FR 2910493 A1 20080627 FR 0655723 A 20061220 La présente invention vise un procédé très général pour diversifier de manière aléatoire une séquence nucléotidique S par PCR, tout en préservant l'identité de certains domaines ou segments de cette séquence, une banque de séquences nucléotidiques ainsi diversifiées, et plus particulièrement une banque de séquences codant des protéines de ciblage de bactériophages modifiées. Les bactériophages se présentent comme des virus capables d'infecter spécifiquement les bactéries et de s'y répliquer. Leur existence a été mise en évidence au début du XXeme siècle par le Britannique Frederick Twort et le Québécois Félix d'Hérelle. Les bactériophages occupent toutes les niches écologiques où se trouvent des bactéries. Ils se manifestent principalement sous deux formes : la forme 1ysogénique, par laquelle ils peuvent demeurer de manière quiescente a l'intérieur de leur hôte, ou bien sous forme lytique, lorsqu'ils se répliquent de manière active en lysant la cellule bactérienne. La forme lytique amène les bactériophages à être libéré en grand nombre dans l'environnement sous une forme infectieuse. Afin de conserver leur caractère infectieux vis4vis de leurs hôtes qui connaissent parfois des mutations rapides, les bactériophages sont amenés à évoluer constamment. De ce fait, Ils présentent naturellement un degré élevé de spécialisation pour les espèces bactériennes qu'ils parasitent et sont très diversifiés, Dès leur découverte, les bactériophages ont été considérés comme un 25 moyen de lutter contre les infections bactériennes, et ce bien avant l'ère des antibiotiques. La démarche consistant a identifier dans la nature des bactériophages spécifique d'une bactérie pathogène afin de traiter les patients infectés par cette bactérie s'est ainsi développée en Russie et dans les pays de l'ancien bloc 30 soviétique pendant la première moitié du XXeme siècle. Cependant l'emploi des antibiotiques, dont le spectre est généralement beaucoup plus large, s'est généralisé dans la seconde moitié du XXeme siècle 2910493 2 de façon massive, sans exploiter toutes les possibilités offertes par les bactériophages. Aujourd'hui, face à l'apparition de souches bactériennes mufti-résistantes aux antibiotiques, et au vu des difficultés rencontrées pas la 5 communauté scientifique pour mettre au point de nouveaux antibiotiques, les bactériophages suscitent un nouvel intérêt pour le traitement des infections bactériennes difficiles à éradiquer, notamment en cas de contaminations nosocomiales [Thiel, K., Nature Biotechnology, 2004, 22 :31-36]. Certaines difficultés persistent toutefois dans l'utilisation des 10 bactériophages, notamment dans le fait que les bactéries peuvent échapper aux bactériophages en masquant ou en modifiant les éléments constitutifs de leur paroi externe. Le cycle de réplication des bactériophages nécessite, en effet, une étape de reconnaissance et d'adhésion du bactériophage à la paroi de la 15 bactérie hôte, laquelle conditionne la possibilité pour le bactériophage d'infecter la bactérie, c'est-à-dire d'injecter le matériel génétique contenu clans sa capside a l'intérieur du cytoplasme de la bactérie. Le bactériophage T4, par exemple, est un bactériophage qui infecte les bactéries de type Escherichia colt, dont le cycle de réplication dure environ 20 30 minutes à 37 C. Ce cycle de réplication débute immédiatement après la reconnaissance de la bactérie hôte par le bactériophage, par la phase d'absorption et de pénétration Il se traduit par l'arrêt immédiat de l'expression des gènes de la bactérie hôte, la synthèse des enzymes nécessaires à la réplication du phage, 5 minutes après l'infection, puis la réplication de l'ADN (démarrant après 10 minutes) et la formation du virus (démarrant après 12 minutes). Le cycle de réplication conduit à l'éclatement de la bactérie (après 30 minutes) et la libération dans l'environnement d'environ cinquante bactériophages par bactérie lysee L'adhésion à la bactérie est essentiellement assurée par les protéines de la plate-forme basale (baseplate) servant d'ancrage au bactéripphage et la reconnaissance est assurée plus particulièrement par des protéines formant les filaments périphériques, appelées fibres de queue . Néanmoins, les protéines de fibres de queue et du baseplate peuvent être à la fois impliquées 2910493 3 dans la reconnaissance et l'adhésion du bactériophage à la paroi bactérienne. L'ensemble de ces protéines dites de ciblage est représenté dans les figures 1 et 3 de la présente demande. Parmi les protéines impliquées dans cette reconnaissance ou cette 5 adhésion chez le phage T4, on peut citer plus particulièrement les glycoprotéines GP12 de la plate forme basale, et les glycoprotéines GP 36, GP 37 et GP 38 des fibres de queue. Afin de limiter l'émergence de bactéries résistantes au dispositif de reconnaissance des bactériophages, il est généralement proposé d'utiliser 10 simultanément différents formes de bactériophages capables de cibler une même bactérie. Ces bactériophages sont prélevés dans la nature ou issus de collections, pour former ensemble ce qu'on appelle un cocktail de bactériophages . 15 Cependant, il convient pour la mise au point de ces cocktails de bactériophages de sélectionner individuellement et rigoureusement les bactériophages qui les composent, en s'assurant, notamment, que ces bactériophages sont lytiques et non lysogèniques ou partiellement lysogèniques, comme c'est le cas souvent des bactériophages prélevés dans le 20 milieu naturel. La nécessité de tester individuellement les bactériophages pour s'assurer de leur efficacité réelle rend le développement des cocktails de bactériophages long et fastidieux, et ce d'autant qu'il faut prévoir un cocktail différent pour chaque bactérie considérée. 25 La demande WO 01/51066 décrit une telle préparation de bactériophages comprenant six bactériophages différents utilisée en tant qu'agent de conservation de produits alimentaires frais pour détruire la bactérie Listeria monocytogenes, responsable de la listériose. Cette préparation naturelle est conditionnée en pulvérisateur pour être pulvérisée sur de la 30 viande ou des produits laitiers, Elle est sans danger pour l'homme, les animaux ou les plantes, car les bactériophages ne peuvent infecter que des bactéries du genre Listeria et non les cellules des organismes pluricellulaires. 2910493 4 Pour remédier aux problèmes posés par la sélection des bactériophages naturels, il est proposé dans la demande WO 06/066224 une méthode pour obtenir des bactériophages dont les protéines de ciblage sont modifiées en vue de cibler spécifiquement un facteur de virulence donné. Les 5 facteurs de virulence sont des molécules décrites comme étant nécessaires à la bactérie pour développer une infection. Ces molécules sont considérées comme des éléments stables, moins susceptibles de varier au cours de l'infection que les éléments de structures externes comme, par exemple, les lipopolysaccharides. Plus particulièrement, cette méthode propose de 10 sélectionner une protéine issue d'un bactériophage naturel (par exemple p37 du phage T4) capable de reconnaître un facteur de virulence décrit dans la littérature (par exemple OmpC d'E.coli), de transférer le gène codant cette protéine dans un bactériophage lambda et d'utiliser le bactériophage lambda pour modifier cette protéine. La modification de la protéine consiste à opérer 15 des échanges entre les différents domaines impliqués dans la reconnaissance du facteur de virulence (par exemples les domaines His de gp37). Les phages lambda sont ensuite testés pour leur capacité à adhérer au facteur de virulence ciblé. Cette méthode, qui s'apparente à la technique du phage display, permet d'isoler différents variants du bactériophage lambda capables de cibler le 20 facteur de virulence, et ainsi de disposer de différentes protéines de ciblage. Les gènes correspondants à ces différentes protéines de ciblage, peuvent, par la suite, être transférés dans des bactériophages infectieux. Ces bactériophages peuvent alors constituer des cocktails de phages actifs vis-à-vis de la bactérie porteuse du facteur de virulence ciblé au départ. 25 Cette méthode constitue un progrès dans l'obtention de bactériophages diversifiés pour la mise au point de cocktails de bactériophages. Néanmoins, il reste que de tels cocktails ne visent que l'espèce bactérienne exprimant le facteur de virulence ciblé initialement. Cette méthode ne peut donc être mise en oeuvre que pour des 30 bactéries pathogènes cultivables sur lesquelles une identification préalable des facteurs de virulence a pu être effectuée. Pour rendre l'emploi des bactériophages plus universel, il serait utile de disposer de bactériophages infectieux vis-à-vis d'un plus grand nombre 2910493 5 d'espèces, par exemple, en créant des bactériophages dont le spectre d'infectivité serait modifié ou élargi. De tels bactériophages pourraient être utilisés à l'encontre de nouvelles espèces bactériennes, notamment à l'encontre de bactéries pathogènes émergentes ou à l'origine d'infections nosocomiales. Néanmoins, la production de phages modifiés dans leur spectre d'infectivité se heurte à la contrainte technique que l'obtention des bactériophages est dépendante de l'hôte bactérien dans lequel le bactériophage est transformé puis multiplié, Les étapes de modification génétique des phages comprennent généralement plusieurs étapes de 10 réplication dans un seul hôte bactérien. Dans les expériences décrites dans les documents de l'art antérieur précités, de nombreux cycles de réplication sont nécessaires pour modifier les bactériophages servant à cibler les facteurs de virulence La recombinaison homologue qui est la technique la plus souvent rencontrée pour transformer le 15 génome des bactériophages implique de nombreux cycles de réplication et de sélection successifs chez la bactérie. Or, les bactériophages modifiés, s'ils parviennent à acquérir la capacité d'infecter des hôtes différents de leurs hôtes habituels, peuvent aussi perdre la capacité d'infecter l'hôte utilisé pour leur réplication. Dès lors, ils se trouvent éliminés de la sélection et échappent à 20 l'expérimentateur. Il en résulte une importante perte de diversité des phages modifiés susceptibles d'être obtenus. Pour remédier aux difficultés précitées, la présente invention propose un nouveau procédé consistant à diversifier de manière aléatoire les séquences nucleotidiques, notamment celles codant les protéines de ciblage des 25 bactériophages, par insertion dans leurs gènes de séquences d'ADN produites de manière aléatoire. Ce procédé est particulièrement utile pour produire des copies de gènes comprenant des segments mutés de manière aléatoire, notamment en vue de leur clonage dans des vecteurs d'expression ou de recombinaison 30 homologue Le présent procédé selon l'invention a été mis au point initialement pour diversifier les protéines de ciblage des bactériophages et ainsi obtenir par recombinaison homologue des bactériophages recombinants dont la spécificité 2910493 6 d'hôte varie. Cependant, il ne saurait se limiter au seul domaine des bactériophages car il peut être appliqué à toute séquence d'ADN ou d'ARN. Les domaines d'applications sont nombreux notamment dans le 5 domaine médical, dès lors que l'on cherche à modifier une séquence génétique de manière aléatoire dans ses domaines variables, tout en préservant l'identité des domaines constants, qui sont généralement essentiels à la fonctionnalité de la protéine, Le procédé selon l'invention est détaillé ci-après, ainsi que son 10 application plus particulière dans le domaine des bactériophages. Figure 1 : représentation du bactériophage T4 montrant les différentes éléments constitutifs du bactériophage. Les protéines considérées dans le cadre de la présente invention sont encadrées. Figure 2 représentation du génome complet du bactériophage T4. Les gènes cités dans la présente demande sont indiqués à l'aide d'une flèche perpendiculaire aux cadres ouverts de lecture. Figure 3 représentation en trois dimensions de la plate-forme basale du bactériophage et des fibres de queue impliquées dans la reconnaissance et 20 l'adhésion du bactériophage à la bactérie hôte, permettant de visualiser ies protéines de ciblage modifiées selon le procédé de l'invention. Figure 4 . schéma résumant le principe d'obtention d'une banque de bactériophages recombinants selon l'invention. Le cadre en haut à gauche représente une bactérie hôte comprenant 3 vecteurs de recombinaison 25 homologues visant à introduire des oligonucléotides dont la séquence est produite de manière aléatoire dans trois gènes codant les protéines de ciblage du bactériophage. Ces vecteurs représentent des constructions d'ADN au sens de la présente invention, porteuses d'une grande diversité génétique. Après infection par un bactériophage et recombinaison homologue, un grand nombre 30 de bactériophages (banque de bactériophages) ayant des protéines de ciblage modifiées sont obtenus, formant une source de diversité de ciblage . Les bactériophages obtenus sont criblés vis-à-vis de nouveaux hôtes potentiels (sélection positive) afin de sélectionner des bactériophages capables d'infecter 2910493 7 ces hôtes. Ils peuvent être également testés sur des hôtes non bactériens (cellules eucaryotes) pour s'assurer qu'ils ne sont pas dangereux pour l'homme ou les animaux. Figure 5 : comparaison de la séquence polypeptidique de GP12 du 5 bactériophage T4 (ligne haute) et de son homologue présente dans le bactériophage RB 69 (ligne basse) selon le protocole BLAST. Les acides aminés communs aux deux protéines sont indiqués sur la ligne intermédiaire. Le symbole + signifie que les acides aminés sont similaires. La partie N-terminale encadrée correspond au domaine de ces deux protéines qui permet 10 l'ancrage du bactériophage sur la paroi de la bactérie, C'est ce domaine d'ancrage, qui est muté de manière aléatoire puis insérée par recombinaison homologue dans le génome du phage selon l'invention. Les segments internes Dl a D4 correspondent aux séquences de la protéine qui sont conservées au cours du procédé de diversification aléatoire mis en oeuvre par PCR selon 15 l'invention, Figure 6 : figure récapitulant les étapes du procédé par PCR mis en oeuvre sefon l'invention pour obtenir, notamment, une copie du domaine d'ancrage de gpl2 dans laquelle sont insérés des oligonudéotidiques produits de manière aléatoire. Les segments internes Dl a D4 dont on souhaite 20 conserver l'identité de la séquence sont figurés par des rectangles. Ces domaines correspondent a ceux mentionnés dans la figure 5 ci-dessus. Les deux segments externes délimitent la séquence du domaine d'ancrage de gp12. A : le domaine d'ancrage de gpl2 est amplifié par PCR haute fidélité. B 4 PCR erreur sont réalisées de manière indépendante à l'aide des 25 oligonucléotides mentionnés. C: Les produits d'amplifications obtenus en B sont purifiés et rassemblés dans une même réaction de PCR haute fidélité. Lesdits produits d'amplification se chevauchent si bien qu'il est possible d'assembler les différents fragments, mais a condition que les domaines Dl à D4 soient suffisamment conservés pour pouvoir hybrider les amorces utilisées. 30 D : Il résulte de la PCR réalisée à l'étape C, deux fragments PA-1 et Pal qui sont assemblés en utilisant les amorces correspondant aux segments externes du domaine d'ancrage de GP12. Au final, on obtient une copie du domaine d'ancrage de gpl2 dont la séquence a été modifiée de manière aléatoire sauf 2910493 8 au niveau des domaines Dl à D4 dont l'identité a été conservée. Description du procédé de diversification des séquences génétiques selon l'invention : 5 La présente invention a donc plus particulièrement pour objet un procédé de PCR permettant de muter de manière aléatoire une séquence nucléotidique S, délimitée à ses extrémités 5' et 3' par deux segments FI et F2, en conservant l'identité d'au moins un segment interne D de ladite séquence 10 nucléotidique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : i) on effectue une PCR-erreur sur la totalité de la séquence S à l'aide d'amorces correspondant aux segments FI et F2, par laquelle la séquence S va être mutée de manière aléatoire sur toute sa longueur; ii) on élue les produits d'amplification obtenus; 15 iii) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits d'amplification élués à l'étape en utilisant les couples d'amorces correspondant respectivement à au moins FI et D, et F2 et D, afin d'amplifier les régions F1--D et D-F2 de S mutées à l'étape i) dont le segment interne D a conservé son identité; 20 iv) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits d'amplification obtenus à l'étape iii) en utilisant les amorces correspondant à FI et F2; v) on purifie les produits de PCR obtenus dont la taille correspond à celle de la séquence nucléotidique 25 Ce procédé est particulièrement avantageux lorsqu'on cherche à conserver l'identité de plusieurs domaines internes DN à DN+a de la séquence nucléotidique S (comme c'est le cas de la protéine P12), Le procédé comprend alors les étapes suivantes i) on effectue une PCR-erreur sur 1 totalité de la séquence S à l'aide 30 d'amorces correspondant aux segments FI et F2, par laquelle la séquence S va être mutée de manière aléatoire sur toute sa longueur ; il) on élue les produits d'amplification obtenus; iii) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits 2910493 9 d'amplification élués à l'étape il), en utilisant les couples d'amorces correspondant respectivement à au moins FI et DN+1, et F2 et DN, afin d'amplifier au moins les régions FI- DN+1, et DN -F2 de S mutées à l'étape i), dont les segments internes et DN ont conservé leur identité; 5 iv) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits d'amplification obtenus à l'étape iii) en utilisant les amorces correspondant à FI et F2; Selon un aspect préféré de l'invention ce procédé est utile pour introduire des oligonucléotides produits de manière aléatoire dans certains 10 domaines variables des séquences codant les protéines de ciblage des bactériophages. Les protéines de ciblage du bactériophage se définissent comme des protéines qui participent à la reconnaissance et à l'adhésion du bactériophage à la bactérie hôte. Ces protéines sont de préférence choisies parmi celles constituant les fibres de queue ou de la plate-forme basale du 15 phage T4. Une protéine particulièrement adaptée au procédé selon l'invention est la protéine GPI2 de la plate forme basale dont la séquence nucléotidique correspond à SEQ ID N 1. D'autres protéines de ciblage préférées sont GP36, GP37 ou GP38 constitutives de la partie distale des fibres de queue. Bien entendu, des protéines homologues de celles citées ci-dessus présentes chez 20 d'autres bactériophages sont également préférées. Par séquence homologue, il faut entendre des séquences ayant au moins 50 % d'identité avec ces dernières, de préférence au moins 70 %, plus préférentiellement au moins 90 % présente chez deux organismes d'espèces différentes. 25 L'exemple est donné dans la présente demande de la modification de la protéine GP12 du bactériophage T4, particulièrement préféré selon l'invention. La protéine GPI2 présente un domaine d'ancrage dans lequel il est souhaitable d'introduire de la variabilité tout en maintenant l'intégrité de certains segments notés Dl à D4 (figure 5), lesquels segments correspondent à des domaines 30 conservés chez les protéines homologues des bactériophages de type-T. Préférentiellement, ce sont les segments des gènes des protéines correspondant aux domaines de la protéine impliqués dans les fonctions d'adhésion ou de reconnaissance qui sont modifiés, et plus préférentiellement 2910493 10 les segments correspondent à des domaines variables. Par domaine variable, il faut entendre les segments d'une séquence qui sont moins conservés lorsqu'on compare deux séquences homologues l'une à l'autre. Inversement, il est préférable de conserver l'identité des domaines les plus conservés, lesquels sont généralement indispensables à la fonctionnalité des protéines codées, le cas échéant, par ces séquences, Les protocoles de PCR utilisés selon l'invention sont des protocoles standards bien connus de l'homme du métier, C'est la manière dont ils sont mis 10 en oeuvre qui fait la particularité de l'invention. Par PCR-erreur, on entend une réaction de polymérisation en chaîne effectuée dans des conditions ne permettant pas une réplication fidèle des séquences d'ADN, Ce type de réaction peut être ObtenU en mettant en oeuvre une polymérase classique de type Taq en condition faiblement stringente et en 15 présence de sels de manganèse, ainsi que cela est décrit dans la littérature [Cadwell, R,C.et al. 1992, Randomization of genes by PCR rnutagenesis, PCR Methods Appt., 2:28-331. Une PCR haute fidélité est, au contraire, une réaction de polymérisation en chaîne permettant d'amplifier une matrice d'ADN avec un taux d'erreur de 20 réplication très faible. Ce type de réaction peut être obtenu en mettant en oeuvre, par exemple, une polyrnérase de type Pfu en condition stringente, ainsi que cela est décrit dans la littérature [Inmis, M.A. et al. Eds., PCR Protocols: a guide to methods and applications, 1989, Academic Press]. Les réactions de PCR haute fidélité mentionnées dans l'étape di) qui 25 permettent d'amplifier les sous-régions de la séquence S situées entre les segments conservés, sont de préférence effectuées de manière séparée, Dans les exemples de la présente demande la lettre F désigne une amorce sens (en anglais forward) et la lettre R désigne une amorce antisens (en anglais reverse). 30 Le présent procédé peut s'appliquer à toute séquence nucléotidique dont on cherche à faire varier sélectivement et de manière aléatoire, certains segments. Le procédé selon entio peut trouver des applications dans de 2910493 Il nombreux domaines thérapeutiques. Sa mise en oeuvre est, en effet particulièrement utile dès lors qu'on cherche à modifier le spectre d'activité, ou d'interaction avec un ligand, d'une protéine en modifiant aléatoirement des domaines particuliers de sa séquence 5 génétique. Ainsi, l'invention prévoit, par exemple, que la séquence S soit une séquence génétique codant pour une protéine ligand dont on cherche à modifier la spécificité vis-à-vis d'un récepteur, ou bien encore une séquence codant pour une immunoglobuline dont on cherche à modifier les domaines 10 variables. Lorsque la séquence S est présente sous forme d'ARN, le présent procédé peut être précédé d'une étape de rétro-transcription permettant d'obtenir une copie de ladite séquence sous forme d'un polynucléotide selon les protocoles usuels, 15 Les produits d'amplifications obtenus selon le procédé particulier de l'invention constituent une banque de séquences nucléotidiques S diversifiées de manière aléatoire dont l'identité des domaines internes DN a été conservée, En général les domaines internes DN conservent, SelOn le procédé de l'invention, plus de 50 % d'identité par rapport à leur séquence initiale dans la 20 protéine sauvage, de préférence plus de 70 %, et plus préférentiellement plus de 90 %, voire plus de 99 %, selon les conditions de PCR utilisées, La banque de séquences nucléotidiques selon l'invention peut être directement clonées clans des vecteurs d'expression, ou plus préférentiellement dans des vecteurs de recombinaison homologue, dont l'homme du métier 25 dispose, et former un ensemble de constructions selon l'Invention. Le procédé selon l'invention permet en particurier de surmonter la difficulté de muter par partie un gène de manière aléatoire. En effet, cela nécessitait dans l'art antérieur de produire des oligonuoléotides de manière aléatoire puis d'assembler ces oligonucléofides par clonage aux parties de la 30 séquence du gène dont on cherchait à conserver l'identité. Or, lorsque plusieurs oiigonudéotides doivent être insérés à différents endroits du gène, ce travail est très fastidieux et le résultat en termes de diversité des séquences obtenues est décevant. 2910493 12 Les constructions d'ADN selon l'invention, prises dans leur ensemble, permettent ainsi plus particulièrement d'intégrer dans le génome un très grand nombre de séquences nucléotidiques différentes codant des protéines modifiées. Une fois traduites en protéine, les séquences nucléotidiques contenues dans la banque susvisée peuvent résulter en l'expression de protéines présentant une diversité de séquences polypeptidiques produites de manière aléatoire incluant des domaines internes DN dont l'identité de la séquence polypeptidique est conservée, 10 A cet égard l'invention vise une banque de protéines résultant de l'expression d'une banque de séquences nucléofidique telle qu'indiquée ci-dessus, lesdites protéines présentant une diversité de séquences polypeptidiques produites de manière aléatoire incluant des segments internes DN ayant conservé leur identité, 15 Le présent procédé permet donc la modification ciblée de toute protéine dont on désire changer certaines spécificités fonctionnelles, en faisant varier de manière aléatoire les séquences de ces protéines impliquées, par exemple, dans des interactions avec des ligands, des activités catalytiques, la toxicité ou le transport. 20 Application des séquences diversifiées obtenues selon le procédé de l'invention à la transformation de bactériophages mutés dans leurs protéines de ciblage : Selon un aspect préféré de l'invention, les produits d'amplifications 25 obtenus sont insérés dans les gènes du bactériophage codant pour ses protéines de ciblage, au moyen de la recombinaison homologue. Les constructions d'ADN préférées selon l'invention comprennent de préférence - une région permettant la duplication de ladite construction dans une 30 bactérie hôte ; - une région permettant la recombinaison homologue dans le génome du bactériophage au niveau d'un gène codant une protéine de Calage, ladite région comprenant deux séquences d'ADN homologues aux séquences dudit 2910493 13 gène codant une protéine de ciblage, lesquelles délimitent un segment d'insertion incluant un oligonucléotide dont la séquence est produite de manière aléatoire, de préférence selon le procédé par PCR décrit ci-dessus. Selon un aspect préféré de l'invention, la région permettant la 5 recombinaison homologue comprend tout ou partie du gène codant la protéine de ciblage, de préférence la totalité de la séquence du gène, De préférence, cette seconde région consiste en un produit d'amplification susceptible d'être obtenu selon le procédé de mutation aléatoire exposé ci-dessus, 10 Selon un aspect préféré de l'invention plusieurs gènes codant des protéines de ciblage du phage sont mutés simultanément par recombinaison homologue selon le procédé de l'invention. Pour parvenir à un tel résultat, l'Invention prévoit de transformer la bactérie hôte successivement à l'aide de vecteurs différents, ciblant chacun un gène différent. 15 Les vecteurs préférés permettant de modifier simultanément les gènes GP12, GP37 ou GP38 du bactériophage T4 selon l'invention dans la bactérie hôte E.coli sont, par exemple, les vecteurs pACYC184 (ATCC 37033), pBAD18-K (ATCC 87397) et RR1 (ATCC 87076). De tels vecteurs présentent l'avantage de posséder des marqueurs conférant une résistance à des antibiotiques 20 différents et ne partagent pas de séquences nucléotidiques communes susceptibles d'occasionner desrecombinaisons entre les différents vecteurs une fois ceux-ci intégrés dans la bactérie hôte. Un bactériophage selon l'invention est, de préférence, un bactériophage lytique, naturel ou modifié 25 De préférence, le bactériophage utilisé est un phage de type-T, tels que les bactériophages T4, T5, T6 et T7, bien connus de l'homme du métier et plus particulièrement le phage T4, dont le génome a été séquencé [Miller, E.S. et al., Bacteriophage T4 genome, Microbiol Mol. Biot. Rev., 2003, 67(1):86-156]. La séquence complète du génome du bactériophage est disponible dans Genbank 30 (AF 158101) Une bactérie hôte selon l'invention est une bactérie utilisée couramment pour répliquer le phage que l'on cherche à modifier. De préférence, la bactérie hôte est une souche que l'on peut transformer à l'aide 2910493 14 d'une construction d'ADN selon l'invention permettant de modifier le phage par recombinaison homologue. Par transformation de cette bactérie hôte à l'aide des constructions d'ADN selon l'invention, on dispose d'une ou plusieurs banques de bactéries 5 hôte transformées. Chacune des bactéries de cette banque contient potentiellement une construction capable de transformer par recombinaison homologue une ou plusieurs des protéines de ciblage du phage de manière différente. Une telle banque de bactéries hôte présente l'avantage de pouvoir être 10 multipliée et conservée. Elle constitue un produit intermédiaire renouvelable utile pour la production des bactériophages recombinants dont les protéines de ciblages sont modifiées de manière aléatoire. Grâce au procédé selon invention, il est possible d'obtenir un ensemble de bactériophages recombinants très diversifié. 15 Ces bactériophages forment une banque de bactériophages au sens de la présente invention. Pour qu'une banque de bactériophages selon l'invention recouvre le plus grand nombre possible de bactériophage différents, il convient de mettre en oeuvre un nombre suffisant de bactéries hôtes transformées, car c'est ce 20 nombre qui détermine le nombre et la diversité des phages récoltés. Si ce nombre est suffisant, une banque de bactériophages selon l'invention comprend au minimum, au moins 106, de préférence 108, plus préférentiellement 1010 variants différents d'un même bactériophage, lesdits variants se distinguant par la séquence d'au moins une de leurs protéines de 25 ciblage. La diversité des bactériophages dans la banque selon l'invention peut se justifier par un calcul simple de dénombrement. Ainsi, si on considère que préférentiellement 3 gènes codant des protéines de ciblages sont modifiés ; par 30 l'insertion d'au moins 3 oligonucléotides composés de séquences aléatoires d'au moins 12 nucléotides ; et que 1/3 des séquences nucléotidiques imposent une modification polypepticlique au niveau des protéines de ciblage ; et que 2910493 15 - seulement 3 des 4 bases (A, T, C, G) sont susceptibles de produire une mutation par rapport à la protéine initiale ; On obtient alors un minimum de 324 possibilités de mutations au niveau polypeptidique, ce qui revient à dénombrer quelques 2,8.1011 bactériophages potentiellement différents. Les protocoles expérimentaux qui suivent ont pour but d'illustrer l'invention à titre d'exemple sans limiter la portée de l'invention revendiquée. Préparation des séquences de variants gp12, gp37 et gp38 de phages T4 Ce qui suit décrit le mode opératoire utilisé pour gp12, mais il peut être transposé sans difficulté pour l'homme du métier à la modification selon 15 l'invention de gp37 et gp38. Etape 1 : Préparation du gène gp12 Le gène gp12 est amplifié par PCR à partir de l'ADN génomique du T4 20 de type sauvage obtenu a partir d'une culture concentrée de lysat de phages (voir ci-dessus) en utilisant comme amorces gp12F 5'-TGAGTAATAATACATATCAACACG (SEQ ID No.2), et gpI2R 5'-TGATTCTTTTACCTTAATTATGTAC (SEQ ID No.3). Après purification sur un gel d'agarose préparatif, le produit de PCR 25 (gp12A) est utilisé comme matrice dans des réactions PCR sensibles à l'erreur avec pour but d'introduire des mutations et insertions ponctuelles dans la région codante correspondant au domaine de liaison au récepteur de gp12 (voir figure 5). 10 2910493 16 Etape 2 : Introduction de mutations aléatoires dans le domaine de liaison au récepteur. Une série de 4 réactions PCR emboîtées (40 cycles chacune) est mise 5 en oeuvre en présence de Mn2 de manière à induire des erreurs de polymérise aléatoires. Les PCR-erreur sont conduites dans un volume réactionnel de 100 pl, en utilisant des matrices et amorces à des concentrations finales respectivement égales à 400 ng et 30 pmol, avec 0,2 mM de dATP et dGTP (de 10 chacun), 1 mM de dCTP et dTTP (de chacun), 2,5 mM de MgCl2, 0,7 mM de MnCl2 et 5 U d'ADN-polyrnérase Taq (New England Biolabs, Inc.) dans du tampon réactionnel lx. La PCR est effectuée à 96 0C pendant 2 min, avec 30 cycles à 95 'C pendant 1 min, 56 C pendant 1 min et 72 C pendant 2 min, et une extension finale à 72 C pendant 7 min. 15 La première réaction (P1-1) utilise comme amorces : p12NFI F 5'-TCAAGGTAACCGCATCGTAAC (SEQ ID No.4) p12NF2R 5'-AAAGACCACGCATGTCAG (SEQ ID No.5) La deuxième réaction (P2-1) utilise comme amorces : p12NF2F 5'-TGCCATGGTGGAACTGTTÇA (SEC) ID No.6) 20 p12NF3R 5'-CACCTAATCTAGGTTTAC (SEC) ID No,7) La troisième réaction (P3-1) utilise comme amorces : pl ZNF3F 5'-CTGACATGCGTGGTCTTT (SEQ ID No.8) p12NF4R 5'-ATGTTTATGATAAGACAT (SEQ ID No.9) La quatrième réaction (P4-1) utilise comme amorces : 25 p12NF4F S-GTAAACCTAGATTAGGTG (SEQ ID No.10) p12NF5R 5'-TCATTCTTTTACCTTAATTAT(SEQ ID No.l 1) Chacun de ces produits de réaction présente un chevauchement partiel avec deux autres pmduits de réaction et les amorces utilisées correspondent à des domaines invariants conservés dans la protéine gp12. Ces domaines 30 doivent être préservés fidèlement dans les structures de gènes mutés finales produites. Cependant, certains des fragments produits par les réactions PCR sensibles à l'erreur peuvent parfaitement avoir subi une mutagenèse dans ces régions. Afin de préserver des domaines intacts, chacun des produits précités 2910493 17 doit alors être soumis à des réactions PCR à haute fidélité ayant pour but d'amplifier sélectivement seulement les fragments dans lesquels le domaine conservé a été retenu. Etape 3 : Amplification sélective des fragments désirés. Celle-ci est effectuée par deux séries de réactions PCR à haute fidélité comprenant chacune 25 cycles. Les PCR haute fidélité sont conduites dans un volume réactionnel de 10 50 pl, en utilisant des matrices et amorces à des concentrations finales respectivement égales à 250 ng et 40 pM, dans du tampon pour pfu 1 x (Tris-HCI 20 mM à pH 9,0, KCI 10 mM, MgSO4 1 mM, (NH4)2SO4 6 mM, 0,1 % de Triton X-100, 0,1 mg/ml de SAB) avec 200 pM de dNTP et 5 U de polymerase pfu (Promega). Les profils de PCR sont les suivants : 94 'C pendant 20 s, 45 C 15 pendant 15 s et 72 C pendant 30 s, avec répétition pendant 20 cycles. Dans la première série de réactions (PI-2 à P4-2), une portion aliquote (environ 250 ng) de chacun des produits de PCR précités est amplifiée en utilisant les amorces F correspondantes (par exemple p12NFI F) biotinylees à l'extrémité 5'. Cela est nécessaire pour séparer les produits 20 désirés des matrices non amplifiables (domaines conservés mutés) qui ont des longueurs pratiquement identiques et qui ne peuvent être séparées par électrophorèse sur gel. Les produits de chaque réaction sont ensuite passés sur des mini- colonnes d'exclusion dimensionnelle (pour éliminer l'excès d'amorces), purifiés 25 individuellement sur des billes de streptavidine, lavés dans du tampon de liaison, élués, précipités et remis en suspension dans ddH20. Dans la seconde série de réactions, une portion aliquote des produits de réaction P1-2 purifiés est mélangée à une quantité égale de produits de réaction P2-2. Ceux-ci ont en commun le site d'amorçage F2-R1 et F3-R.2. En 30 conséquence, le brin des produits de réaction P2-2 sert d'amorce pour le brin + des produits de réaction P1-2 et l'extension avec une polymerase débute au site d'amorçage F2-R1 interne de PI-2. L'extension échoue pour les 2910493 18 produits de réaction P1-2 où ce site conservé a été muté de manière significative. De manière similaire, le brin + des produits de réaction P1-2 sert d'amorce pour le brin - des produits de réaction P2-2 et l'extension avec 5 une polymérase débute au site d'amorçage F3-R2 interne de P2-2. L'extension échoue pour les produits de réaction P2-2 où ce site conservé a été muté de manière significative. Les produits de PCR amplifiés avec succès (PA-1) correspondent à une fusion des fragments P12 et P2-2 dans laquelle chacun des quatre domaines 10 conservés (FI + F2-Rl + F3-R2 + F4-R3) a été retenu à l'état non muté, Un mélange similaire est préparé à partir des produits de réaction P3-2 et P4-2. Dans ces réactions, une extension couronnée de succès est basée sur des sites conservés internes F4-R3 (P3-2) et F5-R4 (P4-2) intacts et les produits de PCR résultants (PA-1 et PB-1) correspondent à une fusion des 15 fragments P3-2 et P4-2 dans laquelle chacun des quatre domaines conservés (F3-R2 + F4-R3 + F5-R4 + R5) a été obtenu à l'état non muté, Les produits obtenus sont purifiés par électrophorèse sur gel préparatif puisque les dimensions des produits de PCR fusionnés sont très différentes de celles des matrices individuelles. 20 Afin d'augmenter le rendement dans cette seconde série de réactions PCR, le protocole d'extension peut être modifié de la manière suivante 10 cycles avec seulement les produits PI-2 et P2-2, et P3-2 et P4-2 dans les mélanges réactionnels. Les réactions sont interrompues, 50 ng de chacune des amorces 25 p12NFIF et p12NF3R sont ajoutés au mélange PA-1 tandis que 50 ng de chacune des amorces p12NF3F et p12NF5R sont ajoutés au mélange PB-1, en laissant ensuite les réactions PCR se poursuivre pendant 15 cycles supplémentaires. 30 Etape 4 Reconstitution du domaine d'ancrage muté de gpI2. Après purification, des portions aliquotes égales des produits PA-1 et PB-1 sont utilisées ensemble dans une réaction PCR à haute fidélité 2910493 19 comprenant 30 cycles ayant pour but de reconstituer le domaine total de liaison au récepteur de gpI2 en fragments uniques renfermant les diverses mutations introduites ci-dessus. Dans ce cas, comme dans la série précédente de réactions, les 5 produits PA-1 servent d'amorces d'extension pour les produits PB-1 et vice versa. Le produit de PCR fusionné final (gp12BD-Fu) est purifié par électrophorèse sur gel puisque ses dimensions sont très différentes de celles des matrices individuelles. 10 Afin d'augmenter le rendement, le protocole d'extension peut être modifié en procédant à une réaction comprenant 15 cycles avec seulement les produits P1-2 et P2-2, et P3-2 et P4-2 dans les mélanges réactionnels. Les réactions sont interrompues, 50 ng de chacune des amorces p12NFIF et p12NF5R sont ajoutés au mélange, puis on laisse ensuite les réactions PCR se 15 poursuivre pendant 15 cycles supplémentaires. Après purification, une portion aliquote (environ 250 ng) du domaine de liaison au récepteur de gp12 reconstitué est utilisée comme matrice dans une nouvelle série de quatre réactions PCR sensibles à l'erreur, avec ensuite des amplifications sélectives et des reconstitutions des domaines de la manière 20 décrite ci-dessus. Cependant, puisque, à chaque étape de fusion (étapes 3 et 4 ci-dessus), toutes les mutations possibles introduites individuellement dans chaque sous-domaine sont brassées de manière aléatoire dans le domaine reconstitué final de liaison au récepteur, il existe des limites quant au nombre 25 de cycles de mutagenèse qui peuvent être effectués sans effet négatif sur les domaines conservés. En raison des étapes nécessaires d'amplification sélective, il est estimé que, au-delà de 4 cycles successifs, toutes les mutations nouvellement introduites présenteront une forte probabilité d'effet négatif sur un domaine conservé ou d'introduction d'une réversion restituant la séquence T4 30 originale, non mutée, 2910493 20 Etape 5 : Reconstitution de la copie modifiée du gène gp12 dans son entier 1) Amplification du segment de gp12 en amont du domaine de liaison au 5 récepteur. Le gène gp12, engendré par PCR, produit ci-dessus (gpl2A) est utilisé comme matrice conjointement avec les amorces gp12F 5'-TGAGTAATAATACATATCAACACG (SEQ ID No.12), et gpl2AR 5'-GTTACGATGCGGTTACCTTGT (SEQ ID No.13) 10 Il s'ensuit une purification des produits d'amplifications obtenus sur un gel d'agarose préparatif, une précipitation puis une remise en suspension dans ddH2O. 2) Amplification du domaine de liaison muté de gpl2 Une portion aliquote (environ 500 ng) du produit de PCR (gp12B) est 15 utilisée conjointement avec une quantité égale de domaine de liaison au récepteur de gpl2 reconstitué (gpl2BD-Fu) dans une réaction PCR à haute fidélité. Il faut noter que ces deux produits présentent seulement en commun un chevauchement de 20 pb. En conséquence, le profil de la réaction PCR doit être modifié pour prendre ce fait en considération, 20 Profil de PCR modifié : A) 30 min à 96 C puis 5 cycles d'l min à 94 C, de 10 s à 45 0C, et ensuite B) 5 cycles d'l min à 94 'C et de 20 s à 50 puis C) 5 cycles d' 1 min à 94 0C, de 30 s à 50 C, et finalement D) 15 cycles d' 1 min à 94 d'l min à 55 de 5 secondes à 72 C. Afin d'augmenter le rendement, la réaction peut être interrompue à la 25 sous-étape D ci-dessus et les amorces gp12F et p12NF5R peuvent être introduites dans le mélange. On laisse ensuite la réaction se rétablir et s'effectuer jusqu'à son terme. Les produits finals (gp12-Mut) sont purifiés sur un gel d'agarose préparatif, précipités et remis en suspension dans ddH2O jusqu'à leur 30 utilisation 2910493 21 Clonage du gène gp12 muté dans un vecteur alternatif pour recombinaison homologue Les modes opératoires précités ont permis d'engendrer, de façon 5 similaire à gpI2, les gènes mutants gp37 et gp38 de T4. Le but des modes opératoires suivants est alors d'introduire ces gènes de T4 variants de manière à favoriser leur introduction, par recombinaison homologue, dans le génome du bactériophage T4 de manière à produire des descendances de T4 ayant des spécificités de ciblage d'hôtes différentes de 10 celle du bactériophage parental. A cet effet, les gènes mutés engendrés ci-dessus doivent être introduits dans des vecteurs alternatifs (un vecteur différent pour chaque gène). Dans le cas présent, les vecteurs pACYC184, pBADI8-K et RRI sont utilisés pour cloner chacun des gènes mutés, 15 Le vecteur choisi (par exemple pACYC184 pour le clonage de gpl2Mut) est coupé au niveau du site Smal, purifié et remis en suspension dans 20 pl de ddH2O et mélangé au produit de PCR gpl2Mut en un rapport de 1:3. Après ligation, l'ADN est purifié, remis en suspension dans ddH2O et transformé dans des cellules DK8 (ATCC 47038) électrocompétentes . Ce 20 vecteur porte un gène de résistance au chloramphénicol Chi), Ainsi, après une électroporation et une période de rétablissement de 1 h, les cellules sont transférées à 10 ml de milieu LB contenant 170 pglml de chloramphénicol et sont cultivées à 30 ''C pendant 4 h avec aération constante. Puis les cellules sont étalées sur des plaques de milieu LB + Chl et cultivées pendant une nuit à 25 30 0C, Quelques colonies sont prélevées pour la vérification par PCR de la présence du segment d'insertion gpl2Mut et quelques colonies positives sont cultivées dans du milieu LB + Chl pour la préparation d'une culture concentrée de cellules (DK8-p12C). 30 Introduction des gènes mutés gp37 et gp38 dans la bactérie hôte Une culture fraîche d'une nuit de DK8-pl2C est utilisée pour préparer des cellules électrocompêtentes. 2910493 22 Le vecteur pBAD18-K est coupé au niveau du site Sma 1, purifié et remis en suspension dans 20 pl de ddH2O et mélangé au produit de PCR gp37Mut en un rapport de 1:3, Après ligation, l'ADN est purifié, remis en suspension dans ddH2O et transformé dans des cellules DK8-p12C 5 électrocompétentes , Le vecteur utilisé dans ce cas porte un gène de résistance à la kanamycine (Kan). Ainsi, après une électroporation et une période de rétablissement de 1 h, les cellules sont transférées à 10 ml de milieu LB contenant 170 pg/ml de chloramphénicol et 50 pg/ml de kanamycine et sont 10 cultivées à 30 C pendant 4 h avec aération constante. Puis les cellules sont étalées sur des plaques de milieu LB + Chl + Kan et cultivées pendant une nuit à 30 C. Quelques colonies sont prélevées pour la vérification par PCR de la présence des segments d'Insertion gpl2lVlut et gp37Mut et quelques colonies pôsitives sont cultivées dans du milieu LB + Chl + Kan pour la préparation d'une 15 culture concentrée de cellules (DK8-p12C-p37K). Une culture fraîche d'une nuit de DK8-p12C-p37K est utilisée pour préparer des cellules électrocompétentes. Le vecteur RR1 est coupé au niveau du site Sma 1, purifié et remis en suspension dans 20 pl de ddH2O et mélangé au produit de PCR gp37Mut en un rapport de 1:3. Après ligation, l'ADN est 20 purifié, remis en suspension dans ddH2O et transformé dans des cellules DK8-p12C-p37K électrocompétentes . Le vecteur utilisé dans ce cas porte un gène de résistance à l'ampicilline (Amp), Ainsi, après une électroporation et une période de rétablissement de 1 h, les cellules sont transférées dans 10 ml de milieu LB contenant 170 pg/rnl de chloramphénicol + 50 pg/ml de kanamycine + 25 60 pg/ml d'ampicilline et sont cultivées a 30 C pendant 4 h avec aération constante, Puis les cellules sont étalées sur des plaques de milieu LB + Chi + Kan + Amp et cultivées pendant une nuit à 30 PC, Quelques colonies sont prélevées pour la vérification par PCR de la présence des segments d'insertion gpl2Mut, gp37Mut et gp38Mut et quelques colonies positives sont cultivées 30 dans du milieu LB + Chl + Kan + Amp pour la préparation d'une culture concentrée de cellules (DK8-p12C-p37K-P38A). Il reste à présent à construire un hôte capable de présenter une puissance de recombinaison extrêmement efficace. 2910493 23 Construction de bactérie hôtes E. colt mini-1 Pour obtenir la recombinaison efficace de l'ADN donneur dans des 5 fonds recA+ ou rec/r, on prépare l'hôte E. colt qui contient un prophage portant les gènes de recombinaison exo, bet et gam sous le contrôle d'un répresseur cl de 1 sensible à la température. Les gènes exo, bet et gam peuvent être aisément actionnés à 42 C et inhibés à 32 C. Lorsque les fonctions de 1 sont actionnées pendant un temps réduit à 5 min, les cellules 10 deviennent plus recombinogènes et absorbent l'ADN linéaire sans sa destruction. 1 Gam inhibe l'attaque de l'ADN linéaire par la nucléase RecBCD de E. colt, et Exo et Beta engendrent une activité de recombinaison pour cet ADN linéaire. De manière plus importante, cette recombinaison est efficace avec des homologies d'ADN limitées à 30 à 50 pb aux extrémités des substrats consistant en ADN linéaire. Les oligonucléotides 5' GTATGCATGCTGGGTGTGG (MIRO et 5' CGCACTCTCGATTCGTAGAGCCTCG (M Rr) sont utilisés comme amorces pour l'amplification par PCR de l'ADN provenant de la région attP-cro en utilisant l'ADN de 2. c1857 comme matrice. 20 Une fois le prophage 1 engendré par PCR, une possibilité consiste a le cloner le prophage 1 dans le plasmide pFN476 (ATCC86962) à petit nombre de copies avec sélection par LacZ, par exemple. Le vecteur pFN476 est coupé au niveau du site Sma 1 (extrémité franche), purifié, remis en suspension dans 20 pl de ddH20 et mélangé au 25 produit de PCR du prophage en un rapport de 1.3 Après ligation, l'ADN est purifié, remis en suspension dans ddH2O et transformé dans des cellules DK8-p12C-p37K-p38A électrocompétentes Après rétablissement, les cellules sont étalées sur des plaques de milieu LB X-gal + Chi + Kan + Amp (voir ci-dessus) et mises en incubation à 30 C. 30 Quelques colonies blanches sont sélectionnées pour la vérification par PCR de la présence du prophage 1, Une colonie positive de prophages 1 est ensuite cultivée pendant une nuit à 30 C dans du milieu LB + Chl + Kan + Amp 2910493 24 pour préparer une culture concentrée de cellules (DK8-T4Mut-2) à utiliser dans les manipulations ultérieures, A cette étape, les hôtes transformés sont inductibles par ),. à température élevée, lacZ-positifs et contiennent des copies de gènes gp12, 5 gp37 et gp38 de T4 mutés prêts pour la recombinaison homologue, Production de la descendance du bactériophage T4 avec des gammes d'hôtes étendues 10 Une culture fraîche d'une nuit de cellules DK8-T4Mut-2,. est préparée dans du milieu LB + Chl + Kan + Amp à 30 C. Les cultures pour infection par T4 sont commencées avec un volume égal ou inférieur à 0,05 ml de cellules d'une culture d'une nuit pour 10 ml de milieu LB + ChI + Kan + Amp afin de garantir que les cellules passent à la 15 phase de croissance exponentielle avant l'addition du bactériophage. Pour améliorer l'aération, ces cultures sont multipliées dans des fioles d'Erlenmeyer de 250 ml à branche latérale, bouchées non hermétiquement, dans un bain d'eau d'agitateur par secousses à 30 250 ml de cellules dans du milieu LB + Chi + Kan + Amp sont cultivés à 20 une densité de 3 x 108 cellules parmi à 30 C avec agitation par secousses, Des portions aliquotes de 10 ml de cellules à croissance exponentielle sont ensuite transférées à 40 ml de milieu LB + Chi + Kan + Amp préchauffé à 42 C et mises en incubation pendant exactement 15 min à 42 C avec aération constante. Du tryptophane est ajouté à une concentration de 0,02 mg/mi et suivi 25 par le bactériophage T4 à une multiplicité d'environ 10 particules par cellule. Les cultures sont transférées à un bain d'eau à 30 C, en laissant la croissance se poursuivre pendant exactement 25 min. Le but dans ce cas consiste à isoler la descendance de la première salve et à interrompre la propagation avant que cette descendance de 30 bactériophages de première génération ait eu le temps de se transformer en reproducteurs, 2910493 25 Récupération de la descendance des bactériophages Les cellules sont recueillies par centrifugation à 5000 tr/min pendant 5 minutes et le surnageant est récupéré, quelques gouttes de chloroforme sont 5 ajoutées et le mélange est centrifugé de nouveau pendant 10 min à 6000 tr/min. Le surnageant, en excluant le chloroforme, est ajusté à une concentration en tampon SM lx (MgSO4 10 mM, NaCI 100 mM, 0,01 % de gélatine et Tris-HCI 50 mM [pH 7,5j) en utilisant du tampon concentré 5x, et est stocké à 4 C avant l'analyse. 10 Les cellules rassemblées en un culot sont remises en suspension dans 8 ml de solution de Tris-chlorhydrate 0,05 M a pH 8,0 avec 25 % de saccharose. Une portion aliquote de 1,6 mi de lysozyme (5 mg/ml) est ajoutée et le mélange est mis en incubation pendant 5 min à 0 'C. Une portion aliquote de 3,2 ml de solution d'EDTA 0,2 M est ajoutée et le mélange est mis en 15 incubation pendant une période de temps supplémentaire de 15 min à o c. Le lysat cellulaire est ajusté à 500 mM de Trïs-HCI à pH 7,4, 100 mM de MnCl2 au moyen de tampon concentré 10x, mis à l'équilibre à 15 C et mis en incubation avec 10 U de Dnasel (Sigma) pendant 2 h. Le mélange est ensuite centrifugé à 6000 tr/min pendant 10 min. Le surnageant limpide est prélevé avec précaution, 20 ajusté à une concentration en tampon SM lx et stocké de la manière précitée. Vérification des extensions des gammes d'hôtes Des cultures de souches bactériennes pathogènes (Yersinia sp., almoneila st", E. col/ 0157 H7, Enterobactersakazakii, etc.) sont préparées. Des portions aliquotes de 3 ml sont ensuite infectées avec 1 ml de culture concentrée de la descendance et mises en incubation à 30 'C avec agitation. La turbidité de la culture est déterminée par colorimétrie immédiatement après l'infection et ensuite toutes les 60 min. Une chute significative de la turbidité de culture en un temps de 5 heures indique que les 30 particules capables d'infecter l'hôte testé étaient présentes dans la descendance de T4 recombinante. Quelques gouttes de chloroforme sont 2910493 26 ajoutées à la ou les cultures, ce qui provoque une chute nette de turbidité, et les cultures sont ensuite centrifugées à 5000 tr/min pendant 5 min. Le surnageant est récupéré et utilisé comme substance infectieuse pour la production de particules de bactériophages dédiées à la bactérie testée, 5 laquelle dans la nature, ne peut être attaquée par le bactériophage sauvage de type T4. 10 REVENDICATIONS 1. Procédé de PCR permettant de muter de manière aléatoire une séquence nucléotidique S, délimitée à ses extrémités 5' et 3' par deux segments FI et F2, en conservant l'identité d'au moins un segment interne D de ladite séquence nucléotidique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : i) on effectue une PCR-erreur sur la totalité de la séquence S à l'aide 10 d'amorces correspondant aux segments FI et F2, par laquelle la séquence S va être mutée de manière aléatoire sur toute sa longueur; ii) on élue les produits d'amplification obtenus; iii) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits d'amplification &Liés à l'étape il), en utilisant les couples d'amorces 15 correspondant respectivement à au moins FI et D, et F2 et D, afin d'amplifier les régions F1-D et D-F2 de S mutées à l'étape i) dont le segment interne D a conservé son identité; iv) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits d'amplification obtenus à l'étape fil) en utilisant les amorces correspondant à FI 20 et F2 ; v) on purifie les produits de PCR obtenus dont la taille correspond à celle de la séquence nucléotidique S. 2. Procédé selon la revendication 1 pour diversifier par PCR une séquence nucléotidique S, délimitée à ses extrémités 5' et 3' par deux 25 segments FI et F2, tout en conservant l'identité d'au moins N domaines internes DI à DN de ladite séquence nucléotidique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes i) on effectue une PCR-erreur sur la totalité de la séquence S à l'aide d'amorces correspondant aux segments F1 et F2, par laquelle la séquence S 30 va être mutée de manière aléatoire sur toute sa longueur ; fi) on élue les produits d'amplification obtenus; iii) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits d'amplification élués à l'étape H), en utilisant les couples d'amorces 2910493 28 correspondant respectivement à au moins FI et DN+1, et F2 et DN, afin d'amplifier au moins les régions F1- DN+1, et DN -F2 de S mutées à l'étape i), dont les segments internes DN+1 et DN ont conservé leur identité; iv) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits 5 d'amplification obtenus à l'étape iii) en utilisant les amorces correspondant à FI et F2; v) on purifie les produits de PCR obtenus dont la taille correspond à celle de la séquence nucléotidique S. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que N est 10 supérieur ou égal à 1. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que N est supérieur ou égal à 2. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence S est une séquence génétique. 15 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisée en ce que la séquence S code pour une protéine ligand dont on cherche à modifier la spécificité vis-à-vis d'un récepteur. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisée en ce que la séquence S code pour une immunoglobuline dont on cherche à modifier les 20 domaines variables ou hypervariables. 8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique S est une séquence codant une protéine de ciblage d'un bactériophage, telle que la protéine GP12 d'un bactériophage de type T. 9. Procédé de diversification d'une protéine codée par une séquence 25 nucléotidique S, caractérisée en ce qu'on traduit en protéines les séquences nucléotidiques produites par PCR obtenues selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 8. 30