FR 2948687 A1 20110204 FR 0903723 A 20090729 Utilisation de microARN pour le traitement de pathologies respiratoires chroniques La présente invention se rapporte au domaine de la régénération et de la différenciation de l'épithélium respiratoire humain et à l'implication de microARN dans le processus de régénération et de différenciation de l'épithélium respiratoire ainsi qu'aux gènes modulés par lesdits microARN. La présente invention se rapporte plus particulièrement à l'utilisation de microARN dans le traitement des maladies respiratoires chroniques pour lesquelles la régénération et/ou la différenciation de l'épithélium respiratoire est défectueuse. Les épithéliums assurent une fonction de barrière entre le milieu interne et l'environnement extérieur. Les voies respiratoires sont tapissées par un épithélium pseudo-stratifié hautement différencié constitué de cellules basales, sécrétrices de mucus et ciliées (chaque cellule ciliée disposant de centaines de cils). Le battement coordonné de ces nombreux cils présents à la surface de cet épithélium permet l'élimination des déchets portés par le mucus au cours d'un processus appelé clairance mucociliaire. A ce titre, les cils jouent un rôle important dans les processus de défenses contre les infections de première ligne des voies aériennes (Puchelle et al. Proc Am Thorac Soc (2006) 3, 726-733). L'exposition permanente de l'épithélium respiratoire à des stress environnementaux causés par des micro-organismes pathogènes, des allergènes, des molécules toxiques, etc... conduit à des lésions tissulaires. A la suite de telles lésions, un processus physiologique de régénération de l'épithélium respiratoire se met en place. Ce processus, lorsqu'il aboutit, répare la lésion et restaure l'intégrité du tissu respiratoire, un tissu différencié et à nouveau fonctionnel se substituant à la lésion. Cette régénération met en jeu plusieurs étapes : 1) les cellules épithéliales prolifèrent et/ou migrent afin de combler le lit de la blessure ; 2) ces premières étapes sont suivies par la mise en place d'une étape de polarisation cellulaire caractérisée par la formation de jonctions serrées et par un adressage différentiel et spécifique de protéines membranaires (canaux, transporteurs d'ions...) entre le pôle apical et le pôle basolatéral (Puchelle et al. 2006 ; Hajj, R. et al. J Pathol (2007) 211, 340-350) ; 3) un stade de différenciation terminale conduisant à la formation de cils à la surface des cellules ciliées (ciliogénèse) et à la présence de cellules sécrétrices responsables de la synthèse et de la sécrétion de mucus. Un épithélium pseudostratifié mucociliaire se substitue ainsi à la lésion, reconstituant un tissu fonctionnel disposant de propriétés identiques à celles du tissu initial. L'ensemble de ces phénomènes biologiques est associé à des mécanismes de transduction de signaux et à des profils d'expression géniques particuliers. Parmi certains acteurs connus et impliqués dans la différenciation et la ciliogénèse de l'épithélium respiratoire, le facteur de transcription Foxj1 est l'un des mieux documentés (Yu, X. et al. (2008) Nat Genet 40, 1445-1453). Foxj1 agit à une phase tardive de la ciliogénèse, jouant un rôle dans l'ancrage des corps basaux (petits organites d'organisation structurale voisine des centrioles indispensables à la formation de la base des cils) à la membrane apicale durant la formation de l'axonème (Gomperts, B.N. et al. (2004) J Cell Sci 117, 1329-1337 (2004). Dans certaines maladies respiratoires chroniques telles que les broncho-pneumopathies obstructives chroniques (BPCO), la mucoviscidose, l'asthme ou encore la dyskinésie ciliaire primaire (DCP), des inflammations et infections chroniques aboutissent à une destruction du tissu respiratoire (Marshall, W.F. (2008) J Cell Bic/ 180, 17-21). Pour des raisons encore mal élucidées, ces maladies sont associées à des défauts de régénération et de différenciation épithéliale. Ces défauts aboutissent à une restructuration anormale du tissu, à une fibrose et à une perte fonctionnelle irréversible (Marshall, W.F., 2008). De nos jours, aucun traitement curatif pour ces différentes maladies n'a été trouvé, et seuls des traitements symptomatiques permettent de lutter avec plus ou moins d'efficacité contre la destruction évolutive du tissu respiratoire. Dans cette perspective, l'élucidation des mécanismes conduisant à la formation de cils fonctionnels (ciliogénèse) représente un enjeu majeur avec des retombées thérapeutiques évidentes. La différenciation cellulaire implique des régulations temporelles et spaciales fines de la transcription et de la traduction gouvernant l'expression de gènes spécifiques. Ces événements sont contrôlés par divers signaux moléculaires et mécaniques. La compréhension des mécanismes physiologiques sous-jacents qui président la mise en place de la différenciation et de la ciliogénèse est donc un prélude indispensable à l'élaboration d'approches thérapeutiques plus spécifiques et plus efficaces. Les microARN (miARN), petits ARN non-codants d'environ 22 bases découverts en 1993 et dotés de propriétés régulatrices, jouent un rôle clé dans la régulation des phénomènes cellulaires tels que la survie, l'apoptose, la prolifération, l'homéostasie ou la différenciation (Lu, Y. et al. (2007) Dev Bic/ 310, 442-453). Leurs mécanismes d'action impliquent la formation d'un complexe entre plusieurs bases du miARN et la partie 3'-non codante de l'ARNm cible. Cette interaction induirait une déstabilisation de l'ARNm cible et/ou une inhibition de la synthèse protéique. La reconnaissance entre un miARN et sa cible est principalement contrôlée par une séquence d'environ 7 bases, située dans la partie 5' du miARN (ci-après séquence de reconnaissance ou seed). De ce fait, chaque miARN aurait la capacité de réguler la stabilité d'un large spectre d'ARNm distincts. Plus de 750 miARN ont été caractérisés à ce jour chez l'homme où ils réguleraient plus de 30% des transcrits. La régulation par les miARN apparaît donc comme une régulation majeure de l'expression génique dont l'impact a été jusqu'à présent sous-estimé (Berezikov, E. et al. (2005) Cell 120, 21-24; Xie, X. et al. (2005) Nature 434, 338-345). Les miARN sont transcrits dans le noyau sous forme de longs précurseurs. Ils subissent une première maturation dans le noyau pour donner un précurseur de miARN (pré-miARN) possédant une structure en épingle à cheveux de plus petite taille. Ce précurseur est exporté du noyau vers le cytoplasme où il va subir une dernière maturation. Une dégradation de sa boucle par l'enzyme Dicer génère deux miARN simple brin (un brin 5p et un brin 3p) ; le brin dit mature est pris en charge par un complexe multi-protéique (le complexe RISC, RNA induced silencing complex) qui interagit avec la partie 3'-non-codante des ARNm cibles, tandis que le brin complémentaire dit � star � va subir une dégradation ; le brin complémentaire d'un miARN miR-xy, miR-xy-z ou let-7x est annoté, respectivement, miR-xy*, miR-xy-z* ou let-7x*. Des études ont récemment montré l'importance jouée par les microARN chez la souris dans les mécanismes de différenciation et de morphogénèse ; en particulier dans le développement embryonnaire et la prolifération des précurseurs des cellules épithéliales de l'épiderme (Lena, A.M. et al. (2008) Cell Death Differ 15, 1187-1195; Yi, R. et al. (2008) Nature 452, 225-229) ou bien encore le développement pulmonaire (Lu, Y. et al. (2007) Dev Biol 310, 442-453 (2007); Harris, K.S. et al. (2006) Proc Nat/ Acad Sci U S A 103, 2208-2213; Lu, Y. et al. (2008) Proc Am Thorac Soc 5, 300-304). Plus précisément, Lena et al. ont démontré l'implication des miARN du locus miR-17-92 dans la morphogénèse pulmonaire chez la souris. Bien qu'il y ait des preuves de l'implication des miARN au cours de la morphogénèse pulmonaire chez la souris, leur(s) rôle(s) précis et leur(s) mécanismes d'action demeurent encore inexplorés. Enfin, plusieurs études suggèrent un rôle particulier de certains miARN dans des pathologies telles que les cancers, l'hypertrophie cardiaque, le diabète ou certaines infections virales (Triboulet, R. et al. (2007) Science 315, 1579-1582 ; Calin, G.A. & Croce, C.M. (2006) Nat Rev Cancer 6, 857-866 ; Grassmann, R. & Jeang, K.T. (2008) Biochim Biophys Acta 1779, 706-711 ; Latronico, M.V., (2008) Physiol Genomics 34, 239-242; Poy, M.N. et al. (2004) Nature 432, 226-230). Aucune étude n'a, à ce jour, montré le rôle ou l'implication des miARN dans la régénération et la différenciation de l'épithélium respiratoire. C'est donc pour la première fois que les Inventeurs ont mis en évidence l'implication de certains miARN dans la régénération et la différenciation de cellules épithéliales respiratoires humaines en un épithélium de surface mucociliaire. Les Inventeurs ont plus particulièrement utilisés différentes approches expérimentales conjuguant le séquençage à haut-débit des miARN, les biopuces miARN ainsi que la RT-PCR quantitative et identifié les miARN intervenant spécifiquement à différents stades de la différenciation de l'épithélium respiratoire humain, à savoir des signatures des miARN spécifiques 1) de l'étape de prolifération, 2) de la polarisation cellulaire et 3) de la différenciation terminale et de la ciliogénèse. Il a ainsi été mis en évidence que 61 miARN sont exprimés ou réprimés et/ou présents en quantité significative dans le tissu épithélial respiratoire sain au cours de la régénération et de la différenciation (voir les Tableaux III, IV, V et VI). La constatation d'une variation de l'expression d'un ou plusieurs miARN chez un individu malade par rapport à un individu sain est un indicateur d'un défaut de régulation de l'expression d'un ou plusieurs gènes ; cette variation pourra donc être compensée en administrant le ou les miARN sous-exprimés et/ou en administrant les antagomirs du ou des miARN sur-exprimés. La présente invention trouve ainsi des applications pour l'évaluation de la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial respiratoire d'un sujet ; la méthode selon l'invention trouve également un intérêt particulier dans le domaine du diagnostic in vitro et in vivo. La présente invention se rapporte ainsi à une méthode d'évaluation de la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial respiratoire chez un sujet mammifère, de préférence, humain, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes : (i) de mesure quantitative du niveau d'expression des miARN du tissu épithélial respiratoire dudit sujet ; (ii) d'établissement du profil d'expression des miARN du tissu épithélial respiratoire dudit sujet ; (iii) de comparaison du profil d'expression des miARN dudit sujet avec le profil d'expression de miARN du tissu épithélial respiratoire sain d'un ou plusieurs autres sujets, ledit profil comprenant tout ou partie des miARN du Tableau 1 ci-après ; (iv) d'identification d'au moins un miARN dont le niveau d'expression par ledit sujet diffère d'au moins un facteur 2 par rapport au niveau d'expression du même miARN par le ou lesdits autres sujets, c'est-à-dire dont l'un quelconque des niveaux d'expression représente au moins deux fois l'autre niveau d'expression ; et (v) de mise en évidence d'un défaut de la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial respiratoire relié à une anomalie d'expression d'au moins un miARN dudit sujet si au moins un miARN dudit profil établi à l'étape (ii) présente un niveau d'expression qui diffère d'au moins un facteur 2 par rapport au niveau d'expression du même miARN dans le profil d'epxression du Tableau L Lorsque le niveau d'expression est exprimé en log2 (comme dans le Tableau I), cela signifie qu'un d'un défaut de la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial respiratoire relié à une anomalie d'expression d'au moins un miARN est observé lorsque le niveau d'expression en log2 du sujet à tester varie d'au moins une unité par rapport au profil d'expression chez un ou plusieurs autres sujets sains. La mise en oeuvre de la méthode selon l'invention nécessite l'établissement du profil d'expression des miARN du tissu épithélial respiratoire d'un sujet pour lequel on souhaite établir un diagnostic relatif à la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial respiratoire et du profil d'expression des miARN du tissu épithélial respiratoire d'un ou plusieurs sujets sains, c'est-à-dire choisis pour ne pas présenter de désordre de la différenciation et/ou de la régénération du tissu épithélial respiratoire. Définitions - Par sujet, on entend un individu mammifère, de préférence, l'homme. De préférence, le sujet pour lequel on souhaite établir un diagnostic relatif à la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial respiratoire et le ou les sujets sains appartiennent à la même espèce. - Par profil d'expression des miARN dans un tissu donné, on entend l'ensemble des miARN ayant un niveau d'expression supérieur ou égal à une valeur choisie. - Le niveau d'expression d'un miARN dans une cellule ou un tissu est déterminé par mesure des miARN présents dans la cellule ou le tissu. - La mesure du niveau d'expression d'un miARN peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier ; on peut notamment citer, après une étape d'extraction des ARN, le séquencage à haut débit des miARN, le séquençage par NASBA (nucleic acid strand based amplification), par extension d'amorce, ou encore, les puces à ADN permettant l'hybridation des miARN. - Le niveau d'expression des miARN peut être exprimé par différents moyens tels que : * le niveau d'intensité d'expression en log2, cette valeur est représentative de la quantité de miARN présent dans une cellule ou un tissu ; pour l'établissement d'un profil d'expression, on retiendra de préférence les miARN qui présentent un niveau d'intensité d'expression en log2 supérieur ou égal à 3 ; Ce niveau d'intensité d'expression peut être calculé par différents moyens en fonction de technique utilisée pour mesurer les miARN exprimés. Dans le cas d'une mesure de fluorescence sur des puces du type Agilent (voir les exemples ci-après), la mesure du niveau d'expression correspond à une intensité de fluorescence dont est ensuite calculé le log2. Dans le cas d'un séquençage à haut débit, le niveau d'intensté d'expression comptabilise le nombre de fois où la séquence d'un miARN est séquencée, ce nombre est normalisé par rapport au nombre total de séquences puis son log2 est calculé. * l'abondance qui représente le pourcentage d'expression d'un miARN dans une cellule ou un tissu par rapport à la quantité totale de miARN exprimés dans la même cellule ou le même tissu, dans ce cas, seront retenus les miARN dont l'abondance est supérieure ou égale à 0,1%, de préférence à 0,5%, de façon encore préférée à 1%. De préférence, les valeurs caractérisant le niveau d'expression sont exprimées en log2. Le Tableau I ci-dessous décrit le profil d'expression dans lequel le niveau d'expression est exprimé en niveau d'intensité d'expression en log2 des miARN d'un tissu épithélial respiratoire humain sain : Nom du miARN Numéro de séquence du Niveau d'intensité miARN (SEQ ID) d'expression en log2 Au stade différencié (WD) mesuré en HTS hsa-miR-100 1 9,00 hsa-miR-106b 2 5,39 hsa-miR-125a-5p 3 14,08 hsa-miR-130a 4 11,98 hsa-miR-140-3p 5 13,12 hsa-miR-141 6 9,75 hsa-miR-148a 7 8,97 hsa-miR-151-5p 8 10,22 hsa-miR-15a 9 7,68 hsa-miR-16 10 5,35 hsa-miR-17 11 11,61 hsa-miR-181a 12 0,01 hsa-miR-191 13 16,82 hsa-miR-193b 14 11,67 Hsa-miR-1975 15 11,22 hsa-miR-200a 16 10,96 hsa-miR-200b 17 10,64 hsa-miR-200c 18 14,57 hsa-miR-203 19 14,55 hsa-miR-205 20 15,24 hsa-miR-21 21 8,09 Hsa-miR-21 * 73 10,49 hsa-miR-210 22 9,29 hsa-miR-22 23 11,22 hsa-miR-224 24 14,10 hsa-miR-23a 25 15,35 hsa-miR-23b 26 9,35 hsa-miR-25 27 3,52 hsa-miR-26a 28 7,75 hsa-miR-26b 29 6,81 hsa-miR-27b 30 14,81 hsa-miR-29a 31 14,53 hsa-miR-29c 32 9,74 hsa-miR-30b 33 0,01 hsa-miR-30c 34 10,87 hsa-miR-30d 35 8,76 hsa-miR-30e 36 12,74 hsa-miR-31 37 11,83 hsa-miR-31* 89 11,18 hsa-miR-34a 38 13,75 hsa-miR-34b 39 10,65 Hsa-miR-34b* 91 14,29 hsa-miR-34c-5p 40 0,01 hsa-miR-365 41 2,78 hsa-miR-374a 42 11,87 hsa-miR-378 43 11,70 hsa-miR-425 44 9,53 hsa-miR-429 45 15,11 hsa-miR-449a 46 12,24 hsa-miR-449b 47 14,56 hsa-miR-574-3p 48 13,42 hsa-miR-92b 49 0,01 hsa-miR-939 50 5,43 hsa-miR-96 51 12,65 hsa-miR-99a 52 9,00 hsa-let-7a 157 4,31 hsa-let-7b 158 11,28 hsa-let-7c 159 7,86 hsa-let-7e 160 7,60 hsa-let-7f 161 5,35 hsa-let-7g 162 12,40 La méthode selon l'invention peut présenter une étape additionnelle consistant à comparer le profil d'expression du tissu épithélial respiratoire du sujet pour lequel on souhaite établir un diagnostic relatif à la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial respiratoire, avec un profil d'expression de miARN du tissu épithélial respiratoire sain d'un ou plusieurs sujets établi à un stade de différenciation particulier, un tel profil peut être établi avec le Tableau IV. La présente invention se rapporte ainsi à l'utilisation d'au moins un miARN identifié par la méthode selon l'invention choisi parmi hsa-miR-100, hsa-miR-106b, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-130a, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-148a, hsa-miR-151-5p, hsa-miR-15a, hsa-miR-16, hsa-miR-17, hsa-miR-181a, hsa-miR-191, hsa-miR-193b, hsa-miR-1975, hsa-miR-200a, hsa-miR-200b, hsa- miR-200c, hsa-miR-203, hsa-miR-205, hsa-miR-21, hsa-miR-210, hsa-miR-22, hsa-miR-224, hsa-miR-23a, hsa-miR-23b, hsa-miR-25, hsa-miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR-27b, hsa-miR-29a, hsamiR-29c, hsa-miR-30b, hsa-miR-30c, hsa-miR-30d, hsa-miR-30e, hsa-miR-31, hsa-miR- 34a, hsa-miR-34b, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-365, hsa-miR-374a, hsa-miR-378, hsamiR-425, hsa-miR-429, hsa-miR-449a, hsa-miR-449b, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-92b, hsa-miR-939, hsa-miR-96, hsa-miR-99a, hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f et hsa-let-7g de séquence SEQ ID N°1 à 52 et 157 à 162 (voir le tableau B ci-dessous), leur brin complémentaire � star � de séquence SEQ ID N°53 à 104 et 163 à 168, ou le brin de séquence complémentaire éventuellement modifié chimiquement, et leur précurseur de séquence SEQ ID N°105 à 156, 169 à 174 et 193 à 200 pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour induire la régénération et/ou la différenciation de l'épithélium respiratoire de mammifère, en particulier de l'homme. Par brin de séquence complémentaire d'un premier fragment d'acide nucléique simple brin donné, on entend le fragment d'acide nucléique simple brin dont la séquence est le complément de la séquence dudit premier fragment et capable de s'apparier avec ledit premier fragment. Dans le cadre de l'invention, il peut être utilisé des brins de séquence complémentaires modifiés chimiquement, c'est-à-dire que leur séquence comprend une ou plusieurs bases modifiées chimiquement, afin d'améliorer leur stabilité intracellulaire et extracellulaire et les rendre moins sensibles à l'hydrolyse dans des conditions acides ou basiques ainsi que sous l'action de nucléases ; les modifications envisageables sont notamment celles listées pour les ARN interférents (siRNA) dans la revue de T. M. Rana (Nature Reviews, . 2007, vol 8: 23-36) ou telles que décrites dans la Demande WO 2007/021896 ; en particulier, les brins de séquence complémentaires peuvent comprendre un nucléotide modifié chimiquement choisi parmi les nucléotides modifié en 2' tels qu'une base 2'-désoxy, 2'-désoxy-2'-fluoro, 2'-O-méthyl, 2'-O-méthoxyéthyl (2'-OMOE), 2'-O-aminopropyl (2'-OAP), 2'-O-diméthylaminoéthyl (2'-O-DMAOE), 2'-O-diméthylaminopropyl (2'-O-DMAP), 2'-O-diméthylaminoéthyloxyéthyl (2'-O-DMAEOE) ou 2'-O-N-méthylacétamido (2'-O-NMA). Tableau Il û m1ARN selon l'invention et référence de leur séquence nucléotidique, de la séquence nucléotidique de leur brin complémentaire et de celle de leur précurseur Nom et Séquence (numéro Nom et séquence (numéro de Séquence du précurseur (numéro de SEQ ID) de SEQ ID) des miARN SEQ ID) du brin complémentaire hsa-miR-100 1 hsa-miR-100* 53 105 hsa-miR-106b 2 hsa-miR-106b* 54 106 hsa-miR-125a-5p 3 hsa-miR-125a-3p 55 107 hsa-miR-130a 4 hsa-miR-130a* 56 108 hsa-miR-140-3p 5 hsa-miR-140-5p 57 109 hsa-miR-141 6 hsa-miR-141 * 58 110 hsa-miR-148a 7 hsa-miR-148a* 59 111 hsa-miR-151-5p 8 hsa-miR-151-3p 60 112 hsa-miR-15a 9 hsa-miR-15a* 61 113 hsa-miR-16 10 hsa-miR-16* 62 114, 193 hsa-miR-17 11 hsa-miR-17* 63 115 hsa-miR-181 a 12 hsa-miR-181 a* 64 116, 194 hsa-miR-191 13 hsa-miR-191* 65 117 hsa-miR-193b 14 hsa-miR-193b* 66 118 Hsa-miR-1975 15 Hsa-miR-1975* 67 119 hsa-miR-200a 16 hsa-miR-200a* 68 120 hsa-miR-200b 17 hsa-miR-200b* 69 121 hsa-miR-200c 18 hsa-miR-200c* 70 122 hsa-miR-203 19 hsa-miR-203* 71 123 hsa-miR-205 20 hsa-miR-205* 72 124 hsa-miR-21 21 hsa-miR-21* 73 125 hsa-miR-210 22 hsa-miR-210* 74 126 hsa-miR-22 23 hsa-miR-22* 75 127 hsa-miR-224 24 hsa-miR-224* 76 128 hsa-miR-23a 25 hsa-miR-23a* 77 129 hsa-miR-23b 26 hsa-miR-23b* 78 130 hsa-miR-25 27 hsa-miR-25* 79 131 hsa-miR-26a 28 hsa-miR-26a* 80 132, 195 hsa-miR-26b 29 hsa-miR-26b* 81 133 hsa-miR-27b 30 hsa-miR-27b* 82 134 hsa-miR-29a 31 hsa-miR-29a* 83 135 hsa-miR-29c 32 hsa-miR-29c* 84 136 hsa-miR-30b 33 hsa-miR-30b* 85 137 hsa-miR-30c 34 hsa-miR-30c* 86 138, 196 hsa-miR-30d 35 hsa-miR-30d* 87 139 hsa-miR-30e 36 hsa-miR-30e* 88 140 hsa-miR-31 37 hsa-miR-31* 89 141 hsa-miR-34a 38 hsa-miR-34a* 90 142 hsa-miR-34b 39 hsa-miR-34b* 91 143 hsa-miR-34c-5p 40 hsa-miR-34c-3p 92 144 hsa-miR-365 41 hsa-miR-365* 93 145, 197 hsa-miR-374a 42 hsa-miR-374a* 94 146 hsa-miR-378 43 hsa-miR-378* 95 147 hsa-miR-425 44 hsa-miR-425* 96 148 hsa-miR-429 45 hsa-miR-429* 97 149 hsa-miR-449a 46 hsa-miR-449a* 98 150 hsa-miR-449b 47 hsa-miR-449b* 99 151 hsa-miR-574-3p 48 hsa-miR-574-5p 100 152 hsa-miR-92b 49 hsa-miR-92b* 101 153 hsa-miR-939 50 hsa-miR-939* 102 154 hsa-miR-96 51 hsa-miR-96* 103 155 hsa-miR-99a 52 hsa-miR-99a* 104 156 hsa-let-7a 157 hsa-let-7a* 163 169, 198, 199 hsa-let-7b 158 hsa-let-7b* 164 170 hsa-let-7c 159 hsa-let-7c* 165 171 hsa-let-7e 160 hsa-let-7e* 166 172 hsa-let-7f 161 hsa-let-7f* 167 173, 200 hsa-let-7g 162 hsa-let-7g* 168 174 L'utilisation selon la présente invention trouve aussi des applications dans la prévention et/ou le traitement des pathologies impliquant un désordre de la régénération et/ou de la différenciation de l'épithélium respiratoire ; ces pathologies sont notamment des maladies respiratoires chroniques et/ou héréditaires telles que les broncho-pneumopathies obstructives chroniques (BCPO), la mucoviscidose, l'asthme, la dyskinésie ciliaire primaire, les inflammations et infections chroniques des voies respiratoires et les insuffisances respiratoires. Les pathologies respiratoires chroniques et/ou héréditaires (e.g. BPCO, mucoviscidose, asthme, DCP, rhinite allergique...) représentent un problème majeur de santé publique, quatrième cause de mortalité dans les pays industrialisés, et dont la prévalence est en augmentation rapide. D'où la nécessité importante de mieux appréhender les causes et les mécanismes de ces maladies afin de mieux cibler leurs traitements. L'asthme est la plus commune des maladies respiratoires chroniques chez l'enfant (5 à 20%) et représente une des causes majeures d'hospitalisation. La recrudescence d'allergies respiratoires et l'augmentation de la pollution industrielle participent à l'augmentation importante des cas d'asthme dans la population (O van Schayck, et al. IPAG DIAGNOSIS & MANAGEMENT HANDBOOK. Chronic Airways Diseases. A Guide for Primary Care Physicians. 1-34, 2005). Les BPCO sont un groupe de maladies respiratoires associées à une forte morbidité et à une forte mortalité. Les BPCO sont causées par des particules toxiques inhalées, dont le tabac est la plus représentative, qui vont conduire à une inflammation et à des infections chroniques fragilisant le tissu respiratoire. Environ 15% des fumeurs sont susceptible de développer une BPCO dans leur vie. L'organisation mondiale de la santé estime qu'il existe près de 1,1 milliard de fumeurs dans le monde, avec une prévalence de BPCO de 0,8 à 6% de la population mondiale. En 2020, des études prédisent que les BPCO représenteront la troisième cause de mortalité dans le monde. Bien que les causes et les mécanismes de ces maladies demeurent largement inconnus, il est probable que d'autres facteurs (géniques, épigénétiques) soient susceptibles d'agir sur le développement de BPCO (O van Schayck, et al. 2005). La mucoviscidose est la maladie génétique héréditaire la plus fréquente dans la population caucasienne (1 naissance sur 2500), affectant les glandes exocrines et donc l'ensemble du tissu épithélial sécréteur des différents organes (poumons, pancréas, foie, glandes sudoripares, intestins). Des défauts de transport d'ions à travers les épithéliums conduisent à un épaississement du mucus responsable notamment d'inflammation et d'infections respiratoires chroniques, aboutissant à une destruction tissulaire irréversible et à une insuffisance respiratoire sévère. Il n'existe aucun traitement curatif de cette maladie, mais l'avancée des connaissances scientifiques et médicales a permis d'instaurer des traitements symptomatiques qui ont fait progresser l'espérance de vie des patients de 3 ans dans les années 60 à environ 45 ans aujourd'hui. La dyskinésie ciliaire primaire (DCP) est une maladie autosomique récessive rare (1 naissance sur 15000) causant un défaut de mobilité des cils de l'épithélium respiratoire conduisant à une clairance mucociliaire défectueuse, des inflammations et infections chroniques et une destruction tissulaire irréversible. L'intérêt de ces miARN en vue du traitement de pathologies impliquant un désordre de la régénération et/ou de la différenciation de l'épithélium respiratoire est confirmépar la régulation par ces miARN de gènes connus pour être impliqués dans la régénération et/ou de la différenciation de l'épithélium respiratoire (voir l'exemple III ci-après). Dans le cadre de l'invention, on préfère utiliser des miARN qui sont présents en quantité significative au sein du tissu épithélial respiratoire au cours de son processus de régénération et de différenciation (de préférence, dont l'abondance est d'au moins 1% des miARN totaux, voir le Tableau III). Ainsi, on préfère utiliser au moins un miARN choisi parmi hsa-miR-34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34b (SEQ ID N°39), hsamiR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa-miR-449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-449b* (SEQ ID N°99), hsa-miR-92b (SEQ ID N°49), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR-378 (SEQ ID N°43), hsa-miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-125a-5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), hsa-miR-574-3p (SEQ ID N°48), hsa-miR-29c (SEQ ID N°32), hsamiR-140-3p (SEQ ID N°5), hsa-miR-205 (SEQ ID N°20), hsa-miR-23a (SEQ ID N°25), hsa-miR-31 (SEQ ID N°37), hsa-miR-31* (SEQ ID N°89), hsa-miR-21 (SEQ ID N°21), hsa-miR-17 (SEQ ID N°11), hsa-miR-29a (SEQ ID N°31), hsa-miR-193b (SEQ ID N°14), hsa-miR-210 (SEQ ID N°22) et hsa-miR-130a (SEQ ID N°4), leur brin complémentaire � star � de séquence SEQ ID N°55 à 57, 63, 65 à 67, 71 à 74, 77, 78, 83, 84, 90 à 92, 95, 98, 100, 101 et 104, leur brin de séquence complémentaire éventuellement modifié chimiquement, et leurs précurseurs de SEQ ID N°107 à 109, 115, 117 à 119, 123 à 126, 129, 130, 135, 136, 141 à 144, 147, 151 à 153 et 156. Parmi ces miARN, on peut distinguer ceux dont l'expression est induite de ceux dont l'expression est réprimée (Tableau IV) ; afin de reproduire un profil d'expression de miARN comparable à celui d'un individu sain, il apparait avantageux d'utiliser un ou plusieurs miARN dont l'expression est induite et/ou un ou plusieurs antagomirs de miARN dont l'expression est réprimée au cours du processus de régénération et de différenciation du tissu épithélial respiratoire. Ainsi, selon une variante avantageuse de l'invention, on utilise selon l'invention au moins un miARN choisi parmi hsa-miR-34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa-miR-449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-449b* (SEQ ID N°99), hsa-miR-92b (SEQ ID N°49), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR-378 (SEQ ID N°43), hsa- miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-125a-5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), et leur précurseurs de séquence SEQ ID N°107, 117, 119, 123, 130, 142 à 144, 147, 150, 151, 153 et 156 et/ou au moins un brin complémentaire � star � des miARN choisis parmi hsa-miR-205, hsa-miR-31, hsa-miR-21, hsa-miR-17, hsa-miR-29a, hsa-miR-193b, hsa-miR-31*, hsa-miR-210 hsa-miR-130a ; ces brins complémentaires � star � sont hsa- miR-205* (SEQ ID N°72), hsa-miR-31 et hsa-miR-31* (SEQ ID N°37 et 89), hsa-miR-21* (SEQ ID N°73), hsa-miR-17* (SEQ ID N°63), hsa-miR-29a* (SEQ ID N°83), hsa-miR-193b* (SEQ ID N°66), hsa-miR-210* (SEQ ID N°74), hsa-miR-130a* (SEQ ID N°56) et leurs précurseurs de séquence SEQ ID N°108, 115, 118, 124 à 126, 135 et 141. De préférence selon l'invention, on utilise, parmi lesdits miARN dont l'expression est modulée au cours du processus de régénération et/ou de différenciation du tissu épithélial respiratoire, ceux dont l'expression est induite : hsamiR-34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa-miR-449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-449b* (SEQ ID N°99), hsa-miR-92b (SEQ ID N°49), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR-378 (SEQ ID N°43), hsa-miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-125a-5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), et leur précurseurs de séquence SEQ ID N°107, 117, 119, 123, 130, 142 à 144, 147, 150, 151, 153 et 156. L'objet de la présente invention se rapporte également à l'utilisation de vecteurs d'expression exprimant au moins un miARN dont l'expression est induite au cours du processus de régénération et/ou de différenciation du tissu épithélial respiratoire. Tout vecteur d'expression capable d'exprimer des ARN dans une cellule eucaryote et dans lequel est cloné une cassette d'expression d'un miARN pourra être utilisé dans le cadre de la présente invention. L'invention se rapporte également à l'utilisation de miARN comportant la séquence de reconnaissance GGCAGUG (SEQ ID N°175) positionnée sur la région 2-7 du miARN, c'est-à-dire du 2ème au 7ème nucléotide du miARN, ou sur la région 3-8 du miARN, c'est-à-dire du 3ème au 8ème nucléotide du miARN ; il s'agit notamment des miARN hsa-miR-34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa-miR-449a (SEQ ID N°46) et hsa-miR-449b (SEQ ID N°47). L'invention se rapporte aussi à l'utilisation de miARN comportant la séquence de reconnaissance AAUCACU (SEQ ID N°176) positionnée sur la région 2-7 ou sur la région 3-7 du miARN ; il s'agit notamment du miARN hsa-miR-34b (SEQ ID N°39). L'invention se rapporte encore à l'utilisation de miARN comportant la séquence de reconnaissance AUCACUA (SEQ ID N°177) positionnée sur la région 2-7 ou sur la région 3-7 du miARN ; il s'agit notamment du miARN hsa-miR-34c-3p (SEQ ID N°40). L'invention se rapporte enfin à l'utilisation d'au moins un miARN décrit précédemment choisi parmi le miARN de séquence SEQ ID N°1 à 52 et 157 à 162, leur brin complémentaire ou antagomir de séquence SEQ ID N°53 à 104 et 163 à 168, éventuellement modifié chimiquement, et leur précurseur de séquence SEQ ID N°105 à 156, 169 à 174 et 193 à 200 pour une utilisation comme médicament. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfèrent à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles : FIGURES La Figure 1 représente des clichés de cultures primaires de cellules épithéliales respiratoires humaines observées par microscopie confocale et électronique permettant d'observer la morphologie des cellules marquées à I'hématoxyline et à l'éosine. Les cellules ont également été immunomarquées afin d'examiner l'expression de marqueurs épithéliaux de différenciation (tubuline-R4 pour les cellules ciliées (Figure 1E-F), mucine MUC5AC pour les cellules sécrétrices à mucus (Figure 1G-H), et la cytokératine 13 pour les cellules basales (Figure 1I-J)). Les états de différenciation ont été évalués. La Figure 2A représente les histogrammes cumulatifs montrant les 26 miARN ayant la plus forte expression dans l'un au moins des différents stades de différenciation de l'épithélium respiratoire humain chez 3 patients distincts : ALI-DO (DO, prolifération), ALI-D7 (D7, prolifération et polarisation), ALI-FC (FC, début de ciliogénèse), ALI-WD (WD, épithélium pleinement différencié). La Figure 2B représente les histogrammes cumulatifs montrant les 22 miARN ayant la plus forte expression et étant significativement modulés dans l'un au moins des différents stades de différenciation de l'épithélium respiratoire humain chez 3 patients distincts : ALI-DO (DO, prolifération), ALI-D7 (D7, prolifération et polarisation), ALI-FC (FC, début de ciliogénèse), ALI-WD (WD, épithélium pleinement différencié). La Figure 3 représente un cluster hiérarchique obtenu par puces miARN Agilent� montrant les variations d'intensité de l'expression des miARN statistiquement exprimés (A>8, P La Figure 5 represente un histogramme des variations observées par PCR quantitative des brins 5p de chacun des miARN testés à chaque stade de différenciation comme indiqué sur le graphique. Les résultats représentent la moyenne de 3 donneurs distincts. La Figure 6 représente une cartographie (Heat-map) des microARN significativement régulés entre des cellules pyramidales (ciliées+sécrétrices) versus des cellules basales. Les 5 microARN positionnés en haut de la colonne sont spécifiques des cellules pyramidales (ciliées+sécrétrices) ; en dessous, plus les miARN apparaissent clairs, plus ils sont spécifiques des cellules basales. La Figure 7 est un graphe montrant les relations existant entre le loge du ratio à deux stades de différenciation (abscisse) et la valeur de significativité statistique (ordonnées) pour chacune des comparaisons 2 à 2 indiquées sur le graphique. Les gènes significativement surexprimés sont indiqués en gris foncé (partie droite du graphe) et les gènes significativement réprimés sont indiqués en gris moyen (partie gauche du graphe). La Figure 8 est un histogramme montrant le loge de l'intensité d'expression de l'ARNm de la cavéoline-1 dans chacune des conditions de cultures étudiées, comme indiqué sur le graphique. La Figure 9 est un histogramme montrant l'effet de chacun des miARN sélectionnés sur l'activité de la luciférase (exprimée par rapport au % de l'effet maximal obtenu avec le vecteur contrôle PSICHECK) quand le gène rapporteur de la luciférase est fusionné à la partie 3' non-codante de l'ARNm de la Cav-1 versus le contrôle r- (PSICHECK). Les données ont été normalisées par rapport aux résultats obtenus avec un miARN contrôle négatif. La Figure 10 regroupe des graphiques illustrant l'enrichissement de gènes contenant la séquence de la séquence de reconnaissance (� seed �) commun aux mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b* et mir-34c. En abscisse est représenté le nombre de gènes analysés (environ 25000) ; ces gènes sont positionnés en fonction de leur niveau de répression ou d'expression : de la gauche vers la droite, figurent les gènes du plus réprimé au plus induit. L'ordonnée représente la valeur statistique en Iog10 du niveau d'enrichissement (le score d'enrichissement reporté sur l'axe des ordonnées correspond à la valeur absolue du log10 de la valeur P, calculée suivant un modèle cumulatif hypergéométrique et binomial décrit par van Dongen S et al. Nat Methods. 2008 Dec;5(12):1023-5). Sur chaque graphe est indiqué le miARN qui a été transfecté dans les cellules HAECs. La Figure 11 représente le résultat de l'identification à l'aide du software IPA de fonctions biologiques et de maladies en relation avec les gènes trouvés modulés par l'expression des miARN selon l'invention. EXEMPLES I- Préparation du modèle cellulaire bioloqique Les essais ont été réalisés avec des cultures primaires de cellules épithéliales respiratoires humaines saines isolées à partir de cornets ou de polypes nasaux collectés chez des patients devant subir une septoplastie, une turbinectomie ou une polypectomie. Les cellules ont ensuite été cultivées sur support poreux recouvert de collagène de type IV (Transwell� clear, polyester, 0.4 pm, Costar) en interface air-liquide (ALI) dans le but d'induire la différenciation (Puchelle, E et al., 2006). Les caractéristiques morphologiques et physiologiques de l'épithélium respiratoire ont été par ailleurs bien décrites (Puchelle, E et al., 2006). 1-1. Matériels et méthodes Patients et échantillons tissulaires Des cornets inférieurs ou des polypes nasaux ont été collectés à partir de 3 patients devant subir une turbinectomies ou des polypectomies pour obstruction nasale ou septoplastie (Dr. Castillo, Département ORL, Hôpital Pasteur, Nice, France). Les patients atteints d'asthme, de mucoviscidose ou d'allergies ont été exclus de l'étude. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Université de Nice-Sophia-Antipolis. Isolement et culture de cellules épithéliales respiratoires humaines saines (HAECs) Les cultures primaires de HAECs saines dérivées de muqueuse nasale ont été réalisées à l'aide d'une méthode adaptée d'études précédentes (Wu et al., 1985; Marcet et al., 2007; LeSimple et al., 2007). Après excision, le tissu est immédiatement immergé dans une solution équilibrée en sels (HBSS (sans Cal+/Mg2+) Invitrogen) contenant de l'HEPES (25 mM, Invitrogen), 100 U/ml pénicilline (Gibco, Invitrogen), 100 mg/ml streptomycine (Gibco, Invitrogen), 100 mg/ml de sulfate de gentamicine (Gibco, Invitrogen), et 2,5 mg/ml d'amphotéricine B (Gibco, Invitrogen). Après 3 rinçages avec du milieu HBSS-HEPES-antibiotiques, le tissu est digéré avec 0,1% de pronase (Sigma) à 4°C, toute la nuit. Le tissu est ensuite délicatement retiré du milieu de digestion, et les cellules épithéliales respiratoires à la surface de la muqueuse nasale sont détachées du stroma par de légères agitations avec du milieu HBSS-HEPES-antibiotiques contenant 10% de sérum de veau foetal (SVF). La suspension cellulaire est centrifugée à 150g, 10 min à 4°C et le culot cellulaire est resuspendu dans 10% SVF-HBSS-HEPES-antibiotiques et centrifugé à nouveau. Le second culot cellulaire est alors resuspendu dans un milieu 10% SVF-antibiotiques-Dulbecco's modified Eagle's (DMEM, Invitrogen) à l'aide d'une aiguille (0,8 mm) et d'une seringue de 10 ml pour dissocier les agrégats cellulaires. Les cellules sont ensuite ensemencées (104/cm2) sur des supports poreux perméables (Transwell�, Costar, Sigma) recouverts de collagène de type IV (Sigma) et incubées dans une atmosphère humidifiée à 37°C, 5% CO2. Le lendemain, le milieu de culture est remplacé par du milieu de prolifération (BEGM) reconstitué à l'aide du milieu BEBM (Lonza) contenant les suppléments hormonaux et autres facteurs de croissances suivants : insuline, apo-transferrine, facteur de croissance épidermique (EGF), épinéphrine, hydroxycortisone, 3,30,5-triiodothyronine, supplément de croissance pour cellules endothéliales (endothelial cell growth supplement), acide rétinoïque (à faible concentration, environ 10 nM), amphotéricine B (2,5 mg/ml), streptomycine (100 mg/ml), pénicilline (100 U/ml), sulfate de gentamicine (50 mg/ml) et L-glutamine (2 mM). La confluence de la monocouche de cellules épithéliales respiratoires est typiquement achevée après 7 jours de culture. Le milieu de surface apicale est alors retiré afin de mettre les cellules en interface air-liquide et le milieu basolatéral est changé par du milieu de différenciation : BEBM/DMEM ratio (1 : 1) et contenant les mêmes suppléments que cités ci-dessus mis à part l'acide rétinoïque qui est cette fois ajouté à forte concentration d'environ 300 nM pour induire la différenciation mucociliaire de l'épithélium respiratoire. Les expériences sont ensuite réalisées sur des cultures différenciées ayant une résistance transépithéliale supérieure à 500 ohm/cm2. Marquage immunocytochimique et microscopie confocale et électronique Les coupes de membranes de cultures de cellules respiratoires cultivées en interface air-liquide sont fixées dans l'acétone ou dans le méthanol (10 min, -20°C). Après rinçage dans du PBS, les sites non-spécifiques sont bloqués dans du PBS-BSA 3%, puis l'anticorps primaire est incubé dans du PBS-BSA-1% de 1h à température ambiante à 16h à 4°C selon l'anticorps utilisé. Après rinçage, l'anticorps secondaire couplé et mis en solution dans du PBS-BSA 1% est incubé 1h à température ambiante. Après rinçage, les noyaux sont marqués au DAPI et contre colorés à l'hématoxyline de Harris. Après rinçage, les lames sont montées et observées au microscope confocal. Dans le cas de doubles marquages séquentiels impliquant deux anticorps de souris, une étape de blocage des sites libres des anticorps primaires est réalisée à l'aide d'anticorps anti-souris anti-Fab (H+L) 30 minutes à température ambiante. Pour la microscopie électronique, les cellules sont fixées dans du tampon phosphate monosodique 0.1M contenant 1,6% de glutaraldéhyde. Tri des cellules épithéliales respiratoires Après dissociation du stroma de polypes nasaux, les cellules épithéliales (environ 20.106) sont incubées en PBS-BSA-EDTA pendant 30 min puis incubées avec l'anticorps marqué CD151-PE et l'anti-FT (facteur tissulaire)-FITC pendant 20 min, 4°C (voir Hajj, R. et al., Stem Cells 25, 139-148 (2007)). Après deux lavages, les cellules sont reprises dans du PBS-EDTA et incubées avec du DAPI pour marquer les cellules dont l'intégrité est altérée. Le tri cellulaire a été effectué sur le trieur FACSAria (BD Biosciences) équipé de 3 lasers, bleu, rouge et violet. Les cellules mortes, les agrégats et les doublets cellulaires ont été exclus. La population doublement positive de cellules basales (CD151+/FT+) et la population négative de cellules cylindriques (contenant les cellules ciliées et les cellules sécrétrices de mucus) (CD151-/FT-) ont été sélectionnées et triées à la vitesse de 5000 événements / s (30 MHz de fréquence). La pureté et l'identité des cellules triées ont ensuite été vérifiées par cytomètre et immunocytochimie. 1-2. Observation de la morphologie des cellules marquées à l'hématoxyline et à l'éosine Des immunomarquages ont été réalisés afin d'examiner l'expression de marqueurs épithéliaux de différenciation (tubuline-(34 pour les cellules ciliées (Figure 1E-F), mucine MUC5AC pour les cellules sécrétrices à mucus (Figure 1G-H), et la cytokératine 13 pour les cellules basales (Figure 11-J)). Les états de différenciation ont été évalués par microscopie confocale et électronique. Il a été choisi d'étudier quatre temps clés de la différenciation : (1) durant les premiers jours de l'établissement de l'interface air-liquide (ALI-DO), les cellules prolifèrent et forment un épithélium squameux stratifié; (2) après 5-7 jours d'interface air-liquide (ALI-D7), la polarisation cellulaire débute; (3) après environ 14 jours d'interface air-liquide, les cellules forment un épithélium pseudostratifié où les premiers cils apparaissent à la surface des cellules (ALI-FC), ainsi qu'un allongement cellulaire, indiquant le début de la ciliogénèse (Figure 1C); (4) après environ 21 jours d'interface air-liquide (ALI-WD), l'épithélium respiratoire devient pseudostratifié, stade complètement différencié où la plupart des cellules sont cylindriques et ciliées, avec une couche sous-jacente de cellules basales, ainsi que des cellules sécrétrices de mucus (Figure ID). Après 3-4 semaines de culture, les critères morphologiques et les marqueurs spécifiques de différenciation des 3 types cellulaires de l'épithélium respiratoire de surface (i.e. basales (Figure 11-J), sécrétrices (Figure 1G-H), et ciliées (Figure 1E-F) peuvent être observés. Il- Mesure de l'expression des miARN dans les cellules sélectionnées Les techniques de séquençage à haut-débit permettent d'établir l'abondance de certains miARN au sein d'un mélange complexe. Sur la base du nombre de séquences spécifiques d'un miARN au sein d'une condition expérimentale, il est possible d'évaluer l'abondance dudit miARN au sein de l'ensemble des miARN. Il-1. Matériels et méthodes Extraction d'ARN totaux et contrôles qualité Les ARN totaux ont été extraits à partir des HAECs cultivées en interface air-liquide à quatre stades de différenciation : ALI-DO (0 jour), ALI-D7 (7 jours), ALI-FC (lors de l'apparition des premiers cils à environ 14 jours) et ALI-WD (pleinement différenciées à environ 21 jours). Les cellules sont lysées dans du réactif au Trizol� (Invitrogen). Les ARN totaux contenant les petits ARN et les microARN sont purifiés sur colonnes Qiagen RNEasy (Qiagen) selon les instructions du fournisseur. La pureté et la concentration des échantillons d'ARN totaux sont d'abord évalués en utilisant le spectrophotomètre Nanodrop. Les ratios 260/280 (ratio des valeurs d'absorbance à 260 et 280 nm d'un échantillon mesurées à l'aide d'un spectrophotomètre) et 260/230 (ratio des valeurs d'absorbance à 260 et 230 nm d'un échantillon mesurées à l'aide d'un spectrophotomètre) ; ces ratios reflètent la pureté en ARN lorsqu'ils sont compris entre 1,5 et 2 ; ils sont vérifiés et doivent avoir une valeur proche de 2. Les ARN sont ensuite chargés sur une puce � RNAnano chip � (Agitent Technologie, France) et leur qualité (intégrité et niveau de dégradation des ARN) est analysée à l'aide du Bioanalyzer System (Agilent Technologies, France). Séquençaqe haut-débit de microARN Les ARN totaux contenant les petits ARN et les microARN sont isolés comme précédemment. La procédure est basée sur la technologie Applied Biosystems Ligase-Enhanced Genome Detection (LEGenDTM) ; le kit SOLiDTM Small RNA Expression (Applied Biosystems, France) a été utilisé. Cette méthode permet de convertir les petits ARN d'un échantillon dans une librairie d'ADN double brin ; elle a été développée par Applied Biosystems SOLiDTM System pour faire du séquençage haut- débit de nouvelle génération. Le séquençage haut-débit des microARN a été réalisé selon les recommandations du fournisseur. Brièvement, les ARN totaux contenant les petits ARN sont hybridés (65°C, 10 min, puis à 16°C, 5 min) et ligués (16°C, 2-16 h dans un thermocycleur) à l'Adaptor Mix A pour produire une matrice pour le séquençage de l'extrémité 5' des petits ARN, ou à l'Adaptor Mix B pour séquencer l'extrémité 3'. Les échantillons sont ensuite reverse-transcrits (42°C, 30 min) pour synthétiser l'ADN complémentaire (ADNc). L'amplification de la bibliothèque des petits ARN est effectuée par PCR et après migration sur gel de polyacrylamide les petits ARN amplifiés sont découpés et extraits du gel suivant leur taille (environ 105-150 bases de longueur, selon les instructions du fournisseur), élués et resuspendus dans de l'eau exempte de nucléases. La concentration d'acides nucléiques est ensuite mesurée et normalisée avant de procéder à la préparation des échantillons pour le séquençage. Analyses statistiques des données de séquençaqe haut-débit Les analyses statistiques sont réalisées à l'aide du logiciel R de Bioconductor� (Peter Dalgaard, statistics and computing, Introductory statistics with R. Springer, 2002 ; R. Gentleman, V.J. Carey, W. Huber, R.A. Irizarry, S. Dudoit. Statistics for biology and health. Bioinformatics and computational biology solutions using R and bioconductor. Springer, 2005). Pour chaque microARN séquencé, le nombre de séquences du brin 5p et du brin 3p du microARN a été normalisé à 106 séquences et converti en pourcentage d'abondance d'expression pour chacun des microARN. Les données ont ensuite été normalisées suivant un modèle linéaire et une méthode Bayésienne empirique en utilisant le logiciel R. Pour les analyses ultérieures, n'ont été retenus que les microARN dont le pourcentage d'expression (ou abondance) est supérieure à 1% du total des microARN dans au moins une condition de culture, avec un ILog2 Ratio' inférieur à 0,5 et une P-Value ajustée inférieure à 0,05. Analyse du microARNome par puces microARN (Aqilent Technoloqies) En parallèle du séquençage haut-débit des microARN, le répertoire d'expression des microARN (microARNome) est étudié à l'aide de la technologie de puces microARN Agilent. Pour cela, les échantillons ARN des mêmes patients que précédemment ont été utilisés, marqués et hybridés sur puces miARN Agilent� (Human miRNA Microarray v2, contenant 866 miARN humains et 89 miARN viraux humains, i.e. l'ensemble des miARN humains contenus et référencés dans Sanger miRBase v.12.0, Agilent Technologies, France) à l'aide du kit � miRNA labelling and hybridization � suivant les instructions du fournisseur (Agilent Technologies). Analyses du transcriptome par puces ADN (Affymetrix�) Pour les analyses du transcriptome, les ARN totaux sont purifiés et leur qualité est vérifiée comme précédemment. L'analyse est ensuite réalisée sur des puces ADN GeneChip� Human Gene 1.0 ST Array (Affymetrix�). Chacun des 28869 gènes est représenté sur la puce par environ 26 sondes recouvrant la longueur entière du gène. Les ARN totaux sont marqués et hybridés à l'aide de "whole Transcript (WT) Sense Target Labeling and Control Reagents, fluidics and scanning instrumentation and basic analysis software". Analyses des données de transcriptome obtenues par puces ADN (Affymetrix�) Les analyses de données sont réalisées à l'aide du logiciel R Bioconductor développé par le consortium statistique R. Puis, les données sont visualisées à l'aide de l'interface Mediante, un système d'information développé pour l'analyse et le stockage d'informations à large échelle obtenues lors d'analyses de puces (Le Brigand and Barbry, 2007). Pour les puces Affymetrix�, les données sont analysées en utilisant l'algorithme RMA (Robust Multi-Chip Average), qui réalise une correction du bruit de fond, une étape de normalisation, et un compte-rendu des niveaux des sondes. Cette méthode montre une précision élevée, particulièrement pour des valeurs d'expression faibles, et montre une spécificité et une sensibilité plus élevée que de nombreuses autres méthodes connues (Irizarry et al., 2003). Les données sont normalisées suivant un modèle linéaire et une méthode Bayesienne empirique à l'aide du logiciel R Bioconductor. Des graphiques en forme de Volcano plots (Figure 7) sont utilisées pour montrer le niveau de régulation quantitatif des gènes exprimé en log2 en fonction de leur significativité statistique par rapport à des réplicas expérimentaux. II-2. Expression des m1RNA dans les cellules sélectionnées Sur l'ensemble des miARN humains connus aujourd'hui (environ 750), les Inventeurs ont ainsi trouvé dans un premier temps à l'aide de la technique de séquençage haut-débit (HTS) de miARN que 115 miARN se retrouvaient exprimés au cours de la différenciation avec une valeur d'intensité supérieure à 8 (correspondant au Log2 du nombre normalisé de miARN séquencés). A l'aide de la technique de séquençage, il est possible de rendre compte de l'abondance en pourcentage de chacun des miARN séquencés. Les Inventeurs ont ainsi pu établir de manière surprenante que 26 miARN étaient présents au sein des différents stades de différenciation de l'épithélium respiratoire humain avec une abondance supérieure à 1% (indiqués dans la Figure 2 et le Tableau III ci-dessous). Les 26 miARN identifiés couvrent à eux-seuls de l'ordre de 80% de tous les miARN exprimés dans l'épithélium respiratoire humain ; cette quantité montre leur implication dans le processus de régénération et/ou de diffrenciation du tissu épithélial respiratoire. Une analyse plus fine de ces 26 miARN montre que 22 sont significativement régulés dans au moins un des quatre stades de différenciation de l'épithélium respiratoire humain et représentent environ 70 % du total des miARN : 13 miARN sont surexprimés tandis que 9 miARN sont réprimés (voir la Figure 2B et le Tableau IV ci-après). La valeur de modulation (aussi désignée ratio du niveau d'intensité d'expression en log2 à deux stades de différenciation) est calculée par la différence entre les niveaux d'intensité d'expression en log2 aux deux stades de différenciation indiqués en haut de chaque colonne. 23 Tableau III. miARN significativement exprimés dans l'épithélium respiratoire humain et avec une abondance supérieur à 1 % à au moins un stade de différenciation, identifiés par séquençage de miARN haut-débit (HTS). Niveau d'intensité d'expression Abondance (%) Modulation (ratio du niveau en log2 d'intensité d'expression en log2 à deux stades de différenciation) Nom Pre-mir brins DO D7 FC WD DO D7 FC WD D7-DO FC-D7 WD-FC WD-DO hsa-miR-449a hsa-mir-449a 5p 4,48 9,69 14,90 15,11 0,00 0,18 6,49 5,70 5,21 5,21 0,21 10,63 hsa-miR-449b hsa-mir-449b 5p 3,64 6,96 12,36 12,24 0,00 0,03 1,12 0,78 3,32 5,40 -0,12 8,60 hsa-miR-449b* hsa-mir-449b 3p 6,40 10,23 13,59 13,84 0,02 0,26 2,62 2,37 3,83 3,36 0,26 7,45 hsa-miR-34b hsa-mir-34b 3p 7,01 8,26 12,43 13,75 0,03 0,07 1,17 2,22 1,25 4,17 1,32 6,74 hsa-miR-34c-5p hsa-mir-34c 5p 7,88 9,21 13,23 14,29 0,05 0,13 2,05 3,23 1,33 4,02 1,06 6,41 hsa-miR-92b hsa-mir-92b 3p 7,49 8,70 12,82 13,42 0,04 0,09 1,54 1,77 1,21 4,12 0,60 5,93 hsa-miR-1975 hsa-mir-1975 3p 11,08 13,22 13,55 14,01 0,48 2,09 2,56 2,67 2,13 0,34 0,46 2,93 hsa-miR-99a hsa-mir-99a 5p 9,77 11,19 11,96 12,65 0,19 0,52 0,85 1,03 1,43 0,77 0,69 2,88 hsa-miR-191 hsa-mir-191 5p 14,67 15,57 16,40 16,82 5,71 10,68 18,46 18,69 0,90 0,84 0,42 2,15 hsa-miR-378 hsa-mir-378 3p 10,37 12,53 12,26 11,87 0,29 1,30 1,04 0,61 2,15 -0,26 -0,39 1,50 hsa-miR-23b hsa-mir-23b 3p 14,06 15,35 15,18 15,35 3,73 9,19 7,92 6,72 1,30 -0,17 0,16 1,29 hsa-miR-125a-5p hsa-mir-125a 5p 12,92 13,55 13,29 14,08 1,69 2,64 2,13 2,79 0,64 -0,27 0,79 1,16 hsa-miR-203 hsa-mir-203 3p 13,49 13,60 13,39 14,57 2,53 2,73 2,29 3,92 0,11 -0,21 1,18 1,08 hsa-miR-574-3p hsa-mir-574 3p 13,64 14,12 14,24 14,56 2,80 3,92 4,12 3,90 0,48 0,12 0,32 0,92 hsa-miR-29c hsa-mir-29c 3p 13,66 14,48 14,50 14,53 2,84 5,03 4,95 3,82 0,82 0,02 0,03 0,87 hsa-miR-140-3p hsa-mir-140 3p 12,39 12,72 13,08 13,12 1,17 1,48 1,85 1,44 0,33 0,37 0,04 0,73 hsa-miR-205 hsa-mir-205 5p 14,61 15,23 14,11 14,55 5,48 8,43 3,76 3,87 0,62 -1,12 0,44 -0,06 hsa-miR-23a hsa-mir-23a 3p 14,42 14,47 13,67 14,10 4,79 4,99 2,77 2,83 0,06 -0,80 0,43 -0,31 hsa-miR-31 hsa-mir-31 5p 13,69 13,31 12,40 12,74 2,89 2,24 1,15 1,10 -0,37 -0,91 0,34 -0,95 hsa-miR-21 hsa-mir-21 5p 16,40 15,66 14,50 15,24 19,01 11,41 4,94 6,26 -0,74 -1,16 0,74 -1,16 hsa-miR-17 hsa-mir-17 5p 12,85 12,68 11,81 11,61 1,61 1,44 0,76 0,50 -0,17 -0,87 -0,20 -1,24 hsa-miR-29a hsa-mir-29a 3p 16,24 14,90 14,79 14,81 17,01 6,72 6,02 4,64 -1,34 -0,11 0,02 -1,43 hsa-miR-193b hsa-mir-193b 3p 13,26 12,09 11,19 11,67 2,16 0,96 0,50 0,52 -1,17 -0,90 0,48 -1,60 hsa-miR-31* hsa-mir-31 3p 13,56 12,91 11,60 11,83 2,64 1,69 0,66 0,59 -0,65 -1,31 0,24 -1,73 hsa-miR-210 hsa-mir-210 3p 12,29 11,33 10,60 10,49 1,10 0,57 0,33 0,23 -0,96 -0,74 -0,10 -1,80 hsa-miR-130a hsa-mir-130a 3p 13,91 12,51 12,71 11,98 3,38 1,28 1,42 0,65 -1,40 0,19 -0,73 -1,94 24 Tableau IV. miARN significativement exprimés et modulés au cours de la différenciation de l'épithélium respiratoire, avec une abondance supérieur à 1 % identifiés par séquençage de miARN haut-débit (HTS). Niveau d'intensité d'expression Abondance (%) Modulation (ratio du niveau en log2 d'intensité d'expression en log2 à deux stades de différenciation) Nom Pre-mir brins DO D7 FC WD DO D7 FC WD D7-DO FC-D7 WD-FC WD-DO hsa-miR-449a hsa-mir-449a 5p 4,48 9,69 14,90 15,11 0,00 0,18 6,49 5,70 5,21 5,21 0,21 10,63 hsa-miR-449b hsa-mir-449b 5p 3,64 6,96 12,36 12,24 0,00 0,03 1,12 0,78 3,32 5,40 -0,12 8,60 hsa-miR-449b* hsa-mir-449b 3p 6,40 10,23 13,59 13,84 0,02 0,26 2,62 2,37 3,83 3,36 0,26 7,45 hsa-miR-34b hsa-mir-34b 3p 7,01 8,26 12,43 13,75 0,03 0,07 1,17 2,22 1,25 4,17 1,32 6,74 hsa-miR-34c-5p hsa-mir-34c 5p 7,88 9,21 13,23 14,29 0,05 0,13 2,05 3,23 1,33 4,02 1,06 6,41 hsa-miR-92b hsa-mir-92b 3p 7,49 8,70 12,82 13,42 0,04 0,09 1,54 1,77 1,21 4,12 0,60 5,93 hsa-miR-1975 hsa-mir-1975 3p 11,08 13,22 13,55 14,01 0,48 2,09 2,56 2,67 2,13 0,34 0,46 2,93 hsa-miR-99a hsa-mir-99a 5p 9,77 11,19 11,96 12,65 0,19 0,52 0,85 1,03 1,43 0,77 0,69 2,88 hsa-miR-191 hsa-mir-191 5p 14,67 15,57 16,40 16,82 5,71 10,68 18,46 18,69 0,90 0,84 0,42 2,15 hsa-miR-378 hsa-mir-378 3p 10,37 12,53 12,26 11,87 0,29 1,30 1,04 0,61 2,15 -0,26 -0,39 1,50 hsa-miR-23b hsa-mir-23b 3p 14,06 15,35 15,18 15,35 3,73 9,19 7,92 6,72 1,30 -0,17 0,16 1,29 hsa-miR-125a-5p hsa-mir-125a 5p 12,92 13,55 13,29 14,08 1,69 2,64 2,13 2,79 0,64 -0,27 0,79 1,16 hsa-miR-203 hsa-mir-203 3p 13,49 13,60 13,39 14,57 2,53 2,73 2,29 3,92 0,11 -0,21 1,18 1,08 hsa-miR-205 hsa-mir-205 5p 14,61 15,23 14,11 14,55 5,48 8,43 3,76 3,87 0,62 -1,12 0,44 -0,06 hsa-miR-31 hsa-mir-31 5p 13,69 13,31 12,40 12,74 2,89 2,24 1,15 1,10 -0,37 -0,91 0,34 -0,95 hsa-miR-21 hsa-mir-21 5p 16,40 15,66 14,50 15,24 19,01 11,41 4,94 6,26 -0,74 -1,16 0,74 -1,16 hsa-miR-17 hsa-mir-17 5p 12,85 12,68 11,81 11,61 1,61 1,44 0,76 0,50 -0,17 -0,87 -0,20 -1,24 hsa-miR-29a hsa-mir-29a 3p 16,24 14,90 14,79 14,81 17,01 6,72 6,02 4,64 -1,34 -0,11 0,02 -1,43 hsa-miR-193b hsa-mir-193b 3p 13,26 12,09 11,19 11,67 2,16 0,96 0,50 0,52 -1,17 -0,90 0,48 -1,60 hsa-miR-31* hsa-mir-31 3p 13,56 12,91 11,60 11,83 2,64 1,69 0,66 0,59 -0,65 -1,31 0,24 -1,73 hsa-miR-210 hsa-mir-210 3p 12,29 11,33 10,60 10,49 1,10 0,57 0,33 0,23 -0,96 -0,74 -0,10 -1,80 hsa-miR-130a hsa-mir-130a 3p 13,91 12,51 12,71 11,98 3,38 1,28 1,42 0,65 -1,40 0,19 -0,73 -1,94 Les Inventeurs ont ensuite utilisé les puces miARN Agilent pour étudier le répertoire d'expression des miARN de l'épithélium respiratoire humain et comparer les résultats obtenus en séquençage haut-débit avec ceux obtenus avec des puces commerciales miARN Agilent�. A l'aide de cette technique, 48 miARN sont retrouvés significativement exprimés et modulés (Log2 du niveau d'intensité de l'expression > 8 ; 1 Ces cinq miARN : mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b, mir-34c sont retrouvés fortement induits au cours de la différenciation, plus particulièrement au début de la ciliogénèse. Une fois induite, leur expression demeure élevée et stable tout au long de la différenciation y compris dans l'épithélium pleinement différencié. Le répertoire des miARN de l'épithélium complètement différencié se caractérise par une abondance remarquable de ces 5 miARN qui représentent près de 20% du nombre total de tous les miARN exprimés dans ce tissu. Concernant mir-34a, son induction est néanmoins moins forte que les quatre autres miARN et est retrouvée de manière plus précoce au stade ALI-D7. De manière intéressante, les brins 5p de chacun des miARN mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b et mir-34c partagent une homologie de séquence au niveau de leur séquence de reconnaissance suggérant qu'ils ciblent en commun certains transcrits. C'est pourquoi les Inventeurs ont ensuite concentré leurs efforts sur ces 5 miARN. Les niveaux de régulations de ces miARN ainsi que de mir-31 (qui est retrouvé réprimé au cours de la différenciation de l'épithélium respiratoire) ont été validés par une troisième approche par PCR quantitative (voir la Figure 5). Ces 5 miARN surexprimés au cours de la différenciation de l'épithélium respiratoire appartiennent à deux familles de miARN distinctes : mir-449 et mir-34. Par ailleurs, la localisation génomique de mir-449a et de mir-449b est identique : tous deux sont localisés au niveau du deuxième intron du gène cdc20b, situé sur le chromosome 5 humain (5q11.2, chr5:54456388-54504760). La famille mir-34 est composée de mir-34a qui est localisé dans une région intergénique du chromosome 1 alors que les miARN mir-34b et mir-34c appartiennent au même cluster et sont localisés tous deux dans une région intergénique du chromosome 11. La famille mir-34 a été fonctionnellement reliée à la voie de signalisation p53. III- Détermination des cibles spécifiques des miARN sélectionnés Ill-1. Identification du type cellulaire spécifique de chaque miARN Comme l'épithélium respiratoire natif, le modèle de différenciation in vitro utilisé dans ces essais est constitué de cellules basales, de cellules ciliées et de cellules sécrétrices de mucus. En vue d'identifier les répertoires des miARN spécifiques à chacun des types cellulaires, les Inventeurs ont utilisé le tri cellulaire par cytométrie de flux à l'aide de marqueurs spécifiques (Hajj, R. et al. 2007). A l'aide de cette technique, des cellules respiratoires adultes progénitrices (correspondant a priori à des cellules basales) ont été isolées, sélectionnées et triées (de telles cellules apparaissent doublement positives pour la tétraspanine CD151 et pour le facteur tissulaire) des cellules pyramidales (i.e. les cellules ciliées et les cellules sécrétrices de mucus) qui apparaissent négatives pour ces mêmes marqueurs. Ces purifications ont été réalisées à partir de polypes ou de cornets nasaux issus de 3 donneurs distincts. Après avoir extrait les ARN totaux, les profils d'expression des miARN ont été établis à l'aide de puces commerciales Agilent� ou par séquençage à haut-débit (HTS). Les deux approches expérimentales corroborent pour plusieurs miARN sélectionnés dont mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b, mir-34b* (mir-34b-5p), mir-34c et mir-34c* (mir-34c-3p) leur expression spécifique dans les cellules épithéliales ciliées. De plus, cette expérience de tri cellulaire permet de montrer que les miARN réprimés dans les cellules en culture (e.g. mir-31, mir-31*, mir-205, mir-130a, mir-193b) sont plus spécifiques des cellules basales (voir la Figure 6 et le Tableau VII). Pour la première fois, les Inventeurs attribuent ainsi de manière spécifique un répertoire d'expression des miARN à des types cellulaires distincts de l'épithélium respiratoire au cours de la différenciation. Tableau VII. miARN spécifiques des cellules basales ou des cellules pyramidales (ciliées+sécrétrices) identifiés par HTS et puces Agilent�. Nom Modulation de l'expression Intensité du niveau Intensité du niveau des miARN dans les cellules d'expression en log2 d'expression en log2 pyramidales (323(-)) par dans descellules dans des cellules rapport aux cellules basales basales (323(+)) pyramydales (323(-)) 323(+) hsa-let-7a -1,29 11,93 10,65 hsa-let-7b -1,96 12,20 10,24 hsa-let-7c -0,48 9,43 8,95 hsa-let-7e -1,42 8,24 6,82 hsa-let-7f -0,94 10,82 9,88 hsa-let-7g -0,15 8,37 8,22 hsa-miR-100 1,62 3,28 4,90 hsa-miR-106b -2,05 7,22 5,16 hsa-miR-125a-5p -0,05 6,63 6,58 hsa-miR-130a -6,33 9,76 3,43 hsa-miR-140-3p 0,91 2,75 3,66 hsa-miR-141 -2,88 11,12 8,24 hsa-miR-148a -1,76 7,14 5,39 hsa-miR-151-5p -0,73 7,24 6,51 hsa-miR-15a -2,10 7,86 5,75 hsa-miR-16 -0,48 9,10 8,62 hsa-miR-17 -2,60 6,64 4,04 hsa-miR-181a -2,29 6,88 4,59 hsa-miR-191 0,00 0,14 0,14 hsa-miR-193b -3,57 3,90 0,33 hsa-miR-200a -0,95 8,80 7,85 hsa-miR-200b -0,15 9,99 9,84 hsa-miR-200c -0,67 10,24 9,57 hsa-miR-203 -3,50 3,64 0,14 hsa-miR-205 -7,00 12,44 5,44 hsa-miR-21 -1,26 11,34 10,08 hsa-miR-21* -2,20 5,03 2,83 hsa-miR-210 -2,03 6,60 4,57 hsa-miR-22 -1,73 8,81 7,07 hsa-miR-224 -2,84 3,65 0,82 hsa-miR-23a -2,45 10,25 7,80 hsa-miR-23b -2,23 9,41 7,18 hsa-miR-25 -0,70 5,40 4,70 hsa-miR-26a -2,24 9,92 7,68 hsa-miR-26b -1,47 8,75 7,28 hsa-miR-27b -3,56 9,77 6,21 hsa-miR-29a -2,95 11,09 8,14 hsa-miR-29c -3,06 11,06 8,00 hsa-miR-30b -0,80 8,76 7,96 hsa-miR-30c -1,01 6,92 5,91 hsa-miR-30d -1,11 8,16 7,05 hsa-miR-30e -1,60 6,94 5,34 hsa-miR-31 -4,31 6,36 2,05 hsa-miR-31 * -3,70 3,84 0,14 hsa-miR-34a 0,64 6,72 7,36 hsa-miR-34b 8,24 0,88 9,12 hsa-miR-34b* 6,05 5,48 11,52 hsa-miR-34c-5p 5,74 4,75 10,49 hsa-miR-365 -0,99 4,83 3,84 hsa-miR-374a -1,04 4,26 3,22 hsa-miR-378 -2,43 4,11 1,68 hsa-miR-425 0,70 4,52 5,22 hsa-miR-429 -0,31 6,92 6,61 hsa-miR-449a 6,07 2,81 8,88 hsa-miR-449b 4,05 0,14 4,18 hsa-miR-574-3p 0,91 3,53 4,44 hsa-miR-768-3p -1,20 10,15 8,95 hsa-miR-92b 1,67 0,40 2,07 hsa-miR-939 1,28 4,81 6,08 hsa-miR-96 -1,51 6,81 5,30 hsa-miR-99a 0,99 5,42 6,40 III-2. Identification des ARNm cibles des miRNA sélectionnés Un enjeu majeur dans la biologie des miARN est de pouvoir identifier et caractériser expérimentalement les ARNm cibles qu'ils régulent. Dans cette perspective, ont été combinées des approches in silico (logiciels bioinformatiques prédictifs de cibles), des approches expérimentales (puces transcriptomes, expression ectopique de miARN ainsi que de vecteurs rapporteur contenant la partie 3'-UTR du gène d'intérêt fusionné à la luciférase). Des expériences complémentaires ont utilisé des approches d'immunocytochimie, de vidéo-microscopie et de biochimie. Plusieurs algorithmes de prédiction de cibles ont été proposés. Ils sont basés généralement sur : i) la complémentarité entre le miARN et le 3'UTR de l'ARNm cible au niveau de la région 5' du miARN (séquence de reconnaissance) ; ii) la conservation phylogénétique de cette séquence dans le 3'UTR de l'ARNm cible. Afin de déterminer les gènes cibles potentiellement régulés par ces miARN d'intérêt, les Inventeurs ont procédé à l'établissement d'un profilage des ARNm par puce d'expression (Affymetrix, human HuGene 1.0 ST microarrays). Les échantillons analysés sont les mêmes que ceux qui ont servi pour la mesure des miARN au cours de la différenciation. Une approche complémentaire a consisté à évaluer le transcriptome de cellules épithéliales respiratoires après manipulation du niveau d'expression des miARN sélectionnés par transfection. Une sélection de gènes-cibles en relation avec la régénération et la différenciation de l'épithélium a été réalisée à l'aide de supports bioinformatiques (Mediante, Ingenuity PathwayTM). Les Inventeurs ont ainsi pu établir un lien fonctionnel entre les miARN précédemment identifiés et un certain nombre de transcrits impliqués dans la régénération et la différenciation de l'épithélium respiratoire humain. Les résultats obtenus montrent que 500-1000 transcrits sont associés à la différentiation (voir la Figure 7). Seule l'expression de quelques gènes varie entre ALI-FC and ALI-WD, indiquant une stabilité de l'expression des ARN une fois la ciliogénèse enclenchée. III-3. Identification in silico des gènes cibles putatifs communs des brins 5p des miARN mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b et mir-34c Les gènes cibles prédits ont été récupérés pour chacun des brins 5p des 5 miARN sélectionnés mir-449a, mir-449b et mir-34a, mir-34b-5p (mir-34b*) et mir-34c-5p qui partagent une homologie de séquence au niveau de leur séquence de reconnaissance, à l'aide d'outils bioinformatiques prédictifs (i.e. TargetScan, mirbase target, picTar and Microcible 2to8) accessibles à travers l'interface réseau Mediante (www.microarray.fr). Les Inventeurs ont tout d'abord sélectionné les gènes cibles prédits communs aux 5 miARN d'intérêts, qui ont été validés à l'aide de la méthodologie détaillée ci-dessus. Sur près de 3500 cibles prédites pour chacun des miARN pris séparément, 1229 cibles sont communes aux 5 miARN sélectionnés. Les 1229 cibles prédites ont ensuite été comparées avec celles significativement réprimées (environ 1000, P IV-2. Matériels et méthodes Vecteurs d'expression 3'-UTR et mesure d'activité luciférase. La séquence complète de la partie non codante (3'-UTR) de la cavéoline (SEQ ID N°178) est amplifiée par PCR puis clonée au niveau des sites Xhol and Notl du vecteur psiCheck2 (Promega). Les microARN synthétiques d'intérêts (miR-34a, miR-34b*, miR-34c-5p et le miR contrôle négatif (miR-Neg1)) ont été synthétisés par la société Ambion (Applied Biosystems). Une transfection inverse a été réalisée sur les cellules HEK293T (20000 cellules par puits) dans une plaque 96-puits blanche avec 100ng de vecteur plasmidique psiCheck2 et 5 nmoles de miARN synthétique en utilisant comme agent de transfection la Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 48 heures après la transfection, les activités des luciférases renilla et firefly ont été évaluées avec le kit Dual Glo Luciferase Assay System (Promega) et mesurées à l'aide d'un luminomètre (Luminoskan Ascent, Thermolab system). Identification de voies de signalisation Le software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Mountain View, USA) a été utilisé pour identifier des réseaux d'interaction entre gènes d'intérêts et d'autres groupes fonctionnels. Les gènes ayant un ratio supérieur à 1 ont été sélectionnés. Ainsi, il est possible d'associer des fonctions biologiques et des maladies à nos résultats expérimentaux. IV-3. Résultats Les Inventeurs ont montré que mir-34b-5p inhibait significativement (P Selon le même principe, l'essai réalisé avec la cavéoline a été reproduit avec d'autres gènes cibles d'intérêt ; la séquence 3'-UTR des gènes suivants a été clonée AREG (SEQ ID N°179), AURKA (SEQ ID N°180), CAPN13 (SEQ ID N°181), CCNB1 (SEQ ID N°182), CCNE2 (SEQ ID N°183), CDC6 (SEQ ID N°184), CDC25A (SEQ ID N°185), CENPK (SEQ ID N°186), CEP55 (SEQ ID N°187), CDC20B (SEQ ID N°188), E2F7 (SEQ ID N°189), FOXM1 (SEQ ID N°190), STATH (SEQ ID N°191) et TOP2A (SEQ ID N°192). Cibles de miR-449a/b ou Description du gène Numéro cibles validées miR-34a,b,b*,c-3p,c-5p d'accession pour au moins testées expérimentalement du gène un des miARN AREG (SEQ ID N°179) Homo sapiens NM_001657 miR-449a/b et amphiregulin (AREG), miR-34a/c-5p mRNA. AURKA (SEQ ID N°180) Homo sapiens aurora NM_198433 miR-34b kinase A (AURKA), transcript variant 1, mRNA. CCNB1 (SEQ ID N°182) Homo sapiens cyclin B1 NM_031966 miR-449a/b et (CCNB1), mRNA. miR-34a/c-5p CCNE2 (SEQ ID N°183) Homo sapiens cyclin E2 NM_057749 miR-449a/b et (CCNE2), mRNA. miR-34a/c-5p CDC25A (SEQ ID N°185) Homo sapiens cell NM_001789 miR-449a/b et division cycle 25 homolog miR-34a/c-5p A (S. pombe) (CDC25A), transcript variant 1, mRNA. CEP55 (SEQ ID N°187) Homo sapiens NM_018131 miR-34b* centrosomal protein 55kDa (CEP55), transcript variant 1, mRNA. Tableau IX ù liste des gènes cibles validé par au moins un des miARN sélectionné Une cible est validée dès lors que son expression est inhibée par un miARN. V- Identification par puces ADN (Affymetrix�) des cibles des miARN d'intérêts : mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b*, mir-34c-5p Afin de déterminer les gènes modulés spécifiquement par l'expression d'un miARN d'intérêt, chaque miARN, mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b* et mir-34c-5p, est transfecté dans des cultures primaires de cellules épithéliales respiratoires non-différenciées (HAECs) et étudié par puces transcriptome (Affymetrix�), 48h après la transfection, les gènes différentiellement modulés. Etant donné que mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b*, mir-34c-5p partagent le même � seed � (séquence 2-7), ils sont susceptibles d'interagir avec des cibles communes. De ce fait, 95 gènes communs ont été obtenus comme significativement modulés par ces miARN. Classiquement il est admis qu'un miARN va directement agir sur ses ARNm cibles en vue de réprimer leur expression. La Figure 10 montre l'enrichissement de gènes cibles contenant de la région complémentaire de la séquence de reconnaissance de ces miARN d'intérêt en réponse à 48h de transfection de chacun de ces miARN. Nous avons observé sur les 95 gènes modulés que 41 gènes sont significativement réprimés (voir le Tableau X). Sur ces 41 gènes réprimés, 18 gènes sont des cibles prédites (par analyse in si/fco) communes aux 5 miARN sélctionnés (voir le Tableau XI) et dont la régulation par lesdits miARN pourraient jouer un rôle clé dans la différenciation de l'épithélium respiratoire et dans la mise en place d'une stratégie thérapeutique de maladies respiratoires (mucoviscidose, asthme, bronchopneumopathies obstructives chronique, dyskinésie ciliaire primaire...). 39 Tableau IX : 41 gènes réprimés communs aux miARN mir-34a, mir-34b*, mir-34c-5p, mir-449a et mir-449b après transfection dans des HAECs de chacun des miARN d'intérêt. Gene Description Niveau Modulation Modulation Modulation en Modulation Modulation en d'intensité en présence en présence présence de en présence présence de d'expression en de mir34a de mir34b-5p mir34c-5p de mir449a mir449b log2 HIST1H3B histone cluster 1, H3b 7,71 -0,57 -0,42 -0,74 -1,03 -0,66 CDC2 cell division cycle 2, G1 to S and 5,59 -0,57 -0,29 -0,64 -1,00 -0,67 G2 to M DTL denticleless homolog (Drosophila) 6,47 -0,65 -0,38 -0,86 -0,97 -0,81 KLRK1//KLRC4 killer cell lectin-like receptor 4,16 -0,78 -0,90 -0,85 -0,97 -0,62 subfamily K, member 1 // killer cell lectin-like receptor subfamily C, member 4 KIAA0101 KIAA0101 6,71 -0,88 -0,65 -0,84 -0,92 -0,72 NUF2 NUF2, NDC80 kinetochore 6,20 -0,91 -0,55 -0,68 -0,92 -0,75 complex component, homolog (S. cerevisiae) HISTIH2BM histone cluster 1, H2bm 8,72 -0,44 -0,59 -0,69 -0,92 -0,66 RAD51AP1 RAD51 associated protein 1 5,42 -1,03 -0,60 -0,92 -0,87 -0,65 CENPK centromere protein K 6,38 -0,89 -0,60 -0,74 -0,83 -0,65 CCNB2 cyclin B2 6,51 -0,65 -0,55 -0,59 -0,83 -0,77 KIF11 kinesin family member 11 5,98 -0,43 -0,20 -0,58 -0,82 -0,54 NUSAP1 nucleolar and spindle associated 6,73 -0,49 -0,30 -0,45 -0,82 -0,51 protein 1 TOP2A topoisomerase (DNA) II alpha 7,06 -0,70 -0,21 -0,63 -0,80 -0,52 170kDa DEPDC1 DEP domain containing 1 5,22 -0,80 -0,39 -0,54 -0,80 -0,71 ASPM asp (abnormal spindle) homolog, 5,73 -0,59 -0,32 -0,62 -0,77 -0,67 microcephaly associated (Drosophila) ARHGAP11B Rho GTPase activating protein 4,69 -0,82 -0,75 -0,71 -0,76 -0,84 11B HELLS helicase, lymphoid-specific 5,95 -0,78 -0,55 -0,69 -0,74 -0,79 CENPI centromere protein 1 6,39 -0,54 -0,67 -0,69 -0,73 -0,91 40 CENPF centromere protein F, 350/400ka 6,61 -0,64 -0,34 -0,57 -0,72 -0,51 (mitosin) BUB1 BUB1 budding uninhibited by 6,49 -0,54 -0,25 -0,54 -0,72 -0,60 benzimidazoles 1 homolog (yeast) RRM2 ribonucleotide reductase M2 7,72 -0,57 -0,29 -0,76 -0,71 -0,60 polypeptide TTK TTK protein kinase 5,11 -0,50 -0,39 -0,81 -0,69 -0,67 ARHGDIB Rho GDP dissociation inhibitor 8,43 -0,54 -0,48 -0,70 -0,69 -0,59 (GDI) beta CEP55 centrosomal protein 55kDa 6,68 -0,52 -0,37 -0,62 -0,68 -0,64 TPX2 TPX2, microtubule-associated, 6,89 -0,69 -0,42 -0,61 -0,68 -0,60 homolog (Xenopus laevis) FOXM1 forkhead box M1 6,22 -0,64 -0,37 -0,38 -0,66 -0,56 AURKA aurora kinase A 7,42 -0,51 -0,38 -0,51 -0,65 -0,66 CASC5 cancer susceptibility candidate 5 6,03 -0,47 -0,14 -0,45 -0,63 -0,59 SPC25 SPC25, NDC80 kinetochore 4,93 -0,46 -0,32 -0,49 -0,61 -0,52 complex component, homolog (S. cerevisiae) PRC1 protein regulator of cytokinesis 1 7,81 -0,57 -0,48 -0,57 -0,60 -0,65 ARHGAP11A Rho GTPase activating protein 6,53 -0,40 -0,24 -0,46 -0,60 -0,53 11A CDC25A cell division cycle 25 homolog A 6,33 -0,60 -0,46 -0,54 -0,59 -0,55 (S. pombe) PRR11 proline rich 11 6,92 -0,59 -0,40 -0,69 -0,58 -0,67 CDC6 cell division cycle 6 homolog (S. 7,64 -0,38 -0,22 -0,57 -0,57 -0,52 cerevisiae) FLJ27243 FLJ27243 protein 6,60 -0,48 -0,54 -0,47 -0,55 -0,65 LOC100130131 similar to melanoma antigen 6,14 -0,32 -0,44 -0,34 -0,54 -0,51 LOC100130131 similar to melanoma antigen 6,14 -0,32 -0,44 -0,34 -0,54 -0,51 DLGAP5 discs, large (Drosophila) homolog- 6,64 -0,68 -0,09 -0,48 -0,52 -0,50 associated protein 5 TRIP13 thyroid hormone receptor 7,35 -0,54 -0,57 -0,58 -0,51 -0,55 interactor 13 L0C253724 hypothetical L0C253724 3,82 -0,59 -0,70 -0,95 -0,51 -0,79 PLK4 polo-like kinase 4 (Drosophila) 6,23 -0,43 -0,18 -0,58 -0,50 -0,55 41 Tableau XI. Cibles prédites réprimées et communes à mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b* et mir-34c-5p et réprimées après transfection dans des HAECs de chacun des miARN sélectionné. Gene_Symbol Gene Description Niveau Modulation Modulation Modulation Modulation Modulation d'intensité en en en présence en en d'expression présence présence de mir34c- présence présence en log2 de mir34a de mir34b* 5p de mir449a de mir449b DTL denticleless homolog (Drosophila) 6,47 -0,65 -0,38 -0,86 -0,97 -0,81 KLRK1//KLRC4 killer cell lectin-like receptor subfamily K, member 1 4,16 -0,78 -0,90 -0,85 -0,97 -0,62 KIAA0101 KIAA0101 6,71 -0,88 -0,65 -0,84 -0,92 -0,72 CENPK centromere protein K 6,38 -0,89 -0,60 -0,74 -0,83 -0,65 CCNB2 cyclin B2 6,51 -0,65 -0,55 -0,59 -0,83 -0,77 KIF11 kinesin family member 11 5,98 -0,43 -0,20 -0,58 -0,82 -0,54 NUSAP1 nucleolar and spindle associated protein 1 6,73 -0,49 -0,30 -0,45 -0,82 -0,51 TOP2A topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa 7,06 -0,70 -0,21 -0,63 -0,80 -0,52 DEPDC1 DEP domain containing 1 5,22 -0,80 -0,39 -0,54 -0,80 -0,71 RRM2 ribonucleotide reductase M2 polypeptide 7,72 -0,57 -0,29 -0,76 -0,71 -0,60 ARHGDIB Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) beta 8,43 -0,54 -0,48 -0,70 -0,69 -0,59 CEP55 centrosomal protein 55kDa 6,68 -0,52 -0,37 -0,62 -0,68 -0,64 TPX2 TPX2, microtubule-associated, homolog (Xenopus 6,89 -0,69 -0,42 -0,61 -0,68 -0,60 laevis) FOXM1 forkhead box M1 6,22 -0,64 -0,37 -0,38 -0,66 -0,56 AURKA aurora kinase A 7,42 -0,51 -0,38 -0,51 -0,65 -0,66 PRC1 protein regulator of cytokinesis 1 7,81 -0,57 -0,48 -0,57 -0,60 -0,65 CDC25A cell division cycle 25 homolog A (S. pombe) 6,33 -0,60 -0,46 -0,54 -0,59 -0,55 CDC6 cell division cycle 6 homolog (S. cerevisiae) 7,64 -0,38 -0,22 -0,57 -0,57 -0,52 5 Une analyse bioinformatique à l'aide du software Ingenuity Pathway Analysis software (IPA) (Ingenuity Systems, Mountain View, USA) a permis d'identifier des réseaux d'interaction entre ces gènes et d'associer des fonctions biologiques et des maladies aux résultats expérimentaux (voir la Figure 11). Les voies régulées par l'expression des miARN sélectionnés sont des voies majeures de régulation du cycle cellulaire. REVENDICATIONS1. Méthode de diagnostic in vitro de la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial respiratoire d'un sujet mammifère caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes : (i) de mesure quantitative du niveau d'expression des miARN par les cellules dudit tissu épithélial respiratoire dudit sujet ; (ii) d'établissement du profil d'expression des miARN du tissu épithélial respiratoire dudit sujet ; (iii) de comparaison du profil d'expression des miARN dudit sujet avec le profil d'expression de miARN du tissu épithélial respiratoire, dans lequel le niveau d'expression est exprimé en niveau d'intensité d'expression en log2, d'un ou plusieurs autres sujets sains, figurant dans le Tableau I ci-après : Nom du miARN Numéro de séquence du Niveau d'intensité miARN (SEQ ID) d'expression en log2 Au stade différencié (WD) mesuré en HTS hsa-miR-100 1 9,00 hsa-miR-106b 2 5,39 hsa-miR-125a-5p 3 14,08 hsa-miR-130a 4 11,98 hsa-miR-140-3p 5 13,12 hsa-miR-141 6 9,75 hsa-miR-148a 7 8,97 hsa-miR-151-5p 8 10,22 hsa-miR-15a 9 7,68 hsa-miR-16 10 5,35 hsa-miR-17 11 11,61 hsa-miR-181 a 12 0,01 hsa-miR-191 13 16,82 hsa-miR-193b 14 11,67 Hsa-miR-1975 15 11,22 hsa-miR-200a 16 10,96 hsa-miR-200b 17 10,64 hsa-miR-200c 18 14,57 hsa-miR-203 19 14,55 hsa-miR-205 20 15,24 hsa-miR-21 21 8,09Hsa-miR-21 * 73 10,49 hsa-miR-210 22 9,29 hsa-miR-22 23 11,22 hsa-miR-224 24 14,10 hsa-miR-23a 25 15,35 hsa-miR-23b 26 9,35 hsa-miR-25 27 3,52 hsa-miR-26a 28 7,75 hsa-miR-26b 29 6,81 hsa-miR-27b 30 14,81 hsa-miR-29a 31 14,53 hsa-miR-29c 32 9,74 hsa-miR-30b 33 0,01 hsa-miR-30c 34 10,87 hsa-miR-30d 35 8,76 hsa-miR-30e 36 12,74 hsa-miR-31 37 11,83 hsa-miR-31* 89 11,18 hsa-miR-34a 38 13,75 hsa-miR-34b 39 10,65 Hsa-miR-34b* 91 14,29 hsa-miR-34c-5p 40 0,01 hsa-miR-365 41 2,78 hsa-miR-374a 42 11,87 hsa-miR-378 43 11,70 hsa-miR-425 44 9,53 hsa-miR-429 45 15,11 hsa-miR-449a 46 12,24 hsa-miR-449b 47 14,56 hsa-miR-574-3p 48 13,42 hsa-miR-92b 49 0,01 hsa-miR-939 50 5,43 hsa-miR-96 51 12,65 hsa-miR-99a 52 9,00 hsa-Iet-7a 157 4,31 hsa-Iet-7b 158 11,28 hsa-let-7c 159 7,86hsa-let-7e 160 7,60 hsa-let-7f 161 5,35 hsa-let-7g 162 12,40 (ivl d'identification d'au moins un miARN dont le niveau d'exores par ledit premier sujet diffère d'au moins un facteur 2, c'est-à-dire d'au moins une unité de log2, par rapport au niveau d'expression du même miARN par le ou lesdits autres sujets sains ; et (v) de mise en évidence d'un défaut de la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial respiratoire relié à une anomalie d'expression d'au moins un miARN dudit premier sujet si au moins un miARN dudit profil établi à l'étape (ii) présente un niveau d'expression qui diffère d'au moins un facteur 2, c'est-à-dire d'au moins une unité de log2 par rapport au niveau d'expression du même miARN par le ou lesdits autres sujets sains. 2. Utilisation d'au moins un miARN identifié par la méthode selon la revendication 1 et choisi parmi hsa-miR-100 (SEQ ID N°1), hsa-miR-106b (SEQ ID N°2), hsa-miR-125a-5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-130a (SEQ ID N°4), hsa-miR-140-3p (SEQ ID N°5), hsa-miR-141 (SEQ ID N°6), hsa-miR-148a (SEQ ID N°7), hsa-miR-151- 5p (SEQ ID N°8), hsa-miR-15a (SEQ ID N°9), hsa-miR-16 (SEQ ID N°10), hsa-miR-17 (SEQ ID N°11), hsa-miR-181a (SEQ ID N°12), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR-193b (SEQ ID N°14), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-200a (SEQ ID N°16), hsa-miR-200b (SEQ ID N°17), hsa- miR-200c (SEQ ID N°18), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), hsa-miR-205 (SEQ ID N°20), hsa-miR-21 (SEQ ID N°21), hsa-miR-210 (SEQ ID N°22), hsa-miR-22 (SEQ ID N°23), hsa-miR-224 (SEQ ID N°24), hsa-miR-23a (SEQ ID N°25), hsa-miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-25 (SEQ ID N°27), hsa-miR-26a (SEQ ID N°28), hsa-miR-26b (SEQ ID N°29), hsa-miR-27b (SEQ ID N°30), hsa-miR-29a (SEQ ID N°31), hsa-miR-29c (SEQ ID N°32), hsa-miR-30b (SEQ ID N°33), hsa-miR-30c (SEQ ID N°34), hsa-miR-30d (SEQ ID N°35), hsa-miR-30e (SEQ ID N°36), hsa-miR-31 (SEQ ID N°37), hsa-miR-34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa-miR-365 (SEQ ID N°41), hsa-miR-374a (SEQ ID N°42), hsa-miR-378 (SEQ ID N°43), hsa-miR-425 (SEQ ID N°44), hsa-miR-429 (SEQ ID N°45), hsa-miR-449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-574-3p (SEQ ID N°48), hsa-miR-92b (SEQ ID N°49), hsa-miR-939 (SEQ ID N°50), hsa-miR-96 (SEQ ID N°51), hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), hsa-let-7a (SEQ ID N°157), hsa-let-7b (SEQ ID N°158), hsa-let-7c (SEQ ID N°159), hsa-let-7e (SEQ ID N°160), hsa-let-7f (SEQ ID N°161) et hsa-let-7g (SEQ ID N°162), leur brin complémentaire � star � de séquence SEQ ID N°53 à 104, 163 à 168 et 193 à 200, leur brin de séquence complémentaire éventuellement modifié chimiquement, et leur précurseur de séquence ion SEQ ID N°105 à 156 et 169 à 174 pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour induire la régénération et/ou la différenciation de l'épithélium respiratoire de mammifère 3. Utilisation selon la revendication 2, pour la prévention et/ou le traitement des pathologies impliquant un désordre de la régénération et/ou de la différenciation de l'épithélium respiratoire. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que lesdites pathologies sont sélectionnées dans le groupe constitué par des maladies respiratoires chroniques et/ou héréditaires telles que les broncho-pneumopathies obstructives chroniques (BCPO), la mucoviscidose, l'asthme, la dyskinésie ciliaire primaire, les inflammations et infections chroniques des voies respiratoires et les insuffisances respiratoires. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en que ledit miARN est sélectionné dans le groupe constitué par hsa-miR- 34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsamiR-449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-449b* (SEQ ID N°99), hsa-miR-92b (SEQ ID N°49), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR-378 (SEQ ID N°43), hsa-miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-125a-5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), hsa- miR-574-3p (SEQ ID N°48), hsa-miR-29c (SEQ ID N°32), hsa-miR-140-3p (SEQ ID N°5), hsa-miR-205 (SEQ ID N°20), hsa-miR-23a (SEQ ID N°25), hsa-miR-31 (SEQ ID N°37), hsa-miR-31* (SEQ ID N°89), hsa-miR-21 (SEQ ID N°21), hsa-miR-17 (SEQ ID N°11), hsa-miR-29a (SEQ ID N°31), hsa-miR-193b (SEQ ID N°14), hsa-miR-210 (SEQ ID N°22) et hsa-miR-130a (SEQ ID N°4), leur brin complémentaire � star � de séquence SEQ ID N°55 à 57, 63, 65 à 67, 71 à 74, 77, 78, 83, 84, 90 à 92, 95, 98, 100, 101 et 104, leur brin de séquence complémentaire éventuellement modifié chimiquement, et leurs précurseurs de SEQ ID N°107 à 109, 115, 117 à 119, 123 à 126, 129, 130, 135, 136, 141 à 144, 147, 151 à 153 et 156. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en que ledit miARN est sélectionné dans le groupe constitué par hsa-miR-34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsamiR-449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-449b* (SEQ ID N°99), hsa-miR-92b (SEQ ID N°49), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR-378 (SEQ ID N°43), hsa-miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-125a-5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), et leur précurseurs de séquence SEQ ID N°107, 117, 119, 123, 130, 142 à 144, 147, 150, 151, 153 et 156 et/ou au moins un brin complémentaire � star � des miARN éventuellement modifié chimiquement choisis parmi hsa-miR-205, hsa-miR-31, hsamiR-21, hsa-miR-17, hsa-miR-29a, hsa-miR-193b, hsa-miR-31*, hsa-miR-210 hsamiR-130a : hsa-miR-205* (SEQ ID N°72), hsa-miR-31 et hsa-miR-31* (SEQ ID N°37 et 89), hsa-miR-21* (SEQ ID N°73), hsa-miR-17* (SEQ ID N°63), hsa-miR-29a* (SEQ ID N°83), hsa-miR-193b* (SEQ ID N°66), hsa-miR-210* (SEQ ID N°74), hsa-miR-130a* (SEQ ID N°56) et leur précurseurs de séquence SEQ ID N°108, 115, 118, 124 à 126, 135 et 141. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que ledit miARN comporte en région 2-7 ou en région 3-8, une séquence de reconnaissance sélectionnée dans le groupe consitué par GGCAGUGA (SEQ ID N°175), AAUCACU (SEQ ID N°176) et AUCACUA (SEQ ID N°177). 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit miARN est sélectionné dans le groupe constitué par hsa-miR-34a (SEQ ID N°38), hsamiR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa-miR-449a (SEQ ID N°46) et hsa-miR-449b (SEQ ID N°47). 9. miARN sélectionné dans le groupe constitué par hsa-miR-100 (SEQ ID N°1), hsa-miR-106b (SEQ ID N°2), hsa-miR-125a-5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-130a (SEQ ID N°4), hsa-miR-140-3p (SEQ ID N°5), hsa-miR-141 (SEQ ID N°6), hsamiR-148a (SEQ ID N°7), hsa-miR-151-5p (SEQ ID N°8), hsa-miR-15a (SEQ ID N°9), hsa-miR-16 (SEQ ID N°10), hsa-miR-17 (SEQ ID N°11), hsa-miR-181a (SEQ ID N°12), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR-193b (SEQ ID N°14), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-200a (SEQ ID N°16), hsa-miR-200b (SEQ ID N°17), hsa- miR-200c (SEQ ID N°18), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), hsa-miR-205 (SEQ ID N°20), hsa-miR-21 (SEQ ID N°21), hsa-miR-210 (SEQ ID N°22), hsa-miR-22 (SEQ ID N°23), hsa-miR-224 (SEQ ID N°24), hsa-miR-23a (SEQ ID N°25), hsa-miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-25 (SEQ ID N°27), hsa-miR-26a (SEQ ID N°28), hsa-miR-26b (SEQ ID N°29), hsa-miR-27b (SEQ ID N°30), hsa-miR-29a (SEQ ID N°31), hsa-miR-29c (SEQ ID N°32), hsamiR-30b (SEQ ID N°33), hsa-miR-30c (SEQ ID N°34), hsa-miR-30d (SEQ ID N°35), hsa-miR-30e (SEQ ID N°36), hsa-miR-31 (SEQ ID N°37), hsa-miR-34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa-miR-365 (SEQ ID N°41), hsa-miR-374a (SEQ ID N°42), hsa-miR-378 (SEQ ID N°43), hsa-miR-425 (SEQ ID N°44), hsa-miR-429 (SEQ ID N°45), hsa-miR-449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-574-3p (SEQ ID N°48), hsa-miR-92b (SEQ ID N°49), hsamiR-939 (SEQ ID N°50), hsa-miR-96 (SEQ ID N°51), hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), hsa-let-7a (SEQ ID N°157), hsa-let-7b (SEQ ID N°158), hsa-let-7c (SEQ ID N°159), hsa-let-7e (SEQ ID N°160), hsa-let-7f (SEQ ID N°161) et hsa-let-7g (SEQ ID N°162), leur brin complémentaire � star � de séquence SEQ ID N°53 à 104, 163 à 168 et 193 à200, leur brin de séquence compélemntaire éventuellement modifié chiliquement, et leur précurseur de séquence SEQ ID N°105 à 156 et 169 à 174 pour une utilisation comme médicament.