FR 2935146 A1 20100226 FR 0855686 A 20080822 POLYNUCLEOTIDES REGULANT NEGATIVEMENT L'EXPRESSION DE LA PROTÉINE SBI La présente invention est relative à des polynucléotides capables de réguler négativement l'expression de la protéine Sbi et à leur application notamment pour la détection, la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique. Les infections staphylococciques sont très répandues dans le monde entier, affectant aussi bien l'homme que les animaux. Les bactéries du genre Staphylococcus ont été découvertes par Louis Pasteur en 1880. À ce jour, une vingtaine d'espèces ont été identifiées. Parmi celles-ci, les plus rencontrées en pathologie humaine et/ou animale sont Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius et Staphylococcus aureus. Ces espèces commensales sont dites pathogènes opportunistes puisqu'elles peuvent entraîner des infections dans des conditions particulières. Ainsi, Staphylococcus epidermidis peut être responsable d'infections de la peau, nasales et aussi d'endocardites et d'infections localisées chez les patients immunodéprimés. Staphylococcus saprophyticus a été identifiée comme responsable de certaines infections urinaires. Staphylococcus hyicus et Staphylococcus intermedius peuvent être responsables d'infections diverses chez l'animal telles que la dermite exsudative du porcelet (S. hyicus) ou encore la furonculose du chien (S. intermedius). L'espèce la plus pathogène des bactéries du genre Staphylococcus est Staphylococcus aureus (S. aureus). S. aureus est un membre de la flore commensale humaine. Cependant, si des barrières mucosales sont franchies ou si les défenses immunes de l'hôte sont altérées, S.aureus peut devenir un pathogène opportuniste et l'une des principales causes des infections nosocomiales et des infections acquises en communauté chez l'homme et les animaux (Lowy, 1998). La pathogenèse de la maladie associée à S. aureus débute habituellement par une infection locale (par exemple, infection d'une blessure, furoncle, cellulite), puis peut se poursuivre par une diffusion systémique (bactériémie), puis par des infections métastatiques (par exemple endocardite, ostéomyélite et arthrite septique). S. aureus est également l'un des agents pathogènes isolés le plus fréquemment lors de mammites bovines aussi bien aux Etats-Unis qu'en Europe. Les vaches atteintes présentent alors une chute de production laitière qui entraîne de lourdes conséquences économiques sur les exploitations agricoles. L'étude des mécanismes moléculaires permettant à l'infection staphylococcique de se mettre en place et de perdurer dans l'organisme colonisé a permis de montrer qu'une des causes principales de succès des infections staphylococciques, en particulier à S. aureus, est leur capacité à produire un grand nombre de facteurs de virulence. Certains de ces facteurs sont exportés à la surface des cellules et d'autres sont excrétés dans le milieu extracellulaire de l'hôte. Ainsi, par exemple, S. aureus est capable de contourner les défenses de l'hôte par la production de pièges de la réponse immunitaire de l'hôte infecté telles que la protéine SpA (� Staphylococcal protein A �, Moks et al., 1986) et la protéine Sbi (� S. aureus IgG binding protein �). La protéine Sbi a été identifiée à l'origine chez S. aureus, comme une protéine de liaison aux immunoglobulines IgG (Zhang et al., 1998). Il a été montré par la suite que son expression est induite par la présence d'IgG humaines (Zhang et al, 2000) et qu'elle précipite avec des IgG humaines (Atkins et al., 2008). Il est désormais établi que la protéine Sbi a également la capacité d'interagir avec des composants du système immunitaire inné de l'hôte. En effet, Sbi est une protéine sécrétée qui piège le système du complément en fixant et titrant le facteur C3 du complément (Burman et al, 2008 ; Upadhyay et al, 2008), molécule centrale des trois voies d'activation du complément. Ainsi, la protéine multifonctionnelle Sbi interfère directement avec le système immunitaire adaptatif de l'hôte via ses deux premiers domaines de liaison aux IgG (Sbi-I et Sbi-II ; Atkins et al., 2008) et module le système immunitaire inné de l'hôte en consommant la voie alternative de l'activation du complément via ses troisième et quatrième domaines (Sbi-III et Sbi-IV ; Burman et al. 2008), en particulier par l'interaction entre son quatrième domaine et la protéine C3 du complément (Upadhyay et al, 2008). Jusqu'à présent, le traitement le plus répandu à une infection staphylococcique est à base d'antibiotiques tels que les pénicillines (pénicilline G, méthicilline, oxacilline céphalosporines) les macrolides et les tétracyclines. Cependant, avec l'utilisation répandue des antibiotiques, la diffusion de souches de bactéries du genre Staphylococcus, en particulier S. aureus, fortement résistantes aux antibiotiques, notamment à la méthicilline (SRM), a considérablement augmenté ces dernières années et constitue un défi clinique et épidémiologique mondial, notamment dans les hôpitaux. Dans une optique de traitement mais également de prévention d'infection staphylococcique, il existe un besoin, tant chez l'homme que chez l'animal de disposer de nouvelles classes d'agents antistaphylococcique comme alternatives aux antibiotiques. Les inventeurs ont à présent isolé des polynucléotides qui permettent de résoudre en tout ou partie les problèmes évoqués ci-dessus. Ces polynucléotides présentent la capacité de réguler négativement l'expression de la protéine Sbi. Les inventeurs ont mis en évidence que ces polynucléotides s'hybrident spécifiquement, sans l'aide de protéine chaperonne associée, avec une séquence particulière qu'ils ont localisée à l'extrémité 5' de l'ARN messager (ARNm) codant la protéine Sbi. En analysant cette séquence particulière, les inventeurs ont identifié la séquence � shine-Dalgarno � prédite d'interaction avec l'ARN ribosomique 16S et le codon d'initiation de la traduction de l'ARNm codant la protéine Sbi. Les inventeurs ont montré que l'hybridation spécifique de ces polynucléotides avec cette séquence particulière de l'ARNm codant la protéine Sbi, empêche la liaison des ribosomes 70S audit ARNm. Les inventeurs ont mis en évidence que ces polynucléotides permettent de réduire la quantité de protéines Sbi présentes dans le milieu intracellulaire mais aussi la quantité de protéines Sbi libérée dans le milieu extracellulaire et ainsi de diminuer la capacité des bactéries du genre Staphylococcus à interférer avec le système immunitaire de l'hôte en interagissant avec certains de ses composants (IgG, protéine C3). Ces polynucléotides sont donc particulièrement utiles pour la prévention et/ou le traitement d'infections staphylococciques, en particulier de souches résistantes aux antibiotiques. En outre, les polynucléotides selon l'invention présentent l'avantage contrairement à des traitements putatifs, d'avoir une action ciblée sur les bactéries du genre Staphylococcus optimisant ainsi leur action et limitant les risques d'effets secondaires. Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet, un premier polynucléotide isolé comprenant une séquence choisie dans le groupe comprenant : - la séquence SEQ ID N°1, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°l et les fragments de celles-ci ; et - la séquence ID N°2, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la 25 séquence SEQ ID N° 2 et les fragments de celles-ci ; et - la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID N°3, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec ladite séquence complémentaire et les fragments de celles-ci ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider 30 spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°3. On entend par � polynucléotide � au sens de la présente invention, un polymère composé de plusieurs nucléotides liés par des liaisons phosphodiesters, tel que l'ADN (Acide DésoxyriboNucléique) et l'ARN (Acide RiboNucléique). Les polynucléotides selon l'invention peuvent être un ADN ou un ARN. L'ADN présente l'avantage d'être plus stable que l'ARN. La séquence ID N°l correspond à la séquence suivante : 5' -ttcattttttatgtattgctccnnttcgggctagtntattaaatttatttttgc-3' dans laquelle le nucléotide en position 23 peut être c ou t ; le nucléotide en position 24 peut être c ou t ; et le nucléotide en position 36 peut être a ou t. On entend désigner ici par � a, t, c, g, u �, respectivement les nucléotides adénine, thymine, cytosine, guanine et uracile. En particulier, le premier polynucléotide isolé selon l'invention comprend une séquence choisie dans le groupe comprenant : - la séquence SEQ ID N°1, dans laquelle les nucléotides en positions 23, 24 et 36 sont t ; - la séquence SEQ ID N°1, dans laquelle les nucléotides en positions 23 et 24 sont c et le nucléotide en position 36 est t ; et - la séquence SEQ ID N°1, dans laquelle les nucléotides en positions 23, 24 sont c et le nucléotide en position 36 est a. La séquence ID N°2 correspond à la séquence suivante : 5 ' -uucauuuuuuauguauugcuccnnuucgggcuagunuauuaaauuuauuuuugc-3 ' dans laquelle le nucléotide en position 23 peut être c ou u; le nucléotide en position 24 peut être c ou u; et le nucléotide en position 36 peut être a ou u. En particulier, le premier polynucléotide isolé selon l'invention comprend une séquence choisie dans le groupe comprenant : - la séquence SEQ ID N°6, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°6 et les fragments de celles-ci ; et - la séquence SEQ ID N°7, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°7 et les fragments de celles-ci ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°3. En particulier, le premier polynucléotide isolé selon l'invention est un ARN comprenant une séquence choisie dans le groupe comprenant : - la séquence SEQ ID N°2, dans laquelle les nucléotides en positions 23, 24 et 36 sont u ; - la séquence SEQ ID N°2, dans laquelle les nucléotides en positions 23 et 24 sont c et le nucléotide en position 36 est u ; et - la séquence SEQ ID N°2, dans laquelle les nucléotides en positions 23, 24 sont c et le nucléotide en position 36 est a ; et - la séquence SEQ ID N°7, dans laquelle les nucléotides en positions 44, 45 et 57 sont u ; - la séquence SEQ ID N°7, dans laquelle les nucléotides en positions 44 et 45 sont c et le 10 nucléotide en position 57 est u ; et - la séquence SEQ ID N°7, dans laquelle les nucléotides en positions 44, 45 sont c et le nucléotide en position 57 est a. La première isoforme des séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°7 telle que définie ci- dessus (la séquence SEQ ID N°2, dans laquelle les nucléotides en positions 23, 24 et 36 sont u et 15 la séquence SEQ ID N°7, dans laquelle les nucléotides en positions 44, 45 et 57 sont u) a été identifiée notamment dans la souche S. aureus N315. La seconde isoforme des séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°7 telle que définie ci-dessus (la séquence SEQ ID N°2, dans laquelle les nucléotides en positions 23 et 24 sont c et le nucléotide en position 36 est u et la séquence SEQ ID N°7, dans laquelle les nucléotides en 20 positions 44 et 45 sont c et le nucléotide en position 57 est u) a été identifiée notamment dans les souches S. aureus MRSA252, Newman. La troisième isoforme des séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°7 telle que définie ci-dessus a été identifiée notamment dans les souches S. aureus NCTC8325, Mu50, Mu3, MSSA476, JH1, JH9, MW2, USA300 TCH1516, USA300 FPR3757. 25 La séquence SEQ ID N°3 correspond à la séquence suivante : 5 ' -gcauacaauaaauuuaauauguaaaaagaaagggaauacacaugaaaaauaaa-3 ' Les inventeurs ont identifié dans cette séquence SEQ ID N°3, le premier nucléotide g correspondant à l'extrémité 5' de l'ARNm codant la protéine Sbi, les nucléotides gaaaggg localisés de la position 28 à 34 correspondant à la séquence � Shine-Dalgarno � prédite 30 d'interaction avec l'ARN ribosomique 16S et les nucléotides aug localisés de la position 42 à 44 correspondant au codon d'initiation de la traduction. On entend par � protéine Sbi � au sens de la présente invention, la protéine de séquence SEQ ID N°5 et ses protéines homologues. On entend désigner ici par � protéine homologue �, les protéines apparentées sur le plan de l'évolution. Les protéines homologues peuvent avoir entre elles une homologie structurale et/ou une homologie de séquences d'aminoacides. Les séquences d'aminoacides des protéines homologues peuvent avoir entre elles au moins 50 % d'identité, de préférence au moins 70 % d'identité et tout préférentiellement au moins 90 % d'identité. Les protéines homologues de la protéine Sbi peuvent avoir une séquence d'aminoacides ayant au moins 50 % d'identité, de préférence au moins 70 % d'identité et tout préférentiellement au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°5. En particulier, les protéines homologues de la protéine Sbi ont la capacité de se lier spécifiquement à la protéine C3 du complément et/ou à des immunoglobulines IgG. À titre d'exemples de protéines homologues de la protéine Sbi on peut citer les inhibiteurs du complément Efb-C (Hammel et al., Nat. Immunol., 2007), Ehp (Hammel et al., J. Biol. Chem., 2007) et SCIN (Rooijakkers et al., 2007). Des études de structure tridimensionnelle par spectroscopie par RMN (Résonance Magnétique Nucléaire) ont montré que le domaine Sbi-IV de la protéine Sbi de séquence SEQ ID N°5 présente une conformation en faisceau à 3 hélices similaires à celles des inhibiteurs du complément Efb-C, Ehp et SCIN (Upadhyay et al., 2008). On entend désigner ici par � séquence homologue �, les séquences apparentées sur le plan de l'évolution ; les séquences homologues pouvant avoir entre elles au moins 50 % d'identité, de 20 préférence au moins 70 % d'identité et tout préférentiellement au moins 90 % d'identité. On entend par � bactéries du genre Staphylococcus � au sens de la présente invention, l'ensemble des souches bactériennes du genre Staphylococcus. En particulier, les bactéries du genre Staphylococcus selon l'invention sont choisies dans le groupe comprenant les souches bactériennes du genre Staphylococcus dont le génome contient : 25 - un gène codant la protéine Sbi de séquence SEQ ID N° 5 ou une protéine homologue ; et/ou - un gène codant un ARN comprenant la séquence SEQ ID N°3 ou une séquence homologue de la séquence SEQ ID N°3 et les fragments de celles-ci ; et/ou - un gène comprenant la séquence SEQ ID N°4 ou une séquence homologue de la 30 séquence SEQ ID N°4 et les fragments de celles-ci. Ces souches peuvent être aisément identifiées par l'Homme du Métier, par exemple, par des techniques de criblage de banques (d'ADN génomique ou d'ADNc de bactéries du genre Staphylococcus) à l'aide de sondes ou d'amorces spécifiques d'une séquence appartenant à des souches bactériennes du genre Staphylococcus telle que définies ci-dessus. De telles sondes ou amorces peuvent être sélectionnées à partir des séquences de polynucléotides selon l'invention. Par exemple, une sonde comprenant une séquence telle que définie selon le premier polynucléotide selon l'invention peut être utilisée. En particulier, l'Homme du Métier peut utiliser la méthode de détection, in vitro, d'ARNm du gène codant la protéine Sbi selon l'invention. Tout particulièrement, les bactéries du genre Staphylococcus selon l'invention sont des souches de Staphylococcus aureus. On entend par � séquence complémentaire d'une deuxième séquence � au sens de la présente invention, une séquence dont l'ensemble des nucléotides contigus ont la capacité de former des appariements Watson-Crick de type g-c, c-g, a-u, u-a, a-t, t-a et éventuellement des appariements wobble de type g-u, u-g avec l'ensemble des nucléotides contigus de la deuxième séquence. Le terme � identité � se réfère à l'identité existant entre deux séquences de polynucléotides. L'identité peut être déterminée par la comparaison des nucléotides présents à une position dans chacune des séquences de polynucléotide alignées dans ce but. Lorsque, à une position donnée un nucléotide est identifié comme identique sur les deux séquences alignées, lesdites séquences sont dites identiques à cette position. Le pourcentage d'identité entre deux séquences de polynucléotides est fonction du nombre de nucléotides identiques aux différentes positions sur les deux séquences de nucléotides alignées. Différents programmes peuvent être utilisés afin d'aligner des séquences de polynucléotides et calculer ainsi le pourcentage d'identité existant entre ces séquences, tels que FASTA ou BLAST. On entend par � séquence dérivée d'une deuxième séquence �, une séquence ayant au moins 70 % d'identité, de préférence au moins 80 % d'identité et tout préférentiellement au 25 moins 90 % d'identité avec une deuxième séquence. Les fragments de séquences du premier polynucléotide selon l'invention peuvent avoir une taille comprise entre 35 et 53, de préférence entre 35 et 50, et tout préférentiellement entre 36 et 45 nucléotides. De préférence, les fragments de séquences du premier polynucléotide selon l'invention comprennent les nucléotides localisés de la position 14 à la position 49 dans la 30 séquence SEQ ID N°l ou la séquence SEQ ID N°2, lesdits nucléotides correspondant aux nucléotides localisés de la position 35 à la position 70 dans la séquence SEQ ID N°6 ou la séquence SEQ ID N°7. La capacité d'hybridation spécifique d'une première séquence de polynucléotide avec une deuxième séquence de polynucléotide peut être déterminée in vitro, par des tests bien connus de l'Homme du Métier. À titre d'exemple, on peut citer le test décrit dans C. Pichon & B. Felden (2005 ; avec l'exemple de l'ARN régulateur sprA et sa cible ARNm SA2216), qui comprend les étapes suivantes : - une première séquence de polynucléotide est marquée radioactivement, purifiée et des quantités croissantes d'une deuxième séquence de polynucléotide non marquée sont ajoutées et analysées par gel d'électrophorèse en conditions natives. L'obtention d'un retard de migration sur ce gel implique la formation d'un complexe entre ces deux séquences de polynucléotides, par hybridation ; - l'effet de l'ajout d'un excès de 100 à 2000 fois, en rapports molaires, d'une troisième séquence de polynucléotide (par exemple un mélange d'ARN de transfert) sur la formation dudit complexe entre les deux premières séquences, est analysé ; - l'effet de l'ajout d'un excès de 100 à 2000 fois, en rapports molaires, de la première 15 séquence de polynucléotide non marqué sur la formation dudit complexe entre les deux premières séquences, est analysé ; - l'hybridation entre les deux premières séquences de polynucléotides sera considérée comme spécifique si (i) ledit complexe préformé entre les deux premières séquences de polynucléotide reste stable en présence de cet excès de troisième séquence de polynucléotide 20 (ex : ARNt) et si (ii) ledit complexe préformé est déstabilisé en présence de faibles quantités de la première séquence de polynucléotide non marquée. L'Homme du Métier pourra aisément déterminer les séquences dérivées et les fragments qui ont la capacité de s'hybrider spécifiquement à la séquence ID N°3 selon le premier polynucléotide isolé selon l'invention, en mettant en oeuvre un test d'hybridation spécifique tel 25 que décrit ci-dessus. En particulier, les séquences dérivées et les fragments qui ont la capacité de s'hybrider spécifiquement à la séquence ID N°3 selon le premier polynucléotide isolé selon l'invention, ont en outre la capacité de réguler négativement l'expression de la protéine Sbi. L'expression � réduction ou régulation négative de l'expression d'une protéine � est 30 utilisée ici pour désigner une diminution d'au moins 20 %, en particulier d'au moins 35 % et tout particulièrement d'au moins 50 % du niveau d'expression d'une protéine par rapport à son niveau d'expression en l'absence d'un premier polynucléotide selon l'invention. La réduction de l'expression d'une protéine peut être déterminée par des techniques bien connues de l'Homme du Métier telles que par � Western-Blot �, utilisant au moins un anticorps spécifique de ladite protéine. La présente invention englobe également les polynucléotides conformes à l'invention, synthétiques, hémi-synthétiques, recombinants et leurs analogues. Les analogues du premier polynucléotide selon l'invention ont la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°3. En particulier, les analogues du premier polynucléotide selon l'invention ont en outre la capacité de réguler négativement l'expression de la protéine Sbi. On entend par � analogue � au sens de la présente invention, des polynucléotides comprenant au moins une modification chimique au niveau de leur sucre, phosphate, de leur base ou de leurs extrémités 5' et 3' ; ladite modification pouvant être réalisée par synthèse chimique ou enzymatique. En effet, les polynucléotides selon l'invention, peuvent comprendre au moins une modification chimique destinée notamment à augmenter leur stabilité, leur résistance à la dégradation par les endo et exonucléases, favoriser leur capacité à entrer dans une cellule d'intérêt et/ou dans le cas du premier polynucléotide selon l'invention à augmenter sa capacité à réguler négativement l'expression de la protéine Sbi. L'augmentation de la capacité du premier polynucléotide selon l'invention à réguler négativement l'expression de la protéine Sbi peut être obtenu, par exemple, par une modification chimique permettant l'augmentation de la formation et/ou de la stabilité d'un complexe entre le premier polynucléotide selon l'invention et la séquence SEQ ID N°3, par hybridation spécifique. Ainsi, les polynucléotides selon l'invention peuvent comprendre des nucléotides modifiés au niveau de leur sucre, phosphate, de leur base et/ou peuvent présenter des modifications, notamment post-transcriptionnelle, aux niveaux de leurs extrémités 5' et 3'. De tels nucléotides modifiés peuvent être choisis dans le groupe comprenant : les 2'-O-methylnucléotides, les 2'-O-methoxyethylnucléotides, les déoxynucléotides tels que les 2'-déoxynucléotides et les 2'-deoxy-2'-fluoronucléotides, les nucléotides à liaisons peptidiques, des fluorochromes et des éléments radioactifs. Les polynucléotides selon l'invention peuvent également comprendre en outre, à leurs extrémités 5' et/ou 3' des éléments structuraux (tels que des hélices stables) renforçant leur stabilité et/ou leur résistance aux dégradations. Les polynucléotides selon l'invention peuvent être obtenus par des méthodes bien connues de l'Homme du Métier telles que par des techniques de criblage de banques (d'ADN génomique ou d'ADNc de bactéries du genre Staphylococcus) par des sondes ou des amorces spécifiques desdits polynucléotides (sélectionnés par exemple à partir des séquences de polynucléotides selon l'invention), mais également, par synthèses chimiques (Beaucage SL., 2008) ou par réactions enzymatiques (Sherlin LD et al., 2001). L'invention a également pour objet une première cassette d'expression comprenant une séquence d'ADN choisie dans le groupe comprenant : - la séquence SEQ ID N°1, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°l et les fragments de celles-ci ; et - la séquence SEQ ID N°6, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°6 et les fragments de celles-ci ; et - une séquence d'ADN pouvant être transcrite en un premier polynucleotide isolé 10 selon l'invention, ledit polynucleotide étant un ARN. On entend par � cassette d'expression � au sens de la présente invention, une cassette comprenant un promoteur et une région de terminaison de la transcription dans laquelle une séquence d'ADN d'intérêt est liée de manière opérationnelle au promoteur afin de permettre la transcription de ladite séquence d'ADN. 15 Il peut s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée, inductible ou non, permettant la transcription d'un polynucléotide selon l'invention. En particulier, le promoteur est choisi parmi les promoteurs permettant la transcription d'un polynucléotide selon l'invention dans au moins une souche bactérienne du genre Staphylococcus. À titre d'exemple de tels promoteurs, on peut citer le promoteur du bactériophage T7 (Milligan JF et al., 1989). 20 L'invention a également pour objet un premier vecteur recombinant comprenant un premier polynucléotide isolé selon l'invention ou une première cassette d'expression selon l'invention. Les vecteurs utilisables peuvent être des vecteurs viraux, tels que des bactériophages, ou non viraux, tels que des vecteurs plasmidiques. 25 À titre d'exemples de vecteurs plasmidiques utilisables selon l'invention, on peut citer l'ensemble des vecteurs dérivés de pCN décrits dans Charpentier et al. (2004). Certains de ces vecteurs, par exemple pCN51, permettent la transcription d'une séquence d'ADN d'intérêt en ARN par l'utilisation d'un promoteur inductible au Cadmium. En particulier, le vecteur plasmidique peut être choisi dans le groupe comprenant les 30 plasmides pCN35 et pCN38 décrits dans Charpentier et al. (2004). Ces plasmides présentent l'avantage d'être maintenus et ainsi de permettre l'expression de polynucléotides selon l'invention, dans des bactéries transformées du genre Staphylococcus. En effet, les inventeurs ont montré que des bactéries S. aureus, transformées par le vecteur pCN38 comprenant la séquence SEQ ID N°6 selon l'invention, sont capables de maintenir ce plasmide au cours de générations bactériennes successives après repiquages et ainsi de permettre l'expression d'un polynucléotide selon l'invention. En particulier, le vecteur selon l'invention est un bactériophage. De préférence, ledit bactériophage est capable d'infecter au moins une souche bactérienne du genre Staphylococcus. On entend par � bactériophage capable d'infecter une souche bactérienne du genre Staphylococcus �, tout virus de bactéries capable d'introduire une partie de son matériel génétique dans le génome d'une souche bactérienne du genre Staphylococcus (prophage) ou de permettre l'expression transitoire de ce matériel génétique dans la bactérie réceptrice sans intégration chromosomique. Les bactéries du genre Staphylococcus sont infectées par trois types de phages : lytiques obligatoires, tempérés et chroniques (Nicholas H. Mann, 2008). L'ensemble de ces phages est utilisable en tant que vecteur selon l'invention. Dans le cadre de la prévention et/ou du traitement d'infection staphylococcique, les phages utilisables comme vecteur selon l'invention sont de préférence à large spectre et capable d'infecter le plus grand nombre possible de souches bactériennes du genre Staphylococcus responsables d'infections chez l'homme et/ou l'animal. À titre d'exemple de tels bactériophages, on peut citer le phage lytique obligatoire 11)812, les phages K et ItIMR11. L'utilisation de bactériophage comme vecteur selon l'invention présente l'avantage d'optimiser la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique ou d'un trouble lié à au moins une bactérie du genre Staphylococcus. En effet, outre l'effet de régulation négative du premier polynucléotide selon l'invention sur l'expression de la protéine Sbi in vitro et in vivo, le bactériophage permet de lyser les bactéries lors de son cycle lytique. En outre, l'utilisation de bactériophage comme vecteur selon l'invention présente l'avantage que le bactériophage utilisé soit potentiellement efficace contre différentes souches bactériennes du genre Staphylococcus, même celles résistantes aux antibiotiques (Nicholas H. Mann, 2008) et de ne pas présenter d'effets secondaires, notamment en étant dénués d'effets néfastes sur les cellules eucaryotes de l'hôte infecté. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une première cellule hôte transformée par une première cassette d'expression selon l'invention ou un premier vecteur selon l'invention. La cellule hôte peut être en particulier un procaryote et avantageusement un bactériophage tel que décrit ci-dessus. L'invention a également pour objet une composition comprenant au moins un composant choisi dans le groupe comprenant un premier polynucléotide isolé selon l'invention, une première cassette d'expression selon l'invention, un premier vecteur selon l'invention et une première cellule hôte selon l'invention. Ladite composition peut être utile notamment comme outil en biologie afin, par exemple, de sélectionner des sondes ou des amorces spécifiques des polynucléotides selon l'invention ou encore pour identifier de potentiels agents capables de moduler (activer ou inhiber) l'interaction entre le premier et les deuxième ou troisième polynucléotides selon l'invention. Avantageusement, la composition selon l'invention est une composition pharmaceutique. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention présentent l'avantage contrairement aux médicaments putatifs d'avoir une action ciblée sur les bactéries du genre Staphylococcus, y compris les souches résistantes aux antibiotiques, optimisant ainsi leur action et limitant les risques d'effets secondaires. En particulier, lesdits composants sont présents dans la composition pharmaceutique selon l'invention en quantités thérapeutiques (quantités actives et non toxiques). De telles quantités thérapeutiques peuvent être déterminées par l'Homme du Métier par des tests de routine comprenant l'évaluation de l'effet de l'administration desdits composants susmentionnés sur des pathologies et/ou des troubles que l'on cherche à prévenir et/ou à traiter par l'administration de ladite composition pharmaceutique selon l'invention, par exemple une infection staphylococcique et sur la toxicité. Par exemple, de tels tests peuvent être mis en oeuvre en analysant de manière quantitative et qualitative l'effet de l'administration de différentes quantités desdits composants susmentionnés sur un ensemble de marqueurs (biologiques et/ou cliniques) caractéristiques de ces pathologies et/ ou de ces troubles, ainsi que par comptage bactériens dans des échantillons de prélèvements biologiques. En outre, l'index thérapeutique de la composition pharmaceutique selon l'invention peut être déterminée par des tests bien connus de l'Homme du Métier. Les polynucléotides selon l'invention peuvent être administrés directement, de préférence à l'aide d'un véhicule approprié permettant de faciliter leur entrée dans la cellule d'intérêt et/ou de les protéger de la dégradation par des endo- ou exo-nucléases. À titre d'exemples de tels véhicules utilisables, on peut citer des microsphères, des liposomes, des nanoparticules. Les polynucléotides selon l'invention peuvent également être administrés via un vecteur tel qu'avantageusement un bactériophage comme décrit ci-dessus. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées par différentes voies compatibles avec l'effet recherché et de préférence par voie orale, parentérale, sous-cutanée, topique, intra-oculaire, sublinguale et tout préférentiellement intra-oculaire. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées en une ou plusieurs fois ou en libération continue. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent se présenter sous différentes formes bien connues de l'Homme du Métier et adaptées aux voies et modes d'administration utilisés. En particulier lorsque les compositions pharmaceutiques sont administrées à des animaux, elles peuvent être incluses dans des compositions alimentaires (par exemple sous forme de poudres ou de granulés). Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet un premier polynucléotide isolé selon l'invention, ou une première cassette d'expression selon l'invention, ou un premier vecteur selon l'invention ou une première cellule hôte selon l'invention, pour son application en tant que médicament pour la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un composant choisi dans le groupe comprenant un premier polynucléotide isolé selon l'invention, une première cassette d'expression selon l'invention, un premier vecteur selon l'invention, une première cellule hôte selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement d'une infection staphylococcique. Les infections staphylococciques comprennent l'ensemble des infections dont sont responsables les bactéries du genre Staphylococcus. Ces infections comprennent l'ensemble des pathologies et/ou des troubles pouvant être améliorés et/ou évités par la réduction de l'expression de la protéine Sbi. En particulier, les infections staphylococciques comprennent les infections à Staphylococcus aureus parmi lesquelles on peut citer les folliculites superficielles ou profondes (tels que les furoncles, l'anthrax et le sycosis staphylococcique), le syndrome staphylococcique des enfants ébouillantés, les infections de blessures, un furoncle, une bactériémie, une endocardite, une ostéomyélite ou encore une arthrite septique. Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet un produit contenant : - au moins un composant choisi dans le groupe comprenant un premier polynucléotide isolé selon l'invention, une première cassette d'expression selon l'invention, un premier vecteur selon l'invention, une première cellule hôte selon l'invention; et - au moins un autre agent antistaphylococcique, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée et/ou étalée dans le temps, pour la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique. On entend par � agent antistaphylococcique � au sens de la présente invention, un agent destiné à lutter contre au moins une souche bactérienne du genre Staphylococcus, en particulier contre au moins une souche bactérienne du genre Staphylococcus choisie dans le groupe comprenant les souches bactériennes du genre Staphylococcus dont le génome contient : - un gène codant la protéine � Sbi � de séquence SEQ ID N° 5 ou une protéine homologue ; et/ou - un gène codant un ARN comprenant la séquence SEQ ID N°3 ou une séquence dérivée ayant ou moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°3 et les fragments de celles-ci ; et/ou - un gène comprenant la séquence SEQ ID N°4 ou une séquence dérivée ayant ou moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°4 et les fragments de celles-ci ; et tout particulièrement contre au moins une souche de Staphylococcus aureus. Ledit agent antistaphylococcique peut être choisi dans le groupe comprenant : - des antibiotiques destinés à prévenir et/ou à traiter des infections locales tels que l'acide fusidique, la mupirocine ; - des antibiotiques destinés à prévenir et/ou traiter des infections systémiques tels que la rifampicine, les fluoroquinolones, l'acide fusidique, le trimethoprime-sulfaméthoxazole, les glycopeptides ; et - des bactériophages tels que 11)812, K et (pMR11. Les produits de combinaison selon l'invention comprenant un autre agent antistaphylococcique présentent les avantages d'optimiser la prévention et/ou le traitement d'une 25 infection staphylococcique et de pouvoir réduire la quantité thérapeutique de chaque composant. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un deuxième polynucléotide isolé comprenant une séquence choisie dans le groupe comprenant : - la séquence SEQ ID N°3, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°3 et les fragments de celles-ci ; et 30 - la séquence SEQ ID N°4, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°4 et les fragments de celles-ci ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°l et/ou avec la séquence SEQ ID N°2. En particulier, le deuxième polynucléotide isolé selon l'invention comprend une séquence choisie dans le groupe comprenant : - la séquence SEQ ID N°8, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°8 et les fragments de celles-ci ; et - la séquence SEQ ID N°9, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°9 et les fragments de celles-ci ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider 10 spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°l et/ou avec la séquence SEQ ID N°2. En particulier, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°l et/ou avec la séquence SEQ ID N°2, selon le deuxième polynucléotide selon l'invention, comprennent les nucléotides gaaaggg localisés en position 28 à 34 (correspondant à la séquence � Shine-Dalgarno �) et les nucléotides 15 aug localisés en position 42 à 44 (correspondant au codon d'initiation de la traduction de l'ARNm codant la protéine Sbi) dans la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4. Les fragments de séquences du second polynucléotide selon l'invention peuvent avoir une taille comprise entre 14 et 50, de préférence entre 20 et 45 et tout préférentiellement entre 41 et 45. De préférence, les fragments de séquences du second polynucléotide selon l'invention 20 comprennent les 41 nucléotides localisés de la position 1 à la position 41 dans la séquence SEQ ID N°3 ou la séquence SEQ ID N°4. Les analogues du deuxième polynucléotide selon l'invention ont la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°l et/ou avec la séquence SEQ ID N°2. L'invention a également pour objet un troisième polynucléotide isolé, comprenant : 25 - une séquence contenant les nucléotides 1 à 41 de l'une des séquences SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4, couplée à son extrémité 3' à une séquence codante d'un gène d'intérêt. On entend par � séquences couplées � au sens de la présente invention, la liaison de deux séquences par des liaisons phosphodiesters. La liaison peut être effectuée par synthèse chimique ou enzymatique ou par construction par PCR (amplification en chaîne par polymérase). En 30 particulier, le troisième polynucléotide selon l'invention comprend une séquence codante d'un gène d'intérêt couplée à son extrémité 5' à l'extrémité 3' d'une séquence contenant les nucléotides 1 à 41 de l'une des séquences SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4. On entend par � une séquence contenant les nucléotides 1 à 41 de l'une des séquences SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 � au sens de la présente invention, une séquence contenant les 41 nucléotides localisés de la position 1 à la position 41 dans la séquence SEQ ID N°3 ou la séquence SEQ ID N°4. On entend par � séquence codante � au sens de la présente invention, une séquence nucléotidique qui définit directement la séquence en acides aminés d'une protéine ou d'un fragment de la protéine correspondante codée par un gène d'intérêt. Une séquence codante d'un gène d'intérêt comprend notamment les codons d'initiation et de terminaison de la traduction de l'ARNm de ce gène en protéine. De préférence, dans le troisième polynucléotide selon l'invention, l'extrémité 5' du codon d'initiation de la traduction de l'ARNm du gène d'intérêt est lié directement par liaison phosphodiester au nucléotide c localisé en position 41 dans l'une des séquences SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4. Ainsi, dans le cas où le codon d'initiation de la traduction de l'ARNm du gène d'intérêt est aug, le nucléotide a de ce codon d'initiation est lié au nucléotide c en position 41 de l'une des séquences SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 pour former l'enchaînement de nucléotides caug. Le gène d'intérêt peut être tout gène qui code pour une protéine ou un fragment protéique d'intérêt dont on souhaite réguler l'expression, en particulier négativement par la présence d'un premier polynucléotide selon l'invention. L'expression de la protéine ou du fragment protéique d'intérêt codé par le gène d'intérêt selon le troisième polynucléotide selon l'invention peut ainsi être régulée négativement par la présence d'un premier polynucléotide selon l'invention. En particulier, une séquence codante d'un gène d'intérêt peut être une séquence codant au moins un domaine de la protéine Sbi, ledit domaine étant capable de se lier spécifiquement à la 25 protéine C3 du complément et/ou à des immunoglobulines IgG. Le troisième polynucléotide selon l'invention peut comprendre en outre au moins une séquence non codante dudit gène d'intérêt. L'invention a également pour objet une deuxième cassette d'expression comprenant une séquence d'ADN choisie dans le groupe comprenant : 30 - la séquence SEQ ID N°4, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°4 et les fragments de celles-ci ; et - une séquence d'ADN pouvant être transcrite en un deuxième ou troisième polynucléotide selon l'invention, ledit polynucléotide étant un ARN. L'invention a également pour objet un deuxième vecteur recombinant comprenant une deuxième cassette d'expression selon l'invention. L'invention a également pour objet une deuxième cellule hôte selon l'invention transformée par une deuxième cassette d'expression selon l'invention ou un deuxième vecteur selon l'invention. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique selon l'invention comprenant en outre : - un troisième polynucléotide isolé selon l'invention dans lequel ladite séquence codante est une séquence codant au moins un domaine de la protéine Sbi, et/ou - un vecteur d'expression comprenant un troisième polynucléotide isolé selon l'invention dans lequel ladite séquence codante est une séquence codant au moins un domaine de la protéine Sbi, ledit domaine de la protéine Sbi étant capable de se lier spécifiquement à la protéine C3 du complément et/ou à des immunoglobulines IgG. On entend par � domaine de la protéine Sbi qui est capable de se lier spécifiquement à la protéine C3 du complément � le domaine Sbi-IV tel que décrit dans Upadhyay et al. (JBC, 11 juin 2008), à savoir le domaine incluant les acides aminés 198 à 266 de la séquence SEQ ID N° 5, les domaines dérivés du domaine Sbi-IV, et les fragments de ceux-ci. Lesdits domaines dérivés du domaine Sbi-IV, et lesdits fragments ayant la capacité de se lier spécifiquement à la protéine C3 du complément. On entend par � domaine de la protéine Sbi qui est capable de se lier spécifiquement à des immunoglobulines IgG �, les domaines Sbi-I et Sbi-II tel que décrit dans Upadhyay et al. (JBC, 11 juin 2008), à savoir le domaine Sbi-I incluant les acides aminés 42 à 94 de la séquence SEQ ID N°5, le domaine Sbi-II incorporant les acides aminés 92 à 156 de la séquence SEQ ID N°4, les domaines dérivés des domaines Sbi-I et Sbi-II, et les fragments de ceux-ci. Lesdits domaines dérivés des domaines Sbi-I et Sbi-II, et lesdits fragments ayant la capacité de se lier spécifiquement à des immunoglobulines IgG. De telles compositions pharmaceutiques selon l'invention présentent l'avantage de permettre la modulation du système immunitaire de l'hôte notamment dans le temps. En effet, les composants de telles compositions pharmaceutiques peuvent être administrés de façon simultanée, séparée et/ou étalée dans le temps afin de moduler le système immunitaire. De telles compositions pharmaceutiques peuvent permettre de faire varier l'expression de la protéine Sbi en fonction de la quantité des composants (premier et troisième polynucléotides selon l'invention) et/ou en fonction du temps et ainsi de faire varier la réponse du système immunitaire adaptif et/ou inné de l'hôte (IgG, protéine C3). La présente invention a également pour objet une méthode de détection, in vitro, de la présence de bactéries du genre Staphylococcus dans un échantillon biologique, comprenant la détection d'au moins une séquence choisie dans le groupe comprenant : - les séquences telles que définies selon le premier polynucléotide selon l'invention; et - les séquences telles que définies selon le deuxième polynucléotide selon l'invention; avec au moins un moyen de détection approprié de ladite séquence. Ledit moyen de détection d'une séquence approprié peut être tout couple d'amorces spécifiques pour l'amplification de ladite séquence (par exemple par PCR ou RT-PCR), ou toute sonde spécifique de ladite séquence. Les séquences des polynucléotides selon l'invention peuvent être utiles pour sélectionner de telles amorces et sondes. En particulier, les séquences telles que définies selon le premier polynucléotide selon l'invention, peuvent être utiles pour sélectionner des sondes permettant la détection de séquences telles que définies selon le deuxième polynucléotide selon l'invention et inversement. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de ladite méthode de détection, in vitro, de la présence de bactéries du genre Staphylococcus dans un échantillon biologique, la détection de ladite séquence peut comprendre les étapes suivantes : 1. la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins une sonde comprenant une séquence choisie dans le groupe comprenant : - les séquences telles que définies selon le premier polynucléotide selon l'invention : - la séquence SEQ ID N°1, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°l et les fragments de celles-ci ; et - la séquence ID N°2, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°2 et les fragments de celles-ci ; et - la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID N°3, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec ladite séquence complémentaire et les fragments de celles-ci ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°3; et - les séquences telles que définies selon le deuxième polynucléotide selon l'invention : - la séquence SEQ ID N°3, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°3 et les fragments de celles-ci ; et - la séquence SEQ ID N°4, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°4 et les fragments de celles-ci ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°l et/ou avec la séquence SEQ ID N°2 ; et 2. la détection de l'hybridation de ladite sonde avec ladite séquence avec au moins un moyen de détection approprié de ladite hybridation. Selon un mode de réalisation particulier de ladite méthode de détection, in vitro, de la présence de bactéries du genre Staphylococcus dans un échantillon biologique, la détection de ladite séquence peut comprendre les étapes suivantes : 1. la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un couple d'amorces spécifiques de ladite séquence dans des conditions permettant une hybridation des amorces à ladite séquence ; 2. l'amplification de ladite séquence ; et 3. la mise en évidence de l'amplification de fragments de ladite séquence correspondant au fragment encadré par les amorces incluant celles-ci. Les amorces spécifiques des séquences telles que définies selon le premier ou le deuxième 25 polynucléotide selon l'invention peuvent être sélectionnées par l'Homme du Métier par des tests de routine à partir desdites séquences. La présente invention a également pour objet une méthode de détection, in vitro, d'ARNm du gène codant la protéine Sbi présent dans un échantillon biologique, comprenant la détection de la séquence SEQ ID N°3, avec au moins un moyen de détection approprié de ladite séquence. 30 La méthode de détection in vitro, d'ARNm du gène codant la protéine Sbi présent dans un échantillon biologique selon l'invention présente l'avantage par rapport à une méthode de détection de l'ADN codant la protéine Sbi de permettre la détection d'infections actives staphylococciques. En effet, il a été montré que l'expression de la protéine Sbi est induite par la présence d'IgG humaines (Zhang et al, 2000). Les séquences telles que définies selon le premier polynucléotide selon l'invention, peuvent être utilisé comme sonde pour détecter, in vitro, spécifiquement et de manière directe de 5 l'ARNm du gène codant la protéine Sbi présent dans un échantillon biologique. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode de détection, in vitro, d'ARNm du gène codant la protéine Sbi présent dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : - la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins une sonde comprenant 10 une séquence choisie dans le groupe comprenant : - la séquence SEQ ID N°1, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°l et les fragments de celles-ci ; et - la séquence ID N°2, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°2 et les fragments de celles-ci ; et 15 - la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID N°3, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec ladite séquence complémentaire et les fragments de celles-ci ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°3; et 20 - la détection de l'hybridation de ladite sonde avec le dit ARNm du gène codant la protéine Sbi avec au moins un moyen de détection de ladite hybridation approprié. La méthode de détection selon l'invention peut comprendre en outre préalablement à l'étape de mise en contact, au moins une des étapes suivantes : - la mise en culture de l'échantillon biologique, éventuellement après isolement 25 des bactéries du genre Staphylococcus sur un milieu sélectif, dans des conditions appropriées permettant la culture de bactéries du genre Staphylococcus ; - la centrifugation de l'échantillon biologique ; - la lyse de bactéries du genre Staphylococcus ; - l'extraction des polynucléotides présents dans ledit échantillon. 30 La présente invention a également pour objet un kit de détection d'ARNm du gène codant la protéine Sbi, comprenant: - au moins une sonde comprenant une séquence choisie dans le groupe comprenant : - la séquence SEQ ID N°1, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°l et les fragments de celles-ci ; et - la séquence ID N°2, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°2 et les fragments de celles-ci ; et - la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID N°3, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec ladite séquence complémentaire et les fragments de celles-ci ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°3; et - au moins un moyen de détection de l'hybridation de ladite sonde avec ledit ARNm du gène codant la protéine Sbi. Ledit moyen de détection approprié de l'hybridation de ladite sonde avec une séquence, notamment avec ledit ARNm du gène codant la protéine Sbi, peut être tout moyen permettant la détection d'une hybridation spécifique entre deux polynucléotides. Notamment, ledit moyen de détection peut être basé sur le marquage de la sonde. Les séquences non marquées peuvent être utilisées directement comme sondes. Cependant les séquences peuvent être marquées directement ou indirectement par un élément radioactif (32P, 35S) ou par une molécule non radioactive (biotine, fluorophore) pour obtenir des sondes utilisables dans de nombreuses applications, notamment dans des méthodes de détection telles que décrites ci-dessus. Les sondes peuvent être en solution ou immobilisés sur un support. La séquence SEQ ID N°3 peut également être utilisée pour sélectionner des amorces oligonucléotidiques, notamment pour les techniques de PCR (à partir d'ADN génomique) et RT- PCR (à partir d'extrait d'ARN total). Ces oligonucléotides pourront être utilisés pour détecter, in vitro, spécifiquement et de manière directe de l'ARNm du gène codant la protéine Sbi présent dans un échantillon biologique. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un kit de régulation de l'expression d'un gène d'intérêt comprenant : - au moins un premier composant choisi dans le groupe comprenant un deuxième ou troisième polynucléotide isolé selon l'invention, une deuxième cassette d'expression, un deuxième vecteur et une deuxième cellule hôte selon l'invention ; et - au moins un second composant choisi dans le groupe comprenant un premier polynucléotide selon l'invention, une première cassette d'expression, un premier vecteur et une première cellule hôte selon l'invention. L'invention a également pour objet l'utilisation, en particulier non thérapeutique, d'un 5 premier polynucléotide isolé selon l'invention pour inhiber l'expression du gène codant la protéine Sbi, notamment pour inhiber la traduction de l'ARNm codant la protéine Sbi. L'invention a également pour objet l'utilisation, en particulier non thérapeutique, d'un premier polynucléotide isolé selon l'invention en combinaison avec un deuxième et/ou troisième polynucléotide isolé selon l'invention pour inhiber l'expression d'un gène d'intérêt, notamment 10 pour inhiber la traduction d'un ARNm codant une protéine d'intérêt. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au regard des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés à titre illustratif et non limitatif. On entend par � sprD � au sens de la première invention, un premier polynucléotide selon 15 l'invention correspondant à la seconde isoforme de la séquence SEQ ID N°7 (à savoir la séquence SEQ ID N°7, dans laquelle les nucléotides en positions 44, 45 et 57 sont u). SprD a été identifiée notamment dans la souche S. aureus N315. La Figure 1 illustre la structure de sprD en solution et son emplacement cellulaire. (A-C) : Sondage structural de sprD. Des autoradiogrammes des produits de clivage de sprD 20 synthétique marqué en 5' par le plomb et les nucléases S1 et V1 après migrations électrophorétiques longue (A) et courte (B). Pistes C, témoins d'incubation ; Pistes GL, bandes obtenues par hydrolyse RNase Ti ; pistes AL, bandes obtenues par hydrolyse RNAse U2 ; pistes AH, bandes obtenues par hydrolyse alcaline. La séquence sprD est indexée au niveau des côtés droits. (C) Modèle de structure secondaire de sprD de la souche N315 de S. aureus, reposant sur 25 une cartographie structurale, montrant les données de sondage. Les triangles correspondent à des coupures par V1 ; les flèches coiffées d'un cercle sont des coupures par S1, les flèches non coiffées sont des coupures par l'acétate de plomb. L'intensité des coupures et des clivages est proportionnelle à la densité de coloration des symboles : un symbole vide (sans coloration), grisé et plein correspond à une coupure faible, moyenne et forte, respectivement. Les domaines 30 structuraux Hl-H4 et L 1-L4 sont indiqués. Le nucléotide encadré correspond à l'extrémité 5' déterminée expérimentalement (RACE) ainsi qu'au site d'initiation de la transcription. Les 36 nucléotides encadrés par les deux crochets noirs ont été délétés dans le mutant sprDA. (D) : Emplacement cellulaire de SprD, de l'ARNtm et de l'ARNIII in vivo, par des Northern-Blots des différentes fractions cellulaires en utilisant des sondes d'ADN spécifiques du brin marquées qui sont spécifiques pour chaque ARN. La fraction cytoplasmique (C) contient les ARNt, la fraction ribosomique (R) contient les trois ARN ribosomiques. La fraction membranaire (M) contient les protéines ErbS et ATPase, selon une analyse par immunoempreinte (Western immunoblot) des fractions cellulaires C, R, et M immunoempreintés (immunoblotted) avec des anticorps anti-ErbS et anti-ATPase. La Figure 2 illustre la régulation de l'expression de sprD in vivo. Analyse par Northern blot de l'expression de sprD, en utilisant une sonde d'ADN spécifique du brin marquée, dans des souches bactérienne RN4220 et SH1000, toutes deux dépourvues du gène sprD, transformées par les vecteurs pCN38 ou pCN51 permettant l'expression de sprD. L'expression de sprD dans la souche N315 est montrée en tant que témoin positif. En tant que témoins de chargement, les blots ont également été sondés pour l'ARNr 5S. La Figure 3 illustre la régulation négative des niveaux de protéine sbi in vivo par sprD. (A). Analyse SDS-PAGE des exoprotéines dans les souches de type sauvage RN4220 et SH1000 et leurs mutants isogéniques produisant sprD préparés à partir de la phase de croissance exponentielle (E). Le gel SDS-PAGE a été coloré au bleu de Coomassie. La flèche met en évidence les niveaux de protéines réduits lorsque sprD est exprimé, à un poids moléculaire d'environ 45 kD, identifié par spectrographie de masse comme la protéine sbi, basé sur 25 séquences peptidiques indépendantes. Une analyse par immunoempreinte (Western immunoblot) des fractions extracellulaires (B) et intracellulaires (C) provenant des souches bactériennes RN4220 et SH1000 exprimant, ou non, sprD à la fois aux phases exponentielle (E) et stationnaire (S). 50 �g de protéine provenant des fractions cellulaires ont été chargées sur SDSPAGE 15 %, transférés sur une membrane en difluorure de polyvinylidène et immunoempreintés (immunoblotted) avec un anticorps anti-sbi, suivie d'une détection par chimioluminescence. La Figure 4 illustre le fait que SprD n'est pas impliqué dans l'induction des niveaux de protéine sbi par le sérum humain. (A) Analyse par immunoempreinte (Western immunoblot) des fractions extracellulaires provenant des souches bactériennes SH1000 et MRSA252 cultivées en présence ou en l'absence de sérum humain. La souche SH1000 exprime sprD (+), ou non (-). Les niveaux d'expression de la protéine A dans chaque bande sont fournis à titre de témoin de chargement interne. (B) Analyse par Northern blot de l'expression de sprD en utilisant une sonde d'ADN spécifique du brin marquée. À titre de témoins de chargement, les blots ont également été sondés pour l'ARNr 5S. La Figure 5 illustre la formation d'un complexe entre sprD et l'ARNm codant la protéine 35 Sbi. (A) L'appariement prédit entre sprD et l'ARNm de sbi, fondé sur (i) une prédiction informatique (ii) une analyse mutationnelle et de retard sur gel natif (iii) un sondage structural de sprD à l'intérieur du duplex. Les domaines structuraux provenant de sprD qui sont dépliés lors de la formation du complexe sont indiqués. Les signes (-) et (+) correspondent aux nucléotides provenant de sprD qui sont protégés (-) ou deviennent clivés (+) par des ribonucléases S1 ou V1 lors de la liaison à l'ARNm codant la protéine Sbi. Le rectangle noir montre l'extrémité 5' de l'ARNm de sbi comme déterminée expérimentalement par 5'RACE. La séquence heptanucléotidique encadrée (GAAAGGG) correspond au RBS (Ribosome Binding site : site de fixation de ribosomes) prédit et l'AUG encadré est le codon de d'initiation de la traduction de l'ARNm de sbi en protéine. (B) Essais de retard sur gel non dénaturant de l'ARN marqué purifié correspondant à 179 (ARNm de sbi) ou 118 (A61 de sbi) nucléotides à son extrémité 5', tous deux avec des quantités croissantes de sprD non marqué purifié, ou avec un mutant sprD dépourvu des nucléotides 35 à 70 (sprD A), ou avec un excès de 100 à 2000 fois d'ARN totaux non marqués purifiés provenant de levure. La Figure 6 représente la cartographie du changement conformationnel induit par la formation d'un complexe entre l'ARNm de sbi et sprD par des sondes structurales. Les autoradiogrammes des produits de clivage de sprD marqué en 5' par les ribonucléases S1 et V1, en présence (+) ou en l'absence (-) d'un excès molaire de 8 fois d'ARNm de sbi dérivé de migrations électrophorétiques courte (à gauche) et longue (à droite). Pistes C, témoins d'incubation ; Pistes GL, bandes obtenues par hydrolyse RNase Ti ; Pistes AL, bandes obtenues par hydrolyse RNase U2 ; la séquence est indexée sur les côtés droits. La zone d'appariement entre les deux ARN est indiquée, en fonction des données mutationnelles et de sondage. La Figure 7 illustre l'inhibition par sprD de l'initiation de la traduction de l'ARNm de sbi via les ribosomes 70S. La localisation par la technique du toeprinting du ribosome sur l'ARNm de sbi comme décrit dans la partie Matériels et Méthodes, ci-après. +1- indique la présence de ribosomes, de sprD de type sauvage (pistes 2, 5, 6 et 7) ou de sprD-A (pistes 3, 8, 9 et 10). Les concentrations de sprD et sprD-A étaient de 0,4 �M (bandes 5 et 8), 2 �M (bandes 6 et 9) et 10 �M (bandes 7 et 10). Les � toeprints � (empreintes avant) déterminés expérimentalement sont indiqués. U, A, G et C, font référence aux échelles de séquençage de l'ARNm de sbi. EXEMPLES 1. Matériels et méthodes 1.1 Souches et plasmides Les souches de S. aureus et les plasmides utilisés dans cette étude sont énumérés dans le tableau 1. Les souches de S. aureus ont été cultivées de manière habituelle à 37 °C dans un bouillon d'infusion de cerveau et de coeur (BHI, Oxoid). Si nécessaire, les inventeurs ont utilisé du chloramphénicol et de l'érythromycine à raison de 10 �g/ml. La souche DH5a d'E. Coli a été utilisée en tant qu'hôte bactérien pour la construction du plasmide. Les souches d'E. Coli ont été cultivées dans un milieu de Luria-Bertani (LB). Dans le plasmide pCN38-sprD, le gène codant pour sprD est exprimé sous le contrôle de son propre promoteur. Pour construire ce plasmide, sprD avec 40 nucléotides en amont et 35 nucléotides en aval a été amplifié par une PCR à partir de l'ARN génomique de la souche N315 de S. aureus en tant que fragment de 217 paires de bases avec des sites de restriction flanquants Pst I et EcoR I. Le produit de la PCR a été cloné entre ces deux sites dans le vecteur pCN38 à faible nombre de copies (Charpentier et al., 2004). E. coli DH5a Sambrook et al. 1989 S. a ureus RN4220 Dérivé défectueux de restriction de 8325-4 Kreiswirth et al. 1983 SH1000 Dérivé fonctionnel rsbU de 8325-4 rsbU Horsburgh et al. 2002 Plasmides pCN51 Charpentier et al. 2004 pCN38 Charpentier et al. 2004 pCN51-sprD Cette étude pCN38-sprD Cette étude Tableau 1 1.2 Fractionnements des cellules Les fractions cellulaires de la souche N315 de S. aureus ont été préparées comme décrit (Chesneau et al., 2005) avec certaines modifications. 300 à 400 ml de cultures bactériennes ont été cultivées jusqu'à la phase exponentielle (DO 600 = 2,0). Les protoplastes ont été recueillis par la lyse des parois cellulaires par la lysostaphine (100 �l de solution mère 1 mg/ml) dans 10 ml de Tris-HC1 pH = 7,5 avec 30 % de sucrose. Ensuite, les protoplastes ont été lysés par choc osmotique dans de 1'HEPES 25 mM pH 7,6, MgC12 10 mM, NH4C1 30 mM, bêtamercaptoéthanol 4 mM et complexe ribonucléoside Vanadyl 10 mM (BioLabs). Les centrifugations ont été effectuées à 30 000 g pendant 30 minutes (P30 : fraction membranaire) et 100 000 g pendant 3 heures (P100 : fraction ribosomique, 5100 : fraction cytoplasmique). 1.3 Isolation de la protéine, spectrométrie de masse et western immunoblots Pour la préparation des extraits de protéines totales et des extraits extracellulaires, les bactéries ont été cultivées jusqu'aux phases de croissance exponentielle (DO600 = 2,0) ou stationnaire (DO600 = 5,0) et les cellules ont été séparées du surnageant par centrifugation pendant 10 minutes à 4 °C (8 000 g). Pour la purification des protéines extracellulaires, les surnageants ont été recueillis, filtrés (filtre stérilisé de 0,45 �m) et précipités avec 10 % d'acide trichloroacétique. Les précipités ont été lavés avec de l'acétone glacée et chargés sur SDS-PAGE selon le procédé de Laemmli, 1970. Pour les extractions des protéines totales, des culots de 2 ml de cultures ont été lavés avec du TE (EDTA 50 mM, Tris 50 mM pH 7,5), et remis en suspension dans 0,2 ml du même tampon contenant 0,1 mg/ml de lysostaphine. Après une incubation à 37 °C pendant 10 minutes, les échantillons ont été mis à bouillir pendant 5 minutes dans un tampon d'échantillon, analysés par SDS-PAGE et colorés au bleu de Coomassie R-250. Les protéines d'intérêt ont été extraites par SDS-PAGE 1D, digérées avec de la tripsine et les peptides obtenus ont été identifiés par spectrométrie de masse Maldi-Toff et RPHPLC/NanoLC/ESI-SM-SM. Pour les analyses par immunoempreinte (immunoblot), les protéines ont été transférées sur une membrane en PVDF (Immobilon-P, Millipore). Les analyses par Western blots ont été effectuées en utilisant un anticorps polyclonal anti-Sbi (don du Dr van den Elsen, Université de Bath, RU) et également des anticorps anti-EbpS et anti-ATP-ase, comme décrit dans Downer et al., (2002). Les signaux ont été visualisés en utilisant un imageur STORM 840 Phosphor-Imager (Molecular Dynamics) et quantifiés en utilisant un logiciel Image-QuantNT 5.2. 1.4 Isolation de l'ARN et Northern blots Les ARN totaux ont été préparés à partir des phases de croissance exponentielle (DO600 = 2,0) ou stationnaire (DO600 = 5,0) de diverses souches de S. aureus comme décrit dans Oh et So (2003). Pour l'ARNs 5S et d'autres ARNs, des Northern blots ont été effectués avec 5 �g d'ARN totaux dénaturés et purifiés sur gel PAGE 8 % dénaturant, comme décrit dans Pichon et Felden (2005). Pour l'ARNm de sbi, des Northern blots ont été effectués comme décrit dans McCallum et al. (2006). 1.5 Essai de 5 '-RACE, transcription in vitro et marquage de l'extrémité 5' de l'ARN Des essais de 5'-RACE ont été effectués conformément au procédé de Antal et al., 2005 avec les amorces décrites dans le tableau 2. Des ARN de type sauvage et mutants pour le sondage de structure, des essais de retard sur gel et des expériences de toeprinting ont été transcrits à partir de fragments de PCR générés à partir de l'ADN génomique avec les amorces décrites dans le tableau 2. Tous les fragments contiennent une séquence promoteur de l'ARN polymérase T7. Pour produire la matrice d'ADN codant pour le mutant de délétion de l'ARN de sprD, sprDA, des oligonucléotides mutagénisés (Tableau 2) ont été utilisés dans un protocole en deux étapes. Tout d'abord, des ADN de � sprDforTR � et � T7sprDdelrev � ont produit un fragment � amont � par PCR et les deux ADN � sprDrevTR � et � T7sprDdelfor � ont généré un fragment d'ADN � aval �. Les fragments amont et aval se chevauchent partiellement. Le mélange des deux fragments purifiés par PCR (200 ng) a été utilisé comme matrice dans une troisième réaction de PCR en utilisant les deux oligonucléotides d'ADN � sprDforTR � et �sprDrevTR � pour produire un fragment codant pour sprDA. Tous les ARN ont été produits par une transcription in vitro en utilisant MEGAscript (Ambion). Des transcrits d'ARN à marquage radioactif ont été produits en ajoutant du [a32-P]UTP dans le mélange de réaction de la transcription. Le marquage des ARN à leurs extrémités 5' a été effectué comme décrit dans Antal et al. (2005). Les ARN marqués et non marqués ont été purifiés sur gel PAGE 8 %, élués, précipités à l'éthanol et stockés à -80 °C avant utilisation. ADNs Séquences Utilisations Antil640 ggcgctccttgaaaacgccc sprD northern/5' Antisprd3 gcccgaaaaggagcaatacat RACE Sbineg5 tcactcgcttttgcttcccca sprD 5' RACE Sbineg3 tcgcgtaatgttttgatgtattgg sbi 5' RACE SprD5PstI ttaaatctgcagagataatgcaatagtagccat pCN38-sprD SprD3EcoRI taaattg ag attccgacataccttattgtatttatag sprD ARNm sprDforTR transcription sprDrevTR Sbi ARNm T7sprD_delfor transcription T7sprD_delrev SBIforTR SBIrevTR SBIdeltaTR taatacgactcactataggggcgttttcaaggagcgcc aaggtaagcaccgaaatgcttac gcgcctttcattttttatgtttgcgctttccaaatcaa ttgatttggaaagcgcaaacataaaaaatgaaaggcgc taatacgactcactataggcatacaataaatttaatatgtaa gttgttttgagttgtttggtgct taatacgactcactataggcgaagttgctagttggggcagca Tableau 2 1.6 Essais de retard sur . et et sondai e de structure d 'ARN en solution Des essais de retard sur gel entre sprD et l'ARNm de sbi ont été effectués comme décrits dans Antal et al. (2005). A partir des essais de retard sur gel, 0,4 pmole d'ARNm de sbi de type sauvage marqué ou tronqué en 5' (SbiA61) ont été mis à incuber avec diverses concentrations (de 1,6 à 20 pmoles) de sprD de type sauvage non marqué ou tronqué (sprDA). Pour une analyse structurale en solution, des duplex d'ARN entre l'ARNm de sbi et sprD ont été préparés en mettant à incuber 0,4 pmole de sprD marqué et 1,6 pmole de l'ARNm de sbi dans un tampon contenant du Tris-HC1 10 mM (pH 7,5), du NaCl 6 mM, de 1'EDTA 10 mM et du dithiothréitol 5 mM pendant 15 minutes à 25 °C. Les analyses structurales d'un sprD marqué à l'extrémité 5' renaturé, soit seul soit dans un complexe avec sa cible, l'ARNm sbi, ont été effectuées comme décrit dans Antal et al. (2005). Les digestions ont été effectuées à 25 °C pendant 15 minutes en présence de 2,5 tg d'ARNt totaux de levure avec les enzymes suivantes : 0,2 ou 1 unité de nucléase S1 et 10-4 ou 5.10.5 unités de RNase V1. Des clivages par le plomb (II) ont été effectués avec 0,2 ou 0,4 mM d'acétate de Pb dans de l'Hepes 25 mM (pH 7,5), de l'acétate de Mg 7 mM et de l'acétate de potassium 35 mM pendant 10 minutes à 25 °C. Des bandes d'hydrolyse alcaline ont été obtenues en incubant sprD marqué dans du NaOH 0,1 M et de 1'EDTA 2 mM à 90 °C pendant 3 minutes. Les réactions ont été terminées par une précipitation à l'éthanol, les culots d'ARN ont été lavés deux fois dans de l'éthanol à 80 % et dissous dans un tampon de charge II d'Ambion. Les échantillons d'ARN ont été dénaturés pendant 5 minutes à 95 °C avant une séparation sur des gels de séquençage polyacrylamide 8 %/urée 8 M dans du TBE X 0,5. Les gels ont été séchés, exposés et visualisés en utilisant un imageur STORM 840 Phosphor-Imager. 1.7 Essais de Toeprinting Les essais de toeprinting ont été réalisés comme décrit dans Hartz et al. (1988), avec des modifications mineures. Les mélanges d'hybridation contenaient 0,2 pmole d'ARNm de sbi non marqué et 1 pmole d'amorce � SBIrevTR � marquée à l'extrémité 5' dans un tampon contenant du Tris-acétate 10 mM (pH 7,5) du NH4C1 60 mM et du DTT 1 mM. Pour les essais d'inhibition du chargement des ribosomes sur l'ARNm de sbi par sprD, différentes concentrations de sprD de type sauvage ou mutant (sprDA) ont été ajoutées avant d'ajouter les sous-unités 70S purifiées provenant d'E. Coli. Les ribosomes 70S ont été renaturés pendant 15 minutes à 37 °C puis dilués dans le tampon de réaction en présence de MgCl2 1 mM (pour favoriser la dissociation des sous-unités) 4 pmoles de sous-unités ribosomiques 70S ont été ajoutées dans chaque essai, mis à incuber pendant 5 minutes et la concentration de MgCl2 a été ajustée à 10 mM (pour favoriser la réassociation des sous-unités). Après 5 minutes d'incubation 10 pmoles d'ARNtfmEt non chargé ont été ajoutés et l'incubation a été prolongée pendant 15 minutes supplémentaires. L'ADNc a été synthétisé avec 2 UI d'AMV RT (Biolabs) par essai pendant 15 minutes. Les réactions ont été terminées en ajoutant 10 �L de tampon de chargement II (Ambion). Les produits d'ADNc ont été chargés et séparés sur des gels de polyacrylamide 8 %/urée 8 M. Les � toeprints � (empreintes avant) ont été localisées sur la séquence d'ARNm de sbi par séquençage de l'ADN avec la même amorce d'ADN marquée à l'extrémité 5'. Les gels ont été séchés et analysés comme décrits ci-dessus. II. Résultats 11.1 La structure de sprD et son emplacement cellulaire sont tous deux compatibles avec une régulation de l'ARNm cible Dans un premier temps, les extrémités 5' et 3' de sprD ont été déterminées. Son extrémité 5' a été identifiée en utilisant une 5'-RACE. A partir de plusieurs clones d'ADN, l'extrémité 5' de sprD a été cartographiée à la position G2007185 de la séquence de S. aureus N315 (Kuroda et al., 2001) extraite à partir de la base de données de génomes du Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL, European Molecular Biology Laboratory). Sa longueur a été déduite à partir de Northern blots sur des gels polyacrylamides (voir figure 1D), ce qui a conduit à une hélice prédite de neuf paires de bases se terminant par une extension U6 agissant en tant que terminateur Rho-indépendant à l'extrémité 3' (H4-L4, figure 1C). L'ARN SprD contient 142 nucléotides. 12 séquences de SprD provenant des génomes des souches N315, MRSA252, Newman, NCTC8325, Mu50, Mu3, MSSA476, JH1, JH9, MW2, USA300 TCH1516 et USA300FPR3757 de S. aureus ont été alignées et possèdent une identité de séquences très élevée, excepté aux positions 44 et 45 (u ou c) et 57 (u ou a) de la séquence SEQ ID N°7. La variation des séquences est trop faible pour établir une structure secondaire de sprD par une analyse phylogénétique. C'est pourquoi, sa conformation a été analysée par des sondes structurales en solution, une approche qui a contribué à l'établissement des structures de bon nombre d'ARN (Felden 2007). Un transcrit sprD a été marqué à son extrémité et sa conformation en solution a été sondée par une RNase VI, qui clive les ARN double brin ou les nucléotides empilés, et par une nucléase S1 et par le plomb, qui tous deux clivent les ARN simple brin. La réactivité vis-à-vis de ses sondes a été étudiée pour chaque nucléotide (les deux panneaux A et B de la figure 1 sont représentatifs). Cinq expériences indépendantes ont été réalisées et leurs données sont résumées sur un modèle de structure secondaire qu'elles supportent (figure 1C). Des coupures spécifiques double brin à partir de U28-U30, G39-C40, A54, A62-A64, U79-U80, A89, G91, Al25-Al27, et l'absence de clivages par la nucléase S1 et le plomb au niveau de Gl-U8, G14-U21, G39-C42, G49-052, G76-U92, U101-U109, G113- U119, G121-U129 et G134-C142 suggèrent que quatre hélices d'ARN se forment en solution : une Hl de 8-pb, une H2 de 4-pb, une H3 de 17-pb et une H4 de 9-pb (figure 1C). L'hélice H2 a pu être allongée davantage et passer de 4 à 13 paires de bases mais sa portion inférieure (U28-U38/A54-A64) est lourdement coupée à la fois par les sondes spécifiques simple brin (U28-U38, G55-A64) et double brin (U28-U30, A62-A64), ce qui implique une instabilité importante en solution. Les clivages par S1 au niveau de U9-G13 (L1), U44-C48 (L2), A95-U100 (L3), C132-G133 (L4) et les coupures par le plomb au niveau de Ali-Al2 (Ll), U46-C48 (L2) et U94 (L3) sont cohérentes avec l'existence de quatre boucles (L 1-L4) coiffant respectivement les hélices Hl à H4. En se fondant sur la présence de plusieurs clivages par S1 et le plomb et sur l'absence de coupures par VI, les extensions de nucléotides U22-U27 et U65-C75 se replient comme des simples brins d'ARN en solution. Les coupures par le plomb au niveau de U110-U112 supportent la présence d'un renflement interne à l'intérieur de H3, A111 étant simple brin. Il n'existe aucun site de dégradation détectable à l'intérieur de la séquence de sprD. En résumé, la structure de sprD consiste en deux extrémités 5' (Hl) et 3' (H3-H4) repliées, qui flanquent un grand (d'une longueur de 54 nucléotides correspondant à la séquence SEQ ID N°2) domaine instable et largement non replié (à l'exception de H2), qui peut être disponible pour des interactions avec des cibles d'ARNm dédiées (voir ci-dessous). Un fractionnement cellulaire a été réalisé et l'emplacement cellulaire de sprD a été analysé par des Northern blots. Des lysats cellulaires provenant de cellules de la souche N315 de S. aureus ont été fractionnés par des centrifugations successives afin d'obtenir des fractions membranaires (M), cytoplasmiques (C) et ribosomiques (R) (pour les détails voir la section Matériels et Méthodes). Conformément à une analyse par immunoempreinte (Western immunoblot), la fraction M contient deux protéines membranaires, ErbS et ATPase, tandis que ces deux protéines sont absentes des fractions R et C (figure 1D). La fraction R contient les trois ARN ribosomiques (ARNr) et la fraction C contient les ARN de transfert (ARNt, figure 1D). L'ARN de transfert-messager (ARNtm) est responsable de la surveillance de la traduction et de la libération des ribosomes bloqués dans des eubactéries (Moore et Sauer 2007) mais cette fonction n'a pas été rapportée dans S. aureus. Comme montré ici, l'ARNtm de S. aureus est présent à la fois dans les fractions C et R in vivo (figure 1D), comme il est attendu d'un ARN qui se lie à, et libère les ribosomes bloqués. L'effecteur du système agr de S. aureus, ARNIII, codant pour la delta-hémolysine, est surtout associé aux ribosomes in vivo, avec uniquement une fraction cytoplasmique mineure qui est disponible pour la liaison de ses ARNm cibles dédiés (Boisset et al., 2007). SprD se situe principalement dans le cytoplasme, compatible avec des fonctions de régulations d'ARNm cible, mais une fraction mineure est associée aux ribosomes (figure 1D). I1.2 Activation et désactivation de l'expression de sprD in vivo Pour étudier la fonction de sprD, les inventeurs ont tiré parti de l'absence d'expression de sprD dans les souches RN4220 (souche de laboratoire, Kreiswirth et al., 1983) et SH1000 (souche virulente, Horsburgh et al., 2002), comme démontrée par des Northern blots à la fois dans les phases exponentielles (E) et stationnaires (S) (figure 2). Le gène sprD, avec sa séquence promoteur prédite en amont a été cloné dans deux vecteurs à faible nombre de copies E. coli-S. aureus, pCN38 et pCN51 (Charpentier et al., 2004) et transformé dans les souches RN4220 et SH1000. Dans les deux souches, aux deux phases E et S, ces deux vecteurs expriment sprD in vivo à sa taille attendue et à des niveaux d'expression comparables à ses niveaux d'expression endogène dans la souche N315 (figure 2). Dans les deux souches de S. aureus, il n'y a pas de phénotypes de croissance détectables que sprD soit, ou non, produit, (les courbes de croissance sont superposables ; non représenté). I1.3 SprD régule négativement (à la baisse) les niveaux de la protéine Sbi in vivo Les inventeurs ont réalisé une comparaison des extraits de protéines totales provenant des souches de S. aureus exprimant, ou non, sprD dans le but de révéler des différences dans les niveaux d'expression des protéines choisies qui pouvaient être extraites et identifiées par spectrométrie de masse (SM). A cette fin, des protéines totales provenant d'extraits extracellulaires et intracellulaires à la fois aux phases E et S ont été préparées à partir des souches RN4220 et SH1000 exprimant, ou non, sprD. De manière remarquable, une comparaison méticuleuse des extraits de protéines extracellulaires des deux souches par SDSPAGE met en évidence une bande protéique d'environ 45 kD dont le niveau diminue en présence de sprD à la phase E (figure 3A). Ce résultat est observé pour les deux vecteurs codant pour sprD, et pour les deux souches de S. aureus, avec une réduction plus prononcée des niveaux de protéines pour la souche SH1000 (figure 3A). La ou les protéines de cette bande ont été éluées, un produit de digestion triptyque a été préparé et les fragments de protéines ont été soumis à une Spectrométrie de Masse Maldi-Toff. Vingt-cinq peptides indépendants ont été identifiés, tous correspondant à la séquence d'acides aminés d'une protéine unique Sbi (tableau 3). Une deuxième confirmation, indépendante, de la régulation négativement (à la baisse) de la protéine Sbi par SprD a été obtenue en étudiant l'expression de la protéine Sbi endogène à la fois dans les extraits de protéine extracellulaire (figure 3B) et intracellulaire (figure 3C) par des Western blots, en utilisant un anticorps polycolonal contre la protéine Sbi. Comme il est attendu d'une protéine de surface cellulaire, sbi est identifiée dans la fraction extracellulaire, mais est également détectée dans le milieu intracellulaire des bactéries. La protéine est fortement exprimée à la phase E mais est également détectée à la phase S. Lorsque sprD est exprimé, dans les deux milieux intra- et extra- cellulaires, l'expression de la protéine sbi est réduite de manière significative à la fois dans les cellules de RN4220 et SH1000 et à la fois aux phases E et S, en accord avec les données provenant des gels SDS-PAGE et de la spectrométrie de masse. A la phase S, sprD réduit aussi le niveau d'expression d'une autre bande de protéines extracellulaire qui a un poids moléculaire apparent d'environ 80 KD. A partir des données de spectrométrie de masse, il ressort qu'elle contient deux protéines, le précurseur de la triacylglycérol lipase extracellulaire et la formate acétyltransférase intracellulaire (une contamination de la fraction extracellulaire par une protéine intracellulaire), respectivement onze et sept séquences peptidiques ont été détectées pour ces protéines . Observé Mr (attendu) Mr (calculé) Peptides 452.2365 902.4584 902.4385 K.YLTDTYK.S 493.2919 984.5692 984.5604 K.QLDALVAQK.D 539.7876 1077.5606 1077.5454 K.AIKDFQDNK.A 542.8126 1083.6107 1083.5964 K.LLGYYQSLK.D 559.8298 1117.6450 1117.6284 K.AFYQVLHLK.G 561.7985 1121.5825 1121.5716 K.VDDKNGYLAK.S 562.8242 1123.6338 1123.6237 K. VEVPQIQ SPK. V 565.8000 1129.5855 1129.5801 R.EVNKAPMDVK.E35 566.2913 1130.5680 1130.5641 R.EVNKAPMDVK.E + Deamidation (NQ) 569.3008 1136.5871 1136.5713 R.AQEVFSESLK.D 589.2702 1176.5259 1176.5127 K.YYYNTYYK.Y 609.3096 1216.6047 1216.6047 K.LNEKDSIENR.R 613.3108 1224.6071 1224.5986 R.NYVTES1NTGK.V 639.8308 1277.6470 1277.6615 K. SAAYEANSKLPK.D 653.3 601 1304.7057 1304.6976 K. SYIQPLKVDDK.N 697.8796 1393.7447 1393.7353 R.VAQQNAFYNVLK.N 734.3853 1466.7560 1466.7252 R.AQEVFSESLKDSK.N 746.3830 1490.7515 1490.7365 R.SQQVWVESVQSSK.A 773.4359 1544.8572 1544.8409 K.GAIDQTVLTVLGSGSK.S 775.9313 1549.8481 1549.8364 R.RVAQQNAFYNVLK.N 793.4562 1584.8978 1584.8551 K.VLYTFYQNPTLVK.T 846.4664 1690.9183 1690.9253 K. VEAPQIQ SPQIEKPK.A 852.9039 1703.7933 1703.7863 K.HQTTQNNYVTDQQK.A 919.0168 1836.0191 1835.9992 K.YKGAIDQTVLTVLGSGSK.S 1018.5161 2035.0177 2034.9857 K.NDNLTEQEKNNYIAQIK.E + Tableau 3 I1.4 SprD n'est pas impliqué dans la régulation des niveaux d'expression de sbi par le sérum humain Le niveau de protéine Sbi à la surface des cellules de S. aureus est faible mais augmente de manière significative après une croissance en présence de sérum humain, le composant du sérum responsable de l'induction de la synthèse de Sbi étant les IgG (Zhang et al., 2000). Etant donné que sprD régule à la baisse les niveaux de protéines sbi (figure 3), les inventeurs ont supposé que sprD pouvait être impliqué dans la régulation des niveaux de protéines sbi par l'IgG provenant de sérum humain. Une hypothèse raisonnable pourrait être que l'IgG humaine régule à la baisse sprD, qui à son tour élève les niveaux de protéines sbi pour agir en tant que récepteurs � de détection de l'environnement �. A la fois dans les souches SH1000 et MRSA252 de S. aureus, la présence de sérum humain augmente le niveau de protéine sbi, comme le montre une analyse par immunoblot en utilisant des anticorps polyclonaux dirigés contre sbi (figure 4A). La présence ou l'absence de sprD, toutefois, n'a aucune influence détectable sur l'effet de stimulation du sérum humain sur les niveaux de protéine sbi (figure 4A). Par ailleurs, les niveaux d'ARN de sprD sont essentiellement similaires en présence ou en l'absence de sérum humain comme le montrent les Northern blots (figure 4B). sprD n'est donc pas impliqué dans le mécanisme d'induction de l'expression de sbi par l'IgG humaine. ILS La régulation de sbi par sprD se produit par une interaction directe entre l'ARNm codant la protéine Sbi et l'ARNsprD Les inventeurs ont permis de répondre aux deux hypothèses suivantes : la régulation des niveaux de la protéine sbi par sprD est-elle effectuée directement ou indirectement, grâce à une liaison à une protéine supplémentaire ou à des régulateurs d'ARN ? Par ailleurs, la régulation médiée par sprD se produit-elle au niveau de l'ARNm et/ou au niveau de la protéine ? Pour établir une distinction entre ces hypothèses et pour comprendre la régulation au niveau moléculaire, des interactions d'appariement putatives entre sprD et l'ARNm de sbi ont été analysées in silico, en se focalisant sur le site de départ de la traduction de l'ARNm codant pour la protéine sbi. Les ARNs bactériens peuvent fonctionner comme des ARN antisens par appariement de bases avec des ARNm cibles (Majdalani et al., 2005). Des sites complémentaires entre sprD et la partie 5' de l'ARNm de sbi, incluant son codon d'initiation AUG et la séquence de Shine et Dalgarno (SD) en amont ont été détectés en utilisant FASTA3 (Pearson 2000). La région de sprD prédite comme étant impliquée dans l'appariement se situe entre Hl et H3, impliquant 43 nucléotides (en gras sur la figure 1C, nucléotides de H2, L2, et des jonctions Hl/H2 et H2/H3), prédits pour former 6 paires de bases GC, 33 paires de bases AU et 4 paires de bases GU (figure 5A) avec l'extrémité 5' de l'ARNm de sbi. L'extrémité 5' de l'ARNm de sbi a été déterminée expérimentalement en utilisant une 5'-RACE. A partir de plusieurs clones d'ADN, l'extrémité 5' de sprD a été cartographiée à la position G2476041 à partir de la séquence de S. aureus N315 (Kuroda et al., 2001) extraite de la base de données de génomes du Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL, European Molecular Biology Laboratory) (encadré G de la figure 5A). Une formation de duplex in vitro entre sprD (un transcrit d'une longueur de 142 nucléotides purifiés) et un fragment d'ARNm de sbi synthétique d'une longueur de 179 nucléotides contenant sa séquence 5' UTR (41 nucléotides) suivis par 46 codons a été étudiée par des essais de retard sur gel. Les deux ARN ont été repliés séparément et indépendamment, refroidis à température ambiante et l'ARNm de sbi marqué a été mis à incuber avec des concentrations croissantes de sprD non marqué. Les réactions ont été analysées par une électrophorèse sur gel au moyen de gels de polyacrylamide non dénaturants (figure 5B). Le duplex � ARNm sbi-sprD � est observé à un rapport molaire de 1:4 et presque toute la protéine sbi se trouve dans le complexe avec son régulateur d'ARN à un rapport molaire de 1:20. C'est pourquoi, in vitro, cette interaction � ARNm Sbi-ARNsprD � se forme en l'absence de la protéine Hfq, apparentée aux protéines Sm, connue pour jouer un rôle clé dans bon nombre de ces transactions d'ARN chez certaines bactéries (Brennan et Link 2007). L'hybridation entre sprD et le fragment d'ARNm de sbi est spécifique parce qu'un excès molaire de 100 à 2 000 fois des ARNt totaux de levure ne déplace pas l'ARNm de sbi à partir d'un complexe spD-ARNm sbi préformé (figure 5B). Un mutant de délétion de l'ARNm de sbi a été produit, Sbi A61 auquel il manque 61 nucléotides à son extrémité 5' incluant ceux prédits comme étant impliqués dans l'interaction avec l'ARN sprD. Ce mutant de délétion devient incapable de s'hybrider à l'ARN sprD, même à un rapport molaire de 1:40 entre Sbi A61 et sprD, démontrant que les 61 premiers nucléotides à l'extrémité 5' de sbi sont essentiels pour que se produise l'hybridation avec sprD, en accord avec l'appariement proposé entre les deux ARN. Un mutant sprD contenant une délétion de 36 nucléotides dans la région prédite comme interagissant avec l'ARNm de sbi (sprDA est dépourvu des nucléotides des positions 35 à 70, voir figure 1C pour plus de détails) n'a pas été à même de s'hybrider spécifiquement à l'ARNm de sbi (figure 5B). Il démontre l'implication des domaines H2, L2 et de la jonction H2/H3 provenant de sprD dans la reconnaissance et l'hybridation spécifique de l'ARNm codant la protéine Sbi. 11 .6 Étude du complexe sprD-ARNm de sbi par des sondes structurales Pour obtenir une compréhension plus approfondie de l'interaction entre l'ARNm de sbi et sprD à un niveau moléculaire, un complexe entre les deux ARN a été formé à un rapport molaire de 1:10 entre sbi et sprD marqué et soumis à des clivages par RNases S1 et V1 (figure 6). En présence de l'ARNm de sbi (figure 4), les clivages S1 aux positions U23-U30 (jonction Hl/H2 et H2), U37-G39 et U56-U61 (H2), U44-C48 (boucle L2) et A68-U73 (jonction H2/H3) disparaissent dans la séquence sprD, tandis que les coupures S1 apparaissent au niveau de C51- U53 (H2). Lors de la formation du complexe, des coupures V1 au niveau de C40 et A54 disparaissent (la partie supérieure de H2) tandis que deux coupures V1 apparaissent au niveau de U44-U45 (L2). Tous les changements structuraux identifiés expérimentalement se situent dans la zone H2-L2 de sprD et dans ses environs, sans aucun changement conformationnel détectable pour les tiges-boucles Hl-L1, H2-L2 et H3-L3. Ces résultats de sondage structuraux confèrent un fort appui expérimental au modèle de structure secondaire de l'interaction entre les deux ARN présentés sur la figure 5A. Lors de la formation du complexe, la tige H2 instable se déplie, permettant des appariements extensifs mais interrompus à partir des nucléotides 22 à 75. Dans le complexe, la boucle L2 se replie comme une hélice d'ARN, comme mis en évidence par l'apparition des coupures V1 (U44-U45) et la disparition des coupures S1 (U44-C48). La relative instabilité en solution de H2 dans la structure sprD seule est bien comprise étant donné que H2 doit se déplier pour un appariement extensif avec une séquence complémentaire provenant de l'ARNm de sbi (U28-C42 et U53-A64 provenant des paires sprD avec A47-C34 et A23-U13 provenant de sbi, respectivement, figure 5A). L'hybridation spécifique de sprD à l'ARNm de sbi conduit à une inhibition de l'initiation de la traduction de l'ARNm de sbi en protéine sbi(Voir figure 7) 11 .7 Le complexe sprD-ARNm de sbi empêche la liaison des ribosomes 70S SprD, lorsqu'il interagit avec l'ARNm de sbi, couvre le site de liaison des ribosomes (RBS) et le codon d'initiation AUG (figure 5A). C'est pourquoi, étant donné que les sites d'interaction de sprD avec l'ARNm de sbi coïncident avec la région des ARNm qui est couverte par les ribosomes au cours de l'initiation de la traduction (Hüttenhofer et Noller 1994), les inventeurs ont testé si ce complexe était capable d'empêcher une liaison des ribosomes 70S en utilisant des essais de � toeprinting �. Le complexe d'initiation ternaire constitué par des ribosomes 70S d'E. coli purifiés, l'initiateur ARNtfm" et l'ARNm de sbi bloque l'élongation d'une amorce d'ADNc par transcriptase inverse (RT) et produit deux � toeprints � de 14 et 17 nucléotides en aval du codon d'initiation (figure 7, bande 4), ce qui confirme expérimentalement le positionnement du codon de départ de sbi comme représenté sur la figure 5A. La présence de sprD réduit l'interaction des ribosomes 70S avec l'ARNm de sbi, d'une manière dépendante de la concentration (figure 7, bandes 5 à 7). L'addition de quantités croissantes d'un mutant de délétion de sprD, spr-A, qui ne peut former un complexe avec l'ARNm de sbi in vitro (figure 5B), n'évite pas l'interaction des ribosomes 70S avec l'ARNm de sbi. C'est pourquoi, l'ARN sprD inhibe la traduction de l'ARNm de sbi en évitant l'interaction des ribosomes avec l'ARNm via une interaction d'appariement antisense directe avec l'ARNm de sbi cible. III. Discussion La variété des symptômes cliniques d'infections staphylococciques dépend de l'expression des facteurs de virulence qui sont sous le contrôle de protéines de régulation intracellulaires spécifiques et de l'ARN. Le seul régulateur d'ARN connu et bien caractérisé de la pathogénèse de S. aureus est l'ARNIII qui contrôle l'expression d'un grand nombre de gènes de virulence (Huntzinger et al. 2005 ; Boisset et al. 2007). Les inventeurs ont mis en évidence qu'il existe un autre ARN exprimé notamment par S. aureus, sprD, qui est également impliqué dans la régulation des gènes de virulence. SprD agit comme un ARN antisens et provoque une répression directe de la traduction de l'ARNm codant la protéine sbi. Les inventeurs ont montré que l'expression de la protéine sbi est modulée par au moins deux régulateurs qui sont indépendants l'un de l'autre (figure 4) : une régulation positive (à la hausse) déclenchée par l'IgG humaine et une régulation négative (à la baisse) médiée par sprD, suggérant que la quantité et la chronologie de production de la protéine sbi sont restreintes à une fenêtre étroite pour que les bactéries du genre Staphylococcus, notamment S. aureus réussisse à se soustraire à la fois au système immunitaire adaptatif et au système immunitaire inné au cours des infections humaines et animales. Les inventeurs ont mis en évidence le rôle régulateur et le mécanisme d'un ARN exprimé notamment par S. aureus, SprD, et ont identifié un ARNm cible : l'ARNm codant la protéine Sbi. SprD a au moins un ARNm cible supplémentaire qui sera soumis à une caractérisation biochimique supplémentaire par les inventeurs. Le domaine central (nucléotides 22-75 de la séquence SEQ ID N°7) de sprD se replie comme une structure tige-boucle flanquée par des simples brins d'ARN (figure 1C) et provoque une répression directe de la traduction de l'ARNm de sbi par des appariements extensifs avec son ARNm cible codant la protéine sbi (figure 5A), formant un long duplex. Sur les 142 nucléotides de la séquence de SprD, 96 sont impliqués dans des interactions d'appariement (figure 1C), indiquant qu'environ 68 % de sa séquence n'est pas accessible pour une digestion par exonucléase, ce qui rend compte de sa stabilité in vivo (figure 2). L'interaction moléculaire entre sprD et l'ARNm codant la protéine sbi est étayée par une analyse mutationnelle des deux ARN (figure 5B) ainsi que par l'utilisation de sondes structurales en solution (figure 6). La séquence leader en 5' de l'ARNm de sbi, d'une longueur de 41 nucléotides (nucléotides 1 à 41 de lé séquence SEQ ID N°3), est capitale pour la régulation parce que sprD est incapable d'interagir avec le mutant de délétion de l'ARNm, sbi061 (figure 5B). Le motif en épingle à cheveux H2-L2 provenant de sprD pourrait faciliter le contact � sprD-ARNm de sbi � initial qui se prolongerait ensuite davantage en amont et en aval, d'une manière similaire aux régulations de � RNAIII-ARNm � (Boisset et al. 2007). En réalité, des appariements efficaces entre des ARN interagissant se produisent initialement entre des interactions limitées de � boucle à boucle � ou de � séquence non appariées-boucle � (Wagner et al. 2002). A la fois, la séquence leader en 5' de l'ARNm de sbi et le domaine central de l'ARNm de sbi ont été soumis à de fortes contraintes d'évolution afin de maintenir l'interaction d'appariement (la séquence nucléotidique leader de l'ARNm de sbi est conservée parmi les séquences de S. aureus). Lorsque ce complexe � ARN antisens-cible � est formé, les ribosomes sont incapables de se lier à la région d'initiation de la traduction de l'ARNm de sbi (figure 7). La formation d'un complexe entre sprD et l'ARNm cible augmente la quantité d'ARNm de sbi détectée in vivo, comme cela est mis en évidence par des Northern blots (données non représentées). Ce résultat pourrait être dû soit à une stimulation directe de sprD pour la transcription de l'ARNm de sbi soit à une conséquence indirecte d'une augmentation de la stabilité de l'ARNm cible en raison d'un appariement extensif avec son ARN régulateur. Des expériences effectuées par les inventeurs sont en cours pour essayer de faire un choix entre ces hypothèses. La formation d'un complexe entre sprD et l'ARNm codant la protéine sbi in vitro ne nécessite pas la présence de la protéine Hfq apparentée aux protéines Sm (figure 5B), et les niveaux d'expression in vivo de sprD ne sont pas affectés par la présence ou l'absence de la protéine Hfq (données non représentées). Ces résultats sont en accord avec des études antérieures étant donné que la protéine Hfq est exprimée à de faibles niveaux dans S. aureus, sans aucun effet détectable sur l'expression du gène de virulence (Geisinger et al. 2006 ; Bohn et al. 2007) et étant donné que Hfq n'a aucun effet majeur sur la stabilité de l'ARNIII et ses cibles d'ARNm in vivo et sur la formation d'un complexe � ARNIII-ARNm � in vitro (Boisset et al, 2007). Les inventeurs ont ainsi mis en évidence un autre exemple de régulation sophistiquée des gènes codant pour des facteurs de virulence dans les bactéries du genre Staphylococcus, notamment S. aureus, suggérant que la chronologie et la quantité de synthèse des facteurs de virulence sont précisément contrôlées pendant le processus infectieux. Références Antal, M., Bordeau, V., Douchin, V., and Felden, B. 2005. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. J. Biol. Chem. 280: 7901-7908. Atkins, K.L., Burman, J.D., Chamberlain, E.S., Cooper, J.E., Poutrel, B., Bagby, S., Jenkins, 10 A.T., Feil, E.J., and van den Elsen, J.M. 2008. S. aureus IgG-binding proteins SpA and Sbi: Host specificity and mechanisms of immune complex formation. Mol. Immunol. 45: 1600- 1611. Beaucage SL. 2008, Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides, Curr Opin Drug Discov Devel. 11:203-216 15 Bohn, C., Rigoulay, C., and Bouloc, P. 2007. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiol. 7: 10. Boisset, S., Geissmann, T., Huntzinger, E., Fechter, P., Bendridi, N., Possedko, M., Chevalier, C., Helfer, A.C., Benito, Y., Jacquier, A., Gaspin, C., Vandenesch, F., and Romby, P. 2007. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and 20 the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes Dev. 21: 1353-1366. Brennan, R.G. and Link, T.M. 2007. Hfq structure, function and ligand binding. Curr. Opin. Microbiol. 10: 125-133. Burman, J.D., Leung, E., Atkins, K.L., O'Seaghdha, M.N., Lango, L., Bernadô, P., Bagby, S., Svergun, D.I., Foster, T.J., Isenman, D.E., and van den Elsen, J.M. 2008. Interaction of 25 human complement with SBI, a staphylococcal immunoglobulin-binding protein: Indications of a novel mechanism of complement evasion by Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283: 17579-17593. Charpentier, E., Anton, A.I., Barry, P., Alfonso, B., Fang, Y., and Novick, R.P. 2004. Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 30 70: 6076-6085. Chesneau, O., Ligeret, H., Hosan-Aghaie, N., Morvan, A., and Dassa, E. 2005. Molecular Analysis of Resistance to Streptogramin A Compounds Conferred by the Vga Proteins of Staphylococci. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 973-980. Downer, R., Roche, F., Park, P.W., Mecham, R.P., and Foster, T.J. 2002. The elastin-binding protein of Staphylococcus aureus (EbpS) is expressed at the cell surface as an integral membrane protein and not as a cell wall-associated protein. J. Biol. Chem. 277: 243-250. Felden, B. 2007. RNA structure: experimental analysis. Curr. Opin. Microbiol. 10: 286-291. Geisinger, E., Adhikari, R.P., Jin, R., Ross, H.F., and Novick, R.P. 2006. Inhibition of rot translation by RNAIII, a key feature of agr function. Mol. Microbiol. 61: 1038-1048. Hammel et al., 2007, A structural basis for complement inhibition by Staphylococcus aureus., Nat. Immunol. 8, 430-437. Hammel et al., 2007, Characterization of Ehp, a secreted complement inhibitory protein from Staphylococcus aureus, J. Biol. Chem., 282, 30051-30061. Hartz, D., McPheeters, D.S., Traut, R., and Gold, L. 1988. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol.164: 419-425. Horsburgh, M.J., Aish, J.L., White, I.J., Shaw, L., Lithgow, J.K., and Foster, S.J. 2002. aB Modulates virulence determinant expression and stress resistance: characterization of a functional rsbU strain derived from Staphylococcus aureus J. Bacteriol. 184: 5457-5467. Huntzinger, E., Boisset, S., Saveanu, C., Benito, Y., Geissmann, T., Namane, A., Lina, G., Etienne, J., Ehresmann, B., Ehresmann, C., et al. 2005. Staphylococcus aureus RNAIII and the endoribonuclease III coordinately regulate spa gene expression. EMBO J. 24: 824-835. Hüttenhofer, A. and Noller, H.F. 1994. Footprinting mRNA-ribosome complexes with chemical probes. EMBO J. 13: 3892-3901. Kreiswirth, B.N., Lofdahl, S., Betley, M.J., O'Reilly, M., Schlievert, P.M., Bergdoll, M.S., and Novick, R.P. 1983. The toxic shock syndrome exotoxin structural gene is not detectably transmitted by a prophage. Nature 305: 709-712. Kuroda, M., Ohta, T., Uchiyama, I., Baba, T., Yuzawa, H., Kobayashi, I., Cui, L., Oguchi, A., Aoki, K., Nagai, Y., Lian, J., Ito, T., Kanamori, M., Matsumaru, H., Maruyama, A., Murakami, H., Hosoyama, A., Mizutani-Ui, Y., Takahashi, N.K., Sawano, T., Inoue, R., Kaito, C., Sekimizu, K., Hirakawa, H., Kuhara, S., Goto, S., Yabuzaki, J., Kanehisa, M., Yamashita, A., Oshima, K., Furuya, K., Yoshino, C., Shiba, T., Hattori, M., Ogasawara, N., Hayashi, H., and Hiramatsu, K. 2001. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet 357: 1225-1240. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. Lowy FD. 1998. Staphylococcus aureus infections. N. Engl. J. Med. 339: 520-532. Majdalani, N., Vanderpool, C.K., Gottesman, S. 2005. Bacterial small RNA regulators. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40: 93-113. McCallum, N., Karauzum, H., Getzmann, R., Bischoff, M., Majcherczyk, P., Berger-Bchi, B., and Landmann, R. 2006. In vivo survival of teicoplanin-resistant staphylococcus aureus and fitness cost of teicoplanin resistance. Antimicrob Agents Chemother. 50: 2352-2360. Milligan JF, Uhlenbeck OC. 1989, Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.Methods Enzymol. ; 1 8 0 : 5 1-62. Moks, T., Abrahmsen, L., Nilsson, B., Hellman, U., Sjoquist, J., and Uhlen, M. 1986. Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains. Eur. J. Biochem. 156: 637-643. Moore, S.D. and Sauer, R.T. 2007. The tmRNA system for translational surveillance and ribosome rescue. Annu. Rev. Biochem. 76: 101-124. Nicholas H. Mann, 2008 The potential of phages to prevent MRSA infections, Research in Microbiology Novick, R.P., Ross, H.F., Projan, S.J., Kornblum, J., Kreiswirth, B., and Moghazeh, S. 1993. Synthesis of staphylococcal virulence factors is controlled by a regulatory RNA molecule. EMBO J. 12: 3967-3975. Pearson, W. R. 2000. Flexible sequence similarity searching with the FASTA3 program package. Methods Mol. Biol. 132: 185-219. Pichon, C. and Felden, B. 2005. Small RNA genes expressed from Staphylococcus aureus genomic and pathogenicity islands with specific expression among pathogenic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102: 14249-14254. Rooijakkers et al., 2007, J. immunol., 179, 2989-2998 Romby, P., Vandenesch, F., and Wagner, E.G. 2006. The role of RNAs in the regulation of virulence-gene expression. Curr. Opin. Microbiol. 9: 229-236. Sherlin LD, Bullock TL, Nissan TA, Perona JJ, Lariviere FJ, Uhlenbeck OC, 2001 Scaringe SA.Chemical and enzymatic synthesis of tRNAs for high-throughput crystallization.RNA. 7:1671-1678 Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition. Cold Spring Habour Laboratory Press, New York. Upadhyay, A., Burman, J.D., Clark, E.A., Leung, E., Isenman, D.E., van den Elsen, J.M., and Bagby, S. 2008. Structure-Function Analysis of the C3 Binding Region of Staphylococcus aureus Immune Subversion Protein Sbi. J. Biol. Chem. 283: 22113-22120. Wagner, E.G.H., Altuvia, S., and Romby, P. 2002. Antisense RNAs in bacteria and their genetic elements. Adv. Genet. 46: 361-398. Zhang, L., Jacobsson, K., Vasi, J., Lindberg, M., and Frykberg L. 1998. A second IgG-binding protein in Staphylococcus aureus. Microbiology 145: 985-991. Zhang, L., Jacobsson, K., Strôm, K., Lindberg, M., and Frykberg L. 1999. Staphylococcus aureus expresses a cell surface protein that binds both IgG and beta2-glycoprotein I. Microbiology 145: 177-183. Zhang, L., Rosander, A., Jacobsson, K., Lindberg, M., and Frykberg L. 2000. Expression of 5 staphylococcal protein Sbi is induced by human IgG. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 28: 211-218. REVENDICATIONS1. Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie dans le 5 groupe comprenant : - la séquence SEQ ID N°1, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°l et les fragments de celles-ci ; et - la séquence SEQ ID N°2, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°2 et les fragments de celles-ci ; et 10 - la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID N°3, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec ladite séquence complémentaire et les fragments de celles-ci ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°3. 2. Polynucléotide isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie dans le groupe comprenant : - la séquence SEQ ID N°6, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°6 et les fragments de celles-ci ; et 20 - la séquence SEQ ID N°7, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°7 et les fragments de celles-ci ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°3. 25 3. Polynucléotide isolé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ARN. 4. Polynucléotide isolé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ARN comprenant une séquence choisie dans le groupe comprenant : 30 - la séquence SEQ ID N°2, dans laquelle les nucléotides en positions 23, 24 et 36 sont u ; 15- la séquence SEQ ID N°2, dans laquelle les nucléotides en positions 23 et 24 sont c et le nucléotide en position 36 est u ; et - la séquence SEQ ID N°2, dans laquelle les nucléotides en positions 23, 24 sont c et le nucléotide en position 36 est a ; et - la séquence SEQ ID N°7, dans laquelle les nucléotides en positions 44, 45 et 57 sont u ; - la séquence SEQ ID N°7, dans laquelle les nucléotides en positions 44 et 45 sont c et le nucléotide en position 57 est u ; et - la séquence SEQ ID N°7, dans laquelle les nucléotides en positions 44, 45 sont c et le nucléotide en position 57 est a. 5. Cassette d'expression comprenant une séquence d'ADN choisie dans le groupe comprenant : - la séquence SEQ ID N°1, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°l et les fragments de celles-ci ; et 15 - la séquence SEQ ID N°6, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°6 et les fragments de celles-ci ; et - une séquence d'ADN pouvant être transcrite en un ARN selon l'une des revendications 3 ou 4. 20 6. Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide isolé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou une cassette d'expression selon la revendication 5. 7. Vecteur selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un bactériophage. 8. Cellule hôte transformée par une cassette d'expression selon la revendication 5 ou un vecteur selon l'une des revendications 6 ou 7. 9. Composition comprenant au moins un composant choisi dans le groupe 30 comprenant un polynucléotide isolé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, une 25cassette d'expression selon la revendication 5, un vecteur selon l'une des revendications 6 ou 7 et une cellule hôte selon la revendication 8. 10. Composition selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une 5 composition pharmaceutique. 11. Polynucléotide isolé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou cassette d'expression selon la revendication 5, ou vecteur selon l'une des revendications 6 ou 7 ou cellule hôte selon la revendication 8, pour son application en tant que médicament pour la 10 prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique. 12. Utilisation d'un composant choisi dans le groupe comprenant un polynucléotide isolé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, une cassette d'expression selon la revendication 5, un vecteur selon l'une des revendications 6 ou 7, une cellule hôte selon 15 la revendication 8, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement d'une infection staphylococcique. 13. Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie dans le groupe comprenant : 20 - la séquence SEQ ID N°3, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°3 et les fragments de celles-ci ; et - la séquence SEQ ID N°4, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°4 et les fragments de celles-ci ; lesdites séquences dérivées et lesdits fragments ayant la capacité de s'hybrider 25 spécifiquement avec la séquence SEQ ID N°l et/ou avec la séquence SEQ ID N°2. 14. Polynucléotide isolé, caractérisé en ce qu'il comprend : - une séquence contenant les nucléotides 1 à 41 de l'une des séquences SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4, couplée à son extrémité 3' à une séquence codante d'un gène d'intérêt. 30 15. Polynucléotide isolé selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ARN. 16. Cassette d'expression comprenant une séquence d'ADN choisie dans le groupe 5 comprenant : - la séquence SEQ ID N°4, les séquences dérivées ayant au moins 70 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°4 et les fragments de celles-ci ; et - une séquence d'ADN pouvant être transcrite en un polynucléotide selon la revendication 15. 19. Vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression selon la revendication 16. 20. Cellule hôte transformée par une cassette d'expression selon la revendication 16 15 ou un vecteur selon la revendication 17. 21. Produit contenant : - au moins un composant choisi dans le groupe comprenant un polynucléotide isolé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, une cassette d'expression selon la revendication 5, un 20 vecteur selon l'une des revendications 6 ou 7, une cellule hôte selon la revendication 8; et - au moins un autre agent antistaphylococcique, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée et/ou étalée dans le temps, pour la prévention et/ou le traitement d'une infection staphylococcique. 25 20. Composition pharmaceutique selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre : - un polynucléotide isolé selon la revendication 14 dans lequel ladite séquence codante est une séquence codant au moins un domaine de la protéine Sbi, et/ou 10- un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide isolé selon la revendication 14 dans lequel ladite séquence codante est une séquence codant au moins un domaine de la protéine Sbi, ledit domaine de la protéine Sbi étant capable de se lier spécifiquement à la protéine C3 du 5 complément et/ou à des immunoglobulines IgG. 21. Méthode de détection, in vitro, de la présence de bactéries du genre Staphylococcus dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection d'au moins une séquence choisie dans le groupe comprenant : 10 - les séquences telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 4; et - les séquences telles que définies selon la revendication 13; avec au moins un moyen de détection approprié de ladite séquence. 22. Méthode de détection, in vitro, d'ARNm du gène codant la protéine Sbi présent 15 dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins une sonde comprenant une séquence choisie parmi les séquences définies selon la revendication 1; et - la détection de l'hybridation de ladite sonde avec le dit ARNm du gène codant la protéine Sbi avec au moins un moyen de détection de ladite hybridation approprié. 23. Kit de détection d'ARNm du gène codant la protéine Sbi, caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins une sonde telle que définie selon la revendication 22; et - au moins un moyen de détection de l'hybridation de ladite sonde avec ledit ARNm du 25 gène codant la protéine Sbi. 24. Kit de régulation de l'expression d'un gène d'intérêt caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins un premier composant choisi dans le groupe comprenant un polynucléotide 30 selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, une cassette d'expression selon la 20 10revendication 16, un vecteur selon la revendication 17, une cellule hôte selon la revendication 18; et - au moins un second composant choisi dans le groupe comprenant un polynucléotide isolé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, une cassette d'expression selon la revendication 5, un vecteur selon l'une des revendications 6 ou 7, une cellule hôte selon la revendication 8. 25. Utilisation non thérapeutique d'un polynucléotide isolé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour inhiber l'expression du gène codant la protéine Sbi. 26. Utilisation non thérapeutique d'un polynucléotide isolé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15 en combinaison avec un polynucléotide isolé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour inhiber l'expression d'un gène d'intérêt.