FR 2926548 A1 20090724 FR 0850372 A 20080121 /65 ENCAPSULATION DE LA VITAMINE C DANS DES DENDRIMÈRES SOLUBLES DANS L'EAU DESCRIPTION 5 Domaine technique [1] La présente invention se rapporte à l'encapsulation de la vitamine C à l'aide de dendrimères solubles dans l'eau, ainsi, notamment, 1 o qu'à son procédé de préparation. [2] L'utilisation de ce dendrimère encapsulant la vitamine C concerne par exemple les domaines de la pharmacie, de la cosmétique, de la chimie organique, ainsi que celui de la chimie verte. [3] Dans la description ci-dessous, les références entre 15 parenthèses (X) renvoient à la liste des références présentées après les exemples. État de la technique 20 [4] Comme son nom l'indique, un dendrimère est une molécule dont l'architecture reprend celle des branches d'un arbre. Il s'agit en effet d'une macromolécule de structure tridimensionnelle, apparentée à un polymère hyperbranché, constituée de monomères qui s'associent selon 25 un processus arborescent autour d'un coeur central multivalent. [5] Les dendrimères prennent généralement une forme globulaire très régulière ou sphérique, hautement ramifiée et plurifonctionnalisée. Ils sont constitués de trois régions spécifiques : -un coeur central multivalent, 30 - un nombre défini (constituant la multivalence) de branches dendritiques intermédiaires connectées au coeur central multivalent /65 où chaque branche dendritique est constituée d'un certain nombre de génération de ramification, - et la périphérie constituée d'une multitude de groupes terminaux fonctionnels. [6] Ces molécules présentent à la fois des cavités internes et un grand nombre de groupements terminaux à la périphérie, facilement accessibles, qui peuvent être responsables de propriétés et de réactivités très variées. [7] On peut citer par exemple le document de Tomalia et al. Macromolécules (1986) 19, page 2466 (1) qui décrit la construction des premiers dendrimères solubles dans l'eau. [8] Les dendrimères sont construits étape par étape à l'aide d'une succession de séquences, chacune aboutissant à une nouvelle génération. Le contrôle structural est déterminant pour les propriétés spécifiques de ces macromolécules. [9] Les dendrimères prennent généralement une forme globulaire très régulière ou sphérique, hautement ramifiée et plurifonctionnalisée. En outre, la taille des dendrimères est généralement monodisperse contrairement aux polymères hyperbranchés. Mais ceci nécessite des méthodes de synthèse autres que des polymérisations ordinaires. En effet, la synthèse des dendrimères est difficile car elle nécessite de nombreuses étapes pour protéger l'emplacement actif, ce qui est un obstacle à la synthèse de quantités importantes. De plus, l'obtention de dendrimères avec des arborescences multiples définies et/ou fonctionnalisées de façon spécifique est un vrai défi pour les chimistes car elle exige des réactions quantitatives et propres afin d'éviter les mélanges sur les branches. [10] Ainsi, ces macromolécules sont ajustables : leur structure, leur flexibilité, leur porosité et leur morphologie peuvent être optimisées afin d'obtenir les propriétés recherchées. Le contrôle de l'architecture des dendrimères et la nature chimique des branches terminales qui peuvent ainsi assurer diverses fonctions suscitent un intérêt croissant pour de 2926548 3/65 nombreuses applications très prometteuses, notamment dans le domaine de la médecine comme décrit par exemple dans l'article de Astruc, C.R. Acad. Sci. (1996), 322, Serie 2b, pages 757-766 (2), mais aussi de l'agroalimentaire, des arômes, de la peintures, de la catalyse, de la 5 décontamination, de la thérapie génique, la thérapie photodynamique, des capteurs biologiques, des nanoélectroniques, etc. [11] D'autre part, la vectorisation de molécules actives est aujourd'hui un enjeu majeur dans les domaines pharmaceutiques et 1 o cosmétiques, comme décrit par exemple dans la publication de Vandamme et al., J. Control. Release (2005), 102(1), pages 23-38 (3). Elle correspond au transport de molécules actives jusqu'à un site d'action ce qui permet de moduler la pharmacocinétique et la biodistribution de ces molécules en favorisant leur présence au niveau des sites d'action tout en limitant leur 15 toxicité ou impact sur les tissus sains. De plus, la vectorisation permet une protection des molécules actives vis-à-vis du milieu dans lesquelles elles sont introduites en évitant par exemple leur métabolisation ou leur dégradation, comme décrit par exemple dans la publication de Zhuo et al. J. Control. Release (1999) 57, page 249 (4). 20 [12] Les vitamines sont d'un grand intérêt, notamment pour les industriels dans les domaines pharmaceutiques et cosmétiques. En effet, elles interviennent dans de nombreux processus biologiques et physiologiques et sont essentielles pour l'organisme. A titre d'exemple, la vitamine C, ou acide ascorbique (AA) a de nombreuses propriétés. Connue 25 pour ses actions tonifiantes et anti-fatigue, elle intervient par exemple dans la synthèse des globules rouges et contribue au système immunitaire. Ainsi, elle participe aux défenses de l'organisme et joue ainsi un rôle dans la lutte contre les infections. La vitamine C favorise également l'absorption du fer, ce qui permet de prévenir l'apparition d'anémie. Elle est également 30 requise dans la synthèse du collagène de la peau et est essentielle à la cicatrisation des plaies. C'est aussi un anti-oxydant et antiradicalaire /65 puissant qui permet de protéger l'organisme des radicaux libres, de prévenir la dégradation oxydative et le vieillissement. Ainsi, ces applications, notamment cosmétiques sont nombreuses, stimulant également le métabolisme cellulaire et ayant un effet photoprotecteur. [13] Cependant, certaines vitamines, et notamment la vitamine C, ne peuvent être synthétisées par l'organisme humain, d'où la nécessité d'un apport exogène. [14] En outre, les vitamines sont des composés fragiles, facilement dégradés par la lumière, la chaleur, l'oxygène de l'air, etc. En particulier, la 1 o vitamine C, la plus fragile parmis toutes les vitamines, est peu stable en solution et est rapidement éliminée par l'organisme. Les produits pharmaceutiques et cosmétiques existants ont donc un temps d'utilisation limité. Pour pallier ce problème d'instabilité, ils utilisent une formulation très différente qui ne permet pas un relarguage modulé. De plus, cette 15 molécule n'étant actuellement pas vectorisée, sa dispersion est non contrôlée et non-spécifique. [15] Il existe donc un réel besoin de disposer de nouveaux composés permettant de vectoriser et de contrôler la libération de 20 molécules actives, en particulier des actifs cosmétiques et notamment des vitamines, par exemple la vitamine C. [16] En outre, il existe un réel besoin de disposer de composés biocompatibles, de faible toxicité, d'architecture définie, de taille et de forme contrôlée, de capacité de charge élevée, de fonctionnalisation 25 spécifique afin d'optimiser l'encapsulation de vitamine C. [17] En outre, il existe un réel besoin pour un procédé permettant d'encapsuler la vitamine C avec de bons rendements, de préserver l'environnement et de réduire les coûts d'obtention de ces composés. 30 /65 Description de l'invention [18] La présente invention a précisément pour but de répondre à ces besoins et inconvénients de l'art antérieur en fournissant un dendrimère conjugué comprenant au moins un dendrimère soluble dans l'eau encapsulant au moins une molécule de vitamine C. [19] On entend par dendrimère conjugué, au sens de la présente invention, l'association d'au moins un dendrimère soluble dans l'eau avec au moins une molécule de vitamine C. En outre, une molécule de vitamine 1 o C peut être associée à un ou plusieurs dendrimères qui peuvent être identiques ou différents, par exemple si les chaînes PEG de différents dendrimères participent à la stabilisation des molécules de vitamine C. [20] En effet, les dendrimères solubles dans l'eau selon la présente invention semblent être des vecteurs appropriés pour le transport de 15 molécules de vitamine C, c'est-à-dire d'acide ascorbique, grâce à leur multivalence contrôlée qui peut être utilisée à la fois pour attacher une ou plusieurs substances ainsi que des groupes ciblants et solubilisants à la périphérie. Cet attachement peut être réalisé par des liaisons supramoléculaires qui permettent le maintien des molécules de vitamine C 2o au coeur et à la périphérie des dendrimères. [21] Les dendrimères de la présente invention peuvent se comporter comme des vecteurs de la vitamine C. La vectorisation vise à modifier la stabilité et les propriétés pharmacocinétiques des principes actifs transportés telles que le franchissement de barrières anatomiques, 25 physiologiques, leur ciblage. Les caractéristiques particulières des dendrimères, et leur forme globulaire, font de ces nouvelles architectures moléculaires des transporteurs idéaux de molécules chargées. En effet ces molécules peuvent être utilisées dans un grand nombre d'applications incluant le contrôle du relâchement de produits pharmaceutiques ou 30 encore cosmétiques. 2926548 6/65 [22] Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le dendrimère soluble dans l'eau peut avoir une structure radiale symétrique. [23] En effet, les inventeurs ont réalisé des dendrimères dits � parfaits �. On entend par dendrimère � parfait � au sens de la présente 5 invention, un dendrimère de structure symétrique qui ne possède pas de défaut, avec une fonctionnalisation totale et uniforme des branches. La haute symétrie de l'architecture des dendrimères a été vérifiée par différentes méthodes de caractérisations (RMN, masse, etc.). Ces données sont exposées dans la partie � Exemples �. [24] Les dendrimères de structure symétrique ont l'avantage de pouvoir être parfaitement contrôlés et caractérisés, avec des résultats reproductibles, ce qui est essentiel pour une transposition au niveau industriel. Cependant des dendrimères � imparfaits � peuvent également encapsuler des molécules de vitamine C. On entend par dendrimère � imparfait � au sens de la présente invention un dendrimère qui n'entre pas dans la définition du dendrimère dit � parfait �. [25] En outre, selon l'invention, le dendrimère soluble dans l'eau peut être constitué de g générations, g étant un nombre entier allant de 0 à 2o 10, de préférence de 0 à 4, afin de respecter une taille admissible dans l'organisme. [26] On entend par génération, au sens de la présente invention, une répétition d'unités de branchement ou monomères organisés en couche autour du coeur central. Une génération est comptée à partir de chaque 25 division d'une branche en au moins deux branches. Le nombre de génération g du dendrimère correspond au nombre de couches concentriques de monomère, mais peut également correspondre au nombre de séquences nécessaires à la synthèse du dendrimère. [27] Le nombre de génération g du dendrimère induit une taille 30 précise du dendrimère et joue également un rôle important sur la conformation du dendrimère. 2926548 7/65 [28] Avantageusement, le dendrimère soluble dans l'eau peut avoir une structure globulaire. Il peut s'agir par exemple d'une structure en lobe, d'une structure elliptique, d'une structure sphérique, parfaite ou non parfaite, de préférence d'une structure sphérique parfaite. 5 [29] En effet, les dendrimères ont une topologie dendritique c'est à dire une architecture construite selon un processus arborescent autour d'un coeur central plurifonctionnel, analogiquement à un réseau neuronal dendritique. Les unités branchées sont des monomères répétés organisés en couches, encore appelées générations. Selon les dendrimères, au delà 10 d'un certain nombre de générations, ils peuvent prendre une forme globulaire si les segments moléculaires sont flexibles. [30] Les dendrimères de structure globulaire présentent l'avantage de pouvoir accueillir des molécules au sein de leurs cavités avec une plus grande capacité. En effet, la topologie dendritique impose des cavités 15 dynamiques absentes dans un polymère linéaire par exemple, dont la topologie est différente. On entend par � cavités � au sens de la présente invention les espaces présents entre les branches des dendrimères. Un dendrimère n'étant pas figé en solution, les cavités peuvent être dynamiques du fait du mouvement des branches au sein de la solution, guidé par le mouvement Brownien. [31] A titre d'exemple, le tableau 1 comparatif suivant détaille les différentes propriétés d'un polymère linéaire et d'un dendrimère. Ainsi, selon les critères souhaités, le dendrimère peut être préféré pour obtenir les différentes propriétés ci-dessous qui diffèrent de celles d'un polymère linéaire. 2926548 8/65 POLYMERE LINEAIRE DENDRIMERE Forme pelote sphérique globulaire Viscosité faible forte Cristallinité haute amorphe Réactivité faible forte Compressibilité forte faible Contrôle structural faible très forte Tableau 1 [32] En particulier, l'avantage principal d'un dendrimère globulaire par rapport à un polymère linéaire est la taille de ses cavités internes qui 5 peuvent être optimisée pour acceuillir de grosses molécules. En effet, Dans le cas du dendrimère, les cavités peuvent être larges et organisées de façon à permettre de plus grandes capacités d'accueil ou d'encapsulation. Au contraire, dans un polymère linéaire replié en pelote sphérique, la structure est aléatoire et les cavités ne sont pas optimisées. 10 [33] Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le dendrimère soluble dans l'eau peut présenter un diamètre inférieur à 200 A, de préférence de 10 A à 50 A. Ce diamètre dépend de la génération du dendrimère. [34] Le dendrimère soluble dans l'eau de la présente invention peut être par exemple un dendrimère de formule (I) suivante : 15 (M1)û(M2)2û [(BT)P 20 Formule (I) dans laquelle : (a) A est le coeur central du dendrimère, de multivalence k, où : - k est un nombre entier allant de 2 à 9 ; 2926548 9/65 - A est un radical choisi dans le groupe comprenant un hétéroalkyle en CI à C22, un phényl substitué par un ou plusieurs groupes hétéroalkyles en CI à C60, le radical A pouvant éventuellement comprendre un ou plusieurs carbone substitué par un groupement oxo (C=0) ; (b) Mi est un monomère de génération i, où : - i est un nombre entier allant de 0 à g, g étant le nombre de génération du dendrimère ; - lorsque i=0, Mi est inexistant, la branche terminale BT est alors directement reliée au coeur central A ; -lorsque i>O, Mi est un radical hétéroalkyle en CI à C22, dans lequel un ou plusieurs carbone peut éventuellement être substitué par un groupement oxo (C=O), par exemple Mi peut être un radical ù(CH2),ùN* ou un radical ù(CH2)aùC(=O)ùNHù(CH2)bùN* avec a et b sont des nombres entiers de 1 à 6 et le symbole * désigne le point d'attachement du radical Mi au avec le monomère de génération supérieure ; (c) BT est la branche terminale, et p le nombre de motifs terminaux issus du monomère de génération inférieure où : 20 - p est un nombre entier allant de 1 à 3, de préférence p est 2 ou 3, de préférence p est 3 ; - BT est un radical choisi dans le groupe comprenant un hydrogène, un groupement ùNH2, un groupement ammonium, un groupement ùOH, un hétéroalkyle en CI à 25 C22, un phényl substitué par un ou plusieurs groupes hétéroalkyles en CI à C60, le radical BT pouvant éventuellement comprendre un ou plusieurs carbone substitué par un groupement oxo (C=0) ; par exemple, BT peut être un radical ùC(=O)ùCH2ù0ù(CH2)2ù0ù(CH3) ou un radical ùC(=O)ùPh((OC2H4)3ùOCH3)3 ; 5 10 15 2926548 10/65 [35] Par � multivalence �, on entend au sens de la présente invention, le nombre de branches dendritiques reliées au coeur central du dendrimère. [36] Par � branche dendritique �, on entend au sens de la présente 5 invention, une branche ramifiée. En particulier, elle peut être constituée d'un enchaînement de monomères Mi, identiques ou différents, où chaque ramification entre les monomères se divise en deux branches ou plus. [37] Par � dendron �, on entend au sens de la présente invention, une branche dendritique hyperramifiée. 10 [38] On entend par � alkyle � au sens de la présente invention, un radical carboné linéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé, éventuellement substitué, comprenant 1 à 60 atomes de carbone, par exemple 1 à 57 atomes de carbone, par exemple 1 à 28 atomes de carbone, par exemple 1 à 22 atomes de carbone, par exemple 1 à 6 15 atomes de carbone. [39] On entend par � alcène � au sens de la présente invention, un radical alkyle, tel que défini précédemment, présentant au moins une double liaison carbone-carbone. [40] On entend par � alcyne � au sens de la présente invention, un 20 radical alkyle, tel que défini précédemment, présentant au moins une triple liaison carbone-carbone. [41] On entend par � aryle � au sens de la présente invention, un système aromatique comprenant au moins un cycle satisfaisant la règle d'aromaticité de Hückel. Ledit aryle est éventuellement substitué, peut être 25 mono ou polycyclique et peut comprendre de 6 à 10 atomes de carbone. [42] On entend par � hétéroalkyle � au sens de la présente invention, un radical alkyle tel que défini précédemment, ledit système alkyle comprenant au moins un hétéroatome, notamment choisi dans le groupe comprenant le soufre, l'oxygène, l'azote, le silicium. 30 2926548 11/65 [43] Selon l'invention, les dendrimères solubles dans l'eau peuvent par exemple présenter à leur surface des fonctions hydrophyles et/ou peu hydrophobes.. [44] Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le 5 dendrimère soluble dans l'eau peut présenter à sa périphérie principalement des fonctions amines primaires libres ou des fonctions ammoniums. [45] En effet, les dendrimères comprenant des amines primaires libres ou des fonctions ammoniums en périphérie présentent l'avantage de 1 o pouvoir réagir soit de manière supramoléculaires avec l'acide ascorbique, comme démontré dans la partie exemples, soit de manière covalente avec d'autres groupements chimiques afin de modifier la périphérie du dendrimère et donc ses propriétés. Par exemple, il peut s'agir de dendrimères comprenant un coeur DiAminoButane (DAB) et des branches 15 poly(propylène)imines (PPI), comme par exemple les dendrimères décrits dans les figures 1 à 4, ou de dendrimères poly(amido)amines (PAMAM), comme par exemple les dendrimères décrits dans les figures 5 à 9. [46] Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le dendrimère soluble dans l'eau peut avoir l'une des structures suivantes : le 20 DAB G2 (figure 1), le DAB G3 (figure 2), le DAB G4 (figure 3), le DAB G5 (figure 4), le PAMAM GO (figure 5), le PAMAM G1 (figure 6), le PAMAM G2 (figure 7), le PAMAM G3 (figure 8), le PAMAM G4 (figure 9), etc. [47] Certains de ces dendrimères sont commerciaux, par exemple les dendrimères DAB G2, DAB G3, DAB G5, PAMAM G1 et PAMAM G4 25 sont commercialisés par la société Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Chemie S.a.r.l., L'Isle d'Abeau Chesnes, 38297 Saint-Quentin Fallavier, France), respectivement sous les références N° 679895 (DAB G2), N° 469076 (DAB G3), N° 469092 (DAB G5), N° 597414 (PAMAM G1) et N° 597856 (PAMAM G4). 30 /65 [48] Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le dendrimère soluble dans l'eau peut être fonctionnalisé à sa périphérie avec au moins un agent de surface organique. [49] On entend par � agent de surface � selon l'invention une molécule présente à la surface du dendrimère permettant de moduler ses propriétés de surface, par exemple : - de modifier sa solubilité - de moduler sa toxicité et sa biodistribution, par exemple pour éviter sa reconnaissance par le système réticulo endothélial (� furtivité �), et/ou - de lui conférer des propriétés de bioadhésion intéressantes lors de l'administration par voies orale, oculaire, nasale, et/ou - de lui permettre un ciblage spécifique de certains organes/tissus, etc. [50] Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'agent de surface organique peut être sélectionné dans le groupe comprenant : une molécule pharmaceutique, une molécule de ciblage ou un groupement solubilisant. [51] Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'agent de surface organique peut être un groupement solubilisant à chaînes polyéthylène glycol. [52] En effet, la fonctionnalisation de ces dendrimères avec différents groupements organiques contenant des chaînes polyéthylènes glycols permet d'améliorer la solubilité dans l'eau de ces macromolécules comme décrit dans le document de Liu et al. J. Polym. Sc/.: part A : Polym. Chem. (1999), page 3492 (5), ainsi que la biocompatibilité. Par ailleurs, de façon surprenante, en plus de ces caractéristiques essentielles pour un produit destiné à une utilisation biologique, ces macromolécules se sont révélées être de meilleurs vecteurs moléculaires par leur rendement d'encapsulation. En outre, ces vecteurs moléculaires peuvent être modifiés /65 à souhait de manière à optimiser l'encapsulation des molécules de vitamine C. [53] Selon un mode de réalisation plus particulier de l'invention, l'agent de surface organique peut être un groupement solubilisant répondant à l'une des structures (II) ou (III) suivantes : O k O 0-R n Structure (II) Structure (III) dans lesquelles : - n, ni, n2 et n3 représentent indépendamment un nombre entier de 1 à 500, et - R, RI, R2 et R3 représentent indépendamment un alkyle en CI à C6, 15 un alcène en C2 à C6, un alcyne en C2 à C6, ou un aryle en C6 à Cao éventuellement substitué. [54] Selon un mode de réalisation plus particulier de l'invention, le groupement solubilisant peut répondre à l'une des structures (IV) ou (V) 2o suivantes dans lesquelles : O OO n 00R3 n3 Structure (IV) 2926548 14/65 Structure (V) 5 dans lesquelles n, ni, n2 et n3 représentent 1 ou 3, de préférence, n représente 1 et ni, n2 et n3 représentent 3 ; [55] Par exemple, le dendrimère soluble dans l'eau selon l'invention peut être un DAB-dendrimère ou un PAMAM-dendrimère fonctionnalisé par le dendron pentafluorophényl tris 3,4,5-tri(triéthylèneoxy)benzoate (ou 10 PentaFluoroPhényl tris 3,4,5-Tri(TriEthylèneGlycol)benzoate ou PFPTTEG) ou par le dendron 2,2-(méthoxyéthoxy)acétylchloride (MEAC). Par exemple, il peut s'agit du DAB G3 fonctionnalisé par le dendron MEAC (figure 10) ou par le dendron PFPTTEG (figure 11). [56] Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le dendrimère soluble dans l'eau peut être un dendrimère nona-ammonuim chlorure répondant à la structure suivante : N H 3CI20 /65 lequel dendrimère est fonctionnalisé à sa périphérie par un groupement solubilisant répondant à l'une des structures (II) ou (III), de préférence à la structure (III), suivantes : O k O n Structure (II) Structure (III) dans lesquelles : - n, ni, n2 et n3 représentent indépendamment un nombre entier de 1 à 500, et - R, RI, R2 et R3 représentent indépendamment un alkyle en CI à C6, un alcène en C2 à C6, un alcyne en C2 à C6, ou un aryle en C6 à Cao éventuellement substitué. [57] On peut noter que le dendrimère nona-ammonuim chlorure n'est pas soluble dans l'eau, d'où l'intérêt de le fonctionnaliser préalablement par des groupes solubilisants, par exemple avec le dendron PFPTTEG, pour l'encapsulation de la vitamine C. Un exemple de méthodologie de fonctionnalisation est donné dans le document de Pan et al., Macromolecules (2000), 33, pages 3731-3738 (6). En effet, ce document décrit qu'il est préférable de fonctionnaliser les dendrimères anioniques avec des groupements solubilisants et biocompatibles même s'ils ont une toxicité moindre que les dendrimères cationiques comme le démontre le document de Malik et al., J. Control. Release (2000), 65, page 133 (7). OO R3 n3 2926548 16/65 [58] Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le dendrimère soluble dans l'eau peut répondre à la structure décrite dans la figure 12 (dendrimère � nona-amine � fonctionnalisé par le dendron PFPTTEG). 5 [59] Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le dendrimère soluble dans l'eau peut réaliser des liaisons supramoléculaires avec la au moins une molécule de vitamine C. [60] Par liaison supramoléculaire, on entend au sens de la présente 1 o invention l'assemblage de plusieurs molécules distinctes par des liaisons hydrogènes, ioniques, de coordination ou encore par interactions hydrophobes. [61] Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la au moins une molécule de vitamine C peut être maintenue au coeur ou à la 15 périphérie du au moins un dendrimère soluble dans l'eau. [62] En effet, leurs multiples cavités et leurs groupements réactifs en périphérie, permettent la reconnaissance et la capture d'anions, tels que l'anion ascorbate. Ainsi, la vitamine C peut être contenue dans le coeur ou maintenue à la surface du dendrimère par liaison supramoléculaire, et 20 notamment par liaison électrostatique. En effet, les molécules d'acides ascorbiques ont un pKa égal à 4,11 à 25°C dans l'eau, et forment ainsi des ascorbates d'ammoniums avec les amines des dendrimères lorsque ces deux produits sont en solution. De plus les molécules de vitamine C réalisent également des liaisons hydrogène entre ses fonctions alcools et les amines des dendrimères. Dans le cas des dendrimères fonctionnalisés, les groupements PEG peuvent participer au transport des molécules d'acides ascorbiques soit en réalisant des liaisons hydrogènes avec les molécules d'ascorbates, soit en les maintenant au coeur hydrophobe du dendrimère. [63] Un dendrimère peut contenir jusqu'à 500 molécules de vitamine C. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le nombre 2926548 17/65 moyen d'encapsulation peut être de 14 (� 1) à 500 (� 20) molécules de vitamine C par dendrimère. [64] Le relarguage de la vitamine C peut s'effectuer dans l'eau par exemple par échange avec des molécules d'eau, où les molécules 5 d'ascorbates peuvent être préalablement protonées avant d'être relarguées sous forme d'acide ascorbique. Le relarguage peut également avoir lieu dans d'autres solvants où la vitamine C est soluble, comme par exemple l'éthanol. Le relarguage pourrait être contrôlé en réalisant une dialyse pour étudier la cinétique de relarguage. En effet, l'utilisation d'une 1 o membrane semi-perméable poreuse (de pores de diamètres identiques et connus) permet de séparer les molécules de vitamine C des dendrimères : par effet d'osmose et d'agitation moléculaire les petites molécules, soit les molécules de vitamine C, traversent la membrane, tandis que les grosses molécules, soit les dendrimères, sont retenues à l'intérieur de la membrane 15 de dialyse. Une quantification de ces molécules de vitamine C permet de suivre la cinétique de relarguage. Par ailleurs, la cinétique de relarguage de la vitamine C peut être modifiée selon le pH puisque le pH influe sur le rapport entre le nombre de molécules d'acide ascorbique et d'ascorbate. 20 [65] L'invention concerne également une composition cosmétique comprenant un dendrimère conjugué selon l'invention. [66] En effet, le dendrimère conjugué selon l'invention peut être formulé dans un produit cosmétique afin d'assurer une délivrance modulée de la vitamine C sur la peau à des fins protectrices (anti-radicaux) et/ou 25 régénératrices. [67] Ainsi, l'invention concerne également l'utilisation du dendrimère conjugué selon l'invention comme agent anti-oxydant et/ou anti-inflammatoire. [68] En outre, l'invention concerne également l'utilisation du 30 dendrimère conjugué selon l'invention pour la préparation d'une composition cosmétique anti-âge ou anti-rides. 2926548 18/65 [69] L'invention concerne également un procédé de soin cosmétique comprenant une étape consistant à appliquer sur la peau une composition cosmétique comprenant un dendrimère conjugué selon l'invention. 5 [70] L'invention concerne également un procédé de préparation d'un dendrimère conjugué comprenant au moins un dendrimère soluble dans l'eau encapsulant au moins une molécule de vitamine C, ledit procédé comprenant une étape de réaction dudit dendrimère soluble dans l'eau avec ladite au moins une molécule de vitamine C dans un solvant et à une 10 température qui facilitent la formation de liaisons supramoléculaires du dendrimère et de la molécule de vitamine C. On peut noter que l'eau est le solvant qui permet à la fois la solubilité et la formation des liaisons entre le dendrimère et la vitamine C. [71] En effet, la mise en présence de ces deux espèces dans un 15 solvant conduit instantanément à la formation d'intéractions supramoléculaires. [72] Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, au cours du procédé de préparation, l'association du dendrimère et de la molécule de vitamine C peut procéder par l'intermédiaire d'au moins une des 20 liaisons suivantes : formation d'ascorbate d'ammonium avec une fonction amine du dendrimère, formation de liaison hydrogène entre une fonction hydroxyle de la vitamine C et une fonction amine du dendrimère. [73] Selon l'invention, l'étape de réaction peut être réalisée dans un 25 solvant choisi dans le groupe comprenant l'eau, les alcools Rs-OH où Rs est un radical alkyle en CI à C6, par exemple l'éthanol, ou un mélange de ceux-ci. En effet, le solvant utilisé peut solubiliser partiellement ou totalement l'acide ascorbique et le dendrimère. Par exemple, l'acide ascorbique n'est que partiellement soluble dans l'éthanol. 30 [74] Selon l'invention, l'étape de réaction peut être réalisée pendant un temps de réaction inférieur à 1 minute, par exemple inférieur à 30 2926548 19/65 secondes, par exemple inférieur à 1 seconde. En effet, le temps de réaction peut aller de quelques millisecondes à quelques secondes, de préférence de quelques millisecondes à une seconde. [75] Selon l'invention, l'étape de réaction peut être réalisée à une 5 température allant de 3 à 90°C, de préférence de 15 à 35°C, de préférence de 20 à 30°C. En outre, une augmentation de la température peut permettre d'accélérer la vitesse de réaction. [76] Selon l'invention, l'étape de réaction peut être réalisée à un pH allant de 0 à 14, de préférence à un pH de 6 à 8, de préférence à un pH de 10 7. En outre, le pH peut influencer la vitesse de réaction mais surtout le rendement d'encapsulation, en effet, le pH a une influence sur la formation des liaisons hydrogène entre l'acide ascorbique et le dendrimère. [77] Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le 15 procédé de préparation peut comprendre la réaction dans l'eau d'une quantité suffisante de vitamine C pour obtenir une concentration inférieure à 10"2 mg/ml, avec une quantité suffisante de dendrimère pour obtenir un dendrimère conjugué ayant un ratio vitamine C : dendrimère de 14 à 500, la réaction étant effectuée à un pH de 6 à 8, de préférence 7, et à une 20 température de 25°C +1- 10°C, de préférence à une température de 25°C +1- 5°C. [78] Ainsi, le procédé de préparation a l'avantage de faire appel à la chimie verte, l'encapsulation pouvant être entièrement réalisée dans l'eau. Ceci présente des avantages à la fois en terme de préservation de 25 l'environnement, de coût de production plus faible, mais également de pureté, permettant des applications dans de nombreux domaines, y compris les domaines pharmaceutiques et cosmétiques. [79] Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé de préparation peut comprendre en outre, avant l'étape de 30 réaction, une étape de fonctionnalisation, consistant à fonctionnaliser la périphérie du dendrimère avec un agent de surface organique sélectionné /65 dans le groupe comprenant : une molécule pharmaceutique, une molécule de ciblage ou un groupement solubilisant. [80] D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures La figure 1 représente le dendrimère DAB G2. 1 o La figure 2 représente le dendrimère DAB G3. La figure 3 représente le dendrimère DAB G4. La figure 4 représente le dendrimère DAB G5. La figure 5 représente le dendrimère PAMAM GO. La figure 6 représente le dendrimère PAMAM G1. 15 La figure 7 représente le dendrimère PAMAM G2. La figure 8 représente le dendrimère PAMAM G3. La figure 9 représente le dendrimère PAMAM G4. La figure 10 représente le dendrimère DAB G3 fonctionnalisé par le MEAC. 20 ù La figure 11 représente le dendrimère DAB G3 fonctionnalisé par le PFPTTEG. ù La figure 12 représente le dendrimère nona-amine fonctionnalisé par le PFPTTEG. - La figure 13 représente les graphiques de variation du 25 déplacement chimique 8 (en ppm ou partie par million) des signaux des protons en RMN 1H par rapport au nombre N de molécules d'acide ascorbique (AA) par dendrimère : (a) représente le graphique de déblindage des signaux des protons 1 à 4 du dendrimère DAB G2 (en ppm) par rapport à N ; et (b) le graphique de blindage des signaux des 30 protons A à c de l'AA (en ppm) par rapport à N. /65 ù La figure 14 représente les graphiques de variation du déplacement chimique 8 (en ppm ou partie par million) des signaux des protons en RMN 1H par rapport au nombre N de molécules d'acide ascorbique (AA) par dendrimère : graphique de déblindage (a) des signaux des protons 1 à 4 du dendrimère DAB G3 en ppm par rapport à N ; graphique de blindage (b) des signaux des protons A à c de l'AA en ppm par rapport à N. ù La figure 15 représente les graphiques de variation du déplacement chimique 8 (en ppm) des signaux des protons en RMN 1H par 1 o rapport au nombre N de molécules d'acide ascorbique (AA) par dendrimère : (a) graphique de déblindage des signaux des protons 1 à 3 du dendrimère DAB G5 en ppm par rapport à N ; (b) graphique de blindage des signaux des protons A à c de l'AA en ppm par rapport à N. ù La figure 16 représente les graphiques de variation du 15 déplacement chimique 8 (en ppm) des signaux des protons en RMN 1H par rapport au nombre N de molécules d'acide ascorbique (AA) par dendrimère : (a) graphique de déblindage des signaux des protons 1 à 4 et 1' à 4' du dendrimère PAMAM G1 en ppm par rapport à N ; (b) graphique de blindage des signaux des protons A à c de l'AA en ppm par rapport au 20 nombre N. ù La figure 17 représente les graphiques de variation du déplacement chimique 8 (en ppm) des signaux des protons en RMN 1H par rapport au nombre N de molécules d'acide ascorbique (AA) par dendrimère : (a) graphique de déblindage des signaux des protons 1 à 4 et 25 1' à 2' du dendrimère PAMAM G4 en ppm par rapport à N ; (b) graphique de blindage des signaux des protons A à c de l'AA en ppm par rapport à N. ù La figure 18 représente les graphiques de variation du déplacement chimique 8 (en ppm) des signaux des protons en RMN 1H par 30 rapport au nombre N de molécules d'acide ascorbique (AA) par 2926548 22/65 dendrimère : (a) graphique de déblindage des signaux des protons 1 à 3 du dendrimère DAB G3 fonctionnalisé par le monomère MEAC en ppm par rapport à N ; (b) graphique de blindage des signaux des protons A à c de l'AA en ppm par rapport à N. 5 ù La figure 19 représente les graphiques de variation du déplacement chimique 8 (en ppm) des signaux des protons en RMN 1H par rapport au nombre N de molécules d'acide ascorbique (AA) par dendrimère : (a) de déblindage des signaux des protons 1 à 3 du dendrimère DAB G3 fonctionnalisé par le dendron PFPTTEG en ppm par 1 o rapport à N ; et (b) de blindage des signaux des protons A à c de l'AA en ppm par rapport à N. La figure 20 représente le graphique de variation du déplacement chimique 8 (ou de blindage) des signaux en RMN 1H des protons A à c de l'AA en ppm par rapport au nombre N de molécules d'AA 15 par dendrimère de nona-amine fonctionnalisé par le dendron PFPTTEG. EXEMPLES 20 Exemple 1: Fonctionnalisation du dendrimère DAB G3 par le monomère MEAC La fonctionnalisation du dendrimère DAB G3 par le monomère MEAC est réalisée selon la réaction suivante, comme décrit dans le 25 document de Kojima, C. et al. Bioconjugate Chem. (2000) 11, 910-917 (8) : /65 H2N N, H2 H2N NH2 NH2 H N~iv N H2 z H2N_ N_rNH2 H2N NH2 H2f NH2 H2N NH2 DMF /Et3N CI Le dendron 2,2-(methoxyethoxy)acetylchloride (210 mg : 1,38 mmol : 2 équiv. par NH2) ainsi que de la triéthylamine (185 mg : 1,84 mmol : 1,5 équiv. par NH2) sont ajoutés à une solution de DAB G3 (97 mg : 57,5 !mol) dans du DMF (1 mL). Le mélange est agité pendant 24 heures à température ambiante sous azote. On ajoute alors 1 mL d'eau distillée au mélange que l'on laisse agiter pendant 10 minutes avant de concentrer le produit sous pression 1 o réduite. On le dilue dans 5 mL de dichlorométhane avant de l'extraire dans une solution aqueuse de carbonate de potassium 1%. Le produit est ensuite purifié par recristallisation dans le pentane puis par une colonne de chromatographie (SiO2) avec comme éluant un mélange chloroforme/ méthanol (95/5). 15 On obtient 50 mg (25%) de dendrimère fonctionnalisé. RMN 1H (CDCL3, 250 MHz) ; 8 ppm : 1,67 (m, CH2-CH2-N) ; 2,43 (m, CH2-N) ; 3,31 (s, CH2-NH) ; 3,39 (s, CH3-O) ; 3,58 (m, CH2-CH2-O) ; 3,97 (m, CH2-CO) ; 7,34 (s, NH-CO). 20 /65 Exemple 2 : Synthèse du dendron PFPTTEG La synthèse du dendron pentafluorophényl tris 3,4,5-tri(triéthylèneoxy)benzoate, décrite dans le document de Baars, M.W.P.L. et al., Angew. Chem. Int. Ed. (2000), 39(7), 1285-1288 (9), est réalisée selon la succession d'étapes réactionnelles suivante : - Synthèse du monotosylate de monométhyltriethylèneglycol - Synthèse de l'acide tris 3,4,5-tri(triéthylèneoxy)benzoïque - Synthèse du pentafluorophényl tris 3,4,5-tri(triéthylèneoxy)benzoate Synthèse du monotosylate de monométhvltriethvlèneglvcol Le monotosylate de monométhyltriethylèneglycol est synthétisé selon la réaction suivante : o o---o o Ts o CH2C12 / Et3N A une solution de monométhyl triéthylèneglycol (16,416 g : 99,775 mmol) dans CH2Cl2 (10 mL), on additionne de la triéthylamine (199,95 mmol : 2 équiv.) et du chlorure de p-toluènesulfonyl (TsCI : 149,96 mmol : 1,5 équiv.). Après agitation pendant 24 heures, le mélange est lavé 2o deux fois avec NaHCO3 aq. La phase organique est séchée en utilisant du sodium de sulfate anhydre, filtrée et évaporée sous vide. Le résidu est purifié dans une colonne de chromatographie (SiO2), et élué avec un mélange éther de pétrole/acétate d'éthyle. Nous obtenons 17,8 g (56%) de monotosylate de 25 monométhyltriéthylèneglycol. RMN 1H (CDCL3, 250 MHz) ; 8 ppm :2,45 (s, CH2-Carom) ; 3,37 (s, CH3-O) ; 3,59 (t, CH2-O) ; 4,16 (t, CH2-O-S) ; 7,36 (d, CHarom-C-CH3) ; 7,78 (d, CHarom-C-S). /65 Synthèse de l'acide tris 3,4,5-tri(triéthylèneoxv)benzoïque : L'acide tris 3,4,5-tri(triéthylèneoxy)benzoïque est synthétisé selon la réaction suivante : Ts 0 a) K2CO3 / acetone b) LiOH.H20 /MeOH 0 0 HO �0~00 A une solution d'ester méthylique trihydroxybenzoate (0,329 g : 1,79 mmol) dans de l'acétone (10 mL) on ajoute du carbonate de potassium (1,772 g : 0,018 mol : 3,5 équiv.) et du monotosylate de monométhyltriéthylèneglycol (2g : 0,006 mol :3,5équiv.). Le mélange hétérogène est chauffé à reflux pendant 24 heures sous azote ; le mélange rose obtenu est alors filtré pour se débarrasser du carbonate de potassium en excès. L'acétone est ensuite évaporé et le produit est dissous dans du dichlorométhane (12 mL). S'en suivent trois lavages avec 10 mL d'eau, puis 5 mL d'HCI 1M et enfin 10 mL d'eau, avant d'évaporer le solvant de la phase organique. Le produit est alors purifié dans une colonne de chromatographie (SiO2) avec, comme éluant, le mélange chloroforme/méthanol 97:3. 8 g (80%) d'ester méthylique tris 3,4,5- tri(triéthylèneoxy)benzoate sont alors obtenus. RMN 1H (CDCL3, 250 MHz) ; 8 ppm : 3,37 (s, CH3-O) ; 3,65 (m, CH2-O) ; 3,88 (s, CH3-O) ; 4,19 (s, CH2-O-Carom) ; 7,29 (s, CHarom). L'ester méthylique tris 3,4,5-tri(triéthylèneoxy)benzoate (3g : 4,823 mmol) est ajouté à une solution de LiOH (251 mg : 6,029 mmol :1,25 équiv.) dans un mélange eau/méthanol (10 mL, 1/3 v/v), avant d'être mélangé pendant 12 heures. Le mélange est évaporé sous vide, dissous de nouveau dans de l'eau et extrait avec du dichlorométhane pour éliminer les sels. 5 /65 2,4 g (80%) d'acide tris 3,4,5-tri(triéthylèneoxy)benzoïque sont obtenus. RMN 1H (CDCL3, 250 MHz) ; 8 ppm : 3,32 (s, CH3-O) ; 3,61 (m, CH2-O) ; 4,00 (s, CH2-O-Carom) ; 7,26 (s, CHarom). Synthèse du pentafluorophénvl tris 3,4,5-tri(triéthylèneoxy)benzoate : Le pentafluorophényl tris 3,4,5-tri(triéthylèneoxy)benzoate est synthétisé selon la réaction suivante : o----o 0 0~ DCC / Diglyme 10 F Une solution d'acide tris 3,4,5-tri(triéthylèneoxy)benzoïque (2,4g : 3,846 mmol ) et de pentafluorophénol (757 mg : 4,115 mmol : 1,07 équiv.) est préparée dans du diglyme (4mL). A cette solution homogène refroidie à on ajoute du 1,3-dicyclocarbodiimide (DCC) (889 mg : 15 4,308 mmol : 1,12 équiv.). Après l'addition complète de DCC, on laisse le milieu réactionnel revenir à température ambiante. Après 24 heures, le mélange réactionnel est filtré et ce filtrat est concentré sous pression réduite. Le produit est enfin précipité avec du cyclohexane et purifié par une colonne de chromatographie (SiO2) avec, comme éluant, le mélange 2o chloroforme/méthanol (9:1). Nous obtenons 1,7 g (56%) de pentafluorophényl tris 3,4,5-tri(triéthylèneoxy)benzoate. RMN 1H (CDCL3, 250 MHz) ; 8 ppm : 3,32 (s, CH3-O-CH2) ; 3,61 (m, CH2-O) ; 4,23 (m, CH3-O-C) ; 7,44 (s, CHarom). 25 /65 Exemple 3 : Fonctionnalisation du dendrimère DAB G3 par le dendron PFPTTEG La fonctionnalisation du dendrimère DAB G3 par le dendron 5 PTPTTEG est réalisée selon la réaction suivante : NHZ NH2 HZN-.N(' 1 Nz-NH2 HZN' N 1 N N NH2 HZNtiN,~N w N-- 1NH2 H2N NHZ HZNJN `NHZ NHZ NHZ CH2C12 F A une solution de DAB G3 (12 mg : 7,114 !mol) dans du dichlorométhane (8 mL), on ajoute le dendron pentafluorophényl tris 3,4,5- 10 tri(triéthylèneoxy)benzoate (92 mg : 116,67 !mol : 1,025 équiv. par NH2). Le mélange est agité pendant 12 heures avant d'être extrait avec NaOH 0,1M. Après évaporation de la phase aqueuse, le produit est dissous dans du dichlorométhane, et précipité par ajout d'éther de pétrole. Quelques milligrammes de produit sont obtenus en quantité 15 suffisante pour en réaliser la titration. RMN 1H (CDCI3, 250 MHz) ; 8 ppm : 1,72 (m, CH2-CH2-NH) ; 2,46 (m, CH2-N) ; 2,96 (m, CH2-NH) ; 3,45 (s, CH3-O) ; 3,65 (m, CH2-CH2-O) ; 4,15 (m, CH2-O-Carom) ; 5,43 (s, NH-CO) ; 7,05 (s, CHarom). 2926548 28/65 Exemple 4: Fonctionnalisation du dendrimère nona-amine par le dendron PFPTTEG La fonctionnalisation du dendrimère nona-amine est réalisée 5 selon la réaction suivante : 0^.00. F O Si 7,1 H :C 1 S , N 0 H :0 1 _Si o N H,CI Et3N, CH2C12 oJ,q),?) Le dendrimère nona-amine (50 mg :31 !mol) ainsi que le dendron PFPTTEG (226 mg : 286 �mol : 1,025 équiv. par amine) sont dissous dans 50 mL de dichlorométhane distillé, avant d'y ajouter la 10 triethylamine (56 mg : 558 �mol : 2 équiv. par amine). Le mélange est agité sous azote à température ambiante pendant 12 heures. Le mélange est séché sous vide, puis le produit est de nouveau dissous dans du dichlorométhane avant d'être extrait avec 150 mL d'une solution de NaOH 0,1M. Il est ensuite lavé 3 fois au pentane puis purifié 15 par recristallisation dans le dichlorométhane par le pentane. On obtient 112 mg (55%) de dendrimère nona-amine fonctionnalisé par le dendron PFPTTEG. RMN 1H (CDCL3, 250 MHz) ; 8 ppm : -0,13 (s, CH3-Si) ; 0,54 (s, CH2-Si) ; 1,08 (s, CH2-CH2-Si) ; 1,87 (s, CH2-CH2-CH2-Si) ; 2,85 (s, Si-CH2- 20 N) ; 3,32 (s, CH3-O) ; 3,62 (s, CH2-CH2-O) ; 4,13 (s, CH2-O-Cdendron) ; 6,96 (S, CHarom dedrimère) ; 7,18 (s, CHarom dendron). IR : v = 3320 cm-1 et v = 1625 cm-1 (NH-CO) /65 Analyse élémentaire : calculé : C 57,33 ; H 8,57 ; N 1,91 ; 0 28,36 ; Si 3,83 ; trouvé : C 55,07 ; H 8,55. Exemple 5: Encapsulation de la vitamine C à l'aide de quelques dendrimères commerciaux Cinq titrations d'AA ont été réalisées : trois avec les dendrimères DAB de générations 2 (noté DAB G2), 3 (noté DAB G3) et 5 (noté DAB G5), et deux autres avec les dendrimères PAMAM de générations 1 (noté PAMAM G1) et 4 (noté PAMAM G4). L'interprétation des données RMN sera détaillée dans le cas d'une seule génération pour chaque dendrimère (DAB G2 et PAMAM G4) ; pour les autres titrations, un schéma du dendrimère ainsi que deux graphiques récapitulatifs des données RMN seront présentés. Un tableau final résumant tous les résultats obtenus clôturera cet exemple. Il est à noter que les réactions suivantes sont analysées aussitôt effectuées (une dizaine de seconde sépare les deux opérations) ce qui est un avantage supplémentaire pour la future utilisation cosmétique du conjugué car sa synthèse instantanée permettrait d'optimiser le temps de formulation. a) Le DAB G2 Protocole opératoire d'encapsulation de la vitamine C dans le DAB G2 : Quinze échantillons E (numérotés de 1 à 15) ayant des concentrations d'acide ascorbique (AA) croissantes par rapport au dendrimère DAB G2 (figure 1) ont été préparés comme suit : - Une solution S1 d'acide ascorbique est obtenue en dissolvant 170,7 mg d'acide ascorbique (AA) dans 1,5 mL de D2O. L'acide ascorbique 2926548 30/65 utilisé ici est commercialisé sous la référence 255564 par la société Sigma-Aldrich (France). - Chaque échantillon E a été préparé en ajoutant un volume V de solution Si d'acide ascorbique dans un tube RMN contenant 5 mg de 5 dendrimère DAB G2 dans 300 pL de D2O. Ce dendrimère est commercialisé sous la référence 679895 par la société Sigma-Aldrich (France). Le volume V introduit, le rapport du nombre de molécules d'AA introduites par dendrimère DAB G2, et la masse d'AA introduite dans le 1 o tube RMN pour chaque échantillon sont détaillés dans le tableau 2 suivant. E Volume V de solution Masse d'AA Rapport du nombre SI introduite introduit de molécules d'AA (pL) (mg) par DAB G2 1 0 0 0 2 10 1,138 1 3 30 3,414 3 4 50 5,690 5 5 80 9,104 8 6 100 11,380 10 7 120 13,656 12 8 140 15,932 14 9 180 20,484 18 10 220 25,036 22 11 260 29,588 26 12 280 31,864 28 13 360 40,968 36 14 420 47,796 42 15 500 56,900 50 Tableau 2 Titration de l'acide ascorbique contenu dans le DAB G2 et résultats : Les échantillons précédents (El à E15) ont été analysés 15 directement après ajout de la solution d'acide ascorbique sans traitement supplémentaire ni temps d'attente car l'encapsulation de la vitamine C dans le dendrimère est instantanée. Les expériences RMN ont été réalisées par le spectromètre BRUKER AC250FT à 25°C. 2926548 31/65 Les données des quinze échantillons analysés par RMN sont détaillées dans les graphiques présentés en figure 13. Le graphique (a) est une représentation des différentes données 5 RMN en ppm pour tous les hydrogènes du dendrimère DAB G2 en fonction de la quantité d'acide ascorbique ajoutée. Les protons du dendrimère sont numérotés de 1 à 4 selon le schéma ci-dessous, pour mieux visualiser le déplacement des signaux RMN de chaque proton : HZN-,, NH2 NH2 2-1 NH2 10 Ainsi, la courbe 1 donne le déplacement chimique 8 en RMN 1H de l'hydrogène numéroté 1 pour chacun des échantillon El à El 5. Les données RMN du pic correspondant aux protons des amines primaires ne sont pas accessibles ; en effet, les spectres RMN sont réalisés dans le solvant D20, et ces protons sont en continuel échange 15 avec le solvant d'où l'absence de leurs signaux. Les signaux de DAB G2 sont progressivement déblindés jusqu'à une concentration d'environ 30 AA/DAB, ce qui signifie que toutes les amines primaires et tertiaires se sont quaternarisées avec l'AA, et quelques AA supplémentaires se sont fixés au dendrimère sûrement par 20 liaisons hydrogènes avec les protons des amines primaires à la périphérie du dendrimère. De plus, les AA se fixent d'abord en périphérie car les courbes 1 et 2 ont une pente initiale plus grande que celles des courbes 3 et 4. /65 Le graphique (b) est représente les différentes données RMN en ppm des hydrogènes de l'acide ascorbique (AA) indexés de A à c comme sur le schéma ci-dessous : HO A partir de 14 AA/DAB les pics de l'AA commencent à se blinder ce qui correspond à l'apparition d'acide ascorbique dans la solution. Nous sommes donc en présence d'un mélanger acide ascorbique/ascorbate. Cependant, la courbe A, qui est la plus significative, continue à croître jusqu'à une concentration atteignant une soixantaine d'AA/DAB. Il y 1 o aurait donc un équilibre AA/ascorbate lorsque le nombre d'AA ajouté se situe entre 14 et 60. Ensuite, la courbe stagne, ce qui signifie qu'au-delà de 60 AA ajoutés on serait en présence d'un équilibre dynamique. De plus il est également possible de calculer le nombre de molécules d'acide ascorbique fixées au dendrimère grâce aux données RMN car, lorsque le 15 pic du proton A de l'acide ascorbique se situe à mi-chemin entre les valeurs de ce même proton sous la forme ascorbique et ascorbate (soit 8 = 4,7 ppm), alors nous pouvons considérer que la moitié des molécules d'acide ascorbique pouvant être transportées s'est fixée. Ce dendrimère nous permettrait donc de transporter jusqu'à 60 AA. 20 On peut noter qu'une titration de l'acide propionique a également été réalisée avec le dendrimère DAB G2 pour approuver l'existence d'encapsulation et de liaisons hydrogènes entre l'AA et le dendrimère. En effet les résultats obtenus montrent la fixation d'uniquement 8 acides propioniques, ce qui correspond à la formation de 8 25 propionates d'ammoniums à la périphérie du dendrimère. 2926548 33/65 Les fonctions alcools présentes sur l'acide ascorbique formeraient alors des liaisons hydrogènes avec les amines du dendrimère et leurs permettraient également de s'encapsuler à son coeur. 5 b) Le DAB G3 Protocole opératoire d'encapsulation de la vitamine C dans le DAB G3 : Douze échantillons (El à E12) ayant des concentrations d'acide ascorbique (AA) croissantes par rapport au dendrimère DAB G3 (figure 2) ont été préparés comme suit : - Une solution S2 d'acide ascorbique est obtenue en dissolvant 104,5 mg d'acide ascorbique (AA) dans 1 mL de D2O. -Chaque échantillon E a été préparé en ajoutant un volume V de solution S2 d'acide ascorbique dans un tube RMN contenant 10 mg de dendrimère DAB G3 dans 300 pL de D2O. Ce dendrimère est commercialisé sous la référence 469076 par la société Sigma-Aldrich (France). Les quantités d'AA introduites et le rapport du nombre de molécules d'AA introduites par dendrimère DAB G3 dans le tube RMN pour chaque échantillon sont détaillés dans le tableau 3 suivant. E Volume V de solution Masse d'AA Rapport du nombre S2 introduite introduit de molécules d'AA (pL) (mg) par DAB G3 1 0 0 0 2 20 2,09 2 3 50 5,22 5 4 100 10,43 10 5 160 16,69 16 6 200 20,87 20 7 250 26,09 25 8 300 31,30 30 9 450 46,95 45 10 600 62,60 60 11 750 78,26 75 12 900 93,91 90 Tableau 3. 5 /65 Titration de l'acide ascorbique contenu dans le DAB G3 et résultats : Les douze échantillons ont été ensuite été analysés directement par RMN. Les données RMN sont détaillées dans les graphiques présentés en figure 14. Le graphique (a) représente le déblindage des hydrogènes du dendrimère numérotés de 1 à 4 comme ci-dessous : H2N NH2 H2N H2N NH2 Le graphique (b) représente les différentes données RMN en 1 o ppm des hydrogènes de l'acide ascorbique (AA) indexés de A à c comme ci-dessous : Un raisonnement similaire à celui du point précédent a) permet 15 de conclure que, pour le dendrimère DAB G3, 16 molécules d'ascorbate peuvent se fixer avant l'apparition de l'acide ascorbique et que le dendrimère DAB G3 peut comprendre 80 molécules d'ascorbate fixées. /65 c) Le DAB G5 Protocole opératoire d'encapsulation de la vitamine C dans le DAB G5 : Quinze échantillons (El à E15) comprenant des quantités croissantes d'acide ascorbique (AA) par rapport au dendrimère DAB G5 (figure 4) ont été préparés comme suit : - Une solution S3 d'acide ascorbique est obtenue en dissolvant 91,5 mg d'acide ascorbique (AA) dans 1,5 mL de D2O. - Chaque échantillon E a été préparé en ajoutant un volume V de solution S3 d'acide ascorbique dans un tube RMN contenant 5 mg de dendrimère DAB G5 dans 300 pL de D2O. Ce dendrimère est commercialisé sous la référence 469092 par la société Sigma-Aldrich (France). Les quantités d'AA introduites et le rapport du nombre de molécules d'AA introduites par dendrimère DAB G5 dans le tube RMN pour chaque échantillon sont détaillés dans le tableau 4 suivant. E Volume V de solution Masse d'AA Rapport du nombre S3 introduite introduit de molécules d'AA (pL) (mg) par DAB G5 1 0 0 0 2 20 1,22 10 3 40 2,45 20 4 60 3,68 30 5 80 4,91 40 6 100 6,14 50 7 128 7,86 64 8 200 12,28 100 9 252 15,47 126 10 300 18,42 150 11 400 24,55 200 12 436 26,76 218 13 600 36,83 300 14 800 49,11 400 15 1200 73,66 600 Tableau 4. /65 Titration de l'acide ascorbique contenu dans le DAB G5 et résultats : Les quinze échantillons ont été analysés par RMN. Les données RMN sont détaillées dans les graphiques présentés en figure 15. Le graphique (a) représente le déblindage des hydrogènes du dendrimère numérotés de 1 à 4 comme ci-dessous : H2N HZN H2N H2N `I HZN H2N H2N- HZN~N H2N H2N--'N H2N H2N H2N H2N HZN\'N H2Nz-' ~ H2N`' HZN HZN HZN NH2 H2 N- /---N"2 /NHZ N NHZ N NHZ 1-21NH z fNHz N~ IV~NHZ N---,NH2 NH2 NH2 NHZ NH2 NHZ NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 Le graphique (b) représente les différentes données RMN en ppm des hydrogènes de l'acide ascorbique (AA) indexés de A à c 10 précédemment. d) Le dendrimère PAMAM G1 Protocole opératoire d'encapsulation de la vitamine C dans le PAMAM G1 : 15 Quinze échantillons (El à E15) comprenant des quantités croissantes d'acide ascorbique par rapport au dendrimère PAMAM G1 (figure 6) ont été préparés comme suit : - Une solution S4 d'acide ascorbique est obtenue en dissolvant 61,5 mg d'acide ascorbique (AA) dans 1 mL de D20. /65 - Chaque échantillon E a été préparé en ajoutant un volume V de solution S4 d'acide ascorbique dans un tube RMN contenant 5 mg de dendrimère PAMAM G1 dans 300 pL de D2O. Ce dendrimère est commercialisé sous la référence 597414 par la société Sigma-Aldrich (France). Les quantités d'AA introduites et le rapport du nombre de molécules d'AA introduites par dendrimère PAMAM G1 dans le tube RMN pour chaque échantillon sont détaillés dans le tableau 5 suivant. E Volume V de solution Masse d'AA Rapport du nombre S4 introduite introduit de molécules d'AA (pL) (mg) par PAMAM G1 1 0 0 0 2 10 0,615 1 3 30 1,23 3 4 50 3,08 5 5 80 4,92 8 6 100 6,15 10 7 120 7,39 12 8 140 8,62 14 9 180 11,08 18 220 13,54 22 11 260 16,00 26 12 280 17,23 28 13 360 22,16 36 14 420 25,85 42 500 30,77 50 10 Tableau 5. Titration de l'acide ascorbique contenu dans le PAMAM G1 et résultats : Les quinze échantillons ont été analysés par RMN. Les données 15 RMN sont détaillées dans les graphiques présentés en figure 16. Le graphique (a) représente le déblindage des hydrogènes du dendrimère numérotés de 1 à 4 comme ci-dessous : /65 HzN 2'NH2 '1 HN NH2 a/N\ o HN-1 HN NH NH NH N HzN NH2 HzN Le graphique (b) représente les différentes données RMN en ppm des hydrogènes de l'acide ascorbique (AA) indexés de A à c précédemment. e) Le dendrimère PAMAM G4 Protocole opératoire d'encapsulation de la vitamine C dans le PAMAM G4 : Quinze échantillons (El à E15) comprenant des quantités croissantes d'acide ascorbique par rapport au dendrimère PAMAM G4 (figure 9) ont été préparés comme suit : - Une solution S5 d'acide ascorbique est obtenue en dissolvant 62 mg d'acide ascorbique (AA) dans 2 mL de D20. - Chaque échantillon E a été préparé en ajoutant un volume V de solution S5 d'acide ascorbique dans un tube RMN contenant 5 mg de dendrimère PAMAM G4 dans 300 pL de D20. Ce dendrimère est commercialisé sous la référence 597856 par la société Sigma-Aldrich (France). Les quantités d'AA introduites et le rapport du nombre de molécules d'AA introduites par dendrimère PAMAM G4 dans le tube RMN pour chaque échantillon sont détaillés dans le tableau 6 suivant. 5 /65 E Volume V de solution Masse d'AA Rapport du nombre S5 introduite introduit de molécules d'AA (pL) (mg) par PAMAM G4 1 0 0 0 2 20 0,62 10 3 40 1,24 20 4 60 1,86 30 80 2,48 40 6 100 3,10 50 7 128 3,96 64 8 200 6,19 100 9 252 7,80 126 300 9,29 150 11 400 12,38 200 12 436 13,50 218 13 600 18,57 300 14 800 24,76 400 1200 37,14 600 Tableau 6. Titration de l'acide ascorbique contenu dans le PAMAM G4 et résultats : Les quinze échantillons ont été analysés par RMN. Les données RMN sont détaillées dans les graphiques présentés en figure 17. Le graphique (a) représente le déblindage des hydrogènes du dendrimère numérotés de 1 à 4 comme ci-dessous : 2926548 40/65 Le graphique (b) représente les différentes données RMN en ppm des hydrogènes de l'acide ascorbique (AA) indexés de A à c 5 précédemment. Les signaux de PAMAM G4 sont progressivement déblindés jusqu'à une concentration de 64 AA/PAMAM. On peut penser que l'AA est au départ encapsulé dans le dendrimère, ce qui ne génère qu'un faible 10 déblindage. Ensuite les signaux 2 et 3 correspondant aux amines primaires externes et aux amines tertiaires internes se déblindent fortement, d'où la présence d'ascorbate d'ammonium au coeur ainsi qu'en périphérie du dendrimère. /65 Ce graphique ne nous laisse pas envisager de préférence quant à la fixation des AA sur les amines primaires ou tertiaires car les courbes évoluent similairement. Il se peut également que l'AA se fixe de manière progressive de génération en génération, la gêne stérique freinant alors son avancée vers le coeur du dendrimère. La fixation d'AA par le dendrimère stagne et les courbes forment alors un plateau lorsque la concentration atteint 400 AA/PAMAM ; ceci laisse penser que la plupart des amines du dendrimère PAMAM s'est quaternarisée et que certains AA supplémentaires se sont fixés au dendrimère soit par encapsulation dans ses pores, soit par liaisons hydrogènes avec les protons des amines primaires à sa périphérie. Jusqu'à une concentration de 64 AA/PAMAM, les pics de l'AA se déblindent, ensuite ils commencent à se blinder, ce qui pourrait suggérer une première fixation des AA sur les 64 amines primaires externes. Ensuite plusieurs centaines de molécules d'acides ascorbiques sembleraient se fixer au coeur du dendrimère ainsi qu'en périphérie par des liaisons hydrogène, tandis que d'autres resteraient sous la forme acide en solution. Pour finir, le fait que les pics 1 et 2 se dissocient respectivement en 1' et 2' peut être expliqué par le nombre de générations du dendrimère. En effet les amines réagissent différemment avec l'AA selon la génération à laquelle elles appartiennent, ceci s'expliquant par un accès encombré selon la profondeur de l'amine au coeur du dendrimère. 2926548 42/65 f) Conclusion Le tableau 7 suivant récapitule les résultats de toutes les titrations précédentes en donnant le nombre d'ascorbates d'ammonium 5 formés avant et après apparition d'acide ascorbique dans le milieu : Dendrimère Nombre de molécules Nombre total de d'ascorbate fixées avant molécules d'ascorbate apparition d'acide fixées ascorbique DAB G2 14 60 DAB G3 16 80 DAB G5 64 400 PAMAM G 1 14 60 PAMAM G4 64 400 Tableau 7. Les résultats obtenus sont cohérents avec ceux attendus ; en 1 o effet, plus la génération du dendrimère est grande, plus le nombre de molécules d'acide ascorbique tranportées est important. De plus, il est à noter que la nature du dendrimère (DAB ou PAMAM) n'a pas d'influence sur la fixation car les résultats sont identiques dans les deux cas ; seul le nombre d'amines primaires et tertiaires présentes en périphérie et au coeur 15 du dendrimère importent (rappelons que les dendrimères DAB G2 et PAMAM G1, ainsi que DAB G5 et PAMAM G4 possèdent un nombre équivalent de fonctions amines). L'objectif souhaité, qui était de visualiser l'existence de liaisons entre la vitamine C et les dendrimères, est donc atteint. Il reste maintenant 20 à réaliser le même type d'expériences ainsi que d'autres complémentaires afin d'optimiser le résultat obtenu et de trouver le bon compromis entre rendement de transport, solubilité et toxicité. /65 Exemple 6: Encapsulation de la vitamine C à l'aide de quelques dendrimères fonctionnalisés Les divers avantages apportés par une greffe de chaînes polyéthylène glycol à la périphérie d'une molécule ont déjà été de nombreuses fois démontrés. En effet, ce polymère soluble dans l'eau, non-toxique et non-immunogène est très adapté à l'utilisation biologique grâce à un haut pouvoir de solubilité dans l'eau et de biocompatibilité . Il a donc été judicieux de fonctionnaliser les dendrimères avec deux molécules différentes contenant soit une (monomère MEAC) soit trois chaînes PEG (dendron PFPTTEG) afin de comparer les propriétés apportées par chacune d'entre elles. a) Le dendrimère DAB G3 fonctionnalisé par le monomère MEAC La fonctionnalisation du dendrimère DAB G3 avec le monomère MEAC est effectuée selon la synthèse décrite dans l'exemple 1. Protocole opératoire d'encapsulation de la vitamine C : Quatorze échantillons (E1 à E14) comprenant des quantités croissantes d'acide ascorbique par rapport au dendrimère DAB G3 fonctionnalisé par le monomère MEAC (figure 10) ont été préparés comme suit : - Une solution S6 d'acide ascorbique est obtenue en dissolvant 49 mg d'acide ascorbique (AA) dans 2 mL de D2O. - Chaque échantillon E a été préparé en ajoutant un volume V de solution S6 d'acide ascorbique dans un tube RMN contenant 5 mg de dendrimère DAB G3 fonctionnalisé par le monomère MEAC dans 300 pL deD2O. 2926548 44/65 Les quantités d'AA introduites et le rapport du nombre de molécules d'AA introduites par dendrimère dans le tube RMN pour chaque échantillon sont détaillés dans le tableau 8 suivant. E Volume V Masse d'AA Rapport du nombre de de solution S6 introduit molécules d'AA par introduite (mg) DAB G3 fonctionnalisé (pL) par le monomère MEAC 1 0 0 0 2 20 0,497 2 3 50 1,243 5 4 100 2,486 10 5 160 3,977 16 6 200 4,972 20 7 250 6,215 25 8 300 7,458 30 9 450 11,186 45 10 600 14,915 60 11 750 18,644 75 12 900 22,373 90 13 1000 24,859 100 14 1500 37,288 150 5 Tableau 8. Titration de l'acide ascorbique contenu dans le dendrimère et résultats : La titration par RMN de l'acide ascorbique avec ce dendrimère fonctionnalisé est effectuée afin de comparer ses propriétés de transport 1 o de la vitamine C. Les données RMN sont détaillées dans les graphiques présentés en figure 18. Le graphique (a) représente le déblindage des hydrogènes du dendrimère numérotés de 1 à 4 comme ci-dessous : 2926548 45/65 Le graphique (b) représente les différentes données RMN en ppm des hydrogènes de l'acide ascorbique (AA) indexés de A à c précédemment. 5 D'après les résultats obtenus, il est clair que ce dendrimère réalise le transport de la vitamine C, avec un rendement similaire au dendrimère DAB G3 non fonctionnalisé mais avec comme avantages une solubilité et une biocompatibilité bien meilleures. En effet, ce dendrimère peut fixer 16 molécules d'ascorbate avant apparition de molécules d'acide i o ascorbique, et jusqu'à 80 molécules d'ascorbate avant d'atteindre un équilibre dynamique. Quant aux données RMN du dendron (5, 6 et 7), elles ne varient pas du tout au cours de la titration; ceci signifie que les branches monoéthylèneglycolées ne participent ni à la fixation des AA, ni à une encapsulation au sein du dendrimère. 2926548 46/65 b) Le dendrimère DAB G3 fonctionnalisé par le dendron PFPTTEG 5 Le dendron PFPTTEG est d'abord synthétisé selon l'exemple 2 afin de réaliser la fonctionnalisation du dendrimère DAB G3 selon le protocole décrit dans l'exemple 3. Protocole opératoire d'encapsulation de la vitamine C : 10 Quatorze échantillons (El à E14) comprenant des quantités croissantes d'acide ascorbique par rapport au dendrimère DAB G3 fonctionnalisé par le dendron PFPTTEG (figure 11) ont été préparés comme suit : - Une solution S7 d'acide ascorbique est obtenue en dissolvant 15,8 15 mg d'acide ascorbique (AA) dans 2 mL de D20. - Chaque échantillon E a été préparé en ajoutant un volume V de solution S7 d'acide ascorbique dans un tube RMN contenant 5 mg de dendrimère DAB G3 fonctionnalisé par le dendron PFPTTEG dans 300 pL de D20. 20 Les quantités d'AA introduites et le rapport du nombre de molécules d'AA introduites par dendrimère dans le tube RMN pour chaque échantillon sont détaillés dans le tableau 9 suivant. 2926548 47/65 E Volume V Masse d'AA Rapport du nombre de de solution S7 introduit molécules d'AA par DAB introduite (mg) G3 fonctionnalisé par le (pL) dendron PFPTTEG 1 0 0 0 2 20 0,158 2 3 50 0,396 5 4 100 0,791 10 5 160 1,266 16 6 200 1,582 20 7 250 1,978 25 8 300 2,373 30 9 450 3,559 45 10 600 4,746 60 11 750 5,933 75 12 900 7,119 90 13 1000 7,911 100 14 1500 11,865 150 Tableau 9. Titration de l'acide ascorbique contenu dans le dendrimère 5 La titration par RMN de l'AA est réalisée afin d'évaluer la capacité de transport de la vitamine C par le dendrimère DAB G3 fonctionnalisé avec le dendron PFPTTEG. Le dendrimère obtenu est soluble dans une large gamme de 1 o solvants des plus apolaires tels que le toluène et le dichlorométhane aux plus polaires tels que l'eau, le méthanol et l'acétonitrile. De plus, ce dendrimère fonctionnalisé est soluble dans l'eau en toutes proportions, ce qui un avantage supplémentaire permettant un grand rendement d'AA transportés. 15 La titration par RMN de l'acide ascorbique avec ce dendrimère fonctionnalisé est effectuée afin de comparer ses propriétés de transport de la vitamine C. Les données RMN sont détaillées dans les graphiques présentés en figure 19. 2926548 48/65 Le graphique (a) représente le déblindage des hydrogènes du dendrimère numérotés de 1 à 4 comme ci-dessous : 5 D'après les résultats obtenus, il est évident que la fonctionnalisation du dendrimère ne gênerait en aucun cas le transport de la vitamine C, bien au contraire. En effet ce dendrimère peut fixer 45 molécules d'ascorbate avant apparition de molécules d'acide ascorbique, et jusqu'à 100 molécules d'ascorbate par la suite, ces nombres étant 1 o nettement supérieurs à ceux obtenus par le même dendrimère DAB G3 non fonctionnalisé. Le dendron permet donc de réaliser des liaisons avec les AA,et participe grandement à une meilleure encapsulation des AA au coeur du dendrimère, propriété ignorée au départ. Il semble donc que ce nouveau dendrimère réunisse tous les 15 avantages à la fois, à savoir une bonne biocompatibilité, une bonne solubilisation dans l'eau ainsi qu'un excellent rendement de transport de l'AA, la dernière propriété étant un avantage supplémentaire par rapport au dendrimère fonctionnalisé avec le monomère MEAC. 2926548 49/65 c) Le dendrimère � nona-amine � fonctionnalisé par le dendron PFPTTEG Le dendron PFPTTEG est d'abord synthétisé selon l'exemple 2 5 afin de réaliser la fonctionnalisation, selon le protocole décrit dans l'exemple 4, d'un nouveau dendrimère soluble dans l'eau contenant neuf branches, nommé ici le dendrimère nona-amine. Protocole opératoire d'encapsulation de la vitamine C : 10 Quatorze échantillons (El à E14) comprenant des quantités croissantes d'acide ascorbique par rapport au dendrimère � nona-amine � fonctionnalisé par le dendron PFPTTEG (figure 12) ont été préparés comme suit : - Une solution S8 d'acide ascorbique est obtenue en dissolvant 26,7 15 mg d'acide ascorbique (AA) dans 2 mL de D20. - Chaque échantillon E a été préparé en ajoutant un volume V de solution S8 d'acide ascorbique dans un tube RMN contenant 5 mg de dendrimère � nona-amine � fonctionnalisé par le dendron PFPTTEG dans 300 pL de D20. 20 Les quantités d'AA introduites et le rapport du nombre de molécules d'AA introduites par dendrimère dans le tube RMN pour chaque échantillon sont détaillés dans le tableau 10 suivant. /65 E Volume V Masse d'AA Rapport du nombre de de solution S8 introduit molécules d'AA par DAB introduite (mg) G3 fonctionnalisé par le (pL) dendron PFPTTEG 1 0 0 0 2 20 0,26 2 3 50 0,67 5 4 100 1,34 10 160 2,14 16 6 200 2,67 20 7 250 3,34 25 8 300 4,01 30 9 450 6,01 45 600 8,01 60 11 750 10,01 75 12 900 12,02 90 13 1000 13,35 100 14 1500 20,03 150 Tableau 10. Titration de l'acide ascorbique contenu dans le dendrimère et résultats : 5 La titration par RMN de l'AA est réalisée avec ce nouveau dendrimère fonctionnalisé soluble dans l'eau afin d'identifier la part de responsabilité des chaînes TEG dans le transport de la vitamine C. Les résultats sont donnés dans le graphique du déblindage des protons de l'AA présenté en figure 20. 10 Grâce à ce dendrimère fonctionnalisé avec les dendrons PFPTTEG, il est possible de transporter plus d'une centaine d'AA. Cette molécule comportant 27 chaînes TEG, ces dernières créent des liaisons électrostatiques et une conformation stérique favorables au maintien des molécules d'acide ascorbique au sein de la molécule, permettant ainsi leur transport. Ce dendrimère, n'étant composé d'aucune amine primaire ni tertiaire, nous démontre bien une composition chimique et une conformation idéales pour l'encapsulation de molécules de 2926548 51/65 vitamines C grâce à ses propriétés particulières apportées par son coeur et ses dendrons. d) Conclusion 5 L'acide ascorbique, dont l'apport exogène est indispensable pour l'organisme humain, a donc des possibilités d'être transporté par certaines molécules organiques à travers un produit cosmétique. En effet, trois types de vecteurs ont été testés, à savoir les dendrimères 10 commerciaux purs, ces mêmes dendrimères fonctionnalisés avec des chaînes éthylène glycol, ainsi que de nouveaux dendrimères solubles dans l'eau comportant également des chaînes éthylène glycols dont la synthèse est entièrement réalisée au laboratoire. Les dendrimères et leurs propriétés particulières permettent un 15 excellent rendement de transport des molécules d'acide ascorbique, notamment lorsqu'ils sont fonctionnalisés avec un dendron comportant trois chaînes triéthylène glycol. Ces dernières réalisent en effet des liaisons hydrogène avec les molécules d'acide ascorbique et leur permettent également de s'encapsuler au coeur du dendrimère, tout en apportant des propriétés de solubilité dans l'eau (ainsi que dans un grand nombre de solvants), de biocompatibilité, et surtout de stabilité. Ainsi, le dendron PFPTTEG participe clairement à une meilleure encapsulation des molécules de vitamines C et réalise également des liaisons hydrogènes avec ces mêmes molécules qui sont alors visualisables par RMN. En revanche, la chaîne du groupe MEAC, trois fois plus courtes que celle du groupe PFPTTEG, ne permet pas de voir, en RMN, une participation du groupe MEAC sur l'encapsulation des molécules de vitamine C. Les rendements de transport des nouveaux dendrimères solubles dans l'eau fonctionnalisés avec des chaînes PEG diffèrent selon que le dendron est plus ou moins imposant avec des chaînes plus ou moins longues. Les deux dendrimères fonctionnalisés avec le dendron 2926548 52/65 PFPTTEG amènent un meilleur rendement de transport ; en effet, grâce à leur encombrement stérique à la périphérie des dendrimères, ils permettent de garder les molécules d'AA à l'intérieur des dendrimères, sans pour autant gêner le passage des molécules d'AA jusqu'à son coeur. 5 Au niveau du rendement de transport des molécules de vitamines C, le dendrimère le plus performant est celui dont la synthèse est entièrement réalisée au laboratoire, à savoir le nona-amine fonctionnalisé par neuf dendrons, soit 27 chaînes éthylène glycol. De plus ce dendrimère ne contenant pas d'amines internes, devrait posséder une toxicité 10 inférieure à ceux commercialisés, ceci étant une de nos futures recherches à développer. Pour conclure, les dendrimères semblent être approprié pour le transport de molécules d'acides ascorbiques en cosmétique grâce à leur multivalence contrôlée qui peut être utilisée pour attacher à la fois une ou 15 plusieurs substances (médicaments, enzymes, agents de contraste pour l'imagerie médicale, ... ici la vitamine C) ainsi que des groupes ciblants et solubilisants à la périphérie. De plus ce type de vecteur a l'avantage de pouvoir être synthétisé dans différentes tailles en faisant varier sa génération. Enfin la basse polymolécularité des dendrimères pourrait 20 fournir une substance pharmacocinétique reproductible, avantage certain pour leur avenir en application. /65 Listes des références (1) Tomalia, D.A. ; Baker, H. ; Hall, M. ; Kallos, G. ; Martin, S. ; Roeck, J. ; Smith, P. Macromolécules (1986) 19, 2466. (2) Astruc, D. ; Research Avenues On Dendrimers towards Molecular Biology from Biomimation to Medicinal Engneering ; C.R. Acad. Sci. (1996), 322, Serie 2b, 757-766. 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REVENDICATIONS 1 Un dendrimère conjugué comprenant au moins un dendrimère soluble dans l'eau encapsulant au moins une molécule de vitamine C. 2. Le dendrimère conjugué selon la revendication 1, dans lequel Iedit,-4e au moins und dendrimère a une structure radiale symétrique. 3. Le dendrimère conjugué selon la revendication 1 ou 2, dans lequel ledit le-au moins un, dendrimère a une structure globulaire. 4. Le dendrimère conjugué selon l'une quelconque des revendications 15 1 à 3, dans lequel ledit le au moins un, dendrimère a un diamètre de 10Aà50A. 5. Le dendrimère conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel leditdte au moins und dendrimère présente à sa 20 périphérie principalement des fonctions amines primaires libres ou des fonctions ammoniums. 6. Le dendrimère conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel ledit, le au moins und dendrimère a l'une des 25 structures suivantes : NH2 H2N HZN.i~N N,/~~NH2 N "N../ ---N N--'----'- H2N -N NHZ NH2 H2N10 5 NH2 /NH2 N H2N /NH2 N...n~ H2N NH2 Nom} ll-NH2 H2N~N~/'N N-~~N H2N/ NH2 N H2N/,.r ~~NH2 NH2 H2N N~/-N~ 1JH2 N NH2 ~~NH? "zN~_~ N r H2N--r NJ H21J rt ' ) H2 ~}f "2l H2N (} 1 j( H2 H2N ! } H2 H2NH2 H2N H2 H2N NH210H2N~N N H2N N H2N_/N-N':N N~ , _ _N H2N N~ . , H2N--z H2N--r H ~-N ~f äN N ~/ N H2N er` HH N~ N /N 2 N H2N N/ H2Nrr H2N _N H2N N N H2N H2N Ir H2N NH2 NN NNHz N~^NH2 NtiNH2 NH2 N N~ NH2 ~ 2 Nom\ NH2 N~ C NH2 NHz NHzNH2 H2N NH2NH2 I H NH2 2NHz NH2 2 J J N :ifNH2 N ,NHz N N fJ 2 NH NH2 w -N^ 2 NH ~ N ÇtH2 H2N H2N NH2 H2N N H2N H2 NHt3H H2N N fiH2 N NJ H2N ~~ ~_NH2 NH2 H2N-2--\ N N N N j r 1 NHz H2N N { N H2N NH N H2N HN 0 NH2 NH25M2! H H l H~ H NNr hH 0>--,--- i H ~,NH2 N?-j 0 H2 NH2 HN H H2NN~N NH H2NO° \ _N H2N ~/ Hz ~\ H O H2N HN; O 1 NH~ /`~O N L--NH L NH /) H HN "'N- ~O N` _ \ O NA 1~ O N O HN H2NN/^H`N O H2N-J N O H H ~N / ~ J H H N O ^Niv H rNH rNJ/ / O Hi O H2N SNH ~ N H2NH NH2 O HN HN N N O H O --(N--T.- NH2 O N 2 O H Op N~ `_NO HN''-N/ N" \-NH2 NH NH2 NÇO /NH N" H \ N \--)---NH 7. Le dendrimère conjugué selon l'une quelconque des revendications à 6, dans lequel ledit, au moins un, dendrimère est fonctionnalisé à 5 sa périphérie avec au moins un agent de surface organique. 8. Le dendrimère conjugué selon la revendication 7, dans lequel ledit, au moins un, agent de surface organique est sélectionné dans le groupe comprenant : une molécule pharmaceutique, une molécule 10 de ciblage ou un groupement solubilisant. 9. Le dendrimère conjugué selon la revendication 8, dans lequel l'agent de surface organique est un groupement solubilisant à chaînes polyéthylène glycol. 151-Q5. Le dendrimère conjugué selon la revendication 9, dans lequel le groupement solubilisant répond à l'une des structures (Il) ou (III) suivantes : O OR - -n Structure (Il) Structure (III) dans lesquelles : - n, ni, n2 et n3 représentent indépendamment un nombre entier de 1 à 500, et - R, RI, R2 et R3 représentent indépendamment un alkyle en CI à C6, un alcène en C2 à C6, un alcyne en C2 à C6, ou un aryle en C6 à C10 éventuellement substitué. 1-4-6. Le dendrimère conjugué selon la revendication 10, dans lequel le groupement solubilisant répond à l'une des structures (IV) ou (V) suivantes : O -n Structure (IV) [oR3 n361 Structure (V) dans lesquelles n représente 1 et n,, n2 et n3 représentent 3. 12. Le dendrimère conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel ledit, au moins un, dendrimère soluble dans l'eau répond à la structure suivante : e e � e a NH3G 10 lequel dendrimère est fonctionnalisé à sa périphérie par un groupement solubilisant répondant à l'une des structures (II) ou (III) suivantes : o Structure (Il) Structure (III) 15dans lesquelles : - n, ni, n2 et n3 représentent indépendamment un nombre entier de 1 à 500, et R, RI, R2 et R3 représentent indépendamment un alkyle en CI à C6, un alcène en C2 à C6, un alcyne en C2 à C6, ou un aryle en C6 à Cao éventuellement substitué. 13.8. Le dendrimère conjugué selon la revendication 12, dans lequel ledit,teùau moins un; dendrimère soluble dans l'eau répond à la structure suivante : 449. Le dendrimère conjugué de l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel ledit, le au moins un, dendrimère soluble dans l'eau réalise des liaisons supramoléculaires avec la au moins une molécule de vitamine C. 15.10. Le dendrimère conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans lequel ladite,la au moins une,, molécule de vitamine C est maintenue au coeur ou à la périphérie du au moins un dendrimère soluble dans l'eau.16. Le dendrimère conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans lequel le nombre moyen d'encapsulation est de 14 (� 1) à 500 (� 20) molécules de vitamine C par dendrimère. 17. Composition cosmétique comprenant un dendrimère conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 16. 18. Utilisation du dendrimère conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 comme agent anti-oxydant et/ou anti-10 inflammatoire. 19. Utilisation du dendrimère conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 pour la préparation d'une composition cosmétique anti-âge ou anti-rides. 20. Procédé de soin cosmétique comprenant une étape consistant à appliquer sur la peau une composition cosmétique comprenant un dendrimère conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 16. 20 21. Procédé de préparation d'un dendrimère conjugué comprenant au moins un dendrimère soluble dans l'eau encapsulant au moins une molécule de vitamine C, ledit procédé comprenant une étape de réaction dudit dendrimère soluble dans l'eau avec ladite au moins une molécule de vitamine C dans un solvant et à une température 25 qui facilitent la formation de liaisons supramoléculaires du dendrimère et de la molécule de vitamine C. 22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel l'association du dendrimère et de la molécule de vitamine C procède par 30 l'intermédiaire d'au moins une des liaisons suivantes : formation d'ascorbate d'ammonium avec une fonction amine du dendrimère, formation de liaison hydrogène entre une fonction hydroxyle de la vitamine C et une fonction amine du dendrimère. 15formation de liaison hydrogène entre une fonction hydroxyle de la vitamine C et une fonction amine du dendrimère. 23:18. Procédé selon la revendication 21 ou 22, comprenant la réaction dans l'eau d'une quantité suffisante de vitamine C pour obtenir une concentration inférieure à 10^2 mg/ml, avec une quantité suffisante de dendrimère pour obtenir une dendrimère conjugué ayant un ratio vitamine C : dendrimère de 14 à 500, la réaction étant effectuée à un pH de 6 à 8 et à une température de 25°C +1- 5°C. 24.19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, comprenant en outre une étape de fonctionnalisation, avant l'étape de réaction avec la vitamine C, consistant à fonctionnaliser la périphérie du dendrimère avec un agent de surface organique sélectionné dans le groupe comprenant : une molécule pharmaceutique, une molécule de ciblage ou un groupement solubilisant.