FR 2930156 A1 20091023 FR 0802220 A 20080421 UTILISATION DU NONAPEPTIDE PAT DANS LE TRAITEMENT DES MALADIES AUTOIMMUNES L'invention se rapporte à l'utilisation du nonapeptide PAT pour la fabrication d'un médicament dans le traitement de maladies autoimmunes Les maladies autoimmunes sont dues à un dysfonctionnement du système immunitaire qui reconnaît de façon inappropriée des constituants du soi conduisant à des réponses immunitaires anormales. L'organisme est � attaqué � par son propre système immunitaire. Aujourd'hui la liste des maladies autoimmunes est exhaustive et comprend entre autres: les maladies inflammatoires chroniques intestinales telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique ; la sclérose en plaques ; l'arthrite psoriasique ; la maladie de Basedow ; la polyarthrite rhumatoïde ; le lupus érythémateux disséminé ; le diabète par insulinorésistance, la sondylarthrite, etc. Parmi les maladies autoimmunes qui représentent un besoin médical urgent, nous allons décrire de manière descriptive mais non limitative : la maladie de Crohn, la rectocolite hémorragique, la sclérose en plaques et le psoriasis. Dans la plupart des maladies autoimmunes telles que la maladie de Crohn, l'arthrite psoriasique, etc., certaines cytokines comme le TNF a induisent une attaque du tissu sain qui produit des lésions diverses caractéristiques de chaque pathologie. Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) sont des maladies caractérisées par une inflammation chronique qui touche les intestins. Le mécanisme physiopathologique commun aux MICI est l'inflammation de la muqueuse intestinale. Cette inflammation est créée par une activation du système immunitaire intestinal qui est déclenchée à la fois par des facteurs génétiques et par des facteurs environnementaux. Ce groupe des MICI correspond à deux grandes maladies chroniques, récurrentes qui évoluent par poussées et qui ont tendance à perdurer toute la vie: - la maladie de Crohn qui peut toucher l'ensemble du tube digestif pratiquement de la bouche jusqu'à l'anus et préférentiellement sur la partie finale de 30 l'intestin grêle et sur le début du côlon. Le diagnostic est basé sur la diarrhée chronique, les douleurs abdominales, les fistules ou abcès péri-anaux, l'amaigrissement et la fièvre. La continuation de l'inflammation dans la maladie de Crohn et la colite ulcérative peut être régulée en partie par une sécrétion accrue de cytokines pro-inflammatoires (Reinecker HC et al., Clin. Exp. Immunol 1993 ;94 :174-181). Selon le même article, le dosage des cytokines pro-inflammatoires TNF-u, Il-1-R et IL-6 à partir de biopsies du colon représente une méthode sensible pour contrôler la sévérité de l'inflammation mucosale chez des patents atteints par une MICI ; - la rectocolite hémorragique (RCH) qui elle, est localisée uniquement au rectum et au côlon. Face aux formes sévères de MICI, différents traitements permettent aujourd'hui aux patients de traiter les poussées symptomatiques et dans une moindre mesure de les espacer comme les anti-inflammatoires ; les corticoïdes ; les immunosuppresseurs ; les biothérapies et la, chirurgie. Parmi les traitements anti- inflammatoires, on distingue les dérivés de salicylés, qui induisent le moins de toxicité. La mésalazine est, selon une pratique courante, le traitement que l'on commence à administrer lors d'une première poussée inflammatoire. Ensuite on passe à des anti-inflammatoires plus puissants mais aussi plus toxiques comme la cortisone. Lorsque ces traitements se révèlent inefficaces on a recours parfois à des thérapeutiques plus récentes comme pour la maladie de Crohn, un nouveau traitement qui s'appelle le Remicade�, anticorps antimonoclonal contre le TNF-a. C'est un médicament très ciblé mais aussi très coûteux qui peut, par exemple. traiter des poussées résistantes au traitement par la cortisone, et maintenir en rémission la maladie de Crohn. Comme traitement d'entretien, pour éviter que le malade ne rechute, on utilise les salicylés et les immuno-suppresseurs qui dépriment l'immunité ; cette dernière étant suractivée lors de ces maladies indiquées ci-dessus. Il faut malheureusement souvent recourir à la chirurgie chez les malades atteintes par ces maladies: plus d'un malade sur deux atteint par la maladie de Crohn sera opéré après huit à dix ans d'évolution, d'une part parce qu'il apparaît souvent des rétrécissements dans l'intestin, parfois également des abcès qui peuvent être localisés autour de la région de l'anus dans 20% des cas environ. Chez les patients atteints par la rectocolite hémorragique qui résistent au traitement, on a alors recours à la chirurgie qui consiste à enlever le côlon et le rectum, ce qui est une intervention relativement lourde. En revanche, chez les sujets atteints par la maladie de Crohn, h chirurgie ne fait que traiter les complications mais n'empêche pas la maladie de réapparaître après que le patient ait été opéré. La sclérose en plaques (SEP) quant à elle est une maladie inflammatoire du système nerveux central. Elle entraîne en particulier une démyélinisation inflammatoire, une destruction de la myéline dans la substance blanche de l'encéphale et de la moelle. Les lésions anciennes sont le siège d'une prolifération astrocytaire qui caractérise la sclérose du tissu nerveux. Ces lésions démyélinisante s ont une répartition et une topographie singulières, non pas diffuses mais en plaques. Les formes multiples que revêt la maladie la rendent difficilement compréhensible pour l'entourage aussi bien que complexe à diagnostiquer pour le corps médical. Actuellement, le traitement vise à limiter la fréquence et l'importance des poussées inflammatoires. Il comporte ainsi deux versants: un traitement de la poussée et un traitement de fond. Dans le traitement de la poussée, on prescrit parfois des corticostéroïdes en relais par voie orale pendant environ 3 semaines, associés à des mesures de prévention des effets secondaires des corticostéroïdes. En traitement de fond, l'interféron bêta et l'acétate de glatiramère (copolymère de plusieurs acides aminés) sont généralement prescrits. Dans les formes sévères, il peut être proposé d'utiliser des immunosupresseurs parmi lesquels la mitoxantrone. I)es anticorps tels que le natalizumab (anticorps contre la chaîne a de l'intégrine des leucocytes) et le Remicade� (monoclonal anti-TNF-a) sont également prescrits. Le psoriasis est une maladie de la peau d'origine mal connue, en partie génétique. Cette affection dermatologique touche 1 à 3 % de la population, aussi bien chez les femmes que chez les hommes. Il existe plusieurs types de psoriasis dont le psoriasis en plaques ; le psoriasis en gouttes ; le psoriasis pustuleux l'arthrite psoriasique. Dans sa forme bénigne, le psoriasis se limite au cuir chevelu. aux ongles, aux genoux, aux coudes, aux pieds, aux mains et, parfois, aux organes génitaux. Dans les cas graves, il s'étend et peut gagner la totalité du corps. Cette dermatose chronique évolue de façon très individuelle, avec des poussées, mais aussi des rémissions au cours desquelles les lésions disparaissent. On dit alors que le psoriasis est �blanchi�. Le répit est de durée très variable et la rémission souver..t incomplète. A ce jour, aucun traitement curatif permettant de guérir complètement du psoriasis n'est connu ; il est toutefois possible de maîtriser le psoriasis, de diminuer l'étendue des lésions et d'améliorer la vie des patients. Il existe différents types de traitement : - un traitement local pour la forme non sévère qui consiste à appliquer une crème à base de corticostéroides, calcipotriène ou de tazarotène sur la zone du psoriasis. Ces traitements ont un effet favorable sur le psoriasis, malheureusement les plaques reviennent souvent dès l'arrêt du traitement. Ce dernier engendre également une forme d'insensibilisation, qui oblige à augmenter les doses dans le temps. De plus, l'effet n'est plus seulement local si l'on applique ces pommades sur de vastes zones. Cette forme de traitement devrait donc être limitée à des formes aiguës ou fortement inesthétiques, pendant une courte période et sur une surface limitée ; - un traitement de photothérapie. L'exposition solaire a le plus souvent une influence favorable sur le psoriasis. Cependant, dans 10% des cas, cette exposition sera en fait néfaste. Le sujet devra alors éviter le soleil, ou du moins éviter d'être directement exposé à ses rayons ; - un traitement systémique. Pour les formes les plus sévères de psoriasis, les médecins peuvent prescrire des traitements par voie orale ou par injection. On utilise dans ce cas, le méthotrexate, la cyclosporine ou les anticorps anti-TIN-a. Ces traitements sont appelés systémiques car les médicaments son` sensés se disséminer dans tout l'organisme. Ils ont souvent des effets secondaires., parfois sérieux. Il résulte de ces exemples que les traitements disponibles actuellement 30 pour soigner les maladies autoimmunes sont en nombre limité et se révèlent parfois très lourds et inefficaces. Ceci explique l'importance de la recherche dans ce domaine. Plusieurs laboratoires pharmaceutiques et universitaires développent des médicaments ou traitements dans les maladies autoimmunes. On peut citer à titre d'exemple, des traitements à base de purines (FR2851248A et WO 96/18397A), d'anticorps contre les cytokines ou des récepteurs (US 2003232009A, WO 06/121852, WO 06/092530, EP 1593393A et WO 07/009065) de vaccins ou d'autoantigènes (WO 01/74375, EP 1621208A, WO 07/044394), etc. Ces molécules thérapeutiques sont encore en stade de recherche fondamentale ou clinique et il est difficile pour l'instant d'évaluer leur efficacité chez l'homme. La Demanderesse s'est intéressée à un peptide analogue de la thymuline actif vis-à-vis du système immunitaire et du traitement des maladies autoimmunes. On connaissait depuis la fin des années 1950 le rôle central joué par le thymus dans la différenciation des lymphocytes T, responsables notamment du rejet des greffes et de la défense contre les virus et contre certaines bactéries. L'hormone, secrétée par le thymus fut alors identifiée comme un peptide de 9 acides aminés : la thymuline (Bach et al Pleau et al. Immunol letters, 1979;1:179-182; Amor et al., Annals of the Rheumatic Diseas 1987 :46 :549-554). Les propriétés de la thymuline sur le système immunitaire se sont révélées être zinc-dépendantes. En effet, le zinc associé au peptide confère à celui-ci une conformation tétraédrique qui correspond à la forme active de la molécule. En l'absence de zinc, la thymuline ne possède plus aucune activité vis-à-vis du système immunitaire. Des peptides analogues de la thymuline de la présente invention ont dé à été décrits pour le traitement de la douleur inflammatoire et neurogène (WO 03/030927) ; Saade et al, Neuroscience, 2003;119(1):855-65 et Safieh- Garabedian et al, Br J Pharmacol. 2002 Jul;136(6):947-55. Dans cette dernière publication, il est rapporté que le peptide PAT présente des actions analgésique et anti-inflammatoire, suite à une série d'expériences réalisées chez le rat en utilisant des injections d'endotoxines par vo:e intraplantaire (i.pl.) et par voie intrapéritonéale (i.p). Des dosages de cytokines ont été réalisés sur des prélèvements de tissus de peau et de foie. Il est important de préciser que ces auteurs ne se sont pas intéressés à la douleur inflammatoire intestinale. De plus, le modèle utilisé dans cette demande ne peut nullement être considéré comme un modèle pour étudier les maladies autoimmmunes et inflammatoires telles que les MICI (maladie de Crohn, rectocolite hémorragique). En effet, dans cette étude le modèle de la capsaïcine a été utilisé comme modèle de douleur viscérale ; c'est une molécule qui provoque des sensations de brûlure et de douleur. Il est bon de préciser qu'elle agit au niveau des neurones sensoriels mais pas au niveau de l'inflammation elle-même. Dans un exemple, on injecte h capsaïcine chez des rats qui ont reçu préalablement du PAT ou non, et on note les scores de nociception (perception douloureuse) provoquée par la capsaïcine. Déjà. par son modèle d'action, le modèle de la capsaïcine n'est pas adapté à l'étude des maladies autoimmunes telles que les MICI. De plus, la demande WVO 03/030927 ne fait pas spécifiquement référence aux maladies autoimmmunes telles que les MICI dont la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique. La Demanderesse s'est intéressée à déterminer, si le nonapeptide PAT dont l'innocuité a été établie, pouvait être considéré comme un nouveau médicament pour traiter les maladies autoimmunes telles que les MICI, la sclérose en plaque ou le psoriasis. La présente invention se rapporte à l'utilisation du nonapeptide PAT répondant à la formule (I) : EAKSQGGSD ; ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables dans la préparation d'un médicament dans le traitement des maladies autoimmunes telles que les maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) ; la sclérose en plaques et le psoriasis dont l'arthrite psoriasique. De préférence, la présente invention se rapporte aux MICI et encore plus préférentiellement à la maladie de Crohn. Par " sel pharmaceutiquement acceptable", on entend par exemple et de manière non limitative un acétate, un sulfate ou un chlorhydrate. L'invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule (I) dans laquelle un ou plusieurs acide aminés sont en configuration D. La composition pharmaceutique selon l'invention se présente sous une forme appropriée pour une administration : - par voie parentérale, comme par exemple, sous forme de préparations injectables par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou. intramusculaire; - par voie orale, comme par exemple, sous forme de comprimés enrobés ou non, de gélules, de poudres, de granulés, de suspensions ou de solutions orales. Une telle forme pour l'administration par voie orale peut être soit à libératio-i immédiate, soit à libération prolongée ou retardée. De telles formes à libératio.a prolongée ou retardée sont décrites, par exemple, dans les demandes EP 253104 ou EP 576 643 ; - par voie rectale, comme par exemple, sous forme de suppositoires ; - par voie topique, notamment transdermique, comme par exemple, sous 15 la forme de " patch ", de pommade ou de gel. - par voie intranasale, comme par exemple sous forme d'aérosols et " sprays ", - par voie perlinguale, - par voie intraoculaire. 20 Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être choisi parmi les véhicules utilisés de manière classique selon chacun des modes d'administration. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : 25 - la figure 1 représente l'effet du nonapeptide PAT sur le poids des animaux chez qui on a induit une colite par injection de TNBS ; - la figure 2 illustre l'effet du nonapeptide PAT sur la diminution de l'inflammation du côlon causée par le TNBS ; - la figure 3 représente l'effet du nonapeptide PAT sur la sécrétion des 30 cytokines pro-inflammatoires TNF-ct, IL-1R et IL-6. EXEMPLE : EFFET DU PAT DANS UN MODELE DE LA MALADIE DE CROHN CHEZ LA SOURIS PROTOCOLE EXPERIMENTAL Synthèse du nonapeptide Le peptide a été assemblé sur phase solide selon une stratégie Foc/tu, clivé et déprotégé par l'acide trifluoroacétique, puis purifié par chromatographie haute pression préparative en phase inverse et lyophilisé. Sa pureté (>95%) et son identité furent confirmées par HPLC analytique et par spectrométrie de masse. Séquence du nonapeptide: (H- EAKSQGGSD-NH2 ; 877 Da) Induction de la colite Le PAT a été étudié chez l'animal dans un modèle de colite expérimentale. Chez la souris, un des modèles de MICI clairement établi est la colite induite par l'acide trinitro benzene sulfonique (TNBS). Le TNBS est un haptène qui, lorsqu'il est administré par voie intrarectale, induit une inflammation transmurale sévère du côlon ; les effets provoqués présentent beaucoup de similitudes avec ceux induits par la maladie de Crohn (Elson CO et al. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2003;10:1344-67, Strober W et al, The immunology of mucosal models of inflammation. Annu Rev Immunol 2002;20:495-49). La colite est induite chez les souris C57BL/6J âgées de 7-8 semaines après administration de TNBS par voie rectale selon le protocole décrit par Sugimoto K. et al. (Gastroenterology 2002: 123 ; 1912-1922). On administre a l'aide d'une seringue de lml et d'une canule polyéthylène (Canules : Intradermic PE-20, Becton Dickinson) chez la souris 100111 d'une solution contenant 2,5 mg de TUBS/souris dissout dans 50�l d'éthanol directement dans la lumière du côlon (sur une longueur de 3 à 4cm). Après l'administration, les souris sont maintenues 30 secondes en position verticale. Traitement Le design de l'étude est le suivant : un lot témoin de 5 souris contrôles traitées par l'éthanol /PBS (vol/vol) : - un lot de 10 souris auxquelles on administre le TNBS (2,5 mg dans 50% éthanol) ; - un lot de 10 souris auxquelles on administre le TNBS et le nonapeptide à la dose de J �g/souris ; - un lot de 10 souris auxquelles on administre le TNBS et le nonapeptide à la dose de 51.tg /souris ; - un lot de 10 souris auxquelles on administre le TNBS et le nonapeptide à la dose de 251,tg /souris. Le nonapeptide PAT est administré par voie intrapéritonéale 30 minutes avant l'induction de colite par le TNBS. Une partie des souris (5 pour chaque groupe des lots testés ; 2 pour le groupe des contrôles) sont sacrifiés le jour 1 après induction par le TNBS. L'autre partie (5 pour chaque groupe des lots testés , 3 pour le groupe des contrôles) sont sacrifiés le jour 3 après induction par le TNBS. Paramètres mesurés Poids des animaux. Les animaux sont pesés tous les jours jusqu'au sacrifice. Inflammation du côlon Dès que les animaux sont sacrifiés, le côlon est retiré et une analyse macroscopique est effectuée. Expression de IL-1/3, IL-6 et TNF-a par RT-PCR quantitative Aux jours 1 et 3 après induction par le TNBS, les animaux sont sacrifiés et les côlons sont prélevés pour qu'une extraction des ARN totaux soit effectuée. Celle-ci est réalisée par dénaturation au thiocyanate de guanidine ; la synthèse des ADNc est effectuée à partir de 1 �g d'ARN à l'aide d'un ki: (Euromedex). On réalise une PCR quantitative ; la réaction se déroule dans un volume final de 25 �l en utilisant le kit SYBR (Eurogentec). Le taux de stimulation est calculé pour chaque cytokine par rapport à l'ADNc de référence qui est celui correspondant à la phosphoprotéine ribosomale 34B4. RESULTATS Poids des animaux Les résultats obtenus dans la Figure 1 montre que injection du TNBS par voie rectale induit une diminution notable du poids des souris, et que l'administration préalable du nonapeptide PAT permet de limiter cette perte de poids surtout à la dose de 25 ag/souris. Les doses de 1�g et de 51.tg /souris n'ont pas eu d'effet significatif. Mesure de l'inflammation du côlon Il a été observé que le nonapeptide PAT permet de réduire de façon significative l'inflammation engendrée par l'injection rectale du TNBS. D'après les résultats montrés dans la Figure 2, cet effet est dose dépendant et l'effet maximum est observé pour la dose de 25 �g/souris. En moyenne, le côlon mesure 7 cm chez le rat témoin, 5 cm chez le rat traité par le TNBS, et 6,5cm chez le rat traité par le TBNS et le PAT. Dosage des cytokines proinflammatoires Dans la figure 3, on observe que l'expression de la cytokine IL-113 est augmentée en moyenne 50 fois chez les souris traitées au TNBS. Lorsque un traitement de 25�g de PAT est administré à la souris, on note que l'expression d'IL-113 diminue de façon significative. L'expression de l'IL-6 est également fortement augmentée chez les souris traitées au TNBS (30 fois en moyenne). En présence de PAT à 25 �g/souris, l'expression d'IL-113 diminue de façon significative. En ce qui concerne le TNF-a, son expression augmente très légèrement (de 4 fois en moyenne) chez les souris auxquelles on a administré du TNBS. En présence de PAT à une dose de 25�g/souris, on observe que cette augmentation est nettement réduite. De façon intéressante, nous avons noté chez les souris traitées au TNBS seule n'augmente pas la production de la cytokine anti-inflammatoire IL-10, alors que l'administration préalable de PAT à une dose de 25 �g/souris provoque une augmentation significative de cette cytokine de plus de 3 fois. Comme indiqué plus haut, le TNBS par voie intrarectale induit une inflammation sévère du côlon. Celle-ci présente beaucoup de similitude avec les symptômes induits par la maladie de Crohn et notamment au niveau de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires. Ces résultats associés aux précédents permettent d'affirmer que l'administration du nonapept:ide PAT est un excellent candidat pour le traitement des maladies autoimmunes donc les MICI font partie.. REVENDICATIONS1. Utilisation du nonapeptide PAT répondant à la formule (I) : EAKSQGGSD ; ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables dans la préparation d'un médicament dans le traitement des maladies autoimmunes telles que les maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) ; la sclérose ela plaques et le psoriasis. 2. Utilisation du nonapeptide PAT selon la revendication 1, caractérisée 10 en ce que la maladie autoimmune est une MICI. 3. Utilisation du nonapeptide PAT selon la revendication 2, caractérisée en ce que la MICI est la maladie de Crohn. 4. Utilisation du nonapeptide PAT selon la revendication 1, caractérisée en ce que la maladie autoimmune est l'arthrite psoriasique 15 5. Utilisation du nonapeptide PAT selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'un ou plusieurs acides aminés du peptide se présente en configuration D. 6. Utilisation du nonapeptide PAT selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que nonapeptide se présente sous une 20 forme administrable par voie parentérale, par voie orale, par voie rectale ou par toute autre voie acceptable. 7. Utilisation du nonapeptide PAT selon la revendication précédente, caractérisée en ce que cette forme pharmaceutique appropriée contient un véhicule pharmaceutiquement acceptable.