FR 2937545 A1 20100430 FR 0805970 A 20081028 L'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un extrait associant le fruit du Baobab et le calice d'Hibiscus pour la préparation d'an produit cosmétique et/ou pharmaceutique à usage topique pour la peau et/ou les phanères caractérisé en ce qu'il est capable à la fois d'inhiber l'expression des sirtuines à de très faible dose de l'ordre de quelques millièmes de pourcent ainsi que la contraction musculaire à des doses de quelques pourcents tout en stimulant l'expression des protéines épidermiques Claudine-1 et HSP-90. L'invention se rapporte également à tout produit cosmétique pour la peau et les phanères comportant un tel extrait de fruit de Baobab et de calices d'Hibiscus capable à la fois d'inhiber les sirtuines et les contractions musculaires tout en stimulant l'expression des protéines épidermiques Claudine-1 et HSP-90. Claudine-1 est une protéine essentielle des jonctions serrées intercellulaires. structure d'attache très puissante entre les cellules épithéliales comme l'épiderme_ elle permet de renforcer la solidité de l'épiderme_ sa cohésion et sa fermeté. HSP-90 pour Heat Shock Protein-90 est une protéine de choc thermique ayant des effets chaperons sur les autres protéines. stimulée en cas d'agression par exemple thermique et leur permettant alors de mieux résister à ces agressions ou mème à des agressions de natures différentes comme les UV ou l'hypoxie . Il est connu d'après des études sur des organismes simples comme la levure de boulangerie (S eerevisiae). les nématodes (C. degans) ou les Drosophiles (D. nelanogaster) que leur longévité peut être augmentée par une restriction calorique et par la stimulation de certains gènes de la famille des Sirtuines (SIR2 pour Bilent information regulator 2) (voir par exemple Howitz et al. Small molecules activators of sirtuins extend Saccliaronivices cervisiae lifespan. Nature 423.191-196. 2003) Ces gènes sembleraient avoir été conservés lors de l'évolution et ils sont présents chez les mammifères y compris l'Homme où au moins 8 gènes auraient été identifiés. Le gène Sirtl est l'équivalent du gène Sir2 de la levure. Ils sont exprimés en autres dans la peau par les kératinocytes et les fibroblastes. Il semble donc logique de penser que la stimulation de ces gènes et par exemple Sirt 1 puisse améliorer la longévité de la peau et son vieillissement (Sirtuin activators ntinùc calorie restriction and delay ageing in metazoans JG.Wood et al..:Vature 2789, 1-4. 2004) et (Composition for manipulating the lifespan and stress response of tells and organisms. patent 20050136537). Les sirtuines agissent en désacétylant diverses molécules qui sont alors inactivées et particulièrement la protéine suppresseur de tumeur p 53 ainsi que les facteurs de transcription FOXO (voir par exemple pour p53 : Langley E.. Human SIR2 deacetylates p53 and antagonizes PML/p53-induced cellular senescence. 17we EtiBOJournal 21, 2383-2396. 2002 et pour FOXO : Brunet A. et al.. Stress-Dependent Regulation of FOXO Transcription Factors b\ the SIRT1 Deacetylase Science 303: 2011-2015.2004). P53 (ou TP 53 pour tumor protein 53) souvent dénommé � gardien du génome � joue un rôle central dans les réponses cellulaires aux stress génotoxiques. Elle déclenche. en fonction du contexte. l'arrêt du cycle cellulaire ou l'apoptose. On nomme apoptose (ou mort cellulaire programmée. ou suicide cellulaire). le processus par lequel des cellules déclenchent leur auto destruction en réponse à un signal. C'est une mort cellulaire physiologique. génétiquement programmée, nécessaire à la survie des organismes pluricellulaires. Elle est en équilibre constant avec la prolifération cellulaire. Le gène p 53 est muté dans au moins 50% des cancers et lorsqu'il n'y a pas de mutation c'est que les cancers ont réussi de contourner l'effet tumeur suppresseur de cette protéine ce qui montre bien que cette molécule est de tous les combats. FOXO (pour Forkhead box sub-group O) est une famille de facteurs de transcription comprenant chez l'Homme 4 membres (FOXOI, FOXO3, FOXO4 et FOXO6). Les fonctions cellulaires des FOXO qui sont l'arrêt du cy cle cellulaire et l'apoptose sont en faveur d'une fonction de suppresseur de tumeur comme pour p53. Ils participent aussi à la résistance cellulaire face au stress oxydatif, activité qui n'est pas perdue en cas de désacétylation par les sirtuines. Lorsque p53 et FOXO sont inactivés, la formation de tumeurs est accélérée (voir par exemple pour FOXO. Hu MC et al. IkappaB kinase promotes tumorigenesis through inhibition of forkhead FOXO3a. Ce/1 117. 225-37, 2(104 et voir par exemple pour p53. Larsen CJ. The ARF-p53 pathway: a fine of defence against oncogenic signais. Pathol Bro1;48:308-17. 2000). Il est donc trivial que toute activation ou stimulation des sirtuines se traduit par une diminution d'activité de p53 et de FOXO et qu'inversement toute inhibition des sirtuines se traduit par une augmentation d'activité de ces gènes suppresseurs de tumeurs. Tout se passe comme s'il y avait un équilibre entre d'un côté apoptose. arrêt des divisions cellulaires. suppression des tumeurs et de l'autre réparation cellulaire et longévité. Un peu comme si on devait choisir. au moins au niveau cellulaire, entre moins vieillir avec un risque de cancer plus élevé ou moins de risque de cancer mais une longévité plus courte. Ainsi le brevet 20050136537 � Composition for manipulating the lifespan and stress response of tells and organisms � décrit deux stratégies opposées pour : - soit stimuler par des agents activateurs de sirtuin (STACs pour Sirtuin activating compounds) afin de réduire l'activité de p53. l'apoptose et augmenter la longévité des cellules et des organismes. - soit par des agents inhibiteurs de sirtuine d'augmenter l'activité de p53. et l'apoptose au niveau cellulaire ou des organismes. Le fait que les sirtuines perturbent certaines transcriptions et sensibilisent à certains facteurs provoquant la mort cellulaire comme le facteur tumoral nécrosant alpha (TNF-alpha) font que les inhibiteurs de sirtuines agissent dans certaines situations également comme des facteur de protection cellulaire (voir à ce sujet Yeung. F. et al. Modulation of NF-kappaB-dependent transcription and cell sur ival b) the SIRTI deacetylase. E.MBO J. 23. 2369-2380, 2004) Les STACs activateurs de sirtuines sont des molécules de petite taille dont les plus connues dérivent du stilbène. Les stilbènes sont une classe de molécules ayant un certain nombre de propriétés biologiques et qui sont assez répandus dans les végétaux. Le plus connu et le plus étudié est le resvératrol. qui est le 3,4.5'trihydroxy-stilbène, et que l'on trouve dans un grand nombre de végétaux. Le resvératrol est revendiqué pour de nombreuses activités biologiques: -Vaso-relaxant. "Endothelium-dependant vasodilatator effects of Resveratrol. a natural phenolic component of red veines. in rat aorta" Orallo et Al. Cardiovascular pharmacologv PA-56 pp.127. -Anti-oxydant. Action anti-oxydante du resvératrol sur la lipoperoxydation J.P. Blond et Al. Sciences des Aliments. (1995). 347-358 . -Anti-inflammatoire. Molecular and cellular effects of Resveratrol in inflammation J. Schwager et Al. MIS 2002, Rennes. France. mai 2002. 11 est également revendiqué dans des brevets de produits de soin de la peau comme le brevet FR 2766176 qui revendique certains esters de resvératrol ou d'oligomères pour leur activité anti-radicalaire, anti-oxydante, vasoprotectrice. Le brevet FR 2777186 (L'Oréal) revendique de 0.001 à 10%d'hydroxystilbènes et dérivés hydroxyalkylés pour stimuler la synthèse de collagène, stimuler la prolifération des fibroblastes. et inhiber l'expression des protéases et des métalloprotéinases de la matrice extracellulaire du derme. L'Oréal revendique les mêmes composés dans les mêmes proportions dans le brevet FR 2777184 pour la réduction de l'adhésion des micro-organismes sur la peau et les muqueuses. et dans le brevet FR 2277183. l'augmentation de la desquamation de la peau et enfin dans le brevet FR 2796278 l'inhibition de la glycation des protéines. Le brevet US 6.085.821 revendique le resvératrol et le picéatannol comme inhibiteur de myéloperoxydase. Le brevet FR 15098000 décrit le resvératrol et ses oligomères comme inhibiteurs de l'enzyme 20 5alpha-réductase. Le brevet FR 2867977 décrit le resvératrol et ses dérivés comme inhibiteur des contractions musculaires. L'epsilon-Viniférine est revendiquée dans des brevets (déjà cités) aux côtés du resvératroI. L'epsilon-Viniférine est également revendiquée dans le brevet FR 2844714 comme hormone-like et 25 dans le brevet FR 2844 714 pour prévenir et/ou lutter contre des affections diverses de la peau et de ses annexes. affections comme la diminution de l'épaisseur. de la souplesse. de l'élasticité. de la fermeté de la peau. ou bien comme des infections microbiennes. comme l'excès de kératine. ou pour lutter contre la pollution ou la glycation. L'epsilon-Viniférine qui est un dimère (oligomère) du resvératrol. est citée dans la littérature 30 scientifique comme ayant un certain nombre d'activités biologiques : -Protection des hépatocytes contre les agressions de CC14 (Oshima Y. et al. Evperimenria: vol 51: n pp 63-66: 1995) -Activité anti-bactérienne (Sultanbawa et al.. Phvtochenristrv; 26:3:1987: 799-802) -Activité anti-tumorale et hépatoprotectrice (Masayaoshi Ohyama et al.. Bionrganic _lfedicinal 35 Chemistrv Letters: 9:1999:3057-3060) -Anti-fongique (Baia A.E.A et al. Journal of Phvsiopathologv:.2000. vol 148, n 1. pp 29-32). L'inconvénient de l'utilisation de substances ayant des effets intéressants mais provocant en plus une stimulation des sirtuines avec des composés comme les resvératrol . l'epsilonviniférine ou autres (STACs) est une déacétylation, par les sirtuines. de la protéine suppresseur de 40 tumeur p53 et des facteurs de transcription FOXO se traduisant par une augmentation néfaste du maintien de cellules problématiques pouvant générer des tumeurs alors que normalement elles auraient dû être éliminées (apoptose) ou stoppées dans leur multiplication (arrêt du cycle cellulaire). Ce risque est d'autant plus important lorsque les cellules ou les organismes sont soumis à 5 un stress important dépassant ou saturant les limites de réparation de la cellule ou de l'organisme comme cela se passe lorsque la peau est soumise aux irradiations solaires. Ce danger à d'ailleurs été confirmé dans deux publication récentes : Wenluai Zhao et al. Negative regulation of the deacetylase SIRTI b} DBCI. Nature 451, 587-590, 2008 et Ja-Eun Kim et al.. DBCI is a negative regulator of SIRTI.. Nature 451, 583-586,2008 : dans lesquelles il est 10 expliqué que BBCI (Deleted in Breast Cancer 1) inhibe l'activité de SIRTI et que sa carence augmente l'activité de SIRTI et donc la déacét}dation de p53 et une incidence de cancer accrue. Il est donc également trivial que toutes ces substances aux propriétés intéressantes mais qui activent les sirtuines pourraient être avantageusement associées à un ou plusieurs inhibiteurs de sirtuine afin de colliger cet inconvénient tout en bénéficiant des effets bénéfiques de ces 15 substances. De manière tout à fait surprenante l'inventeur a constaté qu'une association de deux parties de plantes afiicaines . le fruit du Baobab d'une part et le calice d'Hibiscus d'autre part pouvaient avoir à des concentrations relativement faibles des effets d'inhibition de sirtuines et particulièrement de la SIRT 1 humaine présente dans la peau et dans les cellules épidermiques 20 ainsi que des effets inhibiteurs des contractions musculaires tout en stimulant l'expression des protéines épidermiques Claudine-1 et HSP-90. Il a de plus constaté que des traitements topiques réalisés à partir de cette association amélioraient l'état général de la peau. Il a également remarqué qu'un tel traitement topique réalisé à partir de cet extrait de fruit de Baobab et de calices d'Hibiscus permettait également de développer le buste. de repulper 25 avantageusement les zones cutanées ainsi traitées et d'en effacer les marques du vieillissement en comblant les creux du relief cutané. Il a aussi remarqué que cette association améliorait l'état général de la peau après des agressions comme celles provoquées par une exposition solaire. La présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un extrait de fruit de Baobab et 30 de calices d'Hibiscus pour la préparation d'un produit cosmétique etlou pharmaceutique caractérisé en ce qu'il est capable à la fois d'inhiber l'expression des sirtuines à de très faible dose de l'ordre de quelques millièmes de pourcent ainsi que la contraction musculaire à des doses de quelques pourcents tout en stimulant l'expression de Claudine-1 et de HSP-90. L'invention se rapporte également à tout produit cosmétique pour la peau et les phanères 35 comportant un tel extrait associant le fruit de Baobab et les calices d'Hibiscus capable à la fois d'inhiber les sirtuines et les contractions musculaires tout en stimulant l'expression des protéines épidermiques Claudine-1 et HSP-90. L'invention permet également de protéger la peau de la face des effets disgracieux des contractions répétées des muscles du visage appelés muscles peauciers par son action d'inhibition 40 des contractions musculaires. II est de plus à noter que l'association entre ces deux extraits est plus stable que chaque extrait pris séparément. La composition cosmétique et/ou pharmaceutique selon l'invention peut se présenter dans des contenants adéquats tels que flacons, bouteilles. pots. boites. gélules. capsules. ampoules. lingettes. crayons. porte-sticks. support non tissé imprégné d'une émulsion lyophilisée ou non La composition cosmétique et/ou pharmaceutique contenant l'extrait de fruit de Baobab et de calices d'Hibiscus de façon préférentielle la variété à fibre non colorées peut être associée et de manière nullement limitative une ou plusieurs des molécules ou extraits stimulant les sirtuines du groupe constitué par des isoflavones. des flavones. des flavanones . des cathéchines et tannins. des chalcones, des stilbènes. des oligostilbènes. des stibènoïdes et des anthocyanidines comme par exemple le resvératrol, l'epsilon viniférine. le picéatannol, la pinosylvine, l'isoliquirigénine, la butéine. la fisétine et la quercétine. Certains extraits de fenugrec. certaines protéines ou peptides de riz. et en général toutes substances entrant dans la famille des STACs (Sirtuin activating compounds) comme définie dans l'article (Howitz et al.. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan..Vature -125. 191-196. 1 l September 2003) ou en général tout autre composé dérivant des molécules précédentes (comme leurs acétates. glucosides ou oligomères) et ayant un effet de stimulation et/ou d'activation des sirtuines pourront également être préférés. Ceci afin de contrebalancer les effets secondaires d'une stimulation de sirtuine tout en pouvant bénéficier des autres propriétés de ces substances telles que décrites ci-dessus. L'effet de stimulation et d'activation des sirtuines pourra être mesuré de la manière connue de l'homme de l'art et comme par exemple par un dosage d'activité histone déacetylase (HDAC) comme décrit dans l'article déjà cité (Howitz et al., Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature 425, 191-196, 11 September 2003) et adapté aux fibroblastes et/ou aux kératinocytes. Les extraits végétaux contenant les flavonoïdes cités ci-dessus et activant les sirtuines seront également à préférer lors de la constitution des formules contenant au moins un extrait de fruit de Baobab et de calices d'Hibiscus destiné à contrebalancer les effets de stimulation des sirtuine afin de conserver uniquement les autres avantages de ces composés comme les effets anti- rides , fermeté. éclat du teint suivant la substance considérée et par exemple sans que cela soit limitatif le concentré de vin rouge produit comme arôme alimentaire ou des extraits de plante comme le brocolis, le thé, les noix. de cacahouète, de myrtille. de sarment de vigne. de feuille et bourgeons de vigne. La composition cosmétique. pharmaceutique ou dermo-cosmétique contenant l'extrait de fruit de Baobab et de calices d'Hibiscus de façon préférentielle peut être associée a un autre agent actif et de manière nullement limitative une ou plusieurs des molécules ou extraits inhibant les sirtuines du groupe constitué par nicotinamide, l'acide nicotinique, la niacine, le N-methyl nicotinamide, les différents nicotinates (ethyl. methyl, tocophéryl), les sphingolipides dont la sphingosine, la phytoshingosine et l'ascorbate de phytosphingosine, les dérivés de dihydrocoumarine. le sirtinol, la splitomicine. ou de manière générale tout autre composé ayant un effet d'inhibition des sirtuines et/ou dérivant des molécules précédentes. La composition cosmétique et/ou pharmaceutique selon l'invention peut être réalisée sous différentes formes, en particulier sous la forme d'une émulsion huile dans eau (HIE) ou eau dans huile (E/H). d'émulsion multiple (H/E/H. E/H/E). de microémulsion, d'émulsion à phase gémellaires, d'émulsion PIT, de nano-émulsion. de pseudo-émulsion (dispersion stable de deux phases non miscibles au moyen de gélifiant). de gel aqueux, de gel gras, de gel hydro-alcoolique. de phase grasse. de suspension de savon liquide ou solide. de solution moussante ou non. de gel ou d'émulsion lyophilisée et/ou d'une des formes précédentes contenant des microcapsules. des nanocapsules, des liposomes, des éthosomes. Des poudres compactes ou non de type maquillage pourront également être réalisées. La composition cosmétique et/ou pharmaceutique selon l'invention peut se présenter sous forme de crèmes, de liquides. de pâtes, de lotions, d'émulsions, de lotions, d'huiles. de gels. de solides. de poudres. de masques. de stick. de sprays, d'aérosol. La composition cosmétique et/ou pharmaceutique selon l'invention peut se présenter. afin d'améliorer l'état de la peau de manière plus globale, sous forme de formule utilisable par voie orale comme par exemple gélules. comprimés, sirops A titre illustratif et non limitatif. on décrira ci-après différents procédés d'obtention possibles d'un extrait de fruit de Baobab et de calices d'Hibiscus pouvant être utilisés dans le cadre de la présente invention.. Exemple 1 Le fruit du baobab est d'abord cassé pour en extraire la partie interne blanche poudreuse comportant également des graines et des fibres. Le solvant, eau pure. différentes solutions aqueuses_ alcool ou mélange de deux de ces solvants, peut ensuite être ajouté directement et après agitation le liquide est séparé. par centrifugation ou simple filtration, des graines et des fibres constituant 2/3 de la masse totale. Ce liquide est ensuite lyophilisé ou atomisé ou encore déshydraté par tout moyen respectant sa composition comme la zéodratation utilisant la zéolite comme agent déshydratant. Un autre moyen est de piler. mécaniquement ou non, l'intérieur du fruit afin que la poudre blanche se détache des graines et des fibres et puisse être recueilli par tamisage. Cette poudre peut être utilisée directement et se dénommera alors poudre de fruit de Baobab ou être ensuite extraite par de l'eau pure. différentes solutions aqueuses. de l'alcool ou par un mélange des deux comme par exemple un mélange 60% alcool et 40% eau sans que cet exemple soit limitatif. La solution ainsi obtenue est centrifugée afin d'en recueillir le surnageant puis lyophilisée ou atomisée ou encore déshydraté var tout moyen respectant sa composition comme la zéodratation 35 utilisant la zéolite comme agent déshydratant La poudre ainsi obtenu par chacun des procédés sera dénommée extrait natif de fruit de Baobab. Le fruit du Baobab utilisé proviendra préférentiellement du Sénégal et donc de Adansonia digitata. mais on pourra utiliser indifféremment des fruits d'autres espèces de Baobab (dénommées alors Adansonia sp.) comme par exemple et sans que cela soit limitatif. Adansonia font'. Adansonia 40 madagascariensis. Adansonia gregorii. Adansonia grandidieri, Adansonia za. et Adansonia suarezensis. La plante Hibiscus sabdariffa est cultivée sans engrais ni pesticide dans des parcelles spécialement dédiées à cette culture depuis plusieurs années et ce jusqu'au stade de maturation des fruits pendant lequel la partie correspondant au calice devient charnue et peut être récoltée puis séchée de préférence pendant ou après la période de fructification. Les fruits sont également récoltés et seront semés pour assurer la récolte suivante. II existe plusieurs variétés d'Hibiscus caractérisées par la couleur des fibres de la plantes et du calice. La variété blanche et non colorée sera préférée afin d'éviter une coloration rendant plus difficile la formulation. Ces calices secs sont ensuite soit broyés afin d'obtenir une fine poudre soit extrait directement par un solvant. Le solvant, eau pure, différentes solutions aqueuses. alcool ou mélange de deux de ces solvants comme par exemple un mélange 60% alcool et 40% eau sans que cet exemple soit limitatif. peut ensuite être ajouté directement aux calices séchés ou à la poudre résultant de leur broyage. Après agitation le liquide est séparé, par centrifugation ou simple filtration Ce liquide est lyophilisé ou atomisé ou encore déshydraté par tout moyen respectant sa composition comme la zéodratation utilisant la zéolite comme agent déshydratant. La poudre ainsi obtenu par chacun des procédés sera dénommée extrait natif de calices de Hibiscus. L'extrait natif de fruit de Baobab et l'extrait natif de calices d'Hibiscus peuvent être ensuite mélangés en différente proportion, idéalement et sans que cela soit limitatif 50/50 mais aussi 40/60 ou 30/70. Cette association entre ces deux extraits natifs sera appelé extrait natif Sénégauline dans ce qui suit. Cet extrait natif Sénégauline pourra être resolubilisé dans un solvant facilitant son incorporation dans une formulation à destination topique comme par exemple et sans que cela soit limitatif à de la glycérine. Dans ce cas l'extrait natif ainsi solubilisé s'appellera extrait Sénégauline. Exemple 2 Etude de la concentration efficace pour inhiber la synthèse endogène des sirtuines dans les cellules épidermiques (kératinocytes) Type cellulaire: Normal human epidermal kératinocytes (NHEK) au troisième passage 30 Condition de Culture : 37°C. 5% CO, Milieu de Culture : Kératinocytes-SFM (Invitrogen 17005-034) supplémentés par Epidermal Growth Factor (EOF) 0.25 ng/ml - Pituitary extract (PE) 25 ug/ml (Invitrogen 3700015) Gentamycine 25 ug/ml (Sigma G1397) Milieu d'étude: Kératinocyte-SFM (Invitrogen 17005-034) supplemented with Gentamycine 25 35 ug/ml (Sigma G1397) Extrait testé Aspect Solution Dilution Concentration testée Extrait Sec Natif Poudre 1 % Milieu 0.008% Sénégauline d'étude i n° Batch 2071030 I Dans cette étude l'extrait natif Sénégauline correspond à un mélange 50/50 d'extrait natif de baobab et d'extrait natif de calices d'hibiscus. Culture et traitement: Les cellules sont ensemencées et cultivées dans le milieu de culture décrit ci-dessus jusqu'à confluence et sont ensuite placées dans le milieu d'étude. Les cellules sont ensuite traitées ou non (contrôle) avec l'extrait à tester et cultivées encore 24h. Chaque condition expérimentale est répétée trois fois (triplicate). A la fin du temps d'incubation_ les cellules sont lavées avec une solution de PBS (Invitrogen 14190094). 300 ul de TriReagent sont ajoutés et les cellules sont immédiatement congelées à -80°C Quantitative RT-PCR : Réverse Transcription (RT) : Les ARN totaux sont extraits de chaque échantillon en utilisant le Tri-reagent suivant les recommandations du fournisseur. Les traces de ADN potentiellement contaminantes sont éliminées par utilisation du système ADNfree (Ambion ref 1906) La réverse-transcription de l'ARNm est réalisée en présence d'oligo(dT) et de Superscript Il reverse transcriptase (Invitrogen). PCR anale se en temps réel : La PCR (Polymerase Chain Reactions) est réalisée en triplicate utilisant le � LightCyclerR � system (Roche Molecular S) stems Inc.) en suivant les recommandations du constructeur et qui fonctionne en 2 étapes faisant intervenir un � thermocycler� et un fluorimètre (longueur d'onde détectée: 521 nm). Les primers suivants ont été utilisés pour amplifier les fragments correspondant aux marqueurs sélectionnés. Nom du Gene Abréviation Gène Bank ADNc bp 23-kDa highly basic protein:RPL13A RPL13A NM 002423 483 Sntuin 1 SIRT1 NM 012238 202 Dans cette expérience le gène RPL13A (Ribosomal Protein L I3A) a été utilisé comme marqueur de référence Résultat de la PCR quantitative : L'incorporation de la fluorescence dans l'ADN est mesurée en 25 continu pendant les cycles PCR.. La courbe de l'intensité de la fluorescence en fonction du cycle de PCR permet de déterminer une expression relative (RE) pour chaque marqueur. La valeur retenue pour le calcul de la RE est le rendement maximum de la réaction. Ainsi pour un marqueur donné plus le nombre de cycle est grand plus faible est la quantité d'ARNm. Treatment Cone. RPL13A SIRT1 RPL13A SIRT1 RE SIRT1 ' ~~• Control Cycles Cycles RE (AU) (AU) RPL13A 19.20 25.58 Contrat - 18.94 25.65 2.235 1.958E-02 9.35E-03 100 18.32 25.59 Extrait Sec Natif 17.68 25.65 SENEGAULINE 0.008% 17.86 25.65 4.511 1.886E-02 4.19E-03 45 17.74 25.68 Effets de l'Extrait Sec natif Sénégauline sur l'expression des SIRTI après 24h de traitement. Résultats comparés au marqueur RPL13A (gène de référence). 30 Conclusion : L'extrait sec natif de Sénégauline à une concentration de 0.008% (quelques millièmes de pourcent) réduit l'expression de la sirtuine 1 (SIRT-1) des cellules épidermiques (kératinocytes) de 55%. Exemple 3 Objectif : Evaluer l'effet d'an extrait de fruit de baobab et de calices d'Hibiscus sur les contractions musculaires (effet botox-like) Méthodologie : L'évaluation de l'effet botox litre est faite sur une co-culture nerf-muscle capable de contractions spontanées. Le principe de cette méthode est basé sur la capacité de l'extrait de bloquer ou de diminuer la fréquence de ces cellules musculaires humaines. Un comptage des contractions est fait à des temps définis avant et après l'application de l'extrait. L'effet du produit est validé s'il y a une modification significative des contractions musculaires dans au moins 2 des 3 puits de culture. Résultats : Temps d'incubation Produit testé 2h 6h 24h EXTRAIT SEC NATIF bloque bloque bloque Sénégauline 5 % Batch 2071030 Conclusion : Dans les conditions expérimentales. le produit extrait sec de Sénégauline. testé à 5% bloque les contractions musculaires dans chacun des 3 puits testés. 2 heures. 6 heures et 24 heures après incubation. Exemple 4 Amélioration de la stabilité de chacun des extraits de Baobab et d'Hibiscus par l'association des deux. Dans un premier temps 300 grammes de poudre de fruit de baobab sont mélangés à un litre d'eau à 60 degré Celsius. Après une heure d'agitation et une heure de décantation le surnageant est filtré sur filtre 0.2 micromètre et la solution limpide est conservée à température ambiante dans un récipient hermétique et stérile. Après une semaine on note un précipité blanc attestant d'un manque de stabilité. Suivant le même procédé les capitules d'Hibiscus produisent une solution limpide jaune lorsqu'il s'agit de la variété d'Hibiscus à fibres incolores. Après une semaine la solution est troublée par un début de floculation. Par contre lorsque. après extraction, les 2 extraits sont mélangés. la solution ainsi obtenue est limpide et est plus légèrement colorée que l'extrait d'Hibiscus mais surtout elle reste stable dans le temps. Exemple 5 Selon un premier mode de réalisation de l'invention la composition est composé de : - Acrylate C10-30 0.50 g - Resvératrol 0.001 g - Ethos} digly col 5.00 g !O -Extrait vin rouge \20g -Abmd 2.08g '0uorcdine __________________ 0.0!8 5 -Butylène glycol 0.l4 g 'cur*oomro K/26g 'Eu/a l005 g 'Coueoouteur /i867g -Buüe dcomcuduoia 0jg lO 'Lécithine hydrogénée 0.O9Q Cyclométhicone - -- 020g '7EA 99% -----------------.K62g 'Extrait natif doS6négmùiuc 0,00 8g 'Comoaum 0.0002g 15 - Eau déminéralisée qxp 100g Après 3 semaines d'utilisation plus de 78% des utilisateurs perçoivent une atténuation d'au moins une marque de vieillissement comme les rides, l'éclat du teint. l'hydratation de la peau et de la fermeté. Selon un second mode de réalisation, la composition cosmétique ou pharmaceutique peut 20 ètre composée de : ' Curhos}pol}médglènooupolymère oorboxüiguo 0...0.40& ' Diéduam)umiucod)lphosphate l.j0g ' dodécanol .50 g ' Alcool nd}iquc L00â 25 ' Huile minérale 2/Ng ' Acide stéarique LOUg ' Alcool mtégüguodhox`!é (20E) K]0g ' Alcool cém-oéau!liqux L80g ' Conservateur 0.15 g 30 ' Huile de nmcudumia K50ê ' /ucuuunouomune 0.60g - C)olooé0üouoc !2.00g - Dinéthicuu000po^ol l00g ' Phénd!doédoouo I00ê 35 ' Extrait g13 colique dc86négmùino l00g ' Sépigel 305 1/Ng ' Butylène gl)co 6.00g ' Mica et oxyde dctitane ]/mg - Eau déminéralisée qsp UNg Après ]semaines d'utilisation plus de 72% des utilisatrices perçoivent une amélioration d'au moins un paramètre comprenant. le volume de la poitrine, la fermeté des seins. ouleur tenue. Quatre autres exemples de réalisation sont également exposés ci-après : 1.) Emulsion H/E : - Paraffine liquide 6 g -Lanoline liquide 3 g - Arlacel 165 (commercialisé par Atlas) 6 g - Tween 60 (commercialisé par Atlas) 2 g - Alcool céty lique 1.2 g - Acide stéarique 2.5 g - Rétinyl palmitate 0.5 g - Huile de silicone volatile 10 g - Triéthanolamine 0.1 g - Conservateur 0.3 g - Antiox} dants 0.3 g -Extrait natif de Sénégauline 2,5 g - Extrait glycolique de Sénégauline 2,5 g - Eau déminéralisée qsp 100 g Après une semaine d'utilisation au niveau des pommettes plus de 80% des utilisateurs perçoivent un effet de comblement. leurs pommettes sont comme repulpées. 2.) Crème aux liposomes : - Alcool cétt ligue 4 g - B-sitostérol 4 g - Dicétyl phosphate 0.5 g - Conservateur 0.3 g 2.5 - Carbopol 981 (commercialisé par Goodrich) 0.2 g - Triéthanolamine 0.2 g - Phospholipide 0.05 g - Resvératrol 0.001 g - Extrait glycériné de fruit de Sénégauline 1.5 g 30 - Extrait de sarment de vigne 1g - Eau déminéralisée qsp 100 g Après 3 semaines d'utilisation la peau est plus radieuse et en meilleur état pour plus de 70% des utilisateurs 3.) Emulsion E!H : 35 - Protégin (commercialisépar Goldschmidt) 19 g - Glycérine 3 g - Huile de vaseline 8 g - Sulfate de Mg 0.5 g - Extrait natif de Sénégauline 3 g 40 - Rétinyl palmitate 0.02 g - Conservateur 0.2 g -Eau déminéralisée qsp 100 g Après 15 jours d'utilisation la nuit la peau est plus ferme et plus lisse pour plus de 80 % des utilisateurs 4.) Emulsion gel H/E - Carbopol 981 (commercialisé par Goodrich) 0.6 g - Alcool éthylique 15 g - Huile de silicone volatile 3 g - Huile de pm'cellin 7 g 1 0 - Conservateur 0.3 g - Parfum 0.4 g - Nicotinate de tocopherol 0.1 g - Triéthanolamine 0.2 g - Extrait glyceriné de fruit de Sénégauline 1 g 15 - Eau déminéralisée qsp 100 g Après une semaine d'utilisation suivant une exposition solaire. plus de 75% des utilisateurs trouvent leur peau moins agressée. 5.) Poudre de maquillage. De manière non limitative un exemple de poudre non compactée et ayant la composition 20 pondérale suivante est donnée: - 20 à 94% de mica, - 5 à 45% de poudre de polymères. - 1.5 à 5% d'huile. - o à 4% de savons métalliques. 25 - 0.05 à 1% de poudre de Sénégauline - 0.2 à 1% d'ADN hautement polymérisé - o à 30% d'agents nacrant. -1) à 5% d'autres ingrédients usuels. - et des quantités suffisantes de parfum et de pigments, la somme des pourcentages des ingrédients 30 cités étant égale à 100. Cette poudre de maquillage peut ètre associée à chacune des formules pour former un renfort d'efficacité à utiliser le. jour lorsque la peau est la plus agressée. Exemple 6 Evaluation de l'expression des gènes codant pour Claudines-1 et HSP-90 par micro-puces à ADN (cDNA- 35 array) sur cellules épidermiques humaines (kératinoc) tes). Type cellulaire: Normal human epidermal kératinocytes (NHEK) au troisième passage Condition de Culture : 37°C. 5% CO, Milieu de Culture : Kératinocytes-SFM (Invitrogen 17005-034) supplémentés par Epidermal Growth Factor (EOF) 0.25 ng/ml - Pituitary extract (PE) 25 ug/ml (Invitrogen 3700015) 40 Gentamycine 25 ug/ml (Sigma G1397) Milieu d'étude: Kératinocyte-SFM (Invitrogen 1700 -031) supplemented with Gentamvcine 25 ug/ml (Sigma G1397) Extrait testé Aspect Solution Dilution Concentration testée Extrait Sec Natif Poudre 1% Milieu 0.008% Sénégauline d'étude Batch n° 2071030 1 Culture et traitement: Les cellules sont ensemencées et cultivées dans le milieu de culture décrit ci-dessus jusqu'à confluence et sont ensuite placées dans le milieu d'étude. Les cellules sont ensuite traitées ou non (contrôle) avec l'extrait à tester et cultivées encore 24h. Chaque condition expérimentale est répétée trois fois (triplicate). A la fin du temps d'incubation. les cellules sont lavées avec une solution de PBS (Invitrogen 14190094), 300 ul de TriReagent sont ajoutés et les cellules sont immédiatement congelées à - 80°C Analyse par micro-puce à ADN : L'ARN messager est extrait de chaque culture de kératinocytes (NHEK) et mis en contact avec des sondes ADNc spécifiques fixées de manière covalente sur des micro-puces et des ADNc marqués. L'analyse est réalisée par quantification directe de la radioactivité sur chaque spot après 72 h. Résultats : Dans ces conditions expérimentales et donc au niveau des cellules épidermiques. l'expression du gène Claudine-1 est stimulée de + 138% et celle du gène HSP-90 de + 212% par l'extrait natif Sénégauline à 0.008%. Claudine-1 est une protéine essentielle des jonctions serrées intercellulaires. structure d'attache très puissante entre les cellules épithéliales comme l'épiderme. elle permet de renforcer la solidité de l'épiderme. sa cohésion et sa fermeté. HSP-90 pour Heat Shock Protein-90 est une protéine de choc thermique ayant des effets chaperons sur les autres protéines. stimulée en cas d'agression par exemple thermique et leur permettant alors de mieux résister à ces agressions ou même à des agressions de natures différentes comme les UV ou l'hypoxie.25 REVENDICATIONS1.) Extrait de fruit de Baobab et de calice d'Hibiscus, dans ou pour la préparation d'uune composition cosmétique et pharmaceutique caractérisé en ce qu'il est capable à la fois. -d'inhiber l'expression des sirtuines dans les cellules épidermiques à de très faibles doses de l'ordre de quelques millièmes de pourcent et à la fois , -d'inhiber la contraction des fibres musculaires à des doses de quelques pourcents tout en -stimulant l'expressions des protéines épidermiques Claudine-1 et HP-90. 2.) Extrait selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que l'extrait de fruit de Baobab est un extrait de fruit d'Adansonia digitata et que l'extrait de calices Hibiscus est un extrait de calices Hibiscus sabdariffa à fibre non coloré. 3.) Extrait de fruit de Baobab et de calices d'Hibiscus selon l'une les revendications 1 à 2 caractérisé en ce que cette association en mélange est plus stable dans le temps que chacun des extraits pris séparément. 4.) Composition cosmétique et pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle comprenne en outre un autre agent actif comme par exemple une ou plusieurs substances du groupe constitué par le nicotinamide, l'acide nicotinique. la niacine. le N-meth) 1 nicotinamide. les différents nicotinates (ethyl, methyl, tocophéryl), les sphingolipides dont la sphingosine, la phytoshingosine et l'ascorbate de phytosphingosine. les dérivés de dihydrocoumarine. le sirtinol, la splitomicine. ou de manière générale tout autre composé ayant un effet d'inhibition des sirtuines et/ou dérivant des molécules précédentes . 5.) Composition cosmétique et pharmaceutique selon les revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle comprenne en outre un autre agent actif comme par exemple une ou plusieurs substances du groupe constitué par constitué par des isoflavones. des flavones. des flavanones. des cathéchines et tannins, des chalcones. des stilbènes. des oligostilbènes. des stilbènoïdes et des anthocyanidines ayant un effet de stimulation et/ou d'activation des sirtuines . 6.) Composition cosmétique et pharmaceutique selon les revendications 1 à 5 caractérisés en ce que la compositions est sous la forme d'une émulsion huile dans eau (HIE) ou eau dans huile (E/H). d'émulsion multiple (HIE/H. E/H/E). de microémulsion. d'émulsion à phase gémellaires. d'émulsion PIT_ de nano-émulsion. de pseudo-émulsion (dispersion stable de deux phases non miscibles au moyen de gélifiant). de gel aqueux. de gel gras, de gel hydroalcoolique. de phase grasse. de suspension. de savon liquide ou solide. de solution moussante ou non, de gel ou d'émulsion lyophilisée et/ou d'une des formes précédentes contenant des micro-capsules . des nano-capsules. des liposomes. des éthosomes et pouvant se présenter sans que cela soit limitatif en crèmes. liquides. pâtes. lotions. émulsions. huiles. gels. sirops, solides. poudres. masques. stick, comprimés. sprays. aérosol.gélules. comprimés. sirop. 7.) Utilisation d'une quantité efficace d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 3.pour la préparation d'une composition cosmétique et pharmaceutique. la composition étant destinée à augmenter le volume des zones traitées et à combler les creux du relief cutané. 8.) Utilisation d'une quantité efficace d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 3. pour la préparation d'une composition cosmétique et pharmaceutique, la composition étant destinée à protéger et à réparer la peau de l'accumulation de cellules problématiques générées par tous types d'agressions dont l'exposition solaire. 9.) Utilisation d'une quantité efficace d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 3, pour la préparation d'une composition cosmétique et pharmaceutique. la composition étant destinée à protéger la peau de la face des effets disgracieux des contractions répétées des muscles du visage. 10.) Procédé de traitement cosmétique de la peau destiné à diminuer à la fois la synthèse endogène de sirtuine dans les cellules épidermiques et à réduire les contractions musculaires tout en stimulants les protéines épidermiques Claudine-1 et HSP-90. caractérisé par le fait que l'on applique sur la peau une composition contenant comme principe actif, au moins un extrait tel que défini selon l'une des revendications 1 à 3.