FR 2949469 A1 20110304 FR 0904043 A 20090825 DÉRIVÉS ANTICANCEREUX, LEUR PRÉPARATION ET LEUR APPLICATION EN THÉRAPEUTIQUE La présente invention se rapporte à des conjugués de dimères de pyrrolo[1,4]benzodiazépine (PBD), les compositions les contenant et leur application thérapeutique, notamment comme anticancéreux. L'invention se rapporte aussi au procédé de préparation des conjugués à leur application en tant qu'anticancéreux ainsi qu'aux dimères eux-mêmes. [Domaine technique] Les dimères de pyrrolo[1,4]benzodiazépines sont des anticancéreux qui agissent en se liant de façon covalente à l'ADN des cellules. Ces dérivés ont été décrits dans les demandes WO 00/12508 et WO 2005/085260 ainsi que dans les publications suivantes : Eur.J.Med.Chem. 2005, 40, 641ù654 ; Tetrahedron Letters 1988, 29(40), 5105-5108. La chimie des conjugués est connue depuis de nombreuses années et a été appliquée à plusieurs familles de cytotoxiques comme par exemple les maytansinoïdes (WO 04103272), les taxanes (WO 06061258), les leptomycines (WO 07144709), le CC-1065 et ses analogues (WO 2007102069); voir aussi à propos des conjugués, Monneret C., et al., Bulletin du Cancer2000, 87(11), 829-38 ; Ricart A.D., et al., Nature Clinicat Practice Oncology 2007, 4, 245-255 ; Singh R. et Rickson H.K., Therapeutic Antibodies : Methods and Protocols, 2009, 525, 445-467. [Art antérieur] Des conjugués de dimères de pyrrolo[1,4]benzodiazépine ont déjà été décrits dans les demandes WO 07085930 ou WO 2009/016516. Les dimères utilisés ont pour formules : X-An-T-A'n'- pL~~H X-An-T-A n -X r,N/H dans lesquelles T peut représenter un groupe aryle ou hétéroaryle substitué par ùG-D-(Z)P SZa ou ùG-D-(Z)p-C(=O)ZbRb. G représente une liaison simple ou double ou bien -0-, -S- ou ùNR-. D représente une liaison simple ou bien l'un des groupes suivants : ùE-, -E-NR-, -ENR-F-, -E-O-, -E-O-F-, -E-NR-CO-, -E-NR-CO-F-, -E-CO-, -CO-E-, -E-CO-F, -E-S-, -E-S-F-, - E-NR-C-S-, -E-NR-CS-F- pour lesquels E et F sont choisis parmi - (OCH2CH21alkyl(OCH2CH2)i-, -alkyl(OCH2CH2)i-alkyl-, -(OCH2CH2)i-, - (OCH2CH2);cycloalkyl(OCH2CH2)i-, -(OCH2CH2);hétérocyclyl(OCH2CH2)i-, - (OCH2CH2);aryl(OCH2CH2)i-, -(OCH2CH2);hétéroaryl(OCH2CH2)i-, ûalkyl- (OCH2CH2);alkyl(OCH2CH2)r , -alkyl-(OCH2CH2);-, -alkyl-(OCH2CH2);cycloalkyl(OCH2CH2)r, - alkyl(OCH2CH2);hétérocyclyl(OCH2CH2)i-, -alkyl-(OCH2CH2);aryl(OCH2CH2)i-, - alkyl(OCH2CH2);hétéroaryl(OCH2CH2)i-, -cycloalkyl-alkyl-, -alkyl-cycloalkyl-, -hétérocyclyl- alkyl-, -alkyl-hétérocyclyl-, -alkyl-aryl-, -aryl-alkyl-, -alkyl-hétéroaryl- , -hétéroaryl-alkyl-. I et j représentent des nombres entiers allant de 0 à 2000. Z représente un groupe alkyle et p est un nombre entier valant 0 ou 1. Les dimères suivants sont notamment décrits dans WO 2009/016516 : 0 0 - (ex.5) (ex.7) Ces deux demandes ne décrivent ni ne suggèrent les linkers L de l'invention comprenant une chaîne pegylée. [Problème technique] Le problème technique qu'entend résoudre la présente invention est de proposer de nouveaux conjugués de dimères de pyrrolo[1,4]benzodiazépine. [Définitions] On entend par : • conjugué : un agent de ciblage cellulaire auquel est attaché de façon covalente au moins une molécule d'un composé cytotoxique ; • agent de ciblage cellulaire (ou � cell binding agent � en anglais) : une molécule ayant une affinité pour une cible biologique : il peut s'agir par exemple d'un ligand, d'une protéine, d'un anticorps, plus particulièrement monoclonal, d'un fragment de protéine ou d'anticorps, d'un peptide, d'un oligonucléotide, d'un oligosaccharide. L'agent de ciblage a pour fonction de diriger le composé biologiquement actif comme un cytotoxique vers la cible biologique ; • cible biologique : un antigène (ou groupe d'antigènes) localisé préférentiellement à la surface des cellules cancéreuses ou cellules stromales associées à cette tumeur ; ces antigènes pouvant être par exemple, un récepteur de facteur de croissance, un produit d'oncogène ou de gène � suppresseur de tumeur � muté, une molécule liée à l'angiogénèse, une molécule d'adhésion ; • groupe alkyle : un groupe hydrocarboné aliphatique saturé obtenu en enlevant un atome d'hydrogène d'un alcane. Le groupe alkyle peut être linéaire ou ramifié. A titre d'exemples, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, iso-butyle, tertio-butyle, pentyle, 2,2-diméthylpropyle, hexyle ; • groupe cycloalkyle : un groupe alkyle cyclique comprenant entre 3 et 8 atomes de carbone engagés dans la structure cyclique. A titre d'exemples, on peut citer les groupes cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle ; • groupe aryle : un groupe aromatique ne contenant pas d'hétéroatome, mono- ou bicyclique. Il s'agit plus particulièrement des groupes phényle et naphtyle ; • groupe hétéroaryle : un groupe aromatique comprenant au moins un hétéroatome (O, S, N) engagé dans le cycle et relié aux atomes de carbone formant le cycle, mono- ou bicylique. Il s'agit plus particulièrement des groupes pyridinyle, pyrrolyle, thienyle, furanyle, pyrimidinyle, furanyle, pyrolyle, triazolyle ; • groupe hétérocycloalkyle : un groupe cycloalkyle comprenant au moins un hétéroatome (0, S, N) engagé dans le cycle et relié aux atomes de carbone formant le cycle ; • groupe alcoxy : un groupe -0-alkyle, où le groupe alkyle est tel que défini ci-dessus ; • groupe alcanoyloxy : un groupe -0-CO-alkyle, où le groupe alkyle est tel que défini ci-dessus ; • groupe alkylène : un groupe divalent saturé de formule brute ûCn,H2m, obtenu en enlevant deux atomes d'hydrogène d'un alcane. L'alcane peut être linéaire ou ramifié. A titre d'exemples, on peut citer les groupes méthylène (-CH2-), éthylène (-CH2CH2-), e Me propylène (-CH2CH2CH2-), butylène (-CH2CH2CH2CH2-), isobutylène ( ), hexylène (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-). Un groupe alkylène linéaire peut être plus particulièrement de formule û(CH2)m , m représentant un nombre entier ; • dans les plages de valeurs, les bornes sont incluses (par ex. une plage du type � i allant de 1 à 6 � inclut les bornes 1 et 6. Abréviations utilisées AcOEt : acétate d'éthyle ; ALK : groupe (C1-C12)alkylène, plus particulièrement (C1- C6)alkylène ; CCM : chromatographie sur couche mince (TLC en Anglais) ; Rf : facteur de rétention ; DBU : 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène ; DCC : N,N'-dicyclohexylcarbodiimide ; DCM : dichlorométhane ; DEAD : diéthylazodicarboxylate ; DIC : N,N'-diisopropylcarbodiimide ; DIPEA : N,N-diisopropyléthylamine ; DMA : diméthylacétamide ; DMAP : 4-diméthylaminopyridine ; DME : diméthoxyéthane ; DMF : diméthylformamide ; DMSO : diméthylsulfoxyde ; : coefficient d'extinction molaire ; EEDQ : 2-éthoxy-1- éthoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline ; EDCI : N-(3-diméthylaminopropyl)-N'- éthylcarbodiimide ; EDTA : acide éthylène-diamine-tétraacétique ; Fmoc : fluorénylméthoxycarbonyl ; Hal : atome d'halogène ; HOBt : 1-hydroxybenzotriazole ; HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique ; NHS : N- hydroxysuccinimide ; NMP : N-méthylpyrrolidinone ; PR : pression réduite ; SEC : chromatographie d'exclusion stérique ; TA : température ambiante ; TBDMS : tertbutyldiméthylsilyl ; TEA : triéthylamine ; TFA : acide trifluoroacétique ; TIPS : triisopropylsilyl ; THF : tétrahydrofurane ; tR : temps de rétention. [Figures] Fig.1 : spectre de masse haute résolution déconvolué du conjugué de l'ex.l après déglycosylation ; Fig.2: spectre de masse haute résolution déconvolué du conjugué de l'ex.2 après déglycosylation ; Fig.3: spectre de masse haute résolution déconvolué du conjugué de l'ex.3 après déglycosylation. Ces figures montrent pour chaque conjugué la distribution des espèces portant de 0 à 8 dimères de tomaymycine (Do : aucun dimère ; Dx : x dimères). [Description de l'invention] L'invention est relative à des composés de formule : COZbRb L dans laquelle : 25 représente une liaison simple ou une liaison double avec la condition que si représente une liaison simple alors : • ---- représente une liaison simple ; • U et/ou U' identique ou différent, représente(nt) indépendamment l'un de l'autre H ; (I) • W et/ou W' identique ou différent, représente(nt) indépendamment l'un de l'autre : OH, -OR, ùOCOR, -000R, -OCOOR, ùOCONRR', un carbamate cyclique tel que N10 et C11 soient inclus dans un cycle, ùNRCONRR', - OCSNHR, un thiocarbamate cyclique tel que N10 et C11 soient inclus dans un cycle, - SH, -SR, -SOR, -SOOR, ùSO3 , -NRSOOR', ùNRR', une amine cyclique telle que N10 et Cl1 soient inclus dans un cycle, -NROR', ùNRCOR', ùN3, -CN, Hal, un groupe trialkylphosphonium ou triarylphosphonium ; • RI, R2, RI', R2' identiques ou différents, représentent, indépendamment l'un de l'autre : H, Hal ou un groupe (CI-C6)alkyle éventuellement substitué par un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi : Hal, CN, NRR', CF3, OR, un groupe aryle ou hétéroaryle, S(0)qR avec q =0,1 ou 2 ; ou bien • RI et R2 et/ou Ri' et R2' forment ensemble respectivement une double liaison =CH2 ou =CH-CH3 ; • Y et Y', identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre H ou OR • M représente CH ou N ; • ALK et ALK' identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe (CI-C6)alkylène ; • R et R' représentent indépendamment l'un de l'autre, H ou un groupe (C,-C6)alkyle ou aryle éventuellement substitué par un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi : Hal, CN, NRR', CF3, OR, un groupe aryle ou hétéroaryle ; • L représente: • le groupe -L1-L2- dans lequel LI est rattaché au cycle aromatique comprenant M par le groupe ALK ou OALK et représente l'un des groupes suivants : -ALK-S- o N-CH2 -O-ALK-NR3-ALK-S" ô -O-ALK-NR3-ALK-S- / \ -O-ALK-N N \/ ALK-S-30 / \ -O-ALK- \ /NùALK-S- et L2 représente le groupe -CHIC(=O)-NR3-(CH2CH2O)-ALK- rattaché à LI par û CH2C(=O)- ou bien • le groupe ûO-ALK-NR3-ALK-S-(CH2CH2O);- rattaché au cycle aromatique comprenant M par le groupe OALK • R3 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; • i représente un nombre entier allant de 1 à 40, plutôt de 1 à 20, de préférence de 1 à 10 • Zb représente une liaison simple, -O- ou -NH- et Rb représentant H ou un groupe (Ci-C6)alkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ou bien Zb représente une liaison simple et Rb représente Hal. Les composés de formule (I), y compris ceux exemplifiés, peuvent exister à l'état de bases ou de sels d'addition à des acides pharmaceutiquement acceptables. Plus particulièrement, parmi les composés de formule (I), on distingue ceux de formule (IA) ou (IB) : L-C(=0)-ZbRb L-C(=O)-ZbRb Y et Y' représentent plus particulièrement un groupe (C1-C4)alcoxy, notamment le groupe méthoxy. 25 L peut être plus particulièrement choisi parmi l'un des suivants : -ALK-S-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O)jùCH2CH2- 6 ù/ 5 10 1NùCHZ CH2C(=O)NH-(CH2CH2O) CH2CH2 -O-ALK-NR3 ALK-S" \~ O -O-ALK-NR3-ALK-S-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O)-CH2CH2 0 -O-ALK-N J N/ ALK-S-CN2C(=0)-NH-(CHZCH2O) CH2CH2 \ -O -0-ALK-N\ -ALK-S-CH2C(=0)-NH-(CH,CH2O) CH2CH2 -O-ALK- \ /NùALK-S-CHIC(=O)-NH-(CH2CH2O)~ CH2CH2 ûO-ALK-NR3-ALK-S-(CH2CH2O)~ Parmi ceux-ci, ALK représente plus particulièrement un groupe (CI-C4)alkylène. Le Tableau I décrit des exemples de composés selon la formula (IA). Tableau I Composé de formule (IA) ex. o ex1 ~~~((( H O fZbRb 1 N----y"----o---° --/~o--~ ~I N O 0 o H N O I N O -- / N � o o N NN~/~O~i O~ /~ O^i 0~/~(ZbRb ex.2 0 H N O I N O N~ H / N � O O � N -- 0 � O N~ H ex.3 N � 1 i � N O 0 ^ }Ipf~ ex.4 / ~H^/p\~\O^/O~\O_ ZbRb IN~S JQj 'N � p � p � N~ H N O I I O N \ Ille' ^ }Iqf~, ex.5 fN J ZbRb H,, 'N � O � O �N_ H N O Î I O N \ NV SO~\O~/O` ZbRb ex.6 IOI 0 'N � O O � O � H N N \ O I I I I O \ 0 ex.7 � S~/p\~~p~/p~~~p~ ZbRb ,N p p N~ H N � i � N \ O I O Les composés décrits comprennent le groupe chimique ûC(=O)ZbRb (GCR1) qui est réactif vis-à-vis d'un groupe chimique réactif (GCR2) présent sur l'agent de ciblage. La réaction entre GCR1 et GCR2 assure l'attachement du composé sur l'agent de ciblage par formation d'une liaison covalente. Ainsi, le composé est apte à être conjugué à un agent de ciblage. Plus particulièrement, Zb représente O ; dans ce cas, GCR1 représente une fonction acide (Rb=H) ou ester. Plus particulièrement, -C(=O)ZbRb représente -000H, -COO(C,-C6)alkyle, notamment -COOCH3, ou -COOCH2CH=CH2. Parmi les fonctions esters, on préfère les esters dits � activés � qui présentent une bonne réactivité notamment vis-à-vis des groupes amino présents sur les anticorps. Des exemples d'esters activés sont les 9 SO'M ùCOùo ùCOOùN I ùCO.OùN M=H ou cation ùoo 0 suivants : 0 ° , ou le groupe dans lequel GI représente au moins un groupe inductif tel que ùNO2 ou ùHal, notamment ùF. Il ù peut s'agir par exemple des groupes suivants : COO No, ou de type de groupe ùC(=O)ZbRb est le suivant : A titre d'exemple de GCR2, on peut citer les groupes s-amino des lysines portés par les chaînes latérales des résidus lysine qui sont présents à la surface d'un anticorps, les groupes saccharides de la région charnière ou les thiols de cystéines par réduction de liaisons disulfures intra-chaîne (Garnett M.C., et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001, 53, 171-216). Plus récemment d'autres approches ont été considérées comme l'introduction de cystéines par mutation (Junutula J.R., et al., Nature Biotechnology 2008, 26, 925-932; WO 09026274) ou l'introduction d'acides aminés non-naturels permettant d'autres types de chimie (de Graaf A.J., et al., Bioconjugate Chem. 2009, February 3, 2009 (Review); DOI: 10.1021/bc800294a ; WO 20061069246 et selon Chin J.W., et al., JACS 2002, 124, 9026- 9027 (technologie ReCode�)). Ces modes d'attachement utilisés avec les anticorps sont applicables à l'ensemble des agents de ciblage connus en fonction de leur structure. Les composés selon l'invention peuvent donc être utilisés pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché de façon covalente en position para de M le dimère de formule : Plus particulièrement, l'agent de ciblage est un anticorps. Plus particulièrement, le dimère a pour formule : GI . Un autre ùco.o Ri' RZ20 ù/ Procédé de préparation des composés de formule (I) Les composés de formule (I) peuvent être préparés selon le Schéma 1 : w u u', w' }3 w R,' oH Ho LG,, /-^ //\ LG ALK ALK' P2 Schéma 1 On fait réagir ensemble les composés PI, P'l et P2 pour conduire à P3. LG et LG' désignent un groupe partant tel que par exemple un atome d'halogène, un groupe ùOMs (mésylate), - OTs (tosylate) ou -OPPh3+. L3 peut représenter le groupe ùL-C(=O)ZbRb, dans ce cas, P3 représente donc un composé de formule (I). Dans le cas où P3 ne représente pas le groupe ù L-C(=O)ZbRb, il est nécessaire de transformer L3 en groupe ùL-C(=O)ZbRb à l'aide d'une ou o Jo O-N de plusieurs réactions. En particulier, dans le cas où ùC(=O)ZbRb= ° , on peut introduire le groupe L3 terminé par le groupe ùC(=0)ZbRb= -C(=0)O-(C1-C4)alkyle ou ù C(=O)O-allyle, lequel est transformé ensuite en groupe ùC(=O)OH lequel réagit finalement avec le carbonate de N-N'-disuccinimidyle ou le NHS. La transformation -000alkyle/allyle en ùCOOH peut être réalisée par un traitement à la lithine. II est particulièrement avantageux d'utiliser en particulier un ester méthylique. La réaction avec le carbonate de N,N'- disuccinimidyle est conduite en présence d'une base, par exemple la DIPEA ; celle avec le NHS en présence d'un agent de couplage, par exemple le DCC. De même, dans le cas où ù 0 C(=O)ZbRb= on peut introduire un groupe ùC(=O)ZbRb= -COOH qui réagit ensuite avec le N,N'-carbonyldiimidazole (JACS 1958, 80, 4423 ; JACS 1960, 82, 4596). P3 Les composés Pl et P'1 sont décrits dans les demandes de brevets WO 00/12508, WO 00/12507, WO 2005/040170, WO 20051085260, WO 07085930 ou WO 2009/016516 ou accessibles par synthèse totale (Mori M. et al., Tetrahedron, 1986, 42, 3793-3806). Dans le cas où PI et/ou P'1 représente la tomaymycine de formule : HO 8 A w11 li , cette dernière peut être préparée à l'aide de la souche Tomaymycin MeO Streptomyces croceus en suivant l'enseignement de FR 1516743 ou bien par synthèse totale (voir J. Antibiotics 1983, XXXVI(3), 276-282 Z.Tozuka "Studies on tomaymycin. Total syntheses of the antitumor antibiotics E- and Z- tomaymycins"). II existe également des 10 composes P1/P', commerciaux. Pour les autres Schémas ci-dessous, on utilise pour simplifier les abréviations suivantes : u• vr Tom'1 = Tom1 = Li= -ALK-S- et L2=-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O)i-ALK- LG,,, LG' ALK M ALK'N R3 (CHZCH2O);-ALK-C(=O)ZbRb +P,+P'1 P2 Schéma 2 Préparation de P2 HAL HOC /\ OH P2 est obtenu à partir du diol halogéné correspondant de formule ALK A K selon l'enseignement de l'ex.3 (Schéma 2') : HAL Li ALK-OH 1. protection iv. transformation OH en SH ii. n-BuLi cétone v. déprotection HOC I TBSO OTBS TBSO~ALK MALKOTBS HO~ALK M/\ALK' OH ALK M ALK. ALK M ALK. /NR3 Hal/ v \(CH2CH2O) ALK-C(=0)ZbR, 0 P4 ALK-SH LG~ ^ %\ G. ALK M ALK' PZ NR3 ALK-S \(CHZCH20); ALK-C(=0)ZbRb 0 vi. introduction de LG et LG' ~ N R3 ALK-S \(CH2CH2O) ALK-C(=0)Z,Rb 0 H0~ 0H E ALK M ALK' Schéma 2' i. protection des deux fonctions alcool à l'aide d'un groupement protecteur tel que par ex. le tert-butyl-diméthyl-silyloxy (TBS) ; ii. préparation de l'organolithien ou organomagnésien correspondant à l'aide respectivement de n-BuLi ou de magnésium ; iii. addition nucléophile d'une cétone pour former une fonction alcool ; iv. préparation du thiol via la formation du thioacétate correspondant (voir ex.3.7 et 3.8) ; v. déprotection ; vi. introduction de LG et LG'. Dans le cas d'un groupe mésylate, on utilise le chlorure de méthanesulfonyle en présence d'une base telle qu'une amine tertiaire (par ex. TEA) ; voir ex.1.4. Un exemple de diol halogéné et du diol protégé correspondant est celui décrit sur le schéma 1 en page 48 de WO 20091016516 (composés 2 et 3 du schéma 1). Deux exemples de diols protégés sont ceux de N° CAS 181225-40-1 et 181225-41-2. Le diol halogéné peut être obtenu par réduction du composé diacide ou diester correspondant, par exemple celui de N° CAS 193010-40-1. Voir également dans le cas d'une pyridine (M=N) : Liebigs Annalen der Chemie 1991, 10, 987-988 ou Tetrahedron 2005, 61(7), 1755-1763 (composé 3 du schéma 1). Préparation de P4 25 cas où ALK=CH2CH2 cas où R3=H Hal 0 HO 0,ä0~/, NH2 f) Hal= Brou 1 Etape (i) : formation de l'amide et activation de l'acide ; les deux étapes sont réalisées successivement dans un solvant polaire aprotique comme le DCM : réaction entre la fonction amine et l'halogénoacétate de N-hydroxysuccinimidyle puis addition in situ d'un agent de couplage comme le DIC. cas où ReH 0 ~( ] (i i ) HO LO iO'-/'-NHZ O O (iii) H O\~N~ H F F Hal= Brou 1 Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique et de l'amine sous forme de trifluoroacétamide ; la réaction est réalisée en deux étapes successives dans un solvant polaire aprotique comme le DCM : protection de l'acide par traitement avec le triméthylsilyldiazométhane en présence de méthanol puis protection de l'amine par addition d'anhydride trifluoroacétique et d'une base comme la TEA ; Etape (iii) : alkylation de l'amine et saponification de l'ester ; la réaction est réalisée en deux étapes successives dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF : alkylation de l'amine par traitement avec une base comme NaH en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle R3Hal puis addition de lithine et d'eau ; Etape (i) : suite à l'étape (iii), on reprend les réactions de l'étape (i) pour le cas R3=H. Hal= Brou I cas où ALK≠CHH2 20 cas où R3=H 4O ALK + H00 T Hal ALK cas où ReH 0 ALK~~OO (v) ~O~ALK~~OO R'~NHZ 1 (vi) 0 O)t.ALK--\ + HOO T`es N Hal= Brou 1 Hal O (iii) HO ALK""-\0-0 ]NHR3 ALK~~O~iO~ /~N.000F~ H (i) Hal 25 Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné avec l'alcoolate d'un benzophénone-imine-PEG-alcool généré par l'action de NaH ou du naphtalénure de potassium comme décrit dans WO 20071127440 ; Etape (v) : clivage sélectif de l'imine par hydrogénation en présence de palladium sur charbon selon Wessjohann, L. et al., Synthesis 1989, 5, 359-63 ; Etape (vi) : protection de l'amine par addition d'anhydride trifluoroacétique et d'une base comme la TEA. Les amino-PEG-alcools sont commercialement disponibles pour par exemple i=3,4,7,8 ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. La protection de la fonction amine par la benzophénone peut être réalisée par deshydratation azéotropique en présence d'un acide de Lewis comme l'éthérate de BF3. /~NùCHZ -O-ALK-NR3ALK-S" \~ L1= o et L2= -CH2C(=O)-NR3-(CH2CH2O)i-ALK- O-ALK-NR3-ALK-SSMe 0-ALK-NR3 ALK-SSMe O-ALK-NR3-ALK-SH ALK M ALK' Tortil\ Tom'1 Tom1 \ALK MALK' LG ALK M ALK' Tom'1 Nù(CH2CH2O) ALK-C(=O)ZbRb P5 (I) P2 Schéma 3 Préparation de P2 O-ALK-NH2 i. Br-ALK-NHboc ii.déprotection iii. HxALK-SSMe+Ti3+ GPO /~ ~~ iOGP HOC ~i ~/~ ,OH ALK M ALK' ALK ALK' iv.cyanoborohydrure de sodium Schéma 3' i. réaction nucléophile entre l'une des fonctions ùOH (les deux autres étant protégées par GP qui désigne un groupe protecteur) et une bromo-amine protégée par boc de formule Br-ALKNHboc en présence d'une base telle que par ex. K2CO3 dans un solvant polaire tel que le DMF ou le THF (voir par ex. les conditions en page 63 de WO 07085930). OH O-ALK-NH-CH2ALK-SS M e v. introduction de LG/LG' P2 HOC ,- %N ~OH ALK M ALK' Selon une variante, on peut réaliser la substitution nucléophile de la bromo-amine par OH EtO OEt l'hydroxy- diester de formule : ° puis réduire par la suite la fonction ester en fonction -CH2OH, par exemple avec le borohydrure de sodium ; on peut appliquer pour cela les conditions de la substitution nucléophile et de la réduction données en pages 62-63 de WO 2007/085930 ; ii. déprotection de groupes protecteurs ; iii. amination réductrice avec l'aldéhyde de formule HC(=O)-ALK-SSMe en présence d'isopropoxyde de titane ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ; iv. il se forme un complexe intermédiaire qui est réduit in situ avec un agent réducteur comme par exemple le cyanoborohydrure de sodium ; v. introduction de LG et LG'. Dans le cas d'un groupe mésylate, on utilise le chlorure de méthanesulfonyle en présence d'une base telle qu'une amine tertiaire (par ex. TEA) ; voir ex.1.4. Une variante représentée sur le Schéma 3" consiste à introduire le groupe -ALK-SSMe sur le groupe NHboc en s'inspirant en particulier de la méthode décrite par Kitagawa T. et al. JACS, 2006, 128(45), 14448-14449 utilisée pour introduire des chaines acétylthioalkyles sur une amine secondaire : OH O-ALK-NHboc O-ALK-N boc-ALK-SCO M e GPO~ GPON OGP' ALK M ALK' ALK M ALK' 0-ALK-NH -CH2ALK-SS Me O-ALK-Nboc-ALK-SSMe ix. hydrolyse i. Br-ALK-NHboc Vi. Hal-ALK-SCOMe GPO~ 0G P' ALK M ALK' vii. OH- viii. McSSO2Me HOC x. introduction de LG/LG' GPON I OGP' ALK M ALK ~OH ALK M ALK' P2 Schéma 3" Selon cette variante, on réalise l'alkylation à l'aide d'un intermédiaire Hal-ALK-SCOMe (Hal=l par exemple) puis on libère le thiol par un traitement en milieu basique : vi. alkylation par un halogénure d'alkyle porteur d'un groupe thioacétyle en présence de carbonate de césium dans un solvant aprotique polaire comme la DMF ; vii. clivage sélectif du groupe acétyle en milieu basique faible ; viii. formation du groupe ûSSMe par réaction du thiol intermédiaire avec McSSO2Me ; ix. clivage des groupements protecteurs PG et PG' ; x. transformation des groupes hydroxyles en groupes nucléofuges LG/LG', de préférence des groupes mésylates. O-ALK-NH-ALK-SSMe HO ALK M ALK'O-ALK-NR~ ALK-SSMe HOC /- ALK M ALK' Schéma 3"' L'introduction d'un groupe R3=(C,-C4)alkyle sur un groupe NH est possible à différents stades de la synthèse (un exemple est donné sur le Schéma 3"'). Elle est réalisée par exemple en employant la réaction de Wallach qui utilise un aldéhyde (voir l'ex.1.5 où l'alkylation NH->NMe utilise le formaldéhyde). à propos de P5 Les sociétés Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL. 61105, USA, Jenkem Technology USA 15 Inc., 2033, W.McDermott Dr., Allen Tx 75013-4675, USA et Quanta BioDesign, Ltd.195, West Olentangy Street, Suite O, Powell, Ohio 43065-8720, USA commercialisent des composés o N_ ùNù(CH2CHZO) CHZCHZ C(=O)ùOùN O de formule générale ° désignés par NHSPEG-maleimide. Il peut s'agir plus particulièrement du composé de N° CAS 756525-99-2. 20 L'addition du thiol sur le motif maléimide est décrite en page 721 de � Bioconjugate Techniques �, Greg T. Hermanson, 2ème Ed, Elsevier Inc. (isbn-13: 978-0-12-370501-3; isbn-10:0-12-370501-0). Li= -O-ALK-NR3-ALK-S- et L2= -CH2C(=O)-NR3-(CH2CH2O)i-ALK- O-ALK-NR; ALK-SH Hal LG~ALK MALK' P2 NR3 \(CH2CH2O)i ALK-C(=O)ZbR. O-ALK-NR3-ALK-S 11 \(CH2CH2O) ALK-C(=0)ZbRb o PI + P', (I) Pa LG~ALK MALK' NR3 P2 25 Schéma 4 La préparation est semblable à celle décrite sur le Schéma 3 en remplaçant P5 par P4. II -O-ALK- \ ~N ALK-S- Li= et L2= -CH2C(=O)-NR3-(CH2CH2O)i-ALK- /ù\ ALK-N jN-CO-ALK-SSMe P~+P'I LG~ J /LG' ALK M ALK' ALK N-CO-ALK-SSMe Tom.) Tom' ALK M ALK' O 1-CO-ALK-SH Tom1 Tom' ALK M ALK' P2 (I) N R Hal (CH2CH2O),-ALK-C(=O)ZbRb O ALK-N Schéma 5 Préparation de P2 n OALK- ~/N-CO-ALK-SSMe On utilise le composé P2 de formule : selon le Schéma 5' ci-dessous : OHL G ALK M ALK' /ù\ ALK- NN boc qui est obtenu n I?oc N + (~) ALK~OPG N (ii) ALK-LG GPO-ALK ~M~ALK'--OPG' HO-ALK~M~ALK' --OH r\ ALK-i\ N-CO-ALK-SSMe LG, (iv) HO~ALK~ --OH ALK M ALK' M ALK' (iii) HOyALK-SSMe j O ALK-CN-CO-ALK-SSMe P2 Schéma 5' i. alkylation de l'hydroxyle du cycle aromatique par une pipérazine mono protégée en position 1 et porteuse en 4 d'une chaine alkyle fonctionnalisée en position terminale par un groupe LG nucléofuge. De préférence le groupe nucléofuge est un groupe mésylate et la réaction de Williamson s'opère en présence d'un hydrure dans un solvant polaire aprotique anhydre comme the THF ou la DMF ; ii. déprotection des groupes boc, PG et PG', de préférence en milieu acide, par ex. en présence d'acide chlorhydrique ou de TFA quand les groupes PG et PG' sont le TBDMS. Selon une variante des étapes i et ii, on peut réaliser la substitution nucléophile de la bromo- OH EtO OEt amine par l'hydroxy-diester de formule : puis réduire par la suite la fonction ester en fonction -CH2OH, par exemple avec le borohydrure de sodium ; on peut appliquer pour cela les conditions de la substitution nucléophile et de la réduction données en pages 62-63 de WO 2007/085930 ; iii. couplage réalisé après activation initiale de l'acide en ester de NHS ; iv. introduction des groupes partants LG et LG'. Dans le cas d'un groupe mésylate, on utilise le chlorure de méthanesulfonyle en présence d'une base telle qu'une amine tertiaire (par ex. TEA). /ù\ -0-ALK- N N / L1= ALK-S- et L2= -CH2C(=O)-NR3-(CH2CH2O)i-ALK- p, + P', ,,ALK-N 1NùALKùSSMe LGN _I .---'LG' ALK MALK' ,,ALK-N NùALKùSSMe O Tomi Tom' NALK M ALK' _ALK-N NùALKùSH Tom1 J j /Tom' NALK M ALK' P2 Hal NR3 (CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRb Schéma 6 15 Préparation de P2 n ALK-N\_ /NùALKùSSMe O LGN On utilise le composé P2 de formule : ALK M ALK' qui est obtenu par amination réductrice selon le Schéma 6' ci-dessous. (I) boc N ALKùN Nboc O/ALKùN _ (i) O NH + ALK'--OPG N ( L (ii) ALKùLG GPO-ALK M ALK'--OPG' HOC ALK M % --OH ALK' (v) r HyALKùSSMe O /--\ O,,ALK-N NùCH2ALKùSSMe LG. ALK M ALK' P2 Schéma 6' v. introduction du groupe -ALK-SSMe par amination réductrice effectuée en présence de 5 cyanoborohydrure et d'isopropoxyde de titane ; Une variante similaire à celle représentée sur le Schéma 3" et utilisant la méthode d'alkylation décrite par Kitagawa T. et al. JACS, 2006, 128(45), 14448-14449 est donnée sur le Schéma 6" : boc /--\ /--\ C:) ALKùN Nboc ALKùN NH + (i) ~~ \OPG (vi) ALK' i ALKùLG GPO~ALK~M~ALK-OPG' GPO I i ùOPG' -ALK~M~ALK' n ALK-N NùALKOCH2SSMe (iv) HO, --OH ALK 'M ALK' OH /--\ ~\ ALK- \_/NùALKùSSMe ALK-N NùALKùSSMe ~/ (vii) HaIùALKùSCOMe ALK-N NùALKùSCOMe 10 LG, --LG' ALK M ALK' P2 (ix) PG0 ~OPG' ALK M ALK' (viii) PG(\ J OPG' ALK M ALK' Schéma 6" i. alkylation par pipérazine mono protégée (cf. étape i. de Schéma 5') ; vi. déprotection sélective du groupe Boc en milieu acide 15 vii. alkylation par un halogénure d'alkyle porteur d'un groupe thioacétyle en présence de carbonate de césium dans un solvant aprotique polaire comme la DMF ; viii. clivage sélectif du groupe acétyle en milieu basique faible et formation du groupe ûSSMe par réaction du thiol intermédiaire avec McSSO2Me en présence d'une base telle que la TEA ; 20 ix. clivage des groupements protecteurs PG et PG' et transformation des groupes hydroxyles de préférence en mésylates avec le chlorure de méthanesulfonyle. L'homme du métier pourra s'inspirer des conditions opératoires des exemples décrits ci-après qui sont donnés pour des groupes ALK particuliers et les adapter à d'autres groupes ALK. Procédé de préparation du coniuqué Le conjugué est obtenu par le procédé consistant à : (i) mettre en contact et laisser réagir une solution aqueuse de l'agent de ciblage éventuellement tamponnée et une solution d'un composé de formule (I) ; (ii) puis à éventuellement séparer le conjugué qui s'est formé en (i) de l'agent de ciblage n'ayant pas réagi et des agrégats éventuellement présents dans la solution. Un exemple de procédé applicable dans le cas d'un anticorps et d'un composé de formule (I) est celui donné à l'exemple 1. La solution aqueuse de l'agent de ciblage peut être tamponnée à l'aide par exemple de tampons tels que par exemple le phosphate de potassium ou l'acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique (tampon HEPES). Le tampon dépend de la nature de l'agent de ciblage. Le composé de formule (I) est mis en solution dans un solvant organique polaire, par exemple le DMSO ou la DMA. La réaction a lieu à une température comprise généralement entre 20 et 40°C. La durée de la réaction peut varier entre 1 à 24 h. La réaction entre l'agent de ciblage et composé de formule (I) peut être suivie par SEC avec un détecteur réfractométrique et/ou ultraviolet afin d'en déterminer l'état d'avancement. Si le taux de greffage est insuffisant, on peut laisser réagir plus longtemps. On pourra se reporter à la méthode générale donnée dans la partie exemples pour plus de détails sur des conditions particulières utilisables pour la conjugaison. L'homme du métier dispose de différentes techniques chromatographiques pour la séparation de l'étape (ii) : le conjugué peut être purifié par exemple par chromatographie d'exclusion stérique (SEC), par chromatographie d'adsorption (comme l'échangeuse d'ions, IEC), par chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC), par chromatographie d'affinité, par chromatographie sur des supports mixtes comme l'hydroxyapatite céramique ou par HPLC. La purification par dialyse ou diafiltration peut également être utilisée.35 On entend par � agrégats � les associations qui peuvent se former entre deux agents de ciblage ou plus, les agents de ciblage ayant été modifiés ou non par conjugaison. Les agrégats sont susceptibles de se former sous l'influence d'un grand nombre de paramètres tels qu'une concentration élevée en agent de ciblage dans la solution, le pH de la solution, des forces de cisaillement élevées, le nombre de dimères greffés et leur caractère hydrophobe, la température (voir les références citées dans l'introduction de J. Membrane Sci. 2008, 318, 311-316), l'influence de certains d'entre eux n'étant parfois pas éclaircie avec précision. Dans le cas des protéines ou des anticorps, on pourra se reporter à AAPS Journal, � Protein Aggregation and Bioprocessing � 2006, 8(3), E572-E579. La teneur en agrégats peut être déterminée à l'aide de techniques connues telles que la SEC (voir à ce propos, Analytical Biochemistiy 1993, 212(2), 469-480). Après l'étape (i) ou (ii), la solution du conjugué peut subir une étape (iii) d'ultrafiltration et/ou de diafiltration. On obtient donc à l'issue de ces étapes le conjugué en solution aqueuse. 15 anticorps L'anticorps (voir à ce propos, Janeway et al. � Immunobiology �, 5ème édition, 2001, Garland Publishing, New York) pourra être choisi parmi ceux décrits notamment dans les demandes WO 04043344, WO 08010101, WO 08047242, WO 05009369 (anti-CA6). L'anticorps peut 20 être notamment monoclonal, polyclonal ou multispécifique. II peut s'agir aussi d'un fragment d'anticorps. Il peut s'agir aussi d'un anticorps murin, humain, humanisé ou chimérique. conjuqué Un conjugué comprend généralement de l'ordre de l'ordre de 1 à 10 dimère(s) de 25 pyrrolo[1,4]benzodiazépine attaché(s) à l'agent de ciblage (il s'agit du taux de greffage ou � drug loading � en Anglais). Ce nombre varie en fonction de la nature de l'agent de ciblage et du dimère ainsi que des conditions opératoires utilisées pour la conjugaison (par exemple le nombre d'équivalents de dimère par rapport à l'agent de ciblage, le temps de réaction, la nature du solvant et de l'éventuel cosolvant). La mise en contact de l'agent de ciblage et du 30 dimère conduit à un mélange comprenant : plusieurs conjugués se distinguant individuellement les uns des autres par des taux de greffage différents ; éventuellement l'agent de ciblage n'ayant pas réagi (dans le cas d'une réaction incomplète) ; éventuellement des agrégats. Le taux de greffage qui est déterminé sur la solution finale par exemple par spectroscopie UV correspond donc à un taux de greffage moyen. 35 Le conjugué peut être utilisé en tant qu'anticancéreux. De par la présence de l'agent de ciblage, le conjugué est rendu très sélectif vis-à-vis des cellules tumorales plutôt que des cellules saines. Ceci permet de diriger le composé de formule (I) qui a une activité anticancéreuse dans un environnement proche de celles-ci ou directement à l'intérieur de celles-ci (à ce propos, voir les publications suivantes qui décrivent l'utilisation de conjugués d'anticorps monoclonaux dans le traitement de cancers : � Antibody-drug conjugates for cancer therapy � Carter P.J., et al., Cancer J. 2008, 14, 154û169 ; � Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs � Chari R., Acc. Chem. Res. 2008, 41, 98-107). II est possible de traiter des cancers solides ou liquides. Le conjugué est formulé sous forme d'une solution aqueuse tamponnée à une concentration généralement comprise entre 1 et 10 mg/ml. Cette solution peut être injectée sous forme de perfusion telle qu'elle ou bien être rediluée pour former une solution de perfusion. [Exemples] Méthode A : chromatoqraphie Liquide Haute pression û spectrométrie de masse (LCMS) Les spectres ont été obtenus sur un appareil Waters UPLC-SQD en mode électrospray positif et/ou négatif (ES+/-). Conditions chromatographiques : colonne : ACQUITY BEH C18 1,7 pm - 2,1x50 mm ; solvants : A : H2O (0,1% acide formique) B : CH3CN (0,1% acide formique) ; température de colonne : 50°C ; débit : 1 mi/min ; gradient (2 min) : de 5 à 50 % deBen0,8min; 1,2 min:100% de B; 1,85 min: 100% de B; 1,95:5% de B. Méthode B : chromatographie Liquide Haute pression û spectrométrie de masse (LCMS) Les spectres ont été obtenus sur un appareil Waters ZQ en mode électrospray positif et/ou négatif (ES+/-). Conditions chromatographiques : colonne : XBridge C18 2,5 pm 3x50 mm ; solvants : A : H2O (0,1 % acide formique) B : CH3CN (0,1 % acide formique ; température de colonne : 70°C ; débit : 0,9 ml/min ; gradient (7 min) : de 5 à 100 % de B en 5,3 min ; 5,5 min : 100 % de B ; 6,3 min : 5 % de B. Méthode C : spectrométrie de masse (MS) Les spectres ont été réalisés par ionisation chimique (gaz réactant : ammoniac) sur appareil WATERS GCTof (introduction directe sans LC). Méthode D : chromatographie Liquide Haute pression û spectrométrie de masse (LCMS) Les spectres ont été obtenus sur un appareil Waters UPLC-SQD en mode électrospray positif et/ou négatif (ES+/-). Conditions chromatographiques : colonne : ACQUITY BEH C18 1,7 pm - 2,1x50 mm ; solvants : A : H2O (0,1% acide formique) B : CH3CN (0,1% acide formique) ; température de colonne : 70°C ; débit : 1 ml/min ; gradient (2 min) : de 5 à 50% de B en 1 min ; 1,3 min : 100% de B ; 1,45 min : 100% de B ; 1,75: 5% de B. Méthode E : chromatographie Liquide Haute pression û spectrométrie de masse (LCMS) Les spectres ont été obtenus sur un appareil Waters UPLC-SQD en mode ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif (ES+/-). Conditions chromatographiques : colonne : ACQUITY BEH C18 1,7 pm - 2,1x50 mm ; solvants : A : H2O (0,1 % acide formique) B CH3CN (0,1% acide formique) ; température de colonne : 70°C ; débit : 1 ml/min ; gradient (4 min) : de 5 à 100% de B en 3,15 min ; 3,75 : 5% de B. Méthode F : chromatographie Liquide Haute pression û spectrométrie de masse (LCMS) Les spectres ont été obtenus sur un appareil Waters UPLC-SQD en mode ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif (ES+/-). Conditions chromatographiques : colonne : ACQUITY BEH C18, 1,7 pm - 2,1x30 mm ; solvants : A : H2O (0,1% acide formique) B CH3CN (0,1% acide formique) ; température de colonne : 45°C ; débit : 0,6 ml/min ; gradient (2 min) : de 5 à 50% de B en 1 min ; 1,3 min : 100% de B ; 1,45 min : 100% de B ; 1,75 min : 5% de B. Méthode G : déglycosilation et spectrométrie de masse (HRMS) d'un coniuqué La déglycosylation est une technique de digestion enzymatique à l'aide de glycosidase. La déglycosylation est faite à partir de 500 pl de conjugué + 100 pl de tampon Tris HCI 50 mM + 10 pl d'enzyme glycanase-F (100 unités d'enzyme lyophilisée/100 pl d'eau). Le mélange est passé au vortex et maintenu une nuit à 37°C. L'échantillon déglycosylé est alors prêt à être analysé en HRMS. Les spectres de masse ont été obtenus sur un appareil Waters Q-Tof-2 en mode électrospray positif (ES+). Conditions chromatographiques : colonne : 4 pm BioSuite 250 URH SEC 4,6x300 mm (Waters) ; solvants : A : formiate d'ammonium 25 mM +1% d'acide formique : B : CH3CN ; température de colonne 30°C: débit 0,4 mi/min ; isocratique 70%A+30%B (15 min). Exemple 1 : 1.1. Préparation du coniuqué On prépare un conjugué en faisant réagir le hu2H11 (dénommé aussi hu53 2H11 en page 15 de WO 2008010101 ; il s'agit d'un anticorps comprenant une Vh ayant la séquence d'aminoacides SED ID N°24)) et le 3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7- diméthoxy-1,2,3,11 a-tétrahydro-pyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]- pyridin-4-yloxy)-éthyl]-méthyl-amino}-1,1-diméthyl-éthylsulfanyl)-2, 5-dioxo-pyrrolidin-1-yl]-propanoylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy) -propanoate de N-hydroxysuccinimidyle. A 8,19 mg de hu2H11 dans 2,16 mL d'un tampon aqueux de concentration 0,05 M en acide N-(2-hydroxyéthyl)-pipérazine-N'-2-éthanesulfonique (HEPES), 0,05 M en NaCI et 2 mM en acide éthylène-diamine-tetra-acétique (EDTA) de pH=8, sont additionnés 516 pg de 3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1, 2,3,11 a-tétrahydropyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-pyridin-4-yloxy)-éthyl] -méthyl-amino}-1,1-diméthyl-éthylsulfanyl)-2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl] -propanoylamino}-éthoxy)-éthoxy]- éthoxy}-éthoxy)-propanoate de N-hydroxysuccinimidyle en solution dans 540 pL de DMA. Après 3 h d'agitation à TA, le mélange est filtré sur MillexR-SV 0,45 pM (PVDF Durapore Millipore) et purifié sur une colonne SuperdexTM 200 prep grade (Colonne HiloadTM 26/60 GE) préalablement équilibrée dans un tampon phosphate salin amené à pH=6,5 par addition d'acide chlorhydrique. Les fractions d'intérêt sont réunies et concentrées sur Amicon Ultra-15 (Ultracel 50k Millipore) puis filtrées sur Sephadex G-25 (Colonnes NAP-5 et NAP-10 GE) préalablement équilibrée dans un tampon aqueux de concentration 10 mM en histidine contenant 10% de sucrose et 5% de NMP. Le conjugué obtenu (2,5 mL) est dosé par spectrophotométrie en utilisant les coefficients d'extinction de la 4-{2-[méthyl-(2-méthyl-2-mercapto-propyl)-amino]-éthoxy}-2,6-bis-[(S) -2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3,11 a-tetrahydropyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-pyridine (6319 nm= 8848 M"' cm"' and 6280 nm= 8634 M"' cm-') et de hu2H11 (8280 nm= 208380 M"'cm"') : une moyenne de 3,8 dimères de tomaymycine par molécule d'anticorps à la concentration de 1,52 mg/mL a été déterminée. 1.2. 3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-éth-(E)-vlidène-7-diméthoxy-1, 2,3,11 atetrahydro-pyrrolo[2,1 cl[1,41benzodiazépin-5-one-8-vloxvméthyll-pvridin-4-vloxv) -éthyll-méthvl-am ino}-1,1-diméthyl-éthylsulfanvl)-2,5-dioxo-pvrrolidin-1-vllpropanovlam ino}-éthoxy)-éthoxyl-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de N- hydroxysuccinimidyle A 3,3 mg de diisopropyléthylamine supportée sur résine (3,72 mmol/g), on ajoute une solution de 9,82 mg de 4-{2-[méthyl-(2-méthyl-2-mercapto-propyl)-amino]-éthoxy}-2,6-bis-[(S) -2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3,11 a-tetrahydro-pyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-pyridine dans 50 pL de DMA ainsi qu'une solution de 6,8 mg de 3-{2-[2- (2-{2-[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl)-propanoylamino]-éthoxy} -éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-propanoate de N-hydroxysuccinimidyle dans 50 pL de DMA. Le mélange obtenu est agité pendant 24 h à TA puis filtré sur silice (Interchrom Puriflash Silice 15/35U 2G) en utilisant un gradient de 0 à 10% de méthanol dans le DCM. Les fractions contenant le produit recherché sont réunies, concentrées sous PR puis purifiées par chromatographie flash sur silice (Interchrom Puriflash Silice 15/35U 2G) en utilisant un gradient de 0 à 10% de méthanol dans le DCM. Les fractions contenant le produit recherché sont réunies et concentrées sous PR. On obtient ainsi 1,16 mg de 3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1, 2,3,11 a-tétrahydro-pyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]- pyridin-4-yloxy)-éthyl]-méthyl-amino}-1,1-d iméthyl-éthylsulfanyl)-2,5-d ioxo-pyrrolid in-1-yl]- propanoylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de N-hydroxysuccinimidyle. LC/MS (E) : tr= 1,38 min ; [M+H]+ : m/z 1322. 1.3. 4-{2-[méthvl-(2-méthvl-2-mercapto-propvl)-am inol-éthoxv}-2,6-bis-[(S)-2-éth-(E)-vlidène-7-diméthoxv-1,2,3,11 a-tetrahvdro-pvrrolo[2,1 cl[1,4lbenzodiazépin-5-one-8- vloxvméthvi]-pyridine A 40 mg de 4-{2-[méthyl-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-amino]-éthoxy}-2,6-bis-[ (S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3,11 a-tetrahydro-pyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-pyridine en solution dans 2,1 mL de méthanol et 930 pL de DMF, est additionnée une solution de 40 mg de chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine et de 36,6 mg de NaHCO3 dans 680 pL d'eau. Le mélange est agité 45 min à TA puis concentré sous PR et purifié par chromatographie flash sur silice (Merck SuperVarioFlash 15 g column, Si60 15-40 pm), en utilisant un gradient de 0 à 10% de méthanol dans un mélange DCM/acétonitrile 9:1. Les fractions contenant le produit recherché sont réunies et concentrées sous PR. On obtient ainsi 21 mg de 4-{2-[méthyl-(2-méthyl-2-mercapto-propyl)-amino]-éthoxy}-2,6-bis-[(S) -2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3,11 a-tetrahydropyrrolo[2,1c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-pyridine. LC/MS (E) : tr= 1,28 min ; [M+H]+ : m/z 809 ; [M+H2O+H]+ : m/z 827. 1.4. 4-{2-[méthvl-(2-méthvl-2-méthyldisulfanyl-propvl)-aminol-éthoxy}-2,6-bis-[ (S)-2-éth-(E)-vlidène-7-diméthoxv-1,2,3,11a-tetrahydro-pvrrolo[2,1 cl[1,4lbenzodiazépin-5-one-8-vloxvméthvll-pvridine O A une solution de 22 mg de 4-{2-[méthyl-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-amino]-éthoxy}-2,6-bis- (hydroxyméthyl)-pyridine et de 53 pL de TEA dans 0,5 mL de DCM refroidie à -25°C, est additionnée 19,6 pL de chlorure de méthanesulfonyle. Après 30 min d'agitation, le mélange est hydrolysé et la phase organique lavée à l'eau puis séchée sur MgSO4 et concentrée sous PR. Le résidu ainsi obtenu (22 mg) est additionné à une solution de 20 mg de tomaymycine dans 0,7 mL de DMF, ainsi que 30 mg de K2CO3 et 12 mg de KI. Le mélange est agité 2 h à 30°C puis hydrolysé par 4 mL d'eau. Le précipité résultant est lavé à l'eau, séché sous vide puis dissout dans du DCM, concentré sous PR et purifié par chromatographie flash sur silice (Merck SuperVarioFlash 15 g column, Si60 15-40 pm), en utilisant un gradient de 0 à 5% de méthanol dans le DCM. Les fractions contenant le produit recherché sont réunies et concentrées sous PR. On obtient ainsi 8 mg de 4-{2-[méthyl-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-amino]-éthoxy}-2,6-bis-[ (S)-2-éth-(E)-yl idène-7-d iméthoxy-1,2,3,11a-tetrahydro-pyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-pyridine. RMN 'H (500 MHz, S en ppm, CHLOROFORM-d) : 1,28 (s, 6 H) ; 1,76 (d, J=6,4 Hz, 6 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,43 (s, 3 H) ; 2,60 (s, 2 H) ; 2,91 (s, 2 H) ; 2,97 (s, 4 H) ; 3,91 (d, J=4,2 Hz, 2 H) ; 4,00 (s, 6 H) ; 4,09 (s, 2 H) ; 4,27 (s, 4 H) ; 5,27 (s, 4 H) ; 5,61 (q, J=6,4 Hz, 2 H) ; 6,85 (s, 2 H) ; 7,00 (s, 2 H) ; 7,56 (s, 2 H) ; 7,65 (d, J=4,2 Hz, 2 H). LC/MS (A) : tr= 0,74 min ; [M+H]+ : m/z 855; [M-H]- : m/z 853. 1.5. 4-{2-[méthvl-(2-méthvl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-aminol-éthoxv}-2,6-bis- (hvdroxvméthyl)-pvridine O~iN~3-S HO OH HO A une suspension de 322 mg de 4-[2-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamino)-éthoxy]-2,6-bis- (hydroxyméthyl)-pyridine dans 262 pL de formaldéhyde refroidie à 0°C, est additionné 30 365 pL d'acide formique. Le mélange est chauffé 1 h et quart à 100°C. Après retour à l'ambiante, le mélange est hydrolysé puis additionné d'une solution aqueuse de soude 5N jusqu'à l'obtention d'un pH=12. La phase aqueuse est extraite 3x avec de AcOEt et les phases organiques rassemblées sont séchées sur MgSO4 et concentrées sous PR. On obtient ainsi 310 mg de 4-{2-[méthyl-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-amino]-éthoxy}-2,6- bis-(hydroxyméthyl)-pyridine. RMN 1H (300 MHz, S en ppm, DMSO-d6) : 1,26 (s, 6 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 2,60 (s, 2H) ; 2,88 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 4,13 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 4,45 (d, J=6,0 Hz, 4 H) ; 5,31 (t, J=6,0 Hz, 2 H) ; 6,85 (s, 2 H). LC/MS (A) : tr= 0,22 min ; [M+H]+ : m/z 333 ; [M+HCO2H-H]- : m/z 377. 1.6. 4-[2-(2-méthvl-2-méthvldisulfanvl-propvlamino)-éthoxv]-2,6-bis- (hvdroxvméthvl)-pvridine O~iN~S'S~ OH HO HO OH A une suspension de 390 mg de 4-[2-amino-éthoxy]-2,6-bis-(hydroxyméthyl)-pyridine (préparé après déprotection du groupe boc de 4-(2-tert-butoxycarbonylamino-éthoxy)-2,6-bis- (hydroxyméthyl)-pyridine décrit en page 101 de WO 07085930) dans 2 mL de THF sont additionnés 270 pL de 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde et 730 pL d'isopropoxyde de titane. Après 20 min, 270 pL de 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde et 730 pL d'isopropoxyde de titane supplémentaires sont additionnés et le mélange est agité à TA pendant 2 h. Le mélange est alors additionné de 6 mL d'éthanol, agité pendant 20 min à TA puis additionné de 124 mg de cyanoborohydrure de sodium. Après 45 min d'agitation, 124 mg de cyanoborohydrure de sodium supplémentaires sont additionnés et après 1 h d'agitation, le mélange est concentré sous PR, dilué dans AcOEt et de l'eau. Le précipité résultant est filtré, dissout dans une solution aqueuse HCI 1M. La phase aqueuse obtenue est amenée à pH basique avec une solution aqueuse de soude 5M, extraite trois fois avec du DCM et les phases organiques rassemblées sont concentrées sous PR. On obtient ainsi 322 mg de 4-[2-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamino)-éthoxy]-2,6-bis- (hydroxyméthyl)-pyridine. RMN 'H (400 MHz, en ppm, DMSO-d6) : 1,26 (s, 6 H) ; 1,81 (m large, 1 H) ; 2,39 (s, 3 H) ;2,67 (s large, 2 H) ; 2,94 (t large, J=5,7 Hz, 2 H) ; 4,11 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 4,45 (d, J=5,5 Hz, 4 H) ; 5,32 (t,J=5,5 Hz, 2 H) ; 6,85 (s, 2 H). LC/MS (A) : tr= 0,24 min ; [M+H]+ : m/z 347. Exemple 2 2.1. Préparation du coniuqué On prépare comme pour l'ex.l un conjugué en faisant réagir le hu2H11 et le 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3, 11 a- tetrahydropyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-pyridin-4-yloxy)-éthyl] -méthyl-amino}-1,1-diméthyléthylsulfanyl)-acétylam ino]-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-propanoate de N-hydroxysuccinimidyle. Le conjugué obtenu est dosé par spectrophotométrie en utilisant les coefficients d'extinction de la 4-{2-[méthyl-(2-méthyl-2-mercapto-propyl)- amino]-éthoxy}-2,6-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3,11 a- tetrahydropyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazepine-5-one-8-yloxyméthyl]-pyridine (E319 nm= 8848 M-1 cm-1, E280 nm= 8634 M"1 cm-1) et de hu2H11 (EH() nm= 208380 M"1cm"1) : une moyenne de 5,6 dimères de tomaymycine par molécule d'anticorps a été déterminée. 2.1. 3-{2-f2-(2-{2-f2-(2-(f2-(2,6-bis-f(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxv-1,2,3, 1la-tetra hydro-pvrrolof2,1 cl[1,4lbenzodiazépin-5-one-8-vloxyméthvll-pvridin-4-vloxv) -éthvIlméthvl-amino}-1,1-diméthyl-éthvlsulfanyl)-acétvlam inol-éthoxv}-éthoxy)-éthoxvléthoxv}-propanoate de N-hvdroxvsuccinimidyle A 12 mg d'acide 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3, 11atetrahydro-pyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-pyridin-4-yloxy)-éthyl] -méthyl-amino}-1 ,1-diméthyl-éthylsulfanyl)-acétylamino]-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy} -propanoïque en solution dans 1 mL de THF et 1 mL de DCM sont additionnés 5,5 mg de carbonate de N,N'-disuccinimidyle et 15 pL de DIPEA. Après 3 h à TA, 4 mL de DCM sont additionnés et la phase organique résultante est lavée deux fois avec de l'eau, séchée sur MgSO4, concentrée sous PR et purifiée par chromatographie flash sur silice (Interchrom Puriflash Silice 15/35U 2G), en utilisant un gradient de 3 à 8% de méthanol dans le DOM. On obtient ainsi 8 mg de 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy- 1,2,3,11 a-tétra hydro-pyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-pyridin-4-yloxy)-éthyl] -méthyl-amino}-1,1-diméthyl-éthylsulfanyl)-acétylamino]-éthoxy}-éthoxy) -éthoxy]-éthoxy}-propanoate de N-hydroxysuccinimidyle. LC/MS (E) : tr=1,36 min ; [M+2 H20+Na]+ : m/z 1270 ; [M+H20+Na]+ : m/z 1252 ; [M+H2O+H]+ : m/z 1229 ; [M+H]+ : m/z 1211. 2.2. acide 3-{2-f2-(2-{2-f2-(2-{f2-(2,6-bis-f(S)-2-éth-(E)-vlidène-7-diméthoxy-1,2,3, 11a- tetra hydro-pvrrolo[2,Ic1f1, 41benzodiazépin-5-one-8-vloxyméthvll-pvridin-4-vloxv)- éthvll-méthvl-am ino}-1,1-diméthvl-éthvlsu lfanyl)-acétvlaminol-éthoxy}-éthoxv)-éthoxvl-éth oxv}-propanoïq ue A 18 mg de 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3, 11 atetrahydro-pyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-pyridin-4-yloxy)-éthyl]- méthyl-amino}-1,1-diméthyl-éthylsulfanyl)-acétylamino]-éthoxy}-éthoxy) -éthoxy]-éthoxy}-propanoate de méthyle en solution dans 270 pL de THF, sont additionnés 17,5 pL d'une solution aqueuse de lithine et 100 pL d'eau. Après 2 h, le mélange est dilué dans du DCM et additionné d'un tampon phosphate à pH=3. La phase aqueuse résultante est extraite 3x avec du DCM et les phases organiques rassemblées sont séchées sur MgSO4, concentrées sous PR et purifiées par chromatographie flash sur silice (Interchrom Puriflash Silice 15/35U 2G), en utilisant un gradient de 3 à 15% de méthanol dans le DCM. On obtient ainsi 11,5 mg d'acide 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3, 11 a- tetrahydropyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-pyridin-4-yloxy)-éthyl] -méthyl-amino}-1,1-diméthyl-éthylsulfanyl)-acétylamino]-éthoxy}-éth(m) -éthoxy]-éthoxy}- propanoïque. LC/MS (D) : tr=0,88 min ; [M+H20+Na]+ : m/z 1154 ; [M+H20+H]+ : m/z 1133 ; [M+H]+ : m/z 1115 ; 2.3. 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3, 11 a- tetrahvdro-pyrrolo[2,1 al ,41benzodiazépin-5-one-8-vloxyméthyll-pyridin-4-vloxy)- éthyll-méthyl-am ino}-1 ,1-diméthyl-éthvlsulfanvl)-acétylaminol-éthoxv}-éthoxv)-éthoxv]-éthoxv} -propanoate de méthyle Préparé selon ex.1 à partir du 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-hydroxyméthyl-pyridin-4-yloxy)-éthyl] -méthyl-amino}-1,1-diméthyl-éthylsulfanyl)-acétylamino]-éthoxy}-éthoxy) -éthoxy]-éthoxy}-propanoate de méthyle : 2.4. 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-hydroxyméthyl-pyridin-4-vloxy) -éthyll-méthvl-amino}-1,1-d iméthvl-éthylsulfanvl)-acétvlam inol-éthoxv}-éthoxv)-éthoxyl-éthoxv}-propanoate 30 de méthyle O o O O HOOH WN Ov I p 0 LC/MS (D) : tr= 0,93 min ; [M+H20+H]+ : m/z 1146 ; [M+H]+ : m/z 1128 A 45 mg de 4-{2-[(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-méthyl-amino]-éthoxy}-2,6-bis- (hydroxyméthyl)-pyridine en solution dans 1 mL de DMF, sont additionnés 73,7 mg de 3-[2-(2-{2-[2-(2-iodo-acétylamino)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy] -propanoate de méthyle en solution dans 1 mL de DMF et 39 pL de DIPEA. Après 24 h à TA, le mélange est concentré sous PR et purifié par chromatographie flash sur silice (Analogix Super Flash SiO2 SF25-8g), en utilisant un gradient de 0 à 10% de méthanol dans le DCM. On obtient ainsi 53 mg de 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-hydroxyméthyl-pyridin-4-yloxy)-éthyl] -méthyl-amino}-1,1- diméthyl-éthylsulfanyl)-acétylamino]-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy} -propanoate de méthyle. RMN 1H (400 MHz, â en ppm, DMSO-d6) : 1,21 (s, 6 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 2,50 à 2,56 (m, 4 H) ;2,87 (t, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,15 à 3,23 (m, 4 H) ; 3,40 (t, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,47 à 3,52 (m, 12 H) ; 3,59 (s, 3 H) ; 3,62 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,13 (t, J=5,8 Hz, 2 H) ; 4,45 (d, J=5,8 Hz, 4 H) ; 5,31 (t, J=5,8 Hz, 2 H) ; 6,85 (s, 2 H) ; 7,98 (t, J=5,8 Hz, 1 H). LC/MS (A) : tr= 0,35 min ; [M+H]+ : m/z 620 ; [M+2H]2+: m/z 310,5 (pic de base) ; [M-H+HCO2H]- : m/z 664. 2.5. 3-F2-(2-{2-F242-iodo-acétylamino)-éthoxvl-éthoxy}-éthoxy) -éthoxyl-propanoate de méthyle A 100 mg d'acide 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque est additionné 117,4 mg de iodoacétate de N-hydroxysuccinimidyle en solution dans 3 mL de DCM. Après 2 h à TA, 330 pL de méthanol est additionné et le mélange est refroidi à 0°C. 360 pL d'une solution 2M de triméthylsilyldiazométhane dans l'hexane. Après 1 h, le mélange est neutralisé par addition de 50 pL d'acide acétique puis additionné d'une solution aqueuse saturée de NaHCO3 jusqu'à l'obtention de pH=8. La phase organique est séchée sur MgSO4, concentrée sous PR et purifié par chromatographie flash sur silice (Interchrom Puriflash Silice 15/35U 10G), en utilisant un gradient de 0 à 10% de méthanol dans le DOM. On obtient ainsi 132 mg de 3-[2-(2-{2-[2-(2-iodo-acétylamino)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy] -propanoate de méthyle. RMN 1H (400 MHz, d en ppm, DMSO-d6) : 2,54 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,20 (q, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,41 (t, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,53 (m, 12 H) ; 3,60 (s, 3 H) ; 3,63 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,65 (s, 2 H) ; 8,27 (t large, J=5,8 Hz, 1 H). LC/MS (A) : tr= 0,54 min ; [M+H]+ : m/z 448 ; [M+HCO2H-H]- : m/z 492. 2.6.4-{2-f(2-mercapto-2-méthvl-propyl)-méthvl-am inol-éthoxv}-2,6-bis-(hvdroxvméthvl)-pvridine HO OH OH HO OH A 80 mg de 4-{2-[méthyl-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-amino]-éthoxy}-2,6-bis- (hydroxyméthyl)-pyridine en solution dans 1,95 mL de méthanol, est additionné une solution de 198 mg de chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine dans 730 pL d'eau. Après 2 h à TA, le mélange est concentré sous PR et repris dans 10 mL d'eau. La phase aqueuse est amenée à pH=8 par addition d'une solution aqueuse de soude puis extraite 2x avec de AcOEt. Les phases organiques rassemblées sont lavées avec une solution aqueuse saturée en NaCl et concentrées sous PR. On obtient 68 mg de 4-{2-[(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-méthyl-amino]-éthoxy}-2,6-bis- (hydroxyméthyl)-pyridine. RMN 1H (400 MHz, S en ppm, DMSO-d6) : 1,28 (s, 6 H) ; 2,43 (s, 3 H) ; 2,54 (s, 2 H) ; 2,62 (s, 1H) ; 2,91 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 4,15 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 4,45 (d, J=5,8 Hz, 4 H) ; 5,30 (t, J=5,8 Hz, 2 H) ; 6,85 (s, 2 H). LC/MS (A) : tr= 0,11 min ; [M+H]+ : m/z 301. Exemple 3 : On prépare un conjugué comme pour l'ex.l en faisant réagir le hu2H11 et le 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3,11 a-tetrahydro- pyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-1-méthyl-éthylsulfanyl] -acétylamino}- éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de N-hydroxysuccinimidyle. Le conjugué obtenu est dosé par spectrophotométrie en utilisant les coefficients d'extinction du 1-(1-méthyl-1-méthyldisulfanyl-éthyl)-3,5-bis-[(S)-2-éth-(E) -ylidène-7-diméthoxy-1,2,3,11atetrahydro-pyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl] -benzène (6319 nm= 8460 M_1 cm-1 and 8280nm= 10531 M-1 cm-1) et de hu2H11 (8280nm= 208380 M-1cm-1) : une moyenne de 4,2 dérivés de tomaymycine par molécule d'anticorps a été déterminée. 3.2. 3-(2-{242-(2-{241-(3,5-bis-f(S)-2-éth-(E)-vlidène-7-diméthoxv-1,2,3, 1la-tetrahvdro - pvrrolo[2,1 cl[1,41benzodiazépin-5-one-8-vloxvméthvl]-1-méthvl-éthvlsulfanvil- acétylamino}-éthoxv)-éthoxv]-éthoxy}-éthoxv)-propanoate de N-hvdroxysuccinimidyle Préparé comme pour l'ex.2, à partir de l'acide 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3,11 a-tetrahydro-pyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-1-méthyl-éthylsulfanyl] -acétylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque : LC/MS (F) : tr= 1,27 min; [M+H]+ : m/z 1123 3.3. acide 3-(2-{2-f2-(2-{2-f1-(3,5-bis-[(S)-2-éth-(E)-vlidène-7-diméthoxv-1,2,3,11a- tetrahydro-pvrrolo[2,Ic1f1,41 benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthvll-1-méthyléthvlsulfanvll-acétylamino} -éthoxv)-éthoxyl-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque Préparé comme pour l'ex. 2, à partir du 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-bis-[(S)-2-éth-(E)-ylidène-7-diméthoxy-1,2,3,11 a-tetrahydro-pyrrolo[2,1 c][1,4]benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthyl]-1-méthyl-éthylsulfanyl] -acétylamino}-éthoxy)-éthoQfxy]-éthoxy}-éthoxyQU)-propanoate de méthyle : S~\N^~O~~~O^~O~~O~~\O~ S~\N^~O~\O^~O~~O" v OH H H LC/MS (F) : tr= 1,19 min ; [M+H]+ : rn/z 1026. 3.4. 3-(2-{2-[2-(2-{2-f1-(3,5-bis-[(S)-2-éth-(E)-vlidène-7-diméthoxv-1,2,3, 11a-tetrahydro - 15 pvrrolof2,1c1[1, 41benzodiazépin-5-one-8-yloxyméthvll-1-méthvl-éthvlsulfanvll-acétvl amino}-éthoxy)-éthoxyl-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de méthyle Préparé comme pour l'ex.2, à partir du 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-bis-hydroxyméthyl-phenyl)-1-méthyl-éthylsulfanyl] -acétylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de méthyle : H H N 20 LC/MS (F) : tr=1,28 min ; [M+H]+ : m/z 1040 3.5. 34242424242-F1 -(3,5-bis-hvd roxyméthyl-phenvl)-1-méthyl-éthvlsu lfanvilacétylamino}-éthoxy)-éthoxyl-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de méthyle Préparé comme décrit pour l'ex.2, à partir de 3,Qf5-bis-hydroxyméthyl-1-(1-mercapto-1-méthyl- H 25 éthyl)-benzène : H° OH HO OH RMN 1H (400 MHz, en ppm, DMSO-d6) : 1,64 (s, 6 H) ; 2,53 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 2,93 (s, 2 H); 3,15 (q, J=6,0 Hz, 2 H) ; 3,37 (t, J=6,0 Hz, 2 H) ; 3,49 (m, 12 H) ; 3,59 (s, 3 H) ; 3,62 (t,10 J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,49 (d, J=5,6 Hz, 4 H) ; 5,13 (t, J=5,6 Hz, 2 H) ; 7,14 (s, 1 H) ; 7,32 (s, 2 H) ; 7,84 (t, J=6,0 Hz, 1 H). LC/MS (B) : tr= 2,98 min ; [M+H]+ : m/z 532 ; pic de base : m/z 354 ; [M-H+HCO2H]- : m/z 576. 3.8. 3,5-bis-hvdroxvméthvl-1 -(1-mercapto-1-méthyl-éthyl)-benzène ~s..o Une solution de 43 mg de 5-hydroxyméthyl-1-(1-mercapto-1-méthyl-éthyl)-3- (tert-butyldiméthyl-silanyloxy méthyl)-benzène dans 1 mL d'un mélange acide acétique/THF/eau (3/1/1) est agité à TA pendant 4,5 h, concentré sous PR puis repris dans 3 mL d'eau. Le pH de la phase aqueuse est amené à 7 par addition d'une solution aqueuse 10% de Na2CO3 puis la phase aqueuse est extraite avec AcOEt. La phase organique est séchée sur MgSO4 et concentrée sous PR. On obtient ainsi 18 mg de 3,5-bis-hydroxyméthyl-1-(1-mercapto-1-méthyl-éthyl)-benzène. RMN 1H (400 MHz, S en ppm, DMSO-d6) : 1,76 (s, 6 H) ; 3,19 (s, 1 H) ; 4,48 (d, J=5,9 Hz, 4 H) ; 5,14 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 7,13 (s, 1 H) ; 7,36 (s, 2 H). MS (C) : CI : [M+NH4]+ : m/z 230. 3.9. 5-hvdroxvméthvl-1-(1-mercapto-1-méthyl-éthvl)-3- (tert-butvl-diméthyl-silanvloxv méthyl)-benzène A 336 mg de thioacétate de 1-[3-(tert-butyl-diméthyl-silanyloxyméthyl)-5-hydroxyméthylphenyl] -1-méthyl-éthyle en solution dans 3,7 mL d'acétonitrile est additionnée 114 pL d'hydrate d'hydrazine. Après 3 h à TA, le mélange est concentré sous PR et purifié par chromatographie flash sur silice (Biotage 25+M), en utilisant un gradient de 0 à 55% AcOEt dans l'heptane. On obtient ainsi 230 mg de 5-hydroxyméthyl-1-(1-mercapto-1-méthyl-éthyl)- 3-(tert-butyl-diméthyl-silanyloxyméthyl)-benzène. RMN 'H (400 MHz, b en ppm, DMSO-d6) : 0,08 (s, 6 H) ; 0,92 (s, 9 H) ; 1,76 (s, 6 H) ; 3,19 (s, 1H) ; 4,48 (d, J=5,7 Hz, 2 H) ; 4,71 (s, 2 H) ; 5,14 (t, J=5,7 Hz, 1 H) ; 7,10 (s, 1 H) ; 7,33 à 7,42 (m, 2 H). MS (C) : Cl : [M+NH4]+ : m/z 344. 3.10. thioacétate de 1-f3-(tert-butvl-diméthyl-silanvloxvméthyl) -5-hvdroxvméthvlphenvil-1-méthvl-éthyle OH Si.o ' OH OH .o o \ . ~\ .o OH si -si si A 1 g de 1-(1-Hydroxy-1-méthyl-éthyl)-3,5-bis- (tert-butyl-diméthyl-silanyloxyméthyl)-benzène en solution dans 4,7 mL de 1,2-dichloroéthane sont additionnés 404 pL d'acide thioacétique et 376 mg d'iodure de zinc. Le mélange est chauffé à 50°C pendant 40 min. Après retour à TA, les sels sont éliminés par filtration et la phase organique est concentrée sous PR et purifié par chromatographie flash sur silice (Biotage 40+M), en utilisant un gradient de 0 à 30% AcOEt dans l'heptane. On obtient ainsi 248 mg de thioacétate de 1-[3-(tert-butyldiméthyl-si lanyloxyméthyl)-5-hydroxyméthyl-phenyl]-1-méthyl-éthyle. RMN 'H (400 MHz, 3 en ppm, DMSO-d6) : 0,08 (s, 6 H) ; 0,91 (s, 9 H) ; 1,79 (s, 6 H) ; 2,17 (s, 3H) ; 4,48 (d, J=5,6 Hz, 2 H) ; 4,70 (s, 2 H) ; 5,16 (t, J=5,6 Hz, 1 H) ; 7,11 (s, 1 H) ; 7,33 (s, 1 H) ; 7,35 (s, 1H). LC/MS (A) : tr= 1,23 min ; [M+Na]+ : m/z 391. 3.11. 1-(1-Hvd roxv-1-méthvl-éthvl)-3,5-bis-(tert-butyl-diméthvl-silanvloxvméthvl) -benzène s~•o o Sig si.o o Sig A 4,32 g de 1-bromo-3,5-bis-(tert-butyl-diméthyl-silanyloxyméthyl)-benzène (G.T.Crisp, P.D.Turner Tetrahedron 2000, 56 (42), 8335) en solution dans 150 mL de THF refroidie à - 71°C est additionné goutte à goutte 10,5 mL de n-BuLi en solution 1,6 M dans l'hexane. Après 1h30, 4,27 mL d'acétone est additionné goutte à goutte. Le mélange est laissé remonter à TA puis hydrolysé par une solution aqueuse saturée NH4CI. La phase aqueuse est extraite avec 100 mL AcOEt et les phases organiques rassemblées sont séchées sur MgSO4, concentrées sous PR et purifiées par chromatographie flash sur silice (Biotage 65+M), en utilisant un gradient de 0 à 20% AcOEt dans l'heptane. On obtient ainsi 2,48 g de 1-(1-hydroxy-1-méthyl-éthyl)-3,5-bis- (tert-butyl-diméthyl-silanyloxyméthyl)-benzène. RMN 'H (400 MHz, S en ppm, CHLOROFORM-d) : 0,11 (s, 12 H) ; 0,96 (s, 18 H) ; 1,59 (s, 6H) ; 1,69 (s, 1 H) ; 4,76 (s, 4 H) ; 7,21 (s, 1 H) ; 7,33 (s, 2 H). LC/MS (B) : tr=6,43 min ; [M+Na]+ : m/z 447 ; pic de base : m/z 407. 34 REVENDICATIONS1. Composé de formule (I) : LCOZbRb dans laquelle : • représente une liaison simple ou une liaison double avec la condition que si représente une liaison simple alors : • ---- représente une liaison simple ; • U et/ou U' identique ou différent, représente(nt) indépendamment l'un de l'autre H ; • W et/ou W' identique ou différent, représente(nt) indépendamment l'un de l'autre : OH, -OR, ùOCOR, -OOOR, -OCOOR, ùOCONRR', un carbamate cyclique tel que N10 et C11 soient inclus dans un cycle, ùNRCONRR', -OCSNHR, un thiocarbamate cyclique tel que N10 et C11 soient inclus dans un cycle, -SH, -SR, -SOR, -SOOR, ùSO3, -NRSOOR', ùNRR', une amine cyclique telle que N10 et C11 soient inclus dans un cycle, -NROR', ùNRCOR', ùN3, -CN, Hal, un groupe trialkylphosphonium ou triarylphosphonium ; • RI, R2, RI', R2' identiques ou différents, représentent, indépendamment l'un de l'autre : H, Hal ou un groupe (CI-C6)alkyle éventuellement substitué par un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi : Hal, CN, NRR', CF3, OR, un groupe aryle ou hétéroaryle, S(0)qR avec q =0,1 ou 2 ; ou bien • RI et R2 et/ou RI' et R2' forment ensemble respectivement une double liaison =CH2 ou =CH-CH3 ; • Y et Y', identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre H ou OR ; • M représente CH ou N ; • ALK et ALK' identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe (C1-C6)alkylène ; • R et R' représentent indépendamment l'un de l'autre, H ou un groupe (C,-C6)alkyle ou aryle éventuellement substitué par un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi : Hal, CN, NRR', CF3, OR, un groupe aryle ou hétéroaryle ; • L représente : Ri' R2 (I)• le groupe -L1-L2- dans lequel LI est rattaché au cycle aromatique comprenant M par le groupe ALK ou OALK et représente l'un des groupes suivants : - ALK-S- o NùCHz -O-ALK-NR3-ALK-S" O - O-ALK-NR3-ALK-S-o / /N~_ALK-SO -O-ALK-N\ ALK-S- \ -0-ALK- \ /NùALK-S- et L2 représente le groupe -CH2C(=O)-NR3-(CH2CH2O)i-ALK- rattaché à LI par ù CH2C(=O)- ou bien • le groupe ùO-ALK-NR3-ALK-S-(CH2CH2O)i- rattaché au cycle aromatique comprenant M par le groupe OALK ; • R3 représente H ou un groupe (CI-C6)alkyle ; • i représente un nombre entier allant de 1 à 40, plutôt de 1 à 20, de préférence de 1 à 10 ; • Zb représente une liaison simple, -O- ou -NH-, Rb représentant H ou un groupe (C,- C6)alkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ou bien Zb représente une liaison simple et Rb représente Hal. 3. Composé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel Y et Y' représentent plus particulièrement un groupe (C,-C4)alcoxy. 4. Composé selon la revendication 1 à 3 dans lequel L est choisi parmi : -ALK-S-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O)-CH2CH2- 2. Composé selon la revendication 1 de formule (IA) ou (IB) : L-C(=O)-ZbRb L-C(=0)-ZbRbN-CHZ CH2C(=O)NH-(CH2CH2O); CH2CH2 -O-ALK-NR3-ALK-S-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O)i-CH2CH2 ~- o -O-ALK-N\ \NALK-S-CH2C(=0)-NH-(CH2CH20) CH2CH2 ALK-S-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O) CH2CH2 -O-ALK-Nl N-ALK-S-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O); CH2CH2 -O-ALK-NR3-ALK-S-(CH2CH2O)i- 5. Composé selon la revendication 1 choisi parmi l'un des suivants : o -O-ALK- NN ZbRb 6. Composé selon la revendication 1 à 5 dans lequel ùCOZbRb représente -COOH, -00.0-N -COO(C1-C6)alkyle, -COOCH3, -COOCH2CH=CH2, ou ùCOOOùN O GI -00 .0 , ou le groupe dans lequel GI représente SO3M ùcoùo M=H ou cation ùco.o ùco.o o, au moins un groupe inductif, , plus particulièrement ou F F ou o 7. Procédé de préparation d'un conjugué, consistant à : (i) mettre en contact et laisser réagir une solution aqueuse d'un agent de ciblage éventuellement tamponnée et une solution d'un composé tel que défini à l'une des revendications 1 à 6 ; (ii) puis à éventuellement séparer le conjugué qui s'est formé en (i) de l'agent de ciblage n'ayant pas réagi et des agrégats éventuellement présents dans la solution. 8. Procédé selon la revendication 7 dans lequel l'agent de ciblage est un ligand, une protéine, un anticorps, plus particulièrement monoclonal, un fragment de protéine ou d'anticorps, un peptide, un oligonucléotide ou un oligosaccharide. 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8 dans lequel la réaction a lieu à une température comprise généralement entre 20 et 40 °C et/ou la durée de la réaction varie entre 1 et 24 h. 10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9 dans lequel après l'étape (i) ou (ii), la solution du conjugué subit une étape (iii) d'ultrafiltration et/ou de diafiltration. 11. Conjugué susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 7 à 9.12. Solution de conjugué susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 7 à 9. 13. Composé selon l'une des revendications 1 à 6 en tant qu'anticancéreux. 14. Conjugué selon la revendication 11 en tant qu'anticancéreux. 15. Composition pharmaceutique comprenant un composé selon l'une des revendications 1 à 6 ou bien un conjugué selon la revendication 11 ainsi qu'au moins un excipient. 16. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 6 pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché de façon covalente en position para de M le dimère de formule Ri' RZ 17. Utilisation selon la revendication 16 dans laquelle l'agent de ciblage est un anticorps. 18. Utilisation selon la revendication 16 ou 17 dans laquelle le dimère a pour formule : 19. Utilisation selon la revendication 15 à 18 dans laquelle Y et Y' représentent ùOMe.