FR 2944703 A1 20101029 FR 0901949 A 20090422 COMPOSITION COSMETIQUE ANTI AGE La présente invention concerne une composition cosmétique comprenant un extrait de Thymus citriodorus. La présente invention concerne également l'utilisation de cette composition pour retarder ou pour lutter contre le vieillissement de la peau et/ou l'apparition des signes de vieillissement de la peau. La présente invention concerne aussi l'utilisation de cette composition pour protéger la jonction dermo-épidermique. La peau est constituée de l'épiderme, du derme et de l' hypocerme. Le derme et l'épiderme sont séparés et reliés par une structure très fine mais d'une importance capitale, la jonction dermo-épidermique. Celle-ci, d'origine à la fois dermique et épidermique, doit pouvoir assurer un accrochage solide et stable de l'épiderme au derme sous-jacent. A la différence des autres membranes basales de l'organisme, elle possède des complexes d'attachement spécifiques : les hémidesmosomes, fixant solidement l'épithélium grâce à des fibres de collagène reliées aux plaques d'ancrage. La jonction dermo- épidermique comporte des constituants moléculaires spécifiques localisés au niveau de complexes d'ancrage qui jouent un rôle fondamental dans le maintien de la cohésion de l'épiderme. Lamina densa et lamina lucida forment la lame basale épidermidue. Cette dernière permet de déterminer la polarité cellulaire et influence le métabolisme cellulaire, organise les protéines dans les membranes adjacentes, et peut induire une différenciation cellulaire. La jonction dermo-épidermique est formée de plus d'une vingtaine de macromolécules agencées de façon stricte pour former un réseau très stable. Le collagène IV se situe dans la lamina densa. Il est dépcurvu de l'aspect fibrillaire et de la périodicité ces autres collagènes. Le collagène VII est le composant majeur des fibrilles d'ancrage. Plusieurs types de laminines se retrouvent au niveau de la lame basale, elles y représentent les composants non collagéniques les plus importants. Les isomères présents sont les laminines V, VI et X. La laminine V, localisée au sein des hémidesmosomes, est le constituant majeur des filaments d'ancrages qui lient les kératinocytes aux fibrilles d'ancrage implantés dans le derme papillaire. Protéine d'adhérence préférentielle des kératinocytes, elle joue un rôle important au cours de la ré-épithélialisation car elle est exprimée par les kératinocytes migratoires au cours de la phase précoce de la réparation épidermique. On retrouve aussi de nombreux autres constituants ccmme la fibronectine, qui assure la liaison entre les macromolécules matricielles et les cellules du tissu conjonctif-, le nidogène et l'entactine qui se lient à la laminine, et le perlécan, qui a d'importantes propriétés adoésives et qui est impliqué dans la formation des membranes basales. La _onction dermo-épidermique intervient à de nombreux niveaux. C'est un support mécanique pour l'attachement de l'épiderme au derme par réseau de collagène IV, via les hémidesmosomes. Elle contrôle les échanges de produits métaboliques entre ces deux compartiments, notamment en régulant la perméabilité de la membrane basale. Elle est un réservoir important de facteurs de croissance, le support des kératinocytes lors du phénomène ce cicatrisation. Elle laisse migrer à travers ses couches plusieurs types cellulaires lors de processus immunclogiques et inflammatoires. 3 La jonction dermo-épidermique joue un rôle aussi dans a signalisation et le contrôle du cycle cellulaire au niveau de ses jonctions avec les cellules épithéliales. Au cours du vieillissement cutané, la jonction cermo-épidermique s'aplanit et perd progressivement ses ondulations caractéristiques, ce qui réduit considérablement l'interface épiderme-derme. De plus, les réseaux moléculaires se désorganisent, la charpente protéique se fragilise et l'adhérence des kératinocytes basaux est amoindrie. En conséquence, la fonction mécanique (soutien) et la fonction biologique (échange d'informations et de molécules) de la jonction dermo-épidermique sont altérées. Lrr~qu'il y a blessure cutanée, la jonction dermo-épidermique est endommagée et ses molécules constitutives sont dégradées par des enzymes spécifiques. Dans des conditions favorables, la ré-épithélialisation épidermique cébate quelques heures après le traumatisme. Dès que l'épirr_élium a recouvert le lit de la plaie, les protéines de la jonction dermo-épidermique réapparaissent de façon séquentielle et ordonnée. Avec le vieillissement cutané, chacune de ces étapes se dércoie plus lentement. En particulier, il a été observé une diminution de l'expression des protéines d'adhérence matricielle ainsi que de celle des récepteurs membranaires, qui pourrait constituer la cause majeure du retard observé dans le processus de reconstitution de la jonction derme-épidermique et de l'extrême fragilité des tissus cicatrisés chez les sujets âgés. La laminine 5 est une protéine spécifiquement exprimée dans les lames basales des épithélia squameux et transitionnels spécialisés comme la jonction dermoépidermique de _a peau. Le rôle majeur de la laminine 5 est souligné par l'existence de pathologies héréditaires 4 ou acquises, résultant d'une anomalie de synthèse et/ou d'expression de l'une de ses sous-unités constitutives. Ces maladies, appelées épidermolyses bulleuses fonctionnelles, conduisent notamment à une fragilité de la jonction dermo-épidermique de la peau caractérisée par la formation spontanée de bulles épidermiques. La laminine 5 joue ainsi un rôle crucial et irremplaçable dans la cohésion épi_th1lio-mésenchymateuse. La laminine 5 est porteuse de signaux biologiques déterminants puisqu' elle permet l'adhérence des cellules épithéliales adjacentes par l'intermédiaire des intégrines et induit l'assemblage des structures d'adhérence stable que sont les hémidesmosomes. La demanderesse a mis en évidence de manière surprenante qu'une composition comprenant un extrait de Thymus citriodorus renforce la jonction dermo-épidermique et la protège du vieillissement en stimulant la synthèse de collagène et de laminine 5. On peut donc utiliser un extrait de Thymus citriodorus comme agent actif anti âge, comme agent actif protecteur de la jonction dermo épidermique. On peut également utiliser un extrait de Thymus citriodorus comme agent actif favorisant la synthèse de collagène et/ou de laminine. Le Thymus citriodorus est une plante aromatique de la famille des Labiacées. Il provient du croisement de deux espèces botaniques : Thymus pilegioides et Thymus vulgaris. La composition cosmétique ou dermatologique, objet de la présente invention contient un extrait de Thymus citriodorus. Il s'agit préférentiellement d'un extrait de =eailles de Thymus citriodorus. De façon avantageuse, cet extrait est un extrait aqueux et de préférence il est stabilisé par de la glycérine. De préférence il s'agit d'un extrait aqueux obtenu selon un procédé comprenant au moins les étapes suivantes : - Extraction à l'eau des feuilles de Thymus citriodorus 5 - Ftltration - Stabilisation avec de la glycérine L'extrait aqueux de Thymus citriodorus utilisé dans la composition selon l'invention, est un liquide translucide orange foncé et d'odeur caractéristique. Il présente les caractéristiques analytiques suivantes : pH : 5.9 Densité à 20°C : 1.13 Indice de réfraction : 1.402 Rapport plante/extrait : 1/20 Ce préférence la composition cosmétique ou dermatologique selon l'invention comprend de 0,01 à 10 % d'extrait de Thymus citriodorus en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition. Avantageusement, la composition comprend de 0,01 à 5 % d'extrait de Thymus citriodorus en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition. Les compositions selon l'invention peuvent encore comprendre un ou plusieurs agents de formulation ou additifs d'usage connu et classique dans les compositions cosmétiques et dermatologiques tels que, à titre d'exemples et de façon non limitative, des adoucissants, des colorants, des actifs filmogènes, des tensioactifs, des parfums, des conservateurs, des émulsionnants, des huiles, des glycols, des vitamines comme la vitamine E, des filtres UV, etc... Grâce à ses connaissances en matière de cosmétique, l'nomme du métier saura quels agents de formulation aj,oater aux compositions de l'invention et en quelles quanti tes en fonction des propriétés recherchées. Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toute forme connue de l'homme du métier dans le domaine de la cosmétologie et de la dermatologie sans autre restriction galénique que l'application sur le visage et sur le cors. De façon avantageuse, les compositions selon l'inven_t-on se présentent sous la forme d'un gel, d'une crème, d'une lotion, d'une huile, d'un lait, d'un spray, etc... La composition cosmétique ou dermatologique selon l'invention peut être utilisée pour prévenir, pour retarder ou pouf lutter contre le vieillissement de la peau et/ou l'apparition des signes de vieillissement de la peau. On entend par signes de vieillissement de la peau : les rides, les ridules, le relâchement cutané, la perte d'élasticité des fibres cutanées, une peau flétrie, une peau amincie, en une peau terne et/ou sans éclat. La composition cosmétique ou dermatologique selon l'invention peut être utilisée pour protéger la jonction dermo-épidermique. La composition cosmétique ou dermatologique selon l'invention peut aussi être utilisée pour favoriser la synthèse de la laminine. La composition cosmétique ou dermatologique selon l'invention peut également être utilisée pour favoriser la synthèse du collagène. Les exemples ci-après concernent, d'une part l'évaluation de l'effet d'un extrait de Thymus citriodorus sur la synthèse de collagène et de laminine, et d'autre part des compositions objets de la présente invention. Les exemples font référence aux figures suivantes dans lesquelles : a figure 1 représente la mesure de la quantité de collagène (gg / g de protéine) en fonction de la concentration d'extrait de Thymus citriodorus utilisé 0.5 % et 1% - La figure 2 représente la mise en évidence par Immunofluorescence de la laminine V cellules traitées avec un extrait de Thymus citriodorus utilisé à 0.1, 0.5 et l%.On pe,ät observer en rouge : la laminine V, en bleu les noyaux cellulaires. La figure 3 représente l'intensité de la fluorescence en fonction de la concentration d'extrait de Thymus citricdo:~us utilisé 0.1, 0.5 et 1%. I.EVALUATION DE L'ACTIVITE D'UN EXTRAIT DE 15 THYMUS CITRIODORUS SUR LA SECRETION DU COLLAGENE DE TYPE I Le modèle expérimental retenu consiste en une culture de fibroblastes humains normaux jusqu'à confluence. Les cellules sont incubées avec l'extrait de 20 Thymus citricdoetus à 0,5 et 1 % (concentrations révélées non cytotoxiques pour les cellules au test MTT (diméthyl thiazol diphécyl tétrazolium) : Mosmann, J Immunol Meth 1983 65 : 55-63). 25 Par la méthode ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay : dosage d'immunosorption liée à enzyme) qui présente l'avantage d'une mise en œuvre facile, sensible et spécifique, nous dosons le collagène de type I au niveau du milieu de culture. 30 A.MALERIEL ET METHODE 1) Culture de fibroblastes 10 8 Dans un premier temps, des cultures de fibroblastes ont été établies par la méthode des explants, à partir de prélèvements de peau caucasienne saine (plastie abdominale). Les fibroblastes sont cultivés Jusqu'à confluence, à '7°C, dans un milieu MEM (Milieu essentiel minimum) contenant 2mM de L-Glutamine et 10% de SVF (sérum de veau foetal), dans une atmosphère saturée en humidité avec 5- de CC2. Puis après décollement par une solution isotonique tamponnée pH 7 . 2 de trypsine à o.1% et d'EDTA 0.02%, les cellules sont ensemencées dans des microplaques de 96 puits (Falcon) 104 cellules par puits dans le milieu susnommé. Après 24 heures, ce milieu est remplacé, pour une incubation de 48 heures par le même milieu sans sérum contenant 0,15 mM d'ascorbate de sodium (milieu d'incubation) avec ou sans le complexe d'actifs à tester. Les fibroblastes humains normaux adultes (lot F0004/HF T3), ont été choisis, ils représentent des cellules ayant des caractéristiques normales (aspect fusiforme ou étoilé, bonne activité métabolique, bonne capacité d'étalement...). 2) Dosage du collagène : La quantité de collagène de type I sécrétée dans le milieu après incubation avec ou sans le complexe d'actifs a été déterminée à l'aide d'un test ELISA. Cette méthode permet de détecter certaines molécules (non radioactives) à de très faibles doses. - adsorption de l'antigène (Collagène de type I) à une phase solide (plastique d'une plaque de microtitration réservée à l'ELI=SA) 9 --ajout d'un premier anticorps spécifique (anticorps monoclonal anti-collagène I de souris). -fixation d'un second anticorps (Conjugué immunoglobuline (IgG) chèvre anti-souris) dirigé contre le premier anticorps. - ce second anticorps est lui-même lié à une marque enzymatique, la phosphatase alcaline. -- transformation par la marque enzymatique d'un substrat (p \PP ou le paranitrophénylphosphate) en produit détectable (1e paranitrophénol à 405 nm) au prorata de la quantité d'enzyme liée. B.POCEDURE Le milieu d'incubation est collecté et transféré dans les puits d'une plaque de microtitration. Une incubation de 24 heures à +4°C permet l'adhésion du collagène au plastique. La plaque est ensuite rincée au PBS (Tampon phosphate salin). Après 24 heures d'incubation à +4°C avec de la sérum albumine (2% dans PBS) pour éviter les liaisons anticorps - plastique non spécifiques, on ajoute des anticorps de souris anti- collagène I (Sigma) (dilution 1:2000) conjugués à une phosphatase alcaline (2 heures à température ambiante TA), qui en présence du phosphate de paranitrophényproduira du paranitrophénol absorbant à 405 nm (1 heure à TA). Les densités optiques obtenues sont converties en ng de collagène grâce à une courbe d'étalonnage établie dans les mêmes conditions expérimentales avec du collagène I, de queue de rat (Becton Dickinson). C.RSSULTATS Dans nos conditions expérimentales, l'extrait de Thymus citriodorus utilisé à 1% multiplie par 30 la teneur en collagène de type I par rapport au témoin non traité. L'extrait de Thymus citriodorus initie et dynamise les programmes de synthèse d'un des composants majoritaires cia la matrice extracellulaire du derme, le collagène de type I. II. EVALUATION DE L'ACTIVITE D'UN EXTRAIT DE THYMUS CITRIODCRUS SUR LA SYNTHESE DE LAMININE A.-ATERIEL ET METHODE 15 % Matériel Les kératinocytes sont ensemencés dans des plaques 6 puits avec lamelle de verre à raison de 60 000 cellules par puits dans du milieu DMEM (milieu Dulbecco 20 essentiel modifié) + 10% SVF. 48 h après, le milieu est remplacé par le milieu DMEM seul pendant 24 heures. Les cellules sont ensuite traitées ou non (témoin) par l'extrait de Thymus citriodorus (~ 0.1, 0.5 et 1%) et incubées à l'étuve 25 pendant 24 heures à 37°C, 5002. Chaque tapis cellulaire est ensuite rincé, fixé au méthanol (-20°C) avant de procéder à la révélation de la laminine V par immunofluorescence. 30 2) Méthode Les cellules sont incubées avec le ter anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt puis avec l'anticorps secondaire dirigé contre le 1" anticorps couplé au fluorochrome TRITC (Tetra methyl Rhodamine Iso10 Thio Cyanate, dérivé de la Rhodamine). Le temps d'incubation entre chaque anticorps est d'l heure. Les noyaux cellulaires sont révélés par un marquage au Dapi (Di Aminido Phenyl lndol). Les lamelles sont montées sur lame de verre puis observées au microscope à fluorescence (Nikon Eclipse 50i). Plusieurs champs de la population cellulaire sont pris en photo. Les images de fluorescence TRITC indiquent les régions de localisation de la protéine d'intérêt. Les images de fluorescence DAPI indiquent les noyaux cellulaires et donc le nombre de cellules par champs. Les clichés photographiques sont analysés par le logiciel d'analyse d'image Lucia. (Voir figure 2 et 3) B.RESULTATS Cette étude démontre que l'extrait de Thymus citriodorus favorise de manière significative et dose dépendante la synthèse de la laminine V par les kératinocytes (p II.EXEMPLES DE FORMULATION es pourcentages sont des pourcentages en poids par rapport au poids total de la composition. EMULSION E/H PEG 30 DIPOLYHYDROXYSTEARATE 4,00 TR.IGLYCERIDES C16-C18 HYDROGENES .. 5,00 PEG-45/DODECYL GLYCOL COPOLYMER ... 1,20 TF YGLYCERIDE C8C10 19,00 HUILE DE VASELINE FLUIDE 8,00 30 5 10 15 20 2530 GLYCOLS 10,00 EXT-:AIT DE THYMUS CITRIODORUS 1,00 POL`?OSES D'AVOINE 1,00 EAU DEMINERALISEE Q.S.P 100 LOTION GLYCOL 2,00 C:-?LDRURE DE SODIUM 1,00 ETHANOL 5,00 EXTRAIT DE THYMUS CITRIODORUS 0,50 TRCMETHAMINE 0,80 CONSERVATEURS 0,50 SOLUBILISANT 0,30 PA UM 0,10 EA DEMINERALISEE Q.S.P 100 GEI CA_BOXYMETHYLCELLULOSE 0,03 CARBOMER 0,60 SOUDE 0,17 G'...LYCERINE 5,00 EXTRAIT DE THYMUS CITRIODORUS 1,00 D-PANTHENOL 75L 0,30 POLYOSES D'AVOINE 1,00 PALMITATE DE VITAMINE A 0,10 ACETATE DE TOCOPHEROL 0,05 HUILE DE RICIN HYDROGENEE PEG-40 1,35 CHELATANT 0,03 CONSERVATEURS 0,50 COLORANT 0,017 PARFUM 0,30 EAU DEMINERALISEE Q.S.P 100 GEL-CREME H/E ACRYLOYL DIMETHYL TAURATE/VP COPOLYMER 0,70 HELIOGEL 0,50 GLYCOLS 5,00 CARBOMER 0,50 SOUDE 0,055 CARBOXYMETHYLCELLULOSE 0,30 TRYGLYCERIDE C8C10 4,50 DICAPRYLYL CARBONATE 6,00 ESTER SYNTHETIQUE 3,00 HUILE DE SILICONE 1,50 ACITATE DE TOCOPHEROL 0,05 EXTRAIT DE THYMUS CITRIODORUS 1,00 CONSERVATEUR 0, 10 EHELATANT 0,20 PARFUM 0,30 EAU DEMINERALISEE Q.S._ 100 FMULSION H/E ACRYLOYL DIMETHYLTAURATE/VP COPOLYMER 0,50 HELIOGEL 0,70 GLYCOLS 4,00 POTASSIUM CETYL PHOSPHATE 0,30 714-22 ALCOHOLS & C12-20 ALKYL GLUCOSIDE 2,00 CETEARYL ETHYLHEXANOATE 4,00 CrPRYLIC/CAPRIC TRIGLYCERIDE 8,00 5 BE1 RE DE KARITÉ 3,00 DIJFTHICONE 1,00 E:>TR_AIT DE THYMUS CITRIODORUS 1,00 CFELATANT 0,10 CONSERVATEUR 0,10 PARFUM 0,40 EAU DEMINERALISEE Q.S.P 100 10