FR 2927092 A1 20090807 FR 0800557 A 20080201 - 1 - Biomarqueurs de situations hypoxiques et applications L'invention se rapporte à des biomarqueurs pour des pathologies ou du stress cellulaire associés à des processus hypoxiques et a plus particulièrement pour objet une méthode in vitro pour le pronostic notamment de survie chez des patients souffrant de telles pathologies ou de pronostic de récidive dans le cas de cancers. La capacité des cellules à répondre à une diminution de la pression partielle en oxygène est essentielle à la fois pour un développement normal de l'embryon et la physiologie postnatale. L'hypoxie joue aussi un rôle majeur dans la physiopathologie de maladies telles que le cancer. Le facteur HIF-1 (hypoxia inducible factor-l) est un 20 régulateur exprimé en réponse à une diminution de la pression partielle en oxygène cellulaire. Ce facteur active, en particulier, les gènes impliqués dans l'angiogénèse. Il constitue un régulateur principal d'un grand nombre de gènes contrôlant l'homéostasie de 25 l'oxygène chez de nombreux mammifères. Ainsi, HIF-1 modifie la transcription de gènes impliqués dans l'érythropoïèse, le métabolisme du fer, la régulation du pH, l'angiogénèse et le métabolisme du 30 glucose. Les protéines codées par ces gènes augmentent l'apport15 - 2 d'oxygène ou activent les voies métaboliques alternatives qui ne nécessitent pas d'oxygène. Des travaux récents ont montré que ces protéines sont impliquées dans la progression des tumeurs. HIF-1 est une protéine composée de 2 sous-unités HIF-la et HIF-1(3/ARNT. Ces sous-unités appartiennent à la superfamille des facteurs de transcription bHLH (basic helix-loop-helix) contenant un domaine PAS (PER-ARNT- SIM). HIF-1(3 est une sous-unité commune à plusieurs facteurs de transcription, alors que HIF-la est uniquement présente dans HIF-l. Il s'agit de la seule sous-unité régulée par l'oxygène qui détermine l'activité de HIF-l. L'hypoxie régule la stabilité de HIF-la et affecte également sa localisation dans la cellule, sa capacité à lier l'ADN et la fonction de l'activité transcriptionnelle du complexe HIF-1. HIF-la est composée de 826 acides aminés. Sa partie N-terminale contient les domaines bHLH et PAS qui sont essentiels pour la liaison à l'ADN et la dimérisation et sa partie carboxy-terminale contient deux domaines de transactivation et un signal de localisation nucléaire. La partie médiane comporte un domaine Pro-Ser-Thr de dégradation de l'oxygène (ODD, acides aminés 401-603), qui est responsable de la stabilité de HIF-la.30 - 3 La régulation du messager de HIF-la n'a été que récemment documentée. HIF-la est codée par le locus HIF1A situé sur le chromosome 14g2l-q24, qui code pour 15 exons résultant en 5 un transcrit principal de 8 kb environ. Les exons codent pour des domaines à fonctionnalités différentes. Ainsi, l'exon 2 code pour le domaine bHLH, alors que les exons 3 à 8 codent pour le domaine PAS. La 10 région carboxy-terminale, qui comprend les domaines de transactivation et de stabilité des protéines, est codée par les exons 9 à 15. Sept variants d'épissage alternatif ou isoformes de HIF- 15 la ont été rapportés. Des activités différentes ont été décrites pour ces isoformes dans les lignées cellulaires humaines. HIF-la$27 est similaire au type sauvage HIF-la, mais 20 comporte 3 paires de bases additionnelles (TAG), situées à la jonction entre les exons 1 et 2, ce qui entraîne une différence de 2 acides aminés en amont du domaine bHLH. HIF-1a736 est caractérisé par l'absence de l'exon 14, ce 25 qui produit un décalage du cadre de lecture et introduit un codon stop dans la séquence codante après le motif I1e735. Cette isoforme conserve toute la structure, à l'exception du domaine C terminal de transactivation (TAD) et d'une partie du domaine à propriétés 30 inhibitrices(ID). - 4 Des travaux ont montré que HIF-la827 et HIF-1a736 activent le promoteur du gène VEGF dans des conditions d'hypoxie. HIF-1a557, qui est induit par l'ion Zn, est dépourvu de 5 l'exon 12 et HIF-1a516 des exons 11 et 12. HIF-1a557 (HIF- laZ) et HIF-1a516 fonctionnent in vitro comme des isoformes dominants négatifs de HIF-l. HIF-la785 est dépourvu de l'exon 11 dans le domaine ODD. 10 L'isoforme est régulée en amont par le 12-myristate acétate-13, les espèces réactives d'oxygène et elle est également induite par la chaleur et des stress oxydatifs dans des conditions normoxiques. Ce variant contient tous les domaines fonctionnels et agit comme activateur 15 transcriptionnel. HIF-1a785 augmente la croissance tumorale in vivo dans le modèle animal. L'isoforme HIF-la417 est dépourvue de l'exon 10 et des domaines de transactivation. Cette isoforme fonctionne 20 comme un partenaire de HIF-1(3. La dernière isoforme hHIF-aTe est spécifiquement exprimée dans le testicule humain. Il s'agit d'un régulateur dominant négatif de la fonction HIF-l. 25 Les données de la littérature sur ces isoformes sont issues d'études ayant porté sur des lignées cellulaires humaines in vitro, mais n'apportent aucune information sur l'expression de ces isoformes in vivo et sur leur 30 fonction biologique, notamment dans le cancer humain. - 5 Les travaux des inventeurs ont au contraire porté sur des biopsies de tissus humains et ont concerné l'étude de l'expression de certaines isoformes de HIF-la et de leur fonction biologique dans les pathologies avec dérégulation de l'homéostasie de l'oxygène, comme le cancer. Ils ont ainsi mis en évidence une expression différentielle des ARNm de certaines isoformes de HIF-la dans certains adénocarcinomes invasifs mammaires. En comparant les niveaux d'expression des isoformes dans des lésions bénignes et des adénocarcinomes invasifs, il est ainsi apparu, de manière surprenante, que certaines isoformes étaient surexprimées dans les adénocarcinomes invasifs. De même, il est apparu que certaines isoformes étaient indicatives d'une plus grande agressivité tumorale. On mesure l'intérêt de tels résultats qui permettent, notamment, d'améliorer l'évaluation de l'agressivité du développement d'un processus pathologique, tout particulièrement de l'agressivité tumorale et d'orienter des stratégies thérapeutiques par les équipes médicales impliquées dans le traitement de la pathologie. Ces résultats ont été également confirmés dans des situations de stress cellulaire. L'invention vise donc à fournir des biomarqueurs de 30 pathologies ou de stress cellulaires associés à des situations hypoxiques. - 6 - Elle vise plus particulièrement une nouvelle méthode de pronostic sur l'évolution d'une pathologie ou de ces stress basée sur l'utilisation de telles isoformes comme biomarqueurs. Elle porte également sur de nouveaux outils pour la réalisation de cette méthode et pour l'exploitation des résultats obtenus aux fins de suivi et de traitement de ces pathologies. Elle concerne ainsi en outre les applications médicales de cette méthode, en particulier en oncologie, avec le développement de thérapies innovantes ciblées sur les isoformes de HIF-la surexprimées comme évoqué ci-dessus. L'invention vise donc des biomarqueurs de pathologies et de stress cellulaires associés à des situations hypoxiques, caractérisés en ce qu'il s'agit d'un ou plusieurs variants d'épissage HIF-laTAC, au niveau transcriptionnel ou au niveau protéique, le motif de 3 paires de base TAG étant situé entre les exons 1 et 2. Ces biomarqueurs sont plus spécialement identifiés dans un prélèvement chez un patient provenant du tissu hypoxique analysé, désigné également ci-après � échantillon pathologique � ou dans un prélèvement de fluide biologique tel que sang ou urine, notamment pour des situations non pathologiques.30 - 7 L'invention vise aussi une méthode in vitro, pour établir un pronostic par exemple de survie d'un patient, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à un échantillon pathologique d'un patient atteint d'une maladie avec dérégulation de l'homéostasie de l'oxygène et qu'elle comprend l'utilisation comme biomarqueur, au niveau transcriptionnel ou au niveau protéique, d'un ou plusieurs variants d'épissage HIF-lîTAG, le motif de 3 paires de base TAG étant situé entre les exons 1 et 2. La méthode de pronostic de l'invention est plus particulièrement caractérisée en ce qu'elle comprend : - la quantification du ou des variants d'épissage HIF- lîTAG dans l'échantillon pathologique provenant dudit patient ; - la comparaison à une valeur de référence définie comme la valeur médiane d'une pluralité de mesures de quantification des variants d'épissage HIF-laTAG sur des échantillons pathologiques appartenant à des individus différents. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la méthode de pronostic définie ci-dessus est caractérisée en ce que la quantification porte sur les ARNm desdits variants. De manière avantageuse, la quantification est effectuée par RQ-PCR.30 Selon un autre mode de réalisation, ladite méthode de pronostic est caractérisée en ce que la quantification porte sur les variants protéiques. La quantification est alors effectuée de préférence par des méthodes immunohistochimiques, à l'aide d'anticorps spécifiques desdites isoformes. Des plaques sur lesquelles sont déposés les échantillons à analyser sont alors incubées avec les anticorps, la quantité d'anticorps fixée est avantageusement déterminée selon des techniques classiques. En variante, la quantification des variants protéiques 15 est réalisée par spectrométrie de masse. La méthode de pronostic définie ci-dessus présente un intérêt majeur dans le domaine médical et tout particulièrement en oncologie. 20 Dans le cas par exemple du cancer du sein, qui représente le cancer le plus fréquent chez la femme, dont l'incidence est en augmentation constante, l'application de la méthode de l'invention présente une valeur 25 considérable pour le suivi et la mise en place d'un traitement adapté au cas à traiter. En effet, à ce jour, seuls cinq paramètres pronostiques consensuels sont reconnus et permettent de définir trois 30 catégories de risques chez les patientes opérées d'un cancer du sein : risque � faible �, � intermédiaire � ou - 9 � élevé � de décès ou de survenue de récidive. Quatre de ces paramètres reposent sur des critères cliniques et histologiques : âge des patientes, taille tumorale, grade histologique et emboles vasculaires péritumoraux. Un seul critère repose sur un test immunochimique et correspond à l'expression de la molécule HER2/neu par les cellules tumorales évaluée à l'aide de kits commerciaux pour des techniques d'immunohistochimie ou d'hybridation in situ. Ces méthodes et produits existants ne permettent toutefois qu'une appréciation approximative du pronostic des patientes atteintes d'un cancer du sein. En particulier, la pratique montre que des patientes appartenant au groupe dit � à risque intermédiaire � reçoivent des traitements inadaptés (hormonothérapie versus chimiothérapie). Comme illustré par les résultats rapportés dans les exemples, une augmentation, dans l'échantillon pathologique (adénocarcinome invasif) testé, du taux du ou des variants HIF-laTAC quantifiés par rapport à une valeur de référence, est indicative d'une plus grande agressivité tumorale. Ainsi, selon l'état de la tumeur, ladite augmentation est indicative d'une forte probabilité de l'apparition de métastases. Dans le groupe des adénocarcinomes, le statut ganglionnaire s'est révélé associé à l'expression du variant HIF-1aT. Le grade histopronostique des tumeurs est apparu associé à l'expression totale de HIF-la, à celle des variants HIF-lîTAC et HIF-1a516 L'expression immunohistochimique par les adénocarcinomes des récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone se sont révélés inversement corrélés à l'expression des variants HIF- laTAG et HIF- la516 La méthode de pronostic de l'invention présente ainsi un grand intérêt pour évaluer le risque de développement de la maladie, le stade de la maladie, sa progression ou sa rémission dans le temps, la probabilité de métastases, la survie sans métastase, l'efficacité d'un traitement de chimiothérapie, radiothérapie et/ou hormonothérapie. La méthode de l'invention est également avantageusement utilisable dans le cas de stress cellulaires tels que ceux observés au cours de l'effort sportif, quelle que soit la catégorie d'effort. Selon un autre aspect, l'invention vise également un kit pour la mise en oeuvre de la méthode de pronostic ci-dessus. Un tel kit est caractérisé en ce qu'il comprend : - des amorces de PCR ou des anticorps anti-HIF-la TAG le 25 cas échéant immobilisés sur un support solide, - des réactifs nécessaires pour la quantification des variants d'épissage HIF-lîTAG au niveau des ARNm ou au niveau protéique. 30 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent qui font - 11 - référence aux figures 1 à 7 qui représentent, respectivement : - la figure 1, la combinaison d'amorces et de sondes utilisée pour détecter les ARNm de l'ensemble des transcrits HIF-1a et de 4 isoformes résultant d'épissage alternatif; - les figures 2 à 6, la relation entre le type de tissu et le profil d'expression des isoformes de HIF-la; - la figure 7, un graphique selon Kaplan-Meier illustrant la survie sans métastase chez des patientes atteintes d'un cancer du sein en fonction du niveau d'ARNm de HIF- laTAG . Matériels et méthodes Patients et échantillons de tissus mammaires On soumet des échantillons de tissus mammaires, obtenus conformément aux recommandations éthiques locales en vigueur, à une congélation instantanée dans de l'azote liquide. On fixe dans le formol des coupes parallèles de tissus, on les inclut dans de la paraffine à température ambiante, puis on les traite de façon habituelle. On procède à une analyse d'échantillons tissulaires prélevés sur 29 cas normaux/bénins et 53 carcinomes mammaires invasifs. On obtient des échantillons de tissus mammaires normaux à partir de tissus non tumoraux adjacents, prélevés sur des patientes traitées pour un cancer du sein. On prélève des lésions bénignes sur des patientes subissant une opération chirurgicale pour une adénose ou un adénofibrome. On diagnostique des carcinomes entre le 9 septembre 1989 et le le mai 1996. Aucune des - 12 - 53 patientes n'a fait l'objet d'une radiothérapie ou d'une chimiothérapie avant l'opération chirurgicale. La durée du suivi varie de 9 à 162 mois (moyenne = 80 mois, écart-type = 43). À des fins statistiques, on choisit un nombre approximativement égal de patientes à survie globale longue (n = 31) et à survie globale courte (n = 22). Facteurs cliniques et pathologiques On obtient le statut des ganglions lymphatiques, la taille des tumeurs, la présence d'emboles vasculaires péritumoraux ainsi que le type et le grade histologiques des tumeurs à partir de rapports pathologiques. On détermine le statut des récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone par méthode immunohistochimique sur des coupes incluses dans de la paraffine. Densité microvasculaire des tumeurs On fait prélever, par des médecins pathologistes, des fragments de tissus frais juste après le diagnostic peropératoire. On les conserve aussitôt dans de l'azote liquide à -80°C. On réalise des études d'immunodétection sur coupes tissulaires de 5 micromètres d'épaisseur (Cryostat, Leica CM 3050, Leica Microsystèmes, Rueil Malmaison, France). On effectue des réactions à l'immunoperoxydase en utilisant un anticorps monoclonal (5,6 E) anti-humain de souris CD31/PECAM (Novocastra, Tebu, Le Perray-en-Yvelines, France) et l'automate Ventana Gene II avec des kits Ventana (Ventana, Tucson, Arizona). On évalue le nombre de microvaisseaux dans les zones les plus vascularisées (appelées points chauds) en - 13 - utilisant un objectif x20 avec un microscope Zeiss Axioplan. On retient la valeur moyenne du nombre de vaisseaux des 4 champs en tant que valeur finale. Extraction de l'ARN et transcription inverse On homogénéise les tissus congelés (25 à 50 mg) dans 0,5 mL de réactif Trizol (Life Technologies), avec une matrice de lyse D, dans une machine FastPrep (Q BlOgene), pendant 6 cycles de 30 s à un réglage de 6 m/s. On ajoute du chloroforme (100 gL) à chaque échantillon et on mélange vigoureusement pendant 15 s, puis on laisse incuber pendant 3 min. à température ambiante. On sépare les phases par centrifugation (12 000 g pendant 15 min. à 4°C), et on transfère la phase aqueuse dans un tube propre. On ajoute de l'isopropanol (250 �L) à chacun des échantillons, que l'on mélange ensuite par inversion et que l'on laisse incuber pendant 10 min. à température ambiante. On récupère un culot d'ARN par centrifugation (12 000 g pendant 10 min. à 4°C), on le lave avec 1 mL d' éthanol à 75% refroidi sur de la glace, on le sèche à l'air, et on le remet en suspension dans 15 �L d'eau distillée exempte de RNase. On détermine la concentration en ARN par spectrophotométrie, en mesurant la densité optique à 260 nm. On soumet 1 gg d'ARN à une transcription inverse avec 200 U de transcriptase inverse MMLV, en suivant le protocole EAC (Gabert et al., 2003). On dilue l'ADNc final dans un volume final de 50 L. Identification des variants d'épissage (quantification)_ 30 On utilise des plasmides pCR3 contenant les séquences HIF-1î827 et HIF-1x736 avec une insertion TAG, - 14 - fournis par J. Pouyssegur (Centre Lacassagne, Nice, France). Pour les autres variants d'épissage, on amplifie l'ADNc de cellules HEK 293 en utilisant les amorces suivantes, situées dans les exons 1 et 2 : séquence sens (SEQ ID N° 1), 5'-CCGGCGGCGCGAACGACAAG-3 et séquence anti-sens (SEQ ID N° 2), 5'-TGCGAACTCACATTATGTGG-3', ou les amorces situées dans les exons 10 et 14 : 10 séquence sens (SEQ ID N° 3), 5'-TGACCCTGCACTCAATCAAG-3' et séquence anti-sens (SEQ ID N° 4), 5'-AGTAGCTGCATGTACGTCTG-3'. Les conditions de l'amplification par PCR sont : 15 35 cycles de 30 s à 95°C, 1 min. à 55°C, 1 min. à 72°C et une dernière élongation à 72°C pendant 10 min. Après l'amplification, on sépare le produit de PCR par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2%. On découpe les bandes intéressantes, on les purifie (trousse High 20 Pure Purification, Roche Diagnosis) et on les clone dans le vecteur pCRII TOPO (trousse de clonage TOPO-TA, Invitrogen). Après purification des plasmides (plasmide Nucleospin, Macherey Nagel) et vérification des séquences, on prépare des dilutions en série à 1/10 dans 25 l'ARN d'E. coli (Roche Diagnosis) afin de générer une courbe étalon de RQ-PCR. Analyse PCR quantitative en temps réel On réalise l'amplification et la quantification des 30 variants HIF-la sur le système MX3000P (Stratagene). 2927092 - 15 - La combinaison d'amorces et de sondes utilisée pour détecter les ARNm de quatre isoformes à épissage alternatif connus est illustrée sur la figure 1. Le schéma donné illustre la combinaison des amorces et 5 sondes utilisées pour la détection des ARNm de 4 variants d'épissage alternatif de HIF-la. Chaque boite représente un exon numéroté de 1 à 15. Les amorces sont désignées par une tête de flèche et les sondes par une ligne continue épaisse. L'ARNm de la séquence HIF-la de type sauvage (HIF-lawT) se compose de 15 exons et de 14 introns. Les variants indiqués dans la figure 1 sont générés par une insertion TAG entre l'exon 1 et l'exon 2 (HIF- 1x827 et HIF-lx736), par épissage alternatif des exons 13-15 (HIF-lî736), par épissage alternatif des exons 11-13 (HIF-1a557), et par épissage alternatif des exons 10-13 (HIF-1a516) Les amorces des exons 5 et 6 (étoile) sont appropriées à la quantification de tous les produits de transcription connus aujourd'hui des séquences HIF-la, y compris HIF-la"t. Les paires d'amorces des exons 13 et 15, 11 et 13, et 10 et 13 sont appropriées à la détection spécifique des variants HIF-1x736, HIF-1a557 et HIF-1î516 respectivement. Les amorces des exons 1 et 2 permettent la détection de l'ARNm des deux isoformes HIF-1î827 et HIF-1cc736 (désignées par HIF-laT dans ces résultats). Le tableau 1 détaille les séquences oligonucléotidiques des amorces et des sondes utilisées ainsi que leur position sur les exons pour détecter et - 16 - amplifier les variants d'épissage des ARNm de HIF-la. 1Fa, amorce sens ; R, amorce antisens ; P, sonde oligonucléotidique. - 17 - Tableau 1 Oligonucléotide Position Séquence (5' -> 3') Concentration des amorces et des sondes dans le (exon) mélange réactionnel (nM) Fa gTACCCTAACTAgCCgAggAAgAA 300 HIF-la 6 R gTg AAT gTg gCC TgT gCA gT 300 (toutes isoformes) jonction P Atg AAC ATA Aag TCT gCA ACA Tgg Aag gTA TTg 200 5-6 1 F gCgCgAACgACAAgAAAAATAg 50 HIF-laTA~ 2 R TggCAACTgATgAgCAAgCT 300 2 P ATgCAgCCAgATCTCggCgAAgTAAA 200 jonction F TCACTTTTTCAAgCAgTAggAATTATTTAg 600 13-15 HIF 1a736 15 R TAATTCTTCACCCTgCAgTAggTTT 600 15 P TgA CCA gTT Atg ATT gTg Aag TTA Atg CTC CTATACAAgg 200 11 F TgTggATAgTgATATggTCAATgAATT 300 HIF-1a557 13 R TAgTATCTTTggATTTAgTTCTTCCTCAgg 300 jonction P AAgCAAACCCATTTTCTACTCAgAACTACA 200 11-13 F AgACACCTAgTCCTTCCgATgg 600 HIF-1a516 13 R AAgCTAgTATCTTTggATTTAgTTCTTCCT 600 jonction AgCACTAgACAAAgTTCACCTgAgAACTaCAgT 200 10 13 - 18 - On procède en outre à une amplification du gène TBP (TATA Binding Protein). On utilise le produit de transcription du gène TBP en tant que gène de contrôle (Ginestier et al.), comme décrit précédemment (Bieche 5 et al.). On réalise les amplifications avec 5 gL d'ADNc dilué, dans un volume total de 25 gL contenant 12,5 �L de TaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems) et chacune des amorces sens et antisens ainsi que la sonde. 10 On a optimisé la concentration des amorces et des sondes pour chaque amplicon (tableau 1). Les conditions de la réaction de RQ-PCR pour l'amplification des gènes sont les suivantes : 50°C pendant 2 min., étape de dénaturation de 10 min. à 95°C 15 suivie de 50 cycles de 30 s à 95°C, 1 min d'hybridation et d'extension à 60°C pour tous les produits de transcription, sauf pour HIF-lîTA~, avec 1 min. à 62°C. On réalise les réactions de RQ-PCR en double, sur l'ADNc de chaque échantillon. On trace des courbes étalon, pour la 20 quantification, en utilisant des dilutions de plasmide spécifiques du variant d'épissage allant de 106 à 1 copies, et on détermine le nombre de copies (NC) de chaque isoforme. Afin de corriger les variations de qualité/quantité d'ARN, on exprime les résultats des 25 amplifications par RQ-PCR sous la forme du rapport NC de chaque isoforme de HIF-la/NC du gène de controle, également appelé nombre de copies normalisé (NCN), avec TBP en tant que gène de contrôle. On considère que les échantillons contenant un NC de TBP Analyse statistique On évalue les différences entre les groupes d'échantillons de tissus mammaires (tissu normaux ou lésions bénignes/carcinome canalaire/carcinome lobulaire) en termes de leur concentration en ARNm de HIF-la, en utilisant le test ANOVA et le test post-hoc de Bonferroni. Étant donné que le niveau d'expression des échantillons de cancer du sein présente une distribution non Gaussienne, on utilise des tests non paramétriques (de Spearman, Mann-Whitney et Kruskal-Wallis) pour l'analyse de la corrélation avec les paramètres cliniques et pathologiques. La survie sans métastase est calculée comme l'intervalle de temps séparant la date de chirurgie et la date de survenue des métastases. On utilise le test du log-rank de Kaplan-Meier et les modèles de régression (univariée et multivariée) de Cox pour comparer la survie et identifier des prédicteurs de survie. p Résultats Paramètres cliniques et pathologiques Les caractéristiques des tissus sont résumées dans le tableau 2. On prélève des tissus mammaires normaux ou lésions bénignes sur 29 patientes âgées de 12 à 79 ans (moyenne = 44,7 ans, écart-type = 16,9). Les échantillons - 20 - tumoraux sont des adénocarcinomes invasifs de 53 patientes souffrant de cancer du sein précoce (stade I, II ou III), diagnostiqué entre le 9 septembre 1989 et le le mai 1996, dans le Service de gynécologie oncologique de l'Hôpital de la Conception à Marseille. On prélève les échantillons tumoraux sur des patientes âgées de 30 à 84 ans (moyenne = 54 ans, écart-type = 11,4). On identifie chacune des zones respectives au microscope et les échantillons mammaires sont disséqués par le médecin pathologiste juste après exérèse, avant d'être soumis à une congélation instantanée dans de l'azote liquide. A des fins statistiques, on choisit un nombre approximativement égal de patientes à survie globale longue (> 90 mois) (n = 31) et à survie globale courte � 60 mois) (n = 22). La taille moyenne des tumeurs est de 23,47 mm (écart-type = 12,3) et 3 tumeurs ont une largeur 10 mm et 20 mm et 50 mm, et 2 ont une largeur > 50 mm. On procède à un examen histologique des échantillons chirurgicaux sur des coupes incluses dans de la paraffine colorées à l'hématoxyline-éosine-saffran. Les tumeurs correspondent à des carcinomes canalaires (n = 41) et à des carcinomes lobulaires (n = 12). On réévalue le grade des tumeurs, initialement évalué selon le score de Scarff Bloom et Richardson, en utilisant le score de Elston et Ellis. On trouve une moyenne de 16,9 (écart-type � 5,1) ganglions lymphatiques dans l'excision des ganglions axillaires, et 22 patientes ont des ganglions métastatiques. Toutes les patientes subissent une excision au niveau des ganglions axillaires, combinée à une excision locale large avec marges de sécurité ou à - 21 - une mastectomie, dans le même service. Le traitement post-chirurgical comprend une radiothérapie et une chimiothérapie pour les tumeurs larges et/ou de stade avancé, réalisées par le même groupe d'oncologues. La durée du suivi varie de 9 à 162 mois. Les registres de 2004 montrent que, sur 53 patientes, 22 patientes ont rechuté, parmi lesquelles 18 sont décédées, et 7 ont survécu. On calcule la survie sans métastases comme étant la durée après l'opération jusqu'à la date d'apparition de métastases. - 22 -Tableau 2 Répartition des caractéristiques cliniques et pathologiques de patientes atteintes de cancer du sein Paramètre Nb de patientes Nb de patientes présentant des métastases Âge, années - 10 Taille de la tumeur (mm) 50 Grade histologique 1 2 3 Type histologique tubulaire lobulaire Invasion vasculaire péritumorale (EB) absente présente Statut des ER ER (+) ER (-) Statut des PR PR (+) PR (-) 21 30 25 11 4 7 3 25 23 2 9 26 17 41 12 12 40 32 16 26 24 8 13 1 13 8 18 4 4 18 10 10 6 16 - 23 - Niveau d'expression différentielle des variants d'épissage de HIF-la dans les tissus mammaires normaux ou lésions bénignes et les adénocarcinomes On détermine le niveau d'expression des ARNm de HIF-la dans chacun des 82 échantillons de tissus mammaires normaux ou lésions bénignes et des adénocarcinomes. On détecte des variants d'épissage de HIF-la dans tous les échantillons de tissus normaux ou lésions bénignes et des adénocarcinomes du sein à des niveaux variables. Les figures 2 à 6 donnent la distribution des niveaux d'expression des ARNm de HIF-la pour chaque catégorie de tissu. L'ARNm de HIF-laTAC est l'isoforme la plus dominante de tous les produits de transcription de HIF-la dans l'ensemble des tissus, alors que l'on ne trouve que de faibles niveaux des isoformes de HIF-1a736, HIF-la516 et HIF-la557. Le niveau d'expression de l'ARNm des variants d'épissage HIF-laTAC est similaire au niveau d'expression totale des séquences HIF-la. Le niveau d'expression de l'ARNm des variants d'épissage de HIF-la736 et HIF-1a516 est 100 fois inférieur à celui de HIF-laTZ, et le niveau d'expression de l'ARNm du variant HIF-la557 est 1 000 fois inférieur à celui de HIF-laTAG On n'observe aucune différence statistiquement significative du niveau d'expression totale des séquences HIF-la entre les tissus normaux ou lésions bénignes et les adénocarcinomes (figure 2). De même, le niveau d'expression des ARNm de HIF-laTAC et de HIF-1a557 est similaire entre les deux catégories de tissus (figures 3 et 4). Il est intéressant de noter que le niveau des ARNm de HIF-1a516 est plus - 24 - élevé dans le groupe des carcinomes canalaires que dans celui des tissus normaux ou lésions bénignes (p = 0,012) (figure 5), bien que leur niveau d'expression soit très faible et qu'on l'augmente de façon très modeste. Les ARNm de HIF-lî736 ont tendance à présenter une corrélation avec le phénotype malin, mais sans signification statistique (p = 0,053) (figure 6). Corrélation entre les variants d'épissage de HIF-la et les caractéristiques clinicopathologiques des tumeurs On étudie ensuite la présence de corrélations entre le niveau d'ARNm des variants de HIF-lî et les caractéristiques clinicopathologiques des tumeurs dans le but de tester certaines hypothèses concernant la fonction. On détermine le niveau d'ARNm de chaque variant de HIF-la dans des échantillons tumoraux de 53 patientes atteintes de cancer du sein, et on le compare au statut des ganglions lymphatiques, au grade de la tumeur, à la taille de la tumeur, au statut des récepteurs aux œstrogènes (ER) et au statut des récepteurs à la progestérone (PR). On le compare également à la densité microvasculaire des tumeurs. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 3. Le tableau 3 ci-après donne plus particulièrement les caractéristiques clinicopathologiques et la densité microvasculaire des tumeurs ainsi que la relation qui existe avec le niveau d'ARNm des variants d'épissage de HIF-la (n = 53). - 25 - Tableau 3 Caractéristique Nb de HIF-la P HIF-laTAG P HIF-1a75 P HIF-1a516 P HIF-1a557 P patientes total moyenne (écart- moyenne moyenne moyenne moyenne type) (écart-type) (écart- (écart- (écart- type) type) type) Statut des ganglions lymphatiques 25 10 (9) NS 10,9 (10,9) 0,037 0,19 (0,29) NS 0,02 (0,03) NS 0,003 (0,006) NS négatif positif 22 12,8 (7,8) 21,1 (19,21) 0,26 (0,28) 0,03 (0,03) 0,002 (0,002) Taille de la tumeur 28 10,2 (8,3) NS 12,4 (13,2) NS 0,17 (0,26) NS 0,02 (0,03) NS 0,003 (0,005) NS _0 20 mm > 20 mm 25 11,8 (8,3) 17,3 (17,4) 0,25 (0,28) 0,02 (0,02) 0,002 (0,002) Grade 35 9,2 (7,7) 0,048 11,8 (12,34) 0,048 0,19 (0,3) NS 0,02 (0,02) 0,02 0,002 (0,002) NS 1, 2 3 17 14,6(8,7) 21,48 (19,4) 0,23 (0,2) 0,03 (0,03) 0,004 (0,007) Emboles vasculaire 12 8 (9) 0,028 9,64 (10,1) NS 0,19 (0,36) NS 0,01 (0,02) 0,008 0,002 (0,002) NS péritumoraux absent présent 40 11,9 (8,06) 16,6 (16,6) 0,20 (0,24) 0,03 (0,03) 0,003 (0,005) Statut des récepteurs 16 14,2 (7,3) 0,024 20,8 (11,9) 0,005 0,25 (0,19) 0,06 0,03 (0,03) 0,002 0,004 (0,007) 0,015 aux oestrogènes négatif positif 32 10 (8,8) 12,7 (17,1) 0,20 (0,31) 0,02 (0,02) 0,002 (0,002) Statut des récepteurs à 24 11,8 (7,3) NS 20,08 (17,8) 0,033 0,23 (0,19) 0,08 0,03 (0,03) 0,012 0,004 (0,006) 0,08 la progestérone négatif positif 26 10,8 (9,4) 11,3 (12,3) 0,2 (0,34) 0,01 (0,01) 0,002 (0,002) Densité microvasculaire NS NS NS NS NS de la tumeur (faible/forte) - 26 - Le statut des ganglions lymphatiques est significativement associé au niveau d'ARNm de HIF-laTAG seulement (p = 0,037). On trouve une association à signification statistique entre le grade de la tumeur et le niveau d'ARNm total des séquences HIF-la (p = 0,048), de HIF-laTAC (p = 0,048) et de HIF-1as16 (p = 0,02). La présence d'emboles vasculaires péritumoraux est corrélée avec le niveau d'ARNm total des séquences HIF-la (p = 0,028) et avec le niveau d'ARNm de HIF-1a516 (p = 0,008). On observe également, de façon particulièrement intéressante, que les niveaux d'ARNm de HIF-laTAG et de HIF-1a516 sont inversement corrélés avec le statut des ER et des PR. On ne trouve aucune association significative entre les niveaux d'ARNm de HIF-la étudiés et la taille ou la densité microvasculaire des tumeurs. Expression des variants d'épissage de HIF-la et survie des patientes La force de l'association des caractéristiques clinicopathologiques des tumeurs (statut des ganglions lymphatiques, taille de la tumeur, grade de la tumeur, emboles vasculaires péritumoraux, statut des ER et des PR, densité microvasculaire de la tumeur) et du niveau d'expression des ARNm de HIF-la avec la survie sans métastases est présentée dans le tableau 4 ci-dessous. Ce tableau donne les résultats d'une analyse de la survie sans métastases basée sur une régression univariée et multivariée de Cox, chez des patientes atteintes de cancer du sein, en tenant compte des paramètres clinicopathologiques, de la densité microvasculaire de la tumeur et du niveau des ARNm de HIF-la. - 27 - Tableau 4 Caractéristiques Analyse univariée P Analyse multivariée P Exp. B (IC = 95%) Exp. B (IC = 95%) Age, ans 50 2,5 [0,16-40] 9,1 [0,3-287] Grade (SBR) 0,52 1, 2 1 3 1,33 [0,55-3,22] Emboles vasculaire péritumoraux (EB) 1 0,15 absent présent 2,43 [0,71-8,27] ER 0,379 [0,15-0,94] 0,035 positif négatif 0,228 [0,08-0,64] 0,004 0,19 [0,04-0,81] 0,025 PR positif négatif 1,022 [0,99-1,057] 0,20 Densité microvasculaire de la tumeur Niveau des ARNm de HIF-laTAG 1,03 [1,003-1 , 05] 0,03 0,98 [0,95-1 ] 0,164 Les résultats obtenus montrent que le statut des ganglions lymphatiques (p = 0,003), le statut des récepteurs aux oestrogènes (ER) (p = 0,035), le statut des récepteurs à la progestérone (p = 0,004) et le niveau des ARNm de HIF-laTA (p = 0,03) sont significativement prédictifs de la survie sans métastases. Les patientes atteintes de cancer du sein qui présentent un haut niveau d'expression d'ARNm de HIF-laTAC (seuil médian = 9,95) ont beaucoup plus de risques de rechuter. Le niveau d'expression des autres produits de transcription de HIF-la n'est pas associé au pronostic (non représenté). L'analyse multivariée de Cox permet de déterminer que le statut des ganglions lymphatiques (p = 0,002) et le statut des PR (p = 0,025) sont des prédicteurs indépendants de la survie sans métastases. Le niveau d'ARNm de HIF-laTAG n'est pas une variable pronostique indépendante significative. La figure 7 est un graphique selon Kaplan-Meier pour des patientes atteintes de cancer du sein et il illustre la survie sans métastases en fonction du niveau d'ARNm de HIF-laTAc (seuil médian = 9,95) chez les patientes atteintes de cancer du sein (p = 0,03). REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1 - Gabert J, Beillard E, van der Velden VH, Bi W, Grimwade D, Pallisgaard N, Barbany G, Cazzaniga G, Cayuela JM, Cave H, Pane F, Aerts JL, De Micheli D, Thirion X, Pradel V, Gonzalez M, Viehmann S, Malec M, Saglio G, van Dongen JJ. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia 2003; 17: 2318-2357. 2 - Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Penault-Llorca F, Geneix J, Adélaïde J, Chaffanet M, Mozziconacci MJ, Hassoun J, Viens P, Birnbaum D, Jacquemier J. Comparative multi-methodological measurement of ERBB2 status in breast cancer. J Pathol. 2004;202(3):286-98. 3 - Bièche I, Laurendeau I, Tozlu S, Olivi M, Vidaud D, Lidereau R, Vidaud M. Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumors with a real-time reverse transcription-PCR assay. Cancer Res. 1999;59(12):2759-65. REVENDICATIONS 1 - Utilisation comme biomarqueurs au niveau transcriptionnel ou au niveau protéique de pathologies ou du stress cellulaire associés à des situations hypoxiques, d'un ou plusieurs variants d'épissage HIF-laTAC, le motif TAG étant situé entre les exons 1 et 2. 2 - Méthode in vitro de pronostic de survie d'un patient, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à un échantillon pathologique d'un patient atteint d'une pathologie avec dérégulation de l'homéostasie de l'oxygène et qu'elle comprend l'utilisation comme biomarqueur, au niveau transcriptionnel ou au niveau protéique, d'un ou plusieurs variants d'épissage HIF-lîTAC, le motif TAG étant situé entre les exons 1 et 2. 3 - Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la quantification du ou des variants d'épissage dans 20 l'échantillon provenant dudit patient ; - la comparaison à une valeur de référence définie comme la valeur médiane d'une pluralité de mesures de quantification des variants d'épissage HIF-lîTAG sur des échantillons pathologiques appartenant à des individus différents. 25 4 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la quantification porte sur les ARNm desdits variants. 30 5 - Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que la quantification est effectuée par RQ-PCR. 6 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la quantification porte sur les variants protéiques. 7 - Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que la quantification est effectuée par des méthodes d'immunohistochimie, à l'aide d'anticorps ou par spectrométrie de masse. 8 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle est appliquée en oncologie. 9 - Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à un échantillon de tissu de cancer du 15 sein. 10 - Méthode selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce qu'une augmentation, dans l'échantillon testé, du taux du ou des variants quantifiés par rapport à une valeur de référence, 20 est indicative d'une agressivité tumorale. 11 - Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite augmentation est indicative d'une forte probabilité de métastases. 12 - Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, pour mesurer l'efficacité d'un traitement. 30 13 - Kit pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend : - des amorces de PCR ou des anticorps anti-HIF-la TAC le cas échéant immobilisés sur un support solide, 25- des réactifs nécessaires pour la quantification des variants d'épissage HIF-laTZ au niveau des ARNm ou au niveau protéique.