FR 2924118 A1 20090529 FR 0708189 A 20071122 � Fragments d'anticorps inhibiteurs de la protéine Nef du VIH� L'invention se rapporte à des fragments d'anticorps simple domaine (sdAb) capables d'inhiber la protéine Nef du VIH et à leurs applications immunologiques, plus particulièrement en immunothérapie pour le traitement du SIDA. La spécificité de reconnaissance des anticorps pour atteindre une cible déterminée a été exploitée pour le diagnostic et la thérapie de différentes pathologies, et tout particulièrement dans le cas du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA), où la cible peut être une protéine des virus (le l'immunodéficience humaine de type 1 ou 2 (VIH-1 et VIH-2). Dans le cadre de la recherche d'anticorps candidats pour neutraliser une protéine des VIH, les inventeurs ont orienté leurs travaux vers des anticorps particuliers, dépourvus de chaîne légère, identifiés chez les camélidés (chameau, dromadaire, lama) (Hamers-Casterman et al., 1993). Des domaines variables d'anticorps simple chaîne lourde de camélidés (VHH), reconnaissant spécifiquement un type d'antigène, ont été sélectionnés à partir d'un animal immunisé et ont été produits à partir de constructions plasmidiques. Comme montré dans les exemples, ces fragments d'anticorps se sont avérés capables de cibler spécifiquement des régions de la protéine Nef (facteur de régulation négative) du VIH impliquées dans le développement du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA). L'invention a donc pour but de fournir des fragments d'anticorps simple chaîne lourde (encore appelés sdAbs pour anticorps simple domaine), ayant les propriétés de reconnaissance de cibles et d'épitopes recherchés. Elle a également pour but de fournir un procédé de production de ces fragments d'anticorps. Selon encore un autre aspect, l'invention vise leurs applications immunothérapeutiques. Les fragments sdAbs de l'invention sont caractérisés en ce qu'il s'agit de fragments antiprotéine Nef du VIH correspondant à tout ou partie des domaines VHH de camélidés, notamment de lamas. Selon un aspect de grand intérêt, ces fragments présentent une grande stabilité et peuvent être obtenus en quantités élevées sous des formes solubles dans des bactéries, des levures ou tout autre système de production à partir de cellules procaryotes ou eucaryotes. Leur stabilité élevée leur permet d'acquérir et de conserver un repliement correct et donc de rester solubles même dans des conditions ne permettant pas la formation de ponts Bisulfure, comme le cytoplasme des bactéries ou des cellules eucaryotes. L'invention vise en particulier les fragments d'anticorps anti-Nef présentant une séquence en acides aminés telle que codée par une séquence en nucléotides choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID N° 1 à 6. L'invention vise ainsi plus spécialement les fragments d'anticorps anti-Nef présentant une séquence en acides aminés choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID N° 7 à 12. L'invention vise aussi les CDRs de ces fragments sdAbs. Les acides nucléiques capables de coder pour lesdits fragments entrent également dans le champ de l'invention. L'invention vise en particulier, en tant que nouveaux produits, les acides 20 nucléiques correspondant aux séquences SEQ ID N° 1 à 6. L'invention vise également un procédé de production des fragments d'anticorps anti-Nef définis ci-dessus. 25 Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : l'immunisation de camélidés, notamment de lamas avec, comme immunogène, la protéine Nef, la purification des lymphocytes B récupérés à partir du sang, 30 - la construction de banque de VHH, et - l'isolement des fragments sdAbs à partir de la banque et leur purification. Plus spécifiquement, la protéine Nef utilisée pour l'immunisation est dépourvue de ses 56 premiers acides aminés. 20 25 La construction de la banque comprend avantageusement : - l'extraction des ARN totaux des lymphocytes B, - la transcription inverse des ARN pour obtenir les ADNc correspondants, - l'amplification par PCR des gènes codant pour les régions variables des anticorps simple chaîne lourde anti-Nef, la ligation de fragments d'ADN VHH, obtenus par coupure par des enzymes des ADN amplifiés, avec un phagemide. De préférence, les sdAbs sont isolés à partir des banques par la technique de phage display et purifiés. Les différents sdAbs obtenus ont été validés en termes de spécificité et d'affinité comme illustré par les exemples. Conformément à l'invention, les gènes des sdAbs sélectionnés ont ensuite été introduits dans des vecteurs d'expression, notamment des plasmides, pour produire différents sdAbs anti-Nef capables de se lier à Nef dans des cellules infectées par le VIH. Ces vecteurs d'expression constituent également des produits nouveaux et sont donc aussi visés par l'invention. L'invention vise plus spécialement des vecteurs d'expression, notamment des plasmides, renfermant entre deux sites uniques d'enzymes de restriction les promoteurs, les séquences signal, les séquences nucléotidiques capables de coder pour les fragments sdAbs définis ci-dessus, ou les régions CDRs des sdAbs. Ces vecteurs, notamment ces plasmides sont capables d'exprimer les fragments de l'invention en quantités élevées, sous formes solubles, par exemple dans des bactéries. L'invention vise ainsi les plasmides pET14bNef13, pET14bNefW12, pET14bNefWV10, 30 pHen6HisGS, pHenPhoA6His, pHen-sdAb Nef1, pHen-sdAb Nef2, pHen-sdAb Nef5, pHensdAb Nefl2, pHen-sdAb Nef19, pHen-sdAb Nef2O, pET-sdAb Nef1, pET-sdAb Nef2, pET-sdAb Nef5, pET-sdAb Nef12, pET-sdAb Nefl9, pET-sdAb Nef2O, pcDNA-sdAb Nef19 de séquences, respectivement, SEQ ID N°13 à 30. Les gènes codant pour les sdAbs sont introduits entre des sites uniques d'enzyme de restriction dans les différents plasmides. Les plasmides selon l'invention sont capables d'exprimer en quantités élevées les sdAbs définis ci-dessus, sous des formes solubles, par exemple dans des bactéries. Les régions codant pour les sdAbs peuvent être facilement transférées dans d'autres systèmes d'expression procaryotes ou encore eucaryotes ou encore transférées dans des plasmides destinés à être transfectés dans des cellules eucaryotes. L'identification conformément à l'invention d'une nouvelle cible d'intervention, représentée par une inhibition directe des fonctions de la protéine virale Nef au cours de l'infection naturelle par les VIH, constitue une approche originale pour le développement de molécules antivirales capables de perturber la réplication des VIH dans la cellule cible, mais également d'améliorer la réponse immunitaire des patients infectés. L'invention vise donc la mise à profit des propriétés immunologiques des fragments d'anticorps en immunothérapie. Dans un premier mode de réalisation, l'invention vise plus spécialement les fragments d'anticorps définis ci-dessus, le cas échéant vectorisés, pour une utilisation comme médicaments. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont alors, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins un fragment sdAb tel que défini ci-dessus en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention, ces compositions sont utilisables comme médicaments antiviraux. Dans cette application, les fragments sdAbs sont vectorisés afin de traverser la membrane cellulaire et d'être libérés au sein de la cellule infectée. Le vecteur, par exemple une séquence peptidique, peut être conjugué à la séquence des fragments. 30 En variante, le vecteur est combiné aux fragments sdAbs et correspond par exemple à des composés lipidiques. Selon un autre mode de mise en oeuvre, les compositions pharmaceutiques de l'invention sont 5 utilisées en immunothérapie afin d'inhiber les molécules Nef relarguées dans le milieu plasmatique. Les compositions pharmaceutiques ci-dessus se présentent avantageusement sous des formes appropriées pour une administration par voie orale ou injectable. Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise un médicament de thérapie génique constitué par un vecteur de transfection comportant un acide nucléique tel que défini ci-dessus codant pour un fragment sdAb de l'invention. 15 Des vecteurs utilisables à des fins de thérapie génique comprennent les adénovirus, des virus associés à des adénovirus (AA), des rétrovirus. Ces médicaments sont utilisés pour une immunisation intracellulaire par transfection des cellules infectées. 20 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 10, qui représentent, respectivement, - la figure 1, (A) les courbes de titration des phages-sdAb Nef1, Nef2, Nef5 et Nef19 sur la protéine Nef adsorbée dans les puits d'une microplaque et (B) les courbes de compétition de la 25 liaison des phages-sdAb Nef5 et Nef19 sur la protéine Nef W10 adsorbée dans les puits d'une microplaque par la protéine Nef W10 soluble, - la figure 2, un gel SDS-PAGE présentant les fractions de la protéine sdAb Nef19 purifiée sur TALON, - la figure 3, (A) les courbes de titration des sdAb Nef5 et Nef19 sur la protéine Nef W10 30 adsorbée dans les puits d'une microplaque, (B) la courbe de titration du sdAb Nef5 après amplification du signal et (C) la courbe de compétition de la liaison du sdAb Nef19 sur la protéine Nef W10 adsorbée dans les puits d'une microplaque par la protéine Nef W10 soluble, - la figure 4, le tableau des constantes d'affinités du sdAb Nef19 obtenues par Biacore, 10 - la figure 5, la co-localisation analysée par immunofluorescence du sdAb Nef19 avec la protéine Nef dans des cellules HeLa, - la figure 6, (A) l'analyse par cytométrie de flux de l'inhibition par le sdAb Nef19 de l'effet de Nef sur le niveau d'expression de CD4 à la surface de cellules T HPB-ALL et (B) l'analyse par cytométrie de flux de l'inhibition par le sdAb Nef19 de l'effet de Nef sur le niveau d'expression de CD4 à la surface de cellules HeLa, - la figure 7, (A) l'analyse par cytométrie de flux de l'inhibition par le sdAb Nef19 de la capacité de Nef à interagir avec la machinerie cellulaire de la voie d'endocytose lorsqu'il est exprimé sous la forme d'une fusion CD8-Nef dans des cellules HeLa et (B) l'analyse par immunofluorescence de l'inhibition par le sdAb Nef19 de la capacité de Nef à interagir avec la machinerie cellulaire de la voie d'endocytose lorsqu'il est exprimé sous la forme d'une fusion CD8-Nef dans des cellules HeLa, - la figure 8, l'analyse par des expériences de co-immunoprécipitation de l'interaction du sdAb Nef19 avec la protéine Nef dans des cellules 293T, - la figure 9, l'analyse de l'inhibition par le sdAb Nef19 du pouvoir infectieux du VIH-1 au cours d'un cycle unique de réplication mesurée sur des cellules (A) HeLa-CD4 et (B) T HPBALL, - la figure 10, l'analyse de l'incorporation du sdAb Nef19 dans des particules virales. Exemple 1 : Construction des différents vecteurs d'expression pour produire les protéines recombinantes Nef tronquées chez E. coli et pour la sélection des sdAbs à partir de banques de phage-sdAB. a - Clonage de différentes versions de la protéine Nef dans pET14b pour leur production chez E. coli . al - Obtention du clone Nef 13 Oligonucléotides utilisés : 5' Nef-Ncol-pET SEQ ID N°34 : CTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCAYCAYCAYCAYCAYCAYGGNTCNGAA G CACAAGAGGAGGAGGAG 3' Nef-Blpl-pET SEQ ID N°35 : GGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGTTCTTGAAGTACTCCGGATG Conditions de PCR : Un pl (5 ng) de plasmide pNef-GST (gène codant pour les acides aminés 57 à 205 de la protéine Nef introduit dans le plasmide pGEX-2T, (GE Healthcare)), 5 �l de Tp 10X Deep-Vent, 1 �1 de MgSO4 100 mM, 4 tl mix dNTP 2,5 mM, 10 �M de chaque oligonucléotide (5' Nef-Nco-pET et 3' Nef-Blpl-pET), 0,5 U de Deep Vent, en 50 �l final (94°C 3 min ; 94°C 1 min ;55°C lmin ; 72°C 1 min, 30 cycles puis 72°C 10 min). Les produits de PCR sont purifés à partir de gel d'agarose 2% (gel extraction kit Qiagen, volume final 30 pi). Clonage du fragment de PCR dans le plasmide pET14b : Couper 20 �l du fragment de PCR et 54 (2,5 �g) du vecteur pET14b (Novagen) avec 10U de Nco I et Blp I pendant 16H à 37°C. Les enzymes sont inactivées 10 min à 65°C. Chaque ADN est ensuite précipité et repris avec 20 �l d'H2O. La ligature est réalisée avec 5�l du fragment, 0,5 �l du vecteur et 3 U Weiss de T4 DNA lipase (Biolabs) dans un volume final de 10 pendant 2H à température ambiante. Des bactéries BL21(DE3) compétentes (technique CaCl2) sont transformées avec 5�l du produit de ligature. On obtient ainsi le plasmide pET14bNef13, dont la séquence nucléotidique est donnée en annexe (SEQ ID N°13), qui permet la production du clone Nef 13 dont la séquence en acides aminés est donnée en annexe (SEQ ID N°31). . a2 -Obtention du clone Nef W12 Oligonucléotides utilisés : 5'Nef.Ncol.W SEQ ID N°36 : CTITAAGAAGGAGATATACCATGGGCCACCACCATCATCATCACGGATCCGCCTG GCTAGAAGCACAAGAGGAGGAGGAG 3' Nef-Blpl-pET SEQ ID N°37 : GGGGTTATGCTAGTTAYTGCTCAGCGTTC TGAAGTACTCCGGATG Conditions PCR sur pET14bNef13 : Un �l (5 ng) de plasmide pET14bNef13 , 10 �M de chaque oligonucléotide (5' Nef.Nco.W et 3' Nef-Blpl-pET), 0,5 U de Dynazyme (94°C 3 min ; 94°C 1 min ; 55°C lmin ; 72°C 1 min, 30 cycles puis 72°C 10 min). Les produits de PCR sont purifiés à partir de gel d'agarose 2% (gel extraction kit Qiagen, volume final 50 �l). Clonage du fragment de PCR dans le plasmide pET14b : 20 �l du fragment de PCR et 50 (2,5 �g) du vecteur pET14b sont coupés avec 10U de Nco I et Blp I pendant 16H à 37°C. Les enzymes sont inactivées 10 min à 65°C. Chaque ADN est ensuite précipité et le culot est repris avec 20 �l d'H20. La ligature est réalisée avec 5 �l du fragment, 0,5 �l du vecteur et 3 U Weiss de T4 DNA ligase (Biolabs) dans un volume final de 10 �l pendant 2H à température ambiante. Des bactéries BL21(DE3) compétentes (technique CaC12) sont transformées avec 5 �l du produit de ligature. On obtient ainsi le plasmide pET14bNefW12, dont la séquence nucléotidique est donnée en annexe (SEQ ID N°14), qui permet la production du clone Nef W12 dont la séquence en acides aminés est donnée en SEQ ID N°32. . a3 -Obtention du clone Nef W10 Oligonucléotides utilisés : 5'Nef/pET SEQ ID N°38 : TTAAGAAGGAGATATACCATGGGCTGGCTNGARGCNCARGARGAGGAGGAGGT GGGT 3'Nef/pJF-pET SEQ ID N°39 : GGGGTTATGCTAGTTAGCTCAGCAAGCTTAGGATCCGTGATGATGATGGTGGTG TGCGGCCGCGTTCTTGAAGTACTCCGGATG Conditions PCR sur pET14bNef13 : Un �i (5 ng) de plasmide pET14bNef13 , 5 �l de Tp 10X Dynazyme, 4 �l de mix dNTP 2,5 mM, 10 �M de chaque oligonucléotide (5' Nef.Nco.W et 3' Nef-Blpl-pET), 0,5 U de Dynazyme , dans 50 111 final (94°C 3 min ; 94°C 1 min ; 55°C lmin ; 72°C 1 min, 30 cycles puis 72°C 10 min). Les produits de PCR sont purifiés à partir de gel d'agarose 2% (gel extraction kit Qiagen, volume final 50 �l). Clonage du fragment de PCR dans le plasmide pET14b : 20 111 du fragment de PCR et 5111 (2,5 �g) du vecteur pET14b sont coupés avec 10U de Nco I et Blp I pendant 16H à 37°C. Les enzymes sont inactivées 10 min à 65°C. Chaque ADN est ensuite précipité et repris avec 20 d'HPO. La ligature est réalisée avec 5�l du fragment, 0,5 �l du vecteur et 3 U Weiss de T4 DNA ligase (Biolabs) dans un volume final de 10 �l pendant 2H à température ambiante. Des bactéries BL21(DE3) compétentes (technique CaC12) sont transformées avec 5�l du produit de ligature. On obtient ainsi le plasmide pET14bNefW10, dont la séquence nucléotidique est donnée en annexe (SEQ ID N°15), qui permet la production du clone Nef W10 dont la séquence en acides aminés est donnée en annexe (SEQ ID N°33). Tous les gènes codant pour les différentes versions de Nef insérés dans les plasmides de type pET14b ont été vérifiés par séquençage sur ABI 310 avec des oligonucléotides internes à Nef : 5' Int.Nef SEQ ID N°40 : CACACAAGGCTACTTCCC 3' Int.Nef SEQ ID N°41 : CAACTGGTACTAGC'I GTAG b -Construction des phagemides pHen6HisGS et pHen6HisPhoA pour la construction des banques . b1 - Obtention du phagemide pHen6HisGS Insertion du motif 6HisGlySer en aval de la séquence codant pour l'étiquette c-myc du phagemide pHen1 (Hoogenboom et al, 1991) par PCR de chevauchement. Oligonucléotides utilisés :30 Sup-6HisGS/P3 SEQ ID N°42 : 5' CATCACCACCATCACCATGGGAGCTAGACTGTFGAAAGTTGTTTAGCAAAACC Inf-6HisGS/cmyc SEQ ID N°43 : 5' GCTCCCATGGTGATGGTGGTGATGTGCGGCCCCATTCAGATCCTC Amont-Hind3 SEQ ID N°44 : 5' AACAGCTATGACCATG Aval-Bsm1 SEQ ID N°45 : 5' GCAAGCCCAATAGGAACCC Conditions des PCR1 et PCR2 : Un d pHen1 à 50 ng/�l, 101.11 Tp 10X Dynazyme (Biolabs), 2 �l mix dNTP à 100 nM, 2�l oligonucléotide 5' à 10 pmoles/�l, 2 �l oligonucléotide 3' à 10 pmoles/.l (Couples d'amorces utilisés : PCR 1, Amont-Hindi et Inf-6HisGS/cmyc ; PCR 2 : Sup-6HisGS/P3 et Aval-Bsml), 0,7 �l de Taq polymérase Dynazyme (Biolabs), 82 �l H20. Programme de PCR utilisé : 95°C, 3 min ; 95°C, 45 s ; 50°C, 45 s ; 72°C, 45 s ; 72°C, 3 min ; 30 cycles. La taille des fragments des PCR1 et PCR2 est vérifiée sur gel d'agarose 1 % puis les fragments sont purifiés à l'aide du kit �Qiaquick gel extraction � (Qiagen). Ces 2 fragments sont ensuite utilisés pour la PCR3 de chevauchement. Conditions de PCR 3 : 0,75 �l de chaque produit des PCR1 et PCR2, 10 tl Tp 10X Dynazyme (Biolabs), 2�l mix dNTP à 100 nM, 2 �l oligonucléotide Amont-Hind3 à 10 pmoles/�l, 2 �l oligonucléotide Aval-Bsmlà 10 pmoles/�l, 0,7 �l de Taq polymérase Dynazyme (Biolabs), 82 �l H2O. Programme de PCR utilisé : 95°C, 3 min ; 95°C, 45 s ; 50°C, 45 s ; 72°C, 45 s ; 72°C, 3 min ; 30 cycles. La taille du fragment de la PCR3 est vérifiée sur gel d'agarose 1 % puis les fragments sont purifiés à l'aide du kit � Qiaquick gel extraction � (Qiagen). Ce fragment est ensuite utilisé pour le clonage. 15 20 L'analyse du produit de PCR3 sur gel d'agarose 1 % est conforme à ce qui est attendu (424 pb). Ce fragment été purifié à l'aide du kit � Qiaquick gel extraction � (Qiagen) pour ensuite être cloné. Clonage : Le produit de PCR3 est purifié et coupé dans un volume de 50 �l avec 20 unités d'enzyme de restriction HindlIl en présence de BSA, à 37°C, 4 h. Vingt unités de l'enzyme de restriction BsmI sont ensuite ajoutées, l'échantillon est incubé à 65°C, 4 h. L'enzyme BsmI est dénaturée à 80°C durant 20 min. Dix �g de pHen1 sont coupés dans un volume de 50 �l avec 20 unités de l'enzyme de restriction HindIIl en présence de BSA, à 37°C, 4 h. Vingt unités de l'enzyme de restriction BsmI sont ensuite ajoutées, l'échantillon est incubé à 65°C, 4 h. L'enzyme BsmI est dénaturée à 80°C durant 20 min. Les produits de coupure sont analysés sur gel d'agarose 0, 7 % afin de contrôler la coupure. Le produit de PCR3 et le pHen1 coupés par HindIII et BsmI sont purifiés sur gel 0,7 °,o à l'aide du kit � Qiaquick gel extraction � (Qiagen). Le fragment de PCR est alors cloné dans le phagemide pHen1 entre les sites HindlIl et Bsml (rapport molaire ADN insert / phagemide, 1/5 ; 2000 unités de T4 DNA ligase (Biolabs) ; 2 h à 20°C). La ligase est dénaturée à 65°C, durant 15 min. 25 Des bactéries TG1 compétentes sont transformées avec 10 �l de produit de ligature. Une préparation du phagemide a ensuite été réalisée à partir d'une colonie isolée et le séquençage a été réalisé. L'expression de la protéine p3 du pHen6HisGS a été vérifiée par Western blot en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine p3. La séquence s'est avérée conforme à ce qui était attendu. La séquence nucléotidique du pHen6HisGS est donnée en annexe (SEQ ID 30 N°16). . b2 - Obtention du phagemide pHenPhoA6His Le nouveau vecteur pHen6HisGS peut être directement utilisé pour la construction de la banque naïve. Il est avantageux de l'améliorer pour faciliter l'évaluation de l'efficacité des clonages. En effet, l'isolement de VHH (ou sdAb) de bonne spécificité et en grand nombre nécessite d'obtenir des banques de grande diversité. Une très bonne efficacité de clonage est donc nécessaire pendant la construction des banques. Le gène phoA codant pour la phosphatase alcaline est inséré dans le phagemide pHen6HisGS en amont du gène codant pour l'étiquette c-myc. Ce gène introduit dans la bonne phase de lecture, permet la synthèse d'une protéine de fusion � PhoA-cmyc-6HisGS-p3 � possédant l'activité phosphatase. Une sélection colorimétrique permet ainsi de distinguer les vecteurs refermés sur eux-mêmes (colonies bleues) des vecteurs ayant inséré, à la place du gène de la PhoA, les gènes codant pour les VHH ou sdAb (colonies blanches). Dans un premier temps, la séquence codant pour la PhoA a été amplifiée, à partir du plasmide p55PhoA6HisGS/NAB- (Baty et al., Brevet CNRS/INSERM WO/2006/064136) avec des amorces spécifiques permettant le clonage dans le phagemide pHen6HisGS. Oligonucléotides utilisés : 5' PhoA/pHen SEQ ID N°46 : 5' GGATTGZ TATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCCGATCCTCGAGAGCT CCCG 3' PhoA/pHen SEQ ID N°47 : 5' GAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTTTCAGCCCCAGAGCGGCTTTC Conditions de PCR : Un �l p55PhoA6HisGS/NAB- à 50 ng/�, 10 �l Tp 10X Dynazyme (Biolabs), 2 �l mix dNTP à 100 nM, 2 pl oligonucléotide 5' PhoA/pHen à 10 pmoles/�l, 2 pl oligonucléotide 3' PhoA/pHen à 10 pmoles/�l, 0,7 pl de Taq polymérase Dynazyme (Biolabs), 82 pl H2O. Programme PCR utilisé : 95°C, 3 min ; 95°C, 1 min ; 60°C, 1 min, 72°C, 1 min ; 72°C, 10 min ; 35 cycles. Le produit de PCR est analysé sur gel d'agarose 1 %. Le produit PCR purifié à l'aide du kit Qiaquick gel extraction � (Qiagen) est coupé dans un volume de 50 �l avec 20 unités de l'enzyme de restriction SfiI en présence de BSA, à 50°C, 16 h. Vingt unités de l'enzyme de restriction Notl sont ensuite ajoutées, l'échantillon est incubé à 37°C, 4 h. Dix �g de pHen6HisGS sont coupés dans un volume de 50 �l avec 20 unités de l'enzyme de restriction Sfil en présence de BSA, à 50°C, 4 h. Vingt unités de l'enzyme de restriction Notl sont ensuite ajoutées, l'échantillon est incubé à 37°C, 4 h. Le produit de PCR et le pHen6HisGS coupés par SfiI et Notl sont purifiés sur gel 0,7 °''o à l'aide du kit � Qiaquick gel extraction � (Qiagen). Clonage : Le fragment de PCR est alors cloné dans le phagemide pHen6HisGS entre les sites SfiI et Notl (rapport molaire ADN insert / phagemide, 1/1 ; 1000 unités de T4 DNA ligase (Biolabs); 2 h à 20°C). La ligase est dénaturée à 65°C, durant 15 min. Des bactéries TGI compétentes sont transformées avec 10 �l de produit de ligature, puis étalées sur milieu LB / ampicilline 100 �g/ml / BCIP 30 tg/ml. Une préparation du phagernide a ensuite été réalisée à partir d'une colonie bleue. L'expression 25 de la protéine fusion PhoA-cmyc-6HisGS-p3 a été vérifiée ainsi que l'efficacité du phagemide pour l'infection. La séquence nucléotidique du phagemide pHenPhoA6His est donnée en annexe (SEQ ID N°17). c - Immunisation des lamas et purification des lymphocytes B Un lama mâle a été immunisé avec la région 57 à 205 de la protéine recombinante Nef (Nef57-205) du VIH-1. 20 30 L'animal a été immunisé tous les mois, pendant 3 mois, avec 500 �g de Nef57-205. Cent ml de sang ont été prélevés 15 jours après chaque immunisation. Pour chacun des échantillons prélevés, une titration des sérums et des anticorps purifiés (IgGI, 2 et 3) a été réalisée pour détecter la présence d'anticorps contre l'immunogène Nef57-205. Les lymphocytes B ont ensuite été purifiés sur gradient de Ficoll (histopaque-1077, Sigma-Aldrich), puis lavés 2 fois avec du PBS. d -Construction des banques de phage-sdAb : purification des ARN totaux, transcription inverse, PCR1, PCR2 et clonage dans les phagemides pHen6HisGS et pHenPhoA6His . dl - Purification des ARN totaux Les ARN totaux des lymphocytes B sont extraits selon la méthode utilisant l'isothiocyanate de guanidium (Chomczynski et Sacchi, 1987). Après des extractions phénol/chloroforme en milieu 15 acide, les ARN totaux sont précipités à l'éthanol. La qualité des ARN et leur quantification sont évaluées sur gel d'agarose 1%. Ils sont ensuite convertis en ADNc par transcription inverse. . d2 - Transcription inverse et PCRs 20 Oligonucléotides utilisés : 3' CH2FORTA4 SEQ ID N°48 : CGCCATCAAGGTACCAGTFGA 3'CH2-2 25 SEQ ID N°49 : GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC 3' RC-IgG2 SEQ ID N°50 : GGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG 30 3' RC-IgG3 SEQ ID N°51 : TGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT 5'VH1-Sfi SEQ ID N°52 :10 CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTC TGG 5'VH2-Sfi SEQ ID N°53 : CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCACC"ITGA AGGAGTC TGG 5'VH3-Sfi SEQ ID N°54 : CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC TGG 5'VH4-Sfi SEQ ID N°55 : CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC GGG 3'VHH-Not SEQ ID N°56 : CACGATTCTGCGGCCGCTGAGGAGAC(AG)GTGACCTGGGTCC Cinq �g d'ARN total sont hybridés avec 1 pmole d'oligonucléotide 3' CH2FORTA4 (Arbabi Ghahroudi et al., 1997) ou CH2-2 spécifique du domaine CH2 des IgG simple chaîne lourde de lama rétrotranscrits avec 150 U de superscript II (BRL) pendant 30 min à 50°C. Les oligonucléotides spécifiques des régions charnières des IgG 2 et 3, 3' RC-IgG2 et 3' RC-IgG3, peuvent aussi être utilisées. Les ADNc simples brins sont purifiés sur billes (BioMagR Carboxvl Terminator, Polyscience Inc) et élués avec 17 �l de 10 mM Tris-acétate pH 7,8. . d3 ù PCR1, PCR2 . Conditions de PCR1 : Quatre �l d'ADNc sont amplifiés par PCR avec 0,5 U de Dynazyme Extend DNA polymerase (Finnzymes), 10 pmoles de la même amorce 3' CH2FORTA4 ou CH2-2 et 10 pmoles des 4 amorces 5'VH1-4 Sfi spécifiques du domaine VH des IgG humaines, dans un volume de 50 �l. (94°C, 3 min; 94°C, 1 min; 60°C, 1 min; 72°C, Imin ; 37 cycles, puis 72°C, 10 min). Trois fragments d'ADN sont amplifiés : un fragment d'environ 900 pb codant pour les domaines VH-CH1-CH2 des IgG1 ; et 2 fragments d'environ 600 bp codant pour les domaines VHH-CH2 des IgG2 et 3. . Conditions de PCR2 : Les fragments de 600 pb sont purifiés sur gel d'agarose 1% ( kit � Qiaquick gel extraction �, Qiagen) puis amplifiés par PCR avec 1 U de Deep Vent (Biolabs) et 10 pmoles des 4 amorces 5'VHI-4 Sfi spécifiques du domaine VH des IgG humaines et 10 pmoles de l'amorce 3' VHHNotl. (94°C, 3 min; 94°C, 45 sec; 65°C, 45 sec; 72°C, 45 sec ; 15 cycles, puis, 94°C, 45 sec; 60°C, 45 sec; 72°C, 45 sec ; 15 autres cycles, puis 72°C, 10 min). Les fragments d'environ 400 pb codant pour les VHH sont purifiés sur gel d'agarose 1% ( kit � Qiaquick gel extraction �, Qiagen) rassemblés et précipités par l'éthanol. Ils sont ensuite coupés par les enzymes de restriction Ncol et Notl, ou Bgll et Notl (Biolabs) pour être clonés dans le phagemide pHenl6hisPhoA aux sites Ncol et Notl ou SfiI et Notl. . d4 û Clonage dans les phagemides Préparation du phagemide pHen6HisGS (ou pHen6HisPhoA pour la banque "naïve") : Vingt �g de phagemide pHen6HisGS sont coupés dans un volume de 300 �l avec 50 U de SfiI en présence de BSA, à 50°C, 16 h ; ou avec 50 U de Ncol en présence de BSA, à 37°C, 16 h. Le phagemide linéarisé est purifié sur gel d'agarose 0,7% (kit � Qiaquick gel extraction �, Qiagen). L'ADN élué est ensuite coupé par 50 U de Notl à 37°C dans un volume de 200 �l, 16 h . L'enzyme est détruite par la chaleur 15 min à 65°C et l'ADN est extrait au phénol/chloroforme et précipité à l'éthanol. Le pHen6HisGS coupé est contrôlé sur gel d'agarose 0,7°/0, quantifié et ajusté à 200 ng/�l. . Préparation des fragments d'ADN codant pour les sdAb : Cinq �g de fragments VHH sont coupés dans un volume de 300 d avec 50 U de Bg1I et Notl en présence de BSA, à 37°C, 16 h ; ou avec 50 U de Ncol et Notl en présence de BSA, à 37°C, 16 h. Les enzymes sont dénaturées à 65°C, 15 min ; puis les ADN sont extraits au phénol/chloroforme et précipités à l'éthanol en présence de 10 �g de glycogène (Roche). Les fragments VHH coupés par Ncol et Notl sont purifiés sur gel d'agarose 1%, puis contrôlés sur gel d'agarose 2%, quantifiés et ajustés à 100 ng/pl. . Ligature : Cent cinquante ng de pHen6HisGS sont coupés par SfiI et Notl sont ligaturés avec 60 ng de fragment VHH coupé par Bgll et Notl dans un volume de 20 pl avec 2000 U de T4 DNA ligase (Biolabs) à 16°C, 17 h. La ligase est inactivée à 65°C, 15 min, et le produit de ligature est coupé par 20 U de Xhol (Biolabs) pour éliminer le vecteur résiduel non ligaturé, 37°C, 4 h. Six ligatures sont ainsi réalisées. Les produits de ligature sont ensuite rassemblés en 2 tubes et extraits au phénol/chloroforme, précipités en présence de 10 pg de glycogène et repris dans 2 x 18 pl H2O ultrapure. Deux d sont utilisés par électroporation. Les colonies de différentes électroporations sont rassemblées. La banque de phage-sdAb du lama mâle représente 4,1 104 clones. e - Construction de la banque de phage-sdAb dite "naïve" à partir de lamas non-immunisés La construction de la banque a été réalisée exactement comme décrit pour la banque immune avec les modifications suivantes : - le phagemide utilisé est le pHenPhoA6His - le sang (environ 2400 ml) a été prélevé à partir d'une soixantaine de lamas non-immunisés provenant de 4 élevages différents. La banque de phage-sdAb "naïve" représente 3 107 clones. f - Sélection des sdAbs à partir des banques par la technique de phage- display Les différents sdAbs ont été isolés par la technique du phage-display (Smith, 1985 ; Hoogenboom et al., 1991) quelle que soit la banque utilisée. . f1 -Production de la banque de phages : Dix pl du stock de la banque (cellules TGI transformées avec les phagemides) sont inoculés dans 50 ml de (2TY, 100 pg/ml d'ampicilline, 2% glucose) et incubés à 37°C jusqu'à une D0600 égale à 0,5. Cinq ml de la culture sont alors infectés avec 5 ml de h113KO7 à 10'3 pfu/ml et incubés 30 min à 37°C sans agitation. Après centrifugation, le culot de phages est repris dans 25 ml de (2TY, 100 �g/ml d'ampicilline, 25 .ig/ml kanamycine). La culture est incubée 16 h à 30°C avec agitation. Les phages sont ensuite précipités avec 1/5 vol de 2,5 M NaCl / 20% PEG 6000 et concentrés 25 fois dans du PBS. . f2 - Sélection des sdAbs : Deux cents �l de billes recouvertes de streptavidine (Dynabeads M-280, Dynal) sont équilibrés avec 1 ml de lait 2%/PBS pendant 45 min à température ambiante avec agitation sur une roue. 10'2 phages de la production précédemment décrite sont aussi équilibrés avec du lait 2°/i-PBS dans un volume final de 500 �l pendant 60 min à température ambiante avec agitation sur une roue. Les billes sont compactées avec un aimant, mises en suspension dans 250 �l de lait 2%/PBS et incubées avec 200 pl d'antigène biotinylé pendant 30 min à température ambiante sur une roue. 150, 75 et 25 nM final d'antigène biotinylé sont utilisés au 1er, 2ème et Sème tour, respectivement. Aux 450 pl de billes/antigène-biotine, on rajoute les 500 �l de phages pendant 3 h à température ambiante avec agitation sur une roue. Le mélange billes / antigène-biotine / phages est lavé 5 fois avec 800 �l de lait 4%-PBS, puis transféré dans un nouveau tube Eppendorf. Cinq autres lavages sont réalisés avec 800 �l de PBS-Tween 0,1%, puis le mélange est transféré dans un nouveau tube Eppendorf. Enfin, 5 lavages sont réalisés avec 800 pl de PBS. Les phages anticorps fixés sur les billes/antigène-biotine sont mis en suspension dans 200 pl de PBS et incubés 30 min à 37°C, sans agitation, avec 1 ml de TG1 rendues compétentes pour la fixation des phages au pili (cellules compétentes : à partir d'une culture de TG1 en 2YT sur la nuit, on réalise une dilution au 1/100 et on inocule 50 ml de 2YT à 37°C sous agitation jusqu'à une D0600 proche de 0,5). A chaque sélection, les phages sont comptés et amplifiés pour un nouveau tour de sélection. . f3 -Comptage des sélections : On réalise des dilutions des cellules TG1 transfectées avec les phages (voir ci-dessus) de 10' à 10-5 avec du 2YT. Un, 10 et 100 pl de chaque dilution sont étalés sur boîte de Petri (2YT / ampicilline 100 �g/ml / glucose 2%). Les boîtes sont incubées 16 h à 30°C. . f4 - Etalement de la sélection pour l'isolement des colonies : Les 5 ml de TG1 transfectées sont centrifugés pendant 10 min à 3000 g pour concentrer les cellules et on reprend le culot avec 1 ml de 2YT. Deux cent cinquante �l sont étalés par boîte de Petri (12 cm x 12 cm) (2TY / ampicilline 100 �g/ml / glucose 2%) et incubées 16 h à 30°C. . f5 - Bilan des sélections . f6 - Banque "immune" Deux sdAB spécifiques de la protéine Nef ont été isolés par cette méthode : sdAb Nef19 (SED 10 ID N°1 et 7) et sdAb Nef2O (SEQ ID N°2 et 8). . f7 - Banque "naïve" Quatre sdAB spécifiques de la protéine Nef ont été isolés par cette méthode : sdAb Nef1 (SED ID N°3 et 9), sdAb Nef2 (SEQ ID N°4 et 10), sdAb Nef5 (SEQ ID N°5 et 11) et sdAb Nef12 15 (SEQ ID N°6 et 12). Les séquences ont été alignées selon la nomenclature internationale IMGT (The international ImMunoGeneTics information system) (Lefranc, 2003). 20 g - Production des phages-sdAb et numération . g1 - Production de phage-sdAb unitaire : Vingt ml de 2TY (Ampicilline 100 �g/ml ; glucose 2%) sont inoculés avec 1 colonie isolée de TG1 contenant le phagemide correspondant au phage-sdAb sélectionné. La culture est incubée 25 à 37°C avec agitation jusqu'à une DO600nm proche de 0,5. Cinq ml de cette culture sont infectés avec 5 à 10 1d de phage helper M13KO7 (1013 pfu/ml) et incubés 30 min à 37°C dans un bain marie (sans agitation). La culture est centrifugée 10 min à 3000 g et le surnageant est éliminé. Le culot est repris avec 25 ml de 2TY (Ampicilline 100 �g/ml ; Kanamycine 25�g/ml). La culture est incubée à 30°C 16 h avec agitation, puis le récipient est mis dans la glace 10 min. 30 La culture est ensuite centrifugée 20 min à 3000 g, 4°C. Le surnageant est prélevé et précipité par addition de 1/5 vol de 2.5 M NaCl/20% PEG 6000 pendant 1h dans la glace. La solution est centrifugée 20 min à 3000 g, 4°C. Le culot est repris avec 1 ml de PBS et transféré dans un tube Eppendorf siliconé. Une précipitation rapide est réalisée en ajoutant 200 pl de NaCl/PEG, puis en centrifugeant à 13000 rpm. Le culot est repris avec 1 ml de PBS et centrifugé 1 min, 135 000 rpm. Le surnageant est filtré sur 0,45 �m et transféré dans un tube Eppendorf siliconé puis conservés à 4°C. . g2 - Numération de la solution de phage-sdAb : Des cellules TG1 sont cultivées dans du 2YT à 37°C. Des dilutions successives (de 10 en 10) de phage-sdAb sont réalisées dans des tubes Eppendorf siliconés contenant 500 �l de 2YT. Quand les cellules TG1 sont à une DO600nm de 0.5, 500 �l de TG1 sont ajoutés, puis les cellules sont laissées 30 min à 37°C sans agitation. Cent �l de chaque tube sont étalés sur des boîtes de Petri 2YT (Ampicilline 100 tg/ml ; glucose 2%). Les boîtes sont incubées 16 h à 30°C ou 37°C. Les colonies sont comptées pour déterminer le nombre de phage-sdAb dans la solution de départ. Cette solution servira à caractériser les phages-sdAb par ELISA. h - Caractérisation des phages-sdAb anti-Nef par ELISA . h1 - ELISA des phages-sdAb : Cinq �g/ml d'antigène biotinylé (Nef W10) sont fixés sur une plaque streptavidine (BioBind Assembly Streptavidin Coated, ThermoLabsystems) préalablement saturée en lait 2%-PBS. Différentes dilutions de phages-sdAb sont mises en contact avec l'antigène. La liaison antigène/anticorps est détectée grâce à un ELISA composé d'un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine P8 du phage (HRP/anti-M13 monoclonal conjugate, Pharmacia). L'ajout du substrat, 10 mg ABTS (sel diammoniun de l'acide 2,2'-azino-bis(3-éthvlbenzo-thiazoline-6-sulfonique) à 20 ml tampon de révélation (18 ml PBS, lml acide citrique 1 M, 1 ml citrate de sodium 1 M, 10 ml H202 30%), permet de lire la réaction à 405 nm (Tecan). La figure 1A présente les résultats obtenus avec les phages-sdAb Nef1, Nef2 et NefS obtenus avec la banque "naïve" et le phage-sdAb Nef19 obtenu à partir de la banque "immune". On observe dans toutes les courbes de titration une décroissance de la mesure de l'interaction entre les phages-sdAb et la protéine Nef W10 biotinylée, fixée dans des puits recouverts de streptavidine d'une microplaque, lorsque la quantité de phage-sdAb diminue. Afin de démontrer que cette interaction est spécifique, des ELISA par compétition ont été réalisés. Pour cela, une quantité de phage-sdAb constante (environ 1010 particules phagiques) ont été préincubés avec différentes quantités de protéine Nef W10 non biotinylée 16h à 4°C. Les ELISA sont ensuite réalisés comme décrits précédemment. La figure 1B montre que la fixation des phage-sdAb NefS et Nef19 sur la Nef W10 biotinylée diminue lorsqu'on augmente la protéine Nef W10 non biotinylée dans l'essai. Cette décroissance prouve la spécificité de l'interaction des phages-sdAb pour la protéine Nef W10. De résultats équivalents sont obtenus avec les autres phage-sdAb sélectionnés. i -Production et purification des sdAbs à partir des phagemides pHen6HisGS ou pHen6HisPhoA. . il - Production des sdAb : Une colonie isolée est inoculée dans 3 ml de 2YT / ampicilline 100 �g/ml / 2% glucose et incubée à 37°C avec agitation. Cinquante ml de 2YT / ampicilline 100 �g/ml / 2°,/o glucose sont ensuite ensemencés avec une dilution de la culture précédente et incubés 16 h à 30°C avec agitation. Quatre cents ml de 2YT/ ampicilline 100 �g/ml sont inoculés avec l'équivalent de 0,1 unité D0600nm, et incubés à 30°C avec agitation, jusqu'à une D0600nm de 0,5 à 0,7. La culture est ensuite induite avec de l'IPTG (isopropyl-(3-D-thiogalactopyranoside ; 0, 1 mM final) et cultivée à 30°C pendant 16 h. . i2 - Extraction de la fraction soluble du périplasme : Les cultures à partir desquelles sont produits les sdAb sont centrifugées à 4200 g, 4°C, 40 min. Le culot est repris dans 4 ml de TES glacé (0,2 M Tris-HC1 pH 8,0; 0,5 mM EDTA; 0,5 M sucrose). On ajoute ensuite 160 �l de lysozyme (10 mg/ml dans du TES, fraîchement préparé) puis 24 ml de TES froid dilué au 1/2 dans HZO. Le mélange est incubé 30 min dans la glace. On ajoute ensuite 150 �l de DNAse (10 mg/ml) et 5 mM final de MgCl,, 30 min à température ambiante. Après centrifugation à 4200 g, 4°C, 40 min, on récupère le surnageant (correspondant à la fraction périplasmique). La solution est dialysée 16 h contre le tampon d'équilibre (acétate de sodium 50 mM, NaCl 0,IM pH 7,0). . i3 - Purification des sdAb : La colonne (BD TALON Tm Metal affinity, BD Biosciences Clontech) est équilibrée avec le tampon d'équilibre (acétate de sodium 50mM, NaCl 0,IM, pH 7,0). La fraction périplasmique est déposée sur la colonne. Après lavage de la colonne avec 5 volumes de tampon d'équilibre, le sdAb est élué par gradient de pH ou d'imidazole (gradient entre le tampon d'équilibre pH 7,0 et la solution acétate de sodium 50mM pH 5,0 ou la solution d'imidazole de 0 à 200 mM). Chaque fraction est contrôlée sur un gel SDS/PAGE (acrylamide 15%) après coloration au bleu de coomassie. Les fractions d'intérêt sont rassemblées et dialysées contre du PBS. Le sdAb est concentré sur membrane (Amicon Ultra 5000MWCO, Millipore) et dosé par la méthode colorimétnque de Lowry à l'aide du kit Biorad Protein Assay. La figure 2 montre un profil de purification (C : charge ; NR :fraction non retenue sur la colonne ; L lavage en tampon de charge). Le sdAb Nef19 est élué (fractions 9 à 56) par un gradient de pH de 7 à 5. . i4 - Caractérisation des sdAbs anti-Nef par ELISA Cinq �g/ml d'antigène biotinylé (Nef W10) sont fixés sur une plaque streptavidine (BioBind Assembly Streptavidin Coated, ThermoLabsystems) préalablement saturée en lait 2Yo-PBS. Chaque sdAb (gamme de 0,001 tg/ml à 1 �g/ml) est lié à l'antigène adsorbé dans les micropuits. La liaison est révélée avec un anticorps monoclonal 9E10 dirigé contre l'étiquette cmyc (Santa Cruz Biotechnology, Inc) dilué au 1/1000 et un anticorps polyclonal de chèvre dirigé contre les IgG de souris couplé à la peroxidase dilué au 1/5000 (ref 55556, ICN) en présence d'ABTS (sel de diammonium du 2,2'-Azino-di-(3-éthylbenzthiazoline sulfonate) Roche). La figure 3A présente les résultats obtenus avec les sdAb Nef5 et Nef19. On observe dans toutes les courbes de titration une décroissance de la mesure de l'interaction entre les sdAb et la protéine Nef W10 biotinylée, fixée dans des puits recouverts de streptavidine d'une microplaque, lorsque la quantité de sdAb diminue. Le sdAb Nef 5 étant moins afin que le sdAb Nef19, une amplification du signal (figure 3B) a été obtenu en préincubant le sdAB Nef5 avec le mAb 9E10 pendant 1 h à 25°C avant le dépôt dans les puits de la microplaque. Comme contrôle, le mAB 9E10 a été utilisé en absence de sdAb. Comme pour les phages-sdAB, des ELISA par compétition ont été réalisés. Pour cela une quantité de sdAb constante (5 �g/ml) a été préincubée avec différentes quantités de protéine Nef W10 non biotinylée 16h à 4°C. Les ELISA sont ensuite réalisés comme décrits précédemment. La figure 3C montre que la fixation du sdAb Nef19 sur la Nef W10 biotinylée diminue lorsqu'on augmente la quantité de protéine Nef W10 non biotinylée dans l'essai. Cette décroissance prouve la spécificité de l'interaction du sdAb Nef19 pour la protéine Nef W10. De résultats équivalents sont obtenus avec les autres sdAb. j - Clonage du sdAb Nef19 dans le plasmide pET14bNefW10 10 �l du vecteur pET14bNefW10 et 5 �l du vecteur pHen-sdAb Nef19 sont coupés avec 10U Ncol et Notl pendant 16H à 37°C. Les fragments sont purifiés sur agarose 1 % (gel extraction kit Qiagen volume final 5O111 pour le vecteur pET14bNefW10 et 20 �l pour le fragment correspondant à la séquence du sdAb Nefl9) La ligature est réalisée avec 10 �l de fragment et 1 �l de vecteur dans un volume final de 15 tl en présence de 3 U Weiss de T4 DNA ligase (Biolabs) pendant 2H à température ambiante. Des bactéries BL21(DE3) compétentes (technique CaC12) sont transformées avec 7,5 ti du produit de ligature. On obtient le plasmide pET-sdAb Nef19 (SEQ ID N°28) dont la séquence est indiquée en annexe. h - Constantes d'affinité des anticorps anti-Nef par Biacore Le BIACORE utilise le principe de la résonance plasmonique de surface (SPR) pour suivre en temps réel les interactions entre molécules sans marquage de celles-ci. L'un des partenaires de l'interaction est immobilisé de façon covalente sur un biocapteur alors que l'autre est injecté dans un flux continu. Le principe de détection par SPR permet de suivre les changements de masse à la surface du biocapteur dus à la formation, puis à la dissociation des complexes moléculaires. La réponse, quantifiée en unité de résonance (RU) est une indication directe du taux de fixation de l'analyte par la mesure de la variation de l'indice de réfraction. L'enregistrement du signal (un sensorgramme) est traité de façon mathématique pour obtenir les constantes de vitesse d'association, ka, de dissociation kd et les constantes d'association KA (KA = ka/kd) et de dissociation à l'équilibre KD (KD = kd/ka). Les interactions entre Nef W10 et le sdAb Nef19 produit soit à partir du périplasme (sclAb Nef19P) soit à partir du cytoplame (sdAb Nef19C) de bactéries ont été étudiées sur un BIACORE 3000 muni d'un biocapteur de type CM5 sur lequel 1089 RU de Nef W10 ont été immobilisés de façon covalente suivant la procédure standard de couplage par les amines proposée par BIACORE (activation par NHS/EDC). Les sdAbs Nefl9P ou Nefl9C (en tampon : 10 mM HEPES; 150 mM NaCl; 3 mM EDTA; 0,005% surfactant P20) sont alors injectés. En parallèle, les injections sont réalisées sur un canal contrôle qui a subi la mème chimie de couplage, mais sans injection de protéine. Les constantes d'affinité des sdAb Nefl9P et Nefl9C de SEQ ID N°1 et 7 sont indiquées dans la figure 4 (Il est à noter que les sdAbs Nefl9P et Nefl9C possèdent les mêmes séquences en acides aminés). k - Construction du plasmide permettant l'expression intracellulaire du sdAB Nef19 en cellules 5 eucaryotes et étude de la distribution cellulaire du sdAb Nef 19 . k1 - Obtention du plasmide pcDNA-sdAb Nef19 Oligonucléotides utilisés : 10 SEQ ID N°57 : ANefEcoK5p 5'GAATTCCACCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTG3' SEQ ID N°58 : ANefXho3p 15 5'CTCGAGCTAGCTCCCATGGTGATGGTG La séquence codant pour le sdAB Nef19 tronqué de son peptide signal, mais étiqueté à son extrémité C-terminale par les épitopes c-myc et 6His, a été amplifiée par PCR à partir du vecteur pHEN-sdAb Nef19 à l'aide des 2 amorces nucléotidiques ANefEcoK5p et ANefXho3p. 20 Conditions de PCR : Un �l de pHen-sdAb Nef19 à 50 ng/�l, 10�l Tp 10X Dynazyme (Biolabs), 2 �l mix dNTP à 100 nM, 2 pl oligonucléotide 5' à 10 pmoles/�l, 2 �l oligonucléotide 3' à 10 pmoles/�l (Couples d'amorces utilisés : ANefEcoK5p et ANefXho3p), 0,7 �l de Taq polymérise Dynazyme 25 (Biolabs), 82 �l H2O. Programme de PCR utilisé : 95°C, 3 min ; 95°C, 45 s ; 50°C, 45 s ; 72°C, 45 s ; 72°C, 3 min ; 30 cycles. La taille du fragment de PCR est vérifiée sur gel agarose 1 %, puis les fragments sont purifiés à l'aide du kit � Qiaquick gel extraction � (Qiagen). Clonage : Vingt pl du produit de PCR purifié sont coupés dans un volume de 100 pi avec 10U d'enzyme de restriction EcoRI et 10U d'enzyme de restriction Xhol en présence de BSA, à 37°C, 12 h. Les enzymes sont ensuite dénaturées à 65°C durant 20 min. 30 Le vecteur pcDNA3.1+ (Invitrogen) a été utilisé pour l'expression du sdAb Nef19 en cellules de mammifères. 2,5 tg de pcDNA3.1+ sont coupés dans un volume de 100 �l avec 10 unités d'enzyme de restriction EcoRI et 10 unités d'enzyme de restriction Xhol en présence de BSA, à 37°C, 12 h. Les enzymes sont ensuite dénaturées à 65°C durant 20 min. Les produits de digestion sont analysés sur gel d'agarose 0,7 % afin de contrôler la digestion. Le produit de PCR et le pHen-sdAb Nef19 coupés par EcoRI et Hindili sont purifiés sur gel 0,7 % à l'aide du kit � Qiaquick gel extraction � (Qiagen). La ligature est réalisée avec 5 �l du fragment de PCR, 0,5 �l du vecteur et 3 U Weiss de T4 DNA ligase (Biolabs) dans un volume final de 10 �l pendant 2h à température ambiante. Des bactéries TG1 compétentes sont transformées avec 10 pl de produit de ligature. Une préparation du plasmide a ensuite été réalisée à partir d'une colonie isolée et le séquençage a été réalisé. Le plasmide résultant appelé pcDNA-sdAB Nef19 permet la production du sdAb Nef19 dans des cellules eucaryotes transfectées avec ce plasmide. La séquence du pcDNA-sdAb Nef19 est donnée en annexe (SEQ ID N°30). . k2 -Co- localisation du sdAb Nef19 avec la protéine Nef au niveau de structures membranaires cytoplasmiques La distribution intracellulaire du sdAb Nef19 a été analysée par immunofluorescence indirecte sur des cellules HeLa exprimant de façon transitoire la protéine de fusion Nef-GFP ou la protéine contrôle GFP, dont les vecteurs d'expression ont été précédemment décrits (Burtey et al., 2007). Les cellules (4 x 105) ont été transfectées par la technique de lipofection avec de la Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en suivant la procédure préconisée par le fabricant. 24 h après transfection, les cellules ont été fixées pendant 20 min à 4°C par une solution de PBS-paraformaldéhyde(PFA) à 4 %, puis perméabilisées par une solution de PBS-Triton X100 à 0,1 % pendant 10 min. Le sdAb a été ensuite détecté par un anticorps (Ac) dirigé contre l'épitope c-myc (9E10, Roche) dans du PBS-BSA à 0,1 %, puis un second Ac anti-IgG de souris couplé à Alexa594 (Jackson Laboratories). La localisation du sdAb a été comparée à celle de Nef-GFP en microscopie à fluorescence à l'aide d'un microscope Leica DMB et les images ont été éditées à l'aide du logiciel Adobe Photoshop. Les résultats sont illustrés sur la figure 5. Alors que le sdAb se distribue de façon diffuse entre le cytoplasme et le noyau (partie A, panneau central) dans les cellules exprimant la protéine contrôle GFP (panneau de gauche), il se redistribue vers des structures membranaires cytoplasmiques situées dans la région périnucléaire où il co-localise parfaitement avec la protéine Nef-GFP (partie B). 1û Etude de l'effet du sdAb Nef19 sur les propriétés fonctionnelles de Nef . 11 û Inhibition de l'effet de Nef sur le niveau d'expression de CD4 à la surface cellulaire Afin d'explorer les effets potentiels du sdAb Nef19 sur les propriétés fonctionnelles de Nef, sa capacité à moduler l'expression du récepteur CD4 à la surface des lymphocytes T CD4+ a été dans un premier temps analysée dans des cellules exprimant le sdAb. Des cellules lymphoïdes T humaines de la lignée HPB-ALL (10'), exprimant constitutivement le récepteur CD4, ont été cotransfectées par électroporation (Burtey et al., 2007) avec 10, 20 ou 30 �g du vecteur d'expression du sdAb Nef19 (pcDNA-sdAB Nef19) et 5�g du vecteur d'expression de la fusion Nef-GFP ou de la protéine contrôle GFP. 24 h après transfection, le niveau d'expression de CD4 à la surface cellulaire a été analysé sur les cellules exprimant Nef-GFP ou GFP par cytométrie de flux à l'aide d'un appareil Cytomics FC500 après marquage pendant 1 h à 4°C avec un Ac anti-CD4 directement couplé à phycoérythrine-CY5 (RPA-T4, Beckton-Dickinson), puis fixation des cellules par une solution de formaldéhyde à 3,7 %. Les résultats sont illustrés sur la figure 6A. Alors qu'une expérience représentative est montrée sur le panneau du haut, le panneau du bas correspond à la moyenne des résultats obtenus de 3 expériences indépendantes. En l'absence du sdAb Nef19, Nef entraîne une diminution d'environ 70 % du niveau d'expression de CD4 à la surface cellulaire. L'expression de quantités croissantes de sdAb se traduit par une réversion dose-dépendante de cet effet (barres noires), puisque le niveau de CD4 présent à la surface des cellules exprimant Nef et transfectées avec 30 �g du vecteur d'expression du sdAb Nef19 est pratiquement comparable à celui mesuré en l'absence de Nef. L'expression du sdAb n'induit pas un effet non spécifique, puisque celle-ci, même à la plus forte dose, ne modifie pas le niveau de CD4 présent à la surface des cellules exprimant la protéine contrôle GFP (barres blanches). Cet effet inhibiteur du sdAb Nef19 est également observé sur des cellules non lymphoïdes exprimant stablement le récepteur CD4. Des cellules HeLa exprimant stablement CD4 (HeLa-CD4) ont été co-transfectées comme précédemment par la technique de lipofection avec 1, 2 ou 3 �g du vecteur d'expression du sdAb Nef19 et 1 ag du vecteur d'expression de Nef-GFP ou du contrôle GFP (Coleman et al., 2006). Le niveau d'expression de surface de CD4 a été analysé comme précédemment par cytométrie de flux sur les cellules exprimant Nef-GFP ou GFP. Les résultats correspondant aux moyennes de 3 expériences indépendantes sont rapportés sur la figure 6B. Ils montrent que le sdAb Nef19 est capable d'inhiber en grande partie l'effet de la fusion Nef-GFP sur le niveau d'expression de surface de CD4 (barres noires). . 12 ù étude de l'inhibition par sdAb Nef19 de la capacité de Nef à interagir directement avec la machinerie cellulaire de la voie d'endocytose. L'utilisation par plusieurs équipes d'une protéine de fusion CD8-Nef dans laquelle les régions extracellulaire et membranaire de CD8 sont fusionnées à l'extrémité N-terminale de Nef (CD8-Nef) a permis de montrer que la séquence de Nef contient des déterminants lui permettant d'interagir directement avec la machinerie de transport vésiculaire des protéines au niveau de la voie d'endocytose. La chimère membranaire CD8-Nef possède, comme la protéine Nef native myristillée, la propriété de moduler en trans l'expression de surface du récepteur CD4, mais aussi de moduler en cis son propre niveau d'expression à la surface cellulaire, reflétant ainsi sa capacité à se connecter directement à la machinerie cellulaire de la voie d'endocytose. L'effet inhibiteur du sdAb Nef19 sur le niveau d'expression de surface de la chimère CD8-Nef a donc été exploré, en cytométrie de flux et en immunofluorescence, sur des cellules HeLa. Pour l'analyse en cytométrie, les cellules sont co-transfectées par lipofection avec 1, 2 ou 3 du vecteur d'expression du sdAb Nef19, 0,7 �g du vecteur d'expression de CD8-Nef ou du contrôle CD8-Stop correspondant au récepteur CD8 dépourvu de domaine cytoplasmique, et 0,3 �g du vecteur d'expression de la GFP. 24 h après transfection, les cellules sont fixées pendant 20 min par une solution de PBS-PFA à 4%, et le niveau d'expression de la chimère CD8-Nef à la surface des cellules exprimant la GFP a été évalué à l'aide d'un Ac anti-CD8 (SKI, Becton-Dickinson) couplé à la phycoérythine-Cy5. Pour l'analyse en immunofluorescence, les cellules ont été transfectées avec 1 �g du vecteur d'expression de CD8-Nef ou CD8-Stop et 1 �g du vecteur d'expression du sdAb. 24 h après transfection, les cellules sont fixées pendant 20 min par une solution de PBS-PFA à 4% puis perméabilisées par une solution de PBS-Triton X100 à 0,1%. Le sdAb a été détecté comme précédemment (voir figure 5), alors que la fusion CD8-Nef est détectée par un Ac anti-CD8 couplé au FITC (SFCI, Coulter). Les résultats de ces expériences sont illustrés sur la figure 7. La partie A correspond aux résultats de l'analyse par cytométrie ; le panneau du haut représente une expérience représentative alors que le panneau du bas correspond aux moyennes de 3 expériences indépendantes. En l'absence du sdAb Nefl9, le niveau d'expression de la chimère CD8-Nef est environ cinq fois inférieur à celui de la protéine contrôle CD8-Stop (barres blanches). L'expression de quantités croissantes du sdAb se traduit par une accumulation progressive de la protéine CD8-Nef à la surface cellulaire (barres noires). L'expression du sdAb n'a aucun effet sur le niveau d'expression du contrôle CD8-Stop (barres blanches). Les données des expériences d'immunofluorescence rapportées sur les panneaux du haut de la figure 7B confirment ces résultats, puisque une augmentation nette du marquage de la protéine CD8-Nef à la membrane plasmique est observée dans les cellules co-exprimant le sdAb Nef19 (indiquées par des flèches), alors que ce marquage est presque exclusivement concentré dans un compartiment membranaire périnucléaire en l'absence du sdAb (cellule indiquée par une tête de flèche). Comme sur la figure 5, le sdAb Nef19 se trouve distribué de façon diffuse entre le cytoplasme et le noyau dans les cellules contrôles exprimant la protéine CD8-Stop (panneaux du bas), alors qu'il se re-localise vers les structures membranaires intracellulaires et à la membrane plasmique également marquées par l'Ac anti-CD8 dans les cellules exprimant la fusion CD8-Nef (panneaux du haut). Les résultats de la figure 7 confirment la reconnaissance de Nef par le sdAb Nef19 dans le contexte cellulaire ; ils confirment également les effets inhibiteurs du sdAb sur les interactions de Nef avec la machinerie cellulaire de la voie d'endocytose. . 13 ù Interaction du sdAb Nef19 avec la protéine Nef dans le contexte cellulaire La reconnaissance directe de Nef par le sdAb Nef19 a été explorée au niveau cellulaire par des expériences de co-immunoprécipitation. Des cellules 293T (3 x 10`) ont été co-transfectées, par la technique de précipitation au phosphate de calcium, avec 5�g du vecteur d'expression du sdAb en association avec 5 �g d'un vecteur permettant l'expression de la fusion CD8-Nef sauvage (CD8- Nef WT), ou de mutants ponctuels (CD8-NefLL164-165AA et CD8-NefE62-65A) ou de délétion de Nef (CD8-Nef 1-61 et CD8-Nef 58-189). Ces constructions ont été décrites précédemment (Janvier et al., 2003a,b ; Madrid et al., 2005). Le même type d'expérience a également été réalisé sur des cellules co-exprimant le sdAb et la protéine CD8 dépourvue de domaine cytoplasmique (CD8-Stop) utilisée comme contrôle. 24 h après transfection, les cellules ont été lysées dans un tampon contenant 100 mM de (NH4)2SO4, 20 mM de Tris (pH 7,5), 10 °ô de glycérol, 1 % d'IGEPAL et un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Roche). Le lysat cellulaire (600 �g de protéines totales) a été incubé pendant 1 h à 4°C avec 3 �g de l'Ac anti-CD8 (32M4, Santa Cruz) et 30 �l de billes recouvertes de protéine A-sépharose. Les irnmunoprécipités ont ensuite été analysés par immunoblot à l'aide d'Ac anti-CD8 (H160, Santa Cruz) et anti-c-myc (9E10). Les résultats sont illustrés sur la figure 8. Comme attendu (panneaux de gauche), la bande correspondant au sdAb Nef19 est spécifiquement détectée dans le matériel immunoprécipité à partir des cellules exprimant la protéine de fusion CD8-Nef, alors qu'elle n'est pas détectée dans le matériel immunoprécipité à partir des cellules exprimant la protéine contrôle CD8-Stop. L'analyse du matériel immunoprécipité à partir des cellules exprimant les protéines de fusion mutées indique que le sdAb est toujours capable de s'associer aux mutants ponctuels CD8-NefLL164-165AA et CD8-NefE62-65A, alors que les mutants de délétion, CD8-Nef 1-61 et CD8-Nef 58-189, ne sont pas reconnus par le sdAb. Comme l'immunogène utilisé pour générer le sdAb Nef19 correspondait à une protéine recombinante dépourvue des 57 premiers acides aminés, les résultats de la figure 8 suggèrent que la zone reconnue par le sdAb est localisée à l'extrémité C-terminale de Nef, sur une région comprise entre les résidus 190 à 206 de la protéine. . 14 û inhibition par le sdAb Nef19 des effets positifs de Nef sur le pouvoir infectieux du VIH L'activité inhibitrice du sdAb Nef19 sur la contribution de Nef aux propriétés infectieuses des particules virales a été analysée dans un système expérimental permettant d'évaluer le pouvoir infectieux du VIH-1 au cours d'un cycle unique de réplication (Madrid et al., 2005). Les particules virales recombinantes portant le gène rapporteur GFP ont été produites par co- transfection de cellules 293T comme décrit précédemment (Basmaciogullari et al., 2006) avec 8 �g du vecteur permettant l'expression des protéines issues des gènes gag et pol du VIH-1 (isolat NL43) (Owens et al., 2003), 8 �g du vecteur d'expression du transgène GFP, 2 �g du vecteur permettant l'expression de l'enveloppe du VIH-1 (isolat 89.6) ou du VSV (VSV-G), 1 �g du vecteur d'expression de la protéine Nef étiquetée à son extrémité C-terminale par l'épitope HA (Dorfman et al., 2002), et 8 �g du vecteur d'expression du sdAb. Les particules virales pseudotypées par l'enveloppe du VIH-1 ou celle du VSV ont été récupérées dans le surnageant de culture 48 h après transfection et stockées à -80°C. Les stocks viraux ont été titrés par mesure de l'activité transcriptase inverse (RI), puis utilisés pour infecter des cellules HeLa-CD4 ou des cellules T de la lignée HPB-ALL. 3 x 104 cellules HeLa-CD4 ont été infectées en plaques 24 puits avec 500 �l d'une dilution à 5 x 105 et 5 x 104 unités arbitraires de RT/ml des stocks viraux pseudotypés, respectivement, par l'enveloppe du VIH-1 ou du VSV. Dans le cas de la lignée HPB-ALL, 105 cellules ont été infectées avec 1 ml d'une dilution à 17 x 104 et 17 x 10' unités arbitraires de RT/ml des stocks viraux pseudotypés, respectivement, par l'enveloppe du VIH-1 ou du VSV. 60 h après infection, les cellules ont été récupérées et fixées dans une solution de PBS-formaldéhyde à 3,7%, puis le pourcentage de cellules infectées, exprimant donc la GFP, est évalué par cytométrie de flux. Les résultats correspondant aux moyennes de 3 expériences indépendantes sont rapportés sur la figure 9. Le panneau du haut (A) correspond au pouvoir infectieux des particules virales mesuré sur les cellules HeLa-CD4, et le panneau du bas (B) correspond au pouvoir infectieux mesuré sur les cellules T HPB-ALL. Les résultats sont rapportés en fonction du pouvoir infectieux des particules virales pseudotypées par l'enveloppe du VIH-1 (barres bleues) ou du VSV (barres bordeaux) et produites en l'absence de Nef. Comme attendu, l'expression de Nef dans les cellules productrices se traduit par une nette augmentation du pouvoir infectieux des particules virales exprimant l'enveloppe du VIH-1 (14 fois et 3 fois, respectivement, dans les cellules HeLa-CD4 et HPB-ALL), alors que les virus exprimant l'enveloppe du VSV ne sont pas influencés par l'expression de Nef. L'expression du sdAb Nef19 provoque une inhibition significative et spécifique, de l'ordre de 75%, de l'effet de Nef sur le pouvoir infectieux des particules virales, indépendamment du type cellulaire utilisé. Au contraire, l'expression du sdAb n'influe pas sur le pouvoir infectieux des particules virales exprimant la protéine G du VSV, que les particules soient produites en l'absence ou en présence de Nef. . 15 ù incorporation de sdAb Nef19 dans les particules virales Plusieurs études ayant montré que la protéine Nef du VIH-1 était incorporée dans les particules virales bourgeonnant à la surface des cellules infectées, l'influence de l'expression du sdAb Nef19 dans les cellules productrices sur l'incorporation de Nef dans les particules virales a donc été explorée. Les particules virales ont été produites comme précédemment (voir Figure 9) dans les cellules 293T co-transfectées avec 1 ou 4�g du vecteur d'expression du sdAb Nefl9. Les surnageants de culture ont été soumis à une ultracentrifugation à 27 000 rpm pendant 1h30 à 4°C sur un coussin de PBS/saccharose. Les particules virales ainsi purifiées ont été alors reprises dans du tampon Laemli et analysées par immunoblot à l'aide des Acs anti-HA (3F10, Roche), anti-c-myc (9E10, Roche) et anti-p24 (obtenu du � NIH AIDS Research and Reference Reagent Program �); les lysats des cellules productrices ont été également analysés par immunoblot. Les résultats sont illustrés sur la figure 10A. Les panneaux de gauche correspondent à l'analyse des lysats cellulaires, alors que ceux de droite correspondent à l'analyse des virus purifiés. En l'absence du sdAb Nef19, la protéine Nef-HA est bien incorporée dans les particules virales, comme l'indique la détection des 2 bandes révélées avec l'Ac anti-HA (panneau du haut), correspondant à la protéine entière de 27 kDa et au produit de clivage de 25 kDa environ (Chen et al., 1998 ; Welker et al., 1998). L'incorporation de Nef ne semble pas être perturbée par l'expression du sdAb, mais celui-ci est également incorporé, uniquement quand les particules virales ont été produites à partir de cellules exprimant Nef. Ces résultats montrent que le sdAb est spécifiquement recruté dans les particules virales infectieuses, vraisemblablement par une interaction directe avec la protéine Nef établie dans la cellule productrice. Ce recrutement du sdAb pourrait être responsable de son effet inhibiteur sur les capacités infectieuses des particules virales produites. Afin de confirmer que l'incorporation du sdAb Nef19 dans les particules virales résulte bien de l'association avec la protéine Nef dans les cellules productrices, la capacité du sdAb à interagir avec la protéine Nef-HA a été explorée comme précédemment par co-immunoprécipitation à partir de cellules 293T co-transfectées par les vecteurs permettant respectivement l'expression du sdAb et de Nef-HA. 600 �g de protéines issues de la fraction soluble des lysats cellulaires ont été incubés pendant 1 h à 4°C avec 3 p.g de l'Ac anti-HA (3F10) et 30 �l de billes recouvertes de protéine A-Sépharose. Le matériel immunoprécipité a été ensuite analysé par immunoblot à l'aide d'un Ac spécifiquement dirigé contre la protéine Nef (Ac a56 obtenu du � NIH AIDS Research and Reference Reagent Program �) et de l'Ac anti-c-myc (9E10). Comme le montrent les résultats rapportés sur la partie B de la figure 10, le sdAb est détecté uniquement dans l'immunoprécipité des cellules exprimant Nef-HA, mais n'est pas détecté dans le matériel précipité à partir des cellules transfectées avec le vecteur contrôle Nef-Stop (panneaux de gauche) permettant l'expression d'un polypeptique correspondant aux 46 premiers résidus de la protéine Nef, même si le sdAb est bien exprimé dans ces cellules (panneaux de droite). REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. (Hamers-Casterman et al., 1993) 2. (Hoogenboom et al, 1991) 3. (Chomczynski et Sacchi, 1987) 4. (Arbabi Ghahroudi et al., 1997) 5. (Smith, 1985 ; Hoogenboom et al., 1991) 6. (Lefranc, 2003) 7. (Janvier et al., 2003a,b ; Madrid et al., 2005) 8. (Chen et al., 1998 ; Welker et al., 1998) REVENDICATIONS 1 - Fragments d'anticorps de simple chaîne lourde ou sdAbs, caractérisés en ce qu'il s'agit de 5 fragments anti-protéine Nef du VIH correspondant à tout ou partie des domaines VHH de camélidés, notamment de lamas. 2 - Fragments d'anticorps sdAbs selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils présentent une séquence en acides aminés telle que codée par une séquence en nucléotides choisie dans le 10 groupe comprenant les séquences SEQ ID N° 1 à 6. 3 - Fragments d'anticorps sdAbs selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils présentent une séquence en acides aminés choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID N° 7 à 12. 4 û Fragments d'anticorps sdAbs selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit de CDRs. û Les acides nucléiques codant pour les fragments d'anticorps selon l'une quelconque des 20 revendications 1 à 4. 6 û Acides nucléiques selon la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils présentent une séquence choisie parmi SEQ ID N°1 à 6. 25 7 û Utilisation des acides nucléiques selon les revendications 5 ou 6 pour construire des vecteurs d'expression. 8 û Utilisation selon la revendication 7, pour construire les plasmides du groupe comprenant pET14bNef13, pET14bNefW12, pET14bNefW10, pHen6HisGS, pHenPhoA6His, pHen-sdAb 30 Nef1, pHen-sdAb Nef2, pHen-sdAb Nef5, pHen-sdAb Nef12, pHen-sdAb Nefl9, pHen-sdAb Nef2O, pET-sdAb Nef1, pET-sdAb Nef2, pET-sdAb Nef5, pET-sdAb Nef12, pET-sdAb Nefl9, pET-sdAb Nef2O, pcDNA-sdAb Nef19 répondant, respectivement, aux séquences SEQ ID N°13 à 30. 15 309 - Procédé de production de fragments d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend - l'immunisation de camélidés, notamment de lamas avec, comme immunogène, Nef, - la purification des lymphocytes B récupérés à partir du sang, - la construction de banque de VHH, et - l'isolement des fragments sdAbs à partir de la banque et leur purification. - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la protéine Nef utilisée est dépourvue de ses 56 premiers acides aminés. 10 11 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la construction de la banque comprend les étapes : -d'extraction des ARN totaux des lymphocytes B, - de transcription inverse des ARN pour obtenir les ADNc correspondants, - d'amplification par PCR des gènes codant pour les régions variables des anticorps simple chaîne lourde anti-Nef, - de ligation de fragments d'ADN VHH obtenus par coupure, par des enzymes, des ADN amplifiés avec un phagemide. 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 9, 10 ou 11, caractérisé en ce que les sdAbs sont isolés à partir des banques par la technique de phage display et purifiés. 13 - Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un sdAb anti-Nef selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 14 û Compositions pharmaceutiques selon la revendication 13, comme médicaments antiviraux, dans laquelle les fragments sdAbs sont vectorisés afin de traverser la membrane cellulaire et d'être libérés au sein de la cellule infectée. 15 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 14, caractérisées en ce que le vecteur est une séquence peptidique conjuguée à la séquence des fragments ou correspond à des composés lipidiques combinés aux fragments sdAbs. 16 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées en immunothérapie afin d'inhiber les molécules Nef relarguées dans le milieu plasmatique. 17 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 15, en thérapie génique, caractérisées en ce qu'elles comprennent un vecteur de transfection comportant un acide nucléique codant pour un fragment sdAb selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.