FR 2910024 A1 20080620 FR 0611090 A 20061219 1 L'invention concerne un milieu de culture cellulaire synthétique, chimiquement défini, de préférence sans sérum et aprotéique, une méthode de culture de cellules dans ce milieu synthétique, chimiquement défini, et une méthode de production de protéines recombinantes, en particulier d'anticorps monoclonaux, d'interféron gamma ou de virus. Les premières cultures de cellules de vertébrés ont été réalisées en utilisant des fluides biologiques (liquide chorioallantoïque, sérum), puis en utilisant de tels fluides dilués dans une solution tampon (par exemple sels de Earle) additionnée d'hydrolysat de lactalbumine et d'extrait de levure. La culture des cellules, en particulier des cellules de mammifères, se fait maintenant, de manière courante, dans un milieu dit de base ou minimum , additionné de produits biologiques tel que du sérum (en particulier du sérum foetal bovin, SFB) et/ou des facteurs de croissance, et/ou des cytokines. Cette méthodologie a depuis longtemps fait ses preuves. Cependant elle présente des inconvénients : le sérum ajouté n'a pas de composition chimiquement définie et peut varier d'un lot à l'autre, et d'autre part le facteur risque (probabilité de la présence d'un agent pathogène, d'un dérivé toxique,...) n'est pas défini. Avec l'apparition des technologies de production de protéines recombinantes, l'usage de milieux semi-synthétiques s'est développé. Il existe de très nombreuses formulations de milieux semi-synthétiques chimiquement définis. Toutefois, pour la plupart, ces formulations contiennent des protéines recombinantes ajoutées comme par exemple de l'insuline, ou des facteurs de croissance peptidiques. Seules quelques formulations sont vraiment sans protéine. C'est le cas du milieu ABC de Darfler (Darfler FJ, 1990, In Vitro Cell Dev Biol.; 26(8):769-78 ; Darfler FJ, 1991 û brevet américain US n 5045468), du milieu de Sato modifié par Schneider (milieu BDM ; Schneider YJ, 1989, J Immunol Methods.; 116(1):65-77). Ces milieux permettent de cultiver des hybridomes et quelques autres lignées cellulaires. Toutefois, le milieu ABC est très complexe puisqu'il est formé de 83 composants. II est préparé à partir de 3 solutions conservées séparément (A : acide, B : basique, C : concentrée). Il permet le même niveau de production d'anticorps monoclonal par l'hybridome L243, que celui obtenu avec du milieu DMEM + 10% SFB (5 pg/ml). 2910024 2 Le milieu BDM de Schneider est dérivé du milieu de Sato, c'est-à-dire qu'il s'agit d'un mélange de milieux DMEM Iscove, F12 Ham et NCTC 135. Le milieu BDM permet également la culture d'hybridomes. Le niveau de production d'anticorps monoclonal par l'hybridome 7F11 C7 obtenu en milieu BDM est identique à celui 5 obtenu en milieu DMEM + 10% SFB (60 pg/ml). Cependant le milieu BDM peut comporter de l'albumine porteuse d'acide linoléique. La demande de brevet européen EP 1482031 décrit également un milieu défini, sans sérum et aprotéique, particulièrement destiné aux cultures de cellules épithéliales et fibroblastes. Cependant, ce milieu comprend un chélateur du fer et un 10 sel de zinc qui sont supposés remplacer la transferrine et l'héparine, respectivement, permettant ainsi au milieu de faciliter la croissance de cellules mammifères. La culture de longue durée de cellules en milieu synthétique chimiquement défini et aprotéique, reste toutefois très peu développée, alors qu'elle présente de nombreux intérêts : 15 - Les agents pathogènes non détectables par les procédés conventionnels, véhiculés par le sérum sont absents (sécurisation). Cela concerne les agents non conventionnels, mais aussi les agents conventionnels présents à trop faible concentration. Par exemple, si un lot sérum contient 100 mycoplasmes par litre, la contamination ne sera détectable qu'une fois sur dix avec une prise d'essai de 1 20 millilitre. En revanche des cellules régulièrement cultivées dans un milieu additionné de ce sérum seront inévitablement infectées. - La production, en culture de cellules, de certains virus, dont le Rotavirus, est faible en milieu additionné de sérum. Cette production est considérablement augmentée en l'absence de sérum, et en présence de trypsine. Cela implique des 25 lavages des cellules pour retirer les inhibiteurs sériques de la trypsine. Dans ce cas la culture sans sérum fait gagner du temps et permet un moindre coût (moins de milieu, pas de sérum). - Le stress induit dans la cellule par la privation de sérum est supprimé. - La protéine d'intérêt sécrétée dans le surnageant de culture est relativement 30 propre. En particulier, la protéine d'intérêt qui peut être un anticorps monoclonal sécrété par un hybridome ou une protéine recombinante sécrétée par une lignée cellulaire transfectée, se trouve d'emblée dans un environnement peu contaminé par d'autres protéines indésirables. L'utilisation d'un milieu synthétique aprotéique permet donc de faciliter grandement les opérations ultérieures de purification de la 2910024 3 protéine d'intérêt par rapport à un milieu à 10% de sérum qui contient environ 7,5 mg/ml de protéines, ou un milieu semi-synthétique qui contient de l'insuline, de la transferrine, et parfois de l'albumine. En outre, l'utilisation d'un milieu aprotéique rend possible l'analyse, sans 5 marquage radioactif, des protéines sécrétées dans les surnageants de culture (par exemple après infection virale). Cette analyse est autrement pratiquement impossible même si les cellules, initialement cultivées en milieu avec sérum, sont ensuite replacées en milieu aprotéique. En effet, lorsqu'elles ont été préalablement cultivées en présence de sérum, les cellules placées en milieu sans sérum relarguent les 10 protéines sériques qu'elles ont adsorbées ; ces protéines sériques se mélangent aux protéines sécrétées qui ne peuvent alors être distinguées. - Un milieu défini présente une formulation chimiquement définie et constante, contrairement aux formulations comportant du sérum ou des protéines ajoutées pour lesquelles les lots de sérums ou protéines diffèrent l'un de l'autre, ce qui permet 15 d'atteindre une reproductibilité des expériences de laboratoire ou des productions industrielles. - Un moindre coût : l'addition de sérum multiplie par 3 à 8 les coûts de production. Par ailleurs il est nécessaire de tester plusieurs lots de sérum foetal ou de protéines ajoutées avant de faire l'acquisition d'un lot dont les caractéristiques se 20 rapprochent le plus possible de celles du lot précédent. Cette procédure nécessaire est longue, fastidieuse et coûteuse. - La suppression des effets pharmacologiques qui peuvent être induits par des protéines sériques (foetales et bovines) sur les cellules en culture. L'invention propose donc un milieu synthétique chimiquement défini qui 25 permet de cultiver des cellules mammifères ou non mammifères, en particulier des hybridomes, mais également de nombreuses lignées cellulaires non lymphoïdes. L'établissement de la formule chimiquement définie de ce milieu est décrite ci-après, de même que la mise en oeuvre de ce milieu pour la production de virus, de protéines recombinantes, et d'anticorps monoclonaux par des hybridomes. Les 30 résultats obtenus montrent que le milieu selon l'invention procure des performances aussi bonnes ou meilleures que celles obtenues avec les milieux sans sérum, aprotéiques de l'art antérieur. 2910024 4 Milieu défini synthétique et aprotéique L'invention fournit un milieu de culture cellulaire synthétique, chimiquement défini, dont la formulation de base est dépourvue de sérum et de protéine. Le milieu peut toutefois contenir du sérum, des protéines, hormones, facteurs de croissance, si 5 l'utilisateur le juge nécessaire pour l'utilisation envisagée. Par milieu aprotéique on entend un milieu de culture cellulaire qui ne contient pas de protéine au moment de l'ensemencement avec les cellules. Pour autant, une fois la culture des cellules amorcées, le milieu pourra contenir des protéines ; il s'agira alors de protéines qui auront été synthétisées par les cellules en 10 cultures. Par protéine on désigne indifféremment des peptides ou polypeptides, c'est-à-dire des enchaînements d'au moins deux acides aminés liés par une liaison peptidique. Le milieu de culture selon l'invention est un milieu synthétique 15 chimiquement défini , c'est-à-dire que la nature et la concentration des constituants du milieu sont exactement connues. Ainsi l'invention fournit un milieu de culture cellulaire synthétique, chimiquement défini, qui comprend : - un mélange d'acides aminés naturels ; 20 - au moins un sel minéral; - au moins un sucre ; au moins un acide organique ; au moins un nutriment azoté ; et au moins une vitamine et/ou un antioxydant. 25 Ce milieu permet la culture d'un très grand nombre de cellules sans qu'il soit nécessaire d'ajouter de sérum, d'hormone (insuline par exemple), ou de facteurs de croissance. Avantageusement, ce milieu est donc sans sérum et aprotéique. Pour déterminer la composition du milieu en acides aminés, l'Inventeur s'est 30 appuyé sur les données du codon usage de cellules de mammifères (c'est-à-dire la fréquence d'utilisation par la cellule des différents codons) qui ont été transformées en proportions d'acides aminés nécessaires pour la synthèse des protéines. Par ailleurs Franek et Sramkova (1996, Immunol. Lett.; 52(2-3):139-44) avaient démontré que les cellules en culture requièrent des concentrations élevées 2910024 5 en acides aminés hydrophiles. Sur ces bases, un dosage original des 20 acides aminés a été établi pour tenir compte des besoins en acides aminés des cellules en culture pour la synthèse des protéines mais aussi de leurs besoins en acides aminés comme métabolites. 5 Ce dosage peut être modifié quant aux quantités globales d'acides aminés, mais il est préférable de respecter les proportions entre acides aminés. Ainsi, dans le milieu de culture cellulaire selon l'invention, chaque acide aminé est présent dans le mélange des 20 acides aminés naturels selon le pourcentage (en molarité/molarité totale) indiqué dans le tableau 1. 10 Tableau 1 : pourcentage de chaque acide aminé dans le mélange des 20 acides aminés naturels Acides aminés Ala Arg ;Asn Asp Leu ;Lys Met Phe % (molarité / molarité totale du mélange) Mode de réalisation préféré (molarité / molarité totale du mélange) 9,39 0,99 5,54 0,55 5,09 0,51 1,70 0,17 4,13 0,41 16,35 1,63 2,29 0,23 6,20 0,62 4,58 0,46 1,96 0,20 3,71 0,37 5,61 0,56 0,81 0,08 1,59 0,16 9,52 0,95 9,96 1,00 5,68 0,57 0,52 0,05 1,11 0,11 3,74 0,37 Mode de réalisation encore préféré % (molarité / molarité totale du mélange) 9 93 0 50 5, 541 0,28 5,09 0,25 1,70 0,08 4,13 0,21 16,35 0,82 2,29 0,11 6,20 0,31 4 58 0 23 1,96 0,10 3,71 0,19 5,61 0,28 0,81 0,04 1,59 0,08 9,52 0,48 9,96 0,50 5,68 0,28 0,52 0,03 111+006 3,74 0,19 9,93 1,99 5,54 1,11 5,09 1,021 1,70 0,34 4,13 0,83 16,35 3,27 2,29 0,46 620 124 4,58 0,92 1,96 0,39 3,71 0,74 5,61 1,12 0,81 0,16 159 032 9,52 1,90 9,96 1,99 5,68 1,14 Trp 0,52 0,10 Tyr 1,11 0,22 Val 3,74 0,75 : la cystéine est préférentiellement apportée sous forme de cystine dans le milieu. La cystine peut toutefois être remplacée par de la cystéine, qui est alors 15 apportée en quantité double par rapport à la cystine. # : éventuellement absente car instable en solution ; elle peut être ajoutée extemporanément par l'utilisateur à la quantité indiquée. 2910024 6 Il a été trouvé que la quantité globale d'acides aminés dans le milieu pouvait varier jusqu'à un facteur 7,5 tout en conservant des résultats de culture satisfaisants. En effet, si les cellules cultivées sont peu exigeantes (par exemple s'il s'agit de 5 cellules non sécrétrices) la quantité globale d'acides aminés peut être diminuée par rapport à la quantité globale qui serait utilisée pour des cellules plus exigeantes comme des cellules sécrétrices. Ainsi, dans le milieu de culture selon l'invention, la concentration globale en acides aminés peut varier entre 8,16 x10-3M, environ, et 61,22 x10-3M, environ. 10 Les gammes de concentrations possibles, ou les concentrations préférées, pour chacun des acides aminés dans le milieu sont indiquées dans les Tableaux 2-4. La quantité globale d'acides aminés déterminée pour le milieu appelé H-MSM-1 correspond à une quantité convenable pour des cellules peu exigeantes comme par exemple les cellules des lignées BoSk, CV1, ou L929. La quantité globale d'acides 15 aminés déterminée pour le milieu appelé H-MSM-2 correspond à une quantité proche de la quantité optimale pour la plupart des lignées étudiées (tableau 20). Tableau 2 : Concentration des acides aminés dans le milieu de culture H-MSM-1 Concentration dans le milieu H-MSM-1 (10-3 M) 1,345 0,269 0,75 0,150 0,69 0,138 0,23 0,046 0,56 0,112 2,215 0,443 0,31 0,062 0,84 0,168 0,62 0,124 0,265 0,502 0,76 0,11 0,215 1,29 1,35 Acide aminé '(Cys-Cys)* Gln# ;Glu Gly His lle Leu Lys Met Phe Pro Serde préférence de préférence de préférence encore encore 0,265 0,502 0,76 0,11 0,215 1,29 1,35 1,345 0,135 0,75 0,075 0,69 0,069 0,23 0,023 0,56 0,056 2,215 0,222 0,31 0,031 0,84 0,084 0,62 0,062 1,345 0,067 1,345 0,75 0,038 0,75 0 69 0,035 0,69 0,23 0,012 0,23 0 56 0,028 0,56 2215 0,111 2,215 0,31 0,016 0,31 0,84 0,042 0,84 0,62 0,031 0,62 __ 0,053 0,265 0,027 0,265 0'013 0,100 0,502 0,050 0,502 0,025 0,152 0,76 0,076 0,76 0,038 0,022 0,11 0,011 0,11 0,006 0,043 0,215 0,022 0,215 0,011 0,258 1,29 0,129 1,29 0,065 0,270 1,35 0,135 1,35 0 068 2910024 7 encore Thr 0,77 0,154 0,77 _+ 0,077 0,77 0,039 0,77 Trp 0,07 0,014 0,07 0,007 0,07 0,004 0,07 Tyr 0,15 0,030 0,15 0,015 0,15 0,008 0,15 Val 0,507 0,101 0,507 0,051 0, 507 0,025 0,507 Molarité totale 13,549 2,710 ! 13,549 1,355 13,549 0,677 13,549 * : la cystéine est préférentiellement apportée sous forme de cystine dans le milieu. La cystine peut toutefois être remplacée par de la cystéine, qui est alors apportée en quantité double par rapport à la cystine. # : éventuellement absente car instable en solution ; elle peut être ajoutée 5 extemporanément par l'utilisateur à la quantité indiquée. II est possible de faire varier la concentration de l'ensemble des acides aminés d'un facteur compris entre 0,75 et 3,75, environ, par rapport aux concentrations en acides aminés définies pour le milieu H-MSM-1, tout en conservant des résultats de 10 culture satisfaisants (Tableau 3). La concentration de chacun des acides aminés dans le milieu de culture est alors égale aux concentrations montrées dans le Tableau 2, multipliées par un facteur compris entre 0,75 et 3,75 (bornes inclues). Tableau 3 : Concentrations minimales et maximales conseillées pour les 15 acides aminés dans le milieu de culture selon l'invention Concentration dans le milieu (10"3 M) 'Acide aminé Concentration dans le milieu H-MSM-1 (10-3 M) de préférence de préférence de préférence Acide aminé Ala Arg Concentration minimale Concentration maximale 0,81 6,05 0,45 3,38 Asn 0, 41 3,11 Asp 0,14 1,04 (Cys-Cys)* 0,34 2,52 Gln# 1,33 9,97 Glu 0,19 1,40 Gly 0,50 3,78 His 0,37 2,79 Ile 0,16 1,19 Leu 0,30 2,26 Lys 0,46 3,42 Met 0, 07 0,50 Phe 0,13 0,97 Pro 0,77 5,81 Ser 0,81 6,08 2910024 8 Concentration dans le milieu (10"3 M) Concentration minimale Concentration maximale 0, 46 3,47 0,04 0,32 0,09 0,68 0,30 2,28 8.13 60,97 * : la cystéine est préférentiellement apportée sous forme de cystine dans le milieu. La cystine peut toutefois être remplacée par de la cystéine, qui est alors apportée en quantité double par rapport à la cystine. # : éventuellement absente car instable en solution ; elle peut être ajoutée 5 extemporanément par l'utilisateur à la quantité indiquée. Tableau 4 : Concentration des acides aminés dans le milieu de culture H-MSM-2 Concentration dans le milieu H-MSM-2 (10-3 M) Acide aminé de préférence de préférence de préférence .Molarité totale Ala Arg Asn Asp (Cys-Cys)* Gln# ,Glu Leu Lys Met Phe Pro 2,69 0,54 1,5 0,30 1,38 0,28 0,46 0,09 1,12 0,22 4,43 0,89 0,62 0,12 Gly 1,68 0,34 His 1,24 0,25 Ile 053+011 1 04 + 0 20 1,52 0,30 0,22 0,04 0,43 0,09 2,58 0,52 Ser 2,7 0,54 Thr 1,54 0,31 Trp 0,14 0,03 Tyr 0,3 0,06 2,69 0,27 1,5 0,15 1,38 0,14 1,68 0,17 1,24 0,12 0,53 0,05 1,04 0,10 1,52 0,15 0,22 0,02 0,43 0,04 2,58 0,26 2,7 0,27 1,54 0,15 0,14 0,01 0,3 0,03 0,3 0,02 0,3 1,141 0,10 1,14 0,05 1,14 0,62 0,03 1,68 0,08 1,24+0,06 0,53 0,03 1,04 0,05 1,52 0,08 022 001 0,43 0,02 258 013 2,7 0,14 2,7 1,54 0,08 1,54 0,14 0,01 0,14 0,43 2,58 Val 1,14 0,20 Molarité totale 27,10 5,42 27,10 2,71 27,10 1,35 27,10 * : la cystéine est préférentiellement apportée sous forme de cystine dans le 10 milieu. La cystine peut toutefois être remplacée par de la cystéine, qui est alors apportée en quantité double par rapport à la cystine. # : éventuellement absente car instable en solution ; elle peut être ajoutée extemporanément par l'utilisateur à la quantité indiquée. 2910024 9 La glutamine étant très instable en solution, elle peut éventuellement être absente du mélange d'acides aminés présent dans le milieu de culture selon l'invention. Dans ces cas, elle peut être ajoutée dans le milieu par l'utilisateur final, 5 aux concentrations préconisées, avant emploi du milieu. Les sels minéraux qui peuvent être utilisés dans le milieu de culture selon l'invention incluent des sels de sodium, potassium, calcium, magnésium, phosphate, carbonate, et fer, et des éléments trace tels que zinc, cobalt, molybdène, sélénium, 10 iode, bore, manganèse, étain et lanthane, qui peuvent être apportés sous forme de sels également. De préférence, les sels minéraux contenus dans le milieu comprennent sodium, potassium, calcium, magnésium, phosphate, carbonate, fer, zinc, cobalt, molybdène, sélénium, iode, bore, manganèse, étain et lanthane. 15 De préférence encore, le milieu est dépourvu de cuivre puisque celui-ci peut être toxique pour certaines cellules à des concentrations supérieures à 10"8M. Avantageusement, le fer peut être apporté sous forme de phosphate de fer (Fe4(P2O7)3) qui est plus stable que le sulfate ferreux utilisé dans les milieux de culture de l'art antérieur. Cette forme est en outre préférée à la forme nitrate qui peut 20 être à l'origine de la formation de radicaux libre. Par ailleurs la forme citrate ferrique très prisée par certains auteurs (Schneider YJ., 1989, J Immunol Methods.; 116(1):65-77) peut dans certaines conditions être difficilement soluble. Le bore, sous la forme de borate ou d'acide borique, est un microélément décrit pour les milieux de culture de bactéries et de levures mais qui n'a été que 25 récemment décrit dans les milieux de culture pour cellules de vertébrés (demande de brevet européen EP 1482031). II est susceptible d'améliorer légèrement la croissance des cellules de mammifères, au même titre que le lanthane sous la forme de chlorure à la concentration de 10"9M (Haase et al., 2001, Biot Chem., 382 (8):1227-34), et le cobalt à la concentration de 10 7 5M. 30 La nature des sels minéraux qui peuvent être contenus dans le milieu de culture selon l'invention ainsi que les gammes de concentrations possibles ou préférées pour chacun de ces sels sont indiquées dans le Tableau 5. 2910024 10 Tableau 5 : Concentrations en sels minéraux dans le milieu de culture selon l'invention Sels minéraux Gamme de concentrations Mode de réalisation NaCl 11,5-115 x10-3M 115 x10-3M KCI 0,537-5,37 x10-M 5,37 x1 0"3M CaCl2,2H2O 0,18-1,8 x10-3M 1,8 x10-3M MgSO4.7H2O 0,18-1,8 x10-3M 1,8 x10-3M NaH2PO4.H2O 0,2-2 x1 0"3M 2 x10-3M NaHCO3 2,62-26,2 x1 0"3M 26,2 x10-3M Fe4O21 P6 (Fe4(P207)3) 0,1-1 x10-5'5M 10-5'5M *Zn SO4.7H2O 0,1-1 x10-6.5M 10-65M *CoCl2.6H2O 0,1-1 x10-7'5M 10"7,bM *MoO4Na2.H2O 0,1-1 x10-8M 10-8M *SeO3Na2 0,1-1 x10-8M 10"8M *IK 0,1-1 x10-8M 10"8M BO3H3 0,1-1 x1 0"8M 10-8M MnCl2.4H2O 0,1-1 x1 0"9M 10"9M *SnCl2.2H2O 0,1-1 x10-9M 10"9M *LaCI3.7H2O 0,1-1 x10-9M 10-9M Le milieu de culture selon l'invention contient en outre au moins un sucre, en 5 particulier glucose, fructose, galactose, mannose et inositol, au moins un acide organique, par exemple sodium pyruvate et sodium butyrate, et au moins un composé azoté, tel que choline, éthanolamine et éventuellement alaninol. Les quantités de sucres, acides organiques et éléments azotés utilisées n'ont pas été optimisées pour une lignée cellulaire donnée, mais correspondent à des 10 conditions adaptées au plus grand nombre de lignées cellulaires. La quantité en sucres fournisseurs d'énergie (glucose, fructose) dans le milieu peut être modulée de manière à fournir un milieu plus ou moins riche en fonction du type de cellule à cultiver et de ses exigences énergétiques. Le milieu de culture peut en outre contenir de l'alaninol qui s'est avéré 15 présenter une effet trophique important pour certaines cellules telles que les cellules CV1. Des travaux précédents avaient mis en évidence l'effet trophique de l'ethanolamine (un autre aminoalcool, correspondant à la glycine) sur les cellules d'hybridomes (Murakami et al., 1982, Proc Natl Acad Sci U S A. 79(4):1158-62). L'alanine ayant été décrit comme possédant des propriétés voisines de celles de la 20 glycine en culture cellulaire (Franek et Sramkova, 1996, Immunol. Lett.; 52(2-3):139-44), l'Inventeur a cherché à caractériser les propriétés de l'alaninol, l'alcoolamine correspondant à l'alanine. Les propriétés trophiques de l'alaninol ont ainsi pu être 2910024 11 mises en évidence en se plaçant dans des conditions de culture pauvre en alanine, l'effet trophique de l'alaninol étant fortement masqué en milieu enrichi en alanine. La nature des sucres, acides organiques et éléments azotés qui peuvent être contenus dans le milieu de culture selon l'invention ainsi que les gammes de 5 concentrations possibles ou préférées pour chacun de ces constituants sont indiquées dans le Tableau 6. Tableau 6 : Concentrations en sucres, acides organiques et éléments azotés dans le milieu de culture selon l'invention Sucres Gamme de Mode de Autre mode de concentrations réalisation réalisation Glucose 2,5-10 x10'3M 5 x10-3M 10 x10"3M Fructose 0,79-3,16 x1 03M 1,58 x10-3M 3,16 x10-3M Galactose 10"3'5-10"2,5M 10"3M 10-3M Mannose 10"3'5-10-2 5M 10"3M 10-3M Inositol o-4.5-1 0 3'5M 10"4M 10-4M Acides organiques Sodium Pyruvate 10-3'5-10"2M 10-3M 10-3M Sodium Butyrate 10-6-10"5M 10-5,5M 10-5'5M Composés azotés Choline HCI 10-5-10'4M 10-4M 10"4M Ethanolamine 10-5'5-10 4'5M 10-4'5M 10 4,5M Eventuellement Alaninol 10--10-4M 10-5'5M 10"5.5M 10 Les vitamines et/ou antioxydants qui peuvent être ajoutés dans le milieu de culture incluent par exemple biotine, D-Ca-pantothénate, nicotinamide, pyridoxine, thiamine, acide thioctique, acide folique et éventuellement son précurseur l'acide P-amino benzoïque, rétinylacétate, riboflavine, éthyl linoléate, vitamine B12, et 15 éventuellement acide ascorbique. L'acide ascorbique qui est très instable en solution peut éventuellement être absent du milieu, auquel cas il sera ajouté par l'utilisateur final juste avant d'employer le milieu selon l'invention. II a été trouvé que la biotine présente un effet important sur l'efficacité de clonage des cellules en culture, et que cet effet est d'autant plus marqué que la 20 biotine est présente dans le milieu à une concentration environ 100 fois supérieure à celle du la vitamine B12 et environ 10 fois supérieure à celle du rétinylacétate. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, le milieu de culture comprend de la biotine, de la vitamine B12 et du rétinylacétate, le ratio des concentrations biotine : 2910024 12 vitamine 12 étant compris entre 80 :1 et 120 :1, de préférence entre 90 :1 et 110 :1, et le ratio des concentrations biotine : rétinylacétate étant compris entre 8 :1 et 12 :1, de préférence entre 9 :1 et 11 :1. Selon un mode de réalisation préféré, le milieu contient de la biotine 10"5M, de la vitamine B12 10"7M, et du rétinylacétate 10"6M. 5 Enfin l'acide linoléique est avantageusement présent dans le milieu en tant que facteur de croissance pour les hybridomes. La nature des vitamines et antioxydants qui peuvent être contenus dans le milieu de culture selon l'invention ainsi que les gammes de concentrations possibles ou préférées pour chacun de ces constituants sont indiquées dans le Tableau 7. 10 Tableau 7 : Concentrations en vitamines et antioxydants dans le milieu de culture selon l'invention Gamme de Mode de réalisation concentrations préféré Biotine 10"6-10"4M 10"5M D-Ca-pantothenate 10"6-10"4M 10-5M Nicotinamide 10"6-10"4M 10-5M Pyridoxine 10-6-10-4M 10-5M Thiamine 10"6-10"4M 10-5M Acide thioctique 10"b-10-4M 10"5M Acide folique 10"~5-10"5 5M 10-5.5M Retinylacétate 10 -10" M 10-6M Eventuellement Ac. P.-amino 10"'-10"5M 10-6M benzoique Riboflavine 10-'-10-6M 10"6~5M Ethyl linoléate 10"'-10"6M 10-"5M Vitamine B12 10"6-10"6M 10-'M Eventuellement Acide 10-6-10"3M 104M LAscorbique Le Tableau 8 récapitule la concentration des différents constituants 15 susceptibles d'être présents dans le milieu de culture selon l'invention (H-MSM) et dans deux modes de réalisations particuliers (H-MSM1 et H-MSM2). Tableau 8 : Concentrations en acides aminés naturels, sels minéraux, sucres, acides organiques, nutriments azotés, vitamines et antioxydants H-MSM H-MSM-1 H-MSM-2 Sels minéraux NaCl 11,5-115x10"3M 115x10"3M 115x1 0"3M KCI 0,537-5,37 xl0"3M 5,37x1 0"3M 5,37x10-3M 2910024 13 H-MSM H-MSM-1 H-MSM-2 CaCl2,2H2O 018-1,8 x10-3M 1,8 x10-3M 1,8 x10-3M MgSO4.7H20 0,18-1,8 x10-3M 1,8x10"3M 1,8x10-3M NaH2PO4.H20 0,2-2 x10-3M 2x1 0"3M 2x10-3M NaHCO3 2,62-26,2 x10-3M 26,2x10-3M 26,2x10"3M Fe4O21P6 (0,1-1 x10-5'5M 10-5.5M 10-5'5M (Fe4(P207)3) *Zn SO4.7H20 0,1-1 x10"5'5M 10"~5M 10-b'5M *CoCl2.6H2O 0,1-1 x1 0"7'5M 10"7'5M 10"7'5M *Mo04Na2. H2O 0,1-1 x1 0"8M 10-8M 10"8M *SeO3Na2 0,1-1 x1 0"8M 10"8M 10"8M *IK 0,1-1 x1 0"8M 10-8M 10"8M B03H3 0,1-1 x10-8M 10"8M 10"8M MnCl2.4H20 0,1-1 x10-9M 10"9M 10-9M *SnCl2.2H2O 0,1-1 x10-9M 10-9M 1 x10-9M *LaCI3.7H2O 0,1-1 x10-9M 10"9M 1 x1 0"9M Sucres Glucose 2,5-10 x10-3M 5 x1 0"3M 10 x10-3M Fructose 0,79-3,16 x10-3M 1,58 x10-3M 3,16 x1 0"3M Galactose 10"3'5-10"2'5M 10"3M 10"3M Mannose 10"3'5-10"2'5M 10"3M 10"3M Inositol 10"4'5-10 3'5M 10"4M 10"4M Acides organiques Sodium Pyruvate 10"3,5-10"2M 10"3M 10"3M Sodium Butyrate 10-6-10-5M 10"5.5M 10-5'5M Composés azotés Choline HCI 10"5-10"4M 10-4M 10-4M Ethanolamine 10-5'5-10"4'5M 10"4'5M 10"4'5M Eventuellement Alaninol 10"b-10-4M 10"5.5M 10"5'5M Acides aminés Alanine 1,01-5,04x1 0"3M 1,345 x1 0"3M 2,69 x10-3M Arginine 0,56-2,81 x10-3M 0,75 x10-3M 1,50 x10-3M Asparagine 0,52-2,59 x10-3M 0,69 x10-3M 1,38 x10-3M Acide Aspartique 0,17-0,86 x1 0"3M 0,23 x10-3M 0,46 x1 0"3M Cystine 0,42-2,10 x1 0"3M 0,56 x10-3M 1,12 x10-3M Acide Glutamique 0,23-1,16 x10-3M 0,31 x10-3M 0,62 x10-3M Eventuellement Glutamine 1,66-8,31 x1 0"3M 2,215 x1 0"3M 4,43 x10-3M Glycine 0,63-3,15 x1 0"3M 0, 84 x10-3M 1,68 x10-3M Histidine 0,47-2,33 x10-3M 0,62 x10-3M 1,24 x10-3M Isoleucine 0,20-0,99 x10-3M 0,265 x10-3M 0,53 x10-3M Leucine 0,38-1,88 x1 0"3M 0,502 x1 0"3M 1,04 x1 0"3M Lysine 0,57-2,85 x1 0"3M 0,76 x10-3M 1,52 x10-3M Méthionine 0,08-0,41 x10-3M 0,11 x1 0"3M 0,22 x10-3M Phénylalanine 0,16-0,81 x10-3M 0,215 x10-3M 0,43 x10-3M Proline 0,97-4,84 x1 0"3M 1,29 x1 0"3M 2,58 x1 0"3M 2910024 14 H-MSM H-MSM-1 H-MSM-2 Sérine 1,01-5,06 x10-3M 1,35 x10-3M 2,70 x1 0"3M Thréonine 0,58-2,89 x1 0"3M 0,77 x10-3M 1,54 x10-3M Tryptophane 0,05-0,26 x10-3M 0,07 x10-3M 0,14 x1 0"3M Tyrosine 0,11-0,56 x10-3M 0,15 x10-3M 0,30 x10-3M Valine 0,38-1,90 x10-3M 0,507 x10-3M 1,14 x10-3M total Vitamines Biotine 10"6-10-4M 10-5M 10"5M D-Ca-pantothenate 10"6-10-4M 10"5M 10"5M N icoti nam ide 10"6-10"4M 10"5M 10"5M Pyridoxine 10"6-10"4M 10-5M 10"5M Thiamine 10-6-10"4M 10-5M 10"5MAcide thioctique 10-6-10-4M 10-5M 10"5M Acide folique 10-b'5-10 5'5M 10"5'5M 10"5'5M Retinylacétate 10"b'5-10 5'5M 10-6M 10-6M Eventuellement Ac. P.- 10"'-10"5M 10-6M 10"6M amino benzoique Riboflavine 10"7-10-6M 10-6'5M 10-"m Ethyl linoléate 10"7-10"6M 10"6'5M 10"6'5M Vitamine B12 10"6-10-bM 10-'M 10"7M Eventuellement Acide 10"-10"3M 10"4M 10"4M Ascorbique De préférence, le milieu est sans sérum et/ou aprotéique. Le milieu H-MSM est alors constitué uniquement de 63 molécules (sels minéraux, acides aminés, vitamines, sucres et autres nutriments) chimiquement définies. 30 de ces 63 5 constituants composant le EMEM, le milieu H-MSM décrit dans le Tableau 8 peut facilement être dérivé du EMEM. II contient de la vitamine C et de la glutamine, qui sont instables en solution. Ces deux composants sont préférentiellement conservés séparément, congelés, et ajoutés au milieu au moment de l'emploi, comme c'est le cas pour la glutamine dans 10 tous les milieux destinés à la culture de cellules de vertébrés. Le milieu peut en outre contenir du rouge de phénol en tant qu'indicateur de pH. Le rouge de phénol est typiquement présent dans le milieu à une concentration 0,026 x10-3M. Le milieu selon l'invention peut être formulé à la concentration 1X (c'est-à-dire 15 que tous les constituants du milieu sont à la concentration de travail) ou formulé à des concentrations supérieures, par exemple 5X (c'est-à-dire que la concentration 2910024 15 des constituants du milieu est cinq fois supérieure à celle dans la formulation 1X) ou 10X (concentration dix fois supérieure à celle dans la formulation 1X), le milieu étant le cas échéant dilué avant emploi par l'utilisateur de manière à ramener le milieu à une formulation 1X. 5 Le milieu permet la culture de cellules de vertébrés (mammifères ou non mammifères), ou non vertébrés, comme par exemple des levures, des bactéries ou des cellules d'insecte. Les cellules peuvent être des lignées cellulaires, ou des cellules primaires. II peut s'agir de cellules épithéliales, endothéliales, de fibroblastes, de cellules d'hybridome, de cellules hématopoïétiques, en particulier des 10 lymphocytes, des macrophages/monocytes, des cellules dendritiques, d'hépatocytes ou de chondrocytes. Le milieu de culture peut être utilisé pour cultiver des cellules adhérentes, qui forment une monocouche, ou des cellules en suspension. En particulier, il a été observé que les cellules adhérentes ne meurent pas une fois arrivées à confluence, 15 ce qui constitue un avantage du milieu selon l'invention. Le milieu selon l'invention est extrêmement souple d'utilisation. En effet, aucune adaptation des cellules, préalable à la croissance dans le milieu synthétique, n'est nécessaire pour les cultiver de manière indéfinie dans les conditions expérimentales décrites. D'autre part, les cellules habituellement cultivées en 20 présence de sérum peuvent supporter jusqu'à 4 passages en milieu sans hormones et sans protéines (ratio de repiquage 1/4, soit un facteur de dilution 1/44 = 1/256), sans que leurs caractéristiques de croissance ne soient clairement modifiées. Ce n'est qu'au-delà de ce facteur de dilution que les effets dus aux carences provoquées par l'absence de sérum peuvent éventuellement devenir sensibles. 25 Pour la plupart des cellules, la croissance dans le milieu selon l'invention est assez peu différente de celle que l'on peut observer en milieu EMEM additionné de 3% de sérum foetal bovin. Dans la plupart des cas, le temps moyen de doublement est augmenté d'un facteur 1,1 à 1,2 par rapport au temps de doublement observé avec une culture en milieu EMEM avec sérum. 30 Il a été observé que les cellules HEK293, HT29 et CEV1, forment des tapis cellulaires ( cell layers ) de façon transitoire. Ces cellules, lorsqu'elles arrivent à confluence, marquent des propriétés d'adhésion pour elles mêmes plus fortes que pour le support. Elles s'agrègent alors en amas. Ce phénomène peut être dû, soit à l'inadéquation du support, soit à un défaut de synthèse de matrice extracellulaire par 2910024 16 ces cellules. Ce phénomène semble toutefois être sans grande importance, car il n'affecterait pas la production de protéine recombinante par des cellules CHO transfectées (Houdebine LM, communication personnelle). Le Tableau 9 indique les compositions globales des principaux milieux 5 commercialisés couramment comparées à celle du milieu H-MSM. La concentration de chacun des 20 acides aminés, du glucose et du fructose du milieu H-MSM-2 est double de celle du milieu H-MSM-1, la composition quant aux autres constituants étant inchangée. 10 Tableau 9 : Eléments de comparaison des principaux milieux cités Milieu 199 EMEM RPMI Ham D-MEM Alpha- ABC H-MSM 1640 F12 MEM (Darfler) Nombre de 62 30 39 47 33 42 81 63 composants Acides 758 851 970 590 1581 1136 1427 18208 aminés 3 640b totaux (mg/L) Additifs 10%SFB 10%SFB 10%SFB 10%SFB 10%SFB - - 7500mg/l 7500mg/l 7500mg/l 7500mg/l 7500mg/l Protides 8257,50 8351 8470 9081 8636 1427 1820a mg/L /milieu 3640b complet a : H-MSM-1 b : H-MSM-2 Le milieu de culture synthétique chimiquement défini peut également être fourni sous forme de poudre, le milieu étant alors reconstitué sous forme liquide par 15 l'utilisateur en ajoutant un volume adéquat d'eau distillée filtrée au mélange de constituants pulvérulents. Le Tableau 10 illustre les quantités de constituants qui peuvent être utilisées pour obtenir les deux modes de réalisations H-MSM1 et H-MSM-2 sous forme de poudre, et permettant de reconstituer 1 litre de milieu liquide. 20 Tableau 10 : Contenu des milieux H-MSM1 et H-MSM-2 sous forme de poudre permettant de reconstituer 1 litre de milieu liquide H-MSM-1 H-MSM-2 M* Molarité Quantité Molarité Quantité pour 1 litre pour 1 litre (mg/I) (mg/I) Sels minéraux NaCl 58,44 115x10-3M 6720 115x10-3M 6720 2910024 17 H-MSM-1 H-MSM-2 M* Molarité Quantité Molarité Quantité pour 1 litre pour 1 litre (mg/I) (mg/I) KCI 74,5 5,37x10"3M 400 5,37x1 0"3M 400 CaCl2,2H2O 147 1,8 x10-3M 265 1,8 x10-3M 265 _ MgSO4.7H2O 246,5 1,8x10-3M 443,7 1,8x10"3M 443,7 NaH2PO4.H2O 138 2x10"3M 276 2x1 0"3M 276 NaHCO3 84 26,2x10-3M 2200 26,2x10-3M 2200 Fe4O21P6 (Fe4(P2O7)3) 745 10-5'5M 2,36 10"5'5M 2,36 *Zn SO4.7H2O 287,5 10"6'5M 0,090 10"6'5M 0,090 *CoCl2.6H2O 238 10"7'5M 0,00752 10-7'5M 0,00752 *MoO4Na2.H2O 242 10"8M 0,00242 10-8M 0,00242 *SeO3Na2 173 10-8M 0,00173 10"8M 0,00173 *1K 166 10"8M 0,00166 10"8M 0,00166 BO3H3 61,83 10"8M 0,00062 10"8M 0,00062 MnCl2.4H2O 198 10-9M 0,000198 10"9M 0,000198 *SnCl2.2H2O 225,5 10-9M 0,000225 1 x10"9M 0,000225 *LaCI3.7H2O 371 10"9M 0,000371 1 x10-9M 0,000371 Sucres Glucose 180 5 x10-3M 900 10 x10-3M 1800 Fructose 180 1,58 x1 0"3M 284 _ 3,16 x10-3M 569 Galactose 180 10"3M 180 _ 10-3M 180 Mannose 180 10-3M 180 10-3M 180 Inositol 180 10-4M 18 10-4M 18 Acides organiques _ Sodium Pyruvate 110 10"3M 110 10-3M 110 Sodium Butyrate 110 10"5'5M 0,347 10"5'5M 0,347 Composés azotés Choline HCI 139 10-4M 13,9 10-4M 13,9 Ethanolamine 61 10"4'5M 1,93 10"4'5M 1,93 Eventuellement 75 10-5'5M 0,24 10-5'5M 0,24 Alaninol Acides aminés Alanine 89 1,345 x10-3M 119,7 2,69 x10-3M 239,4 Arginine 174 0,75 x10-3M 130,5 1,50 x10-3M 261 Asparagine 132 _ 91,1 1,38 x10-3M_ 182,2 0,69 x10-3M Acide Aspartique 133 0,23 x1 0"3M 30,1 0,46 x10"3M 60,2 Cystine 240 0,56 x1 0"3M 147,6 1,12 x10-3M 295,2 Acide Glutamique 147 _ 0,31 x10-3M 45 0,62 x10-3M 90 Eventuellement 146 2,215 x10-3M 323,4 4,43 x10-3M 646,8 Glutamine _ _Glycine 77 0,84 x1 0"3M 64,7 1,68 x10-3M 129,4 Histidine 155 C),62 x103M 96,1 1,24 x10-3M 192,2 Isoleucine 131 0,265 x10-3M 34,7 0,53 x10-3M 69,4 2910024 18 H-MSM-1 H-MSM-2 M* Molarité Quantité Molarité Quantité pour 1 litre pour 1 litre (mg/I) (mg/I) Leucine 131 0,502 x10-3M 65,8 1,04 x10- 3M 131,6 Lysine 146 0,76 x10"3M 111 1,52 x10-3M 222 Méthionine 153 0,11 x10-3M 16,8 0,22 x10-3M 33,6 Phénylalanine 165 0,215 x10-3M 35,5 0,43 x10-3M 71 Proline 115 1,29 x10-3M 148,3 2,58 x10-3M 296,6 Sérine 105 1,35 x10-3M 141,7 2,70 x10-3M 283,4 Thréonine 119 0,77 x1 0"3M 91,6 1,54 x103M 183,2 Tryptophane 204 0,07 x1 0"3M 14,3 0,14 x10-3M 28,6 Tyrosine 182 0, 15 x10-3M 27,3 0,30 x10-3M 54,6 Valine 117 0,507 x10-3M 59,3 1,14 x10-3M 118,6 Vitamines Biotine 244 10"5M 2,44 10"5M 2,44 D-Ca-pantothenate 476 10"5M 4,76 10-5M 4,76 Nicotinamide 122 10-5M 1,22 10"5M 1,22 Pyridoxine 169 10"5M 1,69 10-5M 1,69 Thiamine 337 10"5M 3,37 10"5M 3,37 Acide thioctique 206 10"5M 2,06 10"5M 2,06 Acide folique 477 10"5,5M 1,5 10"5, 5M 1,5 Retinylacétate 328 10-6M 0,328 10- I6 0,328 Eventuellement Ac. 159 10-6M 0,16 10- 0,16 P.-amino benzoique Riboflavine 376 10"6,5M 0,12 10"6'5M 0,12 Ethyl linoléate 308,5 10"6.5M 0,975 10"6.5M 0,975 Vitamine B12 1355 10-7M 0,135 10-TM 0,135 Eventuellement Acide 176 10"4M 17,6 10"4M 17,6 Ascorbique M* : poids moléculaire. Applications 5 L'invention porte également sur une méthode de multiplication cellulaire comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact le milieu de culture selon l'invention avec au moins une cellule; et b) cultiver ladite au moins une cellule pendant un temps et dans des 10 conditions permettant la multiplication de ladite cellule. 2910024 19 Les cellules ainsi cultivées peuvent être adhérentes ou en suspension. Les cellules multipliées peuvent être des cellules exprimant une protéine, en particulier une protéine recombinante, ou produisant un virus. L'invention propose donc en outre une méthode de production d'une protéine 5 d'intérêt comprenant les étapes consistants à : a) mettre en contact le milieu de culture selon l'invention avec au moins une cellule exprimant une protéine d'intérêt ; b) cultiver ladite au moins une cellule pendant un temps et dans des conditions permettant l'expression de la protéine d'intérêt ; et 10 c) éventuellement récolter la protéine d'intérêt exprimée. La cellule exprimant une protéine d'intérêt peut par exemple être une cellule transformée avec un acide nucléique comprenant une séquence codant une protéine d'intérêt qui est une protéine recombinante. Selon un mode particulier de réalisation, ladite cellule est un hybridome et la 15 protéine d'intérêt est un anticorps monoclonal. La protéine d'intérêt peut être récoltée en recueillant le surnageant de culture si la protéine est sécrétée, ou bien en recueillant les cellules en culture afin de les lyser et récolter la protéine dans le lysat cellulaire. N'importe quelle méthodologie connue de l'homme du métier peut être employée. 20 Le milieu selon l'invention a l'avantage de permettre la préparation de protéines d'intérêt, telles que des anticorps monoclonaux, dépourvues de contaminants protéiques, en particulier de contaminants d'origine sérique. La protéine d'intérêt peut alors être aisément purifiée. Toutefois, l'addition de facteurs susceptibles d'augmenter les rendements en protéines recombinantes (par exemple 25 un facteur de croissance, une hormone, tels que TGF, insuline, IRTKA, IGF, ...) pourra être envisagée. L'invention propose en outre une méthode de production d'un virus comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact le milieu de culture selon l'invention avec au moins une 30 cellule infectée avec un virus ; b) cultiver ladite au moins une cellule pendant un temps et dans des conditions permettant la réalisation du cycle réplicatif dudit virus ; et c) éventuellement récolter les virus produits. 2910024 20 Le virus peut être n'importe quel virus comme par exemple, un rotavirus, le virus de la maladie d'Aujesky, le virus respiratoire syncitial (RSV), un virus influenza, un herpes virus, etc. Le milieu selon l'invention permet d'obtenir des rendements de production de 5 virus équivalents à ceux obtenus en milieu avec sérum. En outre, dans le cas du rotavirus produit en milieu H-MSM, une meilleure morphogenèse du virus a été observée, en particulier en ce qui concerne les spicules qui apparaissent complets en observation en microscopie électronique. Les productions d'anticorps monoclonaux sont équivalentes en milieux H- 10 MSM-2 (c'est-à-dire le milieu avec des teneurs élevées en acides aminés, glucose et fructose) et en milieu RPMI1640 + 10% SFB. Mais l'avantage du milieu selon l'invention est d'obtenir une protéine très propre sans contamination par des protéines sériques. Une meilleure production a été observée avec le milieu H-MSM-1 (teneurs moins élevées en acides aminés, glucose et fructose), sans doute parce 15 que la vitesse de croissance des hybridomes était alors plus lente. L'utilisation du milieu de culture selon l'invention est donc une alternative intéressante pour la culture des hybridomes : les anticorps monoclonaux peuvent être ainsi produits à moindre coût (pas d'achat de sérum foetal ou de facteurs de croissance) et déjà prépurifiés (pas de protéine ajoutée). 20 L'autre méthode de production d'anticorps monoclonaux dite in vivo , c'est-à-dire en liquide d'ascite permet de produire des solutions très concentrées de ces anticorps. Mais, cette méthode in vivo a l'inconvénient d'induire de la souffrance chez l'animal d'expérience. De ce fait la production d'anticorps monoclonaux est soumise à de très fortes restrictions en France (règlement d'éthique en expérimentation 25 animale), et est même interdite dans de nombreux pays dont des pays de l'Europe du nord. Par ailleurs les liquides d'ascite contiennent des protéines sériques, dont des immunoglobulines. II est impossible de séparer les immunoglobulines monoclonales porteuse de l'activité anticorps d'intérêt des immunoglobulines de l'animal hôte avec lesquelles elles sont mélangées. 30 L'utilisation du milieu selon l'invention permet de contourner ces difficultés. Quant aux hybridomes qui ne sont pas aptes à croître spontanément en milieu H-MSM, ils peuvent être mis en production dans ce milieu H-MSM additionné du facteur de croissance (IL-6, IL-4, etc) pour autant que le(s) facteur(s) de croissance critique(s) soi(en)t connu(s) pour le clone considéré. 2910024 21 Le niveau de protéine recombinante produite par des cellules RK13 sécrétant de l'interféron gamma de porc a été trouvé légèrement meilleur en milieu H-MSM-2 qu'en milieu EMEM + 10% SFB. Là encore, la protéine produite avec le milieu selon l'invention est bien plus propre. 5 Le milieu selon l'invention peut également être utilisé pour la conservation des cellules dans l'azote liquide, en particulier dans un mélange avec du DMSO, par exemple dans du milieu contenant du DMSO à 5,0% +1- 0,25% (volume/volume), soit 5,5% +/- 0,28% en poids/volume, soit DMSO à 0,704 M +/- 0,035M. Le mélange résultant a une osmolarité voisine de 1000 mOsM (milliOsMole). 10 Les Figures et Exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. FIGURES 15 La Figure 1 montre les résultats de croissance d'hybridomes F17 en milieu RPMI1640 + 10% SFB ou en milieu H-MSM-2 seul. La Figure 2 montre les résultats de croissance d'hybridomes G16 en milieu RPMI1640 + 10% SFB ou en milieu H-MSM-2 seul. La Figure 3 montre une analyse en gel de polyacrylamide 4-20% (SDS): A: 20 Marqueurs de taille, B: 2pl SFB, C: 1 pl d'ascite G16, D: 1 pl d'ascite F17, E: -, F: 20 pl de surnageant brut de culture d'hybridome G16 cultivé en RPMI+10% SFB, G: -, H: 20 pl de surnageant brut de culture d'hybridome F17 cultivé en RPMI+ 10% SFB, I: -, J: 500 ng d'IgG Souris, K: 20 pl de surnageant brut de culture d'hybridome G16 cultivé en H-MSM, L: 20 pl de surnageant brut de culture d'hybridome F17 cultivé en 25 H-MSM. La Figure 4 représente l'activité neutralisante des surnageants de culture des hybridomes G16 et F17 après 7 jours de culture en milieu RPMI 1640 + 10% SFB ou en H-MSM-2 seul. La Figure 5 montre les résultats de quantification par test ELISA de l'interféron 30 gamma porcin dans les surnageants de culture des cellules Al2RK13 après 4, 7, 10, et 14 jours de culture en milieu EMEM + 10% SFB, H-MSM-2 seul, et H-MSM-2 + 10% SFB. 2910024 22 La Figure 6 montre l'activité antivirale des surnageants de culture des cellules Al2RK13 après 4, 7, 10, et 14 jours de culture en milieu EMEM + 10% SFB, ou en milieu H-MSM-2, ou en milieu H-MSM-2 + 10% SFB 5 EXEMPLES Exemple 1 : Détermination de la composition du milieu H-MSM Une lignée cellulaire de peau de bovin (cellules BoSk , pour Bovine Skin, L'Haridon, R non publié) établie dans les années 1978/1979 possède la propriété originale de pouvoir se propager en milieux standards aprotéiques (par exemple le 10 RPMI 1640, ou l'EMEM alpha) additionnés seulement de sels de fer. Ce résultat a conduit l'Inventeur à rechercher si d'autres cellules couramment utilisées au laboratoire, notamment CV1 dont dérivent les cellules COS7, PK15, MA 104, RK13, MDBK, avaient des propriétés analogues. Les résultats furent un peu ambigus. La mise en oeuvre d'une formulation de Sato (Mélange DMEM + F12) ou d'autres 15 mélanges incluant le milieu 199 ne conduisaient pas non plus à des croissances cellulaires satisfaisantes. Par ailleurs les grandes distorsions qui existent entre les milieux tels que le EMEM, DMEM, 199, ou RPMI 1640, quant à la concentration en vitamines ont conduit à déterminer l'effet dose/réponse des principales vitamines et antioxygène (vitamines A, H, B1, B2, B6, B7, B12, Bx, C, M, acide thioctique). 20 La formulation du milieu selon l'invention a été établie en mesurant l'effet des différents composants du milieu de culture sur l'efficacité clonale d'un certain nombre de lignées cellulaires. L'efficacité clonale est mesurée par le ratio nombre de colonies/nombre de cellules ensemencées au bout d'un temps donné de culture. 25 • Détermination de la formulation en vitamines et antioxydants Les concentrations consensus des vitamines et antioxydants ont été déterminées expérimentalement. Les concentrations retenues sont les concentrations minimales trophiques non toxiques. Il a ainsi été déterminé que la biotine (vit.H), le D-Ca-pantothenate (vit. B7), le 30 nicotinamide (vit. B3), la pyridoxine (vit.B6), la thiamine (vit B1), et l'acide thioctique ont un effet trophique optimal pour toutes les cellules testées à la concentration 10-5M. L'acide ascorbique présente des propriétés trophiques optimales à la concentration 10-4M. Son effet est complémentaire de celui de l'acide thioctique. En 2910024 23 revanche son effet n'est pas complémentaire de celui de l'alpha tocophérol (vit.E), raison pour laquelle l'alpha tocophérol n'a pas été retenu dans la formulation du milieu selon l'invention. En l'absence de protéine, l'acide folique (vit.M) est toxique à la concentration 5 10-5M et la riboflavine (vit.B2) est toxique à la concentration 10"6M. Les concentrations maximales 10-5.5M et de 10"6.5M, respectivement, ont donc été choisies pour ces deux vitamines. Pour de nombreuses lignées cellulaires la concentration maximale en acide linoléique est 10"6.5M. 10 La cyanocobalamine (vit.B12), et le rétinol acétate (vit A) présentent des propriétés trophiques optimales à la concentration 10"7M et 10-6M, respectivement. Les résultats obtenus par l'Inventeur l'ont ainsi conduit à définir la composition optimale en vitamines et antioxydants définie dans le Tableau 11 ci-dessous. 15 Tableau 11 : concentrations optimales en vitamines et antioxydants Vitamine ou antioxydant Concentration optimale Biotine (vitamine H) 10-5M D-Ca-pantothénate (vitamine B7) 10"5M Nicotinamide (vitamine B3) 10"5M Pyridoxine (vitamine B6) 10-5M Thiamine (vitamine B1) 10"5M Acide thioctique 10"5M Acide folique (vitamine M) 10-5'5M Retinylacétate (vitamine A) 10-6M Eventuellement Ac. P.-amino benzoïque (vitamine Bx) 10"6M Riboflavine (vitamine B2) 10-5'5M Ethyl linoléate 10-6'5M cyanocobalamine (vitamine B12) 10 7M Acide Ascorbique 10"4M L'acide P.-amino benzoique, qui est un précurseur de l'acide folique, peut éventuellement être présent dans la formulation à une concentration optimale de 10"6M. 20 La formulation ainsi définie contient une teneur en biotine particulièrement élevée par rapport aux milieux de l'art antérieur où elle est généralement présente à une concentration de 10-7M. En effet, compte tenu du test utilisé pour déterminer la composition du milieu de culture, il a été remarqué que la biotine a un effet 15 20 2910024 24 déterminant sur l'efficacité de clonage. La concentration 10"5M est apparue comme proche de l'optimum. II a été trouvé que le milieu EMEM de Eagle additionné d'acides aminés non 5 essentiels et de ces vitamines permet une croissance satisfaisante de 4 lignées cellulaires : BoSk, CV1, PK15, RK13. • Détermination de la formulation en éléments minéraux Les concentrations des différents sels dont macroéléments (Mg", PO4"--), et 10 microéléments Fe", Zn++ Co++, Se03" Mo04--, I-, BO--, Sn++, Mn++, La+++ ont été déterminées expérimentalement. Une composition en microéléments en a été déduite (Tableau 12). Tableau 12 : concentrations optimales en microéléments Sels minéraux Concentration optimale NaCl 115 x10-3M KCI 5,37x1 0"3M CaCl2, 2H20 1,8 x10"3M MgSO4.7H2O 1,8 x10"3M NaH2PO4.H20 2 x10-3M NaHCO3 26,2 x10-3M Fe4O21P6 (Fe4(P207)3) 10 5'5M *Zn SO4.7H20 10-6,5M *CoCl2.6H2O 10"7'5M *MoO 4Na2.H2O 10-8M *SeO3Na2 10"5M *IK 10-8M B03H3 10-3M MnCl2.4H2O 10"9M *SnCl2.2H2O 10-9M *LaCI3.7H2O 10-9M Dans cette formulation, le fer est apporté sous une forme originale : le phosphate de fer, qui est plus stable que le sulfate ferreux. Le cobalt est apporté à une concentration relativement élevée tandis que le cuivre, toxique pour de nombreuses cellules, est absent. La composition ainsi déterminée a été améliorée, en particulier dans le but de cultiver des hybridomes. Ces améliorations portent sur le dosage : de 5 sucres 2910024 25 (glucose, fructose, mannose, galactose, inositol), d'un acide gras à courte chaîne (butyrate), et de 2 aminoalcools (éthanolamine, alaninol). • Détermination de la formulation en sucres, acides organiques et 5 nutriments azotés Les différents dosages ne sont pas optimisés pour une lignée cellulaire donnée, mais sont les conditions qui permettent à un nombre maximum de lignées cellulaires de se multiplier convenablement. Les sucres impliqués dans la fourniture d'énergie sont fournis en quantité 10 modulable selon que le milieu est plus ou moins riche. Les sucres qui sont des composants des glycoconjugués sont ajoutés en quantités fixes. Sucres ajoutés en quantités modulables : La concentration du glucose a été choisie par référence à la concentration 15 sanguine moyenne chez l'homme : 0,9 g/1 (milieu H-MSM-1). Cette quantité a été doublée pour le milieu appelé H-MSM-2, soit 1,8 g/I (10"2M). Le fructose, dont le métabolisme n'est pas modulé par l'insuline, a été testé avec satisfaction à la concentration de 1/3 et 1/2 de celle du glucose. La concentration de 1/3 de celle du glucose a été retenue et ramenée 1/3,17 (=1k10) 20 soit 0,28 g/I pour le milieu H-MSM-1, et 0,57 g/I pour le milieu H-MSM-2. Sucres ajoutés en quantités fixes. La concentration optimale de l'inositol a été déterminée expérimentalement (10-4M). Le mannose et le galactose, composants de la partie glycosylée des 25 glycoprotéines, sont ajoutés à 10"3M (Minamoto Y. et al., 1991, Cytotechnology.;5 Suppl 2:S35-51). Acides organiques. L'acide pyruvique (qui est aussi un antioxydant) est utilisé à la concentration 30 de 10"3M, comme dans la plupart des milieux standards. L'acide butyrique est utilisé à la concentration maximale trophique non toxique : 10"5.5M. 2910024 26 Nutriments azotés. Les concentrations consensus en choline, éthanolamine et alaninol ont été déterminées expérimentalement. 5 Tableau 13 : formulation en sucres, acides organiques et nutriments azotés Milieu H-MSM-1 Milieu H-MSM-2 Sucres Glucose 5 x1 0"3M 10 x10-3M Fructose 1,58 x10-3M 3,16 x1 0"3M Galactose 10-3M 10"3M Mannose 10"3M 10-3M Inositol 10-4M 10"4M Acides organiques Sodium Pyruvate 10-3M 10"3M Sodium Butyrate 10"5'5M 10-5'5M Composés azotés Choline HCI 10-4M 10"4M Ethanolamine 10-4'5M 10-4'5M Eventuellement Alaninol 10"5.5M 10"5'5M • Détermination de la formulation en acides aminés Les concentrations en acides aminés ont été calculées à partir des besoins de 10 la cellule pour synthétiser ses protéines mais aussi des besoins énergétiques. Le codon usage donne une bonne idée des besoins en acides aminés nécessaires pour la synthèse des protéines. Les besoins énergétiques de la cellule qui sont couverts par les acides aminés ont fait l'objet d'une excellente étude par Franek et Sramkova (1996, Immunol. Lett. Sep;52(2-3):139-44). 15 Ces acides aminés sont fournis aux cellules dans les proportions nécessaires à la synthèse des protéines, mais les quantités destinées à couvrir les besoins énergétiques de la cellule en culture sont fournies en supplément. Ces acides aminés fournisseurs d'énergie ont été classés en quatre catégories d'après une approche expérimentale sur la base de l'analyse de 20 l'efficacité clonale d'une part, et de la longévité des tapis cellulaires (retard dans l'apparition de l'apoptose) d'autre part : - Grand nourrisseur : la glutamine, est surajoutée à raison de 2x1 0"3M pour le milieu H-MSM-1. 15 2910024 27 - Moyen nourrisseur : l'alanine, l'arginine, la cystéine (à laquelle est substitué la cystine à une concentration deux fois moindre), la proline, la sérine sont surajoutés à raison de 10"3M pour le milieu H-MSM-1. - Petit nourrisseur : l'asparagine, la glycine, l'histidine, la lysine, la 5 thréonine, sont surajoutés à raison de 0,5x1 0"3M et, la valine à raison de 0,25x1 0"3M pour le milieu H-MSM-1. - Non nourrisseur : les autres acides aminés qui ne sont fournis qu'aux quantités requises pour satisfaire aux besoins de la cellule pour synthétiser des protéines (voir tableau 14 : codon usage). Ce sont : l'acide aspartique, l'acide 10 glutamique, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, la phénylalanine, le tryptophane, la tyrosine. Tableau 14 : Codon usage de Sus scrofa (fréquences d'utilisation en pour mille des différents codons par le porc) codon fréquence _AA codon fréquence AA codon fréquence AA codon fréquence AA UUU 16,3 F UCU 11,2 S UAU 11,0 Y UGU 9,2 C UUC 26,4 F UCC 18,4 S UAC 20,5 Y UGC 14,0 C UUA 6,3 L UCA 10,1 S UAA 0,7 Stop UGA 3,5 Stop UUG 10,7 L UCG 4,2 S UAG 0,5 Stop UGG 14,1 W CUU 10,6 L CCU 14,3 P CAU 8,1 H CGU 3,7 R CUC 22,5 L CCC 20,8 P CAC 15,7 H CGC 11,1 R CUA 11,6 L CCA 15,5 P CAA 10,4 Q CGA 5,9 R CUG 43,5 L CCG 7,9 P CAG 32,5 Q CGG 10,1 R AUU 15,8 I ACU 11,0 T .MU 14,4 N AGU 8,2 S AUC 28,4 I ACC 23,2 T AAC 23,7 N AGC 18,5 S AUA 9,3 I ACA 14,4 T AAA 20,6 K AGA 9,5 R AUG 21,9 M ACG 7,4 T AAG 31,7 K AGG 10,2 R GUU 9,0 V GCU 16,6 A GAU 17,7 D GGU 9,5 _ G GUC 17,1 V GCC 31,1 A GAC 28,4 D GGC 24,9 G GUA 7,0 V GCA 13,7 A GAA 23,3 E GGA 17,0 G GUG 31,3 V GCG 7,9 A GAC 38,4 E GGG 16,7 G Tableau 15 : Codon usage de Gallus gallus (fréquences d'utilisation en pour mille des différents codons par la poule) codon fréquence AA codon fréquence AA codon fréquence AA codon fréquence AA _ UUU 16,9 F UCU 14,1 S UAU 12,0 Y UGU 8,8 C UUC 20,1 F UCC 15,6 S UAC 17,8 Y UGC 12,8 C UUA 7,1 L UCA 11,5 S UAA 0,7 Stop UGA 1,0 Stop UUG 12,6 L UCG 5,2 S UAG 0,5 Stop UGG 11,8 W 2910024 28 codon fréquence AA codon fréquence AA codon fréquence M codon fréquence AA CUU 12,5 L CCU 15,3 P CAU 9,6 H CGU 5,4 R CUC 16,6 L CCC 16,5 P CAC 14,2 H CGC 10,3 R CUA 6,0 L CCA 15,6 P CM 12,2 Q CGA 5,3 R CUG 38,2 L CCG 7,6 P CAG 32,6 Q CGG 9,6 R AUU 16,9 I ACU 13,3 T MU 17,0 N AGU 11,3 S AUC 22,0 I ACC 16,4 T AAC 22,6 N AGC 20,0 S AUA 8, 8 I ACA 16,1 T AAA 27, 7 K AGA 12, 3 R AUG 23,3 M ACG 7,6 T MG 34,9 K AGG 11,7 R GUU 13,2 V GCU 20,9 A GAU 25,6 D GGU 11,5 G GUC 13,5 V GCC 22,6 A GAC 25,1 D GGC 19,7 G GUA 7,9 V GCA 19,0 A GAA 31,6 E GGA 17,7 G GUG 28,0 V GCG 9,0 A GAC 41,3 E GGG 15,6 G Tableau 16 : Codon usage de Cyprinus carpio (fréquences d'utilisation en pour mille des différents codons par la carpe) codon fréquence AA codon fréquence M codon fréquence AA codon fréquence AA UUU 17,4 F UCU 15,8 S UAU 12,8 Y UGU 12,5 C UUC 24,3 F UCC 14,6 S UAC 20,0 Y UGC 12,3 C UUA 5,6 L UCA 12,3 S UAA 1,2 Stop UGA 1,0 Stop UUG 11,5 L UCG 4,3 S UAG 0,5 Stop UGG 11,5 W CUU 11,8 LCCU 15,2 P CAU 10,0 H CGU 7,0 R CUC 17,0 L CCC 12,6 P CAC 13,6 H CGC 7,4 R CUA 5,1 L CCA 14,7 P CAA 12,0 Q CGA 4,9 R CUG 36,7 L CCG 6,6 P CAG 32,4 Q CGG 4,8 R AUU 17,1 I ACU 15,8 T AAU 16,2 N AGU 11, 6 S AUC 26,4 I ACC 17,8 T AAC 25,0 N AGC 17,7 S AUA 7,3 I ACA 16,0 T AAA 28,5 K AGA 13,6 R AUG 27,1 M ACG 6, 5 T AAG 34,3 K AGG 9,5 R GUU 15,4 V GCU 23,3 A GAU 26,5 D GGU 16,3 G GUC 17,4 V GCC 20,6 A GAC 28,5 D GGC 18, 0 G GUA 6,4 V GCA 15,3 A GAA 23,5 E GGA 21,6 G GUG 29,8 V GCG 7,6 A GAC 40, 8 E GGG 9,2 G 5 A partir de ces données du codon usage de cellules de mammifères, d'oiseaux et de poisson, les proportions d'acides aminés nécessaires pour la synthèse des protéines ont été déduites. Ces proportions varient peu d'un groupe de vertébrés à l'autre. 2910024 29 Tableau 17 : proportions d'acides aminés nécessaires pour la synthèse des protéines chez un poisson, un oiseau et un mammifère. Mammifère : Oiseau : Poisson : Sus scrofa Gallus gallus Cyprinus carpio AA % Concentrations % Concentrations % Concentrations moléculaires moléculaires moléculaires A Ale 6,93 0,693x10 3M 7,15 0,715x10-3M 6,68 0,668x10"3M _ R Arg 5,10 0,51 x10-3M 5,46 0,546x1 0"3-M 4,72 0,472x10-3M N Asn 3,81 0,381 x10-3M _ 3,96 0,396x10"3-M 4,12 0,412 x1OE-3M _J D Asp 4,61 0,461 x1 0"3M _ 0,507x10-3M 5,50 0,550 x10-3M 5,07 _ C CYs 2,32 0,23 x10-3M 2,16 0,216x1 0"3-M 2,48 0,248 x10-3M Q Gln 4,29 0,43 xl0-3M 4,47 0,447x1 0-3-M 4,44 0,444 x10-3M E Glu 6,17 0,62x10"3M _ 0,729x10"3-M 6,43 0,643 x1 0"3M 7,29 G GIY 6,81 0,68x1 0"3M 6,45 0,645x1 0"'M 6,51 0,651x10-3M H His 2,38 0,24x10"3M 2,38 0,238x10-3M 2,36 0,236 x10-3M I IIe 5,35 0,53x1 0"3M 4,77 0,477x10"3M 5, 08 0,508 x1 0"3M L Leu 10,52 1,05x10"3 M 9,30 0,930x10"3M 8,77 0,877 x10-3M K Lys 5,23 0,52x10-3M 6,26 0,626x1 0"3M 6,28 0,628 x10-3M M Met 2,19 0,22x10-3M 2,33 0,233x10"3M 2,71 0,271 x10-3M F Phe 4,27 0,43x1 0"3M 3,70 0,370x10"3M 4,17 0,417 x10"3M P Pro 5,85 0,58x10-3M 5,50 0,550x10"3M 4,91 0,491 x10-3M S Ser 7,06 0,70x10-3M 7,77 0,777x10-3M 7,63 0,763 x10-3M T Thr 5,40 0,54x10-3M 5,34 0,534x10"3M 4,61 0,461 x10-3M W Trp 1,41 0,14x10"3M 1,18 0,118x10" 3M 1,15 0,115 x1 0"3M Y Tyr 3,15 0,31x10"3M 2, 98 0,298x10"3M 3,28 0,328 x10-3M V val 6,44 0,64x1 0"3M _ 0,626x1 0"3-M 6,90 0,690 x1 0"3M 6,26 stop 0,47 _ 0,27 0,22 99,76 9,93x10"3M 100 99 5 La composition en acides aminés du milieu selon l'invention a été établie en additionnant les concentrations d'acides aminés nécessaires à la synthèse protéique, et déterminées à l'aide du codon usage, avec les concentrations d'acides aminés nécessaires en tant qu'éléments énergiques, comme décrit par Franek et Sramkova (1996, Immunol. Lett. 52(2-3):139-44). 10 Plus spécifiquement, la concentration en leucine nécessaire pour la synthèse protéique a été fixée à 0,5 x10-3M (valeur communément admise dans l'état de la technique). La concentration des autres acides aminés en a été déduite en fonction de la fréquence relative des autres acides aminés d'après le codon usage (Tableau 18). 15 2910024 30 Tableau 18: Concentrations d'acides aminés nécessaires à la synthèse protéique (codon usage), concentrations d'acides aminés nécessaires en tant qu'éléments énergiques, et concentrations dans le milieu H-MSM AA % Concentrations Nutriments* d'après Milieu H-MSM-1 d'après le codon Franek et Sramkova usage de Sus scrofa A Ala 6,93 0,346x10"3M 10"3M(2) 1,345x10"3M R Arg 5, 10 0,250 x1 0"3M 0,5x10"3M(') 0,75x1 0"3M N Asn 3,81 0,190 x10-3M 0,5x10"3M(3) 0,69x10"3M D Asp 4,61 0,230 x1 0"3M - 0,23x10-3M C Cys 2,32 0,115 x10-3M 10-3M(3) 1,115x10"3M(3} Ou cys- / / 0,56x10-3M cys Q Gln 4, 29 0,215 x10-3M 2x10"3M(') 2,215x10"3M E Glu 6,17 0,310x10"3M - 0,31x10-3M G Gly 6,81 0,340x10-3M 0,5x10_3M(2) 0,84x10"3M H His 2,38 0,120x10"3M 0,5x1 0"3M(2) 0,62x10-3M 1 IIe 5,35 0,265x10"3M - 0,265x1 0"3M L Leu 10,52 0,502x10-3 M - 0,502 x1 0"3M K Lys 5,23 0,260x1 0"3M 0,5x10"3M(2) 0,76x10-3M M Met 2,19 0,110x10"3M - 0,11 x10"3M F Phe 4,27 0,215x1 0"3M -0,215x1 0"3M P Pro 5,85 0,290x10-3M 10_3M(2) 1,29 x10"3M S Ser _7,06 0,350x10-3M 10-3M(2) 1,35 x10"3M T Thr 5,4 0,270x10"3M 0,5x1 0"3M(2) 0,77 x1 0"3M W Trp 1,4 0,070x10"3M - 0,07 x10-3M Y Tyr 3,15 _ - 0,15 x10-3M 0,155x1 0"3M V val 6,44 0,320x1 0"M 0,25x1 0"3M(3) 0,507 x10"3M 5x10"3M 8.75x â M * : Les sucres seuls ne sont pas suffisants pour subvenir aux besoins 5 énergétiques de la cellule en culture : ('ia glutamine et I'arginine sont ajoutées à des concentrations élevées dans les principaux milieux traditionnels (EIVIEM, DMEM, RPMI, ...). (2) Les acides aminés hydrosolubles, le plus souvent réputés non essentiels dans la formule de Eagle, sont, d'après les travaux de Franek et Sramkova, 10 déterminants pour la croissance des cellules en culture. (3) Les propriétés trophiques de la cystéine sont connues (Franek et Sramkova 1996). Il est préférable de fournir la cystéine sous la forme de dimère oxydé (cystine plus stable en solution). La cystine est donc apportée à une concentration égale à '/2 fois la concentration en cystéine qu'elle remplace. 15 D'après les résultas ci-dessus, la formulation du milieu H-MSM-1 a été établie. Le milieu H-MSM2 présente des concentrations inchangées en sels minéraux, sucres ajoutés en quantité fixe, acides organiques, composés azotés, vitamines et 2910024 31 antioxydants. Les concentrations en glucose, fructose et acides aminés sont en revanche doublées dans le milieu H-MSM2. Tableau 19 : formulations détaillées du milieu H-MSM-1 et du milieu H-MSM2. H-MSM-1 H-MSM-2 M Molarité mg/I Molarité mg/I Sels minéraux NaCl 58.44 115x10-3M 6720 KCI 74.5 5.37x10-3M 400 inchangée CaCl2 2H2O 147 1.8 x10-3M 265 inchangée MgSO4.7H20 246.5 1.8x10-3M 443,7 inchangée NaH2PO4.H20 138 2x1 0"3M 276 _ inchangée NaHCO3 84 26.2x1 0"3M 2200 Inchangée Fe4O21P6 745 10-5.5M 2,36 Inchangée (Fe4(P207)3) *Zn SO4.7H20 287.5 10-6.5M 0,090 inchangée *CoCl2.6H2O 238 10-7.5m 0,00752 inchangée *MoO4Na2.H2O 242 1.x10-8M 0,00242 _ Inchangée *SeO3Na2 173 1x10-8M 0, 00173 Inchangée *IK 166 1 x10-9M 0,00166 Inchangée B03H3 161.83 1 x10 8M 0, 00062 Inchangée MnCl2.4H20 198 1 x1 0"9M 0,000198 inchangée *SnCl2.2H2O 225.5 1x10-9M 0,000225 Inchangée *LaCI3.7H2O 371 1 x1 0"9M 0,000371 inchangée Sucres Glucose 180 5x10-3M 900 10x10"3M 1800 _ Fructose 180 51 8x10-3M 284 3.16x10-3M 569 Galactose _ 180 10-3M 180 Inchangée Mannose 180 10-3M 180 Inchangée Inositol _ 180 10-4M 18 inchangée Acides organiques Sodium Pyruvate 110 10-3M 110 _ inchangée Sodium Butyrate 110 10-5.5M 0,347 inchangée Composés azotés CholineHCI 139 10"4M 13,9 Inchangée Ethanolamine 61 10-4.5M 1,93 Inchangée Alaninol 75 10-5.5M 0,24 inchangée Acides aminés Alanine 89 1.345x10-3M 119,7 2.69 x10-3M 239,4 Arginine 174 5x1 0"3M 130, 5 1.50 x10-3M 261 Asparagine 132 0.69x10-3M 91,1 1.38 x10M 182,2 Acide Aspartique 133 0.23x10-3M 30,1 _ 0.46 x10-3M 60,2 Cystine 240 0,56x10-3M 147,6 1,12 x10-3M 295,2 Acide Glutamique 147 0.31 x1 0"3M 45 0.62 x10-3M 90 _ Glutamine 146 2.215x10-3M 323,4 4.43 x10"3M 646,8 Glycine 77 0.84 x10-3M 64,7 1.68 x10-3M 129,4 2910024 32 H-MSM-1 H-MSM-2 M Molarité mg/I Molarité mg/I Histidine 155 0,62x10-3M 96,1 1.24 x10-3M 192,2 Isoleucine 131 0.265x10-3M 34,7 0.53 x10-3M 69,4 Leucine 131 0.502x10"3M 65,8 1.04 x10-3M 131,6 Lysine 146 0.76x10-3M 111 ' 1.52 x10-3M 222 Méthionine 153 0.11 x10-3M 16,8 0.22 x10-3M 33,6 Phénylalanine 165 0.215x1 0"3M 35,5 0. 43 x10-3M 71 Proline 115 1.29 x10-3M 148,3 2.58 x10-3M 296,6 Sérine 105 1.35 x10-3M 141,7 2.70 x10-3M 283,4 Thréonine 119 0.77x10-3M 91,6 1.54 x10-3M 183,2 Tryptophane 204 0.07x10-3M 14,3 0.14 x10-3M 28,6 Tyrosine 182 0.15x10-3M 27,3 0.30 x10-3M 54,6 Valine 117 0.507x1 0"3M 59,3 1.14 x10-3M 118,6 total 1819,3 Vitamines Biotine 244 10-5M 2,44 Inchangée D-Ca-pantothenate 476 10-5M 4,76 Inchangée Nicotinamide 122 "' 10-5M 1,22 Inchangée Pyridoxine 169! 10-5M 1,69 Inchangée Thiamine 337 10"5M 3,37 Inchangée Acide thioctique 206 10-5M 2,06 Inchangée Acide folique 477 10-5.5M 1,5 Inchangée Retinylacétate 328 10"6M 0,328 Inchangée Ac. P.-amino 159 10-6M 0,16 Inchangée benzoique Riboflavine 376 10"6.5M 0,12 Inchangée Ethyl linoléate 308.5 10"6.5M 0,975 Inchangée Vitamine B12 1355 10-7M 0,135 , Inchangée Acide Ascorbique 176 10-4M 17,6 Inchangée Rouge de Phénol 376 0.026 x10-3M 10,00 optionnel Exemple 2 : Aptitude de différentes lignées cellulaires à se multiplier de manière indéfinie en milieu synthétique. Au total 25 lignées cellulaires ont été testées pour leur aptitude à se propager 5 en milieu H-MSM-2 (Tableau 20). La technique traditionnelle de repiquage après dispersion des tapis cellulaires avec un mélange trypsine/EDTA a été utilisée. Cependant il est tout à fait possible de propager les cellules par d'autres méthodes. La collecte des cellules en mitoses qui sont en suspension dans le surnageant donne de bons résultats mais peu de cellules. L'avantage, dans ce cas, est de conserver 10 les cellules, continuellement, dans un environnement dépourvu de protéines. La dispersion des cellules avec un mélange papaïne plus versène est en cours d'étude, mais les premiers résultats sont encourageants. 2910024 33 Tableau 20: caractéristiques de culture de différentes lignées cellulaires cultivées en milieu H-MSM-2 Cellules Espèces Tissus Subcultures TMD Tapis (c) cellulaires MDBK(a) Bovin Rein 80 36,5 Oui (g) BoSk(a, f) Bovin Peau 80 ND oui CHO s Hamster ovaire 22 ND suspension BHK21 Hamster Rein Revendications 1. Milieu de culture cellulaire synthétique et chimiquement défini comprenant : a) un mélange d'acides aminés naturels ; b) au moins un sel minéral; c) au moins un sucre ; d) au moins un acide organique ; e) au moins un nutriment azoté ; et f) au moins une vitamine et/ou un antioxydant ; dans lequel le pourcentage (en molarité / molarité totale du mélange) de chaque acide aminé dans le mélange d'acides aminés naturels est : 2. Milieu de culture cellulaire selon la revendication 1, dans lequel la concentration de chacun des acides aminés dans ledit milieu de culture est égale aux concentrations suivantes multipliées par un facteur compris entre 0,75 et 3,75 (bornes inclues): Ala Arg Asn Asp (Cys-Cys) Eventuellement Gln Glu Gly His lle Leu Lys Met Phe Pro Ser r Trp Tyr Val 6,20 1,24 4.58 0,92 96 0,39 3,71 0,74 5,61 1,12 0,81 0,16 1, 59 0,32 9,52 1,90 1,11 0,22 3,74 0,75 5 10 2910024 39 Ala 1,345 0,269 x10-3 M Arg 0,75 0,150 x103 M Asn 0,69 0,138 x10-3 M Asp 0,23 0,046 xl0-3 M (Cys-Cys) 0,56 0,112 x10-3.M2,215 Eventuellement Gin 0,443 x10"3 M Glu 0,31 0,062 x10-3 M Gly 0,84 0,168 xl M His 0,62 0,124 x10-3 M lie 0,265 0,053 xlo-3 M Leu 0,502 0,100 x10-3 M Lys 0,76+0,152 xlo-' m Met 0,11 0,022 x103 M Phe 0,215 0,043 x10"3 M Pro 1,29 0,258 xl M Ser 1,35 0,270 x10-3 M Thr 0,7 7 0,154x10-3M Trp 0, 07 0,014 x10-3 M x10-3 Val 0,15 0,030 M 0,507 0,101 x10-3 M. 3. Milieu de culture cellulaire selon la revendication 1 ou 2, comprenant des sels de sodium, potassium, calcium, magnésium, phosphate, carbonate, fer, zinc, cobalt, molybdène, sélénium, iode, bore, rnanganèse, étain et lanthane. 4. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant du fer sous forme de phosphate de fer (Fe4(P2O7)3). 5. Milieu de culture cellulaire selon la revendication 3 ou 4, comprenant : NaCl 11,5-115 x10- 3M KCI 0,537-5,37 x10 3M CaCl222H2O 0,18-1,8 xlo-3m MgSO4.7H2O 0,18-1,8 x10 3M NaH2PO4.H2O 0,2-2 x10- 3M NaHCO3 2,62-26,2 x10 3m Fe4O21P6 (Fe4(P207)3) 0,1-1 x10" 5'5M *Zn SO4. 7H2O 0,1-1 x10 m *CoCl2.6H2O 0,1-1 x10 m *MoO4Na2.H2O 0,1-1 x10- 8M *SeO3Na2 0,1-1 xlO-M 2910024 40 *IK 0,1-1 x10-8M BO3H3 0,1-1 x10-8M MnCl2.4H2O 0,1-1 x1 0"9M *SnCl2.2H2O 0,1-1 x1 0"9M *LaCI3.7H2O 0,1-1 x10-9M. 6. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant glucose, fructose, galactose, mannose, inositol, sodium pyruvate, sodium butyrate , choline, éthanolamine et éventuellement alaninol. 7. Milieu de culture cellulaire selon la revendication 6, comprenant : Glucose 2,5-10 x10-3M Fructose 0,79-3,16 x10"3M Galactose 10"3'5-10"2'5M Mannose 10"3'5-10-2,5M Inositol Io-4,5-1 0 3,5M Sodium Pyruvate 10-3.5-10"2M Sodium Butyrate 10"6-10~M Choline HCI 10"5-10-4M Ethanolamine 10-5,5-10-4.5M Eventuellement Alaninol 10-6-10 4M. 8. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant de la biotine, de la vitamine B12 et du rétinylacétate, le ratio des 10 concentrations biotine : vitamine 12 étant compris entre 80 :1 et 120 :1, et le ratio des concentrations biotine : rétinylacétate étant compris entre 8 :1 et 12 :1. 9. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant biotine, D-Ca-pantothénate, nicotinamide, pyridoxine, thiamine, acide 15 thioctique, acide folique et éventuellement son précurseur l'acide P-amino benzoïque, rétinylacétate, riboflavine, éthyl linoléate, vitamine B12, et éventuellement acide ascorbique. 10. Milieu de culture cellulaire selon la revendication 8 ou 9, comprenant : Biotine 10-b- 10"4M D-Ca-pantothenate 10"b-10"4M Nicotinamide 10"6-10"4M Pyridoxine 10"b-10"4M Thiamine 10-b-10-4M Acide thioctique 10-6-10-4M 5 2910024 41 Acide folique 10-63-10"5,5M Retinylacétate 10-6,5-10"5'5M Eventuellement Ac. P.-amino benzoique 10"'-10-5M Riboflavine 10-'-10"6M Ethyl linoléate 10-7-lem Vitamine B12 10-6-10"6M Eventuellement Acide Ascorbique 10610"3M. 11. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant : NaCl 11,5-115x10"3M KCI 0,537-5,37 x10"3-M CaCl2,2H2O 0,18-1,8 x10-3M MgSO4.7H2O 0,18-1,8 x10"3-M _ NaH2PO4.H2O 0,2-2 x10"~ _ NaHCO3 2,62-26,2 x10"3M Fe4O21P6 (Fe4(P2O7)3) 0,1-1 x10-5'5M _ *Zn SO4.7H2O 0,1-1 x10-6'5M _ 0,1-1 x10"i'5M *CoCl2.6H2O _ *MoO4Na.H 0 _ 0,1-1 x10 ~M *SeO3Na2 0,1-1 x10-$M _ *IK 0,1-1 x10 8M _ BO3H3 0,1-1 x10- M MnCl2.4H2O 0,1-1 x10- Ï _ *SnCl2.2H2O 0,1-1 x10" M *LaCI3.7H2O 0,1-1 x10" Ï Glucose 2,5-10 x10"3M Fructose 0,79-3,16 x10"3M Galactose 10-3,5-10-2'5M Mannose 10"3'5-10"2'5M Inositol Io-4,5-1 o3'5M Sodium Pyruvate 10"3'5-10"2M Sodium Butyrate 10 -10 MM _ Choline HCI 10 5-10"4M Ethanolamine 10"5,5-10 4,5M Eventuellement Alaninol 10" -10 M Alanine 1,01-5,04x10"3M Arginine 0,56-2,81 x10"3M Asparagine 0,52-2,59 x10-3M ù Acide Aspartique 0,17-0,86 x10-3M Cystine 0,42-2,10 x1 0-3-M Acide Glutamique 0,23-1,16 x10"3-M Eventuellement Glutamine 1,66-8,31 x10-3-Ni 2910024 42 Glycine 0,63-3,15 x10-3M Histidine 0,47-2,33 x10-3M Isoleucine 0,20-0,99 x1 0"3M Leucine 0,38-1,88 x10-3M Lysine 0,57-2,85 x1 0"3M Méthionine 0,08-0,41 x10-3M Phénylalanine 0,16-0,81 x10-3M Proline 0,97-4,84 x1 0"3M Sérine 1,01-5,06 x10-3M Thréonine 0,58-2,89 x10-3M Tryptophane 0,05-0,26 x10-3M Tyrosine 0,11-0,56 x10-3M Valine 0,38-1,90 x10-3M Biotine 10"b-10"4M D-Ca-pantothenate 10-6-10"4M Nicotinamide 10-b1 0"4M Pyridoxine 10"6-10"4M Thiamine 10-6-10"4M Acide thioctique 10-6-104M Acide folique 10"6;5-10"5,5M Retinylacétate 10-~5-10-5'5M Eventuellement Ac. P.-amino 10"7-10"5M benzoique Riboflavine 10"'-10-5M Ethyl linoléate 10"'-10 6M Vitamine B12 10"6-10-5M Eventuellement Acide 10"6-10"3M Ascorbique 12. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant : NaCI 11,5-115x10-3M KCI 0,537-5,37 x10-3M CaCl222H2O 0,18-1,8 x10-3M MgSO4.7H2O 0,18-1,8 x10"3M NaH2PO4.H2O 0,2-2 x10"3M NaHCO3 2,62-26,2 x1 0"3M Fe4O21P6 (Fe4(P207)3) 0,1-1 x10- 5'5M *Zn SO4.7H20 0,1-1 x10-"m *CoCl2.6H2O 0,1-1 x10-',5M *MoO4Na2.H2O 0,1-1 x10-6M *SeO3Na2 0,1-1 x10-6M *IK 0,1-1 x1 0"$M B03H3 0,1-1 x10-6M MnCl2.4H20 0,1-1 x10-9M 2910024 43 *SnCl2.2H2O 0,1-1 x10-9M *LaCI3.7H2O 0,1-1 x10-9M Glucose 2,5-10 x10-3M Fructose 0,79-3,16 x10-3M Galactose 10"3,5-10"2'5M Mannose 10-3,5-10"2,5M Inositol 1 0 4'5-10 3,5M Sodium Pyruvate 10-3'5-10"2M Sodium Butyrate 10"6-10 M Choline HCI 10"5-10-4M Ethanolamine 10"5,5-10 4,5M Eventuellement Alaninol 10"b-104M Alanine 1,345 0,269 x1 0"3M Arginine 0,75 0,150 x10"3M Asparagine 0,69 0, 138 x10-3M Acide Aspartique 0,23 0,046 x10-3M Cystine 0,56 0,112 x10-3M Acide Glutamique 2,215 0,443 x10-3M Eventuellement Glutamine 0,31 0,062 x10-3M Glycine 0,84 0,168 x10-3M Histidine 0,62 0,124 x10"3M Isoleucine 0,265 0,053 x10-3M Leucine 0,502 0,100 x10-3M Lysine 0,76 0,152 x10-3M Méthionine 0,11 0,022 x10-3M Phénylalanine 0,215 0,043 x10-3M Proline 1,29 0,258 x10-3M Sérine 1,35 0,270 x10-3M Thréonine 0,77 0,154 x10-3M Tryptophane 0,07 0,014 x10"3M Tyrosine 0,15 0,030 x1 0"3M Valine 0,507 0,101 x10-3M Biotine 10-b-10-4M D-Ca-pantothenate 10"6-10-4M Nicotinamide 10-6-10-4M Pyridoxine 10"6-10"4M Thiamine 10-b-10"4M Acide thioctique 10k-10 4M Acide folique 10"6'5-10-5'5M Retinylacétate 10"~5-10 5 5M Eventuellement Ac. P.-amino 10"'-10-5M benzoique Riboflavine 10"'-10-'M 2910024 44 Ethyl linoléate 10"'-10"bM Vitamine B12 10"8-10-6M Eventuellement Acide 10-b-10"3M Ascorbique 13. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant : NaCl 11,5-115x1 0"3M KCI 0,537-5,37 x10-3M CaCl2,2H2O 0,18-1,8 x10-3M MgSO4.7H2O 0,18-1,8 x10-3M NaH2PO4.H2O 0,2-2 x10-3M NaHCO3 2,62-26,2 x1 0"3M Fe4O21 P6 (Fe4(P2O7)3) 0,1-1 x10-5'5M *Zn SO4.7H2O 0,1-1 x1 0"6,5M *CoCl2.6H2O 0,1-1 x1 0"',5M *MoO4Na2.H2O 0,1-1 x10-8M *SeO3Na2 0,1-1 x10-8M *IK 0,1-1 x10-8M BO3H3 0,1-1 x10-8M MnCl2.4H2O 0,1-1 x10-9M *SnCl2.2H2O 0,1-1 x10-9M *LaCI3.7H2O 0,1-1 x10-9M Glucose 2,5-10 x1 0"3M Fructose 0,79-3,16 x1 0"3M Galactose 10-3'S-10-2'5M Mannose 10"3'5-10 '5M Inositol I 0 4'5-10 3'5M Sodium Pyruvate 10"3,5-10"2M Sodium Butyrate 10-6-10"5M Choline HCI 10"5-10"4M Ethanolamine 10"5'5-10 4'5M Eventuellement Alaninol 10-b-10"4M Alanine 2,69 0,54 x10" M Arginine 1,5 0,30 x10-3M Asparagine 1,38 0,28 x10"3M Acide Aspartique 0,46 0,09 x10-3M Cystine 1,12 0,22 x1 0"3M Acide Glutamique 4,43 0,89 x1 0"3M Eventuellement Glutamine 0,62 0,12 x10-3M Glycine 1,68 0,34 x10-3M Histidine 1,24 0,25 x10-3M Isoleucine 0,53 0,11 x10-3M 2910024 45 Leucine 1,04 0,20 x10-3M Lysine 1,52 0,30 x10-3M Méthionine 0,22 0,04 x1 0"'M Phénylalanine 0,43 0,09 x10-3M Proline 2,58 0,52 x1 0"3M Serine 2,7 0,54 x10-3M Thréonine 1, 54 0,31 x10-3M Tryptophane 0,14 0,03 x10-3M Tyrosine 0,3 0,06 x10-3M Valine 1,14 0,20 x1 0"3M Biotine 10"6-10"4M D-Ca-pantothenate 10-b- 10"4M Nicotinamide 10"b-10-4M Pyridoxine 10"b-10"4M Thiamine 10"6-10"4M Acide thioctique 10"b-10"4M Acide folique 10 e,5-15M Retinylacétate 10-6 5-10-5 5M Eventuellement Ac. P.-amino 10"'-10-5M benzoique Riboflavine 10"'- 10"6M Ethyl linoléate 10"'-10"bM Vitamine B12 10"6-10-bM Eventuellement Acide 10-b-10"3M Ascorbique 14. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, ledit milieu étant sans sérum et/ou aprotéique. 5 15. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, ledit milieu étant destiné à la culture de cellules de vertébrés. 16. Méthode de multiplication cellulaire comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact le milieu de culture selon l'une quelconque des 10 revendications 1 à 15 avec au moins une cellule; et b) cultiver ladite au moins une cellule pendant un temps et dans des conditions permettant la multiplication de ladite cellule. 17. Méthode selon la revendication 16, dans laquelle ladite au moins une cellule 15 est une cellule adhérente ou une cellule en suspension. 2910024 46 18. Méthode selon la revendication 16 ou 17, dans laquelle ladite au moins une cellule exprime une protéine d'intérêt ou produit un virus. 19. Méthode selon la revendication 18, dans laquelle ladite cellule exprimant 5 une protéine d'intérêt est un hybridome exprimant un anticorps monoclonal ou une cellule transformée avec un acide nucléique comprenant une séquence codant ladite protéine d'intérêt. 20. Méthode de production d'une protéine d'intérêt comprenant les étapes 10 consistant à : a) mettre en contact le milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 avec au moins une cellule exprimant une protéine d'intérêt ; b) cultiver ladite au moins une cellule pendant un temps et dans des conditions permettant l'expression de la protéine d'intérêt ; et 15 c) éventuellement récolter la protéine d'intérêt exprimée. 21. Méthode selon la revendication 20, dans laquelle ladite cellule exprimant une protéine d'intérêt est une cellule qui a été transformée avec un acide nucléique comprenant une séquence codant ladite protéine d'intérêt. 22. Méthode selon la revendication 20, dans laquelle ladite cellule exprimant une protéine d'intérêt est un hybridome exprimant un anticorps monoclonal. 23. Méthode de production d'un virus comprenant les étapes consistant à : 25 a) mettre en contact le milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 avec au moins une cellule infectée avec un virus ; b) cultiver ladite au moins une cellule pendant un temps et dans des conditions permettant la réalisation du cycle réplicatif dudit virus ; et c) éventuellement récolter les virus produits.20