FR 2936064 A1 20100319 FR 0805089 A 20080916 DISPOSITIF D'IMAGERIE PAR SPECTROSCOPIE RAMAN ET SON PROCEDE DE FABRICATION L'invention porte sur un dispositif d'imagerie par spectroscopie Raman à exaltation de surface, ainsi que sur des procédés d'utilisation et de fabrication d'un tel dispositif. Le dispositif de l'invention convient particulièrement à des applications biologiques et médicales, et notamment pour la réalisation d'images in vivo avec une faible invasivité. La spectroscopie Raman est une technique puissante pour étudier une grande variété de systèmes chimiques et biologiques. Elle permet d'obtenir des informations aussi bien qualitatives que quantitatives et avec une haute résolution spatiale à partir d'échantillons tels que des biomolécules, des virus, des cellules, des tissues, en fournissant ainsi des informations moléculaires sur les composants de ces systèmes complexes. La principale limitation de cette technique est sa faible sensibilité, due à la petitesse de la section efficace Raman (typiquement de l'ordre de 1030û 10-25 cm2/molécule), qui est bien au-dessous de la section efficace d'absorption par fluorescence intrinsèque ou extrinsèque (de l'ordre de 10-15 cm2/molécule). Le signal Raman peut cependant être très fortement exalté û d'un facteur pouvant atteindre 1014 û en exploitant une interaction entre les molécules analysées et une surface métallique nanostructurée. Ce phénomène est connu sous le nom de spectroscopie Raman à exaltation de surface ou � SERS � (de l'anglais � Surface-enhanced Raman Spectroscopy �). L'article de K. Kneipp, H. Kneipp, I. Itzkan, R. R. Dasari, et M. S. Feld � Ultrasensitive Chemical Analysis by Raman Spectroscopy � Chem. Rev. 1999, 99, pages 2957-2976 fournit une introduction à la technique SERS et à ses applications. Une description théorique plus approfondie de l'effet d'exaltation du signal Raman induit par une surface métallique nanostructurée peut être trouvée dans l'article de Yuan Vo-Dinh "Surface- enhanced Raman spectroscopy using metallic nanostructures", TrAC Trends in Analytical Chemistry 1998, 17, pages 557 - 582. Trente ans après la découverte de cet effet, des substrats SERS commencent à être disponibles dans le commerce. Voir par exemple le substrat � Klarite � (marque déposée) de la société britannique � D3 Technologies �. Ce substrat est constitué d'une plaquette de silicium pourvue d'un revêtement en or, présentant un réseau régulier de trous à l'échelle nanométrique. Une voie prometteuse pour réduire le coût des substrats SERS, en améliorer l'homogénéité spatiale et en augmenter la reproductibilité consiste à les fabriquer à partir de faisceaux de fibres optiques. On peut citer à ce propos les articles suivants : - D. J. White, P. R. Stoddart, � Nanostructured optical fiber with surface-enhanced Raman scattering functionalii:y � Opt. Lett. 2005, 30, 598-600. - D. J. White, A. P. Mazzolini, P. R. Stoddart � Fabrication of a range of SERS substrate on nanostructures multicore optical fibres �, Journal of Raman Spectroscopy 2007, 38, 377-382 - M. E. Hankus, H. Li, G. J. Gibson, B. M. Cullum, � Surface-Enhanced Raman Scattering-Based Nanoprobe for High-Resolution, Non-Scanning Chemical Imaging � Anal. Chem. 2006, 78, 7535-7546. - V. Guieu, F. Magugné-Labarthet, L. Servant, D. Talaga, N. Sojic � Ultrasharp Optical-Fiber Nanoprobe Array for Raman Local- Enhancement Imaging � Small 2008, 4, No. 1, 96 û 98. Dans tous les cas cités ci-dessus, un substrat SERS est fabriqué à partir d'un faisceau de fibres optiques ou, ce qui est équivalent, d'une fibre optique à coeurs multiples. Un tel dispositif, également connu sous le nom de fibre pour imagerie, consiste en une plu'alité de fibres optiques identiques s'étendant dans une même direction, non torsadées et dont les gaines sont fondues ensemble ou, plus généralement, reliées entre elles de manière à former un faisceau compact. Un faisceau de quelques centaines de micromètres de diamètre peut contenir plusieurs milliers de fibres optiques individuelles. Dans les articles de White et al. (2005 et 2007) et de Hankus et al. il est suggéré d'étirer les faisceaux de fibres pour réduire leur diamètre et augmenter ainsi la résolution spatiale du substrat SERS. Un faisceau de fibres optiques comporte deux faces d'extrémité opposées ; une de ces faces û dite � face distale �, la face opposée étant dite � proximale � û est immergée dans un bain chimique de gravure en phase humide. Lorsqu'on utilise des faisceaux effilés, obtenus par étirement, la � face distale � correspond à l'extrémité la plus fine du faisceau. Le coeur et la gaine des fibres optiques sont réalisées en verre de silice et contiennent des dopants différents afin de modifier leur indice de réfraction. Typiquement, les coeurs peuvent êtres dopés à l'oxyde de germanium et les gaines contenir des fluorures. Incidemment, le dopage modifie les propriétés chimiques du verre, et permet une gravure différentielle du coeur et des gaines. Cet effet permet la nanostructuration de la face distale du faisceau de fibres. Dans toutes les réalisations connues de l'art antérieur, les conditions de gravure (composition chimique du bain, temps d'immersion) sont choisies de manière à provoquer une érosion préférentielle des coeurs des fibres optiques, qui forment ainsi des cavités. Les gaines entourant les coeurs forment des � crêtes � qui culminent en des nano-pointes ultra-aigues, agencées selon un motif régulier. La surface distale est ensuite couverte d'une couche mince d'or ou argent ayant une épaisseur de quelques dizaines de nanomètres. La surface nanostructurée et conductrice ainsi obtenue constitue un excellent substrat SERS. Dans les expériences réalisées par White et al. et par Guieu et al. (voir les articles précités), le substrat SERS est éclairé de l'extérieur et la lumière diffusée vers l'arrière par effet Raman est récoltée à l'aide d'un objectif de microscope. Autrement dit, les surfaces nanostructurées fabriquées à partir de faisceaux de fibres optiques sont utilisés comme de substrats SERS de type classique. Hankus et al., au contraire, collectent la lumière Raman qui a été guidée par les coeurs des fibres optiques individuelles jusqu'à l'extrémité proximale du faisceau. En revanche, l'éclairage est fait depuis l'extérieur des fibres, comme dans les autres cas. Les conditions d'éclairage des substrats SERS connus de l'art antérieur ne permettent pas d'acquérir des images Raman in vivo, notamment à des finalités diagnostiques, d'une manière aussi peu invasive qu'un examen par fibroscopie ou endoscopie classique. Un but de l'invention est précisément de fournir un tel dispositif. Contrairement à l'art antérieur, dans un dispositif de l'invention la lumière d'excitation est injectée dans le coeur des fibres optiques au niveau de la face proximale du faisceau pour se propager de manière guidée jusqu'à la face distale nanostructurée ; et la lumière Raman générée au niveau de ladite face distale se propage le long desdites fibres pour être collectée depuis la face proximale. Conformément à l'invention, ce but peut être atteint grâce à un dispositif d'imagerie par spectroscopie Raman à exaltation de surface comprenant un faisceau de fibres optiques ayant une première extrémité, dite proximale, et une deuxième extrémité, dite distale, ladite extrémité distale présentant une surface structurée à une échelle sub-micrométrique (c'est à dire nanométrique) et revêtue d'une couche mince métallique, caractérisé en ce que ladite surface structurée à une échelle sub-micrométrique se présente sous la forme d'un réseau de pointes formées chacune par un coeur d'une fibre optique du faisceau. Selon des modes de réalisation préférés de l'invention : - Les coeurs des fibres optiques peuvent présenter un gradient radial de concentration d'une espèce chimique de dopage, à cause de quoi l'indice de réfraction desdits coeurs décroit du centre vers la périphérie. - Les pointes du réseau formé sur ladite surface structurées peuvent présenter des apex ayant un rayon de courbure compris entre 20 nm et 100 nm. - La couche mince métallique peut être réalisée en un métal choisi parmi : Cu, Ag, Au, Li, Na, K, ln, Pt et Rh. - La couche mince métallique peut présenter une épaisseur comprise entre 10 et 200 nm. - La distance moyenne entre deux pointes dudit réseau peut être comprise entre 200 nm et 500 pm, et de préférence entre 1 et 50 Pm- - De même, les diamètres des coeurs desdites fibres optiques peuvent être compris entre 200 nm et 500 pm et de préférence entre 1 et 50 pm. - Le dispositif peut comporter également des moyens pour injecter dans les coeurs desdites fibres optiques, au niveau de ladite extrémité proximale, une lumière d'excitation se propageant de vers ladite extrémité distale ; et des moyens pour recueillir, au niveau de ladite extrémité proximale, une lumière générée au niveau de ladite surface structurée et se propageant de manière guidée à l'intérieur des coeurs desdites fibres optiques. - Le dispositif peut comporter également des moyens d'analyse spectrale de la lumière générée au niveau de ladite surface structurée et recueillie au niveau de ladite extrémité proximale. - Ladite lumière d'excitation peut être sensiblement 25 monochromatique. Un autre objet de l'invention est un procédé d'utilisation d'un tel dispositif pour l'acquisition d'images par spectroscopie Raman à acquisition de surface. Encore un autre objet de l'invention est un procédé de 30 fabrication d'un tel dispositif comportant : - une étape de structuration d'une face d'extrémité d'un faisceau de fibres optiques par gravure en phase humide ; et - une étape de dépôt d'une couche mince métallique sur la face structurée. Avantageusement, ladite étape de structuration par gravure en phase humide peut comporter l'immersion d'une extrémité dudit faisceau de fibres optiques dans une solution aqueuse comportant un acide fort et un sel dudit acide, la composition chimique de l'acide et du sel, leurs concentrations et le temps d'immersion étant choisis de manière à obtenir une gravure préférentielle des gaines desdites fibres optiques par rapport aux coeurs. En particulier, ladite solution aqueuse peut contenir de l'acide fluorhydrique et du fluorure d'ammonium, la coricentration du fluorure d'ammonium étant supérieure à celle de l'acide fluorhydrique. D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple et qui représentent, respectivement : - La figure 1, d'une manière schématique, la structure d'un dispositif selon l'invention ; - Les figures 2A, 2B et 2C, des images de microscopie électronique de la surface distale nanostructurée d'un tel dispositif ; - La figure 3, pour comparaison, une image de microscopie électronique de la surface distale nanostructurée d'un dispositif selon l'art antérieur (Guieu et al.) ; et - La figure 4, un spectre de diffusion Raman obtenu à l'aide du dispositif de l'invention. Sur la figure 1, la référence 1 indique un faisceau constitué par une pluralité de fibres optiques individuelles 10. A titre d'exemple, le faisceau 1 peut être du type IGN-035/06 fabriqué par Sumitomo Electric, ayant un diamètre de 350 pm et constitué par 6000 fibres individuelles. Bien que le faisceau 1 soit représenté dans une configuration rectiligne, il est flexible et peut être plié avec un rayon de courbure aussi faible que 15 mm. Chaque fibre individuelle 10 est constituée d'un coeur 11 en verre de silice (SiO2) dopé avec du GeO2, entourée d'une gaine 12 également en verre de silice mais dopée avec du fluore (F). D'une manière conventionnelle, les dopages sont choisis de telle manière que l'indice de réfraction du coeur soit plus élevé que celui de la gaine, de manière à assurer le guidage de la lumière. Le diamètre de chaque coeur est de l'ordre de 3 pm et les coeurs de différentes fibres individuelles sont espacés d'environ 4 pm. Pour des raisons qui deviendront claires par la suite, il est avantageux que le dopage des coeurs des fibres optiques 10 ne soit pas uniforme, mais diminue progressivement (par exemple linéairement) du centre vers la périphérie. Le faisceau de fibres optiques 1 comporte deux faces d'extrémité opposées, dite face proximale (référence 150) et distale (référence 100). La face distale 100 du faisceau 1 est structurée à l'échelle sub-nanométrique. Plus précisément, cette face se présente sous la forme d'un réseau de pointes coniques 13 formées chacune par un coeur 11 d'une fibre optique individuelle 10. La hauteur de chaque ponte 13 est d'environ 5-7 pm et le rayon de courbure à l'apex des pointes est compris entre 20 et 100 nm. De plus, la face distale 100 est recouverte d'une couche mince métallique 110, généralement en or ou en argent, d'une épaisseur de quelques dizaines de nanomètres (par exemple, 10 -- 200 nm) pouvant être réalisée notamment par pulvérisation cathodique. Les figures 2A à 2C montrent des images de la face distale d'un dispositif selon l'invention, réalisées par microscopie électronique à balayage en utilisant des grossissements différents. La figure 2B, en particulier, met en évidence l'agencement relativement régulier des pointes 13. La figure 3 montre, à titre de comparaison, la surface active d'un dispositif SERS à faisceau de fibres optiques connu de l'art antérieur, et précisément de l'article précité de V. Guieu et al. Les valeurs qui ont été indiquées pour les dimensions des pointes, l'épaisseur du revêtement métallique 110 et sa composition chimique n'ont été données qu'à titre d'exemple. L'homme du métier est en mesure de déterminer les valeurs adaptées à produire un effet d'exaltation de la diffusion Raman. La surface distale 150 du faisceau 1 peut être pourvue de moyens de connexion permettant de la relier fonctionnellement à un spectromètre Raman tel qu'un spectromètre Labram HR de Horiba-Jobin-Yvon. Un tel spectromètre comporte une source 2 de lumière d'excitation, notamment un laser ; un dispositif 3 d'analyse spectrale de la lumière, tel qu'un réseau de diffraction ; et un détecteur de lumière 4. La source de lumière (par exemple, un laser Ar-Kr émettant à 647 nm) injecte un rayonnement lumineux à l'intérieur des coeurs 11 des fibres 10 du faisceau 1. Il est entendu que les fibres doivent être susceptibles de guider ce rayonnement, que ce soi en mode unique ou en régime multimodal. Après s'être propagé le long des fibres 10, le rayonnement lumineux émis par la source 2 (dit rayonnement d'excitation) interagit par diffusion Raman avec un analyte adsorbé par le revêtement métallique 110 des nanopointes 13. D'une manière connue en soi, l'analyte absorbe la lumière d'excitation et réémet, par diffusion Raman, un rayonnement présentant un décalage en fréquence caractéristique de ses niveaux vibrationnels et permettant son identification. La lumière Raman est à son tour guidée par les coeurs des fibres optiques jusqu'à la surface distale 150, où elle est décomposée en ses composantes spectrales et analysée en fréquence. La figure 4 montre un spectre Raman obtenu à l'aide du dispositif de la fibre 1, sur la face � active � 100 duquel a été adsorbé du cristal violet (méthyl-violet). Le pic P1 correspond à la silice dopée à l'oxyde de germanium, et peut être observé même en l'absence des nanopointes 13. Les pics P2, P3 et P4, au contraire, caractérisent l'aralyte (c'est à dire, dans l'exemple, le cristal violet), et ne sont pas détectés lorsque la face distale 100 du dispositif n'est pas structurée. Sur le graphique cle la figure 4, l'axe des abscisses représente le décalage Raman (exprimé en cm) et l'axe des ordonnée l'intensité du signal (en unités arbitraires). Etant donné que la lumière diffusée par effet Raman se propage de manière guidée le long des coeurs des fibres optiques du faisceau, l'information spatiale est conservée. Il est donc possible de déterminer la distribution spatiale, sur la face active 100, des analytes identifiés par spectroscopie Raman. Comme le montre la figure 3, les dispositifs connus de l'art antérieur, les nanopointes rendant possible l'exaltation de l'effet Raman ne sont pas réalisées en correspondance des coeurs des fibres, mais au contraire entre lesdits coeurs. Par conséquent, il n'est pas possible d'éclairer les molécules d'analyte situées au niveau desdites pointes (et donc susceptibles de produire un signal Raman exalté) par un rayonnement lumineux guidé le long des coeurs. D'où la nécessité d'éclairer la surface nanostructurée depuis l'extérieur. Il en va de même pour l'acquisition du signal Raman : seule l'utilisation d'une structure selon l'invention permet un couplage efficace de ce signal avec les coeurs des fibres optiques (même si Hankus et collaborateur affirment avoir obtenu un tel couplage en utilisant une structure dans laquelle les nanopointes sont réalisées à partir des gaines). De plus, dans le cas des faisceaux de fibres optiques étirés, les diamètres des coeurs sont trop petits pour assurer la propagation guidée du rayonnement d'excitation et du rayonnement Raman. Il s'ensuit que l'étirement des fibres peut effectivement améliorer la résolution spatiale des mesures, mais uniquement à condition d'éclairer l'échantillon depuis l'extérieur et d'acquérir le signal Raman également depuis l'extérieur, en renonçant à exploiter les propriétés de guidage des fibres optiques. 2936064 'o Par conséquent, seule la structure de l'invention permet de réaliser de l'imagerie SERS à distance en exploitant pleinement les propriétés de guidage des fibres optiques. En particulier, seule cette structure semble autoriser l'endomicroscopie Raman. 5 Par ailleurs, des essais ont montré que les nanopointes sont très résistantes mécaniquement, et ne risquent pas d'être endommagées par contact avec un échantillon biologique. L'utilisation de fibres à gradient d'index (c'est à dire présentant une concentration de dopant dans le coeur qui diminue du centre 10 vers la périphérie) est avantageuse, car la variation radiale de l'index de réfraction tend à concentrer la lumière au centre du coeur, et donc au niveau de l'apex de la pointe. Il en résulte une plus grande efficacité de la diffusion Raman. Comme dans le cas de l'art antérieur, la nanostructuration de 15 la face active 100 du faisceau de fibres optiques 1 peut être obtenue par gravure en phase humide. Cependant, contrairement à l'art antérieur, les conditions de la gravure doivent être choisies de manière à assurer une érosion préférentielle des gaines par rapport aux coeurs. Dans ces conditions de gravure, l'oxyde de germanium agit comme agent de protection des coeurs 20 contre l'attaque chimique. On comprend que l'utilisation d'un dopage radialement variable, avec une concentration de dopant plus élevé au centre des coeurs qu'à leur périphérie, facilite l'obtention de pointes très aiguisées, plutôt que de protubérances en forme de tige. L'utilisation de fibres à gradient d'index est donc avantageuse également pour cette raison de nature 25 strictement technologique. La gravure en phase humide comporte l'immersion de l'extrémité distale d'un faisceau de fibres optiques dans un bain chimique corrosif. Le temps d'immersion et la composition du bain doivent être choisis de manière à assurer une érosion préférentielle de la gaine des fibres 30 individuelles par rapport au coeur. Les structures reproduites sur les figures 2A ù 2C ont été obtenues en immergeant pendant 90 minutes la face d'extrémité d'un faisceau Sumitomo IGN-035/06, préalablement polie, dans un mélange constitué par : 5 parts d'une solution aqueuse de NH4F à 40% ; 1 part d'une solution aqueuse de HF à 48% ; et 1 part d'eau déionisée. Les proportions exactes des composantes peuvent varier, pourvu que la concentration du fluorure d'ammonium reste supérieure à celle de l'acide fluorhydrique. D'autres couples acide fort/sel peuvent également être utilisés, en fonction de la composition chimique des fibres optiques (et notamment de la nature des dopants utilisés dans les coeurs et les gaines, respectivement). D'autres techniques de gravure peuvent également être l0 utilisées, comme par exemple une gravure par faisceau d'ions ; mais ces techniques sont sensiblement plus complexes et plus coûteuses à mettre en oeuvre que la gravure chimique qui constitue le mode de réalisation préféré de l'invention. REVENDICATIONS1. Dispositif d'imagerie par spectroscopie Raman à exaltation de surface comprenant un faisceau (1) de fibres optiques (10) ayant une première extrémité, dite proximale (100), et une deuxième extrémité, dite distale (150), ladite extrémité distale présentant une surface structurée à une échelle sub-micrométrique et revêtue d'une couche mince métallique (110), caractérisé en ce que ladite surface structurée à une échelle sub-micrométrique se présente sous la forme d'un 7éseau de pointes (13) formées chacune par un coeur (11) d'une fibre optique (10) du faisceau. 2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel les coeurs des fibres optiques du faisceau présentent un gradient radial de concentration d'une espèce chimique de dopage, à cause de quoi l'indice de réfraction desdits coeurs décroit du centre vers la périphérie. 3. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les pointes du réseau formé sur ladite surface structurées présentent des apex ayant un rayon de courbure compris entre 20 nm et 200 nm. 4. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la couche mince métallique est réalisée en un métal choisi parmi : Cu, Ag, Au, Li, Na, K, ln, Pt et Rh. 5. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la couche mince métallique présente une épaisseur comprise entre 10 et 200 nm et de préférence entre 1 et 50 pm. 6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la distance moyenne entre deux pointes dudit réseau est comprise entre 200 nm et 500 pm et de préférence entre 1 et 50 pm. 7. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les diamètres des coeurs desdites fibres optiques sont compris entre 200 nm et 500 pm.30 8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, comportant également des moyens (2) pour injecter dans les coeurs desdites fibres optiques, au niveau de ladite extrémité proximale, une lumière d'excitation se propageant de vers ladite extrémité distale ; et des moyens (4) pour recueillir, au niveau de ladite extrémité proximale, une lumière générée au niveau de ladite surface structurée et se propageant de manière guidée à l'intérieur des coeurs desdites fibres optiques. 9. Dispositif selon la revendication 8, comportant également des moyens (3) d'analyse spectrale de la lumière générée au niveau de ladite surface structurée et recueillie au niveau de ladite extrémité proximale. 10. Dispositif selon l'une des revendications 8 ou 9, dans lequel ladite lumière d'excitation est sensiblement monochromatique. 11. Utilisation d'un dispositif selon l'une des revendications précédentes pour l'acquisition d'images par spectroscopie Raman à acquisition de surface. 12. Procédé de fabrication d'un dispositif selon l'une des revendications 1 à 10 comportant : - une étape de structuration d'une face d'extrémité d'un faisceau de fibres optiques par gravure en phase humide ; et - une étape de dépôt d'une couche mince métallique sur la face structurée. 13. Procédé selon la revendication 12 dans lequel ladite étape de structuration par gravure en phase humide comporte l'immersion d'une extrémité dudit faisceau de fibres optiques dans une solution aqueuse comportant un acide fort et un sel dudit acide, la composition chimique de l'acide et du sel, leurs concentrations et le temps d'immersion étant choisis de manière à obtenir une gravure préférentielle des gaines desdites fibres optiques par rapport aux coeurs. 14. Procédé selon la revendication 13 dans laquelle ladite solution aqueuse contient de l'acide fluorhydrique et du fluorure d'ammonium,la concentration du fluorure d'ammonium étant supérieure à celle de l'acide fluorhydrique.