FR 2926461 A1 20090724 FR 0850416 A 20080123 NOUVEAU FACTEUR DE CROISSANCE CELLULAIRE D'ORIGINE NON ANIMALE ET APPLICATIONS L'invention a pour objet un nouveau � facteur de croissance cellulaire � d'origine non animale ainsi que ses applications. En particulier, le facteur de croissance est destiné à être utilisé dans des compositions cosmétiques à visée anti-âge, notamment comme substitut des rétinoïdes, mais également dans des milieux nutritifs standards de fibroblastes et/ou de kératinocytes humains normaux. Dans le domaine de la cosmétique, de nombreuses compositions ont été développées pour lutter contre le vieillissement de la peau, contre l'apparition des rides de même que pour favoriser la régénération de la peau, en particulier chez les personnes âgées. Ces différentes applications sont en général regroupées sous l'indication � anti-âge �. Plusieurs mécanismes peuvent être à l'origine cette indication. L'un d'entre eux consiste notamment à stimuler directement ou indirectement la croissance des fibroblastes, ou la synthèse des protéines de structures. Parmi les molécules capables de stimuler la croissance des fibroblastes, ont notamment été décrits les rétinoïdes. Même si l'effet sur la croissance des fibroblastes est effective, l'inconvénient majeur des retinoïdes reste leur action phototoxique et potentiellement mutagène, laquelle est documentée dans l'article � Photomutagenicity of retinyl palmitate by ultraviolet A irradiation in mouse lymphoma cells � Nan Mei et al Toxicological sciences 88(1), 142-149 (2005). Par ailleurs, le Demandeur a décrit dans le document W096/21421, un concept novateur consistant à mettre au point des milieux nutritifs aqueux comprenant essentiellement des vitamines, acides aminés et minéraux destinés à être incorporés dans des compositions cosmétiques, lesdits milieux nutritifs étant aptes à créer un environnement extracellulaire parfaitement adapté à l'épiderme. Ces milieux nutritifs présentent la caractéristique essentielle d'être totalement dépourvus de facteurs de croissance d'origine animale, tels que sérum de veau foetal et extrait de tige pituitaire de boeuf. Sont également exclus du milieu, les facteurs de croissance médicamentaux non utilisables en cosmétique, tels que EGF, insuline, toxine de choléra, hydrocortisone, éthanolamine, phosphoéthanolamine,... L'activité stimulante de la croissance cellulaire est démontrée vis-à-vis des kératinocytes humains normaux. Ces milieux peuvent donc être incorporés dans des compositions cosmétiques mais également être utilisés tels quels, comme milieu de culture de kératinocytes humains normaux in vitro. Dans le document FR-A-2 864 445, le Demandeur a décrit un milieu perfectionné du même type que le précédent, dans lequel on observe la croissance non seulement des kératinocytes mais également des fibroblastes humains normaux. Le milieu est plus particulièrement adapté à l'indication générale � anti-âge �. Les deux milieux nutritifs illustrés dans ces documents contiennent un acide aminé essentiel, en l'espèce la L-glutamine, utilisé en tant que source d'énergie cellulaire. Ce composant est le composant en plus forte proportion après l'eau et le chlorure de sodium et représente respectivement 0,17% (WO96/21421) et 0,2% (FR-A-2 864 445) en poids du milieu. L'inconvénient majeur de cet acide aminé reste son instabilité dans le temps, nécessitant un ajustement avant utilisation Le Demandeur a maintenant mis au point un nouveau facteur de croissance cellulaire d'origine non animal à base de glutamine stabilisée et d'un extrait de laminaire favorisant la stimulation de la croissance des fibroblastes et des kératinocytes. Un tel produit, dont il est démontré qu'il n'est pas photogénotoxique, se présente donc, en cosmétique, comme un substituant potentiel des rétinoides et de tous les produits ayant une activité sur la prévention des effets de l'âge sur la peau. Ce nouveau facteur de croissance, présente par ailleurs des performances au moins comparables à celles des facteurs de croissance cellulaire d'origine animale en faisant ainsi un candidat à la substitution du sérum de veau foetal et des extraits de tige pituitaire de boeuf dans les milieux de culture standards de fibroblastes ou de kératinocytes. De cette propriété, il en découle la possibilité d'utiliser le facteur de croissance de l'invention dans des bases ou milieux nutritifs du même type que ceux décrits dans les documents WO96/21421 et FR-A-2 864 445, ledit facteur de croissance venant en outre se substituer en tout ou partie à la L glutamine présente dans ces milieux. En d'autres termes, l'invention a pour objet un facteur de croissance cellulaire d'origine non animale, qui se caractérise en ce qu'il contient, en tant que glutamine, de la glutamine stabilisée, en l'espèce la L alanyl L glutamine, associée, avantageusement dans un solvant, à un extrait de laminaire. Le Demandeur a en effet constaté que toutes les glutamines stabilisées ne convenaient pas. En particulier, la N acétyl L glutamine associée à un extrait de laminaire n'a aucun effet sur la croissance cellulaire. La L alanyl L glutamine se présente en pratique en solution, bien qu'elle puisse être également utilisée sous la forme d'une poudre. En pratique, la concentration de L alanyl L glutamine pure dans le facteur de croissance est comprise entre .0,01 et 99,9% en poids. La laminaire est avantageusement choisie comme étant la Laminaria digitata. Il s'agit d'une grande algue brune rarement émergée, poussant sur les rochers de l'étage infralittoral jusqu'à une profondeur de 10 m, dans les zones moyennement battues ou à fort courant. Selon l'invention, l'extrait de laminaire est obtenu à partir de thalles ou de parties de thalles sous forme fraîche, congelée, sèche, entière fragmentée ou broyée. L'extrait est un extrait obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, telle que par exemple macération, décoction, lixiviation dans un solvant, en particulier de l'eau, suivie notamment d'une concentration. L'extrait peut se présenter sous forme sèche ou liquide. Dans un mode de réalisation avantageux, l'extrait est un extrait aqueux contenant de préférence entre 20 et 80% en poids de matière sèche, avantageusement entre 40 et 60% en poids. Un tel extrait aqueux représente en pratique entre 0.01% et 99.9% en poids du facteur de croissance. L'invention a également pour objet une composition cosmétique contenant le facteur de croissance précédemment décrit, éventuellement en présence d'au moins un véhicule cosmétique. Dans un mode de réalisation avantageux, la composition cosmétique ne contient pas de rétinoides. En pratique, le facteur de croissance, lequel est constitué de L alanyl L glutamine pure représentant entre 0,01 et 99,99 % de son poids, le complément à 100% étant constitué par l'extrait aqueux de laminaire, représente entre 0,05 et 20%, avantageusement de 0.5 à 5% en poids de la composition cosmétique. La composition cosmétique de l'invention est en général appliquée par voie topique. Elle peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées pour une application topique sur la peau notamment sous forme d'une émulsion huiledans-eau ou eau-dans-huile ou multiple, d'une émulsion siliconée, d'une microémulsion ou nanoémulsion. Cette composition peut être plus ou moins fluide et avoir l'aspect entre autres d'une crème blanche ou colorée, d'une pommade, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum ou d'un gel. La composition de l'invention peut contenir les véhicules habituels dans les domaines cosmétique et dermatologique, tels que les matières grasses, les émulsionnants et co-émulsionnants, les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres hydrophiles et lipophiles, les matières colorantes, les neutralisants, les agents pro-pénétrants, et les polymères. La composition cosmétique peut également contenir des actifs. Dans ce cas, la présence du facteur de croissance permet de renforcer ou de potentialiser l'action des autres ingrédients actifs. Comme actifs, on peut utiliser notamment les dépigmentants, les anti-radicalaires, les émollients, les hydratants, les anti- séborrhéiques, les anti-inflammatoires, les anti-acnéiques, les agents kératolytiques et/ou desquamants, les agents anti-rides et tenseurs, les agents drainants, les agents anti-irritants, les agents apaisants, les amincissants, les vitamines et leurs mélanges, les agents matifiants, les cicatrisants, les antiseptiques et les huiles essentielles. La composition de l'invention peut être utilisée avantageusement pour lutter contre le vieillissement de la peau et/ou l'apparition des rides et/ou pour favoriser la régénération de la peau et plus généralement comme anti-âge. 10 L'invention a également pour objet l'utilisation du facteur de croissance précédemment décrit pour la fabrication d'un médicament cicatrisant. Dans un mode de réalisation particulier, la composition cosmétique contient une base nutritive du même type que celle décrite dans le document FR-A-2 864 445, dans 15 laquelle est incorporé le facteur de croissance de l'invention. Plus précisément, l'invention concerne également une composition cosmétique qui se caractérise en ce qu'elle comprend une base nutritive aqueuse excluant la présence de facteur de croissance d'origine animale, de même que les facteurs de croissance 20 suivants : EGF, insuline, toxine de choléra, hydrocortisone, éthanolamine, phosphoéthanolamine, ladite base étant constituée d'acides aminés, vitamines, composants inorganiques, et contenant en outre le facteur de croissance à base de L alanyl L glutamine et d'extrait de laminaire, tel que décrit précédemment. 25 Dans ce mode de réalisation, le facteur de croissance contient 10 à 100 fois moins de L alanyl L glutamine pure que d'extrait aqueux de laminaire. Dans un mode de réalisation avantageux, les proportions de L alanyl L glutamine et d'extrait dans le facteur de croissance et la proportion de facteur de croissance en tant que tel dans la base, son calculées pour obtenir dans la base nutritive, une concentration de 0.005 à 30 10%, avantageusement égale à 0.01% en poids de L alanyl L glutamine et une concentration de 0,1 à 5%, avantageusement égale à 1% en poids d'un extrait aqueux de laminaire. Pour ce faire, le facteur de croissance contient par exemple de 0.1 à5 10% en poids de L alanyl L glutamine, le complément à 100% étant constitué par l'extrait aqueux de laminaire, le facteur de croissance représentant dans ce cas entre 0,001 et 2% en poids de la base nutritive. Dans ce cas, la composition cosmétique peut être utilisée telle quelle, en particulier sous la forme de lotions sprayable ou formulée en présence de véhicule(s) cosmétique(s). Elle peut être également incorporée dans une base cosmétique, pour formuler une crème ou autre. Comme déjà dit, le facteur de croissance de l'invention trouve également une application comme substitut de sérum de veau ou extrait de tige pituitaire de boeuf dans un milieu de culture ou de survie cellulaire in vitro. L'invention a donc également pour objet un milieu de culture in vitro de fibroblastes humains normaux contenant, en tant que facteur de croissance, le facteur de croissance précédemment décrit, c'est-à-dire un milieu excluant sérum de veau, extrait de tige pituitaire de boeuf, EGF, insuline, toxine de choléra, hydrocortisone, éthano lamine, pho sphoéthano lamine. L'invention a également pour objet un milieu de culture in vitro de kératinocytes humains normaux contenant, en tant que facteur de croissance, le facteur de croissance précédemment décrit. Enfin l'invention a également pour objet un milieu de survie de kératinocytes 25 humains normaux destiné au maintien en survie des substituts cutanés (feuillets épithéliaux) avant greffe, en particulier pour les grands brûlés. L'invention concerne également un milieu de survie de fibroblastes humains normaux destiné au maintien en survie ou à la culture de substituts cutanés avant 30 greffe, en particulier pour les grands brûlés (notamment cultures de fibroblastes dans des matrices de collagène). Lorsque le facteur de croissance est utilisé dans des milieux de culture ou de survie, il représente entre 0,001 et 20 % en poids du milieu, le facteur de croissance proprement dit contenant de 0.1 à 10% en poids de L alanyl L glutamine, le complément à 100% étant constitué par l'extrait aqueux de laminaire. En pratique, le facteur de croissance représente entre 0,05 et 2%, avantageusement 1% en poids du milieu de culture des fibroblastes. De même et toujours en pratique, le facteur de croissance représente entre 0,005 et 1 %, avantageusement 0,1% en poids du milieu de culture des kératinocytes. L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation qui suivent, à l'appui des figures annexées. La figure 1 est une représentation graphique de l'effet de l'association extrait aqueux de Laminaire / L Glutamine sur la croissance de fibroblastes humains normaux en 15 milieu DMEM sans SVF. La figure 2 est une représentation graphique de l'effet de l'association extrait aqueux de Laminaire / L Alanyl L Glutamine sur la croissance de fibroblastes humains normaux en milieu DMEM sans SVF. La figure 3 est une représentation graphique de l'effet de l'association extrait aqueux 20 de Laminaire / N Acétyl L Glutamine sur la croissance de fibroblastes humains normaux en milieu DMEM sans SVF. La figure 4 est une représentation graphique de l'effet de l'association extrait aqueux de Laminaire / L Glutamine sur la croissance de fibroblastes humains normaux en milieu PBS. 25 La figure 5 est une représentation graphique de l'effet de l'association extrait aqueux de Laminaire / L Alanyl L Glutamine sur la croissance de fibroblastes humains normaux dans la base nutritive désignée EVE Pharma. La figure 6 est une représentation graphique de l'effet de l'association extrait aqueux de Laminaire / L Alanyl L Glutamine sur la croissance de kératinocytes humains 30 normaux dans la base nutritive EVE Pharma. La figure 7 est une représentation graphique de l'effet de l'association extrait aqueux de Laminaire / L Alanyl L Glutamine sur la croissance de fibroblastes humains normaux en milieu DMEM sans SVF versus RETINOL à 10-6M et 10-7M ajouté au milieu DMEM sans SVF. La figure 8 est une représentation graphique de l'effet de l'association extrait aqueux de Laminaire / L Alanyl L Glutamine sur la croissance de fibroblastes humains normaux en milieu DMEM sans SVF versus TRANS RETINAL (Rétinaldéhyde) à 10-6M et 10-7M ajouté au milieu DMEM sans SVF. La figure 9 est une représentation graphique de l'effet de l'association extrait aqueux de Laminaire / L Alanyl L Glutamine sur la croissance de fibroblastes humains normaux en milieu DMEM sans SVF versus RETINOL PALMITATE à 10-6M et 10- 7M ajouté au milieu DMEM sans SVF. La figure 10 est une représentation graphique de l'effet de l'association extrait aqueux de Laminaire / L Alanyl L Glutamine sur la croissance de fibroblastes humains normaux en milieu DMEM sans SVF versus RETINYL ACETATE à 10-6M et 10-7M ajouté au milieu DMEM sans SVF. Matériel : Les produits utilisés dans les exemples sont les suivants : L'ensemble des concentrations est exprimé par rapport au milieu. Extrait aqueux de laminaire 40% de matière sèche obtenu par macération à froid puis 20 concentration à partir d'algues fraîches. L Glutamine (G7513 Sigma 100X) L Alanyl L Glutamine 200 mM ( PAN) N Acetyl L Glutamine (Kyowa Hakko) DMEM (Sigma) 25 PBS Base nutritive "EVE Pharma" : INCI Soit une Soit une concentration concentration finale de la base (en finale de la base mg/1) (en mg/1) EAU q.s.p. 1 litre L-ISOLEUCINE 6 CHLORURE DE SODIUM 6885 ACIDE L-ASPARTIQUE 17.3 L-ALANYL L- 2000 SODIUM SULFATE 3.4 GLUTAMINE SODIUM 1160 SULFATE FERREUX Fe504,7H2O 1.39 BICARBONATE D-GLUCOSE 4500 ACIDE FOLIQUE 1.8 L-ARGININE HCL 421.4 THYMIDINE 0.73 SODIUM ACETATE 300 CYANOCOBALAMINE 0.41 DISODIUM PHOSPHATE 284 D-CALCIUM PANTOTHENATE 1.3 Na2HPO4 L-LEUCINE 131.2 THIAMINE HCL 1.3 L-SERINE 136.6 ACIDE THIOCTIQUE 0.2 CHLORURE DE 120 ZINC SULFATE Zn504,7H2O 0.144 MAGNESIUM MgC12, 6H2O CHLORURE DE 112 SODIUM SILICATE NA2SIO3,4H2O 0.142 POTASSIUM L-VALINE 70.3 PYRIDOXINE HCL 1.06 SODIUM PYRUVATE 55 NIACINAMIDE (NICOTINAMIDE) 1.04 L-LYSINE HCL 54 RIBOFLAVINE 0.14 L-HISTIDINE HCL,H2O 50 d-BIOTIN 0.02 L-CYSTEINE HCL H2O 42 SULFATE DE CUIVRE Cu504,5H2O 0.003 ADENINE (HC1) 24 AMMONIUM MOLYBDATE 0.0012 (NH4)6MO7O24,4H2O L-THREONINE 24 AMMONIUM VANADATE NH4VO3 0.00057 CHLORURE DE 0 CHLORURE DE MANGANESE MnC12, 0.00002 4H2O CALCIUM CaC12, 2H2O MYO- INOSITOL 20 HYALURONATE DE SODIUM 700 ACIDE L-GLUTAMIQUE 29.5 L-PROLINE 46.1 L-ASPARAGINE H2O 29.2 HYDROXYPROLINE 30 L-METHIONINE 13.5 ACIDE ASCORBIQUE 1 L-TYROSINE 2Na2 2H2O 11.7 ADENOSINE 0.1 L-PHENYLALANINE 10 GUANINE 0.1 L-TRYPTOPHANE 9.3 DEOXYRIBOSE 0.1 L-ALANINE 18.1 RIBOSE 0.1 GLYCINE 15.1 CHOLINE CHLORIDE 1 MILK PEPTIDE COMPLEX 0 ou 200 (MPC) Osmolarité 280 et 350 mOsm pH : entre 6.5 et 7.5 9 Exemple 1 : influence du type de L Glutamine associée à un extrait de laminaire sur la croissance de fibroblastes humains normaux 1/ Objectif L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet de l'extrait aqueux de Laminaire, associé ou non à trois types de Glutamine, la L.Glutamine, la L Alanyl L Glutamine, la N Acétyl L-Glutamine sur la croissance de fibroblastes humains normaux cultivés pendant 6 jours. Chacune des Glutamines est ajoutée au milieu à la concentration finale de 2 mM. L'étude est réalisée sur une culture effectuée dans le milieu de culture standard des fibroblastes, le DMEM, sans ajout de sérum de veau foetal, ainsi que dans un milieu tampon PBS (avec CaC12 et MgC12) et dans lesquels sont ajoutés les différents actifs étudiés. L'étude est réalisée en comparaison avec une culture effectuée en conditions standards de culture (milieu DMEM supplémenté de 10% de sérum de veau foetal). 2/ Technique Les fibroblastes sont ensemencés à faible densité (5000 cellules/puit) en plaque 96 puits dans le milieu standard (DMEM + 10% SVF) et poussent pendant 24h après ensemencement dans ce milieu. Au 2eme jour, les cellules sont placées dans les différentes conditions étudiées. • Contrôle : DMEM (contenant L Glutamine à 2 mM) + SVF 10% • DMEM, sans L Glutamine, sans SVF • DMEM, sans L Glutamine, sans SVF + Extrait de Laminaire à 1% • DMEM, sans L Glutamine, sans SVF + L Glutamine (2mM) + Extrait de Laminaire à 1% • DMEM, sans L Glutamine, sans SVF + L Alanyl L Glutamine (2 mM) • DMEM, sans L Glutamine, sans SVF + L Alanyl L Glutamine (2 mM) + Extrait de Laminaire à 1% • DMEM, sans L Glutamine, sans SVF + N Acétyl L Glutamine L2 mM) • DMEM, sans L Glutamine, sans SVF + N Acétyl L Glutamine L2 mM) + Extrait de Laminaire à 1% • Tampon PBS (avec CaC12 et MgC12 , NaHCO3, Glucose (4.5g/1) = concentrations identiques à celles du DMEM) • Tampon PBS + L Glutamine (2mM) • Tampon PBS + L Glutamine (2mM) + Extrait de Laminaire à 1% Chaque condition est réalisée en quadruplicate. Les milieux ne sont pas renouvelés au cours de l'expérimentation. La densité cellulaire est évaluée 24h après l'ensemencement des cellules, avant la mise au contact des différentes conditions d'étude (= TO) puis la croissance des fibroblastes est évaluée au 1ere' 4ème' Sème et hème jours de culture par la méthode de conversion du WST-1 (lecture à 450 nm). 3/ Résultats La figure 1 présente les résultats obtenus pour la culture de fibroblastes humains normaux en milieu DMEM en présence d'extrait aqueux de Laminaire +/- ajout de L 20 Glutamine. - En l'absence de L Glutamine, l'extrait de Laminaire à la concentration de 1% dans le milieu DMEM, ne permet pas de croissance cellulaire. -L'ajout de L.Glutamine (2 mM) au milieu DMEM stimule la croissance des 25 fibroblastes humains normaux. - L'association L Glutamine (2 mM) et d'extrait aqueux de Laminaire à 1% dans le milieu DMEM stimule fortement la croissance des fibroblastes humains normaux. 30 La figure 2 présente les résultats obtenus pour la culture de fibroblastes humains normaux en milieu DMEM en présence de L Alanyl L Glutamine +/- ajout d'extrait aqueux de Laminaire. 15 - Les résultats obtenus avec la L Alanyl L Glutamine, seule ou associée à l'extrait aqueux de Laminaire, sont en tous points similaires avec ceux obtenus avec la L.Glutamine. La figure 3 présente les résultats obtenus pour la culture de fibroblastes humains normaux en milieu DMEM en présence N Acétyl L Glutamine +/- ajout de d'extrait aqueux de Laminaire. - L'ajout de N Acétyl L Glutamine (2 mM) au milieu DMEM ne stimule pas la croissance des fibroblastes humains normaux. - L'ajout de l'extrait aqueux de Laminaire à 1% associé à la N Acétyl L Glutamine (2 mM) dans le milieu DMEM ne stimule pas la croissance des fibroblastes humains normaux. La figure 4 présente les résultats obtenus pour la culture de fibroblastes humains normaux dans le tampon PBS en présence L Glutamine +/- ajout d'extrait aqueux de Laminaire. - En milieu PBS (avec CaC12 et MgC12, NaHCO3, Glucose (4.5g/1) = concentrations identiques à celles du DMEM), on observe une absence de croissance des fibroblastes humains normaux. -L'ajout de L.Glutamine (2 mM) au tampon PBS permet une légère croissance des fibroblastes humains normaux. - L'association L Glutamine (2 mM) et extrait aqueux de Laminaire à 1% dans le tampon PBS augmente l'effet de stimulation de la croissance des fibroblastes humains normaux observé avec la L Glutamine. Dans la mesure où les figures 1 et 2 montrent que la substitution de la L Glutamine par la L Alanyl L Glutamine donne des résultats identiques, on peut s'attendre également à ce que l'utilisation de L Alanyl L Glutamine dans le milieu PBS donne des résultats identiques à ceux obtenus avec la L Glutamine. Exemple 2 : Effet de L Alanvl L Glutamine associée à un extrait de laminaire sur la croissance de fibroblastes humains normaux cultivés dans la base nutritive (EVE Pharma) L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet de l'extrait aqueux de Laminaire associé à la L Alanyl L Glutamine sur la croissance de fibroblastes humains normaux cultivés pendant 7 jours dans la base EVE PHARMA. La base nutritive contient en tant que Glutamine, de la L Alanyl L Glutamine (Glutamine stabilisée). L'étude est conduite dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 La figure 5 présente les résultats obtenus pour la culture de fibroblastes humains 15 normaux dans la base nutritive en présence de L Alanyl L Glutamine et d'extrait aqueux de Laminaire. - L'ajout d'extrait aqueux de laminaire à la concentration de 1% à la base nutritive (contenant la L Alanyl L Glutamine), avec ou sans MPC (Mille 20 Peptide Complex) permet la croissance des fibroblastes humains normaux sur 7 jours de cultures. Exemple 3 : Effet de L Alanvl L Glutamine associée à un extrait de Laminaire sur la croissance de kératinocvtes humains normaux cultivés dans la base 25 nutritive EVE Pharma. L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet de l'extrait aqueux de Laminaire associé à la L Alanyl L Glutamine sur la croissance de kératinocytes humains normaux cultivés pendant 5 jours dans la base nutritive EVE Pharma. La base nutritive contient en tant que Glutamine, de la L Alanyl L Glutamine (glutamine stabilisée). 30 L'étude est conduite dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 mais sur des kératinocytes. La figure 6 présente les résultats obtenus pour la culture de kératinocytes humains 5 normaux dans la base nutritive en présence de L Alanyl L Glutamine et d'extrait aqueux de Laminaire. - L'ajout d'extrait aqueux de Laminaire à la concentration de 0,1% à la base nutritive EVE (contenant la L Alanyl L Glutamine) sans MPC (Milk 10 Peptide Complex) permet la croissance des kératinocytes humains normaux comparable à celle obtenue dans la base nutritive EVE (avec MPC). Exemple 4 : Effet de L Alanvl L Glutamine associée à un extrait de Laminaire sur la croissance de fibroblastes humains normaux en milieu DMEM versus 4 15 rétinoides 1/ Obiectif de l'étude L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet de 4 rétinoïdes sur la croissance de 20 fibroblastes humains normaux, étude comparative versus effet du Complexe extrait aqueux de Laminaire et L Alanyl L Glutamine. L'effet des rétinoïdes sur la croissance cellulaire est évalué sur une culture effectuée dans le milieu de culture standard des fibroblastes, le DMEM, sans ajout de sérum de 25 veau foetal, et dans lequel sont ajoutés les rétinoïdes aux concentrations de 10-6M et 10-7M (concentrations testées non cytotoxiques). L'effet du complexe de l'invention est évalué sur une culture effectuée dans le milieu DMEM sans SVF, en présence de L Alanyl L Glutamine et dans lequel est ajouté l'extrait de Laminaire à 1%. / Technique Les fibroblastes sont ensemencés à faible densité (3000 cellules/puit) en plaque 96 5 puits dans le milieu standard (DMEM + 10% SVF) et poussent pendant 24h après ensemencement dans ce milieu. Au 2eme jour, les cellules sont placées dans les différentes conditions étudiées. 10 • Contrôle : DMEM + SVF 10% (DMEM complet) • DMEM + DMSO à 0.0001% (témoin solvant des rétinoïdes) • DMEM sans SVF + L Alanyl L Glutamine à 2 mM + Extrait de Laminaire à 1% • DMEM sans SVF + RETINOL à 10-6M (solvant DMSO) 15 • DMEM sans SVF + RETINOL à 10-'M (solvant DMSO) • DMEM sans SVF + TRANS RETINAL à 10-6M (solvant DMSO) • DMEM sans SVF + TRANS RETINAL à 10-'M (solvant DMSO) • DMEM sans SVF + RETINOL PALMITATE à 10-6M (solvant DMSO) • DMEM sans SVF + RETINOL PALMITATE à 10-'M (solvant DMSO) 20 • DMEM sans SVF + RETINYL ACETATE à 10-6M • DMEM sans SVF + RETINYL ACETATE à 10-'M Chaque condition est réalisée en triplicate. 25 La densité cellulaire est évaluée 24h après l'ensemencement des cellules, avant la mise au contact des différentes conditions d'étude (= TO) puis la croissance des fibroblastes est évaluée au ter 2ème 3ème et 5ème jours de culture par la méthode de conversion du WST-1 (lecture à 450 nm). 15 / Résultats La croissance cellulaire est objectivée par la mesure de la viabilité cellulaire à différents temps de l'expérimentation. - Comme le montrent les figures 8 à 11, l'extrait aqueux de Laminaire, à la concentration de 1%, associé à la L Alanyl L Glutamine (2mM) en milieu DMEM sans SVF, permet une forte croissance des fibroblastes humains normaux jusqu'au 5eme jour de mise en culture et ce, de façon supérieure aux 4 rétinoïdes testés aux concentrations de 10-6M et 10-7M. Exemples 5 : Evaluation de la photoprotection interne contre les UVA (1.0 J/cm2) de la laminaire extrait aqueux (extrait identique à celui des exemples précédents) et rétinol palmitate par le test des comètes sur des fibroblastes humains normaux Culture de fibroblastes humains normaux Les cultures de fibroblastes humains normaux (FHN) sont réalisées à partir de prépuces d'enfants et de nouveau-nés ayant un phimosis. Les fibroblastes obtenus à partir de fragments de peau sont placés dans le milieu DMEM (Sigma St Louis, MO, USA) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF) (Dominique Dutscher, Brumath, France). Les cultures sont maintenues dans un incubateur à 37°C et sous atmosphère contenant 5% de CO2. Préparation des lames et irradiation des cellules Après un traitement avec un mélange trypsine / EDTA (0,05% / 0,02%) pendant 2 à 3 minutes, les cellules sont récupérées par centrifugation et placées dans du tampon PBS sans Cal+ ni Mg2+ (Sigma). Suivant une seconde centrifugation, les cellules (dont le nombre est compris entre 4,5 x 104 et 5,0 x 104) sont placées en suspension dans 0,5% d'agarose Low Melting Point, LMP (Sigma). Le mélange est directement 16 déposé sur des lames de microscope qui sont recouvertes d'une pré-couche d'agarose (1,6%) séchée pendant une nuit à température ambiante et fraîchement précoatée avec une seconde couche d'agarose (0,8%). Une troisième couche d'agarose LMP est enfin déposée pour emprisonner les kératinocytes. Les irradiations UVA sont générées par un irradiateur UV Bio-Sun (Vilbert Lourmat, Marne la Vallée). Cet appareil est équipé de lampes monochromatiques qui émettent à des longueurs d'onde de 365 nm. Les lampes délivrent une énergie calculée, à l'aide d'un radiomètre de type RMW-365/312 de 4.0 mW/cm2 pour les UVA : les énergies délivrées sont alors de 0,8 J/cm2. Les cellules sont irradiées par les UVA sur un bain de glace et le test des comètes est réalisé immédiatement après l'exposition. Test des comètes (technique des lames sèches) Le protocole du test des comètes est celui de De Méo et Coli (Méo M, Laget M, Castegnaro M, Duménil G. ; Genotoxic activity of potassium permanganate in acidic solutions ; Mutation Res. 1991; 260; 295-306) en incorporant la technique des � lames sèches � (Klaude M, Ericksson S, Nygren J, Annstrom G. The comet assay: mechanism and technical consideration. Mutation Res. 1996; 363; 89-96). Les lames sont placées, après les irradiations, dans un bain de lyse contenant 2,5 M de NaCl, 100 mM de Na2EDTA, 10 mM de Tris-HC1 pH 10, 1% de sodium sarcosinate, 1% de triton X-100 et 10% de DMSO. La lyse cellulaire s'effectue à 4°C pendant 60 min suivie par la dénaturation de l'ADN à température ambiante pendant 20 min dans une solution fortement alcaline comprenant 1 mM de Na2EDTA et 300 mM de NaOH à un pH supérieur à 13,0. Après une électrophorèse (25V, 300 mA) pendant 20 min, les lames sont neutralisées par le tampon Tris-HCI (0,4 M ; pH 7,4) et déshydratées dans de l'éthanol ou du méthanol absolu. Observation microscopique et analyse d'images Les lames sont colorées par une solution de bromure d'éthidium et observées à l'aide d'un microscope à fluorescence BH2-RFL (Olympus, Japon) équipé d'un filtre dichroïque 20BG-W (excitation : 515-560 nm ; émission : 590 nm) et d'un objectif Apo D-Plan 20x. L'analyse d'images s'effectue avec une caméra CCD monochrome haute sensibilité (Cohu 4912-5000) couplée à une carte d'acquisition Matrox IP-8. L'ensemble est piloté par le logiciel Fenestra Komet (Kinetic Imaging, Liverpool, RU, version 3.1). Un total de 100 cellules par échantillon (50 cellules par lame) est analysé. Le paramètre utilisé est " Olive Tail Moment" (OTM qui est défini comme le produit du pourcentage d'ADN dans la queue de la comète par la longueur de celle-ci exprimée en �m). Pour chaque série d'expériences, un contrôle négatif (cellules non irradiées) et un contrôle positif (cellules irradiées sans écran) sont inclus. La photoprotection interne a été mesurée après un traitement de 120 min à 37°C. Pour l'irradiation UVA (320 nm -400 nm), la dose totale d'irradiation était de 1.0 J/cm2 pour une période de 4 min. Les contrôles négatifs comprenaient des fibroblastes non traités et non irradiés et des fibroblastes traités par l'extrait de laminaire (0.1%), et par le rétinol palmitate (10-6 M) et non irradiés. Les coefficients de protection génomique (CPGuvA) sont calculés avec la formule : CPG = 1ù (x20TMe x2oTMCe) x100 (x2OTMc+ ùx2OTMc_ ) Avec x OTMe: x2 OTM de l'échantillon ; x OTMCe : x2 OTM du contrôle non irradié de l'échantillon; x OTMc_ : x2 OTM du contrôle non irradié ; x OTMc+ : x2 20 OTM du contrôle irradié. x2 OTM : paramètre calculé par régression des distributions des OTM selon une fonction x2 (voir : Bauer et Coli (Bauer E, Recknagel RD, Fiedler U, Wollweber L, Bock C, Greulich KO ; the distribution of the tail moments in single cell 25 electrophoresis (comet assay) obeys a chi- square (x2) not a gaussian distribution ; Mutation Res. 1998; 398: 101-110)). Dans ces conditions expérimentales, seules les cassures de brin d'ADN provoquées par des espèces radicalaires ont été examinées. Les lésions directes de l'ADN 30 induites principalement par les rayonnements UVB n'ont pas été détectées. Les résultats sont résumés dans le Tableau 1. Condition Moy�ET Med OTMx2�ET CPGvuv Témoin(DMEM)/NI 1.41 � 0.12 1.27 2.11 � 0.09 100 DMSO(DMEM)/NI 1.62 � 0.13 1.42 2.12 � 0.10 100 Laminaire/NI 4.48 � 0.48 2.89 2.50 � 0.19 10-eM rétinol 3.54 � 0.25 2.79 2.98 � 0.29 palmitate/ NI Témoin/UVA 19.97 � 0.94 17.98 13.21 � 0.50 0 DMSO/UVA 20.47�0.87 20.70 13.53�0.54 0 Laminaire/UVA 15.97�0.81 15.03 10.78�0.30 25.4*** 10-6M rétinol 25.06�1.23 22.73 14.41�0.48 -91.9*** palmitate/UVA Témoin/NI cellules cultivées en milieu DMEM et non irradiées. DMSO (DMEM)/NI cellules traitées directement dans le milieu DMEM - DMSO (solvant solubilisant PR) pendant deux heures à 37°C et non irradiées. Laminaire/NI cellules traitées avec 0.1% de laminaire extrait aqueux pendant deux heures à 37°C et non irradiées. Témoin/UVA cellules cultivées en milieu DMEM et irradiées par des rayonnements UVA (1.0 J/cm2) DMSO/UVA cellules dans le milieu DMEM + DMSO irradiées par des rayonnements UVA (1.0 J/cm2). Laminaire/UVA cellules traitées avec 0.1% de laminaire extrait aqueux pendant deux heures à 37°C puis irradiées par des rayonnements UVA (1.0 J/cm2) 10-6 M rétinol palmitate/ NI : cellules traitées avec 10-6 M de rétinol palmitate pendant deux heures à 37°C et non irradiées. 10-6 M rétinol palmitate/uvA : cellules traitées avec 10-6 M de rétinol palmitate pendant deux heures à 37°C puis irradiées par des rayonnements UVA (1.0 J/cm2). *** significativement différent de Témoin/UVA ou DMSO/UVA (P Exemples 6 : Compositions cosmétiques 20 Composition 1 Facteur de croissance 0.75% - 67% extrait aqueux de laminaire (50/50) + 25 - 33% Alanyl glutamine Isostearyl Isostearate Oxyde de Titane (MT 100Z) Acide hyaluronique Dimethicone trimethylsiloxysilicate 30 Tocopheryl Acetate Eau purifiée Sucroester Glycerin 5,00 % 5,00 % 2,00 % 3,00 % 0,20 % qsp 100 % 5,00 % 5,00 % 0,10 % 0,40 % 0,20 % 1.65% 4,00 % 0,50 % 0,50 % 8,00 % 2,00 % 2,00 % 0,25 % 0,10 % 27,05 % 10,00 % 5,00 % 0,45 % 2,50 % 1,00 % qsp 100 % Methylparaben Phenoxyethanol Parfum Composition 2 Facteur de croissance - 90% extrait aqueux de laminaire (50/50) + - 10% Alanyl glutamine Glyceryl Stearate Alcool cétylique Dimethicone Coco Caprylate/Caprate PVP/Eicosene copolymère Potassium Cetyl Phosphate Methylparaben Disodium EDTA Eau purifiée Polymère acrylique Propylene Glycol Potassium Hydroxide Tocopheryl Acetate Panthenol Parfum Composition 3 Caprylic/Capric Triglyceride Octyl stearate Facteur de croissance - 94% extrait aqueux de laminaire (50/50) + - 6% Alanyl glutamine Parfum Polyglyceryl-3 Diisostearate PEG-20 Glyceryl Laurate 4,00 % 3,00 % 0.85% 0,30 % 4,00 % 1,00 % Eau Polymère acrylique Hexanediol Phenoxyethanol Methylparaben Gomme xanthane Triethanolamine Eau purifiée Acetyl tyrosine Composition 4 : Stéarate de glycérol 1,50 % Octyldodécanol 5,00 % BHA 0,01 % Cétyl phosphate de potassium 0,93 % Stéarate de magnésium 0,70 % Eau déminéralisée qsp 100 % Facteur de croissance 0.02% - 50% extrait aqueux de laminaire (50/50) + - 50 % Alanyl glutamine Cyclomethicone 3,00 % Matricium� 3,00 % Simulgel NS 0,50 % Phenonip 0.50 % Composition 5 : Alcool cetearylique et cetearyl glucoside 4,00 % Huile de jojoba 5,00 % Huile d'amande douce raffinée 5,00 % Polyacrylamide et Isoparaffine C13-C14 et laureh-7 (Sepigel �) 2,00 % BHA 0,01 % Eau déminéralisée qsp 100 % Facteur de croissance 1.05% 66,95 % 0,4 % 2,00 % 0,50 % 0,25 % 0,30 % 0,85 % 3,85 % 2 % - 95% extrait aqueux de laminaire (50/50) + - 5 % Alanyl glutamine Cyclomethicone Polysaccharide bactérien EDTA Acide citrique Methyl paraben Phenoxyethanol Composition 6 : Eau déminéralisée Extrait de thè vert Facteur de croissance - 90% extrait aqueux de laminaire (50/50) + - 10 % Alanyl glutamine Vitamine C stabilisée Paraoxybenzoate de méthyle sodé Cyclomethicone Simulgel NS Phenonip Acide lactique 3,00 % 7,00 % 0,10 % 0,045 % 0,30 % 0.40% qsp 100 % 0,90 % 0.55% 1,00 % 0,20 % 5,00 % 4,00 % 0.65 % qsp pH=6.5 REVENDICATIONS 1/ Composition présentant une activité de facteur de croissance cellulaire d'origine non animale, caractérisé en ce qu'elle contient de la L alanyl L Glutamine, associée, 5 à un extrait de Laminaire. 2/ Composition selon la revendication 1, caractérisé en ce que la Laminaire est la Laminaria digitata. 10 3/ Composition selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'extrait de laminaire est un extrait aqueux. 4/ Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la L alanyl L glutamine est pure et représente entre 0,01 et 99,99 % en poids du facteur, 15 le complément à 100% étant constitué par l'extrait aqueux de laminaire. 5/ Composition cosmétique contenant la composition présentant une activité de facteur de croissance objet de l'une des revendications 1 à 4, éventuellement en présence d'au moins un véhicule cosmétique. 6/ Composition cosmétique selon la revendication 5, caractérisé en ce que la composition présentant une activité de facteur de croissance représente entre 0,05 et 20%, avantageusement de 0.5 à 5% en poids de la composition cosmétique. 25 7/ Composition cosmétique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'elle comprend une base nutritive aqueuse constituée d'acides aminés, vitamines, composants inorganiques. 8/ Composition cosmétique selon la revendication 7, caractérisé en ce que la 30 concentration en L alanyl L glutamine dans la base nutritive est comprise entre 0.005 et 10%, avantageusement égale à 0.01% en poids et la concentration en extrait 20aqueux de laminaire dans la base nutritive est comprise entre 0,1 à 5%, avantageusement égale à 1% en poids. 9/ Utilisation de la composition objet de l'une des revendications 5 à 8, pour lutter contre le vieillissement de la peau et/ou l'apparition des rides et/ou pour favoriser la régénération de la peau. 10/ Milieu de culture in vitro de fibroblastes et/ou de kératinocytes humains normaux contenant, en tant que facteur de croissance, la composition objet de l'une des revendications 1 à 4 11/ Milieu de survie de kératinocytes humains normaux destiné au maintien en survie des substituts cutanés avant greffe, en particulier à un grand brûlé contenant, en tant que facteur de croissance, la composition objet de l'une des revendications 1 à 4. 12/ Milieux selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que la composition présentant une activité de facteur de croissance contient de 0.1 à 10% en poids de L alanyl L glutamine, le complément à 100% étant constitué par l'extrait aqueux de laminaire, ledit facteur représentant entre 0,001% et 20% en poids du milieu.