FR 2912422 A1 20080815 FR 0700930 A 20070209 ENZYMES (3R)-HYDROXYACYL-ACP DESHYDRATASES IMPLIQUEES DANS LA BIOSYNTHESE DES ACIDES MYCOLIQUES ET LEUR UTILISATION POUR LE CRIBLAGE D'ANTIBIOTIQUES La présente invention est relative à de nouvelles enzymes impliquées dans la biosynthèse des acides mycoliques et à leur utilisation pour le criblage d'antibiotiques, médicaments susceptibles d'être utilisés pour traiter des infections chez l'homme ou chez l'animal, dues à des Corynebacterineae et plus particulièrement des infections dues à des mycobactéries pathogènes (Mycobacterium tuberculosis, M. africanum, M leprae, M. ulcerans, M microti, M bovis, M. abscissus, M avium, M fortuitum, M. kansasii...) ainsi que des infections provoquées par d'autres genres tels que Nocardia, Rhodococcus, Gordona... Depuis une quinzaine d'années, on observe une recrudescence de la tuberculose (dont l'agent est M. tuberculosis), notamment dans les pays industrialisés, due à la fois à la multiplication des cas de co-infection tuberculose/VIH et à l'apparition de souches de bacille tuberculeux multirésistantes aux antibiotiques. Ainsi, la conception de nouveaux médicaments antituberculeux est redevenue une priorité. L'identification de cibles pharmacologiques est donc nécessaire pour le développe-ment de nouveaux médicaments. Les acides mycoliques mycobactériens, également appelés eumyco- lates, sont des acides gras à très longue chaîne (C60-C90), a-alkylés et (3-hydroxylés, présents sous forme d'esters dans la paroi de bactéries d'une lignée phylogénétique particulière des actinomycètes, le sous-ordre des Corynebacterineae, également dénommés mycolotas , comprenant, entre autres, les genres bactériens : Mycobacte- rium, Corynebacterium, Rhodococcus, Nocardia, Gordona et Tsukamurella. Les acides mycoliques sont ainsi spécifiques de l'enveloppe des mycobactéries et des bactéries apparentées (Brennan & Nikaido, 1995) ; les acides mycoliques mycobacté- riens se distinguent des acides mycoliques des genres apparentés qui ont des longueurs de chaîne plus courtes (Barry et al., 1998). Ces composés sont importants pour l'architecture et la perméabilité de l'enveloppe mycobactérienne pour laquelle ils représentent une barrière hydrophobe de diffusion (Brennan & Nikaido, 1995). De plus, ils ont un rôle essentiel dans la survie des mycobactéries, et ils sont impliqués 2 clans la virulence et la persistance du bacille tuberculeux chez l'hôte infecté (Dubnau et al., 2000 ; Glickman et al., 2000). Parmi les mycolotas, on trouve des pathogènes majeurs, notamment les mycobactéries Mycobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose et Mycobacte- rium leprae, agent de la lèpre. Plus précisément, le genre Mycobacterium comprend plusieurs espèces classées en 3 groupes en fonction de leur risque d'infection pour l'homme. Dans le groupe des pathogènes stricts, plusieurs espèces sont retrouvées dont le bacille de la lèpre M. leprae ainsi que M tuberculosis qui appartient au sous-groupe appelé "complexe M tuberculosis". Ce sous-groupe est constitué des 4 membres classiques : M. tuberculosis, M bovis, M. microti, M africanum, et des 3 membres définis récemment M canetti, M pinnipedii et M caprae (Aranaz et al., 2003; Cousins et al., 2003; van Soolingen et al., 1997). Le deuxième groupe correspond aux pathogènes opportunistes pour l'homme (comme M avium, M fortuitum, M kansasii...) qui ont été isolés chez certains animaux et dans l'environnement. Ces mycobactéries sont responsables de pathologies chez l'homme (mycobactérioses) notamment chez des sujets présentant un système immunitaire affaibli (par exemple, les personnes atteintes de SIDA). Enfin, le troisième groupe correspond aux mycobactéries non pathogènes saprophytes (M. smegmatis, M phlei, M gastri...) présentes dans l'environnement. Parmi les médicaments anti-tuberculeux, se trouvent ceux qui inter- fèrent avec la biosynthèse de l'enveloppe des mycobactéries, tels que l'isoniazide, l'éthionamide et l'éthambutol (WEBB et al., Molecular Biology and Virulence 1 : 287-307 (eds. Ratledge, C. & Dale, J.) (Blackwell Science Ltd, Oxford), 1999). L'isoniazide, antibiotique spécifiquement antituberculeux a principalement pour cible une enzyme du métabolisme des acides rnycoliques ; il inhibe l'activité de la protéine InhA, qui fait partie du complexe enzymatique ou système FAS-II, dont la fonction est de produire par cycles d'élongation successifs, des acides gras à longue chaîne (acyl-ACP jusqu'à C32 in vitro, voire jusqu'à C60 in vivo), précurseurs des acides mycoliques, en utilisant le malonyl-ACP comme unité d'élongation. InhA, une 2-trans-enoyl-ACP réductase, catalyse la 4eme étape d'un cycle d'élongation qui comprend quatre étapes (Figure 1). Plus précisément, l'initiation du système d'élongation du système FAS-II mycobactérien est réalisée par une /3-cétoacyl-ACP synthase III, (mtFabH ou KasIII), faisant probablement le lien entre les deux systèmes FAS-I et FAS-II en catalysant la condensation des acyl-CoA dérivés de FAS-I avec l'unité d'élongation, le malonyl-ACP (Choi et al., 2000) (figure 1). Le système FASII, quant à lui, fait intervenir les protéines suivantes : la ,(3-cétoacyl-ACP réductase MabA (2eme étape), l'enoyl-ACP réductase InhA (4ème étape), les /3-cétoacyl-ACP synthases KasA, KasB (1è`e étape) (Banerjee et al., 1998; Kremer et al., 2001; Kremer et al., 2002; Marrakchi et al., 2000; Quémard et al., 1995; Schaeffer et al., 2001b) (figure 1). La cible de l'isoniazide est l'enzyme InhA ; l'isoniazide est une pro-drogue qui forme avec le coenzyme de InhA, le NADH, un adduit inhibiteur. Dans un premier temps, MabA a été choisie comme cible et le criblage de molécules inhibant MabA (Demande Internationale WO 03/082911) a été proposé. Toutefois, il existe un réel besoin de trouver des inhibiteurs d'autres enzymes de ce cycle, pour élargir la panoplie de médicaments disponibles, compte tenu de la fréquence d'apparition des résistances aux antibiotiques. D'autre part, multiplier les cibles augmentent les chances de concevoir des molécules pharmaco- logiquement actives qui pourront effectivement être utilisées en clinique. Parmi les enzymes du système FAS-II mycobactérien, l'enzyme (3R)-hydroxyacyl-ACP déshydratase, intervenant dans la troisième étape du cycle et catalysant la transformation des (3R)-hydroxyacyl-ACP en 2-trans-enoyl-ACP, n'a pas encore été identifiée. L'ensemble des enzymes ou domaines hydroxyacyl déshydra- tases sont difficiles à identifier à cause du manque de similarité entre les séquences. Ce fut par exemple le cas du domaine déshydratase de FAS-I de M. bovis BCG et de la (3R)-hydroxyacyl-ACP déshydratase du système FAS-II mitochondrial de Saccharomyces cerevisiae (Fernandes & Kolattukudy, 1996; Kastaniotis et al., 2004). Une activité (3R)-hydroxyacyl-ACP déshydratase a été observée chez des bactéries, (y compris Streptococcus, Staphylococcus, E. coli et Haemophilus influenzae), et correspond aux enzymes FabZ (déshydratase) et FabA (déshydratase-isomérase) (Brevet US 6,951,7298). La recherche de protéines portant le motif consensus FabA/FabZ (`F-x(1,2)-G-H-[FI]-P-x(5)-P-G-V-x(3)-E-[AGS]-[LM]-A-Q') (SEQ ID NO:17) dans le genre Mycobacterium à l'aide du logiciel ScanProsite (www.expasy.ch/tools/scanProsite) n'a pas permis d'identifier de protéines candidates (3R)-hydroxyacyl déshydratases chez les mycobactéries. Ces résultats ont permis de conclure qu'aucune protéine de type FabZ ou FabA n'était présente chez les espèces mycobactériennes disponibles à travers le logiciel ScanProsite. Ceci suggérait que les protéines déshydratases/hydratases (R)-spécifiques des mycobactéries devaient posséder un motif catalytique différent du motif commun FabA/FabZ. Les Inventeurs ont maintenant déterminé les enzymes intervenant dans la troisième étape du cycle d'élongation des acides gras du système FAS-II mycobactérien et leur intérêt comme cible pour le criblage de médicaments et notamment d'antibiotiques actifs sur les microorganismes (bactéries, parasites, par exemple) contenant un système FAS-II, dans lequel la troisième étape du cycle d'élongation est catalysée par une déshydratase contenant un motif hydratase 2, ou un motif catalytique apparenté, dérivé du motif hydratase 2 et constitué au moins par le motif de base D-x(4)-H, dans lequel x(4) représente quatre acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé ou par un motif de base similaire. Des molécules possédant un pouvoir inhibiteur sur l'expression ou l'activité des (3R)-hydroxyacyl-ACP déshydra- tases du système FAS-II mycobactérien pourront également potentiellement inhiber d'autres métabolismes essentiels faisant intervenir des protéines de type hydratases 2, dans un microorganisme donné. Les Inventeurs ont trouvé que les enzymes responsables de la troisième étape (déshydratation) dans le système FAS-II de M. tuberculosis H37rv correspondent à des protéines comprenant des sous-unités protéiques incluant Rv0635 (SEQ ID NO :4), Rv0636 (SEQ ID NO :2) ou Rv0637 (SEQ ID NO :6) de M. tuberculosis H37Rv. Les différentes enzymes contenant Rv0636 sont dépendantes de l'ACP et présentent une spécificité pour des substrats à longues chaînes. La présente invention a en conséquence pour objet une enzyme puri-25 fiée et isolée, impliquée dans le système FAS-II mycobactérien et possédant les caractéristiques suivantes : a) elle est constituée par un dimère ou un multimère sélectionné dans le groupe constitué par (i) les homodimères et les homomultimères comprenant deux ou plusieurs protéines 30 comprenant un motif hydratase 2 [YF] x(1,2)-[LIVG]-[STGC]-G-D-x-N-P-[LIV]-H- x(5)-[AS] (SEQ ID NO:15), (dans lequel x(n) représente n acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé et les acides aminés entre crochets représentent des alternatives) ou un motif catalytique apparenté, dérivé du motif hydratase 2 et constitué au moins par le motif de base D-x(4)-H, dans lequel x(4) représente 4 acides ami-nés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé, ou un motif similaire au motif de base, 5 (ii) les hétérodimères et les hétéromultimères constitués d'une ou plusieurs protéines telles que définies en (i) et d'une ou plusieurs protéines ne portant pas de motif hydratase 2, mais dont la structure tridimensionnelle présente un repliement de type hot dog ; et b) elle catalyse la déshydratation d'un substrat (3R)-hydroxyacyl en 2-trans-enoyl 10 et/ou l'hydratation d'un substrat 2-trans-•enoyl en (3R)-hydroxyacyl, conformément au schéma suivant : CH3ù (CH2)n OH ù CHù CH2 ù (R) O I I CùSù X CH3ù (CH2)n ù CH= CH ù dans lequel X représente ACP et n>0, de préférence n?4, ou CoA et n?0, de préférence 15 n?8. La protéine ne portant pas de motif hydratase 2 (i.e. sans site catalytique) est, par exemple, une protéine fixant une longue chaîne acyle. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la protéine telle que définie en (i) est sélectionnée dans le groupe constitué par la protéine 20 Rv0636 (SEQ ID NO:2) comprenant un motif hydratase 2 Y-A-G-V-S-G-D-L-N-P-IH-W-D-D-E-I-A (SEQ ID NO:16) et une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité avec la protéine Rv0636 de séquence SEQ ID NO :2 de M. tuberculoses H37rv. 25 Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la protéine telle que définie en (ii) qui ne comporte pas de motif hydratase 2, est sélectionnée dans le groupe constitué par : - la protéine Rv0635 (SEQ ID NO :4) ou une protéine qui possède au moins 53 % d'identité ou au moins 67 % de similarité, de préférence au moins 69 % d'identité ou 6 au moins 82 % de similarité avec la protéine Rv0635 de séquence SEQ ID NO :4 de M tuberculosis 1-137RV et -• la protéine Rv0637 (SEQ ID NO :6) ou une protéine qui possède au moins 44 % d'identité ou au moins 61 % de similarité, de préférence au moins au moins 59 d'identité ou au moins 76 % de similarité avec la protéine Rv0637 de séquence SEQ ID NO :6 de M tuberculosis H37Rv. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le dimère ou multimère est sélectionné dans le groupe constitué par : . un homodimère ou un multimère de Rv0636 (SEQ ID NO :2) ou d'une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité, sur la totalité de sa séquence avec la protéine Rv0636 de M tuberculosis, . un hétérodimère ou un hétéromultimère constitué (i) de la protéine Rv0636 (SEQ ID NO :2) ou d'une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité avec la protéine Rv0636 de séquence SEQ ID NO :2 de M tuberculosis H37Rv et (ii) de la protéine Rv0635 (SEQ ID NO :4) ou d'une protéine qui possède au moins 53 % d'identité ou au moins 67 % de similarité, de préférence au moins 69 % d'identité ou au moins 82 % de similarité avec la protéine Rv0635 de séquence SEQ ID NO :4 de M. tuberculosis H37RV et . un hétérodimère ou un hétéromultimère constitué (i) de la protéine Rv0636 (SEQ ID NO :2) ou d'une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité avec la protéine Rv0636 de séquence SEQ ID NO :2 de M. tuberculosis H37Rv et (ii) de la protéine Rv0637 (SEQ ID NO :6) ou d'une protéine qui possède au moins 44 % d'identité ou au moins 61 % de similarité, de préférence au moins au moins 59 % d'identité ou au moins 76 % de similarité avec la protéine Rv0637 de séquence SEQ ID NO :6 de M tuberculosis H37Rv . Les enzymes conformes à l'invention interviennent ainsi dans la 30 troisième étape de déshydratation du cycle d'élongation du système FAS-II mycobactérien en tant que (3R)-hydroxyacyl déshydratase (Figure 1). 7 Les recherches BLAST' ont permis de montrer que ces trois protéines sont très conservées parmi les mycobactéries (Figures 7-9) : -Rv0635 : 70-100 % d'identité et 86-100 % de similarité chez M tuberculosis et M. avium, M. smegmatis, M. bovis et M. leprae ; 53 % d'identité et 5 67 % de similarité chez Nocardia et Rhodococcus. - Rv0636 : 85-100 % d'identité et 90-100 % de similarité chez M tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium et M. smegmatis ; 51-63 % d'identité et 72-78 % de similarité chez Nocardia et Rhodococcus. - Rv0637 : 68-100 % d'identité et 83-100 % de similarité chez M. 10 tuberculosis, M avium, M. smegmatis, M: bovis et M. leprae. En outre, la séquence d'autres Corynebacterinae, à savoir Corynebacterium glutamicum, Rhodococcus sp. RHA1 et Nocardia farcinica a été analysée. Alors que Corynebacterium produit des acides mycoliques courts (C32-C36), Rhodococcus et Nocardia possèdent des acides mycoliques de taille intermédiaire (C34-C48 et 15 C44-C60 respectivement), présentant une chaîne méromycolique de longueur moyenne (C22-C30 et C32-C42) c'est-à-dire plus courte que celle observée dans le genre Mycobacterium. Comme cela a été déjà observé pour d'autres enzymes impliquées dans le système FAS-II, des polypeptides similaires à Rv0635, Rv0636 et Rv0637 n'ont pas pu être détectés chez Corynebacterium. Ceci est en concordance avec le fait que sa 20 voie de biosynthèse des acides mycoliques n'inclut pas d'étape d'élongation des acides gras. Chez Rhodococcus et Nocardia, des protéines orthologues à Rv0635 et Rv0636 sont présentes (voir résultats ci-dessus), comme observé pour les protéines InhA, MabA et KasA. Par contre, aucun orthologue de la protéine Rv0637 n'est présent, tout comme pour KasB. Il y a lieu de noter que les gènes équivalents à Rv0635 et Rv0636 25 sont fusionnés en un long gène unique chez Nocardia (Figure 5). Les protéines Rv0635, Rv0636 et Rv0637 ainsi que les protéines ayant les pourcentages d'identité ou de similarité précisés ci-dessus peuvent avantageusement servir de cible pour le criblage d'antibiotiques utiles comme médicaments anti-infectieux. 30 Par x% d'identité entre un polypeptide P de Iongueur au moins égale à celle de la séquence de référence et une séquence de référence, on entend que lorsque les deux séquences sont alignées, x% des acides aminés de P sont identiques à l'acide aminé correspondant de ladite séquence de référence. Par x% de similarité entre un polypeptide P de longueur au moins égale à celle de la séquence de référence et une séquence de référence, on entend que lorsque les deux polypeptides sont alignés, x% des acides aminés de P sont identiques à l'acide aminé correspondant de ladite séquence de référence ou sont remplacés par un acide aminé du même groupe. Lorsque le polypeptide P est de longueur inférieure à celle de la séquence de référence, l'alignement se fait sur la longueur totale du polypeptide P. Les figures 7-9 montrent les résultats obtenus. Par acide aminé de même groupe, on entend un acide aminé possédant des propriétés chimiques sensiblement identiques. En particulier, on entend par ce terme des acides aminés ayant sensiblement la même charge et/ou la même taille, et/ou la même hydrophilie ou hydrophobie et/ou la même aromaticité. De tels groupes d'acides aminés incluent notamment ; (i) glycine, alanine (ii) isoleucine, leucine, valine (iii) tryptophane, tyrosine, phénylalanine (iv) acide aspartique, acide glutamique (v) arginine, lysine, histidine (vi) sérine, thréonine D'autres substitutions peuvent être envisagées, dans lesquelles on remplace un acide aminé par un autre acide aminé comparable mais non naturel (hydroxyproline, norleucine, ornithine, citrulline, cyclohexylalanine, acides aminés dextrogyres, ..)...DTD: Les pourcentages d'identité et les pourcentages de similarité définis peuvent être obtenus en utilisant le programme BLAST (ou blast2seq, default parameters) (Tatustore et al., FEMS Microbiol. Lett. 1999, 174, 247-250) ou PSI-BLAST (Altschul et al., 1997) avec une fenêtre de comparaison correspondant à la longueur totale des séquences SEQ ID NO:2, 4 et 6, lorsque le polypeptide P comparé est de longueur au moins égale à celle des séquences SEQ ID NO:2, 4 et 6. Lorsque le polypeptide P à comparer est de longueur inférieure à celles des séquences SEQ ID NO: 2, 4 et 6, la fenêtre de comparaison correspond à la longueur totale du polypeptide P. 9 Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites enzymes sont sélectionnées dans le groupe constitué par : l'homodimère ou l'homomultimère de Rv0636, l'hétérodimère ou 1'hétéromultimère Rv0635-Rv0636 et l'hétérodimère ou I'hétéromultimère Rv0636-Rv0637. De manière surprenante, les enzymes comprenant Rv0636 seule ou associée en hétérodimère ou en hétéromultimère avec Rv0635 ou Rv0637 possèdent une activité d'enoyl-CoA hydratase in vitro. En particulier, les trois dimères ou multirnères catalysent efficacement l'hydratation de 2-trans-enoyl-CoA en C12-C20 alors qu'aucune activité n'est détectée en présence de substrats à courte chaîne (C4-C8). Ils présentent donc une spécificité pour des substrats de taille supérieure ou égale à 12 atomes de carbone, propriété comparable aux protéines du système FAS-II mycobactérien InhA, KasA et KasB et au système FAS-II lui-même (Figure 3). Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le substrat (3R)-hydroxyacyl et/ou 2-trans-enoyl desdites enzymes est de préférence un substrat ayant une chaîne acyle de longueur égale ou supérieure à C8, de préférence en C12-C20, dérivé d'ACP (Figure 4). Rv0636 peut s'associer avec un partenaire ne comportant pas de motif catalytique hydratase 2. Ainsi, la protéine partenaire (Rv0635 ou Rv0637) est vraisemblablement présente pour stabiliser la longue chaîne acyle du substrat. L'association de Rv0636 avec Rv0635 en hétérodimère induit une spécificité différente, mais aussi une activité spécifique bien supérieure en comparai-son de celle obtenue avec la protéine Rv0636 seule (Figure 3). Curieusement, la formation de l'hétérodimère Rv0636-Rv0637, quant à elle, ne semble pas modifier les paramètres enzymatiques (activité, spécificité de substrats) de la protéine Rv0636 seule in vitro. Ces deux protéines présentent une activité croissante suivant l'augmentation de la longueur de chaîne des substrats 2-trans-enoyl-CoA (C12-C20), avec une activité optimale apparente pour le substrat C20 (Figure 3). Les profils de spécificité de Rv0635-Rv0636, Rv0636-Rv0637 et Rv0636 sont comparables à ceux obtenus pour certaines protéines du système FAS-II mycobactérien et montrent qu'ils appartiennent au système FAS-II. Le fait que les hétérodimères présentent une activité beaucoup plus élevée en présence de dérivé d'ACP que de dérivé de CoA confirme 10 cette appartenance (Figure 4). Cela expliquerait la faible activité spécifique de ces enzymes en présence de dérivés de CoA. De plus, le fait que la spécificité de substrats de Rv0636-Rv0637 soit déplacée vers les longues chaînes montre qu'il pourrait être impliqué, comme KasB, dans les dernières étapes de l'élongation de la chaîne méromycolique, et prendre le relais de Rv0635-Rv0636 (Figure 6). Cette hypothèse est renforcée par le fait, notamment qu'aucun orthologue de Rv0637 n'est retrouvé dans les espèces séquencées de Nocardia et Rhodococcus. Ce schéma est retrouvé aussi pour KasB. Elle expliquerait la faible activité spécifique générale de Rv0636-Rv0637 (par rapport à Rv0635- Rv0636) qui devrait alors métaboliser des substrats à très longue chaîne (jusqu'à C60 environ) (figure 6). De manière surprenante, les résultats obtenus montrent que les deux hétérodimères ou multimères Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637 interviennent dans l'étape de déshydratation du système FAS-II mycobactérien, et plus précisément que Rv0635-Rv0636 serait impliqué dans les premiers cycles d'élongation alors que Rv0636-Rv0637 interviendrait dans les cycles plus tardifs. Les Inventeurs ont produit et purifié les différents dimères ou multimères sous forme recombinante et ont déterminé leur activité catalytique. Les résultats obtenus par les Inventeurs montrent que ces différents dimères correspondent effectivement à la (3R)-hydroxyacyl-ACP déshydratase inter-venant dans la troisième étape de déshydratation du système FAS-II mycobactérien et qu'il s'agit d'enzymes clés dans l'assemblage de l'enveloppe des mycolates. Des expériences de prédiction d'essentialité chez Mycobacterium tuberculosis suggèrent que les gènes Rv0635 et Rv0636 seraient essentiels pour la viabilité de cette espèce (Sassetti et al., 2003). Auparavant des enzymes appartenant à la famille des hydratases 2 sous forme d'hétéromultimères (par exemple d'hétérodimères), composées d'unités avec un repliement en simple hot dog correspondant à une sous-unité catalytique et à une sous-unité sans site catalytique, n'ont jamais été décrites. En effet, dans l'art antérieur, seule une structure de type "asymétrique" a été décrite pour le domaine hydratase en double hot dog des protéines MFE-2 eucaryotes et a été prédite (par modélisation) pour l'enzyme 11 hydratase/déshydratase Rv3389c de M. tuberculosis, mais dans ces deux cas la structure est composée d'un seul polypeptide possédant deux domaines structuraux, l'un catalytique, l'autre non-catalytique, liés de façon covalente. La structure originale des enzymes selon l'invention peut favoriser la découverte de ligands spécifiques poten- tiellement inhibiteurs de ces enzymes. La présente invention a également pour objet les protéines isolées et purifiées telles que définies ci-dessus sous forme monomérique : Rv0635, Rv0636 et F:v0637. La présente invention a également pour objet les polynucléotides codant pour les différentes protéines telles que définies ci-dessus ; en particulier le polynucléotide de SEQ ID NO :1 code pour la protéine Rv0636 ; le polynucléotide de SEQ ID NO :3 code pour la protéine Rv0635 et le polynucléotide SEQ ID NO :5 code pour la protéine Rv0637 ; le polynucléotide comprenant la séquence qui code pour une protéine Rv0636 et la séquence qui code pour une protéine Rv0635 et/ou une protéine R.v0637. La présente invention a également pour objet un polynucléotide représenté à la séquence SEQ ID NO :7 de la liste de séquences jointe en annexe ; il comprend les ORFs codant pour les protéines Rv0635, Rv0636 et Rv0637 situées entre les positions 731930 et 733525 du génome de M. tuberculosis H37Rv. Les coordon- nées chromosomiques des ORFs dans ledit polynucléotide sont les suivantes : Rv0635 : 731930-732406 (positions 201-677 de la SEQ ID NO:7) ; Rv0636 : 732393-732821 (positions 664-1092 de la SEQ ID NO:7) ; Rv0637 : 732825-733325 (positions 1096-1596 de la SEQ ID NO:7) (figure 12). La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression, comprenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus et notamment un polynucléotide codant pour une protéine Rv0636 conforme à l'invention seul ou associé à un polynucléotide codant pour la protéine Rv0635 et/ou la protéine Rv0637, ainsi qu'une cellule-hôte, procaryote ou eucaryote, transformée par ledit vecteur d'expression. Le vecteur utilisé est n'importe quel vecteur de l'état de la technique. Ledit vecteur peut également comprendre des séquences de régulation pour l'expression de la protéine codée par le polynucléotide (promoteur, site de terminaison, etc...). L'introduction du polynucléotide ou du vecteur d'expression dans la cellule hôte modifiée peut être effectuée par n'importe quelle méthode connue telle que, par exemple, transfection, infection, fusion, électroporation, microinjection ou biolistique. La présente invention a également pour objet un procédé de production d'une enzyme conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'une cellule-hôte conforme à l'invention dans un milieu convenable et la purification de ladite enzyme à partir de ladite culture. De manière avantageuse, ladite purification se fait par chromatographie d'affinité, par exemple IMAC et/ou chromatographie d'exclusion. A titre d"exemple non limitatif, on peut citer la colonne IMAC Ni-sépharose FF et la colonne HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade. La présente invention a également pour objet un procédé pour inhiber la biosynthèse de composés de l'enveloppe des mycolatas, caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibition de l'expression ou de l'activité d'au moins l'une des enzymes telles que définies ci-dessus, sélectionnées dans le groupe constitué par la protéine Rv0636, la protéine Rv0635, la protéine Rv0637 et/ou les complexes protéiques tels que définis ci-dessus (dimères et multimères comprenant la protéine Rv0636). Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, il comprend : a) l'incubation d'un substrat convenable sélectionné dans le groupe constitué par les (3R)-hydroxyacyl-ACP, les trans-2-enoyl-ACP, les (3R)-hydroxyacyl-CoA et les trans-2-enoyl-CoA avec une enzyme conforme à l'invention, en présence ou en l'absence de la molécule à tester, et b) la comparaison de l'activité de l'enzyme selon l'invention en présence et en l'absence de la molécule à tester. L'inhibition de l'activité hydratase/déshydratase peut être effectuée par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier et notamment par mesure d'une variation d'absorbance liée à la disparition du substrat ou à l'apparition d'un 13 produit, à une longueur d'onde appropriée ou par une réaction en tandem (enzyme secondaire ou anticorps qui détectera la quantité résiduelle de substrat ou la quantité de produit formé). Par exemple, la détection du pouvoir inhibiteur de la dite molécule à 5 tester est réalisée par : B I) mesure de la variation d'absorbance liée à ladisparition du substrat ou à l'apparition du produit formé à 263 nm B2) détermination de l'activité enzymatique témoin, en l'absence de ladite molécule à tester 10 B3) détermination de l'activité enzymatique en présence de ladite molécule à tester et B4) comparaison des mesures obtenues en B2) et en B3). Ainsi, les tests d'inhibition des protéines constituées par au moins l'une des protéines Rv0635, Rv0636 et R.v0637 ou des enzymes telles que définies ci- 15 dessus, par des inhibiteurs potentiels, peuvent être suivies de façon aisée et rapide, par spectrophotométrie, en suivant l'hydratation de la double liaison trans en position 2 des substrats trans-2-enoyl ou la déshydratation des substrats (3R)-hydroxyacyl, à 263 nm. Les constantes d'inhibition (Ki) et le mécanisme d'inhibition (inhibition compétil:ive, non compétitive, incompétitive, irréversible, slow binding...) pour chaque 20 molécule peuvent en être déduits. De plus, des tests de fixation de ligands sur les protéines peuvent être réalisés également par spectrofluorimétrie, grâce à la présence de résidus Trp, notamment dans le site de fixation du substrat. Après excitation à 303 nrn, la variation d'intensité d'émission de fluorescence au maximum d'émission permet de détecter la fixation d'un ligand et d'en déduire la constante de dissociation 25 (Kd). La simplicité de ces méthodes de mesure, et les volumes relativement faibles qu'elles requièrent, devraient permettre une miniaturisation des tests d'inhibition ou de fixation de ligand, pour le criblage automatique à haut débit de chimiothèques, grâce à un automate doté d'un spectrophotomètre ou d'un spectrofluorimètre. Du fait de son caractère prédit comme essentiel pour la viabilité, et 30 de la spécificité de sa fonction, la (3R)-hydroxyacyl-ACP déshydratase du système FAS-II mycobactérien constitue une excellente cible potentielle pour la conception de nouveaux médicaments anti-mycobactériens, notamment agissant sur la croissance 14 e:t/ou sur la viabilité de mycobactéries pathogènes (Mycobacterium tuberculosis, M. Gfricanum, M. leprae, M. ulcerans, M. microti, M. bovis, M. abscissus, M avium, M. fortuitum, M. kansasii...) ou de nouveaux médicaments agissant sur la croissance et/ou la viabilité de genres apparentés aux mycobactéries appartenant aux Corynebacteri- neae (par exemple, Nocardia, Rhodococcus, Gordona...). La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une enzyme telle que définie ci-dessus, pour le criblage d'antibiotiques actifs sur les micro-organismes contenant un système FAS-II, dans lequel l'étape de déshydratation est catalysée par une déshydratase contenant un motif hydratase 2 [YF]-x(1,2)-[LIVG]- [STGC]-G-D-x-N-P-[LIV]-H-x(5)-[AS] (SEQ ID NO:15), (dans lequel x(n) représente n acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé et les acides aminés entre crochets représentent des alternatives) ou un motif catalytique apparenté, dérivé du motif hydratase 2 et constitué au moins par le motif de base D-x(4)-H, dans lequel x(4) représente 4 acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé, ou par un motif similaire au motif de base. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de cette utilisation, le motif hydratase 2 est le motif Y-A-G-V-S-G-D-L-N-P-I-H-W-D-D-E-I-A (SEQ ID NO:16). Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de cette utilisa-20 Lion, lesdits microorganismes sont des Corynebacterinae. La présente invention a également pour objet une méthode de criblage de ligands d'une enzyme conforme à l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en présence de l'enzyme telle que définie ci-dessus, dans un 25 milieu réactionnel comprenant le ligand potentiel à tester, - la mesure après excitation à 303 nm de la variation d'intensité de fluorescence au maximum d'émission, - et sur la base de cette mesure, la détection de la fixation dudit ligand sur l'une ou plusieurs des protéines constituant l'enzyme telle que définie ci-30 dessus. La présente invention a également pour objet une méthode de criblage de ligands d'une enzyme conforme à l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - la mise en présence d'une enzyme selon l'invention avec le ligand à 5 tester et - l'analyse du complexe formé en phase soluble entre ladite enzyme et ledit ligand, notamment par RMN et/ou par fluorescence. Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des 10 exemples de mise en oeuvre de l'Invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 représente le cycle des acides gras par le système FAS-II dans les mycobactéries. n 8. Le nom des enzymes catalysant des étapes similaires dans E. con est mentionné entre parenthèses. 15 - la figure 2 illustre les analyses SDS-PAGE des fractions de chromatographie lors de la purification des hétérodimères Rv0635-Rv0636, Rv0636-Rv0637 et de l'homodimère Rv0636. A : Purification de l'hétérodimère Rv0635-Rv0636 à partir de E. coli BL21 star (DE3)/pEXP5-CT/TOPO::H-Rv0635-RvO636-Rv0637. Pistes : 1 : marqueurs de taille (94 ; 63 ; 43 ; 30 ; 20,1 ; 14,4 kDa). 2 : pool 20 des fractions après colonne Ni-sepharose FF. 3-11 : fractions après colonne Superdex S75 ; les fractions 3-7 contiennent l'hétérodimère Rv0635-Rv0636. 12 : marqueur de taille (16,8 kDa). B : Purification de l'hétérodimère Rv0636-Rv0637 et de l'homodimère Rv0636 à partir de E. col/ BL21 star (DE3)/pEXP5-CT/TOPO::H- Rv0636-Rv0637. Pistes : 1 : marqueurs de taille (94 ; 63 ; 43 ; 30 ; 20,1 ; 14,4 kDa). 2 : 25 pool des fractions après colonne Ni-sepharose FF. 3-11 : fractions après colonne Superdex S75 ; les fractions 5-8 contiennent l'hétérodimère Rv0636-Rv0637 et la fraction 11 contient l'homodimère Rv0636. 12 : marqueur de taille (16,8 kDa). Les protéines Rv0636 et Rv0637 ont été identifiées par peptide mapping. H symbolise ici une séquence nucléotidique codant pour une étiquette polyhistidine. 30 - la figure 3 représente la spécificité des enzymes selon l'invention pour les 2-trans-enoyl-CoA. de différentes longueurs de chaîne. Les données sont des moyennes de vitesses initiales avec des déviations standard. Les déviations standard 16 plus importantes observées pour les substrats à longue chaîne sont dues à des problèmes de solubilité. Les tests ont été réalisés en présence de concentrations fixes en substrat et en enzyme dans du tampon phosphate de sodium 100 mM pH 7,0. Les activités détectées pour les protéines Rv0635-Rv0636, Rv0636-Rv0637 et Rv0636 en présence de substrats à courte chaîne (C11-C8) ne sont pas significativement différentes des activités détectées dans les expériences contrôles en absence d'enzyme. La concentration de chaque enzyme a été adaptée afin d'obtenir des conditions optimales de mesure de la vitesse initiale. (A) Spécificité de l'hétérodimère Rv0635-Rv0636 (80 nM) en présence de 2-trans-enoyl-CoA (2, 5 M). (B) Spécificité de l'hétérodimère Rv0636-Rv0637 (543 nM) en présence de 2-trans-enoyl-CoA (25 M). (C) Spécificité de Rv0636 (280 nM) en présence de 2-trans-enoyl-CoA (25 M). (D) Spécificité de Rv0635-Rv0636 (80 nM) en présence de 2-trans-enoyl-CoA (25 M). (E) Spécificité de MabA en présence de 3-cétoacyl-CoA. (2 M) (D'après Marrakchi et al., 2002). (F) Spécificité de InhA en présence de 2-trans-enoyl-CoA (1 M) (D'après Quémard et al., 1995). (G) Spécificité de KasA en présence d'acyl-ACP (10 M) (D'après Schaeffer et al., 2001). (H) Spécificité de KasB en présence d'acyl-ACP (10 M) (:D'après Schaeffer et al., 2001). - la figure 4 représente la comparaison de l'activité spécifique des hétérodimères Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637 en présence de 2-trans-octenoyl- ACP et de 2-trans-octenoyl-CoA. Les données sont des moyennes de vitesses initiales avec des déviations standard pour les tests réalisés en présence de 2-trans-octenoyl-C'oA. Les tests en présence de 2-trans-octenoyl-ACP ont été réalisés une seule fois par manque de matériel. Les tests ont été réalisés en présence de 2,5 M de substrat et de R.v0635-Rv0636 (80 nM) (A) ou de Rv0636-Rv0637 (543 nM) (B), et suivis par spectrophotométrie à 263 nm. Les réponses obtenues pour les hétérodimères Rv0635-R.v0636 et Rv0636-Rv0637 en présence du 2-trans-octenoyl-CoA n'est pas significativement différente de la réponse obtenue pour les expériences contrôles (en absence d'enzyme). - la figure 5 illustre l'organisation chromosomique de l'ensemble des 30 gènes Rv0635, Rv0636 et Rv0637 ou des gènes orthologues chez différentes Corynebacterinae. 17 - la figure 6 illustre le modèle des rôles des hétérodimères Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637 dans la voie de biosynthèse des acides mycoliques. Ce modèle propose que l'enzyme Rv0635-Rv0636 soit impliquée, tout comme l'enzyme KasA, dans les étapes précoces d'élongation catalysées par le système FAS-II dans le genre Mycobacterium. L'enzyme Rv0636-Rv0637 interviendrait ensuite, tout comme l'enzyme KasB, dans les étapes tardives d'élongation catalysées par le système FASII, menant à la formation de chaînes méromycoliques complètes. Dans les Corynebacterinae produisant des acides mycoliques courts comportant des chaînes méromycoliques plus courtes, seules les étapes précoces d'élongation, impliquant des protéines orthologues de Rv0635-Rv0636 et de KasA, doivent avoir lieu. Ces genres ne présentent pas d'orthologues de Rv0637 ni de KasB. - les figures 7, 8 et 9 représentent les pourcentages d'identité et les pourcentages de similarité des protéines Rv0635, Rv0636 et Rv0637 avec les protéines orthologues rencontrées dans les mycobactéries dont le génome a été séquencé (mise à jour : 31/10/06). Dans le cas où le génome n'a pas encore été annoté, est mentionné le nom du contig renfermant le gène en question ainsi que l'emplacement du gène sur le contig (en paires de bases). Le nombre total d'acides aminés (aa) sur lequel a été fait l'alignement de séquence (logiciel BLASTP - protéine/protéine) est mentionné, ainsi que le score obtenu E value . Ces figures (7, 8 et 9) illustrent l'ubiquité des protéines Rv0635, Rv0636 et Rv0637 chez les mycobactéries. - la figure 10 illustre les séquences polypeptidiques correspondant aux séquences nucléotidiques clonées dans les souches de E. coli recombinantes. - la figure I l représente l'analyse par chromatographie d'exclusion d'une fraction de protéines issue d'une colonne de Ni sépharose et obtenue à partie d'une souche de E. coli co-exprimant H-Rv0636 et Rv0637. - la figure 12 représente les séquences codantes de l'opéron Rv0635-Rv0636-Rv0637 chez M. tuberculoses. Le début (start) et la fin (end) de chaque ORF est indiquée par une flèche ou un trait, respectivement. Les gènes Rv0635 et Rv0636 sont chevauchants.30 18 (EXEMPLE 1 : Analyses bioinformatiques et modélisation moléculaire I.A. Analyses de séquences Les analyses de séquences du génome ont été réalisées à l'aide des serveurs Internet de l'Institut Sanger et TubercuList pour Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Cole et al., 1998), et du site Internet "National Center for Biotechnology Information" (NCl3I) pour les autres génomes (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.czi). Les alignements de séquences ont été effectués en utilisant les logiciels BLAST ou PSI-BLAST, ClustalW version 1.8 ou MultAlin avec les paramètres par défaut (Altschul et al., 1997; Corpet, 1998; Thompson et al., 1994). LB. Définition du motif commun spécifique FabA/FabZ Le programme PRATT' version 2.1 de la base de données PROSITE (Jonassen et al., 1995) a été utilisé avec les paramètres par défaut pour définir les deux motifs spécifiques distincts des protéines annotées FabZ ou FabA, basés sur deux listes indépendantes de 36 séquences protéiques de type FabZ, et 24 séquences de type FabA [y compris la protéine FabZl d'Enterococcus faecalis dont la séquence est davantage apparentée aux protéines FabZ mais possédant une activité FabA (déshydratase/isomérase) (Wang & Cronan, 2004)]. Chaque motif a ensuite été utilisé comme sonde contre les banques de données proposées (Swiss-Prot, EMBL et TrEMBL) par le logiciel ScanProsite (paramètres par défaut) afin d'évaluer la spécificité du motif pour les deux familles de protéines (Gattiker et al., 2002). Un motif consensus commun spécifique des FabAlFabZ a ensuite été déterminé manuellement à partir des deux motifs préalablement définis. Ce motif consensus commun a été utilisé comme sonde contre l'ensemble des banques de données de protéines ou contre les banques des protéines prédites pour différentes espèces du genre Mycobacterium disponibles par ce logiciel. Une expérience témoin a été réalisée en utilisant la même stratégie que celle décrite ci-dessus, mais avec les protéines de la famille FabG. Cette analyse contre les protéines prédites du genre Mycobacterium a permis de piocher les protéines annotées comme FabG des espèces mycobactériennes et elle a montré que des protéines mycobactériennes pouvaient être détectées par cette stratégie. EXEMPLE 2 : Amplification PCR et clonage des gènes codant pour Rv0635, Rv0636 et Rv0637 2.1 Amplification par PCR Rv0636 Le gène codant pour la protéine Rv0636 a été amplifié par PCR (Polymerase Chain Reaction) en deux étapes, à partir de l'ADN total de la souche M. tuberculosis H37Rv. Dans une première réaction PCR, le couple d'amorces 5'-GAT TTT CTG ATG GCG CTG CGT GAG TTC-3' (amorce sens) (SEQ ID NO : 8) et 5'-CGG TCT TGA GCG CCA TAA ACT A-3' (amorce anti-sens) (SEQ ID NO : 9) a été utilisé. Dans une seconde réaction PCR, une étiquette N-terminale de 6 histidines a été introduite en utilisant l'amorce sens 5'-ATG GCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGT GCG CTG CGT GAG TTC AGC TCG G-3' (SEQ ID NO : 10). Les réactions PCR ont été effectuées avec la polymérase PfuUltra (Stratagène). Rv0635-Rv0636 Afin de co-exprimer les protéines Rv0635 et Rv0636, les nucléotides 731 930 à 733 325 du génome de la souche de M tuberculosis H37Rv, contenant les trois gènes Rv0635, Rv0636 et Rv0637, ont été amplifiés par PCR à partir du cosmide MTCY20H10 (http://genolist.pasteur.fr/Tuberculist). Une étiquette N-terminale de 6 histidines a été introduite simultanément dans la réaction PCR en utilisant le couple d'amorces 5'-ATG GCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGT GCG TTG AGC GCA GAC ATC G-3' (amorce sens) (SEQ ID NO : 11) et 5'-CAG TTG CTA ATT ACG CGG TC-3' (amorce anti-sens) (SEQ ID NO : 12), et la polymérase PfuUltra (Stratagene). Rv0636-Rv0637 Afin de co-exprimer les protéines Rv0636 et Rv06367, un fragment ADN contenant les deux gènes Rv0636 et Rv0637 a été amplifié à partir du cosmide MTCY20H10 (http://genolist.pasteur.fr/Tuberculist). Une étiquette N-terminale de 6 histidines a été introduite simultanément dans la réaction PCR en utilisant le couple d'amorces 5'-ATG GCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGT GCG CTG CGT GAG TTC AGC TCG G-3' (amorce sens) (SEQ ID NO : 13) et 5'-CAG TTG CTA 20 ATT ACG CGG TC-3' (amorce anti-sens) (SEQ ID NO: 14), et la polymérase PfuUltra (Stratagene). 2.2 Ligation de l'ADN Après l'addition d'une extrémité 3' protrusive poly(A) par incuba- tion avec la Taq polymerase (New England Biolabs), la ligation des gènes amplifiés avec le vecteur pCR T7 TOPO ou pEXP5-CT/TOPO (Invitrogen) a été réalisée dans les conditions précisées par le fabricant. 2.3 Clonage Le clonage a été réalisé dans E. colt TOP10 (Invitrogen), et 10 l'exactitude des gènes isolés a été contrôlée par analyse de la séquence ADN. EXEMPLE 3: Expression et purification des protéines Rv0635, Rv0636 et Rv0637 L'expression des gènes a été effectuée avec E. coliBL21-AI (Invitrogen) transformée par Rv0636 et avec E. coliBL21 Star (DE3) (Invitrogen) 15 transformée par Rv0636-Rv0637 ou par Rv0635-Rv0636-Rv0637, les gènes étant intégrés dans les constructions décrites ci--dessus : E. colt BL21 Star (DE3)/pEXP5-CT/TOPO::H-Rv0635-Rv0636-Rv0637 ; E. colt BL21 Star (DE3)/pEXP5-CT/TOPO::H-Rv0636-Rv0637 et E. colt BL21-AI/pCR T7 TOPO::H-Rv0636. 20 Les bactéries ont été cultivées dans le milieu LB (Luria Browth Base, DIFCO-BRL) supplémenté avec 50 g/ml d'ampicilline, à 37 C. Rv0636 A une DO600=0,7-0,9, l'expression du gène cible Rv0636 a été induite avec 0,02% d'arabinose pendant 3-4 heures. Après centrifugation des cultures 25 bactériennes, le culot cellulaire a été re-suspendu dans un tampon de lyse (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8,0), et lysé en utilisant des cycles de congélation-décongélation. Après centrifugation à 19 000 t/min (43 000x g) pendant 20 minutes, l'extrait exempt de cellules a été déposé sur une colonne Ni Sepharose FF (1 ml, GE 30 Healthcare) pré-équilibrée. Après lavage avec 20 volumes de colonne de tampon (20 mM imidazole, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0), la protéine a été éluée avec 5 volumes de colonne de 250 mM imidazole dans le même tampon. Les fractions contenant la protéine sont regroupées, puis leur tampon est changé par chromatographie sur colonne PD-10 (GE Healthcare). L'enzyme est purifiée plus avant sur une colonne HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade (GE Healthcare) équilibrée avec le tampon 50 mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7,5. La solu- tiion de protéine purifiée est analysée par coloration au bleu de Coomassie sur SDSPAGE (Figure 2). Cette protéine est pure à 95 %. Du glycérol est ajouté à une concentration finale de 50% (v/v) et la protéine est conservée à -20 C. Rv0635-Rv0636 et Rv0636- Rv0637 A une D0600=0,5-0,7, l'expression des gènes Rv0635-Rv0636 et Rv0636- Rv0637 a été induite avec 0,2 mM d'IPTG pendant 3-4 heures. Après centrifugation des cultures bactériennes, le culot cellulaire a été re-suspendu dans un tampon de lyse (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 10%(v/v) glycérol pH 8,0) avec 1 mg/ml lysozyme, 0,01 mg/ml RNAse A, 0,02 mg/ml DNAse I, et 1 mM PMSF, et lysé en utilisant le One Shot Cell disruptor (Constant Systems Ltd.). La fraction soluble a été déposée sur une colonne Ni Sepharose FF (1 ml, GE Healthcare) pré-équilibrée. Après lavage avec 20 volumes de colonne de tampon (20 mM imidazole, 50 mM Naf12PO4 ou HEPES, 300 mM NaCl, 10%(v/v) glycérol, pH 8.0), la protéine a été éluée avec 5 volumes de colonne du même tampon comprenant 250 mM imidazole. Les fractions contenant l'enzyme sont regroupées, puis leur tampon est changé par chromatographie sur colonne PD-10 (GE Healthcare). L'enzyme est purifiée plus avant sur colonne HiLoad 16/60 Superdex 75 pre grade (GE Healthcare) équilibrée avec 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. Du glycérol est ajouté aux fractions (jusqu'à 50 % v/v) et la solution de protéine est stockée à -20 C. La solution de protéine purifiée est évaluée par coloration au bleu de Coomassie sur SDS-PAGE (Figure 2), puis par spectrométrie de masse. EXEMPLE 4 : Analyse de la structure des protéines Rv0635, Rv0636 et Rv0637 Hétérodimères Rv0636 Lors des étapes de chrornatographie décrites ci-dessus il a été mis en évidence une coélution des protéines Rv0635 (fusionnée avec l'étiquette poly-histidine en N-terminale) et Rv0636, et une coélution des protéines Rv0636 (fusionnée avec l'étiquette poly-histidine en N-terminale) et Rv0637 (figure 2). Ces coélutions 22 résultent de l'interaction de Rv0635 avec Rv0636 d'une part, et de Rv0636 avec R.v0637 d'autre part. Les enzymes Rv063 5-Rv0636 (33,1 kDa) et Rv0636-Rv0637 (34,5 kDa) forment des hétérodimères à 20 C et 27 C, alors qu'ils forment des tétra-5 mères à 8 C (Figure 11) . Homodimères Rv0636 Pour la protéine Rv0636 seule, bien que la protéine soit produite en quantité plus faible, et qu'elle soit moins stable, elle forme un homodimère (31,8 kDa). EXEMPLE 5 : Mise en évidence de l'activité catalytique des enzymes in vitro 10 Synthèse des dérivés d'acides gras Le 2-trans-enoyl-CoA a été synthétisé et purifié suivant le protocole décrit dans Quémard et al., 1995. La synthèse du 3-cis-decenoyl-CoA a été réalisée comme suit. Le 3-cis-decenoyl-CoA a été préparé et purifié à partir de l'acide 3- 15 cis-décénoique et du CoA, suivant la même méthode d'anhydride mixte que pour les 2-trans-enoyl-CoA (Goldman & Vagelos, 1961). Le 3-cis-decenoyl-CoA a été purifié par HPLC en phase inverse en utilisant une colonne Nucléosil C18 8 x 250 nm (Bischoff Chromatography). La colonne a été préalablement équilibrée par un mélange méthanol/eau contenant 20 mM de NaH2I'O4, et l'élution a été réalisée par un gradient 20 de 10 à 60% de méthanol dans l'eau à :1,5 ml/min. La détection a été effectuée par mesure de l'absorbance à 260 nm. L'acide 3-cis-décénoïque a été synthétisé par l'oxydation du 3-cisdecen-l-ol avec du dichromate de pyridinium dans du dichlorométhane et du diméthylformamide sec, suivant le protocole décrit de Besra (Besra et al., 1993). Il a été purifié 25 par chromatographie en gel de silice en utilisant comme éluant un mélange CHC13/CH3OH 80/20 (v/v), et caractérisé par spectroscopie RMN-'H. Le 3-cis-decenl-ol a été obtenu par semi hydrogénation catalytique (1 atm) d'une solution de 3-decyn-l-ol (158 mg) dans du diéthyl éther sec sur le catalyseur de Lindlar (40 mg) avec une agitation vive jusqu'à ce que le gaz hydrogène (1,6 mmol) soit absorbé. Puis 30 il a été purifié par chromatographie d'adsorption sur gel de silice avec du nitrate d'argent en utilisant des concentrations croissantes de méthanol dans du dichlorométhane comme éluant. 23 Le 2-trans-octenoyl-ACP a été synthétisé à partir de l'holo-ACP d'E. coli (Sigma ) et de l'acide 2-trans-octénoïque comme préalablement décrit (Cronan & Klages, 1981). Calibration des solutions de réactifs Les concentrations des solutions de substrats 2-trans-enoyl-CoA, 3-cis-decenoyl-CoA, et du 2-trans-octenoyl-ACP ont été déterminées par spectrophotométrie à 260 nm avec les coefficients d'extinction molaire suivants : pour les 2-transenoyl-CoA, x260 = 22600 M-Icm-I), pour le 3-cis-decenoyl-CoA, x260 = 16800 M-Icm-I, ou à 280 nm pour le 2-trans-octenoyl-ACP (c280 = 1800 M"Icm-I). Puis une calibration plus précise de la concentration en 2-trans-octenoyl-ACP a été effectuée en présence de l'enzyme InhA de M. tuberculosis purifiée (25 nM) et de NADH (à concentration saturante : 100 M). La réaction a été suivie par spectrophotométrie à 340 nm, longueur d'onde où l'on suit l'oxydation du NADH, et la concentration totale de substrat transformé a été déduite. Principe du test enzymatique Les hydratases/déshydratases (R)-spécifiques sont plus actives in vitro dans le sens de l'hydratation que de la déshydratation lorsqu'elles sont isolées de leur complexe. Ainsi, leur activité in vitro est souvent étudiée en présence de dérivés enoyle plutôt que (3R)-hydroxyacyle. H2O CH3ù (CH2)n H2O 3-hydroxyacyl- CoA 2-trans-enoyl-CoA La réaction suivie est la transformation d'un 2-trans-enoyl-CoA (ou ACP) en (3R)-hydroxyacyl-CoA (ou ACP) correspondant à la réaction d'hydratation ou la transformation d'un (3R)-hydroxyacylCoA en 2-trans-enoyl-CoA correspondant 25 à la réaction de déshydratation. Conditions standards Ces réactions sont suivies par spectrophotométrie à 263 nm à l'aide d'un spectrophotomètre Uvikon 923, thermostaté (Kontron Instruments). Elles sont réalisées dans une cuve en quartz (trajet optique de 1 cm) dans un volume total de 700 30 l, à 25 C. Le mélange réactionnel contient du tampon phosphate de sodium 100 mM CH3ù (CH2)n OH ù CHù CH2 ù (R) O I I CùSùCoA ù CH=CH ù O I I CùSùCoA pH 7,0, des concentrations variables en substrats. Après équilibration de la ligne de base sur le mélange réactionnel en absence de l'enzyme, les réactions sont déclenchées par l'ajout d'enzyme puis suivies pendant 1,5 à 5 min. La vitesse réactionnelle correspond à la vitesse initiale mesurée en traçant la tangente de la courbe DO = f(temps) au temps zéro. Les transformations correspondant à la réaction d'hydratation et à la réaction de déshydratation sont associées respectivement à une diminution et à une augmentation de l'absorbance à 263 nm, liée à la double liaison conjuguée au carbo- nyle. A une variation de concentration de 100 pM correspond une variation de DO263 10 de 0,67. Détermination de l'activité spécifique hydratase/déshydratase des enzymes Rv0635, Rv0636, Rv0637 Pour réaliser les différents tests enzymatiques, plusieurs concentrations en enzyme ont été testées ce qui a permis de définir pour chaque enzyme la 15 concentration la plus adéquate pour les mesures. Afin de déterminer si les enzymes sont actives, les premiers tests d'hydratation ont été réalisés en présence de 25 M de crotonoyl-CoA ou de 2-transoctenoyl-CoA et des gammes de concentrations en enzyme suivantes : 0,8 à 280 nM de l'hétérodimère Rv0635-Rv0636, 0,8 à 543 nM de l'hétérodimère Rv0636-Rv0637 et 20 0ä8 à 280 nM de la protéine Rv0636. Quant à l'activité déshydratase, elle a été étudiée en présence de 75 M de substrat hydroxybutyryl-CoA et à la même concentration en enzyme que pour les tests d'activité hydratase, à savoir 0,8 à 280 nM de l'hétérodimère Rv0635-Rv0636, 0,8 à 543 nM de l'hétérodimère Rv0636-Rv0637 et 0,8 à 280 nM de la 25 protéine Rv0636. Détermination de la spécificité de substrats des enzymes La spécificité de substrats a été étudiée en présence de 2-trans-enoyl-CoA de différentes longueurs de chaîne (C4-C20). Les vitesses initiales ont été mesurées et comparées à une très faible concentration en substrat pour réduire au maximum 30 les problèmes de solubilité rencontrés avec ces composés amphiphiles. Les réactions ont été réalisées en présence de 2,5 ou 25 M de substrat ; les concentrations respec- 25 t:ives des enzymes Rv0635-Rv0636, Rv0636-Rv0637 et Rv0636 (homodimère) étaient les suivantes : 80 nM, 543 nM et 280 nM. Activité sur des substrats en C4-C8 L'activité de la protéine Rv0636 et des hétérodimères Rv0635- Rv0636 et Rv0636-Rv0637 purifiés a été testée en présence d'un 2-trans-enoyl-CoA puisque les déshydratasesihydratases (R)-spécifiques fonctionnent préférentiellement dans le sens de l'hydratation in vitro lorsqu'elles sont isolées de leur complexe. Les tests ont été réalisés dans du tampon phosphate de sodium 100 mM pH 7,0 en présence de 3-hydroxybutyryl-CoA (75 p.M) ou de 2-trans-octenoyl- CoA (25 M) ou de crotonoyl-CoA (25 M) et d'enzyme (Rv0241c : 8 nM; Rv0635- Rv0636 : 80 nM; Rv0636-Rv0637 : 543 nM; Rv0636 : 280 nM). Plusieurs concentrations en enzyme ont été testées. Dans le cas où aucune activité n'a été détectée, la concentration maximale testée est indiquée. Après addition de l'enzyme, les réactions ont été suivies par spectrophotométrie à 263 nm pendant 1,5 min. Les résultats ont montré que ces enzymes ne sont pas actives dans ces conditions sur des substrats en C4 ou en C8, puisque aucune baisse d'absorbance n'a été observée. Activité sur des substrats en C12-C20 L'activité des différentes enzymes a été testée sur des dérivés à longue chaîne, des C12-C20 trans-2-enoyl-CoAs. Les tests ont été réalisés en présence d'une faible concentration en substrats (2,5 M) pour l'hétérodimère Rv0635-Rv0636 afin de réduire au maximum les problèrnes de solubilité liés à ces molécules amphi- philes. Pour l'hétérodimère Rv0636-Rv0637 et la protéine Rv0636, les expériences ont été réalisées en présence d'une plus forte concentration en substrat (25 M) car à 2,5 M, aucune activité n'a pu être détectée. Pour pouvoir comparer, l'étude de la spécificité de Rv0635-Rv0636 a été également effectuée à 25 M (figure 3). L'hétérodimère Rv0635-Rv0636 présente un profil de spécificité nettement déplacé vers les longues chaînes (C12-C16) et il présente une spécificité apparente centrée sur le 2-trans-hexadecenoyl-CoA (C16) (figure 3A). Eneffet, aucune activité n'a été détectée en présence de substrats à courte chaîne (C4-C8). A 25 M de 2-trans-enoyl-CoA, l'hétérodimère Rv0635Rv0636 présente un profil de spécificité comparable à celui obtenu en présence de 2,5 tM de substrat, si ce n'est l'écart plus faible entre les 26 activités en présence des substrats C12 et C20 (figure 3D). Cette diminution d'écart pourrait être due à un problème de solubilité induisant la formation de micelles du substrat à longue chaîne C20 à 25 M. Pour l'hétérodimère Rv0636-Rv0637 et la protéine Rv0636 seule, des profils de spécificité similaires ont été observés (figures 3B, 3C). Ces enzymes, inactives dans ces conditions en présence de substrats à courte chaîne (C4-C8), montrent une spécificité pour des substrats à moyenne et longue chaîne (C12-C20). Mais contrairement à Rv0635-Rv0636, leur activité augmente graduellement avec la longueur de chaîne, jusqu'à C20. Ces résultats mettent en évidence des différences importantes au niveau de la spécificité de substrats des enzymes conformes à l'invention. La préférence apparente de l'hétérodimère Rv0635-Rv0636 pour l'hexadecenoyl-CoA (C16) rappelle celle de la protéine InhA du système FAS-II mycobactérien (Quémard et al., 1995) (figure 3F). De plus, le profil de spécificité de Rv0635-Rv0636 ressemble égale-ment à celui décrit pour la protéine KasB en présence d'acyl-ACP (Schaeffer et al., 2001b) (figure 3F). Quant aux profils de spécificité de Rv0636-Rv0637 et Rv0636 seule, ils peuvent être comparés avec celui de la protéine KasA obtenu en présence d'acyl-ACP (Schaeffer et al., 2001b) (figure 3G). Il est intéressant de noter que l'association de Rv0636 avec Rv0635 en hétérodimère s'accompagne d'une augmentation très importante de l'activité spéci- fique (grossièrement d'un facteur 100) et d'une modification nette de sa spécificité de substrat par rapport à son auto-association (Rv0636 seule). Au contraire, l'association de Rv0636 avec Rv0637 ne donne pas lieu à des changements de propriétés détectables in vitro, dans les conditions expérimentales utilisées, que ce soit pour le niveau d'activité spécifique ou pour la spécificité de substrat. Ces résultats confirment que les protéines Rv0635, Rv0636 et Rv0637 sont impliquées dans le système d'élongation FAS-II mycobactérien puisque les enzymes qu'elles forment présentent une spécificité de substrats à moyenne et longue chaîne (C12-C20), comme le système FAS-II et certaines de ses protéines déjà caractérisées. Détermination de l'activité isomérase des enzymes Comme dans certains systèmes FAS-II décrits, l'étape de déshydratation peut être catalysée soit par une (3R)-hydroxyacyl-ACP déshydratase, soit par une (3R)-hydroxyacyl-ACP déshydratase/isomérase de type FabA qui transforme, in vivo, les 2-trans-enoyles, formés par l'étape de déshydratation, en 3-cis-enoyles. L'activité isomérase peut être étudiée in vitro en étudiant la réaction inverse, c'est-à-dire la transformation d'un composé 3-cis-enoyle en 2-trans-enoyle. CH3ù (CH2)5 CH =CH O II CH2ùCùSùCoA ù CH3 (CH2)6 ùCH=CH O il CùSùCoA 3-cis-d ecenoyl-CoA 2 -tran s-d e c e n oy l C o A La capacité des protéines à catalyser la réaction d'isomérisation a été étudiée en présence de 3-cis-decenoyl-CoA (10 M) et d'enzyme Rv0635-Rv0636 (80 nM), Rv0636-Rv0637(543 nM) ou Rv0636 (280 nM). Les expériences témoins ont été réalisées en présence de 2-trans-decenoyl-CoA (10 M) et des mêmes concentrations d'enzyme. Les réactions ont été suivies à 263 nm où l'augmentation de l'absorbance résulte de la transformation du 3-cis-decenoyl-CoA en 2-trans-decenoyl-CoA. Aucune variation de l'absorbance n'a été observée en présence de 3-cis-decenoyl-CoA alors que pour les expériences contrôles, les enzymes Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637 présentaient une activité spécifique respective de 9,85 mol/min/mg de protéine, 0,20 mol/min/mg de protéine et 0,02 mol/min/mg de protéine. Pour Rv0636, à cette faible concentration en substrat, aucune activité n'a pu être détectée à la concentration maximale d'enzyme pouvant être utilisée. Dans les conditions testées, les enzymes étudiées ne présentent pas d'activité isomérase. Etude de la dépendance vis-à-vis de l'ACP La particularité des systèmes FAS-II est de posséder une activité dépendante de l'ACP. FAS-II est le seul système de biosynthèse d'acides gras qui soit dépendant de l'ACP chez les mycobactéries. Une analyse préliminaire a été effectuée en comparant l'activité des enzymes Rv0635-Rv0636 (80 nM) ou Rv0636-Rv0637(543 nM) en présence de 2-trans-octenoyl-ACP (2,5 M) ou de 2-trans-octenoyl-CoA (2,5 M). L'activité de la protéine Rv0636 seule n'a pas pu être mesurée. L'hétérodimère Rv0635-Rv0636 a présenté une activité spécifique en 30 présence de 2-trans-octenoyl-ACP de 0,27 !mol/min/mg tandis qu'aucune activité 28 significative n'a été détectée en présence du dérivé de CoA dans ces conditions (figure 4A). Quant à l'hétérodimère Rv0636-Rv0637, l'activité spécifique détectée en présence de 2-trans-octenoyl-ACP (2,5 M) était de 0,010 mol/min/mg de protéine alors qu'en présence de 2-trans-octenoyl-CoA (2,5 .iM), son activité n'était pas signi- ficative par rapport à la réponse de l'expérience contrôle (sans enzyme) (figure 4B). Ces résultats suggèrent fortement que les protéines Rv0635, Rv0636 et Rv0637 sont impliquées dans le système d'élongation FAS-II. Pour les deux hétérodimères, Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637, ils ne sont actifs qu'en présence de dérivés d'ACP à la faible concentration en substrat utilisé. L'ensemble de ces résultats rappelle ce qui a été observé pour les enzymes des systèmes FAS-II décrits, notamment pour les enzymes mycobactériennes InhA, KasA et KasB ainsi que pour les (3R)-hydroxyacyl-ACP déshydratases d'autres organismes qui, bien que montrant une préférence pour les dérivés d'ACP, restent actives en présence de dérivés de CoA. Résumé des propriétés de la protéine Rv0636 La protéine Rv0636 présente les propriétés suivantes : (i) l'ubiquité de la protéine parmi les espèces mycobactériennes ainsi que la présence chez des genres apparentés, dans la mesure où les acides mycoliques sont des composés caractéristiques des Corynebacterinae ; (ii) l'absence de la protéine chez Corynebacterium ; (iii) la présence au voisinage de l'ORF sur le chromosome de gènes décrits comme intervenant dans le métabolisme des acides mycoliques et (iv) la présence d'un motif catalytique. Plus précisément, la séquence codant pour la protéine Rv636 est localisée près du groupe de gènes mmaAl-4 impliqué dans la biosynthèse des acides mycoliques oxygénés chez M. tuberculoses. De plus, cette protéine présente une séquence catalytique caractéristique conservée, appelée motif hydratase 2 (figure 12) qui inclut le motif Y-A-G-V-S-G-D-L-N-P-I-H-W-D-D-E-I-A (SEQ ID NO:16). Ainsi cette protéine appartient à la sous-famille des hydratases 2. Le motif hydratase 2 a tout d'abord été décrit dans les enoyl-CoA hydratases et a également été trouvé dans le domaine (3R)-hydroxyacyl déshydratase des systèmes FAS-I. Ce motif hydratase 2 a récemment été observé dans la (3R)-hydroxyacyl-ACP déshydratase du système FAS- II dans les mitochondries de levure. Enfin le gène Rv0635 chevauche le gène Rv0636 et le gène Rv0637 est décalé de 4 pb par rapport au gène Rv0636. Ces trois gènes forment probablement un opéron ; les protéines codées par cet ensemble de gènes présentent une prédiction de structure SHD, c'est-à-dire de repliement de type simple hot dog . Résumé des propriétés des protéines Rv0635 et Rv0637 Les protéines Rv0635 et Rv0637 présentent les propriétés suivantes : (i) elles sont ubiquitaires parmi les mycobactéries et seule Rv0635 est retrouvée chez des genres apparentés (Corynebacterinae) ; (ii) elles sont absentes chez Corynebacterium ; (iii) leur prédiction de structure correspond à un repliement de type SHD ; (iv) mais elles ne comportent pas de motif catalytique ; (v) elles ont la propriété de s'associer, de façon indépendante à Rv0636, formant des hétérodimères ou des multimères. Résumé concernant des enzymes comportant les protéines Rv0635, Rv0636 et RvO637 De manière surprenante, les enzymes comportant les protéines Rv0635, Rv0636 et Rv0637 présentent les propriétés suivantes : (i) elles forment des structures quaternaires correspondant à des dimères ou des multimères de Rv0636 seule, de l'association Rv0635-Rv0636 et de l'association Rv0636-Rv0637 ; (ii) les structures quaternaires comportant une sous- unité catalytique et une sous-unité non catalytique (Rv0635-Rv0636 et Rv0636-R.v0637) corrèlent avec leur spécificité pour des substrats à longue chaîne (> C12), la sous-unité non catalytique pouvant jouer le rôle d'accepteur de longue chaîne acyle ; (iii) ces enzymes semblent présenter une spécificité marquée pour des dérivés d'ACP par rapport à des dérivés de CoA ; (iv) leur spécificité de longueur de chaîne et de transporteur de la chaîne acyle correspond aux propriétés décrites pour le système FAS-II mycobactérien et pour les enzymes qui le composent ; (v) la préférence de Rv0636-Rv0637 pour des substrats à plus longue chaîne par rapport à Rv0635-Rv0636 et l'absence de protéine orthologue à Rv0637 dans les genres apparentés à Mycobacterium comportant des acides mycoliques courts suggère que Rv0635-Rv0636 serait impliqué dans les cycles précoces d'élongation catalysés par FAS-II, alors que R.v0636-Rv0637 serait impliqué dans les cycles tardifs d'élongation. 30 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES - Altschul, S. 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Functional replacement of the FabA and FabB proteins of Escherichia coli fatty acid synthesis by Enterococcus faecalis FabZ and FabF homologues. 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motif hydratase 2, mais dont la structure tridimensionnelle présente un repliement de type hot dog ; et b) elle catalyse la déshydratation d'un substrat (3R)-hydroxyacyl en 2-trans-enoyl et/ou l'hydratation d'un substrat 2-trans-enoyl en (3R)-hydroxyacyl, conformément au schéma suivant : 20 CH3ù (CH2)n H20 H2O CH3ù (CH2)n ù CH= CH ù O I I Cù Sù X OH ù CHù CH2 ù (R) dans lequel X représente ACP et n>0, de préférence n>4 ou CoA et n ,'A, de préférence n>8. 2 ) Enzyme purifié et isolée selon la revendication 1, caractérisée en 25 ce que la protéine telle que définie en (i) est sélectionnée dans le groupe constitué par la protéine Rv0636 (SEQ ID NO:2) comprenant un motif hydratase 2 Y-A-G-V-S-G- D-L-N-P-I-H-W-D-D-E-I-A (SEQ ID NO:16) et une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité avec la protéine Rv0636 de séquence SEQ ID NO :2 de 30 M. tuberculosis H37Rv. 34 3 ) Enzyme isolée et purifiée selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que la protéine telle que définie en (ii) qui ne comporte pas de motif hydratase 2, est sélectionnée dans le groupe constitué par : - la protéine Rv0635 (SEQ ID NO :4) ou une protéine qui possède au moins 53 % d'identité ou au moins 67 % de similarité, de préférence au moins 69 % d'identité ou au moins 82 % de similarité avec la protéine Rv0635 de séquence SEQ ID NO :4 de AL tuberculosis H37Rv et - la protéine Rv0637 (SEQ ID NO :6) ou une protéine qui possède au moins 44 % d'identité ou au moins 61 % de similarité, de préférence au moins au moins 59 % d'identité ou au moins 76 % de similarité avec la protéine Rv0637 de séquence SEQ ID NO :6 de M tuberculosis H37Rv. 4 ) Enzyme purifiée et isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le dimère ou multimère est sélectionné dans le groupe constitué par : . un homodimère ou un multimère de Rv0636 (SEQ ID NO :2) ou d'une protéine qui possède au moins 51 '% d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité, sur la totalité de sa séquence avec la protéine Rv0636 de M. tuberculosis, . un hétérodimère ou un hétéromultimère constitué (i) de la protéine Rv0636 (SEQ ID NO :2) ou d'une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité avec la protéine Rv0636 de séquence SEQ ID NO :2 de M tuberculosis H37Rv et (ii) de la protéine Rv0635 (SEQ ID NO :4) ou d'une protéine qui possède au moins 53 % d'identité ou au moins 67 A de similarité, de préférence au moins 69 % d'identité ou au moins 82 % de similarité avec la protéine Rv0635 de séquence SEQ II) NO :4 de M tuberculosis H37RV et . un hétérodimère ou un hétéromultimère constitué (i) de la protéine Rv0636 (SEQ ID NO :2) ou d'une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité avec la protéine Rv0636 de séquence SEQ ID NO :2 de M tuberculosis H37Rv et (ii) de la protéine Rv0637 (SEQ ID NO :6) ou d'une protéine qui possède au moins 44 % d'identité ou au moins 61 % de similarité, de préférence au moins aumoins 59 % d'identité ou au moins 76 % de similarité avec la protéine Rv0637 de séquence SEQ ID NO :6 de M. tuberculosis H37Rv . 5 ) Enzyme purifiée et isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : l'homodimère ou l'homomultimère de Rv0636, l'hétérodimère ou I'hétéromultimère Rv0635-Rv0636 et l'hétérodimère ou 1'hétéromultimère Rv0636-Rv0637. 6 ) Enzyme purifiée et isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le substrat (3R) -hydroxyacyl et/ou 2-trans-enoyl de l'enzyme est de préférence un substrat ayant une chaîne acyle de longueur égale ou supérieure à C8, de préférence en C12-C20, dérivé d'ACP. 7 ) Protéine purifiée et isolée, caractérisée en ce qu'elle correspond aux protéines Rv0635, Rv0636 et Rv0637, sous forme monomérique. 8 ) Polynucléotide isolé, caractérisé en ce qu'il code pour une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou une protéine selon la 15 revendication 7. 9 ) Polynucléotide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par le polynucléotide de SEQ ID NO :1, qui code pour la protéine Rv0636 ; le polynucléotide de SEQ ID NO :3, qui code pour la protéine Rv0635, le polynucléotide SEQ ID NO :5 qui code pour la protéine Rv0637 et 20 le polynucléotide comprenant la séquence qui code pour une protéine Rv0636 et la séquence qui code pour une protéine Rv0635 et/ou une protéine Rv0637. 10 ) Polynucléotide, caractérisé en ce qu'il comprend les cadres de lecture codant pour les protéines Rv0635, Rv0636 et Rv0637 et en ce qu'il est représenté par la séquence SEQ ID NO :7 de la liste de séquences jointe en annexe. 25 I l ) Vecteur d'expression, comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 8 à 10. 12 ) Vecteur selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide codant pour une protéine Rv0636 et au moins un polynucléotide codant pour la protéine Rv0635 et/ou la protéine Rv0637. 30 13 ) Vecteur selon la revendication 11 ou la revendication 12, caractérisé en ce qu'il inclut en outre les séquences de régulation pour l'expression de la protéine.14 ) Cellule-hôte, procaryote ou eucaryote, transformée par le vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, ou par un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 8 à 10. 15 ) Procédé de production d'une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou d'une protéine selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'une cellule-hôte selon la revendication 14 dans un milieu convenable et la purification de l'enzyme ou de la protéine à partir de ladite culture. 16 ) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite 10 purification se fait par chromatographie d'affinité, par exemple IMAC et/ou chromatographie par exclusion. 17 ) Procédé pour inhiber la biosynthèse de composés de l'enveloppe des mycolatas, caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibition de l'expression ou de l'activité d'au moins l'une des enzymes selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 6, sélectionnées dans le groupe constitué par la protéine Rv0636, la protéine Rv0635, la protéine Rv0637 et/ou une protéine selon la revendication 7. 18 ) Procédé pour inhiber la biosynthèse de composés de I'enveloppe des mycolatas, , caractérisé en ce qu'il comprend : a) l'incubation d'un substrat convenable sélectionné dans le groupe 20 constitué par les (3R)-hydroxyacyl-ACP, les trans-2-enoyl-ACP, les (3R)-hydroxyacyl-CoA et les trans-2-enoyl-CoA avec une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, en présence ou en l'absence de la molécule à tester, et b) la comparaison de l'activité de l'enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 en présence et en l'absence de la molécule à tester. 25 19 ) Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la molécule à tester inhibe la biosynthèse de composés de l'enveloppe de mycobactéries pathogènes et d'autres bactéries pathogènes parmi les Corynebacterinae. 20 ) Utilisation d'une protéine ou d'une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour le criblage d'antibiotiques actifs sur les 30 microorganismes contenant un système FAS-II, dans lequel l'étape de déshydratation est catalysée par une déshydratase contenant un motif hydratase 2 [YFJ-x(1,2)-[LIVG]-[STGC]-G-D-x-N-P-[LIV]-H-x(5)-[AS] (SEQ ID NO:15), (dans lequel x(n)représente n acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé et les acides aminés entre crochets représentent des alternatives) ou un motif catalytique apparenté, dérivé du motif hydratase 2 et constitué au moins par le motif de base D-x(4)-H, dans lequel x(4) représente 4 acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé ou un motif similaire au motif de base. 21 ) Utilisation selon la revendication 20, caractérisée en ce que le motif hydratase 2 est le motif Y-A-G-V-S-G-D-L-N-P-I-H-W-D-D-E-I-A (SEQ ID NO:16). 22 ) Utilisation selon la revendication 20 ou la revendication 21, caractérisé en ce que lesdits microorganismes sont des Corynebacterinae. 23 ) Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que lesdits Corynebacterinae sont sélectionnés dans le groupe constitué par les mycobactéries pathogènes (Mycobacterium tuberculosis, M africanum, M. leprae, M. ulcerans, M. microti, M. bovis, M. abscissus, M avium, M. fortuitum, M. kansasii...), Nocardia, Rhodococcus et Gordona. 24 ) Méthode de criblage de ligands de la protéine Rv0636, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en présence de la protéine Rv0636 ou d'une enzyme la contenant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans un milieu réactionnel 20 comprenant le ligand potentiel à tester, - la mesure après excitation à 303 nm de la variation d'intensité de fluorescence au maximum d'émission, - et sur la base de cette mesure, la détection de la fixation dudit ligand sur l'une ou plusieurs des protéines constituant l'enzyme selon l'une 25 quelconque des revendications 1 à 6. 25 ) Méthode de criblage de ligands d'une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou d'une protéine selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - la mise en présence d'une enzyme selon l'une quelconque des 30 revendications 1 à 6 ou d'une protéine selon la revendication 7 avec le ligand à tester et- l'analyse du complexe formé en phase soluble entre ladite enzyme et ledit ligand, notamment par RMN et/ou par fluorescence.