FR 2919305 A1 20090130 FR 0705479 A 20070726 VECTEURS VIRAUX ADENO-ASSOCIES POUR L'EXPRESSION DE LA DYSFERLINE DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne le traitement des dysferlinopathies. Elle préconise l'utilisation de deux vecteurs AAV recombinants, permettant d'exprimer une dysferline fonctionnelle. Elle présente l'avantage d'être efficace et 10 d'être basée sur les séquences natives du gène de la dysferline. ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE Les dysferlinopathies sont dues à des mutations dans le gène DYSF codant la protéine 15 dysferline et correspondent à trois maladies cliniquement distinctes (9) (17) : - la dystrophie des ceintures de type 2B (Limb-Girdle Muscular Dystrophy ; LGMD2B OMIM 253601) ; la myopathie distale de Miyoshi (Miyoshi Myopathy ; MM; OMIM 254130) ; et 20 la myopathie du compartiment distal antérieur (Distal Anterior Compartment Myopathy ; DACM; OMIM 606768). Les deux premiers phénotypes sont caractérisés par des niveaux élevés en créatine kinase et une progression lente de la faiblesse musculaire. Dans les LGMD2B, les 25 muscles proximaux des membres et du tronc sont les plus atteints, alors que dans la MM, ce sont les muscles distaux des membres inférieurs qui sont touchés. La DACM est initialement distale, avec atteinte des muscles de la partie antérieure. La maladie est rapidement progressive, conduisant à une faiblesse sévère des muscles proximaux. 30 Tous les types possibles de mutations ont été identifiés dans le gène DYSF, incluant des faux-sens, des non-sens, des délétions ou insertions, des mutations d'épissage et de larges délétions (5) (6) (11) (15). Cependant, un polymorphisme important est également présent dans le gène. Des 35 études récentes indiquent que, dans la plupart des cas, la perte de dysferline visible est associée à une mutation non-sens ou à une perte du cadre de lecture (15). Chez l'homme, DYSF est localisé dans la région chromosomique 2p13 et appartient à la catégorie des grands gènes puisque celui-ci est composé de 55 exons s'étendant sur 150 kb d'ADN génomique et est transcrit en un messager de 6,5 kb (5) (11). Le gène DYSF, bien qu'exprimé dans divers tissus tel que le cerveau et les poumons, est principalement exprimé dans le muscle squelettique, le coeur et les monocytes/macrophages (2). La dysferline est une protéine de 237 kDa composée de 2080 acides aminés, comprenant un domaine transmembranaire en C-terminal et un très long domaine cytosolique en N--terminal. Elle contient six domaines C2 (aussi appelés calcium-senseurs), qui s'étendent le long de la protéine et sont impliqués dans la fixation du calcium et des phospholipides, tels que les phosphoinositides (14). La dysferline contient également deux domaines centraux spécifiques (les domaines dysferline), dont la fonction n'est pas encore élucidée. Des études indiquent que la dysferline est une protéine membranaire dans les fibres du muscle squelettique adulte et s'exprime dès la 5-6ème semaine du développement embryonnaire (2). La dysferline appartient à la famille multiprotéique des ferlines, dont plusieurs membres ont été identifiés, tel que la myoferline. Elles présentent toutes des similarités structurales et contiennent, en particulier, des domaines C2. De plus, la dysferline est hautement conservée parmi les mammifères (5). 25 Des études précédentes ont montré que la dysferline interagit avec différentes protéines telles que : la Cavéoline-3 (12), dont les mutations sont responsables de la LGMD1C (OMIM 607801) ; 30 - la Calpaine-3 (8), le gène muté dans la LGMD2A (OMIM 253600) ; les Annexines I et II (10) ; l'affixine (beta-parvine), une nouvelle protéine se liant aux kinases lié aux intégrines (13) ; et le récepteur dihydropyridine (1) ; 35 - Ahnak (20), 1525 Dans les fibres du muscle squelettique adulte, la dysferline joue un rôle clé dans la réparation du sarcolemme, comme observé dans des muscles humains et murins, déficients en dysferline (3). De plus, une sous-régulation de l'inhibiteur du complément, decay-accelerating factor/CD55, a été observée dans les muscles squelettiques humains et murins, déficients en dysferline, par l'analyse des profils d'expression des messagers. In vitro, l'absence de CD55 mène les myotubes humains à une augmentation de la susceptibilité de l'attaque par le complément (18). La question du traitement des dysferlinopathies reste cruciale. En considérant la nature récessive des dysferlinopathies, le transfert de gène constitue une stratégie thérapeutique possible. Les meilleurs vecteurs, à l'heure actuelle, pour transfecter le muscle sont dérivés des virus associés aux adénovirus (AAV). Cependant, la taille de l'ADNc de la dysferline empêche son incorporation directe dans un vecteur AAV. 20 Il existe donc le besoin de développer de nouveaux outils de thérapie génique permettant de traiter les dysferlinopathies. OBJET DE L'INVENTION Selon un premier aspect, la présente invention concerne une composition comprenant des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) recombinants, avantageusement au nombre de deux, portant des constructions complémentaires permettant l'expression d'une dysferline fonctionnelle. 30 Selon l'invention, un premier vecteur AAV comprend : i) une séquence 5'ITR (Inverted Terminal Repeat) d'AAV ; ii) une portion de gène placée sous le contrôle d'un promoteur; iii) une séquence comprenant un site donneur d'épissage ; 35 iv) une séquence 3'ITR d'AAV. En outre, le second vecteur AAV comprend : v) une séquence 5'ITR (Inverted Terminal Repeat) d'AAV ; vi) une séquence comprenant un site accepteur d'épissage ; vii) une portion de gène; viii) une séquence 3'ITR d'AAV. Ces deux vecteurs AAV, qui peuvent se trouver dans une même composition ou être conditionnés dans deux compositions distinctes, portent des séquences complémentaires qui vont être amenées à constituer une unité fonctionnelle au moment de la concatémérisation. Cet intermédiaire se présente sous la forme d'un intermédiaire, appelé concatémère, déjà isolé et caractérisé dans l'art antérieur. La concatémérisation est assurée grâce à la reconnaissance de séquences terminales inversées répétées, appelées séquences ITR (Inverted Terminal Repeat), présentes et correctement orientées sur chacun des vecteurs AAV. Il se produit alors une recombinaison intermoléculaire des génomes AAV. Les ITR AAV sont une structure en épingle à cheveux, en forme de T. Ces séquences sont essentielles pour la réplication du génome AAV, la réplication et l'empaquetage des particules virales. Selon l'invention et de manière connue, il est choisi des vecteurs avec des ITR non homologues, afin de favoriser la concatémérisation de telle façon que la recombinaison intermoléculaire soit orientée vers l'association adjacente d'hétérodimères complémentaires. En outre et selon l'invention, la réunion des portions de gène portées par les premier et second vecteurs AAV comprend un cadre de lecture ouvert qui code une dysferline fonctionnelle. Dans le cadre de l'invention, on appelle dysferline fonctionnelle , une protéine thérapeutique pour le traitement des dysferlinopathies. Il peut, bien sûr, s'agir de la protéine native complète (comportant 55 exons), en particulier humaine, mais également d'une mini-dysferline (dépourvue de certains motifs répétitifs) ou d'une dysferline mutée conservant une activité thérapeutique. Avantageusement et pour limiter la contrainte de la taille d'encapsidation des AAV, les portions de gène correspondent à des exons. En d'autres termes, les portions de 35 gène sont préférentiellement des fragments d'ADNc. Ainsi et de manière avantageuse, les exons 1 à 55 de la dysferline humaine sont amplifiés à partir d'un vecteur répertorié dans GenBank sous le numéro NM_003494. Pour obtenir une protéine fonctionnelle, le premier vecteur porte avantageusement la 5 partie 5' du gène, alors que le second vecteur porte la partie 3' de ce même gène. En pratique, la dysferline étant constituée de 55 exons, il a été déterminé par les Inventeurs que, dans le but d'avoir des portions de ce gène compatibles avec la taille d'encapsidation des AAV, le clivage doit être réalisé entre les exons 18 et 41 de la 1 o dysferline. Ainsi, le premier vecteur AAV contient avantageusement la portion du gène humaill de la dysferline allant de l'exon 1 à l'exon x, alors que le second vecteur AAV contient la portion allant de l'exon (x+l) à l'exon 55, avec x compris entre 18 et 41. 15 Encore plus avantageusement, le premier vecteur AAV contient les exons 1 à 28 et le second vecteur AAV contient les exons 29 à 55 du gène humain de la dysferline. Pour assurer l'expression du gène de la dysferline après concatémérisation, la portion du gène en 5', c'est à dire celle portée par le premier vecteur AAV, est placée sous le 20 contrôle d'un promoteur fonctionnel. Il peut par exemple s'agir du promoteur synthétique C5-12, bien connu de l'homme du métier et plus particulièrement adapté à l'expression musculaire des gènes. Alternativement, il peut s'agir du promoteur Pdesmine, dérivé du promoteur du gène codant la desmine. 25 Selon une seconde caractéristique de l'invention, la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage contient tous les éléments nécessaires à l'épissage, issus d'un intron natif du gène de la dysferline. 30 Pour assurer cet épissage et de manière classique, un des vecteurs selon l'invention apporte un site donneur d'épissage et l'autre un site accepteur d'épissage. Toutefois, alors que l'art antérieur préconisait de manière générale l'utilisation d'introns mutés dans les éléments d'épissage ou l'utilisation d'introns exogènes voire 35 synthétiques, il a été mis évidence par les Inventeurs, que de manière surprenante et dans le cas de la dysferline, l'utilisation d'introns natifs était non seulement faisable mais performante. L'avantage d'utiliser des séquences endogènes et natives apparaît clairement : les constructions sont beaucoup plus simples à obtenir et ne nécessite pas les mutagénèses lourdes, envisagées dans l'art antérieur. En outre, pour les applications cliniques et la sécurité sanitaire en thérapie génique, il est préféré l'utilisation de séquences endogènes plutôt que l'introduction de séquences exogènes pouvant entraîner des réactions chez l'hôte. Ainsi et selon le principe de l'invention, un intron natif est simplement découpé en deux fragments, la partie comprenant le site donneur d'épissage étant naturellement situé en aval de la partie 5' du fragment de gène dans le premier vecteur AAV et la partie comprenant le site accepteur d'épissage étant naturellement situé en amont de la partie 3' du fragment de gène dans le second vecteur AAV. De manière optimisée, la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage correspond donc à un intron natif du gène humain de la dysferline, avantageusement l'un des introns choisis parmi les introns 18 à 40, et encore plus avantageusement l'intron 28 (SEQ ID 12). C'est par exemple le cas lorsque le clivage est réalisé entre les nucléotides 140 et 141 de cet intron 28. Evidemment, les séquences contenant les sites donneur et accepteur d'épissage peuvent ne pas être strictement identiques à l'intron natif, du fait notamment de délétions ou substitutions liées à leur clonage dans les vecteurs AAV selon l'invention. C'est pourquoi, le concept selon l'invention porte sur le fait que les éléments nécessaires à l'épissage, à savoir les sites donneur et accepteur d'épissage, les points de branchement ( Branch Point ) mais également les séquences ESE ( Exonic Splicing Enhancer ), sont conservés. De manière générale et pour la dysferline, les introns visés, avantageusement les introns 18 à 40 du gène humain et encore plus avantageusement l'intron 28, contiennent au moins 70% de leur séquence potentiellement impliquées dans l'épissage. 5 Avantageusement, la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage présente donc au moins 70%, préférentiellement 80%, encore plus préférentiellement 90% voire 95% d'identité avec la séquence de l'intron natif. Dans le cas particulier de l'intron 28, la réunion de ces deux séquences présente la séquence SEQ ID 13. Cette dernière présente 97% d'identité avec la séquence native de l'intron 28, naturellement localisée entre les exons 28 et 29 (SEQ ID 12). 10 Dans ce cas précis et lorsque le clivage est réalisé en aval du nucléotide 140 de l'intron 28, le premier vecteur AAV présente, en tant que séquence comprenant un site dormeur d'épissage, la séquence SEQ ID 14, alors que le second vecteur AAV présente, en tant que séquence comprenant un site accepteur d'épissage, la séquence SEQ ID 15. 15 De manière avantageuse et pour assurer une bonne stabilité du transcrit, le second vecteur AAV porte en aval de la portion du gène de la dysferline un signal de polyadénylation, par exemple le polyA du SV40. 20 Les deux vecteurs peuvent être utilisés pour la production in vitro de dysferline dans des cellules. Avantageusement, ces cellules sont des cellules musculaires, encore plus avantageusement issus de mammifères, en particulier d'origine humaine. Une alternative à l'utilisation directe des vecteurs AAV est l'utilisation de plasmides 25 de type AAV qui comprennent les éléments i) à iv) ou v) à viii) tels que définis précédemment, et donc des séquences ITR, mais sont dépourvus des séquences codant pour Cap et Rep. Selon un autre aspect, l'invention concerne donc également une méthode de 30 production de la dysferline in vitro dans des cellules, consistant à mettre en contact la cellule avec une composition contenant les vecteurs ou les plasmides AAV recombinants selon l'invention. En pratique, les cieux vecteurs ou plasmides sont introduits de manière simultanée ou 35 séquentielle dans les cellules, notamment par transfection. Pour la production de dysferline à partir de plasmides de type AAV tels que décrits, il est également nécessaire d'apporter les protéines RepCap et une fonction adenovirus helper , soit sous la forme de deux plasmides supplémentaires lors de la transfection, soit en utilisant des lignées cellulaires comportant de façon stable ces séquences. Les conditions de la culture cellulaire sont ajustées par l'homme du métier afin que la concatémérisation, l'épissage et l'expression du gène de la dysferline aient lieu : maintien des vecteurs ou plasmides, activité du promoteur, ... 1 o Les vecteurs AAV recombinants tels que décrits dans la présente invention ont des applications évidentes, notamment dans le domaine thérapeutique. Ainsi et selon un autre aspect de l'invention, l'invention concerne l'utilisation d'une composition, comprenant un seul ou les deux vecteurs AAV tels que définis 15 précédemment, comme médicament. La composition ou îles compositions pharmaceutiques correspondantes comprennent le ou les vecteurs AAV, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et inerte. Divers excipients, stabilisateurs, et autres composés adaptés connus de l'homme du 20 métier peuvent être envisagés dans une telle composition. Lorsque la composition selon l'invention est à injecter au niveau des muscles malades, elle se présente préférentiellement sous forme liquide. La détermination de la concentration en vecteur, de la quantité à injecter et de la fréquence des injections 25 relève de la pratique courante de l'homme du métier. Un autre mode d'administration privilégié selon l'invention est l'administration par voie systémique. 3o De tels médicaments sont notamment destinés à la thérapie génique, en particulier pour le traitement des dysferlinopathies. Comme déjà dit, les deux vecteurs selon l'invention peuvent être conditionnés dans le même médicament ou alternativement peuvent faire l'objet de deux médicaments 35 distincts.5 La présente invention offre donc une solution thérapeutique pour le traitement des dysferlinopathies présentant l'avantage d'être simple, sûre et efficace. EXEMPLES DE REALISATION L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées. Ceux-ci n'ont toutefois aucune portée limitative. Cet exemple porte donc sur l'utilisation de deux vecteurs AAV aptes à concatémériser, permettant la production à un niveau thérapeutique d'une dysferline fonctionnelle. 15 La stratégie utilisée est illustrée à la Figure 1. Elle met en oeuvre deux vecteurs AAV indépendants, un iportant la partie 5' de l'ADNc avec une séquence intronique contenant un site donneur d'épissage, et l'autre portant une séquence intronique avec un site accepteur d'épissage suivi de la partie 3' de l'ADNc. Dans cette stratégie, l'expression de la protéine est obtenue après co-administration des deux vecteurs, 20 concatémérisation des génomes viraux et épissage entre les deux sites d'épissage. Cette approche appliquée à la dysferline a été testée in vivo sur des souris déficientes en dysferline. 25 Figure 1 : Schéma de la stratégie adoptée dans le cadre de l'invention. Figure 2 : Schéma de l'ADNc de la dysferline et de la zone compatible pour le clivage. Les boîtes représentent les différents exons. Figure 3 : Stratégie utilisée pour cliver et cloner les deux parties de l'ADNc de la dysferline. 30 Figure 4 : Séquence de l'intron 28 et position du site de clivage dans l'intron (x). Les nucléotides en gras sont sensés ne pas participer aux ESE. Figure 5 : Schéma des deux vecteurs AAV recombinants utilisés dans l'invention. Figure 6 : A/ Gel d'électrophorèse du produit de PCR de la jonction. Un plasmide GFP-Dysferline a été utilisé comme contrôle positif de l'amplification. B/ RT-PCR 35 quantitative. Les résultats sont présentés suivant le ratio du Ct de la dysferline avec PO, pour normaliser l'ensemble des échantillons. Figure 7 : Analyse par RTPCR des muscles injectés.10 Figure 8 : Analyse des muscles injectés par western blot. Les A/J sont des modèles déficients en dysferline et les C57b6, des souris normales. I) MATERIEL ET METHODES 1) Analyses bioinformatiques Les logiciels et les sites web suivant ont été utilisés : NNSplice: (http://www.fruitfly.org/seq tools/splice.html); SpliceView (http://125.itba.mi.cnr.it/ùwebgene/wwwspliceview.html); Splicc Prcdictor (http://deepc2.psi.iastate.edu/cgi-bin/sp.cgi); ESE-finder (http ://rulai.cshl.edu/tools/ESE/), et Rescue-ESE (http ://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese/). 2) Constructions plasmidiques Un plasmide pcDNA3, pGFP-Dysferline, portant la séquence entière codant la dysferline humaine (GenBank number NM_003494) fusionnée à la Green Fluorescent Protein (GFP) a été utilisé comme matrice pour l'amplification de la partie 5' de la dysferline, de l'exon 1 à 28, en utilisant une amorce en amont contenant le site de restriction Ncol (5'-TTCCATGGGCATGCTGAGGGTCTTCATCC-3') (SEQ ID 1) et une amorce en aval portant les sites de restriction Hindlli et Mfel (5'-TTCAATTGGGAAGCTTGCCCACCTTGCTCATCGACAGCCCGG-3') (SEQ ID 2). Ce produit de PCR a été sous-cloné dans le plasmide TOPO XL PCR Cloning Kit pour obtenir le pTOPO-Dysf5'. La même procédure a été appliquée pour cloner la partie 3' de la dysferline, des exons 29 à 55, en utilisant une amorce en amont portant les sites de restriction SpeI et Mlul (5'-TTACTAGTGGACGCGTCCAGGCTGGGAGTATAGCATCACC-3') (SEQ ID 3) et une amorce en aval portant le site de restriction NotI (5'-TTGCGGCCGCCTACAGGGCAGGAGAGTCCTCAGCTGAAGGGCTTC-3') (SEQ ID 4) pour obtenir le pTOPO-dysf3'. Après digestion avec les enzymes de restriction correspondantes (Ncol / Mfel pour la partie 5' et SpeI / Notl pour la partie 3' de la dysferline), les deux vecteurs ont été clonés indépendamment dans un vecteur AAV basé sur le pSMD2, dérivé d'un vecteur portant des ITR de type 2 (Snyder, 1997) pour obtenir le pAAV-dysf5' et le pAAV-dysf3'. La partie 5' est placée sous le contrôle d'un promoteur C5-12 (Li, 1999) et la partie 3' est suivie par un signal de polyadénylation issu du SV40. Puis, nous avons utilisé une approche utilisant la PCR pour insérer la séquence du site donneur d'épissage (SD) ou la séquence du site accepteur d'épissage (SA) du 28eme intron du gène de la dysferline dans ces deux plasmides. Les amorces HindIII-SD5' : 5'-TTAAGCTTAGCATGTGGAACCTGG-3' (SEQ ID 5) et MfeI-SD3' : 5'- 1 o TTCAATTGAGCTTGGAGTGGGGGGTGC-3' (SEQ ID 6) ont été utilisées pour amplifier la partie 5' de l'intron 28 à partir d'ADN génomique humain et Spel-SA5' : 5'-TTACTAG T GCAAATTAGGACCGAGAGTCAG-3' (SEQ ID 7) et iviïul-SA : 5'-TTACGCGTGGGAGGGGGAACCGGTCACT-3' (SEQ ID 8) pour la partie 3' de l'intron 28. Après digestion adéquate des plasmides et des produits de PCR, ces 15 produits ont été introduits dans le pAAV-dysf5' et pAAV- dysf3' pour générer les plasmides pAAV2-Dysf.E28128 et pAAV2-Dysf.I28E29. 3) Production d'AAV recombinant (AAVr) 20 Les préparations virales d'adénovirus AAV2/1 ont été générées en incorporant les génomes viraux recombinant de type AAV2-ITR dans des capsides AAV 1 en utilisant un protocole de tri-transfections plasmidiques comme décrit (4). Brièvement, des cellules 293 HEK (confluentes à 60%) ont été co-transfectées avec pAAVDysfE28128 ou pAAV-Dysfl28E29, le plasmide RepCap (pLT-RCO2), et le plasmide 25 helper adenoviral (pXX6) à un ratio de 1 :1 :2. Le lysat viral brut est récolté 60 heures après la transfection. Pour faciliter le relargage des particules virales, le lysat brut est séquentiellement traité par quatre cycles de congélation-décongélation, digéré par la benzonase (15' à 37 C) et précipité au sulfate d'ammonium. Finalement, le lysat viral est purifié par deux cycles d'ultracentrifugation en CsCI, puis suivi par des dialyses 30 afin d'éliminer le CsC1. La détermination du titre viral est obtenue par PCR en temps réel (comme décrit dans Fougerousse et al (7)). 4) Cultures cellulaires et transfections 35 Les cellules 293 HEK ont été utilisées pour des analyses in vitro de concatémérisation. Les cellules sont cultivées dans du DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) concentré en glucose complémenté avec 10% de SVF (sérum de veau foetal), 1% de penicilline-streptomycine. Les cellules sont ensemencées dans des boîtes de 10 cm la veille de la transfection. Immédiatement avant la transfection, les cellules sont lavées avec du milieu à 1% de SVF. Les cellules 293 HEK sont co-transfectées avec pAAVDysf 5', pAAV-Dysf 3' et pLT-RCO2 dans un ratio de 1 :1 :1. A 6-7h après la transfection, DMEM(lg/L glucose) avec 10% FBS est ajouté. Les cultures cellulaires sont collectées pour l'analyse de l'expression du transgène 48 heures après la transfection. 5) RT-PCR Les ARNs totaux sont extraits des cellules par la méthode au Trizol (Invitrogen). L'ADN 1T résiduel est éliminé des échantillons avec le kit a Free Free DNA (Ambion). 7 . 1 g d'ARN est rétrotranscrit en utilisant des amorces aléatoires selon le protocole du système de RT-PCR Superscript II first strand synthesis (Invitrogen). Les analyses de 15 RT-PCR quantitative sont réalisées comme décrite précédemment (4). Les paires d'amorces et la sonde Taqman utilisées pour la détection spécifique de la dysferline épissée sont les suivants. Exon28.f 5,CTCAACCGGGCTGTCGAT 3' (SEQ ID 9), Exon29.r 5' GTCGGTGTGTGTAGTACATCTTCTCA 3' (SEQ ID 10), et 20 Exons2829.s 5' CAAGGCTGGGAG 3' (SEQ ID 11) La sonde (Exons2829.$) a été choisie pour chevaucher la jonction entre les exons 28 et 29. La phosphoprotéine ribosomale acidique ubiquitaire (PO) a été utilisée pour normaliser les données entre les échantillons (4). 25 6) Expériences in vivo Les souris Sjl, A/J et Swiss proviennent des laboratoires Charles River (Les Oncins, France). Toutes les expériences sont réalisées selon la Charte Européenne pour l'utilisation des animaux à des fins expérimentales. Les AAV sont délivrés dans le 30 muscle jambier antérieur. Pour l'injection intramusculaire, les souris ont reçu, dans le muscle jambier antérieur gauche (TA), 30 0 d'AAVr2/1-dysf2728 (9 x 10el0 vg) et dans le TA droit, 30 l d'un mélange des vecteurs AAVr2/1-dysf 2828' et 2829 en proportion équivalente (9 35 x 10e10 gv de chaque). Un mois après l'injection, les souris sont sacrifiées et les deux TA sont prélevés puis rapidement congelés dans de l'azote liquide refroidi en isopentane. ) Western blot Les muscles ont été homogénéisés en utilisant un Ultra-Turrax T8 (Ika) dans du tampon de lyse (20 mM pH 7.5 Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EGTA, 0.1% 100X Triton ; 25 l par mg de tissus) complémenté avec Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche) et 2 M E64 (Sigma). Les échantillons sont mélangés avec du tampon de charge INuPage LDS (Invitrogen), DTT 3M (Sigma)], dénaturés pendant 10' à 70 C et rapidement centrifugés. Les échantillons ont été chargés sur des gels NuPAGE en gradient de polyacrylamide 3-10% précoulés (Invitrogen). Les protéines sont séparées par électrophorèse en MOPS, puis un électrotransfert (100V pendant une heure) sur membrane P V DF (Iminobilon-P PVDF transfer membran, Dutscher). L'efficacité du transfert est vérifié par coloration au rouge Ponceau (0.2% de rouge Ponceau / 1% d'acide acétique), suivi d'une décoloration en 1% d'acide acétique. Les membranes ont ensuite été bloquées pendant une heure à température ambiante avec 3% de sérum albumine bovine (BSA) dans du tampon salin Tris avec 0.1% de Tween-20 (TTBS) et hybridées avec l'anticorps primaire monoclonal murin contre la dysferline (NCL-Hamlet, Novocastra, dilution 1 :500) à température ambiante pendant 2/3 heures. Finalement, les membranes sont incubées pendant une heure avec l'anticorps secondaire anti-murin (1 :1,000 en TTBS) couplé à l'horseradish peroxidase (HRP) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). La révélation a été réalisée avec le kit SuperSignal West Pico chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL, USA). La visualisation des bandes spécifiques est obtenue par exposition des membranes sur des films X-OMAT-S (Hyperfilm ECL, Amersham Bioscences). II) RESULTATS Cette stratégie utilise deux vecteurs AAV indépendants, un portant la partie 5' de l'ADNc avec une séquence intronique contenant un site donneur d'épissage, et l'autre portant une séquence intronique avec un site accepteur d'épissage suivi de la partie 3' de l'ADNc. Dans cette stratégie, l'expression de la protéine est obtenue après coadministration des deux vecteurs, concatémérisation des génomes viraux et épissage entre les deux sites d'épissage (Figure 1). Cette approche a été testée in vivo sur des souris déficientes en dysferline. 13 1) Construction des vecteurs AAV Les 6,2 kb du messager de la dysferline sont codés par 55 exons. En considérant la capacité d'encapsidation des vecteurs AAV et la taille minimale des éléments régulateurs nécessaires, il est théoriquement possible de diviser l'ADNc de la dysferline entre les exons 18 et 41 (Figure 2). Concernant les éléments d'épissage devant être introduits dans les deux vecteurs afin de permettre l'épissage entre les deux parties de l'ADNc de la dysferline, il a été choisi, dans le cadre de l'invention, d'utiliser des séquences endogènes du gène de la dystrophine. Pour le présent exemple de réalisation, la séquence codant la dysferline a été clivée dans le 28ème intron (Figure 3). La séquence de cet intron (SEQ ID 12) apparaît à la figure 4. Cet intron est de petite taille (264 bp) etpeut être utilisé dans sa totalité, ce qui garantit que tous les signaux nécessaires pour l'épissage sont présents. Ainsi, il a été vérifié que les sites donneur et accepteur d'épissage ont un score correct en utilisant différents logiciels (NNSplice ; SpliceView ; Splice Preditor ; Table 1). Le site de clivage est matérialisé par une croix dans la séquence représentée à la Figure 4 (entre les nucléotides 140 et 141). Site donneur d'épissage Site accepteur d'épissage NNSplice SpliceView SplicePredictor NNSplice SpliceView SplicePredictor 0,77 0,86 0,84 0,89 0,91 X Table 1 Score des sites d'épissage de l'intron 28 Ensuite, la présence d'éléments favorisant l'épissage, Exon Splicing Enhancer (ESE), a été recherchée dans cet intron, en utilisant ESE-finder et Rescue-ESE, afin d'éviter d'insérer les séquences ITR dans des régions régulant l'épissage. Les nucléotides ne participant pas aux ESE selon les logiciels utilisés sont indiqués en gras sur la Figure 4. Afin de construire les vecteurs désirés, les demis ADNc et demi introns ont été amplifiés en utilisant des amorces portant des sites de restriction, puis successivement insérés dans les vecteurs AAV pour obtenir le pAAV-Dysf5'-E28I28 et pAAVI28E29Dysf3' (Figure 5). 15 2) Expression de la dysferline humaine entière in cellulo Des cellules 293 ont été quadri-transfectées avec pAAV-Dysf5'-E28I28, pAAVI28E29Dysf3' et les plasmides RepCap et adenovirus helper. Une transfection avec pAAV-Dysf5'-E28I28 seul a également été réalisée pour servir de contrôle. Après l'extraction d'ARN, une RT-PCR quantitative a été réalisée pour détecter l'expression de dysferline humaine avec des amorces encadrant la jonction du concatémère d'AAV. Comme attendu, aucune expression de dysferline n'a été détectée chez les cellules 293 transfectées avec le vecteur 5' seul, alors qu'une bande à la taille attendue est détectée pour les cellules transfectées avec les deux vecteurs (Figure 6). 3) Expression de la dysferline humaine entière après injection en intramusculaire chez la souris. Ayant validé la possibilité d'obtenir un messager entier de la dysferline humaine à partir des deux vecteurs, nous avons regardé si un évènement similaire peut se produire in vivo dans les muscles de souris. Nous avons injecté 9 x 1010 génomes viraux (gv) de chaque vecteur dans le muscle jambier antérieur (TA) de trois souches de souris normales, déficientes en dsyferline Sjl et A/J, âgées de 4 mois. Les muscles ont été prélevés 35 jours après l'injection, puis ont subi une analyse de l'expression du niveau de messagers par Taqman quantitative. Comme montré à la Figure 7, un niveau substantiel de transcrit est obtenu (Figure 7). L'évaluation de l'efficacité du transfert de gène a également été faite par western blot. L'analyse des TA injectés a montré l'expression de la protéine entière à 250 kDa (Figure 8). CONCLUSION Nous avons exploité la capacité des vecteurs AAV à se concatémériser pour obtenir l'expression du messager et de la protéine entière de la dysferline. A cet effet, il a été généré un vecteur 5' portant les exons 1 à 28 de l'ADNc de la dysferline et la moitié de l'intron 28 portant le site donneur d'épissage et un vecteur 3' complémentaire portant l'autre moitié de l'intron 28, ayant le site accepteur d'épissage, suivi du reste de l'ADNc de la dysferline, ainsi qu'un signal de polyadénylation. Par la suite, des cotransfections en cellules 293 ou des injections intramusculaires sur des modèles animaux ont été réalisés, les vecteurs 5' et 3' ensemble permettant de produire la dysferline humaine entière. Nos résultats montrent l'utilisation potentielle de la concatémérisation d'AAVs pour l'expression de la dysferline comme une stratégie prometteuse pour les déficiences en dysferline chez l'homme. De manière importante, ceci a été réalisé en utilisant des séquences endogènes du gène de la dysferline. Ceci constitue un atout en thérapie génique où l'introduction de séquences exogènes (source éventuelle de réactions ou de recombinaisons indésirables) est évitée au maximum et simplifie l'obtention des constructions. Il a donc été obtenu, de manière simple et efficace, la compensation d'un défaut de dysferline par thérapie génique. BIBLIOGRAPHIE (1) Ampong, B.N., M. Imamura, T. Matsumiya, M. Yoshida, and S. Takeda. 2005. Intracellular localization of dysferlin and its association with the dihydropyridine receptor. Acta Myol. 24:134-44. (2) Anderson, L.V., K. Davison, J.A. Moss, C. Young, M.J. Cullen, J. Walsh, M.A. Johnson, R. Bashir, S. Britton, S. Keers, Z. Argov, I. Mahjneh, F. 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FASEB Journal 21(3):732-42. to REVENDICATIONS 1/ Composition comprenant au moins : un premier vecteur viral adéno-associé (AAV) comprenant : i) une séquence 5'ITR (Inverted Terminal Repeat) d'AAV ; ii) une portion de gène placée sous le contrôle d'un promoteur; iii) une séquence comprenant un site donneur d'épissage ; iv) une séquence 3'ITR d'AAV ; et un second vecteur viral adéno-associé (AAV) comprenant : v) une séquence 5'ITR (Inverted Terminal Repeat) d'AAV ; vi) une séquence comprenant un site accepteur d'épissage ; vii) une portion de gène; viii)une séquence 3'ITR d'AAV ; caractérisée en ce que : la réunion des portions de gène portées par les premier et second vecteurs AAV comprend un cadre de lecture ouvert qui code une dysferline fonctionnelle, avantageusement d'origine humaine ; la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage contient tous les éléments nécessaires à l'épissage, issus d'un intron natif du gène de la dysferline, avantageusement d'origine humaine. 2/ Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage comprend tous les éléments nécessaires à l'épissage contenus dans l'un des introns 18 à 40 du gène humain de la dysferline, avantageusement ceux de l'intron 28. 3/ Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage présente au moins 70% d'identité avec la séquence de l'intron 28 (SEQ ID 12), et a avantageusement la séquence SEQ ID 13.4/ Composition selon la revendication 2 ou 3 caractérisée en ce que - la séquence iij) du premier AAV a la séquence SEQ ID 14 ; - la séquence vi) du second AAV a la séquence SEQ ID 15. 5/ Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que : la séquence ii) du premier AAV correspond aux exons 1 à x du gène de la dysferline ; la séquence vii) du second AAV correspond aux exons (x+l) à 55 du gène de la dysferline, avec x compris entre 18 et 41, avantageusement égale à 28. 6/ Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le premier vecteur AAV comprend le promoteur synthétique C5-12 ou le promoteur de la desmine, lié fonctionnellement à la portion du gène de la dysferline. 7/ Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le second vecteur AAV comprend un signal de polyadénylation, avantageusement la séquence polyA de SV40, en aval de la portion du gène de la dysferline. 8/ Méthode pour exprimer la dysferline in vitro chez une cellule hôte comprenant la mise en contact entre la cellule et la composition selon l'une des revendications 1 à 7 ou entre la cellule et les plasmides permettant l'obtention de la composition selon l'une des revendications 1 à 7. 9/ Méthode pour exprimer la dysferline selon la revendication 8 caractérisée en ce que la cellule hôte est une cellule de mammifère, préférentiellement une cellule humaine. 10/ Méthode pour exprimer la dysferline selon la revendication 8 ou 9 caractérisée en ce que la cellule hôte est une cellule musculaire. 11/ Utilisation de la composition selon l'une des revendications 1 à 7 pour la préparation d'un médicament. 12/ Utilisation de la composition selon l'une des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'un ou plusieurs médicaments destinés à la thérapie génique, notamment au traitement des dysferlinopathies.13/ Utilisation selon la revendication 1 l ou 12 caractérisée en ce que les deux vecteurs AAV sont conditionnés dans un même médicament. 14/ Utilisation selon la revendication 11 ou 12 caractérisée en ce que chaque vecteur AAV est conditionné dans un médicament distinct.