FR 2947564 A1 20110107 FR 0954634 A 20090706 B5031FR 1 La présente invention est relative à un catalyseur enzymatique hétérogène, à un procédé de préparation d'un tel catalyseur enzymatique, et à son utilisation pour la réalisation de réactions chimiques par catalyse enzymatique en phase hétérogène. La catalyse enzymatique s'inscrit dans le cadre de la chimie � verte � et du développement durable. Elle permet la réalisation de diverses réactions chimiques en minimisant l'utilisation de solvants, tout en favorisant l'utilisation de bioprécurseurs. Compte tenu du prix élevé des enzymes, notamment en raison de leurs coûts de production et de purification, il est important de pouvoir les récupérer facilement io dans le milieu réactionnel lorsque la réaction qu'elles ont catalysée est terminée. Une des solutions proposées pour résoudre ce problème consiste à immobiliser les enzymes sur un support solide. On parle alors de catalyse enzymatique hétérogène. La catalyse hétérogène (ou catalyse de contact) vise à réaliser une 15 transformation de réactifs liquides ou gazeux, en employant un catalyseur solide. Le processus chimique se déroule à l'interface solide-fluide, grâce à une adsorption des réactifs à la surface du solide. Les différents systèmes catalytiques enzymatiques actuellement proposés sont majoritairement constitués d'un support solide généralement poreux (matrices 20 polymères, silice colloïdale, silicate de calcium, zéolithes, zirconium, kaolinite, verre poreux, alumine, etc...), sur lequel une enzyme purifiée est immobilisée. Ces systèmes permettent la récupération aisée de l'enzyme lorsque la réaction est terminée. Ils présentent cependant un inconvénient majeur dans la mesure où les enzymes doivent être préalablement purifiées avant d'être immobilisées sur le 25 support solide, ce qui augmente inévitablement le coût de revient de ces systèmes catalytiques. Certains auteurs ont également proposé des catalyseurs hétérogènes enzymatiques incorporant des enzymes non purifiées. Le brevet US 6,004,786 décrit en particulier un catalyseur enzymatique hétérogène constitué d'un support 30 solide tel que le verre poreux, la bentonite, les gels de silice, la silice colloïdale, l'hydroxyapatite de silice-alumine, les gels calcium-phosphate, etc... sur/dans lequel des lipases non purifiées sont immobilisées par l'intermédiaire d'un agent de couplage de type silane à fonction ester carboxylique. Cependant, il est démontré dans les exemples de ce brevet US 6,004,786 que l'immobilisation des lipases non 35 purifiées sur les supports utilisés ne conduit à des résultats satisfaisants en termes B5031FR 2 d'activité catalytique que lorsqu'un agent de couplage à fonction ester carboxylique est utilisé. A cet égard, des essais comparatifs d'immobilisation de lipases, réalisés avec un agent de couplage ne possédant pas de fonction carboxylique, à savoir le y-glycidoxypropyltriméthoxysilane, également connu sous le nom commercial s GLYMO, ne permettent pas d'aboutir à de bons résultats en termes d'activité catalytique. Il n'est donc pas possible d'utiliser n'importe quel agent de couplage pour immobiliser des enzymes non purifiées sur/dans un support solide. Il a également déjà été proposé, notamment dans le brevet US 6,025,171, io d'immobiliser des enzymes amphiphiles non purifiées telles que des lipases, sur des sucres (amidon, dextrane, dérivés de cellulose, etc...). Cependant, si de tels supports présentent une stabilité thermique améliorée, leur utilisation répétée implique une étape systématique de régénération après chaque réaction de catalyse, ce qui n'est pas pratique d'un point de vue industriel et interdit leur utilisation dans 15 un procédé de catalyse enzymatique en continu. Par ailleurs, la solubilité partielle ou totale de ces supports en milieu polaire (eau et autres solvants polaires) interdit leur utilisation dans tout procédé de catalyse cyclique ou en flux continu. Enfin, leur utilisation pour la production de biodiesel n'est pas envisageable non plus dans la mesure où les composés néoformés sont tous susceptibles de dissoudre les 20 supports précités. Il existe donc un besoin pour un catalyseur enzymatique hétérogène : - permettant l'utilisation d'enzymes non purifiées avec une très grande efficacité catalytique, - qui soit réutilisable un très grand nombre de fois sans perte 25 significative d'activité catalytique, - qui soit utilisable en milieu polaire et/ou dans un procédé de catalyse en continu (ne nécessitant pas d'étape de régénération intermédiaire), et - pouvant être préparé selon un procédé simple à mettre en oeuvre, notamment avec des agents de couplage classiques. 30 Ce but atteint par le catalyseur enzymatique hétérogène qui fait l'objet de la présente invention et qui va être décrit ci-après. La présente invention a pour objet un catalyseur enzymatique hétérogène caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice ou de silice organiquement modifiée, ledit monolithe B5031FR 3 comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 �m à 100 �m ; des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm et des micropores ayant une dimension moyenne di de 0,7 à 1,5 nm, lesdits pores étant interconnectés, et dans lequel la surface interne des macropores est fonctionnalisée par un agent de couplage choisi parmi les silanes sur lequel est fixée, par l'intermédiaire d'une liaison covalente ou électrostatique, une enzyme non purifiée. Au sens de la présente invention, on entend par � enzyme non purifiée �, tout matériel protéique comprenant au moins une enzyme non isolée, n'ayant subi aucune étape de purification. io On entend par � monolithe �, un objet solide ayant une dimension moyenne d'au moins 1 mm. Ainsi que cela est démontré dans les exemples illustrant la présente demande, l'utilisation d'un tel monolithe rend possible la mise en oeuvre d'enzymes non purifiées ce qui présente un grand intérêt d'un point de vue économique. En 15 effet, l'immobilisation d'une enzyme non purifiée par l'intermédiaire d'un agent de couplage choisi parmi les silanes, au sein des macropores d'un tel monolithe conduit à un catalyseur enzymatique hétérogène présentant une activité catalytique très élevée, atteignant le plus souvent 100 % de l'activité catalytique théorique de l'enzyme lorsqu'elle est mise en oeuvre à l'état purifié ou non immobilisé, ainsi 20 qu'une grande cyclabilité. Les Inventeurs ont également démontré que lorsqu'une enzyme non purifiée est immobilisée dans un tel monolithe, sa cinétique de réaction est augmentée. Dans ce monolithe, les parois des macropores ont généralement une épaisseur de 0,5 à 40 �m, et de préférence de 2 à 25 �m. 25 Selon l'invention, les micropores sont présents dans l'épaisseur des parois des macropores, les rendant alors microporeuses. La surface spécifique du monolithe est généralement de 200 à 1000 m2/g environ, préférentiellement de 300 à 700 m2/g environ. Lorsque le monolithe alvéolaire est constitué d'une matrice de silice 3o organiquement modifiée, la silice porte des groupements organiques R répondant à la formule (I) suivante : -(CH2)n-R1 (I) dans laquelle : B5031FR - 0 io catalyseur enzymatique hétérogène conforme à l'invention et tel que défini ci-dessus, ledit procédé comportant une première étape de préparation d'une empreinte de silice solide sous la forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice ou de silice organiquement modifiée, ledit monolithe comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 �m à 100 �m ; des 15 mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm et des micropores ayant une dimension moyenne di de 0,7 à 1,5 nm, lesdits pores étant interconnectés, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes suivantes : - une deuxième étape de fonctionnalisation de la surface interne des macropores par un agent de couplage choisi parmi les silanes, par 20 imprégnation sous vide du monolithe alvéolaire par une solution de l'agent de couplage dans un solvant organique ; - une troisième étape d'imprégnation, sous vide, du monolithe ainsi fonctionnalisé par une solution aqueuse ou une dispersion aqueuse d'au moins une enzyme non purifiée. 25 Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la préparation de l'empreinte de silice, lors de la première étape, est réalisée selon les procédés tels que décrits dans les demandes de brevet FR-A1-2 852 947 et FR-A1-2 912 400. Ces procédés consistent, de façon générale, à : - préparer une émulsion en introduisant une phase huileuse dans une 30 solution aqueuse de tensioactif, - à ajouter une solution aqueuse d'au moins un précurseur d'oxyde de silice et/ou d'au moins un précurseur d'oxyde de silice organiquement modifié à la solution de tensioactif, avant ou après la préparation de l'émulsion, B5031FR 7 - à laisser le mélange réactionnel au repos jusqu'à la condensation dudit précurseur, puis - à sécher le mélange pour obtenir l'empreinte de silice solide attendue. Dans ce cas, le ou les précurseur(s) d'oxyde de silice ou d'oxyde de silice 5 organiquement modifié peuvent être choisis parmi les alcoxydes de silice de formule (II) suivante : R4p(OR5)4-pSi (II) dans laquelle : - R4 représente un radical alkyle ayant de 1 à 5 atomes de carbone ou un io radical aryle qui portent éventuellement un ou plusieurs groupes fonctionnels ; - R5 représente un radical alkyle ayant de 1 à 5 atomes de carbone ou un groupement de formule (I) suivante : -(CH2)n-R1 (I) 15 dans laquelle 0 20 un groupe phényle ou un groupe phényle substitué par un radical alkyle, de préférence un groupe méthyle ; et - p est un nombre entier égal à 0, 1, 2 ou 3. Dans un mode de réalisation, le précurseur de formule (II) comporte un seul type de groupement de formule (I). Dans un autre mode de réalisation, le 25 précurseur de formule (II) comporte au moins deux types différents de groupements de formule (I). En particulier, le groupement organique de formule (I) peut être : - un groupement 3-mercaptopropyle ; - un groupement 3-aminopropyle ; 30 - un groupement N-(3-propyl) pyrrole ; - un groupement N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyle ; - un groupement 3-(2,4 dinitrophénylamino) propyle ; - un groupement phényle ou benzyle ; - un groupement méthyle ; ou B5031FR 8 - un groupement de formule -(CH2OH-CH2OH)q CH2OH ou -(CH2OH-CH2OH)gCH2CH3 dans lesquels q est un nombre entier variant de1à10 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le ou les précurseur(s) de formule (I) sont choisis parmi le tetraméthoxyorthosilane (TMOS), le tetraéthoxyorthosilane (TEOS), le diméthyldiéthoxysilane (DMDES), le (3 -mercaptopropyl)triméthoxysilane, le (3 -aminopropyl)triéthoxysilane, le N-(3-triméthoxysilylpropyl)pyrrole, le 3-(2,4-dinitrophénylamino)- propyltriéthoxysilane, le N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyltriméthoxysilane, le phényltriéthoxysilane, le méthyltriéthoxysilane et leurs mélanges. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, le précurseur de formule (I) est choisi parmi le TEOS, un mélange de TEOS et de DMDES dans lequel le DMDES représente de 5 à 30 % massique par rapport au TEOS, et le TMOS. La concentration en précurseur(s) d'oxyde de silice et/ou en précurseurs d'oxyde de silice organiquement modifié au sein de la solution aqueuse est, de préférence, supérieure à 10 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse. Cette concentration varie plus préférentiellement de 17 à 35 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse. Selon une forme de réalisation particulière de l'invention, et lorsque la matrice de silice ou de silice organiquement modifiée comprend en outre au moins un oxyde métallique MO2 dans lequel M est un métal choisi parmi Zr, Ti, Th, Nb, Ta, V, W et Al, alors la solution aqueuse de précurseur(s) d'oxyde de silice ou de silice organiquement modifiée comprend en outre au moins un précurseur dudit oxyde métallique, ledit précurseur étant choisi parmi les composés de formule (III) suivante : M(OR6)4 (III) dans laquelle : - M est un métal choisi parmi Zr, Ti, Th, Nb, Ta, V, W et Al, et - R6 est un radical alkyle en C1-C4, de préférence un radical méthyle ou éthyle. La phase huileuse est de préférence constituée par un ou plusieurs composés choisis parmi les alcanes linéaires ou ramifiés ayant au moins 12 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer le dodécane et l'hexadécane. La phase B5031FR 9 huileuse peut en outre être constituée par une huile de silicone de faible viscosité, c'est-à-dire inférieure à 400 centipoise. La quantité de phase huileuse présente au sein de l'émulsion peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir pour l'empreinte de silice, étant entendu que plus la fraction volumique huile/eau sera élevée, plus le diamètre des gouttelettes d'huile au sein de l'émulsion sera faible et plus le diamètre des macropores sera faible également. De manière générale, la phase huileuse représente de 60 à 90 % en volume par rapport au volume total de l'émulsion. Cette quantité d'huile permet d'obtenir io une empreinte de silice dans laquelle le diamètre moyen des macropores varie de 1 à 100 �m environ. Le composé tensioactif peut être un tensioactif cationique choisi notamment parmi le bromure de tetradécyltriméthylammonium (TTAB), le bromure de dodécyltriméthylammonium ou le bromure de cétyl-triméthylammonium. Lorsque 15 le composé tensioactif est cationique, le milieu réactionnel est porté à un pH inférieur à 3, de préférence inférieur à 1. Le bromure de tetradécyltriméthylammonium est particulièrement préféré. Le composé tensioactif peut en outre être un tensioactif anionique choisi parmi le dodécylsulfate de sodium, le dodécylsulfonate de sodium et le 20 dioctylsulfosuccinate de sodium (AOT). Lorsque le composé tensioactif est anionique, le milieu réactionnel est porté à un pH supérieur à 10. Le composé tensioactif peut enfin être un tensioactif non ionique choisi parmi les tensioactifs à tête éthoxylée, et les nonylphénols. Parmi de tels tensioactifs, on peut en particulier citer les copolymères blocs d'éthylèneglycol et 25 de propylèneglycol vendus par exemple sous les dénominations commerciales Pluronic� P123 et Pluronic� F127 par la société BASF. Lorsque le composé tensioactif est non ionique, le milieu réactionnel est porté à un pH supérieur à 10 ou inférieur à 3, de préférence inférieur à 1 et contient en outre, de préférence, du fluorure de sodium afin d'améliorer la condensation des précurseurs de l'oxyde de 30 silice. La quantité totale de tensioactif présente au sein de l'émulsion peut également être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir dans l'empreinte de silice. Cette quantité est également variable en fonction la nature du tensioactif utilisé. B5031FR 10 De manière générale, la quantité de tensioactif varie de 1 à 10 % en masse, de préférence de 3 à 6 % en masse, par rapport à la masse totale de l'émulsion. L'étape de condensation du ou des précurseur(s) d'oxyde de silice et/ou du ou des précurseur(s) d'oxyde de silice organiquement modifié est effectuée avantageusement à une température proche de la température ambiante. La durée de cette étape peut varier de quelques heures (2 à 3 heures) à quelques semaines (2 à 3 semaines) en fonction du pH du milieu réactionnel. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'empreinte de silice obtenue à la fin de la première étape est lavée à l'aide d'un solvant organique (tel io que par exemple le tetrahydrofurane, l'acétone et leurs mélanges), puis séchée (par exemple à l'air en étuve ou par lyophilisation) avant de subir l'étape d'imprégnation par la solution de précurseur de carbone ou de précurseur de céramique. Le solvant de la solution d'agent de couplage utilisé lors de la réaction de 15 couplage est un solvant organique, de préférence choisi parmi le chloroforme, le toluène et leurs mélanges. De façon préférentielle, ledit solvant est un mélange à parts égales, de chloroforme et de toluène. La quantité d'agent de couplage dans la solution utilisée pour l'étape de fonctionnalisation peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores du 20 monolithe de silice et de la quantité d'enzyme non purifiée que l'on souhaite immobiliser. De manière générale, cette quantité peut varier de 0,02 M à 0,5 M, et de préférence de 0,05 M à 0,2 M. Selon une forme de réalisation particulière et préférée de l'invention, on utilise une solution d'agent de couplage à 0,1 M dans un mélange de chloroforme et 25 de toluène 50/50 (v/v). L'étape de fonctionnalisation du monolithe alvéolaire par l'agent de couplage est de préférence réalisée sous vide à température ambiante pendant une durée d'environ 72 heures. L'étape d'immobilisation de l'enzyme non purifiée est de préférence réalisée 30 sous vide à température ambiante pendant une durée d'environ 72 heures. Le lavage du monolithe à la fin de l'étape de fonctionnalisation est de préférence réalisé avec un solvant organique tel que par exemple le tetrahydrofurane, le chloroforme ou l'acétone. Enfin, le monolithe est séché, de préférence à l'air pendant 2 jours environ. B5031FR 11 Le lavage du monolithe à la fin de l'étape d'immobilisation de l'enzyme non purifiée est de préférence réalisé avec de l'eau distillée. Le catalyseur enzymatique hétérogène conforme à la présente invention peut être utilisé pour la réalisation de réactions chimiques catalysées en phase hétérogène. La nature des réactions chimiques susceptibles d'être catalysées par le catalyseur conforme à l'invention variera bien entendu en fonction de la nature de l'enzyme non purifiée qui est immobilisée. Ainsi lorsque l'enzyme non purifiée est une lipase, le catalyseur conforme à l'invention est utilisé pour catalyser l'hydrolyse de triglycérides d'acides gras, des réactions d'estérification entre un acide et un alcool, des réactions de transestérification entre un ester et un alcool, des réactions d'inter-estérification entre deux esters ou des réactions de transfert d'un groupement acétyle d'un ester sur une amine ou sur un thiol. En particulier, lorsque l'enzyme est une lipase, ledit catalyseur peut être 15 utilisé par exemple pour catalyser : - la synthèse du butyloléate qui est un lubrifiant pour les biodiesels ; - l'hydrolyse des dérivés de l'ester glycérolinoléique pour conduire à des savons ou à des détergents : - des réactions de trans-estérifications impliquées dans la synthèse de 20 biodiesels à faible viscosité. La présente invention est illustrée par les exemples de réalisation suivants, auxquels elle n'est cependant pas limitée. EXEMPLES Les matières premières utilisées dans les exemples qui suivent sont listées 25 ci-après : - Bromure de tetradécyltriméthylammonium à 98 % (TTAB) : société Fluka ; - Tetraéthoxyorthosilane à 98 % (TEOS) : société Fluka ; - Dodécane à 99 % : société Fluka ; 30 - Agent de couplage : y-glycidoxypropyltriméthoxysilane vendu sous la dénomination commerciale Glymo par la société Sigma Aldrich (St-Louis, MO) ; - Lipase de Candida Rugosa, E.C.3.1.1.3, Type VII, à 700 U/mg, Société Sigma Chemical (St Louis, MO) ; B5031FR 12 - Lipase de Thermomyces Lanuginosus, solution à au moins 100000 U/g, société Sigma Aldrich (St. Louis, MO) ; - Acide oléique, trilinoléate de glycéryle (98 %), linoléate d'éthyle (> 98%), acide linoléique (> 99 %), n-heptane, éthanol, 1-butanol, Société Sigma Aldrich (Paris, France). Les autres produits chimiques et solvants utilisés dans les exemples étaient tous de grade analytiques ou de grade HPLC. Ces matières premières ont été utilisées telles que reçues des fabricants, sans purification supplémentaire. Caractérisations : La macroporosité a été caractérisée de manière qualitative par une technique de microscopie électronique à balayage (MEB) à l'aide d'un microscope électronique à balayage vendu sous la référence JSM-840A par la société JEOL, fonctionnant à 10 kV. Les échantillons ont été revêtus d'or ou de carbone avant leur caractérisation. La macroporosité a été quantifiée par des mesures d'intrusion de mercure, à l'aide d'un appareil commercialisé sous la dénomination Micromeritics Autopore IV, pour atteindre les caractéristiques des cellules macroscopiques composant le squelette du monolithe. Les mesures de surface spécifique et les caractérisations à l'échelle mésoscopique ont été faites par des techniques d'adsorption-désorption d'azote à l'aide d'un appareil commercialisé sous la dénomination Micromeritics ASAP 2010 ; le dépouillement étant fait par les méthodes de calcul B.E.T ou B.J.H.. Les monolithes ont été soumis à une analyse par diffraction des rayons X (RX) aux petits angles (SAX5), à l'aide d'une source de RX à anode tournante de 18 kW (Rigaku-200) utilisant un cristal (111) de Ge comme monochromateur. La radiation diffusée a été collectée sur un collecteur à deux dimensions (Imaging Plate system, commercialisé par Mar Research, Hamburg). La distance du détecteur à l'échantillon était de 500 mm. La mésoporosité a été caractérisée de manière qualitative par une technique de microscopie électronique à transmission (MET) à l'aide d'un microscope vendu sous la référence H7650 par la société Hitachi, ayant une tension d'accélération de 80 kV, et couplé à une caméra vendue sous la référence Orius 11 MPX par la société Gatan Inc.. B5031FR 13 Des analyses par chromatographie liquide haute performance (High Performance Liquid Chromatography � : HPLC) ont été réalisées sur un système équipé de pompes à solvants 600 à injection manuelle (Waters, Milford, MA, USA), en régime isocratique, et en utilisant de l'acétonitrile comme phase mobile. Les composés ont été séparés sur une colonne de chromatographie Atlantis dC18 (4,6 mm x 150 mm, 5 �m) avec une colonne de garde Atlantis dC18 (Waters). Les colonnes ont été utilisées à température ambiante. Le logiciel Empower� (Waters) a été utilisé pour l'acquisition et le traitement des données. Les standards ont été dissous dans le méthyléther de t-butyle (MTBE). Toutes les solutions ont été io filtrées au travers d'une membrane de 0,45 �m et dégazées avant usage. Le débit de la phase liquide a été fixé à 1 ml/min et le volume des échantillons injectés était de 20 pl. Les réactions catalysées d'estérification ont été suivies à l'aide d'un réfractomètre vendu sous la référence 410 par la société Waters (Milford, MA, USA). Pour la détection des produits issus des réactions catalysées d'hydrolyse et 15 de trans-estérification, le système a été équipé d'un détecteur ultraviolet (UV) à barrettes de diodes (WAT996, Waters, Milford, MA, USA). Les mesures ont été réalisées à une longueur d'onde de 204 nm, ce qui correspondait à l'absorbance maximum. Le gradient d'élution suivant a été utilisé : (Solvant A : acétonitrile, solvant B : MTBE) : A/B : 100/0 (v/v) isocratique pendant 4 min., A/B : 70/30 20 (v/v) gradient pendant 2 min., A/B : 70/30 (v/v) puis A/B : 100/0 (v/v) gradient pendant 5 min. La colonne a été équilibrée dans les conditions données ci-dessus pendant 10 minutes. Exemple 1 Préparation de monolithes de silice intégrant une enzyme 25 Dans cet exemple on illustre la préparation de monolithes de silice et l'immobilisation de lipases dans les macropores de ces monolithes. 1) Première étape : Synthèse du monolithe de silice (MSi). 5,02 g de TEOS ont été ajoutés à 16,02 g d'une solution aqueuse de TTAB à 35 % massique. On a ensuite acidifié cette solution par ajout de 5,88 g d'une 3o solution d'acide chlorhydrique concentré à 37 %. On a laissé l'hydrolyse se dérouler sous agitation pendant environ 5 minutes jusqu'à obtention d'un milieu hydrophile monophasique (phase aqueuse de l'émulsion). On a ensuite ajouté à cette phase aqueuse, 40,0 g de dodécane (phase huileuse de l'émulsion) au goutte à goutte et sous agitation. Le mélange a été transféré dans un récipient cylindrique 35 servant de moule macroscopique. On a ensuite laissé l'émulsion se condenser sous forme d'un monolithe de silice pendant 3 jours à température ambiante. Le B5031FR 14 monolithe de silice ainsi synthétisé a ensuite été lavé trois fois au tetrahydrofurane (THF). Le monolithe de silice a alors été mis à sécher pendant 3 jours à température ambiante puis il a été soumis à traitement thermique à 650°C pendant 6 heures en appliquant une vitesse de montée en température de 2°C/min., avec un plateau à 200°C pendant 2 heures. On a obtenu un monolithe de silice que l'on a désigné MSi. Le monolithe ainsi obtenu présentait les caractéristiques morphologiques suivantes : - porosité : 94 % - densité du monolithe : 0,085 g.cm 3 - densité du squelette de silice : 1,56 g.cm 3 - mésopores de type vermiculaire, distance moyenne entre 2 parois : 311, - Surface spécifique : 170 m2.g-1 (BET) significative d'une macroporosité élevée et 45 m2.g-1 (B.J.H.) significative d'une faible mésoporosité. 2) Deuxième étape : Fonctionnalisation du monolithe de silice par un agent de couplage de type silane Le monolithe de silice obtenu ci-dessus à l'étape précédente a été découpé en plusieurs morceaux de 1 g chacun. Chaque morceau a ensuite été fonctionnalisé par du Glymo. Pour ce faire, les différents morceaux de Msi ont été placés dans un récipient contenant une solution de 0,01 mol. de Glymo dans 120 g de chloroforme. La suspension a été placée sous vide pour favoriser l'imprégnation. Après 48 heures à température ambiante, la suspension a été filtrée, puis les morceaux de Msi récupérés ont été lavés au chloroforme, puis à l'acétone, avant d'être finalement séchés à l'air. On a obtenu ainsi des monolithes dont la surfaces des macropores est fonctionnalisée par du Glymo (MSi-Glymo). 3) Deuxième étape : Immobilisation des lipases dans les macropores des MSi-Glymo 540 mg de lipase non purifiée de Candida Rugosa (1CR) ont été dispersés dans 18 ml d'eau distillée et mélangés pendant une heure jusqu'à obtention d'une solution. On a ensuite introduit des morceaux de 250 mg de MSi-Glymo dans la solution aqueuse de lipase, puis on a soumis le mélange à un vide de 20 mbar B5031FR 15 pendant 72 heures à température ambiante afin d'imprégner les MSi-Glymo de la solution de lipase. 53 mg de lipase non purifiée de Thermomyces Lanuginosus (1TL) ont été dissous dans 10 ml d'eau distillée. On a ensuite introduit des morceaux de 350 mg de MSi-Glymo dans la solution aqueuse de lipase, puis on a soumis le mélange à un vide de 20 mbar pendant 72 heures à température ambiante afin d'imprégner les MSi-Glymo de la solution de lipase. Les monolithes de silice ont ensuite été extraits des solutions de lipase puis lavés trois fois à l'eau distillée afin d'éliminer l'excès d'enzymes, puis séchés à température ambiante pendant 12 heures. On a ainsi obtenu des monolithes de silice immobilisant une lipase par l'intermédiaire du Glymo (MSi-Glymo-1CR et MSi-Glymo-1TL). Ces monolithes ont été stockés à 4°C avant leur utilisation à titre de catalyseur enzymatique hétérogène. Exemple 2 Esterification de l'acide oléique par le 1-butanol, en présence d'un catalyseur enzymatique conforme à l'invention Dans cet exemple on a réalisé une réaction catalysée d'estérification de l'acide oléique (1) par le 1-butanol (2) selon le schéma réactionnel suivant : H3C.. ~~(CH2)7 OH (1) (CH2)7 11 I{ O + H3COH (2) Cette réaction conduit à la formation de l'ester butylique de l'acide oléique (3). 2,0 mmoles d'acide oléique (1), 1,0 mmole de 1-butanol (2) et 0,247 mg de MSi-Glymo-1CR tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1, ont été introduits dans 2 ml d'heptane. Le mélange réactionnel a été incubé à 37°C pendant 24 heures et la formation de l'ester (3) a été suivie par HPLC. La même réaction d'estérification a ainsi été répétée 21 fois en utilisant, à chaque fois, le même catalyseur. Entre les 10ème et 11éme réactions, le catalyseur a été stocké à 4°C pendant 2 mois. H3C,, ~~(CH2) CH3 (CH2)7 (3) Heptane, 37°C B5031FR 16 Entre chaque réaction d'estérification, le catalyseur a donc été récupéré, lavé à l'heptane, puis séché avant d'être à nouveau réutilisé pour catalyser une nouvelle réaction d'estérification. La même expérience a été réalisée à titre comparatif avec un monolithe de silice tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1 mais selon un procédé de préparation dans lequel l'étape de fonctionnalisation de la surface interne des pores du monolithe par le Glymo n'a pas été réalisée. L'étape d'imprégnation par la solution de lipase de Candida Rugosa ayant été réalisée directement après la synthèse du monolithe. On a ainsi obtenu un catalyseur enzymatique ne faisant pas partie de io l'invention et qui a été dénommé MSi-1CR. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 1 annexée sur laquelle le taux de conversion de l'acide (1) en ester (3), exprimé en pourcentage, est fonction du temps en heures. Le nombre de cycles (un cycle correspondant à la réalisation d'une réaction d'estérification et d'un lavage du catalyseur) est indiqué au dessus 15 de chacun des pics. Le tracé en ligne continue correspond au suivi des réactions d'estérification catalysées par le catalyseur MSi-Glymo-1CR conforme à l'invention, alors que le tracé en pointillés correspond au suivi des réactions d'estérification réalisées avec le catalyseur MSi-LCR non conforme à l'invention. Les résultats présentés sur la figure 1 démontrent que le catalyseur 20 enzymatique MSi-Glymo-Lc conforme à la présente invention permet de catalyser 19 réactions successives d'estérification de l'acide (1) en ester (3) avec un taux de conversion de 100 %. Une légère diminution du taux de conversion apparaît entre les 20ème et 21ème cycles. Ces résultats montrent également que le stockage du catalyseur MSi-Glymo-1CR à 4°C pendant 2 mois entre les 10è'et 11ème cycles n'a 25 pas affecté ses performances catalytiques. On remarque par contre que l'activité catalytique du catalyseur MSi-1CR non conforme à l'invention n'atteint jamais 100 % (95 % seulement lors du premier cycle) et que la cinétique de la réaction est par ailleurs deux fois plus lente qu'avec le catalyseur enzymatique MSi-Glymo-1CR conforme à la présente invention. L'activité catalytique du MSi-1CR commence 30 d'autre part à diminuer dès le 2ème cycle d'estérification, pour atteindre 87 % au bout du Sème cycle d'estérification. Ces résultats confirment que même en utilisant une enzyme non purifiée, la fonctionnalisation de la surface interne des pores du monolithes de silice utilisé comme support de l'enzyme est nécessaire à l'obtention d'une bonne activité catalytique (taux de conversion de 100 %). 35 En termes d'activité catalytique, le catalyseur MSi-Glymo-1CR conforme à la présente invention conduit à des taux de conversion supérieurs aux meilleurs B5031FR 17 taux obtenus jusqu'à ce jour avec les catalyseurs hétérogènes décrits dans l'art antérieur, cette meilleure activité catalytique étant accompagnée d'une meilleure stabilité dans le temps du catalyseur. En effet, les catalyseurs hétérogènes décrits dans l'art antérieur, en particulier les catalyseurs dans lesquels la même enzyme Candida Rugosa a été immobilisée dans une mousse de polyuréthane (Awang, R et al., Am. J. Biochem. & Biotech., 2007, 3, 163-166), sur du kaolin naturel (Rahman, M.B.A. et al., Applied Clay Science, 2005, 29, 111-116) ou sur des hydroxydes métalliques en double couche (Raman, M.B.A. et al., Catalysis Today, 2004, 93-95, 405-410) ne permettent d'atteindre un taux de conversion qui n'est que de 70 à 85%, taux qui commence à diminuer dès le 9ème cycle. Dans ce type de catalyseur, la durée de vie moyenne de l'enzyme immobilisée est par ailleurs beaucoup plus courte (environ 12 jours). Exemple 3 Hydrolyse de la trilinoléine en présence d'un catalyseur enzymatique conforme à 15 l'invention Dans cet exemple on a réalisé la réaction d'hydrolyse catalysée d'un tri-ester d'acide linoléique, la tri-linoléine (4) qui est l'un des constituants majeurs de l'huile d'olive, dans l'heptane saturé en eau selon le schéma réactionnel suivant : (4) H3C H3C OH OH + HO J~ OH (5) (6) B5031FR 18 Cette réaction conduit à la formation d'acide linoléique (5) et de glycérol (6) ; les composés (4'), (4") et (4"') étant les produits intermédiaires de la réaction. 0,20 g de MSi-Glymo-1CR tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1, ont été introduits dans 15 ml d'heptane saturé en eau (0,6 % en poids). Le mélange a été porté à une température de 37-38°C, puis on y a ajouté 100 �L de trilinoléine dissous dans le MTBE à une concentration de 100 mg/mL pour conduire au final à une solution de trilinoléine ayant une concentration de 0,66 mg/mL. Le milieu réactionnel a été incubé pendant 24 heures à une température de 37-38°C La réaction d'hydrolyse a été suivie en quantifiant la disparition de la trilinoléine et l'apparition des produits intermédiaires (4'), (4") et (4"') et des produits finaux (acide linoléique (5) et glycérol (6)), par HPLC. Après 24 heures d'incubation, le catalyseur hétérogène MSi-Glymo-1CR a été récupéré puis lavé 3 fois avec la solution d'heptane saturée en eau. Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 2 annexée sur laquelle le taux de conversion du tri-ester (4) en acide linoléique (5) exprimé en pourcentage (axe vertical à gauche, courbe en trait continu), et le taux d'apparition de l'acide linoléique exprimé en pourcentage (axe vertical à droite, courbe en pointillés) sont fonction du temps en heures. Le nombre de cycles (un cycle correspondant à la réalisation d'une réaction d'hydrolyse et des lavages du catalyseur) est indiqué au dessus des pics. Sur cette figure la ligne en pointillés située à la verticale du 11ème cycle indique que le catalyseur a été réhydraté dans l'eau sous vide, puis séché à l'air avant d'être utilisé dans un nouveau cycle d'hydrolyse. Ces résultats montrent que le catalyseur hétérogène MSi-Glymo-1CR permet d'assurer l'hydrolyse de la trilinoléine avec un taux de conversion constant d'environ 65 % pendant 7 cycles à 37°C. Ce taux de conversion est supérieur à celui qui est obtenu lorsque l'on utilise la même enzyme immobilisée sur une membrane de polypropylène (Deng, H.-T. et al., Enzyme and Microbial. Tech., 2005, 36, 996-1002) et avec laquelle on obtient un taux de conversion de seulement 60 % et qui chute à 18 % après 7 cycles. Ces résultats démontrent également qu'un tel catalyseur hétérogène est réutilisable et que l'activité catalytique peut être augmentée par réhydratation du catalyseur lorsque celle-ci commence à diminuer, une certaine humidité étant nécessaire au bon fonctionnement de la lipase. B5031FR 19 Exemple 4 Trans-estérification de la trilinoléine en présence d'un catalyseur enzymatique conforme à l'invention Dans cet exemple on a réalisé une réaction de trans-estérification catalysée 5 de la trilinoléine (4) par l' éthanol, en milieu non aqueux, selon le schéma réactionnel suivant : (4) + CH3CH2OH (7) Heptane 37°C OH H3C CH3 + HO OH (6) (8) Cette réaction conduit à la formation d'éthanoate d'acide linoléique (8) et de glycérol (6). Une telle réaction est utilisée pour la production de biodiesels qui sont io des esters méthyliques ou éthyliques d'huiles végétales. La réaction a été effectuée en mode � batch � dans des tubes contenant 4 ml d'heptane, 100 �L de trilinoléate de glycéryle (4) préalablement dissous dans le MTBE à une concentration de 100 mg/mL, 25 mg d'éthanol et 387 mg de MSi-Glymo-1TL tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1. Le milieu réactionnel a été 15 incubé à 37°C pendant 24 heures. La conversion du trilinoléate de glycéryle (4) en éthanoate d'acide linoléique (8) a été suivie par HPLC. Entre chaque réaction de transestérification, le catalyseur a été récupéré, lavé à l'heptane, puis séché avant d'être à nouveau réutilisé pour catalyser une nouvelle réaction de transestérification. 20 Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 3 annexée sur laquelle le taux de conversion du triester (4) en ester (8) exprimé en pourcentage (axe vertical de gauche, courbe en trait continu) et le taux de production de l'ester (8) exprimé en pourcentage (axe vertical de droite, courbe en pointillés) sont fonction du temps en heures. Sur cette figure le nombre de cycle figure au dessus de chaque pic. 25 Ces résultats montrent que le catalyseur hétérogène MSi-Glymo-1TL peut être utilisé pour catalyser la transestérification de le trilinoléine en éthanoate B5031FR 20 d'acide linoléique avec un taux de conversion atteignant 100 % en 24 heures à 37C° lors du premier cycle et qui diminue jusqu'à 45 % au bout du Sème cycle. Cette perte d'activité est cependant certainement due à la présence de l'éthanol qui a une action dénaturante vis-à-vis de la lipase. Ce résultat est néanmoins supérieur aux taux de conversion obtenus en mettant en oeuvre une mousse de polymère modifiée par du polyglutaraldéhyde macroporeux immobilisant la même enzyme et qui est de 90,2 % en 24 heures (Dizge, N. et al., Bioresource Technology, 2009, 100, 1983-1991. Par ailleurs, ces résultats démontrent également que le catalyseur hétérogène io conforme à l'invention permet à la lipase T. Lanuginosus de fonctionner de façon optimale en milieu essentiellement anhydre (heptane) sans qu'il ne soit nécessaire d'ajouter d'eau alors qu'il est bien connu que pour qu'une lipase exprime son potentiel catalytique maximal, elle doit être mise en oeuvre dans un milieu présentant une certaine teneur en eau (Linko, Y.-Y. et al., JAOCS, 1995, 72(11), 15 1293-1299). L'ensemble des résultats présentés dans ces exemples démontre que les catalyseurs enzymatiques hétérogènes conformes à l'invention permettent de catalyser diverses réactions chimiques avec des rendements atteignant le plus souvent 100 % de l'activité catalytique théorique, lesdits catalyseurs étant 20 réutilisables un grand nombre de fois sans perte significative de leur activité catalytique. REVENDICATIONS1. Catalyseur enzymatiques hétérogène, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice ou de silice organiquement modifiée, ledit monolithe comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 �m à 100 �m ; des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm et des micropores ayant une dimension moyenne di de 0,7 à 1,5 nm, lesdits pores étant interconnectés, et dans lequel la surface interne des macropores est fonctionnalisée par un agent de couplage choisi parmi les silanes sur lequel est fixée, par l'intermédiaire d'une liaison covalente ou électrostatique, une enzyme non purifiée. 2. Catalyseur selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit monolithe a une surface spécifique de 200 à 1000 m2/g. 3. Catalyseur selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le monolithe alvéolaire est constitué d'une matrice de silice organiquement modifiée, 15 la silice porte des groupements organiques R répondant à la formule (I) suivante : -(CH2)n-R1 (I) dans laquelle : - 0