FR 2934954 A1 20100219 FR 0855590 A 20080814 Emulsion fluorescente de vert d'indocyanine La présente invention concerne une nouvelle formulation du vert d'indocyanine utile à titre d'agent de diagnostic en particulier pour l'imagerie de fluorescence, ainsi que son procédé de préparation et ses utilisations. [Etat de la technique] L'imagerie de fluorescence est une technique d'imagerie reposant sur l'injection d'un marqueur fluorescent dans l'animal ou chez l'homme, et la détection de la localisation de ce marqueur fluorescent. L'instrumentation comporte donc une source d'excitation du marqueur fluorescent et un détecteur de la fluorescence émise par le marqueur. Aujourd'hui, l'imagerie de fluorescence apparaît comme une technique d'imagerie complémentaire des autres modalités telles que l'IRM (Imagerie par résonance magnétique), le PET (acronyme anglais de � positron emission tomography �), le SPECT (acronyme anglais de � single photon emission computed tomography �), l'échographie ultrasonore, la radiographie ou la tomographie X. En effet, l'imagerie de fluorescence possède un certain nombre d'atouts par rapport aux autres techniques d'imagerie : elle n'utilise pas de rayons ionisants, et ne nécessite donc pas de radioprotection ou de gestion complexe de déchets radioactifs ; - l'instrumentation est peu coûteuse, peu encombrante, et simple d'utilisation ; - les temps d'acquisition sont très courts ; - c'est une technique très sensible en terme de concentration de marqueur à injecter, la concentration de marqueur est beaucoup plus faible que pour l'IRM, et similaire à celle utilisée en PET et SPECT ; - c'est une technique de résolution semblable à l'imagerie nucléaire (PET, SPECT) lorsque l'on image de façon non invasive à l'échelle d'un petit animal ou d'un organe, et qui peut avoir une résolution cellulaire lorsque des techniques de microscopie sont utilisées. Au jour d'aujourd'hui, la fluorescéine et le vert d'indocyanine sont des 30 fluorophores approuvés aux Etats-Unis pour injection chez l'homme. Le vert d'indocyanine, appelé ci-après ICG (acronyme anglais pour indocyanine green), est vendu sous le nom de Cardiogreen (Akorn Inc.), Infracyanine (Serb), ICG-Pulsion (Pulsion Medical System). Le composé a la formule suivante : Il s'agit d'un fluorophore émettant dans le proche infrarouge. Ce domaine est particulièrement intéressant pour l'imagerie de fluorescence puisque comparé 10 au domaine visible, les tissus absorbent moins la lumière, les tissus diffusent moins la lumière et l'auto-fluorescence des tissus est réduite. C'est pourquoi le vert d'indocyanine apparaît aujourd'hui comme le fluorophore de choix pour les applications cliniques de l'imagerie de fluorescence. Cependant, l'ICG présente certaines propriétés qui rendent son utilisation 15 en tant que marqueur fluorescent délicate. Tout d'abord, I'ICG est un composé amphiphile présentant une solubilité de 5 à 10 mg/mL et est donc peu soluble dans l'eau. A des concentrations plus élevées, des dimères ou des agrégats avec des propriétés spectrales différentes se forment. 20 De plus, I'ICG est peu stable et a un faible rendement quantique de fluorescence en solution aqueuse notamment à cause de la formation de ces dimères peu émissifs. Aussi, la FDA impose que les solutions soient préparées moins de 10h avant injection chez le patient. Par ailleurs, I'ICG s'adsorbe de façon importante sur les protéines 25 plasmatiques lors de son injection par voie sanguine, ce qui modifie le spectre d'absorption et d'émission. De plus, la durée de vie de la fluorescence de I'ICG (0.5 ns) est très proche de celle de l'auto-fluorescence des tissus biologiques (typiquement 0.3-0.4 ns). Il est donc difficile de discriminer la fluorescence de I'ICG de l'auto-fluorescence des5 tissus en utilisant une instrumentation de fluorescence basée sur une excitation lumineuse pulsée. Enfin, l'ICG ne possède pas de groupement de greffage permettant de le coupler à des biomolécules ou molécules de ciblage comme les anti-corps, peptides, saccharides, protéines, oligonucléotides ou aptamères. Le greffage de molécules de ciblage est intéressant car il permet après son injection systémique de diriger le fluorophore in vivo vers la zone d'intérêt, ce qui aboutirait à une accumulation préférentielle de I'ICG dans la zone à imager, et dès lors une augmentation de la sensibilité de détection. Un certain nombre de formulations d'ICG ont été proposées afin de surmonter certains de ces problèmes. Ainsi, la demande de brevet WO 2001/017561 propose pour le traitement de lésions par photo-coagulation des formulations d'ICG permettant d'augmenter sa solubilité et sa stabilité chimique, comprenant de l'alcool, des tampons, des surfactants, de la glycérine, du polyéthylène glycol (PEG), du polyvinyl pyrrolidone (PVP), des huiles, des cellules rouges sanguines, des acides gras et des agents antimicrobiens. La demande de brevet US 2004/0156782 décrit des formulations d'ICG sous forme lyophilisée pour l'angiographie, la mesure de la clairance hépatique ou cardiaque, ou la mesure du débit sanguin. La demande de brevet WO 2003/057259 décrit une formulation de I'ICG à base de liposomes qui permet d'augmenter la solubilité du fluorophore. Il n'est pas précisé où est localisé le fluorophore. Cependant, étant donné que le fluorophore est ajouté après formation des liposomes, il est à supposer qu'il soit adsorbé à leur surface. Par ailleurs, la stabilité de cette formulation est inférieure à un mois. Enfin, les liposomes sont des vésicules avec une coque double couche et présentent généralement des tailles de particules supérieures à 100 nm de diamètre ; les solutions de particules de cette taille diffusent la lumière et ne permettent pas une extravasation satisfaisante de la circulation sanguine vers des tissus tumoraux et l'internalisation dans les cellules. Il a été également proposé d'adsorber I'ICG sur des molécules cargos, notamment afin d'augmenter sa durée de demi-vie sanguine. Par exemple, WO 2005/082423 décrit la conjugaison par adsorption non spécifique de l'albumine sérique avec I'ICG. Toutefois, les formulations basées sur des liens non covalents d'adsorption ne sont pas très stables chimiquement et limitent le choix de ligands biologiques de ciblage utilisables. Ainsi, de petits peptides de ciblage comme le cRGD, marqueur d'angiogénèse très étudié (Haubner et al. JACS 1996, 118, 7461-7472), ne peut être associé à l'ICG pour réaliser un marqueur fluorescent par ces méthodes. La demande de brevet US 2005/0019265 propose une formulation de fluorophores dans des polymersomes. Cependant, ces liposomes artificiels sont compliqués à synthétiser, requièrent l'utilisation de polymères synthétiques, et n'aboutissent pas directement à des nanoparticules appropriées pour permettre une bonne extravasation de la circulation sanguine vers des tissus tumoraux et l'internalisation dans les cellules, à savoir moins de 100 nm, voire de 50 nm. De plus, les documents US 7,014,839 et WO 98/48846 décrivent une formulation d'ICG sous forme d'émulsion de type huile dans l'eau, sans cependant indiquer le mode de fabrication ni les caractéristiques de l'émulsion. Cependant, ce type de formulation aboutit le plus souvent à des émulsions dont la taille des gouttelettes est trop importante pour limiter la diffusion de la lumière, et assurer une stabilité colloïdale, et une furtivité après injection in vivo satisfaisantes. [Problème technique] Les formulations proposées ne permettent pas encore d'optimiser les performances de l'ICG en tant que fluorophore pour l'imagerie de fluorescence. Il était donc recherché de disposer d'une formulation de l'ICG utile pour l'imagerie de fluorescence qui soit stable, et qui permette d'optimiser au mieux ses propriétés optiques, notamment en les préservant de l'environnement extérieur et qui permette l'accès à des formulations limpides et présentant, après injection, une extravasation satisfaisante de la circulation sanguine vers des tissus tumoraux et l'internalisation dans les cellules. [Résumé de l'invention] Selon l'invention, il est proposé de formuler l'ICG dans une émulsion comportant dans la phase huileuse un lipide solubilisant. Aussi, selon un premier aspect, l'invention vise une formulation du vert d'indocyanine sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle la phase huileuse comprend du vert d'indocyanine, au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant. De préférence, le lipide amphiphile est un phospholipide. Avantageusement, le lipide solubilisant comprend au moins un glycéride d'acides gras, par exemple au moins un glycéride d'acides gras saturés comportant 12 à 18 atomes de carbone. La phase huileuse peut comporter en outre au moins une huile, notamment une huile présente une balance hydrophile-lipophile (HLB) comprise entre 3 et 6, en particulier l'huile de soja ou l'huile de lin. De préférence, la phase aqueuse comporte en outre un co-tensioactif, notamment un co-tensioactif comportant au moins une chaîne composée de motifs d'oxyde d'éthylène ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. Le cotensioactif peut être choisi notamment parmi les composés conjugués polyéthylèneglycol /phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol, les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. La phase continue de l'émulsion peut comprendre notamment un tampon physiologiquement acceptable. Selon un deuxième aspect, l'invention vise un procédé de préparation d'une formulation de vert d'indocyanine, comprenant au moins une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, comportant les étapes consistant à : (i) préparer la phase huileuse comprenant au moins un lipide solubilisant, un lipide amphiphile et l'ICG ; (ii) disperser la phase huileuse dans une phase aqueuse sous l'action d'un cisaillement suffisant pour former une nanoémulsion; et (iii) récupérer la nano-émulsion ainsi formée. L'action de cisaillement peut être exercée en particulier par sonification. La phase huileuse peut être préparée notamment par mise en solution de tout ou partie des constituants dans un solvant approprié et évaporation subséquente du solvant. Selon un troisième aspect, l'invention vise l'utilisation de ladite formulation du vert d'indocyanine à titre d'agent de diagnostic. Ainsi formulé, l'ICG présente des caractéristiques optiques nettement améliorées (environ 10 fois plus performantes), ce qui permet d'augmenter les performances en imagerie, ou de diminuer la dose injectée. Par exemple, 2 à 10 mL d'ICG formulée en nano-émulsion à 0,27 mg/mL émettent un signal fluorescent au moins aussi intense que 2 à 8 mL d'une solution à 2,5 mg/mL d'ICG (dose injectée par voie intraveineuse chez un homme de 70kg pour une mesure du volume sanguin circulant et du débit cardiaque). En outre, la formulation selon l'invention est très stable, aussi bien en termes chimiques qu'au niveau colloïdal et concernant la performance optique dans le temps. Un autre des avantages présenté par la présente formulation est qu'elle peut être préparée en milieu isotonique, comme du chlorure de sodium à 154 mM, contrairement à I'ICG en suspension, qui flocule en un tel milieu et est donc injecté en milieu hypotonique (eau glucosée 5%). Elle est tout à fait appropriée pour l'utilisation en imagerie de fluorescence dans la mesure où elle est de préférence constituée de composés aujourd'hui tous approuvés pour injection chez l'homme. La formulation d'ICG selon l'invention est par ailleurs aisément accessible étant donné qu'elle est très facile à préparer et peu onéreuse. Par ailleurs, la formulation est adaptable à différentes pharmaco-cinétiques, par modification de la composition molaire des ingrédients. Enfin, la formulation selon l'invention est fonctionnalisable et permet donc de rendre I'ICG transportable dans la zone d'intérêt à imager au moyen d'un greffage avec une biomolécule ou molécule de ciblage, ce qui ouvre de nouvelles applications cliniques de l'imagerie de fluorescence. [Définitions] Dans le cadre de la présente description, on entend par le terme � nanoémulsion � une composition présentant au moins deux phases, généralement une phase huileuse et une phase aqueuse, dans laquelle la taille moyenne de la phase dispersée est inférieure à 1 micron, de préférence de 10 à 500 nm et en particulier de 20 à 100 nm (voir article C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar and M. J. Garcia-Celma, Curr Opin Colloid ln, 2005, 10, 102-110). Le terme � gouttelette � englobe à la fois les gouttelettes d'huile liquide proprement dites ainsi que les particules solides issues d'émulsions de type huiledans-eau dans lesquelles la phase huileuse est solide. Dans ce dernier cas, on parle souvent aussi d'émulsion solide. Le terme � lipide � désigne dans le cadre de cet exposé l'ensemble des corps gras ou des substances contenant des acides gras présents dans les graisses d'origine animales et dans les huiles végétales. Ce sont de molécules hydrophobes ou amphiphiles principalement constituées de carbone, d'hydrogène et d'oxygène et ayant une densité inférieure à celle de l'eau. Les lipides peuvent être à l'état solide à température ambiante (25°C), comme dans les cires, ou liquide, comme dans les huiles. Le terme � phospholipide � vise des lipides possédant un groupe phosphate, notamment les phosphoglycérides. Le plus souvent, les phospholipides comportent une extrémité hydrophile formée par le groupe phosphate éventuellement substitué et deux extrémités hydrophobes formées par des chaînes d'acides gras. Parmi les phospholipides, on citera en particulier la phosphatidylcholine, la phosphatidyl éthanolamine, la phophatidyl inositol, la phosphatidyl sérine et la sphingomyéline. Le terme � lécithine � désigne la phosphatidylcholine, c'est-à-dire un lipide formé à partir d'une choline, d'un phosphate, d'un glycérol et de deux acides gras. Il couvre de manière plus large les phospholipides extraits du vivant, d'origine végétale ou animale, dans la mesure où ils sont majoritairement constitués de phosphatidylcholine. Ces lécithines constituent généralement des mélanges de lécithines portant différents acides gras. On entend par le terme � acide gras � désigner des acides carboxyliques aliphatiques présentant une chaîne carbonée d'au moins 4 atomes de carbone. Les acides gras naturels possèdent une chaîne carbonée de 4 à 28 atomes de carbone (généralement un nombre pair). On parle d'acide gras à longue chaîne pour une longueur de 14 à 22 carbones et à très longue chaîne s'il y a plus de 22 carbones. On entend par le terme � tensioactif � des composés à structure amphiphile qui leur confère une affinité particulière pour les interfaces de type huile/eau et eau/huile ce qui leur donne la capacité d'abaisser l'énergie libre de ces interfaces et de stabiliser des systèmes dispersés. On entend par le terme � co-tensioactif � un tensioactif agissant en plus d'un tensioactif pour abaisser davantage l'énergie de l'interface. [Description de l'invention] [Emulsion] Selon un premier aspect, l'invention porte sur une formulation du vert d'indocyanine sous forme de nanoémulsion, comprenant au moins une phase aqueuse et au moins une phase huileuse, dans laquelle la phase huileuse comprend du vert d'indocyanine, au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant. L'émulsion est donc une émulsion de type huile dans l'eau. Elle peut être simple ou multiple, notamment en comportant dans la phase dispersée une seconde phase aqueuse. L'émulsion est caractérisée en ce que la phase huileuse comprend, outre le fluorophore, au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant. L'émulsion selon l'invention comporte par ailleurs dans la phase huileuse un ou plusieurs lipides amphiphiles qui ont pour mission sa stabilisation. Ces lipides amphiphiles comportent une partie hydrophile et une partie lipophile. Ils sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides, stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan vendus sous les dénominations Span� par la société Sigma; les lipides polymérisés ; les lipides conjugués à de courtes chaînes d'oxyde de polyéthylène (PEG) tels que les tensioactifs non-ioniques vendus sous les dénominations commerciales Tween� par la société ICI Americas, Inc. et Triton� par la société Union Carbide Corp.; les esters de sucre tels que les mono-et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose; lesdits tensioactifs pouvant être utilisés seuls ou en mélanges. Le ou les lipides amphiphiles sont de préférence d'origine naturelle et biocompatibles comme les phospholipides et le cholestérol. L'émulsion selon l'invention comprend par ailleurs un lipide solubilisant. Ce composé a pour mission de solubiliser le lipide amphiphile, peu soluble, dans la phase huileuse de la nanoémulsion. Le lipide solubilisant est choisi parmi les composés présentant une affinité avec le lipide amphiphile suffisante pour permettre sa solubilisation. Il peut s'agir d'une huile ou d'une cire. Dans le cas où le lipide amphiphile est un phospholipide, il peut s'agir notamment de dérivés du glycérol, et en particulier de glycérides obtenus par estérification de glycérol avec des acides gras. De préférence, le lipide solubilisant comprend au moins un glycéride d'acides gras. Particulièrement préférés sont les glycérides d'acides gras saturés comportant 12 à 18 atomes de carbone. Avantageusement, il s'agit d'un mélange de différents glycérides. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante. Les lipides solubilisants particulièrement préférés sont les mélanges de glycérides semi-synthétiques vendus sous la dénomination commerciale Suppocire�NC par la société Gattefossé et approuvés pour l'injection chez l'homme. L'ICG est de préférence du vert d'indocyanine grade médical sans iode résiduel. L'ICG peut être utilisé en solution concentrée dans un solvant organique approprié comme l'éthanol, le DMSO ou le méthanol. Toutefois, on préférera pour une application in vivo les solvants bien tolérés. De préférence, la phase huileuse dispersée de l'émulsion selon l'invention comporte par ailleurs en outre au moins une huile. De préférence, il s'agit d'une huile biocompatible. Les huiles biocompatibles sont de préférence utilisées sans modification chimique ou physique préalablement à la formation de l'émulsion. Les huiles biocompatibles utilisables selon la présente invention peuvent être d'origine naturelle (végétale ou animale) ou synthétique. Parmi de telles huiles, on peut notamment citer les huiles d'origine végétale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de soja, de palme, d'arachide, d'olives, de pépins de raisins et de tournesol ; les huiles d'origine animale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de poissons ; les huiles synthétiques parmi lesquelles figurent notamment les triglycérides, diglycérides, monoglycérides ; lesdites pouvant être utilisées seules ou en mélanges. Ces huiles peuvent être de première expression, raffinées ou inter-estérifiées. Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de l'invention, ces huiles sont choisies parmi les huiles peu solubles dans l'eau, c'est-à-dire présentant une balance hydrophile-lipophile (HLB) généralement inférieure à 8 et encore plus préférentiellement comprise entre 3 et 6 telles que par exemple l'huile de soja. Tout particulièrement préférée est une émulsion dans laquelle la phase huileuse comporte au moins une huile choisie parmi l'huile de soja et l'huile de lin. Bien entendu, l'émulsion comporte par ailleurs une phase aqueuse continue. De préférence, la phase aqueuse comprend ou est essentiellement constituée de l'eau ou d'un tampon physiologiquement acceptable tel qu'un tampon phosphate comme par exemple du PBS ("Phosphate Buffer Saline"), ou une solution de chlorure de sodium. La phase aqueuse peut toutefois en outre contenir des agents permettant d'augmenter la viscosité de la phase continue et faciliter l'émulsification comme le glycérol. Avantageusement l'émulsion selon l'invention comporte en outre un cotensioactif. De préférence, le co-tensioactif comporte au moins une chaîne composée de motifs d'oxyde d'éthylène ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. Avantageusement, le co-tensioactif est choisi parmi les composés conjugués polyéthylèneglycol /phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol, les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. [Procédé de préparation] La formulation décrite ci-dessus est accessible selon l'un des procédés connus d'émulsification, par exemple par sonification. Toutefois, de préférence, les formulations de la présente invention sont obtenues par un procédé dans lequel l'ICG est introduit dans la phase huileuse et non pas dans la solution aqueuse. Cette étape assure une encapsulation plus efficace du fluorophore et de ce fait un meilleur rendement quantique de fluorescence et une meilleure stabilité de la formulation obtenue. Aussi, selon un deuxième aspect, l'invention propose un procédé de préparation de la formulation de vert d'indocyanine comprenant au moins une phase aqueuse et au moins une phase huileuse, comportant de préférence les étapes consistant à : (i) préparer la phase huileuse comprenant au moins un lipide solubilisant, un lipide amphiphile et I'ICG; (ii) disperser la phase huileuse dans une phase aqueuse sous l'action d'un cisaillement suffisant pour former une nano- émulsion; et (iii) récupérer la nano-émulsion ainsi formée. De préférence, l'action de cisaillement est exercée par sonification. Par ailleurs, il est avantageux de préparer la phase huileuse par mise en solution de tout ou partie des constituants dans un solvant approprié et évaporation subséquente du solvant. Lorsque le composé amphiphile est difficilement soluble, il peut être intéressant de préparer la phase huileuse par mélange des composants de la phase dispersée puis dissolution du composé amphiphile dans l'huile à l'aide du lipide solubilisant. On procède ensuite à l'évaporation du solvant organique dans lequel est dissous l'ICG. On peut ensuite ajouter la phase aqueuse préparée par mélange des composants de la phase continue, L'ajout de la phase aqueuse à la phase huileuse est réalisé de préférence à chaud, de manière à ce que la phase huileuse soit liquide. L'émulsification est effectuée sous fort cisaillement, par exemple par ultra- sonification afin d'assurer la formation d'une nano-émulsion. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la formulation peut être fonctionnalisée par greffage de ligands biologiques ou de molécules d'intérêt en surface de la nano-émulsion. De préférence, le greffage est réalisé sur les co-tensioactifs qui forment une partie de l'interface entre la phase continue et la phase dispersée. Le couplage de ces molécules sur les co-tensioactifs peut être réalisé soit avant l'émulsification soit après l'émulsification. Après émulsification, il est préféré que les réactions chimiques de greffage se déroulent en solution aqueuse et à un pH ni trop acide ni trop basique (pH 5-11), afin de ne pas déstabiliser les émulsions. La première variante (greffage avant émulsification) est donc en principe préférée lorsque les réactions chimiques de greffage sont difficiles à conduire. Les molécules d'intérêt utiles pour une fonctionnalisation de l'émulsion selon l'invention peuvent être par exemple : a) Des ligands biologiques: i) un ligand biologique de ciblage : une entité biologique (anticorps, peptide, saccharide, aptamère, oligonucléotide...) ou chimique (acide folique par exemple) qui permet une reconnaissance spécifique de certaines cellules (par exemple des cellules tumorales comme décrit par exemple dans l'article de S. Achilefu, Technology in Cancer Research & Treatment, 2004, 3, 393-408) ou de certains organes, ii) un ligand biologique marqueur d'une activité biologique donnée, par exemple d'une activité enzymatique. Par exemple, ces ligands biologiques seront un peptide clivable par une protéase donnée, à l'extrémité duquel sera greffé un inhibiteur de la fluorescence de l'ICG. Ce type de ligands permet d'imager spécifiquement l'activité enzymatique de la protéase ainsi que cela est reporté dans l'article de C.H. Tung, Biopolymers, 2004, 76, 391-403. Un autre exemple est constitué par un ligand biologique comportant un pont disulfure séparant le label d'un inhibiteur de sa fluorescence. Ce ligand biologique permet d'imager spécifiquement l'internalisation de la sonde dans une cellule comme décrit par exemple dans la demande de brevet français FR 2 888 938 ; b) un agent de furtivité : c'est une entité ayant pour effet d'augmenter le temps de circulation de I'ICG dans l'organisme, et de ralentir son élimination ; c) un "vecteur d'assemblage" : c'est une entité qui peut permettre d'assembler le(s) label(s) fluorescent(s), et/ou le(s) ligand(s) biologique(s) de ciblage, et/ou le(s) agent(s) de furtivité, et/ou une ou d'autres fonctionnalités (délivrance de médicaments, autre modalité d'imagerie, fonction thérapeutique par exemple). L'émulsion peut par ailleurs contenir d'autres agents utiles dans l'application envisagée tels que : - des agents d'imagerie pour d'autres modalités d'imagerie telles que l'IRM (Imagerie par résonance magnétique), le PET (en anglais Positron Emission Tomography), le SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography), l'échographie ultrasonore, la radiographie ou la tomographie X ; ou - des molécules à effet thérapeutique (telles que ADN, oligonucléotides, molécules chimiques, ...) Ces agents peuvent être introduits dans la phase dispersée ou dans la phase aqueuse de l'émulsion, ou encore en sa surface, ou adsorbé sur la phase dispersée par liaison covalente ou non. L'émulsion résultante présente dans la phase dispersée un diamètre moyen de 10 à 500 nm, plus particulièrement de 20 à 200 nm et tout particulièrement inférieur à 100 nm. Sans vouloir être lié par une théorie quelconque, il est actuellement supposé que I'ICG est probablement à la fois encapsulé à l'intérieur de la nanoémulsion et intercalé dans sa membrane (ou coque). Etant donné que I'ICG est présent dès avant l'émulsification, il semble très peu probable que I'ICG soit adsorbé à la surface. La formulation d'ICG proposée présente une excellente stabilité dans le temps et par ailleurs de très bonnes propriétés optiques. Elle permet par ailleurs la fonctionnalisation avec un ligand de ciblage intéressante pour certaines applications. [Méthodes d'utilisation de l'émulsion] La formulation d'ICG proposée est particulièrement utile à titre d'agent de diagnostic. La stabilité chimique, optique et colloïdale, le faible diamètre moyen de la phase dispersée et le rendement quantique de fluorescence élevé et stable de l'ICG dans la formulation proposée la rend particulièrement intéressante pour l'imagerie de fluorescence. Dans cette application, l'émulsion est destinée à être injectée dans le corps pour servir de sonde fluorescente, le signal émis étant collecté par un dispositif de détection approprié. Une application importante est la détection des ganglions sentinelles. En effet, dans ce domaine, les méthodes principalement utilisées en clinique jusque là sont la scintigraphie (imagerie nucléaire) ou l'imagerie de coloration (colorant bleu comme le bleu patenté, le bleu de méthylène...). Les marqueurs utilisés sont alors le plus souvent des conjugués de l'albumine sous forme de nano-colloïdes, et sur laquelle a été absorbé un colorant ou greffé un chélate de radionucléide, généralement à base de 99mTc. Afin de s'affranchir des techniques d'imagerie nucléaire lourdes à mettre en place en salle d'opération, la fluorescence serait une technique de choix, plus sensible et quantifiable que les techniques de coloration. L'invention sera décrite plus en détail au moyen des exemples et des figures en annexe, lesquelles montrent : Fig.1A: La densité optique à 750 nm de nano-émulsions d'ICG selon l'exemple 1 avec un taux de charge de 0 �M à 1000 �M avant et après dialyse, est déterminée sur un spectrophotomètre CARY 300 SCAN. L'équation de la droite de corrélation linéaire avant dialyse 5 10 15 20 25 30 est : y=0,2235x-2,8271 avec un coefficient de corrélation (R) de 0,997; celle après dialyse est: y=0,0754x+0,0111 avec un R de 0,999. Le taux d'incorporation moyen de l'ICG dans les nanoémulsions est d'environ 35% ; Fig.1 B: La densité optique à 750 nm de nano-émulsions d'ICG selon l'exemple 1 avec un taux de charge de 0 �M à 1000 �M dialysées 10 et 40 jours après leur préparation. Après 10 jours, l'équation de la droite de corrélation linéaire est : y=0,0709x-0,1805 avec un R de 0,983; celle après 40 jours est : y=0,0704x-3,7455 avec un R de 0,988. Le taux de perte d'ICG des nano-émulsions 40 jours après encapsulation est estimé à environ 7%; Fig.2A: les spectres d'absorption de l'ICG dans l'eau, le DMSO ou formulé dans les nano-émulsions selon l'exemple 1. L'ICG est dissous dans l'eau ou dans le DMSO à raison de 7,75 mg/mL. Les spectres d'absorption de l'ICG dans l'eau, dans le DMSO et encapsulé dans les nano-émulsions (à la concentration finale de 1 iM),déterminés sur un spectrophotomètre CARY 300 SCAN ; Fig.2B : les spectres d'émission de fluorescence des mêmes échantillons déterminés sur un spectrofluorimètre PERKIN ELMER LS 50B ; Fig.3 : un histogramme du diamètre moyen de la phase dispersée des émulsions préparées comme décrit dans l'exemple 1 : 10 jours (barres graphes noires) et 40 jours (barres graphes blanches) après dialyse. Les mesures sont réalisées sur 1 mL d'une solution de PBS 0,1 x à laquelle a été ajouté un très faible volume (de 0,5 à 2 �L) de nano-émulsions contenant une quantité variable d'ICG (taux de charge variant de 0 à 1500 �M), par diffusion dynamique de lumière dans un ZeitaSizer Nano (Malvern Instrument) ; Fig.4A: Un histogramme représentant le rendement quantique de fluorescence F de l'ICG en solution dans le DMSO, dans l'eau ou encapsulé dans des nano-émulsions selon l'exemple 1,directement après dialyse (barres graphes noires), 10 jours (barres graphes hachurées) et 40 jours après dialyse (barres graphes blanches). Le rendement quantique de fluorescence F est calculé selon la formule : F= Fref x ((I fluo)/(I fluo)ref)) x ((1- l O-Abs 1ref/(l -1 O-Abs)) x (n 2 e f /n2) où Fref est le rendement quantique de fluorescence de la référence (ICG dans le DMSO ; Fref=0,13), Ifluo l'intégrale de fluorescence de l'échantillon, 'fluoref l'intégrale de fluorescence de la référence, Abs l'absorbance de l'échantillon à la longueur d'onde d'excitation, Absref I'absorbance de la référence à la longueur d'onde d'excitation, n2ef l'indice de réfraction de la référence (DMSO), n2 l'indice de réfraction de l'échantillon. A noter que le rendement quantique de l'ICG formulé en nano-émulsion est stable au cours du temps, contrairement à celui de l'ICG en solution dans l'eau ;. Fig.4B: Un histogramme représentant le rendement quantique F de l'ICG dans le DMSO et de différents types d'ICG (Cardiogreen de Sigma Aldrich ou Infracyanine de Serb laboratoires) formulés en nanoémulsions avec un taux de charge de 1000 �M (comme décrit dans l'exemple 1),calculé selon la formule indiquée ci-dessus. Il est important de noter que l'amélioration des propriétés optiques de l'ICG formulé en nano-émulsion est indépendante du type d'ICG utilisé ; 25 Fig 5A : Les niveaux de fluorescence de l'ICG dans l'eau et de l'ICG encapsulé dans les nano-émulsions (comme décrit dans l'exemple 1), sont représentés selon une échelle logarithmique en fonction des gammes de concentrations des deux solutions, déterminés par un dispositif optique constitué d'une source lumineuse émettant dans la 30 bande d'absorption de l'ICG et d'une caméra couplée à un objectif adapté. Les gammes de concentration (allant de 100 �M à 0,01 �M) de l'ICG dans l'eau et de l'ICG encapsulé dans les nano-émulsions (avec un taux de charge après dialyse de 350 �M) sont 10 15 20 5 15 20 25 30 respectivement préparées dans de l'eau ultra-pure et dans du chlorure de sodium à 154 mM et 10�L de chacun des points de concentration sont déposés dans un petit capillaire en PTFE de 1,9 mm de diamètre qui est placé sous la caméra pour la mesure du niveau de fluorescence ; Fig.5B : Les niveaux de fluorescence des capillaires contenant respectivement 2,5 nmoles d'ICG en solution dans l'eau et 0,5 nmoles d'ICG formulé en nano-émulsions comme précédemment décrit, représentés selon une échelle logarithmique, sont mesurés environ 25 min après la mesure illustrée à la figure 5A. A noter la décroissance au cours du temps du niveau de fluorescence de l'ICG dans l'eau et la stabilité de celui de l'ICG encapsulé dans les nanoémulsions ; Fig.6 : Le déclin de fluorescence de l'ICG libre en solution dans le méthanol ou encapsulée dans les nano-émulsions en suspension dans du PBS (10 mM, pH 7,3) préparées selon l'exemple 1, est mesuré sur une chaîne de mesure utilisant un laser Saphir-titane [Tsunami, Spectra-Physics,USA] (80Mhz, 100 femtoseconde), pompé par un laser continu néodyme-vanadate [Millennia Pro, Spectra-Physics, USA)] (532 nm, 5W) et accordable en longueur d'onde de 700 nm à 1000 nm. Selon le mode de fonctionnement de ce dispositif, le laser est injecté dans une fibre optique multimode, utilisée comme fibre excitatrice pour l'échantillon à étudier. Une deuxième fibre optique (de détection) collecte la fluorescence émise ou la diffusion laser via un système de filtrage. Le signal est mesuré par un tube photomultiplicateur [Hamamatsu, Japan] couplé à une carte de comptage TCSPC [Becker&Hickel, Allemagne]. Celle-ci est asservie par une partie prélevée (4 %) du signal laser (train d'impulsions) via une photodiode rapide (PD) [Becker&Hickel, Allemagne] avant l'injection dans la fibre optique. Les mesures ont été faites en utilisant une longueur d'onde d'excitation pulsée de 740 nm. Les 10 15 20 25 30 durées de vie de fluorescence t ont ensuite été obtenues en utilisant le logiciel SPClmage (Becker Hickl GmbH) par un ajustement par un déclin mono-exponentiel (xr2 = 1.0) des courbes de déclin de fluorescence déconvoluées de la fonction de réponse instrumentale (IRF) sont regroupées dans le tableau 2 de l'exemple 1. Fig 7A-D : Des clichés d'imagerie de fluorescence du système vasculaire chez le rat comme décrit à l'exemple 2. La photographie représente en lumière blanche la zone imagée par le dispositif optique. La dissection du cou du rat a été réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2%) et la carotide isolée a été placée au dessus d'une canule de dissection. Puis, on injecte en bolus dans la veine caudale 200 �L d'une solution diluée à 225 �M d'ICG formulée en nanoémulsions (taux de charge après dialyse de 350 �M). Le cliché B montre la carotide très rapidement après injection (dès 0,5 sec après injection). Le cliché C a été pris 1,5 sec après injection et montre que le signal fluorescent devient de plus en plus important au passage du fluorophore. Le cliché D a été pris 2,5 sec après injection et met en évidence un signal fluorescent encore plus important au passage du fluorophore ainsi formulé. Le cliché E a été pris 5 sec après injection et montre qu'après circulation de l'ICG encapsulé dans les nano-émulsions dans le système vasculaire des tissus de la tête, on observe un signal fluorescent de plus en plus intense dans la veine jugulaire (flèche blanche). Le léger signal fluorescent émis ensuite par les tissus environnants pourrait correspondre à la vascularisation de ces derniers. Fig. 8 A-B: Des clichés représentant une superposition entre les images obtenues en lumière blanche et les images de fluorescence des ganglions lymphatiques caudaux (ici le ganglion poplité représenté par les flèches blanches) chez la souris nude après injection intradermique d'ICG en solution dans de l'eau glucosée 5% (A) ou d'ICG encapsulé dans les nano-émulsions (B). Les clichés en lumière blanche ont été obtenus selon le même temps d'intégration (60 ms) alors que les clichés de fluorescence ont été obtenus selon des temps d'intégration différents (200 ms pour le cliché A et 30 ms pour le cliché B). Fig. 9 A-E: Des clichés par imagerie de fluorescence des tumeurs implantées en sous-cutanée deux semaines auparavant chez les souris nude après injection intraveineuse d'ICG encapsulé dans les nano-émulsions (A, C) ou d'ICG en solution dans de l'eau glucosée 5% (B, D). Les clichés A et B sont obtenus avec le dispositif optique sans laser dans une ambiance lumineuse alors que les clichés C et D sont obtenus avec le dispositif optique à l'abri de toute lumière sous excitation laser. Le cliché E représente l'imagerie de fluorescence des tumeurs après exérèse avec à droite la tumeur prélevée chez la souris injectée avec de l'ICG formulée en nanoémulsions et à gauche la tumeur prélevée chez la souris injectée avec de l'ICG en solution aqueuse glucosée 5%. EXEMPLES EXEMPLE 1 Formulation d'ICG sous forme d'émulsion Dans un récipient approprié, on a préparé un pré-mélange constitué de 0,05 g d'huile de soja (Sigma-Aldrich), de 0,150 g de glycérides semi-synthétiques vendus sous la dénomination commerciale Suppocire� NC (Gattefossé), et 0,310 25 mg et 9,30 mg d'ICG (Cardiogreen Sigma-Aldrich ou Infracyanine Serb laboratoires) en solution dans le diméthylsulfoxide (DMSO) ainsi que 0,100 g de lécithine de soja (enrichie à 45 % de phosphatidylcholine) vendue par la société Lipoïd sous la dénomination commerciale Lipoïde S45. Après évaporation du DMSO sous vide, le résidu est chauffé à 50-60°C et 30 le mélange liquide est maintenu à cette température pour l'émulsification (à température ambiante, le mélange devient cireux). La phase continue a été préparée par mélange de 0,05 g de glycérol, de 0,331 g de stéarate de polyoxyéthylène à 50 motifs d'oxyde d'éthylène vendu sous 10 15 20 la dénomination commerciale Myrj� 53 par la société ICI Americas Inc et de solution de chlorure de sodium à 154 mM pour compléter à 1,7 g. Cette solution a été maintenue à chaud (50-60°C) avant émulsification. La solution aqueuse a été ensuite ajoutée au mélange huile/lécithine. Puis la solution bi-phasique est mise en contact avec un sonificateur AV505� équipé d'une sonde conique de 3 mm de diamètre (Sonics, Newtown) plongeant d'environ 1 cm dans la solution. La solution a été sonifiquée pendant 5 minutes avec le sonificateur réglé sur 25 % de la puissance maximale, avec une séquence de pulses suivante : 10 secondes de sonification / 30 secondes de repos. Durant la sonification, la solution a été maintenue à 40°C dans un bain marie. La solution est ensuite dialysée contre une solution de chlorure de sodium à 154 mM avec une membrane de dialyse Spectra/Por� ayant un seuil de coupure égal à 12000 de manière à éliminer les réactifs n'ayant pas réagi. L'émulsion obtenue est filtrée sur un filtre de 0,22 pm de façon à la stériliser et à éliminer les agrégats. Cette émulsion peut ensuite être directement utilisée après dilution comme sonde fluorescente pour l'imagerie fonctionnelle in vivo. Le tableau 1 ci-dessous résume la composition de la formulation obtenue avant dialyse. Tableau 1 : Composition de la formulation de l'exemple 1 Masse mg % en poids Phase Huile de soja 50 2,5 dispersée Suppocire�NC 150 7,5 ICG 0,31-9,3 0,015-0,465 Surfactants Lécithine 100 5 Myrj 53 331 16,55 Phase Glycérol 50 2,5 aqueuse Solution NaCl 1319 65,95 154 mM Total 2000 100 Après dialyse, le fluorophore en excès (non formulé dans les nanoémulsions) est éliminé. Le taux d'incorporation moyen de l'ICG dans les nano- émulsions est de 35%, comme le montre la figure 1A. De plus, cette formulation de l'ICG est très stable pendant au moins 40 jours car il n'y a pas ou très peu de perte de fluorophore 40 jours après l'encapsulation, comme illustré sur la figure 1 B. Les caractéristiques spectrales de l'ICG ainsi formulée sont identiques à celle de l'ICG dans le DMSO, comme mis en évidence dans les figures 2A et 2B et le tableau 2. Tableau 2 : Propriétés optiques de l'ICG dans l'eau, dans le méthanol, dans le DMSO, et en nano-émulsion Fluorophore Absorption Emission F t(ps.) (nm) (nm) ICG dans l'eau 777 802 0,042 - ICG dans le méthanol 783 809 0,16 ICG dans DMSO 793 817 0,13 460 � 10 ICG en nano-émulsion 798 820 0,086 530 � 40 à 400 �M La nouvelle formulation obtenue possède une stabilité chimique, colloïdale et optique très importante (au moins > 40 jours) par rapport à celle recensée dans 15 la littérature (25 jours dans WO 2003/057259). En effet, l'émulsion ainsi obtenue présente un diamètre moyen de la phase dispersée, déterminé par diffusion de lumière (ZeitaSizer Nano, Malvern Instrument), de 29 nm et ce diamètre n'évolue pas au cours du temps, comme le montre la figure 3. 20 Bien que le rendement quantique de fluorescence F de l'ICG diminue légèrement lors de son encapsulation par rapport à celui mesuré dans le DMSO, il reste toutefois bien supérieur à celui mesuré dans l'eau, comme le montre le tableau 2 et la figure 4A. En outre, ce rendement quantique reste stable au cours du temps, contrairement à celui de l'ICG libre dans l'eau, comme l'illustre la figure 25 4A et ce, quelque soit le type d'ICG utilisé (Cardiogreen de Sigma Alrich ou Infracyanine de Serb laboratoires), comme le montre la figure 4B. Ces propriétés optiques optimisées permettent d'abaisser le seuil de détection sous un dispositif de mesure approprié, constitué d'une source lumineuse émettant dans la bande d'absorption de l'ICG avec une puissance d'excitation de l'ordre de quelque mW/cm2 et d'une caméra couplée à un objectif adapté à l'échantillon observé, comme indiquée sur les figures 5A et 5B. Par ailleurs, la durée de vie de fluorescence t de l'ICG augmente lors de son encapsulation, comme le montre la figure 6 et le tableau 2. Cette propriété est très intéressante car elle permet d'envisager l'utilisation de la formulation selon l'invention dans des dispositifs de mesure résolus en temps. Les clichés des figures 7A-7E mettent en évidence l'intérêt de la formulation d'ICG selon l'invention en particulier pour l'imagerie par fluorescence. Au regard de toutes ces propriétés, la formulation selon l'invention pourrait donc être commercialisée sous forme prête à l'emploi. EXEMPLE 2 Imagerie de la vascularisation Des rats mâles de souche Sprague Dawley (Harlan France) sont anesthésiés par inhalation d'isoflurane (4% pour l'induction et 2% pour le maintien) puis placés sous un dispositif d'imagerie. Ce dispositif est constitué : 1) d'une source de lumière émettant dans la bande d'excitation de l'ICG dont la puissance d'excitation est de l'ordre de quelque mW/cm2 et 2) d'une caméra CCD couplée à un objectif adapté à l'échantillon observé. Cet ensemble est équipé de filtres permettant de s'affranchir de la lumière d'excitation, des lumières parasites, et ne recueillir que la lumière de fluorescence. Une dissection de la région du cou est alors réalisée dans le but d'isoler la carotide et la veine jugulaire. Puis, on injecte par voie intraveineuse une formulation de l'ICG préparée tel que décrit dans l'exemple 1 avec un taux de charge de 350 �M après dialyse. On réalise alors l'imagerie de fluorescence du système vasculaire dans cette région avec visualisation dans un premier temps de la carotide puis de la veine jugulaire comme l'illustre la figure 7. Ce système d'imagerie de fluorescence permettrait de guider et/ou de contrôler en per-opératoire les gestes du chirurgien. EXEMPLE 3 Imagerie des ganglions sentinelles Des souris femelles de souche Nude (Janvier) sont anesthésiées par inhalation d'isoflurane (4% pour l'induction et 2% pour le maintien) puis placées sous le dispositif d'imagerie de fluorescence décrit ci-dessus. On injecte par voie intradermique dans la patte arrière droite 10 �L d'une formulation de l'ICG (0,5 nmole injectée) préparée tel que décrit dans l'exemple 1 ou d'ICG diluée dans de l'eau glucosée (1 nmole injectée). On réalise alors un suivi temporel par imagerie de fluorescence des souris ayant subi les injections. On constate que le traceur ICG formulé en nanoémulsions s'accumule rapidement (dès les 5 premières minutes) et préférentiellement dans les ganglions lymphatiques proches du site d'injection. Par ailleurs, l'utilisation du traceur ICG formulé en nano-émulsions permet d'accéder à une détection plus sensible des ganglions lymphatiques en comparaison avec les résultats obtenus en utilisant l'ICG formulée dans de l'eau glucosée 5%, comme l'illustre les figures 8A et 8B. EXEMPLE 4 Imagerie de tumeur Des cellules tumorales d'origine murine Ts/Apc ont été injectées en sous-cutané (106 cellules) dans le dos de souris femelles de souche Nude (Janvier) et la croissance tumorale au niveau du site d'injection est contrôlée pendant toute la période qui précède les séances d'imagerie. Deux semaines après, les souris présentaient une tumeur près du site d'injection et ont alors été anesthésiées par inhalation d'isoflurane (4% pour l'induction et 2% pour le maintien) pour être placées sous le dispositif d'imagerie décrit ci-dessus. Un volume de 200�L de soit une formulation de l'ICG (7 nmoles) préparée tel que décrit dans l'exemple 1, soit d'une solution d'ICG dans l'eau glucosée 5% (7 nmoles) a été injecté par voie intraveineuse respectivement chez 3 de ces souris. Un jour après, nous avons réalisé une nouvelle séance d'imagerie sur ces souris anesthésiées (isoflurane 2,5%) et nous avons observé une meilleure détection de la tumeur par imagerie de fluorescence pour la formulation de l'ICG tel que décrit dans l'exemple 1, comme l'illustre la figure 9. La formulation de l'ICG en nano-émulsions constitue donc un meilleur traceur fluorescent que l'ICG en solution dans de l'eau glucosée, en particulier pour la visualisation des tumeurs. EXEMPLE 5 Emulsion avec cRGD greffé Dans un récipient adapté équipé de moyens d'agitation, on prépare du PEPEG(5000)-maléimide en mélangeant 25mg de phosphatidyl-éthanolamine (PE, Sigma) et 100 mg de SCM-PEG 5000-maléimide (Creative Biochem) dans 1 mL de méthanol avec 5 �L de triéthylamine et on maintient sous agitation à température ambiante. Après 3 heures, le solvant et la triéthylamine sont évaporés, puis le produit obtenu, le PE-PEG(5000)-maléimide, est repris dans 1 mL de méthanol. Une émulsion encapsulant l'ICG est préparée comme dans l'exemple 1, mais en ajoutant dans la phase dispersée outre les 125 mg d'huile de soja, 375 mg de suppo-cire, 350 mg de lécithine et 1.5 mg de fluorophore comme précédemment, 25 mg de PE-PEG(5000)-maléimide précédemment préparé. Le peptide cyclique de ciblage des intégrines aVR3 surexprimées à la surface des cellules endothéliales, c(RGDf[s-S-acétylthioacétyl])K vendu par la société Ansynth Service BV (Pays-Bas) et dénommé cRGD dans ce qui suit possède un groupement thiol protégé sous la forme d'un acide mercapto-acétique. 2 mg de peptide dilué dans l'eau (500 �L) est déprotégé par ajout de 4 �L de TCEP 0.5 M (Sigma) 30 minutes avant le couplage avec la nano-émulsion. Pour la fonctionnalisation, l'émulsion est diluée dans un tampon HEPES/EDTA pH 7.4, puis la solution de peptide cRGD est ajoutée. Le mélange réactionnel est mélangé à température ambiante pendant 1 heure. 4 �mol de 2-mercapto-éthanol est ajouté en fin de réaction pour quencher les groupements maléimide n'ayant éventuellement pas réagi avec le peptide. La solution est ensuite dialysée contre du PBS avec une membrane de dialyse Spectra/Por� ayant un seuil de coupure égal à 12000 de manière à éliminer les réactifs n'ayant pas réagi. L'émulsion précédemment obtenue est filtrée sur filtre de 0,22 pm de façon à éliminer les agrégats, mais aussi de la stériliser. Cette émulsion peut ensuite être directement utilisée après dilution comme sonde fluorescente pour l'imagerie fonctionnelle in vivo. REVENDICATIONS1. Formulation du vert d'indocyanine sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, dans laquelle la phase huileuse comprend du vert d'indocyanine, au moins un lipide amphiphile et au moins un lipide solubilisant. 2. Formulation du vert d'indocyanine selon la revendication 1, dans laquelle le lipide amphiphile est un phospholipide. 3. Formulation du vert d'indocyanine selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le lipide solubilisant comprend au moins un glycéride d'acides gras. 4. Formulation du vert d'indocyanine selon la revendication 3, dans laquelle 15 le lipide solubilisant comprend au moins un glycéride d'acides gras saturés comportant 12 à 18 atomes de carbone. 5. Formulation du vert d'indocyanine selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle la phase huileuse comporte en outre au moins une huile. 6. Formulation du vert d'indocyanine selon la revendication 5, dans laquelle l'huile présente une balance hydrophile-lipophile (HLB) comprise entre 3 et 6. 7. Formulation du vert d'indocyanine selon l'une quelconque des 25 revendications 1 à 6, dans laquelle la phase huileuse comporte au moins une huile choisie parmi l'huile de soja et l'huile de lin. 8. Formulation du vert d'indocyanine selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle la phase aqueuse comporte en outre un co-tensioactif. 9. Formulation du vert d'indocyanine selon la revendication 8, dans laquelle le co-tensioactif comporte au moins une chaîne composée de motifs d'oxyde d'éthylène ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. 20 30 10. Formulation du vert d'indocyanine selon la revendication 9, dans laquelle le co-tensioactif est choisi parmi les composés conjugués polyéthylèneglycol /phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol, les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. 11. Formulation du vert d'indocyanine selon l'une des revendications 1 à 10, dans laquelle la phase continue de l'émulsion comprend un tampon physiologiquement acceptable. 12. Procédé de préparation d'une formulation de vert d'indocyanine, comprenant au moins une phase aqueuse continue et au moins une phase huileuse dispersée, comportant les étapes consistant à : (i) préparer la phase huileuse comprenant au moins un lipide solubilisant, un lipide amphiphile et l'ICG ; (ii) disperser la phase huileuse dans une phase aqueuse sous l'action d'un cisaillement suffisant pour former une nanoémulsion; et (iii) récupérer la nano-émulsion ainsi formée. 13. Procédé de préparation selon la revendication 12, dans lequel l'action de cisaillement est exercée par sonification. 14. Procédé de préparation selon la revendication 12 ou 13, dans lequel la 25 phase huileuse est préparée par mise en solution de tout ou partie des constituants dans un solvant approprié et évaporation subséquente du solvant. 15. Utilisation d'une formulation du vert d'indocyanine selon l'une des revendications 1 à 11 à titre d'agent de diagnostic. 15 20 30