FR 2946756 A1 20101217 FR 0902885 A 20090612 Dosaqe en sana total d'un biomarqueur intracellulaire appartenant à une voie de signalisation cellulaire ù Utilisation pour mesurer l'activation d'une population cellulaire déterminée L'invention concerne une méthode de dosage in vitro d'un biomarqueur intracellulaire impliqué dans une voie de signalisation cellulaire, réalisée sur un échantillon de sang total. L'invention concerne également l'utilisation de cette méthode pour mesurer l'activation de cellules d'une population cellulaire déterminée contenues dans l'échantillon de sang. La demande concerne l'exploration des processus physiologiques susceptibles de se manifester par l'activation de cellules présentes dans le sang. Ces cellules peuvent être des cellules naturellement présentes dans le sang ou des cellules se trouvant dans la circulation sanguine en conséquence d'un état physiologique particulier, notamment d'un état pathologique. On a observé que l'activation cellulaire s'accompagne de la modification de l'état de certaines protéines intracellulaires, et en particulier de la modification de l'état de phosphorylation de protéines appartenant à une voie de la signalisation cellulaire. L'invention concerne l'analyse de ces protéines et de leur état de phosphorylation, en tant que biomarqueurs de l'activation d'une population cellulaire. La demande vise donc une méthode de dosage dans laquelle la protéine intracellulaire impliqué dans une voie de signalisation cellulaire, en particulier dans la transduction du signal, est une protéine dont l'expression est régulée par la phosphorylation. La protéine dont l'état de phosphorylation est observé est donc un biomarqueur de l'activation cellulaire et en conséquence de l'activité cellulaire. Une application particulière de la méthode de dosage de l'état de phosphorylation d'une protéine intracellulaire selon l'invention, concerne le suivi d'agents agonistes ou d'agents antagonistes de l'activation cellulaire de populations cellulaires présentes dans un échantillon de sang total. Une telle application peut notamment contribuer au suivi thérapeutique de patients ou être utile pour le criblage de drogues. La demande se rapporte en particulier dans ce contexte à l'exploration de l'hémostase et notamment de la coagulation sanguine, à partir de l'observation de l'activation de populations cellulaires contenues dans des échantillons de sang total. L'activation cellulaire est en effet un processus se manifestant lors du déclenchement des réactions conduisant à la coagulation du sang. En particulier, l'activation des plaquettes du sang observée à la suite de leur adhésion in vivo aux structures sous-endothéliales ou de l'action d'un stimulus externe in vitro (ADP, thrombine, collagène...) peut conduire à leur agrégation et dans ces conditions, permettre aux réactions de la cascade de la coagulation de se dérouler efficacement en permettant la formation d'un thrombus du fait de la stabilisation de l'agrégat plaquettaire par le réseau fibrillaire. L'invention est donc plus particulièrement applicable à l'analyse de l'état de phosphorylation d'une protéine intracellulaire exprimée dans les plaquettes (thrombocytes) contenues dans un échantillon de sang total, afin de déterminer l'état d'activation desdites plaquettes et plus généralement de contribuer à l'exploration de l'activité plaquettaire. L'invention est particulièrement utile dans le domaine médical lié aux maladies du système vasculaire notamment pour la recherche de substances actives, ou le suivi de substances efficaces dans la prévention ou le traitement des maladies du système vasculaire. Une application particulière de la méthode de l'invention consiste ainsi à réaliser le suivi de la réponse des plaquettes à des antiagrégants plaquettaires connus ou potentiels. Ainsi, la méthode de l'invention permet par exemple le dépistage des résistances biologiques ou autres à des antiagrégants plaquettaires, l'adaptation des posologies des antiagrégants plaquettaires administrés à un patient, ou contribue à déterminer s'il y a lieu de décider de l'interruption ou de la poursuite d'un traitement thérapeutique. Dans le cadre du dosage de l'état de phosphorylation d'une protéine intracellulaire exprimée dans les plaquettes, les pathologies dont le diagnostic ou le suivi y compris pour l'identification de composés pour leur traitement ou leur contrôle, sont susceptibles de bénéficier des moyens de l'invention sont notamment les syndromes coronariens aigus conséquence de l'athérosclérose coronarienne, tels que l'infarctus du myocarde, la thrombose coronarienne, l'occlusion coronarienne, les accidents vasculaires cérébraux d'origine ischémique, le diabète de type Il, la drépanocytose... L'activation des plaquettes est une conséquence du déclenchement du processus thrombotique suivant par exemple une lésion vasculaire ou une rupture d'une plaque d'athérome. Les plaquettes activées adhèrent à la paroi vasculaire puis s'agrègent réversiblement puis irréversiblement, conduisant à la réparation physiologique de la lésion de l'endothélium vasculaire ou, dans une situation pathologique, à l'obstruction du vaisseau. Parmi les partenaires moléculaires mis en évidence dans le processus de l'activation plaquettaire, et intéressants dans le cadre de la réalisation de l'invention, on a observé le rôle du nucléotide ADP (Adénosine Diphosphate), libéré par les granules denses des plaquettes, après avoir été sécrété dans les cellules endommagées, ou en réponse à des facteurs de la coagulation tels que la thrombine. La stimulation par l'ADP des plaquettes conduit à la formation d'agrégats plaquettaires instables. Un des récepteurs plaquettaires à l'ADP est un récepteur de type P2 purinergique désigné P2Y12 (Hollopeter G. et al, Nature 2001 : 409: 202-7), responsable de l'activation sélective de certaines voies (cascades) de la transduction du signal intracellulaire. Le récepteur P2Y12 est responsable de la stabilité des agrégats plaquettaires formés. L'activation des plaquettes peut être stimulée par des agonistes physiologiques tels que les prostaglandines (PGE) en particulier la prostaglandine PGE1, ou la PGE2, par les prostagrandines PGI telles que PGI2 ou encore les PGD telle que la PGD2. L'activation plaquettaire par la PGE1 active la phosphorylation de la protéine VASP (Vasodilator-stimulated phosphoprotein). La phosphorylation de VASP se produit au niveau de la sérine 239 (dans la séquence publiée dans NCBI sous le numéro d'accession NP003361.1 dans la version du 10 mai 2009), dans une mesure proportionnelle à la concentration intracellulaire d'AMPc (cyclic adenosine monophosphate) lorsque l'activation est initiée par PGE1 par exemple et/ou de GMPc (cyclic guanosine monophosphate) lorsque l'activation est initiée par des composés donneurs de NO (oxyde nitrique) par exemple. Les concentrations intracellulaires en AMPc ou en GMPc sont régulées par l'action concertée de l'adénylyl cyclase et de la guanylyl cyclase respectivement et des phosphodiestérases. Les kinases sont des enzymes clés de la régulation de l'activation cellulaire. Ces kinases sont nombreuses et responsables de la phosphorylation des protéines membranaires ou intracellulaires par transfert de groupes phosphates de l'ATP vers les résidus sérine, thréonine ou thyrosine de substrats protéiques. Cette modification post-traductionnelle régule un grand nombre d'activités du cycle cellulaire et une phosphorylation anormale peut être en cause dans de nombreux états pathologiques. Certaines kinases sont les cibles directes ou indirectes de molécules actives biologiquement, notamment de substances actives entrant dans la composition de médicaments, ou candidates pour la définition de principes actifs thérapeutiques ou de molécules d'intérêt diagnostic. Parmi elles figurent les kinases AKT (parfois appelé PKB), ERK, JAK2, BRC-ABL (présents principalement dans certaines cellules tumorales leucémiques), PKA, PGK. En conséquence, dans le cadre de l'invention, des kinases ou des protéines intracellulaires formant des substrats de ces kinases peuvent se révéler être des biomarqueurs intéressants pour suivre l'évolution de l'activité des kinases. La protéine VASP des plaquettes est un substrat de certaines de ces kinases, en particulier de PKA (cAMP-dependant protein kinase) et PKG (cGMP-dependant protein kinase). VASP joue un rôle pivot dans la régulation du dynamisme du cytosquelette plaquettaire et est considérée dans ce cas précis comme un biomarqueur de l'activité de la pKA et/ou de la PKG, mais également de toute la cascade de la signalisation cellulaire se trouvant en amont. Par ailleurs, la phosphorylation de la protéine VASP est également contrôlée par une autre molécule du sang circulant, le nucléotide ADP. Lorsque I'ADP interagit avec le récepteur plaquettaire P2Y12, ce dernier est occupé et en conséquence, la phosphorylation de la protéine VASP (Vasodilator-stimulated phosphoprotein) induite par des agonistes physiologiques est inhibée ou limitée. L'inhibition ou la limitation / modification de la phosphorylation de VASP comprend la déphosphorylation, totale ou partielle, de la protéine VASP préalablement induite par un agoniste de la phosphorylation, ou la prévention, totale ou partielle, de ladite phosphorylation. La protéine AKT est une kinase dont l'expression enzymatique est directement dépendante de l'état de phosphorylation de l'acide aminé Ser 473 (sérine en position 473 dans la séquence identifiée dans la base NCBI sous le numéro d'accession NP001014431.1 dans la version du 22 mai 2009), de son site actif. AKT est aussi considérée comme un médiateur cellulaire ou une protéine de la signalisation cellulaire. Dans la plaquette, l'activation par la thrombine du récepteur PAR-1 à la thrombine induit la phosphorylation d'AKT. De même l'activation par l'ADP du récepteur P2Y12 semble également induire la phosphorylation de l'acide aminé Ser 473. En conséquence, l'état de phosphorylation de la sérine 473 est considéré comme un biomarqueur de l'état du récepteur à la thrombine (PAR-1) ou du récepteur à l'ADP, P2Y12. II est donc important de mesurer l'état d'activation de populations cellulaires du sang et en particulier des plaquettes dans le sang de patients présentant un risque de pathologie vasculaire, ou de patients atteints par de telles pathologies, et également chez des patients traités pour de telles pathologies, en particulier pour évaluer l'interférence de substances actives administrées sur le processus d'activation des plaquettes. Il est également important de mesurer l'état d'activation des plaquettes dans des échantillons de sang total, pour tester des substances candidates pour la conception d'agonistes ou d'antagonistes de l'activation des plaquettes, en particulier par interaction spécifique avec des récepteurs plaquettaires. L'invention propose des moyens à cet effet, qui s'appuient sur l'observation de la phosphorylation de protéines intracellulaires exprimées dans les plaquettes. Des moyens ont d'ores et déjà été décrits dans l'art antérieur pour analyser l'activation des plaquettes en déterminant des modifications de l'état de phosphorylation de protéines intracellulaires exprimées dans les plaquettes. Le kit désigné PLT VASP/P2Y12 de la société Biocytex (Marseille France) propose par exemple un test in vitro réalisé sur des échantillons de sang total et consistant à déterminer l'état d'activation des plaquettes en mesurant l'état de phosphorylation de la protéine intracellulaire VASP (Vasodilator-stimulated phosphoprotein). Dans le cadre de ce test, la mesure de la phosphorylation de la protéine VASP est opérée par une analyse en cytométrie en flux, en double couleur pour comparer les deux conditions de tests (une partie de l'échantillon est soumise à une activation de VASP au moyen de la protaglandine PGE1 et une autre partie est soumise à une activation par PGE1 et ADP). La lecture de l'analyse se fait par détection de la fluorescence et le calcul d'un index de réactivité plaquettaire. L'analyse cytométrique en flux nécessite d'isoler sur le cytogramme, le nuage cellulaire incluant les plaquettes, afin de prévenir l'interférence d'autres groupes cellulaires du sang ou des débris cellulaires, avec la mesure. La détermination des conditions de réalisation de l'analyse cytométrique et la mise en oeuvre de cette analyse peuvent donc représenter une source de difficulté. L'invention propose une alternative à la réalisation de l'analyse cytométrique en sang total, de l'état de phosphorylation de protéines intracellulaires et en particulier de la protéine VASP plaquettaire. Selon cette alternative, l'analyse est effectuée au moyen d'un test immunoenzymatique de type ELISA. Pour ce faire, les inventeurs ont déterminé des conditions d'activation et aussi 10 d'inhibition des plaquettes en sang total, aptes à permettre une mesure spécifique de l'activation des plaquettes médiée par un récepteur plaquettaire déterminé. Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont donc défini un test qui permet de s'écarter des principes biochimiques et cellulaires, suivant lesquels dans une 15 analyse ELISA la mesure du signal consécutif à l'activation d'un récepteur se fait toujours à partir d'une population cellulaire homogène séparée des autres composants et cellules de l'échantillon, ou dont on vérifie qu'elles sont la seule cible de l'analyse (par exemple : lignée cellulaire tumorale en culture ou lymphocytes purifiés ou isolés à partir du sang). 20 En s'affranchissant de cette nécessité, les inventeurs ont donc montré que les raisons qui restreignent l'utilisation des tests de monitoring de l'activité plaquettaire à la préparation préalable d'un PRP (plasma riche en plaquettes) peuvent être surmontées. La présente invention concerne une méthode pour le dosage par ELISA réalisé sur un échantillon de sang total, de l'état d'activation cellulaire d'une population déterminée de cellules de l'échantillon, comprenant la détermination de l'état de 25 phosphorylation d'une protéine intracellulaire impliquée dans la cascade de la signalisation cellulaire (biomarqueur). L'invention propose donc des moyens de détermination dans une analyse en ELISA de l'état de phosphorylation de protéines intracellulaires exprimées dans une population cellulaire déterminée au niveau d'un échantillon de sang total, en particulier au niveau des plaquettes. L'une des protéines intracellulaires ainsi utilisée comme marqueur de l'état d'activation des plaquettes est la protéine VASP. Une autre de ces protéines est la protéine AKT. On appelle échantillon de sang total dans le cadre de la présente demande, un échantillon de sang prélevé chez un sujet humain ou animal, qui est non fractionné préalablement à la mise en oeuvre de la méthode de l'invention. Le volume de l'échantillon de sang pour réaliser le dosage de l'invention est avantageusement limité, par exemple de l'ordre de 80pl répartis en deux parties aliquotes. Lorsque l'échantillon de sang est prélevé chez le sujet, il est important de choisir des conditions permettant de maintenir l'intégrité de la population cellulaire dont on veut déterminer l'état d'activation, par exemple en évitant l'agitation de l'échantillon et les chocs thermiques. En particulier, l'intégrité des plaquettes doit être préservée. Le test ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) selon l'invention met en oeuvre des conditions de réalisation décrites dans les paragraphes qui suivent et plus en détail dans les exemples. II suit le principe bien connu de l'ELISA et peut être réalisé en mode manuel ou automatisé. Il peut s'agir d'un test qualitatif de détermination de l'état de phosphorylation d'une protéine d'un test semi-quantitatif lorsqu'il aboutit à la détermination de l'index de réactivité plaquettaire, ou d'un test quantitatif lorsqu'il inclut la mesure d'un standard calibré. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la population cellulaire dont l'activité est mesurée est la population des plaquettes. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la protéine intracellulaire dont on teste l'état de phosphorylation est une protéine de la famille des kinases ou est une protéine substrat de kinase. Ainsi, des protéines intracellulaires dont on détermine l'état de phosphorylation en utilisant la méthode de l'invention sont par exemple choisies parmi les protéines substrats d'une kinase ou la kinase elle-même, choisie parmi les kinases PKA, PKG, AKT, ERK, JAK2, BCR-ABL. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la protéine intracellulaire dont 15 on teste l'état de phosphorylation est la protéine VASP ou STAT5. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la protéine intracellulaire dont on teste l'état de phosphorylation est choisie parmi AKT, p38, ERK. 20 Le dosage ELISA selon l'invention requiert la formation d'un complexe immunologique entre la protéine biomarqueur ciblée pour déterminer son état de phosphorylation et un anticorps reconnaissant spécifiquement cet état phosphorylé de ladite protéine. La reconnaissance est dite spécifique lorsque l'anticorps considéré reconnaît la protéine en question dans l'état phosphorylé en 25 cause et ne reconnaît pas significativement cette même protéine dans un état non phosphorylé. L'anticorps reconnaît également essentiellement la protéine en question dans l'état phosphorylé en cause et ne reconnaît pas significativement d'autres protéines contenues dans l'échantillon traité. 30 Le test ELISA selon l'invention peut être réalisé en une ou en deux étapes. Lorsqu'il est réalisé en deux étapes (suivant un mode connu standard), l'échantillon de sang traité est mis dans un premier temps en contact avec un anticorps (anticorps de capture) reconnaissant spécifiquement la protéine intracellulaire testée indifféremment de son état de phosphorylation. Ensuite l'antigène capturé est révélé par mise en contact avec un anticorps (anticorps de révélation) reconnaissant spécifiquement la protéine intracellulaire testée dès lors qu'elle est sous forme phosphorylée. Lorsqu'il est réalisé en une étape, la protéine intracellulaire testée est mise en contact avec l'anticorps de révélation simultanément dans le puits contenant 10 l'anticorps de capture. Des anticorps dépendant de l'état de phosphorylation ou spécifiques de cet état de phosphorylation ont été obtenus pour diverses protéines par exemple en utilisant la technique décrite par Czernik A.J. et al (1991) Methods Enzymol. 201 : 15 264. On peut, pour ce faire, immuniser des animaux, par exemple des lapins, avec des protéines phosphorylées ou des phosphopeptides synthétiques représentant la séquence d'acides aminés encadrant le site de phosphorylation considéré dans la protéine cible. Ces peptides doivent être suffisants pour constituer un épitope. Ces peptides peuvent par exemple comprendre de 6 à 20, de 6 à 15 de 20 préférence de 6 à 10 résidus d'acides aminés. On choisira de préférence parmi les anticorps générés ceux qui présentent une forte affinité et une bonne spécificité pour l'antigène constitué par la protéine phosphorylée. Pour la détection de la protéine VASP phosphorylée, la préparation d'anticorps 25 notamment d'anticorps monoclonaux est décrite dans le brevet européen EP 1 042 368. En particulier dans ce brevet, un anticorps monoclonal efficace est l'anticorps produit par l'hybridome 16C2 (clone 16C2) déposé à la Collection DSM sous le numéro d'accessibilité ACC2330. L'exemple 1 de ce brevet EP 1 042 368 décrit la récupération d'anticorps anti-VASP phosphorylée (P-VASP). 30 Dans le cadre de la présente invention d'autres anticorps anti-P-VASP peuvent être générés en utilisant la séquence peptidique KLRKVS239KQ ou la séquence RKVS239KQE. Des anticorps anti-P-VASP sont également disponibles dans le commerce. Outre l'anticorps décrit ci-dessus, on citera l'anticorps monoclonal de souris clone 4167 distribué par US Biological ou l'anticorps polyclonal de chèvre anti-VASP P Ser239 Santa Cruz sc-23507... Le cas échéant, l'ELISA est réalisé en mettant en oeuvre un second anticorps reconnaissant le premier anticorps, pour améliorer la spécificité. Par anticorps on entend un anticorps comprenant l'ensemble des chaînes lourdes et le cas échéant des chaînes légères, ou un fragment d'anticorps contenant ou constitué par le site de reconnaissance pour l'antigène cible, par exemple un fragment constitué par une chaîne lourde ou par l'association des chaînes lourdes, par exemple un fragment (Fab)'2 ou un fragment Fab. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la révélation de la formation du complexe immunologique est effectuée avec un substrat du marqueur de l'anticorps par exemple un substrat coloré ou un substrat fluorescent et comprend une étape de mesure de la densité optique. Un marqueur tel que la peroxidase peut être utilisé. La mesure de densité optique est par exemple mesurée à 450 nm notamment lorsque le marqueur de l'anticorps est une peroxidase. En particulier, l'invention permet de déterminer l'état de phosphorylation d'une protéine intracellulaire qui est un substrat plaquettaire de kinase tel que la protéine VASP phosphorylée à la position sérine 239, ou qui est une kinase telle que la protéine AKT phosphorylée à la position sérine 473, STAT5 phosphorylée à la25 position tyrosine 694, p38 phosphorylée à la position thréonine 180 ou tyrosine 182, ERK phosphorylée à la position thréonine 202 ou à la position tyrosine 204. Des anticorps spécifiques de la forme phosphorylée de ces protéines sont 5 disponibles dans le commerce ou peuvent être préparés par les méthodes citées dans la présente demande. Par exemple, les anticorps suivants sont disponibles : 10 Ac anti-p-Stat5 (Tyr694) de lapin, commercialisé sous les références Réf. : 9351 L PAb Cell Signaling, Clone C71 E5 MAb Cell Signaling, Clone C11 C5 MAb Cell Signaling ou sous les références : Clone 47 BD, Clone 5G4-MCF-7 Nanotools, Clone 14H2 Cell Signaling, Clone ST5P-4A9 Zymed, ou pour l'Ac-anti-p-Akt de lapin Clone 193H12 commercialisé par Cell Signaling. 15 Des anticorps reconnaissant la forme non phosphorylée de ces protéines, pou constituer des anticorps de capture) sont également disponibles dans le commerce : pour STAT5, on citera un anticorps de lapin (clone C-17 Pab Santa Cruz) ou un anticorps de souris (clone 89BD, clone ST5-8F7 Invitrogen, clone A-9 20 Santa Cruz), pour AKT un anticorps de lapin est distribué par Cell Signaling (clone 193H12), Pour ERK phosphorylée des anticorsp spécifiques sont par exemple commercialisés par Cell Signaling (ref clone 197G2), par Calbiochem (référence clone 12D4) ou par Lifesan Biosciences (référence LS-C16383). Pour p38 la société Cell signaling propose aussi des anticorps sous les références 9228, 25 9212, 9215...) ainsi que la société Santa Cruz sous la référence sc-7972 (p38 clone A-12 mouse Mab). Pour la réalisation de l'ELISA selon l'invention, l'échantillon de sang prélevé chez 30 un patient est traité de façon à prévenir la possibilité qu'il coagule. En particulier on y ajoute un agent anticoagulant habituel pour la réalisation des dosages in vitro effectués sur le sang, par exemple de l'héparine ou du citrate de sodium, tel que le trisodium citrate, par exemple le trisodium citrate 0,109M ou 0,129M suivant les proportions de 9 volumes de sang pour 1 volume d'anticoagulant. La méthode de dosage par ELISA selon l'invention comprend en particulier la mise en oeuvre des étapes suivantes : a) l'activation d'une partie aliquote de l'échantillon de sang total avec un premier composé, avantageusement un composé physiologique, agissant sur l'activité cellulaire d'une population de cellules déterminée dudit échantillon par l'activation de la phosphorylation d'une protéine intracellulaire déterminée, et l'activation d'une autre partie aliquote avec ledit premier composé et avec un deuxième composé inhibant ou modifiant ladite phosphorylation, par la voie d'une interaction avec un récepteur cellulaire ou par la voie d'une interaction avec une enzyme de la signalisation cellulaire, b) la lyse des cellules de l'échantillon activé dans des conditions permettant de préserver l'équilibre entre la protéine intracellulaire non phosphorylée et ladite protéine dans son état phosphorylé, ledit équilibre témoignant de l'activité cellulaire de ladite population de cellules déterminée de l'échantillon, c) le lavage pour éliminer les produits de lyse, d) l'incubation de l'échantillon traité avec une sonde de capture comprenant des anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine intracellulaire indifféremment de son état de phosphorylation, ledit anticorps étant une immunoglobuline de type IgG ou un fragment F(ab`)2 ou Fab, e) la révélation de la formation d'un complexe immunologique entre la protéine intracellulaire phosphorylée et l'anticorps de révélation reconnaissant spécifiquement cette protéine intracellulaire dans son état phosphorylé. Le dépôt des réactifs et de l'échantillon, est avantageusement réalisé dans les puits d'une microplaque. Le dépôt de l'échantillon et des réactifs est fait dans un puits unique sans besoin de transfert. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les étapes ci-dessus sont modifiées en ce que le deuxième composé est une substance dont on recherche l'effet d'inhibition ou de modification de l'état de phosphorylation qui est soit administrée au patient, exclusivement avant le prélèvement de l'échantillon, soit est mise en contact avec l'échantillon de sang total prélevé, avant l'activation ci- dessus décrite avec le premier composé physiologique. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape de révélation de la formation du complexe immunologique est suivie d'une étape de détermination de l'index de réactivité plaquettaire (PRI) qui peut être obtenu notamment quand le complexe immunologique est détecté par lecture de la densité optique attachée à la révélation du marqueur de l'anticorps : PRI = DO[C11û DO[C1+C21 DO[C1]-DO[Blanc] Où Cl = premier composé, par exemple activateur de phosphorylation C2 = deuxième composé, par exemple inhibiteur de phosphorylation. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode de dosage, la protéine intracellulaire dont on détermine l'état de phosphorylation est la protéine VASP et la population cellulaire dont on détermine l'activation est la population de plaquettes, une partie aliquote de l'échantillon étant activée avec un premier composé agoniste de phosphorylation de VASP, une autre partie aliquote de l'échantillon étant activée avec le même premier composé et en outre avec un deuxième composé interagissant avec un récepteur plaquettaire cible de substances testées pour leur activité biologique ou thérapeutique. Dans un autre mode de réalisation particulier de la méthode de dosage, l'agoniste physiologique de la phosphorylation de VASP est choisi parmi les prostaglandines activant l'adenylyl cyclase telles que PGE1, PGI2, PDG2 et les substances activant la guanylyl cyclase telles que les substances donneurs de NO (par exemple le SNP : Sodium nitroprusside) ou des peptides natiuritiques (ex ANP : Atrial Natriuretic Peptide ; BNP : B-type natriuretic peptide). Dans un mode de réalisation particulier, le composé inhibant ou modifiant la phosphorylation est une substance interagissant avec un récepteur des plaquettes tel que le récepteur P2Y12 stimulé par l'ADP par exemple une thiénopyridine telle que le clopidogrel ou la ticlopidine et/ou avec une enzyme de la signalisation cellulaire telle que l'adenylyl cyclase, la guanylyl cyclase, les phosphodiestérases telles que PDE2, PDE3 ou PDE5, les protéines kinases telles que PKA ou PKG. Les exemples qui suivent illustrent les résultats obtenus avec des substances ayant une activité sur la phosphorylation de protéines intracellulaires. Ces substances représentent les susdits deuxièmes composés, lorsqu'ils sont utilisés seuls ou en association avec un composé physiologique additionnel (par exemple l'ADP lorsque la voie de signalisation observée fait intervenir P2Y12). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode de dosage peut comprendre, outre les étapes ci-dessus définies, une étape de congélation, par exemple à -20°C ou à -80°C qui est effectuée après l'étape de lavage, pour conserver l'échantillon. Les inventeurs ont observé que l'échantillon peut être testé après avoir ainsi été conservé, sans altération de sa stabilité, et permet ainsi d'obtenir des résultats fiables après conservation par congélation jusqu'à plus de deux mois suivant la collecte. Les inventeurs ont aussi observé qu'en l'absence de congélation, les échantillons peuvent être testés jusqu'à 48 h après prélèvement, dans la mesure où la stabilité des plaquettes est préservée. Selon l'objectif du test, un composé dont on veut observer l'interaction avec l'activation plaquettaire (composé testé) peut, non pas être ajouté après le prélèvement de l'échantillon de sang comme indiqué dans les étapes ci-dessus par renvoi au � deuxième composé � mais avoir été administré au patient préalablement au prélèvement. Dans cette hypothèse, l'administration dudit deuxième composé peut soit n'avoir pas lieu sur l'échantillon de sang total prélevé si le composé testé interagit directement sur la voie impliquant la phosphorylation soit consister en l'administration d'un composé physiologique de la voie de signalisation cellulaire régulant la phosphorylation notamment lorsqu'il est nécessaire à la manifestation de l'activité du composé administré au patient. Lorsque le composé testé est un composé qui a été administré au patient, l'analyse selon l'invention peut être destinée à déterminer le niveau d'efficacité dudit composé ou la résistance du patient au traitement. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le dosage met en oeuvre un tampon de lyse qui comprend ou est constitué par le mélange suivant, ou encore par un mélange fonctionnellement équivalent : • de 2% à 0,02% en concentration finale de Sodium Dodécyl Sulfate (SDS), de préférence 0,2%, • de 5% à 0,2% en concentration finale de Triton X-100 (Octyl Phenoxy poly Ethoxy Phenol), de préférence 2%, • de 1% à 0,004% en concentration finale d'un agent microbicide à large spectre du type d'un microbicide contenant à titre de principes actifs du 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one et 2-méthyl-4- isothiazolin-3-one, de préférence 0,04%. Un mélange fonctionnellement équivalent peut être préparé en remplaçant le SDS par un autre détergent anionique tel que le cholate ou le déoxycholate, et/ou en remplaçant le Triton X-100 par un autre détergent non ionique tel que le Nonidet P-40 ou le Tween 80. Les détergents ioniques et non ioniques peuvent être utilisés dans des concentrations de 5% à 0,005%. Un agent microbicide approprié pour réaliser le tampon de lyse selon l'invention est le ProClin � (Rohm and Haas Company), ProClin 150 ou ProClin 300. Il peut être remplacé par un autre agent à large spectre, capable d'inhiber la croissance des microorganismes et de provoquer la mort des cellules. Avantageusement, pour la réalisation de l'ELISA, toutes les étapes d'incubation sont réalisées à température ambiante ou à une température de 37°C et l'étape de lyse est réalisée pendant une durée de 1 à 30 minutes, de préférence 10 minutes, à température ambiante, ou à une température de 37°C. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les figures 15 et dans les exemples. Figure 1: schéma simplifié de la voie (cascade) de régulation de la phosphorylation de VASP. Figures 2 à 8 : Effet de différentes substances actives sur l'activationplaquettaire, 20 par l'intermédiaire d'une interaction avec la voie de phosphorylation de protéines intracellulaires Figures 9, 10: Etude de la stabilité plaquettaire avant traitement ou après traitement, lyse et congélation. Figure 11 : Résultats lorsque l'ELISA est effectué en une ou deux étapes. 25 Exemples 1. Analyse de l'activation plaquettaire par la phosphorylation de la protéine VASP dans un test ELISA en sang total pour mettre en évidence l'influence de l'activation du récepteur P2Y12 sur l'état de phosphorylation de VASP 30 Même s'il est parfaitement établi que dans les plaquettes, la phosphorylation de VASP (pVASP) peut être le miroir de l'état d'activation du récepteur fonctionnel ADP (P2Y12), les conséquences de la lyse de toutes les cellules sanguines (globules rouges + leucocytes) contenues dans le sang total sur l'activation plaquettaire médiée par le P2Y12 n'ont jusqu'à présent pas été documentées. En particulier, la libération dans le milieu des enzymes impliquées à tous les niveaux de la signalisation compris entre le récepteur (par exemple : P2Y12) et un substrat susceptible d'être phosphorylé constituant un biomarqueur (par exemple : VASP), peut potentiellement perturber l'équilibre biomarqueur biomarqueur phosphorylé [par exemple : VASP pVASP ou tout autre biomarqueur de la signalisation tel que AKT, STAT5, p38, ERK, etc...). Parmi les enzymes ubiquitaires relarguées dans le milieu par l'action de la lyse cellulaire, les protéines kinases (PKA, PKG) et les phosphatases sont responsables de la phosphorylation de VASP ou de sa déphosphorylation. II est donc directement attendu que l'action de ces enzymes peut modifier l'équilibre [pVASP c* VASP] directement au cours de l'étape de lyse cellulaire, altérant dès lors la pertinence des résultats de la mesure. L'analyse ELISA a donc été conçue par les inventeurs de façon à : 1/ - Figer l'activité des enzymes cellulaires relarguées dans le milieu, concomitamment à la lyse cellulaire. 2/ - Rendre inefficace l'effet des nucléotides (ADP, ATP, AMP, AMPc, GMP, GMPc, etc...) libérés sous l'action de la lyse cellulaire. A titre d'exemple, il est bien connu que les globules rouges sont des réservoirs à ADP, pouvant avoir un impact immédiat sur l'activation cellulaire et des plaquettes en particulier. Les inventeurs ont observé qu'il est possible de surmonter ces risques d'interférence dans l'analyse comme l'illustrent l'analyse ELISA conçue dans le cadre de la présente demande et en particulier l'exemple qui suit. Protocole de mise en oeuvre sur plaque de mircopuits Pour l'analyse ELISA de l'état de phosphorylation de VASP sous le contrôle de l'activateur PGE1 et du récepteur P2Y12 activé par l'ADP, les étapes et conditions suivantes ont été mises en oeuvre. 1. Le sang a été prélevé dans des tubes à prélèvement contenant un anticoagulant tel que le Citrate de Na (0,109M ou 0,129M) ; 2. a) Le cas échéant, on a déposé un composé dont l'interaction avec l'activité plaquettaire est testée, dans une partie des puits contenant l'échantillon de sang total. 2. b) L'activateur PGE1 ou PGE1+ADP (40 pl) a été déposé dans les puits correspondants des microplaques ; 3. Le sang (40 pl) a été ajouté puis on a agité par une série d'aspirations / refoulements ; 4. Le mélange a été incubé 10 min à température ambiante ; 5. Le Tampon de lyse (100 pl) a été ajouté dans les puits contenant le sang activé et l'ensemble a été agité par une série d'aspirations / refoulements. On a déposé également du Tampon de lyse (180 pL) dans les puits � blancs � ; 6. Le milieu de réaction a été incubé 30 min à température ambiante ; 7. Puis on a lavé 3 fois la plaque avec la Solution de lavage diluée (3 x 300 pL, fournie concentrée 20X ; 8. La sonde peroxidase comprenant l'anticorps anti-pVASP concentrée 20X a été diluée dans du Tampon de dilution ; 9. La Sonde peroxidase diluée a été déposée dans tous les puits (200 pl) ; 10.On a Incubé 30 min à température ambiante ; 11. La a été lavée trois fois avec la Solution de lavage diluée (3 x 300 pL, fournie concentrée 20X) ; 12. Le substrat TMB de révélation a ensuite été déposé dans tous les puits (200 pL) ; 13.On a incubé 5 min à température ambiante ; 14. puis on a ajouté la Solution d'arrêt dans tous les puits (100 pL) ; 15. et on a laissé reposer la plaque quelques minutes. 16. La D0450nm a été mesurée au moyen d'un lecteur de plaques 17. Le � Platelet Reactivity Index � a été calculé d'après la formule suivante : PRI= D0450nm PGE1 ù D0450nm PGE1 + AD D045onm[PGE1 ] û DO45onm[Blanc] La composition des réactifs utilisés dans le protocole est la suivante : 1. Plaque ELISA : 15 Plaque NUNC � Maxisorp � coatée avec un F(ab')2 anti-VASP total (clone 1E273) d'immunoGlobe, Allemagne (http://www.immunoglobe.com) 2. Activateur PGE1 lyophilisé : Prostaglandine El (5 pM) de Carbomer (http://www.carbomer.com) 20 + Excipients 3. Activateur PGE1+ADP lyophilisé : Prostaglandine El (5pM) de Carbomer (http://www.carbomer.com). On peut modifier la molarité dans l'intervalle 5pM-5mM. + ADP (20 pM) de Sigma (http://www.sigmaaldrich.com). On peut modifier la molarité dans l'intervalle 5pM-5mM. + Excipients 30 4. Tampon de Lyse Tampon PBS contenant : 25 o 2% de Triton X-100 (Sigma, http://www.sigmaaldrich.com). La concentration peut être modifiée dans une gamme de 0.002%- 10% o 0.2% de SDS (Sigma, http://www.siqmaaldrich.com). La concentration peut être modifiée dans une gamme de 0.0002 % - 10 0/0 o 0.4 % de Proclin300 (Sigma, http://www.sigmaaldrich.com). La concentration peut être modifiée dans une gamme de 0.000002 % - 10 % 5. Solution de lavage 20X COMPOSE CONCENTRATION en g/I Sodium Di-Hydrogénophosphate, 2H2O 31,13 Sodium Chlorure 174,90 Tween 20 19,95 Nipagine A 0,998 Gentamycine Sulfate 0,075 Light Green SF Yellowish 0,695 Acide chlorydrique Non quantifiables (pour ajuster le pH) Sodium Hydroxyde pH final = 6,65 � 0,05 15 Densite finéle : 1,14 6. Tampon de dilution Tampon de dilution prêt à l'emploi quantités pour 1 litre Nacl 8,8 g 20 NaH2PO4 3,9 g Tween 20 1 g Albumine bovine 1 g 10 Acid Blue 25 12,5 mg Proclin 0,5 g pH : cible 7,50 (7,30 ù 7,70) 5 7. Sonde peroxidase 20X Il s'agit d'un anticorps monoclonal de souris anti-VASP phosphorylé (clone 1602) décrit dans le brevet EP 1 042 368 et disponible auprès de NanoTools, Allemagne (http://www.nanotools.de) couplé à une enzyme peroxydase HRP : 10 Peroxidase (POD) de Roche, Suisse (http://www.roche-applied-science.com) ou BBI Enzymes, ex-Biozyme (http://www.biozyme.com/) 8. TMB 15 � TMB ONE, ready-to-use substrate � de Kem-En-Tec, Danemark (http://www.kem-en-tec.com) 9. Solution d'arrêt H2SO4=0,2 M 20 La moralité peut varier dans une gamme de 0.0002 M ù 10 M. L'analyse de l'échantillon prélevé peut inclure en parallèle celle d'un échantillon normal. 25 II - ANALYSE DE L' ACTIVATION PLAQUETTAIRE PAR LA PHOSPORYLATION DE LA PROTEINE VASP DANS UN TEST ELISA EN SANG TOTAL POUR EVALUER L'INFLUENCE DE SUBSTANCE AGISSANT SUR LES RECEPTEURS ET/OU LES ENZYMES DE LA VOIE DE LA PHOSPHORYLATION DE VASP 30 I1.1 Test d'un inhibiteur de la PDE3 22 Le cilostazol (Angilillo USA) qui est un principe actif actif sur la phosphodiesterase PDE3, utile pour le suivi de l'activation plaquettaire en liaison avec des pathologies telles que le diabète, a été testé sur sang total humain. On a utilisé 100 pL de sang total et 100 p/L de dilution cilostazol. L'incubation a été réalisée pendant 2h30 à 37°C. Les résultats fournis à la figure 4 montrent l'évolution de l'état de phosphorylation de VASP, en présence différentes quantités de cilostazol. D'autres molécules peuvent être testées de façon analogue. 11.2 Test d'un activateur du récepteur EP3 de PGE2 Le principe actif Sulprostone agissant sur le récepteur EP3 de la prostaglandine PGE2 a été testé en ELISA sur sang total. On a utilisé 10pL (FACS) ou 40pL (ELISA) sang total et 10pL (FACS) ou 40 pL (ELISA) de dilution Sulprostone. L'incubation a été réalisée pendant 10 minutes d'incubation à température ambiante. Son effet sur la phosphorylation de VASP est rapporté à la figure 5. 11.3 Test d'un activateur du récepteur PGD2 Un composé désigné BW245c agissant sur le récepteur DP1 de PGD2 a été analysé par FACS et par ELISA sur sang total. On a utilisé 10pL (FACS) ou 40pL (ELISA) de sang total et 10pL (FACS) ou 40pL (ELISA) de dilution BW245c. L'incubation a été réalisée pendant 10 minutes à 25 température ambiante. Les résultats sont rapportés à la figure7. III - ANALYSE DE L' ACTIVATION PLAQUETTAIRE PAR LA PHOSPORYLATION DE LA PROTEINE VASP DANS UN TEST ELISA EN 30 SANG TOTAL POUR EVALUER L'INFLUENCE DE SUBSTANCE AGISSANT SUR LES RECEPTEURS ET/OU LES ENZYMES DE LA VOIE DE LA PHOSPHORYLATION DE VASP 1. Le sang a été prélevé dans des tubes à prélèvement contenant un anticoagulant tel que le Citrate de Na (0,109M ou 0,129M) ; 2. a) Le cas échéant, on a déposé un composé dont l'interaction avec l'activité plaquettaire est testée, dans une partie des puits contenant l'échantillon de sang total. 2. b) L'activateur PGE1 ou PGEI+TRAP14 (40 pl) a été déposé dans les puits correspondants des microplaques ; 3. Le sang (40 pl) a été ajouté puis on a agité par une série d'aspirations / refoulements ; 4. Le mélange a été incubé 10 min à température ambiante ; 5. Le Tampon de lyse (100 pl) a été ajouté dans les puits contenant le sang activé et l'ensemble a été agité par une série d'aspirations / refoulements. On a déposé également du Tampon de lyse (180 pL) dans les puits � blancs � ; 6. Le milieu de réaction a été incubé 30 min à température ambiante ; 7. Puis on a lavé 3 fois la plaque avec la Solution de lavage diluée (3 x 300 pL, fournie concentrée 20X ; La composition des réactifs est donnée au point II. L'agoniste TRAP14 du récepteur à la thrombine (PAR-1) a été testé d'une part en ELISA, d'autre part en FACS, sur sang total, pour évaluer son effet indirect sur l'état de phosphorylation de la protéine VASP. Les résultats sont présentés à la figure 6. Le composé Cl (premier composé) est PGE1 et le composé C2 (deuxième 30 composé) est TRAP14. IV CONSERVATION DES ECHANTILLONS DE SANG TOTAL APRES ACTIVATION (PAR PGE1 + ADP + MRS2395) Les figures 9 et 10 montrent la stabilité des plaquettes pour les échantillons de sang total (WB) traités par PGE1 + ADP + MRS2395, jusqu'à 48 h après traitement ou, après lyse puis congélation, jusqu'à 22 jours. Les résultats de PRI obtenus en ELISA et en cytométrie en flux sont présentés. Revendications1. Méthode pour le dosage par ELISA réalisé sur un échantillon de sang total, de l'état d'activation cellulaire d'une population déterminée de cellules de l'échantillon, comprenant la détermination de l'état de phosphorylation d'une protéine intracellulaire impliquée dans une voie de la signalisation cellulaire (biomarqueur). 2. Méthode de dosage par ELISA selon la revendication 1, dans laquelle l'état d'activation cellulaire dosée est celui des plaquettes. 3. Méthode de dosage par ELISA selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle la protéine intracellulaire dont on teste le niveau de phosphorylation est une protéine de la famille des kinases ou est une protéine substrat de kinase. 4. Méthode de dosage par ELISA selon la revendication 2, dans laquelle la protéine intracellulaire est une protéine substrat d'une kinase ou la kinase elle-même choisie parmi les kinases PKA, PKG, AKT, ERK, JAK2, BCRABL. 5. Méthode de dosage par ELISA selon l'une des revendications 2 à 4, dans laquelle la protéine intracellulaire est un substrat plaquettaire de kinase tel que la protéine VASP ou STAT5 ou est une kinase telle que la protéine AKT, p38, ERK. 6. Méthode de dosage par ELISA selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant les étapes suivantes effectuées sur un échantillon de sang total : a) l'activationd'une partie aliquote de l'échantillon de sang total avec un premier composé, avantageusement un composé physiologique, agissant sur l'activité cellulaire d'une population de cellules déterminée dudit échantillon par l'activation de la phosphorylation d'une protéineintracellulaire déterminée, et l'activation d'une autre partie aliquote avec ledit premier composé et avec un deuxième composé inhibant ou modifiant ladite phosphorylation, par la voie d'une interaction avec un récepteur cellulaire ou par la voie d'une interaction avec une enzyme de la signalisation cellulaire, b) la lyse des cellules de l'échantillon activé dans des conditions permettant de préserver l'équilibre entre la protéine intracellulaire non phosphorylée et ladite protéine dans son état phosphorylé, ledit équilibre témoignant de l'activité cellulaire de ladite population de cellules déterminée de l'échantillon, c) le lavage pour éliminer les produits de lyse, d) l'incubation de l'échantillon traité avec une sonde de capture comprenant des anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine intracellulaire indifféremment de son état phosphorylation, e) la révélation de la formation d'un complexe immunologique entre la protéine intracellulaire phosphorylée et l'anticorps de révélation reconnaissant spécifiquement cette protéine intracellulaire dans son état phosphorylé, ledit anticorps étant le cas échéant marqué. 7. Méthode de dosage ELISA selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant les étapes suivantes, réalisées sur un échantillon de sang total prélevé chez un patient auquel on a administré un composé interagissant avec l'activation plaquettaire par modification de la phosphorylation d'une protéine intracellulaire déterminée (dit deuxième composé) a) l'activation d'une partie aliquote de l'échantillon de sang total avec un premier composé agissant sur l'activité cellulaire d'une population de cellules déterminée dudit échantillon par l'activation de la phosphorylation d'une protéine intracellulaire déterminée, b) la lyse des cellules de l'échantillon activé dans des conditions permettant de préserver l'équilibre entre la protéine intracellulaire non phosphorylée et ladite protéine dans son état phosphorylé, ledit équilibre témoignant del'activité cellulaire de ladite population de cellules déterminée de l'échantillon, c) le lavage pour éliminer les produits de lyse, d) l'incubation de l'échantillon traité avec une sonde de capture comprenant des anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine intracellulaire indifféremment de son état phosphorylé, e) la révélation de la formation d'un complexe immunologique entre la protéine intracellulaire phosphorylée et l'anticorps de révalation reconnaissant spécifiquement cette protéine intracellulaire dans son état phosphorylé, ledit anticorps étant le cas échéant marqué. 8. Méthode selon la revendication 6, dans laquelle l'activation avec ledit deuxième composé précède l'activation avec ledit premier composé. 9. Méthode de dosage selon la revendication 6 caractérisée en ce que, à l'étape a), l'activation avec ledit deuxième composé inhibant ou modifiant la phosphorylation est une substance dont on teste l'effet sur l'activité cellulaire, par exemple une substance à activité biologique ou thérapeutique. 1O.Méthode de dosage par ELISA selon l'une quelconque des revendications6 à 9, dans laquelle l'étape de lavage est suivie d'une étape de congélation pour conserver l'échantillon. 11.Méthode de dosage par ELISA selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, dans laquelle la révélation de la formation du complexe immunologique est effectuée avec un substrat du marqueur de l'anticorps et comprend une étape de mesure de la densité optique, des deux parties aliquotes traitées de l'échantillon, suivie le cas échéant de la détermination du PRI. 12. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle la protéine intracellulaire dont on détermine l'état de phosphorylation est la protéine VASP et la population cellulaire dont on détermine l'activation est la population de plaquettes, une partie aliquote del'échantillon étant activée avec un premier composé agoniste de phosphorylation de VASP, une autre partie aliquote de l'échantillon étant activée avec le même premier composé et en outre avec un deuxième composé interagissant avec un récepteur plaquettaire cible de substances testées pour leur activité biologique ou thérapeutique. 13.Méthode de dosage selon la revendication 12, dans laquelle l'agoniste physiologique de la phosphorylation de VASP est choisi parmi les enzymes activant l'adenylyl cyclase telles que les prostaglandines PGE1, PGI2, et les substances activant la guanylyl cyclase telles que les substances donneurs de NO ou des peptides natiuritiques. 14.Méthode de dosage selon la revendication 13, dans laquelle le composé inhibant ou modifiant la phosphorylation est une substance interagissant avec un récepteur des plaquettes tel que le récepteur P2Y12 stimulé par l'ADP et/ou avec une enzyme de la signalisation cellulaire telle que l'adenylyl cyclase, la guanylyl cyclase, les phosphodiestérases telles que PDE2, PDE3 ou PDE5, les protéines kinases telles que PKA ou PKG. 15. Méthode de dosage selon l'une des revendications 1 à 13, dans laquelle la protéine intracellulaire dont on détermine l'état de phosphorylation est la protéine VASP et la population cellulaire dont on détermine l'activité est la population de plaquettes, une partie aliquote de l'échantillon étant activée avec un premier agoniste physiologique de la phosphorylation de VASP, tel que PGE1, PDG2 ou PGI2, et une autre partie aliquote étant activée avec le même premier agoniste et en outre avec un deuxième composé interagissant avec un récepteur cellulaire, par exemple interagissant avec le récepteur P2Y12 stimulé par le nucléotide ADP, ledit deuxième composé inhibant la phosphorylation de VASP ou étant testé pour rechercher ses propriétés d'inhibition. 16.Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans laquelle les anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine intracellulaire dans son état phosphorylé sont des anticorps monoclonaux,par exemple des anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement la protéine VASP phosphorylée sur la sérine 239, ou des anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement la protéine AKT phosphorylée sur la sérine 473. 17.Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans laquelle le tampon de lyse comprend ou est constitué par le mélange suivant : de 0,0002% à 10%, de préférence de 2% à 0,02% en concentration finale de Sodium Dodécyl Sulfate (SDS), de préférence 0,2%, - de 0,002 à 10%, de préférence de 5% à 0,2% en concentration finale de Triton X-100 (Octyl Phenoxy poly Ethoxy Phenol), de préférence 2%, - de 0,000002% à 10%, de préférence de 0,004% à 1 %en concentration finale d'un agent microbicide à large spectre du type d'un microbicide contenant à titre de principes actifs du 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one et 2-méthyl-4-isothiazolin-3-one, de préférence 0,04%. 18.Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, dans laquelle toutes les étapes d'incubation sont réalisées à température ambiante ou à une température d'environ 37°C et l'étape de lyse est réalisée pendant une durée de 10 à 30 minutes, de préférence 10 minutes, à température ambiante, ou à une température d'environ 37°C. 19. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans laquelle l'échantillon de sang a été préalablement collecté dans des conditions préservant l'intégrité de la population cellulaire dont on teste l'activité, en particulier dans des conditions empêchant l'activation de ladite population cellulaire pendant la collecte, et l'échantillon collecté est ensuite traité avec un anticoagulant tel que le citrate de sodium, de préférence le trisodium citrate 0,109M ou 0,129M suivant les proportions de 9 volumes de sang pour 1 volume d'anticoagulant. 20. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, appliquée à un échantillon de sang total préalablement collecté chez un patient traité par un agent agoniste ou par un agent antagoniste de l'activité d'une population déterminée de cellules contenues dans l'échantillon. 21. Méthode de dosage selon la revendication 19, dans laquelle l'agent agoniste ou l'agent antagoniste agit sur l'agrégation des plaquettes. 22. Méthode de dosage selon la revendication 20, dans laquelle l'antagoniste de l'activation plaquettaire est un antagoniste du récepteur P2Y12 à I'ADP, par exemple une thiénopyridine telle que le clopidogrel ou la ticlopidine ou est une substance interagissant avec une enzyme de la signalisation cellulaire telle que l'adenylyl cyclase, la guanylyl cyclase, les phosphodiestérases telles que PDE2, PDE3 ou PDE5, le protéines kinases telles que PKA ou PKG. 23. Méthode de suivi in vitro d'un trouble de la coagulation chez un patient traité avec un agent antagoniste de l'activation plaquettaire caractérisée en ce qu'elle comprend le dosage selon la méthode de l'une des revendications 1 à 22, la détermination de l'index de réactivité plaquettaire (PRI) et l'interprétation du PRI par exemple pour déterminer si le patient est un bon répondeur ou un mauvais répondeur audit agent antagoniste. 24. Kit pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une quelconque des revendications caractérisé en ce qu'il comprend : - un tampon de lyse tel que défini à la revendication 17, - une solution de lavage - un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine intracellulaire dans son état phosphorylé, le cas échéant marqué.