FR 2913501 A1 20080912 FR 0701578 A 20070305 -1- "Procédé de détection d'une contamination fongique" La présente invention concerne un procédé de détection d'une contamination fongique dans des environnements 5 intérieurs. Par environnement intérieur on entend un espace confiné à l'intérieur d'un bâtiment qui est aéré de façon non continu. Des exemples d'environnements intérieurs 10 peuvent être trouvés dans les habitations, les musées, les églises, les caves, les monuments historiques, les bâtiments administratifs, les écoles et les hôpitaux. Depuis les années 70 et le premier choc pétrolier, la 15 politique d'économie d'énergie mise en oeuvre a entraîné un confinement des habitations avec notamment l'isolation accrue des bâtiments. Cette politique associée à la généralisation d'équipements ménagers générateurs de vapeur, tels que des lave-linge et des 20 sèche-linge, a eu pour conséquence une augmentation de l'humidité relative favorable à la prolifération des microorganismes, notamment des moisissures, sur la plupart des supports tels que des matériaux de construction. 25 Les locaux sont alors susceptibles de constituer des niches écologiques pour le développement de ce type de microorganismes. Ce phénomène s'est ainsi traduit par une augmentation du nombre de locaux contaminés par 30 les moisissures depuis les trente dernières années. La présence de moisissures dans les environnements intérieurs n'est pas sans conséquences sanitaires. En effet, de nombreuses études ont démontré leur rôle à la 35 fois dans la dégradation des matériaux et des ouvrages qu'elles colonisent, mais également dans l'apparition de symptômes chez les occupants de locaux comportant des moisissures. - 2 - Au cours des deux dernières décennies, de nombreuses études réalisées en Amérique du Nord et en Europe ont mis en évidence que, dans certaines circonstances d'exposition, ces microorganismes pouvaient être responsables de l'apparition de maladies notamment respiratoires telles que des allergies, infections ou toxi-infections. A ce jour, les techniques utilisées pour détecter la présence de moisissures dans les environnements intérieurs reposent sur la reconnaissance visuelle d'un développement fongique et la mise en culture de conidies prélevées dans l'air ou sur les surfaces. Or, la présence de ces microorganismes peut se révéler difficile à diagnostiquer dans le cas de contaminations masquées pour lesquelles les spores ne sont pas émises dans l'environnement (lorsque les contaminations se situent au niveau du système de ventilation ou encore dans les structures du bâtiment par exemple). Invisibles alors à la surface des produits de construction, et indécelables par l'analyse microbiologique de l'air, les moisissures produisent néanmoins, en continu, des métabolites et produits de dégradation inhalables et responsables dans certains cas de maladies. De plus, la réponse de ces techniques de mesure est longue puisqu'il est nécessaire d'attendre la croissance en laboratoire des microorganismes prélevés avant de pouvoir réaliser l'analyse. Un objet de la présente invention est donc de pallier à tout ou partie des inconvénients cités ci-dessus. Les champignons émettent dès le début de leur développement des molécules volatiles (Composés Organiques Volatils) issues soit de leur métabolisme, soit de la dégradation du matériau sur lequel ils se développent par les enzymes ou les acides qu'ils - 3 - produisent. Contrairement aux spores, ces composés se dispersent dans l'environnement sans être retenus par les supports. Par conséquent la détection de certains de ces composés qui sont spécifiques d'une ou de plusieurs espèces fongiques, permet d'une part l'identification d'une contamination dès le début du développement des champignons et d'autre part la détection des contaminations masquées pour lesquelles les spores ne sont pas émises dans l'environnement. La Société Demanderesse a maintenant trouvé que certains COV n'étaient présents dans l'air ambiant qu'en présence de moisissures. Ces COV sont donc spécifiquement issus du métabolisme fongique. La Société Demanderesse a également trouvé que certains autres COV étaient présents dans l'air ambiant non seulement en présence de moisissures, mais aussi en présence de certains matériaux de construction ou encore d'autres contaminations biologiques telles que les contaminations bactériennes. Un exemple d'un telle contamination bactérienne est la géosmine qui est émise à la fois par des moisissures et des bactéries. Forte de cette découverte, la Société Demanderesse a pu mettre en évidence que ces COV spécifiquement issus du métabolisme fongique peuvent être divisés en deux groupes . - les COV qui sont émis indépendamment de l'espèce fongique et du support sur lequel se développe 30 l'espèce fongique, et - les COV qui sont émis en fonction de l'espèce fongique et/ou du support sur lequel elle se développe. 35 Parmi les COV qui sont émis indépendamment de l'espèce fongique et de son support, on distingue les COV qui ne sont émis que par des espèces fongiques et les COV qui peuvent avoir d'autres origines biologiques. - 4 - Elle a ainsi déterminé trois catégories distinctes de COV fongiques. La détection de ces COV est à la base de l'invention. C'est ainsi que la Société Demanderesse a eu le mérite, après des travaux de recherche longs et approfondis, de développer un procédé de détection d'une contamination fongique dans des environnements intérieurs qui permet la détection d'une telle contamination fongique même en l'absence de signes de contaminations visibles. Ainsi, le procédé de détection d'une contamination fongique d'un environnement intérieur selon l'invention comprend les étapes suivantes : a. prélèvement d'un échantillon de composés organiques volatils (COV) dans un environnement intérieur, b. détection de la présence ou de l'absence de certains COV prédéterminés, issus du métabolisme fongique, ces COV prédéterminés comprenant au moins un COV de chacune des trois catégories de COV suivantes : (1) COV qui sont émis indépendamment de l'espèce fongique et de leur support et qui ne sont émis que par des espèces fongiques ; (2) COV qui sont émis indépendamment de l'espèce fongique et du support, mais qui peuvent également avoir d'autres origines biologiques ; et (3) COV qui sont émis en fonction de l'espèce fongique et/ou du support ; c. calcul d'un indice chimique de contamination fongique en fonction respectivement de la présence et de l'absence des COV prédéfinis, issus du métabolisme fongique. Les COV qui ne sont émis que par des espèces fongiques et dont l'émission est indépendante du support comprennent notamment le 1-octèn-3-ol, le 1,3-octadiène et le méthyl-2-éthylhexanoate. Les COV qui peuvent - 5 également avoir d'autres origines biologiques dont l'émission est indépendante du support comprennent le 2-méthylfurane, le 3-méthylfurane, le 3-méthyl-lbutanol, le 2- méthyl-l-butanol et le a-pinène. Les COV qui sont émis en fonction de l'espèce fongique et/ou du support comprennent notamment le 2-heptène, le diméthylsulfide, le 4-heptanone, le 2(5H)-furanone, le 3-heptanol et le méthoxybenzène. Dans un mode de réalisation, les COV prédéterminés comprennent outre les COV des catégories (1), (2), (3) également le 2-éthylhexanol. Conformément au procédé de l'invention, l'étape a) de prélèvement de l'échantillon de COV est de préférence réalisée par échantillonnage diffusif sur un adsorbant solide de type carbographe 4. A partir de l'échantillon de COV prélevé à l'étape a) on détecte la présence ou l'absence de certains COV prédéterminés, issus du métabolisme fongique. Ces COV prédéterminés comprennent au moins un COV qui est émis indépendamment de l'espèce fongique et de son support et qui n'est émis que 25 par des espèces fongiques ; un COV qui est émis indépendamment de l'espèce fongique et du support, mais qui peut également avoir d'autres origines biologiques ; et un COV qui sont émis en fonction de l'espèce 30 fongique et/ou du support. En détectant la présence ou l'absence d'au moins un COV de chacune des trois catégories de COV citées ci-dessus, on augmente la certitude du procédé de 35 détection selon l'invention par rapport à une détection de la présence ou l'absence de COV issus d'une seule de ces catégories. De préférence, on détectera plusieurs COV de chacune - 6 - des trois catégories pré-citées. Dans un mode de réalisation avantageux, les COV de la catégorie (1) sont choisis dans le groupe comprenant le 1-octen-3-ol, le 1,3-octadiène et le méthyl-2-éthylhexanoate, les COV de la catégorie (2) sont choisis dans le groupe comprenant le 2-méthylfurane, le 3-méthylfurane, le 3-méthyl-l-butanol, le 2- méthyl-lbutanol et le a-pinène, et les COV de la catégorie (3) sont choisis dans le groupe comprenant le 2-heptène, le diméthylsulfide, le 4-heptanone, le 2(5H)-furanone et le 3-heptanol. De préférence, les COV prédéterminés sont détectés par 15 chromatographie en phase gazeuse suivie de spectrométrie de masse (GC/MS). Après la détection de la présence ou l'absence de chacun des COV prédéterminés, on calcule un indice 20 chimique de contamination fongique. Ce calcul est basé sur les constatations suivantes, que la Société Demanderesse a pu faire après des recherches longues et approfondies. 25 La présence de COV spécifiquement issus du métabolisme fongique, qui sont émis indépendamment de l'espèce fongique et de son support et qui ne sont émis que par des espèces fongiques, indique directement la présence d'une contamination fongique tandis que l'absence de 30 tels COV indique l'absence d'une contamination fongique. Par contre, la présence de COV issus du métabolisme fongique, qui peuvent aussi avoir d'autres origines 35 biologiques ne permet pas de conclure sur une contamination fongique. Toutefois, l'absence de tels COV indique l'absence d'une contamination fongique. En ce qui concerne les COV spécifiquement issus du - 7 - métabolisme fongique mais qui sont émis en fonction de l'espèce fongique et/ou du support, leur présence indique la présence d'une contamination fongique, tandis que leur absence ne permet pas de conclure sur l'absence d'une contamination fongique. Un cas particulier est le méthyl-2-éthylhexanoate qui, à la base, fait partie des COV émis indépendamment de l'espèce fongique et de son support, mais dont la formation semble être due à la transformation de 2-éthylhexanol par la moisissure. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, il est supposé que le 2-éthylhexanol se transforme en méthyl-2-éthylhexanoate par l'intermédiaire d'une réaction d'oxydation en acide 2-éthylhexanoïque lequel est ensuite estérifié en méthyl-2-éthylhexanoate. La présence de méthyl-2-éthylhexanoate permet de conclure à la présence d'une contamination fongique. En revanche, en cas d'absence de méthyl-2-éthylhexanoate, il est important de détecter la présence ou l'absence de 2-éthylhexanol. Si, dans ce cas, le 2-éthylhexanol est présent, on peut conclure à l'absence d'une contamination fongique. Si, par contre, le 2-éthylhexanol est absent, on ne peut pas conclure à la présence d'une contamination fongique. Sur la base de ces constatations, la Société Demanderesse a eu le mérite de mettre au point une méthode de calcul d'un indice chimique de contamination fongique qui est basé sur l'incrémentation suivante. La présence d'un COV est incrémentée d'une valeur 1 Si la présence du COV indique la présence d'une contamination fongique et d'une valeur 0 Si la présence du COV ne permet pas de conclure à la présence d'une contamination fongique. L'absence d'un COV est incrémentée d'une valeur -1 Si l'absence du COV indique l'absence d'une contamination fongique et d'une valeur 0 Si l'absence du COV ne permet pas de conclure à l'absence d'une contamination fongique. Le - 8 tableau 1 ci-dessous résume les principes d'incrémentation. Tableau 1: Incrémentation Incrémentation COV présence absence émis indépendamment de 1 -1 l'espèce fongique et de son support, émis que par des espèces fongiques émis indépendamment de 0 -1 l'espèce fongique et du support, peut également avoir d'autres origines biologiques émis en fonction de 1 0 l'espèce fongique et/ou du support Dans le cas particulier du méthyl-2-éthylhexanoate la présence du méthyl-2-hexanoate est incrémentée d'une valeur 1 , tandis que son absence est incrémentée d'une valeur -1 Si le 2-éthylhexanol est présent dans l'échantillon et d'une valeur 0 Si le 2-éthylhexanol est absent de l'échantillon. Le tableau 2 résume le principe d'incrémentation par rapport au méthyl-2-hexanoate. Tableau 2: Incrémentation méthyl-2-éthylhexanoate Incrémentation COV présence absence 2-éthylhexanol 2-éthylhexanol présent absent méthyl-2-hexanoate 1 -1 0 - 9 - L'indice chimique de contamination fongique est calculé par addition des incréments qui ont été attribués à la présence ou à l'absence de chacun des COV prédéterminés. Le résultat de cette addition, c'est-à- dire l'indice chimique de contamination fongique est donc soit une valeur négative, soit égale à zéro, soit une valeur positive. Si l'indice chimique de contamination fongique est une valeur inférieure ou égale à 0, ceci indique l'absence d'une contamination fongique. Un indice de contamination fongique strictement positif indique la présence d'une contamination fongique. Le procédé de détection d'une contamination fongique selon l'invention est particulièrement utile pour la détection précoce d'une telle contamination, c'est-à-dire avant l'apparition de signes visibles de contamination. Cette possibilité de détection précoce est par exemple de grande importance dans des monuments historiques, des églises ou des musées, où des dommages irréparables ont en général déjà été causés quand les premiers signes visibles d'une contamination fongique apparaissent. Les exemples de réalisation suivants illustrent la présente invention, sans en limiter en aucune façon la portée. EXEMPLE 1 : Prélèvement d'un échantillon de COV dans un environnement intérieur Des prélèvements de COV in situ ont été réalisés par échantillonnage diffusif sur un adsorbant solide de type carbograph 4 dans douze logements. Cinq des douze logements contenaient au moins une pièce ayant une tache de moisissure visible supérieure à 1 m2 (habitations 1 à 5) et sept des douze logements ne présentaient pas de signes visibles de contamination fongique (habitations 7 à 12). Le prélèvement est -assuré par un tube à diffusion. L'échantillonneur est composé d'une cartouche, d'un corps diffusif et d'un adaptateur. La cartouche est cylindrique (40-60 mesh s.s. net), de diamètre externe 4,8 mm, et contenant 300 mg de charbon graphitisé (Carbograph 4). Cette cartouche est placée avant le prélèvement dans un corps diffusif en polyéthylène. L'ensemble est ensuite vissé sur un portoir à l'aide d'un support clipable. Les tubes passifs sont exposés sur site pendant une durée de 7 jours. Le point de prélèvement se situe entre 0,5 et 1 m de hauteur. Après exposition, les cartouches sont conservées au réfrigérateur avant analyse. La majeur partie des COV (fongique ou non) composant l'air du logement sont alors piégés dans l'adsorbant. EXEMPLE 2 : Détection de la présence ou l'absence de certains COV Les tubes contenant l'adsorbant sont transférés dans une chaîne analytique du laboratoire. Cette chaîne consiste en la combinaison de trois techniques : - la chromatographie en phase gazeuse (GC) utilisée pour séparer les COV, - l'ionisation de flamme (FID) qui permet la détection des diverses molécules, 30 - la spectrométrie de masse (MS) employée pour identifier ces composés. Pour chacun des douze logements, on obtient donc des chromatogrammes et les COV spécifiques y sont recherchés (voir tableau I pour les COV recherchés). 35 - 11 - EXEMPLE 3 : Calcul de l'indice chimique de contamination fongique Un indice de contamination est ensuite calculé afin de 5 regrouper l'ensemble des informations fournies par la présence ou l'absence des COV spécifiques identifiés. Afin de formaliser l'ensemble des observations faite sur l'origine de ces molécules, l'indice est calculé en fonction 10 de la présence ou de l'absence de chacun de ces COV. Concernant le méthyl-2-éthylhexanoate, nous avons pris en compte que sa formation pourrait être due à la transformation de 2-éthylhexanol par la moisissure. D'après la construction de cet indice, une valeur élevée rend probable la présence d'un développement fongique, a contrario, une valeur faible l'exclut. Ainsi, une valeur d'indice strictement supérieur à 0 permet 20 de conclure sur la présence d'un développement fongique dans le logement étudié alors qu'une valeur négative ou nulle l'exclu. Les résultats de l'analyse des chromatogrammes de 25 prélèvements réalisés dans les 12 logements sont référencés dans le tableau I. 15 - 12 - TABLEAU I : Liste des COV issus du métabolisme identifiés dans 12 habitations (0 = absence du composé, 1 = présence du composé) Composés Habitation avec contamination Habitation sans contamination visible visible Hab. 1 Hab. 2 Hab. 3 Hab. 4 Hab. 5 Hab. 6 Hab. 7 Hab. 8 Hab. 9 Hab. 10 Hab. 11 Hab. 12 1-octen-3-ol 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1,3- octadiène 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 méthyl-2-éthylhexanoate 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2-éthylhexanol 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 a-pinène 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2-méthylfurane 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 3-méthyl-1-butanol 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2-méthyl-l-butanol 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diméthyldisulfide 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 2-héptène 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 2-méthylisobornéol 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 sesquiterpène A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Sesquiterpène B 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 Sesquiterpène C 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Terpénoïde 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4-heptanone 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3-heptanol 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Méthoxybenzène 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 (5H) -furanone 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 - 13 - Nous constatons la présence systématique de l'a-pinène et du 3-méthyl-1-butanol. Cette observation confirme l'hypothèse que ces composés possèdent de nombreuses sources d'émission (moisissures, bactéries, plantes). L'indice de contamination établi a ensuite été appliqué pour chaque habitation (voir Figures 1 et 2). Les valeurs de cet indice sont répertoriées dans le tableau II: Tableau II : Valeurs des indices attribuées à chaque habitation Habitation avec Valeur Habitation sans Valeur contamination de contamination de visible l'indice visible l'indice Hl 4 H6 -3 H2 3 H7 -4 H3 2 H8 -3 H4 3 H9 2 H5 3 H10 0 H11 0 H12 -4 Les habitations présentant une contamination visible ont toutes un indicateur strictement positif. Cette valeur positive de l'indice confirme donc la présence probable d'un développement fongique dans ces habitations. A l'exception de l'habitat-_on n 9, les habitations sans contamination visible ont des indicateurs inférieurs ou égaux à O. La valeur des indices est donc corrélée à la présence d'un développement fongique. L'habitation n 9, classée dans les logements a priori sains , se comporte, en termes de traceurs chimiques, de la même manière que les habitations dont 2913501 - 14 - la contamination fongique est avérée (indicateur strictement supérieur à 0). Ces habitations ne présentent donc pas de risque de contamination fongique. 5 Pour vérifier ces hypothèses, nous associons ces résultats à un questionnaire soumis aux occupants de chaque habitation. Parmi les différentes questions, six pouvaient être associées à la présence de nos traceurs. Ces questions ainsi que Les réponses associées pour 10 chaque habitation sont répertoriées dans le tableau III. - 15 - Tableau III : Résultats du questionnaire soumis aux propriétaires des douze habitations (l=oui, 0=non) Moisissures Présence Infiltrations Traitement Présence de Odeur de visibles sur d'humidité dans d'eau au cours contre plantes moisi détecté plus lm2 l'habitation des 12 derniers l'humidité par les mois enquêteurs Habitation 1 1 1 0 0 0 1 Habitation 2 1 1 1 0 1 1 Habitation 3 1 1 1 1 1 1 Habitation 4 1 1 1 0 1 0 Habitation 5 1 1 1 0 1 0 Habitation 6 0 0 0 0 1 0 Habitation 7 0 0 0 0 1 0 Habitation 8 0 0 0 0 1 0 Habitation 9 0 0 1 0 1 0 Habitation 10 0 0 0 0 0 0 Habitation 11 0 0 0 0 1 0 Habitation 12 0 0 0 0 1 0 2913501 - 16 - Nous constatons que l'habitation n 9 (sans signe visible mais avec un indice positif) a subi des infiltrations d'eau au cours des 12 mois précédant le 5 prélèvement. Il est probable que ces infiltrations aient engendré une contamination fongique qui n'a pas été détectée visuellement. Par conséquent, l'indice établi a permis de détecter une contamination avant l'apparition des premières traces visibles d'une 10 croissance fongique. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection d'une contamination fongique d'un environnement intérieur selon l'invention comprenant les étapes suivantes : a. prélèvement d'un échantillon de composés organiques volatils (COV) dans un environnement intérieur, b. détection de la présence ou l'absence de certains COV prédéterminés, issus du métabolisme fongique, ces COV prédéterminés comprenant au moins un COV de chacune des trois catégories de COV suivantes : (1) les COV qui sont émis indépendamment de l'espèce fongique et de son support et qui ne sont émis que par des espèces fongiques ; (2) les COV qui sont émis indépendamment de l'espèce fongique et du support, mais qui peuvent également avoir d'autres origines 20 biologiques ; (3) les COV qui sont émis en fonction de l'espèce fongique et/ou du support ; c. calcul d'un indice chimique de contamination fongique en fonction respectivement de la présence 25 et de l'absence des COV prédéfinis, issus du métabolisme fongique. 2. Procédé de détection d'une contamination fongique selon la revendication 1, caractérisé en ce que 30 l'on détecte la présence ou l'absence de plusieurs COV de chacune des trois catégories de COV. 3. Procédé de détection d'une contamination fongique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce 35 que les COV prédéterminés comprennent outre les COV des catégories (1), (2), (3) également le 2-éthylhexanol. - 18 - 4. Procédé de détection d'une contamination fongique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les COV de la catégorie (1) sont choisis dans le groupe comprenant le 1-octen-3-ol, le 1,3- octadiène et le méthyl-2-éthylhexanoate, les COV de la catégorie (2) sont choisis dans le groupe comprenant le 2-méthylfurane, le 3-méthylfurane, le 3-méthyl-1-butanol, le 2- méthyl-1-butanol et le a-pinène, les COV de la catégorie (3) sont choisis dans le groupe comprenant le 2-heptène, le diméthylsulfide, le 4-heptanone, le 2(5H)-furanone et le 3-heptanol. 5. Procédé de détection d'une contamination fongique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que dans l'étape c), on attribue à chacun des COV prédéterminés un chiffre de -1, 0 ou 1 en fonction de sa présence ou de son absence et on calcule la somme de ces chiffres qui est l'indice de contamination. 6. Procédé de détection d'une contamination fongique selon la revendication 5, caractérisé en ce que, pour chacun des COV à l'exception du méthyl-2-éthylhexanoate, l'attribution des chiffres se fait de la façon suivante : la présence de COV de la catégorie (1) est caractérisée par le chiffre 1 et son absence par - 1 ; la présence de COV de la catégorie (2) est caractérisée par le chiffre 0 et son absence par - 1 ; la présence de COV de la catégorie (3) est caractérisée par le chiffre 1 et son absence par 0. 7. Procédé de détection d'une contamination fongique - 19 - selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que, pour le méthyl-2-éthylhexanoate, l'attribution des chiffres se fait de la façon suivante : La présence de méthyl-2-hexanoate est caractérisée par le chiffre 1 ; L'absence de méthyl-2-éthylhexanoate est caractérisée par le chiffre 0, si on détecte une absence de 2-éthylhexanol, et par le chiffre -1, si on détecte un présence de 2-éthylhexanol.