FR 2948125 A1 20110121 FR 0954994 A 20090717 PROCEDES D'ETABLISSEMENT DE SYMBIOSES Domaine Technique La présente invention concerne l'établissement de nouvelles relations symbiotiques entre un organisme ou une organelle et un organisme, respectivement. Les nouvelles relations symbiotiques ainsi établies peuvent avoir de nombreuses applications, notamment du point de vue bioénergétique, thérapeutique ou 10 environnemental. Etat antérieur de la technique Après l'émergence de la vie sur Terre il y a environ 4 milliards d'années, l'événement le 15 plus important qui a permis l'évolution des formes complexes de la vie a été la formation d' endosymbioses stables et héréditaires. Les premières cellules eucaryotes ont ainsi établi une relation symbiotique avec les protéobactéries, qui a abouti au développement des mitochondries. Un deuxième événement symbiotique a créé la photosynthèse, grâce aux cyanobactéries, donnant naissance aux organelles 20 endosymbiotiques photosynthétiques (cyanelles et plastes), il y a environ 1,5 milliards d'années. Il paraît improbable qu'un tel évènement ne se soit produit qu'une fois. Des études récentes ont en effet montré que la formation d'endosymbioses, ainsi que le transfert 25 horizontal de gènes vers le noyau cellulaire en résultant, pouvait être un des principaux moteurs d'une évolution continue. De tels exemples peuvent se trouver dans des biotopes bactériens présents dans les sources géothermales (un environnement dur, compétitif, pauvre en nutriments), ainsi 30 que dans le développement de nouvelles relations non héréditaires � kleptoendosymbiotiques �, comme dans la limace marine Elysia chlorotica. L'évolution en parallèle des espèces a aussi créé des réseaux complexes de relations exosymbiotiques, commensales et parasites chez des organismes multicellulaires ou 35 monocellulaires, dans une quelconque combinaison de ceux-ci, avec des résultats de type neutres pour l'hôte, bénéfiques à l'hôte ou adverses pour l'hôte. Sur cette base et selon le postulat d'� Extended Phenotype � de R. Dawkins, les gènes d'un organisme (l'organisme parasite/symbiote/commensal) ont des effets phénotypiques sur un autre organisme (l'organisme hôte). Etant donné le succès évolutif des évènements endosymbiotiques anciens, à savoir l'évolution du règne des plantes, des champignons et des animaux, il peut être admis que la pression de sélection positive pour les résultats des évènements endosymbiotiques récents est relativement faible. De plus, étant donné la nécessité de capturer le symbiote potentiel ou d'être infecté par celui-ci, de ne pas le digérer, de ne pas mourir à cause de lui et de le conserver fonctionnel dans le cytosol, la probabilité de l'établissement de nouvelles relations endosymbiotiques dans les populations naturelles est également très faible. Or, il s'avère que certaines voies métaboliques, ou certains métabolites en résultant, sont d'un grand intérêt mais demeurent inexploitables en raison des caractéristiques propres des organismes les abritant, par exemple les conditions de croissance desdits organismes. Ainsi, la question de l'énergie est une des problématiques actuelles de l'humanité. En effet, les pays à développement économique rapide, les pays à forte population, ainsi que les pays industrialisés possédant peu de ressources naturelles ont une priorité stratégique pour assurer des ressources en énergie viables, écologiques et abondantes. Le pétrole ainsi que dans une certaine mesure le charbon qui sont les principales sources d'énergie actuelles, en dehors du dégagement nuisible de CO2 (avec toutes ses conséquences sur la pollution atmosphérique et le réchauffement global), sont sujets à des fluctuations non prévisibles, ayant parfois des motivations politiques, affectant leur prix et leur disponibilité sur le marché. Tous ces facteurs en font un élément stratégique pour tout pays, notamment industrialisé, et particulièrement pour les gros pays industrialisés. L'énergie hydro-électrique, qui nécessite de gros investissements pour la construction et la maintenance, n'est pas assez bon marché et a souvent un impact négatif sur les biotopes des rivières. Les sources d'énergie écologiques et renouvelables (vent, cellules photovoltaïques, marées, ...) ne forment encore qu'une partie mineure du rendement énergétique et dans de nombreux cas, les derniers développements limitent sérieusement leur utilisation économique optimale. De ce fait, l'une des perspectives les plus prometteuses, viables et écologiques dans le domaine des énergies, est la création biotechnologique de microorganismes capables soit de produire par photosynthèse du pétrole (éthanol ou butanol) ou, dans le cas d'animaux importants économiquement, de créer ceux qui peuvent utiliser directement l'énergie du soleil. Ainsi, la production d'éthanol utilisable comme combustible est une voie prometteuse qui, malgré différentes solutions techniques proposées dans les documents US 4,242,455, US 4,350,765, US 4,413,058, WO 88/09379, US 6,699,696, US 5,550,050, n'autorise pas d'exploitation à grande échelle. Dans un autre domaine technique, à savoir le domaine médical, le traitement de certaines maladies requiert la prise régulière et répétée de molécules, dont la synthèse est délicate et/ou le prix élevé. C'est par exemple le cas de maladies et de syndromes métaboliques ou endocrinologiques, dans lesquels une ou plusieurs enzymes vitales ou d'autres substances bioactives manquent, par défaut de production intrinsèque. Il apparaît donc qu'il existe un besoin persistant de développer de nouvelles solutions techniques permettant d'exploiter des métabolismes naturellement présents chez certains organismes, et donc de produire des métabolites d'intérêt. Exposé de l'invention La présente invention repose sur la mise en évidence, par le Demandeur, d'un procédé permettant l'établissement de nouvelles symbioses, de manière � forcée � et contrôlée. On entend par � symbiose � une association intime, temporaire (non héréditaire) ou durable (héréditaire) entre deux organismes d'espèces différentes, l'un étant considéré comme le symbiote et l'autre, en général le plus gros, comme l'hôte. C'est l'hôte qui fournit l'environnement nutritionnel au plus petit endosymbiote. Ceci inclut aussi, sans être limitatif, les organelles des cellules qui résultent d'événements endosymbiotiques anciens, ainsi que ceux créées artificiellement, et les procaryotes modifiés ou les eucaryotes, conçus pour fonctionner à l'intérieur des cellules vivantes comme des "organelles artificielles". Il s'agit donc d'associer deux organismes ou un organisme et une organelle, qui ne préexistent pas sous cette forme ou dans ce type de relations dans la nature. La mise en commun des capacités, en particulier métaboliques, des organismes impliqués dans la symbiose peut présenter divers intérêts, notamment pour la production de métabolites aussi bien intermédiaires que finaux. Ces nouvelles relations symbiotiques peuvent également donner naissance à des effets thérapeutiques, ou plus généralement bénéfiques. On obtient ainsi des hôtes � boostés � par la symbiose, à savoir un organisme dont l'état ou la santé est amélioré, ou plus généralement dont le phénotype a été changé par introduction et éventuellement modification (génétique ou d'une autre manière) de son symbiote, commensal ou parasite. On entend par � symbiote � un organisme ou une organelle qui vit en symbiose avec un autre organisme, pour le bénéfice mutuel de chacun. On entend par � commensal � un organisme qui vit sur ou avec un autre organisme sans lui apporter de bénéfices mais sans lui nuire. On entend par � parasite � un organisme qui vit et se développe aux dépens d'un autre organisme, sans prise en considération de sa pathogénicité. Dans la suite de la description et dans le cadre de la présente invention, on utilisera les 25 termes � symbiote � et � relation symbiotique � comme termes génériques pour couvrir ces différents cas de figure. En final, il s'agit de former des relations améliorées, altérées ou entièrement nouvelles entre deux organismes ou un organisme et une organelle, constituant l'hôte et le 30 symbiote, respectivement. La présente invention offre donc la possibilité de manipuler (réduire, augmenter ou modifier) des relations symbiotiques, au niveau de leur pathogénicité et/ou de leur effet physiologique et/ou de leur comportement, afin de servir un but spécifique d'ordre thérapeutique et/ou diagnostique et/ou biotechnologique et/ou bioactif. La présente invention offre donc une alternative aux 35 composés chimiques classiquement utilisés dans ces différents domaines.20 En pratique, un procédé selon l'invention comprend au moins les étapes suivantes : - sélection d'un organisme ou d'une organelle destiné à constituer le symbiote et d'un organisme destiné à constituer l'hôte, ceux-ci n'existant pas naturellement dans une relation symbiotique ; - éventuellement modification génétique d'un organisme ou d'une organelle constituant le symbiote et/ou de l'organisme constituant l'hôte ; - mise en contact avec le symbiote et l'hôte ; - maintien de l'association entre le symbiote et l'hôte. Le symbiote est constitué d'un organisme à part entière ou d'une organelle, à savoir une partie élémentaire différenciée d'une cellule. On entend par � organisme � aussi bien des virus et/ou des bactéries et/ou des protozoaires et/ou des procaryotes et/ou des eucaryotes mono- ou pluricellulaires. Comme déjà dit, ce procédé met en présence deux entités, à savoir d'un côté le symbiote et de l'autre l'hôte. Ces couples sont choisis au cas par cas, en fonction notamment de leur compatibilité et de l'intérêt de leur phénotype respectif. 20 Par ailleurs, selon une caractéristique de l'invention, le couple choisi ne forme pas dans la nature, suite aux évènements naturels ayant eu lieu spontanément, une symbiose. Ces symbioses naturelles sont largement documentées. De manière avantageuse selon l'invention, le symbiote n'est pas une bactérie fixatrice 25 d'azote ni un champignon endophyte, puisque ce type de symbiose a déjà été rapporté dans l'art antérieur. Concernant les organelles, les mitochondries originaires de la même espèce que l'hôte, sont également avantageusement exclues. De même, les mitochondries de la même 30 espèce que l'hôte ayant été modifiée jusqu'à hauteur de 10% de leur séquence et présentant donc plus de 90% d'identité de séquence sont avantageusement exclues. En revanche, il peut s'agir de cyanelles, de mitochondries artificielles, de chloroplastes, d'hydrogénosomes, ou de mitochondries � xénotransplantées � d'une espèce différente 35 de celle de l'hôte.15 On entend par �modification génétique� le fait que l'identité génétique du symbiote et/ou de l'hôte est modifiée, notamment pour lui conférer un phénotype d'intérêt ou pour favoriser l'établissement de la symbiose. Plus précisément et dans le cadre de l'invention, le terme � modification génétique � est définie comme un changement qualitatif et/ou quantitatif du contenu total en ADN du symbiote et/ou de l'hôte : noyau + organelles + nucléotides cytoplasmiques libres et plasmides. Une telle modification génétique peut résulter notamment d'une mutagénèse, par exemple par exposition aux UV ou par mise en présence d'un agent mutagène, ou par transfert (insertion) de matériel génétique. Toutes ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. A l'issue de cette modification génétique, il est en général nécessaire de faire un criblage pour sélectionner les organismes ou organelles ayant effectivement subi ce changement. Le test de criblage peut en particulier reposer sur le phénotype recherché ou sur un marqueur introduit à cet effet. Comme déjà dit, l'hôte, aussi bien que le symbiote, peut être soumis à de telles modifications génétiques, via des techniques similaires. Tout hôte peut être soumis à ce procédé. Dans un mode de réalisation particulier, les deux partenaires ûle symbiote et l'hôte-25 sont soumis à cette modification génétique. La seconde étape cruciale consiste à mettre en contact le symbiote et l'hôte, et ceci en vue d'établir la symbiose, qui peut aussi bien être une endosymbiose qu'une exosymbiose. On entend par � endosymbiose � une symbiose dans laquelle l'un des deux organismes vit à l'intérieur de la cellule ou des cellules de l'autre. On entend par � exosymbiose � une symbiose dans laquelle les deux organismes vivent 35 à proximité l'un de l'autre. Ainsi, le symbiote se trouve dans ou à l'extérieur des cellules d'un ou de tous les organes ou systèmes d'organes de l'hôte. 30 Cette étape a pour but de créer des conditions expérimentales favorables à la � capture � initiale des symbiotes potentiels. Les techniques de mise en contact sont variées et bien connues de l'homme du métier. Il peut s'agir d'une des techniques choisies dans le groupe suivant : insertion, fusion, en particulier fusion de cellules, implantation, micro-injection, électroporation, phagocytose stimulée ou naturelle, fertilisation inter-espèces, infection, atténuation. De manière simultanée ou ultérieure, le couple symbiote/hôte est avantageusement soumis à une pression de sélection et/ou de maintien. Il s'agit alors de créer des conditions expérimentales de forte pression de sélection positive pour établir et/ou maintenir les nouvelles relations symbiotiques. De telles conditions sont par exemple choisies dans le groupe comprenant : - présence de substances toxiques et/ou d'antibiotiques (par exemple pour 15 l'efficacité métabolique et/ou le recyclage des déchets û bioremédiation, et/ou la sélection de mutants résistants) ; - croissance dépendante de la lumière (par exemple pour la photosynthèse) ; - irradiation / dessiccation (par exemple pour la robustesse) ; - carence nutritionnelle / réduction et/ou modification alimentaire (par exemple 20 pour l'efficacité métabolique et/ou l'adaptation alimentaire) ; - sélection de l'hôte pour une résistance présente chez ou portée par le symbiote (par exemple une résistance à un antibiotique ou à une toxine) ; - sélection au niveau d'une grande population (pour augmenter la chance de sélectionner un évènement rare). 25 Le présent procédé permet donc de créer des organismes totalement nouveaux, aussi bien de type microorganismes, champignons ou organismes animaux multicellulaires. Il trouve de nombreuses applications, notamment en rapport avec l'introduction d'une 30 activité photosynthétique, c'est-à-dire la possibilité pour des organismes autres que les plantes de créer des hydrates de carbone organiques, riches en énergie, uniquement à partir de soleil, d'eau et d'air. Dans le cadre de cette application, des partenaires privilégiés sont : - au niveau du symbiote : Chlorobium tepidum, un autotrophe obligatoire, grand et anaérobie ; des cyanelles de Cyanophora paradoxa ; Ostreococcus tauri, un plus petit eucaryote planctonique avec une bonne activité photosynthétique ; ou 5 Rhodobacter sphaeroides, une bactérie autotrophe ; - au niveau de l'hôte : zygote de grenouille (Xenopus tropicalis albinos) ; cellule souche embryonnaire de souris nude albinos ; Saccharomyces cerevisiae (levure du brasseur) ou Saccharomyces uvarum (cellules larges de levure). 10 Exemples de réalisation La manière de réaliser l'invention ainsi que les avantages qui en découlent ressortiront bien des exemples de réalisation qui suivent, ceux-ci n'ayant toutefois aucune portée limitative. I/PROTOCOLES D 'ETABLISSEMENT DE SYMBIOSES : 1/ Conditions expérimentales : 20 Conditions favorisant l'introduction initiale de l'endosymbiote dans l'hôte : - microinj ection ; - fusion cellulaire ; - électroporation ; - phagocytose stimulée ou naturelle ; 25 - fertilisation entre espèces ; - infection ; - mutagénèse de l'endosymbiote potentiel ; - atténuation. 30 Conditions créant une pression de sélection positive pour l'établissement et le maintien des nouvelles relations symbiotiques : - carence / présence de substances toxiques (par exemple pour l'efficacité métabolique et/ou le recyclage des déchets ù bioremédiation) ; - croissance dépendante de la lumière (par exemple pour la photosynthèse) ; 35 - irradiation / dessiccation (par exemple pour la robustesse) ; - sélection de l'hôte pour des résistances portées par l'endosymbiote (par exemple résistance aux antibiotiques, résistance à une toxine, ...) ; - sélection au niveau de larges populations (pour augmenter la chance de sélectionner un évènement rare). 15 Endosymbiotes : 1) Chlorobium tepidum (grand, anaérobie, autotrophe obligatoire 2) Cyanelles de Cyanophora paradoxa (5 à 10% du génome des cyanobactéries) ; 3) Ostreococcus tauri (plus petit eucaryote, bon photosynthétiseur). 5 Hôtes : a) Zygote de grenouille (Xenopus tropicalis albinos) ; b) Cellule souche embryonnaire de souris nude albinos ; c) Saccharomyces cerevisiae (levure du brasseur) ; 10 d) Saccharomyces uvarum (la plus grande levure) 2/ Tests préliminaires : 2-1/ Sonication d'Ostreococcus tauri ; examen du degré de destruction 15 membranaire : - La suspension cellulaire est placée sur la glace et soumise à des salves courtes et fixées de sonication ; - Après chaque salve, le tube test principal est refroidi ; - Après chaque salve, un échantillon est prélevé à la micropipette et testé sous 20 microscope pour déterminer le ratio optimal entre les membranes cellulaires soumises aux salves et les plastes intacts ; - Le protocole optimal correspond au pré-traitement d'Ostreococcus avant la microinj ection. 25 2-2/ Pré-traitement aux lysozymes de C. paradoxa : - Préparation de solutions de lysozymes à des concentrations de 5, 20, 100, 200 et 300 �g/ml ; - Détermination de la concentration standard en cellules donneuses dans la suspension ; 30 - Températures standards = 20, 25, 30, 37°C ; - Temps standard = 20 minutes d'incubation, puis lavage par centrifugation et resuspension ; - Test sous microscope pour � l'écrasement � des membranes cellulaires � et l'absence de flagelles ; 35 - 20 tests minimum = 5 concentrations à 4 températures ; - Le protocole optimal correspond au pré-traitement de C. paradoxa avant la microinj ection. 2-3/ Pré-traitement aux lysozymes de O. tauri : Comme en 2-2 2-4/ Pré-traitement des cultures de levures avec HU (pour des cellules de levure 5 de grande taille): Milieux : Milieu YEP-galactose-PVP constitué de 15g d'extrait de levure, 30g de peptone bactériologique, 30g de galactose, 280g de polyvinylpyrrolidone (PVP-40, Sigma) et 50 �g d'adénine dans 1 1 d'eau distillée. Le milieu est stérilisé par autoclavage. 10 L'hydroxyurée (HU) est fournie par Sigma. Du facteur a synthétique a été obtenu auprès du Peptide Institute, Osaka, Japon. Concentration = 1,5 mg/ml HU ; Temps d'exposition = 112 minutes ; 15 Nombre standardisé de cellules en suspension ; Après exposition, lavage par centrifugation et resuspension dans un milieu dépourvu de HU. Les plus grandes cellules de levure sont des candidats pour la microinjection. 2-5/ Suppression de gènes codant deux acides aminés essentiels (limitation du danger biologique) : - Délétion des gènes HIS-3 et LEU-2 ; - (pour Saccharomyces cerevisiae, réalisé en MEDILS). 25 2-6/ Pré-traitement par mutagénèse aux UV pour tous les donneurs (éventuellement éthyl-méthyl-sulphonate ou EMS) : - lampe UV + dosimètre UV (but : 10% de survivants ; les cellules survivantes, après le temps de latence, sont les donneurs qui, après un pré-traitement de 30 fragilisation, reçoivent la microinjection) ; - concentration cellulaire standardisée ; - test de la mobilité sous microscope pour la viabilité (Cyanophora paradoxa) dans une grille standardisée ; - coloration à la dihydrorhodamine pour la viabilité (Ostreococcus tauri, 35 Chlorobium tepidum) ; - temps de latence = 1-2 générations (doublement, nombre de survivants quadruplé). 20 2-7/ Test de la toxicité du milieu nutritif du donneur pour l'hôte : Par injection sham de milieu seulement ; si toxique, centrifugation des cellules donneuses et resuspension dans une solution à 0.9% NaCl. 3/ Expériences : A/ Donneur 1 ù Hôte a - culture anaérobie viable standardisée de Chlorobium tepidum ; - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) , - après une période de latence de 4 heures (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations), microinjection à l'intérieur d'un zygote 1 cellule de grenouille ; - 2 doses : a) 10-15 cellules donneuses ; b) 5-10% du volume de cellules hôtes (culture des donneurs survivants après un temps de latence). Observations : - lère observation ù stade 32 cellules - 2nde observation ù têtard (branchies) - 3ème observation ù têtard (poumons) - 4ème observation ù grenouille adulte (in vivo, analyse histologique) B/ Donneur 1 ù Hôte b - culture anaérobie viable standardisée de Chlorobium tepidum ; - culture viable standardisée de cellule souche embryonnaire de souris nude 25 albinos - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) , - après une période de latence de 4 heures (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations), fusion avec du polyéthylèneglycol (PEG) avec des cellules souches embryonnaires de souris (rapport donneur : hôte = 5- 30 10 :1) ; - après la fusion, stimulation électrique de la fusion membranaire (1kV/cm de la hauteur de la culture, 2 pulses). Observations : - Après la fusion, toutes les cultures sont placées sous éclairage (spectre du soleil) dans un rythme circadien (12 h de lumière : 12 h d'obscurité) - lère observation ù ter jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 2nde observation ù 2nd jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 3ème jour ù tous les 3 jours, élimination du milieu de culture de la source de carbone, sous régime d'éclairage constant (12h cycle) par 10% (100% à 90%, 90% à 81%, ...) : observation de la photosynthèse, viabilité. C/ Donneur 1 ù Hôte c - culture standardisée de l'hôte viable Saccharomyces cerevisiae ; culture anaérobie viable standardisée de Chlorobium tepidum ; - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) ; - après une période de latence de 4 heures (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations), fusion avec du polyéthylèneglycol (PEG) avec des cellules de Saccharomyces cerevisiae (rapport donneur : hôte = 5-10 :1) ; - après la fusion, stimulation électrique de la fusion membranaire (lkV/cm de la hauteur de la culture, 2 pulses). Observations : - Après la fusion, toutes les cultures sont placées sous éclairage (spectre du soleil) dans un rythme circadien (12 h de lumière : 12 h d'obscurité) - lère observation ù ter jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 2nde observation ù 2nd jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 3ème jour ù tous les 3 jours, élimination du milieu de culture de la source de carbone, sous régime d'éclairage constant (12h cycle) par 10% (100% à 90%, 90% à 81%, ...) : observation de la photosynthèse, viabilité. D/ Donneur 1 ù Hôte d - culture standardisée viable de l'hôte Saccharomyces uvarum ayant subi un prétraitement HU (voir tests préliminaires ci-dessus) ; culture anaérobie viable standardisée de Chlorobium tepidum ; - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) , Expérience 1D/ - après une période de latence de 4 heures (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations), fusion avec du polyéthylèneglycol (PEG) avec des cellules de Saccharomyces uvarum (rapport donneur : hôte = 5-10 :1) ; - après la fusion, stimulation électrique de la fusion membranaire (1kV/cm de la hauteur de la culture, 2 pulses). Expérience 2D/ - après une période de latence de 4 heures (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations), microinjection à l'intérieur des plus grosses cellules de Saccharomyces uvarum ; - 2 doses : a) 10-15 cellules donneuses ; b) 5-10% du volume de cellules hôtes (culture des donneurs survivants après un temps de latence). Observations : - Après la fusion, toutes les cultures sont placées sous éclairage (spectre du soleil) dans un rythme circadien (12 h de lumière : 12 h d'obscurité) - lère observation ù ter jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 2nde observation ù 2nd jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 3ème jour ù tous les 3 jours, élimination du milieu de culture de la source de carbone, sous régime d'éclairage constant (12h cycle) par 10% (100% à 90%, 90% à 81%, ...) : observation de la photosynthèse, viabilité. E/ Donneur 2 ù Hôte a - culture standardisée de Cyanophora paradoxa ; - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus - après le temps de latence et la vérification de la viabilité : isolation de la fraction des plastes et du noyau + vérification des membranes intactes sous microscope. 30 Expérience 1E/ - microinjection de fraction de cyanelles (membranes préservées, 5-10% du volume de cellules hôtes) Expérience 2E/ - microinjection de fraction de cyanelles et de noyaux (5-10% du volume de 35 cellules hôtes) Observations : - lève observation ù stade 32 cellules - 2nde observation ù têtard (branchies) - 3ème observation ù têtard (poumons) - 4ème observation ù grenouille adulte (in vivo, analyse histologique). 5 F/ Donneur 2 ù Hôte b - culture standardisée de Cyanophora paradoxa ; - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) ; - après une période de latence (temps pour que le nombre de survivants 10 quadruple, 2 générations, vérification de la viabilité sous microscope) : fragilisation du donneur avec du lysozyme (voir tests préliminaires ci-dessus) ; - fusion avec du polyéthylèneglycol (PEG) avec des cellules souches embryonnaires de souris (rapport donneur : hôte = 5-10 :1) ; - après la fusion, stimulation électrique de la fusion membranaire (1kV/cm de la 15 hauteur de la culture, 2 pulses). Observations : - Après la fusion, toutes les cultures sont placées sous éclairage (spectre du soleil) dans un rythme circadien (12 h de lumière : 12 h d'obscurité) 20 - lève observation ù lev jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 2nde observation ù 2nd jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 3ème jour ù tous les 3 jours, élimination du milieu de culture de la source de 25 carbone, sous régime d'éclairage constant (12h cycle) par 10% (100% à 90%, 90% à 81%, ...) : observation de la photosynthèse, viabilité. G/ Donneur 2 ù Hôte c - culture standardisée de Cyanophora paradoxa ; 30 - irradiation du donneur ; - après une période de latence (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations, vérification de la viabilité sous microscope) : fragilisation du donneur avec du lysozyme (voir tests préliminaires ci-dessus) ; - fusion avec du polyéthylèneglycol (PEG) avec des cellules de Saccharomyces 35 cerevisiae (rapport donneur : hôte = 5-10 :1) ; - après la fusion, stimulation électrique de la fusion membranaire (1kV/cm de la hauteur de la culture, 2 pulses). Observations : - Après la fusion, toutes les cultures sont placées sous éclairage (spectre du soleil) dans un rythme circadien (12 h de lumière : 12 h d'obscurité) - lère observation û ter jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 2nde observation û 2nd jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 3ème jour û tous les 3 jours, élimination du milieu de culture de la source de carbone, sous régime d'éclairage constant (12h cycle) par 10% (100% à 90%, 90% à 81%, ...) : observation de la photosynthèse, viabilité. H/ Donneur 2 û Hôte d - culture standardisée viable de l'hôte Saccharomyces uvarum ayant subi un prétraitement HU (voir tests préliminaires ci-dessus) ; - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) , - après une période de latence (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations, vérification de la viabilité sous microscope) fragilisation du donneur avec du lysozyme (voir tests préliminaires ci-dessus) Expérience 1H/ - fusion avec du polyéthylèneglycol (PEG) avec des cellules de Saccharomyces uvarum (rapport donneur : hôte = 5-10 :1) ; - après la fusion, stimulation électrique de la fusion membranaire (1kV/cm de la hauteur de la culture, 2 pulses). Expérience 2Ha/ - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) , - après une période de latence (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations), microinjection de la suspension standardisée de fraction de cyanelles à l'intérieur des plus grosses cellules de Saccharomyces uvarum ; - 5-10% du volume des cellules hôtes (culture des donneurs survivants après un temps de latence). Expérience 2Hb/ - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) , - après une période de latence (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations), microinjection de la suspension standardisée de la fraction cyanelles + noyaux du donneur (50 :50) à l'intérieur des plus grosses cellules de Saccharomyces uvarum ; - 5-10% du volume des cellules hôtes (culture des donneurs survivants après un temps de latence). Observations : - Après la fusion, toutes les cultures sont placées sous éclairage (spectre du soleil) dans un rythme circadien (12 h de lumière : 12 h d'obscurité) - lère observation ù ter jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 2nde observation ù 2nd jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 3ème jour ù tous les 3 jours, élimination du milieu de culture de la source de carbone, sous régime d'éclairage constant (12h cycle) par 10% (100% à 90%, 90% à 81%, ...) : observation de la photosynthèse, viabilité. I/ Donneur 3 ù Hôte a - culture viable standardisée d'Ostreococcus tauri ; - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) ; - après une période de latence (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations), fragilisation des cellules du donneur par sonication ; - microinjection à l'intérieur d'un zygote 1-cellule de grenouille ; - 2 doses : a) 10-15 cellules donneuses ; b) 5-10% du volume de cellules hôtes (culture des donneurs survivants, après un temps de latence). Observations : - lère observation ù stade 32 cellules - 2nde observation ù têtard (branchies) - 3ème observation ù têtard (poumons) - 4ème observation ù grenouille adulte (in vivo, analyse histologique) J/ Donneur 3 ù Hôte b - culture viable standardisée d'Ostreococcus tauri ; - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) ; - après une période de latence (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations), fragilisation des cellules du donneur par sonication ; Expérience 1J/ - fusion avec du polyéthylèneglycol (PEG) avec des cellules souches embryonnaires de souris (rapport donneur : hôte = 5-10 :1) ; - après la fusion, stimulation électrique de la fusion membranaire (1kV/cm de la hauteur de la culture, 2 pulses). Expérience 2J/ - microinjection à l'intérieur de cellules souches embryonnaires de souris ; - 2 doses : a) 10-15 cellules donneuses ; b) 5-10% du volume de cellules hôtes (culture des donneurs survivants, après un temps de latence). Observations : - Après la fusion, toutes les cultures sont placées sous éclairage (spectre du soleil) dans un rythme circadien (12 h de lumière : 12 h d'obscurité) - lève observation û lev jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 2nde observation û 2nd jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 3ème jour û tous les 3 jours, élimination du milieu de culture de la source de carbone, sous régime d'éclairage constant (12h cycle) par 10% (100% à 90%, 90% à 81%, ...) : observation de la photosynthèse, viabilité. K/ Donneur 3 û Hôte c - culture viable standardisée d'Ostreococcus tauri ; - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) ; - après une période de latence (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations), fragilisation des cellules du donneur par sonication ; - fusion avec du polyéthylèneglycol (PEG) avec des cellules de Saccharomyces cerevisiae (rapport donneur : hôte = 5-10 :1) ; - après la fusion, stimulation électrique de la fusion membranaire (1kV/cm de la hauteur de la culture, 2 pulses). Observations : - Après la fusion, toutes les cultures sont placées sous éclairage (spectre du soleil) dans un rythme circadien (12 h lumière : 12 h obscurité) - lève observation û lev jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le 30 cytosol, présence de chlorophylle) - 2nde observation û 2nd jour (microscope, présence de cyanobactéries dans le cytosol, présence de chlorophylle) - 3ème jour û tous les 3 jours, élimination du milieu de culture de la source de carbone, sous régime d'éclairage constant (12h cycle) par 10% (100% à 90%, 35 90% à 81%, ...) : observation de la photosynthèse, viabilité. L/ Donneur 3 û Hôte d - culture standardisée viable de l'hôte Saccharomyces uvarum ayant subi un prétraitement HU (voir tests préliminaires ci-dessus) , - culture viable standardisée d'Ostreococcus tauri ; - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) , - après une période de latence (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations) : fragilisation des cellules du donneur par sonication Expérience 1L/ - fusion avec du polyéthylèneglycol (PEG) avec des cellules de Saccharomyces uvarum (rapport donneur : hôte = 5-10 :1) ; - après la fusion, stimulation électrique de la fusion membranaire (1kV/cm de la hauteur de la culture, 2 pulses). Expérience 2L/ - irradiation du donneur (voir tests préliminaires ci-dessus) , - après une période de latence (temps pour que le nombre de survivants quadruple, 2 générations), microinjection de la suspension standardisée d'Ostreococcus tauri à l'intérieur des plus grosses cellules de Saccharomyces uvarum ; - si non toxique, 5-10% du volume des cellules hôtes (culture des donneurs survivants après un temps de latence). Il est à noter que des expériences similaires peuvent être réalisées en appliquant les procédures décrites ci-dessus, en présence des différents hôtes mentionnés, pour le symbiote Rhodobacter sphaeroides, une bactérie autotrophe jouant le rôle de donneur. II/ ILLUSTRATION POUR LA PRODUCTION D'ACIDE ASCORBIQUE : La présente invention va être illustrée plus avant, en rapport avec la production d'acide ascorbique dans le cadre d'une exosymbiose établie � artificiellement � selon le procédé de la présente invention. Pour rappel, l'acide ascorbique ou vitamine C est synthétisé par de nombreux procaryotes et une grande majorité de plantes et d'animaux. Certains oiseaux, les cobayes, les grands singes et les hommes notamment constituent toutefois des exceptions. Leur inaptitude à cette synthèse est due à un pseudogène yJGULO inactif, responsable de la production de la dernière enzyme de la chaîne de biosynthèse, la L-gulonolactone oxydase. Le but fixé est donc de corriger les conséquences d'une déficience génétique chez l'hôte, en � construisant � un symbiote génétiquement modifié, et ainsi de changer le phénotype de l'hôte de manière contrôlée. Dans le cadre de cet exemple, ceci a été réalisé grâce à un procédé en différentes étapes : A/ Identification et sélection des gènes impliqués dans la biosynthèse de l'acide ascorbique (vitamine C) ; B/ Clonage des gènes sélectionnés dans le chromosome de la bactérie probiotique Escherichia coli Nissle 1917, ou éventuellement dans tout autre procaryote symbiote gastro-intestinal du cobaye, qui constitue ici l'hôte déficient pour la biosynthèse de l'acide ascorbique (vitamine C) ; C/ Etablissement de la symbiose du symbiote génétiquement modifié à l'intérieur de l'hôte cobaye. Ainsi, la biosynthèse de vitamine C par le symbiote compense l'incapacité naturelle de l'hôte pour cette synthèse et cette symbiose prévient le scorbut dans le cas d'un régime déficient en acide ascorbique. A/ Identification et sélection des gènes impliqués dans la biosynthèse de l'acide ascorbique (vitamine C) : Les gènes de biosynthèse du L-ascorbate peuvent être obtenus de différentes manières, par exemple : - isolation de la voie métabolique chez Mycobacterium tuberculosis ; - induction du cluster de gènes responsable de la biosynthèse de vitamine C chez Xanthomonas campestris par stress oxydatif, puis identification et clonage ; - activation et modification de voies métaboliques déjà existantes chez Escherichia coli par génie génétique. B/ Clonage des gènes sélectionnés dans le chromosome de la bactérie probiotique 30 Escherichia coli Nissle 1917, ou éventuellement dans tout autre procaryote symbiote gastro-intestinal du cobaye : Les clusters de gènes étrangers sont alors intégrés au site d'attachement du phage X du chromosome d'E. coli en associant auparavant, par clonage moléculaire, les gènes de 35 biosynthèse dans un vecteur porteur d'un site X-att et un gène INT. De cette manière, l'intégration de gènes se fait sans dommage pour l'hôte et sa stabilité est assurée par l'absence du gène X-xis (nécessaire pour l'excision). En outre, les cellules peuvent être identifiées sur la base de la protéine GFP (Green Fluorescent Protein) codée par le chromosome. Une première sélection des colonies productrices d'acide ascorbique est réalisée par la 5 détection d'un halo autour des colonies individuelles sur des boîtes d'agar McConkey, selon une technique bien connue de l'homme du métier. La réussite de la modification génétique est vérifiée en testant les positifs pour l'ascorbate dans le milieu de culture (CosmoBioCo Ltd. Vitamin C Assay). Si la production de vitamine C est trop faible, le/les gène/s clef responsable/s de la dégradation de l'ascorbate peuvent également être inactivés, par exemple par délétion ciblée. 15 En outre, si nécessaire, les colonies productrices d'ascorbate les plus appropriées sont sélectionnées, c'est-à-dire celles qui ont un profil équilibré entre la production d'ascorbate et la compatibilité avec l'environnement pH gastro-intestinal de l'hôte. C/ Etablissement de la symbiose du symbiote génétiquement modifié à l'intérieur de 20 l'hôte cobaye et prévention du scorbut dans le cas d'un régime déficient en acide ascorbique: Par la suite, le symbiote modifié (E. coli Nissle 1917 ou un autre symbiote intestinal du cobaye) est introduit dans l'hôte (cobaye) à l'aide d'un énéma péri-rectal et/ou d'un 25 tube gastrique. Le maintien in vivo de la culture du symbiote est testé et surveillé en réalisant de la microscopie fluorescente sur les excréments. 30 L'activité anti-scorbut du symbiote est testée à l'aide de l'expérience suivante : Les groupes d'animaux suivants sont formés et soumis à un régime déficient en vitamine C : 1/ Groupe contrôle 1 (avec une flore intestinale normale) ; 35 2/ Groupe contrôle 2 (avec E. coli Nissle 1917 non modifiée) ; 3/ Groupe test 1 (avec E. coli Nissle 1917 produisant de l'ascorbate) ; 4/ Groupe test 2 (cobayes nouveaux nés inoculé avec E. coli Nissle 1917). 10 L'évaluation est réalisée grâce à l'observation des symptômes du scorbut. De manière attendue, les groupes contrôles développent le scorbut, alors que les groupes tests restent asymptomatiques, et ce dès 4 semaines. En conclusion, les nouvelles relations symbiotiques établies à l'aide du procédé selon l'invention présentent de nombreux effets exploitables parmi lesquels : - augmentation et/ou facilitation de l'hôte ; - manipulation et/ou contrôle de l'hôte ; - guérison et/ou rétablissement de l'hôte ; - immunomodulation de l'hôte ; - amélioration de la santé de l'hôte ; - diminution de la santé de l'hôte ; - promotion de la parthénogenèse chez un hôte et/ou production d'un organisme hôte et/ou de clones de tissus hôtes, incluant la prolifération de tissus (animaux adultes produisant leurs propres clones, régénération de tissus, ...) ; - sécrétion d'hormones et/ou de biocatalyseurs et/ou de neurotransmetteurs et/ou de tout autre composé d'intérêt, biologiquement actif chez un hôte ; - changement des paramètres environnementaux en raison de la relation symbiotique (par exemple comme dans la détoxification environnementale, le recyclage biologique, la terra formation, ...) ; - production de composés industriels et/ou de pétrole et/ou d'aliments (y compris d'additifs alimentaires et constituants) dérivés des relations symbiotiques établies. REVENDICATIONS1/ Procédé d'établissement d'une symbiose comprenant les étapes suivantes : - sélection d'un organisme ou d'une organelle destiné à constituer le symbiote et d'un organisme destiné à constituer l'hôte, ceux-ci n'existant pas naturellement dans une relation symbiotique et l'organisme n'étant pas un humain, un animal ou une cellule souche embryonnaire humaine ; - mise en contact entre le symbiote et l'hôte ; maintien de l'association entre le symbiote et l'hôte, le symbiote et/ou l'hôte étant en outre soumis à une modification génétique, avantageusement avant leur mise en contact. 2/ Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le symbiote n'est pas choisi dans le groupe constitué de : bactéries fixatrices d'azote, champignons endophytes, et mitochondries présentant plus de 90% d'identité de séquence avec les mitochondries de l'hôte. 3/ Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la modification génétique résulte d'une mutagénèse ou d'un transfert de matériel 20 génétique. 4/ Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le couple symbiote/hôte est soumis à une pression de sélection et/ou de maintien. 25 5/ Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le symbiote est choisi dans le groupe constitué de : Chlorobium tepidum ; des cyanelles de Cyanophora paradoxa ; Ostreococcus tauri ; et Rhodobacter sphaeroides. 3 0 6/ Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'hôte est choisi dans le groupe constitué de : zygote de grenouille (Xenopus tropicalis albinos) ; cellule souche embryonnaire de souris nude albinos ; Saccharomyces cerevisiae ; et Saccharomyces uvarum. 35 7/ Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il résulte en l'établissement d'une endosymbiose ou d'une exosymbiose.