FR 2922658 A1 20090424 FR 0707299 A 20071018 SYSTÈME D'ILLUMINATION STRUCTURÉE D'UN ÉCHANTILLON L'invention se rapporte à système d'illumination structurée pour la 5 microscopie tridimensionnelle d'un échantillon. La publication de Wilson et al. � confocal microscopy by aperture correlation �, 1996, décrit un tel système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon. Dans cette publication, l'illumination de l'échantillon est structurée par une grille mobile. Une telle structuration permet une amélioration de la résolution axiale du système par rapport à un microscope dit classique mais elle ne permet pas d'améliorer la résolution latérale. 15 L'invention se rapporte plus particulièrement à un système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon comprenant : - des moyens de génération' de faisceaux agencés pour générer 20 des faisceaux lumineux cohérents ; - un objectif ayant un plan focal arrière, l'objectif étant agencé de sorte que l'échantillon soit susceptible d'être positionné dans le plan de mise au point de l'objectif ; des moyens de focalisation agencés pour focaliser les 25 faisceaux lumineux dans le plan focal arrière de sorte que les faisceaux interfèrent de façon collimatée dans le plan de mise au point de l'objectif. Un tel système d'illumination structurée d'un échantillon est 30 notamment connu de la publication de Gustaffson et al. � Extended resolution fluorescence microscopy �, 1999. Dans ce document, comme illustré figure 1, le système d'illumination 1 comprend une source lumineuse 2, un réseau de diffraction 3 35 formant les moyens de génération de faisceaux, le réseau de 10 diffraction 3 étant couplé à un filtre 7 de sorte à générer seulement deux faisceaux lumineux diffractés cohérents 4a et 4b à partir de la source lumineuse 2, une lentille 5 agencée pour focaliser les faisceaux cohérents 4a et 4b dans le plan focal arrière PFA d'un objectif 6 de microscope, un échantillon 18 étant positionné dans le plan de mise au point PMP de l'objectif 6. Les faisceaux cohérents 4a et 4b sont des faisceaux diffractés ayant des ordres symétriques p et ûp. Un tel système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon a notamment l'avantage d'avoir une résolution latérale améliorée et de permettre des mesures en plein champ. Toutefois, il a l'inconvénient d'avoir une résolution axiale identique à celle d'un microscope dit classique, c'est-à-dire de l'ordre de 0,4 micromètre. Un but de l'invention est d'améliorer la résolution axiale dans un tel 20 système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon. Un autre but de l'invention est de fournir un système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon 25 permettant d'améliorer à la fois la résolution axiale et la résolution latérale par rapport à un système d'illumination classique, c'est-à-dire d'atteindre des résolutions axiales de l'ordre de 0,3 micromètres, et des résolutions latérales de l'ordre de 0,1 micromètres. 30 Un autre but de l'invention est de permettre d'atteindre de telles performances tout en conservant une cadence d'acquisition compatible avec l'étude de phénomènes dynamiques, c'est-à-dire supérieure ou égale à 1 Hertz. Au moins un de ces buts est atteint grâce à un système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle tel que décrit ci-dessus, dans lequel les moyens de génération de faisceaux sont agencés pour générer au moins deux faisceaux cohérents non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif. Grâce à l'invention, et notamment au fait que les faisceaux cohérents générés par les moyens de génération comprennent au moins deux faisceaux non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif, l'échantillon est éclairé par des faisceaux cohérents mais non symétriques dans la direction axiale. Dès lors, il est possible, par une modification de la distance entre l'objectif et l'échantillon ou un déplacement axial de l'illumination dans l'échantillon, d'utiliser cette non symétrie à partir notamment de la différence d'illumination entre deux positions axiales de l'échantillon. Ceci permet ainsi d'améliorer la résolution axiale par rapport au système de Gustaffson et al. mentionné ci-dessus, et d'obtenir notamment une résolution axiale inférieure à 0,3 micromètres. En outre, grâce à l'invention, la résolution latérale maintenue autour de 0,1 micromètres, comme dans le système de Gustaffson et al. susmentionné. Enfin, puisque le système selon l'invention est un système d'imagerie 25 plein champ, une cadence supérieure à 1 Hz peut être obtenue. Selon l'invention, on a donc réalisé une structuration tridimensionnelle de l'illumination qui permet de réaliser un codage axial de l'illumination en plus du codage latéral connu en soi. On décrit maintenant des modes de réalisation avantageux de l'invention. 30 Selon un mode de réalisation de l'invention, les moyens de génération de faisceaux peuvent comprendre une source lumineuse apte à générer un signal lumineux, et les moyens de génération de faisceaux sont agencés pour générer les faisceaux cohérents à partir du signal lumineux. Dans ce cas, les moyens de génération de faisceaux peuvent comprendre des moyens de diffraction agencés pour diffracter le signal lumineux de sorte à générer lesdits au moins deux faisceaux cohérents non symétriques. 10 Selon un mode de réalisation, les moyens de diffraction peuvent comprendre un réseau de diffraction agencé pour générer une pluralité de faisceaux cohérents diffractés, et les moyens de génération de faisceaux peuvent comprendre des moyens de filtrage 15 agencés de sorte à filtrer lesdits au moins deux faisceaux cohérents non symétriques parmi la pluralité de faisceaux cohérents. Selon un autre mode de réalisation, les moyens de diffraction comprennent un modulateur spatial de lumière programmé pour 20 générer lesdits au moins deux faisceaux cohérents à partir du signal lumineux. Ce mode de réalisation a l'avantage de permettre de modifier les caractéristiques des faisceaux cohérents non symétriques sans déplacer les moyens de diffraction. En particulier, il est avantageux, dans le cadre de l'invention, de pouvoir simuler un 25 déplacement latéral et ajouter une phase aux faisceaux générés afin de réaliser les mesures sur l'échantillon. De préférence, les moyens de génération de faisceaux peuvent être agencés pour générer trois faisceaux cohérents, au moins deux 30 faisceaux cohérents parmi les trois faisceaux cohérents étant non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif. Dans le cadre de l'invention, la génération de ces trois faisceaux cohérents permet d'obtenir une structuration du champ symétrique par rapport à l'axe optique de l'objectif et un gain d'un facteur deux en résolution axiale5 par rapport à un éclairage avec uniquement deux faisceaux cohérents non symétriques. En particulier, les moyens de génération de faisceaux peuvent comprendre une source lumineuse apte à générer un signal lumineux, et des moyens de diffraction agencés pour générer les trois faisceaux cohérents par diffraction du signal lumineux. De préférence, les moyens de génération de faisceaux sont agencés pour que les trois faisceaux cohérents générés par diffraction correspondent à deux faisceaux diffractés d'ordres de diffraction symétriques et à un faisceau d'ordre de diffraction zéro. Dans ce cas, les faisceaux d'ordre symétriques N et ùN forment, avec le faisceau d'ordre de diffraction zéro, deux couples de faisceaux non symétriques utilisables dans le cadre de l'invention. En particulier, les deux faisceaux diffractés d'ordre de diffraction symétrique peuvent être d'intensité égale, et les deux ordres de diffraction symétriques peuvent être choisis de sorte que l'intensité du faisceau d'ordre de diffraction zéro soit égale à quatre fois l'intensité d'un des faisceaux diffractés d'ordre de diffraction symétriques. On démontre en effet que l'amélioration de la résolution axiale est la meilleure dans ce cas. Afin de permettre des mesures latérales dans un plan xOy perpendiculaire à l'axe optique z de l'objectif, le système peut comprendre des moyens de déplacement latéral agencés pour déplacer latéralement le motif d'interférence généré par lesdits au moins deux faisceaux cohérents non symétriques dans le plan de mise au point de l'objectif. Selon un mode de réalisation, les moyens de déplacement latéral sont agencés pour déplacer latéralement le réseau de diffraction. Ce mode de réalisation a l'avantage d'être simple, mais il nécessite un déplacement mécanique du réseau de diffraction. Selon un autre mode de réalisation, les moyens de déplacement latéral comprennent un calculateur du modulateur spatial de lumière, le calculateur étant programmé de sorte à déphaser lesdits au moins deux faisceaux cohérents par rapport à l'axe optique de l'objectif. Ce mode de réalisation a l'avantage de permettre un déplacement latéral du motif d'interférence dans l'échantillon et simule donc le déplacement latéral d'un réseau de diffraction par programmation du modulateur spatial de lumière. II permet donc de réaliser des mesures latérales sans déplacement physique des composants du système. En outre, afin de réaliser des mesures selon l'axe optique de l'objectif, le système peut comprendre des moyens de déplacement axial agencés pour modifier la distance optique axiale parcourue par lesdits au moins deux faisceaux entre l'objectif et l'échantillon. Ces moyens de déplacement axial peuvent comprendre des moyens agencés pour modifier la distance axiale entre l'objectif et l'échantillon. Ce mode de réalisation a l'avantage d'être simple à mettre en oeuvre, notamment à l'aide de dispositifs piézo-électriques. Selon un autre mode de réalisation, les moyens de déplacement axial peuvent comprendre un calculateur du modulateur spatial de lumière, le calculateur étant programmé de sorte à appliquer un terme de phase constant à chacun desdits au moins deux faisceaux cohérents. Dans ce cas, comme précédemment concernant le déplacement latéral, ce mode de réalisation a l'avantage de permettre de réaliser des mesures axiales sans déplacement physique des composants du système. L'invention se rapporte également à un procédé pour améliorer un microscope existant, le microscope existant comprenant un objectif existant, le procédé comprenant des étapes dans lesquelles : on fournit des moyens de génération de faisceaux agencés pour générer des faisceaux lumineux cohérents de sorte qu'au moins deux faisceaux cohérents soient non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif ; on agence des moyens de focalisation par rapport à l'objectif existant de sorte à permettre une focalisation des faisceaux lumineux dans le plan focal arrière de l'objectif pour que les faisceaux interfèrent de façon collimatée dans le plan de mise au point de l'objectif. Grâce à ce procédé, il est donc possible de réaliser un nouveau microscope ayant une résolution axiale améliorée à partir d'un microscope existant. En agençant les moyens de focalisation par rapport à l'objectif existant de sorte à permettre une focalisation des faisceaux lumineux dans le plan focal arrière de l'objectif, on garantit en effet l'amélioration de la résolution axiale comme mentionné précédemment. On décrit maintenant un mode de réalisation de l'invention en référence aux figures annexées dans lesquelles : la figure 2 représente un système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon selon un mode de réalisation de l'invention ; la figure 3 représente un système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon selon un autre mode de réalisation de l'invention ; la figure 4 représente les trajets de faisceaux lumineux dans un système tel qu'illustré en référence aux figure 2 et figure 3. 30 Sur les figures, des références identiques se rapportent, sauf indication contraire, à des caractéristiques techniques similaires. Comme illustré sur la figure 2, selon un premier mode de réalisation de l'invention, un système 8 d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon comprend une source lumineuse 9 apte à générer un signal lumineux cohérent et polarisé linéairement. La source lumineuse 9 est par exemple un laser. Il comprend également un modulateur spatial de lumière 10 en transmission ou en réflexion programmé pour générer, à partir du signal lumineux reçu de la source 9, trois faisceaux diffractés d'intensité respectives IN, LN et lo. Les faisceaux diffractés IN et LN sont des faisceaux d'ordre symétriques, et le faisceau lo correspond à un faisceau d'ordre zéro. L'ordre des faisceaux diffractés IN et LN est choisi de sorte que l'intensité du faisceau d'ordre zéro soit égal à quatre fois l'intensité de ces faisceaux, soit Io=41N=41_N. On démontre en effet que l'amélioration de la résolution axiale est la meilleure dans ce cas. Afin que le signal lumineux reçu de la source 9 s'adapte à la taille du modulateur spatial de lumière 10, il est possible de positionner un dispositif afocal non représenté entre la source 9. et le modulateur spatial de lumière 10 de sorte à élargir le signal lumineux, par exemple de cinq à dix fois. En sortie du modulateur spatial de lumière 10, les faisceaux diffractés passent par un nouveau dispositif afocal 11 et sont focalisés dans le plan focal arrière PFA d'un objectif 12 de microscope 13 par un doublet achromatique 19. Le facteur de grandissement du dispositif afocal 11 est choisi pour que les angles de diffraction soit adaptés au diarnètre de l'objectif 12 du microscope 13. Un échantillon 14 par exemple sous la forme d'un objet ponctuel fluorescent est positionné dans le plan de mise au point PMP de l'objectif 12 du microscope 13 au niveau duquel les trois faisceaux diffractés IN, LN et Io interfèrent. Le système 8 décrit ci-dessus permet une structuration tridimensionnelle de l'illumination vers l'échantillon 14. En effet, l'utilisation de trois ordres de diffraction fait apparaître un effet Talbot dans le champ transmis par l'objectif. En fonctionnement, pour réaliser des mesures dans le plan latéral xOy, on programme le modulateur spatial de lumière 10 de sorte à déplacer latéralement le motif d'interférence généré par les trois faisceaux diffractés dans le plan de mise au point de l'objectif. Cette programmation permet de simuler un déplacement latéral d'un réseau de diffraction générant les trois faisceaux diffractés sans que le modulateur ne se déplace physiquement. Suite à ce déplacement latéral simulé, on mesure la position de l'objet ponctuel fluorescent de façon connue en soi en combinant plusieurs images ou leur transformée de Fourier pour différentes positions réelles ou simulées du réseau de diffraction, par exernple par différence entre l'intensité de la fluorescence reçue pour deux positions réelles ou simulées du réseau de diffraction.- En outre, en fonctionnement, pour réaliser des mesures selon la direction axiale z, on modifie la distance optique entre l'échantillon 14 et l'objectif 12. Pour ce faire, on peut utiliser une platine piézo-électrique 15 positionnée au niveau de l'échantillon 14 ou déplacer axialement l'objectif 12. Il est également possible de simuler ce déplacement en programmant le modulateur spatial de lumière 10 pour appliquer un terme de phase constant à tous les pixels du modulateur 10. Comme précédemment, et grâce à l'effet Talbot bien connu, on mesure la position axiale de l'objet ponctuel fluorescent par exemple par différence entre l'intensité de la fluorescence reçue pour deux distances réelles ou simulées entre l'objectif 12 et l'échantillon 14. Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention illustré figure 3, on remplace, dans le système 8 selon l'invention, le modulateur spatial de lumière 10 par un réseau de diffraction 16 monté sur une platine piézo-électrique 17. Dans ce cas, pour garantir que seuls les trois faisceaux IN, I_N et Io sont transmis vers l'échantillon 14, le système 8 comprend un filtre agencé pour sélectionner parmi l'ensemble des ordres diffractés, les faisceaux d'ordre IN, LN et lo. Les ordres N et ûN sont de préférence choisis comme précédemment de sorte que I0=4IN=41_N. En fonctionnement, pour réaliser des mesures dans le plan latéral xOy, on déplace le réseau de diffraction 16 latéralement grâce à la platine piézo-électrique 17. En outre, pour réaliser des mesures selon la direction axiale z, on modifie la distance entre l'échantillon 14 et l'objectif 12. Pour ce faire, on peut utiliser une platine piézo-électrique 15 positionnée au niveau de l'échantillon 14 ou déplacer axialement l'objectif 12 en laissant l'échantillon fixe. Sur la figure 4, on a illustré le trajet des faisceaux lumineux grâce au système d'illumination selon l'invention. Selon l'invention, la source lumineuse 9 génère un signal lumineux sous la forme d'une onde plane 22. Cette onde plane est diffractée par des moyens de génération de faisceaux 21 permettant de générer uniquement trois ordres de diffraction k, IN et I..N. Ces moyens de génération de faisceaux correspondent soit au modulateur spatial de lumière 10 décrit en référence à la figure 2, soit à l'ensemble formé par le réseau de diffraction et le filtre 16 et le filtre 20 en référence à la figure 3. Les faisceaux diffractés lo, IN et I_N sont encore des ondes planes. Les moyens de focalisation 19 correspondant par exemple à une lentille ou au doublet achromatique 19 décrit précédemment font converger ces faisceaux vers le plan focal arrière PFA de l'objectif 12 du microscope 13. De la sorte, les faisceaux Io, IN et I_N interfèrent dans le plan de mise au point PMP sous la forme d'ondes planes et les mesures relatives à un échantillon 14 positionné dans le plan de mise au point PMP peuvent être réalisées. On décrit maintenant des variantes de l'invention. On a décrit ci-dessus des moyens de génération de faisceaux permettant de générer trois faisceaux cohérents qui interfèrent au niveau du plan de mise au point de l'objectif. L'effet d'amélioration de la résolution axiale est alors optimal pour des faisceaux IN, I_N et Io, les ordres N et ûN étant choisis comme précédemment de sorte que Io=41N=41_N. Toutefois, on comprend que l'effet d'amélioration de la résolution axiale est obtenu dès lors que les faisceaux diffractés sont tels qu'au moins deux faisceaux cohérents non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif interfèrent au niveau du plan de mise au point PMP de l'objectif 12. En effet, dans ce cas, la symétrie axiale des faisceaux est rompue et il est possible, en déplaçant l'échantillon 14 par rapport à l'objectif 12 ou en simulant ce déplacement comme mentionné précédemment, d'obtenir une information sur la position axiale de l'échantillon 14. Au contraire, on peut noter, en référence à la figure 1, qu'un déplacement de l'échantillon 18 par rapport à l'objectif 6 n'aurait aucun effet dans le cadre du système 1 décrit dans la publication de Gustafsson et al. puisque les deux faisceaux 4a et 4b sont symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif. Un tel déplacement axial ne permet donc pas de réaliser des mesures axiales précises. II a été démontré que l'invention décrite précédemment permettait d'améliorer la résolution axiale d'un facteur de l'ordre de 10 par rapport à la microscopie dite classique. En outre, l'utilisation d'un modulateur spatial de lumière comme décrit en référence à la figure 2 a l'avantage d'éviter les déplacements mécaniques du système et donc d'améliorer la précision des mesures. Le système 8 décrit précédemment peut également facilement s'adapter sur un microscope 13 existant, en parallèle du système d'illumination existant. 10 Dans ce cas, dans les modes de réalisation décrits ci-dessus, le microscope 13 peut être un microscope existant avec un objectif existant 12, et on adapte le système d'illumination de sorte que les faisceaux IN, 1_N et lo soient focalisés dans le plan focal arrière PFA de l'objectif 12. On forme alors un nouveau microscope ayant une 15 résolution améliorée permettant une observation plein champ.5 REVENDICATIONS 1. Système d'illumination structurée (8) pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon (14) comprenant : des moyens de génération de faisceaux (9, 10, 16, 20) agencés pour générer des faisceaux lumineux cohérents (IN, 1_N, 10) ; un objectif (12) ayant un plan focal arrière (PFA), l'objectif étant agencé de sorte que l'échantillon (14) soit susceptible d'être positionné dans le plan de mise au point (PMP) de l'objectif ; des moyens de focalisation (19) agencés pour focaliser les faisceaux lumineux dans le plan focal arrière (PFA) de sorte que les faisceaux interfèrent de façon collimatée dans le plan de mise au point (PMP) de l'objectif (12), caractérisé en ce que les moyens de génération de faisceaux (9, 10, 16, 20) sont agencés pour générer au moins deux faisceaux cohérents (IN, I_N, 10) non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif. 2. Système selon la revendication 1, dans lequel les moyens de génération de faisceaux comprennent une source lumineuse (9) apte à générer un signal lumineux (22), et les moyens de génération de faisceaux sont agencés pour générer les faisceaux cohérents à partir du signal lumineux. 3. Système selon la revendication 2, dans lequel les moyens de génération de faisceaux (9, 10, 16, 20) comprennent des moyens de diffraction (10, 16) agencés pour diffracter le signal lumineux (22) de sorte à générer lesdits au moins deux faisceaux cohérents (IN, I_N, 10). 4. Système selon la revendication 3, dans lequel les moyens de diffraction (10, 16) comprennent un réseau de diffraction (16) agencés pour générer une pluralité de faisceaux cohérents diffractés, et les moyens de génération de faisceaux (9, 10, 16, 20)30comprennent des moyens de filtrage (20) agencés de sorte à filtrer lesdits au moins deux faisceaux cohérents non symétriques parmi la pluralité de faisceaux cohérents. 5. Système selon la revendication 3, dans lequel les moyens de diffraction (10, 16) comprennent un modulateur spatial de lumière (10) programmé pour générer lesdits au moins deux faisceaux cohérents (IN, LN, la) à partir du signal lumineux (22). 6. Système selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les moyens de génération de faisceaux (10, 16, 20, 9) sont agencés pour générer trois faisceaux cohérents (IN, I_N, 10), au moins deux faisceaux cohérents (IN, I_N, la) parmi les trois faisceaux cohérents étant non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif. 7. Système selon la revendication précédente, dans lequel les moyens de génération de faisceaux (10, 16, 20, 9) comprennent une source lumineuse (9) apte à générer un signal lumineux (22), et des moyens de diffraction (10, 16) agencés pour générer les trois faisceaux cohérents (IN, 1_N, la) par diffraction du signal lumineux (22). 8. Système selon la revendication précédente, dans lequel les moyens de génération de faisceaux (10, 16, 20, 9) sont agencés pour que les trois faisceaux cohérents générés par diffraction correspondent à deux faisceaux diffractés d'ordres de diffraction symétriques et à un faisceau d'ordre de diffraction zéro. 9. Système selon la revendication précédente, dans lequel les deux faisceaux diffractés d'ordre de diffraction symétrique sont d'intensité égale, et les deux ordres de diffraction symétriques sont choisis de sorte que l'intensité du faisceau d'ordre de diffraction zéro soit égale à quatre fois l'intensité d'un des faisceaux diffractés d'ordre de diffraction symétrique. 10. Système selon l'une des revendications précédentes, comprenant des moyens de déplacement latéral (17) agencés pour déplacer latéralement le motif d'interférence généré par lesdits au moins deux faisceaux cohérents non symétriques dans le plan de mise au point de l'objectif. 11. Système selon la revendication précédente, dans lequel les 10 moyens de déplacement latéral (17) sont agencés pour déplacer latéralement le réseau de diffraction. 12. Système selon la revendication 10, dans lequel les moyens de déplacement comprennent un calculateur du modulateur spatial de 15 lumière, le calculateur étant programmé de sorte à déphaser lesdits au moins deux faisceaux cohérents par rapport à l'axe optique de l'objectif. 13. Système selon l'une des revendications précédentes, comprenant 20 des moyens de déplacement axial (15) agencés pour modifier la distance optique axiale parcourue par lesdits au moins deux faisceaux entre l'objectif (12) et l'échantillon (14). 14. Système selon la revendication précédente, dans lequel les 25 moyens de déplacement axial (15) comprennent des moyens (15) agencés pour modifier la distance axiale entre l'objectif (12) et l'échantillon (14). 15. Système selon la revendication 13, dans lequel les moyens de 30 déplacement axial comprennent un calculateur du modulateur spatial de lumière (10), le calculateur étant programmé de sorte à appliquer un terme de phase constant à chacun des au moins deux faisceaux cohérents. 16. Microscope comprenant un système d'illumination structurée (8) selon l'une des revendications précédentes. 17. Procédé pour améliorer un microscope existant, le microscope 5 existant comprenant un objectif existant, le procédé comprenant des étapes dans lesquelles : on fournit des moyens de génération de faisceaux agencés pour générer des faisceaux lumineux cohérents de sorte qu'au moins deux faisceaux cohérents soient non symétriques par rapport à 10 l'axe optique de l'objectif ; on agence des moyens de focalisation par rapport à l'objectif existant de sorte à permettre une focalisation des faisceaux lumineux dans le plan focal arrière de l'objectif pour que les faisceaux interfèrent de façon collimatée dans le plan de mise 15 au point de l'objectif.