FR 2944106 A1 20101008 FR 0952208 A 20090403 METHODE DE DOSAGE DE L'INOSITOL HEXAPHOSPHATE (IHP) La présente invention est relative à une méthode de dosage de l'inositol hexaphosphate ou IHP dans un produit injectable à l'homme ou l'animal ou dans une fraction de ce produit, notamment une suspension de globules rouges. L'IHP est un puissant effecteur allostérique de l'hémoglobine. A ce titre, il peut être utilisé pour réduire l'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène et augmenter la libération d'oxygène dans les tissus. Il peut être employé comme adjuvant de radiothérapie en cancérologie, pour les tumeurs hypoxiques notamment. WO-A-2006/016247 décrit l'encapsulation de l'IHP dans des globules rouges servant de biovecteur. L'emploi de globules rouges encapsulant de l'IHP en clinique nécessite de connaître la quantité d'IHP présente, pour pouvoir déterminer le volume de suspension à transfuser en fonction de la dose prescrite. En outre, l'IHP étant un chélateur de métaux, e.g. du calcium, pouvant potentiellement avoir des effets délétères s'il est administré sous forme libre, le dosage de l'IHP extracellulaire présent dans le produit pharmaceutique fini est également indispensable. Diverses méthodes de dosage de l'IHP ont été décrites dans la littérature. La plupart de ces méthodes ont été développées dans le cadre du dosage de l'IHP présent dans des extraits alimentaires. Ces méthodes peuvent être classées en 3 groupes selon qu'elles sont directes, indirectes ou enzymatiques. Parmi les méthodes directes on peut citer notamment la spectrométrie de masse, la résonnance magnétique nucléaire, la conductimétrie et la réfractométrie qui ont en commun de nécessiter une grande pureté de l'échantillon à analyser et présentent par conséquent des temps de réalisation longs. Les méthodes indirectes reposent sur la capacité de l'IHP à complexer les ions métalliques, la formation des complexes [ions métalliques û IHP] pouvant être mesurée par colorimétrie ou fluorimétrie. Kenan Dost, Ozge Tokul (Analytica Chimica Acta 558 (2006): 22-27) décrit une méthode de dosage indirecte de l'IHP dans le blé 30 et les produits à base de blé. Cette méthode est basée sur la réaction de remplacement du complexe coloré [Fe(III)-thiocyanate] par le complexe incolore [Fe(III)-phytate] en présence d'IHP. La lecture se fait au moyen d'une chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée à un détecteur spectrophotométrique UV-visible. Les méthodes enzymatiques reposent sur l'hydrolyse de l'IHP par des enzymes appelées phytases, ces méthodes ne sont pas adaptables à la mesure de l'IHP intraéryth rocytai re. Les méthodes décrites dans la littérature concernant le dosage dans les produits agricoles ne sont pas directement transposables au cas des produits pharmaceutiques contenant de l'IHP, en raison notamment des différences marquées de composition. On trouve aussi dans la littérature des travaux portant sur le dosage de l'IHP dans les érythrocytes employant des méthodes directes qui présentent un certain nombre d'inconvénients les rendant inaptes à un dosage en routine dans le cadre de la fabrication d'un produit pharmaceutique. 20 S. Villa et col. (Adv Exp Med Biol. 1992;326:41-49) décrivent une procédure simple et fiable de mesure de l'IHP dans les érythrocytes par HPLC. La méthode d'analyse proposée comprend les étapes suivantes : • Préparation des échantillons par lyse des érythrocytes incorporant l'IHP et 25 extraction à l'acide perchlorique • Préparation de la phase mobile et équilibrage de la colonne HPLC • Passage des échantillons • Mesure de la concentration en IHP par réfractométrie Cependant cette méthode nécessite une séparation des échantillons en HPLC et son 30 temps de réalisation est de ce fait très long. A titre indicatif, la réalisation de la gamme étalon nécessite la mesure de 10 concentrations d'IHP différentes testées chacune plusieurs fois, sa durée peut-être estimée à 6 heures. Par ailleurs, la limite de détection de cette méthode (0,5 mM) est largement insuffisante pour quantifier l'IHP extracellulaire présent dans les produits finis. Cette méthode ne répond pas aux 15 enjeux de rapidité et de sensibilité du dosage imposés par une production à l'échelle industrielle. B. Teisseire et col. (J Appl Physiol. 1985 Jun;58(6):1810-7) évaluent les effets physiologiques d'une transfusion d'érythrocytes incorporant de l'IHP à des porcelets. L'article décrit une méthode de mesure de l'IHP intra-érythrocytaire basée sur la détermination de la concentration en phosphate intracellulaire avant et après incorporation d'IHP. La différence entre ces deux concentrations étant attribuée à l'IHP. Cette méthode très approximative n'est pas adaptée à la mesure de l'IHP intra- érythrocytaire pour un produit à visée thérapeutique. Mosca et col. (Adv Exp Med Biol. 1992;326:19-26) et R. Nano et col. (Adv Exp Med Biol. 1992;326:35-39) décrivent la même méthode de dosage de l'IHP intraérythrocytaire que celle décrite dans B. Teisseire et col., à la différence près que la mesure de la concentration en phosphate est ici effectuée par RMN. Au défaut d'exactitude déjà mentionné pour la méthode de B. Teisseire s'ajoute donc la difficulté de mise en oeuvre et le coût prohibitif lié à l'appareillage RMN. Un premier objectif de l'invention est de proposer une méthode de dosage rapide et fiable. Un deuxième objectif de l'invention est de proposer une telle méthode qui puisse être aisément automatisée. Un troisième objectif de l'invention est de proposer une telle méthode, manuelle ou automatisée, qui soit apte à respecter les directives fixées par l'ICH (International Conference on Harmonisation). La présente invention a ainsi pour objet une méthode de dosage de l'inositol hexaphosphate (IHP) dans un produit injectable à l'homme ou l'animal ou dans une fraction de ce produit, dans laquelle, à un échantillon ou une fraction de ce produit, on ajoute un composé métallique dont la complexation à l'IHP présent est ensuite détectée, ce grâce à quoi on dose l'IHP présent dans le produit ou sa fraction. Par produit injectable à l'homme ou l'animal, on entend un produit pharmaceutique susceptible de contenir de l'IHP en tant que principe actif ou en tant que contaminant. L'invention vise avant tout le dosage de l'IHP présent en tant que principe actif dans le produit ou une fraction de celui-ci. Par fraction, on entend une partie du produit susceptible de contenir de l'IHP et dont la teneur en IHP doit être connue. L'invention vise notamment le dosage de l'IHP dans des produits formés d'une suspension ou d'une solution de vecteurs chargés de véhiculer l'IHP. Il peut s'agir de vecteurs renfermant ou encapsulant l'IHP ou de vecteurs liés à l'IHP par une liaison quelconque, y compris un contre-ion. Dans une modalité importante, la méthode de dosage selon l'invention est appliquée au dosage de l'IHP total dans une suspension de vecteurs ou au dosage de l'IHP dans l'une, l'autre ou les deux fractions que sont le milieu extra-vecteur, notamment liquide de suspension ou surnageant, et les vecteurs. De manière préférentielle, il s'agit d'une suspension de vecteurs, par exemple liposomes, micro- ou nanosphères, micro- ou nano-capsules, globules rouges, etc. L'invention vise aussi le dosage de l'IHP libre dans le surnageant d'un produit contenant des vecteurs de l'IHP. Suivant le mode de réalisation préféré de l'invention, la complexation produit un complexe dont la coloration est différente de celle du composé métallique de départ. On peut mesurer le changement d'absorbance du complexe par rapport au composé métallique de départ. Suivant une caractéristique avantageuse, le changement d'absorbance est détecté par spectrophotométrie. Suivant un mode de réalisation, le réactif est un composé de Fe (III) coloré. Il s'agit notamment d'un composé métallique permettant de produire un complexe de phytate et l'on peut en particulier se référer à F Crea et al., 2008, Coordination Chemistry Reviews 252, 1108-1120. Comme réactif, on peut citer par exemple Fe(III)-thiocyanate et Fe(III)-acide 5-sulfosalicylique. Le réactif est de préférence du Fe(III)-thiocyanate, susceptible de produire le complexe fer (111)-phytate. Suivant une modalité, la méthode de dosage est appliquée au dosage de l'IHP dans une suspension de globules rouges. L'invention s'applique en particulier au dosage de l'IHP présent dans une suspension de globules rouges chargés en IHP et destinée au traitement d'un patient. La méthode est appliquée au dosage de l'IHP total, de l'IHP intracellulaire et/ou de l'IHP extracellulaire. Suivant un mode de réalisation, la méthode est appliquée au dosage de l'IHP présent dans un certain volume de suspension. Ce dosage peut être utilisé pour déterminer la quantité de suspension à administrer en fonction de la dose d'IHP prescrite au patient tout en tenant compte de la teneur en IHP extracellulaire. Suivant un autre mode de réalisation, la méthode est appliquée au dosage de l'IHP présent dans le surnageant. La méthode, appliquée au dosage de l'IHP total, peut notamment comprendre : - la lyse des globules rouges en présence du milieu extracellulaire, - l'obtention d'une fraction contenant l'IHP et dépourvue d'hémoglobine et débris cellulaires, - l'ajout à cette fraction d'une quantité connue du composé métallique conduisant à la formation d'un complexe avec l'IHP présent, - la détermination de la teneur en IHP total. Appliquée à l'IHP intra-érythrocytaire, la méthode peut notamment comprendre : - l'élimination du milieu extracellulaire, récupération de la fraction globulaire, - la lyse des globules rouges, - l'obtention d'une fraction contenant l'IHP et dépourvue d'hémoglobine et de débris cellulaires, - l'ajout à cette fraction d'une quantité connue du composé métallique conduisant à la formation d'un complexe avec l'IHP présent, la détermination de la teneur en IHP intra-érythrocytaire. Appliquée à l'IHP extracellulaire, la méthode peut comprendre : récupération de la fraction extracellulaire, - l'ajout à cette fraction extracellulaire d'une quantité connue du composé métallique conduisant à la formation d'un complexe avec l'IHP présent, - la détermination de la teneur en IHP extracellulaire. Une procédure similaire peut être appliquée à tout autre type de vecteur renfermant de l'IHP, par exemple des liposomes ou des microsphères, ainsi qu'au dosage de l'IHP libre dans le surnageant d'un produit contenant des vecteurs liés à de l'IHP.30 En combinant la mesure de l'IHP extracellulaire et la mesure de l'IHP total d'une même suspension de globules rouges, on en déduit la teneur en IHP intraérythrocytaire. On peut notamment appliquer la formule suivante : [IHP intracellulaire] = JIHP total' x 100 û [IHP extracellulairel x (100 û hématocrite) Hématocrite Suivant une caractéristique, on élimine l'hémoglobine par une étape de précipitation des protéines en présence d'un acide. Tout acide permettant la précipitation des protéines dont l'hémoglobine est envisageable pour réaliser cette étape d'extraction. L'étape permet d'éliminer ces protéines et les débris de membranes, et de récupérer les petites molécules telles que l'IHP. On peut citer à titre d'exemples non limitatifs : acide perchlorique, acide trichloroacétique, acide oxalique, acide citrique, acide nitrique, acide chlorhydrique, acide sulfurique, acide lactique. L'acide chlorhydrique convient parfaitement. La fraction contenant l'IHP peut être récupérée par centrifugation. Suivant une caractéristique de l'invention, après ajout du réactif Fe(III)-thiocyanate, l'échantillon à doser est incubé pendant une durée suffisante pour que les complexes Fer(lll) û phytate formés soient stabilisés. Cette durée est courte, par exemple une durée comprise entre environ 5 et environ 30 minutes suffit. La durée peut notamment être comprise entre environ 10 et environ 20 minutes, typiquement elle est de l'ordre de 15 minutes. L'incubation est de préférence réalisée à l'obscurité. Suivant une modalité préférée, le réactif de coloration Fe(lll) thiocyanate a les caractéristiques suivantes : - de 0,1 à 1 pmole de Fe(lll) par ml de réactif, notamment de 0,25 à 0,6 pmole/ml, de préférence de 0,3 à 0,4 pmole/ml, - un excès de thiocyanate, notamment de 10 à 50 pmole/ml, de préférence de 20 à 40 pmole/ml, mieux encore de 30 à 40 pmole/ml. Suivant une caractéristique de l'invention, le réactif Fe(lll) thiocyanate comporte de 0,25 à 0,6 pmole de Fe(III)/ml, et de 20 à 40 pmole de thiocyanate/ml. De préférence, le réactif comporte de 0,3 à 0,4 pmole de Fe(III)/ml et de 30 à 40 pmole de thiocyanate/ml. Le réactif comporte en outre de l'eau et est notamment constitué d'une solution acide, notamment avec le même acide qu'employé lors de la précipitation. Suivant une caractéristique, le réactif est une solution chlorhydrique de Felll et de thyocyanate. Suivant une caractéristique, la concentration en acide dans le réactif est comprise entre 0,01 et 0,2 molaire, de préférence entre 0,05 et 0,15 molaire. Suivant un mode de réalisation, l'invention consiste en une méthode spectrophotométrique de dosage de l'IHP basée sur la capacité de l'IHP à complexer les ions Fe(III). La méthode repose sur une réaction de remplacement au cours de laquelle l'ion Fe(lll) présent dans le réactif de dosage sous forme de complexe coloré [Fe(III)-thiocyanate] va former un nouveau complexe incolore [Fe(III)-phytate] avec l'IHP présent dans l'échantillon à doser. Le pic d'absorbance du complexe [Fe(III)-thiocyanate] se situant à 460 nm, la mesure de la DO460 va permettre de déterminer la concentration en [Fe(III)-thiocyanate] et d'en déduire via l'équation bilan de la réaction de dosage la concentration en IHP. Suivant une caractéristique de l'invention, le réactif de coloration [Fe(III)-thiocyanate] est préparé extemporanément. La méthode de dosage peut donc intégrer une étape de préparation du réactif de coloration avant de l'ajouter à l'échantillon à doser ou la fraction d'échantillon. Le réactif Fe(III)-thiocyanate est avantageusement préparé peu avant son utilisation (typiquement 30 minutes à 1 heure avant) et conservé à l'obscurité jusqu'à son utilisation. Cette méthode peut être appliquée à un échantillon représentatif d'un lot de globules rouges encapsulant de l'IHP, avant administration à un patient, ou en contrôle de production. Un blanc peut être réalisé avec des globules rouges lysés-rescélés (GR-LR) de manière à pouvoir décompter le bruit de fond lié à la matrice globules rouges. Suivant un mode de réalisation, la méthode comprend la réalisation d'une gamme étalon en IHP ; de préférence, cette gamme est réalisée le jour du dosage. Suivant un autre mode de réalisation, au lieu d'une gamme étalon, on utilise une méthode par ajout de quantités connues d'IHP à des aliquotes de l'échantillon. Le dosage selon l'invention est parfaitement adapté à la matrice globules rouges. L'étape d'extraction de l'IHP permet notamment d'éliminer l'hémoglobine dont la coloration est susceptible d'affecter la mesure d'absorbance. L'ajout d'un blanc à partir de globules rouges lysés-rescéllés, puis traités comme un échantillon chargé d'IHP permet de connaître et de retrancher l'impact des globules rouges. Le choix du réactif de dosage et l'emploi d'un simple spectrophotomètre permet l'automatisation du dosage, sa rapidité et sa facilité de mise en oeuvre. Le dosage peut ainsi être effectué sur un automate de biochimie. La méthode selon l'invention n'a pas besoin de faire intervenir de chromatographie (HPLC, chromatographie d'échange d'ions) ni de spectroscopie RMN. On obtient une diminution drastique du coût et du temps de réalisation du dosage par rapport aux techniques antérieures. Le passage d'un échantillon sur HPLC nécessite un quinzaine de minutes tandis que quelques secondes suffisent pour l'acquisition de la DO sur spectrophotomètre. Cette diminution du temps de passage s'applique à chaque échantillon testé ainsi que pour chaque point de la gamme étalon devant être réalisée préalablement au dosage. La préparation des échantillons ne nécessite pas non plus de longue étape d'incubation. La durée totale du dosage en est par conséquent considérablement réduite et le rend compatible avec une utilisation à l'échelle industrielle. Enfin la méthode peut être mise en oeuvre sans produit dangereux, par exemple par le choix de l'acide pour la précipitation des protéines. L'invention a aussi pour objet une méthode de traitement d'un patient par un produit pharmaceutique formé d'une suspension de vecteur (notamment liposome, microcapsule, microsphère, globules rouges, etc.) contenant de l'IHP, en particulier une suspension de globules rouges encapsulant de l'IHP, ou d'une solution de vecteur lié à l'IHP, pour le traitement d'une pathologie susceptible de bénéficier d'un tel traitement, comprenant les étapes suivantes : - prendre ou préparer une telle suspension ou solution, en particulier une suspension de globules rouges encapsulant de l'IHP, - prélever un échantillon représentatif de cette suspension ou de cette solution, - doser l'IHP dans l'échantillon en employant la méthode de dosage selon l'invention, - sur la base des données de concentration, calculer le volume de la suspension ou solution, en particulier suspension de globules rouges, à administrer de manière à respecter la dose prescrite pour le patient, - à administrer ce volume audit patient. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs et se référant aux figures : La figure 1 est un graphe représentant la droite étalon ADO en fonction de la concentration en IHP. La figure 2 est un graphe représentant la droite ADO en fonction de la concentration en IHP ajouté, obtenue selon la méthode des ajouts dosés. Exemple 1 : Réactifs et solutions chimiques Préparation d'une solution de chlorure de fer (III) : 20 mg de chlorure de fer (III) sont dissous dans 40 ml d'eau distillée (0.5 mg/ml). Préparation d'une solution de thiocyanate d'ammonium : 200 mg de thiocyanate d'ammonium sont dissous dans 40 ml d'eau distillée (5 mg/ml). Le réactif de coloration est préparé au moins 40 min avant emploi et est composé de 1 ml de chlorure de fer (III) à 0,5 mg/ml, 5 ml de thiocyanate d'ammonium à 5 mg/ml, 0,9 ml d'acide chlorhydrique 1 N et 2 ml d'eau distillée. Préparation de solutions d'acide trichloracétique TCA (poids/volume) Solution à 24% : 3 ml de TCA 6,1 N + 13 ml d'eau distillée Solution à 12% : 10 ml solution TCA 24% + 10 ml d'eau distillée Solution à 6% : 15 ml de TCA 6,1 N + 185 ml d'eau distillée Préparation d'une solution stock d'IHP : pour 1 ml de solution à 45 mM, la quantité X du sel dodecasodium d'IHP à peser est calculée de la manière suivante : X (g) = 415,719 / (p x (100 û H)), p étant la pureté du sel (%) et H le taux d'humidité (%). Le volume final est ajusté à 1 ml avec de l'eau distillée. Méthode d'encapsulation de l'IHP en globules rouges humains : l'IHP (660 g/mol) a été encapsulé dans les globules rouges (GR) humains par la méthode de dialyse hypotonique en colonne. Les GR de poche sont lavés 3 fois en NaCl 0,9%. L'hématocrite est amené à 60% en présence d'IHP ajouté à une concentration finale de 17 ou 20 mM avant de démarrer la dialyse. Les GR sont dialysés à un débit de 1,5 ml/min contre un tampon de lyse à faible osmolarité (contre-flux à 15 ml/min). Les GR lysés en sortie de colonne sont rescellés grâce à l'ajout d'une solution hyper- osmolaire et une incubation de 30 minutes à 37°C. Après plusieurs lavages en NaCl 0,9% glucose 0,2%, les GR sont amenés à hématocrite 50% avec une solution de conservation (tampon AS-3). Exemple 2 : Dosage de l'IHP dans les échantillons totaux GR-IHP et dans le milieu extracellulaire 1) Nature des échantillons à doser Afin de déterminer l'IHP intracellulaire, on dose l'IHP total dans l'échantillon (GR- IHP) ainsi que l'IHP contenu dans le surnageant (milieu extracellulaire). Le surnageant est obtenu par centrifugation des GR-IHP à 1000g, 4°C pendant 10 min. L'échantillon à doser peut également être une solution aqueuse d'IHP qui n'aura alors à subir aucune extraction. Méthode de dosage avec la gamme étalon (étalonnage externe) Préparation des échantillons Les GR-IHP (50�I) et les surnageants (50�I) sont congelés à -20°C pendant 30 min. Après réchauffement à température ambiante, les échantillons sont dilués avec de l'eau distillée pour lyser les cellules et l'IHP est extrait en conditions acides avec de l'acide trichloracétique. Suivant la nature de l'échantillon, la dilution appliquée varie. Chaque réactif est ajouté comme indiqué dans le tableau suivant : Echantillon Volume d'eau Volume d'acide trichloroacétique distillée Surnageant 125 pl 175 pl d'acide trichloroacétique 12% GR-IHP 950 pl 333 pl d'acide trichloroacétique 24% Les échantillons sont ensuite centrifugés à 15000g, 4°c pendant 10 min et le surnageant d'extraction est collecté pour la mise en contact avec le réactif de coloration. Pour les GR-IHP, une dilution supplémentaire est réalisée (75 pl d'acide trichloroacétique 6% sont mélangés avec 75 pl du surnageant d'extraction) avant le mélange avec le réactif de coloration. Préparation de la gamme étalon en IHP Préparation d'une solution 1 mM 20 pl de la solution d'IHP à 45 mM (voir exemple 1) sont mélangés à 880 pl d'acide trichloroacétique 6%. Préparation des solutions standards: Concentration finale en IHP (�M) 20 40 60 80 100 120 Volume d'IHP 1 mM (pl) 20 40 60 80 100 120 Volume d'acide trichloroacétique 980 960 940 920 900 880 6% (pl) 25 Le blanc est constitué d'acide trichloroacétique 6%. Détection photométrique Pour la détermination photométrique, 300�I du réactif de coloration (préparé comme dans l'exemple 1) sont ajoutés à 150 �I de chaque surnageant d'extraction, solution standard et sur le blanc. Après agitation et 15 min d'incubation à l'obscurité, les solutions sont placées dans des cuves de 10 mm et l'absorption est mesurée à 460 nm. Pour chaque concentration (20-120 �M), le delta de d'absorbance AiDO = DO blanc- DO standard est déterminé. La courbe de calibration A,DO/[IHP] est tracée, les paramètres de régression linéaire sont calculés et utilisés pour déterminer la quantité d'IHP présente dans les surnageants d'extraction grâce à la mesure ADO = DO blancûDO échantillon. Pour les GR-IHP, le bruit dû à l'interférence de la matrice globules rouges est évalué grâce au dosage de globules rouges ayant subi le même processus de dialyse et ajustés à 50% hématocrite dans les mêmes conditions (GRLR). Pour les surnageants de GR-IHP, aucune interférence au dosage n'a été observée. 2) Méthode de dosage par les ajouts dosés Cette méthode permet de s'affranchir de l'effet de matrice globules rouges et donc d'éviter la production de GR-LR pour doser l'IHP contenu dans les GR-IHP. L'échantillon à doser contenant X mM d'IHP est aliquoté par 50�I et différents ajouts d'IHP (950 pl) de concentration connue (Cl, C2, C3, C4, C5...) sont réalisés durant l'étape de lyse des globules rouges. L'addition de TCA 24% (333 pl) dans chacun des tubes suivie d'une centrifugation à 15 000 g pendant 10 min permet de récupérer l'IHP dans les surnageants. Pour la détermination photométrique, 300�I du réactif de coloration (préparé comme dans l'exemple 1) sont ajoutés à 150 pl de chaque surnageant d'extraction. Un tube référence est réalisé en ajoutant 300 �I du réactif de coloration à 150 pl de TCA 6%. Après agitation et 15 min d'incubation à l'obscurité, les solutions sont placées dans des cuves de 10 mm et l'absorption est mesurée à 460 nm. Pour chaque point, le delta de d'absorbance DO = DO référence-DO échantillon est déterminé. La courbe de calibration . .DO/[IHP] ajouté est tracée. Si la courbe n'est pas une droite linéaire, les points de concentrations les plus élevés sont dilués dans de l'acide trichloroacétique 6% et redosés. Le point d'intersection entre la droite et l'axe des abscisses (en valeur absolue) donne directement la valeur X d'IHP contenu dans l'échantillon initial. Exemple 3 : Calcul de la quantité d'IHP encapsulée dans les globules rouges La concentration en IHP dans les GR-IHP et dans le milieu extracellulaire est déterminée comme dans l'exemple 2. Pour le calcul de l'IHP intracellulaire, la 10 formule suivant est appliquée : [IHP intracellulaire] = ([IHP]total x 100 - [IHP]extracellulaire x (100-hématocrite)) / hématocrite Exemple 4 : Optimisation et caractérisation des performances de la méthode 15 1) Stabilité du réactif de coloration Le réactif de coloration a été préparé comme indiqué dans l'exemple 1. Sa stabilité a été étudiée par photométrie à 460 nm pendant 300 minutes. Les résultats montrent 20 qu'il est préférable de la préparer au moins 40 min avant utilisation moment à partir duquel il est stable pendant au moins 4h ce qui permet de réaliser toutes les analyses. 2) Linéarité de la gamme 25 La linéarité de la gamme d'IHP a été étudiée sur un domaine allant de 20 à 120 �M IHP (concentration avant la mise en contact avec le réactif de coloration). 150�I de chaque point de gamme préparé comme dans l'exemple 2 ont été mélangés avec 300 pl du réactif de coloration et la gamme a été tracée comme indiqué dans 30 l'exemple 2. Le test de Fisher a montré que le domaine d'étalonnage est valide.5 Désignation Valeur observée Valeur critique avec a = 1 % Conclusion Etalonnage Nombre de niveaux 6 Nombre total de mesures 30 Sensibilité (pente) 0,0044 Blanc (ordonnée à 0,0106 l'origine) Coefficient de 0,9995 Recommandation, ICH : Acceptable détermination R2> 0,995 Linéarité F du modèle de 15494,29 7,82 Modèle régression acceptable F du modèle 1,01 4,22 Domaine d'étalonnage d'étalonnage validé 3) Optimisation des conditions d'extraction des échantillons L'extraction classique utilisant 2,5 volumes d'eau distillée et 3,5 volumes de TCA 12% a été optimisée afin d'obtenir des pourcentages de recouvrements optimisés. Un volume plus important de solution aqueuse non osmolaire (19 volumes) contenant différentes teneurs en IHP a été utilisé pour simuler l'extraction de suspensions de GR+IHP à différentes concentrations en IHP. L'utilisation de TCA concentré 24% utilisé à 6% final permet de ne pas trop diluer les échantillons et évite de perdre en sensibilité du dosage. Les échantillons ont été dosés selon le protocole décrit dans l'exemple 2. Les résultats comparant les deux méthodes d'extraction sont présentées ci-après. Extraction classique Extraction optimisée Concentration d'IHP Concentration % de Concentration % de initiale retrouvée retrouvée recouvrement recouvrement dans l'échantillon (pM) (pM) (PM) 0 533 461 87% 568 107% 1067 963 90% 1171 110% 1334 1136 85% 1446 108% 1600 1387 87% 1736 109% 2134 1780 83% 2344 110% 2400 2025 84% 2619 109% 2667 2269 85% 2459 92% 3200 2555 80% 3430 107% 4) Robustesse de la méthode Le dosage d'un échantillon a été réalisé à différentes température (6°C, 22°C et 35°C). La méthode s'est avérée robuste aux changements de température. 5) Limites de quantification et de détection Les limites de quantification et de détection ont été déterminées selon les recommandations de l'ICH. Pour cela, huit blancs (TCA 6%) ont été préparés et la gamme a été étudiée dans son domaine de linéarité (20 à 120�M). Après mélange avec le réactif de coloration, les blancs et les points de gamme ont été analysés au spectrophotomètre comme décrit dans l'exemple 2. L'écart-type sur les DO obtenues a été calculé pour pouvoir déterminer les LD et LQ en suivant les formules de l'ICH suivantes : LD=3,36/P LQ=106/P Avec :o- = écart type basé sur le blanc P = pente de la droite d'étalonnage La gamme obtenue présente une pente de 0,0045uDO/iM (uDO = unité de DO). L'écart type sur les résultats obtenus par cette méthode est de 0,00477uDO, après calcul les valeurs des LD et LQ sur la gamme sont respectivement de 3,5�M et 10,6�M. On tient compte de l'effet dilution de la méthode, et après correction on obtient les valeurs suivantes : - surnageant LD = 25 pM LQ = 74 �M - totaux LD = 94 �M LQ = 283 �M Exemple 5 1) Exemple de résultat par la méthode avec gamme étalon et élimination du bruit lié à la matrice globules rouges par le dosage de la matrice GRLR Tracé de la droite étalon en IHP (figure 1) à partir des valeurs du tableau ci-dessous : Concentration DO 460 nm ODO Moyenne ODO CV en IHP (�m) 0 0,909 Moyenne 0,915 0,912 0,825 0,087 0,086 1,64 0/0 0,827 0,085 40 0,754 0,158 0,16 1,77 % 0, 75 0,162 60 0,669 0,243 0,242 0,58 % 0,671 0,241 80 0,589 0,323 0,3205 1,10 % 0,594 0,318 100 0,528 0,384 0,386 0,73 % 0,524 0,388 120 0,451 0,461 0,461 0,00 % 0,451 0,461 5 10 15 Calcul de lIHP dans les échantillons : Nom de Facteur de ADO Concen- Concentratio Moyenne Concen- l'échan- dilution dû tration n IHP dans concentration tration tillon à sur la l'échantillon IHP estimée d'IHP l'extraction courbe initial (mM) dans (mM) (Pm) l'échantillon (mM) MatriceG 7 0,170 41,4 0,290 0,290 R-LR GR-IHP 26,67 0,448 114,5 3,054 3,037 2,81 26,67 0,443 113,2 3,019 Surna- 7 0,118 27,7 0,194 0,230 0,23 geant 7 0,085 19,0 0,266 2) Exemple de résultat par la méthode des ajouts dosés L'échantillon à doser a été aliquoté par 50�I et traité comme détaillé dans l'exemple 2 (méthode des ajouts dosés). Le tableau des ajouts réalisés est le suivant : Ajout Cl C2 C3 C4 C5 Concentration de la solution 0 0,0157 0,0314 0,0474 0,0632 ajoutée (mM) Concentration correspondant 0 0,3 0,6 0,9 1,2 à l'ajout dans l'échantillon initial (mM) Les points obtenus (tableau suivant) ont permis de tracer la droite de la figure 2. [IHP] ADO CV ajouté (mM) 0 0,271 5% 0,3 0,324 1 % 0,6 0,381 2% 0,9 0,420 1 % 1,2 0,463 3% 17 La concentration est déterminée au point y = 0, ce qui donne en valeur absolue [IHP] dans l'échantillon initial = 1,72 mM. Elle se calcule à l'aide de l'équation : y = 1,1599x + 0,2756. 3) Comparaison ajouts dosés et méthode gamme étalon Essai Dosage avec Dosage ajouts dosés % CV gamme étalon (mM) (mM) 1 1,64 1,72 3% 2 1,86 1,92 2% 3 1,84 1,82 1% Exemple 6 : Automatisation du dosage Exemple avec le dosage par gamme étalon Le dosage de GR encapsulant de l'IHP a partiellement été automatisé sur un appareil de biochimie (MaxMat). Le réactif de coloration (réactif), le TCA 6% (diluant) et la solution mère d'IHP à 1 mM (étalon) ont été préparés comme dans l'exemple 1, puis placés sur le plateau de l'automate. Les échantillons à doser ont été préparés manuellement suivant le procédé décrit dans l'exemple 2. Chaque surnageant d'extraction des échantillons à doser a été transvasé dans un tube de 1,5 ml et placé sur le plateau. La méthode de dosage a été correctement paramétrée : - mode positif - mode de régression linéaire négative - 30 cycles : o cycle 1 : prélèvement de l'échantillon préparé : 75�I et lecture DO à 460 25 nm o cycle 2 : ajout du réactif de coloration : 150�I o cycle 30 : lecture DO à 460 nm Lorsque le dosage est démarré, I"automate réalise les dilutions de la gamme étalon (1/8.3, 1/10, 1/12, 1/15, 1/25, 1/50) dans du TCA 6%, puis les différents mélanges avec le réactif de coloration. Lorsque les 30 cycles sont terminés, l'automate indique une valeur de DO à 460 nm pour les points de gamme et les différents échantillons. Les résultats sont ensuite reportés dans une feuille de calcul excel identique à celle de l'exemple 3. Le dosage d'un ou plusieurs échantillons est réalisé en moins de 60 min. Les résultats obtenus pour plusieurs échantillons par dosage manuel et automatisé 10 sont comparables (%CV REVENDICATIONS1. Méthode de dosage de l'inositol hexaphosphate (IHP) dans un produit injectable à l'homme ou l'animal ou dans une fraction de ce produit, dans laquelle, à un échantillon ou une fraction de ce produit, on ajoute un composé métallique dont la complexation à l'IHP présent est ensuite détectée, ce grâce à quoi on dose l'IHP présent dans le produit ou sa fraction. 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la complexation produit un complexe dont le coloration est différente de celle du composé métallique. 3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle on mesure le changement d'absorbance du complexe par rapport au composé métallique de départ. 4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle ce changement d'absorbance est détecté par spectrophotométrie. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le réactif est un composé de Fe(III). 6. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle le composé du Fe(lll) est le Fe(III)-thiocyanate. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'échantillon biologique est une suspension de globules rouges. 8. Méthode selon la revendication 7, appliquée à l'IHP total, la méthode 30 comprenant : - la lyse des globules rouges, - obtention d'une fraction contenant l'IHP et dépourvue d'hémoglobine et de débris cellulaires,25- l'ajout à cette fraction d'une quantité connue du composé métallique conduisant à la formation d'un complexe avec l'IHP présent, - la détermination de la teneur en IHP total. 9. Méthode selon la revendication 7, appliquée à l'IHP intra-érythrocytaire, la méthode comprenant : - l'élimination du milieu extracellulaire, récupération de la fraction globulaire, - la lyse des globules rouges, - obtention d'une fraction contenant l'IHP et dépourvue d'hémoglobine et de débris cellulaires, - l'ajout à cette fraction d'une quantité connue du composé métallique conduisant à la formation d'un complexe avec l'IHP présent, - la détermination de la teneur en IHP intra-érythrocytaire. 10. Méthode selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle on élimine l'hémoglobine par une étape de précipitation des protéines en présence d'un acide. 11. Méthode selon la revendication 7, appliquée à ''IHP extracellulaire, la méthode comprenant : - récupération de la fraction extracellulaire, - l'ajout à cette fraction extracellulaire d'une quantité connue du composé métallique conduisant à la formation d'un complexe avec l'IHP présent, - la détermination de la teneur en IHP extracellulaire. 12. Méthode selon la revendication 7, combinant la mesure de l'IHP extracellulaire selon la revendication 11 et la mesure de l'IHP total selon la revendication 8, la teneur en IHP intra-érythrocytaire étant obtenue par la formule suivante : [IHP intracellulaire] = JIHP total' x 100 û [IHP extracellulairel x (100 û hématocrite) Hématocrite