FR 2916972 A1 20081212 FR 0755550 A 20070607 COMPOSITION COSMETIQUE OU DERMATOLOGIQUE A BASE DE POMME ET SON UTILISATION La présente invention concerne une composition cosmétique ou dermatologique qui raffermit, protège, affine le grain de peau et resserre les pores. Tout particulièrement, l'invention concerne une composition cosmétique ou dermatologique comprenant au moins un extrait aqueux biologique de pomme de Provence concentré en polyphénols, du vinaigre de pommes 1 o biologiques, des glyco-protéines d'amandes, du silicium et au moins une huile essentielle de préférence une huile essentielle de coriandre. Les conditions de vie actuelles font subir à l'organisme toutes sortes d'agressions permanentes qui sont mieux connues sous le nom de stress. Parce que la peau agit comme barrière physique, thermique, immunologique, 15 hydrique entre le corps et les éléments extérieurs, elle se trouve alors directement exposée à diverses agressions extérieures (UV, pollution, métaux lourds, variations de température). Un des stress les plus importants sur la peau résulte de l'action des radicaux libres qui du fait de leur réactivité chimique entraîne l'altération des 20 différents composants cellulaires de la peau avec le temps. Simultanément, le vieillissement ralentit le renouvellement cellulaire de la peau et celui de sa matrice extracellulaire, notamment le renouvellement du collagène de type I. Ce moindre renouvellement a pour conséquence d'augmenter encore la sensibilité de la peau aux agressions extérieures et sa 25 détérioration avec le temps. Si différentes compositions ont été mises au point dans l'art antérieur, aucune ne permet toutefois une action qui raffermit, protège, affine les grains de peau et resserre les pores. 30 Il existe donc encore aujourd'hui un besoin pour l'identification de compositions présentant des propriétés anti-radicalaires et de restructuration qui raffermissent, protègent, affinent le grain de peau et resserrent les pores. Les fruits du pommier, les pommes contiennent des tanins, des acides maliques et citriques, de la vitamine C, A, B1, B2, PP, des enzymes, des polyphénols. Le pommier, Pyrus Malus, est un arbre fruitier de la famille des Rosacées, sous famille des Malacées, largement cultivé pour ses fruits, les pommes. Il en existe environ 5 000 variétés dont la moitié d'origine américaine et environ 2 000 d'origine anglaise. En Europe, on distingue deux espèces de pommiers : le pommier sauvage ou pommier des bois (Malus sylvestris Mill.) et le pommier cultivé (Malus domestica Borkh). Le pommier est un arbre autochtone en Europe et particulièrement en France où son existence est attestée depuis la plus haute antiquité. Le pommier cultivé est un arbre à feuilles caduques qui mesure de 4 à 10 mètres de haut et peut être soumis à la taille ou élevé en plein vent. Les feuilles du pommier sont simples, à limbe denté et à disposition alterne. Les fleurs hermaphrodites à symétrie radiaire ont cinq pétales blancs. Les pommes proviennent d'un ovaire infère et sont couronnées par les restes du calice et de l'androcée. La pomme est en partie vrai fruit pour le trognon, le véritable fruit étant les pépins, organes de reproduction, et faux fruit pour la chair qui dérive du réceptacle floral. La demanderesse s'est particulièrement intéressée à la pomme de Provence qui est la région la plus productrice de pomme (et non la Normandie). Avec une moyenne de 500 000 Tonnes par an, la région provençale représente le quart de la production française. La pomme de Provence est riche en vitamine C qui se localise dans la partie externe de la pulpe et plus encore dans la peau puisque celle-ci en renferme 4 à 5 fois plus que le reste du fruit. Elle contient d'autres vitamines comme la provitamine A (carotène), la vitamine B1 (10 à 100 mg pour 100 gr), la vitamine B2 ou riboflavine (0,05 mg pour 100 gr), la vitamine PP dans les parties externes du fruit (0,5 mg pour 100 gr), l'acide pantothénique (0,06 mg pour 100 gr), des enzymes, des polyphénols. La pomme biologique (ou Bio) de Provence contient des minéraux. Dans les cendres, on retrouve du potassium, sodium, silice, calcium, acide phosphorique, fer, magnésium, brome, soufre, manganèse... De par sa forte concentration en polyphénols, l'extrait de pomme Bio de Provence présente des activités anti-radicalaires qui ont été confirmées par des tests in vitro. La pomme contient entre 0,02 et 0,3 % de polyphénols en fonction de la saison, du moment de la récolte et du type de pomme. Trois grandes familles de polyphénols sont présentes entre 20 et 30 0/0 chacune : - Les procyanidines - les hydroxy chalcons avec la phloridzine majoritairement, - Les acides hydroxycinnamiques avec l'acide chlorogénique majoritairement. La phloridzine est le polyphénol caractéristique de la pomme et celui qui possède le pouvoir antioxydant le plus puissant. L'activité anti-radicalaire de l'extrait vis-à-vis du radical diphenylpicrylhydrazyle (DPPH) a été appréciée par la mesure du taux de réduction du radical DPPH en présence du produit. La concentration inhibitrice (Cl) nécessaire pour réduire de 50 % le DPPH a été calculée. L'extrait de pomme BIO de Provence a une Cl 50 de 26 mg/mi. Il présente donc un bon pouvoir inhibiteur du DPPH. Grâce à sa teneur en vitamine C, la pomme a une action stimulante. En effet, la vitamine C permet de stimuler les défenses de l'organisme et contribue à diminuer les réactions cutanées. Elle est indispensable à l'hydroxydation de la proline et donc à l'élaboration et au maintien de l'intégrité du collagène. Les acides organiques qui sont connus pour stimuler le renouvellement tissulaire confèrent à l'extrait de pomme une activité régénérante. Les acides organiques, et notamment l'acide citrique, accélèrent le processus de desquamation, affinent le grain de peau et resserrent les pores. Les pectines, grâce à leur pouvoir absorbant, ont une action hydratante et rafraîchissante. L'élastine est synthétisée par les fibroblastes du derme. Plusieurs types d'enzymes hydrolysant l'élastine ont été décrits : L'élastase de neutrophiles et les élastases appartenant à la famille des métalloprotéases. Nous verrons dans une étude décrite plus loin que l'extrait de pomme Bio de Provence inhibe les enzymes hydrolisant l'élastine. A la suite d'importantes recherches la Demanderesse a mis en évidence qu'une association d'un extrait de pomme, de préférence de pomme Bio et/ou de Provence, de vinaigre de pommes, de préférence biologique et/ou de Provence, de glycoprotéines d'amande douce, de silicium, et d'au moins une 1 o huile essentielle, développe par un effet de synergie des propriétés raffermissantes, un resserrement, un lissage des ridules et du grain de peau. Ainsi, la présente invention se rapporte à une association comprenant les éléments suivants : - un extrait de pomme, de préférence de pomme biologique et/ou de 15 Provence, - du vinaigre pommes, de préférence biologique et/ou de Provence, - des glycoprotéines d'amande douce, - du silicium, et - au moins une huile essentielle, par exemple de coriandre. 20 On entend par association, un mélange qui comprend les éléments précités. Selon l'invention, avantageusement, l'huile essentielle ou les huiles essentielles peut (peuvent) être choisie(s) par exemple dans le groupe comprenant l'huile de romarin, de mirte, l'immortelle, de menthe, de pin, de pin 25 laricio, de coriandre, de camomille, de bouleau, de bois de rose, de basilic, d'arbre à thé, de cajeput, de carotte et de cannelle. De manière générale, il peut s'agir de toute huile essentielle ou mélange d'huiles essentielles connues de l'homme du métier, en particuliers celles utilisées dans les produits cosmétiques. 30 Selon l'invention, l'huile essentielle ou les huiles essentielles représente(nt) de 0,01 à 2 %, de préférence de 0,01 à 1 % en poids par rapport au poids total l'association. Selon l'invention, l'extrait de pomme, de préférence biologique et de préférence encore de Provence, peut représenter avantageusement de 0,5 à 10 %, de préférence de 0,5 à 5 % en poids par rapport au poids total de l'association. Cet extrait peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier. II peut s'agir par exemple d'une technique par pression, par centrifugation et/ou par filtration. Selon l'invention, le vinaigre de pomme, de préférence biologique et de préférence encore de Provence, peut représenter de 0,1 à 5 %, de préférence de 0,1 à 2 % en poids par rapport au poids total de l'association. Le vinaigre utilisé peut être par exemple un vinaigre biologique de pomme commercialisé par la Société GREENTECH (France). Selon l'invention, les glycoprotéines d'amande peuvent représenter de 1 à 15 %, de préférence de 1 à 10 % en poids par rapport au poids total de l'association. Ces glycoprotéines se présentent par exemple sous la forme de concentré de glycoprotéines d'amende, commercialisé par exemple par les Laboratoires Sérobiologiques (France). Selon l'invention, le silicium peut représenter de 0,01 à 3 %, de préférence de 0,01 à 1 % en poids par rapport au poids total de l'association. Il peut s'agir d'un silicium tels que ceux couramment utilisés dans les produits cosmétiques, par exemple commercialisé par la Société EXSYMOL. Selon l'invention, l'association peut comprendre en outre au moins un agent actif choisi parmi des agents restructurants, hydratants, apaisants, régénérants. Ces agents peuvent être ceux couramment utilisés dans les produits cosmétiques, par exemple la glycérine, le bisabolol, la vitamine A, etc.. Un autre objet de l'invention se rapporte à une composition cosmétique ou dermatologique comprenant une association selon l'invention. Selon une forme préférée de réalisation de la présente invention, la composition cosmétique ou dermatologique comprend une quantité d'association au sens de la présente invention qui représente de 0,05 à 30 % en poids, de préférence de 0,05 à 15 % en poids, par exemple de 1 à 20% en poids, de préférence de 0,05 à 10% en poids, de préférence encore de 1 à 10 % en poids de la composition cosmétique ou dermatologique. Les compositions cosmétiques et dermatologiques selon l'invention peuvent comprendre en outre d'autres agents actifs généralement utilisés en35 cosmétique ou dermatologie, comme par exemple, à titre non limitatif : perhydrosqualène naturel, sucroesters, huile de bourrache, huile d'onagre, huile de pépins de raisins, vitamine A, vitamine E, allantoïne. Avantageusement, selon l'invention, de tels agents actifs peuvent représenter de 1 % à 20 % en poids de la composition, de préférence de 10/0 à 10 %. Les compositions cosmétiques et dermatologiques selon l'invention peuvent également comprendre un ou plusieurs agents de formulation, comme des agents conservateurs, des agents solubilisants, des agents gélifiants, des additifs d'origine végétale, des esters, du sorbitol, du glycérol, des bases de 1 o parfum, et de l'eau, par exemple en quantité suffisante pour 100. Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous forme connue de l'homme du métier dans le domaine de la cosmétique et de la dermatologie, comme par exemple, une crème, un lait, une lotion, un gel, un masque, sans aucune restriction galénique particulière autre que celles de la 15 compatibilité avec l'association des actifs de l'invention et pour l'application sur la peau. La présente invention se rapporte également à une méthode de soin cosmétique consistant à appliquer sur la peau une association ou une composition selon l'invention. L'application se fera de préférence en une 20 quantité efficace. L'application est réalisée par exemple quotidiennement, par exemple le matin, par exemple pendant quatre semaines. La méthode de soin selon l'invention permet de renforcer les structures membranaires et de resserrer les pores de la peau. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une 25 association selon l'invention ou d'une composition selon l'invention pour fortifier la peau, stimuler le renouvellement cellulaire, dynamiser les cellules en relançant le processus d'hydratation et en resserrant les pores et en affinant le grain de peau D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention 30 apparaîtront à la lecture des exemples non limitatifs qui suivent. EXEMPLES Sauf indications contraires, dans ces exemples, les % sont exprimés en % en poids/volume, en particulier en g/100 mL. Exemple 1 : Crème Velours Amande Pomme Stéarate de sucrose Distéarate de sucrose 1 o Triglycéride caprylique/caprique Tryglycéride caprylique/caprique/succinique Extrait de Pomme Bio de Provence Vinaigre Bio de Pomme de Provence Glycoprotéines d'amande 15 Silicium HE de Coriandre Acétate de Tocophéryle Urée Glycérine 20 Hyaluronate de sodium Gomme Xanthane Parfum Conservateurs Eau 25 qs : quantité suffisante. Pour le parfum, cela correspond 0,5 à 6 0/0 0,5 à 6 0/0 3à15% 3à15% 0,5 à 5% 0,1 à2% 0,5 à 5% 0,001 à 1 % 0,001 à 2 0/0 0,05 à 1 0/0 0,5 à 2 0/0 0,5 à 3% 0,5 à 3% 0,1 à 0,5 0/0 qs qs qs généralement à 0,1 à 2%, pour les conservateur, de 0,01 à 3%, et pour l'eau, en qsp 100 mL. Exemple 2: EVALUATION DU POUVOIR ANTIRADICALAIRE DE L'EXTRAIT AQUEUX DE POMME BIO DE PROVENCE PAR LA METHODE DES DIENES CONJUGUES 1) OBJECTIF DE L'ETUDE Le radical hydroxyle est une molécule très réactive dont la production est activée par les différents stress subis par la peau (pollution, UV, variation de température...). Il est responsable de nombreux dégâts dans la cellule et notamment de la dégradation des membranes par le phénomène de peroxydation lipidique. L'objectif de cette étude est d'apprécier le pouvoir antiradicalaire d'un actif cosmétique par la méthode in vitro des diènes conjugués. Cette méthode permet de tester l'action protectrice du produit sur des liposomes (analogues de membrane) soumis à une attaque de radicaux hydroxyles ('OH). 2) PRINCIPE L'action des radicaux libres sur les acides gras polyinsaturés des membranes est une péroxydation qui conduit à la formation de diènes conjugués absorbant à 233 nm. L'activité des antioxydants est donc dosée par leur capacité à empêcher la peroxydation d'acides gras polyinsaturés contenus dans des liposomes (modèle in vitro se rapprochant le plus de la réalité in vivo). Cette peroxydation est caractérisée par un pic d'absorption à 233 nm. 3) MATERIELS ET METHODES Réactifs : - Tampon phosphate 0,05M pH 6.8 Na2HPO4 : 3.55 g KH2PO4 : 3.4 g H20 qsp 1000 ml - Solution de potassium thiocyanate 0,03 M KSCN : 0,3 g Tampon phosphate qsp 100 ml - Suspension de liposomes Natipides : 3 g Glydant (conservateur) : 0,3 g Eau distillée qsp 100 ml -Solution de FeCl2 à 2,3 x10-3 M - Solution de H202 à 110 volumes diluée au oème - Solution de CaCl2 à 0,5 M - Heptane Protocole : Une solution mère de l'extrait aqueux de Pomme Bio à 20 % dans le tampon phosphate est réalisée. 3 dilutions sont réalisées ce qui correspond, à l'issue du test, à l'évaluation de 3 concentrations finales : 0,01 %, 0,1 % et 1 %. Sont réalisés en parallèle un témoin non traité appelé Témoin Négatif ainsi qu'un contrôle appelé Témoin Positif. Solutions mères Témoin Actifs Liposomes 5 % 5 0/0 Conditions du test : 0/0 KSCN 5% 5% Actif à tester - 5 0/0 Tampon qsp 100 % qsp 100 Les solutions ainsi préparées sont ensuite oxydées par l'introduction de : 25 - 0,001 % de FeCl2 - 0,004 % de H202 Après homogénéisation, les solutions sont laissées dans une étuve à 45 C durant une nuit. 5 ml de chaque solution sont alors prélevés. Les lipides sont précipités par addition de 5 ml de CaCl2. Ce mélange est agité pendant 10 minutes à l'aide d'un barreau aimanté. On extrait les lipides en ajoutant 10 ml d'heptane et en agitant pendant 15 minutes. Chaque solution est réalisée en double. Mise en évidence : Le témoin négatif génère des radicaux libres, le pourcentage de diènes conjugués entre le produit peroxydé et le produit non peroxydé est maximum. Le témoin positif capte les radicaux libres, le pourcentage de formation de diènes conjugués entre le produit peroxydé et le produit non peroxydé est minimum. L'activité anti-radicalaire se mesure par la diminution du pourcentage de formation de diènes conjugués entre le produit peroxydé et le produit non peroxydé. Cette méthode peut définir la dose active souhaitée. L'absorption (Abs) à 233 nm de chaque solution est ensuite mesurée contre de l'heptane, dans des cuves en quartz. L'absorption à 233 nm de la solution peroxydée, corrigée de l'absorption à la même longueur d'onde de la solution témoin non peroxydée traduit la présence de diènes conjugués et permet de quantifier ces derniers par rapport au témoin non traité (solvant seul). Le pourcentage d'inhibition se calcule comme suit : (Abs témoin P û Abs témoin NP) û (Abs actif P- Abs actif NP) X 100 Abs témoin P û Abs témoin NP P : Peroxydé NP : Non Péroxydé 4) CONCLUSION Au terme de l'essai, dans les conditions expérimentales ainsi définies, il apparaît que l'Extrait Aqueux de Pomme Bio de Provence a un effet anti- radicalaire dès les premières concentrations avec un effet dose. A partir de 1% de l'Extrait Aqueux de Pomme Bio de Provence, l'effet de protection anti-radicalaire est identique au témoin positif. -L'extrait Aqueux de Pomme Bio de Provence, dilué à la concentration de 0,01 0/0 inhibe la péroxydation lipidique de 4 % 3 0/0 - L'extrait Aqueux de Pomme Bio de Provence, dilué à la concentration de 1 0/0 inhibe la péroxydation lipidique de 99,8 % + 0,9 0/0 Exemple 3 : EVALUATION DU POUVOIR ANTIRADICALAIRE DU CONCENTRE VELOURS VISAGE AMANDE POMME PAR LA METHODE 15 DES DIENES CONJUGUES Selon les mêmes principes, matériels et méthodes que ceux décrits dans l'exemple 2 et dans le but d'évaluer le pouvoir antiradicalaire du produit final appelé Concentré Velours Visage Amande Pomme , les résultats suivants ont été obtenus. 20 Au terme de l'essai, dans les conditions expérimentales ainsi définies, il apparaît que le Concentré Velours Visage Amande Pomme a un effet antiradicalaire dès les premières concentrations avec un effet dose. A partir de 1 % de Concentré Velours Visage Amande Pomme l'effet de protection anti-radicalaire est supérieur à 95 %. 25 - Le Concentré Velours Visage Amande Pomme, dilué à la concentration de 0,001 % inhibe la péroxydation lipidique de 1,38 0/0 +5% - Le Concentré Velours Visage Amande Pomme, dilué à la concentration de 0,01 % inhibe la péroxydation lipidique de 12,9 % 30 0,3 0/0 - Le Concentré Velours Visage Amande Pomme, dilué à la concentration de 0,1 % inhibe la péroxydation lipidique de 79,4 % + 4,2 0/0 Le Concentré Velours Visage Amande Pomme, dilué à la concentration de 1 % inhibe la péroxydation lipidique de 95,4 % 0,5 0/0 Exemple 4: EVALUATION IN VITRO DE L'EFFET INHIBITEUR D'UN PRODUIT À L'ESSAI SUR LA DEGRADATION METALLOPROTEASEDEPENDANTE DE L'ELASTINE 1) Introduction 1 o L'élastine est synthétisée par les fibroblastes du derme sous la forme d'un précurseur insoluble : la tropoélastine. Les fibres élastiques matures sont des structures complexes composées d'élastine insoluble dans laquelle les chaînes polypeptidiques de tropoélastine sont reliées entre elles par des liaisons pyrimidiques. L'extrême hydrophobicité de cette molécule ainsi que la 15 présence de nombreuses liaisons intercaténaires sont responsables de l'insolubilité de l'élastine, de sa très faible vitesse de renouvellement dans l'organisme (en conditions physiologiques) et de sa résistance à la protéolyse (excepté à celle initiée par les élastases). Au niveau de la peau, plusieurs types d'enzymes hydrolysant l'élastine 20 ont été décrites : l'élastase de neutrophiles (famille des sérine-protéases) et les élastases appartenant à la famille des métalloprotéases. Ces métalloprotéases (MMPs) regroupent une famille de métalloendopeptidases zinc-dépendantes, regroupant au moins 24 membres. Collectivement, cette famille d'enzymes protéolytiques est capable de dégrader 25 l'ensemble des composants de la matrice extra-cellulaire. Dans cette famille d'enzymes, la MMP12 (ou métalloélastase) ainsi que les gélatinases MMP2-MMP9 et la MMP3 sont capables d'hydrolyser l'élastine. Au niveau du derme, les MMPs sont synthétisées par les fibroblastes. Lors des vieillissements (chronologique ou photo-induit), il existe un 30 déséquilibre de la balance entre la synthèse et la dégradation de la matrice extra-celullaire (induite par les MMPs) : dans les cellules sénescentes ou photo-irradiées, on observe, non seulement une augmentation de la synthèse de certaines MMPs, mais aussi une diminution de la synthèse des inhibiteurs endogènes de ces enzymes. Ce déséquilibre entre MMPs et inhibiteurs entraîne une dégradation exacerbée de la matrice extra-cellulaire. Pour rétablir cet équilibre, le contrôle de l'activité des MMPs peut s'effectuer à différents niveaux : transcription des gènes codant pour les MMPs, stabilité des ARNm, activation des pro-enzymes ou inhibition directe de leur activité protéolytique. On évalue les effets du produit sur la dégradation de l'élastine, dégradation catalysée par les MMPs présentes dans des surnageants de culture de fibroblastes stimulés par de l'interleukine 1 (cytokine pro- inflammatoire). Ces effets ont été évalués par la mesure de la fluorescence générée après hydrolyse de la DQ-élastine et libération de peptides fluorescents. En présence d'un inhibiteur de la synthèse et de l'activité de ces MMPs, l'hydrolyse des fibres d'élastine sera moindre, voire nulle. 2) Matériels et méthodes 2.1 Produits à l'essai - Produit A : hydrosoluble, à conserver à + 4 C (Silicium) - Produit C : huile essentielle (HE Coriandre) - Produit D : hydrosoluble, à conserver à ù 20 C (Glycoprotéines d'amande) 2.2 Réactifs - Interleukine 1b recombinante humaine : SIGMA , référence 19401 - Déxaméthasone : SIGMA, référence D 1756 - Sérum Albumine Bovine (BSA) : SIGMA , référence A 9647 - DQ-élastine marquée par la fluorescéine : MOLECULAR PROBES, référence E-12056 - APMA (Acetate Amino-Phényl-Mercurique) : SIGMA, référence A9563 ; activateur des MMPs -Milieux de culture : BIOPREDIC INTERNATIONAL. 2.3 Système d'essai Culture en monocouche de fibroblastes adultes humains (plaques 24 puits) à 37 C dans une atmosphère humide contenant 5% de CO2. Isolement des fibroblastes à partir d'un fragment de peau humaine collecté après une opération de plastie abdominale. Emploi des cellules au quatrième passage Culture jusqu'à confluence des monocouches dans le milieu MEM additionné de pénicilline (50 UI/ml), de streptomycine (50 mg/ml) et de SVF (10%,v/v). Milieu d'incubation des monocouches avec l'interleukine 1 : milieu MEM sans rouge de phénol et dans lequel le SVF est éliminé (le sérum contient des inhibiteurs naturels des métalloprotéases). Le SVF est remplacé par de l'albumine bovine à 2 mg/ml. 2.4 Préparation des produits à l'essai Le produit A hydrosoluble est stérilisé par filtration sur membrane 0,22 Mélange M1 v/v Mélange M2 v/v Mélange M3 v/v mm, juste avant l'utilisation. 0/0 ProduitA 0,5% 2.5% 5% ProduitD 2% 2% 2% Produit C 0, 001 % 0,001 % 0,001 Le produit C, correspondant à une huile essentielle, est préalablement dilué au 1/100e dans du DMSO avant ajout dans les différents mélanges à tester. Les 3 mélanges sont réalisés par dilution des différents produits dans le milieu MEM contenant 2 mg/ml de BSA. 2.5 Préparation du produit de référence La déxaméthasone, inhibiteur stéroïdien de la synthèse des MMPs, est préparée à 1 mm en DMSO puis dilué à 10-' M dans le milieu MEM contenant 2mg/ml de BSA. 2.6 Protocole d'incubation Système réactionnel : culture monocouche en plaques 24 puits de fibroblastes humains. A confluence, les cellules sont incubées 18 heures dans du milieu sans SVF, supplémenté avec 2 mg/ml de BSA (volume final de 400 ml de milieu par puits de culture). Les fibroblastes sont ensuite pré-incubés 1 heure avec les mélanges à tester ou le produit de référence avant l'ajout d'interleukine 1 (concentration finale : 75 ng/ml). 2.7 Evaluation des effets A la fin de l'incubation, les surnageants de culture sont prélevés. L'effet des produits à l'essai sur la dégradation de l'élastine est évalué par la mesure de la fluorescence générée après hydrolyse de la DQ-élastine (dans laquelle la fluorescence est absorbée ( quenched en anglais) et libération de peptides fluorescents. Les métalloprotéases sont synthétisées sous forme de zymogènes inactifs ; in situ, ces zymogènes sont plus ou moins activés par des protéases endogènes. In vitro, une activation des MMPs par de dAPMA permet de détecter leur activité protéasique totale. Evaluation de l'activité élastolytique contenue dans les surnageants de culture de fibroblastes stimulés par l'interleukine 1 - Répartition de 50 ml de chacun des surnageants de culture dans 3 puits de microplaque 96 puits. Ainsi, chaque condition opératoire (culture Témoin, cultures + Interleukines, cultures + Interleukines + M1, cultures + Interleukine + M2, cultures + Interleukine +M3) a été incubé en triplicate, c'est à dire dans trois puis, pendant 48 heures. - Répartition de tampon concentré afin d'obtenir, en concentration finale, du Tris 50 mM pH 7,4-CaCl2 5mM-NaCI 0,15 M contenant 0,00125 % de Brij 35. - Ajout du substrat DQ-élastine (concentration finale : 20mg/ml) - Ajout d'APMA (concentration finale : 1 mM) dans un des triplicates ; cette condition permet d'évaluer l'activité élastolytique totale (MMP-dépendante et MMP-indépendante) du surnageant testé. - Ajout d'APMA (concentration finale : 1 mM) et d'EDTA (concentration finale : 30mM) dans un autre des triplicates ; cette condition permet d'évaluer l'activité élastolytique MMP-indépendante (I'EDTA est un inhibiteur de l'activité des MMPs). Le troisième réplicate ne contient ni APMA ni EDTA ; cette condition permet d'évaluer l'activité élastolytique intrinsèque du surnageant testé (activité native). A la fin des 48 heures, le surnageant de chaque puits (volume = 400 microlitres) a été divisé en 3 parties de 50 microlitres chacune) qui ont servi à la 1 o détermination de l'activité élastolytique : • 50 microlitres ont été testés directement = activité dégradative directe (= native dans le rapport). • 50 microlitres ont été testés après ajout d'APMA (qui active les MMp secrétées sous forme latente inactive). Cette mesure correspond donc à 15 l'activité totale MMP (MMP déjà activée in situ lors de la culture + activité des MMp secrétées lors de la culture mais sous forme encore inactive) • 50 microlitres ont été testés après ajout d'APMA et d'EDTA : l'EDTA inhibe l'activité des MMP ; ceci sert à montrer que la DQ élastine n'est dégradée que par une activité MMP dépendante. 20 L'apparition de la fluorescence est détectée par un spectrofluorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 485 nm et une longueur d'onde d'émission de 520 nm. La fluorescence est déterminée au temps TO (juste après ajout des réactifs) et après incubation de la microplaque 12 heures à 37 C. 25 2.8 Traitement des données - Calcul du delta de variation de la fluorescence entre le temps 12 heures et le temps 0, - Détermination du pourcentage d'inhibition de la dégradation de l'élastine. - Tests statistiques effectués sur les valeurs delta de fluorescence . 30 Test de la différence entre les moyennes des différents groupes par analyse de la variance à un facteur (ANOVA 1 ; a 3) Résultats Les surnageants de culture de fibroblastes dermiques humains contiennent très peu d'activité élastolytique métallo-dépendante. L'ajoutd'interleukine 1 (cytokine pro-inflammatoire) augmente de 9,6 fois cette activité élastolytique (dont 94 % sont secrétés sous forme latente inactive). Cette augmentation valide l'étape de stimulation des fibroblastes par l'interleukine 1. Testée à 10' M, la dexaméthasone, inhibiteur stéroïdien de la synthèse des MMPs, inhibe de 97.5 % (p Le produit à l'essai M2 (constitué de 2.5 % de A + 2 % de D + 0,001 0/0 de C) inhibe de 25.6 % (p Les résultats obtenus laissent penser que les produits à l'essai permettraient de retarder la formation des rides et par conséquent le vieillissement de la peau. Exemple 5 : CONCENTRE VELOURS AMANDE-POMME - tests d'usage L'investigateur a réalisé une évaluation clinique des points indiqués ci-dessous - Aspect des pores : Selon une échelle analogique en 6 points, de 0 à 5. 1 o Plus l'état du paramètre est considéré comme bon, plus la note se rapproche de 0 et inversement. L'analyse statistique porte sur 25 sujets. Le résultat observé est une réduction moyenne des pores de 28 %. QUESTIONNAIRE 3748-27-DE2 15 Qualités cosmétiques et efficacité du produit : Question : Comment trouvez-vous le produit testé, le Concentré Velours Amande-Pomme ? Réponse : (10) Très agréable 40 % 20 Agréable 48 % (12) Pas très agréable 12 % (3) Désagréable 0 0/0 88 % des sujets trouvent le Concentré Velours Amande-Pomme très 25 agréable ou agréable . Le produit convient-t-il à votre type de peau : OUI = 76 % ; NON = 24 %. 30 Pourcentage de satisfaction (effectifs) 96 % (24) Pendant l'utilisation La texture est veloutée et fondante L'application est facile 96 % (24) Le produit pénètre rapidement 76 % (19) Le parfum est agréable 92 % (23) Le parfum est frais 88 % (22) Le parfum est naturel 96 %(24) Le parfum est bien dosé 92 % (23) Le produit laisse un fini non gras sur la peau 68 % (17) Après utilisation 100 %(25) La peau est plus douce La peau est veloutée 96 %(24) 1 o La peau est souple 100 %(25) La peau est élastique 88 % (22) La peau est hydratée 96 %(24) La peau est nourrie 100 %(25) La peau est confortable 92 %(23) 15 Le grain de peau est plus fin 92 %(23) Le grain de peau est plus lisse 92 % (23) Après 4 semaines d'utilisation 88 %(22) Le grain de peau est plus fin Le grain de peau est plus lisse 92 %(23) 20 Les pores sont resserrés 84 %(21) La peau est raffermie 84 %(21) L'élasticité de la peau est améliorée 92 %(23) La peau est protégée 88 %(22) Les ridules sont lissées 64 %(16) 25 La beauté de la peau est préservée 100 %(25) La peau est visiblement plus belle 92 % (23) Exemple 6 : Etude de la tolérance cutanée, du potentiel comédogène et acnéigène du concentré velours amande pomme 30 Tolérance clinique Un examen clinique a été effectué par l'investigateur à To du temps initial et du temps final. Critère d'évaluation Signes objectifs : examen dermatologique du visage, comptage des comédons et des microkystes, comptage des papules et des pustules. Siqnes subjectifs Les sujets ont noté les signes ressentis pendant l'étude. Ces 5 observations ont été analysées par l'investigateur afin de compléter la recherche des signes fonctionnels apparus durant le test. Le tableau suivant présente l'évolution des signes observés au début de l'étude. 0/0 de cas Signe Nombre de Augmenté Diminué Inchangé cas Sensation 5 0 100 0 d'inconfort Sensation de 5 0 100 0 tiraillement Erythème 6 0 33,3 66,7 Sécheresse 4 0 75 25 Rugosité 4 0 100 0 10 Commentaires Sécurité Aucune manifestation clinique significative d'intolérance ou d'allergie n'a entrainé de sortie prématurée d'essai. 15 Signes fonctionnels Les signes fonctionnels d'irritation regroupent les signes suivants : picotements cutanés, prurit et sensation de cuisson d'intensité et/ou durée traduisant une irritation. Le produit n'a induit aucun signe fonctionnel d'irritation. 20 Signes physiques Le produit n'a induit aucun signe physique d'irritation. Conclusion Compte tenu de ces observations, le produit présente une très bonne sécurité d'utilisation et un potentiel irritant cutané pratiquement nul en application sur le visage dans les conditions de cette étude. Siqnes fonctionnels Evolution des signes présents au début de l'étude. 100 % des sensations d'inconfort et de tiraillement présentent en début d'étude ont diminué pendant la période d'observation. Siqnes physiques Evolution des signes présents au début de l'étude. 100 % des cas d'érythème et de sécheresse présents en début d'étude ont diminué ou sont rester inchangés pendant la période d'observation. 100 % des cas de rugosité présents en début d'étude ont diminué pendant la période d'observation. Commentaires Aucun sujet n'a présenté de signe physique traduisant une modification de l'état cutané, ce qui est très bien pour ce type de produit chez ce type de sujets présentant tous types de peau. Conclusion Par conséquent, le produit est considéré comme confortable en application sur le visage dans les conditions de cette étude. Potentiel comédoqène du produit Le potentiel comédogène du produit est le suivant : -14,58 Microkystes. Ti 1,27 0,67 / Tf 1,27+ 0,67 = P = 1= Pas de diminution ou d'augmentation. Compte tenu de ces résultats, le produit ne présente pas de potentiel comédogène dans les conditions de cette étude. Potentiel acnéigène. Ti 6,88 66,45 /Tf 2,77 33,89 = P = 2,3x10-4 = Diminution significative. Le nombre de papules et de pustules a significativement diminué entre le Temps initial et le Temps final. Par conséquent, le produit ne présente pas de potentiel acnéigène dans les conditions de cette étude. Conclusion Dans les conditions de cette étude, le produit Concentré velours amandes pomme ^ Présente une bonne tolérance cutanée au niveau du visage chez des sujets présentant tous types de peau. • Peut soutenir la revendication non-comédogène • Peut soutenir la revendication non-acnéigène REVENDICATIONS 1) Association caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait de pomme, du vinaigre biologique de pomme, des glycoprotéines d'amande, du silicium, et au moins une huile essentielle. 2) Association selon la revendication 1, comprenant de l'huile essentielle de coriandre. 3) Association selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'extrait de pomme, de préférence biologique, représente de 0,5 à 10 %, de préférence de 0,5 à 5 % en poids par rapport au poids total de l'association. 4) Association selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le vinaigre de pomme, de préférence biologique, représente de 0,1 à 5 %, de préférence de 0,1 à 2 % en poids par rapport au poids total de l'association. 5) Association selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle les glycoprotéines d'amande représentent de 1 à 15 %, de préférence de 1 à 10 % en poids par rapport au poids total de l'association. 6) Association selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le silicium représente de 0,01 à 3 %, de préférence de 0,01 à 1 % en poids par rapport au poids total de l'association. 7) Association selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle la, au moin une, huile essentielle représente de 0,01 à 2 %, de préférence de 0,01 à 1 % en poids par rapport au poids total l'association. 8) Association selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre au moins un agent actif choisi parmi des agents restructurants, hydratants, apaisants, régénérants. 9) Composition cosmétique ou dermatologique comprenant une association selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10) Composition selon la revendication 9, dans laquelle l'association représente de 0,05 à 30 %, de préférence de 0,05 à 10 % en poids par rapport 1 o au poids total de la composition. 11) Composition selon la revendication 9, dans laquelle l'association représente de 1 à 20 %, de préférence de 1 à 10 % en poids par rapport au poids total de la composition. 12) Méthode de soin cosmétique consistant à appliquer sur la peau une association selon la revendication 1 à 8 ou une composition la revendication 9 à 11. 20 13) Utilisation d'une association selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 pour fortifier la peau, stimuler le renouvellement cellulaire, dynamiser les cellules en relançant le processus d'hydratation, en resserrant les pores et en affinant le grain de peau. 15