FR 2927090 A1 20090807 FR 0800516 A 20080131 DESCRIPTION L'invention concerne le domaine de l'évolution dirigée et plus particulièrement le domaine de la sélection de cellules in vivo. Plus particulièrement, l'invention concerne la sélection de cellules 5sur la base de l'activité d'une ou plusieurs enzymes extracellulaires d'intérêt industriel qui sont sécrétés par lesdites cellules et agissent sur un substrat situé à l'extérieur des cellules Les enzymes extracellulaires constituent l'essentiel des enzymes 10utilisées dans l'industrie et ils sont particulièrement recherchés car leur production et leur récupération est aisée. Une catégorie d'enzymes extracellulaires importants sont les enzymes comme certaines protéases (exemple : les protéases de champignons) qui seraient toxiques pour la cellule si elles s'accumulaient dans le 15cytoplasme. Les lipases constituent une classe d'enzymes extracellulaires d'un grand intérêt industriel. Les glucoamylases et alpha-amylases sont utilisées dans la synthèse d'éthanol à partir d'amidon. Diverses enzymes sont utilisées, dans leur cellule naturelle, pour produire de l'acide lactique, monomère permettant la 2Osynthèse de bioplastique. Les phytases sont des enzymes d'un intérêt croissant en alimentation animale et peuvent être produites par sécrétion en grande quantité (5-50g/L) chez une levure, notamment Pichia Pastoris. Les laccases sont des enzymes extracellulaires dégradant une variété de composés phénoliques. Les cellulases sont 25des enzymes sécrétés par des bactéries sous forme de gros complexes plurienzymatiques appellés cellulosomes et qui peuvent dégrader la cellulose. Améliorer l'efficacité des cellulases et parvenir à créer des microorganismes cellulolytiques efficaces est un enjeu majeur pour la création de biocarburants de nouvelle génération, capable de 30remplacer de manière économique et écologique, une fraction significative (jusqu'à 50%) du pétrole actuel. Pour améliorer une enzyme, intracellulaire ou extracellulaire, deux types d'approches sont possibles : la conception rationnelle (� rational design �) ou l'évolution dirigée. La conception rationnelle 35cible un ou un petit nombre de résidus de l'enzyme sur la base d'une 1 modélisation de sa structure tridimensionnelle. L'évolution dirigée est une approche stochastique qui s'inspire de l'évolution Darwinienne pour, au laboratoire, créer des populations d'individus qui sont des variants diversifiés de biomolécules ou de cellules et Strier, au sein de ces populations, des biomolécules ou des cellules présentant des propriétés améliorées par rapport à un critère d'intérêt. Deux types de méthode de tri existent : le criblage, où les variants sont évalués un par un et la sélection où les variants sont évalués 10tous simultanément (� en masse �). Lorsqu'elles existent, les méthodes de sélection sont supérieures au méthodes de criblage car elles sont plus rapide, moins onéreuses et permettent de trier des populations plus grandes. Par exemple si les individus sont des variants d'anticorps, les méthodes dites de 15� ribosome display � ou de � plasmid display � permettent de sélectionner directement des anticorps améliorés, capables de se lier à un antigène d'intérêt, parmi des poulations de 10'0 1012 individus. La question de la sélection sur la base d'une affinité est ainsi largement réglée par l'utilisation de ce type d'outils. 2OLorsque la propriété d'intérêt est une activité catalytique, la sélection est beaucoup plus compliquée à mettre en oeuvre : il faut disposer d'un lien entre génotype (ADN) et phénotype (produit de la réaction enzymatique). Ce lien est créé sous la forme d'une compartimentation: un compartiment naturel ou artificiel renferme 251'ADN, l'enzyme codé et les produits de l'activité enzymatique. Des techniques de sélection in vitro d'activité catalytique ont été décrites. Elles utilisent des émulsions dans lesquelles sont exprimées gràce à un mélange de transcription/traduction in vitro des enzymes. Chaque goutte contient un plasmide et exprime une 30enzyme. Au sens strict, ces techniques sont des méthodes de criblage, car les variants sont évalués individuellement. L'utilisation d'un FACS (� fluorescence activated cell sorter �) permet un criblage à très haut débit tout en conservant un volume réactionnel total faible mais le FACS reste un matériel complexe et 35onéreux. En outre, des émulsions doubles sont utilisées afin de disposer d'une phase continue aqueuse dans l'appareil. Ceci complique notablement la formulation. Les méthodes de sélection in vivo sont donc souvent préférées. Elles Sont l'avantage d'une relative simplicité et permettent de sélectionner l'activité globale d'une cellule et non pas seulement l'activité d'un ou d'un petit nombre de gènes exprimés in vitro. Deux grandes techniques de sélection in vivo existent : la sélection en milieu liquide, dans des chemostats, et la sélection en milieu 10solide. La sélection en milieu liquide a pour inconvénient sa durée souvent plusieurs mois. La sélection en milieu liquide n'est pas adaptée à la sélection d'activités extracellulaires car en raison de la diffusion rapide des petites molécules, des enzymes et, à un 15degré moindre, des cellules et des gros polymères biologiques (par exemple, un échantillon de biomasse), un � cross-feeding � a lieu entre les cellules. Ce cross feeding conduit à rompre le lien génotype-phénotype qui est un prérequis indispensable à toute sélection. 2OUne solution a été récemment proposée (Zhiliang Fan et al. (2005) � Theoretical analysis of selection-based strain improvement for microorganisms with growth dependent upon extracytoplasmic enzymes � Biotechnology and Bioengineering 92 (1) . 35-44): l'utilisation d'enzymes fixés à la surface cellulaire, qui permet de diminuer de 25manière plus ou moins importante le cross-feeding. Cette utilisation d'enzymes fixées à la surface cellulaire a pour inconvénient de compliquer la construction moléculaire et donc de limiter le nombre d'enzymes différents qui peuvent être co-exposés à la surface de la cellule. En outre, l'utilisation d'enzymes exposés sur la paroi 30cellulaire peut générer des biais importants liés au fait que la ou les enzymes sont exprimés en fusion avec une ou des protéines leur permettant d'être dirigés vers la paroi cellulaire : le repliement de l'enzyme d'intérêt peut être affecté. Le lien entre les enzymes et la cellule peut en outre créer des problèmes d'accessibilité au substrat. Dans le cas de la dégradation de la cellulose, qui présente un très grand intérêt dans le cadre de la valorisation de la biomasse sous forme de biocarburants dits de deuxième et troisième génération, ce problème d'accessibilité du substrat peut 5être un problème majeur : les cellules utilisées sont préférentiellement des levures, d'un diamètre de 5pm et les microfibrilles de cellulose ont un diamètre de lpm seulement. La sélection en milieu solide a pour inconvénient de n'être qu'une sélection de type binaire : certaines cellules poussent, d'autres ne 10poussent pas, on n'observe uniquement les résultats finaux de cette pousse sous la forme d'une colonie millimétrique qui devient visible au bout de dizaines de division. La sélection en milieu solide est donc adaptée à l'isolation de cellules ayant une activité donnée au sein d'une population diversifiée de cellules n'ayant pas cette 15activité mais ne permet pas d'enrichir une population en ses cellules les plus actives. Le nombre de cellules positives est au maximum de l'ordre de grandeur de la densité maximale de colonies distingables à l'oeil soit environ 2000 sur une grande boite de pétri (20*25cm). 2OLe procédé selon l'invention est un procédé de sélection en milieu liquide sélectif compartimenté. Les compartiments sont les goutelettes aqueuses d'une émulsion inverse (eau dans huile). Ces goutelettes sont d'une taille située dans la gamme haute des tailles classiques des goutelettes d'émulsion : 5 à 500pm, de préférence 10 25à 100pm de diamètre. Le procédé selon l'invention est un procédé de sélection de cellules caractérisé en ce qu'une population diversifiée de cellules vivantes d'un microorganisme est transférée dans un milieu sélectif puis immédiatement dispersée dans les compartiments d'une émulsion 30inverse, en ce que la croissance et le taux de croissance des cellules dans les compartiment dépend de leur adaptation au critère de sélection introduit par le milieu sélectif et en ce qu'aucun échange n'a lieu entre les dits compartiments. Dans un mode de réalisation particulier, l'émulsion utilisée est cristallisable et l'huile est solide à la température à laquelle poussent les cellules pendant la sélection. De préférence, le nombre moyen de cellules par goutte est inférieur 5à 30, de préférence inférieur à 5, plus préférentiellement compris entre 0.01 et 1. Le micro-organisme soumis à la sélection est une bactérie, une levure ou une micro-algue, mesophile ou thermophile. Dans un mode de réalisation particulier, la population diversifiée 10de cellules est obtenue par mutagenèse du génome des cellules ou par recombinaison in vivo du génome des cellules. Dans un mode de réalisation particulier, la population diversifiée de cellules est obtenue en transformant des cellules identiques par une banque de vecteurs d'expression portant des variants d'un ou 15plusieurs gènes, ces variants ayant été obtenus par mutagenèse aléatoire, mutagenèse dirigée ou recombinaison in vitro. L'émulsion utilisée est de préférence du type suivant : émulsion simple inverse eau dans huile, les cellules étant dans la phase la plus interne de l'émulsion. 2ODans un mode de réalisation particulier, la phase continue de l'émulsion est cristallisable à une température supérieure à la température minimale de pousse des cellules utilisée et inférieure à la température à laquelle les cellules utilisées meurent si elles y sont exposées pendant une durée de l'ordre de la durée de 25cristallisation dans les conditions de l'expérience. Préférentiellement, si l'organisme utilisé est une levure (ex. S. cerevisiae) ou une bactérie (ex. Escherichia coli) mésophile, l'huile est liquide à moins de 30°C (ou 35°C, 40°C) et est solide à partir au dessus de cette température. Préférentiellement, si 301'organisme utilisé est un microorganisme thermophile (ex. Thermus thermophilus, Pyrococcus furiosus), . L'huile utilisée est préférentiellement, sans que cette liste puisse être considérée comme exhaustive, l'une des huile suivante : decane, docecane, kerozène, huile minérale, suppocire, huile de silicone, huile fluorocarbonée, huile végétale alimentaire, triglycérides non 5purifié; les surfactants utilisés sont de préférence un ou plusieurs surfactants de la liste suivante : PGPR, Span 60, Span80, Arlacel P135, Cholesterol et toute autre formulation adaptée connue de l'homme de métier. Préférentiellement, la formule suivante est utilisée : decane, x%v Span60, x%v Cholesterol où x est compris 10entre 2 et 6, prérentiellement 2 et 4. Dans un mode de réalisation particulier, l'émulsion est fabriquée par un disositif dit de microfluidique, et les gouttes ont un diamètre compris entre 1 et 500pm, de préférence compris entre 5 et 200pm, plus préférentiellement compris entre 50 et 150pm. Le 15dispositif microfluidique utilisé est composé de verre - fabriqué préférentiellement par étirement d'un capillaire - ou d'un polymère photosensible comme le PDMS - fabrication par soft lithographie. Dans un un autre mode de réalisation, l'émulsion est fabriquée par un dispositif dit de millifluidique, et où les gouttes ont un 20diamètre compris entre 0.5 et 20 mm, de préférence compris entre 1 et 3mm. Dans un mode de réalisation particulier, le milieu utilisé pour la sélection comprend comme seule source de carbone de la cellulose et les cellules expriment une ou plusieurs enzymes cellulolytiques et 25sont sélectionnées sur leur capacité à dégrader la cellulose. Dans un mode de réalisation particulier, le milieu sélectif utilisé comprend comme seule source d'azote des protéines d'une ou plusieurs espèce et les cellules expriment une ou plusieurs enzymes protéolytiques et sont sélectionnées sur leur capacité à dégrader 301es protéines du milieu. Dans un mode de mise en oeuvre avantageux, le milieu sélectif utilisé comprend comme seule source de carbone de l'amidon, de préférence de l'amidon non liquéfié et les cellules expriment une ou plusieurs enzymes permetant saccharification et fermentation. Dans un mode de réalisation particulier, le milieu sélectif utilisé comprend comme seule source de carbone de l'amidon, de préférence de l'amidon non liquéfié et les cellules expriment une ou plusieurs enzymes permettant de le transformer en acide lactique ou autre 5monomère d'intérêt industriel. De préférence, les cellules sont mises à pousser dans les gouttes de l'émulsion pendant une durée comprise entre 1 heure et 1 mois, de préférence 3 heures et 3 jours, plus préférentiellement 6 à 24 heures. 10Dans un mode de mise en œuvre particulier, après avoir été cultivées dans les gouttes d'émulsion, les cellules sont récupérées vivantes après séparation des phases huileuse et aqueuse à une température où l'huile est liquide et où les cellules sont vivantes, par une méthode adapté, notamment: centrifugation, ajout d'un surfactant, 15ajout d'un autre composé déstabilisant les émulsions mais ne tuant pas les cellules. Dans un mode de réalisation particulier, après avoir été cultivées dans les gouttes d'émulsion, les cellules sont récupérées mortes après séparation des phases huileuse et aqueuse à une température ou 20dans des conditions chimiques qui sont léthales pour les cellules. L'ADN plasmidique des cellules, qui contient le ou les gènes d'intérêt, est alors préparé et retransformé dans des cellules fraîches compétentes. Dans un mode de mise en œuvre particulier, les cellules récupérées 25ou transformées sont soumises à une nouvelle itération du procédé. Préférentiellement, la pression de sélection est augmentée au fil des tours de sélection. Dans un mode de réalisation préféré, les cellules, après un ou plusieurs tours de sélection en émulsion, sont directement étalées 30sur support solide, sélectif ou non. L'invention concerne également les cellules, gènes et protéines obtenus à l'issue du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. Le procédé revient à isoler chaque cellule dans un compartiment distinct, sans aucun échange avec les autres compartiments. Pour tenir compte de la distribution de Poisson, les cellules sont dispersées dans des conditions où il y a en moyenne 1 cellule pour 510 compartiments : ainsi, approximativement, 91% des compartiments sont vides, 8% des compartiments comportent une cellules et 1% des compartiments comportent 2 cellules. La stabilité de l'émulsion pendant plusieurs jours, préférentiellement plusieurs semaines, est assurée par l'utilisation 1Od'une combinaison adaptée d'huile et de surfactants. Les compartiments utilisés sont les gouttelettes aqueuses d'une émulsion inverses. Ces gouttelettes contiennent, outre les cellules, un milieu de croissance sélectif. On laisse les cellules pousser pendant 0-60 jours et de préférence 1-5 jours dans les émulsions, on 15sépare les deux phases aqueuse et huileuse, on récupère les cellules et on les disperse à nouveau dans une émulsion du même genre, après avoir renouvellé le milieu de croissance. On réalise ainsi plusieurs cycles (1-100 cycles et de préférence 1-10 cycles). Créer des gouttes d'un diamètre suffisant, qui soient stables 20pendant toute la durée de l'expérience, à la température de l'expérience (généralement : 30°C ou 37°C mais éventuellement plus si on utilise des microorganismes thermophiles), est un problème non trivial et n'a jamais été décrit. Les émulsions peuvent être créées directement par cisaillement 25manuel, en utilisant un procédé microfluidique ou encore en utilisant une membrane. Une bonne monodispersité des émulsions est préférable car elle améliore l'efficacité de la sélection mais pas indispensable. Toutefois, il est évident que compte-tenu du grand nombre de 3Ocellules, dont la valeur sélective est distribuée de manière continue, et du grand nombre de gouttes, quelle que soit la polydispersité des gouttes, un enrichissement relatif des cellules les plus adaptés est observé. Dans un mode de réalisation préféré, afin d'assurer une très bonne stabilité de l'émulsion et une absence totale d'échanges entre les compartiments aqueux, on utilise une huile cristallisable. L'huile cristallisable est solide à la température de pousse mais liquide à 51'a température d'émulsification, température à laquelle les cellules restent vivantes. Après avoir poussé dans ce milieu liquide sélectif compartimenté, les cellules ne sont pas analysées individuellement mais sont récupérées par séparation des phases . Le milieu ainsi récupéré est automatiquement enrichi en cellules ayant 10poussé plus rapidement que la moyenne dans le milieu sélectif. Alternativement un traitement chimique ou thermique plus rigoureux permet de séparer les phases huile et eau, les cellules sont détruites mais on récupère leur ADN plasmidique qu'on peut retransformer. 15La formule d'émulsion inverse cristallisable utilisée dépendt de la température de pousse des cellules, de la taille souhaitée pour les gouttes, de la stabilité requise pour l'émulsion, du type d'émulsification et de la méthode utilisée pour séparer les phases après la pousse des cellules. Cette formule peut notamment 20comprendre, et sans que cette liste puisse être considérée comme exhaustive : octane, decane, docecane, kerozène, huile minérale, suppocire, huile de silicone, huile fluorocarbonée, huile végétale alimentaire, triglycérides non purifié et un ou plusieurs surfactants de la liste suivante : PGPR, Span 60, Span80, Arlacel 25P135, Cholesterol. Préférentiellement, la formule suivante est utilisée : decane, x%v Span60, x%v Cholesterol où x est compris entre 2 et 6, prérentiellement 2 et 4. Suivant l'huile utilisée, et le caractère cristallisé ou non de l'émulsion, on peut choisir de laisser diffuser dans la phase 30continue certains gaz (notamment le dioxygène, ce qui permet la croissance de cellules en aérobiose), voir certains métabolites (ce qui peut permettre de renouveller le milieu). Préférentiellement, l'huile est cristallisée et ne permet aucune diffusion de gaz ni de molécules et les cellules sont sélectionnées en anaérobie. La 35culture de microorganismes en aérobie est avantageuse industriellement car elle évite d'avoir à agiter les cultures pour oxygéner le milieu, ce qui augmente de manière significative (20 à 60%) le coût du procédé. REVENDICATIONS 1- Procédé de sélection de cellules caractérisé en ce qu'une population diversifiée de cellules vivantes d'un microorganisme est transférée dans un milieu sélectif puis immédiatement dispersée dans 51es compartiments d'une émulsion inverse, en ce que la croissance et le taux de croissance des cellules dans les compartiment dépend de leur adaptation au critère de sélection introduit par le milieu sélectif et en ce qu'aucun échange n'a lieu entre les dits compartiments. 102- Procédé selon la revendication 1) où l'émulsion utilisée est cristallisable et où l'huile est solide à la température à laquelle poussent les cellules pendant la sélection. 3-Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où le nombre moyen de cellules par goutte est inférieur à 30, de 15préférence inférieur à 5, plus préférentiellement compris entre 0.01 et 1. 4- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où le micro-organisme est une bactérie, une levure ou une micro-algue, mesophile ou thermophile. 205- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où la population diversifiée de cellules est obtenue par mutagenèse du génome des cellules ou par recombinaison in vivo du génome des cellules. 6-Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où 251a population diversifiée de cellules est obtenue en transformant des cellules identiques par une banque de vecteurs d'expression portant des variants d'un ou plusieurs gènes, ces variants ayant été obtenus par mutagenèse aléatoire, mutagenèse dirigée ou recombinaison in vitro. 307-Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes ou l'émulsion est une émulsion du type suivant : émulsion simple 11inverse eau dans huile, les cellules étant dans la phase la plus interne de l'émulsion. 8- Procédé l'une quelconque des revendications précédentes où la phase continue de l'émulsion est cristallisable à une température 5supérieure à la température minimale de pousse des cellules utilisée et inférieure à la température à laquelle les cellules utilisées meurent si elles y sont exposées pendant une durée de l'ordre de la durée de cristallisation dans les conditions de l'expérience; préférentiellement, si l'organisme utilisé est une levure (ex. S. 10cerevisiae) ou une bactérie (ex. Escherichia coli) mésophile, l'huile est liquide à moins de 30°C (ou 35°C, 40°C) et est solide à partir au dessus de cette température. 9- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où l'huile utilisée est l'une des huile suivante : decane, docecane, 15kerozène, huile minérale, suppocire, huile de silicone, huile fluorocarbonée, huile végétale alimentaire, triglycérides non purifié et où les surfactants utilisés sont un ou plusieurs surfactants de la liste suivante : PGPR, Span 60, Span80, Arlacel P135, Cholesterol et toute autre formulation adaptée connue de 201'homme de métier; préférentiellement, la formule suivante est utilisée : decane, x%v Span60, x%v Cholesterol où x est compris entre 2 et 6, prérentiellement 2 et 4. 10- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où l'émulsion est fabriquée par un dispositif dit de microfluidique, et 25où les gouttes ont un diamètre compris entre 1 et 500pm, de préférence compris entre 5 et 200pm, plus préférentiellement compris entre 50 et 150pm; le dispositif microfluidique utilisé est composé de verre - fabriqué préférentiellement par étirement d'un capillaire - ou d'un polymère photosensible comme le PDMS -fabrication par 30soft lithographie. 11- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 où l'émulsion est fabriquée par un dispositif dit de millifluidique, et où les gouttes ont un diamètre compris entre 0.5 et 20 mm, de préférence compris entre 1 et 3mm.12- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où le milieu sélectif utilisé comprend comme seule source de carbone de la cellulose et où les cellules expriment une ou plusieurs enzymes cellulolytiques et sont sélectionnées sur leur capacité à dégrader 51a cellulose. 13- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où le milieu sélectif utilisé comprend comme seule source d'azote des protéines d'une ou plusieurs espèce et où les cellules expriment une ou plusieurs enzymes protéolytiques et sont sélectionnées sur leur 10capacité à dégrader les protéines du milieu. 14- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où le milieu sélectif utilisé comprend comme seule source de carbone de l'amidon, de préférence de l'amidon non liquéfié et où les cellules expriment une ou plusieurs enzymes permetant saccharification et 15fermentation. 15- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où le milieu sélectif utilisé comprend comme seule source de carbone de l'amidon, de préférence de l'amidon non liquéfié et où les cellules expriment une ou plusieurs enzymes permettant de le transformer en 20acide lactique ou autre monomère d'intérêt industriel. 16- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où les cellules sont mises à pousser dans les gouttes de l'émulsion pendant une durée comprise entre 1 heure et 1 mois, de préférence 3 heures et 3 jours, plus préférentiellement 6 à 24 heures. 2517- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où, après avoir été cultivées dans les gouttes d'émulsion, les cellules sont récupérées vivantes après séparation des phases huileuse et aqueuse à une température où l'huile est liquide et où les cellules sont vivantes, par une méthode adaptée 30centrifugation, ajout d'un surfactant, ajout d'un autre composé déstabilisant les émulsions mais ne tuant pas les cellules. 18- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où, après avoir été cultivées dans les gouttes d'émulsion, lescellules sont récupérées mortes après séparation des phases huileuse et aqueuse à une température ou dans des conditions chimiques qui sont léthales pour les cellules; l'ADN plasmidique des cellules, qui contient le ou les gènes d'intérêt, est alors préparé et retransformé dans des cellules fraîches compétentes. 19-Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12 où les cellules récupérées ou transformées sont soumises à une nouvelle itération du procédé selon l'une quelconque des revendications 11 ou 20; préférentiellement, la pression de sélection est augmentée au fil des tours de sélection. 21- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où les cellules, après un ou plusieurs tours de sélection en émulsion, sont directement étalées sur support solide, sélectif ou non. 22- Cellules obtenues à l'issue du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.