FR 2906810 A1 20080411 FR 0654089 A 20061004 PROCEDE DE FORMATION D'UN FILM DE POLYMERE(S) SUR DES SITES PREDETERMINES D'UN SUBSTRAT DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention a pour objet un 5 procédé de formation d'un film de polymère(s) sur des sites prédéterminés d'un substrat. Ce procédé s'applique en particulier pour réaliser la protection de sites prédéterminés dans la fabrication d'une matrice de sondes d'oligonucléotides 10 (également appelées biopuces) présentant des séquences différentes, en vue d'être utilisées pour l'analyse, le diagnostic ou la recherche en génétique (mutations, polymorphismes, transcriptome), d'oligosaccharides ou de tout autre molécule d'intérêt. 15 Ce procédé peut également s'appliquer à la réalisation d'écrans plats. ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE De nombreux systèmes ou dispositifs d'analyse chimique ou biologique sont utilisés pour le 20 séquençage et l'étude de l'expression des gènes. Ils sont constitués d'un ensemble de sondes moléculaires (oligonucléotides) fixées sur la surface miniaturisée d'un substrat afin de réaliser une biopuce à ADN. Au cours de l'analyse d'un échantillon, les 25 acides nucléiques cibles extraits sont marqués et déposés sur la matrice de sondes. L'hybridation (appariement entre les brins complémentaires de la double hélice d'ADN) entre les sondes et les cibles 2906810 2 marquées permet de repérer et d'identifier les séquences de l'échantillon d'ADN. Différentes techniques de greffage et d'immobilisation des sondes (par liaison covalente ou électrostatique) sur différents substrats (silicium, verre, polymère, électrodes en or) ont fait l'objet de recherches et de développements industriels. Les matrices de sondes sont ainsi réalisées . - soit par l'immobilisation d'oligonucléotides présynthétisés de façon enzymatique ou chimique par greffage de ceux-ci par des moyens mécaniques, électrochimiques ou par jet d'encre sur un substrat fonctionnalisé ou sur un polymère conducteur (appelée communément synthèse off chip ) ; soit par synthèse in situ des oligonucléotides sondes sur le substrat structuré (appelée communément synthèse on chip ). Les procédés de synthèse in situ se déroulent classiquement de la manière suivante : 1) une étape de fixation sur l'ensemble des sites de greffage d'un premier nucléotide protégé en position 5' par un groupement protecteur ; 2) une étape de masquage de sites de fixation prédéterminés ; 3) une étape de fixation sur les sites non masqués d'un deuxième nucléotide sur le premier nucléotide ; les étapes de masquage 2) et de fixation 3) étant répétées jusqu'à obtenir des olinucléotides de séquence voulue sur chacun des sites de greffage. 2906810 3 Les étapes de fixation sur les sites non masqués d'un nucléotide (n+1) sur un nucléotide n se déroulent selon un cycle comprenant généralement 4 phases . 5 - une phase de déprotection qui active le OH en 5' du nucléotide n par voie chimique (par exemple, lorsque le groupe protecteur est le diméthoxytrityle), par voie photochimique (par exemple, lorsque le groupe protecteur est un groupe photolabile, 10 tel que l'((a-méthyl-2-nitropipéronyl)-oxy)carbonyle)) ou encore par voie électrochimique (par exemple, lorsque le groupe protecteur est un groupe électrolabile par réduction, tel que le p- nitrobenzoyle) ; 15 - une phase de couplage par addition du nucléotide (n+1) protégé en 5' et activé en 3' par un groupe phosphoramidite, phosphite ou phosphonate, avec l'hydroxyle en 5' du nucléotide n ; une phase de capping destinée à 20 éliminer les réactifs n'ayant pas réagi ; une phase d'oxydation du phosphore trivalent en son homologue pentavalent de la position 3' avant d'entreprendre le cycle suivant. L'étape de masquage 2) définie ci-dessus 25 est réalisée en vue de protéger les sites non destinés à subir la fixation d'un nucléotide lors du cycle défini ci-dessus. Ce masquage doit être efficace pour obtenir au final des oligonucléotides de séquences différentes prédéterminées pour des sites donnés. 30 Dans l'art antérieur, notamment dans le document WO 0053310, la fixation d'oligonucléotides 2906810 4 s'effectue sur des sites fonctionnalisés se présentant sous forme de cuvettes pratiquées dans le substrat. L'étape de masquage s'effectue donc par dépôt d'une capsule de protection dans les cuvettes 5 appropriées. La capsule de protection décrite dans WO 0053310 est réalisée avec du polyhydroxystyrène déposé dans les cuvettes par éjection d'une solution comprenant du diméthylsulfoxyde (solvant) et ledit polymère. Le substrat est ensuite chauffé dans sa 10 totalité pour évaporer le solvant et laisser le polymère sous forme d'un film d'épaisseur inhomogène dans les cuvettes. Cependant, cette technique est limitée car il est techniquement difficile de déposer suffisamment 15 de polymère pour protéger parfaitement les cuvettes qui ne doivent pas subir l'étape de greffage de nucléotides. En particulier, le polymère s'accumule inutilement sur les parois de la cuvette sans couvrir totalement le fond et ce quelle que soit la quantité de 20 polymère injectée. Les inventeurs se sont donc fixé comme objectif de mettre au point un procédé de protection de sites prédéterminés d'un substrat à partir d'un substrat sensiblement plan, ce qui permettrait de 25 surmonter les inconvénients liés à l'utilisation de substrats présentant des cuvettes, et qui permette une localisation exclusive du polymère sur les sites prédéterminés. EXPOSÉ DE L'INVENTION 30 Ainsi, l'invention a trait selon un premier objet à un procédé de formation d'un film de 2906810 5 polymère(s) sur des sites prédéterminés d'un substrat comprenant successivement : a) une étape de dépôt sur lesdits sites prédéterminés d'une goutte comprenant un solvant 5 organique et le(s) polymère(s), lesdits sites étant mouillables vis-à-vis du solvant tandis que les zones entourant lesdits sites ne sont pas mouillables par ledit solvant ; b)une étape de chauffage dudit substrat à 10 une température efficace pour obtenir une évaporation dudit solvant. Grâce au choix judicieux d'un substrat comprenant des sites présentant une mouillabilité vis-à-vis du solvant dans lequel le(s) polymère(s) est 15 (sont) dissous, tandis que les zones entourant les sites sont non mouillables vis-à-vis de ce solvant, il est ainsi possible de concentrer la goutte sur les sites choisis et d'obtenir après chauffage un film dudit polymère couvrant exclusivement les sites 20 choisis. La mouillabilité est définie par l'angle de contact (ou angle de raccordement) que forme la goutte avec le substrat sur les sites de dépôt de la goutte. Ainsi, lorsque l'on précise que les sites 25 de dépôt sont mouillables vis-à-vis du solvant, cela signifie, généralement, que la goutte déposée va former par rapport au site de dépôt un angle de contact présentant généralement une valeur inférieure à 40 tandis que, pour les zones non mouillables entourant 30 ledit site, cela signifie que l'angle de contact formé entre la goutte et ces zones présente généralement une 2906810 6 valeur supérieure à 60 , de préférence supérieure à 80 . D'un point de vue pratique, cela signifie que les gouttes déposées vont s'étaler sur toute la superficie des sites mouillables tandis qu'elles ne s'étalent pas 5 ou plus difficilement sur les zones entourant ces sites. La goutte reste ainsi localisée sur ces sites et le film de polymère obtenu après évaporation du solvant reste ainsi concentré exclusivement sur les sites mouillables. 10 Concrètement, dans le cadre de l'invention, la goutte éjectée vient s'étaler essentiellement sur le site mouillable et éventuellement légèrement sur les zones non mouillables entourant ce site. Cet éventuel débordement n'est pas préjudiciable, puisque l'étape 15 d'évaporation permet au polymère de se recentrer exclusivement sur le site mouillable sans perdurer sur les zones non mouillables entourant ledit site. D'un point de vue chimique, un liquide va mouiller un substrat solide s'il présente une affinité 20 chimique vis-à-vis de celui-ci. Ainsi un substrat solide hydrophobe va être mouillable vis-à-vis des liquides hydrophobes et inversement. Le procédé de l'invention peut comprendre 25 une étape de préparation du substrat de façon à créer des sites prédéterminés mouillables vis-à-vis des gouttes comprenant le solvant et le (s) polymère (s) destiné(s) à constituer un film de protection adhérant auxdits sites et des zones entourant ces sites non 30 mouillables vis-à-vis desdites gouttes. 2906810 7 Ainsi, la préparation du substrat peut consister à préparer sur ledit substrat des sites prédéterminés mouillables vis-à-vis du solvant par fonctionnalisation chimique et des zones non 5 mouillables par ledit solvant entourant lesdits sites. Ces zones non mouillables peuvent exister de façon inhérente, de part la nature du substrat, auquel cas seuls les sites mouillables devront être préparés ou vice-versa. Les zones non mouillables et les sites 10 mouillables pourront être amenés à être créés par des traitements appropriés, si aucune de ces propriétés ne préexistent à l'état naturel sur le substrat. Nous explicitons ci-dessous la préparation d'un substrat comprenant des sites hydrophiles et des 15 zones hydrophobes, de façon à pouvoir mouiller ces sites par un solvant aqueux (comprenant de l'eau) ou du DMSO. En partant d'un substrat en silicium, la préparation de celui-ci en vue de délimiter des zones 20 hydrophobes et des sites hydrophiles peut consister à : - soumettre ledit substrat à une oxydation thermique de façon à créer une couche d'oxyde de silicium ; déposer sur ladite couche d'oxyde de 25 silicium une couche de résine photosensible ; - éliminer par photolithographie la résine en des zones prédéterminées ; - générer des fonctions silanols sur lesdits zones prédéterminées en soumettant lesdites 30 zones prédéterminées à un plasma d'oxygène ; 2906810 8 - greffer sur lesdites fonctions silanols un composé silane hydrophobe, tel que le perfluorooctyltrichlorosilane. éliminer la résine photosensible 5 subsistante, générant ainsi des sites prédéterminés hydrophiles et des zones hydrophobes entourant lesdits sites. L'on obtient ainsi à l'issue de cette préparation un substrat présentant des zones 10 hydrophobes (zones greffées par le composé silane hydrophobe) et des sites hydrophiles (sites entourés par lesdites zones et protégés lors du greffage par une résine photosensible). Ces sites sont mouillables vis-à-vis d'un 15 solvant sélectionné par son caractère mouillant, tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO). Le DMSO a notamment la capacité de dissoudre des polymères tels que les polyhydroxystyrènes. Il sera donc possible de protéger, par un film de protection en polyhydroxystyrène, les 20 sites hydrophiles susmentionnés en déposant sur ceux-ci une goutte comprenant du diméthylsulfoxyde (DMSO) et un polyhydroxystyrène. L'étape de dépôt de la goutte comprenant le 25 solvant et le (s) polymère (s) sur les sites prédéterminés peut se faire par adressage mécanique, par exemple, en utilisant des techniques de microdéposition sélective du type actuateur piézoélectrique, pin and ring , impression par jets 30 d'encre, vis d'Archimède et micropipettage. L'adressage du polymère par microdéposition permet de distribuer 2906810 9 localement sur les sites prédéterminés des gouttelettes calibrées d'un polymère en solution. Qui plus est, du fait du caractère mouillant des sites prédéterminés par rapport aux zones les entourant, la goutte se centre 5 automatiquement sur le site prédéterminé en quelques centaines de millisecondes pour des gouttes présentant un diamètre de quelques millimètres. Une fois l'étape de dépôt réalisée, le procédé de l'invention comprend une étape de séchage du 10 substrat à une température efficace pour obtenir une évaporation du solvant. Ce séchage s'accompagne automatiquement d'un centrage du polymère sur le site prédéterminé (même si la goutte initiale a une taille plus élevée que le site actif). L'étape de séchage est 15 généralement réalisé en chauffant le substrat à une température allant de 60 à 80 C pendant une durée allant, par exemple, de 1 minute à 10 minutes et, préférentiellement, de 2 minutes à 5 minutes. A l'issue du séchage, les polymères forment sur les sites 20 prédéterminés des couvercles étanches ajustés sur ces sites et peuvent ainsi assurer un rôle protecteur vis-à-vis de ces sites. En fonction de la stratégie de chauffage adoptée (puissance de chauffage plus ou moins importante, chauffage directement consécutif au dépôt), 25 il est possible de contrôler la taille et la géométrie finale des spots de dépôt, afin d'obtenir des capsules de protection homogène centrée et d'épaisseur contrôlée. Différents moyens de chauffage sont 30 envisageables, tels qu'un chauffage par contact direct 2906810 10 du substrat ou via un courant d'air chaud ou encore par application d'un rayonnement infra-rouge. Ce procédé peut trouver son application dans des domaines très variés, notamment tous les 5 domaines nécessitant le dépôt d'un film de polymère exclusivement sur des sites choisis à partir de solutions le comprenant. Cela peut être le cas des procédés de réalisation d'une matrice de séquences de molécules 10 chimiques ou biologiques formées d'enchaînements différents de molécules, telle que les puces à ADN, à oligosaccharides, à protéines, etc.. Compte tenu que ces matrices présentent des séquences différentes sur différents sites, il est 15 nécessaire lors de la synthèse in situ de ces séquences de protéger certains sites pour éviter un greffage de molécules sur ceux-ci, la protection consistant à mettre en oeuvre le procédé de formation de film de polymère décrit ci-dessus. 20 Ainsi, l'invention a trait également, selon un deuxième objet, à un procédé d'élaboration d'une matrice de séquences de molécules chimiques ou biologique formées d'enchaînements différents de molécules M1, M2,...,Mn par synthèse in situ sur un 25 substrat tel que défini ci-dessus, comprenant des étapes successives de greffage sur des sites prédéterminés d'une molécule M1, M2, ...ou Mn constitutive desdites séquences, lesdits sites prédéterminés comprenant des groupes fonctionnels aptes 30 à former une liaison covalente avec ladite molécule M1, M2,...ou Mn, ces étapes de greffage étant précédées, 2906810 11 lorsque cela est nécessaire, d'une étape de protection des sites ne nécessitant pas ce greffage, cette étape de protection étant réalisée par la mise en oeuvre du procédé de formation d'un film de polymère tel que 5 défini ci-dessus, ce film de polymère étant éliminé lorsque le site concerné doit subir à nouveau une étape de greffage. Grâce à la protection de certains sites, lors de la réalisation des séquences, l'on obtient 10 ainsi à l'issue du procédé des séquences de molécules chimiques ou biologiques formées d'enchaînements différents de molécules MI, M2,...Mn. Les groupes fonctionnels aptes à former une liaison covalente avec les molécules MI, M2... ou Mn 15 peuvent être issus d'une molécule MI, M2,... ou Mn précédemment greffée ou, lorsqu'il s'agit du premier cycle de greffage, d'un groupe fonctionnel lié directement à des sites choisis du substrat, lequel groupe conférant d'ailleurs la mouillabilité à ce site 20 vis-à-vis du solvant de la solution comprenant le polymère destiné à former un film de protection. Le groupe fonctionnel issu d'une molécule précédemment greffée peut être, lorsque les molécules constitutives de l'enchaînement sont des nucléotides, 25 un groupe OH en 5' apte à créer une liaison covalente avec le phosphoramidite de la position 3' du nucléotide à greffer. Le groupe fonctionnel lié directement au substrat peut être un groupe silane comportant par 30 exemple des liaisons Si-OH, lequel groupe est donc : 2906810 12 - apte par son caractère mouillant à permettre le dépôt d'un film de polymère localisé conformément au procédé de l'invention ; et - à réagir, lorsque que non protégés par un 5 film de polymère(s), avec des fonctions réactives en regard du groupe silane d'une molécule MI, M2, Mnpour former une liaison covalente. On peut citer, comme exemple de tel groupe, un groupe silane porteur d'une fonction du type diol ou 10 époxyde. Les molécules MI, M2, .Mn peuvent être de différents types. A titre d'exemple, il peut s'agir d'acides aminés naturels ou synthétiques L- ou D-, de nucléotides (ARN ou ADN), de pentose ou d'hexose. Dans 15 le cas des acides aminés, le nombre de molécules M1, M2, ...Mn peut être important. Dans le cas des nucléotides, le nombre de molécules est plus limité, puisqu'il inclut A, T (ou U), G et C. Dans le cas où les molécules à greffer sur 20 la matrice sont des oligonucléotides, la synthèse in situ sur des sites prédéterminés tel que définis ci-dessus comprend la mise en oeuvre de plusieurs cycles de synthèse comprenant respectivement, hormis le premier nucléotide de l'enchaînement : 25 - une étape de couplage de l'extrémité -OH en 5' d'un nucléotide greffé avec l'extrémité activée en 3' (phosphoramidite, phosphotriester ou H-phosphonate) d'un autre nucléotide pour former une liaison covalente entre ces deux nucléotides ; 2906810 13 une étape d'oxydation du groupement phosphoramidite, phosphotriester ou H-phosphonate en groupe phosphate ; une partie de ces cycles de synthèse étant 5 réalisée uniquement sur certains des sites prédéterminés, les autres sites étant alors protégés par un film de polymère réalisé par le procédé de formation de film tel que défini ci-dessus, lequel film étant éliminé ultérieurement en vue de pouvoir subir un 10 cycle de synthèse, moyennant quoi l'on obtient à l'issue du procédé des oligonucléotides greffés sur les sites prédéterminés, présentant des enchaînements différents. Il est à noter que le greffage du premier 15 nucléotide sur chacun des sites prédéterminés se fera par couplage de ce nucléotide avec des groupes fonctionnels liés directement sur les sites prédéterminés, ces groupes fonctionnels conférant également les caractéristiques de mouillabilité 20 mentionnées ci-dessus aux sites prédéterminés. Préalablement, à l'étape de couplage, il peut être nécessaire, le cas échéant, de procéder à une étape de déprotection de l'extrémité -OH en 5', cette extrémité étant généralement protégée avant couplage 25 par un groupe trityle, tel que le groupe diméthoxytrityle. Entre l'étape de couplage et l'étape d'oxydation, il peut être procédé à une étape de blocage (dite étape de capping ) des groupes 30 fonctionnels réactifs (généralement le groupe activé à l'extrémité 3') des nucléotides à greffer n'ayant pas 2906810 14 réagi, de sorte à ce que ces nucléotides n'interviennent pas dans les cycles de synthèse ultérieurs. Les cycles de synthèse (comprenant 5 éventuellement une étape de déprotection, une étape de couplage, éventuellement une étape de blocage, et une étape d'oxydation) sont réalisés classiquement dans un synthétiseur automatique d'oligonucléotides, par trempage du substrat dans la chambre de réaction du 10 synthétiseur. L'étape de formation d'un film de protection sur certains des sites prédéterminés lors de certains cycles de synthèse (qui correspond à une protection sélective de ces sites par un polymère de protection) est effectuée classiquement à l'aide de 15 techniques de microdéposition. Le choix du polymère protecteur dans la réalisation de matrice est très important et doit répondre avantageusement à un certain nombre de 20 critères, tels que l'éjectabilité qui sera fonction de la concentration et de la nature du polymère et la résistance aux étapes chimiques. Tout d'abord, le polymère doit pouvoir avantageusement être déposé par les techniques de 25 microdéposition citées précédemment, par le biais d'une solution du polymère dans un solvant. Dans le cas de la synthèse de nucléotides, et où le polymère de protection est destiné à être maintenu durant la totalité du cycle de synthèse tel 30 que défini ci-dessus, celui-ci doit être, de préférence, inerte, et de préférence exempt de 2906810 15 fonctions réactives capables de se coupler aux molécules et réactifs de synthèse. Il ne doit pas être soluble dans les solvants utilisés dans les étapes du cycle et présenter une imperméabilité vis-à-vis de ces 5 solvants. En réalité, il suffit que le polymère joue son rôle de couvercle protecteur essentiellement dans l'étape de déprotection (généralement, une étape de détritylation) ou dans l'étape de couplage. Il est 10 alors possible d'adapter et d'optimiser le couple polymère-solvants pour l'étape retenue. Par exemple, dans le cas de puces à ADN, il est préférable que le polymère de protection ne comporte pas de fonctions avec des hydrogènes libres du 15 type OH, NH2 ou COOH qui seraient capables de se coupler avec les molécules MI, M2, ..., Mn, par exemple, les nucléotides, au cours de l'étape de couplage, pour éviter de consommer inutilement des réactifs qui seront éliminés ensuite avec le polymère de protection. 20 Le polymère doit pouvoir être éliminé par un solvant inerte vis-à-vis des nucléotides. Le choix du polymère de protection sera effectué : - d'une part, en fonction de la(des) 25 étape(s) pendant lesquelles il doit protéger certains des sites de greffage, en tenant compte de sa solubilité dans les solvants susceptibles d'être utilisés pour la synthèse des nucléotides ; et - d'autre part, en fonction de la nature 30 des sites de greffage à recouvrir d'un film, étant entendu que ces sites doivent être mouillants vis-à-vis 2906810 16 d'un solvant de ce polymère de protection, de sorte qu'une goutte comprenant le solvant et le polymère puisse se concentrer exclusivement sur ces sites, lors de l'évaporation. 5 En d'autres termes, le polymère doit être soluble dans un solvant mouillant vis-à-vis des sites de greffage et insolubles dans les solvants utilisés dans les étapes contre lesquels le polymère doit protéger les sites choisis. 10 Dans le cas de la synthèse d'oligonucléotides, si l'on veut assurer la protection par le polymère uniquement pendant l'étape de déprotection des extrémités 5' d'un nucléotide, généralement une étape de détritylation, il suffit de 15 choisir un polymère insoluble dans les réactifs de détritylation qui sont généralement constitués par de l'acide dicholoroacétique (DCA) ou trichloroacétique (TCA) ou un acide de Lewis du type ZnBr2, à environ 25% dans un solvant tel que le dichlorométhane, 20 l'acétonitrile ou le toluène. Ainsi, on peut citer comme exemple de tels polymères, les polyhydroxystyrènes insolubles dans les solvants mentionnés ci-dessus (dichlorométhane, acétonitrile ou toluène) et soluble dans un solvant 25 différent de ceux listés ci-dessus, lequel solvant est mouillant vis-àvis des sites de greffage à protéger. Des exemples de couples polymères/solvants sont présentés dans le tableau suivant. 30 2906810 17 Polymère Solvant (s) dans le(s)quel(s) le polymère est soluble Polyvinylalcool Eau, DMSO Polystyrène Toluène, Acétone, CH2C12 Polyhydroxystyrène CH3CN, THF, Alcool, Acétone, PGMA Polyéthylène oxyde CH3CN, CH2C12, Eau Polyvinylcarbazole CH2C12, chlorobenzène Polyimide Anisole, CH2C12 Par exemple, en partant d'un substrat présentant des sites prédéterminés greffés par un 5 composé silane porteur d'une fonction époxyde ou diol (servant de bras espaceur entre le support et l'enchaînement de nucléotides et conférant des caractéristiques de mouillabilité à ces sites) et des zones entourant ces sites constituées d'une couche 10 d'oxyde de silicium sur laquelle est greffé un silane perfluoré, les sites prédéterminés peuvent être protégés en déposant sur ceux-ci une goutte d'une solution comprenant du diméthylsulfoxyde (DMSO) et un polyhydroxystyrène (soluble dans le DMSO), cette goutte 15 se concentrant exclusivement sur les sites mouillables de part la nature du composé silane greffé vis-à-vis du DMSO et après évaporation constituant un film de polymère protecteur sur ces sites. Les sites non protégés peuvent subir les étapes du cycle de synthèse 20 pour greffer les nucléotides voulus tandis que les sites protégés ne subissent pas ce greffage. Dans ce 2906810 18 cas de figure, le film de polymère est ensuite éliminé par exemple, par lavage avec du THF, libérant ainsi le site en vue d'un greffage ultérieur de nucléotides. 5 Le procédé de formation de films de polymère ainsi que le procédé de réalisation de matrice de séquences différentes présentent de nombreux avantages. En effet, par rapport au procédé décrit 10 dans la référence WO 0053310 qui utilise un substrat présentant en surface des microcuvettes, pour constituer les sites de greffage, le procédé de l'invention est mis en oeuvre avec des substrats essentiellement plans (c'est-à-dire ne comportant pas 15 de reliefs en surface), la différence de mouillabilité entre des sites prédéterminés et les zones entourant ces sites permettant de positionner les films de polymère exclusivement sur ces sites, sans devoir utiliser des cuvettes susceptibles d'accueillir les 20 films. Du fait que la goutte déposée se concentre sur des sites prédéterminés du fait de ses caractéristiques de mouillabilité, il est ainsi 25 possible d'augmenter la densité des substrats en ces sites prédéterminés. Compte tenu que ces sites prédéterminés sont fonctionnalisés de façon à leur conférer des propriétés de mouillabilité adéquates et également pour pouvoir permettre le greffage de 30 molécules, il est ainsi possible d'obtenir, par 2906810 19 exemple, des matrices présentant un nombre très élevé de sondes oligonucléotidiques de séquences différentes. Du fait que la goutte déposée se positionne 5 automatiquement sur les sites prédéterminés, le procédé de formation de film est un procédé de mise en oeuvre rapide. Egalement, du fait que suite à l'évaporation du solvant, le polymère vient se 10 concentrer uniquement sur le site désiré, il est possible d'employer des solutions avant éjection plus diluée, ce qui facilite l'éjection dans le cadre du procédé. Il est à noter que, selon l'invention, 15 l'éjection n'a pas à être aussi précise que, selon l'art antérieur, car la différence de mouillabilité entre les zones et les sites permettent un repositionnement aisé du film polymère sur le site à masquer. En particulier, il est tout à fait admissible 20 lors de l'éjection de la goutte comprenant un solvant et le polymère, de déborder éventuellement du site mouillable sur les zones non mouillables, l'étape d'évaporation ultérieure permettant de concentrer le polymère exclusivement sur ledit site mouillable. 25 Le procédé de formation de film de l'invention présente une excellente fiabilité car il permet une meilleure protection par le polymère des sites prédéterminés. 30 2906810 20 Il est possible également grâce à ce procédé d'optimiser la taille et la forme du film de polymère, et la concentration de polymère en fonction de la taille du site. 5 Outre le fait de permettre la réalisation de films de protection dans le cadre de la synthèse de molécules d'intérêt, telles que les oligonucléotides, le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre également pour la réalisation d'écran plat, qui 10 nécessite, lors de leur conception, le dépôt sur un substrat à des endroits bien déterminés de gouttelettes comprenant des encres polymères, ces encres polymères pouvant être, par exemples, des encres polyimides. 15 L'invention va maintenant être décrite par rapport aux exemples cidessous donnés à titre illustratif et non limitatif. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 illustre une vue de dessus de 20 la matrice réaliséeconformément à l'exemple ci-dessous, cette matrice présentant plusieurs couples de lignes (couples de lignes 18, T, g, C, A, 14 et 18) présentant un ensemble de sites, chacun desdits sites correspondant à une séquence oligonucléotidique donnée 25 greffée. La figure 2 illustre schématiquement une séquence oligonucléotidique greffée sur un site de la matrice représentée sur la figure 1. 30 2906810 21 EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS EXEMPLE 1 Sur une plaque neuve de silicium est effectuée une oxydation thermique à 1100 C pour créer 5 une couche d'oxyde de silicium de 5000 Â. Sur cette couche est déposée une couche de résine photosensible suivie d'une étape de photolithographie effectuée de manière à créer des disques de résine photosensible pour définir des sites circulaires. La plaque est 10 ensuite soumise à un plasma d'oxygène ce qui a pour effet d'activer la surface des zones non protégées par la résine par génération de sites silanols. L'ensemble de la plaque est ensuite silanisé avec un silane hydrophobe (perfluooctyl-trichlorosilane) pendant 10 15 minutes à température ambiante dans du toluène anhydre (concentration de silane de 9 mM). Les molécules de silane hydrophobe vont se greffer uniquement sur les zones non protégées par la résine. La plaque est ensuite lavée à l'acétone, à l'éthanol et nettoyée aux 20 ultrasons pendant 5 minutes dans l'éthanol. La puce est ensuite étuvée pendant 1 heure à 110 C. L'angle de contact mesuré avec de l'eau est de 110 . La résine photosensible est éliminée au cours du passage dans les bains d'acétone et d'éthanol. L'angle de contact mesuré 25 avec de l'eau sur les zones protégées par la résine est voisin de 50 . Des expériences d'éjection sont effectuées avec une tête d'éjection piézoélectrique (robot de la société MicroDrop GmbH) et une solution de 30 diméthylsulfoxide (DMSO) contenant 5% en poids de poly(4-hydroxystyrène) (PHS) de masse molaire voisine 2906810 22 de 20000 g.mol-1. Trois gouttes de 90 pm de diamètre en vol sont éjectées sur un site actif de 85 pm de diamètre fabriqué par la technique décrite ci-dessus. Puis le substrat est placé sur une plaque chauffante à 5 80 C pendant 5 minutes pour évaporer le DMSO. Une image en microscopie électronique à balayage est prise après cette étape de chauffage qui montre que le polymère est bien centré uniquement sur le site actif sans déborder. Il faut souligner également que l'épaisseur du film de 10 polymère (15 pm) est bien supérieure à celle pouvant être obtenue avec la méthode précédente utilisant des cuvettes (toujours inférieure à 1 pm). EXEMPLE 2 15 Sur une plaque neuve de silicium est effectuée une oxydation thermique à 1100 C pour créer une couche d'oxyde de silicium de 5000 Â. Sur cette couche est déposée une couche de résine photosensible 20 suivie d'une étape de photolithographie effectuée de manière à définir des motifs dans la résine photosensible. La plaque est ensuite soumise à un plasma d'oxygène ce qui a pour effet d'activer la surface des zones non protégées par la résine par 25 génération de sites silanols. L'ensemble de la plaque est ensuite silanisé avec un silane hydrophobe (perfluooctyl-trichlorosilane) pendant 10 minutes à température ambiante dans du toluène anhydre (concentration de silane de 9 mM). Les molécules de 30 silane hydrophobe vont se greffer uniquement sur les zones protégées par la résine. La plaque est ensuite 2906810 23 lavée à l'acétone, à l'éthanol et nettoyée aux ultrasons pendant 5 minutes dans l'éthanol. La puce est ensuite étuvée pendant 1 heure à 110 C. L'angle de contact mesuré avec de l'eau est de 110 . La résine 5 photosensible est éliminée au cours du passage dans les bains d'acétone et d'éthanol. Une étape de photolithographie est à nouveau effectuée de manière à définir des motifs dans une résine photosensible de polarité négative. La 10 résine est laissée sur toutes les zones préalablement rendues hydrophobes par silanisation. La plaque est soumise à un plasma d'oxygène ce qui a pour effet d'activer la surface des zones non protégées par la résine (génération de sites silanols). L'ensemble de la 15 plaque est ensuite silanisé avec le silane 5,6-époxyhexyltriéthoxysilane à 5 mM dans du toluène anhydre avec 3% en volume de triéthylamine pendant 16 heures à 80 C. La plaque est alors lavée à l'acétone, à l'éthanol et nettoyée aux ultrasons pendant 5 minutes 20 dans l'éthanol. Cette procédure enlève aussi la résine photosensible qui protégeait les zones hydrophobes. Puis la plaque est placée dans un bain d'une solution aqueuse de HC1 à 0,2N pendant 3 heures. La plaque est finalement découpée sous la 25 forme de substrats carrés de 1 cm de côté. Le substrat ainsi obtenu est ensuite utilisé pour réaliser différents d'oligonucléotides, à l'aide d'un synthétiseur automatique d'oligonucléotides 30 EXPEDITE 8909. 2906810 24 Chaque oligonucléotide est synthétisé par greffage de nucléotides, le premier nucléotide étant greffé sur le composé silane greffé (référence 3 sur la figure 2) sur des endroits prédéterminés (référence 1 5 sur la figure 2) de la plaque de silicium. Chaque oligonucléotide comprend la séquence suivante : Espaceur 5T(référence 5 sur la figure 2)- 10 Séquence connue de 7 nucléotides (référence 7 sur la figure 2) -Base variable (référence 9 sur la figure 2)-séquence connue de 7 nucléotides(référence 11 sur la figure 2) ; l'espaceur 5T correspondant à un 15 enchaînement de 5 bases T, lié au composé silane greffé (référence 3 sur la figure 2) à des endroits prédéterminés (référence 1 sur la figure 2) de la plaque de silicium, la base variable étant A, C, G, T ou encore une liaison simple. 20 Le protocole de synthèse comporte une première étape de dépôt d'une première base commune à tous les plots : la thymine modifiée, laquelle réagit par l'intermédiaire de sa fonction phosphoramidite en 3' avec le groupe OH du composé silane greffé pour 25 former une liaison covalente entre le composé silane et la thymine. Ensuite, les 4 bases T ainsi que la séquence connue de 7 nucléotides sont greffées base par base selon un protocole classique utilisant la chimie 30 de la phosphoramidite comprenant un cycle de quatre étapes . 2906810 25 - une étape de détritylation de la base greffée pour libérer la fonction -OH réactive en 5' ; une étape de couplage de la base à greffer avec la base greffée, par réaction de la 5 fonction -OH en 5' de la base greffée et la fonction phosphoramidite de la base à greffer ; une étape de capping destinée aux fonctions -OH réactives en 5' des nucléotides greffés n'ayant pas réagi, de sorte à ce que ces nucléotides 10 n'interviennent pas dans les cycles de synthèse ultérieurs ; une étape d'oxydation destinée à oxyder le phosphore trivalent en son homologue pentavalent avant d'entreprendre le cycle suivant. 15 Ce cycle est répété 11 fois de façon à obtenir l'enchaînement de 5 bases T et de la première séquence connue de 7 nucléotides. Ensuite, le couplage de la base variable A 20 est réalisé selon le cycle de synthèse suivant : après enlèvement du substrat du synthétiseur, dépôt dans un robot de dépôt de polymère (robot de la société MicroDrop GmbH) sur les sites ne devant pas subir de greffage de la base A, de 2 gouttes 25 d'une solution de PHS/DMSO à 3% qui est ensuite évaporée à 80 C pendant 2 minutes ; - détritylation des bases greffées non masquées en les soumettant à 1 ml de solution DMTRemoval (3% d'acide trichloroacétique/dichlorométhane) 30 pendant 1 minute sous agitation ; rinçage dans un bain de dichlorométhane ; 2906810 26 - couplage de la base A ; - élimination du polymère dans un bain de tétrahydrofurane (THF). Compte tenu de la différence de 5 mouillabilité du DMSO entre les sites silanisés et les zones silanisées non mouillantes, le film se localise uniquement et uniformément sur les sites choisis et empêche ainsi la base A de se greffer sur les sites non désirés. 10 Ce cycle de synthèse est répété pour obtenir le couplage de la base C, G et T. Une fois les 4 cycles de synthèse réalisés, la deuxième séquence connue de 7 nucléotides est 15 réalisée par un protocole identique à celui exposée ci-dessus pour la synthèse de la première séquence connue de 7 nucléotides. Pour finir, le substrat est sorti du synthétiseur et est incubé dans NH4OH (Sigma-Aldrich 20 32014-5) pendant 45 minutes à 60 C, afin d'éliminer les groupements protecteurs des bases nucléotidiques, puis il est rincé à l'eau et séché sous flux d'azote. A l'issue de ce procédé, on obtient ainsi 25 une matrice comprenant un ensemble de couples de lignes, chacune des lignes présentant un nombre prédéterminé de sites greffés par des sondes oligonucléotidiques de séquence connue (cf. figure 1). Pour un couple de ligne donnée, l'ensemble des sites 30 est greffé par les mêmes sondes nucléotidiques (28 sondes au total pour chaque couple de lignes). 2906810 27 Les caractéristiques de ces lignes sont données dans le tableau suivant. Lignes Nombre de Séquences des sondes Nombre nucléotides (hormis l'espaceur d'étapes de des sondes comprenant un formation de enchaînement de 5 film de thymine) polymère nécessaires pour réaliser les sondes 18 14 3'ATCTCACCAAATAG 5' 4 A 15 3'ATCTCACACAAATAG5' 3 C 15 3'ATCTCACCCAAATAG5' 3 g 15 3'ATCTCACGCAAATAG5' 3 T 15 3'ATCTCACTCAAATAG5' 3 18 18 3'ATCTCACACGTCAAATA 0 G5' 5 L'hybridation est effectuée avec une solution d'oligonucléotides cibles de séquence 5' CAT AgA gTg ggT TTA TCC 3' (complémentaire de l'oligonucléotide des lignes C ) à 10 nM. Ces cibles portent un groupement fluorescent Cy3 sur l'extrémité 10 5'. Après hybridation, le substrat est rincé et séché. La lecture en fluorescence est effectuée avec le scanner Genetac (Genomic Solutions) avec un gain de 34. 15 L'image obtenue en fluorescence correspond au résultat qui était attendu : 2906810 28 la ligne C correspondant à l'hybridation entre deux séquences d'oligonucléotides complémentaires produit le signal de fluorescence le plus élevé ; 5 - les lignes T , g , A et 14 donnent un signal plus faible car l'hybridation n'est pas parfaite en raison de la différence d'une base dans la séquence ; - les lignes 18 ont un signal très 10 faible, presque négligeable, car les séquences d'oligonucléotides diffèrent de 3 bases...FT: PROCEDE DE FORMATION D'UN FILM DE POLYMERE(S) SUR DES SITES PREDETERMINES D'UN SUBSTRAT. REVENDICATIONS 1. Procédé de formation d'un film de polymère(s) sur des sites prédéterminés d'un substrat comprenant successivement : a) une étape de dépôt sur lesdits sites prédéterminés d'une goutte comprenant un solvant et le (s) polymère(s), lesdits sites étant mouillables par ledit solvant, tandis que les zones entourant lesdits sites ne sont pas mouillables par ledit solvant ; b) une étape de chauffage dudit substrat à une température efficace pour obtenir une évaporation dudit solvant. 2. Procédé de formation d'un film selon la 15 revendication 1, comprenant, avant l'étape a), une étape de préparation du substrat de façon à créer des sites prédéterminées mouillables vis-à-vis des gouttes comprenant le solvant et le polymère et des zones entourant ces sites non mouillables vis-à-vis desdites 20 gouttes. 3. Procédé de formation d'un film selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les sites prédéterminés sont des sites hydrophiles et les zones 25 entourant lesdits sites sont des zones hydrophobes. 4. Procédé de formation d'un film selon la revendication 3, dans lequel, lorsque le substrat avant préparation est un substrat en silicium, l'étape 30 de préparation de ce substrat comprend les étapes consistant à : 10 2906810 30 soumettre ledit substrat à une oxydation thermique de façon à créer une couche d'oxyde de silicium ; - déposer sur ladite couche d'oxyde de 5 silicium une couche de résine photosensible ; - éliminer par photolithographie la résine en des zones prédéterminées ; générer des fonctions silanols sur lesdits zones prédéterminées en soumettant lesdites zones prédéterminées à un plasma d'oxygène ; - greffer sur lesdites fonctions silanols un composé silane hydrophobe, tel que le perfluorooctyltrichlorosilane. éliminer la résine photosensible subsistante, générant ainsi des sites prédéterminés hydrophiles et des zones hydrophobes entourant lesdits sites. 5. Procédé de formation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape de dépôt s'effectue par adressage mécanique. 6. Procédé de formation selon la revendication 5 dépendant uniquement de la revendication 4, dans lequel la goutte comprenant un solvant et le polymère est une goutte comprenant du diméthylsulfoxyde et du polyhydroxystyrène. 7. Procédé d'élaboration d'une matrice de séquences de molécules chimiques ou biologique formées d'enchaînements différents de molécules M1, M2,...,Mn par 2906810 31 synthèse in situ sur un substrat tel que défini à la revendication 1, ledit procédé comprenant des étapes successives de greffage sur des sites prédéterminés d'une molécule M1, M2, .ou Mn constitutive de ladite 5 séquence, lesdits sites prédéterminés comprenant des groupes fonctionnels aptes à former une liaison covalente avec ladite molécule M1, M2,...ou Mn, ces étapes de greffage étant précédées, lorsque cela est nécessaire, d'une étape de protection des sites ne 10 nécessitant pas ce greffage, cette étape de protection étant réalisée par la mise en oeuvre du procédé de formation d'un film de polymère tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ce film de polymère étant éliminé lorsque le site concerné doit 15 subir de nouveau une étape de greffage...CLMF: 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel les séquences de molécules sont des oligonucléotides. 20 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel une étape de greffage d'un nucléotide, hormis le premier nucléotide de l'enchaînement, comprend successivement les sous-étapes suivantes : 25 coupler l'extrémité -OH en 5' d'un nucléotide greffé avec l'extrémité activée en 3' (phosphoramidite, phosphotriester ou H-phosphonate) d'un autre nucléotide pour former une liaison covalente entre ces deux nucléotides ; 30 oxydation du groupe phosphoramidite, phosphotriester ou H-phosphonate en groupe phosphate. 2906810 32 10. Procédé selon la revendication 7, dans lequel les séquences de molécules sont des oligosaccharides. 11. Procédé d'élaboration d'un écran plat comprenant une étape de mise en oeuvre du procédé tel que défini à la revendication 1.