FR 2918460 A1 20090109 FR 0704741 A 20070702 La présente invention concerne un nouveau dispositif permettant la détection d'analytes sur les échantillons de fluides biologiques comme les échantillons de sang, de salive, d'urines ou autres 5 échantillons de fluides biologiques. Ce dispositif est appliqué dans le phenotypage pour le système ABO avec les antigènes A et/ou B, le système Rhésus avec les antigènes D, E, C, c, e. le système Kell avec les antigènes K ou k , le système Duffy avec les antigènes Fya et Fyb et tout les autres systèmes moins fréquent tel que le système mineur MNs , Lewis etc Et à la recherche d'anticorps irréguliers (RAI) ainsi 10 que tout les autres phénotypes de système rares. Ce procédé peut également être appliqué concernant la recherche de virus et de bactéries ou tout autre élément pouvant provoquer une activité immunologique. Classiquement la détermination du groupe sanguin se fait sur la reconnaissance antigene-15 anticorps. Pour la recherche d'anticorps réguliers, il s'agit d'immunoglobulines de type IgM qui sont capables d'agglutiner les globules rouges in vitro. Ces propriétés sont mises à profit pour déterminer le groupe ABO par les épreuves de Beth-vincent et de Simonin. L'épreuve de beth-vincent permet de déterminer les antigènes portés par les globules rouges. 20 L'épreuve de Simonin réalise l'étude complémentaire par la détermination des anticorps anti-A et/ou anti-B circulants présents dans le sérum de l'individu. Dans l'épreuve de Beth-vincent, les globules rouges de l'individu sont mis en présence de sérums tests ou anticorps tests possédant chacun un type d'anticorps précis, dirigés contre un antigène du système ABO. Il s'agit donc d'un test d'agglutination des globules rouges avec des 25 sérums tests. Dans l'épreuve de Simonin appelé contre épreuve, le sérum de l'individu contenant ses anticorps circulants est mis en présence de globules rouge test appartenant chacun à un groupe antigénique précis du système ABO. Il s'agit donc d'un test d'agglutination du sérum avec des globules rouge test. 30 Pour la recherche d'anticorps dit irrégulier ou RAI, il s'agit de détecter la présence ou l'absence dans le sang d'un individu d'IgG dirigées contre divers antigènes érythrocytaires. pour cela on cherche à mettre en évidence la fixation de ces IgG sur des globules rouges tests dont les antigènes sont connus, la comparaison des résultats permettant de déduire la ou les IgG présentes. Il existe un grand nombre de variantes des techniques pour le phenotypage ou la recherche d'agglutinines irrégulier, elles sont basées sur la mise en évidence d'une agglutination des globules rouges après centrifugation. Les techniques habituellement utilisées, mises en oeuvre pour rechercher et identifier la présence ou l'absence d'antigène de groupe sanguin à la surface des érythrocytes ou visant à rechercher et identifier la présence ou l'absence d'anticorps anti-antigène de groupe sanguin, régulier (pour le groupe ABO) ou irrégulier dans le cadre de la RAI (recherche d'agglutinine irrégulière) dans le sérum ou le plasma sont bien connues de l'homme de l'art. Pour la recherche et l'identification dans l'échantillon de sérum ou plasma du patient à tester d'anticorps anti-antigène de groupe sanguin , réguliers pour le groupage ABO ou irréguliers dans le cadre de la RAI , on met en général en présence du sérum du patient avec des hématies ûtest , d'antigenicité connue dans un certain nombre de systèmes de groupes sanguins (ABO, Rhésus, Kell , Duffy , Kidd, MNSs,....) pour la RAI , pour laquelle les anticorps susceptibles d'être présents sont plutôt de type non agglutinants, les techniques utilisées sont de types Coombs indirect par agglutination au moyen d'une anti-immunoglobuline ou par immunoadherence sur une phase solide revêtue d'une antiglobuline. II existe un grand nombre de variantes des techniques utilisées pour le phenotypage ou la RAI dans le domaine de l'immunologie hématologie, ces techniques pouvant être manuelles, sur plaque d'opaline, en tube ou en cupule de microplaque, ou complètement automatisée à l'aide de robot distributeur d'échantillon et de réactif, agitateur, incubateur et lecteur automatique dont les programmes sont adaptées aux techniques mises en oeuvre. Parmi les techniques utilisées, on peut citer les techniques pour lesquelles la présence d'anticorps anti-antigène de groupe sanguin ou d'antigène de groupe sanguin est basée sur la mise en évidence d'agglutination de globules rouges après centrifugation mettant en oeuvre une mini colonne de filtration transparente (gel type Sephadex ou microbilles) dont l'évasement à l'extrémité supérieure sert de chambre d'incubation et dont le seuil de coupure choisi pour la colonne (voir notamment le document brevet EP 0 194 212 ou brevet EP 0 755 719)35 On peut également citer les techniques pour lesquelles le phenotypage ou la RAI est basée sur la mise en évidence de globules rouges sensibilisée avec un anticorps après centrifugation par immun adhérence mettant en oeuvre une barrière de séparation constituée d'un gel ou d'un liquide dont la densité est choisie de telle manière que seuls les globules rouges peuvent traverser cette barrière lors d'une centrifugation le container à réaction étant revêtu dans sa partie inférieure d'une antiimmunoglobuline afin de piéger les globules rouges sensibilisés et donner une image caractéristique. Parmi ces techniques, on peut citer le document brevet EP 0 058 780 qui décrit un procédé de Phenotypage sanguin dans lequel le mélange réactionnel est centrifugé au travers d'un coussin de densité supérieure (de type solution d'albumine ou de polyvinyle pyrrolidone), ce qui présente L'avantage de supprimer l'étape de lavage des hématies sensibilisées. On peut également citer le document brevet WO 98/02752 qui décrit un procédé général pour déterminer la présence d'un antigène sanguin présent sur des hématies ou d'un anticorps fixant un tel antigène. dans ce procédé, les hématies sensibilisées ou non, sont séparés des anticorps non fixés par centrifugation grâce à un milieu de séparation dont la densité est supérieure à celle du liquide contenant les anticorps, mais inférieures à celle des hématies , les globules rouges sensibilisés étant séparés des hématies non sensibilisées sur la paroi inférieure du container à réaction sur lequel est immobilisée une anti-immunoglobuline, les hématies non sensibilisées étant rassemblés dans le fond du container, l'analyse de l'image finale obtenue étant spécifique de la présence ou non de l'analyte recherché. Parmi les variantes des techniques utilisées pour le phenotypage ou la RAI , on peut également citer celles qui ont été développées de manière générale pour la recherche dans un échantillon d'un analyte capable de se fixer sur une cellule en utilisant des particules magnétiques ceci notamment afin de supprimer la centrifugation , opération nécessaire notamment dans les techniques basées sur l'agglutination comme la technique à l'antiglobuline pour la RAI ou encore pour le phenotypage , ou encore, comme pour la RAI , lorsqu'il est nécessaire de laver les hématies sensibilisées afin d'éliminer les anticorps non spécifiques capables de reconnaître l'anti-immunoglobuline utilisée à l'étape suivante.35 En effet l'étape de centrifugation est toujours difficile à mettre dans les procédés que l'on souhaite entièrement automatiser, notamment due au coût et l'encombrement des 5 centrifugeuses, leurs manipulations, etc.... Les particules magnétiques sont depuis longtemps utilisées pour la détection de complexes de type ligand récepteur ou anticorps-antigène, on peut citer par exemple les procédés tels que ceux décrits dans les documents brevets suivants : - Le document WO 92/17781 qui décrit une méthode de détermination de la présence d'un 10 Ligand dans un échantillon dans laquelle on incube des particules de latex magnétiques, Pouvant être de couleurs différentes, revêtues d'une substance, telle un anticorps, capable de se fixer avec un ligand, puis on applique un champ magnétique au milieu de l'incubation et enfin on observe la présence ou l'absence d'agglutination ; ou encore 15 - Le document EP 0 426 170 qui décrit une méthode de détermination de la présence d'un ligand dans un échantillon, méthode dans laquelle on incube des particules de gélatine magnétiques sensibilisées avec des antigènes ou des anticorps capables de se fixer avec se ligand, puis on applique un champ magnétique au milieu de l'incubation et enfin on observe la Présence ou l'absence d'agglutination ladite méthode étant caractérisée en ce qu'on observe 20 L'état de glissement de ces particules après inclinaison du container, notamment une cupule de microplaque à fond en V. De telles particules magnétiques ont déjà été utilisées en immunohematologie pour le phenotypage et I ou la RAI. Parmi les documents décrivant de telles applications, on peut citer 25 notamment : -le document EP 0 351 857 qui décrit un procédé de dosage immunologique utilisant des marqueurs magnétisés tels que des anticorps ou des antigènes fixés sur des billes de latex magnétiques. Ces marqueurs sont capables de se lier à une substance que l'on souhaite déterminer dans une étape d'immunoréaction, et l'on rassemble ensuite les particules 30 magnétiques à marquer sur une région prédéterminer de la surface d'une paroi dans un récipient de mesure à l'aide d'un aimant positionné sous cette cupule et sous l'action d'un champ magnétique, ce procédé pouvant comprendre une substance qui peut se lier spécifiquement à la substance à déterminer immobilisée sur une région prédéterminée de la surface de la paroi du récipient de mesure. 35 Il est décrit notamment une technique RAI par immunoadhrence dans laquelle des hématies préalablement fixées au fond d'une cupule de microplaque sont ensuite sensibilisés avec le sérum du receveur, puis lavés (ou par aspiration et injection du liquide de lavage), puis dans laquelle cupule on ajoute les billes de latex magnétiques revêtues d'une anti-immunoglobuline avant d'appliquer un champ magnétique. -le document EP 0 528 708 qui décrit un procédé de détection par immunoadherence d'une substance biologique susceptible d'être présente dans un échantillon. Dans ce procédé les érythrocytes à phénotype ou servant de panel de dépistage et I ou d'identification sont fixés préalablement sur le fond d'une microplaque. Après sensibilisation des érythrocytes ainsi fixés avec le sérum test (pour le phenotypage) ou le sérum du receveur à tester (Pour la RAI), les cupules sont lavées et on ajoute ensuite des billes de latex magnétiques revêtues d'antiimmunoglobuline. Dans ce procédé, on applique notamment deux types de champ magnétiques non liées spécifiquement avec la substance à rechercher ; et -le document brevet EP 0 230 768 qui décrit un procédé de co-agrégation de particules magnétiques capable de se lier à une substance contenue dans un échantillon au moyen de composés polycationiques en présence d'un champ magnétique. Ce document décrit en particulier la séparation du plasma d'un échantillon de sang total contenant des hématies dans lequel procédé, on ajoute séquentiellement dans un container placé sur un aimant l'échantillon de sang total et un ferrofluide (FeCl2 IFeCl3) revêtue d'albumine bovine sérique succinylée, les agrégats de particules d'hématies ainsi obtenues étant entraînés vers l'aimant permettant ainsi de récupérer le plasma clarifié par décantation. 35 Le but de l'invention est de proposer une méthode simple et facile d'utilisation pour la détermination du système ABO, Rhésus ainsi que les autres phénotypes rares, RAI etc. -un autre but de l'invention est de proposer une méthode rapide ne nécessitant pas l'utilisation d'une centrifugeuse. - un autre but de l'invention est l'obtention d'un résultat de lecture par positivité. - un autre but de l'invention est l'obtention de plusieurs résultats sur un seul dispositif. -un autre but de l'invention est de proposer une méthode permettant l'obtention de la détermination du système ABO, Rhésus et RAI. -un autre but de l'invention est de proposer un dispositif permettant d'effectuer une épreuve (beth-vincent) et une contre épreuve (simonin) sur une même carte contenant d'autres zones réactives sans l'utilisation de courant électrique (centrifugeuse). - un autre but de l'invention est de proposer un dispositif de détermination du système ABO, 15 Rhésus et RAI jetable après usage unique. - un autre but de l'invention est de proposer un dispositif de détermination du système ABO, Rhésus et RAI complètement automatisables permettant ainsi d'augmenter le nombre de test a effectué. Selon l'objectif de l'invention, le dispositif comporte les éléments qui contenant tout les facteurs 20 concourant à la formation d'un complexe antigene-anticorps permettant la lecture afin de déterminer le groupe sanguin ABO, le Rhésus et la RAI d'un échantillon sanguin. Le dispositif est également caractérisé par le fait qu'il soit entièrement jetable après usage unique et qu'il est constitué d'un support solide comprenant : -au moins un élément de réception pouvant accueillir un certains volume d'échantillons 25 sanguins. Cet élément de réception est fournit d'au moins une zone réactive. - un support permettant de maintenir les zones réactives dans l'ensemble du dispositif. La présente invention peut être tapissée d'une membrane tampon absorbante permettant la récupération de l'exces d'échantillon sanguins. La présente invention est également fournit d'un réservoir contenant une solution permettant le 30 lavage des zones réactives pour leur lecture. Les zones réactives se présentent sous forme de bande ou sous forme circulaire permettant d'accueillir un certain volume d'échantillon sanguin ou autres fluides biologique. La zone réactive comprend au moins une zone d'imprégnation d'un réactif déclenchant l'activité immunologique. Selon un mode de réalisation du dispositif, l'invention comporte un système coulissant permettant aux zones réactives de pénétrer dans le réservoir. Selon un autre mode du dispositif le support solide maintient le support des zones réactives. Ces zones réactives sont faite d'une matière plastique car déformable représenté par du HDPE (Hight Density Polyéthylène), polypropylène. Selon ce mode de réalisation les anticorps, fragments de membranes d'hématies-test ou autres cellules, lysats cellulaires, fragments de membrane ou au moins un fragment d'épitope caractérisant l'antigenicité d'une cellule sont imprégné dans les zones réactives. Toujours selon ce mode de réalisation l'agglutination des anticorps, des cellules d'interets par les éléments imprégnés forme un agrégat. Selon ce dispositif le support solide est fournit d'un dispositif de coulissage permettant a celui-ci de rentrer dans le réservoir. Selon le dispositif, l'invention comporte au moins une zone réactive imprégnée d'un réactif adéquate à la complexation dérivant de l'activité immunologique. Parmi les substances pouvant être utilisés sur les zones réactives, on peut citer les anticorps 20 permettant la reconnaissance et la determination des groupes sanguins ainsi que les analytes permettant une activité biologique de l'échantillon sanguin. Selon une variante de l'invention, le dispositif peut être utilisé sans réservoir. 25 Le dispositif selon l'invention est particulièrement destiné aux phenotypages, détection et détermination des systèmes ABO, Rhésus, Kell, RAI et autres phénotypes rares et étendues. 30 Dispositif permettant de détecter et de déterminer les systèmes de groupe sanguin ABO, rhésus, 5 RAI et autres phénotypes 10 15 20 25 30 REVENDICATIONS 1) le dispositif permettant la détermination et la détection des groupes sanguins ABO, Rhésus , et RAI et autres analytes contenu dans un fluides biologiques tels que le sang veineux , artérielle , capillaires ,le plasma, les urines , la salive caractérisé en ce qu'il comprend un support solide (1) permettant de soutenir les zones réactives, une membrane absorbante permettant de récupérer l'excès de fluides biologiques (2) ,un support permettant d'accueillir les zones réactives (3) , au moins une zone réactive (4) , un réservoir contenant une solution de lavage (5). 2) Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support solide coulisse par un système coulissant dans le réservoir (4), le réservoir emboîtant le support solide. 3) Dispositif selon les revendications 1 à 2, caractérisé en ce que les zones réactives (4) sont imprégnées d'un réactif de complexation comme des anticorps et! ou des fragments de membranes d'hématies tests ou autres cellules, lysats cellulaires, fragments de membrane permettant la reconnaissance antigénique de celle-ci. 4) Dispositif selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il y a au moins une zone 20 réactive sur le support (3). 5) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le support des zones réactives est fait d'une matière absorbante plastique polyéthylène. 6) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le dispositif de l'invention contienne une solution de lavage permettant de révéler les 25 analytes recherché et d'éluer les éléments non fixé. 7) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la lecture du résultat se fait par complexation des réactifs lisible par positivité de résultat et peut être amélioré par un colorant. 8) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le 30 dispositif se présente sous forme de carte contenant au moins une zone réactive. 9) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le dispositif est caractérisé par le fait que le dépôt d'un certain volume d'echatillon de fluide biologique soit déposé dans la ou les zones réactives et la lecture du résultat se fait sur cette zone. 10) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le dispositif est constitué d'un réservoir contenant une solution de lavage et/ou de révélation permettant d'accueillir les zones réactives et solidaire ou non des autres parties du dispositif appliqué à l'usage en question. 20