FR 2928372 A1 20090911 FR 0851513 A 20080310 Procédé de synthèse peptidique La présente invention concerne un procédé de synthèse de peptides ou de dérivés de peptide. Les peptides synthétiques trouvent une application vaste notamment comme principe actif de médicaments. La synthèse de peptide nécessite généralement l'utilisation d'acides aminés qui soient à la fois protégés et activés, préalablement à leur mise en oeuvre. Cette stratégie n'est ni des plus simples ni des plus économiques. Les N-carboxyanhydrides d'acides aminés (ci-après dénommés NCAs ou anhydrides de Leuchs), éventuellement protégés, sont une alternative intéressante aux couplages peptidiques classiques. Les NCAs, généralement obtenus par phosgénation d'acides aminés, sont des composés très réactifs, qui ne forment pas, par réarrangement notamment, de produits secondaires et dont l'unique sous-produit de réaction est le dioxyde de carbone. Des N-carboxyanhydrides d'acides aminés (UNCAs) substitués par des groupements uréthane ont été décrits dans la littérature, et notamment dans le domaine de la synthèse peptidique. Plus d'une centaine de dérivés UNCAs ont été décrits à ce jour (voir par exemple William D. Fuller et al., J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 7414-7416 and William D. Fuller et al., Urethane-protected-alpha-amino acid N-carboxyanhydrides and peptide synthesis, Biopolymers, 1996, 40,183-205). Il est à noter que seuls les acides aminés présentant une fonction amine primaire peuvent être transformés en leur dérivé UNCA correspondant. William D. Fuller et al. ont passé en revue (dans Urethane-protected-alphaamino acid N-carboxyanhydrides and peptide synthesis, Biopolymers, 1996, 40,183-205) diverses applications des UNCAs en synthèse peptidique tant en phase solide qu'en phase liquide et commenté les avantages et inconvénients liés à leur utilisation. Les auteurs Zhu et Fuller ont décrit une synthèse rapide de tripeptides à partir de fragments dipeptidiques ayant une fonction carboxylique protégée sous forme d'ester ou d'amide (Tetrahedron Letters, vol 36, N°6, 807-810, 1995). L'invention a pour objet en particulier de fournir un procédé efficace, rapide et économique de synthèse de peptides ou de dérivés de peptide présentant -2 une pureté notamment optique élevée et pouvant être facilement utilisé dans l'industrie. En particulier, le procédé selon l'invention permet d'effectuer la synthèse à grand échelle de peptides courts tels des di- tri- ou tétrapeptides. La Demanderesse a trouvé que le procédé selon l'invention permet de manière surprenante l'obtention de peptides optiquement purs avec un rendement élevé en utilisant des acides aminés libres ou des peptides libres à la place des acides aminés ou des peptides protégés sur leurs fonctions carboxyliques utilisés auparavant. En outre, les peptides ou dérivés de peptides obtenus grâce au procédé ne nécessitent généralement pas de purification ou, à tout le moins, peuvent être purifiés de manière aisée. L'invention concerne dès lors un procédé de préparation d'un peptide ou d'un dérivé de peptide qui comprend au moins une étape dans laquelle on fait réagir un acide aminé libre ou un peptide libre avec une solution de N-carboxyanhydride d'acide aminé protégé sous forme d'uréthane (UNCA). Par acide aminé, on entend désigner, aux fins de la présente invention tout composé comportant au moins un groupe NR1R2, qui est de préférence un groupe amine NH2, et au moins un groupe carboxyle. Les acides aminés de la présente invention peuvent être d'origine naturelle ou synthétique. Les acides aminés naturels, à l'exception de la glycine, contiennent un atome de carbone chiral. Les acides aminés utilisés dans la présente invention sont de préférence des acides aminés énantiopurs. Par aminoacide énantiopur, on entend désigner un acide aminé chiral constitué essentiellement d'un énantiomère. L'excès énantiomérique (ee) est défini : ee (%) = 100(xi-x2)/(xi+x2) avec xi>x2 ; xi et x2 représentent la teneur du mélange en énantiomère 1 ou 2 respectivement. L'on peut utiliser des acides aminés naturels ou non-naturels. Les acides aminés peuvent avoir la configuration D ou L. Les résidus de certains acides aminés utilisables sont abrégés selon les codes à 3 lettres suivants: Alanine (Ala), Arginine (Arg), Acide aspartique (Arg), Asparagine (Asn), Cystéine (Cys), Acide glutamique (Glu), Glutamine (Gln), Glycine (Gly), Histidine (His), Isoleucine (Ile), Leucine (leu), Lysine (Lys), Méthionine (Met), Phénylalanine (Phe), Serine (Ser), Threonine (Thr), Tryptophane (Trp), Tyrosine (Tyr) et Valine (Val). Les acides aminés présentant des chaînes latérales nucléophiles sont avantageusement protégés dans la chaîne latérale préalablement à leur mise en oeuvre dans le procédé selon la présente invention. On entend par groupe protecteur tout type de groupe qui empêche l'atome ou le groupement auquel il est attaché, par exemple, un atome d'oxygène ou -3 d'azote, de participer à des réactions indésirables au cours de la synthèse. Les groupes protecteurs incluent des groupes protecteurs de chaîne latérale et de parties C-ou N-terminales, communément dénommés groupes protecteurs d'amines ou d'acides. A titre d'exemples non exhaustifs de groupes protecteurs d'amines, mention peut être faite en particulier aux groupes benzoyle (Bz), acétyl (Ac), trifluoroacétyl (Tfa), benzyloxycarbonyle (Z), le p-chlorobenzyloxycarbonyle (2C1Z), le p-bromobenzyloxycarbonyle (2BrZ), le p-nitrobenzyloxycarbonyle, le p- methoxybenzyloxycarbonyle, le benzhydryloxycarbonyle, le 9-fluorényl méthyloxy carbonyle (Fmoc), le tert-butyloxycarbonyle (BOC), le benzènesulfonyle, p-toluènesulphonyle ou le 2-nitrobenzènesulfonyle. En tant qu' exemples non exhaustifs de groupes protecteurs d'acides, on peut mentionner les groupes de type alkyle, aryle, aralkyle ou silyle, tels que le méthoxyméthyle, le méthylthiométhyle, le 2,2,2-trichloroéthyle, le 2-haloéthyle, le 2-(triméthylsilyl)éthyl, le t-butyle, l'aryle, l' alkyle,1' aralkyle, l'allyle, le benzyle, le triphénylméthyle (trityl), le benzhydryle, le p-nitrobenzyle, le p-méthoxybenzyle et les groupes trialkylsilyls comme le triméthylsilyléthers, le triéthylsilyle, le t-butyldiméthylsilyle, ou l'i-propyl-dimethylsilyle. Aux fins de la présente invention, le terme � peptide � se réfère à un polymère dans lequel les monomères sont des acides aminés reliés ensemble par des liens covalents de type amide. Les dérivés de peptides désignent des composés analogues aux peptides originaux dans lesquels un ou plusieurs atomes ont été remplacés ou rajoutés. Un peptide dont les groupements latéraux sont protégés est un exemple typique d'un dérivé de peptide. Les peptides comprennent au moins 2 acides aminés. De préférence, le nombre d'acides aminés dans la chaîne peptidique est supérieur ou égal à 3. La chaîne peptidique comprend souvent au plus 100 acides aminés. De préférence, le nombre d'acides aminés dans la chaîne peptidique est inférieur ou égal à 20. De manière particulièrement préférée, le nombre d'acides aminés dans la chaîne peptidique est inférieur ou égal à 15. Le procédé selon l'invention convient particulièrement pour la synthèse de di-, tri- et tétrapeptides, notamment à grand échelle. Il est également avantageux pour produire, par exemple, des penta-, hexa- ou heptapeptides. En outre, toutes les séquences peptidiques sont représentées par des formules allant de la gauche vers la droite dont l'orientation est dans le sens -4 conventionnel, c'est-à-dire allant de la partie aminée terminale à la partie carboxylée terminale. Il a été trouvé que le procédé selon l'invention convient particulièrement bien pour la synthèse de peptides et dérivés de peptide présentant un degré élevé de pureté diastéréomérique. Les peptides et dérivés de peptide obtenus dans le procédé selon l'invention présentent généralement une pureté diastéréomérique, définie comme teneur pondérale en diastéréomère souhaité, supérieure ou égale à 98 %. Souvent, la pureté diastéréomérique est supérieure ou égale à 99 %. De préférence, la pureté diastéréomérique est supérieure ou égale à 99,5 %. De manière particulièrement préférée, la pureté diastéréomérique est supérieure ou égale à 99,9 %. Le procédé selon l'invention permet donc le couplage d'un acide aminé sous forme UNCA avec un autre acide aminé libre ou un peptide libre. Aux fins de l'invention, le terme �couplage� se réfère en particulier à la réaction entre le groupe carboxyle d'un acide aminé ou de la partie C-terminale d'un peptide et le groupe amino d'un autre acide aminé ou l'extrémité N-terminale d'un second peptide. Aux fins de l'invention, le terme �C-terminal� désigne la partie terminale ou la fin de la chaîne d'acides aminés d'un peptide terminé par un groupe carboxyle (-COOH). D'autre part, le terme �N-terminal� renvoie à la partie terminale ou la fin de la chaîne d'acides aminés d'un peptide terminé par un groupe aminé (-NH2). Aux fins de la présente invention, l'acide aminé libre ou le peptide libre désigne un acide aminé ou un peptide dont au moins un groupement carboxyle, le cas échéant C-terminal, est sous forme de ûCOOH. Plus particulièrement dans l'acide aminé libre ou le peptide libre le groupement amino, le cas échéant N-terminal, est sous forme de ûNH2. Encore plus particulièrement, � acide aminé libre � ou � peptide libre � désigne un acide aminé non protégé ou un peptide non protégé. Il est entendu que les sels internes des acides aminés ou peptides libres sont, le cas échéant, également compris dans cette définition. Dans le cadre de la présente invention, l'abréviation � NCA � désigne un N- carboxyanhydride d'aminoacide et � UNCA � désigne un N-carboxyanhydride d'aminoacide protégé sous forme d'uréthane. La solution de N-carboxyanhydride d'acide aminé protégé sous forme d'uréthane (UNCA) qui réagit avec l'acide aminé libre ou le peptide libre dans le -5 procédé selon la présente invention est généralement obtenue en dissolvant dUNCA dans un solvant approprié. De manière préférée,1'UNCA mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention est un UNCA qui comprend un groupement BOC, Fmoc ou Z. De manière tout particulièrement préférée,1'UNCA comprend un groupement BOC. Le peptide protégé obtenu lorsqu'on met en oeuvre un UNCA protégé peut être déprotégé et, le cas échéant, utilisé comme produit de départ pour une prochaine étape de synthèse peptidique, en particulier effectuée selon le procédé selon l'invention. Dans le procédé selon l'invention, on fait réagir de manière avantageuse un acide aminé libre ou un peptide libre avec une solution d'UNCA dans un solvant dans lequel l'acide aminé libre ou le peptide libre est au moins partiellement soluble. Ainsi, l'acide aminé libre sous forme solide ou le peptide libre sous forme solide peut être mis en contact avec la solution d'UNCA. Dans le procédé selon l'invention, le solvant est de préférence choisi de telle manière que l'acide aminé libre ou le peptide libre présente une solubilité suffisante dans le solvant pour initier la réaction. Sont préférés des solvants qui permettent d'atteindre une conversion en produit de couplage d'au moins 50 % de dUNCA présent dans la solution dans une durée de réaction inférieure ou égale à 24 heures. Plus particulièrement le solvant permet d'atteindre cette conversion dans une durée de réaction inférieure ou égale à 12 heures, voire 6 heures. De manière plus préférée, le solvant est un solvant aprotique polaire qui peut notamment être choisi parmi le diméthylsulfoxyde (DMSO), la N,N-diméthylformamide (DMF), la N,N-diméthylacétamide (DMA), la N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP), le formamide et le sulfolane, le tétrahydrofurane (THF) et 1'acetonitrile. D'excellents résultats ont été obtenus avec le diméthylsulfoxyde. Peuvent également être mis en oeuvre à titre de solvant les liquides ioniques, par exemple des sels liquides d'imidazoles alkylés. Dans le procédé selon l'invention, la réaction est généralement effectuée dans un milieu liquide. Ce milieu peut être homogène. Souvent, le milieu réactionnel est, notamment initialement, hétérogène, par exemple peut il s'agir d'une suspension d'acide aminé libre ou de peptide libre dans la solution de UNCA. Le milieu réactionnel peut aussi être constitué d'un corps solide -6 constitué d'acide aminé libre ou de peptide libre qui est immergé dans la solution de UNCA. Il est préféré que le milieu liquide soit substantiellement anhydre. Géneralement, la teneur en eau dans le milieu liquide est maintenue à au plus 1000 mg d'eau /kg de milieu liquide. Souvent, cette teneur est d'au plus 500 mg d'eau /kg de milieu liquide. De préférence, cette teneur est d'au plus 250 mg d'eau /kg de milieu liquide. Souvent la teneur en eau dans le milieu liquide est supérieure ou égale à 10, voire 50, mg d'eau /kg de milieu liquide. Si le procédé fait réagir un acide aminé libre et la solution d'UNCA, on met souvent en oeuvre un acide aminé libre énantiopur, c'est-à-dire un acide aminé chiral constitué essentiellement d'un énantiomère, dont l'excès énantiomérique est supérieur ou égal à 99 %. On préfère un acide aminé énantiopur dont l'excès énantiomérique est supérieur ou égal à 99,5 %. De manière particulièrement préférée, on met en oeuvre un acide aminé énantiopur dont l'excès énantiomérique est supérieur ou égal à 99,9 %. Si le procédé fait réagir un peptide libre et la solution d'UNCA, on met généralement en oeuvre un peptide libre diastéréomériquement pur, caractérisé par une pureté diastéréomérique supérieure ou égale à 98 %. Souvent, la pureté diastéréomérique est supérieure ou égale à 99 %. De préférence, la pureté diastéréomérique est supérieure ou égale à 99,5 %. De manière particulièrement préférée, la pureté diastéréomérique est supérieure ou égale à 99,9 %. Dans le procédé selon l'invention, on fait avantageusement réagir l'acide aminé libre ou le peptide libre avec la solution d'UNCA, dans des proportions telles que l'acide aminé libre ou le peptide libre soit en léger excès stoechiométrique par rapport à dUNCA. Généralement on met en oeuvre de 1 à 1.5 équivalents de l'acide aminé libre ou du peptide libre. De préférence, la quantité d'acide aminé libre ou de peptide libre mise en oeuvre est supérieure ou égale à environ 1.1 équivalents. Dans le procédé selon l'invention, on fait avantageusement réagir l'acide aminé libre ou le peptide libre avec la solution d'UNCA à une température de 15°C à 90°C. Souvent, la réaction est effectuée à une température supérieure ou égale à 20°C. De préférence, la température est supérieure ou égale à 30°C. Souvent, la réaction est effectuée à une température inférieure ou égale à 80°C. De préférence, la température est inférieure ou égale à 60°C. Les peptides et dérivés de peptides obtenus par le procédé selon l'invention présentent généralement une pureté diastéréomérique, définie comme teneur -7 pondérale en diastéréomère souhaité, supérieure ou égale à 98 %. Souvent, la pureté diastéréomérique est supérieure ou égale à 99 %. De préférence, la pureté diastéréomérique est supérieure ou égale à 99,5 %. De manière particulièrement préférée, la pureté diastéréomérique est supérieure ou égale à 99,9 %. La pression est généralement choisie de manière à maintenir le milieu réactionnel, en particulier la solution d'UNCA, à l'état liquide. La pression atmosphérique (environ 101,3 kPa) et des pressions super-atmosphériques conviennent bien. De manière préférée, des pressions inférieures à la pression atmosphérique sont utilisées. Ce mode de réalisation convient bien pour éliminer le dioxyde de carbone formé par la réaction. Dans le procédé selon l'invention, on fait avantageusement réagir l'acide aminé libre ou le peptide libre avec la solution d'UNCA pendant un temps de réaction qui peut aller de 0.5 à 10 heures. Généralement, ce temps est de 1 à 3 heures. En fin de réaction, de l'acide aminé libre non réagi ou du peptide libre non réagi peut généralement être récupéré par une opération de séparation solide/liquide, par exemple une centrifugation ou, de préférence, une filtration. Le cas échant, dans ce mode de réalisation, il peut être avantageux de diluer le milieu réactionnel avec un deuxième solvant organique, moins polaire que le solvant ou mélange de solvants présent dans le milieu réactionnel. A titre d'exemple de deuxième solvant approprié on citera les esters d'alkyle, par exemple l'acétate d'éthyle ou, de préférence, l'acétate d'isopropyle. Le cas échéant après la récupération d'acide aminé libre ou de peptide libre, le milieu réactionnel est généralement traité à l'eau et le peptide ou dérivé de peptide obtenu peut être récupéré par extraction. L'isolement du peptide produit, peut être effectué, par exemple, par précipitation dans un solvant de précipitation approprié, typiquement un alcane, en particulier choisi parmi le cyclohexane, 1'ether de pétrole et le n-heptane. On peut également isoler le peptide produit par formation d'un sel d'ammonium, par exemple un sel de DCHA (dicyclohexylamine) ou de CHA (cyclohexylamine). Le procédé selon la présente invention permet l'obtention de peptides et dérivés de peptides avec un rendement typiquement supérieur à 80 %. Les exemples ci-après entendent illustrer l'invention sans toutefois la limiter. -- 8 Exemple 1 : Synthèse du Boc-Ile-Leu-OH Dans un ballon de 250 ml, on a introduit 45 ml de DMSO ainsi que 6.30 g (1.2 éq.) de H-Leu-OH pour obtenir une suspension. On a porté le milieu réactionnel à 60°C avant d'y ajouter 10.29 g (1.0 éq.) de UNCA de Boc-Ile. Après 2 heures de réaction, un prélèvement du milieu réactionnel a été analysé en HPLC. Le milieu réactionnel a été refroidi jusqu'à température ambiante avant de le diluer par 360 ml d'acétate d'isopropyle. On a ajouté 0.1 éq. de diméthylaminopropylamine (DMAPA) et agité à température ambiante pendant environ 10 min. La phase organique a ensuite été lavée successivement par : - 300 ml de NaC15 % aq. contenant 1.0 éq. de KHSO4 (5.45 g), - 300 ml de NaCl 5 % aq., - 300 ml d'eau déminéralisée. On a concentré la phase organique par évaporation et effectué un séchage azéotropique à l'acétate d'isopropyle (300 ml au total). En cours de refroidissement, le dipeptide commençait à cristalliser. On a dilué avec 150 ml de cyclohexane et poursuivi l'évaporation. La suspension a été refroidie à 0 � 5°C. Après filtration, lavage du solide obtenu par 70 ml de cyclohexane et séchage on a obtenu 12.8 g du peptide souhaité. Rendement (basé sur la RMN) = 93 %. Exemples 2-6 Selon des procédés analogues à l'exemple 1, une série de composés ont été synthétisés. Le tableau ci-dessous reprend les résultats obtenus sur une série d'essais faits sur le UNCA de Boc-Ile-. Série UNCA de Boc-Ile Structure Conversion Pureté Rendement Ex. No. RMN 2 Boc-Ile-Leu-OH 100 % Peptide 100 % 93 % 3 Boc-Ile-Pro-OH 100 % Peptide 95 %, 83 % Acétate d' isopropyle 1.2 %. 4 Boc-Ile-Trp-OH.DCHA 100 % Peptide 69 %, 87 % DCHA 30 %. 5 Boc-Ile-Glu(OtBu)- 100 % Peptide 68 %, 71 % OH.DCHA DCHA 29 %. 6 Boc-Ile-Nle-Glu(OtBu)-OH 100 % Peptide 73 %, 71 % DCHA 25.2 %, DCU 0.6 %, IPE 0.1 %. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un peptide ou d'un dérivé de peptide qui comprend au moins une étape dans laquelle on fait réagir un acide aminé libre ou un peptide libre avec une solution de N-carboxyanhydride d'acide aminé protégé sous forme d'uréthane (UNCA). 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on fait réagir l'acide aminé libre ou le peptide libre avec la solution d'UNCA dans un solvant dans lequel l'acide aminé libre ou le peptide libre est au moins partiellement soluble. 3. Procédé selon la revendication 2 dans lequel le solvant est un solvant dans lequel l'acide aminé libre ou le peptide libre présente une solubilité dans le solvant permettant d'atteindre une conversion en produit de couplage d'au moins 50 % de dUNCA présent dans la solution dans une durée de réaction inférieure ou égale à 24 heures. 4. Procédé selon la revendication 3 dans lequel le solvant est un solvant aprotique polaire. 5. Procédé selon la revendication 4 dans lequel le solvant aprotique polaire est choisi parmi le le diméthylsulfoxyde (DMSO), la N,N-diméthylformamide (DMF), la N,N-diméthylacétamide (DMA), la N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP), le formamide et le sulfolane, le tétrahydrofurane (THF) et 1' acetonitrile. 6. Procédé selon la revendication 5 dans lequel le solvant est le DMSO. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel on fait réagir l'acide aminé libre ou le peptide libre avec la solution d'UNCA à une température de 15 à 90°C. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel dUNCA comprend un groupement BOC, Fmoc ou Z. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel on soutire le dioxyde de carbone formé.- 10 - 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'acide aminé libre ou le peptide libre est mis en oeuvre sous forme solide. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le milieu réactionnel est une suspension d'acide aminé libre ou de peptide libre dans la solution de UNCA. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel on récupère à la fin de la réaction de l'acide aminé libre ou du peptide libre non réagi par une opération de séparation solide/liquide. 13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel, préalablement à la séparation solide/liquide, on dilue le milieu réactionnel avec un deuxième solvant organique, moins polaire que le solvant ou mélange de solvants présent dans le milieu réactionnel.