FR 2943686 A1 20101001 FR 0951962 A 20090330 PROCEDE D'OBTENTION D'UNE PREPARATION DE I.3-AMYLASES A PARTIR DES FRACTIONS SOLUBLES DE PLANTES AMIDONNIERES La présente invention est relative à un procédé d'obtention d'une préparation de 13-amylases à partir de résidus d'amidonnerie. Plus particulièrement, la présente invention porte sur un procédé d'obtention d'une préparation de 13-amylases à partir des résidus liquides (encore appelés � fractions solubles �, quoique renfermant encore des substances insolubles résiduelles, des particules et des colloïdes divers et variés) fabriqués lors de l'extraction par voie humide des composants (amidons, protéines et fibres) des plantes amidonnières. Au sens de l'invention, on entend par � plantes amidonnières � des plantes susceptibles d'être traitées en amidonnerie pour en extraire l'amidon, telles notamment le maïs, la pomme de terre, le blé, le riz, le pois, la fève, la fèverole, le manioc, le sorgho, le konjac et l'orge. La présente invention est également relative à un procédé comprenant une première étape de clarification des fractions solubles puis, de manière optionnelle, une deuxième étape d'ultrafiltration pour obtenir une préparation purifiée (au sens où elle est débarrassée de ses sels) et/ou concentrée en 13-amylases. La présente invention permet enfin de disposer d'une préparation de 13-amylases d'une qualité telle qu'il soit possible de l'utiliser de la même manière qu'une 13-amylase purifiée, notamment pour la production de sirop riche en maltose. Les 13-amylases sont des exo-hydrolases qui libèrent des 30 unités maltose à partir des extrémités non réductrices des polymères ou oligomères de glucose liés en a-1,4, la réaction s'arrêtant au premier point de branchement a-1,6 rencontré. Composants majoritaires du � pouvoir diastatique � (correspondant aux activités combinées des a-amylases, R-35 amylases, a-glucosidases et enzymes débranchantes) durant le 5 10 15 maltage (germination artificielle des graines de céréales), les activités R-amylasiques isolées de ce cocktail enzymatique sont essentielles pour la production du maltose ou d'autres sucres fermentescibles générés à partir d'amidon. Le maltose et les autres sucres fermentescibles ainsi obtenus sont par exemple destinés à la fermentation éthanolique par les levures. L'activité saccharifiante des seules R-amylases est donc exploitée dans bon nombre d'applications : en panification, en malterie, comme additif alimentaire, voire même comme agent � digestif �, - pour la production de maltose et de sirops enrichis en maltose (précurseur du maltitol et des sirops de maltitol), - pour la production d'édulcorants, - en pharmacie, pour la production de vaccins. Les R-amylases des céréales sont toutes semblables, en 20 regard de leur activité enzymatique. Cependant le fait que certaines céréales sont choisies de préférence à d'autres comme sources de R-amylases pour la malterie, ou pour d'autres procédés biotechnologiques, est fonction de la richesse en R-amylases de leurs graines, et est 25 fonction de la facilité avec laquelle elles peuvent être isolées de ces milieux riches en activités enzymatiques variées. C'est ainsi que deux sources d'extraction des R-amylases sont bien identifiées. La première source d'extraction des R-amylases dites 30 � classiques � est l'endosperme du blé, de l'orge ou du seigle, source connue pour produire les R-amylases de façon majoritaire et en grandes quantités. La seconde source d'extraction correspond aux graines mises artificiellement à germer. Il est ainsi procédé à un 35 enrichissement artificiel notamment en R-amylases par le déclenchement de la germination ; les activités R-amylasiques sont alors surexprimées avec d'autres activités amylasiques et glucosidasiques. Le domaine technique auquel s'attache la présente invention 5 est celui de la première source d'extraction, permettant de produire plus efficacement la R-amylase en tant que telle, en quantité plus importante ; la seconde source de R-amylases étant plus particulièrement destinée à la préparation de cocktails enzymatiques. 10 Il est déjà admis de l'homme du métier que les graines d'orge, de seigle ou de blé non germées sont autant de matériels biologiques de choix pour la préparation commerciale, à grande échelle, de R-amylases. Il est par ailleurs connu de l'homme du métier que la 15 moitié des R-amylases extractibles des graines non germées de l'orge, du blé ou du seigle peut être facilement obtenue sous la forme d'enzymes libres par extraction avec de l'eau et des solutions salines. L'autre moitié se présente en partie sous forme � liée � 20 qui nécessite l'addition d'agents réducteurs ou des enzymes protéolytiques pour son extraction. Une autre fraction de R-amylases dite � latente � a également été décrite : il faut des détergents pour l'extraire des graines de céréales. 25 Par ailleurs, les procédés d'extraction de la R-amylase décrits dans l'état de la technique sont adaptés en fonction de l'application visée. Plus particulièrement celles destinées à la saccharification de l'amidon et pour les essais expérimentaux 30 sont extraites de façon intensive de sources botaniques, telles que le soja, le blé, l'orge, l'avoine, le seigle et la patate douce, ou sont produites par des microorganismes, tels que Bacillus polymixa et autres. Dans le cas de la préparation du maltose à partir d'amidon, 35 une des contraintes est de limiter au maximum la production concomitante d'autres oligosaccharides tels le glucose et maltotriose. En malterie, par exemple, il est connu que la présence du glucose perturbe la fermentation des levures en inhibant leur croissance. Pour la fabrication commerciale de maltitol à partir des sirops de maltose, il est recommandé de limiter la production de sorbitol et maltotriitol. Il sera donc préféré de l'homme du métier les procédés permettant d'obtenir des préparations de R-amylases les plus pures possibles. Ces procédés auront bien évidemment l'inconvénient d'être coûteux. Dans le brevet US 3.492.203, il est ainsi décrit l'extraction de R-amylases pures à partir du son de blé pour la 15 préparation de sirop riche en maltose. Il est ainsi évité de partir du malt, qui contient également de l'a-amylase, difficile à séparer de la R-amylase. Le son de blé présente alors l'avantage d'être peu coûteux, recyclable comme milieu de culture, mais est surtout choisi pour 20 son contenu majoritaire en R-amylases. Le procédé consiste ici à extraire la R-amylase pure avec de l'eau à une température comprise entre 20 et 40°C Cependant, ce procédé ne permet de récupérer efficacement que la moitié du contenu en R-amylase disponible du son. 25 Par ailleurs, l'inconvénient majeur de ce procédé est qu'il fournit une R-amylase instable bactériologiquement : la R-amylase ainsi produite doit être utilisée extemporanément pour saccharifier l'amidon. Aucune pasteurisation n'est réalisée. Dans le brevet US 3.801.462, la R-amylase est extraite de 30 la patate douce, plus particulièrement de l'eau de lavage après l'étape de râpage des patates douces. Le procédé proprement dit d'extraction consiste en un traitement à un pH de 4,5 et la récupération de la R-amylase sous forme d'un précipité. Le rendement d'extraction est plus élevé 35 lorsque la température est ajustée à 55°C. Cependant, des activités a-amylasiques et maltases contaminent encore cette fraction enrichie en R-amylases, ce qui complique bien évidemment l'obtention de préparation pure. Dans le brevet US 4.675.296, il est proposé une méthode de préparation d'une R-amylase commerciale par un procédé d'extraction à l'eau (à une température comprise entre 5 et 50°C, pendant 5 à 70 h), mais qui demande de partir de grain d'orge intact ou partiellement décortiqué. Le procédé décrit est délicat à mettre en oeuvre, car il repose sur l'utilisation de la surface du grain comme une membrane semi-perméable, qui retiendrait tous les constituants dudit grain, sauf la R-amylase. Il est cependant utile d'ajouter un agent réducteur afin de faciliter la libération de la R-amylase, agent réducteur à base 15 de dioxyde de soufre ou d'acide sulfurique. Par ailleurs, il est recommandé de stabiliser l'enzyme par des sels, des polyols, des sucres ou des acides. D'autres procédés de la littérature recommandent d'utiliser des enzymes afin de faciliter l'extraction des R-amylases. 20 Dans la demande de brevet internationale WO 02/062980, il est ainsi procédé à l'extraction en milieu aqueux de R-amylases à partir de céréales en présence d'un cocktail complexe d'enzymes présentant des activités de cellulases, d'hémicellulases et de R-glucanases. L'extrait obtenu doit être finement purifié afin de 25 séparer la R-amylase ainsi récupérée du mélange réactionnel. Les céréales choisies sont l'orge et le blé. L'extraction est effectuée en conditions réductrices (eau sulfitée) dans des proportions bien définies, et dans des gammes de température et de temps de réaction bien arrêtées. 30 Dans l'US 3.769.168, il est préféré la voie de la purification d'extraits enrichis en R-amylases. Les extraits bruts préparés à partir de son de blé, de soja ou de patates douces sont traités avec un agent adsorbant de type bentonite ou kaolinite. Les (3-amylases adsorbées sont ensuite éluées à l'aide d'une solution présentant une force ionique de plus de 0,5 p à un pH supérieur à 5. De tout ce qui précède, il résulte qu'il demeure un besoin 5 non satisfait de disposer d'un procédé, simple, peu couteux, permettant d'obtenir des préparations de (3-amylases de qualité suffisante pour permettent notamment la production efficace de sirops riche en maltose. L'invention a donc pour but de répondre à ce besoin et la 10 société Demanderesse a eu le mérite de trouver, après de nombreux travaux, que ce but pouvait être atteint contre toute attente dès lors que l'on utilise les résidus d'amidonnerie. Plus particulièrement, le procédé d'obtention de la préparation de F3-amylases conforme à l'invention consiste à 15 choisir les milieux sources de (3-amylases dans le groupe constitué des fractions solubles du blé, du pois, de la fève, de la fèverole, du riz, de l'orge et de la pomme de terre, préférentiellement les fractions solubles du blé et de l'orge, à clarifier lesdits milieux puis, de manière optionnelle, à 20 effectuer une ultrafiltration afin de récupérer, voire de concentrer, les F3-amylases qu'elles contiennent. Il est du mérite de la société Demanderesse d'avoir trouvé que les résidus d'amidonnerie peu valorisables dans des secteurs autres que celui de la fermentation (comme source azotée), ou 25 celui de la nutrition animale (mélangés avec les issues du blé) pouvaient constituer un milieu de choix pour extraire aisément des enzymes d'intérêt, et plus particulièrement les (3-amylases, à un niveau de qualité suffisante pour les applications visées, telle la préparation de sirop riche en maltose. 30 Le procédé conforme à l'invention est caractérisé en ce que l'on : a) choisit la fraction soluble des plantes amidonnières dans le groupe constitué des fractions solubles du blé, de la pomme de terre, du pois, de fève, de fèverole, du riz, de l'orge 35 et préférentiellement du blé et de l'orge, b) effectue une clarification desdites fractions solubles de manière à en éliminer les substances insolubles et les colloïdes, c) de manière optionnelle, réalise une ultrafiltration 5 desdites fractions solubles clarifiées de manière à obtenir un rétentat d'ultrafiltration contenant la R-amylase concentrée et un perméat d'ultrafiltration, d) récupère la R-amylase concentrée ainsi obtenue. Dans le cas où l'étape d'ultrafiltration est mise en oeuvre, 10 il peut être également réalisé le mélange du perméat d'ultrafiltration avec les insolubles et colloïdes de l'étape b) de manière à récupérer la fraction soluble des plantes amidonnières sans sa composante R-amylase. La première étape du procédé conforme à l'invention 15 consiste à choisir la fraction soluble des plantes amidonnières dans le groupe constitué des fractions solubles du blé, de la pomme de terre, du pois, de fève, de fèverole, du riz, de l'orge et préférentiellement du blé et de l'orge. Les solubles de blé, par exemple, proviennent du flux de 20 séparation des amidons de blé � B � résultant de la séparation de l'amidon dans le procédé de l'amidonnerie de blé humide. L'amidon B ou amidon second est l'amidon constitué essentiellement par une proportion prépondérante de petits granules d'amidon ou de granules endommagés. 25 Les solubles de pomme de terre sont obtenus par récupération de la fraction soluble issue de l'écrasage des pommes de terre en début d'extraction de la fécule. Les solubles de pois résultent de l'eau de trempage du pois et sont récupérés avant l'écrasage et la séparation des 30 différents constituants du pois. Les solubles de fève résultent de l'eau de trempage des fèves et sont récupérés avant l'écrasage et la séparation des différents constituants de la fève. Les solubles de fèverole résultent de l'eau de trempage des 35 fèveroles et sont récupérés avant l'écrasage et la séparation des différents constituants de la fèverole Les solubles de riz résultent de l'eau de trempage du riz et sont récupérés avant l'écrasage et la séparation des différents constituants du riz. Les solubles d'orge sont issus du flux de séparation des amidons � B � résultant de la séparation de l'amidon dans le procédé de l'amidonnerie d'orge. L'amidon B ou amidon second est l'amidon constitué essentiellement par une proportion prépondérante de petits granules d'amidon ou de granules endommagés. Ces fractions solubles renferment encore des protéines de haut poids moléculaire, dont certaines présentent des activités enzymatiques d'intérêt, cependant mélangées à des débris insolubles de toute sorte (notamment fibres, traces d'amidon...) et des substances colloïdales (notamment phospholipides, glycoprotéines, cellules de l'assise externe de l'endosperme, encore appelée la couche d'aleurone...). La société Demanderesse a donc bien été à l'encontre d'un préjugé de l'état de la technique qui ne décrivait jusqu'à présent l'utilisation par l'homme du métier de ces fractions solubles que dans deux domaines d'application à faible valeur ajoutée . - source d'azote en fermentation, après qu'un traitement protéasique ait rendu la composante protéique de haut poids moléculaire résiduelle assimilable par les microorganismes, - source nutritive pour les animaux d'élevage, et encore adjuvantée de matières fibreuses (e.g. son de blé dans le cas des solubles de blé). La deuxième étape du procédé conforme à l'invention consiste donc à réaliser une étape de clarification desdites fractions solubles de manière à en éliminer les substances insolubles et les colloïdes. Cette étape de clarification est contrôlée par la mesure de la turbidité de la solution après chacun des traitements effectués. La turbidité désigne la teneur d'un liquide en matières qui le troublent. Elle est causée par des particules colloïdales qui absorbent, diffusent et/ou réfléchissent la lumière. Cette mesure de turbidité est réalisée à l'aide d'un néphélomètre (ou turbidimètre) de laboratoire. Cette méthode est normalisé (NF EN ISO 7027) ; deux unités de mesure de la turbidité utilisant la formazine comme étalon : - FNU (Formazine Néphélométric Unit), ou NFU utilisé dans le décret n°2001-1220 du 20 décembre 2001. Cette unité mesure la turbidité sous un angle de 90° à une longueur d'onde de 860 nm ; - FAU (Formazine Attenuation Unit) mesure la lumière transmise (180°). L'unité de turbidité prescrite par l'Environmental Protection Agency (EPA - USA) est le NTU (Nephelometric Turbidity Unit). La mesure s'effectue sur la lumière diffusée à 90°, mais à une longueur d'onde différente de 860 nm. Quant à la mesure de l'activité enzymatique, elle consiste à déterminer l'activité diastasique, mesure classiquement utilisée pour déterminer l'activité amylasique du malt de l'orge ou d'autres préparations enzymatique (cf article DIASTASE ACTIVITY - DIASTATIC POWER - de la partie General Tests and Assay / Appendix V / pp 1117-1118 du Food Chemical Codex 6). L'activité diastasique est exprimée en degré de pouvoir diastasique (°DP), défini comme la quantité d'enzyme contenue dans 0,5 ml d'une solution à 5 % d'un échantillon de préparation d'enzymes suffisante pour réduire 5 ml de liqueur de Fehling, quand ledit échantillon est placé dans 100 ml du substrat pendant 1 h à 20°C. Le pouvoir diastasique permettant de mesurer toutes les activités enzymatiques de type amylasique, la société Demanderesse s'est assurée par d'autres méthodes enzymatiques plus spécifiques (par exemple en utilisant le kit de dosage MEGAZYME spécifique à 1' (X-amylase commercialisé par CERALPHA METHOD) que la préparation de R-amylases conforme à l'invention ne refermait pas d'autres activités contaminantes. De même, comme il sera exemplifié ci-après, les essais de saccharification en laboratoire avec la préparation enzymatique conforme à l'invention ont montré une forte teneur en maltose sans présence significative de glucose. LA première étape de clarification du procédé conforme à l'invention peut être réalisée de trois façons différentes : 1) Dans un premier mode de réalisation du procédé conforme l'invention, la clarification des fractions solubles est réalisée par filtration, au moyen d'une technique choisie dans le groupe constitué de la filtration frontale, de la filtration sous pression et de la filtration sous vide. Les fractions solubles de départ présentent une turbidité élevée, dont la mesure ne peut être faite étant donné leur forte charge en particules colloïdales et insolubles résiduels. Dans le cas de l'utilisation d'un filtre sous pression, ces fractions solubles sont poussées à travers ce filtre préalablement chargé de cellulose microcristalline. Le produit sortant du filtre présente alors une turbidité de l'ordre de 20 à 60 NTU selon le type de cellulose utilisé. Dans le cas de la filtration sous vide, la société Demanderesse recommande d'effectuer la filtration à l'aide de filtres à bandes ou de filtres rotatifs. On utilise par exemple un filtre à précouche sous vide 20 préalablement chargé d'une couche de cellulose. 2) Dans un deuxième mode de réalisation du procédé conforme l'invention, la clarification des fractions solubles est réalisée par centrifugation. Le surnageant de centrifugation des solubles présente alors 25 également une turbidité de 20 à 60 NTU selon le débit et la concentration du culot de centrifugation (plus l'accélération de la centrifugeuse sera élevée, plus le produit sortant dans le surnageant aura une faible turbidité). Plus particulièrement, la société Demanderesse recommande 30 de réaliser cette étape de centrifugation à l'aide : - d'une centrifugeuse à assiettes de type séparateur à buses ou de type auto-débourbeur NA7, ou - d'une centrifugeuse à assiettes de type séparateur à buses vortex haute performance BTUX 35 (ces deux types de centrifugeuse NA7 ou BTUX étant commercialisées par la société AlphaLaval). Après centrifugation, mais de manière facultative, il peut être utile de procéder à une filtration supplémentaire dite de � sécurité � en vue de diminuer au maximum la charge des fractions solubles. Le filtre chois est un filtre de type PADOVAN� à plateaux horizontaux sous pression. Le filtre est chargé avec une précouche de cellulose de fine granulométrie. Les fractions solubles ainsi filtrées sont adjuvantées par un nourrissage plus ou moins important avec de la cellulose. La turbidité du filtrat tombe ainsi à une valeur comprise entre 5 et 10 NTU. 3) Dans un troisième mode de réalisation du procédé conforme l'invention, la clarification des fractions solubles est réalisée par filtration tangentielle membranaire. Plus particulièrement, la société Demanderesse recommande de réaliser la filtration membranaire par microfiltration tangentielle avec des membranes par exemple céramiques présentant une porosité de 0,1 à 1 pm. Le perméat dans ce cas présente avantageusement une 20 turbidité de l'ordre de 0 NTU. Cette technique peut conduire cependant à une perte de R-amylases qui s'adsorbe à la membrane. Cependant, cette perte est négligeable en regard de la quantité présente initialement dans les fractions solubles. 25 De manière facultative, cette étape de clarification peut être précédée d'une étape de floculation des particules colloïdales, par toute technique connue par ailleurs de l'homme du métier, comme il sera exemplifié ci-après. Comme il sera exemplifié, et de manière surprenante et 30 inattendue, la préparation ainsi clarifiée présente une qualité telle qu'il est possible de l'utiliser en tant que telle, sans traitement complémentaire, comme source d'enzymes destinées à la préparation de sirops riches en maltose. De manière optionnelle, soit pour disposer d'une 35 préparation débarrassées des sels résiduels contaminants, ou pour concentrer ladite préparation en R-amylases, il est choisi de réaliser une ultrafiltration desdites fractions solubles clarifiées de manière à obtenir un rétentat d'ultrafiltration contenant la R-amylase et un perméat d'ultrafiltration (l'ultrafiltration sera ainsi soit utilisée en dialyse, soit en concentration). Plus particulièrement, la société Demanderesse recommande de réaliser l'ultrafiltration à l'aide de membrane présentant un seuil de coupure de 10.000 Da à 50.000 Da, de préférence un seuil de 30.000 Da. Les solubles sont ultrafiltrés sur un module équipé de membranes polysulfonées d'un seuil de coupure de 30.000 Da en cassettes à l'échelle laboratoire et membranes spiralées polysulfonées d'un seuil de coupure de 30.000 Da à l'échelle pilote. L'enzyme se concentre dans le rétentat au fur et à mesure 15 du Facteur de Concentration Volumique (FCV). Pour 10 litres d'une solution de départ dosée à 22 °DP/ml, on obtient pour un FCV de 5, deux litres de rétentat à 110 °DP/ml et huit litres de perméat ne présentant pas de pouvoir diastasique. 20 Une dernière étape du procédé conforme à l'invention peut consister, dans le cas où l'étape d'ultrafiltration est mise en oeuvre, à mélanger le perméat d'ultrafiltration avec les insolubles et colloïdes de l'étape b) de manière à récupérer la fraction soluble des plantes amidonnières sans sa composante R-25 amylase. Ce mélange rejoint les fractions solubles non traitées de l'amidonnerie. Contre toute attente, et comme il sera exemplifié ci-après, la qualité de la préparation de R-amylases ainsi obtenue (uniquement clarifiée ou clarifiée puis ultrafiltrée) est telle 30 qu'elle permet la production d'un sirop à haute richesse en maltose, classiquement obtenue à l'aide de R-amylases pures. Exemple 1 : Obtention d'une première préparation de R- amylases à partir de solubles de blé - Echelle laboratoire 35 En amidonnerie de blé, on prélève 60 litres de fractions solubles à l'entrée de l'évaporateur des solubles, étape classiquement mise en oeuvre pour l'alimentation du bétail après concentration, commercialisé par la société Demanderesse sous le nom de CORAMI�. Ces fractions solubles présentent un pH de 4 et une activité R-amylasiques de l'ordre de 25 °DP/ml. On centrifuge ces 60 litres sur centrifugeuse à assiettes de type débourbeuse SA1 commercialisée par la société WETPHALIA, 10 à un débit de 40 litres/heure. 45 litres de surnageant de la centrifugation sont récupérés. On mesure une turbidité de 60 NTU. On les filtre ensuite sur un filtre à plaque chambrée de laboratoire de type CHOQUENET de 56 cm2, filtre à toiles 15 préalablement chargé avec des celluloses de type CLAR 0 CEL 13/6 (CECA) et VITACEL L10 (J.RETTENMAIER UND SOHNE). On effectue également un nourrissage continu avec ces celluloses à raison de lg/L. On récupère 40 litres de filtrat d'une turbidité de 8 NTU 20 et d'une activité R-amylasique de 22 °DP/ml. Le filtrat est ensuite ultrafilté sur un module de laboratoire MILLIPORE avec 0.18 m2 de membranes. On récupère 39.5 litres de filtrat ultrafiltré concentré d'un facteur de 75 et présentant une activité R-amylasique 25 comprise entre 1500 et 1600 °DP/ml. La préparation de R-amylases ainsi obtenue est alors stockée à + 4°C. Exemple 2 : Obtention d'une première préparation de R-30 amylases à partir de solubles de blé - Echelle laboratoire avec floculant En amidonnerie de blé, on prélève 120 litres de fractions solubles à l'entrée de l'évaporateur des solubles. 35 On ajuste le pH à une valeur de 5,5 à 6 avec de la soude à 5 o. 25 On traite ensuite avec 20 ppm de Fei+ et 25 ppm de floculant anionique FLOPAM AN 923 PWG (SNF) de type polymérique de manière à floculer les particules insolubles et colloïdales. Les fractions solubles ainsi traitées sont ensuite centrifugées dans les conditions de l'exemple 1 à un débit de 40 litres /heure. 90 litres de fractions solubles ainsi centrifugés sont obtenus. Ils présentent une turbidité de l'ordre de 17 NTU et une activité R-amylasique est de 21 °DP/ml. De la même manière que dans l'exemple 1, cette fraction subit une filtration fine sur filtre à plaque chambrée. On obtient 80 litres d'une solution présentent une turbidité de 5 NTU. On ultrafiltre également sur un module de laboratoire 15 MILLIPORE avec 0.18m2 de membranes d'un seuil de coupure de 30 kDa. On récupère 79 litres de filtrat ultrafiltré concentré d'un facteur de 80 et présentant une activité R-amylasique comprise entre 1500 et 1600 °DP/ml. 20 La préparation de R-amylases ainsi obtenue est alors stockée à + 4°C. Exemple 3 : Obtention d'une première préparation de 13-amylases à partir de solubles de blé - Echelle Pilote L'essai Pilote consiste en un essai où 10 m3 de fractions solubles de blé sont prélevées et préparées comme dans l'exemple 2. Les particules insolubles et colloïdales sont éliminées par 30 centrifugation sur un équipement de type NA7 en mode de fonctionnement auto débourbage. On récupère 7 m3 de surnageant présentant une turbidité de 22 NTU. Ce surnageant est en ensuite filtré par filtration frontale 35 sur un filtre AMAFILTER 0.3 m2 chargé avec les celluloses préalablement définies. On le nourrit avec 1 g/1 de celluloses. Une fois filtrée, la solution présente une turbidité de 5 NTU. On l'ultrafiltre sur un équipement constitué de membranes spirales polysulfonées d'un seuil de coupure de 30 kDa. On obtient alors 75 litres de rétentat présentant une activité R-amylasique d'environ 2000 °DP/ml. Pour stabiliser l'enzyme, on ajoute 50 Kg de sorbitol poudre commercialisés par la société Demanderesse sous le nom de marque NEOSORB� à 99.5 de matière sèche. La préparation finale présente alors une activité R- amylasique de 1550 °DP/ml. Exemple 4 : Obtention de la préparation de R-amylases à partir de solubles d'orge On ajoute dans un pétrin 100 kg de farine d'orge et 72 litres d'eau de façon à obtenir une pâte dure. Après 30 minutes de repos à température ambiante, la pâte est lavée à contre-courant dans un tamis rotatif réalisé par la société demanderesse avec de l'eau de manière à séparer l'amidon du gluten. On recueille 200 litres d'une suspension d'amidon que l'on tamise sur un premier tamis vibrant de 100 pm, puis un second de 63 pm, pour éliminer les fibres, les gommes et le gluten résiduel. Le filtrat est ensuite centrifugé à fort débit (200 L/h) sur un décanteur centrifuge commercialisé sous le nom de SEDICANTEUR par la marque FLOTTWEG de manière à isoler les amidons A (gros granule) dans le concentrât et les amidons B (petit granule) dans le surnageant. L'overflow de suspension d'amidon B est à nouveau centrifugé sur la séparatrice à assiette SA1 débourbeuse à débit réduit (40 L/h) de manière à isoler les amidons B dans le concentrât, et les fractions solubles dans le surnageant. 60 litres du surnageant ainsi récupérés présentent une turbidité de 120 NTU et sont floculés suivant l'exemple n°2. On centrifuge sur la centrifugeuse débourbeuse précédente à 40L/h et on récupère 40 litres de fraction soluble présentant une activité (3-amylasique de 28 °DP/ml et une turbidité de 21 NTU. Cette fraction soluble est filtrée sur un filtre à plaque chambrée préalablement chargé avec des celluloses de type CLAR 0 CEL 13/6 (CECA) et VITACEL L10 (J.RETTENMAIER UND SOHNE). La fraction soluble a été nourrie avec 1 g/1 de celluloses. 40 litres de filtrat présentant une turbidité de 6 NTU et une activité (3-amylasique de 27 °DP/ml sont ainsi obtenus. On ultrafiltre sur module de laboratoire MILLIPORE avec 0.18m2 de membranes 30 KD, décrit dans l'exemple 2. On obtient finalement 0,6 litres d'une solution d'enzymes concentrées présentant une activité (3-amylasique de 1700 °DP/ml. On la stabilise avec 400 g de sorbitol poudre commercialisés par la société Demanderesse sous le nom de marque NEOSORB� à 99.5 de matière sèche. La préparation enzymatique présente alors une activité 13-amylasique de 1400 °DP/ml. Exemple 5 : Obtention de sirops riches en maltose avec en témoin une (3-amylase purifiée commerciale. a) obtention du sirop de maltose par l'action de la R-amylase seule On réalise en laboratoire une saccharification comparée à l'aide d'une (3-amylase purifiée commerciale de la société GENENCOR (OPTIMALT BBA) et à l'aide de la préparation de 13-amylases conforme à l'invention, préparée selon l'exemple 1. On ajoute la (3-amylase à la concentration de 4 sur une solution d'amidon liquéfié à 30 de matière sèche, présentant un taux de Dextrose Equivalant de 6. Les doses sont volontairement élevées pour détecter la présence éventuelle d'activités enzymatiques parasites. La réaction est menée à une température de 58°C et à pH 5 pendant 24 heures. Les résultats sont exprimés en % de monomères et d'oligomères de glucose générés par l'action (3-amylasique, oligomères de degré de polymérisation égal à 2 et plus, déterminés par Chromatographie Liquide Haute Pression de type sodium. Les DP2 correspondent au maltose, les DP1 au glucose et DP3 au maltotriose. DP > 3 DP3 DP2 DP1 solution de départ (t = 0) 96, 5 1, 5 1, 2 0, 3 (3-amylase GENENCOR 44 5,3 49,9 0,4 (t = 24h) 3-amylase exemple 1 42,6 5,7 51,4 0,4 (t = 24h) Les résultats démontrent que la préparation de (3-amylases conforme à l'invention peut se substituer efficacement la 13-amylase commerciale. b) obtention d'un sirop riche en maltose par l'action d'une préparation (3-amylasique combinée avec une pullulanase et une maltogénase en laboratoire. Les essais sont réalisés dans les conditions précédente à la différence que l'on ajoute 2 enzymes simultanément à l'ajout de la préparation (3-amylasique. Il s'agit de la pullulanase PULLUZYME� commercialisée par la société ABM qui hydrolyse spécifiquement les liaisons alpha 1- 6 de l'amidon et de l'a-amylase maltogénique commercialisée par la société NOVOZYMES sous la dénomination MALTOGENASE� qui hydrolyse spécifiquement les DP3 en DP2 + DP1 (maltose + glucose). Ces enzymes sont également ajoutées dans des proportions de 4 pour mille. En témoin, on utilise comme source de (3-amylases une préparation (3-amylasique provenant d'un extrait de malt (= cocktail d'enzymes majoritairement composé de (3-amylase). DP SUP DP3 DP2 DP1 solution de départ (t = 0) 96,5 1,5 1,2 0,3 F3-amylase GENENCOR 7 2 85,3 5,5 (t = 24 h) (3-amylase selon l'exemple 1 7,2 1,5 85,5 5,2 (t = 24 h) 13-amylase extrait de malt T 6,3 3,3 83,3 7,0 (t = 24 h) Si le profil glucidique obtenu à partir de la (3-amylase purifiée ou de la préparation de (3-amylases conformes à l'invention sont équivalent, démontrant par la même l'excellent comportement de la dite préparation selon l'invention, celui obtenu à partir d'extrait de malt produit une teneur en glucose bien supérieur. c) obtention d'un sirop riche en maltose par l'action d'une préparation (3-amylasique combinée avec une pullulanase et une 15 maltogénase à l'échelle industrielle. Pour réaliser l'essai industriel, on utilise la préparation de l'exemple n°3. La saccharification est réalisée sur 200 m3 d'une solution 20 d'amidon liquéfié à 30 % de matière sèche, présentant un taux de Dextrose Equivalant de 6. La préparation de (3-amylase (1 pour mille sur sec), la pullulanase et la maltogénase sont ajoutées simultanément dans les conditions suivantes : pH 5, 55 °C. On obtient les résultats suivants après 66 heures (exprimés 25 en de DP générés - mesure effectuées par CLPHP sodium) . DP > 3 DP3 DP2 DP1 6 1,1 88,3 4,3 Ce sirop riche en maltose peut être purifié, hydrogéné et cristallisé pour obtenir un maltitol de qualité identique celui obtenu par les voies classiques. REVENDICATIONS1. Procédé d'obtention d'une préparation de R-amylases à partir de la fraction soluble des plantes amidonnières, 5 caractérisé en ce que l'on : a) choisit la fraction soluble des plantes amidonnières dans le groupe constitué des fractions solubles du blé, de la pomme de terre, du pois, de fève, de fèverole, du riz, de l'orge et préférentiellement du blé et de l'orge, 10 b) effectue une clarification desdites fractions solubles de manière à en éliminer les substances insolubles et les colloïdes, c) de manière optionnelle, réalise une ultrafiltration desdites fractions solubles clarifiées de manière à obtenir un 15 rétentat d'ultrafiltration contenant la R-amylase concentrée et un perméat d'ultrafiltration, d) récupère la R-amylase ainsi obtenue. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 20 qu'après l'étape c) d'ultrafiltration menée sur la fraction soluble clarifiée, on mélange le perméat d'ultrafiltration avec les insolubles et colloïdes de l'étape b) de manière à récupérer la fraction soluble des plantes amidonnières sans sa composante R-amylase. 25 3. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la clarification des solubles est effectué par filtration, au moyen d'une technique choisie dans le groupe constitué de la filtration frontale, de la filtration sous 30 pression et de la filtration sous vide. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la filtration sous vide est effectuée à l'aide de filtres à bandes ou de filtres rotatifs. 35 5. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la clarification est effectuée par centrifugation. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la centrifugation est réalisée à l'aide d'une centrifugeuse à assiettes de type séparateur à buses ou de type auto-débourbeur, ou d'une centrifugeuse à assiettes de type séparateur à buses vortex haute performance. 7. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la clarification est effectuée par filtration tangentielle membranaire. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la filtration tangentielle membranaire est une microfiltration d'un seuil de coupure compris entre 0,1 à 1 pm. 9. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'ultrafiltration est réalisée à l'aide de membrane présentant un seuil de coupure de 10.000 Da à 50.000 Da, de préférence un seuil de 30.000 Da. 10. Utilisation de la préparation de R-amylases telle 25 qu'obtenue selon le procédé d'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la préparation de sirops riches en maltose. 30