FR 2924126 A1 20090529 FR 0759400 A 20071128 Nouveau procédé de culture d'une microalgue hétérotrophe. La présente invention a pour objet un nouveau procédé de culture d'une microalgue hétérotrophe, et un procédé destiné à l'obtention de biomasse d'une microalgue hétérotrophe. Les algues sont des organismes autotrophes, c'est-à-dire capables de synthétiser de la 10 matière organique à partir du dioxyde de carbone contenu dans l'air et de la lumière grâce à la photosynthèse. On distingue deux grands groupes d'algues : o Les phytobenthos ou macroalgues : espèces fixées au fond de l'eau par un thalle, o Le phytoplancton ou microalgues : espèces qui flottent ou nagent en pleine eau. Les principaux groupes de microalgues sont: • Les diatomées • Les dinophycées, • Les prymnésiophycées (haptophycées), • Les cyanophycées, • Les rhodophycées, • Les chlorophycées (ou chlorophytes). Ainsi, les microalgues représentent un large groupe potentiellement fournisseur de composés ayant des activités biologiques valorisables en cosmétique, dans l'industrie pharmaceutique voire dans l'industrie agro-alimentaire. Certaines microalgues, en particulier chez les chlorophytes, et par exemple Chlorella, 25 sont également des organismes hétérotrophes, c'est-à-dire qu'elles synthétisent de la matière organique à partir de matière organique préalablement fabriquée par d'autres organismes. Ces microalgues sont dites mixotrophes, c'est-à-dire capables de synthétiser de la matière organique à partir de matière inorganique comme le dioxyde de carbone et également capables de vivre comme des hétérotrophes en absence d'énergie lumineuse 30 ou chimique. On sait cultiver certaines de ces algues, en particulier Chlorella, de manière totalement hétérotrophe c'est à dire dans des fermenteurs classiques en présence de sources de 15 20 carbone organique et de sources d'azote minéral ou organique, en présence d'oxygène. Dans ce cas on ensemence successivement des fermenteurs de plus en plus grands avec des cultures cultivées en hétérotrophie en présence de carbone organique (glucose par exemple), d'oxygène (air) et dans l'obscurité car dans ces conditions, la présence de lumière n'est pas nécessaire à la croissance de l'algue. Ce type de procédé permet d'obtenir une croissance rapide des algues et surtout il permet d'obtenir des concentrations cellulaires extrêmement élevées, supérieures à 10 grammes de matière sèche par litre, allant même jusqu'à 50 grammes et plus par litre. Un inconvénient de ce procédé est qu'il nécessite une source coûteuse de carbone organique et une forte dépense énergétique pour l'aération et l'agitation des fermenteurs. En outre, la qualité biochimique des microalgues cultivées dans des conditions de culture hétérotrophe n'est pas très bonne, en particulier concernant la concentration en molécules à haute valeur ajoutée qu'elles contiennent (pigments tels que chlorophylle, phycoérythrine, phycocyanine, luteine et béta-carotène, lipides tels que l'acide linolénique, l'acide eicosapentaénoique, phospho-et sulfo lipides, acides aminés tels que la proline...). On sait aussi cultiver les algues, en particulier Chlorella, de manière totalement autotrophe en présence de lumière et de carbonates (gaz carbonique) ainsi que d'azote (nitrates, ammonium) et d'autres minéraux. Une telle production est souvent obtenue en bassins circulaires légèrement agités et de faible profondeur. Là également, on ensemence successivement des bassins de plus en plus grands avec des cultures cultivées en autotrophie en présence de CO2, bicarbonates et carbonates et à la lumière car dans ces conditions, la croissance de l'algue est le résultat du phénomène de photosynthèse. Un inconvénient de ce procédé est qu'il ne permet pas d'obtenir une croissance rapide des algues à cause des phénomènes d'auto-ombrage des cultures, de l'alternance des jours et des nuits, de l'impossibilité de réguler aux valeurs optimales des paramètres tels que la température ou le pH des milieux de culture. La croissance des algues est donc lente dans ces conditions et elles sont donc sujettes à contamination par d'autres micro-organismes plus compétitifs, voire des protozoaires. On sait cultiver Chlorella et d'autres algues ou microalgues dans des photobioréacteurs clos, généralement tubulaires, où l'on peut injecter du gaz carbonique en haute concentration et ainsi améliorer la performance des bassins en termes de concentration cellulaire finale et vitesse de croissance, tout en mettant les microalgues à l'abri des contaminations. Dans ce procédé de culture des algues en autotrophie et en milieu confiné, l'ensemencement des cultures finales est également le résultat de cultures successives dans des réacteurs éclairés de plus en plus grands. Dans de tels réacteurs et en fonction inverse du diamètre des tubes, la concentration cellulaire peut aller jusqu'à un maximum de 5 g/1 au terme de chaque subculture. Le principal intérêt de la culture de microalgues réside d'une part dans la production de biomasse en grande quantité, exploitée ensuite dans l'industrie agro-alimentaire, les cosmétiques ou l'agriculture et d'autre part dans la production des molécules à haute valeur ajoutée qu'elles contiennent. Dans ces deux cas le problème à résoudre actuellement est de mettre au point un procédé de culture de microalgues permettant d'obtenir une biomasse en quantité importante, c'est à dire supérieure à 1 g/1, tout en préservant la qualité biochimique des microalgues cultivées. Il est connu dans l'art antérieur que certaines souches de microalgues hétérotrophes sont capables de changer de métabolisme, passant d'un mode hétérotrophe à un mode autotrophe, et vice versa (document Ogbonna et al: J.C. Ogbonna, H. Masui et H. Tanaka, in Journal of Applied Phycology, 1997, 9, pp 359-366). Ainsi, ce document Ogbonna et al. décrit la culture séquentielle en mode hétérotrophe/autotrophe de microalgues hétérotrophes, en particulier de Chlorella. Ce document décrit en fait une culture de Chlorella en conditions de culture hétérotrophe dans laquelle, lorsque la concentration en glucose est réduite à zéro, le milieu de culture contenant les Chlorella est transféré dans un flacon à la lumière pour une photostimulation en conditions de culture autotrophe. Le passage de la phase en conditions de culture hétérotrophe à la phase en conditions de culture autotrophe se passe donc à volume constant. Toutefois, pour l'Homme du métier spécialiste de la culture des microalgues, le passage entre deux conditions de cultures totalement différentes, à savoir les conditions autotrophes et les conditions hétérotrophes ne peut que se manifester par une importante phase de réadaptation de l'algue à de nouvelles conditions, dont les plus brutales sont un passage d'un milieu saturé en oxygène à un milieu saturé en gaz carbonique, d'un milieu où le carbone est organique (glucose) à un milieu où il est inorganique (CO2) et de l'obscurité à la lumière. Cette phase de réadaptation se traduit notamment par une baisse de la concentration en microalgues. C'est ce que l'on observe dans le document Ogbonna et al. à la page 365 colonne gauche premier paragraphe : la concentration en microalgues diminue au bout de 24h en conditions autotrophes. On observe également une faible augmentation de la concentration en protéines. Or, la Société Demanderesse a découvert de manière surprenante que malgré ce préjugé technique, il est possible d'obtenir une culture de microalgues en conditions hétérotrophes suivie d'une culture en conditions autotrophes sans phase de réadaptation ni diminution de la concentration en microalgues lors du changement des conditions de culture, et même avec une bonne croissance en phase autotrophe, tout en augmentant la concentration en chlorophylle et en protéines des microalgues. Ce nouveau procédé est basé sur la préparation d'un inoculum par culture d'une microalgue hétérotrophe en conditions de culture hétérotrophe, l'inoculation d'un milieu de culture dans un photobioréacteur par l'inoculum obtenu et culture du milieu de culture inoculé dans le photobioréacteur dans des conditions de culture autotrophe. De manière encore plus surprenante, ces améliorations sont les plus sensibles lorsque la phase de culture autotrophe est réalisée dans des photobioréacteurs clos. En outre, la concentration cellulaire beaucoup plus élevée de l'inoculum obtenu par culture en conditions de culture hétérotrophe (par rapport à des conditions de culture autotrophe) permet, à volume d'inoculum égal, de faire démarrer beaucoup plus vite la subculture et de gagner plusieurs générations de multiplication et donc plusieurs jours de culture en conditions de culture autotrophe. Ainsi, un premier aspect de la présente invention concerne un procédé de culture d'une microalgue hétérotrophe, comprenant les étapes suivantes : (a) Préparation d'un inoculum par la mise en culture d'au moins une souche de microalgue hétérotrophe dans des conditions de culture hétérotrophe, (b) Inoculation d'un milieu de culture dans un photobioréacteur, avec ledit inoculum, (c) Culture de ladite microalgue dans ledit photobioréacteur, dans des conditions de culture autotrophe ou mixotrophe, de préférence autotrophe. Selon un autre aspect de l'invention le procédé est un procédé de culture d'une microalgue hétérotrophe, comprenant les étapes suivantes : (a) Préparation d'une pré-culture d'au moins une souche de microalgue hétérotrophe par la mise en culture de ladite souche dans des conditions de culture hétérotrophes, avantageusement telle que l'on obtienne une concentration en ladite microalgue hétérotrophe supérieure à 5g/1 (b) Mise en culture de la pré-culture obtenue à l'étape a) dans un photobioréacteur dans des conditions de culture autotrophes ou mixotrophes, de préférence autotrophes, avantageusement telle que l'on obtienne une concentration en chlorophylle supérieure à 0.01 g/1, une concentration en protéines supérieure à 0.5 g/1, et/ou concentration en microalgue supérieure à 1 g/1. caractérisé en ce que à l'étape b) le volume de la pré-culture est inférieur à 1/5 du volume de culture 20 Par microalgue hétérotrophe, on désigne selon la présente invention une microalgue capable de synthétiser de la matière organique en présence de sources de carbone organique et/ou de sources d'azote minéral ou organique, en présence d'oxygène et en absence de lumière. 25 Par inoculum, on désigne selon la présente invention une culture pure ou quasiment pure de microalgue hétérotrophe, c'est-à-dire sans contamination de la culture, de volume réduit, c'est à dire inférieur à 1/5 du volume final souhaité de culture de microalgue hétérotrophe, en concentration importante de microalgue hétérotrophe avantageusement supérieure à 5 g/1 et de façon encore plus avantageuse supérieure à 30 10 g/1, et obtenue par culture de microalgue hétérotrophe en conditions de culture hétérotrophe. Le but de l'inoculum est d'être une pré-culture en conditions de culture hétérotrophe afin de faire démarrer rapidement la culture en conditions autotrophe, car elle permet d'obtenir la concentration en microalgue hétérotrophe désirée en un minimum de temps. 15 Par inoculation, on désigne selon la présente invention la dilution de l'inoculum dans un milieu de culture adapté à la culture en conditions autotrophe, le volume de l'inoculum étant inférieur à 1/5 du volume dudit milieu de culture. Par conditions de culture hétérotrophe, on désigne selon la présente invention des conditions de culture avec - un milieu de culture comprenant une ou plusieurs sources de carbone organique et/ou de sources d'azote minéral ou organique, 10 - un apport en oxygène, et - une absence de lumière. La température optimale pour la culture de microalgues en conditions de culture hétérotrophe est généralement comprise entre 20 et 40 °C. Le pH optimal pour la culture de microalgues en conditions de culture hétérotrophe est 15 généralement compris entre 5 et 8. Le milieu de culture en conditions de culture hétérotrophe est agité par introduction d'air et de façon complémentaire par un agitateur. Par milieu de culture pour conditions de culture hétérotrophe, on désigne un milieu comportant les éléments chimiques nécessaires à la croissance de la microalgue en 20 absence de lumière et en présence d'oxygène. Un tel milieu comprend généralement : • une ou plusieurs sources de carbone organique et/ou de sources d'azote minéral ou organique, • Une source de potassium et de phosphore (K2HPO4 par exemple), 25 • Une source d'azote et de soufre ((NH4)2SO4 par exemple), • Une source de magnésium (MgCl2 par exemple), • Une source de calcium: (CaCl2 par exemple), • Une source de fer: (citrate de fer par exemple)), • Une source d'oligo-éléments: (sels de Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti par exemple), 30 • De l'eau (par exemple de l'eau stérilisée), • Un tampon pH: il permet de maintenir un pH correct voire optimum: (KH2PO4 par exemple).5 On peut citer comme exemple de sources de carbone organique pour les microalgues le glucose, le corn steep, l'acide acétique, l'éthanol, l'urée... Certains produits tels le corn steep ont l'avantage d'être à la fois une source de carbone organique mais aussi d'azote organique, d' oligoéléments et de fer. L'acide acétique et l'éthanol présentent l'avantage de ne pas pouvoir être utilisés comme sources de carbone par de nombreux microorganismes, ce qui limite donc les contaminations microbiennes de la culture de microalgues. Cependant toutes les microalgues hétérotrophes ne sont pas capables d'utiliser l'acide acétique ou l'éthanol comme source de carbone. S'ils peuvent être utilisés pour la culture de la Chlorella ou d'autres microalgues, le glucose peut être utilisé de manière plus générale. On peut citer comme exemple de sources d'azote minéral pour les microalgues les nitrates, nitrites et sels ammoniacaux. On peut citer comme exemple de sources d'azote organique pour les microalgues des extraits d'algues, de levures, le corn steep, l'urée... Un exemple de composition de milieu de culture pour des conditions de culture hétérotrophe est donné ci après : Exemple de composition du milieu de culture : KNO3 2g KH2PO4 2g MgSO4.H2O 2g Corn steep 25g Glucose 25g Urée 5g Eau qsp 1 000 mL Par photobioréacteur, ou PBR, on désigne selon la présente invention tout type de dispositif qui s'avère apte à la prolifération ordonnée et à une échelle commerciale de microorganismes photosynthétiques, en présence de lumière et de dioxyde de carbone. Selon la présente invention, les PBR peuvent être ouverts ou clos. De manière préférée selon l'invention les PBR sont clos. Les PBR ouverts sont caractérisés en ce qu'ils sont à ciel ouvert, la lumière provenant du soleil et les gaz dissous dans ces PBR ouverts étant en équilibre avec ceux de l'atmosphère qui les surplombe. . Les PBR ouverts peuvent être de différents types, par exemple : - les lacs et étangs (les sels minéraux proviennent du sol, le gaz carbonique de l'air) - les bassins artificiels - les bassins circulaires à agitateur rotatif - les champs de courses (ou � raceways) - les systèmes à plan incliné Pour éviter au maximum les problèmes d'auto-ombrage conduisant à une faible croissance des microalgues, la profondeur des PBR ouverts est de l'ordre de 10 à 30 cm. Toutes les installations de PBR ouverts peuvent être contaminées par des contaminations extérieures (poussières de toutes sortes, cadavres d'insectes, de petits animaux ou encore déjection d'oiseaux...). Pour limiter au maximum les échanges avec l'extérieur et de telles contaminations, il a été développé également des PBR clos qui limitent fortement les échanges des moûts de culture avec l'extérieur. Dans les PBR clos, contrairement à ce qui se passe avec les PBR ouverts, la lumière doit passer au travers d'une paroi qui sert en même temps à confiner les gaz et les liquides. Dans ces PBR clos, la concentration en gaz carbonique des milieux de culture est alors beaucoup plus élevée que dans les PBR ouverts en raison du confinement. Les PBR clos offrent en outre l'avantage d'éliminer pratiquement le phénomène d'évaporation du milieu de culture ou encore de dilution par les pluies et permettent un contrôle facilité des paramètres de culture tels que la température, le pH, les concentrations en gaz dissous et en composés nutritifs. Ils offrent aussi la possibilité de travailler sous de faibles épaisseurs de culture et donc de limiter le phénomène d'auto-ombrage conduisant alors à une concentration en algues accrue, limitant ainsi l'énergie d'agitation et de pompage lors de la culture et l'énergie de centrifugation lors de la récupération de biomasse. Les PBR clos sont classés en différents types, à la fois selon leur forme et leur principe de fonctionnement. Les combinaisons entre les différentes possibilités sont si nombreuses que seules quelques unes seront citées ci après : - photobioréacteurs tubulaires réacteur tubulaire horizontal en zigzag plat réacteur tubulaire horizontal en zigzag forme souple réacteur tubulaire horizontal en zigzag à superposition réacteur tubulaire horizontal à répartition réacteur tubulaire horizontal à répartiteur réacteur tubulaire spiralé réacteur tubulaire à circulation triangulaire réacteurs à couche mince panneaux alvéolaires plats à vitres à cadre rigide et à feuille souple à méandres à feuille suspendue à développement cylindrique à développement sphérique cylindres verticaux et manches réacteurs cylindriques verticaux manches verticales manches horizontales Par conditions de culture autotrophe, on désigne selon la présente invention des conditions de culture avec 20 - un apport en dioxyde de carbone (apporté par exemple par l'air naturel ou de l'air enrichi en CO2, par du CO2 pur, des carbonates ou des bicarbonates), et - une présence de lumière, naturelle ou artificielle. En particulier, la culture de microalgues doit être éclairée avec une intensité lumineuse suffisante, mais non létale pour les microalgues, et les paramètres physiques de la 25 culture (pH, CO2, salinité, température, absorbance...) doivent être contrôlés. La température optimale pour la culture de microalgues en conditions de culture autotrophe est généralement comprise entre 20 et 40 °C Le pH optimal pour la culture de microalgues en conditions de culture autotrophe est généralement compris entre 5 et 8. 30 Une agitation du milieu de culture est également préconisée en conditions de culture autotrophe. Le milieu de culture pour conditions de culture autotrophe comprend les éléments chimiques nécessaires à la croissance de la microalgue en présence de lumière et de dioxyde de carbone. 10 15 Un tel milieu peut comprendre : • Une source de potassium et de phosphore (K2HPO4 par exemple) • Une source d'azote et de soufre ((NH4)2SO4 par exemple) • Une source de magnésium (MgC12 par exemple) • Une source de calcium: (CaC12 par exemple) • Une source de fer: (sulfate de fer par exemple)) • Une source d'oligo-éléments: (sels de Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti par exemple) • De l'eau (par exemple de l'eau stérilisée) • Un tampon pH : il permet de maintenir un pH correct voire optimum: (KH2PO4 par exemple) ou à tout le moins d'en atténuer les variations. Un exemple de composition de milieu de culture pour conditions de culture autotrophe est donné ci après : Exemple de composition du milieu de culture : KNO3 2g KH2PO4 2g MgSO4- 7H2O 2g Extrait de levure 5g Urée 5g FeSO4 -7H2O 100 mg Solution d'oligoéléments # 5m1 Eau 1 000 mL 25 Composition de la solution d'oligoéléments # : H3B 03 2.86 g MnSO4-7H2O 2,5 g ZnSO4-7H2O 0,222 g 30 CuSO4-5H2O 79,0 mg Na2MO4 21,0 mg Eau distillée 1 000 ml En conditions de culture autotrophe, de même qu'en conditions de culture hétérotrophe, les microalgues présentent des temps de doublement sensiblement plus longs que les bactéries : il s'agit de 24h environ, au lieu de 20 min à 1h. Par conditions de culture mixotrophe, on désigne selon la présente invention des conditions de culture avec - un apport en oxygène, - un apport en dioxyde de carbone, - une présence de lumière, et - un milieu de culture comprenant une ou plusieurs sources de carbone organique et/ou de sources d'azote minéral ou organique L'apport en dioxyde de carbone peut être supprimé si la source de carbone est l'acide acétique, car la décomposition oxydative de l'acide acétique conduit à la formation de dioxyde de carbone dans le milieu de culture. La température optimale pour la culture de microalgues en conditions de culture mixotrophe est généralement comprise entre 20 et 40 °C Le pH optimal pour la culture de microalgues en conditions de culture mixotrophe est généralement compris entre 5 et 8. Le milieu de culture pour conditions de culture mixotrophe peut être identique au milieu de culture en conditions de culture hétérotrophe décrit précédemment, mais les concentrations de tous les constituants peuvent être un peu augmentées et on peut y ajouter quelques grammes par litre de carbone organique pour supporter une concentration un peu supérieure de microalgues. Une légère agitation du milieu de culture est également préconisée en conditions de culture mixotrophe. Avantageusement l'étape a) du procédé selon la présente invention comprend plusieurs sous-étapes successives de culture dans des conditions de culture hétérotrophe. Préférentiellement, l'étape a) du procédé selon la présente invention comprend entre deux et quatre sous-étapes successives de culture dans des conditions de culture hétérotrophe. Lesdites sous-étapes de culture successives s'effectuent avantageusement avec des volumes de culture croissants. Avantageusement, le facteur de dilution entre chaque étape de culture successive est compris entre 1/5 à 1/50 ; de préférence 1/10 à 1/30. Avantageusement, la pré-culture de microalgues de départ nécessaire à la mise en oeuvre de l'étape a) du procédé est d'environ 1 litre. Ainsi par exemple si l'étape a) du procédé selon la présente invention comprend trois sous-étapes successives de culture, le facteur de dilution entre chaque étape de culture successive étant de 1/10 alors l'étape a) peut être décrite comme : - pré-culture de microalgues d'environ 1 litre -dilution des environ 1 litre de pré-culture dans environ 9 litres de milieu de culture, - culture en conditions de culture hétérotrophe des environ 10 litres ainsi obtenus - dilution des environ 10 litres de culture dans environ 90 litres de milieu de culture - culture en conditions de culture hétérotrophe des environ 100 litres ainsi obtenus Il est à noter que le facteur de dilution entre les sous-étapes de culture successives n'est pas forcément identique. Ainsi il est possible d'avoir un facteur de dilution de 1/10 20 (dilution d'environ 1 litre de pré-culture de microalgues dans environ 9 litres de milieu de culture) puis de passer à un facteur de dilution de 1/20 pour la sous-étape de culture suivante (dilution des environ 10 litres obtenus dans environ 190 litres de milieu de culture) 25 De manière préférée, l'étape a) du procédé selon l'invention correspond à la mise en culture d'une microalgue hétérotrophe jusqu'à l'obtention d'une concentration supérieure à 1 g/l. Avantageusement, la source de carbone du milieu de culture hétérotrophe est introduite 30 lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, de manière semi-discontinue pendant lesdites sous-étapes de culture successives. Le mode de culture semi-discontinue, dite � fed- batch �, est réalisé par ajout de la source de carbone du milieu de culture hétérotrophe de manière linéaire ou contrôlée. Ainsi le milieu de culture de départ ne comprendra pas la totalité de la quantité de source de carbone prévue au départ dans la 15 composition du milieu de culture mais sera ajoutée progressivement au milieu de culture. Ceci a pour intérêt d'éviter les contaminations, notamment bactériennes. De manière préférée l'inoculum préparé à l'étape a) du procédé selon l'invention est axénique. Par inoculum axénique on entend selon la présente invention, une culture pure d'une souche de microalgue exempte de tous micro-organismes étrangers ou parasites décelables, résultant d'une culture en bioréacteur stérile. Avantageusement, il pourra être prévu une étape A' ), préalable à l'étape a), l'étape A' ) étant une étape de pré-culture de la microalgue hétérotrophe en conditions de culture autotrophe. Cette étape A'), préalable à l'étape a), a pour but de favoriser l'apparition de l'appareil photosynthétique (chloroplastes ...) dans les microalgues afin de faciliter le passage des conditions de culture hétérotrophes de l'étape a) aux conditions de culture autotrophe de l'étape c). Avantageusement à l'étape b) du procédé selon la présente invention, le volume de l'inoculum correspond à 1/5 à 1/50, de préférence 1/10 à 1/30 du volume de milieu de culture De manière préférée, l'étape c) du procédé selon l'invention correspond à la mise en culture d'une microalgue hétérotrophe jusqu'à l'obtention d'une concentration en chlorophylle supérieure à 0,01g/l et/ou une concentration en protéine supérieure à 0,5 g/1, et/ou une concentration en microalgue supérieure à 1 g/l. De manière préférée la microalgue hétérotrophe selon l'invention est choisie parmi les chlorophytes, en particulier Chlorella, Scenedesmus et Muriellopsis, encore plus préférentiellement Chlorella vulgaris ou encore parmi les diatomées comme Odontella aurita. Avantageusement les souches choisies sont riches en chlorophylle. De manière préférée la souche de la microalgue hétérotrophe est une souche obtenue par adaptation à la croissance hétérotrophe. Par adaptation à la croissance hétérotrophe, on désigne selon la présente invention un procédé par lequel on opère une isolation sélective des souches les plus aptes à croître en conditions de culture hétérotrophe. Ce procédé d'adaptation comprend une première étape optionnelle de soumission des microalgues d'intérêt à un rayonnement UV ou a un agent mutagène, par exemple l'acriflamine ; on procède ensuite à la culture desdites microalgues en boite de Petri en absence de lumière sur milieu gélifié contenant une ou plusieurs sources de carbone organique et/ou de sources d'azote minéral ou organique ; on sélectionne les colonies de microalgues présentant la croissance la plus importante ; optionnellement on peut cultiver en milieu liquide dans des conditions de culture hétérotrophe et individuellement les colonies ainsi sélectionnées. Un tel procédé, sans l'étape optionnelle de soumission à un rayonnement UV est décrit par exemple page 2 du document de brevet GB 1,109,659. Un tel procédé, avec l'étape optionnelle de soumission à un rayonnement UV ou à un agent mutagène est décrit par exemple dans la demande de brevet WO 00/36084. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé selon l'invention destiné à l'obtention de biomasse d'une microalgue hétérotrophe qui comprend en outre une étape d) de récolte de la biomasse de la microalgue hétérotrophe obtenue à l'issue de la culture selon l'étape c). Par récolte de la biomasse de la microalgue hétérotrophe, on désigne selon la présente invention la séparation de la microalgue hétérotrophe de son milieu de culture, et récupération de la microalgue hétérotrophe ainsi obtenue, dite � pâte algale �. La � pâte algale � obtenue comprend alors généralement entre 15 et 30% de matière sèche De manière préférée, l'étape d) de récolte de la biomasse de la microalgue comprend une étape de centrifugation ou est réalisée par filtration de la culture de microalgue, de manière encore plus préférée est réalisée par centrifugation. Dans le cas où la filtration serait utilisée, on emploiera préférentiellement une filtration de type tangentielle. Avantageusement, le procédé destiné à l'obtention de biomasse selon l'invention comprend en outre une étape e) de séchage de la biomasse récoltée de la microalgue hétérotrophe obtenue à l'issue de l'étape d). De manière préférée, l'étape e) de séchage de la biomasse récoltée de la microalgue est réalisée par atomisation ou par lyophilisation. Avantageusement le procédé selon l'invention comprend en outre une étape f) de congélation de la biomasse récoltée de la microalgue hétérotrophe obtenue à l'issue de l'étape d), cette étape de congélation pouvant être effectuée sous vide ou sous atmosphère contrôlée. Les exemples ci-après décrivent des modes de réalisation préférentiels du procédé selon la présente invention, sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 : Culture de Chlorella vulgaris selon le procédé de la présente invention La culture de Chlorella vulgaris selon l'exemple 1 comprend - trois sous-étapes de culture en conditions de culture hétérotrophe à partir d'une pré-culture de 1 litre , avec un facteur de dilution de 1/25 entre la première sous-étape et la deuxième sous-étape et un facteur de dilution de 1/24 entre la seconde sous-étape et la troisième sous-étape, et 5 jours de culture à chaque sous-étape pour l'obtention d'un inoculum -l'inoculation d'un milieu de culture pour conditions de culture autotrophe avec 1'inoculum avec un facteur de dilution de 1/50 - culture pendant 2 jours en conditions de culture autotrophe. Ainsi, une pré-culture de microalgues Chlorella vulgaris de 1 litre est cultivée sous aération et agitation pendant 5 jours dans le milieu de culture A et à 35°C : Composition du milieu de culture A, pour 1 litre : KNO3 2g KH2PO4 2g MgSO4.H2O 2g Corn steep 25g Glucose 25g 16 Urée 5g Eau qsp 1 000 mL pH 6,5 La pré-culture de microalgues Chlorella vulgaris de 1 litre est diluée dans 24 litres de milieu de culture A Les 25 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 5 jours en conditions de culture hétérotrophe, c'est-à-dire en absence de lumière et en présence d'air dans un fermenteur classique de 25 litres, tel que ceux utilisés pour les fermentations bactériennes. Du glucose est ajouté de manière discontinue et automatisée au fur et à mesure de sa consommation par les microalgues Chlorella vulgaris en culture. Les 25 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont dilués dans 575 litres de milieu de culture A. Les 600 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 5 jours en absence de lumière et en présence d'air dans un fermenteur classique de 600 litres, tel que ceux utilisés pour les fermentations bactériennes. Du glucose est ajouté de manière discontinue et automatisée au fur et à mesure de sa consommation par les microalgues Chlorella vulgaris en culture. Les 600 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus ont une concentration en microalgues Chlorella vulgaris de 15 g/1 et constituent l'inoculum de microalgues Chlorella vulgaris. L'inoculation d'un milieu de culture B dans un photobioréacteur clos tubulaire, avec ledit inoculum, est réalisée par dilution des 600 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus dans 29 400 litres de milieu de culture B. Composition du milieu de culture B, pour 1 litre : Urée 0,3 g/1 Nitrate d'ammonium 0,4 g/1 KH2PO4 0,35 g/130 17 Sulfate de magnésium 0,5 g/1 Sulfate ferreux 0,5 g/1 A cette solution de macroéléments, on ajoute 0,01 ml/l d'une solution de microéléments composée comme suit : 75 g/1 Sulfate de zinc Borax 6 g/1 Sulfate de cobalt 24 g/1 Sulfate de cuivre 24 g/1 Sulfate de manganèse 410 g/1 10 et 0,01 ml/l d'une solution de molybdate d'ammonium à 9,2 g/l. Le pH du milieu de culture sera réglé entre 6,5 et 7 par injection de gaz carbonique. Les 30 000 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 2 jours, en présence de lumière et en présence de dioxyde de carbone dans un photobioréacteur tubulaire de 30 000 litres (ou 30 m3). On obtient après 2 jours de culture une concentration en microalgues Chlorella vulgaris de 3 g/1, une concentration en chlorophylle 0,12 g/1 et une concentration en protéine de 1,5 g/l. Exemple 2: Culture de Chlorella vulgaris uniquement en conditions de culture autotrophe L'exemple 2 est un exemple comparatif de l'exemple 1, la culture de Chlorella vulgaris étant réalisée uniquement en conditions de culture autotrophe. La culture de Chlorella vulgaris selon l'exemple 2 comprend - cinq étapes de culture en conditions de culture autotrophes à partir d'une pré-culture de 1 litre , avec un facteur de dilution de 1/10 entre les quatre première étapes et un facteur de dilution de 1/30 entre la quatrième et la cinquième étape de culture, 7 jours de culture pour les quatre première étapes et 9 jours de culture pour la cinquième étape. 15 20 25 30 Ainsi, une pré-culture de microalgues Chlorella vulgaris de 1 litre est cultivée pendant 7 jours dans un photobioréacteur clos tubulaire de 1 litre. Cette pré-culture est diluée dans 9 litres de milieu de culture B Les 10 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 7 jours en conditions de culture autotrophe, c'est-à-dire en présence de lumière et en présence de dioxyde de carbone dans un photobioréacteur clos tubulaire de 10 litres Les 10 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont dilués dans 90 litres de milieu de culture B. Les 100 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 7 jours en conditions de culture autotrophe, c'est-à- dire en présence de lumière et en présence de dioxyde de carbone dans un photobioréacteur clos tubulaire de 100 litres Les 100 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont dilués dans 900 litres de milieu de culture B. Les 1000 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 7 jours en conditions de culture autotrophe, c'est-à-dire en présence de lumière et en présence de dioxyde de carbone dans un photobioréacteur clos tubulaire de 1000 litres 25 Les 1000 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus ont une concentration en microalgues Chlorella vulgaris de 3 g/1. Les 1000 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont dilués 30 dans 29 000 litres de milieu de culture B. Les 30 000 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 9 jours en conditions de culture autotrophe,20 c'est-à-dire en présence de lumière et en présence de dioxyde de carbone dans un photobioréacteur clos tubulaire de 30 000 litres (ou 30 m3). On obtient après un total de 30 jours de culture une concentration en microalgues Chlorella vulgaris de 3 g/1, une concentration en chlorophylle de 0,12 g/1 et une concentration en protéine de 1,5 g/l. Comparaison exemple 1/exemple 2 : Il apparait que pour obtenir une concentration en Chlorella vulgaris identique, ayant une qualité biochimique identique (quantité de chlorophylle, quantité en protéines), une culture en conditions de culture autotrophe uniquement nécessite 30 jours de culture (exemple 2) contre seulement 17 jours grâce au procédé selon l'invention (exemple 1) soit un gain de temps de 13 jours (44%).15 Revendications 1. Procédé de culture d'une microalgue hétérotrophe, comprenant les étapes suivantes : (a) Préparation d'un inoculum par la mise en culture d'au moins une souche de microalgue hétérotrophe dans des conditions de culture hétérotrophe, (b) Inoculation d'un milieu de culture dans un photobioréacteur, avec l'inoculum, (c) Culture de la microalgue dans le photobioréacteur, dans des conditions de culture autotrophe ou mixotrophe, de préférence autotrophe. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape a) comprend plusieurs sous-étapes successives de culture dans des conditions de culture hétérotrophe. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdites sous-étapes de culture successives s'effectuent avec des volumes de culture croissants. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le facteur de dilution 20 entre chaque étape de culture successive est compris entre 1 /5 à 1/50; de préférence 1/10 à 1/30. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape a) correspond à la mise en culture d'une microalgue hétérotrophe jusqu'à 25 l'obtention d'une concentration supérieure à 5 g/1, de manière préférée supérieure à 10 g/l. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que la source de carbone du milieu de culture hétérotrophe est introduite lors de l'étape a) de 30 manière semi-discontinue pendant lesdites sous-étapes de culture successives.15 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'inoculum est axénique. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que à l'étape b), le volume de l'inoculum correspond à 1/5 à 1/50, de préférence 1/10 à 1/30 du volume de culture. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le photobioréacteur est choisi parmi les photobioréacteurs clos et les photobioréacteurs ouverts, de préférence parmi les photobioréacteur clos. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'étape c) correspond à la mise en culture d'une microalgue hétérotrophe jusqu'à l'obtention d'une concentration en chlorophylle supérieure à 0,01 g/1 et/ou une concentration en protéine supérieure à 0,5 g/1, et/ou une concentration en microalgue supérieure à 1 g/l. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la microalgue hétérotrophe est choisie parmi les chlorophytes, en particulier Chlorella, Scenedesmus et Muriellopsis, ou parmi les diatomées, en particulier Odontella aurita. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la souche de microalgue hétérotrophe est obtenue par adaptation à la croissance hétérotrophe. 13. Procédé d'obtention de biomasse d'une microalgue hétérotrophe comprenant les étapes du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d) de récolte de la biomasse de la microalgue hétérotrophe obtenue à l'issue de la culture selon l'étape c). 20 25 30 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'étape d) de récolte de la biomasse de la microalgue comprend une étape de centrifugation de la culture de microalgue. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape e) de séchage de la biomasse récoltée de la microalgue hétérotrophe obtenue à l'issue de l'étape d). 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape f) de congélation de la biomasse récoltée de la microalgue hétérotrophe obtenue à l'issue de l'étape d).15