FR 2913335 A1 20080912 FR 0753675 A 20070306 UTILISATION DE CONJUGUES D'ACIDES GRAS ET DE POLY-L-LYSINE POUR LUTTER CONTRE DES MICROORGANISMES PATHOGENES La présente invention se rapporte à l'utilisation de poly-L-Lysine greffée avec au moins un acide gras ou dérivé d'acide gras, pour lutter contre des bactéries, des levures et des champignons pathogènes. Les microorganismes pathogènes sont à l'origine de multiples maladies 5 infectieuses, responsables de nombreux décès dans le monde. La découverte des antibiotiques a permis de lutter efficacement contre certaines de ces maladies bactériennes et mycosiques. Les antibiotiques sont des substances naturelles produites par des bactéries du sol, certains champignons ou des produits de synthèse, qui à faibles 10 concentrations, agissent sur d'autres microorganismes en les tuant ou en ralentissant leur croissance, sans être toxiques pour l'homme ou l'animal. Toutefois l'usage massif des antibiotiques a engendré des phénomènes de résistance aux bactéries, levures et champignons pathogènes, les microorganismes s'adaptant aux changements environnementaux par leur 15 multiplication rapide. En outre, plus la résistance est élevée, plus on prescrit des antibiotiques nouveaux, ce qui a favorisé l'émergence de nouvelles résistances aux antibactériens et anti-fongiques classiques et entraîné l'apparition des maladies nosocomiales ou la résurgence de maladies infectieuses telle que la tuberculose. Il est donc impératif de trouver et développer de nouveaux systèmes capables de lutter efficacement contre les microorganismes pathogènes, en vue d'éradiquer les maladies infectieuses dont ils sont responsables. C'est l'objectif de la présente invention qui se propose, pour y répondre, d'utiliser 5 des acides gras greffés sur un polypeptide spécifique. En particulier, la présente invention vise l'utilisation d'au moins un conjugué entre au moins un acide gras ou dérivé d'acide gras, et au moins une poly-L-Lysine, pour fabriquer un médicament destiné à lutter contre des microorganismes pathogènes. 10 L'invention est maintenant décrite en détail. Par microorganismes pathogènes on entend des bactéries, des levures et/ou des champignons, responsables d'infections humaines ou animales. Par poly-L-Lysine, on entend une poly-L-Lysine linéaire ou ramifiée. Avantageusement les conjugués selon l'invention sont capables de détruire ou de 15 ralentir la croissance des microorganismes pathogènes. On suppose que la poly-L-Lysine s'absorbe sur certaines parois cellulaires et est ensuite internalisée avec les composés acides gras spécifiques interférant dans le métabolisme des microorganismes. L'effet bactéricide propre de la poly-LLysine linéaire ou ramifiée est amplifié par la présence des acides gras. 20 Selon un autre avantage les acides gras du conjugué utile selon l'invention ne sont pas métabolisés lorsqu'ils sont administrés à l'homme ou à l'animal. Les conjugués circulent dans l'organisme jusqu'à fixation sur le microorganisme ciblé. En fonction de l'activité spécifique recherchée, les conjugués utiles selon l'invention sont réalisés avec des acides gras adaptés à un effet particulier. C'est 25 la conformation spécifique des acides gras utilisés avec la poly-L-Lysine qui donne l'effet bactéricide, anti-mycosique ou anti-lévurien au conjugué. Des conjugués préférés pour la présente invention sont des conjugués monofonctionnels c'est-à-dire des conjugués de la poly-L-Lysine avec un seul acide gras ou dérivé d'acide gras, et des conjugués bifonctionnels c'est-à-dire des conjugués de la poly-L-Lysine avec deux acides gras et/ou dérivés d'acide gras différents. Parmi les conjugués monofonctionnels particulièrement adaptés pour la présente invention on peut citer notamment l'Acide Acétique-poly-L-Lysine ou acétyl-poly-L-Lysine, l'Acide Pyruvique-poly-L-Lysine ou pyruvyl-poly-L-Lysine, l'Acide Propionique-poly-L-Lysine ou propionyl-poly-L-Lysine, l'Acide Butyrique-poly-LLysine ou butyryl-poly-L-Lysine, l'Acide Lactique-poly-L-Lysine ou lactyl-Poly-LLysine, l'Acide Succinique-poly-L-Lysine ou succinyl-poly-L-Lysine, l'Acide glutarique-poly-L-Lysine ou glutaryl-poly-L-Lysine, l'Acide caproïque-poly-LLysine ou caproyl-poly-L-Lysine, l'Acide caprylique-poly-L-Lysine ou caprylylpoly-L-Lysine l'Acide caprique-poly-L-Lysine ou capryl-poly-L-Lysine, l'Acide Azélaique poly-L-Lysine ou azélayl-poly-L-Lysine, l'Acide Laurique-poly-L-Lysine ou lauryl-poly-L-Lysine, l'Acide Myrisitique-poly-L-Lysine ou myristyl-poly-L- Lysine, l'Acide Palmitique-poly-L-Lysine ou palmityl-poly-L-Lysine, l'Acide Palmitoléique-poly-L-Lysine ou palmitoleyl-poly-L-Lysine, ou encore l'Acide Oléique-poly-L-Lysine ou oléyl-poly-L-Lysine. A titre d'exemple, le conjugué lauryl-poly-L-Lysine est particulièrement actif sur les staphylocoques, et le conjugué pyruvyl-poly-L-Lysine est particulièrement actif sur les streptocoques, les citrobacters et/ou les levures telle que Candida albicans par exemple. Parmi les conjugués bifonctionnels particulièrement adaptés pour la présente invention on peut citer à titre d'exemple le capryl-poly-L-Lysine-laurique ou le farnésyl-poly-L-Lysine Oléique. Selon un aspect de l'invention, on utilise préférentiellement des concentrations en acide gras ou dérivés d'acides gras pour réaliser les conjugués de l'ordre de 20 à 100 milligrammes/litre. Ces faibles concentrations ont pour avantage de conduire à des produits stables et non toxiques. 4 Les conjugués selon l'invention peuvent être utilisés pour fabriquer des médicaments pour lutter contre des infections en général. Un médicament particulièrement efficace présentant une large activité bactéricide comprendrait par exemple une association de pyruvyl-poly-L-Lysine à 5 5X10-'Molaire et de lauryl-poly-L-Lysine-Capryl à 5x10-4Molaire. Les conjugués selon l'invention peuvent également être utilisés en cosmétologie. Les conjugués utiles selon l'invention peuvent être synthétisés selon le schéma réactionnel suivant, illustré avec l'acide laurique : 10 H3C-(CH 2)10-COOH + CI-CO-CH 2-CH3 acide laurique Chloroformiate d'éthyle H3C-(CH 2)10-CO-O-CO-CH 2-CH 3 + HC1 + R-NH 2 lauryl-ECF, composé E-aminé de la Poly-L-Lysine intermédiaire instable H3(CH2)10-CO-NH-R + CH3-CH2-COOH lauryl-Poly-L-Lysine acide acétique Les acides gras ou dérivés d'acides gras n'étant pas solubles en milieux aqueux, ils sont repris dans un solvant organique, par exemple et préférentiellement le méthanol anhydre. 40 On adjoint aux acides gras du chloroformiate d'éthyle qui active leur groupement carboxylique. 20 30 Le composé d'activation obtenu est ensuite mis en présence sous agitation d'une solution aqueuse contenant de la poly-L-Lysine, ce qui provoque immédiatement une réaction d'amidification. On obtient ainsi un conjugué acide(s) gras-poly-L-Lysine, ou dérivé(s) d'acide(s) gras-poly-L-Lysine qui est finalement purifié par dialyse pour éliminer les solvants, l'excès d'acide(s) gras et les produits secondaires de la réaction d'amidification. Ce conjugué acide(s) gras-poly-L-Lysine, ou dérivé(s) d'acide(s) gras-poly-LLysine peut éventuellement être associé à un ou plusieurs conjugués anti- oxydant(s)-poly-L-Lysine et/ou à un ou plusieurs conjugués acide(s) aminé(s)-poly-L-Lysine. La solution obtenue a également un effet bactéricide. Des essais ont été effectués pour montrer l'efficacité des conjugués utiles selon l'invention. Différentes souches de microorganismes ont été utilisées pour ces essais : - des souches bactériennes Gram- : • Citrobacter koserii • Citrobacter diversus • Escherichia coli (plusieurs sérotypes) • Klebsiella pneumoniae • Klebsiella oxytoca • Morganella morganii • Proteus mitabilis • Pseudomonas aeruginosa • Pseudomonas putida • Serratia marcescens • Alcalescens diaspar • Enterobacter hafniae - des souches bactériennes Gram+ : • Staphylococcus aureus • Streptococcus epidermis • Streptococcus A, B, D • Mycobacterium tuberculosis - des souches bactériennes multirésistantes aux antibiotiques (Staphylococcus aureus, Alcalescens dispar , Escherichia coli, Staphylococcus epidermis, Pseudomonas aeruginosa), - des levures Candida albicans de 6 sous-groupes différents. Les différents essais ont été réalisés selon le mode opératoire décrit en suivant. Les effets anti-bactéricides et anti-fongiques des solutions testées ont été évalués sur des boîtes contenant des milieux de cultures appropriés à la croissance : - gélose chocolat haemophilus pour la culture de Neisseria, - gélose BCP pour les germes peu exigeants, - gélose Mueller Hinton 2 (MH2-F) pour la majorité des souches bactériennes sauf Neisseria et les streptocoques, - gélose columbia ANC (COL ANC-F) pour les streptocoques, - gélose Sabouraud gentamicine chloramphénicol (SAB GENTA CHL-F) pour les candidas albicans et les levures en général, et - milieu Leowenstein, Coletsos pour Mycobacterium tuberculosis. Les boîtes sont recouvertes par 1ml de solution bactérienne ou mycosique à la concentration de 0,5 à 1 de Mac Farland (lecture au densitomètre) soit 1,5x108 bactéries/ml. La boîte est ensuite séchée 15 minutes à 37 , et on applique 2 gouttes (50pl) de chaque solution à tester. La boîte de culture est recouverte après 16 heures d'incubation à 37 . Chaque plage de lyse due à l'activité anti-bactérienne ou anti-fongique des conjugués est mesurée. La lecture de l'effet bactéricide ou antifongique est mesuree en cm2. Les résultats de différents tests sont présentés ci-dessous. - 1 - Comparaison de l'activité bactéricide des conjugués selon l'invention avec celle d'acides gras libres Les résultats sont évalués visuellement selon l'échelle suivante 0 pas d'activité, culture négative + correspond à 103 colonies ++ correspond à 104 colonies +++ correspond à 106 colonies, et ++++ correspond à 10' colonies. Ils sont présentés dans le tableau ci-dessous : Longueur de Nom de l'acide gras Activité bactéricide Activité bactéricide la chaîne non lié sur Escherichia coli sur Escherichia coli ou Staphylococcus ou Staphylococcus aureus aureus de l'acide gras seul du conjugué C2-C4 C2 = acetate 0 +++ C3 = propionate 0 +++ C4 = butyrate 0 +++ C5 = acide valérique 0 +++ C6 Acide Caproïque ++ +++ C8 Acide Caprylique +++ +++ C10 Acide Caprique ++++ +++ C12 Acide Laurique ++++ ++ C14 Acide Myristique + + C16 Acide Palmitique 0 + C16 : 1 Acide Palmitoléique ++ +++ C18 : 1 Acide Oléique + + Farcys Farnesyl-cystéine 0 ++ - 2 - Efficacité de conjugués d'acides gras et poly-L-Lysine sur certains microorganismes La concentration en acides gras sur la poly-L-Lysine est de 5x10-3M. Lactyl - po ly- Propionyl - Pyruvyl - Butyryl - Acétyl - L-Lysine poy-L-lysine Poly-L- poly-L- poly-L- (H3C- (CH3-CH2- Lysine (H3C- Lysine (H3C-Lysine CHOH-CO- CO-PL) CO-CO-PL) CH2-CH2- (H3C-CO- NH-PL) CO -PL) PL) Staphylococcus 1,82 cm2 2,3 cm2 2,13 cm2 1,82 cm2 1,68 cm2 aureus. Escherichia coll. 1,92 cm2 2,09 cm2 2,65 cm2 0 Pseudomonas 2,34 cm2 0 1, 32 cm2 aeruginosa. Candida albicans. 1,05cm2 2,13cm2 2,46 cm2 2,3 cm2 1, 97cm2 Citro becter 1,13 cm2 0 1,54 cm2 1,77 cm2 1,77 cm2 koserii. Klebsiella 0 0 1,33 cm2 0 3,14 cm2 oxytoca. Streptocoque B. peu sensible 0 1,77cm2 1,33 cm2 3,14 cm2 ggls colonies ggls colonies colonies Streptocoque D. 2,01 cm2 0 2,27 cm2 0 4,15cm2 Enterobacter 1,44cm2 1,12 cm2 2,27 cm2 2,03 cm2 2,71 cm2 Hafniae Alcalescens 1,53cm2 1,13cm2 inhibition 1,53cm2 0,85 cm2 1, 4cm2 Diaspar. partielle Morganella 0 0 0 0 0 Morganii. Proteus 0 0 0 0 0 Mirabilis. Nesseria 1,65cm2 1,13 cm2 2,01cm2 0,78 cm2 2,27cm2 - 3 -Comparaison de l'activité bactéricide des conjugués selon l'invention avec celle d'acides gras conjugués avec une poly-Ornithine (ORN) Les solutions testées sont à la même concentration en acides gras que celles avec les conjugués poly-L-Lysine, soit 5x10-3 d'acides gras liés. Lactyl-ORN Pyruvyl-ORN Butyryl-ORN Acétyl-ORN Staphylococcu 0 0 0 0 s aureus. Pseudomonas 0 0 0 0 aeruginosa. Escherichia 0 0 0 0 coll. Ces résultats montrent bien que c'est la conformation des acides gras liés aux acides aminés de la poly-L-Lysine qui donne l'effet bactéricide et antimycosique. 10 - 4 - Efficacité d'un mélange de conjugués selon l'invention sur des souches multi-résistantes Les exemples de bactéricidie sont obtenus avec la préparation capryl-poly-LLysine-lauryl et pyruvyl-poly-L-Lysine à différentes concentrations : à 5x10-4M 15 (5b4), à 5x10-3M (5b3) et à 5x10-2M (5b2). Pyruvyl -PoIy-L-Lysine Pyruvyl -PoIy-L-Lysine Pyruvyl -PoIy-L-Lysine (5b4) + Capryl-PoIy-L- (5b3) + Capryl-PoIy- (5b3) + Capryl-Poly- Lysine-Lauryl (5b4) L-Lysine-Lauryl (5b4) L-Lysine-Lauryl (5b2) Staphylococcus 1,33 cm2 1,65 cm2 2,27 cm2 aureus. Escherichia coll. Non testé 1,54 cm2 1,77 cm2 Pseudomonas spp Non testé 2,86 cm2 Non testé Staphylococcus Non testé 2,54cm2 Non testé epidermidis 5 Plus de 15 souches multirésistantes prélevées sur des malades ont toutes été sensibles à ces préparations de mélanges de conjugués selon l'invention. - 5 - Efficacité de l'activité bactéricide des conjugués selon l'invention sur la souche Mycobacterium tuberculosis La souche Mycobacterium tuberculosis est cultivée pendant un mois et demi sur milieu de Loewenstein Coletsos : des colonnies apparaissent à la concentration de 106. On met en contact du Mycobacterium tuberculosis une solution pyruvyl-poly-LLysine à 5x10-3M + capryl-poly-L-Lysine-Lauryl à 5x10-4M. On obtient une culture négative. La solution contenant le mélange de conjugués selon l'invention a donc un effet bactéricide sur Mycobacterium tuberculosis. - 6 - Activité bactéricide des conjugués selon l'invention On ajoute à 1mL de pyruvyl-poly-L-Lysine à 5x10-3M + capryl-poly-L-Lysine-Lauryl à 5x10-4M, les souches suivantes : - Staphylococcus aureus (densité de Mac Farland = 4, 1,2x109 bactéries/ml) - Escherichia coli (densité de Mac Farland = 2, 6x10$ bactéries/ml) - Pseudomonas aeruginosa (densité de Mac Farland = 2, 6x10$ bactéries/ml). Les mesures de l'activité bactéricide après 1 heure, 3 heures, 5 heures et 24 heures de contact sont répertoriées dans le tableau suivant : Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa 1 heure +++ 106 +++ 106 +++ 106 3 heures Négative + 103 +++ 106 heures Négative Négative + 103 24 heures Négative Négative Négative - 7 - Evaluation de la concentration minimale inhibitrice des conjugués selon l'invention Sur une souche multirésistante de staphylococcus epidermidis, la concentration minimale inhibitrice pour une solution capryl-poly-L-Lysine-lauryl + pyruvatepoly-L-Lysine est : -inférieure à 1,25x105M pour capryl-poly-Lysine-lauryl, et - inférieure à 1,25x104M pour pyruvate-poly-Lysine. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins un conjugué entre au moins un acide gras ou dérivé d'acide gras, et au moins une poly-L-Lysine, pour fabriquer un médicament destiné à lutter contre des microorganismes pathogènes. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le 5 conjugué est obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé comprenant notamment les étapes suivantes : - adjonction de chloroformiate à au moins un acide gras ou dérivé d'acides gras, - mise en présence du composé obtenu d'une solution aqueuse 10 contenant de la poly-L-Lysine, - réaction d'amidification et obtention du conjugué acide(s) gras - poly-L-Lysine ou dérivé(s) d'acide(s) gras-poly-L-Lysine. 6. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le ou les acide(s) gras ou dérivé(s) d'acide(s) gras sont utilisés dans des 15 concentrations comprises entre 20 à 100 milligrammes/litre pour réaliser les conjugués. 7. Utilisation selon l'une quelconque des précédentes revendications, caractérisée en ce que au moins un conjugué est monofonctionnel. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, 20 caractérisée en ce que au moins un conjugué est le conjugué lauryl-poly-L-Lysine pour fabriquer un médicament destiné à lutter contre des staphylocoques. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que au moins un conjugué est le conjugué pyruvyl-poly-Lysine pour fabriquer un médicament destiné à lutter contre des citrobacters et/ou 25 des streptocoques et/ou des levures.7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que au moins un conjugué est bifonctionnel. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'on associe un conjugué lauryl-poly-L-Lysine-Capryl et un conjugué pyruvyl-poly-L-Lysine pour fabriquer un médicament destiné à lutter contre Mycobacterium tuberculosis. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le au moins un conjugué est associé à un ou plusieurs conjugués anti-oxydant(s)-poly-L-Lysine et/ou à un ou plusieurs conjugués acide(s) aminé(s)-poly-L-Lysine.