FR 2926465 A1 20090724 FR 0800245 A 20080117 COMPOSITION ANTIVIRALE ET RETROVIRALE NOTAMMENT LE SIDA L'invention a pour objet des compositions possédant notamment des propriétés antivirales, et en particulier antirétrovirales. La lutte contre les maladies provoquées par les rétrovirus mobilise de nombreuses équipes de chercheurs de par le monde. En particulier, des efforts considérables sont déployés pour lutter contre l'épidémie du SIDA (Syndrome d'Immunodéficience acquise). On sait que l'agent responsable su SIDA est un rétrovirus, appelé VIH, pour Virus de l'Immunodéficience Humaine, ou le plus communément HIV, selon la désignation abrégée en anglais. Les médicaments antiviraux les plus utilisés sont des dérivés de nucléosides, j dont la zidovudine, ou AZT, qui fut le premier antiviral disponible. Depuis l'émergence de mutants résistants a conduit à rechercher de nouveaux traitements. Les travaux réalisés par l'inventeur sur un mélange de produits d'origine naturelle l'ont amené à mettre au point des compositions de grande efficacité pour inactiver le pouvoir infectieux de HIV. L'invention a pour but de fournir de nouvelles compositions antirétrovirales capables. Elle vise également u procédé d'obtention de telles compositions. Les compositions selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir d'extraits de noix de coco, de solution de sels minéraux, d'extraits de cactacée, de liliacée, d'anacardiacée et d'euphorbiacée, de graminée, de -&, musacée, de passiflorée, .de rutacée, d'artocarpée, de bombacée et de poux de bois. La noix de coco est le fruit du cocotier. Conformément à l'invention, on utilise avantageusement la chair blanche rapée. Les cactacées convenant particulièrement pour la mise en oeuvre de 5 l'invention comprennent l'opuntia. On rappelle que l'opuntia est le nom génétique de la raquette, du nopal, du figuier de barbarie et autres espèces originaires de l'Amérique tropicale. On utilise plus spécialement les fruits de la raquette verte. Des liliacées appropriées dans le cadre de l'invention comprennent la 3-o salsepareille, et l'aloès. On utilise avec avantage la racine de salsepareille et la crème d'aloès. Comme anarcadiacée, on a plus particulièrement recours au mombin, et notamment à l'écorce de mombin. ) es euphorbiacées particulièrement préférées sont constituées par le ricin et le 3S manioc doux. Les graines de ricin, notamment à l'état grillé et sous forme de poudre, sont plus spécialement utilisées pour l'invention. Le manioc est utilisé sous forme râpée dans le cadre de l'invention. Des graminées appropriées dans le cadre de l'invention comprennent le maïs et le vétiver. On utilise avec avantage les stigmates du maïs (chevelures de maïs) et LQ les racines de vétiver. Comme musacée, on a plus particulièrement recours aux racines de bananier pourri Une passiflorée particulièrement préférée est constituée par la calebasse marron. Des rutacées convenant particulièrement pour la mise en oeuvre de l'invention comprennent le citron. Des artocarpées appropriés dans le cadre de l'invention comprennent l'arbre à pain. On utilise avec avantage le fruit de l'arbre à pain. Comme bombacée, on a plus particulièrement recours au mapou ou racine de baobal. Les poux de bois sont également utilisés dans le cadre de l'invention. On utilise avantageusement les poux de bois vivants dans leur nid. Des composition préférées sont élaborées à partir de noix de coco rapée, d'eau de mer, de fruits de raquette verte, de racines de salsepareille, d'écorce de mombin, 3 de poudre de graines de ricin grillées, d'aloès, de maïs, de racine de vétiver, de coeur de bananier pourri et séché, de poux de bois, de callabasse marron, de citron, de fruit à pain, du mapou ou baobal, de manioc doux rapée. On utilise avantageusement ces différents ingrédients selon les proportions suivantes : - poudre de noix de coco (de préférence, chair blanche rapée) : équivalent d'environ 10 noix de coco -solution de sels minéraux (notamment sodium, potassium, magnésium, calcium, phosphates, chlorures, sulfates, carbonates et bicarbonates), par exemple eau de mer : 3 à 5 litres, en particulier 4 litres - raquette, notamment fruits de raquette verte râpés : 10 à 20 fruits cul respondant à 1 ou 2 Kg - racine de sa Isepareille : 500g à 1Kg, notamment 75 g environ - écorce de mombin : de 500 g à 1,5Kg en particulier 1 Kg - graines de ricin grillées et moulues : de 500 g à 1,5Kg, notamment 1Kg environ ;_- de 100 à 300 g de centre de coeur de bananier pourri, et de préférence 200g -10 à 30 g de stigmate de maïs ou la valeur de 2 maïs - de 300 à 700 g de manioc doux rapée 3c> L'aloès peut peser de 75 à 125g, et notamment 100g. On utilise une cuillerée à soupe de calebasse. On utilise un citron, de préférence coupé en àu moins trois morceaux. On utilise de 15 à 35 centigrammes d'écorce de mapou ou de baobal, et de préférence environ 25 centigrammes. On utilise de la racine de vétiver à raison de 10 à 30 g centigrammes, et de préférence à raison de 20 g. Le fruit de l'arbre à pain à peine à maturité représente une quantité dans la composition de 10 à 30g. On utilise 1 à 2 I d'eau lustrale, notamment 1,51 ; obtenue de la manière suivante : prendre les poux de bois vivants dans leur nid, brûler le nid avec les poux ; la cendre obtenue est disposée sur un linge et passée à l'eau de pluie ; le liquide ainsi obtenu est l'eau lustrale. On utilise 400 à 600 ml de vinaigre en tant qu'acide acétique, notamment 500ml I1 L'invention a pour but de guérir le SIDA et de guérir et soulager la prostate et le kyste. Lorsque l'on souhaite obtenir un effet virucide, on utilise 4 à 5 I de vinaigre. Les compositions de l'invention sont telles qu'obtenues en laissant macérer de la noix de coco en poudre avec du vinaigre pendant environ 24h, en ajoutant au filtrat du mélange de macération les divers ingrédients énumérés ci-dessus, avantageusement selon les proportions indiquées, en portant le mélange obtenu à ébullition pendant au moins 1h et en récupérant le filtrat. La solution est soumise ensuite à un protocole classique d'extraction de composé actif, L'invention vise également un procédé d'obtention des compositions définies ci-dessus, caractérisé par les étapes précédemment rapportées. Il a été procédé à : 1) Une délipidation éventuelle à pH neutre par du pentane qui a conduit, après évaporation du solvant, à une première fraction baptisée F1, puis par du chlorure de méthylène pour donner la fraction F2 après évaporation sous pression réduite. 2) La solution est ensuite basifiée à pH 9 par ajout d'ammoniac et est extraite de l'acétate d'éthyle puis du chlorure de méthylène qui, après élimination du solvant, donne la fraction F7. Le tableau ci-dessous donne les différentes masses de substrats obtenues dans ces conditions. Volume de solution : 2000 ml Masse de solution : 2034,8g X15 Aspect : orange clair pH : 4-5 Manipulation pH Masse extraite Délipidation Initial 140 mg Extraction pentane Délipidation Initial 105 mg Extraction CH:,CL2 Acétate d'éthyle Basique 69 mg sur 0,5 I Dichlorométhane Basique 26 mg sur 0,5 I Compte tenu de l'identité des spectres IR et des chromatogrammes HPLC (ci-joints), les fractions extraites avec le dichlorométhane et l'acétate d'éthyle sont réunies. La fraction initiale extraite au pentane présente des caractéristiques différentes. Q Ces deux fractions sont purifiées par HPLC sur colonne C18 semi-séparative. On obtient ainsi : - 66 mg de la fraction extraite au dichlorométhane et à l'acétate d'éthyle, - 73 mg de la fraction extraite au pentane Après analyse chimique complète par les techniques IR, UV et RMN (proton et carbone) - 73 mg de la fraction extraite au pentane F2 - 53 mg de la fraction extraite au dichlorométhane et à l'acétate d'éthyle F7 Les deux fractions F2 et F7 ont été solubilisées dans 200 pl de diméthylsulfoxyde 3------') o Inactivation du virus La suspension cle particules virales A dans le milieu de culture RPMI 1640 (HIV-1 III B, activité transcriptase inverse 3,8x106 cpm/ml) est incubée avec F2 et F7 pendant 20 min à 4°C, puis 1 heure à température ambiante, enfin 2 heures à 37°C. En fin d'incubation, le mélange est dilué au 1/10ème, 1/20, 1/40, 1/100, J- (b 1/200 dans le milieu de culture RPMI 1640 plus 10% de sérum de veau foetal (SVF), chauffé au préalable durant 30 min à 56°C. o Infection Des culots de 5 x 105 cellules MT4 (cellules humaines d'origine lymphoïde transformées par HTLV-1) sont remis en suspension dans 250 pl des différentes dilutions du mélange virus-composition. Après 1 heure d'adsorption à température ambiante, avec remise en suspension des cellules toutes les 15 min, le virus non adsorbé est éliminé par centrifugation des cellules. Celles-ci sont lavées deux fois avec du RPMI, puis remises en suspension dans le milieu RPMI 10% SVF, à la concentration de 2x 105 /ml. Les cellules infectées sont mises en culture dans des plaques de microtitration (Costar 96 godets) à raison de 200 pl/godet. Toutes les cultures sont faites au moins en double. Les cultures sont diluées avec un volume identique cle milieu après 5 jours et 8 jours d'infection. Une série de cultures témoins sont infectées en parallèle avec la suspension de virus A mélangée (VN) avec du milieu RPMI. Les incubations et les dilutions sont . 5 réalisées strictement dans les mêmes conditions que pour le virus traité avec la composition. On évalue la production de HIV après infection de cellules MP4 avec du virus préincubé avec la composition. Les fractions F2 et F7 inhibent la réplication du VIH-1 dans les cellules MT-4. ,2`, Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins une composition telle que définie ci- dessus, en association avec un véhicule pharmaceutique inerte. Ces compostions sont particulièrement appropriées pour la prévention et le '' traitement du SIDA, le cas échéant en combinaison avec d'autres médicaments. v5 Ces compositions sont administrées de préférence par voie injectable sous forme de solutions ou de suspensions injectables isotoniques vis-à-vis du plasma sanguin. L'étude des propriétés des compositions de l'invention a mis en évidence un effet inhibiteur de l'activité reverse transcriptase de HIV-1 pouvant dépasser 90% par rapport à l'activité mesurée chez les témoins. On constate également une diminution ~jode l'effet cytopathogène de HIV-1 chez des cellules infectées par ce virus, traitées par des compositions de l'invention. L'absence de toxicité de ces compositions a été vérifiée sur la souris par injection intra-péritonéale à pH physiologique. L'invention vise donc la mise à profit des propriétés de ces compositions pour S l'élaboration de compositions pharmaceutiques. La quantité de principe actif varie suivant l'état du patient, la posologie chez l'homme étant le plus souvent de l'ordre de 1 à 500 mg par jour de principe actif (extrait sec). L'invention sera illustrée ci-après par un exemple de préparation d'une composition de grande efficacité vis-à-vis du virus HIV-1 et par les résultats d'essais in vitro et in ,lo vivo. Exemple 1 : Préparation d'une composition selon l'invention On ajoute au filtrat récupéré les ingrédients suivants : - solution riche en minéraux, comme de l'eau de mer : 41 ; - raquette verte rapée : 1,5 Kg S racine de salsepareille : 750g - écorce de mombin : 1 Kg - poudre de graines de ricin grillées : 1 Kg - 20 g de stigmate de mais ou la valeur de 2 maïs 400 g de manioc doux rapée 100g d'aloès - 1 cuillerée à soupe de calebasse un citron, de préférence coupé en au moins trois morceaux - écorce de mapou ou de baobal : 25 centigrammes - racine de vétiver : 20 g Le fruit de l'arbre à pain à peine à maturité : 20g - Eau lustrale : 1,51 Le mélange ainsi obtenu est porté à ébullition pendant environ l h, puis filtré. Exemple 2 : Etude de l'inactivation de HIV-1 par la composition de l'exemple 1. La production de virus a été mesurée par un dosage de l'activité transcriptase inverse associée aux particules virales libérées par les cellules dans le milieu de culture. La transcriptase inverse est également appelée transcriptase reverse ou RT en abrégé. Le test RT est fait sur 65 pl de milieu selon le protocole décrit par Moog et Col., dans Antiviral Research, 24 (1994), 275-288. Les résultats sont exprimés en cpm/essai a2.S" (tableau, partie inférieure). La viabilité cellulaire est mesurée par le test MTT décrit par Moog et Col. Dans la référence donnée ci- dessus (tableau, partie supérieure). L'intensité de la coloration est exprimée en milli DO. Expérience A : On évalue la production de HIV après infection de cellule MT4 avec du virus Q préincubé avec la composition. Après 5 ou 7 jours d'infection, les valeurs des RT sont comprises entre 699 et 1538 cpm/essai, alors que, pour des surnageants de cultures non infectées, elles sont de 1400-2100 cpm/essai. Toutes les cultures infectées avec le virus non traité produisent du virus de J5 à J11. Expérience B : On évalue la production de HIV après infection de cellules CEM-SS 35- par HIV-1 Lai Une suspension, de virus B (HIV-1 Lai, activité reverse transcriptase 3x106 cpm/ml) incubée (v/v) avec la composition. Toutes les autres étapes sont celles décrites pour l'expérience faite sur cellule MT4. Dans ces conditions, les cellules infectées avec le virus préincubé avec la 'o' composition, les R-r sont semblables à celles mesurées sur des surnageants de cultures non infectées (1707-2564 cpm/essai) après 11 jours d'infection. Expérience C : Le protocole expérimental suivi est identique à celui de l'expérience A. Les mesures ;tes à J5 et J7 post-infection montrent qu'on ne détecte pas, ou très peu, de réplication du virus lorsqu'il a été préincubé avec la composition (RT des cellules témoins non infectées 972-12192 cpm/essai) Expérience D : Afin de pouvoir mesurer la production de virus à des temps plus précoces que dans l'expérimentation B, une concentration de virus 10 fois supérieure a été utilisée. _a production de virus après 5 et 8 jours est très fortement inhibée par la préincubation du virus avec la composition. L'absence d'effet observé en utilisant la solution 0.15 M NaCI indique que l'inhibition du virus est spécifique de la composition. Ces résultats montrent donc que la préincubation du virus HIV-1 avec la composition de l'invention entraîne une inactivation du pouvoir infectieux des particules virales. Exemple 3 : Etude de l'effet de la composition de l'exemple 1 sur l'activité reverse transcriptase dlHIV-1. 4'5 Une suspension cle virus HIV-1 a été mélangée (v/v) à différentes dilutions de la composition. La détermination de l'activité réverse a été effectuée comme décrit par Moog et Al., dans la référence ci-dessus. Les mesures ont été effectuées sur au moins deux échantillons. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 1. On constate que l'utilisation de la composition, aux concentrations les plus élevées, inhibe l'activité RT de plus de 90%. Une autre série d'expériences, dont les résultats sont donnés dans le tableau 2, confirme les données précédentes. Ces expériences mettent donc en évidence que les compositions selon l'invention sont capables d'inhiber l'activité de la réverse transcriptase mesurée in vitro. Tableau 2 ù Activité RT (Cpm/essai) DILUTION FINALE DES COMPOSITIONNIRUS SOLUTIONS 7553 Moyenne 83 666 (100%)* 1~4 5925 724 (100%) 24 1/8 572 507 (100%) 1/16 7970 854 (100%) 1/32 27.045 28.790 (82%) 30. 535 1/64 55.180 63.265 (60%) 71.351 1/128 108.652 106.163 (32%) 103.673 1/256 129.555 118.548 (24%) 107.540 1/512 81.234 115.466 (26%) 149.698 1 /1024 167.936 156.267 144.598 Témoin virus 157.233 155.059 Moyenne 156.146 *Les chiffres entre parenthèses indiquent le % d'inhibition de l'activité RT. Tableau 1 Activité RT (Cpm/essai) DILUTION FINALE COMPOSITION / VIRUS DES SOLUTIONS 1/2 1.164 MOYENNE 783 973 (93 %)* 759 1/6 688 724 (94 %) 2.453 1/8 2.875 2664 (80 %) 6.875 1/54 5.949 6.412 (50 %) 10.035 1/162 8.220 9.128 (29 %) 11.747 1/486 12.981 12.364 * Les chiffres entre parenthèses indiquent le % 30 d'inhibition de l'activité RT 14.318 10.743 11.764 TEMOIN VIRUS 12.687 12.218 15.036 MOYENNE 12.794 10 15 20 25 Tableau 2 -Activité RT (Cpm/essai) DILUTION FINALE COMPOSITION / VIRUS DES SOLUTIONS MOYENNE 1/2 550 783 666 (100 %)* 925 1/4 524 724 (100 %) 572 1/8 442 507 (100 %) 910 1/16 797 854 (100 %) 27.045 1/32 30.535 28.790 (82 %) 55.180 1/64 71.351 63.265 (60 %) 108.652 1/128 103.673 106.163 (32 %) 129.555 1/256 107.540 118.548 (24 %) 81.234 1/512 149.698 115.466 (26 %) 167.936 1/1024 144.598 156.267 157.233 MOYENNE 30 TEMOIN VIRUS 155.059 156.146 * Les chiffres entre parenthèses indiquent le % d'inhibition de l'activité RT 10 15 20 25 Masse de solution initiale = 61g pH solution initiale = 6 Volume de solution initiale = 60-65m1 Projet 11 Manipulations Fractions Volume de solvant en ml Masse en g [)elipidation Extraction au n Pentane F1 2x25 s Extraction au chlorure de methylene F2 3x25 0,142 Acidification 1 Fraction obtenue après acidification F3 masse= 14mg Fraction obtenue après basification F7 masse= 11 mg Fraction obtenue après une seconde lyophilisation F7' masse= 0.480g Fractions obtenues après la reprise a l'ethanol : Après filtration, le précipité nommé FO Après évaporation la pate nommé F8 FO masse= 1.405g F8 masse= 1.596g REVENDICATIONS 1/ Composition possédant notamment des propriétés antivirales et, en particulier, élaborées à partir d'acide acétique et d'extraits de poudre de noix de coco, de solution de sels minéraux, d'extraits de cactacée, de liliacée, d'anacardiacée, et d'euphorbiacée. 2/ Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on utilise la chair blanche râpée de la noix de coco. 3/ Composition selon la revendication 1 ou 2 , caractérisée en ce qu'on utilise une opuntia, comme cactacée, en particulier de la raquette, et plus spécialement des fruits de la raquette verte. 4/ Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'on utilise, comme liliacée, de la salsepareille, en particulier de la racine de salsepareille. 5/ Composition selon l'une des revendications là 4, caractérisées en ce qu'on utilise, comme anacardiacée, du mombin, en particulier de l'écorce de mombin. 6/ Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'on utilise, comme euphorbiacée, des graines de ricin, en particulier de la poudre de graines de ricin grillées. qü' - i - Lem r e...;,% - poudre âe noix de coco (de préférence, chair blanche rapée) : équivalent d'environ 10 noix de coco - solution de sels minéraux . (notamment sodium, potassium, magnésium, calcium, phosphates, chlorures, sulfates, carbonates et bicarbonates), par exemple eau de mer : 3 à 5 litres, en particulier 4 litres - raquette, notamment fruits de raquette verte râpés 10 à 20 fruits cul respondant à 1 ou 2 Kg - racine de salsepareille : 500g à 1Kg, notamment 75 g environ - écorce de mombin : de 500 g à 1,5Kg en particulier 1Kg - graines de ricin grillées et moulues : de 500 g à 1,5Kg, notamment 1Kg environ Composition selon l'une des revendications 1 à E, caractérisée en ce- de 100 à 300 g de centre de coeur de bananier pourri, et de préférence 200g - de 10 à 30g de stigmate de maïs ou la valeur de deux maïs - de 300 g à 700 g de manioc doux râpée L'aloès peur peser de 75 g à 125 g, et notamment 100 g. On utilise une cuillérée à soupe de calebasse. On utilise un citron, de préférence coupé en au moins trois morceaux .On utilise de 15g à 35 centigrammes d'écorce de mapou ou de baobal, et de préférence environ 25 centigrammes. On utilise de la racine de vétiver à raison de 10 à 30 centigrammes, et de préférence à raison de 20 g. Le fruit de l'arbre à pain à peine à maturité représente une quantité dans la composition de 10 g à 30 g. On utilise 1 à 2 litres d'eau lustrale, notamment 1,5 litre ; obtenue de la manière suivante : prendre les poux de bois vivants dans leur nid, brûler le nid avec les poux ; la cendre obtenue est disposée sur un linge et passée à l'eau de pluie ; le liquide ainsi obtenu et l'eau lustrale. On utilise 400 à 600 ml de vinaigre en tant qu'acide acétique, notamment 500 ml Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce le est élaborée à partir d'acide acétique, de noix de coco râpée, d'eau de mer, de fruits de raquette verte, de racine de salsepareille, d'écorce de mombin, de poudre de graines de ricin grillées. 9) Composition selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'on utilise s différents ingrédients selon les propsrtions suivantes : - 400 grammes de vinaigre et 3 litres ou 4 litres � d'acide acétique �. - poudre de noix de coco (de préférence, chair blanche râpée) : équivalent d'environ 10 noix de coco ; solution de sels minéraux (notamment sodium, potassium, calcium, magnésium, phosphates, chlorures, sulfates, carbonates et bicarbonates), par exemple eau de mer : 3 à 5 litres, en particulier 4 litres ; - raquette, notamment fruits de raquette verte râpés : de 10 à 20 fruits correspondant à 1 à 2 kg, notamment 15 fruits environ correspondant à environ 1,5 kg ; - racine de salsepareille : 500g à lkg, notamment 750g environ ; - écorce de mombin : 500g à 1,5kg, en particulier environ 1 kg ; - graines de ricin grillées et moulues : de 500g â 1,5 notamment environ 1 kg. r 4 5� 2926465 10/ Procédé d'obtention d'une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on fait macérer de la noix de coco en poudre avec de l'acide acétique, pendant environ 24 heures, on ajoute au filtrat du mélange de macération les ingrédients selon l'une des revendications 1 à 8, on porte le mélange à ébullition pendant au moins 1 heure et on récupère le filtrat. Il/ Médicaments possédant notamment des propriétés antirétrovirales, caractérisés en ce qu'ils renferment une quantité efficace d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9., en association avec un véhicule inerte.