FR 2932090 A1 20091211 FR 0853757 A 20080606 COMPOSITIONS ANXIOLYTIQUES COMPRENANT DES PEPTIDES DERIVES DE LA CASEINE ALPHA si La présente invention concerne des compositions pharmaceutiques et des 5 compositions alimentaires comprenant des peptides dérivés de la caséine asi ayant une activité anxiolytique. La caséine donne, par diverses techniques de fractionnement, les principales fractions qui sont dénommées respectivement : caséine x, caséine 13, caséine asi et caséine as2. Les séquences en acides aminés de ces caséines sont bien connues, en particulier celle 10 de la caséine asi a été déterminée par MERCIER et al. (1) et NAGAO et al. (2). Il a été montré que certains fragments peptidiques de ces différentes caséines ont des activités biologiques diverses et notamment des activités opiacées ou anti-opiacées et des activités inhibitrices de l'enzyme de conversion de l'angiotensine I. Ainsi, les peptides 90-96 et 90-95 de la caséine asi ont une activité opiacée démontrée in vitro [ZIOUDROU 15 et al. (3) et LOUKAS et al. (4)]. Le résidu d'arginine en position 90 semble important pour cette activité opiacée. Les peptides 91-95 et 91-96 dans lesquels le résidu d'arginine est supprimé sont pratiquement inactifs et ils ont donc une activité opiacée très inférieure au peptide 90-96. Les peptides 23-34 et 194-199, quant à eux, sont des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine I [MARUYAMA et SUZUKI (5) et 20 MARUYAMA et al. (6)]. Un peptide présentant une activité originale de type anxiolytique a été mis en évidence dans un hydrolysat trypsique de caséine asi [EP 0714910 (7)] Il correspond au fragment 91-100 et a été nommé a-casozépine [MICLO et al. (8)]. La structure de ce décapeptide a été étudié par 1H-RMN bidimensionnelle. La séquence comprise entre les 25 résidus de glycine 93 et de leucine 99 adopte, en milieu micellaire, une structure en hélice 310 initiée et terminée par un tour d'hélice a. Les chaînes latérales des résidus hydrophobes se situent sur la même face de l'hélice alors que les chaînes latérales des résidus hydrophiles se situent sur l'autre face, ce qui confère un caractère amphiphile au peptide et peut lui permettre des interactions avec les membranes. Les interactions ioniques entre le 30 groupement guanidinium du résidu d'arginine 100 et les groupements carboxyliques des résidus d'acide glutamique 96 et d'arginine 100 montrent le rôle capital du résidu d'arginine carboxy-terminal dans la stabilisation de la structure hélicoïdale. Dans une telle structure, les noyaux aromatiques des deux résidus de tyrosine en position 91 et 94 sont orientés de telle façon que la distance entre leur centre (0,56 nm en moyenne) est 35 comparable à la distance observée entre les centres des noyaux aromatiques du nitrazépam, benzodiazépine connue pour ses propriétés anxiolytiques [LECOUVEY et al. (9)]. La substitution du résidu d'arginine 100 par un résidu d'alanine diminue fortement l'hélicité du décapeptide et il en résulte une diminution de l'affinité de ce peptide pour le site benzodiazépine du récepteur GABAA d'un facteur 300.000 [Thèse Céline Frochot, (10)]. Ce décapeptide, après absorption orale, peut subir des attaques protéolytiques par les enzymes du tractus digestif ce qui peut diminuer sa biodisponibilité et par conséquent l'empêcher d'atteindre sa cible biologique. Or il est bien connu pour les petits peptides que l'absorption entérocytaire est plus efficace que celle de fragments plus importants et que leur résistance vis-à-vis des protéases digestives est accrue. Ainsi, parmi les fragments générés au cours de la digestion du décapeptide, certains pourraient être plus absorbables et plus résistants, mais au vu des données structurales issues du décapeptide, sans pouvoir conserver la moindre activité de type anxiolytique. La demande de brevet pendante PCT/EP2007/063863 montre de manière surprenante que les peptides 91-97, 91-98, 91-99 dérivés du décapeptide et ne contenant pas le résidu-clé d'arginine 100 montrent dans des tests comportementaux in vivo chez le rat des propriétés anxiolytiques. Au vu de leur petite taille, ces peptides sont plus facilement absorbables et moins facilement dégradables. La présente demande concerne maintenant des compositions pharmaceutiques et des produits alimentaires ayant des propriétés anxiolytiques comprenant les peptides 91-95 et 91-96 dérivés de la caséine asi. Les propriétés anxiolytiques de ces peptides ont pu être démontrées dans des tests comportementaux in vivo chez le rat. Listage des séquences SEQ ID NO. 1 : Pentapeptide correspondant aux positions 91-95 de la caséine asi SEQ ID NO. 2 : Hexapeptide correspondant aux positions 91-96 de la caséine asi Description de l'invention L'invention a pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant à titre de principe actif une quantité efficace d'un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou d'un peptide selon la SEQ ID No. 2 en combinaison avec un véhicule pharmaceutique approprié. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention ont une activité de type benzodiazépine et conviennent plus particulièrement pour le traitement de l'anxiété, des troubles du sommeil et de l'épilepsie. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant un hydrolysat ou une fraction d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine asi, contenant une quantité efficace d'un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou d'un peptide selon la SEQ ID No. 2. L'invention se rapporte aussi à un produit alimentaire pour les personnes sujettes notamment à l'anxiété, aux troubles du sommeil et/ou à l'épilepsie comprenant une quantité efficace d'au moins un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou la SEQ ID No. 2. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le produit alimentaire comprend un hydrolysat ou une fraction d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine asi, contenant une quantité efficace d'un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou d'un peptide selon la SEQ ID No. 2. L'invention a aussi pour objet des polynucléotides isolés codant pour un peptide selon la SEQ ID No. 1 ou pour un peptide selon la SEQ ID No. 2. L'invention se rapporte également à des vecteurs d'expression comprenant un polynucléotide selon l'invention. Un autre objet de l'invention est un organisme hôte, à l'exclusion de l'homme, transformé avec un polynucléotide selon l'invention et/ou avec un vecteur d'expression selon l'invention. L'invention a également pour objet un organisme hôte transformé, à l'exclusion de l'homme, exprimant un peptide selon la SEQ ID No. 1 ou un peptide selon la SEQ ID No. 2. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un peptide selon la SEQ ID No. 1, d'un peptide selon la SEQ ID No. 2, d'un polynucléotide selon l'invention, d'un vecteur d'expression selon l'invention et/ou d'un organisme hôte selon l'invention pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de l'anxiété, des troubles du sommeil et de l'épilepsie. De préférence, l'invention concerne l'utilisation d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine asi et/ou d'une fraction d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine asi, contenant une quantité efficace d'un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou d'un peptide selon la SEQ ID No. 2 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de l'anxiété, des troubles du sommeil et de l'épilepsie. Préférentiellement le médicament a une activité de type benzodiazépine. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un peptide selon la SEQ ID No. 1, d'un peptide selon la SEQ ID No. 2, d'un polynucléotide selon l'invention, d'un vecteur d'expression selon l'invention et/ou d'un organisme hôte selon l'invention pour la fabrication d'un produit alimentaire pour les personnes sujettes notamment à l'anxiété, aux troubles du sommeil et/ou à l'épilepsie. De manière préférée, l'invention a pour objet l'utilisation d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine asi et/ou d'une fraction d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine asi, contenant une quantité efficace d'un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou d'un peptide selon la SEQ ID No. 2 pour la fabrication d'un produit alimentaire pour les personnes sujettes notamment à l'anxiété, aux troubles du sommeil et/ou à l'épilepsie. Ainsi la présente invention a pour objet des compositions pharmaceutiques et des produits alimentaires comprenant des peptides dérivés de la caséine asi dont la séquence est représentée aux SEQ ID NOs. 1 et 2. L'invention concerne donc des compositions pharmaceutiques et des produits alimentaires contenant des peptides dont la séquence en acides aminés est choisie parmi : Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu et Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu. L'invention se rapporte également à des compositions pharmaceutiques et à des produits alimentaires comprenant des peptides modifiés ayant l'une des SEQ ID NOs. 1 ou 2 et conservant leurs propriétés anxiolytiques. L'invention se rapporte également à des compositions pharmaceutiques et à des produits alimentaires comprenant des protéines de fusion ou des protéines recombinantes comprenant les peptides selon la SEQ ID No. 1 et/ou selon la SEQ ID No. 2. Dans un deuxième aspect, l'invention se rapporte à des polynucléotides codant pour les peptides selon la SEQ ID No. 1 et la SEQ ID No. 2. En raison de la dégénérescence du code génétique, différents polynucléotides peuvent coder pour un même peptide. Selon la présente invention, on entend par "polynucléotide " une chaine nucléotidique simple brin ou son complémentaire pouvant être de type ADN ou ARN, ou une chaine nucléotidique double brin pouvant être de type ADNc (complémentaire) ou génomique. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les polynucléotides modifiés. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. (Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989) ou par synthèse chimique. Un autre objet de l'invention est un organisme hôte exprimant un peptide selon l'une des SEQ ID NOs. 1 ou 2. Les peptides selon la SEQ ID No. 1 et la SEQ ID No. 2 peuvent être exprimés et produits dans différents organismes hôtes selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Typiquement, l'organisme hôte est transformé avec une cassette d'expression comprenant un polynucléotide codant pour un peptide selon la SEQ ID No. 1 ou la SEQ ID No. 2. Ce polynucléotide peut être intégré dans le génome de l'organisme hôte ou se répliquer de manière stable dans l'organisme hôte. Par organisme hôte, on entend en particulier selon l'invention tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, en particulier choisi parmi les bactéries, les levures, les champignons et les mammifères. Par organisme hôte, on entend un organisme non humain. Les peptides selon la SEQ ID No. 1 ou la SEQ ID No. 2 peuvent donc être produits puis isolés ou purifiés à partir d'organismes hôtes transformés les exprimant. De préférence, les peptides selon la SEQ ID No. 1 ou la SEQ ID No. 2 sont obtenus à partir de la caséine du lait et plus préférentiellement à partir de la caséine asi. La caséine utilisée est de préférence la caséine du lait de bovins et plus préférentiellement de vaches laitières (Bos taurus). La séquence de la caséine asi est référencée dans la base de données Swiss Prot sous le numéro P02662. Après fractionnement des protéines du lait, la caséine est � digérée � ou hydrolysée avec des enzymes appropriées pour obtenir les peptides selon l'invention. Dans un premier mode de réalisation, la caséine du lait est directement hydrolysée avec des enzymes pour obtenir les peptides souhaités. Dans ce mode de réalisation, il peut être nécessaire de purifier partiellement ou totalement les peptides selon la SEQ ID No. 1 ou la SEQ ID No. 2 après l'hydrolyse. Dans un deuxième mode de réalisation selon l'invention, l'hydrolyse enzymatique s'effectue directement sur de la caséine as'. Dans ce mode de réalisation, l'hydrolysat obtenu sera déjà enrichi en peptides selon la SEQ ID No. 1 ou la SEQ ID No. 2 et des étapes de purification supplémentaires ne sont souvent pas nécessaires. L'homme du métier choisira les enzymes appropriées pour obtenir les peptides souhaités. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier et décrites dans la littérature. L'invention a donc également pour objet un hydrolysat de la caséine comprenant un peptide selon la SEQ ID No. 1 ou la SEQ ID No. 2. De préférence, il s'agit d'un hydrolysat de la caséine asl. Les compositions pharmaceutiques et les produits alimentaires selon la présente invention ont une activité de type benzodiazépine et notamment un effet anxiolytique. L'invention concerne des compositions pharmaceutiques ayant une activité de type benzodiazépine notamment pour le traitement de l'anxiété, des troubles du sommeil, de l'épilepsie. L'invention se rapporte donc aussi à des compositions pharmaceutiques contenant à titre de principe actif une quantité efficace d'un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou un peptide selon la SEQ ID No.2 en combinaison avec un véhicule pharmaceutique approprié. Ces compositions peuvent être formulées pour l'administration aux mammifères, y compris l'homme. La posologie varie selon le traitement et selon l'affection en cause. Ces compositions sont réalisées de façon à pouvoir être administrées par la voie digestive ou parentérale. Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale ou rectale, l'ingrédient actif peut être administré sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux ou aux êtres humains. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intranasale ou intraoculaire et les formes d'administration rectale. Lorsque l'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif. On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un 5 diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures. Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, un antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient 10 actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, de même qu'avec des correcteurs du goût ou des édulcorants. Les compositions selon l'invention peuvent être employées en thérapie seules, ou en combinaison avec au moins un autre agent actif. Ces autres agents actifs sont en particulier choisis parmi les actifs appropriés pour le traitement de l'anxiété, des troubles 15 du sommeil et de l'épilepsie. Il peut s'agir d'adjuvants permettant d'améliorer l'activité des composés selon l'invention, ou encore d'autres actifs connus pour leur emploi dans le traitement des dites affections. De tels agents actifs sont bien connus de l'homme du métier, disponibles dans le commerce ou encore décrits dans des ouvrages de référence comme Le Dictionnaire Vidal, édité avec mises à jours chaque année. 20 La présente invention concerne donc également une composition pharmaceutique comprenant un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou un peptide selon la SEQ ID No. 2 ainsi qu'un autre agent actif comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie, et en particulier dans le traitement de l'anxiété et des troubles du sommeil. Ces autres agents actifs sont en particulier choisis parmi les 25 actifs appropriés pour le traitement de l'anxiété comme par exemple les composés de la classe des benzodiazépines ou les inhibiteurs de la recapture de la sérotonine. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un peptide selon la SEQ ID No. 1, d'un peptide selon la SEQ ID No. 2, d'un polynucléotide selon l'invention, d'un vecteur d'expression selon l'invention et/ou d'un organisme hôte selon l'invention pour la 30 fabrication d'un médicament pour le traitement de l'anxiété, des troubles du sommeil et de l'épilepsie. De préférence, l'invention concerne l'utilisation d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine asi et/ou d'une fraction d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine asi, contenant une quantité efficace d'un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou d'un peptide 35 selon la SEQ ID No. 2 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de l'anxiété, des troubles du sommeil et de l'épilepsie. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un peptide selon la SEQ ID No. 1, d'un peptide selon la SEQ ID No. 2, d'un polynucléotide selon l'invention, d'un vecteur d'expression selon l'invention et/ou d'un organisme hôte selon l'invention pour la fabrication d'un produit alimentaire pour les personnes sujettes notamment à l'anxiété, aux troubles du sommeil et/ou à l'épilepsie. De manière préférée, l'invention a pour objet l'utilisation d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine asi et/ou d'une fraction d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine asi, contenant une quantité efficace d'un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou d'un peptide selon la SEQ ID No. 2 pour la fabrication d'un produit alimentaire pour les personnes sujettes notamment à l'anxiété, aux troubles du sommeil et/ou à l'épilepsie. Par produit alimentaire, on entend tout ce qui est propre à servir d'aliment. Les peptides de la SEQ ID No. 1 et de la SEQ ID No. 2 peuvent être utilisés comme principe actif soit dans des produits alimentaires en combinaison avec des supports alimentaires de nature protéique, glucidique ou lipidique, soit dans des produits alimentaires destinés à une alimentation particulière. Les produits alimentaires de la présente invention peuvent aussi se présenter sous forme de compléments alimentaires. Ces compléments alimentaires conviennent pour supplémenter l'alimentation des personnes sujettes notamment à l'anxiété, aux troubles du sommeil et à l'épilepsie. L'invention concerne également des procédés d'obtention des peptides de la SEQ ID No. 1 et de la SEQ ID No. 2. La caséine entière est obtenue à partir du lait par précipitation acide et neutralisation à l'aide d'un alcali selon des procédés bien connus. Par exemple, on peut utiliser la méthode de NITSCHMANN et LEHMANN (11). La caséine ou la caséine asi, utilisées comme produit de départ pour l'obtention des peptides selon la SEQ ID No. 1 et la SEQ ID No. 2, peuvent être obtenues par les procédés classiques bien connus de l'homme du métier à partir du lait, de caséines entières, de caséinates et de concentrés de protéines totales du lait, obtenus par exemple selon les procédés décrits par THOMSON (12) et MAUBOIS (13). Par exemple, on peut préparer la caséine asi en mettant en oeuvre la méthode décrite par SANOGO et al. (14). Cette méthode est une méthode de fractionnement sur DEAE-cellulose utilisant un gradient discontinu de chlorure de calcium comme éluant. Elle présente l'avantage de séparer rapidement l'ensemble des caséines. Elle peut être avantageusement mise en oeuvre avec, comme support échangeur d'anions, la DEAE-cellulose DE 52 [commercialisée par WHATMAN Ltd, Springfeld, Grande-Bretagne] qui est une résine pré-conditionnée ne nécessitant aucun pré-cycle acido-basique avant sa première utilisation. Les peptides peuvent ensuite être obtenus par hydrolyse de la caséine avec des enzymes appropriées. Les peptides peuvent ensuite être concentrés ou isolés par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse, par chromatographie liquide haute performance d'échange d'anions ou par chromatographie de gel filtration de seuil 1.000 Da ou par centrifugation sur membrane et autres techniques de séparation sur membrane (microfiltration, ultrafiltration, etc.). Un autre objet de la présente invention est donc un procédé de préparation de peptides ayant une activité de type benzodiazépine et notamment une activité anxiolytique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - hydrolyse enzymatique de la caséine; - isolement d'au moins un peptide choisi parmi les peptides ayant les SEQ ID Nos. 1 et 2. Par isolement, on entend la purification partielle ou totale des peptides ou simplement l'enrichissement de l'hydrolysat obtenu en peptides selon la SEQ ID No.l et la SEQ ID No. 2. Cet enrichissement peut s'effectuer par exemple par fractionnement de l'hydrolysat obtenu. Alternativement, l'hydrolysat obtenu à partir de caséine asi contenant au moins un peptide selon la SEQ ID No. 1 ou la SEQ ID No.2 peut être utilisé directement pour l'obtention des compositions pharmaceutiques et des produits alimentaires selon l'invention. Les peptides peuvent aussi être obtenus par synthèse peptidique selon les procédés 15 bien connus de l'homme de l'art, tels que ceux décrits par exemple par MERIFFIELD (15). L'invention va être maintenant décrite plus en détail par les exemples ci-après non limitatifs. 20 Figures Figure 1 : Test du labyrinthe en croix surélevé Figure 2 : Test de la boîte claire/obscure 25 Exemples 1. Modalités d'obtention du pentapeptide La caséine entière est obtenue à partir du lait par précipitation acide et neutralisation à 30 l'aide d'un alcali selon des procédés bien connus. Le pentapeptide ayant la séquence en acides aminés ci-après : Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu de masse moléculaire de 627 Da, correspond au peptide 91-95 de la caséine asi. Il peut être obtenu à partir de la caséine asi par hydrolyse enzymatique, en particulier à l'aide de la trypsine et ensuite de la pepsine. L'hydrolyse par la trypsine de la caséine asi libère des 35 fragments peptidiques divers. L'ensemble des fragments trypsiques subit une hydrolyse par la pepsine A (EC 3.4.23.1) (issu de muqueuse gastrique porcine, avec une activité de 3.200-4.500 unités/mg de protéine), dans un rapport E/S=1/200 à un pH acide, dans un tampon et à une température optimum pour l'activité de l'enzyme pendant 240 minutes. Cette dernière hydrolyse libère de nouveaux fragments dont le pentapeptide 91-95 de la caséine asi. Ce pentapeptide peut être également généré à partir des fragments trypsiques de la caséine asi par une hydrolyse à l'aide de la Corolase PP�, un mélange d'enzymes pancréatiques. L'hydrolyse est réalisée pendant 240 min dans un rapport E/S=1/100 à un pH, une température et dans un tampon optimum pour ce mélange enzymatique. Le pentapeptide peut être ensuite concentré ou isolé par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse, par chromatographie liquide haute performance d'échange d'anions ou par chromatographie de gel filtration ou par centrifugation sur membrane et autres techniques de séparation sur membrane (micro filtration, ultrafiltration, etc.). 2. Etudes pharmaco-comportementales chez le rat Wistar 2.1. Labyrinthe en croix surélevé 2.1.1. Principe Le test du labyrinthe en croix surélevé permet de mesurer la densité du comportement exploratoire dans une situation nouvelle aversive [PELLOW et al., 1985 (16)]. L'expérience exploite le conflit, chez les rongeurs, entre la peur des espaces ouverts et le désir d'explorer un nouvel environnement. Le rat, placé au centre du dispositif, est contraint d'explorer son environnement. Les bras ouverts constituent un environnement anxiogène, alors que ce n'est pas le cas des bras fermés. Le nombre d'entrées dans l'ensemble des bras, celui concernant les bras ouverts, les bras fermés, le temps passé dans les bras ouverts, la latence d'entrée dans le premier bras ouvert constituent des paramètres reflétant le degré d'anxiété de l'animal. 2.1.2. Appareillage Le labyrinthe en croix surélevé, construit en bois, est constitué de quatre branches à 90° les unes des autres. Les deux branches ouvertes (45 x 10 cm) et les deux branches fermées (45 x 10 cm ; entourées de plaques de bois sur une hauteur de 40 cm) sont disposées en vis-à-vis. Le carré central mesure 10 x 10 cm. Les branches ouvertes sont éclairées par une lumière blanche d'une intensité de 500 lux. Le labyrinthe en croix surélevé se situe à 50 cm du sol. 2.1.3. Protocole Les observations ont lieu entre 9 h et 11 h du matin pour minimiser l'influence du rythme circadien. Avant chaque passage dans le labyrinthe en croix surélevé, l'animal est placé pendant 10 min dans un openfield afin de stimuler son comportement exploratoire. Il est ensuite placé dans le carré central du labyrinthe en croix surélevé et observé pendant 5 min. Le labyrinthe en croix est lavé avec de l'éthanol à 95% (v/v) entre deux passages afin d'éliminer les odeurs. 2.1.4. Traitements L'étude a portée sur 45 rats répartis en trois groupes : - un groupe témoin (15 rats) ayant reçu 2 mL/kg d'une solution contenant 1% (v/v) de glycérol et 0,2% (v/v) de méthylcellulose (véhicule), - un groupe traité avec du diazépam (Valium , Roche, Neuilly-sur-Seine, France) à la dose de 1 mg/kg mis en suspension dans le véhicule (15 rats) servant de contrôle positif, - un groupe traité avec le fragment 91-95 de la caséine asi, préalablement dissous dans le véhicule, à la dose de 0,5 mg/kg (15 rats). Les animaux reçoivent leur traitement respectif par voie intra-péritonéale une demi-heure avant le passage dans l'openfield. 2.1.5. Résultats L'effet de l'injection intrapéritonéale chez le rat Wistar de 2 mL/kg d'une solution contenant 1% (v/v) de glycérol et 0,2% (v/v) de méthylcellulose (n=15) ou de 1 mg/kg de diazépam (n=15) ou de 0,5 mg/kg du pentapeptide CNasi-f(91-95) (n=15) sur (i) le nombre total d'entrées dans les différents bras, (ii) le nombre d'entrées dans les bras ouverts, (iii) le temps passé dans les bras ouverts a été étudié par analyse de variance non paramétrique (Kruskall-Wallis) et les comparaisons de moyennes ont été réalisées par le test de Mann-Whitney (A, B moyennes pour chaque traitement significativement différentes p 2.2.1. Principe Les tests clair/obscur sont basé sur l'aversion innée des rongeurs pour les environnements fortement éclairés et sur leur comportement exploratoire spontané en réponse à des facteurs de stress légers comme un nouvel environnement et la lumière. Le dispositif de la boîte claire/obscure permet d'étudier le comportement exploratoire du rongeur vis-à-vis d'un compartiment non familier aversif (fortement éclairé en lumière blanche) après habituation dans un compartiment non aversif (sombre) qui devient alors familier [BOURIN et HASCOËT, 2003 (17)]. Les anxiolytiques classiques peuvent être détectés en utilisant ce dispositif. 2.2.2. Appareillage et protocole La boîte claire/obscure mesure 65 x 49 x 35 cm (h x L x 1) et est séparée en deux compartiments identiques par une plaque percée de trois portes de 8 x 8 cm. Le sol est recouvert de sciure. Chaque rat est placé pendant 24 h dans le compartiment arrière de la boîte, les portes de communication avec le compartiment avant étant inaccessibles. Le compartiment arrière devient ainsi le compartiment familier. L'animal est nourri et hydraté ad libitum. Le jour du test, le rat, après traitement, est replacé dans le compartiment familier et les portes communicant avec le compartiment avant (non familier) sont rendues accessibles afin que l'animal puisse explorer librement l'environnement. Le compartiment non familier est rendu aversif par un éclairage en lumière blanche d'une intensité de 1500 lux. Les animaux sont observés pendant 10 min et le temps passé dans chacun des compartiments est mesuré. 2.2.3. Traitements L'étude a portée sur 36 rats répartis en trois groupes : - un groupe témoin (12 rats) ayant reçu 2 mL/kg d'une solution contenant 1% (v/v) de glycérol et 0,2% (v/v) de méthylcellulose (véhicule), - un groupe traité avec du diazépam (Valium , Roche, Neuilly-sur-Seine, France) à la dose de 1 mg/kg mis en suspension dans le véhicule (12 rats) servant de contrôle 30 positif, - un groupe traité avec le fragment 91-95 de la caséine asi, préalablement dissous dans le véhicule, à la dose de 0,5 mg/kg (12 rats) Les animaux reçoivent leur traitement respectif par voie intra-péritonéale une demi-heure 35 avant l'ouverture de la communication entre le compartiment familier et le compartiment non-familier. 2.2.4. Résultats L'effet de l'injection intrapéritonéale chez le rat Wistar de 2 mL/kg d'une solution contenant 1% (v/v) de glycérol et 0,2% (v/v) de méthylcellulose (n=12) ou de 1 mg/kg de diazépam (n=12) ou de 0,5 mg/kg du pentapeptide CNasi-f(91-95) (n=12) sur (i) le nombre d'entrées dans le compartiment non-familier, (ii) le temps passé dans le compartiment familier et (iii) le temps passé dans le compartiment non-familier a été étudié par analyse de variance non paramétrique (Kruskall-Wallis) et les comparaisons de moyennes ont été réalisées par le test de Mann-Whitney (A, B moyennes pour chaque traitement significativement différentes p (1) MERCIER, J.C., GROSCLAUDE, F., and RIBADEAU-DUMAS, B., 1971, Structure primaire de la caséine asi bovine. Séquence complète. Eur. J. Biochem., 23, 41-51. (2) NAGAO, M., MAKI, M., SASAKI, R., and CHIBA, H., 1984, Isolation and sequence analysis of bovine asi-casein cDNA clone. Agric. Biol. Chem., 48, 1663-1667. (3) ZIOUDROU, C., STREATY, R.A., and KLEE, W.A., 1979, Opioid peptides derived 10 from food proteins: the exorphins. J. Biol. Chem., 254, 2446-2449. (4) LOUKAS, S., VAROUCHA, D., ZIOUDROU, C., STREATY, R.A., and KLEE, W.A., 1983, Opiod activities and structure of a-casein-derived exorphins. Biochemistry, 22, 4567-4573. (5) MARUYAMA, S., and SUZUKI, H., 1982, A peptide inhibitor of angiotensin I converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein. Agric. Biol. Chem., 46, 1393-1394. (6) MARUYAMA, S., MITACHI, H., AWAYA, J., KURONO, M., TOMIZUKA, N., and 20 SUZUKI, H., 1987, Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of the C-terminal hexapeptide of asi-casein. Agric. Biol. Chem., 51, 2557-2561. (7) MICLO, L., PERRIN, E., DRIOU, A., BOUDIER, J.-F., IUNG, C., and LINDEN G., 1995, Utilisation d'un décapeptide à activité de type benzodiazépine pour la préparation de 25 médicaments et de compléments alimentaires. Brevet européen n°EP 0714910A1. (8) MICLO, L., PERRIN, E., DRIOU, A., PAPADOPOULOS, V., BOUJRAD, N., VANDERESSE, R., BOUDIER, J.-F., DESOR, D., LINDEN, G., and GAILLARD, J.-L., 2001, Characterization of a-casozepine, a tryptic peptide from bovine asi-casein with 30 benzodiazepine-like activity. FASEB J. (June 8, 2001) 10.1096/fj.00-0685fje. (9) LECOUVEY, M., FROCHOT, C., MICLO, L., ORLEWSKI, P., DRIOU, A., LINDEN, A., GAILLARD, J.-L., MARRAUD, M., CUNG, M.-T. and VANDERESSE R., 1997, Two dimentional 1H-NMR and CD structural analysis in a micellar medium of a 35 bovin asi-casein fragment having benzodiazepine-like properties. Eur. J. Biochem., 248, 872-878. 15 (10) FROCHOT, C. 1998, Étude d'un décapeptide à activité de type benzodiazépine issu d'une protéine du lait bovin. Thèse de l'Institut Polytechnique de Lorraine (INPL). (11) NITSCHMANN, H.S., and LEHMANN, W., 1947, Zum Problem der Labwirkung auf 5 Casein, Helv. Chim. Acta, 130, 804. (12) THOMSON, A.R, 1984, Recent developments in protein recovery and purification. J. Chem. Tech. Biotechnol., 34B, 190-198. 10 (13) MAUBOIS, J.L, 1984. Separation, extraction and fractionation of milk protein components. Lait, 64, 485-495. (14) SANOGO, T., PÂQUET, D., AUBERT, F., and LINDEN, G., 1989, Purification of asi-casein by Fast Protein Liquid Chromatography. J. Dairy Sci., 72, 2242-2246. (15) MERRIFIELD, R.B., 1963, Solid phase peptide synthesis. I. Synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154. (16) PELLOW, S., CHOPIN, P., FILE, S.E., and BRILEY, M., 1985, Validation of open : 20 closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J. Neurosci. Methods, 14, 149-167. (17) BOURIN, M., and HASCOËT, M., 2003, The mouse light/dark box test. Eur. J. Pharmacol., 463, 55-65. 15 REVENDICATIONS1. Composition pour le traitement de l'anxiété, des troubles du sommeil et de l'épilepsie caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif une quantité efficace d'un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou d'un peptide selon la SEQ ID No. 2. 2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend un hydrolysat ou une fraction d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine asi, contenant une quantité efficace d'un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou d'un peptide selon la SEQ ID No. 2. 3. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutique approprié. 4. Composition selon l'une des revendications 1-2 caractérisée en ce qu'elle est un produit alimentaire. 5. Utilisation d'un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou d'un peptide selon la SEQ ID 20 No. 2 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de l'anxiété, des troubles du sommeil et de l'épilepsie. 6. Utilisation d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine as' et/ou d'une fraction d'un hydrolysat de la caséine ou de la caséine asi, contenant une quantité efficace 25 d'un peptide selon la SEQ ID No. 1 et/ou d'un peptide selon la SEQ ID No. 2 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de l'anxiété, des troubles du sommeil et de l'épilepsie.15