FR 2940969 A1 20100716 FR 0900066 A 20090109 -2- La présente invention se rapporte à des composés peptidiques de formule générale (I) R1-(AA)n- Xi ù Ser ù Thr ù Pro ù X2 ù (AA)p ù R2 destinés à restaurer le rythme circadien et à resynchroniser l'horloge biologique des cellules de la peau, ainsi que leurs utilisations en cosmétique et/ou pharmaceutique afin de prévenir et corriger les 5 effets du vieillissement. La fonction première de l'épiderme, est de constituer une barrière entre l'environnement extérieur et le milieu intérieur. C'est la couche la plus externe de l'épiderme, le stratum corneum, qui assure cette fonction. Il est composé de 10 kératinocytes au stade ultime de leur différenciation, les cornéocytes, scellés les uns aux autre par un épais ciment intercellulaire, à la fois souple et imperméable. Cette barrière physique qu'est la peau permet au corps humain de se protéger de nombreux types d'agressions. Ces agressions peuvent avoir diverses origines intrinsèques, telles que le vieillissement chronologique ou encore des modifications biochimiques qui ont 15 lieu lors d'états de fatigue, de stress, de changements hormonaux comme lors de la grossesse.... D'autres agressions elles, ont une origine extrinsèque, telle que la pollution, le soleil, les maladies En réponse à ces agressions, l'aspect de la peau est modifié et l'on voit apparaître alors des rides et ridules, des taches d'hyper ou d'hypopigmentation, une sècheresse voire une déshydratation de la peau, un amincissement de 20 l'épiderme, une élastose, des imperfections, des taches de vieillesse.... Ces modifications sont dues à l'altération des fonctions de renouvellement cellulaire, de cohésion cellulaire, de synthèse de collagène, d'élastine et d'autres protéines et conduisent finalement à une diminution des qualités de barrière protectrice de la peau et à un aspect peu esthétique de celle-ci. 25 La peau comme tous les autres organes, est soumise à l'influence de variations périodiques. Elle est le siège d'une organisation cohérente de rythmes circadiens et nycthéméraux modulant divers cycles biologiques, le plus souvent de grande amplitude (F. Henry et al., Rev Med Liege; 57 : 10 : 661-665). Ces rythmes cutanés chez 30 l'homme suggèrent que le jour, la peau privilégie diverses fonctions protectrices vis-à-vis de l'environnement. En soirée et la nuit, elle favorise son renouvellement cellulaire et divers processus métaboliques de synthèse. Un sujet en bonne santé, dont l'organisme vit en harmonie avec son environnement, présente une synchronisation de ses rythmes biologiques. En revanche, des 2940969 -3- perturbations des rythmes biologiques peuvent apparaître dans un certain nombre de conditions dites de désynchronisation (Reinberg et Touitou, 1996). Une désynchronisation est un état où deux variables rythmiques (ou plus), antérieurement synchronisées, ont cessé de présenter les mêmes relations de fréquence et/ou d'acrophase et montrent des relations temporelles différentes des relations habituelles. La désynchronisation peut être d'origine externe, elle dépend alors des modifications de l'environnement et se retrouve, par exemple, lors d'un vol trans- méridien de cinq fuseaux horaires (phénomène du jet-lag) ou dans le travail de nuit. La désynchronisation d'origine interne, quant à elle, ne dépend pas des facteurs de l'environnement. On la retrouve dans le vieillissement ou dans un certain nombre de maladies telles que la dépression ou certains cancers. Ces troubles de la désynchronisation peuvent être corrigés par divers traitements : par exemple l'administration de lumière forte pour traiter la dépression saisonnière, ou encore l'administration de mélatonine (Dijk et coll., 1995 ; Eastman et Miescke, 1990 ; Palm et coll., 1991 ; Shochat et coll., 1998 ; Touitou et coll., 1998). En cosmétique, il est bien connu que l'efficacité d'un soin peut être optimisée selon le moment de la journée durant lequel il est administré. Par exemple, les crèmes de jour permettent de protéger la peau des agressions extérieures durant la journée, alors que les crèmes de nuit permettent à la peau de réparer les dommages subis pendant la journée par augmentation du renouvellement et du métabolisme cellulaires. En outre, il a été démontré que le vieillissement s'accompagne d'une modification des rythmes biologiques, avec une diminution de l'amplitude et une tendance à l'avance de phase (Weinert D., Chronobiol. Int. 2000 ; 17 :261-83). De plus, il a été montré que l'horloge circadienne était altérée par ce même vieillissement. Cependant, aucun traitement ne permet, à l'heure actuelle, à la peau de � réinitialiser � ou encore de relancer son cycle circadien, ni de resynchroniser son horloge biologique. Un tel traitement permettrait ainsi d'aider la peau à se remettre d'un décalage horaire, d'un travail de nuit, ou encore de lutter contre les signes dus au vieillissement. De manière surprenante, la Demanderesse a découvert que des composés peptidiques de formule générale suivante R1-(AA)n- Xi ûSer û Thr û Pro û X2 û (AA)pû Ri avaient la propriété de restaurer le rythme circadien et de resynchroniser l'horloge biologique des cellules de la peau. Aucun document de l'art antérieur ne décrit de tels composés peptidiques permettant d'obtenir de tels effets. Par ailleurs, ces composés peptidiques sont caractérisés par le fait qu'ils sont des agents activateurs de la protéine Clock 2940969 -4- (Circadian Locomotor Output Cycles Kaput) et ce de manière directe ou indirecte, qui est impliquée dans la régulation du cycle circadien. Par conséquent, la présente invention a pour objet des composés peptidiques activateurs de Clock ainsi que leur utilisation dans des compositions cosmétiques et pharmaceutiques afin de restaurer le 5 rythme circadien et de resynchroniser l'horloge biologique des cellules de la peau ou encore de prévenir ou corriger les signes dus au vieillissement. On sait depuis longtemps que l'horloge circadienne est contrôlée par une boucle négative de régulation impliquant un ensemble de gènes, notamment les gènes Per-1 10 (Period), Clock et BMAL-1 (Brain and Muscle ARNt-like Protein). Jusqu'à présent. dans l'art antérieur, de nombreuses applications ont déjà été proposées quant à l'utilisation des nucléotides et/ou de protéines issues des gènes Clock, Per-1 ou BMAL-1. On peut citer par exemple le brevet US 6 291 429 qui décrit l'utilisation du produit du gène Clock pour la resynchronisation du cycle du sommeil ou de processus 15 physiologiques ou endocriniens, la resynchronisation du corps après un décalage horaire.... Cependant, aucun document de l'art antérieur ne décrit l'utilisation de peptides spécifiques activateurs de Clock pour restaurer l'horloge biologique interne de la peau. 20 La présente invention a pour premier objet des composés peptidiques de formule (I) suivante R1-(AA)ä- X1 ù Ser ù Thr ù Pro ù X2 ù (AA)pù R2 Dans laquelle, X1 représente une thréonine, une sérine, ou est égal à zéro, 25 X2 représente une isoleucine, une leucine, une proline, une valine, une alanine, une glycine, ou est égal à zéro, AA représente un acide aminé quelconque, ou un de ses dérivés, et n et p sont des nombres entiers compris entre 0 et 4, R1 représente la fonction amine primaire de l'acide aminé N-terminal, libre ou 30 substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement tosyle ou un groupement benzyloxycarbonyle, R2 représente le groupe hydroxyle de la fonction carboxyle de l'acide aminé C-terminal, substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi une 2940969 -5- chaîne alkyle de CI à C20, ou un groupement NH2, NHY ou NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de CI à C4, ladite séquence de formule générale (I) étant constituée de 3 à 13 résidus d'acides aminés, 5 ladite séquence de formule générale (I) pouvant comprendre des substitutions des acides aminés Xi et X2 par d'autres acides aminés chimiquement équivalents, caractérisé en ce qu'il permet de restaurer le rythme circadien et resynchroniser l'horloge biologique des cellules de la peau. 10 La présente invention a pour second objet une composition cosmétique comprenant des composés peptidiques de formule générale (I). La présente invention a pour troisième objet l'utilisation d'une composition cosmétique comprenant des composés peptidiques de formule générale (I). Enfin, la présente invention a pour quatrième objet un procédé de traitement cosmétique à l'aide d'une composition comprenant des composés peptidiques de formule générale (I). 20 Le premier objet de l'invention se rapporte à un composé peptidique de formule générale (I) suivante : Dans laquelle, RI-(AA)n- X1 ù Ser ù Thr ù Pro ù X2 ù (AA)Qù R2 Dans laquelle, 25 XI représente une thréonine, une sérine, ou est égal à zéro, X2 représente une isoleucine, une leucine, une proline, une valine, une alanine, une glycine, ou est égal à zéro, AA représente un acide aminé quelconque, ou un de ses dérivés, et n et p sont des nombres entiers compris entre 0 et 4, 30 RI représente la fonction amine primaire de l'acide aminé N-tenninal, libre ou substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement tosyle ou un groupement benzyloxycarbonyle, 15 2940969 -6- R2 représente le groupe hydroxyle de la fonction carboxyle de l'acide aminé C-terminal, substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi une chaîne alkyle de C1 à C20, ou un groupement NH2, NHY ou NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de C1 à C4, 5 ladite séquence de formule générale (1) étant constituée de 3 à 13 résidus d'acides aminés, ladite séquence de formule générale (I) pouvant comprendre des substitutions des acides aminés X1 et X2 par d'autres acides aminés chimiquement équivalents, caractérisé en ce qu'il permet de restaurer le rythme circadien et resynchroniser 10 l'horloge biologique des cellules de la peau. Le composé peptidique selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est activateur des produits des gènes du rythme circadien. Par � gènes du rythme circadien � on entend les gènes Clock, Per-1 et BMAL-1. 15 En outre, le composé peptidique selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est utilisé en tant que principe actif activateur de Clock. On entend par peptide � activateur de Clock�, tout peptide ou dérivé biologiquement actif capable d'augmenter l'activité de Clock, soit par augmentation de la synthèse protéique de Clock (par modulation 20 directe ou indirecte de l'expression génique de Clock) soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation de la protéine Clock ou encore la stabilisation des transcrits d'ARN messager. Dans un mode de réalisation particulier, le composé peptidique est protégé par une 25 acylation ou une acétylation de l'extrémité amino-terminale. Préférentiellement, le composé peptidique présente l'une des séquences suivantes : (SEQ ID n°1) Tyr ù Val - Ser ù Thr ù Pro ù Tyrù Asnù NH2 (SEQ ID n°2) Val - Ser ù Thr ù Pro ùGlu ù NH2 30 (SEQ ID n°3) Ser ù Thr ù Pro ù NH2 (SEQ ID n°4) Leu -His ù Ser ù Thr ù Pro ù NH2 (SEQ ID n°5) Arg -His ù Ser ù Thr ù Pro ùGlu ù NH2 (SEQ ID n°6) His ù Ser ù Thr ù Pro ùGlu - NH2 2940969 -7- Dans un mode de réalisation particulier, la séquence du composé peptidique est la séquence SEQ ID n°3, c'est-à-dire Ser û Thr û Pro û NH2. Dans un autre mode de réalisation, la séquence du composé peptidique est la séquence SEQ ID n°4, c'est-à-dire Leu -His û Ser û Thr û Pro û NH2. 5 L'invention concerne aussi des formes homologues de ces séquences. Le terme � homologue � désigne, selon l'invention, toute séquence peptidique identique à au moins 50%, ou de préférence au moins 80%, et encore plus préférentiellement à au moins 90% de ladite séquence peptidique, choisie parmi les séquences SEQ ID n° 1 à SEQ ID n° 6. Par � séquence peptidique identique à au moins X% �, on entend 10 désigner un pourcentage d'identité entre les résidus d'acides aminés des deux séquences à comparer, obtenu après l'alignement optimal des deux séquences. L'alignement optimal est obtenu à l'aide d'algorithmes d'homologies locales tels que ceux utilisés par les logiciels informatiques BLAST P ou T BLAST N disponibles sur le site NCBI. 15 Le terme � homologue � peut également désigner un peptide qui diffère de la séquence d'un peptide de séquence SEQ ID n° 1 à SEQ ID n° 6 par la substitution d'acides aminés chimiquement équivalents, c'est-à-dire par la substitution d'un résidu par un autre possédant les mêmes caractéristiques. Ainsi, les substitutions classiques se font entre Ala, Val, Leu et Ile ; entre Ser et Thr ; entre les résidus acides Asp et Glu ; 20 entre Asn et Gln ; et entre les résidus basiques Lys et Arg ; ou entre les résidus aromatiques Phe et Tyr. Le terme � peptide � ou � composé peptidique � désigne un enchaînement de deux ou plusieurs acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques ou par des 25 liaisons peptidiques modifiées. Par � peptide � ou � composé peptidique �, il faut entendre le peptide naturel ou synthétique de l'invention tel que décrit ci-dessus, ou au moins l'un de ses fragments, qu'il soit obtenu par protéolyse ou de manière synthétique, ou encore tout peptide naturel ou synthétique dont la séquence est totalement ou partiellement constituée par 30 la séquence du peptide précédemment décrit. De façon à améliorer la résistance à la dégradation, il peut être nécessaire d'utiliser une forme protégée du peptide selon l'invention. La forme de protection doit 2940969 -8- évidemment être une forme biologiquement compatible et doit être compatible avec une utilisation dans le domaine des cosmétiques ou de la pharmacie. De nombreuses formes de protection biologiquement compatibles peuvent être envisagées. Elles sont bien connues de l'homme du métier comme, par exemple. 5 l'acylation ou l'acétylation des extrémités amino et/ou carboxy-terminale. Ainsi. l'invention concerne une composition telle que définie précédemment. caractérisée par le fait que le peptide de séquence SEQ ID n°1 à SEQ ID n°6 est sous forme protégée de façon simple ou double. De préférence, on utilise, pour la protection de la fonction hydroxyle de l'extrémité carboxy-terminale, une amidation par un groupement NYY 10 avec Y représentant une chaîne alkyle de CI à C4, ou l'estérification par un groupement alkyle. Il est également possible de protéger les deux extrémités du peptide. Le peptide de formule générale (I) selon l'invention peut être obtenu soit par synthèse chimique classique (en phase solide ou en phase homogène liquide), soit par 15 synthèse enzymatique (Kullman et al., J. Biol. Chem. 1980, 225, 8234), à partir d'acides aminés constitutifs ou de leurs dérivés. Le peptide selon l'invention peut être d'origine naturelle ou synthétique. Préférentiellement selon l'invention, le peptide est obtenu par synthèse chimique. Enfin, le principe actif peut être un peptide unique, un mélange de peptides ou de 20 dérivés peptidiques et/ou constitués de dérivés d'acides aminés. Le composé peptidique selon l'invention peut être utilisé à titre de médicament. Le second objet de la présente invention se rapporte à des compositions cosmétiques 25 comprenant ledit composé peptidique de formule générale (I). De manière préférée, les compositions selon l'invention se présentent sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable. Par � cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable �, on entend des milieux qui conviennent à une utilisation en contact avec la peau ou les phanères 30 humains, sans risque de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité, de réponse allergique et autres. Préférentiellement, ledit composé peptidique est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,0005 et 500 ppm environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 et 5 ppm. Dans les compositions selon l'invention, le composé peptidique est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs 2940969 -9- solvants cosmétiquement ou dermatologiquement acceptables, comme l'eau. le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol. les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants. 5 Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, le principe actif selon l'invention est préalablement solubilisé dans un vecteur cosmétique ou pharmaceutique comme les liposomes ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisé dans, ou fixé sur, tout vecteur physiologiquement acceptable. 10 Les compositions destinées à être appliquées sur la peau peuvent se présenter sous forme de solution aqueuse ou hydro- alcoolique, d'émulsion eau dans huile ou huile dans eau, de microémulsion, de gel aqueux ou anhydre, de sérum, ou encore de dispersion de vésicules, de patch, de crème, de spray, d'onguent, de pommade, de lotions, de colloïde, de solution, de suspension ou autres. Les compositions peuvent 15 aussi être appliquées sur les phanères sous forme de shampoing, de teinture ou de mascara à appliquer au pinceau ou au peigne, en particulier sur les cils, les sourcils ou les cheveux, ou encore de soins pour les ongles tels que les vernis. Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention contient en 20 outre, au moins un autre principe actif favorisant l'action dudit principe actif peptidique. On peut citer, de manière non limitative, les classes d'ingrédients suivantes : d'autres agents actifs peptidiques, des extraits de végétaux, des agents cicatrisants, anti-âge, anti-rides, apaisants, anti-radicalaire, anti-UV. des agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou le métabolisme énergétique, des 25 agents hydratants, anti-bactériens, anti-fongiques, anti-inflammatoires, anesthésiques, des agents modulants la différenciation, la pigmentation ou la dépigmentation cutanée, des agents stimulants la pousse des ongles ou des cheveux.... Préférentiellement, on utilisera un agent anti-radicalaire ou antioxydant, ou un agent stimulant la synthèse de macromolécules dermiques, ou encore un agent stimulant le métabolisme énergétique. 30 En outre, des additifs tels que des agents épaississants, émulsifiants, humectants, émollients, des parfums, des antioxydants, des agents filmogènes, chélatants, séquestrants, conditionnants....peuvent être ajoutés à la composition. 2940969 -10- Dans tous les cas. l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de 5 l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la 10 composition. Un troisième objet de la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une composition selon ladite invention pour restaurer le rythme circadien et resynchroniser l'horloge biologique des cellules de la peau. 15 Une réalisation particulière de l'invention est l'utilisation d'une composition pour activer le renouvellement cellulaire et stimuler le métabolisme cellulaire. Plus particulièrement, l'invention consiste en l'utilisation d'une composition pour réduire les dysfonctionnements causés par le décalage horaire et/ou le travail de nuit. 20 Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation dudit composé peptidique dans une composition destinée à respecter la chronobiologie cutanée notamment par une application en soin cosmétique la nuit. Une autre réalisation de l'invention consiste en l'utilisation d'une composition pour 25 prévenir ou traiter les signes cutanés du vieillissement. Les � signes cutanés du vieillissement � incluent, mais ne se limitent pas à, toutes les manifestations visibles sur la peau causés par le vieillissement. On entend notamment, les rides, ridules, crevasses, pores élargis, imperfections, perte de fermeté, décoloration, tâches de vieillesse, kératoses, perte de collagène, et autres changements du derme et de 30 l'épiderme....Par � signes cutanés du vieillissement �, on entend également toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau et des phanères dues au vieillissement comme, par exemple, les rugosités superficielles de la couche cornée, les rides et ridules, mais également toute modification interne de la peau qui ne se traduit pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, 2940969 -11- l'amincissement du derme ou toute autre dégradation interne de la peau consécutive à une exposition aux rayonnements ultraviolets (UV). Plus particulièrement, l'invention se rapporte à l'utilisation de la composition telle que décrite précédemment afin de réduire les signes de fatigue de la peau. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une quantité efficace de principe actif peptidique selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à lutter contre les pathologies liées aux dysfonctionnements du rythme circadien. 10 Un dernier objet de la présente invention se rapporte à un procédé de traitement cosmétique caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau ou les phanères à traiter une composition contenant une quantité efficace de principe actif peptidique pour restaurer le rythme circadien et resynchroniser l'horloge biologique des cellules. 15 Par ailleurs, ce procédé de traitement cosmétique est caractérisé en ce que la composition est appliquée avant le coucher de façon à respecter le rythme circadien de la peau pour obtenir un effet anti-vieillissant sur la peau. En effet, durant la nuit, la peau privilégie des fonctions de renouvellement ainsi que des processus métaboliques de synthèse. Par conséquent, l'application de la composition telle que revendiquée, en 20 respectant le rythme biologique de la peau permet d'obtenir un effet anti-vieillissant, stimulant le renouvellement cellulaire, régénérant et réduisant ainsi les signes du vieillissement. Les exemples suivants décrivent et démontrent l'efficacité de composés peptidiques 25 tels que décrits selon l'invention. Les formulations cosmétiques citées sont représentatives de l'invention mais sont données uniquement à titre d'illustration et ne doivent pas être interprétés comme des limitations de la présente invention. Exemple 1 : Mise en évidence de l'effet activateur du peptide SEO ID n°2 sur 30 l'expression de la protéine Clock sur des fibroblastes en culture. Une étude de l'effet activateur du peptide SEQ ID n°2, a été réalisée en évaluant l'expression des protéines Clock en western blot sur des fibroblastes en culture. La technique de western blotting est une méthode semi-quantitative qui permet d'apprécier le taux de protéines Clock dans les cellules. 5 2940969 -12- Protocole Des fibroblastes en cultures sont cultivés dans des boîtes de diamètre 100 mm à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2 pendant 18 h en présence ou non du peptide SEQ ID n°2, dilué 1% (à partir d'une solution 10-4M). Les cellules sont 5 rincées puis détachées du support à l'aide d'un tampon d'extraction (20mM TRIS, 150mM NaCl, 10mM EDTA, 0.2% Triton X10) en présence d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Sigma). Les protéines ainsi extraites, sont centrifugées à 4°C à 10000 rpm pendant 10 minutes avant d'être dosées par le kit de dosages des protéines BCA (Pierce). Les .lysats cellulaires sont mélangés à un tampon de dénaturation et soumis à 10 une électrophorèse SDS-PAGE. Le gel utilisé est un Nupage 4-12% (invitrogen). Les protéines sont enfin transférées sur une membrane de nitrocellulose (Pal corporation). Les membranes sont saturées dans du PBS-lait 5%, 0,1% tween 20, 2 h à température ambiante, puis incubées à 4°C toute la nuit avec un anticorps primaire anti-Clock au 1/1000è' (ABcam) suivie d'une incubation avec un anticorps secondaire anti-lapin 15 Iggy-peroxydase dilué au 1/5000è'. La révélation est effectuée par un substrat chimioluminescent. L'évaluation quantitative des protéines présentes dans les cellules est effectuée grâce au logiciel chemiimager (Alpha innotech Corporation USA). La quantité des protéines est exprimée en pourcentage d'intensité lumineuse comparée à la condition contrôle qui n'a pas eu le traitement. 20 Résultats : Les résultats obtenus montrent que le traitement par le peptide SEQ ID n°2, dilué à 1% augmente de façon significative la protéine Clock dans les fibroblastes en culture. Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous. Intensité (%) Expérience 1 Contrôle non traités 100 % 1% traitement 154% L'expérience a été réalisée plusieurs fois et démontre par le test statistique du t Student que l'augmentation de l'expression de la protéine Clock est significative (p = 0,0445). 25 30 2940969 -13- Conclusion : Le peptide SEQ ID n°2 permet d'augmenter l'expression de la protéine Clock sur des cellules dermiques en culture. 5 Exemple 2 : Mise en évidence de l'effet activateur du peptide SEO ID n°3 sur l'expression de la protéine Clock, Per-1 et BMAL-1 sur des biopsies de peau. Une étude de l'effet activateur du peptide SEQ ID n°3, a été réalisée en évaluant l'expression de la protéine Clock, Per-1 et BMAL-1 sur des biopsies de peaux ex vivo. 10 Protocole Des études ex vivo par immunomarquage ont permis de mettre en évidence l'expression de la protéine Clock, Per-1, et BMAL-1 sur des échantillons de peau. Des échantillons de peau humaine, sont mis en culture à l'interface air/liquide. Le peptide SEQ ID n°3 dilué à 1% (à partir d'une solution 10"4M).est appliqué de façon topique 15 sur ces échantillons pendant 48 h. Des échantillons de peau non traitées par le peptide SEQ ID n°3 servent de contrôle. Les échantillons de peaux sont fixés au formaldéhyde 10% et inclus dans la paraffine. Des coupes de 3 �m sont réalisées au microtome. L'immunomarquage est effectué après un déparaffinage et un démasquage des sites antigéniques. L'immunomarquage 20 s'effectue pour la protéine Clock, par un anticorps (ABcam) dilué au 1/250ème et un anticorps secondaire au 1 /50ème couplé à un fluorochrome. L'immunomarquage s'effectue pour la protéine Per-1, par un anticorps polyclonal (Cosmobio) dilué au 1/100ème et un anticorps secondaire au 1/50ème couplé à un fluorochrome. 25 L'immunomarquage s'effectue pour la protéine BMAL-1, par un anticorps polyclonal (Aviva Systems Biology) dilué au 1/120eme et un anticorps secondaire au 1/50ème couplé à un fluorochrome. Les lames sont alors montées dans un milieu adéquat et observées au microscope à épifluorescence (Nikon Eclipse E600). 30 Résultats : Les résultats obtenus montrent que les peaux traitées avec le peptide SEQ ID n°3 expriment des quantités de protéine Clock, Per-1 et BMAL-1 supérieures aux peaux non traitées. 2940969 -14- L'évaluation semi-quantitative du marquage est effectuée par observation microscopique et résumée dans le tableau ci-dessous. Non traité Traité par peptide SEQ ID n°3 dilué à 1 % Marquage +/- + protéine Clock Marquage + +++ protéine PER-1 Marquage + +++ BMAL-1 Conclusion : 5 L'administration de peptide SEQ ID n°3 permet d'augmenter l'expression des protéines Clock, Per-1 et BMAL- l sur une peau irradiée et traitée. Exemple 3 : Mise en évidence de l'effet activateur du peptide SEQ ID n°3 sur l'expression de la protéine Clock, sur des biopsies de peau au cours du 10 vieillissement Une étude de l'effet activateur du peptide SEQ ID n°3, a été réalisée en évaluant l'expression de la protéine Clock sur des modèles de peaux, vieillis artificiellement en culture. L'analyse s'est effectuée après 62 h et 134 h de culture. 15 Protocole Des études ex vivo par immunomarquage ont permis de mettre en évidence l'expression de la protéine Clock, sur des échantillons de peau vieillis en culture. Des échantillons de peau humaine, sont mis en culture à l'interface air/liquide, pendant 62 h et 134 h. Le peptide SEQ ID n°1 dilué à 1% (à partir d'une solution 104M).est appliqué 20 de façon topique sur ces échantillons à raison de 2 fois par jour pendant le temps de l'expérience. Des échantillons de peau non traitées par le peptide SEQ ID n°3 servent de contrôle. Les échantillons de peaux sont fixés au formaldéhyde 10% et inclus dans la paraffine. Des coupes de 3 �m sont réalisées au microtome. L'immunomarquage est effectué 25 après un déparaffinage et un démarquage des sites antigéniques. L'immunomarquage 2940969 -15- s'effectue pour la protéine Clock, par un anticorps anti-rabbit (ABcam) dilué au 1/250ème et un anticorps secondaire au 1/50eme couplé à un fluorochrome. Les lames sont alors montées dans un milieu adéquat et observées au microscope à épi fluorescence (Nikon Eclipse E600). 5 Résultats : Les résultats obtenus montrent que le marquage de la protéine Clock (essentiellement épidermique) est augmenté après 62 heures de culture, par rapport aux lames témoins non traitées. Cette augmentation perdure dans le temps puisqu'au bout de 134 heures, le 10 marquage de la protéine Clock est fortement augmenté par rapport aux peaux témoins non traitées. Le tableau ci-dessous donne une évaluation visuelle du marquage. Non traité Traité par peptide SEQ ID n°3 dilué à 1 % Marquage protéine + ++ Clock 62 h Marquage protéine - ++ Clock 134 h Conclusion : 15 L'application du composé peptidique SEQ ID n°3 permet d'augmenter l'expression de la protéine Clock sur des biopsies de peau traitées et vieillies artificiellement en culture. Exemple 4 : Mise en évidence de l'effet anti-vieillissement du peptide SEQ ID 20 n°3 sur des fibroblastes en culture. Une étude de l'effet anti-vieillissement du peptide SEQ ID n°3, a été réalisée en évaluant l'activité de la béta-galactosidase sur des fibroblastes en culture à court et long terme. En effet, la béta-galactosidase est connue pour être présente dans les cellules sénescentes alors qu'on ne trouve pas d'activité béta-galactosidase dans les cellules 25 pré-sénescentes, quiescentes ou immortelles. 2940969 -16- Protocole Des fibroblastes en cultures dans des labteck 8 puits sont maintenus 2 semaines (effet court terme) ou 7 semaines (effet long terme) en présence ou non du peptide SEQ ID n°3, dilué 1% (à partir d'une solution 10-4M). Le traitement est effectué une fois par 5 jour. Les cellules non traitées mais maintenues en culture pendant 2 ou 7 semaines selon les besoins de l'expérience servent de contrôle. Le jour du marquage, les cellules sont rincées, fixées dans un mélange (2% glutaraldéhyde ù 2% formaldéhyde) pendant 3 minutes. Les cellules sont rincées et on applique 300 �l de (5-bromo-4-chloro-3 indolyl b-D-galactosidase) appelé communément X-gal (substrat de la béta- 10 galactosidase). L'incubation s'effectue 24 h dans l'incubateur à CO2, puis les cellules sont rincées et la labteck est rapidement montée dans un milieu adéquat. L'observation s'effectue au microscope à transmission. Le principe est simple, lorsque les cellules sont sénescentes et contiennent la béta-galactosidase, le substrat X-gal est clivé en un produit bleu insoluble. 15 Résultats : L'activité béta-galactosidase est mesurée dans les cellules témoins non traitées par une coloration de celles-ci en bleues. L'activité béta-galactosidase est fortement réduite dans les cellules traitées par le peptide SEQ ID n°3. Cet effet est observé à la fois dans 20 les cellules traitées à court terme (2 semaines d'expérience) mais également à long terme lorsque les cellules sont traitées pendant 7 semaines consécutives. Conclusion : L'administration du peptide SEQ ID n°3 permet de mettre en évidence un effet anti- 25 vieillissement sur des fibroblastes en culture vieillis artificiellement pendant 2 ou 7 semaines. Exemple 5 : Préparation d'une crème anti-âge Noms commerciaux Noms INCI % massique Phase A Montanov 68 Cetearyl Alcohol (and) Cetearyl Glucoside 6,00 2940969 -17- Noms Noms INCI % commerciaux massique Squalane Squalane 3,00 Cetiol SB 45 Butyrospermum Parkii ( Shea Butter) 2.00 Waglinol 250 Cetearyl Ethylhexanoate 3.00 Amerchol L- 101 Minerai Oil (and) Lanolin Alcohol 2.00 Abil 350 Dimethicone 1,50 BHT BHT 0.01 Coenzyme Q10 Ubiquinone 0.10 Phase B Huile d'Avocat Persea Gratissima (Avocado) Oil 1.25 Phenonip Phenoxyethanol (and) Methylparaben (and) Ethylparaben 0,75 (and) Butylparaben (and) Propylparaben (and) Isobutylparaben Phase C Eau déminéralisée Aqua (Water) qsp Butylene Glycol Butylene Glycol 2.00 Glucam El0 Methyl Gluceth-10 1,00 Allantoin Allantoin 0.15 Carbopol Ultrez 10 Carbomer 0,20 Phase D TEA Triethanolamine 0.18 Phase E Peptide SEQ ID n° 2 1 ppm GP4G Water (and) Artemia Extract 1.50 Collaxyl Water (and) Butylene Glycol (and) Hexapeptide-9 3.00 Phase F Parfum Parfum (Fragrance) qsp 2940969 -18- Noms Noms INCI % commerciaux massique Colorant qsp Mode Opératoire : 5 Préparer et fondre la phase A à 65-70°C. Chauffer la phase C à 65-70°C. La phase B est ajoutée à la phase A juste avant d'émulsionner A dans B. A environ 45°C, le carbomer est neutralisé par addition de la phase D. La phase E est ensuite additionnée sous légère agitation et le refroidissement est poursuivi jusqu'à 25°C. La phase F est alors additionnée si souhaité. REVENDICATIONS1. Composé peptidique de formule générale suivante (I) : RI-(AA)n X1ùSer ù Thr ù Pro ù X2 ù (AA)p ù R2 Dans laquelle, XI représente une thréonine, une sérine, ou est égal à zéro, X2 représente une isoleucine, une leucine, une proline, une valine, une alanine, une glycine, ou est égal à zéro, AA représente un acide aminé quelconque, ou un de ses dérivés, et n et p sont des nombres entiers compris entre 0 et 4, RI représente la fonction amine primaire de l'acide aminé N-terminal, libre ou substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement tosyle ou un groupement benzyloxycarbonyle, R2 représente le groupe hydroxyle de la fonction carboxyle de l'acide aminé C-terminal, substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi une chaîne alkyle de CI à C20, ou un groupement NH2, NHY ou NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de CI à C4, ladite séquence de formule générale (1) étant constituée de 3 à 13 résidus d'acides aminés, ladite séquence de formule générale (1) pouvant comprendre des substitutions des acides aminés XI et X2 par d'autres acides aminés chimiquement équivalents, caractérisé en ce qu'il permet de restaurer le rythme circadien et resynchroniser l'horloge biologique des cellules de la peau. 2. Composé peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est protégé par une acétylation de l'extrémité amino-terminale. 3. Composé peptidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il correspond à une des formules suivantes : (SEQ ID n°1) Tyr ù Val - Ser ù Thr ù Pro ù Tyrù Asnù NH2 (SEQ ID n°2) Val - Ser ù Thr ù Pro ùGlu ù NH2 (SEQ ID n°3) Ser ù Thr ù Pro ù NH2 (SEQ ID n°4) Leu -His ù Ser ù Thr ù Pro ù NH2 2940969 -20- (SEQ ID n°5) Arg -His û Ser û Thr û Pro ûGlu û NH2 (SEQ ID n°6) His û Ser û Thr û Pro ûGlu - NH2 4. Composé peptidique selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il correspond à 5 la séquence (SEQ ID n°3). 5. Composé peptidique selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence (SEQ ID n°4). 10 6. Composé peptidique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il est utilisé à titre de médicament. 7. Composition cosmétique comprenant à titre de principe actif ledit composé peptidique selon l'une des revendications 1 à 5. 8. Composition cosmétique selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu cosmétiquement acceptable. 20 9. Composition selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisée en ce que ledit composé peptidique est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,0005 et 500 ppm environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 et 5 ppm. 25 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce que ledit principe actif peptidique est solubilisé dans un ou plusieurs solvants, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants. 30 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce qu'elle contient en outre, au moins un autre principe actif favorisant l'action dudit principe actif peptidique. 15 2940969 -21- 12. Composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce que ledit principe actif est un agent anti-radicalaire ou antioxydant, ou un agent stimulant la synthèse de macromolécules dermiques, ou encore un agent stimulant le métabolisme énergétique. 13. Utilisation d'une composition cosmétique contenant ledit composé peptidique tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5 et un milieu cosmétiquement acceptable pour restaurer le rythme circadien et de resynchroniser l'horloge biologique des cellules de la peau 14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite composition permet d'activer le renouvellement cellulaire. 15. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée 15 en ce que ladite composition permet de stimuler le métabolisme cellulaire. 16. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que ladite composition permet réduire les dysfonctionnements causés par le décalage horaire et/ou le travail de nuit. 17. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à respecter la chronobiologie cutanée notamment par une application en soin cosmétique la nuit. 25 18. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que ladite composition permet de prévenir ou de traiter les signes cutanés du vieillissement. 19. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, 30 caractérisée en ce que ladite composition permet de réduire les signes de fatigue de la peau. 20. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif peptidique, tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6, pour la préparation d'une composition pharmaceutique 5 10 20 2940969 -22- destinée à prévenir ou à lutter contre les pathologies liées aux dysfonctionnements du rythme circadien. 21. Procédé de traitement cosmétique caractérisé en ce que l'on applique topiquement 5 sur la peau ou les phanères à traiter, une composition contenant une quantité efficace de principe actif peptidique, tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5, pour restaurer le rythme circadien et de resynchroniser l'horloge biologique des cellules. 22. Procédé de traitement cosmétique, tel que défini dans la revendication précédente, 10 caractérisé en ce que la composition est appliquée avant le coucher de façon à respecter le rythme circadien de la peau. 23. Procédé de traitement cosmétique, tel que défini dans l'une des revendications 21 ou 22, caractérisé en ce que la composition est appliquée avant le coucher afin de prévenir 15 ou de traiter les signes cutanés du vieillissement.