FR 2943062 A1 20100917 FR 0901168 A 20090313 NOUVEAU PEPTIDE PROMOTEUR DE L'ADHESION ET DE LA MIGRATION CELLULAIRE L'invention a pour objet un nouveau peptide de séquence définie présente sur la chaîne alpha3 du globule LG4 de la laminine 332 (laminine 5), ainsi que des peptides de séquence homologue audit peptide de séquence définie, et capables de se lier au récepteur syndécan-1. Elle a également pour objet une composition pharmaceutique ou cosmétique contenant ledit peptide. Elle concerne enfin l'utilisation du peptide dans le domaine de la cicatrisation ou comme adjuvant dans des milieux de culture destinés à la reconstruction épidermique ou épithéliale. Chaque année des dizaines de millions de patients souffrent de pertes tissulaires ou de déficiences d'organes. Bien que la transplantation des organes et des tissus concernés permette de répondre à une partie de la demande, cette approche thérapeutique est extrêmement limitée par le manque de donneur et par le rejet potentiel des allogreffes nécessitant des traitements immunosuppresseurs à long terme. Depuis une dizaine d'années, l'intérêt pour le génie tissulaire a connu un essor incomparable tant sur le plan de la recherche fondamentale que sur celui de la définition et de la mise au point de "tissus artificiels" qui commencent à être proposés pour des applications cliniques par diverses sociétés. Le génie tissulaire est un domaine pluridisciplinaire qui applique les principes de l'Ingénierie et des Sciences de la Vie pour le développement de substituts biologiques en vue de restaurer, maintenir ou améliorer une fonction tissulaire. Le génie tissulaire associe des biomatériaux naturels ou synthétiques biodégradables, des cellules non différenciées (cellules souches) ou différenciées (kératinocyte, fibroblaste, chondrocyte ...) et (ou) des molécules actives comme des facteurs de croissance ou des molécules d'adhérence. En effet, l'adhérence cellulaire est une étape indispensable et déterminante au succès de l'implantation des biomatériaux dans l'organisme humain. Si celle-ci a pu être améliorée par la mise au point de surfaces hautement interactives, il n'en reste pas moins qu'elle reste dépendante de la présence, ou de la synthèse par les cellules, de protéines matricielles d'adhérence. Par ailleurs, 5 millions de personnes ont besoin annuellement de pansements cicatrisants pour le traitement des plaies difficiles (escarres et ulcères de jambes). De nombreux pansements supposés favoriser la cicatrisation cutanée sont actuellement sur le marché et les recherches dans ce domaine se multiplient. Malgré les efforts fournis dans le traitement et la prévention de l'infection et de la déshydratation, de nombreux problèmes subsistent dans la prise en charge des problèmes de cicatrisations compliquées. En effet, le problème de la cicatrisation des plaies chroniques va en s'accroissant du fait de l'allongement de la durée de la vie et du vieillissement des populations. Une nouvelle ère s'annonce avec la mise au point de pansements porteurs de molécules d'adhérence. La cicatrisation cutanée est un phénomène complexe au cours duquel des événements dermiques et épidermiques sont étroitement impliqués et n'est pas, comme on l'a longtemps cru, un simple processus linéaire au cours duquel des facteurs de croissance sont synthétisés pour activer la prolifération et la migration cellulaires. C'est au contraire la résultante de plusieurs processus dynamiques et interactifs mettant en jeu des facteurs solubles, des éléments sanguins, des composants de la matrice extracellulaire (MEC) et des cellules parenchymateuses et épithéliales (Clark, 1996). Les interactions entre les cellules et la MEC jouent un rôle dans le contrôle du comportement cellulaire en contrôlant l'expression de certains gènes, ou en modulant la migration, la prolifération, la différenciation ou la mort cellulaire programmée (Hynes, 1992). Ce contrôle du comportement cellulaire est crucial au cours des remaniements tissulaires. Lorsqu'il y a une blessure cutanée, la jonction dermo-épidermique (JDE) est endommagée et ses molécules constitutives sont détruites ou dégradées par des enzymes spécifiques. Le derme joue un rôle fondamental au cours de la ré-épithélialisation en produisant des facteurs solubles destinés aux cellules épithéliales et des molécules matricielles informatives avec lesquelles les kératinocytes ont un contact direct. Dans des conditions favorables, la ré-épithélialisation épidermique débute quelques heures après le traumatisme. La réaction inflammatoire entraîne l'apparition sur le lit de la plaie de molécules matricielles et les kératinocytes des structures épithéliales résiduelles migrent rapidement sur le lit de la plaie. Au cours du processus de réparation, les kératinocytes migrants perdent leur polarité apicale-basale, adhèrent à la matrice provisoire, et émettent des pseudopodes qui leur permettent d'effectuer une migration latérale (Larjava et al., 1993). Lorsque l'épithélium à recouvert le lit de la plaie, les protéines de la JDE réapparaissent de façon séquentielle et ordonnée à partir des marges de la plaie jusqu'au centre. Les kératinocytes basaux ré-adoptent alors un phénotype stationnaire à polarité apicale, fermement ancrés à la JDE par l'intermédiaire des hémidesmosomes (HDs) reconstitués sur leur surface basale. Ce contrôle de la migration et de l'adhésion des kératinocytes basaux s'effectue par des interactions spécifiques entre certains motifs peptidiques présents sur les molécules matricielles et des récepteurs trans-membranaires, regroupés dans des complexes d'adhérence et dont le domaine intracellulaire est relié aux constituants du cytosquelette (Aumailley et al., 1996). Les complexes d'adhérence cellulaires sont de larges agrégats multimoléculaires permettant le transfert bidirectionnel de l'information au travers de la membrane cellulaire. Ces complexes, constitués de protéines extracellulaires, transmembranaires (intégrines et syndécans), cytosoliques et cytosquelettiques, sont des structures hautement dynamiques et stabilisées de façon plus ou moins transitoire par des interactions spécifiques entre les divers constituants. L'assemblage et le désassemblage des complexes d'adhérence sont finement régulés pour permettre à la cellule d'effectuer des opérations primordiales comme l'adhérence, la migration, la prolifération et la différenciation. Dans le large éventail de ligands extracellulaires, la laminine 332 (LN332) également désignée laminine 5 joue un rôle fondamental au cours de ces deux processus (Aumailley and Rousselle, 1999 ; Ghohestani et al., 2001). Cette molécule d'adhérence a une double fonction : selon une régulation finement contrôlée, elle est capable d'induire une adhérence cellulaire forte et statique ou au contraire une adhérence de faible affinité, transitoire permettant la migration cellulaire. Cette propriété est très bien illustrée dans la peau puisque la LN332 est d'une part, responsable de l'ancrage de l'épiderme, et d'autre part impliquée dans la migration des kératinocytes lors des processus de cicatrisation. La LN332, constituée par l'assemblage de 3 sous-unités alpha3, beta3 et gamma2 (figure 1). Elle est la protéine d'adhérence majeure et irremplaçable de l'épiderme où elle a été identifiée comme étant le composant majeur des filaments d'ancrage, structures qui relient les HDs à la partie basale de la JDE dans la peau (Rousselle et al., 1991). Elle intervient dans l'adhérence d'un grand nombre d'autres cellules épithéliales de l'organisme (Rousselle et Aumailley, 1994). Elle est synthétisée exclusivement par les cellules épithéliales sous la forme d'un précurseur de 460 kDa (pre-LN332). La chaîne alpha3 plus longue que les 2 autres comporte à son extrémité carboxy-terminale un domaine globulaire constitué de 5 répétitions de résidus basiques apparaissant comme 5 globules appelés LG 1 à LG5 (LG 1-2-3-4-5). Ces domaines globulaires sont très importants puisqu'ils comportent les domaines responsables de l'adhérence des kératinocytes. Le document WO2000/66731 décrit la production de laminine 5 entière sous forme recombinante. Le document WO2006/018551 décrit quant à lui l'implication de la séquence 15 TALRIRATYGEY présente sur la chaine gamma 2 de l'extrémité N terminale de la laminine 5 dans l'adhérence des kératinocytes de l'épiderme. Dans la présente demande, le Demandeur s'est intéressé à l'extrémité carboxy-terminale de la chaîne alpha3 de la pre-LN332. 20 Dans les conditions physiologiques, chacune des sous-unités alpha3 et gamma2 de la LN332 subit un clivage post-traductionnel extracellulaire de leur extrémité carboxyterminale et amino-terminale respectivement (Marinkovich et al., 1994 ; Goldfinger et al., 1998 ; Amano et al., 2000). Ces différents clivages aboutissent à la forme mature qui joue 25 un rôle crucial dans la cohésion épithélio-mésenchymateuse tant sur le plan de l'organisation supra-moléculaire au niveau des extrémités amino-terminales que des interactions cellulaires portées par les domaines LG (Aumailley et Rousselle, 1999). En effet, la maturation de la chaine alpha3, qui résulte de la coupure du tandem LG4/5, induit des changements fonctionnels déterminants de la LN332 puisqu'elle permet 30 l'adhérence des cellules épithéliales adjacentes par l'intermédiaire des intégrines alpha6béta4 et induit l'assemblage des structures d'adhérence stables que sont les hémidesmosomes. (Sonnenberg et al., 1993 ; Rousselle et Aumailley, 1994; Niessen et al., 1994). La LN332 mature constituerait ainsi, une barrière à la motilité cellulaire (Baker et al., 1996 ; Goldfinger et al., 1998 ; Ryan et al., 1999). La pre-LN332 est quant à elle capable, par le biais des globules LG4/5 de la chaine alpha3 précurseur, d'empêcher la formation des hémidesmosomes et d'induire la migration cellulaire (Ryan et al., 1999 ; Goldfinger et al., 1999 ; Bachy et al., 2008). Des études in vivo de la cicatrisation cutanée ont montré une expression accrue des différentes chaînes de la LN332 par les kératinocytes localisés dans la zone de colonisation de la plaie (Ryan et al., 1994), celle-ci étant présente dans la matrice extracellulaire sous sa forme précurseur (Ryan et al., 1994; Lampe et al., 1998; Nguyen et al., 2000). La pre-LN332 est ainsi présente dans la matrice provisoire mais elle est totalement absente dans les lames basales organisées où elle apparaît sous sa forme maturée (Lampe et al., 1998; Goldfinger et al., 1999; Tungall et al., 2002). Par ailleurs, si les études in vitro ont très tôt rapporté une sur-expression et une synthèse accrue de la LN332 par des kératinocytes mobiles (Rousselle et al., 1991), son implication par le biais de la forme précurseur a été plus tardive (Nguyen et al., 2000 ; Décline and Rousselle, 2001). L'ensemble de ces données montre que le domaine LG4/5 influence la migration cellulaire et joue un rôle dans le processus de réparation épithéliale. Des travaux dont ceux des inventeurs de la présente demande, ont montré que la pre-LN332 coopère avec l'intégrine alpha3bétal pour contrôler la polarisation et la migration cellulaires (Goldfinger et al., 1998; Décline and Rousselle, 2001 ; Frank and Carter, 2004 ; Bachy et al., 2008). Par ailleurs, une étude propose un rôle du fragment LG4/5 dans le dépôt et la rétention de la pre-LN332 dans la matrice extracellulaire (Sigle et al., 2004). Enfin, il a été montré que le domaine LG4/5 de la pre-LN332 interagit avec un récepteur de la famille des protéoglycannes, le syndécan-1, au cours de la migration des kératinocytes (Okamoto et al., 2003 ; Bachy et al., 2008). Dans l'épiderme, le syndécan-1 est localisé dans la région péricellulaire des kératinocytes des couches suprabasales et est assez peu exprimé dans la couche basale. De façon remarquable, l'expression du syndécan-1 est fortement activée au cours de la cicatrisation et est principalement localisée au niveau des bords des plaies (Elenius et al., 1991; Oksala et al., 1995; Jaakkola et al., 1998). Ce patron d'expression est spécifique du syndécan-1 puisqu'il n'a pas été retrouvé pour les autres syndécans (Gallo et al., 1996). Par ailleurs, les souris déficientes pour le gène codant le syndécan-1 présentent des défauts de prolifération et de migration des kératinocytes pendant la cicatrisation (Stepp et al, 2002). Les syndécans sont connus pour intervenir dans des processus cellulaires comme la migration et ils sont connus comme étant des co-récepteurs, coopérant avec des intégrines et des facteurs de croissance (Bernfield et al., 1999 ; Woods et al., 2000). L'ensemble de ces éléments conforte l'hypothèse selon laquelle le domaine LG415 de la pre-LN332 représenterait un ligand préférentiel du syndécan-1 au cours de la cicatrisation et serait à la base d'une cascade de signalisation intracellulaire favorable au processus de réparation épithéliale. Le site de clivage du fragment LG4/5 sur la chaine alpha3 a été déterminé (Décline et al., 2003) et le fragment LG4/5 a été produit sous forme recombinante (Okamoto et al., 2003). Des expériences d'adhérence et de migration cellulaires menées avec le fragment LG4/5 ont permis de montrer que ce domaine est impliqué dans la migration cellulaire et qu'un récepteur membranaire, le syndécan-1, est spécifiquement impliqué dans sa reconnaissance (Okamoto et al., 2003, Bachy et al., 2008). Les syndécans appartiennent à une famille de récepteurs membranaires à chaînes d'héparane sulfate exprimée à la surface de toutes les cellules adhérentes. Ces récepteurs ont été décrits comme étant des "facilitateurs" moléculaires capables de moduler, par une signalisation intracellulaire reliée au cytosquelette, l'activité des intégrines. L'adhésion cellulaire au fragment LG4/5 est dépendante des chaînes d'héparane sulfate et de chondroitine sulfate présentes sur le syndécan-1. Si ces deux chaines de glycosaminoglycannes se lient au fragment LG4/5 avec des affinités différentes, elles reconnaissent le même domaine d'interaction dans le globule LG4/5 (Okamoto et al., 2003). La pre-LN332 induit la migration des kératinocytes humains normaux par le biais de l'interaction du syndécan-1 avec le domaine LG4/5. L'adhérence syndécan-1 dépendante au domaine LG4/5 de la pre-LN5, induit une réorganisation du cytosquelette des keratinocytes humain normaux conduisant à la formation de filopodes et de microspicules, prolongements cytoplasmiques protrusifs caractéristiques de la migration cellulaire. Cette étape précoce est accompagnée d'une activation des GTPases Rac et Cdc42, GTPases connues pour être impliquées dans la formation de complexes d'adhérence transitoires spécifiques de la migration cellulaire (Bachy et al., 2008). L'obtention de la structure du module LG5 de la chaîne alpha2 de la LN211 (Tisi et al., 2000 ; Timpl et al., 2000), à permis d'établir un modèle structural de base de ces modules LG. Ces modules sont organisés sous la forme de 14 feuillets béta A à N reliés les un aux autres par des boucles orientées à l'extérieur de la structure. A l'aide d'une technologie basée sur le couplage covalent du fragment LG4/5 recombinant sur des billes recouvertes d'héparine suivi d'une fragmentation enzymatique de la protéine, trois séquences correspondant à des � zones de liaison à l'héparine � ont été identifiés (Vives et al., 2004), respectivement les séquences KKLRIKSKEK, PSGKPKSLP et TSVTPKQSL. Dans ce document, les expérimentations ont été conduites à partir de la protéine native et les sites de liaison ont été identifiés sans pour autant qu'ils aient été isolés à l'état de peptide. Parallèlement les documents JP2006063033 et Utani et al, 2001, décrivent la séquence NSFMALYLSKGR (du résidu 1412 au résidu 1423 de la séquence de la chaine alpha 3) localisée dans le module LG4, comme inductrice de l'adhérence cellulaire via les syndécans 2 et 4. Le Demandeur a démontré que la séquence KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) (du résidu 1433 au résidu 1442 de la séquence de la chaîne alpha3 et localisé au niveau d'une boucle reliant les feuillets béta F et G dans le globule LG4 est le site de liaison au syndécan-1 dans le module LG4 puisque (1) elle est la seule capable d'induire l'adhérence cellulaire syndécan-1 dépendante et (2) elle est capable de lier le syndécan-1 de façon spécifique et équivalente au domaine LG4/5 entier. Dès lors, l'invention a tout d'abord pour objet un peptide synthétique ou analogue comprenant la séquence KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) ou une séquence de taille identique, dans laquelle les résidus K (en position 1) et R (en position 4) sont conservés, la séquence étant apte à se lier au récepteur syndecan-1. La liaison au syndécan-1 peut être facilement révélée par toute technique connue de l'homme du métier, en particulier par technique de chromatographie d'affinité. Un test de ce type peut par exemple consister à fixer le peptide à tester sur des billes, puis les incuber avec des lysats de kératinocytes. Les protéines cellulaires ainsi fixées sur le peptide peuvent ensuite être analysées par électrophorèse SDS PAGE suivie d'une immunodetection pour évaluer le contenu en syndécan 1. Il est démontré dans la suite de la description par le biais d'une analyse quantitative que l'adhérence cellulaire révélée par le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) est plus efficace que celle révélée par le peptide NSFMALYLSKGR puisque d'une part, l'adhérence cellulaire est induite par une quantité plus basse de peptide immobilisée et d'autre part, le nombre total de cellules adhérées est supérieur de 200% sur le peptide KKLRIKSKEK quelle que soit la quantité de peptide immobilisé. Dans la suite de la description et dans les revendications, par �peptide analogue �, on désigne le peptide de l'invention sous forme modifiée à condition que ledit peptide garde sa capacité de liaison au syndécan 1. Les modifications peuvent être d'ordre conformationnelle. Le peptide peut ainsi se présenter sous forme oligomérisée, repliée, cyclisée. Les modifications peuvent être également d'ordre chimique. Ainsi par exemple, un peptide sur lequel serait greffé un motif d'intérêt ou dont la chaine latérale serait modifié chimiquement est également couvert par la présente invention Dans un mode de réalisation particulier, le peptide de l'invention contient au plus 30 acides aminés, de préférence au plus 18 acides aminés et contient la séquence KKLRIKSKEK (SEQ ID 1). Dans un autre mode de réalisation, le peptide est constitué par la séquence KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) ou une séquence de taille identique, dans laquelle les résidus K (en position 1) et R (en position 4) sont conservés. Dans un mode de réalisation particulier, le peptide de l'invention contient ou est constitué de la séquence aa,aa2aa3aa4aa5aa6aa7aa8aa9aa,o dans laquelle, à pH physiologique : - aa, est un résidu lysine, aa4 est un résidu arginine, - aa2, aa6, aa8, aa,o sont des résidus de charge positive ; au plus un d'entre eux pouvant être substitué par un résidu de charge neutre, - aa3 est un résidu de charge neutre - aa5 est un résidu de charge neutre - aa, est un résidu de charge neutre à l'exception de l'alanine. - aa9 est un résidu de charge négative ou un résidu de charge neutre. 35 Dans la suite de la description et dans les revendications, par résidu de charge neutre on désigne les acides aminés suivants : phénylalanine, méthionine, tryptophane, valine, leucine, isoleucine, alanine, proline, glycine, cystéine, asparagine, glutamine, sérine, thréonine, tyrosine. De même, par résidu de charge positive, on désigne les acides aminés suivants : lysine, arginine et histidine. Enfin, par résidu de charge négative, on désigne les acides aminés suivants : acide 10 aspartique, acide glutamique. Le Demandeur a obtenu de très bons résultats d'adhésion cellulaire avec les peptides contenant ou étant constitués par les séquences suivantes : A2 : KALRIKSKEK (SEQ ID 2) 15 A3 : KKARIKSKEK (SEQ ID 3) - A5 : KKLRAKSKEK (SEQ ID 4) - A6 : KKLRIASKEK (SEQ ID 5) - A8 : KKLRIKSAEK (SEQ ID 6) - A9 : KKLRIKSKAK (SEQ ID 7) 20 A10 : KKLRIKSKEA (SEQ ID 8) - M2 : KKLRLRSKER (SEQ ID 9) - M4 :KKLRHKSKEK (SEQ ID 10) - M5 : KKLRTKSKEK (SEQ ID 11) M6 : KKLRKKSKEK (SEQ ID 12) 25 - M7 : KKLRAKSKEK (SEQ ID 13) - M8 : KKLRIKLKEK (SEQ ID 14) - M9 : KKLRIKQKEK (SEQ ID 15) - UI : KKLRIQSKEK (SEQ ID 16) - U2 : KKLRIKSQEK (SEQ ID 17) 30 - U3 : KKLRIKSKEQ (SEQ ID 18) L'invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence peptidique synthétique comprenant ou constituée du peptide ci-avant défini comme médicament ou pour la fabrication d'une composition pharmaceutique ou un dispositif médical destiné à 35 améliorer la cicatrisation de la peau, en suite notamment de pathologie de la peau ou de traumatisme.5 Les pathologies cutanées concernées sont notamment : - Ulcères, escarres, - Traitement de la peau après des procédures dermatologiques, par exemple à but esthétique pour le traitement du vieillissement, du melasma, traitement laser CO2, ou Erbium, laser fractionnel, peeling chimique, microdermabrasion - Pathologie de la jonction dermo-épidermique, par exemple epidermolyse bulleuse, - Psoriasis Les traumatismes concernés sont notamment : - Brûlure du deuxième degré, superficiel à profond, du troisième degré dermabrasion, ampoules - Reconstruction dermique, chirurgie plastique, greffe de peau - Zones donneuses de greffe de peaux L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique ou cosmétique comprenant le peptide précédemment décrit susceptible d'adopter plusieurs formes. Dans une première forme de réalisation, la composition pharmaceutique de l'invention s'apparente davantage à un dispositif médical, en l'espèce un support sur lequel est greffé ou déposé, ou à l'intérieur duquel est incorporé le peptide synthétique de l'invention, le support se présentant sous la forme d'un film ou d'une matrice constitués d'un matériau biologique choisi dans le groupe comprenant collagène, gélatine, polysaccharide, acide hyaluronique, cellulose, carboxyméthylcellulose, pectine, chitosane, derme humain ou animal acellularisé, ou d'un matériau synthétique choisi dans le groupe comprenant silicone, polyuréthane, PLLA, ou d'un matériau textile du type pansement choisi dans le groupe comprenant coton, polyester, polyamide. De tels dispositifs sont notamment utilisés pour la reconstruction de la peau dans des brûlures du troisième degré. L'invention a dès lors également pour objet un procédé de reconstruction de la peau, en particulier dans des brûlures du troisième degré, consistant à appliquer le dispositif médical ci-avant décrit au contact de la peau. Dans un second mode de réalisation, la composition pharmaceutique ou cosmétique de l'invention se présente sous la forme d'une crème, d'un hydrogel, d'une solution, d'une formulation injectable ou d'un spray comprenant éventuellement des kératinocytes autologues ou des cellules mésenchymateuses. Dans le cas de la solution, de la crème ou de l'hydrogel, le ou les peptides sont incorporés dans ces préparations destinées par exemple à être badigeonnée sur la peau lors de greffe de peaux au niveau des sites donneurs et receveurs de greffons épidermiques ou dermoépidermiques mais également pour une cicatrisation de la peau après éraflure, brûlure du deuxième degré, dans le cas des plaies chroniques ou toute procédure médicale de traitement de l'épiderme. Dans une autre application, le ou les peptides sont incorporés dans une formulation injectable pour le traitement du vieillissement cutané par exemple en mésothérapie . 10 La forme spray est plus particulièrement adaptée dans des applications de génie tissulaire avant la pose de feuillets épidermiques ou peaux totales autologues ou allogéniques, par exemple pour le traitement des grands brûlés ou la cicatrisation des plaies récalcitrantes type ulcères. Dans un mode de réalisation particulier, la forme spray peut également 15 contenir, outre le peptide, des kératinocytes autologues. Le traitement effectué notamment sur les grands brûlés peut être exécuté en un temps ou deux temps. Traitement en un temps : o prélèvement d'un lambeau d'épiderme suivi de la digestion 20 enzymatique de ce tissu puis récupération d'une suspension cellulaire à laquelle le ou les peptides sont ajoutés. Le mélange cellules/ peptides est alors pulvérisé sur la plaie à traiter. Traitement en deux temps : o prélèvement d'un lambeau d'épiderme suivi d'une digestion 25 enzymatique du lambeau épidermique. Les kératinocytes sont isolés puis mis en culture pour amplification. Récupération des cellules sous forme de suspension à laquelle le ou les peptides sont ajoutés. Le mélange est ensuite pulvérisé sur la plaie à traiter. 30 L'invention a également pour objet un milieu de culture contenant le peptide précédemment décrit, destiné à la culture in vitro de cellules épithéliales ou mésenchymales. Plus précisément, le ou les peptides peuvent être ajoutés à des milieux de culture 35 spécifiques pour la culture in vitro de cellules épithéliales ou mésenchymales (kératinocytes et fibroblastes entre autres) soit directement dans le milieu de culture lors de sa fabrication. ou extemporanément dans le milieu de culture lors de l'utilisation. Un tel milieu de culture peut être destiné à la culture de kératinocytes et d'autres cellules épithéliales (épithélium cornéen, épithélium buccal ou vaginal) pour des applications médicales, scientifiques, de recherche ou de pharmacotoxicologie, l'ajout du ou des peptides étant de nature à faciliter et/ou raccourcir les étapes de culture, et/ou améliorer la qualité des cultures et construction cellulaire (tapis cellulaire, pseudoépiderme, épithéliums reconstruits). Un milieu type de culture de kératinocytes est par exemple décrit dans le brevet US5654135. Les applications des cultures de keratinocytes ou des cellules épithéliales sont par exemple: ^ Réalisation d'épiderme ou d'épithélium reconstruit pour des tests de molécules pharmacologiques ou cosmétiques ou de préparations pharmacologiques ou cosmétiques (en s'affranchissant de modèles animaux) ^ Pour le traitement des grands brulés ou le traitement de la cicatrisation (ex ulcères variqueux ou ulcère diabétique), par la réalisation de spray de cellules ou de feuillets épidermiques. Le peptide de l'invention peut également être mis en oeuvre dans un milieu de culture de kératinocytes humains normaux destiné au maintien en survie des substituts cutanés avant greffe, en particulier à un grand brûlé. ^ A des fins de recherches, thérapie génique, étude des kératinocytes, test de nouveaux actifs, facteurs de croissances... ^ Pour la constitution de banques de cellules Le milieu de culture contenant le ou les peptides peut être destiné à la culture de fibroblastes in vitro en vue de la réalisation de peaux totales, et préalablement à l'ensemencement des kératinocytes et ensuite dans les phases de réalisation du pseudoépiderme. Le ou les peptides permettent une meilleure adhésion et étalement des fibroblastes limitant ainsi la perte des fibroblastes immédiatement après ensemencement ainsi qu'une plus grande mobilité des fibroblastes ensemencés. La durée d'obtention d'un derme équivalent de qualité est réduite et permet d'obtenir une peau totale plus rapidement. In vivo la présence du peptide au sein de la matrice tridimensionnelle permet une meilleure adhésion et étalement des fibroblastes ainsi qu'une limitation de la formation du tissu de granulation lors de la cicatrisation cutanée. L'invention a également pour objet un support de culture de cellules épithéliales tels que par exemple des kératinocytes contenant le peptide. Les supports peuvent se présenter sous la forme de membranes ou matrices pouvant servir à la réalisation de pseudo épiderme ou de peaux totales pouvant servir aux tests toxicologiques de produits, molécules ou formulations cosmétiques ou pharmaceutiques. Le ou les peptides permettent de diminuer les pertes à l'ensemencement, augmenter la vitesse de reconstruction de l'épiderme et améliorer la qualité structurelle de l'épiderme reconstruit. Plus précisément le support de culture peut se présenter sous la forme de boites de cultures en polystyrène sur lesquelles sont adsorbés, greffés les peptides. Le support de culture peut également se présenter sous la forme d'une membrane ou film 25 de biopolymère utilisé pour la reconstruction d'épiderme équivalent, par exemple sur une membrane de collagène de type I et de collagène de type IV, sur lesquelles sont adsorbés ou greffés les peptides. Dans les applications où le peptide est greffé en surface d'un film, d'une matrice, d'une 30 membrane, d'une boite de culture cellulaire, il peut être ajouté à la partie C ou N terminale un groupement qui permettra une liaison covalente sur le support. Ce groupement réactif vis-à-vis du support sera éventuellement espacé du peptide par un bras espaceur.20 Le groupement pourra consister par exemple en greffage du motif Cys-Gly-Gly sur la partie N terminale pour une réaction sur un chitosan chloroacethylé comme décrit dans la publication de Masuda. Il peut aussi être ajouté un bras biotine qui permettra un greffage non covalent sur un support fonctionnalisé avec de l'avidine. Le support de culture peut également se présenter sous la forme d'une membrane textile ou matrice poreuse sur laquelle sont adsorbés ou greffés les peptides. Le support de culture peut également se présenter sous la forme de gels, par exemple des gels de collagène acido-soluble sur lesquels sont adsorbés ou greffés les peptides. Le ou les peptides peuvent aussi être apportés indépendamment du milieu de culture sous 15 la forme d'une solution de coating, par exemple pour le coating de boite de culture ou pour le coating de membrane de biopolymère utilisée pour la reconstruction d'épiderme équivalent, par exemple sur une membrane de collagène de type I et de collagène de type IV. 20 L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront bien des exemples qui suivent à l'appui des figures annexées. Figure 1 : Présentation de la laminine 332 Les chaînes alpha3, béta3 et gamma2 sont assemblées pour former une hélice alpha 25 super-enroulée au niveau de leur extrémité C-terminale. La chaine alpha 3, plus longue que les deux autres, comporte à son extrémité C-terminale une série de 5 domaines globulaires nommés LG 1 à LG5. La molécule est organisée en domaines : LN (laminin N-terminal domain), LE (laminin epidermal growth factor like domain), L4 (laminin domain 4), LG (laminin globular domain), LCC (laminin coiled-coil). 30 Figure 2 : Séquence peptidique du domaine LG4/5 et localisation du site de liaison au syndécan-1.10 Séquence du domaine LG4/5 de la chaine alpha3 de la pre-LN332. La séquence N-terminale commence à partir du site de clivage au niveau de l'acide aspartique en position 1338 et se termine par un acide glutamique en position 1713. Les régions soulignées représentent des domaines linéaires � espaceurs � présents entre les globules. Le domaine de liaison au syndécan-1 KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) est représenté en noir foncé, position 1433 à position 1442. Figure 3 : Adhérence des kératinocytes humains normaux et des cellules HT1080 au fragment LG4/5 et au peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1). (A, B) Adhérence cellulaire dose dépendante des kératinocytes humains normaux et des cellules de la lignée HT1080 au peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) et à la protéine LG4/5. Le peptide (A) et la protéine LG4/5 (B) ont été immobilisés sur des plaques 96 puits aux concentrations indiquées en abscisse. 6.104 cellules ont été déposées dans chaque puits et les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie. (C) Observation des kératinocytes humains normaux et des cellules HT1080 adhérés au peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) et à la protéine LG4/5. L'observation a été faite avec un microscope Axiovert 40 Zeiss équipé d'un bloc interférentiel PlasDic. Barre, 50 �m. Figure 4 : Effet du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) sur l'adhérence des cellules au fragment LG4/5 et à la laminine 332. Les protéines LG4/5 (barres blanches) et LN332 (barres grises) (1 �g/puits) ont été adsorbées dans des plaques 96 puits. (A) Effet de l'anticorps polyclonal anti-LG4/5 sur l'adhérence cellulaire à la protéine LG4/5 et à la LN332. Après saturation des puits, une solution d'anticorps anti-LG4/5 (l0gg/ml) a été appliquée pendant une heure avant de réaliser le test d'adhérence avec les cellules HT1080 (6.104 cellules/puits). (B, C) Effet de la protéine LG4/5 et du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) en solution sur l'adhérence syndécan-1 dépendante au fragment LG4/5. Les cellules HT1080 ont été détachées des boîtes et déposées dans les puits (6.104 cellules/puits) tel quel ou en présence de la protéine LG4/5 (l0gg/ml) ou du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) (201.tg/ml) comme indiqué sur le graphe. (A, B, C) Les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie. L'adhérence cellulaire en présence de l'anticorps ou des protéines compétitrices a été présentée en pourcentage de l'adhérence cellulaire obtenue sur le même substrat sans compétiteur. Figure 5: Mise en évidence de la liaison spécifique du syndécan-1 au peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) par chromatographie d'affinité. (A) Un lysat de kératinocytes humains normaux a été préparé comme décrit dans Matériel et Méthodes et 2 mg de lysat ont été incubé avec des billes de neutravidine non recouvertes (ligne 1) ou recouvertes des peptides KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) (ligne 2), PSGKPKSLP (SEQ ID 19) (ligne 3) et TSVTPKQSL (SEQ ID 20) (ligne 4) biotinylés. Après des lavages, le matériel lié aux billes a été digéré avec un mélange d' heparitinase I et de chondroitinase ABC pour libérer la partie protéique du syndécan-1 des glycosaminoglycannes. Les échantillons ont ensuite été analysés par électrophorèse SDS PAGE dans un gel à 8% d'acrylamide en conditions non réductrices puis analysées par immunotransfert avec 1' anticorps polyclonal anti-syndécan H174. (B) Un lysat de kératinocytes humains normaux a été préparé et 2 mg de lysat ont été incubé avec des billes de neutravidine non recouvertes (ligne 1) ou recouvertes de peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) biotinylé (ligne 3), ou avec des billes de sépharose recouvertes du fragment LG4/5 entier (ligne 2). Après des lavages, le matériel lié aux billes a été digéré avec un mélange d'heparitinase I et de chondroitinase ABC pour libérer la partie protéique du syndécan-1 des glycosaminoglycannes. Les échantillons ont ensuite été analysés par électrophorèse SDS PAGE dans un gel à 8% d'acrylamide en conditions non réductrices puis analysées par immunotransfert avec l'anticorps polyclonal anti-syndécan HI74. (A, B) La position des marqueurs de poids moléculaire est indiquée sur la gauche. Figure 6 : Adhérence des cellules HT1080 aux peptides KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) et NSFMALYLSKGR (SEQ ID 21). (A) Une gamme décroissante de peptides KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) et de peptide NSFMALYLSKGR (SEQ ID 21) ont été immobilisés dans des plaques 96 puits Multisorp et la détermination de la quantité réellement adsorbée a été effectué par un dosage des protéines en se référant à une gamme du peptide correspondant effectuée extemporanément. Les quantités de peptide testées sont indiquées en abscisse sur le graphe. 6.104 cellules ont été déposées dans chaque puits et les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 1 heure. Après lavages, les cellules adhérées ont été fixées et l'adhérence cellulaire a été mesurée comme décrit dans la partie méthodologie. (B) Observation des cellules HT1080 adhérés au peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) et au peptide NSFMALYLSKGR (SEQ ID 21). L'observation a été faite avec un microscope Axiovert 40 Zeiss équipé d'un bloc interférentiel PlasDic. Barre, 50 �m. Figure 7 : Mutagénèse du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) et conséquence sur la liaison au syndécan-1. Une série de mutations ponctuelles ont été introduites dans le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) en remplaçant successivement chaque acide aminé par une alanine (A). Les différents peptides mutés biotinylés sont présentés sur la figure et numérotés de Al à A10. Le peptide sauvage (T+) est représenté en noir. Les acides aminés � en gras � représentent la position des acides aminés basiques (lysines et arginines) supposés jouer un rôle important dans l'interaction avec les glycosaminoglycannes. Chacune des mutations en alanine (A) est représentée soulignée. Un lysat de kératinocytes humains normaux a été préparé comme décrit dans Matériel et Méthodes et 2 mg de lysat ont été incubé avec des billes de neutravidine non recouvertes (ligne T-), recouvertes du peptides KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) (T+) ou recouvertes des différents peptides mutés (Al à A10). Après des lavages, le matériel lié aux billes a été digéré avec un mélange d' héparitinase I et de chondroitinase ABC pour libérer la partie protéique du syndécan-I des glycosaminoglycannes. Les échantillons ont ensuite été analysés par électrophorèse SDS PAGE dans un gel à 8% d'acrylamide en conditions non réductrices puis analysées par immunotransfert avec l'anticorps polyclonal anti-syndécan H174. La position des marqueurs de poids moléculaire est indiquée sur la gauche. Figure 8 : Mutagénèse du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) et conséquence sur la liaison au syndécan-1. Une série de mutations ponctuelles ou groupées ont été introduites dans le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) en remplaçant une ou plusieurs Lysine (K) par une glutamine (Q). Les différent peptides mutés biotinylés sont présentés sur la figure et dénommés U l à U9. Le peptide sauvage est désigné T+. Les acides aminés � en gras � représentent la position des acides aminés basiques (lysines et arginines) supposés jouer un rôle important dans l'interaction avec les glycosaminoglycannes. Chacune des mutations en glutamine (Q), ponctuelle ou multiple, est représentée soulignée. Un peptide raccourci et privé de 3 résidus est désigné U9. Un lysat de kératinocytes humains normaux a été préparé comme décrit dans Matériel et Méthodes et 2 mg de lysat ont été incubé avec des billes de neutravidine non recouvertes (ligne T-), recouvertes du peptides KKLRIKSKEK (T+) ou recouvertes des différents peptides modifiés (U1 à U9). Après des lavages, le matériel lié aux billes a été digéré avec un mélange d' héparitinase I et de chondroitinase ABC pour libérer la partie protéique du syndécan-1 des glycosaminoglycannes. Les échantillons ont ensuite été analysés par électrophorèse SDS PAGE dans un gel à 8% d'acrylamide en conditions non réductrices puis analysées par immunotransfert avec l'anticorps polyclonal anti-syndécan H174. La position des marqueurs de poids moléculaire est indiquée sur la gauche. Figure 9 : Mutagénèse du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) par recherche d'homologie dans les protéines de la matrice extracellulaire et conséquence sur la liaison au syndécan- 1. Une série de variants du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) ont été produits sur la base d'homologies de séquences retrouvées dans des protéines de la matrice extracellulaire. Le peptide sauvage est désigné T+. Les acides aminés � en gras � représentent la position des acides aminés jouant un rôle important dans l'interaction avec le syndécan-1 (voir figures 6 et 7). Les acides aminés qui diffèrent de la séquence d'origine sont soulignés. (A) Des séquences homologues de la séquence KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) ont été retrouvées dans les protéines de la matrice extracellulaire et ont été appelées MI (issue de la chaîne de laminine a4 humaine ou murine), M2 (issue de la chaîne de laminine a3 murine) et M3 (issue de la protéine ADAM 20 humaine). (B) Des séquences homologues de la séquence R-X-KSK ont été retrouvées dans les protéines de la matrice extracellulaire et ont été listées de M4 à M7. (C) Des séquences homologues de la séquence RIK-X-K ont été retrouvées dans les protéines de la matrice extracellulaire et ont été listées de M8 à M9. Des lysats de kératinocytes humains normaux ont été préparés comme décrit dans Matériel et Méthodes et 2 mg de lysat ont été incubé avec des billes de neutravidine non recouvertes (ligne T-), recouvertes du peptides KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) (T+) ou recouvertes des différents peptides modifiés (MI à M9). Après des lavages, le matériel lié aux billes a été digéré avec un mélange d'héparitinase I et de chondroitinase ABC pour libérer la partie protéique du syndécan-1 des glycosaminoglycannes. Les échantillons ont ensuite été analysés par électrophorèse SDS PAGE dans un gel à 8% d'acrylamide en conditions non réductrices puis analysées par immunotransfert avec l'anticorps polyclonal anti-syndécan H174. La position des marqueurs de poids moléculaire est indiquée sur la gauche. Figure 10 : Effet du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) sur la viabilité des NHKs. Les NHKs ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 10 000 cellules par puits. Après 24 heures, les milieux de culture ont été enlevés et remplacés par du milieu KBM-2 contenant les concentrations de peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) (courbe du haut) ou de protéine LG4/5 (courbe du bas) indiquées. Après 48 h de contact à 37°C, les milieux ont été enlevés et cette étape a été renouvelée deux fois. Après 48 h de contact à 37°C, les milieux ont été remplacés par le réactif XTT. Les plaques ont ensuite été placées dans un incubateur à 37°C et la lecture de l'absorbance a été effectuée à 6 h. Des témoins sans peptide ni protéine ont été réalisés sur la même plaque. Figure 11 : Effet du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) sur la migration des NHKs par vidéomicroscopie en temps réel sur cellules vivantes. Les NHKs ont été ensemencées dans des plaques 24 puits à raison de 20 000 cellules par puits en absence (A) ou en présence du fragment LG4/5 (101.lg/ml, B) ou du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) (10�g/ml ; C) dans du milieu de culture KGM. Le comportement des cellules a ensuite été immédiatement enregistré par vidéomicroscopie en temps réel (Time-Lapse) pendant 5 heures à raison d'une prise d'image toutes les 10 minutes. Les schémas illustrent le comportement de 20 cellules prises au hasard dans un champ donné. Pour faciliter l'analyse des données, les trajets ont été orientées selon x(0), y(0). Les distances parcourues sont indiquées en micromètres sur les axes des graphes. Exemples de réalisation 1 °) Procédé de fabrication des peptides La synthèse peptidique a été effectuée sur un Synthétiseur Milligen 9050 en utilisant une chimie Fmoc-Opfp/Hobt. Le peptide est ensuite détaché de la résine et déprotégé en utilisant une solution de TFA contenant des scavengers (phénol, eau, ethanedithiol et30 thioanisole). Le peptide est ensuite analysé et purifié sur une colonne Vydac C18, 5mm de 4.6 ou l Omm de diamètre et 250mm de longueur puis caractérisé par spectrométrie de masse électrospray sur un SCIEX API 165. Les peptides biotinylés ont été produits par la société Eurogentec (Eurogentec, Anger, France). 2°) Information sur le peptide d'intérêt : KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) Nombre d'acides aminés: 10 Poids moléculaire: 1257.5 10 Point isoéléctrique théorique: 10.58 Composition en acides aminés: Arg (R) 1 10.0% Glu (E) 1 10.0% Ile (I) 1 10.0% 15 Leu (L) 1 10.0% Lys (K) 5 50.0% Ser (S) 1 10.0% Nombre total de résidus chargés négativement (Asp + Glu): 1 Nombre total de résidus chargés positivement (Arg + Lys): 6 20 Points isoélectriques théoriques des peptides analogues compris entre 10 et 12 : A2 : KALRIKSKEK : 10.46 A3 : KKARIKSKEK : 10.58 A5 : KKLRAKSKEK : 10.58 A6 : KKLRIASKEK : 10.46 A8 : KKLRIKSAEK : 10.46 A9 : KKLRIKSKAK : 11,39 A10 : KKLRIKSKEA : 10.46 M2 : KKLRLRSKER : 11.73 M4 :KKLRHKSKEK : 10.58 M5 : KKLRTKSKEK : 10.58 M6 : KKLRKKSKEK :10.68 M7 : KKLRSKSKEK : 10.58 M8 : KKLRIKLKEK : 10.58 25 30 M9 : KKLRIKQKEK : 10.58 - UI : KKLRIQSKEK : 10.46 - U2 : KKLRIKSQEK : 10.46 U3 : K(LRIKSKEQ : 10.46 3°) Les cellules utilisées pour l'étude A- les lignées 10 Les cellules utilisées proviennent de lignées exprimant une quantité importante de syndécan-1 à leur surface (Okamoto et al., 2003). Il s'agit de cellules de la lignée HT1080 (fibrosarcoma, Human), American Type Culture Collection CCL-121. Ces cellules ont été maintenues en culture dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal et 2mM glutamine et ont été cultivés à 37°C dans un incubateur à 15 CO2 (5 % de CO2, 95% d'air et 98% d'humidité). B- les kératinocytes primaires Des kératinocytes humains normaux fraîchement isolés ont été utilisés. Les kératinocytes 20 humains ont été obtenus à partir de biopsie de prépuce (déchet opératoire, Pavillon T-Bis, Hôpital Edouard Herriot). Le milieu de culture utilisé a été le milieu défini pour culture de kératinocytes KGM-2 (contenant : Extrait pituitaire bovin 35 mg, hEGF 10 ng/ml, insuline 5 gg/ml, Hydrocortisone 0,5 gg/ml, transferrine 0,1%, épinéphrine 0,1%) fabriqué par Clonetics et commercialisé par Lonza (Belgique) contenant 0,15 mM de 25 CaC12, pH 7,2 à 7,4. Les kératinocytes ont été obtenus selon la technique décrite par Boyce et Ham (Cultivation, frozen storage, and clonal growth of normal human epidermal keratinocytes in serum free-media, Tiss Cult. Meth. 1985, 9 :83-93). Les morceaux de peau, après 30 rinçage soigné dans du tampon PBS contenant des antibiotiques, est débarrassé du tissu graisseux situé sous le derme à l'aide d'instruments stériles. La peau a ensuite été découpée en morceaux de 3 mm2, lesquels ont été placés dans une solution stérile de trypsine à 0,25 % dans du PBS pendant 16 heures à 4°C. La séparation derme / épiderme 215 a été effectuée à l'aide de pinces fines dans une boîte de Pétri contenant du milieu de culture afin d'arrêter l'action enzymatique de la trypsine. Les fragments d'épiderme ont été aspirés et refoulés plusieurs fois avec une pipette pour en détacher les cellules basales libres. La suspension cellulaire ainsi obtenue a été centrifugée 5 min à 1000 tours/min et le culot ainsi obtenu a été suspendu dans un volume connu de KBM-2 pour effectuer un comptage des cellules vivantes à l'aide d'un colorant d'exclusion : le bleu trypan. 3.104 cellules vivantes ont été ensemencées par cm2 sur des boîtes pour culture de tissus de 25 cm2 (Corning, Polylabo, France). Les kératinocytes ont été cultivés à 37°C dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, 95% d'air et 98% d'humidité). Le milieu a été changé tous les deux jours. La sub-culture a eu lieu quand les cellules ont atteint la subconfluence. Le tapis cellulaire a alors été rincé avec du PBS, puis recouvert d'une solution de Trypsine-EDTA (0,05-0,02 %). Après une courte incubation à 37°C, les cellules se sont détachées du support plastique. Les cellules ont alors été ensemencées dans des boîtes de culture de 75 cm2. La congélation des cellules (3 à 5 millions par ampoule) a été réalisée dans le milieu de culture utilisé, en présence de 10% de Diméthyl sulfoxyde (DMSO) et 20 % de sérum de veau sous un volume de 1 ml. 4) Analyse quantitative des propriétés d'adhérence cellulaire du peptide d'intérêt par un test colorimétrique: - Préparation des substrats d'adhérence Les peptides, la protéine LG4/5 purifiée (Belin et Rousselle, 2007) et la LN332 purifiée (Rousselle et al., 1991) ont été utilisés au cours des expériences d'adhérence cellulaire. Une gamme de 7 concentrations décroissantes a été réalisée par dilution successive dans du PBS (Phosphate Buffer Saline, KH2PO4 1,54 mM ; Na2HPO4 1,42 mM ; NaCl 131 mM), à partir d'une solution de départ à 1 mg/ml. Ces solutions ont été immédiatement distribuées sur des plaques de culture 96 puits (Greiner, Dutscher, Brumath, France) à raison de 100 �l par puits. Les plaques ont ensuite été placées à +4°C pendant 16 à 18 heures. Les solutions ont ensuite été enlevées par retournement des plaques et chaque puits a été saturé par une solution de PBS-SAB 1% (sérum albumine bovine). Trois puits supplémentaires sans substrat ont subit le même traitement et ont servi de blanc. Les expériences de comparaison de l'adhérence médiée par les peptides KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) et NSFMALYLSKGR (SEQ ID 21) a été réalisée en utilisant les plaques 96 puits Multisorp (Nunc, Dutscher) sur lesquelles les 2 peptides ont été immobilisés avec la même efficacité. Le dosage de la quantité de peptide immobilisé a été effectué par l'acide Bicinchoninic (BCA Protein Assay, Perbio Science, Brebière, France). - Test d'adhérence cellulaire Les cellules ont été détachées des boîtes de culture par une solution de PBS/EDTA 10 mM, puis ont été suspendues dans du milieu DMEM sans additifs pour les lignées cellulaire et KBM-2 sans additifs pour les kératinocytes humains. Le nombre de cellules semées par puit est indiqué sur les graphes (50 000 à 100 000 cellules par puits). - Evaluation du test d'adhérence cellulaire Après ensemencement des cellules, les plaques multipuits ont été placées dans un incubateur à 37°C sous atmosphère 5 % CO2. Après une incubation de 30 à 60 minutes, les cellules sont observées au microscope contraste de phase afin de vérifier que le test se soit correctement déroulé. Le milieu d'adhérence a alors été éliminé et chaque puits a été lavé avec une solution de PBS stérile afin d'enlever les cellules n'ayant pas adhérées. Les cellules restantes, adhérentes au substrat, ont ensuite été fixées à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde 1 % dans du PBS, pendant 15 minutes. La solution de glutaraldéhyde a été enlevée et les cellules ont alors été colorées avec une solution de crystal violet dilué à 1 % dans de l'eau distillée pendant 30 minutes. Après d'importants rinçages à l'eau, les cellules ont été perméabilisées par une solution de triton à 0,02 % pendant 15 minutes, afin de solubiliser le crystal violet. La lecture de l'absorbance a été effectuée à 570 nm, à l'aide d'un lecteur de plaques ELISA reader (MR500, Dynatech, Guernsey Chanel, Island). Chaque point expérimental a été réalisé en trois exemplaires. La valeur du blanc représente la moyenne de l'absorbance des 3 puits témoins (SAB). Celle-ci a été soustraite à chacune des valeurs de densité optique obtenues pour les points expérimentaux. On a ensuite calculé les moyennes des trois valeurs d'absorbances pour chacune des tripliquettes. Les résultats ont été représentés sous forme de courbe, avec en ordonnée, les valeurs de l'absorbance, et en abscisse, les différentes concentrations en substrat. Les cellules adhérées ont été photographiées en microscopie à contraste de phase. 5 ) Tests d'inhibition de l'adhérence des cellules par compétition Les plaques 96 puits ont été recouvertes des quantités indiquées de peptide KKLRIKSKEK ou de laminine 332 par adsorption à +4C pendant 16 à 18 heures. Comme précédemment, les puits ont été saturés par une solution de PBS-SAB 1% pendant une heure. Les cellules HT1080 ont été détachées des boîtes de culture puis ont été suspendues dans du milieu DMEM sans sérum. Après comptage des cellules, la protéine LG4/5 entière ou le peptide ont été ajoutés à la suspension cellulaire 30 minutes avant le test d'adhérence. Un contrôle sans compétiteur a systématiquement été effectué et a été considéré comme le 100 % d'adhérence. Dans le cas de l'inhibition par l'anticorps anti-LG4/5, ce dernier a été appliqué sur les protéines immobilisées pendant une heure après la saturation par la solution de PBS-SAB 1%. 6 ) Test de viabilité cellulaire L'effet du peptide sur la viabilité cellulaire a été analysé à l'aide d'un test colorimétrique (Cell Proliferation Kit XTT, Roche Diagnostics, Meylan, France) sur les kératinocytes humains normaux. Un contrôle avec la protéine LG4/5 entière a été effectué en parallèle. La réaction chimique du test est basée sur la production de NADPH des cellules vivantes permettant la réduction des sels de tétrazolium XTT jaunes en sels de formazan orange. La mesure de l'absorbance est effectuée à 490 nm à l'aide d'un lecteur de plaques ELISA-Reader. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 10 000 cellules par puits (6 puits/condition) dans du milieu de culture KBM-2. Après 24 heures de culture à 37°C en présence de 5% de CO2, les milieux de culture ont été enlevés et remplacés par du milieu sans sérum contenant les quantités de peptide ou de protéine indiquées sur les graphes et le réactif du test. Les plaques ont ensuite été placées dans un incubateur à 37°C et des lectures de l'absorbance ont été effectuées à 1h, 2h, 3h, 4h et 5h. Des témoins sans peptide ont été réalisés sur la même plaque. Les résultats sont présentés sous la forme du pourcentage de la viabilité des cellules mises en présence du peptide ou protéine par rapport aux témoins sans peptide ni protéine. Dans ce cas, la viabilité cellulaire a été calculée selon la formule : %viabilité = (Abs. cellules avec peptide / Abs. cellules témoins) X 100. 7 ) Expérience de chromatographie d'affinité et détection du syndécan-1 Pour identifier la nature du récepteur cellulaire se liant au peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1), des expériences de chromatographie d'affinité ou � pull-down � ont été effectuées par l'incubation de billes recouvertes de peptides avec des lysats cellulaires. Les lysats de kératinocytes primaires ont été réalisés à l'aide d'un tampon de lyse 1% triton X-100 en PBS, pH 7.5, contenant N-éthylmaléimide et phénylméthylsulfonylfluoride 50 mM. Le peptide sauvage KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) et les peptides mutés ont été couplés à la biotine au niveau de leur extrémité amino-terminale et 100 �g de chaque peptide biotinylé a été associé à des billes d'agarose-neutravidine (Perbio Science, Bezons, France) par une incubation de 16 heures à +4°C. Les billes ont ensuite été incubées avec 2 mg de lysat cellulaire pendant 2 heures à +4°C. Après 3 lavages avec du tampon de lyse, les billes ont été transférées dans un tampon de digestion (20 mM sodium acetate, 5 mM CaCl2, pH 7.0) contenant 8 mU/ml d' héparitinase I and 50 mU/ml de chondroitinase ABC (Seikagaku America, Coger, Paris, France) pendant 2 heures à 25°C. Ce traitement permet de dénuder la partie protéique du syndécan-1 des glycosaminoglycannes, la rendant plus facilement analysable par immunotransfert. Les échantillons ont ensuite été analysés par électrophorèse SDS PAGE dans un gel à 8% d'acrylamide en conditions non réductrices puis analysées par immunotransfert avec l'anticorps polyclonal anti-syndécan H174 (Santa Cruz Biotechnology, Le Perray en Yvelines, France). 8 ) Vidéomicrocopie en temps réel sur cellules vivantes (Time Lapse) Les experiences de vidéomicrocopie ont été réalisées avec un microscope Axiovert 100M Zeiss equipé d'une caméra CCD (1 image toutes les 10 minutes). Dans chaque expérience, nous avons analysé les mouvements de 100 cellules à l'aide du logiciel Metaview (Roper Scientific, Princeton Instruments, Evry, France). Résultats : a/ Etude de l'adhérence des kératinocytes humains normaux et des cellules HT1080 au fragment LG4/5 et au peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) 5 Comme le montre la figure 3, le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) induit l'adhérence cellulaire des cellules HT1080 et des kératinocytes humains normaux de façon dose dépendante. Une expérience contrôle d'adhérence a été effectuée avec les mêmes cellules sur le fragment LG4/5 entier purifié afin de mettre en évidence l'adhérence syndécan-1 10 dépendante et de comparer la morphologie cellulaire obtenue entre le fragment LG4/5 entier et la séquence peptidique d'interaction du syndécan-1. Les cellules sont solidement ancrées sur le peptide puisqu'elles ont résisté, de façon comparable au fragment LG4/5 entier, aux différents lavages avant fixation. L'adhérence cellulaire maximale a été obtenue lorsqu'une quantité moyenne de 10 microgrammes de peptide a été déposée dans 15 les puits pour l'immobilisation. Le profil d'adhérence des deux types cellulaires HT1080 et NHK est identique sur le peptide d'intérêt. Cette expérience est qualitative et a été réalisée dans le but d'analyser le comportement des cellules au contact du peptide. Les concentrations inductrices de l'adhérence sont donc indicatives puisque (1) elles ne tiennent pas compte de la quantité de peptide réellement immobilisé dans les puits et (2) 20 elles dépendent de la quantité de cellules apportée dans chaque puits. Ces observations indiquent que les quantités annoncées sont surévaluées et que des quantités moins importantes pourront avoir un effet d'induction de l'adhérence cellulaire syndécan-1 dépendante. En effet, un nombre relativement faible de cellules a volontairement été utilisé dans cette expérience dans le but de mettre en évidence l'effet dose-réponse et de 25 pouvoir analyser la morphologie de cellules individuelles. Un tapis trop confluent aurait gêné cette observation. Les photos obtenues en microscopie à contraste de phase montrent que les cellules HT1080 et les kératinocytes adhérés au peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) présentent la même morphologie que ces mêmes cellules adhérées au fragment LG4/5 entier. Ceci indique que le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) est 30 capable d'induire les propriétés d'adhérence portées par le fragment LG4/5 entier. Comme décrit largement dans les publications du Demandeur, l'adhérence à LG4/5 induit l'étalement cellulaire sous la forme de prolongements cytoplasmiques protrusifs de type filopodes (Décline et al., 2003, Okamoto et al., 2003, Bachy et al., 2008, Sulka et al., 26 2009). Ces structures associées au cytosquelette d'actine interviennent dans les processus de migration cellulaire. Pour confirmer que le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) correspond à la séquence responsable de l'adhérence cellulaire sur le fragment LG4/5, des expériences de compétition ont été effectuées en pré-incubant les cellules avec le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) avant de les faire adhérer au fragment LG4/5 (Figure 4). Dans cette expérience, l'adhérence cellulaire a également été testée sur la LN332 afin de nous assurer de la spécificité de l'effet du peptide sur la protéine LG4/5 et non sur d'autres protéines matricielles. Un contrôle positif et spécifique de l'inhibition de l'adhérence à LG4/5 a été effectué avec un anticorps polyclonal anti-LG4/5 que nous avons caractérisé comme bloquant la fonction de LG4/5. La protéine LG4/5 entière a également été utilisée comme contrôle positif dans cette expérience. Ainsi, les cellules HT1080 ont, soit été utilisées tel quel, soit été pré-incubées avec la protéine LG4/5 entière ou avec le peptide. Elles ont été ensuite déposées sur les substrats LG4/5 et LN332 pour l'expérience d'adhérence. De façon attendue, notre anticorps anti-LG4/5 a inhibé l'adhérence au fragment LG4/5 sans altérer l'adhérence à la LN332. Le fragment LG4/5 apporté en solution a bloqué lui aussi, en se fixant sur le syndécan-1 des cellules, l'adhérence au fragment LG4/5 immobilisé sans perturber l'adhérence à la LN332. Le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) apporté en solution a, lui aussi, bloqué complètement l'adhérence des cellules au fragment LG4/5 et il n'a pas affecté l'adhérence à la LN332. Ce résultat montre que le peptide a été capable à lui seul de se fixer sur le récepteur impliqué dans l'adhérence au fragment LG4/5. Le fait qu'il n'ait pas inhibé l'adhérence à la LN332 confirme la spécificité de son activité sur le fragment LG4/5. Ces résultats montrent que la séquence KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) représente la séquence responsable de l'adhérence syndécan-1 dépendante sur le fragment LG4/5. Ils montrent également que le fragment LG4/5 ou le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) apportés sous forme soluble, présentent la capacité d'interagir avec les cellules et de se fixer sur le récepteur syndécan-l. Ceci indique que ces protéines pourraient également activer des voies de signalisation syndécan-1 dépendantes lorsqu'elles sont apportées sous forme soluble. b/ Mise en évidence de la liaison spécifique du syndécan-1 au peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) par chromatographie d'affinité Pour démontrer que le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) est le site d'interaction du syndécan-1 sur le fragment LG4/5, des expériences de chromatographie d'affinité ont été effectuées en fixant le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) associé à la biotine sur les billes de streptavidine. Le peptide ainsi exposé à la surface des billes sert d'hameçon moléculaire destiné à piéger son récepteur dans un extrait de kératinocytes humains normaux. Dans cette expérience, les 2 autres séquences identifiées dans le fragment LG4/5 comme impliquées dans la liaison à l'héparine (PSGKPKSLP (SEQ ID 19) et TSVTPKQSL (SEQ ID 20), Vives et al., 2003) ont également été biotinylées et testées. Des homogénats de kératinocytes primaires ont été préparés et les billes recouvertes des différents peptides ont été incubées avec des quantités équivalentes de ces lysats (Figure 5A). Les protéines fixées sur les billes ont été ensuite analysées par électrophorèse SDS- PAGE suivi d'une immunodétection pour évaluer leur contenu en syndécan-1. Comme montré figure 5A, seul l'extrait protéique fixé sur les billes recouvertes du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) (ligne 2) présente une protéine reconnue par l'anticorps antisyndécan-1. Les billes non recouvertes de peptide (témoin négatif, ligne 1), ainsi que les billes recouvertes des deux autres peptides (lignes 3 et 4) n'ont pas retenu le syndécan-1. Pour confirmer l'identité de la protéine associée au peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) comme étant le syndécan-1, l'expérience a été répétée en utilisant le fragment LG4/5 entier comme contrôle positif (Figure 5B). Dans ce cas, la protéine purifiée par le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) (ligne 3) correspond bien au syndécan-1, puisque qu'elle correspond à la protéine purifiée par le fragment LG4/5 entier (ligne 2). Les billes non recouvertes de peptide ne montrent aucune fixation non spécifique (ligne 1). Ces résultats montrent que le syndécan-1 est un récepteur spécifique du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) de façon comparable au fragment LG4/5 entier. c/ Adhérence des cellules HT1080 aux peptides KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) et NSFMALYLSKGR (SEQ ID 21) (décrit dans JP2006063033). Par une approche basée sur la production de peptides recouvrant séquentiellement la totalité de la séquence des modules LG4/5, une autre séquence a été identifiée comme inductrice de l'adhérence cellulaire (Utani et al., 2001 et JP2006063033) via d'autres récepteurs comme le syndécan 2 ou 4. Cette séquence NSFMALYLSKGR (SEQ ID 21) (du résidu 1412 au résidu 1423 de la séquence de la chaine alpha 3) est localisée dans le module LG4. Pour comparer la capacité d'induction de l'adhérence cellulaire du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) avec cette séquence peptidique, un test d'adhérence a été effectué de façon comparative avec les cellules HT1080, qui expriment le syndécan-1 (Figure 6). Les deux peptides ont été immobilisés sur des plaques 96 puits et la quantité de peptide adsorbé a été quantifiée afin de garantir des quantités équivalentes de peptide dans les 2 cas. Une gamme de peptide réellement immobilisé comprise entre 21.tg et 0,071.tg par puits a ainsi été effectuée. Après avoir été détaché des boites de culture dans des conditions préservant les syndécans, les cellules HT1080 ont été déposées dans les puits contenant les deux peptides et sont restés en contact pendant une heure en absence de sérum (Figure 6A). L'analyse quantitative de l'adhérence cellulaire révèle que le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) est plus efficace que le peptide NSFMALYLSKGR (SEQ ID 21) puisque (1) l'adhérence cellulaire est induite pour une quantité de peptide immobilisée plus basse (de l'ordre de 0,025 �g) et (2) l'adhérence cellulaire maximale atteinte au plateau est significativement plus importante (de l'ordre de 200%). Par ailleurs l'analyse de la morphologie cellulaire montre que, si les cellules adhérées à KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) présentent une morphologie typique de l'adhérence syndécan-1 dépendante au fragment LG4/5 (voir figure 3), l'adhérence des cellules au peptide NSFMALYLSKGR (SEQ ID 21) n'est pas homogène et n'est pas accompagnée d'étalement cellulaire puisque l'on note l'absence de prolongements cytoplasmiques (Figure 6B). L'adhérence à ce peptide a été décrite comme impliquant les syndécans -2 et -4 (Utani et al., 2001). Ceci suggère que ce peptide pourrait être impliqué dans des processus cellulaires différents de ceux que nous décrivons pour le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1). d/ Mutations Dans un objectif de caractérisation de l'activité du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1), l'importance des différents acides aminés dans l'interaction avec le syndécan-1 a été évaluée en effectuant un certain nombre de substitutions de ces acides aminés. Ce travail a également eu pour objectif d'identifier les résidus essentiels à l'activité du peptide. Dans un premier temps, et pour ne provoquer qu'un minimum d'altérations structurales du peptide, chacun des acides aminés de la séquence KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) ont été successivement substitué par un acide aminé neutre, l'alanine (A) (Figure 7). Les expériences de recrutement du syndécan-1 avec cette série de peptides mutés montrent que la substitution individuelle de trois résidus est suffisante pour inhiber l'interaction avec le syndécan-l. Ces résidus sont l'acide aminé 1 : une lysine (K), l'acide aminé 4 : une arginine (R) et l'acide aminé 7 : une sérine (S). On note la présence de 5 résidus Lysine dans la séquence du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1), et seule la mutation de la première a provoqué une perte totale de l'activité d'interaction du peptide. Ceci indique que l'activité de chacun des autres résidus Lysine a été compensée lors de l'interaction avec le syndécan-1. Pour caractériser plus précisément le rôle de ces résidus Lysine dans la séquence peptidique, la charge de chacun de ces résidus a été modifiée, et l'impact de ce changement dans la fixation au syndécan-1 a été analysé. Pour cela, ces acides aminés ont été remplacés par une glutamine (Q), acide aminé neutre à pH physiologique (Figure 8). Ces mutations ont été soit ponctuelles (un seul acide aminé substitué), soit regroupées (2 ou 3 substitutions simultanées). e/ Séquences homologues Des recherches d'homologies de la séquence KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) dans les protéines de la matrice extracellulaire ont été effectuées afin d'identifier un potentiel homologue ayant des propriétés de liaison au syndécan-1 et de nous assurer de la spécificité de l'activité de cette séquence. Les 4 protéines de la matrice extracellulaire identifiées comme présentant une séquence homologue à la séquence KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) de la chaîne de laminine alpha 3 humaine sont la chaîne de laminine alpha 3 murine (M2), les chaînes de la laminine alpha 4 de laminine humaine (M1) et murine (M1) et la protéine transmembranaire ADAM 20 (M3) (Figure 9A). L'ensemble de ces 30 séquences ont été testées pour leur capacité à lier le syndécan-1 et seules les séquences de laminine alpha 3 et alpha 4 humaines et murines se sont révélées capable de lier le syndécan-1 alors que la séquence de la protéine ADAM 20 a été inactive (Figure 9C). L'ensemble de ces résultats montre que la séquence de liaison au syndécan-1 présente dans la chaîne de laminine alpha 3 humaine est conservée chez la souris. De plus, on note qu'une séquence homologue est présente dans la chaîne de laminine alpha 4. Le fait que la séquence présente dans la protéine ADAM 20 ne lie pas le syndécan-1 appuie le caractère de spécificité et d'unicité de la séquence présente dans les laminines. Pour étayer les possibilités de substitution de quelques résidus, des recherches d'homologie ont été effectuées sur des fragments de la séquence du peptide et les séquences identifiées ont été replacées dans le cadre du peptide entier (Figure 9B). Notamment, des substitutions de l'acide aminé 5 (Isoleucine, M4 à M7) et de l'acide aminé 7 (Sérine, M8 et M9) ont été identifiées. On remarque figure 9C qu'aucune de ces mutations n'a entraîné d'inhibition de l'interaction. f/ Viabilité cellulaire Enfin pour s'assurer que le peptide n'ait pas d'activité toxique envers les kératinocytes, un test de viabilité cellulaire a été effectué en utilisant une gamme de peptide variant de 100 à 1 �g/ml. Un contrôle avec la protéine LG4/5 entière a été effectué en parallèle (Figure 10). Les kératinocytes ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 10 000 cellules par puits. Après 24 heures, les milieux de culture ont été enlevés et remplacés par du milieu KBM-2 contenant les quantités de peptide (courbe rose) ou de protéine LG4/5 (courbe bleue) indiquées sur les graphes. Après deux jours à 37°C, cette étape a été renouvelée deux fois et la quantification des cellules vivantes a été effectuée avec le réactif du test XTT. Les résultats, présentés sous la forme du pourcentage de la viabilité des cellules mises en présence du peptide ou de la protéine LG4/5 par rapport aux témoins, montrent que ni le peptide KKLRIKSKEK, ni la protéine LG4/5 ne possède pas d'activité cytotoxique à long terme sur les kératinocytes de l'épiderme.30 g/ Induction de la migration cellulaire L'effet de l'apport du fragment LG4/5 entier ou de la séquence KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) sous forme soluble dans le milieu de culture des kératinocytes humains normaux a été analysé par vidéomicrocopie en temps réel sur cellules vivantes. L'observation des kératinocytes pendant 5 heures a permit de mettre en évidence des différences significatives selon les conditions. Les kératinocytes normaux maintenus dans le milieu de culture classique ont effectués des mouvements circulaires permanents de faible amplitude dont la distance totale ne dépassait jamais 40 �m (Figure 11A). L'ajout de la protéine LG4/5 ou du peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) dans le milieu de culture a induit un changement drastique de comportement (figure 11B et C). Dans les deux cas, les mouvements circulaires des kératinocytes ont été remplacés par des déplacements linéaires aléatoires dont la distance (par rapport à l'origine) pouvait atteindre 150 �m. Ces résultats montrent que le fragment LG4/5 induit la migration cellulaire lorsqu'il se fixe sur les cellules. Le peptide KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) est capable de reproduire l'activité du fragment LG4/5. Si l'adhésion au fragment LG4/5 joue un rôle important dans la migration cellulaire induite par la pre-LN332, ce même fragment LG4/5 (ou sa séquence minima KKLRIKSKEK (SEQ ID 1)) est capable à lui seul d'induire la migration cellulaire. Le peptide présente des propriétés d'induction de la cicatrisation cutanée. 32 BIBLIOGRAPHIE Amano S, Scott IC, Takahara K, Koch M, Champliaud MF, Gerecke DR, Keene DR, Hudson DL, Nishiyama T, Lee S, Greenspan DS, and Burgeson RE. (2000) J. Biol. Chem. 275, 22728-2273 5. Aumailley M, Gimond C, and Rousselle P. (1996) Integrin-mediated cellular interactions with laminins. In 'The laminins" Eds. P. Ekblom, R. Timpl, Harwood Academic Publishers, pp 127-158. Aumailley M, and Rousselle P. (1999) Laminins of the dermo-epidermal junction. Matrix Biol., 18 :19-28. Bachy S, Letourneur F, and Rousselle P. (2008) Syndecan-1 interaction with the LG4/5 domain in laminin-332 is essential for keratinocyte migration. J Cell Physiol., 214 :238-249. Baker SE, Hopkinson SB, Fitchmun M, Andreason GL, Frasier F, Plopper G, Quaranta V, and Jones JC. (1996) J. Cell Sci. 109, 2509-2520. Belin V, and Rousselle P. (2006) Production of a recombinantly expressed laminin fragment by HEK293-EBNA cells cultured in suspension in a dialysis-based bioreactor. Protein Expr. Purif. 48:43-48. Bernfield M, Gotte M, Park PW, Reizes O, Fitzgerald ML, Lincecum J, and Zako M. (1999) Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans. Ann. Rev. Biochem. 68, 729-777. Clark RAF. (1996). Wound repair : overview and general considerations. In : The molecular and cellular biology of wound repair. Clark R.A.F, Editor. Plenum Press/New York. 3-50. Decline F, and Rousselle P. (2001). Keratinocyte migration requires alpha2betal integrinmediated interaction with the laminin 5 gamma2 chain. J. Cell Sci. 114:811-823. Decline F, Okamoto O, Mallein-Gerin F, Helbert B, Bernaud J, Rigal D, Rousselle P. (2003). Keratinocyte motility induced by TGF-betal is accompanied by dramatic changes in cellular interactions with laminin 5. Cell Motil. Cytoskeleton 54:64-80. Elenius K, Vainio S, Laato M, Salmivirta M, Thesleff I and Jalkanen M. (1991) Induced expression of syndecan in healing wounds. J. Cell Biol. 114:585-595. Frank DE and Carter WG. (2004). Laminin 5 deposition regulates keratinocyte polarization and persistent migration. J. Cell Sci. 117:1351-1363. Gallo R, Kim C, Kokenyesi R, Adzick NS and Bernfield M. (1996) Syndecans-1 and -4 are induced during wound repair of neonatal but not fetal skin. J. Invest. Dermatol. 107:676-683. Ghohestani RF, Li K, Rousselle P, and Uitto J. (2001) Molecular organization of the cutaneous basement membrane zone. Clin. Dermatol., 19:551-562. Goldfinger LE, Hopkinson SB, deHart GW, Collawn S, Couchman JR, and Jones JC. (1999) The alpha3 laminin subunit, alpha6beta4 and alpha3betal integrin coordinately regulate wound healing in cultured epithelial cells and in the skin. J. Cell Sci. 112:2615-2629. Goldfinger LE, Stack MS, and Jones JC. (1998) Processing of laminin-5 and its functional consequences: role of plasmin and tissue-type plasminogen activator. J. Cell Biol. 141: 255-265. Hynes RO. (1992) Integrins : versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell 69:11-25. Jaakkola P, Kontusaari S, Kauppi T, Maata A, and Jalkanen M. (1998) Wound reepithelialization activates a growth factor-responsive enhancer in migrating keratinocytes. FASEB J 12: 959-969. Lampe PD, Nguyen BP, Gil S, Usui M, Olerud J, Takada Y, and Carter WG. (1998) Cellular interaction of integrin alpha3betal with laminin 5 promotes gap junctional communication. J. Cell Biol. 143,1735-1747. Larjava H, Salo T, Haaspasalmi K, Kramer RH, Heino J. (1993) Expression of integrins and basement membrane components by wound keratinocytes. J. Clin. Invest. 92:1425-1435. Marinkovich MP, Lunstrum GP, and Burgeson RE. (1992) The anchoring filament protein kalinin is synthesized and secreted as a high molecular weight precursor. J. Biol. Chem. 267, 17900-17906. Nguyen BP, Ryan MC, Gil SG and Carter WG. (2000) Deposition of laminin 5 in epidermal wounds regulates integrin signaling and adhesion. Curr. Opin. Cell Biol. 12:554-562. Niessen CM, Hogervorst F, Jaspars LH, de Melker AA, Delwel GO, Hulsman EH, Kuikman I and Sonnenberg A. (1994) The alpha 6 beta 4 integrin is a receptor for both laminin and kalinin. Exp Cell Res 211:360-367. Okamoto O, Bachy S, Odenthal U, Bernaud J, Rigal D, Lortat-Jacob H, Smyth N and Rousselle P. (2003) Normal human keratinocytes bind to the alpha3LG4/5 domain of unprocessed laminin-5 through the receptor syndecan-1. J. Biol. Chem. 278:44168-44177. Oksala O, Salo T, Tammi R, Hakkinen L, Jalkanen M, Inki P and Larjava H. (1995) Expression of proteoglycans and hyaluronan during wound healing. J. Histochem. Cytochem. 43:125-135. Rousselle P, Aumailley M. (1994) Kalinin is more efficient than laminin in promoting adhesion of primary keratinocytes and some other epithelial cells and has a different requirement for integrin receptors. J. Cell Biol. 125: 205-214. Rousselle P, Keene DR, Champliaud MF, Van der Rest M, and Burgeson R.E. (1997) Laminin 5 binds type VII collagen thru its NC1 domain. J. Cell Biol. 138:719-728. Rousselle P, Lunstrum GP, Keene DR, and Burgeson RE. (1991) Kalinin : an epithelium- specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. J. Cell Biol. 114:567-576. Ryan MC, Lee K, Miyashita Y, and Carter WG. (1999) Targeted disruption of the LAMA3 gene in mice reveals abnormalities in survival and late stage differentiation of epithelial cells. J. Cell Biol. 145:1309-1323. Ryan MC, Tizard R, VanDevanter DR and Carter WG. (1994) Cloning of the LamA3 gene encoding the alpha 3 chain of the adhesive ligand epiligrin. Expression in wound repair. J. Biol. Chem. 269:22779-22787. Sigle RO, Gil SG, Bhattacharya M, Ryan MC, Yang TM, Brown TA, Boutaud A, Miyashita Y, Olerud J, and Carter WG. 2004. Globular domains 4/5 of the laminin alpha3 chain mediate deposition of precursor laminin 5. J. Cell Sci. 117:4481-4494. Sonnenberg A, de Melker AA, Martinez de Velasco AM, Janssen H, Calafat J, and Niessen CM. (1993) Formation of hemidesmosomes in cells of a transformed murine mammary tumor cell fine and mechanisms involved in adherence of these cells to laminin and kalinin. J. Cell Sci. 106:1083-1102. Stepp MA, Gibson HE, Gala PH, Iglesia DD, Pajoohesh-Ganji A, Pal-Ghosh S, Brown M, Aquino C, Schwartz AM, Goldberger O, Hinkes MT and Bernfield M. (2002) Defects in keratinocyte activation during wound healing in the syndecan-1-deficient mouse. J. Cell Sci. 115, 4517-4531. Sulka B, Lortat-Jacob H, Terreux R, Letourneur F, and Rousselle P. (2009) Tyrosine déphosphorylation of the syndecan-1 PDZ binding domain regulates syntenin-1 recruitment. J. Biol. Chem. Feb 19. Timpl R, Tisi D, Talts JF, Andac Z, Sasaki T, and Hohenester E. (2000) Structure and function of laminin LG modules. Matrix Biol., 19:309-317. Tisi D, Talts JF, Timpl R, a,d Hohenester E. Structure of the C-terminal laminin G-like domain pair of the laminin alpha2 chain harbouring binding sites for alphadystroglycan and heparin. Embo J. 2000, 19: 1432-1440. Tunggal L, Ravaux J, Pesch M, Smola H, Krieg T, Gaill F, Sasaki T, Timpl R, Mauch, C and Aumailley M. (2002) Defective laminin 5 processing in cylindroma cells. Am. J. Pathol. 160:459-468. Utani A, Nomizu M, Matsuura H, Kato K, Kobayashi T, Takeda U, Aota S, Nielsen PK and Shinkai H. (2001) A unique sequence of the laminin alpha 3 G domain binds to heparin and promotes cell adhesion through syndecan-2 and -4. J. Biol. Chem. 276:28779-28788. Vivès R, Crublet E, Andieu JP, Gagnon J, Rousselle P, and Lortat-Jacob H. (2004) A novel strategy for defining critical amino acid residues involved in protein/glycosaminoglycan interactions. J. Biol. Chem., 279:54327-54333. Woods, A, and Couchman JR. (2000) Integrin modulation by lateral association. J. Biol. Chem. 275, 24233-24236 REVENDICATIONS1/ Peptide synthétique comprenant la séquence KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) ou une séquence de taille identique, dans laquelle les résidus K (en position 1) et R (en position 4) sont conservés, la séquence étant apte à se lier au récepteur syndecan-1. 2/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué de la séquence KKLRIKSKEK (SEQ ID 1) ou une séquence de taille identique, dans laquelle les résidus K (en position 1) et R (en position 4) sont conservés. 3/ Peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il contient ou est constitué de la séquence aa,aa2aa3aa4aa5aa6aa7aa8aa9aa,o dans laquelle, à pH physiologique : - aal est un résidu lysine, - aa4 est un résidu arginine, aa2, aa6, aa8, aa,o sont des résidus de charge positive ; au plus un d'entre eux pouvant être substitué par un résidu de charge neutre, aa3 est un résidu de charge neutre aa5 est un résidu de charge neutre - aa7 est un résidu de charge neutre à l'exception de l'alanine. - aa9 est un résidu de charge négative ou un résidu de charge neutre. 4/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient ou est constitué d'une séquence choisie dans le groupe suivant : - KALRIKSKEK (SEQ ID 2) KKARIKSKEK (SEQ ID 3) KKLRAKSKEK (SEQ ID 4) - KKLRIASKEK (SEQ ID 5) - KKLRIKSAEK (SEQ ID6) KKLRIKSKAK (SEQ ID 7) - KKLRIKSKEA (SEQ ID 8) KKLRLRSKER (SEQ ID 9) KKLRHKSKEK (SEQ ID 10) KKLRTKSKEK (SEQ ID 11) KKLRKKSKEK (SEQ ID 12) - KKLRSKSKEK (SEQ ID 13) KKLRIKLKEK (SEQ ID 14)KKLRIKQKEK (SEQ ID 15) KKLRIQSKEK (SEQ ID 16) - KKLRIKSQEK (SEQ ID 17) - KKLRIKSKEQ (SEQ ID 18) 5/ Peptide selon l'une des revendications 1 à 4 pour utilisation comme médicament. 6/ Utilisation du peptide selon l'une des revendications 1 à 4, pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à favoriser la cicatrisation de la peau. 7/ Composition pharmaceutique ou cosmétique comprenant un peptide objet de l'une des revendications 1 à 4. 8/ Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la 15 forme d'une crème d'un hydrogel, d'une solution, d'une formulation injectable ou d'un spray comprenant éventuellement des kératinocytes autologues ou des cellules mésenchymateuses. 9/ Dispositif médical comprenant un peptide objet de l'une des revendications 1 à 4. 20 10/ Dispositif médical selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'un support sur lequel est greffé ou déposé, ou à l'intérieur duquel est incorporé le peptide synthétique, le support se présentant sous la forme d'un film ou d'une matrice constitués d'un matériau biologique choisi dans le groupe comprenant collagène, 25 gélatine, polysaccharide, acide hyaluronique, cellulose, carboxyméthylcellulose, pectine, chitosane, derme humain ou animal acellularisé, ou d'un matériau synthétique choisi dans le groupe comprenant silicone, polyuréthane, PLLA, ou d'un matériau textile du type pansement choisi dans le groupe comprenant coton, polyester, polyamide. 30 11/ Milieu de culture contenant le peptide objet de l'une des revendications 1 à 4, destiné à la culture in vitro de cellules épithéliales ou mésenchymateuses. 12/ Support de culture de cellules épithéliales comprenant un support proprement dit sur lequel est greffé ou adsorbé le peptide objet de l'une des revendications 1 à 3, le support 35 se présentant sous la forme d'une boite de culture en polystyrène, d'un film ou d'une matrice poreuse réalisée en biopolymère, d'une membrane textile ou d'un gel de collagène. 38 10