FR 2934684 A1 20100205 FR 0855296 A 20080731 i METHODE DE DETECTION DE L'INTERNALISATION DE PROTEINES MEMBRANAIRES L'invention est relative à une méthode de détection de l'internalisation de protéines membranaires par des cellules vivantes et est particulièrement utile pour mettre en évidence des composés capables de provoquer cette internalisation. Plus précisément, la présente invention décrit une méthode de détection de l'internalisation d'une protéine transmembranaire couplée à un complexe métallique fluorescent, basée sur la mesure d'une variation de la luminescence dudit complexe io métallique fluorescent lorsqu'il est internalisé. ETAT DE LA TECHNIQUE : INTERNALISATION is Lors de l'activation des cellules par des ligands de récepteurs membranaires, ces derniers sont soumis à une cascade de mécanismes qui conduit classiquement à leur internalisation par la cellule. Ce processus permet d'une part, de supprimer ou diminuer le stimulus subi par la cellule par capture du ligand, généralement agoniste, et d'autre part, conduit à une désensibilisation des récepteurs et donc à 20 l'interruption de la cascade de transduction classique du signal. Cette désensibilisation de l'unité de transduction est un mécanisme complexe qui a été relativement bien décrit (voir par exemple Gainetdinov et al., Annu Review Neurosci 2004 v27 p107-44) 25 Ce mécanisme d'internalisation est l'un des processus majeurs de régulation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ainsi que des récepteurs à activité tyrosine-kinase. De manière schématique, l'activation d'un RCPG par un agoniste conduit à la phosphorylation de ce récepteur dans sa partie intracellulaire, ce qui induit le 30 recrutement d'un certain nombre de protéines intracellulaires, en particulier de l'arrestine qui provoque la formation de vésicules d'endocytose recouvertes de clathrine. Ces vésicules sont alors prises en charge par des mécanismes de transport intracellulaire qui conduisent à leur dégradation par fusion avec les lyzosomes, ou bien à leur reconversion par fusion avec la membrane plasmique. Les RCPGs constituent une cible de choix pour le développement de nouvelles molécules à activité thérapeutique, et plusieurs techniques existent pour mesurer des variations de leur niveau d'activation par des composés candidats : agonistes, s antagonistes ou encore agonistes inverses. Certaines d'entre elles ont justement pour objet de détecter l'activation de RCPGs en étudiant des événements liés à leur internalisation. L'arrestine est une protéine intracellulaire jouant un rôle majeur dans le processus io d'internalisation des RCPG et elle est utilisée dans plusieurs approches de détection de l'internalisation ainsi que le montre les documents ci-après : La demande WO 01/67106 décrit une méthode visant à identifier des ligands de RCPG, en mesurant la modulation de la liaison entre un RCPG et un mutant 15 constitutivement actif de l'arrestine, dont l'activité est indépendante du niveau de phosphorylation du RCPG, ledit ligand étant marqué par un atome radioactif, une enzyme, une protéine rapporteuse ou un composé fluorescent. La demande WO 01/59451, décrit une méthode de détection de l'activation d'un 20 RCPG qui utilise la technologie � ICAST � (Intercistronic Complementary Analysis Screening technology ou Technologie de criblage par analyse complémentaire intercistronique) basée sur la complémentation de deux sous-unités d'une enzyme mutante, chaque fragment de l'enzyme étant exprimé sous forme de protéine de fusion avec un RCPG d'une part, et avec par exemple l'arrestine d'autre part. Si une 25 interaction RCPG-arrestine a lieu, l'enzyme va être reconstituée par complémentation et pourra générer un signal détectable. Là encore, il s'agit donc d'analyser l'activation de RCPGs par détection de leur liaison à l'arrestine. Cette technique peut être améliorée en utilisant des mutants de RCPG ou de l'arrestine, comme décrit dans la demande WO 01/58923. 30 La demande WO 2005/007822 décrit une méthode pour déterminer si un composé module l'interaction entre deux protéines d'intérêt. Cette méthode est également basée sur la détection de la liaison RCPG-arrestine. La méthode présentée repose sur l'utilisation d'un RCPG fusionné, dans sa partie C-terminale, avec un facteur de transcription via une séquence peptidique sensible à une protéase spécifique. L'arrestine est quant à elle fusionnée avec cette protéase. Lors de l'activation du RCPG par un ligand agoniste, l'arrestine va interagir avec le RCPG, ce qui aura pour effet de rapprocher la protéase de la séquence de clivage et de provoquer la libération du facteur de transcription, qui sera alors capable d'activer la transcription d'un gène rapporteur dont l'activité pourra être détectée. Un des problèmes liés à l'utilisation de la liaison arrestine-RCPG comme marqueur de l'activation d'un RCPG est le caractère instable de cette liaison, qui n'est qu'une étape intermédiaire dans une cascade d'évènements conduisant à la formation de vésicules d'endocytose. La demande WO 04/065963 se propose de résoudre ce problème en utilisant des mutants de l'arrestine qui, contrairement à l'arrestine sauvage ne sont pas capables de se lier avec les partenaires protéiques de cette cascade et par conséquent restent liés de manière relativement stable au récepteur. Charest et al. (EMBO Rep. 2005 Apr; 6(4):334-40) ont développé une technique permettant la détection de variation de la structure tridimensionnelle de l'arrestine, qui survient lors de son interaction avec les RCPGs activés ; les auteurs ont construit une protéine de fusion luciférase-arrestine-YFP (� yellow fluorescent protein � ou protéine fluorescente jaune) et ont mis en évidence une augmentation du signal de BRET (� Bioluminescent Resonance Energy Transfer � ou transfert d'énergie de résonance par bioluminescence) intramoléculaire lors de l'activation de RCPGs. (technique connue sous l'expression � arrestine double-brillance �). La société Molecular Devices commercialise la technologie � Transfluor ��, décrite notamment dans le brevet EP 1 015 608, qui repose sur l'utilisation de protéine de fusion arrestine-GFP : l'utilisation de cellules exprimant cette protéine de fusion permet de visualiser, avec l'équipement d'acquisition d'images approprié, la translocation d'arrestine-GFP et sa redistribution dans la cellule, en réponse à l'activation d'un RCPG d'intérêt. D'autres approches de mise en évidence de l'internalisation de récepteurs membranaires qui ne sont pas basées sur la détection de la liaison RCPG-arrestine ou de la translocation intracellulaire d'arrestine ont été décrites notamment dans les documents ci-après : La demande WO 00/03246 décrit une méthode d'identification de composés capables d'induire l'internalisation de RCPGs, basée sur le marquage luminescent des récepteurs, soit par utilisation d'une protéine de fusion RCPG-protéine luminescente, soit en rajoutant dans le milieu une molécule marquée capable de se lier à ces récepteurs. Cette méthode comprend une étape d'acquisition d'images des cellules qui doivent être analysées pour identifier celles dont les récepteurs ont été io internalisés. La société Amersham Biosciences commercialise des dérivés de cyanine sous le nom commercial CypHer5� ; ces fluorophores organiques décrits notamment dans la demande WO 00/75237, ont la propriété de n'être que très faiblement fluorescents is à pH neutre, et très fluorescents à pH acide. Ces dérivés de cyanine peuvent être conjugués par exemple avec des anticorps capables de se lier à des RCPGs : lors de l'internalisation de l'anticorps-Cypher5 lié au RCPGs, Cypher5 va passer d'un milieu à pH neutre (milieu extracellulaire) à un milieu à pH acide (endosome) et sa luminescence va augmenter. 20 COMPLEXES DE LANTHANIDES ET EXTINCTION DE FLUORESCENCE PAR FRET DYNAMIQUE L'utilisation de complexes de lanthanides (également dénommés ci-après � complexes de terres rares �) en tant que composés fluorescents utiles à l'étude 25 de phénomènes biologiques a été développée dans les années 1990 (voir par exemple l'article de Mathis et al, Clin. Chem. 1995 Sep; 41(9):1391-7). Le phénomène de FRET est largement utilisé en biologie, notamment pour étudier des interactions biologiques. Il est basé sur l'utilisation d'un composé donneur 30 fluorescent (par exemple un complexe de lanthanide) et d'un composé accepteur éventuellement fluorescent, chacun couplé à une molécule biologique. Lorsqu'une interaction biologique étudiée provoque le rapprochement des molécules biologiques, et que le composé donneur est excité, un transfert d'énergie a lieu entre le donneur et l'accepteur et va résulter en une variation de la luminescence émise par le milieu réactionnel. Plusieurs sociétés commercialisent des réactifs permettant la mise en oeuvre de cette approche pour étudier des processus biologiques ; par exemple la Demanderesse fournit des composés donneurs et accepteurs ainsi que des trousses pour l'étude de phénomènes biologiques particuliers (détection d'activité enzymatique, dosage de seconds messagers etc...) Le phénomène de transfert d'énergie dynamique entre deux composés donneur et accepteur diffusant librement en solution dans un milieu à été décrit notamment par D. Thomas et al., (1978), PNAS, 75 :12, 5746-5750. Ce phénomène est souvent io désigné par l'acronyme DEFET, qui signifie en langue anglaise � Diffusion Enhanced Fluorescence Energy Transfer �. Contrairement au transfert d'énergie classiquement utilisé pour l'étude de phénomènes biologiques, qui est basé sur l'occurrence d'une interaction biologique qui va rapprocher les composés donneurs et accepteurs, le FRET par transfert dynamique, ou DEFET, repose sur la diffusion libre d'un ou des 15 deux partenaires de FRET dans le milieu réactionnel. D. Thomas et al. (1978), PNAS, 75 :12, 5746-5750) ont décrit un DEFET entre un complexe de terbium (Tb(DPA)3 et la rhodamine, tous deux en solution, et ont également utilisé le DEFET pour déterminer la distance minimale d'approche entre 20 du Tb(DPA)3 présent dans le milieu aqueux d'une vésicule membranaire et le chromophore éosine de l'éosine-phosphatidylcholine contenue dans la membrane. Ces travaux ont été effectués dans les conditions dites de � limite rapide de diffusion �, en particulier en utilisant un fluorophore donneur à durée de vie longue (2,2 msec). Ces conditions permettent notamment d'observer un signal à faible 25 concentration d'accepteur et dans lesquelles l'efficacité du transfert d'énergie ne dépend essentiellement que de la distance minimale d'approche entre le donneur et l'accepteur. La demande de brevet GB 2 223 096 décrit une méthode de détection d'une 30 molécule (par exemple un anticorps ou un antigène) qui est basée sur le concept même de FRET dynamique dont il est connu qu'il dépend de la constante de diffusion des partenaires de FRET. La méthode décrite consiste en effet à mesurer la variation du FRET dynamique entre un composé donneur et un composé accepteur, cette variation résultant de la modification de la diffusion du donneur ou 25 de l'accepteur dans le milieu suite à son interaction avec la molécule à détecter. Cette méthode nécessite qu'un des composés donneur ou accepteur soit conjugué avec une espèce capable d'interagir avec la molécule à détecter (par exemple le donneur ou l'accepteur est conjugué avec une protéine ou un anticorps). Zheng et al (J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 16178-16188) ont mis au point une classe de macrocycles lipophiles (DTPA-PDA-Cn, n=10,12) capables de complexer des lanthanides et de s'insérer dans les membranes lipidiques de manière non-spécifique, pour des applications de marquage cellulaire et d'utilisation en io résonnance magnétique nucléaire (dans le cas de complexes de gadolinium). Les auteurs ont utilisé la technique de DEFET pour déterminer la localisation cellulaire de ces complexes, en mesurant le signal résultant d'un transfert d'énergie entre des complexes de terbium et la calcéine. Les auteurs ont pu détecter un DEFET entre leurs complexes et la calcéine lorsque celle-ci est ajoutée au milieu extracellulaire 15 (la calcéine est imperméable à la membrane cellulaire) mais pas avec la calcéine intracellulaire (introduite dans les cellules sous forme d'ester neutre de calcéine), et en ont donc conclu que leurs complexes de lanthanides lipidiques s'insèrent sur la face externe de la membrane plasmique. Cette équipe n'a pas étudié les éventuelles variations de signal en cas d'internalisation de leurs complexes de lanthanides. 20 Le DEFET a été également utilisé par plusieurs équipes pour étudier la structure de protéines incorporant des motifs accepteurs d'énergie et leur interaction avec des composés donneurs d'énergie, pour déterminer les potentiels électrostatiques à la surface de protéines. COMPLEXES DE LANTHANIDES ET EXTINCTION DE FLUORESCENCE PAR EFFET REDOX L'effet de certains agents réducteurs sur la luminescence des complexes de 30 lanthanides a été décrit dans la littérature : Kielar et al., par exemple, ont étudié l'extinction dynamique de l'état excité de complexes d'europium et de terbium par différents agents réducteurs (Org. Biomol. Chem., 2007, 5, 2975-2982), et ont montré que pour les complexes de terres rares étudiés, les composés ayant un potentiel d'oxydation légèrement inférieur à 1 V peuvent avoir un effet extincteur de fluorescence par réduction : c'est le cas par exemple de l'ion iodure (+0,54V), de l'urate (+0,59V), l'ascorbate (+0,30 V) et certains catécholates (+0,54 V à pH 7). Ces auteurs ont par ailleurs démontré que l'effet extincteur de fluorescence de ces composés sur les complexes de terbium est plus important que celui observé sur les complexes d'europium, à structure chélatante identique. La demande W02008/007089 est relative à une méthode de dosage d'analytes io ayant un pouvoir réducteur par des complexes de terbium ou d'europium. Il existe un réel besoin d'une méthode sensible, facile à mettre en oeuvre et adaptée à une application à haut débit, pour détecter l'internalisation de protéines membranaires d'intérêt. Une telle méthode serait particulièrement intéressante pour is mettre facilement en évidence des composés capables de provoquer l'internalisation de protéines membranaires, notamment dans les approches visant à détecter de nouveaux médicaments. Par ailleurs, dans la mesure où seulement 10 à 40 % des récepteurs susceptibles d'être internalisés le sont effectivement, la méthode en question doit être suffisamment sensible pour permettre l'observation d'une 20 variation de signal lorsque l'internalisation a lieu. DEFINITIONS � Couple de partenaires de FRET � : cette expression désigne un couple constitué 25 d'un composé fluorescent donneur et d'un composé accepteur; lorsqu'ils sont à proximité l'un de l'autre et lorsqu'ils sont excités à la longueur d'onde d'excitation du composé fluorescent donneur, ces composés émettent un signal de FRET. Il est connu que pour que deux composés fluorescents soient partenaires de FRET, le spectre d'émission du composé fluorescent donneur doit recouvrir partiellement le 30 spectre d'excitation du composé accepteur. Les couples de partenaire de FRET préférés sont ceux pour lesquels la valeur RO (distance de Forster, distance à laquelle le transfert d'énergie a une efficacité de 50%) est supérieure ou égale à 30 À. � Signal de FRET � : désigne tout signal mesurable représentatif d'un FRET entre un composé fluorescent donneur et un composé accepteur. Un signal de FRET peut donc être une variation de l'intensité ou de la durée de vie de luminescence du composé fluorescent donneur ou du composé accepteur lorsque ce dernier est fluorescent. � Milieu réactionnel � : désigne tout contenant dans lequel peuvent être mises en contact des cellules vivantes avec des réactifs, tel que, par exemple, un puits d'une plaque, un tube à essai, etc. i0 " EDTA " : acide éthylènediaminetétraacétique " DTPA " : acide diéthylène triamine pentaacétique " TTHA " : acide triéthylènetétramine- N, N, N'N"N"'N"'-hexaacétique " DOTA " : acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N',N",N"'-tétraacétique 15 " NTA " : acide nitrilotriacétique "HDTA": acide hexaméthylènediamine tétraacétique "DTPP": acide diéthylènetriaminepentaphosphonique "EDTP": acide éthylènedinitrilotétrakis (méthylphosphonique) "NTP": acide nitrilotri(méthylènephosphonique) 20 "DOTP": acide 1, 4, 7, 10-tétra-azacyclododécane- N',N",N",'N"'- tetrakis(méthylènephosphonique) "DO3A": acide 1, 4, 7, 10-tétraazacyclododécane trisacétique "DOTAGA":1-(1-carboxy-3-carboxy-propyl)-4, 7, 10(carboxyméthyl)-1,4,7,10- tétraazacyclododéca ne 25 "DY647": fluorophore à structure pentaméthine commercialisé par la société Dyomics "D2": composé fluorescent accepteur organique commercialisé par la société Cisbio Bioassay. "PSB": Solution de tampon phosphate 30 " Lumi4-Tb " : complexe de terbium commercialisé par les sociétés Lumiphore et Cisbio Bioassay. "DMEM " : "Dulbecco's Modified Eagle's Medium" Milieu de culture cellulaire, disponible commercialement et utilisé dans de nombreuses applications. DESCRIPTION La présente invention a pour objet une méthode de détection de l'internalisation de protéines, qui comprend les étapes suivantes : a) marquage de la protéine d'intérêt par un complexe métallique fluorescent dont la durée de vie est supérieure à 0,1 ms, de préférence comprise entre 0,5 et6ms; b) ajout dans le milieu réactionnel d'un composé susceptible de provoquer io l'internalisation de la protéine d'intérêt ; c) ajout dans le milieu réactionnel d'un agent modulateur choisi parmi : 1. un composé accepteur de FRET fluorescent ou non-fluorescent, compatible avec ledit complexe métallique fluorescent, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est supérieure à 10-' 15 M, et de préférence comprise entre 10-6 M et 10-3 M, et dont le poids moléculaire est inférieur à 50 kD, de préférence compris entre 0,1 et 10kD; 2. un agent réducteur dont le potentiel redox est inférieur à +0,1 V et de préférence compris entre 0,25 et 0,75 V ; 20 3. un agent se liant de manière spécifique par liaison non covalente avec le complexe métallique fluorescent ; 4. un ion métallique qui rentre en compétition avec la terre rare pour former un complexe métallique non-fluorescent ; d) mesure de la luminescence émise par le milieu réactionnel à la longueur 25 d'onde d'émission du complexe métallique fluorescent et/ou à la longueur d'onde d'émission de l'agent modulateur ; e) comparaison du signal mesuré à l'étape d) avec un signal de référence mesuré sur des cellules ayant subit uniquement les étapes a) et c), une différence du signal mesuré à l'étape d) par rapport au signal de référence 30 étant représentative de l'internalisation de la protéine d'intérêt. Ces étapes essentielles peuvent être mise en oeuvre dans cet ordre (a, b, c, d, e). Ce mode de mise en oeuvre est préféré puisque dans ce cas le composé modulateur n'est pas présent dans le milieu extracellulaire lors de l'internalisation de la protéine 9 d'intérêt, ce qui réduit le risque que du composé modulateur soit présent dans les endosomes. Lorsque le modulateur est un composé accepteur de FRET ou un agent réducteur, ces étapes peuvent également être mise en oeuvre dans l'ordre suivant : a), c), b), d), e). Par ailleurs, une étape de lavage peut être ajoutée entre l'étape a) et l'étape suivante. Par �étape de lavage �, on entend une étape consistant à changer le io milieu de culture, une ou plusieurs fois (de préférence 2 ou 3 fois). Cette étape de lavage sert à éliminer du milieu extracellulaire le complexe métallique fluorescent qui ne se serait pas couplé avec la protéine d'intérêt ; cette étape est néanmoins optionnelle puisque que l'invention est basée sur l'observation d'une différence de signal en fonction de l'internalisation. Il est toutefois préférable d'opérer ce lavage 15 pour améliorer la sensibilité de la méthode. La méthode selon l'invention est basée sur la détection d'un signal émis par un milieu réactionnel contenant des cellules vivantes et les réactifs appropriés, et dont l'intensité varie en fonction de l'internalisation par les cellules d'une protéine 20 membranaire d'intérêt. Plus précisément, dans la méthode selon l'invention la protéine membranaire d'intérêt est liée, de manière directe ou indirecte et au niveau d'un domaine exposé au milieu extracellulaire, à un complexe métallique fluorescent capable d'émettre un 25 signal luminescent. Le milieu extracellulaire contient un composé (dit � composé modulateur �) dont la présence dans le milieu réactionnel a pour effet de modifier le signal émis par le complexe métallique fluorescent. L'internalisation de la protéine membranaire d'intérêt modifie l'accessibilité du 30 complexe métallique fluorescent pour le composé modulateur : le complexe métallique fluorescent ne sera plus exposé au milieu extracellulaire, mais à celui de l'intérieur d'une vésicule d'endocytose, ou au cytosol après un certain temps. Les inventeurs ont trouvé que ce changement d'accessibilité du complexe métallique fluorescent pour le composé modulateur se traduit par une variation du signal de luminescence émis par le milieu réactionnel, cette variation étant détectable voire éventuellement quantifiable, et cela malgré le fait que seulement 10 à 40 % des récepteurs transmembranaires susceptibles d'être internalisés le sont effectivement. Le signal de luminescence émis par le milieu réactionnel correspond à la luminescence émise par le complexe métallique fluorescent ou bien, lorsque le modulateur est composé accepteur de FRET, à celle émise par le modulateur. Dans les deux cas c'est la différence d'accessibilité du complexe métallique fluorescent pour le composé modulateur qui entraîne une différence de la io luminescence mesurée dans le milieu réactionnel. Les réactifs mis en oeuvre dans la méthode selon l'invention ainsi que les variantes de mise en oeuvre de celle-ci vont être maintenant décrites plus en détail. is A. Complexe métal/igue fluorescent De manière générale on entend par complexe métallique fluorescent un composé constitué d'un lanthanide ou de ruthénium et d'un agent complexant polydenté, c'est-à-dire comportant au moins 2, et de préférence entre 2 et 9 hétéroatomes 20 donneurs d'électrons, tels que N, O, S, ces atomes formant des liaisons de coordination avec le lanthanide ou le ruthénium. De manière préférée, le complexe métallique fluorescent comprend un ou plusieurs chromophores constitués de structures aromatiques ; de préférence ces structures aromatiques comprennent 1, 2 ou 3 hétéroatomes choisis parmi N et O, qui jouent le rôle d'atomes de 25 coordination du lanthanide ou du ruthénium. Un complexe métallique fluorescent approprié aux fins de l'invention doit être stable en termes d'association/dissociation de l'agent complexant et de la terre rare, et de préférence sa constante de formation (Kf) doit être supérieure à 1010 M-1 30 De nombreux agents complexants ont été décrits et sont connus de l'homme du métier : on peut citer à titre d'exemples d'agents complexants les composés suivants : EDTA, DTPA, TTHA, DOTA, NTA, HDTA, DTPP, EDTP, HDTP, NTP, DOTP, DO3A, DOTAGA. Des exemples de complexes métalliques fluorescents appropriés aux fins de l'invention sont : • Les cryptates de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptates de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et WO 01/96 877. Les cryptates de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptates de lanthanides sont commercialisés par la société Cisbio Bioassay. i0 • Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets US 4 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 15 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société PerkinElmer. • Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant tel que le tetraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles 20 aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. 25 • Les cryptates de terres rares décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP 1 154 990 sont également utilisables, en particulier ceux connus sous la dénomination commerciale Lumi4-Tb. 30 • Le quantum dye de la société Research Organics, de formule : • Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion s ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(II) tris(2,2'- bipyridine). Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodymium (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont également des io complexes de terres rares appropriés aux fins de l'invention, les complexes d'europium (Eu3+) et de terbium (Tb3+) étant particulièrement préférés. De très nombreux complexes de lanthanides ont été décrits et plusieurs sont actuellement exploités commercialement notamment par les sociétés PerkinElmer, 15 Invitrogen, Molecular Devices et Cisbio Bioassay. La figure 1 montre quelques exemples de complexes d'europium et de terbium pouvant être utilisés aux fins de l'invention. Bien que l'utilisation d'un complexe métallique fluorescent soit une des 20 caractéristiques essentielles de l'invention, celle-ci n'est pas limitée à un type de complexe métallique fluorescent donné, et l'homme du métier est à même de choisir parmi les complexes de métaux fluorescents, ceux qui sont les plus adaptés à son utilisation particulière et qui ont une durée de vie supérieure à 0,1 ms, de préférence comprise entre 0,5 et 6 ms. 25 Selon l'invention, le complexe métallique fluorescent est conjugué, c'est-à-dire lié de manière covalente, à un agent de couplage qui va permettre le marquage direct ou H3C 1 r,,, iH3 ,,N N Eu3' indirect de la protéine d'intérêt par le complexe métallique fluorescent. Ces agents de couplage sont décrit dans la partie � marquage des protéines d'intérêt � et sont de manière préférée un membre d'un couple ligand/récepteur, tel que par exemple un anticorps anti-tag, la biotine, ou bien un substrat d'une enzyme � suicide �, tels qu'un dérivé de la benzylguanine ou d'un chloroalcane. La conjugaison d'un complexe métallique fluorescent avec un agent de couplage relève des connaissances générales de l'homme du métier et repose sur l'utilisation de groupes réactionnels. Des complexes de terres rares disponibles io commercialement comportent un groupe réactionnel permettant cette conjugaison à un agent de couplage, ou comportent déjà un tel agent de couplage et sont prêts à l'emploi. B. Composé modulateur 15 B.1 : le composé modulateur est un accepteur d'énergie Dans l'une des mises en oeuvre de la méthode selon l'invention, on utilise un composé modulateur capable de modifier le signal émis par le complexe métallique fluorescent par le phénomène de transfert d'énergie de résonance de Forster 20 (FRET) du complexe métallique fluorescent (le donneur d'énergie) vers le composé modulateur (l'accepteur d'énergie). Ce phénomène bien connu de l'homme du métier est basé sur un transfert d'énergie entre deux composés partenaires de FRET, lorsqu'ils sont à proximité l'un de l'autre, dans le cas présent entre le complexe métallique fluorescent et le composé modulateur qui diffuse librement 25 dans le milieu réactionnel. En général, l'utilisation du phénomène de FRET pour étudier des processus biologiques implique que les membres du couple de partenaires de FRET soient chacun conjugués à des composés qui vont interagir entre eux, et ainsi amener les 30 partenaires de FRET à proximité l'un de l'autre, ce qui va générer un signal de FRET. Dans la méthode selon l'invention, l'accepteur d'énergie n'est pas conjugué à un composé quelconque et diffuse librement dans le milieu réactionnel, alors que le complexe métallique fluorescent est couplé de manière directe ou indirecte à la protéine membranaire d'intérêt : le transfert d'énergie entre les deux partenaires de 30 FRET dépend seulement de la diffusion du composé accepteur dans le milieu réactionnel, selon le phénomène de DEFET. Les inventeurs ont déterminé les conditions nécessaires à l'établissement d'un DEFET entre un complexe métallique fluorescent couplé à une protéine membranaire et un accepteur diffusant dans le milieu extracellulaire, ces conditions permettant également d'observer une variation de signal lorsque la protéine d'intérêt est internalisée. io Selon cette mise en oeuvre, les conditions expérimentales à utiliser pour observer un DEFET dépendant de l'internalisation de la protéine d'intérêt et du complexe métallique fluorescent sont les suivantes : • le complexe métallique fluorescent et le composé modulateur sont des partenaires de FRET ; 15 • la durée de vie du complexe métallique fluorescent doit être supérieure à 0,1 ms, de préférence comprise entre 0,5 et 6 ms. • la concentration du composé modulateur dans le milieu extracellulaire doit être comprise entre 0,1 pM et 1 mM. De manière préférée, la concentration de ce composé est comprise entre 1 pM et 100 pM, ce qui permet de 20 travailler dans la limite de diffusion rapide et de mesurer un signal de DEFET indépendant de la concentration en complexe métallique fluorescent. • le composé modulateur ne doit pas, de préférence, traverser la membrane cellulaire. De plus, sa constante de diffusion doit être suffisamment élevée. De manière générale, un composé modulateur ayant un poids inférieur à 25 50 kD, de préférence compris entre 0,1 et 10 kD est approprié aux fins de l'invention. Dans cette mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, le composé modulateur peut être fluorescent ou pas. Dans le cas ou le composé modulateur est un composé fluorescent accepteur d'énergie et que le lanthanide est le terbium ou l'europium, ce composé modulateur peut être choisi parmi les composés ou familles de composés suivants : les dérivés de cyanines, DY647, D2, la fluorescéine, la coumarine, la rhodamine, la carbopyronine, l'oxazine et ses analogues, les AlexaFluors, le crystal violet, les fluorophores de type perylènebisimide, les squaraines, les BODIPY� et leurs analogues, le NBD (nitrobenzoxadiazole) et ses dérivés, le DABCYL (acide 4-((4-(dimethylamino) phenyl) azo) benzoïque) Des composés non-fluorescents peuvent également être utilisés, sous réserve que leur spectre d'absorption soit compatible avec le spectre d'émission du complexe métallique fluorescent. Les accepteurs non-fluorescents suivants sont disponibles commercialement : les produits QXL de la société Anaspec et en particulier io QXL 570, QXL 610, QXL 670 et QXL 680 ; les produits DYQ660 et DYQ661 de la société Dyomics, les produits QSY7, QSY9 et QSY21 de la société Invitrogen. Le signal détecté dans le milieu réactionnel peut être : la luminescence émise par le complexe métallique fluorescent, ou, dans le cas ou le composé accepteur est 15 également fluorescent, la luminescence émise par le composé accepteur, leur intensité ou leur durée de vie. Dans tous les cas, ces signaux dépendent du phénomène de DEFET et vont varier lors de l'internalisation de la protéine transmembranaire d'intérêt, de la manière suivante : 20 • l'intensité ou la durée de vie de la luminescence du complexe métallique fluorescent mesurée à sa longueur d'onde d'émission va augmenter si la protéine transmembranaire est internalisée ; • si le modulateur est un composé fluorescent accepteur, l'intensité ou la durée de vie du signal mesuré à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur 25 va changer lorsque la protéine est internalisée. Il faut noter que le signal du composé accepteur dépend du DEFET avec le complexe métallique fluorescent, mais également d'éventuels effets d'extinction de luminescence intermoléculaires, se produisant dans le milieu extracellulaire lorsque la concentration en composé accepteur est élevée. Pour cette raison, après 30 internalisation, le signal émis à la longueur d'onde d'émission du composé modulateur accepteur peut augmenter ou diminuer. • si le modulateur est un composé fluorescent accepteur, son signal peut être corrigé en calculant le ratio signal accepteur/signal donneur. Cette méthode de correction ratiométrique du signal de FRET est largement utilisée et décrite dans la littérature. B2 : le composé modulateur est un agent réducteur pour le complexe métallique 5 fluorescent : Les inventeurs ont découvert que des agents réducteurs capables de diminuer la luminescence des complexes métalliques fluorescents par des réactions d'oxydoréduction au niveau du métal du complexe métallique fluorescent et/ou de la io structure complexante, peuvent être avantageusement utilisés dans la méthode selon l'invention. L'agent réducteur doit avoir un potentiel redox approprié pour réduire le complexe métallique fluorescent. L'homme du métier est à même, selon le complexe is métallique fluorescent choisi, de déterminer quels agents réducteurs sont appropriés pour mettre en oeuvre la méthode selon l'invention, mais les agents réducteurs dont le potentiel redox est compris entre + 0,1 et + 1,2 V sont préférés. De manière encore plus préférée, le potentiel redox de l'agent réducteur est compris entre + 0,25 et + 0,75 V. 20 Ainsi, lorsque le composé modulateur du signal émis par le complexe métallique fluorescent est un agent réducteur, il peut être choisi par exemple parmi les agents réducteurs suivants : Iodure, Ascorbate, Urate, catécholates, composés inorganiques tels que Fe(CN)62t Ces ions sont ajoutés au milieu de mesure sous 25 forme de sels avec un contre-ion, par exemple pour les anions, sous forme de sels de sodium ou de potassium. Dans cette mise en oeuvre, le signal mesuré va correspondre à la luminescence émise par le complexe métallique fluorescent, modulé par l'agent réducteur présent 30 dans le milieu extracellulaire : lorsque la protéine d'intérêt couplée au complexe métallique fluorescent est internalisée, le complexe métallique fluorescent n'est pas en contact ou à proximité de l'agent modulateur et sa luminescence sera plus importante que dans le cas ou l'internalisation n'a pas lieu, de même que sa durée de vie. 15 Dans cette mise en oeuvre, et pour pouvoir mesurer une différence de signal entre le cas ou il y a internalisation et le cas ou l'internalisation n'a pas lieu, les inventeurs ont déterminés que l'agent réducteur doit être présent dans le milieu réactionnel à une concentration supérieure ou égale à la constante de Stern-Volmer du couple complexe métallique fluorescent/agent réducteur. Cette constante est définie comme étant la concentration d'agent réducteur nécessaire pour provoquer une diminution de l'intensité de luminescence de complexe métallique fluorescent de 50 %. Des exemples de constante de Stern-Volmer pour des couples complexe lo métallique fluorescent/agent réducteur sont donnés notamment dans un article de Kielar et al (Org. Biomol. Chem., 2007, 5, 2975-2982) Ainsi dans un premier aspect de cette mise en oeuvre, c'est la luminescence du complexe métallique fluorescent qui est mesurée. Dans un deuxième aspect de cette mise en oeuvre, la première étape de la méthode selon l'invention comprend l'ajout dans le milieu de mesure d'un premier complexe métallique fluorescent et d'un second complexe métallique fluorescent destinés à marquer la protéine d'intérêt. 20 Ce deuxième complexe métallique fluorescent est identique au premier complexe à l'exception du métal qui est différent. Par exemple, le premier complexe métallique fluorescent est un complexe d'europium et le second complexe est un complexe de terbium comportant la même structure chélatante. Dans cette mise en oeuvre, une 25 protéine d'intérêt donnée est donc potentiellement soit liée de manière directe ou indirecte au premier complexe métallique fluorescent, soit liée de manière directe ou indirecte au deuxième complexe métallique fluorescent (soit n'est marquée par aucun complexe métallique fluorescent). 30 Dans cette mise en oeuvre il est possible de standardiser le signal mesuré, par exemple en faisant un ratio de la luminescence émise par un des complexes de lanthanides avec l'intensité de la luminescence émise par le second complexe métallique fluorescent. Ce type de mesure permet de comparer les signaux obtenus à partir de milieux réactionnels différents, et est donc particulièrement approprié pour effectuer des études quantitatives. B3 : le composé modulateur est un agent se liant de manière spécifique par liaison non covalente sur le complexe métallique fluorescent : Le composé modulateur peut être un agent possédant un domaine permettant une liaison spécifique et non-covalente avec le complexe métallique fluorescent : ces composés peuvent en effet provoquer une diminution de la luminescence du io complexe métallique fluorescent. Ces composés peuvent être choisis parmi : des anticorps ou des fragments d'anticorps, des peptides, ou des aptamères, chacun possédant un domaine de liaison au complexe métallique fluorescent. Parmi ces agents, les modulateurs préférés sont les anticorps ou fragments is d'anticorps capables de reconnaître un complexe métallique fluorescent. La demande WO2007/116069(A1) décrit la préparation d'anticorps spécifiques de complexes de terres rares et l'homme du métier dispose par ailleurs de techniques lui permettant de fabriquer ce type de composés. 20 Pour mettre en oeuvre la méthode selon l'invention avec ce type de modulateur, il convient de rajouter le composé susceptible de provoquer l'internalisation avant d'ajouter l'agent modulateur, qui dans le cas contraire serait internalisé en même temps que le complexe métallique fluorescent. Autrement dit, dans cette mise ne oeuvre, les étapes de la méthode décrite ci-dessus doivent être effectuées dans 25 l'ordre suivant : a), c), b), d), e). B4 : le composé modulateur est un ion métallique qui rentre en compétition avec la terre rare pour former un complexe métallique non-fluorescent : 30 Un autre type de modulateur qui convient pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention est un ion métallique qui va rentrer en compétition avec la terre rare pour former un complexe non-fluorescent avec l'agent complexant. Dans le cas des chélates de terre rare, l'agent modulateur peut ainsi être l'ion Mn2+. Dans ce cas l'agent modulateur est ajouté au milieu extracellulaire sous forme de sel avec un contre-ion approprié, par exemple sous forme de MnCl2. Pour mettre en oeuvre la méthode selon l'invention avec ce type de modulateur, il convient de rajouter le composé susceptible de provoquer l'internalisation avant d'ajouter l'agent modulateur. Autrement dit, dans cette mise en oeuvre, les étapes de la méthode décrite ci-dessus doivent être effectuées dans l'ordre suivant : a), c), b), d), e). io C. Protéines d'intérêt ù Marouage par un complexe métallioue fluorescent L'invention peut être mise en oeuvre avec toutes les protéines membranaires susceptibles d'être internalisées, sous réserve qu'elles puissent être couplées, de manière directe ou indirecte et dans leur partie extracellulaire, avec un complexe is métallique fluorescent. L'invention est particulièrement utile pour étudier l'internalisation des récepteurs couplés aux protéines G (ci-après � RCPG�), et les récepteurs à activité tyrosine-kinase (ci-après � RTK �), dont un des mécanismes de régulation est 20 l'internalisation, comme mentionné précédemment. Il est néanmoins possible de mettre en oeuvre l'invention avec d'autres protéines membranaires dont on veut vérifier si elles sont internalisées ou non. 25 Une mise en oeuvre particulièrement aisée de l'invention consiste à conjuguer le complexe métallique fluorescent à un composé connu (ligand) comme étant capable de se lier à une protéine d'intérêt : le ligand modifié, en se liant à la protéine d'intérêt, permets le marquage indirect de cette protéine. Cette mise en oeuvre peut néanmoins limiter le domaine d'application de l'invention puisqu'elle ne permettra 30 pas d'identifier de nouveaux ligands de cette protéine qui se lieraient au même domaine de liaison sur la protéine. Elle peut néanmoins être utilisée par exemple avec des modulateurs allostériques. De nombreuses techniques ont été décrites pour modifier les protéines et l'homme du métier est à même d'utiliser les outils existants pour coupler une protéine à un complexe métallique fluorescent. En particulier les techniques classiques de biologie moléculaire permettent de rajouter, supprimer ou modifier un domaine donné d'une protéine. La seule caractéristique essentielle à la mise en oeuvre de l'invention est que le complexe métallique fluorescent soit couplé à la protéine de manière à se trouver dans le milieu extracellulaire, pour que le signal de luminescence émis par le milieu réactionnel soit effectivement dépendant de la présence dans le milieu io extracellulaire d'un composé modulateur. Si la protéine d'intérêt est un RCPG ou un RTK, le complexe métallique fluorescent sera donc conjugué à cette protéine via une modification de son domaine N-terminal (extracellulaire), pour permettre son marquage direct ou indirect par le 15 complexe métallique fluorescent selon une des techniques décrite ci-après. A titre illustratif et non limitatif, on peut citer les techniques suivantes pour coupler une protéine transmembranaire avec un complexe métallique fluorescent : 20 * Couplage de /a protéine d'intérêt avec un complexe métallique fluorescent de manière indirecte (non covalente). Le complexe métallique fluorescent peut être couplé avec la protéine d'intérêt par l'intermédiaire d'un couple de partenaires de liaisons dont l'un au moins est de nature protéique. Dans cette approche, la protéine d'intérêt est fusionnée par les 25 techniques classiques de biologie moléculaire avec le partenaire de liaison de nature protéique par les techniques classiques de biologie moléculaire (construction d'un vecteur d'expression comprenant une séquence de nucléotides codant pour la protéine d'intérêt, fusionnée avec celle codant pour le partenaire de liaison protéique, et introduction du vecteur d'expression dans la cellule). Le complexe 30 métallique fluorescent est conjugué de manière covalente à l'autre partenaire de liaison, que l'on appelle ici agent de couplage, qui sera ensuite ajouté au milieu extracellulaire. La reconnaissance des partenaires de liaison permet le marquage indirect de la protéine d'intérêt par le complexe métallique fluorescent. A titre d'exemple non limitatif de partenaires de liaison particulièrement adaptés à la mise en oeuvre de l'invention on citera : • le couple constitué de la séquence cystéine-cystéine-X-X-cystéine-cystéine (CCXXCC) dans laquelle X est un acide aminé quelconque et d'un composé bi-arsenic. Ces composés bi-arsenic peuvent être facilement marqués avec une molécule organique du type fluorescéine ou rhodamine (voir B.A.Griffin et al. (1998) Science. 1998, 281, 269-271 et S.A. Adams et al. (2002) J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 6063-6076 pour des détails sur la technologie). io • Le peptide BTX (bungarotoxine), composé d'un peptide de 13 acides aminés qui est reconnu par la bungarotoxine (BTX), peut être couplé à une molécule fluorescente. (voir C. M. McCann et al. (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952). • Le couple streptavidine / Biotine : La séquence de liaison de la Streptavidine is (SBP-Tag) est une séquence formée par 38 acides aminés qui présente une haute affinité pour la biotine pouvant être préalablement marquée avec un complexe métallique fluorescent (voir C. M. McCann et al. (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952). • La séquence de l'enzyme dihydrofolate réductase d'E. coli (eDHFR) qui lie 20 spécifiquement et avec une haute affinité des ligands, tels que la triméthoprime sur lesquels peuvent être greffés le complexe métallique fluorescent selon la technologie dénommée � Ligand link Universal labelling technology � de la Société Active Motif. • Les couples tags/antitags sont des partenaires de liaison fréquemment 25 utilisés pour marquer des protéines. Le terme � tag � désigne une petite � étiquette � protéique constituée d'un séquences d'acides aminés, généralement mais pas obligatoirement assez courte (moins de 15 acides aminés), qui est fusionnée à la protéine d'intérêt ou bien est naturellement présente dans cette protéine. Le terme antitag désigne un anticorps se liant 30 de manière spécifique audit tag. Dans cette mise en oeuvre, l'anticorps antitag est lié de manière covalente au complexe métallique fluorescent. Lorsque l'anticorps ainsi marqué est ajouté au milieu extracellulaire, il se lie au tag conjugué à la protéine d'intérêt et l'interaction tag/antitag permet le marquage indirect de cette protéine par le complexe métallique fluorescent. A titre d'exemple non-limitatif de couples tags/antitags, on peut citer les couples suivants dont les membres sont disponibles commercialement : GST/anticorps anti-GST dans lequel GST représente la glutatione S-transférase ou un de ses fragments ; 6HIS/anticorps anti-6HIS dans lequel 6HIS est un peptide constitué de 6 histidines ; Myc/anticorps anti-Myc dans lequel Myc est un peptide constitué des acides aminés 410-419 de la protéine Myc humaine ; FLAG/anticorps anti-FLAG dans lequel FLAG est un peptide ayant les 8 acides aminés DYKDDDDK ; HA/anticorps anti HA dans lequel HA est un épitope de l'hémaglutinine d'Influenza, constitué des io 9 acides aminés YPYDVPFYA. Il est clair que la nature exacte du tag n'est pas critique pour la mise en oeuvre de l'invention. * Couplage de /a protéine d'intérêt avec un complexe métallique fluorescent de manière directe (covalente). is Dans cette approche, le complexe métallique fluorescent va être couplé à la protéine d'intérêt par une liaison covalente ; plusieurs techniques ont été décrites et les réactifs nécessaires à leur mise en oeuvre sont disponibles commercialement. Pour ce couplage, on pourra utiliser l'une quelconque des techniques ci-après : 20 • Formation d'une liaison covalente au niveau d'un groupe réactif présent sur la protéine d'intérêt, en particulier au niveau d'un des groupes suivants les groupes suivants : le groupe amino terminal, le groupe carboxylate terminal, les groupes carboxylate des acides aspartiques et glutamiques, les groupes amines des lysine, les groupes guanidines des arginine, les groupes thiol des 25 cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioethers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines. Ces groupes présents sur la protéine d'intérêt peuvent former une liaison 30 covalente avec un groupe réactif porté par le complexe métallique fluorescent. Les groupes réactifs appropriés sont connus de l'homme du métier : un complexe métallique fluorescent fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols portés par les cystéines de la protéine. De même, un complexe métallique fluorescent portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à une amine de la protéine d'intérêt. • Utilisation d'une enzyme suicide : Les enzymes suicides sont des protéines qui ont une activité enzymatique modifiée par des mutations spécifiques qui leur confèrent la capacité de lier rapidement et de façon covalente un substrat. Ces enzymes sont dites io suicides car chacune ne peut lier qu'une seule molécule fluorescente, l'activité de l'enzyme étant bloquée par la fixation du substrat. Ces enzymes constituent par conséquent un outil de choix pour marquer spécifiquement des protéines d'intérêt avec un rapport d'une molécule fluorescente pour une protéine. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les enzymes suivantes : 15 - le mutant d'une alkylguanine-DNA alkyltransférase (ou SnapTag commercialisé par la société Covalys) (voir Klepper A. et al. (2003) in Nature Biotechnology, vol. 21, p. 86 et WO 02/083937 A2), dont un des substrats est la benzylguanine et ses dérivés, sous réserve qu'ils possèdent un motif benzylguanine ; 20 - le mutant d'une déhalogénase (HaloTag commercialisé par Promega) qui génère également une réaction enzymatique du type suicide (voir WO 04/072232 A2), dont certains des substrats sont des composés de la famille des chloroalcanes, en particulier les chloroalcanes comportant le motif -NH-CHZCHZ-O-CHZCHZ-O-(CH2)6-Cl .Dans ce cas, le complexe 25 métallique fluorescent sera conjugué à ce type de motif ; - La protéine ACP (� Acyl Carrier Protein �), présence de phosphopanthéthéine transférase, qui transfère le résidu 4'-phosphopantéthéine du coenzyme A sur une sérine de l'ACP (N.George et al, Journal of the American Chemical society 126 (2004) p 8896-8897). 30 Lorsque cette approche est utilisée pour marquer la protéine d'intérêt par le complexe métallique fluorescent, il est nécessaire de rajouter au milieu réactionnel de la phosphopantéthéine transférase. Dans cette approche, une enzyme suicide est fusionnée avec la protéine d'intérêt par les techniques classiques de biologie moléculaire (fabrication d'un vecteur d'expression comprenant la séquence nucléique codant pour l'enzyme suicide et celle codant pour la protéine d'intérêt, et introduction de ce vecteur dans la cellule), et le substrat de l'enzyme, lié de manière covalente à un complexe métallique fluorescent, est introduit dans le milieu extracellulaire. La réaction enzymatique a pour conséquence la liaison covalente du substrat marqué à l'enzyme, et donc le marquage de la protéine d'intérêt par le complexe métallique fluorescent. i0 Exemple : Détection de l'internalisation du récepteur de la vasopressine V2-R On se propose dans cet exemple de détecter l'internalisation d'une protéine de fusion comprenant le récepteur V2 de la vasopressine, l'enzyme Snaptag et le tag 15 HA, par la méthode selon l'invention. Plus précisément, on utilise ici un conjugué cryptate de terbium (LUMI4-TB) ù benzylguanine (BG) comme composé donneur, la cyanine Cy5-COOH comme accepteur, et l'on observe les variations de signal résultant d'une variation du DEFET consécutif à l'internalisation du récepteur. 20 Réactifs et matériels utilisés : OptiMEM (Invitrogen (51985-026)) Tampon phosphate PBS DMEM SRP (Milieu de culture DMEM sans rouge de phénol,Invitrogen) 25 DMEM+ : DMEM auquel ont été rajoutés : L-alanyl/L-glutamine 1mM, NaPyruvate 1mM, sérum de veau foetal (Invitrogen SKU#10091- 148) 10%, Pénicilline Streptomycine 1% (Invitrogen SKU#15070- 063), HEPES 2 mM, Acides Aminés Non Essentiels 1%) DMEM SRP+ (Milieu DMEM+, sans rouge de phénol) 30 Krebs-Tris + glucose 0,5 g/l BG-LUMI4-TB (conjugué cryptate de terbium benzylguanine, commercialisé par Cisbio Bioassay) BG : 06-benzylguanine (Sigma B2292) Vasopressine (Bachem) Cyanine Cy5-COOH : Eras Laboratories Cy5-COO H Traitement des alaaues 50 pl de solution de poly-L-Ornithine (solution 0.01%, poids moléculaire 30,000-70,000 (SIGMA P4957) sont distribués dans chaque puits d'une plaque de 96 puits (Cellstar, noires à fond noir) afin de favoriser l'adhérence io des cellules au fond du puits, et les plaques sont mises à incuber pendant 30 min à 37° C, avant d'être rincées 1 fois avec 100 pl de DMEM+. Transfection Le mélange de transfection suivant ou un mélange contrôle négatif de 15 composition ci-après sont ensuite distribués dans les puits : Mélange de contrôle négatif (par Mélange de transfection (par puits) : puits): 0,32pg plasmide HA-ST-V2 (CIS BIO) 0,32 pg Plasmide PRK6 (CIS BIO) 0,8 �l Lipofectamine 2000 0,8 pl Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 50 pl Milieu Biologique (DMEM+) 50 pl milieu Biologique (DMEM+) Après 30 minutes d'incubation, 100 pl de cellules COS7 (CIS BIO), soit 80000 cellules sont rajoutées dans chaque puits, puis incubées pendant 24 heures à 37°C en présence de 5% de CO2. 20 15 Courbe de dose réponse Les puits sont rincés une fois avec du milieu DMEM SRP+, avant l'ajout d'une solution de 156 nM de BG-LUMI4-TB ou de 156 nM de BG (contrôle négatif) dans du milieu DMEM SRP+ (100pI), et la plaque est ensuite incubée pendant 1h30. Chaque puits est ensuite lavé 3 fois avec 100 pl du tampon de Krebs-Tris + glucose (0.5 g/I), avant l'ajout de tampon Krebs-Tris, puis de vasopressine (agoniste du récepteur V2) diluée avec le tampon Krebs-Tris (4°C, 10pI, concentration variable, voir plan de plaque). Après 30 minutes d'incubation, 264 pM de Cyanine5-COOH en solution dans le tampon Krebs-Tris (10pI) sont ajoutés dans les lignes B, D, E-H (voir plan) pour obtenir une concentration finale d'accepteur de 24 pM. La plaque est agitée pendant 15 minutes avant d'être lue sur un lecteur Envision (PerkinElmer), équipé d'un laser azote 337 nm et avec des filtres d'émission 545 nm et 665 nm. La lecture est effectuée dans les deux canaux avec un délai de 400 ps et une fenêtre de lecture entre 400 et 2900 ps. 20 Le plan de la plaque à 96 puits est représenté ci-dessous avec les quantités de réactifs ajoutés dans chaque puits : 1-4 5-8 9-12 A PRK6 PRK6 PRK6 BG (110 pl, 156 nM) BG-LUMI4-TB (110 BG-LUMI4-TB (100 pl, 156 pl, 156 nM) nM) Vasopressine (10p1 10pM) B PRK6 PRK6 PRK6 BG (100 pl, 156 nM) BG-LUMI4-TB (100 BG-LUMI4-TB (90 pl, 156 nM) Cy5 (10p1, 264 pM) pl, 156 nM) Vasopressine (10p1 10pM) Cy5 (10p1, 264 pM) Cy5 (10p1, 264 pM) C HA-ST-V2 HA-ST-V2 BG (110 pl, 156 nM) BG-LUMI4-TB (110 pl, 156 nM) D HA-ST-V2 HA-ST-V2 BG (100 pl, 156 nM) BG-LUMI4-TB (100 pl, 156 nM) Cy5 (10p1, 264 pM) Cy5 (10p1, 264 pM) E HA-ST-V2 HA-ST-V2 BG (90 pl, 156 nM) BG (90 pl, 156 nM) Cy5 (10p1, 264 pM) Cy5 (10p1, 264 pM) Vasopressine (10p1, 10pM) Vasopressine (10p1, 100pM) F HA-ST-V2 HA-ST-V2 BG (90 pl, 156 nM) BG (90 pl, 156 nM) Cy5 (10p1, 264 pM) Cy5 (10p1, 264 pM) Vasopressine (10p1, 1nM) Vasopressine (10p1, 10nM) G HA-ST-V2 HA-ST-V2 BG (90 pl, 156 nM) BG (90 pl, 156 nM) Cy5 (10p1, 264 pM) Cy5 (10p1, 264 pM) Vasopressine (10p1, 100nM) Vasopressine (10p1, lpM) H HA-ST-V2 HA-ST-V2 BG (90 pl, 156 nM) BG (90 pl, 156 nM) Cy5 (10p1, 264 pM) Cy5 (10p1, 264 pM) Vasopressine (10p1, 10pM) Vasopressine (10p1, 100pM) 10 15 20 25 Ligne A : contrôle négatif avec le plasmide PRK6, donc pas de marquage Snaptag (ST), signal observé en l'absence d'accepteur Cy5, en l'absence de donneur LUMI4-TB (A1-A4), en présence de donneur LUMI4-TB sans vasopressine (A5-A8) ou avec vasopressine (A9-Al2) Ligne B : contrôle négatif avec plasmide PRK6, donc pas de marquage Snaptag (ST), signal observé en présence d'accepteur Cy5, en l'absence de donneur LUMI4-TB (B1-B4), en présence de donneur LUMI4-TB sans vasopressine (B5-B8) ou avec vasopressine (69-B12) Cette ligne permet d'estimer le bruit de fond en l'absence de marquage du récepteur et permet de corriger /es signaux mesurés. Ligne C : contrôle négatif avec le plasmide HA-ST-V2, donc en présence de Snaptag, mais sans vasopressine ni accepteur Cy5, signal observé en présence de BG non fluorescent (C1-C4), ou fluorescent avec le donneur LUMI4-TB (C5-C12). Ligne D : contrôle négatif avec plasmide HA-ST-V2, donc en présence de Snaptag, mais sans vasopressine, et en présence d'accepteur Cy5 ; signal observé en présence de BG non fluorescent (D1-D4), ou fluorescent avec le donneur LUMI4-TB (D5-D12). Cette ligne permet d'obtenir le signa/ de référence en l'absence d'internalisation du récepteur V2 marqué par BG-LUMI4-TB. Les lignes E à H correspondent au signal observé en présence de différentes concentrations de vasopressine. Résultats & Discussion: La figure 1 représente l'évolution de la luminescence du donneur, mesurée à 545 nm en fonction de la concentration en vasopressine et donc en fonction de l'internalisation du récepteur. 30 4AS% correspond au pourcentage d'augmentation du signal du donneur au cours de l'internalisation, par rapport au signal de référence mesuré sans internalisation (sans vasopressine). Plus précisément, pour une concentration donnée de vasopressine, par exemple 10 pM (puits E1-E6), 4AS% est calculé de la façon suivante : ([E1-E6 ] 545 û [D5-D12] 545) 4AS% = ([D5-D12] 545 û [D1-D4] 545 ) û ( [B5-B8] 545 û [B1-B4] 545 ) Dans laquelle �[E1-E6] 545�, � [D5-D12] 545 � etc ... correspondent à la moyenne des signaux mesurés dans les puits El à E6, D5 à D12 etc ... à la 10 longueur d'onde du donneur BG-LUMI4-TB (545nm) Le numérateur correspond à la différence entre les signaux mesurés en présence et en l'absence de vasopressine (et donc d'internalisation) et le dénominateur correspond au signal de référence en l'absence 15 d'internalisation ([D5-D12] 545) et corrigé par le bruit de fond ([D1-D4] 545, mesuré en l'absence de donneur BG-LUMI4-TB) ainsi que par le signal non spécifique ([B5-B8] 545-[B1-B4] 545 en l'absence de marquage Snaptag) La figure 2 montre une variation (dans ce cas une augmentation) de la 20 luminescence du composé donneur BG-LUMI4-TB à 545 en présence de concentrations croissantes de vasopressine et valide donc l'utilisation de la méthode selon l'invention pour mettre en évidence l'internalisation de récepteurs membranaires. 25 Des résultats similaires sont obtenus si l'on s'intéresse au signal émis par l'accepteur à 665 nm (Cy5), corrigé par le signal du donneur à 545 (cette correction ratiométrique permet de s'affranchir de la variabilité du signal d'un puit à l'autre). 30 La figure 2 représente l'évolution de 4ASR% en fonction de la concentration en vasopressine et donc de l'internalisation du récepteur V2.4ASR% correspond au pourcentage du signal de référence sans internalisation (mesuré en l'absence de vasopressine) Pour une concentration donnée de vasopressine, par exemple 10 pM (puits E1-E6), 4ASR% est calculé de la façon suivante : [E1-E6]665 ù [D1-D4]665 ù ([B5-B8]665 ù [B1-B4]665) [E1-E6]545ù [D1-D4]545 ù ([B5-B8]545 ù [B1-B4]545) 4ASR% = 1- [D5-D12]665ù [D1-D4]665 ù ([B5-B8]665 ù [B1-B4]665) [D5-D12]545ù [D1-D4]545 ù ([B5-B8]545 ù [B1-B4]545) Le signal mesuré en présence de vasopressine ([E1-E6] 665/[E1-E6] 545) et le signal de référence ([D1-D12] 665/[D1-D12] 545) sont chacun corrigés par le bruit de fond ([D1-D4], mesuré en l'absence de donneur BG-LUMI4-TB) et par le signal non spécifique ([B5-B8]-[B1-B4]) mesuré en l'absence de marquage Snaptag. La figure 3 montre une variation (une diminution du signal émis par le composé accepteur) lorsque des concentrations croissantes de vasopressine sont présentes dans le milieu, et valide donc l'utilisation de la méthode selon l'invention pour mettre en évidence l'internalisation de récepteurs membranaires. REVENDICATIONS1. Méthode de détection de l'internalisation d'une protéine transmembranaire d'intérêt exprimée à la surface d'une cellule comprenant les étapes suivantes : a) marquage de la protéine d'intérêt par un complexe métallique fluorescent dont la durée de vie est supérieure à 0,1 ms, de préférence comprise entre 0,5 et6ms; b) ajout dans le milieu réactionnel d'un composé susceptible de provoquer l'internalisation de la protéine d'intérêt ; io c) ajout dans le milieu réactionnel d'un agent modulateur choisi parmi : 1. un composé accepteur de FRET fluorescent ou non-fluorescent, compatible avec ledit complexe métallique fluorescent, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est supérieure à 10-' M, et de préférence comprise entre 10-6 M et 10-3 M , et dont le poids 15 moléculaire est inférieur à 50 kD, de préférence compris entre 0,1 et kD; 2. un agent réducteur dont le potentiel redox est inférieur à +0,1 V et de préférence compris entre 0,25 et 0,75 V ; 3. un agent se liant de manière spécifique par liaison non covalente 20 avec le complexe métallique fluorescent ; 4. un ion métallique qui rentre en compétition avec la terre rare pour former un complexe métallique non-fluorescent ; d) mesure de la luminescence émise par le milieu réactionnel à la longueur d'onde d'émission du complexe métallique fluorescent et/ou à la longueur 25 d'onde d'émission du composé modulateur lorsque celui-ci est un composé accepteur fluorescent ; e) comparaison du signal mesuré à l'étape d) avec un signal de référence mesuré sur des cellules ayant subit uniquement les étapes a) et c), une différence du signal mesuré à l'étape d) par rapport au signal de référence 30 étant représentative de l'internalisation de la protéine d'intérêt. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les étapes sont mise en oeuvre dans l'ordre suivant : a), b), c), d), e).3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent modulateur est soit un composé accepteur de FRET soit un agent réducteur et en ce que les étapes sont mise en oeuvre dans l'ordre suivant : a), c), b), d), e). 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'il comprend une étape de lavage entre l'étape a) et l'étape suivante. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le complexe métallique fluorescent est : io a) un complexe de lanthanide dans lequel le lanthanide est choisi parmi l'europium, le terbium, le néodymium, le samarium et le dysprosium ; ou b) un complexe de ruthénium. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que le complexe métallique is fluorescent est un chélate ou un cryptate de lanthanide. 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que le complexe métallique fluorescent comprend (i) au moins 2, et de préférence entre 2 et 9 hétéroatomes donneur d'électrons choisis parmi : N, O, S, ces atomes formant des liaisons de 20 coordination avec le lanthanide ou le ruthénium, et (ii) un ou plusieurs chromophores comprenant des structures aromatiques, de préférence comprenant 1, 2 ou 3 hétéroatomes choisis parmi N et O, qui jouent le rôle d'atomes de coordination du lanthanide ou du ruthénium. 25 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'agent modulateur est un composé accepteur fluorescent choisi parmi les composé suivants : les dérivés de cyanines, DY647, D2, CY5, Cy5-COOH, la fluorescéine, la coumarine, la rhodamine, la carbopyronine, l'oxazine ses analogues, les flurophores AlexaFluor, le Crystal violet, les fluorophores perylènebisimide, les fluorophores 30 squaraines, le NBD (nitrobenzoxadiazole) et ses dérivés, le DABCYL (acide 4-((4-(dimethylamino) phenyl) azo) benzoique). 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'agent modulateur est un composé accepteur non-fluorescent choisi parmi lescomposés suivants : QXL 570, QXL 610, QXL 670 et QXL 680 ; DYQ660 et DYQ661 ; QSY7, QSY9 et QSY21. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le composé modulateur est un agent réducteur choisi parmi les composés suivants : iodure, ascorbate, urate, catécholate, et les espèces inorganiques, telles que le Fe(CN)62+ 11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'agent modulateur io est un agent réducteur et en ce que l'étape a) comprend l'ajout d'un premier complexe métallique fluorescent et l'ajout d'un second complexe métallique fluorescent, lesdits complexes métallique fluorescent ayant les mêmes structures chélatantes mais étant complexées à des métaux différents. is 12. Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que le premier complexe de terre rare est un complexe d'europium et le second complexe de terre rare est un complexe de terbium, les complexes de terbium et d'europium possédant la même structure chélatante. 20 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 4, caractérisée en ce que le composé modulateur est un agent se liant de manière spécifique par liaison non covalente sur le complexe métallique fluorescent. 14. Méthode selon la revendication 13 caractérisée en ce que l'agent modulateur 25 est choisi parmi les composé suivants : anticorps, fragments d'anticorps, peptides, aptamères, chacun possédant un domaine de liaison au complexe métallique fluorescent. 15. Méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 4, caractérisée en ce 30 que le composé modulateur est un ion métallique qui entre en compétition avec la terre rare pour former un complexe métallique non-fluorescent. 16. Méthode selon la revendication 16 caractérisée en ce que ledit ion est l'ion Manganèse. 25 17. Méthode selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le marquage de la protéine d'intérêt par le complexe métallique fluorescent est un marquage indirect via un couple de partenaires de liaison, dont l'un des membres est conjugué de s manière covalente au complexe métallique fluorescent, et l'autre membre est conjugué de manière covalente à la protéine d'intérêt ou est présent de manière native sur la protéine d'intérêt. 18. Méthode selon la revendication 17, caractérisée en ce que le couple de lo partenaires de liaison est choisi parmi les couples suivants : la séquence CCXXCC (dans laquelle C=Cystéine et X = un acide aminé quelconque) / composé biarsenic ; peptide BTX / bungarotoxine ; streptavidine ou avidine / Biotine ; un fragment d'eDHFR / triméthoprime ; tag / anticorps anti-tag ; ligand connu de la protéine d'intérêt/protéine d'intérêt. 15 19. Méthode selon la revendication 18, caractérisée en ce que le complexe métallique fluorescent est lié de manière covalente à un anticorps anti tag choisi parmi : un anticorps spécifique de la protéine d'intérêt ; un anticorps spécifique d'un tag choisi parmi : GST, 6HIS, Myc, FLAG, HA, et en ce que la protéine d'intérêt 20 contient le tag correspondant. 20. Méthode selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le marquage de la protéine d'intérêt par le complexe métallique fluorescent est un marquage direct par liaison covalente. 21. Méthode selon la revendication 20, caractérisée en ce que le complexe métallique fluorescent est conjugué à un substrat d'une enzyme suicide, et en ce que la protéine d'intérêt est exprimée sous forme d'une protéine de fusion dont la partie extracellulaire contient l'enzyme suicide. 30 22. Méthode selon la revendication 21, caractérisée en ce que le couple enzyme suicide / substrat d'enzyme suicide est choisi parmi les couples suivants : un mutant de l'alkylguanine-DNA alkyltransférase/benzylguanine ; un mutant d'unedéhalogénase/chloroalcane, ACP/Coenzyme A en présence de phosphopantéthéine transférase. 23. Méthode selon la revendication 20 caractérisée en ce que le complexe métallique fluorescent comporte un premier groupe réactif susceptible de former une liaison covalente avec un second groupe réactif présent sur la protéine d'intérêt, en particulier avec le groupe amino terminal, le groupe carboxylate terminal, les groupes carboxylates des acides aspartiques et glutamiques, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols io des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioethers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines. 24. Méthode selon la revendication 23 caractérisée en ce que le complexe is métallique fluorescent comporte un groupe maléimide destiné à réagir avec les groupes thiols de la protéine d'intérêt. 25. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le complexe métallique fluorescent est un cryptate d'Europium ou de Terbium 20 lié de manière covalente à la benzylguanine ou un de ses dérivés, et en ce que la protéine d'intérêt est exprimé sous forme de protéine de fusion avec un mutant de l'alkylguanine-DNA alkyltransférase, en particulier le mutant Snaptag. 26. Méthode selon la revendication 1 à 4, caractérisée en que le complexe 25 métallique fluorescent est un cryptate d'Europium ou de Terbium lié de manière covalente à la benzylguanine ou un de ses dérivés, et en ce que la protéine d'intérêt est exprimé sous forme de protéine de fusion avec un mutant de l'alkylguanine-DNA alkyltransférase, en particulier le mutant Snaptag, et en ce que le composé modulateur est un dérivé de cyanine, en particulier la Cy5 ou la Cy5-COOH. 30 27. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 26, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est choisie parmi : les récepteurs couplés aux protéines G et les récepteurs à activité tyrosine kinase.