FR 2946984 A1 20101224 FR 0954288 A 20090623 BIOREACTEUR POUR CULTIVER DES CELLULES DOMAINE TECHNIQUE GENERAL La présente invention concerne la culture in vitro de cellules Plus précisément, elle concerne un bioréacteur pour cultiver in vitro des cellules alimentées par un milieu nutritif, par exemple pour l'évaluation toxicologique de substances. ETAT DE L'ART L'évaluation toxicologique d'une substance peut être réalisée sur différents modèles expérimentaux, en particulier : - les animaux, on parle de test in vivo - les cultures de cellules, on parle de test in vitro. Bien que l'utilisation de modèles in vitro soit de plus en plus fréquente, un complément expérimental in vivo est souvent requis, nécessitant le sacrifice d'un nombre important d'animaux. Depuis des années, des pressions à la fois économiques et éthiques apparaissent au niveau international pour proposer des alternatives à l'expérimentation animale. Ainsi, les modèles in vitro seront de plus en plus utilisés pour la recherche, le développement et l'évaluation de la sécurité d'une substance comme un xénobiotique, un cosmétique, un médicament ou plus généralement tout principe actif. Pour ce faire, il est nécessaire de disposer de bioréacteurs reproduisant un environnement favorable au développement et à l'organisation de cellules, 30 proche de celui d'un tissu ou d'un organe animal ou humain. Le document � Développement et caractérisation d'une puce à cellules pour le criblage d'agents toxiques � décrit un bioréacteur en PDMS (pour PolyDiMéthylSiloxane) comprenant une chambre de culture pour le développement de cellules. Le bioréacteur comprend un point d'entrée de fluide et un point de sortie de 5 fluide pour permettre le passage d'un fluide nutritif nécessaire au développement des cellules. On entend par chambre de culture une chambre comportant une paroi supérieure et une paroi inférieure présentant des microstructures. 10 Dans ce document, les microstructures sont en forme de plots et de flèches d'une hauteur d'environ 100pm, et définissent, sur la paroi inférieure de la chambre de culture : - des chambres de dimensions micrométriques désignées par le terme 15 � microchambres � dans la suite - des canaux de dimensions micrométriques désignés par le terme � microcanaux � dans la suite et formant un réseau de circulation de fluide reliant le point d'entrée de fluide à chaque microchambre, et chaque microchambre au point de sortie de fluide, de sorte que le fluide nutritif 20 circule dans chaque microchambre. Les cellules, alimentées par le fluide nutritif, sont destinées à se développer en particulier dans les microchambres, plus particulièrement encore au niveau de zones partiellement protégées du fluide Dans ces zones protégées, le fluide est ralenti par des microstructures en forme de flèche ce qui permet aux cellules de s'agréger sans être entraînées par le fluide. 30 Un tel bioréacteur présente ainsi une géométrie favorable au développement de cellules, en particulier par rapport aux dispositifs de culture plans comme les boites de Pétri. 25 Les différentes dimensions de ce bioréacteur sont les suivantes : - hauteur entre parois inférieure et supérieure : 300pm - microchambres en forme de pavés de 300pm x 300pm x 100pm - microcanaux de 400pm x 115pm x 100pm - surface totale de la paroi inférieure : 1.2 cm2 - volume total de la chambre : 30pL, soit 30mm3. Ce bioréacteur présente des inconvénients, notamment pour la culture de cellules hépatiques. En effet, les cellules hépatiques ont une forte activité lorsqu'elles s'agrègent en sphéroïdes de l'ordre de 100 à 200pm de diamètre. Or, avec ce bioréacteur de l'art antérieur, un sphéroïde de cet ordre de grandeur est fortement susceptible d'être arraché par la circulation du fluide. En outre, la dimension des microcanaux, en particulier leur largeur de 115pm, ne permet pas la migration de morceaux d'organe de foie à travers ce type de réseau. 20 De plus, une microchambre de côté long de 300pm impose un confinement ne permettant pas une activité optimale des cellules hépatiques développées dans la microchambre. PRESENTATION DE L'INVENTION 25 L'invention propose de pallier au moins un de ces inconvénients. A cet effet, l'invention propose un bioréacteur pour cultiver des cellules comprenant : - une chambre de culture comportant une paroi supérieure et une paroi inférieure présentant un ensemble de microstructures comprenant des 30 micromurs et des microplots, l'ensemble de microstructures définissant, sur la paroi inférieure de la chambre de culture, des microchambres et des microcanaux, - une entrée de fluide connectée à au moins une partie des microcanaux, et 15 - une sortie de fluide connectée à au moins une partie des microcanaux, les microcanaux formant un réseau reliant l'entrée de fluide à chaque microchambre et chaque microchambre à la sortie de fluide, de sorte à permettre une circulation de fluide dans les microchambres, les microchambres présentant une dimension de longueur et une dimension de largeur par rapport à une direction de circulation du fluide chacune comprise entre 500pm et 550pm. L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques 10 suivantes, prises seules ou en une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : - les microcanaux présentent une dimension de longueur par rapport à une direction de circulation du fluide comprise entre 700pm et 750pm et une dimension de largeur par rapport à une direction de circulation du fluide 15 comprise entre 200pm et 250pm, - les microchambres comprennent une zone d'entrée et une zone de sortie, les micromurs comprenant des zones anguleuses de part et d'autre de la zone d'entrée et de la zone de sortie d'au moins une chambre, les zones anguleuses présentant une dimension de largeur par rapport à une direction 20 de circulation du fluide comprise entre 100pm et 120pm de sorte à définir, de part et d'autre de la zone d'entrée de ladite chambre des zones partiellement protégées, - la chambre de culture présente une surface de culture dans un rapport avec une surface globale de la paroi inférieure compris entre 90% et 110%, 25 et - la chambre de culture présente une surface de culture dans un rapport avec un volume global disponible de fluide de la chambre compris entre 4/mm et 6/mm. L'invention présente de nombreux avantages. 30 L'invention permet un développement optimal de cellules, en particulier de cellules hépatiques, dans les microchambres et les microcanaux de la paroi inférieure de la chambre. Le bioréacteur selon l'invention permet une migration de morceaux d'organes de foie dans le réseau de microcanaux. En outre, le bioréacteur selon l'invention présente des zones protégées favorisant une agrégation des cellules hépatiques en sphéroïdes de l'ordre 5 de 100pm de diamètre. PRESENTATION DES FIGURES D'autres caractéristiques, buts et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit, qui est purement illustrative et non limitative, et qui doit 10 être lue en regard des dessins annexés sur lesquels : - la figure 1 représente, de manière schématique, un bioréacteur en coupe en vue de face selon une réalisation possible de l'invention ; - la figure 2 représente une vue au microscope de microstructures de la paroi inférieure de la chambre du bioréacteur selon une réalisation possible 15 de l'invention ; - la figure 3 représente un bioréacteur en coupe en vue de haut selon une réalisation possible de l'invention ; et - la figure 4 représente, de manière schématique en vue de haut, des microstructures de la paroi inférieure de la chambre du bioréacteur, ainsi 20 que des dimensions de ces microstructures selon une réalisation possible de l'invention. DESCRIPTION DETAILLEE 25 En référence à la figure 1, un bioréacteur 100 selon l'invention comprend une chambre 10 de culture comportant une paroi supérieure 12 et une paroi inférieure 11. La chambre 10 de culture est isolée par une enceinte 40, préférentiellement 30 constituée de matériau poreux à l'oxygène comme le PDMS. L'enceinte peut comprendre une partie inférieure et une partie supérieure (non représentées) hermétiquement assemblées. La paroi inférieure 11 a sensiblement une forme de rectangle définissant une longueur et une largeur. A titre d'exemple non limitatif, la longueur et la largeur de la paroi inférieure peuvent mesurer respectivement 13.25mm et 11.23mm Dans la suite, on définit l'horizontal comme parallèle à la paroi inférieure 11 et la verticale comme orthogonale à la paroi 11. Ainsi, on dira que la paroi inférieure 11 est horizontale. Cette définition a pour but de clarifier la suite du texte et ne doit en aucun cas être interprétée comme une limitation de la position d'utilisation du bioréacteur selon l'invention dans un repère de quelconque. 15 La paroi inférieure 11 présente un ensemble de microstructures représentées en trois-dimensions sur la figure 2. L'ensemble de microstructures comprend : - des plots 114 de dimensions micrométriques désignés par � microplots � 20 dans la suite, et - des murs 113 de dimensions micrométriques désignés par � micromurs � dans la suite. On entend par � surface globale � de la paroi inférieure 11 la surface 25 qu'aurait la paroi inférieure 11 si on projetait les microstructures sur la paroi 11 dans la direction verticale. Il s'agit de la surface du rectangle que forme la paroi 11 comme représenté sur la figure 1. Les micromurs 113 présentent des parties en forme de flèche et des parties droites, et s'étendent sur toute la longueur de la paroi inférieure 11. 10 30 Un micromur 113 définit des microchambres 110 au niveau de ses parties en forme de flèche en complémentarité avec un autre micromur 113, et des microcanaux 112 au niveau de ses parties droites en complémentarité avec des microplots 114, comme représenté sur la figure 2. Chaque microplot 114 définit deux microcanaux situés de part et d'autres du microplot, chacun en complémentarité avec un micromur. La paroi inférieure 11 de la chambre de culture 12 comprend ainsi des 10 lignes périodiques sur toute sa largeur, chaque ligne comprenant une alternance de microchambres 110 et de microcanaux 112, deux lignes étant séparées par un micromur 113. A titre d'exemple non limitatif, chaque ligne peut comprendre 9 15 microchambres 110 et 8 plots 114 ù correspondant chacun à deux microcanaux 112 ù en alternance, la paroi inférieure 11 comprenant un total de 15 lignes. Les microstructures permettent une organisation des cellules en trois 20 dimensions, à condition de les alimenter en fluide nutritif contenant des éléments nécessaires au développement des cellules, en particulier de l'oxygène ou du glucose. A cet effet, le bioréacteur selon l'invention comprend en outre une entrée 21 25 de fluide et une sortie 31 de fluide comme représenté sur la figure 3. L'entrée 21 de fluide est connectée à au moins une partie des microcanaux 112 par l'intermédiaire d'un réseau 22 d'entrée. 30 Le réseau 22 d'entrée comprend des ramifications successives pour alimenter chacune des lignes de la paroi inférieure 11 de la chambre de culture à partir de l'entrée 21 de fluide.5 Le fluide nutritif est destiné à circuler au niveau des microcanaux 112 et des microchambres 110, et au dessus des microstructures dans la chambre 10 de culture pour alimenter les cellules en développement. La sortie 31 de fluide est connectée à au moins une partie des microcanaux par l'intermédiaire d'un réseau 32 de sortie. Le réseau 32 de sortie comprend des points de confluence successifs pour relier chacune des lignes de la paroi inférieure 11 de la chambre 10 à la 10 sortie 31 de fluide. Ainsi, les microcanaux 112 forment un réseau reliant l'entrée 21 de fluide à chaque microchambre 110 ù par l'intérmédiaire du réseau 22 d'entrée ù et chaque microchambre à la sortie 31 de fluide ù par l'intérmédiaire du réseau 15 32 de sortie. Les microchambres 110 comprennent préférentiellement une zone d'entrée 115 et une zone de sortie 116 pour permettre la circulation du fluide dans une direction dl représentée sur la figure 2. En référence à la figure 4, les microchambres 110 présentent une dimension de longueur et une dimension de largeur par rapport à la direction dl chacune comprise entre 500pm et 550pm, préférentiellement de 520pm. Ainsi, les dimensions des microchambres 110 du bioréacteur 100 selon l'invention sont préférentiellement 520pm x 520pm x 100pm. Ces dimensions sont particulièrement favorables au développement de 30 cellules hépatiques dans les microchambres 110. En effet, les inventeurs ont découvert que le cisaillement dans les microchambres 110 du bioréacteur 100 selon l'invention est plus faible que 20 25 le cisaillement dans les microchambres du bioréacteur divulgué dans le document � Développement et caractérisation d'une puce à cellules pour le criblage d'agents toxiques � pour un même débit de fluide nutritif en entrée. Il est d'environ 20% inférieur. Ainsi, les cellules sont peu susceptibles d'être arrachées par le fluide dans les microchambres 110 du bioréacteur 100 selon l'invention. Avantageusement, les microcanaux 112 présentent par rapport à la 10 direction dl une dimension de longueur comprise entre 700pm et 750pm, préférentiellement de 720pm, et une dimension de largeur comprise entre 200pm et 250pm, préférentiellement de 220pm. Ainsi, les dimensions des microcanaux 112 du bioréacteur 100 selon 15 l'invention sont préférentiellement 720pm x 220pm x 100pm. Les microcanaux 112 ainsi dimensionnés facilitent le développement de cellules hépatiques ; ils permettent en particulier la migration de morceau d'organe de foie à travers le réseau de microcanaux. On a par ailleurs représenté sur la figure 4 plusieurs autres dimensions caractéristiques des micromurs 113, des microplots 114 et des microcanaux 112 pour une réalisation possible du biroéacteur 100 de l'invention. 25 Selon une variante avantageuse, les micromurs 113 comprennent des zones anguleuses 117 de part et d'autre de la zone d'entrée 115 et de la zone de sortie 116 d'au moins une chambre 110, comme représenté sur les figures 2 et 4. 30 Ces zones anguleuses 117 présentent une dimension de largeur par rapport à la direction dl comprise entre 100pm et 120pm, préférentiellement de 110pm. En particulier, elles présentent une arête transversale à la direction dl de circulation du fluide 20 Les zones anguleuses 117 définissent, par rapport à la direction dl, des zones partiellement protégées de part et d'autre de la zone d'entrée 115 de ladite chambre 110, c'est-à-dire des zones où la circulation du fluide est brutalement ralentie. Ainsi, les cellules se développant dans de telles zones partiellement protégées sont peu susceptibles d'être arrachées par le fluide circulant dans la microchambre 110. Naturellement, l'étendue d'une zone où les cellules sont protégées d'un arrachement par le fluide dépend des conditions de circulation, en particulier du débit et du cisaillement 15 Néanmoins, les zones partiellement protégées présentent, selon cette variante avantageuse de l'invention, une arête transversale à la direction dl d'une largeur d'au moins 100pm. Elles permettent ainsi une agrégation des cellules au niveau de coins 118 20 de la microchambre 110 disposés transversalement de part et d'autre et en aval de la zone d'entrée 115 par rapport à la direction dl . En particulier, des cellules hépatiques sont susceptibles de s'agréger en sphéroïde de diamètre important, de l'ordre de 100pm, forme favorable à une bonne activité cellulaire. 25 De manière générale, le réseau de microcanaux permet aux cellues de se développer et de s'agréger en structures tridimensionnelles au niveau de zones de développement, à savoir : - la partie de la paroi inférieure 11 au niveau des microchambres 110, 30 - la partie de la paroi inférieure 11 au niveau des microcanaux 112, - les parois latérales des micromurs 113, et - les parois latérales des microplots 114.10 On désigne par � surface de culture � l'ensemble de ces zones de développement. Avantageusement, le rapport entre la surface de culture et la surface 5 globale de la paroi inférieure 11 est compris entre 90% et 110%. Il est préférentiellement égal à 100% à une précision d'1 % près. A titre d'exemple numérique non limitatif, la surface de culture peut être 10 décomposée de la manière suivante (pour une surface globale de la paroi inférieure de 149mm2) : - surface de la paroi inférieure au niveau des microchambres 110 et des microcanaux 112 : 96.5 mm2, - surface des parois latérales des micromurs 113 : 36.5mm2 15 - surface des parois latérales des microplots 114: 18mm2, La surface de culture est donc de 151 mm2. Le rapport de surface de culture sur la surface globale de la paroi inférieur est donc, dans cet exemple, de 101%. 20 Ainsi, les microstructures sur la paroi inférieure 11 ne modifient presque pas la surface disponible pour la culture par rapport à la surface globale de la paroi inférieure 11, tout en permettant un développement tridimensionnel. En outre, des cellules peuvent aussi se développer sur les surfaces 25 supérieures des micromurs 113 et des microplots 114, bien que de telles zones ne soient pas particulièrement favorables au développement tridimensionnel. On appelle alors � surface de culture totale � la surface de culture définie 30 précédemment à laquelle on ajoute les surfaces supérieures des micromurs 113 et des microplots. Dans l'exemple numérique précédent, ces surfaces supérieures sont de 52.5mm2 et la surface de culture totale est de 203.5mm2 et le rapport entre la surface de culture totale et la surface globale de la paroi inférieure est de 137%. Avantageusement encore, la chambre 10 de culture présente un volume et le rapport R2 entre la surface de culture totale et le volume de la chambre 10 de culture est compris entre 4mm-' et 6mm"' Si le volume est trop faible par rapport à la surface de culture totale (R2 > 6mm-l) les cellules risquent d'être confinées et de ne pas disposer d'assez de nutriments distribués par le fluide, ce qui est néfaste à leur développement. Par ailleurs, un volume trop important par rapport à la surface de culture totale (R2 En reprenant les valeurs de l'exemple numérique précédent, et pour une hauteur de chambre de 0.3mm, on peut déterminer le volume de la chambre 10 de culture : 149 x 0.3 û 52.5 x 0.1 = 39.45mm3 25 Le rapport entre surface de culture totale et volume de la chambre 10 est alors de 203.5mm2 / 39.45mm3 = 5.16mm"'. REVENDICATIONS1. Bioréacteur (100) pour cultiver des cellules comprenant : - une chambre (10) de culture comportant une paroi supérieure (12) et une paroi inférieure (11) présentant un ensemble de microstructures comprenant des micromurs (113) et des microplots (114), l'ensemble de microstructures définissant, sur la paroi inférieure (11) de la chambre de culture, des microchambres (110) et des microcanaux (112), - une entrée (21) de fluide connectée à au moins une partie des 10 microcanaux (112), et - une sortie (31) de fluide connectée à au moins une partie des microcanaux (112), les microcanaux formant un réseau reliant l'entrée (21) de fluide à chaque microchambre (110) et chaque microchambre (110) à la sortie (31) de 15 fluide, de sorte à permettre une circulation de fluide dans les microchambres (110), le bioréacteur (100) étant caractérisé en ce que les microchambres (110) présentent une dimension de longueur et une dimension de largeur par rapport à une direction de circulation du fluide chacune comprise entre 500pm et 550pm. 20 2. Bioréacteur (100) selon la revendication précédente, dans lequel les microcanaux (112) présentent une dimension de longueur par rapport à une direction de circulation du fluide comprise entre 700pm et 750pm et une dimension de largeur par rapport à une direction de circulation du fluide 25 comprise entre 200pm et 250pm. 3. Bioréacteur (100) selon la revendication précédente, dans lequel les microchambres (110) comprennent une zone d'entrée (115) et une zone de sortie (116), les micromurs (113) comprenant des zones anguleuses (117) 30 de part et d'autre de la zone d'entrée (115) et de la zone de sortie (116) d'au moins une chambre (110), les zones anguleuses (117) présentant une dimension de largeur par rapport à une direction de circulation du fluide comprise entre 100pm et 120pm de sorte à définir, de part et d'autre de la 13 part et d'autre de la zone d'entrée (115) de ladite chambre (110) des zones partiellement protégées. 4. Bioréacteur (100) selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la chambre (10) de culture présente une surface de culture dans un rapport avec une surface globale de la paroi inférieure compris entre 90% et 110%. 5. Bioréacteur (100) selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la chambre (10) de culture présente une surface de culture dans un rapport avec un volume global disponible de fluide de la chambre compris entre 4/mm et 6/mm.