FR 2927633 A1 20090821 FR 0851054 A 20080219 SYSTEME ET PROCEDE DE CULTURE CLONALE DE CELLULES EPITHELIALES ET LEURS APPLICATIONS La présente invention se rapporte au domaine de la biologie cellulaire et de l'ingénierie tissulaire. Plus précisément, l'invention propose des moyens et méthodes permettant d'évaluer et exploiter les propriétés spécifiques d'une cellule épithéliale particulière présente dans un échantillon biologique. Ainsi, la présente invention a pour objet un système de culture de cellules épithéliales, dans lequel au moins une culture clonale est ensemencée avec une cellule épithéliale extraite d'un échantillon biologique. L'invention concerne en outre un procédé de culture de cellules épithéliales, comprenant au moins les étapes consistant à : a) extraire une ou plusieurs cellules épithéliales d'un échantillon biologique ; b) facultativement, sélectionner au moins une population et/ou sous-population de cellules épithéliales parmi les cellules extraites à l'étape a) ; c) réaliser une culture clonale ensemencée avec une cellule épithéliale distincte issue de l'étape a) ou b) ; et d) évaluer qualitativement et/ou quantitativement la croissance cellulaire dans la culture clonale de l'étape c). De plus, l'invention vise les applications d'un tel système ou procédé. Les systèmes et procédés in vitro portant sur les tissus épithéliaux tels que l'épiderme trouvent des applications dans des domaines aussi divers que la recherche médicale et le développement clinique, l'ingénierie tissulaire et la toxicologie. Les différents tissus épithéliaux pluristratifiés (notamment l'épiderme, la cornée, les tissus muqueux...) partagent un certain nombre de caractéristiques communes qui imposent des contraintes pour la conception d'architectures de tests in vitro à grande échelle. Ces caractéristiques générales sont bien exemplifiées dans le cas de l'épiderme. L'épiderme constitue la structure la plus superficielle de la peau et en assure notamment la fonction barrière. Majoritairement constitué de kératinocytes, il se renouvelle tous les 28 jours en moyenne. Ce tissu comprend 4 couches qui correspondent aux 4 étapes du programme de différenciation que les kératinocytes subissent lors de leur migration de la couche basale, la plus profonde, vers la couche cornée, la plus surperficielle. Le processus physiologique continuel de renouvellement des différentes couches de kératinocytes est appelé kératinopoïèse. La couche basale de l'épiderme, qui ne comporte qu'une seule assise cellulaire, est le compartiment germinatif. C'est au niveau de cette couche que s'effectue la prolifération des kératinocytes. Parmi les kératinocytes basaux, on trouve une faible proportion de cellules appelées cellules souches, dont il est admis qu'elles sont à l'origine du renouvellement à long terme de l'épiderme. La descendance immédiate des cellules souches est appelée population des progéniteurs. Ces derniers assurent le renouvellement rapide à court terme de l'épiderme. La notion de cellule souche, au sein de l'épiderme inter-folliculaire humain, définit donc le compartiment situé le plus en amont de la hiérarchie de la kératinopoïèse. Ces cellules se caractérisent notamment par une capacité d'autorenouvellement importante, que ne possèdent pas les cellules progénitrices, et a fortiori les kératinocytes engagés dans la différenciation. De plus, une propriété importante des cellules souches est de conserver de manière durable le potentiel de régénération et de reconstruction du tissu épidermique. Comme les autres tissus épithéliaux pluristratifiés, l'épiderme est donc constitué d'un ensemble hétérogène de cellules présentant des degrés de différenciation (ou d'immaturité) variables. Il est généralement admis que les kératinocytes basaux représentent environ 10% de l'ensemble des kératinocytes de l'épiderme, et le compartiment des cellules souches épidermiques seulement de l'ordre de 0,1%. Compte tenu des besoins quantitatifs nécessaires à la mise en oeuvre des méthodes actuelles d'évaluation fonctionnelle et de criblage, le matériel cellulaire collecté en routine à partir de biopsies cutanées, à savoir l'ensemble des kératinocytes obtenus après dissociation d'un échantillon d'épiderme, permet la constitution de banques de cellules d'une taille suffisante pour une utilisation à l'échelle industrielle. Cependant, le matériel utilisé pour la constitution de ce type de banques correspond à un ensemble hétérogène de cellules, comprenant des kératinocytes basaux possédant différentes capacités de croissance, et des kératinocytes supra-basaux en cours de différenciation et ne possédant plus de capacité de croissance. S'agissant des banques de kératinocytes, par exemple destinées à la production industrielle de kits d'épidermes reconstruits, un procédé classique consiste à congeler les cellules à l'issue d'une étape unique de multiplication en culture, de manière à constituer un stock de multiples ampoules équivalentes, qui sont conservées en azote liquide. En fonction des besoins, les ampoules de cellules sont décongelées et placées en culture afin de réaliser une seconde étape de multiplication. À l'issue des deux étapes de multiplication successives, les kératinocytes ont généralement effectué de l'ordre de 10 doublements de population. À ce stade, ils sont utilisés pour la production de modèles de tissus reconstruits. Appliquer en l'état ces systèmes à un matériel cellulaire rare, tel que les cellules souches, est en revanche impossible à l'échelle industrielle où de vastes campagnes de tests doivent être menées. En somme, plusieurs types de modèles compatibles avec la réalisation de campagnes de tests in vitro à grande échelle sont actuellement disponibles. Le matériel biologique utilisé dans ces tests peut être : 1) des lignées cellulaires immortalisées ; 2) des banques de cellules normales extraites de biopsies de tissus et amplifiées en culture ; 3) des tissus tridimensionnels reconstruits. Cependant, pour la mise en oeuvre à grande échelle de tels modèles, il est nécessaire de disposer de grandes quantités de matériel cellulaire. Par exemple, dans le cas de tests réalisés sur des cellules normales, on utilise des populations cellulaires amplifiées in vitro, ce qui en modifie certaines propriétés en fonction des paramètres de culture appliqués. En outre, si l'on s'intéresse aux sous-populations de cellules rares, telles que les cellules progénitrices ou les cellules souches épidermiques, ces cellules sont obtenues en quantités insuffisantes à partir de biopsies de tissus. Gangatirkar et al. (2007) décrivent un procédé permettant de reconstruire un épiderme à partir de kératinocytes totaux ou à partir de sous-populations triées sur la base de phénotypes distincts. Les deux options proposées consistent d'une part à utiliser les cellules directement après extraction à partir du tissu et tri cellulaire, et d'autre part, à utiliser le matériel cellulaire après une phase d'expansion en culture. Cependant, les besoins quantitatifs en matériel cellulaire pour mettre en oeuvre le procédé décrit restent inadaptés à la réalisation de campagnes de tests parallèles à grande échelle. En outre, le matériel cellulaire utilisé correspond à un mélange complexe de cellules différentes dont l'aptitude à reconstruire un épiderme est utilisée de manière globale. L'hétérogénéité des cellules composant les tissus épithéliaux pluristratifiés, et notamment celle des kératinocytes de l'épiderme, est donc un facteur limitant dans l'élaboration de stratégies de tests in vitro. En effet, dans la mesure où les cellules présentent certaines caractéristiques qui leur sont propres, elles sont susceptibles de répondre différemment à un stimulus ou à un stress. Il en est de même pour des tissus épithéliaux pathologiques. Par exemple, les carcinomes sont des tumeurs très hétérogènes, dans lesquelles une faible proportion de cellules souches tumorales représente une cible clé pour les traitements. En outre, lorsque des cellules présentant des caractéristiques distinctes sont mélangées en culture, le comportement spécifique de certaines d'entre elles peut être modifié ou ignoré au sein du mélange. En définitive, les solutions classiques qui consistent à travailler à partir de populations cellulaires complexes hétérogènes ne sont pas adéquates pour répondre aux besoins médicaux, cliniques et industriels actuels. Il existe donc un besoin pour des moyens et méthodes qui permettent d'accéder aux propriétés individuelles des cellules issues des tissus épithéliaux pluristratifiés, tout en étant adaptés à la mise en oeuvre de campagnes de tests in vitro à grande échelle, même dans le cas d'un matériel cellulaire 100 à 1000 fois plus rares que les populations tout-venant que l'on utilise actuellement. La présente invention répond pour la première fois à ce besoin en proposant des moyens et méthodes de culture qui (i) permettent d'accéder aux propriétés individuelles de cellules de tissus épithéliaux pluristratifiés, (ii) préservent le potentiel individuel desdites cellules, (iii) sont, même lorsqu'ils sont mis en oeuvre à grande échelle, peu consommateurs de matériel cellulaire, ce qui les rend adaptés à l'étude et l'exploitation à l'échelle industrielle des cellules les moins représentées (cellules souches et progénitrices). Ainsi, un objet de la présente invention concerne un système de culture de cellules épithéliales optimisé pour l'évaluation et l'exploitation des propriétés spécifiques d'une cellule unique, comprenant au moins une culture clonale ensemencée avec une cellule épithéliale extraite d'un échantillon biologique. Avantageusement, ledit système comprend au moins deux cultures clonales parallèles, chacune desdites cultures étant ensemencée avec une cellule épithéliale distincte extraite dudit échantillon biologique. De préférence, un tel système se présente sous la forme de biopuce. Les cultures clonales ensemencées en parallèle sont alors par exemple des micro-cultures. En pratique, la biopuce peut être notamment réalisée à partir de plaques de cultures comprenant de multiples puits distincts, par exemple 6, 24, 96 puits, ou plus. Alternativement, la biopuce peut avoir comme support une lame, en verre ou en n'importe quel autre matériau approprié, sur laquelle on crée de multiples micro-surfaces destinées à recevoir les cellules, par exemple par un traitement de surface permettant aux cellules d'adhérer et de croître. Les biopuces réalisées sur lames peuvent être compartimentées physiquement, par exemple à l'aide de grilles, ou chimiquement, par exemple suite à un traitement de surface des lames qui empêche les cellules clonées de migrer en dehors de leurs micro-surfaces de culture respectives. Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de culture de cellules épithéliales optimisé pour l'évaluation et l'exploitation des propriétés spécifiques d'une cellule unique, comprenant au moins les étapes consistant à : a) extraire une ou plusieurs cellules épithéliales d'un échantillon biologique ; b) facultativement, sélectionner au moins une population et/ou sous-population de cellules épithéliales parmi les cellules extraites à l'étape a) ; c) réaliser une culture clonale ensemencée avec une cellule épithéliale distincte issue de l'étape a) ou b) ; et d) évaluer qualitativement et/ou quantitativement la croissance cellulaire dans la culture clonale de l'étape c). De manière intéressante, les cellules utilisées dans le procédé objet de la présente invention peuvent être des populations totales de cellules directement extraites de ces tissus, et/ou des sous-populations triées sur la base de caractères précis. Ainsi, le matériel cellulaire issu de l'étape b) peut avantageusement correspondre à une ou plusieurs sous-populations enrichies en progéniteurs et/ou en cellules souches épithéliales. Lors de l'étape c) (qui peut être considérée comme une étape de croissance primaire), on utilise la préparation cellulaire ainsi extraite pour initier des cultures ou micro-cultures clonales parallèles. Il s'agit d'ensemencer les cellules d'intérêt individuellement dans des conditions permettant leur croissance, par exemple dans des puits de culture séparés. En pratique, les ensemencements clonaux peuvent être effectués de manière automatisée par des technologies telles que notamment la cytométrie en flux ou la micro-fluidique. De préférence, l'étape c) comprend la réalisation d'au moins deux cultures clonales parallèles, chacune desdites cultures étant ensemencée avec une cellule épithéliale distincte issue de l'étape a) ou b). En particulier, lors de l'étape d), on analyse la croissance des cellules clonées sur la base d'un ou plusieurs paramètres quantitatifs et/ou qualitatifs tels que : - la fréquence de clones obtenus par rapport au nombre de cultures ensemencées : efficacité clonogénique ("clone-forming efficiency" [CFE]) ; - le potentiel prolifératif des clones : nombre de cellules composant chaque clone à un temps de culture donné ; - le phénotype des clones : degré de différenciation des cellules composant les clones, expression de marqueurs moléculaires. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé objet de la présente invention comprend en outre l'étape e) consistant à amplifier la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), ou sa descendance, par une ou plusieurs sous-cultures successives. Il s'agit ici de réaliser, à partir des clones cellulaires obtenus à l'issue de l'étape de croissance primaire c), des cultures cellulaires indépendantes, parallèles, à long terme via des sous-cultures successives amplifiées pendant plusieurs semaines. En fonction des besoins, l'amplification peut être conduite sur des périodes allant par exemple de 2 à 8 semaines environ, voire plus (cf. Exemple de réalisation n°1, B.2, ci-dessous). Ces cultures indépendantes permettent d'obtenir une grande quantité de cellules que l'on peut congeler et stocker sous la forme d'une ou plusieurs banques de cellules, pour un usage ultérieur. Les banques cellulaires clonales susceptibles d'être ainsi obtenues représentent également un objet de la présente invention. Dans un autre mode de réalisation, additionnel ou alternatif, le procédé selon l'invention comprend en outre l'étape f) consistant à évaluer le potentiel de reconstruction tissulaire de la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), ou de sa descendance. En pratique, pour réaliser cette étape, on peut décoller de leur support de culture les cellules issues des cultures ou micro-cultures clonales primaires, puis les utiliser, individuellement pour chaque clone d'intérêt, afin de produire un modèle de culture organotypique tridimensionnel (par exemple, un épithélium, un épiderme ou une peau reconstruit(e)). Les tissus tridimensionnels reconstruits à partir des cultures clonales, susceptibles d'être obtenus à l'issue de l'étape f) du procédé selon l'invention font partie des objets de la présente invention. Ces tissus sont produits selon un nouveau modèle organotypique tridimensionnel car les caractéristiques structurales et fonctionnelles des tissus objets de l'invention sont tout à fait spécifiques dans la mesure où elles découlent des propriétés d'une cellule unique. De tels tissus sont notamment choisis parmi les différents tissus épithéliaux, la peau, l'épiderme. En outre, les biopuces comprenant au moins un tissu tel que décrit ci-dessus constituent un autre objet de l'invention. Ces biopuces peuvent par exemple être constituées à partir de micro-cultures réalisées au sein d'un gel tridimensionnel fait d'un biomatériau compatible avec la croissance cellulaire. On peut également envisager des systèmes à base de multiples micro-tissus tridimensionnels reconstruits, chacun généré indépendamment directement au sein de la biopuce, sans étape de culture préalable. Dans un autre mode de réalisation, additionnel ou alternatif, le procédé selon l'invention comprend en outre l'étape g) consistant à évaluer le potentiel d'expansion à long terme de la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c). Par exemple, on pourra décoller de leur support de culture les cellules issues des cultures ou micro-cultures clonales primaires, puis les sous-cultiver dans des conditions favorisant leur multiplication, jusqu'à épuisement de leur potentiel de multiplication. Dans un autre mode de réalisation, additionnel ou alternatif, le procédé selon l'invention comprend en outre l'étape h) consistant à évaluer le potentiel clonogénique de la descendance de la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c). Pour cela, on pourra, par exemple, décoller de leur support de culture les cellules constituant chaque clone, puis réaliser, pour chacun d'entre eux, un test de clonogénicité (notamment, des cultures secondaires strictement clonales et/ou des cultures à faible densité permettant la croissance de colonies individualisées). De manière générale, dans le cadre de la présente invention, l'échantillon biologique initial est un échantillon de tissu épithélial sain ou malade, par exemple obtenu par biopsie chez un mammifère, de préférence humain. En particulier, l'échantillon tissulaire peut être choisi parmi les épithéliums, par exemple l'épiderme interfolliculaire de peau humaine adulte ou néonatale, la cornée, les muqueuses, les follicules pileux. Des échantillons de tissus épithéliaux malades sont par exemple obtenus par biopsie de patients atteints d'une maladie génétique (telle que xeroderma pigmentosum, les épidermolyses bulleuses, etc.), ou par biopsie de peau cicatricielle (chez les grands brûlés notamment). Les tissus épithéliaux malades peuvent également être des tissus tumoraux (carcinomes, etc.) L'échantillon biologique peut également comprendre des cellules issues de la différenciation épithéliale (notamment kératinopoïétique) de cellules souches pluripotentes choisies parmi les cellules souches pluripotentes embryonnaires, foetales et induites. On citera à titre d'exemples de cellules présentant un potentiel épithélial issues de cellules souches foetales : cellules du feuillet embryonnaire ectodermique, cellules des tissus épithéliaux, kératinocytes, etc. Les cellules présentant un potentiel épithélial issues de cellules souches pluripotentes dites � induites � (IPS pour � induced pluripotent stem cells �) sont générées par reprogrammation de cellules issues d'un tissu adulte qui peuvent être des cellules différenciées. Avantageusement, les cellules épithéliales extraites de l'échantillon biologique sont des cellules saines ou malades choisies parmi les cellules progénitrices, les cellules souches, les kératinocytes. Un autre objet de la présente invention concerne une composition ou un système (ou un kit) obtenu par la mise en oeuvre des étapes a) à c) au moins du procédé selon l'invention. Ces compositions ou systèmes présentent des propriétés particulières découlant du fait qu'ils dérivent de cultures clonales. Il peut par exemple s'agir d'un kit de diagnostic, d'un test d'évaluation d'une activité biologique, d'un test de toxicité, etc. Il est bien clair pour l'homme du métier que les termes � test �, � kit �, � système � peuvent être, selon le contexte dans lequel ils sont utilisés ici, équivalents. La présente invention se rapporte également aux applications du procédé et utilisations des divers moyens (système, composition, kit, banque cellulaire, tissu, biopuce) décrits plus haut. Des exemples préférés de telles utilisations et applications sont : - pour identifier et sélectionner des agents présentant une activité biologique d'intérêt. Un � agent � peut être une molécule candidate que l'on teste pour son activité biologique et que l'on sélectionne en fonction des applications, ladite activité pouvant être positive (e.g., pour la sélection d'effecteurs d'intérêt pharmaceutique, thérapeutique, cosmétique, etc.) ou négative (e.g., pour la sélection de molécules toxiques). Alternativement, un � agent � peut être de nature non chimique, par exemple les rayons UV, la lumière visible, les rayonnements ionisants, les ondes magnétiques, etc. ; - pour le traitement et/ou le diagnostic et/ou le pronostic dans le domaine de la thérapie cellulaire et/ou génique, notamment dans le domaine des 5 greffes ; - pour étudier le comportement et/ou les propriétés structurelles et/ou fonctionnelles individuelles spécifiques d'une cellule unique, d'un sous-type cellulaire, d'une sous-population cellulaire, ou d'une population cellulaire ; 10 - pour réaliser un ou plusieurs outils de génomique fonctionnelle, qui sont notamment utiles pour induire des phénomènes de gain ou perte d'activité biologique, à des fins médicales et/ou dans n'importe quel type d'exploration fonctionnelle. On citera par exemple les ARN interférents, les vecteurs de surexpression et/ou de répression, viraux ou non viraux, etc. 15 En définitive, les différents objets de la présente invention présentent, par rapport aux moyens et méthodes actuellement disponibles, les avantages considérables suivants : (i) La possibilité de réaliser des séries de micro-cultures parallèles, initiées à partir d'une cellule unique, ce qui rend possible en pratique la mise en 20 oeuvre de campagnes de tests à grande échelle ciblant des sous-populations rares, faiblement représentées au sein des tissus, ce qui n'est pas envisageable dans les modèles classiques, fortement consommateurs en matériel cellulaire. (ii) La possibilité d'initier des cultures clonales à partir de cellules de 25 phénotype choisi ensemencées individuellement, par exemple en micro-puits, immédiatement après sélection à partir du tissu, ce qui permet d'envisager la mise en place de stratégies de tests sur un matériel cellulaire n'ayant pas subi d'étape de multiplication en culture, et donc moins susceptible d'avoir été modifié par des paramètres artificiels de 30 culture avant la réalisation des tests, en particulier lorsque le traitement ou stimulus est appliqué immédiatement après ensemencement des micro-cultures. (iii) Le fait d'avoir, pour la première fois, accès au comportement de cellules placées en culture individuellement, ce qui offre la possibilité de qualifier et quantifier les propriétés biologiques et les réponses spécifiques des différentes cellules constituant une population d'intérêt, permettant l'analyse de l'hétérogénéité cellulaire, ce qui n'est pas possible dans des modèles classiques utilisant de manière globale des populations cellulaires. Ainsi, les différents objets de la présente invention trouvent une utilité dans de très nombreux domaines. En sus des exemples d'applications déjà décrits plus haut, on pourra notamment citer, de manière non limitative : (i) Evaluation de l'efficacité d'agents présentant une activité biologique : gains de fonction. • Évaluation de l'efficacité de composés porteurs d'une activité biologique bénéfique (par exemple , molécules d'intérêt pharmaceutique, actifs cosmétiques) : - Réalisation de campagnes de criblage permettant de quantifier les effets d'actifs biologiques à l'échelle d'une cellule unique isolée : action d'un traitement sur la cellule cible elle-même, impact sur sa descendance. - Possibilité de développer des stratégies de tests d'évaluation ciblés sur des populations faiblement représentées, telles que les cellules souches normales ou pathologiques. • Exemples : - test d'effecteurs susceptibles 1) d'induire la multiplication des cellules souches ou progénitrices des tissus épithéliaux pluristratifiés, 2) de favoriser un maintien du caractère souche en culture dans la descendance de cellules souches isolées ; - test de nouvelles molécules anti-cancéreuses sur des cellules souches isolées de carcinomes. (ii) Problématiques de toxicologie : pertes de fonction, transformation cancéreuse. • Estimation de l'impact de stress et de toxiques à l'échelle de cellules traitées isolément, après sélection sur la base de critères précis. Ces tests peuvent être appliqués sélectivement aux cellules responsables du renouvellement long terme (cellules souches) et court terme (progéniteurs) des tissus épithéliaux. • Ils permettent également, suivant le type de cellules ciblées, de concevoir des tests adaptés au pronostic et à la distinction d'effets délétères aigus ou tardifs sur un tissu ou organe : - Réalisation de tests toxicologiques permettant d'estimer l'innocuité d'un traitement ou, au contraire, de quantifier ses effets toxiques : effet à court terme sur la cellule isolée elle-même, conséquences sur sa descendance. - Évaluation de l'impact d'agressions génotoxiques : à l'échelle de cellules étudiées isolément, acquisitions de dommages à l'ADN, transmission de mutations et/ou d'anomalies génétiques à la descendance, conséquences sur l'organogénèse, etc. (iii) Technologie des bio-puces : modèles parallèles / massivement parallèles de quantification et qualification de réponses biologiques. - Cribles de génomique fonctionnelle sur des cultures cellulaires bidimensionnelles et/ou des modèles organotypiques tridimensionnels. - Criblage à haut débit de molécules porteuses d'une activité biologique / mise en évidence de propriétés délétères (� high throughput screening � [HTS]). (iv) Thérapie cellulaire et génique. • Qualification d'échantillons de cellules destinées à être greffées, et/ou destinées à être utilisées pour la production de greffons de tissus reconstruits : - Tests en culture permettant d'estimer le potentiel régénératif de cellules destinées à un usage clinique : potentiel de croissance estimé individuellement sur cellules en condition clonale. - Tests pronostics de la capacité de prise de greffe de tissus reconstruits in vitro : estimation du maintien ou de la perte du potentiel de croissance des cellules utilisées pour la production de greffons. • Validation de protocoles de transfert de gènes à visée clinique : - Évaluation de l'efficacité d'un protocole de correction génétique : estimation de la fréquence de cellules effectivement corrigées à l'issu du procédé de transfert de gènes. - Évaluation de la stabilité de la correction génétique : transmission à la descendance de cellules individualisées. (v) Ingénierie cellulaire et tissulaire. Systèmes cellulaires et modèles organotypiques compatibles avec la mise en oeuvre de tests sur cellules suivies isolément et leur descendance : -Production parallèle de banques de cellules, chacune constituée par la descendance d'une seule cellule placée en culture isolément. - Modèles de tissus reconstruits in vitro, normaux ou pathologiques, générés à partir de la descendance d'une seule cellule placée en culture en condition clonale. Les figures suivantes illustrent, en relation avec les exemples ci-dessous, des modes de réalisation de la présente invention : - Figure 1 : schéma représentant un mode de réalisation du procédé selon l'invention ; - Figure 2 : représentation graphique des résultats d'une expérience d'expansion à long terme pour la production de banques de kératinocytes multiples, chacune issue de la descendance d'une cellule unique ; - Figure 3 : résultats d'une expérience de production d'épidermes reconstruits multiples, chacun issu de la descendance d'une cellule unique ; - Figure 4 : représentation graphique des résultats d'une expérience où l'on a quantifié à l'échelle de la cellule unique isolée l'impact d'une irradiation sur des kératinocytes épidermiques de phénotypes distincts ; -Figure 5 : résultats d'une expérience dans laquelle on a utilisé le test fonctionnel des micro-cultures clonales parallèles pour évaluer les conséquences d'une irradiation effectuée sur cellule isolée, sur le potentiel de croissance de sa descendance, et dans laquelle on a comparé le comportement de kératinocytes épidermiques de phénotypes distincts. Des modes de réalisation particuliers et avantages de la présente invention sont décrits dans les exemples de réalisation ci-dessous, qui portent sur les kératinocytes de l'épiderme interfolliculaire humain adulte. Ces exemples sont fournis à titre purement illustratif ; ils ne limitent en aucune façon l'objet et la portée de l'invention. EXEMPLES A- PROCÉDURES EXPÉRIMENTALES A-1- Préparation du matériel cellulaire A-1-1- Cellules épithéliales destinées à être utilisées pour les cultures clonales Les biopsies de tissu, qui sont dans les exemples décrits ici, des biopsies de peau humaine adulte, ont tout d'abord été décontaminées, par exemple par trempage dans une solution physiologique contenant de la bétadine. Afin de permettre la séparation entre le tissu épithélial et le tissu conjonctif associé (dans le cas présent, épiderme et derme), les échantillons ont ensuite été incubés dans une solution enzymatique à 4°C pendant 10 à 15 heures (trypsine Gibco). À l'issue de cette étape de digestion enzymatique, les échantillons de tissu ont été disséqués à l'aide de pinces fines, de manière à isoler la partie épithéliale du tissu (ici, l'épiderme interfolliculaire). Le traitement enzymatique, complété par une étape de dissociation mécanique par aspirations et refoulement à l'aide d'une pipette, permet d'extraire les kératinocytes qui composent les fragments d'épithéliums . La suspension cellulaire a enfin été filtrée sur un tamis d'une maille de 50 à 70 microns (BD Falcon), afin d'éliminer les agrégats de cellules. À l'issue de ces étapes, les échantillons cellulaires se présentent sous la forme de suspensions monocellulaires, utilisables pour l'ensemencement des cultures clonales. A-1-2- Fibroblastes utilisés comme cellules de soutien Dans les exemples décrits, les cellules épithéliales (kératinocytes obtenus à partir d'épiderme interfolliculaire) ont été étudiées en condition clonale dans un système de culture utilisant comme support une couche nourricière de fibroblastes rendus incapables de se multiplier par une irradiation gamma à une dose de 60 Grays. Ainsi, ces cellules restaient statiques mais vivantes, et elles soutenaient la croissance des cellules épithéliales étudiées. Ces fibroblastes peuvent notamment être extraits de la partie dermique de biopsies cutanées. Pour ce faire, des fragments de derme ont été incubés dans une solution enzymatique constituée d'un mélange de dispase (Roche) et de collagénase (Roche) pendant 2 à 4 heures à 37°C. La digestion par les enzymes, combinée à une agitation mécanique, permet l'extraction des fibroblastes. Après élimination des fragments de tissu non digérés par filtration sur un tamis (BD Falcon), puis lavage, les fibroblastes obtenus ont été placés en culture dans un milieu composé de 90% de DMEM (Gibco) et de 10% de sérum d'origine bovine (Gibco), pour être amplifiés. Après multiplication en culture, les fibroblastes ont été irradiés, puis congelés pour être stockés jusqu'à utilisation. A-2- Marquages immuno-phénotypiques Les cellules épithéliales utilisées pour illustrer certains modes de réalisation de l'invention sont des kératinocytes présentant un fort niveau d'expression de l'intégrine a6 (Itga6 ou CD49f) et faible niveau d'expression du récepteur de la transferrine (CD71) : phénotype Itga6f°hi CD71 faible Pour la réalisation du marquage à l'aide d'anticorps fluorescents nécessaire pour la définition de ce phénotype, les échantillons cellulaires ont été placés en suspension dans un tampon salin physiologique (PBS) supplémenté de 2% de sérum albumine bovine (SAB) (Sigma), puis incubés pendant 10 minutes à 4°C avec des immunoglobulines de souris (Jackson Immuno-Research), afin de saturer les sites non spécifiques de fixation des anticorps. Le marquage des antigènes CD49f et CD71 a ensuite été effectué par ajout d'anticorps spécifiques couplés à des fluorochromes, puis incubation pendant 30 minutes à 4°C : anti-CD49f-PE (phycoérythrine) (clone GoH3, BD Pharmingen) et anti-CD71-APC (allophycocyanine) (clone M-A712, BD Pharmingen). Après lavage des anticorps en excès, les échantillons étaient prêts à être utilisés pour l'ensemencement des cultures clonales. A-3- Ensemencement automatisé des micro-cultures cultures clonales A-3-1-Ensemencement Dans les exemples de réalisations décrits, les micro-cultures clonales de kératinocytes ont été ensemencées de manière automatisée à l'aide d'un cytomètre en flux équipé d'un module de clonage (MoFlo, Cytomation). L'excitation des fluorochromes couplés aux anticorps de marquage a été réalisée en utilisant un laser argon à 488 nm (Coherent) et une diode laser à 630 nm. Les signaux émis par la phycoérythrine (PE) et l'allophycocyanine (APC) ont été respectivement détectés et quantifiés dans des fenêtres de longueur d'onde de 580 � 30 nm et 670 � 30 nm. Le critère de tri choisi dans le cas présent correspondait à des kératinocytes présentant le phénotype Itga6f°hi CD71 faibie et représentant de l'ordre de 10/0 des kératinocytes totaux : sous- population de kératinocytes décrite comme étant enrichie en cellules souches épidermiques (Li et al., 1998). A-3-2- Contrôle qualité des ensemencements clonaux En parallèle des cultures clonales destinées à être utilisées pour les tests et études (conditions de culture décrites ci-après), des séries d'ensemencements clonaux ont été réalisées dans le but de valider la procédure de dépôt des cellules. Ces dépôts ont été effectués dans des conditions techniques rigoureusement identiques, mais dans un milieu plus favorable au repérage des cellules que celui utilisé pour leur croissance. Ce milieu d'observation peut être, par exemple, un tampon salin physiologique (PBS) additionné de Hoeschst 33342 (Sigma) à une concentration de 10 microgrammes / ml. Le Hoechst est un colorant de l'ADN qui fluoresce sous excitation aux UV. Dans ces conditions, les cellules ensemencées individuellement dans un grand nombre de puits de culture peuvent être repérées, ce qui permet de vérifier l'efficacité du procédé. Chaque micro-culture doit contenir une seule cellule, jamais deux, et la fréquence des puits vides doit être minimisée. A-4- Conditions de culture A-4-1- Croissance clonale primaire Dans les exemples décrits, les micro-cultures clonales de kératinocytes ont été réalisées en plaques de culture comprenant 96 puits dans lesquelles était adsorbé du collagène de type I (Biocoat, Becton- Dickinson). La veille de l'ensemencement des cellules épithéliales en condition clonale, une couche nourricière de fibroblastes irradiés était mise en place dans les puits de culture. Ces cellules de soutien ont été ensemencées à une densité de 6000 cellules / cm2. Le milieu de culture utilisé pour la croissance des kératinocytes avait pour base un mélange de milieu DMEM (Gibco) et de milieu de Ham F12 (Gibco), additionné de sérum d'origine bovine (Hyclone). Ce milieu de base était notamment supplémenté avec de l'EGF (Chemicon), de l'insuline (Sigma), de l'hydrocortisone (Sigma), de l'adénine (Sigma), de la triiodothyronine (Sigma), de la L-glutamine (Gibco), et avec une solution d'antibiotiques et d'antimycotiques (Gibco). Après ensemencement automatisé des kératinocytes à raison d'une cellule unique par puits, les cultures ont été maintenues en culture à 37°C dans une atmosphère comprenant 90% d'humidité, en présence de 5% de 002, dans le cas présent pendant 2 semaines. Au temps choisi, un comptage des puits dans lesquels un clone cellulaire s'était développé a été effectué, puis le nombre de kératinocytes constituant chaque clone a été déterminé individuellement, après décollement des cellules par trypsination (Gibco). A-4-2- Étude du potentiel de reconstruction tissulaire Dans les exemples décrits, le potentiel de reconstruction tissulaire de la descendance des kératinocytes initialement placés en culture individuellement a été mis en évidence dans un modèle de reconstruction épidermique sur derme humain mort dé-épidermisé (Régnier et al., 1986). Pour la préparation des supports dermiques, des échantillons de peau humaine ont été incubés pendant 10 jours à 37°C dans du tampon PBS, afin d'en détacher l'épiderme, qui a été éliminé. Les échantillons de derme exempts d'épiderme ont été coupés en carrés d'environ 1 cm2. Ils ont alors subi plusieurs cycles de congélation/ décongélation successifs qui ont conduit à tuer les cellules dermiques. Les dermes acellulaires obtenus ont été stockés à -20°C jusqu'à utilisation. Le processus de reconstruction d'un épiderme tridimensionnel comprenait 2 étapes de cultures successives. Les échantillons cellulaires issus des micro-cultures clonales ont tout d'abord été ensemencés sur les supports dermiques et cultivés pendant 1 semaine en immersion dans un milieu de culture comparable similaire à celui utilisé pour la culture clonale primaire (exemple de composition décrit ci-dessus). La seconde étape du procédé de reconstruction épidermique consistait à placer les épidermes en formation à l'interface entre le milieu liquide et l'air ambiant de l'incubateur. La culture a alors été poursuivie pendant 1 à 2 semaines pour parvenir à une différenciation complète. Les caractéristiques histologiques des tissus tridimensionnels reconstruits ont été visualisées après fixation, coupe et coloration hémalum-éosine-safran (HES). A-4-3- Évaluation de la capacité d'expansion à long terme Les kératinocytes issus des micro-cultures clonales ont été décollés par trypsination (Gibco), puis placés en culture de masse, individuellement pour chaque clone étudié. Ces cultures ont été réalisées sur des surfaces plastiques sur lesquelles était adsorbé du collagène de type I (par exemple boites de Pétri, Biocoat, Becton-Dickinson). Les conditions de cultures étaient équivalentes à celles utilisées pour la croissance clonale primaire : couche nourricière de fibroblastes irradiés, milieu de culture de composition similaire. Au bout d'une semaine, les cultures atteignaient 50% à 80% de confluence. Les kératinocytes ont alors été décollés par trypsination, comptés, puis réensemencés à une densité de 2000 à 3000 cellules / cm2, dans des conditions identiques. Les cultures ont ainsi été repiquées et sous-cultivées chaque semaine, jusqu'à épuisement du potentiel d'expansion des cellules. À l'issue de l'étape de la croissance du clone primaire et des sous-cultures successives, la prolifération cellulaire a été estimée en termes de coefficient d'expansion et de nombre de doublements de population effectués, afin de quantifier le potentiel d'expansion total des kératinocytes initialement placés en culture individuellement. Nombre de doublements de population = (Log N/No)/Log 2 No = Nombre de cellules ensemencées N = Nombre de cellules obtenues à l'issue de l'étape de culture. A-4-4- Analyse de la capacité clonogénique secondaire Il s'agit d'estimer le maintien ou la perte du potentiel à générer des colonies parmi les cellules constituant la descendance des kératinocytes clonés. Pour ce faire, les cellules des clones primaires ont été décollées par trypsination (Gibco), puis ensemencées à faible densité de manière à obtenir une croissance de colonies séparées les unes des autres (par exemple, 5 cellules / cm2) dans des conditions similaires à celles décrites ci-dessus pour l'évaluation du potentiel d'expansion à long terme. Après 14 jours, les cultures ont été fixées à l'aide d'éthanol à 70%, séchées, puis colorées par deux bains successifs dans de l'éosine (Réactifs RAL) et du Bleu RAL 555 (Réactifs RAL). Les paramètres pris en compte pour quantifier la capacité clonogénique des cellules étudiées étaient notamment le nombre et la taille des colonies obtenues. B- EXEMPLE DE RÉALISATION N°1 Utilisation du modèle des micro-cultures clonales parallèles pour la production de banques de kératinocytes multiples, chacune issue de la descendance d'une cellule unique (Figure 2). B-1- Matériels et méthodes - Extraction de kératinocytes à partir d'un épiderme issu d'une biopsie cutanée adulte (réduction mammaire), dissociation et mise en suspension. - Marquage des kératinocytes en suspension à l'aide d'anticorps couplés à des fluorochromes permettant de trier un phénotype de cellules "souches" (fort niveau d'expression de l'intégrine a6 (Itga6) et faible niveau d'expression du récepteur de la transferrine (CD71) : phénotype Itga6f°hi CD71 faible ; modèle de sélection : Li et al., 1998). - À l'aide d'un module de clonage par cytométrie en flux, ensemencement automatisé de plaques de culture multi-puits, à raison d'une cellule de phénotype "souche" unique par puits. - Après 2 semaines de culture, repérage des puits dans lesquels le kératinocyte cloné a donné naissance à un clone cellulaire. - Ensemencement de cultures de masse à partir de chaque micro-culture clonale, dans des conditions favorisant la multiplication cellulaire. -Repiquages successifs des cultures afin d'obtenir la descendance des cellules initiales clonées à différents stades d'amplification (par exemple : état de culture "jeune" ou "âgé"), et une quantité de matériel cellulaire issu des cellules clonées compatible avec la constitution de banques de cellules congelées. - Test du nombre de sous-cultures successives maximal qu'il était possible de réaliser pour chaque culture initiée à partir d'un kératinocyte unique et estimation du nombre total cumulé de kératinocytes produits à l'issue des cultures à long terme. B-2- Résultats Sur une cohorte de 5 clones cellulaires testés pour leur aptitude à générer une banque de kératinocyes, tous ont pu être sous-cultivés et leur descendance suffisamment amplifiée pour être congelée. Deux semaines après l'initiation des cultures, les 5 clones choisis étaient constitués de 8,64x104 à 1,11x105 kératinocytes, ce qui équivaut à 16,40 à 16,86 générations cellulaires successives effectuées depuis le stade de la cellule unique clonée. - 1 clone a généré une descendance cumulée de 8,48x1012 kératinocytes en 8 semaines de multiplication en culture (n°1), ce qui équivaut à un cumul de 42,95 doublements moyens de population. - 2 clones ont généré une descendance cumulée de 6,36x1011 et 2,4x1011 kératinocytes (n°2 et n°3), ce qui équivaut respectivement à 39,21 et 37,80 doublements moyens de population. - 1 clone a généré une descendance cumulée de 2,03x1010 kératinocytes en 6 semaines de multiplication en culture (n°4), ce qui équivaut à un cumul de 34,24 doublements moyens de population. - 1 clone a généré une descendance cumulée de 2,15x109 kératinocytes en 6 semaines de multiplication en culture (n°5), ce qui équivaut à un cumul de 31,00 doublements moyens de population. B-3- Conclusion - Le modèle des micro-cultures clonales parallèles conforme à la présente invention représente une technologie permettant de générer de manière standardisée de multiples banques de kératinocytes, chacune issue de la descendance d'une cellule unique directement isolée à partir d'un prélèvement tissulaire. - Il permet également d'estimer et de comparer, à l'échelle de la cellule individuelle, le potentiel de prolifération de types cellulaires distincts (par exemple : progéniteurs, cellules souches épidermiques). C- EXEMPLE DE RÉALISATION N°2 Utilisation du système des micro-cultures clonales pour la production d'épidermes reconstruits multiples, chacun issu de la descendance d'une cellule unique (Figure 3). C-1- Matériels et méthodes - Extraction de kératinocytes à partir d'un épiderme issu d'une biopsie cutanée adulte (réduction mammaire), dissociation et mise en suspension. - Marquage des kératinocytes en suspension à l'aide d'anticorps couplés à des flurochromes permettant de trier en cytométrie de flux un phénotype de cellules "souches" (fort niveau d'expression de l'intégrine a6 (Itga6) et faible niveau d'expression du récepteur de la transferrine (CD71) : phénotype Itga6f°hi CD71 fa'b'e ; modèle de sélection : Li et al., 1998). - À l'aide d'un module de clonage par cytométrie en flux, ensemencement automatisé de plaques de culture multi-puits, à raison d'une cellule de phénotype "souche" unique par puits. - Après 2 semaines de culture, repérage des puits dans lesquels le kératinocyte cloné a donné naissance à un clone cellulaire. - Utilisation des kératinocytes constituant les clones cellulaires, séparément pour chacun d'entre eux, pour la production d'épidermes reconstruits (par exemple : reconstruction d'un épiderme sur derme humain mort dé-épidermisé : Régnier et al., 1986). C-2- Résultats Une cohorte de 5 clones cellulaires a été testée pour l'aptitude individuelle de chaque clone à générer un épiderme reconstruit tridimensionnel. L'expérience a été réalisée à un stade de croissance des clones équivalent à celui décrit dans l'exemple de réalisation n°1 (multiplication correspondant à -16 à 17 générations cellulaires successives). Les 5 clones testés se sont avérés capables de produire un épiderme présentant une organisation représentative de celle d'un épiderme natif. C-3- Conclusion - La technologie des micro-cultures clonales parallèles selon l'invention permet de produire des séries d'épidermes reconstruits dont la particularité est d'être chacun issus de la descendance d'une cellule unique, alors que les modèles classiquement utilisés pour des campagnes de tests à large échelle sont générés à partir de banques issues d'un mélange de cellules. - Les épidermes reconstruits produits selon le procédé objet de la présente invention sont générés à partir d'une cellule clonée immédiatement après extraction à partir du tissu, et non après une étape de multiplication en culture, susceptible d'en modifier les caractéristiques. - Dans cet exemple de réalisation, les clones ont été utilisés pour la reconstruction épidermique à un stade de croissance correspondant à -16 à 17 générations cellulaires successives. Dans d'autres modes de réalisation, les reconstructions épidermiques peuvent être réalisées à partir d'un stade plus précoce ou plus tardif de croissance des cellules clonées. Le modèle de culture selon la présente invention fournit donc un test fonctionnel original permettant de qualifier le potentiel d'organogenèse de cellules initialement placées en culture individuellement, immédiatement à la suite de la sélection à partir du tissu. Il offre la possibilité d'évaluer l'impact d'un stimulus ou d'un stress à différents stades de croissance de cellules placées en culture isolément, puis d'en étudier les conséquences sur la capacité de reconstruction tissulaire à court ou moyen terme après traitement. D- EXEMPLE DE RÉALISATION N°3 Utilisation du test fonctionnel des micro-cultures clonales parallèles pour quantifier à l'échelle de la cellule unique isolée l'impact d'une irradiation sur des kératinocytes épidermiques de phénotypes distincts (Figure 4). D-1- Matériels et méthodes - Extraction de kératinocytes à partir d'un épiderme issu d'une biopsie cutanée adulte (réduction mammaire), dissociation et mise en suspension. - Marquage des kératinocytes en suspension à l'aide d'anticorps couplés à des flurochromes permettant de trier en cytométrie de flux un phénotype de cellules "souches" (fort niveau d'expression de l'intégrine a6 (Itga6) et faible niveau d'expression du récepteur de la transferrine (CD71) : phénotype Itga6f°hi CD71faibie) et un phénotype de "cellules progénitrices" (fort niveau d'expression de l'intégrine a6 (Itga6) et fort niveau d'expression du récepteur de la transferrine (CD71) : phénotype Itga6f°hi CD71f°hi) (modèle de sélection : Li et al., 1998). -À l'aide d'un module de clonage par cytométrie en flux, ensemencement automatisé de plaques de culture multi-puits, à raison d'une cellule unique par puits, et ce, pour chacun des deux phénotypes cellulaires étudiés. - Vingt heures après ensemencement, irradiation de chaque cellule isolée, à une dose unique de 2 Gy (rayonnements y). - Après 2 semaines de culture, comptage des puits dans lesquels un clone cellulaire s'était développé, puis décollement et comptages des kératinocytes, individuellement pour chaque clone. D-2- Résultats D-2-1- Impact de l'irradiation sur la capacité clonogénique des 15 kératinocytes isolés (Figure 4A) En condition contrôle (sans irradiation), les deux phénotypes de kératinocytes testés montraient une forte capacité à générer un clone cellulaire. Ils ne se distinguaient pas de manière notable sur ce critère. - 70,3% des kératinocytes de phénotype Itga6f°hi CD71fa'bie (sous- 20 population enrichie en cellules souches) ensemencés individuellement ont donné naissance à un clone cellulaire. -61,7% des kératinocytes de phénotype Itga6f°hi CD71f°hi (sous-population composée de progéniteurs) ont généré un clone. Les kératinocytes des deux phénotypes étaient en revanche 25 affectés de manière différente par l'irradiation. - Le pourcentage de kératinocytes de phénotype Itga6f°hi CD71fa'bie donnant naissance à un clone était abaissé de 70,3% (condition contrôle) à 47,3% (irradiation 2 Gy), ce qui a permis d'estimer le maintien de la capacité clonogénique de ces cellules à 67,3%. - La capacité clonogénique des kératinocytes de phénotype Itga6f°hi CD71f°hi était diminuée de manière plus drastique par l'irradiation : 61,7% de cellules donnant naissance à un clone en condition contrôle versus 23,0% en condition d'irradiation, ce qui a permis d'estimer un maintien de la capacité clonogénique à seulement 37,3%. D-2-2- Impact de l'irradiation sur le potentiel de croissance des clones (Figure 4B) En condition contrôle, la taille des clones produits ne s'est pas non plus avérée être un critère permettant de distinguer nettement les deux types de kératinocytes étudiés. - Les kératinocytes des deux phénotypes se sont montré capables de générer une proportion importante de clones de taille importante, comprenant au moins 5x104 kératinocytes. L'analyse des distributions de la taille des clones obtenus a fourni des paramètres permettant de distinguer clairement les réponses spécifiques à l'irradiation des kératinocytes de phénotypes distincts. - Réduction modérée de la capacité des kératinocytes Itga6f°hi CD71fa'bie clonés à générer des clones de grande taille suite à l'irradiation (taille médiane des clones en condition contrôle : 10,1x104 cellules / clone ; taille médiane pour le groupe irradié : 6,8x104 cellules / clone). - Réduction fortement marquée de la capacité des kératinocytes Itga6f°hi CD71f°hi à produire des clones de grande taille suite à l'irradiation (taille médiane des clones, groupe contrôle : 8,5x104 cellules / clone ; taille médiane pour le groupe irradié : 1,2x104 cellules / clone). D-3- Conclusion - Le modèle des micro-cultures clonales parallèles selon l'invention se montre performant pour analyser la capacité de croissance de kératinocytes de phénotypes précis à l'échelle de la cellule individuelle. En effet, les valeurs d'efficacités clonogéniques obtenues dans ce modèle, atteignant 60 à 70% des cellules clonées, s'avèrent très supérieures à ce qui est généralement décrit dans des systèmes de culture conventionnels, concernant des kératinocytes directement issus d'une biopsie de tissu, pour lesquels les valeurs sont de l'ordre de 10%. - Ce modèle s'avère également performant pour détecter, qualifier et quantifier un effet délétère sur le potentiel de croissance cellulaire. Le présent exemple illustre l'aptitude du système à être valorisé par le développement de tests in vitro de radio-toxicologie. E- EXEMPLE DE RÉALISATION N°4 Utilisation du test fonctionnel des micro-cultures clonales parallèles pour évaluer les conséquences de l'irradiation d'une cellule unique sur le potentiel de croissance de sa descendance. Comparaison du comportement de kératinocytes épidermiques de phénotypes distincts (Figure 5). E-1- Matériels et méthodes À la suite de la procédure décrite dans le cadre de l'exemple de réalisation n°3 : - Ensemencement à faible densité d'une partie des kératinocytes issus des clones, de manière à obtenir des colonies individualisées : dans cet exemple, densité de 5 kératinocytes / cm2. - Après 2 semaines de culture, fixation et coloration des colonies, de manière à pouvoir effectuer une observation microscopique et macroscopique. E-2- Résultats En condition contrôle (sans irradiation des cellules initiales placées en culture individuellement), les groupes de clones testés pour leur aptitude à générer des colonies secondaires ont montré des caractéristiques très similaires pour ce critère. - La capacité à produire des colonies secondaires des 2 séries de clones, respectivement issus de kératinocytes Itga6f°hi CD71 faibie [clones (1) à (5)] et de kératinocytes Itga6f°hi CD71f°hi [clones (11) à (15)], s'est avérée comparable. - Ces 2 groupes comprenaient à la fois des clones cellulaires donnant naissance en abondance à des colonies secondaires de grande taille [par exemple : clones (1) et (11)] et des clones donnant naissance à des colonies peu abondantes et de petite taille [par exemple : clones (5) et (15)] Pour ce qui était des groupes des clones issus d'une cellule ayant subi une irradiation (dose unique 2 Gy), l'aptitude à générer des colonies secondaires s'est avérée clairement distincte pour les 2 phénotypes de kératinocytes testés. - Le groupe de clones issus de kératinocytes Itga6f°hi CD71fa'bie [clones (6) à (10)] montrait une capacité à produire des colonies secondaires équivalente à celle des groupes non irradiés. - En revanche, le groupe de clones issus de kératinocytes Itga6f° CD71f°hi ayant subi une irradiation [clones (16) à (20)] montrait une capacité clonogénique secondaire diminuée (pertes des colonies de diamètre 5 mm). E-3- Conclusion Le modèle des micro-cultures clonales parallèles selon la présente invention est adapté pour mettre en évidence, qualifier et quantifier, les conséquences non immédiates d'une irradiation réalisée sur des kératinocytes étudiés individuellement. Dans le cas présent, l'effet délétère mis en évidence était une perte de capacité de croissance mesurée sur la descendance des cellules placées en culture clonale. REFERENCES • Gangatirkar et al., Nat Protoc. 2007. 2: 178-186 • Li et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1998. 95 : 3902-3907 5 • Régnier et al., Exp Oeil Res. 1986. 165: 63-72 REVENDICATIONS 1. Système de culture de cellules épithéliales optimisé pour l'évaluation et l'exploitation des propriétés spécifiques d'une cellule unique, dans lequel un support de culture comprend au moins une culture clonale ensemencée avec une cellule épithéliale extraite d'un échantillon biologique. 2. Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit support de culture comprend au moins deux cultures clonales parallèles, chacune desdites cultures étant ensemencée avec une cellule épithéliale distincte extraite dudit échantillon biologique. 3. Système selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme de biopuce. 4. Procédé de culture de cellules épithéliales optimisé pour l'évaluation et l'exploitation des propriétés spécifiques d'une cellule unique, comprenant au moins les étapes consistant à : a) extraire une ou plusieurs cellules épithéliales d'un échantillon biologique ; b) facultativement, sélectionner au moins une population et/ou sous-population de cellules épithéliales parmi les cellules extraites à l'étape a) ; c) réaliser une culture clonale ensemencée avec une cellule épithéliale distincte issue de l'étape a) ou b) ; et d) évaluer qualitativement et/ou quantitativement la croissance cellulaire dans la culture clonale de l'étape c). 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape e) consistant à amplifier la population cellulaire de laculture clonale de l'étape c), ou sa descendance, par une ou plusieurs sous-cultures successives. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape f) consistant à utiliser la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), ou sa descendance, pour reconstruire un tissu tridimensionnel, de manière à évaluer son potentiel de reconstruction tissulaire. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape g) consistant à sous-cultiver la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), dans des conditions favorisant l'expansion cellulaire jusqu'à épuisement du potentiel d'expansion, de manière à évaluer le potentiel d'expansion à long terme de ladite population cellulaire. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape h) consistant à évaluer le potentiel clonogénique de la descendance de la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), à l'aide d'un test quantitatif de clonogénicité dans lequel on réalise des cultures secondaires strictement clonales et/ou des cultures à faible densité permettant la croissance de colonies individualisées. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que l'étape c) comprend la réalisation d'au moins deux cultures clonales parallèles, chacune desdites cultures étant ensemencée avec une cellule épithéliale distincte issue de l'étape a) ou b). 10. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé ence que ledit échantillon biologique est un échantillon de tissu épithélial sain ou malade, par exemple obtenu par biopsie chez un mammifère, de préférence humain. 11. Système ou procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit tissu épithélial est choisi parmi les épithéliums, par exemple l'épiderme interfolliculaire de peau humaine adulte ou néonatale, la cornée, les muqueuses, les follicules pileux. 12. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique comprend des cellules issues de la différenciation épithéliale de cellules souches pluripotentes choisies parmi les cellules souches pluripotentes embryonnaires, foetales et induites. 13. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 10 à 12, ou procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, caractérisé en ce que la ou les cellules épithéliales extraites dudit échantillon biologique est(sont) une(des) cellule(s) saine(s) ou malade(s) choisie(s) parmi les cellules progénitrices, les cellules souches, les kératinocytes. 14. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est obtenu par la mise en oeuvre des étapes a) à c) au moins du procédé selon la revendication 4. 15. Banque cellulaire clonale susceptible d'être obtenue à l'issue de l'étape e) du procédé selon la revendication 5. 2927633 .34 16. Tissu tridimensionnel reconstruit à partir d'une culture clonale susceptible d'être obtenu à l'issue de l'étape f) du procédé selon la revendication 6. 17. Tissu selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les épithéliums, la peau, l'épiderme. 18. Biopuce comprenant au moins un tissu selon la revendication 16 ou 17. 19. Utilisation : - du système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 10 à 13, ou - de la composition ou du système selon la revendication 14, ou - de la banque cellulaire selon la revendication 15, ou - du tissu selon la revendication 16 ou 17, ou - de la biopuce selon la revendication 18, ou application du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 13, pour identifier et sélectionner des agents présentant une activité biologique d'intérêt. 20. Utilisation : - du système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 10 à 13, ou - de la composition ou du système selon la revendication 14, ou - de la banque cellulaire selon la revendication 15, ou - du tissu selon la revendication 16 ou 17, ou - de la biopuce selon la revendication 18, ou application du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 13, pour le diagnostic in vitro et/ou le pronostic in vitro dans le domaine de la thérapie cellulaire et/ou génique, notamment dans le domaine des greffes.- 21. Utilisation : - du système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 10 à 13, ou - de la composition ou du système selon la revendication 14, ou - de la banque cellulaire selon la revendication 15, ou - du tissu selon la revendication 16 ou 17, ou - de la biopuce selon la revendication 18, ou application du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 13, pour étudier le comportement et/ou les propriétés structurelles et/ou fonctionnelles individuelles spécifiques d'une cellule, d'un sous-type cellulaire, d'une sous-population cellulaire, ou d'une population cellulaire. 22. Utilisation : - du système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 10 à 13, ou - de la composition ou du système selon la revendication 14, ou - de la banque cellulaire selon la revendication 15, ou - du tissu selon la revendication 16 ou 17, ou - de la biopuce selon la revendication 18, ou application du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 13, pour réaliser un ou plusieurs outils de génomique fonctionnelle. 23. Utilisation : - du système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 10 à 13, ou - de la composition ou du système selon la revendication 14, ou - de la banque cellulaire selon la revendication 15, ou - du tissu selon la revendication 16 ou 17, ou - de la biopuce selon la revendication 18, ouapplication du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 13, pour évaluer l'efficacité ou l'impact de traitements, notamment par des agents présentant une activité biologique, des stress, des toxiques, des agressions génotoxiques.