FR 2926369 A1 20090717 FR 0800142 A 20080110 2926369 UTILISATION D'UNE PROTEINE OU D'UNE SEQUENCE PEPT1DIQUE NITREE POUR LA MISE EN OEUVRE D'UNE METHODE DE DIAGNOSTIC. La présente invention a pour objet l'utilisation d'une protéine ou d'une séquence 5 peptidique nitrée pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic. La présente invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'une protéine ou d'une séquence peptidique nitrée pour la mise en oeuvre du diagnostic de l'état de gravité et d'évolutivité de pathologies associées, entraînant ou dues au stress nitrant. 10 Le stress oxydant (ou stress oxydatif) est un type d'agression des constituants de la cellule dû aux espèces réactives oxygénées (ROS, Reactive Oxygen Species) et aux espèces réactives de l'azote (RNS, Reactive Nitrogen Species) oxydantes. Ces espèces sont, par définition, des radicaux libres. Par assimilation, le peroxyde d'hydrogène (H202) est considéré comme une ROS car, en présence de fer (sous forme ionique), il se dismute en deux radicaux 15 hydroxyle (OH) (Réaction de Haber-Weiss). La production de ROS et RNS est normale pour tous les organismes vivant en aérobie et ne constitue pas en soit une situation de stress oxydant parce que la cellule dispose d'un système complexe de détoxification contre les ROS comprenant des enzymes (superoxyde dismutase, catalase, glutathion péroxydase ) et des petites molécules (vitamine E, vitamine 20 C, glutathion,...). En situation physiologique, l'anion superoxyde (02) est produit essentiellement par les NADPH oxydases (NOX) et le monoxyde d'azote (NO) par la famille des NO synthases. Le stress oxydant devient une situation pathologique dès que le système de protection est submergé par les ROS et RNS. Ceci peut être par exemple dû à : 25 - l'introduction dans la cellule de radicaux libres ou d'espèces réactives oxygénées (polluants chimiques pénétrant l'organisme via le système respiratoire, l'alimentation ou les muqueuses) - une surproduction de ROS et RNS induite par l'hypoxie ou des processus de type ischémie-reperfusion qui sont à l'origine d'une partie des rejets des greffes ou à la présence de 30 certains composés chimiques prooxydants. - un dysfonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale suite par exemple à une hypoxie, une hypoglycémie ou à des xénobiotiques agissant sur certains de ses complexes. - une activation de la xanthine oxydase 2 2926369 - une augmentation de l'expression ou de l'activité de la NOS II suite par exemple au déclenchement d'une réaction inflammatoire. - un défaut du système de protection, par exemple une mutation ou des xénobiotiques inactivant une des enzymes du système de protection ou une carence en une des vitamines 5 antioxydantes (vitamines C et E). - l'introduction dans la cellule ou dans un organe de molécules hautement réactives, par exemple nanoparticules (très petite et à surface spécifique très développée). Si ces nanoparticules sont nombreuses, les macrophages n'arrivent plus à les traiter et peuvent libérer leurs oxydants dans l'organisme en provoquant une réaction inflammatoire exacerbée. 10 Le stress oxydant a des conséquences fonctionnelles très différentes selon son intensité. Des travaux récents indiquent que le rapport ions superoxyde sur monoxyde d'azote (02.-/NO) est déterminant. En effet, tant que ce rapport 1, les ions 02 puis les radicaux OH" � libres � induisent l'oxydation irréversible des protéines, lipides et acides nucléiques, qui peut être mesurée à 20 l'aide de nombreux marqueurs plasmatiques. Ces modifications sont par ailleurs le reflet d'un des mécanismes de défense cellulaire vis à vis du stress oxydant : la production de NO. On peut donc postuler qu'une fois la capacité cellulaire à � absorber � le NO+ et l'ONOO- produits, ceux-ci, étant diffusibles au travers de la membrane plasmique, pourront respectivement nitroser et nitrer des protéines 25 extracellulaires parmi lesquelles les protéines plasmatiques. Les stress oxydant et nitrant sont des facteurs d'inflammation et de mutagenèse. Ils sont aussi considérés comme une des principales causes de cancer et joueraient un rôle dans les maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer, sclérose en plaques, SLA), tout comme 30 dans plusieurs pathologies plus courantes telles que le diabète sucré de types 1 et 2, les maladies cardio-vasculaires, les accidents vasculaires cérébraux, l'arthrite rhumatoïde ou la cataracte. A ce jour, il n'existe aucune méthode permettant de mettre en évidence le stress nitrant en dosant un marqueur circulant de façon spécifique et quantitative. 3 2926369 Khan et collaborateurs (Khan et al. Biochem J, 1998, 330, 795-801) divulguent une méthode permettant de doser les protéines nitrées sur les résidus tyrosines (test ELISA) en utilisant des anticorps reconnaissant les tyrosines nitrées de toutes les protéines. Il est clairement stipulé que la méthode décrite par Khan et al. permet un dosage qualitatif des protéines nitrées, mais ceci ne permet pas de mesure précise et fiable des taux de nitration des protéines circulantes. En effet, Khan et al. divulguent l'utilisation d'anticorps capables de reconnaître toutes les protéines nitrées et non pas des protéines spécifiques. L'art antérieur décrit des méthodes de détection de la quantité de NO associé aux protéines. En particulier la demande WO/1998/029452 décrit des anticorps reconnaissant les tyrosines nitrosylées, en particulier les tyrosines nitrées des protéines transporteuses de NO, pour leur utilisation en tant qu'agents thérapeutiques pour soigner des pathologies associées à la nitrosylation et la nitration des protéines. Bien que ce document divulgue des anticorps reconnaissant des protéines nitrées ou nitrosylées, et en particulier l'albumine, il n'est rien dit concernant la production d'anticorps spécifiques dirigés contre des résidus nitrés, particulièrement les résidus tyrosine Y138 et Y411 de l'albumine, ou tout autre résidu de position définie dans des protéines circulantes. La nitration de l'albumine a été décrite dans l'art antérieur. En particulier, Jiao et al. (Analytical. Biochem, 2001, 293, 43-52) divulguent les résidus nitrés de l'Albumine. Jiao et al. décrivent la nitration des résidus Y138 et Y411 de l'albumine, après nitration in vitro de l'albumine par du péroxynitrite, et identification des sites de nitration par spectrométrie de masse. Malan, P. G., et al. (1970) Biochemistry 9(16), 3205-3214 et Sokolovsky, et al. (1966) Biochemistry 5(11), 3582-3589 décrivent quant à eux des méthodes de nitration in vitro des protéines utilisant du tétranitrométhane en tant qu'agent nitrant. Un des aspects de l'invention est de fournir une méthode de diagnostic de l'état de gravité et d'évolutivité de pathologies dues ou associées au stress nitrant, ou provoquant. L'un des autres aspects de l'invention est de fournir une méthode de dosage quantitatif in vitro des taux de nitration de protéines physiologiques. Un autre aspect de l'invention est de permettre la détermination de la position des tyrosines nitrées dans les protéines physiologiques, au cours d'un stress nitrant. 4 2926369 La présente invention a pour objet l'utilisation du dosage quantitatif, notamment in vitro, dans un échantillon biologique, du taux de nitration de résidus tyrosine d'une protéine ou d'une séquence peptidique physiologique déterminée nitrée, pour la mise en oeuvre d'une 5 méthode de diagnostic in vitro de l'état de gravité et d'évolutivité d'une pathologie chronique ou aigüe associée au stress nitrant. La présente invention repose sur la constatation inattendue de l'existence d'une corrélation entre la valeur du taux de nitration physiologique de protéines et l'état de gravité et d'évolutivité d'une pathologie associée au stress nitrant. 10 Dans l'invention, on entend par � dosage quantitatif du taux de nitration� l'action qui consiste à déterminer de manière précise la quantité de protéines déterminées nitrées. La quantification du taux de nitration de la protéine déterminée nitrée est effectuée par l'établissement du rapport entre la quantité de protéine déterminée nitrée et la quantité totale de ladite protéine déterminée, nitrée et non nitrée. Cette valeur est donc comprise entre 0 et 1. 15 Dans l'invention, il est appelé � protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée �, toute protéine, peptide, fragment de protéines ou de peptides, ou tout enchaînement d'au moins 2 acides aminés, connu dont la synthèse à lieu au sein d'un organisme vivant, généralement sans intervention extérieure humaine. Il est également entendu que les termes � protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée � 20 correspondent à � une protéine physiologique déterminée � ou à � une séquence peptidique physiologique déterminée �. Selon un mode de réalisation de l'invention, les protéines particulièrement concernées sont des protéines circulantes, retrouvées dans le sang, le liquide céphalorachidien ou les urines. Les autres protéines ne sont pas exclues de l'invention. On entend également par protéine, dans ce qui suit, tout enchainement d'acides aminés 25 présentant des propriétés antigéniques, et donc capable de permettre la réaction du système immunitaire et ainsi de générer des anticorps. Ces anticorps sont alors eux même capables de reconnaitre la dite protéine qui a permis leur synthèse. Par �nitré �, on définit dans l'invention la présence d'un groupement -NO2 lié de façon covalente à une protéine ou une séquence peptidique. Aussi, par protéine nitrée on définit une 30 protéine dont une ou plusieurs tyrosines possèdent sur leur groupement phénol un groupement -NO2 en position 3. Ces groupements -NO2 se fixent sur les protéines, in vivo, suite à la production de peroxynitrite pouvant réagir avec certains résidus tyrosine déterminés de protéines déterminées. 5 2926369 On entend dans ce qui suit par pathologie chronique toute affection de longue durée et évoluant généralement de façon péjorative et s'accompagnant fréquemment de complications sous la forme de pathologies associées pouvant être elles-mêmes aigües ou chroniques. On entend par pathologie aigüe toute affection manifestée par des symptômes plus ou moins 5 importants se terminant après une période relativement courte par la guérison ou la mort. � L'état de gravité et d'évolutivité d'une pathologie � est défini dans l'invention comme une étape définie, caractérisée en ce qu'elle décrit un état particulier de ladite pathologie, ledit état pouvant correspondre de l'absence de symptômes caractéristiques de ladite pathologie à l'état le plus avancé, c'est-à-dire où tous les symptômes décrits jusqu'à présent sont cumulés. 10 La caractérisation de l'état de gravité et d'évolutivité de la pathologie est basée sur les connaissances cliniques et physiopathologiques de ladite pathologie. Il est défini dans l'invention une corrélation entre taux de nitration et stress nitrant. Par stress nitrant, on définit une surproduction de peroxynitrite (ONOO") par rapport à la quantité de peroxynitrite produite chez un individu déclaré sain. Cela signifie que plus la quantité de 15 peroxynitrite est élevée dans l'organisme, plus les espèces azotées dérivées du peroxynitrite seront capable de nitrer les protéines. Aussi, plus le stress nitrant sera élevé, plus les protéines seront susceptibles d'être nitrées. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le dosage quantitatif est 20 effectué à l'aide d'au moins un anticorps spécifique reconnaissant une tyrosine nitrée physiologiquement de ladite protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée. Par �tyrosine nitrée �, on entend dans l'invention la modification de résidu tyrosine après l'addition du groupe -NO2 sur le cycle aromatique de la tyrosine. Le NO2 ainsi présent sur le résidu tyrosine l'est de préférence en position 3. Les termes � tyrosine � et � résidu 25 tyrosine � sont utilisé de manière uniforme dans l'invention pour désigner l'acide aminé en question. Dans l'invention, l'expression � anticorps spécifique reconnaissant une tyrosine nitrée � désigne un anticorps reconnaissant une séquence d'acides aminés immunogène spécifique, ou particulière, dans laquelle se trouve un résidu tyrosine nitré. La reconnaissance est dite 30 spécifique, ce qui signifie que la séquence d'acides aminés immunogène dans laquelle se trouve un résidu tyrosine non nitré n'est pas reconnue par le dit anticorps spécifique, et qu'une séquence d'acides aminés immunogène différente de la séquence en acide aminés immunogène spécifique, ou particulière, contenant une tyrosine, ou un résidu tyrosine, même nitré, ne sera par reconnue par ledit anticorps spécifique. 6 2926369 Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la protéine physiologique ou séquence peptidique déterminée nitrée est choisie parmi les protéines suivantes : l'albumine, la préalbumine, la protéine de liaison à la vitamine D (Vitamin D Binding 5 Protein ; VDBP), la transferrine, la céruloplasmine, la protéine de liaison au rétinol (Retinol Binding Protein ; RBP), l'insuline, l'hémoglobine, l'actine f3, la protéine bande 3 du transporteur d'anion érythrocytaire, la chaine 13 de la spectrine érythrocytaire, le précurseur de la fibronectine, la chaine (3 du fibrinogène et la protéine de la membrane érythrocytaire bande 4.1. 10 Lesdites protéines: l'albumine, la préalbumine, la protéine de liaison à la vitamine D (Vitamin D Binding Protein ; VDBP), la transferrine, la céruloplasmine, la protéine de liaison au rétinol (Retinol Binding Protein ; RBP), l'insuline, l'hémoglobine, l'actine 13, la protéine bande 3 du transporteur d'anion, la chaine 13 de la spectrine erythrocytaire, le précurseur de la fibronectine, la chaine 13 du fibrinogène et la protéine de la membrane érythrocytaire bande 15 4.1, décrites dans l'invention sont des protéines circulantes, présentes dans le sang des humains ou des animaux et purifiables ou productibles in vitro selon les techniques classiques connues de l'homme de métier. La préalbumine décrite dans l'invention est également communément appelée transthyrétine. 20 Dans l'invention, l'actine f3 peut également être appelée (3 actine. L'hémoglobine est une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend 4 sous unités : deux sous unités d'hémoglobine a et deux sous unités d'hémoglobine (3. Il est également à noter que la protéine bande 3 du transporteur d'anion érythrocytaire correspond à l'antigène CD233. 25 Les protéines impliquées dans l'invention, sous leur forme non nitrée, sont représentées par les séquences suivantes :l'albumine est représentée par la séquence SEQ ID NO : 1, la transthyrétine est représentée par la séquence SEQ ID NO : 2, la VDBP par la séquence SEQ ID NO : 3, la transferrine par la séquence SEQ ID NO : 4, la céruloplasmine par la séquence SEQ ID NO : 5, la RBP par la séquence SEQ ID NO : 6, l'Insuline par la séquence SEQ ID 30 NO : 7, l'hémoglobine a par la séquence SEQ ID NO : 8, l'hémoglobine (3 par la séquence SEQ ID NO: 9, l'actine (3 par la séquence SEQ ID NO: 10, la protéine bande 3 du transporteur d'anion érythrocytaire par la séquence SEQ ID NO : 11, la chaine 13 de la spectrine érythrocytaire par la séquence SEQ ID NO : 12, le précurseur de la fibronectine par 7 2926369 la séquence SEQ ID NO : 13, la chaine [3 du fibrinogène par la séquence SEQ ID NO : 14 et la protéine de la membrane érythrocytaire bande 4.1 par la séquence SEQ ID NO : 15. Dans l'invention, les protéines précédentes, sous leur forme non nitrée représentées par les séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 15, sont également représentées par les variants ou 5 isoformes des dites séquences, ou toute protéine présentant une identité de séquence d'au moins 90%, et plus particulièrement 100%, avec ladite protéine. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, lesdites pathologies chroniques ou aigües associées au stress nitrant appartiennent au groupe suivant : les maladies 10 inflammatoires et autoimmunitaires, les maladies infectieuses, les maladies neurodégénératives, les maladies ischémiques, le diabète sucré de types 1 et 2, les maladies métaboliques, l'hyper- et l'hypothyroïdie, les maladies cardiovasculaires et respiratoires ainsi que le cancer. 15 Les pathologies impliquées dans l'invention correspondant aux maladies neurodégénératives peuvent être entre autre les maladies de Parkinson, d'Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose en plaques, la leucomalacie périventriculaire ou encore la maladie de Creutzfeld-Jacob. Les maladies ischémiques impliquées dans l'invention peuvent être entre autres les 20 Maladies coronariennes, l'infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux, les chocs ou la prééclampsie et l'éclampsie. Les maladies liées à l'hypoxie, telles que les bronchopathies chroniques obstructives, l'asthme, l'emphysème, le tabagisme, les pneumopathies fibrosantes, le syndrome d'apnées du sommeil sont également des pathologies couvertes par la présente invention. L'hypoxie 25 des nouveaux-nés ne fait pas partie des pathologies visées par l'invention. Le diabète décrit dans l'invention correspond aux diabètes de type 1 et 2 ainsi que l'insulinorésistance précédant le diabète de type 2. L'hypoglycémie des nouveaux nés ne fait pas partie des pathologies de l'invention. L'hypoglycémie peut survenir dans le cadre de diabètes mal ou non équilibrés ou traités 30 est couverte par l'invention ainsi que plus généralement toutes les complications du diabète telles et de façon non exclusive, la rétinopathie, la néphropathie, la neuropathie, l'artériopathie et la cardiopathie diabétiques. 8 2926369 Les maladies cardiovasculaires impliquées dans l'invention peuvent être entre autre l'athérosclerose, l'insuffisance et la décompensation cardiaque ou l'hypertension artérielle et l'hypertension artérielle pulmonaire. 5 Dans l'invention, il est également question du suivi des malades ayant subi une transplantation telle que les greffes de moelle, rénales, cardiaques, cardiopulmonaires et hépatiques. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite protéine ou 10 séquence peptidique physiologique déterminée nitrée impliquée dans l'invention est l'albumine nitrée. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le dosage quantitatif, notamment in vitro, mentionné précédemment, est effectué à l'aide d'un anticorps spécifique 15 reconnaissant spécifiquement le résidu tyrosine Y13% nitrée de l'albumine, en particulier un anticorps monoclonal. Par � résidu tyrosine Y138 �, il est entendu dans l'invention qu'il s'agit de la tyrosine en position 138 dans l'albumine humaine. L'invention concerne également la tyrosine en position équivalente dans les albumines d'autres mammifères non humains. 20 Dans l'invention, le résidu Y'38 de l'albumine humaine (l'albumine étant représentée sous sa forme non nitrée par la séquence SEQ ID NO 1) est contenu, sous sa forme nitrée, dans le peptide de séquence SEQ ID NO 16. Selon un autre de mode de réalisation avantageux de l'invention, le dosage quantitatif, 25 notamment in vitro, mentionné précédemment, est effectué à l'aide d'un anticorps spécifique reconnaissant spécifiquement le résidu tyrosine Y41' nitrée de l'albumine, en particulier un anticorps monoclonal. Par � résidu tyrosine Y411 �, il est entendu dans l'invention qu'il s'agit de la tyrosine en position 411 dans l'albumine humaine. L'invention concerne également la tyrosine en 30 position équivalente dans les albumines d'autres mammifères non humains. Dans l'invention, le résidu Y411 de l'albumine humaine (l'albumine étant représentée sous sa forme non nitrée par la séquence SEQ ID NO 1) est contenu sous sa forme nitrée dans le peptide de séquence SEQ ID NO 17. 9 2926369 Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un anticorps reconnaissant spécifiquement l'albumine nitrée sur le résidu tyrosine Y138, en particulier un anticorps monoclonal. 5 L'invention concerne également un anticorps reconnaissant spécifiquement l'albumine nitrée sur le résidu tyrosine Y411, en particulier un anticorps monoclonal. Les anticorps de l'invention sont à la fois des anticorps polyclonaux et monoclonaux. Les deux anticorps de l'invention sont plus particulièrement des anticorps monoclonaux. 10 Le terme anticorps dans l'invention inclut tous les fragments dérivés des anticorps, en particulier les fragments des dits anticorps monoclonaux présentant substantiellement la même spécificité antigénique pour la protéine déterminée nitrée. Ces fragments comprennent des fragments d'anticorps (c'est-à-dire Fab, F(ab')2, CDRs, etc...), des anticorps polyfonctionnels, des anticorps monocaténaires (ScFv) etc... Les anticorps de l'invention 15 peuvent être produits à l'aide de méthodes conventionnelles, comprenant l'immunisation d'un animal et la récupération des cellules spléniques de manière à produire des hybridomes par fusion cellulaire. Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés avantageusement sous forme d'un mélange d'anticorps monoclonaux. 20 Les méthodes de production des anticorps monoclonaux sont connues de l'homme de métier. Elles comprennent généralement l'immunisation d'un animal non humain avec un antigène, suivie de la récupération des cellules de thymus de l'animal qui sont fusionnées avec des cellules immortalisées, généralement des cellules de myélome. Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux. 25 Les anticorps avantageux de l'invention sont préparés par immunisation d'animaux non humains à l'aide de peptides spécifiques des séquences encadrant les tyrosines Y138 et y411 nitrés de l'albumine substantiellement purs. Ces peptides ont les séquences suivantes : ûEETFLKK(Y-NO2)LYEIARRû comprenant la tyrosine Y138, et représenté par la séquence SEQ ID NO : 16. 30 ûLVR(Y-NO2)TKKVû comprenant la tyrosine Y411, et représenté par la séquence SEQ ID NO : 17. Les peptides ci-dessus sont nouveaux. 10 2926369 L'invention a également pour objet de fournir une méthode de diagnostic in vitro de l'état de gravité et d'évolutivité d'une pathologie chronique ou aigüe associée au stress nitrant dans un échantillon biologique d'un individu, comprenant : - le dosage quantitatif, dans un échantillon biologique d'un individu, du taux de 5 nitration d'une première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée, - la quantification dudit taux de nitration de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée en comparant la concentration de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée avec la concentration 10 totale de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée, nitrée et non nitrée, issus d'un échantillon biologique du même individu, - la comparaison dudit taux de nitration de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée avec le taux de nitration d'une seconde protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée issue d'un échantillon biologique 15 d'un individu non affecté par ladite pathologie chronique ou aigüe, • ladite seconde protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée étant un variant ou une isoforme, ou présentant une identité de séquence en acides aminés d'au moins 90%, et notamment 100%, avec la susdite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée, 20 • ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée étant nitrée sur au moins un résidu tyrosine situé à une position équivalente dans la susdite seconde protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée, - la déduction, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, du degré de stress nitrant de l'individu pouvant correspondre à un état de gravité et d'évolutivité de la dite 25 pathologie chronique ou aigüe. Cette méthode s'appuie sur la découverte par les inventeurs d'une méthode de nitration des protéines in vitro permettant la nitration sur des résidus tyrosines équivalents aux résidus nitrés physiologiquement. La quantification du taux de nitration de la protéine déterminée nitrée est réalisée par l'établissement du rapport entre la quantité de protéine déterminée nitrée et la quantité totale de ladite protéine déterminée, nitrée et non nitrée. Cette valeur est donc idéalement comprise entre 0 et 1. 30 11 2926369 Par � première protéine physiologique � on entend dans ce qui suit toute protéine physiologique correspondant à la protéine physiologique étudiée, prélevée de l'échantillon biologique de l'individu en question, à savoir l'individu testé. Par � seconde protéine physiologique � est définie une protéine présentant une identité 5 de séquence d'au moins 90%, et plus particulièrement 100%, avec ladite première protéine déterminée, cette dite seconde protéine étant issue d'un échantillon biologique, de même nature ou de nature différente, d'un autre individu que l'individu d'où est issue la première protéine déterminée. En particulier l'individu duquel est issu la deuxième protéine déterminée nitrée correspond à un individu n'étant pas affecté par ladite pathologie associée au stress 10 nitrant. Par � variant � ou � isoforme � de la protéine déterminée, on définit toute protéine, peptide ou polypeptide encodés par un même gène, sauvage ou mutant, dont les séquences en acides aminés sont proches de celle de la protéine déterminée et présentant une identité de séquence d'au moins 90%, et plus particulièrement 100%, avec la protéine dont il est question 15 et qui possède généralement la même fonction biologique que la dite protéine en question. Ne sont donc pas exclus des variants issus de mutations géniques et présentant des gains ou pertes de fonction. Ces variants ou isoformes peuvent être, par exemple, le résultat d'un épissage alternatif d'un même gène ou de l'expression de plusieurs gènes homologues dont les séquences ont divergé. 20 La première protéine physiologique et la seconde protéine physiologique peuvent être les mêmes protéines, exception faite de la nitration ou non d'un ou plusieurs résidus tyrosine. Par � position équivalente � de tyrosine entre la première et la seconde protéine, on entend dans l'invention une position dans la séquence en acides aminés de la première protéine déterminée qui correspond à la position d'une tyrosine dans la seconde protéine 25 déterminée telle que, si on aligne les deux protéines selon des procédures standard d'alignement de séquences (algorithme de NeedlemanûWunsch, Algorithme de Sm.ith-Waterman ...), ces deux résidus se retrouvent à la même position. De manière plus explicite, cela signifie que même si les deux protéines ne sont pas de même taille, à l'issue de l'alignement, les deux résidus se retrouveront à des positions identiques par rapport aux 30 séquences environnantes. La méthode également décrite dans l'invention consiste donc en un dosage du taux de nitration physiologique ou pathologique d'une première protéine physiologique déterminée de l'invention, à partir d'un échantillon biologique d'un individu. L'échantillon biologique 12 2926369 avantageux dans l'invention peut être du sang ou un produit dérivé de celui-ci (plasma, sérum, globules, plaquettes). Les échantillons biologiques tels que l'urine, le liquide céphalo-rachidien, les tissus, les tumeurs, des cellules, les frottis sanguins, etc... peuvent également être impliqués dans l'invention. Le dosage consiste donc en l'évaluation de la nitration des 5 protéines physiologiques nitrées. Une valeur finie du taux de nitration physiologique de ladite protéine déterminée est donc établie. Le taux de nitration déterminé précédemment est comparé au taux de nitration de la seconde protéine déterminée issue d'un échantillon biologique d'un individu considéré comme n'étant pas atteint par l'une des pathologies de l'invention. 10 A ce jour, les taux de nitration normaux des protéines physiologiques ne sont pas connus de manière quantitative. Ils sont généralement estimés comme étant faibles ( Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le taux de nitration de la 25 première protéine déterminée peut être comparé au taux de nitration d'une troisième protéine physiologique déterminée nitrée. Par troisième protéine physiologique, on définit une protéine présentant une identité de séquence d'au moins 90%, et plus particulièrement 100%, avec ladite première protéine déterminée, cette dite troisième protéine étant issue d'un échantillon biologique, de même nature ou de nature différente, d'un autre individu que l'individu d'où 30 est issue la première protéine déterminée. En particulier, l'individu duquel est issue la troisième protéine déterminée nitrée correspond à un individu étant affecté par ladite pathologie associée au stress nitrant, et présentant la totalité des symptômes associés à cette pathologie. 13 2926369 Ainsi, de la comparaison du taux de nitration de la première protéine physiologique avec le taux de nitration de la seconde et/ou de la troisième protéine physiologique déterminée, il est possible de déterminer le degré de stress nitrant pouvant être corrélé à l'état de gravité et d'évolutivité de la pathologie, chronique ou aigüe, associée au stress nitrant chez le patient 5 d'où est issue la première protéine physiologique. L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic in vitro caractérisée par les étapes suivantes : - le dosage quantitatif, dans un échantillon biologique d'un individu, du taux de 10 nitration d'une première ou séquence peptidique protéine physiologique déterminée nitrée, - la quantification dudit taux de nitration de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée en comparant la concentration de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée avec la 15 concentration totale de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée, nitrée et non nitrée, issus d'un échantillon biologique du même individu, la comparaison dudit taux de nitration de résidus tyrosine de la première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée avec les taux de 20 nitration d'un ensemble de n protéines ou séquences peptidiques physiologiques déterminées, la valeur du taux de nitration de chacune des susdites n protéines ou séquences peptidiques déterminées étant connues et associées respectivement à un état déterminé de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie chronique ou aigüe, • lesdites n protéines ou séquences peptidiques physiologiques déterminées 25 étant des variants ou des isoformes de la susdite première protéine ou séquence peptidique déterminée, ou présentant une identité de séquence en acides aminés d'au moins 90%, et notamment 100%, avec la susdite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée, • lesdites n protéines ou séquences peptidiques physiologiques déterminées 30 étant nitrées sur au moins un résidu tyrosine situé à une position équivalente au résidu tyrosine dans la susdite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée, 14 2926369 - la déduction, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, du degré de stress nitrant de l'individu pouvant correspondre à un état de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie chronique ou aigtie. 5 Les n protéines physiologiques déterminées de l'invention sont définies telles qu'elles présentent une homologie de séquence d'au moins 90%, et plus particulièrement 100% d'identité avec la première protéine déterminée ou qu'elle sont issues du même gène. Dans l'invention, n varie de 2 à 10, et avantageusement de 2 à 5. 10 Les dites n protéines sont issues de n échantillons biologiques différents. Le taux de nitration de chacune des n protéines déterminées est de valeur connue et est associé à un état particulier de ladite pathologie associée au stress nitrant. La méthode également décrite dans l'invention consiste donc en un dosage du taux de 15 nitration physiologique d'une première protéine physiologique déterminée de l'invention, à partir d'un échantillon biologique d'un individu. Le taux de nitration déterminé précédemment est comparé au taux de nitration d'un ensemble de n protéines déterminées, chacune des n protéines déterminées étant issue d'un échantillon biologique différent, soit n échantillons biologiques. Les n échantillons peuvent 20 provenir soit de n individus différents, soit du même individu mais dont des échantillons ont été prélevés aux cours des n stades de la pathologie associée au stress nitrant qu'il a développé. Les n échantillons biologiques correspondent à un stade d'évolution différent de la pathologie associée au stress nitrant bien caractérisé, et quantifié. 25 Dans un des modes avantageux de l'invention, les n protéines déterminées sont définies de la manière suivante : une protéine déterminée correspond à une protéine issue d'un échantillon biologique d'un individu non atteint par la pathologie associée au stress nitrant, et les n-1 autres protéines déterminées correspondent à n-1 échantillons biologiques définissant n-1 états de gravité et d'évolutivité particuliers différents de la dite pathologie associée au 30 stress nitrant. Les taux de nitration de la première et de la deuxième protéine physiologique déterminée sont alors comparés. 15 2926369 Lorsque le taux de nitration de la première protéine nitrée correspond au taux de nitration de l'une des n protéines physiologiques déterminées l'individu est atteint d'un stress nitrant associée à la pathologie chronique ou aigüe dont il est question, au même degré que celui de l'individu dont est issu la protéine n physiologique déterminée nitrée. Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode de diagnostic in vitro dans laquelle le dosage quantitatif in vitro est effectué à l'aide d'au moins un anticorps, chaque anticorps reconnaissant spécifiquement un résidu tyrosine nitré d'une protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée. 10 De manière avantageuse, l'invention décrit une méthode de diagnostic mentionnée précédemment, dans laquelle la protéine physiologique déterminée nitrée est choisie parmi : l'albumine, la préalbumine, la protéine de liaison à la vitamine D (Vitamin D Binding Protein ; VDBP), la transferrine, la céruloplasmine, la protéine de liaison au rétinol (Retinol 15 Binding Protein ; RBP), l'insuline, l'hémoglobine, l'actine (3, la protéine bande 3 du transporteur d'anion érythrocytaires, la chaine R de la spectrine erythrocytaire, le précurseur de la fibronectine, la chaine 13 du fibrinogène et la protéine de la membrane érythrocytaire bande 4.1. 20 De plus, l'invention décrit une méthode de diagnostic, dans laquelle la pathologie chronique ou aigüe liée au stress nitrant appartient au groupe suivant : les maladies inflammatoires, les maladies infectieuses, les maladies neurodégénératives, les maladies ischémiques, le diabète, les maladies métaboliques, les maladies cardiovasculaires et respiratoires ainsi que le cancer. 25 Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention décrit une méthode de diagnostic in vitro de l'état de gravité et d'évolutivité d'une pathologie chronique ou aigüe associée au stress nitrant, dans un échantillon biologique, comprenant : la détection d'un complexe immun résultant de la mise en contact d'au moins 30 un anticorps reconnaissant spécifiquement un résidu tyrosine nitré de l'albumine physiologique avec l'albumine physiologique nitrée issue d'un échantillon biologique d'un individu, la dite détection du complexe immun permettant la détermination du taux de nitration de ladite albumine physiologique nitrée, 5 16 2926369 la comparaison dudit taux de nitration de résidu tyrosine de l'albumine physiologique, avec les taux de nitration de résidus tyrosine d'un ensemble de n albumines physiologiques dont la valeur du taux de nitration est connue et associée respectivement à un état déterminé de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie 5 chronique ou aigüe, la déduction, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, du degré de stress nitrant de l'individu pouvant correspondre à un état de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie chronique ou aigüe. 10 Le � complexe immun � dont il est question ci-dessus (ou complexe antigène-anticorps) résulte de la combinaison d'un épitope (antigène) avec un anticorps dirigé contre cet épitope et seulement contre cet antigène. L'antigène impliqué dans l'invention correspond aux protéines déterminées nitrées citées précédemment. La détection du complexe immun est effectuée à l'aide d'anticorps monoclonaux ou 15 polyclonaux reconnaissant spécifiquement la protéine déterminée, de manière directe ou indirecte. Lors d'une détection directe, ledit anticorps permettant la détection est généralement couplé à des marqueurs. Les marqueurs peuvent être choisis parmi les radiomarqueurs, la biotine, des enzymes, des agents fluorescents, des particules magnétiques, etc... 20 Lors d'une détection indirecte, l'anticorps reconnaissant la protéine déterminée est lui même reconnu par un anticorps de détection couplé à l'un des marqueurs. Les anticorps utilisés peuvent être mis en oeuvre sous forme soluble, ou immobilisés sur des supports, et plus particulièrement des billes, des plaques, des colonnes, etc... 25 La méthode décrite dans l'invention consiste en un dosage du taux de nitration physiologique d'une première protéine physiologique déterminée, à partir d'un échantillon biologique d'un individu. Le taux de nitration déterminé précédemment est comparé au taux de nitration d'un ensemble de n protéines déterminées, chacune des n protéines déterminées étant issue d'un 30 échantillon biologique différent, soit n échantillons biologiques. Les n échantillons peuvent provenir soit de n individus différents, soit du même individu mais dont des échantillons ont été prélevés aux cours des n stades de la pathologie associée au stress nitrant qu'il a développée. 17 2926369 Les n échantillons biologiques correspondent à un stade d'évolution différent de la pathologie associée au stress nitrant bien caractérisé, et quantifié. Dans un des modes avantageux de l'invention, les n protéines déterminées sont définies de la manière suivante : une protéine déterminée correspond à une protéine issue d'un 5 échantillon biologique d'un individu non atteint par la pathologie associée au stress nitrant, et les n-1 autres protéines déterminées correspondent à n-1 échantillons biologiques définissant n-1 états de gravité et d'évolutivité particuliers différents de la dite pathologie associée au stress nitrant. 10 Lorsque le taux de nitration de la première protéine nitrée correspond au taux de nitration de l'une des n protéines physiologiques déterminées, l'individu est atteint par la pathologie chronique ou aigüe associée au stress nitrant dont il est question, à un stade identique à celui de l'individu dont est issue la protéine n physiologique déterminée nitrée. 15 Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode de diagnostic in vitro, dans laquelle ledit anticorps reconnaissant la nitration de l'albumine sur le résidu tyrosine Y138 Egalement, l'invention concerne une méthode de diagnostic in vitro, dans laquelle ledit anticorps reconnaissant la nitration de l'albumine sur le résidu tyrosine Y4" 20 L'un des aspects de l'invention concerne plus particulièrement une méthode de diagnostic in vitro de l'état de gravité et d'évolutivité d'une pathologie chronique ou aigüe associée au stress nitrant, dans un échantillon biologique, comprenant : la détection, à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'albumine, d'un complexe 25 immun résultant de la mise en contact d'au moins un anticorps spécifique, avec l'albumine physiologique nitrée issue d'un échantillon biologique d'un individu, la dite détection du complexe immun permettant la détermination du taux de nitration l'albumine physiologique nitrée, la comparaison dudit taux de nitration de résidu tyrosine de l'albumine 30 physiologique nitrée, avec les taux de nitrations de résidus tyrosine d'un ensemble de n albumines physiologiques nitrées dont la valeur du taux de nitration de résidus tyrosine de l'albumine physiologique nitrée est connue et associée respectivement à un état de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie chronique ou aigüe, 18 2926369 - la déduction, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, du degré de stress nitrant de l'individu pouvant être correspondre à un état de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie chronique ou aigüe. 5 Ainsi, la méthode décrite dans l'invention consiste en un dosage du taux de nitration physiologique de l'albumine physiologique de l'invention, à partir d'un échantillon biologique d'un individu, en utilisant les anticorps spécifiques reconnaissant l'albumine nitrée de l'invention. Les anticorps de l'invention permettent d'immobiliser spécifiquement l'albumine nitrée 10 parmi une population de protéines, nitrées et non nitrées. Le complexe immun formé est alors détecté et la quantité de complexe est indicative du taux de nitration de l'albumine dans l'échantillon biologique. Le taux de nitration déterminé précédemment est comparé au taux de nitration d'un ensemble de n albumines, chacune des n albumines étant issue d'un échantillon biologique 15 différent. Les n échantillons peuvent provenir soit de n individus différents, soit du même individu mais dont des échantillons ont été prélevés aux cours des n stades de la pathologie associée au stress nitrant que le patient a développé. Les n échantillons biologiques correspondent à des stades d'évolution différents de la pathologie associée au stress nitrant bien caractérisés, selon les critères cliniques de la 20 pathologie, et le taux de nitration de l'albumine issus de ces n échantillons est quantifié. Dans un des modes avantageux de l'invention, les n albumines déterminées sont définies de la manière suivante : une albumine déterminée correspond à une protéine issue d'un échantillon biologique d'un individu non atteint par la pathologie associée au stress nitrant, et les n-1 autres albumines déterminées correspondent à n-1 échantillons biologiques 25 définissant n-1 états de gravité et d'évolutivité particuliers différents de la dite pathologie associée au stress nitrant. L'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro dans laquelle le degré de stress nitrant de l'individu peut correspondre à un état de gravité et d'évolutivité des 30 pathologies choisies parmi: les maladies inflammatoires, les maladies infectieuses, les maladies neurodégénératives, les maladies ischémiques, le diabète, les maladies métaboliques, les maladies cardiovasculaires et respiratoires ainsi que le cancer. 19 2926369 Une méthode de diagnostic in vitro avantageuse de l'invention met particulièrement en oeuvre la détection du complexe immun à l'aide de techniques conventionnelles telles que l'ELISA (direct ou compétitif), l' immunohistochimie et l' immunocytochimie, l'immunoprécipitation, la néphélométrie, la turbidimétrie, le western blot ou toute autre 5 méthode immunochimique. L'ELISA, l' immunohistochimie et 1'immunocytochimie, l'immunoprécipitation, la néphélométrie, la turbidimétrie, le western blot ou toute autre méthode immunochimique sont des techniques classiques connues de l'homme de métier. 10 La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine ou d'une séquence peptidique déterminée nitrée, nitrée sur au moins un résidu tyrosine, pour la mise en oeuvre d'une méthode de dosage quantitatif, notamment in vitro, du taux de nitration physiologique d'une protéine ou d'une séquence peptidique physiologique nitrée, ladite protéine ou séquence peptidique déterminée nitrée présentant une identité de séquence en 15 acides aminés d'au moins 90%, et notamment 100%, avec la susdite protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée, ladite protéine ou séquence peptidique déterminée nitrée présentant une nitration sur au moins un résidu tyrosine à une position équivalente à celle du résidu tyrosine de la susdite protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée, la nitration de ladite protéine ou séquence peptidique 20 physiologique déterminée étant corrélée au stress nitrant associé à des pathologies chroniques ou aigües. L'invention à plus particulièrement pour objet l'utilisation d'une protéine ou d'une séquence peptidique déterminée nitrée, dans laquelle ladite protéine ou séquence peptidique 25 déterminée nitrée permet de générer au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal capable de reconnaître spécifiquement un résidu tyrosine nitré de la dite protéine ou séquence peptidique déterminée, lequel anticorps étant capable de reconnaître également spécifiquement ledit résidu tyrosine nitré à une position équivalente dans la protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée. 30 L'invention a également pour objet un procédé de préparation in vitro d'une protéine ou séquence peptidique déterminée nitrée sur des résidus tyrosine dans lesquelles les résidus tyrosine nitrés correspondent aux résidus tyrosine nitrés physiologiquement d'une protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée dans des pathologies chroniques ou 20 2926369 aigües associées au stress nitrant, ladite protéine ou séquence peptidique déterminée nitrée présentant une identité de séquence en acides aminés d'au moins 90%, et notamment 100%, avec la susdite protéine physiologique déterminée nitrée, comprenant : la nitration in vitro d'une protéine ou séquence peptidique déterminée par du 5 tetranitrométhane dans un rapport molaire avec les tyrosines nitrables de la protéine ou séquence peptidique déterminée n'excédant pas 20 :1, dans un tampon aqueux de pH compris entre 7,5 et 8,5, l'identification in vitro des tyrosines nitrées de ladite protéine déterminée nitrée, en particulier par spectrométrie de masse, et 10 éventuellement, la comparaison des tyrosines nitrées identifiées sur ladite protéine ou séquence peptidique déterminée avec les résidus tyrosine de la protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée. II existe de nombreux agents nitrant des protéines, et particulièrement le péroxynitrite, 15 le tétranitrométhane, le 3-morpholino-sydonimine, le sodium a-oxyhyponitrite spermine-NONOate et autres NONOates, le chlorure de nitryle (NOZC1) et le nitroprussiate. Ces agents nitrants ne sont pas les seuls. La précédente liste d'agents nitrant n'est pas exhaustive. L'invention a pour avantage de fournir un procédé permettant de nitrer in vitro des protéines sur des résidus tyrosines, résidus qui sont susceptibles d'être nitrés 20 physiologiquement. Contrairement à ce qui est décrit dans l'art antérieur, le procédé de l'invention utilise du tétranitrométhane dans des conditions de concentrations faibles qui peuvent être considérées comme mimant des conditions proches des conditions de nitration physiologiques. L'avantage de la nitration in vitro par du tétranitrométhane en milieu aqueux à pH faiblement alcalin par 25 rapport au peroxynitrite consiste dans le fait qu'utilisé dans ces conditions le tétranitrométhane est beaucoup moins oxydant que le peroxynitrite ce qui évite de ce fait la formation de dérivés oxydés et produits d'oxydation des acides aminés, en particulier des cystéines, méthionines, tryptophanes et tyrosines, des protéines traitées. Cette méthode minimise également la formation de ponts disulfure ainsi que de dityrosines. 30 Le procédé de l'invention décrit donc une étape de nitration des protéines, où les quantités de tétranitrométhane sont dépendantes de la quantité de tyrosines susceptibles d'être nitrées contenues dans la protéine à nitrer. Pour adapter les concentrations de 21 2926369 tétranitrométhane à utiliser dans le procédé de l'invention, il est donc nécessaire d'estimer ou de déterminer le nombre de tyrosines nitrables ou nitrées des protéines considérées. Un des moyens de déterminer les tyrosines nitrables ou nitrées des protéines, est de réaliser une nitration in vitro des protéines avec du tétranitrométhane, à des rapports molaires 5 croissants par rapport au nombre de résidus tyrosine présents dans la protéine. A l'issue de la nitration, la protéine est purifiée sur de l'anti-nitrotyrosine conjugué à l'agarose. Les résidus nitrés sont ensuite déterminés par spectrométrie de masse. Cette méthode permet d'avoir une information relative sur le nombre de tyrosines susceptibles d'être nitrées 10 Les figures suivantes illustrent l'invention : Figure 1 : La figure 1 représente un gel de séparation des protéines nitrées issues d'échantillons de plasma. Les échantillons de plasma sont soumis à une immunoprécipitation par un anticorps anti- 15 nitrotyrosine conjugué à l'agarose. Les protéines nitrées immunoprécipitées sont séparées par électrophorèse (SDS-PAGE) et révélées par coloration au bleu de Coomassie colloïdal. Les pistes correspondent à des immunoprécipités de protéines nitrées issues de plasma de différents patients. Des marqueurs de poids moléculaire sont indiqués sur la partie gauche du gel. 20 Figures 2 : Les figures 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G et 2H représentent les spectres de masse des protéines nitrées prélevées sur le gel de séparation. Les spectres de masse des peptides sont obtenus à l'aide de la méthode MALDI-TOF. La figure 2A correspond au spectre de masse correspondant aux peptides issus de l'albumine. 25 La figure 2B correspond au spectre de masse correspondant aux peptides issus de l'actine f3. La figure 2C correspond au spectre de masse correspondant aux peptides issus de la protéine de liaison à la vitamine D.. La figure 2D correspond au spectre de masse correspondant aux peptides permettant d'identifier la bande 3 de la protéine transporteuse d'anion érythrocytaire. 30 La figure 2E correspond au spectre de masse correspondant aux peptides issus de la chaine f3 de la spectrine érytrocytaire. La figure 2F correspond au spectre de masse correspondant aux peptides issus de la chaine f3 du fibrinogène La figure 2G correspond au spectre de masse correspondant aux peptides issus de la protéine de membrane érythrocytaire bande 4.1. La figure 2H correspond au spectre de masse correspondant aux peptides issus du précurseur de la fibronectine. Figure 3 : La figure 3 schématise les conséquences cellulaires des modifications du rapport molaire 02.- / NO' Figure 4 : La figure 4 représente les réactions et modifications posttraductionnelles provoquées par les ROS et RNS formées en fonction du rapport molaire NO '/ O2 Figure 5 : La figure 5 représente la courbe d'étalonnage du dosage ELISA de l'albumine nitrée. Ce dosage utilise un anticorps de capture polyclonal anti-nitrotyrosine et un anticorps de détection anti-albumine humaine. Figure 6 : la figure 6 représente les corrélations entre les valeurs obtenues pour les dosages d'albumine nitrée, effectués en triple, dans 192 plasmas. Exemples : Exemple 1 : Nitration in vitro de l'Albumine. Matériels : Albumine humaine (> 98%, Fluka) Tetranitrométhane (Aldrich) Tris (Sigma) Ethanol absolu (Carlo Erba) Méthode: L'albumine est dissoute dans une solution de Tris (50 mM, pH 8.0) à une concentration de 0.1 mM. Le tetranitrométhane est dissous dans de l'éthanol absolu à une concentration de 800 mM et stocké à -20 °C. Du tetranitrométhane est ajouté à la solution d'albumine sous agitation pour obtenir une concentration finale de 2 mM. Cette solution est incubée à 20 °C pendant 12 h sous légère agitation à l'obscurité. Après nitration, la solution est congelée à -80 °C et lyophilisée afin d'éliminer le tetranitrométhane résiduel et d'assurer une conservation optimale de l'albumine nitrée. La méthode de nitration a été modifiée d'après Malan, P. G., et al. (1970) Biochemistry 9(16), 3205- 3214 et Sokolovsky, et al. (1966) Biochemistry 5(11), 3582-3589. 23 2926369 Exemple 2 : Nitration in vitro de l'Insuline. Matériels : Insuline bovine (1 1882, Sigma, ?25 USP units/mg) 5 Tetranitrométhane (Aldrich) Tris (Sigma) Ethanol absolu (Carlo Erba) Méthode: L'insuline est dissoute dans une solution de Tris (50 mM, pH 8.0) à une concentration del 10 mM. Le tetranitrométhane est dissous dans de l'éthanol absolu à une concentration de 800 mM et stocké à -20 °C. Du tetranitrométhane est ajouté à la solution d'insuline sous agitation pour obtenir une concentration finale de 20 mM. 15 Cette solution est incubée à 20 °C pendant 12 h sous légère agitation à l'obscurité (adapté de Morris et al. Biochemistry, 1970, 9(20) 3930-3937 et Carpenter et al. Biochemistry, 1980, 19(25) 5926-5931. Après nitration, la solution est congelée à -80°C et lyophilisée afin d'éliminer le tetranitrométhane résiduel et d'assurer une conservation optimale de l'insuline nitrée. 20 Exemple 3 : Nitration in vitro de L'Hémoglogine Matériels : Hémoglobine bovine (H2500 Sigma) Tetranitrométhane (Aldrich) 25 Tris (Sigma) Ethanol absolu (Carlo Erba) Méthode: L'hémoglobine est dissoute dans du tampon phosphate 75 mM/carbonate 25 mM, pH 7.5 30 saturé en CO2, à une concentration de 0.1 mM. Le tetranitrométhane est dissous dans de l'éthanol absolu à une concentration de 800 mM et stocké à -20 °C. 24 2926369 Du tetranitrométhane est ajouté à la solution d'hémoglobine sous agitation pour obtenir une concentration finale de 4 mM. Cette solution est incubée à 20 °C pendant 12 h sous légère agitation à l'obscurité. Après nitration, la solution est congelée à -80°C et lyophilisée afin d'éliminer le 5 tetranitrométhane résiduel et d'assurer une conservation optimale de l'hémoglobine nitrée. La méthode de nitration a été modifiée d'après Pietraforte, D.,et al. (2003) Amino Acids 25(3-4), 341-350, Pietraforte, D., et al. (2001) Biochemistry 40(50), 15300-15309 et Minetti, M., et al. (2000) Biochemistry 39(22), 6689-6697. 10 Exemple 4 : Mise en évidence de protéines plasmatiques nitrées Les figures 1 et 2 illustrent cet exemple Matériels : 15 Plasma humain Anti-nitrotyrosine polyclonal purifié par affinité sur colonne de 3-nitrotyrosine CarboLink Gel et AminoLink Gel (Pierce) Echantillons de plasma 20 Les échantillons de sang ont été collectés sur tube EDTA dans le cadre d'une étude approuvée par le Comité d'Ethique concerné, soit dans le cadre du bilan d'individus sains soit dans le cadre de bilans diagnostiques chez des individus ayant souffert d'asphyxie. Les échantillons ont été conservés dans de la glace et centrifugés à 4°C dans l'heure. Les 25 plasmas obtenus ont été stockés à -20°C avant leur analyse. Tous les échantillons ont été analysés moins de 6 mois après leur prélèvement. Immunoprécipitation des protéines nitrées 30 L'anticorps anti-nitrotyrosine polyclonal de lapin obtenu par immunisation avec de la KLH nitrée, est purifié par affinité sur une colonne de 3-nitrotyrosine couplée à l'agarose (AminoLink) par le groupement amine. L'anticorps purifié est ensuite couplé de façon covalente à de l'agarose par l'intermédiaire de ses résidus glucidiques oxydés (carbonyles) avec les groupements hydrazides greffés sur l'agarose (CarboLink). Les liaisons hydrazones ainsi formées sont stabilisées par réduction au cyanoborohydrure de sodium (NaCNBH3). Les échantillons de plasma sont incubés pendant 14 h à 4°C sous agitation légère avec les billes d'anti-nitrotyrosine-agarose et lavées ensuite 6 fois avec du PBS/triton X-100 0,1 %. Les billes sont reprises dans un volume équivalent de tampon de Laemmli 2X, chauffées 5 min à 60°C et chargées sur un gel SDS polyacrylamide de 10% d'une Épaisseur de 1,0 mm. Des marqueurs de poids moléculaire sont chargés afin de pouvoir estimer la masse des protéines détectées. A la fin de la migration, le gel est fixé et coloré au Bleu de Coomassie colloïdal (cf. figure 1). 10 Identification des protéines présentes sur le gel Les bandes visualisées par coloration au Bleu de Coomassie colloïdal sont excisées et congelées à -80°C. 15 Elles sont ensuite digérées à la trypsine et analysées par spectrométrie de masse (MALDIQTOF). Les spectres de masse permettant l'identification des peptides des protéines identifiées sont représentés par les figures 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G et 21-1. Dans les échantillons plasmatiques, les inventeurs ont trouvé l'albumine, la protéine de liaison 20 à la vitamine D (Vitamin D Binding Protein ; VDBP), l'actine f3, la protéine bande 3 du transporteur d'anion érythrocytaire, la chaine f3 de la spectrine érythrocytaire, le précurseur de la fibronectine + la chaine (3 du fibrinogène et la protéine de la membrane érythrocytaire bande 4.1. 25 Interprétation Les résultats permettent la visualisation et l'identification de ces protéines nitrées, sous la forme de bandes colorées, dans le plasma de ces sujets. On voit que l'intensité des bandes varie selon les sujets, indiquant un taux de nitration variable des protéines d'un sujet à l'autre. Parmi les protéines visibles sur le gel, les suivantes ont pu être identifiées par spectrométrie 30 de masse : l'albumine, la protéine de liaison à la vitamine D (Vitamin D Binding Protein ; VDBP), l'actine (3, la protéine bande 3 du transporteur d'anion érythrocytaire, la chaine J3 de la spectrine érythrocytaire, le précurseur de la fibronectine + la chaine f3 du fibrinogène et la protéine de la membrane érythrocytaire bande 4.1. Exemple 5: Evaluation de la nitration de l'albumine chez des patients atteints d'insuffisance cardiaque. Introduction : Il est démontré que l'insuffisance cardiaque (IC) s'accompagne d'une augmentation du stress oxydant et que l'augmentation de ce stress est corrélée avec le stade de la maladie [1-5]. Il semble évident que l'hypoperfusion et l'hypoxie relative des tissus, résultant de l'IC, induit un stress oxydant. Cependant, l'idée selon laquelle une augmentation du stress oxydant pourrait être à l'origine de la progression de 1'IC, ou du moins y contribuer, gagne du terrain. Ce stress oxydant pourrait, comme pour d'autres maladies chroniques, être d'origine inflammatoire systémique [6-9]. La nitrosation induite par le NO+ et la nitration provoquée par le ONOO- sont donc des évènements qui surviennent avant l'oxydation. Ces modifications entraînent, comme nous l'avons montré pour les MAP kinases et PKB/Akt, des changements fonctionnels au niveau d'enzymes et de protéines structurales et de ce fait des effets métaboliques et trophiques [11, 12, 14, 15] (fig.4). Les deux autres marqueurs disponibles pour le stress nitrant, la nitrotyrosine plasmatique et le NHPA urinaire n'étant pas fiables [18, 19], l'albumine nitrée semble donc constituer un nouveau marqueur spécifique et unique de ce stress et pourrait à ce titre refléter la capacité de l'organisme à faire face au stress oxydant auquel il est confronté. Afin de vérifier cette hypothèse, un nouveau marqueur plasmatique potentiel de nitration est proposé, l'albumine nitrée dont le dosage par ELISA a été mis au point(fig. 5 et 6). La population d'intérêt dans le cadre de cette étude est celle des insuffisants cardiaques représentatifs de la population générale des deux régions participant au projet : Auvergne et Rhône-Alpes. Nous disposons pour cela d'une part de l'accès aux patients ambulatoires de la cohorte RESIC38 (environ 450 patients) et d'autre part à ceux des hôpitaux de jour (Grenoble, Lyon, Clermont-Ferrand) pour couvrir les différents stades de l'insuffisance cardiaque tels que définis par la NYHA (New York Heart Association, accessible sur http://www.resic38.org/doc/Documents/Classification-nyha.pdf). Les sujets témoins sains seront recrutés par l'intermédiaire du CIC de Grenoble. Il nous semble essentiel de faire porter cette étude sur une population représentative qui comportera de ce fait de nombreux patients âgés et atteints de co-morbidités, mais dont les résultats seront de ce fait applicables en pratique médicale courante. Jusqu'à présent, seuls deux marqueurs biologiques pronostiques ont été validés dans l'insuffisance cardiaque: le BNP ou son précurseur le proNT-BNP ainsi que la troponine T. D'autres paramètres biologiques, en particulier des marqueurs de l'inflammation ont été étudiés récemment et semblent indiquer l'existence d'un syndrome inflammatoire dans l'insuffisance cardiaque [8]. L'hypothèse de l'existence d'un syndrome inflammatoire chronique associé à un certain nombre de facteurs de risques et de pathologies chroniques systémiques a fait l'objet d'un commentaire dans Lancet en 2007 [20]. Parmi ces pathologies figure l'insuffisance cardiaque. Sur la base de cette hypothèse et de résultats obtenus avec des médicaments ayant des propriétés anti-inflammatoires, les auteurs suggèrent que la prise en charge de cette composante inflammatoire chronique pourrait contribuer à l'amélioration de pathologies telles le syndrome métabolique, la BPCO (bronchopathie chronique obstructive), et l'insuffisance cardiaque ainsi que des co-morbidités fréquentes chez les patients atteints. Pour valider cette hypothèse, il faut tout d'abord en démontrer l'existence qui repose pour l'instant essentiellement sur l'élévation de la CRP (protéine C-réactive). Compte tenu du nombre de facteurs connus ayant des effets pro ou anti-inflammatoires directs ou indirects, des variations d'expression de leurs récepteurs cellulaires et solubles, une étude détaillée de ceux-ci à grande échelle semble difficilement réalisable et en tirer des conclusions quant à la résultante globale de leurs interactions impossible. Une autre approche consisterait donc à étudier des marqueurs de points de convergence des voies activées ou inhibées par l'ensemble de ces facteurs afin d'obtenir une indication précise de l'existence ou non d'un état inflammatoire. L'augmentation de la concentration d'un certain nombre de protéines plasmatiques tels la CRP (protéine C-réactive), l'orosomucoïde et le fibrinogène reflètent l'existence d'un état inflammatoire mais cette élévation est généralement transitoire même en cas de persistance de l'inflammation. Seule la CRP peut rester détectable à l'aide de techniques de dosage ultra-sensibles. Le déclenchement d'une réponse inflammatoire par des agents non spécifiques tels les lipopolysaccharides provoque un stress oxydatif au niveau cellulaire. Ce stress oxydatif correspond à la formation de � radicaux libres � de l'oxygène et de l'azote qui induisent des modifications fonctionnelles réversibles ou non selon leur nature, des macromolécules. Ce sont ces modifications qui, surtout si elles sont irréversibles, peuvent entraîner des altérations du métabolisme, voir la mort cellulaire et de ce fait des lésions tissulaires. Comme indiqué plus haut, nombre de ces modifications ont été identifiées et leurs conséquences sont maintenant souvent connues. Il est de ce fait important de pouvoir d'une part identifier la nature des radicaux libres générés et surtout de déterminer si l'organisme a pu y faire face grâce à ses systèmes de défense naturels. Comme dit précédemment, la production de peroxynitrite se situe à la croisée des chemins puisqu'elle est la dernière étape permettant la � captation � des ions superoxyde et qu'il est le dernier radical libre donnant lieu à des modifications post-traductionnelles réversibles (nitration des tyrosines). On peut imaginer que cette étape de nitration, réversible, des protéines constitue un � tampon � entraînant certes des adaptations ou des perturbations temporaires, mais permettant aussi de protéger l'ADN chromatinien d'oxydation et de nitration qui induiraient l'apoptose. Le peroxynitrite et ses précurseurs étant extrêmement diffusibles, il semble logique de penser qu'une fois les mécanismes de captation et de dégradation de ceux-ci saturés, il y aura extravasation vers le milieu extracellulaire et de ce fait nitration de protéines de ce milieu, donc entre autres dans le plasma. Cette situation correspondrait à un stress nitrant � décompensé �. Cette hypothèse est renforcée par nos premières études cliniques réalisées dans l'asphyxie perpartale et l'hypoglycémie néonatale dont il a été montré par ailleurs par d'autres qu'elles entraînent un nitration importante des protéines cellulaires en particulier au niveau cérébral[16, 17, 21]. Il semble donc bien que cette nitration cellulaire � décompensée � s'accompagne d'une augmentation de la nitration de l'albumine plasmatique qui constitue un marqueur de la saturation des capacités d'absorption d'ions superoxyde et de peroxynitrite par la cellule. L'association d'une nitration intense au déclenchement de l'apoptose ayant été décrite par plusieurs auteurs[22, 23], il semble justifié d'étudier ce paramètre dans toute pathologie s'accompagnant d'une part d'un stress oxydatif augmenté et d'autre part d'un remodelage tissulaire lié à une augmentation de l'apoptose. Objectifs Objectif principal : Evaluer l'intérêt pronostique du dosage de l'albumine nitrée plasmatique par ELISA 30 dans l'insuffisance cardiaque à l'aide d'un critère combiné comportant la mortalité et le passage à une classe NYHA supérieure. Critère de jugement principal : Il s'agit d'un critère combiné comportant la mortalité et le passage à une classe NYHA supérieure à 2 ans. Ce paramètre est évalué en fonction des données démographiques (âge, sexe), addictions passées et actuelles (tabac, alcool), anthropométriques (taille, poids, index de masse corporelle, rapport taille/hanches, voire composition corporelle), de la classification NYHA et des paramètres cliniques classiques de l'insuffisance cardiaque (fraction d'éjection ventriculaire gauche, tension artérielle moyenne, fréquence cardiaque, fibrillation auriculaire, cardiomyopathie ischémique, données de l'épreuve d'effort cardio-respiratoires comme la VO2 et les équivalents respiratoires du CO2 et de l'02 si disponible dans les 6 mois précédant l'inclusion, de l'étiologie et du type de l'insuffisance cardiaque (systolique ou diastolique), des co-morbidités éventuelles (diabète, BPCO, maladies inflammatoires chroniques), des traitements préexistants ou instaurés (diurétiques, inhibiteurs de l'enzyme de conversion, antagonistes de l'angiotensine, B-bloquants, statines, aspirine, défibrillateurs implantables, réhabilitation à l'effort), et de leur durée ainsi que de l'évolution de l'IC chez les sujets suivis Le phénotypage et le suivi de la cohorte RESIC 38 (environ 450 patients inclus) servent de référence. Le recrutement des patients de la cohorte RESIC 38 est complété par l'hôpital de jour afin de disposer de malades des différents stades NYHA. Le recrutement des témoins se fait par 20 l'intermédiaire du CIC de Grenoble. L'évaluation est faite de façon comparative par rapport à une série de marqueurs pronostiques connus et dans une certaine mesure validés dans l'IC (troponine T, NT-pro-BNP, hématocrite, adiponectine), du stress oxydant (8-isoprostaglandine F2a, GSH/GSSG, vitamine E,et albumine carbonylée) et de l'inflammation (CRP ultrasensible, IL-6, récepteur soluble de 25 l'IL-6 et IL-10)[2, 26-36]. Objectif 2 : Evaluation de la valeur prédictive de l'albumine nitrée plasmatique sur la survenue de comorbités. 30 Critères de jugements : Corrélation entre la concentration de l'albumine nitrée plasmatique dosée lors de l'inclusion et à 1 an et la survenue de pathologies associées (syndrome métabolique, BPCO, diabète, athérosclérose,..). Objectif 3 : Evaluation de la valeur et le cas échéant de la sensibilité de l'albumine nitrée plasmatique comme marqueur d'un état inflammatoire chronique. Critères de jugements : Corrélation entre la concentration de l'albumine nitrée plasmatique et des paramètres inflammatoires reconnus : CRP ultra sensible, IL-6 et son récepteur soluble, IL-10. Objectif 4 : Evaluation de la valeur et le cas échéant de la sensibilité de l'albumine nitrée plasmatique 10 comme marqueur du stress oxydatif � intermédiaire �. Critères de jugements : Corrélation entre la concentration de l'albumine nitrée plasmatique et des paramètres du stress oxydatif correspondant à différents stades de celui-ci : - GSH/GSSG: oxydation des thiols : stade "précoce" 15 - 8-isoprostaglandine F2 et albumine carbonylée: peroxydation des lipides et oxydation des protéines : stade "avancé" - vitamine E : anti-oxydants Procédures d'investigation menées et différences par rapport à la prise en charge 20 habituelle En dehors de la prise de sang à l'inclusion et à 1 an, il n'y a pas de procédures supplémentaires par rapport à la prise en charge habituelle des patients. CARACTERISTIQUES DES SUJETS 25 Recrutement Les patients sont recrutés lors des consultations spécialisées de cardiologie. Ils sont alors sollicités pour participation à l'étude. Le recrutement des patients de la cohorte RESIC 38 est complété par l'hôpital de jour afin de disposer de malades des différents stades de la classification de la NYHA. Le 30 recrutement des témoins se fait par l'intermédiaire du CIC de Grenoble. Sont proposés pour l'étude les sujets répondant à chacun des critères suivants : - Age compris entre 18 et 90 ans - Personne affiliée à la sécurité sociale ou bénéficiaire d'un tel régime - Insuffisants cardiaques de classe NYHA II à IV Ne peuvent pas être inclus les sujets répondant à au moins un des critères suivants : - Pathologie non reliée avec l'insuffisance cardiaque (ex : maladie neuro-5 musculaire évoluée, cancer métastatique de la prostate) et engageant le pronostique vital dans les 6 mois. - Femme enceinte, parturiente, mère qui allaite Personne privée de liberté par décision judiciaire ou administrative, personne faisant l'objet d'une mesure de protection légale 10 - Personne inapte à répondre aux questions VARIABLES MESURÉES ET MÉTHODES DE MESURE • Age, sexe • Addictions passées et actuelles (tabac, alcool) • Etiologie de la cardiopathie 15 • Classe NYHA • Antécédents, co-morbidités • Traitements en cours • Tension artérielle, pouls • Périmètre de marche de 6 min 20 • Indice de masse corporelle • Tour de taille, hanches et bassin • Hospitalisations en rapport avec l'insuffisance cardiaque Paramètres para-cliniques Les examens suivants doivent dater de moins de trois mois par rapport à la date prévue pour 25 les différentes visites. • Echo-doppler cardiaque et carotidien • ECG • Spirométrie (VEMS, CV) et gaz du sang à l'air ambiant • Dexascann pour mesurer la composition corporelle 30 Paramètres biologiques • Paramètres pronostiques "reconnus": - NT-pro-BNP: immunochimie - Troponine T: immunochimie - Hématocrite: optique - Adiponectine: ELISA • Stress nitrant : - Albumine plasmatique nitrée: ELISA - Albumine plasmatique: immunochimie • Inflammation : - CRP ultrasensible: immunochimie - IL-6 et IL-6sr: ELISA - IL-10: ELISA • Stress oxydatif : - 8-isoprostaglandine F2^ urinaire: ELISA - GSH/GSSG: enzymatique - Albumine carbonylée: ELISA (mise au point en cours) - Vitamine E: HPLC • Etat nutritionnel : - Protéines plasmatiques totales: colorimétrie - Albumine plasmatique: immunochimie - Préalbumine (TTY): immunochimie • Sérothèque : excédents de sérum et plasma aliquotés et stockés à -80°C • Urinothèque : 50 ml d'urines seront aliquotés et stockés à -80°C ANALYSE STATISTIQUE DES PARAMÈTRES MESURÉS Calcul du nombre de sujets Le calcul du nombre de sujets est basé sur la comparaison non paramétrique de la mortalité entre deux groupes ; il est obtenu à partir de la formule suivante : n_ nAflùSA(t)J+nB[lùSB(t)] 2ùSA(t)ùSB(t) (Source : "Analyse statistique des données de survie" Catherine Hill, et coll. -Médecine-sciences Flammarion) La "survie sans aggravation" est définie par l'absence d'événement (décès, passage à une classe NYHA supérieure à 2 ans.) Compte tenu d'une amélioration attendue du critère de jugement principal ("survie sans aggravation ") de 25% entre les deux groupes, le nombre de sujet à inclure est de 48 par groupe, soit 192 sujets pour les 4 quartiles, avec un risque alpha de 5% et une puissance de 80%, permettant de mettre en évidence un odds-ratio de 1,7 entre quartiles. Stratégie d'analyse des données Seuil Statistique et conditions d'applications : Lors d'un test, le seuil statistique (a) retenu pour considérer une différence comme statistiquement significative sera p inférieur ou égal à 0,05. Toutefois, pour parer à la perte de puissance qu'introduisent les comparaisons multiples sur 15 des paramètres non indépendants, on met en oeuvre la méthode corrective de Bonferroni avec comme seuil statistique a' = a / k. On met en oeuvre le test de Shapiro-Wilks pour démontrer la normalité des paramètres. On met en oeuvre le test de Levene pour démontrer l'homogénéité des variances. Lorsque que les conditions d'application des tests paramétriques ne seront pas satisfaites, des 20 tests non paramétriques pourront être réalisés. Pour démontrer les liaisons entre paramètres quantitatifs, le test de corrélation de Pearson est mis en oeuvre après vérification de la normalité des paramètres. Pour démontrer les liaisons entre paramètres qualitatifs, le test du chi-deux est mis en oeuvre. Variables Quantitatives 25 Les paramètres quantitatifs pour lesquels la normalité a été admise sont décrits par la moyenne � écart-type, l'intervalle de confiance à 95% ainsi que les 5ème et 95ème percentiles. Ils sont exprimés en médiane, minimum, maximum et percentiles à 5ème et 95ème lorsque la normalité aura été rejetée. 30 Variables Qualitatives Les paramètres qualitatifs sont exprimés en effectif et pourcentage. Les variables catégorielles sont résumées par des statistiques descriptives à chaque temps de l'évaluation et dans chaque groupe : Effectif et fréquence. Populations d'analyse Une analyse statistique globale est réalisée sur l'ensemble de la population. Analyse du critère principal - Objectif 1 Evaluer l'intérêt pronostique du dosage de l'albumine nitrée plasmatique par ELISA dans l'insuffisance cardiaque à l'aide d'un critère combiné comportant la mortalité et le passage à une classe NYHA supérieure. - Paramètres Le critère de censure retenu est le critère combiné suivant : le décès, le passage à une classe NYHA supérieure à 2 ans. Le critère de jugement est évalué lors des visites de suivi des patients au sein de chaque centre. Une confirmation de la mortalité est prévue à l'issue de l'étude par l'envoi de courrier aux mairies de naissance de tous les patients. Bien qu'il s'agisse d'un paramètre quantitatif continu, la durée de survie est décrite par sa médiane et son intervalle de confiance à 95% ainsi que les quartiles, afin de tenir compte de sa distribution asymétrique. -Test: 1.1) On teste l'intérêt du paramètre (albumine nitrée plasmatique) à l'aide du modèle de Cox en univarié, après vérification des conditions d'application. 1.2) Dans un second temps, le modèle est ajusté sur les facteurs démographiques (age, Sexe, BMI) et sur les facteurs pronostics de l'insuffisance cardiaque reconnus ; c'est à dire : la classe fonctionnelle NYHA, le score de test de marche, le niveau de fraction d'éjection (+ ou-de 45 %), le taux de NT-pro BNP plasmatique. 1.3) La méthode de Kaplan-Meier est mise en oeuvre pour estimer les courbes de survie de chaque quartile pour les facteurs significatifs dans le modèle de Cox ajusté. La comparaison des courbes de survie est réalisée à l'aide du test du Log-Rank ajusté sur l'ensemble des strates (facteurs pronostiques connus). Références bibliographiques 1. Sorescu, D. and K.K. Griendling, Reactive oxygen species, mitochondria, and NAD(P)H oxidases in the development and progression of heart failure. Congest Heart Fail, 5 2002. 8(3): p. 132-40. 2. White, M., et al., Increased systemic inflammation and oxidative stress in patients with worsening congestive heart failure: improvement after short-term inotropic support. Clin Sci (Lond), 2006. 110(4): p. 483-9. 3. Mallat, Z., et al., Elevated levels of 8-iso-prostaglandin F2alpha in pericardial fluid of patients with heart failure: a potential role for in vivo oxidant stress in ventricular dilatation and progression to heart failure. Circulation, 1998. 97(16): p. 1536-9. 4. Dhalla, A.K., M.F. Hill, and P.K. Singal, Role of oxidative stress in transition of hypertrophy to heart failure. J Am Coll. 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Circulation, 2005. 112(12): p. 1756-62. 10 39 Revendications 1- Utilisation du dosage quantitatif in vitro, dans un échantillon biologique, du taux de nitration de résidus tyrosine d'une protéine ou d'une séquence peptidique physiologique déterminée nitrée, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de l'état de gravité et d'évolutivité d'une pathologie chronique ou aigüe associée au stress nitrant. 2- Utilisation du dosage quantitatif selon la revendication 1, dans laquelle le dosage quantitatif est effectué à l'aide d'au moins un anticorps spécifique reconnaissant une tyrosine nitrée physiologiquement de ladite protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée. 3- . Utilisation du dosage quantitatif selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle la protéine physiologique ou séquence peptidique déterminée nitrée est choisie parmi les protéines suivantes : l'albumine, la préalbumine, la protéine de liaison à la vitamine D (Vitamin D Binding Protein ; VDBP), la transferrine, la céruloplasmine, la protéine de liaison du rétinol (Retinol Binding Protein ; RBP), l'insuline, l'hémoglobine, l'actine (3, la protéine bande 3 du transporteur d'anion érythrocytaire, la chaine (3 de la spectrine érythrocytaire, le précurseur de la fibronectine, la chaine E3 du fibrinogène et la protéine de la membrane érythrocytaire bande 4.1. 4- Utilisation du dosage quantitatif selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle ladite pathologie chronique ou aigle associée au stress nitrant appartient au groupe suivant : les maladies inflammatoires, les maladies infectieuses, les maladies neurodégénératives, les maladies ischémiques, le diabète, les maladies métaboliques, les maladies cardiovasculaires et respiratoires ainsi que le cancer. 5- Utilisation du dosage quantitatif selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle ladite protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée est l'albumine nitrée. 20 25 30 40 2926369 6- Utilisation du dosage quantitatif in vitro selon la revendication 5, dans laquelle le dosage quantitatif est effectué à l'aide d'un anticorps spécifique reconnaissant spécifiquement le résidu tyrosine Y138 nitrée de l'albumine, en particulier un anticorps monoclonal. 7- Utilisation du dosage quantitatif in vitro selon la revendication 5, dans laquelle le dosage quantitatif est effectué à l'aide d'un anticorps spécifique reconnaissant spécifiquement le résidu tyrosine Y41' nitrée de l'albumine, en particulier un anticorps monoclonal. 10 8- Anticorps reconnaissant spécifiquement l'albumine nitrée sur le résidu tyrosine Y138, en particulier un anticorps monoclonal. 9- Anticorps reconnaissant spécifiquement l'albumine nitrée sur le résidu tyrosine 15 Y411, en particulier un anticorps monoclonal. 10-Méthode de diagnostic in vitro de l'état de gravité et d'évolutivité d'une pathologie chronique associée au stress nitrant dans un échantillon biologique d'un individu, comprenant : - le dosage quantitatif, dans un échantillon biologique d'un individu, du taux de nitration d'une première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée, - la quantification dudit taux de nitration de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée en comparant la concentration de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée avec la concentration totale de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée, nitrée et non nitrée, issus d'un échantillon biologique du même individu, - la comparaison dudit taux de nitration de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée avec le taux de nitration d'une seconde protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée issue d'un échantillon biologique d'un individu non affecté par ladite pathologie chronique ou aigüe, 5 20 25 30 41 2926369 • ladite seconde protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée étant un variant ou une isoforme, ou présentant une identité de séquence en acides aminés d'au moins 90 %, et notamment 100%, avec la susdite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée ou encore provenant du même gène, sauvage ou muté, • ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée étant nitrée sur au moins un résidu tyrosine situé à une position équivalente dans la susdite seconde protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée, - la déduction, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, du degré de stress nitrant de l'individu pouvant correspondre à un état d'de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie chronique ou aigüe. 15 11-Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 10, ladite méthode comprenant : - le dosage quantitatif, dans un échantillon biologique d'un individu, du taux de nitration d'une première protéine ou séquence peptidique protéine physiologique déterminée nitrée, - la quantification dudit taux de nitration de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée en comparant la concentration de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée avec la concentration totale de ladite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée, nitrée et non nitrée, issus d'un échantillon biologique du même individu, - la comparaison dudit taux de nitration de résidus tyrosine de la première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée avec les taux de nitration d'un ensemble de n protéines ou séquences peptidiques physiologiques déterminées, la valeur du taux de nitration de chacune des susdites n protéines ou séquences peptidiques déterminées étant connue et associée respectivement à un état déterminé de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie chronique ou aigüe, • lesdites n protéines ou séquences peptidiques physiologiques déterminée étant des variants ou des isoformes de la susdite première 5 10 42 2926369 protéine ou séquence peptidique déterminée, ou présentant une identité de séquence en acides aminés d'au moins 90%, et notamment 100%, avec la susdite première protéine ou séquence peptidique physiologique déteiuiinée, • lesdites n protéines ou séquences peptidiques physiologiques déterminées étant nitrées sur au moins un résidu tyrosine situé à une position équivalente au résidu tyrosine dans la susdite première protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée, - la déduction, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, du degré de stress nitrant de l'individu pouvant être correspondre à un état de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie chronique ou aigüe. 12-Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 10 ou 11, dans laquelle le 15 dosage quantitatif in vitro est effectué à l'aide d'au moins un anticorps, chaque anticorps reconnaissant spécifiquement un résidu tyrosine nitré d'une protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée. 13-. Méthode de diagnostic in vitro selon l'une des revendications 10 à 12, dans 20 laquelle la protéine physiologique déterminée nitrée étant choisie parmi les protéines suivantes : l'albumine, la préalbumine, la protéine de liaison à la vitamine D (Vitamin D Binding Protein ; VDBP), la transferrine, la céruloplasmine, la protéine de liaison du rétinol (Retinol Binding Protein ; RBP), l'insuline, l'hémoglobine, l'actine [3, la protéine bande 3 du transporteur d'anion érythrocytaire, la chaine (3 de la spectrine 25 érythrocytaire, le précurseur de la fibronectine, la chaine f3 du fibrinogène et la protéine de la membrane érythrocytaire bande 4.1 14-Méthode de diagnostic in vitro selon l'une des revendications 10 à 13, dans laquelle la pathologie chronique ou aigüe liée au stress nitrant appartient au groupe 30 suivant : les maladies inflammatoires, les maladies infectieuses, les maladies neurodégénératives, les maladies ischémiques, le diabète, les maladies métaboliques, les maladies cardiovasculaires et respiratoires ainsi que le cancer. 5 10 43 2926369 15-Méthode de diagnostic in vitro selon les revendications 10 à 14, ladite méthode comprenant : - la détection d'un complexe immun résultant de la mise en contact d'au moins un anticorps reconnaissant spécifiquement un résidu 5 tyrosine nitré de l'albumine physiologique avec l'albumine physiologique nitrée issue d'un échantillon biologique d'un individu, la dite détection du complexe immun permettant la détermination du taux de nitration de ladite albumine physiologique nitrée, - la comparaison dudit taux de nitration de résidu tyrosine de l'albumine physiologique, avec les taux de nitrations de résidus tyrosine d'un ensemble de n albumines physiologiques dont la valeur du taux de nitration est connue et associée respectivement à un état déterminé de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie chronique ou aigüe, la déduction, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, du degré de stress nitrant de l'individu pouvant correspondre à un état de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie chronique ou aigüe. 16-Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 15, dans laquelle ledit 20 anticorps reconnait la nitration de l'albumine humaine sur le résidu tyrosine y'. 17-Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 15, dans laquelle ledit anticorps reconnait la nitration de l'albumine humaine sur le résidu tyrosine Y411 25 18-Méthode de diagnostic in vitro selon les revendications 16 et 17, ladite méthode comprenant : la détection, à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'albumine, d'un complexe immun résultant de la mise en contact d'au moins un anticorps spécifique selon les revendications 8 et 9, avec l'albumine 30 physiologique nitrée issue d'un échantillon biologique d'un individu, la dite détection du complexe immun permettant la détermination du taux de nitration l'albumine physiologique nitrée, - la comparaison dudit taux de nitration de résidu tyrosine de l'albumine physiologique nitrée, avec les taux de nitration de résidus 10 15 44 2926369 tyrosine d'un ensemble de n albumines physiologiques dont la valeur du taux de nitration de résidus tyrosine de l'albumine physiologique nitrée est connue et associée respectivement à un état déterminé de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie chronique ou aigüe, 5 - la déduction, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, du degré de stress nitrant de l'individu pouvant être correspondre à un état de gravité et d'évolutivité de la dite pathologie chronique ou aigüe. 10 19-Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 18, dans laquelle le degré de stress nitrant de l'individu peut correspondre à un état de gravité et d'évolutivité des pathologies choisies parmi: les maladies inflammatoires, les maladies infectieuses, les maladies neurodégénératives, les maladies ischémiques, le diabète, les maladies métaboliques, les maladies cardiovasculaires et respiratoires ainsi que le 15 cancer. 20-Méthode de diagnostic in vitro selon les revendications 15 à 19, dans laquelle la dite détection du complexe immun est réalisée par les techniques d' immunohistochimie, d' immunocytochimie, d' immunoprécipitation ou de western 20 blot. 21-Utilisation d'une protéine ou d'une séquence peptidique déterminée nitrée, nitrée sur au moins un résidu tyrosine, pour la mise en oeuvre d'une méthode de dosage quantitatif in vitro du taux de nitration physiologique d'une protéine ou d'une 25 séquence peptidique physiologique nitrée, ladite protéine ou séquence peptidique déterminée nitrée présentant une identité de séquence en acides aminés d'au moins 90%, et notamment 100%, avec la susdite protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée, ladite protéine ou séquence peptidique déterminée nitrée présentant une nitration 30 sur au moins un résidu tyrosine à une position équivalente à celle du résidu tyrosine de la susdite protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée, la nitration de ladite protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée étant corrélée au stress nitrant associé à des pathologies chroniques ou aigües. 45 2926369 22-Utilisation d'une protéine ou d'une séquence peptidique déterminée nitrée selon la revendication 21, dans laquelle ladite protéine ou séquence peptidique déterminée nitrée permet de générer au moins un anticorps monoclonal capable de reconnaître spécifiquement un résidu tyrosine nitré de la dite protéine ou séquence 5 peptidique déterminée, lequel anticorps étant capable de reconnaître également spécifiquement ledit résidu tyrosine nitré à une position équivalente dans la protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée. 23-Procédé de préparation in vitro d'une protéine ou séquence peptidique 10 déterminée nitrée sur des résidus tyrosine dans lesquelles les résidus tyrosine nitrés correspondent aux résidus tyrosine nitrés physiologiquement d'une protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée dans des pathologies chroniques ou aigüe associées au stress nitrant, ladite protéine ou séquence peptidique déterminée nitrée présentant une identité 15 de séquence en acides aminés d'au moins 90%, et notamment 100%, avec la susdite protéine physiologique déterminée nitrée, même gène comprenant : - la nitration in vitro d'une protéine ou séquence peptidique déterminée par du tetranitrométhane dans un rapport molaire avec les 20 tyrosines susceptibles d'être nitrées de la protéine ou séquence peptidique déterminée n'excédant pas 20 : 1, dans un tampon aqueux de pH compris entre 7,5 et 8,5, - l'identification in vitro des tyrosines nitrées de ladite protéine déterminée nitrée, en particulier par spectrométrie de masse, et 25 éventuellement, la comparaison des tyrosines nitrées identifiées sur ladite protéine ou séquence peptidique déterminée avec les résidus tyrosine de la protéine ou séquence peptidique physiologique déterminée nitrée. 30