FR 2932189 A1 20091211 FR 0853848 A 20080610 1 BIOPUCES POUR LA DETECTION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE D'UNE ENZYME PROTEASE DESCRIPTION 5 DOMAINE TECHNIQUE La présente invention a trait à une biopuce pour détecter l'activité enzymatique d'une enzyme protéase, en particulier d' enzymes métalloprotéases, telle que des MMP (abréviation correspondant aux 10 métalloprotéases de matrice extracellulaire). Ces biopuces trouvent leur application dans le domaine du diagnostic, notamment dans la détermination de l'état d'avancement de certaines pathologies impliquant des enzymes protéases, telles 15 que les MMP (telles que le cancer, et particulièrement l'angiogénèse tumorale et l'agressivité tumorale) et dans le domaine du développement et de la validation de nouvelles thérapeutiques contre les enzymes protéases, telles que les MMP. 20 ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE Les enzymes protéases du type MMP sont une famille d'endopeptidases, au nombre de 28, contenant un atome de zinc au niveau de leur site actif. Elles peuvent être classées en deux sous-familles, selon 25 qu'elles sont sécrétées ou associées à une membrane. Les MMP sécrétées comprennent les collagénases (telles que MMP-1, 8, 13 et 18), les gélatinases (telles que MMP-2 et 9), les matrilysines (telles que MMP-7 et 26), les stromélysines (telles que MMP-3, 10 et 11), 30 l'épilysine (MMP-28), l'énamélysine (MMP-20). Les MMP 2 associées à une membrane comprennent les MMP transmembranaires telles que MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-23, MMP-24 et MMP-25. Les MMP sont capables de cliver tous les éléments de la matrice extracellulaire ainsi que certains facteurs de croissance, ou encore des molécules d'adhésion. Les MMP sont régulées par des inhibiteurs naturels, tels que les TIMP (abréviation correspondant aux inhibiteurs tissulaires de métalloprotéases), et jouent un rôle important dans les processus physiologiques (tels que la croissance embryonnaire, l'angiogénèse, le remodelage du tissu osseux). Lorsque la balance MMP/TIMP est déréglée, des processus pathologiques apparaissent tels que la croissance tumorale, les métastases, les arthrites rhumatoïdes, les maladies cardiaques. Le rôle des MMP dans la progression tumorale est multiple, notamment du fait de la capacité des MMP à dégrader la matrice extracellulaire, favorisant ainsi l'invasion tumorale. Il a été démontré que les MMP ont également une activité protéolytique contre des protéines non matricielles, ce qui leur confère un rôle complexe dans plusieurs autres étapes de la progression tumorale, la perte d'adhérence, l'invasion, la prolifération, l'angiogénèse, l'intravasion, l'extravasion et la croissance métastatique. La cellule endothéliale présente une remarquable stabilité génétique et sera donc peu sujette à des mutations provoquant une résistance aux traitements. L'angiogénèse tumorale est donc clairement 3 l'un des domaines les plus prometteurs et les plus actifs de la recherche contre le cancer. Plusieurs produits actuellement utilisés pour le traitement de certaines tumeurs ont des effets anti-angiogéniques. Le remodelage de la matrice extracellulaire, en particulier sa dégradation, est nécessaire dans plusieurs étapes de la progression tumorale. Cette dégradation est assurée en grande partie par les MMP. L'expression des MMP varie selon les étapes de la progression tumorale. Par exemple, ce sont les gélatinases (MMP-2 et 9), qui sont les plus exprimées dans l'angiogénèse tumorale. La plupart de ces MMP, en l'occurrence MMP-1, 2, 3, 7 et 8, 9, 10 et 133 et la MT1-MMP sont devenues des cibles thérapeutiques importantes pour le traitement de tumeurs cancéreuses. Les MMP sont impliquées dans la dégradation de nombreuses protéines de la matrice extracellulaire mais aussi non matricielles. Des tests utilisant des peptides peuvent être des outils efficaces pour la biologie, la chimie médicinale dans l'identification d'inhibiteurs, des séquences reconnues par des enzymes, d'activités enzymatiques. Actuellement, pour les enzymes protéases telles que les MMP, ces tests en solution utilisent des substrats synthétiques ou des fragments de substrats protéiques. Cependant, les substrats synthétiques ou naturels sont peu solubles, ce qui pose de nombreux problèmes. 4 Il existe donc un véritable besoin pour des tests supportés, à savoir des biopuces, pour suivre l'activité d'enzymes protéases qui permettent : une utilisation moindre des substrats synthétiques ou naturels de l'enzyme protéase ; - la disparition des problèmes liés à la solubilité des substrats ; - d'éviter l'adsorption des substrats sur le support de test sans qu'il y ait liaison par covalence, ce qui générait une non reproductibilité des résultats. EXPOSÉ DE L'INVENTION Ainsi, l'invention a pour objet une biopuce destinée à la détection de l'activité d'une enzyme protéase comprenant un support solide comprenant des sites prédéterminés recouverts d'une couche, laquelle couche est susceptible d'être obtenue par : - mise en contact des sites prédéterminés avec au moins un premier composé silane et au moins un deuxième composé silane, lesdits premier composé silane et second composé silane comprenant respectivement un groupe apte à réagir avec un groupe fonctionnel du support pour former une liaison covalente, un bras espaceur et un groupe terminal, ledit groupe terminal du premier composé silane étant un groupe apte à réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente et ledit groupe terminal du second composé silane étant un groupe n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant quoi les sites prédéterminés sont greffés par le premier composé silane et le second composé silane ; - mise en contact des sites prédéterminés ainsi greffés avec le substrat de l'enzyme protéase 5 susmentionnée, moyennant quoi le substrat réagit par le biais d'un groupe pendant, avec le groupe terminal du premier composé silane pour former une liaison covalente. En formant sur des sites prédéterminés d'un support solide une couche à base de deux types de composés silanes tels que mentionnés ci-dessus, l'on peut accéder ainsi à un greffage par covalence sur les sites prédéterminés de substrats de l'enzyme protéase (dont on veut mesurer l'activité) sans qu'il y ait adsorption desdits substrats à la surface desdits sites (cette adsorption étant évitée grâce au second composé silane comprenant une fonction terminale telle que définie ci-dessus). Sans que l'on soit nullement lié par la théorie, ces couches constituent des monocouches autoassemblées (souvent dénommées couches SAM), ces monocouches étant des films monomoléculaires très compacts résultant, dans notre cas de figure, de la fixation par covalence desdits premier et second composés silanes, cette fixation étant permise grâce à la réaction entre un groupe desdits premier et second composés silanes et un groupe fonctionnel de la surface du substrat (ce groupe fonctionnel étant généralement un groupe hydroxyle). Avantageusement, le bras espaceur du premier composé silane et du second composé silane est 6 une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17. Ainsi, avec de tels composés, l'on obtient une couche dense entraînant une bonne protection des liaisons de covalence entre le support et les composés silanes tout en permettant une bonne réactivité de la fonction terminale du premier composé silane. On obtient, de la sorte, une biopuce permettant une excellente détection de l'activité de l'enzyme protéase que l'on veut analyser. Le support solide constitutif des biopuces de l'invention est classiquement un support solide inorganique. Par exemple, les supports solides inorganiques peuvent être choisis dans le groupe constitué par les verres, les quartz, les céramiques (telles que les céramiques oxydes, comme la silice, l'alumine), les métaux (tels que l'aluminium, le chrome, le cuivre, le zinc, l'argent, le nickel, l'étain ou l'or), les métalloïdes (tels que le silicium). Dans le cas où les supports solides sont en métalloïdes, ils pourront être amenés à subir un traitement d'oxydation, de sorte à créer, à leur surface, notamment sur les sites prédéterminés susmentionnés, des groupes -OH, ces groupes -OH constituant les groupes fonctionnels susmentionnés. En particulier, le support solide peut être un wafer en silicium. Le support peut également être de nature organique. Il peut s'agir notamment d'un polymère choisi parmi les polyuréthanes, les polyoléfines, les polycarbonates, les polyéthylènetéréphtalates, ces 7 polymères étant avantageusement fluorés voire perfluorés. Parmi les polymères fluorés susceptibles de convenir, on peut citer le polyfluorure de vinylidène, les copolymères de tétrafluoroéthylène et de tétrafluoropropylène (connus sous l'abréviation FEP), les copolymères d'éthylène et de tétrafluoroéthylène (connus sous l'abréviation ETFE), les copolymères d'hexafluoropropène et fluorure de vinylidène (connus sous l'abréviation HFP-co-VDF). Ces supports solides comprennent des groupes aptes à réagir un groupe des premier et second composés silanes afin de former une liaison covalente. Ces groupes présents à la surface des supports solides sont classiquement des groupes hydroxyles, lesquels sont aptes à réagir avec un groupe desdits premier et second composé silane, pour former une liaison covalente. Le premier composé silane répond avantageusement à la formule (I) suivante : X1 \ X2 /Si A B X3 (I) dans laquelle : - XI, X2 et X3, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés en C1-C6r les groupes hydrolysables, à condition que l'un au moins des groupes XI, X2 et X3 soit un groupe hydrolysable ; 8 A correspond à un bras espaceur consistant en une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17 ; et - B correspond à un groupe terminal apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente. Le second composé silane répond avantageusement à la formule (II) suivante : X1\ X2 /Si A D X3 (II) dans laquelle : - XI, X2 et X3, identiques ou différents, 15 sont choisis dans le groupe constitué par les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés en C1-C6r les groupes hydrolysables, à condition que l'un au moins des groupes XI, X2 et X3 soit un groupe hydrolysable ; - A correspond à un bras espaceur 20 consistant en une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17 ; et - D correspond à un groupe terminal n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée. 25 Lesdits XI, X2 et X3, lorsqu'ils constituent des groupes hydrolysables, peuvent être choisis dans le groupe constitué par les atomes d'halogène, les groupes -OR', R' représentant un groupe alkyle, linéaire ou10 9 ramifié, en Cl à c6. En particulier, lorsque le support solide comporte, à sa surface, des groupes fonctionnels hydroxyles, les groupes hydrolysables sont avantageusement des atomes d'halogène, tels que Cl. A peut représenter un groupe - (CH2) n-, où n est un entier supérieur à 17, par exemple égal à 22. Pour le premier composé silane, le groupe B sera choisi de façon à pouvoir réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme protéase dont on veut déterminer l'activité. Il peut s'agir d'un groupe susceptible, par réaction chimique, de former une liaison ester ou une liaison amide ou un groupe susceptible de former une liaison par une réaction de métathèse ou chimie de Click (Huisgen). Il peut ainsi d'agir d'un groupe allyle, d'un groupe alcyne, d'un groupe amine, d'un groupe azoture ou d'un groupe carboxyle. Par exemple, la fonction du substrat peut être un groupe carboxyle ou amine, auquel cas, lorsqu'il s'agit d'un groupe carboxyle, le groupe B sera avantageusement un groupe polyéthylèneglycol, tel que le groupe triéthylèneglycol de formule suivante : Un premier composé silane particulièrement avantageux est un composé répondant à la formule (III) suivante : CI Si O O Cl/ 120 O OH (III) le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl. Pour le second composé silane, le groupe D sera choisi de sorte à ne pas réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme dont on veut déterminer l'activité. Par exemple, lorsque la fonction est un groupe carboxyle, le groupe terminal D peut être un groupe hydroxyle lié directement au bras espaceur. Un second composé silane particulièrement avantageux est un composé répondant à la formule (IV) suivante : Cl CI Si OH Cl / 20 (V) le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl. Les biopuces sont destinées, comme annoncé ci-dessus, à la détermination de l'activité enzymatique d'enzymes protéases. Ainsi, ces biopuces comprennent sur les sites prédéterminés des substrats de l'enzyme protéase dont on veut déterminer l'activité, ces substrats étant greffés sur lesdits sites via les premiers composés silanes tels que définis ci-dessus. On précise que par � substrat de l'enzyme 25 protéase �, on entend une séquence peptidique Cl 11 comprenant une séquence peptidique cible de l'enzyme protéase, dont on veut mesurer l'activité. Outre la séquence peptidique cible apte à être clivée par l'enzyme protéase, ce substrat comprendra avantageusement des sondes, par exemple, fluorescentes, afin de pouvoir effectuer des mesures d'activité. Ces biopuces sont particulièrement adaptées à la détermination de l'activité enzymatique d'enzymes métalloprotéases du type MMP, auquel cas le substrat comprendra une séquence peptidique cible d'une enzyme protéase. En particulier, les séquences peptidiques cibles peuvent être cibles d'une enzyme MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-5, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP- 12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-19, MMP-23, MMP-25 et MMP-26. Les séquences synthétiques peuvent comprendre, par exemple les acides aminés ou groupes suivants . Nva (Nor-valine) ; Cha (3- cyclohexylalanine) ; Dpa (N-3(2,4-dinitrophényl)-L-2,3- diaminopropionyle) ; Abu : acide a-aminobutyrique ; Cys(Me) correspondant à la S-méthylcystéine, ce qui signifie que le groupe -SH est remplacé par le groupe - S-CH3, D-Arg correspondant à la D-Arginine. Dans la suite de cet exposé, on précise que les abréviations listées ci-dessous ont les significations suivantes . Gly : glycine ; Pro : proline ; Leu leucine ; Ala : alanine ; Gln : glutamine ; Ile isoleucine ; Arg : arginine ; Val : valine ; Tyr 10 15 20 25 30 12 tyrosine ; Glu : glutamate ; Met : méthionine ; Phe : phénylalanine ; Asn : Asparagine ; Thr : thréonine ; Trp : tryptophane ; Ser : sérine ; His : histidine, ces abréviations correspondant à la nomenclature officielle à 3 lettres des acides aminés. Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-1, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-SEQ. 1 - Ala-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-SEQ. 2 - Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-SEQ.3 - Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Ile-SEQ.4 - Gly-Pro-Glu-Gly-Leu-Arg-Val-Gly-SEQ.5 -Tyr-Glu-Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-SEQ.6 - Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-Glu-Arg-SEQ.7 - Ala-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Ser-Thr-SEQ.8 - Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-SEQ.9 - Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-SEQ.10 - Thr-Glu-Gly-Glu-Ala-Arg-Gly-Ser- SEQ.11 - Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu- SEQ.12 - Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Leu-Pro-Ala- SEQ.13 - Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- SEQ.14 Deng, S.J., et al. 2000. J. Biol. Chem. 275, 31422 - Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys- SEQ.15 Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg- SEQ. 16 Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58 Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199 Stack, M.S., and Gray, R.D. 1989. J. Biol. Chem. 264, 4277 - Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-SEQ. 17 Netzel-Arnett, S., et al. 1991. Anal. Biochem. 195, 86 - Pro-Cha-Abu-Cys(Me)-His-Ala-SEQ.18 McGeehan, G.M., et al. 1994. J. Biol. Chem. 269, 32814 - Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-SEQ. 19 Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58 45 -Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-SEQ. 20 10 15 20 25 30 35 40 Mohan, M.J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ.21 Knâuper, V. et al. 1996. J. Biol. Chem. 271, 1544 10 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly- SEQ. 22 15 Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730 - Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-20 SEQ. 17 A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156 Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20957 25 -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg- SEQ. 23 30 J. Berman et al. 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437 - Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-SEQ. 24 35 Kraft, P.J. et al. 2001. Connect.Tissue Res. 42, 149-163 Itoh, M. et al. 1997. J.Pharm.Biomed.Anal. 15, 1417-1426 Welch, A.R. et al. 1995. Arch.Biochem.Biophys. 324, 59-64 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala- SEQ. 25 Lauer-Fields, J.L. and Fields, G.B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105 Lauer-Fields, J.L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803 -Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met- SEQ. 26 Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, 5314-5315 50 Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957 40 45 5 15 20 25 30 35 40 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-2, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val- SEQ.10 - Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala- SEQ.27 -Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu- SEQ.12 - Gly-Pro-His-Leu-Leu-Val-Glu-Ala- SEQ.28 - Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Leu-Pro-Ala- SEQ.13 - Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys- SEQ.29 Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221 - Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-SEQ. 16 Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58 Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199 Stack, M.S., and Gray, R.D. 1989. J. Biol. Chem. 264, 4277 - Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-SEQ.30 Murphy, G., et al. 1994. J. Biol. Chem. 269, 6632 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ.21 Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 - Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-SEQ. 31 Netzel-Arnett, S., et al. 1991. Anal. Biochem. 195, 86 -Pro-Leu-Gly-SCH[CH2CH (CH3) 2] -CO-Leu-Gly- SEQ. 32 Weingarten, H., et al. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Weingarten, H., et al. 1985. Biochemistry 24, 6730 -Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe- SEQ. 33 G.D. Johnson and K. Ahn 2000. Anal. Biochem. 286, 112 -Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ.21 Knight, C.G. et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 20 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly-SEQ.22 Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730 Xia, T. et al. 1996. Biochim. Biophys. Acta 1293, 259 -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg- SEQ.23 J. Berman et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437 -Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg- SEQ.24 Kraft, P.J. et al. 2001. Connect.Tissue Res. 42, 149-163 Itoh, M. et al. 1997. J.Pharm.Biomed.Anal. 15, 1417-1426 40 Welch, A.R. et al. 1995. Arch.Biochem.Biophys. 324, 59-64 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala- SEQ. 25 45 Lauer-Fields, J.L. and Fields, G.B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105 Lauer-Fields, J.L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803 -Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met- SEQ. 26 15 25 30 35 50 Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, 5314-5315 10 15 20 25 30 35 40 Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-3, elle peut 5 ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Gly-Pro-Glu-Gly-Leu-Arg-Val-Gly-SEQ.5 - Arg-Val-Gly-Phe-Tyr-Glu-Ser-Asp-SEQ.34 - Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr-SEQ.35 - Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-SEQ.36 - Ile-Ala-Gly-Arg-Ser-Leu-Asn-Pro-SEQ.37 - Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-SEQ.10 - Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-SEQ.38 - Asp-Val-Ala-Gln-Phe-Val-Leu-Thr- SEQ.39 -Asp-Thr-Leu-Glu-Val-Met-Arg-Lys- SEQ.40 15 20 25 30 35 40 45 18 - Asp-Val-Gly-His-Phe-Arg-Thr-Phe-SEQ.41 -Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-Met-Leu-Thr- SEQ.42 - Arg-Val-Ala-Glu-Met-Arg-Gly-Glu- SEQ.43 - Asp-Leu-Gly-Arg-Phe-Gln-Thr-Phe-SEQ.44 - Pro-Phe-Ser-Pro-Leu-Val-Ala-Thr-SEQ.45 - Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Leu-Pro-Ala-SEQ.13 - Ala-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Ser-SEQ.46 - Phe-Ser-Ser-Glu-Ser-Lys-Arg-Glu-SEQ.47 - Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu-SEQ.12 - Gly-Pro-His-Leu-Leu-Val-Glu-Ala-SEQ.28 - Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Phe-Gln-SEQ.48 -Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- SEQ. 49 Deng, S.J., et al. 2000. J. Biol. Chem. 275, 31422 - Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys- SEQ. 15 Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221 -Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-Ala-Lys- SEQ. 50 Beekman, B., et al. 1997. FEBS Lett 418, 305 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg- SEQ. 16 Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58 K night, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199 Stack, M.S., and Gray, R.D. 1989. J. Biol. Chem. 264, 4277 -Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Met-Arg- SEQ. 51 Netzel-Arnett, S., et al. 1991. Anal. Biochem. 195, 86 -Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp- SEQ. 52 Bickett, D.M., et al. 1994. Ann. N.Y. Acad. Sci. 732, 351 - Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-SEQ. 20 Mohan, M.J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ. 21 45 K night, C.G. et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly- 50 SEQ. 22 30 35 40 Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730 - Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-SEQ. 26 Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, 5314-5315 Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957 - Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-SEQ. 50 Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, 5314-5315 Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957 Lorsque la séquence peptidique cible est 20 destinée à être cible de l'enzyme MMP-5, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-Ala-Lys-25 SEQ. 50 Beekman, B., et al. 1997. FEBS Lett 418, 305 Lorsque la séquence peptidique cible est 30 destinée à être cible de l'enzyme MMP-7, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-35 SEQ. 16 Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58 Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199 40 Stack, M.S., and Gray, R.D. 1989. J. Biol. Chem. 264, 4277 -Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 10 15 45 Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 - Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-Ser- SEQ. 24 Welch, A.R., et al. 1996. Biochemistry 35, 10103 Welch, A.R., et al. 1995. Arch. Biochem. Biophys. 324, 59 - Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20 Mohan, M.J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly-SEQ. 22 Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730 - Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- SEQ. 17 30 A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156 Shabani, F. et al.1998. Free Radic.Res. 28, 115-123 Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20957 - Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Met-Arg-SEQ. 51 Finch-Arietta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo,C189-C191 Netzel-Arnett, S. et al. 1991 Anal.Biochem.195, 86-92 - Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp-SEQ. 52 Finch-Arietta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo,C189-C191 Bickett, D.M. et al., 1994. Ann.N.Y.Acad.Sci. 732, 351-355 35 40 45 22 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-8, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : - Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg-SEQ. 53 Netzel-Arnett, S., et al. 1991. Anal. Biochem. 195, 86 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg- SEQ. 16 15 Grams, F. et al. 2001. Biol. Chem. 382, 1277 - Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20 20 Mohan, M.J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150 25 -Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ. 21 Knâuper, V. et al. 1996. J. Biol. Chem. 271,1544 30 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly- SEQ. 22 35 Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730 - Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-40 SEQ. 17 A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156 Shabani, F. et al.1998. Free Radic.Res. 28, 115-123 Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20957 -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg- SEQ. 23 J. Berman et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437 10 45 50 -Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg- SEQ. 24 Kraft, P.J. et al. 2001. Connect.Tissue Res. 42, 149-163 Itoh, M. et al. 1997. J.Pharm.Biomed.Anal. 15, 1417-1426 Welch, A.R. et al. 1995. Arch.Biochem.Biophys. 324, 59-64 10 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-SEQ. 25 Lauer-Fields, J.L. and Fields, G.B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105 15 Lauer-Fields, J.L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-9, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : - Gly-Pro-Pro-Gly-Val-Val-Gly-Pro-SEQ.54 - Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Gly-Glu-SEQ.55 - Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-SEQ.56 - Ile-Pro-Gln-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-SEQ.57 - Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala-SEQ.58 - Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu-SEQ.12 - Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- 20 25 30 35 40 45 SEQ. 14 10 15 20 25 30 35 40 45 50 24 Deng, S.J., et al. 2000. J. Biol. Chem. 275, 31422 - Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys-SEQ. 15 Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221 -Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-Ala-Lys- SEQ. 50 Beekman, B., et al. 1997. FEBS Lett 418, 305 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg- SEQ . 16 B ickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58 Knight, C.G., et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199 Stack, M.S., and Gray, R.D. 1989. J. Biol. Chem. 264, 4277 - Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ . 19 B ickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58 -Pro-Leu-Gly-SCH[CH2CH (CH3) 2] -CO-Leu-Gly- SEQ. 32 Weingarten, H., et al. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Weingarten, H., et al. 1985. Biochemistry 24, 6730 -Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe- SEQ. 33 G.D. Johnson and K. Ahn 2000. Anal. Biochem. 286, 112 - Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20 Mohan, M.J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150 25 -Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 Roy, N. et al. 1999. Prot. Expr. Purif. 16, 324 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly- SEQ. 22 Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730 Xia, T. et al. 1996. Biochim. Biophys. Acta 1293, 259 -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg- SEQ. 23 J. Berman et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-10, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu- SEQ.12 -Gly-Pro-His-Leu-Leu-Val-Glu-Ala- SEQ.28 -Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 Kannan, R. et al. 1999. Prot. Expr. Purif. 16, 76 40 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-11, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-SEQ. 20 10 15 20 25 30 35 45 Mohan, M.J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ. 21 Kannan, R. et al. 1999. Prot. Expr. Purif. 16, 76 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-12, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : 15 -Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-SEQ. 20 20 Mohan, M.J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- 25 SEQ. 21 Park, H.I. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275, 20540 30 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly-SEQ. 22 Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 35 Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730 - Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-SEQ. 17 A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156 Shabani, F. et al.1998. Free Radic.Res. 28, 115-123 Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20957 -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg- SEQ. 23 Berman, J. et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437 10 40 45 50 -Pro-Tyr-Al a-Tyr -Trp-Met-Arg- SEQ . 51 Finch-Arietta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo,C189-C191 Netzel-Arnett, S. et al. 1991 Anal.Biochem.195, 86-92 - Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Al a-Nva-Trp- SEQ. 52 Finch-Arietta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo,C189-C191 Bickett, D.M. et al., 1994. Ann.N.Y.Acad.Sci. 732, 351-355 -Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-SEQ. 24 Kraft, P.J. et al. 2001. Connect.Tissue Res. 42, 149-163 Itoh, M. et al. 1997. J.Pharm.Biomed.Anal. 15, 1417-1426 Welch, A.R. et al. 1995. Arch.Biochem.Biophys. 324, 59-64 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala- SEQ. 25 Lauer-Fields, J.L. and Fields, G.B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105 Lauer-Fields, J.L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803 - Arg-Pro -Lys -Pro - Tyr-Al a-Nva-Trp-Met-SEQ. 26 Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315 Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957 - Arg-Pro-Lys-Pro -Val -Glu-Nva-Trp-Arg-SEQ. 50 40 Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315 Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957 - Arg-Pro-Lys-Pro -Gln-Gln Phe-Trp-45 SEQ. 59 Bickett, D.M. et al. 1994. Ann.N.Y.Acad.Sci. 732, 351-355 30 35 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-13, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes -Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- SEQ. 49 Deng, S.J., et al. 2000. J. Biol. Chem. 275, 31422 -Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-Ala-Lys-SEQ. 50 Beekman, B., et al. 1997. FEBS Lett 418, 305 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-Dpa-SEQ. 25 Knauper, V., et al. 1996. J. Biol. Chem. 271, 1544 - Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20 Mohan, M.J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 Knauper, V. et al. 1996. J. Biol. Chem. 271, 1544 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly-SEQ.22 Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 40 Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg- SEQ. 16 Netzel-Arnett, S. et al. 1991. Anal.Biochem.195, 86-92 Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156 Bickett, D.M. et al., 1993. Anal.Biochem. 212, 58-64 45 50 - Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-SEQ. 17 A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156 Shabani, F. et al.1998. Free Radic.Res. 28, 115-123 Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20957 -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg- SEQ. 23 J. Berman et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437 - Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-SEQ. 31 Netzel-Arnett, S. et al.1991. Anal.Biochem.195, 86-92 d'Ortho, M.P. et al., 1997. Eur.J.Biochem. 250, 751-757 - Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Met-Arg-SEQ. 51 Finch-Arietta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo,C189-C191 Netzel-Arnett, S. et al. 1991 Anal.Biochem.195, 86-92 -Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp- SEQ. 52 Finch-Arietta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo,C189-C191 Bickett, D.M. et al., 1994. Ann.N.Y.Acad.Sci. 732, 351-355 - Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-SEQ. 24 40 Kraft, P.J. et al. 2001. Connect.Tissue Res. 42, 149-163 Itoh, M. et al. 1997. J.Pharm.Biomed.Anal. 15, 1417-1426 Welch, A.R. et al. 1995. Arch.Biochem.Biophys. 324, 59-64 - Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg-45 SEQ. 53 Aschi, M. et al. 2002. J.Comput.Aided Mol.Des 16, 213-225 Netzel-Arnett, S. et al. 1991. Anal.Biochem.195, 86-92 10 15 20 25 30 35 50 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala- SEQ. 25 Lauer-Fields, J.L. and Fields, G.B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105 Lauer-Fields, J.L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803 -Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met- SEQ. 26 Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315 Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957 -Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln--Phe-Trp- SEQ. 59 Bickett, D.M. et al. 1994. Ann.N.Y.Acad.Sci. 732, 351-355 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-14, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Pro-Leu-Ala-Cys(p-OMeBz)-Trp-Ala-Arg- SEQ. 60 Mucha, A., et al. 1998. J. Biol. Chem. 273, 2763 Holtz, B., et al. 1999. Biochemistry 38, 12174 - Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- 35 SEQ. 20 Mohan, M.J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W.P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ. 21 Roderfeld, M. et al. 2000 . Prot. Expr. Purif. 19, 369 Kannan, R. et al. 1999. Prot. Expr. Purif. 16, 76 15 20 25 30 40 45 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly- SEQ. 22 Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-15, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 Xue, C.-B. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 2636 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-16, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 Shimada, T. et al. 1999. Eur. J. Biochem. 262, 907 Xue, C.-B. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 2636 30 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-17, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- 35 SEQ. 21 English, W.R. et al. 2001. FEBS Lett. 491, 137 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly-SEQ. 22 40 5 10 15 20 25 35 32 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-19, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ. 21 Pendâs, A.M. et al. 1997. J. Biol. Chem. 272, 4281 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-23, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ. 21 Velasco, G. et al. 1999. J. Biol. Chem. 274, 4570 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-25, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ. 21 English, W.R. et al. 2001. FEBS Lett. 491, 137 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-26, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg- SEQ. 16 Park, H.I. et al. 2002. J. Biol. Chem. 277, 35168 40 33 Dans certains cas, il est possible qu'un substrat naturel ou synthétique soit reconnu et clivé par plusieurs MMP. Afin de déterminer quelle MMP est responsable du clivage, il faudra alors utiliser et comparer les données de cinétique enzymatique des différentes MMP pour ce substrat. Ces données de cinétique enzymatique qui permettent la discrimination entre plusieurs MMP, sont généralement la constante de Mickaelis (Km) qui est l'indicateur d'affinité d'un enzyme pour son substrat et le rapport de la constante catalytique (Kcat, nombre de moles de produits formées par seconde et par mole d'enzyme) sur la constante de Mickaelis qui est l'indicateur de l'efficacité catalytique de l'enzyme. Généralement, il existe donc un couple de valeurs (Km et kcat/Km) spécifique pour un couple MMP/substrat. Il sera donc posible, à titre d'exemple, pour 2 MMP reconnaissant le même substrat de déterminer laquelle est responsable de l'activité visualisée. Des substrats adéquats susceptibles d'être greffés sur les sites prédéterminés peuvent répondre à la formule (V) suivante : (X)-S- (X2) m (V) dans laquelle S correspond à une séquence peptidique cible de l'enzyme protéase (dont on veut déterminer l'activité), cette séquence pouvant correspondre à l'une de celle explicitée ci-dessus pour les enzymes MMP ; 34 - n et m sont des entiers égaux à 0 ou 1 ; - lorsque m et n sont égaux à 1, X1 est une sonde porteuse d'un groupe donneur fluorescent et X2 est une sonde porteuse d'un groupe accepteur fluorescent ou non fluorescent, le groupe donneur et le groupe accepteur étant choisis, de préférence, de sorte à ce que le spectre d'émission de fluorescence du groupe donneur recouvre, au moins en partie, le spectre d'absorption du groupe accepteur. Ces substrats réagissent classiquement par le biais d'une fonction pendante, telle qu'une fonction carboxyle ou une fonction amine, présente dans la séquence peptidique, laquelle fonction est apte à réagir avec les groupes terminaux des premiers composés silane. Des substrats adéquats susceptibles d'être greffés sur les sites prédéterminés peuvent correspondre également à des peptides cycliques comprenant la séquence suivante : -S1-X1-S2-X2- dans laquelle S1 est une première séquence peptidique cible d'une enzyme protéase El, S2 est une seconde 25 séquence peptidique cible d'une enzyme protéase E2, S1 et S2 pouvant être identiques ou différents, E1 et E2 pouvant correspondre à la même enzyme protéase ou à deux enzymes protéases distinctes, X1 est une sonde porteuse d'un groupe donneur fluorescent et X2 est une 30 sonde porteuse d'un groupe accepteur fluorescent ou non fluorescent.20 35 De préférence, le groupe donneur et le groupe accepteur sont choisis de sorte à ce que le spectre d'émission de fluorescence du groupe donneur recouvre, au moins en partie, le spectre d'absorption du groupe accepteur. Ainsi, en présence d'une enzyme protéase E (si E1 et E2 ne constituent qu'une seule et même enzyme et S1 et S2 sont des séquences peptidiques cibles de la même enzyme protéase) ou à la fois d'une enzyme protéase E1 et d'une enzyme protéase E2 (lorsqu'elles sont distinctes et que S1 est une séquence peptidique cible de l'enzyme protéase E1 et S2 est une séquence peptidique cible de l'enzyme protéase E2), les peptides cycliques de l'invention vont se cliver à la fois au niveau de la première séquence peptidique S1 et au niveau de la seconde séquence peptidique S2, ce qui va générer un éloignement dans l'espace des sondes X1 et X2, du fait de la disposition des sondes X1 et X2. S'ensuit un éloignement des groupes donneur et accepteur et, par voie de conséquence, une variation du transfert de l'énergie de résonance entre ces deux groupes. A partir de la variation d'énergie de résonance, il est ainsi possible de remonter à l'activité enzymatique de l'enzyme protéase E ou des enzymes protéases E1 et E2. Dans ce qui précède et ce qui suit, par groupe donneur fluorescent, on entend classiquement un groupe apte à absorber de l'énergie lumineuse (dite lumière d'excitation, dont la longueur d'onde appartient généralement au domaine de l'ultraviolet) et 36 de la restituer sous deux formes possibles en fonction de son environnement . a) sous forme d'un transfert d'énergie d'excitation par résonance avec un groupe accepteur, à condition que ce dernier se trouve à une distance compatible avec le phénomène de FRET décrit précédemment et préférentiellement, à une distance allant de 10 à 100 Â ; ou b) sous forme d'une lumière fluorescente (dite lumière d'émission du donneur), dont la longueur d'onde appartient, généralement, au domaine du visible. Par groupe accepteur, on entend classiquement, au sens de l'invention, un groupe apte à absorber l'énergie d'excitation du groupe donneur par énergie de résonance. Cette énergie d'excitation pourra être restituée selon deux grands modes : a) par émission radiative (émission de photons), auquel cas on parlera de groupe accepteur fluorescent ; ou b) par émission non radiative (à savoir tout autre mode de désactivation autre que l'émission de photons), auquel cas on parlera de groupe accepteur non fluorescent. Par sonde, on entend classiquement, au sens de l'invention, un reste d'acide aminé porteur d'un groupe donneur (dans le cas de la sonde X1) ou porteur d'un groupe accepteur (dans le cas de la sonde X2). Par séquence peptidique cible, on entend classiquement, au sens de l'invention, une séquence peptidique apte à être reconnue et clivée par l'enzyme protéase E. 37 L'utilisation d'un peptide cyclique comprenant deux séquences peptidiques cibles d'une enzyme protéase E1 et E2 entre lesquelles sont disposées respectivement une sonde X1 et une sonde X2 conforme à l'invention permet, comme explicité ci-dessus, de fournir de bons outils pour la quantification de l'activité d'une enzyme protéase. Des substrats cycliques de l'invention peuvent répondre à la formule (VI) suivante : S1ùX1ùS2ùX2 R1ù Y R2 10 dans laquelle : - SI, X1, S2 et X2 répondent à la même définition que celle donnée ci-dessus ; 15 - R1 et R2 correspondent indépendamment à une liaison simple, un reste d'acide aminé ou une séquence peptidique ; - Y correspond à un groupe -CONH- ou -NHCO-. S1 et S2 peuvent être identiques ou 20 différents, notamment lorsque le peptide est destiné à différencier la présence d'isoformes de la même enzyme ou lorsque qu'il s'agit de différencier deux enzymes protéases distinctes E1 et E2. Lorsque S1 et S2 sont identiques, elles 25 peuvent être disposées dans le même sens ou en sens inverse. Par exemple, lorsque S1 correspond à la séquence -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-, la séquence 38 S2 peut correspondre à la même séquence disposée en sens inverse, à savoir la séquence suivante -Ala-Gly-Leu-Leu-Gly-Gln-Pro-Gly-. Qu'ils soient linéaires ou cycliques, les substrats peuvent comprendre au moins un sonde X1 porteuse d'un groupe donneur fluorescent et au moins une sonde X2 porteur d'un groupe accepteur fluorescent ou non fluorescent, de sorte à ce que, de préférence, le spectre d'émission de fluorescence du groupe donneur recouvre, au moins en partie, le spectre d'absorption du groupe accepteur, ce qui se traduit par un phénomène de transfert non radiatif de l'énergie d'excitation du groupe donneur vers le groupe accepteur (ou transfert d'énergie de résonance). De tels groupes comprennent classiquement un noyau aromatique, tel qu'un noyau benzénique, anthracénique ou coumarine. On peut citer, par exemple, les couples suivants (le premier membre du couple étant le groupe donneur, tandis que le second membre du couple étant le groupe accepteur) . *Tryptophane/2,4-dinitrophényle (symbolisé par l'abréviation W/Dnp) ; *Acide o-aminobenzoïque/2,4-dinitrophényle (symbolisé par l'abréviation Abz/Dnp) ; *(7-méthoxycoumarin-4-yl)-acétyle/2,4-dinitrophényle (symbolisé par l'abréviation Mca/Dnp) ; *(7-méthoxycoumarin-4-yl)-acétyle/N-3-(2,4- dinitrophényl)-L-2, 3-diaminopropyle (symbolisé par l'abréviation Mca/Dpa) ; 39 *Tryptophane/Dansyle (symbolisé par l'abréviation W/Dns) ; *N-méthylanthranoyle/2,4-dinitrophényle (symbolisé par l'abréviation Nma/Dnp) ; *6,7-diméthoxycoumarin-4-yl-acétyle/acide 6-N-(7- nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)aminohexanoïque (symbolisé par l'abréviation DMC/Nbd) ; *Acide 5-(2'-aminométhyl)naphtalène sulfonique/acide 4-(4'-diméthylaminophénylaza)benzoïque (symbolisé par l'abréviation EDANS/Dabcyl) ; * acide 7-méthoxycoumarin-3-carboxylique/acide 7- diéthylaminocoumarin-3-carboxylique/ (symbolisé par l'abréviation MC/DAC), lesdits groupes répondant aux formules suivantes .15 N O2N CO2 H Dnp Dansyle Abz NH4 HN EDANS O OùPùO O NH2 DABCYL HN N O2 Nbd H Dpa Nma Avantageusement, le groupe donneur et le groupe accepteur sont des groupes comprenant un noyau coumarine. Du fait que ces groupes présentent un motif aromatique commun du type coumarine, cela permet la formation d'un complexe de nature hydrophobe ou du type n-stacking, qui participe à la stabilité des peptides cycliques de l'invention. En particulier, le couple préféré peut être le couple MC/DAC, ayant pour formules respectives, une fois liés à la sonde, les formules suivantes : OCH3 MC Les sondes X1 et X2 peuvent être des restes 5 d'acide aminé. Un exemple de sonde X1 peut être ainsi la sonde -Lys(MC)- de formule suivante : OC H3 o 43 tandis qu'un exemple de sonde X2 peut être la sonde -Lys(DAC)- de formule suivante : 0 le groupe -NH- du reste de la lysine devenant un groupe -NH2 lorsque la sonde Lys(DAC) constitue un groupe terminal et non un groupe faisant pont. S1 et S2 peuvent correspondre à une séquence cible d'une MMP telle que définie ci-dessus, en particulier à la séquence suivante : - Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala- ou - Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro ces séquences correspondant respectivement 20 à des séquences reconnues par l'enzyme MMP-1 et l'enzyme MMP-9. Un substrat cyclique conforme à l'invention peut être un peptide cyclique de formule suivante :15 Gly-Pr o-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-XI-Gly-Pr o-Gln-Gly-Leu-Leu-G ly-Ala-X2 R1ù Y R2 XI, X2, R1, Y et R2 répondant à la même définition que celle donnée ci-dessus. Un peptide cyclique précis conforme à l'invention répond à la formule suivante : Gly-Pr o-Gln- Gly-Leu- Leu -Gly-Ala-Lys(DAC)-Gly-Pr o-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys(MC) NH COùLys les groupes -Lys(DAC)- et -Lys(MC)- répondant à la même définition que celle donnée ci-dessus. Les séquences en gras seront clivées en présence de l'enzyme MMP1, contribuant ainsi à éloigner l'une de l'autre les sondes Lys(Dac) et Lys(MC). S'ensuit une variation du transfert de résonance, permettant ainsi de quantifier l'activité de l'enzyme MMP1. Des exemples de substrats linéaires susceptibles d'être greffés sur les sites prédéterminés par le biais des premiers composés silanes sont les suivants . Lys(DAC)-Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-Lys(MC)-Ala, les groups Lys(DAC) et -Lys(MC) répondant aux formules respectives suivantes:25 HN NH2 O OC H3 NH+ o la liaison sur le composé silane se faisant, classiquement, par la fonction -0O2H portée par l'acide aminé Ala. La séquence peptidique, représentée en gras, est cible de l'enzyme MMP-9, cette enzyme étant impliquée dans le processus d'angiogénèse tumorale. Elle fait également partie des marqueurs et des cibles potentielles en cancérologie. 46 Les substrats présentant des sondes X1 et X2 telles que définies ci-dessus et greffés sur des sites prédéterminés d'un substrat solide via les premiers composés silanes tels que définis ci-dessus vont permettre de suivre l'activité d'enzyme protéase : - par variation du transfert d'énergie par résonance grâce, par exemple, à un microscope d'épifluorescence ; et - par augmentation de la fluorescence de l'une des sondes fluorescentes dans le milieu biologique réactionnel après clivage du peptide. Les biopuces de l'invention peuvent être préparées par le procédé suivant : - éventuellement, une étape d'activation de la surface d'un support solide en des sites prédéterminés, de façon à créer des fonctions aptes à réagir avec un groupe des premier et deuxième composés silanes pour former une liaison covalente ; - une étape de mise en contact des sites prédéterminés avec au moins un premier composé silane et au moins un deuxième composé silane, lesdits premier composé silane et second composé silane comprenant respectivement un groupe apte à réagir avec le support pour former une liaison covalente, un bras espaceur et un groupe terminal, ledit groupe terminal du premier composé silane étant un groupe apte à réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente et ledit groupe terminal du second composé silane étant un groupe n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant 47 quoi les sites prédéterminés sont greffés par le premier composé silane et le second composé silane ; - une étape de mise en contact des sites prédéterminés ainsi greffés avec le substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennent quoi le substrat réagit avec le groupe terminal du premier composé silane pour former une liaison covalente. Ainsi, le procédé de l'invention peut comprendre une étape d'activation du support en des sites prédéterminés pour créer des fonctions réactives. Classiquement, lorsque le support est un support en silicium, l'étape d'activation peut consister à soumettre le support sur des sites prédéterminés à un traitement d'oxydation de sorte à créer des groupes -OH à la surface du support, ce traitement d'oxydation pouvant à consister à soumettre le support à un flux d'ozone pendant une durée appropriée. Pour les étapes de mise en contact, les premier et second composés silanes répondent à la même définition que celle donnée ci-dessus de même que le substrat. Selon un mode particulier de réalisation, le support peut être un support en silicium, tandis que les premier et second composés peuvent répondre respectivement aux formules (III) et (IV) suivantes : Cl O O 20 (III) O OH 48 le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl ; Cl CI /Si OH Cl 20 (IV) le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl ; et le substrat peut répondre à la formule suivante : 10 Lys(DAC)-Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-Lys(MC)-Ala Lys(DAC) et Lys (MC) répondant à la même formule que celle donnée ci-dessus pour le substrat linéaire. Avant l'étape de mise en contact, les 15 composes silanes peuvent être préalablement par des techniques classiques de synthèse organique. Ainsi, à titre d'exemple, le premier composé silane de formule (III) peut être préparé selon le schéma réactionnel suivant : 20 g f Mg Br 9 Br\ 10H X11 Br J h ~00 v O v OH ~p Il\O O v OAc CIC/Si 20 O v O v OAc f: Mg, THF; g: MeLi, THF; h: Cul, TA, 15h; j: Et3N, TsC1, DCM, TA, 12h; k: THF, reflux 12h 1: DCM, Ac2O, reflux 12h; m: toluène, HSiC13, catalyseur de K irsted, 40°C, 2h les abréviations THF, Me, TA, Et, Ts, DCM, Ac correspondant respectivement à : tétrahydrofurane, méthyl, température ambiante, éthyle, tosyle, dichlorométhane et acétyl. Quant au second composé silane de formule (IV), il peut être préparé selon le schéma réactionnel suivant . o HOC O O ONa CI f Ç)r MgBr OH g Br h //OH 20 %9 OH OAc 20 \ CI Si OAc Cl/ , 20 f: Mg, THF; g: MeLi, THF; h: CuI, TA, 15h; i: pyridine, Ac2O, TA, 12h; m: toluène, HSiC13, catalyseur de Karsted, 40°C, 2h Les premier et second composés silanes sont destinés à être mis en contact avec le support éventuellement activé. Préalablement à la mise en contact, les premier et second composés silanes peuvent être solubilisés dans un ou plusieurs solvants organiques, la solution résultante constituant ainsi le bain dans lequel sera plongé le support en vue d'être fonctionnalisé par lesdits composés silanes. A titre d'exemple, les composés de formules (III) et (IV) susmentionnées, peuvent être solubilisés dans un mélange hexane/chloroforme/tétrachlorure de carbone. Une fois mis en contact avec le support éventuellement activé si nécessaire, les composés silanes réagissent avec les fonctions adéquates du substrat solide en des sites prédéterminés et se lient Cl 1 à ces derniers par covalence notamment en formant des liaisons siloxane. Avec des composés silanes de formules (III) et (IV) susmentionnées, le schéma réactionnel peut être 5 le suivant : O CCISi /`,.~0 /`0~.O /`off Si i ../ ÎHO zo O n n: cyclohexane/chloroforme/tétrachlorure de carbone (80/13/7), 18°C, 15h; o: potasse caustique, 20 min Les réactions de greffages peuvent être suivies par imagerie FR-IR (infra-rouge par transformée 10 de Fourier). Cette technique permet notamment d'obtenir une image, où chaque pixel représente un spectre IR. En réalisant les rapports de bande, il est possible de 52 visualiser la présence ou non des molécules introduites. Une telle imagerie peut être obtenue à partir d'un imageur SpotLight 300 de chez Perkin-Elmer. Pour confirmer les résultats par imagerie FT-IR sur les biopuces, il est possible de réaliser, en parallèle, des mesures des surfaces du support par ellipsométrie, qui est une technique optique d'analyse de surface fondée sur la mesure du changement de l'état de polarisation de la lumière après réflexion sur une surface plane. Cette technique permet d'avoir accès à de nombreux paramètres tels que l'épaisseur de la couche mince, son indice de réfraction. Après l'étape de mise en contact avec les composés silanes, le support peut être soumis à une étape destinée à éliminer les composés silanes n'ayant pas réagi, cette étape pouvant consister à le soumettre à une sonication pendant quelques minutes. Le support ainsi fonctionnalisé est ensuite mis en contact avec un substrat de l'enzyme dont on veut déterminer l'activité, ce substrat comprenant une fonction apte à réagir avec un groupe terminal du premier composé silane, de sorte à former une liaison covalente. Avec un substrat greffé avec des composés silanes particuliers tels que mentionnés ci-dessus, le schéma réactionnel peut être le suivant : i/~äjO/~O-^.O/,OH + HOOC Substrat O 1iOH O O Si i~O/~O~0' C:) Substrat O i,/1,4OH 1 20 Le signal de la biopuce pourra être suivi des façons suivantes : - par augmentation de l'intensité de fluorescence de la sonde telle que définie ci-dessus (sous réserve d'être présente), se trouvant sur la partie peptidique relarguée après hydrolyse du peptide substrat grâce à l'utilisation d'un spectrofluorimètre et d'une cellule de fluorescence ; - par variation de l'énergie de résonance (FRET) sous réserve que le substrat comprenne des 53 54 sondes telles que définies ci-dessus à l'aide d'un microscope d'épifluorescence ; - par imagerie FT-IR en visualisant le rapport de bandes d'absorption de fonctions chimiques en fonction du temps. Les biopuces de l'invention sont destinées à être utilisées pour déterminer l'activité enzymatique d'enzyme protéase. De ce fait, elles peuvent être destinées à être mises en contact avec des fluides biologiques comprenant l'enzyme protéase, dont on veut déterminer l'activité ou avec des milieux comprenant des cultures cellulaires ou cellules tumorales et l'enzyme protéase, dont on veut déterminer l'activité. L'invention va maintenant être décrite en référence aux exemples suivants, donnés à titre illustratif et non limitatif. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS Les figures 1A et 1B représentent l'imagerie par FT-IR du support de silicium avant et après greffage des composés silanes de formules (III) et (IV) conformément au point e) de l'exemple. La figure 1C représente l'image par ellipsométrie du support après greffage. Les figures 2A à 2C représentent l'imagerie par FT-IR du support de silicium conformément au point f de l'exemple et la figure 2D représente l'image par ellipsométrie de la biopuce obtenue conformément au point f de l'exemple. La figure 3 représente un schéma correspondant à une cellule de fluorescence utilisée pour la détermination des cellules enzymatiques. 55 EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS Dans les exemples ci-dessous, tous les produits chimiques et les solvants sont de qualité analytique et ont été achetés chez Sigma. La résine Fmoc-Ala-Wang, le PyBOP et tous les acides aminés (protégés en Na par Fmoc) ont été achetés chez Advanced Chemtech. Toutes les réactions chimiques ont été réalisées sous N2 avec des solvants anhydres. Le DMF a été desséché sur CaH2 au reflux pendant une nuit et distillé. Le DCM a été distillé avant utilisation. Les spectres de fluorescence ont été réalisés sur un spectrofluorimètre PTI et un Jobin-Yvon JY3 avec une cuve thermostatée à 37°C. La synthèse peptidique en phase solide a été effectuée sur un synthétiseur Applied Biosystem 433A. Les purifications ont été réalisées sur une HPLC Shimadzu en phase inverse (contrôleur SLC-10 AVP, pompes LC8A, détecteur UV/Vis SPD-10 AVP (longueurs d'onde 214, 267 et 254 nm) et colonne C18 Satisfaction RP18AB 5 pm 250*4,6 mm. Le système de solvants utilisés pour l'élution est : (A) solution aqueuse de TFA à 0,1% et (B) solution aqueuse d'ACN à 70%. Les images de fluorescence ont été obtenues avec un microscope d'épifluorescence Olympus BX 51 de chez Olympus (Japon). Toutes les images ont été acquises avec un temps d'exposition de 1/3 s. Le filtre d'excitation utilisé est un filtre 330-385 nm. Les images et les spectres FT-IR ont été obtenus en utilisant un système imageur SpotLight 300 30 56 de chez Perkin-Elmer (France), équipé avec un spectrophotomètre Spectrum One. Les spectres d'acquisition FT-IR ont été réalisés en utilisant le mode transmission (8 scans à une résolution de 8 cm-1). La taille des pixels des images FT-IR est de 6,25*6,25 microns. Toutes les mesures ont été conduites avec un système purgé à l'azote. La correction atmosphérique a été réalisée sur chaque spectre FT-IR, afin de réduire l'absorption de l'eau et du CO2. Les mesures d'ellipsométrie ont été effectuées sur un ellipsomètre Nanofilm lelli 2000, équipé d'un objectif *10, à 563 nm pour déterminer l'épaisseur de la monocouche d'alkylsilanes à la surface des wafers de silicium. La surface de mesure est de 450*450 }1m2. L'angle d'incidence est de 70°. Les indices de réfraction pour la couche d'alkylsilane et la couche alkylsilane/peptide ont été estimés à 1,46. L'épaisseur de toutes les couches ont été calculées avec 0=151,6° et ij=13,57°. Dans ces exemples, il est employé les abréviations suivantes . ACN : acétonitrile ; DAC : acide 7- diéthylamino coumarin-3-carboxylique ; DCM dichlorométhane ; DIEA : diisopropyléthylamine ; DMSO diméthylsulfoxyde ; DMF : diméthylformamide ; EDC chlorure de 1-éthyl-3-(3- diméthylaminopropyl)carbodiimide ; Fmoc : 9- fluorophénylméthyloxycarbonyl ; HBTU : N-[1H- benzotriazol-1-yl)diméthylamino)méthylène]-N- méthylméthaminium hexafluorophosphate N-oxyde ; HOBt N-hydroxybenzotriazole ; MC : acide 7-méthoxycoumarin- 3-carboxylique ; MeOH : méthanol ; NHS : N- hydroxysuccinimide ; ; OtBu : 0-t-butyle ; Pmc 2,2,5,7,8-pentaméthylchroman-6-sulfonyl ; AMPA : 4- aminophénylmercurique acétate ; PyBOP : benzotriazol-1- yl-oxy+tris-pyrrolidinophosphonium ; TA : température ambiante ; TFA : acide trifluoroacétique ; THF tétrahydrofurane ; TIS : triisopropylsilane ; TRIS tris(hydroxyméthyl)aminométhane. a) Synthèse du peptide substrat de la MMP-9 Le schéma réactionnel de synthèse de ce peptide est le suivant : a b Fmoc-A1aù Wang > HzNùAIaùWangù> Fmoc-Lys(MC)-AlaùWang lc HzN-GPGGV V GP-Lys(MC)-AlaùWang Fmoc-Lys(DAC)-GPGGV VGP-Lys(MC)-A1 Wang a: 20% pipéridine/DMF, TA, 2h; b: FmocLys(MC), PyBOP, HOBt, DIEA, DMF, TA, 5h; c: Synthèse peptidique en phase solide; d: FmocLys(DAC), PyBOP, HOBt, DIEA, DMF, TA, 5h; e: 20% pipéridine/DMF, TA, 2h, TFA/H201TIS (95:2,5:2,5), TA, 3h Le peptide Lys(DAC)-GPGGVVGP-Lys(MC)A, les lettres G, P, V, A correspondant respectivement aux acides aminés glycine, proline, valine, alanine, a été synthétisé, en utilisant la stratégie Fmoc à 0,1 mmol. Une résine commerciale préchargée Fmoc-Ala-Wang (0,5 g, 0,8 mmol/g) est déprotégée selon la procédure standard de déprotection du groupe Fmoc pour donner la résine 58 H2N-Ala-Wang. Cette dernière réagit avec la Fmoc-Lys(MC) (228 mg, 0,4 mmol) en présence de PyBOP (173 mg, 0,392 mmol), de HOBt (54 mg, 0,4 mmol) et de DIEA (103 mg, 0,8 mmol) dans le DMF (5 mL) pendant 5 heures à température ambiante. La solution est filtrée et la résine résultante est lavée avec 5*10 mL de DMF, 5*10 mL de dichlorométhane et 5*10 mL de méthanol pour donner 0,14 g de résine Fmoc-Lys(MC)-Ala-Wang. Le taux de substitution de cette nouvelle résine est estimé à 0,425 mmol/g par mesure UV de la concentration de dibenzofulvène libéré après clivage du groupe Fmoc avec la pipéridine. Les fonctions amines n'ayant pas réagi sont acétylées, afin de prévenir toute réaction secondaire dans les étapes suivantes. Cette étape de � capping � est réalisée avec de l'anhydride acétique (16 mg, 0,16 mmol) et de la pipéridine (12 mg, 0,16 mmol) dans le DMF (2 mL) pendant 40 minutes à température ambiante. Après lavage, 0,14 g de cette résine est isolée et l'efficacité du � capping � est vérifiée par un test à la ninhydrine. Après plusieurs synthèses, 0,238 g de résine Fmoc-Lys(MC)-Ala-Wang sont placés dans le réacteur du synthétiseur automatique de peptide. Les acides aminés Na-Fmoc (Gly, Pro et Val) sont utilisés avec un excès de 10 fois avec du HBTU en présence de HOBt et de DIEA pendant 16 heures. 0,368 g de peptide lié à la résine, qui est déprotégée à l'extrémité N-terminale. La Fmoc-Lys(DAC) réagit avec le peptide lié à la résine en présence de PyBOP (216,7 mg, 0,49 mmol), de HOBt (67,5 mg, 0,5 mmol) et de DIEA (129,2 mg, 1 mmol) dans DMF pendant 5 heures à température ambiante. La solution est filtrée et la 20 OH 59 résine est lavée pour donner 0,392 g de peptide lié à la résine. Après un traitement en présence de 20% de pipéridine dans le DMF à température ambiante, le peptide est clivé de la résine grâce à une solution de TFA/H20/TIS (92 :2,5 :2,5) pendant 3 heures à température ambiante. La résine est éliminée par filtration et elle est lavée avec du TFA (2*1 mL) et du dichlorométhane (10 mL). Le filtrat est évaporé sous pression réduite puis noyé dans de l'éther diéthylique froid. Après 12 h à -20°C, un précipité est isolé (100 mg) et collecté après filtration. Après purification par chromatographie HPLC préparative, 30,5 mg de peptide pur est obtenu. b) Synthèse de l'acétate de docos-21-ényle *Synthèse de docos-21-èn-1-ol Cette partie illustre la préparation du docos-21-èn-1-ol répondant à la formule suivante : Cette synthèse comprend trois étapes : - la formation du 11-bromomagnésium-lundécène ; 25 - la formation de l'alcoolate de lithium ; - la formation du docos-21-èn-1-ol. - Formation du 11-bromomagnésium-l-undécène A une solution de THF anhydre contenant 30 2,7 g (107 mmoles) de magnésium sous forme de20 60 roublures, est ajoutée, goutte à goutte, une solution de 5 g (21,4 mmoles) de 11-bromo-l-undécène dans 21 mL de THF. Cette réaction est réalisée sous atmosphère inerte. L'exothermie de la réaction est régulée à l'aide d'un bain de glace. Puis 5 mL de dibromoéthane sont ajoutés à ce mélange. La réaction est maintenue active pendant une heure et le surnageant est prélevé à l'aide d'une seringue puis placé dans un ballon sous atmosphère inerte. - Formation de l'alcoolate de lithium A une solution de THF anhydre sont ajoutés 5,4 g (21,4 mmoles) de 10-bromoundécanol. La solution est placée à -78°C sous atmosphère inerte, puis à l'aide d'une ampoule équi-pression, 0,71 mL (23,45 mmoles) de méthyllithium laissée progressivement revenir à température ambiante. - Formation du docos-21-èn-l-ol A la solution contenant le 11-bromomagnésium-l-undécène refroidie à -78°C, 0,21 g (1,1 mmoles) d'iodure de cuivre est additionné. La solution contenant le dérivé lithien y est ajoutée goutte à goutte par l'intermédiaire d'une canule. Le mélange est agité pendant une heure à cette température, puis 15 heures à température ambiante. La réaction est arrêtée par addition de 40 mL d'éthanol absolu. Un précipité noir se forme. Ce dernier est accentué par l'ajout de 3 mL d'HCl 10%. Après filtration sur fritté, la solution limpide obtenue est extraite trois fois à l'aide de diéthyléther. La phase éthérée restante est alors lavée 61 à l'eau puis avec une solution saturée en NaHCO3. La phase organique est alors récupérée, séchée sur MgSO4 puis concentrée par évaporation des solvants sous pression réduite. Le résidu restant est finalement reprécipité dans l'acétonitrile anhydride. Après filtration sur fritté, 4,86 g de docos-21-èn-1-ol sont obtenus (rendement=70%). *Synthèse de l'acétate de docos-21-ènyle L'acétate de docos-21-ènyle répond à la formule suivante . O A 2 g (6 mmoles) de docos-21-èn-1-ol sont ajoutés 20 mL de pyridine anhydre. Après quelques minutes d'agitation, la solution est refroidie par un bain de glace et 0,7 mL (7,2 mmoles) d'anhydride acétique sont ajoutés. Après un retour à température ambiante, la solution est agitée pendant 12 heures. La pyridine est alors co-évaporée à l'aide de toluène anhydre, puis le résidu est noyé dans 30 mL de dichlorométhane. Cette solution est lavée 3 fois à l'aide d'une solution aqueuse saturée en hydrocarbonate de sodium. Les phases organiques sont rassemblées après séchage sur MgSO4r les solvants sont évaporés sous pression réduite. Une poudre blanche est récupérée. Après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice avec comme éluant un mélange dichlorométhane/méthanol (98/2, v/v), 1,34 g d'acétate de docos-21-ènyle désigné ci-après composé 6 sont 62 récupérés sous forme d'une huile translucide, qui durcit et blanchit à température ambiante (Rendement : 62%). c) Synthèse du 1-0-acétyl-10-0-[1-docos-21- ényl] triéthylèneglycol *Synthèse du tosylate de docos-21-ène L'activation de l'extrémité hydroxyle du docos-21-èn-1-ol, par action du chlorure de tosyle en présence de triéathylamine dans le dichlorométhane à température ambiante a permis d'obtenir du tosylate de docos-21-ène de formule : A une solution de 4 g (12 mmoles) de docos-21-ène-1-ol dans 4 mL de triéthylamine anhydre et 30 mL de dichlorométhane anhydre, sont ajoutés, sous azote et 20 à température ambiante, 4,6 g (34 mmoles) de chlorure de tosylate lui-même dilué dans 30 mL de dichlorométhane. Le mélange jaunâtre est agité pendant 12 heures. Après filtration sur fritté et évaporation des solvants sous pression réduite, le résidu est 25 purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice avec, pour éluant, le dichlorométhane à 100%. 3,4 g de tosylate de docos-21-ène sont récupérés (rendement=60%). O15 *Synthèse du 2- (2- (2- (docos-21- ényloxy)éthoxy)éthoxy)éthanol A 1,9 g (12,6 mmoles) de triéthylène glycol en solution dans 30 mL de THF anhydre sont additionnés 83 mg (2,1 mmoles) d'hydrure de sodium à 60% dans l'huile. Après 15 minutes d'agitation sous azote, 1 g (2,1 mmoles) du composé (2) en solution dans 40 mL de THF pendant 12 heures. Après retour à température ambiante, la solution est filtrée sur fritté, les solvants sont évaporés et le résidu est purifié par chromatographie sur colonne sur gel de silice avec, pour éluant, un mélange dichlorométhane/méthanol (98/2 v/v). Il est récupéré 0,64 g de 2- (2- (2- (docos-21-ényloxy)éthoxy)éthoxy)éthanol de formule : )r°O O OH dit composé (3). 20 *Synthèse du 2- (2- (2- (docos-21- ényloxy)éthoxy)éthoxy)éthylacétate Dans une solution de 20 mL de dichlorométhane est dissous 0,5 g (1 mmole) de 2-(2-(2- (docos-21-ényloxy)éthoxy)éthoxy)éthanol (3), puis 0,26 mL (2,7 mmoles) d'anhydride acétique est ajouté. La solution est agitée sous azote pendant 1 heure puis au reflux avec du dichlorométhane pendant 12 heures. Après retour à température ambiante, la solution est extraite 3 fois à l'aide de 50 mL de dichlorométhane. La phase organique est ensuite lavée trois fois à 64 l'aide d'une solution aqueuse saturée en hydrocarbonate de sodium. Après séchage sur MgSO4 et évaporation des solvants sous pression réduite de la phase organique, une pâte jaunâtre est récupérée. Après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice avec, pour éluant un mélange dichlorométhane/méthanol (98/2 v/v) est récupéré 0,45 g de 1-0-acétyl-10-0-[1-docos-21-ényl]triéthylèneglycol (ou acétate de 2-[2-(2-docos-21- ényloxy-éthoxy)-éthoxy]éthyle ci-après désigné par composé organique 4 répondant à la formule suivante : O d) Hydrosilylation des composés organiques 4 et 6 Les composés organiques 4 et 6 présentent à l'une de leur extrémité une insaturation. Cette double liaison a été fonctionnalisée à l'aide de chlorosilane pour fixer dans un deuxième temps ces composés à un support en silicium. Cette hydrosilylation a été effectuée par réaction du trichlorosilane sur les composés 4 et 6 dans du toluène en présence d'un catalyseur de Kârstedt. Le composé organique 4 (200 mg, 0,5 mmole) 25 est placé dans un tube de Schlenk ayant préalablement été purgé par commutation alternative entre une rampe à vide et un rampe à argon. Après addition de 2 mL de toluène fraîchement distillé, la solution est soumise à une agitation, sous argon, jusqu'à complète dissolution 20 65 du solide. Puis 300 pL de trichlorosilane fraîchement distillé sont ajoutés ainsi que 2 gouttes du catalyseur de Kârstedt. La solution devenue jaune pâle est agitée 2 heures à 40°C. Après évaporation sous pression réduite, un solide brut est obtenu puis est utilisé dans l'état pour l'étape de greffage. Ce solide correspond à l'acétate de 22-(trichlorosilanyl)-docosyle ci-après dénommé composé organique 7 de formule suivante . Cl CI ~ i O~ Cl 20 O A partir du composé 6 et dans les mêmes conditions opératoires, est obtenu le composé organique 5 correspondant au 1-0-acétyl-10-0-[22- (trichlorosilanyl)-docosyl]triéthylèneglycol de formule . Cl O CI ~ i O O O O CI 20 e)Greffage des composés organiques 7 et 5 sur un support en silicium Dans un premier temps, on procède à un mélange des deux types de composés dans une proportion équimolaire, dans le but d'obtenir une surface présentant une densité moyenne de sites actifs vis-à- vis du peptide. 66 Ainsi, après nettoyage sous un flux d'ozone de 30 minutes, le substrat en silicium est introduit dans un réacteur. L'enceinte du réacteur permet de sécher le substrat à une température contrôlée en évitant toute contamination organique postérieure au nettoyage. Plus précisément, les composés 5 et 7 sont solubilisés dans le mélange hexane/chloroforme 90/10 à une concentration finale de 6.10-3 M pour chaque composé. Cette solution dite � de silanisation � est alors introduite dans le réacteur, où se trouvent les substrats en silicium. Après une nuit d'immersion, les substrats sont retirés de l'enceinte et plongés dans un bain d'eau osmosée soumis à des ultrasons sur une durée de 5 minutes. Ce type de traitement permet d'éliminer les composés organosiliciés seulement adsorbés sur le support sans fragiliser la couche greffée. L'étape suivante est la déprotection de la fonction -OH par saponification des restes de composés 5 et 7 fixés sur support en utilisant de la potasse alcoolique à 0,5 M. Les substrats sont immergés dans cette solution de KOH pendant 20 minutes. Les supports sont ensuite retirés et les impuretés sont éliminées par 3 traitements successifs de 3 minutes par ultrasons dans un bain d'eau osmosée. Les substrats sont alors séchés sur papier adsorbant. Il est à noter, qu'en présence d'un greffage hétérogène, KOH pénètre au sein de la couche greffée et rompt les liaisons liant les bras organosiliciés à la surface. Dans le cas d'un greffage 67 homogène, les molécules de cette base forte ne trouvent pas d'espace entre les molécules greffées pour atteindre la surface. Le greffage de matériau inorganique restera donc intact. L'utilisation de potasse alcoolique permet donc aussi de tester l'homogénéité du greffage. Une analyse par infrarouge en transmission et en imagerie FT-IR a été réalisée, afin de caractériser le nombre d'ondes correspondant aux groupements -CH2- des chaînes aliphatiques des composés 5 et 7 greffés. L'analyse confirme la présence en surface de la longue chaîne aliphatique par l'observation des bandes caractéristiques des liaisons CH2 (vas=2921 cm-1, vs= 2852 cm-1) (voir figures 1 A et 1B représentant respectivement l'image par FT-IR du support de silicium avant et après greffage). De plus, l'intensité des bandes obtenues ici (ODO=3.10-3) est comparable à la simulation effectuée avec une monocouche d'arachidate sur verre (ODO=2,5.10-3). Ceci indique donc bien la formation en surface du support d'une monocouche des composés 5 et 7. La couche greffée est suffisamment compacte et dense pour empêcher la pénétration de la potasse alcoolique au sein de la couche. L'image par ellipsométrie 3D du support après greffage est représentée sur la figure 1C. Les résultats obtenus en ellipsométrie montrent également la formation d'une monocouche d'alkylsilanes d'une épaisseur de 2,3 nm, épaisseur comparable avec la longueur des bras greffés en surface. 68 f) Fixation du peptide cible de la MMP-9 Chaque support fonctionnalisé est placé dans un pilulier, chacun des piluliers étant placé dans un réacteur, qui est purgé par commutation alternative entre une rampe à vide et une rampe à argon, dans lequel s'est déroulé le greffage. Un microbarreau aimanté est ajouté, afin d'assurer l'agitation. Les supports se trouvent donc sous atmosphère inerte. Il est ajouté une solution dite d'activation comportant, par unité de support, 2 mmol de HOBt et 2 mmol d'iodure de [3-(N-éthylcarbodiimide)-N-propyl]triéthylammonium (DiPC) mis en solution, sous atmosphère inerte, dans 1 mL de solvant de greffage (eau osmosée à 9 g/L de NaCl). La solution peptidique (par support, 1 mmol de peptide 1 mis en solution sous argon dans 1 mL de solvant de greffage) est ajoutée, goutte à goutte, très lentement, sous agitation, au support préalablement immergé dans la solution d'activation. L'agitation est maintenue 30 minutes puis est arrêtée. Les supports restent immergés pendant 20 heures. Les substrats sont ensuite retirés des piluliers et les molécules non fixées de façon covalente sont éliminées par ultrasons et par traitements successifs de 2 minutes dans de l'eau osmosée puis sont analysées comme précédemment. L'observation du spectre met en évidence les bandes caractéristiques du groupe CO appartenant à un groupe amide (vco=1651 cm-1) et du groupe -NH appartenant à un groupe amide (vNH=1556 cm-1). 69 Les substrats de silicium obtenus lors des différentes expériences ont été analysés par FT-IR L'analyse des spectres révèle la présence de peptides uniquement sur les substrats préalablement greffés par les composés 5 et 7. L'imagerie FT-IR des puces fonctionnalisées montre la présence du peptide en surface des peptides (figure 2A). La figure 2B confirme que la monocouche d'alkylsilanes est toujours présente à la surface du silicium après fonctionnalisation par les peptides. La figure 2C présente la répartition des peptides à la surface de la puce (image d'épifluorescence). La fonctionnalisation a été également confirmée par ellipsométrie avec une épaisseur de la couche d'alkylsilanes greffée par le peptide de 4,2 nm (figure 2D). Ce résultat est en accord avec la taille du peptide. q) Cinétiques enzymatiques La puce préalablement préparée est soumis à l'action de l'enzyme MMP-9. Pour ce faire, la puce est introduite dans une cellule de fluorescence représentée à la figure 3, cette cellule comprenant : - une cuve de quartz 1 ; - un agitateur magnétique 3 ; - la biopuce 5 ; et une solution 7 comprenant de l'enzyme MMP-9 surmontant la biopuce. La solution consiste en un volume réactionnel de 2 mL avec 2 nM de MMP-9 activée par de 25 30 70 l'AMPA, ces 2 mL étant issus d'une préparation obtenue par mélange à 37°C pendant 4 heures de 25 pL de MMP-9 commerciale (90% sous forme zymogène) activée avec une solution de AMPA (1 mM) avec une solution tampon contenant 0,1 N de TRIS, 0,1 M de NaCl et 10 mM de CaCl2 à pH=4,6. Après l'ajout de la solution sur la biopuce, il est procédé à la mesure de l'intensité de flurorescence à 470 nm de la sonde fluorescente relargué après clivage dans la solution (en l'espèce, ici, mesure de la fluorescence du groupe accepteur (N- diéthylaminocoumaryl). En effet, l'extrémité C terminale étant liée de façon covalente au support, seule la moitié du peptide contenant la partie N- terminale est libérée dans la solution. L'augmentation de l'intensité de fluorescence à 470 nm a été tracée en fonction du temps. Kcat/Km a été estimé à 153000 s-1.M-1, ce qui atteste du fait que l'enzyme MMP-9 a bien reconnu le peptide greffé sur la biopuce. Une image de fluorescence a été réalisée de façon à présenter la surface de la puce après hydrolyse du peptide par la MMP-9. L'obtention de fluorescence dans la bleu confirme que le peptide a bien été hydrolysé (présence unique de l'extrémité C-terminale contenant le groupe donneur). Par la suite, la puce hydrolysée a été soumise à une analyse par imagerie FT-IR. Aucune bande d'absorption des amides n'a pu être observée, ce qui signifie que le peptide a donc bien été hydrolysé. 71 L'analyse par ellipsométrie a permis de déterminer une épaisseur de la couche d'alkylsilanes et du peptide hydrolyse de 2,7 nm, ce qui, en comparant aux valeurs obtenues précédemment, permet de confirmer l'hydrolyse du peptide. REVENDICATIONS1. Biopuce destinée à la détection de l'activité d'une enzyme protéase comprenant un support comprenant des sites prédéterminés recouverts d'une couche, laquelle couche est susceptible d'être obtenue par : - mise en contact des sites prédéterminés avec au moins un premier composé silane et au moins un deuxième composé silane, lesdits premier composé silane et second composé silane comprenant respectivement un groupe apte à réagir avec un groupe fonctionnel du support pour former une liaison covalente, un bras espaceur et un groupe terminal, ledit groupe terminal du premier composé silane étant un groupe apte à réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente et ledit groupe terminal du second composé silane étant un groupe n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant quoi les sites prédéterminés sont greffés par le premier composé silane et le second composé silane ; - mise en contact des sites prédéterminés ainsi greffés avec le substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant quoi le substrat réagit, par le biais d'un groupe pendant, avec le groupe terminal du premier composé silane pour former une liaison covalente. 2. Biopuce selon la revendication 1, dans laquelle le bras espaceur du premier composé silane etdu second composé silane est une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17. 3. Biopuce selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le support est un support solide inorganique. 4. Biopuce selon la revendication 3, dans laquelle le support solide inorganique est choisi dans le groupe constitué par les verres, les quartz, les céramiques (telles que les céramiques oxydes, comme la silice), les métaux (tels que l'aluminium, le chrome, le cuivre, le zinc, l'argent, le nickel, l'étain ou l'or), les métalloïdes (tels que le silicium). 5. Biopuce selon la revendication 3 ou 4, dans lequel le support solide est un wafer en silicium. 6. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le premier composé silane répond à la formule (I) suivante : X1\ X2 /Si A B X3 (I) dans laquelle : - XI, X2 et X3, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés en C1-C6r les groupes 25hydrolysables, à condition que l'un au moins des groupes XI, X2 et X3 soit un groupe hydrolysable ; - A correspond à un bras espaceur consistant en une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17 ; et - B correspond à un groupe apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente. 7. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le second composé silane répond à la formule (II) suivante : X1\ X2 /Si A D X3 (II) dans laquelle : - XI, X2 et X3, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés en C1-C6r les groupes hydrolysables, à condition que l'un au moins des groupes XI, X2 et X3 soit un groupe hydrolysable ; A correspond à un bras espaceur consistant une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17 ; et - D correspond à un groupe n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée. 75 8. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le groupe pendant du substrat est un groupe carboxyle ou amine. 9. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle, lorsque le groupe pendant du substrat est un groupe carboxyle, le groupe B est un groupe polyéthylèneglycol, tel que le groupe triéthylèneglycol de formule suivante : /O O x\ O OH 10. Biopuce selon la revendication 6, dans laquelle le premier composé silane répond à la formule (III) suivante : Cl CI Si O O Cl / 20 (III) O OH le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl. 20 11. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle, lorsque le groupe pendant du substrat est un groupe carboxyle, le groupe D est un groupe hydroxyle lié directement au 25 bras espaceur. 76 12. Biopuce selon la revendication 7, dans laquelle le second composé silane répond à la formule (IV) suivante : Cl CI Si OH Cl/ 20 (IV) le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl. 13. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'enzyme protéase est une enzyme métalloprotéase du type MMP. 14. Biopuce selon la revendication 13, dans laquelle l'enzyme métalloprotéase du type MMP est choisie parmi la MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-5, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-19, MMP-23, MMP-25 et MMP-26. 15. Biopuce selon la revendication 14, dans lequel le substrat comprend : - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-1 répondant à l'une au moins des formules 25 suivantes . -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala- SEQ. 1- Ala-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-SEQ. 2 - Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-SEQ.3 - Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Ile-SEQ.4 - Gly-Pro-Glu-Gly-Leu-Arg-Val-Gly-SEQ.5 -Tyr-Glu-Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-SEQ.6 - Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-Glu-Arg-SEQ.7 - Ala-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Ser-Thr-SEQ.8 - Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-SEQ.9 - Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-SEQ.10 - Thr-Glu-Gly-Glu-Ala-Arg-Gly-Ser-SEQ.11 - Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu-SEQ.12 - Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Leu-Pro-Ala-SEQ.13 - Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu-SEQ.14 -Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys-30 SEQ.15 10 15 20 25-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg- SEQ. 16 - Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-SEQ. 17 - Pro-Cha-Abu-Cys(Me)-His-Ala-SEQ.18 - Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-SEQ. 19 - Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-SEQ. 20 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ.21 30 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly- SEQ. 22 - Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- 35 SEQ. 17 -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg-40 SEQ. 23 - Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg- SEQ. 24 45 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala- 10 15 20 25 SEQ. 25 79 -Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met- SEQ. 26 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-2 répondant à l'une au moins des formules suivantes . -Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val- SEQ.10 - Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala- SEQ.27 -Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu- SEQ.12 - Gly-Pro-His-Leu-Leu-Val-Glu-Ala- SEQ.28 - Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Leu-Pro-Ala- SEQ.13 -Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys- SEQ.29 25 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-SEQ. 16 30 -Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-SEQ.30 35 -Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ.21 15 20 40 80 - Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg- SEQ. 31 -Pro-Leu-Gly-SCH[CH2CH (CH3) 2] -CO-Leu-Gly- SEQ. 32 -Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe- SEQ. 33 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ.21 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly- SEQ.22 -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg- SEQ.23 30 - Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg- SEQ.24 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala- SEQ. 25 -Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met- SEQ. 26 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-3 répondant à l'une au moins des formules suivantes . 20 25 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 45 81 -Gly-Pro-Glu-Gly-Leu-Arg-Val-Gly-SEQ.5 - Arg-Val-Gly-Phe-Tyr-Glu-Ser-Asp-SEQ.34 - Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr-SEQ.35 - Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-SEQ.36 - Ile-Ala-Gly-Arg-Ser-Leu-Asn-Pro-SEQ.37 - Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-SEQ.10 - Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-SEQ.38 - Asp-Val-Ala-Gln-Phe-Val-Leu-Thr-SEQ.39 - Asp-Thr-Leu-Glu-Val-Met-Arg-Lys-SEQ.40 - Asp-Val-Gly-His-Phe-Arg-Thr-Phe-SEQ.41 - Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-Met-Leu-Thr- SEQ.42 - Arg-Val-Ala-Glu-Met-Arg-Gly-Glu-10 15 20 25 30 35 40 82 SEQ.43 - Asp-Leu-Gly-Arg-Phe-Gln-Thr-Phe-SEQ.44 - Pro-Phe-Ser-Pro-Leu-Val-Ala-Thr-SEQ.45 - Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Leu-Pro-Ala-SEQ.13 - Ala-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Ser-SEQ.46 - Phe-Ser-Ser-Glu-Ser-Lys-Arg-Glu-SEQ.47 - Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu-SEQ.12 - Gly-Pro-His-Leu-Leu-Val-Glu-Ala-SEQ.28 - Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Phe-Gln- SEQ.48 -Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- SEQ. 49 -Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys- SEQ. 15 45 83 -Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-Ala-Lys- SEQ. 50 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg- SEQ. 16 -Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Met-Arg- SEQ. 51 15 -Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp- SEQ. 52 20 -Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20 25 -Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 30 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly- SEQ. 22 - Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met- 35 SEQ. 26 - Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg- SEQ. 50 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme 45 MMP-5 répondant à l'une au moins des formules suivantes . 10 40 5 15 20 25 30 35 40 84 -Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-Ala-Lys- SEQ. 50 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-7 répondant à l'une au moins des formules suivantes . -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg- SEQ. 16 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 - Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-Ser- SEQ. 24 - Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly- SEQ. 22 - Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- SEQ. 17 - Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Met-Arg- SEQ. 51 - Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp- SEQ. 52 45 ou 10 15 20 25 30 35 4085 - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-8 répondant à l'une au moins des formules suivantes . - Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg-SEQ. 53 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg- SEQ. 16 - Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-SEQ. 20 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly- SEQ. 22 - Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- SEQ. 17 -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg- SEQ. 23 -Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg- SEQ. 24 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala- SEQ. 25 ou- une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-9 répondant à l'une au moins des formules suivantes . - Gly-Pro-Pro-Gly-Val-Val-Gly-Pro-SEQ.54 - Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Gly-Glu-SEQ.55 - Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-SEQ.56 - Ile-Pro-Gln-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-SEQ.57 - Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala-SEQ.58 - Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu- SEQ.12 - Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- SEQ. 14 -Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys- SEQ. 15 -Arg-Pro-Lys-Pro-Val -Gl u -Nva-Trp-Arg-Gl u -Ala-Lys-40 SEQ.50 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg- 10 15 20 25 30 35 45 SEQ. 16- Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ . 19 -Pro-Leu-Gly-SCH[CH2CH (CH3) 2] -CO-Leu-Gly- SEQ. 32 -Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe- SEQ. 33 - Pro-/3-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-SEQ. 20 20 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 25 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly- SEQ. 22 30 -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg- SEQ. 23 35 - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-10 répondant à l'une au moins des formules suivantes . - Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu- SEQ.12 - Gly-Pro-His-Leu-Leu-Val-Glu-Ala- SEQ.28 10 15 ou 40 45 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-11 répondant à l'une au moins des formules suivantes . - Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-12 répondant à l'une au moins des formules suivantes . 30 -Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20 35 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 40 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly-SEQ. 22 10 15 20 25 45 5 15 20 25 30 35 40 4589 - Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- SEQ. 17 -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg- SEQ. 23 - Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Met-Arg- SEQ. 51 - Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp- SEQ. 52 - Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg- SEQ. 24 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala- SEQ. 25 - Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met- SEQ. 26 - Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg- SEQ. 50 - Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Trp- SEQ. 59 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-13 répondant à l'une au moins des formules suivantes . - Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- SEQ. 49-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-Ala-Lys- SEQ. 50 - Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-Dpa- SEQ. 25 -Pro-Cha -Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly-20 SEQ.22 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg- SEQ. 16 - Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- SEQ. 17 -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-Ala-D-Arg- SEQ. 23 - Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg- SEQ. 31 - Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Met-Arg- SEQ. 51 -Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp- 10 15 25 30 35 40 45 SEQ. 52 91 - Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-SEQ. 24 - Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg- SEQ. 53 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala- SEQ. 25 -Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met- SEQ. 26 -Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Trp- SEQ. 59 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme 25 MMP-14 répondant à l'une au moins des formules suivantes . -Pro-Leu-Ala-Cys(p-OMeBz)-Trp-Ala-Arg- SEQ. 60 - Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20 40 -Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ. 21 45 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly- 10 15 20 30 35 SEQ. 22ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-15 répondant à l'une au moins des formules 5 suivantes . - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ. 21 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-16 répondant à l'une au moins des formules 15 suivantes . - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-SEQ. 21 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-17 répondant à l'une au moins des formules suivantes . 25 - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 30 -Pro-Leu-Gly-[2-mercapto-4-methyl-pentanoyl]-Leu-Gly-SEQ. 22 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-19 répondant à l'une au moins des formules suivantes . - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- 92 10 20 35 40 SEQ. 21ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme 5 MMP-23 répondant à l'une au moins des formules suivantes . - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-10 SEQ. 21 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme 15 MMP-25 répondant à l'une au moins des formules suivantes . - Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-20 SEQ. 21 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-26 répondant à l'une au moins des formules 25 suivantes . -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-30 SEQ. 16 16. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le substrat 35 adéquat susceptible de réagir avec les sites prédéterminés répond à la formule suivante : (X)-S- (X2) m 93 94 dans laquelle S correspond à une séquence peptidique cible de l'enzyme protéase (dont on veut déterminer l'activité), cette séquence pouvant correspondre à l'une de celle explicitée selon l'une quelconque des revendications 15 à 19 ; - n et m sont des entiers égaux à 0 ou 1 ; - lorsque m et n sont égaux à 1, X1 est une sonde porteuse d'un groupe donneur fluorescent et X2 est une sonde porteuse d'un groupe accepteur fluorescent ou non fluorescent, le groupe donneur et le groupe accepteur étant choisis, de préférence, de sorte à ce que le spectre d'émission de fluorescence du groupe donneur recouvre, au moins en partie, le spectre d'absorption du groupe accepteur. 17. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans laquelle le substrat adéquat susceptible de réagir avec les sites prédéterminés est un peptide cyclique comprenant la séquence suivante : -S1-X1-S2-X2- dans laquelle S1 est une première séquence peptidique cible d'une enzyme protéase El, S2 est une seconde séquence peptidique cible d'une enzyme protéase E2, S1 et S2 pouvant être identiques ou différents, E1 et E2 pouvant correspondre à la même enzyme protéase ou à deux enzymes protéases distinctes, X1 est une sonde porteuse d'un groupe donneur fluorescent et X2 est une sonde porteuse d'un groupe accepteur fluorescent ou non fluorescent. 95 18. Biopuce selon la revendication 16 ou 17, dans laquelle le groupe donneur porté par la sonde X1 et le groupe accepteur porté par la sonde X2 comprennent un noyau aromatique. 19. Biopuce selon la revendication 18, dans laquelle le noyau aromatique est un noyau benzénique, anthracénique ou coumarine. 20. Biopuce selon la revendication 18, dans laquelle le groupe donneur porté par la sonde X1 et le groupe accepteur porté par la sonde X2 sont choisis parmi les couples suivants : *Tryptophane/2,4-dinitrophényle ; *Acide o-aminobenzoïque/2,4-dinitrophényle ; * (7-méthoxycoumarin-4-yl)-acétyle/2,4-dinitrophényle ; * (7-méthoxycoumarin-4-yl)-acétyle/N-3-(2,4-dinitrophényl)-L-2, 3-diaminopropyle ; *Tryptophane/Dansyle ; *N-méthylanthranoyle/2,4-dinitrophényle ; *6,7-diméthoxycoumarin-4-yl-acétyle/acide 6-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl)aminohexanoïque ; *Acide 5-(2'-aminométhyl)naphtalène sulfonique/acide 4- (4'-diméthylaminophénylaza)benzoïque * acide 7-méthoxycoumarin-3-carboxylique/acide 7-diéthylaminocoumarin-3-carboxylique. 21. Biopuce selon l'une quelconque des 30 revendications 16 à 20, dans laquelle le groupe donneur 96 porté par la sonde X1 et le groupe accepteur porté par la sonde X2 comprennent un noyau coumarine. 22. Biopuce selon la revendication 21, dans laquelle le groupe donneur porté par la sonde X1 et le groupe accepteur porté par la sonde X2 répondent respectivement aux formules suivantes : OC H3 MC 23. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 16 à 22, dans laquelle les sondes X1 et X2 sont des restes d'acide aminé. 15 24. Biopuce selon la revendication 17, dans laquelle S1 et S2 correspondent à une séquence cible répondant à l'une des formules suivantes :10- Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala- ou - Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro 25. Biopuce selon la revendication 24, dans laquelle le peptide cyclique répond à la formule suivante : Gly-Pr o-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-XI-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-X2 R1ù Y R2 10 X1r X2 répondant à la même définition que celle donnée dans les revendications précédentes, R1 et R2 correspondent indépendamment à une liaison simple, un reste d'acide aminé ou une séquence peptidique et Y 15 correspond à un groupe -CONH- ou -NHCO. 26. Biopuce selon la revendication 25, dans laquelle le peptide cyclique répond à la formule suivante : 20 Guly-Pr o-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys(DAC)-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu -Leu-G ly-Ala- Lys(MC) NHCOùLys les groupes -Lys(DAC)- et -Lys(MC)- aux formules respectives suivantes .5OC H3 o 27. Biopuce selon la revendication 16, dans laquelle le peptide linéaire répond à la formule suivante : Lys(DAC)-Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-Lys(MC)-Ala Lys(DAC) et Lys(MC) correspondant aux formules respectives suivantes .HN NH2 O OC H3 NH+ o 28. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le support solide est un support en silicium, les premier et second composés répondent respectivement aux formules (III) et (IV) suivantes : 2932189 100 CI Si O O Cl / 20 (III) O OH le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl ; Cl CI Si OH Cl/ 20 (IV) le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl ; et le substrat répond à la formule 10 suivante : Lys(DAC)-Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-Lys(MC)-Ala, Lys(DAC) et -Lys(MC)- répondant aux mêmes définitions que celles données à la revendication 27. 29. Procédé de préparation d'une biopuce telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 28, comprenant les étapes suivantes: - éventuellement, une étape d'activation de la surface d'un support solide en des sites prédéterminés, de façon à créer des fonctions aptes à réagir avec un groupe des premier et deuxième composés silanes pour former une liaison covalente ; - une étape de mise en contact des sites 25 prédéterminés avec au moins un premier composé silane et au moins un deuxième composé silane, lesdits premier Cl 5 101 composé silane et second composé silane comprenant respectivement un groupe apte à réagir avec le support pour former une liaison covalente, un bras espaceur et un groupe terminal, ledit groupe terminal du premier composé silane étant un groupe apte à réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente et ledit groupe terminal du second composé silane étant un groupe n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant quoi les sites prédéterminés sont greffés par le premier composé silane et le second composé silane ; - une étape de mise en contact des sites prédéterminés ainsi greffés avec le substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennent quoi le substrat réagit avec le groupe terminal du premier composé silane pour former une liaison covalente.