FR 2932885 A1 20091225 FR 0803528 A 20080624 1 Procédé et dispositif de détection de la fluorescence d'une biopuce L'invention concerne un procédé et un dispositif de détection de la fluorescence d'une biopuce, et plus précisément de la fluorescence émise 5 par des chromophores fixés sur un substrat de la biopuce. Les biopuces sont largement utilisées aujourd'hui aussi bien pour la recherche que dans l'industrie. Elles comprennent essentiellement un substrat solide, en général plat, sur lequel on vient immobiliser des biomolécules telles que des brins d'ADN ou d'ARN, des protéines, des 10 antigènes, des anticorps, des aptamers, etc... ou bien des microorganismes entiers ou fractionnés tels que des bactéries, des cellules, des virus, des spores etc..., ou encore des micro-objets portant eux-mêmes des biomolécules. Les biopuces connues à fluorescence sont en général constituées 15 d'une lame de verre dont la surface a été fonctionnalisée chimiquement et porte, après réaction avec des composants d'intérêt, des � spots � fluorescents qui, en réponse à une excitation lumineuse à une longueur d'onde donnée, émettent une lumière sur une autre longueur d'onde. Cette lumière émise peut être collectée par une optique appropriée 20 et transmise à un capteur par exemple à photodétecteurs du type CCD ou CMOS. L'image obtenue de la surface de la biopuce comporte des points lumineux dont les intensités sont fonction de la quantité de chromophores présents en ces points. Les chromophores qui sont placés à l'interface entre un milieu 25 d'indice plus élevé et un milieu d'indice plus faible (typiquement une interface verre-air ou verre-liquide) vont préférentiellement émettre vers le milieu d'indice plus élevé dans un rapport égal (en première approximation) au cube du rapport des indices de réfraction des deux milieux, soit environ 4,1 dans le cas du verre et de l'air, ce qui signifie que, lorsque le capteur 30 est placé au-dessus de la biopuce, 80% environ de l'émission lumineuse des chromophores est perdu dans la lame de verre. En outre, les optiques utilisées ont une ouverture numérique limitée de sorte que seule une faible fraction de la lumière émise vers l'air peut être transmise au capteur. L'efficacité totale de collecte de la lumière émise par les chromophores est alors limitée à quelques pourcents. Pour réduire ces inconvénients, on a déjà proposé de capter la lumière émise par les chromophores vers le milieu d'indice plus élevé. Dans ce contexte, la réalisation la plus simple consiste à utiliser le capteur lui-même comme substrat de la biopuce et donc à déposer sur la surface du capteur un réseau de sondes biologiques que l'on mettra ensuite en contact avec les molécules à analyser. L'inconvénient de cette technique est son coût, car chaque analyse nécessite l'emploi d'un nouveau capteur. La présente invention a essentiellement pour but d'apporter une solution, simple, économique et efficace à l'ensemble de ces problèmes. Elle propose à cet effet un procédé de détection de la fluorescence émise par des chromophores fixés sur un substrat d'une biopuce, la détection consistant à éclairer les chromophores à une longueur d'onde d'excitation et à capter la lumière émise par les chromophores en réponse à cet éclairage, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser un substrat au moins partiellement transparent à la longueur d'onde d'émission des chromophores et portant des sondes biologiques mises en contact avec des cibles biologiques recherchées, à mettre le substrat en contact avec un capteur, par exemple à matrice de photodétecteurs du type CCD ou CMOS ou à émulsion photosensible, en interposant entre les chromophores et le capteur un filtre de réjection de la longueur d'onde d'excitation, ce filtre étant transparent à la longueur d'onde d'émission, et en assurant une continuité d'indice au moins partielle entre le substrat et le capteur, puis à éclairer le substrat à la longueur d'onde d'excitation des chromophores et à détecter au moyen du capteur les signaux lumineux émis par les chromophores. Après acquisition de ces signaux lumineux, le capteur est réutilisable pour une autre analyse : il suffit de séparer le substrat du capteur et de le remplacer par un autre substrat. L'acquisition des signaux lumineux des chromophores peut être faite � à sec � de façon traditionnelle, le substrat étant séché avant d'être posé sur le capteur. En variante, le procédé selon l'invention prévoit de poser et de fixer sur le substrat un dispositif fluidique comportant des canaux et/ou des chambres d'introduction ou de circulation de fluides, et d'utiliser ce dispositif pour amener des cibles biologiques en contact avec les sondes fixées sur le substrat. Dans ce cas, l'ensemble formé par le dispositif fluidique et par le substrat peut être posé sur le capteur avant que les cibles biologiques soient mises en contact avec les sondes du substrat. L'acquisition des images au moyen du capteur permet alors de suivre en temps réel les interactions entre les cibles et les sondes. L'invention propose également un dispositif de détection de la fluorescence émise par des chromophores fixés sur un substrat d'une biopuce, la détection étant réalisée par exécution du procédé décrit ci- dessus, le dispositif étant caractérisé en ce qu'il comprend : - un substrat au moins partiellement transparent à la longueur d'onde d'émission des chromophores, - un filtre de réjection de la longueur d'onde d'excitation des chromophores, - des moyens de détection et d'acquisition de la lumière émise par les chromophores en réponse à leur excitation lumineuse, ces moyens comprenant un capteur à matrice de photodétecteurs du type CCD ou CMOS par exemple ou à émulsion photosensible, - et des moyens de mise en contact du substrat avec le capteur, assurant une continuité d'indice au moins partielle entre le substrat et le capteur et permettant de retirer le substrat du capteur après usage. Le substrat est par exemple une plaque mince de verre ou de saphir, un film d'une matière plastique telle que du PDMS, du Mylar, du Zeonex, un filtre polariseur, un faisceau de fibres optiques ou un ensemble de tubes capillaires contenant les sondes. En variante, le substrat peut être formé par le filtre de réjection de la longueur d'onde d'excitation. Avantageusement, ce filtre comprend un filtre absorbant ou un filtre réfléchissant ou une combinaison de filtres absorbant et réfléchissant, notamment comme décrit dans la demande antérieure WO 200704575 de la déposante. Les moyens assurant la continuité d'indice entre le substrat et le capteur comprennent une couche mince de liquide ou de gel d'indice approprié ou de matière souple (par exemple en PDMS) reliant le substrat au capteur. Selon une autre caractéristique de l'invention, un dispositif fluidique comprenant des canaux et/ou des chambres d'introduction ou de circulation de fluides est destiné à être posé sur le substrat pour amener des cibles biologiques en contact avec des sondes fixées sur le substrat, ce dispositif étant réalisé en verre par gravure ou en polymère par moulage, par thermoformage ou par assemblage de films de polymère comportant des découpes correspondant aux canaux et/ou chambres précitées. L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 représente schématiquement un dispositif de détection selon l'invention, - les figures 2, 3 et 4 représentent schématiquement différentes étapes de réalisation d'une variante de réalisation de ce dispositif ; - la figure 5 est une vue schématique de dessus du dispositif de la figure 4 ; - la figure 6 illustre l'utilisation de ce dispositif posé sur un capteur ; - la figure 7 représente schématiquement l'image obtenue par le capteur du dispositif de la figure 6 ; - la figure 8 est une vue schématique agrandie du halo flou qui entoure chaque point de l'image de la figure 7. On se réfère d'abord à la figure 1, qui représente schématiquement un dispositif de détection selon l'invention, dans lequel la détection est faite � à sec �. Ce dispositif comprend un capteur 10, par exemple du type matriciel à photodétecteurs CCD ou CMOS ou bien en variante, un support d'une émulsion photosensible, sur lequel on a déposé un substrat mince 12 portant sur sa surface supérieure une série de sondes biologiques 14 par exemple agencées en réseau. Ces sondes ont été mises en contact avec des cibles biologiques d'intérêt, de façon classique, qui se sont fixées sur les sondes correspondantes, cette fixation étant mise en évidence par des marqueurs fluorescents. Après fixation des cibles sur les sondes 14, le substrat 12 est lavé, puis séché et ensuite posé sur le capteur 10 en étant positionné sur ce capteur de façon précise par tout moyen approprié et avec interposition d'une couche 16 d'une matière telle qu'un liquide ou un gel ou un film souple, assurant une continuité d'indice au moins partielle entre le substrat 12 et le capteur 10. L'éclairage du substrat 12 par une source lumineuse appropriée, telle par exemple qu'un générateur laser ou une diode électroluminescente 18 associée à un filtre 20, émettant sur une longueur d'onde d'excitation des marqueurs fluorescents, permet de détecter et de dénombrer les cibles biologiques fixées sur les sondes 14. Il faut monter, entre les marqueurs fluorescents et le capteur 10, un filtre de réjection de la lumière d'excitation des marqueurs fluorescents, ce filtre ayant un taux de réjection de la longueur d'onde d'excitation d'au moins 10-5 et étant transparent au moins à une partie du spectre d'émission des marqueurs fluorescents. Ce filtre de réjection peut constituer le substrat 12 lui-même ou être interposé entre ce substrat et le capteur 10. II peut être constitué d'un filtre absorbant ou d'un filtre réfléchissant ou de leurs combinaisons, comme déjà décrit dans la demande antérieure WO 200704575 de la déposante. On peut par exemple placer un filtre réfléchissant sur le substrat 12 et un filtre absorbant sur le capteur 10. Cette combinaison permet de bénéficier d'une amplification de la lumière d'excitation des marqueurs fluorescents, par un effet d'interférence constructive, et également d'une amplification de la fluorescence émise par les marqueurs. Le substrat est au moins partiellement transparent aux longueurs d'onde du spectre d'émission des marqueurs fluorescents ou des chromophores précités. En pratique, le rapport de ses transmittances des longueurs d'onde d'émission et d'excitation des marqueurs ou chromophores peut être d'au moins 105. Après acquisition de l'image fournie par le capteur 10, le substrat 12 peut être séparé de ce capteur et remplacé par un autre substrat 12 pour une nouvelle acquisition d'image. Le substrat peut être posé sur le capteur de la façon représentée au dessin, en étant en contact avec le capteur par sa face opposée à celle portant les marqueurs. En variante, c'est la face du substrat portant les marqueurs, qui peut être en contact avec le capteur. Dans la variante de réalisation représentée aux figures 2 à 6, un dispositif fluidique est associé au substrat pour la mise en contact des cibles biologiques avec les sondes portées par le substrat. Ce dispositif fluidique 22 comprend des canaux et/ou des chambres d'introduction et de circulation de fluides, ce dispositif étant réalisé en verre ou en polymère, par exemple par moulage, par thermoformage, ou par assemblage de films. On peut en particulier couler dans un moule un polymère réticulable ou polymérisable par exemple du type PDMS (polydiméthylsiloxane) ou une colle optique NOA, le fond du moule comprenant une structure en relief correspondant aux canaux et/ou chambres que l'on veut obtenir. Le polymère est ensuite réticulé ou polymérisé au moins partiellement de façon à ce que le produit moulé ait une tenue suffisante pour sa manipulation. En variante, on peut former le dispositif 22 par un assemblage de films polymères dont certains ont été découpés, par exemple au laser, pour réaliser les canaux et/ou les chambres voulus. Dans une autre variante, le dispositif 22 est réalisé par thermoformage d'un matériau polymère pressé sur un moule chauffé. Comme représenté en figure 2, le dispositif 22 est ensuite placé sur un substrat 12 porté par un support 24, la face supérieure du substrat 12 portant un ensemble de sondes 14 comme déjà décrit en référence à la figure 1. Lorsque le polymère du dispositif 22 n'a été que partiellement réticulé ou polymérisé lors du moulage de ce dispositif, on procède à une étape de réticulation ou de polymérisation finale de ce dispositif pour le fixer au substrat. Dans les autres cas, si l'adhérence du polymère du dispositif 22 sur le substrat 12 n'est pas suffisante, on applique une couche de colle optique sur le dispositif 22 préalablement à sa pose sur le substrat 12 et on irradie avec un rayonnement ultraviolet lorsque la pose du dispositif sur le substrat est faite. En variante, on peut également utiliser une colle sensible à la pression. On sépare ensuite l'ensemble dispositif 22-substrat 12 du support 24 et on pose cet ensemble sur un capteur 10 comme représenté en figure 4, la continuité au moins partielle d'indice entre le substrat et le capteur étant assurée par une goutte 26 de liquide ou d'un gel d'indice approprié déposé sur le capteur 10. Lorsque le substrat 12 est en matière souple, par exemple en PDMS ou lorsqu'il comprend une couche inférieure d'une telle matière souple, il suffit de l'application d'une pression pour assurer un contact optique entre le substrat 12 et le capteur 10. II faut ensuite alimenter le dispositif 22 en fluide et l'éclairer par une source lumineuse appropriée émettant sur la longueur d'onde d'excitation des marqueurs fluorescents, comme représenté schématiquement en figure 6, pour suivre en temps réel les fixations des cibles biologiques sur les sondes du substrat. Il faut également, comme décrit en référence à la figure 1, placer un filtre de réjection de la lumière d'excitation entre les sondes 14 et le capteur 10, ce filtre pouvant faire partie du substrat ou du capteur ou être ajouté à ces derniers, comme mentionné plus haut. Dans l'exemple de réalisation représenté au dessin, le dispositif 22 comprend un conduit 28 d'amenée de liquide et un conduit 30 de sortie de liquide, qui sont formés sur toute son épaisseur et qui communiquent à leurs extrémités inférieures avec un canal 32 formé en creux sur la face inférieure du dispositif 22 et qui est configuré pour passer sur toutes les sondes 24 portées par le substrat 12 (figure 5), ou avec un ensemble de canaux reliés entre eux et qui passent sur les sondes 14 du substrat 12. Le capteur permet d'obtenir une image du substrat 12 telle que celle 34 représentée schématiquement en figure 7, qui comprend un certain nombre de points lumineux 36 correspondant aux sondes 14 sur lesquelles sont fixées des molécules cibles associées à des marqueurs fluorescents. L'intensité lumineuse en chaque point 36 est une fonction du nombre de molécules cibles qui se sont fixées sur les sondes 14 en ce point. On constate que chaque point lumineux 36 présente un halo flou, ce qui rend nécessaire l'utilisation d'algorithmes appropriés de traitement de l'image par filtration ou par segmentation. L'étendue E de ce halo flou autour de chaque point lumineux 36 est déterminée par le diagramme de rayonnement des chromophores ou marqueurs fluorescents utilisés. Dans le cas d'un chromophore placé à une interface verre/air, l'émission est concentrée dans un cône d'environ 120° autour de la normale, avec un pic principal à 40° environ de la normale. Si t est l'épaisseur du substrat 12 et a l'angle d'émission, l'étendue E du halo flou est égale à tana. Dans le cas où le substrat 12 est une lamelle de verre ayant une épaisseur de 0,17 mm avec de l'air au-dessus, l'étendue E du halo est égale à 0,15 mm. Pour limiter cette étendue et augmenter l'efficacité de collecte de la lumière (c'est-à-dire la quantité de lumière émise dans le substrat), il est souhaitable d'utiliser des substrats ayant un indice de réfraction le plus élevé possible ou un empilement de couches diélectriques du type miroir de Bragg, et cela d'autant plus lorsque les mesures sont effectuées en phase liquide, car l'indice de réfraction du milieu au-dessus du substrat 12 est alors égal à 1,3 environ au lieu de 1 pour l'air. Le dispositif selon l'invention peut également être utilisé lorsque le phénomène observé pour la détection est la luminescence. Dans ce cas, les cibles sont liées à un substrat enzymatique qui émet des photons lorsqu'une espèce chimique réagissante est ajoutée. REVENDICATIONS1. Procédé de détection de la fluorescence émise par des chromophores fixés sur un substrat, par éclairage de ces chromophores à une longueur d'onde d'excitation et captation de la lumière émise par les chromophores en réponse à cet éclairage, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser un substrat (12) au moins partiellement transparent à la longueur d'onde d'émission des chromophores, et portant des sondes biologiques (14) mises en contact avec des cibles biologiques recherchées, à mettre le substrat (12) en contact avec un capteur (10), par exemple à matrice de photodétecteurs du type CCD ou CMOS ou à émulsion photosensible, en interposant entre les chromophores et le capteur (10) un filtre de réjection de la longueur d'onde d'excitation, ce filtre étant transparent à la longueur d'onde d'émission, et en assurant une continuité d'indice au moins partielle entre le substrat (12) et le capteur (10), puis à éclairer le substrat à la longueur d'onde d'excitation des chromophores et à détecter au moyen du capteur les signaux lumineux émis par les chromophores. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à sécher le substrat (12) avant de le placer sur le capteur (10). 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à poser et à fixer sur le substrat (12) un dispositif fluidique (22) comportant des canaux et/ou des chambres (28, 30, 32) d'introduction ou de circulation de fluides, et à utiliser ce dispositif pour amener des cibles biologiques en contact avec les sondes (14) fixées sur le substrat (12). 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'ensemble du dispositif fluidique (22) et du substrat (12) est placé sur le capteur (10) avant d'amener les cibles biologiques en contact avec les sondes du substrat. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que, après acquisition des signaux lumineux émis par leschromophores, le capteur (10) est séparé du substrat (12) et est réutilisable avec un autre substrat. 6. Dispositif de détection de la fluorescence émise par des chromophores fixés sur un substrat, par exécution du procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend : - un substrat (12) au moins partiellement transparent à la longueur d'onde d'émission des chromophores, - un filtre de réjection de la longueur d'onde d'excitation des chromophores, - des moyens de détection et d'acquisition de la lumière émise par les chromophores en réponse à leur excitation lumineuse, ces moyens comprenant un capteur (10) du type à matrice de photodétecteurs CCD ou CMOS par exemple ou à émulsion photosensible, - et des moyens de mise en contact du substrat (12) avec le capteur (10), assurant une continuité d'indice au moins partielle entre le substrat et le capteur et permettant de séparer le substrat du capteur après usage. 7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que le substrat est une plaque mince de verre ou de saphir, un film d'une matière plastique telle que du PDMS, du Mylar, du Zeonex, un filtre polariseur, un faisceau de fibres optiques ou un ensemble de tubes capillaires contenant les sondes. 8. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que le substrat est formé par le filtre de réjection de la longueur d'onde d'excitation. 9. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend un filtre absorbant ou un filtre réfléchissant ou une combinaison de filtres absorbant et réfléchissant. 10. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que les moyens assurant la continuité d'indice entre le substrat et le capteur comprennent une couche mince de liquide ou de gel ou de matériau souple d'indice approprié reliant le substrat au capteur. 11. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce qu'un dispositif fluidique (22) comprenant des canaux et/ou des chambres (28, 30, 32) d'introduction ou de circulation de fluide est destiné à être posé sur le substrat (12) pour amener des cibles biologiques en contact avec les sondes (14) fixées sur le substrat, ce dispositif (22) étant réalisé en verre par gravure ou en polymère par moulage, thermoformage ou assemblage de films de polymère comportant des découpes correspondant aux canaux et/ou aux chambres précitées.