FR 2916000 A1 20081114 FR 0703279 A 20070507 Moyens pour réduire l'accumulation d'acétoïne dans des milieux de fermentation alcoolique L'invention a pour objet des levures et procédés de fermentation utilisant ces levures, pour réduire l'accumulation d'acétoïne dans des milieux de fermentation alcoolique. Depuis une quinzaine d'années, les connaissances scientifiques et savoir-faire en viticulture et en oenologie ont conduit à une amélioration très significative des qualités organoleptiques des vins. Les pratiques viticoles actuelles favorisent la production de vins à potentiel qualitatif élevé en retardant le moment de la vendange. Il en résulte, comme conséquence majeure, une augmentation de la teneur en sucre des moûts, et donc de la teneur en alcool des vins (fréquemment supérieure à 14 ). Cette dérive, rencontrée dans la. plupart des zones de production, pose ouvertement de nombreux problèmes à la filière viticole mondiale. Des teneurs en alcool excessives sont en effet difficilement compatibles avec les préoccupations de santé et de bien- être des consommateurs, et font par ailleurs l'objet de taxes dans certains pays. Il existe de ce fait une demande croissante pour des méthodes et outils permettant de réduire la teneur en alcool des vins et d'autres boissons alcoolisées. Les approches physiques (par exemple distillation sous vide) sont de plus en plus utilisées, mais sont difficilement compatibles avec le maintien d'une qualité organoleptique satisfaisante. Une solution biologique reposerait sur l'utilisation de souches de levures à faible rendement en alcool. Par exemple, les levures Saccharomyces cerevisiae, notamment les levures Saccharomyces cerevisiae oenologiques, transforment les sucres en alcool avec un rendement de 0,47 g/g, qui varie peu suivant la souche utilisée. De ce fait, l'obtention d'une levure Saccharomyces cerevisiae à faible rendement en alcool nécessite la mise en oeuvre de stratégies génétiques visant à dévier une partie des sucres vers la formation d'autres sous-produits. Plusieurs approches d'ingénierie génétique ont été mises en oeuvre pour dévier une partie des sucres vers la production d'autres sous-produits que l'éthanol. Ces approches ont été basées sur la modification de l'activité d'enzymes impliquées dans la synthèse de glycérol ou dans l'utilisation du pyruvate. Par exemple, la surproduction de glycérol, obtenue par surexpression de GPD1 ou GPD2 codant pour la glycérol 3-phosphate déshydrogénase (Michnick et al, 1997 ; Remize et al, 1999 ; demande de brevet internationale WO 96/41888) a ainsi permis de diminuer la teneur en éthanol de 1 à 2 . Elle s'accompagne toutefois de modifications majeures du niveau de production d'autres métabolites, dont certains indésirables dans le vin, notamment l'acétate et l'acétoïne (3-hydroxy-2-butanone). La production d'acétate peut être réduite par délétion de ALD6 codant pour une acétaldéhyde déshydrogénase. Par contre, aucune stratégie n'a été pour l'instant décrite permettant de réduire l'accumulation d'acétoïne. Ce composé est accumulé à raison de plusieurs grammes par litre, alors qu'il est défavorable, par exemple dans le vin, à plus de 150 mg/L (seuil de détection olfactif). La solution proposée par les inventeurs consiste à convertir l'acétoïne produit en 2,3-butanediol, composé considéré comme neutre d'un point de vue organoleptique, son seuil de détection dans le vin étant supérieur à 12 g/L. La production de 2,3-butanediol à partir de l'acetoïne est réalisée par l'enzyme butanediol déshydrogénase (Bdhlp) codée par BDH1. La voie de production de 2,3-butanediol contribue à l'équilibre redox NAD+/NADH intracellulaire. Chez les bactéries, cette voie peut également intervenir dans la régulation du pH intracellulaire. Le 2,3-butanediol est produit sous plusieurs formes (2R,3R)-2,3-butanediol et (2S,3S)-2,3-butanediol, deux formes 5 optiquement actives, (2R,3S)-2,3-butanediol et (2S,3R)-2,3-butanediol, correspondant aux formes méso. La butanediol déshydrogénase codée par BDH1 est la principale enzyme impliquée dans la production de 2,3- butanediol. Elle est responsable de la formation de la 10 totalité du (2R,3R)-2,3-butanediol et d'une partie du (méso)2,3-butanediol, à partir de R-acétoïne et S-acétoïne, respectivement. Bdhlp ayant d'autre part une plus forte affinité pour l'acétoïne (Kmacétoïne : 4,5 mM, Km2,3-butanediol : 14 mM), la réaction est fortement déplacée dans 15 le sens de la formation de 2,3-butanediol. Dans l'approche suivie, les inventeurs ont considéré que le niveau de synthèse de la 2,3-butanediol déshydrogénase est un facteur limitant la réaction de conversion de l'acétoïne en 2,3-butanediol. Ils ont également retenu le fait qu'une 20 moindre disponibilité en NADH pourrait empêcher une conversion plus efficace de l'acétoïne. Une stratégie de surexpression de BDH1 et de mutagenèse dirigée de BDH1 a été alors mise en oeuvre pour changer sa spécificité de cofacteur de NADH à NADPH. 25 Leurs travaux ont ainsi permis de transformer des souches de Saccharomyces et de les rendre capables de convertir efficacement de l'acétoïne en 2,3-butanediol au cours d'une fermentation alcoolique, même lorsque l'acétoïne est produit e:ri quantités importantes (plusieurs g/1). 30 L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles souches de levures génétiquement transformées pour surexprimer BDH1 et présentant une spécificité modifiée de cofacteur, afin de produire de plus grandes quantités de 2,3-butanediol à partir d'acétoïne. L'invention vise également à fournir un procédé d'obtention de telles souches. Elle a également pour but la mise à profit des propriétés de ces souches de levures transformées dans un procédé de fermentation alcoolique ainsi que pour la production de 2,3-butanediol. Les souches de levure de l'invention sont des levures surexprimant le gène BDH1 codant pour Bdhlp. Ces souches sont caractérisées en ce qu'elles sont génétiquement transformées et/ou mutées de manière à obtenir un taux de conversion d'acétoïne en 2,3-butanediol d'au moins 2 fois supérieur à celui de la souche initiale. Par souche initiale , on entend une souche avant surexpression ou modification du gène BDH1. L'invention vise plus particulièrement des souches de levures telles que définies ci-dessus, génétiquement transformées pour surexprimer BDH1 à l'aide de séquences régulatrices propres à augmenter l'expression dudit gène. On peut utiliser tout promoteur actif chez l'hôte dans lequel on souhaite obtenir l'expression de ce gène, de préférence des promoteurs décrits comme forts (codant pour des gènes fortement exprimés) dans les conditions d'intérêt. C'est le cas par exemple de gènes glycolytiques fortement exprimés en fermentation comme ADH1 (alcool déshydrogénase), PGK1 (phosphoglycérate kinase), TDH3 (glycéraldéhyde déshydrogénase), ou du facteur de transcription TEF1, mais il en existe de nombreux autres. L'invention vise également des souches comprenant une ou plusieurs mutations dans Bdhlp afin de présenter une affinité 30 accrue pour le cofacteur NADPH au lieu du NADH. Le choix des acides aminés à modifier repose sur le fait que le NAD (H) diffère du NADP(H) dans le groupement phosphate estérifié à la position 2' du ribose d'adénosine. De ce fait, 35 les acides aminés interagissant avec ce groupement sont des candidats pour le changement de spécificité de cofacteur. Le résidu déterminant de la spécificité de NAD(H) est l'aspartate (Asp) ou le glutamate (Glu), qui forment des liaisons hydrogène avec les groupements hydroxyle 2' et 3' dans la partie ribosyle du coenzyme. Les déshydrogénases NADP(H)-dépendantes ont un résidu plus petit et neutre tel que la glycine (Gly), l'alanine (Ala) et la serine (Ser), à la même position. De plus, un résidu d'arginine (Arg) adjacent permet une bonne interaction avec le groupement phosphate de NADP(H). Ainsi, des remplacements avantageux conformément à l'invention concernent le résidu Glu(E)221 par Ser(S), le résidu Ile (I) 222 par Arg (R) et le résidu Ala(A)223 par Ser, en se basant sur la structure de l'enzyme NADPH-dépendante Adh6p de S. cerevisiae (les positions sont notées selon la séquence en acides aminés de Bdhlp de Saccharomyces cerevisiae S288C) . La (les) modification(s) de Glu (Asp) 221 et/ou Ile(val)222, et/ou Ala223 et toute combinaison possible de ces 3 modifications entrent également dans le champ de l'invention. Le premier résidu peut être également une sérine (comme dans l'exemple), ou tout acide aminé petit et neutre comme Gly ou Ala. L'invention vise aussi des souches telles que définies ci-dessus génétiquement modifiées pour surexprimer BDH1 à l'aide d'un promoteur fort de levures et comprenant une ou plusieurs mutations dans BDH1 afin de présenter une spécificité de cofacteur pour le NADPH. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, les souches de levure qui produisent de l'acétoïne sont des souches surproductrices de glycérol. Il s'agit notamment de souches contenant le gène GPD1 ou le gène GPD2 surexprimé, par exemple obtenu par transformation des souches par le plasmide pVT100U-ZEO-URA3-GPD1 ou par changement in situ de son promoteur par un promoteur fort. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les souches de levure sont génétiquement modifiées de manière à réduire la production d'acétate (en plus de la surexpression de GPD1). Plus particulièrement, il s'agit de souches dans lesquelles le gène ALD6 et le cas échéant ses copies, a (ont) été délété (es) . Des souches préférées appartiennent au genre Saccharomyces et: comprennent, notamment, les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces uvarum et Saccharomyces kudriavzevii. D'autres souches préférées appartiennent au genre non Saccharomyces. L'invention vise également les hybrides des souches définies ci-dessus. L'invention vise également un procédé d'obtention des souches de levures ci-dessus mentionnées. Ce procédé met avantageusement à profit les techniques du génie génétique et de mutagénèse dirigée. On mentionnera à titre d'exemple l'utilisation d'un oligonucléotide comportant les mutations cibles souhaitées pour modifier le gène BDH1 d'une souche de levure, et la transformation de la souche avec un fragment amplifié, l'amplification d'une région du gène comportant les mutations, ou encore le croisement entre souches, en partant d'une souches comportant par exemple les mutations désirées pour les transférer dans une autre. L'invention a également pour objet un procédé de fermentation, caractérisé par l'addition d'une souche de levure transformée telle que définie ci-dessus au milieu de fermentation. Le milieu de fermentation est notamment un moût, avantageusement un jus de raisin. Selon un aspect de grand intérêt, le 2,3-butanediol obtenu en utilisant les souches de levure de l'invention constitue un composé important pour une variété de matières de base chimiques et carburants liquides. Ce composé peut conduire par déshydratation la formation de méthyléthyl cétone, utilisable en tant qu'additif de carburant liquide. Le 2,3-butanediol peut également être converti en 1,3-butanediène, composé utilisé dans la production de gomme synthétique. D'autres dérivés, pour des utilisations, par exemple, comme agents antigel (forme lévo), solvants et plastiques, peuvent aussi être préparés à partir de 2,3-butanediol. En plus, il peut être ajouté à des produits alimentaires en tant qu'arôme après conversion en diacétyle par déshydrogénation. L'estérification de butanediol amène vers la formation de précurseurs de polyuréthane pour utilisation dans des médicaments, produits cosmétiques et lotions etc. L'utilisation des souches de levure pour produire du 2,3-butanediol notamment dans les applications mentionnées ci-20 dessus entre aussi dans le champ de l'invention. En particulier, l'invention fournit des moyens pour obtenir un rendement et une productivité plus importants en 2,3-butanediol de manière générale, mais également pour obtenir des stéréoisomères purs, en quantités importantes au 25 lieu d'un mélange d'isomères. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent de modes de réalisation. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 4 qui représentent, respectivement : 30 - Fig. 1 : l'effet de la surexpression de BDH1 sur la production d'acétoïne par la souche V5a1d6 BDH1 pGPD1 pour des concentrations en glycérol variables ; - Fig. 2 : la production d'acétoïne (a et a') et de 2,3-butanediol (b et b') au cours de la fermentation pour les souches V5 et V5ald6 pGPD1 et V5a1d6 BDH1 pGPD1 dans conditions (i) : a, b et (ii) . a', b' ; Fig. 3 : l'alignement de séquences de BDH1 (en gras) et BDH1223. En gris : le changement des 3 résidus acides 5 aminés E221S/V222R/A223S induisant une réversion de la spécificité du cofacteur chez Bdhlp ; Fig. 4 : la formation d'acétoïne dans les souches V5a1d6 BDH1 pGPD1 (noir) et V5a1d6 BDH1223 pGPD1 (blanc) au cours d'une fermentation. 10 - Fig. 5 : la formation finale d'acétoïne dans les souches CEN.PKald6 pGPD1 (blanc), CEN.PKa1d6 BDH1 pGPD1 (gris) et CEN.PKa1d6 BDH1223 pGPD1 (noir) à l'issue de plusieurs fermentations. 15 • Obtention de souches Saccharomyces cerevisiae surexprimant BDH1 Le promoteur de BDH1 a été remplacé par le promoteur de TDH3 in situ, en utilisant la technique de Short Flanking Homologous (SFH) PCR (Polymerase Chain Reaction) (Guldener et 20 al . , 1996). Un fragment constitué du module kanMX, qui porte le gène ka.nR conférant la résistance à l'antibiotique G418R, et du promoteur TDH3 a été amplifié par PCR à partir du plasmide bactérien pUG6-NOXE (Heux et al., 2005) à l'aide des 25 oligonucléotides de séquences, respectivement, SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2, portant une séquence homologue à pUG6-NOXE et une séquence flanquante (en italique) homologue à la région cible chromosomique (promoteur BDH1). 30 SEQ ID N 1 : 5' CTTTCCTCCT TACGGGGTCC TAGCCTGTTT CTCTTGATAT GCAGGTCGAC AACCCTTAAT 3' SEQ ID N 2 : 5' AGTGAATATC ACCCTTCTTG AAATATGCCA AAGCTCTCAT TCGAAACTAA GTTCTTGGTGT 3' Conditions expérimentales utilisées pour la PCR: Oligonucléotide SEQ ID N 1 5 l (20 pmoles) Oligonucléotide SEQ ID N 2 5 l (20 pmoles) DyNazyme EXT Buffer 10X + 15 mM MgC12 5111 (:EINNZYMES, Finlande) dNTP 2 mM 5 l pUG6-NOXE 1111 (25 ng) H2O 28,25 l DyNazyme EXT 0,75111 (FINNZYMES, Finlande) 30 cycles (45 sec 94 C, 30 sec 55 C, 2 min 72 C) sur un amplificateur Perkin-Elmer Cetus modèle 9600. Le produit de PCR obtenu a été précipité à l'éthanol en présence de sels. 3 g de l'ADN précipité ont été utilisés pour transformer les souches de levure S. cerevisiae V5 et V5a1d6. La souche V5 (MATa, ura3) est dérivée d'une souche œnologique. La souche V5 et la souche V5a1d6 (Remize et al., 1999) dans laquelle les deux copies du gène ALD6 ont été délétées ont été transformées par la méthode d'acétate de lithium (Schiestl et Gietz, 1989). Les transformants ont été sélectionnés sur boîtes YPD G418R. L'intégration du promoteur TDH3 à la place du promoteur BDH1 a été vérifiée par PCR. Résultats Les résultats obtenus montrent que la souche V5 BDH1 a la même croissance et vitesse de fermentation que la souche témoin V5. La mesure de l'activité BDH au cours de la phase exponentielle et: de la phase stationnaire montre que l'activité enzymatique BDH de la souche surexprimant BDH1 est supérieure d'environ 30 fois à celle de la souche sauvage (activité spécifique moyenne V5 : 0,1 U/mg protéine totale ; activité spécifique moyenne V5 BDH1 : 3,2 U/mg protéine totale). • Effet de la surexpression de BDHI dans des souches surexprimant GPD1 Les souches V5, V5ald6, V5 BDH1 et V5ald6 BDH1 ont été transformées par 10 ng du vecteur multicopie pVT100U-ZEO-GPD1 (Remize et al, 1999) portant le gène URA3. Les transformants ont été sélectionnés sur boîtes YNB supplémentées en méthionine (115 mg/L). Après vérification par PCR, quatre souches : V5 pGPD1, V5ald6 pGPDI, V5 BDH1 pGPDI et V5ald6 BDH1 pGPD1 ont été obtenues.. • Effet de la surproduction de Bdhlp sur la synthèse d'acétoïne Conditions de culture - Les souches étudiées pendant la fermentation en conditions oenologiques sont indiquées dans le tableau 1 ci-après. Tableau 1. Souche Caractéristiques V5 Souche S. cerevisiae dérivée d'une levure oenologique MATa, ura3 Vii BDH1 Souche V5 surexprimant BDH1 V5 pGPD1 Souche V5 surexprimant GPD1 V5 BDHI pGPD1 Souche V5 surexprimant BDH1 et GPD1 V5ald6 pGPDI Souche V5 délétée pour ALD6 et surexprimant GPD1 V5ald6 BDH1 pGPD1 Souche V5 délétée pour ALD6, surexprimant GPD1 et BDH1 Les fermentations ont été réalisées dans des réacteurs de 1,2 litres (SGI, France) avec un volume réactionnel de 1 litre. Le milieu MS a été utilisé pour la préculture et la culture. Il s'agit d'un milieu synthétique qui simule un moût standard de raisin (Bely et al., 1990). Le milieu MS contient 2096 glucose, 6 g/1 d'acide malique, 6 g/1 d'acide citrique, 460 mg/1 d'azote, sous forme de NH4C1 (120 mg/1) et d'acides aminés (340 mg/1). Le milieu est supplémenté avec de la méthionine (115 mg/1) et si nécessaire de l'uracile (50 mg/1). Le pH du milieu MS est de 3,3. Des facteurs d'anaérobiose, ergostérol (7,5 mg/1), acide oléique (2,5 mg/1) et Tween 80 (0,21 g/1) sont ajoutés. Les précultures ont été réalisées dans des erlenmeyers de 100 ml contenant 20 ml de milieu à 28 C sous agitation (150 rpm) pendant 30h. Les réacteurs ont été inoculés à partir de ces précultures, à une densité cellulaire de 1.106 cellules/ml, et maintenus à température constante de 28 C avec agitation permanente (300 rpm). Les échantillons de culture ont été collectés à l'aide d'une seringue. Les données de fermentation sont exprimées en fonction du temps. Méthodes analytiques - La croissance a été suivie par la mesure de la densité optique à 600 nm et par le comptage du nombre de cellules sur un appareil de type Coulter Counter (ZBI) à partir d'une fraction aliquote de milieu de culture. Les métabolites ont été dosés dans le surnageant, après centrifugation à 13000 rpm pendant 5 minutes des prélèvements réalisés. Les concentrations en glucose, glycérol, éthanol, pyruvate, succinate, acétate, a-cétoglutarate et 2- hydroxyglutarate ont été déterminées par chromatographie liquide sous haute pression (HPLC) en utilisant une colonne de type HPX-87H (Bio-Rad). La concentration en acétaldéhyde a été déterminée par la méthode enzymatique décrite par Lundquist, (1974). Les concentrations en acétoïne et en 2,3-butanediol ont été déterminées par chromatographie en phase gazeuse comme décrit par Michnick et al., 1997. La figure 1 montre l'impact de la surexpression de BDH1 sur la production d'acétoïne. Dans cet exemple, la production de ce composé a été analysée au cours de la fermentation par V5ald6 pGPD1 et V5a1d6 BDH1 pGPD1. Deux conditions différentes de surproduction de glycérol ont été utilisées. En conditions (:L) aucune pression de sélection n'a été utilisée pour maintenir le plasmide pVT100U-ZEO-GPD1, résultant en une surproduction modérée de glycérol, atteignant 10-15 g/L. En conditions (ii), les souches V5 BDH1 pGPD1 et V5a1d6 BDH1 pGPD1 ont été cultivées en l'absence d'uracile, permettant le maintien du plasmide tout au long de la fermentation, générant une surproduction très élevée de glycérol, 20-30 g/L. Dans les deux conditions testées (i) et (ii) la surexpression de BDH1 permet une diminution drastique de la production d'acétoïne jusqu'à 90 % par rapport au niveau produit par la souche témoin V5a1d6 pGPD1, et une augmentation correspondante de la production de 2,3-butanediol (Fig. 2). La souche V5 a été utilisée comme contrôle. Cette souche n'accumule pas d'acétoïne et produit environ 0,5 g/L de 2,3-butanediol. La figure 2 montre les niveaux d'acétoïne obtenus après plusieurs expériences de fermentation avec les souches V5a1d6 pGPDÎ et V5a1d6 BDH1 pGPD1, dans les même conditions que ci dessus. Mutagénèse dirigée in vitro de BDH1 En partant de la séquence protéique codée par le gène BDH1 de la souche S288C [Saccharomyces genome database ht:tp://www.yeastgenome.org/], des mutations correspondant au changement d'un acide aminé ont été introduites à chaque étape de PCR. Grâce aux oligonucléotides comprenant les mutations souhaitées et un plasmide contenant le BDH1 natif de S288C (pYES2-BDH1), les enzymes mutées suivantes ont été construites . Enzyme sauvage : BDH1 de S288C 221 EIAERR 226 Simple mutant : E221S 221 SIAERR 226 Double mutant : E221S/I222R 221 SRAERR 226 Triple mutant : E221S/I222R/A223S 221 SRSERR 226 - Mutagénèse dirigée Les mutations ont été introduites en utilisant une méthode basée sur le Quickchange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, USA). Le mutant E221S a été construit à partir de la région codante de BDH1 de la souche de laboratoire S288C clonée dans le plasmide pYES2 (Invitrogen, Carlsbad,CA) . pYES2-BDH1 (Gonzalez E, 2000). Ce vecteur navette contient un promoteur inductible (promoteur et séquence UAS de GAL1), l'origine de réplication 2 , le marqueur de sélection URA3 et les éléments bactériens (origine de réplication et gène de résistance à l'ampicilline). Le plasmide pYES2-BDH1 contenant les mutations E221S, E221S/I222R et E221S/I222R/A223S a été utilisé comme matrice pour obtenir le simple, le double et triple mutant, respectivement. La mutagenèse a été effectuée par PCR en utilisant des o:ligonucléotides contenant les mutations (en gras) et dans le sens direct et dans le sens inverse (E221S : MUT 221-1 (SEQ ID N 3), MUT 221-2 (SEQ ID N 4) ; E221S/I222R : MUT 222-1 (SEQ ID N 5), MUT 222-2 (SEQ ID N 6) ; E221S/I222R/A223S : MUT 223-1 (SEQ ID N 7), MUT 2232 (SEQ ID N 8)). SEQ ID N 3 (MUT223221-1.) `_ GGGCTAGTAAAATTGTAGTGTCTTCAATTGCAGAGAGAAGAATAGAAATGG 3', SEQ ID N 4 (MUT223221-2) 5' CCATTTCTATTCTTCTCTCTGCAATTGAAGACACTACAATTTTACTAGCCCC 3' SEQ ID N 5 (MUT224222-1) 5' GGGGCTAGTAAAATTGTAGTGTCTTCAAGAGCAGAGAGAAGAATAGAAATGG 3' 25 SEQ ID N 6 (MUT224222-2) Vii' CCATTTCTATTCTTCTCTCTGCTCTTGAAGACACTACAATTTTACTAGCCCC 3' SEQ ID N 7 (MUT225223-1) 5' GGGGCTAGTAAAATTGTAGTGTCTTCAAGATCAGAGAGAAGAATAGAAATGG 3' SEQ ID N 8 (MUT225223-2) 30 5' CCATTTCTATTCTTCTCTCTGATCTTGAAGACACTACAATTTTACTAGCCCC 3' Des cellules d'Escherichia coli (XL-10 Gold ultracompétentes, Stratagène, La Jolla, CA) ont été transformées successivement par les plasmides construits. Les transformants ont été cultivés à 37 C dans 5 ml de milieu LB supplémenté avec 50 g/ml d'ampicilline et l'ADN plasmidique de ces clones a été extrait par le kit Genelute Plasmid M:i.n.iprep (Sigma, USA) et analysé par séquençage. - Transformation La souche de laboratoire FY834 bdhla (MATa his3A200 ura3-52 1eu241 lys2A trplo) a été transformée par pYES2-BDH1, pYES2-MUT 221, pYES2-MUT 222, pYES2-MUT 223. La méthode de transformation utilisée est celle de l'acétate de lithium décrite par Schiestl et Gietz (1989). Le milieu sélectif utilisé pour sélectionner les souches transformées par les plasmides est du YNB (0,67% Yeast nitrogen base, 2% glucose) supplémenté en histidine, leucine, lysine et tryptophane. L'absence d'uracile permet de conserver une pression de sélection pour les plasmides. - Conditions de culture ml de milieu YNB (20 % galactose) ont été inoculés par 5 transformants, respectivement. La culture a été réalisée à 28 C pendant 2 jours. - Dosage d'activité enzymatique 20 L'activité butanediol déshydrogénase a été déterminée à partir des extraits protéiques bruts à 25 C en mesurant le changement d'absorbance à 340 nm. Une unité d'activité correspond à 1 mol de cofacteur utilisé par min, basé sur un coefficient d'absorption de 6220 cm-1 M-1 à 340 nm pour NADH et NADPH. Les trajets optiques pour les réactions de réduction étaient 1 cm, 0,5 cm et 0,2 cm. Les dosages d'activité enzymatique ont été réalisés en présence de 50 mM d'acétoïne dans 33 mM NaH2PO4, pH 7,0/NaOH. Les paramètres cinétiques ont été obtenus par des dosages d'activité avec des concentrations en coenzyme de 1/3xKm à 10xKm de BDH pour NADH (0,055 mM). L'activité BDH a été déterminée sur des extraits bruts de la souche exprimant la forme sauvage (pYES2-BDH1) et des souches exprimant les formes mutées. Les paramètres cinétiques des différentes formes ont également été déterminés (Tableau 2) . Les trois mutants présentent une affinité pour le NADH très fortement réduite, de 90 % en moyenne par rapport à celle de 5 l'enzyme native. Tableau 2 NADH AS (pmol/min.mg) Kma (mM) BDH 4,9 0,8 0,04 0,00 BDH221 0,5 0,1 ND BDH222 0,7 0,2 ND BDH223 0,3 0,2 ND NADPH AS (pmol/min.mg) Kma (mM) BDH Non détecté - BDH221 1,0 0,1 0,12 0,02 BDH222 4,6 0,1 0,24 0,14 BDH223 5,6 0,7 0,15 0,01 ND : Non déterminé 10 Une réversion importante de la spécificité de cofacteur de NADH à NADPH est observée pour tous les mutants (Tableau 2). En effet, les mutants présentent tous une activité NADPH dépendante. La constante d'affinité apparente (Kma) pour le NADPH est du même ordre pour les trois mutants. 15 L'ensemble des données montre que les mutations réalisées diminuent très fortement l'activité NADH-dépendante de l'enzyme et introduisent une affinité pour le NADPH. Les trois mutants présentent une affinité proche pour le NADPH. En revanche, les formes double et triple mutantes sont 20 particulièrement intéressantes en raison de leur meilleure activité spécifique comparativement au simple mutant. Afin d'évaluer l'impact du changement de cofacteur de la BDH dans la souche modèle oenologique V5a1d6, le gène BDHI 25 portant la triple mutation, appelé BDH1223, a été surexprimé dans cette souche par mutagénèse dirigée in situ. Deux oligonucléotides, dont l'un de 55 paires de bases (SEQ ID N 9) contenant les mutations cibles, ont été synthétisés et utilisés pour amplifier la région loxpKanMXloxp-TDH3p-BDH1 d'une souche V5a1d6 BDH1. Le fragment amplifié, contenant le marqueur KanMX et, sous contrôle du promoteur TDH3, le gène BDH1 jusqu'à la région contenant les 3 mutations, a été utilisé pour transformer une souche V5a1d6. Cette stratégie a permis en une étape d'intégrer par recombinaison homologue les mutations cibles dans la séquence génomique de Bdhlp tout en surexprimant le gène muté. SEQ ID N l 5' CTTTCCTCCT TACGGGGTCC TAGCCTGTTT CTCTTGATAT GCAGGTCGAC AACCCTTAAT SEQ ID N 9 5' GGCCATTTCTATTCTTCTCTCTGATCTTGAAGACACTACAATTTTACTGGCCCCC Conditions expérimentales utilisées pour la PCR : Oligonucléotide (1) 5 l (20 pmoles) Oligonucléotide (2) 5 l (20 pmoles) Ta.q Buffer 10X + 15 mM MgCl2 5 l dNTP 2,5 mM 4 l ADN total V5a1d6 BDH1 2 l (50 ng/ l) 28,25 l 0,75 l 30 cycles (10 cycles : 20 sec 94 C, 20 sec 60 C, 3 min 72 C ; 20 cycles : 15 sec 94 C, 30 sec 60 C, 2 min + 20s/cycle 72 C). 30 Le produit de PCR obtenu a été précipité à l'éthanol en présence de sels. 4 g de l'ADN précipité ont été utilisés pour transformer les souches de levure S. cerevisiae V5a1d6. L'intégration a été vérifiée par digestion enzymatique du produit de PCR pendant 2 heures à 37 C par l'enzyme Bbs I en 35 utilisant le mélange réactionnel suivant: 13,5 gl produit de PCR; 1,5 l tampon NEB2 10X (Biolabs, USA) 0,25 gl (1,25 U) de Bbs I(Biolabs, USA). H2O Ta.q L'activité enzymatique a été ensuite été déterminée sur l'extrait brut protéique d'une souche ayant intégré les mutations souhaitées. Pour chaque dosage, 20 l d'extrait brut ont été utilisés en présence de 0,2 mM de NADH/NADPH et 50 mM d'acétoïne. En parallèle, la région modifiée a été séquencée, ce qui a permis de vérifier que la séquence de BDH1 mutée est identique à celle du gène natif, à l'exception des mutations introduites, qui conduisent au changement de 3 acides aminés dans la protéine (Fig.3). Impact physiologique du changement de spécificité du cofacteur de Bdhl La souche V5a1d6 BDH1 pGPD1, surexprimant la Bdhl sauvage, a été comparée avec le clone ayant la Bdhl NADPH-dépendante (V5a1d6 BDH1223 pGPD1) en fermentation oenologique sur moût synthétique à 200 g/1 de glucose. Ces 2 souches ont été étudiées en fermentation en absence d'uracile (pression de sélection). Dans ces conditions les profils de vitesse de fermentation et de biomasse sont identiques. Aucun effet significatif n'est observé sur les sous-produits fermentaires sauf une augmentation de la formation en a-cétoglutarate (de 480 mg/L à 620 mg/L), en OH-glutarate (de 1400 mg/L à 1620 mg/L) et en glycérol (de 30,2 g/L à 32,2 g/L) dans la souche surexprimant l Ceci montre clairement un effet physiologique lié au changement de spécificité de cofacteur de Bdhl à des fortes concentrations en glycérol. Non seulement la quantité d'enzyme Bdhl mais également la disponibilité en NADH est limitante dans des souches surproductrices de glycérol. L'invention fournit ainsi des souches de levures sauvages et mutées, surproduisant la 2,3-butanediol déshydrogénase y compris des souches surproductrices de glycérol avec production d'acétate maîtrisée, accumulant du 2,3-butanediol en quantité importante et avec une production considérablement réduite d'acétoïne. Comme le montrent les exemples ci-dessus, la surexpression de BDH1 via un remplacement in situ de son promoteur par celui de TDH3 s'avère très efficace, puisqu'une augmentation d'activité d'un facteur 30 a été obtenue. L'analyse de ces souches au cours de la fermentation oenologique montre par ailleurs que le niveau d'expression de BDH1 et d'activité enzymatique de BDH est bien un facteur limitant dans la conversion d'acétoïne en 2,3-butanediol dans des souches surproduisant du glycérol. Ces résultats montrent que la conversion d'acetoïne en 2,3-butanediol est également limitée par la disponibilité en NADH. En effet, la surexpression d'une forme mutée de la BDH NADPH-dépendante engendre une diminution supplémentaire en acétoïne par rapport à une souche surexprimant l'enzyme sauvage. Ainsi, la stratégie suivie selon l'invention de surexpression de BDH1 et de changement de spécificité de cofacteur de la BDH de NADH en NADPH permet une conversion extrêmement efficace de l'acétoïne en 2,3-butanediol. La stratégie de surexpression de BDH1223 peut être envisagée pour réduire l'acétoïne dans toute souche de levure modifiée ou non modifiée qui accumule ce composé, comme les souches surproductrices de glycérol. Un autre exemple est une souche surexprimant une NADH oxydase bactérienne. Il a en effet été montré que la surexpression du gène NOXE codant pour la NADH oxydase de Lactococcus lactis dans la souche V5 diminue la teneur intracellulaire en NADH, ce qui entraîne une baisse du rendement d'éthanol du fait de la limitation de l'activité alcool déshydrogénase. Chez cette souche, les carbones non dirigés vers la formation d'éthanol s'accumulent au niveau du noeud acétaldéhyde, en particulier l'acétoïne (Heux et al, 2006). L'expression d'une forme mutée de la BDH utilisant du NADPH en tant que cofacteur, en favorisant la conversion de l'acétoïne en 2,3-butanediol, pourrait diminuer la production de ce composé. Les autres mutants décrits plus haut, qui présentent une affinité augmentée vis à vis du NADPH, en particulier le double mutant qui a les mêmes caractéristiques que le triple mutant, peuvent également s'avérer intéressants pour réduire l'acétoïne dans des conditions physiologiques. L'expression d'une Bdhlp NADPH dépendante dans la levure permet de modifier l'équilibre des cofacteurs NADP/NADPH et, à ce titre, peut constituer un outil intéressant dans l'étude de l'équilibre d'oxydoréduction intracellulaire. BDH1 chez la levure : homologies de séquence inter- et 10 intra-espèce. Le changement de spécificité de la BDH a été conduit dans les souches S288C et V5 alors que le site de liaison du cofacteur diffère d'un acide aminé entre ces 2 souches. La souche V5 a en effet une valine à la position 222 alors que 15 S288C a une isoleucine à la même position. Dans chacune de ses souches, l'introduction des mutations E221S, E221S/I(V)222R et E221S/I222R/A223S s'est avérée efficace et a permis d'obtenir un changement complet de spécificité de cofacteur de NADH en NADPH. 20 La conservation de ce site a été analysée dans d'autres souches de Saccharomyces cerevisiae dont le génome a été séquencé http://www.sanger.ac.uk/gbrowse/gbrowse/Saccharomyces/). L'étude montre que les 12 souches analysées se divisent en 2 25 groupes, l'un (DBVPG1373, DBVPG1853, DBVPG6765, L_1374, L_1528 et: SKI) caractérisé pair la séquence 221 EVA 223 (séquence type V5), l'autre (DBVPG6044, S288C, Y55, YGPM, YPS128 et YPS606) par la séquence 221 EIA 223 (séquence type S288C). Ces observations indiquent que les effets de la mutagénèse dirigée 30 décrits précédemment peuvent s'étendre aux autres souches de S. cerevisiae. De la même manière, les homologies de séquence de Bdhlp (S288C) avec d'autres espèces de levure (http://cbi.labri.fr/Genolevures/path/) ont été recherchées. 5 gènes orthologues de BDH1 ont été trouvés chez Candida glabrata, Kluyveromyces lactis et Debaryomyces hansenii. L'alignement des séquences protéiques montre une très forte conservation du site de liaison au NADH, les acides aminés 221 et 223 étant identiques à ceux de S. cerevisiae. La position de l'acide aminé 222 est plus variable, comme observé entre souches S. cerevisiae. Dans le cas des levures non Saccharomyces, cet acide aminé est une proline, de même famille (acides aminés aliphatiques hydrophobes) que l'isoleucine ou la valine. Du fait de cette similarité de séquence, les changements d'acides aminés par mutagenèse dirigée décrits précédemment et leurs effets peuvent tout à fait s'appliquer à d'autres espèces levuriennes que S. cerevisiae.15 Références bibliographiques Gonzalez, E, Fernandez, M R, Larroy, C, Sola, L, Pericas, M A, Pares, X, and Biosca, J A. 2000. Characterisation of a (2R,3R)-2,3-Butanediol Dehydrogenase as the Saccharomyces cerevisiae YAL060W Gene Product. J. Biol. Chem. 275: 35876-35885. Remize, F, Roustan, J L, Sablayrolles, J M, Barre, P, and Dequin, S. 1999. Glycerol Overproduction by Engineered Saccharomyces cerevisiae Wine Yeast Strains Leads to Substantial Changes in By-Product Formation and to a Stimulation of Fermentation Rate in Stationary Phase. Appl. Environ. Microbiol. 65: 143-149. Güldener, U, Heck, S, Fiedler, T, Beinhauer, J and Hegemann J.H. 1996. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in buddinq yeast. Nucl. Ac. Res. 24: 2519-2524 Schiestl, R. H. and. R.D. Gietz. 1989. High efficiency transformation of intact cells using single stranded nucleic acid as carrier. Curr. Genet. 16:339-446. Bely, M., Sablayrolles J.M. and P. Barre. 1990. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in enological conditions. J. Ferm. Bioeng. 70:246-252. Michnick S, Roustan JL, Remize F, Barre P, Dequin S, 1997. Modulationof glycerol and ethanolyields during alcoholic fermentation in Saccharomyces cerevisiae strains overexpressed or disrupted for GPD1 encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase. Yeast 1. 3: 783-793. Heux, S, Cachon, R, Dequin, S. 2005. Cofactor engineering in Saccharomyces cerevisiae: expression of a H2O-forming NADH oxidase and impact on metabolic flux redistribution. Metab. Eng. Heux S., Sablayrolles JM, Cachon R. and Dequin S (2006) Engineering S. cerevisiae wine yeast with reduced ethanol 22 production during fermentation under controlled m.icrooxygenation conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72:5822-5828 Lundquist, F. (1974). Acetaldehyd : Bestimmung Mit Aldehyd-5 dehydrogenase., Methods of Enzymatic Analysis., Academic Press, Inc., pp. 1509-1513. REVENDICATIONS 1. Souches de levures comportant le gène BDH1 codant pour Bdhlp, caractérisées en ce qu'il s'agit de souches génétiquement transformées et/ou mutées capables de convertir l'acétoïne produite par les levures en 2,3-butanediol selon un taux au moins 2 fois supérieur à celui de la souche initiale. 2. Souches de levures comportant le gène BDH1 codant pour Bdhlp, caractérisées en ce qu'il s'agit de souches génétiquement transformées pour surexprimer BDH1 à l'aide d'un promoteur fort de levures. 3. Souches de levures selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles comprennent une ou plusieurs mutations dans le gène BDH1 afin de présenter une spécificité de cofacteur pour le NADPH au lieu du NADH. 4. Souches de levures selon la revendication 3, caractérisées en ce que la protéine codée par le gène BDHI muté comprend 3 mutations en position 221, 222 et 223, correspondant à un fragment 221 SRS 223 par référence à la souche de Saccharomyces cerevisiae S288C. 5. Souches de levures selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles ce qu'elles sont génétiquement transformées et comprennent également une ou plusieurs mutations dans le gène BDH1 afin de présenter une spécificité de cofacteur pour le NADPH au lieu du NADH. 6. Souches de levures selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce qu'elles sont surproductrices de glycérol. 7. Souches de levures selon la revendication 6, caractérisées en ce qu'elles comportent un gène GPDI ou un gène GPD2 surexprimé. 8. Souches de levures selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce qu'il s'agit de souches génétiquement modifiées et capables de réduire la quantité d'acétate produite par rapport à la souche selon la revendication 7. 9. Souches de levures selon la revendication 8, caractérisées en ce que le gène ALD6 a été délété et le cas échéant ses copies. 10. Souches de levures selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisées en ce qu'elles appartiennent au genre Saccharomyces. 20 11. Souches de levures selon la revendication 10, caractérisées en ce qu'il s'agit de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces uvarum et Saccharomyces kudriavzevii 25 12. Souches de levures selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisées en ce qu'elles appartiennent au genre non Saccharomyces. 13. Souches de levures selon l'une quelconque des 30 revendications 10 à 12, caractérisées en ce qu'il s'agit d'hybrides. 14. Procédé de fermentation de jus de fruit, caractérisé en ce qu'il comprend l'addition dans un milieu15de fermentation de souches de levure telles que définies dans l'une quelconque des revendications 1 à 13. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en 5 ce que le jus de fruit est du jus de raisin. 16. Utilisation des souches de levures selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, pour produire du 2,3-butanediol. 10