FR 2918375 A1 20090109 FR 0756303 A 20070705 DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la purification de protéines. L'invention est en particulier relative à un procédé permettant de réduire la quantité d'ADAMTS13 présent dans une solution de facteur von Willebrand (VWF) et à l'utilisation de supports de chromatographie et de tampons spécifiques pour la réduction de la quantité d'ADAMTS13 présents dans de tels échantillons. ART ANTERIEUR Le facteur von Willebrand (VWF) est la plus grande molécule connue en circulation dans le plasma. Il est constitué d'un ensemble de multimères liés par des ponts S-S, dont l'élément de base a un poids moléculaire voisin de 250 kilodaltons (KDa). La plus petite forme de VWF, dans le plasma, est un dimère de 500 KDa et les formes les plus grandes sont des multimères de ce dimère dont le poids moléculaire peut atteindre 20 millions de daltons. Cet assemblage des sous-unités en multimères peut être spécifique des cellules productrices, le VWF étant synthétisé et polymérisé dans les mégacaryocytes et dans les cellules endothéliales. Ce facteur joue un rôle essentiel dans l'hémostase par deux fonctions distinctes : comme protéine d'adhésion il permet l'adhésion et l'agrégation des plaquettes sanguines sur le sous-endothelium vasculaire (et participe ainsi au processus de l'hémostase primaire au niveau des vaisseaux lésés) et, d'autre part, il assure la stabilisation et le transport du Facteur VIII (FVIII) dans la circulation sanguine. Une déficience congénitale en VWF (quantitative) ou une anomalie structurale de ce facteur (qualitative) entraîne la maladie de Willebrand qui se manifeste par des hémorragies cutanéo-muqueuses. Cette maladie est très hétérogène dans son expression clinique et pose de graves problèmes en cas d'intervention chirurgicale. Le traitement de la maladie de Willebrand s'impose pour corriger les anomalies de l'hémostase primaire (temps de saignement) et de la coagulation (temps de céphaline activé et activité coagulante du FVIII, FVIII : C). La maladie se traite par thérapie de substitution par des dérivés de plasma humain enrichis en VWF (par exemple la fraction cryoprécipitée du plasma, des concentrés de FVIII contenant suffisamment de VWF (concentré de FVIII/VWF) ou des concentrés de VWF (dépourvus de FVIII). La maladie de Willebrand peut s'accompagner ou pas d'un déficit en FVIII selon que la protéine est absente ou qualitativement anormale respectivement. Généralement les patients déficients pour ces deux facteurs de la coagulation sont traités avec un concentré de FVIII/VWF. Par contre lorsque le patient déficient en VWF exprime normalement le FVIII il est préférable d'utiliser un concentré de VWF dépourvu de FVIII. Pour ces patients, l'utilisation de tel concentré permet de compenser le seul déficit en VWF et d'éviter les excès de FVIII. Les excès de FVIII peuvent engendrer de graves complications telles que la thrombose veineuse ou l'embolie pulmonaire. Néanmoins, les concentrés de VWF sont généralement très instables en solution si le VWF est dénaturé par des enzymes protéolytiques telles que l'ADAMTS13. L'ADAMTS13 est une protéase de la famille des métalloprotéases qui est naturellement présente dans le plasma humain. Son rôle est de convertir les longs multimères hyper actifs de VWF en multimère plus petits moins actifs. L'ADAMTS 13 est capable de dénaturer le VWF in vivo mais également in vitro, par exemple dans les solutions dérivées du plasma contenant du VWF, comme les concentrés de VWF ou les concentrés de FVIII/VWF. Bien que ces dérivés du plasma peuvent généralement être conservés sous forme de poudre lyophilisée pendant plusieurs années, la présence d'ADAMTS13 affecte la stabilité du VWF lors de la mise en solution de la poudre lyophilisée. Ce problème de stabilité du VWF exclut certaines formes de traitement thérapeutique, par exemple le traitement par perfusion continue ou discontinue pendant plusieurs jours. Ce mode de traitement permet le maintien de taux circulants constants de VWF permettant d'éviter la survenue de taux en dehors des zones thérapeutiques lorsque l'administration est réalisée par injection discontinue. La Demanderesse a donc cherché à mettre au point des moyens efficaces pour réduire la quantité de protéine ADAMTS13 présente dans des compositions dérivées du plasma contenant du VWF, afin d'accroître leurs propriétés de stabilité dans le temps. RESUME DE L'INVENTION L'invention a pour objet l'utilisation d'un support de chromatographie d'échanges d'ions comportant une résine de type polymère vinylique à larges pores portant des groupements DEAE et d'un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présente dans une solution dérivée du plasma contenant du VWF humain et de l'ADAMTS13. L'invention a aussi pour objet un procédé pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présent dans une solution dérivée du plasma contenant du VWF humain comprenant une étape de chromatographie d'échanges d'ions sur une résine de type polymère vinylique à large pores portant des groupements DEAE réalisée dans un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 illustre une étude de la stabilité de l'activité RCo du concentré de VWF. : La figure 1 représente un graphique représentant la concentration en fonction du temps du VWF:RCo d'un concentré de VWF dépourvu d'ADAMTS13 conservé dans des cassettes ou des seringues. La Figure 2 illustre une étude de la stabilité de l'antigène VWF du concentré de VWFLa Figure 2 représente un graphique représentant la concentration en fonction du temps du VWF:Ag d'un concentré de VWF dépourvu d'ADAMTS13 conservé dans des cassettes ou des seringues. DESCRIPTION DE L'INVENTION La Demanderesse a trouvé de manière surprenante que certains types de supports de chromatographie d'échanges d'ions utilisés dans des conditions spécifiques possèdent la capacité d'éliminer les molécules de la protéine ADAMTS13, ou de réduire efficacement la quantité de la protéine ADAMTS13, qui est présente dans des compositions enrichies en VWF. Ainsi, présente invention concerne l'utilisation d'un support de chromatographie d'échanges d'ions comprenant une résine de type polymère vinylique à larges pores portant des groupements DEAE (diéthylaminoéthyl) et d'un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présente dans une solution dérivée du plasma contenant du VWF humain. La présente invention concerne également un procédé pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présent dans une solution dérivée du plasma contenant du VWF humain comprenant une étape de chromatographie d'échanges d'ions sur une résine de type polymère vinylique à large pores portant des groupements DEAE réalisée dans un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine. Avantageusement, le support de chromatographie d'échanges d'ions est une résine de DEAE-Fractogel TSK 650 (appelée aussi DEAE-Toyopearl 650) équilibrée avec du tampon d'équilibrage comprenant du citrate trisodique 0,01 M, du chlorure de sodium 0,11 M, du chlorure de calcium 0,001 M, de la glycine 0,12 M et de la lysine 0,016 M, à pH 7 0,1. Le DEAE-Fractogel TSK 650 est un gel synthétique hydrophile. Le support est un copolymère d'oligoethylèneglycol, de glycidineméthacrylate et de pentaérythritol-diméthacrylate sur lequel sont greffés des groupements DEAE comme -O-CH2-CH2N+(C2H5)2 HC1, ce qui constitue un échangeur d'anions faiblement alcalin. Le DEAE-Fractogel TSK 650 est disponible sous deux tailles de particules (après réhydratation) : le type S (0,025-0,050 mm) et le type M (0,045-0,090 mm) ; les deux types peuvent être utilisés pour la présente invention. Selon l'invention, les solutions dérivées du plasma englobent les dérivés du plasma sanguin, tels que la fraction cryoprécipitée (fraction non purifiée) et les dérivés purifiés du cryoprécipité. La présente invention concerne en particulier les solutions dérivées du plasma susceptibles de contenir du VWF. Dans un mode de réalisation préféré, la fraction cryoprécipitée du plasma, prépurifiée, ayant optionnellement subi un traitement d'inactivation virale, est appliquée sur la colonne de chromatographie échangeuse d'ion équilibrée. La fraction retenue est ensuite éluée par une augmentation de la concentration de chlorure de sodium du tampon à 0,14-0,15 M. Cette étape permet de réduire la quantité d'ADAMTS13 de plus de 500 fois par rapport à la quantité d'ADAMTS13 initialement contenue dans l'échantillon de plasma de départ (tableau 1). Dans un mode de réalisation particulier, on réduit la quantité de ADAMTS13 présente dans une solution dérivée du plasma contenant le facteur von Willebrand en réalisant deux étapes successives de chromatographie d'échanges d'ions, dans les conditions décites ci-dessus, notamment avec le tampon d'équilibrage décrit ci- dessus. Conformément au mode de réalisation ci-dessus, la fraction éluée après l'utilisation de la première colonne peut être de nouveau appliquée sur une seconde colonne de chromatographie identique à la première, dans les mêmes conditions que sur la première, excepté qu'après élimination du filtrat et le rinçage de la colonne avec le tampon d'équilibrage, les protéines adsorbées sur le support chromatographique sont éluées par une augmentation de la concentration de chlorure de sodium du tampon à 0,15-0,17 M. Cette chromatographie supplémentaire permet de réduire la quantité d'ADAMST13 de plus de 2000 fois par rapport à la quantité d'ADAMTS13 contenue dans l'échantillon plasma de départ (tableau 1). Selon l'invention la réduction de la quantité d'ADAMTS13 est supérieure à 200 fois, 300 fois, 400 fois, 500 fois, 600 fois, de préférence supérieure à 700 fois, 800 fois, 900 fois, 1000 fois, 1500 fois, 2000 fois, 2500 fois par rapport à la quantité d'ADAMTSI3 contenue dans l'échantillon de plasma de départ. Pour la fabrication d'une composition enrichie en VWF, la fraction éluée à partir du support de chromatographie d'échanges d'ions, ou bien du support de chromatographie d'échanges d'ions utilisé en second lieu, selon le mode de réalisation de l'invention considéré, peut ensuite être soumise à une étape de chromatographie d'affinité sur support de gélatine-sépharose, en présence d'un tampon d'équilibrage identique au tampon d'équilibrage utilisé pour la réalisation de la ou des étape(s) de chromatographie d'échanges d'ions. Le support de chromatographie de gélatine-sépharose a la capacité de retenir les molécules de fibronectine résiduelle contaminantes. Le choix du tupe de support de gel associé à la gélatine n'est pas une caractéristique essentielle pour la réalisation de cette étape de chromatographie ultérieure. : On peut également utiliser, comme support de chromatographie d'affinité, un support choisi parmi la gélatine-Ultrogel , la gélatine- Spherodex etla gélatine-Fractogel . On utilise de préférence un support de gélatine-sépharose . Des tests in vitro ont confirmé la stabilité du concentré contenant du VWF ainsi obtenu lorsqu'il est mis en solution (exemple 3). En mettant en oeuvre le procédé de réduction de la quantité de protéine ADAMTS13 selon l'invention, on obtient, à partir de diverses solutions liquides issues de plasma, tout particulièrement de plasma humain, des compositions ayant une teneur réduite en protéine ADAMTS13 et qui sont enrichies en VWF. De telles compositions, du fait des propriétés de stabilité dans le temps du VWF, sont utilisables sous une forme liquide pour réaliser des traitements médicaux par administration de VWF par voie intra-veineuse. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'une composition liquide à teneur réduite en protéine ADAMTS13 et enrichie en VWF, telle qu'obtenue par le procédé défini dans la présente description, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter une pathologie liée à un déficit en VWF biologiquement actif. Avantageusement, ledit médicament se présente sous une forme adaptée à son administration par voie intra-veineuse. Dans certains modes de réalisation, ledit médicament se présente sous une forme lyophilisée, à laquelle on ajoute la quantité appropriée d'eau stérile et apyrogène afin de réaliser une composition liquide adaptée pour une administration par voie intra-veineuse. Dans d'autres modes de réalisation, ledit médicament se présente sous une forme liquide qui peut être utilisée directement pour l'administration par voie intra-veineuse. La présente invention est également relative à une méthode pour prévenir ou traiter une maladie liée à un déficit en VWF biologiquement actif, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape dans laquelle on administre, à un patient qui le nécessite, une composition enrichie en VWF et appauvrie en protéine ADAMTS13, telle qu'obtenue selon le procédé défini dans la présente description. Avantageusement, selon la méthode de traitement ou de prévention ou de traitement ci-dessus, l'étape d'administration de la composition consiste en une étape d'administration par voie intraveineuse. Préférentiellement, l'étape d'administration par voie intra-veineuse consiste en une étape de perfusion continue, c'est-à-dire une étape de perfusion continue pendant une durée d'au moins 8 heures et pouvant aller jusqu'à 200 heures, la durée de cette étape étant adaptée à l'état du patient. L'étape d'administration par perfusion continue a généralement une durée allant de 8 heures à 120 heures, et usuellement jusqu'à 24 heures. Selon un mode de réalisation avantageux, l'étape d'administration par perfusion continue est réalisée avec un unique conteneur ou flacon d'une composition enrichie en VWF et appauvrie en ADAMTS13 obtenue selon le procédé de l'invention. L'utilisation d'un conteneur unique contenant un lot unique de la composition, pendant la totalité de la durée de l'étape d'administration par perfusion continue, est rendue possible du fait de la grande stabilité du VWF dans la composition. Des méthodes thérapeutiques comprenant une étape d'administration d'une composition enrichie en facteur de Willebrand sont, en elles-mêmes, connue dans l'état de la technique. De telles méthodes ont été décrites par exemple par Martinowitz et al. (1997, Transfusion Medicine Review, Vol. 11 : 56-63) et Martinowitz et al. (1994, International Journal of Pediatric Hematology/Oncology, Vol. 1 : 471-478). Généralement, la composition enrichie en VWF et appauvrie en protéine ADAMTS13 est administrée au patient, par perfusion continue, de manière à administrer audit patient une quantité de Facteur de Willebrand allant de 20 à 200 VWF :RCo UI/kg,/24 h. Les composition utilisées, obtenues directement ou indirectement par le procédé de l'invention, possèdent avantageusement une teneur en VWF allant de 10 à 250 UI/ml, par exemple 100 UI/ml. Les exemples suivant illustrent des modes de réalisation de la présente invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLES Exemple 1 : fabrication d'un concentré de VWF dépourvu d'ADAMTSI3 -Matériau de départ. Le sang a été prélevé en présence de citrate de sodium (4%) ou de solution anticoagulante CPD (citrate, phosphate, dextrose), et congelé au plus tard 6 heures après son prélèvement. Le plasma a été obtenu après centrifugation, et congelé à - 60 C puis conservé à -35 C. Les lots de plasma contiennent de 1800 à 2000 litres et sont rassemblés par lots de 4000 litres pour chaque mise en oeuvre du procédé. En vue de la décongélation, le plasma a été placé dans une chambre à -7 C pendant au moins 12 heures pour assurer un réchauffement lent et régulier puis il est dégelé dans une enceinte thermostatée à 0-2 C, sous agitation constante. Le cryoprécipité (qui représente environ 9 g/litre de plasma) a été récupéré par centrifugation à froid. Après centrifugation, le cryoprécipité récupéré a été remis en solution et adsorbé sur hydroxyde d'aluminium pour éliminer les principaux contaminants, c'est-à-dire les composants du complexe prothrombinique (particulièrement le Facteur VII), le Facteur XII. Le surnageant a été ensuite refroidi à 15 C (ce qui élimine en partie le fibrinogène et la fibronectine). -Traitement d'inactivation virale. La solution contenant le FVIII-VWF a été soumise à un traitement par solvant-détergent connu pour son efficacité contre les virus à enveloppe lipidique (Horowitz et al., 1985, Transfusion, 25, 516-522.) et qui comprend une incubation de 8 heures à 25 C en présence de 0,3 % tri-n-butyl phosphate (TnBP) et de 1 /o de Tween 80. -Procédé de séparation chromatoqraphique. La première chromatographie a été réalisée sur une colonne de DEAEFractogel(M) TSK 650 (Merk). Le tampon d'équilibrage contient du citrate trisodique (0,01 M), du chlorure de calcium (0,001 M), du chlorure de sodium (0,11 M), de la glycine (0,12 M) et de la L-lysine (0, 016 M). Le VWF, le FVIII et la fibronectine sont retenus par la colonne ; les protéines contaminantes (principalement le fibrinogène et des IgG) faiblement ou pas fixées par la colonne et les résidus du traitement d'inactivation virale sont éliminés par plusieurs lavages successifs avec le même tampon. La colonne a été utilisée avec une vitesse de flux linéaire de 100 cm/heure. La fraction adsorbée sur la colonne, contenant du VWF, est éluée par une augmentation de la concentration en NaCl du tampon à 0,15M. 7 La fraction contenant le VWF élué de cette première colonne est réinjectée sur une seconde colonne, identique à la première et dans les mêmes conditions, après une légère dilution avec le tampon d'équilibrage, pour ajuster la force ionique de la fraction VWF à l'équivalent de 0,11 M en chlorure de sodium. La fraction adsorbée sur la colonne, contenant du VWF est éluée par une augmentation de la concentration en NaCl du tampon à 0,15 M. L'analyse électrophorétique de cet éluat révèle la présence d'une légère contamination par de la fibronectine et de l'inter-alpha trypsine inhibiteur (ITI). Ce second éluat est soumis à une troisième étape de purification sur colonne de gélatine-Sepharose CL4B (Pharmacia) équilibrée avec le tampon d'élution de la colonne précédente, pour éliminer la fibronectine. Ce gel de chromatographie d'affinité a une capacité de rétention de la fibronectine de > 5 mg/ml ce qui permet de réduire ce contaminant à des quantités indétectables ( Le concentré de VWF dépourvu d'ADAMTS13 se retrouve dans le filtrat de cette dernière étape et peut être directement conditionné et lyophilisé. Le concentré final obtenu ne nécessite aucune addition de stabilisant. Exemple 2 : mesure de la réduction de la quantité d'ADAMTSI3 dans la 20 concentré de VWF L'objectif de cet exemple est de mesurer le facteur de réduction des ADAMTS13 présent dans un concentré de VWF fabriqué selon l'exemple 1 - Matériau de départ. Quatre fractions correspondant aux solutions/concentrés avant et après 25 chaque étape de chromatographie de l'exemple 1 ainsi qu'une fraction du plasma de départ ont été prélevées. A chaque fraction a été prélevé un échantillon de 1 mL étiquetés A, B, C, D et E. A : plasma de départ B : cryoprécipité entre le Solvant/détergent et la première DEAE 30 C : éluat de la première chromatographie DEAE D : éluat de la deuxième chromatographie DEAE E : fraction de la colonne Gelatine-Sépharose contenant le VWF - Dosage des ADAMTSI3. La concentration d'ADAMTS de chaque échantillon a été mesurée avec un kit 35 IMUBIND ADAMTS13 ELISA (American Diagnostica) utilisant des anticorps de lapin anti-ADAMTS13 humain. Parallèlement la concentration de VWF :RCo a été mesurée (voir le protocole du dosage dans l'exemple 3). - Résultats Les résultats des différents dosages sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : dosage des ADAMTS13 et du VWF aux différentes étapes du procédé de l'exemple 1 et calcul du facteur de réduction des ADAMTS13 Echantillon Quantité VWF:RCo ADAMTS/VWF:RCo Facteur de (volume total de d'ADAMTS13 réduction la fraction) dans la fraction des (pg) ADAMTS13 A (4000 L) 2 600 000 pg 5 200 000 U I 0,5 pg/Ul 1 B (270 L) 284 040 pg 2 430 000 U I 0,1169 pg/UI 4 C (74 L) 1258 pg 1 776 000 U I 0,0007 pg/UI 714 D (11 L) 308 pg 1 452 000 UI 0,0002 pg/UI 2500 E (16 L) 272 pg 1 104 000 UI 0,0002 pg/UI 2500 NB : Le facteur de réduction des ADAMTS13 est calculé en divisant la valeur ADAMTS/VWF:RCo de la fraction par la valeur ADAMTS/VWF:RCo pour la fraction de plasma. - Conclusion 15 Le facteur de réduction des ADAMTS13 après la première chromatographie est supérieur à 700. Ce facteur de réduction est de l'ordre de 2500 après la deuxième chromatographie. Par contre la troisième chromatographie ne permet pas de réduire la quantité d'ADAMTS13. Cet exemple montre la grande efficacité des colonnes de chromatographie et des tampons utilisés pour l'élimination des 20 ADAMTS13. Exemple 3 : Stabilité du concentré de VWF dépourvu d'ADAMTSI3 L'objectif de cet exemple est d'évaluer la stabilité biologique après reconstitution du concentré lyophilisé de VWF dépourvu d'ADAMTS13 fabriqué selon 25 l'exemple 1 dans différents contenants et en condition de pratique courante lors de fractionnement des doses en seringue ou en discontinue ou lors de l'administration du produit en perfusion continue à l'aide d'une pompe à perfusion.10 Matériel Médicaments testés : Trois lots différents de concentrés de VWF ont été testés : ^ Lot n 1 : VWF:RCo 1010 UI/Flacon de 10 ml ^ Lot n 2 : VWF:RCo 1080 UI/Flacon de 10 ml ^ Lot n 3 : VWF:RCo: 1000 UI/Flacon de 10 ml Le matériel de perfusion utilisé ^ Pompe à perfusion CADD PRIZMTM VIP (SIMS Deltec, Inc, St Paul, MN, USA) ^ Réservoirs MEDICATION CASSETTETM 50 ml en polychlorure de vinyl ^ Prolongateur Delt pour pompe avec valve anti-syphonage 114 cm/45 in en polychlorure de vinyl ^ Seringues 3P Plastipak 10mI Luer Lock H810LL en polypropylène Automate utilisé pour les dosages : automate BCS (Dade Behring, Marburg GmbH) pour les dosages de l'activité co-facteur de la ristocétine (VWF:Rco) et les dosages du Willebrand Antigène (VWF:Ag). Dosage de l'activité cofacteur de la ristocétine (VWF:Rco) - BC Réactif von Willebrand (Dade Behring Marburg GmbH). - NaCl utilisé pour la dilution des échantillons - Dilution des échantillons: Bovin Serum minimum 98%. L'albumine (Bovin Sérum) a été préalablement diluée dans du sérum physiologique. (NaCl 0,9%) Dosage du Willebrand Antigène (VWF:Ag) - Réactif VWF: Ag Dade Behring (Dade Behring Marburg GmbH) contenant: ^ 1 flacon VWF : Ag diluant pour réactif latex 4ml : solution contenant de la glycine, pour la dilution du réactif Latex ^ 1 flacon VWF: Ag de réactif latex 2ml : suspension de petites particules de polystyrène recouvertes d'anticorps (de lapin) anti-VWF humain ^ 1 flacon VWF: Ag tampon 5ml : tampon glycine -Conservation après reconstitution : 15 jours à + 2/+ 8 C - Tampon Owren Kroller sert à la dilution des échantillons - Dilution des échantillons: Bovin Serum minimum 98%. L'albumine (Bovin Sérum) a été préalablement diluée dans du sérum physiologique (NaCl 0,9%). Dosage des Multimères Les réactifs et Tampons sont les suivants : Tampon TBS 50 mM, pH 7,4 ^ 5% lait écrémé = Tampon de saturation ^ 0,05% Tween 20 = Tampon de lavage Anticorps polyclonaux anti-VWF couplés à la phosphatase alcaline 634.0052 Kit de révélation û Biorad (stocké à -20 C) Plasma Standard et Contrôles qualité Plasma Standard Humain (Dade Behring Marburg GmbH) : étalonnage par rapport au standard OMS 97/586. Contrôles: - VEQ A (Contrôle Normal) (Dade Behring Marburg GmbH) Valeurs cibles : RCo: 71% (64-79) et Ag: 90% (83-97) - VEQ B (Contrôle Pathologique) (Dade Behring Marburg GmbH) Valeurs cibles : Rco: 22% (17-27) et Ag: 33% (30-35) Conditions techniques étudiées Température ambiante : 23 2 C A l'abri de la lumière Reconstitution sous hotte à flux d'air laminaire (classe A ; ISO 5), dans une salle à atmosphère contrôlée (Classe C ; ISO 7). (Selon les Bonnes Pratiques de Fabrication : lignes directives particulières : Fabrication des Médicaments stériles ; Bulletin officiel N 2007/1 bis). Méthode Préparation des échantillons û Conditions techniques étudiées Au total, six préparations ont été testées : chaque lot a été testé à la fois dans une seringue et une cassette. Le concentré lyophilisé de VWF dépourvu d'ADAMTS13 est une poudre à reconstituer extemporanément avec de l'eau pour préparations injectables. Serinques : à TO, les produits ont été reconstitués avec le solvant fourni (eau pour préparation injectable) et le matériel (système de transfert muni d'un évent à filtre stérilisant et une aiguille-filtre), puis transférés dans les seringues sous hotte à flux d'air laminaire (classe A), dans une salle à atmosphère contrôlée (Classe C). L'étude a été réalisée en conditions statiques pendant 3 jours (72h), les préparations ont été conservées à température ambiante et à l'abri de la lumière. Cassettes : à TO, les produits ont été reconstitués dans les mêmes conditions que pour les seringues. La première étape a été réalisée dans des conditions statiques , de 0 à 48 heures. La deuxième étape, de 48 à 120 heures a été réalisée dans des conditions dynamiques : la pompe a été mise en fonctionnement à J2 et maintenue à un débit faible (0,1 ml/heure) jusqu'à la fin de l'étude (120ème heure). Les préparations ont été conservées à température ambiante et à l'abri de la lumière. Préparation des échantillons : Les prélèvements pour les dosages du VWF:RCo et VWF:Ag ont été effectués juste après la reconstitution (TO) puis à : ^ T12, 24, 36, 48, 60, 72 heures après reconstitution pour les seringues ^ T12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 heures après reconstitution pour les cassettes. Un échantillon (250 pl) a été prélevé en triple pour chaque point, dans des microtubes Eppendorf numérotés et gradués, puis immédiatement congelé à - 80 C. Les prélèvements pour le dosage de multimères ont été effectués à : ^ TO, 72 Heures pour les seringues ^ TO, 60, 120 Heures pour les cassettes. Les prélèvements ont été immédiatement congelés à -80 C. Le plasma standard et les contrôles Les contrôles VEQ A, VEQ B et le plasma standard ont été reconstitués avec 1 ml d'eau distillée non froide puis sont laissés à stabiliser pendant 1 heure. Pour le dosage de l'activité VWF:RCo une gamme étalon a été réalisée le jour même des dosages. La calibration a été réalisée par une dilution du standard avec du tampon Owren Koller automatiquement par le BCS. Le passage des contrôles VEQ A et VEQ B a permis de valider la calibration. Les contrôles ont été repassés à la fin du passage des échantillons correspondants aux seringues, puis avant ceux correspondants aux cassettes, validant ainsi une nouvelle reconstitution du réactif plaquettes. Pour le dosage de l'Antigène Willebrand, la gamme étalon a été validée par le passage des contrôles VEQ A et VEQ B. Dosage du VWF:Rco Principe du dosage : le VWF présent dans l'échantillon provoque, en présence de la ristocétine (antibiotique), une agglutination des plaquettes stabilisées contenues dans le réactif BC réactif von Willebrand. Le processus d'agglutinationdiminue la turbidité du mélange réactionnel. L'appareil de coagulation (automate Dade Behring BCS) mesure la modification de la Densité Optique et calcule automatiquement l'activité cofacteur de la ristocétine de l'échantillon en % de la normale. Nous avons réalisé une gamme en 6 points à partir du plasma standard de 10 à 150% (10, 20, 40, 60, 100 et 150%). Méthode : le BC réactif VWF contient des plaquettes stabilisées, de la ristocétine et de l'EDTA, sous forme lyophilisée. Après reconstitution avec 4 ml d'eau distillée, le réactif BC réactif von Willebrand est laissé 15 min à stabiliser sans agiter. Il est ensuite agité 2 fois 5 sec au vortex très doucement, puis est posé sur le BCS. Ce dernier doit être agité toutes les 30 min. Le NaCl servant à la dilution des échantillons, est également posé sur le BCS. Dosage du VWF:Ag Principe du dosage : l'addition de réactif à l'échantillon qui contient l'antigène de Von Willebrand entraîne l'agglutination des petites particules de polystyrène recouvertes d'anticorps spécifiques (Ac lapin), fixés pas liaison covalente. Cette agglutination est mesurée par turbidimétrie sur le BCS. La turbidimétrie est directement proportionnelle au taux d'Ag VWF présent dans l'échantillon. Une gamme en 5 points a été réalisée à partir du plasma standard de 10% à 180% (10, 40, 70, 150 et 180%). Méthode : la totalité du flacon diluant a été versée dans le flacon de réactif latex, puis mise sous agitation en évitant les bulles. Après 15 min de repos à température ambiante, le mélange a été déposé sur l'automate. Traitement des échantillons Les échantillons ont été décongelés 5 min à 37 C puis agités au vortex et enfin dilués au 1/100ème dans du Bovin Serum Minimum 98% (préalablement diluée sans du sérum physiologique). Après agitation au vortex les échantillons sont déposés sur le BCS. Les Multimères Préparation des échantillons : les échantillons ont été dilués au 1/10ème en tampon de dilution des échantillons + bleu de bromophénol de façon à ajuster le taux de VWF:Ag à environ 0,1 Ul/ml. Les échantillons ont été ensuite chauffés 30 minutes à 60 C. Electrophorèse : 30 pL d'échantillons ont été déposés dans les puits du gel d'agarose. Dès l'arrêt de l'électrophorèse, le gel a été plongé dans un bêcher d'eau distillée et rincé au moins 1 heure sous agitation légère. Le gel a été ensuite séché sous courant d'air froid puis a été saturé 1 heure dans le tampon de saturation. Le gel a été incubé pendant une nuit, sous agitation douce, dans un bain d'anticorps anti-VWF polyclonaux lié à la phosphatase alcaline (anti-VWF-PA) dilués en tampon TBS 50 mM. Après incubation, le gel a été incubé, sous agitation avec plusieurs bains successifs de tampon de lavage, durant au moins 2 heures. La solution de révélation a été préparée en ajoutant à 100 ml de Tris 0,1 M pH 9,5, 1 ml de solution A + 1 ml de solution B (solutions du kit). Expression et analyse des résultats Exploitation des résultats pour VWF:Rco et VWF:Ag : pour l'analyse statistique une méthode de régression linéaire a été utilisée répondant à une réaction d'ordre 0, la plus simple : y = a + bx. On a vérifié qu'il n'y ai pas de différence significative entre les pentes à l'aide du test de Student, avec t 0,05 pour N-2 dd. Exploitation des résultats des Multimères : Chaque plaque a été scannée afin d'obtenir un tracé densitométrique des bandes correspondant aux différents multimères. Pour chaque bande, l'intégration a été exprimée en pourcentage de la surface totale. Les bandes ont été identifiées de 1 à x, de la plus légère à la plus lourde. Les résultats sont donnés en pourcentage de la totalité : des multimères de la 15ème bande incluse à la Xème (>_ 15-mères) des multimères de la 10ème bande incluse à la Xème (>_ 10-mères) ^ des multimères de la 5ème bande incluse à la Xème (>_ 5-mères) Résultats Résultats des contrôles : données non montrées Résultats des dosages Après reconstitution avec 10 ml d'eau pour préparations injectables, un flacon contient 1000 UI de facteur Willebrand humain ce qui correspond à une activité co- facteur de la ristocétine égale à 1000I/ml. Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations émises par la FDA (Q1 D) et I'EMEA (CPMP/ICH/420/02) concernant l'évaluation de la stabilité de médicaments après reconstitution. Les résultats sont exprimés dans les tableaux n 2 et 3 pour les données brutes. Les stabilités en fonction du temps selon l'activité co-facteur de la ristocétine et selon le Willebrand antigènes sont représentés dans les figures n 1 et 2. Tableau 2: Résultats des dosages des seringues (Données brutes, Moyennes et Ecart-type) :eMpS4neUre 0 128,2 96,3 12 113,5 92 24 112,3 101,4 36 113,4 97,8 48 105,6 97,1 60 104,5 104 72 123,3 104,1 114,4 (7,5) 98,9 (4,5) S2 0 132,1 103,4 S2 12 122,3 101,8 S2 24 125 105,1 S2 36 133,4 100,3 S2 48 129,2 97,5 S2 60 137,7 105,7 S2 72 128,3 107 129,7 (4) 103 (9,2) S3 0 101,8 95,6 S3 12 101,3 97,6 S3 24 94,3 95 S3 36 91,2 100,3 S3 48 88,6 93,3 S3 60 108,3 90,4 S3 72 104 100 98,5 (7,3) 96 (3,7) 1 2 Moyennes ( Ecart-type) Moyennes Ecart-type Moyennes ( ...EcartTtype) 3 Tableau 3: Résultats des dosages des cassettes (Données brutes, Moyennes et Ecart-type) Lot Cassette Temps 1 K1 0 126,7 109,3 12 111,5 105,8 24 106,2 105 36 116,3 107,5 48 109,1 105,6 60 130,1 119,4 72 146,6 129,5 84 123,3 110,8 96 118,2 108,2 108 104,7 103,2 120 132,1 110,8 Moyennes (Ecart-type) 120,7 (11,71) 110,5 (6,9) 2 K2 0 134,4 114,2 12 122,9 102,6 24 120,3 106,6 36 99,8 100,2 48 123,6 113,7 60 129,7 110,9 72 120,3 106,9 84 119,2 108,5 96 143,1 119,5 108 131,3 113 120 113,2 114,7 Moyennes 123, 4 (9,2) 110,4 (4,8) 3 K3 0 149,3 118,8 12 113,9 102,6 24 116,5 103,2 36 123,5 105,1 48 110,7 101 60 107,5 103,7 72 116,4 110,5 84 117,3 106,4 96 116,7 108,8 108 118,1 112,6 120 111,3 103,7 Moyennes (Ecart-type) 118,3 (9,4) 107 (4,9) Les tests sur les pentes de régression ne sont pas significativement différentes de zéro avec a = 5% et p>0'05 sous l'hypothèse de variations aléatoires et non normales cela confirme l'absence d'un phénomène de dégradation significatif des paramètres étudiés (VWF:RCO 8tVWF:Ag) dans les délais (72h et 120h) et les conditions de l'essai. Résultat des multimères Les résultats des multimères sont représentés dans le tableau n 4. Tableau 4 : Résultats des multimères Lot Seringue/Cassette Temps(heure) Multimères 1,5% (%PN) 15 >_ 10 >5 si o 54 71 93 si 72 43 63 91 1 S2 S2 o 72 38 29 61 47 94 76 2 S3 S3 o 72 48 36 63 55 95 89 3 Aucune différence significative n'est observée sur les différents multimères (Haut Poids Moléculaire, Intermédiaire et Faible Poids Moléculaires) tout au long de l'étude dans les différents contenants (seringue et cassette). Conclusion Les résultats de notre étude ont montré la stabilité biologique (qualitative et quantitative) du concentré lyophilisé de VWF dépourvu d'ADAMTS13 reconstitué pour la période étudiée (durant 72h pour les seringues et 120h pour les cassettes) dans les conditions opératoires prédéfinies. Ces résultats ont montré qu'il est possible de fractionner des doses en seringues (administrées en pédiatrie par exemple) ; et de mettre en place d'éventuelles administrations automatisées de bolus au moyen d'une pompe à perfusion voire de la perfusion continue dans la maladie de Willebrand (comme cela est déjà fait pour l'Hémophilie) Revendications 1. Utilisation d'un support de chromatographie d'échanges d'ions comprenant une résine de type polymère vinylique à larges pores portant des groupements DEAE et d'un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présente dans une solution dérivée du plasma contenant du facteur von Willebrand humain. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le support de 10 chromatographie d'échanges d'ions est une colonne de DEAE-Fractogel . 3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le tampon de la chromatographie comprend du citrate trisodique 0,01 M, du chlorure de calcium 0,001 M, de la glycine 0,12 M et de la lysine 0,016 M et du 15 chlorure de sodium en concentration variant de 0,11 M à 0,17 M. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la fraction qui s'est adsorbée sur le support de chromatographie est éluée par une augmentation de la concentration de chlorure de sodium du tampon à 0,14-0,17 20 M. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que le pH du tampon est compris entre 6,9 et 7,1. 25 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'ADAMS13 est éliminé par deux étapes successives de séparation chromatographique utilisant ledit support de chromatographie d'échanges d'ions et ledit tampon. 30 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la réduction de la quantité d'ADAMTS13 est supérieure à 200 fois par rapport à la quantité d'ADAMST13 du plasma de départ. 8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la réduction de la quantité d'ADAMTS13 est supérieure à 500 fois par rapport à la quantité d'ADAMST13 du plasma de départ. 9. Procédé pour réduire la quantité d'ADAMTS13 présent dans une solution dérivée du plasma contenant du VWF humain comprenant une étape de chromatographie d'échanges d'ions sur une résine de type polymère vinylique à large pores portant des groupements DEAE réalisée dans un tampon comprenant du citrate trisodique, du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, de la glycine et de la lysine 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la chromatographie d'échanges d'ions est un support de DEAE-Fractogel . 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que le tampon de la chromatographie comprend du citrate trisodique 0,01 M, du chlorure de calcium 0,001 M, de la glycine 0,12 M et de la lysine 0,016 M et du chlorure de sodium en concentration variant de 0,11 M à 0,17 M. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que la fraction qui s'est adsorbée sur le support de chromatographie est éluée par une augmentation de la concentration de chlorure de sodium du tampon à 0,14-0,17 M. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que le pH du tampon est compris entre 6,9 et 7,1. 14. Procédé selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que l'ADAMS13 est éliminé par deux étapes successives de séparation chromatographique utilisant ledit support de chromatographie d'échanges d'ions et ledit tampon. 15. Procédé selon l'une des revendications 9 à 14, caractérisé en ce que la réduction de la quantité d'ADAMTS13 est supérieure à 200 fois par rapport à la 35 quantité d'ADAMST13 du plasma de départ. 16. Procédé selon l'une des revendications 9 à 15, caractérisé en ce que la réduction de la quantité d'ADAMTS13 est supérieure à 500 fois par rapport à la quantité d'ADAMST13 du plasma de départ.