FR 2931841 A1 20091204 FR 0802874 A 20080527 UTILISATION DE SOUCHES D'ALGUES DEPOURVUES DE PAROI CELLULAIRE POUR LA PRODUCTION DE LIPIDES NEUTRES. La présente invention concerne l'utilisation de souches d'algues dépourvues de paroi cellulaire pour la production de lipides neutres. Les lipides et particulièrement les triglycérides ont un intérêt commercial important dans le domaine de l'alimentation et plus récemment dans celui des biocarburants. Les triglycérides sont généralement produits par les végétaux supérieurs (colza, tournesol, soja par exemple) où ils s'accumulent dans des organes de réserve spécifiques, les graines. Les algues unicellulaires sont également susceptibles d'accumuler des lipides au sein de leur cellule unique. Chez les végétaux supérieurs, l'accumulation de triglycérides de réserve a lieu au moment du remplissage du grain, alors que chez les microalgues elle a généralement lieu en réponse à une carence nutritive (carence en azote chez les chlorophycées ou en silice chez les diatomées). Si quelques espèces d'algues ont été répertoriées comme accumulant des quantités significatives de lipides (par exemple les chlorophycées Chlorella vulgaris et Neochloris oleoabundans), d'autres comme Chlamydomonas reinhardtii ont été décrites comme n'accumulant pas de lipides (Sheehan et al., 1998 et Hu et al., 2008). Par ailleurs, chez C. reinhardtii, la carence minérale est aussi connue pour provoquer une augmentation importante du contenu en amidon (Bail et al. 1990). Diverses méthodes ont été proposées pour augmenter le contenu en lipides de végétaux ou d'algues. Ces méthodes reposent principalement sur des techniques de génie génétique : par exemple sur-expression d'un gène codant pour l'acétyl-coenzyme A ou une UDP-glucose pyrophosphorylase (voir les Brevets américains US 5,559,220 et US 5,928,932, et les Demandes Internationales WO 00/66749 et WO 01/81604). Dans un contexte de diminution programmée des réserves de carburant fossile, l'utilisation de microalgues comme source de biocarburants connaît un vif regain d'intérêt (Chisti, 2007 et Haag, 2007). La culture de microalgues présente un certain nombre d'avantages par rapport aux cultures terrestres : production surfacique supérieure, compétition limitée avec la production de denrées alimentaires ou avec les ressources en eau, pression sur l'environnement maîtrisable (recyclage des intrants). Toutefois, les coûts de production des microalgues d'une part et d'extraction des lipides d'autre part sont encore trop élevés par rapport au prix du produit commercialisable, limitant ainsi les applications. Dans ce contexte, l'amélioration des capacités de production de lipides représente un enjeu majeur (Chisti, 2007 et Hu et al., 2008). Les Inventeurs ont entrepris des travaux de recherche sur les mécanismes moléculaires d'accumulation des lipides chez les microalgues. Ils ont choisi comme modèle d'étude l'algue verte unicellulaire biftagellée Chlamydomonas reinhardtii, dont le génome entier a été séquencé et pour laquelle des outils moléculaires sont disponibles (par exemple, possibilité de transformer génétiquement ses trois génomes : nucléaire, chloroplastique et mitochondrial). De manière surprenante, les Inventeurs ont mis en évidence une augmentation significative de l'accumulation de lipides neutres (principalement des triglycérides) chez des souches de Chlamydomonas reinhardtii mutantes dépourvues de paroi cellulaire, cultivées dans des conditions de carence en azote par rapport aux souches de type sauvage pourvues d'une paroi cellulaire cultivées dans les mêmes conditions. Ils ont en outre constaté que dans le cas de souches de C. reinhardtii dépourvues de paroi cellulaire et également affectées dans le métabolisme de l'amidon, le contenu en lipides neutres pouvait atteindre jusqu'à 50% du poids sec de la culture, après trois à quatre jours de carence totale en azote. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'une souche mutante d'algue, ladite souche étant dépourvue de paroi cellulaire, pour la production de lipides neutres, de préférence des triglycéride3. Ces lipides neutres peuvent également être des mono- et/ou di-glycérides (qui peuvent être produits en tant qu'intermédiaires de biosynthèse des triglycérides). Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention ladite algue est une algue verte, de préférence une algue verte unicellulaire (Chlorophycée), choisie de préférence parmi les Chlorococcales, notamment les genres Scenedesmus, Chlorococcum, Clïorella, et les Volvocales, notamment les genres Lobochlamys et Chlamydomonas. Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, ladite algue appartient au genre Chlamydomonas. Avantageusement, ladite algue appartient à l'espèce Chlamydomonas reinhardtii. Des souches mutantes d'algues dépourvues de paroi cellulaire sont connues en elles-mêmes, et peuvent être aisément identifiées notamment sur la base de leur morphologie amiboïde molle et/ou de tests tels que le test au TritonTM X-100 (Jaenicke et al., 1987) décrit ci-après ; à titre d'exemples non limitatifs on citera les souches de Chlamydomonas décrites par Davies and Plaskitt, (1971), qui ont été réparties par ces auteurs en trois classes : - classe A : la paroi cellulaire est produite en quantité normale mais n'est pas attachée à la membrane plasmique ; - classe B : la paroi cellulaire est produite en quantité normale, attachée à la membrane plasmique mais la morphologie des colonies des souches appartenant à cette classe est identique à celle des mutants de classe A ou C, c'est-à-dire que la force structurale des colonies est perdue ; - classe C : de faibles quantités de paroi cellulaire sont produites et ne 10 sont pas attachées à la membrane plasmique. Une souche dépourvue de paroi cellulaire peut être identifiée, par exemple, sur la base du test suivant. Il est incubé un volume (environ 100 �l à 1 ml) de cellules (en culture liquide) avec un volume équivalent de 0.5% TritonTM X-100 de préférence pendant 10 à 40 minutes. Après incubation, les cellules sont centrifugées 15 pendant 5 minutes à 10 000 g en présence du TritonTM X-100 et le culot cellulaire est observé. La couleur verte du culot cellulaire indique que la souche est pourvue d'une paroi cellulaire (dont la fonction est intègre) ; la couleur blanche du culot cellulaire indique que la souche est dépourvue de paroi cellulaire. De manière générale, on peut utiliser pour la mise en oeuvre de la 20 présente invention, toute souche qui présente une mutation inactivant un gène codant pour un constituant de la paroi cellulaire et/ou des protéines impliquées dans l'intégrité fonctionnelle de la paroi cellulaire (par exemple des glycoprotéines riches en hyrdoxyproline), ainsi que tout gène impliqué dans la régulation de l'expression des gènes de la voie de biosynthèse de la paroi cellulaire. A titre d'exemples de gènes codant pour des glycoprotéines riches en hydroxyproline, on peut citer les gènes suivants qui ont été identifiés chez Chlamydomonas reinhardtii : - les gènes VSP (VSP1, VSP3, VSP4, VSP6 et VSP7) codant pour les protéines VSP correspondantes (hydroxyproline-rich tell Wall protein), - les gènes GPI et GP2 codant pour les protéines gpl (� vegetative tell Wall protein �) et gp2 (� extracellular matrix protein �), et - les gènes codant pour les pherophorines (Hallman, 2006). 25 30 Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de la présente invention, ladite souche mutante dépourvue de paroi cellulaire est en outre affectée dans la synthèse de l'amidon. On définit comme souche mutante affectée dans la synthèse de l'amidon, une souche qui accumule au plus 90%, de préférence 50% et par ordre croissant de préférence 40%, 30%, 20%, 10%, 5% et 1% de la quantité d'amidon accumulée par une souche de type sauvage de la même espèce, cultivée dans les mêmes conditions. Il s'agit notamment de souches présentant une mutation inactivant l'une des sous-unités de l'ADP-glucose pyrophosphorylase (protéines codées par les gènes STA1 et STA6), ou d'une mutation inactivant un gène codant une enzyme de la voie de biosynthèse de l'amidon telle que les synthétases solubles de l'amidon (gènes SSS1 à SSS5 et STA3), les synthétases liées au grain d'amidon (gènes GBSS), les enzymes de branchement de l'amidon (gènes SBE1 à SBE3), l'isoamylase (gène STA7), les enzymes de débranchement (gènes ISO1 à IS03) et le D-enzyme (gène STA11). A titre illustratif, un schéma montrant la voie de biosynthèse de l'amidon chez Chlamydomonas reinhardtii dans laquelle interviennent les enzymes ci-dessus est présenté à la Figure 8. A titre d'exemples non limitatifs de souches mutantes dépourvues de paroi cellulaire utilisables selon la présente invention, on citera les souches de C. reinhardtii CC-820 (cw17 mt-), CC-846 (cwl mt-), CC-847 (cw14 mt+), CC-848 (cw8 mt+), CC-849 (cw10 mt-), CC-850 (cw18 mt-), CC-851 (cw2 mt+) (souche de la classe A telle que définie ci-dessus), CC-852 (cw9 mi`-), CC-853 (cw19 mt-), CC-854 (cw2O mt+) (souche de la classe B telle que définie ci-dessus), CC-855 (cw6 mt+), CC-856 (cw18 mt+), CC-857 (cw4 mt+), CC-858 (cw177 m '+), CC-859 (cw5l mt+), CC-860 (cw3 mt+), CC-406 (cw15 mt-) (souche de la classe C telle que définie ci-dessus), BAFJ3 (mt+ nitl nit2 cw15 arg7-7 stal-2::ARG7), BAFJ5 (nitl nit2 cw15 arg7-7 sta6-1::ARG7) et BAFJ6 (mt+ nitl nit2 cw15 arg7-7 sta7-1::ARG7), de préférence les souches CC-406, BAFJ3, BAFJ5 et BAFJ6, ainsi que les souches dérivées de celles-ci. Les souches mutantes CC-820, CC-846, CC-847, CC-848, CC-849, CC-850, CC-851, CC-852, CC-853, CC-854, CC-855, CC-856, CC-857, CC-858, CC-859, CC-860 et CC-406 sont disponibles auprès du Chlamydomonas Center, Duke University, Durham, NC, Etats-Unis Parmi ces souches, - les souches mutantes CC-851, CC-854 et CC-406 sont connues pour ne pas être affectées dans la synthèse de l'amidon ; - la souche mutante BAFJ3 est connue pour être à la fois dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la synthèse de l'amidon (Van den Koornhuyse et al., 1996). Cette souche est mutée au locus STA1., par insertion d'une cassette d'expression de l'enzyme argininosuccinate lyase (pARG7), dans le gène codant pour la grande sous-unité (sous-unité régulatrice) de l'ADP-glucose pyrophosphorylase ; - la souche BAFJ5 est aussi connue pour être à la fois dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la synthèse de l'amidon ; cette souche est mutée au locus STA6, dans le gène codant pour la petite sous-unité catalytique de l'ADP-glucose pyrophosphorylase (Zabawinski et al., 2001) ; - la souche BAFJ6 est également connue pour être à la fois dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la synthèse de l'amidon ; cette souche est mutée au locus STA7, par insertion d'une cassette d'expression de l'enzyme argininosuccinate lyase (pARG7), dans le gène codant pour l'isoamylase (Mouille, 1996). On entend par � souches de C. reinhardtii, dérivées de la souche X � (X étant les souches mutantes CC-820, CC-846, CC-847, CC-848, CC-849, CC-850, CC-851, CC-852, CC-853, CC-854, CC-855, CC-856, CC-857, CC-858, CC-859, CC-860, CC-406, BAFJ3, BAFJ5 ou BAFJ6, ou toute autre souche mutante dépourvue de paroi cellulaire, et éventuellement affectée dans la synthèse de l'amidon, telle que définie ci-dessus), des souches de Chlamydomonas reinhardtii obtenues soit par croisement avec une autre souche soit par mutagénèse ou par transformation génétique de la souche X, et conservant au moins les propriétés d'accumulation des lipides neutres de la souche X. Il peut s'agir de souches résultant d'un croisement entre la souche X et une souche de C. reinhardtii de type sauvage (par exemple, la souche 137C), telles que par exemple la souche CC-3491 (cw15 mt-) (disponible auprès du Chlamydomonas Center) qui résulte d'un tel croisement à partir de la souche CC-406. Il peut s'agir également de souches dans lesquelles un ou plusieurs des gènes endogènes de la souche X a (ont) été muté(s) et/ou de souches résultant de la transformation génétique de la souche X par un ou plusieurs gène(s) d'intérêt, de manière à modifier certaines de ses propriétés physiologiques et/ou conférer à ladite souche des caractéristiques physiologiques supplémentaires (par exemple, forte productivité de biomasse, fort taux de division, antennes chlorophylliennes de taille réduite, résistance au stress oxydatif, résistance aux pathogènes). Ces souches peuvent être obtenues à partir de la souche X par les techniques classiques de mutagénèse aléatoire (par exemple mutation aux rayons X ou par insertion) ou dirigée et de transformation génétique de C. reinhardtii, telles que celles décrites par exemple par Harris, 1989 ; Boyton et al., 1988 ; Fernandez et al., 1989 ; Debuchy et al., 1989 et Shimogawara et al., 1998.. L'utilisation d'une souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire telle que définie ci-dessus pour la production de lipides neutres, présente en outre l'avantage de faciliter la récupération des gouttelettes lipidiques produites par ladite souche, les cellules pouvant être aisément cassées par choc osmotique ou mécanique. Les gouttelettes lipidiques peuvent ensuite être récoltées par flottaison, centrifugation par séparation de phase ou filtration par exemple. La présente invention a aussi pour objet un procédé de production de lipides neutres, notamment de triglycérides, qui comprend une étape de culture d'une souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire, et optionnellement aussi affectée dans la synthèse de l'amidon, telle que définie ci-dessus, en conditions photoautotrophes (lumière comme source d'énergie et dioxyde de carbone comme source de carbone) et de carence totale ou partielle en azote, et sous atmosphère d'air enrichi à environ 1% à 5% de dioxyde de carbone (CO2), de préférence 2%. On définit comme � conditions de carence totale en azote � la culture d'une souche mutante d'algue telle que définie ci-dessus dans un milieu de culture ne contenant pas d'azote. On définit comme � conditions de carence partielle en azote � la culture d'une souche mutante d'algue telle que définie ci-dessus dans un milieu de culture dont la concentration en azote, de préférence sous forme d'ammonium (NH4C1), est strictement inférieure à 7,5 mM, de préférence inférieure ou égale à 5 mM, et par ordre croissant de préférence, inférieure ou égale à 2,5 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM et 0,1 mM. Le procédé selon la présente invention peut comprendre en outre une étape d'extraction des lipides. Les techniques d'extraction des lipides à partir de microorganismes eucaryotes et plus particulièrement d'algues unicellulaires sont connues de l'homme du métier (voir par exemple les Demandes Internationales WO 01/54510 et WO 2008/013548). La présente invention a également pour objet une méthode de criblage de souches mutantes de Chlamydomonas qui accumulent des lipides comprenant les étapes suivantes : a) incubation des souches de Chlamydomonas en présence de Rouge Nil (7-diethylamino-3,4-benzophenoxazine-2-one), b) excitation des souches de Chlamydomonas à une longueur d'onde comprise entre 450 nm et 540 nm, de préférence à 488 nm, c) mesure de la fluorescence émise par les souches de Chlamydomonas à une longueur d'onde comprise entre 560 et 640 nm, de préférence à 580 nm, d) comparaison de la quantité de fluorescence émise par les différentes souches de Chlamydomonas. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode de criblage, les souches de Chlamydomonas sont préalablement cultivées en conditions photoautotrophes et de carence totale ou partielle en azote et sous atmosphère d'air enrichi à environ 1% à 5% de dioxyde de carbone (CO2), de préférence 2%. Selon une disposition particulière de ce mode de mise en oeuvre, les souches de Chlamydomonas sont cultivées en milieu minimum (Harris, 1989) et sous atmosphère d'air enrichi à 2% de dioxyde de carbone, puis mises en conditions de carence azotée totale (par exemple, pendant 3 jours). Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode de criblage, les souches de Chlamydomonas sont incubées, de préférence à l'obscurité, en présence de Rouge Nil pendant au moins cinq minutes, de préférence de dix à quarante minutes, et de préférence encore pendant vingt minutes. Les dispositifs permettant de mesurer la fluorescence émise par un 20 microorganisme sont bien connus de l'Homme du métier. Il peut par exemple utiliser un spectrofluoromètre. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant les propriétés d'accumulation de lipides neutres des souches mutantes 25 de Chlamydomonas reinhardtii dépourvues de paroi cellulaire, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la Figure 1 illustre l'accumulation d'amidon et de lipides neutres en réponse à une carence totale en azote chez une souche de Chlamydomonas reinhardtii de type sauvage (CC-124, dénommée 137C) et chez une souche dépourvue de paroi cellulaire 30 (CC-406, dénommée cwl5). Les cellules sont cultivées en milieu minéral sous air enrichi avec 2% CO2. Au cours de la phase exponentielle de croissance, les cellules sont récoltées par centrifugation et mises en suspension dans un milieu minéral dépourvu d'azote. Les mesures sont soit effectuées en phase exponentielle de croissance (+N), soit à différents temps après la carence totale en azote (-N, 1 à 4 jours après la carence). A) Le contenu intracellulaire en amidon est exprimé en dag d'amidon/106 cellules. B) Le contenu intracellulaire en lipides neutres est suivi quotidiennement par la mesure de la fluorescence émise à 580 nm après coloration des cellules par une sonde fluorescente spécifique des lipides, le Rouge Nil (ajouté à une concentration finale de 4ig/ml) et exprimé en unité arbitraire ; - la Figure 2 illustre l'accumulation d'amidon et de lipides neutres en réponse à une carence totale en azote chez deux souches de C. reinhardtii affectées dans la voie de biosynthèse de l'amidon et respectivement pourvue ou dépourvue de paroi cellulaire (souches I7 et BAFJ3 respectivement). Les cellules sont cultivées dans les conditions décrites pour la Figure 1 ci-dessus. A) Le contenu intracellulaire en amidon est exprimé en �g d'amidon/106 cellules. B) Le contenu intracellulaire en lipides neutres est suivi quotidiennement par la mesure de la fluorescence émise à 580 nm après coloration des cellules par une sonde fluorescente spécifique des lipides, le Rouge Nil (ajouté à une concentration finale de 1�g/ml) et exprimé en unité arbitraire ; - la Figure 3 illustre l'évolution du contenu intracellulaire en acides gras totaux (AG tx) et de la productivité de différentes souches de C. reinhardtii (CC-124 (137C), CC-406 (cwl5), I7 et BAFJ3). Les cellules sont cultivées dans les conditions décrites pour la Figure 1 ci-dessus. A) Le contenu intracellulaire en acides gras totaux est exprimé en �g d'acides gras totaux /106 cellules. B) La productivité des souches est exprimée en pourcentage d'acides gras totaux par rapport au poids sec ; - la Figure 4 illustre l'évolution des différentes classes de lipides en réponse à une carence azotée totale chez différentes souches de C. reinhardtii (CC-124 (137C), CC-406 (cw15), I7 et BAFJ3). Les cultures sont prélevées soit en phase exponentielle de croissance (+N), soit quatre jours après l'application d'une carence totale en azote (-N, J+4). Leur contenu lipidique est analysé en chromatographie sur couche mince. La migration est effectuée dans un solvant n-hexane/diéthyl éther/acide acétique (85:15:1) et la révélation est réalisée par vapeur d'iode. La position des lipides polaires et neutres (notamment les triglycérides, TG) est indiquée ; La Figure 5 illustre la localisation subcellulaire des vésicules de stockage de triglycérides chez différentes souches de C. reinhardtii (CC-124 (137C), CC-406 (cwl 5), I7 et BAFJ3) après coloration des cellules au Rouge Nil et observation en microscopie à épifluorescence. Les colorations au Rouge Nil sont effectuées sur des échantillons de culture soit prélevés en phase exponentielle de croissance (+N), soit à différents temps après la carence azotée totale (-N, 1 à 4 jours après la carence). Les images sont obtenues en lumière visible (panneau haut) et après excitation à 488 nm des échantillons colorés (panneau bas). La fluorescence jaune est émise par les lipides neutres intracellulaires colorés au Rouge Nil (580 run) et la fluorescence rouge correspond à l'autofluorescence de la chlorophylle (670 nm). Les flèches indiquent : ù _-_~ fluorescence rouge (autofluorescence de la chlorophylle) ; --> fluorescence jaune (lipides neutres) ; fluorescence orangée (lipides polaires, dégradation des membranes) ; - la Figure 6 illustre l'analyse par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie des protéines associées aux plastoglobules (PGLs). Les plastoglobules sont partiellement purifiés à partir de la souche BAFJ6 après trois jours de carence totale en azote. A) Les protéines totales contenues dans un extrait cellulaire (8 �g de protéines) ainsi que les fractions I et II des PGLs (contenant respectivement 10 et 5 �g de protéines) sont analysées sur gel 12% SDS-PAGE et colorées au bleu de Coomassie. B) Après transfert sur membrane une immunodétection est réalisée en présence d'un anticorps dirigé contre CDSP34 (WB anti-PAPfib34), une PAP-fibrilline de 34 kDa de pomme de terre (Langenkamper et al., 2001) ; - la Figure 7A illustre la fluorescence émise par les microalgues à 580 nm en réponse à une excitation à 488 nm et mesurée grâce à un spectrofluorimètre (Perkin Elmer), après 20 min d'incubation à l'obscurité en présence de Rouge Nil. Des gammes de concentrations cellulaires allant de 3.103 à 107 cellules/mL et de concentrations en Rouge Nil allant de 104 à 10-2 mg/mL sont testées. Ces essais ont permis de déterminer une gamme de concentrations cellulaires dans laquelle le signal de réponse au Rouge Nil est proportionnel à la quantité de cellules (et donc de lipides neutres). La Figure 7B illustre la validation expérimentale de la méthode de criblage en comparant la réponse de la souche BAFJ5 accumulatrice de lipides (souche mutante) et d'une souche de type sauvage (CC-124). Deux volumes de culture (100�L et 200�L) sont testés et donnent des résultats comparables. - la Figure 8 illustre la voie de biosynthèse de l'amidon chez 30 Chlamydomonas reinhardtii. EXEMPLES I- MATERIELS ET METHODES Souches et conditions de culture La souche de Chlamydomonas reinhardtii de type sauvage CC-124 (dénommée aussi 137C) (mt- nitl nit2) et la souche mutante de C. reinhardtii dépourvue de paroi cellulaire CC-406 (mt- cwl5) (dénommée aussi cwl5) utilisées dans cette étude ont été obtenues auprès du Chlamydomonas C enter (Duke University, Durham, NC, USA). Les souches de C. reinhardtii mutées dans le métabolisme de l'amidon stal -2 (souche BAFJ3, mt+ nit] nit2 cw15 arg7-7 stal-2::ARG7, Van den Koornhuyse et al., 1996), stal- 1 (souche I7, mt- nitl nit2 stal-1, Bail et al.., 1991), sta6 (souche BAFJ5, nitl nit2 cw15 arg7-7 sta6-1::ARG7, Zabawinski et al., 2001), et sta7 (souche BAFJ6, mt+ nit] nit2 cw15 arg7-7 sta7-1::ARG7, Mouille et al., 1996) ont été obtenues auprès de l'Université des Sciences et Technologies de Lille, France. Les souches de C. reinhardtii sont maintenues à 25 °C en milieu liquide TAP (Harris, 1989) sous éclairage constant (150 �mol.m 2.sec 1) et agitées continuellement afin d'obtenir des cultures � starters � (inocula). Pour les cultures sous concentration élevée en CO2, les cultures starters en fin de phase logarithmique sont utilisées pour inoculer une nouvelle culture dans une colonne de 300 ml contenant 200 ml de Milieu Minimum (Harris, 1989) ajusté à 80 mM de Trizma (pH 7,4) à une densité de départ de 1).105 cellules.ml-1 sous éclairage constant (150 �mol.m 2.sec-') et sous atmosphère d'air enrichi à 2% (v/v) de CO2 (bullage du milieu de culture). Après 72 heures, la culture en milieu de phase logarithmique est récoltée (4x106 cellules / ml), remise en suspension dans 200 ml de Milieu Minimum sans azote et mise sous atmosphère d'air enrichi à 2% (v/v) de CO2 pendant 3 à 7 jours. La croissance des cellules est suivie par comptage cellulaire à l'aide d'un compteur de cellules automatisé (MultisizerTM 3 Coulter Counter - Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Quantification de la chlorophylle et de l'amidon La quantification de la chlorophylle et de l'amidon est réalisée en utilisant, respectivement, la méthode de Lichtenthaler (1987) et un protocole adapté de la méthode citée dans Klein et Betz (1978). 2x106 cellules de Chlamydomonas reinhardtii cultivées dans du Milieu Minimum, 80 mM Trizma et sous atmosphère d'air enrichi à 2% (v/v) CO2 sont récoltées, soit pendant la phase exponentielle de croissance ou à différents 2931841 11. temps après la carence totale en azote, et stockées à -80 °C. Les culots de cellules sont remis en suspension dans 2 ml de méthanol pour l'extraction de la chlorophylle, mélangés vigoureusement pendant 1 min et centrifugés. Les surnageants sont utilisés pour quantifier la chlorophylle par photométrie selon la méthode de Lichtenthaler (1987). Les culots sont 5 utilisés pour quantifier l'amidon. Les culots sont rincés avec 1 ml de tampon acétate de sodium (100 mM, pH 4,5), remis en suspension dans 500 �l de tampon acétate de sodium et passés à l'autoclave pendant 15 min à 120 °C pour solubiliser l'amidon. L'amidon total est ensuite quantifié en suivant la conversion enzymatique en glucose à l'aide d'un kit commercial basé sur une méthode enzymatique (Starch Assay Kit SA-20 - Sigma-Aldrich, 10 St. Louis, MO, USA), selon les recommandations du fournisseur. Analyse de la teneur en lipides neutres en utilisant la coloration au Rouge Nil Le Rouge Nil (9-diéthylamino-5H-benzophénoxazine-5-un) est un colorant qui est excité à 488 nm et émet une fluorescence jaune-or (Xmax = 580) en présence 15 de lipides neutres et orange-rouge (Xmax = 615) en présence de lipides polaires. Il est largement utilisé pour la coloration des lipides, car il peut interagir et fluorescer en présence de phospholipides, cholestérols, esters cholestéryl et triglycérides (Greenspan and Fowler, 1985). La teneur en lipides cellulaires est ainsi déterminée en utilisant le Rouge Nil (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, N3013), tel que décrit dans de la Jara et al. 20 (2003). L'intensité de fluorescence des cellules colorées au Rouge Nil est linéairement corrélée à la teneur en lipides polaires et neutres telle que déterminée par gravimétrie (de la Jara et al., 2003). Les solutions de Rouge Nil sont préparées dans du méthanol (0,1 mg.mlt). Brièvement, 2x106 cellules de C. reinhardtii sont incubées dans l'obscurité pendant 20 min avec la solution de coloration (0,1 �g.ml 1 de Rouge Nil dans du TBS 1X). Les 25 mesures de fluorescence sont effectuées en utilisant un spectrofluoromètre (Perkin-Elmer LS50B) (!excitation = 488 nm, Xémission = 580 nm). Les cellules non colorées sont utilisées comme contrôles d' autofluorescence. Extraction des lipides et chromatographie sur couche mince Les lipides sont extraits des cellules de C. reinhardtii en utilisant la 30 méthode en deux étapes décrite dans Bligh et Dyer (1959). La masse totale de lipides est déterminée par gravimétrie après élimination des solvants à l'aide d'un léger courant de N2 gazeux. Pour l'analyse par chromatographie sur couche mince (CCM), les lipides sont dissouts dans l'hexane et séparés sur les plaques de chromatographie (250 �M, 20 x 20 cm ; Adsorbosil-Plusl, Alltech, France) avec du n-hexane / diéthyl éther / acide acétique (85:15:1, v/v). Les différentes classes de lipide sont visualisées à l'aide de la vapeur d'iode. Analyse des esters méthyliques d'acides gras (FAMEs) par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse Les acides gras totaux des cellules entières de C. reinhardtii sont quantifiés par chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse (GC/MS). Les lipides extraits sont d'abord dérivés au trifluorure de bore (BF3) dans du méthanol (7%, p/v) pour obtenir des esters méthyliques d'acides gras (FAMEs), selon Morrison et Smith (1964). L'acide heptadécanoïque (17:0) est utilisé comme standard externe. Les esters lipidiques sont ensuite extraits par l'hexane e: injectés dans un chromatographe en phase gazeuse (FOCUS) couplé à un spectromètre de masse quadripolaire (DSQ II, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA). L'hydrogène est utilisé comme gaz porteur. L'injecteur et la ligne de transfert sont maintenus à 225 °C et 250 °C respectivement, et la source d'ions à 200 °C. Les FAMEs sont séparés sur une colonne TR-WAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 �m ; Thermo Fisher Scientific) en mode split (ratio de fractionnement 5:1) à une température de four de 45 °C. Après 1,5 min, la température du four est portée à 150 °C à 15 °C.min-1, puis à 240 °C à 6 °C.min-1 et tenue à 240 °C pendant 3 min. Les esters méthyliques d'acides gras sont identifiés et quantifiés par comparaison aux standards (FAME Mixture Me-100, Larodan Fine Chemicals AB, Malmd, Suède). Les chromatogrammes et spectres de masse sont analysés en utilisant le logiciel Xcalibur (Thermo Fisher Scientific). Purification des plastoglobules Après 3 jours de croissance dans des conditions de carence totale en azote, les cellules de C. reinhardtii sont récoltées et remises en suspension dans du tampon R (50 mM HEPES-KOH, pH 8,5, 5 mM MgCl2) contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases, tel que décrit dans Ytterberg et al. (2006). Les cellules sont isolées en utilisant une presse Yeda (N2 gazeux, 4,2 bar). Après centrifugation (10 min à 600g), le culot est remis en suspension dans du tampon R complété avec 0,2 M de saccharose, puis soniqué (deux fois pendant 5 sec) et centrifugé (25 min à 150000g). Le coussinet de plastoglobules qui flotte, en raison de la faible densité de ceux-ci, est récolté et remis en suspension dans 1 ml de tampon R complété avec 0,5 M de saccharose, recouvert par 0,3 ml de tampon R avec 0,2 M de saccharose, puis par 0,3 ml de tampon R. Après centrifugation pendant 25 min à 380000g, les plastoglobules (PGLs) partiellement purifiés (fractions I et II) sont collectés et conservés à -80 °C. Analyse des protéines et Western blot Les protéines sont extraites par 2% SDS à partir des cellules entières de C. reinhardtii cultivées pendant trois jours dans des conditions de carence totale en azote. 10 �g de protéines totales et 10 �g de fractions partiellement purifiées de plastoglobules sont soumis à du gel Bis-Tris SDS-PAGE 12% dans du tampon MOPS et colorés avec le bleu de Coomassie (Imperial Protein Stain, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Le gel SDS / PAGE (en double) est transféré sur la membrane de nitrocellulose (BioTrace NT - Pall Corporation, Ann Arbor MI, USA), suivi par le blocage avec le tampon SeaBlock (Uptima - Interchim, Montluçon, France) et immunomarqué en utilisant un anticorps primaire polyclonal de lapin anti-CDSP34, une PAP-fibrilline de 34 kDa de pomme de terre (dilution 1/800 ; Langenkamper et al., 2001) et un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin IR Dye680 (dilution 1/10000 ; LI-COR, Biosciences, Lincoln, NE, USA). Les bandes de protéines sont visualisées en utilisant le Système d'Imagerie Infrarouge Odyssey (LI-COR) dans le canal de fluorescence à 680 nm. Observation par microscopie à épifluorescence du Rouge Nil et de la chlorophylle La fluorescence du Rouge Nil et de la chlorophylle des cellules de C. reinhardtii est observée à l'aide d'un microscope à épifluorescence Leica DMRXA en utilisant un objectif à immersion à huile 63 X/1.6 (Leica Microsystems, Germany ; filtre d'excitation ByPass 475/40 et filtre barrière Long Pass 510). Les images sont saisies avec le logiciel Spot Insight 4 (Diagnostic Instruments, Inc, Sterling Heights, MI). II- COMPARAISON DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN AMIDON ET EN LIPIDES NEUTRES DE LA SOUCHE DE C'. REINHARDTH DE TYPE SAUVAGE 137C (CC-124) AVEC LA SOUCHE CC-406 DEPOURVUE DE PAROI CELLULAIRE Les contenus intracellulaires en amidon et en lipides neutres de la souche de C. reinhardtii de type sauvage CC-124 (137C) et de la souche mutante CC-406 (cwl5) dépourvue de paroi cellulaire ont été comparés dans des conditions photoautotrophes dans un milieu minéral sous air enrichi en CO2 (2 °A) et de carence totale en azote. Les résultats sont présentés à la Figure 1. Au cours de la phase exponentielle de croissance, le contenu cellulaire en amidon est de l'ordre de 10 à 15 �g.10-6 cellules quelque soit la souche considérée. Ce contenu s'accroît dès le premier jour de carence azotée totale pour atteindre environ 50 �g.10-6 cellules et se stabiliser ensuite chez la souche sauvage ou continuer à augmenter pour atteindre 130-140 �g.10-6 cellules chez la souche mutante CC-406 (Figure 1A). Quant au contenu intracellulaire en lipides neutres suivi par la fluorescence du Rouge Nil (Figure 1 B), il évolue assez peu chez la souche sauvage. A l'inverse, chez la souche mutante CC-406 (cwl5) dépourvue de paroi cellulaire, on observe une forte augmentation de cette fluorescence indiquant un accroissement net du contenu en lipides neutres. L'accumulation de lipides neutres intervient après 3 jours de carence totale, ce aui correspond au moment où l'accumulation d'amidon atteint un plateau. III- COMPARAISON DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN AMIDON ET EN LIPIDES NEUTRES DE DEUX SOUCHES DE C. REINHARDTH AFFECTEES DANS LA SYNTHESE DE L'AMIDON ET DEPOURVUES OU NON DE PAROI CELLULAIRE Les contenus intracellulaires en amidon et en lipides neutres ont été comparés chez deux mutants affectés dans la biosynthèse de l'amidon : BAFJ3 et I7. La souche 17, issue de la souche sauvage CC-124 (137C), possède une paroi cellulaire normale (Ball et al., 1991). La souche BAFJ3, issue d'une souche CC-406 (cwl5), est dépourvue de paroi cellulaire (Van der Koornhuyse et al., 1996). Les deux souches sont mutées au même locus, STA1, dans le gène codant pour la sous-unité régulatrice de l'ADP-glucose pyrophosphorylase (Ball et al 1991 ; Van der Koornhuyse et al., 1996). Les résultats sont représentés à la Figure 2. En réponse à une carence totale en azote, les mutants BAFJ3 et 17 n'accumulent que peu d'amidon (Figure 2A), comme cela avait été précédemment observé (Bail et al., 1991 et Van der Koornhuyse et al., 1996). En revanche, on observe dès le premier jour de carence totale en azote chez la souche affectée dans la synthèse de l'amidon et dépourvue de paroi cellulaire, BAFJ3, une forte augmentation de la fluorescence du Rouge Nil indiquant une accumulation de lipides neutres (Figure 2B). Quant à la souche 17, qui est affectée dans la synthèse de l'amidon mais qui présente une paroi cellulaire normale, aucune augmentation de la fluorescence du Rouge Nil significative des lipides neutres n'est observée, suggérant que cette souche n'accumule pas de lipides neutres au cours de la carence totale en azote. On remarque que la cinétique d'accumulation de lipides neutres diffère entre les deux souches dépourvues de paroi cellulaire. En effet, l'accumulation semble survenir plus tôt (à J+2) chez la souche BAFJ3 que chez la souche CC-406 (à J+3). IV- MESURES QUANTITATIVES DU CONTENU INTRACELLULAIRE EN LIPIDES TOTAUX ET EN ACIDES GRAS TOTAUX CHEZ LES SOUCHES CC-124 (137C), CC-406, I7 ET BAFJ3 Les résultats essentiellement qualitatifs obtenus avec le Rouge Nil ont été confirmés par des mesures de la production en lipides totaux par méthode gravimétrique, et du contenu intracellulaire en acides gras totaux, effectuées après trans-estérification par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse. Les dosages ont été effectués sur des cellules en phase exponentielle de croissance (+N), ou 4 jours après une carence totale en azote (-N, J+4). Les lipides totaux ont été dosés par méthode gravimétrique. Les esters méthyliques d'acides gras (AG totaux) obtenus après trans-estérification des lipides totaux sont analysés et dosés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse. Le contenu intracellulaire en acides gras totaux est exprimé en �g d'AG totaux /106 cellules. La productivité en acides gras totaux et lipides totaux est exprimée pour chaque souche en pourcentage par rapport à la matière sèche (l'écart-type est calculé sur les résultats de trois prélèvements indépendants effectués pour chaque condition). CC-124 (137C) : souche sauvage ; CC-406 (cwl5) : souche dépourvue de paroi cellulaire ; I7 : souche affectée dans la biosynthèse d'amidon et BAFJ3 : souche dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la synthèse de l'amidon. Les résultats sont présentés au Tableau 1 ci-dessous et à la Figure 3. �g AG totaux/106 %AG totaux/MS % lipides/MS cellules CC-124 +N 8,0 +/- 3,7 7,2 +1- 5,1 13,3 +1- 0,9 -N, J+4 8, 4 +/- 2,1 12, 9 +1- 1, 5 18,1 +/- 2, 6 CC-406 +N 7,9 +1- 1,9 11,1 +/- 2,8 15,6 +/- 2,9 -N, J+4 24,0 +1- 2,0 17,4 +1- 3,2 22,9 +/-4,2 I7 +N 7,3 +/- 1,0 7,7 +1- 2,1 20,5 +1- 0,3 -N, J+4 11,7 +/- 1,5 16,0 +/- 3,0 26,0 +/- 3,3 BAFJ3 +N 3,1 +/- 1,1 5,4 +/- 2,2 17,9 +/- 4,5 -N, J+4 25,2 +1- 4,2 30,6 +1- 6,0 48,2 +1- 5,0 Les données de productivité en lipides de chaque souche présentées dans le Tableau 1 montrent que la souche BAFJ3 dépourvue de paroi cellulaire et affectée dans la voie de biosynthèse de l'amidon accumule des lipides de façon significative (jusqu'à 48% du poids sec) au cours de la carence azotée. Dans les mêmes conditions, le contenu en lipides de la souche sauvage CC-124 (137C) pourvue d'une paroi cellulaire ne dépasse pas 18% du poids sec. En parallèle, les dosages d'acides gras totaux (exprimés en �g AG totaux par cellule) indiquent que leur contenu intracellulaire augmente d'un facteur allant jusqu'à 4 pour la souche dépourvue de paroi cellulaire CC-406 (cw15) et d'un facteur allant jusqu'à 8 pour BAFJ3 entre la phase exponentielle de croissance et après 4 jours de 2931841 1 6 carence azotée (Figure 3A). A l'inverse, ces concentrations restent stables pour la souche CC-124 et n'augmentent pas même d'un facteur 2 pour la souche I7 (Figure 3A). Enfin, en terme de productivité en acides gras et/ou lipides totaux (quantité exprimée en pourcentage par rapport à la matière sèche formée), les souches CC-406 et CC-124 contenant 5 respectivement beaucoup plus d'amidon que les souches BAFJ3 et I7, produisent moins d'acides gras ou de lipides: par exemple, 17 % d'AG totaux pour CC-406 contre 30% pour BAFJ3 après 4 jours de carence azotée (Figure 2B). V- ANALYSE DES LIPIDES PRODUITS PAR LES SOUCHES DEPOURVUES DE PAROI CELLULAIRE (CC-406 ET BAFJ:J 10 La séparation par chromatographie sur couche mince des différentes classes de lipides accumulés au cours de la carence totale en azote confirme que les lipides représentés chez les mutants dépourvus de paroi cellulaire (CC-406 et BAFJ3) sont essentiellement des lipides neutres de type triglycérides (Figure 4). De plus, l'observation par microscopie à épifluorescence des cellules colorées au Rouge Nil révèle la présence de 15 vésicules lipidiques de couleur jaune chez 1es souches CC-406 (cwl5) et BAFJ3. Ces mêmes vésicules sont absentes ou peu nombreuses chez les souches CC-124 (137C) et I7. Les triglycérides accumulés au cours de la carence totale en azote chez les souches mutantes dépourvues de paroi cellulaire seraient donc stockés dans ces vésicules pour remplir la quasi-totalité du volume cellulaire en fin d'expérience (Figure 5). 20 VI- MISE EN EVIDENCE DE LA PRÉSENCE DE PAP-FIBRILLINE DANS LES GOUTTELETTES LIPIDIQUES S'ACCUMULANT CHEZ LA SOUCHE MUTANTE BAFJ6 EN REPONSE A UNE CARENCE TOTALE EN AZOTE. Chez les plantes, les lipides de réserve sont généralement stockés dans des organites de réserve (oléosomes dans les graines, plastoglobules dans les plastes). Une 25 analyse bioinformatique du génome de Chlamydomonas reinhardtii n'a pas révélé la présence de gènes codant pour des oléosines, les protéines stabilisant les structures lipidiques des graines (résultat non montré). Par contre, le génome de Chlamydomonas reinhardtii contient 10 séquences génétiques codant pour des PAP-fibrillines présumées, les protéines identifiées dans les plastes comme impliquées dans la stabilisation des plastoglobules (Bréhelin et al. 2007). Après purification partielle des plastoglobules, un anticorps dirigé contre une PAP-fibrilline de pomme de terre reconnaît spécifiquement une bande protéique de 33 kDa (voir Figure 6) indiquant la présence de PAP-fibrilline dans les structures de stockage des lipides. Par conséquent, les plastoglobules représentent vraisemblablement les structures de réserve des triglycérides chez Chlamydomonas reinhardtii. VII- MISE AU POINT ET VALIDATION D'UNE METHODE DE CRIBLAGE SUR PLAQUE MULTI-PUITS POUR LA SELECTION DE SOUCHES MUTANTES DE 5 C. REINHARDTH QUI ACCUMULENT DES LIPIDES. Dans le but de cribler des mutants de l'algue Chlamydomonas reinhardtii sur-producteurs de lipides de réserve, un crible de sélection, basé sur la coloration des lipides par une sonde fluorescente spécifique, le Rouge Nil, a été mis au point et validé. Après excitation à 488 nm du Rouge Nil, l'émission maximale de fluorescence se situe 10 autour de 580 nm (dans le jaune) pour les lipides neutres et de 620 nm (dans le rouge) pour les lipides polaires. Une méthode de criblage faisant appel à des plaques multi-puits de type Elisa a été mise au point pour cribler un grand nombre de souches (Figure 7A). Pour cela, la souche mutante BAFJ5 accumulatrice de lipides a été utilisée. Cette souche a été 15 préalablement cultivée en Milieu Minimum et sous atmosphère d'air enrichi à 2% de CO2 puis placée pendant 3 jours en carence azotée totale. Il a été ensuite procédé à la validation de cette méthode de criblage sur micro-puits par comparaison des fluorescences émises en présence de Rouge Nil par une souche sauvage (137C) non productrice de lipides et la souche BAFJ5 productrice de lipides. Les résultats montrent une nette différence de 20 fluorescence entre la souche sauvage et la souche mutante (Figure 7B). Ce crible est donc utilisable pour le criblage haut-débit de banques de mutants d'algues dans le but de rechercher des mutants qui accumulent ou au contraire n'accumulent pas ou peu de lipides, ces mutants présentant un intérêt pour la production de lipides elle-même ou pour la caractérisation des mécanismes moléculaires impliqués dans 25 l'accumulation de lipides. BIBLIOGRAPHIE - Ball S (1990) Plant Science 66, 1-9 - Ball S et al. (1991) Planta 185, 17-26 30 - Bligh EG and Dyer WJ (1959) Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 37, 911-917 - Boyton JE et al (1988) Science 240, 1534-1538 - Bréhelin C et al. 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Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite souche de Chlamydomonas est la souche BAFJ3 ou une souche dérivée de celle-ci. 6. Procédé de production de lipides neutres, caractérisé en ce qu'il 15 comprend une étape de culture d'une souche mutante d'algue dépourvue de paroi cellulaire, et optionnellement affectée aussi dans la synthèse de l'amidon, en conditions photoautotrophes et de carence totale ou partielle en azote, et sous atmosphère d'air enrichi à environ 1% à 5% de dioxyde de carbone. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite souche 20 est une souche d'algue verte, de préférence de Chlamydomonas. 8. Procédé selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'extraction des lipides neutres. 10