FR 2918377 A1 20090109 FR 0704860 A 20070705 L'invention concerne des gels injectables de polysaccharides co-réticulés, le procédé de préparation desdits gels injectables, ainsi que leurs utilisations notamment en chirurgie réparatrice, en chirurgie esthétique, et en chirurgie de comblement des tissus biologiques. lo [0002] Les gels (et hydrogels, lorsque les gels sont présents en milieu aqueux) injectables de polysaccharides résorbables (ou biodégradables) ou de polymères permanents sont connus et utilisés dans de larges domaines thérapeutiques et esthétiques depuis de longues années. [0003] Ainsi des gels de polymères biodégradables sont injectés dans 15 l'articulation du genou ou de la hanche en cas d'arthrose pour supplémenter le liquide synovial déficient et restaurer temporairement les propriétés chondroprotectrices dudit liquide biologique. [0004] Ces mêmes solutions viscoélastiques injectables peuvent été utilisées pour optimiser la chirurgie de la presbytie, suite aux incisions sclérales 20 permettant de modifier la courbure de l'oeil. En effet, l'injection de tels gels biodégradables au coeur desdites incisions permettra de supprimer la cicatrisation bord à bord des incisions ou rétraction qui annulerait le bénéfice de la chirurgie. [0005] Si la durée de rémanence du gel biodégradable est suffisante, la 25 cicatrisation aura eu lieu avant la disparition finale du gel. Ce dernier permettra donc de garantir une bonne cicatrisation des incisions sans rétraction ainsi qu'une cicatrisation optimale de la cornée. Le gel viscoélastique utilisé devra cependant être cohésif et suffisamment rémanent pour garantir la réussite de l'opération. 30 [0006] Dans le même type d'application, des solutions viscoélastiques sont injectées pour séparer certains tissus. Ces solutions injectables sont par exemple utilisées pour éviter des adhésions péritonéales suite à une intervention chirurgicale, mais aussi dans le sphincter, l'urètre. -2 [0007] Enfin, ce type de solutions viscoélastiques est particulièrement utilisé en chirurgie esthétique ou réparatrice, afin de combler les rides ou les défauts cutanés, pour augmenter le volume des lèvres, des pommettes ou du menton, et pour la correction des cicatrices. s [0008] Dans ce domaine de comblement des rides et défauts cutanés, deux types principaux de produits sont utilisés, ceux à base de produits ou polymères permanents, type gel de silicone ou gel de polyacrylamide, et ceux à base de produits biorésorbables comme le collagène ou l'acide hyaluronique, ainsi que ses sels et dérivés, réticulés ou non. io [0009] Les produits biphasiques sont une variante des solutions ci-dessus et consistent à injecter des particules permanentes ou semi-permanentes préalablement dispersées dans un gel biorésorbable qui sert de matrice d'injection. [0010] Les produits permanents sont sujets à controverse suite aux réactions 15 secondaires qu'ils peuvent générer, de type granulomes, nodules ou ulcères de la peau, liés la plupart du temps au phénomène de rejet à corps étrangers. Ces réactions secondaires peuvent apparaître très tardivement et sont alors particulièrement difficiles à traiter. La migration éventuelle des produits dans des tissus sousjacents peut également être très néfaste (voir Management of 20 complications after implantation of fillers , K. De Boulle, Journal of Cosmet. Derm., 3, (2004), 2-15 ; Foreign body granulomas due to injectable aesthetic microimplants , C. Rudolph et P. Soyer, Surg. Pathol., 23, (1999), 113-7). [0011] Ainsi les injections de silicone, très utilisées auparavant, ont parfois été la cause de siliconomes (nodules inflammatoires) (voir Adverse reactions to 25 injectable soft tissue permanent fillers , L. Christensen et V. Breiting, Aesthetic Plastic Surgery, 29, (2005), 34-48), voire de réactions allergiques tardives. De même des réactions de nature infectieuse ont été observées dans les premières années qui ont suivi l'injection de gel polyacrylamide (APS, 29, (2005), 34-48). [0012] Il en est de même pour les injections de produits contenant des 30 particules solides, celles-ci, si elles sont non résorbables ou à cinétique de résorption très lente (tel le PLA, environ 5 ans) peuvent dans certains cas entraîner des réactions inflammatoires chroniques, voire l'apparition de granulomes. -3 [0013] Le principe de ces gels avec particules est basé sur une réponse à corps étrangers. En effet, ces particules sont censées générer une réaction inflammatoire à corps étranger supposée stimuler la synthèse de nouvelles fibres de collagène en induisant une prolifération des fibroblastes, voire une fibrose, ce qui participera à la création de volumes ( Management of complications after implantation of fillers , K. De Boulle, Journal of Cosmet. Derm., 3, (2004), 2-15). [0014] Cependant la difficulté est de trouver le bon équilibre entre la génération d'une prolifération légère et maîtrisée de fibroblastes, et l'apparition de réactions inflammatoires trop fortes générant des infections, ou d'une fibrose io trop importante, non maîtrisée, qui deviendra gênante. [0015] Les réactions inflammatoires sont également directement liées à la taille des particules. Ainsi les particules inférieures à 10 pm sont inadaptées à l'injection sous-cutanée car elles vont pouvoir migrer plus facilement en dehors du site ; elles seront également phagocytées très rapidement. 15 [0016] Cependant, dans le cas d'injections à visée esthétique (comblement des rides et défauts cutanés, augmentation du volume des lèvres), la taille des particules ne doit pas non plus être trop importante afin de pouvoir être injectées à travers des aiguilles de diamètre fin. Le compromis est donc difficile à maîtriser industriellement. 20 [0017] Les produits injectables avec particules, tels qu'ils viennent d'être définis, se positionnent sur deux marchés complémentaires de l'esthétique : • les produits de comblement des rides profondes, et • les volumateurs , qui sont destinés à redonner du volume dans les pommettes, le menton, etc... 25 [0018] Cependant du fait des effets secondaires liés aux particules, et/ou à l'aspect permanent de certains implants, les praticiens injecteurs préconisent de plus en plus des implants résorbables. [0019] Parmi les produits résorbables, le collagène a été largement utilisé. Il 30 a toutefois été montré qu'il pouvait être parfois à l'origine de réactions allergiques. Pour cette raison, il a été progressivement délaissé au profit des sels d'acide hyaluronique. Cette mise à l'écart trouve également une autre raison dans son origine bovine, avec les risques connus aujourd'hui qu'elle peut entraîner. -4 [0020] Les gels d'acide hyaluronique, en particulier ses sels et/ou dérivés, réticulés ont donc pris une part importante sur le marché du comblement des rides et défauts cutanés. Ils bénéficient d'une rémanence accrue suite à la réticulation du polysaccharide, et sont bien perçus du fait de leur bonne tolérance s liée à l'innocuité et à la pureté du polysaccharide, d'origine non animale pour la majorité des produits. [0021] Cependant, afin d'augmenter la rémanence du gel injecté dans les tissus, de forts taux de réticulation sont souvent utilisés, rendant le gel difficile à injecter et limitant la précision du geste chirurgical, pouvant même générer plus so d'ecchymoses, ou d'oedèmes post-injection qu'habituellement, ce qui ne satisfait ni les médecins ni les sujets traités. [0022] La demande de brevet CA 2 561 685 décrit des particules de matériau viscoélastique, sous forme de particules de gel, injectables, lorsqu'elles sont soumises à une solution saline physiologique. .15 [0023] Dans la demande de brevet EP 0 466 300 est décrit un gel biphasique, la première phase comprenant des particules d'un gel polymère gonflé uniformément distribuées, par simple mélange, dans une solution viscoélastique d'un polymère formant la seconde phase. [0024] La demande de brevet FR 2 865 737 divulgue un procédé de 20 fabrication d'un gel réticulé biocompatible, ledit procédé comprenant la réticulation d'une quantité prédéterminée d'au moins un polymère biocompatible, puis l'ajout d'une quantité supplémentaire de polymère, avec dilution et réticulation. Le gel réticulé biocompatible obtenu est un gel dont le degré de réticulation varie, avec des zones fortement réticulées dont le taux de réticulation 25 diminue progressivement. 5] Un premier objectif de la présente invention consiste à proposer un gel injectable permettant de s'affranchir des défauts et inconvénients des gels injectables connus aujourd'hui et utilisés notamment dans les domaines de la 30 chirurgie réparatrice, chirurgie esthétique, chirurgie de comblement des tissus biologiques et autres. [0026] Plus particulièrement, la présente invention a pour objectif des gels injectables permettant de garantir une rémanence accrue et suffisante pour la -5 pathologie ou le défaut traité, rémanence alliée à une facilité d'injection au cours de l'acte clinique, même à travers de fines aiguilles comme généralement requis en chirurgie esthétique. [0027] Un autre objectif de l'invention consiste à proposer un gel cohésif, afin d'assurer son maintien sur le site d'injection et d'éviter sa migration dans les tissus voisins, tout en garantissant un bon remplissage du volume visé. [0028] Selon un autre objectif, l'invention propose un produit sous forme de gel présentant une double action : • un comblement immédiat et durable ; et io un phénomène de relance fibroblastique potentiel suite à une réaction légère à corps étrangers (les particules) permettra d'augmenter le volume sous-cutané. [0029] D'autres objectifs encore apparaîtront à la lumière de la description de l'invention qui suit. 15 [0030] La Demanderesse a maintenant découvert que ces objectifs sont atteints en totalité ou en partie grâce aux gels cohésifs injectables de polysaccharides co-réticulés décrits plus en détails ci-après. [0031] Selon un premier objet, la présente invention concerne un gel cohésif co-réticulé comprenant : 20 1) au moins un premier gel de polysaccharide fortement réticulé, et 2) au moins un second gel de polysaccharide faiblement réticulé, ledit au moins premier gel étant lié par liaisons de covalence audit au moins second gel. [0032] Le polysaccharide constituant le gel fortement réticulé peut être 25 identique à, ou différent du polysaccharide constituant le gel faiblement réticulé. [0033] Les polysaccharides qui peuvent être mis en oeuvre dans le gel de la présente invention sont de tout type connu dans le domaine et sont de préférence choisis parmi ceux produits par fermentation bactérienne. Généralement les polysaccharides utilisables dans le cadre de la présente 30 invention présentent une masse moléculaire Mw comprise entre environ 0,03 et environ 6 MDa, de préférence comprise entre environ 0,04 et environ 4 MDa, de préférence encore comprise entre environ 0,05 et environ 3 MDa. -6 [0034] Ils sont ainsi généralement choisis parmi les polysaccharides et leurs dérivés et leurs mélanges, et notamment parmi l'acide hyaluronique et ses sels, la chondroïtine sulfate, le kératan, le kératan sulfate, l'héparine, l'acide alginique, la cellulose et ses dérivés (carboxyméthylcellulose, hydroxypropylméthyl- s cellulose, ...), les alginates, la gomme xanthane, le chitosane, et parmi les mélanges de deux ou plusieurs d'entre eux. [0035] On préfère particulièrement l'acide hyaluronique et ses sels, en particulier ses sels acceptables du point de vue physiologique, tels que les sels de sodium, potassium, calcium, avantageusement le sel de sodium. Sont so également avantageusement utilisés la chondroïtine sulfate et ses sels et les dérivés cellulosiques tel que l'hydroxypropylméthylcellulose, et les mélanges de deux ou plusieurs d'entre eux. De manière particulièrement préférée, le gel fortement réticulé et le gel faiblement réticulé sont à base de hyaluronate de sodium. 15 [0036] En effet, le hyaluronate de sodium présente des propriétés particulièrement avantageuses en raison de son recul important d'utilisation en injection intradermique, intra-articulaire, intrapéritonéale, et autres, ainsi que pour ses excellentes propriétés rhéologiques. [0037] Le gel selon la présente invention comprend donc un premier 20 polysaccharide fortement réticulé et un second polysaccharide faiblement réticulé, lesdits premier et second polysaccharide étant liés entre eux par liaisons de covalence, c'est-à-dire que les deux polysaccharides sont co-réticulés. [0038] Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le polysaccharide fortement réticulé se présente sous la forme de particules, de 25 taille généralement comprise entre 10 pm et 5 mm, de préférence entre 20 pm et 1 mm, idéalement entre 50 pm et 500 pm, et réparties de manière homogène dans le polysaccharide faiblement réticulé (la matrice), lesdites particules de polysaccharide fortement réticulé étant liées de manière covalente (ou encore co-réticulées) à la matrice (polysaccharide faiblement réticulé). 30 [0039] L'agent de co-réticulation permettant la formation des liaisons de covalence entre les particules de polymère fortement réticulé et la matrice de polysaccharide faiblement réticulé, est de tout type connu en soi et peut par exemple être avantageusement choisi parmi les agents de réticulations -7 eux-mêmes connus pour effectuer les réticulation des polysaccharides, comme on le verra plus loin. [0040] Il doit être compris que le gel selon la présente invention comprend deux gels distincts, l'un fortement réticulé, l'autre faiblement réticulé, les deux s gels étant liés entre eux par liaison de covalence, le gel faiblement réticulé présentant au moins une zone dans laquelle le taux de réticulation (noté X2 dans la suite) est substantiellement constant. Avantageusement, le gel faiblement réticulé présente au moins une zone dans laquelle le taux de réticulation (X2) est substantiellement constant et le gel fortement réticulé présente au moins une io zone dans laquelle le taux de réticulation (noté X1 dans la suite) est substantiellement constant, avec X1 supérieur à X2. [0041] Par l'intermédiaire de particules de gel fortement réticulé, elles-mêmes co-réticulées au sein d'une matrice plus faiblement réticulé, le gel selon la présente invention présente une double action : comblement immédiat et 15 durable dû au gel final (matrice et particules co-réticulées au sein de cette matrice) et dans un deuxième temps, lorsque la matrice plus faiblement réticulée est biodégradée dans les tissus, phénomène de relance fibroblastique potentiel suite à une réaction légère à corps étrangers (les particules) entraînant une augmentation du volume sous-cutané. 20 [0042] En effet, les particules des polysaccharide fortement réticulées ont un aspect souple et conformable, celles-ci étant des particules de gel totalement biocompatibles (résorbables) et non des particules rigides, susceptibles d'entraîner une très légère réaction à corps étranger et ainsi d'éviter les complications décrites plus haut avec les produits biphasiques à particules 25 solides et plus ou moins rigides. 3] Selon la présente invention, le gel de polysaccharides co-réticulés conduit, après hydratation dans un tampon isotonique, à un hydrogel cohésif composé d'une matrice d'un ou plusieurs polysaccharides, tels que définis 30 précédemment, ladite matrice étant réticulée avec des particules de ce même polysaccharide, ou d'un ou plusieurs autres polysaccharides, fortement réticulées et liées à cette matrice. Cet hydrogel est injectable même à travers des aiguilles de fin diamètre. -8 [0044] Le taux de réticulation d'une part du polysaccharide fortement réticulé et d'autre part du polysaccharide faiblement réticulé sont des paramètres importants à respecter : le taux de réticulation du polysaccharide fortement s réticulé doit être suffisamment élevé pour garantir un gel selon l'invention qui soit cohésif, et le plus rémanent possible. D'autre part, le taux de réticulation du polysaccharide faiblement réticulé doit être suffisamment élevé pour garantir un gel cohésif, monophasique, et qui reste implanté au site d'injection sans se propager hors dudit site, sans toutefois être trop élevé pour une utilisation aisée io notamment par injection. [0045] Dans la présente invention, on définit un premier taux de réticulation X1, caractéristique du gel fortement réticulé qui est ensuite réduit en particules de gel réticulé (comme on le verra plus loin), et un deuxième taux de réticulation X2, caractéristique de la matrice de polysaccharides incorporant les particules 15 qui seront réticulées en son sein. [0046] Chacun des taux de réticulation Xl et X2 est défini comme étant égal au rapport : nombre de moles de réticulant introduites dans le milieu réactionnel X nombre total de motifs disaccharides introduits dans le milieu réactionnel [0047] Typiquement, le polysaccharide fortement réticulé présente un taux 20 de réticulation Xl compris entre environ 0,2 et environ 0,7, préférentiellement entre environ 0,22 et environ 0,6. Quant au polysaccharide faiblement réticulé, son taux de réticulation X2 est typiquement compris entre environ 0,03 et environ 0,3, de préférence entre environ 0,05 et environ 0,25. [0048] Dans le gel de la présente invention, le rapport pondéral entre le 25 polysaccharide fortement réticulé et le polysaccharide faiblement réticulé peut varier dans de très larges proportions, selon la nature des polysaccharides utilisés, leurs taux de réticulation respectifs, et également selon l'utilisation envisagée. [0049] Généralement la proportion pondérale des particules de 30 polysaccharide fortement réticulé dans le produit fini est comprise entre environ 0,5 à 99%, préférentiellement de 5 à 60%, plus préférentiellement de 10 à 40%. -9 [0050] Selon un second aspect, la présente invention concerne le procédé de préparation du gel injectable co-réticulé, tel qu'il vient d'être, ledit procédé comprenant les étapes de : a) réticulation en milieu aqueux, en présence d'un agent réticulant d'au moins un premier polysaccharide jusqu'à un taux de réticulation X1 ; b) broyage dudit premier polysaccharide en particules de granulométrie souhaitée ; c) éventuellement séchage dudit premier polysaccharide réticulé ; d) mélange des particules sèches ou hydratées dans un milieu aqueux ; io e) ajout d'au moins un second polysaccharide (identique ou différent de celui-ci employé à l'étape a)) ; f) réticulation dudit au moins second polysaccharide en présence d'un agent réticulant jusqu'à un taux de réticulation X2 et co-réticulation en présence d'un agent réticulant dudit au moins second polysaccharide faiblement réticulé 15 avec les particules dudit au moins premier polysaccharide fortement réticulé ; et g) récupération d'un gel co-réticulé comprenant des particules d'au moins un premier polysaccharide fortement réticulé, liées de manière covalente à une matrice d'au moins un second polysaccharide faiblement réticulé. 20 [0051] Dans le procédé de préparation qui vient d'être décrit, les deux étapes de réticulation/co-réticulation a) et f) sont réalisées dans un milieu dont la valeur de pH est sensiblement la même, voire identique. Chacune de ces étapes peut être effectuée en milieu acide ou basique, de préférence en milieu basique, par exemple à un pH compris entre 8 et14, de préférence entre 8 et 13. 25 [0052] Les réactions de réticulation et co-réticulation mises en oeuvre dans le précédé de l'invention sont des réactions bien connues de l'homme du métier. Pour chaque polysaccharide et/ou agent réticulant, l'homme du métier pourra mettre au point et optimiser les conditions de réticulations en fonction dudit ou desdits polysaccharide(s) et dudit ou desdits agent(s) réticulant(s) : taux de 30 réticulation, température, pH. Il est cependant précisé que les étapes de réticulation et de co-réticulation sont réalisées à pH constant, soit acide, soit basique, comme indiqué précédemment. ù 10 [0053] Les agents réticulants qui interviennent dans les étapes de réticulation et de co-réticulation sont généralement des réticulants bi- ou poly-fonctionnels de différents types, et peuvent par exemple être choisis parmi la DVS (divinylsulfone) en milieu alcalin (voir US 4 582 865), les époxy bi- ou poly-fonctionnels (voir US 4 716 154), les carbodi-imides, le formaldéhyde (voir GB 2 151 244). [0054] On préfère en particulier les agents de type bi- ou poly-époxydes, les réactions se faisant en milieu basique pour générer des liaisons éther avec les fonctions ûOH du polysaccharide, ou en milieu acide ce qui donne lieu à des io liaisons de type ester. La demande de brevet WO 2000/46253 utilise successivement ces deux conditions de pH afin d'optimiser la réticulation du polysaccharide. On préfère toutefois réaliser les réactions de réticulation et de co-réticulation en conditions de pH basique, puisque, en milieu aqueux, les liaisons ester, obtenues en milieu acide, sont généralement plus labiles que les 15 liaisons éther, obtenues en milieu basique. [0055] À titre d'agent réticulant, on peut utiliser un époxyde ou ses dérivés, et notamment le 1,4-butanedioldiglycidyléther (BDDE), le diépoxy-octane ou le 1,2-bis-(2,3-époxypropyl)-2,3-éthylène. On préfère tout particulièrement utiliser le 1,4-butanedioldiglycidyléther (BDDE) pour chacune des étapes de réticulation 20 et de co-réticulation. [0056] Il doit être compris que chacune des étapes de réticulation et de co-réticulation peut être effectuée avec un ou plusieurs agents réticulants, ceux-ci pouvant être identiques ou différents dans l'une ou l'autre des étapes de (co-)réticulation, dans les conditions de pH indiquées plus haut. 25 [0057] De manière générale, les taux de réticulation X1 et X2 sont exprimés comme indiqués ci-dessus, la caractéristique étant que X1 est très supérieur à X2, comme décrit plus haut. [0058] Après chacune des étapes a) et f) de réticulation, les polysaccharides fortement réticulé et faiblement réticulé/co-réticulé peuvent avantageusement 30 être purifiés, selon des techniques classiques de purification (par exemple par lavage par flux d'eau continu, bains de dialyse, et autres), afin d'éliminer l'agent de réticulation résiduel n'ayant pas réagi. -11 [0059] En outre, les étapes de réticulation/co-réticulation a) et f) peuvent avantageusement être suivies d'une étape de neutralisation (i.e. jusqu'à une valeur de pH d'environ 7), par exemple par ajout d'une quantité appropriée d'acide chlorhydrique IN. [0060] Le broyage du premier polysaccharide sec ou hydraté peut être effectué selon tout procédé connu dans le domaine, et par exemple peut être un broyage mécanique, notamment au moyen d'un broyeur de type Ultraturrax, ou par cisaillement au cours de la pression à travers des tubes de diamètres intérieurs maîtrisés, pour obtenir les tailles souhaitées selon l'application lo envisagée. [0061] Selon une première variante du procédé de l'invention, les particules de gel fortement réticulées sont co-réticulées au sein du gel final sous leur forme hydratée, permettant l'obtention d'un gel transparent de particules de gel co-réticulées dans le gel final. 15 [0062] Selon une autre variante, le procédé de l'invention met en oeuvre une étape c) de séchage (déshydratation) des particules de gel après réticulation et broyage, et avant co-réticulation avec le polysaccharide faiblement réticulé. Dans cette variante, il peut également être envisagé de déshydrater (sécher) le polysaccharide fortement réticulé, avant l'étape de broyage. 20 [0063] Cette étape de séchage peut être effectuée par tous moyens connus de l'homme du métier, par exemple séchage en étuve sous vide, ou à l'air libre sous flux laminaire. Le séchage est avantageusement conduit, mais non nécessairement, jusqu'à déshydratation totale du gel (élimination de l'eau libre). [0064] Lorsque des particules déshydratées sont mises en oeuvre dans le gel 25 selon l'invention, il est apparu que, si la réticulation réalisée génère des liaisons stables (telles que des liaisons éther notamment, voire supra), les particules déshydratées ne se réhydratent pas totalement dans le gel final, voire l'hydrogel final, et ce même après un séjour de 2h30 dans l'hydroxyde de sodium à 1% (poids/poids). 30 [0065] On obtient alors un gel final co-réticulé avec des particules en partie hydratées seulement, des voiles blancs, filaments blancs sont visibles dans le produit fini. Dans cette variante, le gel selon l'invention comportant des particules de gel fortement réticulé déshydratées ou partiellement déshydratées -12 (ou hydratées) est susceptible de générer un plus grand effet volumateur, par un effet de relance fibroblastique plus important, qu'avec un gel comportant des particules de gel fortement réticulé n'ayant subi aucun séchage avant co-réticulation avec la matrice. s [0066] À l'issue de la première réticulation et/ou de la deuxième réticulation/co-réticulation, il peut être avantageux de neutraliser le gel obtenu, selon les procédés standards connus dans le domaine, et par exemple par ajout d'acide lorsque la réticulation est conduite en milieu acide, et par ajout d'une base, lorsque la réticulation est conduite en milieu acide. io [0067] Le gel cohésif co-réticulé obtenu selon le procédé décrit ci-dessus est enfin avantageusement soumis à une étape d'hydratation complémentaire, afin d'obtenir un gel co-réticulé sous forme d'hydrogel injectable, adapté aux applications envisagées. [0068] Cette hydratation est généralement effectuée, comme pour l'étape d) 15 du procédé décrit plus haut, dans un milieu aqueux, par simple mélange du gel réticulé avec une solution aqueuse, avantageusement physiologique tamponnée, de manière à obtenir une concentration finale, variable dans de très larges proportions, selon la nature des polysaccharides utilisés, leurs taux de réticulation respectifs, et également selon l'utilisation envisagée. La solution 20 tamponnée utilisable peut par exemple être une solution physiologique, iso-osmolaire présentant un pH compris entre environ 6,8 et environ 7,5. [0069] Cette concentration finale en polysaccharides totaux est généralement comprise entre environ 5 et environ 100 mg/g, de préférence entre environ 5 et environ 50 mg/g par exemple environ 20 mg/g d'hydrogel. 25 [0070] Le procédé de la présente invention permet ainsi d'obtenir un gel (ou un hydrogel) co-réticulé biocompatible, cohésif, injectable et de rémanence longue. Les particules fortement réticulées (totalement hydratées, ou en partie) au sein de ce gel permettront éventuellement de générer une néo-collagénèse au sein du derme suite à la dégradation de la matrice plus légèrement réticulé. 30 [0071] Ainsi une double action de ce gel peut être escomptée, notamment pour une utilisation esthétique de comblement des rides : • un comblement immédiat des volumes grâce à l'injection d'un hydrogel monophasique épais au sein de la dépression dermique qu'est la ride, ù 13 • une relance du phénomène de synthèse endogène de collagène et une prolifération des fibroblastes suite à la réaction à corps étranger induite par les particules souples de gel fortement réticulé. [0072] La présente invention propose donc un gel comprenant des particules de polysaccharide(s), préalablement fortement réticulé(s), puis réduites en particules de très fines dimensions, comme indiqué précédemment, au sein d'une matrice de polysaccharide(s) faiblement réticulé(s). Ainsi le gel (ou l'hydrogel, obtenu après hydratation du gel comme décrit plus haut) s'injecte io facilement, même àtravers des aiguilles de diamètre fin (type 27 Gauge), est cohésif et se répartit facilement dans les tissus, sans former de paquets , qui sinon seraient difficiles à homogénéiser sous la peau. [0073] En outre, sa cinétique de dégradation est ralentie du fait des particules fortement réticulées qui restent dans le derme beaucoup plus longtemps que les 15 gels réticulés classiques, sans pour autant générer de fortes réactions à particules étrangères comme dans le cas de particules solides et de formes souvent mal maîtrisées. Ainsi, il pourra être observé une prolifération des fibroblastes susceptibles de participer à la création de volumes dans un second temps, augmentant encore la durée de comblement du produit. 20 [0074] Ainsi, et selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet les utilisations des gels et hydrogels précédemment définis pour séparer, combler les tissus, augmenter le volume desdits tissus, remplacer un fluide biologique, ou encore pour servir de matrice d'injection à relargage contrôlé à un ou des principe(s) actif(s) dispersé(s). 25 [0075] Les applications visées sont plus particulièrement les applications communément observées dans le cadre des viscoélastiques injectables de polysaccharides utilisés ou potentiellement utilisables dans les pathologies ou traitements suivants : • injections esthétiques : de comblement des rides, défauts cutanés ou 30 volumatrices (pommettes, mentons, lèvres) ; • traitement de l'arthrose, injection dans l'articulation en remplacement ou complément du liquide synovial déficient ; ù 14 • injection péri-urétrale pour le traitement de l'incontinence urinaire par insuffisance sphinctérienne ; • injection post chirurgicale pour éviter les adhésions péritonéales notamment ; • injection suite à une chirurgie de la presbytie par incisions sclérales au laser. 6] Plus particulièrement, en chirurgie esthétique, et selon la taille et la proportion de particules au sain du gel final co-réticulé, ce dernier pourra être io utile : • pour le comblement des rides fines, moyennes ou profondes, et être injecté avec des aiguilles de diamètre fin (27 Gauge par exemple) ; • comme volumateur avec une injection par des aiguilles de diamètre plus important, de 22 à 26 Gauge ; dans ce cas, son caractère cohésif permettra 15 de garantir son maintien à l'emplacement de l'injection. [0077] En chirurgie urologique, la taille des particules et leur proportion seront adaptées à l'application et permettront de garantir une rémanence accrue. La cohésivité du produit permettra un comblement efficace de l'organe. [0078] Le gel co-réticulé selon l'invention trouve également une application 20 importante en chirurgie articulaire et en chirurgie dentaire pour le comblement des poches parodontales par exemple. [0079] Ces exemples d'utilisation ne sont nullement limitants, le gel co-réticulé selon la présente invention étant plus largement prévu pour : • combler des volumes ; 25 • générer des espaces au sein de certains tissus, favorisant ainsi leur fonctionnement optimal ; • remplacer des liquides physiologiques déficients. [0080] Le gel co-réticulé selon l'invention peut également trouver une application tout à fait intéressante en tant que matrice de relargage d'un (ou 30 plusieurs) principe(s) actif(s) au préalable dispersé(s) en son sein. Par principe actif on entend tout produit actif sur le plan pharmacologique : principe actif médicamenteux, anti-oxydant, antiseptique, etc... ù 15 [0081] De manière pratique, le gel selon l'invention, de préférence après purification et hydratation en hydrogel, comme décrit précédemment, peut être conditionné, par exemple dans des seringues, et stérilisé selon tout moyen connu en soi (par exemple par autoclavage) pour commercialisation et/ou utilisation directe. [0082] Selon un autre aspect, la présente invention concerne une trousse (ou kit) comprenant un gel co-réticulé selon l'invention, avantageusement sous forme d'hydrogel prêt à l'emploi, conditionné en seringue stérile, ou avec une solution tampon pour préparation extemporanée, ainsi qu'un nécessaire à injection comprenant au moins une aiguille d'injection. 3] Des exemples de réalisation de la présente invention sont présentés ci-après, et ont pour but d'illustrer l'invention, sans toutefois y apporter une quelconque limitation. Exemple 1 : Étape a) : Hydratation de fibres de hyaluronate de sodium sous forme de gel non réticulé [0084] Des fibres de hyaluronate de sodium de qualité injectable (1 g ; masse moléculaire : environ 1,5 MDa ; sont pesées et préalablement séchées dans un récipient. Une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 10/0 (poids/poids) dans l'eau (6,2 g) est ajoutée, le tout est homogénéisé pendant environ 1 heure à température ambiante. Étape b) : Première réticulation [0085] Du BDDE (150 mg) est ajouté au gel de hyaluronate de sodium (NaHA) non réticulé obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé mécaniquement pendant environ 30 minutes à température ambiante. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 50 C +/- 2 C pendant 2h15 à 3h, afin d'obtenir un taux de réticulation X1 d'environ 0,32. Le gel de NaHA réticulé est alors placé dans 3 bains successifs d'EDI (eau désionisée) de 8 à 12 h chacun, afin de gonfler et d'éliminer le réticulant résiduel n'ayant pas réagi. ù 16 Étape c) : Broyage du polysaccharide fortement réticulé [0086] Le gel réticulé hydraté est ensuite broyé à l'Ultra-turrax afin d'obtenir des particules de gel de taille variant entre 0,1 et 3 mm. Les particules de gel sont laissées à égoutter pendant 2 heures sur un tamis de porosité 100 pm. Étape d) : Réticulation du second polysaccharide et co-réticulation [0087] Les particules hydratées sont pesées (5 g) dans un récipient dans lequel on ajoute 0,8 g de fibres de NaAH sèches (masse moléculaire : environ 1,5 MDa) et 2 g de solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 1,5% io (poids/poids), l'ensemble étant homogénéisé pendant environ 30 minutes à température ambiante. [0088] Au mélange sont alors ajoutés 30 mg de BDDE, puis l'ensemble est homogénéisé mécaniquement pendant 30 minutes environ, avant d'être placé au bain-marie à 50 C +/-2 C pendant 2h à 2h30, afin d'obtenir un taux de réticulation 15 X2 d'environ 0,08. 9] Le gel final co-réticulé est ensuite neutralisé par ajout d'HCI 1 N, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement. On obtient ainsi un hydrogel co-réticulé 20 conformément à l'invention. 0] En final, l'hydrogel est placé en poches de dialyse dans divers bains de tampon phosphate afin d'éliminer l'agent réticulant excessif, puis est homogénéisé avant d'être rempli en seringues qui sont stérilisées par 25 autoclavage. [0091] L'hydrogel ainsi obtenu est transparent, injectable à travers des aiguilles hypodermiques 22 Gauge, pour la création de volumes dans les pommettes ou le menton. Sa concentration finale en NaHA est ajustée à 20 mg/g de gel. 30 Exemple 2 : [0092] Les étapes a) et b) de l'exemple 1 sont reproduites dans ce deuxième exemple. -17 Étape c) : Broyage et séchage du polysaccharide fortement réticulé [0093] Le gel réticulé hydraté est ensuite broyé à l'Ultra-turrax afin d'obtenir des particules de gel de taille variant entre 0,1 et 3 mm. Les particules de gel sont laissées à égoutter pendant 2 heures sur un tamis de porosité 100 pm, puis à sécher une nuit en étuve ventilée à 35 C. Étape d) : Réticulation du second polysaccharide et co-réticulation [0094] Les particules déshydratées sont pesées (600 mg) dans un récipient io dans lequel on ajoute 5 g de fibres de NaAH sèches (masse moléculaire : environ 1,5 MDa) et 36 g de solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 1% (poids/poids), l'ensemble étant homogénéisé pendant environ 1 heure à température ambiante. [0095] Au mélange sont alors ajoutés 300 mg de BDDE, puis l'ensemble est 15 homogénéisé mécaniquement pendant 30 minutes environ, avant d'être placé au bain-marie à 50 C +1-2 C pendant 2h à 2h30, afin d'obtenir un taux de réticulation X2 d'environ 0,12. 6] Le gel final co-réticulé est ensuite neutralisé par ajout d'HCI 1 N, et 20 placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement. On obtient ainsi un hydrogel co-réticulé conformément à l'invention. [0097] Comme précédemment, l'hydrogel est placé en poches de dialyse dans divers bains de tampon phosphate afin d'éliminer l'agent réticulant excessif, 25 puis est homogénéisé avant d'être rempli en seringues qui sont stérilisées par autoclavage. [0098] L'hydrogel ainsi obtenu est transparent dans l'ensemble, avec des zones de voiles blancs, des filaments blanchâtres visibles en son sein, injectable à travers des aiguilles hypodermiques 22 à 27 Gauge pour la création 30 de volumes dans les pommettes ou le menton, ou le comblement des rides profondes. Sa concentration finale en NaHA est de 20 mg/g de gel. -18 Exemple 3 : (comparatif) [0099] L'étape a) de l'exemple 1 est réalisée. Étape b) : [0100] Du BDDE (70 mg) est ajouté au gel de hyaluronate de sodium (NaHA) non réticulé obtenu à l'étape précédente, le tout étant homogénéisé mécaniquement pendant environ 30 minutes à température ambiante. L'ensemble est ensuite placé au bain-marie à 50 C +/- 2 C pendant 2h15 à 3h, afin d'obtenir un taux de réticulation X1 d'environ 0,15. io [0101] Le gel final co-réticulé est ensuite neutralisé par ajout d'HCI 1 N, et placé dans un bain de tampon phosphate pour stabiliser le pH et permettre son hydratation, ou gonflement. On obtient ainsi un hydrogel de NaHa réticulé par la voie classiquement utilisée. 15 [0102] L'hydrogel est ensuite placé en poches de dialyse dans divers bains de tampon phosphate afin d'éliminer l'agent réticulant excessif, et est homogénéisé avant d'être rempli en seringues stérilisées par autoclavage. [0103] La durée d'homogénéisation finale est fixée équivalente à celle du gel réalisé lors de l'exemple 2, afin de se placer dans des situations comparables. 20 [0104] Ce gel final est transparent, sa concentration finale en NaHA est de 20 mg/g de gel. 5] La comparaison des gels obtenus dans l'exemple 2 (selon l'invention, gel co-réticulé) et dans l'exemple 3 (gel réticulé simple) met en évidence une 25 différence d'aspect : ainsi dans le cas de l'exemple 2, des zones voilées blanchâtres, des filaments blancs sont visibles au sein du gel transparent dans l'ensemble, alors que le gel de l'exemple 3 est totalement transparent. [0106] Les deux hydrogels ont un aspect cohésif lorsqu'ils sont extrudés de la seringue. Par ailleurs, l'hydrogel de l'exemple 2 est plus facile à expulser au 30 travers d'une aiguille 22 Gauge 1/2 que l'hydrogel de l'exemple 3, les deux hydrogels étant conditionnés en seringue 2 mL identiques. C ceci confirme une plus grande facilité d'injection de l'hydrogel de l'exemple 2. ù 19 [0107] Ainsi, pour deux gels de concentration finale 20 mg/g de hyaluronate de sodium, réticulés par une concentration équivalente de BDDE (70 mg BDDE pour 1 g d'acide hyaluronique) mais dans des conditions différentes, on observe une facilité d'injection accrue de l'hydrogel de l'invention, ceci pour une durée d'homogénéisation finale de l'hydrogel équivalente. [0108] Par ailleurs les particules fortement réticulées du gel de l'exemple 2, sont aptes à induire in fine une rémanence accrue dans le temps du gel après implantation, avec un phénomène de relance fibroblastique et de néo-collagénase. io [0109] Ces deux exemples comparés mettent en évidence l'intérêt de l'hydrogel co-réticulé selon la présente invention. REVENDICATIONS 1. Gel cohésif co-réticulé comprenant : 1) au moins un premier gel de polysaccharide fortement réticulé, et 2) au moins un second gel de polysaccharide faiblement réticulé, ledit au moins premier gel étant lié par liaisons de covalence audit au moins second gel. io 2. Gel selon la revendication 1, dans lequel le polysaccharide constituant le gel fortement réticulé peut être identique à, ou différent du polysaccharide constituant le gel faiblement réticulé. 15 3. Gel selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel le polysaccharide est choisi parmi l'acide hyaluronique et ses sels, la chondroïtine sulfate, le kératan, le kératan sulfate, l'héparine, l'acide alginique, la cellulose et ses dérivés (carboxyméthylcellulose, hydroxypropylméthylcellulose, ...), les alginates, la gomme xanthane, le chitosane, et parmi les mélanges de deux ou 20 plusieurs d'entre eux. 4. Gel selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le polysaccharide est choisi parmi l'acide hyaluronique et ses sels, la chondroïtine sulfate, le kératan, le kératan sulfate, l'héparine, l'acide alginique, la cellulose et 25 ses dérivés (carboxyméthylcellulose, hydroxypropylméthylcellulose, ...), les alginates, la gomme xanthane, le chitosane, et parmi les mélanges de deux ou plusieurs d'entre eux, de préférence encore parmi l'acide hyaluronique et ses sels, la chondroïtine sulfate et ses sels et les dérivés cellulosiques tel que l'hydroxypropylméthylcellulose, et les mélanges de deux ou plusieurs d'entre eux, 30 plus préférentiellement encore parmi l'acide hyaluronique et ses sels, avantageusement le polysaccharide est le hyaluronate de sodium.-21- 5. Gel selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit au moins premier polysaccharide fortement réticulé se présente sous la forme de particules réparties de manière homogène dans le polysaccharide faiblement réticulé (la matrice), lesdites particules de polysaccharide fortement réticulé étant liées de manière covalente (ou encore co-réticulées) à la matrice (polysaccharide faiblement réticulé). 6. Gel selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le polysaccharide fortement réticulé présente un taux de réticulation X1 compris entre environ 0,2 et environ 0,7, préférentiellement entre environ 0,22 et environ 0,6 et le polysaccharide faiblement réticulé présente un taux de réticulation X2 compris entre environ 0,03 et environ 0,3, de préférence entre environ 0,05 et environ 0,25. 7. Gel selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la proportion pondérale des particules de polysaccharide fortement réticulé dans le produit fini est comprise entre environ 0,5 à 99%, préférentiellement de 5 à 60%, plus préférentiellement de 10 à 40%. 8. Procédé de préparation d'un gel selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) réticulation en milieu aqueux en présence d'un agent réticulant d'au moins un premier polysaccharide jusqu'à un taux de réticulation X1 ; b) broyage dudit premier polysaccharide sec ou hydraté en particules de 25 granulométrie souhaitée ; c) éventuellement séchage dudit premier polysaccharide réticulé ; d) mélange des particules sèches ou hydratées dans un milieu aqueux ; e) ajout d'au moins un second polysaccharide (identique ou différent de celui-ci employé à l'étape a)) ; 30 f) réticulation dudit au moins second polysaccharide en présence d'un agent réticulant jusqu'à un taux de réticulation X2 et co-réticulation en présence d'un agent réticulant dudit au moins second polysaccharide faiblement réticulé-22 avec les particules dudit au moins premier polysaccharide fortement réticulé ; et g) récupération du gel co-réticulé comprenant des particules d'au moins un premier polysaccharide fortement réticulé, liées de manière covalente à une s matrice d'au moins un second polysaccharide faiblement réticulé. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisée ne ce que les étapes de réticulation et de co-réticulation sont réalisées à pH constant, soit acide, soit basique, de préférence basique. io 10. Procédé selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisé en ce que les agents réticulants sont des agents réticulants bi- ou poly-fonctionnels et de préférence choisis parmi la divinylsulfone, les époxy bi- ou poly-fonctionnels, les carbodi-imides, le formaldéhyde et leurs mélanges, de préférence encore 15 parmi le 1,4-butanedioldiglycidyléther, le diépoxy-octane ou le 1,2-bis-(2,3-époxypropyl)-2,3-éthylène, et leurs mélanges. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que les particules du premier gel réticulé sont séchées avant l'étape de 20 co-réticulation. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que les particules de gel réticulé sont maintenues hydratées avant l'étape de co-réticulation. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi l'acide hyaluronique et ses sels. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisé 30 en ce que le gel co-réticulé obtenu est soumis à une étape d'hydratation complémentaire, afin d'obtenir un gel co-réticulé sous forme d'hydrogel de concentration comprise entre environ 5 et environ 100 mg/g, par exemple environ 20 mg/g d'hydrogel. 25-23 15. Utilisation d'un gel co-réticulé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 8 à 14, pour séparer, combler les tissus, augmenter le volume desdits tissus, remplacer s un fluide biologique, ou encore pour servir de matrice d'injection à relargage contrôlé à un ou des principe(s) actif(s) dispersé(s). 16. Utilisation selon la revendication 15 pour le comblement des rides fines, moyennes ou profondes et des défauts cutanés. 10 17. Trousse comprenant un gel co-réticulé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 8 à 14, avantageusement sous forme d'hydrogel prêt à l'emploi, conditionné en seringue stérile, ainsi qu'un nécessaire à injection comprenant au 15 moins une aiguille d'injection.