FR 2932182 A1 20091211 FR 0853851 A 20080610 CYCLOPEPTIDES UTILISABLES EN TANT QU'INHIBITEURS D'ENZYMES PROTEASES DU TYPE MMP DESCRIPTION 5 DOMAINE TECHNIQUE La présente invention a pour objet de nouveaux cyclopeptides utilisables en tant qu'inhibiteurs d'enzymes protéases du type MMP (abréviation correspondant aux métalloprotéases de 10 matrice extracellulaire). Les MMP sont une famille d'endopeptidases, au nombre de 28, contenant un atome de zinc au niveau de leur site actif. Elles peuvent être classées en deux sous-familles, selon qu'elles sont sécrétées ou 15 associées à une membrane. Les MMP sécrétées comprennent les collagénases (telles que MMP-1, 8, 13 et 18), les gélatinases (telles que MMP-2 et 9), les matrilysines (telles que MMP-7 et 26), les stromélysines (telles que MMP-3, 10 et 11), l'épilysine (MMP-28), l'énamélysine 20 (MMP-20). Les MMP associées à une membrane comprennent les MMP transmembranaires telles que MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-23, MMP-24 et MMP-25. Les MMP sont capables de cliver tous les éléments de la matrice extracellulaire ainsi que 25 certains facteurs de croissance, ou encore des molécules d'adhésion. Les MMP sont régulées par des inhibiteurs naturels, tels que les TIMP (abréviation correspondant aux inhibiteurs tissulaires de métalloprotéases), et jouent un rôle important dans les 30 processus physiologiques (tels que la croissance embryonnaire, l'angiogénèse, le remodelage du tissu osseux). Lorsque la balance MMP/TIMP est déréglée, des processus pathologiques apparaissent tels que la croissance tumorale, les métastases, les arthrites rhumatoïdes, les maladies cardiaques. Le rôle des MMP dans la progression tumorale est multiple, notamment du fait de la capacité des MMP à dégrader la matrice extracellulaire, favorisant ainsi l'invasion tumorale. Il a été démontré que les MMP ont également une activité protéolytique contre des protéines non matricielles, ce qui leur confère un rôle complexe dans plusieurs autres étapes de la progression tumorale, la perte d'adhérence, l'invasion, la prolifération, l'angiogénèse, l'intravasion, l'extravasion et la croissance métastatique. La cellule endothéliale présente une remarquable stabilité génétique et sera donc peu sujette à des mutations provoquant une résistance aux traitements. L'angiogénèse tumorale est donc clairement l'un des domaines les plus prometteurs et les plus actifs de la recherche contre le cancer. Plusieurs produits actuellement utilisés pour le traitement de certaines tumeurs ont des effets anti-angiogéniques. Le remodelage de la matrice extracellulaire, en particulier sa dégradation, est nécessaire dans plusieurs étapes de la progression tumorale. Cette dégradation est assurée en grande partie par les MMP. L'expression des MMP varie selon les étapes de la progression tumorale. Par exemple, ce sont les gélatinases (MMP-2 et 9), qui sont les plus exprimées dans l'angiogénèse tumorale. La plupart de ces MMP, en l'occurrence MMP-1, 2, 3, 7 et 8, 9, 10 et 133 et la MT1-MMP sont devenues des cibles thérapeutiques importantes pour le traitement de tumeurs cancéreuses. Les MMP sont impliquées dans la dégradation de nombreuses protéines de la matrice extracellulaire mais aussi non matricielles. Durant ces dernières années, nombre d'inhibiteurs de l'activité catalytique de ces MMP ont été répertoriés ou développés à des fins thérapeutiques, tels que des inhibiteurs de formules suivantes . HOC HN ^ /N\ N OMe O O OH 0 NH Me Le but de la présente invention est de proposer de nouveaux inhibiteurs des enzymes MMP présentant une bonne sélectivité. Plus particulièrement, et contrairement aux molécules actuelles à spectre large, il s'agit de développer des inhibiteurs à spectre étroit, ciblant peu de MMP et dans le meilleur des cas, une seule. EXPOSÉ DE L'INVENTION Ainsi, l'invention a trait à de nouveaux cyclopeptides répondant à la formule suivante : X M1ùS1ùM2ùY dans laquelle : - S1 est une séquence peptidique cible d'une enzyme MMP ; - M1 et M2 représentent, indépendamment, une liaison simple, un groupe hydrocarboné ou un reste d'acide aminé, éventuellement porteur d'un groupe pendant aromatique ; - X et Y représentent, indépendamment, une liaison simple, un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié, pouvant comporter dans sa chaîne, un ou plusieurs hétéroatomes, ou un reste d'acide aminé. Avant d'entrer plus en détail dans la description, nous proposons les définitions suivantes. Par séquence peptidique cible, on entend classiquement, au sens de l'invention, une séquence peptidique apte à être reconnue et clivée par une enzyme protéase MMP. Par groupe hydrocarboné, on entend, généralement, un groupe comprenant dans sa chaîne des atomes de carbone et d'hydrogène, dans laquelle peuvent venir s'intercaler un ou plusieurs hétéroatomes tels que 0, N et/ou S. A titre d'exemple, on peut citer les groupes hydrocarbonés aliphatiques, tels que les groupes alkylènes comportant un nombre d'atomes de carbone inférieur ou égal à 10, préférentiellement 5, dans lesquels peuvent s'intercaler un ou plusieurs hétéroatomes tels que 0, auquel cas on parlera de groupes polyéthers. Par reste d'acide aminé, on entend, classiquement, le reste d'acide aminé résultant de la réaction d'une fonction -NH2 d'un acide aminé ou -CO2H et analogues avec une fonction d'un autre composé, de sorte à former une liaison covalente. Par groupe pendant aromatique, on entend un 20 groupe latéral aromatique lié de façon covalente au groupe hydrocarboné tel que défini ci-dessus ou au reste d'acide aminé tel que défini ci-dessus, ce groupe aromatique pouvant comprendre un ou plusieurs hétéroatomes tels que 0, N et/ou S. Les séquences peptidiques cibles de l'invention peuvent être cibles d'une enzyme MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-5, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-19, MMP-23, MMP-25 et MMP-26. La séquence peptidique S1 peut être issue de séquences peptidiques naturelles rencontrées dans les 25 30 substrats naturels des MMP ou bien être issues de séquences synthétiques reconnues comme étant des substrats synthétiques des MMP. Les séquences synthétiques peuvent comprendre, par exemple les acides aminés ou groupes suivants . Nva (Nor-valine) ; Cha (3- cyclohexylalanine) ; Dpa (N-3(2,4-dinitrophényl)-L-2,3- diaminopropionyle) ; Abu : acide a-aminobutyrique ; Cys(Me) correspondant à la S-méthylcystéine, ce qui signifie que le groupe -SH est remplacé par le groupe - S-CH3. Dans la suite de cet exposé, on précise que les abréviations listées ci-dessous ont les significations suivantes : Gly : glycine ; Pro : proline ; Leu leucine ; Ala : alanine ; Gln : glutamine ; Ile isoleucine ; Arg : arginine ; Val : valine ; Tyr tyrosine ; Glu : glutamate ; Met : méthionine ; Phe phénylalanine ; Asn : Asparagine ; Thr : thréonine Ser : sérine ; His : histidine, ces abréviations correspondant à la nomenclature officielle à 3 lettres des acides aminés. Lorsque la séquence peptidique S1 est destinée à être cible de l'enzyme MMP-1, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala- SEQ. 1 - Ala-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln- SEQ. 2 - Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln- 5 10 15 20 25 30 SEQ.3 - Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Ile-SEQ.4 - Gly-Pro-Glu-Gly-Leu-Arg-Val-Gly-SEQ.5 -Tyr-Glu-Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-SEQ.6 - Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-Glu-Arg-SEQ.7 - Ala-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Ser-Thr-SEQ.8 - Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-SEQ.9 - Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-SEQ.10 - Thr-Glu-Gly-Glu-Ala-Arg-Gly-Ser-SEQ.11 - Pro-Cha-Abu-Cys(Me)-His-Ala-SEQ.12 McGeehan, G.M., et al. 1994. J. Biol. Chem. 269, 32814 - Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-SEQ. 13 Bickett, D.M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58 Lorsque la séquence peptidique S1 est destinée à être cible de l'enzyme MMP-2, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : - Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala- 35 SEQ.14 - Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys-SEQ.15 Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221 - Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg- SEQ.16 Murphy, G., et al. 1994. J. Biol. Chem. 269, 6632 Lorsque la séquence peptidique S1 est destinée à être cible de l'enzyme MMP-3, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : - Arg-Val-Gly-Phe-Tyr-Glu-Ser-Asp- SEQ.17 - Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr-SEQ.18 - Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-SEQ.19 - Ile-Ala-Gly-Arg-Ser-Leu-Asn-Pro-SEQ.20 - Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-SEQ.21 - Asp-Val-Ala-Gln-Phe-Val-Leu-Thr- SEQ.22 -Asp-Thr-Leu-Glu-Val-Met-Arg-Lys- SEQ.23 25 30 35 40 45 - Asp-Val-Gly-His-Phe-Arg-Thr-Phe-SEQ.24 -Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-Met-Leu-Thr- SEQ.25 - Arg-Val-Ala-Glu-Met-Arg-Gly-Glu- SEQ.26 - Asp-Leu-Gly-Arg-Phe-Gln-Thr-Phe-SEQ.27 - Pro-Phe-Ser-Pro-Leu-Val-Ala-Thr-SEQ.28 - Ala-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Ser-SEQ.29 - Phe-Ser-Ser-Glu-Ser-Lys-Arg-Glu-SEQ.30 - Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Phe-Gln-SEQ.31 Lorsque la séquence peptidique S1 est 35 destinée à être cible de l'enzyme MMP-9, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : - Gly-Pro-Pro-Gly-Val-Val-Gly-Pro- 40 SEQ.32 - Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Gly-Glu-SEQ.33 15 20 25 30 45 - Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-SEQ.34 - Ile-Pro-Gln-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-SEQ.35 - Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala-SEQ.36 Lorsque la séquence peptidique S1 est destinée à être cible de l'enzyme MMP-14, elle peut 15 ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Pro-Leu-Ala-Cys(p-OMeBz)-Trp-Ala-Arg- SEQ. 37 20 Mucha, A., et al. 1998. J. Biol. Chem. 273, 2763 Holtz, B., et al. 1999. Biochemistry 38, 12174 Lorsque X et/ou Y représentent un groupe 25 hydrocarboné, il peut s'agir notamment d'un groupe alkylène comportant de 1 à 4 atomes de carbone, dans lequel peut s'intercaler un ou plusieurs hétéroatomes. Lorsque X et/ou Y représentent un reste d'acide aminé, outre le fait qu'il peut s'agir d'un 30 reste d'acide aminé naturel ou non naturel, il peut s'agir d'un acide aminé comportant un groupe pendant aromatique, d'un acide aminé comportant un groupe pendant porteur d'un hétéroatome, tel que OH, SH. En particulier, X et/ou Y peuvent être un reste de 35 cystéine. En particulier, lorsque X et Y sont tous deux des restes de cystéine, ils sont avantageusement liés entre eux par un pont disulfure, conférant ainsi 10 une certaine stabilité au cyclopeptide résultant, lesdits restes pouvant ainsi répondre aux formules suivantes . les accolades correspondant aux endroits par lesquels sont liés les restes de cystéine, à savoir l'accolade au niveau du groupe -CO- étant l'endroit par lequel est lié ce groupe -CO- à MI, l'accolade au 10 niveau du groupe -NH- étant l'endroit par lequel est lié ce groupe -NH- à M2. M1 et/ou M2 peuvent être des groupes hydrocarbonés porteurs d'un groupe aromatique ou encore des restes d'acide aminé porteurs d'un groupe pendant 15 aromatique. Lorsque M1 et M2 sont tous deux porteurs d'un groupe aromatique, cela peut permettre la formation d'un complexe de nature hydrophobe ou du type n-stacking, qui participe à la stabilité des cyclopeptides de l'invention. De préférence, M1 et M2 20 sont porteurs de groupes aromatiques comprenant un noyau identique. Des groupes aromatiques susceptibles de convenir peuvent être des groupes benzéniques, anthracéniques ou coumarines. 25 De préférence, M1 et M2 sont des groupes hydrocarbonés ou des restes d'acide aminé porteurs d'un Il O 2N CH CI C H 2 SI+ u [_NHÏHCOH 5 groupe coumarine, ledit groupe coumarine pouvant répondre aux formules suivantes : OCH3 MC Ainsi, M1 et M2 peuvent correspondre à un reste d'acide aminé, tel que la lysine, porteur d'un groupe coumarine, de tels restes pouvant répondre à l'une des formules suivantes : 10 OC H3 NH� o NH+ ces restes étant dénommés par les abréviations respectives Lys(MC) et Lys(DAC). Des cyclopeptides particuliers conformes à l'invention peuvent être des cyclopeptide de formule générale telle que définie ci-dessus, dans laquelle : - M1 et M2 sont des restes d'acide aminé porteurs d'un groupe pendant aromatique ; - X et Y sont des restes d'acides aminés. o Des cyclopeptides particuliers conformes à l'invention peuvent être notamment des peptides de formule suivante . Cys M1ùS1ùM2ùCys S S SI, M1 et M2 étant tels que définis ci-dessus, les restes Cys liés à M1 et M2 répondant respectivement aux formules suivantes . O O Il II H2N ùCHùC-+ tfNH CH C OH l CH2 CH2 les accolades correspondant aux endroits par lesquels sont liés les restes de cystéine. S1 peut correspondre à une séquence cible d'une MMP-1 telle que définie ci-dessus, en particulier à la séquence suivante : -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala- Un cyclopeptide particulier conforme à l'invention peut être un cyclopeptide de formule suivante : ys-Lys(DAC)-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys(MC)- ys S S les groupes -Lys(DAC)- et -Lys(MC)- répondant aux formules respectives suivantes : o 15 OC H3 NH� o le groupe Cys lié au groupe Lys(DAC) répondant à la formule suivante . 010 tandis que le groupe Cys lié au groupe Lys(MC) répond à la formule suivante : B NH le groupe -Ala- pouvant être remplacé pour le groupe -Gly-, sans qu'il y ait perte d'activité. Dans certains cas de figure, les peptides de l'invention, outre le fait d'assurer un rôle d'inhibiteur, pourront être utilisés comme vecteur dans des applications d'imagerie ou de systèmes de délivrances de médicaments en milieu in vitro et in vivo afin de localiser et/ou de délivrer des médicament à l'endroit de surexpression, la MMP ciblant la séquence peptidique S. A titre d'exemples et non limitatif, les peptides de l'invention peuvent être alors couplés avec un radionucléide pour une utilisation en imagerie radionucléaire comme par exemple par radiomarquage au 8F, 50, C ou au 64Cu pour la tomographie d'émission de positons, à des fluorochromes, comme par exemple à un quantum dot, pour une utilisation en imagerie optique, à un agent de contraste pour l'imagerie par résonance magnétique comme par exemple à des chélates de gadolinium ou à des nanoparticules d'oxyde métallique, à des nonaparticules, comme les nanoparticules de polymères, des assemblages supramoléculaires ou encore à des liposomes pour des systèmes de délivrance de molécules biologiquement actives ou de médicaments. Les cyclopeptides de l'invention peuvent être préparés par des procédés mettant en jeu une étape de synthèse automatique sur une phase solide par un procédé classique, suivie d'un couplage des extrémités du peptide linéaire pout former le pont reliant les extrémités, de sorte à obtenir le cyclopeptide de l'invention, la cyclisation pouvant avoir lieu soit après avoir libéré le peptide de la phase solide, soit en le libérant ensuite de la phase solide. La phase solide est classiquement une résine porteuse de groupes aptes à réagir avec une fonction -NH2 ou -COOH de façon à former une liaison covalente, cette liaison étant destinée à être clivée ultérieurement, de façon à libérer le peptide une fois synthétisé. De telles résines peuvent être des résines dite de Wang fonctionnalisées, telles que la résine Fmoc-Cys(Acm)-Wang, le groupe Fmoc-Cys(Acm) correspondant à la formule suivante : O ..ä -CH2 S FmocNH CH C+ O Fmoc signifiant 9-fluorénylméthyloxycarbonyl et l'accolade représentant l'endroit par lequel le groupe Fmoc-Cys(Acm) est lié à la résine de Wang. Selon un premier mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend : a) une étape de préparation d'un peptide linéaire par synthèse chimique sur une phase solide ; b) une étape de libération du peptide linéaire de la phase solide ; et c) une étape de cyclisation par couplage des groupes présents aux extrémités du peptide linéaire, de sorte à obtenir le cyclopeptide de l'invention. Selon un second mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend : a) une étape de préparation du peptide linéaire par synthèse chimique sur une phase solide ; b) une étape de cyclisation par couplage des groupes présents aux extrémités du peptide 18 CI H2 linéaire, de sorte à obtenir le cyclopeptide de l'invention; et c) une étape de libération du cyclopeptide de la phase solide, les étapes b) et c) pouvant être réalisées de façon concomitante. Que ce soit pour le premier ou le second mode de réalisation, l'homme du métier utilisera, pour synthétiser le peptide linéaire, les groupes protecteurs appropriés. Dans le cas où X et Y sont des restes de cystéine, le peptide linéaire avant cyclisation correspondra à un peptide linéaire comportant la séquence suivante : HS-Cys-M1-S1-M2-Cys-SH, les groupes -SH appartement aux restes de cystéine. Les cyclopeptides de l'invention constituent d'excellents inhibiteurs d'enzymes protéases du type MMP. Plus précisément, l'utilisation des cyclopeptides de l'invention peuvent être envisagées de plusieurs façons : - ils peuvent être utilisés dans le domaine de la thérapie cancéreuse, ou plus largement pour toutes maladies faisant intervenir une dérégulation de l'activité métalloprotéasique ; - ils peuvent être utilisés sur support pour purifier une solution comprenant différentes MMP. Par exemple, une chromatographie d'affinité peut être effectuée sur une solution comportant la MMP à purifier, laquelle solution est amenée au contact d'un support greffé d'un cyclopeptide conforme à l'invention comportant une séquence cible de ladite MMP à purifier. Dans ces conditions, la MMP désirée s'accroche sur les cyclopeptides immobilisés sur le support, tandis que les autres MMP éventuellement présentes sont éluées. Le support est récupérée et la MMP désirée est décrochée ; - ils peuvent être utilisés comme vecteur dans le domaine de l'imagerie médicale ou dans le domaine thérapeutique. L'invention va maintenant être décrite par rapport aux exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure unique est un graphique représentant la variation d'intensité de fluorescence DIF donneur (en unités arbitraires a.u) d'un substrat de la MMP-1 (le peptide 1 répondant à la formule suivante : DNP-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-OH, DNP signifiant 2,4-dinitrophényle) en présence ou non de l'inhibiteur Cyclo-SS-MMP-1 (pas d'inhibiteur pour la courbe (a), inhibiteur à une concentration de 0,5 pM pour la courbe (b) et inhibiteur à une concentration de 1 pM pour la courbe (c)) , en fonction du temps t (en min), le substrat étant mis en présence d'une solution de MMP-1 (1nM). EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS Cet exemple illustre la préparation d'un cyclopeptide inhibiteur sélectif de la MMP-1, cet inhibiteur comportant une séquence peptidique S1 correspondant à une séquence cible d'une enzyme MMP-1, cette séquence étant la suivante : -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala- Cet inhibiteur est dénommé Cyclo-SS-MMP-1. La préparation de ce cyclopeptide comprend les séquences suivantes . a) le greffage d'un acide aminé de départ le Fmoc-Lys(MC) sur une résine Fmoc-Cys(Acm)-Wang ; b) la synthèse de la séquence -Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Leu-Leu-Ala- ; c) la modification du peptide obtenu par 10 greffages successifs de Lys(MAC) et Cys(Acm); d) la cyclisation du peptide linéaire. Dans les protocoles exposés ci-dessus, les abréviations suivantes ont été utilisées : Acm : S-acétamidométhyl ; ACN : 15 acétonitrile ; DAC : acide 7-diéthylaminocoumarin-3- carboxylique ; DCM : dichlorométhane ; DIEA : N,N'- diisopropyldiéthylamine ; DMF : diméthylformamide; Fmoc : 9-fluorénylméthyloxycarbonyle ; GABA : acide y- aminobutyrique ; HBTU : 0-benzotriazole-N,N,N',N'- 20 tétraméthyluroniumhexafluorophosphate ; HOBt : N- hydroxybenzotriazole ; MC : acide 7-méthoxycoumarin-3- carboxylique ; NMP : N-méthylpyrrolidone ; pAMPA acétate 4-aminophénylmercurique ; Tis triisopropylsilane PyBOP : benzotriazole-1-yloxy-tris- 25 pyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate ; TA température ambiante ; TFA : acide trifluoroacétique ; TRIS : tris(hydroxyméthyl)aminométhane ; Trt : trityl. Tous les produits chimiques et les solvants sont de qualité analytique et ont été achetés chez 30 Sigma. La résine Fmoc-Cys(ACM)-Wang, le PyBOP et tous les acides aminés (protégés en Na par Fmoc) ont été achetés chez Advanced Chemtech. Toutes les réactions chimiques ont été réalisées sous N2 avec des solvants anhydres. Le DMF a été desséché sur CaH2 au reflux pendant une nuit et distillé. Le DCM a été distillé avant utilisation. Les spectres UV/Visible ont été enregistrés sur un spectrophotomètre Hitachi modèle U-2010. Les spectres de fluorescence ont été réalisés sur un spectrofluorimètre PTI et un Jobin-Yvonb JY3 avec une cuve thermostatée à 37°C. La synthèse peptidique en phase solide a été effectuée sur un synthétiseur Applied Biosystem 433A. Les purifications ont été réalisées sur une HPLC Shimadzu en phase inverse (Longueurs d'onde 214, 267 et 254 nm) et colonne C18 SATISFACTION RP18AB 5 }lm, 250*4,6 mm. Le système de solvants utilisé pour l'élution est : (A) solution aqueuse de TFA à 0,1% et (B) solution aqueuse d'ACN à 70%. La spectrométrie de masse MALDI-TOF a été réalisée sur un Bruker Reflex III. a) Greffage du Fmoc-Lys(MC) sur une résine Fmoc-Lys (Acm) -Wang Le schéma réactionnel est le suivant : 1) 20% Pipéridine/DMF, TA, 30 min /S-Acm j~ ~OùWang Fmoc-HN 2) FmocLys(MC), PyBOP, HOBt, DIFA DMF, TA, 5 h Fmoc-NH` ^ ^ / /S-Acm O OùWang O O N H-MC le réactif Fmoc-Lys(MC) répondant à la formule suivante . OMe HO\ N H-Fmcc o les groupes Fmoc et Acm correspondant respectivement aux formules suivantes : CHz Où C ~CH2ù NH o o la résine obtenue étant symbolisée par 10 Fmoc-Lys (MC) -Cys (Acm) -Wang. Dans un premier temps, la résine Fmoc-Cys(Acm)-Wang (330 mg, 0,8 mmol/g) a été déprotégée (c'est-à-dire débarassée du groupe Fmoc) par mise en contact avec un mélange comprenant 20% de pipéridine 15 dans du DMF à température ambiante (T.A) pendant 3 heures. La présence d'amine primaire libre a été vérifiée par le test de Kaiser. Cette résine est mise à réagir avec de la Fmoc-Lys(MC) (330 mg, 0,578 mmol) en présence de PyBOP (260 mg, 0,58 mmol), de HOBt (82 mg, 0,6 mmol) et de DIEA (200 pL, 1,6 mmol) dans le DMF (5 mL) pendant 5 heures à température ambiante. La résine est, par la suite, filtrée et lavée avec du DMF, DCM et du méthanol. 464 mg de Fmoc- Lys(MC)-Cys(Acm)-Wang sont récupérés. Le taux de substitution de cette nouvelle résine a été déterminé à 0,53 mmol/g par mesure UV du complexe dibenzofulvène après traitement à la pipéridine. Les fonctions amines, qui n'ont pas réagi ont été acétylées en présence d'anhydride acétique (16 mg, 0,16 mmol), de pipéridine (12 mg, 0,16 mmol) dans du DMF (5 mL) pendant 40 minutes à température ambiante. b) Synthèse peptidique automatisée de la séquence Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Leu-Leu-Ala Le schéma réactionnel est le suivant : Fmoc-Lys(MC)-Cys(Acm)ù Wang H2N-G ly -Pro -Gln (Trt)-Gl y-Leu-Leu- Gly -Al a- Ly s(MC)-Cys (Acm)ù Wang La résine Fmoc-Lys(MC)-Cys(Acm)-Wang (188 mg, 0,1 mmol) est introduite dans le réacteur du synthétiseur. Les acides aminés (Gly, Pro, Gln(Trt), Leu et Ala) protégés en Na (Fmoc) sont introduits en excès (10 fois). Les étapes de couplage sont réalisées en présence de HBTU, HOBt et DIEA. Après 15 heures, 227 mg de peptide lié à la résine sont récupérés. 5 10 c) Modification du peptide Le schéma réactionnel est le suivant : H2N-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys(MC)-Cys(Acm)ùWang 1) Fmoc-Lys(DAC), PyBOP, HOBt, DIEA, DMF, TA, 5h 2) Fmoc-Cys(Acm), PyBOP, HOBt, DIEA, NMP, TA, 12h Fmoc-Cys(Acm)-Lys(DAC)-G1y-Pro-G1n(Trt)-G1y-Leu-Leu-G1y-A1a-Lys(MC)-Cys (Acmù W an g le FmocûLys(DAC) et le FmocûCys(Acm) répondant respectivement aux formules suivantes : N H-Fmoc S-Acm OH Fmoc-N O La FmocûLys(DAC) (190 mg, 0,3 mmol) est couplée au peptide sur résine en présence de PyBOP (153 mg, 0,3 mmol), de HOBt (40,53 mg, 0,3 mmol) et de HO o DIEA (99,1 pL, 0,6 mmol) dans du DMF (5 mL) pendant 5 heures à température ambiante. Par la suite, la résine est filtrée et lavée comme précédemment. 235 mg sont récupérés. Le taux de substitution est évalué à 0,28 mmol/g. Les aminés n'ayant pas réagi sont acétylées par la même procédure que celle décrite plus haut. Après un traitement avec 20% de pipéridine dans le DMF, la Fmoc-Cys(Acm) (207,24 mg, 0,5 mmol) est couplée au peptide sur la résine en présence de PyBOP (255 mg, 0,49 mmol), de HOBt (67,67 mg, 0,5 mmol) et de DIEA (165 pL, 1 mmol) dans la NMP (5 mL) à température ambiante pendant 12 heures. La résine est filtrée et lavée pour donner 253 mg de peptide sur résine. d) Cyclisation du peptide Ensuite, la cyclisation du peptide linéaire obtenu est opérée selon le schéma réactionnel suivant : Fmoc-Cys(Acm) -Lys(DAC)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Leu-Leu-Gly-Al a-Ly s(MC)-Cys(Acm)ù Wan g Ti(CF3CO2)3, DMF/Anisole (19:1) 0°C, 1,5 h Fmoc-y s-Lys(DAC)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Ly s(MC)-Cyy Wang s s 20% Pipéridine/DMF, TA, 30 min HzN-Cjs-Lys(DAC)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys(MC)- ysùWang S S TFAITIS/H20 (95:2,5:2,5), TA, 3h H2N-Cr s-Lys(DAC)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys(MC)- ys-OH s s Après un traitement avec 20% de pipéridine dans du DMF, la résine est mise en suspension dans une solution de DMF/anisole (19/1). L'ensemble est refroidi à 0°C et du Ti (CF3CO2) 3 (65,2 mg, 0,12 mmol) est ajouté. Après 1,5 h d'agitation, la résine est filtrée et lavée avec du DMF (50 mL) et du DCM (50 mL). Après déprotection de l'extrémité N- terminale (20% pipéridine/DMF), 112 mg de la résine est mise en suspension dans une solution de TFA/H20/TIS (95/2,5/2,5). Après 3 heures à température ambiante, la résine est filtrée, lavée avec du TFA (2*1 mL) et du 10 20 DCM (10 mL). Le filtrat est évaporé partiellement sous pression réduite puis noyé dans l'éther froid. Après 12 heures à -20°C, le précipité est filtré et lavé pour obtenir 38 mg de produit brut. Après purification par HPLC semi-préparative, 16 mg de Cyclo-SS-MMP-1 sont obtenus. La structure du peptide a été vérifiée par ESMS. La formule du produit obtenu est la suivante C s-Lys(DAC)-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys(MC)-C s S S le groupe Cys lié au groupe Lys(DAC) répondant à la formule suivante . 0 H2NùCHùC+ CH2 tandis que le groupe Cys lié au groupe Lys(MC) répond à la formule suivante : B NH CH C OH CH2 ce cyclopeptide étant dénommé par l'abréviation Cyclo-SS-MMP-1. e) Mesure de l'activité inhibitrice du Cyclo-SS-MMP-1 Les tests en présence de MMP-1 ont été réalisés dans un tampon TRIS 0,1 N (pH=7,46) en présence de 0,1 M de NaCl et de 10 mM de CaC12. Les tests ont été réalisés avec de la MMP-1 active et activée par du pAPMA (Sigma Aldrich). Avant leur utilisation, la présence de MMP-1 active a été contrôlée par électrophorèse. Différentes solutions mères ont été préparées pour effectuer les mesures de cinétiques : - Solution A : le peptide a été dissous dans la solution tampon, pour obtenir une concentration finale de 90 pM ; - Solution B : le peptide Cyclo-SS-MMP-1 a été dissous dans la solution tampon pour obtenir une concentration finale de 54,8 pM. Ces concentrations ont été vérifiées par mesure de l'absorbance à 431 nm (Àmax du fluorophore DAC, E=42000 M-1.cm-1). Tous les essais ont été réalisés dans un volume final de 2 mL avec une concentration finale de MMP-1 de 1 nM en faisant varier la concentration du peptide 1 (2,5 ; 5 et 10 pM) et du Cyclo-SS-MMP-1 (0,25 ; 0,5 et 1 pM). En présence du Cyclo-SS-MMP-1, on a pu constater une diminution de l'hydrolyse du peptide 1 au cours du temps (comme l'atteste la figure 1). Afin de tester l'activité du Cyclo-SS-MMP-1 sur d'autres MMP, des essais en présence du peptide 2 (Dabcyl-GABA-Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-EDANS-Ala-Lys-NH2), Dabcyl et EDANS signifiant respectivement acide 4-(4'-diméthylaminophénylaza)benzoïque et acide 5-(2'-aminométhyl)naphtalènesulfonique, et de MMP-9 ont été réalisées. Les essais en présence ou non de Cyclo-SS- MMP-1 n'ont pas montré de variation de l'hydrolyse du peptide 2 au cours du temps. f) Détermination de la constante d'inhibition Après addition de l'enzyme, l'hydrolyse du peptide 1 est suivie par l'augmentation de l'émission de fluorescence à 403 nm (MC) après excitation à 340 nm. Les différents graphes de variation de fluorescence de MC en fonction du temps sont obtenus en faisant varier les concentrations du peptide 1 et du cyclopeptide Cyclo-SS-MMP1. Les vitesses initiales sont alors extrapolées puis utilisées pour déterminer la constante d'inhibition K du Cyclo-SS-MMP1 par la représentation de Dixon. Elle est évaluée à 187 nM.20 REVENDICATIONS1. Cyclopeptide répondant à la formule suivante : X M1ùS1ùM2ùY dans laquelle : - S1 est une séquence peptidique cible d'une 10 enzyme MMP ; - M1 et M2 représentent, indépendamment, une liaison simple, un groupe hydrocarboné ou un reste d'acide aminé, éventuellement porteur d'un groupe pendant aromatique ; - X et Y représentent, indépendamment, une liaison simple, un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié, pouvant comporter dans sa chaîne, un ou plusieurs hétéroatomes, ou un reste d'acide aminé. 2. Cyclopeptide selon la revendication 1, dans lequel l'enzyme MMP est choisie parmi la MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-5, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-19, MMP-23, MMP-25 et MMP-26. 3. Cyclopeptide selon la revendication 2, dans lequel : 15 20 25 5 15 20 25 30- la séquence peptidique SI, lorsqu'elle est cible de l'enzyme MMP-1, répond à l'une des formules suivantes . -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-SEQ. 1 - Ala-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-SEQ. 2 - Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-SEQ.3 - Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Ile-SEQ.4 - Gly-Pro-Glu-Gly-Leu-Arg-Val-Gly-SEQ.5 -Tyr-Glu-Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-SEQ.6 - Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-Glu-Arg-SEQ.7 - Ala-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Ser-Thr-SEQ.8 - Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-SEQ.9 - Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-SEQ.10 - Thr-Glu-Gly-Glu-Ala-Arg-Gly-Ser-SEQ.11 - Pro-Cha-Abu-Cys(Me)-His-Ala-SEQ.12 - Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-SEQ. 13 ou 10 15 20 25 30 35 40- la séquence peptidique SI, lorsqu'elle est cible de l'enzyme MMP-2, répond à l'une des formules suivantes . -Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala- SEQ.14 - Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys- SEQ.15 - Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-SEQ.16 ou - la séquence peptidique SI, lorsqu'elle est cible de l'enzyme MMP-3, répond à l'une des formules suivantes . - Arg-Val-Gly-Phe-Tyr-Glu-Ser-Asp-SEQ.17 - Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr-SEQ.18 - Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-SEQ.19 - Ile-Ala-Gly-Arg-Ser-Leu-Asn-Pro-SEQ.20 - Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-SEQ.21 - Asp-Val-Ala-Gln-Phe-Val-Leu-Thr-SEQ.22 - Asp-Thr-Leu-Glu-Val-Met-Arg-Lys-SEQ.23 - Asp-Val-Gly-His-Phe-Arg-Thr-Phe-SEQ.24 - Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-Met-Leu-Thr- SEQ.25 - Arg-Val-Ala-Glu-Met-Arg-Gly-Glu- SEQ.26 - Asp-Leu-Gly-Arg-Phe-Gln-Thr-Phe-SEQ.27 - Pro-Phe-Ser-Pro-Leu-Val-Ala-Thr-SEQ.28 - Ala-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Ser-SEQ.29 - Phe-Ser-Ser-Glu-Ser-Lys-Arg-Glu-SEQ.30 - Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Phe-Gln-40 SEQ.31 ou - la séquence peptidique SI, lorsqu'elle est cible de l'enzyme MMP-9, répond à l'une des formules 45 suivantes . 10 15 20 25 30 35-Gly-Pro-Pro-Gly-Val-Val-Gly-Pro- SEQ.32 - Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Gly-Glu- SEQ.33 - Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro- SEQ.34 - Ile-Pro-Gln-Asn-Phe-Phe-Gly-Val- SEQ.35 - Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala- SEQ.36 ou - la séquence peptidique SI, lorsqu'elle est cible de l'enzyme MMP-14, répond à l'une des formules suivantes . -Pro-Leu-Ala-Cys(p-OMeBz)-Trp-Ala-Arg-30 SEQ. 37 4. Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le groupe X et le groupe Y représentent un reste d'acide aminé 35 comportant un groupe pendant aromatique ou un reste d' acide aminé comportant un groupe pendant porteur d'un hétéroatome, tel que OH, SH. 5. Cyclopeptide selon l'une quelconque des 40 revendications précédentes, dans lequel le groupe X et 10 15 20 25 5 15le groupe Y répondent respectivement aux formules suivantes . Il II H2N CH C� NH CH C OH l H2 H2 SI+ +SI 6 . Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel M1 et M2 sont des groupes hydrocarbonés ou des restes d'acide aminé porteurs d'un groupe pendant aromatique. 7. Cyclopeptide selon la revendication 6, dans lequel le groupe pendant aromatique est un groupe benzénique, anthracénique ou coumarine. 8. Cyclopeptide selon la revendication 7, dans lequel le groupe coumarine répond à l'une des formules suivantes .OC H3 MC 9. Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : - M1 et M2 sont des restes d'acide aminé porteurs d'un groupe pendant aromatique ; et - X et Y sont des restes d'acide aminé. 10. Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel M1 et M2 répondent respectivement aux formules suivantes :OC H3 10 NH+ o o 11. Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, répondant à la formule suivante : Cys M1ùS1ùM2ùCys S S SI, M1 et M2 étant tels que définis dans les revendications précédentes et les restes Cys liés à M1 et M2 répondant respectivement aux formules suivantes :O O Il +NHùCHùCùOH HCH C� CH2 CH2 4- 12. Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la séquence peptidique S1 répond à la formule suivante : -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala- 13. Cyclopeptide selon la revendication 12, répondant à la formule suivante: ys-Lys(DAC)-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys(MC)- ys S S les groupes -Lys(DAC)- et -Lys(MC)- répondant aux formules respectives suivantes : oOC H3 NH� o le groupe Cys lié au groupe Lys(DAC) répondant à la formule suivante : 0 tandis que le groupe Cys lié au groupe Lys(MC) répond à la formule suivante : B NH-14. Utilisation d'un cyclopeptide tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 en tant qu'inhibiteurs d'une enzyme protéase MMP.