FR 2923054 A1 20090501 FR 0707480 A 20071024 PROCEDE ET DISPOSITIF DE RECONSTRUCTION DU VOLUME D'UN OBJET A PARTIR D'UNE SEQUENCE D'IMAGES DE COUPES DUDIT OBJET L'invention porte sur un procédé de reconstruction du volume d'un objet à partir d'une séquence d'images de coupes dudit objet, le positionnement desdites coupes par rapport à l'objet étant connu de manière incertaine. L'invention s'applique en particulier, mais de manière non limitative, à la microscopie confocale. La reconstruction d'une image tridimensionnelle du volume d'un objet à partir d'une séquence d'images bidimensionnelles de coupes dudit objet est un puissant outil de recherche, particulièrement en biologie et en médecine. Des nombreuses méthodes mathématiques ont été développées pour résoudre le problème de la reconstruction. Ces méthodes se basent généralement sur l'hypothèse que la position et l'orientation des plans de coupe par rapport à l'objet à reconstruire sont connues de manière précise. Or, cette hypothèse n'est pas toujours satisfaite, surtout lorsque l'objet à reconstruire présente des dimensions microscopiques. L'article de S. Brant et M. Mevorah � Camera motion recovery without correspondence from microrotation sets in wide-field light microscopy � (Proceedings of the Statistical Methods in Mufti-Image and Video Processing Workshop - ECCV 2006, Graz, Autriche, mai 2006) esquisse une technique de reconstruction prenant en compte l'instabilité des positions des plans de coupe. Conformément à cette méthode, les mouvements de rotation des plans de coupe sont estimés à partir d'une fonction d'auto-corrélation de la séquence d'images, exprimée sous la forme d'une séquence temporelle monodimensionnelle, et les mouvements de translation sont estimés par segmentation des images et recalage de leurs centres de masse. Ensuite, les estimations sont affinées par inversion bayesienne. L'efficacité de cette méthode repose sur des hypothèses qui ne sont pas toujours réalistes, en particulier lorsque les images des coupes sont obtenues par microscopie confocale à balayage ou par d'autres techniques d'imagerie par fluorescence. La microscopie confocale à balayage est une technique de microscopie bien connue permettant d'obtenir une image d'une section d'un objet tel qu'une cellule, ladite section correspondant au plan focal de microscope. En déplaçant successivement le plan focal, on acquiert une série d'images bidimensionnelles à partir desquelles le volume de l'objet peut être reconstruit en trois dimensions. Cette technique ne peut s'appliquer qu'à des objets qui peuvent être fixés à un substrat, tels que des cellules adhérentes. Or, des nombreuses cellules ù et notamment celles du système immunitaire ù ne sont pas adhérentes, et ne peuvent donc pas être reconstruites de cette manière. Le document EP1413911 décrit un microscope équipé d'un réceptacle muni d'un ensemble d'électrodes qui permettent la manipulation d'un objet en suspension dans ledit réceptacle. En soumettant ledit objet en suspension à des mouvements de translation et/ou de rotation alors que le plan focal du microscope est maintenu fixe, il est donc possible d'acquérir une succession d'images de coupes dudit objet. L'acquisition d'une succession de coupes obtenues par rotation est particulièrement intéressante, car elle permet de minimiser l'aberration axiale, un artefact résultant du fait que la résolution axiale d'un microscope confocale est moins bonne (d'environ un facteur deux) que sa résolution transversale. La principale limitation de cette technique réside dans le fait que le mouvement de l'objet dans le réceptacle ne peut être contrôlé que de manière imparfaite à cause, entre autres, du mouvement brownien. Il s'ensuit que le positionnement et/ou l'orientation des coupes dans le volume dudit objet est soumis à une indétermination. On peut modéliser cette situation en considérant qu'une translation/rotation aléatoire se superpose à des translations et/ou rotations nominales de l'objet. Dans ces conditions, les techniques de reconstruction connues de l'art antérieure ne peuvent pas s'appliquer. Une première tentative de prendre en compte les incertitudes du mouvement est décrite dans l'article � Camera Motion Recovery Without Correspondence from Microrotation Sets in Wide-Field Light Microscopy �, de S. Brandt et M. Merovah, in Proc. Statistical Methods in Mufti-Image and Video Processing Workshop, ECCV, 2006. Cependant, la méthode proposée par cette publication ne fournit pas une estimation satisfaisante des translations/rotations aléatoires, et par conséquent ne permet pas une reconstruction acceptable de l'objet observé. Un but de l'invention est de fournir des procédés permettant la reconstruction du volume d'un objet à partir d'une séquence d'images de coupes, ces procédés pouvant s'appliquer même lorsque le positionnement et/ou l'orientation des coupes dans le volume dudit objet est soumis à une indétermination. Un objet de l'invention est donc un procédé de reconstruction du volume d'un objet à partir d'une séquence d'images de coupes dudit objet, lesdites coupes correspondant à différents positionnements et/ou orientations d'un plan d'acquisition par rapport à l'objet, lesdits positionnements et/ou orientations étant soumis à des incertitudes, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte : (a) le choix d'une base finie de fonctions, sur laquelle le volume à reconstruire peut être décomposé ; (b) le choix d'une première fonction de quantification de l'écart entre le positionnement et/ou l'orientation réels de chaque coupe par rapport audit objet, et son positionnement et/ou orientation nominaux ; (c) le choix d'une deuxième fonction de quantification de la cohérence spatiale du volume reconstruit; (d) le choix d'une troisième fonction de quantification de l'écart entre les images de coupes de l'objet et les coupes correspondantes du volume reconstruit ; (e) le choix d'une fonction de cout global, dont la valeur dépend de celle desdites première, deuxième et troisième fonctions de quantification ; et 4 (f) l'estimation conjointe, par minimisation de ladite fonction de cout globale, des positionnements et/ou des orientations réels des coupes, ainsi que des coefficients de décomposition de l'image de l'objet sur ladite base de fonctions. Ledit objet est généralement tridimensionnel, mais l'invention peut également s'appliquer à la reconstruction d'un objet bidimensionnel à partir d'une succession de coupes monodimensionnelles_ Le terme � volume � doit donc être interprété dans un sens large. Selon des modes de réalisation particuliers de l'invention - Ladite base finie de fonctions, sur laquelle le volume à reconstruire peut être décomposé, peut être constituée de fonctions gaussiennes. - Ladite base finie de fonctions, sur laquelle le volume à reconstruire peut être décomposé peut être une base définissant un espace 15 d'Hilbert à noyau auto-reproduisant Dans ce cas, ladite deuxième fonction de quantification de la cohérence spatiale du volume reconstruit peut être proportionnelle à la norme dudit espace d'Hilbert à noyau auto-reproduisant. - Ladite première fonction de quantification de l'écart entre le positionnement et/ou l'orientation réels de chaque coupe, et son 20 positionnement et/ou orientation nominaux, peut être basée sur une norme euclidienne et/ou sur une norme géodésique. - Ladite première fonction de quantification de l'écart entre le positionnement et/ou l'orientation réels de chaque coupe, et son positionnement et/ou orientation nominaux, peut dépendre d'au moins un 25 paramètre de calibrage caractéristique de l'instrument utilisé pour l'acquisition des images de coupes dudit objet. Ladite deuxième fonction de quantification peut dépendre d'au moins un paramètre de calibrage de la cohérence spatiale et ladite troisième fonction de quantification dépend d'au moins un paramètre de 30 calibrage d'écart, ledit procédé comportant également, préalablement à ladite étape (t), une étape (d') d'estimation conjointe, à partir de ladite séquence 10 d'images de coupes dudit objet, d'au moins lesdits paramètres de calibrage de la cohérence spatiale et d'écart. -L'étape (d') peut comporter l'estimation conjointe d'au moins lesdits paramètres de calibrage de la cohérence spatiale et d'écart par 5 une méthode de maximum de vraisemblance, à partir de ladite séquence d'images de coupes dudit objet. En particulier, cette estimation par une méthode de maximum de vraisemblance peut être basée sur l'hypothèse que ladite deuxième fonction de quantification de la cohérence spatiale du volume reconstruit, ainsi que ladite troisième fonction de quantification de l'écart entre les images de coupes de l'objet et les coupes correspondantes du volume reconstruit, suivent des distributions gaussiennes. - Ladite fonction de cout global peut être une combinaison linéaire desdites première, deuxième et troisième fonctions de quantification. Ladite étape (f) d'estimation conjointe des positionnements etlou des orientations réels des coupes, ainsi que des coefficients de décomposition de l'image de l'objet sur ladite base de fonctions, peut s'effectuer par minimisation de ladite fonction de cout globale selon une méthode de descente de gradient. - Lesdites coupes de l'objet peuvent être obtenues par des translations nominales successives, auxquelles se superposent des rotations- translations aléatoires, inconnues à priori, d'un plan d'acquisition d'image. - En variante, lesdites coupes de l'objet peuvent être obtenues par des rotations nominales successives autour d'un même axe, auxquelles se superposent des rotations-translations aléatoires, inconnues à priori, d'un plan d'acquisition d'image. Dans ce cas, lesdites étapes (a) à (f) peuvent avantageusement être répétées pour au moins deux séquences de coupes obtenues par des rotations nominales successives d'un plan d'acquisition d'image, les axes de rotations correspondant auxdites deux séquences de coupes étant sensiblement orthogonales entre eux, et dans lequel les reconstructions du volume de l'objet obtenues à partir desdites deux séquences de coupes sont fusionnées par interpolation, par exemple par lissage spline. Un autre objet de l'invention est un procédé de reconstruction du volume d'un objet à partir d'une pluralité de séquences d'images de coupes dudit objet, chaque séquence étant constituée de coupes obtenues par des translations nominales successives d'un plan d'acquisition, l'orientation nominale dudit plan d'acquisition étant différente pour chaque séquence et connue de manière imparfaite. Ce procédé est dénommé � protocole P.M. � (� piles multiples �), car il exploite une multiplicité de � piles � de coupes de l'objet. Non seulement les orientations réciproques des différents piles sont connues de manière imparfaite, mais à l'intérieur de chaque pile des rotations-translations aléatoires, inconnues à priori, se superposent aux translations nominales du plan d'acquisition. Un tel procédé comporte : (A) l'estimation des positionnements et des orientations relatifs du plan d'observation pour chacune des coupes desdites séquences 15 par un procédé tel que décrit plus haut ; (B) l'estimation des décalages et des différences d'orientation entre les différentes séquences et par rapport audit objet ; (C) la compensation des décalages et différences d'orientation entre séquences d'images de coupes ; et 20 (D) la reconstruction dudit volume par interpolation à partir des images de coupes desdites séquences, considérées comme un seul ensemble. Selon des modes de réalisation particuliers : - Ladite étape (B) d'estimation des décalages et des 25 différences d'orientation entre les différentes séquences d'images de coupes dudit objet peut être effectuée au moyen d'une analyse en composantes principales. Cette analyse en composantes principales peut, en particulier, être effectuée sur des versions binarisées desdites séquences d'images de coupes. Plus précisément, chaque séquence d'images de coupes peut être 30 binarisée à l'aide d'un seuil de binarisation qui est estimé conjointement à un seul de binarisation d'une séquence choisie comme référence, cette estimation étant effectuée, pour chaque séquence autre que la séquence de référence, par minimisation d'une fonction d'écart entre les valeurs propres de la matrice de variance-covariance de ladite séquence et celles de la matrice de variance-covariance de ladite séquence de référence. Notamment, cette (r o fonction d'écart peut être donnée par : , où et 2k sont les valeurs propres des matrices de variance-covariance de la séquence binarisée considérée et de la séquence binarisée de référence, respectivement, tandis que i, r' sont les seuils de binarisation respectifs. Encore un autre objet de l'invention est un procédé de reconstruction du volume d'un objet, exploitant une pluralité de séquences d'images de coupes dudit objet, lesdites séquences étant de nature différente. En particulier, une première séquence peut être obtenue par des translations d'un plan d'observation par rapport audit objet (une � pile �), et au moins une deuxième séquence peut être obtenue par des rotations d'un plan d'observation par rapport audit objet. Comme dans les cas précédents, des rotations-translations aléatoires, inconnues à priori, peuvent se superposer auxdites translations ou rotations du plan d'observation associée aux différentes coupes. Un tel procédé comporte : (i) une reconstruction préliminaire dudit volume à partir de ladite première séquence d'images par un procédé tel que décrit plus haut ; (ii) l'estimation du positionnement et de l'orientation des coupes de ladite ou desdites deuxièmes séquences, et leur recalage spatial à partir de ces estimations ; et (iii) la reconstruction dudit volume, par interpolation à partir de ladite ou desdites deuxièmes séquences d'images recalées de coupes. Autrement dit, la � pile � constituée par la première séquence d'images est utilisée pour effectuer une reconstruction préliminaire, qui ne sert que pour permettre le positionnement des coupes obtenues par rotation (deuxième séquence). C'est cette deuxième séquence qui est utilisée pour la reconstruction du volume, de manière à profiter de meilleure résolution 8 spatiale qu'elle offre en raison du phénomène d'aberration axiale mentionné plus haut. Ce procédé est appelé � bi-protocole �, car il combine deux types différents d'acquisitions. En variante, on peut utiliser une pluralité de premières séquences d'images de coupes de l'objet, obtenues par des translations d'un plan d'observation par rapport audit objet. Dans ce cas, le procédé comporte : (i) une reconstruction préliminaire dudit volume à partir 10 desdites premières séquences d'images selon le protocole � P.M. � décrit plus haut ; (ii) l'estimation du positionnement et de l'orientation des coupes de ladite ou desdites deuxièmes séquences, et leur recalage spatial à partir de ces estimations ; et 15 (iii) la reconstruction dudit volume par interpolation à partir de ladite ou desdites deuxièmes séquences d'images recalées de coupes. En variante, la première séquence d'images de coupes de l'objet peut être obtenue par des rotations d'un plan d'observation par rapport audit objet, tandis que la ou les deuxièmes séquences d'images de coupes de 20 l'objet sont obtenues par des translations dudit plan d'observation par rapport à l'objet. Autrement dit, les rôles des � piles � et de la ou des séquences obtenues par rotation sont inversés. Ce procédé comporte à son tour : (i) une reconstruction préliminaire dudit volume à partir de ladite première séquence d'images par un procédé tel que décrit plus haut ; 25 (ii) l'estimation du positionnement et de l'orientation des coupes de ladite ou desdites deuxièmes séquences, et leur recalage spatial à partir de ces estimations ; et (iii) la reconstruction dudit volume, par interpolation à partir de ladite ou desdites deuxièmes séquences d'images recalées de coupes. 30 Cette variante est avantageuse lorsque la résolution axiale est meilleure que la résolution transversale. 9 Selon des modes de réalisation particuliers d'un procédé de type � bi-protocole � : - Ladite étape (ii) d'estimation du positionnement et de l'orientation des coupes de ladite ou desdites deuxièmes séquences, et de recalage spatial à partir de ces estimations, peut comporter la minimisation d'une fonction de quantification de l'écart entre les images de coupes de l'objet et les coupes correspondantes du volume reconstruit préliminaire. - La minimisation d'une fonction de quantification de l'écart entre les images de coupes de l'objet et les coupes correspondantes du volume reconstruit préliminaire peut comporter : une première phase d'estimation préliminaire, basée sur l'hypothèse que toutes les coupes de ladite ou de chaque deuxième séquence sont obtenues par des déplacements et/ou des translations constants mais inconnues dudit plan d'observation ; et une deuxième phase d'affinement comportant l'estimation des rotations-translations aléatoires se superposant aux translations ou rotations supposées constantes du plan d'observation associée aux différentes coupes. - Ladite étape (iii) de reconstruction dudit volume par interpolation à partir de ladite ou desdites deuxièmes séquences d'images 20 recalées de coupes peut s'effectuer par lissage spline. Il est intéressant d'observer que les procédés de type � P.M. � et � bi-protocole � peuvent également être utilisés en l'absence de translations-rotations aléatoires se superposant aux déplacements nominaux du plan d'acquisition. 25 Les procédés décrits ci-dessus s'appliquent en particulier au cas où lesdites séquences d'images de coupes dudit objet sont acquises par microscopie confocale. Encore plus particulièrement, ces procédés s'appliquent au cas où ledit objet est disposé dans un réceptacle d'un microscope confocal, lesdites séquences d'images de coupes dudit objet 30 étant acquises en déplaçant ledit objet par rapport au réceptacle. L'invention peut cependant s'appliquer aussi au cas plus conventionnel où c'est le plan focal du microscope qui se déplace, alors que lo l'objet reste fixe. Ce qui compte est qu'il y ait un déplacement relatif entre le plan d'acquisition et l'objet. L'invention n'est d'ailleurs pas limitée au domaine de la microscopie. Encore un autre objet de l'invention est un dispositif de reconstruction du volume d'un objet, comportant : un moyen d'acquisition d'une séquence d'images de coupes dudit objet, lesdites coupes correspondant à différents positionnements et/ou orientations d'un plan d'acquisition par rapport à l'objet ; et un moyen de traitement de données pour reconstruire le volume dudit objet à partir de ladite séquence d'images de coupes de ce dernier ; caractérisé en ce que les positionnements et/ou orientations du plan d'acquisition correspondant aux différentes coupes sont soumis à des incertitudes ; et en ce que le moyen de traitement de données est adapté pour mettre en oeuvre un procédé tel que décrit ci-dessous. Ledit moyen d'acquisition d'une séquence d'images de coupes dudit objet peut être, en particulier, un microscope confocal muni d'un réceptacle pour contenir ledit objet, et de moyens pour déplacer ledit objet par rapport au réceptacle. D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention 20 ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple et qui représentent, respectivement : - Les figures 1A à 1 D, un exemple simple de reconstruction d'un objet bidimensionnel à partir d'une pluralité de coupes monodimensionnelles ; - La figure 2, un organigramme d'un procédé de reconstruction selon un premier mode de réalisation de l'invention ; -La figure 3, un organigramme d'un procédé de reconstruction selon un deuxième mode de réalisation de l'invention (protocole � P.M. �) ; - La figure 4, un organigramme d'un procédé de reconstruction selon un troisième mode de réalisation de l'invention (� biprotocole �) ; 25 30 2923054 Il - La figure 5, une pluralité d'images de coupes acquises par rotation d'un plan d'acquisition par rapport à une cellule visualisée au moyen d'un microscope confocal ; - Les figures 6A, 6B, 7A et 7B, des reconstructions de cette 5 cellule à partir d'une séquence d'images de coupes obtenues respectivement par translation (6A, 7A) et par rotation (6B, 7B) d'un plan d'acquisition par rapport à ladite cellule ; et - La figure 8, un dispositif pour la mise en oeuvre d'un procédé de reconstruction selon l'invention. 10 Les figures 1A à 1 D permettent de comprendre de manière intuitive l'enjeu de l'invention. La figure 1A montre un objet bidimensionnel, plus exactement une image en noir et blanc du chiffre � 5 �. La figure 1B montre une pluralité de lignes d'acquisition qui 15 � sondent � cet objet bidimensionnel. Nominalement, ces lignes sont obtenues par rotation d'un angle N(po, avec N entier, d'une ligne de base ; en réalité, on peut observer qu'une rotation-translation aléatoire se superpose à ce mouvement nominal de rotation pure. La figure 1C montre une reconstruction de l'objet obtenue en supposant que la position et l'orientation de chaque ligne d'acquisition coïncident avec la position et l'orientation nominales. On peut voir que l'image est très dégradée en raison des rotations-translations aléatoires qui perturbent l'acquisition des images monodimensionnelles. Enfin la figure 1 D montre une reconstruction réalisée par un procédé de l'invention. Cette reconstruction est pratiquement parfaite, malgré l'incertitude qui affecte la position et l'orientation de chaque ligne d'acquisition. Evidemment, s'agissant d'une simulation, les positions et orientations réelles des lignes d'acquisition étaient connues a priori, mais cette connaissance (qui n'est pas disponibles dans des conditions opérationnelles) n'a pas été exploitée pour obtenir l'image de la figure 1 D. Pour décrire les procédés de l'invention de manière rigoureuse, on considère un instrument (par exemple, un microscope 12 confocal), permettant d'acquérir une séquence de coupes = "` } d'un objet par déplacement et/ou rotation d'un plan d'acquisition par rapport audit objet. Le mouvement peut être continu ou discret. Peu importe que ce soit le plan d'acquisition qui se déplace alors que l'objet reste fixe ou l'inverse : ce qui compte est qu'il y ait un mouvement relatif permettant au plan d'acquisition de � sonder � le volume de l'objet. Les mouvements du plan d'acquisition engendrés par l'instrument sont plus ou moins instables. Par exemple dans le cas où l'instrument à été réglé pour un mouvement de rotation continue, la position de l'axe de rotation peut évoluer avec le temps autour de la position qui à été paramétrée lors du réglage. De plus, l'axe peut être soumis à des translations parasites. Ainsi, vis-à-vis de la séquence I, ce mouvement se traduit par une séquence de micromouvements = {0= = (Ri,T), = 1,...n} où R, et T, sont respectivement des micro-rotations et des micro-translations définissant la 15 position de la coupe Ii. Cette séquence constitue une version dégradée ou � bruitée � du mouvement nominal de rotation ° (..,0), 2 1,...n} paramétré lors du réglage de l'instrument. De même, dans le cas où l'instrument a été réglé pour un mouvement de translation continue, la position de l'axe de translation peut 20 évoluer avec le temps autour de la position qui a été paramétrée lors du réglage. Vis-à-vis de la séquence 1, ce mouvement se traduit par une séquence de micromouvements 4' ù {0' (R'- Vii)' 1.... -Il où R et Ti sont respectivement des micro-rotations et des micro-translations définissant la positon de la coupe li. Cette séquence constitue une version dégradée ou 25 � bruitée � du mouvement nominal de translation (el ù { ù (41, T). l ..7L} paramétré lors du réglage de l'instrument. Les procédés de l'invention permettent la reconstruction d'une image 3-D de l'objet à partir d'une séquence de coupes de cet objet. La reconstruction consiste à déterminer un volume de "densités" 13 f = {f (s), s E R } à partir d'une séquence de coupes I = {T,(s); .s E Z2, i ù 1, , n} la position des coupes définies par = {q"j i = 1 ...n} n'étant pas connue de façon précise. On entend par � position � d'un plan d'acquisition un ensemble de paramètres définissant complètement sa situation dans l'espace, y comprise son orientation. La fonction des � densités � f peut exprimer, par exemple, les niveaux de gris d'une image monochromatique ; dans ce cas, f est une fonction scalaire des coordonnées spatiales. Pour une image en couleurs (ou en fausses couleurs), f sera une fonction vectorielle avec, par exemple, une composante de luminance et deux composantes de chrominance. On suppose pour commencer que l'instrument est réglé pour un mouvement paramétré sur l'instrument par ` (R". °) avec = 0 dans le cas d'une rotation pure et R° Id dans le cas d'une translation pure. L'idée à la base de la présente invention est d'estimer simultanément les positions {0'1 des coupes et la fonction f des densités de l'objet. Les positions estimées le sont dans le voisinage du mouvement nominal 4"0. Le volume estimé est déterminé de façon à optimiser la cohérence spatiale des densités du volume. Les deux estimations sont interdépendantes : meilleure est l'estimation des positions et meilleure est la cohérence des densités. Cette procédure s'applique à des "objets" de dimensions d (typiquement, d=2 ou 3), les coupes étant de dimension d-1. Dans la suite, on supposera toujours d=3. La figure 2 montre un organigramme d'un procédé de reconstruction selon un premier mode de réalisation de l'invention. Soit = {Iä 1 = 1 ..., n} une séquence de coupes de l'objet correspondant à un mouvement continu, soit de rotation, soit de translation, paramétré par 6". On commence par choisir un plan de référence II" par placer toutes les images de coupe à la même place dans ce plan. Soit f = {f(s), E 231 le volume inconnu. La position de chacune des coupes dans f peut être définie en appliquant Ho a une rotation affine -"r3). On pose = {0a* i et 4'0 û f °- i =1û'1. La suite de la procédure ci-présente permet d'estimer et I*. La première étape (a) du procédé consiste à choisir une base finie de fonctions sur laquelle le volume à reconstruire (ou, plus précisément, la fonction f représentative des densités dans ce volume) peut être décomposée. Cette étape permet de représenter la fonction spatiale f par un nombre fini de coefficients, et de donner ainsi une dimension finie au problème d'optimisation que l'on se propose de résoudre. Cette base peut être constituée, par exemple, par une famille de gaussiennes. Ensuite û étape (b) û on choisit une fonction de quantification j`'(4') des écarts des mouvements � réels � du plan d'acquisition par rapport aux mouvements nominaux `'°. Par exemple : 15 où d'(1 , RD (P (Ti . ) (T1 -t- 4 i) cos' r(Imce(R(R') -1) - 1r:t_3 j dg?, RI) "(T; T') = [ T û 7u l' :,, , (dicta nce Euclidienne). Les paramètres un et règlent l'écart entre les 4' et E'r} Ces paramètres d'incertitude sont des paramètres de calibrages caractéristiques de l'instrument et sont supposés donnés. 20 La troisième étape (c) consiste à choisir une fonction de quantification de la cohérence spatiale des densités de a . Le sens physique de cette fonction de cohérence spatiale est d'exprimer la � continuité � spatiale du volume reconstruit : en général, on ne s'attend pas à reconstruire un volume � fragmentaire �, dans lequel la fonction f présenterait des 25 nombreuses discontinuités, mais plutôt un volume � continu �, dans lequel les variations de f seraient plus graduelles. Bien entendu, le degré de cohérence (distance géodésique) spatiale de l'objet à reconstruire n'est pas connu à priori. C'est pourquoi, avantageusement, la fonction de cohérence spatiale peut dépendre d'un ou plusieurs paramètres de calibrage qui devront à leur tour être estimés. On reviendra plus tard sur ce point. Selon une variante de l'invention, la base finie de fonctions choisie lors de l'étape (a) peut être une base définissant un espace d'Hilbert à noyau auto-reproduisant, et ladite deuxième fonction de quantification de la cohérence spatiale du volume reconstruit peut être proportionnelle à la norme dudit espace d'Hilbert à noyau auto-reproduisant. Par exemple, la deuxième fonction de quantification de la cohérence spatiale du volume reconstruit peut être donnée par : J,(.t) = u I fhi( où (f11 est une norme associé à un (� noyau auto reproduisant � k: P.) = a,k(s;, ;illl. = oia5k(s; -J k($. t) r~(ll( t)illal) La fonction de base, ou � fonction d'interaction spatiale � Fj peut être, par exemple, une fonction Gaussienne. N est le nombre de noeuds de la grille sur laquelle f est calculée. Les paramètres sont les coordonnées de f sur les fonctions de base Les paramètres caf et À1 20 constituent les paramètres de calibrage mentionnés plus haut, et qui devront être estimés. L'étape (d) du procédé comporte le choix d'une troisième fonction de quantification de l'écart entre les images 1i de coupes de l'objet et les coupes correspondantes du volume reconstruit, ° . Par exemple : ~2i ) = if (v,(8)) - 25 i=7 sEn,~ 10 15 16 où af est un autre paramètre de calibrage dépendant de l'objet, qui doit donc être estimé. On remarquera que l'ordre des étapes (a) à (d) n'a que peu d'importance. Les paramètre de calibrage 'i À f et aÉ sont estimés lors d'une étape (d'). Pour ce faire, on suppose que les écarts (I(` ùf',{=(s)) (ici 9 appartient à f3) entre la coupe acquise et sa correspondante dans l'objet, sont distribués suivant une loi gaussienne A((0,. On suppose aussi que I est distribuée suivant la loi gaussienne ' 1 ' 0 ' 1'0 dont la matrice de covariance cr est r8(..I) cfpUIx6 `t Il/\f)-�? =t. Ici, 1H>est un vecteur de dimension égale à celle de l'espace Ho et dont les éléments sont identiquement égaux à 1, tandis que 1s=tvaut 1 si s=t et 0 autrement. On utilise donc le principe du Maximum de Vraisemblance 0 _ (;j. pour estimer conjointement les paramètres a la valeur {J qui 1o'P(I maximise_ ,10 avec logP(Ijl0) = lu,f(I; ù fi )r ' ~(i~ ù tl.f1rl) 1og(li'ol) +constante . L'étape successive (e) comporte le choix d'une fonction de 20 coût globale, ou � fonction de cohérence �, dépendant des trois fonctions de quantification définies lors des étapes précédentes. Par exemple, on peut choisir une combinaison linéaire : 3U.4.>) = J0(t) + J1(f) + .7,(.f, (1') Ensuite, lors de l'étape (f), on minimise cette fonction afin 25 d'obtenir le volume reconstruit et la position des coupes 4', par exemple en utilisant une procédure basée sur une descente de gradient qui alterne15 17 successivement la minimisation en 4' et en f, cette procédure étant initialisée par 4'~ Dans le cas d'une rotation, lorsque l'axe de rotation de n" n'est pas dans le plan d'acquisition, il existe une région de l'objet, de forme cylindrique ou biconique, qui n'est jamais interceptée par le plan d'acquisition et donc la reconstruction en cette région est impossible. Dans ce cas: • on considère une seconde séquence de rotation I' dont l'axe de rotation est plus ou moins orthogonal au précédent. • On répète pour cette seconde séquence les étapes précédentes (a) à (f). On désigne par f' cette seconde reconstruction. On obtient ainsi deux images, présentant chacune une zone où la reconstruction est impossible. Pour obtenir la reconstruction complète, on peut : • � recaler � les volumes reconstruits l'un sur l'autre ; et • interpoler continuellement sura l'ensemble des données constituées par la réunion de ,f et f', notamment par un lissage de type � spline �. Une précision s'impose à propos des notions de � lissage � et �interpolation �. La reconstruction du volume revient à estimer un champ de densités f dans l'espace tridimensionnel. Pour les points x situés à l'emplacement des coupes, f(x) approxime la valeur de la coupe au point x : c'est ce qu'on appelle une opération de lissage. Pour les points x situés entre les coupes, f(x) crée une valeur là où il n'y en avait pas : c'est ce qu'on appelle une interpolation. En fait, les deux opérations sont étroitement liées : l'opération d'interpolation découle de l'opération de lissage qui crée une fonction régulière f(x) dans l'espace tridimensionnel. La décomposition de la fonction des densités sur une base de fonctions de dimension finie, décrite plus haut, constitue en fait une forme de lissage/interpolation. 18 De moins en principe, le recalage des volumes reconstruits peut être obtenu par une méthode semblable à celle qui sera décrite plus loin en référence à la figure 3 : on segmente les volumes reconstruits et on fait coïncider leurs centres de gravité et leurs axes principaux d'inertie. Cependant, il faut considérer que la présence de zones non reconstruites différentes dans les deux volumes rend ce décalage délicat. L'algorithme de la figure 2 s'applique de manière générale à toute sorte de mouvements (nominaux) du plan d'acquisition : rotations pures d'un angle constant ou variable, translation pures d'un pas constant ou variable, combinaison de rotations et translations. Les figures 3 et 4 se rapportent à des procédés plus spécifiques exploitant des combinaisons particulières de séquences d'acquisition. La figure 3 montre un organigramme d'un algorithme que l'on a convenu d'appeler protocole des � piles multiples �, ou � P.M. �. Conformément à ce protocole, l'instrument est réglé pour effectuer une translation pure du plan d'acquisition, qui � scrute � l'objet sur toute sa longueur suivant l'orientation sélectionnée. Ensuite, cette opération est répétée pour au moins une autre orientation. Ces acquisitions en translation fournissent un ensemble de � piles � qui une fois recalées les unes par rapport aux autres permettent une estimation du volume J. La difficulté est double : d'une part, chaque séquence élémentaire de translations (chaque � pile �) est affectée par des rotations-translations aléatoires du plan d'acquisition ; d'autre part, le positionnement et l'orientation relatifs des différentes piles ne sont connus que de manière imparfaite. Soit 1= {1'. n} la première séquence de coupes de l'objet correspondant à un mouvement de translation paramétré sur l'appareil par ù (1`' T) Soient , etc. les autres séquences de translation correspondant respectivement aux paramètres de l'instrument , etc. La première étape (A) du procédé consiste à appliquer le procédé de la figure 2 pour � positionner � dans la pile correspondante 19 chacune des images de coupes d'une séquence. Cette étape permet de déterminer la position et l'orientation relatives des coupes d'une même pile, mais pas l'orientation relative des différentes piles entre elles. Cette étape peut être omise si l'on considère que les 5 séquences ne sont pas affectées de manière sensible par les rotations-translations aléatoires qui se superposent aux mouvements nominaux. Ensuite, une pile I est choisie en tant que � pile de référence � ; les décalages et différences d'orientation des autres piles 1', etc. par rapport à ladite pile de référence sont estimées û étape (B) û et 10 compensées û étape (C) û afin de permettre la reconstruction du volume û étape (D). Pour � recaler � une pile générique sur la pile de référence Î. on procède comme suit. - On choisit une fonction de binarisation des coupes, 15 paramétrée le paramètre de seuil r, qui transforme I en une coupe j binarisée telle que L 1 ou O. Dans le cas d'un objet clair sur un fond sombre, une telle fonction peut être, par exemple, 1_ û 1 'i JI > r si L > _ et 0 sinon. Soi r' le paramètre de binarisation de 1', défini de la même manière. Les paramètres de seuil r et r' sont à déterminer. 20 - Pour chaque couple (r,T'), on réalise une Analyse en Composantes Principales de k (resp. I) sur le nuage des points de 'X' composé des coordonnés des pixels z tels que . On désigne par {agi. k = les valeurs propres de la matrice de variance-covariance du nuage (resp. {Al' = 1-2'31 celles associées au nuage de L). 25 - Ensuite, on estime (T- T') en minimisant la fonction log .X ù log A'kI2 20 - En utilisant le couple précédemment obtenu, on peut recaler les deux nuages correspondants en faisant correspondre leurs centres de gravités ainsi que tes vecteurs propres de leur matrice de variance- covariance. On désigne par (1?`l') l'application affine de ce recalage et par ~~`'" '.,(3. etc. les piles recalées sur i Ces différentes opérations sont répétées pour toutes les piles autres que la pile de référence. On remarque que le paramètre de seuil r est estimé à chaque fois, et que sa valeur n'est pas la même à chaque itération de la procédure. Enfin û étape (D) û on Interpole ces piles recalés, considérées comme un seul ensemble, par un lissage � spline � en trois dimensions. Le procédé de la figure 4, que l'on a convenu d'appeler � bi- protocole �, s'applique lorsqu'on dispose au moins d'une séquence obtenue par rotation et au moins d'une séquence i obtenue par translation. Dans un premier temps, la ou les séquences de translation sont utilisées pour obtenir une reconstruction préliminaire f Dans un second temps, les positions des coupes la sont obtenues par positionnement dans f , la reconstruction finale étant basée sur I. Ce protocole convient particulièrement lorsque l'information apportée par 1 est moindre que celle apportée par i. Par exemple, quand la résolution est plus grande latéralement (c'est-à-dire dans le plan d'acquisition) qu'axialement (perpendiculairement à ce plan) on préfère utiliser pour la reconstruction finale les séquences de coupes en rotation et on exploite les séquences en translation uniquement pour la reconstruction préliminaire. Soit " 1' "''une séquence de coupes de l'objet correspondant à des rotations d'un angle constant'' du plan d'acquisition. Soit = {f; = 1,...,n} une seconde séquence correspondant à un mouvement de rotation continue dont l'axe de rotation est plus moins orthogonale au précédent. On choisit un plan de référence HH0 et on place toutes les coupes de rotation à la même place dans ce plan_ Soit I {Iz, i 4, .-7"} une séquence ou � pile � de coupes 5 de l'objet correspondant à un mouvement de translation. Eventuellement, on peut prendre une seconde séquence de coupes en translation P, et même plusieurs (1' > ~~'_...) En cas d'instabilité du mouvement de translation, on positionne chacune des coupes dans la pile correspondante en appliquant l'algorithme de la figure 2. Ce positionnement fournit autant de piles que de 10 séquences. Soit f {f(8), K E R'} le volume inconnu à reconstruire. La position de chacune des coupes de rotation dans lest définie en = (Ri, Ti) appliquant à une rotation affine qu'il s'agit d'estimer comme suit. 15 Etape (A) : Reconstruction préliminaire. Dans le cas d'une seule pile Î., il suffit d'interpoler cette pile continuellement sur R3, par exemple en utilisant un lissage spline en trois dimensions, le résultat constituant une reconstruction initiale notée f . Si on dispose d'une pluralité de piles, on procède selon 20 l'algorithme de la figure 3. Du fait des incertitudes de positionnement des piles, cette procédure calcule pour chacune des piles etc. sa position relative vis-à-vis de la pile de référence f, puis utilise ces positions pour recaler ces piles sur ladite pile de référence. L'ensemble de ces piles recalées sont interpolées par un lissage spline en trois dimensions, le résultat 25 constituant une reconstruction initiale notée f. Etape (B) : Estimation du positionnement et de l'estimation des coupes de la (ou des) deuxième(s) séquence(s), et leur recalage spatial. 22 Cette étape s'effectue en deux phases : une estimation préliminaire, dans laquelle on suppose que le mouvement de rotation du plan d'acquisition est exactement û (` 'O), c'est-à-dire que l'on néglige momentanément les incertitudes ; et une deuxième phase d'affinement, dans laquelle on prend en compte les incertitudes négligées en précédence. Lors de la première phase, la définition de la position des coupes a lieu en deux temps. D'abord, on déploie les coupes stockées dans le plan H0 pour les amener en position de rotation dans l'espace : la position de rotation du premier plan de coupe est alors le résultat d'une rotation affine (RI-Ti) appliquée à H0 : P1 = RIIIn + Tt , tandis que les plans de coupe suivants sont obtenus par application successive de Ie-0 à ce premier plan de coupe : = (°)'` t'i. Ensuite on positionne dans .f cet ensemble de coupes en rotation. Le mouvement de rotation étant supposé stable, la position des r' dans f est donnée par une unique rotation affine û (IL T ) 15 appliquée aux Finalement, la position des coupes est définie par les parametres 0' f ç. ' , qui sont estimés en minimisant E expression dans laquelle Pi dépend de v l. Lors de la deuxième phase de l'étape (B), les estimations 20 sont affinées afin de tenir compte des instabilités. On note 1=I les positions issues de l'estimation précédente. La position finale est à proximité de et (Ai = (Ri. s;) est définie par une rotation affine appliquée à On estime {�bi,z = i; n} en minimisant ~;Iflùf((h 0 23 L'étape (C) de reconstruction s'effectue en interpolant continuellement sur les coupes ji positionnées, par exemple en utilisant un lissage spline en trois dimensions, le résultat constituant une reconstruction du volume J, notée f. Quand l'axe de rotation de R" n'est pas dans le plan d'acquisition, il existe une région de l'objet qui n'est jamais interceptée par le plan d'acquisition et donc la reconstruction en cette région est impossible. Dans ce cas, les étapes (A) et (B) sont répétée pour la séquence 1', puis on interpole continuellement sur l'ensemble des coupes et 1, en utilisant un lissage spline en trois dimensions, le résultat constituant une reconstruction du volume f, notée encore f. Plus généralement, on peut utiliser une pluralité de � deuxièmes séquences � en rotation. Jusqu'ici on a considéré le cas où la reconstruction préliminaire est obtenue à partir d'une ou plusieurs séquences de coupes en translation et la reconstruction finale à partir d'une ou plusieurs séquences de coupes en rotation. L'inverse est également possible ; seulement, comme cela a été discuté plus haut, la fusion des images de deux séquences de coupes en rotation autour d'axes différents peut s'avérer délicate. L'invention peut s'appliquer en particulier, mais pas exclusivement, à la microscopie confocale. Dans ce domaine, elle permet, par exemple : • la reconstruction virtuelle en trois dimensions de cellules individuelles vivantes et non-adhérentes à partir d'une séquence d'images bidimensionnelles de microscopie confocale de fluorescence ; et • la suppression de l'aberration axiale inhérente à la microscopie et l'amélioration de la résolution spatiale. Les techniques conventionnelles de reconstruction en trois 30 dimension d'une cellule nécessitent de fixer cette dernière sur une surface 24 transparente. La cellule y est manuellement positionnée suivant quelques orientations. Pour chaque orientation, une séquence de coupes en translation verticale est acquise, c'est le protocole connu sous l'appellation anglo-saxonne � z-stack �. La fusion de ces piles donne alors une représentation tridimensionnelle de la cellule qui ne peut cependant s'affranchir pleinement de l'aberration axiale et du manque de résolution. En outre, ce procédé ne peut pas être appliqué, ou difficilement, aux cellules non-adhérentes. Dans la base ATCC (American Type Cell Culture Collection) qui met à la disposition des chercheurs 4000 types de cellules, de l'ordre de 1500 sont non-adhérentes. Parmi elles, 280 sont des cellules humaines qui sont sous-exploitées par manque d'analyse tridimensionnelle. Le document EP1413911 précité décrit un microscope équipé d'un instrument (� manipulateur de cellules �) qui permet de capturer une cellule en suspension dans une solution aqueuse puis de la faire se mouvoir en rotation ou en translation sous l'objectif du microscope. Ce mouvement permet ainsi d'examiner la cellule sous différentes orientations. La partie centrale de cet instrument est une "cage" de capture placée sous l'objectif. C'est un champ diélectrique généré dans la cage qui permet la capture et le mouvement de la cellule, et ceci en accord avec le paramétrage du champ qui est réglable au niveau de la cage. Le premier avantage expérimental de cet instrument est de permettre l'analyse d'objets en suspension ce qui est particulièrement intéressant pour les cellules non-adhérentes (comme celles du système immunitaire). Malheureusement, la reconstruction nécessite une connaissance relativement précise des orientations de la cellule. Or, le � manipulateur � du document EP1413911 ne permet de régler que grossièrement l'orientation de la cellule, empêchant par là d'utiliser en routine cette nouvelle technique. Le � manipulateur de cellules � présente en outre l'avantage de rendre possibles des acquisitions � en rotation �, ce qui permet de s'affranchir de I� REVENDICATIONS 1. Procédé de reconstruction du volume d'un objet à partir d'une séquence d'images de coupes dudit objet, lesdites coupes correspondant à différents positionnements et/ou orientations d'un plan d'acquisition par rapport à l'objet, lesdits positionnements et/ou orientations étant soumis à des incertitudes, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte : (a) le choix d'une base finie de fonctions, sur laquelle le volume à reconstruire peut être décomposé ; (b) le choix d'une première fonction de quantification de l'écart entre le positionnement et/ou l'orientation réels de chaque coupe par rapport audit objet, et son positionnement et/ou orientation nominaux ; (c) le choix d'une deuxième fonction de quantification de la cohérence spatiale du volume reconstruit; (d) le choix d'une troisième fonction de quantification de l'écart entre les images de coupes de l'objet et les coupes correspondantes du volume reconstruit ; (e) le choix d'une fonction de cout global, dont la valeur dépend de celle desdites première, deuxième et troisième fonctions de 20 quantification ; et (f) l'estimation conjointe, par minimisation de ladite fonction de cout globale, des positionnements et/ou des orientations réels des coupes, ainsi que des coefficients de décomposition de l'image de l'objet sur ladite base de fonctions. 25 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit objet est un objet tridimensionnel. 3. Procédé selon la l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite base finie de fonctions, sur laquelle le volume à reconstruire peut être décomposé, est constituée de fonctions gaussiennes. 30 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite base finie de fonctions, sur laquelle le volume à 27 reconstruire peut être décomposé est une base définissant un espace d'Hilbert à noyau auto-reproduisant. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel ladite deuxième fonction de quantification de la cohérence spatiale du volume reconstruit est proportionnelle à la norme dudit espace d'Hilbert à noyau auto-reproduisant. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite première fonction de quantification de l'écart entre le positionnement et/ou l'orientation réels de chaque coupe, et son positionnement et/ou orientation nominaux, est basée sur une norme euclidienne et/ou sur une norme géodésique. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite première fonction de quantification de l'écart entre le positionnement et/ou l'orientation réels de chaque coupe, et son positionnement et/ou orientation nominaux, dépend d'au moins un paramètre de calibrage caractéristique de l'instrument utilisé pour l'acquisition des images de coupes dudit objet. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite deuxième fonction de quantification dépend d'au moins un paramètre de calibrage de la cohérence spatiale et ladite troisième fonction de quantification dépend d'au moins un paramètre de calibrage d'écart, ledit procédé comportant également, préalablement à ladite étape (f), une étape (d') d' estimation conjointe, à partir de ladite séquence d'images de coupes dudit objet, d'au moins lesdits paramètres de calibrage de la cohérence spatiale et d'écart. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'étape (d') comporte l'estimation conjointe d'au moins lesdits paramètres de calibrage de la cohérence spatiale et d'écart par une méthode de maximum de vraisemblance, à partir de ladite séquence d'images de coupes dudit objet. 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel ladite estimation par une méthode de maximum de vraisemblance est basée sur l'hypothèse que ladite deuxième fonction de quantification de la cohérencespatiale du volume reconstruit, ainsi que ladite troisième fonction de quantification de l'écart entre les images de coupes de l'objet et les coupes correspondantes du volume reconstruit, suivent des distributions gaussiennes. 11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite fonction de cout global est une combinaison linéaire desdites première, deuxième et troisième fonctions de quantification. 12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite étape (f) d'estimation conjointe des positionnements et/ou des orientations réels des coupes, ainsi que des coefficients de décomposition de l'image de l'objet sur ladite base de fonctions, s'effectue par minimisation de ladite fonction de cout globale selon une méthode de descente de gradient. 13. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel lesdites coupes de l'objet sont obtenues par des translations nominales successives, auxquelles se superposent des rotations-translations aléatoires, inconnues à priori, d'un plan d'acquisition d'image. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel lesdites coupes de l'objet sont obtenues par des rotations nominales successives autour d'un même axe, auxquelles se superposent des rotations-translations aléatoires, inconnues à priori, d'un plan d'acquisition d'image. 15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel lesdites étapes (a) à (f) sont répétées pour au moins deux séquences de coupes obtenues par des rotations nominales successives d'un plan d'acquisition d'image, les axes de rotations correspondant auxdites deux séquences de coupes étant sensiblement orthogonales entre eux, et dans lequel les reconstructions du volume de l'objet obtenues à partir desdites deux séquences de coupes sont fusionnées par interpolation. 16. Procédé de reconstruction du volume d'un objet à partir d'une pluralité de séquences d'images de coupes dudit objet, chaque séquence étant constituée de coupes obtenues par des translations nominales successives, auxquelles se superposent des rotations-translationsaléatoires, inconnues à priori, d'un plan d'acquisition, l'orientation nominale dudit plan d'acquisition étant différente pour chaque séquence et connue de manière imparfaite, ledit procédé comportant : (A) l'estimation des positionnements et des orientations relatifs du plan d'observation pour chacune des coupes desdites séquences par un procédé selon l'une des revendications 1 à 13 ; (B) l'estimation des décalages et des différences d'orientation entre les différentes séquences et par rapport audit objet ; (C) la compensation des décalages et différences d'orientation entre séquences d'images de coupes ; et (D) la reconstruction dudit volume par interpolation à partir des images de coupes desdites séquences, considérées comme un seul ensemble. 15 17. Procédé selon la revendication 16, dans lequel ladite étape (B) d'estimation des décalages et des différences d'orientation entre les différentes séquences d'images de coupes dudit objet est effectuée au moyen d'une analyse en composantes principales. 18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel ladite 20 analyse en composantes principales est effectuée sur des versions binarisées desdites séquences d'images de coupes. 19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel chaque séquence d'images de coupes est binarisée à l'aide d'un seuil de binarisation qui est estimé conjointement à un seul de binarisation d'une séquence choisie 25 comme référence, cette estimation étant effectuée, pour chaque séquence autre que la séquence de référence, par minimisation d'une fonction d'écart entre les valeurs propres de la matrice de variance-covariance de ladite séquence et celles de la matrice de variance-covariance de ladite séquence de référence. 30 20. Procédé selon la revendication 19, dans lequel ladite fonction d'écart est donnée par , où 4 et -k 10sont les valeurs propres des matrices de variance-covariance de la séquence binarisée considérée et de la séquence binarisée de référence, respectivement, tandis que T, T' sont les seuils de binarisation respectifs 21. Procédé de reconstruction du volume d'un objet à partir 5 d'une pluralité de séquences d'images de coupes dudit objet, dans lequel ladite pluralité de séquences comprend : - une première séquence d'images de coupes de l'objet, obtenue par des translations d'un plan d'observation par rapport audit objet ; et 10 - au moins une deuxième séquence d'images de coupes de l'objet, obtenues par des rotations d'un plan d'observation par rapport audit objet ; où des rotations-translations aléatoires, inconnues à priori, se superposent auxdites translations ou rotations du plan d'observation associée 15 aux différentes coupes ; ledit procédé comportant : (i) une reconstruction préliminaire dudit volume à partir de ladite première séquence d'images par un procédé selon l'une des revendications 1 à 13 ; (ii) l'estimation du positionnement et de l'orientation des coupes de ladite ou desdites deuxièmes séquences, et leur recalage spatial à partir de ces estimations ; et (iii) la reconstruction dudit volume par interpolation à partir de ladite ou desdites deuxièmes séquences d'images recalées de coupes. 22. Procédé de reconstruction du volume d'un objet à partir d'une pluralité de séquences d'images de coupes dudit objet, dans lequel ladite pluralité de séquence comprend : - une pluralité de premières séquences d'images de coupes de l'objet, obtenue par des translations d'un plan d'observation par 30 rapport audit objet ; et 20 2531 - au moins une deuxième séquence d'images de coupes de l'objet, obtenues par des rotations d'un plan d'observation par rapport audit objet ; où des rotations-translations aléatoires, inconnues à priori, se 5 superposent auxdites translations ou rotations du plan d'observation associée aux différentes coupes ; ledit procédé comportant : i) une reconstruction préliminaire dudit volume séquences à partir desdites premières séquences d'images par un procédé selon l'une des 10 revendications 16 à 20 ; ii) l'estimation du positionnement et de l'orientation des coupes de ladite ou desdites deuxièmes séquences, et leur recalage spatial à partir de ces estimations ; et iii) la reconstruction dudit volume par interpolation à partir de 15 ladite ou desdites deuxièmes séquences d'images recalées de coupes. 23. Procédé de reconstruction du volume d'un objet à partir d'une pluralité de séquences d'images de coupes dudit objet, dans lequel ladite pluralité de séquence comprend : - une première séquence d'images de coupes de l'objet, 20 obtenue par des rotations d'un plan d'observation par rapport audit objet ; et - au moins une deuxième séquence d'images de coupes de l'objet, obtenues par des translations d'un plan d'observation par rapport audit objet ; où des rotations-translations aléatoires, inconnues à priori, se 25 superposent auxdites translations ou rotations du plan d'observation associée aux différentes coupes ; ledit procédé comportant : (i) une reconstruction préliminaire dudit volume à partir de ladite première séquence d'images par un procédé selon l'une des 30 revendications 1 à 12 ou 14 ou 15 ; 32 (ii) l'estimation du positionnement et de l'orientation des coupes de ladite ou desdites deuxièmes séquences, et leur recalage spatial à partir de ces estimations ; et (iii) la reconstruction dudit volume par interpolation à partir de ladite ou desdites deuxièmes séquences d'images recalées de coupes. 24. Procédé selon l'une des revendications 21 à 23, dans lequel ladite étape (ii) d'estimation du positionnement et de l'orientation des coupes de ladite ou desdites deuxièmes séquences, et de recalage spatial à partir de ces estimations, comporte la minimisation d'une fonction de quantification de l'écart entre les images de coupes de l'objet et les coupes correspondantes du volume reconstruit préliminaire. 25. Procédé selon la revendication 24, dans lequel la minimisation d'une fonction de quantification de l'écart entre les images de coupes de l'objet et les coupes correspondantes du volume reconstruit préliminaire comporte : - une première phase d'estimation préliminaire, basée sur l'hypothèse que toutes les coupes de ladite ou de chaque deuxième séquence sont obtenues par des déplacements et/ou des translations constants mais inconnues dudit plan d'observation ; et - une deuxième phase d'affinement comportant l'estimation des rotations-translations aléatoires se superposant aux translations ou rotations supposées constantes du plan d'observation associée aux différentes coupes. 26. Procédé selon l'une des revendications 21 à 25, dans lequel ladite étape (iii) de reconstruction dudit volume à partir de ladite ou desdites deuxièmes séquences d'images recalées de coupes s'effectue par interpolation de type lissage spline. 27. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel lesdites séquences d'images de coupes dudit objet sont acquises 30 par microscopie confocale. 28. Procédé selon la revendication 27, dans lequel ledit objet est disposé dans un réceptacle d'un microscope confocai, et dans lequellesdites séquences d'images de coupes dudit objet sont acquises en déplaçant ledit objet par rapport au réceptacle. 29. Dispositif de reconstruction du volume d'un objet, comportant : - un moyen d'acquisition d'une séquence d'images de coupes dudit objet, lesdites coupes correspondant à différents positionnements et/ou orientations d'un plan d'acquisition par rapport à l'objet ; et - un moyen de traitement de données pour reconstruire le 10 volume dudit objet à partir de ladite séquence d'images de coupes de ce dernier ; caractérisé en ce que - les positionnements et/ou orientations du plan d'acquisition correspondant aux différentes coupes sont soumis à des 15 incertitudes ; et en ce que - le moyen de traitement de données est adapté pour mettre en oeuvre un procédé selon l'une des revendications 1 à 28. 30. Dispositif selon la revendication 29, dans lequel ledit moyen d'acquisition d'une séquence d'images de coupes dudit objet est un 20 microscope confocal muni d'un réceptacle pour contenir ledit objet, et de moyens pour déplacer ledit objet par rapport au réceptacle.