FR 2920155 A1 20090227 FR 0757145 A 20070823 1 Procédé de concentration stérile de préparations de collagènes et préparations de collagène obtenues La présente invention a trait à un procédé de concentration stérile de préparations de collagènes, notamment de collagènes de type I, II, III, IV,V, ou autres types dits mineurs, ou leurs mélanges par exemple de type 1+111, ces collagènes pouvant être d'origine animale, par exemple bovine ou porcine, ou humaine, et alors, de préférence d'origine placentaire ou dermique, le terme de collagène incluant naturellement les collagènes obtenus par synthèse, par exemple par expression dans des organismes recombinants. Les préparations de collagène, sous différentes formes injectables ou implantables, sont bien connues, comme le décrivent, par exemple, les brevets US 3,949,073 aux noms de Daniels et Knapp et US 4,488,911 aux noms de Luck et Daniels, qui sont à l'origine de la création de la société Collagen Corporation en 15 Californie et des implants de collagène bovin Zyderm . La difficulté bien connue pour préparer ces implants injectables est de réaliser leur concentration dans des conditions rigoureusement stériles. La concentration de solutions acides de collagène dans des boyaux de dialyse est décrite dans le brevet US 3949073, par absorption de l'eau grâce à un 20 tissu absorbant placé autour d'un tube de dialyse. Cependant, cette technique ne permet pas la préparation d'un produit physiologique directement injectable. La neutralisation du gel acide par dialyse contre une solution physiologique n'est pas envisagée, probablement à cause de la difficulté et du temps nécessaire pour dialyser une solution très visqueuse de collagène concentré. Par exemple, 25 lorsqu'une solution concentrée de collagène est soumise à la dialyse, la pression oncotique très élevée du gel de collagène entraîne rapidement un afflux de liquide dans le boyau qui peut éclater. En outre, cet afflux de liquide dilue le collagène et en diminue la concentration, rendant cette technique inopérante. Le même brevet mentionne que les suspensions fibrillaires de collagène sont concentrées par 30 centrifugation. Dans le brevet US 4,488,911, les deux extraits ci-dessous, donnent un état de l'art dans les années 1980, qui est encore pratiqué actuellement : 2 "Selon une technique simplifiée, le collagène en solution est dialysé contre une solution diluée d'acide carboxylique (...) à température ambiante, puis dialysé par cisaillement à rotation contre une solution diluée alcaline de .phosphate, par exemple une solution de phosphate de disodium à 0,02 M pendant'une période suffisante, jusqu'à ce que des micropolymères se forment. Généralement, 2 à 8 heures (de préférence, environ 4 à 6 heures) à température ambiante sont nécessaires, bien que des températures d'environ 15 C à 40 C peuvent être utilisées. Les NFMs qui sont formés sont collectés par centrifugation, lavés avec de l'eau et stockés. Les gammes discutées précédemment sont applicables à cette procédure. Après retrait du sac de dialyse de la solution, les micropolymères fibreux sont collectés par centrifugation. Ils peuvent être ensuite utilisés directement ou stockés humides à 4 C ou, de façon alternative, lyophilisés pour une période de stockage indéfinie." La collecte des fibres de collagène et leur concentration par centrifugation posent cependant le problème majeur de réaliser ces opérations sans risque d'introduire des agents infectieux contaminants, d'altérer ainsi le contenu des seringues sans garantie de stérilité bactérienne et fungique. En effet, la centrifugation suppose de répartir la suspension collagénique en godets de centrifugation préalablement stérilisés, de les introduire dans une machine non stérile, généralement en dehors du local stérile et de les ouvrir en fin de centrifugation, sans réintroduire de microbes dans le produit ou le local stérile qui le protège. La validation des conditions stériles dans un tel procédé est très difficile et les opérations manuelles nécessaires sont longues, très délicates, risquées et coûteuses. L'assurance de stérilité finale du produit injectable s'en trouve réduite, ce qui peut entraîner certaines infections locales et réactions d'intolérance après l'injection. Le brevet US 5,002,071 au nom de Harrell, apporte une solution au problème de la stérilité en soumettant le collagène injectable à une stérilisation finale par irradiation. Cependant, outre les risques d'altération du collagène, cette technique n'apporte pas de solution à l'élimination physique des microbes introduits lors des opérations manuelles. Certes ces microbes sont tués par l'irradiation, mais l'absence de corps bactériens n'est pas garantie et de ce fait des réactions pyrogènes à l'injection de ces produits ne peuvent être exclues. La présente invention concerne, notamment mais non exclusivement, les préparations injectables, en particulier pour le comblement des tissus, dont une application importante consiste dans le comblement des rides cutanées. On connaît déjà des procédés de préparation de collagène à partir de tissus animaux ou humains, par exemple le placenta humain. Ces procédés sont décrits, par exemple, dans les trois documents précédents et beaucoup d'autres cités en particulier dans le brevet US 5,436,135 aux noms de Tayot et Tardy. Les étapes habituelles consistent en des lavages des tissus à traiter, leur digestion partielle par des protéases telles que la pepsine ou la trypsine, l'extraction et la purification du collagène acido- soluble par des précipitations salines. Le collagène obtenu, par exemple sous forme précipitée ou sous forme de poudre séchée, est ensuite dissout dans une solution acide, par exemple pour subir une stérilisation par filtration sur une membrane stérilisante. Cette solubilisation se fait en générai à une faible concentration de 1 à 3 mg/ml, pour obtenir une viscosité réduite permettant la filtration stérilisante. Comme l'indique l'état de l'art déjà cité, la préparation de suspensions fibrillaires, concentrées, stériles et injectables implique ultérieurement une reprécipitation du collagène formant une suspension extrêmement diluée. Celle-ci est très difficile à filtrer ou à concentrer dans des conditions aseptiques rigoureuses, pour obtenir une suspension injectable stérile à une concentration de l'ordre de 30 à 60 mg/ml (soit 3 à 6 %). En effet, le collagène en suspension colmate très rapidement les filtres et dans tous les cas, la récupération de la pâte sur les filtres habituels est très difficile. Généralement, comme discuté précédemment, on effectue donc cette concentration par centrifugation, ce qui, compte tenu des volumes importants à concentrer, représente des opérations manuelles longues, très délicates et impliquant de toute façon des risques de rupture de la stérilité, lors des opérations hors zone stérile. La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients, et de fournir un procédé de concentration simple, rapide et n'impliquant pas de transfert entre diverses installations, de sorte que l'étape de concentration, ainsi que la répartition finale dans des récipients stériles, peut être effectuée dans le même 4 environnement stérile, par exemple dans une enceinte ou sous une hotte stérile à flux laminaire vertical ou horizontal. L'invention a pour objet un procédé de préparation de collagène stérile, notamment de collagène injectable, comprenant les étapes de préparation d'une solution acide purifiée de collagène, de stérilisation de cette solution, notamment par filtration sur un filtre ou une membrane stérilisante, de précipitation de la solution stérile sous forme de suspension, et de concentration de la suspension de collagène, procédé dans lequel ladite suspension est placée dans un filtre tubulaire souple allongé constituant une paroi filtrante poreuse, perméable au liquide, mais non perméable aux fibres de collagène, et est concentrée par passage lent du liquide à travers ladite paroi, sans pression autre que la pesanteur, pour éviter le colmatage de la paroi filtrante par les fibres de collagène. Le passage du liquide peut être augmenté, notamment en fin de concentration par absorption du liquide par une couche absorbante, préalablement stérilisée, appliquée sur ladite paroi, ou faisant partie de celle-ci. Dans ce cas, le liquide est relargué à l'extérieur de la couche absorbante en s'écoulant de la couche absorbante lorsqu'elle est saturée, ou/et s'évaporant au contact d'un flux d'air stérile. Dans une forme de réalisation particulièrement préférée de l'invention, lesdites étapes sont conduites dans un même environnement stérile, dans lequel, de préférence, on peut aussi conduire les étapes préalables de filtration stérile du collagène purifié et/ou ultérieures de répartition du collagène concentré en récipients ou seringues stériles. En effet, le faible encombrement des moyens de concentration selon l'invention, permet de procéder à toutes ces opérations, par exemple, dans une même enceinte ou hotte stérile à flux d'air stérile par un dispositif automatique, sous le contrôle d'un opérateur au début et à la fin de la concentration. De préférence, ladite paroi perméable est constituée d'une simple nappe filtrante souple, de forme tubulaire, pouvant être obturée à son extrémité inférieure et contenir la suspension de collagène. Ladite nappe peut être, à sa face opposée, en contact avec ladite couche absorbante, par exemple une nappe de cellulose ou de papier absorbant préalablement stérilisée par irradiation. En allongeant suffisamment un tel tube, et en le connectant au réservoir stérile contenant la suspension à concentrer, on peut de manière surprenante obtenir une concentration progressive d'un flux continu de suspension. La porosité, ou le maillage dans le cas d'un tissu textile, doit être telle que le liquide aqueux traverse facilement la paroi alors que le collagène a tendance à la colmater. L'humidité dans la paroi s'évacue spontanément par suintement, en l'absence de pression autre que la simple pesanteur. Plus le précipité de collagène est fin, plus la porosité de la paroi ou nappe filtrante doit être réduite. Pour les précipités les plus fins, celle ci peut être par exemple un tissu textile dont les fils sont très serrés et offrent une porosité estimée à 1 micron par le fabricant. Pour les précipités les plus structurés ou à larges fibrilles, une porosité allant jusqu'à environ 100 microns peut être utilisée. Le liquide peut aussi être pris en charge par la couche absorbante, si elle est présente, par exemple en fin de concentration, et parvient à la paroi extérieure de celle-ci, où elle s'écoule ou s'évapore. Le matériau formant ladite couche absorbante doit être tel qu'il absorbe cette humidité mais sans la retenir à demeure, de sorte que lorsqu'il est saturé, il relargue facilement cette humidité à sa face opposée, éloignée de ladite paroi perméable au liquide aqueux de la suspension. La couche absorbante peut être, par exemple, un papier filtre usuel en cellulose, ou en d'autres polymères hydrophiles de type polyesters ou autres, en une ou plusieurs épaisseurs, préalablement stérilisé par irradiation bêta ou gamma. Le dispositif mettant en oeuvre l'invention peut comporter un moyen, récipient ou conduit de recueil du liquide qui s'écoule, ou encore un dispositif de ventilation pour évaporer le liquide à la paroi externe de ladite couche absorbante. On peut aussi prévoir de créer un vide partiel autour de ladite paroi externe, en fin de concentration. L'invention a également pour objet les préparations stériles concentrées de collagène obtenues, et notamment de collagène injectable, par exemple pour le 30 comblement des tissus, par exemple les rides cutanées. Au lieu d'une préparation injectable, on peut, cependant aussi continuer à traiter le collagène, à partir de la suspension concentrée obtenue, pour préparer d'autres matériaux collagéniques implantables, solides ou non, et stériles ou stérilisables. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. Exemple 1: Concentration d'une suspension de précipité neutre de collagène fibrillaire Une solution acide de collagène de type 1 ou 1+111, de pH compris entre 2 et 10 3, est préparée par dissolution d'une poudre lyophilisée ou acétonique de fibres de collagène en acide chlorhydrique 0,02N. Cette poudre peut être d'origine commerciale ou préparée selon l'enseignement des brevets déjà cités, dont en particulier le brevet US 5,436,135. La solution d'un volume de 1,5 litre est ajustée à une concentration en collagène de 3 gll. Elle est filtrée stérilement sur une 15 membrane en acétate de cellulose, de porosité 0,22 à 0,45 micron pour éliminer les bactéries et autres microbes éventuellement présents dans le produit de départ. La solution filtrée est recueillie dans un flacon stérile, sous une hotte à flux laminaire stérile et ne quittera plus cet espace avant d'être concentrée et répartie en seringues. Tous les accessoires nécessaires sont stérilisés par irradiation 20 préalable à 30 kGray. La solution acide filtrée est ensuite réchauffée à une température de 20 à 25 C, puis additionnée de phosphate disodique Na2HPO4, 12H2O, pour atteindre une concentration finale de 20 mM, ce qui entraîne une précipitation du collagène sous forme colloïdale, puis fibrillaire. La précipitation est complétée par ajustement du pH à 7,2 avec de la soude NaOH 1 N. 25 La suspension diluée de fibrilles de collagène est ensuite introduite par gravité dans un entonnoir réservoir relié au tube de toile filtrante, lui-même fermé à l'autre extrémité par une pince. La toile filtrante commercialisée par la société de droit helvétique Sefar Fyltis, située à Freibach CH 9425 Thal, sous la référence Nycom PA 1 42072 AC, 03-1/1, de vide de maille 1 micron, convient parfaitement 30 à cette application. Cette toile peut être réalisée sous la forme d'un tube continu, de diamètre interne de 10 à 60 mm, dont les côtés sont soudés par ultrasons. La référence du produit choisi est un tube Sefar Nitex 03-1/1, de diamètre 20 mm. Pour un diamètre de tube filtrant de 20 mm et une longueur de 60 cm, il est5 possible de concentrer jusqu'à environ 20 fois la suspension de 1,5 litre de collagène, en une nuit. Le lendemain matin, le réservoir de collagène à filtrer est vide. La concentration finale dans le tube filtrant peut ensuite être complétée par entourage du tube avec un enroulement de papier filtre en cellulose. Il est ainsi possible de préparer un gel fibrillaire, sans bulles d'air, à une concentration de 3 à 6 %. Le gel fibrillaire de collagène stérile étant contenu dans un tube cylindrique, son transfert dans un récipient stérile peut se faire par simple pression manuelle sur les parois souples du tube. La répartition stérile du gel de collagène en seringues de l ml, par une machine automatique, sous le flux stérile, s'en trouve ainsi facilitée. L'augmentation d'échelle est facilement réalisée par l'addition côte à côte de plusieurs systèmes filtrants identiques dans l'enceinte stérile. Ces systèmes peuvent être reliés à un même réservoir contenant plusieurs dizaines de litres de la suspension à concentrer. L'intérêt majeur de ce procédé est qu'il ne nécessite qu'un minimum d'opérations manuelles et s'effectue exclusivement dans l'enceinte stérile. Le niveau de stérilité final obtenu est donc optimal. Exemple 2 : Concentration d'une suspension de précipité acide de collagène 20 Certains collagènes comme le collagène de type IV, ne forment pas de précipité fibrillaire en présence de phosphate à pH neutre. Pour ce collagène, comme pour tous les autres types fibrillaires ou non, une précipitation acide par addition de NaCl, à une concentration finale de 40 à 50 gll est possible. 25 Le précipité acide de l'un quelconque des types de collagène peut alors être récolté par le même mode opératoire que dans l'exemple 1. Si la solution initiale acide a été filtrée stérilement sur membranes de porosité 0,22 ou 0,45 micron, on obtient en final un précipité concentré stérile. Ce précipité acide concentré est contenu dans le tube filtrant qui peut ensuite être fermé à sa partie 30 supérieure, comme à sa partie inférieure, puis baigné dans une solution physiologique de pH neutre si nécessaire, pour en corriger lentement le pH. L'avantage majeur par rapport à un tube de dialyse est que la paroi de ce tube filtrant laisse passer l'eau par filtration (et non pas par osmose très lente) et ne 8 risque donc pas d'éclater. Pour la même raison, l'effet osmotique de dilution est largement évité et la préparation de concentrés acides ou neutres de tous les types de collagène est ainsi. possible. Ces concentrés peuvent servir à la fabrication des biomatériaux 5 coflagéniques connus, gels, films, éponges, granules, lentilles optiques, matériaux imprégnés, selon les techniques connues et publiées. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de collagène stérile,_ notamment de collagène injectable, comprenant les étapes de préparation d'une solution acide purifiée de collagène, de stérilisation de cette solution, notamment par filtration sur un filtre ou une membrane stérilisante, de précipitation de la solution stérile sous forme de suspension, et de concentration de la suspension de collagène, procédé dans lequel ladite suspension est placée dans un filtre tubulaire souple allongé constituant une paroi filtrante poreuse, perméable au liquide, mais non perméable aux fibres de collagène, et est concentrée par passage lent du liquide à travers ladite paroi, sans pression autre que la pesanteur, pour éviter le colmatage de la paroi filtrante par les fibres de collagène. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le liquide est absorbé par une couche absorbante, préalablement stérilisée, appliquée sur ladite paroi, ou faisant partie de celle-ci, et relargué à l'extérieur de ladite couche absorbante. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel cette absorption est effectuée vers la fin de la concentration. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel lesdites étapes sont conduites dans un même environnement stérile, notamment une hotte stérile. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel on conduit aussi, dans le 25 même environnement stérile, les étapes préalables d'obtention du collagène purifié et/ou ultérieures de répartition du collagène concentré en récipients ou seringues stériles. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel ledit filtre 30 tubulaire est formé par une nappe textile. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel le filtre présente une porosité de l'ordre de 1 micron.20 10 8. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, dans lequel la couche absorbante est choisie parmi la cellulose, les polyesters hydrophiles et les autres polymères hydrophiles. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel on dispose un moyen de recueil du liquide s'écoulant de ladite face éloignée de ladite couche absorbante, et/ou un dispositif d'évaporation dudit liquide. 10. Préparations stériles concentrées de collagène, notamment de collagène injectable, notamment pour le comblement des tissus, ou rides cutanées, obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.