FR 2906724 A1 20080411 FR 0608660 A 20061004 1 L'invention a pour objet une méthode permettant d'induire une protection contre les 4 sérotypes de la dengue chez un patient, comprenant (a) une première série d'administrations (i) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un deuxième sérotype , et (ii) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un troisième sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype et (b) une deuxième série d'administrations des doses (i) et (ii), dans laquelle les doses (i) et (ii) sont administrées simultanément à des sites anatomiques distincts, et dans laquelle la deuxième série (b) est mise en oeuvre au moins 30 jours à au plus 12 mois après la première série (a). Les maladies dengue sont causées par quatre virus du genre flavivirus de type sérologique proches mais distincts d'un point de vue antigénique (Gübler et al., 1988 In: Epidemiology of arthropod-borne viral disease. Monath TPM, editor, Boca Raton (FL): CRC Press: 223-60 ; Kautner et al., 1997, J. of Pediatrics, 131:516-524; Rigau-Pérez et al., 1998, Lancet; 352: 971-977 ; Vaughn et al., 1997, J Infect Dis; 176: 322-30). L'infection avec un sérotype de la dengue peut produire un spectre de maladie clinique allant d'un syndrome viral non spécifique jusqu'à une maladie sévère hémorragique fatale. La période d'incubation de la fièvre dengue après piqûre du moustique est d'environ 4 jours (allant de 3 à 14 jours). La fièvre dengue est caractérisée par une fièvre biphasique, des maux de tête, des douleurs dans différentes parties du corps, une prostration, des éruptions, une lymphadénopathie et une leucopénie (Kautner et al., 1997, J. of Pediatrics, 131:516-524 ; Rigau-Pérez et al., 1998, Lancet; 352: 971-977). La période virémique est la même que la période fébrile (Vaughn et al., 1997, J. Infect. Dis.; 176: 322-30). La guérison de la fièvre dengue est acquise au bout de 7 à 10 jours, mais une asthénie prolongée est usuelle. Des baisses de la numération des leucocytes et des plaquettes sont fréquentes. La dengue hémorragique est une maladie fébrile sévère caractérisée par des anomalies de l'homéostasie et une augmentation de la perméabilité vasculaire qui peut conduire à une hypovolémie et à une hypotension (dengue 2906724 2 avec syndrome de choc) souvent compliquée par des hémorragies internes sévères. Le taux de mortalité de la dengue hémorragique peut atteindre jusqu'à 10 % sans thérapie, mais est de 1 % dans la plupart des centres ayant une expérience thérapeutique (WHO technical Guide, 1986. Dengue haemorrhagic 5 fever: diagnosis, treatment and control, p1-2. World Health Organization, Geneva, Switzerland). Le diagnostic de routine en laboratoire de la dengue est basé sur l'isolation du virus et/ou la détection d'anticorps spécifiques du virus de la dengue. 10 La dengue est la deuxième maladie infectieuse tropicale la plus importante après la malaria, plus de la moitié de la population mondiale vivant dans des zones à risque de transmission épidémique. Chaque année, les cas de dengue sont estimés à 50-100 millions, les cas de patients hospitalisés pour une dengue hémorragique à 500 000, et le nombre de morts à 25 000. La 15 dengue est endémique en Asie, dans le Pacifique, en Afrique, en Amérique latine et dans les Caraïbes. Plus de 100 pays tropicaux sont endémiques pour les infections par le virus de la dengue et la dengue hémorragique a été documentée dans 60 de ces pays (Gubler, 2002, TRENDS in Microbiology. 10:100-103 ; Monath, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.; 91: 2395-2400). Un certain 20 nombre de facteurs bien décrits semblent être impliqués dans la dengue : la croissance de la population ; une urbanisation non planifiée et non contrôlée, en particulier en association avec la pauvreté ; une augmentation des voyages aériens ; le manque de contrôle effectif des moustiques et la détérioration des infrastructures sanitaires et de santé publique (Gubler, 2002, TRENDS in 25 Microbiology. 10:100-103). Les voyageurs et expatriés sont de plus en plus alertés contre la dengue (Shirtcliffe et al., 1998, J. Roy. Coll. Phys. Lond.; 32: 235-237). La dengue a constitué une des principales causes de maladies fébriles au sein les troupes américaines au cours de déploiements dans des zones tropicales endémiques pour la dengue (DeFraites et al., 1994, MMWR 30 1994; 43: 845-848). Les virus sont maintenus dans un cycle qui implique les humains et Aedes aegypti, un moustique domestique piquant le jour, qui préfère s'alimenter sur l'homme. L'infection chez l'homme est initiée par l'injection du 2906724 3 virus au cours du repas de sang d'un moustique Aedes aegypti infecté. Le virus salivaire est déposé principalement dans les tissus extravasculaires. La première catégorie de cellules infectées après inoculation sont les cellules dendritiques, qui migrent ensuite vers les ganglions lymphatiques (Wu et al., 5 2000, Nature Med.; 7:816-820). Après une réplication initiale dans la peau et dans les ganglions lymphatiques, le virus apparaît dans le sang au cours de la phase fébrile aiguë, généralement pendant 3 à 5 jours. Les monocytes et les macrophages sont, avec les cellules dendritiques, parmi les premières cibles du virus de la dengue. La protection contre une 10 réinfection homotypique est complète et dure probablement toute la vie, mais une protection croisée entre les différents types de dengue dure moins de quelques semaines à quelques mois (Sabin, 1952, Am. J. Trop. Med. Hyg.; 1: 30-50). En conséquence, un sujet peut subir une infection avec un sérotype différent. Une seconde infection par la dengue est en théorie un facteur de 15 risque de développer une maladie dengue sévère. Cependant, la dengue hémorragique est multifactorielle : ces facteurs incluent la souche du virus impliqué, ainsi que l'âge, le statut immun et la prédisposition génétique du patient. Deux facteurs jouent un rôle majeur dans la survenue de la dengue hémorragique: une réplication virale rapide avec une virémie élevée (la sévérité 20 de la maladie étant associée au niveau de la virémie ; Vaughn et al., 2000, J. Inf. Dis.; 181: 2-9) et une réponse inflammatoire importante avec la libération de niveaux élevés de médiateurs inflammatoires (Rothman and Ennis, 1999, Virology; 257: 1-6). II n'y a aucun traitement spécifique contre la dengue. Le traitement de la fièvre dengue est symptomatique avec un alitement, un 25 contrôle de la fièvre et de la douleur avec des antipyrétiques et des analgésiques, et une prise de boisson adéquate. Le traitement de la dengue hémorragique nécessite l'équilibrage des pertes de liquide, le remplacement des facteurs de coagulation et la perfusion d'héparine. Les mesures de prévention reposent actuellement sur le contrôle du 30 vecteur et des mesures de protection personnelle qui sont difficiles à mettre en oeuvre et coûteuses. Aucun vaccin contre la dengue n'est approuvé pour le moment. Etant donné que les quatre sérotypes de la dengue sont en circulation dans le monde et comme ils ont été rapportés comme étant impliqués dans des 2906724 4 cas de fièvre hémorragique dengue, la vaccination devrait idéalement conférer une protection contre les quatre sérotypes du virus de la dengue. L'utilisation de sites anatomiques différents pour l'administration de virus de la dengue a déjà été décrite dans la littérature. 5 Ainsi, Halstead et al. (1973, Am. J. Trop. Med. Hyg., 22 :375-381) ont montré qu'une administration de virus dengue sauvages effectuée en 2 ou 4 sites anatomiques séparés pour les 4 sérotypes différents induisait une protection contre une infection ultérieure. Cependant, les auteurs n'ont observé aucune supériorité de ce type d'immunisation séparée par rapport à une 10 immunisation conduite en un seul site. Les formes virales atténuées des virus dengue conduisent à des interférences chez l'homme lorsqu'elles sont administrées sous forme de vaccin tétravalent. Ce phénomène a en particulier été décrit dans les publications suivantes : Gubler D.J. Clin. Microbiol. Rev. 1998 ; 11 (3): 480-96 ; 15 Rothman A.L. et al Vaccine 2001 ; 19 : 4694-9. Zhou H et Deem MW. (Vaccine. 2006 Mar 24;24(14):2451-9) ont développé un modèle mathématique basé uniquement sur l'utilisation des épitopes CD8 et visant à simuler les interférences entre les épitopes CD8 des 4 sérotypes de la dengue. Selon ce modèle théorique, la meilleure façon d'éviter 20 les interférences serait de faire une primo immunisation utilisant un épitope CD8 non dominant suivie d'un rappel par une administration à des sites anatomiques différents des mêmes épitopes CD8 de chacun des 4 sérotypes. Il existe donc un besoin d'une méthode permettant de réduire les interférences entre les différents sérotypes et permettant d'induire des 25 anticorps neutralisant contre les 4 sérotypes de la dengue. Les inventeurs ont mis en évidence qu'il est possible de générer une réponse immune homologue comprenant des anticorps neutralisant les 4 sérotypes lorsque ces derniers sont administrés simultanément deux par deux en des sites anatomiques distincts lors d'une première série 30 d'administrations puis d'une deuxième série d'administrations mise en oeuvre 30 jours à 12 mois après la première administration des 4 sérotypes. Les inventeurs ont en particulier montré qu'une immunisation bivalente DEN-1,2 concomitante à une immunisation bivalente DEN-3,4 réalisée au 2906724 -5 niveau de deux sites anatomiques distincts et suivie d'un rappel des mêmes doses vaccinales dans les mêmes conditions induit des réponses contre les quatre sérotypes chez tous les singes immunisés, à l'exception d'un sérotype chez un animal. A l'inverse, une immunisation tétravalente conduite en un seul 5 site n'a permis d'induire une réponse satisfaisante que contre deux sérotypes sur 4. La réponse immune générée par la méthode selon la présente invention est donc plus importante quantitativement et qualitativement (couvre tous les sérotypes). 10 Selon un premier objet, la présente invention concerne donc une méthode permettant d'induire une protection homologue contre les 4 sérotypes de la dengue chez un patient, comprenant (a) une première série d'administrations (i) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal 15 de la dengue d'un deuxième sérotype et (ii) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un troisième sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype et (b) une deuxième série d'administrations des doses (i) et (ii), dans laquelle les doses (i) et (ii) sont administrées simultanément à des 20 sites anatomiques distincts, et dans laquelle la deuxième série est mise en oeuvre au moins 30 jours à au plus 12 mois après la première série. Selon un autre mode de réalisation de la méthode selon l'invention, les virus vaccinaux de la dengue (i) sont administrés sous forme d'une dose 25 vaccinale bivalente unique. Selon un autre mode de réalisation de la méthode selon l'invention, les virus vaccinaux de la dengue (ii) sont administrés sous forme d'une dose vaccinale bivalente unique. Selon un mode de réalisation particulier de la méthode d'immunisation 30 selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est sélectionné dans le groupe constitué de la souche VDV1 et d'un ChimerivaxTM DEN-1. 2906724 6 Selon un autre mode de réalisation particulier de la méthode selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est sélectionné dans le groupe constitué de la souche VDV2 et d'un ChimerivaxTM DEN-2. Selon un autre mode de réalisation particulier de la méthode selon 5 l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est la souche VDV1 et ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est la souche VDV2. Selon un autre mode de réalisation particulier de la méthode selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est un ChimerivaxTM DEN-1 et ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est un ChimerivaxTM 10 DEN-2. Selon un autre mode de réalisation particulier de la méthode selon l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 3 est un ChimerivaxTM DEN-3. Selon un autre mode de réalisation particulier de la méthode selon 15 l'invention, ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 4 est un ChimerivaxTM DEN-4. Selon un autre mode de réalisation particulier de la méthode selon l'invention, les premier et deuxième sérotypes sont respectivement CYD DEN-1 et CYD DEN-2 et les troisième et quatrième sérotypes sont respectivement 20 CYD DEN-3 et CYD DEN-4. Selon un autre mode de réalisation particulier de la méthode selon l'invention, les premier et deuxième sérotypes sont respectivement CYD DEN-1 et CYD DEN-3 et les troisième et quatrième sérotypes sont respectivement CYD DEN-2 et CYD DEN-4. 25 Selon un autre mode de réalisation particulier de la méthode selon l'invention, la quantité de virus vaccinaux de la dengue de sérotypes 1, 2, 3 et 4 est comprise dans une gamme allant de 103 à 106 DICC50. Selon un autre mode de réalisation de la méthode selon l'invention, les virus vaccinaux utilisés dans la deuxième série d'administrations sont 30 identiques à ceux utilisés dans la première série d'administration. Selon un autre mode de réalisation de la méthode selon l'invention, la deuxième série d'administrations est mise en oeuvre 30 à 60 jours après la première série d'administrations. 2906724 7 La présente invention a également pour objet un kit d'immunisation contre le virus de la dengue comprenant un boitier contenant au moins les virus vaccinaux de la dengue des sérotypes 1, 2, 3 et 4 (a) sous la forme de compositions monovalentes contenues dans 4 5 récipients séparés, ou (b) sous la forme de deux compositions bivalentes contenues dans 2 récipients séparés. Selon un mode de réalisation, le kit selon l'invention comprend au moins: 10 (a) un premier récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-2, et (b) un deuxième récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-3 et un ChimerivaxTM DEN-4. Selon un autre mode de réalisation, le kiit selon le kit selon l'invention 15 comprend au moins : (a) un premier récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-3, et (b) un deuxième récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-2 et un ChimerivaxTM DEN-4. 20 La présente invention a également pour objet un kit d'immunisation contre le virus de la dengue comprenant un boitier contenant au moins les virus vaccinaux de la dengue d'un premier et d'un deuxième sérotypes, (a) sous la forme de 2 compositions monovalentes contenues dans 2 récipients séparés, ou 25 (b) sous la forme d'une composition bivalente contenue dans 1 seul récipient. Selon un mode de réalisation, le kit comprend au moins : (a) un récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-3, ou 30 (b) un récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-2 et un ChimerivaxTM DEN-4, ou (c) un récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN1 et un ChimerivaxTM DEN-2, ou 2906724 8 (d) un récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-3 et un ChimerivaxTM DEN-4. La présente invention fournit également une composition ou un vaccin bivalent comprenant une quantité immunoefficace des virus vaccinaux de la 5 dengue d'un premier et d'un deuxième sérotypes et un excipient pharmaceutiquement acceptable. Selon un mode de réalisation particulier, la composition ou vaccin bivalent comprend les virus vaccinaux sélectionnés dans le groupe consistant en : ChimerivaxTM DEN-1 et ChimerivaxTM DEN-3 ; ou ChimerivaxTM DEN-2 et 10 ChimerivaxTM DEN-4 ; ou ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-2 ; ou ChimerivaxTM DEN-3 et ChimerivaxTM DEN-4. L'invention va être décrite plus en détails dans la description qui suit. 15 Définitions Dans le cadre de la présente invention, deux sites anatomiques sont distincts , s'ils sont drainés par des ganglions lymphatiques différents. Par exemple, le bras droit et le bras gauche sont considérés comme des sites distincts. On peut également citer à titre d'exemples non limitatifs les sites 20 distincts suivants: le bras droit/la cuisse droite ; le bras gauche /la cuisse gauche, le bras gauche/la cuisse droite. On entend dans le cadre de la présente invention par administrations simultanées des administrations mises en oeuvre le même jour (i.e. au plus 24H). Des administrations simultanées sont avantageusement réalisées à au 25 plus 1 heure d'intervalle l'une de l'autre, classiquement à 1-5 minutes l'une de l'autre. Dans le cadre de présente invention, les doses (i) sont administrées au niveau d'un premier site anatomique, soit sous la forme de deux doses monovalentes, soit sous la forme d'une dose bivalente unique. Les doses (ii) 30 sont quant à elles administrées simultanément au niveau d'un deuxième site anatomique, soit sous la forme de deux doses monovalentes, soit sous la forme d'une dose bivalente unique, les premier et deuxième sites étant des sites distincts tels que définis ci-dessus. 2906724 9 Les virus de la dengue ou DEN sont des virus à ARN simple-brin, positif, appartenant au genre Flavivirus de la famille des flaviviridae. L'ARN génomique contient une coiffe de type I à l'extrémité 5' mais est dépourvu de queue poly-A à l'extrémité 3'. L'organisation génomique est 5 constituée des éléments suivants : région non codante (NCR) 5', protéines structurales (capside (C), pré-membrane/membrane (prM/M), enveloppe (E)) et protéines non structurales (NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) et NCR 3'. L'ARN viral génomique est associé aux protéines de la capside pour former une nucléocapside. Comme pour les autres flavivirus, le génome viral DEN 10 code une région codante ininterrompue qui est traduite en une polyprotéine unique. Par virus vaccinal de la dengue on entend dans le cadre de la présente invention, toute forme virale du virus de la dengue capable d'induire une réponse immune homologue spécifique, de préférence toute forme virale 15 du virus de la dengue utilisable dans le cadre d'un programme d'immunisation chez l'homme contre une infection par un virus de la dengue. Par virus vaccinaux de la dengue on entend donc les virus inactivés, les virus atténués, ou les protéines recombinantes telles que la protéine d'enveloppe du virus de la dengue. 20 Un virus vaccinal est considéré comme inactivé s'il ne se réplique plus sur des cellules permissives. Un virus vaccinal est considéré comme atténuée Si après croissance à 37 C ou 39 C sur cellule hépatique Huh-7, VERO et/ou C6/36, ledit virus vaccinal présente un titre maximal inférieur d'au moins 10 fois au titre maximal 25 obtenu avec la souche parentale sauvage dans les mêmes conditions de culture et tel que mesuré en utilisant la même méthode de titrage. Un virus vaccinal qui présente une croissance diminuée sur au moins l'un des trois types cellulaires identifiés ci-dessus est donc considéré comme atténué dans le cadre de la présente invention. 30 Un virus vaccinal utilisable chez l'homme présente un rapport bénéfices/risques positif, ledit rapport permet généralement de satisfaire aux exigences réglementaires pour l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché. Un virus vaccinal de la dengue utilisé dans le cadre de la présente 2906724 -10- invention est de préférence un virus atténué de telle sorte qu'il n'induise pas la maladie chez l'homme. Avantageusement, ledit virus vaccinal ne conduit qu'à des effets secondaires au plus d'intensité modérée (i.e. moyenne à faible, voire nulle) chez la majorité des sujets vaccinés tout en conservant sa capacité à 5 induire une réponse anticorps neutralisante. On peut citer à titre d'exemples non limitatifs, de virus vaccinal de la dengue utilisable dans le cadre de la présente invention : les virus vaccinaux inactivés, les virus vaccinaux atténués tels que les souches atténuées VDV-1, VDV-2, les souches décrites par exemple dans les demandes : WO02/66621, 10 WO0057904, WO0057908, WO0057909 ; WO0057910, WO02/0950075 et WO02/102828, ou les chimères. Les virus chimères ont la particularité de présenter les caractéristiques des virus atténués tels que définis ci-dessus. Tout virus chimères exprimant la protéine d'enveloppe d'un virus dengue et induisant une réponse immune comprenant des anticorps neutralisant le 15 sérotype dont est issue la protéine d'enveloppe peut donc être utilisé dans le cadre de la présente invention. On peut citer à titre d'exemples non limitatifs : les chimerivax TMdengue tels que décrits par exemple dans la demande de brevet WO 98/37911, les chimères dengue/dengue tels que décrits par exemple dans les demandes de brevets WO9640933 et WO0160847.Le virus 20 vaccinal de la dengue de sérotype 1 peut être par exemple la souche vaccinale VDV1 ou un ChimerivaxTM DEN-1, en particulier un virus YF17D/DEN-1, ou encore une souche DEN-1 16007/PDK13. Le virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 peut être par exemple la souche vaccinale VDV2 ou un ChimerivaxTM DEN-2, en particulier un virus YF17D/DEN-2, ou encore une 25 souche DEN-2 16681/PDK53. Le virus vaccinal de la dengue de sérotype 3 peut être un ChimerivaxTM DEN-3, en particulier un virus YF17D/DEN-3. Le virus vaccinal de la dengue de sérotype 4 peut être un ChimerivaxTM DEN-4, en particulier un virus YF17D/DEN-4.. Cette souche a été décrite dans la demande de brevet EP1159968 au nom de Mahidol University et a été 30 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro 1-2483. VDV ou vaccin dengue Vero désigne une souche virale dengue vivante atténuée adaptée sur cellule Vero et capable d'induire une réponse 2906724 -11- humorale spécifique, y compris l'induction d'anticorps neutralisants, chez les primates et en particulier chez l'homme. VDV-1 est une souche obtenue à partir d'une souche sauvage DEN-1 16007 ayant subi 11 passages sur cellules PDK (DEN-1 16007/PDK11) 5 qui a ensuite été amplifiée sur cellules Vero à 32 C, et dont l'ARN a été purifié et transfecté dans des cellules Vero. La souche VDV-1 présente 14 mutations supplémentaires par rapport à la souche vaccinale DEN-1 16007/PDK13 (13 passages sur cellules PDKûPrimary Dog Kidney). La souche DEN-1 16007/PDK13, aussi appelée LAV1 , a été décrite dans la demande de 10 brevet EP1159968 au nom de Mahidol University et a été déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro 1-2480. La séquence complète de la souche VDV-1 est donnée à la séquence SEQ ID NO :1. Ladite souche peut être facilement reproduite à partir de ladite séquence. Un procédé de préparation et la caractérisation de la 15 souche VDV-1 ont été décrits dans la demande de brevet internationale déposée aux noms de Sanofi-Pasteur et du Center for Disease Control and Prevention sous le numéro PCT/IB 2006/001313. VDV-2 est une souche obtenue à partir d'une souche sauvage DEN-2 16681 ayant subi 50 passages sur cellules PDK (DEN-2 16681/PDK50), 20 purifiée par plaque et dont l'ARN a été extrait et purifié avant d'être transfecté dans des cellules Vero. La souche VDV-2 a ensuite été obtenue par purification par plaque et amplification sur cellules Vero. La souche VDV-2 présente 10 mutations supplémentaires par rapport à la souche vaccinale DEN-2 16681/PDK53 (53 passages sur cellules PDK), dont 4 mutations silencieuses. 25 La souche DEN-2 16681/PDK53, aussi appelée LAV2 , a été décrite dans la demande de brevet EP1159968 au nom de Mahidol University et a été déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro 1-2481. La séquence complète de la souche VDV-2 est montrée dans la séquence SEQ ID NO :2. La souche VDV-2 peut être 30 facilement reproduite à partir de ladite séquence. Un procédé de préparation et la caractérisation de la souche VDV-2 a été décrit dans la demande de brevet internationale déposée aux noms de Sanofi-Pasteur et du Center for Disease Control and Prevention sous le numéro PCT/IB 2006/001513. 2906724 - 12 - Les souches VDV 1 et 2 sont préparées par amplification sur cellules Vero. Les virus produits sont récoltés et clarifiés des débris cellulaires par filtration. L'ADN est digéré par traitement enzymatique. Les impuretés sont éliminées par ultrafiltration. Les titres infectieux peuvent être augmentés par 5 une méthode de concentration. Après ajout d'un stabilisant, les souches sont stockées sous forme lyophilisée ou congelée avant utilisation puis reconstituées extemporanément. Par ChimeriVaxTM dengue ou CYD on désigne un virus de la fièvre jaune (YF) chimère qui comprend le squelette d'un virus YF dans lequel 10 les séquences codant pour les protéines de pré-membrane et d'enveloppe ont été remplacée par celles d'un virus DEN. On appelle ainsi CYD-1 ou CYD DEN1 un virus YF chimère contenant les séquences prM et E d'une souche dengue sérotype 1(DEN-1). On appelle CYD-2 ou CYD DEN2 un virus YF chimère contenant les séquences prM et E d'une souche DEN-2. On appelle 15 CYD-3 ou CYD DEN3 un virus YF chimère contenant les séquences prM et E d'une souche DEN-3. On appelle CYD-4 ou CYD DEN4 un virus YF chimère contenant les séquences prM et E d'une souche DEN-4. La préparation de ces ChimeriVaxTM dengue a été décrite en détails dans les demandes de brevet internationales WO 98/37911 et WO 03/101397 20 auxquelles on peut se reporter pour un descriptif précis de leur procédé de préparation. Les chimères décrits dans les exemples ont été générés par utilisation des séquences prM et E issues des souches DEN 1 PUO359 (TYP1140), DEN2 PUO218, DEN3 PaH881/88 et DEN 4 1288 (TVP 980). Toute souche du virus de la dengue pourrait être utilisée dans le cadre de la 25 présente invention pour la construction des chimères. De préférence, le virus YF chimère comprend le squelette d'une souche de la fièvre jaune atténuée YF17D (Theiler M, and Smith HH (1937) J Exp. Med 65, p767-786.) (virus YF17D/DEN-1, YF17D/DEN-2, YF17D/DEN-3, YF17D/DEN-4). Des exemples de souches YF17D susceptibles d'être utilisées 30 incluent YF17D204 (YF-Vax , Sanofi-Pasteur, Swifwater, PA, USA ; Stamaril , Sanofi-Pasteur, Marcy l'Etoile, France ; ARILVAXTM, Chiron, Speke, Liverpool, UK ; FLAVIMUN , Berna Biotech, Bern, Switzerland ; YF17D-204 France (X15067,X15062) ; YF17D-204,234 US (Rice et al., 1985, Science, 2906724 -13 - 229 :726-733), ou encore des souches apparentées YF17DD (Genbank numéro d'accès U17066), YF17D-213 (Genbank numéro d'accès U17067) et les souches YF17DD décrites par Galler et al. (1998, Vaccines 16(9/10) :1024-1028). Toute autre souche de virus de la fièvre jaune atténuée utilisable chez 5 l'homme peut être utilisée dans le cadre de la présente invention pour la construction des chimères. La présente invention a donc également pour objet une composition ou vaccin bivalent comprenant une quantité immunoefficace d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et d'un virus vaccinal de la dengue d'un 10 deuxième sérotype et un excipient pharmaceutiquement acceptable. Pour un descriptif des virus vaccinaux utilisables dans les vaccins selon l'invention, on peut se référer à la description qui en est donnée dans le cadre de la méthode d'immunisation selon l'invention. Selon un mode de réalisation particulier, la composition ou vaccin 15 bivalent selon l'invention comprend CYD DEN-1 et CYD DEN-2, ou CYD DEN-3 et CYD DEN-4, ou CYD DEN-1 et CYD DEN-3 ou CYD DEN-2 et CYD DEN-4, avantageusement les virus vaccinaux sont présents dans le vaccin à une quantité de 105 DICC50. Chaque virus vaccinal dengue monovalent ChimeriVaxTM (sérotypes 1, 20 2, 3et 4) a été préparé par amplification de chaque sérotype sur cellules Vero. Plus spécifiquement, les quatre virus sont produits séparément sur des cellules Vero adhérentes en milieu sans sérum. La récolte virale, clarifiée des débris cellulaires par filtration, est alors concentrée et purifiée par ultrafiltration et chromatographie pour enlever l'ADN des cellules hôtes. Après ajout d'un 25 stabilisant, les souches vaccinales sont stockées sous forme congelée ou lyophilisée avant utilisation puis reconstituées extemporanément. Le même procédé est appliqué pour les quatre chimères. Une dose, une composition ou un vaccin est monovalent lorsqu'il contient outre un excipient pharmaceutiquement acceptable un seul sérotype 30 de virus dengue. Une dose, une composition ou un vaccin est bivalent lorsqu'il contient deux sérotypes différents de virus dengue. Une dose, une composition ou un vaccin est trivalent lorsqu'il contient trois sérotypes différents de virus dengue. Une dose, une composition ou un vaccin est 2906724 - 14 - tétravalent lorsqu'il contient quatre sérotypes différents de virus dengue. Les compositions multivalentes sont obtenues par simple mélange des compositions monovalentes. Par patient , on désigne une personne (enfant ou adulte) susceptible 5 d'être infectée par la dengue, en particulier une personne à risque d'infection comme par exemple une personne voyageant dans des régions où la dengue est présente ou un habitant de ces régions. Ce terme englobe donc les personnes naïves ainsi que les personnes non-naïves pour le virus de la dengue. 10 Immunisation simultanée en des sites anatomiques distincts Les inventeurs ont montré en particulier que l'administration des 4 sérotypes sous la forme de deux administrations bivalentes simultanées à des sites anatomiques distincts suivies d'un rappel 30 jours à 12 mois après la 15 première série d'administrations permet d'obtenir une protection homologue efficace contre les 4 sérotypes. La méthode selon la présente invention présente donc un intérêt tout particulier dans le cadre d'une stratégie d'immunisation contre la dengue. Selon la présente invention, les 4 sérotypes de la dengue peuvent être 20 administrés dans un ordre quelconque pour autant qu'ils soient administrés deux par deux (i.e. doses (i) et (ii) respectivement sous forme de deux doses monovalentes ou d'une dose bivalente unique) de façon simultanée en des sites distincts. La méthode selon la présente invention peut donc être mise en oeuvre 25 avec les modes de réalisation décrits ci-dessous : - (i) : sérotypes 1 et 2 ; (ii) sérotypes 3 et 4 ; ou - (i) : sérotypes 1 et 3 ; (ii) sérotypes 2 et 4 ; ou - (i) : sérotypes 1 et 4 ; (ii) sérotypes 2 et 3 ; ou - (i) : sérotypes 2 et 3 ; (ii) sérotypes 1 et 4 ; ou 30 - (i) : sérotypes 2 et 4 ; (ii) sérotypes 1 et 3 ; ou - (i) : sérotypes 3 et 4 ; (ii) sérotypes 1 et 2. De préférence, la méthode selon la présente invention comprend l'administration des virus vaccinaux de la dengue suivants : (i) : sérotypes 1 et 2906724 - 15 - 2 ; (ii) sérotypes 3 et 4 ou (i) sérotypes 1 et 3 ; (ii) sérotypes 2 et 4. Les doses (i) et (ii) se présentent avantageusement sous la forme de doses bivalentes. Selon des modes de réalisation particuliers, la présente invention couvre donc les schémas suivants : 5 - (i) CYD DEN-1 et CYD DEN-2 ; (ii) CYD DEN-3 et CYD DEN-4 - (i) CYD DEN-1 et CYD DEN-3 ; (ii) CYD DEN-2 et CYD DEN-4 - (i) CYD DEN-1 et CYD DEN-4 ; (ii) CYD DEN-2 et CYD DEN-3 - (i) CYD DEN-2 et CYD DEN-3 ; (ii) CYD DEN-1 et CYD DEN-4 - (i) CYD DEN-2 et CYD DEN-4 ; (ii) CYD DEN-1 et CYD DEN-3 10 - (i) CYD DEN-3 et CYD DEN-4 ; (ii) CYD DEN-1 et CYD DEN-2 - (i) VDV-1 et CYD DEN-2 ; (ii) CYD DEN-3 et CYD DEN-4 - (i) VDV-1 et CYD DEN-3 ; (ii) CYD DEN-2 et CYD DEN-4 - (i) VDV-1 et CYD DEN-4 ; (ii) CYD DEN-2 et CYD DEN-3 - (i) CYD DEN-2 et CYD DEN-3 ; (ii) VDV-1 et CYD DEN-4 15 - (i) CYD DEN-2 et CYD DEN-4 ; (ii) VDV-1 et CYD DEN-3 - (i) CYD DEN-3 et CYD DEN-4 ; (ii) VDV-1 et CYD DEN-2 - (i) CYD DEN-1 et VDV-2 ; (ii) CYD DEN-3 et CYD DEN-4 - (i) CYD DEN-1 et CYD DEN-3 ; (ii) VDV-2 et CYD DEN-4 - (i) CYD DEN-1 et CYD DEN-4 ; (ii) VDV-2 et CYD DEN-3 20 - (i) VDV-2 et CYD DEN-3 ; (ii) CYD DEN-1 et CYD DEN-4 - (i) VDV-2 et CYD DEN-4 ; (ii) CYD DEN-1 et CYD DEN-3 - (i) CYD DEN-3 et CYD DEN-4 ; (ii) CYD DEN-1 et VDV-2 - (i) VDV-1 et VDV-2 ; (ii) CYD DEN-3 et CYD DEN-4 - (i) VDV-1 et CYD DEN-3 ; (ii) VDV-2 et CYD DEN-4 25 - (i) VDV-1 et CYD DEN-4 ; (ii) VDV-2 et CYD DEN-3 - (i) VDV-2 et CYD DEN-3 ; (ii) VDV-1 et CYD DEN4 et - (i) VDV-2 et CYD DEN-4 ; (ii) VDV-1 et CYD DEN-3. De préférence, la méthode d'immunisation selon l'invention comprend l'administration des virus vaccinaux de la dengue suivants (i) CYD DEN-1 et 30 CYD DEN-2 ; (ii) CYD DEN-3 et CYD DEN-4 ; ou (i) CYD DEN-1 et CYD DEN- 3 ; (ii) CYD DEN-2 et CYD DEN-4. Les doses (i) et (ii) se présentent avantageusement sous la forme de doses bivalentes. 2906724 -16- La méthode d'immunisation selon la présente invention comprend une deuxième série d'administrations réalisée de 30 jours à 12 mois, avantageusement de 30 jours à 3 mois, de préférence 30 jours, 45 jours ou 60 jours après la première série des administrations (i et ii) qui comprend 5 avantageusement l'administration des mêmes compositions que celles utilisées lors de la première série qui sont administrées avantageusement dans les mêmes conditions. On entend par dose de virus vaccinal dans le cadre de la présente invention une composition comprenant une quantité immunoefficace du 10 virus vaccinal de la dengue, c'est-à-dire une quantité suffisante de virus de la dengue pour induire une réponse anticorps neutralisante homologue, qui peut être mise en évidence par exemple par le test de séroneutralisation tel que décrit ci-dessous dans l'exemple 1. Un sérum est considéré comme positif pour la présence d'anticorps neutralisants lorsque le titre d'anticorps neutralisants 15 ainsi déterminé est supérieur ou égal à 1 :10 (unité : 1/dilution). Les quantités de souche vaccinales sont exprimées communément en termes d'unité formant des plages virales (PFU) ou de dose infectant 50% de la culture tissulaire ou encore de dose infectant 50% de la culture cellulaire (DICC50). Par exemple, les compositions selon l'invention peuvent contenir de 20 10 à 106 DICC50, en particulier de 103 à 105 DICC50 de virus vaccinal dengue de sérotype 1, 2, 3 ou 4 pour une composition monovalente ou bivalente. Ainsi dans les compositions ou utilisation selon l'invention, les doses de virus vaccinaux de la dengue de sérotype 1, 2, 3 et 4 sont préférentiellement comprises chacune dans une gamme allant de 10 à 106 DICC50, tels que 10, 25 10',102,103,104,105 ou 106 DICC50 en particulier dans une gamme allant de 103 à 105 DICC50, Les virus vaccinaux peuvent être utilisés à des doses identiques ou différentes, qui peuvent être ajustées en fonction de la nature du virus vaccinal utilisé et de l'intensité de la réponse immunitaire obtenue. Selon un mode de réalisation particulier de la méthode selon la présente 30 invention, les doses, monovalentes ou bivalentes, de virus vaccinaux comprennent respectivement 105 DICC50 de CYD DEN-1, de CYD DEN-2, de CYD DEN-3 et de CYD DEN-4. 2906724 -17- La réponse anticorps neutralisante est avantageusement durable, c'est-à-dire qu'elle peut être détectée dans le sérum jusqu'à au moins 6 mois, après la deuxième série des administrations (i) et (ii). La dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et la 5 dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un deuxième sérotype (i.e. dose(s) (i)) sont administrées simultanément sous forme de deux compositions monovalentes, ou avantageusement sous la forme d'une composition ou dose bivalente unique. De la même manière, la dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un 10 troisième sérotype et la dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype (i.e. dose(s) (ii)) sont administrées simultanément sous forme de deux compositions vaccinales monovalentes, ou avantageusement sous la forme d'une composition vaccinale bivalente unique. Les virus vaccinaux sont administrés sous forme de compositions 15 vaccinales ou doses de virus vaccinaux qui peuvent être préparées selon n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier. Habituellement, les virus, généralement sous forme lyophilisée, sont mélangés avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, tel que de l'eau ou une solution saline tamponnée au phosphate, des agents mouillants ou stabilisants. Par 20 excipient pharmaceutiquement acceptable , on entend tout solvant, milieu de dispersion, charge etc, qui ne produit pas de réaction secondaire, par exemple allergique, chez l'humain ou l'animal. L'excipient est sélectionné en fonction de la forme pharmaceutique choisie, de la méthode et de la voie d'administration. Des excipients appropriés, ainsi que les exigences en matière 25 de formulation pharmaceutique, sont décrites dans Remington : The Science & Practice of Pharmacy , qui représente un ouvrage de référence dans le domaine. De préférence, les compositions vaccinales sont préparées sous forme injectable, et peuvent correspondre à des solutions liquides, des suspensions 30 ou des émulsions. Les compositions peuvent en particulier comprendre une solution aqueuse tamponnée de manière à maintenir un pH compris entre environ 6 et 9 (comme déterminé avec un pH-mètre à température ambiante). 2906724 - 18 - Bien qu'il ne soit pas nécessaire de rajouter un adjuvant, Les compositions peuvent néanmoins comprendre un tel composé, c'est-à-dire une substance qui augmente, stimule, ou renforce, la réponse immunitaire cellulaire ou humorale induite par la souche vaccinale administrée simultanément. 5 L'homme de l'art est à même de sélectionner parmi les adjuvants classiquement utilisés dans le domaine vaccinal, un adjuvant qui puisse être approprié dans le cadre de la présente invention. Les compositions vaccinales selon l'invention peuvent être administrées selon n'importe quelle voie utilisée habituellement en vaccination, par exemple 10 la voie parentérale (notamment intradermique, sous-cutanée, ou intramusculaire), avantageusement par voie sous-cutanée. De préférence, les compositions vaccinales sont des compositions injectables administrées par voie sous-cutanée au niveau de la région du deltoïde gauche et du deltoïde droit. 15 Le volume de composition administré dépend de la voie d'administration. Pour des injections sous-cutanées, le volume est généralement compris entre 0,1 et 1,0 ml, de préférence environ 0,5 ml. La période optimale pour l'administration de la totalité des sérotypes 1 à 4, est d'environ 1 à 3 mois avant l'exposition au virus de la dengue. Les 20 vaccins peuvent être administrés en tant que traitement prophylactique d'une infection par un virus de la dengue chez les adultes et les enfants. Les populations ciblent incluent donc des personnes qui peuvent être naïves (i.e. non préalablement immunisés) ou non-naïves vis-à-vis du virus de la dengue. Des administrations de rappel des virus vaccinaux de la dengue de 25 sérotypes 1 à 4 peuvent en outre être mises en oeuvre par exemple entre 6 mois et 10 ans, par exemple 6 mois, 1 ans, 3 ans, 5 ans ou 10 ans après l'administration de la deuxième série d'administrations selon l'invention. Les administrations de rappel vont être mises en oeuvre avantageusement en utilisant les mêmes compositions vaccinales (i.e. les mêmes virus vaccinaux) et 30 de préférence dans les mêmes conditions d'administrations (sites anatomiques et voies d'administration) que celles utilisées pour les 1 ère et 2ème séries d'administrations. 2906724 -19Les phénomènes d'interférence peuvent s'expliquer par la dominance d'un ou plusieurs sérotypes par rapport à d'autres et sont donc indépendants de la technologie utilisée pour la fabrication du candidat vaccin (ex VDV ou chimerivax). La méthode selon la présente invention peut donc s'appliquer de 5 façon générale à tout virus vaccinal de la dengue. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation de doses de virus vaccinal de la dengue pour la préparation d'un vaccin pour induire une protection contre les 4 sérotypes de la dengue comprenant : 10 (a) une première série d'administrations (i) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un deuxième sérotype, et (ii) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un troisième sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype et 15 (b) une deuxième série d'administrations des doses (i) et (ii), dans laquelle les doses (i) et (ii) sont administrées simultanément à des sites anatomiques distincts, et dans laquelle la deuxième série est mise en oeuvre au moins 30 jours à au plus 12 mois après la première série. 20 Pour un descriptif des virus vaccinaux de la dengue utilisables dans le cadre de la présente invention on peut se reporter au descriptif qui en est donné en relation avec la méthode d'immunisation selon l'invention. La présente invention a également pour objet un kit d'immunisation 25 contre les quatre sérotypes du virus de la dengue. Le kit selon la présente invention comprend les doses telles que définies ci-dessus en relation avec la méthode d'immunisation proposée. Le kit selon l'invention comprend donc un boitier renfermant les différents récipients contenant les doses vaccinales et avantageusement une brochure explicative renfermant les informations utiles 30 pour l'administration des vaccins. Selon un mode de réalisation, le kit selon l'invention comprend un boitier contenant au moins les virus vaccinaux de la dengue des sérotypes 1, 2, 3 et 4 2906724 - 20 - (a) sous la forme de compositions monovalentes contenues dans 4 récipients séparés, ou (b) sous la forme de deux compositions bivalentes contenues dans 2 récipients séparés. 5 Selon un autre mode de réalisation, le kit selon l'invention comprend un boitier contenant au moins les virus vaccinaux de la dengue d'un premier et d'un deuxième sérotype, (a) sous la forme de 2 compositions monovalentes contenues dans 2 récipients séparés , ou 10 (b) sous la forme d'une composition bivalente contenue dans 1 seul récipient. Pour un descriptif des virus vaccinaux de la dengue utilisables dans le kit selon l'invention, on peut se référer à la description des virus vaccinaux donnée ci-dessus en relation avec la méthode d'immunisation selon l'invention. 15 Selon un mode de réalisation particulier, le kit selon la présente invention comprend donc au moins : (a) un premier récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-2, et (b) un deuxième récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un 20 ChimerivaxTM DEN-3 et un ChimerivaxTM DEN-4. Selon un autre mode de réalisation, le kit selon l'invention comprend au moins : (a) un premier récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-3, et 25 (b) un deuxième récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-2 et un ChimerivaxTM DEN-4. Selon un autre mode de réalisation, le kit selon l'invention comprend au moins : (a) un récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un 30 ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-3, ou (b) un récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-2 et un ChimerivaxTM DEN-4, ou 2906724 -21- (c) un récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-2, ou (d) un récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-3 et un ChimerivaxTM DEN-4. 5 Les kits selon l'invention peuvent contenir un exemplaire unique ou plusieurs exemplaires des récipients tels que décrits ci-dessus. Si les vaccins utilisés se présentent sous forme lyophilisée, le kit comprendra avantageusement au moins un récipient supplémentaire contenant le diluant permettant de reconstituer une dose vaccinale injectable. Tout diluant 10 pharmaceutiquement acceptable peut être utilisé pour ce faire, classiquement, de l'eau ou une solution aqueuse tamponnée au phosphate. L'invention est illustrée par les exemples suivants. 15 EXEMPLES Exemple 1 : Immunisation par injection simultanée de deux compositions bivalentes en des sites anatomiques distincts chez le singe La virémie et l'immunogénicité ont été testées dans un modèle singe. La virémie, en particulier, a été identifiée comme l'un des facteurs associés avec 20 la virulence et la sévérité de la maladie chez les hommes et constitue donc un paramètre important à prendre en considération. L'immunogénicité est quant à elle un paramètre clé dans le cadre de l'évaluation de la protection conférée. 1.1 Matériels et méthodes : 25 Les expériences chez les singes ont été menées selon les Directives européennes relatives à l'expérimentation animale. Les immunisations ont été effectuées chez des singes cynomolgus (Macaca fascicularis) originaires de Mauritanie. Les singes ont été mis en quarantaine pendant six semaines avant immunisation. 30 Les singes ont été immunisés par voie sous-cutanée dans les bras avec 0,5 ml de composition vaccinale. Après une légère anesthésie avec de la kétamine (Imalgene, Merial), du sang a été collecté par ponction au niveau des veines inguinale ou saphène. Aux jours 0 et 28 suivant chaque immunisation, 2906724 - 22 - 5 ml de sang ont été échantillonnés pour évaluer les réponses anticorps, alors qu'entre les jours 2 et 10, 1 ml de sang était échantillonné pour évaluer la virémie. Le sang était collecté sur la glace et conservé sur la glace jusqu'à séparation du sérum. Pour ce faire, le sang a été centrifugé pendant 5 20 minutes à 4 C et le sérum collecté stocké à -80 C jusqu'au moment des tests. Mesure de la virémie Les virémies post vaccinales ont été suivies par RT-PCT quantitative en 10 temps réel (qRT-PCR). Deux jeux d'amorces et de sondes localisées dans le gène NS5 de des souches DEN1 et DEN2 ont été utilisés pour quantifier l'ARN de VDV-1 et VDV-2 respectivement. Un troisième jeu de 2 amorces et 1 sonde localisées dans le gène NS5 du virus YF a été utilisé pour quantifier l'ARN du CYD. Enfin, 4 jeux d'amorces et de sondes spécifiques des différents 15 sérotypes CYD, localisées à la jonction des gènes E (DEN) / NS1 (YF) ont été utilisés pour identifier le sérotype dans les échantillons positifs pour l'ARN NS5 YF (voir aussi tableau I). 7 plasmides contenant, sous le contrôle du promoteur T7, la région ciblée par chaque PCR, ont été transcrits in vitro pour générer une série d'ARN synthétiques qui ont été inclus comme référence interne dans 20 chaque essai de RT-PCT. Ces ARN synthétiques ont été dosés par spectrophotométrie, la quantité d'ARN obtenue a été convertie en nombre de copies d'ARN et exprimée en GEQ (équivalents génomiques). 0,140 ml de sérum de singe a été extrait à l'aide du kit d'extraction d'ARN Nucleospin 96 virusTM de Macherey Nage!, selon les instructions du 25 fabriquant, puis l'ARN purifié a été élué avec 0,140 ml (0,090 ml, puis 0,05 ml) d'eau exempte de RNase. Pour éviter des cycles répétés de congélation/décongélation, une première quantification a été réalisée immédiatement après l'extraction sur 5 gl de ladite préparation d'ARN. Le volume restant a été congelé à 70 C. 30 Les mélanges réactionnels contenaient, en plus des composants du kit de quantification RT-PCR Qiagen QauntitectTMprobes (Qiagen), 10 picomoles de chaque amorce, 4 picomoles de chaque sonde et 5 l d'ARN, dans un volume total de 25 l. Dans le cas des ARN à tester, 5 0 de la 2906724 - 23 - préparation purifiée ont été directement introduits dans le mélange réactionnel, sans étape de dilution préalable. Les ARN synthétiques ont été dilués au 1/10 dans de l'eau exempte de RNAse, et 7 dilutions contenant approximativement 10 à 106 GEQ dans 5 l ont été quantifiées en parallèle afin de générer la 5 courbe étalon. Les réactions de quantification ont été réalisées par l'appareil ABIPrism 700TM d'Applied Biosystem, en utilisant le programme suivant : 50 C/30 min, 95 C/15 min, puis 40 cycles de 95 C/15 secû60 C/60 sec. La limite de quantification de l'ARN viral dans ce test est de 2,9 à 10 3,3 log1oGEQ/ml (800 à 2000 GEQ/ml; 4 à 10 GEQ/réaction), selon les cibles PCR (déviation standard : +/-0,3 log1o) La corrélation entre le titre infectieux et la quantification d'ARN viral a été établie parallèlement aux essais, par analyse de 0,140 ml d'échantillons de sérums de singe négatifs (DO) dans lesquels on a ajouté une quantité connue 15 de particules infectieuses des virus ayant servi à l'immunisation (CYD ou VDV). Lesdits sérums contrôles ont été préparés à deux dilutions contenant environ 1 PFU et environ 100 PFU dans 5 l (2.3 and 4.3 Iog1oPFU/ml, respectivement). Dans les tests utilisés dans les exemples la corrélation entre GEQ et 20 PFU est la suivante :Ratio GEQ/PFU de 2.7 log10 (soit : 1 PFU = 500 GEQ) pour les sera positifs en YF ou CYDs. Ratio GEQ/PFU de 2.5 logo (soit : 1 PFU = 320 GEQ) pour les sera positifs en VDV1 ou VDV2. Les Limites de quantification étant VDV1-NS5. 5' Fam-TTC ACA CCA CTT CCA C-M GBINFQ (16 b) VDV2-NS5 sens 5' AAT GAC AGA CAC GAC TCC (18 b) ^ w V DV2-NS5 anti: 5' CCC AAA ACC TAC TAT CTT CAA C (22 b) - V DV2-NS5 5' Farn-TGG AAG TCG GCA CGT GA-M GBINFQ (17 b) Mesure des anticorps neutralisants (test de seroneutralisation) (SN50)) 5 Classiquement, la mesure des anticorps Dengue est établie à l'aide du test PRNT50 (test de neutralisation par réduction à 50% du nombre de PFU). Ce test étant lourd et consommateur de matériel, nous avons développé le test SN50, basé sur la réduction à 50 % du nombre d'unités mesurées en test DICC50. 10 Dans une plaque de 96 puits, 0,120 ml de chaque sérum décomplémenté est ajouté à 0,480 ml de diluant (ISCOVE 4% SVF) par puits. Des dilutions en série d'un facteur 6 sont réalisées par transfert de 0,150 ml de sérum dans 0,450 ml de diluant. 450 l de dilution virale à 2,7 1og10 DICC50/ml sont ajoutés dans chaque puits de façon à obtenir 25 DICC50/puits. La plaque 15 est incubée à 37 C pendant 1 heure. 0.1 ml de chaque dilution est ensuite distribué dans 6 puits d'une plaque de 96 puits dans laquelle des cellules VERO ont été ensemencées 3 jours avant le début de l'expérience à une densité de 8000 cellules/puits, dans 0.1 ml de milieu ISCOVE 4% SVF,. Après 6 jours d'incubation à 37 C, en présence de 5% de CO2, les cellules sont fixées 20 à l'aide d'un mélange éthanol/acétone (70/30) à 4 C pendant 15 minutes, puis 2906724 - 25 - lavées à 3 reprises dans du PBS et incubées pendant l h à 37 C en présence de 0.05 ml d'une dilution au 1/2000 d'un anticorps monoclonal anti-flavivirus (mAb 4G2). Les plaques sont ensuite lavées à 2 reprises et incubées 1H à 37 C en présence de 0. 05 ml d'une dilution au 1/1000 d'une IgG anti-souris 5 conjuguée à la phosphatase alcaline. Les plages de lyse sont révélées par addition de 0.05 ml d'un substrat coloré : BCIP/NBT. Les titres en anticorps neutralisants sont calculés en utilisant la formule de Karber telle que définie ci-dessous : 10 Iog,oSN50 = d + f/N (X + N/2), Dans laquelle: d : représente la dilution conduisant à 100% de neutralisation (soit 6 réplicats négatifs c'est-à-dire ne présentant pas de signe d'infection) 15 f : représente le facteur de dilution en log10 (e.g. facteur de dilution de 1:4,f = 0,6) N: représente le nombre de réplicats / dilution (N=6) X: nombre total de puits ne présentant aucun signe d'infection, à l'exception de la dilution d. 20 La limite de détection virale est de 10 SN50 (i .e. 1.0 logioSN50). Les souches virales qui ont été utilisées pour la neutralisation sont les souches DEN1 16007, DEN2 16681, DEN3 16562 or DEN4 1036. Pour les contrôles, les dilutions virales initiales ont été re-titrées. La corrélation entre le titre neutralisant mesuré en test SN50 et le titre 25 neutralisant mesuré classiquement en test PRNT50 est : Iog1oPRNT50 = logioSN50 + 0,2. 1.2 Evaluation des immunisations simultanées 2 groupes de 4 singes d'âge et poids équivalents ont été immunisés. 30 (voir tableau 2) 2906724 - 26 - L'immunisation a été effectuée par voie sous-cutanée dans le bras avec une aiguille 23G1, à une dose 105 DICC50 pour chaque sérotype pour les vaccins CYD DEN 1 à 4. 5 Tableau 2 : Composition des groupes et protocole d'immunisation Singes Groupe Immunisations JO J58 1 CYD 1 2 dans CYD 1 2 dans un bras un bras CYD 3 4 dans CYD 3 4 dans l'autre bras l'autre bras 2 CYD 1234 CYD 1234 Les résultats d'immunogénicité obtenus après une immunisation (J28) et deux immunisations (J86) sont présentés dans le tableau 3. 10 Les résultats de virémie sont donnés dans le tableau 4. Tableau 3 : titre neutralisant SN5O (unités 1/dil) Singes J0+28 J58+28 Groupe ID mmunisatio DEN-1 DEN-2 DEN-3 DEN-4 DEN-1 DEN-2 DEN-3 DEN-4 JU J58 AP545 20 25 50 40 50 319 A0949 CYD 1 2 dans CYD 1 2 dans 20 - - 20 319 20 13 100 1 AP335 un bras un bras 20 - - 252 100 16 10 200 CYD 3 4 dans CYD 3 dans 4 AP817 l'autre bras l'autre bras 20 16 32 40 319 25 32 402 1oy.géomét1que 20 10 8 56 142 25 12 225 AP676 63 - - 126 100 - - 40 AQOO5 25 - 63 50 - - 63 2 AP961 CYD 1234 CYD 1234 50 - - 158 80 - 80 400 AQ163 63 - - 40 100 - 16 252 Moy.géométnque 47 REVENDICATIONS 1. Utilisation de doses de virus vaccinal de la dengue pour la préparation 5 d'un vaccin pour induire une protection contre les 4 sérotypes de la dengue comprenant : (a) une première série d'administrations (i) d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un premier sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un deuxième sérotype , et (ii) d'une dose d'un virus vaccinal de 10 la dengue d'un troisième sérotype et d'une dose d'un virus vaccinal de la dengue d'un quatrième sérotype et (b) une deuxième série d'administrations des doses (i) et (ii), dans laquelle les doses (i) et (ii) sont administrées simultanément à des sites anatomiques distincts, et 15 dans laquelle la deuxième série est mise en oeuvre au moins 30 jours à au plus 12 mois après la première série. 2. Utilisation selon la revendication 1 dans laquelle les virus vaccinaux de la dengue (i) sont administrés sous forme d'une dose bivalente unique. 3. Utilisation selon les revendications 1 ou 2, dans laquelle, les virus vaccinaux de la dengue (ii) sont administrés sous forme d'une dose vaccinale bivalente unique. 25 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans laquelle ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est sélectionné dans le groupe constitué de la souche VDV1 et d'un ChimerivaxTM DEN-1. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans 30 laquelle ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est sélectionné dans le groupe constitué de la souche VDV2 et d'un ChimerivaxTM DEN-2. 20 2906724 -31- 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans laquelle ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est la souche VDV1 et ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est la souche VDV2. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans laquelle ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 1 est un ChimerivaxTM DEN-1 et ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 2 est un ChimerivaxTM DEN-2. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans laquelle ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 3 est un ChimerivaxTM DEN-3. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans 15 laquelle ledit virus vaccinal de la dengue de sérotype 4 est un ChimerivaxTM DEN-4. 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et 7 à 9 dans laquelle les premier et deuxième sérotypes sont respectivement CYD 20 DEN-1 et CYD DEN-2 et les troisième et quatrième sérotypes sont respectivement CYD DEN-3 et CYD DEN-4. 11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 dans laquelle la quantité de virus vaccinaux de la dengue de sérotypes 1, 2, 3 et 4 25 est comprise dans une gamme allant de 103 à 106 DICC50. 12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 dans laquelle les virus vaccinaux utilisés dans la deuxième série d'administrations sont identiques à ceux utilisés dans la première série d'administration. 13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 dans laquelle la deuxième série d'administrations est mise en oeuvre 30 à 60 jours après la première série d'administrations. 30 2906724 - 32 - 14. Kit d'immunisation contre le virus de la dengue comprenant un boitier contenant au moins les virus vaccinaux de la dengue des sérotypes 1, 2, 3 et 4 5 (a) sous la forme de compositions monovalentes contenues dans 4 récipients séparés, ou (b) sous la forme de deux compositions bivalentes contenues dans 2 récipients séparés. 10 15. Kit selon la revendication 14 comprenant au moins : (a) un premier récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-2, et (b) un deuxième récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-3 et un ChimerivaxTM DEN-4. 16. Kit selon la revendication 14 comprenant au moins : (a) un premier récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-3, et (b) un deuxième récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un 20 ChimerivaxTM DEN-2 et un ChimerivaxTM DEN-4. 17. Kit d'immunisation contre le virus de la dengue comprenant un boitier contenant au moins les virus vaccinaux de la dengue d'un premier et d'un deuxième sérotype, 25 (a) sous la forme de 2 compositions monovalentes contenues dans 2 récipients séparés, ou (b) sous la forme d'une composition bivalente contenue dans 1 seul récipient. 30 18. Kit selon la revendication 17 comprenant au moins : (a) un récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-3, ou 2906724 - 33 - (b) un récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-2 et un ChimerivaxTM DEN-4, ou (c) un récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-2, ou 5 (d) un récipient contenant un vaccin bivalent comprenant un ChimerivaxTM DEN-3 et un ChimerivaxTM DEN-4. 19. Vaccin bivalent comprenant une quantité immunoefficace des virus vaccinaux de la dengue d'un premier et d'un deuxième sérotype et un excipient 10 pharmaceutiquement acceptable. 20. Vaccin bivalent selon la revendication 19 comprenant les virus vaccinaux sélectionnés dans le groupe consistant en : ChimerivaxTM DEN-1 et ChimerivaxTM DEN-3 ; ou ChimerivaxTM DEN-2 et ChimerivaxTM DEN-4 ; ou 15 ChimerivaxTM DEN-1 et un ChimerivaxTM DEN-2 ; ou ChimerivaxTM DEN-3 et ChimerivaxTM DEN-4.