FR 2943535 A1 20101001 FR 0952072 A 20090331 La présente invention porte sur une nouvelle utilisation d'un extrait végétal obtenu à partir d'au moins une plante appartenant au genre Citrus, ou un hybride issu du croisement d'espèces végétales dont l'une au moins appartient au genre Citrus, comme agent cosmétique plus particulièrement pour produire un effet anti-âge au niveau cutané, 10 L'invention vise plus particulièrement un extrait d'une plante du genre x 0'troforttmel/a, par exemple un extrait de calamondin (x Citrofortunella microcarpa), en tant qu'agent actif cosmétique, ainsi que sur des compositions cosmétiques anti-âge comprenant ledit extrait et les méthodes cosmétiques utilisant lesdites compositions pour stimuler 15 l'activité de l'aconitase mitochondriale et obtenir un effet anti-âge au niveau cutané. ETAT DE LA TECHNIQUE Le vieillissement est un phénomène multifactoriel. existe 20 plusieurs théories du vieillissement parmi lesquelles la théorie des radicaux libres basée sur la nature chimique et la présence ubiquitaire de ces radicaux (Harman D., J. Geronto/., 1956; 11, 298-300). Ces radicaux libres, également dénommés espèces réactives de l'oxygène (ERS}) peuvent être d'origine exogène ou produits par 25 différentes processus cellulaires, notamment los de Ta respiration 'IlIt-C)(hHriCOdie �-dScr,-.? E. ot 2000.29 Au cours Cie ia respiration, une faible mais significative guantite total consommé par ia -haine _apinitltoire t COrl'i'Orti 30. (J qui peut conduire a la tormanon cllautirc 1 Oix1ygene COMMe le pe..1-0 iiiy/Cle. d'hydrogène i_DL':11 rOciftli \/eb aU> yClrCi lais et Te Hus ' ro.r0o,/nlf,Ote nitions am] ;'citlf c_ l'ADN et des lipides, ainsi qu'à des changements dans l'expression des protéines mitochondriaies et contribue au processus de vieillissement cutané (Hull-eau et aL,, E\-/) Getonto/, 2006, 31,653-657). Au cours du vieillissement, on observe une moindre efficacité du système de maintenance des macromolécules cellulaires et une augmentation constante de la production d'EROs au sein des mitochondries (Humphnes et ai,/ Free Radie Res, 2006; 40, 1239-1243). Or la mitochondrie joue un rôle important dans de nombreuses 10 fonctions cellulaires, parmi lesquelles la production du gradient de proton établi par la chaîne respiratoire et la production d'ATP par l'intermédiaire du cycle de Krebs (Liu et al., J. Neurochem., 2002 80, 780-782). L'accumulation des dommages oxydatifs et d'anomalies de structure entraîne pour la mitochondrie la perte progressive de sa 15 capacité à produire I'ATP nécessaire au fonctionnement et à l'intégrité de la cellule (FRENZEL et al., 1984). L'aconitase est une enzyme mitochondriale essentielle du cycle de Krebs, qui convertit le citrate en isocitrate. Elle joue également un rôle 20 dans la préservation de l'ADN mitochondrial. Par le biais de l'aconitase, la stabilité et la transmission héréditaire de cet ADN sont ainsi étroitement liées à l'état métabolique de la cellule (Cher et al, Pr-oc Nat/ Acad Sci S A, 2007; 104, 13738-13743). L'activité de l'aconitase dépend de l'intégrité de son centre fer- 25 soufre [4Fe-45]' (Fe/net, et a/., Fesch J. 19q3,* 14-/2-Hst9). L'attaque par des ovdants de son centre fer-souffre 1'4R-4'D entr,Ine la formation h un o fer soufi -JFe-t',- qui inactPie l'aconitase. , ,rte d'artnste de vaconitase mitochondriale est Un ar-r_, qui-Pn�dgeÇ, O n, In, UU UISSnniunt 30 IlUlUV De nnnnhrnu x d `',n' r,c3` elugeneidt^ ,( 3 duÇjn irnitJUOH Cu') OL3. Chute C.e 1 ,I(UVItU acrinitase dans mitoulinndus yeu L'inactivation de l'aconitase entraîne notamment un changement des ratios NADH/NAD+. En effet, la production de NADH par l'ut-ketoglutarate déshydrogénase et l'isocitrate deshydrogénase sera diminuée dans le cycle de Krebs du fait de la baisse d'activité de l'aconitase (cf Numphries et aL, supra; Nu/ton-Persson et a1., J Bic/ Chem, 2001,276, 23357-23361). Dans ces conditions d'accumulation de NAD+, on observe une augmentation des EROs à cause de l'auto-oxydation des métabolites réduits. Une telle inactivation de l'aconitase mitochondriale peut également initier une cascade de réactions oxydatives contribuant à l'accumulation de protéines endommagées (cf Humphries et aL, 2006 supra). Il est donc essentiel, au cours du vieillissement, de maintenir un degré suffisant d'activité pour l'aconitase mitochondriale dans les cellules cutanées, afin de prévenir l'accumulation des ces dommages cellulaires et de favoriser les processus de réparation et la réactivation de l'aconitase mitochondriale endommagée par ces EROs. RESUME DE L'INVENTION Les inventeurs de la présente invention ont mis en évidence que l'activité de l'aconitase mitochondriale diminue d'environ 85% dans des fibroblastes de derme humains en culture issus de donneurs de 70 ans en comparaison avec ceux issus les donneurs de 20 ans, sans changement d'expression de la protéine avec l'âge. Partant de ce constat, ils ont démontré qu'il est possible de protéger totalement l'aconitase mitochondriale et de rétablir son activité dans ces fibroblastes âgés mis en culture, par un traitement esdits fibroblastes à l'aide d'un extrait végétal obtenu à partir d'au moins une plante appartenant au genre Citrus ou un lar ride issu du croisement d espèces végétales dont l'une au moins c. ppar k..._'nt .''.i oenre C.Itr'us, et plus particulièrement un l x:tralt de emcndin, al_ rs pue mes-ne traitement apnliperès au/ fibre Uilaste d'un ne donneur ne moddie pa s l act lvlte de l'aconitase mitochondriale. Un tel effet de stimulation etonites .. dans E_ de KÀLas t i dans a préservation Cie i Al âJ mi tOchondrial, et gins! de préserver le fonctionnement, notamment métabolique des cellules cutanées. Il résulte du rétablissement de l'activité de l'aconitase mitochondriale des cellules de la peau de sujets âgés, un effet de 5 ralentissement du vieillissement cellulaire au niveau cutané se traduisant par un effet cosmétique anti-âge. Par ailleurs les inventeurs ont également mis en évidence, que l'extrait susmentionné permet une diminution significative du taux de 10 protéines oxydées intracellulaires qui augmente avec l'âge des donneurs, de sorte que cette augmentation est totalement réversée par le traitement de ces cellules par un extrait végétal tel que défini précédemment. Cette activité anti-oxydante de l'extrait de l'invention dont le lien avec l'activité de l'aconitase mitochondriale n'est pas établi, confère à 15 l'extrait de l'invention des propriétés supplémentaires particulièrement intéressantes dans le domaine cosmétique en tant qu'agent actif cosmétique pour améliorer ou restaurer l'éclat du teint de la peau. En effet, les protéines oxydées ont des propriétés optiques différentes des protéines normales. La technique du dichroïsme circulaire 20 a montré que la lumière que renvoie une protéine oxydée est différente de celle que renvoie une protéine normale. (Friquet et al, FEBS Lett, 1997, 405(1): 21-5). De ce fait, l'accumulation de protéines oxydées a un impact sur la peau, et en particulier sur le teint de la peau, en provoquant un dérèglement du cycle cellulaire au niveau cutané, aboutissant à une 25 altération de sa coloration naturelle, déterminée génétiquement, et sur la rra'rr [iPtIC)a visuelle LILI'Cla a un OhSerVaL'al Des travaux (non publiés a ce jour) ont été menés par la [Demanderesse pour étudier par brillancemétrie (appareil SAMBA fourr par u société BOSSA NOVA TECHNOLOGIE) ai- un modèle de peau 30 onstrultei, réfleaion de la lumiere sur la peau influence de /dation du la réfleyion lumineuse. Il a ainsi été montré que des peaux trait( ont une di)flcaion de la lumière totale lmimrtanta mi on' r r -HOM Le genre x 0"trofottunel/a regroupe des espèces végétales issues du croisement de plantes du genre Citrus avec celles du genre Fortunella. Parmi les espèces végétales appartenant au genre Citrofortunella, on peut citer de façon non limitative et à titre d'exemple x Citrofortunella floridana, x Citrofortunella microcarpa ou encore x Citrofortunella mitis Parmi ces espèces végétales, on choisit avantageusement le calamondin (x Citrofortunella microcarpa), également dénommé ro indifféremment kalamansi ou bien encore Citrus madurensis. La demande de brevet japonais JP 2003-199527 divulgue un aliment inhibant l'augmentation de la glycémie ou de la pression sanguine, ledit aliment étant caractérisé en ce qu'il contient un extrait du fruit entier 15 d'un hybride d'un citrus et d'un kumquat du genre Fortunella. Egalement, la demande de brevet japonais JP2005029491 divulgue une méthode d'extraction du limonène par distillation fractionnée du péricarpe de Citrofortunella mitis. A ce jour, il n'a pas été divulgué la remarquable activité d'un 20 extrait végétal obtenu à partir d'au moins une plante appartenant au genre Citrus ou un hybride issu du croisement d'espèces végétales dont l'une au moins appartient au genre Citrus, par exemple au genre x Citrofortunella, et en particulier un extrait de calamondin (x Citrofortunella microcarpa) vis-à-vis des protéines oxydées des cellules de la peau et de 25 l'aconitase mltochondriale. Extrait calamondin constitue au-Ica un nouvelagent actif dans domaine cosmetrue, et notamment tant qu'agent actJf ai crans une composition asmetmue visant a ralentir u att lec effets du vieillissement Cutané, natamnient (Jar onpldtion d un `tress oxydant su ICI peau. BUTS DE L'INVENTION L'invention a pour but principal notamment de fournir une nouvelle utilisation d'un extrait végétal obtenu à partir d'au moins une plante appartenant au genre Citrus ou un hybride issu de croisement d'espèces végétales dont l'une au moins appartient au genre Citrus, en tant qu'agent actif cosmétiquement acceptable, plus particulièrement pour produire un effet anti-âge au niveau cutané et/ou pour le soin de !a peau endommagée, notamment par les rayonnements ultraviolets, et/ou pour améliorer ou restaurer l'éclat du teint de la peau. L'invention vise plus particulièrement une nouvelle utilisation d'un extrait de plante appartenant au genre x Citrofortunella, et notamment d'un extrait de calamondin (Citrofortunella microcarpa), en tant que nouvel agent actif cosmétique, son utilisation en tant qu'agent actif dans une composition cosmétique, et une méthode de soin cosmétique utilisant ladite composition. La présente invention a aussi pour but principal une nouvelle utilisation d'un extrait de calomondin (x Citrofortunella microcarpa) en tant qu'agent actif dans une composition cosmétique comprenant au moins un excipient cosmétiquement acceptable. Cette nouvelle utilisation vise en particulier à prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou les traiter, notamment liés aux dommages causés par un excès d'EROs, ou pour produire un effet anti-âge au niveau cutané. Cette nouvelle utilisation vise en outre à améliores ou restaurer 25 l'éclat du teint de fa peau L'invention a également pour but principal une méthode srmii.tique utilisant ledit extrait dans une composition cosmetique en vue -i prevenir ou ralentir les 'effets du vieillissement cutané 't ou daiméliorer 30 ou restaurer l'éclat du teint de la peau, par application de ladite omposition comprenant extrait selon 'invention sur au moins une partie nnnci dl' corna ou du YISHge_ L'invention a aussi pour but principal de proposer l'utilisation d'un extrait de calamondln, comme agent actif dans une composition cosmétique anti-âge et/ou comme agent actif dans une composition destinée à améliorer ou restaurer l'éclat du teint de la peau. L'invention a égaiement pour but l'utilisation dudit extrait en tant qu'agent actif dans des compositions cosmétiques, et les méthodes de soin cosmétique utilisant lesdites compositions pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou en atténuer les effets et/ou pour améliorer ou restaurer l'éclat du teint de la peau. L'invention a encore pour but principal de fournir une méthode de soin cosmétique, utilisant ledit extrait, notamment pour réaliser les soins cosmétiques indiqués ci-dessus. Description de l'invention Un premier objet de la présente invention vise ainsi une nouvelle utilisation d'un extrait végétal obtenu à partir d'au moins une plante appartenant au genre Citrus ou un hybride issu de croisement d'espèces végétales dont l'une au moins appartient au genre Citrus, en tant qu'agent actif cosmétiquement acceptable, plus particulièrement pour produire un effet anti-âge au niveau cutané et /ou pour le soin de la peau endommagée, notamment par les rayonnements ultraviolets et/ou pour améliorer ou restaurer l'éclat du teint de la peau. Parmi les hybrides, on préfère particulièrement ceux appartenant au genre x C/trofortunie//a, résultant du croisement d'espèces v'é'gétales des genres C drus avec des espèces v detdies appartenant au genre Forturiella et pire, particulièrement le ccaalannondirl micro(uind) Un autre objet de id présente invention ussi une nuweiiiii utilisetior lien e rait de cdiamondin tant qu'agent actif cosmetiquei, plus pardculierement pour produire un effet anti-acie au niveau cutané ;u pnd! nfrelinria Olé ,st3it (qat da Le matériel végétal utilisé pour la préparation de l'extrait peut être la plante entière ou une partie de la plante telle que ta racine, le rhizome ou une partie aérienne, notamment la tige, les feuilles, les fleurs graines, les fruits ou les boutons floraux. Il peut être avantageusement constitué du fruit entier ou d'une partie du fruit d'une des plantes mentionnées précédemment. Un extrait préféré est obtenu à partir du fruit du calamondin. Préalablement à l'étape d'extraction elle-même, le matériel 10 végétal peut avoir été séché et/ou broyé, ou encore être à l'état fraîchement récolté. L'extrait peut être préparé par différents procédés d'extraction connus de l'Homme du Métier. L'extraction peut être réalisée sans solvant, par exemple par 13 pressage, notamment d'un fruit entier ou d'une partie d'un fruit. Toutefois, l'extraction est avantageusement réalisée par mise en contact du matériel végétal sélectionné avec un solvant polaire ou un mélange de solvants polaires, notamment par trempage, macération ou décoction dudit matériel végétal dans le solvant ou mélange de solvant 20 approprié. Selon une variante particulièrement avantageuse, l'extrait est obtenu à partir d'un suc de fruits d'une de ces plantes , notamment obtenu par pressage, par mise en contact avec un solvant polaire ou un mélange de solvants polaires, de préférence un milieu aqueux. ?5 Le solvant polaire ou le mélange de solvants polaires utilisé(s) pour i' ,,traction est avantageusement choisi parmi l'eau, un alcool en C1- n purtl. Lilicr choisi parmi l'ethanol ou le butanol, un glycol choisi 'e ilement pumii ie ]lycerol, le hL,tylc'! e lycoI et le fil coi I~ po, y glYeerol- ; et leur r c,? mé'iangc Iélang D ret -res ont des mélange_, d U nioins alçooi au moins un glycol et d'eau, comprenant au moins 10' gl~.'rnl lr solde Fiant constitue d'eau: Con O h ~!"i~flt~ r~~_ fi ' H dntS c niprend un m 3nù f ci ethun, L dans rapport 50/50 vlv, ou un mélange d'eau et de butylène glycol dans un rapport 50/50 v/v. Selon une mise en oeuvre préférée, l'extraction est avantageusement réalisée en milieu aqueux ou hydroglycolique. L'extraction peut aussi comprendre, de façon optionnelle, une étape supplémentaire consistant en un traitement du matériel végétal ou de l'extrait végétal, visant à le décolorer partiellement ou complètement, ou à le purifier, par exemple par un traitement du matériel végétal ou de 10 l'extrait par une solution d'un solvant ou d'un mélange de solvant apolaires ou par un traitement consistant en une mise en contact de l'extrait avec des particules de charbon actif, ou bien encore par un traitement à l'aide du CO2 à l'état supercritique. L'extraction peut être complétée par une étape d'élimination 15 partielle ou totale des solvants d'extraction. Dans le premier cas, on concentre généralement l'extrait jusqu'à obtenir un concentré aqueux dépourvu de quantités significatives de solvant organique, dans le second cas on obtient un résidu sec. De façon alternative, le produit de l'étape d'extraction peut être lyophilisé ou atomisé sous la forme d'une poudre. 20 La poudre peut être utilisée en l'état dans une composition cosmétique selon l'invention ou être dispersée ou dissoute dans un solvant polaire ou un mélange de solvants polaires ou encore être adsorbée sur un support solide. 25 Selon une variante de réalisation oie a présente invention, !'agent actif précité est délivré topiquement incorporé dans une composition cosmétique ledit agent actif etant présent en une quantité efficace pour prévenir ou retarder les signes de iieilllsistérémt cutané, ou atténuer les effets ; et/ou pour le soin de la peau endommagée, les ray(DUUUMUUt-S ultraviolet p(é r tirrieié r Ou stéésér eclat du teint de la peau. Ledit agent actif peut aussi T.2tICILP:'.'U-11 réé itlOrl Sur c3 peau du corp`: rie. Ainsi, l'invention vise également une composition cosmétique comprenant au moins un agent actif cosmétiquement acceptable et au moins un excipient cosmétiquement acceptable, caractérisé en ce que ledit agent actif est un extrait végétal obtenu à partir d'au moins une plante appartenant au genre Citrus ou un hybride issu de croisement d'espèces dont l'une au moins appartient au genre Citrus, notamment une plante appartenant au genre x Citrofortunel/a. La composition cosmétique selon l'invention comprend une quantité efficace d'extrait de l'invention pour obtenir l'effet recherché. Par "quantité efficace", pour tout aspect de l'invention, on entend une quantité qui est au moins égale à la quantité nécessaire pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou en atténuer les effets ; et /ou pour le soin de la peau endommagée, notamment par les rayonnements ultraviolets ; et/ou pour améliorer ou restaurer l'éclat du teint de la peau. La composition cosmétique selon l'invention comprend avantageusement de 0,001% et 5 % en poids, de préférence comprise entre 0,01 et 3 % en poids de la composition, en agent actif. Elles peuvent également avantageusement comprendre d'autres agents actifs présentant des effets cosmétiques similaires et/ou complémentaires à ceux de l'invention, notamment au moins un autre agent actif participant au maintien et/ou à l'intégrité de la structure de la peau, et au moins un excipient cosmétiquement acceptable qui peut être notamment choisi parmi des pigments, des colorants, des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des parfums, es lectrolytes, des ajusteurs dl p dl_' agents anti o ydants, 'Jes ce ns rvateur et leurs mélanges. l composition cosmétique >elon l'invention pr ur ét1 formulée sous forint', par emple, d'un serum, une lotion, une .'mulsion, par 'nipi Cr'_'nie dl] ben 'ncor' un h dn_ïo 'l en( un masque, , ou se présenter sous la forme d'un stick, ou encore dun patc' pré ente invention ., ncern enfin ont' utilisation de l` trait r1 l(!i~rl} �ri If ,eL3 r .ppantit,n e nn du vieillis ledit agent cosmétique stimulant l'activité de l'aconitase mitochondriale au niveau des cellules de la peau. L'invention porte également sur une utilisation de l'agent actif cosmétique de l'invention pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou en atténuer les effets et/ou destinées à améliorer ou restaurer l'éclat du teint de la peau. L'invention vise enfin une méthode de soin cosmétique destinée 1t~ à prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou à en atténuer les effets et /ou destinée au soin de la peau endommagée, notamment par les rayonnements ultraviolets et/ou destinée à améliorer ou restaurer l'éclat du teint de la peau, caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance sur au moins une zone concernée de la peau du 15 corps ou du visage, d'une quantité efficace d'au moins un agent actif cosmétiquement acceptable, ledit agent actif étant un extrait végétal obtenu à partir d'une plante appartenant au genre Citrus, ou un hybride issu du croisement d'espèces végétales dont l'une au moins appartient au genre Citrus, notamment une plante appartenant au genre x 20 eltrofortunella, et en particulier une plante de l'espèce végétale x Crtrofortunella microcarpa. Ladite méthode est de préférence caractérisée en ce que l'agent actif, incorporé dans un composition cosmétique comprenant en outre au moins un excipient cosmétiquement acceptable, est délivré 2 topiquement par application de ladite composition sur au moins une zone concernée d(' la peau du corps OU du visage La méthode dk' soin selon l'invention r >t: ne re caractci en que la conc:ent"atlon r=n agent actif est cemphse enta' (),OOL c. p i I de Id composition COSnnetlque. Dautres buts, caractéristiques et a\. antages de l'invention apparàtrnt clairement è narti,r de la d `crj pli'cat".. C)U ivre donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention. Dans la description, et en particulier !es exemples qui suivent, les pourcentages sont donnés en poids, la température est en degré Celsius, la pression est la pression atmosphérique, sauf indications contraires. Description des Figures 10 La Figure 1 est relative à la modulation de l'activité aconitase mitochondriale avec l'âge, mesurée après culture et traitement de fibroblastes humains issus de donneurs âgés de 20 et 70 ans, selon l'exemple 2 : (A) mesure de l'activité aconitase mitochondriale (cf. ex. 2, paragraphe 3) ; (B) dosage d'aconitase mitochondriale par Western-Biot 15 (WB) (cf. ex. 2, paragraphe 4). La Figure 2 est relative aux modifications du site actif de l'aconitase mitochondriale avec l'âge, mesurées après culture et traitement de fibroblastes humains issus de donneurs âgés de 20 et 70 ans, selon 20 l'exemple 2 ; Séparation et mesure des formes d'aconitase mitochondriale par Immunoélectrofocusing (IEF) puis Western-blot (ex. 2, paragraphe 5). La Figure 3 est relative à la mesure de l'activité aconitase mitochondriale mesurée après culture de fibroblastes humains issus de donneurs âgés de 20 et 70 ans, mis en culture selon l'exemple 2, puis traltPmont Par un extrait de calamondin 2,5 pendant 48 heures 2, paragraphe 3).. iteotjon proteines Zef 30 o b'i %t sur des ro-iit(-),oridrLes0jrtr f-PrOnIci5to; nia n s`sus de donneurs âges 20 et 70 an mis en toiture puis ait_' t de ctilampndin tifs , "qui séant EXEMPLES _Exemple 1 ù préparation d'un extrait de calamondin pour réaliser les tests On prépare l'extrait de calamondin (x Citrofortunella microcarpa) par pressage de fruits entiers de la plante. Après filtration puis centrifugation, la pulpe de fruits est extraite IO par un mélange d'eau et de polyglycérol. L'extrait obtenu contient 35-45% en poids de matière sèche. Cet extrait est utilisé tel quel pour réaliser les essais des exemples 2 et 3, et pour préparer des compositions cosmétiques, par exemple celle de l'exemple 4. 15 Exemple 2- Mesure d'activité de l'aconitase mitochondriale dans des fibroblastes humains. MA TERIEL ET METHODES 20 1. Culture des fibroblastes humains et traitement Milieux et réactifs 25 Milieu de cuivre des fibroblastes DMEM 1/ml de glucose Gibco) 1(l' SVF pyruvate de sodium 100mM (GU:Do()) 30 tic ",s geoitaotirt solution-ni ere est préparée par dilution so ution de.yta ait. dans milieu DMENl (? en pouti:ai s do mati f rd h ,"-(lLrr '(il(-',. 13 C: I .4 a û Cuiltu e cellulaire et traitement Fibroblastes humains en culture primaire provenant d'une plastie d'un donneur âgé de 20 ans et d'un donneur âgé de 70 ans, à passage 12. Ensemencement à 3o Fibroblastes 15.10 5 cellules/boite de 75 cm2 en triplicata dans 10 le milieu DMEM (10 ml/boite) Traitement à 35 La solution-mère est diluée dans le milieu DMEM pour atteindre les concentration mentionnées ci-dessous : 15 - extrait de calamondin à 2,S% en poids dans le milieu, soit environ l% en poids de matière sèche. Récupération des cellules à 37 Préparation des mitochondries 20 2 rinçages au PBS Sur lit de glace récupération dans 2 ml de Tampon d'homogénéisation. b - Isolation des mitochondries On part pour chaque donneur de 32. boites 1-75Les cellule à confluence sont Iavees deux fois avec, le tampon PBS pH 7.2 (tampon phosphate_ i, sodium pH 7.2 0,13 M de NnCI, mM de K.Clä 8 mM de NaHPO. NI de KHiiPO) (it sont décollges par grattage, puis 30 riintriftiei. g g 1500 g à 40C pendant 5 minutes. Le culot c(el lulaIre est In tampon PBS, centrifuge à nouveau puis mis dans glace. culot dan ,impoi cilhomogeneisatign -girl (0 mon n toi Fgg:,A A la nO.I LIPPFIc,- gpi i f(1H 3 CU10b)ä 10MUa(Snts'i sur a E-1CL-_' arien un harilOC)()f-h- r verre de 2 ml. La suspension cellulaire est centrifugée à 1000g à 4°C pendant 10 minutes. On centrifuge de nouveau le surnageant à 10000g à C pendant 15 minutes. Le surnageant contient la fraction cytosolique, le culot représente la fraction mitochondriale. La fraction mitochondriale est lavée 2 fois avec le tampon d'homogénéisation froid. On mesure la concentration de protéines selon la méthode de Bradford. 2. Dosage des protéines (méthode de Bradford); 1O a - Préparation de la gamme étalon Solution mère de BSA: 50pg/ml ( BIORAD ; protéine standard) Protéines BSA (pl) H20 (pl) (pg/tube) 0 0 800 1 20 780 2 40 760 3 60 740 4 80 720 100 700 6 120 680 8 160 640 Dans chaque tube, on additionne 200pl de bleu de Coomassie 15 G250. Le bleu est préparé extemporanément par dilution au 1/sème de la solution-mère. ~rcpar t~~~n dei ci( ii-ii a 20 ° si lu concentration p!oté que 3 mgii lier Ofi dilua, 'kticb. oelliilu r su 1 1.00ém - Dosage oies echantillons On homogénéise les échantillons par vortex, puis après 5 minutes au repos, on lit la densité optique au spectrophotomètre à la longueur d'onde de 595nm, 3. Dosage de l'activité aconitase mitochondriale a ù Réactifs 15 - Tampon TRIS 25mM pH 7,5 (Sigma) - citrate de sodium (Sigma) -Isocitrate dehydrogenase (Sigma) - MnCl2(Sigma) 20 b - Principe du dosage de l'activité aconitase matochondriafe quantifie l'activité de l'aconitase mitochondriale par la mesure de l'absorbante à 340 nm dans un milieu réactionnel contenant 0,2 mM NADPi, 5 mM de citrate de sodium et une unité/ml de isocitrate deshydrogénase dans 25 mM Tris-HCI plus 0,6 mM MnCl et 0,05 7o Triton x-100. Pour lE dosage, 50taq de protéines n itochondriales sont' aoutf es 5 1,0 nul de milieu réactionnel 3 250C. Les mesure s 3 340 nm ~n (rira astreres dans des cuvettes de 1. _m des interve les de 5 10 n i r l a i r ~ I ~ ( ? I ~ ~ NNADPH �+,22 ti 0 M (m C't cri nuopo tint I minutes et l'activité aconitase mitochondriale de ahsc nue 310 calcukte Selon o idb nt I ?n 5 t rI par l'[soditrate dehydrogenase d'une molécule de citrate en une molécule de NADPH. 4. Dosage de l'aconitase mitochondriale par Westernblot a - Principe du dosage L'électrophorèse des protéines est réalisée en minigel de 10 polyacrylamide de 1mm à 1,5mm d'épaisseur, en conditions dénaturantes et réductrices, en tampon discontinu selon la méthode de Laemmli (Nature, 1970; 227, 680). Les gels à 12% T, 2.7% C permettent de séparer les protéines de faibles poids moléculaires (20 à 120 kDa). Les gels à 8% T 2,7%C permettent de séparer les protéines à hauts poids 15 moléculaires (35 à 250 kDa). Les solutions nécessaires à l'élaboration des gels sont présentées en annexe A. Gel de séparation 20 Le gel est coulé au moins deux heures avant la migration. Le coulage du gel est réalisé à l'aide d'une pipette jusqu'à environ 0,5 mm du bas du peigne prévu pour le gel de concentration. On ajoute de l'éthanol absolu en surface pour obtenir une ligne de base régulière (� lml /gel). -f)Lcje ehtratteri éthanol st élimine. On couic 5ral gel laldc Pasteur de transfert en polyéthylène (Blorad) puis les cjne sont InSerés, Le C c est pOlyMedSe dptI'S urge heure. é Preparation den écirlaint . _ mite( une ce' de pu ryei'~lyluni de Lions réductrice H 30 2943535 1.8 Laer-1 mli. Les échantillons (25-40pg des protéines) sont réduits pendant 5 minutes à 100°C dans le tampon de dépôt. Après dépôt des échantillons et des marqueurs, (a migration s'effectue à 200V pendant 1 heure, dans un tampon 50 mM Tris-HCI, 100 mM glycine, 2 mM EDTA pH 8.4 contenant 0,1% de SDS. c Eléetrophorèse Dépôts 10 Les échantillons sont chauffés à 95°c pendant 5 min. Le volume à déposer est fonction de la quantité de protéine désirée (volume maximum = 25 pL pour un gel de lmm et 40pL pour un gel de 1,5mm ). 10 pg de protéines, correspondant à 10 pl, est la quantité de référence, elle est ensuite adaptée selon l'expression de la protéine 15 ciblée. Les peignes sont retirés. On verse 200 ml du tampon de migration 1X sur les gels, dans le compartiment central entre les deux gels, puis dans la cuve au quart. On dépose les échantillons à l'aide d'une pointe Affilée adaptée 20 sur la micropipette ainsi que 10 pl de témoins précolorés à bas poids moléculaires (Biorad, Prestained SDS-PAGE standards Low Range) ou à haut poids moléculaires (Amersham, Full Range Rainbow). Migration 25 L'électrophorèse est réalisée à température ambiante, à 200V. Celle-, i est. arrêtée lorsque le front de migration sorti du q 'I (E 'ciron 40 minutes migration ILOU5 30 Deux feuilles ciDaisseti- de papier tiitre (-3iorad et membranes de ceiluiose (Blorad) sont trempées dans le tampon de triijosyeT,rt Tov(:01n (DA/AS-. IO�). 76(0) rr Tintin x.e p), humidifiée er;t OOOOq( Une fois la migration terminée, le gel de concentration est éliminé et le gel de séparation est déposé sur la membrane de cellulose. La membrane comprenant le gel est déposée sur la feuille de papier filtre. La deuxième feuille de papier filtre est déposée sur le gel. Au cours de la fabrication du "sandwich", on prend soin d'éliminer toutes bulles d'air à l'aide d'une tige en verre pour ne pas gêner le transfert. L'appareil est fermé par un couvercle constitué de la cathode. Le transfert de protéines est réalisé à 10 V pendant 90 minutes. 10 Marquage au rouge Ponceau Pour vérifier la qualité du transfert, les protéines sont colorées au rouge Ponceau (Sigma). La membrane de cellulose est rincée à l'eau milliQ puis trempée une fois dans un bain au rouge Ponceau pendant 10 minutes sous agitation. Elle est ensuite lavée dans plusieurs bains d'eau 15 milliQ jusqu'à ce que la coloration ne subsiste que sur les bandes protéiques. La membrane est insérée dans un plastique et scannée. Les bandes protéiques peuvent être quantifiées pour déterminer la totalité des protéines transférées. 20 Blocage des sites de liaisons aspécifiques La membrane est placée sous agitation pendant une nuit à 4°C ou 90 minutes à température ambiante dans une solution de blocage des sites de liaisons aspécifiques constituées de 5% de lait écrémé (Régilait) dans du tampon PBS-T (cf. annexe B) (20ml/membrane). Inini hl T-10ÇIEri11eÇtiQn Les reféni...2nces dilutions optimales de; anticorps sont dOrIrkE. en annexe L. Apr _s bkXiiagia des sites non membru ne est 30 -àp cernent dans du PBS-T. Cette membrane est à r à à 'anticorps primaire dilue à la concentration optimale dans du Elle est ensuite rincée rapidement puis trois fois 10 minutes dans du PBS-T afin d'éliminer l'excès d'anticorps libre non fixé. Puis elle est mise en contact avec l'anticorps secondaire adéquat couplé à la peroxidase dilué dans le PBS-T ou le lait 5% (5ml) sous agitation à température ambiante. Après 45 minutes d'incubation, elle est rincée rapidement deux fois, puis lavée 5 fois pendant 5 minutes avec du tampon PBS-T et une dernière fois dans du PBS 1X. Egouttée, elle est placée sur un film alimentaire (SARAH), coté protéine vers le haut. La membrane est révélée à l'aide d'un kit de détection par chimioluminescence (Amersham; ECL Western blotting), hautement sensible utilisant le luminol comme substrat de la péroxydase. Sous l'action de la péroxydase et d'un amplificateur, le luminol est oxydé et passe dans un état excité transitoire. Le retour à l'état fondamental se fait par émission de photons qui impressionnent un film autoradiographique placé sur la membrane. On mélange 1 ml de chacune des deux solutions du kit de détection, soit 2 ml, volume minimum nécessaire au recouvrement de la membrane. Aussitôt, le mélange est versé uniformément sur la membrane et laissé en contact pendant exactement une minute à température ambiante. La membrane égouttée est enfermée sous film alimentaire Saran et mise sous cassette à l'abri de la lumière, puis recouverte d'un film autoradiographique pré-flashé (Amersham, Hyperfilm ECL). Après 5 minutes d'exposition, le film autoradiographique est révélé. Un nouveau film peut être exposé si nécessaire, pour optimiser le signal désiré (jusqu'à l h de temps d'exposition). Les bandes sont quantifiées grâce au logiciel rie t 5- Dosage de I'aconitase mitochondriale par IEF C , tte toc h ique ne r ni et de épar r r de Va con t mitochondriale, lu forme active [4Fe-dSI tu for"C?l ' Inactive r C fr mo \vme_ coton IeLlr purot .o ''t ct. ;7i_tP 5;(1 tri 1 1EF H ! (Lu lorad ), L 3 nl r; ration S E'jtectut_' Jans e 'Cuo cntri( (Biorad) pendant 1 heure à 100V 1 heure à 250V et 30 minutes à 500V. Après la migration, le gel est transféré sur une membrane de nitrocellulose et un Western-blet anteaconitase mitochondriale est réalisé conformément au protocole décrit au paragraphe 4. RESULTATS L'activité aconitase mitochondriale a été mesurée après isolation des mitochondries à partir de ces cultures cellulaires. On met en u) évidence une baisse de l'activité aconitase mitochondriale avec le vieillissement. Ces mesures indiquent une diminution d'environ 85% de l'activité de l'aconitase mitochondriale dans les mitochondries des donneurs de 70 ans en comparaison avec les donneurs de 20 ans ( cf 15 figure 1). Cependant, il n'y a pas de différences significatives dans l'expression de l'enzyme, c'est-à-dire au niveau de la quantité d'enzyme présente dans les jeunes et dans les vieux fibroblastes ( cffigure 1). 20 Pour vérifier si la baisse de l'activité de l'aconitase mitochondriale mise en évidence cyhez les fibroblastes âgés n'était pas due à des dommages oxydatifs au niveau du centre Fe-5 de l'enzyme, on a effectué une séparation des trois formes structurales de l'enzyme (apoenzyme, forme active et forme inactive) selon leur point isoélectrique, 25 par isoelectrofocusing (IEF). A l'aide de cette méthode, on met en eVInun(é Une différence avec rage au niveau de 1 apOnn7yrné mals II aucune rrfferen(e env rhveau' des autres formes c/r äheh, dTl. t'lous avons montré que 1 acon1tuse mito(hondnule ,w yan ,en diminuer avec l'ace dans (Ë,=, fi brobiastes de derme humains en 30 uitui _. Cette d 'd Lti \, U.e S 'd r C 0 Mnnnnnni- un unC!e ent pl -n)bK3ii de 3 nrij .nnu avec éQe. sultet, non Mn( hOn"ind fibroblastes de derme issu de ces donneurs d'âge différents (cf figure 3 et tableau]). Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à l'activité de l'aconitase mitochondriale dans des fibroblastes non traités d'un jeune donneur (20 ans), qui constitue le 100%. non traité Calamondin (%) 20 ans 100 97 70 ans 18 108 Tableau 1 : Activité de l'aconitase mitochondriale de fibroblastes de donneurs âgés de 20 ans et 70 ans. 10 Ces résultats indiquent qu'un traitement par ces extraits permet de protéger l'aconitase mitochondriale de l'action d'oxydants. On n'observe par contre aucune activation significative de l'aconitase mitochondriale, 48 heures après traitement des fibroblastes de donneurs âgés de 20 ans avec ces extraits. En revanche le même traitement sur des 15 fibroblastes de donneurs âgés de 70 ans résulte en une totale protection de l'enzyme Exemple 3 - Mise en évidence des protéines oxydées par OXYBLOT 20 a -Principe On met. en étildonce .q groupements carbonylc. (marqueurs de qtloiiq introduits dans les chalnes protéiques par qntqisrmédrdIre 25 RUS ou d'autres mecanismes d'cx"ydut.icn tels que la ltil Ici 1100peOxygatlon, selon `~l~'Ccici no tc si-? 1111000. 1 qois;ui iq d h 30 uiritr \, ,yrimicilil (L)NPH) pcqu donner usa ' 110,. échantillons DNP-dérivés sont séparés sur un gel de polyacrylamide par électrophorèse. La séparation est suivie d'un transfert sur une membrane de nitrocellulose comme pour le Western Biot. La membrane est ensuite incubée en présence du premier anticorps, spécifique de la molécule de DNP liée aux protéines possédant un groupement carbonyle. L'étape suivant est l'incubation avec l'anticorps secondaire anti-anticorps primaire (anti-lapin) et qui est couplé à la peroxydase. La révélation se fait à l'aide des mêmes réactifs utilisés en Western Blot. 10 b û Protocole Tous les réactifs utilisés proviennent du kit OXYBLOT (Appligene-Oncor, France). 15 Dénaturation des échantillons On utilise une quantité de protéines comprise entre 15-20 pg, correspondant à 2 pg par dépôt provenant des lysats de mitochondries contenues dans 5 pl d'extrait cellulaire obtenu selon l'exemple 2 (Matériel et méthodes, paragraphe 1.). On ajoute 10 pl de DNPH à concentration 20 lx, puis 5 pl de SDS à 12 % ; on laisse agir 15 min à température ambiante. On ajoute 7,5 pl de solution neutralisante et le tampon d'échantillon à lx. Les échantillons sont prêts à être déposés. Les protéines sont enfin séparées par électrophorèse sur gel d'acrylamide SDS 12% et transférées sur membrane de nitrocellulose. 25 E'E j fion_ t 'e Kit ECL (Arnlersharn) pour re _ler O per l'aide d ion RESULTATS On observe une augmentation des protéines oxydées avec l'âge (figure 4). Cependant le traitement des fibroblastes âgés par l'extrait de calamondin permet de revenir à un niveau de protéines oxydées correspondant à celui des fibroblastes jeunes. Ces résultats démontrent que l'extrait susmentionné possède une activité anti-oxydante vis-à-vis des protéines oxydées de la peau. Exemptes de formulations cosmétiques, Exemple 4: composition cosmétique comprenant un 10 extrait de fruits de calamondin. L'extrait obtenu à l'exemple 1 est utilisé tel quel dans la composition cosmétique ci-dessous : - Extrait végétal de Ça/amandi ou Ça/amans/s (EX1) 0,1 % Tensio actif (Arlacel� 165 VP) 5 % 15 - Alcool cétylique 95% 1 % Alcool stéarylique 1 % Cire d'abeille 1,5 % Huile (Perleam(D) 8,5 % Tri caprate/caprylate glycerides 3 % 20 - Huile silicone (diméthicone 100 CS) 1 % - Polymère (Keltrol�) Soude EDTA tetrasodique poudre Conservateurs 25 - Eau composition cosmétique est prepa! ee der manière habituelle, bien connu,. d o l'homme de l'art, par mclange des di ers composants en ius eurs 't 3p0 . Lette composition peut Jtre uppiiqut'e sur ia pe lu du `. sdge quotidiennement pendant plusieurs semaines pour obtenir iras effets tiä~ e~•, ont ~n Dr ce mn"i ~r~t inc act~.~ atant. 0,35 % 0,04 % 0,1 % 0,5 % qsp 100 ANNEXE A 1 - Tampons et solutions_u t illsées pour les gels d'électrophorèse en_conditions dénaturantes et réductrice, en tampon discontinu Solution de monomères: acrylamide / Bis-acrylamide, 30% T, 2,67% C (Biorad) on de gel de résolution:Tris-Ha_ 1,5M pH 8,8. - 18,15g de Tris base(Sigma) pour 100 ml d'eau distillée - pH ajusté à 8,8 avec de l'HCI 12N Tampon de ge de concentratiomTris-HCL 0,5M pH 6,8. - 6g de Tris base pour 100 ml d'eau distillée - pH ajusté à 6,8 avec de l'HCI 12N 15 Tampon de migration 10X: Tris 0,25M pH 8,3 , glycine 1,92M; SDS 1% 10 - Tris base - Glycine(Research Organics Inc) - SDS 10% (Sigma) - Eau distillée 12 g 57,6 g 40 ml qs 400 ml Persu/fate d'ammonium (NH4)25208: (Sigma) 0 p/v), soit 100 plg7ml Tampon d'échantillon réducteur Laenunfi 2X:. Tris-HU pH6, ; SDS 2,3 ; Glycei 1000 . Bleu de 0iion-lophénol 0,o2si -tampon de ge - SDS 10% - Glycérol - Eau distillée 6,8 6,25 ml 11,50 ml ml qs 50 ml de concentration Tris 0, p Bleu de bromophénol 10X ( solution saturée): On disperse une pointe de spatule de bleu de bromophénol dans 5 ml de Tampon Laemmli 2X. Après agitation, sonication puis centrifugation, on récupère le surnageant. II - Gels d'électrophorèse O -Préparation du gel de résolution à 12% T Solutions Volumes Concentrations pour 2 gel (10m° finale Solution de monomère 4,0 ml 12%T; 2,7% C Tampon de gel de résolution 2,5 ml 0,375M SDS 10% 100 pl 0,1% Persulfate d'ammonium (10%) 50 pl 0,05% TEMED(Research Organics Inc) 5 pl Eau distillée 3,4 ml -Préparation du gel de concentration à 8% T Solutions Volumes Concentrations pour 2 gel s (5ml) finale Solution de monomère 2 ml 8%T; 2,7% C Tampon de gel de résolution 1,25 ml 0,175M SDS IO', 50 pi 0, Persulfate d'ammonium (le ,2) 25 pl FErIEDi,,ésearch Organics Inc) 5 pl Eau cilutIllee ) mi _u ANNEXE B Solutions pour le transfert et l'immunoclétection Tampon de transfert de Towbin : Tris-HCL 25mM, pH 8,3 ; Glycine 192 mM; 20% Méthanol - Tris base 3,03g Glycine(Research Organics Inc) 14,4 g à dissoudre dans 100ml d'eau distillée - Méthanol 200 ml - Eau distillée qs 1000 ml Tampon PBS-T Dilution au 1/10 du PBS 10X (Invitrogen) + Tween 20 à 0,1% (Sigma) Rouge Ponceau (Sigma) Solution à 0,1% (p/v) dans une solution d'acide acétique à 5% 1.5 ANNEXE C Liste anticorps primaires et secondaires Anticorps référence dilution Temps d'incubation Anti-Aconitase Non commercial. 1/1000' 1 heure humaine (cf ref. ci-desssous) Anti rabbit IgG HRP Amersham 1/50000e.m 1 heure e Ref. : Bulteau et al. Biochemistry, 2003; 42, 14846-14855 REVENDICATIONS1. Utilisation d'un extrait végétal obtenu à partir d'au moins une plante appartenant au genre Citrus ou un hybride issu de croisement d'espèces végétales dont l'une au moins appartient au genre Citrus, en tant qu'agent actif cosmétiquement acceptable, plus particulièrement pour produire un effet anti-âge au niveau cutané et /ou pour le soin de la peau endommagée, notamment par les rayonnements ultraviolets et/ou pour améliorer ou restaurer l'éclat du teint de la peau. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'extrait est obtenu à partir d'une plante appartenant au genre x Citrofortunella, en particulier un extrait de calamondin (x Citrofortunella microcarpa). 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un extrait de la plante entière ou d'une partie de ladite plante, telle que la racine, le rhizome ou une partie aérienne, notamment la tige, les feuilles, les fleurs, les graines, les fruits, les boutons floraux, le fruit entier ou une partie du fruit. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée 20 en ce que l'extrait est obtenu à partir du matériel végétal séché et/ou broyé ou à l'état fraîchement récolté. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 a 4, caractérisée en ce que l'extrait est obtenu à partir de fruits de calamondin, par pr 6S')dge 25 Utilisation selon i..ine des revendications 1 à Cidi-CtieiiiiS(iie en { que l'.Xitrait est obtenu partir d'un SUC de tr ails diUne de CeS pi n s, notamment Obtenu pUr preSSE3 par 'mise en contact av°C 'un oinge de suivant'- p et areS Utilisation selon la revendication 6 caracten en ce eue le peu' est parmi ea'ci _apréférentiellement parmi l'éthanol ou le butanol, un glycol choisi préférentiellement parmi le glycérol, le butylène glycol et le propylène glycol, le polyglycérol-3 ou leur(s) mélange(s). 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que les mélanges préférés sont des mélanges d'au moins un arcool et d'eau ou d'au moins un glycol et d'eau, comprenant au moins 10% v/v d'alcool ou de glycol, le solde étant constitué d'eau. 9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le mélange de solvant comprend un mélange d'eau et d'éthanol dans un 10 rapport 50/50 v/v ou un mélange d'eau et de butylène glycol dans un rapport 50/50 v/v. 10. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'extraction est réalisée en milieu aqueux ou hydroglycolique. 11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, 15 caractérisée en ce que l'extrait se présente sous la forme d'une poudre après lyophilisation ou atomisation du produit de l'étape d'extraction. 12. Utilisation de l'extrait tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes, en tant qu'agent actif délivré topiquement incorporé dans une composition cosmétique, ledit agent actif étant 20 présent en une quantité efficace pour prévenir ou retarder les signes de vieillissement cutané, ou en atténuer les effets ; et /ou pour le soin de la peau endommagée, notamment par les rayonnements ultraviolets et/ou pour améliorer ou restaurer l'éclat du teint de la peau. 13. Composition cosmétique comprenant au moins un agent i osniétiquernent acceptable et au moins un cipient nCY)MotiqULMC'nt acceptable, caractérise c'n ce {ue ledit acient actit est un ,tra oegotal obtenu a partir d'au moins une plante appartenant au o Citrus d H y hi do ':s d Cru S