FR 2921834 A1 20090410 FR 0758073 A 20071004 1 AGENT ANTI-OXYDANT A BASE D'EXTRAITS VEGETAUX, ET COMPOSITION COSMETIQUE COMPRENANT LEDIT AGENT L'invention a pour objet un agent anti-oxydant à base d'extraits végétaux. Elle concerne 5 également les compositions cosmétiques comprenant ledit agent. De manière plus générale, l'agent objet de l'invention est destiné à lutter contre l'altération des cellules, en particulier celles de la peau, provoquée par les agressions extérieures, et en particulier par les UVA responsables de la formation des radicaux 10 libres. En effet, les radicaux libres ont un effet oxydant de la membrane cellulaire notamment, entraînant de fait, le vieillissement des cellules. L'objectif de l'invention est donc de protéger les cellules épidermiques et dermiques de ces agressions en réduisant la nocivité des espèces oxydantes, en protégeant et en 15 restaurant les membranes cellulaires altérées, en protégeant la matrice collagénique et en empêchant l'action des protéases sur les protéines essentielles du tissu cutané. Le Demandeur a constaté que de manière tout à fait surprenante, cet objectif était atteint en associant des extraits de chêne appartenant à la famille des Fagacées et d'anis vert 20 appartenant à la famille des Apiacées. En d'autres termes, l'invention a tout d'abord pour objet un agent anti-oxydant ou antiradicalaire à base d'extraits végétaux qui se caractérise en ce qu'il contient un mélange d'au moins un extrait de chêne et d'au moins extrait d'anis vert. Selon une première caractéristique, les extraits de chêne sont au moins au nombre de un, avantageusement au nombre de deux, et de préférence trois, choisis dans le groupe comprenant le chêne rouvre (Quercus robur), le chêne vert (Quercus ilex) et le chêne truffier (Quercus pubescens). Le Demandeur a constaté que l'agent anti-oxydant était particulièrement efficace lorsque les extraits de chêne étaient obtenus à partir de l'écorce. 25 30 2 Dans un mode de réalisation avantageux, l'agent anti-oxydant de l'invention contient donc trois extraits d'écorce de chêne, respectivement Quercus robur, Quercus ilex, Quercus pubescens et un extrait d'anis vert. En pratique, les extraits sont obtenus séparément avant d'être mélangés. L'extraction à partir des écorces de chêne ou d'anis est effectuée en trois étapes, respectivement : - macération ou décoction ou percolation, -filtration - distillation. S'agissant de la première étape, décoction, macération ou percolation peuvent être effectuées en solution alcoolique, en particulier dans de l'éthanol, pendant une durée de 3 à 72 heures. En fonction de la nature du procédé mis en oeuvre, la température peut varier. Elle est d'environ 40°C lorsqu'il s'agit d'une macération, la décoction et la percolation peuvant être effectuées à des températures plus élevées de l'ordre de 75°C. Dans cette seconde hypothèse, l'extraction ne doit pas durer plus de 48 heures, du fait du risque d'oxyder et de détruire l'ensemble des actifs de la plante. Dans une seconde étape, les extraits sont filtrés sur une maille comprise entre 1 et 100 �m, de sorte à séparer de l'extrait proprement dit, les parties restantes d'écorce. L'étape de distillation, correspondant à la troisième étape, a pour objectif d'évaporer l'alcool utilisé dans la première étape et dans le cas d'espèce, l'éthanol pour permettre de concentrer l'extrait en matière sèche. Cette distillation est avantageusement conduite sous vide partiel, à une température comprise entre 40 et 50°C. En fin d'extraction, les extraits d'écorce de chêne et d'anis obtenus contiennent de 1 à 10% en poids de matière sèche, avantageusement de l'ordre de 6%. En vue de leur association avec les autres extraits, les extraits concentrés sont mélangés avec des véhicules huileux et/ou aqueux tels que par exemple huile végétale ou glycérine dans une proportion pondérale (extrait/vehicule) comprise entre 60/40 et 40/60, avantageusement 50/50. 3 Dans un mode de réalisation avantageux, pour optimiser davantage encore l'extraction, les écorces de chêne sont ramassées fraîches et séchées. Avant la première étape de macération, percolation ou décoction, l'écorce est broyée ou 5 réduite en taille pour donner des fragments de l'ordre de 1 à 2 cm de longueur. Au sein de l'agent anti-oxydant, les extraits mélangés à leur véhicule peuvent représenter des proportions variables, typiquement comprises entre 5 et 50%, avantageusement de l'ordre de 10 à 30% en poids. 10 Ainsi, l'invention a également pour objet un agent anti-oxydant comprenant : - 20 à 40% d'un extrait hydroglycériné de Quercus robur , - 20 à 40% d'un extrait glycériné de Quercus pubescens, - 5 à 20% d'un extrait hydroglycériné de Quercus ilex, 15 - 20 à 40% d'un extrait hydroglycériné d'anis vert. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une composition cosmétique comprenant l'agent antioxydant tel que précédemment décrit à base d'au moins un extrait de chêne et d'un extrait d'anis vert. En pratique, cet agent anti-oxydant représente entre 3 et 20 % en poids de la composition cosmétique. Une telle composition de l'invention est appliquée par voie topique, la présence de l'agent 25 anti-oxydant permettant de lutter contre le vieillissement cutané. Bien entendu, la composition peut se présenter sous toutes les formes galéniques applicables sur la peau, telles que notamment solution, émulsion, microémulsion, gel, crème, pommade, lait, lotion. Elle peut contenir les adjuvants habituels des compositions cosmétiques et dermatologiques, tels que matières grasses, émulsionnants, co-émulsionnants, gélifiants, 30 conservateurs, solvants, parfums... L'invention a également pour objet un procédé de traitement cosmétique pour lutter contre le vieillissement cellulaire de la peau, en particulier celui provoqué par les agressions extérieures telles que UVA et UVB, consistant à appliquer sur la peau la 35 composition cosmétique telle que précédemment décrite. 20 4 L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront bien des exemples de réalisation suivants. EXEMPLE 1: PREPARATION ET EFFICACITE DE L'AGENT ANTI OXYDANT DE 5 L'INVENTION A/ PREPARATION 1. Extraction d'écorce de chêne Quercus robur, Quercus ilex et Quercus pubescens 10 Le procédé suivant est appliqué séparément sur chaque extrait. 10 g d'écorces sont réduits en fragments de 1 à 2 cm et sont placés dans une enceinte de 100 L. Les fragments sont ensuite immergés dans environ 50 L d'éthanol à 50%. La cuve 15 est ensuite mise sous vide et chauffée par hyperfréquence à une température de l'ordre de 40°C pendant 3 heures. L'extrait obtenu est ensuite séparé des fragments d'écorces par tamisage sur une maille de 50 �m. L'extrait est ensuite mis sous vide à une température de 45°C permettant d'évaporer la phase alcoolique par distillation jusqu'à obtention d'un extrait à 6% de matière sèche. L'extrait ainsi obtenu est ensuite dilué dans la glycérine 20 dans un rapport de poids 1/1. 2. Extraction d'anis Le protocole d'extraction ci-avant décrit est mis en oeuvre à l'identique pour l'extraction 25 d'anis. 3. Agent anti oxydant de l'invention (AAO) On prépare ensuite la composition suivante par mélange des extraits obtenus selon les 30 procédés décrits dans le paragraphe ci-avant en % en poids. Extrait hydroglycériné de Quercus robur : 35 Extrait glycériné et de Que rcus pubescens : 25 Extrait hydroglycériné et de Quercus ilex : 15 35 Extrait hydroglycériné et d'anis vert : 25 B/ ACTIVITE ANTIOXYDANTE DE L'AGENT DE L'INVENTION Dans cet exemple, on teste l'activité antioxydante de la composition décrite dans le paragraphe ci-dessus. Les propriétés anti-radicalaires sont recherchées en mesurant le taux relatif de différentes espèces radicalaires à l'intérieur même de chaque cellule. La mesure peut être réalisée sur des cellules au repos (état radicalaire basal) et sur des cellules stressées par une irradiation UV. Le but de l'étude est d'évaluer les effets de la composition sur le taux de peroxydation lipidique (PL) dans des cellules humaines (Jurkat) exposées ou non à une irradiation UVA + UVB. La mesure de PL a été réalisée en utilisant une sonde fluorescente spécifique, par la méthode de cytométrie de flux. Cette méthode présente l'avantage d'une très grande sensibilité en mesurant la fluorescence de chaque cellule, et cela sur un grand nombre de cellules (10 000 cellules analysées par échantillon). Matériel et méthodes Cellules utilisées - Type : cellules lymphoïdes humaines Jurkat - Culture : 37°C, 5% CO2 - Milieu de culture : RPMI 1640 (Invitrogen 31870-025) L-glutamine 2 mM (Invitrogen 25030024) Pénicilline 50 UUml-Streptomycine 50 �g/m1 (Invitrogen 15070063) Sérum de veau foetal 10 % (Invitrogen 10106451). - Milieu d'essai : MEM sans rouge phénol et sans sérum de veau (Poly labo 5503401) bicarbonate de sodium 1,87 mg/ml (Invitrogen 2508 0060) L-glutamine 2mM (Invitrogen 25030024) Pénicilline 50 UUml-Streptomycine 50 �g/ml (Invitrogen 15070063) 535 Produit à l'essai, référence et sonde : AAO Solution-stock Dilution Concentrations finales testées Liquide marron En milieu d'essai 0.016%, 0.0032% et opaque stocké à 4°C 0.00064 % Anti-oxydant Solution-stock Dilution Concentrations finales de référence testées Butylated 50 mM en éthanol En milieu d'essai 100 �M hydroxyanisole absolu (BHA, Sigma B1253) Sonde Solution-stock Dilution Concentrations finales fluorescente testées N-dodecanoyl 5 mM en éthanol En milieu d'essai 1�M Aminofluoresceinl absolu (sonde pour mesure de la (C11-fluor, péroxydation lipidique) interchim D109) 5 ' Makrigiorgos (1997), Free Rad. Biol. Med., 22, 93-100 Traitements et analyse Pré-culture des cellules Jurkat en milieu RPMI 1640 complet. Lavage des cellules en milieu MEM sans rouge phénol ni SVP, puis incubation en présence de AAO ou de la référence. Addition de la sonde C11-fluor à chacun des lots pour le dosage de PL. La sonde C11-fluor, une fois intégrée aux membranes, voit sa fluorescence diminuée avec l'oxydation. Deux lots ont été préparés, 1 lot étant irradié et 1 lot étant protégé des UVs. Les tests ont été réalisés en triplicata pour les cellules irradiées et en monoplicata pour les cellules non irradiées. Incubation 45 minutes à 37 °C et 5 % de CO2. Pour dosage de PL, la sonde C11-fluor a été éliminée par lavages des cellules en milieu MEM. Irradiation UVB à 240 mJ/cm2 (3.2 J/cm2 UVA) ; un contrôle sans UV est réalisé en parallèle. Incubation 30 minutes à 37°C et 5 % de CO2. Mesure des paramètres de fluorescence par cytométrie de flux sur 10 000 cellules individuelles par échantillon à l'aide du cytomètre FACSCArray (Becton-Dickinson). 6 Traitement des données Les données brutes de comptage ont été transférées et traitées sous le logiciel PRISM (Graph Pad Software). Les comparaisons intergroupes ont été réalisées par analyse de variance (ANOVA) à l'aide du test de comparaison multiple de Dunnett. Le pourcentage de protection a été calculé selon la formule: (témoin _uv û traitéfuv) x 100 P%100 témoin_vv û témoin+Uv Résultats Effets sur le taux de peroxydes lipidiques 15 Dans ce dosage, la détermination de la quantité relative de peroxydes lipidiques (PL) est basée sur la mesure de la diminution de fluorescence de la sonde C11-fluor intégrée aux membranes. Il est donc important de noter qu'une diminution du signal de fluorescence de la sonde traduit une augmentation du taux de peroxydes lipidiques membranaires (et inversement). 20 Dans ces conditions, et afin de simplifier la compréhension des résultats obtenus, les données expérimentales ont été exprimées par la valeur 1/intensité de fluorescence et les pourcentages par rapport au témoin + UV présentés ont été calculés avec ces valeurs. 7 25 Les résultats figurent dans le tableau suivant : Quantité Intracellulaire relative de Confrdle • dhR Traitement Conc. eraxydes Ii intensité de fluorescence (n=10000 cellules) 194 77 idiques (PL) moyenne ed 60 ifs 1/lnt,f luo p %témoin +uv % de protection 14 0 Contrâle -UV 3313 2047 3897 $386 0,00030 P0.01 100 0,00070 100... 11111 ~� 0,00033 ~ e r fi.~•• r e WB 18 MI Dans ces conditions expérimentales, le niveau basal de peroxydes lipidiques (PL) était non négligeable (contrôle-UV). L'irradiation a diminué de façon significative l'intensité de fluorescence de la sonde, traduisant la présence de réactions radicalaires (peroxydation) au niveau des membranes cellulaires et donc l'augmentation de la quantité de PL (augmentation d'un facteur 2.3 environ). L'antioxydant de référence BHA testé à 100 tM a diminué significativement le taux relatif de peroxydes lipidiques dû à l'irradiation UV (protection de 80%). Ce résultat était attendu, il valide donc l'essai. Le BHA est une molécule synthétique aujourd'hui pas utilisée en cosmétique � bio �. La composition de l'invention testée à 0.016%, 0.0032% et 0,00064% a diminué de façon significative mais non dose dépendant la quantité de peroxydes lipidiques. L'agent antioxydant de l'invention a donc protégé nettement les cellules de l'irradiation et aux trois concentrations testées (43% à 51% de protection). Conclusion La composition de l'invention présente une activité anti-radicalaire importante et permet de limiter la péroxydation des lipides suite à l'irradiation par les UVA+B. Témoin (+UV) BHA LTCA0074 O.0D064% 0.0032% 100pM 2088 2485 2738 1993 2129 2878 1383 1489 1478 2898 2807 3478 1438 2994 0,00041 69 Pca05 0,00044 Pe0.05 PeUQ1 o 8025 Exemple 2 : Composition du sérum contour des yeux EAU PURIFIEE HYDROLAT DE CHENE GLYCERINE EXTRAIT DE L'INVENTION DUB ISIS MONTANOV 68 EXTRAIT DE BOURGEON DE CHENE 1% BEURRE DE KARITE HUILE D'ARGAN GEOGARD 221 GOMME XANTHANE MERITOSE DERMOFELL PP GELCARIN PC911 ARGIRELINE Composition de la solution moussante EAU PURIFIEE HYDROLAT DE BARDANE HYDROLAT DE CHENE GLYCERINE BASE LAVANTE EXTRAIT DE L'INVENTION EXTRAIT DE BARDANE GEOGARD 221 ACIDE CITRIQUE JAGUAR C 162 SORBATE DE POTASSIUMQSP 100 10à20% 10à30% 4à6% 20à30% 0,75 à 3 % 0,5 à 2 % 0,5% 0,2% 0,1 à 0,5 % 0,1% QSP 100 10à20% 5à10% 5à10% 3à5% 3à5% 1 à3% 1 à3% 1à2% 0,6% 0 à 0,45% 0,45 à 0,7 % 0,4% 0 à 0,31% 0,001 à 0,1%35 REVENDICATIONS 1/ Agent anti-oxydant à base d'extraits végétaux caractérisé en ce qu'il contient un mélange d'au moins un extrait de chêne et d'au moins extrait d'anis vert. 2/ Agent anti-oxydant selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'extrait de chêne est choisi dans le groupe comprenant le Quercus robur, Quercus ilex et Quercus pubescens. 3/ Agent anti-oxydant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient un extrait de Quercus robur, Quercus ilex et Quercus pubescens. 4/ Agent anti-oxydant selon la revendication 1, caractérisé en ce que les extraits de chêne sont des extraits d'écorce. 5/ Agent anti-oxydant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient trois extraits d'écorce de chêne, respectivement Que rcus robur, Que rcus ilex et Quercus pubescens, ainsi qu'un extrait d'anis vert. 20 6/ Agent anti-oxydant selon la revendication 1, caractérisé en ce que les extraits contiennent de 1 à 10% en poids de matière sèche. 7/ Agent anti-oxydant selon la revendication 1, caractérisé an ce qu'il contient : - 20 à 40% d'un extrait hydroglycériné de Quercus robur , 25 - 20 à 40% d'un extrait glycériné de Quercus pubescens, - 5 à 20% d'un extrait hydroglycériné de Quercus ilex, - 20 à 40% d'un extrait hydroglycériné d'anis vert. 8/ Composition cosmétique topique comprenant l'agent anti oxydant objet de l'une des 30 revendications 1 à 7. 9/ Composition cosmétique selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'agent antioxydant représente entre 3 et 20 % en poids de la composition.1510/ Procédé de traitement cosmétique pour lutter contre le vieillissement cellulaire de la peau consistant à appliquer sur la peau la composition cosmétique objet de l'une des revendications 8 ou 9.