FR 2910969 A1 20080704 FR 0611535 A 20061229 La présente invention se rapporte à un procédé de mesure de la concentration de facteur VIIa (FVIIa) dans un échantillon en utilisant un plasma dépourvu de facteur VII (FVII) et d'au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII (FVIII), le facteur IX (FIX) et le facteur XI (FXI). La coagulation sanguine est un mécanisme qui permet aux organismes de contrôler les effusions de sang lors de lésions vasculaire et ainsi d'éviter les hémorragies. La coagulation sanguine se déroule selon des étapes en cascade impliquant différentes proenzymes et procofacteurs présents dans le sang qui sont convertis, par l'intermédiaire d'enzymes protéolytiques, en leur forme activée. Dans cette succession d'étapes (ou cascade) de la coagulation on distingue deux voies, appelées voie extrinsèque de la coagulation et voie intrinsèque de la coagulation. Toutes deux conduisent à la formation du complexe, appelé prothrombinase, constitué de facteur X activé, de facteur V activé (FVa), de phospholipides et de calcium. C'est la prothrombinase qui active la prothrombine en thrombine permettant la transformation du fibrinogène soluble en fibrine insoluble qui forme le caillot. La voie extrinsèque implique l'intervention du FVII présent dans le plasma. Toutefois, ce dernier doit être préalablement activé en FVIIa pour initier la cascade de la coagulation. Le FVIIa seul (non complexé) présente une faible activité protéolytique. Cette activité est potentialisée lorsque le FVIIa est complexé au facteur tissulaire (FT), protéine associée à des phospholipides, qui est libéré lors de la lésion vasculaire. Le complexe FVIIa-FT transforme le facteur X en facteur Xa en présence d'ions calcium. Le complexe FVIIa-FT transforme aussi le FIX en FIXa catalysant ainsi la voie intrinsèque de la coagulation. Les facteurs IXa et Xa, en retour, activent le FVII en FVIIa. Le facteur Xa complexé au FV activé et aux phospholipides (prothrombinase) transforme la prothrombine en thrombine. La thrombine agit sur le fibrinogène en le transformant en fibrine et présente également d'autres activités parmi lesquelles l'activation du facteur. V en Facteur Va et du FVIII en FVIIIa. La thrombine active également en présence de calcium le facteur XIII en facteur XIIIa qui permet la consolidation du caillot de fibrine. Alors que dans la voie extrinsèque de la coagulation le FIX est activé en FIXa par le complexe FVIIa/FT, dans la voie intrinsèque de la coagulation, le FIXa est généré à partir du FIX par le FXIa lui même activé par le facteur XII activé par le contact du sang avec une surface électronégative telle que le sous-endothélium. Le FVIIa, une glycoprotéine dépendante de la vitamine K, joue donc un rôle important dans les mécanismes de la coagulation, aboutissant à la formation de caillot sanguin. Le FVIIa présente l'intérêt de pouvoir agir localement en présence du facteur tissulaire libéré après lésion de tissus engendrant des hémorragies, même en l'absence de Facteur VIII ou IX. C'est pourquoi le FVIIa est utilisé depuis de nombreuses années pour corriger certains troubles de la coagulation se manifestant par des saignements. 30 La première approche fut d'obtenir le FVIIa, à partir du plasma. Mais, la production de FVIIa à partir du plasma est limitée par la disponibilité de la source d'approvisionnement et. cette utilisation de plasma présente des risques de transmission d'agents 35 pathogènes comme par exemple le prion et les virus. Ces problèmes ont été résolus avec le développement d'un FVIIa recombinant (rFVIIa) par Novo Nordisk 10 15 20 25 Pharmaceuticals qui est une glycoprotéine structurellement similaire au FVIIa plasmatique. La principale indication thérapeutique pour le rFVIIa (aux USA, EU et Japon) concerne le traitement du saignement spontané ou chirurgical des hémophiles A ayant développé des anticorps anti-facteur VIII et des hémophiles B ayant développé des anticorps antifacteurs IX. En Europe, il est aussi indiqué pour son utilisation chez des patients avec une déficience congénitale en FVII et chez les patients atteints de la thrombasthénie de Glanzmann. En outre, de nombreuses publications rapportent l'efficacité du rFVIIa dans le contrôle de l'hémorragie lors d'interventions chirurgicales, chez des patients qui n'ont ni déficit congénital en facteur de la coagulation ni de thrombasthénie. Cette utilisation de plus en plus large du FVIIa a conduit à mettre au point des méthodes pour mesurer l'activité du FVIIa ainsi que des méthodes pour déterminer la concentration en FVIIa, par exemple, pour mesurer la concentration d'un échantillon contenant potentiellement du FVIIa ou pour mesurer la concentration plasmatique de FVIIa d'un patient afin de vérifier que la dose de FVIIa administrée est bien adaptée au traitement du trouble de l'hémostase à corriger et que le patient traité ne se trouve pas en hypo-coagulation ou en hyper-coagulation. Les méthodes les plus connues pour détecter l'activité du FVIIa sont la mesure du temps de coagulation, le PTT (Partial Thromboplastin Time -Temps Partiel de Thromboplastine), l'aPTT (activated partial thromboplastin time - Temps partiel de Thromboplastine activé), le TEG (thromboélastographe) et le TGT (test de génération de thrombine). Ces méthodes permettent de détecter l'activité du FVIIa mais ne permettent pas de mesurer directement la concentration précise du FVIIa. Les mesures directes de la concentration de FVIIa pratiquées, telles que le dosage fluorogénique ou chromogénique du FXa généré par le FVIIa, se sont révélées inappropriées car elles ne permettent pas de différencier l'effet du FVIIa et du FVII. Un kit commercial de dosage immunologique du FVIIa est disponible (IMUBIND Factor VII ELISA kit) mais les conditions expérimentales pour la mise en œuvre de cette technique sont difficilement maîtrisables. D'autres méthodes de mesure de la concentration de FVIIa sont décrites dans la littérature, comme la mesure de son activité protéolytique avec l'utilisation de FT recombinant tronqué (Staclot VIIa-rTF, Stago) et (US 5,472,850, US 5,741,658, WO 1992/018870, US 5,750,358, US 5,741,658, US 5,472,850, EP 0 641 443) ou la mesure de la concentration d'un complexe FVIIa- antithrombine (WO 03/004694). Cependant ces méthodes sont peu précises et difficiles à mettre en oeuvre. Actuellement une méthode fréquemment employée par les cliniciens pour évaluer l'efficacité d'un traitement avec le FVII:a est basée sur l'utilisation de la thromboélastographie. Cette méthode consiste à mesurer les propriétés physiques d'un sang total en analysant de manière mécanique la formation du caillot en fonction du temps. Selon les paramètres extraits d'un graphique (appelé thrombinogramme) généré par le thromboélastographe, le clinicien peut évaluer l'aptitude à la coagulation d'un patient. Bien que précise, cette méthode est fastidieuse et peu adaptée à une analyse routinière et répétitive, difficilement applicable à un multiéchantillonnage car elle nécessite d'être effectuée dans l'heure qui suit le prélèvement sanguin. De plus, cette méthode ne permet pas de mesurer la concentration de FVIIa. -5 Il existe donc un réel besoin de disposer d'un procédé efficace et facile à mettre en oeuvre pour mesurer la concentration de FVIIa, par exemple pour mesurer la concentration d'un échantillon contenant potentiellement du FVIIa ou pour mesurer la concentration plasmatique de FVIIa d'un patient afin de vérifier que la dose thérapeutique de FVIIa administrée est bien adaptée au traitement du trouble de l'hémostase à corriger et que le patient traité ne se trouve pas en hypo-coagulation ou en hyper-coagulation, comme indiqué ci-dessus. La présente invention concerne un procédé de mesure in vivo, in vitro ou ex-vivo de la concentration de FVIIa dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) mélanger ledit échantillon avec un plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI ; b) ajouter des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine comprenant une source d'ions calcium, un agent phospholipidique et du facteur tissulaire ; c) effectuer un test de génération de thrombine (TGT) sur le milieu réactionnel ainsi obtenu afin d'obtenir un thrombinogramme fournissant des paramètres; d) comparer au moins l'un des paramètres du thrombinogramme à un paramètre homologue de thrombinogrammes standards, chaque thrombinogramme standard étant obtenu avec une concentration étalon fixée de FVIIa dans ledit milieu réactionnel, comprise dans une plage allant de 1 pM à 1 nM, et e) déduire de l'étape d) une mesure de la concentration de FVIIa de l'échantillon comprise dans ladite plage. - 6 La Demanderesse a trouvé de manière surprenante que l'utilisation d'un plasma dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI permet d'obtenir un réactif utilisable dans un procédé de mesure de la concentration de FVIIa dans un échantillon, fiable, reproductible et facile à mettre en œuvre. En effet, par le procédé de l'invention, il est maintenant possible d'établir une corrélation entre la concentration de FVIIa dans un échantillon et certains paramètres d'un test de génération de thrombine. Grâce à cette corrélation établie par des thrombinogrammes standards, c'est-à-dire effectués avec des concentrations étalons et variables en FVIIa dans le milieu réactionnel, il est possible de déterminer la concentration en FVIIa inconnue dans un échantillon, par comparaison des données fournies par l'intermédiaire de thrombinogammes standards et de celles fournies par le throbinogramme de l'échantillon à mesurer. Le test de la génération de thrombine (TGT) de l'étape c), connu de l'homme du métier, est basé sur la mesure du temps nécessaire pour générer la thrombine lorsque des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine, dans le cas présent la source d'ions calcium, l'agent phospholipidique et le facteur tissulaire (FT) de l'étape b), sont mis en présence avec l'échantillon contenant du FVIIa mélangé à un plasma dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI. Dès que l'ensemble de ces composants, constituant ainsi le milieu réactionnel, de volume prédéterminé, est mis en contact, la réaction de génération de thrombine débute, ce qui permet de fixer le temps initial du début de test (to). Bien entendu, la teneur en chacun des composants est choisie de façon à ce que cette réaction puisse se produire. Ce test est -7 avantageusement mis en oeuvre à l'aide d'un agent de révélation de la thrombine générée. Un tel agent est un agent fluorogénique qui va être dégradé par la thrombine pour donner un composé émettant une fluorescence, ou un agent chromogénique. La fluorescence est détectée par un dispositif de mesure de la formation de thrombine dans le milieu réactionnel, tel qu'un fluorimètre classique comprenant en outre un logiciel adapté pour recueillir des données permettant de tracer un thrombinogramme. Ce thrombinogramme se présente sous forme d'une courbe, établie en fonction de la durée du test, présentant un maximum correspondant à la quantité maximale de thrombine générée. Plus la quantité en FVIIa dans l'échantillon augmente, et donc dans le milieu réactionnel, plus le temps pour générer la thrombine diminue pour atteindre ensuite une valeur limite. Le thrombinogramme permet de fournir les données représentant au moins l'un des paramètres du thrombinogramme (étape d)) définis de la façon suivante. Le premier des paramètres est la hauteur de pic qui correspond au maximum de thrombine générée, comme indiqué plus haut. Le deuxième est le temps de latence correspondant au temps qui s'écoule entre le début du TGT (to) et l'apparition de la thrombine. Le temps au pic, troisième paramètre, correspond au temps qui s'écoule entre le début du TGT (to) et le maximum de thrombine générée. La vélocité, quatrième paramètre, exprimée en M/min de thrombine formée, correspond à la hauteur de pic divisée par la différence entre le temps au pic et le temps de latence. Ces paramètres peuvent être directement fournis par le dispositif de mesure de la formation de la thrombine. Par conséquent, à l'étape d), l'un au moins des paramètres du thrombinogramme obtenu avec le procédé selon l'invention est choisi parmi la hauteur de pic, la vélocité, le temps de latence et le temps au pic. Selon l'invention, les paramètres de thrombinogrammes standards sont déterminés en réalisant une série de TGT avec des échantillons étalons, constitués du même milieu réactionnel, mais dont chacun comprend une concentration étalon finale en FVIIa fixée dans la gamme de 1 pM et 1 nM. On se place donc dans les mêmes conditions opératoires afin de pouvoir conserver un même volume du milieu réactionnel, bien que de faibles variations de volumes soient acceptables par l'ajout de l'échantillon de FVIIa. On obtient donc un thrombinogramme pour chaque milieu réactionnel dont la teneur en FVIIa est étalonnée. A partir de chaque thrombinogramme standard, il est établi des courbes étalons de variation de chacun des paramètres ci-dessus en fonction de la concentration finale en FVIIa dans le milieu réactionnel. Les paramètres ci-dessus obtenus pour un échantillon dont la concentration en FVIIa est inconnue sont ensuite comparés à ceux homologues obtenus précédemment (étape d)). On déduit ainsi directement la concentration de FVIIa de l'échantillon mesuré quel que soit le paramètre utilisé, car celle-ci est déterminée par comparaison avec des courbes de concentrations standards étalons, c'est-à-dire établies à partir de thombinogrammes standards. Dans le cadre de l'invention, l'échantillon de FVIIa, le plasma dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, FIX ou FXI, les composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine peuvent être sous forme lyophilisée ou en poudre, le milieu réactionnel étant alors préparé par dissolution dans un solvant aqueux approprié, tel que l'eau purifiée pour injection (PPI). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'échantillon de FVIIa est sous forme liquide. Pour l'établissement de thrombinogrammes standards, il suffit de prélever le volume approprié à mélanger avec le plasma considéré, pour obtenir les concentrations finales désirées dans le milieu réactionnel. Ceci peut également être effectué par ajout d'un volume constant de l'échantillon de FVIIa dans ledit plasma, mais de concentrations différentes. Le FVIIa peut également se présenter sous forme de lyophilisat, au quel cas, il suffit d'en ajouter le poids nécessaire et de le dissoudre dans le milieu réactionnel. Il est également possible d'établir plusieurs thrombinogrammes pour un échantillon contenant une teneur en FVIIa à déterminer, par dilution successive de celui-ci et ajout d'un même volume dans le plasma considéré, le volume du milieu réactionnel étant maintenu constant. La comparaison des résultats des paramètres obtenus avec ceux des standards, et du fait de la connaissance des rapports de dilution, permet de fournir la teneur en FVIIa avec une précision accrue. Tout type d'agent phospholipidique convient dans le cadre de l'invention. Il peut se présenter sous la forme de concentré ou de lyophilisat. De même tout facteur tissulaire (FT) tronqué, plasmatique, recombinant ou transgénique convient. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'échantillon contenant du FVIIa est un échantillon plasmatique, en particulier contenant potentiellement du FVII, un échantillon thérapeutique, de préférence contenant un ou plusieurs principes actifs dont le FVII, ou un échantillon thérapeutique contenant du FVIIa recombinant (rFVIIa) ou transgénique, sous forme liquide ou lyophilisée. Le terme dépourvu signifie que la concentration en FVII, FVIII, FIX et/ou FXI est en dessous du seuil de détection dudit facteur mesuré par les méthodes 5 10 15 20 25 30 35 - 10 - classiques de dosage bien connues de l'homme de l'art. On peut par exemple utiliser des kits ou réactifs provenant de la Société Stago et mettre en oeuvre des méthodes immunologiques classiques. Le procédé de l'invention permet de mesurer la concentration de FVIIa plasmatique, de FVIIa recombinant et/ou de FVIIa transgénique. Selon un mode de réalisation préféré, le plasma utilisé dans le procédé selon l'invention est dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII et le FIX. Le plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII le FIX et le FXI peut être obtenu de différentes manières. Dans le procédé selon l'invention, on peut utiliser, par exemple, un plasma d'hémophile A (dépourvu de FVIII) qui est ensuite déplété en FVII, un plasma d'hémophile B (dépourvu de FIX) qui est ensuite déplété en FVII ou de patients ayant un déficit complet en facteur XI. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention utilise un plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI qui est un plasma humain immunodéplété. L'immunodéplétion se fait de différentes manières comme par exemple : Le plasma dépourvu de FVII et FVIII est obtenu, par exemple, par déplétion au moyen d'anticorps spécifiques du FVII, du FVIII ou d'une protéine liée à un de ces facteurs comme par exemple, et sans s'y limiter, avec des anti-FVII, anti-FVIII, antifacteur Willebrand, le facteur Willebrand étant une protéine plasmatique qui transporte le FVIII dans le sang. - 11 - - Le plasma dépourvu de FVII et FIX est obtenu, par exemple, par déplétion au moyen d'anticorps spécifiques du FVII, du FIX ou d'une protéine liée à un de ces facteurs comme par exemple, et sans s'y limiter, avec des anti-FVII et anti-FIX. - Le plasma dépourvu de FVII et FXI est obtenu, par exemple, par déplétion au moyen d'anticorps spécifiques du FVII, du FXI ou d'une protéine liée à un de ces facteurs comme, par exemple, des anti-FVII et anti-FXI. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI est un plasma humain déplété chimiquement. Le plasma humain peut être déplété en FVIII, qui est un facteur Cal+ dépendant, avec de l'EDTA. Une fois le plasma déplété en FVIII, l'EDTA est éliminé par des méthodes bien connues de l'homme de l'art, notamment 20 par dialyse. Les méthodes de déplétion peuvent être combinées entre elles afin d'obtenir le plasma déplété en facteurs ci-dessus. 25 De préférence, à l'étape b), la concentration finale en ions calcium dans le milieu réactionnel est comprise entre 14 et 18 mM, en particulier elle est de 16,7 mM. La source d'ions calcium représente toute source 30 biologiquement compatible, telle que le CaCl2. La concentration finale de l'agent phospholipidique dans le milieu réactionnel est comprise entre 1 et 20 pM, en particulier entre 3 et 5 IIM, et celle du facteur tissulaire (FT) est comprise entre 1 et 10 pM, en 35 particulier entre 1 et 6 pM. Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un plasma humain dépourvu de facteur 10 15 - 12 - VII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII, le facteur IX et le facteur XI pour mesurer in vivo, in vitro ou ex-vivo la concentration de facteur VIIa d'un échantillon. Comme montré précédemment, c'est le fait qu'un plasma soit non seulement dépourvu de FVII mais également dépourvu d'au moins l'un des facteurs ci-dessus qui rend possible l'établissement d'une corrélation entre la quantité de FVIIa présente dans un échantillon et certains paramètres du TGT, ce qui n'avait pas été connu à ce jour. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon dont on mesure la concentration en FVIla est un échantillon plasmatique, un échantillon thérapeutique ou un échantillon thérapeutique contenant du FVIIa recombinant ou transgénique, tel que défini plus haut. Un autre objet de la présente invention est un kit susceptible d'être utilisé pour la mise en œuvre du procédé de l'invention comprenant : - un plasma lyophilisé dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII le FIX et le FXI ; un lyophilisat contenant un agent phospholipidique et du facteur tissulaire, et une source d'ions calcium ; et - un échantillon de FVIIa lyophilisé pour déterminer au moins l'un paramètres de thrombinogrammes standards. Un tel kit est donc avantageusement utilisé pour la mise en oeuvre du procédé de mesure de la concentration de FVIIa dans un échantillon de l'invention. A cette fin, il sera toutefois nécessaire de se munir d'un dispositif pour effectuer le TGT. Le dispositif pour réaliser le test de génération de thrombine comprend notamment un agent de révélation de 35 -13 - la thrombine générée, par exemple un réactif fluorogénique approprié, un appareil de mesure, par exemple un fluorimètre comprenant en outre un logiciel adapté pour recueillir des données permettant de tracer un thrombinogramme, et des microplaques. Avantageusement, le kit comprend des récipients destinés à contenir les différents lyophilisats. Le contenu de tels récipients est ensuite dissous dans un solvant aqueux, telle que l'eau purifiée pour injection (PPI), de façon à obtenir les concentrations efficaces des composants d'intérêt pour la mise en œuvre du test TGT. De tels récipients peuvent représenter des puits de microplaques. De préférence, les concentrations finales des composants d'intérêt dans le milieu réactionnel sont celles indiquées précédemment. De préférence, le kit comprend en outre des dispositifs de prélèvement, telle que des pipettes ou des micropipettes. Comme mentionné plus haut, pour la mise en oeuvre du procédé selon un mode préféré, un plasma lyophilisé dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII le FIX et le FXI et le lyophilisat contenant un agent phospholipidique, du facteur tissulaire et une source d'ions calcium sont dissous dans de l'eau PPI auxquels on ajoute différentes quantités de FVIIa lyophilisé de façon à ce que la concentration finale en FVIIa dans le milieu réactionnel ainsi obtenu soit compris dans la gamme de 1 pM à 1 nM. Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un kit tel que défini précédemment pour la mesure in vivo, in vitro ou ex-vivo de la concentration en FVIIa d'un échantillon. Un tel kit est simple d'emploi et peut être stocké à température de 4 C pendant au moins 1 ans. Il suffit de se munir, le cas échéant, d'un agent de révélation de la thrombine générée, par exemple un réactif fluorogénique approprié comme défini plus haut, un 5 10 15 20 25 30 35 - 14 - appareil de mesure, par exemple un fluorimètre comprenant un logiciel permettant d'établir un tracé d'un thrombinogramme et des microplaques pour mettre en oeuvre le TGT afin de déterminer avec précision la concentration inconnue en FVIIa d'un échantillon. Cela suppose toutefois l'établissement de thrombinogrammes standards et d'un thrombinogramme de l'échantillon dont on souhaite déterminer la concentration en FVIIa. Selon un mode de réalisation particulier, le kit est utilisé pour mesurer la concentration de FVIIa d'un échantillon plasmatique, d'un échantillon thérapeutique ou d'un échantillon thérapeutique contenant du FVIIa recombinant ou transgénique, comme défini précédemment. Les exemples ci-dessous illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemples Exemple 1 : obtention d'un plasma dépourvu de FVII Un anticorps polyclonal fabriqué dans le lapin dirigé contre le FVII plasmatique humain purifié a été couplé à du sépharose activé au CNBr (Pharmacia) puis 2mL du gel obtenu sont placés dans une colonne. La colonne a été équilibrée avec 25 mL de tampon d'équilibrage (NaCl 0,15 M, citrate 10 mM, pH 7,4). Ensuite, 6 mL de plasma humain ont été passés sur la colonne. Dans ces conditions, le FVII reste fixé sur la colonne et l'éluat est récupéré. La colonne a été régénérée en éluant le FVII fixé avec 20 mL de tampon de régénération (NaCl 50 mM; glycine 0,1 M pH 2,4) puis la colonne a été rééquilibrée avec 20 mL de tampon d'équilibrage (citrate 10 mM; NaCl 0,15 M pH 7,4). Ces étapes ont été répétées 7 à 8 fois afin d'obtenir 6 mL de plasma dépourvu de FVII. - 15 - Exemple 2 : préparation du milieu réactionnel pour réaliser un thrombinogramme standard On prélève le volume adéquat d'un échantillon de rFVIIa (NovoSeven -Novonordisk) que l'on ajoute à 80 pl de plasma dépourvu de FVII obtenu à l'Exemple 1, de façon à ce que chaque mélange réactionnel contienne une concentration finale étalon comprise entre 0,02 nM et 10 nM. Le milieu réactionnel est obtenu par mélange de 20 pl de facteurs initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Ca2 , phospholipides et FT) à des concentrations finales de 5 pM en FT, 4 pM en phospholipides, (réactif Biodis TS 30.00 - Biodis) et 16,7 mM en Cal'-, de 20 gl d'agent fluorogénique spécifique de la thrombine (réactif Fluca kit Biodis TS 50.00) avec le plasma contenant du rFVIIa ci-dessus. Les courbes de TGT ont été établies pour des concentrations finales de rFVIIa comprises entre 0,02 nM et 10 nM de manière à obtenir les thrombinogrammes montrés à la Figure 1. Ils sont établis à l'aide d'un dispositif fluorimétrique de mesure du temps de formation de la thrombine (Fluoroskan - Thermo Electron) muni d'un logiciel pour établir les thrombinogrammes (Société Thrombinoscope), pour une longueur d'onde d'excitation de 390 nm et de détection à une longueur d'onde d'émission de 460 nm. Cette figure montre que les différents thrombinogrammes établies pour le plasma dépourvu du seul FVII ne permettent pas d'obtenir une corrélation entre la concentration de rFVIIa et le temps de formation de la thrombine mesuré au pic. En effet, on n'observe pas de variation notable entre ce temps au pic et la quantité de rFVIIa, ni même une variation significative de la hauteur des pics en fonction de cette quantité. Les figures 2 et 3 présentent les thrombinogrammes respectifs obtenus en ajoutant de 0,1 nM à 100 nM de - 16 - rFVIIa dans du plasma dépourvu du seul FVIII, provenant de la Société Stago ou d'hémophiles A, et du seul FIX, provenant de la Société Stago, respectivement. Ces figures montrent que les différents thrombinogrammes établis pour les plasmas dépourvus des seuls FVIII et de FIX respectivement ne permettent pas d'obtenir une corrélation entre la concentration de FVIIa et le temps de formation de la thrombine mesuré au pic. En effet, on n'observe pas de variation notable de ce temps au pic, à savoir qu'il est quasi constant en fonction de la quantité de FVIIa ajoutée. Exemple 3: obtention d'un plasma dépourvu de FVII et FVIII, FIX ou FXI Un anticorps polyclonal fabriqué dans le lapin dirigé contre le FVII plasmatique humain purifié a été couplé à du sépharose activé au CNBr (Pharmacia) puis 2mL du gel obtenu est placé dans une colonne. La colonne a été équilibrée avec 25 mL de tampon d'équilibrage (NaCl 0,15 M, citrate 10 mM, pH 7,4). Ensuite, 6 mL de plasma commercial déjà déplété en FVIII, FIX ou FXI, chacun provenant de la Société Stago, ont été passés sur la colonne. Dans ces conditions, le FVII reste fixé sur la colonne et l'éluat est récupéré. La colonne a été régénérée en éluant le FVII fixé avec 20 mL de tampon de régénération (NaCl 50 mM; glycine 0,1 M pH 2,4) puis la colonne a été rééquilibrée avec 20 mL de tampon d'équilibrage (citrate 10mM; NaCl 0,15 M pH 7,4). Ces étapes ont été répétées 7 à 8 fois afin d'obtenir 6 mL de plasma double déplété en FVIII, FIX ou FXI et en FVII. Exemple 4 préparation du milieu réactionnel pour réaliser un thrombinogramme standard On prélève le volume adequat d'un échantillon de rFVIIa que l'on ajoute à 80 l de plasma dépourvu de FVIII, provenant de la Société Stago ou étant un plasma d'hémophiles A, qui a été ensuite déplété de FVII - 17 - obtenu selon la procédure de l'Exemple 1, de façon à ce que chaque mélange réactionnel contienne une concentration finale étalon de rFVIIa comprise entre 1 pM et 1 nM. Le milieu réactionnel est obtenu par mélange de 20 l de facteurs initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Ca2+, phospholipides et FT) à des concentrations finales de 5 pM en FT, 4 gM en phospholipides, (réactif Biodis TS 30.00 - Biodis) et 16,7 mM en Ça+2, de 20 gl d'agent fluorogénique spécifique de la thrombine (réactif Fluca kit Biodis TS 50.00) avec le plasma contenant du FVIIa ci-dessus. Les courbes de TGT ont été établies pour des concentrations finales de rFVIIa comprises entre 1 pM et 5 nM de manière à obtenir des thrombinogrammes dont les divers paramètres (temps de latence, hauteur de pic, temps au pic et vélocité) sont progressivement corrigés, de façon dose-dépendante, en fonction du taux de FVIIa. Ils sont établis à l'aide du même dispositif de mesure fluorimétrique et dans les mêmes conditions que celles données à l'Exemple 2. La figure 4 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 1 pM à 5 nM de rFVIIa dans du plasma dépourvu en FVII et FVIII. Il est observé une diminution du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de la quantité de rFVIIa présente dans l'échantillon. Ce temps atteint une limite que l'on peut estimer à 3 minutes pour une concentration en rFVIIa de 1 nM. On note qu'un plasma dépourvu de FVII et de FVIII ne génère pas de formation de thrombine. Les figures 5, 6 et 7 représentent respectivement les variations des hauteurs du pic, du temps au pic et de la vélocité, en fonction de la quantité de rFVIIa présente dans l'échantillon et donc dans le milieu réactionnel. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre la concentration de - 18 - FVIIa et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes entre 1 pM et 1 nM. Exemple 5 L'expérience de l'Exemple 4 est reprise, mais en considérant un plasma réactif dépourvu de FIX, provenant de la Société Stago, qui a ensuite été déplété de FVII selon la procédure de l'Exemple 1. La figure 8 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 5 pM à 1 nM de rFVIIa dans du plasma dépourvu en FVII et FIX. Il est observé une diminution du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de la quantité de FVIIa présente dans l'échantillon. Ce temps atteint également une limite que l'on peut estimer à 3 minutes pour une concentration en rFVIIa de 1 nM. On note qu'un plasma dépourvu de FVII ou de FIX sans l'ajout de FVIIa ne génère pas de formation de thrombine. Les figures 9, 10, 11 et 12 représentent respectivement les variations des hauteurs du pic, du temps de latence, du temps au pic et de la vélocité, en fonction de la quantité de rFVIIa présente dans l'échantillon et donc dans le milieu réactionnel. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre la concentration de FVIIa et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes. 30 Exemple 6 L'expérience de l'Exemple 4 est reprise, mais en considérant un plasma réactif dépourvu de FXI, provenant de la Société Stago, qui a ensuite été déplété de FVII selon la procédure de l'Exemple 1 (à 35 préciser). La figure 13 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 5 pM à 1 nM de rFVIIa dans du plasma dépourvu en FVII et FXI. Il est observé une diminution 10 15 20 25 5 15 20 25 30 35 - 19 - du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de la quantité de FVIIa présente dans l'échantillon. Ce temps atteint également une limite que l'on peut estimer à 3 minutes pour des concentrations en rFVIIa comprises entre 0,5 et 1 nM. On note qu'un plasma dépourvu de FVII et de FXI ne génère pas de formation de thrombine. Les figures 14, 15, 16 et 17 représentent respectivement les variations des hauteurs du pic, du temps de latence, du temps au pic et de la vélocité, en fonction de la quantité de rFVIIa présente dans l'échantillon et donc dans le milieu réactionnel. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre la concentration de FVIIa et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes. Exemple 7 : exemple de mesure de la concentration de FVIIa d'un échantillon de concentration inconnue Un volume de 10 l d'un échantillon de concentration inconnue de rFVIIa a été mélangé avec du plasma déplété en FVII et FVIII, tel que décrit précédemment. On y a ajouté les composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Ca2+, phospholipides et FT) à des concentrations finales de 5 pM en FT, 4 pM en phospholipides (réactif Biodis TS 30.00), 16,7 mM en Ça+2, et 20 l d'agent fluorogénique spécifique de la thrombine (réactif Fluca kit Biodis TS 50.00). Différentes dilutions de l'échantillon de rFVIIa ont été effectuées (voir Tableau 1) et un volume constant de 10 l de ces échantillons dilués ont été ajoutés dans 170 l de plasma déplété en FVII et FVIII pour obtenir un volume total de 200 l en milieu réactionnel. Un TGT a été réalisé pour les différentes dilutions de l'échantillon (voir Tableau 1) de manière à obtenir des thrombinogrammes et les différents paramètres 10 15 20 25 - 20 - correspondant : temps de latence, hauteur de pic, temps au pic et vélocité. Parallèlement, on prélève différents volumes d'un échantillon de concentration étalon connue de rFVIIa que l'on mélange avec du plasma déplété en FVII et FVIII de façon à obtenir des concentrations finales en rFVIIa comprises entre 1 pM et 5 nM. On y a ajouté des facteurs initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Ca2+, phospholipides et FT) à des concentrations finales de 5 pM en FT, 4 M en phospholipides (réactif Biodis TS 30.00), 16,7 mM en Ça+2 et 20 l d'agent fluorogénique spécifique de la thrombine (réactif Fluca kit Biodis TS 50.00). Les paramètres de thrombinogrammes standards ont été mesurés de manière à tracer des courbes étalon des valeurs de chacun des paramètres en fonction du -log de la concentration finale en rFVIIa (voir figures 5, 6, 7 et 8). Les valeurs des paramètres obtenues pour les différentes dilutions de l'échantillon de concentration inconnue de rFVIIa ont été reportées sur les différentes courbes étalon standard. Les dilutions 1/200 à 1/5000 correspondent à des concentrations respectives sur les courbes étalon de 0,25 nM à 0,01 nM. En tenant compte du facteur de dilution, la concentration en rFVIIa de l'échantillon inconnu est de 50 nM. Tableau 1 : Valeur des différents paramètres pour l'échantillon de concentration en FVIIa inconnue Paramètres Dilution Dilution Dilution Dilution Dilution Dilution Dilution Dilution Dilution 1/10 1/20 1/50 1/10.0 1/200 1/500 1/1000 1/2000 1/5000 Temps de 1,13 1,13 1,13 1,46 1,8 2,13 2,8 3,47 4,47 latence Hauteur du 343,27 352,23 345,72 336,76 304,22 245,44 195,49 154, 73 110,47 pic Temps au 3,3 3,3 3,47 3,63 4,47 5,81 7,81 10,15 13,82 pic Vélocité , 158,19 , 162,31 , 147,74 , 155,18 113,94 66,69 39,01 23,16 11,81 Revendications 1. Procédé de mesure in vitro ou ex-vivo de la concentration de FVIIa dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) mélanger ledit échantillon avec un plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI ; b) ajouter des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine comprenant une source d'ions calcium, un agent phospholipidique et du facteur tissulaire ; c) effectuer un test de génération de thrombine (TGT) sur le milieu réactionnel ainsi obtenu afin d'obtenir un thrombinogramme fournissant des paramètres ; d) comparer au moins l'un des paramètres du thrombinogramme à un paramètre homologue de thrombinogrammes standards, chaque thrombinogramme standard étant obtenu avec une concentration étalon fixée de FVIIa dans ledit milieu réactionnel, comprise dans une plage allant de 1 pM à 1 nM, et e) déduire de l'étape d) une mesure de la concentration de FVIIa de l'échantillon comprise dans ladite plage. 30 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les paramètres de thrombinogrammes standards sont déterminés en réalisant une série de TGT avec des échantillons 35 étalons, constitués du même milieu réactionnel, chacun desdits échantillons comprenant une concentration étalon finale en FVIIa fixée dans la gamme de 1 pM et 1 nM. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que à l'étape d) l'un au moins des paramètres du 20 25- 23 - thrombincgrammè est choisi parmi la hauteur de pic, la vélocité, le temps de latence et le temps au pic. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'échantillon contenant du facteur VIIa est un échantillon plasmatique, un échantillon thérapeutique ou un échantillon thérapeutique contenant du facteur VII recombinant ou transgénique. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le plasma humain dépourvu de facteurs VII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII, le facteur IX et le facteur XI est un plasma humain immunodéplété. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le plasma humain dépourvu de facteurs VII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII, le facteur IX et le facteur XI est un plasma humain déplété chimiquement. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le plasma humain dépourvu de facteur VIII est déplété chimiquement avec de l'EDTA. 8. Kit susceptible d'être utilisé pour la mise en œuvre du procédé tel que défini selon l'une des revendications 1 à 7, comprenant : un plasma lyophilisé dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII le FIX et le FXI ; un lyophilisat contenant un agent phospholipidique et du facteur tissulaire, et une source d'ions calcium ; et un échantillon de FVIIa lyophilisé de concentration connue pour déterminer au moins l'un paramètres de thrombinogrammes standards.- 24 - 9. iJtilisation d'un kit tel que défini selon la revendication 8, pour la mesure in vitro ou ex-vivo de la concentration en FVIIa d'un échantillon. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'échantillon est un échantillon plasmatique, un échantillon thérapeutique ou un échantillon thérapeutique contenant du FVIIa recombinant ou transgénique. 11. Utilisation d'un plasma humain dépourvu de facteur VII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII, le facteur IX et le facteur XI pour mesurer in vitro ou ex-vivo la concentration de facteur VIIa d'un échantillon. 12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que l'échantillon est un échantillon plasmatique, un échantillon thérapeutique ou un échantillon thérapeutique contenant du FVIIa recombinant ou transgénique.