FR 2935986 A1 20100319 FR 0856167 A 20080912 VARIANTS DE BETA-GLUCOSIDASE A ACTIVITE AMELIOREE ET LEURS UTILISATIONS La présente invention porte sur l'expression et l'optimisation d'enzymes impliquées dans la dégradation de la biomasse lignocellulosique. La présente invention porte plus particulièrement sur des variants de la betaglucosidase comportant au moins une altération parmi les acides aminés situés en position 225, 238, 240 et 241 selon la numérotation de la SEQ ID :2 de la beta-glucosidase de Trichoderma reesei, ainsi que sur l'utilisation de ces variants à performance améliorée dans des procédés de dégradation de la cellulose et des procédés de production de biocarburant (par exemple : éthanol, butanol, isopropanol). La possibilité de produire de l'éthanol à partir de la cellulose a reçu beaucoup d'attention en raison de la disponibilité de grandes quantités de matière première ainsi que de la propreté de l'éthanol à titre de carburant. Les matières premières naturelles cellulosiques pour un tel processus sont désignées par le terme "biomasse". De nombreux types de biomasse, y compris le bois, les résidus agricoles, les cultures herbacées et les déchets solides municipaux, ont été considérés comme des matières premières pour la production de biocarburant. Ces matériaux sont constitués principalement de cellulose, d'hémicellulose et de lignine. La cellulose, est un polymère constitué de molécules de glucose reliées par des liens bêta 1-4, qui est très résistant à la dégradation ou à la dépolymérisation à l'aide d'acides, d'enzymes, ou de microorganismes. Une fois la cellulose convertie en glucose, celui-ci est facilement fermenté en biocarburant, par exemple l'éthanol, en utilisant une levure. Les plus anciennes méthodes étudiées pour convertir la cellulose en glucose sont basées sur l'hydrolyse acide. Ce processus peut se faire en présence de concentrés d'acides ou d'acides dilués. Cependant, plusieurs inconvénients tels que la mauvaise récupération de l'acide lors de l'utilisation des concentrés d'acides et la faible production de glucose dans le cadre de l'utilisation d'acides dilués empêchent le processus d'hydrolyse acide de parvenir à la commercialisation. Pour surmonter les inconvénients du processus d'hydrolyse acide, les processus de conversion de la cellulose ont porté plus récemment sur l'hydrolyse enzymatique, à l'aide d'enzymes de type cellulase. Cette hydrolyse enzymatique de la biomasse lignocellulosique (par exemple, la cellulose) présente cependant l'inconvénient d'être un procédé industriel coûteux. De ce fait, il est nécessaire d'utiliser des souches de microorganismes sécréteurs de cellulases de plus en plus performantes. A ce titre, beaucoup de microorganismes comportent des enzymes qui hydrolysent la cellulose, tels que les champignons Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Fusarium ainsi que les bactéries telles que Thermomonospora, Bacillus, Cellulomonas et Streptomyces. Les enzymes présentes dans ces microorganismes possèdent trois types d'activités utiles dans la conversion de la cellulose en glucose et se divisent en trois groupes: les endoglucanases, qui attaquent les fibres de celluloses aléatoirement en interne, les exoglucanases qui vont attaquer les extrémités des fibres en libérant du cellobiose, et les beta-glucosidases qui vont hydrolyser ce cellobiose en glucose. Ces dernières constituent l'étape limitante du procédé de conversion de la cellulose. En effet, la difficulté première du procédé réside dans la conversion du cellobiose en glucose, car tout cellobiose non hydrolysé à la fin du procédé représente une perte de rendement lors de la production de biocarburant. Cette accumulation de cellobiose est un problème majeur dans l'hydrolyse enzymatique, étant donné que plusieurs microorganismes producteurs de cellulases, dont Trichoderma, produisent très peu de beta-glucosidase. En fait, moins de 1% des protéines totales produites par des souches de Trichoderma industrielles sont de type betaglucosidase. Cette faible quantité de beta-glucosidase résulte donc en une faible capacité à hydrolyser le cellobiose en glucose ; de là, son accumulation dans le système. Or une forte concentration de cellobiose inhibe l'activité des autres cellulases et notamment les exoglucanases pour qui le cellobiose est le produit final de réaction. Plusieurs approches ont été proposées pour augmenter l'activité beta-glucosidase dans les microorganismes et par conséquent la conversion du cellobiose en glucose. Une première approche consiste à ajouter aux mélanges sécrétés par les microorganismes de la beta-glucosidase produite de façon exogène, pour améliorer l'hydrolyse. Cependant, ce procédé n'est pas viable commercialement, car beaucoup trop coûteux. Une seconde approche, telle que décrite dans WO92/010581, est d'utiliser le génie génétique pour insérer de nouvelles copies du gène de la beta-glucosidase dans le génome des microorganismes, de façon à ce que ces derniers produisent une plus grande quantité d'enzyme. Une troisième approche, décrite dans WO99/46362, consiste à modifier génétiquement les microorganismes à l'aide d'une construction génétique qui comprend un promoteur, le gène de la beta-glucosidase mature et la séquence signal de sécrétion de la xylanase. La présence de la séquence signal de sécrétion de la xylanase permet d'augmenter de manière significative la quantité de betaglucosidase produite par les microorganismes. Or, pour qu'une hydrolyse de la biomasse lignocellulosique soit efficace et économiquement rentable, le mélange enzymatique doit être produit par une seule et unique souche microbienne, et doit comporter des proportions équilibrées d'activités enzymatiques diverses (entre autres, mais non exclusivement exoglucanases, endoglucanases, xylanases et beta-glucosidases). A titre d'exemple, dans les mélanges natifs de Trichoderma reesei on constate généralement la présence de 70-80% d'exoglucanases, 15-20% d'endoglucanases, quelques pourcentages d'hémicellulases et environ 0,5% de beta- glucosidases. Ce mélange convient parfaitement pour hydrolyser la majorité des substrats prétraités (ex. type paille de blé explosée à la vapeur en conditions acides) avec des rendements acceptables. En somme, l'augmentation de l'activité beta-glucosidase, si elle est faite par enrichissement en quantité d'enzyme, ne doit pas se faire au détriment des autres activités enzymatiques. En conséquence, la possibilité d'obtenir de hautes activités beta-glucosidase sans modifier notablement la proportion de l'ensemble des enzymes du mélange serait un gain significatif pour le procédé de conversion de biomasse lignocellulosique en biocarburant. Dans cette optique, les sociétés déposantes, ont eu le grand mérite de trouver, après de nombreuses recherches, un polypeptide isolé ou purifié ayant une activité betaglucosidase améliorée par rapport à l'activité beta- glucosidase de la protéine sauvage BGL1 (SEQ ID NO :2), comprenant une séquence d'acides aminés dans laquelle au moins un acide aminé est altéré par rapport à la séquence d'acides aminés selon SEQ ID No :2, ledit acide aminé altéré étant choisi parmi les positions 225, 238, 240 et 241 de la séquence d'acides aminés SEQ ID No :2. De plus, les polypeptides selon l'invention présentent l'avantage d'être moins sensibles à l'inhibition par le glucose et conservent de ce fait une meilleure activité beta-glucosidase en présence d'une forte concentration de glucose. Dans un mode de réalisation, le polypeptide tel que décrit précédemment est caractérisé en ce qu'il a une activité beta-glucosidase déterminée en présence de glucose qui est améliorée par rapport à l'activité beta-glucosidase de la protéine sauvage BGL1 (SEQ ID NO :2) déterminée en absence de glucose. L'homme du métier pourra par exemple déterminer l'augmentation ou autrement dit l'amélioration de l'activité enzymatique d'un polypeptide selon l'invention par un test d'activité enzymatique à l'aide du substrat pnp-glucopyranoside. La quantité de paranitrophénol obtenue après action de la beta-glucosidase pourra par exemple être déterminée par lecture de la densité optique à 414 nm. Un exemple de protocole, que l'homme du métier pourra utiliser pour déterminer si un polypeptide selon l'invention présente une activité enzymatique améliorée par rapport à celle de la protéine sauvage BGL1, est le suivant . - formation d'une culture stock de E. coli exprimant un 25 polypeptide selon l'invention pendant toute la nuit à 37°C ; - ensemencement d'un milieu de culture LB avec 1% de culture stock pendant 24h à 20°C; - centrifugation pendant 2 minutes à 13000 rpm ; 30 -resuspension des culots cellulaires avec du tampon succinate 100 mM à pH 5 (DO600 finale 100) ; - incubation de 50 pl de cellules avec 100 pl de tampon succinate 100 mM à pH 5 contenant 15 mM de pnpglucopyranoside pendant 1h30 à 50°C, suivi de 5 minutes sur 35 la glace ; - ajout de 150 pl de Na2CO3 0.2 M ; - centrifugation pendant 2 minutes à 13000 rpm ; -lecture de la densité optique à 414 nm sur 150 pl de surnageant. De plus, l'homme du métier pourra utiliser le protocole décrit ci-dessus en incubant les 50 pl de cellules avec 100 pl de tampon succinate 100 mM à pH 5 contenant 15 mM de pnp-glucopyranoside et 60 g/L de glucose pendant 1h30 à 50°C, pour déterminer si un polypeptide selon l'invention est moins sensible à l'inhibition par le glucose que la protéine sauvage BGL1. Dans le cadre de l'invention, un acide aminé dit � altéré � signifie un acide aminé � substitué �, � inséré � ou � délété �. Selon un mode de réalisation, l'acide aminé dit � altéré � est � substitué � par rapport à la séquence d'acides aminés selon SEQ ID No:2. 20 Selon un mode de réalisation, l'acide aminé dit � altéré � est � inséré � par rapport à la séquence d'acides aminés selon SEQ ID No:2. Selon un mode de réalisation, l'acide aminé dit 25 � altéré � est � délété � par rapport à la séquence d'acides aminés selon SEQ ID No:2. Selon un mode de réalisation, le polypeptide tel que décrit précédemment est caractérisé en ce qu'au moins deux 30 acides aminés de la séquence d'acides aminés sont altérés par rapport à la séquence d'acides aminés SEQ ID No :2, lesdits acides aminés altérés étant choisis parmi les positions 225, 238, 240 et 241 de la séquence SEQ ID No :2. 35 Selon un mode de réalisation, le polypeptide tel que décrit précédemment est caractérisé en ce qu'au moins trois acides aminés de la séquence d'acides aminés sont altérés par rapport à la séquence d'acides aminés SEQ ID No :2,15 lesdits acides aminés altérés étant choisis parmi les positions 225, 238, 240 et 241 de la séquence d'acides aminés SEQ ID No :2. Selon un mode de réalisation, le polypeptide tel que décrit précédemment est caractérisé en ce qu'au moins quatre acides aminés de la séquence d'acides aminés sont altérés par rapport à la séquence d'acides aminés SEQ ID No :2, lesdits acides aminés altérés étant ceux des positions 225, 238, 240 et 241 de la séquence d'acides aminés SEQ ID No :2. Selon un mode de réalisation, le polypeptide tel que décrit précédemment est caractérisé en ce qu'au moins un, au moins deux, au moins trois, ou au moins quatre acides aminés de la séquence d'acides aminés sont altérés par rapport à la séquence d'acides aminés SEQ ID No :2, lesdites altérations étant choisies parmi Q225H, V238I, T240G et T241S. Selon un mode de réalisation, le polypeptide tel que décrit précédemment est caractérisé en ce qu'un acide aminé est altéré par rapport à la séquence SEQ ID No: 2, ladite altération étant Q225H. Selon un mode de réalisation, le polypeptide tel que décrit précédemment est caractérisé en ce que trois acides aminés sont altérés par rapport à la séquence SEQ ID No: 2, lesdites altérations étant V238I, T240G et T241S. Selon un mode de réalisation, le polypeptide tel que décrit précédemment est caractérisé en ce que quatre acides aminés sont altérés par rapport à la séquence SEQ ID No: 2, lesdites altérations étant Q225H, V238I, T240G et T241S. Selon un mode de réalisation, le polypeptide tel que décrit précédemment comprend en outre au moins un acide aminé altéré supplémentaire choisi parmi les positions 97, 99, 100, 118, 119, 121, 123, 126, 127, 128, 130, 132, 134, 135, 140, 147, 151, 153, 163, 168, 173, 174, 177, 179, 182, 187, 193, 206, 207, 212, 217 et 621 de la séquence d'acides aminés SEQ ID No:2. Selon un mode de réalisation, le polypeptide tel que décrit précédemment est caractérisé en ce que ledit acide aminé altéré supplémentaire comprend une ou plusieurs altérations sélectionnées dans le groupe consistant en V97I, Y99F, S100G, V118T, N119E, I121M, E123Q, Q126E, F127Y, I128L, E130A, V132A, A134G, S135C, S135V, I140L, P147A, T151I, Q153H, V163T, T168A, G173A, G173S, Q174E, N177E, I179L, V182A, V182N, T187C, L193V, N206D, P207V, L212M, T217L, L621F et L621T. Selon un mode de réalisation, le polypeptide tel que décrit précédemment est sélectionné dans le groupe consistant en : - une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID No :4, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :12; SEQ ID NO :14 ou - une séquence d'acides aminés SEQ ID NO : X présentant : i) un pourcentage de résidus identiques par rapport à la longueur de SEQ ID NO : 4, 6, 8, 10, 12 ou 14 d'au moins 70% d'identité, préférentiellement 75%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% ; ii) un pourcentage de résidus identiques par rapport à la longueur de SEQ ID NO : X d'au moins 70% d'identité, préférentiellement 75%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99%. Des variants des séquences d'acides aminés de la présente invention peuvent être préparés par diverses méthodes conventionnelles, telles que la mutagénèse aléatoire, la mutagénèse dirigée, la synthèse de gènes ou le shuffling, en utilisant la totalité ou une partie des séquences nucléotidiques ou peptidiques présentées dans le présent texte. De tels variants comprennent par exemple des délétions et/ou insertions et/ou substitutions de résidus dans la séquence d'acides aminés de l'enzyme. La présente invention concerne tout variant obtenu à partir des séquences présentées dans ce texte dès lors que les variants desdites séquences d'acides aminés conservent une fonction beta-glucosisase améliorée (telle que définie plus haut) par rapport à Bgl-1. Dans un mode de réalisation, l'invention porte sur une séquence d'acides aminés, nommée ci-après pour des raisons d'ordre pratique SEQ ID NO : X, qui lorsqu'alignée avec SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 ou 14, comprend: a) un pourcentage de résidus identiques par rapport à la longueur de SEQ ID NO : 4, 6, 8, 10, 12 ou 14 d'au moins 70% d'identité, préférentiellement 75, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% ; et b) un pourcentage de résidus identiques par rapport à la longueur de SEQ ID NO : X d'au moins 70% d'identité, préférentiellement 75, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99%. Selon l'invention, le pourcentage de résidus identiques par rapport à la longueur de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 ou 14 correspond au nombre de résidus identiques entre SEQ ID NO: X et SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 ou 14 divisé par le nombre de résidus dans SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 ou 14. Lorsqu'en utilisant la base de données GenomeQuest, lesdits pourcentages de résidus identiques par rapport à la longueur de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 ou 14 correspondent à des pourcentages d'identité d'Interrogation (% id Query), où Interrogation correspond à la séquence SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 ou 14. Selon l'invention, le pourcentage de résidus identiques par rapport à la longueur de SEQ ID NO: X correspond au nombre de résidus identiques entre SEQ ID NO: X et SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 ou 14 divisé par le nombre de résidus dans SEQ ID NO: X. Lorsqu'en utilisant la base de données GenomeQuest, lesdits pourcentages de résidus identiques par rapport à la longueur de SEQ ID NO: X correspondent à des pourcentages d'identité du Sujet (% id Subject), où Sujet correspond à SEQ ID NO : X. L'invention a également pour objet, un acide nucléique purifié ou isolé codant pour au moins un polypeptide tel que décrit précédemment. Le tableau 1 ci-dessous comprend les identifications des séquences nucléiques et peptidiques pour les gènes Bgl-1, les gènes A et C, ainsi que pour les polypeptides de l'invention. TABLEAU 1 Clones Acide nucléique Polypeptide BGL1 (sauvage) SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :2 10H7 SEQ ID NO :3 SEQ ID NO :4 59B8 SEQ ID NO :5 SEQ ID NO :6 164A2 SEQ ID NO :7 SEQ ID NO :8 100B11 SEQ ID NO :9 SEQ ID NO :10 115E1 SEQ ID NO :11 SEQ ID NO :12 149G7 SEQ ID NO.13 SED ID NO :14 Gène A SEQ ID NO.15 SED ID NO :16 Gène C SEQ ID NO.17 SED ID NO :18 L'invention porte également sur un vecteur comprenant 15 un acide nucléique tel que décrit précédemment. Selon l'invention, on entend par � vecteur � toute séquence d'ADN dans laquelle il est possible d'insérer des fragments d'acide nucléique étranger, les vecteurs 20 permettant d'introduire de l'ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage P1 (PAC), 25 les vecteurs dérivés de virus. Selon l'invention, l'acide nucléique tel que décrit précédemment pourra être lié opérationnellement à un promoteur, un terminateur ou toute autre séquence 30 nécessaire à son expression dans la cellule hôte. Le vecteur selon l'invention pourra également porter un marqueur de sélection. On entend par � marqueur de sélection � un gène dont l'expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Il s'agit par exemple d'un gène de résistance aux antibiotiques. L'invention a également pour objet une cellule hôte isolée comprenant soit au moins l'un des polypeptides tels que décrit précédemment, soit au moins l'un des acides nucléiques tels que décrit précédemment ou soit au moins l'un des vecteurs tels que décrit précédemment. L'homme du métier pourra introduire l'un des polypeptides, l'un des acides nucléiques ou l'un des vecteurs tels que décrit précédemment dans la cellule hôte par des méthodes conventionnelles bien connues. Par exemple, on peut citer le traitement au chlorure de calcium, l'électroporation, l'utilisation d'un pistolet à particules. Selon un mode de réalisation, la cellule hôte isolée telle que décrite précédemment est choisie parmi Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Penicillium, Fusarium, Thermomonospora, Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia et Saccharomyces. Selon un mode de réalisation préférée, la cellule hôte isolée telle que décrite précédemment est choisie parmi Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus piger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Neurospora crassa, Humicola grisae, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pi chia pastoris, Yarrowia lipolityca et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation préférée, la cellule hôte 5 isolée telle que décrite précédemment est Trichoderma reesei. L'invention porte également sur l'utilisation de l'un quelconque des polypeptides décrits précédemment pour 10 l'hydrolyse du cellobiose en glucose. L'invention a également pour objet, l'utilisation de l'un quelconque des polypeptides décrits précédemment pour la production de biocarburant. 15 Selon l'invention, le terme biocarburant peut être défini comme tout produit issu de la transformation de la biomasse et pouvant être utilisé à des fins énergétiques. D'une part et sans vouloir se limiter, on peut citer à 20 titre d'exemple des produits pouvant être incorporés (éventuellement après transformation ultérieure) à un carburant ou être un carburant à part entière, tels que des alcools (l'éthanol, le butanol et/ou l'isopropanol selon le type d'organisme fermentaire utilisé), des 25 solvants (acétone), des acides (butyrique), des lipides et leurs dérivés (acides gras à courtes ou longues chaînes, esters d'acides gras), ainsi que l'hydrogène. De manière préférée, le biocarburant selon l'invention 30 est un alcool, par exemple l'éthanol, le butanol et/ou l'isopropanol. Plus préférentiellement, le biocarburant selon l'invention est l'éthanol. Les souches de champignons filamenteux, de préférence 35 Trichoderma, plus préférentiellement T. reesei, capables d'exprimer au moins un polypeptide selon l'invention sont cultivées en fermenteurs, en présence d'un substrat carboné, tel que le lactose ou le glucose, choisi pour la croissance du microorganisme. Dans un mode de réalisation, ce substrat carboné, selon sa nature, est introduit dans le fermenteur avant stérilisation ou est stérilisé séparément et introduit dans le fermenteur après stérilisation de ce dernier pour obtenir une concentration initiale de 20 à 35 g/L. Une solution aqueuse contenant le substrat choisi pour la production des enzymes est ensuite ajoutée. Une composition enzymatique agissant sur la biomasse lignocellulosique produite par les champignons est enfin récupérée par filtration du milieu de culture. Dans cette composition, on retrouve notamment l'endoglucanase, l'exoglucanase et la beta-glucosidase selon l'invention. Dans un mode de réalisation, la solution aqueuse contenant le substrat choisi pour la production des enzymes est préparée à la concentration de 200-250 g/L ; cette solution doit contenir le substrat inducteur tel que le lactose. Cette solution aqueuse est injectée après l'épuisement du substrat carboné initial de façon à apporter une quantité optimisée, comprise entre 35 et 45 mg/g de cellules ("fed batch"). Pendant cette phase de "fed batch", la concentration résiduelle en sucre dans le milieu de culture est inférieure à 1 g/L et les enzymes agissant sur la biomasse lignocellulosique sont sécrétées par le champignon. Ces dernières peuvent être récupérées par filtration du milieu de culture. L'invention a pour objet une composition enzymatique agissant sur la biomasse lignocellulosique, ladite composition enzymatique étant produite par des champignons filamenteux et comprenant au moins un polypeptide ayant une activité beta-glucosidase améliorée par rapport à l'activité beta-glucosidase de la protéine sauvage BGL1. Enfin, l'invention a pour objet un procédé de production de biocarburant à partir de la biomasse comprenant les étapes suivantes : - mise en suspension en phase aqueuse du matériau à hydrolyser ; - ajout d'une composition enzymatique agissant sur la biomasse lignocellulosique telle que décrite précédemment; - dosage des sucres libérés ; - séparation de la solution sucrée de la fraction solide non hydrolysée ; - fermentation de la solution sucrée ; -séparation du biocarburant du moût de fermentation. Dans un mode de réalisation, le matériau à hydrolyser est mis en suspension en phase aqueuse à raison de 6 à 40 % de matière sèche, de préférence 20 à 30 %. Le pH est ajusté entre 4 et 5,5, de préférence entre 4,8 et 5,2 et la température entre 40 et 60°C, de préférence entre 45 et 50°C. La réaction d'hydrolyse est démarrée par l'ajout de la composition enzymatique agissant sur la biomasse lignocellulosique; la quantité habituellement utilisée est de 10 à 30 mg de protéines excrétées par gramme de substrat prétraité ou moins. La réaction dure généralement de 15 à 48 heures. La réaction est suivie par dosage des sucres libérés, notamment le glucose. La solution sucrée est séparée de la fraction solide non hydrolysée, essentiellement constituée de lignine, par filtration ou centrifugation ; elle est utilisée pour la fermentation. Dans un mode de réalisation, le biocarburant pourra être séparé du moût de fermentation par distillation. 30 Un autre objet de l'invention est un procédé de production de biocarburant à partir de la biomasse, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en suspension en phase aqueuse de la biomasse à 35 hydrolyser ; - ajout simultané d'une composition enzymatique agissant sur la biomasse lignocellulosique telle que définie précédemment et d'un organisme fermentaire; -séparation du biocarburant du moût de fermentation. Selon ce mode de réalisation, la cellulose présente dans la biomasse est convertie en glucose, et en même temps, dans le même réacteur, l'organisme fermentaire par exemple une levure) convertit le glucose en produit final selon un procédé de SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) connu de l'homme du métier. Selon les capacités métaboliques et hydrolytiques de l'organisme fermentaire, le bon déroulement de l'opération peut nécessiter l'addition d'une quantité plus ou moins importante de mélange cellulolytique exogène. Dans un autre mode de réalisation, un même organisme 15 fermentaire pourra être capable de convertir la biomasse en glucose puis le glucose en produit final. D'autres aspects, objets, avantages et caractéristiques de l'invention, seront présentés à la 20 lecture de la description non restrictive qui suit et qui décrit des modes de réalisation préférés de l'invention donnés par le biais d'exemples et de la figure 1. La Figure 1 est un graphique représentant 25 l'amélioration de l'activité beta-glucosidase pour les variants 149G7, 100B11, 115E1 en comparaison avec le gène parent BGL1, lorsqu'en présence de glucose. 30 EXEMPLES Exemple 1 : ler tour de shuffling 35 La séquence du gène de la beta-glucosidase de Trichoderma reesei (gène parental BGL1, SEQ ID NO : 1) a été soumise à un premier tour de shuffling selon le procédé breveté décrit dans EP 1104457B1 avec le gène de la glucosidase putative de Chaetomium globosum (gène A) (SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16 (séquence protéique)) possédant 70% d'identité avec le gène parental BGL1. 1- Criblage à haut débit Un test de criblage à haut débit a permis de sélectionner les meilleurs clones issus du shuffling de ces deux séquences, c'est-à-dire ceux présentant un facteur d'amélioration supérieur à 2 au niveau de l'activité beta- glucosidase lorsque comparés avec le gène parental BGL1 de T. reesei. Le test de criblage de la banque du premier tour de shuffling a été réalisé selon les étapes suivantes : -isolement sur gélose des différentes colonies de E.coli exprimant les variants de shuffling de l'enzyme recombinante selon l'invention et mise en pré-cultures en milieu LB desdites colonies pendant la nuit à 37°C; - inoculation d'un milieu LB à 3% avec la pré-culture puis incubation 4h à 37°C ; - induction de l'expression des variants par addition d'isopropyl-beta-thio-galactoside (IPTG) 100 pM puis incubation à 20°C pendant la nuit ; - centrifugation pendant 2 minutes à 13000 rpm ; -re-suspension des culots cellulaires dans 100 pL de tampon succinate 0.1M contenant 2.2 mM de paranitrophenyl-D-glucoside-6-phosphate (pNPG1c) ; - incubation 3h à température ambiante ; - lecture de la densité optique à 414 nm après 30 alcalinisation. Dans ces conditions de criblage, une amélioration de l'activité beta-glucosidase par rapport à l'enzyme de référence BGLI a été trouvée dans plusieurs clones, dont 35 notamment les clones 10H7 (SEQ ID NO :3 et 4), 59B8 (SEQ ID NO : 5 et 6) et 164A2 (SEQ ID NO : 7 et 8). 2-Détermination de l'amélioration de l'activité R-glucosidase. 2-1/ Sur le substrat pNPGlc Afin de déterminer le kcat relatif des variants sélectionnés au premier tour de shuffling, on procède de la façon suivante : - formation d'une culture stock de E. coli exprimant une enzyme recombinante selon l'invention pendant toute la nuit à 37°C ; - ensemencement d'un milieu de culture LB avec 1% de culture stock pendant 24h à 20°C avec induction à l'IPTG (250 pM) ; - centrifugation pendant 2 minutes à 13000 rpm ; -resuspension des culots cellulaires avec du tampon succinate 100 mM à pH 5 (D06H finale 100); - incubation de 50 pl cellules avec 100 pl de tampon succinate 100 mM à pH 5 contenant 15 mM de pnpglucopyranoside pendant 1h30 à 50°C suivi de 5 minutes sur la glace ; - ajout de 150 pl de Na2CO3 0.2 M ; - centrifugation pendant 2 minutes à 13000 rpm ; - lecture de la densité optique à 414 nm sur 150 pl de surnageant. Le tableau 2 présente les valeurs des kcat ainsi que les facteurs d'améliorations obtenus pour les clones 10H7, 59B8 et 164A2 dans ces conditions expérimentales. TABLEAU 2 : Amélioration de l'activité beta-glucosidase (résultats des cultures induites) Clones Kcat (min-') Facteur amélioration 10H7 590,0 8 Clones du 1er tour 59B8 518,6 7 164A2 1437,3 20 Protéine de référencec~~ 71,0 1 35 Les résultats montrent des améliorations d'activités enzymatiques très importantes par rapport à l'enzyme de référence (BGLI) pour les 3 clones 10H7, 59B8 et 164A2. 2-2/ Sur le cellobiose L'amélioration d'activité des clones 10H7, 59B8 et 164A2 a ensuite été confirmée sur un second substrat : le cellobiose. 10 Ce test a été effectué sur des cultures de E. coli exprimant une enzyme recombinante selon l'invention. Les étapes du test sont les suivantes : - Ensemencer un milieu de culture LB avec 1% de culture 15 stock induites avec de l'IPTG puis incubation toute la nuit à 37°C. - Cultiver lesdites cellules à 37°C jusqu'à l'obtention d'une densité optique à 600 nm de 0.4. - Induire lesdites cellules avec de l'IPTG 250 pM à 20 20°C pendant 20 heures. - Laver les culots cellulaires trois fois dans un tampon succinate 100 mM pH 5 pour éliminer le glucose du milieu de culture. - Incuber 10 pl desdites cellules avec 190 pl de 25 cellobiose à 263.2 mM (250 mM finale) pendant 12 heures à 50°C en microplaque. Révélation : 30 -Mélanger et incuber pendant 1h à température ambiante - 10 pl réaction ci-dessus - 90 pl tampon succinate 100 mM à pH 5 - 5 pl glucose oxydase 44 U/ml 35 -Mélanger et incuber pendant 30 min à température ambiante - 10 pl réaction glucose oxydase - 2 pl horse radish peroxydase à 10 U/ml5 - 5 pl ABTS 100 mM - 83 pl tampon phosphate 50 mM pH 7.4 Lire les densités optiques à 420 nm. TABLEAU 3 : Amélioration de l'activité beta-glucosidase (résultats des cultures induites) Clones Kcat (min"') Facteur amélioration 10H7 69,1 13 Clones du 1er tour 59B8 37,7 7 164A2 213,2 41 Protéine de référence 5,2 1 15 De même, les résultats montrent des améliorations d'activités enzymatiques très importantes par rapport à l'enzyme de départ (BGL1) pour les clones 10H7, 59B8 et 164A2 lorsque le cellobiose est utilisé comme substrat. 20 Exemple 2 : 2eme tour de shuffling Les séquences des gènes améliorés obtenu au premier tour de shuffling ont par la suite été soumises à un 25 deuxième tour de shuffling (toujours selon le procédé breveté décrit dans EP1104457B1). Afin d'augmenter la diversité génétique, au moins un gène codant pour une betaglucosidase ayant 70% identité a été ajouté. Dans cet exemple précis, le gène de la glucosidase putative de 30 Neurospora crassa (gène C) (SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 18 (séquence protéique)) a été utilisé. 1- Criblage à haut débit Un test de criblage à haut débit tel que décrit 35 précédemment (à l'exception de l'étape d'induction à l'IPTG, puisque l'amélioration apportée au premier tour de shuffling permet une détection de l'activité beta- glucosidase basée uniquement sur la fuite du promoteur) a 10 été effectué sur les clones obtenus à la suite de ce second tour de shuffling, afin de sélectionner les meilleurs clones, c'est-à-dire ceux présentant un facteur d'amélioration supérieur à 2 au niveau de l'activité beta- glucosidase lorsque comparés avec le clone 164A2. Dans ces conditions de criblage, une amélioration de l'activité beta-glucosidase par rapport à l'enzyme de référence (164A2) a été trouvée dans plusieurs clones, dont notamment les clones 100B11 (SEQ ID NO :9 et 10), 115E1 (SEQ ID NO : 11 et 12). 2-Détermination de l'amélioration de l'activité R- glucosidase. 2-1/ Sur le pNPGlc Afin de déterminer le kcat relatif, les activités des clones 100B11 et 115E1 ont été mesurées par le test d'activité tel que décrit précédemment. Le tableau 4 présente les valeurs des kcat ainsi que les facteurs d'améliorations obtenus pour les clones 100B11 et 115E1 dans ces conditions expérimentales. TABLEAU 4 : Amélioration de l'activité beta-glucosidase (résultats des cultures induites) Clones Kcat (min-') Facteur amélioration 100811 4342,8 3,0 Clones du 2eme tour 115E1 3989,2 2,8 Protéine de référence~~~ 1437,3 1 Les résultats montrent des améliorations d'activités enzymatiques très importantes par rapport à l'enzyme de 35 référence (164A2) et à (BGLI) (X60) pour les clones 100B11 et 115E1. 30 -2/ Sur le cellobiose L'amélioration d'activité des clones 100B11 et 115E1 a ensuite été confirmée sur un second substrat : le 5 cellobiose. Afin de déterminer le kcat relatif, les activités des clones 100B11 et 115E1 ont été mesurées par le test d'activité tel que décrit précédemment en utilisant le 10 cellobiose comme substrat. TABLEAU 5 : Amélioration de l'activité beta-glucosidase (résultats des cultures induites) Clones Kcat (min"') Facteur amélioration I OOBI I 387,2 1,8 Clones du 2eme tour 115E1 406,4 1,9 Protéine de référence 213,2 1 De même, les résultats montrent des améliorations d'activités enzymatiques importantes par rapport à l'enzyme de référence (164A2) pour les clones 100B11 et 115E1 lorsque le cellobiose est utilisé comme substrat. Exemple 3 : 3ème tour de shuffling Les séquences des gènes améliorés obtenu au deuxième tour de shuffling ont par la suite été soumises à un 30 troisième tour de shuffling (toujours selon le procédé breveté décrit dans EP1104457B1). Afin d'augmenter la diversité génétique, au moins un gène codant pour une betaglucosidase ayant 70% identité a été ajouté. Dans cet exemple précis, le gène de la glucosidase putative de 35 Neurospora crassa (gène C) (SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 18) et le gène de la glucosidase putative de Chaetomium globosum (gène A) (SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16) ont été utilisés. 21 15 20 25 1- Criblage à haut débit Un test de criblage à haut débit tel que décrit précédemment (à l'exception de l'étape d'induction à l'IPTG, puisque l'amélioration apportée au premier tour de shuffling permet une détection de l'activité betaglucosidase basée uniquement sur la fuite du promoteur) a été effectué sur les clones obtenus à la suite de ce troisième tour de shuffling, afin de sélectionner les meilleurs clones, c'est-à-dire ceux présentant un facteur d'amélioration supérieur à 2 au niveau de l'activité betaglucosidase lorsque comparés avec le clone 115E1. Dans ces conditions de criblage, une amélioration de l'activité beta-glucosidase par rapport à l'enzyme de référence (115E1) a été trouvée notamment pour le clone 149G7 (SEQ ID NO : 13 et 14). 2-Détermination de l'amélioration de l'activité R- 20 glucosidase. 2-1/ Sur le pNPGlc Afin de déterminer le kcat relatif, l'activité du clone 149G7 a été mesurée par le test d'activité tel que 25 décrit précédemment. Les résultats montrent une amélioration de l'activité enzymatique du clone 149G7 de 2,4 fois par rapport au clone 115E1 et de plus de 100 fois par rapport à BGL1. Exemple 4 : Activité 3-glucosidase améliorée en présence de glucose 35 Afin de comparer l'activité des clones 149G7, 100B11, 115E1 avec BGLI, l'activité de ces clones a été mesurée par le test d'activité tel que décrit précédemment sur le 30 pNPGlc en présence de 60g/L de glucose dans le milieu réactionnel (produit de la réaction). La figure 1 montre que le clone 149G7 retient 61% de 5 son activité en présence de 60g/L de glucose alors que la protéine parentale de référence BGLI n'en retient que 27%. Bien que la présente invention ait été décrite ci-dessus par le biais d'exemples de ses modes de réalisation 10 préférées, il est entendu qu'elle peut être modifiée sans se détourner de l'esprit et de la nature de l'invention telle que définie dans les revendications annexées. REVENDICATIONS1. Polypeptide isolé ou purifié ayant une activité betaglucosidase améliorée par rapport à l'activité beta- glucosidase de la protéine sauvage BGL1 (SEQ ID NO :2), caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés dans laquelle au moins un acide aminé est altéré par rapport à la séquence d'acides aminés SEQ ID No :2, ledit acide aminé altéré étant choisi parmi les positions 225, 238, 240 et 241 de la séquence d'acides aminés SEQ ID No :2. 2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins un acide aminé de la séquence d'acides aminés est altéré par rapport à la séquence d'acides aminés SEQ ID No :2, ladite altération étant choisie parmi Q225H, V238I, T240G et T241S. 3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit polypeptide comprend en outre au moins un acide aminé altéré supplémentaire choisi parmi les positions 97, 99, 100, 118, 119, 121, 123, 126, 127, 128, 130, 132, 134, 135, 140, 147, 151, 153, 163, 168, 173, 174, 177, 179, 182, 187, 193, 206, 207, 212, 217 et 621 de la séquence d'acides aminés SEQ ID No :2. 4. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit polypeptide comprend en outre au moins un acide aminé altéré supplémentaire, ladite altération étant sélectionnée dans le groupe consistant en V97I, Y99F, S100G, V118T, N119E, I121M, E123Q, Q126E, F127Y, I128L, E130A, V132A, A134G, S135C, S135V, I140L, P147A, T151I, Q153H, V163T, T168A, G173A, G173S, Q174E, N177E, I179L, V182A, V182N, T187C, L193V, N206D, P207V, L212M, T217L, L621F et L621T. 5. Polypeptide isolé ou purifié selon l'une quelconques des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que leditpolypeptide est sélectionné dans le groupe consistant en : - une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID No :4, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :12; SEQ ID NO :14 ou - une séquence en acides aminés SEQ ID NO : X présentant : i) un pourcentage de résidus identiques par rapport à la longueur de SEQ ID NO : 4, 6, 8, 10, 12 ou 14 d'au moins 70% d'identité, préférentiellement 75%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% ; ii) un pourcentage de résidus identiques par rapport à la longueur de SEQ ID NO : X d'au moins 70% d'identité, préférentiellement 75%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99%. 6. Acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il code pour au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Vecteur caractérisé en ce qu'il comprend un acide nucléique selon la revendication 6. 8. Cellule hôte isolée caractérisée en ce qu'elle comprend 25 soit au moins l'un des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, soit au moins l'un des acides nucléiques selon la revendication 6 ou soit au moins l'un des vecteurs selon la revendication 7. 30 9. Cellule hôte isolée selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Penicillium, Fusarium, Thermomonospora, Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, 35 Streptomyces, Yarrowia, Pichia et Saccharomyces. 10. Cellule hôte isolée selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce qu'elle est choisi parmi Trichoderma20reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus piger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Neurospora crassa, Humicola grisae, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum et leurs mélanges. 11. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour l'hydrolyse du cellobiose en glucose. 12. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la production de biocarburant. 13. Composition enzymatique agissant sur la biomasse lignocellulosique, ladite composition enzymatique étant produite par des champignons filamenteux et comprenant au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 14. Procédé de production de biocarburant à partir de la biomasse, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes . - mise en suspension en phase aqueuse de la biomasse à hydrolyser ; - ajout d'une composition enzymatique agissant sur la biomasse lignocellulosique selon la revendication 13 pour débuter l'hydrolyse ; - dosage des sucres libérés - séparation de la solution sucrée de la fraction solide non hydrolysée ; -fermentation de la solution sucrée ; - séparation du biocarburant du moût de fermentation. 15. Procédé de production de biocarburant à partir de la biomasse, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes . - mise en suspension en phase aqueuse de la biomasse à 5 hydrolyser ; - ajout simultané d'une composition enzymatique agissant sur la biomasse lignocellulosique selon la revendication 13 et d'un organisme fermentaire; - séparation du biocarburant du moût de fermentation.