FR 2933303 A1 20100108 FR 0803663 A 20080630 B0942FR 2933303 1 La présente invention concerne un substitut osseux et un procédé pour sa préparation. L'os est un matériau hybride constitué principalement par des cellules, du collagène de type I qui constitue une trame organique protéique et des cristaux d'hydroxyapatite de taille nanométrique. Cette association confère à la fois de l'élasticité et de la dureté au tissu osseux lui permettant de résister aux forces qui lui sont appliquées. L'os est donc dur, dense et très résistant. L'os compact présente un agencement de structures cylindriques parallèles de taille millimétrique, désignées par "ostéones". Ces ostéones sont eux-mêmes constitués de lamelles concentriques. La partie centrale des os longs riche en cellules est appelée "os spongieux". Au niveau de cet os, des lamelles osseuses forment un réseau macroporeux de travées minces et irrégulières. Plusieurs classes de matériaux synthétiques (désignés par "matériaux d'implants") ou naturels (désignés par "greffons") sont proposés dans l'art antérieur. Les matériaux d'implants sont généralement bio inertes, c'est-à-dire simplement tolérés par l'organisme, ou biocompatibles, c'est-à-dire qu'ils s'intègrent parfaitement à l'organisme hôte. Un greffon est un tissu osseux prélevé sur la personne à laquelle il est destiné (autogreffe) ou sur une tierce personne (allogreffe), et il est généralement ostéoconducteur, c'est-à-dire qu'il est capable de guider la repousse osseuse. Un substitut osseux ostéo-inducteur, c'est-à-dire capa- ble d'induire une reconstruction osseuse, constitue néan- moins un substitut idéal. L'élaboration d'un tel matériau est complexe. Sa mise en place nécessite l'utilisation de constituants qui ont une nature chimique et une phase cris- talline particulière afin d'optimiser sa parfaite intégra- tion au sein d'un organisme humain ou animal, et d'éviter ainsi le rejet. Son organisation tridimensionnelle doit être reconstituée pour assurer d'une part les propriétés mécani- B0942FR 2 ques et d'autre part une porosité appropriée à la colonisation dudit substitut par le tissu hôte. L'accès à l'organisation de la trame organique de l'os (20% en masse), ainsi que son association avec la phase minérale (70% en masse) dans le tissu sont très difficiles à reproduire in vitro. De nombreux travaux ont été effectués en vue de la synthèse de substituts osseux, et notamment des travaux portant sur la minéralisation de collagène. La minéralisation de collagène de tendons osseux de dinde a été étudiée par W. Traub, et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 9822-9826], mais le matériau obtenu ne présente pas une organisation analogue à celle de l'os. D'autres essais ont été effectués avec du collagène purifié in vitro, mais les conditions de forte dilution dans lesquelles les essais ont été effectués n'ont pas permis d'obtenir un matériau présentant la densité osseuse et l'organisation tridimensionnelle du collagène trouvées dans les tissus osseux vivants [Cf. D. Lickorish, et al. (J. Biomed. Mat. Res. 2004, 68A, 19-27) ; S. Yunoki, et al., (Matcr. Lett., 2006, 60, 999- 1002) ; D. A. Wahl, et al. (Eur. Cell. Mat. 2006, 11, 43-56)]. La cristallisation de calcite CaCO3 à partir d'une solution de CaC12 sous une atmosphère d'ammoniac générée par la décomposition thermique à température ambiante d'une poudre de (NH4) CO3 a été décrite par L. Addadi, et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84, 2732-2736). Il est également connu de précipiter du collagène à partir d'une solution acide par une augmentation du pH. R. L. Ehrman, et al. (J. Nat. Cancer Inst. 1956, 16, 1375-1403) décrivent un procédé dans lequel une solution de collagène dans l'acide acétique est mise en contact avec des vapeurs de NH3. Elle se transforme en un gel contenant des grains fins. La structure du matériau obtenu n'est pas décrite. M.M. Giraud-Guille, et al. (J. Mol. Biol. 1995, 251, 197-202) et (J. Mol. Biol. 1992, 224, 861-873) décrivent la structure "cristal liquide" obtenue à partir d'une solution B0942FR 3 concentrée en collagène ainsi que la transition sol-gel obtenue par élévation du pH de acide à basique. G. Mosser, M. M. Giraud-Guille, et al., (Matrix Biol. 2006, 25, 3-13) décrivent un procédé dans lequel une solu- tion acide en collagène (5 mg/mL) est concentrée progressivement dans des microchambres en verre afin d'obtenir une organisation hélicoïdale à longue portée des molécules de collagène ainsi qu'un gradient de concentration. La solution est alors mise en présence de vapeurs d'ammoniac, pour former des fibrilles et stabiliser l'organisation mise en place en phase liquide. B. A. Harley, et al., (Biomaterials 2006,) 27, 866-874) décrivent l'élaboration d'une matrice structurée de collagène contenant également un glucosaminoglycane. Des micron- brilles de collagène sont mélangées au sulfate de chondroïtine de manière homogène à 4°C. La solution est ensuite centrifugée dans un moule, congelée de manière ultra rapide, lyophilisée, puis réticulée à 105°C sous un vide de 50 mTorr pendant 24 heures. La nature fibrillaire du collagène n'est pas décrite. C. Guo, et al., (Biomaterials 2007, 28, 1105-1114) décrivent l'utilisation de billes magnétiques pour aligner une solution de fibrilles de collagène. Une solution de colla-gène préparée dans un tampon phosphate à des concentrations de 2,5 mg/ml, maintenue à 4°C, est mise en présence des billes magnétiques. Les mêmes échantillons sont également pré-parés en présence de cellules à une concentration finale en collagène à 1,2 mg/ml. Dans les deux cas, les échantillons sont mis dans un champ magnétique de moins de 1G lors de l'induction de la fibrillogenèse produite par une élévation de température à 37°C. Une atmosphère en CO2 est également utilisée lorsque des cellules sont intégrées dans la matrice. Les matrices sont très lâches et la nature fibrillée du collagène n'est pas mentionnée. M. J. Olsza, et al., (Calcif. Tissue Int. 2003, 72, 583-591) décrivent la calcification d'une éponge de collagène, en présence ou en 30 35 B0942FR 4 absence d'un polymère du type poly(acide aspartique). L'éponge de collagène est constituée par du collagène de type I obtenu à partir de tendon bovin. Le minéral est du carbonate de calcium et non du phosphate de calcium, aucune phase apatite n'est donc obtenue. La présence de fibres striées n'est pas démontrée et les fibres de collagène ne sont pas orientées. J. H. Bradt, et al., (Chem. Mater. 1999, 11, 2694-2701) décrivent un procédé dans lequel on prépare à 4°C, d'une part une solution de collagène (collagène de type I de derme de veau) à 1 mg/mL acidifiée par HC1 et contenant CaC12, et d'autre part une solution tampon contenant des ions phosphate. La solution de phosphate est ensuite mélangée à la solution de collagène permettant d'atteindre un pH de 6,8, et l'ensemble est chauffé à 30°C. La coprécipitation donne un mélange de phases contenant du phosphate de calcium, de l'hydroxyapatite et du phosphate octacalcique. De plus, les fibres de collagène sont isolées non orientées et ne constituent pas une matrice dense. N. Gehrke, N. Nassif, et al., (Chem. Mater. 2005, 17, 6514-6516) décrivent la re- minéralisation par du carbonate de calcium, en présence ou en l'absence d'un polymère du type poly(acide aspartique), de la trame organique de la nacre préalablement déminéralisée. Le but de la présente invention est de fournir un matériau utilisable comme substitut osseux biocompatible, ayant une structure très proche de la structure de l'os vivant, ainsi qu'un procédé pour sa préparation. Un matériau selon la présente invention comprend une phase organique (I) et une phase minérale (II). La phase organique (I) comprend des fibrilles constituées par des triples hélices de collagène I, lesdites fibrilles étant ordonnées à grande distance selon une géométrie 3D, qui peut être aléatoire, alignée, ou cholestérique, ou une combinaison des trois. La phase minérale (II) a une structure cristalline hexagonale, groupe d'espace 6/m, analogue à celle de B0942FR l'apatite, et sa composition chimique correspond à l'une des formules Calo-XMX (PO4) 6-y (HPO4) y (OH) 2+y-2x (a) Cal()-w/2[ (PO4) 6-w (CO3) w] [ (OH) 2-2z (CO3) z] (b) 5 dans lesquelles OSx 20 remplacement partiel de OH- et/ou de PO43- par un autre anion. Le remplacement de PO43- tend à faire augmenter le rapport Ca/P. Dans les formules (I) et (II), Cal+ peut être remplacé totalement ou partiellement par des ions de même charge tel 25 que par exemple Mg2+, Bat+, ou Sr2+. Les anions OH- et PO43- peuvent être remplacés partielle-ment ou totalement par des ions de même charge tels que par exemple F-, Cl-, ou Br- ou par des ions de charge différente tels que par exemple CO32-. 30 Le matériau selon l'invention peut en outre contenir une quantité infinitésimale de protéoglycanes, de glycosaminoglycanes et de molécules organiques favorisant la minéralisation. Par quantité infinitésimale, on entend une proportion inférieure à 2%. B0942FR 6 Les caractéristiques d'un matériau de l'invention peu-vent être déterminées par des analyses en microscopie optique, des analyses en microscopie électronique à balayage MEB, des analyses en microscopie électronique à transmission MET, et des analyses en diffraction des rayons X. Des lames semifines d'un matériau selon l'invention, observées en microscopie optique en lumière polarisée montrent des propriétés de biréfringence. Dans un cas idéal, l'observation d'alternances de bandes éclairées et de bandes éteintes associée au déplacement de ces franges lors de la rotation de la platine du microscope, indique une structure hélicoïdale. Des échantillons du matériau de l'invention, analysés en MEB, montrent des fibrilles orientées immergées dans une gangue minéralisée, sans amas cristallins individualisés d'ordre micrométrique. Des clichés de diffusion des rayons X aux petits angles, effectués sur un matériau de l'invention, montrent le signal anisotrope des fibrilles de collagène et les harmoni- ques de la période D = 67 nm. Des clichés de diffusion des rayons X aux grands angles montrent les pics principaux de la phase apatite. L'existence d'un coalignement entre le signal des fibrilles et celui du minéral caractérise le matériau de l'invention. Ce coalignement est mis plus particu- lièrement en évidence localement dans les zones où les fibrilles sont alignées. Un matériau selon l'invention peut être obtenu par un procédé consistant à préparer une solution aqueuse acide de collagène précurseur de la phase organique (I), et une solu- tion aqueuse de précurseurs de la phase minérale (II) et à faire précipiter le collagène par élévation du pH jusqu'à une valeur d'au moins 7. Il est caractérisé en ce que la précipitation de la phase minérale (II) est effectuée par mise en contact de la solution de précurseurs de la phase minérale avec la phase organique (I), avant ou après la précipitation de ladite phase organique (I). La durée du B0942FR 7 contact est fixée selon la vitesse de précipitation et le taux de charge minérale envisagé dans le matériau final. Dans un premier mode de mise en oeuvre du procédé, on fait précipiter le collagène de la phase organique (I) avant sa mise en contact avec une solution neutre de précurseurs de la phase minérale (II). Dans ce cas, la solution de précurseurs de la phase minérale (II) contient au moins les sels de calcium et de phosphate. La proportion de phase minérale dans le matériau final est modulée par la quantité d'ions apportée à la solution. Dans ce mode de mise en oeuvre, le collagène a acquis sa structure fibrillaire avant sa mise en contact avec la phase minérale. Dans un deuxième mode de mise en oeuvre du procédé, une solution acide de précurseurs de la phase organique (I) est mise en contact avec une solution acide de précurseurs de (II). Le mélange est alors soumis à une augmentation de pH qui induit la coprécipitation du collagène et de l'hydroxyapatite. Dans ce mode de mise en oeuvre, il convient d'éviter la dilution de la solution concentrée de collagène initiale. Un premier moyen pour éviter la dilution est de contenir la solution acide concentrée de précurseurs de la phase organique (I) dans un moule, dont la forme est adaptée à l'usage recherché et enfermé dans une membrane de dialyse. Un second moyen est d'introduire la solution concentrée de collagène dans une enveloppe souple constituée par une membrane de dialyse. Le moule ou ladite enveloppe sont ensuite immergés dans la solution de précurseurs de la phase minérale (II). La solution initiale de collagène présente de préférence les caractéristiques suivantes : sa concentration en collagène est entre 75 mg/mL et 1000 mg/mL, de préférence entre 100 mg/mL et 400 mg/mL - son pH est inférieur à 4, de préférence inférieur à 3, en présence d'acides, de préférence d'acide acétique 0,5 M. B0942FR 8 La solution de précurseurs de la phase minérale (II) présente de préférence les caractéristiques suivantes : la concentration en précurseur de phosphate, par exemple NaH2PO4, est inférieure à la limite de solubilité, de préférence de 1,5 à 900 mM, plus particulièrement de 66 à 330 mM ; la concentration en précurseur de calcium, par exemple CaCl2, est inférieure à la limite de solubilité, de préférence de 2,5 mM à 1,5 M, plus particulièrement de 11 à 550 mM) ; les quantités de précurseurs sont telles que le rapport molaire Ca/P est entre 1,5 et 1,8, de préférence de l'ordre de 1,67. A titre d'exemple, la limite de solubilité à 20°C est 15 de 7,08 M pour NaH2PO4, et de 3,83 M pour CaC12. Lorsque le matériau recherché contient une hydroxyapatite non stoechiométrique, la solution de précurseurs de la phase minérale contient en outre un ou plusieurs sels dont le cation est destiné à remplacer au moins partiellement 20 Cal+, et/ou un ou plusieurs sels dont l'anion est destiné à remplacer au moins partiellement PO43- ou OH-. Les sels des cations destinés à remplacer Cal+ sont avantageusement choisis parmi les sels contenant des cations monovalents ou divalents, tels que par exemple MgCl2, BaC12, 25 SrC12, NaCl, KC1, et NH4C1. Le précurseur de CO32 peut être NaHCO3. La quantité de précurseur de CO32- est de préférence telle que le rapport NaH2PO4/NaHCO3 soit égal à 1. En présence de carbonate, le rapport molaire Ca/(P+C) est entre 1,5 et 1,8, de préférence de l'ordre de 1,67. 30 La solution de précurseurs de la phase minérale (II) peut contenir en outre des protéoglycanes, des glycosaminoglycanes et des molécules organiques favorisant la minéralisation, telles que des chaînes de polymères d'acides aminés acides, de préférence un poly(acide aspartique) ayant une 35 longueur de chaîne entre 50 et 150 unités acide aminé, de B0942FR 2933303 9 préférence environ 100, et avec une concentration entre 0,01 �g/mL et 1,5 mg/mL, de préférence 0,1 �g/mL. L'élévation du pH est effectuée avantageusement par une atmosphère gazeuse basique, en particulier une atmosphère de 5 NH3, ou de (NH4) 2CO3 dans un mode de réalisation particulier dans lequel PO43 ou OH-et partiellement remplacé par CO32-. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape supplémentaire au cours de laquelle on imprègne le matériau obtenu par coprécipitation, par une 10 solution dite SBF (simulated body fluid) analogue à un fluide biologique, puis on ajuste le pH du milieu à 7,4. NaCl NaHCO3 KC1 K2HPO4.3H20 CaC12 Na2SO3Na2SO4 MgC12. 6H20 de 137 à 213 mM (par exemple 213,0 mM) de 1,2 à 6,3 mM (par exemple 6,3 mM) de 3 à 4,5 mM (par exemple 4,5 mM) de 1 à 1,5 mM (par exemple 1,5 mM) de 2,6 à 3,8 mM (par exemple 3,8 mM) de 0,5 à 0,75 mM (par exemple 0,75 mM) de 1,5 à 2,3 mM (par exemple 2,3 mM). Les concentrations de cette solution SBF représentent 20 environ 1,5 fois celles effectivement mesurées pour un fluide biologique (Cf. Zhang L.-J., et al., Mater. Lett. 2004, 58, 719-722). Le pH peut être ajusté à 7,4 avec un mélange de tris(hydroxyméthyl)aminométhane 0,01 mol/L et d'HC1 à 25 0,01 mol/L à 37°C. La présente invention est décrite plus en détail à l'aide des exemples suivants, auxquels elle n'est cependant pas limitée. Dans les exemples, on a utilisé un collagène de type I 30 préparé à partir de queues de jeunes rats Wistar, selon le mode opératoire suivant. Les tendons de queue de rat sont excisés dans une hotte à flux laminaire stérile, puis lavés dans une solution tampon phosphate saline contenant 137 mM B0942FR 2933303 10 de NaCl, 2,68 mM de KC1, 8,07 mM de Na2HPO4r et 1,47 mM de NaH2PO4r pour éliminer les cellules et les traces de sang. Les tendons sont ensuite trempés dans une solution de NaCl 4 M pour éliminer les cellules intactes restantes et 5 précipiter une partie des protéines à poids moléculaire élevé. Après un nouveau lavage avec la solution tampon saline, les tendons sont dissous dans une solution aqueuse à 500 mM d'acide acétique. La solution ainsi obtenue est clarifiée par centrifugation à 41000 g pendant 2 h. Les 10 protéines autres que le collagène de type I sont précipitées de manière sélective dans une solution aqueuse de NaCl 300 mM, puis éliminées par centrifugation à 41000 g pendant 3 h. Le collagène est récupéré à partir du surnageant par précipitation dans une solution aqueuse de NaCl 600 mM 15 suivie d'une centrifugation à 3000g pendant 45 min. Les culots ainsi obtenus sont dissous dans une solution aqueuse d'acide acétique 500 mM, puis dialysés soigneusement dans le même solvant pour éliminer totalement NaCl. Les solutions sont maintenues à 4°C et centrifugées à 41000 g pendant 4 h avant d'être utilisées. Des solutions de collagène à différentes concentrations sont préparées par dialyse inverse contre du polyéthylène glycol (35 kDa, Fluka) dissous dans une solution aqueuse d'acide acétique 500 mM, jusqu'à 50% (m/v) ou par évaporation lente dans une hotte à flux laminaire. La concentration en collagène de la solution acide a été déterminée avant la fibrillogenèse par détermination de la quantité d'hydroxyproline. Bien entendu, d'autres sources de collagène peuvent être utilisées. Exemple 1 On a préparé une solution précurseur de la phase minérale en dissolvant dans 40 ml d'eau, 110 mM de NaH2PO4r 66 mM de CaC12, 500 mM d'acide acétique et 0,40 �g de poly(acide aspartique). La solution est équilibrée à pH 2,2. B0942FR 11 La solution de collagène utilisée dans cet exemple a été dosée à environ 300 mg/ml. Elle se présente sous forme d'un gel élastique partiellement fibrillaire. La solution de collagène est introduite dans un boudin de dialyse (PM = 3500 Da), et le boudin est placé dans la solution de précurseurs de la phase inorganique dans un récipient ouvert. Ledit récipient est ensuite placé sous atmosphère d'ammoniac jusqu'à complète précipitation des sels à une température de 20°C. L'atmosphère d'ammoniac a provoqué une coprécipitation de collagène et d'hydroxyapatite, visible dès 3 heures. On peut laisser le milieu réactionnel mûrir pendant 8 jours. Les échantillons sont lavés par immersion dans une solution, avantageusement une solution tampon au phosphate 15 PBS (phosphate buffer solution). La figure 1 illustre l'analyse du matériau par diffusion des rayons X. La figure la représente un cliché SAXS et la figure lb représente un cliché WAXS. Le cliché SAXS montre le signal anisotrope des fibrilles de collagène 20 et les harmoniques de la période D = 67 nm. Ce signal est dans la même direction que celle observée pour le signal de la phase minérale observée sur le cliché WAXS en (b). Le cliché WAXS montre le signal de la phase minérale renforcé dans la même direction que le signal des fibrilles observé 25 en (a). Le signal correspondant à l'interdistance diatérai des molécules de collagène dans la fibrille est perpendiculaire au signal de la phase minérale. Les deux clichés indiquent une co-localisation des fibrilles striées du collagène et la présence de cristaux d'hydroxyapatite. De plus, ils indi- 30 quent que les cristaux d'hydroxyapatite sont orientés essentiellement le long de l'axe des fibrilles de collagène. Cette signature en diffraction des rayons X est comparable à celle trouvée sur l'os. La figure 2 représente une micrographie MEB. Elle 35 montre la présence de fibrilles orientées minéralisées. B0942FR 2933303 12 La figure 3 représente une coupe semi-fine du matériau observé par microscopie optique à lumière polarisée (A) et entre polariseurs croisés (B,C,D). - 3A représente une coupe semi-fine colorée au bleu de 5 toluidine qui sert d'agent contrastant ; - 3B représente la même zone que 2A, mais observée entre polariseurs croisés. La biréfringence est due d'une part à l'organisation de la phase organique et d'autre part à son imprégnation par la phase minérale ; 10 - 3C représente une autre zone observée entre polariseurs croisés ; 3D représente la même zone que 3C, également observée entre polariseurs croisés mais tournés de 45° par rapport à 3C. La variation des bandes de biréfringence entre les deux positions des polariseurs indique une ondulation, dans le plan de la coupe, des orientations des fibrilles de collagène minéralisées constituant le matériau. Exemple 2 Une solution diluée de collagène (1 mg/1) est injectée de manière à contrecarrer une évaporation d'eau dans une microchambre en verre de 15 �l. L'injection se poursuit jusqu'à obtenir une phase dense cristalline liquide de collagène. Le collagène est précipité sous atmosphère d'ammoniac, puis la microchambre est immergée dans la solution de précurseurs minéraux (ladite solution contenant : NaCl 213,0 mM, NaHCO3 6,3 mM , KCl 4,5 mM, K2HPO4.3H2O 1,5 mM, CaC12 3,8 mM, Na2SO3Na2SO4 0,75 mM, et MgC12.6H2O 2,3 mM) ajustée pH à 7,4 et maintenue dans cette solution pendant une durée de 6 mois à une température de 37°C. Ensuite, le matériau précipité est lavé par immersion dans une solution tampon au phosphate (PBS). B0942FR 13 La figure 4 illustre l'analyse du matériau par diffusion des rayons X. 4a représente un cliché SAXS et 4b représente un cliché WAXS. Les deux clichés sont analogues à ceux de l'exemple 1. Exemple 3 Une solution diluée à 5 mg/ml de collagène, préalablement dialysée contre une solution de NaH2PO4 (66 mM) et de CaC12 (110 mM), est injectée de manière à contrecarrer une évaporation d'eau dans une microchambre en verre de 15 �l. L'injection se poursuit jusqu'à obtenir une phase dense cristalline liquide de collagène. La microchambre est immergée dans une solution de précurseurs de la phase inorganique analogue à celle de l'exemple 1, dans un récipient ouvert. Ledit récipient est ensuite placé sous atmosphère de carbonate d'ammonium jusqu'à complète précipi- tation des sels à une température de 20°C. L'atmosphère d'ammoniac et de dioxyde de carbone a provoqué une co-précipitation de collagène et d'hydroxyapatite, visible dès 3 heures. On peut laisser le milieu réactionnel mûrir pendant 8 jours. Les échantillons sont lavés par immersion dans une solution tampon au phosphate PBS (PBS). La figure 5 représente une micrographie MEB. Elle montre la présence de fibres minéralisées présentant une organisation hélicoïdale. B0942FR Revendications1. Matériau comprenant une phase organique (I) et une phase minérale (II), caractérisé en ce que : - la phase organique (I) comprend des fibrilles constituées par des triples hélices de collagène I, lesdites fibrilles étant ordonnées à grande distance selon une géométrie 3D, qui est aléatoire, alignée, ou cholestérique ; - la phase minérale (II) a une structure cristalline hexagonale, groupe d'espace 6/m, analogue à celle de l'apatite, et sa composition chimique correspond à l'une des formules Calo-xMx (PO4) 6-y (HPO4) y (OH) 2+y-2x (a ) Calo-w/2 [ (PO4) 6-w(CO3)w] [ (OH) 2-2z (CO3) z] (b) dans lesquelles 0 3. Matériau selon la revendication 1, caractérisé en ce que la phase minérale est une hydroxyapatite non stoechiométrique, correspondant à l'une des formules (a) ou (b) dans lesquelles au moins l'un des indices x, y, w ou z des formules (a) ou (b) est non nul. 4. Matériau selon la revendication 3, caractérisé en ce que, dans les formules (a) et (b), Cal+ est remplacé totalement ou partiellement par des ions Mg2+, Bat+, ou Sr2+. 5. Matériau selon la revendication 3, caractérisé en ce que, dans les formules (a) et (b), les anions OH- et PO43-sont remplacés partiellement ou totalement par F-, Cl-, Br-ou CO32-. B0942FR 2933303 15 6. Matériau selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient en outre une quantité de protéoglycanes, de glycosaminoglycanes ou de molécules organiques favorisant la minéralisation, inférieure à 2%. 5 7. Procédé de préparation d'un matériau selon la revendication 1, consistant à préparer une solution aqueuse acide de collagène précurseur de la phase organique (I), et une solution aqueuse de précurseurs de la phase minérale (II) et à faire précipiter le collagène par élévation du pH 10 jusqu'à une valeur d'au moins 7, caractérisé en ce que la précipitation de la phase minérale (II) est effectuée par mise en contact de la solution de précurseurs de la phase minérale avec la phase organique (I), avant ou après la précipitation de ladite phase organique (I). 15 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on fait précipiter le collagène de la phase organique (I) avant sa mise en contact avec une solution neutre de précurseurs de la phase minérale (II), ladite solution neutre contenant au moins les sels de calcium et de phosphate. 20 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'une solution acide de précurseurs de la phase organique (I) est mise en contact avec une solution acide de précurseurs de (II), et le mélange ainsi obtenu est soumis à une augmentation de pH qui induit la coprécipitation du 25 collagène et de l'hydroxyapatite. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la solution acide concentrée de précurseurs de la phase organique (I) est contenue dans un moule qui est enfermé dans une membrane de dialyse, l'ensemble étant 30 ensuite immergé dans la solution de précurseurs de la phase minérale (II). 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la solution concentrée de collagène est introduite dans une enveloppe souple constituée par une membrane de B0942FR 2933303 16 dialyse, ladite enveloppe étant ensuite immergée dans la solution de précurseurs de la phase minérale (II). 12. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la solution initiale de collagène présente les 5 caractéristiques suivantes : - sa concentration en collagène est entre 75 mg/mL et 1000 mg/mL ; - son pH est inférieur à 4, en présence d'acides. 13. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en 10 ce que la solution de précurseurs de la phase minérale (II) présente de préférence les caractéristiques suivantes : - la concentration en précurseur de phosphate est inférieure à la limite de solubilité ; - la concentration en précurseur de calcium est 15 inférieure à la limite de solubilité ; - les quantités de précurseurs sont telles que le rapport molaire Ca/P est entre 1,5 et 1,8. 14. Procédé selon la revendication 7, pour la préparation d'un matéraiu selon la revendication 3, 20 caractérisé en ce que la solution de précurseurs de la phase minérale contient en outre un ou plusieurs sels dont le cation est destiné à remplacer au moins partiellement Ca2+, et/ou un ou plusieurs sels dont l'anion est destiné à remplacer au moins partiellement PO43- ou OH-. 25 15. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la solution de précurseurs de la phase minérale (II) contient en outre des protéoglycanes, des glycosaminoglycanes et des molécules organiques favorisant la minéralisation. 30 16. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'élévation du pH est effectuée par une atmosphère gazeuse basique.