FR 2911346 A1 20080718 FR 0700238 A 20070112 La présente invention concerne un procédé de culture in vitro de lymphocytes T, en particulier de lymphocytes T infiltrant les tumeurs dits TIL, ou TILs, ainsi qu'un récipient destiné à la culture de tels lymphocytes T et une composition pharmaceutique anti-tumorale comprenant de tels lymphocytes T. Face à l'inefficacité relative de la chirniothérapie pour le traitement de certains cancers ou tumeurs, de nouveaux traitements par immunothérapie cellulaire adoptive sont apparus. L'immunothérapie cellulaire adoptive apparaît aujourd'hui comme une alternative thérapeutique. Elle consiste à injecter à des to patients atteints de cancer des lymphocytes T autologues préalablement amplifiés in vitro en vue d'accroître la fréquence des lymphocytes T à activité anti-tumorale spécifique. L'un des précurseurs dans ce domaine fut l'équipe de Rosenberg, dont les 15 travaux sont relatés dans la publication "Topalian SL, Muul LM, Solomon D, Rosenberg SA. Expansion of human tumor infiltrating lymphocytes for use in immunotherapy trials. Journal of immunological methods. 1987:102: 127-141". Le procédé de culture décrit dans cette publication comprend une première 20 étape de traitement de prélèvements tumoraux (enzymatique, filtration, séparation cellulaire) en vue d'en extraire les lymphocytes T potentiellement spécifiques de la tumeur. Ces lymphocytes T subissent ensuite une étape de stimulation en milieu de culture type RPMI supplémenté notamment en interleukine 2 recombinante et en surnageant de culture de cellules LAK de 25 donneurs sains, cette étape de stimulation étant elle-même suivie d'une étape d'amplification. L'étape de stimulation s'opère le plus généralement en plaques 24 puits même si l'utilisation de poches de culture est suggérée. Ce procédé est critiqué du fait 30 de la grande quantité de milieu de culture nécessaire pour produire 2.1011 cellules (plus de 200 L). En outre, il nécessite l'utilisation d'une dose d'interleukine 2 très élevée dont le caractère toxique à de telles concentrations pour le receveur a été démontré. Enfin, la préparation des prélèvements tumoraux est laborieuse et implique l'utilisation de réactifs incompatibles pour une application clinique. La demande de brevet EP-0.690.125 décrit quant à elle un procédé de préparation de lymphocytes T à activité tueuse cytotoxique anti-tumorale. Le procédé consiste en la co-culture de lymphocytes issus du sang périphérique de patients atteints de tumeur et d'un tissu tumoral brut vivant ou fixé obtenu à partir du même sujet. Cette étape de co-culture s'opère en plaques de culture et met en oeuvre un milieu de culture complexe supplémenté de plusieurs ~o cytokines. L'étape de stimulation des lymphocytes T utilise un système de coculture autologue laissant présager un rendement de production final plus faible que celui obtenu dans le cas d'un :système de stimulation allogénique. Par ailleurs, l'utilisation d'un système de culture ouvert (boîte de culture) n'est pas compatible avec un usage clinique. En effet, dans un cadre médical, les 15 récipients de culture doivent présenter des garanties en matière de confinement des cellules, de prévention des risques de contamination et des erreurs techniques de manipulation. Lesdits récipients se doivent donc de respecter les règles strictes de bonnes pratiques des produits transfusables pour le conditionnement clos et le transfert des cellules. 20 Un autre procédé de culture en système ouvert est décrit dans l'article Pandolfino MC, Labarrière N, Tessier MH, Cassidanius A, Bercegeay S, Lemarre P, Dehaut F, Dreno B, Jotereau F. High scale expansion of melanoma-reactive TIL by a polyclonal stimulus : predictability and relation with 25 disease advancement. Cancer Immunol. Immunother. 2001; 50 (3):134-40. Le procédé de culture de lymphocytes T décrit dans cette publication comprend une étape d'émergence des lymphocytes T à partir de fragments tumoraux vivants qui s'opère en plaques 12 puits, une étape de stimulation des 30 lymphocytes T qui s'opère en plaques 96 puits et une étape d'amplification en plateaux de culture. L'ensemble du procédé utilise du milieu de culture supplémenté en sérum allogénique humain posant le problème de la sécurité virale du produit fini. D'autre part, le dit procédé est mis en oeuvre dans un système ouvert incompatible avec un usage clinique. On connaît également, à travers la demande internationale WO 90/14097 un procédé de culture comprenant une étape de culture primaire (en plaque multi puits Costar ou dans un contenant plastique de type poche Surlyn) d'un échantillon tumoral humain à partir duquel les TIL vont être amplifiés et maintenus en culture pendant une certaine période (rajout de milieu (AIM V ou RPMI additionné d'rIL2) régulier mais sans retrait). Au bout de cette période, une quantité définie (75 %) de TIL présents dans cette culture primaire est transférée dans un récipient de culture adapté à l'amplification cellulaire (de préférence une poche perméable au gaz de type SteriCell, présentant une surface de culture plus importante, et une possibilité de formation d'agrégats cellulaires moindre). Le reste des TlLs (25%) est maintenue en culture primaire en contenant Surlyn. Les TILs en poche SteriCell sont entretenus par addition régulière de milieu neuf (AIM V + rIL2 décrit dans le protocole de Rosenberg) et les cultures sont dédoublées dans de nouvelles poches à chaque fois que le milieu de culture change de couleur (variation de pH du milieu) ou que la concentration cellulaire dépasse le million/ ml. Périodiquement, la culture des TILs en poche est additionnée de cellules provenant de la culture primaire et / ou de surnageant de culture issu de la culture primaire. Les TIL en poche sont ainsi stimulés par ces cellules issues de la culture primaire ou par la composition du surnageant de culture primaire. A nouveau, la culture s'opère dans un contexte autologue puisque les TILs sont stimulés par les cellules issues de la 'masse tumorale dont ils sont eux-mêmes originaires. II en résulte une activation cellulaire de rendement moindre. L'étape de stimulation pendant laquelle les TILs sont stimulés par les cellules issues de la culture primaire et par les surnageants du milieu dérivé de cette culture primaire oblige à maintenir en parallèle deux systèmes de culture correspondant l'un à l'étape de culture primaire ou d'émergence des TILs, l'autre à l'étape de stimulation. Le maintien en parallèle de deux systèmes de culture rend l'ensemble complexe et fastidieux en termes de manipulation. En conclusion, tous les procédés décrits ci-dessus présentent des inconvénients résultant soit d'un rendement de production plus faible dû notamment au contexte autologue des conditions de culture, soit d'un procédé mis en oeuvre dans un système ouvert (plaque de puits de culture, boîtes de Pétri) empêchant toute mise en oeuvre d'un tel procédé dans un contexte clinique. Un but de la présente invention est donc de proposer un procédé de culture in io vitro de lymphocytes T dont la spécificité des étapes mises en oeuvre permet une culture en système clos respectant les bonnes pratiques, notamment en termes de confinement et de risque de contamination sans nuire ni au rendement de cellules produites, ni à la qualité des cellules produites, le nombre de lymphocytes spécifiques de la tumeur, en particulier de lymphocytes 15 T CD8+ et leur activité cytotoxique vis-à-vis de la lignée tumorale autologue étant supérieurs à tous les résultats observés jusqu'à présent. A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de culture in vitro de lymphocytes T, en particulier de lymphocytes T infiltrant les tumeurs dits TIL, 20 modifiés ou non, à partir de prélèvement tumoral ou de sang issu de patient atteint de tumeur, ledit procédé comprenant successivement au moins une étape d'émergence des lymphocytes T contenus dans la tumeur ou le sang prélevé, une étape de stimulation des lymphocytes T issus de l'étape d'émergence et une étape d'amplification des lymphocytes T stimulés, 25 caractérisé en ce qu'on procède à la stimulation des lymphocytes T dans un récipient de culture clos compartimenté. II est à noter que dans tout ce qui précède et dans tout ce qui suit, on entend par récipient de culture clos un système permettant d'entretenir des cellules en 30 culture dans un milieu adapté sans que celles-ci ne soient directement au contact avec l'environnement extérieur. Ainsi, le récipient est clos, c'est-à-dire que son volume intérieur n'est pas en contact avec l'air ambiant, notamment lors de la phase de culture, lorsque les cellules et le milieu de culture sont introduits dans le récipient. La mise en oeuvre de l'étape de stimulation dans un récipient de culture clos s compartimenté permet une augmentation quantitative significative du rendement global des TILs (jusqu'à 2,5 fois) par comparaison avec la même technique mise en oeuvre dans un système ouvert. Elle permet également une augmentation qualitative des TILs produits. En effet, parmi les TIL produits, la proportion de TIL CD8+ est supérieure à celle produite (85% versus 60%) en ~o condition classique et présente une activité cytotoxique spécifique vis à vis de la lignée tumorale autologue plus importante (14% versus 2%). Elle permet, grâce à l'utilisation d'un système de culture clos, la sécurisation du procédé permettant une utilisation plus appropriée dans un contexte clinique, un gain de temps lors des manipulations et par conséquent un coût de main d'oeuvre 15 moindre puisque l'utilisation d'un récipient de culture clos de type poche permet de cultiver, dans au maximum 4 poches, l'équivalent de 60 plaques de culture 96 puits. Il doit être noté que les améliorations mentionnées ci-dessus ne sont 20 observées que dans un récipient clos compartimenté et non dans un récipient clos non compartimenté. Selon une mise en oeuvre préférée clu procédé, on stimule les lymphocytes T en présence au moins de cellules nourricières allogéniques non proliférantes. 25 Ces cellules nourricières allogéniques, c'est-à- dire provenant de la même espèce, mais d'un individu génétiquement différent, sont rendues non proliférantes par exemple par irradiatiion. On stimule les lymphocytes T par coculture avec un mélange formé de cellules mononucléées issues de sang de donneur humain sain et de cellules B EBV transformées de type LAZ. 30 La mise en oeuvre de l'étape de stimulation des lymphocytes T dans un récipient clos compartimenté par co-culture avec des cellules allogéniques explique probablement les avantages de rendement et de spécificité obtenus. En effet, la présence d'un compartiment dans le récipient de culture combiné à l'utilisation de cellules nourricières, de préférence allogéniques, afin d'augmenter la diversité antigénique, permet de favoriser un contact étroit entre les TlLs et les cellules nourricières tout en permettant les changements de s milieu sans induire de turbulences au niveau du tapis cellulaire. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé, on co-cultive les cellules nourricières allogéniques non proliférantes et les lymphocytes T dans un milieu de culture sélectif sans sérum de type X- VIVO 15TM supplémenté en io interleukine 2. Le milieu de culture X-VIVO 15TM est un milieu de culture sans sérum commercialisé par Cambrex Corp., Walkersville, Md., USA et optimisé pour la culture des TIL. L'interleukine 2 joue un rôle important comme facteur de croissance et d'activation des lymphocytes. En outre, au cours de l'étape de stimulation, on introduit dans le récipient de stimulation clos, parallèlement aux 15 lymphocytes, un agent mitotique tel que la PHA L (phytohémaglutinine de type L) favorable à l'amplification des lymphocytes. Généralement, le récipient clos de stimulation comportant au moins deux compartiments, dits l'un chambre technique, l'autre chambre de tranquillisation, 20 communiquant entre eux, et au moins une voie d'accès débouchant dans l'un des compartiments, on introduit les lymphocytes et les cellules nourricières allogéniques non proliférantes en suspension dans un milieu de culture par l'intermédiaire de ladite voie d'accès, et on renouvelle le milieu de culture par l'intermédiaire de la ou d'une autre voie d'accès. 25 De préférence, le récipient clos comportant au moins deux voies d'accès débouchant dans la chambre technique, on introduit les lymphocytes et les cellules nourricières allogéniques non proliférantes en suspension dans un milieu de culture par l'intermédiaire d'une première voie d'accès qui est 30 positionnée la plus proche de la chambre de tranquillisation, et on renouvelle le milieu de culture par l'intermédiaire d'une seconde voie d'accès qui est positionnée la plus éloignée de ladite chambre de tranquillisation. Lors de l'étape de stimulation, on dispose le récipient clos de stimulation avec la chambre technique s'étendant au-dessus de la chambre de tranquillisation. Du fait de cette disposition, il en résulte à nouveau une amélioration du contact cellules nourricières û lymphocytes T apte à accroître le rendement en lymphocytes T cytotoxiques spécifiques. De préférence, préalablement à l'étape de stimulation, on met en oeuvre l'étape d'émergence des lymphocytes T, en particulier de culture primaire du ou des prélèvements tumoraux, dans un récipient de culture clos. De même, to postérieurement à l'étape de stimulation, de préférence, on transfère, après stimulation, les lymphocytes T stimulés dans un récipient de culture clos d'amplification. Ainsi, on met en oeuvre les étapes d'émergence, de stimulation et d'amplification dans un récipient de culture clos différent d'une étape à une autre. 15 L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique anti-tumorale, caractérisée en ce qu'elle comprend comme agent actif des lymphocytes T obtenus par le procédé du type précité. Cette composition est un produit de thérapie cellulaire composé d'une suspension cellulaire hétérogène de 20 lymphocytes T dont la proportion de lymphocytes T CD8+ cytotoxiques spécifiques de la tumeur autologue est supérieure à celle obtenue par les techniques de préparation conventionnelle décrites jusqu'à présent. L'invention a encore pour objet un récipient de culture pour la mise en oeuvre 25 de l'étape de stimulation du procédé de culture in vitro de lymphocytes T du type précité, caractérisé en ce que le récipient de culture est un récipient clos compartimenté qui comprend : - une première et une deuxième feuilles en matériau thermoplastique souple solidarisées l'une à l'autre au voisinage de leur périphérie de sorte à former un 30 volume intérieur ; - au moins une voie d'accès audit volume qui est agencée pour permettre l'introduction des cellules ; - un cordon de soudure entre les feuilles qui est agencé pour former, dans le volume intérieur, deux compartiments communiquant entre eux et avec la ou au moins une voie d'accès, ledit cordon de soudure étant discontinu et étant associé de façon étanche à un bord du récipient. De préférence, la ou au moins une voie d'accès est prévue sur le bord du récipient qui est opposé au bord auquel le cordon de soudure est associé. L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante io d'exemples de réalisation, en référence aux dessins annexés dans lesquels : la figure 1 représente de façon schématique une vue de face du récipient de culture clos compartimenté de l'étape de stimulation et 15 la figure 2 représente de façon schématique une coupe transversale suivant A-A du récipient de la figure 1. Comme mentionné ci-dessus, le procédé de culture, objet de l'invention, comprend au moins trois étapes successives, à savoir : 20 - une étape d'émergence des lymphocytes T contenus dans la tumeur ou le sang prélevé, - une étape de stimulation des lymphocytes T issus de l'étape d'émergence - et une étape d'amplification des lymphocytes T stimulés. 25 II est possible de mettre en oeuvre les étapes d'émergence, de stimulation et d'amplification dans un récipient de culture clos différent d'une étape à une autre. Dans ce cas, le transfert d'un récipient clos à un autre est réalisé de façon 30 stérile, par exemple en connectant, à l'aide d'un appareil de connexion stérile de type SCDO de Terumo, les tubulures servant de voies d'accès. En variante, les récipients clos d'émergence, de stimulation et d'amplification sont préconnectés entre eux au moment de la fabrication, de sorte à former un système clos. Un tel système permet de réaliser la culture complète des lymphocytes T en système clos, limitant ainsi le risque de contamination. De manière caractéristique à l'invention, ce procédé se caractérise par l'étape de stimulation mise en oeuvre dans un récipient 1 de culture clos io compartimenté. Ce récipient 1 comprend généralement : - une première et une deuxième feuilles en matériau thermoplastique souple solidarisées l'une à l'autre au voisinage de leur périphérie de sorte à former un 15 volume intérieur ; - au moins une voie d'accès 4 audit volume qui est agencée pour permettre l'introduction des cellules ; - un cordon 6 de soudure entre les feuilles qui est agencé pour former, dans le volume intérieur, deux compartiments 2, 3 communiquant entre eux et avec la 20 ou au moins une voie 4 d'accès, ledit cordon 6 de soudure étant discontinu et étant associé de façon étanche à un bord du récipient 1. La liaison étanche entre cordon 6 de soudure et bord du récipient 1 est représentée en 7 à la figure 1. 25 La ou au moins une voie 4 d'accès est prévue sur le bord du récipient 1 qui est opposé au bord auquel le cordon 6 de soudure est associé. Dans l'exemple représenté aux figures, le récipient 1 comprend deux voies 4, 5 d'accès au volume intérieur respectivement pour l'introduction et la récupération des cellules. Les deux voies 4, 5 d'accès débouchent dans le même compartiment 30 2, les compartiments 2, 3 étant forrnés respectivement entre un bord dudit récipient 1 et le cordon 6 de soudure, le cordon de soudure s'étendant parallèlement aux bords longitudinaux dudit récipient 1. Ce cordon de soudure est formé d'une succession de points de soudure qui sont régulièrement espacés. Ces points de soudure ont une longueur comprise entre 1 mm et 5 mm tandis que les espacements présentent une longueur comprise entre 1 mm et 1 cm. Le cordon 6 de soudure présente à son extrémité opposée à celle s'étendant au voisinage des voies 4, 5 d'accès une liaison 7 étanche audit récipient 1. Les deux voies 4, 5 d'accès débouchent ici dans un premier compartiment 2 appelé chambre technique 2, cette chambre technique 2 s'étendant au- dessus du second compartiment 3 appelé la chambre de tranquillisation 3. Chaque voie d'accès 4,5 est par exemple formée d'une portion de tubulure, soudée entre les deux feuilles 2,3 formant le récipient. Dans une variante non représentée, la tubulure s'étend dans le volume intérieur du récipient. Cette tubulure peut être munie d'un clamp pour contrôler l'écoulement de fluide au travers de la tubulure. L'extrémité de la tubulure est par exemple munie d'un connecteur de type Luer femelle, fermé par un bouchon amovible. Ce connecteur permet de venir connecter une seringue remplie de cellules ou un container de milieu de culture. On introduit donc les lymphocytes et les cellules nourricières allogéniques non proliférantes en suspension dans un milieu de culture par l'intermédiaire de la première voie 4 d'accès qui est positionnée la plus proche de la chambre de tranquillisation 3 et on renouvelle le milieu de culture par l'intermédiaire de la seconde voie d'accès 5 qui est positionnée la plus éloignée de ladite chambre de tranquillisation 3. L'introduction des cellules par la voie d'accès 4 la plus proche de la chambre de tranquillisation 3 permet de limiter le 'parcours des cellules dans le récipient 1, et donc de limiter leur stress. L'utilisation de deux voies d'accès 4,5 différentes pour l'introduction des cellules et le renouvellement du milieu limite les risques de contamination lors de la manipulation du récipient. La présence de cette chambre de tranquillisation 3 favorise un contact étroit entre TILs et cellules nourricières tout en permettant les changements de milieu sans induire de turbulences au niveau du tapis cellulaire. La chambre technique 2 est en effet utilisée pour introduire et/ou retirer du milieu de culture dans le volume intérieur du récipient 1, sans perturber les cellules placées dans la chambre de tranquillisation 3. En effet, le cordon de soudure 6 ralentit et dévie un écoulement de fluide arrivant sur lui, de sorte que 2911346 Il les cellules ne sont pas en contact direct avec le flux du milieu nouvellement introduit, limitant ainsi le déplacement ou la remise en suspension des cellules. Lors de la phase de culture des cellules, le récipient 1 est positionné de sorte à disposer la chambre technique 2 au dessus de la chambre de tranquillisation 3. 5 Dans cette position, les cellules sédimentent dans le fond de la chambre de tranquillisation 3 qui présente une forme en V favorisant la concentration et la communication des cellules en culture. Comme illustré sur les figures, le cordon de soudure 6 est discontinu, c'est-à-dire qu'il présente une pluralité d'interruptions, notamment plus de trois. Ces interruptions permettent un échange fluidique limité entre la chambre de tranquillisation 3 et la chambre technique 2. Le cordon de soudure 6 est associé de façon étanche à un bord 7 du récipient, de sorte que la chambre technique 2 et la chambre de tranquillisation 3 ne communiquent pas entre is elles à ce niveau. Ainsi, les cellules placées dans la chambre de tranquillisation 3 ne peuvent pas être transférées dans la chambre technique 2, à ce niveau. Notamment, lors de l'introduction des cellules, par exemple du côté opposée à cette zone, les cellules restent dans la chambre de tranquillisation 3. La chambre de tranquillisation 3 fournit un espace confiné dans lequel les cellules 20 sont tranquilles, c'est-à-dire peu ou pas déplacées après leur introduction dans le récipient 1. Deux exemples de mise en oeuvre d'un procédé de culture vont à présent être décrits, chacun étant, pour son étape de stimulation mis en oeuvre dans un 25 récipient conforme à celui décrit ci-dessus. L'exemple I concerne la stimulation, en système clos compartimenté, de TIL issus de culture primaire de fragments tumoraux d'un patient identifié BOSE et atteint de mélanome. Il doit être noté que les lymphocytes T infiltrant les tumeurs ou TIL sont des cellules immunes isolées à partir d'une tumeur ou de sang issu de patient 30 atteint de tumeur. Réinjectés après stimulation et amplification, ils ont un pouvoir antitumoral, spécifique de la tumeur de laquelle ils sont issus. Dans le cadre de la thérapie génique, ces lymphocytes T peuvent être modifiés 5 par incorporation de gène tel qu'un gène de récepteurs chimères, augmentant leur pouvoir antitumoral. Le procédé comprend une étape d'émergence ou d'extraction des TIL à partir de fragments tumoraux. Les TILs sont obtenus à l'issue de la culture primaire 10 de fragments tumoraux de patient atteint de mélanome (patient BOSE) et ayant subi un curage ganglionnaire axillaire. Les fragments tumoraux sont obtenus par fragmentation mécanique d'un des ganglions de la chaîne ganglionnaire prélevée et présentant un processus tumoral malin, puis congelés. Les fragments tumoraux sont ensuite décongelés puis cultivés en plaques 12 puits 15 (Nunc) en milieu X-VIVO 15TM (Cambrex) supplémenté en rIL2 à 300 UI final/ ml (Chiron). La culture primaire de fragments est entretenue deux fois par semaine (retrait de milieu et rajout cle milieu neuf). A l'issue de 11 jours de culture en incubateur à atmosphère humide, à 5% de CO2 et à température constante de 37 C, les TILs en sortie des fragments tumoraux sont récoltés et 20 congelés en cryotubes en DMSO10% (Braun) /AH4% (LFB). L'étude décrite ci dessous a été réalisée à partir d'une banque de TIL congelés issu d'un même patient BOSE. L'étape d'émergence est suivie d'une étape de stimulation polyclonale des TIL 25 en poche compartimentée. Les TIL issus de la banque TIL_ congelés sont décongelés puis mis en culture (JO) dans un système de culture clos, de type poche compartimentée (figure 1) (Maco-Pharma SA). Cette étape de stimulation va permettre la stimulation polyclonale des TILs ainsi que leur prolifération. La phase d'ensemencement des TILs dans cette poche spécifique 30 de culture se déroule en 2 étapes : •3 Dans un premier temps, les TILs sont co-ensemencés en présence de cellules nourricières de source allogéniques (afin d'augmenter la diversité antigénique) préalablement irradiées donc non proliférantes. Les cellules nourricières sont composées d'un pool de cellules mononucléées issues de 3 donneurs sains et d'une lignée de lymphocytes B transformés par l'EBV (Virus EpsteinûBarr) de type LAZ. L'ensemble TIL et cellules nourricières est introduit dans la poche 1, et plus particulièrement dans la chambre dite de tranquillisation, par la voie d'accès 4 proche de cette charnbre (figure 1) aux ratios suivants : 0,39 x 106 TIL, 26 x 106 LAZ et 52 x 106 CMN en suspension sous 10 ml de milieu X-VIVO 15TM seul (soit 1 TIL pour 66 LAZ et 133 CMN). • Dans un second temps, le volume de suspension cellulaire TIL-cellules nourricières préalablement déposé dans la chambre dite de tranquillisation est complété par un volume de 185 ml de milieu cette fois complet (X-VIVO 15TM supplémenté en rIL2 à 150 UI final / ml et de l'agent mitogène PHA-L (Sigma) à raison de 1 dag/ml). Ce volume additionnel est introduit dans la poche par la voie d'accès 5 située au niveau de la chambre 2 dite technique . Durant toute la phase d'ensemencement, la poche 1 est maintenue en position verticale (dans sa partie la plus large, figure 1) afin de faciliter le dépôt des cellules au fond de la chambre 3 de tranquillisation et de favoriser le contact étroit entre les cellules, condition impérative à un rendement de stimulation optimal. Les TIL sont maintenus en culture dans cette poche 1, toujours en position verticale, pendant une période de 10 jours. La culture est entretenue deux fois par semaine par retrait de 1/3 du milieu (par retrait du milieu au niveau de la voie d'accès 5 et rajout d'1/3 de milieu neuf (X-VIVO 15TM additionné de 150 UI / ml final)) par cette même voie. Les transferts de milieu par cette voie évitent d'induire des turbulences au niveau de la chambre 3 de tranquillisation pouvant perturber le contact cellulaire TIL-cellules nourricières très important durant cette phase de stimulation. L'étape de stimulation est suivie d'une étape d'amplification. A l'issue des 13 jours de culture (J13), les TIL en culture dans la chambre 3 de tranquillisation sont mis en suspension par massages répétés de la poche compartimentée. La suspension cellulaire de TIL est ensuite transférée via la voie d'accès 5 dans une poche adaptée dite de transfert (Baxter) pour être concentrée par centrifugation. Le culot cellulaire est ensuite remis en suspension dans du milieu X-VIVO 15M supplémenté en rIL2 (150 UI final /ml) à raison de 1 x 106 / ml. La suspension cellulaire ainsi obtenue est ensuite transférée de la poche de transfert vers une ou plusieurs poches de culture classiques adaptées à l'amplification cellulaire (poche de culture de type Lifecell perméable au gaz, Miltenyi Biotec) pendant une période supplémentaire de 7 jours (J20). Les cultures sont entretenuestous les 3 jours et la concentration cellulaire est ramenée à 1 x 106 Cellules / ml par ajout de milieu neuf. Afin d'évaluer les paramètres de production des TIL utilisant le procédé de la présente invention, désigné ci-après Invention et en particulier, utilisant la stimulation des TIL en système clos en poche de culture compartimentée, les résultats ont été comparés à ceux obtenus dans les conditions classiques de culture telles qu'elles sont actuellement utilisées dans le cadre du protocole de recherche clinique multicentrique intitulé TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes) et Interleukine 2 versus abstention en traitement adjuvant des mélanomes avec un seul ganglion envahi après curage ganglionnaire. Etude de phase Ill, randomisée, ouverte, multicentrique . Cette technique que l'on appellera Contrôle s'inspire de la méthode de production décrite dans l'article référencé High-scale expansion of melanoma-reactive TIL by a polyclonal stimulus: predictability and relation with disease advancement. Cancer Immunol Immunother. 2001 May;50(3):134-40 . Dans cette technique conventionnelle, les étapes extraction des TIL et phase d'amplification sont identiques à celles décrites dans la technique test à l'exception de l'étape de stimulation polyclonale des TIL, qui se déroule en système ouvert de type plaques de culture 96 puits (Falcon). Au cours de cette étape de stimulation en plaques, les ratios TIL-cellules nourricières, le milieu de culture, les réactifs et les fréquences d'entretien sont exactement les mêmes que la technique test . Le volume de suspension cellulaire ensemencé à JO et en cours de culture jusqu'à J10 est toujours maintenu à 150 pl /puits au maximum. Au total 13 plaques de culture sont ensemencées à JO ce qui représente un total de 0,39 x 106 TIL soit l'équivalent de la quantité de TIL ensemencée en poche de culture compartimentée. Les paramètres de production des TIL utilisant les 2 techniques comparatives sont les suivants : • Rendement en cellules viables et facteur d'amplification par rapport à JO to obtenus par numération manuelle (sur cellule de Malassez) des cellules aux points J13, J17 et J20. • Phénotype à J13 et J20 des sous-populations de lymphocytes T (T cytotoxiques CD8+ et T helper CD4+) par immunomarquage et analyse par cytométrie en flux. 15 • Spécificité des T CD8+ par évaluation de la proportion (sur les TIL totaux) à J20 de T CD8+ produisant de l'INFy en réponse à la lignée tumorale autologue (par immunomarquage anti-CD8 et anti-INFy puis analyse par cytométrie de flux). Les résultats représentés dans les tableaux 1 à 5 ci-dessous indiquent la 20 moyenne des valeurs obtenues sur 4 essais indépendants. Tableau 1 Nombre de TIL totaux viables Nombre de cellules (* 106 ) Date JO J13 J17 J20 Méthode 1,8 489 1770 3250 contrôle Méthode 1,8 603 2460 5060 Invention 25 10 Tableau 2 Facteur d'amplification (par rapport à JO) Date JO J13 J17 J20 Méthode 1 272 983 1806 contrôle 335 1370 2810 Méthode ' Invention Tableau 3 Viabilité cellulaire des TIL totaux produits Viabilité cellulaire (%) Date JO J13 J17 J20 Méthode 75 77 81 contrôle 51 Méthode 75 84 89 Invention Tableau 4 Nombre de TIL CD8+ viables Nombre de cellules (* 10) Date JO J13 J20 Méthode 1,33 176 1820 contrôle Méthode 433 4120 Invention 15 Tableau 5 : Nombre de TIL CD8+ spécifiques (*106) dela lignée tumorale autoloque Date J20 Méthode 27,1 contrôle Méthode 699,4 Invention L'utilisation du procédé de stimulation polyclonale des TILs décrit dans la présente invention et illustrée par l'exemple décrit ci dessus, fait apparaître plusieurs avantages d'ordre technique mais également quantitatifs et qualitatifs par comparaison à la méthode classique de stimulation utilisée en plaques mais également par rapport à la méthode de production décrite par d'autres auteurs (confer demande internationale WO 90/14097, Pandolfino et colt, io 2001) : Les avantages techniques sont les suivants : • Gain de temps considérable à valeur économique sur le coût de production globale puisqu'il faut en moyenne 2h30 pour l'entretien de 60 is plaques de culture alors que moins d'une heure est nécessaire pour l'entretien en poche de l'équivalent du même nombre de plaques. • Facilité de production (manipulation en poche de culture plus simple qu'en plaques de culture) • La phase de stimulation cellulaire ne nécessite pas de maintenir en 20 parallèle une culture primaire d'échantillon tumoral (contenant TIL + cellules tumorales autologues) comme source de stimulation et d'éléments nutritifs pour l'expansion ultérieure des TILs. Il s'agit ici de la culture d'une seule population cellulaire, les TILs, en co-culture avec des cellules nourricières allogéniques non proliférantes. Cette méthode 25 est d'autant plus efficace, puisqu'elle permet de stimuler de manière polyclonale les TIL, la diversité de stimulation antigénique étant apportée par la co-culture des TIL avec les cellules allogéniques. 17 • La consommation de milieu (X-VIVO 15TM supplémenté en rIL2) dans les 2 méthodes est équivalente (soit 8 litres au total) donc économiquement viable par rapport aux méthodes conventionnelles décrites précédemment et nécessitant 1,5 fois plus de milieu pour produire une quantité de TIL équivalente. • Les concentrations d'IL2, seule cytokine utilisée dans la culture, sont également largement inférieures puisqu'elles varient de 3000)/ml (phase de culture primaire des fragments tumoraux) à 150UI/ml (phases de stimulation et d'amplification) contre 1000 Ul/ml dans le modèle décrit précédemment (confer demande internationale WO 90/14097) pour un rendement de prolifération 2 fois moindre. Ces résultats ont non seulement un intérêt économique certain mais plaident également en faveur d'une toxicité cellulaire moindre liée à l'utilisation de concentrations trop élevées de cette cytokine. Les avantages en termes de rendement cellulaire en référence aux tableaux 1 et 2 sont les suivants : Le rendement cellulaire en TILs totaux est 1.5 fois supérieur à celui obtenu par la méthode classique de stimulation en plaques. En effet le facteur d'amplification est de l'ordre de 2810 pour les TILs cultivés dans les conditions utilisant le procédé de stimulation de la présente invention contre 1806 pour le procédé conventionnel en plaques. Par ailleurs, le facteur d'amplification cellulaire des TILs observé par la présente invention correspond à plus du double de celui observé dans la méthode décrite dans la demande internationale WO 90/14097 (d'une valeur de 1229). Il est donc possible par cette méthode de produire 2 fois plus de TILs pour une durée de culture identique. Enfin, les avantages thérapeutiques sont les suivants : Les TILs produits par le procédé de l'invention peuvent ensuite être conditionnés dans une solution saline contenant 4% de sérum albumine humaine de type Vialebex 40 mg/mi (LFB) en vue d'une utilisation thérapeutique en tant que composition anti-tumorale. En effet plusieurs paramètres sont indicateurs d'une utilisation dans un contexte thérapeutique. • La viabilité cellulaire est à J20 supérieure de 10% à celle observée dans la méthode contrôle démontrant une parfaite tolérance des TILs au procédé de stimulation de l'invention. Un produit de thérapie cellulaire de lo bonne viabilité cellulaire permet d'éviter les risques d'intolérance au produit liée à une trop forte concentration de cellules mortes et de débris cellulaires. • L'analyse des résultats indiqués en tableaux 3 et 5 démontre clairement que la méthode de stimulation en poche favorise, non seulement la 15 prolifération des CD8+ totaux (jusqu'à 2,3 plus de TIL CD8+ totaux produits), mais également, la sélection dans cette population, de TIL CD8+ spécifiques de la lignée tumorale autologue (taux de CD8+ spécifiques jusqu'à 26 fois supérieur à celui obtenu par la méthode classique de stimulation en plaques). Pour une dose thérapeutique de 20 CD8+ spécifiques donnée, la quantité de TIL totaux à produire sera donc inférieure à celle qu'il faudra produire en condition classique en plaques ce qui représente une économie non seulement en termes de coût mais également en terme de temps de production. • Optimisation du temps de production (mise à disposition d'un traitement 25 anti-tumoral efficace (TIL spécifiques) plus rapide. • Production sécurisée (système entièrement clos) en faveur de la sécurité biologique du patient. En conclusion, dans le cadre de cet exemple 1, ce procédé de stimulation 30 en poche compartimentée permet la préparation rapide d'une composition anti-tumorale efficace et de qualité (à taux de TIL CD8+ spécifique élevé), sécurisée et économique.10 20 L'utilisation de ce procédé peut également être élargie à d'autres préparations de composition anti-tumorale impliquant des lymphocytes CD8+ spécifiques. Ces lymphocytes T CD8+ pouvant être spécifiques d'un antigène donné préalablement caractérisé (seul ou chargé sur des lignées tumorales allogéniques ou sur des cellules présentatrices d'antigène de type cellules dendritiques). Le deuxième exemple ci-dessous décrit la méthodologie appliquée à cette nouvelle approche. Ce deuxième exemple décrit un procédé de stimulation, en système clos compartimenté, de PBL (lymphocytes du sang périphérique) issus de patient atteint de Mélanome et préalablement stimulés par un antigène tumoral spécifique du mélanome. 15 Ce procédé comporte une première étape de stimulation spécifique des PBL par un antigène spécifique du mélanome. Les PBL sont obtenus à partir d'un prélèvement sanguin de patient atteint de 20 mélanome. Les lymphocytes sont extraits du sang périphérique par séparation cellulaire sur gradient de Ficoll (méthode de centrifugation sur gradient de densité). La suspension cellulaire ainsi obtenue est enrichie en cellules mononucléées de types monocytes et lymphocytes. Les cellules mononucléées, et plus 25 précisément les lymphocytes T sont, dans un premier temps stimulées, par un antigène peptidique spécifique du mélanome. Cet antigène spécifique peut être utilisé seul ou préalablement chargé sur une lignée tumorale allogénique de manière à amplifier le signal de stimulation. Cette phase de pré-stimulation est généralement réalisée en plaque 96 puits (Falcon) mais peut également se 30 dérouler en poche de culture sécurisée. Cette phase de pré-stimulation se déroule en 1, 2 ou 3 stimulations successives en milieu RPMI supplémenté dune ou plusieurs cytokines et de sérum humain allogénique sécurisé. La durée de culture est généralement de 20 jours en incubateur à atmosphère humide, à 5% de CO2 et à température constante de 37 C. Cette phase de prési:imulation permet, par amplification, de sélectionner spécifiquement les lymphocytes T CD8+ spécifiques de II'antigène tumoral (jusqu'à 30 à 40% des lymphocytes T CD8+ totaux). Cette étape est suivie d'une étape de stimulation polyclonale des lymphocytes T en poche compartimentée. En effet, la phase de stimulation spécifique peut être suivie d'une deuxième phase de stimulation, cette fois polyclonale. Les cellules sont co-cultivées en présence de cellules nourricières allogéniques dans un système de culture clos, de type poche compartimentée (figure 1) (Maco-Pharma SA). Cette étape de stimulation supplémentaire va permettre d'amplifier les lymphocytes T CD8+ d'intérêt. La méthodologie appliquée à cette phase de stimulation reprend exactement celle décrite dans l'exemple 1 décrit précédemment. Cette étape de stimulation peut être suivie d'une étape d'amplification facultative. A l'issue de l'étape de stimulation en poche compartimentée, une étape d'amplification peut alors être appliquée si une production plus importante des cellules d'intérêt est souhaitée. La méthodologie appliquée à cette phase d'amplification reprend exactement celle décrite dans l'exemple 1 décrit précédemment. Les avantages techniques et thérapeutiques mis en évidence au travers de cette nouvelle approche rejoignent sensiblement ceux décrit dans l'exemple I.25 REVENDICATIONS 1. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T, en particulier de lymphocytes T infiltrant les tumeurs dits TIL, modifiés ou non, à partir de prélèvement tumoral ou de sang issu de patient atteint de tumeur, ledit procédé comprenant successivement au moins une étape d'émergence des lymphocytes T contenus dans la tumeur ou le sang prélevé, une étape de stimulation des lymphocytes T issus de l'étape d'émergence et une étape d'amplification des lymphocytes T to stimulés, caractérisé en ce qu'on procède à la stimulation des lymphocytes T dans un récipient (1) de culture clos compartimenté. 2. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon la revendication 1, 15 caractérisé en ce qu'on transfère, après stimulation, les lymphocytes T stimulés dans un récipient de culture clos d'amplification. 3. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon l'une des revendications 1 et 2, 20 caractérisé en ce qu'on stimule les lymphocytes T en présence au moins de cellules nourricières allogéniques non proliférantes. 4. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on stimule les lymphocytes T par co-culture avec un 25 mélange formé de cellules mononucléées issues de sang de donneur humain sain et de lymphocytes B transformés par l'EBV de type LAZ. 5. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon l'une des revendications 3 et 4, 30 caractérisé en ce qu'on co-cultive les cellules nourricières allogéniques non proliférantes et les lymphocytes T dans un milieu de culture sélectif de type X-VIVO 15TM supplémenté en interleukine 2. 226, Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que, au cours de l'étape de stimulation, on introduit dans le récipient de stimulation clos, parallèlement aux lymphocytes, un agent mitotique, tel que la PHA L (phytohémaglutinine de type L), apte à favoriser l'amplification des lymphocytes. 7. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon l'une des revendications 1 à 6, io caractérisé en ce que le récipient (1) clos de stimulation comportant au moins deux compartiments (2, 3), dits l'un chambre technique (2), l'autre chambre de tranquillisation (3), communiquant entre eux, et au moins une voie (4, 5) d'accès débouchant dans l'un (2) des compartiments (2, 3), on introduit les lymphocytes et les cellules nourricières allogéniques non proliférantes en 15 suspension dans un milieu de culture par l'intermédiaire de ladite voie (4) d'accès, et en ce qu'on renouvelle le milieu de culture par l'intermédiaire de la (4) ou d'une autre voie (5) d'accès. 8. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon la revendication 7, 20 caractérisé en ce que le récipient (1) clos comportant au moins deux voies (4, 5) d'accès débouchant dans la chambre technique (2), on introduit les lymphocytes et les cellules nourricières allogéniques non proliférantes en suspension dans un milieu de culture par l'intermédiaire d'une première voie (4) d'accès qui est positionnée la plus proche de la chambre de tranquillisation (3), 25 el en ce qu'on renouvelle le milieu de culture par l'intermédiaire d'une seconde voie d'accès (5) qui est positionnée la plus éloignée de ladite chambre de tranquillisation (3). 9. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon la revendication 7 ou 8, 30 caractérisé en ce que, lors de l'étape de stimulation, on dispose le récipient (1) clos de stimulation avec la chambre technique (2) s'étendant au-dessus de la chambre de tranquillisation (3).10. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre l'étape d'émergence des lymphocytes T, en particulier de culture primaire du ou des prélèvements tumoraux, dans un 5 récipient (1) de culture clos. 11. Procédé de culture in vitro de lymphocytes T selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre les étapes d'émergence, de stimulation io et d'amplification dans un récipient de culture clos différent d'une étape à une autre. 12. Composition pharmaceutique anti-tumorale, caractérisée en ce qu'elle comprend comme agent actif des lymphocytes T 15 obtenus par le procédé conforme à l'une des revendications 1 à 11.