FR 2919616 A1 20090206 FR 0756890 A 20070802 Polynucléotides insulateurs dérivés de l'élément D4Z4 et leurs utilisations en transgénèse La présente invention concerne des polynucléotides possédant des propriétés insulatrices permettant de protéger en cis l'expression d'un transgène des éléments adjacents dans les cellules d' eucaryotes supérieurs. L'invention a également pour objet l'utilisation de ces polynucléotides pour la transgénèse, la thérapie génique, la production de protéines recombinantes tant en protégeant l'expression des transgènes que les séquences endogènes de l'influence des transgènes. Le fonctionnement normal d'une cellule à un moment et dans un tissu donné résulte d'une combinaison de mécanismes d'activation et d'inactivation finement orchestrés permettant à celle-ci d'afficher un phénotype particulier. La spécificité et le mode d'expression de chaque gène sont déterminés par sa séquence d'ADN à laquelle se superposent des régulations structurales au niveau de la fibre chromatinienne. Le degré de compaction de la chromatine reflète l'activité transcriptionnelle des gènes qui s'y trouvent. Plus précisément, les gènes actifs sont généralement contenus dans des régions peu compactes (état d'euchromatine), facilement accessibles à la machinerie protéique permettant la transcription. En revanche, les régions d'ADN inertes, ou ne contenant pas de gènes actifs, sont davantage condensées (état d'hétérochromatine). La formation d'hétérochromatine dans une région du génome peut induire la répression de grandes régions d'ADN (silencing). Lorsqu'un transgène est intégré à proximité de régions d'hétérochromatine, il subira au cours du temps une extinction de son expression appelée effet de position . Cette variégation par effet de position (PEV) d'une région d'hétérochromatine sur un gène peut s'exercer même lorsque la distance avec le gène est importante. Egalement, dans différents organismes, les télomères situés à l'extrémité des chromosomes peuvent avoir un effet répresseur sur l'expression des gènes situés à proximité : ceci est appelé effet de position télomérique ou TPE. Parallèlement au rôle respectif de ces états chromatiniens, il existe au sein du génome des éléments contrôlant l'expression des gènes, inhibiteurs ou activateurs de la transcription de ces gènes. Ces éléments cis-régulateurs ne sont pas nécessairement positionnés à proximité de leur gène cible, et peuvent parfois être situés à une distance importante de leur cible. Il a été montré que la formation de boucles intervenait dans ces mécanismes. Toutes ces régulations internes au génome représentent un problème lorsque l'on veut intégrer de l'ADN exogène dans un génome. Certaines méthodes permettent de cibler le site d'intégration de l'ADN exogène. Dans d'autres applications, lorsque l'intégration du gène exogène se fait de manière aléatoire, le niveau d'expression du gène dépendra de la 2 structure de la chromatine, et de la présence d'éléments cis-régulateurs pouvant influencer la transcription de ce gène. Le niveau d'expression du gène sera totalement imprévisible. Une solution à ce problème est l'utilisation d'éléments dits insulateur ou isolateur qui protègent un gène des éléments régulateurs environnants. Les insulateurs sont définis par deux propriétés qui peuvent être couplées ou dissociées. Ils peuvent bloquer l'interaction entre un régulateur transcriptionnel et un promoteur lorsqu'ils sont placés entre les deux éléments et/ou peuvent limiter la propagation de zones de chromatine condensée vers les régions environnantes et en limiter les effets positifs ou négatifs. Différents insulateurs ont été décrits et caractérisés chez les eucaryotes. Chez les eucaryotes supérieurs, l'insulateur le mieux décrit est celui du locus de la beta-globine chez le poulet (Chung JH, Whiteley M, Felsenfeld G. (1993). Cell. 74(3):505-14). Ce locus contient plusieurs gènes régulés par un élément commun appelé LCR qui contrôle l'expression des différentes iso formes au cours de l'embryogenèse et de la différenciation de la lignée hématopoïétique. Ce locus est bordé d'une part par un ensemble de gènes codant pour des récepteurs olfactifs et d'autre part, par une région de chromatine condensée. Un élément de 1,2 kb situé en amont de ce locus a été caractérisé pour ses propriétés insulatrices. La fonction insulateur est contenue dans une séquence de seulement 242 paires de bases, contenant 5 sites de liaison protéiques putatifs (Chung JH, Whiteley M, Felsenfeld G. (1993). Cell. 74(3):505-14; Bell AC, West AG, Felsenfeld G. (1999). Cell. 98(3):387-96). Le site n 2 lie la protéine CTCF qui est la seule protéine à activité insulatrice décrite jusqu'alors chez les vertébrés. Cette protéine lie un motif d'ADN de 42 paires de bases et permet l'activité de blocage des régulateurs transcriptionnels mais ne protège pas de la variégation par effet de position. Ce second effet est médié par d'autres séquences encore partiellement caractérisées. Cet insulateur a fait l'objet de plusieurs demandes de brevets (W094/023046; WO96/004390; WO01/002553) et est utilisé dans différents types d'applications (Malik P, Arumugam PI, Yee JK, Puthenveetil G. (2005). Ann N Y Acad Sci. 1054:238-49; Puthenveetil G, Scholes J, Carbonell D, Qureshi N, Xia P, Zeng L, Li S, Yu Y, Hiti AL, Yee JK, Malik P. (2004). Blood. 104(12):3445-53). Toutefois, la force de cet insulateur n'est parfois pas suffisante à limiter la variégation d'expression des transgènes (van Meerten T, Claessen MJ, Hagenbeek A, Ebeling SB. (2006). Gene Ther. 13(9):789-97; Martin-Duque P, Jezzard S, Kaftansis L, Vassaux G. (2004). Hum Gene Ther. 15(10):995-1002). En effet, l'utilisation de deux copies de cet élément s'avère généralement nécessaire, indiquant que dans certains contextes les mécanismes d'insulation médiés par cet élément ne permettent pas de contrecarrer l'influence chromatinienne. D'autres éléments porteurs d'activité insulatrice totale ou partielle identifiés chez les eucaryotes supérieurs ont été décrits dans la littérature (Majem M, Cascallo M, Bayo-Puxan N, Mesia R, Germa JR, Alemany R. (2006). Cancer Gene Ther. 13(7):696-705; 3 Kalos M, Fournier RE. (1995). Mol Cell Biol. 15(1):198-207) ou ont fait l'objet de dépôt de demande de brevet (WO 04/065581). L'objet de la présente invention est donc de proposer de nouveaux polynucléotides possédant des propriétés insulatrices ou insulatrices. Les polynucléotides de la présente 5 invention sont dérivés d'une séquence nommée D4Z4. D4Z4 est une séquence répétée humaine dont la fonction d'insulateur n'a jamais été décrite préalablement. Une séquence D4Z4 est enregistrée dans Genbank sous le numéro d'accès D38024. La délétion de cette séquence à l'extrémité télomérique du bras long du chromosome 4 (locus 4q35) est impliquée dans la dystrophie musculaire facioscapulo- 10 humérale (FSHD). L'élément D4Z4 est présent en un nombre variable de copies au locus 4q35. Ce nombre de séquences varie de 11 à 95 chez les individus normaux et, est généralement inférieur à 10 chez les malades. Des séquences identiques à D4Z4 sont présentes à d'autres endroits du génome, proches de télomères (10g26), de régions d'hétérochromatine sur le chromosome 1 et les chromosomes acrocentriques. Le rôle exact 15 de D4Z4 à ces différents loci n'est pas connu, mais ils ne sont associés à aucune pathologie. Les échanges subtélomériques observés entre séquences homologues en 4q35 et 1Op26, sans association avec les signes cliniques de la FSHD, indiquent que D4Z4 ne code pas pour le gène responsable de cette maladie et que le nombre et non la séquence D4Z4 elle-même est important dans l'étiologie de cette dystrophie. Il paraît donc important 20 de préciser que l'élément D4Z4 isolé n'est la cause d'aucune maladie et que seul le contexte chromatinien particulier du locus 4q35 induit une manifestation pathologique. Ainsi le changement d'organisation chromatinienne lié à la délétion d'un certain nombre de D4Z4 au locus 4q35 pourrait modifier l'expression de différents gènes à proximité de cet élément ou à une distance importante sur le chromosome 4 (van der Maarel SM, Frants 25 RR. (2005). Am J Hum Genet. 76(3):375-86). L'élément D4Z4 a été entièrement séquencé, sans que sa fonction ne soit identifiée, et présente des caractéristiques communes aux régions répétées humaines. En outre, cette séquence contient une région codante potentielle (ORF, Open Reading Frame) pour une protéine à double homéodomaine (Dux4). Toutefois, aucun transcrit n'a pu être mis en 30 évidence. Cette séquence contient également une séquence d'ADN de 27 paires de bases liant potentiellement un complexe protéique répresseur (Gabellini D, Green MR, Tupler R. (2002). Cell. 110(3):339-48 ; WO/2005/037231) (figure 1). Cet élément ne présente aucune homologie avec la séquence de l'élément insulateur du locus de la beta-globine de poulet ni aucun insulateur connu décrit dans d'autres espèces. 35 La présente invention concerne des polynucléotides dérivés de l'élément D4Z4 possédant des propriétés insulatrices des éléments en cis. Avantageusement, les polynucléotides de la présente invention possèdent les deux propriétés caractéristiques des insulateurs , c'est-à-dire, (i) blocage de l'effet des 4 éléments régulateurs transcriptionnels (activateur et répresseur) et (ii) limitation de la variégation par effet de position. Avantageusement, les polynucléotides selon l'invention ont également la propriété de limiter l'effet de position télomérique. Un autre avantage de la présente invention est que les propriétés insulatrices ou isolatrices des polynucléotides ne sont pas dépendantes de leur orientation. De façon particulièrement avantageuse, les polynucléotides de la présente invention ne régulent ni positivement ni négativement l'expression du transgène. Description des séquences SEQ ID NO. 1 : Polynucléotide de 1381bp correspondant au fragment 1-1381 du polynucléotide D4Z4. SEQ ID NO. 2 : Polynucléotide de 65 bp correspondant au fragment 441-505 du polynucléotide D4Z4. SEQ ID NO. 3 : Polynucléotide D4Z4 (Genbank D38024) Description de l'invention La présente invention concerne des polynucléotides possédant des propriétés insulatrices permettant de protéger l'expression d'un transgène des éléments en cis dans les cellules d'eucaryotes supérieurs choisis parmi les polynucléotides suivants : - le polynucléotide de la SEQ ID NO.1, - le polynucléotide de la SEQ ID NO.2, -un fragment d'au moins 50 nucléotides du polynucléotide de la SEQ ID NO.1, de la SEQ ID NO.2 ou de la SEQ ID NO. 3. L'invention concerne aussi des cassettes d'expression comprenant dans le sens de la transcription : - un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, - un transgène, - une séquence terminatrice dans le même organisme hôte, comprenant, en amont du promoteur et/ou en aval de la séquence terminatrice, au moins un polynucléotide possédant des propriétés insulatrices permettant de protéger l'expression d'un transgène des éléments en cis dans les cellules d'eucaryotes supérieurs choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotide tel que défini ci-dessus, b) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 3, c) un polynucléotide présentant au moins 90% de similarité avec un polynucléotide selon la SEQ ID NO. 1, la SEQ ID NO. 3 ou la SEQ ID NO. 3. L'invention concerne aussi des cassettes d'expression comprenant dans le sens de la transcription : - une séquence activatrice de la transcription, - un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, 5 - un transgène, - une séquence terminatrice dans le même organisme hôte, comprenant en amont de la séquence activatrice de la transcription et/ou en aval de la séquence terminatrice, au moins un polynucléotide possédant des propriétés insulatrices permettant de protéger l'expression d'un transgène des éléments en cis dans les cellules d'eucaryotes supérieurs choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotide tel que défini ci-dessus, b) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 3, c) un polynucléotide présentant au moins 90% de similarité avec un polynucléotide selon la SEQ ID NO. 1, la SEQ ID NO. 2 ou la SEQ ID NO. 3. Dans un mode de réalisation préféré, les cassettes d'expression selon l'invention comprennent plusieurs copies en tandem d'un polynucléotide possédant des propriétés insulatrices. Avantageusement, les cassettes d'expression comprennent plusieurs copies en tandem du polynucléotide de la SEQ ID NO. 2. L'invention a également pour objet, des vecteurs comprenant un polynucléotide ou une cassette d'expression selon l'invention. Un autre aspect de l'invention est une cellule eucaryote transformée avec une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Un autre objet de la présente invention est un organisme hôte à l'exception de 25 l'homme comprenant une cassette d'expression, un vecteur et/ou une cellule transformée selon l'invention. Un autre aspect de l'invention est une composition pharmaceutique comprenant une cassette d'expression, un vecteur et/ou une cellule selon l'invention. Un autre aspect est l'utilisation d'une cassette d'expression, d'un vecteur et/ou 30 d'une cellule selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les maladies génétiques, les cancers, les maladies inflammatoires, les maladies auto-immunes, les allergies. L'invention se rapporte aussi à un procédé pour isoler l'expression d'un transgène inséré dans le génome d'une cellule hôte d'eucaryote supérieur, de l'influence des 35 éléments en cis adjacents au site d'insertion dans ledit génome de la cellule hôte comprenant les étapes suivantes : a) on construit une cassette d'expression selon l'invention et/ou un vecteur selon l'invention comprenant ledit transgène, 6 b) on transforme la cellule hôte d'eucaryote supérieur avec la cassette et/ou le vecteur obtenus à l'étape a), c) on insère le transgène dans le génome de ladite cellule hôte d'eucaryote supérieur, d) on exprime le transgène. L'invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotide tel que défini ci-dessus, b) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 3, c) un polynucléotide présentant au moins 90% de similarité avec un polynucléotide selon la SEQ ID NO. 1, la SEQ ID NO.2 ou la SEQ ID NO. 3, pour isoler l'expression d'un transgène intégré dans le génome d'une cellule hôte d'eucaryote supérieur de l'influence d'éléments en cis. Dans un mode de réalisation préféré, les éléments en cis sont des éléments régulateurs de la transcription tels que des activateurs ou des répresseurs. Dans un autre mode de réalisation préféré, les éléments en cis sont les contraintes topologiques des régions chromatiniennes environnantes. Enfin, l'invention a pour objet l'utilisation d'un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotide tel que défini ci-dessus, b) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 3, c) un polynucléotide présentant au moins 90% de similarité avec un polynucléotide selon la SEQ ID NO. 1, la SEQ ID NO. 2 ou la SEQ ID NO. 3, pour la transgénèse, la thérapie génique ou la production de protéines recombinantes. Polynucléotides Selon la présente invention, on entend par "polynucléotide " une chaine nucléotidique simple brin ou son complémentaire pouvant être de type ADN ou ARN, ou une chaine nucléotidique double brin pouvant être de type ADNc (complémentaire) ou génomique. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les polynucléotides modifiés. Les polynucléotides de la présente invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. (Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989) ou par synthèse chimique. Les polynucléotides objet de la présente invention sont des isolateurs ou des insulateurs . Ces polynucléotides possèdent donc des propriétés insulatrices permettant 7 de protéger l'expression d'un transgène des éléments en cis dans les cellules d'eucaryotes supérieurs. Ces propriétés insulatrices dans les cellules d'eucaryotes supérieurs peuvent être testées selon des techniques bien connues de l'homme du métier (Gaszner & Felsenfeld. (2006). Nature Genetics Reviews. (7): 703-13). Des tests appropriés sont également décrits dans les exemples. Les polynucléotides de la présente invention possèdent des propriétés insulatrices des éléments en cis. Selon l'invention, on entend par propriétés insulatrices des éléments en cis la protection d'un transgène des éléments proximaux au site d'insertion dans le génome. Ces éléments en cis sont des régulateurs transcriptionels (activateurs répresseurs), et/ou des contraintes topologiques de la chromatine environnante. Lorsqu'un transgène est intégré dans le génome d'un organisme hôte, les polynucléotides de la présente invention permettent d'isoler la transcription et donc l'expression du transgène de l'influence en cis des éléments adjacents au site d'intégration. Les polynucléotides de la présente invention protègent ainsi des éléments activateurs ( enhancer ) ou répresseurs ( silencer ) de la transcription. Les polynucléotides de la présente invention isolent l'expression du transgène des éléments cis-régulateurs par blocage de ces éléments régulateurs transcriptionels. Les polynucléotides de la présente invention protègent également le transgène des contraintes topologiques des régions chromatiniennes environnantes. Ils protègent donc le transgène de la variégation par effet de position. Les polynucléotides de la présente invention protègent également le transgène contre l'effet de position télomérique. Les polynucléotides de la présente invention possèdent au moins une de ces propriétés insulatrices des éléments en cis. De manière avantageuse, les polynucléotides de la présente invention protègent le transgène à la fois des éléments régulateurs transcriptionels, de l'effet de position (variégation) et de l'effet de position télomérique. Dans un mode de réalisation préféré, les propriétés insulatrices des polynucléotides ne sont pas dépendantes de leur orientation 5'3'. L'invention concerne donc également les séquences complémentaires aux séquences des SEQ ID NO. 1-3. Dans un autre mode de réalisation préféré, les polynucléotides de la présente invention ne régulent ni positivement ni négativement l'expression du transgène. Selon la présente invention, le polynucléotide de la SEQ ID NO. 3 possède des propriétés insulatrices des éléments en cis mais on a également montré que le polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 1381 de la SEQ ID NO. 3 (SEQ ID NO. 1) et le polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 441 et 505 de la SEQ ID NO. 3 (SEQ ID NO. 2) possèdent des propriétés insulatrices. Le terme "fragment" d'un polynucléotide désigne un polynucléotide comprenant une partie mais pas la totalité du polynucléotide dont il est dérivé. Les fragments selon la 8 présente invention conservent les propriétés insulatrices des polynucléotides dont ils sont dérivés. L'invention concerne ainsi un fragment d'au moins 50, 65, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3300 nucléotides du polynucléotide de la SEQ ID No. 1, de la SEQ ID NO. 2 ou de la SEQ ID NO. 3. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les fragments de la présente invention comprennent le polynucléotide de la SEQ ID NO. 1. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l'invention, les fragments de la présente invention comprennent le polynucléotide de la SEQ ID NO. 2. De manière avantageuse, les fragments de la présente invention ont une taille minimale tout en conservant leurs propriétés insulatrices. De façon remarquable, le polynucléotide de la SEQ ID NO. 2 d'une longueur de seulement 65 bp possède des propriétés insulatrices. L'invention concerne également des polynucléotides présentant un degré d'identité ou de similarité avec les polynucléotides de la SEQ ID NO. 1, de la SEQ ID NO. 2 ou de la SEQ ID NO. 3. Ces polynucléotides conservent les propriétés insulatrices des polynucléotides de référence. L'invention concerne ainsi des polynucléotides présentant au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 99% d'identité avec les polynucléotides de la SEQ ID NO. 1, de la SEQ ID NO. 2 ou de la SEQ ID NO. 3. Par nucléotides identiques, on entend des nucléotides invariants ou inchangés entre deux séquences. Ces polynucléotides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport au polynucléotide de référence. L'invention concerne aussi des polynucléotides présentant au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 99% de similarité avec les polynucléotides de la SEQ ID NO. 1, de la SEQ ID NO. 2 ou de la SEQ ID NO. 3. Par similarité, on entend la mesure de la ressemblance entre séquences protéiques ou nucléiques. Ces polynucléotides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport au polynucléotide de référence. Le degré de similarité entre deux séquences, quantifié par un score, est basé sur le pourcentage d'identités et/ou de substitutions conservatrices des séquences. Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité et du degré de similarité entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple Vector NTi Vector NTi 9.1.0, programme d'alignement AlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). De préférence, on utilise les paramètres par défaut. L'invention concerne aussi des polynucléotides capables de s'hybrider de manière sélective avec les polynucléotides de la SEQ ID NO. 1, de la SEQ ID NO. 2 ou de la SEQ 9 ID NO. 3. Ces polynucléotides conservent les propriétés insulatrices des polynucléotides de référence. De préférence, l'hybridation sélective est effectuée dans des conditions de moyenne stringence et préférentiellement dans des conditions de forte stringence. Par "séquence capable de s'hybrider de manière sélective ", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier. En général la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5 C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 30 C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60 C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant: 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 ug/ml sperme de saumon dénaturé DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0,1% SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 0,1% SDS et à forte stringence dans un tampon 0,1X SSC, 0,1%SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989). De préférence, les polynucléotides s'hybridant de manière sélective à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence. Cassettes d'expression Selon un mode de réalisation de l'invention, les polynucléotides possédant des propriétés insulatrices sont insérés dans une cassette d'expression en utilisant des techniques de clonage bien connues de l'homme du métier. Cette cassette d'expression comprend les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction du transgène d'intérêt notamment un site d'initiation et de terminaison de la transcription. Avantageusement, cette cassette d'expression comprend à la fois des éléments permettant de faire produire un polypeptide ou un polynucléotide par une cellule hôte ou un organisme hôte et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression. Typiquement les cassettes d'expression comprennent au moins un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un transgène et une séquence terminatrice dans le même organisme hôte. Selon l'invention les cassettes d'expression comprennent également 10 en amont du promoteur et/ou en aval de la séquence terminatrice, au moins un polynucléotide possédant des propriétés insulatrices selon l'invention. Par en amont du promoteur , on entend un polynucléotide placé avant le promoteur dans le sens de la transcription ou en 5' du promoteur. Par en aval de la séquence terminatrice , on entend un polynucléotide placé après la séquence terminatrice dans le sens de la transcription ou en 3' de la séquence terminatrice. Les polynucléotides possédant des propriétés insulatrices sont donc placés de part et/ou de l'autre du transgène et des éléments nécessaires à son expression. Ainsi les polynucléotides insulateurs protègent le transgène de l'influence des éléments en cis. Lorsque le transgène est intégré dans un génome, les polynucléotides insulateurs protègent aussi les régions environnantes de l'influence du transgène et des éléments nécessaires à son expression. Ceci peut être particulièrement avantageux lorsque les cassettes d'expression selon l'invention comprennent également des séquences activatrices de la transcription. Il est entendu que les polynucléotides insulateurs selon l'invention peuvent être placés en amont et/ou en aval du transgène et des éléments nécessaires à son expression. Avantageusement, on peut aussi placer plusieurs copies en tandem d'un polynucléotide insulateur selon l'invention en amont et/ou en aval du transgène. L'utilisation de plusieurs copies en tandem peut permettre d'augmenter l'effet isolateur. Ceci est particulièrement utile lorsque le polynucléotide est un fragment de petite taille tel que le polynucléotide insulateur de la SEQ ID NO. 2 d'une longueur de 65 nucléotides par exemple. Avantageusement, les cassettes d'expression selon l'invention permettent l'expression du transgène dans une cellule d'eucaryote supérieur ou dans un mammifère. Par transgène on entend tout gène étranger ou toute séquence exogène introduite dans un organisme par transformation génétique. Le transgène est introduit dans le génome de l'organisme hôte pour son expression. Cela peut être par exemple un gène codant pour une protéine qui n'est pas exprimée habituellement dans cet organisme. Le transgène peut être choisi parmi : un gène utilisé en thérapie, un gène de diagnostic, un gène marqueur tel que le gène de la GFP ou la luciférase, un gène destiné à inhiber la prolifération cellulaire, un gène stimulant des fonctions cellulaires. Plus généralement on entend par transgène toute molécule d'acide nucléique exogène, codantpour un produit biologique, à savoir soit un transcrit tel qu'un ARNm, un ARNr, un ARNt, un ribozyme, ou un aptazyme, soit une protéine, un polypeptide, ou un peptide d'intérêt thérapeutique ou expérimental. Selon l'invention, le transgène inclut un ADNg, un ADNc, des ADN naturels ou obtenus totalement ou partiellement par synthèse chimique. II peut aussi s'agir d'une séquence antisens, d'une 11 séquence mutante d'un gène donné, ou d'une séquence intervenant dans les fonctions de transcription, d'expression, d'activation de gènes, ou encore une séquence appropriée pour l'activation de pro-drogues ou de substances cytotoxiques. Le transgène d'intérêt est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans l'organisme hôte. Tout type de séquence promotrice peut être utilisé dans les cassettes d'expression selon l'invention. Le choix du promoteur dépendra notamment de l'organisme hôte choisi pour l'expression du transgène. Certains promoteurs permettent une expression constitutive alors que d'autres promoteurs sont au contraire inductibles. Le promoteur peut également être actif seulement dans certains types de cellules ou de tissus. Tous ces promoteurs sont décrits dans la littérature et bien connus de l'homme du métier. Parmi les promoteurs pour l'expression d'un transgène dans les cellules d'eucaryotes supérieurs on citera notamment les promoteurs permettant l'expression constitutive (CMV, SV40, Thymidine kinase, EF-la, Ubc), les promoteurs inductibles (système TeT, Ecdysone inductible ou répressible), les promoteurs permettant l'expression virale et lentivirale. Les cassettes d'expression, selon la présente invention, peuvent en outre inclure toute autre séquence nécessaire à l'expression de polypeptides ou de polynucléotides comme par exemple des éléments de régulation ou des séquences signal permettant la sécrétion des polypeptides produits par l'organisme hôte. On peut notamment utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression du transgène inséré dans la cassette d'expression. Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation telles que des activateurs de transcription ("enhancer"). Parmi les séquences activatrices de la transcription fonctionnelles dans les cellules d'eucaryotes supérieurs on citera notamment les enhancers viraux (SV40, CMV, Moloney murine leukemia virus (MMLV) LTR), les enhancers spécifiques de gènes (à titre d'exemple, la beta globine humaine ou murine, l'interferon responsive enhancer element). Une grande variété de séquences terminatrices sont utilisables dans les cassettes d'expression selon l'invention, ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de l'ARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte sélectionné peut être utilisée. Vecteurs Avantageusement, les polynucléotides et les cassettes d'expression selon la présente 35 invention sont insérés dans un vecteur. Par vecteur , on entend toute molécule d'acide nucléique capable d'autoréplication dans laquelle il est possible d'insérer des fragments d'acide nucléique étranger destinés à être introduits dans une cellule-hôte pour y créer une modification 12 génétique. Au sens large, le terme vecteur désigne tout véhicule de matériel génétique d'une cellule à une autre. Les techniques de construction de ces vecteurs et d'insertion d'un polynucléotide de l'invention dans ces vecteurs sont bien connues de l'homme du métier. L'homme du métier choisira les vecteurs appropriés en fonction de l'organisme hôte à transformer, et en fonction de la technique de transformation mise en oeuvre. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention se rapporte à un vecteur de transgenèse comprenant une cassette selon l'invention. Un tel vecteur peut être préparé selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier. Ces vecteurs sont destinés à être intégrés dans une cellule hôte. On utilise de préférence des vecteurs intégratifs qui vont permettre l'intégration de la molécule d'acide nucléique exogène de façon aléatoire dans le génome de la cellule hôte. L'homme du métier connaît différents systèmes intégratifs, plasmidiques ou viraux, qu'il sait choisir en fonction des cellules hôtes. Un tel vecteur de transgenèse peut être utilisé en thérapie, et notamment en thérapie génique. Avantageusement les vecteurs peuvent comporter plusieurs cassettes d'expression séparées ou isolées entre-elles par des polynucléotides insulateurs selon l'invention. Cellules eucaryotes transformées et organismes hôtes L'invention se rapporte également à une cellule eucaryote transformée avec une cassette selon l'invention, en particulier ayant intégré dans son génome une telle cassette. L'homme du métier connaît bien les méthodes standard pour faire pénétrer une cassette (séquence d'ADN) dans une cellule hôte, telles que par exemple : la transfection, la lipofection, l'électroporation, la microinjection, l'infection virale, le choc thermique, la transformation après perméabilisation chimique de la membrane ou la fusion cellulaire. Les méthodes d'intégration de séquences dans le génome de cellules eucaryotes sont bien connues de l'homme du métier. Préférentiellement, les cellules eucaryotes transformées sont des cellules d'eucaryotes supérieurs transformées. Avantageusement, il s'agit de cellules de mammifère. De manière préférentielle, les cellules sont des cellules animales transformées par les méthodes telles que décrites dans Vasquez et al. ((2001) PNAS 98, 8403-8410) et Yanez et al ((1999), Somatic cell and molecular genetics 25, 27-31). Dans un mode de réalisation de l'invention, il s'agit de cellules humaines. Par transformation , on entend l'introduction de tout matériel génétique étranger dans une cellule. La présente invention concerne également un organisme hôte transformé avec une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Par organisme hôte, on entend en particulier selon l'invention tout organisme pluricellulaire, inférieur ou supérieur. Par organisme hôte on entend un organisme non humain. 13 L'invention est également relative à un animal, à l'exception de l'homme, comprenant au moins une cellule modifiée, c'est-à-dire ayant intégré une cassette selon l'invention. Les polynucléotides possédant des propriétés insulatrices selon l'invention permettent d'isoler l'expression d'un transgène dans un animal transgénique. Le transgène est protégé de l'influence négative ou inappropriée des éléments à proximité du site d'intégration mais les polynucléotides isolateurs limitent aussi l'impact des séquences intégrées expérimentalement sur les éléments endogènes présents au site d'intégration ce qui pourrait avoir un effet délétère sur la cellule ou l'organisme manipulée génétiquement. Les méthodes d'obtention d'animaux transgéniques sont bien connues de l'homme du métier, et notamment décrites pour le mouton (Wilmut et al. Nature 385, 810-813, 1997 ; WO 97 07669), la souris (Wakayama et al. Nature 394, 369-374, 1998 ; WO 99 37143), les bovins (Wells et al. Biol. Reprod. 60, 996-1005, 1999), la chèvre (Baguisi et al. Nature Biotechnol. 17, 456-461, 1999 ; WO 00 25578), le porc (Polejaeva et al. Nature 407, 86-90, 2000), le lapin (Chesne et al. Nature Biotechnol. 20, 366-369, 2002) et le rat (Zhou & al., Science, 25 septembre 2003 ; PCT/FR04/001275). Les méthodes de transfert nucléaire sont notamment décrites par Campbell & al. (Nuclear transfer in practice, School of Biosciences, University of Nottingham, Leicestershire, United Kingdom). Compositions pharmaceutiques Selon un aspect de l'invention, les cassettes d'expression, les vecteurs ou les cellules transformées selon l'invention peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné notamment à traiter les maladies génétiques, les cancers, les maladies inflammatoires, les maladies auto-immunes, les allergies. Selon un aspect de l'invention, les vecteurs de transgénèse selon l'invention peuvent être utilisés pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter une thérapie nécessitant l'expression d'un gène absent ou muté dans une cellule de l'organisme. Ceci inclus en particulier les maladies liées à une anomalie génétique ou le cancer. Les cellules transformées peuvent être, selon un aspect préféré de l'invention, une cellule tumorale dont on désire contrôler la prolifération; dans ce cas la cassette intégrée dans le génome comprend un transgène destiné à inhiber la prolifération cellulaire. L'insulateur de la beta globine identifié chez le poulet a été utilisé dans le traitement de diverses pathologies. Par exemple, dans le cas de la thérapie cellulaire basée sur l'utilisation d'adénovirus, différentes stratégies visant à contrôler l'expression et la stabilité du gène ciblé ont été développées. L'une des premières approches a été d'introduire des terminateurs de la transcription. Ultérieurement, l'emploi d'éléments insulateurs permettant de bloquer l'effet des séquences cis-régulatrices s'est avérée plus efficace suggérant une importance grandissante pour ce type de séquences dans le traitement cible de multiples pathologies. Les polynucléotides, les cassettes, les vecteurs et 14 les cellules transformées selon l'invention pourraient donc être aussi employé dans des stratégies de thérapie génique ou de transfert de gènes pour cibler par exemple des cellules malignes et délivrer des toxines ou des gènes médicaments. Une description détaillée des techniques utilisées pour réaliser l'invention peut être trouvée dans les ouvrages classiques de biologie moléculaire, comme par exemple Molecular cloning : a laboratory manual , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, par Sambrook, Fritsch et Maniatis ; Short protocols in molecular biology , Fourth edition, par Ausubel et al., Description des figures Figure 1 : Représentation schématique de l'élément D4Z4 du nucléotide 1 à 3303. La région codante putative de la protéine Dux4 est indiquée en gris, ainsi que les deux homéodomaines qu'elle contient. La position de la séquence d'ADN de 27 paires de bases (DBE) liant le complexe protéique YY1, HMGB2 et Nucléoline est indiquée (Gabellini D, Green MR, Tupler R. (2002). Cell. 110(3):339-48. WO/2005/037231). Figure 2 : Détail des constructions utilisées pour étudier l'effet de D4Z4 sur la protection contre l'effet de position. Les différents vecteurs contiennent un gène de résistance à l'hygromycine (HyTK) et un gène rapporteur eGFP placés sous le contrôle de promoteurs CMV. Les vecteurs portent ou non une graine de télomère (triangles) qui permet l'intégration des vecteurs linéarisés par clivage par des enzymes de restriction en position chromosomique terminale après transfection dans les cellules humaines C33A (adénocarcinome cervical) tandis que les autres constructions s'intégreront aléatoirement. Cette intégration est vérifiée par hybridation fluorescente in situ sur des préparations de chromosomes métaphasiques. Dans certaines constructions, l'ADN du phage lambda a été cloné entre le gène et le télomère (colonne de gauche) ou en aval du gène pour contrôler que l'effet dû à D4Z4 ne dépend pas de l'augmentation de la distance entre le gène rapporteur et les éléments régulateurs putatifs au site d'intégration dans la cellule hôte. Après transfection les cellules ayant intégré le transgène sont sélectionnées en présence d'hygromycine dans le milieu de culture et l'expression de l'eGFP est mesurée au cours du temps en cytométrie de flux. Figure 3 : L'expression du gène rapporteur eGFP est suivie par cytométrie de flux pendant plusieurs semaines dans les différentes populations de cellules. L'élément répété D4Z4 protège de la variégation par effet de position lorsque le gène rapporteur eGFP est intégré de façon aléatoire dans le génome humain (comparer les vecteurs GFPD4Z4 et pCMV) ou de l'effet de position télomérique (comparer les vecteurs GFP-D4Z4 15 Telo et pCMVTe1o). Cette insulation n'est pas dépendante de l'augmentation de la distance entre le gène rapporteur et les séquences télomérique de la cellule hôte (comparer GFPTelo et pCMVlambda). Figure 4 : L'élément D4Z4 a été comparé à l'insulateur de la beta-globine de poulet (5' HS4, séquence de 1.2 kilobases). L'expression du gène rapporteur eGFP a été mesurée au cours du temps par cytométrie de flux. Figure 5 : Les vecteurs permettant de tester l'activité insulatrice d'une séquence d'ADN sont représentés d'après la méthode de Chung JH, Whiteley M, Felsenfeld G. (1993). Cell. 74(3):505-14. Lorsque l'activateur (enhancer) est placé à proximité immédiate du gène de sélection à la Néomycine, les cellules K562 forment un certain nombre de colonies en présence de la drogue. Le nombre de colonies ainsi obtenues sert de standard pour mesurer l'activité insulatrice d'une séquence (vecteur pNI, valeur 1 de l'histogramme). Le nombre de colonies obtenues lorsque la séquence test est intégrée dans le vecteur est déterminé de la même manière et rapporté au nombre de clones pour le vecteur pNI. Les résultats obtenus pour l'insulateur de la beta-globine de poulet sont représentés (FII(5-4)) et comparés à un vecteur dans lequel 2,3 kb de l'ADN du phage lambda a été inséré entre le promoteur et l'activateur ( 3-4 ). Figure 6 : Test de l'activité de blocage des éléments cis-régulateur par D4Z4. Pour chaque construction, le nombre de clones obtenus est compté 3 semaines après transfection et croissance en présence de Néomycine. Ce nombre est rapporté à celui obtenu lorsque le vecteur contrôle est transfecté dans les cellules (pNI). Figure 7 : Test de l'activité d'un fragment de 65 pb. Une séquence de 65 paires de bases (position 441 à 505) au sein de la séquence D4Z4 de 3303 pb possède une partie des propriété insulatrice de D4Z4. Cette séquence de 65 paires de bases a été clonée entre le gène rapporteur eGFP et le télomère et l'expression du gène rapporteur a été mesurée au cours du temps par cytometrie de Flux. L'élément de 65 pb protège de la variégation par effet de position mais présente un effet plus faible que celui de l'élément de 3303 pb. Exemples Exemple 1 : Evaluation de la protection contre la variégation par effet de position Nous avons réalisé des constructions comportant une répétition D4Z4 clonée à proximité d'un gène rapporteur codant pour la protéine eGFP (Green Fluorescent Protein) comportant un gène de sélection pour les cellules humaines (Hygromycine) (Koering et al., 16 2002). Les constructions ont été transfectées dans différentes lignées de cellules humaines transformées (C33A, adenocarcinome cervical; TE671, Rhabdomyosarcome ; K562, leucémie erythrocytaire) et des myoblastes murin immortalisés, C2C12. Après transfection, les cellules sont cultivées en milieu sélectif (hygromycine) permettant seulement la croissance des cellules ayant intégré le transgène. L'intégration des différents transgènes a été vérifiée par des méthodes de cytogénétique (étalements métaphasiques et Fluorescence par hybridation in situ) et de biologie moléculaire classique (Southern blot) au niveau des populations cellulaires ou de clones isolés (figure 2). L'expression d'un gène rapporteur eGFP conduit à la production d'une protéine fluorescente dont le niveau d'expression peut être mesuré par cytométrie de flux à intervalles de temps régulier pendant plusieurs semaines (figure 3). Les cellules ayant intégré le transgène présentent un niveau d'expression moyen dépendant des contraintes répressives de la chromatine environnante et une variégation de l'expression au cours du temps. Cet effet répressif peut être levé lorsque les cellules sont traitées avec un inhibiteur de la desacetylation des histones (Trichostatine A), l'une des étape de l'hétérochromatinisation. En revanche, lorsque l'élément D4Z4 est présent au sein des séquences, il permet de maintenir l'expression du transgène à un niveau constant au cours du temps quel que soit l'environnement chromatinien (télomère et reste du génome). Ces premiers résultats démontrent donc un rôle insulateur de la séquence D4Z4 de 3303 paires de bases vis-à-vis du silencing par effet de position à proximité des régions hétérochromatiniennes ou télomériques. Egalement, un fragment de 1381 paires de bases correspondant à l'extrémité 5' de D4Z4 de la position 1 à 1381 protège l'expression d'un gène rapporteur du silencing par effet de position ou effet de position télomérique. Nous avons également isolé une courte séquence de 65 paires de bases (position 441 à 505 de D4Z4) et montré que cet élément protégeait l'expression du gène rapporteur du silencing (figure 7). A proximité d'un télomère, l'insulateur de la beta-globine de poulet intégré à une copie (GFP-5'HS4) ou deux copies (GFP-2x 5'HS4) ne protège de l'effet répresseur et ne permet pas de maintenir un niveau élevé du transgène au cours du temps (figure 4). Par contre, il protège de la variégation pas effet de position lorsqu'il est intégré de manière aléatoire (GFP-5'HS4) mais ne permet pas une expression élevée du transgène. Exemple 2 : Evaluation de la capacité à interférer avec les éléments cis-régulateurs Dans un deuxième temps, nous avons voulu savoir si D4Z4 possédait la seconde propriété caractéristique des éléments insulateurs, c'est-à-dire la capacité à interférer entre un promoteur et un activateur ou répresseur transcriptionnel, en réalisant une série de constructions différentes. 17 La méthode que nous avons utilisé à été employée pour la description de l'insulateur de la beta-globine de poulet (Chung JH, Whiteley M, Felsenfeld G. (1993). Cell. 74(3):505-14). Dans ce type de construction, l'élément à tester est intégré entre le promoteur contrôlant l'expression du gène de la résistance à la Néomycine et un activateur transcriptionnel. Les constructions contenant ou non l'élément sont ensuite transfectées dans des cellules humaines (lignée cellulaire de leucémie érythrocytaire, K562) et cultivées en présence de Néomycine. Environ 3 semaines après transfection, le nombre de clones s'étant développé en milieu sélectif sera directement proportionnel à l'activation du gène de résistance Néomycine. Ainsi, si la séquence d'ADN insérée dans le vecteur possède la capacité à interférer entre ce promoteur et l'activateur transcriptionnel, le nombre de colonies formées en milieu sélectif sera significativement diminué par rapport aux contrôles (figure 5). Nous avons employé cette méthode pour évaluer l'activité de D4Z4 comme (i) activateur transcriptionnel, (ii) répresseur, ou (iii) insulateur pouvant interférer entre un enhancer et un promoteur (figure 6). Nous avons montré que D4Z4 ne possède pas l'activité d'un répresseur ou d'un activateur lorsqu'il est placé à proximité d'un promoteur quelle que soit son orientation. Les constructions pNlblX-Ea; pNlblX-E permettent de tester l'effet activateur. Le nombre de clones obtenus est très faible par rapport au vecteur contrôle (pNI) qui sert de référence indiquant donc que D4Z4 n'agit pas comme activateur de la transcription dans ce contexte. La construction pNIX1X permet de tester l'effet de D4Z4 sur la répression de la transcription. Dans ce cas, le nombre de clones obtenus est similaire à celui du vecteur contrôle (valeur 1). En revanche, il est capable de bloquer l'interaction entre un enhancer et un promoteur lorsqu'il est intégré entre les deux quelle que soit son orientation (constructions pNlblXa et pNlblX). Le nombre de colonies est significativement plus faible avec cet élément (diminution de 91 et 71,5 fois respectivement par rapport au vecteur pNI). L'insulateur de la beta globine (FII(5-4)) est utilisé comme contrôle et montre une diminution de 3,45 fois du nombre de clones par rapport au vecteur contrôle (pNI). Lorsqu'un fragment d'ADN du bactériophage Lambda est intégré entre le promoteur contrôlant la Néomycine et l'élément enhancer, le nombre de clones se développant sur milieu sélectif est comparable au vecteur pNI. REVENDICATIONS 1. Polynucléotide possédant des propriétés insulatrices permettant de protéger l'expression d'un transgène des éléments en cis dans les cellules d'eucaryotes supérieurs caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polynucléotides suivants : - le polynucléotide de la SEQ ID NO.1, - le polynucléotide de la SEQ ID NO.2, - un fragment d'au moins 50 nucléotides du polynucléotide de la SEQ ID NO.1, de la SEQ ID NO.2 ou de la SEQ ID NO. 3. 2. Cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription : -un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, - un transgène, - une séquence terminatrice dans le même organisme hôte, caractérisée en ce qu'elle comprend en amont du promoteur et/ou en aval de la séquence terminatrice, au moins un polynucléotide possédant des propriétés insulatrices permettant de protéger l'expression du transgène des éléments en cis dans les cellules d'eucaryotes supérieurs choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotide selon la revendication 1, b) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 3, c) un polynucléotide présentant au moins 90% de similarité avec un polynucléotide selon la SEQ ID NO. 1, la SEQ ID NO. 2 ou la SEQ ID NO. 3. 3. Cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription : - une séquence activatrice de la transcription, - un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, - un transgène, - une séquence terminatrice dans le même organisme hôte, caractérisée en ce qu'elle comprend en amont de la séquence activatrice de la transcription et/ou en aval de la séquence terminatrice, au moins un polynucléotide possédant des propriétés insulatrices permettant de protéger l'expression du transgène des éléments en cis dans les cellules d'eucaryotes supérieurs choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotide selon la revendication 1, b) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 3, c) un polynucléotide présentant au moins 90% de similarité avec un polynucléotide selon la SEQ ID NO. 1, la SEQ ID NO. 2 ou la SEQ ID NO. 3.19 4. Cassette d'expression selon l'une des revendications 2-3 comprenant plusieurs copies en tandem du polynucléotide possédant des propriétés insulatrices. 5. Cassette d'expression selon la revendication 4 comprenant plusieurs copies en 5 tandem du polynucléotide de la SEQ ID NO. 2. 6. Vecteur comprenant un polynucléotide possédant des propriétés insulatrices selon la revendication 1 et/ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 2-5. 10 7. Cellule eucaryote transformée avec une cassette d'expression selon l'une des revendications 2-5 et/ou un vecteur selon la revendication 6. 8. Organisme hôte à l'exception de l'homme caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon l'une des revendications 2-5, un vecteur selon la revendication 15 6, et/ou une cellule selon la revendication 7. 9. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une cassette d'expression selon l'une des revendications 2-5, un vecteur-selon la revendication 6, et/ou une cellule selon la revendication 7. 10. Utilisation d'une cassette d'expression selon l'une des revendications 2-5, d'un vecteur selon la revendication 6, et/ou d'une cellule selon la revendication 7 pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les maladies génétiques, les cancers, les maladies inflammatoires, les maladies auto-immunes, les allergies. 25 11. Procédé in vitro pour isoler l'expression d'un transgène inséré dans le génome d'une cellule hôte d'eucaryote supérieur, de l'influence des éléments en cis adjacents au site d'insertion dans ledit génome caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on construit une cassette d'expression selon l'une des revendications 2-5 et/ou 30 un vecteur selon la revendication 6 comprenant ledit transgène, b) on transforme la cellule hôte d'eucaryote supérieur avec la cassette et/ou le vecteur obtenus à l'étape a), c) on insère le transgène dans le génome de ladite cellule hôte d'eucaryote supérieur, 35 d) on exprime le transgène. 12. Utilisation in vitro d'un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotide selon la revendication 1, 20 20 b) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 3, c) un polynucléotide présentant au moins 90% de similarité avec un polynucléotide selon la SEQ ID NO. 1, la SEQ ID NO. 2 ou la SEQ ID NO. 3, pour isoler l'expression d'un transgène intégré dans le génome d'une cellule hôte d'eucaryote supérieur de l'influence d'éléments en cis. 13. Utilisation selon la revendication 12 dans laquelle les éléments en cis sont des éléments régulateurs de la transcription tels que des activateurs ou des répresseurs. 14. Utilisation selon la revendication 12 dans laquelle les éléments en cis sont les contraintes topologiques des régions chromatiniennes environnantes. 15. Utilisation non thérapeutique d'un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucléotide selon la revendication 1, b) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 3, c) un polynucléotide présentant au moins 90% de similarité avec un polynucléotide selon la SEQ ID NO. 1, la SEQ ID NO. 2 ou la SEQ ID NO. 3, pour la transgénèse, ou la production de protéines recombinantes à l'exclusion de 20 l'homme.