FR 2944278 A1 20101015 FR 0952322 A 20090409 La présente invention se situe dans le domaine de la chimie et de la pharmacie et concerne un procédé de préparation de complexes moléculaires solubles par la technologie des fluides denses sous pression, notamment celle du CO2. En particulier, la présente invention se rapporte à un procédé de préparation de complexes moléculaires entre un agent rétinoïde et des cyclodextrines par la technologie de fluides denses sous pression. Les nouvelles molécules pharmaceutiques, à forte valeur ajoutée, sont dans 40% des cas insolubles ou peu solubles dans l'eau, ce qui nuit à leur biodisponibilité. Dans les domaines pharmaceutiques, cesmétigue et nutraceutique, il existe un certain nombre denao_dos do brevets, brevets et publications relatifs à la formation, en milieu sous pression, de complexes moléculaires d'une substance active dans un substrat enrobant. Neanm.oins, la plupart des procédés décrits ne concerne pas l'objectif d'amélioration de la biodisponibilité, mais plutôt l'adsorption d'une substance active sur un substrat. Van Hees et al. (Application of supercritical carbon dioxide for tAze preparation of a Piroxicam-ss-cyclodextrin inclusion compound, Pharmaceutical Research, Vol. 16, N 12, 1999) décrivent dans leur publication un procédé d'inclusion de Piroxicam dans les (3-cyclodextrines par CO2 supercritique. Le piroxicam étant peu soluble dans l'eau, son inclusion dans les P-cyclodextrines doit permettre d'augmenter sa solubilité dans l'eau. Le procédé consiste à placer un mélange de piroxicam et de (3-cyclodextrines dans un réacteur, laissé en mode statique. Après dépressurisation le mélange obtenu est broyé et homogénéisé avant caractérisation par : DSC (Differential Scarming Calorimetry), mesure de solubilité dans l'acétonitrile et comparaison avec la solubilité du piroxicam seul, et méthodes spectroscopiques. L'analyse par DSC permet de conclure quant complexation du piroxicam avec la p-cyclodextine. Dans la demande W02006/070093, il est décrit une composition comprenant de l'adapalene solubilisé en milieux aqueux avec des cyclodextrines ou des dérivés de celles-ci. La composition comprend donc un mélange physique entre l'adapalène et les cyclodextrines. La demande W02004/096284 décrit un procédé de prépara t_.__ de c_c.ploxes moleccic: as soluble une ou plusieurs substances actives peu solubles dans an milieu aqueux incluses dans un ou plusieurs molécules hôtes et en particulier des analgésiques, des antip'r.t__uos, des antibiotiques, des anti-inflammatoires. Ledit procédé comprend une étape (a) de mise en contact d'une ou plusieurs substances actives avec une ou plusieurs molécules hôtes, une étape (b) de mise en oeuvre d'une étape de diffusion moléculaire par mise en contact, en mode statique, d'un fluide dense sous pression avec le mélange obtenu à l'étape (a) en présence d'un ou plusieurs agents de diffusion, (c) récupération du complexe moléculaire ainsi formé. De façon surprenante, les inventeurs de la présente demande ont découvert qu'un procédé comprenant une étape de diffusion moléculaire par un fluide dense sous pression en mode statique et dépourvu de l'étape de lavage subséquente à l'aide d'un fluide supercritique, améliorait significativement le taux d'inclusion de la substance active et en particulier un agent rétinoïde en fonction de la quantité d'un agent de diffusion ajoutée au milieu. En effet, comme démontré dans les exemples, ce procédé 5 permet d'obtenir un complexe moléculaire c:mpremant agent rétinoïde et des cyclodextrines dont la solubilité est très améliorée par rapport au mélange physique avec un agent rétinoïde et des cyclodextrines. 10 Ainsi, la présente invention concerne un ssédé de préparation de complexes moléculaires solubles comprenant une substance active peu soluble dans un milieu aqueux et en particulier un agent rétinoïde incluse dans une ou plusieurs molécule s hôtes, caractérisé en ce nu' _1 est 15 ot_ ment co__sL t ,é par las es -Las: (a) mise en contact d'une ou plusieurs ssbstasses actives avec une cu plusieurs molécules hôtes, (b) mise en ivre diane etc:pe de .._ lf _s_o n par mise en contact, en mode statique, d'un fluide dense 20 sous pression avec le mélange obtenu à l'étape (a) en présence d'un ou plusieurs agents de diffusion, (c) récupération du complexe moléculaire ainsi formé. Le procédé décrit ci-dessus peut comprendre une étape supplémentaire d) de séchage du complexe, avantageusement à 25 une température comprise entre 40°C et 60°C de préférence sous vide. La présente invention se rapporte à un procédé de préparation de complexes moléculaires entre un agent 30 rétinoïde et des cyclodextrines par la technologie des fluides denses sous pression. En particulier, la présente invention se rapporte à un procédé de préparation de complexes moléculaires entre le rétinal et des cyclodextrines par la technologie des fluides denses sous pression. Par fluide dense sous pression, on entend au sens de la présente invention tout fluide util_ol a une temp rature une pression supérieure à leur valeur critique. Avantageusement il s'agit du CO2 pur ou en mélange avec un solvant organique classiquement utilisé par l'homme du métier. Par substance active peu soluble dans un milieu aqueu._x, entend au sens de la présente invention toute substance active peu ou pas soluble dans un milieu aqueux et ayant en particulier une solubilité inférieure moins Avantageusement 11 s'agit d'une bss .s active choisie dans le groupe des rétinoïdes ou les dérivés à l'exception de l'adapalène. Par rétinoïde, on entend tout composé se liant aux récepteurs RAR et/ou RXR tel que la trétinoine (notamment le produit Retacnyl� commercialisé par la société Galderma) ou l'isotrétinoïne (produit Roaccutane� commercialisé par les Laboratoires Roche). Le rétinoïde préférentiellement choisi est le rétinal. A titre d'exemple on peut encore citer comme rétinoïde, l'acide rétinoique, la trétinoine, le tazarotène, le rétinal, le rétinol ainsi que ceux décrits dans les brevets ou demandes de brevet suivants : US 4,581,380, EP 0 210 929, EP 0 232 199, EP 0 292 348, EP 0 325 540, EP 0 359 621, EP 0 409 740, EP 0 552 282, EP 0 584 191, EP 0 514 269, EP 0 661 260, EP 0 661 258, EP 0 679 628, EP 0 679 631, EP 0 679 630, EP 0 709 382, EP 0 722 928, EP 0 728 739, US 4, 666, 941, EP 0 260 162, EP 0 409 728, EP 0 514 264, EP 0 658 553, EP 0 708 100, EP 0 732 328, EP 0 740 937, EP 0 776 885, EO 0 776 881, EP 0 823 903, EP 0 832 057, EP 0 832 081, EP 0 816 352, EP 0 826 657, EP 0 874 626, EP 0 934 295, EP 0 915 823, EP 0 882 033, EP 0 850 909, EP 0 879 814, E? 0 952 974, EP 0 905 118, EP C 947 496, ",1098/56783, 99!10322, 239, U099/65872.] Les concentrations en rétinoïde préférées sont comprises entre 0,0001 et 20 % en poids par rapport au poids total de 10 la composition. De manière préférée, la composition selon l'invention comprend entre 0.001 et 5% et avantageusement entre 0.01 et n p i inoïc pa rapport au 15 composition, préférentiellement entre 0.01 et de préférence, entre 0.1 et 0.4 en poids de rétinoïde, encore plus préférentiellement 0.3 1 en poids de rétinoïde. Par molécule hôte, on entend au sens de la présente 20 invention toute substance apte à capter des substances actives. Avantageusement la molécule hôte est choisie dans le groupe constitué par les polyoses et les oses, notamment les cyclodextrines et leur mélange. Les cyclodextrines utilisées dans la présente invention 25 sont celles connues de la littérature. Les cyclodextrines (CD) sont des oligosaccharides cycliques constitués d'unités (a-1,4) a-D- glucopyranose avec une cavité centrale lipophile et une surface externe hydrophile (Frdmming KH, Szejtli J : � Cyclodextrins in pharmacy �, 30 Kluwer Academic Publishers, Dortrecht, 1994). Les cyclodextrines sont connues pour augmenter la solubilité de molécules par la formation d'une structure en forme de � cage � possédant une partie hydrophile externe et une partie hydrophobe interne. Les cyclodextrines peuvent ainsi former des complexes d'inclusion avec beaucoup de médicaments en acceptant à l'interieur de la cavité la molécule entière, ou plus communément la partie lipophile de la molécule. Les cyclodextrines naturelles les plus abondantes sont les a-cyclodextrines, les (3-cyclodextrines et les 7-cyclodextrines. Les a-cyclodextrines (connues également sous le nom de Schardinger's a-dextrin, cyclomaltohexaose, cyclohexaglucan, cyclohexaamylose, a-CD, ACD, C6A) comprennent 6 unités de glucopyranose. Les (3-cyclodextrines (connues également sous le nom Schardinger's (3-dextrin, cvclomaltoheotaose, ccloheptaglucan, cvolohenta_.n.~.'lcse, (3- CD, BCD, C7A) comprennent 7 unités de glucopc racose, et les y-cyclodextrines (connues également sous le nom Schardinger's y-dextrin, cyclomalLooctaose, cyclooctaglucan, cyclooctaamylose, y-CD, GCD, C8A) comprennent 8 unités de glucopyranose. Parmi ces trois types de CDs, les (3-cyclodextrines apparaissent comme les agents pharmaceutiques complexants les plus utiles en raison de la taille de leur cavité, de leur disponibilité, de leurs propriétés et de leur faible coût. Selon Dr J. Szejtli (� Cyclodextrins �, in Encyclopedia of Supramolecular Chemistry, eds. Marcel Dekker, 2004) les cyclodextrines sont avantageuses mais présentent également des facteurs limitants qui restreignent l'application des cyclodextrines à certains types de produits pharmaceutiques. Par ailleurs, tous les produits ne sont pas appropriés pour une complexation avec des cyclodextrines. Beaucoup de produits ne peuvent pas être complexés ou bien la complexation ne procure aucun avantage essentiel. Les composés inorganiques sont en général inappropriés à la complexation avec des cyclodextrines. Les dérivés des cyclodextrines sont également utilisables dans la présente invention. Dans les cyclodextrines, :hay'.e unité de glucopyranose possède trois groupements hydroxyles libres qui diffèrent dans leur fonction et leur réactivité. De façon avantageuse, i]. s'agit de la cyclodextrine alpha, de la cyclodextrine beta, de la cyclodextrine gaina ainsi qu'aux dérivés de cyclodextrine tel que la methyl beta cyclodextrine, l'hydroxy-propyl beta cyclodextrine, la sulfobutylcyclodextrine . Dans un mode de réalisation p e_~ rec ..~ l' _nv choisira la methyl P-cyclodextrir:e notamment cule c sous le om de CRISMEB et préférentiellement � randomised � methyl (3-cyclodextrine connue sous le nom oe RAMEB. Le ratio molaire entre l'agent actif et la ou les cyclodextrine(s) sont de l'ordre de 1 :1 à 1 :10. Dans un mode préféré, le ratio molaire est 1 :2 ou 1 :4 ou 1 :6 ou 1 : 8 ou encore 1 :10. 25 Par agent de diffusion, on entend au sens de la présente invention n'importe quel solvant favorisant une interaction de la substance active avec la molécule-hôte Avantageusement, cet agent de diffusion est choisi dans le 30 groupe constitué par les alcools, les cétones, les éthers, les esters et l'eau avec ou sans agent surfactant et leurs mélanges. De façon encore plus avantageuse, il s'agit de l'eau.20 Par � mode statique � on entend au sens de la présente invention une réaction ou un procédé dans lequel tous les réactifs sont mis simultanément en présence et où on laisse la réaction se dérouler. Par exemple, dans l'étape (b) de la présente invention, on cet dans un autoclave la les substance (s) active (s), de l'eau et du CO2 supercritique et on laisse réagir pendant plusieurs heures. La masse de produit n'évolue pas durant la réaction. A l'inverse, en mode dynamique, les réactifs sont apportés au fur et à mesure de l'évolution de la réaction ci ce la production. Souvent dans le cadre d'un mode dynamique, il y a circulation d'un fluide ou agitation. La masse de produit évolue durant la production. ? substance act_ . o et la molécule dit nt sous forme solide ou liquide dans un récipient dans lequel est injecté le fluide dense sous pression et l'agent de diffusion dans des proportions judicieusement choisies. Les 20 conditions de pression et de température ainsi que la durée du traitement sont définies, par toute méthode appropriée, en fonction de la nature de la ou des substances actives et du ou des molécules-hôtes. 25 De façon avantageuse, l'étape (b) de diffusion moléculaire du procédé selon la présente invention est réalisée sous agitation. L'agent de diffusion peut être ajouté en continu ou en 30 discontinu dans une quantité comprise entre 1 et 25% en masse, de préférence entre 8 et 20% en masse. Préférentiellement, pour des cyclodextrines naturelles la quantité est comprise entre 10 et 15% ; entre 8 et 15% pour15 des cyclodextrines de type RAMEB ou HBCD ; entre 12 et 15% pour des dérivés de cyclodextrines. Le temps nécessaire à la diffusion moléculaire de l'étape (b) est déterminé par toute méthode appropriée. Cette étape (b) peut être réitérée autant de fois que souhaitée pour obtenir une vitesse de dissolution satisfaisante. Avantageusement, l'étape (b) dure entre environ 2 et 16 heures. Les conditions de pression et de température de l'étape (b) sont choisies de façon à favoriser la diffusion moléculaire. Avantageusement la pression du fluide supercritique est comprise entre 5 MPa et 40 MPa et la température entre 0 et 120°C. Dans un mode préféré de l'invention, les conditions de température de l'étape b) se situent entre 60 °C et 90°C et de manière préférentielle entre 60°C et 85°C. Avantageusement l'étape (b) du procédé selon la présente invention est mise en oeuvre dans un réacteur fermé en haute pression. Dans un mode alternatif de la présente invention, le procédé comporte une étape supplémentaire (b') dans la quelle, la ou les cyclodextrine (s) sont ajoutées en excès. Dans un mode préféré, l'excès de cyclodextrine(s) est ajouter pour obtenir en fin de procédé une concentration totale de cyclodextrine(s) de l'ordre de 24 g/1 à 98 g/1 et de préférence entre 60 g/1 et 85 g/1. Le procédé peut être mis en oeuvre en batch ou comme décrit dans la demande de brevet WO 03/043604. De façon avantageuse le procédé selon la présente invention est réalisé en batch. La présente invention concerne également les complexes moléculaires solubles comprenant une substance active peu soluble dans un milieu aqueux de type rétinoïde incluses dans une ou plusieurs molécules hôtes, caractérisés en ce qu'ils ont susceptibles d'être obtenus par le procédé selon la présente invention. La mise en oeuvre de l'étape de diffusion moléculaire en milieu dense sous pression en présence d'un agent de diffusion permet une forte interaction des particules de substance active avec la molécule hôte, ce qui favorise la dissolution en milieu aqueux, laquelle est multipliée par environ 100 par le procédé selon la présente invention. L'invention se rapporte également à l'utilisation des complexes obtenus par le procédé pour le traitement. En particulier, compte-tenu de l'activité marquée des rétinoïdes dans les domaines de la différenciation et de la prolifération cellulaire, les complexes de l'invention conviennent particulièrement bien dans les domaines thérapeutiques suivants : 1) pour traiter les affections dermatologiques liées à un désordre de la kératinisation portant sur la différenciation et sur la prolifération notamment pour traiter les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, rosacées, les acnés nodulokystiques, conglobata, les acnés séniles, les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle, 1'hidradenite supurative, 2) pour traiter d'autres types de troubles de la kératinisation, notamment les ichtyoses, les états ichtyosiformes, la maladie de Darrier, les kératodermies palmoplantaires, les leucoplasies et les états leucoplasiformes, le lichen cutané ou muqueux (buccal), 3) pour traiter d'autres affections dermatologiques liées a un trouble de la. kératinisation av une composante inflammatoire et/ou immuno-allerggi^ e et notamment toutes les formes de psoriasis qu'il soit cutané, muqueux ou unguéal, et même le rhumatisme psoriatique, ou encore l'atopie cutanée, telle que l'eczéma ou l'atopie respiratoire ou encore l'hypertrophie gingivale ; les composés peuvent également être utilisés dans certaines affections inflammatoires ne présentant pas de trouble de la kératinisation telles que les folliculites, ^) pour tr ~_to toutes les prolicérations der:- épicierllos scient b_nign qu'elles soient ou non d'origine virale telles que verrues vulgaires, les verrues planes, le molluscum contagiosum, et l'épidermodysplasie verruciforme, les papillomatoses orales ou florides et les proliférations pouvant être induites par les ultra-violets notamment dans le cas des kératoses actiniques, 5) pour réparer ou lutter contre le vieillissement de la peau, qu'il soit photo-induit ou chronologique, ou pour réduire les pigmentations, ou toutes pathologies associées au vieillissement chronologique ou actinique, 6) pour traiter de manière préventive ou curative les troubles de la cicatrisation, les ulcères cutanés, pour prévenir ou pour réparer les vergetures, ou encore pour favoriser la cicatrisation, 7) pour lutter contre les troubles de la fonction sébacée tels que l'hyperséborrhée de l'acné ou la séborrhée simple, 8) dans le traitement de toute affection d'origine fongique au niveau cutané tel que le tinea pedis et le tinea versicolor, 9) dans le traitement d'affections dermatologiques à 5 composante immunologique, 10) dans le traitement de désordres cutanés dus une exposition aux rayonnements U.V., et ) dais le traitement d'affections dermatologiques liées à une inflammation ou une infection des tissus 10 environnants le follicule pileux, notamment dues à une colonisation ou infection microbienne notamment l'impétigo, la dermite seborrhéique, la folliculite, le sycosis barbae ou impliquant tout autre agent bactérien ou fongique. 15 ^e préfo_ __co, les complexa: selon l' in v ent particulièrement adaptés au traitement, de manière préventive on curative, des acnés vulgaires. 20 Les exemples suivants de mise en oeuvre du procédé sont donnés à titre indicatif non limitatif. Exemple 1 Obtention d'un complexe comprenant de l'Adapalene (substance active) et différents types de 25 cyclodextrines (molécule-hôte) Cet exemple a pour but de vérifier la complexation de l'adapalène avec des cyclodextrines par CO2 supercritique afin d'augmenter la solubilité aqueuse du principe actif 30 Le rendement de complexation est évalué par mesure de la réduction (ou disparition) du pic thermique relatif au principe actif resté libre. Matières utilisées Le tableau I ci-dessous répertorie l'ensemble des matières utilisées au cours de cette étude. M (g/mol) eau gag N° Lot Adapalène 412,52 / RM000144u1263 Cyclodextrine alpha 972 9 % 60P304 Cv -.i ' : Les conditions opératoires sont fixées par défaut - Une mole d'adapalène avec l'équivalent de plusieurs moles de cyclodextrines. - Ajout d'eau pour atteindre une teneur de 20 % pour les cyclodextrines naturelles, 10 % pour les cyclodextrines greffées. - Maturation de 2 heures à 60°C et 150 bars 15 - Séchage à 50°C sous vide durant une nuit. Méthodes analytiques La teneur en principe actif et les cinétiques de dissolution ont été effectuées en suivant les méthodes 20 décrites ci-après. 13 10 a) Méthode de Dosage Conditions chromatographiques HPLC : • Colonne : Symmetry C18 250x4.6 mm 5 pm • Phase mobile : 430 volumes d'acétonitrile 360 volumes de tétrahydrofurane 210 d'eau 0.2 volume d'acide trifloroacéticue • Appareillage HPLC : WATERS 2690 / 2487 • Débit . mi / min • Longueur d'onde : 270 nm • Sensibilité du détecteur : 2 AUFS • Volume injecté : 10 pl • Température du four : 25°C • Temps d'analyse : 15 minutes Préparation des solutions : Solutions à examiner : Introduire l'équivalent de 200 mg d'Adapalène exactement pesés dans une fiole de 25 ml. Dissoudre et compléter au volume avec du Diméthylformamide ( DMF ) HPLC. Prélever 1.0 ml de solution dans une fiole de 20 ml. Ajouter 5 ml de DMF, compléter au volume avec la phase mobile. Solution témoin : SM : Introduire 100 mg d'Adapalène témoin dans une fiole de 100 ml. Dissoudre et compléter au volume avec du Tétrahydrofurane ( THF ). Gamme Tl : Dilution au 1/1000ème de SM dans la phase mobile ( 0.001mg/ml ) T2 : Dilution au 1/100ème de SM dans la phase mobile ( 0.010 mg/ml ) T3 : Dilution au 1/50ème de SM dans la phase mobile 0.020 mg / ml ) 14 T4 : Dilution au 1/20ème de SM dans la phase mobile 0.050 mg / ml ) T5 : Dilution au 1/10ème de SM dans la phase mobile 0.100 mg / ml ) Réalisation de l'essai : Injecter 10 pl de chaque solution témoin. Effectuer une régression linéaire des surfaces des pics d'Adapalène par rapport aux concentrations. Le coefficient 10 de corrélation doit être supérieur à 0.995. Réaliser 2 préparations par essai Injecter 20 pl des solutions à examiner. Mesurer l'aire du pic d'Adapalène dans chaque solution à examiner. En déduire 15 la concentration X en mg/ml d'après la droite de régression des témoins La teneur en d'Adapalène exprimée en p.cent (m/m) est donnée par la formule : [Adapalène] en p.cent (m/m) = X x 500x100 / Pe 20 Pe : prise d'essai en mg de la substance à examiner b)Cinétique de dissolution à 3 g/1 et à 25°C Les conditions chromatographiques et les concentrations des solutions témoin sont les mêmes que celle du dosage. 25 Appareillage : • Agitation : Banc 15 positions • Bain thermostaté : 25°C +/- 2°C vérifié sur sonde Prolabo PR 531 30 • HPLC Waters 2690 - Détecteur 2487/2996 • Pesées : Balance Sartorius A200 • Dilutions Micro-pipette Eppendorf Research 1000, Eppendorf Research 5000, Gilson M1000 • Station d'eau Ultrapure : ELGA Conditions opératoires : Dans un erlenmeyer de 100 ml, introduire une prise d'essai équivalente à 150 mg d'Adapalène. Ajouter 50 ml d'eau. Mettre sous agitation magnétique à 400 rpm ou position 4 dans un bain-marie à 25°C +/- 2°C. Effectuer un prélèvement de 2 ml sous agitation magnétique à 15, 30, 60, 120 et 1140 minutes. Filtrer ces prélèvements sur filtres polypropylène 0.45pm Geiman GHP Acrodisc. La solution doit être limpide. Diluer les prélèvements dans la phase mobile d'un facteur � a � permettant d'avoir un pic d'Adapalène de surface comprise entre les surfaces des Témoin 1 et Témoin 5. Réalisation de l'essai Injecter 10 pl de chaque solution témoin. Effectuer une régression linéaire des surfaces des pics de Adapalène par rapport aux concentrations. Le coefficient de corrélation doit être supérieur à 0.995. Injecter 10 al des solutions à examiner. Mesurer l'aire du pic d'Adapalène dans chaque solution .~ 20 examiner. En déduire la concentration X en pg/ml d'après la droite de régression des témoins Calculer la concentration en pg d'Adapalène solubilisé par ml avec la formule : 25 [Adapalène] en pg/ml = X x a Représenter graphiquement la variation de la quantité dissoute en pg/ml en fonction du temps. Immédiatement, en fin de dissolution, noter l'aspect et 30 mesurer le pH de la solution. RESULTATS ET DEROULEMENT DE L'ETUDE Afin de vérifier la solubilité apparente de l'adapalène en milieux aqueux, trois essais ont été réalisés avec différentes cyclodextrines et en utilisant l'éthanol comme agent de diffusion: - la cyclodextrine alpha (6 unités glucose) la cyclodextrine méthyl-beta CRISMER - la cyclodextrine méthyl-beta RAMER / Ethanol 10 Ces échantillons ont été analysés et les résultats sent regroupés dans le tableau II, ci-dessous dans lequel sont indiqués . - Les differents systèmes � cyclodextrine / ratio molaire � 15 - La référence de l'échantillon - La teneur massicrue en principe actif après maturation - Les résultats de dissolution aqueuse à 15, 30, 60 et 120 minutes de l'adapalène après maturation (gras) et pour un mélange physique correspondant (italique). 20 - Le pH du milieu de dissolution après 120 minutes pour la poudre après maturation (gras) et pour le mélange physique correspondant (italique). Tableau II Sans maturation Avec maturation cydo rât % PA 15' 30' 60' 120' pH 15' 30' 60' 120' pH TNT-01229A (pha rrj; 15,9 0 0 0 0 6 0 0 0 0 6 TNT-01229B ME .r° 10,1 1 1 2 2 5 6 5 5 4 5 TNT -01229C 13,2 1 2 2 3 5 382 400 376 346 4 25 Cet exemple montre la complexation de l'adapalene avec au moins 2 types de cyclodextrines et montre une solubilité très améliorée dans la cas de la complexation de l'adapalène avec la cyclodextrine méthyl beta RAMEB. Exemple 2 : stabilisation du complexe comprenant de l'Adapalene et la cyclodextrine méthyl beta RAMEB Cet exemple a pour but de montrer la stabilité du complexe obtenu dans l'exemple 1 en faisant varier les paramètres de ratio molaire et de température du procédé en étudiant le profil de dissolution du complexe. Afin de confirmer l'intérêt d'augmenter la concentration de cyclodextrine et de différencier l'effet des cyclodextrines complexées au cours de la maturation avec l'effet des cycldextrines ajoutées au milieu de dissolution, des complexes à différents ratios ont été réalisés par CO2 supercritique ( ratio molaire 1:2 ; 1:4 ; 1:6 ; 1:8 ; 1:10). Par ailleurs, pour cette série d'essai, la température de maturation a été de 85°C au lieu de 60°C. Des cinétiques de dissolution ont été ensuite effectuée à 15 minutes, 7 jours, 30 jours et 48 jours (Tableau III). Ces valeurs sont reportées graphiquement sur la Figure 1. On constate que l'augmentation de la température de maturation et du ratio de cyclodextrine ont permis d'obtenir une solubilité apparente plus importante même si les profils restent généralement décroissants. Tableau III Dissolution (pH) N° de lot cyclo / ratio Teneur 15 7 30 48 massique minutes jours jours jours 19 100 % 0 pg/ml 0 pg/ml nr (5,7) (5.7) Adapalène seul nr TNT-01149 Méthyl-beta RAMEB/1:2 TNT-02041 Méthyl-beta RAMEB/1:4 TNT-02042 Méthyl-beta RAMEB/1:6 TNT-02043 Méthyl-beta RAMEB/1:8 TNT-02044 Méthyl-beta RAMEB/1: 10 12,5 % 993 pg/mI 720 pglml 391 pg/mI 370 pg/mI (3.9) (3.9) (nr) (4.6) 7,3 % 1413 pg/mI 854 pg/mI 704 pg/mI 625 pg/mI (3.9) (3.9) (nr) (4.5) 5.0 % 2406 pg/mI 1723 pg/mI 1456 pglml 1392 pg/mI (3.8) (3.8) (nr) (4.0) 3,4 % 2307 pg/mI 1867 pg/mI 1755 pg/ml 1829 pg/mI (3.7) (3.8) (nr) (3.9) 3,1 % 2919 pg/mI 2383 pg/mI 2189 pg/mI 2318 pg/mI (3.8) (3.8) (nr) (3.8) Augmenter le ratio molaire au cours de la maturation revient à augmenter la concentration de cyclodextrine méthyl-beta RAMEB présent ultérieurement dans le milieu ûe dissolution. Pour bien dissocier ces deux effets, des profils de dissolution des lots ratio 1:2, 1:4 et 1:6 ont aussi été effectués dans une solution contenant de la cyclodextrine en excès afin de maintenir une concentration totale en cyclodextrine de 80 g/l (Figure 2). Sur le graphe en figure 2, les courbes pointillés correspondent à des solutions dont les compositions sont strictement identiques (C-adapalène = 3 g/l, C- cyclodextrine = 80 g/1). Les valeurs numériques de ces courbes sont indiquées dans le tableau IV ci-dessous. Tableau IV Dissolution (pH) N° de lot cyclo / ratio 15 7 30 35 48 minutes jours jours jours jours Mélange physique 2 pg/ml 80 pg/ml nr 82 pg/ml nr (5,0) (4.5) (4.6) TNT-01149 Méthyl-beta 1001pg/mI 934 pg/mI 896 pg/mI nr 979g/ml RAMEB / 1 : 2 (4.0) (3.9) (nr) (4.12) TNT-02041 Méthyl-beta 1468 pg/mI 1304pg/mI 1308 pg/mI nr 1257 pg/ml RAMEB / 1 : 4 (3.9) (3.9) (nr) (4.0) TNT-02042 Méthyl-beta 2425 pg/mI 1964 pg/mI 1864 pg/mI nr 1914 pg/mI RAMEB / 1 : 6 (3.8) (3.7) (nr) (3.9)) Nous pouvons conclure que la cyclodextrine complexée au cours de la maturation contribue à augmenter la solubilité apparente de l'adapalène tandis que la cyclodextrine simplement ajoutée au milieu améliore la stabilité de la solution d'adapalmne en maintenant l'état d'équilibre vers la forme complexée. Exemple 3 : Obtention d'un complexe comprenant du Rétinal (substance active) et différents types de cyclodextrines (molécule-hôte) Cet exemple a pour but de vérifier la complexation du rétinal avec des cyclodextrines par CO2 supercritique afin 15 d'augmenter la solubilité aqueuse du principe actif Le rendement de complexation est évalué par mesure de la réduction (ou disparition) du pic thermique relatif au principe actif resté libre. 20 20 Matières utilisées Le tableau V ci-dessous répertorie l'ensemble des matières utilisées au cours de cette étude. M (g/mol) eau g%g N° Lot Rétinal 284,44 / LP 120 Cyclodextrine gama 1297 2,6 % 80P211 Cyclodextrine Méthyl-beta RAMEB 1311,4 1,00 % 71P018 N = 7*1,8 Eau distillée stérile 18 / MP 12695 Conditions opératoires Les conditions opératoires sont fixées par défaut : 10 - Une mole de rétinal avec l'équivalent de 2 moles de cyclodextrines. Ajout d'eau pour atteindre une teneur de 20 % pour les cyclodextrines naturelles, 10 % pour les cyclodextrines greffées. 15 - Maturation de 2 heures à 40°C et 150 bars. Méthodes analytiques La teneur en principe actif et les cinétiques de 20 dissolution ont été effectuées en suivant les méthodes décrites ci-après. 215 c) Méthode de Dosage Conditions chromatographiques HPLC : • Colonne : - Phase stationnaire : Symmetry 30 C 18 - Dimension L x D (mm) : 250 x 4,6 - Diamètre des particules (�m) : 5,0 • Phase mobile : Phase A : Acétonitrile Phase B : Tampon pH 6,40 • Appareillage HPLC : WATERS 2690 / 2487 • Débit : 1,5 ml / min • Longueur d'onde : 365 nm • Volume injecté : 10 pl • Temps d'analyse : 47 minutes • Phase de dissolution : Acétonitrile 15 Préparation des solutions : Solutions à examiner : Dans une fiole jaugée de 50,0 ml, introduire 25,0 mg exactement pesés de rétinal, diluer dans 5,0 ml de 20 Diméthylformamide et compléter au volume avec la phase de dissolution. Solution témoin : Solution Mère (SM) . Dans une fiole jaugée de 50,0 ml, introduire 50,0 mg exactement mesuré de rétinal et compléter au volume avec la phase de dissolution. 30 Gamme : Ti : Dilution au 1/100ème de SM (0,010 mg/ml) T2 : Dilution au 1/50ème de SM (0,020 mg/ml) T3 : Dilution au 1/25eme de SM (0,040 mg/ml) 35 T4 : Dilution au 1/10ème de SM (0,100 mg/ml) T5 : Dilution au 1/5ème de SM (0, 200 mg/ml) 22 10 25 Réalisation de l'essai : Injecter 10 pl de chaque solution témoin. Effectuer une régression linéaire des surfaces des pics de rétinal par rapport aux concentrations. Le coefficient de 5 corrélation doit être supérieur à 0.995. Réaliser 2 préparations par essai Injecter 10 pl des solutions à examiner. Mesurer l'aire du pic de rétinal dans chaque solution à examiner. En déduire 10 la concentration X en mg/ml d'après la droite de régression des témoins La teneur en de rétinal exprimée en p.cent (m/m) est donnée par la formule : [Rétinal] en p.cent (m/m) = X x 50x100 / Pe 15 Pe : prise d'essai en mg de la substance à examiner d)Cinétique de dissolution à 37°C Les conditions chromatographiques et les concentrations des solutions témoin sont les mêmes que celle du dosage. 20 Appareillage : • Agitation : Banc 15 positions • Bain thermostaté 37°C+/- 2°C vérifié sur sonde Prolabo PR 531 25 • HPLC Waters 2690 - Détecteur 2487/2996 • Pesées : Balance de précision Mettler A200 • Dilutions Micro-pipette Eppendorf Research 1000, Eppendorf Research 5000, Gilson M1000 • Station d'eau Ultrapure : ELGA 30 • Filtration sur Acrodisc GHP : 0,45�m Conditions opératoires : Dans un erlenmeyer de 100 ml, introduire une prise d'essai équivalente à 50 mg de rétinal. Ajouter 50 ml d'eau. Mettre sous agitation magnétique à 400 rpm ou position 4 dans un bain-marie à 37°C +/- 2°C. Effectuer un prélèvement de 2 ml sous agitation magnétique à 15, 30, 60, 120 minutes. Filtrer ces prélèvements sur filtres polypropylène 0.45pm Gelman GHP Acrodisc. Réalisation de l'essai Injecter 10 pl de chaque solution témoin. Effectuer une régression linéaire des surfaces des pics de rétinal par rapport aux concentrations. Le coefficient de corrélation doit être supérieur à 0.995. Injecter 10 pl des solutions à examiner. Mesurer l'aire du pic de rétinal dans chaque solution à examiner. En déduire la concentration X en pg/ml d'après la droite de régression des témoins Calculer la concentration en pg de rétinal solubilisé par ml avec la formule : [rétinal] en pg/ml = X x 1000 Représenter graphiquement la variation de la quantité 25 dissoute en pg/ml en fonction du temps. Immédiatement, en fin de dissolution, mesurer le pH de la solution. RESULTATS ET DEROULEMENT DE L'ETUDE Afin de vérifier la solubilité apparente du rétinal en milieux aqueux, deux essais ont été réalisés avec différentes cyclodextrines : 30 - la cyclodextrine gamma (Figure 3) - la cyclodextrine méthyl-beta RAMEB (Figure 4) Ces échantillons ont été analysés et les résultats sont 5 regroupés dans le tableau VI, ci-dessous dans lequel sont indiqués . - Les differents systèmes � cyclodextrine / ratio molaire � - La référence de l'échantillon 10 - La teneur massique en principe actif après maturation - Les résultats de dissolution aqueuse à 15, 30, 60 et 120 minutes du rétinal après maturation (gras) et pour un mélange physique correspondant (italique). - Le pH du milieu de dissolution après 120 minutes pour la 15 poudre après maturation (gras) et pour le mélange physique correspondant (italique). Dissolution Mélange Physique Dissolution après maturation (pg/mL) (pglmL) cyclo % API 15' 30' 60' 120' 15' 30' 60' 120' /ratio Rétinal 100 0,0 0,0 0,0 0,0 / I I I TNT 06 175 B gama 1:2 4,16 2,8 2,7 2,9 3,0 4,6 4,6 6,2 6,6 TNT 06 175 C RAMEB 5,3 2,8 3,2 6,7 16,1 22,5 23,0 24,4 21,6 1:2 20 Cet exemple montre la complexation du rétinal avec au moins 2 types de cyclodextrines et montre un solubilité très améliorée dans le cas de la complexation du rétinal avec la cyclodextrine méthyl béta RAMEB. 25 REVENDICATIONS1. Procédé de préparation de complexes moléculaires solubles comprenant une substance active peu soluble dans un milieu aqueux incluses dans une ou plusieurs molécules hôtes, caractérisé en ce qu'il est constitué par les étapes suivantes : (a) mise en contact d'une ou plusieurs substances actives avec une ou plusieurs molécules hôtes, (b) mise en oeuvre d'une étape de diffusion moléculaire par mise en contact, en mode statique, d'un fluide dense sous pression avec le mélange obtenu à l'étape (a) en présence d'un ou plusieurs agents de diffusion, (c) récupération du complexe moléculaire ainsi formé, caractérisé en ce que la substance active est un rétinoïde ou l'un de ses sels, à l'exception àe l' adapalène . 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rétinoïde est le rétinal. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire d) de séchage du complexe, avantageusement à une température comprise entre 40°C et 60°C de préférence sous vide. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fluide dense sous pression est du CO2. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la molécule hôte est choisie dans le groupe constitué par les polyoses et les oses, de préférence parmi les cyclodextrines et les dérivés de cyclodextrines et leur mélange. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les cyclodextrines sont choisis parmi les -cyclodextrines et les cyclodextrines méthyl béta RAMEB 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'agent de diffusion est choisi dans'le groupe constitué par les alcools, les cétones, les éthers, les esters et l'eau avec ou sans agent surfactant et leurs mélanges. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'agent de diffusion est l'eau. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'étape (b) de diffusion moléculaire est réalisée sous agitation. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte un étape (b') dans laquelle la cyclodextrine est ajoutée en excès. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'agent de diffusion est ajouté en continu ou en discontinu dans une quantité comprise entre 1 et 25 % en masse, de préférence entre 8% et 15 % en masse. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le ratio molaire rétinoïde/cyclodextrine est compris entre 1/1 et 1/10, avantageusement entre 1/1 et 1/6 et de préférence entre et 1~. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la pression du fluide supercritique est comprise entre 5 MPa et 40 MPa et la température entre 0 et 120 C, préférentiellement entre 60° C et 90°C. 14. Complexes moléculaires solubles comprenant une substance active peu soluble dans un milieu aqueux incluse dans une ou plusieurs molécules hôtes, caractérisés en ce qu'ils ont susceptibles d'être obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.