FR 2934117 A1 20100129 FR 0855166 A 20080728 La présente invention concerne le domaine technique des herbicides. Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation d'une plante Myrica gale pour la production d'un agent herbicide ou pour la préparation d'une composition herbicide, ainsi que les compositions herbicides correspondantes et les compositions herbicides contenant un agent herbicide nouvellement mis en évidence. Les Myricacées sont, au vu des données de paléobotanique, très certainement la plus ancienne famille de plantes actinorhizienne et seraient apparues au Cénomanien durant le Crétacé Supérieur (96 millions d'années) (Eriksson 0. et Bremer B. 1992, Pollination systems, dispersai modes, life forms, and diversification rates in angiosperm familles. Evolution 46 : 333). Plus de 50 espèces appartiennent à cette famille, toutefois. la taxonomie intrafamiliale a posé beaucoup de difficultés aux botanistes et deux hypothèses, quant au nombre de genres au sein de cette famille, ont été débattues depuis plus d'un siècle, en particulier en ce qui concerne le rang taxonomique à donner à Myrica gale (Wilbur R.L. 1994, The Myricaceae of the United States and Canada : genera, subgenera, and series. SIDA 16 : 93; et Gleason H.A. et Cronquist A. 1991, Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada. 2nd Edition. New York Botanical Garden, Bronx, pp 80-81 notamment). Récemment, les travaux de Huguet et al 2005 (Huguet V. Gouy M. Normand P. Zimpfer J.F. et Fernandez M.P. 2005, Molecular Phylogeny of Myricaceae : a reexamination of hostsymbiont specificity. Molec.Phylo.Evol. 34 : 557) ont confirmé que le genre Myrica gale était un genre à part entière de la famille des Myricacées, au côté du genre Comptonia et du genre Morelia. Le genre Myrica gale (également nommée M. gale), dont la distribution géographique est la plus importante, est décrit pour certaines propriétés thérapeutiques tant en Amérique du Nord qu'en Europe (Sylvestre M. Legault 3. Dufour D. et Pichette A. 2005, Chemical composition and anticancer activity of leaf essential ol of Myrica gale L. Phytomedicine 12: 299). Des infusions de ses feuilles sont utilisées pour le traitement de troubles gastriques et de difficultés cardiaques (Svoboda K.P. Inglis A. Hampson J. Galambosi B. Asakawa Y. 1998, Biomass production, essential oil yield and composition of Myrica gale L. harvested from wild populations in Scotland and Finland. Flav.Frag. 13: 367). L'huile essentielle de feuilles de Myrica gale est utilisée en aromathérapie pour son action mucolytique et anticatarrhale en cas de problèmes respiratoire (Bremness, L. (Ed) 1996 L'oeil Nature : Les plantes aromatiques et médicinales. Bordas, Paris). Cette huile essentielle aurait également des propriétés abortives et est utilisée également comme répulsif d'insectes en Scandinavie (Svoboda et al 1998 ; Jaenson T.G.T. Palsson K. et Borg-Karlson A.K. 2005 Evaluation of extracts and oils of tick- repellent plants from Sweden Med.Vet.Entomol. 19 : 345). Par ailleurs, les feuilles et les fruits de Myrica gale, très aromatiques et couvertes de cellules glandulaires, sont utilisés comme épices pour aromatiser breuvages, soupes et bière (Behre, K.E. 1999 The history of beer additives in Europe-a review. Vegetation History and Archaeobotany, 8, 35). Dans le cadre de l'invention, et ce de façon totalement inattendue, les inventeurs sont mis en évidence que les plantes Myrica gale, sous la forme de partie brute de la plante ou d'extraits, présentaient une activité phytotoxique et pouvaient par conséquent être utilisés, en tant que telles comme bioherbicides ou encore pour la production de bioherbicides. Dans ce contexte, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une plante Myrica gale pour la préparation d'une composition herbicide. Selon un mode de réalisation particulier, un extrait d'une plante de Myrica gale est préparé et incorporé dans la composition herbicide. L'extrait utilisé est, par exemple, issu des racines, des feuilles, des tiges, des fruits, des graines et/ou des fleurs. De façon avantageuse, l'extrait utilisé est issu des feuilles, des fruits ou des graines. L'extrait utilisé peut, notamment, être obtenu par extraction avec un solvant choisi parmi l'eau, les alcools, les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés et les mélanges d'au moins deux des solvants précités. Les inventeurs ont préparé, dans le cadre de l'invention, des extraits riches en flavonoïdes et dérivés. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne l'utilisation d'une plante Myrica gale pour la production d'un agent herbicide. En fonction des étapes mises en oeuvre, l'agent herbicide pourra être sous une forme isolée et purifiée ou en mélange dans un extrait de Myrica gale. L'agent herbicide produit est, notamment, choisi parmi : la Myrigalone A, la Myrigalone E, la Myrigalone B, l'uvangoletin, le demethoxymatteucinol, la Myrigalone D, le demethoxymatteucinol-7-methyl ether, la 2',4',6'-trihydroxy-3',5'-dimethyldihydrochalcone, composés dont les inventeurs ont mis en évidence l'activité herbicide dans des extraits de fruits produits. L'invention a également pour objet des compositions herbicides comprenant un extrait de Myrica gale, ainsi que des compositions herbicides comprenant un composé choisi parmi : l'agent herbicide est choisi parmi : la Myrigalone A, la Myrigalone E, la Myrigalone B, l'uvangoletin, le demethoxymatteucinol, la Myrigalone D, le demethoxymatteucinol-7-methyl ether, la 2',4',6'-trihydroxy-3',5'-dimethyldihydrochalcone. L'extrait utilisé dans le cadre de l'invention est un extrait cellulaire ou un extrait extracellulaire (lessivage de feuilles par exemple) de la plante qui peut être préparé selon toute méthode connue de l'homme du métier pour extraire des composés des tissus végétaux. L'extrait peut être obtenu à partir des racines, des feuilles, des tiges, des fruits, des graines et/ou des fleurs. De façon avantageuse, l'extrait sera issu des feuilles, des fruits ou des graines, dont l'utilisation n'entraîne pas la mort de la plante dont ils sont extraits. De plus, les extraits des feuilles et des fruits sont particulièrement actifs. A titre d'exemples de méthodes d'extraction, on peut citer les méthodes classiques d'extraction en solvant à chaud ou à froid, la macération, la lixiviation, la cryoextraction, la digestion, la décoction, les extractions par le CO2 supercritique, seul ou en mélange avec un co-solvant les extractions utilisant un rayonnement ondulatoire, tel que les micro-ondes ou les ultrasons. Ces méthodes peuvent être combinées à une étape ultérieure de purification, filtration, concentration et/ou séchage. De façon avantageuse, l'extrait utilisé est obtenu par extraction avec un solvant choisi parmi l'eau, les alcools, les alcanes, les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés et les mélanges d'au moins deux des solvants précités. En particulier, l'extraction pourra être réalisée à l'aide d'un solvant, tel qu'un solvant alcoolique choisi parmi l'éthanol ou le méthanol ou encore le polyéthylène glycol ou le chloroforme. Un solvant tel que précédemment cités est particulièrement préféré pour l'extraction à partir des feuilles, des fleurs et des fruits de la plante. Dans le cas d'une extraction par solvant, par exemple, on peut procéder de la façon suivante : la partie de la plante sélectionnée est récoltée. Cette partie de la plante dont l'extrait est souhaité, qui peut se trouver sous forme fraîche ou sèche, est broyée et/ou déchiquetée, dans le solvant sélectionné ou pas, puis laissée à macérer, de préférence sous agitation, dans le solvant, de préférence pendant 1 heure à 30 jours. De façon avantageuse, on utilisera un rapport massique partie de la plante sur solvant compris entre 1/1 et 1/10 (m/m). L'extraction peut être réalisée à une température comprise entre -10 et 70°C, et notamment entre 18 et 60°C ou à reflux du solvant d'extraction utilisé. L'extraction peut également être réalisée par lixiviation. L'extrait obtenu peut alors être concentré, ou séché, par exemple par évaporation ou lyophilisation. L'extrait obtenu peut être incorporé tel quel à la composition ou bien être purifié, traité ou fractionné, de façon à enrichir en principe actif recherché. En particulier, l'extrait utilisé sera riche en flavonoïdes, et pourra notamment contenir un ou plusieurs composés choisis parmi la Myrigalone A, la Myrigalone E, la Myrigalone B, l'uvangoletin, le demethoxymatteucinol, la Myrigalone D, le demethoxymatteucinol-7-méthyl ether, la 2',4',6'-trihydroxy-3',5'-dimethyldihydrochalcone. Les extraits de Myrica Gale ou directement les composés ci-dessus, obtenus, de préférence à partir de plantes Myrica gale, notamment des fruits, peuvent être utilisés pour préparer des compositions herbicides. L'activité herbicide recherchée peut être de nature à inhiber la germination de graines, à empêcher la reprise de développement de méristèmes et de bourgeons souterrains ou aériens, à inhiber le développement et la croissance des racines ainsi que des hypocotyles, des épicotyles et de toutes parties aériennes des plantes. Tout type de compositions herbicides connues pourra être préparé. On pourra notamment utiliser des compositions herbicides sous la forme de granules, de liquides, d'émulsions aqueuses ou de concentrés émulsifiables comme adjuvants pour bouillie herbicide. Dans des adjuvants pour bouillie herbicide, la partie brute de Myrica Gale, un de ses extraits ou un des agents herbicides précédemment cités pourront être associés à un ou plusieurs composés choisis parmi : sulfate d'ammonium, huile de pétrole, huile de colza estérifiée, amine grasse de suif éthoxylée, huile minérale de paraffine, nonylphénol polyéthoxyle, Laminaria digitata, polymère d'amine gras, polysorbate 20, Huile de pin, dérives d'acides gras végétaux, alcools terpéniques, acide oléique, esters méthyliques d'acides gras, esters de phosphate d'alcools gras polyoxyalkyles, polyoxyéthylène amine, alkyl polysaccharides, lécithine de soja, octylphénol octaglycol éther, ester sulfurique, alcools et acides gras sulfones, triéthanolamine, polymère complexe d'éthylène et de propylène, heptaméthyltrisiloxane modifié polyalkylèneoxide, alkyl phénol, polyoxyéthylène, heptaméthyltrisiloxane modifié, polyalkyleneoxide, oxyde d'éthylène, couramment utilisés dans des adjuvants pour bouillie herbicide, comme le montre la liste publiée par le ministère de l'agriculture et de la pêche français sur le site http:IJephy.agriculture.gouv.frlusa131651003.htm auquel on pourra se référer. Les compositions herbicides pourront également être incorporées à des tissus imprégnés ou des films polymères. Les compositions seront, par exemple, utilisées de manière à avoir des concentrations, au moment du traitement, allant de 10"12 à 102 M, de préférence de 10"5 et 10° M d'agent herbicide actif. Dans le cas de compositions sous la forme de granulés notamment, l'ajout d'eau sera alors nécessaire. Les exemples ci-après, en référence aux Figures annexées, permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif. La Figure 1 résume le protocole de fractionnement utilisé. La Figure 2 présente les données RMN des composés isolés. Les Figures 3 à 6 présentent les longueurs moyennes (cm) des racines de moutarde en présence, respectivement, de différentes quantités de broyats de feuilles de M. gale, de graines entières de M. gale, de lessivat méthanolique de graines de M. gale et de Myrigalone A en solution méthanolique. Extraits de Myrica gale et identification des Métabolites Matériel végétal Les fruits de Myrica gale ont été récoltés le long de l'étang de Biscarosse en Gironde en décembre 2004. L'extraction par lessivage assisté aux ultrasons de 350g de fruits secs dans 2L de méthanol a permis d'obtenir 35g de résidu sec. L'extrait est résineux à température ambiante. Fractionnement et Purification Systèmes analytiques et détection Après chaque étape de la purification, les fractions obtenues sont analysées sur différents systèmes chromatographiques, CCM et HPLC, afin de déterminer leur composition et de réunir celles qui sont qualitativement homologues. Les fractions réunies, considérées comme intéressantes, sont conservées pour la suite du travail et font alors l'objet de mises au point de nouveaux systèmes de séparation. A chaque étape du fractionnement, la révélation et la visualisation des plaques CCM font appel à l'irradiation UV à 254 et 366nm. Les analyses HPLC sont réalisées sur un Agilent 1100, la colonne Kromasil (250 x 4,6 mm, 5pm, 100Â) est constituée de silice greffée en C18. Le volume d'échantillon injecté dans la colonne est de 5 pL avec une détection UV entre 200 et 700 nm grâce à un détecteur à barrettes de diodes. Quatre longueurs d'onde particulières sont utilisées pour la visualisation des chromatogrammes : 254, 280, 320 et 350 nm. Le solvant d'élution est un gradient d'acétonitrile dans l'eau avec 0,4% d'acide acétique. Systèmes préparatifs Le protocole de fractionnement est résumé Figure 1 sur laquelle les fractions n'ayant donné lieu à l'obtention d'aucune molécule pure ne sont pas représentées. Le lessivat de fruits de M. gale est fractionné par une première chromatographie sur colonne ouverte de Séphadex LH-20 (600x45mm) avec un solvant d'élution constitué de méthanol. Ce partage permet la récupération de 13 fractions (A à m). L'analyse de la fraction C a montré qu'elle n'était constituée que d'une molécule, le composé 1, à hauteur de 12g. Le composé 2 (6mg) a été obtenu suite à sa cristallisation dans la fraction D à -20°C. Les fractions de plus grandes masses (E, 8g et F, 7g) ont ensuite fait l'objet de chromatographies supplémentaires. Une MPLC (450x25mm) de la fraction E sur silice 60 (15x40Nm) avec un solvant d'élution constitué d'un gradient d'acétone dans de l'hexane a permis l'obtention de 2 molécules pures (3, 200mg et 4,100mg). Les 13 fractions FA à FM ont été obtenues par chromatographie de la fraction F par MPLC (450x25mm) sur phase inverse (RP18 15x40pm). Deux de ces fractions étaient constituées chacune d'une molécule pure (composés 5, 26mg et 6, 8mg). La fraction FL a fait l'objet d'une HPLC semi-préparative sur phase inverse (X-Terra Prep MS C18, 5pm, 10 x 100mm, isocratique 40% de solvant A (H20) 60% de solvant B (acétonitrile), débit 3 ml/min). Cette dernière chromatographie a permis la purification des composés 7 et 8 (4 et 3,6mg). Analyses Structurales L'élucidation structurale des composés a été établie par l'interprétation des données de spectroscopie UV, de spectrométrie de masse et de RMN monodimensionnelle 'H et 13C ainsi que RMN bidimensionnelle hétéronucléaire 1H-13C HSQC et 1H-13C HMBC. Les spectres UV ont été enregistrés sur un appareil UVIKON 943 dans le méthanol. Les spectres de masse ont été réalisés sur une chaîne LC-MS Agilent 1100 équipé d'un détecteur MSD 1100 avec une interface APCI positive et négative. Les spectres RMN ont été réalisés au service commun de RMN de l'UCBL sur un appareil Bruker DRX500 dans le méthanol-d4 à 500,13 MHz en proton et 125,77 MHz en carbone-13. Les différentes étapes de chromatographies successives réalisées sur le lessivat de fruits de M. gale ont permis de purifier et d'identifier 8 5 métabolites. Les structures de ces composés sont les suivantes : CHg 2' R 5 4. R� 5I rie i . Il l r ,- a R 3' ~!I Ra' Ol Il R7~20275' oh O 2: R2'sOH. R3.'=CH3, Fis'=OCH3, R3'-H, Rb'=OCH3 3; R3'Ra'=OH; R3'_RS'-H3. R{'-!OCH3. 4:R2 ==OH; 'R3' .=13 ,1q.;5'r OC H3 3 R2'=.1 V'=R6'=OH;.R3'=Rs'=CH3 . 4 CH3 HIC CH3 Q0OC H 5; e_II 3 , 3 H3C -'--- H 3C 2 Il l 6: Re.OH 8:R1iDCH3 O O 4H l 7 Les élucidations structurales ont été établies par l'interprétation des données RMN du proton et du carbone en respectant les corrélations observées en HMBC (Figure 2). Les tableaux présentés Figure 2 donnent les 10 valeurs des déplacements RMN 1H et 13C des chalcones et dihydrochalcones (A) et des flavanones (B). Les déplacements sont donnés en ppm, les constantes de couplage entre parenthèse sont en Hz. Toutes les molécules purifiées sont des flavonoides. Toutes les formules proposées sont cohérentes avec l'ensemble des autres données spectrales, UV et masse. 15 Tous les composés avaient déjà été décrits dans la littérature. Sur les 8 molécules purifiées, 5 avaient déjà été identifiées chez M. gale et portent les noms suivants : Myrigalone A, E et B, pour les composés 1, 2 et 3 respectivement, Myrigalone D, pour le composé 7 et l'uvangoletin pour le composé 4. Les autres composés suivants n'avaient jamais été décrits chez 20 M. gale : deméthoxymatteucinol, pour le composé 6, deméthoxymatteucinol- 7-méthyl ether, pour le composé 8. Enfin, la 2',4',6'-trihydroxy-3',5'- diméthyldihydrochalcone pour le composé 5 n'avait jamais été décrite comme substance naturelle. Activité Bio-herbicide de Myrica gale Matériel et Méthodes Extraits végétaux utilisés pour évaluer leur activité herbicide : Les extraits suivants ont été testés quant à leurs propriétés herbicides - Feuilles sèches réduites en poudre - Fruits entiers, secs - Lessivat méthanolique de fruits - Myrigalone A pure en solution méthanolique Plantes utilisées comme cible de l'activité herbicide Les plantes suivantes ont été utilisées pour évaluer l'activité herbicide des différents extraits de M. gale : - Sorgho - Blé - Moutarde - Cresson - Renouée Tests d'activité de phytotoxicité Les graines des plantes cibles sont déposées à la surface d'un papier filtre (Whatman n°1) au sein d'une boite de Pétri (9cm de diamètre). En 25 fonction des plantes cibles, le nombre de graines par boite de Pétri varie de 8 à 15 graines. Dans la boite de Pétri, 8mL d'eau sont rajoutés pour assurer la germination des graines cibles. A ces 8mL d'eau sont incorporés les différents extraits méthanoliques 30 de M. gale à tester à des concentrations de 0,lmg/mL, 0,5 mg/mL ou 1mg/mL apportés par 50pL de méthanol. Les témoins sont constitués de méthanol. Pour les évaluations des activités des extraits secs (broyat de feuilles et fruits entiers), à la surface des boites de Pétri sont saupoudrés les extraits à des concentrations de 10mg/mL, 20mg/mL ou 30mg/mL. Les témoins ne sont pas saupoudrés. Toutes les conditions testées sont répétées au moins 3 fois (3 boites de Pétri par traitement contenant chacune de 8 à 15 graines). Les expériences ont été reproduites indépendamment plusieurs fois. Après ajout des différents extraits à tester, les boites de Pétri sont mises à 28°C. La lecture des boites est réalisée dès que les témoins ont convenablement poussés avant le stade 1 feuille. Paramètres mesurés pour l'évaluation herbicide Après germination des graines cibles, les longueurs des racines et des 15 hypocotyles de chaque plantule sont mesurées ainsi que le taux de germination des graines. Résultats La Figure 3 présente les longueurs moyennes (cm) des racines de 20 moutarde en présence de 10, 20 et 30 mg/mL de broyats de feuilles de M. gale. L'inhibition du développement des plantules est totale dès 10mg/mL. La Figure 4 présente les longueurs moyennes (cm) des racines de cresson en présence de 10, 20 et 30 mg/mL de graines entières de M. gale. La Figure 5 présente les longueurs moyennes (cm) des hypocotyles de 25 moutarde en présence de 0,1, 0,5 et 1 mg/ml de lessivat méthanolique de graines de M. gale. La Figure 6 présente les longueurs moyennes (cm) des racines de moutarde en présence de 0,1, 0,5 et 1 mg/ml de Myrigalone A en solution méthanolique. 30 REVENDICATIONS1 - Utilisation d'une plante Myrica gale pour la préparation d'une composition herbicide. 2 - Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'un extrait 5 d'une plante de Myrica gale est préparé et incorporé dans la composition herbicide. 3 - Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que l'extrait utilisé est issu des racines, des feuilles, des tiges, des fruits, des graines et/ou des fleurs. 10 4 - Utilisation selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'extrait utilisé est issu des feuilles, des fruits ou des graines. - Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'extrait utilisé est obtenu par extraction avec un solvant choisi parmi l'eau, les alcools, les cétones, les esters, les éthers, les 15 polyols, les solvants chlorés et les mélanges d'au moins deux des solvants précités. 6 - Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'extrait utilisé est riche en flavono des et dérivés. 7 - Utilisation d'une plante Myrica gale pour la production d'un agent 20 herbicide. 8 - Utilisation selon la revendication 7 caractérisée en ce que l'agent herbicide est sous une forme isolée et purifiée ou en mélange dans un extrait de Myrica gale. 9 - Utilisation selon la revendication 7 ou 8 caractérisée en ce que l'agent 25 herbicide est choisi parmi : la Myrigalone A, la Myrigalone E, la Myrigalone B, l'uvangoletin, le demethoxymatteucinol, la Myrigalone D, le demethoxymatteucinol-7-méthyl ether, la 2',4',6'-trihydroxy-3',5'- dimethyldihydrochalcone. - Composition herbicide comprenant un extrait de Myrica gale. 30 11 - Composition herbicide comprenant un composé choisi parmi : l'agent herbicide est choisi parmi : la Myrigalone A, la Myrigalone E, la Myrigalone B, l'uvangoletin, le demethoxymatteucinol, la Myrigalone D, ledemethoxymatteucinol-7-méthyl ether, la 2',4',6'-trihydroxy-3',5'- dimethyldihydrochalcone. 12 - Composition herbicide selon la revendication 10 ou 11 caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme de granules, de liquides, d'émulsions aqueuses ou de concentrés émulsifiables comme adjuvants pour bouillie herbicide. 13 - Composition herbicide selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'un adjuvant pour bouillie herbicide, qui contient en outre un ou plusieurs composés choisis parmi : sulfate d'ammonium, huile de pétrole, 'huile de colza estérifiée, amine grasse de suif éthoxylée, huile minérale de paraffine, nonylphénol polyéthoxyle, Laminaria digitata, polymère d'amine gras, polysorbate 20, Huile de pin, dérives d'acides gras végétaux, alcools terpéniques, acide oléique, esters méthyliques d'acides gras, esters de phosphate d'alcools gras polyoxyalkyles, polyoxyéthylëne amine, alkyl polysaccharides, lécithine de soja, octylphénol octaglycol éther, ester sulfurique, alcools et acides gras sulfones, triéthanolamine, polymère complexe d'éthylène et de propylène, heptaméthyltrisiloxane modifié polyalkylèneoxide, alkyl phénol, polyoxyéthylène, heptaméthyltrisiloxane modifié, polyalkyleneoxide, oxyde d'éthylène. 14 - Composition herbicide selon la revendication 10 ou 11 caractérisée en ce qu'elle est incorporée à un tissu imprégné ou un film polymère.