FR 2924224 A1 20090529 FR 0708317 A 20071128 TITRE MARQUEURS SANGUINS DU REJET DE L'INTESTIN TRANSPLANTÉ DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé de détection du rejet d'une greffe d'intestin. La présente invention trouve notamment une application dans le domaine médical, plus particulièrement dans le domaine des transplantations et la détection du rejet des greffes. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([]) renvoient à la liste des références présentées après les exemples. État de la technique L'insuffisance intestinale chronique irréversible a deux causes principales : un grêle court anatomique consécutif par exemple à des résections de l'intestin grêle, ou un grêle court fonctionnel dû à une maladie de la cellule intestinale ou à des troubles de la motricité intestinale (dysfonction motrice provoquant des obstructions partielles chroniques et une malabsorption). Le résultat principal de l'insuffisance intestinale chronique est une dépendance à la nutrition parentérale. Cette nutrition parentérale présente plusieurs inconvénients tout d'abord les contraintes matérielles de prise en charge des patients ainsi que des complications pouvant mettre en jeu le pronostic vital des patients. Une alternative à la nutrition parentérale et également à la mise en jeu du pronostic vital des patients est la réalisation de greffe d'intestin. La transplantation de l'intestin connaît depuis 2001 une augmentation constante. Plus de 140 greffes par an sont réalisées aux Etats-Unis. En France, le potentiel est de 40 à 50 nouveaux cas par an. Ainsi, selon le registre international de transplantation intestinale, 1292 transplantations ont été effectuées dans le monde chez 1210 patients. Sur ces 1210 patients transplantés, en mars 2005 seulement 658 étaient toujours en vie et ce malgré l'augmentation du taux de survie des transplantés. Une des causes principales de décès des patients transplantés après le sepsis, est le rejet du greffon représentant 9% des décès. De plus, le sepsis, qui est responsable de 50% des décès, complique le plus souvent le traitement du rejet diagnostiqué tardivement. L'identification de marqueurs de rejet du greffon pour les greffes d'intestin tel qu'il en existe pour les transplantations rénales ou les transplantations du foie permettrait donc de prévenir les décès dus au rejet de la greffe donc de réduire significativement le nombre de décès dus au rejet de la greffe. Des études dans l'état de la technique ont proposé la citrulline plasmatique comme un marqueur potentiel du rejet de la greffe d'intestin. En effet, la citrulline dans P. Crenn et al. � Postabsorptive plasma citrulline concentration is a marker of absoptive enterocte mass and intestinal failure in humans. Gastroenterology � 2000 ;119 :1496-505 [1] est décrite comme un marqueur de l'insuffisance intestinale et dans LC. Lutgens et al. � Monitoring myeloablative therapy-induced small bowel toxicity by serum citrulline concentration : a comparaison with sugar permeability tests � Cancer 2005 ; 103 :191-9 [2] comme un marqueur de la mort cellulaire dans l'intestin. Dans l'article de PA. Pappas et al. � Serum citrulline and rejection in small bowel transplantation : a preliminary report � Transplantation 2001 ; 72 :1212-16 [3], les auteurs ont lié la citrulline avec le rejet des greffes intestinales et dans PA. Pappas et al � An analysis of the association between serum citrulline and acute rejection among 26 recipients of intestinal transplant � Am J Transplantation 2004 ;4 :1124-32 [4] les auteurs décrivent la citrulline comme un marqueur potentiel de rejet de greffe d'intestin. Cependant les essais cliniques utilisant ce marqueur n'ont pas permis de démontrer que ce marqueur était fiable. En effet de nombreux facteurs confondant et méthodologiques tels que l'âge, le recul postopératoire, la fonction rénale et le stress chirurgical ont altéré les résultats et ont empêché de confirmer que la citrulline plasmatique est bien un marqueur du rejet de la transplantation d'intestin. Le seul moyen actuel de confirmation du diagnostique de rejet est la réalisation de biopsies itératives à l'aveugle avec un examen histologique en espérant un diagnostique précoce du rejet. Le diagnostic précoce du rejet d'une greffe d'intestin permet d'améliorer la prise en charge des patients et le devenir des patients. Il existe donc un réel besoin de disposer de marqueurs fiables et d'un procédé de détection non invasif desdits marqueurs, permettant d'obtenir un diagnostic rapide du rejet de greffe d'intestin afin de détecter le plus précocement et avec le plus de sécurité possible le rejet d'une greffe d'intestin, permettant ainsi de diminuer le nombre de rejets et de décès lié un rejet de greffe d'intestin. Description de l'invention La présente invention a précisément pour but de répondre aux besoins et inconvénients précités en fournissant un procédé de détection du rejet d'une greffe d'intestin. Le procédé de l'invention comprend la détection in vitro du rejet d'une greffe d'intestin comprenant les étapes de : a) mesure de la concentration dans un échantillon liquide d'au moins deux marqueurs choisis dans le groupe comprenant : l'aspartate, la citrulline, la taurine et la phénylalanine, b) calcul de la différence pour chaque marqueur desdites concentrations mesurées à l'étape a) avec une concentration de référence dudit marqueur, c) comparaison pour chaque marqueur de la valeur absolue de ladite différence avec une variation seuil discriminante, d) affectation d'un score pour chaque marqueur en fonction de ladite comparaison et sommation desdits scores. Selon l'invention, la détection du rejet d'une greffe d'intestin est observée dans 100% des cas quand la sommation des scores réalisée à l'étape d) est 30 supérieure ou égale à 2. La présente invention se rapporte également à un kit pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. La présente invention se rapporte également à l'utilisation du procédé de l'invention pour le diagnostic de rejet de greffe intestinale. Selon la présente invention par � échantillon liquide � ou � échantillon � on entend tout échantillon liquide susceptible de permettre la réalisation de la mesure de la concentration d'au moins deux marqueurs. II peut s'agir par exemple de tout liquide biologique, par exemple un échantillon de sang, un échantillon plasmatique, un échantillon de liquide céphalorachidien, un échantillon d'urine, de salive, de sueur, liquide synovial, etc. Selon la présente invention, l'échantillon liquide peut provenir par exemple d'un prélèvement effectué sur un mammifère ou un rongeur. Le mammifère peut être par exemple un être humain, un cochon et/ou un singe. Selon la présente invention, l'échantillon liquide peut provenir d'un individu greffé ou non greffé, sains ou malade par exemple présentant une insuffisance intestinale, cardiaque, rénale, hépatique, pulmonaire, pancréatique, etc. et/ou d'un individu ayant subi une greffe d'intestin. Selon la présente invention, l'échantillon liquide peut être également un échantillon préalablement dilué, concentré et/ou purifié. Il peut s'agir également d'un échantillon solide ou semi solide traité préalablement pour être solubilisé, par exemple par dispersion dans un liquide physiologique. Selon la présente invention, la mesure de la concentration des marqueurs peut être effectuée par tout moyen connu de l'homme du métier. Par exemple, la mesure de la concentration d'au moins un des marqueurs peut être effectuée par un moyen choisi dans le groupe comprenant la Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC), l'immunodosage, la chromatographie gazeuse en phase inverse avec une précolonne de dérivation avec différents réactifs par exemple du 9-fluorenyméthylchloroformate, du phénylisothiocyanate, du chlorure de diméthylaminaphthalènesulfonyle, du chlorure de diméthylaminoazobenzenesulfonyle et/ou du 4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3- diazole, une chromatographie échangeuse d'ions avec une post colonne de dérivation utilisant de OPA et/ou de ninhydrine, une chromatographie échangeuse d'ions automatisée utilisant le dispositif Hitachi L-8500A tel que décrit dans Le Boucher J, et al. Amino acid determination in biological fluids by automated ion-exchange chromatography : performance of Hitachi L-8500A. Clinical Chemistry 1997;43:1421-28 [5]. La présente invention décrit également un procédé tel que défini 5 précédemment dans lequel à l'étape a) on mesure la concentration de 2, ou de 3, ou de 4 marqueurs. Selon la présente invention, la concentration de référence de l'étape b) est une concentration pour chaque marqueur déterminée par mesure dans un 10 échantillon provenant d'un individu ou issue d'une normalisation de mesures à partir de différents d'échantillons provenant de différents individus. Selon la présente invention, le ou les individu(s) précité(s) peut (peuvent) être par exemple un ou des individu(s) n'ayant pas subi(s) de transplantation d'intestin, ce ou ces individu(s) peut (peuvent) être un ou des individu(s) sain(s) 15 ou en attente d'une greffe d'intestin. II peut s'agir par exemple d'un ou plusieurs individu(s) ayant un âge, un poids, une taille et/ou des caractéristiques physiologiques proches voir identiques à celles de l'individu duquel provient l'échantillon sur lequel on mesure à l'étape a) la concentration des marqueurs. Selon la présente invention, la mesure de la concentration de référence 20 peut être effectuée par tout moyen de mesure adapté à la réalisation du procédé de l'invention. Par exemple la mesure de la concentration de référence peut être réalisée par les méthodes de mesure précitées. Dans un mode particulier de réalisation de la présente invention présenté ci-après la concentration de référence est mesurée sur un échantillon prélevé 25 sur un patient avant greffe. Dans ce mode de réalisation, la concentration de référence pour chaque marqueur est la concentration dudit marqueur avant greffe. Selon la présente invention, le calcul effectué à l'étape b) correspond au 30 calcul de la différence pour chaque marqueur de la valeur mesurée dans l'échantillon liquide de l'étape a) avec la valeur de référence telle que définie précédemment. Selon la présente invention, le calcul effectué à l'étape b) du procédé de l'invention peut être effectué par tout moyen connu de l'homme du métier. Par exemple au moyen d'une calculatrice, par calcul mental, par un moyen automatisé etc. Selon 'la présente invention, on retient pour l'étape c) du procédé de l'invention la valeur absolue du résultat du calcul effectué à l'étape b). Selon la présente invention, la comparaison effectuée à l'étape c) du procédé de l'invention permet de déterminer si la valeur absolue de la différence calculée à l'étape b) pour chaque marqueur est supérieure ou inférieure à une variation seuil discriminante pour chaque marqueur. Selon la présente invention par � une variation seuil discriminante� on entend une valeur établie pour chaque marqueur correspondant à la variation minimale de la concentration de chaque marqueur en présence de rejet de greffe. Cette variation seuil discriminante peut également être appelée � valeur discriminante �. Selon la présente invention, la variation seuil discriminante peut être déterminée par tout moyen connue de l'homme du métier. Par exemple la détermination des variations seuils discriminantes de chaque marqueur a été effectuée par l'établissement de courbes de caractéristiques d'efficacité (� receiver operating characteristic � ou � ROC �) construites à partir des différents seuils étudiés puis par la recherche du seuil offrant le meilleur compromis de la sensibilité (Se) et de la spécificité (Sp) : maximisation de l'indice de Youden (Se + Sp -1). Pour chaque acide aminé, on peut calculer la valeur absolue de la différence entre la concentration de référence et la concentration dans un échantillon liquide: valeur de référence ù valeur dans échantillon. Pour chaque seuil de variation étudié, on peut calculer la sensibilité, spécificité, la valeur prédictive positive et négative. Selon la présente invention, par� sensibilité � on entend la probabilité que la valeur absolue de la différence soit supérieure à la variation seuil discriminante si l'animal appartient au groupe rejet, Selon la présente invention, par � spécificité � on entend la probabilité que la valeur absolue de la différence soit inférieure ou égale à la variation seuil discriminante si l'animal appartient au groupe absence de rejet , Selon la présente invention par � valeur prédictive positive � on entend la probabilité que l'animal appartienne au groupe rejet si la valeur absolue de la différence est supérieure à la variation seuil discriminante, Dans la présente invention par � valeur prédictive négative � on entend la probabilité que l'animal appartienne au groupe absence de rejet si la valeur absolue de la différence est inférieure ou égale à la variation seuil discriminante. Les taux plasmatiques des quatre acides aminés peuvent être significativement corrélés via les calculs de la sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive et la valeur prédictive négative à la survenue du rejet La sensibilité de chaque marqueur peut être déterminée par la probabilité que la valeur absolue de la différence soit supérieure au seuil si l'animal appartient au groupe rejet. La spécificité de chaque marqueur peut être déterminée par la probabilité que la valeur absolue de la différence soit inférieure ou égale à la variation seuil discriminante si l'animal appartient au groupe absence de rejet. La valeur prédictive positive de chaque marqueur peut être déterminée par la probabilité que l'animal appartienne au groupe rejet si la valeur absolue de la différence est supérieure à la variation seuil discriminante. La valeur prédictive négative de chaque marqueur peut être déterminée par la probabilité que l'animal appartienne au groupe absence de rejet si la valeur absolue de la différence est inférieure ou égale à la variation seuil discriminante. Selon la présente invention, on peut construire un modèle de régression logistique comportant pour variable dépendante la variable rejet et pour variable indépendante le score tel que décrit dans SAS/STAT Software: "Changes and enhancements through release 6.11". In. 6.11 ed. Cary, NC, USA; 1996.[6]. Soit Y la réponse d'un animal, notée 0 en l'absence de rejet et 1 en présence de rejet, soit x le vecteur des variables indépendantes, soit Tr la probabilité de la réponse à modéliser, le modèle logistique peut s'écrire selon la formule suivante : dans laquelle a est l'intercepte et 1i' est le vecteur des paramètres. Soit N le nombre total d'observations, soit t le nombre total de paires de réponses, soit ne le nombre de paires concordantes, nd le nombre de paires discordantes et t û û nd le nombre de paires ex-aequo. L'aire sous la courbe (AUC) peut être calculée de la façon suivante : C = (nc + 0,5 (t nc û nd)) / t Le calcul des probabilités précédentes peut être réalisé par calcul des aires sous la courbe (AUC). Selon la présente invention, la variation seuil discriminante de l'aspartate peut être comprise dans la gamme allant de 18 à 24 pmol/L, de préférence la variation seuil discriminante d'aspartate est de 21 pmol/L. Selon la présente invention, la variation seuil discriminante de taurine peut être comprise dans la gamme allant de 17 à 23 pmol/L, de préférence la variation seuil discriminante de taurine est de 20 pmol/L. Selon la présente invention, la variation seuil discriminante de citrulline est comprise dans la gamme allant de 22 à 30 pmol/L, de préférence la variation 20 seuil discriminante de citrulline est de 26 pmol/L. Selon la présente invention, la variation seuil discriminante de phénylalanine est comprise dans la gamme allant de 34 à 46 pmol/L, de préférence la variation seuil discriminante de phénylalanine est de 40 pmol/L. Selon la présente invention, l'affectation d'un score pour chaque marqueur 25 effectuée à l'étape d) du procédé de l'invention correspond à l'attribution pour chaque marqueur de la valeur 0 ou 1. L'attribution est fonction de la comparaison effectuée à l'étape c) du procédé de l'invention pour chaque marqueur. Si la comparaison révèle que la valeur absolue du résultat du calcul effectué à l'étape b) est supérieure ou égale à la variation seuil discriminante, 30 un score de 1 est affecté. Si la valeur absolue du résultat du calcul effectué à l'étape b) est inférieure à la variation seuil discriminante, un score de 0 est affecté. Enfin après affectation d'un score pour chaque marqueur une sommation desdits scores est effectué. Selon la présente invention, lorsqu'un résultat de la sommation effectuée à l'étape d) conduit à un score supérieur ou égale à 2 ceci correspond à un rejet de greffe. Selon un mode de réalisation particulier de réalisation de l'invention, la 10 présente invention comprend également un procédé tel que défini précédemment dans lequel la mesure de l'étape a) est effectuée après greffe, et dans lequel la concentration de référence de l'étape b) correspond à une mesure de la concentration dudit marqueur avant greffe. 15 Les expérimentations menées par les inventeurs de la présente ont démontré que le procédé de l'invention permet de déterminer avec certitude le rejet d'une greffe d'intestin. Ce procédé présente de très nombreux avantages au regard des procédés de l'état de la technique. 20 Tout d'abord ce procédé est non invasif permettant un diagnostic précoce du rejet du greffon sans biopsies itératives à l'aveugle, c'est-à-dire aléatoires, réalisée sans véritables signes d'appels du rejet, comme cela est pratiqué dans l'état de la technique. La détection précoce du rejet permet d'augmenter le taux de survie des patients de 11 à 80% par une meilleure prise en charge médicale. 25 Le caractère non invasif du procédé de l'invention permet également une meilleure acceptation par le patient du procédé de l'invention par rapport à des biopsies intestinales itératives. Le caractère non invasif permet également d'éliminer les risques liés aux biopsies intestinales itératives avec ou sans endoscopies intestinales, tels que les hémorragies, les perforations digestives, 30 etc. Le procédé de l'invention permet en outre d'avoir un diagnostic du rejet de greffe fiable à 100% au contraire de l'état de la technique. En effet dans l'état de la technique, la détection se fait par biopsie à l'aveugle, le prélèvement peut5 donc correspondre à une partie d'organe ne présentant pas encore les signes histologiques de rejet et donc conduire à un mauvais diagnostic. Le procédé de l'invention permet donc une détection rapide, fiable, non invasive du rejet de greffe d'intestin et indirectement une augmentation du taux de survie des personnes greffées. II permet de traiter précocement le rejet de greffe avant qu'il devienne irréversible et entraîne une perte du greffon, voir la mort du patient. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la 10 lecture des exemples ci-dessous fournis à titre illustratif et non limitatifs. EXEMPLES 15 Exemple 1 Mesure de la concentration dans un échantillon liquide des marqueurs. AI population étudiée. Dans cet exemple, 24 cochons femelles Large WithexLandrace pesant 20 entre 25 et 30kg, anesthésiés, intubés et ventilés ont été utilisés. Deux groupes ont été étudiés : - groupe 1, 8 cochons ont reçu une autogreffe d'intestin, et - groupe 2, 8 cochons ont reçu une greffe allogénique mais sans aucun traitement immunosuppresseur. 25 Les individus des deux groupes ont reçu un greffon intestinal segmentaire de 5 � 0,,2 m après exérèse de 70% du grêle proximal. Tous les individus ont été sacrifiés au 8ème jour post-opératoire. La survie des individus à J8 a été de 100% dans les deux groupes. Tous les individus ont été nourris dès le premier jour post-opératoire, à 30 volonté, avec l'aliment complet pour porcelets de la société SAS BERMOND ALIMENT BETAIL composé des ingrédients suivants : blé, orge, tourteaux de soja, petites graines et enveloppes de céréales, oléagineux, pulpes de betteraves, maïs, phosphate bicalcique, pois, prémélange d'additifs, huile végétale, carbonate de calcium, maxid, thréonine, lysine, sel, méthionine. Les teneurs des différents éléments étant : protéine brute 17,9 %, matières grasses brutes 1,3 %, cellulose brute 4,4 %, cendres brutes 5,5%, lysine 11,0 g/Kg, vitamine A 9 000 UI/Kg, vitamine D3 2 000 UI/Kg, vitamine E 20 UI/Kg, cuivre (sous forme sulfate) 100 mg/Kg et avilamycine 30 mg/Kg. Les paramètres étudiés à l'incision (TO) et au moment du sacrifice au 8ème jour post opératoire (T1) ont été les taux plasmatiques des acides aminés et l'histologie de l'intestin transplanté. BI Préparation de l'échantillon Des échantillons de sang ont été prélevés chez tous les individus avant transplantation. Les prélèvements ont été effectués en utilisant une seringue connectée à un cathéter placé dans la veine jugulaire externe droite. Le volume de chaque échantillon était de 4 ml. La séparation de la fraction plasmatique et des globules rouges a été effectuée par centrifugation. Ces échantillons correspondaient aux échantillons de référence. Après greffe, des échantillons de sang ont été prélevés au 8ème jour postopératoire. Les prélèvements ont été effectués en utilisant une seringue connectée au cathéter veineux central placé dans la veine jugulaire externe lors de la greffe. Le volume de chaque échantillon était de 4 ml. La séparation de la fraction plasmatique et des globules rouges a été effectuée tel que décrit précédemment. Ces échantillons correspondaient aux échantillons tests. Ils ont été congelés à -80°C en attendant le dosage des acides aminés. C/ Mesure de la concentration des marqueurs Après prélèvement des échantillons avant et après greffe tel qu'effectué précédemment, la concentration de la citrulline, de la taurine, de l'aspartate et de la phénylalanine a été mesurée dans chacun des échantillons. Le dosage de la citruline, phénylalanine, l'acide aspartique et la taurine dans les liquides biologiques a été réalisé par Chromatographie Haute Pression (HPLC) couplée à la spectrométrie de masse (LC-MSIMS) tel que décrit dans l'article de PIRAUD Monique et al. � Ion pairing, reversed phase liquid chromatography/ electrospray ionization mass spectrometric analysis of 76 underivatized amino acids of biological interest: a new tool for diagnosis of inherited disorders of amino acids metabolism �. Rapid Com Mass Spectrometry, 2005; 191p: 1587-1602. [7] Les réactifs utilisés pour le dosage étaient le méthanol HPLC grade et l'acétonitrile provenant de la société CARLO-ERBA (Val de Breuil û France), La L-citruline et l'acide tridécafluoraheptanoique (TDFHA) provenant de la société SIGMAûALDRICH ,(L'ISLE D'ABEAU CHESNES -St QUENTIN FALLAVIER- France). Les standards internes de référence utilisés étaient la DL- Alanine (2,3,3-D4), l'isotope stable deutéré de l'alanine, la phenylalanine (noyau D5) et l'acide L-aspartique (2,3,3-D3), provenant de la société CAMBRIDGE ISOTOPE LABORATORY (Andover, MA, USA). L'eau stérile (VersolûLaboratoires AGUETTANT û LYON ûFrance) a été utilisée pour la préparation des réactifs en solution aqueuse. Dans un premier temps, les prélèvements ont été déprotéinés par Chromatographie Liquide à Haute Pression en milieu éthanolique pour doser les acides aminés libres. Grâce à un système automatisé de prélèvement et d'injection (AGILENT û PARIS-France) la chromatographie des acides aminés applique le principe de chromatographie par appariement d'ions. La colonne possédait une phase stationnaire de type QS UPTISPHERE 120 A, 3 pm BP2, 50 x 2 mm (UP3 BP2#5QS Interchrom, Interchim, Montluçon, France). Les gradients qui ont été appliqués (eau - TDFHA et Acétonitrile) étaient identiques à ceux divulgués dans l'article de Monique Piraud et al. [7] Après la séparation des aminoacides par chromatographie HPLC telle que décrite précédemment, les analyses par spectrométrie de masse en tandem ont été réalisées au moyen d'un spectromètre de masse API 3000 triple quadrupole (Sciex Applied Biosystems, Toronto, Canada), le logiciel d'acquisition des résultats correspondant à la version 1.4.1. Les transitions spécifiques (des acides aminés non-isotopiques) et celles des standards de référence ont été utilisées en mode positif et leurs paramètres optimaux d'obtention ont été appliqués à chaque molécule. L'analyse simultanée de ces transitions a permis la mise en place d'une méthode d'analyse qualitative et quantitative des aminoacides. Les limites des valeurs de quantification pour chaque molécule étaient compatibles avec leur dosage dans le plasma, l'urine et le liquide céphalorachidien (LCR) grâce à la calibration préalable des données par une droite d'étalonnage pour chaque série d'analyses. Celles-ci ont fait l'objet d'un contrôle de qualité interne et externe (national et international) pour vérifier la conformité des résultats obtenus et le bon fonctionnement de l'équipement. Les coefficients de variation (CV) des résultats obtenus étaient inférieurs ou égaux à 5 % en répétitivité et reproductibilité. Cette méthode a été choisie car elle permet de doser 76 aminoacides simultanément avec une plus grande précision, plus rapidement (16 minutes de chromatographie et de détection par spectrométrie de masse) et plus économiquement que la méthode de séparation sur colonne échange d'ion. En effet, la séparation sur colonne échange d'ion est suivie d'une dérivation post-colonne avec la ninhydrine, cette technique nécessitant un temps de 120 minutes de chromatographie par prélèvement. Exemple 2 : Détermination de la concentration de référence pour chaque marqueur. La détermination de la concentration de référence a été effectuée de deux manières lors des expériences. Une première méthode de détermination de la concentration de référence pour chaque individu et pour chaque marqueur a été faite telle que présentée à l'exemple 1. Elle correspond au prélèvement avant greffe (TO) d'un échantillon liquide pour chaque individu puis mesure pour chaque marqueur de la valeur de la concentration dans chaque échantillon avant greffe. Une seconde méthode a été utilisée durant nos expériences afin de déterminer la concentration de référence pour chaque marqueur. Celle-ci correspond au prélèvement d'un échantillon liquide tel que décrit à l'exemple 1 chez plusieurs individus sains. Après prélèvements, une mesure de la concentration telle que décrit à l'exemple 1 de chaque marqueur dans chaque échantillon a été effectuée. Les différentes mesures de concentration de chaque marqueur ont été ensuite normalisées. Les valeurs de référence selon la première méthode utilisée pour les individus testés à l'exemple 1 sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous. Acide aminé Citrulline Taurine Phénylalanine Aspartate pmohIL) Individus 1 59 140 61 21 2 68 179 43 20 3 60 279 78 25 4 87 192 69 14 ô 5 40 278 73 19 o 6 80 153 79 17 7 108 187 64 23 8 67 194 81 19 9 107 102 80 11 10 91 106 56 16 11 111 88 60 11 N Q 12 58 79 70 12 ô 13 91 59 54 16 14 62 66 64 13 15 38 41 56 21 16 61 117 67 24 Tableau 1 : concentrations de référence de chaque marqueur pour chaque individu de l'exemple 1 Exemple 3 : détermination des variations seuils discriminants La détermination des variations seuils discriminantes de chaque marqueur a été effectuée par l'établissement de courbes (ROC) construites à partir des différents seuils étudiés puis par la recherche du seuil offrant le meilleur compromis de la sensibilité (Se) et de la spécificité (Sp) : maximisation de l'indice de Youden (Se + Sp -1). 1) Pour chaque acide aminé, on a calculé la valeur absolue de la différence entre TO et T1 : valeur à T1 û valeur à TO 2) Pour chaque seûil de variation étudié, on a calculé la sensibilité, spécificité, la valeur prédictive positive et négative : La sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive, la valeur prédictive négative sont telles que définies précédemment. Les taux plasmatiques de quatre acides ont été significativement corrélés via les calculs de la sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive et la valeur prédictive négative à la survenue du rejet La sensibilité de chaque marqueur a été déterminée par la probabilité que la valeur de la variation entre T1 et TO soit supérieure au seuil si l'animal appartient au groupe rejet� La spécificité de chaque marqueur a été déterminée par la probabilité que la valeur de la variation entre T1 et TO soit inférieure ou égale au seuil si l'animal appartient au groue absence de rejet. La valeur prédictive positive de chaque marqueur a été déterminée par la probabilité que l'animal appartienne au groupe rejet si la valeur de la variation entre Ti et TO est supérieure au seuil. La valeur prédictive négative de chaque marqueur a été déterminée par la probabilité que l'animal appartienne au groupe absence de rejet si la valeur de la variation entre Ti et TO est inférieure ou égale au seuil. 3) établissement du score Le score a été établi à partir de la variation de plusieurs acides aminés en comptabilisant 1 point si la valeur est supérieure au seuil et 0 point si la valeur est inférieure ou égale au seuil. Dans le cas d'un score construit à partir de 4 acides aminés (taurine, phénylalanine, aspartate, çitrulline), avec les seuils suivants : taurine : seuil = 20 ; phénylalanine : seuil = 40 ; aspartate : seuil = 21 ; citrulline : seuil = -26 : -animal n°i avec les valeurs taurine = 15; phénylalanine = 45; aspartate = 25; citrulline = -5: score = 3, -animal n°j avec les valeurs taurine = 15; phénylalanine = 32; aspartate = 25; citrulline = -35 : score = 1, 4) Calcul des aires sous la courbe (AUC) On a construit un modèle de régression logistique à l'aide du logiciel SAS provenant de l'entreprise SAS Institute Inc et décrit dans SAS/STAT Software: "Changes and enhancements through release 6.11". In. 6.11 ed. Cary, NC, USA; 1996.[6]. Ce modèle comporte pour variable dépendante la variable rejet et pour variable indépendante le score tel qu'établi au point 3). Soit Y la réponse d'un animal notée 0 en l'absence de rejet et 1 en présence de rejet, soit x le vecteur des variables indépendantes, soit rr la probabilité de la réponse à modéliser, le modèle logistique s'écrit selon la formule suivante : logitg dans laquelle a est l'intercepte et [3' est le vecteur des paramètres. Soit N le nombre total d'observations, soit t le nombre total de paires de réponses, soit nd le nombre de paires concordantes, nd le nombre de paires discordantes et t û n~ û nd le nombre de paires ex-aequo. L'aire sous la courbe (AUC) est calculée de la façon suivante : C=(nd+0,5(tûncûnd))/t L'établissement de cette courbe nous a permis de calculer les différentes 25 valeurs statistiques pour la réalisation de la présente invention. La valeur de la variation seuil discriminante de chaque marqueur, la sensibilité la spécificité, la valeur prédictive positive ainsi que sa valeur prédictive négative sont présentées dans le tableau 2. Marqueurs Variation Sensibilité Spécificité Valeur Valeur seuil Prédictive Prédictive discriminante Positive Négative Taurine 20 pmol/L 88% 88% 88% 88% Phénylalanine 40 pmol/L 75% 100% 100% 80% Aspartate 21 pmol/L 88% 100% 100% 89% Citrulline 26 pmol/L 50% 75% 67% 60% Tableau 2 : variation seuil discriminante, sensibilité, spécificité, valeur prédictive positive, valeur prédictive négative de chaque marqueur. Exemple 4 :Calcul de la différence pour chaque marqueur, affectation d'un 5 score pour chaque marqueur et sommation des scores. Le calcul de la différence de concentration entre la concentration de référence et la concentration après greffe de chaque marqueur pour les individus de l'exemple 1 a été effectué par calcul de la valeur absolue de la différence entre TO et T1 : valeur à T1 ù valeur à TO 10 La concentration pour chaque individu après greffe est présentée dans le tableau 3 aleur absolue de chaque résultat Citrulline Taurine Phénylalanine Aspartate pmol/L) Individus 1 37 136 56 21 2 42 186 79 22 3 61 - - 43 Q 4 39 187 109 35 ô 5 42 188 63 38 0 6 35 186 68 34 7 70 185 81 41 8 63 140 60 - 9 33 1440 222 480 10 19 502 187 60 11 33 324 100 36 N a) 12 25 311 133 56 ô 13 10 109 138 24 14 53 447 166 38 15 16 56 86 45 16 34 276 186 60 -concentration non mesurée Tableau 3 : concentration pour chaque individu et chaque marqueur après greffe. L'affectation du score pour chaque individu a été effectuée en fonction de la comparaison pour chaque marqueur de la valeur absolue de la différence avec le taux discriminant. Lorsque la valeur absolue de la différence d'un marqueur était supérieure à son taux discriminant un score de +1 a été affecté. Lorsque la valeur absolue de la différence d'un marqueur était inférieure à son 1 o taux discriminant un score de +0 a été affecté. Cette affectation du score a été faite pour chaque individu et pour chaque marqueur. Après affectation du score par marqueur la somme des scores par individu a été faite afin de donner le score total. Exemple 5 : Vérification de la corrélation entre la sommation des scores et le rejet. Cette expérience a été menée à partir des individus de l'exemple 3. Une histologie intestinale a été effectuée sur un prélèvement d'intestin avec un microscope Olympus BX41 à J8 pour chaque individu de l'exemple 1. La classification communément admise du rejet intestinal est la suivante : pour le grade "indéterminé", les lésions sont habituellement minimes et il y a une augmentation des cellules en apoptoses mais avec moins de 6 apoptoses pour 10 glandes et peu voire pas, d'inflammation. Pour le rejet minime (grade 1), les cellules en apoptoses dépassent 6 pour 10 glandes et un infiltrat inflammatoire à prédominance mononuclée discret à modéré est observé. Dans le rejet modéré (grade 2), une augmentation des cellules en apoptose est observée. Les cellules en apoptose deviennent confluentes et peuvent aboutir à des destructions glandulaires et un infiltrat mononuclée modéré à sévère. Enfin dans le rejet sévère (grade 3) une destruction glandulaire plus importante avec des zones de disparition des glandes voire des érosions ou -des ulcérations et un infiltrat inflammatoire marqué sont observés. Ces observations sont décrites dans l'article de Ruiz P et al. � Histological criteria for the identification of acute cellular rejection in human small bowel allografts: results of the pathology workshop at the VIII International Small Bowel Transplant Symposium �. Transplant Proc 2004;36:335-337 [8]. L'observation histologique des prélèvements des individus de l'exemple 1 n'a révélé aucune anomalie (normale) dans le groupe 1 tandis que tous les 25 individus du groupe 2 ont présenté un rejet modéré à sévère du greffon. La corrélation entre le rejet observé histologiquement et le score calculé ont été vérifiés tel que décrit précédemment. La répartition des individus en fonction du score obtenu et le rejet éventuel 30 de la greffe est présenté dans le tableau 4. Observation histologique Effectifs Groupe 1 Groupe 2 d'un rejet de greffe 4 0 1 Oui 3 .0 4 Oui 2 0 3 Oui Score 1 5 0 Non 0 3 0 Non Total 8 8 Tableau 4 : répartition des individus en fonction du score obtenu. Tel que présenté dans le tableau 5, il a été vérifié et confirmé qu'un score supérieur ou égal à 2 pour un individu permet de prédire la présence d'un rejet 5 de greffe dans 100% des cas. Pourcentage Groupe 1 Groupe 2 Observation histologique d'un rejet de greffe 6,25%* 4 0 Oui (100)% t 25%* 3 0 Oui (100)%t 18,75%* 2 0 Oui Score (100)% t 31,25%* 1 0 Non (100)%t 18,75%* 0 0 Non (100)% Total 50% 50% * calcul des % par rapport au total général : 5/16 = 31,25% ; 3/16 = 18,75% ; 1/16 = 6,25%,... t calcul des % par rapport au total de la ligne Tableau 5 : répartition du pourcentage des individus en fonction du score et du 10 groupe Exemple 6 : Etude de la concentration plasmatique de citrulline. Cet exemple à été réalisé sur une population de cochons comme dans l'exemple 1. Comme dans l'exemple 1, deux groupes ont été formés : - groupe 1 : 8 cochons ont reçu une autogreffe d'intestin, et - groupe 2 : 8 cochons ont reçu une greffe allogénique mais sans aucun traitement immunosuppresseur. N Anesthésie des cochons. Les cochons ont été anesthésiés pour la transplantation selon le protocole suivant : une prémédication intramusculaire a été pratiquée avec 20-25 mg/kg' de kétamine (Imalgène 1000, marque déposée, 10 mL, Mérial, Lyon, France), et 0,004-0,01 mg/kg de glycopyrrolate (Robinul V, marque déposée, 5 mL, Vétoquinol, Lure, France) ; induction avec du gaz isofluorane (AErran, marque déposée, Baxter SA, Maurepas, France) administré avec un masque. Les animaux ont été intubés en utilisant un laryngoscope et un tube endotrachéal (Hudson RCI, marque déposée, Sheridan/CF, ID 6,0-7,0mm) et ventilé mécaniquement (Modèle 2000 de ventilateur anesthésique Vétérinaire, Hallowell FC) (flux respiratoire : 15 û 20/min ; FIO2=30%). Pendant ces opérations, les cochons ont été perfusés par voie intraveineuse 50mL/kg de NaCl à 0,9% (B. Braun) et 65mUkg glucose 5% (glucose isotonique Aguettant, marque déposée, Aguettant, Lyon, France). Avant incision abdominale, un cathéter veineux a été introduit dans la veine jugulaire externe pour mesurer la pression veineuse centrale et perfuser. La pression artérielle a été mesurée (SC 7000, Siemens, France) via un cathéter cervical inséré dans l'artère carotide. Le rythme cardiaque ainsi que la saturation en oxygène ont été mesurées continuellement en utilisant un sphygmo-oxymètre avec un détecteur fixé à une gencive. (Modèle 9847 V, Nonin Medical Inc, Plumouth, UK). B/ dommages ischémique due à la reperfusion in situ. La technique d'ischémie intestinale in-situ utilisée dans le présent exemple dérive de celle décrite par Lauronen et al. "Effects of extrinsic denervation with or without ischemia-reperfusion injury on constitutional mucosal characteristics in porcine jejunoileum". Dig Dis Sci 2001;46(3):476-85 [ 9 ] et de Pakarinen MP, Pirinen P, Lauronen J, Raivio P, Kuusanmaki P, Halttunen J. Effects of transection and extrinsic denervation and a model of autotransplantation of the porcine jejunoileum on cholesterol biodynamics. J Ped Surg 2003;38(11):1585- 90 [10]. L'iléon a été sectionné de manière transversale coté proximal à 10 cm de la valve iléocécale, au sommet de la courbe formée par l'extrémité de l'artère mésentérique supérieure. Le mésentère correspondant a été sectionné. L'artère mésentérique supérieure a été libérée de la branche duodénale à la seconde branche jéjunale. Le jéjunum correspondant à la première artère jéjunale a été sectionné au niveau de la première artère jéjunale, à environ 30 cm distalement du ligament de Treitz. le mésentère correspondant a été sectionné de manière transversale jusqu'à l'origine de la première artère jéjunale. Toutes les connections nerveuses et lymphatiques du jéjunum, sauf les vaisseaux mésentériques supérieurs, ont été sectionnées.L'artère mésentérique supérieure, la veine mésentérique supérieure et les branches coliques, provenant du tronc principal des vaisseaux mésentériques, ont été squelettisés sur une longueur d'au moins 2 cm (entre l'origine de l'artère duodénale et la seconde artère jéjunale). Ainsi, les vaisseaux mésentériques squelettisés et leurs branches coliques sont restés les seules connections maintenant la perfusion sanguine du jéjunoiléon. Après l'injection intraveineuse de 100 U1/kg de poids corporelle d'héparine (Heprin Choay marque déposée), les vaisseaux mésentériques squelettisés ont été clampés afin de produire une ischémie jéjunale. supérieure a été clampée au niveau de l'origine proximale de l'artère duodénale. L'artère duodénale et l'artère colique ont été clampées séparément au niveau de leurs origines afin de prévenir le passage de la solution de conservation dans la circulation systémique tout en prévenant le reflux artériel dans la circulation jéjunale. La veine mésentérique supérieure a été clampée distalement de la veine colique, permettant un flux sanguin à travers la veine colique. Par la suite, l'artère mésentérique supérieure a été cathétérisée en aval du clamp, via la première artère jéjunale. Le jéjunum ainsi isolé a été lavé avec 1000 mL de solution froide (4°C) d'IGL-1 (Institut Georges Lopez, Lyon, France). Une petite incision de la veine mésentérique supérieure a été faite en amont du clamp pour permettre la sortie de l'effluent. Après l'ischémie froide, la petite incision dans la veine mésentérique supérieure a été refermée par une suture de prolène 6-0. La première artère jéjunale a été liée à son origine et le clamp vasculaire a été enlevé, permettant une reperfusion du jéjunoiléon. La longueur jéjunale a ensuite été mesurée le long des bords antimésentériques à partir de l'extrémité proximale vers l'extrémité distale. Soixante-dix pour cent du jéjunoiléon proximal a été réséqué. De ce fait, environ 5 m du petit intestin incluant 30 cm du jéjunum proximal et les 30% du grêle distal sont restés in situ. La continuité intestinale a été rétablie en réanastomosant le jéjunum à l'iléon. Les brèches mésentériques ont ensuite été refermées. CI Allogreffe. Chez le donneur, l'artère et la veine mésentérique supérieures ont été disséqués au niveau des branches coliques. Les branches coliques ont été liées et sectionnées. Le petit intestin proximal a été sectionné à environ 30 cm en aval du ligament de Treitz. L'iléon a été sectionné à 10 cm en amont de la valve iléocaecale, au sommet dë la courbe formée par l'extrémité de l'artère mésentérique supérieure. Le mésentère correspondant a été sectionné. Après l'injection intraveineuse d'héparine (Héparine Choay, marque déposée, 100 Ullkg), 800 mLlkg de sang du donneur ont été prélevés pour être utilisés pour une transfusion chez le receveur. Ensuite, jéjunoiléon isolé a été lavé avec 1000 mL de solution IGL-1 froide (4°C) par l'aorte sous-rénale. Le greffon a alors comporté le jéjunum et l'iléon en totalité, l'artère mésentérique supérieure en continuité avec un segment d'aorte abdominale, la veine mésentérique supérieure en continuité avec la veine porte. Le greffon a été temporairement conservé dans une solution froide (4°C) d'IGL-1. Le contenu du grêle n'a pas été lavé. Après reperfusion, le greffon a été réduit à partir de l'extrémité proximale du segment jéjunoiléal, laissant environ 4,5 m pour prendre en compte les 30 cm de jéjunum proximal et les 10 cm d'iléon natifs laissés chez le receveur. Chez le receveur, le petit intestin proximal a été sectionné à environ 30 cm en aval du ligament de Treitz et l'iléon a été sectionné à 10 cm en amont de la valvule iléocaecale. L'iléojéjunum isolé a été réséqué. La totalité du colon et du rectum du receveur ont été conservés. L'allogreffe a été ensuite implanté. L'aorte abdominale du greffon a été anastomosée à l'aorte abdominale sous-rénale du receveur par une suture au prolène 6-0. La veine mésentérique supérieure a été anastomosée à la veine cave inférieure sous-rénale. La continuité digestive a été rétablie avec des anastomoses du jéjunum et de l'iléon. Les brèches mésentériques ont été refermées Dans les deux groupes, le mésentère a une apparence blanchâtre avant la fermeture de l'abdomen. Dl Soins post-opératoires. A la fin de l'intervention, une dose unique intramusculaire de 4 mg/kg d'acide Tolfenamic (Tolfedine 4%, marque déposée, Vétoquinol, Lure, France) a été administrée à tous les animaux pour l'analgésie postopératoire et une dose unique intramusculaire de 15 mg/kg d'amoxycillin à longue durée d'action (Clamoxyl L.A, marque enregistrée, Pfizer) a été administrée comme traitement prophylactique antimicrobien. Les animaux ont été extubés après l'opération et placés dans des cages métaboliques avec des lampes chauffantes. Chaque animal a reçu une 250mL de glucose 5% en intraveineuse le premier et le deuxième jour après l'opération en utilisant le cathéter veineux central laissé dans la veine jugulaire externe. Les animaux ont été nourris à partir du premier jour post opératoire avec les aliments tels que présenté dans l'exemple 1. Les animaux ont été euthanasiés au 8éme jour postopératoire avec une dose intraveineuse de pentobarbital de sodium (Dolethal, marque enregistrée, Vétoquinol SA, Lure, France) après une laparotomie sous anesthésie générale à l'isoflurane. El Résultats Le temps de survie, le poids, l'apparence des selles et de l'intestin 8 jours après transplantation ont été observés comme dans l'exemple 5. La concentration plasmatique de la citrulline a été mesurée à TO et TI 30 comme dans l'exemple 1. Le poids moyen mesuré au moment de la transplantation était de 25.8 � 7.6 kg dans le groupe 1, et 20.6 � 2.7 kg dans le groupe 2. La longueur du petit intestin restant était de 5 � 0,2m dans les deux groupes. Tous les animaux ont survécu jusqu'à la fin de l'étude, le taux de survie au 8éme jour était donc de 100%. Une variation du poids des cochons dans chaque groupe a été observée : -dans le groupe 1, une perte de poids allant jusqu'à 10% et un gain de poids allant jusqu'à 6% a été observé, - dans le groupe 2, une perte de poids allant de 10 à 15% a été observée. Les observations histologiques au 8ème jour après transplantation de l'intestin dans le groupe 1 étaient normales sans signe de rejet. Les observations histologiques au 8é' jour après transplantation de l'intestin dans le groupe 2 présentaient des signes de rejet de greffe chez tous les individus. Le niveau de rejet de-greffe était situé entre 3 et 4 pour tous les individus de ce groupe. Le petit intestin et le colon natif ne présentaient aucun signes histologiques anormales. La concentration plasmatique moyenne de la citrulline avant greffe et au 8é" jour pour chaque groupe d'individus est représentée dans le tableau 6 suivant : Concentration Concentration au avant greffe 8e' jour Groupe 1 71,1 � 20,6 48,6 � 13,7 Groupe 2 77, 4 � 26,2 27,9 � 13,5 Comparaison des Différence non Différence groupes spécifique significative P 1) nombre de patients 10 Le calcul du nombre de patients inclus, c'est-à-dire utilisés dans le présent test, est basé sur la citrulline car celle-ci a été associée au risque de rejet comme dans l'exemple 6 précédent. La citrulline a été caractérisée par un pouvoir discriminant de la survenue de rejet inférieur à celui d'autres marqueurs (taurine, phénylalanine, aspartate), 15 un nombre de patients basé sur la citrulline avec un risque R de 20% permet de mettre en évidence des associations significatives pour les autres marqueurs avec une puissance statistique suffisante (au moins supérieure à 80%). Le nombre de sujets à inclure est calculé avec un risque a de 5% en bilatéral et un risque f3 de 20% et se base sur 3 études. 20 L'étude précédente de l'auteur montre une baisse de plus de 40% de la citrulline chez les cochons allogreffés par rapport aux cochons autogreffés où un effectif de 16 était suffisant. L'étude de Gondolosi et al Gondolesi G et al. � The value of plasma citrulline to predict mucosal injury in intestinal allografts �. Am J Transplant. 25 2006 Nov;6(11):2786-90 [11] réalisée chez des hommes transplantés, retrouve une baisse de 40% des taux de citrulline en cas de lésions de la muqueuse intestinale (23+/-15) par rapport aux patients sans lésion muqueuse (38+/-23). Sous cette hypothèse, en choisissant un écart-type moyen de 20, un effectif minimum de 60 patients est nécessaire pour mettre en évidence un tel écart. 30 L'étude de David Al et al. � An association of lower serum citrulline levels within 30 days of acute rejection in patients following small intestine transplantation. � Transplant Proc. 2006 Jul-Aug;38(6):1731-2 [12] , il a été observé une baisse de 35% du taux de citrulline en cas de rejet c'est-à-dire5 18,8 en période libre versus 12,4 dans le mois précédant le rejet. Le nombre de sujets nécessaire est alors de 30 avec un écart-type de 6. En conséquence, un effectif de 50 patients est choisi pour trois raisons : - La baisse des taux de citrulline pourrait être plus importante que dans l'étude de Gondolesi et al. car la comparaison ne porte pas sur la présence ou pas de lésions muqueuses intestinales mais sur la survenue ou pas d'un rejet, donc le nombre de patients à inclure peut être inférieur à 60. - Une sécurité par rapport à l'étude de David et al.[12] est prise au cas où la différence observée est plus faible, un effectif supérieur à 30 est nécessaire. - Les groupes à comparer dans notre étude (rejet versus non rejet) ne sont pas d'effectifs identiques, ce qui entraîne une perte de puissance statistique. D'après les données de la littérature, le taux de rejet observé est de 60% environ. 2) Application du procédé. Le procédé de l'invention est appliqué à un échantillon liquide provenant d'un être humain choisi dans le groupe des cinquante individus tel que défini précédemment. Le prélèvement de l'échantillon liquide est effectué par prise de sang. La concentration de référence de chaque marqueur est celle correspondant à la mesure faite immédiatement avant la greffe intestinale ou après la greffe, mais en l'absence de rejet confirmée histologiquement. La mesure de la concentration de chaque marqueur est effectuée par la technique citée précédemment dans l'exemple 1 c) . Le calcul de la différence pour chaque marqueur est effectué par simple soustraction. L'affectation du score par marqueur est effectué telle que décrit dans l'exemple 4. La sommation des scores par marqueur est effectué telle que décrit dans l'exemple 4. La corrélation des scores avec le rejet de greffe est effectué telle que décrit dans l'exemple 5. La détection du rejet de la greffe est observée quand la somme des scores des marqueurs est supérieur à 2. La mise en oeuvre du procédé de l'invention permet donc de mettre en 5 évidence 100% des rejets de greffe d'intestin comme présenté dans l'exemple 2 et donc est adapté à une utilisation pour le diagnostique de rejet de greffe. Listes des références [1] P. Crenn et al. � Postabsorptive plasma citrulline concentration is a marker of absoptive enterocte mass and intestinal failure in humans � ; 5 Gastroenterology 2000 ;119 :1496-505. [2] LC. Lutgens et al. � Monitoring myeloablative therapy-induced small bowel toxicity by serum citrulline concentration : a comparaison with sugar permeability tests �. Cancer 2005 ; 103 :191-9. [3] PA. Pappas et al. � Serum citrulline and rejection in small bowel transplantation : a preliminary report �. Transplantation 2001 ; 72 :1212-16. 15 [4] PA. Pappas et al � An analysis of the association between serum citrulline and acute rejection among 26 recipients of intestinal transplant. � Am J Transplantation 2004 ;4 :1124-32 [5] Le Boucher J, et al. � Amino acid determination in biological fluids by 20 automated ion-exchange chromatography : performance of Hitachi L-8500A. � Clinical Chemistry 1997;43:1421-28 [6] SAS Institute Inc et décrit dans SAS/STAT Software: "Changes and enhancements through release 6.11". In. 6.11 ed. Cary, NC, USA; 25 1996. [7] PIRAUD Monique et al. � Ion pairing, reversed phase liquid chromatography/ electrospray ionization mass spectrometric analysis of 76 underivatized amino acids of biological interest: a new tool for 30 diagnosis of inherited disorders of amino acids metabolism �. Rapid Com Mass Spectrometry, 2005; 191p: 1587-1602. 10 [8] Ruiz P et al. � Histological criteria for the identification of acute cellular rejection in human small bowel allografts: results of the pathology workshop at the VIII International SmaII Bowel Transplant Symposium �. Transplant Proc 2004;36:335-337. [9] Lauronen et al. "Effects of extrinsic denervation with or without ischemia-reperfusion injury on constitutional mucosal characteristics in porcine jejunoileum". Dig Dis Sci 2001;46(3):476-85. 10 [10] Pakarinen MP, Pirinen P, Lauronen J, Raivio P, Kuusanmaki P, Halttunen J. "Effects of transection and extrinsic denervation and a model of autotransplantation of the porcine jejunoileum on cholesterol biodynamics". J Ped Surg 2003;38(11):1585-90. 15 [11] Gondolesi G et al. � The value of plasma citrulline to predict mucosal injury in intestinal allografts �. Am J Transplant. 2006 Nov;6(11):2786-90. [12] David Al et al. � An association of Iower serum citrulline levels within 20 30 days of acute rejection in patients following small intestine transplantation. � Transplant Proc. 2006 Jul-Aug;38(6):1731-2.5 REVENDICATIONS 1. Procédé de détection in vitro du rejet d'une greffe d'intestin comprenant les étapes de : a) mesure de la concentration dans un échantillon liquide d'au moins deux marqueurs choisis dans le groupe comprenant : l'aspartate, la citrulline, la taurine et la phénylalanine, b) calcul de la différence pour chaque marqueur desdites concentrations mesurées à l'étape a) avec une concentration de référence dudit marqueur, c) comparaison pour chaque marqueur de la valeur absolue de ladite différence avec une variation seuil discriminante, d) affectation d'un score pour chaque marqueur en fonction de ladite comparaison et sommation desdits scores. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel à l'étape a) on mesure la concentration d'au moins trois desdits marqueurs. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on mesure à l'étape a) la concentration des quatre marqueurs. 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la variation seuil discriminante de l'aspartate est comprise dans la gamme allant de 18 à 24 pmol/L , la variation seuil discriminante de taurine est comprise dans la gamme allant de 17 à 23 pmol/L, la variation seuil discriminante de citrulline est comprise dans la gamme allant de 22 à 30 pmol/L et la variation seuil discriminante de phénylalanine est comprise dans la gamme allant de 34 à 46 pmollL. 5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la mesure de l'étape a) est effectuée après greffe, et dans lequel la concentration de référence de l'étape b) correspond à une mesure de la concentration dudit marqueur avant greffe. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la mesure de la concentration d'au moins un des marqueurs est réalisée par une des techniques suivantes : Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC), l'immunodosage, la chromatographie gazeuse en phase inverse avec une précolonne de dérivation avec différents réactifs par exemple du 9-fluorenyméthylchloroformate, du phénylisothiocyanate, du chlorure de diméthylaminaphthalènesulfonyle, du chlorure de diméthylaminoazobenzenesulfonyle et/ou du 4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole, une chromatographie échangeuse d'ions avec une post colonne de dérivation utilisant de OPA et/ou de ninhydrine, une chromatographie échangeuse d'ions automatisée utilisant le dispositif Hitachi L-8500A. 7. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour le diagnostique d'un rejet de greffe intestinal. 8. Kit pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant des moyens de mesure de la concentration d'au moins deux marqueurs choisis dans le groupe comprenant la taurine, l'aspartate, la phénylalanine et la citrulline.