et adaptés pour le développement de systèmes d'analyse portables et utilisables directement sur le site de mise en oeuvre du procédé selon l'invention tel qu'un site de production de NTC ou un laboratoire de recherche [21]. Une préamplification de l'échantillon en plus grand volume sur le microsystème ou pas peut être réalisée si nécessaire pour améliorer la limite de détection de la méthode. Dans ce cas, une dizaine de cycles PCR peuvent être réalisés pour cette étape de préamplification. Elle pourra être effectuée en mode monoplexe, c'est-à-dire avec un seul couple d'amorces par mélange réactionnel et en effectuant autant de réactions en parallèle que de couples d'amorces testés. Elle pourra également être effectuée en mode multiplexe, c'est-à-dire avec l'ensemble ou une partie des amorces testées dans le même mélange réactionnel. Dans ce denier mode, des modifications du protocole PCR en termes de concentration d'amorces, de temps et de température des plateaux d'hybridationûélongation pourront être effectuées car il a été montré qu'il est ainsi possible de réaliser cette étape de préamplification en conservant le ratio en concentration des différentes matrices géniques. Il a également été montré que cette méthode est efficace pour un très grand nombre de séquences d'amorces sans optimisation de séquences pour l'amplification multiplexe. La détection du (ou des) éventuel(s) produit (s) amplifié (s) lors des étapes (a), (c1) et (c2) 30 peut se faire, lors des étapes (b), (d1) et (d2), en utilisant toutes les méthodes adaptées à la détection d'un produit d'amplification. A titre d'exemples de méthodes utilisables lors des étapes (b), (d1) et (d2), nous pouvons citer : - les méthodes type électrophorèse qui permettent la détection du produit d'amplification après migration dans un gel ou toute autre matrice adaptée, la distance de migration étant reliée à la taille dudit produit ; - les méthodes d'hybridation sur surface solide ; et/ou - la PCR en temps réel. Ces différentes méthodes peuvent éventuellement être utilisées successivement. Elles seront utilisées en se reposant sur les méthodes de mises en oeuvre connues et décrites dans l'état de l'art. Dans le cas de l'hybridation sur surface solide, le mélange réactionnel obtenu suite aux étapes (a), (c1) et (c2) et contenant éventuellement au moins un produit d'amplification est mis en contact avec un dispositif dont la surface a été préalablement fonctionnalisée avec des oligonucléotides de séquence connue. La surface peut être fonctionnalisée avec des oligonucléotides de séquences différentes en localisant chaque dépôt sous forme de spots par exemple. Des dispositifs commerciaux tels que les puces Affymetrix, ou les puces Agilent sont notamment utilisables. Les techniques classiques de dépôt d'oligonucléotides sur surface solide (� Spotting � avec un robot des 31 oligonucléotides sur surface fonctionnalisée ou synthèse in situ) sont adaptées à la préparation des dispositifs de détection par hybridation. Le mélange réactionnel obtenu suite aux étapes (a), (c1) et (c2) et contenant éventuellement au moins un produit d'amplification peut être déposé soit sans modification sur le dispositif, soit en ajoutant une solution permettant d'optimiser le mélange réactionnel pour l'hybridation en termes de sélectivité vis-à-vis de la séquence des oligonucléotides et de la cinétique d'hybridation. Ce tampon optimisé peut contenir une (ou plusieurs) espèce (s) connue (s) dans l'état de l'art et choisies parmi les sel(s) monovalent(s) tels que par exemple NaCl ou KC1 ; une ou plusieurs espèces permettant de tamponner le pH de la solution ; des additifs permettant de réduire l'adsorption non spécifique d'oligonucléotides recherchés ou marqués avec un fluorophore tels que de l'ADN exogène ; des protéines connues pour saturer les surfaces par adsorption ; et des additifs connus pour accélérer la réaction d'hybridation tels que des agents de condensation de l'ADN connus comme le PEG, les ions multivalentsûspermine, spermidine, magnésium, cobalt hexamine, etc.... A la fin de cette réaction d'hybridation, tout élément ne s'étant pas hybridé avec les oligonucléotides fixés sur la surface sont éliminés par une étape de rinçage. Différentes méthodes peuvent alors être utilisées pour détecter s'il y a eu hybridation entre certains oligonucléotides fixés sur la surface et un produit d'amplification obtenu en solution après les 32 étapes (a), (c1) et (c2). Il est possible d'utiliser des amorces marquées et/ou des dNTP marqués lors de l'amplification des étapes (a), (c1) et (02). Les marqueurs peuvent contenir des espèces détectables telles que des molécules radioactives ou fluorescentes. Dans ce cas, la détection se fait directement après les phases d'hybridation et de rinçage. Egalement, lors de l'amplification, certains dNTP ou NTP sont porteurs d'une fonction (ex : biotine) qui pourra être reconnue par une enzyme ou un conjugué protéine-enzyme. Une fois la reconnaissance faite, l'enzyme catalyse la transformation du substrat en produit et on détecte le produit par voie optique ou électrique. Il est également possible de détecter directement l'hybridation par des méthodes électriques si le dispositif fonctionnalisé pour l'hybridation le permet. Il est également possible de procéder à une seconde étape après hybridation û lavage pour la détection telle qu'une hybridation secondaire ou une réaction avec un substrat lié au produit d'amplification obtenu après les étapes (a), (c1) et (c2) . La détection du substrat peut alors se faire par des réactions enzymatiques. Ainsi ladite hybridation secondaire peut se faire avec une sonde de détection porteuse d'une enzyme et l'on fournit un substrat à cette enzyme. L'enzyme catalyse la transformation du substrat en produit et on détecte le produit par voie optique ou électrique. La méthode avantageusement mise en oeuvre est l'utilisation d'amorces marquées et/ou de dNTP marqués avec des molécules fluorescentes et détection par fluorescence du produit d'hybridation. 33 Lorsque la PCR en temps réel est utilisée, les étapes (a) et (b), (c1) et (d1) ou (c2) et (d2) se font simultanément ou quasi-simultanément puisque la détection et l'éventuelle quantification peuvent être réalisées à chaque cycle thermique i.e. durant l'amplification ou en point final i.e. après le dernier cycle thermique donc après l'amplification. Dans le cas de la PCR en temps réel, au moins une sonde marquée spécifique du produit d'amplification susceptible d'être obtenu suite à l'étape (a), (c1) réactionnel. ou (c2) peut être ajoutée au milieu Par � sonde marquée �, on entend, dans le cadre de la présente invention, une sonde fluorescente susceptible de se fixer soit sur l'ADN double brin (technologie SYBR où l'on a un intercalant) ou sur une séquence d'ADN précise (technologie Taqman et Beacon). Les sondes marquées spécifiques peuvent être de n'importe quelle sorte parmi les sondes connues et décrites dans l'état de l'art. A titre d'exemples de sondes marquées spécifiques utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les sondes TaqMan, les molecular Beacons, les sondes Scorpion et les sondes LNA et tout autre sonde permettant de réaliser des PCR en temps réel. La détection se fera par mesure de fluorescence à chaque cycle thermique ou en point final, c'est-à dire après le dernier cycle thermique.30 34 Le choix entre les différentes méthodes de détection se fera en fonction de l'information recherchée. Lorsque peu d'information est recherchée, par exemple lorsqu'il est nécessaire de tester simultanément entre une dizaine et une centaine de combinaisons de séquences, la PCR en temps réel est particulièrement adaptée. En revanche, lorsque le nombre de combinaisons de séquences recherchées est important, jusqu'à plusieurs dizaines de milliers, la PCR suivie d'une hybridation sur puce est préférable. Des criblages successifs pourront être réalisés. Par exemple, une PCR avec une détection non spécifique en utilisant un agent intercalant de l'ADN double brin peut être initialement effectuée : elle permet de mettre en évidence une structure double brin impliquant une amorce du mélange réactionnel et une séquence nucléotidique présente dans l'échantillon. Si cette détection non spécifique est positive, une deuxième analyse peut être effectuée en utilisant une PCR en temps réel et/ou l'hybridation sur puce à ADN pour connaître quelle(s) séquence(s) nucléotidique(s) est(sont) présente(s) dans l'échantillon. Lorsque la quantification des NTC fonctionnalisés est souhaitée lors des étapes (b), (d1) et (d2), il est nécessaire de réaliser simultanément une PCR en temps réel avec une gamme d'oligonucléotides à des concentrations connues. La concentration d'oligonucléotides dans l'échantillon testé peut ainsi être déduite de la gamme référence. Le taux de marquage 35 des NTC étant, par ailleurs, connu, la concentration de NTC dans l'échantillon testé peut ainsi être déterminée. la présente invention concerne enfin l'utilisation d'un kit d'éléments comprenant : - au moins un élément choisi parmi au moins une enzyme telle qu'une ADN ou ARN polymérase thermostable comme la Taq polymérase ou la T7-ARN polymérase, une transcriptase inverse, une RNase-H et une ADN ligase ; un sel tel que du TRIS (pour � trishydroxyméthylaminométhane �), du KC1, du NaCl ou du MgC12 ; des déoxyribonucléotides triphosphates éventuellement marqués tels que dATP, dGTP, dTTP, dCTP et éventuellement dUTP ; des ribonucléotides triphosphates éventuellement marqués tels que ATP, CTP, TTP, UTP et GTP ; au moins une paire d'amorces éventuellement marquées, spécifiques ou dégénérées, pouvant comprendre de 10 à 100 paires de base, notamment de 15 à 50 paires de base et, en particulier, de 15 à 35 paires de base ; une amorce oligo-dT ou spécifique notamment utile pour la transcription inverse ou pour la T7-ARN polymérase et une sonde marquée ; éventuellement au moins une séquence nucléotidique, et pour détecter, identifier et éventuellement quantifier au moins un nanotube de carbone dans un échantillon. Ledit kit peut en outre comprendre un (ou plusieurs) additif(s) tel(s) que précédemment décrit(s) 36 et/ou un (ou plusieurs) dispositif(s) et microdispositif(s) tel(s) que précédemment décrit(s). D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La Figure 1 propose un schéma représentatif de la fonctionnalisation des NTC par l'ADN. La Figure 2 présente la fluorescence lors de la PCR en temps réel dans une goutte de 65 nl sur puce fonctionnant par électromouillage (courbe avec losanges) et dans un tube plastique classique pour la PCR en temps réel avec 10 pl de solution (courbe avec carrés). La Figure 3 présente une courbe de référence pour la détection quantitative de nanotubes fonctionnalisés avec le cycle seuil (ou � Ct � pour � Cycle treshold �) en fonction de la concentration de nanotubes fonctionnalisés exprimée en poids de nanotubes/ pl. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS 1. Fonctionnalisation covalente des NTC avec de l'ADN. Dans cet exemple, les nanotubes mis en oeuvre sont des nanotubes multiparois (MWNT) fournis par 37 Arkema. L'ADN a été synthétisé avec une amine à l'extrémité 5'-terminale. Le protocole de la fonctionnalisation covalente des MWNT par l'ADN comporte trois étapes représentées à la Figure 1 et consistant en - l'oxydation des MWNT pour générer des groupes carboxyliques sur les MWNT ; - l'activation des groupes carboxyliques par du N-hydroxysuccinimide (NHS) ; - le couplage des groupes carboxyliques activés avec les amines de l'ADN. Trois lots de MWNT ont été réalisés, dont deux servent de contrôle à la fonctionnalisation, en variant les paramètres de cette dernière : • Lot A pour lequel l'étape d'oxydation a été omise ; • Lot B pour lequel, suite à l'étape d'oxydation, l'agent de couplage (NHS et DCC) a été omis pendant l'étape d'activation ; • Lot C pour lequel les trois étapes complètes ont été réalisées. 1.1. Oxydation des nanotubes. Quinze mg de MWNT ont été ajoutés dans 20 ml de H2SO4 + HNO3 (3:1). Le mélange a été soumis à un traitement par les ultrasons pendant 5 h (bain d'ultrasons) à 30°C. La suspension de nanotubes a été diluée dans de l'eau et filtrée sur une membrane (0,2 pin). Les MWNT ont été récupérés de la membrane et rincés plusieurs fois à l'eau. 38 Ensuite, ils ont été traités par du HC1 (20 mL, 1 M) pour transformer les groupements carboxylates portés par les MWNT en groupements carboxyliques. Les MWNT ainsi traités i.e. MWNT oxydés ont été séchés sous vide à température ambiante. 1.2. Synthèse des MWNT activés. Environ 2,4 mg de MWNT oxydés (- 0,2 mmol C) ont été dispersés dans 40 ml de DMF. La suspension a été purgée par N2 pendant 30 min. Du NHS (46 mg, 0,4 mmol) a été solubilisé dans 10 ml de DMF. La solution de NHS a été ajoutée dans les nanotubes en suspension avec une seringue. Ensuite, du dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (82,4 mg, 0,4 mmol) a été solubilisé dans 10 ml de DMF, et ajouté dans les MWNT en suspension. Le mélange a été agité pendant 30 min à température ambiante. De la 4-Diméthylaminopyridine (DMAP) (2,4 mg, 0,02 mmol) a été solubilisée dans 10 ml de DMF et ajoutée, goutte à goutte, aux MWNT en suspension. La réaction a été maintenue à température ambiante sous N2 pendant 18 h. Après la réaction, les MWNT activés ont été récupérés sur une membrane de filtration, et rincés par du DMF. Puis, ils ont été séchés sous vide. 1.3 Couplage de MWNT activés avec l'ADN. Les MWNT activés (- 2 mg) ont été dispersés dans du DMF (5 ml) par un traitement aux ultrasons. 10 pl d'oligonucléotides (76 bases, 100 pM) ont été dilués dans 3 ml de Na2HPO4 (0,2 M). La solution d'oligonucléotides a été ajoutée, goutte à goutte, dans la suspension de MWNT activés sous agitation magnétique. La réaction de couplage a été réalisée à température ambiante pendant 18 h. Après la réaction, les MWNT fonctionnalisés ont été récupérés sur une membrane de filtration et rincés 3 fois par du DMF et 3 fois par de l'eau désionisée (15 ml à chaque rinçage). Les MWNT activés et les MWNT fonctionnalisés ont été caractérisés par spectroscopie InfraRouge à Réflexion Totale Atténuée (ou ATR-IR pour � Attenuated Total Reflection Infrared �) et par spectroscopie photoélectronique X (ou XPS pour � X-ray photoelectron spectroscopy �). Le spectre ATR-IR des MWNT activés montre un pic d'adsorption correspondant à la liaison C=O, caractéristique des groupes NHS. Les MWNTs fonctionnalisés i.e. couplés avec l'ADN ont été caractérisés par XPS. Le pourcentage d'élément phosphore, qui n'existe pas dans les MWNT activés, est de 0,23%. Ce pourcentage correspond à un rendement de greffage de 10 à 100 oligonucléotides par MWNT selon la taille des MWNT. 2. Détection de NTC fonctionnalisés avec un oligonucléotide par PCR sur microsystème. La détection par PCR en temps réel a été réalisée sur un micro-système permettant la manipulation de gouttes de très petit volume (65 nl). Le fonctionnement du micro-système repose sur le principe d'électromouillage et permet de réaliser les étapes micro-fluidiques unitaires 40 suivantes : formation de gouttes de volume connu et reproductible, déplacement de gouttes, mélange de deux gouttes de solutions éventuellement différentes avec homogénéisation en quelques secondes [21]. Lors de la PCR réalisée avec une solution de NTC fonctionnalisés avec des oligonucléotides, l'ensemble de la puce a été chauffé pendant les cycles thermiques de PCR. Une PCR avec une suspension de NTC fonctionnalisés avec des oligonucléotides a été réalisée sur la puce. La séquence de l'oligonuclétide greffé sur les NTC est 5'-NH2-C6-TTTTTCGGGTAACGTCAATGAG CAAAAAAATATCATTGGTGTCGGATACCCAAGGAGCATGTATTAGGCACGCCGC-3' (SEQ ID NO. 1 dans la liste de séquences en annexe). Les séquences des amorces sont CGGGTAACGTCAATG AGCAAA (primer forward, SEQ ID NO. 2 dans la liste de séquences en annexe) et GCGGCGTGCCTAATACATGC (primer reverse, SEQ ID NO. 3 dans la liste de séquences en annexe) et celle de la sonde : 5-FAM-CACCAATGATATTTT- MGB-3' (SEQ ID NO. 4 dans la liste de séquences en annexe). Le mélange réactionnel contient le tampon de l'enzyme AmpliTaq Gold sans MgC12 lx (ABI), de la BSA à 0,8 mg/mL, du MgC12 à 3 mM, des nucléotides (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) à 200 pM, de la bétaine à 450 mM et de l'AmpliTaq gold 0,5 U/pl (ABI). L'échantillon est tout d'abord mélangé en tube avec les réactifs PCR pour la première étape de dénaturation et activation de la Taq Polymerase (10 min à 95°C). Cette solution est ensuite introduite sur la puce à travers un trou du capot et par activation des électrodes. Une goutte de 65 nl de cette solution est 41 ensuite formée par activation des électrodes puis les cycles thermiques sont effectués (95°C 10 sec, 60°C 20 sec) en chauffant l'ensemble de la puce avec un élément Peltier en contact avec la puce. La lecture de la fluorescence de la goutte se fait à la fin de chaque palier thermique à 60°C avec un microscope optique. En parallèle, 10 pl du même mélange réactionnel initial (échantillon + réactifs pour la PCR) a été placé dans un tube réactionnel pour la PCR et celle-ci a été réalisée avec un appareil commercial de PCR en temps réel (Stratagene Mx3005P) avec des cycles thermiques de 60°C 60 sec, 95°C 60 sec. Pour finir, le signal de fluorescence obtenu dans la goutte de 65 nl a été comparé au signal obtenu dans 10 pl de solution dans un tube plastique classique avec un appareil de PCR en temps réel commercial (MX3005P Stratagene). Il apparaît que le signal normalisé obtenu dans les deux cas est absolument similaire (Figure 2). 3. Exemple de quantification de NTC fonctionnalisés par PCR en tube. Une PCR a été réalisée avec des dilutions successives de NTC marqués avec un oligonucléotide et 25 préparés conformément au point 1 ci-dessus. La quantité de NTC initialement utilisée pour le marquage est connue et il est donc possible de relier chaque cycle seuil (Ct) obtenu lors de cette PCR avec la concentration de NTC dans la dispersion lors de 30 la PCR. Il est ainsi possible d'établir des courbes étalon, comme celle présentée Figure 3, permettant 42 ensuite de donner un résultat quantitatif après analyse d'un échantillon inconnu en reliant le Ct obtenu avec la concentration de NTC. En se basant sur la courbe de référence de 5 la Figure 3, un nouvel échantillon donnant un Ct de 31 contient 10-3 pg/pl de nanotubes fonctionnalisés. 43 RÉFÉRENCES [1] Sayes et coll., 2006, � Functionalization density dependence of single-walled carbon nanotubes cytotoxicity in vitro �, Toxicology Letters, vol. 161, p. 135-142. [2] Wôrle-Knirsch et coll., 2006, � Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays �, Nano Letters, vol. 6, p. 1261-1268. [3] Lam et coll., 2004, � Pulmonary toxicity of single-wall carbon nanotubes in mice 7 and 90 days after intratracheal instillation �,, Toxicological Science, vol. 77, p. 126-134. [4] Roberts et coll., 2007, � In vivo biomodification of lipid-coated carbon nanotubes by daphnia magna �, Environ. Sci. Technol., vol. 4, p. 3025-3029. [5] Kostarelos, 2008, � The long and short of carbon nanotube toxicity �, Nature Biotechnology, vol. 26, p. 774-776. [6] Donaldson et coll., 2006, � Carbon nanotubes: a review of their properties in relation to pulmonary toxicology and workplace safety �, Toxicological Sciences, vol. 92, p. 5-22. [7] Tantra et coll., 2007, � The detection cf airborne carbon nanotubes in relation to toxicology and workplace safety �, Nanotoxicology, vol. 1, p. 251-265. [8] Leeuw et coll., 2007, � Single-walled carbon nanotubes in the intact organism: near-IR 44 imaging and biocompatibility studies in Drosophila �, Nana Letters, vol. 7, p. 2650-2654. [9] Williams et coll., 2002, � Carbon nanotubes with DNA recognition �, Nature, vol. 420, p. 761. [10] Lee et coll., 2004, � Electrically addressable biomolecular functionalization of carbon nanotubes and carbon nanofiber electrodes �, Nano Lett., vol. 4, p. 1713-1716. [11] Demande internationale WO 2004/000727 (CEA) publiée le 31 décembre 2003. [12] Demande internationale WO 03/053846 (Universities Space Research Association) publiée le 3 juillet 2003. [13] Bahr et coll., 2002, � Covalent chemistry of single-wall carbon nanotubes �, J. Mater. Chem., vol. 12, p. 1952-1958. [14] Liu et coll., 1998, � Fullerene pipes �, Science, vol. 280, p. 1253. [15] Miyata et coll., 2006, � Selective oxidation of semiconducting single-wall carbon nanotubes by hydrogen peroxide �, Science, vol. 110, p. 25.. [16] Hwang et coll., 1995, � Efficient 25 cleavage ofcarbon graphene layers by oxidants �, Chem. Commu., vol. 2, p. 173. [17] Marcoux et coll., 2004, � Electrochemical functionalization of nanotube films : growth of aryl chain on single-walled carbon 30 nanotubes �, New J Chem., vol. 28, p. 302. 15 20 45 [18] Wang et coll., 2005, � Microwaveinduced rapid chemical functionalization of singlewalled carbon nanotubes �, Carbon, vol. 43, p. 1015. [19] Hu et coll., 2003, � Sidewall functionalisation of single-walled carbon nanotubes by addition of dichlorocarbene �, J Am. Chem. Soc., vol. 125, p. 14893. [20] Ito et coll., 2003, � Observation of DNA transport through a single carbon nanotube channel using fluorescence microscopy �, Chem. Commun., p. 1482-1483. [21] Fouillet et coll., 2008, � Digital microfluidic design and optimization of classic and new fluidic functions for lab on a chip systems �, Microfluidics and Nanofluidics, vol. 4, p. 159-165. REVENDICATIONS1) Procédé pour détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier au moins un nanotube de carbone éventuellement présent dans un échantillon comprenant les étapes consistant à : (a) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification d'une séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique, ledit nanotube de carbone éventuellement présent ayant été fonctionnalisé par ladite séquence nucléotidique préalablement à ladite étape (a), et (b) détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier le produit d'amplification éventuellement obtenu suite à l'étape (a). 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes successives suivantes consistant à : a1) préparer au moins un nanotube de carbone fonctionnalisé par au moins une séquence nucléotidique ; b1) prélever un échantillon susceptible de 25 contenir ledit nanotube de carbone ; c1) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification de ladite séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique ; et 47 d1) détecter, éventuellement identifier et éventuellement quantifier le produit d'amplification éventuellement obtenu suite à l'étape (c1). 3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes successives suivantes consistant à : a2) mettre en contact ledit échantillon avec au moins une séquence nucléotidique dans des conditions permettant la fonctionnalisation du (ou des) nanotube(s) éventuellement présent (s) par ladite séquence nucléotidique ; b2) éliminer toute séquence nucléotidique non impliquée dans la fonctionnalisation ; c2) soumettre ledit échantillon à des conditions permettant l'amplification de ladite séquence nucléotidique en utilisant des amorces aptes à amplifier ladite séquence nucléotidique ; et d2) détecter et éventuellement quantifier le 20 produit d'amplification éventuellement obtenu suite à l'étape (02). 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit 25 échantillon est choisi dans le groupe constitué par un échantillon biologique ; un échantillon d'eau de ville, de rivière, de mer, de lac, souterraine ou de tours aéro-réfrigérées ; un prélèvement aérien ; un échantillon de terre ; un échantillon obtenu sur un 30 site industriel ou un de leurs mélanges. 48 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique est choisie dans le groupe constitué par un oligonucléotide, éventuellement modifié ; un acide désoxyribonucléique (ADN), éventuellement modifié ; un acide ribonucléique (ARN), éventuellement modifié ; une portion et un fragment de ceux-ci. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, lors de la fonctionnalisation du (ou des) nanotube(s) par ladite séquence nucléotidique, cette dernière se lie de façon covalente au(x)dit(s) nanotube(s). 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, lors de la fonctionnalisation du (ou des) nanotube(s) par ladite séquence nucléotidique, cette dernière se lie de façon covalente et indirecte au(x)dit(s) nanotube(s). 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite liaison covalente et indirecte se fait via un espaceur comprenant deux fonctions chimiques distinctes et capables de former une liaison covalente, une avec un groupement porté par le NTC et l'autre avec un groupement porté par la séquence nucléotidique. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites fonctions chimiques, 49 identiques ou différentes, sont choisies dans le groupe constitué par une fonction carboxyle, un groupe aryle, une entité radicalaire, une fonction hydroxyle, une fonction alcool, une fonction amine, une fonction ester, une fonction aldéhyde, une fonction hydrazide, une fonction cétone, une fonction époxy, une fonction isocyanate, une fonction maléimide, un diène et une fonction thiol. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que ladite étape de fonctionnalisation comprend deux sous-étapes consistant à : (i) soumettre l'échantillon ou le(s)dit(s) nanotube(s) à des conditions permettant la formation d'au moins une entité réactive à la surface d'un nanotube de carbone, puis (ii) mettre en contact ledit échantillon ou le(s)dit(s) nanotube(s) avec au moins une séquence nucléotidique et éventuellement avec un espaceur tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 ou 9. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite entité réactive formée à la surface d'un NTC lors de l'étape (i) présente un groupement choisi dans le groupe constitué par une fonction carboxyle, un groupe aryle, une entité radicalaire, une fonction hydroxyle, une fonction alcool, une fonction amine, une fonction ester, une fonction aldéhyde, une fonction hydrazide, 50 une fonction cétone, une fonction époxy, une fonction isocyanate, une fonction maléimide, un diène et une fonction thiol ou - un groupe alkyle substitué par un tel groupement. 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que, lors de la fonctionnalisation du (ou des) nanotube(s) par ladite séquence nucléotidique, cette dernière se lie de façon non-covalente au(x)dit(s) nanotube(s). 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que, lors de la fonctionnalisation du (ou des) nanotube(s) par ladite séquence nucléotidique, cette dernière se lie de façon non-covalente et indirecte au(x)dit(s) nanotube(s). 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite liaison non covalente et indirecte se fait via une molécule intermédiaire capable de se lier de façon non covalente audit NTC et de se lier, de façon covalente ou non covalente, à ladite séquence nucléotidique. 15) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite amplification est choisie parmi une amplification par réaction en chaîne par polymérase ou PCR (acronyme anglais pour � Polymerase Chain Reaction �), une PCR asymétrique, une PCR asymétriquethermique entrelacée, une PCR en gradient de température, une PCR en point final, une PCR multiplexe, une PCR en temps réel, une RT-PCR (acronyme anglais pour � Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction �), une RT-PCR multiplexe, une NASBA (acronyme anglais pour � Nucleic Acid Sequence Based Amplification �), une LCR (acronyme anglais pour � Ligase Chain Reaction �) ou une TMA (acronyme anglais pour � Transcription Mediated Amplification �). 16) Utilisation d'un kit d'éléments comprenant : - au moins un élément choisi parmi au moins une enzyme telle qu'une ADN ou ARN polymérase thermostable comme la Taq polymérase ou la T7-ARN polymérase, une transcriptase inverse, une RNase-H et une ADN ligase ; un sel tel que du TRIS (pour � trishydroxyméthylaminométhane �), du KC1, du NaCl ou du MgC12 ; des déoxyribonucléotides triphosphates éventuellement marqués tels que dATP, dGTP, dTTP, dCTP et éventuellement dUTP ; des ribonucléotides triphosphates éventuellement marqués tels que ATP, CTP, TTP, UTP et GTP ; au moins une paire d'amorces éventuellement marquées, spécifiques ou dégénérées ; une amorce oligo-dT ou spécifique notamment utile pour la transcription inverse ou pour la T7-ARN polymérase et une sonde marquée ; éventuellement au moins une séquence nucléotidique, et 2 pour détecter, identifier et éventuellement quantifier au moins un nanotube de carbone dans un échantillon.