FR 2940616 A1 20100702 FR 0807496 A 20081230 UTILISATION D'UN ANTICORPS ANTI-CD20 POUR LE TRAITEMENT DU LYMPHOME PRIMAIRE INTRAOCULAIRE DESCRIPTION 5 Domaine technique La présente invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO: 1 1.0 dont la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO: 2, et dont les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine, comme médicament pour le traitement du lymphome primaire intraoculaire. 15 Dans la description ci-dessous, les références entre crochets (H) renvoient à la liste des références présentée après les exemples. Etat de la technique 20 L'antigène CD20 est une protéine transmembranaire hydrophobe d'un poids moléculaire de 35-37 kDa présente à la surface des lymphocytes B matures (Valentine et al. (1987) Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (22) : 8085-9 [1]; Valentine et al. (1989) J.Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287 [2]). Il est exprimé au cours du développement des lymphocytes B dès le stade pré-B 25 précoce et ce jusqu'à la différenciation en plasmocyte, stade où cette expression disparaît. L'antigène CD20 est présent à la fois sur les lymphocytes B normaux et sur les cellules B malignes. Plus particulièrement, l'antigène CD20 est exprimé sur la plupart des lymphomes de phénotype B (80% des lymphomes) : il est exprimé par exemple sur plus de 90% des 30 lymphomes non-Hodgkiniens (NHL) de lymphocytes B. La fonction du CD20 n'est pas encore totalement élucidée, mais il pourrait agir comme un canal calcique et intervenir dans la régulation des premières étapes de la différenciation (Golay et al. (1985) J. Immunol.; 135(6) :3795-801 [3]) et de la prolifération des lymphocytes B (Tedder et al. (1986) Sur J. Immunol . 1986 Aug;16(8) :881-7 [4]). Ainsi, bien qu'il subsiste des incertitudes quant à son rôle dans l'activation et la prolifération des lymphocytes B, l'antigène CD20 est, de par sa localisation, une cible importante pour le traitement des pathologies impliquant des lymphocytes B tumoraux, comme par exemple les NHL ou la LLC-B (leucémie lymphoïde chronique B) par des anticorps reconnaissant spécifiquement le CD20. De plus, cet antigène est une cible idéale car il s'agit d'une protéine membranaire pour laquelle on ne connaît pas de modulation d'expression ou de polymorphisme. Un seul anticorps monoclonal anti-CD20 non radiomarqué, le rituximab (Genentech), est actuellement disponible sur le marché, pour le traitement des lymphomes de cellules B. Il montre chez les patients atteints de NHL des résultats cliniques encourageants lorsqu'il est associé à une chimiothérapie. Toutefois, son efficacité reste variable et souvent modeste lorsqu'il est utilisé comme agent unique (Teeling et al. (2004) Blood 104(6).-1793-800 [5]). Le lymphome primaire intraoculaire (PIOL) est un lymphome non-Hodgkinien du système nerveux central. Cette forme affecte en général le vitré ou la rétine. Les signes oculaires du PIOL peuvent précéder, parfois de plusieurs années, l'atteinte nerveuse centrale ou systémique, et l'ophtalmologiste est parfois le premier à poser le diagnostic. L'âge d'apparition des premiers symptômes est variable, mais l'affection est exceptionnelle avant la quarantaine. En général, les patients ont entre 60 et 70 ans. Initialement, l'atteinte est unilatérale, mais elle devient bilatérale dans 50 à 80 % des cas. Les premières manifestations oculaires sont en général une baisse de vision ou une vision trouble. Le diagnostic peut être réalisé au moyen d'un examen cytologique de la ponction de chambre antérieure, révélant la présence de cellules caractéristiques d'un lymphome non-Hodgkinien hautement malin. La méthode de traitement la plus couramment utilisée est la chimiothérapie par méthotrexate en systémique ou par injection intravitréenne. Toutefois, le traitement par méthotrexate nécessite de nombreuses injections et induit des complications oculaires, comme l'épithéliopathie de la cornée (Ohguro et al. (2008). Arch. OphtalmolNol. 126 (No. 7) ; 1002-1003 [6]). Par ailleurs, un autre cas rapporté par SMET MD montre que même si le methotrexate administré par voie intravitréenne est bien toléré et induit une rémission rapide, il n'empêche pas la survenue de récidives en cas de monothérapie (SMET et al. Bull. Soc. Belge Ophtalml., 279, 91-95, 2001 [20]). De plus le méthotrexate est connu pour présenter un certain nombre d'autres effets indésirables et notamment une immunosupression et des atteintes hépatiques. Le PIOL est un lymphome comportant des néoplasmes à larges cellules B exprimant le CD20. Des injections intraveineuses de rituximab ont contribué à prolonger la survie des patients présentant un lymphome à large cellules B systémiques. Toutefois, le rituximab n'a pas affecté le pronostic du lymphome du système nerveux central, probablement en raison du fait que l'anticorps monoclonal ne traverse pas la barrière hémato-encéphalique. De même, il est peu probable qu'un traitement par injections intraveineuses de rituximab des lésions oculaires associées au lymphome du système nerveux central, soit bénéfique en raison de la barrière hémato-oculaire ([6]). Toutefois, des essais d'injections intravitréennes de rituximab ont montré une absence d'effets toxiques oculaires significatifs chez des patients atteints d'un lymphome primaire du système nerveux central (Kitzamnn et al. (2007) Eye 21, 1524-1527 [7]). Cependant, en raison des traitements complémentaires systémiques ou oculaires reçus par les patients, il n'est pas possible d'en tirer des conclusions quant à l'efficacité d'une thérapie au moyen d'administration intravitréenne de rituximab. Par ailleurs, des essais d'injections intravitréennes de rituximab chez deux patients atteints de PIOL ont montré, dans l'oeil, une disparition des cellules malignes de lymphome ([6]). Cependant, un cas sur deux a présenté une réaction inflammatoire de la chambre antérieure de l'oeil. L'étude indique aussi une absence de complications. Toutefois, les observations se sont limitées deux mois après le traitement par rituximab et elles n'ont pas été basées sur des résultats de biopsie, mais uniquement sur des observations cliniques. II existe donc un réel besoin d'un outil thérapeutique palliant ces inconvénients et obstacles quant au traitement du PIOL. Description de l'invention 10 Un premier objet de l'invention se rapporte ainsi à l'utilisation d'un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 1, dont la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ 15 ID NO : 2, et dont les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine, pour le traitement du lymphome primaire intraoculaire. Les anticorps sont constitués de chaînes lourdes et de chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en 20 position N- terminale, d'une région (ou domaine) variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour les chaînes légères et V-D- J pour les chaînes lourdes) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C- terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour les chaînes légères ou de plusieurs domaines pour les chaînes 25 lourdes . Aux fins de l'invention, les expressions " anticorps monoclonal " ou " composition d'anticorps monoclonal " se réfèrent à une préparation de molécules d'anticorps possédant une spécificité identique et unique. L'anticorps selon l'invention, dont les régions variables des chaînes légères 30 et lourdes appartiennent à une espèce différente des régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes, est qualifié d'anticorps " chimérique5 Les séquences d'acide nucléique murines SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 codent pour le domaine variable de chacune des chaînes légères et le domaine variable de chacune des chaînes lourdes respectivement de l'anticorps produit par l'hybridome murin CAT-13.6E12, disponible à la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) sous le numéro ACC 474. Cet hybridome produit un anticorps monoclonal murin de type IgG2a,K dirigé contre le CD20. La séquence SEQ ID NO. 1 comporte néanmoins un acide nucléique qui diffère par rapport à la séquence codant pour la région variable de la chaîne légère de l'anticorps produit par l'hybridome murin CAT-13.6E12. Ces séquences murines ont été choisies pour dériver les séquences des régions variables des anticorps selon l'invention en raison de la spécificité de l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour l'antigène CD20. Les régions variables des anticorps selon l'invention comportent au moins 70% d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 cette identité de séquences conférant une identité de spécificité des anticorps selon l'invention avec l'anticorps murin CAT-13.6E12. De préférence, cette identité de séquences confère également une identité d'affinité pour la cible entre l'anticorps selon l'invention et l'anticorps murin CAT-13.6E12. Les anticorps utilisés dans l'invention possèdent en outre des régions constantes de ses chaînes légères et lourdes appartenant à une espèce nonmurine. A cet égard, toutes les familles et espèces de mammifères nonmurins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les muridés (sauf la souris), les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi que les oiseaux. Les anticorps utilisés comme médicament dans l'invention peuvent être construits en utilisant les techniques standard de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier, et plus particulièrement en utilisant les techniques de construction des anticorps " chimériques " décrites par 3o exemple dans Morrison et al., Proc. Nat! . Acad. Sci . U.S.A., 81, pp. 6851-55 (1984), où la technologie de l'ADN recombinant est utilisée pour remplacer la région constante d'une chaîne lourde et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine. Un mode de réalisation particulier sera illustré plus loin. De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisés dans l'invention est codée par une séquence possédant au moins 80% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 80% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2. De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 90% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 90% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2. De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisés dans l'invention est codée par une séquence possédant au moins 95% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 95% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO:2. De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisés dans l'invention est codée par une séquence possédant au moins 99% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 99% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO :2. Avantageusement, tout anticorps possédant des régions variables de leur chaînes lourdes et légères présentant une ou plusieurs substitution(s), insertion(s) ou délétion(s) d'un ou plusieurs acides nucléiques, ces modifications de séquences répondant aux pourcentages d'identités de séquences tels que définis ci-dessus, et n'altérant ni la spécificité de l'anticorps pour sa cible, ni son affinité pour sa cible, peut être utilisé aux fins de l'invention. Les anticorps utilisés dans l'invention s'entendent aussi de tout anticorps possédant les régions CDR (Complementary Determining Région) de l'anticorps CAT-13.6E12, associées à des régions FR (framework, régions très conservées des régions variables, nommées aussi "charpente"). De tels anticorps possèdent une affinité et une spécificité très comparables, de préférence identiques, à l'anticorps murin CAT-13.6E12. De manière préférée, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisé dans l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2. Dans un premier mode de réalisation de l'invention, un anticorps utilisé, notamment comme médicament, dans l'invention est donc un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2, et les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine. Ainsi, par � dirigé contre l'antigène CD20 �, on entend désigner la capacité de l'anticorps monoclonal à lier tout ou partie de l'antigène CD20, et notamment l'épitope reconnu par l'anticorps EMAB603. De manière préférée, les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention sont des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation préféré de l'invention permet de diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type K. Tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Km(1), Km(1, 2), Km(1, 2, 3) ou Km(3) mais l'allotype préféré est Km(3) . Dans un autre mode de réalisation complémentaire, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type k. Dans un aspect particulier de l'invention, et notamment lorsque les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention sont des régions humaines, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y. Selon cette variante, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps peut être de type y1, de type y2, de type y3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, ou encore de type y4. Les anticorps possédant une région constante de chacune des chaînes lourdes de type y appartiennent à la classe des IgG. Les immunoglobulines de type G (IgG), sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CH1, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CH1 et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps, reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs FcyR et le Clq. La région Fc, constituée des 2 domaines globulaires CH2 et CH3, est glycosylée au niveau du domaine CH2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné de type lactosaminique, lié à l'Asn 297. De manière préférée, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y1, car un tel anticorps montre une capacité à engendrer une activité ADCC chez le plus grand nombre d'individus (humains). A cet égard, tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Glm(3), G1m (1, 2, 17), G1 m(1, 17) ou Glm(1, 3) . De manière préférentielle, l'allotype est G1m(1, 17) . Dans un aspect particulier de l'invention, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y1, et elle est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3, la région constante de chacune de ses chaînes légères étant codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4. Ainsi, un tel anticorps possède une région variable murine et une région constante humaine, avec des chaînes lourdes de type y1. Cet anticorps appartient donc à la sous-classe des IgG1. Selon le mode de réalisation de l'anticorps utilisé dans l'invention, l'anticorps possède deux chaînes légères dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 et la région constante humaine est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 4, et deux chaînes lourdes dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2 et la région constante est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3. De manière préférentielle, chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6. La séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps. La séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6 codant pour chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3 codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps. Dans un aspect particulier de l'invention, lorsque chacune des chaînes légères de l'anticorps est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et que chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murinehumaine SEQ ID NO : 6, la séquence peptidique de chacune des chaînes légères, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 5, est la séquence SEQ ID NO : 7 et la séquence peptidique de chacune des chaînes lourdes, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 6, est la séquence SEQ ID NO : 8. L'acide aminé situé en position 106 est une lysine (K) dans la séquence SEQ ID NO : 7. L'invention s'entend aussi à l'utilisation des anticorps dont chacune des chaînes légères codées par une séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine possède au moins 70% d'homologie ou d'identité avec la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 7 et chacune des chaînes lourdes codées par une séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine possède au moins 70% d'homologie ou d'identité avec la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 8, ces modifications n'altérant ni la spécificité de l'anticorps ni ses activités effectrices, comme l'activité ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) . De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps utilisé dans l'invention est produit par une lignée cellulaire d'hybridome de rat. La lignée productrice de l'anticorps selon l'invention est une caractéristique importante puisqu'elle confère à l'anticorps certaines de ses propriétés particulières. En effet, le moyen d'expression des anticorps est à l'origine des modifications post-traductionnelles, notamment des modifications de la glycosylation, qui peuvent varier d'une lignée cellulaire à l'autre, et ainsi conférer des propriétés fonctionnelles différentes à des anticorps ayant pourtant des structures primaires identiques. Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps est produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662). Cette lignée a été choisie en raison de sa capacité à produire des anticorps présentant une activité ADCC améliorée par rapport à des anticorps de même structure primaire produits par exemple dans CHO. Dans un autre mode de réalisation particulier, un autre anticorps selon l'invention est l'anticorps EMAB603 produit par le clone R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). Chacune des chaînes légères de l'anticorps EMAB603 est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO: 5, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6. Cet anticorps chimérique entre en compétition avec l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour la fixation du CD20 et possède une activité cytotoxique très supérieure à celle du rituximab, qui peut être attribuée pour partie à la glycosylation particulière du N-glycanne de la chaîne lourde de ces anticorps. En effet, le clone R603 a pour particularité de produire une composition d'anticorps EMAB603 possédant un ratio taux de fucose/taux de galactose inférieur à 0,6, pour lequel il a été démontré dans la demande de brevet FR 03 12229 qu'il est optimal pour conférer une forte activité ADCC aux anticorps. Cet anticorps peut être particulièrement intéressant comme outil thérapeutique pour le traitement du PIOL. Avantageusement, les anticorps de l'invention peuvent permettre la formation de lymphocytes T mémoires. Ces lymphocytes T mémoires peuvent posséder la capacité de proliférer, et de se réactiver de manière rapide lors d'ue deuxième exposition aux cellules tumorales. Avantageusement, les anticorps de l'invention peuvent permettre une infiltration de cellules T dans la tumeur, ce qui peut induire un ralentissement de la croissance tumorale, et une meilleure clairance des cellules tumorales. De tels anticorps, ainsi qu'un procédé permettant leur fabrication, sont décrits dans le document WO 2006/064121. Un exemple de vecteur d'expression d'un anticorps selon l'invention, est le vecteur de séquence SEQ ID NO : 17. Ce vecteur est un vecteur permettant l'expression d'un anticorps selon l'invention dont la chaîne légère est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 5, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 7, et dont la chaîne lourde est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 6, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 8. Ce vecteur est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 5 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps et la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 6 codant chacune des chaînes lourdes de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il possède des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier, et peuvent être un adénovirus, un rétrovirus, un plasmide ou un bactériophage, cette liste n'étant pas limitative. De plus, toute cellule de mammifère peut être utilisée comme cellule hôte, c'est-à-dire comme cellule exprimant l'anticorps selon l'invention, par exemple YB2/0, CHO, CHO dhfr- (par exemple CHO DX BII, CHO DG44) , CHO Lec13 , SP2/0, NSO, 293, BHK ou COS. Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps de l'invention peut être produit par co-expression dans une cellule de deux vecteurs d'expression, l'un premettant l'expression de la chaîne légère, et l'autre celle de la chaîne lourde de l'anticorps.Tout comme indiqué précédemment, ces vecteurs possèdent des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. Tout comme indiqué précédemment, les vecteurs peuvent être par exemple un plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un bactériophage, et la cellule hôte peut être toute cellule de mammifère, par exemple YB2/0, CHO, CHO dhfr- (CHO DX BIl, CHO DG44) , CHO Lecl3, SP2/0, NSO, 293, BHK ou COS. De manière avantageuse, la lignée cellulaire stable exprimant un anticorps utilisé dans l'invention est choisie parmi le groupe consistant en : SP2/0, YB2/0, IR983F, un myélome humain comme Namalwa ou toute autre cellule d'origine humaine comme PERCE, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-(CHO DX BII, CHO DG44), ou d'autres lignées choisies parmi Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293- HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653. De manière préférée, la lignée utilisée est l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662). Cette lignée a été choisie en raison de sa capacité à produire des anticorps présentant une activité ADCC améliorée par rapport à des anticorps de même structure primaire produits par exemple dans CHO. Les milieux de culture adaptés à ces cellules sont bien connus de l'homme du métier, et on peut citer de manière non exhaustives les milieux de culture RPMI 1640 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967) [14]), Eagle's MEM (Science, 122, 501 (1952) [15]), Dulbecco's modified MEM (Virology, 8, 396 (1959) [16]), F12 Medium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965) [17]), IMDM (J. Experimental Medicine, 147, 923 (1978) [18]), ou encore ceux décrits dans le document EP1229125. Un objet particulier de l'invention se rapporte à une méthode de traitement au moyen des anticorps précédemment décrits du lymphome primaire intraoculaire. Avantageusement, la méthode de traitement comprend l'étape d'administration des anticorps à un patient atteint de PIOL. Avantageusement, l'anticorps utilisé dans l'invention est administré avec un support pharmaceutiquement acceptable, approprié pour l'effet thérapeutique attendu. A cet égard, l'anticorps utilisé dans l'invention peut être utilisé en combinaison avec un ou plusieurs autre(s) anticorps, par exemple monoclonal(ux), dirigé(s) contre un ou plusieurs autre(s) antigène(s) exprimé(s) sur les cellules lymphoides, comme par exemple, de façon non limitative, les antigènes CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11, CD16, CD18, CD19, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD29, CD30, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD49, CD50, CD52, CD53, CD54, CD55, CD58, CD59, CD69, CD70, CD71, CD80, CD81, CD82, CD86, CD95, CD103, CD118, CD119, CD120, CD132, CD210, CD217. Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps selon l'invention peut être utilisé en association avec des cellules exprimant des FcyR telles que les cellules NK, les cellules NKT (Natural Killers T) , les lymphocytes Tyô, les macrophages, les monocytes ou les cellules dendritiques, c'est-à-dire en association avec une thérapie cellulaire (Peller S, Kaufman S Blood 1991, 78:1569 ([8]) ; Kimby E et al. 1989 Leukemia 3 (7) :501-504 ((9]); Soorskaar D et al. 1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87(2) ;159-164 ([10]) ; Ziegler HW et al. 1981 Int J Cancer 27(3) ;321-327 ([11]) ; Chaperot L et al. 2000 Leukemia 14 (9) :1667-77 ([12]) ; Vuillier F, Dighiero G 2003 Bull Cancer. 90 (8-9) :744-50 ([13])) . Par ailleurs, la dose d'anticorps administrée aux patients est de préférence inférieure à 375 mg/m2, 187,5 mg/m2, à 75 mg/m2, à 37,5 mg/m2, 15 mg/m2, 7,5 mg/m2 ou de manière particulièrement avantageuse inférieure à 3,75 mg/m2. La dose administrée est avantageusement comprise entre 187,5 mg/m2 et 75 mg/m2, ou entre 75 mg/m2 et 37,5 mg/m2, entre 75 mg/m2 et 15 mg/m2, entre 75 mg/m2 et 7,5 mg/m2 ou encore entre 75 mg/m2 et 3,75 mg/m2. De préférence, la dose administrée est comprise entre 3,75 mg/m2 et 0,5 mg/m2, plus particulièrement comprise entre 2 mg/m2 et 1 mg/m2. Le mode d'administration de l'anticorps utilisé dans l'invention peut être intraoculaire, par exemple par injection dans le corps vitré, par injection péri-et intra-oculaire, sous-conjonctivale, péri- ou latéro-bulbaire, rétro-bulbaire, par instillation de collyres, notamment par instillation intravitréenne, par iontophorèse, par implatation intrasclérale, par l'application d'une pommade ophtalmique, par injection intraveineuse rétinienne ou encore par application d'ultrasons. L'anticorps peut être administré comme médicament selon les règles standard, bien connues de l'homme du métier, de traitement des lymphomes. Les anticorps utilisés dans l'invention ont pour particularité et avantage d'être cytotoxiques. A ce titre, ils présentent la capacité d'activer, in vivo et in vitro, par leur région Fc le récepteur FcyRIIIA. Ceci représente un intérêt considérable, car ce récepteur est exprimé à la surface de cellules appelées " cellules effectrices " : la liaison de la région Fc de l'anticorps à son récepteur porté par la cellule effectrice provoque l'activation du FcyRIIIA et la destruction des cellules cibles. Les cellules effectrices sont par exemple des cellules NK (Natural Killer), des macrophages, des neutrophiles, les lymphocytes CD8, les lymphocytes TyB, les cellules NKT, les éosinophiles, les basophiles ou les mastocytes. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du lymphome primaire intraoculaire. Par ailleurs, un autre objet de l'invention est un procédé de préparation d'un médicament destiné au traitement du lymphome primaire intraoculaire, consistant à mélanger l'anticorps monoclonal utilisé dans l'invention avec un support pharmaceutiquement acceptable, puis à obtenir le médicament. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures - La figure 1 est la représentation schématique du vecteur CKHu utilisé pour la chimérisation de la chaîne légère kappa des anticorps EMAB603. - La figure 2 : Représentation schématique du vecteur G1 Hu utilisé pour la chimérisation de la chaîne lourde des anticorps EMAB603. - la figure 3 : Représentation schématique du vecteur d'expression des chaînes lourdes et légères utilisé pour la production de l'anticorps EMAB603. EXEMPLES Exemple 1: Construction des vecteurs d'expression de l'anticorps chimériques anti-CD20 EMAB603 A. Détermination de la séquence des régions variables de l'anticorps murin CAT-13.6E12 L'ARN total de l'hybridome murin CAT-13.6E12 (fournisseur : DSMZ, réf. ACC 474) produisant une immunoglobuline de type IgG2a,x a été isolé (kit RNAeasy, Qiagen réf. 74104). Après transcription inverse, les domaines variables des chaînes légères (VK) et lourdes (VH) de l'anticorps CAT- 13.6E12 ont été amplifiées par la technique de 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (kit GeneRacer, Invitrogen réf. L1500-01). Les amorces utilisées pour ces deux étapes sont les suivantes : 1. amorces de transcription inverse a. Amorce antisens spécifique Kappa murin (SEQ ID NO : 9) 5' - ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' b. Amorce antisens spécifique G2a murin (SEQ ID NO : 10) '- CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG -3' 2. amorces de PCR 5'RACE a. Amorce antisens spécifique Kappa murin (SEQ ID NO : 11) 5 5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' b. Amorce antisens spécifique G2a murin (SEQ ID NO : 12) 5'- GAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAG -3' Les produits de PCR VH et VK ainsi obtenus ont été clonés dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO (Zéro blunt TOPO PCR cloning kit, Invitrogen, réf. K2875-20) puis séquencés. La séquence nucléotidique de la région VK de l'anticorps murin CAT-13.6E12 est indiquée sous la séquence SEQ ID NO : 1, hormis le dernier nucléotide qui est remplacé par A (AAA au lieu de AAC) . Le gène Vx appartient à la famille VK4 (Kabat et al., "Séquences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991) [19]). La séquence nucléotidique de la région VH de CAT-13.6E12 est la séquence SEQ ID NO : 2. Le gène VH appartient à la famille VH1 ([19]). B. Construction des vecteurs d'expression des chaînes lourdes et des 20 chaînes légères des anticorps chimériques EMAB603 1. Vecteur chaîne légère Kappa de l'anticorps EMAB603 La séquence VK clonée dans le vecteur de séquençage pCR4Blunt-TOPO a été amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes : 25 a) amorce sens VK (SEQ ID NO : 13) 5'-CTCAGTACTAGTGCCGCCACCA TGGATTTTCAAGTGCAGATTTTC AG -3' La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I, la séquence 30 en gras correspond à une séquence de Kozak consensus, l'ATG initiateur est en italiques. b) amorce antisens VK: (SEQ ID NO : 14) 5'- TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTCCG[ - 3' Cette amorce réalise la jonction des séquences VK murine (en italique) et région constante (CK) humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III. Cette amorce réalise la jonction des séquences VK murine (en italique) et région constante (CK) humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III. Le produit de PCR VK ainsi obtenu contient la séquence codant le peptide signal naturel de l'anticorps murin CAT-13.6E12, avec la mutation AAC -> AAA (nucléotide encadré dans la séquence de l'amorce antisens SEQ ID NO : 14) qui correspond à la mutation N106K par rapport à la séquence naturelle VK de CAT-13.6E12. La séquence de la chaîne légère de l'anticorps chimérique EMAB603 codée par ce vecteur est présentée en SEQ ID NO : 5 pour la séquence nucléotidique et correspond à la séquence peptidique déduite SEQ ID NO : 7. Cette PCR VK a été ensuite clonée entre les sites Spe I et Dra III du vecteur de chimérisation chaîne légère (Fig. 1) qui correspond à la séquence SEQ ID NO : 1, en 5' de la région constante CK humaine, dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 4. La séquence CK humaine de ce vecteur de chimérisation avait été préalablement modifiée par mutagénèse silencieuse afin de créer un site de restriction Dra III pour permettre le clonage de séquences VK murines. Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection dhfr (dihydrofolate reductase) . TTTATTTCCAGCCTGGT . Vecteur chaîne lourde Une démarche similaire a été appliquée pour la chimérisation de la chaîne lourde de l'anticorps EMAB603. La séquence VH clonée dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO a été tout d'abord amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes : a) amorce sens VH (SEQ ID NO :15) 5'- CTCAGTACTAGTGCCGCCACCA TGGGATTCAGCAGGATCTTTCTC -3 La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I, la séquence en gras correspond à une séquence de Kozak consensus, l'ATG initiateur est en italique. 15 b) amorce antisens VH (SEQ ID NO :16) 5'- GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGC TGAGGAGACGGTGACTGAGGTTC C -3' 20 Cette amorce réalise la jonction des séquences VH murine (en italique) et région constante GI humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Apa I . Le fragment VH amplifié contient la séquence codant le peptide signal 25 naturel de l'anticorps murin CAT-13.6E12. Cette PCR VH a été ensuite clonée entre les sites Spe I et Apa I du vecteur de chimérisation chaîne lourde (Fig. 2) qui correspond à la séquence SEQ ID NO : 2, en 5' de la région constante yl humaine dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 3. Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et 30 une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection néo. 19 10 La séquence de la chaîne lourde de l'anticorps chimérique EMAB603 codée par ce vecteur est présenté en SEQ ID NO : 6 pour la séquence nucléotidique et en séquence SEQ ID NO : 8 pour la séquence peptidique déduite. 3. Vecteurs d'expression finaux Vecteur d'expression de l'anticorps EMAB603 Un vecteur d'expression unique contenant les deux unités de transcription 10 chaîne lourde et chaîne légère de l'anticorps anti-CD20 EMAB-603 a été construit à partir des deux vecteurs de chimérisation de la chaîne légère et de la chaîne Ce vecteur d'expression HK463-25(FDA) présente deux gènes de sélection, néo (neo-phosphotransphérase Il) et dhfr (dihydrofolate reductase) ainsi que deux unités de transcription chaîne lourde et chaîne 15 légère sous le contrôle d'un promoteur RSV (Figure 3). Exemple 2 : Création de lignées cellulaires dérivées de la lignée YB2/0 productrices de l'anticorps chimérique anti-CD20 EMAB603 20 La lignée de rat YB2/0 (ATCC # CRL-1662) a été cultivée en milieu EMS (Invitrogen, réf. 041-95181M) contenant 5% de sérum de veau foetal (JRH Biosciences, réf. 12107). Pour la transfection, 5 millions de cellules ont été électroporées (électroporateur Biorad, modèle 1652077) en milieu Optimix (Equibio, réf. EKITE 1) avec 25 �g de vecteur chaîne légère, pRSV-HL- 2 5 EMAB-603 pour l'expression de l'anticorps EMAB603. Les conditions d'électroporation appliquées étaient de 230 volts et 960 microfarads pour une cuvette de 0,5 ml. Chaque cuvette d'électroporation a été ensuite répartie sur 5 plaques P96 avec une densité de 5000 cellules/puits. La mise en milieu sélectif RPMI (Invitrogen, ref 21875- 034) contenant 5% de sérum dialyse 30 (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 pg/ml de G418 (Invitrogen, réf. 10131- 027) et 25 nM de methotrexate (Sigma, réf. M8407), a été réalisée 3 jours après la transfection.5 Les surnageants des puits de transfection résistants ont été criblés pour la présence d'immunoglobulines (Ig) chimériques par dosage ELISA spécifique des séquences Ig humaines. Les 10 transfectants produisant le plus d'anticorps ont été amplifiés en plaques P24 et leur surnageant redosé par ELISA afin d'estimer leur productivité et de sélectionner les 3 meilleurs producteurs pour le clonage par dilution limite (40 cellules/plaque) . 10 A l'issue du clonage, le clone R603 a été sélectionné pour la production de l'anticorps chimérique EMAB603 et adaptés progressivement au milieu de production CD Hybridoma (Invitrogen, réf. 11279-023). La production des anticorps chimériques EMAB603 a été réalisée par expansion de la culture 15 adaptée en milieu CD Hybridoma, obtenue par dilution à 3xI05 cellules/ml en flacons de 75 cm2 et 175 cm2 puis par dilution à 4,5x105 cellules/ml en flacon de type roller. Après avoir atteint le volume maximal, la culture a été poursuivie jusqu'à ce que la viabilité cellulaire ne soit plus que de 20%. Après production, les anticorps chimériques EMAB603 ont été purifiés par 20 chromatographie d'affinité sur protéine A (pureté estimée par HPLC Listes des références [1] Valentine et al. (1987) ; Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (22) : 8085-9. [2] Valentine et al. 1989 J.Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287. [3] Golay et al. (1985) J. Immunol.; 135(6) :3795-801. [4] Tedder et al. (1986) J. Immunol . 1986 Aug;16(8) :881-7. [5] Teeling et al. (2004) Blood 104(6).-1793-800. [6] Ohguro et al. (2008). Arch. OphtalmolNol. 126 (No. 7) ; 1002-1003. [7] Kitzamnn et al. (2007) Eye 21, 1524-1527. [8] Peller S, Kaufman S Blood 1991, 78:1569. [9] Kimby E et al. 1989 Leukemia 3 (7) :501-504. [1o] Soorskaar D et al. 1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87(2) ;159-164. [11] Ziegler HW et al. 1981 Int J Cancer 27(3) ;321-327. [12] Chaperot L et al. 2000 Leukemia 14 (9) :1667-77. [13] Vuillier F, Dighiero G 2003 Bull Cancer. 90 (8-9) :744-50. [14] The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967) [15] Science, 122, 501 (1952) [16] (Virology, 8, 396 (1959) [16]) [17] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965) [18] J. Experimental Medicine, 147, 923 (1978) [19] Kabat et al., "Séquences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991) [20] SMET et al. Bull. Soc. Belge Ophtalml., 279, 91-95, 2001 REVENDICATIONS1. Anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 1, dont la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 2, et dont les 'régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine, pour le traitement du lymphome primaire intraoculaire. 2. Anticorps selon la revendication 1, dont les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes sont des régions constantes humaines. 3. Anticorps selon la revendication 1 ou 2, dont la région constante de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3 et dont la région constante de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques humaine SEQ ID NO :4. 4. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, dont chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et dont chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine- humaine SEQ ID NO : 6. 5. Anticorps selon la revendication 4, dont chacune des chaînes légères est constituée de la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 et dont chacune des chaînes lourdes est constituée de la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8. 6. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662). 7. Anticorps selon la revendication 5, produit par le clone R603 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM). l 0 8. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du lymphome primaire intraoculaire.5