FR 2917623 A1 20081226 FR 0704506 A 20070622 2917623 Utilisation d'un probiotique pour la prévention des infections des voies respiratoires Les infections acquises en milieu hospitalier sont considérées comme étant un facteur important pour le devenir des patients admis dans une unité de soins intensifs (USI). Chez les patients gravement malades, la colonisation du tube digestif et en particulier de l'estomac est considérée comme un facteur de risque vis à vis des pneumopathies acquises sous ventilation mécanique (1, 11, 38). En effet, le tractus gastro-intestinal constitue un réservoir pour nombre de pathogènes nosocomiaux (34), et la décontamination digestive sélective (DDS) est généralement utilisée comme stratégie de prophylaxie des infections. La DDS inclut notamment l'administration d'antibiotiques par voie locale, non absorbables, au niveau de l'oropharynx et entéral, en combinaison ou non avec une antibiothérapie systémique (par voie intraveineuise). Cette approche vise l'éradication de la colonisation de l'oropharynx, l'estomac et l'intestin par des microorganismes aérobies potentiellement pathogènes, tout en ne perturbant pas ou très peu la flore anaérobie endogène. Toutefois, la pression sélective exercée par la DDS antibiotique peut causer des effets secondaires importants, comme par exemple la surcroissance de microorganismes de la microflore endogène ou la résistance de microorganismes pathogènes d'origine exogène aux antibiotiques administrés (8, 22, 23, 28). De plus, l'administration en prophylaxie d'antiulcéreux , largement utilisés chez les patients d'USI, augmente le pH de l'estomac et de ce fait facilite la prolifération bactérienne. Il en résulte que l'estomac est la principale source de survenue de pneumopathies nosocomiales par voie rétrograde (7, 12, 19). Les probiotiques sont définis comme des étant des microorganismes vivants ou viables qui produisent un bénéfice sur la santé et notamment dans le traitement et la prévention de certaines pathologies (17). Il s'agit généralement de bactéries ou de levures. La plupart des probiotiques bactériens appartiennent aux genres Lactobacillus et Bifidobacterium ; ils doivent être non pathogènes, non toxiques et capables de survivre dans le tractus gastro-intestinal. Les applications des probiotiques ont principalement été limitées au traitement de désordres intestinaux tels que la diarrhée et les maladies inflammatoires (13, 16, 24, 27, 33, 36). Bien que le mécanisme d'action demeure à explorer, l'effet bénéfique des probiotiques sur le plan clinique a également été mis en évidence dans la prévention de vaginites, d'infections du tractus urinaire et de gastrites causées par Helicobacter pylori (21, 31, 32, 41). L'utilisation de probiotiques pour traiter les dermatites atopiques, plus particulièrement chez l'enfant, a également été décrite, notamment dans W02007023226. D'autres résultats tendent à montrer que les probiotiques pourraient aussi constituer à l'avenir une stratégie alternative à la décontamination digestive sélective (DDS). Une décroissance du taux d'infections post-opératoires fut observée chez les patients recevant oralement L. plantarum en combinaison avec une nutrition entérale en fibres (24). Des effets similaires furent obtenus dans des études impliquant des patients subissant des interventions chirurgicales abdominales majeures ou souffrant de pancréatites aiguës (13, 16). Il a été montré que la souche Lcr35 de Lactobacillus rhamnosus, est capable d'adhérer à des cellules intestinales et de coloniser de manière transitoire le tractus intestinal (10, 14). Des essais in vitro ont mis en évidence l'effet inhibiteur de Lcr35 sur la croissance de coques à Gram positif et de bacilles à Gram positif et négatif, dont notamment Pseudomonas aeruginosa (14). II a également été montré que le surnageant de culture de bactéries Lactobacillus rhamnosus cultivées sur un milieu de culture contenant du lactose, agissait comme un inhibiteur de croissance de bactéries pathogènes in vitro (14). Cependant aucune utilisation d'un probiotique bactérien n'a été décrite à l'encontre de pathologies respiratoires telles que des pneumopathies nosocomiales liées à la colonisation des voies respiratoires par des bactéries pathogènes. La présente invention concerne l'utilisation (i) de bactéries probiotiques sous forme vivante, ou (ii) du surnageant de culture de bactéries probiotiques cultivées sur un milieu comprenant du lactose, ou d'une substance extraite dudit surnageant de culture, pour la fabrication d'un médicament ou complément alimentaire destiné à prévenir ou retarder la colonisation du système respiratoire d'un patient par des bactéries pathogènes. Plus particulièrement, le médicament ou complément alimentaire selon l'invention vise à prévenir ou retarder la colonisation du système respiratoire d'un patient par des bactéries pathogènes qui colonisent les voies respiratoires par voie rétrograde après avoir séjourné dans le tractus gastro-intestinal, et plus particulièrement dans l'estomac. Dans une mise en oeuvre préférée, le médicament ou complément alimentaire selon l'invention prévient ou retarde également la colonisation du tractus gastro-intestinal, et notamment de l'estomac, par les bactéries pathogènes. Par médicament ou complément alimentaire, il faut entendre toute forme acceptable sur le plan pharmacologique, notamment sous forme de d'aliment diététique de complémentation orale, de produit d'hygiène, de denrée alimentaire ou diététique à fins médicales particulières (ou spéciales), ou dispositif médical, ou toute autre forme adaptée bien connue de l'homme du métier. Le médicament ou complément alimentaire est de préférence sous une forme galénique adaptée à l'administration orale, par exemple sous forme de suspension buvable ou de gélule. Il peut également se présenter sous forme de poudre ou granule à ajouter aux aliments ou à une boisson, ou bien à sucer. Par prévenir ou retarder la colonisation des voies respiratoires par des bactéries pathogènes, on entend notamment l'augmentation de la durée de non contamination (NAE) d'une pathologie des voies respiratoires causée par lesdites bactéries pathogènes ou l'augmentation de la durée médiane de séjour en milieu hospitalier ou encore d'intubation avant acquisition de cette pathologie, par rapport à la NAE ou à la durée médiane avant acquisition observée en l'absence de traitement avec le médicament ou complément alimentaire selon l'invention. L'augmentation de la NAE ou de la durée médiane de séjour en milieu hospitalier ou d'intubation avant acquisition est avantageusement d'au moins 10 jours, préférentiellement d'au moins 20 ou 30 jours. Par tractus gastro-intestinal (ou tube digestif ou appareil digestif), on entend l'ensemble des éléments impliqués dans la digestion, à savoir la bouche, l'cesophage, l'estomac, l'intestin grêle, le côlon et le rectum. Par voies respiratoires (ou voies aériennes), on entend l'ensemble des voies impliquées dans la respiration, à savoir, le nez, la bouche, le pharynx, le larynx, la trachée, les poumons et les bronches. Par colonisation par voie rétrograde, on entend le fait que les bactéries pathogènes séjournent dans un premier temps dans le tractus gastro-intestinal, et plus particulièrement dans l'estomac, avant de coloniser les voies respiratoires, notamment les bronches et les poumons. La durée de séjour au niveau de l'estomac avant contamination des voies respiratoires varie notamment en fonction du germe pathogène, de l'état de santé du patient et des traitements qui lui sont administrés. Cette durée peut par exemple être comprise entre 2 et 30 jours, entre 5 et 20 jours ou encore entre 10 et 20 jours. Dans une étude, il a été constaté que dans plus de 50% des cas, les germes sont isolés au niveau de l'estomac jusqu'à 16 jours avant d'être isolés au niveau de la trachée (19). Par séjourner, on entend le fait de pouvoir détecter les bactéries pathogènes par des techniques classiques mises en oeuvre par l'homme de métier à la date de l'invention. Les bactéries probiotiques utilisées pour la mise en oeuvre de la présente invention sont de préférence des bactéries du genre Lactobacillus, par exemple des bactéries de l'espèce L. rhamnosus (aussi nommée Lactobacillus casei subsp. rhamnosus), L. casei, L. reuteri, L. gasseri, L. johnsonii ou L. acidophilus. Préférentiellement, il s'agit de bactéries de l'espèce L. rhamnosus. Des exemples de souches de bactéries L. rhamnosus sont les souches Lcr35, GG (déposée à l'ATCC sous le numéro ATCC 53103) et GR-1. Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, les bactéries probiotiques sont des bactéries de la souche Lcr35, dérivée de l'espèce Lactobacillus rhamnosus, cette dernière étant déposée à l'ATCC sous le numéro ATCC 7469. La souche particulière Lactobacillus rhamnosus Lcr35 peut notamment être obtenue selon le protocole défini dans l'exemple 1 De préférence le probiotique est une bactérie capable de fermenter le lactose. Dans le choix d'un probiotique pour obtenir un produit selon l'invention, il est essentiel de rechercher une bactérie qui n'ait aucun effet pathogène et qui soit de préférence connue comme ayant de bonnes propriétés en ce qui concerne son taux de survie dans le tractus digestif. Un autre paramètre à prendre en compte est sa résistance aux procédés technologiques. Dans la mesure où elle présente les différents avantages mentionnés ci-dessus, la souche spécifique Lactobacillus rhamnosus Lcr35 est particulièrement préférée dans le cadre de la présente invention. Par ailleurs, les caractères fermentaires de cette souche sont particulièrement avantageux. II peut également être avantageux que le probiotique en question possède des résistances à la plupart des antibiotiques classiques. La souche Lcr35 notamment est résistante à la streptomycine, à la tétracycline, à l'érythromycine, à l'acide nalidixique, à l'acide pipémidique, à l'acide fusidique, à la colistine, à la polymyxine, au sulfaméthoxazole et à la triméthoprime. A l'inverse, il est des situations où le probiotique est de préférence sensible à la majorité des antibiotiques connus. Avantageusement, le médicament ou complément alimentaire comprend également un prébiotique, c'est-à-dire une substance qui ne peut être digérée par l'organisme du patient et qui a des effets bénéfiques sur la personne qui les consomme en stimulant la croissance ou l'activité de certaines bactéries non pathogènes et naturellement présentes dans l'organisme, et plus particulièrement dans le tractus gastro-intestinal, ou en facilitant la survie d'un probiotique administré simultanément. De préférence le prébiotique est le lactose et/ou l'amidon de pomme de terre. Le médicament ou complément alimentaire utilisé dans le cadre de la présente invention comprend de préférence des bactéries probiotiques sous forme vivante. Par vivante, il faut comprendre que l'intégrité de la cellule est conservée et que les processus cellulaires 5 2917623 se produisent ou peuvent se produire si la bactérie est cultivée dans un milieu et des conditions adéquates. Toute bactérie vivante peut être de nouveau ensemencée sur un milieu de culture adéquat et se multiplier, dans des conditions adéquates. La présente invention comprend donc notamment l'utilisation de bactéries probiotiques sous forme 5 lyophilisée ou sous forme congelée. Le médicament ou complément alimentaire selon l'invention peut se présenter sous toute forme appropriée. Des formes appropriées sont bien connues de l'homme du métier. Elles doivent notamment permettre d'assurer la survie du probiotique. Il est très important de tenir compte de trois facteurs essentiels qui sont l'atmosphère, l'humidité et la 10 température. Les différents moyens de conservation des probiotiques sont bien connus de l'homme du métier. De préférence, le médicament ou complément alimentaire est sous forme lyophilisée. En effet, cette forme assure non seulement une excellente conservation, mais elle permet également de préserver toute bactérie vivante faisant partie du médicament ou 15 complément alimentaire selon l'invention. Il est important de déterminer le dénombrement du probiotique lors de l'obtention d'un médicament ou complément alimentaire lyophilisé selon l'invention. La bactérie probiotique contenue dans le médicament ou complément alimentaire peut être le seul élément lyophilisé, mais de préférence, la bactérie est lyophilisée avec un 20 milieu de culture, par exemple un milieu à base notamment de lactose. Le médicament ou complément alimentaire peut bien sûr comprendre des constituants additionnels, en sus de la bactérie et du milieu à base par exemple de lactose. De tels constituants sont ou bien ajoutés avant lyophilisation des autres composants, ou bien après (cas par exemple des excipients permettant la mise en forme galénique du produit). 25 Dans un médicament ou complément alimentaire selon la présente invention, le nombre de bactéries ou germes par gramme de produit est de préférence supérieur à 1 x 108, par exemple compris entre 1 x 108 et 1 x 1010, plus particulièrement entre 1 x 108 et 1 x 109. Avant une éventuelle lyophilisation du médicament ou complément alimentaire selon l'invention, celui-ci est généralement sous forme liquide. Dans une telle situation, le 30 médicament ou complément alimentaire comprend de préférence une concentration dans le milieu égale ou supérieure à 1 x 108 UFC (unités formant colonies ou germes) par mL. Pour prévenir ou retarder la colonisation du système respiratoire d'un patient par des bactéries pathogènes, des doses comprenant chacune de préférence entre environ 1 x 108 et 1 x 1010 UFC de bactéries probiotiques sont administrée au patient. 6 2917623 Plusieurs prises, préférentiellement entre une et quatre, peuvent être administrées par jour. Les doses peuvent être ajustées, notamment en fonction de la corpulence du patient à traiter et de son éventuelle réaction au traitement. Dans une mise en oeuvre préférée, deux doses journalières d'un gramme contenant 5 chacune au moins 1 x 108 germes de bactéries probiotiques par gramme sont administrées avec au moins 8 heures d'intervalle entre chaque prise. Avantageusement, le médicament ou complément alimentaire selon l'invention comprend un probiotique sous forme vivante ainsi qu'un ou plusieurs prébiotiques pouvant être 10 dégradés par le probiotique. L'utilisation d'un ou plusieurs prébiotiques permet potentiellement d'accroître la durée de vie du probiotique après son administration au patient. En effet, du fait que le prébiotique correspond à un milieu de culture adapté au probiotique, lorsque le médicament ou complément alimentaire selon l'invention est administré (et notamment quand il se présente sous forme lyophilisée et qu'il est remis en 15 suspension avant l'ingestion), le probiotique se trouve immédiatement dans un milieu compatible avec sa survie. Cette association de prébiotique(s) et probiotique constitue un symbiotique. Selon une mise en oeuvre préférée, le probiotique est une bactérie capable de fermenter le lactose, par exemple une bactérie de la souche Lcr35, et le ou l'un des prébiotiques est 20 le lactose ou l'amidon de pomme de terre. Il est particulièrement avantageux que préalablement à son incorporation dans le médicament ou complément alimentaire selon l'invention, le probiotique soit cultivé sur un milieu contenant le ou les prébiotiques, de préférence un milieu contenant du lactose et/ ou de l'amidon de pomme de terre. En effet, dans ces conditions, le milieu contient 25 également des métabolites résultant de cette culture. Or certains de ces métabolites peuvent avoir des propriétés antimicrobiennes avantageuses. L'association de ces composés (probiotique, prébiotiques et métabolites) contribue à l'effet bénéfique sur les infections respiratoires. De préférence encore, en vue de l'obtention du médicament ou complément alimentaire, 30 le milieu dans lequel se trouve le probiotique demeure inchangé. Ceci évite un trop grand nombre d'étapes de centrifugation ; en effet, lors des centrifugations, les parois cellulaires des micro-organismes peuvent être endommagées, ce qui nuit à leur survie. Ainsi, en évitant de changer le probiotique de milieu et en réduisant par conséquent le nombre de centrifugations, on assure un meilleur taux de survie au probiotique. 35 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la bactérie probiotique est cultivée sur un milieu de culture contenant du lactose, et l'ensemble constitué par le probiotique et ce milieu est utilisé ensuite pour la préparation du médicament ou complément alimentaire selon l'invention. Avantageusement, la bactérie est cultivée pendant au moins 4 heures, au moins 12h, de préférence au moins 24, 48 ou 72 heures, voire plus, sur un milieu de culture à base notamment de lactose qui est ensuite éventuellement complété pour former le médicament ou complément alimentaire selon l'invention. Alternativement, le médicament ou complément alimentaire utilisé dans le cadre de la présente invention ne comprend pas le probiotique mais le surnageant de culture des bactéries probiotiques cultivées sur un milieu comprenant du lactose, et ce surnageant présente la capacité de prévenir ou retarder la colonisation, et plus particulièrement la colonisation par voie rétrograde, du système respiratoire d'un patient par des bactéries pathogènes. Avantageusement, la bactérie probiotique est cultivée pendant au moins 4 heures, au moins 12h, de préférence au moins 24, 48 ou 72 heures, voire plus, sur le milieu de culture à base de lactose avant que le surnageant ne soit collecté, puis utilisé pour la préparation du médicament ou complément alimentaire selon l'invention. Alternativement encore, le médicament ou complément alimentaire utilisé dans le cadre de la présente invention ne comprend pas le probiotique mais une substance active produite par les bactéries probiotiques, extraite du surnageant de culture des bactéries probiotiques cultivées sur un milieu comprenant du lactose, et présentant la capacité de prévenir ou retarder la colonisation, et plus particulièrement la colonisation par voie rétrograde, du système respiratoire d'un patient par des bactéries pathogènes. Avantageusement, la bactérie probiotique est cultivée pendant au moins 4 heures, au moins 12h, de préférence au moins 24, 48 ou 72 heures, voire plus, sur le milieu de culture à base de lactose avant que ladite substance active ne soit extraite du surnageant, puis utilisée pour la préparation du médicament ou complément alimentaire selon l'invention. Que le médicament ou complément alimentaire utilisé pour la mise en oeuvre de la présente invention comprenne le probiotique, le surnageant de culture du probiotique ou une substance extraite de ce surnageant de culture, le probiotique est avantageusement cultivé dans un premier temps sur un milieu à base de lactose contenant au moins 5% en masse de lactose, de préférence au moins 20%. Ledit milieu est de préférence stérile avant ensemencement avec le probiotique. De préférence, un tel milieu est un milieu de culture (de fermentation) contenant donc d'autres substances. Le milieu est de préférence un milieu essentiellement constitué de lait, par exemple de lait écrémé. Le milieu à base de lactose contient avantageusement également de l'amidon de pomme de terre. II peut contenir également de la dextrine maltose. Tout autre composé ou excipient pharmacologiquement acceptable peut également entrer dans la composition d'un milieu à base de lactose comme défini. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le milieu à base de lactose correspond à un milieu de culture compatible avec la fermentation du lactose par la bactérie probiotique comprise dans le produit selon l'invention. De préférence, le probiotique utilisé n'est pas ensemencé ou cultivé sur du MRS. Les bactéries pathogènes peuvent notamment mais non limitativement être des bactéries de la famille des Pseudomonadaceae, Moraxellaceae, Streptococcaceae, Pasteurellaceae, Staphylococcaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae ou Xanthomonadaceae. Il s'agit plus particulièrement de bactéries reconnues comme étant à l'origine de pneumopathies, notamment de pneumopathies acquises en milieu hospitalier, telles que par exemple Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Stenotophomonas maltophilia, Staphylococcus aureus, Enterobacter, Enterococcus faecium ou Xanthomonas maltophilia. Plus particulièrement il s'agit de bactéries Pseudomonas aeruginosa. Les bactéries pathogènes peuvent également être des bactéries présentant une résistance à un ou plusieurs antibiotiques, notamment mais non limitativement une résistance à un antibiotique appartenant à la famille des Bêta-lactamines (comprenant notamment les Pénicillines, Carbapénèmes et Céphalosporines), Aminosides, Phénicols, Tétracyclines, Sulfamides-Triméthoprime ou Quinolones. Plus particulièrement, il peut s'agir d'une résistance à la Pénicilline G, la Méthycilline, l'Oxacilline, l'Ampicilline, l'Amoxicilline, l'Ertapénème, la Ceftizoxime, la Ceftriazone, la Ceftazidime, la Streptomycine, la Gentamicine, la Kanamycine, le Chloramphénicol, la Tétracycline, la Triméthoprime ou la Rifampicine. Il peut plus particulièrement s'agir de bactéries Pseudomonas aeruginosa résistantes, notamment des bactéries Pseudomonas aeruginosa résistantes à la Ceftazidime. Par pneumopathie, on entend une infection du tissu pulmonaire causée le plus souvent par une infection pulmonaire due à des bactéries, virus, germes atypiques, mycose ou d'autres parasites. La présente invention couvre plus particulièrement le cas où les bactéries pathogènes sont à l'origine d'une infection nosocomiale. Par infection nosocomiale, on entend une infection contractée dans un établissement de soins. Une infection est considérée comme telle lorsqu'elle était absente au moment de l'admission du patient. Lorsque l'état infectieux du patient à l'admission est inconnu, l'infection est classiquement considérée comme nosocomiale si elle apparaît après un délai de 48 heures d'hospitalisation. Une pneumopathie infectieuse nosocomiale (PN) est définie comme une infection pulmonaire acquise après au moins 48 heures d'hospitalisation. Le terme de pneumopathie nosocomiale acquise sous ventilation mécanique (PNAVM) concerne les infections acquises après 48 heures au moins de ventilation artificielle invasive. Le taux de mortalité des patients atteints d'une pneumopathie nosocomiale est d'environ 50%. Par ventilation mécanique, on entend le fait de suppléer ou assister à la respiration spontanée d'un patient à l'aide d'un appareil (respirateur ou ventilateur). La ventilation mécanique est généralement pratiquée dans un contexte de soins critiques (urgences, soins intensifs) et d'anesthésie. L'interface patient-ventilateur est généralement réalisée par l'intermédiaire d'une sonde endotrachéale, d'un masque étanche, d'une canule de trachéotomie ou d'un masque laryngé. Le médicament ou complément alimentaire selon l'invention peut être administré par diverses voies. Selon un mode de réalisation privilégié, il est administré par voie orale ou nasale. Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, le médicament ou complément alimentaire est administré par l'intermédiaire d'une sonde nasogastrique. Le patient traité recevant le médicament ou complément alimentaire tel que décrit est de préférence un être humain, de préférence un adulte. Par adulte, on entend toute personne âgée d'au moins 18 ans. Alternativement, le médicament ou complément alimentaire selon l'invention peut être employé à des fins vétérinaires, le patient considéré pouvant en ce cas notamment être un mammifère autre que l'homme, par exemple un singe, un chien, un chat ou un lapin. Le médicament ou complément alimentaire selon l'invention peut être administré à des patients hospitalisés ou non. Selon une mise en oeuvre préférée, la composition est administrée à des patients hospitalisés, par exemple dans un service d'anesthésie, de réanimation ou de chirurgie. Il s'agit notamment de patients sous assistance respiratoire. Le médicament ou complément alimentaire est par exemple destiné à être administré au patient pendant une durée d'une à six semaines, ou de deux à quatre semaines. Le médicament ou complément alimentaire selon l'invention peut être administré aux patients préalablement à leur hospitalisation, par exemple pendant une à trois semaines, et/ou pendant la durée de leur hospitalisation ou de leur placement sous assistance respiratoire, et/ou après leur sortie de l'hôpital, par exemple pendant une à trois semaines. De préférence, le médicament ou complément alimentaire est administré au patient pendant toute la durée de son séjour en milieu hospitalier. De préférence, le médicament ou complément alimentaire tel que décrit est destiné à être administré à des patients hospitalisés pour une durée d'au moins 2 jours, d'au moins 4 jours, d'au moins 7 jours ou d'au moins deux semaines. De préférence encore, dans le cas de patients placés sous ventilation mécanique, le médicament ou complément alimentaire est administré au patient pendant toute la durée durant laquelle le patient est placé sous ventilation mécanique. Le pH stomacal de patients hospitalisés, par exemple dans une unité de soins intensifs, est généralement supérieur à la normal, par exemple supérieur à environ 4, du fait de l'administration de médicaments prophylactiques destinés notamment à minimiser le risque de survenue d'un ulcère. II est estimé que cette élévation du pH peut faciliter la survie ou la prolifération de bactéries pathogènes mais également du probiotique au niveau de l'estomac. Dans un mise en oeuvre particulière de l'invention, le médicament ou complément alimentaire tel que décrit est administré à des patients dont le pH stomacal est supérieur à 4. Le médicament ou complément alimentaire peut être administré en association avec un autre médicament, tel qu'un antibiotique ou un anti-ulcéreux. Selon un autre mode de réalisation privilégié, il s'agit d'un anti-ulcéreux gastrique. Selon une mise en oeuvre particulière, il s'agit d'un inhibiteur de la pompe à protons. Selon un mode de réalisation privilégié, le médicament ou complément alimentaire est destiné à être administré en association, en prévention et/ou à la suite d'un traitement antibiotique préventif. Une étude a été menée afin de déterminer si l'administration orale d'un médicament selon l'invention, contenant le probiotique L. rhamnosus, souche 35 (Lcr 35), pouvait prévenir la colonisation de l'estomac et des voies respiratoires par le pathogène P. aeruginosa, et ainsi impacter le développement d'un processus infectieux. Lcr35 fut administré sous forme de poudre par voie orale ou par le biais d'une sonde nasogastrique, ce en quoi cette étude diffère d'études précédentes dont l'objectif était de modifier la flore intestinale. Des études antérieures in vivo sur des volontaires humains ayant montré que L. rhamnosus colonise le tractus intestinal lorsque 1 x 108 UFC/jour sont administrées (10), il fut choisi d'utiliser une dose minimale de 1 x 108 UFC/12h. Le principal résultat de cette étude est d'avoir montré que l'administration d'organismes probiotiques pour réduire le risque d'infection due à P. aeruginosa représente une alternative à la DDS. En effet, les colonisations bronchiques, nasales et digestives sont survenues plus fréquemment chezles patients recevant le placebo (groupe A) que chez les patients recevant Lcr35 (groupe B). Des études précédentes avaient montré que P. aeruginosa, et notamment des souches P. aeruginosa multirésistantes sont principalement isolées après un long séjour en milieu hospitalier incluant une période sous assistance respiratoire supérieure à 7 jours (2, 6, 29, 39, 40). Les résultats de cette étude ont montré que le délai moyen d'acquisition de P. aeruginosa était plus élevé chez les patients du groupe B que chez les patients du groupe A, et ce notamment pour des prélévements bronchiques. Enfin, une différence significative d'un point de vue statistique a été observée dans les délais de survenue des pneumopathies acquises sous ventilation mécanique (PAVM) entre les deux groupes (avec un nombre de cas inférieur pour les patients du groupe B. Cette étude confirme ainsi que l'administration orale de probiotiques représente une alternative pour prévenir la colonisation des voies respiratoires par ce pathogène et peut être un moyen de limiter cette contamination jusqu'à l'arrêt du recours à l'assistance respiratoire. Dans l'ensemble, les résultats obtenus indiquent que l'administration du Lcr35 pour prévenir les complications infectieuses liées à la décontamination sélective du tube digestif entérale, représente une stratégie alternative partielle mais néanmoins intéressante. Par ailleurs, bien que les probiotiques aient été largement utilisés depuis de nombreuses années dans l'industrie alimentaire et aient dans l'ensemble présenté d'excellents résultats sur le plan de la sécurité (20), la principale préoccupation associée à leur utilisation concerne le risque de sepsis. Dans cette étude, qui n'a pas inclus de patients immuno-déprimés, aucun cas de sepsis n'a été observé parmi les patients du groupe B recevant 2 doses journalières de la souche de Lactobacillus Lcr35. Partie expérimentale Exemple 1 : Obtention de la souche Lactobacillus rhamnosus Lcr35 lyophilisée et conditionnement. Réactivation Les germes obtenus dans le commerce (Bacilor des laboratoire Lyocentre) ou issus de la souchothèque des laboratoires Lyocentre, sont remis en activité en ensemençant avec 100 à 200 mg du produit lyophilisé 10mL de milieu au lait écrémé enrichi (glucose 15g/L, extrait de levure 5g/L). Ce tube est placé dans une étuve à 37 C pendant 72 heures. 1 mL de la culture de ce premier tube est introduit dans un second tube contenant 10mL de milieu au lait enrichi stérile, ce tube est placé à l'étuve à 37 C, pendant 72 heures. Cette opération est recommencée plusieurs fois de manière à obtenir une population la plus importante possible, supérieure à 1 x 109 germes par mL. Préparation du pied de cuve 1 mL de cette souche réactivée est introduit dans un ballon contenant 180mL de lait écrémé enrichi stérilisé puis cultivé à 37 C pendant 72 heures, ce pied de cuve sert à ensemencer les ballons. Milieu de culture Afin de pouvoir disposer d'une culture lyophilisée de Lactobacillus rhamnosus (aussi dénommée Lactobacillus casei var. rhamnosus) de titre adapté, celle-ci est élaborée simultanément selon 2 procédés de culture différents : sur milieu simplifié sur milieu enrichi a) constituants des milieux : 1. Milieu simplifié : 100g lait écrémé en poudre Eau, qsp 1,000 L 2. Milieu enrichi: 16,650g lait écrémé en poudre Glucose 4,450g Sulfate de manganèse 0,028g Citrate de sodium 0,560g Phosphate monopotassique 1,780g Phosphate dipotassique 3,560g25 13 Autolysat de levure de bière 1,670g Eau, qsp 1,000 L b) Préparation et stérilisation des milieux : 100g 1. Milieu simplifié : formule : lait écrémé en poudre Eau, qsp 1,000 L Méthode : Dans un contenant, mettre 200 litres d'eau et ajouter par petites fractions sous agitation lente les 28kg de lait écrémé en poudre. Après complète dispersion, ajuster à 280 L avec de l'eau. Ce lait est réparti en contenants correctement bouchés et stérilisés à l'autoclave pendant 30 minutes à 115 C. 2. Milieu enrichi : Formule pour un contenant de 2000 litres Méthode : Dans un contenant, mettre 1000L d'eau, puis sous agitation rapide, ajouter le lait ; après complète dispersion ajouter le glucose, le sulfate de manganèse, le citrate de sodium, les phosphates mono et dipotassique, et enfin l'autolysat de levure de bière. Après dispersion complète, ajuster à 1800 litres par de l'eau. Ensuite, toujours sous agitation, stériliser ce milieu à 115 C pendant 30 minutes puis 30 refroidir pour le ramener à 37 C. Ensemencement et culture a) milieu simplifié : Introduire par contenant de 1 à 2 ml de préculture provenant du pied de cuve, sous une 35 hotte à flux d'air laminaire vertical. lait écrémé en poudre 30,00kg Glucose 8,00kg Sulfate de manganèse 0,05kg Citrate de sodium 1,00kg Phosphate monopotassique 3,20kg Phosphate dipotassique 6,40kg Autolysat de levure de bière 3,00kg Eau, qsp 1800,00 L Ensuite ces contenants sont placés pendant 72 heures dans des étuves de bactériologie maintenues à 37 C, plus ou moins 2 C. b) milieu enrichi : Introduire par contenant de 1800 litres, 2,4 litres de préculture provenant du pied de cuve. Maintenir grâce à un dispositif thermostaté approprié la température à 37 C pendant 48 heures sous agitation lente. Préparation de la culture pour lyophilisation : a) milieu simplifié : constituants : - culture de Lactobacillus rhamnosus 136,8 L - amidon de pomme de terre 35,0 kg - lactose 15,0 kg - suspension d'hydroxyde de calcium q.s. pour neutralisation pH=7,0 Méthode de préparation : Sous hotte à flux d'air laminaire, verser la culture obtenue dans une cuve de 200 litres, agiter fortement pour briser le caillé et ajouter sous agitation rapide l'amidon de pomme de terre et le lactose. Quand leur dispersion est totale, mesurer le pH qui doit être voisin de 3. Ensuite, avec de l'hydroxyde de calcium, neutraliser ce mélange jusqu'à pH=7,0 t 0,1. b) milieu enrichi constituants : 25 - suspension d'hydroxyde de calcium q.s. pour neutralisation pH=7,0 30 Méthode de préparation : La culture de Lactobacillus. rhamnosus est centrifugée en continu dans une centrifugeuse pour éliminer totalement le surnageant. Le culot est récupéré sous hotte à flux d'air laminaire, il est mélangé sous agitation rapide avec les excipients de lyophilisation. Ensuite, à l'aide d'hydroxyde de calcium, neutraliser ce mélange jusqu'à pH=7,0 0,1. 35 Lyophilisation - culture de Lactobacillus rhamnosus 1800,0 L - amidon de pomme de terre 6,6 kg - lactose 3,3 kg - dextrine maltose 6,0 kg 15 2917623 Les préparations de culture de Lactobacillus rhamnosus pour lyophilisation sont réparties aseptiquement dans des plateaux en acier inoxydable. Congeler rapidement à -40 C, ensuite effectuer la sublimation à -22 C. Quand le produit a dépassé le seuil de 0 C, réaliser un étuvage à +37 C. 5 Selon les préparations mises en oeuvre, les quantités obtenues de produit sec lyophilisé sont environ les suivantes : Culture lyophilisée de Lactobacillus. rhamnosus Milieu simplifié 57 kg Milieu enrichi 17 kg Broyage, mélanqe, conditionnement a) broyage 10 Dans une pièce à atmosphère déshumidifiée (H.R. inférieure à 50% et filtrée (filtration 99,999)), la culture lyophilisée de Lactobacillus rhamnosus est récupérée, broyée et tamisée sur calibreur de type oscillant équipé d'une grille de 60 MESH, un échantillon est prélevé pour dénombrement des lactobacilles. Le produit est conservé dans des containers hermétiquement clos. 15 Après titrage des Lactobacillus rhamnosus vivants, les produits sont homogénéisés afin d'obtenir une matière première de titre désiré. b) mélange Afin d'obtenir des lots de culture lyophilisée de Lactobacillus rhamnosus de 200 à 225 kg 20 dont le titre est compris entre 1 x 109 et 1 x 1010 germes par gramme, un mélange est effectué dans un mélangeur doux selon la méthode suivante : -Q.S. de culture lyophilisée de Lactobacillus rhamnosus sur milieu simplifié. -Q.S. de culture lyophilisée de Lactobacillus rhamnosus sur milieu enrichi, de telle sorte que le poids du mélange final soit compris entre 200 et 225 kg d'une poudre dont le titre est compris entre 1 x 109 et 1 x 1010 germes par gramme. c) conditionnement Après mélange, des échantillons sont prélevés pour contrôles. Le reste du mélange est conditionné en fonction de la demande en containers adaptés hermétiquement clos. 30 Puis cette poudre est mise en forme galénique. Exemple 2 : Prévention de la colonisation des voies respiratoires par Pseudomonas aeru_ginosa La colonisation du tube digestif par des agents pathogènes nosocomiaux représente un facteur de risque pour les patients des unités de soins intensifs (USI) et peut conduire fréquemment à une pneumopathie acquise sous ventilation mécanique. Par ailleurs, la décontamination digestive sélective faisant appel à des antibiotiques peut promouvoir l'émergence de résistances microbiennes. C'est pourquoi l'identification de méthodes alternatives permettant de diminuer la concentration en agents pathogènes opportunistes ou d'origine exogène dans le tube digestif et les voies respiratoires supérieures sans augmenter la pression sélective liée aux antibiotiques présente un grand intérêt. La prévention de la colonisation de l'estomac des patients par des agents pathogènes susceptibles d'acquérir une résistance aux antibiotiques, faisant appel à l'administration orale de probiotiques est en conséquence une alternative intéressante. En modifiant la composition de la flore endogène, les probiotiques et plus particulièrement les bactéries lactiques sont bien adaptés à des environnements acides, connus pour prévenir la croissance de bactéries non-acidophiles, la fonction de barrière de l'intestin pourrait être renforcée et contribuer à la prévention d'infections nosocomiales associées à la contamination de l'intestin. Pour tester cette hypothèse, une étude clinique prospective fut menée sur 211 patients d'USI afin d'étudier la prévention du portage digestif d'un agent pathogène à l'origine d'infections nosocomiales, P. aeruginosa, au moyen de l'administration orale d'un probiotique connu, Lactobacillus rhamnosus Lcr35 (10, 14). Les patients furent randomisés en deux groupes, 104 d'entre eux appartenant au groupe probiotique (groupe B) reçurent deux doses journalières d'au moins 1 x 108 UFC de Lcr35, les 107 restant appartenant au groupe placebo (groupe A) reçurent deux doses journalières du milieu de culture sans le prébiotique. La recherche de Pseudomonas aeruginosa s'est faite sur des prélèvements par écouvillons du nez et de l'anus, par aspiration du liquide gastrique et sur des prélèvements bronchiques. Des analyses bactériologiques d'échantillons prélevés pour suivre l'état d'infection des patients furent également monitorées. Quel que soit le type d'échantillons, P. aeruginosa fut isolé chez moins de patients du groupe B que du groupe A, avec une différence significative dans le délai moyen d'acquisition de 50 contre 11 jours (p=0,001), et une durée moyenne de non contamination de 48 contre 15 jours (p=0,01) des P. aeruginosa isolés dans les prélèvements bronchiques. Par ailleurs la survenue de pneumopathies acquises sous ventilation mécanique fut moins fréquente chez les patients du groupe B (2,9%) que du groupe A (7,5%). MATERIEL ET METHODES A - Sujets Les patients âgés de 18 ans et plus dont la durée de séjour dans l'USI était d'au moins 48h furent inclus pour l'étude. Les patients présentant l'une des caractéristiques suivantes furent exclus : âgés de moins de 18 ans, immuno-déprimés, présentant une neutropénie inférieure à 500/mm3, atteints de syndrome digestif hémorragique, présentant une contre- indication à une l'administration de liquide par voie entérale, présentant une colonisation par P. aeruginosa résistant à la Ceftazidime détectée par le prélèvement réalisé à l'admission ou par un prélèvement respiratoire dans les 4 premiers jours de l'hospitalisation en réanimation. B - Cadraqe de l'étude Cette étude prospective randomisée en double aveugle fut menée dans une USI comptant 17 lits au sein du centre hospitalier universitaire de Clermont-Ferrand (France) entre mars 2003 et octobre 2004. L'étude a été réalisée en accord avec la déclaration d'Helsinki et fut approuvée sur le plan éthique par le comité consultatif de protection des personnes dans la recherche biomédicale d'Auvergne (CCPRB, AU 479). Avant d'être inclus dans l'étude, les patients ou leurs parents les plus proches donnèrent leur consentement éclairé. Le milieu de culture sans le probiotique (placebo) ou le probiotique sous sa forme pharmaceutique disponible (L. rhamnosus lyophilisé contenant au moins 1 x 108 UFC/g) furent administrés deux fois par jour aux patients respectivement des groupes A et B par l'intermédiaire d'une sonde nasogastrique à double lumière (Maxter-catheters, Marseille, France) ou oralement après le retrait de la sonde, du troisième jour après l'admission jusqu'à la fin de séjour dans le service. C - Données cliniques Les données cliniques suivantes ont été collectées : age, sexe, score de gravité à l'admission (SAPS) (25), comorbidité, et traitements antibiotiques préalables. Tout au long de l'étude, l'administration d'antibiotiques et les données bactériologiques furent enregistrées. La pneumopathie acquise sous ventilation mécanique (PAVM) fut définie par au moins un échantillon obtenu par prélèvement distal protégé (PDP) ou par brosse télescopique protégée (BTP) contenant plus de 103 UFC/mI, ou par un aspirat entéro- 17 trachéal contenant plus de 105 UFC/ml, par la présence d'un nouvel infiltrat parenchymateux sur une radiographie de thorax, et par l'un des signes suivants : sécrétion trachéale purulente, fièvre (température > 38,5 C), présence de bactéries pathogènes dans une hémoculture en dehors d'une autre source d'infection ou un lavage broncho-alvéolaire (LBA) présentant plus de 5% de cellules ayant des bactéries intracellulaires. D - Echantillons microbiologiques Des prévévements nez, anus et, tant que le tube gastrique était en place, des prélèvements gastriques ont été réalisés à l'admission, une fois par semaine et à la sortie. Chez les patients recevant une alimentation entérale, les prélèvements gastriques furent réalisés avant le changement des bouteilles de produit nutritif. Lorsque aucun résidu gastrique ne fut obtenu, 10 ml de sérum physiologique furent injectés dans la sonde et aspirés. Les prélèvements gastriques furent ensemencés sur gélose Drigalski en présence ou en absence de Ceftazidime (4mg/l) et sur gélose Mueller-Hinton, puis après 10 dilutions successives sur gélose MRS (Oxoïd, Basinstoke, UK) afin de pratiquer une analyse quantitative du taux de L. rhamnosus Lcr35. Les prélèvements nez et anus furent immergés dans 1 ml de solution sérum physiologique et ensemencés sur gélose Drigalski contenant 4mg/l de Ceftazidime. Les colonies apparues furent identifiées à l'aide d'une galerie ID32GN (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France). Les résultats des analyses d'échantillons prélevés par le laboratoire hospitalier en vue de diagnostics microbiologiques de routine en raison de l'état d'infection des patients furent également intégrés à l'étude. E - Analyse statistique Les analyses statistiques ont été réalisées avec le programme SPSS 11.0 (SPSS, Paris, France). Le test du Chi-deux ou le test exact de Fisher furent utilisés pour comparer les variables qualitatives, et le test t de Student ou le test non paramétrique de Mann-Whitney furent utilisés pour les variables quantitatives. Pour chaque patient, la moyenne géométrique des concentrations bactériennes fut calculée pour chacun des types d'échantillons. La médiane obtenue pour les différents patients fut incluse dans les résultats. Le seuil de signification statistique fut fixé à 0,05. Les taux de patients non colonisés par P. aeruginosa furent estimés et les deux groupes furent comparés en utilisant la méthode des courbes de survie selon Kaplan Meier et le test de Logrank. La durée moyenne de non contamination (NAE), ainsi que la durée de séjour sans acquisition de Pseudomonas aeruginosa, furent calculée après exclusion des patients chez lesquels les bactéries considérées furent isolées au cours des 4 premiers jours de séjour dans l'unité. RESULTATS Les résultats sont détaillés dans le tableau 1 ci-après. Prélèvements Ecouvillon nasal Liquide gastrique Voies respiratoires Groupe2 A B A B A B P. aeruginosa Présence lors de 2 2 0 2 1 1 l'admission Acquisition au 7 3 6 3 13 5 cours du séjour Durée médiane 17(8-46) 37(31-69) 30(6-53) 16(6-18) 11 (5-40) 50(11-75) avant acquisition (extrêmes)3 NAE moyenne (IC)4 75 (65-84) 83 (74-91) 73 (61-85) 87 (82-92) 15 (9-21) 48 (26-70) % NA au 21e jour 92.8 100 97.6 94.6 85.4 98.5 % NA au 42e jour 85.3 90.1 84.8 94.6 71.6 92.9 P. aeruginosa CAZK Présence lors de 0 1 0 0 0 0 l'admission Acquisition au 5 2 3 1 5 0 cours du séjour Durée médiane 17 (8-33) 50 (31-69) 10 (6-33) 18 20 (5-40) NA avant acquisition NAE moyenne 79 (72-87) 85 (77-93) 83 (78-89) 89 (86-92) 78 (69-87) NA oc) ' % NA au 21e jour 94.3 100 97.6 97.9 93.6 100 % NA au 42e jour 86.8 95.8 93.2 97.9 82.3 100 1 0 1. Echantillon obtenu par prélèvement distal protégé (PDP) ou par brosse télescopique protégée (BTP) présentant plus de 10' UFC/ml ou aspirat endotrachéal contenant plus de 105 UFC/ml 2. Groupe A (n = 107), placebo ; groupe B (n = 104), patients recevant Lcr35 par voie oral deux fois par jour 3. Durée moyenne du séjour hospitalier avant acquisition bactérienne calculée en utilisant les méthodes de Kaplan Meier et de Logrank 15 4. NAE = durée moyenne de non contamination ; IC = Intervalle de confiance Tableau 1 û Fréquence des patients infectés par P. aeruginosa au moment de l'admission et au cours du séjour, durée médiane avant acquisition et durée moyenne de non contamination (NAE) A Inclusion des patients Au total 211 patients furent inclus, parmi lesquels 104 reçurent la souche probiotique (groupe B). La plupart des patients furent hospitalisés à la suite d'une opération chirurgicale (29,4%), d'un traumatisme (24,2%) ou d'une détresse respiratoire (11,4%). Aucune différence significative ne fut à noter entre les patients des groupes A et B tant au niveau de l'âge (âge moyen, 51, SD 15,2 vs 57,2 SD 17,1) (SD = écart-type), du sexe (sex ratio homme/femme, 0,30 vs 0,55), du score de gravité à l'admission (SAPS moyen, 44 SD 15,2 vs 44,6 SD 15,9), de la durée médiane d'hospitalisation (14 vs 14 jours), de la durée médiane d'intubation gastrique (11 vs 12 jours), trachéale (9 vs 12 jours), de la ventilation mécanique (13,5 vs 14 jours) ou de l'utilisation de cathéters (14 vs 14,5 jours). Il n'y eut aucune différence significative entre les antibiotiques administrés avant et pendant l'étude. Aucun des patients ne reçut de pipéracilline ou de céphalosporines de première génération avant ou pendant leur séjour ; la seule différence concerne le fluconazole, administré respectivement à 27 patients du groupe A et à 45 patients du groupe B (p=0,006). Des doses d'oméprazole de 20mg/jour furent administrées à 90 (84,7%) et 93 (89,4%) patients respectivement des groupes A et B comme traitement prophylactique de l'ulcère de stress. B - Détection de Lcr35 dans les aspirats gastriques Lactobacillus rhamnosus fut détecté dans le liquide gastrique de 53 patients du groupe B. Il fut détecté dans 49,6 % (SD 24,9) des séjours hospitaliers et la durée médiane de séjour avant sa détection fut de 13 jours (IC 9-17). La concentration bactérienne médiane fut de 103/ml (extrêmes 102-106/ml). Aucun patient ne contracta d'infection au Lactobacillus en cours de l'étude. Lcr35 n'a pas colonisé l'estomac de tous les patients du groupe B puisqu'il n'a été détecté que dans l'estomac de 51% des patients testés. Des facteurs individuels inconnus, tels que la composition de la flore endogène, pourraient expliquer que certains patients n'aient pas été colonisés, car aucun lien statistique n'a été observé entre la colonisation par Lcr35 et le traitement antibiotique. C - Détection de P. aeruginosa Dans chaque groupe, des souches P. aeruginosa furent isolées au cours des 3 premiers jours suivant l'admission, et ce à partir des prélèvements par écouvillon de nez ; un seul patient du groupe B présenta une colonisation par P. aeruginosa résistant à la Ceftazidime. Pendant la durée de l'étude et parmi les autres patients (105 et 104 respectivement pour les groupes A et B), P. aeruginosa fut détecté dans les écouvillons de nez de 7 et 3 patients. Seuls 5 (4,7%) et 2 (1,9%) de ces prélèvements provenant respectivement des groupes A et B présentèrent une résistance à la Ceftazidime. Les délais médians d'acquisition de P. aeruginosa dans les écouvillons de nez furent de 17 jours (extrêmes 8-46) dans le groupe A et de 37 jours (extrêmes 31-69) dans le group B, et les NAE moyennes furent de 75 jours (IC 65-84) dans le groupe A et de 83 jours (IC 74-91) dans le groupe B. Dans les groupes A et B respectivement, 92,8% et 100% des patients au 21 ème jour, et 85,3% et 90,1% au 42ème jour, n'avaient pas acquis P. aeruginosa. Par ailleurs, la différence observée entre les patients des deux groupes présentant des prélèvements résistants à la Ceftazidime ne fut pas significative. Des souches de P. aeruginosa furent isolées dans le liquide gastrique de seulement deux patients du groupe B au cours des trois premiers jours de séjour ; aucun de ces prélèvements ne présentant une résistance à la Ceftazidime. Au cours de l'étude, 6 et 3 patients parmi respectivement les 107 (groupe A) et 102 (groupe B) patients restants, acquirent P. aeruginosa au niveau gastrique. Seuls 3 (2,8%) et 1 (1,0%) patients appartenant respectivement aux groupes A et B acquirent des souches résistantes à la Ceftazidime. Trois patients du groupe B acquirent quant à eux concomitamment Lcr35 et P. aeruginosa dans le liquide gastrique. Les délais médians d'acquisition de P. Aeruginosa au niveau gastrique furent de 30 jours (extrêmes 6-53) dans le groupe A et de 16 jours (extrêmes 6-18) dans le groupe B, et les NAE furent de 73 jours (IC 61-85) pour le groupe A et 87 jours (IC 82-92) pour le groupe B. De la même manière que pour les prélèvements par écouvillon du nez, la différence observée entre les deux groupes de patients présentant des souches résistantes à la Ceftazidime ne fut significative. L'analyse des échantillons prélevés au niveau des voies respiratoires montra la présence de souches P. aeruginosa chez un patient de chaque groupe au moment de l'admission ; aucun de ces échantillons ne présenta une résistance à la Ceftazidime. Au cours de l'étude, 13 échantillons positifs dont 5 résistants à la Ceftazidime furent détectés dans le groupe A contre 5 seulement, tous sensibles à la Ceftazidime dans le groupe B. Une différence significative fut observée vis-à-vis des délais médians d'acquisition de P. aeruginosa au niveau des voies respiratoires qui furent de 11 jours (extrêmes 5-40) dans le groupe A et de 50 jours (extrêmes 11-75) dans le groupe B (p=0,01), et les NAE furent de 15 jours (IC 9-21) pour le groupe A et 48 jours (IC 26-70) pour le groupe B (p=0,01, test de Logrank). Dans les groupes A et B respectivement, 85,4% et 98,5% des patients au 21eme jour; et 71,6% et 92,9% au 42éme jour, n'avaient pas acquis P. aeruginosa. Ce micro-organisme fut aussi responsable de pneumopathies acquises sous ventilation mécanique (PAVM) chez 8 patients du groupe A et 3 patients du groupe B. Les délais médians d'acquisition d'une PAVM furent respectivement de 15 jours (extrêmes 5-40) pour le groupe A et de 65 jours (extrêmes 11-75) pour le groupe B. La présence de P. aeruginosa a également été recherchée dans les prélèvements anaux. Aucun ne fut positif à l'admission, mais au cours de la durée de l'étude, les écouvillons anaux d'un patient de chaque groupe furent positifs. Ces deux souches étaient résistantes à la Ceftazidime. P. aeruginosa fut détecté dans d'autres échantillons chez trois autres patients au cours de leur séjour, un isolat résistant à la Ceftazidime dans le groupe A et deux isolats sensibles à la Ceftazidime dans le groupe B. Références 1. Alcon, A., N. Fabregas, and A. Torres. 2003. Hospital-acquired pneumonia: etiologic considerations. Infect Dis Clin North Am 17:679-95. 2. American Thoracic Society. 1996. Hospital-acquired pneumonia in adults: diagnosis, assessment of severity, initial antimicrobial therapy, and preventive strategies. A consensus statement, American Thoracic Society, November 1995. Am J Respir Crit Care Med 153:1711-25. 3. Anderson, A. D., C. E. McNaught, P. K. Jain, and J. MacFie. 2004. Randomised clinical trial of synbiotic therapy in elective surgical patients. Gut 53:241-5. 4. Bengmark, S. 1998. Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic flora. Gut 42:2-7. 5. Bengmark, S. 2004. Synbiotics to strengthen gut barrier function and reduce morbidity in critically ill patients. Clin Nutr 23:441-5. 6. Bert, F., and N. Lambert-Zechovsky. 1998. [Bacteria isolated from protected bronchopulmonary samples: variation as a function of the previous length of stay in the recovery room]. Pathol Biol (Paris) 46:380-4. 7. Bonten, M. J., C. A. Gaillard, R. van der Hulst, P. W. de Leeuw, S. van der Geest, E. E. Stobberingh, and P. B. Soeters. 1996. Intermittent enterai feeding: the influence on respiratory and digestive tract colonization in mechanically ventilated intensive-care-unit patients. Am J Respir Crit Care Med 154:394-9. 8. Bonten, M. J., B. J. Kullberg, R. van Dalen, A. R. Girbes, I. M. Hoepelman, W. Hustinx, J. W. van der Meer, P. Speelman, E. E. Stobberingh, H. A. Verbrugh, J. Verhoef, and J. H. Zwaveling. 2000. Selective digestive decontamination in patients in intensive care. The Dutch Working Group on Antibiotic Policy. J Antimicrob Chemother 46:351-62. 9. Boyle, R. J., R. M. Robins-Browne, and M. L. Tang. 2006. Probiotic use in clinical practice: what are the risks? Am J Clin Nutr 83:1256-64; quiz 1446-7. 10. de Champs, C., N. Maroncle, D. Balestrino, C. Rich, and C. Forestier. 2003. Persistence of colonization of intestinal mucosa by a probiotic strain, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus Lcr35, after oral consumption. J Clin Microbiol 41:1270-3. 11. Dodek, P., S. Keenan, D. Cook, D. Heyland, M. Jacka, L. Hand, J. Muscedere, D. Foster, N. Mehta, R. Hall, and C. Brun-Buisson. 2004. Evidence-based clinical practice guideline for the prevention of ventilator-associated pneumonia. Ann Intern Med 141:305-13. 12. Driks, M. R., D. E. Craven, B. R. Celli, M. Manning, R. A. Burke, G. M. Garvin, L. M. Kunches, H. W. Farber, S. A. Wedel, and W. R. McCabe. 1987. Nosocomial pneumonia in intubated patients given sucralfate as compared with antacids or histamine type 2 blockers. The rote of gastric colonization. N Engl J Med 317:1376-82. 13. Fedorak, R. N., and K. L. Madsen. 2004. Probiotics and the management of inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 10:286-99. 14. Forestier, C., C. De Champs, C. Vatoux, and B. Joly. 2001. Probiotic activities of Lactobacillus casei rhamnosus: in vitro adherence to intestinal cells and antimicrobial properties. Res Microbiol 152:167-73. 15. Giantsou, E., N. Liratzopoulos, E. Efraimidou, M. Panopoulou, E. Alepopoulou, S. Kartali-Ktenidou, G. I. Minopoulos, S. Zakynthinos, and K. I. Manolas. 2005. Both early-onset and late-onset ventilator-associated pneumonia are caused mainly by potentially multiresistant bacteria. Intensive Care Med 31:1488-94. 16. Guarner, F., and J. R. Malagelada. 2003. Gut flora in health and disease. Lancet 361:512-9. 17. Havenaar, R., J. Huis, and J. Veld. 1992. Probiotics: a general view. Elsevier Applied Science, London, UK. 18. Ibrahim, E. H., S. Ward, G. Sherman, and M. H. Kollef. 2000. Acomparative analysis of patients with early-onset vs late-onset nosocomial pneumonia in the ICU setting. Chest 117:1434-42. 19. Inglis, T. J., M. J. Sherratt, L. J. Sproat, J. S. Gibson, and P. M. Hawkey. 1993. Gastroduodenal dysfunction and bacterial colonisation of the ventilated lung. Lancet 341:911-3. 20. Ishibashi, N., and S. Yamazaki. 2001. Probiotics and safety. Am J Clin Nutr 73:465S- 470S. 21. Kabir, A. M., Y. Aiba, A. Takagi, S. Kamiya, T. Miwa, and Y. Koga. 1997. Prevention of Helicobacter pylori infection by lactobacilli in a gnotobiotic murine model. Gut 41:49-55. 22. Kollef, M. H. 1996. Private attending physician status and the withdrawal of Iife- sustaining interventions in a medical intensive care unit population. Crit Care Med 24:968-75. 23. Kollef, M. H. 1993. Ventilator-associated pneumonia. A multivariate analysis. Jama 270:1965-70. 24. Kruis, W. 2004. Review article: antibiotics and probiotics in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther 20 Suppl 4:75-8. 25. Le Gall, J. R., S. Lemeshow, and F. Saulnier. 1993. A new Simplified Acute Physiology Score (SAPS II) based on a European/North American multicenter study. Jama 270:2957-63. 26. O'May, G. A., N. Reynolds, and G. T. Macfarlane. 2005. Effect of pH on an in vitro model of gastric microbiota in enterai nutrition patients. Appt Environ Microbiol 71:4777-83. 27. Reid, G., J. Jass, M. T. Sebulsky, and J. K. McCormick. 2003. Potential uses of probiotics in clinicat practice. Clin Microbiol Rev 16:658-72. 28. Rello, J., V. Ausina, M. Ricart, J. Castella, and G. Prats. 1993. Impact of previous antimicrobial therapy on the etiology and outcome of ventilator-associated pneumonia. Chest 104:1230-5. 29. Rello, J., V. Ausina, M. Ricart, C. Puzo, E. Quintana, A. Net, and G. Prats. 1994. Risk factors for infection by Pseudomonas aeruginosa in patients with ventilatorassociated pneumonia. Intensive Care Med 20:193-8. 30. Rello, J., M. Sa-Borges, H. Correa, S. R. Leal, and J. Baraibar. 1999. Variations in etiology of ventilator-associated pneumonia across four treatment sites: implications for antimicrobial prescribing practices. Am J Respir Crit Care Med 160:608-13. 31. Saavedra, J. M., N. A. Bauman, 1. Oung, J. A. Perman, and R. H. Yolken. 1994. Feeding of Bifidobacterium bifidum and Streptococcus thermophilus to infants in hospital for prevention of diarrhoea and shedding of rotavirus. Lancet 344:1046-9. 32. Sakamoto, I., M. Igarashi, K. Kimura, A. Takagi, T. Miwa, and Y. Koga. 2001. Suppressive effect of Lactobacillus gasseri OLL 2716 (LG21) on Helicobacter pylori infection in humans. J Antimicrob Chemother 47:709-10. 33. Sartor, R. B. 2004. Therapeutic manipulation of the enteric microflora in inflammatory bowel diseases: antibiotics, probiotics, and prebiotics. Gastroenterology 126:1620-33. 34. Stiefel, U., and C. J. Donskey. 2004. The Role of the Intestinal Tract As a Source for Transmission of Nosocomial Pathogens. Curr Infect Dis Rep 6:420-425. 35. Stoutenbeek, C. P., H. K. van Saene, D. R. Miranda, and D. F. Zandstra. 1984. The effect of selective decontamination of the digestive tract on colonisation and infection rate in multiple trauma patients. Intensive Care Med 10:185-92. 36. Sullivan, A., and C. E. Nord. 2002. Probiotics in human infections. J Antimicrob Chemother 50:625-7. 37. Tenover, F. C., and J. M. Hughes. 1995. WHO Scientific Working Group on monitoring and management of bacterial resistance to antimicrobial agents. Emerg Infect Dis 1:37. 38. Torres, A., M. el-Ebiary, N. Soler, C. Monton, J. Gonzalez, and J. Puig de la Bellacasa. 1995. The rote of the gastric reservoir in ventilator-associated pneumonia. Clin Intensive Care 6:174-80. 39. Trouillet, J. L., J. Chastre, A. Vuagnat, M. L. Joly-Guillou, D. Combaux, M. C. Dombret, and C. Gibert. 1998. Ventilator-associated pneumonia caused by potentially drugresistant bacteria. Am J Respir Crit Care Med 157:531-9. 40. Trouillet, J. L., A. Vuagnat, A. Combes, N. Kassis, J. Chastre, and C. Gibert. 2002. Pseudomonas aeruginosa ventilator- associated pneumonia: comparison of episodes due to piperacillin-resistant versus piperacillin-susceptible organisms. Clin Infect Dis 34:1047-54. 41. Vanderhoof, J. A. 2001. Probiotics: future directions. Am J Clin Nutr 73:1152S-1155S. Revendications 1. Utilisation (i) de bactéries Lactobacillus sous forme vivante, ou (ii) du surnageant de culture de bactéries Lactobacillus cultivées sur un milieu comprenant du lactose, ou d'une substance extraite dudit surnageant de culture, pour la fabrication d'un médicament ou complément alimentaire destiné à prévenir ou retarder la colonisation du système respiratoire d'un patient par des bactéries pathogènes qui colonisent les voies respiratoires par voie rétrograde après avoir séjourné dans le tractus gastro-intestinal, et plus particulièrement dans l'estomac. 2. Utilisation selon la revendication 1, où ledit médicament ou complément alimentaire prévient ou retarde également la colonisation du tractus gastro-intestinal, et notamment de l'estomac, par lesdites bactéries pathogènes. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, où lesdites bactéries pathogènes appartiennent à la famille des Pseudomonadaceae, Moraxellaceae, Streptococcaceae, Pasteurellaceae, Enterococcaceae ou Xanthomonadaceae. 4. Utilisation selon la revendication 3, où les bactéries pathogènes sont des bactéries de l'espèce Pseudomonas aeruginosa. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où les bactéries 25 Lactobacillus sont des bactéries Lactobacillus rhamnosus ou des Lactobacillus casei, par exemple des Lactobacillus rhamnosus de la souche Icr 35. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, où ledit médicament ou complément alimentaire comprend des bactéries Lactobacillus vivantes ainsi qu'un 30 prébiotique. 7. Utilisation selon la revendication 6, où ledit prébiotique est le lactose et/ou l'amidon de pomme de terre.20 8. Utilisation selon la revendication 6 ou 7, où ledit médicament ou complément alimentaire comprend également des métabolites produits par lesdites bactéries Lactobacillus. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, où le patient est un humain. 10. Utilisation selon la revendication 9, où le patient est âgé de 18 ans ou plus. 11. Utilisation selon la revendication 9, où le patient est hospitalisé, plus particulièrement où le patient est hospitalisé dans un service d'anesthésie, de réanimation ou de chirurgie. 12. Utilisation selon la revendication 11, où ledit patient est hospitalisé pour une durée d'au moins 2 jours. 13. Utilisation selon la revendication 11 ou 12, où le patient est placé sous ventilation mécanique. 14. Utilisation selon la revendication 13, où ledit médicament ou complément alimentaire est destiné à être administré audit patient pendant toute la durée durant laquelle il est placé sous ventilation mécanique. 15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, où lesdites bactéries pathogènes sont des agents causatifs d'une infection nosocomiale. 16. Utilisation selon la revendication 15, où ladite infection nosocomiale est une pneumopathie, plus particulièrement une pneumopathie acquise sous ventilation mécanique. 17. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, où les bactéries pathogènes sont résistantes aux antibiotiques. 18. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, où ledit médicament ou 35 complément alimentaire est destiné à être administré sous forme lyophilisée.30 19. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, où ledit médicament ou complément alimentaire est destiné à être administré par voie orale. 20. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, où ledit médicament ou complément alimentaire est destiné à être administré par voie nasale, plus particulièrement par l'intermédiaire d'une sonde nasogastrique. 21. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, où ledit médicament ou complément alimentaire comprend un nombre de bactéries Lactobacillus compris entre 1 x 108 et 1 x 1010 unités formant colonies, préférentiellement entre environ 1 x 108 et 1 x 109 unités formant colonies par ml ou par gramme. 22. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, où ledit médicament ou complément alimentaire est destiné à être administré en association avec un autre médicament. 23. Utilisation selon la revendication 22, où ledit médicament ou complément alimentaire est destiné à être administré en association avec un anti-ulcéreux. 24. Utilisation selon la revendication 23, où ledit anti-ulcéreux est un inhibiteur de la pompe à protons. 25. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, où ledit médicament ou complément alimentaire est destiné à être administré en association, en prévention ou à la suite d'un traitement antibiotique préventif. 26. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 25, où le pH stomacal du patient est supérieur à 4. 27. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 26, où ledit médicament ou complément alimentaire est destiné à être administré à raison de deux doses d'un gramme par jour, chaque dose comprenant un nombre de bactéries égal ou supérieur à 1 x 108 germes par gramme. 28. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 27, où lesdites bactéries Lactobacillus ont préalablement été cultivées sur un milieu à base de lactose pendant au moins 24, 48 ou 72 heures.5