FR 2921837 A1 20090410 FR 0758102 A 20071005 NOUVEAU PROCÉDÉ DE PRÉPARATION DE NANOPARTICULES RECOUVERTES D'UNE COUCHE STABILISATRICE ORGANIQUE COUPLÉE À DES LIGANDS DE CIBLAGE L'invention concerne un nouveau procédé de préparation de nanoparticules pour l'imagerie médicale comprenant un noyau métallique, une couche stabilisatrice organique et au moins un ligand de ciblage d'un tissu pathologique. On connaît des nanoparticules métalliques utilisées en imagerie de diagnostique, notamment en imagerie par résonance magnétique IRM, comportant un noyau métallique, recouvert d'une couche organique stabilisatrice couplée le cas échéant à des ligands de ciblage biologique. Parmi ces nanoparticules, on connaît notamment des nanoparticules métalliques couramment désignées USPIO qui sont de très petites particules d'oxyde de fer, dont notamment de magnétite (Fe30a), de maghémite (-y-Fe2O3) et autres composés minéraux magnétiques d'éléments de transition, de taille inférieure à environ 100-150 nm. Pour obtenir des solutions colloïdales de particules magnétiques, stables en milieu physiologique, il est nécessaire de conditionner la surface des particules magnétiques. Pour cela on recouvre la particule d'une couche organique stabilisatrice constituée de macromolécules telles que des carbohydrates comme le dextran, ou de petites molécules organiques telles que des acides carboxyliques. Afin d'obtenir des informations pertinentes pour le diagnostique par imagerie médicale, il est très avantageux de coupler ces dernières à un ligand de ciblage approprié, de manière à ce que les particules se lient à et/ou soient reconnues spécifiquement par des cellules ou tissus cibles. Cette reconnaissance est souvent assurée par la formation d'un complexe d'affinité entre un ligand d'affinité (ou biovecteur) fixé à la particule et un récepteur à la surface de cellules cibles, ou à l'aide de ligands intervenant sur la biodistribution du produit par exemple par un mécanisme de type phagocytose de la particule par des cellules du système immunitaire telles que les macrophages. Les ligands à affinité spécifique sont typiquement des peptides ou d'autres molécules organiques (sucres, ligands pharmacologiques...). Des ligands intervenant sur la biodistribution sont par exemple des groupements hydrophiles tels que des groupements aminoalcool, ou des composés de type polyéthylène glycol. Le document WO 97/01760 décrit des particules magnétiques recouvertes d'acide dimercaptosuccinique (ADMS), couplées à une entité de ciblage spécifique, l'annexine, via les fonctions thiols de l'ADMS. Les documents EP 888 545 et WO20041034411 décrivent des particules de diamètres de l'ordre de 5 nm, recouvertes de groupes aliphatiques polyacides carboxyliques, ces groupes pouvant être liés à des substances pharmaceutiques actives (ligands de ciblage) notamment choisies parmi des protéines, des enzymes, des antibiotiques, des endotoxines, des substances thérapeutiques dans les domaines notamment cardiovasculaires, cancéreux. Les procédés de l'art antérieur comprennent schématiquement les étapes suivantes : - préparation du noyau métallique des nanoparticules métalliques ; -enrobage du noyau avec la couche stabilisatrice, par exemple polyacide carboxylique ; - couplage de la particule obtenue avec le ligand de ciblage. Toutefois, ces procédés de préparation antérieurs rencontrent des difficultés pour obtenir un contrôle totalement satisfaisant de la quantité de ligand greffée et de l'affinité. Par exemple, dans le cas de peptides biocouplés par des méthodes usuelles (carbodiimido), les fonctions latérales lysine, glutamique, aspartique, peuvent réagir, tout comme les fonctions N et C terminales. Or, ce contrôle est important pour optimiser l'affinité de l'agent de contraste injecté pour la zone pathologique, pour moduler la pharmacocinétique, la biodistribution et éventuellement le métabolisme, l'excrétion et l'innocuité de ces particules. Ce contrôle est de plus très utile pour une production à l'échelle industrielle de tels composés et qui respecte les impératifs de sécurité clinique du produit injecté aux patients. Pour certaines couches stabilisatrices telles que le citrate, la nanoparticule avant couplage avec les ligands n'est pas suffisamment stable pour la fabrication industrielle, ou le taux de greffage des ligands n'est pas maîtrisé de manière totalement satisfaisante : on risque alors d'avoir un manque ou au contraire un excès de ligands greffés ou une trop forte hétérogénéité entre les particules du lot de produit fabriqué et le cas échéant de devoir procéder à des étapes de purification complexes ou inopérantes. Pour certaines couches stabilisatrices, il n'est tout simplement pas possible d'après les essais réalisés par le demandeur avec les procédés décrits dans la littérature d'obtenir une particule suffisamment stable avant le couplage avec les ligands : c'est le cas en particulier des couches suivantes : phosphonates, phosphinates, hydroxamates. Le demandeur a réussi à obtenir un nouveau procédé de synthèse de nanoparticules métalliques permettant de pallier les inconvénients de l'art antérieur pour plusieurs couches stabilisatrices, et désigné procédé par voie inverse. Dans ce procédé, on prépare des éléments constitués par un ou plusieurs ligands couplés chimiquement avec des groupements organiques de liaison (également désignés groupes stabilisateurs ou groupes d'attache), puis ces éléments [ensemble : groupement de liaison + ligand] sont couplés aux nanoparticules métalliques. Les groupements organiques de liaison appartiendront à ou formeront la couche stabilisatrice (également désignée couche d'attache). Les nanoparticules métalliques sont de diamètre varié, notamment de l'ordre de 3 à 300 nm, avantageusement de 5 à 100 nm, et notamment de 5 à 50 nm. Le procédé s'applique efficacement à des ligands de nature chimique et de propriété pharmaceutique thérapeutique et/ou diagnostique très variées et avantageuses. De plus, pour les couches stabilisatrices instables avec les procédés antérieurs, il permet d'obtenir des particules stables et pouvant être greffées par des ligands, ces particules étant donc des composés nouveaux. II n'était de plus pas du tout évident pour l'homme du métier que cette voie inverse conduise à des performances améliorées, illustrées dans les exemples 30 détaillés. L'invention concerne ainsi, selon un premier aspect, un procédé de préparation de nanoparticules métalliques comprenant un noyau métallique N recouvert d'une couche stabilisatrice organique couplée à au moins un ligand de ciblage, ledit procédé comprenant les étapes de : a) préparation du noyau métallique N des nanoparticules métalliques ; b) préparation d'éléments de ciblage de formule S û C, dans laquelle : - S est un groupe d'attache choisi parmi les groupes suivants et leurs dérivés : acide polycarboxylique, acide hydroxy polycarboxylique, phosphonate, sulfonate, hydroxamate, silane, siloxane catécholate; C est un ligand de ciblage ; c) puis greffage sur le noyau N des éléments de ciblage S-C. Chaque groupement S comprend au moins une partie de liaison au noyau N, et au moins une fonction chimique X de couplage avec un ligand C, plus précisément de liaison covalente à une fonction réactive du ligand C. Selon des réalisations, pour les couvertures permettant une couverture stable (citrate par exemple), on pourra partiellement recouvrir le noyau métallique N avec une couche de groupes stabilisateurs/d'attache S, avant d'y greffer des éléments de ciblage S-C lors de l'étape c). Les étapes a) et b) peuvent être réalisés dans n'importe quel ordre mais avant l'étape c). Selon un mode de réalisation, le ligand est un groupe hydrophile à effet sur la biodistribution (répartition dans les tissus, captation macrophagique ...), avantageusement un groupe aminoalcool ou polyéthylène glycol. Selon un mode de réalisation, le ligand est un ligand d'affinité (biovecteur), à affinité de liaison pour une cible surexprimée dans une cellule ou un tissu pathologique, notamment un récepteur cellulaire, une enzyme, et avantageusement choisi parmi un peptide linéaire ou cyclique, un pseudopeptide, un monosaccharide, un polysaccharide, une vitamine, un anticorps, un acide nucléique, une substance pharmacologiquement active. Selon un mode de réalisation, une partie des ligands sont des biovecteurs d'affinité, et une autre partie des ligands sont des ligands à effet sur la biodistribution. Ainsi à l'étape c), on recouvre le noyau, d'une part, d'éléments de ciblage avec ligands de ciblage à affinité spécifique et, d'autre part, de groupes stabilisateurs/d'attache liés à des ligands de stabilité/biodistribution. Selon des réalisations, on greffe sur le noyau, d'une part, des éléments de ciblage S-C et, 5 d'autre part, des groupes de stabilisation S non porteurs de ligands. On aura par exemple 5% à 100% de groupes S-C et le complément (95 à 0%) de groupes S. Les tableaux de la description détaillée illustrent ces possibilités. Ces taux correspondent au taux de couverture (au niveau des sites de fixation possible, typiquement les sites protonés localisés à la surface de la nanoparticule) sur le noyau des éléments S ou S-C. Ainsi, pour un taux de 100%, la surface du noyau sera sensiblement totalement recouverte par des éléments S-C et/ou S. Ce taux de couverture est ainsi distinct du taux de greffage décrit ci-après. L'ensemble des groupements S greffés sur le noyau N constitue la couche d'attache (stabilisatrice). Le taux de greffage (pourcentage en mol de composé S-C et/ou S par mol de fer ; le taux de greffage est calculé à partir des méthodes de microanalyse connues) des éléments de ciblage S-C sur le noyau N est typiquement compris entre 0,5 et 5%, ou entre 1 et 10%, notamment entre 1 et 3%, par exemple 1%, 2%, 3%, 5%, 10% pour une taille cristalline du noyau de l'ordre de 7-8 nm. Les ligands peuvent donc être identiques ou différents entre les éléments de ciblage greffés. Selon des réalisations, les nanoparticules métalliques obtenues après greffage auront ainsi par exemple une partie des éléments de ciblage avec un ligand d'affinité (biovecteur peptide par exemple ; par exemple 0,1 à 50% : avantageusement de l'ordre de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 30, 50% des fonctions X des groupes S sont couplés à un biovecteur), et une autre partie (typiquement 10 à 99 % des éléments de ciblage) avec un ligand différent (autre biovecteur d'affinité ou ligand de biodistribution). On peut ainsi combiner plusieurs ligands d'affinité et/ou de biodistribution. Généralement, on réalise un taux de couplage approprié pour obtenir une taille hydrodynamique de la particule finale satisfaisante, tout en permettant d'assurer un ciblage spécifique efficace. Selon des réalisations, l'acide polycarboxylique comprend au moins deux fonctions carboxyliques et est choisi parmi les acides suivants : acide citrique, acide tartarique (D,L), acide tartrique, acide glutarique, acide malique, acide cyclo- hexanetricarboxylique, acide cyclohexanehexacarboxylique, acide éthylènediaminetétraacétique, acide diéthylènetriaminepentaacétique, acide 4-bromomandélique, l'acide cis,cis,cis,cis-1,2,3,4-cyclopentanetétracarboxylique, acide DL-malique, acide dibenzoyle-D-tartarique, acide chélidonique, acide tétra-hydrofurane-1,3,4,5-tétracarboxylique, acide DL-isocitrique, acide mucique, acide oxalique, acide glucuronique. Parmi les dérivés d'acide carboxylique, on peut utiliser des acides aliphatiques ou aromatiques, des composés substitués des acides polycarboxyliques, dont les groupes carboxyle sont inchangés, mais dont un ou plusieurs atomes d'hydrogène sont remplacés par des groupes alkyle ou des atomes d'halogène. Les groupes de liaison S, en particulier les acides carboxyliques, utilisés pour une liaison à des ligands de ciblage comprennent au moins une fonction de couplage au noyau et au moins une fonction de couplage avec un ligand. Avantageusement, l'acide polycarboxylique est un acide tricarboxylique, de préférence l'acide citrique qui comprend : - une fonction CO2H permettant un couplage chimique à un biovecteur, par exemple par une fonction amine du biovecteur en utilisant des techniques de biocouplage peptidique - une partie en interaction avec le noyau, comprenant deux fonctions CO2H. Selon des réalisations, le groupement S est choisi parmi les groupes suivants, pour lesquels le greffage direct sur le noyau n'est pas réalisable de manière satisfaisante dans des conditions de greffage standard décrites dans la littérature : phosphonate, sulfonate, hydroxamate, siloxane, silane, catécholate. Fonction Structure phosphonate o - R O Phosphonate O monoester R O Où R' phosphinate O R,P O R' sulfonate S'O R~O O hydroxamate R~O { - N-O H siloxane 0- -i RùSi-O^ o- catécholate R OH Ô OH R est par exemple un groupe X-L, où : - X est une fonction capable d'assurer le couplage avec un biovecteur (tel que décrit plus loin) ; L est un lien chimique linker choisi parmi : - une simple liaison, un groupe aliphatique (notamment les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, tert-butyle, isobutyle, pentyle et hexyle) ; un groupe aromatique (groupement hydrocarboné mono- ou polycyclique aromatique comprenant préférentiellement de 5 à 20 atomes de carbone) ; aromatique-aliphatique, lesdits groupes aliphatiques, alicycliques et aromatiques pouvant être éventuellement substitués par un groupe méthyle, hydroxy, méthoxy, acétoxy, amido, ou un atome de chlore, d'iode ou un groupe aliphatique ; alicyclique ; alicyclique-aliphatique ; brome ; un groupement -LI-NHCO-L2 où L, et L2 sont soit identiques, soit différents et représentent un groupe aliphatique ; alicyclique ; aromatique ; alicyclique-aliphatique ou aromatique-aliphatique, lesdits groupes pouvant être éventuellement substitués par un groupe méthyle, hydroxy, méthoxy, acétoxy, amido ou un atome de chlore, d'iode ou de brome. R' est typiquement un groupe aliphatique ou H. L'homme du métier comprend que l'interaction des groupes S du tableau précédent avec le noyau est localisée sensiblement au niveau des groupes porteurs des atomes d'oxygène. Les silanes sont typiquement de formule (SinH2n+2), les siloxanes de formule [R2SiO], (où R est tel que défini ci-dessus - par exemple [SiO(CH3)2]ä . Selon des réalisations, des groupements S sont rendus fluorescents, on couvre alors les nanoparticules avec d'une part des éléments S-C non fluorescents, et d'autre part des éléments S ou S-C rendus fluorescents (exemples détaillés plus loin), les nanoparticules étant d'intérêt en imagerie multimodale (IRM et imagerie optique proche infra rouge notamment) pour affiner le diagnostic. Selon des réalisations, on utilise comme dans le document US 6,638,494 un second composé stabilisateur tel que cité dans le paragraphe [0040] de ce document. Selon des réalisations, en plus des éléments de ciblage S-C, on greffe aussi des groupes ayant un effet sur la stabilité de la nanoparticule, par exemple des acides hydroxy mono carboxyliques, par exemple choisi parmi les suivants : acide gluconique, acide oxalique, acide mandélique, acide 4-hydroxy-3-méthoxymandélique, acide lactobionique, acide alpha-hydroxyhippurique, acide méthyl 2-hydroxybutyrique, acide glycolique, acide N-acétylneuraminique, acide phosphoénolpyruvique. De manière très avantageuse, le procédé du demandeur permet de parfaitement contrôler le taux de greffage des nanoparticules en composés porteurs de ligands, ce qui est très utile pour le coût et le contrôle de l'efficacité physiologique du produit. La fabrication des éléments de ciblage S-C est par ailleurs totalement maîtrisée, en particulier leur pureté avant le greffage, ce qui est majeur pour la fabrication industrielle. Le noyau métallique des nanoparticules préparées est typiquement composé en tout ou partie d'hydroxyde de fer ; d'oxyde de fer hydraté ; d'oxydes de fer mixtes tels que des oxydes de fer mixtes de cobalt, de nickel, de manganèse, de béryllium, de magnésium, de calcium, de baryum, de strontium, de cuivre, de zinc ou de platine ; ou d'un mélange de ceux-ci. Le terme "ferrite" désigne les oxydes de fer de formule générale [xFe2O3,y MOz], où M désigne un métal magnétisable sous l'effet d'un champ magnétique tel que Fe, Co, Ru, Mg, Mn, le métal magnétisable pouvant être éventuellement radioactif. De façon préférentielle, les particules magnétiques des compositions de l'invention comprennent une ferrite, notamment la maghémite (yFe2O3) et la magnétite (Fe3O4), ou encore les ferrites mixtes de cobalt (Fe2CoO4) ou de manganèse (Fe2MnO4). On pourra aussi utiliser pour le noyau des métaux non superparamagnétiques tels que des oxydes de lanthanides (gadolinium et europium notamment), des particules à luminescence retardée (PNAS, 2007, 29,104,22,9266: particules de CaZnHgSiO dopé avec des lanthanides Eu3+, Dy3+,Mn2+), un composé mixte à base des éléments choisis dans le groupe consistant en Ca, Mn, Mg, Si et O, ledit composé mixte étant dopé par des lanthanides, des particules de type quantum dot. A titre de ligands d'affinité préférés, on citera les glycoprotéines, les lectines, la biotine, les vitamines, les dérivés ptéroïques ou aminoptéroïques, les dérivés de l'acide folique et antifolique, les anticorps ou fragments d'anticorps, les peptides et leurs dérivés, les mono- ou polysaccharides, l'avidine, les inhibiteurs ou substrats de récepteurs (membranaires ou nucléaires), les phospholipides, les stéroïdes et leurs analogues, les oligonucléotides, les séquences d'acide ribonucléique, les séquences d'acide désoxyribonucléique, les hormones ou substances analogues aux hormones, les acides aminés, les molécules organiques à activité pharmacologique, les pharmacophores, les protéines éventuellement recombinantes ou mutées, les anticorps ou fragments d'anticorps, les aminoalcools, les dérivés de phospholipide, les saccharides ; les dérivés de l'acide folique et antifolique, les agents de ciblage d'intégrines ou de métalloprotéases étant particulièrement préférés. Selon des réalisations avantageuses, le ligand à affinité est choisi parmi la liste suivante (les documents et références entre parenthèses sont des exemples et non une liste limitative) : 1) Les biovecteurs ciblant des récepteurs VEGF et angiopoiétine (décrits dans WO 01/97850), les polymères tels que polyhystidine (US 6,372,194), les polypeptides ciblant la fibrine (WO 2001/9188), les peptides de ciblage d'intégrines (WO 01/77145, WO 02 26776 pour alphav beta3, WO 02/081497, par exemple RGDWXE), les pseudopeptides et peptides de ciblage de métalloprotéases MMP (WO 03/062198, WO 01/60416), les peptides ciblant par exemple le récepteur KDR/Flk-1 dont R-X-K-X-H et R-X-K-X-H, ou les récepteurs Tie-1 et 2 (WO 99/40947 par exemple), les glycosides de sialyl Lewis (WO 02062810 et � Müller et al, Eur. J. Org. Chem, 2002,3966-3973), les antioxydants tels que l'acide ascorbique (WO 02/40060), les biovecteurs de ciblage de la tuftsine (par exemple US 6,524,554), de ciblage de récepteurs à protéine G GPCR en particulier la cholécystokinine (WO 02/094873), les associations entre antagoniste d'intégrine et mime de la guanidine (US 6 489 333), les quinolones ciblant alphav beta3 ou 5 (US 6,511,648), les benzodiazépines et analogues ciblant des intégrines (US A 2002/0106325, WO01/97861), les imidazoles et analogues (WO 01/98294), les peptides RGD (WO 01/10450), les anticorps ou fragments d'anticorps (FGF, TGFb, GV39, GV97, ELAM, VCAM, inductible par TNF ou IL (US 6,261,535), les molécule de ciblage modifiées par interaction avec la cible (US 5,707,605), les agents de ciblage de dépôts amyloïdes (WO 02/28441 par exemple), les peptides clivés cathepsines (WO 021056670), les mitoxantrone ou quinone (US 6,410,695), les polypeptides ciblant des cellules épithéliales (US 6,391,280), les inhibiteurs de cystéines protéases (WO 99/54317), les biovecteurs décrits dans : US 6,491,893 (GCSF), US 2002/0128553, WO 02/054088, WO 02132292, WO 02/38546, W020036059, US 6,534,038, WO 0177102, EP 1 121 377, Pharmacological Reviews (52, n°2, 179 ; facteurs de croissance PDGF, EGF, FGF...), Topics in Current Chemistry (222, W.Krause, Springer), Bioorganic & Medicinal Chemistry (11, 2003, 1319-1341 ; dérivés tétrahydrobenzazépinones ciblant alphav beta3). 2) Les inhibiteurs d'angiogenèse, notamment ceux testés en essais cliniques ou déjà commercialisés, notamment : - les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des récepteurs FGFR ou VEGFR tels que SUI 01, SU5416, SU6668, ZD4190, PTK787, ZK225846, des composés 30 azacycles (WO 00244156, WO 02059110) ; - les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des MMP tels que le BB25-16 (marimastat), le AG3340 (prinomastat), le solimastat, le BAY12-9566, le BMS275291, le metastat, le neovastat ; - les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des intégrines tels que le SM256, le SG545, des molécules d'adhésion bloquant le EC-ECM (tels que le EMD 121-974, ou la vitaxine) ; - des médicaments à mécanisme d'action antiangiogenèse plus indirect tels 5 que le carboxiamidotriazole, le TNP470, la squalamine, le ZD0101 ; - les inhibiteurs décrits dans le document WO 99/40947, les anticorps monoclonaux très sélectifs pour la liaison au récepteur KDR, les analogues de la somatostatine (WO 94/00489), les peptides de liaison à la sélectine (WO 94/05269), des facteurs de croissance (VEGF, EGF, PDGF, TNF, MCSF, 10 interleukines); des biovecteurs de ciblage de VEGF décrits dans Nuclear Medicine Communications, 1999, 20 ; - les peptides inhibiteurs du document WO 02/066512. 3) Des biovecteurs capables de cibler des récepteurs : CD36, EPAS-1, ARNT, NHE3, Tie-1, 1/KDR, FIt-1, Tek, neuropiline-1, endogline, pléientropine, 15 endosialine, AxI., alPi, a2ssl, a4P1, a5pl, eph B4 (éphrine), récepteur laminine A, récepteur neutrophiline 65, récepteur leptine OB-RP, récepteur chimiokine CXCR-4 (et autres récepteurs cités dans le document WO99/40947), LHRH, bombésine/GRP, récepteurs gastrine, VIP, CCK. 4) Des biovecteurs de type inhibiteurs de tyrosine kinase. 20 5) Les inhibiteurs du récepteur GPllblllla connus choisis parmi : (1) le fragment fab d'un anticorps monoclonal du récepteur GPllb/Illa, Abciximab, (2) les petites molécules peptidiques et peptidomimétiques injectées en intraveineuse telles que l'eptifibatide et le tirofiban. 6) Des peptides antagonistes de récepteurs au fibrinogène (EP 425 212), 25 des peptides ligands de récepteurs IIb/llla, des ligands du fibrinogène, des ligands de la thrombine, des peptides capables de cibler la plaque d'athérome, les plaquettes, la fibrine, des peptides à base d'hirudine, des dérivés à base de guanine ciblant le récepteur IIb/Illa. 7) D'autres biovecteurs ou fragments biologiquement actifs de biovecteurs 30 connus de l'homme du métier comme médicaments, à action anti-thrombotique, anti agrégation plaquettaire, antiathérosclérotique, antiresténotique, anticoagulante. 8) D'autres biovecteurs ou fragments biologiquement actifs de biovecteurs ciblant avj33, décrits en association avec des DOTA dans le brevet US 6 537 520, choisis parmi les suivants : mitomycine, tretinoine, ribomustine, gemcitabine, vincristine, etoposide, cladribine, mitobronitol, methotrexate, doxorubicine, carboquone, pentostatine, nitracrine, zinostatine, cetrorelix, letrozole, raltitrexed, daunorubicine, fadrozole, fotemustine, thymalfasin, sobuzoxane, nedaplatin, cytarabine, bicalutamide, vinorelbine, vesnarinone, aminoglutethimide, amsacrine, proglumide, elliptinium acetate, ketanserin, doxifluridine, etretinate, isotretinoine, streptozocine, nimustine, vindesine, flutamide, drogenil, butocin, carmofur, razoxane, sizofilan, carboplatine, mitolactol, tegafur, ifosfamide, prednimustine, picibanil, levamisole, teniposide, improsulfan, enocitabine, lisuride, oxymetholone, tamoxifen, progesterone, mepitiostane, epitiostanol, formestane, interferon-alpha, interferon-2 alpha, interferon-beta, interferon-gamma, colony stimulating factor-1, colony stimulating factor-2, denileukin diftitox, interleukin-2, leutinizing hormone releasing factor. 9) certains biovecteurs ciblant des types particuliers de cancers, par exemple des peptides ciblant le récepteur ST associé au cancer colorectal, ou le récepteur tachykinine. 10) des biovecteurs utilisant des composés de type phosphines. Il) des biovecteurs de ciblage de P-sélectine, E-sélectine ; par exemple, le 20 peptide de 8 acides aminés décrit par Morikawa et al, 1996, 951, ainsi que différents sucres. 12) l'annexine V ou des biovecteurs ciblant les processus apoptotiques. 13) tout peptide obtenu par des technologies de ciblage telles que le phage display, modifié éventuellement par des acides aminés non naturels 25 (httpllchemlibrary.bri.nrc.ca), par exemple des peptides issus de banques phage display : RGD, NGR, CRRETAWAC, KGD, RGD-4C, XXXY*XXX, RPLPP, APPLPPR. 14) d'autres biovecteurs peptidiques connus de ciblage de plaques d'athérome, cités notamment dans le document WO 20031014145. 30 15) des vitamines. 16) des ligands de récepteurs hormonaux dont les hormones et les stéroïdes. 17) des biovecteurs ciblant des récepteurs opioïdes. 18) des biovecteurs ciblant des récepteurs TKI. 19) des antagonistes LB4 et VnR. 20) des composés nitriimidazoles et benzylguanidines. 21) des biovecteurs rappelés dans Topics in Current Chemistry, vol.222, 260-274, Fundamentals of Receptor-based Diagnostic Metallopharmaceuticals, notamment : - des biovecteurs de ciblage de récepteurs peptidiques surexprimés dans les tumeurs (récepteurs LHRH, bombésine/GRP, récepteurs VIP, récepteurs CCK, récepteurs tachykinine par exemple), notamment les analogues de somatostatine ou de bombésine, des peptides dérivés octréotide éventuellement glycosylés, les peptides VIIP, les alpha-MSH, les peptides CCK-B -des peptides choisis parmi : des peptides cycliques RGD, fibrine- chaîne alpha, CSVTCR, tuftsine, fMLF, YIGSR (récepteur : laminine). 22) des oligosaccharides, des polysaccharides et des dérivés d'oses, des dérivés ciblant les récepteurs Glut (récepteurs d'oses). 23) des biovecteurs utilisés pour des produits de type smart. 24) des marqueurs de la viabilité myocardique (tétrofosmine et hexakis2méthoxy-2méthylpropylisonitrile). 25) des traceurs du métabolisme des sucres et des graisses. 26) des ligands de récepteurs de neurotransmetteurs (récepteurs D, 5HT, Ach, GABA, NA). 27) des oligonucléotides. 28) le facteur tissulaire 29) des biovecteurs décrits dans WO 03120701, en particulier le PK11195 ligand du récepteur périphérique aux benzodiazépines. 30) des peptides liant la fibrine, notamment les séquences peptidiques décrites dans WO 03/11115. 31) des inhibiteurs d'agrégation de plaques amyloïdes décrits dans 30 WO 02/085903. 32) des composés de ciblage de la maladie d'Alzheimer, en particulier les composés comprenant les squelettes de type benzothiazole, benzofuranes, styrylbenzoxazoles/thiazoles/imidazoles/quinoline, styrylpiridines. Les ligands, dont notamment les anticorps et les pharmacophores, peuvent être éventuellement fonctionnalisés de manière à pouvoir réagir avec les fonctions de couplage X des groupes de liaison S, et former une liaison covalente de préférence de type -CONH-, -COO-, -NHCO-, -OCO-, -NH-CS-NH-, -C-S-, -N-NHCO-, -CO- NH-N-, -CH2-NH-, -N-CH2-, -N-CS-N-, -CO-CH2-S-, -N-CO-CH2-S-, -NCO-CH2-CH2-S-, -CH=NH-NH-, -NH-NH=CH-, -CH=N-O-, -O-N=CH-ou répondant aux formules suivantes : Cl NLN H NNN H N - 40 / -N O 5 HN H H H N 10 A titre de ligands à effet sur la biodistribution du produit de contraste, on utilise avantageusement des groupes hydrophiles, notamment des aminoalcools et des PEG. On cite en particulier les aminoalcools de formule générale (II) : R2 15 dans laquelle RI et R2 sont identiques ou différents et représentent une chaîne hydrocarbonée aliphatique comportant de 2 à 6 atomes de carbone, substituée de préférence par 6 à 10 groupements hydroxyles, ou bien par 4 à 8 groupements hydroxyles dans le cas où RI et/ou R2 est interrompu, notamment pour lesquels RI représente un groupe-(CH2)-(CHOH)4-CH2OH ou -(CH2)-CHOH-CH20H et R2 un 20 groupe -CH2-(CHOH)4-CH2OH, et en particulier le groupe HN R, CH2(CHOH)4CH2OH O CH2(CHOH)4CH20H O JCH2(CHOH)4CH2OH H2N~~nl a N CH2(CHOH)4CH2OH 0 Parmi les polyéthylèneglycols, on préfère particulièrement les composés de formule (II) dans laquelle RI et R2, identiques ou différents, représentent H, un groupe alkyle ou une chaîne polyéthylèneglycol de formule -CH2-(CH2-O-CH2) k-CH2OR3 dans laquelle k varie de 2 à 100, et R3 est choisi parmi H, alkyle ou -(CO)Alk, le terme "alkyle" ou "alk" désignant un groupe aliphatique hydrocarboné, linéaire ou ramifié, ayant environ de 1 à 6 atomes de carbone dans la chaîne. Des exemples d'aminopolyéthylèneglycols sont notamment les composés O-(2-aminoéthyl)-O'-méthylpolyéthylèneglycol 1100, O-(2-aminoéthyl)-O'-méthylpoly- éthylèneglycol 2000, O-(2-aminoéthyl)-O'-méthylpolyéthylèneglycol 750, les composés PEG 340, PEG 750, PEG 2000 par exemple. Selon des variantes dans lesquelles des biovecteurs différents sont couplés via les fonctions X à la surface de particules magnétiques, on peut coupler sur chaque particule magnétique deux biovecteurs différents ciblant une même pathologie (par exemple un peptide ciblant un premier type de récepteur surexprimé dans des cellules tumorales et un second type de récepteur surexprimé dans des cellules tumorales), ou des pathologies différentes. Un couplage mixte peut par exemple être utilisé avec des biovecteurs différents mais capables de cibler spécifiquement une même pathologie, tels que des peptides de séquences différentes capables de cibler différentes intégrines ou métalloprotéases surexprimées dans une zone pathologique cancéreuse ou cardiovasculaire. On pourra aussi réaliser un couplage de molécules fluorescentes, phosphorescentes, radioactives (pour imagerie, PET, SPECT), pour une imagerie multimodale. Selon un mode particulier, on réalise un couplage "mixte" entre un ligand associé à une reconnaissance par des cellules du système immunitaire (par exemple des groupes hydrophiles améliorant la captation macrophagique, en particulier dans des zones inflammatoires ou neurodégénératives), et un ligand de nature différente, c'est à dire présentant soit une affinité spécifique pour une cible donnée, soit une activité pharmacologique et/ou cytotoxique, de manière à modifier la biodistribution du produit final. On peut ainsi obtenir une grande variété de nanoparticules vectorisées (portant au moins un ligand). L'invention concerne ainsi également l'utilisation des nanoparticules pour la préparation d'une composition diagnostique ou thérapeutique. Les nanoparticules sont en particulier utilisées comme agent de contraste de type composition de nanoparticules telles que décrites en détail dans le document W02004058275, pour l'imagerie IRM ou scanner RX. Selon des réalisations, les particules sont véhiculées dans des systèmes de libération de principes actifs, tels que des systèmes d'encapsulation de type liposomes ou nanoparticules lipidiques solides qui peuvent également enfermer, en plus des nanoparticules utilisées comme agent de diagnostique, des principes actifs thérapeutiques. Le demandeur a par ailleurs étudié ce procédé voie inverse pour des particules non métalliques ou métalliques comprenant un noyau et au moins une couche de monomères ou de polymères organiques porteuse de ligands de ciblage utiles sur le plan diagnostique ou thérapeutique. Le demandeur a par ailleurs étudié ce procédé voie inverse pour des particules comprenant un noyau (typiquement métallique, mais pas nécessairement), sur lequel les éléments de ciblage comprennent un groupe de liaison (linker) relié au biovecteur (médicament par exemple), le groupe de liaison étant biodégradable de manière à pouvoir libérer le médicament in vivo. L'invention est illustrée à l'aide des exemples détaillés suivants. Dans ce qui suit, les abréviations M, MIL, M théorique, N et M/z, ES+, ES, kD et CCM ont les mêmes significations que dans le document WO 2004/058275 (US 2004/253181). M ou MIL : concentration molaire (mole/litre). M théorique : masse moléculaire théorique. N : normalité. M/z : masse sur charge déterminée par spectrométrie de masse. ES+ : électrospray mode positif. ES- : électrospray mode négatif. TFA : acide trifluoroacétique. kD : unité de masse moléculaire (kiloDalton). CCM : Chromatographie sur Couche Mince. Z ave : diamètre hydrodynamique mesuré par PCS. Poly o : polydispersité mesurée par PCS. La nomenclature chimique qui suit est issue du logiciel ACD/NAME (société Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Canada), selon les règles IUPAC. Dosage du fer total : Le fer est dosé par spectroscopie d'absorption atomique (Spectrophotomètre VARIAN AA10) après minéralisation par HCI concentré et dilution par rapport à une gamme étalon d'ions ferrique (0, 5, 10, 15 et 20 ppm). Taille des particules : - Diamètre hydrodynamique de la particule greffée (Z ave) = Taille PCS : Déterminé par PCS (appareil Malvern 4700, laser 488 nm à 90°) sur un échantillon dilué à - 1 millimolaire avec de l'eau PPI filtrée sur 0.22 dam. PCS = Photon Correlation Spectroscopy = Technique par Diffusion de Lumière Dynamique - Référence : R. Pecora dans J. of Nano. Res. (2000), 2, p. 123-131. - Diamètre de la particule magnétique (p) (avant greffage) : Déterminé par déconvolution des courbes d'aimantation (mesures effectuées 25 sur un magnétomètre SQUID) à différentes températures (Référence : R.W. Chantrell dans 1EEE Transactions on Magnetics (1978), 14(5), p. 975-977). Analyses structurales : Par spectroscopie de masse (appareil MICROMASS VG Quattro II) avec une 30 source Electrospray. Exemples 1 et 2 : préparation d'un USPIO avec couverture phosphonate + amino-alcool (ligand de biodistribution : branche P792) Exemple 1 : 5 Etape 1 : P O Branche P792 OH EDCI / HOBT OH OH OH OH OH AA28 = Br O } 600 mg (1.8 10-3 M) d'acide dibenzylphosphopropionique sont solubilisés dans 20 ml d'eau et 20 ml de dioxane. 3 gr (2.1 10-3 M) de la branche P792 sont 10 ajoutés à cette solution. Le pH est ajusté à 6.2 et 36 mg (2.3 10-3M) de HOBT sont mis en réaction pendant %4 d'heure. 450 mg (2.3 10-3M) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 24 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est concentré à sec sous vide. Le produit obtenu est utilisé tel quel sans purification, avec un rendement quantitatif et un spectre de masse conforme. 15 Etape 2 : AA28 o TFA 20 500 mg (2.9 10-4 M) du produit issu de l'étape 1 sont mis en agitation dans 5 ml de TFA pendant 4 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est concentré à sec avec de l'azote. Le résidu huileux est repris avec de l'lPA et de l'éther éthylique et est agité 24 heures. Le précipité obtenu est filtré sous vide. Le produit obtenu est utilisé tel quel sans purification, avec un rendement quantitatif et un spectre de masse conforme. Exemple 2 : Fe203 Fe203 26 n 125 mg (8 10-5M) du produit issu de l'étape 2 de l'exemple 1 (mis en solution dans 1 ml d'eau) sont ajoutés à une solution de 1 ml de Fe203 à 2 MIL dilué avec 100 ml d'eau. L'ensemble est agité 1/4 heure, le pH est ajusté à 7 avec QSP de NaOH 0.1N. La solution est ultrafiltrée sur 30 KD jusqu'à une conductivité de 30 ps dans le filtrat. 20 ml de solution sont obtenus avec une concentration en Fer de 0.087M/L. Micro analyse : N = 90%, C = 84 %, Br = 93 %. Taux de greffage à partir des dosages de Phosphore = 2.4 % (pourcentage en mol de composé de l'exemple 1-étape 2, par mol de fer). Taille PCS = 25.9 nm. Polydispersité = 0.23. Exemple 3 : produit à couverture sulfonate, non stable par le procédé de l'art antérieur (voie directe) Etape 1 : H202 HOC/SH O o HO S1'OH O O Le protocole décrit dans Takahashi Doi et coll., J. Org. Chem 1985, vol. 50, p. 5716-5719 est utilisé. Une solution de 14 ml d'acide acétique et 14 ml de H202 à 25 % est chauffée 25 à 50°C. 2 g (1.88 10"2 M) d'acide mercaptopropanoique sont introduits lentement en maintenant une température de 50°C. L'agitation est maintenue 1 heure à 50°C et une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est concentré à sec sous vide. Le produit obtenu est utilisé tel quel sans purification (Spectre de masse ES- conforme). Etape 2 : o HO 1,0H Fe203 ä.,.c, - `S \o Fe203 n 30 mg (1.95 10-4M) du produit issu de l'étape 1 de l'exemple 3 (mis en solution dans 1 ml d'eau) sont ajoutés à une solution de 1 ml de Fe203 à 2M/L 10 dans 100 ml d'eau. La solution est agitée 1/ H à température ambiante et 1/2 H à 90°C. Le pH est ajusté à 7 avec QSP de NaOH 0.1N. La solution obtenue n'est pas stable à ce pH. Exemples 4 et 5 : produit à couverture sulfonate avec biovecteur aminoalcool 15 (ligand de biodistribution : branche désignée AAGIAA28Br), par le procédé de l'invention par voie inverse Exemple 4 : HO 0 OH o 0 o HO 5'OH O o OH// \ o O AAG,AAZBBr AAGI AA28Br AAG 1 AA28Br = HzN 20 200 mg (1.3 10"3M) de l'étape 1 de l'exemple 3 sont solubilisés dans 10 ml d'eau. 1.46 gr (1.3 10"3M) de AAG1AA28Br sont introduits dans cette solution et le pH est ajusté à 6.2 avec QSP de NaOH 0.1 N. 250 mg (1.3 10"3M) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 8 heures. 250 mg (1.3 10-3M) sont à nouveau ajoutés et l'ensemble est agité 16 heures. Le milieu réactionnel est en partie concentré sous vide et le concentrat est versé dans 200 ml d' IPA, agité 2 heures, filtré et séché sous vide. Le précipité est élué sur une colonne de 50 ml de résine Amberlite H+ 252 Na. La solution est concentrée à sec sous vide. Le résidu est mis en agitation dans de l'IPA 2 heures puis est filtré et séché. Le spectre de masse est conforme. Exemple 5 n 72 mg (5.67 10"5M) du produit issu de l'étape 1 de l'exemple 4 (mis en solution dans 1 ml d'eau) sont ajoutés à une solution de 1 ml de Fe203 à 1.92 M/L dans 100 ml d'eau. La solution est agitée 1/2 heure à 90°C. Le pH est ajusté à 11 avec QSP de NaOH 1 N puis à 7.2 avec QSP d'HCI 0.1 N. La solution obtenue est ultrafiltrée sur 30 KD jusqu'à une conductivité de 30 tas dans le filtrat. Taille PCS : 30 nm. La fixation au noyau Fe203 se fait au niveau des groupements SO3H. Exemples 6 et 7 : produit à couverture citrate avec biovecteur aminoalcool, par le procédé de l'invention par voie inverse 0 O H~~ \ /O O AAG,AA29Br 11 OH~~ \ O O AAG1AA28Br Fe2O3 - Fe2O325 Exemple 6 OH OH HO O AAGI AA28Br OH OH 3.2 g (1.67 10-2M) d'acide citrique sont solubilisés dans 240 ml d'eau. 19.2 g (1.7 10"2M) de AAG1AA28 sont introduits dans cette solution et le pH est ajusté à 6.2 avec QSP de NaOH 5 N. 4 g (2 10"2M) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 8 Heures. 4 g (2 10-2M) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 16 heures. Le milieu réactionnel est en partie concentré sous vide. La solution est éluée sur une colonne de 200 ml de résine Amberlite H+ 252 Na. La solution est concentrée à sec sous vide. Le résidu est mis en agitation dans de l'éthanol 24 heures puis est filtré et séché. Exemple 7 OH Fe203 Fe203 oH 0H ù AAG IAA28 o n 500 mg (3.84 10-4M) du produit issu de l'exemple 6 (mis en solution dans 2 ml d'eau) sont ajoutés à une solution de 14 ml de Fe203 à 1.336 M!L dans 100 ml d'eau. La solution est agitée '/4 H à TA et '/ H à 90°C. Le pH est ajusté à 7.2 avec QSP de NaOH 0.1 N. La solution obtenue est ultrafiltrée sur 30 KD jusqu'à une conductivité de 30 ps dans le filtrat. Volume final = 60 ml. [Fe] = 0.312 MIL. PCS (dans une formulation citrate) = 30.6 nm. Polydispersité = 0.263. Taux de AAG1AA28lFe = 1.14 %. OH AAG1AA20 OH OH Exemples 8 et 9 : produit à couverture citrate avec biovecteur glucosamine, par le procédé de l'invention par voie inverse Exemple 8 OH OH OH HO 0 EDCI HO OH 400 mg (2.08 10-3M) d'acide citrique, sont solubilisés dans 30 ml d'eau. 539 mg (2.5 10-3M) de (D) glucosamine chlorhydrate sont introduits dans cette solution et le pH est ajusté à 6.2 avec QSP de NaOH 1 N. 500 mg (2.6 10-3M) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 8 Heures. 500 mg (2.6 10-3M) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 16 heures. Le milieu réactionnel est en partie concentré sous vide. Le résidu est mis en agitation dans de I' IPA 24 heures puis est filtré et séché. Le rendement est quantitatif, le spectre de masse conforme. Le produit obtenu est utilisable tel quel sans purification. Exemple 9 OH Fe203 n Fe203 70 mg (2 10"4M) du produit issu de exemple 8 (mis en solution dans 5 ml d'eau) sont ajoutés à une solution de 2 ml de Fe203 à 1.92 M/L dans 100 ml d'eau. La solution est agitée '/2 H à 90°C. Le pH est ajusté à 7.2 avec QSP de NaOH 1 N. La solution obtenue est ultrafiltrée sur 30 KD jusqu'à une conductivité de 30 ps dans le filtrat. Le volume final est de 25 ml. La taille PCS du composé formulé citrate (formulation citrate = 2.9 g de citrate de sodium pour 100 ml de solution) est de 36.7 nm, avec une polydispersité de 0.3. La taille PCS du composé non 24 formulé citrate est de 32.7 nm avec une polydispersité de 0.256. Le taux de citrate-Glucamine IFe est de 3.20 %. Exemple 10 : produit à couverture citrate avec couverture mixte (biovecteur 5 peptidique (ligand d'affinité), et ligand de biodistribution AAG1AA28), par le procédé de l'invention par voie inverse Fe2O 3 O O Fe2O3 OH H,N n 10 16.5 mg (2 10-5M) du peptide (molécule ciblant l'intégrine avp3), mis en solution dans 1 ml d'eau, sont ajoutés à une solution de 2 ml de Fe203 à 1.92 MIL dans 100 ml d'eau. La solution est agitée 1/4 heure. 261 mg (2 10-4M) du composé de l'exemple 6 (mis en solution dans 2 ml d'eau) sont ajoutés au milieu réactionnel. La solution est agitée '/2 H à 90°C. Le pH est ajusté à 7.2 avec QSP 15 de NaOH 1N à température ambiante. La solution obtenue est ultrafiltrée sur 30 KD jusqu'à une conductivité de 30 ps dans le filtrat. Volume final = 25 ml. PCS (non formulé citrate) = 36.7 nm - Polydispersité = 0.242. PCS (formulé citrate) = 32.7 nm. Polydispersité = 0.22. 20 Exemple 11 : préparation de composés désignés pinces fluorescentes (groupements citrate porteurs de groupements fluorescents). Liste des colorants fluorescents engagés dans la réaction de couplage avec l'acide citrique. 25 30 Colorant N° Type Structure 1 fluorescéine NHZ HO � 0 , O •OH 2 Rhodamine N � 0 ~iNO O � , S0 0=5=0 H NH; 3 Cyanine rNH2 0 r-j ~NH 0"O-Na' o,..-o=.0 Naù0 4 Cyanine /ù/NH, O N~0 0 9-0 0=5'0 0_ Na Na 400 mg (2.08 mmol) d'acide citrique, sont dissous dans 30 ml d'eau et 2,5 mmol de colorant sont introduites dans cette solution et le pH est ajusté à 6.2 avec NaOH 1 N. 500 mg (2.6 mmol) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 8 Heures. 500 mg (2.6 mmol) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 16 heures. Le milieu réactionnel est concentré sous vide. Le résidu est précipité dans l'éther puis filtré et séché. Le produit est ensuite purifié par chromatographie flash sur cartouche de silice C18. Colorant N° Type Structure SM fluorescéine OH ES- conforme O H° °H ° a HO 0 N oH 0 H 6 Rhodamine N � O ~/N 'HO ES- conforme OS 0 OH � 10 OH 0=5=0 O\ N 7 Cyanine OH ES- conforme HO OH Tj rH of N \o ONH g ~ N N `•' O.SO- O°s,0 O 8 Cyanine OH ES- conforme HO OH H O N~ �N S NÔ g' O 10 Exemple 12 : synthèse des nanoparticules d'oxyde de fer fluorescentes ayant une couverture citrate porteuse, d'une part, de ligands hydrophiles (aminoalcool) et, d'autre part, de groupements fluorescents. Selon le mode opératoire de l'exemple 9, en utilisant un mélange des pinces (groupements de liaison porteurs des ligands) des exemples 6 et 8, avec les pinces fluorescentes 5, 6, 7 ou 8 dans des proportions variables tel que résumé dans le tableau suivant : Particule Citrate Citrate Rapport molaire Taille N° aminoalcool colorant citrateAminoalcool/citrate PCS nm colorant 9 Exemple 6 5 90/10 31 Exemple 6 5 95/5 35 11 Exemple 6 6 95/5 36 12 Exemple 6 7 98/2 32 13 Exemple 6 8 98/2 32 14 Exemple 6 8 95/5 34 Exemple 8 5 95/5 37 16 Exemple 8 6 90/10 30 17 Exemple 8 6 95/5 36 18 Exemple 8 7 95/5 35 19 Exemple 8 7 98/2 35 Exemple 8 8 98/2 36 Exemple 13 : synthèse des pinces vectorisées (groupements de liaison porteurs des ligands biovecteurs). 10 N° Type Structure citrate + biovecteur SM 21 Peptide ° conforme Ho OH HN O O HzN N O NH H NHH OH HN 0 0 o 22 Folate ° ES- OH conforme HO OH OHO O /j H OH H ~\fj N/~ N O H N IH o J. ^ H2N N N Les biovecteurs sont couplés avec l'acide citrique selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1. Les proportions du cosolvant sont ajustées en fonction de la solubilité des produits mis en oeuvre. Exemple 14 : synthèse des nanoparticules d'oxyde de fer vectorisées Selon le mode opératoire de l'exemple 9 en utilisant un mélange des pinces des exemples 6 et 8 avec les pinces biovecteur n°21 ou 22 dans des proportions variables tel que résumé dans le tableau suivant : Particule N° Citrate Citrate Rapport molaire Taille PCS aminoalcool biovecteur citrateAminoalcool ou nm ou glucosamine /citrate glucosamine biovecteur 23 Exemple 6 21 90/10 33 24 Exemple 6 21 95/5 35 25 Exemple 6 22 95/5 32 5 26 Exemple 6 22 98/2 36 27 Exemple 8 21 98/2 36 28 Exemple 8 21 95/5 34 29 Exemple 8 22 95/5 33 30 Exemple 8 22 90/10 30 Exemple 15 : synthèse des nanoparticules d'oxyde de fer vectorisées et fluorescentes Selon le mode opératoire de l'exemple 9, en utilisant un mélange des pinces des exemples 6 et 8, avec les pinces biovecteur 21 ou 22 et des pinces fluorescentes 5,6,7 ou 8 dans des proportions variables tel que résumé dans le tableau suivant : 10 Particule Citrate Citrate Citrate Rapport molaire Taille N° aminoalcool biovecteur colorant citrateAminoalcool/citrate PCS biovecteur/citrate nm colorant 31 Exemple 6 21 5 90/8/2 35 32 Exemple 6 21 5 95/4/1 37 33 Exemple 6 22 6 90/5/5 36 34 Exemple 6 22 6 96/2/2 36 35 Exemple 8 21 5 95/3/2 35 36 Exemple 8 21 6 90/5/5 34 37 Exemple 8 22 7 80/10/10 37 38 Exemple 8 22 8 85/10/5 35 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de nanoparticules métalliques comprenant un noyau métallique N recouvert d'une couche stabilisatrice organique couplée à au moins un ligand de ciblage, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) préparation du noyau métallique N des nanoparticules métalliques ; b) préparation d'éléments de ciblage de formule : S û C dans laquelle : - S est un groupe organique de liaison choisi parmi les groupes : acide polycarboxylique, phosphonate, sulfonate, hydroxamate, silane, siloxane, catécholate ; - C est un ligand de ciblage ; c) greffage sur le noyau N des éléments de ciblage S-C. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le noyau métallique est choisi parmi les suivants : hydroxyde de fer, oxyde de fer hydraté, ferrite, oxyde de fer mixte, oxyde de lanthanides, composé mixte à base des éléments choisis dans le groupe consistant en Ca, Mn, Mg, Si et O, ledit composé mixte étant dopé par des lanthanides. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que S est un groupe acide polycarboxylique, avantageusement di ou tricarboxylique. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que S est un groupe phosphonate, sulfonate, hydroxamate, siloxane, catécholate. 5. Procédé selon la revendication 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand est un groupe hydrophile à effet sur la biodistribution ou la captation macrophagique, avantageusement un groupe aminoalcool ou polyéthylène glycol. 6. Procédé selon la revendication 1 à 5, caractérisé en ce que le ligand est un ligand d'affinité, à affinité de liaison pour une cible surexprimée dans une cellule ou un tissu pathologique, notamment un récepteur cellulaire, une enzyme, et avantageusement choisi parmi : un peptide linéaire ou cyclique, un pseudopeptide, un monosaccharide, un polysaccharide, une vitamine, un anticorps, un acide nucléique, une substance pharmacologiquement active. 7. Procédé selon la revendication 1 à 6, caractérisé en ce qu'une partie des ligands sont des biovecteurs d'affinité, et une autre partie des ligands sont des ligands à effet sur la biodistribution. 8. Procédé selon la revendication 1 à 7, caractérisé en ce que l'on greffe sur le noyau, d'une part, des éléments de ciblage S-C et, d'autre part, des groupes de stabilisation S non porteurs de ligands. 9. Procédé selon la revendication 1 à 8, caractérisé en ce que le taux de greffage des éléments de ciblage sur le noyau est de 1 à 10%, avantageusement 1, 2, 3, 5, 10 %. 10. Nanoparticule comprenant un noyau métallique recouverte d'une couche stabilisatrice de type phosphonate, sulfonate, hydroxamate, catécolate, sur laquelle sont greffés des ligands de ciblage, susceptible d'être obtenue par un procédé selon la revendication 1 ou 2. 11. Utilisation d'une particule selon la revendication 10 pour la préparation d'une composition de diagnostic pour imagerie médicale.