FR 2946883 A1 20101224 FR 0903010 A 20090622 i PRODUIT ET PROCEDE POUR AMELIORER LA FERTILITE DES MAMMIFERES La présente invention concerne un produit de confort et d'hygiène, destiné à augmenter la fertilité des mammifères, en favorisant les conditions nécessaires à la nidation d'un ovule fécondé, avant la saillie ou l'insémination artificielle. Elle concerne plus particulièrement un produit à base de biopolymères d'origine marine, et plus particulièrement de nacre pulvérulente, diluée dans un solvant particulier, et se présentant sous la forme d'une solution de rinçage ou d'un gel actif, ainsi qu'un procédé pour la mise en oeuvre de ce type de produit. Chez les mammifères, en particulier les humains, la fertilité peut être affectée par des facteurs, tels que la nutrition, les comportements sexuels, la culture, l'endocrinologie, le mode de vie ou les émotions. La fertilité animale est quant à elle plutôt dépendante de facteurs extérieurs, tels que la pollution, qui peuvent être des perturbateurs endocriniens. Ces facteurs peuvent agir en amont de la reproduction, par exemple en délétant la spermatogénèse ou les ovules, ou en aval en raison de leur toxicité pour l'ovule, l'embryon ou l'utérus ; ils peuvent également interférer avec les processus biologiques nécessaires à la phase d'implantation de l'oeuf. Ainsi, par exemple chez les équidés, divers facteurs peuvent influencer la fertilité, tels que : - des défauts dans la mise en place de l'insémination, comme la durée de la saison de monte, le nombre de juments saillies, ou l'alimentation à titre d'exemples, - des dysfonctionnements pathologiques du tractus génital, - ou encore des maladies infectieuses. Des problèmes physiologiques peuvent également se greffer aux facteurs précédemment cités. Ils concernent notamment les chaleurs, et plus particulièrement : - leur blocage, dû à la persistance d'un corps jaune pseudogestatif, - leur absence, à cause de la transformation en kyste d'un des follicules, - leur rapprochement, voire leur continuité, résultant en une miction très fréquente, et une difficulté conséquente pour réaliser la fécondation. Chacun de ces problèmes est généralement traité au moyen de prostaglandines, afin de permettre une gestation ultérieure. Il faut cependant attendre que l'organisme récupère de ces divers problèmes, retardant d'autant plus une grossesse éventuelle, ce qui est préjudiciable, notamment dans les élevages, en raison du coût des manipulations nécessaires à la réalisation d'une saillie ou d'une insémination artificielle. L'invention propose un nouveau produit, à partir d'un élément naturel, destiné à favoriser le développement de l'embryon, en améliorant la nidation de l'embryon par régénération tissulaire et bioactivité. A et effet, la présente invention a pour objet un produit destiné à améliorer la fertilité des mammifères constitué de biopolymères d'origine marine sous forme de poudre d'une granulométrie égale ou inférieure à 50 microns, dissoute dans un solvant neutre. La fécondation et la nidation obéissent à une succession d'évènements dépendants les uns des autres, ce qui fait que l'échec de l'une d'entre elles aboutit à l'insuccès de l'ensemble de la procédure, et ne permet pas une gestation réussie. En effet, la phase d'implantation de l'ovule fécondé, appelé également blastocyte, correspondant à la nidation, fait suite à son éclosion, permettant ainsi sa libération. Les cellules extérieures du blastocyte peuvent alors interagir avec les autres tissus de l'environnement dans lequel il évolue, et en particulier avec les cellules de la muqueuse utérine. Cette interaction est permise grâce à l'influence d'hormones ovariennes, qui vont moduler la réceptivité de la muqueuse utérine. Pour que la nidation se déroule correctement, le blastocyte et la muqueuse utérine doivent interagir, ce qui suppose des modifications structurelles de ces deux éléments. Le blastocyte doit tout d'abord migrer dans les trompes. Aucune interaction cellulaire ne doit se faire, car elle serait néfaste pour le déplacement de l'embryon et pourrait résulter en une implantation anormale de l'embryon, comme une grossesse extra-utérine. Ceci est permis grâce à la présence d'une zone pellucide. Pendant ce temps, les cellules de l'épithélium de surface de l'utérus, à savoir l'endomètre, modifient leurs villosités en raison des changements hormonaux, et en particulier par production de progestérone. Une activité d'endocytose, c'est-à-dire le transport de molécules et de particules vers l'intérieur de la cellule, se manifeste, ce qui permet la diminution de la cavité utérine par absorption des liquides. Ainsi, le blastocyte peut être en contact maximal avec la muqueuse de l'endomètre. Les cellules épithéliales de la muqueuse utérine sont recouvertes de glycoprotéines formant un glycocalyx, constitué de glycoprotéines et de glycolipides. Les glycoprotéines proviennent d'une N-glycosilation sur une asparagine, dont le sucre terminal est toujours l'acide sialique. Les protéoglycanes sont des sucres 0-glycosilés. Chacune de ces molécules présentent de longues chaînes non ramifiées, et sont fortement chargées négativement, ce qui leur permet de retenir l'eau à l'extérieur de la membrane. Le glycocalyx subit des modifications lors de la période préimplantatoire. Cependant, la nature exacte de la zone de contact entre l'embryon et la muqueuse est mal connue. Par ailleurs, au niveau du site d'implantation, une synthèse moléculaire de ténascine se produit. Cette substance est une glycoprotéine hexapode constituant de la matrice extracellulaire, souvent associée à la fibronectine des tissus conjonctifs. Cette synthèse est rendue possible par la préparation hormonale préalable de la muqueuse à la nidation. La ténascine favorise la diminution de l'adhérence des cellules épithéliales sous-jacentes, ce qui permet la pénétration du blastocyte dans la muqueuse. Ainsi, à l'issue de la nidation, l'embryon est profondément enfoui dans la muqueuse. 4 Une fois que le blastocyte a commencé sa nidation, ses cellules se différencient, afin de permettre la formation des différents tissus les plus superficiels des annexes embryonnaires. Il est fondamental que l'étape de nidation soit parfaite pour permettre la poursuite de la gestation. Ceci s'explique par le fait que la cellule initiale, l'ovocyte, est pauvre en réserves cytoplasmiques ; l'oeuf fécondé n'a donc que peu de réserves et présente ainsi une autonomie très limitée dans le temps. La nidation est une étape qui permet la connexion avec l'organisme maternel, de manière à lui soutirer les apports nutritionnels, nécessaires au bon développement de l'oeuf fécondé. Afin de favoriser la nidation, le produit selon l'invention est fabriqué à partir d'un élément naturel, consistant en un mélange de biopolymères marins, issus d'huîtres perlières, auquel est ajouté un ou plusieurs liquides et gels neutres, servant de solvant et ayant un rôle de support pour l'expression des éléments constitutifs de la nacre. Ces biopolymères sont constitués d'une pluralité d'éléments qui vont accélérer le processus de régénération cellulaire et tissulaire, améliorant ainsi la cicatrisation et la réparation de tissus lésés suite à une précédente gestation, réussie ou échouée. Les biopolymères constituant le produit selon l'invention forment la nacre, ayant également la dénomination d'aragonite conchylifère. Cet élément est une formation minéralisée biogène, Elle est constituée d'une matrice organique fibreuse et non fibreuse et d'aragonite, cette matrice représentant environ 1,7 à 2% de la masse totale. La phase organique est constituée de protéines fibreuses, sous forme de collagènes ancestraux, et de protéines non fibreuses. La moitié environ de la matrice est hydrosoluble, tandis que l'autre partie ne peut être obtenue qu'après décalcification. L'aragonite, représentant la phase minérale de la nacre, est du carbonate de calcium (CaCO3) sous forme cristalline, obtenue sous le mode orthorhombique. L'aragonite est associée à divers oligo-éléments, tels que le sodium, le magnésium, le lanthane, le zinc, le brome, le césium, le fer, le manganèse, le chlore, le cuivre, le potassium, le calcium, le strontium et le soufre. La nacre constitutive du produit selon l'invention peut être obtenue à partir de coquilles de mollusques marins nacriers ou de céphalopodes, tels que le nautile. L'huître perlière Pinctada Maxima est la source préférée pour la nacre destinée à fabriquer le produit pour favoriser la nidation d'un embryon. La nacre 5 doit être purifiée avant son utilisation, même si elle est employée sous forme brute, c'est-à-dire débarrassée des autres éléments de la coquille, riches en polysaccharides et calcite. La nacre utilisée est préférentiellement blanche, dans la mesure où les inclusions pigmentaires peuvent être responsables d'intolérances. Elle est 10 utilisée sous forme de poudre de granulométrie déterminée. La nacre est obtenue par le procédé suivant. Les morceaux à traiter sont tout d'abord contrôlés au niveau de leur tranche et de leurs deux faces. Les pièces présentant des inclusions, tels que des points bruns ou noirs, des piqûres 15 ou des altérations des feuillets de nacre. Les morceaux sélectionnés sont ensuite placés à plat sur des clayettes d'une machine à laver, où elles sont traitées avec une solution à base de calbénium, qui a une action bactéricide et virucide. Après séchage, les morceaux sont retirés et placés dans un container pour aller dans une zone sèche, où ils 20 vont être concassés, après avoir été contrôlés une seconde fois, re-triés, pesés et aspirés pour enlever toutes les poussières et impuretés. Cette opération est répétée trois fois, de manière à ce que le concassage permette d'obtenir des morceaux les plus petits possibles, pour être ensuite broyés plusieurs fois. 25 Le premier broyage est réalisé à l'aide d'un planétaire, du type Pulverisette 5. On place quinze billes de 30 mm de diamètre dans un bol de zirconium, qu'on remplit avec 350 g de poudre de coquilles d'huîtres. L'ensemble est ensuite versé dans une passoire où les billes sont brossées et remises dans 30 le bol. Le second broyage est réalisé à l'aide d'un planétaire, du type Pulverisette 4. Vingt-cinq billes de 20 mm de diamètre sont disposées dans les bols de zirconium, qui sont remplis avec 350 g de poudre de coquilles d'huîtres, préalablement broyée. Un troisième broyage est réalisé avec le même type d'appareillage que pour le second broyage. On place cent billes de 10 mm avec la même quantité de poudre de coquilles d'huîtres que lors des étapes précédentes de broyage. La troisième étape d'obtention de la poudre de nacre consiste à tamiser les poudres obtenues. Pour cela, on place le fond de collecte sur le plateau de la tamiseuse avec le tamis de 20 microns et 20 billes en nacre de 5 mm de diamètre. Le tamis de 50 microns avec 20 billes en nacre de 5 mm de diamètre est ensuite placé, puis celui de 140 microns avec la même quantité et les mêmes caractéristiques pour la nacre, et pour finir le tamis de 250 microns avec 20 billes de 5 mm de diamètre. Quatre pelles de 300 g de la poudre obtenue selon l'étape précédente sont incorporées dans le tamis de 250 microns ; la tamiseuse est ensuite mise en 15 route. La poudre résiduelle du tamis de 250 microns est mise dans le récipient prévu à cet effet. La même opération est réalisée pour le tamis de 140 et 50 microns avec le même protocole. La poudre du tamis de 20 microns est réservée dans le récipient prévu à 20 cet effet, ainsi que la poudre du fond de collecte. On procède de manière identique pour la collecte de poudre résiduelle de chaque tamis en récupérant la poudre et les billes séparément dans les récipients identifiés avec le chiffre de la granulométrie. Les poudres sont pesées et identifiées selon leur granulométrie. 25 Le produit selon l'invention utilise une poudre de granulométrie égale ou inférieure à 50 microns. II est également possible d'utiliser des nanoparticules de nacre. Dans ce cas, l'extraction de cet élément se fait par mécanosynthèse à partir de machines du type Pulverisette 4. 30 Un procédé industriel d'extraction des biopolymères solubles et insolubles actifs du test nacré et de la coquille externe, a été mis au point. La nature de ces divers éléments a été précisée par des analyses physico-chimiques. Ainsi, les biopolymères se composent : - des 20 acides aminés majoritaires, nécessaires au maintien de la vie, - de protéines, - de glycosaminoglycanes, - de glycoprotéines, - de protéoglycanes, - de facteurs de croissance, - de cytokynes, - et de la plupart des oligoéléments, modificateurs de terrain, - de pigments mélaniniques, - de caroténoïdes, - de métalloenzymes, - de métalloprotéines, - et d'anti-radicalaires. Ces divers constituants jouent un rôle dans les processus de réparation, de cicatrisation et régénération des tissus lésés. C'est ainsi que la nacre acquiert ses propriétés particulières, concernant notamment la régénération cellulaire et tissulaire, la biocompatibilité, et la bioactivité. La nacre possède également d'autres propriétés spécifiques, telles que des actions antibiomimétiques, antiphlogistiques, antibradykinines, angiogéniques, bioadhésives et hémostatiques. La mise en application des préparations à visée thérapeutique à base de nacre nécessite des tests tels que des tests de sécurité microbiologique, des certificats d'analyses, des tests de biocompatibilité, une validation de stérilisation, un certificat de non-contamination, des tests de cytotoxicité, une toxicité systémique, une recherche de pyrogène, des tests d'Ames. II s'avère par ailleurs que la physiologie du biomatériau dans son biotope a une édification strictement identique à celle du squelette de l'embryon humain. En effet, dans un milieu protégé, des cellules spécialisées du manteau du mollusque sécrètent un complexe de macromolécules qui s'organisent en fibres de collagène de type I et III, sur lesquelles viennent se fixer des cristaux d'aragonite réalisant un squelette interne composé de biocristaux comparables à ceux du tissu humain. Un procédé breveté permettant l'extraction des molécules actives a permis d'identifier, en plus des acides aminés majoritaires, des molécules 8 comparables dans leurs effets à des facteurs de croissance tels que la BMP (propriétés ostéoinductives), TGF 13 (stoppant le cycle cellulaire en phase G1 ainsi que la prolifération, la différenciation et induisant l'apoptose), NGF (facteur de croissance des nerfs), ainsi que des activateurs, des cytokines (messagers chimiques de la communication intercellulaire), des facteurs d'angiogénèse et des inhibiteurs, des bradykinines, des peptides aux propriétés antibiomimétiques et dont la formule chimique est proche de celle de la streptomycine. Le produit selon l'invention est constitué de nacre, sous forme de poudre dispersée dans un solvant. Selon le type de solvant, le produit peut se présenter sous la forme d'une solution de rinçage ou d'un gel actif. Quand le produit est se présente comme solution de rinçage, il permet de réaliser une douche vaginale et utérine. Le solvant est du sérum physiologique auquel on ajoute 2 grammes de nacre pulvérulente, de granulométrie inférieure à 50 microns. Comme solution de rinçage, le solvant peut être une solution à base d'eau de mer, comprenant : - 84% de chlorure de sodium, - 16% de corps décelables à l'état de traces, - 14% de soufre, magnésium, potassium, et de calcium, - 1,99% de brome, carbone, silicium, fer, azote, fluor, phosphore, lithium, iode, bore, - 0,01% d'arsenic, cuivre, argent, or, zinc, manganèse, strontium, baryum, césium, rubidium, aluminium, plomb, cobalt. Cette composition est celle vendue sous l'appellation � liquide de quinton �, connue pour sa richesse en vitamines et oligoéléments, facilitant les grossesses chez les femmes subissant des fausses couches à répétition, ou ayant des prématurés, des mort-nés ou encore donnant naissance à des enfants atteints de maladies héréditaires. Ceci s'explique par le fait que cette solution étant identique au milieu intérieur, les globules blancs leucocytaires continuent à présenter une activité normale in vitro. Elle stimule également la reconstitution d'une masse sanguine 9 saine, ce qui la rend particulièrement indiquée dans les cas d'immunodépression et d'anémie. Le produit peut également se présenter sous la forme d'un gel actif. Ce gel peut être du type � Nutragel (marque déposée) comprenant de l'eau purifiée, de la dermastérone, un biofacteur d'oligopeptide de protéines, un triglycéride caprylique/caprique. Dans ce cas, on y ajoute 4 grammes de nacre pulvérulente pour 20 cm3 de gel. Le gel actif peut être constitué d'eau apyrogène stérile, à laquelle on ajoute 4 grammes de nacre pulvérulente et 1 grammes de gomme xanthane, jouant un rôle viscosant et stabilisant pour 20 cm3 de liquide. Le gel peut également avoir une composition à base d'eau de mer, similaire à celle décrite pour la solution de rinçage, cette solution se présentant alors sous forme gélifiée. Selon que le produit se présente sous la forme d'une solution de rinçage ou d'un gel actif, son utilisation est différente. Pour la solution de rinçage, le matériel utilisé se compose d'une poche spéciale étanche, d'une contenance approximative d'un litre, du type poche à perfusion. Cette poche est raccordée à un cathéter d'une longueur d'environ 1,5 mètre. L'extrémité de la tubulure est connectée à un système double de tuyaux de longueur différente et juxtaposés. Ce montage permet le remplissage et l'irrigation en flux continu de la cavité vaginale et utérine, ainsi que l'évacuation du liquide. Afin de faciliter la mise en place de la douche, la poche contenant la solution de rinçage est surélevée, pour que le liquide puisse couler à travers la tubulure jusqu'à l'utérus par le simple effet de la pression atmosphérique. Le rinçage doit préférentiellement être réalisé au moins 48 heures avant la saillie ou l'insémination. La mise en place du gel est réalisée au moyen d'une seringue et d'une tubulure d'une longueur maximale d'un mètre. L'extrémité de la tubulure est constituée d'un corps oblong dont le bout est perforé d'une multitude de trous à la manière d'un pommeau de douche. Cette forme particulière permet une répartition homogène du gel sur toute la muqueuse utérine. Afin de faciliter l'application in utero, le corps de la seringue est placé dans un pistolet permettant 2946883 i0 la démultiplication de la force pour que le gel puisse glisser aisément à travers la tubulure. Le gel doit être injecté 2 heures avant la saillie ou l'insémination. La solution de rinçage agit comme une douche vaginale et utérine. Elle 5 est surtout préconisée chez les mammifères non humains. La solution de rinçage permet de nettoyer les muqueuses des impuretés et traumatismes liés à la mise bas, dans la mesure où il est fréquent de procéder à une saillie ou une insémination quelques jours après la mise bas, notamment chez les juments. Ainsi, le produit selon l'invention permet de traiter et réparer les lésions, avant de 10 procéder à une nouvelle fécondation, et donc une nouvelle nidation. Le gel actif a des propriétés angiogéniques, favorisant la néo formation de vaisseaux sanguins à la surface de la muqueuse utérine. Ces nouveaux vaisseaux peuvent augmenter les chances de survie de l'embryon au moment où 15 il entre en contact avec la muqueuse. De plus, la présence de vaisseaux en plus grand nombre favorise la possibilité de microhémorragie, issue de la modification de l'épithélium de surface apportant ainsi de nombreux nutriments à l'ceuf, permettant ainsi la préparation du futur placenta. De plus, les propriétés bioadhésives de la nacre, associées aux qualités 20 collantes du gel, favorisent la biodisponibilité de la nacre par l'épithélium. Les cellules de la muqueuse utérine peuvent ainsi hydrolyser facilement les grains ou nanoparticules de nacre pour en extraire les principes actifs. Les acides aminés et oligoéléments sont alors disponibles immédiatement pour les cellules de la muqueuse utérine. Ces cellules nourries par les éventuels substrats manquants, 25 retrouvent alors leurs capacités physiologiques et deviennent capables de retrouver et d'assumer leur transformation pour réussir la nidation. De plus, il est connu que la nacre a un pouvoir de mimétisme cellulaire, c'est-à-dire qu'elle est capable de provoquer la formation du milieu dans lequel elle se trouve, de la même manière que des cellules souches. 30 Par exemple, au contact des fibroblastes, la nacre augmente la synthèse de nouveaux fibroblastes. De la même manière, elle devient ostéoinductrice en présence d'os. En contact avec la peau, elle permet une régénération de toutes les couches, c'est-à-dire l'épiderme, le derme et l'hypoderme. Cette faculté de mimétisme est exercée de façon beaucoup plus rapide que la régénération cellulaire physiologique. Sachant que le gel est mis en place sur la muqueuse utérine au moment de la fécondation, la muqueuse peut alors se régénérer et devenir propice à la nidation. Le produit selon l'invention, qu'il se présente sous forme de solution de rinçage ou de gel actif, est particulièrement adapté pour les grossesses interrompues par absence de nidation, c'est-à-dire quand l'embryon n'arrive pas à s'implanter dans l'utérus. Il permet ainsi de rendre la saillie ou l'insémination du mammifère efficace à plus de 90%. S'il est utilisé dans les élevages, le produit permet ainsi de diminuer significativement les coûts de reproduction, dans la mesure où les paillettes de spermatozoïdes représentent une somme importante. Pour son utilisation en médecine humaine, le produit selon l'invention permet de réduire les stimulations ovariennes et les implantations répétitives, dans le cas de fécondation in vitro, en augmentant le taux de grossesse réelle. 25 30 REVENDICATIONS1. Produit destiné à améliorer la fertilité des mammifères constitué de biopolymères d'origine marine sous forme de poudre d'une granulométrie égale ou inférieure à 50 microns, dissoute dans un solvant neutre. 2. Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que les biopolymères proviennent de coquille de mollusque marin, formant la nacre. 3. Produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant est du sérum physiologique. 4. Produit selon l'une des revendications 1, et 2, caractérisé en ce que le solvant est une solution à base d'eau de mer, comprenant - 84% de chlorure de sodium, - 16% de corps décelables à l'état de traces, - 14% de soufre, magnésium, potassium, et de calcium, - 1,99% de brome, carbone, silicium, fer, azote, fluor, phosphore, lithium, iode, bore, - 0,01% d'arsenic, cuivre, argent, or, zinc, manganèse, strontium, baryum, césium, rubidium, aluminium, plomb, cobalt. 9. Produit selon l'une des revendications 1, et 2, caractérisé en ce que le solvant est un gel actif. 10. Produit selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le gel actif comprend de l'eau purifiée, de la dermastérone, un biofacteur d'oligopeptide de protéines, un triglycéride caprylique/caprique. 11. Produit selon la revendication 5, caractérisé en ce que le gel actif est constitué d'eau apyrogène stérile et de gomme de xanthane. 12. Produit selon la revendication 5, caractérisé en ce que le gel actif est constitué d'une solution gélifiée à base d'eau de mer comprenant : - 84% de chlorure de sodium, - 16% de corps décelables à l'état de traces, - 14% de soufre, magnésium, potassium, et de calcium, - 1,99% de brome, carbone, silicium, fer, azote, fluor, phosphore, lithium, iode, bore, - 0,01% d'arsenic, cuivre, argent, or, zinc, manganèse, strontium, baryum, césium, rubidium, aluminium, plomb, cobalt.9. Procédé d'obtention de la nacre utilisée dans le produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : - concassage des coquilles de mollusque, avec une solution à base de calbénium, permettant d'obtenir des morceaux grossiers ; - broyage desdits morceaux en présence de billes, d'un diamètre donné jusqu'à obtention d'une poudre de taille donnée ; - tamisage de la poudre obtenue selon l'étape précédente.