FR 2924805 A1 20090612 FR 0759716 A 20071211 2924805 La présente invention concerne un microscope à plasmon de surface à haute résolution comportant un interféromètre hétérodyne et utilisant une polarisation radiale du faisceau de génération du plasmon de surface. Le domaine technique de l'invention est celui de la conception de systèmes d'imagerie permettant la détection de faibles variations d'indice de réfraction dans un milieu d'observation et/ou d'objets diélectriques de l'ordre de quelques nanomètres ne présentant pas nécessairement des propriétés optiques remarquables (fluorescence, luminescence, résonance plasmonique localisée ou encore résonance Raman) et localisés près d'une surface et immergés dans tout milieu d'indice de réfraction inférieur à 1,5 et notamment dans l'air ou dans un milieu aqueux. Un plasmon de surface est une onde électromagnétique de surface qui se propage au niveau d'une interface métal/ milieu diélectrique d'observation. La naissance de cet effet, c'est à dire l'excitation du plasmon de surface nécessite des conditions de couplage optique particulières. Il faut en effet un milieu de couplage et une lumière incidente à l'interface métal/milieu diélectrique sous un angle particulier qu'on appelle généralement angle de résonance plasmon ep. De part les propriétés de résonance des plasmons de surface, l'angle Op (en d'autres termes la condition de couplage) est très sensible aux moindres modifications des propriétés optiques au niveau de l'interface métal/milieu diélectrique. Cette sensibilité rend exploitable le plasmon de surface pour la réalisation d'images d'objets de très petites tailles situés au niveau de l'interface métal/milieu diélectrique, lesdits objets modifiant les propriétés optiques du plasmon de surface au niveau de cette interface ce qui permet d'obtenir un contraste entre l'objet et son milieu. En outre le plasmon de surface étant une onde évanescente, il permet de s'affranchir des effets de volume au sein du milieu d'observation. Le principe d'excitation du plasmon dans la microscopie de plasmon de surface est très souvent illustré dans la littérature en référence à la configuration dite de Kretschmann-Raether. Celle-ci prévoit le dépôt sur une face d'un prisme de verre, en contact avec un milieu diélectrique tel que l'air, d'une couche métallique 2 2924805 de l'ordre de 50 nanomètres d'épaisseur. Lorsqu'un faisceau lumineux de forte intensité traverse le prisme et rencontre la couche métallique sous l'angle d'incidence 6p un plasmon de surface prend alors naissance dans le métal et l'onde évanescente qui en résulte est confinée sur quelques centaines de 5 nanomètre au niveau de l'interface métal/ milieu diélectrique. Parmi tous les rayons arrivant à la surface, uniquement ceux qui ont un angle d'incidence suffisamment proche (typiquement inférieur à 2 degrés) de l'angle de résonance plasmon 6p excitent le plasmon de surface et contribuent à l'imagerie par plasmon de surface. Les plasmons de surface sont à ce jour 10 essentiellement utilisés comme capteurs chimiques et/ou biologiques, et il existe d'ailleurs des systèmes commerciaux basés sur la configuration de Kretschmann. Cependant, la résolution de ces systèmes, limitée par la propagation latérale du plasmon, est relativement faible, de l'ordre de quelques dizaines de microns seulement dans les longueurs d'onde visibles. 15 Depuis une dizaine d'années, quelques groupes de recherche fondamentale ont développé une génération de microscopes à plasmons de surface dont la résolution n'est plus limitée, comme auparavant, par la propagation latérale du plasmon, mais simplement par la diffraction. Ces différents microscopes ont tous pour idée commune de focaliser un 20 faisceau laser avec un objectif à forte ouverture numérique et à fort grossissement au niveau d'une surface qui présente une couche métallique (or, argent, cuivre, aluminium etc) de quelques dizaines de nanomètres d'épaisseur. Ceci permet à la fois d'exciter et de confiner le plasmon de surface de film mince. On peut cependant différencier ces techniques d'une part par le profil 25 d'illumination à l'entrée de l'objectif et d'autre part par le mode de détection du signal. En effet quand un faisceau arrive à l'entrée de l'objectif du microscope, seul un anneau très fin de lumière contribue à l'excitation du plasmon de surface. La partie du faisceau réfléchi qui contient l'information liée au plasmon de surface est 30 très fine et se retrouve noyée dans le reste du faisceau lumineux. Sans traitement particulier du faisceau, l'imagerie serait quasiment impossible. 3 2924805 Dans certaines publications, notamment dans la demande de brevet japonaise JP 2003083886, l'illumination et la détection reposent sur un filtrage spatial, à l'entrée de l'objectif, des rayons lumineux qui contribuent à l'excitation plasmon et sur l'élimination de ceux qui n'y contribuent pas. 5 Dans certaines autres publications telles que le brevet américain US 6,970,249 B1 ou mieux encore dans l'article de M. G, Somekh, S. G Liu, T. S Velinov and C. W See, � Optical V(z) for high-resolution 2p plasmon microscopy �, Optics Letters 25, 823 (2000) et, � High-resolution scanning surface-plasmon microscopy �, Applied Optics 39, 6279 (2000), il ressort que la détection se fait 10 sur la mesure de la phase du plasmon de surface et non sur l'amplitude. Plus lourde car elle nécessite l'utilisation d'un interféromètre, cette méthode apporte cependant une bien meilleure sensibilité. L'article de Somekh et al. propose comme représenté aux figures 1B et 2A un dispositif de microscopie qui permet une mesure de la phase mais qui ne filtre 15 pas les rayons lumineux ne contribuant pas à l'excitation plasmon faisceau en éliminant sa partie inintéressante. Le couplage de ces deux aspects techniques présente l'avantage d'avoir une résolution et une sensibilité inégalée par rapport aux autres techniques connues à ce jour Toutefois dans cette forme de mise en oeuvre particulière, on constate, 20 comme cela est représenté à la figure 2B qui représente la distribution de l'intensité du faisceau laser au niveau du plan focal arrière de l'objectif après rétro-diffusion et repassage par l'objectif, deux anneaux en forme de croissant qui correspondent à la zone du faisceau de départ qui a participé à l'excitation du plasmon de surface. La zone des rayons concernés présente une orientation 25 privilégiée qui est celle de la direction de polarisation de la lumière à l'entrée de l'objectif. Dans le dispositif proposé par Somekh, aucun rayon ne contribue à l'excitation du plasmon de surface dans la direction orthogonale (verticale passant par 0 dans la figure 2B) et il n'y a qu'une fraction de l'énergie lumineuse incidente qui participe à l'excitation du plasmon de surface. 30 Un but de la présente invention est de procurer un microscope à plasmon de surface à haute résolution qui présente une résolution et une sensibilité accrue par rapport aux microscopes à plasmon de surface existants. 4 2924805 Un autre but de l'invention est de fournir un microscope à plasmon de surface qui permette l'observation de molécules et particules dans des milieux diélectriques aqueux, et notamment dans des liquides biologiques. L'invention vise notamment à procurer un microscope à plasmon de surface 5 à haute résolution qui permette la détection et la visualisation d'objets de très faibles tailles, de l'ordre du nanomètre, tels que des molécules biologiques par exemple, sans avoir recours à des marqueurs chimiques, optiques ou radioactifs de ces objets. Un autre but de l'invention est enfin de fournir un microscope à plasmon de 10 surface simple à réaliser et à utiliser. Les différents objectifs ainsi définis sont atteints conformément à la présente invention grâce à un microscope à plasmon de surface à balayage à haute résolution comportant essentiellement : a) une source de lumière cohérente, et 15 b) un milieu de couplage et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif à grande ouverture numérique, une huile à immersion et une lamelle de verre, et c) une couche métallique recouvrant une surface de la lamelle de verre du milieu de couplage qui n'est pas en en contact avec l'huile d'immersion de ce 20 dernier, la couche métallique étant apte à être mise en contact avec un milieu d'observation contenant un échantillon à observer et à émettre un plasmon de surface généré par excitation d'au moins un faisceau lumineux issu de la source de lumière, et d) un interféromètre apte à diviser un faisceau lumineux émis par la source 25 de lumière en au moins un faisceau de référence et au moins un faisceau de mesure dirigé vers le milieu de couplage et la couche métallique pour générer un plasmon de surface, l'interféromètre étant positionné entre la source lumineuse et l'objectif du milieu de couplage pour former un faisceau interférométrique entre le faisceau de référence et du faisceau de mesure après réflexion de chacun d'eux 30 respectivement par un miroir et par la couche métallique, et e) des moyens de balayage de la couche métallique à l'aide du faisceau lumineux de mesure, et 5 2924805 f) des moyens de détection du faisceau interférométrique issu de l'interféromètre, et g) des moyens de traitement et de formation d'une image à partir du faisceau interférométrique. 5 Le microscope de l'invention se caractérise par le fait qu'il comporte, disposé entre la source lumineuse et l'interféromètre, au moins un convertisseur de polarisation linéaire en polarisation radiale des faisceaux lumineux émis par la source lumineuse. Ainsi, le microscope de l'invention se distingue par rapport à l'état de la 10 technique en ce qu'il permet une conversion en polarisation radiale du faisceau de génération du plasmon de surface. L'introduction d'une telle faculté d'illumination par un faisceau polarisé radialement de l'interface couche métallique/milieu diélectrique d'observation procure un progrès significatif par rapport à l'état de la technique parce qu'elle 15 permet, comme il sera présenté par la suite, une amélioration de la résolution des images obtenues d'un facteur 3 et de la sensibilité d'un facteur 4. D'autres caractéristiques et avantages du microscope de l'invention ressortiront mieux à la lecture de la description détaillée qui va suivre, faite en référence aux figures annexées parmi lesquelles : 20 - la Figure 1A représente le principe d'excitation et de confinement du plasmon de surface dans un microscope de l'art antérieur avec un faisceau lumineux focalisé à l'interface métal/milieu diélectrique ; - la Figure 1B représente le principe d'excitation et de confinement du plasmon de surface dans un microscope de l'art antérieur avec un faisceau 25 lumineux défocalisé dans l'interface métal/milieu diélectrique ; - la Figure 1C représente une courbe expérimentale V(z) dans l'eau obtenue avec un microscope à plasmon de surface de l'art antérieur en polarisation linéaire ; - la Figure 2A représente un microscope à plasmon de surface à haute 30 résolution tel que connu de l'art antérieur mettant en oeuvre une excitation et un confinement du plasmon de surface tel que représenté à la Figure 1B ; 6 2924805 - la Figure 2B représente le profil de distribution de lumière réfléchie par la surface métallique de génération du plasmon de surface à la sortie de l'objectif du microscope de la Figure 2A ; - la Figure 2C représente la réponse impulsionnelle du microscope de la 5 Figure 2A en polarisation linéaire par calcul numérique de la distribution de la lumière focalisée au niveau d'un l'interface entre une couche métallique d'or et un milieu diélectrique formé par de l'eau, avec un objectif d'ouverture numérique égale à 1.65 ; - la Figure 3A, représente schématiquement un microscope à plasmon de 10 surface à haute résolution conforme à la présente invention ; - la Figure 3B représente le profil de distribution de lumière réfléchie par la surface métallique de génération du plasmon de surface à la sortie de l'objectif du microscope de l'invention représenté à la Figure 3A ; - la Figure 3C représente la réponse impulsionnelle du microscope de la 15 Figure 3A en polarisation radiale par calcul numérique de la distribution de la lumière focalisée au niveau d'un l'interface entre une couche métallique d'or et un milieu diélectrique formé par de l'eau, avec un objectif d'ouverture numérique égale à 1.65 ; - les Figures 4A et 4B représentent respectivement l'image d'une particule 20 de Latex de 50 nanomètres de diamètre obtenue avec le microscope de l'art antérieur représenté à la Figure 2A et avec le microscope de l'invention représenté à la Figure 3A ; - la Figure 5 représente schématiquement l'effet de conversion de polarisation du champ électrique du faisceau lumineux de génération du plasmon 25 de surface mis en oeuvre dans le microscope de la présente invention - la Figure 6 représente en détail un mode de réalisation préféré du microscope de la présente invention, tel que représenté schématiquement à la Figure 3A. La présente invention propose un microscope à plasmon de surface à 30 balayage à haute résolution fonctionnant selon le principe de l'effet dit V(z) qui prévoit que la réponse V du microscope varie en fonction de la distance de 7 2924805 défocalisation z par rapport à l'interface couche métallique/milieu diélectrique d'observation du microscope. Les premières expérimentations concluantes d'exploitation de ce principe de l'effet V(z) ont été présentées notamment dans les articles de M. G, Somekh, S. G 5 Liu, T. S Velinov and C. W See, � Optical V(z) for high-resolution 2p plasmon microscopy �, Optics Letters 25, 823 (2000) et, � High-resolution scanning surface-plasmon microscopy �, Applied Optics 39, 6279 (2000) précédemment cités pour les mesures dans l'air et dans l'article L. Berguiga, S. Zhang, J. Elezgaray and F. Argoul "High resolution Surface Plasmon imaging in air and in 10 liquid: V(z) curve and operating conditions", Optics Letters 32, 509 (2007) pour les mesures dans l'eau. Les éléments essentiels de ces expérimentations sont présentés rapidement ci-après en référence aux Figures 1A à 2B et permettent de mieux comprendre l'effet V(z) en microscopie à plasmon de surface à haute résolution 15 ainsi que par la suite le microscope de la présente invention qui sera décrit en référence aux Figures 3A à 6 plus particulièrement. En référence aux Figures 1A et 1B, le principe d'excitation du plasmon de surface dans la microscopie de plasmon de surface à haute résolution est analogue à la configuration dite de Kretschmann. Il met en oeuvre en premier lieu 20 un milieu de couplage qui remplace le prisme de verre de la configuration dite de Kretschmann. Ce milieu de couplage est constitué d'un objectif O à forte ouverture numérique, typiquement au moins 1.2 NA, baignant par la surface d'un de ses dioptres sur une huile à immersion Hi qui elle-même est en contact avec une première face d'une lamelle de verre Gs. La face libre de la lamelle de verre 25 Gs (c'est-à-dire celle non en contact avec l'huile) est recouverte d'une couche métallique Ms d'environ 45 nm d'épaisseur, par exemple d'or ou d'argent. Au contact de la couche métallique et s'étendant dans le sens de l'axe Z sur la Figure 1A s'étend un milieu diélectrique D d'analyse ou d'observation dans lequel sont immergés les objets que l'on souhaite observer. Ce milieu d'analyse D 30 peut être l'air, l'eau ou une solution aqueuse ou plus généralement tout milieu diélectrique présentant un indice de réfraction inférieur ou égal à 1,5. 8 2924805 Un faisceau lumineux L tel qu'un faisceau laser, représenté par les doubles flèches sur les Figures 1A et 1B, est envoyé en direction de la couche métallique Ms au travers du milieu de couplage. Parmi tous les rayons atteignant la couche métallique Ms et l'interface de celle-ci avec le milieu diélectrique D, uniquement 5 ceux qui se réfléchissent sur la couche métallique avec un angle d'incidence proche de l'angle de résonance plasmon 9p excitent le plasmon de surface, représenté par les rayons en trait plein sur la Figure 1A, à l'interface entre la couche métallique Ms et le milieu d'observation diélectrique D. Comme cela est représenté sur la Figure 1A, lorsque que le faisceau 10 lumineux L est focalisé dans le plan de l'interface métal Ms/milieu diélectrique D, tous les rayons lumineux du faisceau incident sont réfléchis et arrivent à un photodétecteur (non représenté) placé à l'infini. Il est alors nécessaire pour exploiter le plasmon de surface et obtenir une image de supprimer tous les rayons réfléchis ne participant pas à la génération du plasmon, c'est-à-dire tous les 15 faisceaux représentés en pointillés sur le Figure 1A. Afin de contourner cette difficulté, grâce à une défocalisation du plan de l'objectif O derrière la surface métallique Ms comme l'indique la figure 1B, par construction d'optique géométrique, tous les faisceaux réfléchis qui ne passent pas par le point 0 n'atteignent pas le photodétecteur placé à l'infini. En l'occurrence 20 seul le faisceau en incidence normale et les rayons qui participent à la naissance du plasmon de surface arrivent au photodétecteur. Sur la Figure 1B, la défocalisation du plan focal de l'objectif O derrière la surface métallique Ms à observer permet au plasmon de surface, excité par le rayon Ri de se propager, de réémettre, pendant toute sa propagation à l'interface 25 des rayons avec un angle 6p et seul celui qui passe par 0, c'est à dire Rp se propage en direction du photodétecteur. Le rayon Rp présente un retard de phase par rapport au rayon Rn, qui est le rayon normal réfléchi dans l'axe de l'objectif. Ce retard de phase qui vaut A0 = jr +47c noz(1ù cos8p ), où no est l'indice de réfraction du milieu de couplage, 30 est introduit par la propagation du plasmon de la surface à l'intérieur du spot de focalisation. Ce retard de phase varie avec la distance de défocalisation z selon 9 2924805 l'axe Z dans le repère XOZ et la vitesse de propagation du plasmon de surface. En fixant la distance de défocalisation z, ce déphasage entre les rayons Rn et Rp est en conséquence uniquement lié à la condition de couplage, en d'autres termes à l'angle 6p. 5 Une mesure de ce déphasage et un balayage sur la surface point par point permettent de sonder les variations locales de la résonance plasmon et permettent donc de visualiser, avec une résolution de la taille du spot de lumière focalisée, les variations locales des propriétés optiques au niveau de l'interface. L'image est alors formée point par point. 10 Cette technique a été mise en oeuvre dans le microscope proposé dans la publication précédemment présentée, et dont le schéma est reproduit à la Figure 2A. Comme le montre cette figure, le dispositif comporte une source laser LG dont le faisceau L est divisé en deux par un séparateur de faisceau BS, formant 15 ainsi un interféromètre. Un des deux faisceaux après agrandissement par un élargisseur de faisceau BE passe par un milieu de couplage comprenant un objectif O qui permet l'excitation du plasmon grâce à sa très grande ouverture numérique et qui confine le plasmon grâce à son fort grossissement, une huile à immersion Hi et une lame de verre recouverte sur sa surface externe d'une 20 couche métallique Ms d'or ou d'argent au contact d'un milieu diélectrique d'observation D. Le faisceau réfléchi par la couche métallique Ms repasse par l'objectif O et est recombiné avec l'autre faisceau qui a été réfléchi par un miroir M. Les deux faisceaux génèrent un signal d'interférence présentant une modulation temporelle générée par un décalage de la fréquence optique différent 25 dans chaque bras de l'interféromètre. Le signal interférométrique est collecté par un détecteur optique PD et une électronique démodule le signal modulé. Le signal ainsi obtenu représente l'intensité d'un pixel de l'image. En déplaçant le faisceau incident sur la surface métallique Ms on peut ainsi réaliser un balayage complet de l'interface couche métallique Ms/milieu d'observation D et 30 reconstituer une image complète. Toutefois, comme le montre la Figure 2B, la distribution de lumière réfléchie par la surface métallique à la sortie de l'objectif du microscope n'est pas 10 2924805 uniforme et seul deux croissants latéraux participent à la génération du plasmon de surface. Ceci présente l'inconvénient de procurer un microscope dont la réponse impulsionnelle se compose de deux lobes distincts de lumière. Alors, dans le cas d'observation de molécules uniques ou d'objets de taille inférieure à celle du 5 faisceau lors du passage de celui-ci sur l'objet, chaque lobe passe sur l'objet, générant ainsi une image dédoublée de l'objet comme cela est par exemple représenté sur la Figure 2C. La présente invention apporte un perfectionnement significatif à la technique antérieure, notamment en permettant l'obtention d'une distribution de 10 lumière uniforme en sortie d'objectif du microscope, ce qui procure une résolution et une sensibilité grandement améliorée comme il va être présenté ci-après. Un exemple particulier de réalisation du microscope de l'invention est présenté schématiquement à la Figure 3A dans lequel les éléments communs avec le microscope de la Figure 2A portent les mêmes références. 15 Le microscope de l'invention, de façon similaire au microscope de la Figure 2A, comporte une source de lumière cohérente LG, par exemple une source de type L.A.S.E.R., et notamment un laser à gaz hélium-néon (He-Ne). À la sortie du laser se trouve un polariseur P complété d'un agrandisseur de faisceau BE pour élargir le faisceau laser L avant son entrée dans un 20 interféromètre de Twymann-Green fonctionnant en mode hétérodyne qui comprend en premier lieu un diviseur de faisceau BS pour former deux faisceaux lasers LRef et LMes se propageant dans deux bras distincts de l'interféromètre. Un premier faisceau laser LRef se propage dans un premier bras, dit de référence, qui comporte un miroir de réflexion MRef de ce premier faisceau 25 lumineux de référence. Le second faisceau laser Lies, que nous appellerons de mesure se propage dans un second bras, dit de mesure, vers un milieu de couplage et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif O à grande ouverture numérique, une huile à immersion Hi et une lamelle de verre Gs. 30 De façon préférée, le bras de mesure comporte également au moins un agrandisseur de faisceau BE placé entre le séparateur de faisceau BS et le milieu de couplage. 11 2924805 De plus, il est également préférable et avantageux de prévoir dans chaque bras de l'interféromètre au moins un modulateur acousto-optique AOMRef, AOMMeSj par exemple constitué d'une cellule de Bragg, apte à introduire un décalage de la fréquence optique des faisceau lumineux LRef et LMes de référence 5 et de mesure respectivement. De façon privilégiée, l'objectif O du milieu de couplage présente une ouverture numérique supérieure ou égale à 1.2 dans l'air et à 1.55 dans une solution aqueuse et un grossissement supérieur à soixante fois. Ces caractéristiques de l'objectif O assurent ainsi une bonne excitation et un bon 10 confinement du plasmon de surface. Une surface extérieure de la lame de verre Gs du milieu de couplage est recouverte d'une couche métallique Ms au contact d'un milieu d'observation diélectrique D d'indice de réfraction inférieur à 1,5, par exemple de l'air ou de l'eau, contenant un échantillon à observer. 15 Le faisceau de mesure Lies est ainsi dirigé vers le milieu de couplage et la couche métallique Ms pour générer un plasmon de surface à l'interface couche métallique/milieu diélectrique D. Le faisceau de mesure Lies réfléchi par la surface métallique Ms repasse par l'objectif O et est ensuite recombiné avec le faisceau LRef réfléchi par le miroir 20 MRef dans le bras de référence. Les deux faisceaux génèrent un signal interférométrique collecté par des moyens de détection optique PD tel qu'un photomultiplicateur ou une caméra CCD par exemple ou encore un compteur de photons, ou une photodiode à avalanche. Ce signal interférométrique présente une modulation temporelle générée 25 par un décalage de la fréquence optique de chaque faisceau lumineux réfléchi dans chaque bras de l'interféromètre. Pour démoduler ce signal et l'exploiter, le microscope comporte une électronique de démodulation appropriée ainsi que des moyens de traitement et de formation d'une image à partir du faisceau interférométrique essentiellement 30 constitués de moyens informatiques de traitement et de visualisation. Conformément à une caractéristique essentielle, le microscope de l'invention se distingue des microscopes de l'art antérieur et notamment de celui 12 2924805 de Someck et al. en ce qu'il comporte, disposé entre la source lumineuse LG et l'interféromètre, au moins un convertisseur PC de polarisation linéaire en polarisation radiale du faisceau laser L émis par la source lumineuse LG. Le passage en polarisation radiale du faisceau laser L émis par la source 5 lumineuse LG permet en effet d'illuminer l'entrée de l'objectif O du milieu de couplage avec une polarisation qui présente, comme représenté à la Figure 5, une symétrie radiale par rapport à l'axe du faisceau. Le convertisseur de polarisation PC permet avantageusement de modifier la polarisation, et donc l'orientation de tous les vecteurs champ électrique Eo par rapport à l'axe de 10 propagation du faisceau L de sorte que ces vecteurs soient tous orientés radialement à l'axe de propagation afin que la contribution à la génération des plasmon de surfaces par les front d'ondes incidents sur la surface métallique Ms soit uniforme et optimale. Ainsi, comme le représente la Figure 3B, la distribution de lumière 15 réfléchie à la sortie de l'objectif est bien uniforme et circulaire, ce dont on peut conclure, par simple comparaison des Figures 2B et 3B, que la zone du faisceau qui contribue à l'excitation du plasmon est plus importante et sa surface sensiblement multipliée par deux par rapport aux microscopes de l'art antérieur. En outre, le fonctionnement en polarisation radiale du microscope de 20 plasmon de surface de l'invention permet d'améliorer de façon sensible la résolution et la sensibilité du microscope comme cela apparaît distinctement des Figures 2C et 3C qui représentent l'intensité lumineuse au niveau de l'interface calculée respectivement en polarisation linéaire et en polarisation radiale. Comme cela ressort de la Figure 2C, en polarisation linéaire, la distribution 25 en intensité lumineuse au niveau de la surface du spot focalisé est constituée de deux pics intenses. En conséquence la réponse impulsionnelle du microscope d'un objet nanométrique individuelle est donnée par deux pics brillants de part et d'autre de l'objet. Par opposition, comme cela ressort de la Figure 3C, en polarisation 30 radiale, le spot ne présente qu'un seul pic intense qui permet d'une part de reconcentrer le faisceau de lumière et d'autre part d'améliorer la réponse 13 2924805 impulsionnelle du microscope. L'intensité du spot focalisé obtenue avec le microscope de l'invention est en conséquence quatre fois plus intense. On constate par cette expérimentation que le microscope de l'invention procure une amélioration du profil de la réponse optique puisque l'on obtient un 5 seul pic au lieu de deux avec les microscopes antérieures, mais également une augmentation par 3 de la résolution, qui passe de 600 nm à 200 nm. Les profils d'intensité lumineuse calculés numériquement dans les Figures 2C et 3C ont été confirmés expérimentalement par l'imagerie plasmon de nanoparticules de Latex (50 nm) illustrées dans les Figures 4A et 4B pour des 10 polarisations linéaire et radiale respectivement. Afin de pouvoir réaliser des images complètes du plasmon de surface, le microscope de l'invention comporte des moyens de balayage de la couche métallique à l'aide du faisceau lumineux de mesure, notamment des moyens piézoélectriques de déplacement en translation de la lamelle et/ou de l'objectif du 15 milieu de couplage selon deux directions X, Y orthogonales dans un même plan. Afin de garantir le contraste des images, les moyens de balayages du microscope de l'invention comprennent des moyens piézoélectriques de déplacement de l'objectif en translation selon une direction Z normale au plan de chacune des surfaces de la lamelle de verre du milieu de couplage et de la couche 20 métallique, assurant ainsi une connaissance de la distance de l'objectif par rapport à la lamelle. Pour compléter plus précisément la description du microscope de la présente invention, la Figure 6 représente en détail un microscope à plasmon de surface dans un mode préféré de réalisation conforme à l'invention. 25 Il comporte en premier lieu une source de lumière LG formée par un laser He-Ne de longueur d'onde de 633 nm non polarisé, de puissance 5mW et d'une longueur de cohérence d'une vingtaine de centimètres. Cette source lumineuse LG émet un faisceau laser L en direction de deux miroirs de renvoi successifs M1 et M2 avec un angle d'incidence de 45° environ. 30 Ces deux miroirs M1, M2 permettent un ajustement précis de la hauteur et du parallélisme du faisceau L par rapport à un plan horizontal et un axe qui définira le centrage de tous les composants optiques et notamment l'axe de symétrie de 14 2924805 l'objectif de focalisation et la direction de l'incidence normale de la surface de la lamelle. Le faisceau L passe ensuite par un polariseur P qui polarise le faisceau verticalement, puis un diaphragme Do. Le faisceau L est collimaté et agrandi au 5 moyen d'un premier télescope TI composé d'un objectif 01 et d'une lentille Li. Son facteur de grandissement est de 2,3. Le faisceau L passe ensuite au travers d'un convertisseur de polarisation CP qui convertit la distribution uniforme de la polarisation linéaire verticale initiale en une distribution spatiale de symétrie radiale de la polarisation par rapport au centre du faisceau. 10 Il existe différentes techniques de conversion. A titre d'exemple, un système composé de trois couches de cristaux liquides a été choisi pour le microscope de l'invention car il présente l'avantage d'être compact. Cette solution technique n'est toutefois pas exclusive et d'autres types de convertisseurs peuvent être employés pour autant qu'ils permettent une conversion radiale du faisceau 15 laser d'excitation. En sortie de convertisseur CP, le faisceau laser L passe par un diaphragme DI puis entre dans un interféromètre de type Twyman-Green en mode hétérodyne dont la description est donnée ci-dessous. Le positionnement du convertisseur CP avant l'interféromètre est un critère important parce qu'il limite les défauts 20 optiques du front d'onde, ceux ci étant éliminés par la suite par la technique interférométrique. L'interféromètre comporte en premier lieu un cube séparateur BS par lequel le faisceau L passe et est divisé en deux faisceaux Lies, LRef d'égales intensités. Le premier faisceau Lies n'est pas dévié et continue sa trajectoire dans 25 un premier bras de l'interféromètre que l'on nomme le bras de mesure (à droite du cube sur le schéma de la Figure 6). Le deuxième faisceau LRef est dévié de 90° par rapport au faisceau initial L. Il continue sa propagation dans un second bras que l'on nomme le bras de référence (en dessous du cube sur le schéma de la Figure 6). 30 Dans le bras de référence, le faisceau entre dans un modulateur acoustooptique AOMRef constitué par exemple d'une cellule de Bragg avec un angle d'incidence de 6,95 milliradians. Une onde acoustique de fréquence S2ref = 75 MHz 15 2924805 générée et envoyée dans AOMRef par un synthétiseur S permet d'y générer un réseau de diffraction du faisceau LRef. Ainsi, au passage du faisceau LRef dans AOMRef, la lumière subit un décalage de sa fréquence optique cWopt de +S2ref. L'angle d'incidence du faisceau est alors ajusté à l'angle de Bragg afin de 5 transférer toute l'intensité lumineuse dans l'ordre +1 de diffraction. L'ajustement permet d'obtenir 85% de l'intensité de départ, le reste étant distribué par ordre d'intensité décroissante dans les ordres 0,-1, 2,-2 etc. Cet ajustement est possible par une platine de rotation (non représentée) fixée sous le modulateur AOMRef et nécessite une précision de positionnement supérieure à 0.1 milliradian. 10 A la sortie d'AOMRef, Le faisceau passe par un diaphragme DRef de 2mm diamètre afin d'éliminer tous les faisceaux diffractés excepté l'ordre 1, qui est décalé en fréquence de QRef. Ce faisceau arrive ensuite en incidence normale sur un miroir de référence MRef de qualité optique maximale et d'une planéité de À /20, À étant bien entendu la longueur d'onde du faisceau laser L. 15 Le faisceau LRef réfléchi repasse par le diaphragme DRef et arrive sur le modulateur acousto-optique AOMRef avec le même angle de Bragg qu'à l'aller. Le faisceau est à nouveau diffracté et décalé de +QRef à la sortie du modulateur acousto-optique AOMRef. Ce faisceau est donc décalé en fréquence de 2xQ2ref par rapport au faisceau initial, et se propage sur le même axe optique que celui-ci à la 20 sortie du cube séparateur BS. Il repasse par le cube séparateur sans déviation et arrive sur un photodétecteur optique PD qui présente un diaphragme D2 à son entrée éliminant ainsi tous les ordres diffractés différents de l'ordre 1. Dans le bras de mesure, le faisceau Lies entre dans un modulateur acousto-optique AOMMeSj également de type cellule de Bragg. Une onde 25 acoustique de fréquence QMes=75,05 Mhz générée et envoyée dans AOMMes par le synthétiseur S permet d'y générer un réseau de diffraction du faisceau Lies. Au passage du faisceau Lies dans le modulateur AOMMeSj la lumière subit un décalage de sa fréquence optique cwopt de +WMeS. L'angle d'incidence du faisceau est ajusté à l'angle de Bragg afin de transférer toute l'intensité lumineuse dans 30 l'ordre +1 de diffraction. A nouveau l'ajustement de AOMMes permet d'obtenir 85% de l'intensité de départ, le reste étant distribué par ordre d'intensité décroissante dans les ordre 0,-1, 2, -2 etc. 16 2924805 Cet ajustement est possible par une platine de rotation fixée sous le modulateur et non représentée sur la Figure 6. Ici le principe de sélection de l'ordre 1 est différent de celui du bras de référence, pour des raisons d'encombrement et pour préserver un équilibrage des 5 longueurs des deux bras (mesure et référence). Les faisceaux lumineux diffractés aux différents ordres de Lies passent par un objectif 02 d'un grossissement de 10 fois et un filtre spatial Fs constitué d'un trou de 50 pm de diamètre, placé dans le plan focal image de l'objectif 02. Le filtre Fs permet d'une part de ne garder que l'ordre 1 de diffraction et 10 d'autre part de nettoyer le faisceau Lies par un filtrage spatial. Le faisceau divergent est collimaté par une lentille L2 de focale 100 mm. Le télescope T2 ainsi formé par l'objectif 02 et la lentille L2 permet un agrandissement du diamètre du faisceau Lies d'un facteur 6,06. A l'entrée de l'objectif du microscope OM le diamètre du faisceau de mesure 15 LMeS est ainsi de 19 mm environ. Cette largeur de faisceau permet de recouvrir la pupille d'entrée de l'objectif avec une distribution de l'intensité lumineuse optimisée dans l'exemple présenté pour le fonctionnement du microscope en milieu liquide, afin d'observer notamment des molécules organiques en solution. L'objectif de microscope OM choisi pour un fonctionnement en liquide 20 possède une ouverture numérique de 1.65. Il s'agit d'un objectif particulier qui nécessite l'emploi de lamelles Gs de microscope d'indice de réfraction n=1.78450 à 633 nm, supérieur au verre optique standard. Pour avoir le meilleur ajustement possible entre l'indice des lamelles Gs et celui de l'huile à immersion Hi nécessaire à la réalisation du milieu de couplage du 25 microscope, une huile à immersion Hi telle que l'huile commerciale GEM refractometer liquid n(5893A)=1.81 �0.005 de Cargille Laboratories est de préférence utilisée. Une couche métallique Ms d'or de 45 nanomètres est déposée sur une face externe de la lamelle Gs utilisée afin de permettre la génération d'un plasmon de 30 surface à l'interface de cette couche métallique avec un milieu diélectrique d'observation D. 17 2924805 Dans ces conditions, le faisceau Lies pénétrant dans l'objectif OM est focalisé exactement au niveau de l'interface entre la couche métallique Ms recouvrant la lamelle de verre Gs et le milieu diélectrique d'observation D, choisi en l'espèce pour être un liquide. 5 La lumière Lies après avoir traversé le milieu de couplage est réfléchie par la surface métallique Ms et repasse en sens inverse par l'objectif OM. La position du point de focalisation du faisceau laser de mesure Lies par rapport à la couche d'or Ms étant un paramètre fondamental pour le contraste des images obtenues par le microscope et c'est pourquoi cette position est contrôlée 10 au moyen d'un dispositif de positionnement piézo-électrique avec une résolution de quelques dizaines de nanomètres sur une gamme de 100 pm. L'alignement de l'axe de l'objectif OM avec la normale de la surface de la lamelle Gs est réalisé pour cette raison par un système de positionnement (non représenté sur la figure 6) quatre axes manuels sur l'objectif OM et deux axes 15 manuels contrôlant le support de la lamelle Gs. L'objectif comme la platine sont en outre portés sur deux platines PLI, PLz de déplacement piézoélectrique permettant une précision dans le déplacement selon deux directions X, Y orthogonales dans un même plan et en positionnement supérieure à 10 nm. Ces platines PLI, PLz sont avantageusement commandées 20 par des moyens de pilotage électroniques EC reliés à un ordinateur de commande et de contrôle COMP. Le microscope de l'invention comporte également des moyens piézoélectriques de déplacement de l'objectif OM en translation selon une direction Z normale au plan de chacune des surfaces de la lamelle de verre Gs et de la 25 couche métallique Ms recouvrant l'une d'elle Si l'alignement est correct, le faisceau réfléchi par la couche métallique Ms revient alors par le filtre spatial Fs, l'objectif 02 et l'acousto-optique AOMMeSj pour être mélangé avec le faisceau de référence Lref dans le cube séparateur BS. Ce faisceau est décalé en fréquence de 2xQMes par rapport au faisceau initial. 30 En sortie de l'interféromètre on obtient un faisceau lumineux Lä unique formé de la somme les faisceaux de référence et de mesure LRef, LMes et passe par un diaphragme D2 pour arriver sur un détecteur optique tel que par exemple 18 2924805 un photodétecteur PD. Le signal optique V résultant de la détection du faisceau Lä présente une modulation temporelle à la somme et à la différence des fréquences optiques des deux faisceaux, c'est à dire 2S2mes+2S2ref et 2Qmes-2Qref• Étant donnée la réponse temporelle du détecteur PD seule la composante 5 du signal V dont la fréquence correspond à la différence 2S2mes-2S2ref, dont la valeur vaut 100 kHz dans la configuration choisie est utilisée. Le signal de sortie V du photodétecteur PD est filtré par un filtre approprié (non représenté) est ensuite démodulé par des moyens de détection synchrone Dtec qui reçoivent également le signal de référence de la détection synchrone 10 VRef, issu du mélange en fréquence et du filtrage des deux signaux modulant les acousto-optiques AOMRef et AOMMeS par le mélangeur et filtre passe-bas F. Le signal démodulé Vd est envoyé pour conversion numérique-analogique sur le micro-ordinateur COMP lequel permet alors de former les images. Celles-ci sont construites point par point en balayant la position dans un 15 plan parallèle à celui de la lamelle Gs par rapport à l'objectif OM au moyen des platines PLI, PL2. Le contraste de ces images s'appuie sur la technique de définition de profils V(z), obtenus par un balayage dans la direction Oz (normale à la lamelle Gs) et dont les variations sont fortement corrélées au plasmon de surface. 20 Le balayage se faisant à une position z fixe, il est ainsi possible d'obtenir des images du type de celle de la Figure 4B de particules de quelques dizaines de nanomètres, comme par exemple une particule de Latex de 50 nm de diamètre sur la Figure 4B, avec une résolution de l'ordre de 200 nm. 19 REVENDICATIONS 1. Microscope à plasmon de surface à balayage à haute résolution comportant : a) une source (LG) de lumière cohérente, et b) un milieu de couplage et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif (O, OM) à grande ouverture numérique, une huile à immersion (Hi) et une lamelle de verre (Gs), et c) une couche métallique (Ms) recouvrant une surface de la lamelle de verre (Gs) du milieu de couplage qui n'est pas en en contact avec l'huile d'immersion de ce dernier, la couche métallique étant apte à être mise en contact avec un milieu d'observation (D) contenant un échantillon à observer et à émettre un plasmon de surface généré par excitation d'au moins un faisceau lumineux (L) issu de la source de lumière (LG), et d) un interféromètre apte à diviser un faisceau lumineux émis par la source de lumière en au moins un faisceau de référence (LRef) et au moins un faisceau de mesure(LMeS) dirigé vers le milieu de couplage et la couche métallique (Ms) pour générer un plasmon de surface, l'interféromètre étant positionné entre la source lumineuse et l'objectif du milieu de couplage pour former un faisceau interférométrique (Lv) entre un faisceau de référence et un faisceau de mesure après réflexion de chacun d'eux respectivement par un miroir (M) et par la couche métallique (Ms), et e) des moyens de balayage (PLI, P12, EC)de la couche métallique à l'aide du faisceau lumineux de mesure, et f) des moyens de détection (PD) du faisceau interférométrique issu de l'interféromètre, et g) des moyens de traitement (S, F, DTec, COMP) et de formation d'une image à partir du faisceau interférométrique, caractérisé en ce qu'il comporte, disposé entre la source lumineuse et l'interféromètre, au moins un convertisseur de polarisation linéaire en polarisation radiale (CP) des faisceaux lumineux (L) émis par la source lumineuse (LG). 20 2924805 2. Microscope selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'interféromètre est un interféromètre de Twyman-Green en mode hétérodyne dont un premier bras, dit de référence, comporte un miroir (MRef) de réflexion du faisceau lumineux de référence (LRef) et un second bras, dit de mesure, dans 5 lequel se propage le faisceau de mesure (LieS) comporte le milieu de couplage (O, OM ; Hi ; Ms) et la couche métallique (Ms) recouvrant une surface de la lame de verre (Gs) de ce dernier. 3. Microscope selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que chaque bras de l'interféromètre comporte au moins un modulateur acousto-optique 10 (AOMRef, AOMMes) apte à introduire un décalage de la fréquence optique du faisceau lumineux de référence (LRef) et du faisceau de mesure (Lies) respectivement. 4. Microscope selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les moyens de détection (PD) du faisceau interférométrique (Lv) comportent au 15 moins un des éléments du groupe suivant : photomultiplicateur, caméra CCD, compteur de photons, photodiode à avalanche. 5. Microscope selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un agrandisseur de faisceau (BE) placé entre la source de lumière (LG) et l'interféromètre et entre l'interféromètre et le milieu de couplage 20 (0, OM ; Hi ; Ms). 6. Microscope selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu d'observation (D) est un milieu diélectrique dont l'indice de réfraction est inférieur à 1,5. 7. Microscope selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que 25 l'objectif (O, OM) du milieu de couplage présente une ouverture numérique supérieure ou égale à 1.2 dans l'air et à 1.55 dans une solution aqueuse et un grossissement supérieur à soixante fois. 8. Microscope selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les moyens de balayage de la couche métallique (Ms) à l'aide du faisceau 30 lumineux de mesure (Lies) comportent des moyens piézoélectriques de déplacement en translation (PLI, PL2) de la lamelle (GS) et/ou de l'objectif (0, 21 2924805 OM) du milieu de couplage selon deux directions X, Y orthogonales dans un même plan. 9. Microscope selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens piézoélectriques de déplacement de l'objectif (O, OM) en 5 translation selon une direction Z normale au plan de chacune des surfaces de la lamelle de verre (Gs) et de la couche métallique (Ms) recouvrant l'une d'elle. 10. Microscope selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la source de lumière cohérente (LG) est une source de type L.A.S.E.R., et notamment un laser à gaz hélium-néon (He-Ne). 10