FR 2925327 A1 20090626 FR 0708980 A 20071221 -1- La présente invention se situe dans le domaine cosmétique, et pharmaceutique, et plus particulièrement dans le domaine de la dermatologie. L'invention concerne l'utilisation d'un hydrolysat peptidique d'épeautre (Triticum monococcum) en tant que principe actif capable d'activer la synthèse des aquaporines, par voie orale ou topique, dans une composition cosmétique ou nutraceutique destinée à améliorer l'hydratation et la fonction barrière de l'épiderme et à stimuler la régénération cutanée. De préférence, le principe actif provient de l'hydrolyse de protéines d'épeautre (Triticum monococcum) et contient principalement des peptides. Le principe actif peut être utilisé seul ou en association avec d'autres principes actifs. L'invention est également relative à l'utilisation de ce nouveau principe actif pour la réalisation d'une composition pharmaceutique, et notamment dermatologique, par voie orale ou topique, destinée à réguler etlou stimuler l'activité des aquaporines et traiter ainsi les pathologies impliquant une sècheresse pathologique de la peau ou des muqueuses, telles que la xérose ou l'eczéma, les symptômes de bouche sèche ou la sècheresse de l'oeil. L'invention porte encore sur un procédé de traitement cosmétique destiné à prévenir ou à lutter contre la sècheresse de la peau et des muqueuses et les manifestations du vieillissement cutané, selon lequel on applique une quantité efficace d'un peptide capable d'activer la synthèse des aquaporines ou une composition le contenant, sur les zones à traiter. La peau est un organe vital composé de plusieurs couches (derme, couches prolifératives et stratum corneum) qui recouvre toute la surface du corps et assure essentiellement une fonction de barrière vis-à-vis du milieu extérieur. Cette fonction barrière repose en particulier sur la qualité de l'épiderme qui dépend notamment de la l'état du stratum corneum et de l'équilibre entre la prolifération et la différenciation des kératinocytes épidermiques. - La qualité et le bon fonctionnement de la peau sont étroitement liés à la teneur en eau des différentes couches de l'épiderme. Ainsi dans un épiderme normal, les couches prolifératives contiennent environ 70 % d'eau, alors que le stratum corneum en contient seulement 10 à 15 %. L'hydratation du stratum corneum est la résultante de trois facteurs : l'approvisionnement en eau à partir du derme, la perte en eau vers le milieu extérieur et la capacité du stratum corneum à fixer les molécules d'eau. La régulation de la distribution en eau se fait par des hormones (aldostérone, hormones sexuelles), le pH ou les variations osmotiques. Les membranes cellulaires sont -2- de nature hydrophobes et donc peu perméables à l'eau, mais il existe des canaux hydriques, sortes de pores facilitant le passage de l'eau et de certains solutés. Les aquaporines sont une classe de protéines transmembranaires transporteurs d'eau et de petites molécules en solution, telles que le glycérol et l'urée, qui facilitent le transport 5 de l'eau dans les épithéliums et les endothéliums. La fonction déterminante des aquaporines dans les épithéliums impliqués dans le transport de l'eau ou des solutés, tels que le rein, a été bien étudiée (Deen et al., 1994). De même, les aquaporines ont été rapidement identifiées dans les glandes exocrines productrices de la salive ou des pleurs. Toutefois, la découverte d'aquaporines de type 3, 10 ou AQP3, dans l'épiderme humain, et plus précisément dans la membrane plasmique des kératinocytes des couches prolifératives de l'épiderme (SOUGRAT R. et al., J. Invest. Dermatol., 2002), a mis en lumière l'importance des flux hydriques régulés dans la peau. Les AQP3 sont capables de transporter l'eau et le glycérol, ce dernier jouant un rôle important dans la constitution du film hydrolipidique de surface ainsi que dans le 15 maintien de la souplesse et des qualités sensorielles du stratum corneum. L'importance des AQP3 a été démontrée chez la souris. En effet, l'inactivation du gène provoque l'apparition de multiples déficiences de la peau, telles qu'un faible taux d'hydratation, une fonction barrière inefficace, un temps de régénération tissulaire augmenté et une diminution de l'élasticité (Ma T. et al., J. Mol. Biol., 2002). On a 20 découvert depuis que l'aquaporine 3 est exprimée dans les fibroblastes dermiques où elle intervient dans la migration de ces cellules lors de la régénération des plaies (Cao C. et al., Biochem J., 2006). D'autre part, les aquaporines jouent un rôle dans la fonction barrière en régulant positivement l'établissement des liaisons et communications cellulaires de type tight junction (KAwedia J. et al., PNAS 104(9), 2007). 25 L'hydratation et la teneur en AQP3 des kératinocytes sont étroitement liées. Ainsi, l'augmentation d'AQP3 dans la peau provoque une meilleure hydratation de l'épiderme (Dumas M., J. Drugs Dermatol., Jun6, 2007). Les pertes cutanées en eau peuvent avoir plusieurs origines, héréditaires, acquises ou 30 liées à l'environnement. Dans un environnement très sec, les pertes en eau par évaporation à partir du stratum corneum sont significatives et peuvent excéder le taux de remplacement par diffusion transcellulaire. -3- Au cours du vieillissement cutané, la peau devient sèche. Ainsi, il est très souvent constaté chez les sujets âgés, et notamment de plus de 50 ans, la manifestation d'une xérose ou d'une sècheresse des muqueuses, liée à une moindre sécrétion de sébum, à des modifications hormonales ou à des ralentissements du flux hydrique à travers l'épiderme. La peau est alors le siège de démangeaisons et de tiraillements, deux symptômes caractéristiques d'une peau sèche. Parmi les pathologies acquises se traduisant par une sècheresse de la peau, on peut citer la xérose induite par la photo-chimiothérapie et l'eczéma. Parmi les pathologies acquises provoquant une sècheresse de la bouche, ou xérostomie, on peut citer le syndrome de Sjogren ou la radiothérapie du cou. Enfin, parmi les pathologies impliquant une sècheresse des muqueuses, on peut citer les sècheresses oculaires ou vaginales. Une première alternative de traitement des peaux sèches consiste à administrer par voie topique des produits destinés à restaurer la barrière cutanée, tels que des agents humectants capables de fixer l'eau, parmi lesquels on peut citer l'urée et l'acide lactique qui entrent dans la composition du NMF (Natural Moisturizer Factor ; dérivés protéolytiques de la filaggrine), des agents filmogènes destinés à retenir l'eau, ou encore des agents capables de reconstruire la barrière cutanée (squalènes, céramides acides gras). Toutefois, ces produits ont une action superficielle qui ne corrige pas les défauts biologiques d'une peau souffrant de déshydratation chronique. Dans ce contexte, les propriétés particulières des aquaporines en font des cibles biologiques possibles pour améliorer l'hydratation de la peau et diminuer les signes de sècheresse cutanée. Ainsi, le brevet FR 2 801 504 décrit l'augmentation d'AQP3 dans la peau par un extrait de plantes Ajuga turkestanica, et a permis d'améliorer l'hydratation de la peau. Un extrait de grenade a, part ailleurs, été décrit comme principe actif par voies orale et topique pour stimuler l'activité des aquaporines et réguler les mouvements d'eau et de glycérol dans les tissus (FR 2 874 502).Toutefois, à ce jour, aucune composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant un hydrolysat peptidique d'épeautre (Triticum monococcum) capable d'activer la synthèse des aquaporines, tel que divulgué dans la présente invention, n'a encore été décrite. -4- La présente invention a pour principal objectif de fournir un nouveau principe actif d'origine végétale, capable d'activer la synthèse des aquaporines et ainsi de prévenir et de lutter contre la sècheresse de la peau et des muqueuses et les manifestations du vieillissement cutané. Les inventeurs ont en effet mis en évidence une activité biologique utile dans le domaine cosmétique et thérapeutique, notamment dermatologique, d'un hydrolysat peptidique d'épeautre (Triticum monococcum) capable d'activer la synthèse des aquaporines. Il a en particulier été mis en évidence que cet hydrolysat peptidique d'épeautre, lorsqu'il est appliqué sur la peau, améliore l'hydratation et la fonction barrière de l'épiderme et des muqueuses et stimule la régénération cutanée. Ces propriétés ont été démontrées par une protection du tissu cutané et une diminution de l'apoptose à la suite d'un stress hydrique. On entend par � principe actif capable de prévenir et de lutter contre la sècheresse de la peau et des muqueuses et les manifestations du vieillissement cutané�, toute substance capable d'améliorer l'hydratation et la fonction barrière de l'épiderme et des muqueuses ou de diminuer l'apoptose dans des cellules ou des tissus soumis à un stress hydrique. On entend par � hydrolysat peptidique �, un mélange de composés majoritairement représentés par des peptides ou des oligopeptides. On entend par � application topique �, le fait d'appliquer ou d'étaler le principe actif 20 selon l'invention, ou une composition le contenant, à la surface de la peau ou d'une muqueuse. On entend par � cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable �, que le principe actif selon l'invention, ou une composition le contenant, est approprié pour entrer en contact avec la peau ou une muqueuse sans provoquer de réactions de toxicité 25 ou d'intolérance. On entend par � nutraceutique � une méthode de soin de la peau, qui implique l'administration de principes actifs par des voies autres que la voie topique, à des sujets en bonne santé qui veulent améliorer ou entretenir leur apparence physique. Par l'expression � biologiquement actif �, on entend � qui possède une activité in vivo 30 ou in vitro caractéristique de l'activité du principe actif selon l'invention �. Le terme � hydrolysat ou issu de l'hydrolyse �, désigne toute substance ou mélange de substances, ou préparation isolée, obtenue après hydrolyse de matière végétale. -5- On entend par � principe actif capable d'activer la synthèse des aquaporines �, toute substance capable d'augmenter l'activité des aquaporines, soit par l'augmentation de la synthèse protéique de l'aquaporine (par modulation directe ou indirecte de l'expression génique de l'aquaporine), soit par l'augmentation de l'activité biochimique de l'aquaporine, soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation de la protéine aquaporine ou encore la stabilisation des transcrits d'ARN messager. Préférentiellement, selon la présente invention, l'aquaporine sera l'aquaporine 3, ou AQP3, présente dans les membranes des kératinocytes. Le principe actif selon l'invention peut être obtenu par extraction de protéines d'origine végétale, suivie d'une hydrolyse contrôlée qui libère des fragments peptidiques biologiquement actifs. De très nombreuses protéines trouvées dans les plantes sont susceptibles de contenir des fragments peptidiques biologiquement actifs au sein de leur structure. L'hydrolyse ménagée permet de dégager ces fragments peptidiques. Il est possible, mais non nécessaire pour réaliser l'invention, d'extraire soit les protéines concernées d'abord et de les hydrolyser ensuite, soit d'effectuer l'hydrolyse d'abord sur un extrait brut et de purifier les fragments peptidiques ensuite. Il est également possible d'utiliser certains extraits hydrolysés sans en purifier les fragments peptidiques correspondant aux peptides biologiquement actifs selon l'invention, mais en s'assurant toutefois de la présence desdits fragments par des moyens analytiques appropriés. Pour réaliser l'extraction, on peut utiliser la plante entière ou une partie spécifique de la plante (feuille, grain, etc.). Plus particulièrement selon l'invention on utilise les graines d'une plante de la famille des graminées (poacées) et plus particulièrement de l'engrain (Triticum monococcum), appelé parfois � petit épeautre � qui est un blé diploïde, très ancien, dont les premières traces de culture datent d'environ 9000 ans avant JC (Toussaint-Samat, 1992). C'est un blé primitif, véritable ancêtre des céréales modernes polyploïdes. Aujourd'hui, l'engrain est cultivé de façon marginale dans le pourtour méditerranéen (Kimber et Feldman, 1987). Sa culture est très limitée, il est utilisé essentiellement pour ses propriétés agronomiques, notamment, afin d'aider à l'amélioration des blés modernes. Par ailleurs, des études récentes ont mis en évidence des qualités nutritionnelles remarquables des blés diploïdes : ils sont considérés comme plus nutritifs que les blés � communs �. En effet, ils possèdent -6- notamment un taux particulièrement élevé en protéines (Vallega 1992) mais aussi en caroténoïdes, en phosphore et en potassium (Abdel-Aal et al., 1995 ; Mtuz et al., 2000). En outre, un des plus grand intérêts des blés diploïdes provient du fait que les protéines de T. monococcum, notamment, semblent être non toxiques vis-à-vis des individus souffrant de maladies coeliaques (Auricchio et al. 1982) et qu'il n'est pas un facteur induisant ce type de maladie (Favret et al. 1984, 1987). Préférentiellement, le principe actif capable d'activer la synthèse des aquaporines selon l'invention est un hydrolysat peptidique et provient de l'hydrolyse des protéines 10 d'épeautre (Triticum monococcum). Toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée afin de préparer l'hydrolysat selon l'invention. Dans une première étape, les graines sont broyées à l'aide d'un broyeur à plantes. La poudre ainsi obtenue peut ultérieurement être "délipidée" à l'aide d'un solvant organique 15 classique (comme par exemple un alcool, l'hexane ou de l'acétone). On réalise ensuite l'extraction des protéines de la plante suivant le procédé classique (Osborne, 1924) modifié ; le broyat de plante est mis en suspension dans une solution alcaline contenant un produit adsorbant de type polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) insoluble (0.01 -20 %) ; en effet il a été observé que les opérations d'hydrolyses et de 20 purifications ultérieures étaient facilitées par ce moyen. En particulier, la concentration en substances de type phénoliques, interagissant avec les protéines, se trouve nettement réduite. La fraction soluble, contenant les protéines, les glucides et éventuellement des lipides, est recueillie après des étapes de centrifugation et de filtration. Cette solution brute est 25 ensuite hydrolysée dans des conditions ménagées pour générer des peptides solubles. L'hydrolyse se définit comme étant une réaction chimique impliquant le clivage d'une molécule par de l'eau, cette réaction pouvant se faire en milieu neutre, acide ou basique. Selon l'invention, l'hydrolyse est réalisée par voie chimique et/ou de façon avantageuse par des enzymes protéolytiques. On peut alors citer l'utilisation des endoprotéases 30 d'origine végétale (papaïne, bromelaïne, ficine) et de micro-organismes (Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, etc.). Cette forme brute d'hydrolysat constitue une première forme du principe actif selon l'invention. Pour les mêmes raisons que précédemment, c'est-à-dire l'élimination des substances polyphénoliques, une quantité de polyvinylpolypyrrolidone est additionnée au milieu -8- La composition utilisable selon l'invention peut en particulier consister en une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, un après-shampooing, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant, une lotion restructurante pour les cheveux, un masque, etc. La composition cosmétique selon l'invention peut être utilisée notamment dans les traitements mettant en oeuvre une application qui est suivie ou non d'un rinçage, ou encore sous forme de shampooing. La composition selon l'invention pourra avantageusement être utilisée dans les soins antipelliculaires. Elle peut également se présenter sous forme de teinture ou de mascara à appliquer au pinceau ou au peigne, en particulier sur les cils, les sourcils ou les cheveux. 10 Il est bien entendu que le principe actif selon l'invention peut être utilisé seul ou bien en association avec d'autres principes actifs, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique et/ou dermatologique. Avantageusement, les compositions utilisables selon l'invention contiennent en outre 15 divers agents actifs hydratants, destinés, notamment, à la prévention et/ou au traitement des désordres liés au vieillissement. Ainsi, la composition selon l'invention peut associer du glycérol, en tant que principe actif adjuvant, au principe actif décrit dans la présente invention. Cette association est particulièrement avantageuse et procure une efficacité d'hydratation optimale, comparée à l'utilisation du glycérol seul. 20 La composition utilisable selon l'invention pourra être appliquée par toute voie appropriée, notamment orale, parentérale ou topique externe, et la formulation des compositions sera adaptée par l'homme du métier, en particulier pour des compositions cosmétiques ou dermatologiques. Avantageusement, les compositions selon l'invention 25 sont destinées à une administration par voie topique cutanée. Ces compositions doivent donc contenir un milieu cosmétiquement et/ou dermatologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau et les phanères, et couvrent toutes les formes cosmétiques ou dermatologiques. Ces compositions pourront notamment être sous forme de crèmes, émulsions huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsions multiples, solutions, 30 suspensions, gels, laits, lotions, sticks ou encore de poudres, et adaptées à une application sur la peau, les lèvres et/ou les phanères. Ces compositions comprennent les excipients nécessaires à leur formulation, tels que solvants, épaississants, diluants, tensioactifs, antioxydants, colorants, conservateurs, parfums. -9- Selon une autre forme de l'invention, les compositions utilisables pour l'invention seront appropriées à une administration orale pour un usage pharmaceutique ou nutraceutique. Ainsi les compositions pourront notamment se présenter sous forme de comprimés, capsules, gélules, pâtes à mâcher, poudres à consommer telles quelles ou à mélanger extemporanément avec un liquide, sirop, gels, et toute autre forme connue de l'homme du métier. Elles contiendront des excipients de formulation appropriés, tels que colorants, édulcorants, aromatisants, agents de charge, liants, conservateurs. Il est bien évident que l'invention s'adresse aux mammifères en général, et plus particulièrement aux êtres humains. La quantité efficace de principe actif correspond à la quantité nécessaire pour obtenir le résultat recherché, à savoir, améliorer l'hydratation et la fonction barrière de l'épiderme, et/ou stimuler la régénération cutanée, et/ou réguler ou stimuler l'activité des aquaporines, et/ou prévenir ou lutter contre la sècheresse de la peau et des muqueuses et les manifestations du vieillissement cutané. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le principe actif selon l'invention est présent dans les compositions de l'invention à une concentration comprise entre 0,0001 % à 20 % environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,05 % et 5 % environ par rapport au poids total de la composition finale. Ces compositions pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ; d'une émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ; elles peuvent aussi se présenter sous forme de crèmes, de suspensions, ou encore de poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les phanères. Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol. Elles peuvent être utilisées comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage de la peau. Ces compositions comprennent, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des anti-oxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des actifs cosmétiques ou pharmaceutiques, des -10- huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc. Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition. Par ses activités particulières, le principe actif selon l'invention pourra être utilisé avantageusement dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique. En particulier, le principe actif selon l'invention pourra être utilisé avantageusement dans une composition cosmétique destinée à lutter de manière préventive et/ou curative contre les manifestations du vieillissement cutané et, plus spécifiquement, afin de lutter contre et/ou de prévenir le vieillissement photo-induit (photo-vieillissement). Par manifestations cutanées du vieillissement, on entend toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau et des phanères dues au vieillissement comme, par exemple, les rides et ridules, la peau flétrie, la peau molle, la peau amincie, le manque d'élasticité et/ou de tonus de la peau, la peau terne et sans éclat ou les taches de pigmentation de la peau, la décoloration des cheveux ou les taches sur les ongles, mais également toute modification interne de la peau qui ne se traduit pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, toute dégradation interne de la peau consécutive à une exposition aux rayonnements ultraviolets (UV). Le principe actif selon l'invention, ou la composition le contenant, permettra de lutter, en particulier, contre la perte d'élasticité et de fermeté de la peau. Le principe actif selon l'invention permet de protéger la peau et les muqueuses contre tous types d'agressions extérieures. On entend par l'expression � agression extérieure �, les agressions que peut produire l'environnement. A titre d'exemple, on peut citer des agressions telles que la pollution, les UV, ou encore les produits à caractère irritant tels que les tensioactifs, les conservateurs -11- ou les parfums. Par pollution, on entend aussi bien la pollution � extérieure � due par exemple aux particules de diesel, à l'ozone ou aux métaux lourds, que la pollution � intérieure � qui peut être due notamment aux émissions de solvants de peintures, de colles, ou de papier-peints (tels que toluène, styrène, xylène ou benzaldehyde), ou bien encore la fumée de cigarette. La sècheresse de l'atmosphère est également une cause importante de dessèchement cutané. Les agressions que subissent la peau et les cheveux sont dues, par exemple, à un déséquilibre du gradient électrochimique à travers la membrane cellulaire, ce qui peut aboutir à des variations importantes de la pression osmotique et cela peut avoir pour conséquence des chocs osmotiques et donc la lyse des cellules. Or les inventeurs ont démontré, d'une manière surprenante, que le principe actif selon l'invention protège les cellules contre ces chocs osmotiques. La peau peut également être agressée par des traitements tels que le rasage. Avantageusement, l'invention a pour objet l'utilisation dans une composition cosmétique, d'une quantité efficace de principe actif tel que décrit précédemment, le principe actif, ou la composition le contenant, étant destiné à prévenir ou à traiter les dommages causés à la peau par le rasage. L'invention a également pour objet l'utilisation dans une composition cosmétique, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de principe actif tel que décrit précédemment, le principe actif, ou la composition le contenant, étant destiné à stimuler la régénération cutanée. L'invention a également pour objet l'utilisation dans une composition cosmétique, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de principe actif tel que décrit précédemment, le principe actif, ou la composition le contenant, étant destiné à prévenir les dommages causés à la peau par une exposition au soleil ou à un environnement desséchant. L'invention consiste encore en l'utilisation du principe actif selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à réguler et/ou stimuler l'activité des aquaporines et prévenir ou traiter ainsi les pathologies provoquées par les dysfonctionnements des aquaporines de la peau et des muqueuses, tels que l'eczéma, la xérose, les dermatites atopiques, les sècheresses buccales, oculaires ou vaginales. -12- L'invention consiste encore en un procédé de traitement cosmétique destiné à améliorer l'aspect de la peau et prévenir ou à lutter contre la sècheresse de la peau et des muqueuses, selon lequel on applique une quantité efficace d'un peptide selon l'invention capable d'activer l'aquaporine ou une composition le contenant sur les zones à traiter. L'invention consiste encore en un procédé de traitement cosmétique destiné à prévenir et/ou à lutter contre les signes cutanés du vieillissement et/ou du photo-vieillissement, selon lequel on applique une quantité efficace d'un peptide selon l'invention capable d'activer l'aquaporine ou une composition le contenant, sur les zones à traiter. Des modes de réalisation particuliers de ce procédé de traitement cosmétique résultent également de la description précédente. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif. 15 Exemple 1 : Préparation d'un hydrolysat peptidique d'épeautre (Triticum monococcum) Les grains d'épeautre (Triticum monococcum) sont mis en solution dans 10 volumes d'eau en présence de 2% de POLYCLAR� 10 (polyvinylpyrrolidone ù PVPP - insoluble). Le mélange est ajusté à un pH compris entre 6 et 8 avec une solution aqueuse 20 de soude 1 M. Après ajustement du pH, une amylase (hasidase�) et une protéase (papaïne à 2%) sont ajoutées dans le milieu réactionnel. L'hydrolyse est obtenue après 2 heures d'agitation à 50°C. On procède ensuite à l'inactivation de l'enzyme par chauffage de la solution à 80°C pendant 2 heures. Après centrifugation, la solution aqueuse surnageante correspondant à 25 un hydrolysat brut d'épeautre est récupérée. Le procédé de purification de l'hydrolysat brut commence par des filtrations successives à l'aide de filtres-plaques Seitz-Orion de porosité décroissante (jusqu'à 0.2 �m) afin d'obtenir une solution brillante et limpide, qualifié d'hydrolysat 1. A cette étape, l'hydrolysat 1 d'épeautre est caractérisé une couleur jaune clair et par 30 un extrait sec titrant de 20-25 g/kg, un taux de protéines de 10 à 12 g/1 et un taux de sucres de 5 à 8 g/l. 10 -13- La nature protéique de l'hydrolysat 1 est mise en évidence après analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide NuPAGE� Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen). L'hydrolysat protéique d'épeautre est chauffé à 70°C pendant 10 minutes dans des conditions réductrices dénaturantes dans un tampon de préparation d'échantillon NuPAGE� LDS. Une solution de NuPAGE� Antioxydant est ajoutée dans la cuve intérieure (cathode) pour éviter que les protéines réduites ne se réoxydent durant l'électrophorèse. La migration des protéines est réalisée dans du tampon de migration NuPAGE� MES avec le standard SeeBlue Plus2 comme marqueur de poids moléculaire. La coloration des protéines est effectuée à l'aide de Bleu de Coomassie� R-250. Dans ces conditions, on observe une bande à 24 kDa, correspondant à l'enzyme, puis des protéines inférieures à 6 kDa. L'hydrolysat 1 est ensuite purifié par ultrafiltration à l'aide de la cassette Pellicon� 2 Biomax 5 kDa afin d'éliminer toutes traces d'enzymes. En fin de purification, on obtient un hydrolysat peptidique jaune-orangé, brillant et limpide. On procède à une phase de dilution afin d'obtenir un hydrolysat peptidique caractérisé par une teneur en protéines de 1,5 à 3,5 g/1. Cet hydrolysat peptidique correspond au principe actif selon l'invention. Cet hydrolysat peptidique est alors analysé en chromatographie liquide haute pression (HPLC) à l'aide d'un appareil HP1100 piloté par le logiciel ChemStation. La colonne utilisée lors de l'élution de l'hydrolysat 2 est une Nucleosil� 300-5 C4 MPN (125 x 4 mn), permettant de chromatographier des protéines ayant des poids moléculaires de 0.2 à 25 kDa (selon un gradient de solvants approprié). Dans ces conditions chromatographiques, plusieurs fractions peptidiques ont pu être isolées. Ces diverses fractions sont ensuite analysées par spectrométrie de masse afin d'identifier leurs pics moléculaires. La détermination de la composition en acides aminés du principe actif selon l'invention a également été réalisée. Celle-ci est réalisée après hydrolyse acide et identification par chromatographie liquide haute pression à l'aide d'une pré-dérivation au PICT (phenylisothiocyanate). Un exemple de composition en acides aminés de l'hydrolysat est donné dans le 30 tableau suivant (en %) : Acides aminés % Alanine 3,1 Acide Aspartique 4,7 Arginine 3,1 Acide Glutamique 32,8 -14- Glycine 3,1 Histidine Les cristaux de formazan sont solubilisés dans du DMSO, ils donnent une densité optique (D.O.) proportionnelle au nombre de cellules vivantes présentes dans l'échantillon. Des mesures de densité optique ont ensuite été réalisées pour chaque échantillon étudié (La D.O. se lisant à 540 nm). La D.O. est alors directement proportionnelle à l'activité enzymatique ainsi qu'au nombre de cellules vivantes. Résultats : Les résultats obtenus montrent une augmentation de la viabilité, dose-dépendante, des cellules soumises au choc osmotique lorsque les cellules sont traitées avec le principe actif selon l'exemple 1, en comparaison avec les cellules non traitées. L'augmentation de viabilité est de 12 % lorsque les cellules sont traitées avec le principe actif selon l'exemple 1 à 3 %, Conclusions : Le principe actif selon l'exemple 1 protège efficacement les kératinocytes humains normaux soumis à un choc osmotique. Exemple 3 : Evaluation de l'effet protecteur du principe actif selon l'exemple 1 vis-à-vis d'une déshydratation cutanée induite Le but de cette étude est de déterminer l'effet protecteur du principe actif selon l'exemple 1, vis-à-vis de cultures d'épiderme ex vivo soumises à un stress par une déshydratation cutanée induite. Protocole : Des biopsies de peau humaine sont débarrassées de leur couche cornée par arrachage à l'aide de ruban adhésif (tape stripping) puis maintenues en culture ex vivo, traitées avec une solution à 1 %, de principe actif selon l'exemple 1, pendant 24 heures. L'absence de couche cornée induit une déshydratation importante. Des coupes et des colorations histologiques hématoxyline-éosine (H&E) permettent d'évaluer la qualité des structures cutanées. Résultats : L'observation des coupes de peau montrent une nette diminution des signes de stress cellulaire et une meilleure préservation des structures cutanées dans les biopsies de peau traitées par le principe actif selon l'exemple 1, comparées aux biopsies de peau non traitées. D'autre part, l'aspect des kératinocytes de l'assise basale montre un effet régénérant du principe actif selon l'exemple 1. -15-30 -16- Conclusions : Le principe actif selon l'exemple 1 protège efficacement la peau du stress induit par la déshydratation. D'autre part, le principe actif selon l'exemple 1 permet une régénération de l'épiderme. Exemple 4 : Mise en évidence de l'effet activateur du principe actif selon l'exemple 1 sur l'expression des claudines et de la kératine K10 Le but de cette étude est de déterminer l'influence du principe actif selon l'exemple 1 sur l'expression des claudines et de la kératine K10. Les claudines sont les principales protéines transmembranaires des structures d'adhésion intercellulaires nommées tight- junction, qui jouent un rôle dans la communication cellulaire et la cohésion épidermique. La kératine K10 est une kératine spécifique des couches épidermiques différenciées (stratum granulosum) et intervient dans la fonction barrière de la peau. La quantité de protéine a été évaluée par immunofluorescence sur des coupes de peau humaine. Protocole : Des échantillons de peau humaine sont mis en culture à l'interface air/liquide. Une solution à 1 % de principe actif selon l'exemple 1 est appliquée topiquement, puis les échantillons sont incubés durant 24 heures. Ces échantillons de peau sont ensuite fixés avec du formaldéhyde puis inclus dans la paraffine. Des coupes de 2 à 3 im sont alors réalisées. L'immunomarquage est effectué 20 après différentes étapes de lavage et d'incubation de ces coupes. L'immunomarquage de la Claudin-1 est réalisé à l'aide d'un anticorps spécifique de la claudin-1 (anticorps claudin-1: rabbit polyclonal, ref: Ab15098, Abcam, dilution 1/200eme) puis d'un anticorps secondaire, couplé à un marqueur fluorescent (alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG, A21206, Molecular Probes, 1/1000ème) 25 L'immunomarquage de la Kératine 10 est réalisé à l'aide d'un anticorps spécifique de la kératine 10 (anticorps K10: moule monoclonal, ref: LHP1, Novocastra, dilution 1/50ème), puis d'un anticorps secondaire, couplé à un marqueur fluorescent (alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG, A21202, Molecular Probes, 1/1000ème) Les coupes de peau sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Nikon 30 Eclipse E600 microscope). Résultats : Les observations microscopiques montrent une fluorescence plus forte dans les peaux traitées par le principe actif selon l'exemple 1 à 1 %, en particulier les -17- couches supérieures de l'épiderme aussi bien pour la protéine claudin-1 que pour la kératine K10. Conclusions : Le principe actif selon l'exemple 1 stimule fortement l'expression des claudines, en particulier dans les couches supérieures de l'épiderme. De même, le principe actif selon l'exemple 1 stimule fortement l'expression de la kératine K10, et plus généralement les fonctions barrières de l'épiderme. Exemple 5 : Mise en évidence de l'effet stimulant du principe actif selon l'exemple 1 sur l'expression d'aquaporines Le but de cette étude est de déterminer l'influence du principe actif selon l'exemple 1 sur l'expression de l'aquaporine 3 dans des échantillons de peau ex vivo. Protocole : Des échantillons de peau humaine sont mis en culture à l'interface air/liquide. Une solution à 1 % de principe actif selon l'exemple 1 est appliquée topiquement, puis les échantillons sont incubés durant 24 heures ou 48 heures. Ces échantillons de peau sont ensuite fixés avec du formaldéhyde puis inclus dans la paraffine. Des coupes de 2 à 3 !lm sont alors réalisées. L'immunomarquage est effectué après différentes étapes de lavage et d'incubation de ces coupes. L'immunomarquage est réalisé à l'aide d'un anticorps polyclonal spécifique de l'aquaporine 3 (Anti-aquaporin 3 (C-18): goat polyclonal, sc-9885, Santa Cruz, dilution 1/100èf1e) puis d'un anticorps secondaire, couplé à un marqueur fluorescent (Alexa-fluor 488 donkey anti-goat Ig G, Molecular Probes, dilution 1/1000ème) Les coupes de peau sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Nikon Eclipse E600 microscope). Résultats : Les observations microscopiques montrent une fluorescence plus forte dans les peaux traitées par le principe actif selon l'exemple 1 à 1 %, en particulier dans les couches supérieures de l'épiderme par rapport au contrôle non traité. Conclusions : Le principe actif selon l'exemple 1 stimule l'expression de l'aquaporine 3, en particulier dans les couches supérieures de l'épiderme. -18- Exemple 6 : Préparation de compositions 1 - Crème de jour Noms commerciaux 1 Noms INCI % massique PHASE A MONTANOV 68 Cetearyl Alcohol (and) Cetearyl 5,00 Glucoside HUILE DE JOJOBA Simmondsia Chinensis (Jojoba) Seed 3,00 Oil HUILE DE VASELINE Paraffinum Liquidum (Minerai Oil) 2,00 SQUALANE Squalane 3,00 CERAPHYL 368 Ethylhexyl palmitate 4,00 CERAPHYL 41 C12-C15 Alkyl Lactate 3,00 RAPITHIX A-60 Sodium polyacrylate (and) 0,30 Hydrogenated Polydecene (and) Trideceth -6 PHASE B GLYCERINE Glycerin 5,00 ALLANTO NE Allantoin 0,10 EAU DEMINERALISEE Aqua (Water) qsp 100 PHASE C ROKONSAL MEP Phenoxyethanol (and) Methylparaben 0,50 (and) Ethylparaben (and) Propylparaben PHASE D PRINCIPE ACTIF 5 % SELON EXEMPLE 1 PHASE E PARFUM Parfum (Fragrance) qsp Mode Opératoire : Peser les ingrédients de la phase grasse et chauffer à 70°C sous agitation. Préparer la phase B et la chauffer à 70°C. Emulsionner la phase A dans la phase B. Ajouter la phase D vers 50°C sous agitation. En dessous de 40°C, additionner le principe actif (Phase D). Parfumer et refroidir jusqu'à température ambiante. - Crème hydratante W/O Noms commerciaux Noms INCI % massique PHASE A ARLACEL P 135 PEG-30 Dipolyhydroxystearate 2,00 Isononanoate CERAPHYL 375 Isostearyl Neopentanoate 3,00 PANALANE L-14E Hydrogenated Polyisobutene 3,00 CERAPHYL ODS 1 Octyldodecyl Stearate 9,00 CERAPHYL 368 I Ethylhexyl Palmitate 3,00 PHASE B EAU DEMINERALISEE Aqua (Water) qsp 100 ATLAS G-2330 Sorbeth-30 4,00 SULFATE DE Magnesium Sulfate 0,70 MAGNESIUM 7 H2O PRINCIPE ACTIF PHASE C 2 % SELON EXEMPLE 1 LIQUAPAR OPTIMA Phenoxyethanol (and) Methylparaben 0,50 (and) Isopropylparaben (and) Isobutylparaben (and) Butylparaben PHASE D PARFUM Parfum (Fragrance) qsp Mode Opératoire : Peser la phase A et chauffer à 75°C sous agitation. Préparer la phase B et la chauffer à 75°C. Emulsionner la phase B dans la phase A sous forte agitation rotor-stator. Homogénéiser quelques minutes. Refroidir brutalement à l'aide d'un bain d'eau glacée sous vive agitation. Ajouter la phase C aux environs de 50°C et additionner le parfum (phase D) à 40°C. Poursuivre le refroidissement jusqu'à température ambiante. 3 -Lotion hydratante Noms commerciaux Noms INCI % massique EAU DEMINERALISEE Aqua (Water) qsp 100 GLYCERINE Glycerin 2,00 PROPYLENE GLYCOL Propylene Glycol 2,00 GLUCAM E-10 Methyl Gluceth -10 1,00 -19- -20- Noms commerciaux Noms INCI % massique NEOSORB Sorbitol 5,00 ALLANTOINE Allantoin 0,10 ROKONSAL BSB Benzoic Acid (and) Sorbic Acid (and) 0,30 Benzyl Alcohol PRINCIPE ACTIF 0,5 % SELON EXEMPLE 1 PARFUM hydrosoluble Parfum (Fragrance) qsp Mode Opératoire : Incorporer les ingrédients un à un à la quantité d'eau nécessaire et agiter jusqu'à parfaite dissolution. Réajuster le pH aux environs de 5,5 si nécessaire. Incorporer l'actif 5 en fin de formulation. Parfumer avec un parfum hydrosoluble sous faible agitation. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une quantité efficace d'hydrolysat peptidique d'épeautre (Triticum monococcum), en tant que principe actif capable d'activer la synthèse des aquaporines, seul ou en association avec d'autres principes actifs, dans une composition cosmétique ou nutraceutique destinée à améliorer l'hydratation et la fonction barrière de l'épiderme. 2. Utilisation d'une quantité efficace d'hydrolysat peptidique d'épeautre (Triticum monococcum), en tant que principe actif capable d'activer la synthèse des aquaporines, seul ou en association avec d'autres principes actifs, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou traiter les sècheresses pathologiques de la peau ou des muqueuses. 3. Utilisation selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le principe actif, contient entre 0,1 et 8 g/1, et préférentiellement entre 1,5 et 3,5 g/1 de composés de nature peptidique. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le principe actif est utilisé en une quantité représentant de 0,0001 % à 20 % du poids total de la composition, et préférentiellement en une quantité représentant de 0,05 % à 5 % du poids total de la composition. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le principe actif est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs solvants cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants. 6. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les aquaporines sont des aquaporines de type 3.-22- 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition se présente sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu cosmétiquement et/ou dermatologiquement acceptable. 8. Utilisation selon les revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la composition se présente sous une forme adaptée à l'administration orale. 9. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une 10 quelconque des revendications 1 à 5, dans une composition cosmétique destinée à améliorer l'hydratation et la fonction barrière de l'épiderme. 10. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans une composition cosmétique destinée à 15 prévenir ou à traiter la sècheresse cutanée. 11. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans une composition cosmétique destinée à protéger la peau et les muqueuses des agressions extérieures. 12. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, destinée à stimuler la régénération cutanée. 13. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans une composition cosmétique destinée à prévenir ou à traiter les signes cutanés du vieillissement et/ou du photo-vieillissement. 30 14. Procédé de traitement cosmétique destiné à améliorer l'aspect de la peau et à prévenir et/ou lutter contre la sècheresse de la peau et des muqueuses, caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau ou les muqueuses à traiter une composition telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 20 25-23- 15. Procédé de traitement cosmétique destiné à prévenir et/ou à lutter contre les signes cutanés du vieillissement et/ou du photo-vieillissement, caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau à traiter une composition telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.