FR 2907687 A1 20080502 FR 0609528 A 20061030 PROCEDE DE PURIFICATION DE SIALYLLACTOSE PAR CHROMATOGRAPHIE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention a pour objet un procédé de purification de sialyllactose par chromatographie d'une solution contenant le sialyllactose sur un lit fixe de résine spécifique. ETAT DE LA TECHNIQUE 1 o Le sialyllactose a un rôle de lutte contre les bactéries pathogènes; il permet de réduire les risques d'infections. Une étude récente a par ailleurs démontré que le sialyllactose réduit le risque de contamination par le HIV. Le sialyllactose est formé par association entre l'acide sialique et le lactose. Ce composé de formule brute C23H39NO19 (MW 633) est représenté par la formule 15 suivante (le sialyllactose présente une fonction acide carboxylique): 20 Sa concentration dans le lait est donnée à titre indicatif dans le tableau ci-dessous. Lait colostrum Lait Lait longue lactation Humain 1018+/229 365+/-245 Nd bovin 231+/75 33+/-8 54 +/-18 Le lait humain contient donc beaucoup plus de sialyllactose que le lait bovin. 25 Les laits infantiles produits à partir de lait bovin sont donc beaucoup moins riches que le lait humain et donc ne protègent pas aussi efficacement contre les bactéries pathogènes que le lait maternel. Ainsi, il serait utile de pouvoir compléter un lait R_ ABreeets\25400A25432-061027-v3.doc - 30 octobre 2006 - 1,12 2907687 2 infantile avec du syalyllactose, et pour ce faire il serait intéressant de disposer d'une source de sialyllactose. De nombreux brevets ou publications proposent l'utilisation d'enzymes ou de bactéries issues du génie génétique pour enrichir le lait en sialyllactose, ce qui 5 permet d'obtenir une solution riche en sialyllactose. Cependant, le sialyllactose n'est pas d'origine naturelle dans ce cas. La séparation entre le lactose et le sialyllactose a été réalisée sur du lactosérum après délipidation, à l'aide d'une séparation par tamis moléculaire avec de la résine Sephadex G50. Cette séparation est certes efficace mais l'adsorbant utilisé est cher et lo plutôt adapté à un usage de recherche au laboratoire plutôt qu'à une séparation à l'échelle industrielle. La demande US2004/0185146 décrit un procédé qui consiste à déminéraliser le lactosérum et à récupérer le sialyllactose sur une résine anionique, après décationisation sur une résine cationique. Ce procédé implique une consommation 15 élevée de réactif, car le lactosérum est totalement déminéralisé par le procédé. Ainsi, il existe un besoin d'un procédé de purification de sialyllactose utilisable à l'échelle industrielle qui donne de bons rendements. RESUME DE L'INVENTION. Il a maintenant été mis en évidence que l'utilisation d'une résine particulière 20 dans un procédé de séparation par chromatographie permet la séparation efficace de sialyllactose. L'invention fournit donc un procédé de purification de sialyllactose par chromatographie d'exclusion ionique d'une solution contenant le sialyllactose sur une résine cationique forte sous forme majoritaire monovalente, Na ou K, et obtention 25 d'un raffinat enrichi en sialyllactose. Selon un mode de réalisation, la résine est une résine du type polystyrène divinylbenzène sulfonée. Selon un mode de réalisation, la température est comprise entre 0 et 80 C. Selon un mode de réalisation, le procédé comprend une étape préalable de 30 substitution des ions divalents par des ions monovalents, en particulier substitution des ions calcium par des ions sodium ou potassium. Selon un mode de réalisation, le procédé comprend une étape préalable de nanofiltration. Selon un mode de réalisation, le procédé comprend une étape ultérieure de 35 concentration du raffinat ainsi obtenu. Selon un mode de réalisation.. la solution contenant le sialyllactose est du lactosérum, du perméat de lactosérum, du lait, des eaux-mères de cristallisation de lactose. R :1Brevets',25400 25432-061027-v3-doc - 30 octobre 2006 - 2/12 2907687 3 Selon un mode de réalisation, le procédé est mis en oeuvre de façon continue multi-colonnes. Selon un mode de réalisation, le procédé comprend une étape de substitution des ions divalents par des ions monovalents puis une étape de concentration par 5 nanofiltration, l'étape de chromatographie d'exclusion ionique et une étape de concentration sur membranes du raffinat. L'invention a aussi pour objet un procédé d'enrichissement de laits maternisés par adjonction de sialyllactose comprenant la production de sialyllactose par le procédé selon l'invention et l'ajout du sialyllactose ainsi obtenu à un lait maternisé to ou un précurseur de ce lait maternisé. L'invention vise donc aussi les laits maternisés obtenus par adjonction de sialyllactose obtenu par le procédé. L'invention a encore pour objet un dispositif pour la purification du sialyllactose comprenant au moins une unité de décalcification, au moins une unité de nanofiltration et au moins un unité chromatographie, pour la mise en oeuvre du 15 procédé selon l'invention. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES. La figure 1 représente un profil d'élution dans une colonne remplie avec une résine cationique forte; - La figure 2 représente un profil de concentration interne dans Ies colonnes 20 d'une installation mettant en oeuvre le procédé selon l'invention; - La figure 3 représente schématiquement un mode de réalisation de l'invention. EXPOSE DETAILLE DE MODES DE REALISATION DE L'INVENTION. L'invention s'applique de façon générale à toutes les fractions du lait contenant 25 le sialyllactose, en particulier le lactosérum. De même, l'invention permet la séparation des sialyloligosaccharides, en particulier le sialyllactose. En général, le lactosérum se présente sous deux grandes catégories: - Lactosérum doux. Egalement appelé lactosérum de fromagerie, il est produit au cours de l'élaboration des fromages obtenus au moyen de 30 présure. Le pH des lactosérums doux peut varier typiquement de 5,2 à 6,7. - Lactosérum acide. Il s'agit de sous produits de l'élaboration de caséine, de caillebotte ou de fromage frais. Le lactosérum de caséine provient de la fabrication par coagulation par l'acide lactique ou l'acide chlorhydrique. La fermentation naturelle produit de l'acide lactique confère une acidité élevée 35 au lactosérum. Le pH de cette gamme de produit va typiquement de 3,8 à 4,6. L'invention s'applique aux deux types de lactosérum décrits ci-dessus et de façon générale aux produits laitiers qui sont des solutions contenant des R:`Brev-ets'25400'25432-061027-s3.doc - 30 octobre 2006 - 3,12 2907687 4 sialyloligosaccharides, en particulier le sialyllactose. Des exemples de telles solutions sont le lactosérum issu de fromagerie, le perméat de lactosérum, le lait, les eaux-mères de cristallisation de lactose. Le procédé est basé sur la découverte que le sialyllactose peut être purifié de 5 façon notable par chromatographie d'exclusion d'ions en utilisant une résine cationique polystyrène divinylbenzène sulfonée. Le sialyllactose est séparé du lactose qui est le constituant majoritaire (80%) du lactosérum et se retrouve avec les molécules ionisées et les macromolécules présentes dans le lactosérum. En éliminant le lactose, la pureté du sialyllactose peut être multipliée par 5. Le principe de la séparation est basé sur deux phénomènes chromatographiques complémentaires, qui sont réalisés sensiblement simultanément sur la résine: - de par sa matrice polystyrene divinylbenzene, la résine adsorbe les molécules présentant une masse molaire faible comme le lactose mais exclue les masses molaires élevées comme le sialyllactose. Il y a donc un effet d'exclusion de taille (size exclusion chromatography) - de par sa ionisation, la résine exclue les molécules ionisées, tel que le sialyllactose, dont la fonction acide est dissociée au pH du lactosérum. Il y a donc un effet d'exclusion ionique (ion exclusion chromatography). Le procédé est mis en oeuvre, la résine étant majoritairement sous forme monovalente, Na ou K La combinaison de deux effets chromatographiques permet une bonne efficacité de purification, sans utilisation de réactif pour la régénération de l'adsorbant, en utilisant un adsorbant très bon marché et compatible avec un usage alimentaire du sialyllactose. L'invention permet donc la séparation de lactosérum en sensiblement deux fractions, la première fraction contenant le lactose et la seconde fraction contenant le sialyllactose, les molécules ionisées et des macromolécules La résine utilisée est une résine polystyrène divinylbenzène sulfonée. Toute résine polystyrènique gel, réticulée avec du divynilbenzène, peut être utilisée. Le taux de divynilbenzène (DVB) sera typiquement compris entre 2 et 16 %, préférentiellement entre 4 et 8% et plus préférentiellement entre 5 et 6%. La résine est une résine échangeuse de cations forts, utilisée en élution sous forme ionisée, Le cation peut être Na ou K. La résine cationique forte est sous forme majoritaire monovalente, c'est-à-dire que plus de 50% de la capacité totale de la résine est sous forme ionisée, Na ou K. Des exemples de résines sont les suivantes: Diaion UBK 550, Diaion UBK530, Dowex 99/310, 99/320, 99/350, Lanxess MDS 1368, Rohm&Haas CR1320, Rohm&Haas CR1310. R:ABrevets\25400`25432-061027-0.doc - 30 octobre 2006 - 4,12 2907687 5 La chromatographie selon l'invention peut être continue, discontinue (batch) ou séquentielle (notamment connue sous le nom de SSMB). L'invention peut être mise en oeuvre sur une seule colonne, ou dans un dispositif multi-colonnes, les dispositifs multi-colonnes étant préférés ici. 5 La technologie de SMB (Simulated Moving Bed) est connue depuis longtemps, et est l'objet notamment des brevets suivants US2957927, US2985589, US3205166, US3291726 et US3310486 (UOP). Des colonnes avec des longueurs chromatographiques variables peuvent aussi être utilisées dans l'invention. Ainsi, on peut mettre en oeuvre l'invention dans un système dit Varicol , développé par la 10 demanderesse, et correspondant aux brevets US6136198, US6375839, US6712973, US6413419 et WO00/25885. On peut aussi mettre en oeuvre l'invention dans un système dit Cyclojet , lui aussi développé par la demanderesse, et correspondant aux brevets US5630943 et WO97/20206, ainsi que US6063284 et WO98/51391. Tout autre procédé chromatographique, incluant la chromatographie batch, 15 qu'il soit multi-colonnes ou non, peut être utilisé; on pourra citer les systèmes connus sous les noms de ModiCon et PowerFeed , ainsi que la chromatographie SMB deux zones. L'éluant utilisé dans les procédés est tout éluant susceptible d'être utilisé en alimentaire; notamment il s'agit d'eau. 20 Le pH auquel est mis en oeuvre le procédé varie dans l'intervalle des pH de 0 à 12, préférentiellement, il est compris entre 5 et 7. La température à laquelle on met en oeuvre le procédé peut être comprise entre 0 C et 80 C, notamment par exemple à environ la température ambiante. La pression est telle que l'on opère en général en phase liquide. 25 Le sialyllactose est efficacement séparé par chromatographie (avantageusement continue) du lactose. Cependant, la forte concentration de phosphate de calcium dans le lactosérum peut présenter un risque de précipitation dans le séparateur. Ainsi, selon le cas, l'invention implique une étape préalable de prétraitement du lactosérum pour enlever tout ou partie du phosphate de calcium dans le lactosérum. Notamment, 30 on peut échanger les ions divalents en ions monovalents, et ainsi il est possible d'augmenter la teneur en sialyllactose dans le perméat entier. A titre d'exemple de prétraitement, on peut citer les procédés objet des demandes WO99/04903 et W02004/022787, WO2004/022788 et WO2004/022789. Notamment, l'étape d'échange ou substitution du phosphate de calcium fait emploi 35 d'une résine cationique dont le contre-ion est un cation métallique monovalent, comme le sodium ou le potassium par exemple. On peut aussi procéder, avant ou après la substitution des cations, à une substitution des anions bivalents en anions R,'1Brccets',25400A25432-061027-c 3.doc - 30 octobre 2006- 5/12 2907687 6 monovalents (par ex chlorure), dans des conditions décrites dans les demandes ci-dessus. On peut encore procéder à une concentration par nanofiltration sur membranes, pour éliminer les sels monovalents et concentrer les carbohydrates. Les différents 5 flux peuvent être traités pour être recyclés dans le procédé. Le raffinat contenant le sialyllactose qui est obtenu par le procédé selon l'invention peut être concentré selon des techniques classiques, par exemple par clarification par membranes, filtre à pré-couche, etc. On peut procéder à l'échange ionique décrit ci-dessus sur le raffinat obtenu par 10 le procédé selon l'invention. La figure 3 représente une installation faisant emploi de la technique préalable de substitution des cations divalents par des cations monovalents, en particulier de la substitution du phosphate de calcium par du phosphate de sodium ou de potassium. L'installation comprend alors une unité 1 d'échange des ions divalents en ions 15 monovalents, chlorure et sodium oui potassium. Le flux est traité par nanofiltration sur membranes dans l'unité 2. Le flux sortant est envoyé vers la séparation chromatographique 3. Cette unité 3 comprend par exemple 6 colonnes. On obtient un extrait et un raffinat. Enfin, l'invention a pour objet l'application du procédé de préparation de 20 sialyllactose pour son usage dans un lait maternisé. Des laits maternisés sont décrits notamment dans le document EP-A-0302807. Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. EXEMPLES Exemple 1. Chromatographie d'élution. 25 On utilise une colonne de 2,5 cm de diamètre et 100 cm de long est remplie de résine Diaion UBK 530 au préalable équilibrée avec du lactosérum. La température est maintenue à 60 C par un bain marie. Le débit de circulation est de 600 ml/h. 20 ml de perméat de lactosérum sont introduits dans la colonne puis élués par de l'eau. La concentration en sialyllactose dans le perméat de lactosérum est 30 d'environ 150 mg/l. L'effluent de la colonne est fractionné et le lactose, le sialyllactose et la matière sèche totale sont analysés. La courbe d'élution est donnée à la figure 1. BV signifie Bed Volume ou volume du lit. Si on collecte la fraction de 0,32 à 0,42 BV, 75% (lu sialylactose entrant est récupéré, et la pureté du sialyllactose passe de 0,15% sur matière sèche à une pureté de 0,62% sur matière sèche. Le 35 lactose se trouve principalement dans la fraction de 0,42 à 0,63 BV. Le tableau ci-dessous regroupe les valeurs (%ms étant % sur matière sèche) R t\Brevets\25400`,25432-061027-v3.doc 30 octobre 2006 - 6/ 12 2907687 7 Fraction Sialyllactose % ms Lactose %ms Reste %ms 0.32 à 0.42 0.66 7.77 91.56 0.42 0 0.62 0.04 97.03 2 .93 Exemple 2. Chromatographie continue. On utilise un pilote composé de 6 colonnes de dimension identiques à celle de l'exemple 1, fonctionnant suivant un procédé continu de type SSMB (sequential 5 Simulated Moving Bed). La température est maintenue à 60 C. Le lactosérum est concentré à 20% de matière sèche et filtré. On récupère ainsi un extrait et un raffinat. L'extrait contient le matériau le plus retenu sur la résine, tandis que le raffinat contient le produit le moins retenu. Le sialyllactose se retrouve dans le raffinat. Le profil de concentration interne est donné à la figure 2. Le tableau ci-dessous regroupe 10 les valeurs (%ms étant % sur matière sèche) Fraction Sialyllactose % ms Lactose %ms Reste %ms Raffinat 1,18 41,93 56,89 Extrait 0.01 93,71 6,28 Le procédé continu permet une séparation efficace entre le sialyllactose et le lactose, la pureté du sialyllactose atteint 1,18% et le rendement de récupération 98%. 15 Exemple 3. Installation avec séparation des ions. On met en oeuvre l'installation décrite à la figure 3. Le lactoserum qui est le flux d'alimentation des résines échangeuses d'ions comprend une teneur en ms de 6%, dont 80,56% de lactose et 0,30% de sialyllactose. Après échange ionique, le 20 profil du flux n'est pas sensiblement modifié, si ce n'est que la teneur en lactose est alors de 80,16%. Après nanofiltration, le rétentatest un flux comprenant alors 24% de ms, dont 90,45% de lactose et 0,32% de sialyllactose. Cette solution est traitée dans une installation de SSMB (disponible chez Applexion, Epone, France). La résine utilisée est une résine du type Diaion UBK 550, Diaion UBK530, Dowex 99/310, 25 99/320, 99/350, Lanxess MDS 1368, Rohm&Haas CR1320 ou encore Rohm&Haas CR1310. On utilise de l'eau de procédé comme éluant. Pour un débit de solution à traiter de 201/h, on utilise un débit d'eau d'environ 851/h. L'extrait (env. 451/h) contient alors 10,06% de ms dont 99,22% de lactose et 0,02% de sialyllactose, tandis que le raffinat (env. 601/h) contient alors 0,93% de ms, dont 16,97% de lactose et 30 2,88% de sialyllactose. R:\Brevets\25400\25432-061027-v3.doc - 30 octobre 2006 - 7/12 REVENDICATIONS 1. Procédé de purification de sialyllactose par chromatographie d'exclusion ionique d'une solution contenant le sialyllactose sur une résine cationique forte sous forme majoritaire monovalente, Na ou K, et obtention d'un raffinat enrichi en sialyllactose. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine est une résine du type polystyrène divinylbenzène sulfonée. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la température est comprise entre 0 et 80 C. 4. Procédé selon l'une (les revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il 15 comprend une étape préalable de substitution des ions divalents par des ions monovalents, en particulier substitution des ions calcium par des ions sodium ou potassium. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il 20 comprend une étape préalable de nanofiltration. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend une étape ultérieure de concentration du raffinat ainsi obtenu. 25 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la solution contenant le sialyllactose est du lactosérum, du perméat de lactosérum, du lait, des eaux-mères de cristallisation de lactose. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est 30 mis en oeuvre de façon continue multi-colonnes. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de substitution des ions divalents par des ions monovalents puis une étape de concentration par nanofiltration, l'étape de chromatographie d'exclusion 35 ionique et une étape de concentration sur membranes du raffinat. 10. Procédé d'enrichissement de laits maternisés par adjonction de sialyllactose comprenant la production de sialyllactose par le procédé selon l'une des R:ABrevets\25400`25432-061027-s3.doc - 30 octobre 2006 -8/12 5 2907687 9 revendications 1 à 9 et l'ajout du sialyllactose ainsi obtenu à un lait maternisé ou un précurseur de ce lait maternisé. RPBrevets i25400\25432-061027-v3.doc - 30 octobre 2006 - 9 '12