FR 2923609 A1 20090515 FR 0707938 A 20071113 12/11/2007 15:22:38 L'invention concerne un test utilisant une réaction photochimique pour la mesure de la résistance d'un liquide biologique d'un tissu ou d'un extrait tissulaire ainsi plus généralement d'un matériau vivant ou non au stress oxydant et plus généralement aux espèces réactives oxydantes (EROs) produites lors du métabolisme normal, pathologique ou induites lors de la mise en oeuvre d'un traitement. Les EROs produits initialement (EROs primaires) vont ensuite se désactiver progressivement en donnant des EROs secondaires dont la nature varie en fonction du substrat avec lequel l'ERO primaire a réagi. On va donc assister à une production en cascade d'EROs secondaires qui vont ensuite produire à leur tour d'autres EROs mais qui seront de moins en moins réactifs. Le stress oxydant a fait l'objet de nombreuses études ces dernières années en raison de son implication dans un grand nombre de processus normaux pathologiques ou thérapeutiques. Des tests permettant de quantifier tel ou tel facteur impliqué dans la défense vis-à-vis des EROs ont été élaborés. De plus des systèmes permettant la mesure du total antioxydative status (TAS) ont été aussi développés. Imanox TAS kit, Randox Kit (PCT/GB91/02228), PCT 2003/016527, Fras 4. Notre invention se situe dans le cadre de la mesure du TAS. Par ailleurs l'identification de sources potentielles d'EROs ont été étudiées et parmi elles il a été montré que les réactions photochimiques produisent des EROs dont la nature et la quantité varient en fonction de la nature chimique du photosensibilisant de l'intensité de la lumière délivrée au photosensibilisant et de la nature du tissus qui a été sensibilisé par le photosensibilisant préalablement à l'irradiation lumineuse. Dans ce contexte l'ERO primaire le plus réactif formé en plus grande quantité est l'oxygène singulet (102). Le stress oxydant et les EROs sont produits lors de l'exposition de matériaux à des agents chimiques ou physiques (par exemple de la matière plastique exposée au soleil) ou en biologie dans les réactions physiologiques de phagocytose par les globules blancs aboutissant à la destruction de bactéries par exemple, mais aussi et surtout lors de réactions biochimiques nombreuses du métabolisme normal. Les EROs produites en excès ou insuffisamment neutralisées vont avoir des effets délétères pouvant conduire au vieillissement accéléré de constituants biologiques ou non, conduisant à la dégradation précoce de tissus biologiques ou même de matériaux. Parmi les pathologies directement ou indirectement liées aux EROs on peut citer la maladie d'Alzheimer, le diabète et ses conséquences, certains cancers, certaines pathologies dégénératives du tissu osseux et du cartilage, l'athérosclérose. Plus généralement une hypothèse du vieillissement des êtres vivants repose aussi sur une action délétère oxydative des EROs qui altèrent de manière diffuse l'ensemble des constituants biologiques protéiques, lipidiques ou glucidiques. Parmi les EROs on peut citer 02.- radical superoxyde, HO2. radical perhydroxyle, .OH radical hydroxyle, RO2. radical peroxyle, RO. Radical alkoxyle, .N0 monoxyde d'azote, auxquels il faut ajouter 102 ou oxygène singulet, une des deux formes excitées de l'oxygène. Les radicaux libres vont altérer diverses cibles biologiques en particulier lipides, proteines et acides nucleiques et donc ces espèces radicalaires sont impliquées dans de nombreuses pathologies regroupées sous le terme de stress oxydant. Les facteurs influençant en l'augmentant l'action des EROs sont nombreux au premier rang desquels la pression partielle en oxygène dans le tissus et donc le pH ainsi que d'un point de vue biologique tous les enzymes de régulation de la mort cellulaire. Les facteurs influençant en la diminuant l'action des EROs sont également nombreux : Protéines, vitamines, superoxyde dismutase (SOD), le système glutathion/glutathion 12/11/2007 15:22:38 peroxydase etc... L'action de l'ERO va être une sorte de compromis entre sa réactivité, sa durée de vie, son affinité vis-à-vis de telle ou telle cible ou constituant biologique. 55 Les substances antioxydantes en fait présentent une très forte affinité pour l'ERO qui le détourne ainsi d'un autre constituant qui aurait autrement été attaqué par l'ERO. Malgré cela le composé, y compris une éventuelle substance anti oxydante subissant l'attaque de l'ERO va à son tour devenir oxydant et potentiellement délétère quoique avec une réactivité moindre que l'ERO. Tout réactif ajouté y compris pour la détection et à fortiori 60 pour provoquer la réaction oxydante peut d'ailleurs se comporter de la même manière en présence d'EROs. La présence d'un témoin, ne réagissant pas à la lumière, permettant de comparer avec un sérum à doser est donc indispensable. Ainsi la détoxification des ERO est-elle une sorte de cascade d'événements aboutissant à la neutralisation de l'ERO. 65 Pour étudier les EROs on peut analyser leur production en les détectant directement mais ce n'est pas possible pour la plupart des espèces en particulier c'est difficile pour 102 (mesure de la durée de vie de luminescence de l'1O2 à 1270nm, 5 us dans l'eau), ou indirectement et pour la plupart d'entre elles impossible à mettre en place 70 simplement dans un tissus ou un matériau donné en particulier les tissus broyés ou liquides biologiques du fait de la décroissance rapide de la réactivité et de l'impossibilité de réaliser une mesure temps réel de longue durée. On peut analyser la transformation d'un marqueur coloré ou fluorescent sous l'influence des EROs produits ou circulants. Mais la réaction qui abouti à la production des EROs abouti aussi souvent à la 75 destruction du marqueur. Dans un test commercialisé on fait agir une substance chimique oxydante avec le substrat dont on veut mesurer la résistance aux EROs (TAS). Dans ce cas cependant le réactif qui demeure en solution est partie de la mesure puisque la substance n'est pas neutralisée et donc source d'artefact. Par ailleurs les applications à ce jour publiées ne font pas mention de mesures globales 80 réalisées à l'échelle d'un tissu. Enfin on peut étudier individuellement les facteurs qui influent sur la réactivité des EROs soit en les dosant soit en mesurant leur transformation sous l'influence des EROs ce qui est fastidieux couteux et ne tient pas compte des interactions entre quenchers. 85 C'est pour palier l'ensemble de ces difficultés et pour satisfaire au besoin d'une mesure globale de la capacité de résistance aux EROs aussi appelé TAS pour Total Antioxydant Status que le test objet de la présente invention a été mis au point. A cet effet, l'invention dans une version la, représentée schématiquement en Figure 1, 90 a pour objet de réaliser une réaction photochimique dans des conditions parfaitement standardisées dans le but de produire des EROs de plus haut niveau d'énergie possible en particulier de l'oxygène singulet (102) grâce à un sensibilisant standardisé. Etape 1 : Un photo sensibilisant produisant de l'oxygène singulet est placé en solution par exemple dans de l'eau et on ajoute le substrat par exemple un sérum ou consistant 95 en un matériau, un tissu biologique broyé ou un liquide biologique, contenant ou non des substances dont on souhaite mesurer le potentiel antioxydant (par exemple des aminothiols, Vitamine C ou E etc...) et dont on veut mesurer la capacité antioxydante sur lequel vont agir les EROs primaires et secondaires après irradiation lumineuse à une longueur d'onde absorbée par le sensibilisant. 100 Etape 2 : L'ensemble est tamponné par ajout de tampon phosphate (250mM) à pH 7,2. et thermostaté. Etape 3 : Irradiation lumineuse à une longueur d'onde absorbée par le photo sensibilisant. L'énergie délivrée sera telle quelle n'entraine pas d'élévation thermique dans la solution irradiée et qui est thermostatée. 12/11/2007 15:22:38 105 Etape 3 : De façon synchrone à la fin de l'irradiation de la solution contenant le sensibilisant et le substrat on ajoutera un révélateur connu ou non par exemple le système dichlorofluoresceine- dichlorofluoresceine réduite (DCF-DCFH) qui génère une fluorescence après attaque par les EROs, au fur et à mesure de la désactivation en cascade de la réactivité des EROs produites par la réaction photochimique initiale. 110 Etape 4 : On mesurera ensuite en fonction du temps et de manière thermostatée l'activité oxydante des EROs résiduels sur un révélateur connu ou non. Cette disparition va en effet être influencée par la nature du substrat qui consiste en un matériau, un tissu biologique broyé ou un liquide biologique, contenant ou non des substances dont on souhaite mesurer le potentiel antioxydant (par exemple des aminothiols, Vitamine C 115 ou E etc...) et dont on veut mesurer la capacité antioxydante. La disparition des EROs par la mesure de leur présence révélée par la DCF-DCFH est le reflet de la capacité globale en fonction du temps d'un matériau, tissus biologique ou liquide biologique à inhiber les EROs et donc à limiter leurs effets délétères au sein du substrat dont on cherche à mesurer le TAS. La forme du signal obtenu grâce à un réactif coloré 120 approprié dont un exemple peut-être la DCF-DCFH fluorescent après attaque par des EROs est caractéristique du matériau subissant la réaction photochimique et absolument différente du signal obtenu en absence du matériau ou liquide biologique (Fig 2). De plus l'évolution de la fluorescence est parfaitement reproductible d'une expérience à l'autre lorsque l'irradiation lumineuse d'un sensibilisant identique est 125 réalisée successivement 40 fois en présence d'un substrat identique (Sérum de veau foetal FCS) (Fig 3). C'est donc bien l'évolution en fonction du temps du signal obtenu qui va être analysée et qui correspond, à la désactivation progressive des EROs produits aboutissant à une 130 activation de la DCF-DCFH dont la fluorescence augmente avec le nombre d'EROs qui ont interagit avec la forme non fluorescente de la DCF-DCFH. Il ne s'agit nullement d'un artefact même si on ne peut exclure une contribution de l'autooxydation de la DCFDCFH à ce signal. Mais même dans ce cas la contribution elle-même est proportionnelle à l'intensité de la production d'EROs par la réaction photochimique et 135 inversement proportionnelle au TAS du milieu objet de la mesure. A la fin de la mesure plus l'aire sous la courbe de la mesure de la fluorescence de la DCF-DCFH oxydée par les EROs en fonction du temps est grande est grande et moins le matériau est capable de neutraliser rapidement les EROs primaires générés à parti de la réaction photochimique initiale standardisée. Le TAS est donc d'autant plus fort que l'aire sous 140 la courbe est plus petite. Le pH de la solution dans laquelle est effectuée l'irradiation lumineuse du sensibilisant permettant la production d'EROs primaires puis la détection des EROs par DCF-DCFH tel que décrit ci-dessus est tamponné par un tampon phosphate très concentré 145 (250mM) à pH 7.2. Cette condition permet un bon signal de fluorescence, élimine les artéfacts liés à des variations de pH du fait des ajouts de solutés ou de composés et est compatible avec le pH biologique. Dans le cas de la mesure de fluorescence obtenue en ajoutant un milieu composé 150 d'extraits tissulaires au substrat cette mesure peut-être appréciée par rapport aux substances caractérisant ce milieu par exemple le taux de protéines totales présent dans l'extrait et mesuré par exemple avec un test au bleu de coomassie. Dans une application particulière destinée à mesurer la capacité antioxydante d'un 155 sérum dans le but de détecter une anomalie de cette capacité antioxydante associée à une maladie les EROs ou conséquence de cette maladie sont produites directement 12/11/2007 15:22:38 dans le sérum du patient à tester et comparé aux valeurs obtenues dans un sérum de référence et à des valeurs normales obtenues préalablement dans un échantillon de témoins sains. 160 Dans une perspective clinique un prélèvement sanguin est réalisé avant traitement, immédiatement après le traitement et ensuite plus à distance. Les résultats obtenus après traitement sont comparés aux valeurs d'avant traitement. Ainsi et à titre d'exemple, il sera possible de vérifier l'impact de la Circulation extracorporelle sur le 165 taux de complications post opératoires ou alors de mesurer l'impact de la radiothérapie sur un patient donné. Dans une application particulière le test est utilisé pour tester le TAS d'un matériau quelconque broyé. Dans ce cadre la procédure est identique mais le sensibilisant 170 produisant des EROs peut être lipophile et dissous dans un solvant adapté à celui du matériau à tester (ex polypropylène). Dans ce cas le pH est lui aussi adapté et n'est plus tamponné à 7,2. En revanche l'ensemble de la procédure est thermostaté. Dans une seconde version lb L'expérience mesurant l'influence d'un matériau, tissus 175 biologique ou liquide biologique dans la disparition des EROs va être reproduite pour des concentrations variables du matériau, tissus biologique ou liquide biologique, contenant ou non des substances dont on souhaite mesurer le potentiel antioxydant, à tester. Ainsi les aires sous la courbe de l'évolution de la fluorescence induite par les EROs produites au sein du substrat se déplaceront en fonction de la modification du 180 pouvoir antioxydant induite par ces matériaux, tissus biologique ou liquides biologique. Lorsque le pouvoir antioxydant augmentera il y aura un déplacement de la courbe vers le bas. Lorsque le pouvoir antioxydant diminuera il y aura déplacement vers le haut. II sera ainsi possible par la mesure de la pente de la courbe de caractériser très précisément le TAS et donc autoriser les comparaisons ultérieures par exemple avec 185 d'autres matériaux dont on voudrait mesurer le TAS. Dans la version lb la séquence de manipulations aboutissant à la réalisation du test est : Dans un ensemble rigoureusement thermostaté ajout du photosensibilisant au substrat de référence et ajout du sérum, de l'extrait ou du réactif à tester en 190 concentration croissante. Irradiation des solutions à tester, du substrat seul et du produit à tester seul (sans le réactif photosensibilisant). De façon synchrone à la fin de l'irradiation lumineuse ajout de révélateur DCF-DCFH puis analyse de l'évolution de la fluorescence de la DCF-DCFH en fonction du temps des différentes solutions. 195 En fonction du type de EROs vis-à-vis de laquelle on mesure la capacité à résister d'un matériau, tissus biologique ou liquide biologique il peut être choisi un agent photosensible susceptible de produire préférentiellement tel ou tel type de ERO. Cependant il est préférable de choisir un sensibilisant produisant majoritairement I"espèce la plus énergétique c'est-à-dire 102. Ainsi un exemple de photosensibilisant 200 utilisé pourra être le rose bengal un autre étant le Tetra (4 sulfonato-phenyl) porphyrine (TPPS) les deux ayant des rendements quantiques de production de 102 de 0.75. Un autre critère de choix est l'absence de réaction chimique entre le photosensibilisant et le sérum à tester lorsque le mélange est à l'abri de la lumière. L'irradiation lumineuse sera réalisée au maximum d'absorption du spectre du 205 photosensibilisant soit pour le rose bengal (520 nm) dans le cadre d'un exemple préférentiel. L'énergie délivrée au mélange sérum-photosensibilisant sera de 10j/cm2 dans une application préférentielle. L'irradiation lumineuse puis la détection de fluorescence devront être réalisées dans des conditions thermostatées strictes. 12/11/2007 15:22:38 210 Une procédure préférentielle est décrite en annexe 1. Dans une version 2 représentée en figure 4, le test peut être utilisé pour évaluer la capacité de différents agents à produire des EROs et d'une manière générale la capacité de production d'EROs de différents agents ou traitements thérapeutiques 215 parmi lesquels la radiothérapie, la photochimiothérapie ou des agents chimiques ou physiques pro oxydants. Dans ce cadre le substrat est standardisé et c'est l'agent produisant les EROs qui va changer soit de nature et être comparé à un traitement de référence soit de concentration ou de puissance par exemple et être comparé à un traitement de conditions basales. 220 Dans une perspective expérimentale un échantillon standardisé est soumis à un traitement produisant des EROs et cette production est comparée à celle produite à l'aide d'un traitement de référence. Dans le cas de la photochimiothérapie on comparera la production d'EROs en fonction des agents photosensibles ajoutés au substrat (sérum de référence) à la production de ROS obtenue dans le même substrat 225 avec un photosensibilisant connu. Ainsi il sera possible de détecter les agents susceptible de produite la plus grande quantité d'EROs. Une telle expérience a été réalisée sur des dérivés d'indirubines dont la photoréactivité a été mesurée par du luminol (ref Patrice et olivier 2007) et par notre test. Une parfaite corrélation a été trouvée entre les deux techniques démontrant ainsi la fiabilité du test par ailleurs plus 230 sensible que la méthode au luminol. Nous avons pu vérifier que la structure chimique ne permettait pas de prédire la photoréactivité mais que le test objet du présent document a permis de retrouver une corrélation parfaite avec la phototoxicité observée sur des cellules et traitées par photochimiothérapie en utilisant ces mêmes composés (Table 1). 235 Photoreactivity F98 cell line (LD 50, pg/ml) Narre DCF Luminol Toxicity Phototoxicity (20J/cmZ) MLS 2049 0,7641 137 >5 4. 5 MC 131 0,5576 219 4 2 MLS 2063 0,5239 107 1.5 1.5 MLS 2048 0,5181 116 >5 >5 MLS 2050 0,4807 96 4 2.5 MLS 2046 0,4730 70 >5 >5 MLS 2041 0,3650 86 >5 >5 MC 129 0,3088 0 >5 >5 MC 117 0,3047 65 >5 3.5 6 BIO 0,2582 0 >5 >5 MC 118 0,2455 46 5 5 MLS 2052 0,2164 50 2 1.5 indirubine 3' oxyme 0,1402 0 >5 >5 MC 125 0,1295 39 >5 >5 MLS 2064 0,0776 27 0.6 0.6 MLS 2047 _ 0,0755 23 >5 >5 MLS 2061 0,0312 19 >5 >5 MLS 2040 0,0252 17 >5 4 AB 194 0,0168 5 >5 >5 7 BIO 0,0000 0 >5 3 MC 132 0,0000 0 >5 >5 6 12/11 /2007 :22:38 MLS 2039 0,0000 0 >5 >5 MLS 2044 0,0000 8 2 2 MLS 2060 0, 0000 12 >5 >5 MC 135 0,0000 0 >5 >5 MC 136 0,0000 0 >5 >5 AB 187 0,0000 0 >5 >5 BIO 0,0000 0 >5 >5 bis indigotin 0,0000 7 >5 >5 De la même façon il est possible grâce au test objet de l'invention de comparer et de prédire les efficacités de photosensibilisants connus (Fig 5). Une description schématique de la version 2 du test est donnée ci-dessous. 240 Pour la version la, lb ou 2 un échantillon appelé témoin interne identique d'une expérience à l'autre sur une longue période de temps permet de s'assurer qu'il n'y a pas de modification de l'ensemble de la chaine de mesure (matériel ou réactifs). 245 La réaction photochimique initiale induit bien la production d'EROs et en particulier de 102 puisque cette réaction peut être inhibée partiellement lors d'une irradiation dans une atmosphère saturée en N2 ou de façon encore plus nette avec une atmosphère saturée en argon (Fig 6). 250 Un point important est le choix du sérum de référence dans le cas où il s'agit de mesurer la valeur de la capacité antioxydante d'un tel tissu. Il importe que le lot témoin d'où est issu l'échantillon de référence soit stable afin de s'assurer de la reproductibilité. (Fig 3). Un autre point important est de mesurer l'absorbance finale de la solution dans laquelle 255 on veut mesurer le TAS et ce avant de provoquer la réaction photochimique par l'irradiation lumineuse. En effet la lumière servant à exciter le sensibilisant provoquant la réaction photochimique servant à mesurer le TAS (version 1) ou la mesure du TAS dans un matériau standardisé (version 2) va être influencée par cette absorbance et par suite l'intensité de la réaction photochimique servant à mesurer le TAS sera modifiée 260 (diminuée si l'absorbance est trop forte). De la même façon la mesure de fluorescence émise par la DCF-DCFH après la réaction photochimique va être absorbée par l'absorbance de la solution. La mesure de l'aire sous la courbe doit donc être calculée en fonction de l'absorbance et ce pour des valeurs d'absorbance inscrites dans la portion horizontale de la mesure de l'aire sous la courbe en fonction de l'absorbance ce 265 qui implique un étalonnage. L'invention sera bien comprise en considérant un exemple préférentiel de procédure de réalisation du test en version 1, donné en annexe 1. 270 Le résultat d'une procédure réalisée à concentration constante selon un mode opératoire préférentiel cité en annexe 1 se présente sous la forme d'une courbe (Fig 2). Les résultats sont présentés en pourcentage de la valeur témoin de référence. L'aire sous la courbe est calculée pour le sérum à tester et pour le sérum de référence. Les essais réalisés en utilisant le test objet de l'invention et présentés ci-dessous 275 permettent de mesurer la capacité anti oxydante de sérums humains sains (Fig 7). Il a été possible de montrer que ce potentiel était différent pour l'homme et la femme pour lesquels deux valeurs moyennes ont pu être calculées. Utilisé de la même manière sur des sérums pathologiques obtenus chez des patients atteints de diabète compliqués 12/11/2007 15:22:38 d'ischémie une valeur du test supérieure au valeurs des témoins sains a pu être 280 mesurée (Fig 8). Enfin le potentiel anti oxydant a été analysé sur des sérums obtenus chez des animaux d'espèces différentes. Nous avons pu noter à la fois une variation importante entre les espèces et aussi une variation interindividuelle importante au sein d'une espèce donnée se traduisant par un écart-type important cependant plus faible pour les sérums 285 humains (Fig 9). Il existe différents tests permettant d'évaluer le pouvoir antioxydant de matériaux biologiques. Parmi ceux ûci la méthode de référence est appelée � Randox �. Notre test diffère significativement de ce test en cela que nous utilisons une méthode optique 290 pour produire des ROS (limitant ainsi les artefacts liés à l'introduction potentielle de contaminants par ex Métaux lourds, ou de réactifs iatrogènes). Par ailleurs l'utilisation de 102 oxygène singulet pour une telle réaction (durée de vie extrêmement brève, consommation minimale d'oxygène dans le milieu d'ou encore risque minimum d'artefact), au pouvoir oxydant maximum permet une détection globale totale des ROS 295 induits. Par ailleurs la durée de l'irradiation étant très brève en tous cas terminée au moment de l'ajout du réactif de détection des ROS induits immédiatement après la fin de l'irradiation lumineuse peu importe la réactivité de ce réactif DCF-DCFH à la lumière, qui ne mesure que les EROs captés et donc encore absence d'artefacts. Par ailleurs la fluorescence obtenue après réaction avec Randox est très instable le signal diminuant 300 de 50% en 60 secondes suivant le temps de mesure dont le temps optimal préconisé par le fournisseur est après 3 minutes. Revendications : 1. - un test destiné à mesurer capacité d'un matériau vivant ou non à résister à la production d'espèces réactives de l'oxygène. Comprenant l'utilisation et la mise en oeuvre successives des étapes décrites de a à f: a- un agent photoréactif placé en contact avec un substrat à évaluer d'origine biologique ou non et mélangé en solution aqueuse ou non dans un compartiment thermostaté ou non permettant la propagation de la lumière. La concentration de cet agent photoréactif est comprise entre 0.01 ug/ml et 1 mg/ml. Dans le cas de l'analyse de substrats d'origine biologique le pH est tamponné à 7.2 par tampon phosphate 250 mM b- Un dispositif d'éclairement mono chromatique continu ou pulsé ou non mono chromatique permettant l'éclairement du compartiment en un temps bref d'une durée comprise entre la femto seconde et plusieurs secondes Le dispositif permet l'obtention d'une réaction photochimique avec le substrat. c- L'ajout à la solution et au contenant décrits en 1 et immédiatement après la fin de l'irradiation lumineuse réalisée en b à l'aie du dispositif décrit d'un réactif coloré ou fluorescent soluble dans la composition a permettant la détection des EROs produits sur une période de temps s'étendant de l'instant de la fin de l'irradiation telle que décrite en b jusqu'à plusieurs heures ou jours après la fin de l'irradiation. La concentration de ce réactif coloré est comprise entre 0.01 ug/ml et 1 mg/ml d- Un dispositif thermostaté ou non de détection colorimétrique ou fluorescent permettant la détection des EROs grâce aux modifications induites dans le réactif coloré décrit en 3. e- Un système de traitement des données automatisé ou non et incluant a- l'analyse spectrale en un ou plusieurs points de l'absorption du matériau à évaluer b- le calcul de l'aire sous la courbe établie par l'évolution en fonction du temps des modifications induites dans le réactif coloré décrit en 3 c- les corrections éventuelles à apporter en fonction des valeurs de 5a 30 d- le rapport entre la valeur de l'aire sous la courbe mesurée en 5b et la valeur d'un matériau de référence traité de manière identique au matériau. f- Un dispositif permettant de traiter simultanément de 1 à plusieurs échantillons grâce aux éléments mis en oeuvre ci-dessus décrits de a à e et comprenant au moins un 35 substrat ou matériau de référence. 2- Un système incluant en particulier les éléments décrits en 1 de a à f permettant en un seul test de mesurer la capacité d'un matériau vivant ou non à résister à la production d'espèces réactives de l'oxygène 3- Un test utilisant le système décrit ci-dessus afin de mesurer la capacité d'un matériau vivant ou non à résister à la production d'espèces réactives de l'oxygène et obtenu à partir de prélèvements solides ou liquides réalisés chez des êtres vivants normaux 45 4- Un test utilisant le système décrit ci-dessus afin de mesurer la capacité d'un matériau vivant ou non à résister à la production d'espèces réactives de l'oxygène et obtenu à partir de prélèvements solides ou liquides réalisés chez des êtres vivants atteints de pathologies sans présumer de la nature ou de l'étiologie ou de la cause de la pathologie. 50 5- Un test utilisant le système décrit ci-dessus afin de mesurer la capacité d'un matériau vivant ou non à résister à la production d'espèces réactives de l'oxygène et obtenu à 4012/11/2007 15:22:38 partir de prélèvements solides, broyés ou non, ou liquides réalisés chez des êtres vivants atteints de pathologies sans présumer de la nature ou de l'étiologie ou de la 55 cause de la pathologie mais soumis à des traitements sans présumer de leur nature physique biologique ou chimique afin de mesurer l'impact l'intérêt ou l'efficacité de ce traitement. 6- Un test utilisant le système incluant en particulier les éléments décrits en 1 de a à f 60 permettant en un seul test de mesurer la capacité d'un matériau vivant ou non à résister à la production d'espèces réactives de l'oxygène et permettant la comparaison de la production de EROs au sein d'un matériau vivant ou non par l'analyse successive de la capacité de ce matériau à résister à la production d'espèces réactives de l'oxygène 65 7- Un test utilisant le système décrit ci-dessus afin de mesurer la capacité d'un agent chimique ou physique, d'une substance médicamenteuse ou plus généralement d'une thérapeutique à diminuer la capacité d'un matériau vivant ou non à résister à la production d'espèces réactives de l'oxygène 70 8- Un test utilisant le système décrit ci-dessus afin de mesurer la capacité d'un agent chimique ou physique, d'une substance médicamenteuse ou d'une thérapeutique à augmenter la capacité d'un matériau vivant ou non à résister à la production d'espèces réactives de l'oxygène12/11/2007 15:22:38 Références : D. Olivier, MA. Poincelot, S. Douillard, T. Patrice et al Photoreactivity of Indirubin derivatives, 2007 Photochem. Photobiol. Sci in press 80 R. Cathcart, E. Schwiers, B.N. Ames, Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay, Anal. Biochem. 134 (1983) 111ù116 C.P. LeBel, H. Ischiropoulos, S.C. Bondy, Evaluation of the probe 29-79-Dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress, Chem. Res. Toxicol. 5 (1992) 227ù231. 229ù240. H. Zhu, G.L. Bannenberg, P. Moldeus, G. Shertzer, Oxidation pathways for the intracellular probe 29-79-dichlorofluorescin, Arch. Toxicol. 68 (1994) 582ù587. 90 J. Frank, H.K. Biesalski, S. Dominici, A. Pompella, The visualization of oxidant stress in tissues and isolated cells, Histol. His- topathol. 15 (2000) 173ù183. M. Valkonen, T. Kuusi, Spectrophotometric assay for total peroxyl radical-trapping antioxidant potential in human sérum, J. Lipid Res. 38 (1997) 823ù833. Toxicol. 68 (1994) 582ù587.12/11/2007 15:22:38 Annexe 1 Une procédure préférentielle pour la version 1 du test pourrait ainsi consister en un substrat le FCS (50 pI) un réactif le rose bengal pour une concentration 5 pg/mI, puis ajout des solutions à tester (par exemple sérum, FCS ou tout autre substrat consistant 100 en un matériau, tissu biologique ou liquide biologique, contenant ou non des substances dont on souhaite mesurer le potentiel antioxydant et dont on veut mesurer la capacité antioxydante en fonction du temps) de 1 à 50 pI par exemple 1 5 10 20 30 40 50 pI. L'ensemble est en solution dans de l'eau et tamponné à pH 7,2 par ajout de tampon phosphate concentré (250mM). L'irradiation est réalisée par exemple à l'aide d'un laser émettant une fluence de 1 à 10 j/cm2 à 514 nm (de 10 à 50 secondes d'irradiation). Le révélateur la DCF est ajouté avec un dispositif automatique à la fin de l'irradiation lumineuse et agité. La fluorescence est analysée dans un système également thermostaté pour l'ensemble des solutions de manière à ce que les intervalles entre les prises de mesure soient identiques pour l'ensemble des solutions. 0 110 la fin d'une période de 10 à 60 minutes les aires sous la courbe sont calculées ainsi que les pentes permettant de caractériser la courbe d'évolution de la fluorescence à différents temps par exemple 1, 2, 5 10 20 40 et 60 minutes. Ces manipulations permettent d'obtenir des rapport d'aires sous la courbe qui va évoluer en fonction de la concentration du sérum, de l'extrait ou du réactif anti ou prooxydant à tester. Ainsi quand la substance à tester présentera un déficit de pouvoir antioxydant ou aura une activité prooxydant il y aura augmentation des rapports d'aire sous la courbe et lorsque il y aura hyperprotection ou activité antioxydante il y aura diminution de ces rapports par rapport aux contrôles. La normalité pourra être appréciée par rapport à des sérums normaux de référence. 12012/11/2007 15:22:38 Figures Figure 1 : Schéma général de l'invention objet du brevet dans une version 1 destinée à mesurer le total antioxydant status (TAS) d'un matériaux ou milieu biologique Figure 2: Evolution du signal de fluorescence de la DCF-DCFH ajoutée à un milieu contenant du sérum et soumis à une irradiation lumineuse en présence de rose bengal 130 Figure 3 : Reproductibilité du test objet du présent brevet sur du sérum de veau foetal utilisé comme substance dont le potentiel antioxydant est mesuré. La mesure a été reproduite dans des conditions identiques sur 40 échantillons. Figure 4 : Schéma général de l'invention objet du brevet dans une version 2 destiné Figure 5 : Evolution du signal de fluorescence de la DCF-DCFH ajoutée à un milieu contenant du sérum de veau foetal issu d'un même lot et soumis à une irradiation lumineuse en présence de sensibilisants différents connus. Il s'agit d'une application de la version 2 du test décrit en référence Figure 6 : Evolution du signal de fluorescence de la DCF-DCFH ajoutée à un milieu contenant du sérum et soumis à une irradiation lumineuse en présence de rose bengal une atmosphère saturée en argon ou en azote. Visualisation du potentiel antioxydant des gaz neutres selon la procédure version la du test. Figure 7 : Evolution du signal de fluorescence de la DCF-DCFH ajoutée à un milieu contenant du sérum prélevé chez 20 hommes et 20 femmes présumés sains et soumis à une irradiation lumineuse en présence de rose bengal 150 Figure 8 : Evolution du signal de fluorescence de la DCF-DCFH ajoutée à un milieu contenant du sérum prélevé chez des patients diabétiques et soumis à une irradiation lumineuse en présence de rose bengal. Figure 9 : Evolution du signal de fluorescence de la DCF-DCFH ajoutée à un milieu contenant du sérum prélevé chez des animaux issus de différentes espèces (nombre d'individu minimum par espèce = 8) et soumis à une irradiation lumineuse en présence de rose bengal. 140 160 170