FR 2934279 A1 20100129 FR 0855114 A 20080725 L'invention concerne la détection d'anomalies chromosomiques par hybridation de sondes d'acide nucléique spécifiques. Arrière-plan technologique : Les anomalies chromosomiques, qu'elles soient constitutionnelles ou acquises, sont à l'origine de nombreuses pathologies. Elles peuvent être équilibrées (c'est-à-dire ne s'accompagnant pas de perte de matériel chromosomique) ou déséquilibrées, c'est-à-dire s'accompagnant de pertes ou de gains de matériel chromosomique. On parle alors de déséquilibres génomiques. Avec les techniques dont on dispose aujourd'hui en routine (caryotype en bande et hybridation in situ fluorescente), on estime que les anomalies chromosomiques, sont responsables de 10 à 15% des retards mentaux et des malformations congénitales. Par ailleurs, elles sont très fréquemment retrouvées associées dans les cellules cancéreuses. Dans de très nombreux cas, elles en déterminent le pronostic, et elles permettent d'en comprendre la cause moléculaire et d'envisager des traitements ciblés. C'est pourquoi que ce soit en pathologie constitutionnelle ou dans les cancers, le diagnostic des anomalies chromosomiques est fondamental tant pour le traitement que pour la recherche. Les anomalies chromosomiques peuvent être visibles au microscope ou non. Lorsqu'elles le sont, leur détection est assurée par les techniques classiques du caryotype. Mises au point dans les années 60, elles permettent de visualiser les chromosomes avec une succession, le long de leur axe longitudinal, de bandes claires et plus sombres caractéristiques de chaque paire de chromosomes. L'examen de la morphologie globale des chromosomes et de l'ordonnancement des différentes bandes permet d'établir le caryotype. La plus petite des bandes observables est de 5 millions de paires de bases (5 mégabases ou Mb). Ceci est une première limite à cette technique. Une deuxième est que des échanges de régions télomériques, de même taille et dont la teinte (en générale noire) est identique, ne peuvent être détectés par les techniques classiques du caryotype. Ces anomalies non détectables par les techniques de bandes sont dites cryptiques. Une approche pour détecter ces anomalies chromosomiques cryptiques met en oeuvre des sondes fluorescentes spécifiques qui hybrident sur les chromosomes. Cette technique, appelée FISH pour � fluorescence in situ hybridization � (FISH), consiste à hybrider sur l'ADN cible un fragment d'ADN complémentaire dans lequel a été introduit un fluorochrome (opération dite de marquage). Un tel fragment d'ADN est appelé sonde. L'hybridation in situ en fluorescence peut être mise en oeuvre sur des chromosomes métaphasiques, auquel cas elle utilise des sondes spécifiques d'un chromosome, d'un bras, d'une région chromosomique, d'un locus donné. La révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par une visualisation au microscope des sites fluorescents correspondant aux sites de l'ADN cible s'étant hybridés avec les sondes. L'une des indications majeures de la FISH est la détection des anomalies cryptiques télomériques. Ces anomalies occasionnent à elles seules près de 5% des retards mentaux avec malformations. Par ailleurs, dans les cancers, il a été décrit des anomalies télomériques (équilibrés dans ces pathologies) dont la fréquence est importante. C'est ainsi que la t(12 ;21) des leucémies aiguës de l'enfant est invisible par les techniques classiques de cytogénétique alors qu'elle est l'anomalie génétique la plus fréquente dans cette pathologie (Romana et al, Genes Chromosomes Cancer, 1994, 9(3):186-91). Les systèmes de détection des anomalies chromosomiques disponibles pour l'instant dans le commerce sont composés d'un ou deux sondes représentant les extrémités télomériques d'une ou de deux paires chromosomiques. Cela suppose, si l'on veut étudier l'ensemble des extrémités, d'hybrider ces sondes sur une ou plusieurs lames, en les déposant sur différentes parties de ces lames. Ce système suppose des préparations chromosomiques riches en métaphases pour que des mitoses soient présentes sur toutes les parties de la lame où seront déposées les différentes sondes. Ces prés requis ne peuvent être atteints pour les préparations de chromosomes venant de cultures d'amniocytes en cytogénétique constitutionnelle prénatale, ni dans les cancers. Pour ces deux situations, il restait nécessaire de développer un système permettant l'étude de l'ensemble des extrémités chromosomiques sur une ou deux mitoses. C'est ce à quoi Brown et al (Nature Medicine, 7(4) :497-501) ont voulu répondre en développant le système M-Tel. Dans ce système, les sondes télomériques d'un chromosome sont marquées avec une combinaison spécifique de fluorochrome. Ainsi, ils purent fabriquer des sondes spécifiques de 12 chromosomes, détectables chacune après l'hybridation sur une seule métaphase. En utilisant deux lots de sondes, l'ensemble des 23 paires chromosomiques pouvait être exploré en étudiant deux mitoses. Ce test, utilisé ensuite dans l'étude Brown et al, 2002, Blood, 99(7) :2526-2531, présente néanmoins certains inconvénients. En particulier, les sondes utilisées produisent un signal faible, avec un rapport signal/bruit bien trop élevé. Il existait toujours un besoin d'un test de détection des anomalies télomériques cryptiques, qui soit rapide, pratique, et fiable. Le test proposé par les inventeurs répond à ces exigences et est en outre utilisable non seulement pour le diagnostic des pathologies chromosomiques constitutionnelles prénatale et postnatale, mais aussi pour le diagnostic de celles associées aux cancers. Ce test est également particulièrement adapté à la détection d'anomalies chromosomiques équilibrées. Résumé de l'invention L'invention fournit un procédé in vitro pour détecter des anomalies chromosomiques chez un animal, de préférence un vertébré, de manière plus préférée un mammifère, comprenant : - l'hybridation in situ de n chromosomes d'une préparation de chromosomes métaphasiques avec des ensembles d'une pluralité d'acides nucléiques, chaque ensemble hybridant sur une longueur de 700 000 à 3 000 000 pb, de manière spécifique aux extrémités subtélomériques spécifiques desdits chromosomes, chaque ensemble étant marqué de manière détectable par un fluorochrome, de telle sorte que chaque chromosome est distinguable par un fluorochrome particulier ou une combinaison particulière de fluorochromes, n étant un nombre entier compris entre 2 et le nombre total de chromosomes du dit animal, le nombre total de fluorochromes utilisés étant un entier inférieur à n, - la détection de la fluorescence émise par les fluorochromes, par ce en quoi des anomalies chromosomiques sont détectées. Légende de la Figure : La Figure montre un protocole général de l'obtention de l'ADN des clones télomériques. Description détaillée de l'invention : Définitions : Une � extrémité subtélomérique spécifique� est la région spécifique d'un chromosome la plus proche de la séquence consensus télomérique d'un chromosome (commune à tous les chromosomes). Elle se situe en générale entre 100 à 300 kb des séquences consensus. Un � télomère � ou � extrémité télomérique � est une région hautement répétitive, non codante, d'ADN à l'extrémité d'un chromosome. Chez l'homme, la séquence TTAGGG est spécifique des télomères et est répétée plusieurs centaines de fois. Cette séquence est commune à tous les chromosomes. Par � hybridation spécifique � on désigne la capacité d'un ensemble d'une pluralité de nucléotides à s'hybrider à une séquence d'ADN donnée. En d'autres termes, un ensemble s'hybridant de manière spécifique à une extrémité subtélomérique d'un chromosome ne s'hybride pas à une autre extrémité subtélomérique. Par exemple, un ensemble s'hybridant de manière spécifique à l'extrémité subtélomérique du bras long du chromosome 1 ne s'hybridera pas à l'extrémité subtélomérique du bras court du chromosome 1, ni à aucune autre séquence de ce chromosome ou d'un autre chromosome. Pour des raisons de commodité, on appelle dans ce qui suit "chromosome cible", le 10 chromosome suspecté d'être affecté par une anomalie. Préparation des échantillons Les échantillons à tester sont des préparations de liquides ou tissus biologiques contenant des chromosomes métaphasiques d'un animal. De préférence il s'agit d'échantillons sanguins, de 15 liquide amniotique dans le cas de diagnostic prénatal ou de moelle osseuse pour les hémopathies malignes. De préférence l'animal est un mammifère, de préférence un humain, quel que soit son sexe ou son âge. Il peut s'agir d'un embryon, d'un foetus, d'un nouveau-né, d'un enfant, d'un adolescent, ou d'un adulte. 20 Les échantillons sont préparés comme pour une analyse cytogénétique classique sur lame, qu'il s'agisse de prélèvements mis en culture ou analysés directement. Une procédure générale pour préparer des chromosomes métaphasiques consiste à mettre en culture, si possible, les cellules contenant les chromosomes à analyser et à les arrêter en mitose avec un inhibiteur du fuseau mitotique, par exemple avec de la colchicine. Les 25 chromosomes sont ensuite fixés avec un mélange acide acétique/méthanol, puis étalés sur lame. Sondes utilisées : Le procédé de l'invention utilise des sondes d'acides nucléiques qui couvrent une longueur de 30 700 000 à 3 000 000 bases (pb) contiguës d'au moins une extrémité subtélomérique de chaque chromosome cible. De préférence, les sondes couvrent au moins 800 000 pb, de préférence encore au moins 1 Mb, de manière encore préférée 1 à 1,5 Mb, des extrémités subtélomériques spécifiques des chromosomes. Les sondes sont constituées par un ensemble d'une pluralité d'acides nucléiques (ci-après �un ensemble �) recouvrant tout ou parties de l'extrémité subtélomérique spécifique du bras long ou du bras court du chromosome cible. La pluralité d'acides nucléiques est composée d'acides nucléiques complémentaires de parties contiguës de l'extrémité subtélomérique dont l'ensemble est spécifique. Ces parties contiguës peuvent éventuellement être légèrement chevauchantes. L'extrémité subtélomérique à laquelle hybrident les sondes n'est pas celle d'un bras court d'un chromosome acrocentrique (i.e. les chromosomes 13,14,15,21 et 22 chez l'être humain). Comme illustré dans le tableau 2, les ensembles d'acides nucléiques hybrident à une distance variable du télomère, selon le chromosome visé. Par exemple, les ensembles d'acides nucléiques utilisés dans les exemples hybrident à une distance de 4110 pb de l'extrémité proximale du télomère 21q, ou 828 698 pb de l'extrémité proximale du télomère 1p. Cette distance est liée à l'impératif de spécificité de la sonde. En effet, certaines régions même subtélomériques d'un chromosome donné peuvent avoir des séquences d'ADN communes avec d'autres chromosomes. La taille de ces séquences partagées peut être variable selon les chromosomes. C'est ce qui explique la variabilité, selon les chromosomes, de la distance qui existe entre la séquence consensus télomérique et l'extrémité distale de la sonde subtélomérique spécifique. Le nombre total de chromosomes présents dans les cellules normales d'un animal donné est fixe et connu. Ainsi, les cellules d'un être humain comprennent normalement 23 paires de chromosomes, dont une paire correspond aux chromosomes XX ou XY. Dans le procédé de l'invention, n chromosomes sont analysés de manière simultanée, n étant un nombre entier compris entre 2 et le nombre total de chromosomes de l'animal. De préférence, au moins 12 chromosomes sont analysés simultanément. Selon un mode préféré de l'invention, l'ensemble d'une pluralité d'acides nucléiques est produit par amplification d'un ou plusieurs BAC dans lesquels est inséré un fragment de l'extrémité subtélomérique du chromosome cible. Différents sites Internet permettent de visualiser la position de ces BACs le long de chaque chromosome. Par exemple, sur le site de l'UCSC (http://genome.ucsc.edu/) L'amplification peut être réalisée par tout moyen d'amplification d'ADN connu de l'homme du métier. A titre exemple, on peut citer une amplification par PCR ou une amplification du type Rolling-Circle Amplification (RCA). Marquage des sondes : Dans le procédé de l'invention, chaque ensemble est marqué de manière détectable par un fluorochrome, de telle sorte que chaque chromosome est distinguable des autres chromosomes par un fluorochrome particulier ou une combinaison particulière de fluorochrome. Les acides nucléiques composant l'ensemble d'une pluralité d'acides nucléiques peuvent être marqués avec des nucléotides conjugués avec une molécule fluorescente, ou fluorochrome (marquage direct). L'incorporation de nucléotides conjugués avec un fluorochrome dans les sondes de 10 l'invention peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment par nick-translation ou PCR. De manière alternative, les acides nucléiques peuvent être marqués avec des nucléotides conjugués avec une molécule reconnue spécifiquement par un ligand, de préférence un anticorps conjugué à un fluorochrome (marquage indirect). 15 Plus particulièrement, le marquage indirect des sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome cible est réalisé par un couplage de chacune d'elles à un haptène, et par une réaction d'affinité entre cet haptène et un ligand apte à se lier spécifiquement au dit haptène et qui est, soit conjugué à un fluorochrome, soit rendu fluorescent par réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome. 20 À titre d'exemples d'haptènes susceptibles d'êtres employés pour un marquage indirect des sondes utiles dans la présente invention, on peut notamment citer : -la digoxigenine, le dinitrophénol et le 2-acetylaminofluorène, auquel cas la réaction d'affinité haptène/ligand est avantageusement réalisée au moyen d'anticorps dirigés contre ces composés et conjugués à un fluorochrome ; 25 -la biotine, auquel cas la réaction d'affinité haptène/ligand est avantageusement réalisée au moyen d'avidine conjuguée à un fluorochrome, ou en utilisant des anticorps anti-biotine, puis des anticorps dirigés contre ces derniers et qui sont conjugués à un fluorochrome. Les fluorochromes utilisés peuvent être indifféremment choisis parmi différents composés 30 fluorescents utilisés pour le marquage de sondes nucléiques tels que la fluorescéine (fluorescéinate de sodium) et ses dérivés tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC); la rhodamine et ses dérivés tels que la tetraméthyl rhodamine isothiocyanate (TRITC); le diaminidophényl indo (DAPI); l'acridine; les colorants fluorescents à amines réactives tels que l'ester succinimidylique de l'acide 6-((725 ami no-4-mhétylcoumnarin-3-acétyl)amino) hexanoque (A. NICA); les colorants fluorescents vendus sous les dénominations commerciales BODIPY telles que BODIPY'J, FR-Br, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY TR et les BODIPY 530/550 vendus par la société Bio-Rad Inc. (USA), les colorants Cascade Blue (Trilink BioTechlnologies USA), Cy2, Cy3. Cy3.5. CYS, Cy5.5, et Cy7 (Bio- Rad Inc., USA), DABCYL et EDANS (Eurogentec, BE); l'Eosine; l'Erythrosine; le 6-Farn et le Texas Red. La coumarine et son dérivé la diéthyl aminométhyl coumarine (DEAC) sont des fluorochromes également préférés. Le procédé selon l'invention est un procédé en multi-fluorescence. En d'autres termes, le nombre de fluorochromes utilisés pour la détection des anomalies chromosomiques est inférieur au nombre n de chromosomes analysés. Les chromosomes sont donc marqués de manière combinatoire pour pouvoir les distinguer les uns des autres. Ce marquage des chromosomes est réalisé par chaque ensemble d'une pluralité d'acides nucléiques. De préférence, les extrémités subtélomériques des bras courts et longs (p et q, respectivement) d'un même chromosome sont marquées avec le même fluorochrome ou la même combinaison de fluorochromes. Dans un mode de réalisation préféré, on utilise au moins quatre fluorochromes (par exemple un marquage direct par les fluorochromes FITC, rhodamine, Coumarine, et un marquage indirect par la Biotine, cette dernière étant révélée par de la streptavidine marquée au Cy5), ce qui permet 15 combinaisons différentes de fluorochromes (24-1). Pour détecter des anomalies sur l'ensemble des chromosomes d'un animal ayant plus de 15 chromosomes, on peut alors utiliser deux lots de sondes (pour 12 chromosomes pour l'un et 11 chromosomes pour l'autre pour l'étude de chromosomes humains, pour un total de 41 sondes qui hybrident toutes les extrémités des bras longs et courts des chromosomes humains, sauf les bras courts des chromosomes acrocentriques). Ainsi peuvent être étudiées, à partir de l'analyse d'une mitose choisie sur deux zones différentes d'une lame sur laquelle ont été déposés les deux lots de sondes, toutes les extrémités télomériques. De préférence, les lots de sondes sont regroupées de manière à éviter d'analyser dans un même groupe des chromosomes se ressemblant du point de vue cytogénétique (par exemple, les chromosomes 21 et 22 humains sont de préférence analysés par 2 lots différents). Le tableau 1 ci-dessous illustre de manière théorique les 15 combinaisons possibles pour 4 fluorochromes différents : Tableau 1 : Marquage F1TC Rhodamine Coumarine Biotine 1 X 2 X 3 X 4 X X X 6 X X 7 X X 8 X X X 9 X X X X X X 11 X 12 X X 13 X X 14 X X X Hybridation : 5 L'hybridation est réalisée selon les conditions classiques d'hybridation in situ (Romana et al. 1994, supra) ; À titre indicatif, les chromosomes métaphasiques en suspension dans un mélange acide acétique/méthanol (1/3-2/3) sont étalés sur des lames. Après avoir été séchées à l'air, elles sont plongées 5 minutes dans une solution saline 2XSSC, déshydratées dans des solutions d'alcool de concentration croissante (60% à 100%) et séchées à l'air. 10 Les deux lots de sonde sont ensuite dénaturés pendant 10 minutes à 70°C dans 50% Formamide (FLUKA) /2XSSC (Standard Sodium Citraté) à pH 7. Les sondes dénaturées sont déposées sur la lame à deux emplacements différents et recouvertes par deux lamelles scellées hermétiquement avec une colle type � rubber cement �. L'ensemble est mis sur une plaque chauffante pendant 3 à 4 minutes. L'ensemble est ensuite mis à hybrider durant 18 heures à 15 37°C dans une chambre humide. Les lavages post-hybridation sont effectués à 72°C pendant 5 minutes dans du tampon 1XSSC. Dans le cas d'utilisation de sondes marquées à la digoxigénine ou à la biotine notamment, la détection des sondes se fait par une utilisation d'anticorps couplés à des fluorochromes différents. Dans le cas d'utilisation de sondes directement marquée avec des fluorochromes, on peut procéder tout de suite à la contre-coloration des chromosomes avec du DAPI (1�g/ml, Molecular Probes) et au montage des lames dans du p-phenyl-diamine. Des variations de ces modes opératoires sont présentées dans la partie expérimentale. 8 Visualisation : La révélation se fait généralement après 18 heures d'incubation à 37°C. Les lames sont observées à l'aide d'un microscope à épifluorescence équipé d'une caméra 5 CCD et de filtres appropriés. Les images sont analysées à l'aide d'un système informatique de traitement d'image. Une anomalie chromosomique sera détectée en cas d'absence de signal au niveau d'une extrémité subtélomérique d'un chromosome cible, ou en cas de signal qui n'est pas localisé au 10 niveau du chromosome correspondant à la sonde. Applications : Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre pour la détection de deux chromosomes ou plus ou, de préférence, pour l'ensemble des chromosomes de la préparation de chromosomes. 15 Le procédé de l'invention est utilisable non seulement pour le diagnostic des pathologies chromosomiques constitutionnelles, mais aussi pour le diagnostic des cancers. Ce test est également particulièrement adapté à la détection d'anomalies chromosomiques équilibrées. Il est notamment utile en diagnostic de routine, pour la vérification des anomalies chromosomiques suspectées par un examen chromosomique par les techniques de bandes. Par ailleurs, il peut être mis en oeuvre pour le diagnostic des anomalies chromosomiques cryptiques en pathologie chromosomique constitutionnelle prénatale et prénatale et dans les cancers, notamment dans les hémopathies malignes (où elles sont souvent équilibrées). 20 La zone d'hybridation entre l'extrémité subtélomérique analysée et l'ensemble d'une pluralité d'acides nucléiques qui lui est spécifique permet la détection d'un signal de forte intensité. Ceci a pour principal avantage d'augmenter le rapport signal/bruit. En outre, le marquage fluorescent combinatoire est particulièrement avantageux si la quantité 25 d'échantillons disponible pour le diagnostic est restreinte. En effet, comme indiqué ci-dessus, l'utilisation d'une combinaison de 4 fluorochromes permet une analyse sur deux mitoses. Les exemples et figures illustrent l'invention sans en limiter la portée. 30 EXEMPLES Exemple 1 : Construction de 41 sondes télomériques Les sondes sont préparées à partir de BACs (Bacterial Artificial Chromosome). Un BAC est un fragment d'ADN humain, de taille comprise généralement entre 150.000 et 200.000 paires de bases (150kb - 200kb), inséré dans un plasmide transfecté dans E. Coli. Différents sites Internet permettent de visualiser la position de ces BACs le long de chaque chromosome. En consultant le site UCSC (http://genome.ucsc.edu/), les inventeurs ont sélectionné 286 BACs situés au niveau des régions subtélomériques spécifiques des bras longs et courts de tous les chromosomes, à l'exception de celles des bras courts des 5 chromosomes acrocentriques (13, 14, 15, 21 et 22) qui sont composés de séquences répétées communes à ces 5 chromosomes. Pour les 41 extrémités (23 paires chromosomiques moins 5), les BACs ont été choisis en contiguïté sur une distance d'au moins 800 000 paires de bases (800 kb) de façon à obtenir une sonde générant un signal puissant. 10 2 : caractéristiques des sondes utilisées (dist du télo=distance du télomère) es Clones contigus Position (pb) Longueurs (pb) N° Accession Marqueur Gène CTD-3113J13 828698-1021785 193088 AQ780886 D1S118 AGR CTD-2587K1 6 1051546-1205883 154338 AQ470435 SHGC-142119 SDF, RP11-421 C4 1247484-1432829 185345 BZ774583 D1S1287 DVL 663 320pb RP11-846C3 1457626-1687885 230259 6X663510 RH25018 CDC2 RP11-798H13 1734771-1923265 188494 AQ492839 D1S930 GNB élo: 828 698pb RP11-547D24 1881315-2014198 132883 AL391845 D1S1328 GABF RP11-181G12 2062347-2242269 179922 AL590822 RH103396 SKI RP11-1012C20 2291750-2492018 200268 AQ670062 RH46873 PEX1 127 322pb RP11-438F14 246754133-246932000 177867 AC098483 Dl S554 OR2T CTD-3000019 246529431-246722177 192746 AQ105134 Dl S3148 élo: 495 586pb RP11-469H22 246250426-246455373 204947 AQ630268 5T5G32593F5 RP11-908P10 245985930-246193139 207209 AQ670208 RH78729 OR2V CTD-2548B21 244064096-244262971 198875 AQ390121 SHGC-84075 RP11-356M6 178830-334228 155398 AC079779 RH103149 ACP 36 223pb RP11-1105H20 292902-510007 217105 AQ685436 D252147 RP11-478N3 510170-688604 178434 AQ635663 D251318 TMEM élo: 178 830pb RP11-100K14 714657-885732 171075 AQ342063 RH92499 CTD-2504K9 882429-1115053 232624 AQ265200 RH99251 SNTC RP11-351E10 242375991-242565755 189764 AC134880 NEU4 NEU 076 262pb RP11-875C22 242147376-242359508 212132 AQ800748 D252142 ATG4 RP11-90E11 242009527-242187120 177593 AQ281512 RH47042 BON élo: 385 394pb RP11-952H3 241827539-242014017 186478 AQ600636 D2S1880 SEPT RP11-185C8 241680132-241864592 184460 AQ418167 D251499E PASI RP11-143H14 241489493-241648076 158583 AQ373316 RH36299 RP11-306H5 159320-343406 184086 ACO26187 D352359 CHL RP11-114K9 333634-518315 184681 AC011609 D353938 CHL 103 495pb RP11-775C23 576763-773499 196736 AC087431 AFM240XF12 RP11-86C13 768337-958276 189939 AC090044 D3S1762 élo: 159 320pb RP11-242C8 955503-1107788 152285 AC087430 SHGC-132794 RP11-392M7 1064434-1255997 191563 ACO27123 SHGC-82415 CNTN RP11-416N8 1244099-1420317 176218 ACO34192 SHGC-8915 CNTN RP11-717M12 1388171-1562815 174644 ACO26214 SHGC-111745 CNTN RP11-159K3 199038951-199230435 191484 AQ375640 RH74944 LMLf CTD-252909 198655574-198826526 170952 AQ353056 RH78729 BDH RP11-114F20 198339452-198528164 188712 AQ342618 SHGC-37072 DLG RP11-183022 198146622-198339454 192832 AQ416118 WI-6636 MFI: 918 615pb RP11-927L5 197896915-198070611 173696 AQ623198 D3S2348 PAK; 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RP11-103G13 62608394-62794238 185844 AQ323224 RH32542 ZNFS! 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RP11-946P8 643506-870272 226766 AQ600003 DXYS6796 RP11-892B14 1108980-1329314 220334 AQ819426 G66030 CSF21 élo: 272 751 pb RP11-261 P4 1457956-1620348 162392 AL683870 DXYS140 ASM- CTD-3047L21 1610184-1762933 152749 AQ134439 DXYS155E ASM' CTD-3239E12 1685500-1912181 226682 AQ211694 DXYS155E ASM' RP11-479B17 154703321-154862054 158733 AQ629322 DXS7859 SYBL RP11-175B5 154533822-154703245 169423 AQ418259 G65952 SPR\ RP11-954J6 154388631-154559759 171128 AQ624034 DXS1108 TMLI- 126 929 pb RP11-405N23 154111989-154275960 163971 AZ301102 RH70015 CLIC RP11-207016 153896624-154041384 144760 AQ415867 STSG604444 CXorf élo: 51 700pb RP11-524G17 153688415-153923534 235119 AL645722 STSG604337 F8 RP11-103M23 153435125-153609357 174232 AQ611327 STSG604213 IKBK 1.1. Culture des BACs Les BACs sont commandés au Centre National de Séquençage à Evry (Génoscope), qui les fournit sous forme de colonies dans des boîtes de Pétri. Chaque BAC est mis en culture selon le protocole suivant : S00�1 de milieu de culture TB contenant du chloramphénicol (25�g/ml) est déposé dans chacun des puits de la plaque 96 puits. Puis une colonie de chaque clone bactérien est mise en culture par puits. Les plaques sont incubées pendant 24 heures à 37°C sous agitation. Les cultures sont arrêtées en ajoutant S00�1 de milieu TB/30% de glycérol. Ceci formera la plaque Glycérol Stock, à partir de laquelle 3 répliques seront générées : la plaque M (Mère), la plaque S (Sauvegarde) et la plaque T (Travail) chacune contenant 150�i de culture. La plaque T sert à l'obtention de l'ADN. Les plaques sont stockées à -80°C dans des congélateurs différents. 1.2. Amplification de l'ADN par RCA (Rolling Circle Amplification) : C'est l'étape de la production d'ADN a) Principe L'amplification de l'ADN par RCA est basée sur la réplication à température constante de courts segments d'ADN circulaires simple brin. La réaction consiste en l'extension d'amorces hexamériques aléatoirement liées à la matrice d'ADN permettant d'obtenir des copies d'ADN simple brin linéaire, pouvant à leur tour servir de matrice pour l'hybridation d'autres amorces. Ceci permet d'éviter les étapes classiques d'extraction type phénol-chloroforme. b) Protocole : Kit GE Healthcare Europe: ref 25-6400-80 Cette étape utilise le protocole fourni avec le kit de RCA. Elle s'effectue en plaque 96 ce qui permet la production simultanée d'ADN (10�g) à partir de 4�i de culture de 96 clones différents. On obtient une concentration finale d'ADN de 100ng/�l (10�g dans l00�1 d'eau). La 30 vérification de l'amplification se fait sur gel d'agarose. 1.3. Marquage C'est l'étape qui va permettre l'incorporation de molécules fluorescentes à l'ADN. Chaque produit de RCA est marqué par le principe de la nick-translation. On obtient en 2h30 une solution à 20 ng/�l d'ADN marqués par un fluorochrome. Les marquages sont vérifiés comme suit : 4m1 de la réaction de marquage sont déposés sur gel d'agarose à 1% afin de visualiser sous 5 UV, l'ADN dans lequel se sont intégrés les fluorochromes. Ceci permet d'apprécier la qualité du marquage. 1.4. Précipitation des sondes Cette étape permet la fabrication de la sonde prête à l'emploi. 10 200ng de chacune des sondes sont précipités en présence de 50X (soit 10�g) d'ADN Cotl (ADN riche en séquences répétées qui bloqueront les séquences répétées existantes dans la sonde), avec 0,15M de NaCl 3M et 3 volumes d'éthanol 100%. Le culot est ensuite repris dans 6�i de tampon d'hybridation (50% formamide, 2X SSC, 0,1% SDS, 40mM 15 NaH2PO4/NaHPO4). La concentration d'utilisation de la sonde est donc d'environ 30ng/�l. 1.5. Vérification de la localisation des sondes par FISH Avant de constituer un contig de sonde, chaque sonde (BACs) a été vérifiée par FISH sur 20 métaphase. Tous les BACs générant un signal sur plusieurs chromosomes, ou non en place sur le chromosome attendu, ont été remplacés. 1.6. Formation du " pool " Ceci permet de simplifier considérablement le processus en ne manipulant que 41 ADN 25 pools en place des 286 clones le constituant. La plaque "pool" est formée à partir de la plaque de travail. Pour chaque extrémité chromosomique, 20�l de TB/glycérol, de chaque clone bactérien correspondant à un BAC constituant le contig, sont prélevés puis mélangés dans un seul puit d'une plaque 96. Ainsi 30 est constituée une plaque contenant 41 mélanges de clones bactériens à partir desquels sont fabriquées très rapidement, selon les procédés décrits précédemment (culture, RCA, marquage, et vérification par FISH), des sondes spécifiques de chacune des 41 extrémités chromosomiques. À partir de la plaque T (20gl de chaque BAC) lp lq 2p 2q 3p 3q 4p 4q 5p 5q 6p 6q '7p 7q 8p 8q 9p 9q l0p l0q llp llq l2p 12q 13q 14q 15q l6p 16q l7p 17q l8p 18q l9p 19q 20p 20q 21q 22q XYp XYq Plaque 41 extrémités = plaque "pool" Exemple 2 : Fabrication du système MTP (� Mega telomeric probes �) La stratégie adoptée a conduit à la fabrication de 41 sondes qui sont marquées grâce à une 10 combinaison de 5 fluorochromes : FITC, rhodamine, DEAC, biotine (révélée par la streptavidine-Cy5) et digoxygénine (révélée en Cy5.5). Les extrémités d'un même chromosome sont marquées par la même combinaison de couleurs. 15 2.1 Marquage des deux groupes Chaque groupe a été construit de façon à éviter de rassembler des chromosomes se ressemblant du point de vue cytogénétique (le 21 et le 22, dans deux groupes différents, par exemple). 20 Toutes les extrémités qui contiennent le même fluorochrome sont marquées ensemble par nick-translation et selon les Tableaux 3A et 3B ci-dessous. Pour le groupe I, 1960ng d'ADN ont été marqués en FITC, 2120ng en rhodamine, 1050ng en coumarine, 1983ng en Biotine, et 1860ng en digoxygénine dans des volumes respectifs de 83, 98, 50, 88 et 84�l. Pour le groupe II, 1810ng ont été marqués en FITC, 1860ng en Rhodamine, 1607ng en 25 Biotine, et 1944ng en digoxygénine. Cette différence de quantité d'ADN marqué vise à renforcer le signal de certaines extrémités plus faibles. Tableaux 3A et 3B : Tableaux de marquage des deux groupes avec table combinatoire A- GROUPE I FITC Rhoda Couma Cy5 Cy5.5 1p/lq vert jaune 2p/2q vert 4p/4q jaune fushia 6p/6q vert rouge jaune fushia 7p/7q bleu 8p/8q rouge jaune llp/llq jaune 13q vert rouge jaune 15q vert rouge 17p/17q rouge jaune fushia 19p/19q rouge 21q vert jaune fushia B- GROUPE II FITC Rhoda Cy5 Cy5.5 3p/3q vert rouge 5p/5q jaune 9p/9q rouge 10p/lOq rouge jaune fushia 12p/12q vert jaune fushia 14q vert rouge jaune fushia 16p/16q vert jaune 18p/18q rouge jaune 20p/20q jaune fushia 22q vert rouge jaune XpYp/XqYq vert 2.2. Précipitation des groupes Pour une hybridation et par groupe, l'ensemble des sondes marquées est précipité 5 simultanément et repris dans 4,1 de tampon d'hybridation. 2.3. Hybridation des sondes L'hybridation des sondes dites � Mega telomeric probes � (MTP) se réalise selon le même protocole que pour les BACs, mais nécessite des lames à deux dépôts pour traiter 10 simultanément les deux groupes de chromosomes. 2.4. Révélation des lames et analyse Les lames sont lavées dans un bain de 1XSSC à 72°C pendant 5min, puis révélées par deux couches d'anticorps pour révéler les sondes marquées à la biotine et la digoxygénine. La 15 première couche d'anticorps (50 �l de bicarbonate de soude 1X + 2�l d'anti streptavidine Cy5 (lmg/ml) pour la biotine + 0,5itl d'anti-digoxygénine souris et la deuxième couche (50 �l de bicarbonate de soude 1X+ l�1 d'anti souris Cy5.5 (lmg/ml)) permet la révélation de la digoxygénine. Les lames sont montées avec l0�1 d'une solution de DAPI/Vectashield� (Vector 20 Laboratories) puis recouvertes d'une lamelle 24x60. Les lames sont observées à l'aide d'un microscope à épi fluorescence équipé d'une caméra et de filtres appropriés et les métaphases analysées à l'aide d'un système d'analyse. Exemple 3 : Mise en évidence d'une translocation équilibrée subtélomérique 25 t(5 ;11)(q35 ;p15) Pour tester la résolution des sondes, les inventeurs ont réalisé une hybridation de celles-ci chez un patient ayant une leucémie aiguë myéloïde associée à une anomalie télomérique cryptique, la t(5;11)(g35;p15) invisible donc en cytogénétique classique. Cette translocation recombine les gènes NUP98 codant pour une nucléoporine de 98 kDa situé à 3Mb du télomère du bras court du chromosome 11 et le gène NSD1 codant pour le nuclear receptor SET domain proteine situé à 4 Mb du télomère du bras long du chromosome 5. La résolution du caryotype en bandes est de 5 à 10 Mb (souvent 10Mb pour les chromosomes des cellules leucémiques). Le système MTP de l'invention a permis de 10 détecter aisément cette anomalie. Pour confirmer qu'il s'agit bien d'une translocation remaniant l'extrémité distale du bras long d'un chromosomes 5 et celle du bras court d'un chromosome 1l, les inventeurs ont hybridé les sondes spécifiques des bras court et long du chromosome 11 (respectivement marquées par de la coumarine (en bleu) et de la biotine révélée par de la streptavidine Cy5 15 (jaune) et celle des bras courts (marqués par du FITC, vert) et longs (marqués par de la Rhodamine, rouge) du chromosome 5. Les inventeurs ont ainsi pu visualiser une translocation t(5;11)(gter;pter). REVENDICATIONS1. Procédé in vitro pour détecter des anomalies chromosomiques chez un animal, 5 comprenant : - l'hybridation in situ de n chromosomes d'une préparation de chromosomes métaphasiques avec des ensembles d'une pluralité d'acides nucléiques, chaque ensemble hybridant, sur une longueur de 700 000 à 3 000 000 pb contiguës, de manière spécifique aux extrémités subtélomériques spécifiques desdits chromosomes, chaque ensemble étant 10 marqué de manière détectable par un fluorochrome, de telle sorte que chaque chromosome est distinguable par un fluorochrome particulier ou une combinaison particulière de fluorochromes, n étant un nombre entier compris entre 2 et le nombre total de chromosomes dudit animal, le nombre total de fluorochromes utilisés étant un entier inférieur à n, 15 - la détection de la fluorescence émise par les fluorochromes, par ce en quoi des anomalies chromosomiques sont détectées. 2. Procédé selon la revendication 1, le procédé étant mis en oeuvre pour la détection d'au moins douze chromosomes. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, le procédé étant mis en oeuvre pour l'ensemble des chromosomes de la préparation de chromosomes métaphasiques. 25 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les ensembles d'une pluralité d'acides nucléiques est produit par amplification d'un ou plusieurs BAC dans lesquels sont insérés un ou plusieurs fragments de l'extrémité subtélomérique dudit chromosome. 30 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'amplification est une amplification du type Rolling-Circle Amplification (RCA). 20 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les acides nucléiques d'au moins un ensemble sont marqués avec des nucléotides conjugués avec une molécule reconnue spécifiquement par un ligand marqué avec un fluorochrome. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel les acides nucléiques d'au moins un ensemble sont marqués avec des nucléotides conjugués avec un fluorochrome. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel, pour chaque 10 chromosome, les extrémités subtélomériques du bras court et du bras long sont marquées avec le même fluorochrome ou avec la même combinaison de fluorochromes. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l'animal est l'humain. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour le diagnostic d'une pathologie chromosomique constitutionnelle. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour le diagnostic d'un 20 cancer. 15