FR 2940286 A1 20100625 FR 0858884 A 20081219 NOUVEAUX CRYPTATES DE TERRES RARES COMPORTANT UN MOTIF TETRAAZATRIPHENYLENE ,ETAT DE LA TECHNIQUE L'utilisation de complexes de lanthanides en tant que composés fluorescents pour l'étude de phénomènes biologiques a été développée dans les années 1990 (voir par exemple l'article de Mathis et al., Clin. Chem. 1995 Sep; 41(9)1391-7). Ces complexes de lanthanides ont la propriété de pouvoir générer un FRET intermoléculaire, c'est-à-dire une fluorescence résultant d'un transfert 10 d'énergie de résonance entre deux composés, l'un accepteur d'énergie et l'autre donneur d'énergie (en anglais � Fluorescent Resonance Energy Transfert �) lorsqu'ils sont à proximité d'un composé accepteur d'énergie et qu'ils sont excités à leur longueur d'onde maximale d'absorption. Le phénomène de FRET est largement utilisé en biologie, notamment pour étudier des interactions 15 moléculaires. Il est basé sur l'utilisation d'un composé donneur fluorescent (par exemple un complexe de terre rare) et d'un composé accepteur éventuellement fluorescent, chacun de ces composés étant couplé à une molécule biologique. Lorsqu'un phénomène biologique provoque le rapprochement de ces molécules, et que le composé donneur est excité, un transfert d'énergie a lieu entre le donneur et l'accepteur et va résulter en une variation de la luminescence émise par le 20 milieu réactionnel. Plusieurs sociétés commercialisent des réactifs permettant la mise en œuvre de cette approche pour étudier des processus biologiques par exemple la Demanderesse fournit différents réactife, dont des cryptates de terres nonam, pour l'étude de phénomènes biologiques particuliers (détection d'activité enzymatique, dosage de seconds messagers etc...) 25 Les cryptates de terres rarea, décrits notamment dans les brevets EP 0 180 492. EP O321 353, EPO6O1 113.EP129O448'sont des m comportant des motifs dont l'énergie de l'état triplet est supérieure à celle de la terre rare complexée ; en particulier, ces motifs peuvent être des cycles aromatiques azotén, substitués ou non. Ces cryptates de terres rares sont très stables en milieu acide ou alcalin ce qui facilite la mise en oeuvre des dosages immunologiques dont les 30 anticorps ont été marqués par ces molécules. De plus, leur durée de vie est suffisamment longue (de l'ordre de la milliseconde) pour pouvoir travailler en temps résolu. Cependant les cryptates de trisbipyridine notamment présentent un coefficient d'absorption molaire peu élevé à 337 nm (4500 Mol-1 cm-1), !ongueurd^onde du laser à azote utilisée pour exciter le composé donneur d'énergie ou chromophore. Une autre limitation des cryptates de trisbypiridine est l'obligation 35 d'ajouter au milieu de mesure du fluorure de potassium, pour éviter l'extinction de fluorescence du cryptate liée à la présence de molécules d'eau. Le motif tétraazatriphénylène a été décrit en tant qu'antenne capable de collecter l'énergie excitatrice et de la transférer sur le cation lanthanide, conduisant ainsi à une sensibilisation de la 40 luminescence des lanthanides. Van der Tol et al. ont ainsi étudié une série de dérivés du 2 tétraazatriphénylène et ont souligné leurs excellentes propriétés en tant que chromophores et leur capacité à former des complexes assez stables avec les ions europium et terbium dans l'acétonitrile. (E. B. Van der Tol et al., Chem. Eur. J., 1998, 4, 11, 2315-2823). Le brevet EP 1019401 revendique ces complexes de terres rares, constitués d'un dérivé de tétraazatriphénylène et d'une terre rare. Bakheret al. ont souligné que la stabilité des complexes bétraazathphénvlène/terre rare en milieu aqueux est relativement faible, par rapport àmdle observée dans des solvents aprotiques, tels que l'acétonitrile. Pour remédier à ce problème, les auteurs proposent de greffer des groupes carboxylates au squelette triphénylène (B.H.Bakheredal.Chem.Rev..2U0O.2O8.3-18). Bobba*t ont été parmi les premiers à intégrer l'antenne tétraazatriphénylène à un motif capable de coordonner efficacement les ions de terres rares, en l'occurrence un motif tétraazacyclododécane (Chem.Commun., 2002. 890-891. Org. Biomol. Chem, 2003. 1, 1870-1872).otnnt montré que les complexes obtenus peuvent s'intercaler dans l'ADN. Des complexes de terres rares (chélates de terres rares) similaires, constitués d'une antenne de Lypetëtnaazotriphén}lène et d'une région chélatante dérivée d'un squelette tétrazaoyclododénane, ont été synthétisés et étudiés par Parker et al. En particulier cette équipe s'est intéressée à leur capacité à être adaptés èdea applications d'imagerie cellulaire (R. A. Poole et al., Org. Biolmol. Chem. 5 (2007)2066-2062et R. A. Poole edal.. Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 1013-1024). ainsi qu'à l'effet d'agents réducteurs sur la luminescence de ces complexes (F. Kielar et al., Org. Biolmol. Chem. 5 (2007) 2975-2982 et R. A. Poole et al., Chem. Commun.(2006) 4084-4086). Un des problèmes posés par ces complexes de terres rares est leur relative instabilité lorsqu'ils sont en solution dans des milieux compatibles avec les milieux biologiques (tampon phosphate, tampon hepes). Au regard de l'intérêt des complexes de terres rares en tant que composés fluorescents, les inventeurs ont développé une nouvelle famille de composés macropolycycliques capables de 30 former avec des terres rares des complexes macropolycycliques fluorescents. DESCRIPTION La présente invention a pour objet des composés macropolycycliques possédant un ou plusieurs motifs dérivés du groupe tétraazatriphénylène (TATP), ainsi que des motifs pyridine ou biidine. 5 Elle a également pour objet les complexes macropolycycliques de terres rares ou cryptates de terres rares. Les composés macropolycycliques de l'invention forment des complexes stables avec les terres rares, en particulier avec le terbium et l'europium et leurs spectres d'absorption sont plus 10 favorables à une excitation à 337 nm que les cryptates de terres rares de !'ad antérieur, en particulier que les cryptates Eu-trisbipyridine. Enfin, ces composés sont plus résistants à l'extinction de fluorescence due aux molécules d'eau que !aocryptateo de l'art antérieur, en particulier !eecrypt41eod'eunopium-triebipyridinm. 15 L'invention a aussi pour objet les conjugués constitués par une molécule organique ou biologique couplée à un cryptate de terre rare selon l'invention. COMPOSES MACROPOLYCYCLIQUES 20 Les composés macropolycycliques selon l'invention sont les composés de formule (1) : R, R2 25 dans laquelle : (0 A et B sont choisis parmi les groupes de formules (Il), (Ill), (IV) : 40 00 dans lesquelles : R1, R2, R8, R9 sont identiques ou différents et sont choisis parmi les atomes ou groupes suivants : H, -alk(CI.6), -CN, -alk(CI.6)-COOH, -CONH-alk(CI.6), -COO-alk(CI.6), -LG, ou encore R1 et R2 et/ou R8 et R9 forment ensemble, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons ou un cycle succinimide dont l'azote porte un atome ou groupe choisi parmi : H, -alk(CI6 ou - LG ; R3, R4, R10, R11 sont identiques ou différents et sont choisis parmi les atomes ou groupes suivants : H,ùLG ou les groupes donneurs d'électrons choisis parmi les groupes ou atomes suivants : -NH2, -NH alk(CI_6), -N [alki(CI.6) alk2(CI.6)], -OH, -0-alk(CI_6), -alk(C1_6 -CH-(alk(C1_6))2, -C(alk(CI.6))3, -NHCO-alk(CI.6), -S alk(C1.6), -SH, F, Cl, Br, 1 ; R5, R6 et R7 sont identiques ou différents et sont choisis parmi les atomes ou groupes suivants : -C(alk(CI.6))3, -NHCO-alk(CI.6), -S alk(CI.6), -SH, F, Cl, Br, 1 ; L est un bras de liaison et G est un groupe réactif. Les composés dans lesquels R3, R4, R10 et RI, sont choisis parmi les groupes H, OH et Cl sont des composés préférés. Les composés selon l'invention peuvent optionnellement comprendre un ou plusieurs groupes ùLG, de préférence 1 ou 2 groupes ùLG, L représentant un bras de liaison et G représentant un groupe réactif dont la fonction est de former une liaison covalente avec une molécule organique ou biologique que l'on souhaite marquer avec les produits selon l'invention. Les composés selon l'invention peuvent comporter des motifs dérivés du TATP, de la pyridine et de la bipyridine. En particulier, les composés selon l'invention peuvent donc avoir pour formules l'une des formules (V) à (x) : 30 35 H, -COO-alk(CI_6), -LG, les groupements donneurs d'électrons choisi parmi : -COOH, -NH2, -NH alk(CI_6), -N [alki(CI_6) alk2(CI.6) , -OH, -0-alk(CI_6), -alk(C1_6), -CH-(alk(C1_6))2, 40 15 20 (V) 25 30 35 40 (VII!) (X) 6 Bien que les groupes RI.R2, R2 et R4 puissent être différents, les composés dans lesquels R/=R2 et R3=R4 sont préférés dans la mesure où leur synthèse est plus aisée car elle ne nécessite pas d'étapes de séparation des espèces mono- ou di-substituées. De même et pour faciliter la synthèse, composés dans lesquels R8=R9,R10=R~~sont également préférés. Enfin et pour les mêmes raisons, les composés dans lesquels R5=R6 sont aussi préférés. On définit ci-après les différentes familles de composés préférés selon l'invention. Une première famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (!)dans laquelle, lorsqu'ils sont présents H/=Rc, R3=R4, Re=R� Rio=R/, ' R6=R6, ou bien RI 15 et R2 et/ou R8 et Ro fonnert, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné aatunéà 5 ou 6 chaînons. Une deuxième famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (V) dans laquelle RI=R2.R3=R4, R8=Ro et R10=Rnou bien RI et R2 et/ou R8 et R9 forment, 20 avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons La sous-famille de composés de formule (V) et dans laquelle RI=Re=Ra=Reou bien R, et R2 et R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons et R3=R4=R10=R11 est encore plus préférée. 25 Une troisième famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (VI) dans laquelle RI=R2 ou bien RI et R2 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons, R3R4 et R5=R6. Une quatrième famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de 30 formule (Vl!) dans laquelle RI=Raou bien RI et R2 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé b5ouGchaînons, R�=R4 sdRn=Rs. Une cinquième famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (VIII) dans laquelle Ri=R2, R3=R4, R8=R9, Rln=Rnou bien RI et R2 etIou R8 et R9 forment, 35 avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à GmuSchaînons La sous-famille de formule (N!!) dans laquelle RI=Ru=Ro=Roou bien RI et R2 et R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à5 ou 6 chaînons et Rm=H+=Rm=R1/est encore plus préférée. 10 7 Une sixième famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (IX) dans laquelle Ri=R2 ou bien RI et R2 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné soiuréà 5ouGchaînons, Ro=R4. 5 Une septième famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (X) dans laquelle Ri=R2, R3=R4, R8=R9, R~Ro R5=R6 ou bien RI et R2 et/ou R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à5 ouG chaînons. La sous-famille de formule (X) dans laquelle RI=Ro=Ru=Roou bien RI et R2 et R8 et R9 forment, 10 avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé bGouGchaînons et R3=R4=R19=R11 est encore plus préférée. Pour les familles ci-dessus, les composés particulièrement préférés cont ceux dans lesquels RI, R2.R8 et R9 sont des atomes d'hydrogène ou bien les couples R1-R2 et F8-Ryforment, avec les 15 atomes de carbone auxquels ils sont !iés, un cycle saturé à 5 ou 6 atomes, et dans lesquels les groupes R9, R4, Rio et RI, sont choisis parmi les groupes H, OH et Cl, et R5, Re et R7 sont des groupes ûLG. Les composés l'invention peuvent comporter un groupe réactif G permettant de coupler le 20 complexe de terre rare fluorescent avec une espèce que l'on souhaite rendre fluorescente, par exemple une molécule organique, un peptide ou une protéine. Le groupe réactif G peut être porté indifféremment par l'un ou l'autre de substituants RI à R11, mais sera de préférence porté par l'un des substituants R5, R6 ou R7 lorsqu'ils sont présents, et cela 25 pour faciliter la synthèse du polymacrocycle. En d'autres termes, lorsque le groupe ûLG est présent, au moins un des groupes R5, R6 ou R7 est un groupe -UG. Typiquement, le groupe réactif G est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe n i!oouà ikaappnzphé, 30 respectivement. La réaction de conjugaison entre un composé selon l'invention comportant un groupe réactif et une molécule organique, un peptide ou une protéine portant un groupe fonctionnel entraîne la formation d'une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactif. De préférence, le groupe réactif G est un groupe dérivé d'un des composés : un 35 acrylamide, une amine activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide oorboxy!ique, un diazoa!oune, un ha!uaoébamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, !adich!ondriazine' une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de aulfonWe, ou un thiol, une 40 cétone, une amine, un halogénure d'acide, un ester d`hvdrnnyeuocininnidWe, un ester 8 d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un dithio pn)pionemidm.unolyoxal et en particulier les groupes de formule : Mi ) (CH2) NCS 0 iNH ) (CH2)i '01 NH ) (CH2) SH ( NH ) (CH2) NH-Ar NCS ( NH (Il iNHi ) (CH2)ùN O NH ) (CH ) dans lesquels wvahe daO à 8 et vest égal à0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons, 5 saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome De manière préférée, le groupe réactif G est un acide carboxylique, un ester deauccinhnidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, une amine aliphatique. lO Ces groupes réactifs peuvent être liés au cryptate de terre rare directement ou via un bras de liaison L constitué de manière avantageuse par un redioal organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylènes linéaires ou ramifiés en CI-Co. contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons; les groupes cycloalkylène en C5-C8 et les groupes arylène en C6-C14, 15 lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) 510 carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle en C1-C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo. En particulier, les bras de liaison L peuvent être choisis parmi les groupes divalents suivants : 1) ù(CH2) 0 0 Il II 2) ù(CH2),,ùNH-Cù(CH2)m C 3) ù(CH2)nù0ù(CH2)m 0ù(CH2)p O I 5) ù(CH2)nùNH-Cù(CH2)p I I (CH2)nù0ù(CH2)n7 Où(CH2)pùNH-Cù(CH2)n o o I I O 6) ù(CH2)nùNH-Cù(CH2)P N/ 7) ù(CH2)NH-Cù(CH2)P S 15 >'/ 0 Sù(CH2), 0 Nù(CH ,)r 0 I I ù(CH2)nùNH-C (CH2)p 0 li 9) ù(CH2)nùNH-C(CH2) 20 10 10) ---(CH N O p dans lesquels n, m, p, r sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5. 10 De manière préférée, les groupes ûLG sont constitués d'un groupe réactif G choisi parmi: un acide carboxyique, un ester de succinimidyle, un hekoocétamide, une hydrazine, un ieodliocyanate, un groupe maléimide, une amine aliphatique, ledit groupe G étant lié au cryptate directement ou via une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone. 15 De manière encore plus préférée, le groupe -LG est un acide carboxylique lié au cryptate directement ou via une chaîne alkylène comprenant de 1àGatomes decarbone. Une molécule organique, un peptide ou une protéine susceptible d'être marquée par un composé selon l'invention comprendra donc un groupe fonctionnel avec lequel réagira le groupe réactif du 20 cryptate de terre roro, porté éventuellement par un bras de liaison. Par exemple, la molécule organique, la protéine ou le peptide comporte un des groupes fonctionnels suivants : amine, arnide, thiol, a!000!, e!déhvde, oétone, hydrazine, hydroxylamine, amine secondaire, halogénure, 8poxvde, ester (carboxylate d'alkyle), acide carboxylique, des groupes comportant des doubles liaisons ou une combinaison de ces groupes fonctionnels. Les groupes amine ou thiol présents 25 naturellement sur les protéines sont souvent utilisés pour procéder au marquage de ces molécules. COMPLEXES MACROPOLYCYCLIQUES (CRYPTATES) DE TERRES RARES L'invention concerne également les complexes macropolycycliques (dits également cryptates) de terres rares constitués d'un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique tel que 30 décrit ci-dessus, la terre rare étant choisie parmi : E"3+.Tb3+`Ga3+`n"3+,ma3+ ,vb3+'Er3+. De préférence, la terre rare est Tb3+ ou Eu3+. Ces complexes sont préparés en mettant en contact les cryptands selon l'invention et un sel de terre rare Ainsi la réaction entre 1 équivalent de cryptand et 1,2 équivalent de chlorure de 35 lanthanide (europium ou terbium) dans l'acétonitrile à reflux pendant plusieurs heures conduit au cryptate corn*epondamt. 11 CONJUGUES : Les complexes de terres rares selon l'invention comportant un groupe réactif sont particulièrement adaptés au marquage de molécules organiques ou biologiques comportant un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif pour former une liaison covalente. Ainsi l'invention concerne aussi l'utilisation de complexes de terres rares pour le marquage de molécules biologiques. L'invention concerne donc également les molécules marquées par un cryptate de terre rare selon l'invention. Toutes les molécules organiques ou biologiques peuvent être conjuguées avec un cryptate de terre rare selon l'invention si elles possèdent un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif. En particulier, les conjugués selon l'invention comportent un cryptate de terre rare selon l'invention et une molécule organique choisie permi: un acide aminé, un peptide, une protéine, un anticorps, un sucre, une chaîne glucidique, un nucléoside, un nucléotide, un oligonucléotide, un substrat d'enzyme, en particulier un substrat d'enzyme suicide telle qu'une benzylguanine. Les inventeurs ont par ailleurs découvert que la réaction de la benzylguanine avec l'enzyme alkylguanine-DNA alkyltransférase est beaucoup plus rapide lorsque la benzylguanine est conjuguée avec un cryptate de terre rare selon l'invention, en comparaison avec la réaction de cette même enzyme avec une benzylguanine coup!éeà un autre type de fluorophore. Définitions et abréviations : � ": désigne un groupe alkyle linéaire ou ramifié comportant de 1 à n atomes de carbone, tels que les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, néopentyle ouhaxvle. 25 Lorsque une molécule comprend 2 groupes alkyles, les abréviations a/kl/CI.Jcd alk2(CI_n) sont utilisées. � Ctyptand � : désigne un composé macropolycyclique de formule : D F 30 dans laquelle D, E, F sont des chromophores, généralement des cycles carbonés ou des hétérocycles aromatiques, éventuellement substitués. Des cryptands sont décrits dans les brevets � Cryptate de terre rare � : désigne un complexe comportant une terre rare et un cryptand, la terre 35 rare étant liée au oryptand par des liaisons de coordination. 12 Dans la suite de la description, la nomenclature suivante sera utilisée : °Cgptate&æ �. Par exemple, un cryptate d'europium, dont !eohnzmnnphora E est une pyridine et les chromophores Eod F sont des bipyridines, sera dénommé : Cryptate d'Europium Pyridine-bisbiPyridine ou encore Cryptate Eu Py-bisbiPy. "T4TP": 1,4, o py~: pyridine � T7/T48TP" : 10,11'12'13-&ét,ahvdro'4,5,9,14-tétraooa-benzo[b]triphény!ène 10 "MS (El) ": Spectrométrie de Masse (Impact électronique) "/R&YG/E/ ": Spectrométrie de Masse Haute Résolution (Impact électronique) � P.F. " : Point de fusion "MALDV°: Ionisation désorption sur matrice assistée par laser a ix Assisted Laser Desorption Ionisation) 15 "8&4LD/T{JF �: La technique K8ALD!'TC>F(WYathxAaeietedLaser DenorptionIonisation -TimeCf Flight) est un couplage entre la technique MALDI et la spectrométrie de masse dite à temps de vol (T{JF-Ume'of-f!ight mass spectrometry), en raison principalement de sa large plage de fonctionnement en masse. Ce nom est couramment utilisé pour désigner I'appareilllage en!ui' même. 20 °Matrice CHCA ": résine contenant des groupes acide alpha cyano-4-hydroxycinnamique "Matrice ID4A": résine contenant des groupes acide trans-3-indoleacrylique "FRB": domaine de liaison de la protéine FRAP avec le complexe FKBPùrapemyoinm(en langue anglaise "FKBPùrapamycin bindinQdomainofFRAP^) "FRAP": protéine se liant au complexe FKBP-rapamycine (en langue anglaise, FKBPù25 /apanlycinbindingprotein") °FKBp": protéine eoliant à!aprotéine FNSOG(onlangue anglaise, "FK5OSbindinQpnzb�in") 30 La préparation des composés macropolycyclîques et des cryptateaaekon l'invention est décrite de manière schématique ci-après, et de manière plus détaillée dans la partie expérimentale. 35 40 13 Synthèse du chromophore TA TP Le schéma général de la synthèse du chromophore TATP et de ces dérivés est décrit ci-dessous: FI 1R2 Néocuproîne R1= R2 cyclohexyl NaBH4 MeOH SeO2 Dioxane 5 Quelle que soit la méthode choisie, il est nécessaire d'utiliser la néocuproïne comme produit de départ. La néocupro'ine peut être héxachlorée en présence de N-chlorosuccinimide puis le composé chloré ainsi obtenu est traité dans des conditions oxydantes conduisant ainsi à !'odhoquinone di-acide. Lorsque ce composé est traité avec une 1,2-diamine de formule !O NH2-CR1-CR2-NH2, le motif TATP est formé dans la molécule. Le diacide résultant n'est pas isolé directement mais est estérifié sous forme de di-ester méthylique qui peut être purifié par chromatographie. Ce diester est ensuite réduit par le borohydrure de sodium conduisant au diol souhaité. Alternativement, ce diol peut être obtenu par une autre voie de synthèse mais toujours à partir de la néocuproïne. En effet lorsque ce composé est traité avec un mélange brome û acide 15 nitrique, généré in situ via un mélange de bromure de potaaeium, d'acide sulfurique et d'acide 14 nitrique, l'orthoquinone correspondante est obtenue. Le traitement de ce composé avec la 1^2-diamine de formule NH2{}R1-CR2NH2 conduit au motif TATP souhaité correspondant au squelette de base comportant le cycle pyrazinique. Ensuite !afonoUonna!impdion en position 2 et 2' est possible en oxydant les groupes méthyle par de l'oxyde de sélénium dans le dioxane. La 5 réduction des fonctions aldéhydes en fonctions alcools est effectuée facilement par du borohydrure de sodium conduisant ainsi au diol. En traitant le diol avec du trichlorure de phosphore dans le chloroforme, on obtient le composé dichloré correspondant. Lorsque le motif TATP comporte des groupes R3 et R4 différents de l'hydrogène, la synthèse du 10 chromophore diffère de celle présentée précédemment. En particulier, les positions 4 et 4' de la phénanthroline de départ doivent être activées. Ces produits de départ ne sont pas commerciaux, et peuvent être préparés comme indiqué sur le schéma suivant : JûCOB NH HN + H2N NH2 Cl C 15 La phénylène 1,2-diamine est condensée sur l'acétoacétate d'éthyle selon le protocole décrit dans la littérature (T. W. Bell et al .J. Org. Chem. 1987, 52, 3847). Le bis-adduit obtenu est séparé du mono-adduit par chromatographie flash sur colonne de silice. La formation du motif phénantroline est effectuée en chauffant à température élevée (2400{}), en présence de l'oxyde de phényle 5 (PhO). Le composé dichloré correspondant est obtenu avec un bon rendement (89%) en utilisant le POCI3. Ensuite la stratégie utilisée précédemment est appliquée sur cette molécule ce qui permet d'obtenir une série de dérivés du motif TATP. Ces chromophores sont ensuite utilisés dans l'élaboration des produits selon l'invention. 10 Préparation de dérivés de la p yridine ou de la bile yridine diamine : F~ PdKC1O% NH2 NH2 La pyridine dibromée est convertie en diamine correspondante par aminolyse en faisant réagir le 15 composé dibromé dans une solution de diméthylformamide saturée en ammoniac. Une autre alternative à cette stratégie consiste à préparer le diazide puis à réduire le composé intermédiaire pour donner la diamine souhaitée. La même stratégie est utilisée pour la bipyridine. Synthèse de composés macropolycycliques et cryptates dont au moins deux des trois Parmi les différentes méthodes de cyclisation pour former des composés macropolycycliques, la méthode appelée °2+1 "eut l'une des plus efficaces permettant en une seule étape d'obtenir un bismacrocycle. Cette méthode consiste à faire réagir deux chromophores dihalogénés avec un chromophore diaminé. Les schémas ci-après représentent la synthèse d'un composé mecropo!yoyoÜquade formule générale (V) ou (X) et des cryptates correspondants. 16 R5 R6 5 Le cryptate de lithium est obtenu en condensant deux équivalents de dérivé TATP dichloré avec un équivalent de pyridine ou bien de bipyridine diamine. Après extraction classique du mélange réactionnel, le produit brut est traité avec du chlorure d'europium ou du chlorure de terbium, ce qui conduit au cryptate de !anthanidennrraapondanL Les crptates sont en général isolés en petite 10 quantité (à l'échelle de la !mol) par HPLC préparative en utilisant un mélange d'acëtonüri!æ-eau' anideLrif!uoruacétique comme é!uant. 15 15 17 Synthèse des cryptates dont les 3 chromophores sont différents : D'autres méthodes également efficaces mais comportant un nombre supérieur d'étapes consistent à préparer un macrocycle sur leouel est condensé un chromophore portant deux groupements ~ partants. Cette méthode permet l'obtention d'un cryptate comportant trois chromophores différents, ce qui n'est pas possible avec la méthode précédente *2+1 �. On peut citer par exemple les méthodes suivantes : - Préparation de macrocycles via des bases de Schiff utilisées par David E. Fenton (S.R.C|o!!inson.D.E.Fenton, Coord.Chem.Rev.1S9G.148.19)et 10 - Synthèse de macrocycles utilisant la méthode de Stetter et Marx, qui a été utilisée par Jean-Marie Lehn pour élaborer des macrocyo!ee(H. Stetter, J. Marx, Ann. Chem., 1967. vol. GO7.S9-GG.; B.Dietrich, J.yW.Lehn.J.P.Sauvage, TetmuhodronLett.1SGB.2885-2888). Les étapes essentielles de ces approches classiques sont résumées dans les schémas suivants : Technique par amination réductrice via une base de Schiff, H rNH2 3 o cil. w LNH2 3 ~ oxmmonhoæo cxmmonxvmx chmmvphvma cxmnmnhomo X= groupement partant Technique par amidation (Stetter et Marx) chmmunhomo communhomo oxmmvvhomx cxmmovhome + NH2 X= groupement partant Synthèse de conjugués ù Marquage de molécules organiques avec les composés selon 20 l'invention Les techniques de conjugaison de deux molécules organiques sont basées sur l'utilisation de groupes réactifs et relèvent des connaissances générales de l'homme du métier. Ces techniques classiques sont décrites par exemple dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academic 25 Press, 1996. p. 137-166. Typiquement la préparation d'un conjugué est réalisée selon le protocole décrit ci-dessous (exemple de marquage d'une benzylguanine (8G) aminée par un cryptate Eu P). ù* cryptate possédant une fonction carboxylique est activé sous forme d'ester de NHS (TBTU et diisopropyléthylamine). La benzylguanine aminée réagit réagit avec cet ester pour conduire au conjugué 5 Cryptate-BG souhaité. ? 5 NH2 0 19 EXEMPLES Exemple 1 : Synthèse du 7,10-Dichlorométhyl-1.4,8.9-tétraazatriphénylène 2,9-bls(trichlorométhyl)-1,1 NCS, mCPBA Néocuproïne A une suspension de néocuproïne (5.2g.25 mmol) dans CCN (200 ml) ont été ajoutés en une !O seule portion la N-Chlorosuccinimide (20.06 g, 150 mmol) puis l'acide 3-chloroperbenzoïque (20 mg). La suspension blanche a été chauffée à reflux sans précaution particulière. Au cours du temps la suspension s'est coloré en jaune. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 20 h dans ces conditions, la réaction était complète. La solution a été refroidie à température ambiante puis le solvant a été éliminé sous pression réduüe, oonduioantà un solide. A ce solide a 15 été ajouté du dichlorométhane (150 ml) pour conduire à une suspension qui a été filtrée. Le solide a été écarté et le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le résidu a été dilué dans de l'acétate d'éthyle (150 ml). Cette solution a été lavée avec une solution de saumure (3 x 50 ml), puis avec une solution de Na2CO3 à 10% dans l'eau (50 ml xl). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée puis concentrée sous pression réduite pour donner un solide. Ce produit a été 20 purifié par chromatographie en utilisant un gradient d'éluant cyclooxexane-Acétate d'éthyle (5/1 à 4/2). Les fractions de même Rf sont regroupées et concentrées sous pression réduite pour conduire au produit désiré (8.G4g.83% Rdd.P.F.: 225"C.1HRyWN(30OMHz, CDC!n): 88.45/d.J 25 1, Dans un ballon de 250 ml on a introduit de la 2` 1,10-phénanthroline (16 g, 16,86 mmol) et le bromure de potassium (10`03 g ~ 84,33 mmol). Le mélange a été refroidi par un bain de glace, puis de l'acide sulfurique froid (60 ml) a été ajouté sans précautions particulières. Le mélange a été agité pendant 15 min àcette température puis l'acide nitrique à été ajouté goutte à goutte (30 ml). Le mélange a ensuite été chauffé à 85°C pendant 1h30. La 20 formation de vapeur rousse a pu être observée (brome). (brmélange réactionnel a ensuite été versé dans un mélange glace/eau (1:1, 400 ml) et le précipité jaune formé a été filtré, lavé avec 5 ml de dichlorométhane et séché sous pression réduite pendant 24 h, Un solide jaune a été obtenu (4,45 Q. 88%), correspondant au produit souhaité. P.F.: 202'208 "C (déc). `H RMN (300 MHz, DMSO d6): 0 8.59 (d, J= 7.8 Hz, 2 H) ; 8,27 (d, J= 8,1 Hz, 2 H). 13r RMN (75 MHz, de &méthyle. 10 Dans un ballon de 250 ml on uintroduit (4,45 g; 14,93 mmol) de diane et de !'éthanol absolu (180 ml). A cette solution on aaouté goutte à goutte de l'éthylène diamine (1.19m! ; 17,91 mmol) sous agitation magnétique. Un précipité gris s'est formé au cours de cette addition. Le mélange a 15 ensuite été chauffé à reflux pendant 60 h. Après cette période, le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu dissous dans du nné#huno! (180 ml) puis de l'acide sulfurique concentré (10 ml) a été ajouté. Le mélange a été chauffé à nouveau à reflux pendant 3h. Après cette période de l'eau (300 ml) a été additionnée au mélange dans lequel s'est formé un précipité qui a été filtré, lavé successivement avec de l'eau (100 ml) puis de l'éther diéthylique (50 ml). Le 20 solide ainsi obtenu a été séché sous pression réduite puis purifié par chromatographie flash sur colonne de silice en utilisant un éluant (dichlorométhane-méthanol, 9:1). Un solide beige a été alors obtenu (1.5g. 29%) correspondant au produit souhaité. P.F.: 300-302"{|. `H RMN (300 MHz, CDCI3): B 9'67 (dd, J= 0'4 Hz ; 8,3; 2 H)' 9.07 (s, 2 H), 8.65 (d, J= 8.1 Hz, 2H), 4.15 (s, OMe, 6 H). 13n RMN (75 MHz, CDCI3): O 106'2; 15O,4; 14G.8; 146.0 ; 141'0; 13S.2; 130;0 ; 125,2 ; 7, N Dans un ballode 250 ml, on a introduit le composé diestær/G18mQ; 1,49 mmol) et du méthanol (125mn0.Acette suspension on a ajouté, par petites portions, du borohydrure de sodium (350 mg, 9.25 mmol). L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. A ce mélange réactionnel on a 21 ajouté de l'eau (25 ml) puis le solvant mété éliminé sous pression réduite. Le solide jaune pâle obtenu a été filtré et séché sous pression réduite pendant 24 h pour donner le produit souhaité (300 mg, 68%). `H RMN (300 MHz, DMSO de): J 9,48 (d, J = 8,3 Hz ; 2 H) ; 9,15 (s, 2 H) ; 8,07 .J=8,5 Hz ; 2 H), 4,95 (s, 4H0.1orRK8N(75MHz, DMSO de): D166.1; 140.3; 140,6 ; 134/4; 5 126/4 ; 122,]; 85,8; HRMS (El) Calculé pour C16H12N402 ~ 282'0960, trouvée : M, 292,0950; MS (E0/n/z 8n1 rei)2S1(W-H'1OO).282 (K8+.84)262(4Q)'244(53) 7, Ho c Cl /O A une suspension de diol (250 mQ; 0\85nnmoD. dans du chloroforme (150 ml) on a ajouté du trichlorure de phosphore (830rng; 6,8 mmol). Le mélange a été chauffé àGO"C pendant 6 h. La réaction a été ensuite refroidie à température ambiante puis le mélange a été versé avec 15 précaution dans une solution saturée de bicarbonate de sodium (100 ml). La phase organique a été séparée et la phase aqueuse a été extraite avec du dichlorométhane (2 x 100 ml). Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le composé brut obtenu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant /edich!onomnédhanecomme é!uonL On a ainsi obtenu le composé souhaité pur (92 mg, 33%). 1H 20 RMN (300 MHz, CDCI3): ~9,59(d. J=8,4Hz ; 2 H) ; 9,00 (s, 2 H) ; 8,10 (d, J=B'1 Hz ; 2 H) ; 5,14 (s, 4 H). 13C RMN (100 MHz, CDCI3): 8 159,7 (]. 144,8 (CH), 140,3 (G), 134,7 (CH), 126'7 (G). 123,5 (CH), 47,2 (CH2). HRMS (El) Calculé pour C|16H10C12N* 328'0283; trouvée 329,0297; MS (E!)nl/z (ini rmi)328(K8-H. 100), 330 (K8+H. 73)`293(K8+HC[ 53). Le ohn}mophonaeimsi obtenu, dérivé du TATP dichloré convient pour la synthèse de cryptates par 25 la méthode dite � 2+1 �. 22 benzol'bltriphénylène 10,11,12,13-tétrahydra-4,5,9,14-têtraaza-benzolbitriphénylène-3, 6-dicarboxylate de 1) H2N NH2 2)K8eOH H(]~C CO.H H2SO4 25 A une suspension d'acide 1.10-phénanthrol/me-5.6-dione-2,9-dicarboxylique dans du méthanol 10 absolu (200 ml) on eajouté goutte à goutte de la 1.2-diaminocyclohexane (3,0m[25,2 mmol). Un précipité gris a été observé dans le mélange. Celui-ci a été chauffé à 65°C pendant 20h et refroidi jusqu'à la température ambienhe. De l'acide sulfurique (3 ml) concentré a été additionné à ce mélange qui a été ensuite chauffé pendant 3h. A cette solution a été additionnée de l'eau (200 ml) conduisant ainsi à un précipité. Le méthanol a été éliminé sous pression réduite et la phase 15 aqueuse restante a été extraite par du dichlorométhane (3 x 75 ml). Les phases organiques ont été réunies et séchées sur sulfate de magnésium. Le résidu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant dichlorométhane-méthanol 100-0 à 97-3 pour donner le composé souhaité (2.33g.34%)P.F.: 302"C (dén).1HRK8N(3OOMHz, CDCI3): DS.G2 (d, J=8.4Hz' 2 H) ; 8,58 (d, J=8.4Hz ; 2 H) ; 4,15 (s, OK8e, G H) ; s ,4 4H) ; 2,11 (bro` 4 H). 20 1�rRK8N(75MHz, CDCk): Ü1S5,B([]; 155.3(C); 149'2([) ; 137.7(C); 134'3({}H); 1298(C); 124,5 (CH) ; 80,2 (C) ; 53,1 (Me); 32,8kCH2; 22,6 VCH" ; HRMS (El) Calculée pour C22H18N404. 402,1328, trouvée 402,1332; MS (CI) mlz Ont. rel.) 403 (M+H, 55), 405 (28), 315 (19). 3,fi-Dihydroxyméthyl-10, 11, 12, 13-tétrahydro-4, 5, 9, 14-tétraaza-benzojbjtriphénylène NaBH4 MeOH N HO HO A une suspension de -1[\11'12,1 1 dicarboxyate de diméthyle (1,37 g, 3.27 mmol) dans du méthanol (300 ml) on a ajouté du 23 borohydrure de sodium (834 mg; 22,32 mmol par petites portions (70 mg) toutes les 30 min. L'avancement de la réaction oété suivi porHPLC. De l'eau (50 ml) a été ajoutée à ce mélange et le méthanol a été éliminé sous pression réduite. Le solide jaune pâle formé a été filtré et séché pour donner !edio!attendu (834mg,73%).'HRK8N(3OOMHz, DK88C}4): G8,34 (d,J=8'4Hz'2 5 H) ; 8,02 (d, J=8.7Hz, 2 H) ; 5,74 (m, 2 H, {}H) ; 4'82(rn.4H); 3,18(brn. 4H) ; 2'04(brs. 4 H). 13r RMN (75 MHz, 8K88{} d6): Ô 164'9 ({}) ; 154,4 (C); 146,2 (C|) ; 137,5 (C); 133,6 (CH); 126,0 (C); 121,7 8C!0; 65`6 ACHu ; 33,1 K|Hc ; 230 (CH2). HRMS (E!) Calculée pour C20H18N402. 346,1430, tnouvAe: 346,1412; MS (B) m/z /inL rd.) 345 (M-H, 100), 346 (N+'8B)' 316 (58), 317 (45). 10 (TH TA BTP) 15 A une suspension de 3.G-dhvdronynnéthyl-1O,11'12.1 ro-4.5,9'14'bétraazabmzo[b]thohëmylène (600 mg; 1,73 g) dans du chloroforme (300 ml) on a ajouté ionné du trichlorure de phosphore (1.2 nn! ; 13.88nnrnc8). Le mélange eàté chauffé à 60°C pendant 6h, puis refroidi à température ambiante et versé prudemment dans une solution saturée de NaHCO3 20 (200 ml). La phase organique a été séparée et la phase aqueuse a été extraite avec du dichlorométhane (2 x 100 ml). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant dich!oponnëthanennéthuno! (100-0 à 98'2) pour donner le composé désiré (508 mg, 77%) 1H RMN (300 MHz, An^4 H). /ar RMN (100 MHz, O 158'7(C) ; 154,3 /C\; 137,4 (C}; 134,3 (CH) ; 126,8 (C) ; 123,1 (CH) ; 80,7 (C) ; 47,2 /CHJ ; 32,8 (CH" ; 22,7 (CH2). HRMS (E!) Calculée pour C2OH17Cl2N4: 382,0752, trouvée : 382,0746.; K88(E0nvz' Ont. æH.)382 (100),384/68\'847(45,N-HCU. Le chromophore ainsi obetenu, qui est une dérive dichloré du TATP convient pour la synthèse de cryptates par la méthode dite ^2+1 �. 24 benzorbItriphénylène de 5 Di-adduit Mono-adduit Un mélange de 1.2-diamine C32.40 A; 0,3 mol) et d'acétoacétate d'éthyle (84.59 g; 0,65 mol) ont été placés dans un grand cristallisoir et conservés sous pression réduite (20 mm de Hg) en présence de pentoxyde de phosphore pendant 2 semaines. Le mélange réactionnel a été 10 utilisé dans l'étape suivante sans purification. Cependant un échantillon analytique a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice avec un éluant cyclohexane-acétate d'éthyle (1-9). Cette première chromatographie a permis d'enrichir une fraction en produit désiré. Une deuxième chromatographie flash sur colonne de silice en utilisant un ë!uentcyc!oheuene-ucétated'éthyle (15-85) apannk* d'obtenir un produit pur sous forme d'une huile incolore. 1H RMN (300 MHz, 15 CDCI3): Ô 10,10 (s, 2 H, NH) ; 7.14(o.4H. ArH).4.75 (s, 2 H) ; 4,12 (q, J=7'2 Hz.4H) ; 1,91 (s, 6 H) ; 1,25 (t, J = 7.2 ; 6 H); 13C RMN (75 MHz, CDCI3): S 170.0 (C) ; 158,4 (C) ; 134,6 ([}) ; 126.4 (CH); 125,6 (CH) ; 876 (CH) ; 58.2 ACHe ; 19,9 kCHo ; 14,5 (CH3). HRMS (El) Calculée pour C18H25N204: 333.1814,trouvée 333.1014; MS (El) nvz (int. nei)333(75, M+H), 332 (36. K8)'245 (100' M-2EtOH). 20 Le sous-produit principal qui a été isolé correspond au monoadduit sous forme solide incolore. R.F. 83'84"C.'HRK8N(3OOMHz, {|[}C!J: 69'75 (bra,1H,NH); 7,08(t,J=7'8; 1H'ArH); 8.98(d.J = 7,8 ; 1 H, ArH) ; 6.73 (m, 2 H, ArH) ; 4,73 (s, 1 H) ; 4,16 (q, J = 6,9 Hz, 2 H) ; 3.83 (br s, 2 H, NHu ; 1,81 (a,3!) ; 1,30 (t, J=6,9, 3 H); 13rRMN (75 MHz, CDCI3): 5 1708(C); 181'5(C) ; 158,5 (C); 143,j(C); 128,6 (CH) ; 1280(CH); 118,3 (CH) ; 115,6 (CH) ; 85,1 (CH) ; 58,7 /CH" ; 25 19,7 (CH° ; 14.6 (CH3). NH2 0 _O ~ Y\ 0 (] Ph2O HO OH 240 0C 30 25 Du diphényléther (50 ml) a été introduit dans un ballon tricol et chauffé à 200'C sous un courant d'azote. Le produit brut contenant le bis-adduit (1 g) a été additionné et chauffé è24O"C pendant 30 min., puis !e mélange oété refroidi à température ambiante. De l'éther de pétrole (15 ml) a été additionné et le ooUdea été filtré, lavé avec de l'éther (2 x 15 ml) et introduit dans un ballon 5 monocol contenant de l'acétone (15m!).Ce mélange a été chauffé à ébullition pendant 15 min et le compoméa été filtré et séché pour donner un solide beige (130 mg, 30%). R.F. 340°C (déc). HO OH POCI3 10 25 Le composé dihydroxylé obtenu précédemment (2,74 g; 11,4 mmol) a été mélangé à de !tmychkorunede phosphore (QOnn0*dchauffé à8O°C pendant une nuit. Le mélange a ensuite été versé dans un mélange glace pilée-eau (200 g - 400 g). Après 15 mm, du chloroforme (100 ml) a 15 été ajouté et le pH de la phase aqueuse a été ajusté à 13-14 en utilisant une solution concentrée d'hydroxyde de potassium. La phase organique aàté séparée et la phase aqueuse eétb extraite avec du chloroforme (2 x 100 ml). Les phases organiques ont été réunies et séchées sur sulfate de nnegnéaiurn, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie flash en utilisant un éluant dich/ononoéthene-nnéthano! (98-2) pour donner un 20 solide incolore (2.74Q ; 89%). P.F. 202 °C (déc). 1H RMN (300 MHz, CDCI3): Ô 8,25 (s, 2 H); 7.63 (s, 2 H); 2,93 (s, 6 H); 13C NMR (75 MHz, CDCI3): O 158,9 (C), 145,4 (G); 141,8 (C); 124,0 ~; 123,1 (CH); 121,1 (CH); 24,8 (CH3). 4, 7-Di'chloro-2,9-di'méth yl-1 , KBr, HNOuHuGO^ A un mélange du composé dichloré obtenu précédemment (60Omg; 1]]5 mmol) et de bromure de potassium (2,19g~ 18,5 mmol) dans un ballon de 25 ml ont été ajoutés lentement sous agitation, 30 de l'acide sulfurique (4 ml) puis de l'acide nitrique (2 ml). Le mélange aéhé chauffé à 80°C pendant 3h et versé très lentement dans une solution contenant de l'eau (60 ml) et du NaHCO3 (14 g). La phase aqueuse a été extraite avec du chloroforme (3 x 50 ml). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice en utilisant un solvant dichlorométhane-méthanol (98-2) pour donner la dione souhaitée (213 mg, 26%). 1H RMN (300 MHz, CDCI3): Ô 7,36 (s, 2 H); 2,72 (s, 6 H); 13C RMN (75 MHz, CDCI3): Ô 178,5 (CO); 166,0 (C); 154,0 (C); 146,5 (C); 128,0 (C); 124,6 (CH); 25,4 (CH3). 1,8-dichlom-3,6-D'iméthyl-10,11,12,13-tétrahydro-4,5,9,14-tétraaza-benzo [bItriphénylène C 20 A une solution de la dione obtenue précédemment (120 mg ; 0,39 mmol) dans du méthanol anhydre (6 ml) a été additionné de la 1,2-diaminocyclohexane (56 gl ; 0,47 mmol) et le mélange a été chauffé sous agitation à 65°C pendant 20h. Le solvant a été évaporé et le résidu purifié par chromatographie flash sur colonne de silice avec un éluant dichlorométhane-méthanol (98-2) pour donner le produit souhaité. Calculée pour C20H16C12N4 382,07, trouvée M+1=382,97; Exemple 4 : 3,6-Dicarboxaldehvde-10,11,12,13-tétrahydro-4,5,9,14-tétraa benzorbltriphénvIène 2,9-Diméth yl- 1,1 0-phénanthroline-5,6-dione H2SO4 Dans un ballon bicot de 100 ml on a introduit de la néocuproïne (2,0 g ; 9,6 mmol) et du bromure de potassium. (11,4 g ; 96 mmol), puis de l'acide sulfurique à 96% (30 ml). Le mélange a été agité 25 pendant 15 min puis de l'acide nitrique (14 ml) y a été ajouté. La solution a ensuite été chauffée à 80°C pendant 3h. Le mélange a été refroidi à température ambiante et versé avec prudence dans une solution aqueuse (400 ml) contenant du bicarbonate de sodium (100 g). La phase aqueuse a été extraite avec du chloroforme (2 x 250 ml). Les phases organiques ont été réunies, lavées avec une solution saturée de saumure (200 ml) et séchées par du sulfate de magnésium. La suspension a été filtrée puis concentrée sous pression réduite pour conduire à un résidu qui a été purifié par chromatographie flash sur gel de silice en utilisant un éluant dichlorométhane-méthanol (9:1) 27 conduisant ainsi au composé désiré. 1H NMR (300 MHz, CDCI3): O8,37(d,J=[L1 Hz, 2H); 7,41 A une solution de 2.9-dméthvl-1.10-ohànanthnoline-5.0-dione (4,9 g; 23,3 mmol) dans du méthanol 1,2-diaminocyclohexane an (3,26 m/; 26,8mmo0et le mélange a 10 été chauffé àG6"C pendant 2Ohpuis refroidi àtempérature ambiante.Le aoiventaété àUminé ooum pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice avec un éluant dichlorométhane-méthanol (98-2). Le solide isolé a été recristallisé dans de !'éthænol pour donner des cristaux incolores (1.280 g; 20%). R.F.: 321 °C (dec). 1H RMN (300 MHz, CDCI3): 9,33 (d, J=8.4 Hz, 2H) ; 7.59(d. J=8.4 Hz, 2 H) ; 3,21 (m, 4 H) ; 2,96 (s, 6 H) ; 2,07 (m, 4H). 13C 15 RMN (75 MHz ; CDCI3): 0 160.8 ([) ; 153,1 (C) ; 146.3 ([) ; 133.0 (CH) ; 125,7 ([) ; 124,9 (C) ; 123.9 (CH); 32.7KCH2; 25.8KCH2; 22,8 (Me). HRMS (El) Calculée pour C20HIBN4: 394,1531, trouvée : 314,1526.; MS (El) rn/z Ont. rel.) 314 (100), 315 (25, M+H). 5 N A une solution de 3~~iméthyl-101.12,1 vo-4,5,9,1 ylène (200 mQ; 0,64mmol) dans du dioxane (100 ml) a été additionné de l'oxyde de sélénium (246 mg, 2.22 mmol). La solution a été chauffée à 1OQ°C pendant 4h et sa couleur initialement jaune pâle est devenue progressivement rose puis une suspension verdâtre et finalement une suspension noire. Le mélange a été refroidi puis filtré sur Celite et le filtrat a été concentré sous pression réduite pour conduire à un solide rose pâle correspondant au dialdéhyde (177 mg, 81%). RF. (déc). 1H RMN (300 MHz, CDCI3): 8 10.45 (s, 2 H. CHO) ; 9'50 (d, J=8'4 Hz, 2 H) ; 8,32 (d, J=8,1 28 155,9 /C\; 153,3 (C) ; 146,3 (C) ; 137,7 (C); 134,78CHD; 130,6 (C) |121.1(CH) ; 32,8(CH2; 22,5 (CH2). HRMS (El) Calculée pour C20H14N402: 342.1117.trouvée : M ; 342,1128; MS (El) m/z Ont. rai)314(55,N-20)^342 (43), 286 (20, Ce composé ainsi obtenu qui est un chromophore dérivé du TATP et porteur de fonctions aldehydes convient pour la fabrication de cryptate via la formation de bases de Schiff. NaBH4 MeOH OHC CHO 10 A une solution de 3'0-DicarboxmNéhvde-1[\11.12,1 ro-4.5.9,14-bétruaze- (50mg,0.14mmo dans du méthanol (12mUona ajouté duborohvdmnece sodium (60 mg, 1.60 mmol) par petite portion sur une période de 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après 2 h, le mélange réeotionnel a été filtré puis de l'eau a été 15 ajoutée (5 ml). Le méthanol a ensuite été éliminé sous pression réduite. Le solide jaune pâle a été filtré et séché sous pression réduite pendant 24 h conduisant ainsi au diol souhaité (29.5 mg, 58%). %).1H RMN (300 MHz, OMS{] d6): 5 8.34(d. J=8.4 Hz, 2 H); 8.02 (d, J=8'7 Hz, 2 H) ; 5,74(nn'2H'OH); 4,92(n'4H); 3'18(bre'4H) ; 2'04(brs,4H)./�cRK8N(75MHz, OK8GOdj: O 164,9 (C) ; 154,4 (C) ; 146,2 (C) ; 137,5 (C) ; 133,6 (CH) ; 126.0 (C) ; 121,7 (CH) ; 65'6 (CHJ ; 20 33,1 (CH2) ; 23,0 (CH2). HRMS (El) Calculée pmrC20H18N402. 346,1430, trouvée : 346,1412; MS Exemple 5 : Préparation d'un dérivé de pvridine di-aminée, utilisable pour la synthèse de 25 H2, PeC 10% 29 A une solution de 3,6-dibromométhyl pyridine-4-méthoxycarbonyle (500 mg; 1,55 mmol) dans du diméthylformamide (35 ml) on a ajouté de l'azoture de sodium 01Omg; 3,25 mmol) et le mélange aëté agité àtempérature ernbianbapendantuoe nuh.Lumoludionobtenuea étéfiltnàaet !oædvant aétë éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (30 ml). Les 5 sels insolubles ont été filtrés et lavés avec du dichlorométhane. Le solvant a été éliminé sous pression réduite puis on a ajouté du nnàthano! (30 ml) et du Pd/C 10%. La suspension noire obtenue a été hydrogénée sous 1 ednnoophènyd^hvdrogéne pendant une nuit. Le mélange a été ensuite filtré sur Celite et concentré sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur alumine en éluant avec un mélange dichlorométhane-méthanol-ammoniaque 10 (90-8-1) pour donner un solide blanc (188,3nng. 66%). P.F.: 62°C. 1H RMN (300 MHz, CDCI3): 8 7,68 (s, 2 H); 4'01 (s, 2 H); 3'92 (s, 3 H, OMe); 1'78 (bro, 4 H. NH2). 13C RMN (75 MHz, CDCI3): Ô 165,8 (C); 162.8 (G); 138,4 (C); 118.4 (CH); 52,5 (OMe); 47,6 (CH2). HRMS (El) Calculée pour C9H13N302: 195,1008, trouvée 195'1012; MS (El) rn/z (ird. roi) 195 (25), 178 (100). 15 Example 6 : Préparation d'un Cryptate d'Europium Py-bisTHTABTP portant un proupe réactif amine par la méthode dite � 2+1 � 1ULiuCOx CH3CN C 20 Le composé dichloré (20 mg, 45 unno0 fabriqué selon l'exemple 2, la diamine (4,4 mg ; 23 mol) fabriquée selon l'exemple 6 et du carbonate de lithium (34nmg'453pnmcd)ontété mélangés dans de l'acétonitrile anhydre (30 ml) et le mélange a été chauffé à 90°C pendant 7 j. On a ensuite ajouté à la suspension obtenue, du trichlorure d'europium hexahydraté (10 mg, 27 !mol) et le 25 mélange a été chauffé à 90°C pendant 24h supplémentaires. Le produit brut a été purifié par HPLC préparative pour conduire au cryptate d'europium correspondant. E8! IT-MS: (trouvée K8+2TF4=1194),KdALD!T[)F (Trouvée K8=905); K8ALD{(K8adhx!O/V\'trouvée K0=965) 30 Exemple 7 : Préparation d'un Crvp ate de Terbium Pv-bisTHTABTP portant un qroupe réactif amine par la méthode dite � 2+1 1V4COn CH3CN 5 C H2N 1)Tb0o Le composé dichloré fabriqué selon l'exemple 2, (36 mg, 82 mol), la diamine (8.9 mg, 45 gmol) fabriquée selon l'exemple 6 et le carbonate de lithium (68 mg, 906 gmol) ont été ajoutés dans de l'acétonitrile anhydre (60 ml). Le mélange a été chauffé à 90°C pendant 1O]. Après cette période 10 2/3 du mélange aéüé transféré dans un ballon de 50 ml et à cette solution on a ajouté du chlorure de terbium hexahydraté (11'3mg; 30.2 'mol). Le mélange a été chauffé pendant 24h. Le produit bru1a été purifié par HPLC préparative pour conduire à un solide (7 mg). K4ALD! (matrix CHCA, K8=189)1162(K8+K4alrix-2H). Le solide précédent a été dissous dans du mddhunol anhydre (G ml) et de l'éthylène diamine 15 (0.2 ml) àO"C. Le mélange a été réchauffé à température ambiante sur une période de 1h puis a été purifié par HPLC préparative pour conduire au composé souhaité. K8ALD! (matrix CHCAyN=189)(tnouvée: N1+msdrix'2H=1189). 31 Exemple 8 : Préparation d'un conjugué Cryptate d'Europium Pv-bisTHTABTP avec une Benzylquanine NH2 5 Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml ont été introduits 200 p/de solution à 10~~1-1 dans du diméthylsulfoxyde anhydre (2 pmol) de 6-(4-(aminométhyl)benzyloxy)-9H-purin-2-amine, 200 pI de solution à 1Ommol.[` dans du diméthylsulfoxyde anhydre (2 pmol) de cryptate d'Europium Py-bisTHTABTP-COOH ; 0,7 mg (2,2 pmol) de 0-(Benzotriazo/-1'y0-N,K(N~N'-tétoaméthy!unoniumn 10 tétrafluoroborate (TBTU)et4p!de diisopropyléthylamine (DIPEA). Le mélange a été agité pendant 2h. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP"18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0'2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC prépandivoa été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 15 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. Un solide blanc a été obtenu (611 nmol par mesure de densité optique, 30%) correspondant au produit souhaité. MS (E8~lm/z : [M+TFAI 1316,5. 20 Exemple 9 : Etude de la réactivité du coniuqué de l'exemple 7 avec une enzyme AGT Cet exemple a pour objet de mesurer la réactivité d'un conjugué benzylguanine-cryptate de terre 25 rare selon l'invention avec l'enzyme SNAP-tag. 32 Pour cela, une protéine de fusion SNAPtag-FKBP a été mise en contact avec un conjugué benzylguanine-cryptate, et une protéine FRB marquée avec un fluorophore accepteur d'énergie (DY647). La réaction de l'enzyme SNAPtag avec son substrat benzylguanine va conduire au marquage de la 5 protéine de fusion SNAPtag-FKBP par le cryptate de terre rare. En présence de rapamycine, les protéines FRB et FKBP vont interagir, et ainsi provoquer le rapprochement du cryptate de terre rare et du DY647 rendant possible l'émission d'un signal luminescent de FRET. Dans la mesure où l'enzyme G0APtegne peut réagir qu'avec un seul substrat benzylguanine, l'augmentation du signal de FRET est directement proportionnelle au pourcentage de protéine marquée dans le milieu 10 réactionnel. Matériel utilisé : Conjugué Benzylguanine-Cryptate d'Europium Py-bisTHTABTP Conjugué Benzylguanine-Cryptate Terbium Py-bisTHTABTP 15 Conjugué Benzylguanine-Cryptate d'Europium tris-biPy (Gis bio international) La protéine de fusion GST-SNAPtag-FKBP a été produite à partir du plasmide pSET-26b selon le protocole du kit commercial (SNAP express pSTE7-26b kit Covalys Biosciences AG VVitternvv!/8vvüzedand). La protéine F8Baété couplée par des techniques classiques de conjugaison avec le DY647 20 (Dyomics) Mode opératoire 2 nmoles de protéine recombinante FRB, préalablement marquée avec un accepteur (DY647) .ont été oo-incubées à température ambiante avec 2 nmoles de protéine recombinante 25 GST'SnopTogO-FNBP et des concentrations croissantes de conjugué Benzylguanine-Cryptate d'Europium Py-bisTHTABTP , de conjugué Benzylguanine-Cryptate de Terbium Py-bisTHTABTP ou de conjugué Benzylguanine-Cryptate d'Europium tris-biPy. Les lectures de fluorescences ont été effectuées à 620 nm (Europium) ou520nmn (Terbium) et à 30 605nnn( sur Analyst (BMG laboratory) en configuration TR-FRET (FRET en temps résolu) après une excitation à 337 nm. Les lectures sont réalisées avant et après induction de l'interaction protéique. L'induction protéine 'pnotéine entre les partenaires FRBIFKBP a été obtenue par ajout ajout de 100 nM de rapamycine. Ce modèle in vitro permet d'établir des cinétiques de marquage enzymatique en fonction de l'excès de substrat engagé dans la réaction. 33 Les résultats sont indiqués soit en d665 soit en % de marquage suivant les formules suivantes : d 665 = (signal 665 nm avec la protéine GST-SNAPtag-FKBP) - (signal 665 sans la protéine 5 Le pourcentage de marquage obté obtenu par comparaison à l'incubation pendant une nuit (18 h) qui correspond à 100 % de la protéine marquée. % marquage =/d865 à t mesure /d665 18 hb�100 Résultats : 10 Les résultats sont présentés sur la figure 1. La réactivité des conjugués benzylguanine-cryptate selon l'invention (Eu Py-bisTHTABTP et Tb Pv-bisTHTABTp ) a été fortement améliorée par rapport à celle du composé de référence (Eu-TBP). Après 1h d'incubation un excès de substrat (facteur 12,5) permet d'atteindre la saturation de 15 marquage avec les BG -TATP alors que cette saturation n'a été pas atteinte avec un excès de substrat de référence (facteur 50). Exemple 9 : Comparaison des spectres UV d'un cryptate Eu-TBP et d'un crvptate Eu lev-, 20 bisTHTABTP Les spectres d'absorption des cryptates Eu-TBP et Eu Py-bisTHTABTP ont été mesurés et sont présentés sur la figure 2(Aba.TBPedAbe.TATPnaapecÜvemenU. Le spectre d'absorption du cryptate Eu Py-bisTHTABTP a été beaucoup plus favorable que celui 25 du cryptate Eu TrisbiPy à une excitation à la longueur d'onde du Laser (337 nm) Cette caractéristique a été particulièrement intéressante pour l'utilisation des composés selon l'invention dans des systèmes nécessitant une excitation par rayon laser, telles que leur utilisation dans des dosages basés sur le phénomène de FRET. 30 34