FR 2945126 A1 20101105 FR 0902087 A 20090429 PROCEDE ET APPAREIL DE COMPTAGE DES THROMBOCYTES L'invention porte sur un procédé de comptage des thrombocytes ou � plaquettes � dans un échantillon de sang par marquage fluorescent spécifique et traitement numérique d'images, ainsi que sur un appareil pour la mise en oeuvre d'un tel procédé. Le procédé et l'appareil permettent en particulier le comptage des thrombocytes dans un échantillon de sang entier non lysé, peu ou pas dilué. Les plaquettes ou thrombocytes sont des cellules sanguines de 2 à 5pm de diamètre sans noyau et de forme variable. Elles sont présentes dans le sang au nombre de 150.000 à 500.000/pL chez un sujet sain. Elles interviennent dans le processus d'hémostase primaire, et donc dans la coagulation. L'hémostase primaire permet d'arrêter le saignement dû à la lésion de capillaires, mais elle doit être renforcée par la coagulation si le calibre du vaisseau endommagé est plus important. Le rôle des thrombocytes est de s'agréger après activation et de sécréter diverses substances intervenant dans la coagulation comme la sérotonine, le calcium, l'adénosine diphosphate.contenus dans les granules denses du cytoplasme. Les plaquettes ont donc un rôle très important dans le phénomène de coagulation. Une diminution trop importante du nombre de plaquettes entraîne un risque hémorragique (à envisager avant une intervention chirurgicale par exemple). Une augmentation de leur nombre entraîne au contraire un risque de thrombose par formation d'agrégats plaquettaires. Les désordres plaquettaires peuvent être causés par une cirrhose, une insuffisance rénale (déficit de filtration du sang par les reins), une atteinte de la moelle osseuse, une infection virale ou encore une intoxication (Phénylbutazone, phénacétine, acide acétylsalicylique, etc.). La méthode couramment utilisée pour compter les cellules sanguines, et en particulier les thrombocytes, est la cytométrie en flux, même 30 si d'autres alternatives existent, comme la centrifugation. Le principe de la cytométrie de flux est de compter les cellules en les faisant défiler une par une devant un système de mesure (optique ou électrique). Cela permet, à la fois de compter les cellules en détectant leur passage devant le système de mesure mais aussi de les caractériser (taille, conductivité, forme...). Pour permettre le passage des cellules une par une, de très forts facteurs de dilution sont appliqués à l'échantillon. Les deux types de cytométrie en flux sont la cytométrie optique (diffusion de lumière et/ou émission de fluorescence) et la cytométrie d'impédance. Des nombreux cytomètres en flux combinent les deux techniques pour permettre une mesure plus précise. La centrifugation d'un échantillon sanguin dans un tube capillaire induit une séparation des différents types cellulaires selon leur densité. Les différents types cellulaires sont préalablement marqués spécifiquement. Les globules rouges se retrouvent au fond du tube, le plasma est au dessus. Entre les deux une zone appelée � couche leucocytoplaquettaire � (� buffy-coat � en anglais) contient les plaquettes et les différents globules blancs. Un flotteur de densité adéquate est utilisé pour amplifier cette couche leucocyto-plaquettaire afin d'améliorer la précision. En mesurant les épaisseurs des différentes couches colorées, on en déduit le nombre de particules dans chaque couche donc le nombre de chaque type cellulaire. Ces procédés nécessitent un équipement relativement lourd ; par conséquent, ils ne peuvent être mis en oeuvre que dans un laboratoire spécialisé. En outre, ils nécessitent de volumes relativement importants de sang (au moins de l'ordre de 100 pl). Un procédé de comptage des thrombocytes très ancien, et désormais pratiquement désuet, comporte l'utilisation d'un hémocytomètre. L'hémocytomètre est un dispositif essentiellement constitué par une veine fluidique réalisée en verre, sur laquelle est gravée une grille de comptage. Un échantillon de sang lysé, dilué au moins 100 fois et dont les plaquettes sont marquées par un agent de contraste non spécifique du type colorant de Giemsa ou de Wright, est introduit dans l'hémocytomètre, puis observé en microscopie, ce qui permet le comptage manuel des cellules d'intérêt. Cette méthode a été pratiquement abandonnée en raison de sa précision insuffisante et du travail long et fastidieux qu'il demandait à un opérateur spécialisé pour identifier les plaquettes et effectuer le comptage manuel. L'article de J.-S. Lin et al. � A PC-based imaging system for automated platelet identification �, IEEE Transactions on Biomedical Engineering, Volume 39, N° 9, septembre 1992, pages 990 û 993 décrit un procédé d'indentification des plaquettes qui adhèrent à un substrat fonctionnalisé dans des conditions d'écoulement proches de celles rencontrées in vivo. Ce procédé, qui comporte un marquage fluorescent desdites plaquettes et l'utilisation d'un système informatique de traitement des images, ne permet pas de déterminer la concentration des plaquettes dans un échantillon sanguin car seules les cellules qui adhérent au substrat fonctionnalisé sont identifiées. L'invention vise à procurer un procédé simple et fiable de comptage des thrombocytes contenus dans un échantillon de sang, permettant de surmonter au moins certains des inconvénients de l'art antérieur. Conformément à l'invention, ce but est atteint par un procédé de comptage des thrombocytes contenus dans un échantillon de sang, comportant : - le mélange dudit échantillon avec : o des marqueurs fluorescents susceptibles de se lier spécifiquement avec les thrombocytes ; et o un agent inhibiteur de l'activation desdits thrombocytes ; - l'introduction de l'échantillon dans une chambre fluidique ayant au 25 moins une face transparente ; - l'acquisition d'au moins une image numérique dudit échantillon par microscopie à fluorescence ; et - le comptage des thrombocytes présents dans ladite ou dans chaque image par des moyens informatiques de traitement des 30 images. Selon des modes de réalisation particuliers du procédé de l'invention : - Ladite étape de mélange de l'échantillon de sang peut être mise en oeuvre avant l'injection de l'échantillon dans ladite chambre fluidique. - Inversement, lesdits marqueurs fluorescents et ledit agent inhibiteur de l'activation peuvent être présents à l'état sec dans ladite chambre fluidique, ladite étape de mélange étant donc effectuée en même temps que l'injection de l'échantillon. - Lesdits marqueurs fluorescents peuvent être des anticorps, eux-mêmes marqués par un fluorophore, susceptibles de se lier 10 spécifiquement aux thrombocytes. Ledit agent inhibiteur de l'activation des thrombocytes peut être choisi entre : de la prostaglandine El, du Dipyridamole, du Clopydogrel, de la Ticlopidine et de l'acide acétylsalicylique. - Le mélange de l'échantillon de sang avec un 15 anticoagulant peut également être prévu. - L'échantillon de sang peut ne pas être dilué, sauf par ajout des réactifs nécessaires à la détection (anticoagulants, marqueurs, agent inhibiteur de l'activation). En variante, il peut être dilué d'un facteur inférieur ou égal à 50. 20 - Ladite chambre fluidique peut présenter une épaisseur comprise entre 15 pm et 60 pm. - L'étape d'acquisition d'au moins une image numérique dudit échantillon peut être effectuée par microscopie à épifluorescence. - L'étape de comptage des thrombocytes peut comporter 25 une étape de seuillage et binarisation des pixels de ladite ou de chaque image, suivie par une opération de comptage au sens propre. - Le volume dudit échantillon de sang, avant ladite étape de mélange, peut être compris entre 1 et 100 pl. - Ledit échantillon de sang peut être un échantillon de sang 30 complet non lysé. - Une étape consistant à déduire, du nombre de thrombocytes identifiées sur ladite ou chaque image numérique, un nombre de thrombocytes par unité de volume dans l'échantillon de sang peut également être prévue. Un autre objet de l'invention est un appareil de comptage des thrombocytes comportant : - une chambre fluidique dans laquelle peut être introduit un échantillon de sang, comportant une paroi au moins partiellement transparente et contenant : un agent inhibiteur de l'activation desdits thrombocytes ; et des marqueurs fluorescents susceptibles de se lier spécifiquement avec lesdits thrombocytes ; - une source de lumière pour exciter lesdits marqueurs fluorescents ; - un système optique pour acquérir au moins une image numérique de fluorescence dudit échantillon ; et - des moyens informatiques de traitement des images 15 adaptés pour compter de manière automatique les thrombocytes présents dans ladite ou chaque image de fluorescence. D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple et qui représentent, respectivement : 20 - la figure 1, le principe de la méthode ; et - la figure 2, un graphique illustrant ses performances. Le principe du procédé repose sur l'acquisition et l'analyse informatique d'images, acquises au microscope, d'un échantillon de sang dont les thrombocytes ont été inactivés et marqués de manière spécifique. 25 Ci-après sera exposé, à titre d'exemple, un protocole de mise en oeuvre d'un tel procédé. Un échantillon de sang entier est prélevé sur un anticoagulant tel que l'ETDA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) déposé à sec à une concentration de 1,8 mg/ml, ou du citrate de sodium liquide à la concentration 30 de 1 volume pour 9 volumes de sang. Puis, un volume de 5pl de cet échantillon est mélangé avec 45pl de tampon salin (PBS û � phosphate buffer saline �), le diluant ainsi 10 fois. La dilution n'est pas essentielle à la mise en 10 oeuvre, mais elle facilite le comptage des thrombocytes par analyse d'images en augmentant leur séparation moyenne et en évitant ainsi des effets de superposition pouvant conduire à une sous-estimation du nombre effectif de cellules. Un volume de 0,5 pl de prostaglandine El est ajouté pour inactiver les thrombocytes et empêcher ainsi leur agrégation. Ensuite, 10 pl d'anticorps marqué (anti-CD61 FITC à 0,5 mg/ml) sont ajoutés à la solution pour marquer de manière spécifique les thrombocytes. L'anti-CD61 est un anticorps susceptible de se lier aux thrombocytes, et la FITC (Fluorescéine Iso Thio Cyanate) est un fluorophore d'utilisation courante. Le mélange est homogénéisé par aspirations et largages successifs à l'aide d'une micropipette �P ; puis il est laissé à incuber à température ambiante, dans l'obscurité, pendant 15 minutes. Il est intéressant de noter que l'utilisation d'anticoagulant n'est pas indispensable si on limite à environ 3 - 5 minutes le temps d'incubation, ce qui semble être suffisant pour réaliser le marquage. Au contraire, l'adjonction de prostaglandine El ou d'un autre inhibiteur de l'activation des thrombocytes s'est avérée essentielle. En effet, en son absence les thrombocytes s'activent et, même en présence d'un anticoagulant, forment des agrégats, ce qui empêche leur comptage. Après incubation, l'échantillon E obtenu par mélange du sang avec le diluant et les différents réactifs (anticoagulant, anti-activant, anticorps marqué) est introduit dans une chambre fluidique CF ayant au moins une face transparente, qui peut être constituée par deux lames de verre de microscope, L1 et L2, réunies par l'intermédiaire de deux bandes adhésives BA de manière à délimiter une veine fluidique ayant une épaisseur de l'ordre de 30 �m. Le remplissage peut s'effectuer, très simplement, par capillarité. Ensuite la chambre fluidique û ou plutôt une région de cette chambre û est observée dans un microscope à épifluorescence MEF de type conventionnel, comportant une source de lumière d'excitation des fluorophores et un système optique d'acquisition d'images de fluorescence, relié à un ordinateur O. II est possible d'effectuer plusieurs observations à plusieurs endroits différents de la chambre (par exemple, les trois régions R1, R2 et R3 sur la figure 1) pour compenser d'éventuelles inhomogénéités résiduelles. Une ou plusieurs images numériques IN sont acquises, dans lesquelles les thrombocytes marqués apparaissent comme des points lumineux T, isolés grâce à l'agent anti-activant qui empêche leur agrégation, sur un fond plus sombre. Ensuite, la ou les images sont traitées par un ordinateur de la manière suivante : - leur contraste est rehaussé, et leur luminosité est réglée par l'utilisateur ; - un seuil de binarisation est défini, de manière à convertir les images d'un format à niveaux de gris à un format binaire noir et blanc ; et - le nombre d'objets (points blancs, ou noirs si on travaille 15 en négatif) est compté directement, de manière automatique. En faisant l'hypothèse que chaque objet sur l'image représente un et un seul thrombocyte, on détermine ainsi un nombre de cellules pour chaque fenêtre d'observation. La moyenne des valeurs ainsi déterminées est enfin convertie en nombre de cellules par unité de volume 20 grâce à l'estimation du volume de la chambre fluidique correspondant à une fenêtre d'observation du microscope. L'ensemble de la mesure prend environ 20 minutes, du prélèvement de l'échantillon de sang à l'obtention du comptage plaquettaire. Ce temps peut encore être réduit en abrégeant la période d'incubation. 25 Le procédé de l'invention a été comparé avec un comptage de thrombocytes obtenu par cytométrie de flux à l'aide d'un analyseur � Automate Coulter LH 780 Hematology Analyzer � combinant une mesure optique et une mesure électrique. Les mesures de référence en cytométrie de flux ont été 30 effectuées sur des échantillons de 200 ~tl de sang total prélevé sur EDTA, dilués d'un facteur 6250. Pour le procédé de l'invention, le protocole décrit ci- 10 dessus a été appliqué. On remarquera que l'invention permet d'utiliser des quantités de sang bien plus faibles que la cytométrie de flux. La figure 2 permet de comparer les valeurs de numération plaquettaire obtenus par la méthode de référence (axe des abscisses, x) et par la méthode de l'invention (axe des ordonnées, y) pour 17 échantillons de sang total issus de patients différents. La corrélation est linéaire : y=1,15x, avec un bon coefficient de régression linéaire (R2=0,945) ; la répétabilité des mesures est satisfaisante (Coefficient de Variation ou CV, représentant l'écart type de la mesure divisée par la moyenne, exprimé en pourcentage inférieur ou égal à 10% pour une concentration de plaquettes comprise entre 50.000 pl-' et 1000000 pl-')). Pour comparaison, la variation de la méthode de référence, donnée par le CV, est comprise entre 3,3 % et 6,6, selon les gammes de concentration plaquettaire (3.3 % entre 280000 pf-' et 320000 pl-' ù 6.6% entre 90000 pl-' et 110000 pl-l). Ces résultats pourraient être améliorés en utilisant des chambres fluidiques d'épaisseurs plus homogènes. L'hématocrite des échantillons analysés varie entre 25% et 46% ; il a été vérifié que cette variation du taux d'hématocrite n'a pas d'influence significative sur les résultats obtenus. Le procédé de l'invention a été décrit en référence à un mode de réalisation particulier ; cependant, des nombreuses modifications peuvent être envisagées. En particulier : Tout anticoagulant connu peut être utilisé en remplacement ou en complément de l'ETDA, par exemple le citrate de sodium ou l'héparine. Comme discuté plus haut, la dilution de l'échantillon n'est pas essentielle, mais elle permet d'utiliser un traitement d'images particulièrement simple en réduisant la probabilité que deux ou plusieurs plaquettes se superposent sur l'image. Si on souhaite travailler sans dilution, il est nécessaire de prévoir un traitement d'images plus complexe, permettant de mesurer la surface des objets fluorescents enregistrés pour déterminer s'ils correspondent à une ou plusieurs plaquettes. Le taux de dilution ne devrait pas non plus être trop élevé afin de ne pas dégrader la statistique du comptage, étant donné que le procédé de l'invention prévoit l'observation de très faibles volumes de sang. Typiquement, des taux de dilution compris entre 0 (pas de dilution) et 50 et de préférence de l'ordre de 10 s'avèrent adaptés à la mise en oeuvre de l'invention. Le diluant peut être du PBS (Phosphate Buffer Saline en anglais ou tampon salin phosphaté), d'une solution de thyorode mélangé à de l'acide 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonique, du trishydroxyméthyl- aminométhane, ou tout autre tampon salin qui maintient l'osmolarité de l'échantillon et le pH à des valeurs physiologiques. L'anti-activant peut être de la Prostaglandine El, du Dipyridamole, du Clopidogrel, de la Ticlopidine, de l'acide acétylsalicylique (ou aspirine). Tout autre anti-agrégeant plaquettaire peut être utilisé, ayant par exemple comme mode d'action : - l'augmentation des taux des nucléotides cycliques ; - l'inhibition du métabolisme de l'acide arachidonique ; - l'inhibition des récepteurs membranaires ; - l'inhibition des processus d'activation (inhibition des 20 canaux calciques, inhibition de la calmoduline, inhibition du cytosquelette, - l'inhibition de la formation et/ou de l'action de la thrombine ; L'anticorps de marquage pourra être choisi de manière à 25 maximiser l'affinité avec les cellules d'intérêt. Pour cela, le clone le plus afin doit être choisi. Comme discuté plus haut, le temps d'incubation doit avantageusement être le plus court possible, tout en assurant le marquage de la quasi-totalité des plaquettes. Si ce temps d'incubation est suffisamment 30 court, l'utilisation d'un anticoagulant peut s'avérer superflue. 2945126 'o Le fluorophore couplé à l'anticorps pourra être varié, par exemple l'iso thio cyanate de fluoresceine (ou FITC), la protéine de peridinine chlorophylle (ou PerCP), la R-phycoérythrine (ou R-PE), etc. L'épaisseur de la veine fluidique peut être comprise de 5 préférence entre 15 pm et 60 pm. Une épaisseur plus fine pourrait engendrer des problèmes de remplissage car la hauteur de la chambre serait du même ordre de grandeur que la taille des plus grandes cellules sanguines. Une épaisseur trop importante introduirait un risque de chevauchement des plaquettes sur l'image et, de ce fait, demanderait d'utiliser une optique trop 10 résolutive pour visualiser les plaquettes dans l'épaisseur de la veine. Dans le mode de réalisation décrit en détail, la chambre fluidique été constituée par deux lames de verre superposées et réunies par des bandes adhésives. Bien entendu, tout autre dispositif microfluidique adapté peut être utilisé. En particulier, la chambre fluidique peut être intégrée 15 à une puce microfluidique. Ce qui est nécessaire est qu'au moins certaines zones de la face supérieure soient transparentes aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission des fluorophores pour permettre l'observation des plaquettes marquées. D'autres matériaux biocompatibles que le verre peuvent être utilisés, tels que le polycarbonate. D'autres techniques d'imagerie à fluorescence que la microscopie à épifluorescence peuvent être utilisées. Une régulation de la température de l'échantillon peut également être prévue. Lorsque le taux de dilution est faible, par exemple inférieur à 5, ou en cas d'absence de dilution, (taux de dilution égal à 0), l'hypothèse selon laquelle, sur l'image de fluorescence, chaque point lumineux correspond à un et un seul thrombocyte, peut aboutir une sous-estimation de la détermination du nombre de thrombocytes. En effet, les thrombocytes étant plus concentrés, les signaux de fluorescence peuvent se superposer. Cette sous-estimation peut-être atténuée en adoptant un traitement d'image plus raffiné, tenant compte de la forme et/ou de la surface de chaque point détecté. REVENDICATIONS1. Procédé de comptage des thrombocytes contenus dans un échantillon de sang, comportant : - le mélange dudit échantillon avec : o des marqueurs fluorescents susceptibles de se lier spécifiquement avec les thrombocytes ; et o un agent inhibiteur de l'activation desdits thrombocytes ; l'introduction de l'échantillon (E) dans une chambre fluidique (CF) ayant au moins une face transparente ; - l'acquisition d'au moins une image numérique (IN) dudit échantillon par microscopie à fluorescence ; et - le comptage des thrombocytes (T) présents dans ladite ou dans chaque image par des moyens informatiques de traitement des images (0). 2. Procédé de comptage des thrombocytes selon la revendication 1, dans lequel ladite étape de mélange de l'échantillon de sang est mise en oeuvre avant l'injection de l'échantillon dans ladite chambre fluidique. 3. Procédé de comptage des thrombocytes selon la revendication 1, dans lequel lesdits marqueurs fluorescents et ledit agent inhibiteur de l'activation sont présents à l'état sec dans ladite chambre fluidique, ladite étape de mélange étant donc effectuée en même temps que l'injection de l'échantillon. 4. Procédé de comptage des thrombocytes selon l'une des revendications précédentes, dans lequel lesdits marqueurs fluorescents sont des anticorps, eux-mêmes marqués par un fluorophore, susceptibles de se lier aux thrombocytes. 5. Procédé de comptage des thrombocytes selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ledit agent inhibiteur de l'activation des thrombocytes est choisi entre : de la prostaglandine E1, duDipyridamole, du Clopydogrel, de la Ticlopidine et de l'acide acétylsalicylique. 6. Procédé de comptage des thrombocytes selon l'une des revendications précédentes, comportant également le mélange de l'échantillon de sang avec un anticoagulant. 7. Procédé de comptage des thrombocytes selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon de sang n'est pas dilué. 8. Procédé de comptage des thrombocytes selon l'une des revendications 1 à 6 comportant également la dilution de l'échantillon de sang d'un facteur inférieur ou égal à 50. 9. Procédé de comptage des thrombocytes selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite chambre fluidique présente une épaisseur comprise entre 15 pm et 60 pm. 10. Procédé de comptage des thrombocytes selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape d'acquisition d'au moins une image numérique dudit échantillon est effectuée par microscopie à épifluorescence. 11. Procédé de comptage des thrombocytes selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape de comptage des thrombocytes comporte une étape de seuillage et binarisation des pixels de ladite ou de chaque image, suivie par une opération de comptage au sens propre. 12. Procédé de comptage des thrombocytes selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le volume dudit échantillon de sang, avant ladite étape de mélange, est compris entre 1 et 100 pl. 13. Procédé de comptage des thrombocytes selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ledit échantillon de sang est un échantillon de sang entier non lysé. 14. Procédé de comptage des thrombocytes selon l'une des revendications précédentes, comportant également une étapeconsistant à déduire, du nombre de thrombocytes identifiés sur ladite ou chaque image numérique, un nombre de thrombocytes par unité de volume dans l'échantillon de sang. 15. Appareil de comptage des thrombocytes comportant : - une chambre fluidique (CF) dans laquelle peut être introduit un échantillon de sang, comportant une paroi au moins partiellement transparente et contenant : un agent inhibiteur de l'activation desdits thrombocytes ; et des marqueurs fluorescents susceptibles de se lier spécifiquement avec lesdits thrombocytes ; une source de lumière pour exciter lesdits marqueurs fluorescents ; - un système optique (MEF) pour acquérir au moins une image numérique de fluorescence (IN) dudit échantillon ; et - des moyens informatiques de traitement des images (0) adaptés pour compter de manière automatique les thrombocytes (T) présents dans ladite ou chaque image de fluorescence.