FR 2942939 A1 20100917 FR 0901094 A 20090310 Levure probiotique stable à la granulation, compositions probiotiques la comprenant, leur procédé de préparation et leurs utilisations. La présente invention se rapporte au domaine des compositions probiotiques utiles pour l'alimentation et la santé humaine et/ou animale. Elle se rapporte particulièrement aux compositions comprenant des microorganismes probiotiques stables notamment lors de la préparation des comprimés ou des granulés destinés à l'application finale. Le terme �probiotiques � désigne des micro-organismes vivants ou revivifiables, qui lorsqu'ils sont ingérés en quantité suffisante exercent un effet positif sur l'organisme hôte en améliorant les propriétés de sa flore intestinale au-delà des effets nutritionnels traditionnels. Ils constituent une alternative à l'emploi des antibiotiques dans l'alimentation animale. Il s'agit le plus souvent de bactéries ou de levures présentes soit dans les aliments soit dans les compléments alimentaires. Il existe quatre grands types de probiotiques : les ferments lactiques (les lactobacilles et les coques), - les bifidobactéries d'origine humaine ou animale, les différentes levures dont les levures de type Saccharomyces, les autres bactéries sporulées, dont Bacillus subtillis et cereus. Les micro-organismes tués par la chaleur ne répondent pas à la définition des probiotiques, même si certains effets thérapeutiques ont pu leur être attribués. Par extension, le terme � probiotiques � désigne également les aliments contenant de tels micro-organismes. Les probiotiques sont de plus en plus utilisés tant en alimentation humaine qu'en alimentation animale, notamment comme substituts aux antibiotiques compte tenu notamment d'un retour à une alimentation plus saine, plus naturelle et plus respectueuse de l'environnement. En nutrition animale, ces micro-organismes sont en général ajoutés dans un aliment granulé par l'intermédiaire d'un pré-mélange contenant également des vitamines, des oligo-éléments et des acides aminés. De manière générale, la fabrication des granulés est divisée en au moins deux étapes : A- la préparation d'un pré-mélange d'additifs, B- la production par le fabricant d'aliment de granulés comprenant le pré-mélange (A). Les microorganismes probiotiques sont incorporés soit dans le pré-mélange soit lors de la fabrication des granulés. L'introduction des micro-organismes probiotiques dans les granulés n'est cependant pas aisée. Les micro-organismes probiotiques sont le plus souvent détruits au cours du processus de granulation. En effet, la fabrication des granulés est effectuée en présence de vapeur à des températures comprises entre 60°C et 120°C et sous des pressions allant de 0,5 à 40 bars. Ces procédés de granulation associent des contraintes thermiques, mécaniques et d'humidité très importantes auxquelles les microorganismes doivent survivre. Dans la demande de brevet EP 0 694 610, la résistance à la granulation de levures de l'espèce Phaffia rhodozyma qui produisent un colorant, l'astaxanthine, et sont utilisées dans l'alimentation piscicole pour donner la couleur rouge aux saumons et truites d'élevage, a été améliorée par séchage en présence d'un sucre comme le glucose. Cependant, il ne s'agissait pas là de levures probiotiques qui doivent rester vivantes jusqu'à leur ingestion par les animaux afin de remplir leurs fonctions. Dans la demande de brevet n° WO 2007/135278, on a décrit que des micro-organismes probiotiques pouvaient présenter une stabilité améliorée dans les pré-mélanges au cours du temps par mélange avec des parois de levures et/ou des levures désactivées en lieu et place des autres supports de pré-mélange traditionnellement utilisés tels la farine de blé ou le carbonate de calcium, cette stabilité améliorée au cours du temps les rendant alors plus résistants à la granulation. Il existe donc un réel besoin en micro-organismes probiotiques qui soient à la fois stables au cours du temps et aussi au cours du processus de granulation de telle sorte que l'effet escompté sur la santé de l'être qui les ingère soit réel. La demanderesse a trouvé que la sélection d'un microorganisme probiotique dont la définition exacte des caractéristiques associée à l'optimisation des conditions opératoires du procédé de granulation permet de résoudre le problème cité précédemment. La solution de l'invention permet une meilleure stabilité des microorganismes, c'est-à-dire des pertes après traitement inférieures à I1ogCFU/g (CFU : Colony Forming Unit) Plus spécifiquement, la demanderesse a trouvé que la solution à ce problème réside dans la sélection d'un microorganisme choisi parmi les levures probiotiques présentées sous une forme sèche agglomérée en sphérules ayant un taux de matière sèche (MS) compris entre 93 et 98 % et un diamètre médian des sphérules (d) compris entre 500 et 1500�m. Le couple MS/d est choisi de manière à ce que les pertes en microorganismes probiotiques après granulation soient inférieures à 1 log CFU/g d'aliment granulé comme expliqué plus loin. Les sphérules selon l'invention présentent avantageusement un taux de matière sèche compris entre 93 et 96% et un diamètre médian (d) compris entre 800 et 1200�m. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un microorganisme choisi parmi les levures probiotiques telles que décrites précédemment pour la réalisation d'une composition probiotique destinée notamment à l'alimentation animale et/ou humaine. L'invention a aussi pour objet une composition probiotique (A) comprenant : - de 2 à 30 % en poids par rapport au poids total de la composition, de micro-organisme probiotique choisi parmi les levures probiotiques selon l'invention, et de 70 à 98 % en poids par rapport au poids total de la composition, d'un complément nutritionnel comprenant au moins un constituant choisi parmi les vitamines, les oligoéléments, les acides aminés, et d'autres additifs destinés à l'alimentation et/ou la santé animale ou humaine. La préparation et le séchage des levures est une technique bien connue. On cultive la levure sous forme d'une biomasse pure, la levure est ensuite récoltée, mélangée éventuellement avec des auxiliaires technologiques à raison de quelques pour cent de la matière sèche mise en oeuvre, extrudée et séchée par différentes techniques : fluidisation, séchage sur bande ou encore en tambour rotatif. Ces différentes techniques sont décrites dans des manuels de base comme Yeast Technology, Reed and Nagodawithana, second édidition, an AVI book, Van Nostrand Reinhold. L'homme du métier sait adapter les conditions opératoires notamment les dimensions de la filière de granulation et des tamis, ainsi que les conditions de séchage pour obtenir les levures selon la présente invention comme indiqué dans la partie expérimentale. A titre d'exemple de levure probiotique, on peut citer les levures probiotiques choisies dans le groupe comprenant les levures du genre Saccharomyces, de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, ou du genre Kluyveromyces telle que la Kluyveromyces marxianus et leurs mélanges. Des exemples préférés de souches de Saccharomyces cerevisiae sont la souche Saccharomyces cerevisiae Sc47 déposée auprès du NCYC sous le numéro 47, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée auprès de la collection Pasteur (CNCM) sous le numéro I-1077, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée auprès de la collection Pasteur (CNCM) sous le numéro I-1079, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée auprès de la collection MUCL sous le numéro 39 885, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée auprès de la collection CBS sous le numéro 39 493.94, la souche Kluyveromyces marxianus déposée auprès de la collection MUCL sous le numéro 39434, et leurs mélanges. De façon tout à fait préférentielle la composition selon la présente invention comprend des levures correspondant à la souche Saccharomyces cerevisiae Sc47 déposée auprès du NCYC sous le numéro 47. Selon un mode préféré de l'invention la composition probiotique comprend : de 5 à 20 % en poids par rapport au poids total de la composition, de micro-organisme probiotique choisi parmi les levures probiotiques selon l'invention, et de 80 à 95 % en poids par rapport au poids total de la composition, d'un complément nutritionnel comprenant au moins un constituant choisi parmi les vitamines, les oligoéléments, les acides aminés, et d'autres additifs destinés à l'alimentation et/ou la santé animale ou humaine. La composition probiotique de l'invention peut être utilisée dans l'alimentation animale et/ou humaine. Elle peut être administrée sous différentes formes. Selon un mode préféré de l'invention, la composition probiotique destinée à l'alimentation animale est administrée sous la forme de granulé. De manière générale, la chaine de fabrication des granulés est divisée en plusieurs étapes : A- la préparation d'un pré-mélange d'additifs (vitamines, oligo-éléments, micro-organismes, huiles essentielles ... dilués sur un support ou adjuvant. Il existe plusieurs adjuvants, d'origine minérale ou végétale, utilisés classiquement comme la farine à base de blé, le carbonate de calcium, l'argile sépiolitique ou les drèches d'amidonnerie). Le pré-mélange se présente sous une forme farine finement broyée (diamètre médian des particules de 100�m environ). B- la production des granulés par le fabricant d'aliment comprenant : a- une phase de macro-mélange avec des matières premières broyées (blé, maïs, orge, tourteaux, ...), des additifs et des prémélanges. Ce macro-mélange se présente sous forme d'une farine grossière (diamètre médian des particules de 500�m), b- une phase de pré-granulation (traitement thermique à la vapeur seule ou avec contraintes mécaniques), c- une phase de granulation (fabrication des granulés) caractérisée par une température de la filière (T) et un diamètre des granulés (D), d- une phase de séchage-refroidissement. Généralement, les levures sont incorporées dans le pré-mélange (étape A), ou directement au moment du macro-mélange (étape Ba). Le procédé de granulation mis en oeuvre selon l'invention, comprend les étapes suivantes : - incorporation de la composition probiotique (A) à un mélange nutritionnel adapté à l'alimentation animale, - injection de vapeur d'eau à une température comprise entre 60°C et 85°C sous des pressions allant de 0,5 à 4 bars dans le mélange obtenu à l'étape précédente, - granulation par pressage à une température (T) comprise entre 70 et 92°C pour l'obtention de granulés de diamètre (D) compris entre 2 et 6mm et refroidissement. Le taux de matière sèche (MS) et le diamètre médian (d) de la levure sont ajustés en fonction de la température de la filière de granulation (T) et du diamètre (D) des granulés de manière à satisfaire l'équation (1) suivante : X = -196,482 û 0,023 d + 2,256 (MS) û 14,793 T+ 3,046 D + 6,25.10-5 d (MS) + 0,001 d.T + 5,6310-5 d .T + 0,167(MS) .T û 0,036 (MS) .T û 0,023D.T + 4,06.10-6 dz + 0,003 TZ dans laquelle, X représente les pertes en microorganisme après granulation (1ogCFU/g) = logCFU/g initiales û logCFU/g d (�m) représente le diamètre médian des sphérules MS (%) représente la matière sèche des sphérules D (mm) représente le diamètre des granulés T (°C) représente la température de la filière Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les conditions suivantes sont appliquées : Température filière Diamètre Diamètre Matière sèche (°C) des granulés (mm) des sphérules (�m) des sphérules (%) 1000 94,0 85 3,5 1200 93,0 800 94,0 90 4 970 94,8 865 94,8 92 4 950 94,7 Les conditions suivantes sont celles qui provoquent les pertes les plus faibles : Température filière Diamètre Diamètre Matière sèche (°C) des granulés (mm) des sphérules (�m) des sphérules (%) 92 4 865 94,8 92 4 950 94,7 La composition (A) est introduite dans les granulés à raison de 0,01 à 10% de levure probiotique selon l'invention par rapport au poids sec de l'aliment, ce qui se traduit par 1.E7 à 1.E12 CFU par kg d'aliments granulés. Un autre objet de l'invention est un granulé dans lequel les pertes des microorganismes probiotiques après granulation sont inférieures à Ilog CFU/g d'aliment granulé. Ce qui suit décrit les modes de réalisation de l'invention sans en limiter la portée. Les études suivantes ont été réalisées : identification des paramètres de granulation critiques pour les levures, étude des effets individuels des paramètres identifiés sur la survie de la levure en fonction de ses propriétés physico-chimiques, étude de la granulation complète sur la levure (en pilote) = établissement d'un modèle mathématique reliant les propriétés physiques des sphérules et leur stabilité, détermination d'un couple [granulométrie et MS] conduisant à des pertes minimales, validation du couple [granulométrie et MS des sphérules] au cours de granulations industrielles. Dans ce travail, la levure sous forme ADY/SPH a été utilisée. C'est une levure sèche de panification à hydrater. Elle nécessite une réhydratation avant usage. Elle se présente sous forme de sphérules. 1. Identification des paramètres de granulation critiques pour les levures Des plans expérimentaux complexes ont permis d'obtenir la classification suivante des paramètres critiques par ordre décroissant de sévérité : diamètre des granulés, température de pré-granulation, longueur des canaux de la filière, humidité de l'aliment. Les contraintes physiques sont donc l'humidité de l'aliment, la température de traitement et la compression (diamètre et longueur des canaux étant directement reliés aux forces de compression).30 II. Effet de la granulation complète sur la stabilité de levures ADY/SPH Un plan expérimental complet (multi-factoriel, multi-niveaux) faisant varier les paramètres ci-dessous a été suivi : paramètres liés à la levure : matière sèche et diamètre médian paramètres de la granulation : température de filière, diamètre des granulés. Les essais ont été réalisés sur une presse pilote Kahl L14-175, 3kW. Facteurs Niveaux Valeurs Matière sèche 2 95 93 (%) Diamètre des 4 1250 1050 865 570 sphérules (�m) Température 3 93 88 83 (°C) Diamètre 2 4 3,2 granulés (mm) Pour exemple, voici quelques résultats obtenus : Diamètre médian des sphérules MS Diamètre des T°C PERTES (IogCFU/g) granulés 865 93 3,2 83 0,6 1250 95 3,2 83 0,5 1250 93 4 83 0,4 865 93 4 83 0,6 570 95 3,2 83 0,4 865 93 3,2 88 1,4 1250 95 3,2 93 1 1050 93 4 88 0,7 570 93 3,2 88 1,5 1250 95 3,2 88 1 1250 93 4 93 1,4 1050 95 3,2 93 0,6 Ce plan a conduit à l'établissement d'un modèle expliquant les pertes en levures après granulation en fonction de ces 4 facteurs. L'équation mathématique du modèle complet est présentée ci-dessous (valable dans notre champ expérimental). X = -196,482 - 0,023 d + 2,256 (MS) - 14,793 T+ 3,046 D + 6,25.10"5 d (MS) + 0,001 d.T + 5,6310-5 d.T + 0,167(MS) .T - 0,036 (MS) .T - 0,023D.T + 4,06.10"6 d2 + 0,003 T2 Avec : X représente les pertes en microorganisme après granulation (logCFU/g) = logCFU/g initiales - logCFU/g d (�m) = le diamètre médian des sphérules MS (%) = la matière sèche des sphérules D (mm) = le diamètre des granulés T (°C) = la température de la filière Selon nos objectifs de stabilité - pertes inférieures à 11ogCFU/g - les couples [MSxDiamètre médian des sphérules] qui nous intéressent, doivent être définis en fonction des conditions de granulation appliquées. L'équation mathématique devient alors : 1,0 > -196,482 - 0,023 d + 2,256 (MS) - 14,793 T+ 3,046 D + 6,25.10-5 d (MS) + 0,001 d.T + 5,6310-5 d .T + 0,167(MS) .T - 0,036 (MS) .T - 0,023D.T + 4,06.10-6 dz + 0,003 Tz Il est important de noter que pour des conditions de granulation données, il existe une multitude de couples [MSxDiamètre médian des sphérules]. Voici quelques exemples de couples permettant d'avoir des pertes inférieures à 1,01ogCFU/g d'aliment : Température Diamètre Diamètre Matière sèche filière (°C) des granulés des sphérules des sphérules (mm) (�m) (%) 1000 94,0 85 3,5 1200 93,0 800 94,0 90 4 970 94, 8 92 4 865 94,8 950 94,7 Deux couples ont alors été retenus pour validation en granulation industrielle (selon les faisabilités de fabrication des produits) : Couple 1 : d = 950�m et MS = 94,7% Couple 2 : d = 865 gm et MS = 94,8% Description détaillée du procédé de préparation de la levure selon l'invention La levure est préparée sous forme d'une biomasse pure, elle est ensuite récoltée, mélangée avec des auxiliaires technologiques à raison de quelques pour cent de la matière sèche mise en oeuvre, extrudée et séchée par différentes techniques : fluidisation, séchage sur bande ou encore en tambour rotatif. A ù le diamètre médian (d): Une maille d'extrusion de 2mm est utilisée dans le but d'obtenir des sphérules ayant un diamètre médian de 9501am et une maille de 1.8mm afin d'avoir des sphérules ayant un diamètre médian de 8651,tm. B ù Le taux de matière sèche (MS) : Le procédé consiste en un séchage en tambour classique tel que décrit plus loin. Les temps de séchage ont été optimisés de manière à avoir les taux de MS désiré. Description du procédé de fabrication Nous distinguons plusieurs étapes de fabrication, une étape de déshydratation et une étape de séchage. A ù la déshydratation Cette étape permet d'obtenir une pâte de levure à 33% (plus ou moins 3%) de MS à partir d'une crème de levure à 18% (plus ou moins 2%) de MS. Principe : Est incorporée à la crème de levure une saumure (eau + Na CL) jusqu'à l'obtention d'une conductivité variant entre 150001.tS et 200001,tS. Cette crème salée passe ensuite sur un deshydrateur (filtre rotatif sous vide) sur lequel nous aurons au préalable réalisé une précouche de fécule (eau � fécule). Après le passage sur le deshydrateur, la crème de levure passe d'un état liquide à un état de pâteux (30 à 36% de MS). Cette pâte de levure est ensuite émiettée dans un granulateur (cylindre avec des bras mélangeurs brassant la levure et la poussant vers un autre cylindre au bout duquel se trouve une grille perforée à 2mm ou 1.8mm). Cette étape est primordiale dans l'obtention de la granulométrie souhaitée. La levure émiettée est ensuite transportée vers les organes de séchage. 2942939 io B- Le séchage Le séchage se fait de manière discontinue dans un cylindre rotatif horizontal muni de pâles brassant la levure et à l'intérieur duquel passe un courant d'air chaud. La température et le débit de l'air chaud sont fixés de manière à atteindre une température 5 levure de l'ordre de 43°C (+-1 °C) en fin de séchage. Une fois que la MS souhaitée est atteinte, la levure est vidangée vers un silo d'emballage. REVENDICATIONS1. Levure probiotique stable à la granulation ayant un taux de matière sèche (MS) compris entre 93,0% et 98,0% et un diamètre médian (d) des sphérules compris entre 500 et 1500�m, caractérisée en ce que le couple matière sèche / diamètre médian est choisi de manière à satisfaire l'équation suivante : X = -196,482 - 0,023 d + 2,256 (MS) -- 14,793 T+ 3,046 D + 6,25.10-5 d (MS) + 0,001 d.T + 5,6310-5 d .T + 0,167(MS) .T - 0,036 (MS) .T - 0,023D.T + 4,06.10-6 d2 + 0,003 T2 dans laquelle : - les pertes en levure après granulation X (logCFU/g initiales ù logCFU/g après granulation) sont inférieures à 1 log CFU/g d'aliment granulé, - le diamètre des granulés (D) exprimé en mm, est compris entre 2 et 12mm, - la température de la filière T (°C) est comprise entre 70 et 92°C. 2. Levure probiotique selon la revendication 1 caractérisée en ce que le taux de matière sèche est compris entre 93 et 96% et en ce que le diamètre médian des sphérules est compris entre 800 et 1200�m. 3. Levure probiotique selon la revendication 2 caractérisée en ce que le couple d/MS est choisi parmi les couples suivants : Diamètre Matière sèche des sphérules des sphérules (d) (�m) (%) 1000 94,0 1200 93,0 800 95,6 950 94,7 865 94,8 970 94,8 4. Levure probiotique selon la revendication 3 caractérisée en ce qu'elle présente le couple matière sèche/granulométrie préféré suivant MS à 94,7% et diamètre médian 25 des sphérules de 950�m. 5. Levure probiotique selon l'une des revendications précédentes choisie dans le groupe comprenant les levures du genre Saccharomyces, de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, ou du genre Kluyveromyces, de préférence de l'espèce Kluyveromyces marxianus et leurs mélanges. 6. Levure probiotique selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les levures correspondant aux souches choisies dans le groupe comprenant la souche Saccharomyces cerevisiae Sc47 déposée auprès du NCYC sous le numéro 47, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée auprès de la collection Pasteur (CNCM) sous le numéro I-1077, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée auprès de la collection Pasteur (CNCM) sous le numéro I-1079, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée auprès de la collection MUCL sous le numéro 39 885, la souche Saccharomyces cerevisiae déposée auprès de la collection CBS sous le numéro 39 493.94, la souche Kluyveromyces marxianus déposée auprès de la collection MUCL sous le numéro 39434, et leurs mélanges. 7. Levure probiotique selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle correspond à la souche Saccharomyces cerevisiae Sc47 déposée auprès du NCYC sous le numéro 47. 8. Utilisation de la levure probiotique selon l'une des revendications précédentes pour la préparation d'une composition probiotique destinée à l'alimentation animale et/ou humaine. 9. Composition probiotique (A) comprenant : - de 2 à 30 % en poids du poids total de la composition, de levure probiotique selon l'une des revendications 1 à 7, de 70 à 98 % en poids du poids total de la composition, d'un complément nutritionnel comprenant au moins un constituant choisi parmi les vitamines, les oligoéléments, les acides aminés, et autres additifs destinés à l'alimentation et/ou la santé animale ou humaine. 10. Composition probiotique (A) selon la revendication 9, comprenant de préférence : - de 5 à 20 % en poids du poids total de la composition de levure probiotique selon l'une des revendications 1 à 7,de 80 à 95 % en poids du poids total de la composition, d'un complément nutritionnel comprenant au moins un constituant choisi parmi les vitamines, les oligoéléments, les acides aminés, et autres additifs destinés à l'alimentation et/ou la santé animale ou humaine. 11. Procédé de granulation comprenant les étapes suivantes : - incorporation de la composition probiotique (A) selon l'une des revendications 9 ou 10, à un mélange nutritionnel adapté à l'application visée, - injection de vapeur d'eau à une température comprise entre 60°C et 85°C sous des pressions allant de 0,5 à 4 bars dans le mélange obtenu à l'étape précédente, - granulation par pressage à une température comprise entre 70 et 92°C pour l'obtention de granulés de diamètre (D) compris entre 2 et 6mm, et - refroidissement, caractérisé en ce que la température (T) de la filière de granulation et le diamètre des 15 granulés sont fixés de manière à satisfaire l'équation suivante : X = -196,482 ù 0,023 d + 2,256 (MS) ù 14.793 T+ 3,046 D + 6,25.10-5 d (MS) + 0,001 d.T + 5,6310-5 d.T + 0,167(MS) .T ù 0,036 (MS) .T 0,023D.T + 4,06.10-6 d2 + 0,003 T2 dans laquelle : - les pertes en levure après granulation X (logCFU/g initiales 1ogCFU/g après 20 granulation) sont inférieures à 1 log CFU/g d'aliment granulé. 12. Procédé selon la revendication 1l caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre dans les conditions suivantes : Température filière Diamètre Diamètre Matière sèche (°C) des granulés (mm) des sphérules (�m) des sphérules (%) 85 3,5 1000 94,0 1200 93,0 90 4 800 94,0 970 94,8 92 4 865 94,8 92 4 950 94,7 25 13. Granulé probiotique pouvant être obtenu selon la revendication 11 ou 12 comprenant - de 0,01 à 5 % en poids de levure probiotique selon l'une des revendications 1 à 5, et - de 95 à 99,9% en poids d'un mélange nutritionnel adapté à l'alimentation animale. 14. Granulé selon la revendication 13 dans lequel les pertes en levures probiotiques après granulation sont inférieures à 1 log CFU/g d'aliment granulé. 15. Utilisation d'une composition probiotique selon l'une des revendications 9 ou 10 pour l'alimentation animale ou humaine. 16. Utilisation de granulés selon l'une des revendications 13 ou 14 pour l'alimentation animale.