FR 2949344 A1 20110304 FR 1053219 A 20100427 VACCINS DE PROTECTION CONTRE LA GRIPPE DOMAINE TECHNIQUE Cette invention entre dans le domaine de fabrication de vaccins destinés à protéger contre l'infection due au virus de la grippe et en particulier contre la (les) souche(s) de la grippe porcine qui a (ont) fait son (leur) apparition en avril 2009. ART ANTERIEUR En avril 2009, une épidémie humaine de la grippe porcine a été confirmée dans de nombreux pays comprenant le Mexique et les États-Unis et s'est ensuite rapidement étendue à tout le globe. Une pandémie a été déclarée par l'OMS en juin 2009. La maladie est provoquée par un virus de la grippe porcine nouvellement identifié A/California/04/2009 A(H1 N1). Cette souche de la grippe porcine semble n'avoir aucune réaction immunologique croisée avec les souches humaines actuelles des vaccins contre la grippe, y compris l'antigène A(H1 N1) dans les vaccins saisonniers humains actuels. Le virus a été dénommé de diverses façons "grippe porcine", "nouvelle grippe H1 N1 d'origine porcine", "grippe porcine humaine", "nouvelle grippe A(H1 N1)" et "grippe A(H1 N1)v". Il existe un besoin de prévoir des procédés pour fabriquer un vaccin permettant d'empêcher la transmission ultérieure de l'homme à l'homme de cette grippe porcine et de variantes de celles-ci. DIVULGATION DE L'INVENTION L'invention fournit des procédés pour fabriquer des vaccins contre la grippe. Les procédés utilisent une souche H1 N1 du virus de la grippe A avec une hémagglutinine qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SED ID NO: 3. Le vaccin peut être adjuvanté avec un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau. L'hémagglutinine suscite une réponse immunitaire d'un receveur, et l'adjuvant accroît la couverture hétérovariante de cette réponse de sorte 2949344 -2- qu'une protection peut être fournie contre la souche homologue et également contre des variantes de celle-ci telles que des souches dérivées qui peuvent apparaître naturellement. L'invention a été utile pour préparer les produits vaccinaux FOCETRIATM et CELTURATM 5 Composants antigéniques L'invention utilise l'hémagglutinine du virus de la grippe A comme antigène du vaccin. L'antigène est préparé à partir de virions d'influenza. Diverses formes de vaccins contre le virus de la grippe sont 10 actuellement disponibles (par exemple, voir les chapitres 17 & 18 de la référence 1). L'antigène dans les vaccins produits selon l'invention prend la forme d'un virus inactivé. Les moyens chimiques pour inactiver un virus incluent un traitement avec une quantité efficace d'un ou plusieurs des agents suivants: détergents, formaldéhyde, formaline, 3-propiolactone, 15 ou rayons UV. Des moyens chimiques additionnels pour l'inactivation comprennent un traitement avec du bleu de méthylène, du psoralène, du carboxyfullerène (C60) ou une quelconque combinaison de ceux-ci. D'autres méthodes d'inactivation virale sont connues dans l'art, comme par exemple l'éthylamine binaire, l'acétyléthylèneimine ou l'irradiation 20 gamma. Le vaccin peut comprendre un virion entier, un virion fragmenté ou des antigènes de surface purifiés (comprenant de l'hémagglutinine et comprenant, en général, de la neuramidase). Le virion fragmenté et les antigènes de surface purifiés (c'est-à-dire des vaccins à 25 sous-unités de virion) sont particulièrement utiles pour l'invention. Les virions peuvent être récoltés à partir de fluides contenant le virus par divers procédés. Par exemple, un processus de purification peut comprend une centrifugation zonale utilisant une solution à gradient de sucrose linéaire qui comprend du détergent pour dissocier 30 les virions. Les antigènes peuvent alors être purifiés, après dilution optionnelle, par diafiltration. Les virions fragmentés sont obtenus en traitant les virions 2949344 -3- avec des détergents (par exemple, éther éthylique, polysorbate 80, désoxycholate, phosphate de tri-N-butyle, Triton X-100, Triton N101, bromure de cétyltriméthylammonium, Tergitol NP9, etc.) pour produire des préparations de sous-unités de virion, comprenant le processus de 5 fragmentation "Tween-ether". Les procédés de fragmentation de virus influenza sont bien connus dans l'art, par exemple, voir les références 2 û 7, etc. La fragmentation de virus est en général effectuée en dissociant ou en fragmentant des virus entiers, qu'ils soient infectieux ou non infectieux avec une concentration dissociante d'un agent de 10 fragmentation. La dissociation a pour résultat une solubilisation totale ou partielle des protéines du virus, altérant l'intégrité du virus. Les agents de fragmentation préférés sont des agents de surface non ioniques et ioniques (par exemple, cationiques), par exemple alkylglycosides, alkylthioglycosides, sucres acylés, sulfobetaines, betaines, 15 polyoxyéthylène alkyl éthers, N,N-dialkyl-glucamides, Hecameg, alkylphénoxy-polyéthoxyéthanols, composés d'ammonium quaternaire, sarcosyl, CTAB (bromures de cétyltriméthylammonium), phosphate de tri-N-butyle, Cetavlon, sel de myristyltrimethylammonium, lipofectine, lipofectamine, et DOT-MA, octyl- ou nonylphénoxy- polyoxyéthanols (par 20 exemple les agents de surface Triton, tels que Triton X-100 ou Triton N101), polyoxyéthylène sorbitan esters (les agents de surface Tween), éthers de polyoxyéthylène, esters de polyoxyéthylène, etc. Une procédure de fragmentation utile utilise les effets consécutifs du désoxycholate de sodium et du formaldéhyde, et la fragmentation peut 25 avoir lieu pendant la purification initiale du virion (par exemple dans une solution à gradient de sucrose linéaire). Donc un processus de fragmentation peut comprendre la clarification du matériel contenant des virions (pour éliminer le matériel qui n'est pas des virions), la concentration des virions récoltés (par exemple en recourant à un 30 procédé par adsorption tel que l'adsorption CaHPO4), la séparation de virions entiers du matériel qui n'est pas des virions, la fragmentation des virions à l'aide d'un agent de fragmentation au cours d'une étape de 2949344 -4- centrifugation à gradient de densité (par exemple, en utilisant un gradient de sucrose qui contient un agent de fragmentation tel que du désoxycholate de sodium), et puis la filtration (par exemple ultrafiltration) pour éliminer les matériels indésirables. Les virions fragmentés peuvent 5 être utilement remis en suspension dans une solution de chlorure de sodium isotonique tamponnée de phosphate de sodium. Les produits BEGRIVACTM, FLUARIXTM, FLUZONETM et FLUSHIELDTM sont des vaccins à virions fragmentés. Les vaccins à antigènes de surface purifiés comprennent 10 les antigènes de surface hémagglutinine et, typiquement, neuramidase du virus de la grippe. Les processus pour préparer ces protéines sous forme purifiée sont bien connus dans l'art. Les produits FLUVIRINTM AGRIPPALTM et INFLUVACTM sont des vaccins à sous-unités. Les antigènes d'influenza peuvent également être 15 présentés sous la forme de virosomes [8] (particules liposomales de type viral sans acide nucléique), comme dans les produits INFLEXAL VTM et INVAVACTM mais on préfère ne pas utiliser des virosomes avec la présente invention. Donc, dans certaines formes de réalisation, l'antigène d'influenza n'a pas la forme d'un virosome. 20 L'antigène hémagglutinine dans le vaccin peut provenir d'une quelconque souche appropriée. Dans certaines formes de réalisation, l'hémagglutinine est une hémagglutinine qui, quand elle est administrée à un sujet humain sous une forme non adjuvantée, peut susciter le développement d'anticorps anti-hémagglutinine qui peuvent 25 avoir une réaction croisée avec l'hémagglutinine A/California/04/2009 (SEQ ID NO: 1); dans ces formes de réalisation, un adjuvant peut améliorer la réponse immunitaire de sorte qu'un sujet humain produit un large spectre d'anticorps, ce qui peut contribuer à protéger contre des dérives de la souche A/California/04/2009. Dans d'autres formes de 30 réalisation, l'hémagglutinine provient de A/California/04/2009 (SEQ ID NO: 1). Dans d'autres formes de réalisation, l'hémagglutinine comprend une séquence d'acide aminé HA1 ayant au moins 1% d'identité de 2949344 -5- séquence avec la SEQ ID NO: 2, i étant égal à 85 ou supérieur, par exemple 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus (par exemple 100). Des souches H1 N1 avec des antigènes HA appropriés 5 comprennent A/California/04/2009 même, A/California/7/2009, A/Texas/5/2009, A/England/195/2009, et A/New York/18/2009. L'hémagglutinine est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 (A/California/04/2009) qu'à la SEQ ID NO: 3 (A/Chile/1/1983). Une hémagglutinine qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 10 1 qu'à la SEQ ID NO: 3 (c'est-à-dire qui a une identité de séquence plus grande avec la SEQ ID NO: 1 qu'avec la SEQ ID NO: 3 quand on les compare en utilisant le même algorithme et les mêmes paramètres) est dénommée ci-après une hémagglutinine H1*. Les SEQ ID NO: 1 et 3 sont à 80,4% identiques. 15 Des séquences complètes utiles d'hémagglutinine H1 à utiliser avec l'invention comprennent la SEQ ID NO: 1 et la SEQ ID NO: 6, ainsi que celles comprenant une séquence d'acide aminé ayant au moins i% d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: 2 comme discuté ci-dessus, ou ayant au moins i% d'identité de séquence avec la SEQ ID 20 NO: 7. Idéalement, l'hémagglutinine ne comprend une région hyper basique autour du site de clivage HA1/HA2. Les hémagglutinines préférées ont une préférence de liaison pour les oligosaccharides avec un disaccharide terminal Sia(a2,6)Gal plutôt qu'avec les oligosaccharides avec un disaccharide terminal Sia(a2,3)Gal (voir ci-dessous). 25 La SEQ ID NO: 6 (comprenant la SEQ ID NO: 7) est une hémagglutinine H1* utile. Elle diffère de la SEQ ID NO: 1 au niveau des résidus 214, 226 et 240 (c'est-à-dire une identité de 99,47%). En plus de comprendre une hémagglutinine H1 (telle que l'hémagglutinine H1*), les compositions réalisées en utilisant l'invention 30 peuvent comprendre un (des) antigène(s) provenant d'une ou de plusieurs (par exemple, 1, 2, 3, 4 ou plus) souches additionnelles du virus de la grippe, y compris le virus de la grippe A et / ou le virus de la grippe 2949344 -6- B. Donc, une composition peut comprend un antigène provenant d'une ou plusieurs souches caractéristiques d'un vaccin saisonnier normal plus au moins une hémagglutinine H1*, par exemple un vaccin à 4 valences avec deux souches H1 (une qui est une hémagglutinine H1*, une qui 5 n'est pas une hémagglutinine H1*), une souche H3N2 et une souche de la grippe B, ou un vaccin à 5 valences avec deux souches H1 (une qui est une hémagglutinine H1*, une qui n'est pas une hémagglutinine H1*), une souche H3N2 et deux souches du virus de la grippe B (une souche analogue à B/Victoria/2/87 et une souche analogue à 10 B/Yamagata/16/88). Quand un vaccin comprend plus d'une souche de grippe, les différentes souches sont typiquement cultivées séparément et sont mélangées après que les virus ont été récoltés et les antigènes préparés. Donc, un processus de l'invention peut comprendre l'étape consistant à mélanger des antigènes de plus d'une souche de grippe. 15 Le virus influenza peut être résistant à la thérapie antivirale (par exemple résistant à l'oseltamivir [9 ] et / ou au sanamivir). Dans certaines formes de réalisation, les souches utilisées avec l'invention auront donc de l'hémagglutinine avec une préférence de liaison pour des oligosaccharides avec un disaccharide terminal 20 Sia(a2,6)Gal plutôt que pour des oligosaccharides avec un disaccharide terminal Sia(a2,3)Gal. Pour déterminer si un virus à une préférence de liaison pour des oligosaccharides avec un disaccharide terminal Sia(a2,3)Gal, différents dosages peuvent être utilisés, voir par exemple les références 10 à 13. En fonction du type de dosage, il sera effectué 25 directement avec le virus même ou il peut être effectué indirectement avec l'hémagglutinine purifiée provenant du virus. Dans certaines formes de réalisation, l'hémagglutinine H1 a une glycosylation différente de celles que l'on voit dans les virus dérivés d'oeufs. Donc, la HA (et autres glycoprotéines) peut comprendre des 30 glycoformes que l'on ne voit pas dans les oeufs de poule. La HA utile comprend des glycoformes canines. En plus de comprendre l'antigène hémagglutinine, les 2949344 -7- vaccins fabriqués en utilisant l'invention comprennent typiquement aussi une protéine neuramidase, par exemple le vaccin comprendra une neuramidase virale. L'invention peut protéger contre un ou plusieurs sous-types NA du virus de la grippe A, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 5 ou N9, mais il protégera en général contre N1 (par exemple un virus H1 N1) ou N2 (par exemple un virus H1 N2). Des vaccins à virions entiers, à virions fragmentés ou à sous-unités comprennent tous et hémagglutinine et neuramidase. Quand un vaccin comprend un antigène neuramidase, la neuramidase peut avoir au moins j% d'identité de 10 séquence avec la SEQ ID NO: 4, j étant égal à 75 ou plus, par exemple 75, 80, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus (par exemple 100). De nombreuses séquences de ce genre sont disponibles. Dans certaines formes de réalisation, la neuramidase est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 4 qu'à la SEQ ID NO: 5. Les SEQ ID NO: 4 et 5 sont à 15 82% identiques. Les vaccins peuvent aussi comprendre une protéine matrice, telle que M1 et / ou M2 (ou un fragment de celle-ci), et / ou une nucléoprotéine. Un modèle porcin a montré que l'ajout de M2 à un vaccin contre le virus inactivé de la grippe porcine H1 N1 (adjuvanté avec une 20 émulsion d'huile dans de l'eau) peut améliorer l'efficacité du vaccin [14]. Le virus de la grippe peut être une souche réassortie, et peut être obtenu par des techniques de génétique inverse. Les techniques de génétique inverse [par exemple 15 ù 19] permettent à des virus de la grippe avec des segments génomiques désirés d'être 25 préparés in vitro en utilisant des plasmides ou des systèmes exempts de plasmide. De manière typique, la technique comprend l'expression (a) de molécules d'ADN qui codent des molécules d'ARN virales désirées, par exemple de promoteurs poil ou promoteurs polymérases bactériophages, et (b) de molécules d'ADN qui codent des protéines virales, par exemple 30 de promoteurs polII, de sorte que l'expression des deux types d'ADN dans une cellule conduit à l'assemblage d'un virion infectieux intact complet. L'ADN fournit de préférence la totalité de l'ARN viral et des 2949344 -8- protéines virales, mais il est également possible d'utiliser un virus auxiliaire pour fournir une partie de l'ARN et des protéines. Un virus de la grippe A utilisé avec l'invention peut comprendre un ou plusieurs segments d'ARN d'un virus A/PR/8/34 5 (typiquement 6 segments de A/PR/8/34, les segments HA et N provenant d'une souche de vaccin, c'est-à-dire d'un réassortiment 6 :2), en particulier quand on fait croître les virus dans des oeufs. Un vaccin protège typiquement contre une souche qui est capable de transmission de l'homme à l'homme, et donc le génome de la souche comprendra en 10 général au moins un segment d'ARN qui provient d'un virus grippal de mammifère (par exemple d'un être humain). Les virus utilisés comme source des antigènes peuvent être cultivés sur des oeufs ou sur une culture cellulaire. Le procédé standard actuel de culture de virus grippal a recours à des oeufs de poule 15 embryonnés exempts d'agents pathogènes spécifiques (SPF), le virus étant purifié du contenu de l'oeuf (fluide allantoïque). Plus récemment, toutefois, des virus ont été cultivés dans ces cultures cellulaires animales et, pour des raisons de rapidité et d'allergies des patients, cette méthode de culture est préférée. Si la culture virale sur des oeufs est utilisée, alors 20 un ou plusieurs acides aminés peuvent être introduits dans le fluide allantoïque de l'oeuf en même temps que le virus [7]. Quand on a recours à la culture cellulaire, le substrat de croissance virale sera typiquement une lignée cellulaire d'origine mammifère. Les cellules appropriées d'origine mammifère comprennent, 25 sans toutefois y être limitées, celles du hamster, de bovins, de primates (y compris l'homme et les singes) et de chiens. Les lignées cellulaires de mammifères préférées pour faire croître des virus de la grippe comprennent : les cellules MDCK [20 ù 23], issues d'un rein de chien (Madin Darby canine kidney), les cellules Vero [24 ù 26], issues du rein 30 du singe vert africain (Cercopithecus aethiops), ou les cellules PER.C6 [27] issues de rétinoblastes embryonnaires humains. Ces lignées cellulaires sont largement disponibles, par exemple auprès de la 2949344 -9- American Type Oeil Culture (ATCC) collection, des Coriell Oeil Repositories ou de la collection européenne de cultures cellulaires animales (ECACC). Par exemple, l'ATCC fournit divers types de cellules Vero sous les numéros de catalogue CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 et 5 CRL-1587, et elle fournit des cellules MDCK sous le numéro de catalogue CCL-34. Des cellules PER.C6 peuvent être obtenues auprès de l'ECACC sous le numéro de dépôt 96022940. Les lignées cellulaires qui ont la plus grande préférence pour cultiver des virus de la grippe sont les lignées cellulaires MDCK. La 10 lignée cellulaire MDCK originale peut être obtenue auprès de l'ATCC en tant que CCL-34, mais des dérivés de cette lignée cellulaire peuvent aussi être utilisés. Par exemple, la référence 20 divulgue une lignée cellulaire MDCK qui a été adaptée pour être cultivée dans une culture en suspension (`MDCK 33016', déposée comme DSM ACC 2219). De 15 manière similaire, la référence 28 divulgue une lignée cellulaire issue de la lignée MDCK qui grandit en suspension dans une culture sans sérum ('B-702', déposée comme FERM BP-7449). La référence 29 divulgue des cellules MDCK non tumorigènes, comprenant `MDCK-S' (ATCC PTA-6500), `MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), `MDCK-SF102' (ATCC 20 PTA-6502) et `MDCK-SF103' (PTA-6503). La référence 30 divulgue des lignées cellulaires MDCK avec une susceptibilité élevée à l'infection, comprenant des cellules `MDCK.5F1' (ATCC CRL-12042). N'importe laquelle de ces lignées cellulaires MDCK peut être utilisée. Quand un virus a été cultivé sur une lignée cellulaire de 25 mammifère, alors la composition peut avantageusement être exempte de protéines d'oeuf (par exemple ovalbumine et ovomucoïde) et de l'ADN de la poule, réduisant ainsi l'allergénicité. Quand le virus a été cultivé sur une lignée cellulaire, alors la culture de croissance, et également l'inoculum viral utilisé pour 30 démarrer la culture, seront de préférence exempts (c'est-à-dire auront été testés et auront un résultat négatif en ce qui concerne la contamination par) le virus herpes simplex, le virus syncytial respiratoire, le virus 2949344 - 10 - parainfluenza de type 3, le coronavirus SRAS, l'adénovirus, le rhinovirus, les réovirus, les polyomavirus, les birnavirus, les circovirus et / ou les parvovirus [31]. L'absence de virus herpes simplex est particulièrement préférée. 5 Pour la croissance sur une lignée cellulaire, par exemple sur des cellules MDCK, on peut faire croître le virus sur des cellules en suspension [20, 32, 33] ou dans une culture adhérente. Une lignée cellulaire MDCK appropriée pour une culture en suspension est MDCK 33016 (déposée comme DSM ACC 2219). Comme alternative, une 10 culture sur des microporteurs peut être utilisée. On fait de préférence croître les lignées cellulaires supportant une réplication du virus de la grippe dans des milieux de culture sans sérum et/ou sans protéine. Est dénommé milieu sans sérum dans le contexte de la présente invention un milieu dans lequel il n'y a 15 pas d'additifs de sérum d'origine humaine ou animale. Il est entendu que sans protéine signifie des cultures dans lesquelles la multiplication des cellules survient à l'exclusion de protéines, de facteurs de croissance, d'autres additifs de protéines et de protéines qui ne sont pas de protéines de sérum, mais qui peuvent comprendre optionnellement des protéines 20 de type trypsine ou d'autres protéases qui peuvent être nécessaires pour la croissance virale. Les cellules croissant dans de telles cultures contiennent naturellement elles-mêmes des protéines. On fait de préférence croître les lignées cellulaires supportant la réplication du virus de la grippe à moins de 37° C [34] 25 pendant la réplication virale, par exemple à 30 û 36° C, à 31 - 35° C, ou à 33+1°C. Le procédé pour propager un virus dans des cellules cultivées comprend en général les étapes consistant à inoculer aux cellules cultivées la souche à cultiver, à cultiver les cellules infectées 30 pendant une période de temps désirée pour la propagation du virus, telle que déterminée par exemple par titre viral ou expression d'antigènes (par exemple entre 24 et 168 heures après inoculation) et à collecter le virus 2949344 -11- propagé. On inocule aux cellules cultivées un virus (mesuré par PFU or TCID50) dans un rapport cellulaire de 1 : 500 à 1 : 1, de préférence de 1 : 100 à 1 : 5, mieux encore de 1 : 50 à 1:10. Le virus est ajouté à une suspension de cellules ou est appliqué à une monocouche des cellules, 5 et le virus est absorbé sur les cellules pendant au moins 60 minutes mais en général pendant moins de 300 minutes, de préférence entre 90 et 240 minutes à une température de 25° C à 40°C, de préférence de 28° C à 37° C. La culture de cellules infectées (par exemple monocouches) peut être enlevées soit par gel - dégel ou par action enzymatique pour 10 accroître le contenu viral des surnageants de culture récoltés. Les fluides récoltés sont alors soit inactivés soit stockés congelés. Les cellules cultivées peuvent être infectées avec une multiplicité d'infection (� MOI �) d'environ 0,0001 à 10, de préférence de 0,002 à 5, mieux encore de 0,001 à 2. Mieux encore, les cellules sont infectées avec une MOI 15 d'environ 0,01. Les cellules infectées peuvent être récoltées de 30 à 60 heures après infection. Les cellules sont de préférence récoltées de 34 à 48 heures après infection. Mieux encore, les cellules sont récoltées de 38 à 40 heures après infection. Des protéases (typiquement de la trypsine) sont en général ajoutées pendant la culture cellulaire pour permettre la 20 libération du virus, et les protéases peuvent être ajoutées à un quelconque stade approprié pendant la culture. L'hémagglutinine (HA) est le principal immunogène dans les vaccins inactivés contre la grippe et les doses de vaccin sont standardisées par référence à des niveaux de HA, typiquement mesurés 25 par un dosage par immunodiffusion radiale simple (SRID). Les vaccins actuels contiennent typiquement environ 15 pg de HA par souche, bien que des doses plus faibles soient également utilisées, par exemple pour les enfants ou dans des situations d'urgence. Des doses fractionnaires telles que '/2 (c'est-à-dire 7,5 pg de HA par souche), 1/4 (c'est-à-dire 3,75 30 pg par souche) et 1/8 ont été utilisées [35, 36], tout comme des doses plus fortes (par exemple des doses 3x ou 9x [37, 38]. Donc, les vaccins peuvent comprendre entre 0,1 et 150 pg de HA par souche grippale, de 2949344 - 12 - préférence entre 0,1 et 50 pg, par exemple. 0,1 - 20 pg, 0,1 - 15 pg, 0,1 - 10 pg, 0,1 - 7,5 pg, 0,5 - 5 pg, 3,75 - 15 pg etc. Des doses particulières comprennent par exemple environ 45, environ 30, environ 15, environ 10, environ 7,5, environ 5, environ 3,8, environ 3,75, environ 5 1,9, environ 1,5, etc. pg par souche. La HA utilisée avec l'invention peut être une HA naturelle telle qu'on la trouve dans un virus ou peut avoir été modifiée. Quand on a fait croître un virus sur une lignée cellulaire, alors la pratique courante est de réduire la quantité d'ADN résiduel de la 10 lignée cellulaire dans le vaccin final afin de réduire toute activité oncogénique de l'ADN. Donc, la composition contient de préférence moins de 10 ng, de préférence moins de 1 ng, et mieux encore moins de 100 pg) d'ADN résiduel de la cellule hôte par dose, bien que des quantités d'ADN de la cellule hôte sous forme de trace peuvent être 15 présentes. En général, l'ADN de la cellule hôte qu'il est souhaitable d'exclure est l'ADN qui est plus long que 100 bp. L'ADN contaminant peut être éliminé pendant la préparation du vaccin en utilisant des procédures de purification standard, par exemple la chromatographie, etc. L'élimination de l'ADN résiduel de la 20 cellule hôte peut être améliorée par traitement à la nucléase, par exemple en utilisant une DNase. Un procédé commode pour réduire la contamination par l'ADN de la cellule hôte est divulgué dans les références 39 & 40; il comprend un traitement en deux étapes, tout d'abord l'utilisation d'une DNase (par exemple Benzonase) qui peut être 25 utilisée pendant la croissance virale et puis d'un détergent cationique (par exemple CTAB) qui peut être utilisé pendant la dissociation des virions. Un traitement avec un agent alkylant, tel que de la 3-propiolactone, peut aussi être utilisé pour éliminer l'ADN de la cellule hôte et peut aussi être avantageusement utilisé pour inactiver les virions [41] tout en évitant 30 l'utilisation de formaldéhyde. 2949344 - 13 - Adjuvants sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau Des compositions réalisées en utilisant l'invention peuvent comprendre (ou être utilisées avec) un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau qui peut fonctionner pour améliorer les réponses 5 immunitaires (humorales et / ou cellulaires) obtenues chez un patient qui reçoit la composition. Diverses émulsions appropriées sont connues et elles comprennent typiquement au moins une huile et au moins un agent tensioactif, l'huile (les huiles) et l'agent tensioactif (les agents 10 tensioactifs) étant biodégradables (métabolisables) et biocompatibles. Les gouttelettes d'huile dans l'émulsion font en général moins de 5 pm de diamètre, et l'émulsion comprend avantageusement des gouttelettes d'huile de diamètre submicronique, ces petites tailles étant obtenues avec un microfluidiseur pour fournir des émulsions stables. On préfère 15 des gouttelettes ayant une taille inférieure à 220 nm étant donné qu'elles peuvent être soumises à une stérilisation par filtration. Les adjuvants spécifiques sous forme d'émulsion qui sont utiles avec l'invention incluent, sans toutefois y être limités: • Une émulsion submicronique de squalène, de Tween 80 et de Span 20 85. La composition de l'émulsion en volume peut être d'environ 5 0/0 de squalène, d'environ 0,5 % de polysorbate 80 et de 0,5 % de Span 85. En termes de poids, ces rapports deviennent 4,3 % de squalène, 0,5 % de polysorbate 80 et 0,48 % de Span 85. Cet adjuvant est connu en tant que `MF59' [42 û 44], comme décrit de manière plus 25 détaillée au chapitre 10 de la référence 45 et au chapitre 12 de la référence 46. L'émulsion de MF59 comprend avantageusement des ions de citrate, par exemple 10 mM de tampon citrate de sodium. • Une émulsion comprenant du squalène, un a-tocophérol, et du polysorbate 80. Ces émulsions peuvent avoir de 2 à 10 % de 30 squalène, de 2 à 10 % de tocophérol et de 0,3 à 3 % de Tween 80 et le rapport pondéral de squalène : tocophérol est de préférence 1 (par exemple 0,90) étant donné qu'il fournit une émulsion plus stable. 2949344 - 14 - Squalène et Tween 80 peuvent être présents selon un rapport volumique d'environ 5 : 2, ou un rapport pondéral d'environ 11 : 5. Une telle émulsion peut être réalisée en dissolvant du Tween 80 dans du PBS pour donner une solution à 2 %, puis en mélangeant 90 ml de 5 cette solution avec un mélange de (5 g de DL-a-tocopherol et 5 ml de squalène), puis en microfluidisant le mélange. L'émulsion résultante peut avoir des gouttelettes d'huile submicroniques, par exemple ayant un diamètre moyen entre 100 et 250 nm, de préférence d'environ 180 nm. 10 • Une émulsion comprenant du squalène, un solvant aqueux, un agent tensioactif non ionique hydrophile à base d'éther d'alkyle polyoxyéthyléné (par exemple un éther de cétostéaryle polyoxyéthyléné (12)) et un agent tensioactif non ionique hydrophobe (par exemple un ester de sorbitan ou un ester de mannide, tel que du 15 monoléate de sorbitan ou du `Span 80'). L'émulsion est de préférence thermoréversible et / ou a au moins 90 % de gouttelettes d'huile (en volume) ayant une taille inférieure à 200 nm [47]. L'émulsion peut aussi comprendre un ou plusieurs de: alditol (par exemple mannitol), un agent cryoprotecteur (par exemple un sucre tel que du 20 dodécylmaltoside et/ ou du sucrose), et/ ou un alkylpolyglycoside. De telles émulsions peuvent être lyophilisées. L'émulsion peut comprendre du squalène : éther de cétostéaryle polyoxyéthyléné : oléate de sorbitan : mannitol 330 : 63 : 49 : 61. Les antigènes et les adjuvants dans une composition seront 25 typiquement un ajout mélangé au moment de l'administration à un patient. Les émulsions peuvent être mélangées avec l'antigène pendant la fabrication ou de manière extemporanée au moment de l'administration. Donc, l'adjuvant et l'antigène peuvent être conservés séparément dans un vaccin emballé ou distribué, prêt pour la formulation 30 finale au moment de l'utilisation. L'antigène se présentera en général sous une forme aqueuse de sorte que le vaccin est finalement préparé en mélangeant deux liquides. Le rapport volumique des deux liquides 2949344 - 15 - pour le mélange peut varier (par exemple entre 5 : 1 et 1 : 5) mais est en général d'environ 1 : 1. Quand une composition comprend un tocophérol, on peut utiliser un quelconque des a, [3, y, 6, c ou tocophérols mais on préfère 5 les a-tocophérols. Un a-tocophérol préféré est le DL- a-tocophérol et le sel préféré de ce tocophérol est le succinate. Comme mentionné ci-dessus, les émulsions d'huile dans de l'eau comprenant du squalène sont particulièrement préférées. Dans certaines formes de réalisation, la concentration de squalène dans une 10 dose de vaccin peut être de l'ordre de 5 û 15 mg (c'est-à-dire une concentration de 10 û 30 mg / ml, pour un volume de dose de 0,5 ml). Il est néanmoins possible de réduire la concentration de squalène [48, 49], par exemple pour comprendre 60 ans), ces critères sont : (1) 60 % de séroprotection; (2) 30 % de séroconversion et / ou (3) une augmentation de la MGT 2 fois. Ces critères sont fondés sur des essais ouverts avec au moins 50 patients. Les critères s'appliquent pour chaque souche dans un vaccin. Virus réassortis Comme mentionné ci-dessus, l'invention peut utiliser une souche de virus de la grippe réassorti. Dans un tel virus réassorti, (a) le gène viral de l'hémagglutinine code une hémagglutinine qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3 et (b) au moins un autre gène viral provient de la souche de virus de la grippe (A/Puerto Rico/8/34). Donc, le virus peut comprendre au moins un des segments NP, M, NS, PA, PB1 et / ou PB2 de A/PR/8/34. Dans un autre virus réassorti, (a) le gène viral de l'hémagglutinine code une protéine hémagglutinine qui a au moins k % d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: 1, k étant égal à 85 ou plus, par exemple 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus (par exemple 100), et (b) au moins un autre gène viral provient de la souche de virus de la grippe (A/Puerto Rico/8/34). Donc, le virus peut comprendre au 2949344 - 24 - moins un des segments NP, M, NS, PA, PB1 et / ou PB2 de A/PR/8/34. Dans ces virus, le gène neuramidase viral peut coder une protéine neuramidase qui a au moins j % d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: 4, j étant égal à 75 ou plus, par exemple 75, 80, 85, 88, 90, 5 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus (par exemple 100). Dans certaines formes de réalisation, la neuramidase est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 4 qu'à la SEQ ID NO: 5. Les huit segments du génome du virus de la grippe A codent (i) la sous-unité PA de la polymérase virale, (ii) la sous-unité PB1 10 de la polymérase virale, (iii) la sous-unité PB2 de la polymérase virale, (iv) la nucléoprotéine virale, (v) les protéines de la matrice virale, (vi) les protéines virales NS1 et NS2, (vii) l'hémagglutinine et (viii) la neuramidase. Les virus réassortis préférés sont des réassortis 6 : 2, c'est-à-dire qu'ils comprennent 6 segments d'une souche (par exemple 15 de A/PR/8/34) mais les segments HA et NA d'une souche différente (par exemple comme défini ci-dessus par référence aux SEQ ID NO 1 et 4). Dans d'autres formes de réalisation, il y a un réassorti 7 : 1 avec HA comme défini ci-dessus. Dans d'autres formes de réalisation, le virus comprend des gènes de trois origines différentes mais avec au moins un 20 segment (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6) provenant de A/PR/8/34. Des segments viraux de A/PR/8/34, et leurs séquences, sont largement disponibles Ces virus sont particulièrement utiles pour préparer des vaccins et peuvent être commodément préparés par génétique inverse. 25 Des vaccins comprenant un ou plusieurs des gènes viraux de A/PR/8/34 peuvent être utilisés pour préparer des vaccins inactivés contre la grippe. Les virus réassortis peuvent être cultivés dans des cellules MDCK et l'invention utilise un procédé pour préparer un vaccin comprenant les étapes consistant à : (i) infecter une culture cellulaire 30 avec un virus comme défini ci-dessus, (ii) cultiver la culture cellulaire de l'étape (i) pour produire d'autres virus, (iii) purifier les virus obtenus à l'étape (ii), et (iv) traiter les virus purifiés à l'étape (iii) pour préparer un 2949344 - 25 - vaccin. Le vaccin peut être un vaccin en vrac. Il peut être utilisé pour produire un produit de vaccin final monovalent ou il peut être utilisé comme un composant pour fabriquer un produit de vaccin final multivalent. La culture cellulaire à l'étape (i) est de préférence une culture 5 de cellules MDCK mais d'autres cellules (idéalement des cellules de mammifères tels que des cellules PER.C6) peuvent être utilisées comme alternative. L'invention fournit également un procédé pour préparer un vaccine comprenant les étapes consistant à (i) préparer un virus de la 10 grippe réassorti en recourant à la génétique inverse, par exemple avec un gène hémagglutinine viral codant une hémagglutinine qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: qu'à la SEQ ID NO: 3; (ii) utiliser la souche réassortie pour fabriquer un vaccin. L'étape (ii) peut comprendre: la culture d'un virus (par exemple dans des oeufs ou en 15 culture cellulaire) et la préparation du vaccin à partir du virus cultivé. Le virus cultivé peut être inactivé, et le virus inactivé peut ensuite être utilisé pour préparer le vaccin (par exemple après fragmentation ou après purification des antigènes). L'invention fournit également un procédé pour préparer un 20 vaccin comprenant une étape consistant à utiliser un virus de la grippe réassorti comme défini ci-dessus, qui a été préparé en recourant à la génétique inverse. Généralités Le terme � comprenant � englobe � contenant � ainsi que 25 � consistant �, par exemple une composition comprenant X peut consister exclusivement en X ou peut contenir quelque chose en plus par exemple X + Y. Le mot � essentiellement � n'exclut pas � complètement �, par exemple une composition qui est � essentiellement exempte � de Y 30 peut être complètement exempte de Y. Quand c'est nécessaire, le mot � essentiellement � peut être omis de la définition de l'invention. Le terme � environ � se rapportant à une valeur numérique - 26 - x est optionnel et signifie, par exemple x � 10 %. Sous réserve d'indication spécifique, un processus comprenant une étape consistant à mélanger deux ou plus de deux composants ne requiert pas un ordre spécifique de mélange. Donc, les composants peuvent être mélanger dans un ordre quelconque. Quand il y a trois composants, deux composants peuvent alors être combinés l'un avec l'autre et la combinaison peut ensuite être combinée avec le troisième composant, etc. Quand des matériels animaux (et notamment bovins) sont utilisés dans la culture de cellules, ils doivent être obtenus de sources qui sont exemptes d'encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) et notamment exemptes d'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB). Dans l'ensemble, on préfère des cellules de culture en l'absence totale de matériels dérivés d'animaux. Quand un substrat cellulaire est utilisé pour des procédures de réassortiment ou de génétique inverse, il est de préférence un substrat qui a été approuvé pour une utilisation dans la production de vaccins humains, par exemple comme dans le chapitre général 5.2.3 de la Ph Eur. Une identité entre des séquences de polypeptide est de préférence déterminée par l'algorithme de recherche d'homologie de Smith-Waterman tel qu'implémenté dans le programme MPSRCH (Oxford Molecular) en utilisant une recherche affine gap avec les paramètres gap open penalty=12 et gap extension penalty=l. MODES DE MISE EN OEUVRE DE L'INVENTION Produits FocetriaTM et CelturaTM Soit des oeufs SPF (pour FocetriaTM) soit une culture en suspension de cellules MDCK (pour CelturaTM) ont été infectés avec une souche réassortie H1 N1 du virus de la grippe A avec une hémagglutinine qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3. Les virus ont été cultivés en utilisant des techniques connues, puis collectés et inactivés, et des vaccins monovalents à antigènes de 2949344 - 27 - surface ont été préparés à partir des virus purifiés. Les antigènes purifiés ont été dilués et puis combinés avec une émulsion d'huile dans de l'eau comprenant des gouttelettes de squalène submicroniques (MF59TM) pour fournir le vaccin en vrac pour le produit FocetriaTM (ayant 7,5 pg 5 d'hémagglutinine par dose unitaire de 0,5 ml) et le produit CelturaTM (ayant 3,75 pg d'hémagglutinine par dose unitaire de 0,5 ml). Les produits sont introduits dans des seringues. Donc, les produits sont distribués dans des seringues pré-remplies pour injection, par exemple dans le deltoïde ou la partie antérolatérale de la cuisse. Ces deux 10 produits sont sûrs et efficaces et ont été autorisés pour un usage humain dans divers territoires. Autres produits Comme indiqué dans la référence 52, un vaccin monovalent à virions fragmentés non adjuvanté a été préparé à partir 15 d'une souche A/California/7/2009 HlN1sw dans des oeufs de poule embryonnés avec les mêmes techniques standard que celles qui sont utilisées pour la production du vaccin inactivé trivalent saisonnier CSL [53]. Deux vaccins différents ont été fabriqués : un avec une dose de 15 pg de HA (volume de 0,25 ml) et un autre avec une dose de 30 pg de HA 20 (volume de 0,5 ml). La référence 54 fournit des détails de fabrication d'un vaccin monovalent inactivé à virions entiers avec un adjuvant de phosphate d'aluminium, ayant 6 pg de HA par dose. Il est entendu que l'invention n'a été décrite qu'à titre 25 d'exemple et que des modifications peuvent être apportées tout en restant dans le cadre et l'esprit de l'invention. - 28 - REFERENCES [1] Vaccines. (eds. Plotkin & Orenstein). 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216- 9688-0. [2] WO02/28422. [3] WO02/067983. 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Procédé pour fabriquer un vaccin, dans lequel le vaccin est adjuvanté avec un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau, comprenant les étapes consistant à : (i) préparer un virus de la grippe réassorti en recourant à la génétique inverse, dans lequel le virus a une hémagglutinine comprenant une séquence d'acide aminé HA1 ayant au moins 95 % d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: 2; et (ii) utiliser la souche réassortie pour fabriquer un vaccin en cultivant un virus dans des oeufs ou en culture cellulaire, et préparer le vaccin à partir du virus cultivé. 3. Procédé pour fabriquer un vaccin, comprenant une étape consistant à utiliser un virus de la grippe réassorti qui est préparé en recourant à la génétique inverse, dans lequel le virus réassorti a une hémagglutinine comprenant une séquence d'acide aminé HA1 ayant au moins 95 % d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: 2, et dans lequel le vaccin est adjuvanté avec un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau. 4. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le vaccin est préparé à partir de virions grippaux inactivés. 5. Procédé de la revendication 4, dans lequel le vaccin comprend des virions entiers, des virions fragmentés ou des antigènes de surface purifiés. 6. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'hémagglutinine comprend la SEQ ID NO: 7. 7. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le virus a de la neuramidase qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 4 qu'à la SEQ ID NO: 5. 8. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le virus comprend un ou plusieurs segments d'ARN d'un virus A/PR/8/34. 9. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on fait croître le virus sur des oeufs. 10. Procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel on fait croître le virus en culture cellulaire. 11. Procédé de la revendication 10, dans lequel on fait croître le virus en culture cellulaire MDCK ou en culture cellulaire Vero.