FR 2909099 A1 20080530 FR 0610313 A 20061124 1 Méthode de diagnostic et de suivi d'une vaginose bactérienne par quantification moléculaire. La présente invention concerne une méthode de diagnostic et de suivi in vitro de l'état de la flore bactérienne vaginale au regard de la présence d'une vaginose bactérienne (VB) ou de son évo:[ution, le cas échéant pour le suivi de sa prise en charge thérapeutique. Les techniques actuelles de diagnostic de la VB, qui est une infection fréquente avec des conséquences néfastes pour la grossesse, reposent sur des critères qui sont peu fiables. Certaines bactéries ont été décrites comme étant associées à cette maladie, sans jamais avoir bénéficiées d'une qualification et d'une quantification moléculaire fiable. Pendant longtemps, la VB a été définie du point de vue microbiologique par une quasi-disparition de la flore vaginale normale composée principalement de lactobacilles au profit d'autres bactéries, notamment Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp. et mycoplasmes génitaux [Spiegel CA, CMR 1991 ; Thorsen P, AJGO 1998]. La VB est un motif fréquent de consultation médicale, elle est notamment impliquée dans la susceptibilité aux infections sexuellement transmissibles comme le VIH, et pour les grossesses dans la prématurité et la naissance d'enfants de petits poids. Sa prévalence chez la femme, y compris durant la grossesse, se situe entre 8 et 23% [Guise JM, AJPM 2001] selon les méthodes actuelles d'investigation. Cependant, la revue de la littérature est divergente quant à l'impact de la prise en charge thérapeutique de cette pathologie. En effet, les premières études, qui avaient mis en évidence une réduction du risque d'accouchement prématuré lors du traitement de la VB, n'ont pu être confirmées [Morales HJ, AJOG 1994 ; Hauth JC, NEJM 1995 ; Guise JM, AJPM 2001 ; McDonald H, CDSR 2005 ; Varma R, EJOGRB 2006 ; Okun N, 0G, 2005 ; Leitich H, AJOG 2003 ; Guerra B, EJOGRB 2006]. 2909099 2 L'objectif initial de la présente invention était d'évaluer l'impact de la VB pendant la grossesse ainsi que l'efficacité de la prise en charge thérapeutique de la VB pendant la grossesse. Mais, pour ce faire aucun outil diagnostique objectif n'était disponible. En effet, l'étude de la 5 littérature révèle une grande confusion concernant la prise en charge thérapeutique de la VB liée principalement à l'absence d'outil rationnel pour le diagnostic et le suivi de cette pathologie. Actuellement, les deux outils diagnostiques disponibles sont le score de Nugent et les critères d'Amsel. Le score de Nugent est la méthode la 10 plus couramment rapportée dans la littérature, considérée par certains comme la technique de référence, même si elle n'est pas réalisée en routine dans les laboratoires de microbiologie clinique du fait du caractère fastidieux de sa mise en oeuvre [Fredricks DN, NEJM 2005 ; Thomason JL, AJOG 1992 ; Ison CA, STD 2002 ; Nugent RP, JCM 1991]. Le score de 15 Nugent identifie la VB grâce à une analyse morphologique semiquantitative des bactéries après coloration de Gram. C'est donc une technique subjective dont la reproductibilité a été mise en cause [Sha BE, JCM 2005 ; Schwebke JR, 0G 1996]. Les critères cliniques d'Amsel (pH vaginal supérieur à 4,5 ; leucorrhées grisâtres homogènes adhérentes; odeur 20 azotée après adjonction de KOH à 10%; présence de clue-tells) représentent la seconde approche diagnostique [Amsel R AJM 1983]. Comme le score de Nugent, il est de détermination délicate et non utilisé en pratique clinique courante. Une des limites les plus péjoratives de ces méthodes diagnostiques 25 est l'absence d'identification de certains microorganismes impliqués dans la VB. D'une part, l'absence de paroi des mycoplasmes ne permet pas leurs identifications par la coloration de Gram et donc leurs coi_ations par le score de Nugent. D'autre part, l'apport de la biologie moléculaire a permis d'identifier de nouvelles bactéries pouvant être impliquées dans la VB mais leur mise en évidence par les 2 méthodes diagnostiques existantes est impossible. Àtopobium vaginae est la principale nouvelle espèce bactérienne caractérisée. Sa présence a été corrélée à la VB dans quelques articles sans 2909099 3 toutefois qu'une appréciation quantitative fiable de sa place relative par rapport aux autres microorganismes ait été réalisée [Bradshaw CS, JID 2006, Rodriguez JM, IJSB 1999 ; Ferris MJ, BMCID 2004 ; Ferris MJ, JCM 2004 ; Verhelst R, BMCM 2004]. 5 Dans l'article publié récemment par Bradshaw et col. [Bradshaw CS, JID 2006], il est notamment décrit une relation entre la détection des bactéries A. vaginae et G. vaginalis et la VB, mais ces résultats sont insuffisants pour réaliser un diagnostic de VB et/ou un suivi de l'évolution d'une VB fiables. En effet, les données présentées dans ce travail 10 permettent le dépistage desdites bactéries et non pas leur réelle quantification. De plus, ce dépistage a montré une bonne sensibilité, A. vaginae et G. vaginalis étant détectées respectivement chez 96% et 99% des patientes atteintes de VB. Cependant, sa spécificité est mauvaise car A. vaginae est détectée chez 12% des patientes présentant une flore normale et 15 G. vaginalis chez 60%. Les auteurs ont alors tenté une approche dite semi--quantitative en classant les charges bactériennes comme faibles ou élevées par comparaison des CT ( Cycle Treshold ) médians de détection des microorganismes au sein de tous les échantillons analysés. Ainsi, les 20 auteurs ont estimé une charge médiane de 4 x 105 copies pour G. vaginalis (médiane correspondant à 21 cycles) et 4 x 106 copies pour A. vaginae (médiane à 18 cycles). Les charges élevées de G. vaginalis (>4 x 105) et d'A. vaginae (>4 x 10`) étaient significativement plus présentes chez les patientes présentant une VB par rapport aux patientes avec une flore normale. 25 Cependant, ces valeurs présentaient une mauvaise sensibilité, A. vaginae et G. vaginalis étant seulement détectées respectivement chez 49% et 71% des patientes atteintes d'une VB (Table 1). De plus, 16 patientes (28%) avec une rechute de VB après traitement présentaient une concentration en G. vaginalis en dessous du seuil donné (Table 3). Quarante patientes (70%) 30 avec une rechute de VB présentaient aussi une concentration en dessous du seuil en A. vaginae. 2909099 4 L'approche semi-quantitative des auteurs n'est donc pas applicable en tant qu'outil diagnostique et de suivi immédiat des patients. En fait, les techniques utilisées pour obtenir ces résultats étaient insuffisantes sur plusieurs points. Tout d'abord, les techniques de PCR 5 n'étaient pas suffisamment sensibles car les cibles moléculaires amplifiaient de trop longs fragments (fragment de l'ARN 16S ribosomique de 430 paires de base pour A. vaginae et de 291 paires de base pour G. vaginalis). Il est actuellement établi qu'avec une séquence ciblée lors d'une réaction de PCR aussi longue, la sensibilité est faible. En plus, les techniques de PCR en 10 temps réel utilisaient pour la détection et quantification un marquage en SybrGreen du produit d'amplification, méthode beaucoup moins spécifique que celles qui utilisent des sondes d'hydrolyse marquées qui nécessitent une triple spécificité (deux amorces plus la sonde, pour amplifier un fragment dont la taille n'excède pas 120 paires de bases). Les 15 quantifications s'effectuent vraisemblablement avec un standard variable et non pas en fonction d'une gamme plasmidique stable, reproductible et comparable au cours du temps. Enfin, ils ne bénéficiaient pas d'un outil de contrôle quantitatif permettant de juger de la qualité de leurs prélèvements. En effet, il recherchait seulement la présence de (3globine humaine dans 20 les échantillons sans la quantifier. Il est donc très difficile de comparer quantitativement les échantillons entre eux car la variation de la quantité des bactéries peut être liée à une variation qualitative et quantitative des sécrétions vaginales prélevées. L'évaluation de la prise en charge thérapeutique des VB, ne peut 25 donc se passer de la mise au point préalable d'un outil fiable adapté au diagnostic de la VB et au suivi qualitatif et quantitatif de la flore vaginale. Le but de la présente invention est de fournir une méthode de diagnostic et de suivi de la VB à la fois plus fiable, plus précise et plus simple à mettre en oeuvre en routine dans les laboratoires d'analyse 30 microbiologique clinique. 2909099 5 Pour ce faire, les inventeurs ont étudié les prélèvements vaginaux de 204 femmes enceintes, et recherché la présence de chaque micro-organisme impliqué dans la VB, en développant une méthode de PCR en temps réel permettant la détection de l'ADN spécifique des bactéries et la 5 détermination de la charge bactérienne au moyen d'une gamme plasmidique établie grâce à la construction d'un plasmide étalon. Ce plasmide comprend les fragments d'ADN spécifiques desdites bactéries à amplifier et à quantifier et du gène de l'albumine humaine utilisé comme contrôle de la qualité de l'échantillon d'ADN et de l'amplification moléculaire ainsi que 10 de la richesse de l'échantillon biologique. Les microorganismes cibles étudiés (Lactobacillus sp., G. vagina.lis, Mobilincus curtisii, Mobilincus mulieris, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, A. vaginae, et Candida albicans) étaient ceux décrits comme pouvant être impliqués dans la VB et/ou la prématurité. Les résultats de la quantification des divers microorganismes 15 obtenus par biologie moléculaire ont été confrontés à la classification par le score de Nugent. Selon la présente invention il a été démontré que la présence d'A.vaginae à partir d'un certain seuil de concentration peut être associée à une VB de façon très spécifique et significativement et que cette détection 20 moléculaire rend le diagnostic facile et fiable. L'existence d'un seuil de concentration spécifique de la VB pour la bactérie G. vaginalis a aussi été démontrée selon la présente invention. En outre, il a été démontré que l'association des 2 bactéries à certaines concentrations permet le diagnostic de VB avec notamment une 25 prédictivité positive supérieure à 95% et surtout une prédictivité négative supérieure à 99%. Par ailleurs, au cours des VB, les bactéries du genre Lactobacillus sp., normalement présentes dans le vagin, présentent une concen:ration qui va en diminuant et il a été démontré selon la présente invention qu'en deçà 30 d'un certain seuil de concentration la quantification de ces bactéries Lactobacillus sp. permet de diagnostiquer de façon fiable une VB. Enfin, il a 2909099 6 été démontré qu'une évolution du rapport des concentrations de Lactobacillus sp. vs l'addition des concentrations de A. vaginae et G. vaginalis permet d'évaluer l'évolution de la VB de façon fiable. Plus précisément la présente invention fournit une méthode de 5 diagnostic et de suivi in vitro de l'état de la flore bactérienne vaginale au regard de la présence d'une VB, et, le cas échéant, pour le suivi de son traitement thérapeutique, caractérisée en ce que 1' on détermine la présence d'une vaginose bactérienne ou l'échec d'un traitement thérapeutique en cours si les concentrations de séquences spécifiques présents en une seule 10 copie dans l'ADN des bactéries A. vaginae et respectivement G. vaginalis, dans l'ADN extrait d'un échantillon de sécrétion vaginale de patiente, sont telles que l'une au moins des 2 conditions a) et b) suivantes est respectée : a) la concentration Ca en dit fragment d'ADN d'A. vaginae est supérieure ou égale à 108 copies/ml, et 15 b) la concentration Cg en dit fragment d'ADN de G. vaginalis est supérieure ou égale à 109 copies/ml. D'autre part, on relève que le développement d'une vaginose bactérienne est confirmé si les concentrations Ca, Cg et Cl d'au moins trois fragments de séquences spécifiques présents en une seule copie dans 20 l'ADN des bactéries A. vaginae (Ca), G. vaginalis (Cg) et respectivement Lactobacillus sp. (Cl) dans l'ADN extrait d'un échantillon de sécrétion vaginale de patiente sont telles que le rapport des concentrations Cl/(Ca+Cg) diminue entre les 2 échantillons prélevés successivement dans le temps à intervalle de temps suffisant, de préférence au moins 1 mois. 25 On entend ici par développement d'une vaginose une aggravation d'une vaginose déjà détectée ou, dans certains cas, un risque d'apparition d'une vaginose, c'est-à-dire d'un déséquilibre ou une anomalie de la flore vaginale risquant de devenir pathologique. 2909099 7 De même, l'échec du traitement en cours en fonction des concentrations des séquences spécifiques présentes en une seule copie dans l'ADN des bactéries est confirmé si le rapport des concentrations Cl/(Ca+Cg) diminue ou n'augmente pas entre les 2 échantillons prélevés à 5 intervalle de temps suffisant, de préférence au moins 1 mois. Plus particulièrement, on détermine une vaginose bactérienne si en outre la concentration Cl en fragment d'ADN de séquence spécifique des bactéries Lactobacillus sp. présent en une seule copie dans l'ADN extrait d'un échantillon de sécrétion vaginale de patiente, est inférieure ou égale à 10 1e 108 copies/ml, de préférence inférieure à 10' copies/ml. Selon la présente invention, la concentration en bactéries du genre Lactobacillus sp. n'est pas suffisante pour conclure à la présence d'une vaginose bactérienne, mais vient en complément ou confirmation dans le cas où les conditions de concentrations en A. vaginae et G. vaginalis sont 15 réunies. De préférence, on détermine une vaginose bactérienne si lesdites concentrations sont telles que les 3 conditions suivantes sont respectées : a- concentration Ca en dit fragment d'ADN de séquence spécifique d'Atopobium vaginae supérieure ou égale à 108 copies/ml, 20 b- concentration Cg en en dit fragment d'ADN de séquence spécifique de Gardnerella vaginalis supérieure ou égale à 10' copies/ml, et c- concentration Cl en dit fragment d'ADN de séquence spécifique de Lactobacillus sp. inférieure ou égale à 10' copies/ml. Avantageusement, lesdites concentrations Ca, Cg ou Cl sont 25 déterminées par amplification enzymatique de type PCR en temps réel et quantification de l'ADN desdits fragments d'ADN de séquences spécifiques des bactéries respectivement Atopobium vaginae , Gardnerella vaginalis et le cas échéant Lactobacillus sp, ainsi que, de préférence, d'un 2909099 8 fragment d'ADN humain présent dans tout prélèvement biologique humain contenant des cellules. De préférence, on détermine lesdites concentrations de bactéries par co-amplification enzymatique du type PCR en temps réel desdits fragments 5 d'ADN de séquences spécifiques respectivement desdites bactéries Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis, et le cas échéant Lactobacillus sp. contenus d'une part dans ledit ADN extrait de l'échantillon, et d'autre part dans des échantillons d'ADN synthétiques comprenant chacune desdites séquences spécifiques desdites bactéries servant de standards d'étalonnage 10 de quantification de l'ADN, lesdits fragments d'ADN de séquences spécifiques respectivement desdites bactéries Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis, et le cas échéant Lactobacillus sp. présentant une taille de 70 à 150 nucléotides de préférence de 90 à 120 nucléotides. De préférence encore, les détection et quantification desdits 15 fragments amplifiés sont réalisées à l'aide de sondes marquées de séquences distinctes de celles des amorces d'amplification pour chacun desdits fragments d'ADN de séquences spécifiques respectivement desdites bactéries Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis, et le cas échéant Lactobacillus 3p. 20 De préférence encore, on met en oeuvre un grand fragment synthétique d'ADN servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdites séquences spécifiques respectivement de chacune desdites bactéries. La présence de plusieurs cibles moléculaires sur un même fragment nucléique 25 permet de quantifier des cibles différentes dans un même échantillon et de les coquantifier de façon homogène, la quantification en utilisant la même gamme d'étalonnage de plusieurs espèces moléculaires, permettant la comparaison de l'efficacité des différentes réactions de PCR entre elles et d'une détermination à l'autre au cours du temps et évite les biais liés au 30 témoin positif. 2909099 9 On entend par "séquence spécifique de ladite bactérie", une séquence du génome de ladite bactérie qu'on ne retrouve dans aucun autre génome d'organisme vivant. On entend par "fragment d'ADN", un fragment d'ADN ou 5 oligonucléotide dont les séquences sont écrites ci-après dans le sens 5'--3'. Plus particulièrement, lesdites séquences spécifiques desdites bactéries comprennent : - pour la bactérie Atopobium vaginae: le fragment des positions 248 à 334 du gène ARN 16S ribosomal de référence Genebank AY 738658.1, 10 - pour la bactérie Gardnerella vaginalis, le fragment des positions 981 à 1072 du gène Cpn 60 de la protéine chaperonne de 60kDa de référence Genebank AF 240579.3, et pour la bactérie Lactobacillus sp., une séquence commune aux bactéries Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jenseneii, Lactobacillus gasseri, 15 Lactobacillus ineri et Lactobacillus acidophilus au sein du gène tuf codant pour le facteur d'élongation aux positions 253 à 343 du gène de référence Genebank AY 562191.1. Plus particulièrement encore, lesdites séquences spécifiques desdites bactéries sont les séquences suivantes incluant des séquences sondes 20 (soulignées) encadrées par des séquences amorces (en gras) ou leurs séquences reverses et complémentaires pour les amorces anti-sens: - pour Atopobium vaginae: Seq. n 2 = 5'-CCCTATCCGCTCCTGATACCGGCAGGCTTGAGT CTGGTAGGGGAAGATGGAATTCCAAGTGTGAAATGCGCAGATATT 25 TGG-3' - pour Gardnerella vaginalis: 2909099 10 Seq. n 3 = 5'-CGCATCTGCTAAGGATGTTGAAACATCGTTTAA GGCTACTGCAACTATTTCTGCAGCAGATCCTGAAGTTGGCGAAAAG ATTGCTG-3' - pour Lactobacillus sp. 5 Seq. n 4 = 5'-TACATCCCAACTCCAGAACGTGATACTGACAAGC CATTCTTAATGCAGTTGAAGACGTATTTACTATCACTGGTCGTGGTA CTGTTGCTT-3' Avantageusement, on réalise en outre la quantification des cellules humaines présentes dans ledit échantillon, notamment dans l'ADN obtenu 10 à partir de prélèvement vaginal à tester, à titre de contrôle de la richesse du prélèvement, de la qualité de l'extraction de l'ADN, et de la présence potentielle d'inhibiteurs de la réaction de PCR. Pour ce faire, on quantifie le nombre de copies d'un gène humain présent dans tout prélèvement biologique humain contenant des cellules, notamment le nombre de copies 15 du gène d'albumine humaine. La quantification du gène de l'albumine humaine sert ainsi de contrôle interne pour attester de la qualité et de la richesse de l'échantillon. De plus, au cours du suivi des patientes, cette quantification est un moyen de normalisation entre deux échantillons prélevés à des temps différents. En effet, le calcul du nombre de 20 microorganismes par millions de cellules humaines autorise une comparaison inter-échantillon rigoureuse. L'albumine est présente uniquement en 2 copies dans les cellules humaines et la mesure du signal de cette séquence permet donc la quantification du nombre de cellules humaines initiales dans le prélèvement. Une quantité de cellules inférieures 25 ou égales à 102 pour 5 l d'échantillon soit un CT supérieur ou égal à 26 amène à rejeter le prélèvement du fait d'une quantité insuffisante. Du fait de la variabilité de qualité du prélèvement, du transport et de la conservation, la présente invention contient ainsi un témoin moléculaire de qualité permettant une systématisation du diagnostic avec une 30 quantification fiable. 2909099 11 Plus particulièrement, on réalise en outre la quantification de l'ADN humain contenu dans ledit échantillon, et ledit grand fragment d'ADN comprend en outre une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester telle qu'une séquence spécifique de l'albumine. 5 Plus particulièrement encore, ladite séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester comprend le fragment des positions 16283-16423 de l'exon 12 du gène de l'albumine humaine de référence Genebank M12523.1 de séquence du listage de séquence suivante ou la séquence complémentaire: 10 Seq. n 1= 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGT(CT CCAC)TTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCT CTCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAG CAGCTCCCATGAGTTT-3', de préférence une séquence Seq. n 1 modifiée par insertion d'un site de clivage, notamment le site Xhol 15 (séquence rayée entre parenthèses) en dehors des séquences correspondant aux amorces (séquences en gras) et séquence sonde (séquence soulignée) comme la séquence Seq. n 17. Avantageusement encore, on réalise des réactions d'amplification et de quantification en mettant en oeuvre des jeux d'amorces et des sondes 20 d'hydrolyse spécifiques de chacune des différentes bactéries dites séquences spécifiques de chacune desdites bactéries, et le cas échéant d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester, telle que une séquence spécifique de l'albumine humaine. Plus particulièrement, de façon connue, ladite séquence spécifique 25 comprend une séquence sonde encadrée par des séquences aptes à servir comme amorce dans une réaction d'amplification du type PCR desdites séquences spécifiques. On entend ici par "sonde", un oligonucléotide, de préférence encore de 20 à 30 nucléotides, s'hybridant spécifiquement avec ladite séquence 30 spécifique et donc permettant de la détecter et de la quantifier de façon 2909099 12 spécifique grâce à la mesure de l'accroissement de la fluorescence liée de la réaction de PCR. La sonde permet de détecter l'ADN spécifique amplifié et de le quantifier par comparaison de l'intensité du signal avec celui du standard 5 de quantification. On entend ici par "amorce", un oligonucléotide de préférence de 15 à 25 nucléotides qui s'hybride de façon spécifique avec une des 2 extrémités de la séquence que l'ADN polymérase amplifiera dans la réaction de PCR. 10 Plus particulièrement, on met en oeuvre les jeux d'amorces et de sondes choisis le cas échéant parmi les séquences suivantes du listage de séquence annexé à la présente description, ou respectivement leurs séquences complémentaires : - pour Atopobium vaginae: 15 Amorce 5' : Seq. n 5 = 5'-CCCTATCCGCTCCTGATACC-3' Amorce 3' : Seq. n 6 = 5'-CCAAATATCTGCGCATTTCA-3' Sonde : Seq. n 7 = 5'-GCAGGCTTGAGTCTGGTAGGGGA-3' - pour Gardnerella vaginalis: Amorce 5' : Seq. n 8 = 5'-CGCATCTGCTAAGGATGTTG-3' 20 Amorce 3' : Seq. n 9 = 5'-CAGCAATCTTTTCGCCAACT-3' Sonde : Seq. n 10 = 5'-TGCAACTATTTCTGCAGCAGATCC-3' - pour Lactobacillus sp.: Amorce 5' :Seq. n 11 = 5'-TACATCCCAACTCCAGAACG-3' Amorce 3' : Seq. n 12 = 5'-AAGCAACAGTACCCACGACCA-3' 2909099 13 Sonde : Seq. n 13 = 5'-TGACAAGCCATTCTTAATGCA-3', - pour l'albumine humaine : Amorce 5' : Seq. n 14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3' Amorce 3' : Seq. n 15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3' 5 Sonde :Seq. n 16 = 5'-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC- 3' De préférence, ledit grand fragment d'ADN synthétique constitutif de l'ADN de l'échantillon standard d'étalonnage de la quantification est inséré dans un plasmide. 10 La réaction de quantification peut avantageusement être réalisée par PCR en temps réel. La technique de PCR en temps réel consiste en une PCR classique en utilisant des amorces de séquence directe et inverse, et une sonde dite d'hydrolyse apte à être hydrolysée par la Taq polymérase. Ladite sonde est marquée par un fluorophore en 5' et un agent 15 bloquant en 3' permettant quand la sonde est hydrolysée une émission de fluorescence qui est proportionnelle au nombre d'amplifiats. Le principe de la PCR en temps réel repose donc sur la capacité de la Taq polymérase pendant l'étape d'élongation d'hydrolyser une sonde hybridée sur l'ADN à copier. Cette hydrolyse permet la libération de la fluorescence et ainsi peut 20 permettre une quantification. Au cours de la même réaction, on peut quantifier deux cibles différentes, en introduisant dans le mélange réactionnel deux amorces et une sonde dirigées contre une première cible, et deux autres amorces et sonde dirigées contre l'autre cible. Les deux sondes étant marquées avec un fluorophore différent. 25 Dans ces méthodes de quantification d'ADN, il est important de savoir si une réaction positive n'est pas due à une contamination par le plasmide recombinant utilisé comme standard de quantification ou comme témoin positif. Pour résoudre ce problème, un site de coupure par un enzyme de restriction est avantageusement introduit dans au moins une des 2909099 14 cibles moléculaires. Ce site étant absent sur la séquence naturelle. Donc, par coupure enzymatique et analyse du fragment amplifié sur gel d'agarose, ou en utilisant une sonde de PCR en temps réel qui reconnaît spécifiquement le site de restriction, on peut ainsi détecter la présence 5 éventuelle du plasmide contaminant. Ainsi, on peut mettre en oeuvre plus particulièrement, les étapes suivantes dans lesquelles : 1- on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique d'au moins un desdits 10 agents, dans l'ADN extrait desdits échantillons à tester et dans l'ADN de l'échantillon standard d'étalonnage, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier à la fois au moins ladite séquence spécifique authentique et ladite séquence spécifique modifiée, 2- on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits 15 échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique, et 3- on détecte les faux positifs éventuels provenant de contaminations éventuelles desdits échantillons à tester par de l'ADN provenant de l'échantillon de standard d'étalonnage, par l'une au moins des étapes suivantes : 20 - 3a- on réalise une digestion enzymatique du produit de PCR obtenu avec une enzyme correspondant au site de clivage et analyse sur gel d'agarose du produit de digestion en comparaison avec le produit de PCR non digéré par l'enzyme de restriction. Si le fragment digéré provient de l'amplification de la cible 25 moléculaire insérée dans le plasmide témoin, il contient le site de restriction, et il sera d'une taille inférieure au fragment non digéré. - 3b- on réalise une réaction de type PCR en temps réel avec des amorces directes et inverses de l'une des cibles moléculaires, et une sonde spécifique de ladite séquence exogène contenant le site de restriction. 2909099 15 Seul un fragment provenant du plasmide témoin et contenant la séquence exogène pourra être amplifié. Plus particulièrement, on met en oeuvre une dite séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester qui comprend le fragment des 5 positions 16283-16423 de l'exon 12 du gène de l'albumine humaine de référence Genebank M12523.1 modifiée par insertion d'un site de clivage, notamment le site Xhol, en dehors des séquences correspondant aux amorces (séquences en gras) et séquence sonde (séquence soulignée) de séquence du listage de séquence suivante : 10 Seq. n 17 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGT(C TCGAG)TTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATC TCTCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCA GCAGCTCCCATGAGTTT-3', comprenant le site Xhol (entre parenthèses) en dehors des séquences correspondant aux amorces 15 (séquences en gras) et séquence sonde (séquence soulignée). Avantageusement encore, on met en oeuvre une pluralité de réactions d'amplifications enzymatiques PCR simultanées ou non de chacune desdites séquences spécifiques desdites bactéries avec le même grand fragment d'ADN synthétique étalon, à l'aide d'une pluralité de différents jeux 20 d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacune desdites bactéries, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différentes ditesbactéries et lesdites amorces pouvant être mises en oeuvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le même protocole et, notamment, à la même 25 température d'hybridation. On connaît différentes méthodes pour construire un grand fragment d'ADN chimère combinant plusieurs fragments, notamment d'origine diverses, notamment la méthode décrite dans FR 2 882 063 dans laquelle on prépare un grand premier fragment d'ADN synthétique double brin de 30 séquence déterminée comprenant un enchaînement dans un ordre déterminé d'une pluralité de n deuxièmes petits fragments d'ADN 2909099 16 synthétiques contigus, consistant essentiellement dans la dimérisation d'une pluralité de n oligonucléotides par amplification enzymatique à l'aide d'une enzyme polymérase thermorésistante comprenant : - une première étape de réaction d'amplification d'acides nucléiques 5 de type PCR en présence d'une dite enzyme polymérase, d'une série de n oligonucléotides de séquences déterminées, sans amorces exogènes, comprenant une série de cycles dans des conditions de températures permettant l'hybridation desdits oligonucléotides, suivie d'une élongation du complexe obtenu, destinée à mettre bout à bout dans un ordre 10 déterminé lesdits oligonucléotides., les séquences desdits oligonucléotides correspondant successivement et alternativement aux séquences sens et anti-sens des différents dits deuxièmes fragments synthétiques, et chaque dit oligonucléotide contenant dans ses régions 5' et 3' des séquences complémentaires de celles des oligonucléotides suivant et précédent, le cas 15 échéant, et - une deuxième étape d'amplification à l'aide d'amorces spécifiques des extrémités 5' et 3' du dit brin directe dudit grand premier fragment synthétique à préparer, permettant de produire des copies identiques dudit grand premier fragment. 20 Cette technique est donc basée sur l'utilisation et la maîtrise d'un artefact de la PCR, qui consiste en l'hybridation des amorces entre elles (dimérisation des amorces). Ce phénomène est observé dans le cas où les conditions de PCR, notamment de température, sont mal adaptées, et que les amorces contiennent des séquences partiellement complémentaires. 25 La technique de construction consiste donc, à partir des séquences cibles, à choisir les séquences des oligonucléotides, avec une alternance d'oligonucléotides de séquences directes ( sens ) ou inverses (encore dénommées reverses ou anti-sens ). Afin de rendre possible la mise bout à bout de ces oligonucléotides, on prend soin d'introduire en 3' de la 30 séquence d'un oligonucléotide une séquence nucléotidique complémentaire des premiers nucléotides de l'oligonucléotide suivant. Ces oligonucléotides 2909099 17 seront hybridés par leur parties complémentaires, et grâce à l'activité polymérasique, par exemple de la Taq polymérase, une synthèse de 5' en 3' se réalise afin d'obtenir des fragments doubles brins. Le fragment final (assemblé) est synthétisé par PCR en utilisant un couple d'amorces directe 5 et inverse correspondant aux séquences des extrémités du premier grand fragment d'ADN synthétique bicaténaire désiré. Comme mentionné précédemment, avantageusement, lesdits grands fragments d'ADN synthétiques, sont avantageusement insérés dans un plasmide. 10 Cette technique de construction générique d'un fragment nucléotidique synthétique permet la mise en contiguïté de plusieurs cibles moléculaires d'intérêt. Il s'agit d'une méthode simple à mettre en oeuvre, rapide et fiable, et ne nécessitant pas un équipement lourd et coûteux. La présente invention a également pour objet une trousse de 15 diagnostic utile pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic et suivi d'une vaginose selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend : des échantillons d'ADN standard d'étalonnage à une concentration connue comprenant desdites séquences spécifiques de chacun desdites bactéries tels que définis ci-dessus, et de préférence une dite séquence 20 spécifique de l'ADN humain telle que définie ci-dessus, et de préférence encore un dit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdits séquences spécifiques de chacun desdites bactéries tels que définis ci-dessus, et de préférence une dite séquence spécifique de l'ADN humain telle que définie ci-dessus, ainsi que 25 - desdits jeux d'amorces spécifiques desdits fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques desdites bactéries et de préférence encore, desdites sondes tels que définis ci-dessus, et - des réactifs de mise en oeuvre d'une réaction d'amplification d'ADN de type PCR. 2909099 18 D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre de différents exemples de réalisation en référence au listage de séquence et aux figures 1 à 4, dans lesquelles : 5 - la figure 1A représente l'analyse des charges microbiennes de 20 vaginoses bactériennes définies par le score de Nugent quantifiées par PCR en temps réel selon la présente invention. - la figure 1B représente l'analyse des charges microbiennes de 167 flores normales définies par le score de Nugent quantifiées par PCR en 10 temps réel selon la présente invention. - la figure 2 représente l'analyse des charges microbiennes de 44 flores intermédiaires identifiées par le score de Nugent quantifiées par PCR en temps réel selon la présente invention. la figure 3 montre 25 vaginoses bactériennes identifiées sur des 15 critères moléculaires et quantifiées selon la présente invention à partir du groupe des 44 flores intermédiaires définies par le score de Nugent.la figure 4 présente 19 flores normales identifiées sur des critères moléculaires et quantifiées selon la présente invention après application des critères moléculaires de la vaginose bactérienne au groupe des 44 flores 20 intermédiaires identifiées par le score de Nugent. 1. PATIENTES, MATERIELS ET METHODES I.1 Réalisation et transport des prélèvements vaginaux Les femmes enceintes, suivies pour leur grossesse, ont été recrutées à l'hôpital de La Conception à Marseille. Un consentement éclairé est la 25 condition nécessaire à l'inclusion. Les prélèvements ont été réalisés au niveau du cul de sac vaginal postérieur sous spéculum stérile non lubrifié et sans antiseptique. Quatre prélèvements sont réalisés pour chaque femme : deux prélèvements par écouvillon coton sur tube sec (Copan innovation , Brescia, Italie) et deux prélèvements par cytobrosse 2909099 19 (Scrinet 5,5 mm, laboratoire C.C.D. international, Paris, France) Un écouvillon coton est utilisé pour l'état frais et la culture bactérienne. Un second est placé dans un milieu de transport spécifique (RI Urée-Arginine LYO 2, BioMérieux SA, Marcy l'Etoile, France) pour la recherche des 5 Mycoplasmes génitaux (M. hominis et M. urealyticum). Une cytobrosse est utilisée pour l'étalement sur lame et coloration de Gram. Une seconde pour l'extraction de l'ADN aux fins de quantification par amplification moléculaire est transportée dans 500 l de milieu de transport MEM (Minimum Essential Medium, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, 10 USA). Elle est congelée à -80 C dés son arrivée au laboratoire jusqu'à son utilisation. I.2 Analyse bactériologique I.2.1 Etat frais La recherche de Trichomonas vaginalis est réalisée par un examen à 15 l'état frais entre lame et lamelle au microscope optique (objectif 10X). 1.2 Score de Nugent : 1.2.2.1 La coloration de Gram : Après étalement du prélèvement sur lame de verre et séchage la coloration de Gram comprend: une coloration au cristal violet oxalate (1 20 minute), une coloration au liquide de Lugol (1 minute), une décoloration à alcool/acétone et coloration au safranine en solution (BioMérieux). Chaque étape est suivie d'un lavage à l'eau. La coloration de Gram permet d'établir le score de Nugent selon une évaluation semi-quantitative de 3 morphotypes bactériens (Tableau 1). En fonction du score trois flores 25 vaginales sont identifiées : une flore normale (FN) pour un score de 0 à 3, une flore intermédiaire (FI) pour un score de 4 à 6 et une VB pour un score supérieur à 7. I.2.2.2 Culture 2909099 20 Les prélèvements vaginaux sont ensemencés sur 3 milieux de culture : la gélose Columbia ANC plus 5% de sang de mouton (BioMérieux), la gélose Chocolat Poly Vitex PVX (BioMérieux), la gélose CHOC VCAT (BioMérieux) incubés à 37 C pendant 48 heures. Pour la 5 recherche des Mycoplasmes, les prélèvements sont ensemencés sur kit spécifique (Urée-Arginine LYO 2, BioMérieux) puis incubés à 37 C puis inoculés sur milieux de culture anaérobie (BioMérieux) durant 48 heures. I.3. Détection et quantification par PCR en temps réel : I.3.1 Extraction de l'ADN 10 L'extraction de l'ADN utilise le kit QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen , Courtaboeuf, France). Le protocole est modifié de la façon suivante : incubation pendant 12 heures à 56 C de 200 l d'échantillon pour 200 l de tampon de lyse et 20 tl de protéinase K. Le lysat est traité selon les recommandations du fabriquant. L'ADN est élué dans 100 l de 15 tampon d'élution puis stocké à ù 20 C. I.3.2 Mise au point des PCR en temps réel I.3.2.1 Choix des cibles moléculaires L'analyse des données de la littérature, et des séquences déposées dans le site GenBank 20 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html) permet de prendre connaissance des séquences disponibles pour chacun des microorganismes cibles. La spécificité des amorces, des sondes et des fragments des séquences cibles de chacun des microorganismes choisis sont testées pour leur spécificité sur le site Internet NBCI 25 (htte_1_/ "W...'.n~l~i__n_lt~i__iiili_ o~L13LAST/). Les inventeurs ont sélectionné des cibles sur tous les agents potentiels de vaginose, y compris des agents au rôle incertain. D'une façon surprenante, la cible la plus significative Atopobium vaginae n'était pas considérée comme un agent essentiel. 2909099 21 Les cibles retenues sont localisées sur la séquence du gène codant pour la protéine chaperonne de 60 KDa (Cpn6O) pour G. vaginalis et M. curtisii, sur celle de l'ARN 16S pour M. mulieris et A. vaginae, le gène fts Y pour M. hominis, sur celle de l'uréase pour U. urealyticum, le gène de la 5 topoisomérase III pour C. albicans. Pour la cible de Lactobacillus sp., une séquence commune au: Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jenseneii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus ineri et Lactobacillus acidophilus est choisie, elle est située sur le gène codant pour le facteur d'élongation tu (tuf). Une séquence située dans l'exon 12 du gène de l'albumine humaine est choisie 10 afin d'attester de la présence et de la quantité d'ADN dans l'échantillon testé. I.3.2.2 Choix des sondes et amorces Pour chaque microorganisme étudié (Lactobacillus sp., G. vaginalis, M. curtisii, M. mulieris, U. urealyticum, M. hominis, A. vaginae, C. albicans) et 15 l'albumine humaine une sonde, un couple amorce sens et anti-sens sont choisies sur les séquences cibles précédemment définies en utilisant le programme Primer 3 (http://frodo.wi.mit edu/primer3/primer3_code .html). Les amorces et sondes sont décrites dans l'annexe 1 ci- après Chaque amorce et sonde sont analysées sur le site In.ternet NBCI 20 (http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) pour s'assurer de leur spécificité in silico (Annexe 1). Afin de réaliser des PCR en temps réels en double reconnaissance (PCR duplex) des couples de reconnaissance de microorganismes sont arbitrairement choisies : une des sondes étant marquée FAM et l'autre étant 25 marquée VIC. Quatre couples de PCR sont ainsi définis. - Lactobacillus sp. (FAM) et G. vaginalis (VIC) - M. curtisii (FAM) et M. mulieris (VIC) - U. urealyticum (VIC) et albumine humaine (FAM) 2909099 22 - A. vaginae (VIC) et C. albicans (FAM) Mycoplasma hominis (FAM) sera quantifié seul. Les amorces sont synthétisées par Eurogentec (Seraing, Belgique), et les sondes par Applied Biosystems (Warrington, Cheshire, IJK). 5 I.3.2.3 Test de spécificité vis à vis des différentes souches testés Afin de tester la spécificité des amorces et des sondes, l'ADN extrait de souches bactériennes de référence (L. acidophilus CIP 104464, A. vaginae CIP 106431, G. vaginalis CIP 103660, M. curtisii subsp. holmesii ATCC 35242, M. mulieris ATCC 35239, C. albicans UMIP 1180.79, U. urealyticum 10 CIP 103755 et M. hominis CIP 103715) est utilisé à trois dilutions (1/10`, 1/100`, 1/1000`) pour la mise au point des PCR en temps réel (détermination des quantités relatives d'amorces et de sondes, des spécificités, des réactivités croisées). Chaque souche est testée avec les amorces et la sonde spécifique mais aussi avec les sondes et amorces des 7 15 autres microorganismes et celles de l'albumine humaine. I.3.2.4 Mise au point des PCR duplex On a mesuré les valeurs de CT ( cycle threshold ). Il s'agit du point d'intersection entre la ligne de base de la réaction et la courbe logarithmique de représentation de l'amplification. Cette valeur de CT 20 correspond au nombre de cycle d'amplification nécessaire pour que l'amplification commence. Elle est en relation avec la concentration du produit nucléique à quantifier, à savoir que plus le CT est bas plus la concentration est élevée. Les quantités d'amorces et de sondes nécessaires pour l'obtention 25 d'une amplification optimale en simple et en double fluorescence sont définies en testant les réactions d'amplification sur un mélange d'ADN bactérien des 8 souches de référence en équimolarité, ainsi qu'avec les souches pures, pour une concentration finale au 1/10e dans les deux cas. 2909099 23 Les conditions expérimentales retenues sont celles pour lesquelles les valeurs de CT sont identiques à celles obtenues en simple fluorescence. I.3.2.5 Test de spécificité vis à vis de 40 souches non testées : Les échantillons d'ADN génomique provenant de 40 souches 5 bactériennes différentes (Annexe) autres que les 8 souches bactériennes de référence sont testés en dilution au 1/10'. L'ensemble de ces tests est effectué en prenant soin d'introduire lors de chaque réaction d'amplification des témoins négatifs ne contenant aucun ADN ou des témoins positifs (mélange de l'ADN des 8 souches de référence). La 10 spécificité est testée avec les quatre couples de PCR en temps réel ainsi que Mycoplasma hominis. I.4. Construction du plasmide On a mis en oeuvre la méthode de préparation décrite dans FR 2 882 063. 15 I.4.1 Séquence du fragment hybride de quantification : La séquence nucléotidique du fragment hybride de quantification est obtenue en alignant les séquences cibles des PCR en temps réel pour les 8 micro-organismes ainsi que celles de l'albumine humaine. Nous obtenons un fragment hybride de 931 paires de bases décrit à l'Annexe 2 ci- après. 20 I.4.2 Séquences des oligonucléotides de construction du fragment hybride de quantification : La séquence du fragment nucléotidique hybride est divisée en 6 fragments d'oligonucleotides consécutifs décrits à l'Annexe 3. Afin d'assurer la mise en continuité des oligonucléotides adjacents, 10 25 nucléotides complémentaires de l'extrémité 3' sur l'oligonucléotide d'amont sont ajoutés à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide d'aval. Les tailles des 6 séquences oligonucléotidiques s'échelonnent de 155 à 172 nucléotides. Les oligonucléotides consécutifs sont alternativement en séquence directe et 2909099 24 reverse. Ainsi, les oligonucléotides 1, 3 et 5 sont utilisés sous forme de séquence directe, alors que les oligonucléotides 2, 4 et 6 sont utilisés en séquence reverse. Des amorces dites de construction (sens et antisens) dont les séquences correspondent à celles des 20 nucléotides en 5' et 3' du 5 fragment hybride de quantification vont être synthétisées. Les oligonucléotides et les amorces sont synthétisés par Eurogentec . I.4.3 Construction du fragment hybride : Le fragment nucléotidique double brin est construit par réaction d'amplification grâce à la complémentarité des extrémités de deux 10 oligonucléotides adjacents. Deux PCR successives sont nécessaires. I.4.3.1 Première PCR : Elle permet l'hybridation des oligonucléotides par leurs extrémités et une élongation partielle quand elle est compatible avec l'activité de la Taq polymérase. Les 6 oligonucléotides sont introduits en équimolarité (0,2 15 mMol), avec du tampon de polymérase 1 X MgC12 (1,5 mMol), les dNTP (0,2 mMol), 0,2 l de Taq Roche (Roche ) à 5 UI/ l, dans un volume réactionnel de 50 l. Le programme d'amplification est : 95 C 2min, suivi de 40 cycles comportant 94 C 30 sec (dénaturation), 37 C 1 min (hybridation), 72 C 1 min 30 sec (élongation). 20 L4.3.2 Deuxième PCR : Elle permet d'obtenir un fragment de PCR contenant bout à bout les motifs oligonuléotides attendus (Annexe 4). Un l de produit d'amplification de la première PCR est ajouté au mélange réactionnel suivant : tampon de polymérase Hotstar (Qiagen ) 1 X MgCl, (1,5 mMol), 25 les dNTP (0,2 mMol), 0,2 ti de Hotstar (Qiagen ) à 5 UI/ l, 0,2 mMol des amorces de construction sens et anti-sens. Le programme de PCR est : 95 C 15 min, suivi de 95 C 30s, 58 C 45s, 72 C 2min 40 cycles, 72 C 5min. Le fragment de PCR obtenu est analysé sur gel BET Agarose à 1,5% dans du tampon TBE 0,5X. Si la taille du fragment est conforme à la taille 2909099 25 attendue, il est purifié en utilisant le kit QIAquick PCR Purification Kit 250 PCR Qiakit (Qiagen ). I.4.3.3 Clonage de l'insert Deux 111 du fragment précédemment obtenu sont introduits dans un 5 mélange réactionnel de ligation contenant 51.tl de tampon de ligase, 14 de ligase et l 1 de plasmide PGEM (kit pGEM -T Easy Vector System 2 Promega , Madison, Wiconsin, USA) linéarisé et déphosphorylé. Le volume final est de 1O1.11. Le produit de ligation est incubé à 15 C pendant une nuit. Sept l du produit de ligation sont mélangés à 50 l de cellules 10 compétentes (Escherichia coli JM 109) maintenues pendant 20 minutes dans la glace puis incubées pendant 1 minute à 42 C. Après ajout de 950 tl de LB broth (USB , Cleveland, Ohio, USA), et incubation pendant 1h30 à 37 C, 500 et 250 pi de ce milieu de culture sont étalés sur 2 boites de Pétri contenant du LB agar (USB ) avec 100 g/ml d'Ampicilline. Les boites 15 sont incubées pendant une nuit à 37 C. Les colonies recombinantes sont déposées à la fois dans 504 d'eau distillée stérile et sur une boite de LB agar Ampicilline. Les colonies d'E. coll. recombinantes sont prélevées pour être analysées par PCR : 5 t1 de suspension bactérienne dans l'eau distillée, le 20 couple d'amorces M13 (10 pm/ l) et le milieu réactionnel de PCR précédemment décrit. Le programme de PCR est identique à celui utilisé pour la deuxième étape de la construction. Les produits de PCR obtenus sont analysés sur gel d'Agarose à 1,5% dans du tampon TBE 0,5 X. Les fragments de la taille attendue sont purifiés en utilisant le kit Qiaquick 25 PCR Purification Kit 250 Qiakit (Qiagen ). Ils sont ensuite séquencés en utilisant le Big Dye Terminator V1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems , Warrington, UK), 3,2 pmol/ l d'amorces \/I13 sens et antisens chromatographiées sur le séquenceur ABI PRIM 3100 (Applied Biosystems ). La séquence obtenue est comparée à la séquence du 30 fragment attendu en utilisant les programmes auto assembler et Sequence Navigator (Applied Biosystems ). Un des clones recombinants, conforme à 2909099 26 la séquence attendue, va être produit en grande quantité dans 100 ml de LB BROTH Ampicilline et purifié selon le protocole High Speed Plasmid Midi Kit (Qiagen ). Le plasmide purifié est ensuite stocké à -200C. La souche recombinante sélectionnée est congelée à ù 80 C. 5 I.4.3.4 Obtention de la gamme plasmidique Sa concentration est déterminée par la mesure de la densité optique à 260 nm. Soit par exemple : 0,38 pour la solution initiale. 1 unité DO correspond à 50 l/ml : 0,38 x 50 = 19 g/ml = 19. 10-6 g/ml de plasmide dans la solution initiale. La taille du plasmide = taille du pGEM -T Easy 10 + taille du fragment = 3015 + 931 = 4334 pb, soit 8668 bases. La masse molaire d'un nucléotide est de 330 Da (g/mol). La masse molaire du plasmide sera de 8668 x 330 = 2,860.106 g/mol. La concentration du plasmide sera en mol/ml, soit 19.10-6 / 2,860.106 = 6,64.10-'2 mol/ml. Multiplié par le nombre d'Avogadro, on obtient le nombre de copies de 15 plasmide pour 1 ml de solution, soit : 6,64.10'2 x 6,023. 10`; = 40.10" copies/ml soit 2.101 copies/5 l. Une première dilution de la solution plasmidique initiale au 1/2500' permet d'ajuster la concentration au premier palier de la gamme plasmidique, soit le point 10' copies/5 l de solution plasmidique. Une cascade de dilution par pas de 10 permet de 20 créer les paliers successifs de la gamme (de 10' copies à 1 copie pour 51.11 de solution). I.S. Analyse des échantillons I.5.1 PCR quantitative en temps réel On réalise les réactions de quantification par PCR en temps réel sur 25 les extraits d'ADN des prélèvements vaginaux. Au sein de chaque plaque de réaction, est introduit: 4 contrôles négatifs (NTC), la gamme plasmidique d'étalonnage (de 10' à 1 copie par puits), 24 échantillons à tester, purs et dilués au 1/10' et au 1/100' pour rechercher des inhibiteurs. Les contrôles négatifs ainsi que les points de la gamme plasmique sont testés en double. 30 Pour l'amplification et la quantification des 8 micro-organismes ainsi que 2909099 27 de l'albumine humaine, on réalise 4 plaques de PCR en double fluorescence et une en simple fluorescence. Pour la préparation du mélange réactionnel, on utilise le kit Quantitect Probe PCR Kit (Qiagen ) contenant le mélange réactionnel 2X associant le tampon de la Taq polymérase et la Taq 5 polymérase (Hotstar), les dNTP et dUTP. A ce milieu réactionnel, on ajoute les amorces sens et anti-sens et les sondes nécessaires à la réalisation de la PCR en simple ou en double fluorescence selon les conditions expérimentales rapportées décrites à l'Annexe 6, les prises d'essai des échantillons dilués ou non et des points de gamme plasmidique 10 sont de5 l et 0,25 l d'UDG (Uracil DNA glycosylase à 100 Unités, Sigma-Aldrich, Lyon, France) est ajouté pour un volume réactionnel final de 25 l. Les réactions de PCR sont réalisées sur l'appareil Stratagene MX 3000P (La Jolla, California). Le programme d'amplification est le suivant: 2 minutes à 50 C, 15 minutes à 95 C, suivi de 45 cycles de PCR comportant 15 la dénaturation à 95 C durant 30 secondes puis la phase d'hybridation et d'élongation à 60 C durant 1 minute. I.5.2 Calcul de la charge bactérienne Pour chaque prélèvement vaginal et pour chaque microorganisme, afin d'assurer la comparabilité des échantillons, la charge bactérienne est 20 définie de la façon suivante. La quantification en nombre de copies d'ADN de chaque micro-organisme pour 5 l d'extrait d'ADN est rapportée en nombre de bactéries pour 1 ml d'échantillon initial. Il faut tenir compte du volume d'élution de l'ADN (100 l), du volume du milieu de transport par échantillon initial (200 l) et du fait que le gène quantifié est un gène 25 unique. La valeur obtenue pour chaque microorganisme en nombre de copies pour 5 l d'extrait est multipliée par 102 pour obtenir une concentration en nombre de bactéries par ml. I.5.3 Analyse statistique L'analyse statistique des données de la quantification bactérienne par 30 PCR en temps réel est réalisée en utilisant le test de Wilcoxon et le test de Mann-Whitney pour un le degré de signification p _10s/ml et/ou d'une quantification de G. vaginalis ?109/ml a une sensibilité de 95%, une spécificité de 99%, une valeur prédictive positive (VPP) de 95% et une valeur prédictive négative (VPN) de 99%. II.3.3.4 Caractérisation moléculaire des flores intermédiaires 15 L'application aux FI du score de Nugent (Figure 2; des critères moléculaires d'identification de la VB précédemment définis par une quantification d'A. vaginae ?108/ml et/ou d'une quantification de G. vaginalis > 10`'/ml, permet de caractériser 25 flores (57%) présentant un profil de VB (Figure 3) et 19 flores (43%) présentant un profil de FN 20 (Figure 4). II.3.3.5 Suivi bactériologique Huit femmes présentant une VB ou une FI par le score de Nugent ont bénéficié d'un suivi (Tableau 7). La quantification moléculaire permet la mise en évidence de la récidive de la VB non identifiée par le score de 25 Nugent pour le sujet 1. Elle permet de confirmer la disparition de la VB pour les sujets 7 et 8. Elle caractérise comme VB les FI du score de Nugent persistantes à plus d'un mois d'intervalle pour les sujets 2 et 5. Enfin, elle confirme le caractère normal du suivi de la flore vaginale du sujet 3. III DISCUSSION 2909099 32 La répartition des flores vaginales en FN (71%), VB (10%) et FI (19%) selon le score de Nugent est conforme à celles rapportées dans la littérature en France [Goffinet F, EJOGR 2003], en Europe [Guise JM, AMJPM 2001] et aux Etats-Unis [Delaney ML, 0G 2001]. L'originalité de 5 la présente invention est d'avoir établi un outil rationnel d'identification de la flore vaginale en associant la technique de détection spécifique par PCR en temps réel et la quantification relative par un plasmide d'étalonnage. Le résultat le plus surprenant concerne A. vaginae. Cette bactérie a été identifiée pour la première fois en 1999 par amplification et séquençage 10 de l'ARN 16S à partir d'un prélèvement vaginal de sujet sain [Rodriguez JM, IJSB 1999]. En 2003, A. vaginae a été isolée par culture dans un prélèvement d'abcès tubo-ovarien, laissant supposer un rôle pathogène de la bactérie [Geissdorfer W, JCM 2003]. En 2004, une approche d'amplification de l'ARN 16S r couplée à des techniques de clonage a 15 permis la mise en évidence de la bactérie dans des prélèvements obtenus en per opératoire chez des patientes présentant une salpingite [Hebb JK, JID 2004]. Selon la présente invention, cette bactérie est d'identification fréquente dans 19 des 20 VB (95%) et 115 des 167 FN (69%). Le critère le plus discriminant pour le diagnostic des VB et des FN est une 20 concentration d'A. vaginae ? 10s/ml avec une sensibilité de 90% (18 cas sur 20 VB) et une spécificité de 99% (1 cas sur 167 FN). Depuis 2004, 4 études basées sur diverses techniques moléculaires ont mis en évidence une possible association entre A. vaginae et la VB mais aucune ne prenait en compte de critères de quantification rigoureux. Tout 25 d'abord, une approche par PCR ciblant l'ARN 16S r suivi d'une migration sur gel a permis de mettre en évidence A. vaginae parmi seulement 12 VB sur 20 (60%) et 2 FN sur 24 (8,3%) [Ferris MJ, BMCID 2004]. Par PCR ciblant spécifiquement le gène de l'ARN 16S r d'A. vaginae, l'ADN de la bactérie a été retrouvée parmi 7 VB sur 9 (77,8%) et 22 FN sur 112 30 (19,6%) [Verhelst R, BMCM 2004]. En appliquant la même technique, l'ADN d'A. vaginae a été mis en évidence parmi 19 VB sur 22 (86,4%) et 59 FN sur 403 (14,7%) [Verhelst R, BMCM 2005]. Enfin par des techniques 2909099 33 d'amplification, clonage et séquençage, l'ADN d'A. vaginae a été observé chez 26 VB sur 27 (96%) et 9 FN sur 46 (19,5%) [Fredricks DN, NEJM 2005]. Aucun de ces travaux n'a quantifié l'ADN d'A. vaginae, ce qui est essentiel dans les vaginoses bactériennes où la concentration des bactéries 5 est un élément important du diagnostic. A. vaginae fait défaut dans le score de Nugent malgré sa place capitale dans les anomalies de la flore vaginale. Son identification par des critères morphologiques est peu adaptée. Sa morphologie variable sous forme d'un petit coccobacille (0.6-0.9 m) à Gram positif parfois regroupé 10 par pair ou en courte chaîne lui assure un camouflage au contact d'autres bactéries, le rendant ainsi indétectable [Verhelst R, BMCM 2004]. Sa ressemblance aux Lactobacillus sp. et aux streptocoques est donc source d'erreur d'identification [Rodriguez JM, IJSB 1999]. La description d'une association entre A. vaginae et G. vaginalis dans 15 la VB est récente, peu documentée et de portée diagnostique limitée en l'absence de quantification. Cette association est de 87,8% (8 sur 9 VB) [Verhelst R, BMCM 2004] et de 90% (20 sur 22 VB) [Zariffard MR, FEMS 2002] par PCR spécifique ciblant le gène de l'ARN 16S r d'A. vaginae et G. vaginalis. Une publication récente fait état de la présence d'A. vaginae dans 20 les vaginoses bactériennes par une méthode semi-quantitative [Bradshaw CS, JID 2006]. Selon la présente invention, cette association d'A. vaginae et G. vaginalis est de 90% (18 sur 20 VB) mais la prise en compte de la quantification d'A. vaginae ?l 08/mL et/ou de G. vaginalis 109/mL avec 25 une sensibilité de 95%,/0 (19 sur 20 VB) présente les meilleurs critères de spécificité (99%), de VPP (95%) et de VPN (99%) jamais obtenu pour l'identification de la VB. En conséquence, on utilise une concentration d'A. vaginae >_10'/mL et/ou une concentration de G. vaginalis >109/mL pour le diagnostic moléculaire de la VB. 30 Les résultats selon la présente invention suggèrent que la quantification de G. vaginalis est moins discriminante que celle d'A. vaginae. 2909099 34 Pour les Lactobacillus sp., leur diminution dans la VB objectivée par le score de Nugent est confirmée par ces résultats. En effet, si on considère une concentration de Lactobacillus sp. inférieure ou égale à 10'/ml, la sensibilité pour diagnostiquer une VB est de 100% et la spécificité de 44%. D'autre 5 part, si nous considérons une concentration de Lactobacillus rp. supérieure ou égale à 108/ml, nous observons une spécificité de 100% pour mettre en évidence une flore vaginale normale. Pour les Mobiluncus spp., malgré la place qui leur est ac:cordée par le score de Nugent, aucune PCR n'est positive pour M. mulieris. Seule M. 10 curtisii est associée à la VB. Cependant, son utilisation comme possible critère diagnostique moléculaire reste mineure. Les mycoplasmes génitaux ne sont pas pris en compte par le score de Nugent. Ils restent identifiables par culture ou biologie moléculaire. L'étude par culture de 445 VB et 2729 FN, identifiait M. hominis comme 15 significativement associé à la VB avec une prévalence de 29% (129 VB) et U. urealyticum comme non associé à la VB malgré une prévalence de 56% (253 VB) [Thorsen P, AJOG 1998]. Une étude sur 203 VB et 203 FN ciblant M. hominis par PCR en temps réel, suggérait une implication de M. hominis dans la VB [Zariffard MR, FEMS 2002]. Cependant, une étude 20 identique sur un effectif plus restreint (5 VB et 16 FN) ne mettait pas en évidence ce lien [Sha 13E, JCM 2005]. Selon la présente invention, seul M. hominis est corrélé à la VB mais cette corrélation est insuffisante pour proposer ce microorganisme comme critère diagnostique de la VB. Les résultats selon la présente invention ne mettent pas en évidence 25 de lien entre la VB et C. albicans comme le montre les données de la littérature [Thorsen P, AJOG 1998]. Ceci est intéressant car si le portage génital à Candida albicans ne majore pas le risque de prématurité [Cotch MF, AJOG 1998], une étude récente [Kiss H, BMJ 2004] a montré une réduction du taux de prématurité par le traitement du portage génital à C. albicans. 30 L'originalité de la présente invention est de pouvoir proposer pour la première fois un outil diagnostic de la VB basé sur la quantification d'A. 2909099 vaginae et G. vaginalis. Les critères retenus actuellement associent une concentration d'A. vaginae 108/mL et/ou une concentration de G. vaginalis >_109/mL. Ce test diagnostique a une sensibilité de 95% une spécificité de 99%, une VPP de 95% et une VPN de 99%. Plusieurs méthodes de lecture 5 des résultats de PCR, notamment celles par calcul de ratio et de produits de concentrations bactériennes, ont été testées pour permettre d'identifier la méthode la plus pertinente- L'une des applications la plus troublante de l'outil de biologie moléculaire selon la présente invention est celle réalisée sur la FI du score 10 de Nugent. Nous savons que la FI, uniquement identifiée par le score de Nugent, constitue une fraction non négligeable (8% à 22%) de la totalité des flores identifiées par ce dernier [Guerra B, EJOGRB 2006 ; Goffinet F, EJOGRB 2003 ; Delaney ML, 0G 2001 ; Libman MD, DMID 2006 ; Larsson PG, STI 2004] et qu'elle est associée à de nombreuses incertitudes. 15 En effet, son interprétation est sujet à caution car nous ne savons pas à quelle réalité microbiologique cette flore intermédiaire correspond. Certains la considèrent comme une flore de transition entre FN et VB [Ison CA, STI 2002 ; Guerra B, EJOGRB 2006 ; Goffinet F, EJOGRB 2003 ;Ugwumadu A, Lancet 2003 ; Carey JC, NEJM 2000]. D'autres la 20 considèrent comme un groupe hétérogène regroupant des FN et des VB [Ison CA, STI 2002 ; Libman MD, DMID 2006 ; Larsson PG, STI 2004]. Des tentatives de caractérisation de la FI en FN ou VB sont rapportées dans la littérature. Par l'application des critères d'Amsel à 13 FI, 12 FI sont reclassées en FN et 1 en VB [Ison CA, STI 2002 ]. Par la coloration 25 de Kopeloff pour l'établissement du score de Nugent, 69 des 232 FI (30%) sont reclassés en FN ou VB [Libman MD, DMID 2006 ]. Dans cette coloration, la fuchsine remplace la safranine de la coloration de Gram pour permettre une meilleure identification des bactéries à Gram négatif. Enfin, la standardisation des critères du score de Nugent en fonction de la surface 30 du champ optique de l'appareil microscopique utilisé, a permis de reclasser 458 des 1176 FI (39%) en FN ou VB [Larsson PG, STI 2004]. 2909099 36 L'application aux FI des critères moléculaires selon la présente invention associant à la VB une concentration d'A. vaginae ?l 08/ml et/ou d'une concentration de G. vaginalis ?l0'/ml permettent d'envisager une caractérisation rationnelle de cette FI. Ainsi, 24 FI (57%) présentent un 5 profil similaire à celui des VB. Les dix-neuf autres FI (43%) présentent un profil similaire à celui des FN. Ces résultats laissent donc suggérer d'une part le caractère hétérogène des FI et d'autre part un défaut de sensibilité du score de Nugent pour diagnostiquer plus de la moitié des VB. Ces données confirment donc les limites du score de Nugent. 10 L'étiologie de la VB reste encore bien mystérieuse mais on dispose pour la première fois d'un outil de quantification objectif permettant une approche diagnostique rationnelle de la VB. Le caractère singulier de la présente invention est d'avoir montré à la fois la position capitale d'A. vaginae dans la VB mais aussi son utilisation par quantification comme 15 critère diagnostique principal de la VB. On comprend d'autant mieux le problème thérapeutique soulevé par le caractère relativement résistant d'A. vaginae au métronidazole pouvant expliquer en partie la fréquence des récidives après traitement [ANAES 2001 ; Ferris MJ , BMC ID 2004 ; Secor AM, CNP 1997 ; Geissdorfer W, JCM 2003 ; De Backer E, BMC ID 2006]. 20 Les critères moléculaires retenus pour le diagnostic de la VB associent une concentration d'A. vaginae ?108/ml et/ou d'une concentration de G. vaginalis ? 10'/ml. Cet outil moléculaire permet le diagnostic de la VB et la caractérisation en VB d'une fraction de la FI. Nous pouvons aussi envisager notre outil moléculaire comme une méthode diagnostique de la 25 VB et de suivi pour l'évaluation la prise en charge thérapeutique de la VB durant la grossesse. 2909099 37 Annexe 1. Cible moléculaire et séquence nucléotidique du couple d'amorces et de la sonde pour chaque microorganisme étudié. Dans le tableau ci-dessous, les séquences des amorces sens et sondes sont écrites dans le sens 5'->3', et les séquences des amorces 5 anti-sens sont écrites dans le sens 5'->3' complémentaire inversé Micro- Cibles Séquences nucléotidiques organismes M. curtisii Cpn 60 Amorce sens : TGGAAAAGGTGGGTCAAGAG Amorce anti-sens AAACGCATACCTTCGGTGAC Sonde : FAM- GGCGTCATCACCGTGGAAGAA-TAMRA M. mulieris ARN 16 S Amorce sens : ribosomal ATGGATATGCGTGTGGATGG Amorce anti-sens CCAGGCATGTAAGCCCAAAC Sonde : VIC- TTTTGGGTGGGGGCGCTA-TAMRA G. vaginales Cpn 60 Amorce sens : CGCATCTGCTAAGGATGTTG Amorce anti-sens : CAGCAATCTTTTCGCCAACT Sonde :VIC- TGCAACTATTTCTGCAGCAGATCC-TAMRA Lactobadllus 3p. Tif Amorce sens : TACATCCCAACTCCAGAACG Amorce anti-sens AAGCAACAGTACCACGACCA Sonde : FAM- TGACAAGCCATTCTTAATGCCA- TAMRA U. urealyticum Uréase Amorce sens : ACTGGTGACCGTCCTATCCA Amorce anti-sens : CCTGATGGAATATCGAAACGA Sonde:VIC- TGAAAAAGGAAACGAAGAC1\ÀAGA-TAMRA 2909099 38 M. hominis fis Y Amorce sens : A 1` 1 GAI' l'GCTGCAGGTGATACA Amorce and-sens GGTGTTACAATATCAGCCCCAAC Sonde : FAM- AGAGCAGCGGCAG"1"lGAA-TAMRA A. vaginae ARN 16S Amorce sens : ribosomal CCCTATCCGCTCCTGATACC Amorce anti-sens C CAA.ATATCTGC GCA 1`1 `1CA Sonde :VIC-GCAGGC1`1GAGTCTGGTAGGTAGGGGA- TAMRA C. albicans Topoisoméras Amorce sens : e3 CAACGCCAACGAAGACAAG Amorce anti-sens C CA GC'I `l' l'GTTTGCATCAA C Sonde : FAM- AAAGCC GATGGTAGTAGAAAACTGC- TAMRA Albumine Exon 12 Amorce sens : humaine GCTGTCATCTC'1"l'GTGGGCTGT Amorce and-sens : AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC Sonde : FAM- CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-TAMRA 2909099 39 Annexe 2. Séquence théorique globale de l'insert de 939 paires de bases. Séquences en gras = Séquences des amorces sens et anti-sens Séquences en souligné = Séquences des sondes spécifiques 5 Séquences en noir = Séquences intercalentes Séquences entre parenthèses= Séquences du site de restriction Xhol Seq.n 18= 5'GCCATGGAAAAGGTGGGTCAAGAGGGCGTCATCA CCGTGGAAGAACATCGTCTCGAGTTAAGGAGCCTCGAAGTCACCGA AGGTATGCGTTTCATTATGGATATGCGTGTGGATGGATTA(CTCGA 10 G)CTGCCTGTTTTGGGTGGGGGCGCTATCGGGGTTTGGGCTTACAT GCCTGGCCCTCGCATCTGCTAAGGATGTTGAAACATCG,T(CTCGAG) TTAAGGCTACTGCAACTATTTCTGCAGCAGATCCTGAAGTTGGCGA AAAGATTGCTGAATACATCCCAACTCCAGAACGTGATACTGACAAG CCATTCTTAATGCCAGTTGAAGACGTATTTACTATCACTGGTCGTGG 15 TACTGTTGCTTCTATACTGGTGACCGTCCTATCCAAGTTGGATCAC ATCGT(CTCGAG)TTAAGAACAAATAGTGCATTAGTATTCTTTGATGA AAAAGGAAACGAAGACAAAGAACGTAAAGTTGCTTATGGACGTCG TTTCGATATTCCATCAGGTAATTGATTGCTGCAGGTGATACATTTA GAGCAGCGGCAGTTGAACAATTCATCGT(CTCGAG)TTAAGGAGTTG 20 GGGCTGATATTGTAACACCAAACCCCTATCCGCTCCTGATACCGGC AGGCTTGAGTCTGGTAGGGGAAGATGGAATTCCAAGT(CTCGAG)G TGAAATGCGCAGATATTTGGAAGCCAACGCCAACGAAGACAAGGCA CTTCAAAAAGCCGATGGTAGTAGAAAACTGCGACATCGT(CTCGAG) TTAAGTTGGTTGATGCAAACAAAGCTGGTAGTTGCTGTCATCTCTT 25 GTGGGCTGTAATCATCGT(CTCGAG)TTAAGAGTAATATTGCAAAAC CTGTCATGCCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGA TGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTTGG-3' 2909099 Annexe 3. Séquences des 6 oligonucléotides et des amorces de construction de l'insert. -Oligonucléotide 1 sens, 178 nucléotides: séquences de M. curtisii et M. mulieris 5 Seq. n 19=5'GCCATGGAAAAGGTGGGTCAAGAGGGCGTCATC ACCGTGGAAGAACATCGTCTCGAGTTAAGGAGCCTCGAAGTCACCG AAGGTATGCGTTTCATTATGGATATGCGTGTGGATGGATTACTCGA GCTGCCTGTTTTGGGTGGGGGCGCTATCGGGGTTTGGGCTTACAT GCCTGGCC3' 10 -Oligonucléotide 2 anti-sens, 183 nucléotides: G.. vaginalis et Lactobacillus sp. Seq. n 20=5'CGACCAGTGATAGTAAATACGTCTTCAACTGGCAT TAAGAATGGCTTGTCAGTATCACGTTCTGGAGTTGGGATGTATTCA GCAATCTTTTCGCCAACTTCAGGATCTGCTGCAGAAATA GTTGCAGT 15 AGCCTTAACTCGAGACGATGTTTCAACATCCTTAGCAGATGCGAGG GCCAGGCAT3' -Oligonucléotide 3 sens, 145 nucléotides: U. urealyticum Seq. n 21=5'TCACTGGTCGTGGTACTGTTGCTTCTA,TACTGGTG ACCGTCCTATCCAAGTTGGATCACATCGTCTCGAGTTAAGAACAAAT 20 AGTGCATTAGTATTCTTTGATGAAAAAGGAAACGAAGACAAAGAAC GTAAAGTTGCTTATGGA3' -Oligonucléotide 4 anti-sens., 188 nucléotides: M. hominis Seq. n 22=5'CTTGGAATTCCATCTTCCCCTACCAGACTCAAGCC TGCCGGTATCAGGAGCGGATAGGGGTTTGGTGTTACAATATCAGCC 25 CCAACTCCTTAACTCGAGACGATGAATTGTTCAACTGCCGCTGCTCT AAATGTATCACCTGCAGCAATCAATTACCTGATGGAATATCGAAACG ACGTCCATAAGCA3' -Oligonucléotide 5 sens, 152 nucléotides: A. vaginae et C. albicans 2909099 41 Seq. n 23=5'GAATTCCAAGTCTCGAGGTGAAATGCGCAGATAT TTGGAAGCCAACGCCAACGAAGACAAGGCACTTCAAAAAGCCGATG GTAGTAGAAAACTGCGACATCGTCTCGAGTTAAGTTGGTTGATGCA AACAAAGCTGGTAGTTGCTGTCAT3' 5 - Oligonucléotide 6 anti-sens, 147 nucléotides: albumine humaine Seq. n 24=5'CCAAACTCATGGGAGCTGCTGGTTCTCTTTCACTG ACATCTGCAAAGACAACAATGCCAGGGAGAGATTTGTGTGGGCATG ACAGGTTTTGCAATATTACTCTTAACTCGAGACGATGATTACAGCCC ACAAGAGATGACAGCAA3' 10 -Amorces de construction pour le plasmide recombinant avec le fragment de 939 paires de bases - Sens Seq. n 25=5'GCCATGGAAAAGGTGGGTC3' Anti-sens Seq. n 28=5'CCAAACTCATGGGAGCTGCT3' Annexe 4. Schémas théoriques de construction d'un insert par double PCR. Le principe de construction d'un insert avec 6 oligonucléotides. Schéma de construction du plasmide Oligo 1 Oligo 2 Oligo 3 Oligo 4 Oligo 5 Oligo 6 n Hybridation des oligonucléotides Elongation I l --- ------------------- I Synthèse du fragment sens Synthèse du fragment attendu ç 4- - Annexe 5. Quantité de sonde et d'amorces sens et anti-sens nécessaire à la réaction d'amplification de 5 l d'extrait d'ADN pour chaque micro-organisme et l'albumine humaine. Micro-organismes Sonde Amorce sens Amorce anti-sens (quantité exprimée en par puits) (quantité exprimée en l par puits) (quantité exprimée en pl par puits) M. curtisii 0,25 0,5 0,5 M. mulieris 0,25 0,5 0,5 G. vaginalis 0,25 0,5 0,5 Lactobadllus sp. 0,25 0,5 0,5 U. urealyticum 0,25 0,5 0,5 M. hominis 0,125 0,125 0,125 A. vaginae 0,25 0,5 0,5 C. albicans 0,25 0,5 0, 5 Albumine humaine 0,125 0,125 0,125 5 Tableau. 1 Résultats de la culture bactérienne pour les 3 types de flore identifiés par le score de Nugent. Culture Flore normale Flore intermédiaire Vaginose Total bactérienne Micro-organisme recherché Nombre de prélèvements positifs sur nombre de prélèvements Testés ( ,%) G. vaginalis 6 sur 167 6 sur 44 15 sur 20 27 sur 231 (3,6%) (13,6%) (75%) (12%) M. hominis et U. urealyticum 16 sur 163 6 sur 39 4 sur 16 26 sur 2 (9,8%) (15%) (25%) (9%) C. albicans 30 sur 167 17 sur 44 3 sur 20 50 sur 231 (18%) (38,6%) (15%) (21,6%) Streptococcus agalactiae 5 sur 167 1 sur 44 0 sur 20 6 sur 231 (3%) (2%) (2,6%) 2909099 Tableau 2. Détection de la présence des 8 microorganismes par PCR en temps réel pour les 231 échantillons. Micro-organismes Nombre et pourcentage de PCR positive ciblés par PCR (seuil de positivité 103/rnl) Lactobacillus sp. 177 (77%) G. vaginalis 131 (57%) A. vaginae 172 (74%) M. mulieris 1 (0,4%) M. curtisii 41 (18%) M. hominis 47 (20%) U. urealyticum 32 (14%) C. albicans 60 (26%) Tableau 3. Analyse des concentrations bactériennes médianes obtenues par PCR quantitative pour les vaginoses bactériennes et les flores vaginales normales déterminées par le score de Nugent. Micro-organismes 20 vaginoses bactériennes 167 flores normales P value Concentration bactérienne médiane/mi Test statistique de Mann-Whitney (concentration minimale et maximale) Lactohacil/us 3p. 2,7.10'- 103-8.107) 5,6.10' ( 103 116 (69%) 19 (95%) 0,95 0,31 0,14 0,98 > 104 65 (39%) 19 (95%) 0,95 0,61 0,23 0,99 105 25 (15%) 19 (95%) 0,95 0,85 0,43 0,99 > 106 13 (7,8%) 19 (95%) 0,95 0,92 0,59 0,99 > 107 6 (3,6%) 19 (95%) 0,95 0,96 0,76 0,99 > 108 1 (0,6%) 18 (90%) 0,90 0,99 0,95 0,99 > 109 0 13 (65%) 0,65 1,00 1,00 0,96 G. vaginalis > 103 79 (47%) 19 (95%) 0,95 0,53 0,19 0,99 > 104 59 (35%) 19 (95%) 0,95 0,65 0,24 0,99 > 105 39 (23%) 19 (95%) 0,95 0,77 0,33 0,99 > 106 25 (15%) 19 (95%) 0,95 0,85 0,43 0,99 107 12 (7%) 18 (90%) 0,90 0,93 0,60 0,99 > 108 7 (4%) 16 (80%) 0,80 0,96 0,70 0,98 > 109 0 10 (50%) 0,50 1,00 1,00 0,94 M. curtisii > 103 21 (12,6%) 13 (65%) 0,65 0,87 0,38 0,95 > 104 2 (1,2%) 9 (45%) 0,45 0,99 0,82 0,94 105 0 9 (45%) 0,45 1,00 1,00 0,94 > _ 106 0 1 (5%) 0,05 1,00 1,00 0,90 M. hominis > 103 22 (13%) 10 (50%) 0,50 0,87 0,31 0,94 > 104 13 (7,8%) 7 (35%) 0,35 0,92 0,35 0,92 > 105 6 (3,6%) 7 (35%) 0,35 0,96 0,54 0,93 > 106 2 (1,2%) 6 (30%) 0,30 0,99 0,75 0,92 107 2 (1,2%) 6 (30%) 0,30 0,99 0,75 0,92 > 108 2 (1,2%) 1 (5 /o) 0,05 0,99 0,33 0,90 109 1 (0,6%) 0 0 0,99 0 0,89 U. ureatuur > 103 22 (13 ,/ ) 5 (25 ,/ ) 0,25 0,87 0,18 0,91 > 104 17 (10%) 5 (25%) 0,25 0,90 0,23 0,91 105 13 (7,8%) 3 (15%) 0,15 0,92 0,19 0,90 >_ 106 7 (4,2%) 0 0 0,96 0 0,89 Lactobacillus 103 141 (84%) 12 (60%) 0,60 0,16 0, 08 0,76 spp. > 104 134 (80%) 7 (35%) 0,35 0,20 0,05 0,72 105 116 (69%) 4 (20%) 0,20 0,30 0,03 0,76 > 106 106 (63%) 4 (20%) 0,20 0,36 0,04 0,79 > 107 97 (58%) 3 (15%) 0,15 0,42 0,03 0,80 > 108 74 (44%) 0 0 0,55 0 1 > 109 13 (7,8%) 0 0 0,92 0 1 *Nbre de FN et nbre de VB identifiées sur 167 FN testées (%) et 20 VB testées (%)*Nbre de FN et nbre de VB identifiées sur 167 FN testées (%) et 20 VB testées (%) respectivement. **Sensibilité et Spécificité du seuil de quantification pour l'identification des VB ***VPP valeur prédictive positive et VPN valeur prédictive négative Tableau 5. Impact de l'association des critères de quantification par PCR en temps réel d'A. vaginae et G. vaginalis pour l'identification des vaginoses bactériennes. Le groupe de flores normales et des vaginoses bactériennes définies par le score de Nugent sont utilisés comme référence. Micro-organismes Seuil de quantifica- don FN VB identifiées* Sensibilité**o Spécificité** VPP*** VPN*** associés de G. vaginales identifiées* (bactéries /ml) A. vaginae 107 et G. 106 5 (3%) 18 (90%) 0,90 0,97 0,78 0,99 vaginales 107 5 (3 /ô) 17(85%) 0,85 0,97 0,77 0,98 > 108 2 (1,2%) 15 (75%) 0,75 0,99 0,88 0,97 > 109 0 9 (45%) 0,45 1 1 0,94 A. vaginae ? 108 et G. > 106 1 (0,6%) 17 (85%) 0,85 0,99 0,94 0,98 vaginalis > 107 1 (0,6%) 17 (85%) 0,85 0,99 0,94 0,98 > 108 0 15 (75%) 0,75 1 1 0,97 > 109 0 9 (45%) 0,45 1 1 0,94 A. vaginae ? 107 > 106 26(15%) 20 (100%) 1 0,84 0,43 1 et/ou G. paginons 107 13 (7,8%) 20(100%) 1 0,92 0,61 1 108 11 (6,6%) 20 (100%) 1 0,93 0,64 1 109 6 (3,6%) 20 (100%) 1 0,96 0,77 1 A. vaginae 108 > 106 25(15%) 20 (100%) 1 0,85 0,44 1 et/ou G. paginons > 107 12(7,2%) 19 (95%) 0,95 0,93 0,61 0,99 > 108 7(4,2%) 19(95%) 0,95 0,96 0,73 0,99 > 109 1 19(95%) 0,95 0,99 0,95 0,99 *Nbre de FN et nbre de VB identifiées sur 167 FN testées (%) et 20 VB testées (%)*Nbre de FN et nbre de VB identifiées sur 167 FN testées (%) et 20 VB testées (%) respectivement. **Sensibilité et Spécificité du seuil de quantification pour l'identification des VB ***VPP valeur prédictive positive et VPN valeur prédictive négative Tableau 6. Suivis bactériologiques de 8 patientes présentant une vaginose bactérienne ou une flore intermédiaire par score de Nugent. Correspondance entre la classification par score de Nugent et l'identification de la VB par critères moléculaires. Sujet Terme du Classification par Traitement BV par critères Terme de Poids nouveau 1 prélèvement Score de Nugent moléculaires l'accouchement né (gramme) vaginal VB 24 SA FN 28 SA FN 38 SA Oui oui 39 SA 3420 oui _ 2 27 SA FI oui 40 SA 3090 39 SA FI oui _ 3 6 SA FN 40 SA 3490 28 SA FI 32 SA FI 4 6 SA FI oui 38 SA 3580 31 SA FN 37 SA FN 40 SA FN 5 26 SA FI oui 38 SA 2970 31 SA FI oui 6 31 SA FN oui 39 SA 2700 39 SA FI 7 25 SA VB Oui oui 37 SA 4100 29 SA FN 1 8 27 SA VB Oui oui 38 SA 2700 30 SA FN 32 SA FN 2909099 51 BIBLIOGRAPHIE ANAES. 2001. Prévention anténatale du risque infectieux bactérien anténatal. Recommandations pour les professionnels de santé. Amsel R, Totten PA, Spiegel CA, Chen KC, Eschenbach D, Holmes 5 KK. Nonspecific vaginitis. 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Méthode de diagnostic et suivi in vitro de l'état de la flore bactérienne vaginale au regard de la présence d'une vaginose bactérienne, et le cas échéant pour le suivi de son traitement thérapeutique, caractérisée en ce que l'on détermine la présence d'une vaginose bactérienne ou l'échec du traitement thérapeutique en cours si les concentrations des séquences spécifiques présents en une seule copie dans l'ADN des bactéries Atopobium vaginae et respectivement Gardnerella vaginalis, dans l'ADN extrait d'un échantillon de sécrétion vaginale de patiente, sont telles que l'une au moins des 2 conditions a) et b) suivantes est respectée : a) la concentration Ca en dit fragment d'ADN d'Atopobium vaginae est supérieure ou égale à 108 copies/ml, et b) la concentration Cg en dit fragment d'ADN de Gardnerella vaginalis est supérieure ou egale à 10' copies/ml. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on détermine une vaginose bactérienne si en outre la concentration Cl en fragment d'ADN de séquence spécifique des bactéries Lactobacillus sp. présent en une seule copie dans l'ADN des bactéries Lactobacillus sp., dans l'ADN extrait d'un échantillon de sécrétions vaginales de patiente est inférieure ou égale à 10" copies/ml, de préférence inférieure ou égale à 10' copies/ml. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'on détermine une vaginose bactérienne si lesdites concentrations sont telles que les 3 conditions suivantes sont respectées : a- concentration Ca en dit fragment d'ADN de séquence spécifique d'Atopobium vaginae supérieure ou égale à 10" copies/ml, b- concentration Cg en en dit fragment d'ADN de séquence spécifique de Gardnerella vaginalis supérieure ou égale à 10' copies/ml, et 2909099 57 c- concentration (Cl) en dit fragment d'ADN de séquence spécifique de Lactobacillus sp. inférieure ou égale à 10' copies/ml. 4. Méthode selon l'une des revendication 1 à 3, caractérisée en ce que lesdites concentrations Ca, Cg ou Cl sont déterminées par amplification 5 enzymatique de type PCR et quantification de l'ADN desdits fragments d'ADN de séquences spécifiques des bactéries respectivement Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis et le cas échéant Lactobacillus sp.. 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'on détermine lesdites concentrations de bactéries par co-amplification 10 enzymatique du type PCR desdits fragment d'ADN de séquences spécifiques respectivement desdites bactéries Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis, et le cas échéant Lactobacillus sp. contenus d'une part dans ledit ADN extrait de l'échantillon, et d'autre part dans des échantillons d'ADN synthétiques comprenant chacune desdites séquences spécifiques desdites bactéries 15 servant de standards d'étalonnage de quantification de d'ADN, lesdits fragment d'ADN de séquences spécifiques respectivement desdites bactéries Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis, et le cas échéant Lactobacillus sp. présentant une taille de 70 à 150 nucléotides de préférence de 90 à 120 nucléotides. 20 6. Méthode selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisée en ce que les détection et quantification desdits fragments amplifiés étant réalisées à l'aide de sondes marquées de séquences distinctes de celles des amorces d'amplification pour chacun desdits fragments d'ADN de séquences spécifiques respectivement desdites bactéries Atopobium vaginae, Gardnerella 25 vaginalis, et le cas échéant Lactobacillus sp.. 7. Méthode selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisée en ce qu'on réalise en outre la quantification des cellules humaines présentes dans ledit échantillon en quantifiant le nombre de copies d'un gène humain présent dans tout prélèvement biologique humain contenant des cellules. 8. Méthode selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisée en ce qu'on met en oeuvre un grand fragment synthétique d'ADN servant de 2909099 58 standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdites séquences spécifiques respectivement de chacune desdites bactéries . 9. Méthode selon la revendication 4 à 8, caractérisée en ce que 5 lesdites séquences spécifiques desdites bactéries comprennent : - pour la bactérie Atopobium vaginae: le fragment des positions 248 à 334 du gène ARN 16S ribosomal de référence Genebank AY 738658.1, - pour la bactérie Gardnerella vaginalis, le fragment des positions 981 à 1072 du gène Cpn 60 de la protéine chaperonne de 60kDa de référence 10 Genebank AF 240579.3, et - pour la bactérie Lactobacillus sp., une séquence commune aux bactéries Lactobacillus cri.ipatus, Lactobacillus jenseneii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus ineri et Lactobacillus acidophilus au sein du gène tuf codant pour le facteur d'élongation aux positions 253 à 343.du gène de référence Genebank 15 AY 562191.1. 10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que lesdites séquences spécifiques desdites bactéries sont les séquences suivantes incluant des séquences sondes (soulignées) encadrées par des séquences amorces (en gras) ou leurs séquences complémentaires: 20 - pour Atopobium vaginae: Seq. n 2 = 5'-CCTATCCGCTCCTGATACCGGCAGGCTTGAGTCT GGTAGGGGAAGATGGAATTCCAAGTGTGAAATGCGCAGATATTTGG -3' - pour Gardnerella vaginalis: 25 Seq. n 3 = 5'-GCATCTGCTAAGGATGTTGAAACATCGTTTAAGG CTACTGCAACTATTTCTGCAGCAGATCCTGAAGTTGGCGAAAAGATT GCTG-3' - pour Lactobacillus sp. 2909099 59 Seq. n 4 = 5'-TACATCCCAACTCCAGAACGTGATACTGACAAGCC ATTCTTAATGCAGTTGAAGACGTATTTACTATCACTGGTCGTGGTAC TGTTGCTT-3' 11. Méthode selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisée en 5 ce qu'on réalise en outre la quantification de l'ADN humain contenu dans ledit échantillon, et ledit grand fragment d'ADN comprend en outre une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester telle qu'une séquence spécifique de l'albumine. 12 Méthode selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisée en 10 ce que ladite séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester comprend le fragment des positions 16283-16423 de l'exon 12 du gène de l'albumine humaine de référence Genebank M12523.1 de séquence du listage de séquence suivante ou la séquence complémentaire: Seq. n 1 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGTTTA 15 AGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCCCTGGC ATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCAT GAGTTT-3' 13. Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester comprend le 20 fragment des positions 16283-16423 de l'exon 12 du gène de l'albumine humaine de référence Genebank M12523.1., est modifiée par insertion d'un site de clivage, notamment le site Xhol (séquence entre parenthèses) en dehors des séquences correspondant aux amorces (séquences en gras) et séquence sonde (séquence soulignée) de séquence du listage de séquence 25 suivante ou la séquence complémentaire: Seq. n 17 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGT(CT CGAG)TTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTC TCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCA GCTCCCATGAGTTT-3' 2909099 60 14 Méthode selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'on réalise les réactions d'amplification et la quantification en mettant en oeuvre des jeux d'amorces et des sondes d'hydrolyse spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacune desdites 5 bactéries, et le cas échéant d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester, telle qu'une séquence spécifique de l'albumine humaine. 15. Méthode selon l'une des revendications 6 à 14, caractérisée en ce qu'on met en oeuvre les jeux d'amorces et de sondes choisis le cas échéant 10 parmi les séquences suivantes du listage de séquence ou respectivement leurs séquences complémentaires: - pour Atopobium vaginae: Amorce 5' : Seq. n 5 = 5'-CCCTATCCGCTCCTGATACC-3' Amorce 3' :Seq. n 6= 5'-CCAAATATCTGCGCATTTCA-3' 15 Sonde : Seq. n 7 =5'-GCAGGCTTGAGTCTGGTAGGGGA-3' - pour Gardnerella vaginalis: Amorce 5' : Seq. n 8 = 5'-CGCATCTGCTAAGGATGTTG-3' Amorce 3' : Seq. n 9= 5'-CAGCAATCTTTTCGCCAACT-3' Sonde : Seq. n 10= 5'-TGCAACTATTTCTGCAGCAGATCC-3' 20 - pour Lactobacillus sp. : Amorce 5' :Seq. n 11= 5'-TACATCCCAACTCCAGAACG-3' Amorce 3' : Seq. n 12 = 5'-AAGCAACAGTACCACGACCA-3' Sonde :Seq. n 13 = 5'-TGACAAGCCATTCTTAATGCA-3', - pour l'albumine humaine : 25 Amorce 5' : Seq. n 14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3' 2909099 61 Amorce 3' : Seq. n 15 = 3-'AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3' Sonde :Seq. n 16 = 5'-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3' 16. Méthode selon l'une des revendications 8 à 15, caractérisée en ce que ledit grand fragment d'ADN synthétique constitutiî de l'ADN de 5 l'échantillon standard d'étalonnage de la quantification est inséré dans un plasmide. 17. Trousse de diagnostic utile pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisée en ce qu'elle comprend 10 - des échantillons d'ADN standard d'étalonnage comprenant desdites séquences spécifiques de chacun desdites bactéries telles que définies dans l'une des revendications 4, 5, 9 et 10, de préférence une dite séquence spécifique de l'ADN humain telle que définie dans les revendications 7, 12 et 13, et, de préférence encore, un dit grand fragment d'ADN synthétique tel 15 que défini dans l'une des revendications 8, 11 et 16, ainsi que desdits jeux d'amorces spécifiques desdits fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques desdites bactéries et de préférence encore, desdites sondes tels que définis dans l'une des revendications 6, 14 et 15, et des réactifs de mise en oeuvre d'une réaction d'amplification d'ADN 20 de type PCR.