FR 2910491 A1 20080627 FR 0655935 A 20061222 1 PROCEDE D'AMPLIFICATION DU VHC CHEZ LES MOUSTIQUES Aedes DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne l'identification de nouveaux systèmes permettant l'amplification du virus de l'Hépatite C (VHC). Ainsi, il a été mis en évidence que certains moustiques du genre Aedes permettaient la réplication efficace in vivo du VHC. Ceci offre des perspectives prometteuses, notamment en termes de vaccinologie et de développement de médicaments contre cette infection. ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE Le virus de l'hépatite C (VHC) a été identifié comme étant responsable de l'hépatite non A non B pouvant évoluer en pathologies chroniques malignes, du type par exemple cirrhose du foie ou encore carcinome hépato-cellulaire. Le VHC, membre du genre Hepacivirus, appartient à la famille des Flaviviridae qui sont des virus à ARN monobrin enveloppés, parmi lesquels on rencontre les virus responsables de maladies épidémiques majeures telles que la Fièvre Jaune (YF), la Dengue (DEN) et la Dengue Hémorragique (DHF), l'Encéphalite Japonaise (JE), l'Encéphalite de Saint-Louis (SLE), la fièvre de West Nile (WN) et l'Hépatite C (HC) pour ne citer que les plus importantes. Les Flavivirus sont transmis par des insectes vecteurs, selon des modalités épidémiologiques très différentes. Certaines maladies sont typiquement humaines (ou liées aux primates) et ne touchent jamais les animaux comme la DEN et la DHF ; d'autres infections sont plutôt zoonotiques et touchent plus ou moins accidentellement l'être humain, comme la JE, la SLE et le WN. Enfin, certains Flavivirus peuvent circuler de façon épidémique aussi bien dans des populations humaines qu'animales (YF). Ces modalités épidémiologiques différentes ont pourtant des bases communes telles qu'une amplification virale dans des cellules d'insectes. Concernant le VHC, les voies de transmission aujourd'hui bien établies sont : transmission par les produits sanguins, toxicomanie, transmission sexuelle et contexte nosocomial. Toutefois, 30 à 40% des infections à VHC aujourd'hui répertoriées chez l'homme ont une origine inexpliquée, dans la mesure où aucune des conditions listées ci-dessus n'est réunie. Par ailleurs, il a été noté une forte prévalence de l'infection à VHC 2910491 2 dans des régions chaudes et humides, telles que l'Egypte, ainsi que dans le Japon Sud, à proximité du JEV. A ce jour, aucune explication n'a pu être donnée quant à cette répartition géographique de la maladie. 5 Concernant les stratégies vaccinales anti-VHC, elles sont aujourd'hui basées sur deux procédés usuels dans le domaine : d'une part des recombinants Vaccinia ou AAV (Adeno-Associated Virus) ; d'autre part, les stratégies de vaccinothérapie anti-VHC sont développées sur la base de polypeptides dérivés des protéines du VHC. 10 Dans la lutte menée contre les hépatites virales de type C, un obstacle majeur, entravant le développement d'un traitement et d'un vaccin efficace, est l'absence d'un système permettant la multiplication à haut niveau du virus in vitro. Ceci pourrait s'expliquer par une mauvaise adaptation du virus chez l'homme, le rendant incapable de se répliquer in vitro sur des modèles cellulaires conventionnels, tels que la lignée 15 d'hépatocarcinome ou les cellules hépatiques primaires. Des constructions moléculaires ont été proposées pour pallier ce problème, notamment le modèle des réplicons, mais elles partagent toutes le défaut d'être des formes alternatives assez éloignées des particules C naturelles. De manière plus exhaustive, les modèles actuellement disponibles pour l'amplification du VHC sont les suivants : Les modèles in vivo d'infection et de réplication virale sont répertoriés dans la 25 revue de Bartenschlager et al. (1). Concernant les modèles animaux conventionnels, le seul animal susceptible à l'infection par le VHC est le chimpanzé (P. troglodytes), chez qui les virémies sont à haut titre. D'autres primates (Tupaia belangeri chinensis) sont infectables, mais avec des virémies faibles et intermittentes. Un autre modèle animal disponible est la souris beige/nude/immunodéficiente avec xénotransplantation 30 d'hépatocytes humains (souris trimera R ), qui présente une virémie importante mais dont le succès est lié à la durée de vie du transgène. La revue de Bartenschlager et al. (1) rapporte également l'existence de systèmes de cultures cellulaires. Aucune lignée cellulaire autorisant un cycle permissif complet et la 35 production de particules virales, après infection conventionnelle, n'a été décrite (8). Le seul système efficace permettant la réplication est celui décrit par Bartenschlager et Lohmann (2) : il s'agit d'un système de réplicon subgénomique permettant, après transfection de cellules Huh-7 par du réplicon cloné, la réplication de l'ARN génomique VHC et l'expression des protéines non structurales (en particulier la protéase-hélicase et 20 2910491 3 l'ARN polymérase). Ce système est utilisé dans les criblages antiviraux. Une amélioration importante a été apportée par Wakita et al. (11). Ce dernier système de réplicon (clone HCV-JFH1) permet la production de particules virales complètes infectieuses (après transfection en cellules Huh-7). Toutefois et à l'heure actuelle, le système n'est pas adapté 5 à la production de biomasse importante. Enfin, des systèmes d'expression hétérologues ont été développés. Il s'agit, d'une part, des Virus Like Particles (VLPs), obtenues grâce à un baculovirus exprimant les glycoprotéines d'enveloppe hétérodimériques E1E2 (4). Récemment, le système 10 baculovirus a été exploité sur la base d'un recombinant contenant un ADNc des protéines core + gp E1E2, dans une expérience d'immunisation de chimpanzés à visée vaccinale. D'autre part, des pseudotypes ou pseudo particules (pp) rhabdoviraux (VSV, 6) ou rétroviraux (HIV ou MLV, 3) ont été obtenus. Ces systèmes, d'intérêt fondamental, sont utilisés pour l'étude de l'entrée virale via les gp E1E2. Ils ne sont utilisables que pour 15 l'étude des anticorps neutralisants anti-enveloppe VHC et ne présentent donc aucun intérêt en vaccinologie. Il apparaît donc qu'aucun des systèmes décrits ne donne entièrement satisfaction et qu'il persiste le besoin de développer de nouveaux modèles permettant une 20 amplification efficace du VHC. EXPOSE DE L'INVENTION 25 Ainsi et pour répondre à ce besoin, l'invention concerne un procédé d'amplification in vivo du virus de l'hépatite C (VHC) comprenant les étapes suivantes : a/ ingestion de la source virale par des moustiques femelles du genre Aedes ; b/ élevage des moustiques pendant le temps nécessaire à l'amplification du virus. 30 La première étape consiste donc à faire passer le virus dans le moustique de la manière la plus efficace possible, en l'occurrence par ingestion. Après ingestion par le moustique, le virus arrive dans l'estomac où il va franchir la paroi stomacale, puis se disperser dans l'hémocèle et atteindre différents organes, tels que les ovaires et les 35 glandes salivaires, où il est susceptible de se multiplier. Le virus peut par conséquent être transmis aux générations suivantes de moustiques ou à l'homme lors d'une piqûre. 2910491 4 Les moustiques du genre Aedes sont des Diptères, Nématocères, de la famille des Culicidae, sous-famille Culicinae, Tribu Aedini. Les femelles sont caractérisées par des palpes courts et des antennes non plumeuses. 5 Dans le cadre de la présente invention, les espèces Aedes vexans et Aedes caspius ont été utilisées. De manière avantageuse, ce sont des souches sauvages de ces espèces qui sont utilisées dans le cadre de l'invention. Ainsi, la population mise en oeuvre dans le procédé 10 provient d'un élevage réalisé à partir de matériel (oeufs, larves ou adultes) prélevé directement sur le terrain, dans le biotope privilégié de ces deux espèces. Les individus utilisés appartiennent avantageusement aux générations F0, F1 ou F2. Comme déjà dit, la mise en contact entre la source virale et les moustiques se fait 15 par ingestion. Avantageusement, la source virale est conditionnée à l'aide de globules rouges par exemple de mouton, éventuellement supplémentés avec de l'ATP, pour augmenter l'appétence des moustiques femelles. En pratique, l'ingestion se fait donc au cours d'un repas sanguin pris par les 20 moustiques femelles. Avantageusement, l'ingestion est réalisée à l'aide de la technique du gorgement. Cette technique particulièrement efficace est bien connue des entomologistes et décrite par exemple dans Fouque et al. (7). Dans le principe, un repas sanguin est proposé à des 25 moustiques femelles dans un gorgeoir qui permet de maintenir le repas à 37 C. Le gorgeoir est recouvert d'une peau au travers de laquelle les moustiques insèrent leur proboscis et prennent le repas. Dans un mode de réalisation avantageux de cette technique, il est mis en oeuvre 30 une peau de poulet. Selon l'invention, la source virale comprend un virus natif (virulent), ou avantageusement atténué. Un virus virulent permet de reproduire l'infection et donc offre un modèle expérimental de premier choix. De manière plus appliquée, un virus atténué 35 présente un intérêt particulier dans la production de vaccins ou d'anticorps. Selon un mode de réalisation privilégiée de l'invention, la charge virale provient d'un sérum, avantageusement d'origine humaine, par exemple celui d'un porteur 2910491 5 d'hépatite chronique VHC de génotype lb. Le titre classique d'un tel sérum est généralement autour de 2E6 copies / ml. Dans le cadre de l'invention, il a été déterminé que la mise en contact devait 5 avoir lieu à hauteur d'au moins 1000 copies du virus par moustique, avantageusement 1500 copies du virus par moustique. La seconde étape du procédé selon l'invention consiste à élever les moustiques pendant une durée déterminée. L'élevage est réalisé dans des conditions contrôlées, 10 notamment de température et d'humidité. La durée de l'élevage est déterminée en fonction des critères suivants : - elle doit être inférieure à la durée de vie moyenne de l'espèce de moustiques en captivité ; - elle doit permettre de réaliser au moins un cycle d'amplification extrinsèque 15 chez le moustique et préférentiellement d'obtenir un taux de réplication maximal du virus. Dans le cadre de l'invention, l'amplification apparaît optimale entre 15 et 30 jours d'élevage pour les Aedes testés, avec comme valeur moyenne avantageuse une 20 durée d'élevage d'environ 20 jours. La récupération du virus, notamment sous forme de particules virales, peut nécessiter leur extraction des tissus de moustiques. Des tissus privilégiés sont les ovaires et les glandes salivaires. L'invention offre donc un procédé d'amplification du VHC, se déroulant in vivo chez des espèces de moustiques spécifiques, donnant des résultats tout à fait inattendus et remarquables. 30 Il était certes connu de FR 2793 258 et Germi et al. (9) de produire in vitro du VHC dans de cellules d'insectes, mais avec des résultats insuffisants. Par ailleurs, des expériences antérieures, réalisées in vivo sur des moustiques appartenant aux espèces Aedes aegypti, Aedes albopictus, Anopheles stephensi et Culex 35 quinquefasciatus, respectivement, se sont révélées négatives (10, 5). Ces résultats sont cohérents avec le concept d'une longue coadaptation et d'une grande spécificité entre virus et moustique vecteur, mettant en lumière le mérite de la présente invention. 25 2910491 6 Comme déjà dit, le procédé selon l'invention offre des perspectives très prometteuses, y compris pour la production massive in vitro du VHC. Ainsi, le procédé selon l'invention donne accès à des tissus, notamment d'ovaire 5 ou de glande salivaire, ou des cellules d'Aedes, avantageusement d'Ae. Caspius ou vexans, porteurs du VHC. Ces cellules peuvent être utilisées en tant que telles pour la production massive du VHC in vitro. 10 Selon un autre aspect, l'invention concerne également un procédé d'obtention de cellules productrices in vitro de VHC. Il s'agit alors de cocultiver les cellules d'Aedes, porteuses du VHC, obtenues à l'aide du procédé selon l'invention, et des cellules de type AP61 ou C6/36. Les cellules de type AP61 et C6/36 ont été décrites par Germi et al. (9). 15 Il s'agit de lignées cellulaires de moustique, en particulier d'Aedes pseudoscutellaris, continues et bien définies. La coculture a pour but de transférer le VHC dans ces lignées cellulaires. L'invention concerne donc également des cellules de moustique productrices in vitro de VHC, obtenues à l'issu de ce procédé. 20 Ces deux sources cellulaires de VHC offrent d'importantes perspectives, notamment pour la production de particules virales d'une nouvelle nature (issues d'Aedes), d'anticorps et de vaccins. EXEMPLES DE REALISATION L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées. Ceux-ci ne sont cependant en aucun cas limitatifs. La figure 1 correspond à un gel illustrant la détection de l'ARN viral au sein des 30 moustiques Aedes vexans infectés par le VHC, après extraction des ARN totaux et RTPCR classique avec révélation de l'ADN au bromure d'éthidium. Piste 1). Témoin négatif de la PCR ; piste 2) Témoin négatif moustique; pistes 3, 4) jour 0; piste 5) jour 14; pistes 6, 7, 8) jour 21. 35 La figure 2 illustre la détection de l'ARN viral par qRT-PCR, après extraction des ARN totaux des moustiques Aedes (vexans + caspius) après 24 jours d'élevage. La courbe standard a été réalisée sur une dilution logarithmique d'un extrait d'ARN viral de titre connu (120 000 copies/run à 1 200 copies/run) (Fig. 2A). Dans la figure 2B, les témoins positifs sont identifiés par (JO, T+), et les individus susceptibles d'avoir répliqué le VHC 25 2910491 7 après 24 jours par (J20). Pour chaque échantillon, sont indiqués (i) le nombre de cycles au bout desquels l'ARN viral a été détecté (ii) ainsi que sa concentration au départ par rapport à la courbe standard. La courbe de la figure 2B montre l'évolution de la détection du signal pour chaque échantillon. 5 La figure 3 illustre la détection de l'ARN viral par qRT-PCR, après extraction des ARN totaux des moustiques Culex (pipiens) après 28 jours d'élevage La courbe standard a été réalisée sur une dilution logarithmique d'un extrait d'ARN viral de titre connu (800 000 copies/run a 8 000 copies/run) (Fig. 3A). Pour chaque échantillon, sont indiqués (i) le 10 nombre de cycles au bout desquels l'ARN viral a été détecté (ii) ainsi que sa concentration au départ par rapport à la courbe standard. La courbe de la Fig. 3B montre l'évolution de la détection du signal pour chaque échantillon. PARTIE EXPERIMENTALE I - Infections expérimentales 1. Elevage des espèces testées Les individus testés proviennent d'un élevage réalisé à partir de moustiques (oeufs, larves 20 et adultes) collectés sur le terrain dans la zone urbaine de Marseille pour l'espèce Culex pipiens et dans la réserve de la Tour du Valat en Camargue pour les espèces Aedes vexans et Aedes caspius. Ces élevages ont été réalisés dans les locaux de 1'ENSAM situés au Domaine du Merle, à Salon de Provence. Ces élevages sont réalisés dans un insectarium classique, aux normes d'élevage. Les larves sont nourries avec de la levure de bière et de 25 l'alimentation pour poisson et les adultes sont nourris avec une solution de sucrose. Les repas sanguins des Culex et Aedes sont composés de globules rouges lavés de mouton, le but du lavage étant d'éliminer l'interférence des éléments du sang. 2. Introduction des moustiques dans le Laboratoire Sécurisé (niveau 2+) 30 Au jour J-1, les moustiques femelles sont répartis en lots, placés dans les boites de gorgement avec un coton humide sur chaque boite et introduits dans le laboratoire sécurisé. Les moustiques sont conservés à température et humidité contrôlées (T = 25 C 2, RH 80% 10). 35 3. Introduction du virus VHC dans le Laboratoire L2+ Au jour JO, la solution virale contenant du virus VHC (sérum de patient porteur d'hépatite chronique à 2E6 copies/ml) est transportée par transporteur spécial jusqu'au L2+ où sont placés les moustiques. La solution virale est fournie par le Laboratoire de Virologie 15 2910491 8 moléculaire et structurale de la Faculté de Médecine de Grenoble. La solution virale est conservée dans le congélateur à -80 C du L2+. 4. Préparation de la solution sanguine infectée 5 Au jour JO, le mélange globules rouges lavés (sang de mouton) non-infectés et solution virale est réalisé, de manière à obtenir un titre suffisant pour infecter des moustiques (û1500 copies / moustique). De l'ATP est rajouté pour rendre le sang plus attractif et augmenter l'appétence des femelles. Chaque moustique prend entre 3 et 5 l par repas de sang. 10 5. Infection des lots de femelles Au jour JO, le gorgeoir contenant le sang infecté et chauffé à 37 C est présenté aux femelles, privées de glucose depuis 24 heures. Le gorgeoir est posé sur chaque boite et laissé sur place environ 4 heures pour la prise de repas sanguin. En parallèle, le gorgeoir 15 avec du sang non contaminé est présenté au lot de femelles témoins négatifs. Au bout de la durée de gorgement des femelles, celles-ci sont récupérées par l'aspirateur à bouche, endormies par les vapeurs de chloroforme puis triées sous loupe binoculaire. Les femelles ayant gorgé du sang sont remises dans les cages. Un gîte artificiel est laissé dans chaque cage métallique à la disposition des femelles pour la ponte (bac d'eau pour les femelles 20 Aedes et terre humide pour les femelles Culex). A partir de ce jour, les cages métalliques contenant les femelles gorgées ne sont ni ouvertes, ni manipulées jusqu'au sacrifice des moustiques. 6. Entretien des lots de femelles 25 Les lots de femelles sont maintenus à une température constante d'environ 28 C et avec une humidité contrôlée d'au moins 70%. Chaque jour, les femelles sont nourries grâce à du coton imbibé d'une solution de glucose à 10 % déposé sur la cage métallique. Les gîtes de ponte sont humidifiés à travers la cage avec une pissette. 30 7. Traitement des femelles Aux jours de prélèvement, les moustiques sont sacrifiés en plaçant la cage métallique au froid. Les moustiques sont ensuite placés dans des tubes 1,5 ml, identifiés et remis au congélateur jusqu'à l'étape d'extraction d'ARN avant les PCR. Les témoins négatifs, gorgés sur sang non virémique sont aussi sacrifiés. Le lot de moustiques, sacrifié au jour 35 JO et mis au congélateur à -80 C, constitue les témoins positifs JO de gorgement, d'extraction et d'amplification de l'ARN viral. 2910491 II ù Recherche d'ARN viral 8. Extraction de l'ARN pour les organes infectés L'extraction de l'ARN viral du VHC à partir de tissus de moustiques a été réalisée sous 5 hotte, à l'aide du kit High Pure RNA Tissue Kit commercialisé par Roche. 9 Amplification de l'ARN viral Les amorces utilisées ainsi que la sonde (pour la qPCR) ont été conçues pour l'amplification de la région conservée de l'extrémité 5' non codante du génome viral. 10 Nous avons utilisé l'amorce sens 2CH (5'-AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA-3') (SEQ ID 1), localisée entre les nucléotides -289 et -269, et l'amorce antisens 1TS (5' GCG ACC CAA CAC TAC TCG GCT-3') (SEQ ID 2), localisée entre les nucléotides - 70 et -90. La sonde utilisée pour la qPCR est la TM416 (5'-6Fam-AAC CCG CTC AAT GCC TGG A-Tamra-3') (SEQ ID 3) située entre les nucléotides -137 et-119. 15 La composition du mélange réactionnel pour la RT PCR classique et la qRT PCR est résumée dans le tableau suivant : Conc. Initiale Conc. Finale Volume par Conc. Initiale Conc. Finale Volume par tube ( l) tube ( l) 5X 1X 12.5 5X 1X 4.8 10mNl 2 10mNl 0.8 10 M 0.6 M 0.75 10 M 0.6 M 0.3 10 M 0.6 M 0.75 10 M 0.6 M 0.3 7.95 9 Tampon è dNTP Amorce sens Amorce antisens Sonde 2910491 10 La RT-PCR a été réalisée dans les conditions suivantes: La rétrotranscription se déroule pendant 30 minutes à 50 C, suivie par une étape de désactivation de la rétrotranscriptase (15 minutes à 95 C), puis 45 cycles de PCR alternant une étape d'élongation (1 minute à 63 C) et une étape de dénaturation (30 secondes à 90 C). RESULTATS Une première série d'expériences a révélé la présence de l'ARN viral chez Aedes vexans 10 après 21 jours d'élevage. Les résultats sont illustrés à la figure 1, qui montre des quantités détectables du virus au jour 21. Une seconde série d'expériences a été réalisée en parallèle sur Culex pipiens (Fig. 3), Aedes vexans et Aedes caspius (Fig. 2). Pour Aedes, les résultats obtenus dans 15 l'expérience précédente sont confirmés. L'analyse par RT-PCR en temps réel de l'ARN total extrait des moustiques gorgés au sang virémique après 24 jours d'élevage montre clairement la présence d'ARN viral du VHC génotype lb, alors qu'il est totalement absent dans les individus témoins négatifs (Fig. 2). 20 Ces expériences montrent que : a. II est possible de détecter l'ARN viral présent dans les moustiques ; ceci valide le procédé d'extraction de l'ARN total à partir des moustiques complets et l'amplification par RT-PCR en temps réel du génome viral (capillaires 14, 15 et 16, Fig. 2). b. L'ARN viral est totalement absent au sein des individus du genre Culex élevé 25 jusqu'au 28ème jour (Fig. 3). c. Enfin, il est totalement exclu que l'ARN détecté soit de l'ARN résiduel du fait de l'absence totale de cet ARN dans les moustiques Culex au J28 (Fig. 3, capillaires 6 à 17), comme il est exclu qu'il puisse s'agir d'une contamination, vu l'absence de tout ARN viral détectable au sein des témoins négatifs. 5 2910491 11 BIBLIOGRAPHIE (1) Bartenschlager R, Frese M, Pietschmann T (2004). Novel insights into hepatitis C 5 virus replication and persistence. Advances in Virus Research. 63 : 71-180. (2) Bartenschlager R, Lohmann V (2001). Novel cell culture systems for the hepatitis C virus. Antiviral Research. 52(1):1-17. (3) Bartosch B, Dubuisson J, Cosset FL (2003). Infectious hepatitis C virus pseudo particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of 10 Experimental Medicine. 197(5) : 633-42. (4) Baumert TF, Ito S, Wong DT, Liang TJ (1998). Hepatitis C virus structural proteins assemble into viruslike particles in insect cells. 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REVENDICATIONS 1/ Procédé d'amplification in vivo du virus de l'hépatite C (VHC) comprenant les étapes suivantes : a/ ingestion de la source virale par des moustiques femelles Aedes vexans ou Aedes caspius ; b/ élevage des moustiques pendant le temps nécessaire à l'amplification du virus. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moustiques sont issus de souches sauvages. 3/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la source virale est supplémenté en globules rouges, et éventuellement en ATP. 4/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ingestion de la source virale par les moustiques est réalisée par repas sanguin, avantageusement à l'aide de la technique de gorgement. 20 5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la technique de gorgement met en oeuvre une peau de poulet. 6/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la source virale est du sérum, avantageusement d'origine humaine. 7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la source virale comprend du virus atténué. 8/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ingestion 30 se fait à hauteur d'au moins 1000 copies du virus / moustique. 9/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'élevage des moustiques est réalisé pendant un temps allant de 15 à 30 jours, avantageusement pendant environ 20 jours. 10/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'à la fin du temps d'élevage, le virus est récupéré à partir des tissus de moustique. 25 35 2910491 13 11/ Tissu d'Aedes porteur du VHC susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 10. 12/ Cellule d'Aedes porteuse du VHC susceptible d'être obtenue par le procédé selon 5 l'une des revendications 1 à 10. 13/ Procédé d'obtention de cellules productrices in vitro de VHC comprenant la culture de cellules selon la revendication 12 en présence de cellules de type AP61 ou C6/36. 10 14/ Cellule de moustique productrice in vitro de VHC susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 13. 15/ Utilisation des cellules selon les revendications 12 ou 14 pour la production de particules virales, pour la production d'anticorps ou pour la préparation d'un vaccin.