FR 2936254 A1 20100326 FR 0856314 A 20080919 2936254 L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs d'un facteur de transcription SOX, pour le traitement de l'alopécie. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de cette pathologie. Chez l'être humain, la croissance des cheveux est cyclique et comporte trois phases successives : la phase anagène, la phase catagène et la phase télogène. Chaque follicule de la chevelure se renouvelle donc en permanence, de façon cyclique et indépendante aux follicules adjacents (Kligman 1959, Montagna et Parakkal, 1974). La phase anagène ou phase de croissance, au cours de laquelle les cheveux s'allongent, dure plusieurs années. Cette phase récapitule la morphogenèse du cheveux et est divisée en 7 différentes stades (anagène I à anagène VII) (Muller-Rover et col., 2001). Pour simplifier, la phase anagène est généralement réduite à trois étapes qui regroupent chacune plusieurs stades : précoce pour les étapes I-III, milieu d' anagène pour les étapes IV à v et anagène tardive pour les étapes VI et VII. La phase catagène qui succède à la phase anagène est très courte et ne dure que quelques semaines. Cette phase est divisée en 8 différentes stades (catagène I à catagène VIII) (Muller-Rover et col., 2001) Au cours de cette phase, le cheveu subit une involution, le follicule s'atrophie et son implantation dermique apparaît de plus en plus haute. La phase télogène, qui dure quelques mois, correspond à une période de repos du follicule où le cheveu finit par tomber. Après cette phase de repos un nouveau follicule est régénéré, sur place, et un nouveau cycle recommence. (Montagna et Parakkal, 1974). A chaque instant, tous les cheveux ne sont pas dans la même phase au même moment. Ainsi, sur les 150 000 cheveux environ que comporte une chevelure, seuls 10% d'entre eux environ sont au repos et seront donc remplacés en quelques mois selon une horloge biologique propre à chaque cheveu (Montagna, 1974). Chez la souris et les autres mammifères à fourrures, les follicules pileux possèdent également un cycle de renouvellement comportant les trois phases anagène, catagène et télogène, découpées en différents stades. Par contre, les cycles pilaires des jeunes animaux sont souvent � synchronisés �, c'est-à-dire dans la même phase du cycle au même moment au sein d'une même région (Muller-Rover et col., 2001). La chute ou perte naturelle des cheveux est un phénomène physiologique qui se produit 35 en permanence et peut être estimée, en moyenne, à quelques cent cheveux par jour pour 2 2936254 un état physiologique normal. Cependant, il arrive que le cycle pilaire puisse se dérégler et que la chute des cheveux s'accélère et conduise à une perte temporaire ou définitive des cheveux appelée alopécie. Différentes causes peuvent être à l'origine d'une alopécie. 5 II existe différentes types d'alopécie, les formes principales sont : • l'alopécie androgénétique héréditaire, qui est la plus fréquente : elle se manifeste par une diminution du volume des cheveux, voire une calvitie, et touche 70% des hommes ; • l'alopécie aiguë : elle peut être liée à un traitement par chimiothérapie, un stress, des 10 carences alimentaires importantes, une carence en fer, des troubles hormonaux, au sida, une irradiation aiguë ; • l'alopécie areata qui semble être d'origine auto-immune (mécanisme de médiation cellulaire) qui se caractérise par une atteinte en "patch" plus ou moins gros et à un ou plusieurs endroits. Cette forme de pelade peut atteindre toute la tête et on parle 15 d'alopécie Totalis et parfois l'ensemble du corps c'est l'alopécie Universalis et dans ce cas il n'y a plus aucun poil ni cheveu sur l'ensemble du corps. Dans tous ces trois cas, la chute des cheveux est en relation directe avec le cycle pilaire, le follicule n'entrant plus dans la phase anagène, ou la phase anagène n'étant pas 20 maintenue, ce qui implique que le follicule ne produit plus de tige pilaire donc plus de cheveux. Pour lutter contre l'alopécie, il est donc nécessaire de relancer le cycle pilaire en activant la phase anagène. On recherche ainsi depuis de nombreuses années, dans l'industrie cosmétique ou 25 pharmaceutique, des compositions permettant de supprimer ou de réduire l'alopécie, et notamment d'induire ou de stimuler l'entrée en phase anagène ou la croissance des cheveux. La demanderesse a maintenant trouvé que le gène SOX était exprimé spécifiquement 30 dans les kératinocytes du follicule pileux, et que son expression était induite au moment de l'entrée en anagène, in vivo, dans un modèle d'induction de l'entrée en anagène par gonadectomie. Elle propose dès lors de cibler ce gène ou son produit d'expression, pour prévenir ou améliorer les phénomènes d'alopécie. 3 2936254 Par alopécie, on entend toutes les formes d'alopécie, à savoir notamment les alopécies androgénétiques, aiguë ou areata. Les gènes Sox : 5 La famille des gènes Sox (pour "Sry-related high mobility group (HMG) box") tient son nom du premier membre isolé, le gène Sry de détermination du sexe lié au chromosome Y chez les mammifères. Les gènes Sox sont caractérisés par une séquence d'ADN conservée codant pour un domaine � HMG � de 79 acides aminés responsables d'une liaison à l'ADN spécifique de la séquence. Les protéines SOX peuvent être 10 classées en huit groupes, revus dans Lefebvre et al, the International Journal of Biochemistry & Cell biology, 2007, 39: 2195-2214. La plupart présentent un domaine de transactivation ou un domaine de transrépression, et agissent comme des facteurs de transcription. Chaque gène a un profil d'expression particulier, et des propriétés moléculaires distinctes. 15 Les séquences des gènes Sox et des protéines codées par ces gènes sont connues. De nombreuses références décrivent en outre leurs propriétés (voir Tableau 1). Tableau 1 : Classification des gènes Sox Croupe Gène Références Uuhh,i~ c t cil.. 1992. Proceedings u/ the National Academy of Scient es of the United States of America, No. 89, pages A Sry 7953-7957 - Dubin et al., 1995, Molecular Endocrinology, No. 9, pages 1645-1654 Bl Sox1 - Collignon et al., 1996, Development, No. 122, pages Sox2 509-520 Sox3 Kamachi et al., 1999, Molecular and Cellular Biology, No. 19, pages 107-120 - Collignon et al., 1996, Development, No. 122, pages 509-520 - Kamachi et al., 1999, Molecular and Cellular Biology, No. 19, pages 107-120 Collignon et al., 1996, Development, No. 122, pages 509-520 B2 Sox14 - Hargrave et al., 2000, Developmental Biology, No. 219, Sox2] pages 142-153 - Uchikawa et al., 1999, Mechanisms of Development, No. 84, 103-120 C Sox4 - Van de Wetering et al., 1993, EMBO Journal, No. 12, pages Sox11 3847-3854 Sox12 - Kuhlbrodt et al., 1998, Journal of Neuroscience, No. 18, pages 237-250 - NCBI û CAM23207 4 2936254 - Denny et al., 1992, Nucleic Acids Research, No. 20, page D Sox5 2887 L-Sox5 Lefebvre et al., 1998, EMBO Journal, No. 17, pages Sox6 5718-5733 Sox13 Lefebvre et al., 1998, EMBO Journal, No. 17, pages 5718-5733 - Hiroaka et al., 1998, Biochimica et Biophysica Acta, No. 1399, pages 40-46 Lefebvre et al., 1998, EMBO Journal, No. 17, pages 5718-5733 - Takamatsu et al., 1995, Molecular and Cellular Biology, No. 15, 3759-3766 - Connor et al., 1995, Nucleic Acids Research, No. 11, pages 3365-3372 Kido et al., 1998, Gefle, No. 208, pages 201-206 E Sox8 Shepers et al., 2000, Nucleic Acids Research, No. 28, pages Sox9 1473-1480 Sox10 - Sudbeck et al., 1996, Nature Genetics, No. 13, pages 230-232 Wright et al., 1995, Nature Genetics, No. 9, pages 15-20 Pusch et al., 1998, Human Genetics, No. 103, pages 115-123 Kuhlbrodt et al., 1998, Journal of Neuroscience, No. 18, pages 237-250 F Sox? - Taniguchi et al., 1999, Biochimica et Biophysica Acta, Sox17 No. 1445, pages 225-231 Sox18 - Takash et al., 2001, Nucleic Acids Research, No. 29, pages 4274-4283 - Kanai et al., 1996, Journal of Cell Biology, No. 133, pages 667-681 - Dunn et al., 1995, Gefle, No. 19, pages 223-225 Hosking et al., 2001, Biochemical Biophysical Research Communication, No. 287, pages 493-500 G Sox15 Beranger et al., 2000, Journal of Biological Chemistry, No. 275, pages 16103-16109 H Sox30 - Osaki et al., 1999, Nucleic Acids Research, No. 27, pages 2503-2510 Voir également la demande US2002/142415 qui décrit les séquences de Soxl8. 5 De manière préférentielle, le facteur de transcription SOX visé ici est choisi dans le groupe constitué de Sox 4, Sox 10, Sox 13, et Sox 18. La cible plus particulièrement préférée est Sox 10. Applications diagnostiques 10 Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de l'alopécie chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité d'un facteur de transcription SOX, de l'expression de son gène ou de 5 2936254 l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle. L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette protéine SOX par un test immunohistochimique ou immunoessai, par exemple par dosage ELISA. 5 Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du facteur de transcription SOX peut être également envisagé. Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet � contrôle � est un sujet � sain �. Dans le cadre d'un suivi de l'évolution de l'alopécie, le � sujet contrôle � fait référence 10 au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence de l'expression ou d'activité de la protéine SOX, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur du facteur de transcription SOX, tel qu'envisagé plus haut 15 ou par un autre traitement contre l'alopécie. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement. Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une alopécie, comprenant la 20 comparaison de l'expression ou de l'activité du facteur de transcription (SOX), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle. Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine SOX, par un test immunohistochimique ou immunoessai, par exemple par dosage 25 ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du facteur de transcription SOX peut être également envisagé. Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble capillaire lié 30 à une alopécie. Le sujet � contrôle �, dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence � saine �. La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'alopécie. 6 2936254 Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par épilation de cheveux ou biopsie. 5 Méthodes de criblage Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité d'un 10 facteur de transcription SOX ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'alopécie. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité d'un facteur de transcription SOX, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 15 Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges 20 réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine SOX, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses 25 promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine SOX, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans 30 l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. Par �modulation �, on entend tout effet sur le niveau d'expression ou d'activité d'un facteur de transcription SOX, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une inhibition, mais de préférence une stimulation, partielle ou complète. 7 2936254 Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus induisent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine SOX, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par 5 � expression d'une protéine �, on entend la quantité de cette protéine ; Par � activité d'une protéine �, on entend son activité biologique ; Par � activité d'un promoteur �, on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante). 10 Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés. Différentes techniques peuvent être mises en oeuvre pour tester ces composés et 15 identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité du facteur de transcription SOX. Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du 20 promoteur du gène SOX, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta 25 glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codé par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres. 30 Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour le facteur de transcription SOX, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. 8 2936254 La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène SOX de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule de prostate, ou encore mieux une cellule de la peau, des kératinocytes du follicule pileux ou des fibroblastes de papille dermique. On peut également utiliser des organes 5 d'origine humaine ou animale, comme par exemple des cheveux, ou des follicules pileux de vibrisses. Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour le facteur de transcription SOX, de préférence humaine ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par 10 exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection. 15 Dans ces méthodes, l'expression du gène SOX peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite. 20 L'homme du métier est familier avec les techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la Rnase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, 25 enzymatiques or autres ligands (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (par 30 exemple radioactif ou enzymatique) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybridé est alors 35 incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle 9 2936254 sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéïnisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par exemple par autoradiographie ou chimioluminescence. 5 Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal antiùSOX peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel 10 qu'un lapin ou une souris, à l'aide de la protéine entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues par l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des 15 anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSES pour E.coli). 20 Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des 25 particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques. Des dosages ELISA, des immunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut 30 être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est 35 effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés 10 2936254 physico-chimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les 5 protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot). Le facteur de transcription SOX peut être produit selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Il peut également être produit à 10 l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21. Modulateurs du facteur de transcription 15 L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur du facteur de transcription SOX pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie. Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un 20 modulateur du facteur de transcription SOX, à un patient nécessitant un tel traitement. De préférence, de tels modulateurs sont des activateurs (ou inducteurs) du facteur de transcription SOX. 25 L'invention comprend l'utilisation de composés inducteurs du facteur de transcription SOX, tels que ceux identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut, pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie. Les composés modulateurs sont formulés au sein de compositions pharmaceutiques, en 30 association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, 35 d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques 11 2936254 ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au 5 traitement de la peau, des muqueuses et du cuir chevelu et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une 10 libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion. 15 La composition peut comprendre une teneur en modulateur du facteur de transcription SOX allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition. La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des 20 combinaisons de ces additifs, tels que : - des agents mouillants; - des agents d'amélioration de la saveur; - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque; - des agents stabilisants; 25 - des agents régulateurs d'humidité; - des agents régulateurs de pH; - des agents modificateurs de pression osmotique; - des agents émulsionnants; - des filtres UV-A et UV-B ; 30 - et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, I'Ubiquinol ou certains chélatants de métaux. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. 35 12 2936254 Légende des figures: La Figure 1 illustre l'induction du passage en anagène par ovariectomie. Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovariotomie ou non (contrôle) au jour 1 de l'étude. Un prélèvement de la peau de la région 5 du dos des souris a été effectué aux jours 0 et 8 de l'étude. La Figure lA représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris au jour 0 de l'étude. La Figure 1B représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris ovariectomisée au jour 8 de l'étude. La Figure 1C représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris contrôle au jour 8 de l'étude. L'analyse histologique montre clairement que 10 l'ovariectomie a induit le passage en anagène (Figure 1B). La Figure 2 est un tableau qui présente la modulation du niveau d'expression des facteurs de transcription Sox 4, 10, 13 et 18, exprimés par rapport au Jour 0 de l'étude, dans la peau de la région dorsale de souris ovariectomisées au jour 8 de l'étude et dans la peau de la région 15 dorsale de souris contrôle (peau en phase télogène) au jour 8 de l'étude par utilisation de la technologie des puces Affymetrix. Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovariotomie au jour 1 de l'étude. Des souris non ovariectomisées ont été conservées pour servir de groupe contrôle. Un prélèvement de la peau de la région dorsale des souris a été effectué aux jours 0 et 8 de l'étude. 20 Les ARN ont été isolés et l'expression des gènes a été analysée par la technologie des puces Affymetrix. La Figure 3 montre l'expression Sox 4 dans la peau de souris en début d'anagène et anagène tardive par hybridation in situ. La Figure 3A est la photographie de l'image en fond noir d'une 25 coupe de peau de souris en anagène précoce soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde anti-sens de Sox 4, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés). La Figure 3B est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagène précoce contre-colorée à l'hématoxyline. 30 La Figure 3C est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en anagène tardive soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde anti-sens de Sox4, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés). La Figure 3D est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagène tardive contre-colorée à l'hématoxyline. 35 La Figure 4 est un graphe qui présente la modulation du niveau d'expression des facteurs de transcription Sox 4, 10 et 13 dans de la région dorsale de souris en télogène traitées par minoxidil exprimés par rapport niveau d'expression dans de la région dorsale de souris en 13 2936254 télogène traitées par le véhicule éthanol. Des souris mâles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène, ont été traitées par de l'éthanol absolu ou minoxisil à 2.5% dans de l'éthanol absolu. Un prélèvement de la peau de la région dorsale des souris a été effectué6 heure après le traitement. Les ARN ont été isolés et l'expression des gènes a été 5 analysée par la technologie de kRT-PCR. Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES Exemple 1 : Expression de SOX au cours de l'entrée en anagène induite par 10 l'ovariectomie par la technologie des puces Affymetrix. Méthodes : Des souris C57BL/6 femelles de 42 jours dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène (Chase, 1954) ont été ovariectomisées ou non au jour 1 de l'étude. L'ovariectomie 15 pratiquée pendant la phase télogène provoque sous une semaine une entrée massive des follicules pileux de la région dorsale en phase anagène (Chanda, 2000.) alors que les follicules pileux de la région dorsale des animaux contrôles sont toujours en télogène. Des prélèvements de peau ont été réalisés dans la région dorsale aux jours 0, 6 et 8 de l'étude. Une partie du prélèvement a été utilisé pour confirmer le passage en anagène par analyse 20 histologique. L'autre partie du prélèvement a été utilisé pour réaliser une analyse du transcriptome par la technologie des puces Affymetrix. L'expression des gènes a été analysée sur une station Affymetrix (module microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les recommandations du fournisseur. En résumé, les ARN totaux isolés des tissus sont transcrits en ADNc. A partir d'ADNc double brin, les 25 ARNc marqués à la biotine sont synthétisés en utilisant la polymérase T7 et un précurseur NTP conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système � Lab on a chip � d'Agilent pour confirmer la bonne efficacité des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un 30 fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après différents lavages, la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MASS fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la présence ou l'absence de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide 35 hybridant parfaitement (� perfect match �) versus un oligonucléotide qui contient une mutation,(� single mismatch �) dans la région centrale de l'oligonucléotide. 14 2936254 Résultats: Figure 1 : En début d'étude au jour 0, l'analyse histologique montre que les follicules pileux de la région dorsale de la peau des souris sont en phase télogène (1A). Chez les souris soumises à une 5 ovariectomie, les follicules pileux de la région dorsale de peau sont en début de phase anagène (1B). A l'inverse, les follicules pileux de la région dorsale de peau des souris contrôles (non ovariectomisées) sont restés en phase télogène. Ainsi, l'ovariectomie à induit la transition de la phase télogène à la phase anagène. La phase anagène est avérée par l'analyse histologique au jour 8 de l'étude. 10 Figure 2 : Le facteur de transcription Sox4 n'est pas ou peu exprimé en phase télogène et devient exprimé en phase anagène du cycle pilaire. Les facteurs de transcription SoxlO, Soxl3 et Sox 18 sont exprimés en phase télogène et en phase anagène du cycle pilaire. 15 L'analyse différentielle entre l'expression au stade télogène à (J0) et anagène (J8 ovariectomisé) montre que l'expression des transcrits des gènes Sox4, SoxlO, Sox13 et Sox18 est induite en anagène précoce par rapport au stade télogène, alors que chez les souris contrôles, l'expression de ces facteurs n'est pas induite par rapport au début d'étude. 20 Exemple 2 : Expression de Sox 4 dans la peau de souris par � hybridation in situ � Méthodes : Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du facteur de transcription Sox4 par 25 incubation du gène linéarisé (21.tg) avec 63 �Ci de [35S]UTP (1250 Ci/mmol ; NEN, Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé dans de la paraffine. Des sections (41.tm de large) ont ensuite été déparaffinées dans du toluène et réhydratées dans un gradient d'alcool. Après séchage, les différentes sections ont été incubées dans un tampon de 30 préhybridation pendant deux heures. L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon de préhybridation avec 10mM DTT et 2X106 cpm ARN/�l 35S marqué) à 53°C. L'excès de sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées dans une émulsion photographique LM1 (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4°C pendant au moins un mois. Les coupes ont alors été développées et contre-colorées avec de l'hématoxyline 35 et de l'éosine. Suite à l'incubation en présence d'une émulsion photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se manifeste par un marquage positif avec la sonde antisense 15 2936254 (Figure 4B et Figure 5B) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 3A et Figure 4A) utilisé comme contrôle négatif. Résultats: 5 Figure 3 Les images (A à B) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en début d'anagène. Les images (C à D) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en milieux d' anagène. La Figure 3A montre que le facteur de transcription Sox4 est exprimé dans la peau de souris. Les transcrits sont spécifiquement présent au niveau des follicules pileux en début 10 d'anagène. Plus particulièrement, Sox4 est présent dans la gaine épithéliale interne des follicules pileux. La Figure 3C montre que le facteur de transcription Sox4 est exprimé de façon spécifique dans les follicules pileux en milieux d'anagène. Plus particulièrement, Sox4 est présent dans la gaine épithéliale interne et externe des follicules pileux. 15 Exemple 3 : Mise en évidence de l'activité de minoxidil sur l'expression de SOX4,, 10 et 13 dans la peau de souris par la technologie des kRT-PCR (Applied Biosystem). Méthodes : Des souris C57BL/6 femelles de 42 jours dont les follicules pileux de la région dorsale étaient 20 en télogène ont été traitées avec 50 �l d'éthanol minoxidil 2.5%. Le traitement par minoxidil 2.5% pendant la phase télogène provoque une entrée rapide des follicules pileux de la région dorsale en phase anagène par rapport aux animaux contrôles. Des prélèvements de peau ont été réalisés dans la région dorsale aux temps 6 h, 24 h et 48 h de l'étude. 25 L'expression des gènes a été analysée par kRT-PCR en suivant les recommandations du fournisseur (Applied Biosystem). En résumé, les ARN totaux isolés des tissus sont transcrits en ADNc. Les ANDc sont incubés avec des primers spécifiques pour les gènes de Sox 4, Sox 10 et Sox 13 qui ont été obtenus auprès d'Applied Biosystem. La kRT-PCR se déroule selon les conditions recommandées par le fournisseur. Chaque point a été fait en duplicate et chaque 30 valeur de Ct a été normalisée par rapport au Ct du gène 18S. Pour chaque temps le niveau d'expression est calculé par rapport au niveau d'expression chez les individus contrôles. 35 Résultats: Figure 4 16 2936254 Le graphe 1 montre que les facteurs de transcription Sox 4, Sox 10 et Sox 13 sont induit 6 h après le traitement minoxidil. A partir de 24 h, le niveau d'expression des facteurs de transcription Sox 4, Sox 10 et Sox 13 reviens au niveau d'expression dans la peau des individus contrôles. 5 Conclusion: L'exemple 1 montre, que les gènes Sox4, Soxl8 et SoxlO sont exprimés dans la peau et induits au cours de l'entrées en anagène. L'exemple 2 souligne que le gène Sox4 est exprimé de façon spécifique dans les ans les kératinocytes des follicules pileux en anagène. L'exemple 3 indique 10 que le traitement par minoxidil induit l'expression des Sox4, So13 et SoxlO. L'ensemble de ces travaux permet de soutenir l'utilisation de modulateurs de l'expression des facteurs de transcription Sox chez l'Homme pour obtenir une stimulation de la croissance des follicules pileux en induisant l'entrée en phase anagène. Egalement, ils soutiennent l'intérêt de l'utilisation des facteurs de transcription Sox pour diagnostiquer ou prognostiquer cette 15 pathologie. 17 REVENDICATIONS1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité d'un facteur de transcription SOX ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité d'une protéine SOX, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité d'une protéine SOX, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) activent l'expression ou l'activité d'une protéine SOX, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour un facteur de transcription SOX, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. 18 2936254 5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour un facteur de transcription SOX, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène. 6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont choisies parmi les kératinocytes et les fibroblastes de la papille dermique ou du derme. 7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des 10 cellules transformées par un acide nucléique hétérologue codant pour un facteur de transcription SOX. 8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène. 9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, dans laquelle le facteur de 20 transcription est choisi dans le groupe constitué de Sox 4, Sox 10, Sox 13 et Sox 18. 1 1 . Méthode selon l'une des revendications I à 10, dans laquelle le facteur de transcription est Sox 10. 5 15 25