FR 2929850 A1 20091016 FR 0802019 A 20080414 -1- Inhibiteurs de l'enzyme tyrosinase La présente invention a pour objet des inhibiteurs de l'enzyme tyrosinase et leurs applications dans des compositions cosmétiques et alimentaires pour un effet de blanchiment de la peau. Ces inhibiteurs de tyrosinase sont caractérisés en ce qu'ils sont élaborés à partir de tétramères de resvératrol et plus particulièrement des molécules de la famille des vitisines, et/ou de leurs glycosides et/ou de leurs esters, et/ou d'extraits naturels en contenant, et plus particulièrement à partir d'extraits de racine de vigne et/ou d'extraits de cep de vigne. La coloration de la peau dépend de la production de mélanine par les mélanocytes, cellules de la couche basale. Ces cellules ont des prolongements cytoplasmiques qui s'insinuent entre les kératinocytes de l'épiderme. La mélanine est produite par les mélanocytes au niveau des mélanosomes, organites cytoplasmiques. Ces mélanosomes résultent de la fusion entre des vésicules contenant de la tyrosinase et d'autres composés. On décrit deux types de pigments : l'eumélanine (noir/marron) et phéomélanine (jaune/orangé). Ces pigments sont produits à partir de la L-tyrosine qui est hydroxylée en L-Dopa par la tyrosinase. La L-dopa est ensuite oxydée en dopaquinone par cette même enzyme. La dopaquinone réagit ensuite avec la cystéine entrant dans la voie de synthèse de la phéomélanine. Si la quantité de cystéine est faible dans la cellule, la dopaquinone s'oxyde spontanément en dopachrome et suit la voie de synthèse de l'eumélanine. La tyrosinase est l'enzyme clef de la synthèse de la mélanine. La synthèse de la mélanine est soumise à des régulations complexes, par des hormones, des cytokines ainsi que par certaines prostaglandines. La mélanine produite s'accumule dans les mélanosomes et est ensuite transférée dans les kératinocytes, et colore ainsi la surface de la peau. Le rôle de la mélanine est de protéger les noyaux des cellules contre les rayons ultraviolets du soleil. Lors du vieillissement cutané, les mélanocytes sont altérés et la régulation de la production de mélanine est perturbée. Ce dysfonctionnement entraîne l'apparition de tâches brunâtres sur la peau, plus communément appelées � tâches de vieillesse �. -2- L'utilisation d'inhibiteurs de tyrosinase conduit à limiter la production de mélanine. Cette méthode est couramment utilisée en dermo-cosmétique pour blanchir et unifier le teint de la peau ou pour estomper les tâches brunâtres dues au vieillissement cutané. L'inhibiteur de tyrosinase de référence est l'acide kojique, utilisé dans des compositions cosmétiques à effet de blanchiment. L'hydroquinone a également longtemps été utilisée, avant que sa toxicité sur la peau ne soit démontrée. Des extraits végétaux ayant une activité anti-tyrosinase ont été développés. On peut citer l'extrait de Rumex, de Morus Alba (mûrier), de l'algue Elephantopus mollis, ou encore de licorice. Le resvératrol [Bo-Seong and al, 1998] et ses dérivés, l'alpha-viniférine [Bo-seong and al, 1998], l'epsilon-viniférine [FR2842102;], le picéide, le vaticanol A, le vaticanol G, le vaticanol B, l'hopéaphenol et le picéatannol ont déjà été décrits comme des inhibiteurs de tyrosinase. L'activité de ses produits n'est pourtant pas satisfaisante et les cosmétologues sont toujours à la recherche d'inhibiteurs de tyrosinase naturels et plus performants. De manière surprenante et inattendue, la demanderesse a découvert que les vitisines présentent la particularité d'inhiber efficacement l'activité de l'enzyme tyrosinase, et ce de façon plus efficace que les autres oligomères de resvératrol décrits dans l'art antérieur. Dans l'art antérieur, les vitisines ont été décrites comme ayant des propriétés anti-oxydantes, neuroprotectrices, anti-inflammatoires et contre l'agrégation plaquettaire. Mais leur capacité à inhiber l'activité de l'enzyme tyrosinase n'a jamais été décrite à ce jour. De la même manière, la demanderesse a également découvert qu'un extrait de racine de vigne et un extrait de cep de vigne, ayant des teneurs en vitisines particulièrement élevées, présentent la particularité d'inhiber l'activité de l'enzyme tyrosinase, et ce de façon plus efficace que les autres extraits de la vigne décrits dans l'art antérieur. Dans l'art antérieur, les extraits de sarments de vigne [FR2842103], ort été décrits comme inhibiteur de tyrosinase du fait de leur teneur en resvératrol et en viniférine. L'extrait de racine et l'extrait de cep de vigne qui présentent des teneurs élevées en vitisines n'ont jamais été décrits dans l'art antérieur comme inhibiteurs de la tyrosinase. -3- L'invention a donc pour objet des inhibiteurs de tyrosinase élaborés à partir de vitisines et de leurs dérivés. Sans que cette liste ne soit limitative, le terme vitisines comprend, la vitisine A, la vitisine B, la vitisine C, la vitisine D et la vitisine E. Sans que cette liste ne soit limitative, les dérivés de vitisines représentent les glycosides de vitisines, notamment les glucosides de vitisines, et les esters de vitisines, notamment les acétates de vitisines. Selon l'invention, les vitisines peuvent être utilisées seules ou en mélange, être d'origine naturelle ou synthétique, ou être le constituant d'un extrait naturel. L'invention a aussi pour objet des inhibiteurs de tyrosinase élaborés à partir d'extraits de racine et/ou d'extraits de cep de vigne contenant des vitisines. La teneur en vitisines de ces extraits est généralement comprise entre 1 et 80%. L'invention concerne aussi les autres extraits végétaux contenant des vitisines et/ou des dérivés de vitisines. Sans que cette liste ne soit limitative, on peut citer, les extraits de vin, les extraits de rafle de vigne, les extraits de Cassia quinquangulata Rich, de Shorea hemsleyana, de Caragna chamlagu, de Carex humilis, de Cyphostemma crotalarioides, de Hopea parviflora, de Iris clake , de Sophora davidii, de Vatica rassak et de Vitaceae du genre Vitis. L'invention a également pour objet l'utilisation des inhibiteurs de l'enzyme tyrosinase élaborés à partir de vitisines ou de leurs dérivés, seuls ou contenus dans un extrait végétal, dans des compositions cosmétiques et alimentaires afin de limiter la production de mélanine ; ceci dans le but de blanchir le teint de la peau ou de prévenir et de traiter les affections dues au dérèglement de la synthèse de la mélanine liée à l'âge et ainsi d'atténuer les tâches de vieillesse. Les compositions cosmétiques et alimentaires contenant ces nouveaux inhibiteurs de tyrosinase peuvent se présenter sous forme de liquides, de pâtes, de crèmes, d'émulsions, de lotions, d'huiles, de gels, de masques, de solides, de poudres, de granulés, de sprays, d'aérosols, de comprimés, de sirops, présentées dans des contenants adéquats tels que flacons, bouteilles, sachets, pots, boites, ampoules, gélules, crayons, porte-bâtons. Ces compositions cosmétiques et alimentaires peuvent être composées d'émulsion huile/eau ou eau/huile, d'émulsion à phases gémellaires, de micro-émulsion, d'émulsion PIT, de nanoémulsion, d'émulsion multiple eau/huile/eau ou huile/eau/huile, de pseudoémulsion (dispersion de deux phases non miscibles au moyen de gélifiants), de gel aqueux, de gel gras, de gel hydro-alcoolique, de phase grasse, de suspension, -4- de savon solide ou liquide, de solution moussante, de liquide aqueux, de liquide gras, de liquide hydro-alcoolique, de poudre compressée ou non, d'une des formes précédentes contenant de micro-capsules, des nano-capsules, des liposomes. Ces compositions cosmétiques et alimentaires peuvent également contenir en plus des vitisines, des agents anti-microbiens comme le triclosan, le trichlocarban, la chlorhexidine digluconate, l'undécylénate de zinc, le piroctone olamine, des produits antioxydants et anti-radicalaires comme l'acide ascorbique pur ou ses dérivés, les tocophérols, le gluthation et les flavonoïdes, des produits inhibiteurs de tyrasinase comme l'acide kojique, ainsi que tout autre principe actif complémentaire et nécessaire au traitement envisagé, habituellement utilisé par l'homme de l'art. Selon la présente invention, la teneur en vitisines dans les compositions cosmétiques et alimentaires peut être comprise entre 0,00001% et 10%, et de 15 préférence entre 0,00005% et 5%. Divers modes particuliers de réalisation de l'invention sont décrits en détails dans les exemples suivants. Ces descriptions ci-après ne sont en aucun cas limitatives. Exemple 1 : Capacité des vitisines A et B à inhiber l'activité enzymatique de la tyrosinase. A. Les molécules 5 Les vitisines A et B sont obtenues à partir d'un extrait hydro-alcoolique de racine de vigne. L'extrait est fractionné par séparation sur silice. Les fractions obtenues sont ensuite purifiées par HPLC semi-préparative. Cette méthode permet d'obtenir de la vitisine A ayant une pureté de 94 0/0 et de la vitisine B ayant une pureté de 96 %. Le resvératrol et l'epsilon-viniférine testés ont des puretés respectives de 99% et de 98%. B. Test d'activité enzymatique de la tyrosinase Le principe de ce test in vitro est le suivant. En présence de la tyrosirase, la L-DOPA (3-(3,4)-dihydroxyphenyl)-L-alanine) et la L-tyrosine ((S)-2-Amino-3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid) sont transformées en dopachrome. Le dosage du dopachrome par spectrophotométrie (492nm) permet de déterminer l'activité de la tyrosinase et d'évaluer l'effet inhibiteur des produits testés. Dans une plaque 96 puits, les conditions sont réalisées en triplicate. Pour chaque produit et à chaque concentration un blanc est effectué sans enzyme. Des contrôles sont réalisés sans produit. La plaque est préincubée 5 minutes à 37°C avec par puits : 100pI de tampon phosphate à 67mM, à pH 6,8 ; 20pl de tyrosinase et 40pl de produit à tester. On injecte ensuite dans chaque puits 45pl d'un mélange des deux substrats, avec la L- DOPA à 0,5mM et la L-Tyrosine à 2,5mM dilués dans du tampon phosphate. La lecture de DO à 492nm est effectuée après 10, 20 ou 30 minutes d'incubation à 37°C. Les DO obtenues varient entre 0,050 pour les inhibitions les plus fortes à 0,800 pour les contrôles les plus forts. La DO représente le i:aux de dopachrome formé par la tyrosinase. Les résultats sont exploités de la manière suivante : °/) inhibition = [(DCi control- DO test) / DO control] x 100. 6 C. Résultats Les résultats de ces tests sont présentés dans le tableau suivant : Inhibition de l'activité de l'enzyme tyrosinase (résultats exprimés en pourcentage d'inhibition) Concentrations Acide Resvératrol Epsilon- Vitisine A Vitisine B Kojique Viniférine 125pM 32,9% 47,2% 48,2% 65,2% 74,4% 250pM 52,4% 60,0% 65,4% 76,1% 87,3% 500pM 73,8% 63.7% 82,7% 88,1% 97,3% 1000pM 84,8% 66.2% 83,1% 93,6% 100% Les résultats présentés ci-dessus montrent que les vitisines A et B inhibent de façon significative et dose dépendante l'activité de l'enzyme tyrosinase. Cet effet est plus important que pour l'acide kojique, le resvératrol et l'epsilon- viniférine. Exemple 2 : Capacité d'un extrait de racine et de cep de vigne à inhiber l'activité enzymatique de la tyrosinase. A. Les extraits Les extraits de racine et de cep de vigne sont obtenus par macération hydro- alcoolique de la matière végétale broyée. Les teneurs en vitisines dans ces extraits sont respectivement de 25 et 30%. B. Test d'activité enzymatique de la tyrosinase Ce test est effectué de la même façon que dans l'exemple 1. C. Résultats Inhibition de l'activité de l'enzyme tyrosinase (résultats exprimés en pourcentage d'inhibition) Concentrations Extrait de Racine de vigne Extrait de cep de vigne 31,25pg/ml 62% 31,8% 62,5pg/ml 74,4% 52,4% 125pg/ml 87,8% 72,3% 250pg/ml 92,9% 86,1% Les résultats présentés ci-dessus montrent que l'extrait de racine et l'extrait de cep de vigne inhibent de façon significative et dose dépendante l'activité de 5 l'enzyme tyrosinase. Exemple 3 : Composition cosmétique à effet de blanchiment de peau à partir de d'extrait de racine de vigne. La phase grasse est préparée en mélangeant et chauffant à 80°C le Biophilic H et 10 le Crodamol DOA. Biophilic H 5% Crodamol DOA 8% La phase aqueuse est préparée en solubilisant le trilori B et le sepicide HB dans de l'eau, puis en y mélangeant l'Arnigel. La phase aqueuse est ensuite chauffée à 15 80°C Amigel 0,30% Trilon B 0,05% Eau déminéralisée 79,90% Sepicide HB 0,5% 20 La phase grasse homogène est versée lentement sur la phase aqueuse, sous agitation forte, puis maintenue agitée pendant 10 minutes. L'extrait est solubilisé dans du butylène glycol. Extrait de racine de vigne 2% Butylène Glycol 98% 7 -8- Lorsque que l'émulsion est homogène, elle est refroidie sous agitation. Lorsqu'elle est en dessous de 40°C, on ajoute : Sepigel 1,25% puis Extrait de racine en solution 5% Après homogénéisation, l'émulsion est refroidie jusqu'à 30°C sous agitation lente. On obtient une crème qui convient parfaitement au blanchiment de la peau. Exemple 4: Composition cosmétique à effet de blanchiment des tâches de vieillesse à partir d'extrait de cep de vigne. La phase grasse est préparée en mélangeant et chauffant à 80°C le Biophilic H et le Crodamol DOA. Biophilic H 5% Crodamol DOA 8% La phase aqueuse est préparée en solubilisant le trilon B et le sepicide HB clans de l'eau, puis en y mélangeant l'Amigel. La phase aqueuse est ensuite chauffée à Sepicide HE3 0,5% La phase grasse homogène est versée lentement sur la phase aqueuse, sous agitation forte ensuite maintenue pendant 10 minutes. L'extrait est solubilisé dans du butylène glycol Extrait de cep de vigne 2% Butylène glycol 98% Lorsque que l'émulsion est homogène est elle refroidie sous agitation. Lorsqu elle est en dessous de 40°C, on ajoute : Sepigel 1,25% puis Extrait de cep de vigne en solution 5% Après homogénéisation, l'émulsion ,est refroidie jusqu'à 30°C sous agitation lente. On obtient une crème qui convient parfaitement au blanchiment des tâches de vieillesse. 80°C Amigel 0,30% Trilon B 0,05% Eau déminéralisée 79,90% -9- Exemple 5 : Composition cosmétique à effet de blanchiment de peau à partir de 10 Le tétrasodium EDTA et le mélange de conservateurs sont dissous dans l'eau et l'ensemble est porté à 80°C. On ajoute ensuite le sclerotium gum que l'on dissout en agitant vigoureusement à 80°C .La phase grasse, homogène et chauffée à 15 70°C, est versée lentement sur la phase aqueuse, sous agitation assez vive. L'agitation est maintenue pendant 10 minutes après la fin de l'introduction de la phase grasse. L'émulsion huile dans eau se forme. On prépare par ailleurs le mélange suivant : 20 La vitisine A est dissoute dans le butylène glycol et l'eau sous agitation vigoureuse. Le mélange est ensuite ajouté à l'émulsion encore chaude. Ensuite, l'émulsion est refroidie sous agitation modérée. On ajoute ensuite : 25 Sepigel� 305 1.25g Après homogénéisation, l'émulsion est refroidie jusqu'à 30°C sous agitation lente. On obtient ainsi une émulsion de couleur ivoire de consistance agréable utilisable pour le blanchiment du teint de peaux colorées ou pour le traitement des tâches de vieillesse. 30 Exemple 6 : Composition de complément alimentaire à effet de blanchiment de peau à partir d'extrait de racine. Gélule contenant Extrait de racine de vigne 100mg Lactose 100mg vitisine purifiée. On prépare la phase grasse suivante : Biophilic H� 5g Dioctyl succinate 8g Ce mélange est porté à 70°C et bien homogénéisé. Par ailleurs, on prépare la phase aqueuse suivante : Eau purifiée Q.S.100g Tetrasodiurn EDTA 0.05g Mélange de phénoxyéthanol et de parabens 0.5g Sclerotium gum 0.3g Vitisine A purifiée à 94 % 0,3 mg Butylène glycol 2.25g Eau purifiée 0.6g REVENDICATIONS1. Inhibiteurs de l'enzyme tyrosinase, caractérisés en ce qu'ils sont élaborés à partir de vitisines et/ou de leurs dérivés, ces dérivés étant des glycosides de vitisines et/ou des esters de vitisines. 2. Inhibiteurs de l'enzyme tyrosinase selon la revendication 1, caractérisés en ce que lesdites vitisines sont la vitisine A, la vitisine B, la vitisine C, la vitisine D et la vitisine E. 3. Inhibiteurs de l'enzyme tyrosinase selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisés en ce que lesdites vitisines et lesdits dérivés de vitisines sont les constituants d'un extrait végétal. 4. Inhibiteurs de l'enzyme tyrosinase selon la revendication 3, caractérisés en ce que ledit extrait végétal, est un extrait de racine etlou de cep de vigne. 5. Inhibiteurs de l'enzyme tyrosinase selon la revendication 3, caractérisés en ce que ledit extrait végétal est un extrait de Vitaceae, de Cessia quinquangulata Rich, de Shorea hemsleyana, de Caragna chamlagu, de Carex humilis, de Cyphostemma crotalarioides, de Hopea parviflora, de Iris clarkei, de Sophora davidil, de Vatica rassak. 6. Utilisation des inhibiteurs de l'enzyme tyrosinase selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans des compositions cosmétiques et alimentaires ayant un effet de blanchiment de la peau et/ou d'atténuation des tâches, de vieillesse. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que la teneur en vitisines et dérivés de vitisines dans lesdites compositions cosmétiques et alimentaires est comprise entre 0,00001 % et 10%. 8. Utilisation selon les revendications 6 et 7, caractérisée en ce que lesdites compositions cosmétiques et alimentaires se présentent sous forme de liquides, de pâtes, de crèmes, d'émulsions, de lotions, d'huiles, de gels, de masques, de solides, de poudres, de granulés, de sprays, d'aérosols, de comprimés, de sirops, présentées dans des contenants adéquats tels que flacons, bouteilles, sachets, pots, boites, ampoules, gélules, crayons, porte-bâtons. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que lesdites compostions cosmétiques et alimentaires peuvent être composées d'émulsion huile/eau ou eau/huile, d'émulsion à phases gémellaires,-11- de micro-émulsion, d'émulsion IPIT, de nano-émulsion, d'émulsion multiple eau/huile/eau ou huile/eau/huile, de pseudo-émulsion (dispersion de deux phases non miscibles au moyen de gélifiants), de gel aqueux, de gel gras, de gel hydroalcoolique, de phase grasse, de suspension, de savon solide ou liquide, de solution moussante, de liquide aqueux, de liquide gras, de liquide hydroalcoolique, de poudre compressée ou non, d'une des formes précédentes contenant de micro-capsules, des nano-capsules, des liposomes. 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 a 9, caractérisée en ce que lesdites compositions cosmétiques et alimentaires peuvent également contenir en plus des vitisines, des agents anti-microbiens comme le triclosan, le trichocarban, la chlorhexidine digluconate, l'undécylénate de zinc, le piroctone olamie, des produits antioxydants et anti-radicalaires comme l'acide ascorbique pur ou ses dérivés, les tocophérols, le gluthation et les flavondides, des produits inhibiteurs de tyrosinase comme l'acide kojique ainsi que tout autre principe actif connu complémentaire et nécessaire au traitement envisagé.