FR 2912409 A1 20080815 FR 0701055 A 20070214 HEPARINES DE BAS POIDS MOLECULAIRE COMPRENANT AU MOINS UNE LIAISON COVALENTE AVEC LA BIOTINE OU UN DERIVE DE LA BIOTINE LEUR PROCEDE DE PREPARATION, LEUR UTILISATION La présente invention concerne des héparines de bas poids moléculaire, ou mélanges de polysaccharides dérivés d'héparinoïdes, présentant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine. 10 L'héparine est un mélange de mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale, utilisée notamment pour ses propriétés anticoagulantes et anti-thrombotiques. L'héparine présente cependant des inconvénients qui limitent les conditions de son utilisation. En particulier, son activité anticoagulante importante, anti-facteur Ila, peut occasionner des hémorragies (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol 15 5 sup. 3 (1999)). Des héparines de bas poids moléculaire compris par exemple entre 3500 et 5500 Daltons, notamment obtenues par dépolymérisation basique d'esters d'héparine et actuellement commercialisées, telle que l'Enoxaparine présentent également une activité anti-thrombotique anti-facteur Ila importante. 20 Les dérivés d'héparines sont connus pour ces effets secondaires hémorragiques indésirables. Dans le domaine du traitement de la thrombose avec les produits ci-dessus, on doit rétablir ou maintenir la fluidité du sang tout en évitant de provoquer une hémorragie. Il est en effet bien connu que, pour une cause accidentelle quelconque, une hémorragie peut se déclencher chez un patient sous traitement. 25 On peut également avoir besoin d'intervenir chirurgicalement chez un malade sous traitement antithrombotique. De plus, au cours de certains actes chirurgicaux, des anticoagulants peuvent être utilisés à forte dose de façon à empêcher la coagulation du sang, et il est nécessaire de les neutraliser à la fin de l'intervention. II est donc intéressant d'avoir des agents antithrombotiques neutralisables pour 30 stopper l'activité anticoagulante à tout moment. Des agents antithrombotiques neutralisables, tels que des polysaccharides de synthèse biotinylés, ont été décrits dans les demandes de brevet WO 02/24754 et WO 06/030104. Leur synthèse, comprenant notamment le greffage de la biotine ou 35 du dérivé de biotine réalisé sur des équivalents protégés des polysaccharides5 rnentionnés ci-dessus et non sur ces polysaccharides eux-mêmes, n'est pas applicable aux composés de la présente invention. Cette synthèse ne permet pas la biotinylation de l'ensemble des chaînes saccharidiques fonctionnalisables des héparines de bas poids moléculaire et n'induit pas une régio-sélectivité suffisante cle la position du greffage de la biotine ou du dérivé de la biotine Les héparines de bas poids moléculaire étant des mélanges de polysaccharides dérivés d'héparine, il est préférable que la biotinylation soit effectuée sur des produits finis afin que leur activité biologique soit conservée et que la neutralisation des héparines de bas poids moléculaire biotinylées soit suffisante. Des approches de biotinylation sont décrites seulement sur une héparine porcine, par l'équipe de R. I.W. Osmond and Coll., Analytical Biochemistry, 31 (2002) 199-207. Une des approches procède au greffage de la biotine sur des fonctions non définies de l'héparine. Les conditions opératoires telles que décrites dans cette publication pour la biotinylation spécifique de l'héparine porcine ne permettent pas l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées avec des caractéristiques attendues, comme un taux de biotinylation suffisant pour une bonne neutralisation et avec une bonne pureté. Par ailleurs la méthode décrite par R. I.W. Osmond and Coll. ne décrit en rien, ni ne suggère, la biotinylation d'héparines de bas poids moléculaire. La présente invention concerne de nouvelles héparines de bas poids moléculaire modifiées, en ce sens que au moins 90 % des chaînes polysaccharidiques fonctionnalisables constitutives du mélange présentent une liaison covalente avec la biotine (acide hexahydro-2-oxo-1H-thiéno[3,4-d]imidazole-4-pentanoïque) ou avec un dérivé de la biotine. De manière surprenante, il apparaît que l'introduction de biotine ou d'un dérivé de la biotine ne modifie pas l'activité pharmacologique des nouvelles héparines de bas poids moléculaire, ciaprès dénommées "héparines de bas poids moléculaire biotinylées". En effet, les nouvelles héparines de bas poids moléculaire biotinylées, objet de l'invention, ont des activités antithrombotiques anti-facteur Xa (anti-FXa) et anti-facteur Ila (anti-Flla), comparables aux héparines de bas poids moléculaire natives, c'est à dire avant la biotniylation. Elles possèdent un avantage considérable par rapport aux héparines de bas poids moléculaires natives, elles peuvent être rapidement neutralisées par un antidote spécifique, en situation d'urgence. Cette antidote spécifique est l'avidine sous forme tétramérique ou monomérique ou la streptavidine de masses respectives égale à environ 66 000, 16 400, et 60 000 Da (The Merck Index, Twelfth edition, 1996, M.N. 920, pages 151-152; Revue Pierce Avidin-Biotin Handbook). Elles possèdent également l'avantage de pouvoir être utiles dans des indications thérapeutiques pour lesquelles les doses utilisées sont plus élevées. D'une manière générale, l'invention concerne des héparines de bas poids moléculaire à activité anti-thrombotique dont les chaînes polysaccharidiques constitutives du mélange présentent une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de biotine. Lesdites héparines de bas poids moléculaire dont les chaînes polysaccharidiques constitutives du mélange présentent une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de biotine sont également appelées ci-dessous héparines de bas poids moléculaire biotinylées. Les héparines de bas poids moléculaire natives, c'est à dire les héparines de bas poids moléculaires de départ avant la biotinylation, sont dénommées ci-après "héparines de bas poids moléculaires". Dans le cadre de la présente invention on entend par mélange les mélanges de polysaccharides dérivés d'héparine constituant lesdites héparines de bas poids moléculaire biotinylées ou lesdites héparines de bas poids moléculaire natives. La présente invention a pour objet des héparines de bas poids moléculaire, possédant la structure générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine, et lesdits polysaccharides constitutifs du mélange comportant à leur extrémité réductrice au moins 75 pour cent d'une glucosamine sous forme hémi-acétale, caractérisées en ce qu'elles présentent un poids moléculaire moyen de 3000 à 7000 Daltons, et en ce que lesdits polysaccharides constitutifs du mélange possèdent la structure générale de formules (la) ou (lb) telles que définies ci-dessous: Ox OH P OX f-NùRl---Biot NHYox OH P OX NHùBiot NHY35 dans lesquelles, F'E : représente une chaîne polysaccharidique ayant la structure générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine, X représente H ou SO3Na, Y représente SO3Na ou COCH3, le trait ondulé désigne une laison située soit au-dessous soit au-dessus du plan du cycle pyranosique, R, représente un des enchaînements choisis parmi : O ir'i- CH2. H Nom/ _CH 2 I O 20 dans lesquels j et k, identiques ou différents, sont des entiers pouvant prendre toute valeur de 1 à 10, et Biot représente le groupe biotine de formule: ou O CH4. k H-- ùCù(CH2)â'' O H ) (ù~H 25 30 HNNH O ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Les dérivés de biotine sont disponibles commercialement (catalogue "Pierce" Biotin-avidin products, 2005, pages 7-1'1), ou peuvent être préparés en utilisant des méthodes classiques connues de l'homme de l'art. 35 Dans le cadre de la présente invention, on entend par glucosamine le sucre de formule générale : OX NHY avec, X représentant H ou SO3Na ; et Y représentant COCH3 ou SO3Na; le trait ondulé désigne une laison située soit au-dessous soit au-dessus du plan du cycle pyranosique. On entend par extrémité réductrice : l'extrémité des polysaccharides comportant une glucosamine telle que définie plus haut. Les chaînes à l'extrémité réductrice desdits polysaccharides peuvent se trouver sous forme de 1,6-anhydro, à une teneur inférieure ou égale à 25 % et sous forme hémi-acétale, telle que décrite dans la formule (Il), pour une teneur supérieure ou égale à 75%. On entend par les polysaccharides fonctionnalisables constitutifs du mélange, lesdits polysaccharides constitutifs du mélange comportant à leur extrémité réductrice une glucosamine sous forme hémi-acétale telle que définie dans la formule (II) , On entend par polysaccharides constitutifs de l'héparine : un mélange de polysaccharides caractérisé par la répétition d'un motif disaccharidique contenant un résidu d'acide uronique, tel que l'acide D-glucuronique ou l'acide L-iduronique, et d'une D-glucosamine qui peut-être N-sulfatée ou N-acétylée. L'unité disaccharidique peut-être également O-sulfatée en positions C6 et / ou C3 de la D-glucosamine et en C2 de l'acide uronique (Heparin-binding proteins, H.Edward Conrad, 1998, p1). Selon un aspect particulier, l'invention concerne des héparines de bas poids moléculaire, possédant la structure générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine, et lesdits polysaccharides constitutifs du mélange comportant à leur extrémité réductrice au moins 75 pour cent d'une glucosamine sous forme hémi- acétale, caractérisées en ce qu'elles présentent un poids moléculaire moyen de 5 3000 à 7000 Daltons, et en ce que au moins 90% desdits polysaccharides comportant à leur extrémité réductrice une glucosamine sous forme hémi-acétale possèdent la structure générale de formules (la) ou (lb) telles que définies plus haut. Selon un aspect particulier, l'invention concerne des héparines de bas poids moléculaire biotinylées mentionnées plus haut, dans lesquelles R1 représente un des enchaînements choisis parmi : O 10 dans lequel j a pour valeur 5, 15 ou o CH NH i 2 k N 2 20 dans lequel j et k ont chacun pour valeur 5. Selon un aspect particulier, l'invention concerne des héparines de bas poids 25 moléculaire biotinylées mentionnées plus haut, caractérisé en ce que lesdites héparines de bas poids moléculaire de départ sont choisies parmi l'Enoxaparine, l'Ardeparine, la Bémiparine, la Parnaparine, et la Tinzaparine. Selon un aspect particulier, l'invention concerne des héparines de bas poids 30 moléculaire biotinylées mentionnées plus haut, préparées à partir de l'Enoxaparine et qui comprennent; de 9% à 20% desdits polysaccharides constitutifs du mélange ont un poids moléculaire moyen inférieur à 2000 daltons, de 5% à 20% desdits polysaccharides ont un poids moléculaire moyen supérieur à 35 8000 daltons, de 60-86% desdits polysaccharides ont un poids moléculaire moyen compris entre 2000 et 8000 daltons, le ratio entre la masse moléculaire en masse et la masse moléculaire en nombre s'étendant entre 1,3 et 1,6 et lesdits héparines de bas poids moléculaire montrent une biodisponibilité et une activité anti-thrombotique meilleure que celle de l'héparine et possèdent un poids moléculaire moyen entre approximativement 3500 et 5500 daltons. L'invention englobe les héparines de bas poids moléculaire biotinylées sous la forme de l'un quelconque de leurs sels pharmaceutiquement acceptables. La présente invention concerne un procédé de préparation des héparines de bas poids moléculaire biotinylées mentionnées plus haut caractérisé en ce que : - on effectue une amination réductrice en présence d'un sel d'amine et d'un agent réducteur à une température comprise entre 20 et 80 C sur les héparines de bas poids moléculaire telles que définies dans les paragraphes ci-dessus, - puis on effectue une acylation avec un groupe -Biot ou -R1-Biot activé en présence d'une base en milieu aqueux, ou en milieu organique - lesdites étapes du procédé de préparation étant contrôlées par un suivi analytique HPLC type SAX, ou éventuellement par LC-MS. On vérifie notamment après l'étape cl'amination réductrice qu'au moins 90% desdits polysaccharides constitutifs du mélange comportant à leur extrémité réductrice une glucosamine sous forme hémi-acétale portent une fonction -NH2. On vérifie notamment après l'étape d'acylation qu'au moins 90% desdits polysaccharides amino-réduits comportant à leur extrémité réductrice une fonction -NH2 sont biotinylés, La présente invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation des héparines de bas poids moléculaire biotinylées caractérisé en ce que : - on effectue une amination réductrice en présence d'un sel d'halogénure d'ammonium et d'un sel de borohydrure à une température comprise entre 50 et 80 C sur les héparines de bas poids moléculaire telles que définies plus haut, - puis on effectue une acylation avec un groupe -Biot ou -R1-Biot activé en présence d'une base en milieu aqueux, -lesdites étapes du procédé de préparation étant contrôlées par un suivi analytique HPLC type SAX, ou éventuellement par LC-MS. Le suivi desdites étapes du procédé de préparation par HPLC type SAX est effectué en utilisant la méthode décrite dans le brevet WO2004/027087. Le suivi desdites étapes du procédé de préparation par LC-MS est effectué en utilisant par exemple la méthode décrite par Robert J. Linhardt dans J. Biol. C,hem., 2004, 279 (4), pp 2608-2615. Les héparines de bas poids moléculaire biotinylées peuvent être également analysées et caractérisées par chromatographie d'affinité sur avidine monomérique supportée. L'avidine monomérique supportée utilisée est commercialisée par la société Pierce, et les conditions d'analyses utilisées sont celles décrites par le fournisseur. Dans son principe le procédé de préparation des composés selon l'invention utilise des héparines de bas poids moléculaire préparés comme précédemment rapporté dans la littérature. On se référera notamment aux brevets US RE38,743 pour l'Enoxaparine, US 4,757,057 pour l'Ardeparine, EP293539 pour la Bémiparine, US 4,791,195 pour la Parnaparine et US 5,106,734 pour la Tinzaparine. Lesdits sels d'amine utilisés lors de la réaction d'amination réductrice peuvent être particulièrement des sels d'halogénures d'ammonium (NH4Z), Z représentant un halogène tel que par exemple chlore, brome, ou iode. Lesdits agents réducteurs utilisés lors de la réaction d'amination réductrice telle que définie plus haut peuvent être des sels de borohydrure, et plus préférentiellement des sels de cyanobohydrure. Ladite base utilisée lors de la réaction d'acylation telle que définie plus haut peut être à titre d'exemple un sel d'hydrogénocarbonate, ou de carbonate préférentiellement sous forme de sel de sodium, ou de potassium. Elle peut être également remplacée par toute autre base organique hydrosoluble connue de l'homme de l'art. Les dérivés R1-Biot tels que définis plus haut peuvent être mis en jeu dans la réaction d'acylation directement sous forme d'esters activés, préformé ou généré in-situ en utilisant des conditions classiques de couplage connues de l'homme de l'art. Le procédé décrit utilise plus particulièrement des esters activés qui peuvent être sous forme de dérivés succinimidyl et encore plus particulièrement des dérivés 3-sulfo-succinimidyl, sel de sodium. Le procédé de préparation selon la présente invention des héparines de bas poids moléculaire biotinylées mentionnées plus haut, dans lesquelles lesdits polysaccharides comprennent une liaison covalente avec un groupe -R1-Biot tel que défini plus haut, peut être décrit selon le schéma 1 suivant: o ox HNxNH OH H H E X H_R s o NHY B P SuIfoNHSR,Biot Base schéma 1 Selon le schéma 1, lesdites héparines de bas poids moléculaire biotinylées sont notamment transformées par une réaction d'amination réductrice en dérivé (A) présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice en présence d'un sel d'amine et d'un agent réducteur tel qu'un sel de borohydrure. Ce dérivé est ensuite notamment converti en dérivé biotinylé (B) par réaction avec un dérivé activé de biotine R1-Biot. Cette réaction s'effectue notamment avec l'ester de 6- biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfo-succinimidyl, sel de sodium en présence d'une base lorsque R1 représente l'enchaînement suivant: O N CH2 CH _ N-- z H clans lequel j et k ont chacun pour valeur 5. Elle peut s'effectuer avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfo-succinimidyl, sel de sodium en présence d'une base, lorsque R1 représente l'enchaînement suivant:30 o H iNùcH2 clans lequel j a pour valeur 5. La préparation définie dans le schéma 1 peut être généralisée auxdits polysaccharides comprenant une liaison covalente avec un groupe -Biot tel que défini plus haut; l'acylation s'effectuant notamment par réaction avec l'ester de biotinoyl 3-sulfo-succinimidyl, sel de sodium en présence d'une base. Dans ce qui suit, des exemples de synthèse des composés selon l'invention, et différents intermédiaires utiles à leur obtention, sont détaillés à titre d'illustration. Les abréviations suivantes sont utilisées ; SAX : est le sigle anglais Strong anion exchange chromatography ; Q.S.P. : Quantité Suffisante Pour ; I-IPLC : est le sigle anglais pour chromatographie liquide à haute pression (Hight Pressure Liquid Chromatography) ; LC-MS : est le sigle anglais pour Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy pour décrire le couplage chromatographie liquide -spectroscopie de masse. LC : est le sigle pour Long Chain est correspond à I'enchainement chimique 6-amino-hexanoyl ; LC LC : est le sigle pour représenter deux enchaînements LC qui correspond à l'enchaînement chimique amido hexanoyl-6-amino-hexanoyl ; Sulfo-NHS : sel de sodium de l'ester 3-sulfo-succinimidyl. Héparinase 1 est l'enzyme héparine lyase I (EC 4.2.2.7) de Flavobacterium heparinum. 1030 Exemple 1 : Enoxaparine NH LC Biotinoyl L'Enoxaparine: héparine de bas poids moléculaire obtenue selon le procédé décrit dans le brevet US RE38,743 peut également être convertie en dérivé biotinylé 5 selon la séquence réactionnelle décrit dans le schéma suivant : Composé 2 L'Enoxaparine est transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 1 présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice. Ce dérivé est ensuite converti en composé biotinylé 2 par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinmidyl, sel de sodium. 20 1.1: Enoxaparine 1- amino : 1 g d'Enoxaparine est mis en solution dans 40 ml d'une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 1 g de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution obtenue. Le mélange est porté à 60 C pendant 24 heures. La solution est ramenée à une température proche de 20 C, diluée à l'eau (Q.S.P. 100 ml). Le X = H or SO,Na Y = SO,Na, COCH, X= H or SO,Na Y = SO,Na, COCH, Enoxaparine sodique Composé 1 NaOOC NHY OX NHY a X H or SO,Na Y = SO,Na, COCH, 10 15 filtrat obtenu est déssalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 824 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 82 %. Le produit est contrôlé par HPLC SAX (voir figure 1) et engagé tel que dans l'étape de biotinylation. 1.2: Enoxaparine NH LC Biotinoyl : A une température voisine de 20 C, 200 mg d'Enoxaparine 1-amino sont mis en solution dans 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 136 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 20 C pendant 1 heure. La suspension obtenue est diluée par 10 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 136 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 18 heures. 136 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure. 70 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 3 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q.S.P. 200 ml), filtré sur membrane 0,45 pm, puis déssalé sur une colonne de Séphadex G10. La fraction obtenue est injectée sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée est déssalée sur une colonne de Séphadex G10. Le produit obtenu est de nouveau purifié par passage sur une colonne de Q-Sépharose et dessalage sur Séphadex G10. La fraction finale récoltée est lyophilisée. On obtient 190 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 87 %. Le produit obtenu est contrôlé par HPLC SAX (voir figure 1). Le produit obtenu est injecté sur une colonne d'avidine monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites par le fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non biotinylées (non affines à l'avidine) obtenues sont injectées sur HPLC SAX (voir figure 2). Spectre du mélange d'oligosaccharides dans D2O (25 C, 3 en ppm) : entre 1,3 et 1,8 (12H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (2CH2CO biotine, m), 2, 80 (1H, d, 12Hz), 3,03 (1H, dd, 12 et 5Hz), entre 3,15 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,99 (1H, d, 4Hz). La structure des composés principaux est confirmée par un couplage LC-MS. La figure 1 illustre le suivi réactionnel par HPLC SAX de la transformation de l'Enoxaparine par une réaction d'amination réductrice en dérivé (1) présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice. Ce dérivé est ensuite converti en dérivé biotinylé (2) par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinmidyl, sel de sodium. La méthode d'analyse employée est décrite dans le brevet WO2004/027087. La figure 1 (dessin 1/4) montre que les espèces présentant une glucosamine activée sont transformées en dérivé présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice avec un taux de conversion supérieur à 90 % pour fournir l'Enoxaparine 1-amino. La figure 1 montre également que les espèces présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées en dérivé biotinylé par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinmidyl, sel de sodium avec un taux de conversion supérieur à 90 % pour fournir l'Enoxaparine NH LC biotinoyl. A titre d'exemple, la figure 1 décrit la structure de certains composés principaux du mélange oligosaccharidiques. La nomenclature utilisée correspond à celle du brevet WO2004/027087. Les structures référencées sont les suivantes :30 NHSO~Na OSO,Na OSO,Na NHSO,Na AISISIdISId OSO,Na NaOOC A1SISId NaOOC NHS0,Na 41SISIdISIdISId 4ISISId1,6anhydro NHS0,Na 4ISISIdISIdl,Hanhydro AISISIdIsIdISId1 6anhydro 4IsIs,dNH2 4IsIsIdIsIdNH2 %N NHS0,Na OSO,Na NHSO Na 4IsIsIdNH LC Biot NaOOC NHS0,Na 41sIsIdIsIdNH LC Biot OSO,Na OSO,Na OSO,Na H COONa COONa N O O 0 OH H O NHSOsNa OSOyNa NHSO,Na OS%Na NHS0,Na NaOOC 41sisldIsIdIs,dNH LC Biot L'analyse LC-MS permet de confirmer la structure des composés ci-dessus par les spectres de masse correspondants aux produits sous forme acide : 4lslsld m/z = 1154 ; 4IsIsIdlsId m/z = 1731 ; 41slsIdlsldlsId m/z = 2308 ; 4lslSldl,6-anhydro m/z = 1056 ; 4ISISIdISId1,6-anhydro m/z = 1633 ; 4ISISIdISIdISld1,6-anhydro m/z =2210; 4lslsld NH2 m/z = 1155 ; 4lslsldlsld NH2 m/z = 1732 ; 4lslsldIsldlsId NH2 m/z = 2309 ; 4lslsld NH LC Biot mlz = 1494 ; 4lslsldlsld NH LC Biot m/z = 2071 ; 4IsIsldIsldIsld NH LC Biot m/z = 2648. La figure 2 illustre l'analyse HPLC SAX des fractions biotinylées et non biotinylées obtenues après passage sur une colonne d'avidine monomérique supportée. La figure 2 (dessin 2/4) montre que les espèces présentant une glucosamine activée ont été converties en espèces biotinylées correspondantes avec un taux de conversation supérieur à 90 %. La fraction non affine est constituée principalement des dérivés 1,6-anhydro qui de part leur nature ne peuvent pas être convertis en dérivés biotinylés. Les structures de certains des pics majoritaires sont fournies à titre d'exemple pour caractériser le produit obtenu. 25 30 35 Exemple 2 : Enoxaparine NH Biotinoyl L'Enoxaparine: héparine de bas poids moléculaire obtenue selon le procédé décrit dans le brevet US RE38,743 peut également être convertie en dérivé biotinylé selon la séquence réactionnelle décrit dans le schéma suivant : X = H or SO,Na Y = SO,Na, COCH, OSO,Na NHY O% NHY n X = H or SO,Na Y= SO,Na, COCH, NH,CI I NaBH,CN NaOOC Enoxaparine sodique NaOOC Composé 1 Composé 3 20 L'Enoxaparine est transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 1 présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice. Ce dérivé est ensuite converti en composé biotinylé 3 par réaction avec l'ester de biotinoyl-3- 25 sulfo-succinmidyl, sel de sodium. A une température voisine de 20 C, 200 mg d'Enoxaparine 1-amino sont mis en solution dans 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 107 mg de Sulfo-NHS-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 20 C pendant 1 heure 30. La suspension obtenue est 30 diluée par 10 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 107 mg de Sulfo-NHS- Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 3 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q.S.P. 150 ml), filtré sur membrane 0,45 pm, puis est injectée sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée est 10 15 déssalée sur une colonne de Séphadex G10 Là fraction récoltée est lyophilisée. On obtient 190 mg d'un Iyophilisat blanc. Le rendement observé est d'environ 90 %. Le produit obtenu est contrôlé par HPLC SAX (voir figure 3). Le produit obtenu est injecté sur une colonne d'avidine monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites par le fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non biotinylées (non affines à l'avidine) obtenues sont injectées sur HPLC SAX (voir figure 3). Spectre du mélange d'oligosaccharides dans D2O (25 C, â en ppm) : entre 1,4 et 1,8 (6H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,3 (CH2CO biotine, m), 2,80 (1H, dd, 12 et 7Hz), 3,03 (1H, m), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1H, d, 4Hz). La structure des composés principaux est confirmée par un couplage LC-MS. La figure 3 ( dessin 3/4) montre le profil HPLC SAX de l'Enoxaparine NH biotinoyl. Elle montre que les espèces présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées en dérivé biotinylé par réaction avec l'ester de biotinoyl-3-sulfo-succinmidyl, sel de sodium avec un taux de conversion supérieur à90%. A titre d'exemple, la figure 3 décrit la structure de certains composés principaux du mélange oligosaccharidiques. Les structures référencées sont les suivantes : OSO,Na NHSO,Na OSO/Na OSO,Na NHSO,Na 41SISIdISldt,6anhydro NHSO,Na Als l sid lsidl s,d,,6anhydro 41slsidNH Biot 41sIsidIsidNH Biot 41slsidlsidIs dNH Biot 20 L'analyse LC-Ms permet de confirmer la structure des composés ci-dessus par les spectres de masse correspondants aux produits sous forme d'acide : AISISId1,6-anhydro mlz = 1056 ; AlslSldlSld1,6-anhydro mlz = 1633 ; AISISIdlSIdlSldl,6-anhydro mlz 25 =2210; AIslsld NH Biot mlz = 1381 ; Alslsldlsld NH Biot mlz = 1958 ; /ISISIdISIdISId NH Biot mlz = 2535. La figure 3 illustre également l'analyse HPLC SAX des fractions biotinylées et non 30 biotinylées obtenues après passage sur une colonne d'avidine monomérique. La fraction non affine est constituée principalement des dérivés 1,6-anhydro qui de part leur nature ne peuvent pas être convertis en dérivés biotinylés. H 15 35 Exemple 3 : Enoxaparine NH-LC-LC Biotinoyl L'Enoxaparine: héparine de bas poids moléculaireobtenue selon le procédé décrit dans le brevet US RE38,743 peut également être convertie en dérivé biotinylé selon la séquence réactionnelle décrit dans le schéma suivant : NaOOC NH4CI / NaBH3CN OSO,Na NHY OX NHY n X = H or SO,Na Y = S0,Na, COCH, Enoxaparine sodique NaOOC NHY OX NHY _ n X = H or SO,Na Y= SO,Na, COCH0 Composé 1 15 20 Composé 4 L'Enoxaparine est transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 1 présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice. Ce dérivé est ensuite converti en composé biotinylé 4 par réaction avec l'ester de 6- 25 biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfo-succinmidyl, sel de sodium. A une température voisine de 20 C, 200 mg d'Enoxaparine 1-amino sont mis en solution dans 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 164 mg de Sulfo-NHS-LC-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 20 C pendant 2 heures. La suspension obtenue est 30 diluée par 10 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 164 mg de Sulfo-NHS-LC-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 5 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q.S.P. 150 ml), filtré sur membrane 0,45 pm, puis est injectée sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée est déssalée sur une colonne de Séphadex G10. La fraction récoltée est lyophilisée. On obtient 210 mg d'un Iyophilisat blanc. Le rendement observé est d'environ 92 %. Le produit obtenu est contrôlé par HPLC SAX (Voir figure 4). Le produit obtenu est injecté sur une colonne d'avidine monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites par le fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non biotinylées (non affines à l'avidine) obtenues sont injectées sur HPLC SAX (voir figure 4). Spectre du mélange d'oligosaccharides dans D2O (25 C, â en ppm) : entre 1,3 et 1,8 (16H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (6H, m), 2,80 (1H, dd, 12 et 7Hz), 3,03 (1H, m), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1 H, d, 4Hz). La structure des composés principaux est confirmée par un couplage LC-MS. La figure 4 (dessin 414) montre le profil HPLC SAX de l'Enoxaparine NH LC LC biotinoyl. Elle montre que les espèces présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées en dérivé biotinylé par réaction avec le 6-biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfo-succinmidyl, sel de sodium avec un taux de conversion supérieur à 90 %. A titre d'exemple, la figure 4 décrit la structure de certains composés principaux du mélange oligosaccharidiques. Les structures référencées sont les suivantes : 41SIS,d1.6anhydro 41sIs,dISId1,6anhydro NaOOC NHSO,Na OSO,Na NHSO,Na 41sIs,dNH LC LC Biot 4I S I S, d I s,d I S, d 1.6 a n hy dro 10 41SIs,dIS,dIs,dNH LC LC Biot 25 L'analyse LC-MS permet de confirmer la structure des composés ci-dessus par les spectres de masse correspondants aux produits sous forme d'acide L\ISISIdl,6-anhydro m/z = 1056 ; AISISIdlSldl,6-anhydro mlz = 1633 ; AISISIdISIdISId1,6-anhydro m/z =2210; AIslsld NH LC LC Biot m/z = 1607 ; AIsIsIdIsId NH LC LC Biot mlz = 2184 ; 30 DISISIdISIdlsId NH LC LC Biot mlz = 2761. La figure 4 illustre également l'analyse HPLC SAX des fractions biotinylées et non biotinylées obtenues après passage sur une colonne d'avidine monomérique supportée. NaOOC OSO,Na NHSO,N OSO,N OSO,Na NHSO,Na 41sls,dls,dNH LC LC Biot NHSO,Na OSO,Na 0$0,Na OSO,Na OSO,Na NaOOC 000Na COONa COONa ~O 0 N OV,`. O O 0 OH 0 15 20 La fraction non affine est constituée principalement des dérivés 1,6-anhydro qui de part leur nature ne peuvent pas être convertis en dérivés biotinylés. Exemple 4 : Tinzaparine NH LC Biotinoyl La Tinzaparine : héparine de bas poids moléculaire d'environ 6000 Daltons obtenue par traitement à l'héparinase 1 peut également être convertie en dérivé biotinylé selon la séquence réactionnelle décrite dans le schéma suivant : NaOOC NH4CI / NaBH3CN NHY OX NHY X = H or SOaNa Y = SO,Na, COCH44.1 : Tinzaparine 1- amino Composé 5 15 X = H or SO,Na Y = SO,Na, COCH, Composé 6 La Tinzaparine est transformée par une réaction d'amination réductrice en 20 composé 5 présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice. Ce dérivé est ensuite converti en composé biotinylé 6 par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinmidyl, sel de sodium. 250 mg de Tinzaparine sont mis en solution dans 10 ml d'une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 250 mg de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution obtenue. Le mélange est porté à 70 C pendant 20 heures. La solution est ramenée à une température proche de 20 C, diluée à l'eau (Q.S.P. 20 ml). Le filtrat obtenu est déssalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 215 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 86 %. Spectre du mélange d'oligosaccharides dans D2O (25 C, 8 en ppm) : 2,05 (CH3CO, s), 3,10 et 3,40 (1H chacun, m, CH2NH2), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1H, d, 4Hz). Le composé peut être contrôlé par HPLC SAX, en utilisant la méthode exposée précédemment dans l'exemple 1. Le produit est engagé tel que dans l'étape de biotinylation. 4.2 :Tinzaparine NH LC Biotinoyl A une température voisine de 20 C, 100 mg de Tinzaparine 1- amino sont mis en solution dans 2,5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 47 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 20 C pendant 1 heure 45 minutes. La suspension obtenue est diluée par 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 47 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 6 heures. 47 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 20 heures. La suspension est encore diluée par 1 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium et 47 mg de Sulfo-NHS-LCBiotine sont ajoutés de nouveau. Le mélange réactionnel est agité pendant 20 heures. La suspension est de nouveau diluée par 6,5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium et 47 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau. Le mélange réactionnel est agité pendant 22 heures puis est dilué à l'eau (Q.S.P. 100 ml), filtré sur membrane 0,45 pm, est injecté sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée est déssalée sur une colonne de Séphadex G10. La fraction finale récoltée est lyophilisée. On obtient 110 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est quantitatif. Spectre du mélange d'oligosaccharides dans D2O (25 C, 6 en ppm) : entre 1,3 et 1,8 (12H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (4H, m), 2,80 (1H, dd, 12 et 7Hz), 3,03 (1H, m), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1H, d, 4Hz). Les composés Tinzaparine 1-amino et Tinzaparine NH LC Biotinoyl obtenus peuvent également être caractérisés par les méthodes HPLC SAX précédemment utilisées dans l'exemple 1. Ce contrôle HPLC montre que les espèces présentant une glucosamine activée sont transformées en dérivé présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice avec un taux de conversion supérieur à 90 % pour fournir la Tinzaparine 1-amino. Il montre également que les espèces présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées en dérivé biotinylé par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinmidyl, sel de sodium avec un taux de conversion supérieur à 90 % pour fournir la Tinzaparine NH LC biotinoyl. De la même façon que dans l'exemple 1, les structures des composés principaux peuvent être confirmés par analyse LC-MS. Le produit obtenu peut également être injecté sur une colonne d'avidine monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites par le fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non biotinylées (non affines à l'avidine) obtenues peuvent être contrôlées par HPLC SAX. Exemple 5 : Bémiparine NH LC Biotinoyl La Bémiparine : héparine de bas poids moléculaire d'environ 3500 Daltons obtenue par dépolymérisation alcaline peut également être convertie en dérivé biotinylé selon la séquence réactionnelle décrit dans le schéma suivant : 30 Composé 8 La Bémiparine est transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 7 présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice. Ce dérivé est ensuite converti en composé biotinylé 8 par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfo-succinmidyl, sel de sodium. 15 5.1 Bémiparine 1- amino : 250 mg de Bémiparine sont mis en solution dans 10 ml d'une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 250 mg de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution obtenue. Le mélange est porté à 70 C pendant 20 heures. La solution est ramenée à une température proche de 20 C, diluée à l'eau (Q.S.P. 20 ml). La 20 solution obtenue est déssalée sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 227 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 91 %. Spectre du mélange d'oligosaccharides dans D2O (25 C, 6 en ppm) : 2,05 (CH3CO, s), 3,10 et 3,40 (1H chacun, m, CH2NH2), entre 3,20 et 5,80 (protons 25 polysaccharides), 5,98 (1H, d, 4Hz). 10 Le composé peut être contrôlé par HPLC SAX, en utilisant la méthode exposée précédemment dans l'exemple 1. Le produit obtenu est engagé tel que dans l'étape de biotinylation. 5.2: Bémiparine NH LC Biotinoyl : A une température voisine de 20 C, 100 mg de Bémiparine 1-amino sont mis en solution dans 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 80 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 20 C pendant 2 heures. La suspension obtenue est diluée par 10 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 80 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 2 heures. 40 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 20 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q.S.P. 50 ml) puis déssalé sur une colonne de Séphadex G10. La fraction obtenue est injectée sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée est déssalée sur une colonne de Séphadex G10. Le produit obtenu est de nouveau purifié par passage sur une colonne de Q-Sépharose et dessalé sur Séphadex G10. La fraction finale récoltée est lyophilisée. On obtient 101 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 92 %. Spectre du mélange d'oligosaccharides dans D20 (25 C, 8 en ppm) : entre 1,3 et 1,8 (12H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (4H, m), 2,80 (1H, dd, 12 et 7Hz), 3,03 (1H, m), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1H, d, 4Hz). Les composés Bémiparine 1-amino et Bémiparine NH LC Biotinoyl obtenus peuvent également être caractérisés par les méthodes HPLC SAX précédemment utilisées dans l'exemple 1. Ce contrôle HPLC montre que les espèces présentant une glucosamine activée sont transformées en dérivé présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice avec un taux de conversion supérieur à 90 % pour fournir la Bémiparine 1-amino. Il montre également que les espèces présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées en dérivé biotinylé par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinmidyl, sel de sodium avec un taux de conversion supérieur à 90 % pour fournir la Bémiparine NH LC biotinoyl. De la même façon que dans l'exemple 1, les structures des composés principaux peuvent être confirmées par analyse LC-MS. Le produit obtenu peut également être injecté sur une colonne d'avidine monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites par le fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non biotinylées (non affines à l'avidine) obtenues peuvent être contrôlées par HPLC SAX. Les composés selon l'invention ont fait l'objet d'études biochimiques et pharmacologiques. 1. Mesure de l'activité anti-facteur Ila et de l'activité anti-facteur Xa L'activité anti-facteur lla (anti-Fila) et l'activité anti-facteur Xa (anti-FXa) dans le plasma humain ou un système tampon sont analysés par méthode chromogènique : l'activité anti-facteur lla est testée au moyen du kit d'anti-facteur lia d'héparine d'Actichrome (American diagnostica) contenant le substrat chromogène S-2238, l'a-thrombine et l'ATIII humain (antithrombine III). L'activité anti-FXa est déterminée avec l'instrument automatisé de coagulation ACL 7000 (Instrumentation Laboratory) employant le kit Héparine (Instrumentation Laboratory) contenant de l'ATIII, le facteur Xa et le substrat chromogène S-2765. Les deux analyses sont réalisées exactement selon les instructions du fabricant. Les standards suivants sont employés pour établir une courbe d'étalonnage standard pour mesurer l'activité in vitro des fractions d'énoxaparine biotinylée dans le plasma humain et le système tampon : - 1er standard international pour les héparines de bas poids moléculaire (National Institute for Biological Standards and Control, Londres, R-U, établi en 1987, code n 85/600) -2ème standard international pour les héparines de bas poids moléculaire (National Institute for Biological Standards and Control, Londres, R-U, établi en 1987, code n 01/608, utilisé depuis juin 2006) - Enoxaparine (Clexane , sanofi-aventis, France) a été employé comme référence interne. Pour les déterminations d'activité anti-Fila, 10 pI d'échantillon ou de standards internationaux des héparines de bas poids moléculaire sont dilués au 1:16 avec l'antithrombine dans le plasma humain ou le système tampon contenant Tris HCI 0,05 M, NaCl 0,154M, à pH 7,4. 10 pl de cette solution sont ajoutés dans une plaque 96 puits microtitre. La mesure est reproduite en triple (sur 3 puits). La plaque microtitre est maintenue à 37 C en agitant à 300 t/min. 40 pI de thrombine sont ajoutés à chacun des puits et incubés pendant exactement 2 mn. 40 pI de Spectrozyme sont ajoutés. Après 90 secondes, la réaction est arrêtée par ajout de 40 pI d'acide acétique. L'absorption est mesurée à 405 nm en utilisant un SpectraMax 340 (Molecular devices). Pour des mesures d'activité anti-FXa, l'échantillon ou les standards internationaux des héparines de bas poids moléculaire sont dilués dans le plasma humain ou le système tampon contenant Tris HCI 0,05 M, NaCl 0,154M, pH 7,4. Les échantillons contenant les héparinoïdes dans le plasma ou le tampon sont encore dilués au 1:20 avec un tampon de travail contenant l'ATIII, et placés en double dans le rotor de sondage. Le réactif facteur Xa et le substrat chromogène sont versés dans les réservoirs indiqués de l'instrument automatisé de coagulation ACL 7000. La mesure de l'activité anti-FXa est réalisée avec le protocole "héparine" intégrée dans le logiciel de I'ACL 7000. Pendant l'analyse, 50 pI de l'échantillon (dilué avec le tampon de travail) sont mélangés à 50 pI du réactif facteur Xa. Après un temps d'incubation de 60 secondes à 37 C, 50 pI de substrat chromogène de concentration 1,1 mM sont ajoutés et les changements de l'absorption en fonction du temps sont mesurés à la longueur d'onde de 405 nM. 35 Les résultats obtenus sont décrits notamment dans le tableau ci-dessous : Activité anti-FXa UI / mg Activité anti-Fila UI / mg Enoxaparine 121 28 Enoxaparine 1-amino 116 26,5 Enoxaparine NH LC 101 21 Biotinoyl Enoxaparine NH Biotinoyl 98 29 Enoxaparine NH LC LC 82 24 Biotinoyl Tinzaparine 108 79 Tinzaparine 1-amino 113 80 Tinzaparine NH LC 106 63 biotinoyl Bémiparine 138 17 Bémiparine 1-amino 101 16 Bémiparine NH LC 93 13 biotinoyl 2. Mesure de l'activité du facteur anti-FXa après neutralisation par l'avidine. Neutralisation de l'effet de produits biotinylés par l'avidine en solution L'activité anti-FXa ou anti-Fila antithrombine dépendante des produits est mesurée en présence de concentration croissante d'avidine afin de mesurer l'effet de la liaison de l'avidine à la biotine du produit sur cette activité. Les produits à étudier sont mis en solution à 1 mg/ml dans eau à 0,9% NaCl. On dilue ensuite les produits de façon à obtenir une concentration de produit capable d'inhiber 50 % de l'activité du facteur Xa (Factor Xa, chromogenix Milan, Italie), ou du facteur lia (Factor Ila, laboratoire du sang, Strasbourg) en présence d'antithrombine (Antithrombine humaine Milan, Italie). On mesure ensuite cette inhibition en présence de concentration décroissante d'avidine (Avidine SIGMA du blanc d'ceuf, Ref A-9275, à diluer dans NaCl) :300, 30, 3, 0.3, 0.03, 0.003, 0 pg/ml. Le dosage de l'activité résiduelle du facteur Xa (ou facteur lia) se fait en ajoutant un substrat chromogène spécifique ; S2222 (Chromogenix, Milan, Italie) pour le facteur Xa, le substrat S2238 (Chromogenix, Milan, Italie) pour le facteur Ila. La lecture de la densité optique se fait à 405 nm. Mise en évidence de la liaison des produits biotinylés à l'avidine liée à des billes en tampon Afin d'évaluer la capacité des produits à lier l'avidine, les produits sont mis en présence d'avidine liée à des billes. Après centrifugation du mélange l'activité anti- FXa ou anti-Fila est déterminée dans le surnageant. Cette activité permet de déterminer la concentration restante dans le milieu et ainsi de déterminer la partie de produit piégée dans le culot après centrifugation du mélange. Les produits à étudier sont mis en solution à 1 mg/ml dans une solution NaCl 0,9 15 %. Les produits sont dilués de façon à pouvoir inhiber 80 % de l'activité anti-FXa ou anti-Fila présent dans le test. La solution de billes est amenée à 1 mg/mL en la diluant avec le tampon de lavage tris Maléate 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,35. La solution est bien agitée et 100 pl de la solution contenant les billes (1 mg/ml) 20 sont placés dans un tube Eppendorf. On ajoute 500 pl de tampon. Les tubes sont centrifugés à 12000 tlmn pendant 5mn. Après élimination du surnageant le culot est repris dans 500 pm de tampon. Après agitation une deuxième centrifugation est pratiquée et le surnageant est à nouveau éliminé. Les solutions de produit sont alors mises en présence de différentes solutions 25 contenant les billes de façon à avoir les ratio produit/billes exprimés en pg produitlpg avidine (Avidine SIGMA Ref A-9275 ,solution à environ3mg/ml selon le lot) de 1, 0.1, 0.01 et 0.001. Les mélanges sont ensuite agités et laissé au repos pendant 1 heure avant une centrifugation à 12000 t/mn pendant 5 minutes. Le surnageant est alors repris pour 30 doser l'activité anti-FXa afin de déterminer la concentration de produit restant dans le surnageant. Le dosage de l'activité anti-FXa ou anti-Fila se fait en suivant une méthode modifiée de celle décrite par Teien A.N and le M. Thrombosis Research 10, 399-410 (1977). 35 Les résultats obtenus sont décrits notamment dans le tableau ci-dessous : Quantité d'avidine (tag) Activité anti-FXa résiduelle Enoxaparine NH LC 0,034 19 % Biotinoyl Enoxaparine NH Biotinoyl 0,0245 19 % Enoxaparine NH LC LC 0,0276 13 % Biotinoyl Ainsi, la présente invention a également pour objet un procédé mettant en oeuvre l'avidine ou la streptavidine caractérisé en ce qu'il permet de neutraliser des héparines de bas poids moléculaire biotynilées selon l'invention. L'avidine ou la streptavidine peuvent être utilisées pour la préparation de médicaments destinés à neutraliser des héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la présente invention. Les composés de la présente invention, lesdites héparines de bas poids moléculaires biotinylées, peuvent être utilisés comme agents anti-thrombotiques. En particulier, ils sont utiles pour la prévention des thromboses veineuses, des accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde, ou l'angor instable, les thromboses artérielles périphériques telles que les arthériopathies des membres inférieurs, les thromboses artérielles cérébrales, et les accidents vasculaires cérébraux. Ils sont également utiles dans la prévention et le traitement de la prolifération des cellules musculaires lisses, l'angiogénèse, et comme agent neuroprotecteurs de l'athérosclérose et de l'artériosclérose. Les composés selon l'invention peuvent être utilisés pour la préparation de médicaments destinés à traiter les maladies ci-dessus. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique contenant, en tant que principe actif, des héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'invention ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables, éventuellement en association avec un ou plusieurs excipients inertes et appropriés. Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités : orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, transmuqueux, locale ou rectale. Dans chaque unité de dosage, le principe actif est présent dans les quantités adaptées aux doses journalières envisagées afin d'obtenir l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré. Chaque unité de dosage peut contenir de 20 à 150 mg de principe actif, de préférence de 40 à 100 mg. Ces doses de composés anticoagulants pourraient être neutralisées par des doses d'avidine ou de streptavidine allant de 0,2 à 2 g en injection iv (intraveineuse), bolus ou perfusion. Les composés selon l'invention peuvent également être utilisés en association avec un ou plusieurs autres principes actifs utiles pour la thérapeutique souhaitée tels que des anti-thrombotiques, des anticoagulants, des antiagrégants plaquettaires. REVENDICATIONS 1. Héparines de bas poids moléculaire liées de façon covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. 5 2 Héparines de bas poids moléculaire, possédant la structure générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine, lesdits polysaccharides constitutifs du mélange comportant à leur extrémité réductrice au moins 75 pour cent d'une glucosamine sous forme hémi-acétale, caractérisées en ce qu'elles présentent un 10 poids moléculaire moyen de 3000 à 7000 Daltons, et en ce que lesdits polysaccharides constitutifs du mélange possèdent la structure générale de formules (la) ou (lb) telles que définies ci-dessous: OX OH P EL' OX~NùR1 ùBiotOX OH P OXrNHùBiot NHY (la) NHY (lb) dans lesquelles, 15 PE : représente une chaîne polysaccharidique ayant la structure générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine, X représente H ou SO3Na, Y représente SO3Na ou COCH3, le trait ondulé désigne une laison située soit au-dessous soit au-dessus du plan du 20 cycle pyranosique, R, représente un des enchaînements choisis parmi : O ou k H 25 CH2dans lesquels j et k, identiques ou différents, sont des entiers pouvant prendre toute valeur de 1 à 10, et Biot représente le groupe biotine de formule: S ùCù(CH2V.. 0 HH HN_ NH 0 ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. 3. Héparines de bas poids moléculaires biotinylées selon la revendication 2 caractérisées en ce que RI représente un enchaînement, choisis parmi : O H CH2 dans lequel j a pour valeur 5, ou 0 H CH2 k Nù H CH2 dans lequel j et k ont chacun pour valeur 5, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. 4. Héparines de bas poids moléculaires biotinylées selon l'une quelconques des revendications 1 à 3 caractérisées en ce que lesdites héparines de bas poids moléculaire sont choisies parmi l'Enoxaparine, l'Ardeparine, la Bémiparine, la Parnaparine, et la Tinzaparine, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. 5. Héparines de bas poids moléculaires biotinylées selon l'une quelconques des revendications 1 à 3 caractérisées en ce que: de 9% à 20% desdits polysaccharides constitutifs du mélange ont un poids moléculaire moyen inférieur à 2000 daltons,de 5% à 20% desdits polysaccharides ont un poids moléculaire moyen supérieur à 8000 daltons, de 60-86% desdits polysaccharides ont un poids moléculaire moyen compris entre 2000 et 8000 daltons, le ratio entre la masse moléculaire en masse et la masse moléculaire en nombre s'étendant entre 1,3 et 1,6, et lesdits héparines de bas poids moléculaire montrent une biodisponibilité et une activité anti-thrombotique meilleure que celle de l'héparine et possèdent un poids moléculaire moyen entre approximativement 3500 et 5500 daltons, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. 6. Procédé pour la préparation des héparines de bas poids moléculaires biotinylées telles que définies dans l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que : - on effectue une amination réductrice en présence d'un sel d'amine et d'un agent réducteur à une température comprise entre 20 et 80 C sur des héparines de bas poids moléculaire, - puis on effectue une acylation avec un groupe -Biot ou -R1-Biot activé en présence d'une base en milieu aqueux, -lesdites étapes du procédé de préparation étant contrôlées par un suivi analytique HPLC type SAX, ou éventuellement par LC-MS. 7. Procédé pour la préparation des héparines de bas poids moléculaires biotinylées selon la revendication 6 caractérisé en ce que ladite amination réductrice s'effectue en présence d'un sel d'halogénure d'ammonium et d'un sel de borohydrure à une température comprise entre 50 et 80 C sur lesdites héparines de bas poids moléculaire. 8. Utilisation d'une héparine de bas poids moléculaire biotinylées selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la préparation d'un médicament utile dans la prévention des thromboses veineuses, des accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde, ou l'angor instable, les thromboses artérielles périphériques telles que les arthériopathies des membres inférieurs, les thromboses artérielles cérébrales, et les accidents vasculaires cérébraux, dans la prévention et le traitement de la prolifération des cellulesmusculaires lisses, l'angiogénèse, et comme agent neuroprotecteurs de l'athérosclérose et de l'artériosclérose. 9. Compositions pharmaceutiques contenant, en tant que principe actif, des héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 éventuellement en association avec un ou plusieurs excipients inertes et appropriés. 10. Utilisation des compositions pharmaceutiques selon la revendication 9 comme agents antithrombotiques, pour la prévention des thromboses veineuses, des accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde, ou l'angor instable, les thromboses artérielles périphériques telles que les arthériopathies des membres inférieurs, les thromboses artérielles cérébrales, et les accidents vasculaires cérébraux, pour la prévention et le traitement de la prolifération des cellules musculaires lisses, l'angiogénèse, et comme agent neuroprotecteurs de l'athérosclérose et de l'artériosclérose. 11. Procédé mettant en oeuvre l'avidine ou la streptavidine caractérisé en ce qu'il permet de neutraliser les héparines de bas poids moléculaires biotinylées selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 12. Utilisation d'avidine ou de streptavidine pour la préparation de médicaments destinés à neutraliser les héparines de bas poids moléculaires biotinylées selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.20