FR 2927634 A1 20090821 FR 0850976 A 20080215 La présente invention concerne un procédé de culture de microorganismes pour augmenter la biomasse et/ou l'activité métabolique de microorganismes (i.e augmenter la production de certains métabolites, c'est-à-dire de certaines molécules produites par les micro-organismes), ceci par la régulation combinée du potentiel d'oxydo-réduction et de l'oxygène dissous. A titre illustratif, l'invention peut concerner par exemple des bactéries lactiques, mais également des microorganismes ayant préférentiellement un métabolisme anaérobie tel que des levures. L'invention vise également le domaine de certains produits finis dont 10 le procédé de production met en oeuvre une étape de fermentation, tels le vin ou encore la bière. L'étape de culture proprement dite a lieu en cuve, sous agitation ou non, dans un milieu de culture dont la composition est adaptée aux besoins 15 spécifiques de chaque micro-organisme. La composition du milieu de culture peut être extrêmement variée, mais on cite couramment la présence d'un ou plusieurs éléments parmi les polysaccharides, le glycérol, le lait, le glucose etc... De même les paramètres tels que par exemple le pH, la température, 20 la pression d'oxygène dissous peuvent être régulés. Il existe différents types de conduite de culture : - la culture discontinue ou � batch �, utilisée notamment pour la production de ferments lactiques ou de levure de panification, - la culture semi-continue ou � fed-batch �, utilisée par 25 exemple pour la production de ferments sensibles à un produit de la fermentation ou pour la production de biomasse sensible à l'inhibition par le substrat de la fermentation, - la culture continue sans ou avec recyclage, cette dernière étant utilisée notamment pour la production de ferments, de molécules d'intérêt, 30 et pour l'épuration biologique d'eaux résiduaires. L'étape de conservation de la biomasse peut se faire sous forme liquide, par congélation, par cryo-conservation, par lyophilisation ou par séchage. Des agents protecteurs sont utilisés pour préserver les micro-organismes des effets néfastes des traitements de conservation. La lyophilisation est on le sait une opération de déshydratation à basse température qui consiste à éliminer par sublimation, la majeure partie de 5 l'eau contenue dans le produit après congélation. Comme on l'a dit, les micro-organismes sont largement utilisés dans le domaine alimentaire, notamment les bactéries lactiques, comme ferments ou cultures probiotiques. La viabilité et l'activité métabolique de ces bactéries 10 lactiques, produites à grande échelle pour leurs critères d'aptitude technologique, peuvent être affectées par les différentes étapes qu'elles subissent lors de leur production (inoculation, culture et concentration) et de leur conservation (congélation ou lyophilisation). Les microorganismes peuvent également être mis à contribution pour 15 la production de biocarburants, notamment par transformation du sucre en éthanol. Les microorganismes permettent également la production de molécules d'intérêt, notamment dans le domaine pharmaceutique. L'optimisation de la biomasse et/ou de l'activité métabolique de ces cultures est donc très importante et a nécessairement une importance à la fois 20 technologique et économique. Les paramètres environnementaux ont un rôle clé sur la croissance des microorganismes, sur les réactions métaboliques et sur les mécanismes physiologiques responsables de l'activité des micro-organismes. Tout comme le pH, la température ou la composition du milieu, la 25 valeur du potentiel d'oxydo-réduction semble avoir un effet sur la croissance et la viabilité des souches bactériennes. En effet, plusieurs travaux sur les bactéries lactiques ont mis en évidence un effet du potentiel d'oxydo-réduction sur les flux métaboliques, la survie des ferments probiotiques, la production et/ou stabilité de molécules d'intérêts. On pourra à cet égard se reporter aux 30 documents suivants : les documents EP-1 856 241 et EP-1 649 755 ainsi que WO 2007/036653 Al au nom de la Demanderesse, ou encore le brevet US-7 078 201. On notera que le document WO2007/036653 s'intéresse à la régulation du potentiel redox à l'une ou plusieurs étapes d'un procédé de fabrication d'un produit alimentaire ou biotechnologique comprenant une étape de fermentation, de façon à réaliser au moins une des étapes du procédé en condition réductrice et au moins une des étapes du procédé en condition oxydante, et notamment permettant d'alterner des phases de la fermentation considérée en conditions réductrices avec des phases de la fermentation considérée en conditions oxydantes. Différents composés peuvent être utilisés comme agent réducteur et induire une baisse et/ou un maintien du potentiel d'oxydo-réduction. Parmi ceux-ci, nous pouvons citer les sulfites, l'ammoniaque mais également des gaz réducteurs comme l'hydrogène ou des mélanges comportant de l'hydrogène. Ces travaux de l'art antérieur ont permis de démontrer que l'utilisation de milieux réduits, milieux où le potentiel d'oxydo-réduction est bas, permet d'augmenter la biomasse produite mais également la viabilité du produit au cours de sa conservation ultérieure, elle permet également d'augmenter la production de métabolites. Un autre moyen répertorié par l'art antérieur pour augmenter la biomasse produite est l'utilisation d'une faible quantité d'oxygène. Bien que l'oxygène ait un effet inhibiteur sur les bactéries lactiques, bactéries anaérobies facultatives, il est décrit dans la littérature comme pouvant être bénéfique à leur croissance. Ainsi des travaux ont montré que pour une souche de Lactococcus lactis MG1363, l'ajout d'oxygène permet d'augmenter la biomasse produite. Ainsi, la concentration en biomasse passe de 0.54 g/I (poids sec) en culture anaérobie à 0.68g/I pour une culture à laquelle on ajoute un pourcentage d'oxygène dissous de 5%. (on se reportera aux travaux de Jensen et al intitulés � Metabolic behavior of Lactococcus lactis MG1363 in microaerobic continuous cultivation at a Iow dilution rate � parus dans AEM û 2001, Vol.67, N°6). Il apparaît alors que les deux solutions préconisées par l'art antérieur, à savoir la mise en place d'un faible potentiel redox dans le premier cas, et l'action sur la quantité d'oxygène dissous dans le second cas, paraissent clairement incompatibles. En effet, l'oxygène étant un puissant agent oxydant, son ajout dans un milieu de culture va augmenter significativement le potentiel redox. Comme on le verra ci-dessous plus en détails, c'est donc le mérite de la présente invention d'avoir démontré qu'il est possible d'apporter et de réguler une quantité d'oxygène dissous tout en régulant le potentiel redox à une valeur basse souhaitée et fixée, ceci entraînant de façon extrêmement avantageuse une augmentation significative de la productivité des souches cultivées, alors que l'action sur les deux paramètres précités pouvaient apparaître à l'Homme du Métier au premier abord au vu de l'art antérieur évoqué plus haut, et fort logiquement, comme s'annihilant. La présente invention propose donc un procédé mettant en oeuvre des régulations simultanées, utilisant préférentiellement des gaz ou mélanges gazeux pour assurer ces régulations : - avantageusement la régulation du potentiel redox utilisera l'injection d'un gaz ou mélange gazeux réducteur (par exemple un mélange gazeux comportant de l'hydrogène) dans le milieu de culture . On conçoit que l'ajout de produits chimiques tels l'acide ascorbique (vitamine C) par exemple pourrait également être mis en oeuvre pour réaliser cette régulation du redox, mais on préférera comme on l'a dit utiliser l'injection de gaz appropriés. - tandis qu'avantageusement la régulation de la valeur d'oxygène dissous se fera par injection d'air ou d'oxygène pur ou encore d'air enrichi en oxygène dans le milieu de culture ou encore de tout .gaz susceptible de libérer de l'oxygène, par exemple des mélanges comportant de l'oxygène et du CO2 etc.... - ces régulations sont effectuées durant tout ou partie de la fermentation, c'est-à-dire durant tout ou partie de la culture de la souche bactérienne. On notera que le document US-7 078 201 cité ci-dessus indique qu'une valeur optimale du potentiel redox peut augmenter la production d'éthanol, diminuer la formation de glycérol et diminuer la durée de la fermentation par rapport à une fermentation classique. Le procédé proposé par ce document propose pour cela le maintien d'une valeur de potentiel redox dans le fermenteur comprise entre -250 et + 50 mV grâce à une aération en continu du milieu via une injection d'air. L'objectif recherché par les auteurs de ce document est d'aller à l'encontre d'une baisse du potentiel redox, et pour cela, selon un des modes recommandés par le document, l'auteur, en lieu et place de l'utilisation traditionnelle d'ammoniac (considéré comme trop réducteur) pour réaliser la régulation du pH lors de la croissance, recommande l'ajout de soude afin de limiter la baisse de la valeur du potentiel redox. On comprend donc que les auteurs n'évoquent à aucun moment le fait de réaliser une régulation stable et continue du redox à une valeur fixée (régulation fine) et encore moins le fait de réguler une quantité d'oxygène dissous tout en régulant le potentiel redox à une valeur basse souhaitée et fixée (teneur en oxygène dissous qui naturellement aurait tendance à faire remonter le potentiel redox). La présente invention concerne alors un procédé de culture de microorganismes, procédé du type où l'on procède notamment à une étape d'ensemencement d'un milieu de culture avec une ou plusieurs souches de microorganismes, et à une étape de culture du milieu ainsi ensemencé, se caractérisant en ce que l'on procède durant tout ou partie de la culture, aux deux régulations suivantes de façon simultanées : - on régule la quantité d'oxygène dissous dans le milieu à une consigne d'oxygène dissous donnée ; - on régule la valeur du potentiel redox Eh du milieu à une valeur de consigne Eh donnée. On doit comprendre à la lecture de ce qui précède que selon l'invention, on régule la valeur du potentiel redox Eh du milieu à une valeur de consigne qui est inférieure à la valeur qui serait naturellement atteinte par régulation du seul oxygène dissous. L'invention pourra par ailleurs adopter l'une ou plusieurs des caractéristiques techniques suivantes : - la valeur du potentiel redox ainsi régulée est négative. - le potentiel redox est régulé dans la gamme allant de - 400 à 0 mv. - la valeur d'oxygène dissous est régulée dans la gamme allant de 1 à30%. - on réalise des séquences différentes de régulation en fonction de la phase de croissance concernée, par la mise en oeuvre de couples (consigne de valeur du potentiel redox, consigne d'oxygène dissous) différents en fonction de la phase considérée de croissance de la dite souche. - la régulation du potentiel redox utilise l'injection d'un gaz ou mélange gazeux réducteur dans le milieu de culture, tel qu'un mélange gazeux comportant de l'hydrogène, tandis que la régulation de la valeur d'oxygène dissous utilise une injection d'air ou d'un gaz ou mélange gazeux susceptible de libérer de l'oxygène tel l'oxygène pur ou encore de l'air enrichi en oxygène dans le milieu de culture. - la régulation du potentiel redox utilise l'injection d'un composé 20 chimique dans le milieu de culture. - les deux régulations simultanées sont réalisées par une régulation de type PID selon la procédure suivante : - on a réalisé au préalable l'évaluation de l'impact de l'injection d'air ou d'oxygène ou d'un mélange susceptible de libérer de l'oxygène, et d'un gaz 25 ou mélange gazeux réducteur, sur la valeur d'oxygène dissous d'une part et sur le potentiel redox d'autre part, via la réalisation d'essais préalables mettant en oeuvre des débits de gaz variables injectés dans le milieu ; - on dispose de deux régulateurs de débit aptes à réguler le débit du gaz susceptible de libérer de l'oxygène et le débit du gaz ou mélange gazeux 30 réducteur dans le milieu de culture. Ces régulateurs constituent les actionneurs du système de régulation ; - on dispose d'un système de régulation avec acquisition de données, par exemple un automate qui périodiquement examine chacun des régulateurs de débit, au niveau de sa valeur de consigne et de la valeur de mesure du paramètre qui lui est associé, et qui corrige en conséquence sa sortie ; - on a déterminé à partir desdites évaluations d'impact les mesures 5 de correction de chaque régulateur en fonction d'une perturbation du système pour des consignes données de potentiel redox et d'oxygène dissous. L'invention sera mieux comprise à la lecture de l'exemple qui suit et se réfère à la figure 1 qui illustre de façon schématique le montage expérimental 10 utilisé pour effectuer les essais réalisés. Les essais ont été réalisés sur une souche mésophile, Lactococcus lactis, en fermenteur de capacité de 1,5 litres. Les valeurs cibles fixées (consignes) pour le potentiel d'oxydoréduction et l'oxygène dissous étaient respectivement de -200 mV et 15 10%. Voici ce que l'on doit entendre par cette valeur d'oxygène dissous à 10% : L'appareillage utilisé est capable de mesurer la concentration en oxygène du milieu de culture grâce à une sonde. Cette sonde est étalonnée de la manière suivante : on injecte un mélange H2-N2 (4/96) dans le milieu de culture 20 pour retirer tout l'oxygène présent. A ce stade, la sonde doit alors indiquer une concentration de 0% d'oxygène dissous. En un second temps, on remplace le mélange H2-N2 précité par de l'air, qui est injecté en grande quantité (typiquement au débit maximum que le système peut fournir). On attend que la valeur mesurée soit stable, le système doit alors indiquer une valeur de 100% 25 d'oxygène dissous. Si ce n'est pas le cas, on réalise une calibration de la sonde qui consiste à faire prendre la valeur de 100% à la sonde. Ce � 100% d'oxygène dissous� correspond donc au maximum d'oxygène que le milieu considéré puisse dissoudre. Une fois cette calibration réalisée, on peut activer la régulation sur l'oxygène dissous avec la consigne que l'on souhaite mettre en 30 place dans le milieu de culture (ici par exemple 10 %). Les essais étaient donc réalisés à 10% du maximum que le milieu considéré puisse dissoudre. De même on va détailler dans ce qui suit un mode de réalisation des deux régulations simultanées conformément à la présente invention. On dispose d'un automate qui périodiquement (selon une période qui lui a été imposée, par exemple inférieure à la seconde), examine chacun des régulateurs de débit massique, à savoir sa valeur de consigne et la valeur de mesure du paramètre considéré et qui corrige en conséquence sa sortie i.e l'instruction qu'il donne en rétroaction. On utilise en l'occurrence une régulation de type PID qui permet ici de réguler à la fois le Redox et l'oxygène dissous. Comme on va l'expliquer plus en détail dans ce qui suit il faut en effet signaler que le potentiel redox et l'oxygène dissous n'ont pas le même comportement, ils n'ont pas les mêmes constantes de temps, ni une même amplitude de réaction pour une variation de débit identique. En conséquence, les paramètres de chaque régulateur ne sont pas identiques et le réglage fin mis en place sur chaque PID permet que les régulateurs n'oscillent pas, cette mise en oeuvre limite ainsi les interférences entre eux. La mise en oeuvre décrite ci-dessus n'est qu'illustrative d'un mode de mise en oeuvre, elle n'exclue pas bien entendu, et ceci sans à aucun moment sortir du cadre de la présente invention, d'utiliser d'autres moyens de régulations. On décrit ci- dessous les entrées / sorties de régulateur typiquement mises en place : Pour le Redox : - En entrée : i) Consigne de Redox en millivolt donnée depuis l'Interface Homme Machine (IHM) j) Mesure de Redox en millivolt envoyée par la sonde plongée 25 dans le milieu de culture - En sortie : k) Débit d'H2-N2 envoyé dans le milieu Pour l'oxyqène dissous : 30 - En entrée : i) Consigne d'O2 dissous exprimée en pourcentage (0-100%) et qui a été entrée depuis l'Interface Homme Machine (IHM) j) Mesure d'O2 dissous envoyée par la sonde correspondante en mV et convertie en pourcentage pour disposer de la même unité que celle de la consigne - En sortie : k) Débit d'air envoyé dans le milieu Plus précisément, pour l'exemple de mise en oeuvre indiqué ci-dessus : -on a utilisé un régulateur de type PID qui est en fait un Régulateur Proportionnel Intégral. On pourrait également utiliser d'autres types de régulateurs comme par exemple à modèle interne ou à logique floue. - comme on l'a indiqué plus haut, le potentiel redox et l'oxygène dissous n'ont pas le même comportement, ils n'ont pas les mêmes constantes de temps, ni une même amplitude pour une variation de débit identique. En conséquence, les paramètres de chaque régulateur ne sont pas identiques et le réglage adapté mis en place sur chaque PID permet que les régulateurs n'oscillent pas, ce qui limite ainsi les interférences entre eux. Plus précisément, ce qui permet selon l'invention de différencier les paramètres de chaque régulateur c'est la quantification préalable de l'impact de l'air ou autre gaz susceptible de libérer de l'oxygène et du mélange comprenant de l'hydrogène sur la valeur d'oxygène dissous d'une part et sur le potentiel redox d'autre part. Cette quantification a été réalisée via la réalisation d'essais préalables où l'on a mis en place des variations de débits de gaz injecté dans le milieu. Ces essais ont permis de déterminer l'impact de l'injection d'air sur le potentiel redox et sur l'oxygène dissous, puis l'impact de l'injection d'un mélange comportant de l'hydrogène sur le potentiel redox et sur l'oxygène dissous. Ces essais permettent de connaître l'impact de chaque gaz sur sa grandeur mesurée de référence mais également son impact (ou la perturbation qu'il engendre) sur l'autre grandeur mesurée. Ces expérimentations ont permis de conclure que dans le cas étudié (mélanges gazeux, milieu traité...) : - l'influence du mélange hydrogéné sur l'oxygène dissous est environ quatre fois plus faible que celle de l'air. - pour ce qui est du potentiel Redox, l'air a un impact environ 10 fois plus faible que celui du mélange hydrogéné. Prenant en compte cette identification des fonctions de transfert, il est ainsi possible de déterminer les paramètres de chaque correcteur, en se donnant pour objectif que le système réagisse correctement à une perturbation du système pour une consigne fixe. En effet, selon l'invention on met en place une consigne donnée durant tout ou partie de la croissance, en revanche il fallait inclure dans la détermination des paramètres du correcteur l'effet de la croissance des bactéries dans le milieu de culture. On sait en effet que la croissance des bactéries a une influence sur le potentiel redox : le potentiel redox diminue durant la croissance et la consommation d'oxygène augmente. Il s'agit d'un phénomène perturbant pour la régulation : le réglage des correcteurs est fait pour réagir au mieux à cette perturbation. De cette manière, c'est la combinaison des identifications effectuées et de la manière dont est réglé le correcteur (réponse à une perturbation et non à un changement de consigne) qui permet d'obtenir les résultats observés avec l'utilisateur de régulateurs � simple � de type PID (monovariable). L'objectif de la régulation durant les essais rapportés ci-dessous est de maintenir durant au moins une partie de la croissance de la souche une valeur constante de potentiel redox ainsi qu'une valeur constante d'oxygène dissous (on le visualise d'ailleurs bien sur la figure 2 qui sera commentée ci-après). La biomasse, l'activité acidifiante et la productivité par opération ont été mesurées en fin de fermentation (fin de culture), mais également au niveau des pellets congelés ainsi qu'au niveau du produit lyophilisé. Ces résultats sont comparés à une culture témoin dans laquelle ni le potentiel redox ni l'oxygène dissous n'ont été régulés (culture anaérobie, réalisée avec un simple balayage d'azote de 0,5 I/min dans l'espace de tête du fermenteur). Les résultats présentés en figure 2 montrent le suivi de la régulation des valeurs d'oxygène dissous (pO2) et de potentiel d'oxydo-réduction (Eh) pour une souche de Lactococcus lactis. Les différents gains obtenus au cours des différentes étapes de production sont décrits dans le tableau ci-dessous. On met donc en évidence le résultat primordial de cette invention selon lequel il est possible, par un système de régulation maîtrisé, de découpler les deux paramètres tout en les régulant simultanément : potentiel d'oxydoréduction et oxygène dissous. On constate alors que les gains obtenus sont supérieurs à 50% à l'étape du produit lyophilisé ce qui est très satisfaisant. En régulant simultanément les deux paramètres, potentiel d'oxydo-réduction et oxygène dissous, on obtient des gains importants au niveau de la biomasse et de l'activité acidifiante. Fin de Pellets congelés Produit lyophilisé fermentation Gain en biomasse 28% 45% 55% (en %) Gain en activité 17% 19% 71 % acidifiante (en %) Gain en productivité 17% Non déterminé 71 % (en %) Tableau de résultats obtenus Comme il apparaîtra clairement à l'homme du métier, la valeur optimale en oxygène dissous et en potentiel redox sera à adapter en fonction des souches et de l'objectif visé (production de biomasse et/ou production de métabolites). Il est également envisageable de réaliser des séquences différentes de régulation en fonction de la phase de croissance concernée, c'est à dire de mettre en place des couples (valeur du redox / pO2) différents en fonction de la phase de croissance de la souche, à titre illustratif on donne ci-dessous un exemple numérique : - en début de croissance une valeur de redox basse, voisine de -400 mV et une valeur d'oxygène dissous voisine de 10 % , - puis en phase exponentielle une valeur de redox voisine de -400 mV et une valeur d'oxygène dissous voisine de 5%, - et en phase stationnaire une valeur de redox voisine de -400 mV et une valeur d'oxygène voisine de 0%. ----------------------- REVENDICATIONS 1. Procédé de culture de microorganismes, procédé du type où l'on procède notamment à une étape d'ensemencement d'un milieu de culture avec une ou plusieurs souches de microorganismes, et à une étape de culture du milieu ainsi ensemencé, se caractérisant en ce que l'on procède durant tout ou partie de la culture, aux deux régulations suivantes de façon simultanées : - on régule la quantité d'oxygène dissous dans le milieu à une consigne d'oxygène dissous donnée ; - on régule la valeur du potentiel redox Eh du milieu à une valeur de consigne Eh donnée. 2. Procédé de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que la valeur du potentiel redox ainsi régulée est négative. 3. Procédé de culture selon la revendication 1 ou 2, caractérisé 15 en ce que le potentiel redox est régulé dans la gamme allant de - 400 à 0 mv. 4. Procédé de culture selon la revendication 1 à 3, caractérisé en ce que la valeur d'oxygène dissous est régulée dans la gamme 1 à 30 %. 5. Procédé de culture selon l'une des revendications 20 précédentes, caractérisé en ce que l'on réalise des séquences différentes de régulation en fonction de la phase de croissance concernée, par la mise en oeuvre de couples (consigne de valeur du potentiel redox, consigne d'oxygène dissous) différents en fonction de la phase considérée de croissance de la dite souche. 25 6. Procédé de culture selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la régulation du potentiel redox utilise l'injection d'un gaz ou mélange gazeux réducteur dans le milieu de culture, tel qu'un mélange gazeux comportant de l'hydrogène, tandis que la régulation de la valeur d'oxygène dissous utilise une injection d'air ou d'un gaz ou mélange 30 gazeux susceptible de libérer de l'oxygène tel l'oxygène pur ou encore de l'air enrichi en oxygène dans le milieu de culture. 7. Procédé de culture selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la régulation du potentiel redox utilise l'injection d'un composé chimique dans le milieu de culture. 8. Procédé de culture selon l'une des revendications 1 à 6, 5 caractérisé en ce que les deux régulations simultanées sont réalisées par une régulation de type PID selon la procédure suivante : - on a réalisé au préalable l'évaluation de l'impact de l'injection d'air ou d'un mélange susceptible de libérer de l'oxygène, et d'un gaz ou mélange gazeux réducteur, sur la valeur d'oxygène dissous d'une part et sur le potentiel 10 redox d'autre part, via la réalisation d'essais préalables mettant en oeuvre des débits de gaz variables injectés dans le milieu ; - on dispose de deux régulateurs de débit aptes à réguler le débit du gaz susceptible de libérer de l'oxygène et le débit du gaz ou mélange gazeux réducteur dans le milieu de culture ; 15 - on dispose d'un système de régulation avec acquisition de données, par exemple un automate qui périodiquement examine chacun des régulateurs de débit, au niveau de sa valeur de consigne et de la valeur de mesure du paramètre qui lui est associé, et qui corrige en conséquence sa sortie ; 20 - on a déterminé à partir desdites évaluations d'impact les mesures de correction de chaque régulateur en fonction d'une perturbation du système pour des consignes données de potentiel redox et d'oxygène dissous. ----------------------------