FR 2914190 A1 20081003 FR 0852038 A 20080328 B05-0571FR1 Au nom de : DIANA NATURALS CEVA Universitat de Barcelona Faculty of Biology Università degli studi di Milano, DISTAM - Sezione Nutrizione Extrait d'algues contenant des polyphénols Invention de : BESNARD Matthieu MEGARD Denis INISAN Claude ROUSSEAU Isabelle LERAT Yannick GRANDIEU Patricia MITJAVILA Maria Theresa SIMONETTI Paolo PRIORITE D'UNE DEMANDE DE BREVET EP N 07300903.7 DEPOSEE LE 28 MARS 2007 Extrait d'algues contenant des polyphénols La présente invention concerne un extrait d'algues comprenant une grande quantité de polyphénols. La présente invention concerne également une composition basée sur cet extrait d'algues riche en composés polyphénoliques, pour son utilisation en tant que produit médicinal destiné à être utilisé dans le traitement de processus inflammatoires. Les polyphénols constituent un groupe de métabolites secondaires largement représentés chez les plantes, et forment une famille de composés qui sont très divers quant à la structure ou la taille. Dans le phylum des algues brunes (Phaeophyceae), les composés phénoliques ou phlorotanins sont dérivés par polymérisation d'un seul et même monomère : le phloroglucinol (1, 3,5-tri-hydroxybenzéne) (formule 1). oH Formule 1 Il existe divers types de phlorotanins, qui peuvent être distingués par le 15 nombre de motifs monomères et leurs types de liaisons : - les fucols composés de monomères phloroglucinol liés par des liaisons aryle-aryle ; - les phloréthols composés de monomères liés par des liaisons aryle-éther en position para, ortho ou méta ; 20 - les fucophloréthols, largement représentés chez les algues brunes, constitués de nombreux monomères phloroglucinol reliés par des liaisons aryle-aryle et aryle-éthyle. - les hydroxyfucophloréthols, qui ne sont pas largement représentés dans ce phylum, consistent en fucophloréthols comportant un ou plusieurs groupes hydroxy 25 supplémentaires. D'autres polyphénols d'algues sont moins répandus, tels que les fuhalols, les phlorotanins qui sont les plus sensibles à l'oxydation, les hydroxyfuhalols, les déhydroxyfuhalols, les isofuhalols, les pseudofuhalols, les carmalols, les eckols et les phlorotanins sulfatés. Fucus vesiculosus et Ascophyllum nodosum sont les espèces d'algues brunes qui sont les plus riches en phlorotanins, avec des teneurs qui varient entre 3 et 10 % (poids sec) selon la saison, la période de récolte, l'origine géographique, le taux d'irradiation est le stress dû à l'environnement et à la salinité (Connan S. et coll., 2004, Botanica Marina, 47, p. 410-416). Les phlorotanins d'algues diffèrent des tanins provenant de plantes terrestres quant à leur voie de biosynthèse. Chez les algues brunes, les polyphénols de faible masse moléculaire semblent avoir des propriétés antifongiques, antivirales, antibiotiques et anti-algues. D'autres études rapportent une toxicité des phlorotanins à l'égard de divers animaux marins. Les polyphénols sont considérés être de très puissants agents chélateurs de métaux lourds et sont donc considérés participer à la détoxication des cellules. On pense également qu'ils jouent un rôle protecteur contre le rayonnement UV. Enfin, les phlorotanins ont un grand pouvoir antioxydant. Les polyphénols de masse moléculaire élevée (entre 30 000 et 100 000 daltons) qui sont contenus dans l'extrait brut de Fucus vesiculosus, Ascophyllum nodosus et Pelvetia canaliculata sont considérés être de puissants inhibiteurs d'enzymes impliquées dans le stress oxydant (alpha-amylase, lipase et trypsine). L'utilisation d'extraits d'algues pour la préparation de compositions pharmaceutiques, cosmétiques ou alimentaires, ou de compositions à usage agricole, est connue d'après le document WO 91/07946 (SECMA). Toutefois, ce document ne décrit par la composition des extraits d'algues obtenus. La demanderesse a mis au point de nouveaux extraits d'algues, ayant une forte teneur en composés phénoliques, qui constituent l'objet de l'invention. Un autre objet est l'utilisation de ces extraits d'algues en tant que médicament. Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation de cet extrait dans une composition pharmaceutique destinée au traitement de processus inflammatoires. Les processus inflammatoires sont au moins impliqués dans l'arthrite et l'allergie. L'objet de l'invention est également le procédé pour la préparation de cet extrait. D'autres objets apparaîtront à la lecture de la description et des exemples et dessins ci-après. Sur ces dessins la figure 1 est une représentation de l'expression de molécules d'adhésion cellulaire (A : sélectine P ; B : VCAM-1 ; C : ICAM-1) dans l'endothélium (1 - groupe témoin ; 2 - extrait aqueux ; 3 - extrait éthanolique ; 4 - phloroglucinol). Les granules fluorescents plus denses sont des précipités d'anticorps secondaires. L'extrait polyphénolique selon l'invention comprend entre 11 et 19 % en poids de polyphénols, par rapport au poids sec de l'extrait d'algues, et de préférence au moins 15 % en poids de polyphénols par rapport au poids sec de l'extrait d'algues. La teneur en composés phénoliques d'un extrait d'algues selon invention est évalué au moyen de la méthode de dosage "Folin Ciocalteu" selon Glombitza. L'extrait polyphénolique selon l'invention contient entre 0 et 1 % en poids d'iode, par rapport au poids sec de l'extrait. L'apport nutritionnel recommandé (ANR) d'iode dépend de la situation géologique, du sexe, de l'âge et des conditions physiques et pathologiques : ANR en Europe ( g/jour) Enfants de 6 mois à 6 ans 90 Enfants de 7 à 10 ans 120 Adolescents et adultes 150 Femmes enceintes et allaitant 200 Source : Maretin et coll., 2001, Apports nutritionnels conseillés pour la population 15 française, 3e édition. Chez la femme enceinte, l'ANR tient compte d'une clairance rénale accrue d'iode au cours de la grossesse, ainsi que des besoins spécifiques du foetus. Chez la femme allaitant, l'ANR compense les pertes journalières moyennes de 30 à 50 g 20 d'iode dans le lait maternel. Il n'existe pas de consensus sur le seuil de toxicité de l'iode. La valeur de 1 000 à 2 000 g/jour, correspondant à l'apport constaté pour l'apparition de l'effet Wolff-Chaikoff, un signe d'alerte de troubles thyroïdiens, apparaît comme un seuil pathologique. 25 En ce qui concerne la teneur en iode des aliments, le Comité scientifique européen sur les produits alimentaires (SCF, Scientific Committee on Foo récemment émis une opinion sur les limites supérieures maximales pour les vitamines et des minéraux qui peuvent représenter un risque pour la santé. L'iode a été examiné (Opinion of the Scientific Committee on Food on the Tolerable Level of Iodine, 26 septembre 2002) et il est énoncé que l'apport maximum tolérable est de 600 g/jour. Il est également spécifié qu'en France, dans les régions où des troubles dus à une déficience en iode se sont manifestés pendant longtemps, il est suggéré de ne pas excéder un seuil maximum de 500 g/jour, afin d'éviter le risque d'apparition d'hyperthyroïdie. Aux Etats-Unis, cette limite, fixée par le JECFA, est de 1 000 g/jour (Gévaudan, 2000). En ce qui concerne les compléments alimentaires, l'Union européenne a établi un nouveau réglement (2006/352) indiquant les quantités journalières maximales pour une série de composés, incluant l'iode. Une réglementation française a été établie pour se conformer à cette directive européenne et a été publiée dans le JORF 123 du 9 mai 2006. Cette réglementation fixe la quantité journalière maximale d'iode apporté par le complément alimentaire à 150 g/jour. La valeur maximale pour l'apport journalier provenant d'une alimentation normale reste inchangée. Pour se conformer à cet apport d'iode recommandé, la teneur en iode, exprimée en milligrammes par gramme de poids sec, est réduite par comparaison avec la concentration initiale dans la matière première utilisée. La concentration finale d'iode dans l'extrait est encore inférieure à 1 % du poids sec de l'extrait d'algues. L'extrait d'algues selon invention peut être obtenu à partir d'algues brunes, de préférence à partir de micro-algues ou macro-algues alimentaires. Ces algues peuvent appartenir à la classe des Phaeophyceae, et de façon particulièrement préférée à l'espèce Fucus sp. ou Ascophyllum sp. L'extrait d'algues selon invention peut être obtenu à partir d'un mélange d'algues appartenant à cette classe. L'objet de l'invention est l'utilisation de cet extrait d'algues, riche en polyphénols, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de processus inflammatoires conduisant au moins à l'arthrite et à l'allergie. L'inflammation est la réponse complexe, à la fois systémique et locale, de l'hôte à une infection ou une lésion. Du point de vue clinique, les caractères principaux de l'inflammation sont chaleur, rougeur (érythème), tuméfaction (oedème) et douleur, conduisant à une perte de fonction. La réponse de l'hôte tente de limiter l'étendue du dommage, à s'opposer à l'infection et à promouvoir la guérison et le rétablissement de la fonction. L'inflammation comporte deux composantes principales - cellulaire et exudative. La composante cellulaire implique la migration des globules blancs des vaisseaux sanguins vers le tissu inflammé. Les globules blancs, ou leucocytes, jouent un rôle important dans l'inflammation ; ils passent par extravasation des capillaires vers le tissu et agissent en tant que phagocytes, en absorbant les bactéries et les débris cellulaires. Ils peuvent également aider en circonscrivant une infection et en empêchant sa propagation. La composante exudative implique le mouvement de fluide, habituellement contenant de nombreuses protéines importantes telles que la fibrine et les immunoglobulines (anticorps). Les vaisseaux sanguins sont dilatés en amont d'une infection (ce qui provoque rougeur et chaleur) et sont contractés en aval, tandis que la perméabilité des capillaires menant au tissu affecté est accrue, ce qui conduit à une perte nette de plasma sanguin dans le tissu - donnant naissance à l' oedème ou à la tuméfaction. La tuméfaction distend les tissus, comprime les extrémités nerveuses, et provoque ainsi la douleur. L'inflammation peut être reconnue par l'oxyde nitrique. Si l'inflammation du site affecté persiste, les cytokines IL-1 et TNF libérées vont inciter les cellules épithéliales afin qu'elles activent les récepteurs VCAM-1 (molécule d'adhésion aux cellules vasculaires 1), ICAM-1 (molécule d'adhésion intercellulaire 1), la sélectine E et la sélective L pour diverses cellules immunitaires. L'activation des récepteurs augmente l'extravasation des neutrophiles, des monocytes, des lymphocytes T cytotoxiques et lymphocytes T auxiliaires activés, et des lymphocytes T et B mémoire vers le site infecté. Si l'agent nocif persiste, une inflammation chronique s'ensuivra. Ce processus, caractérisé par une inflammation persistant pendant plusieurs jours, mois ou même années, peut conduire à la formation d'une plaie chronique. L'inflammation chronique se caractérise par une présence dominante de macrophages dans les tissus lésés, qui migrent par extravasation par les mêmes méthodes indiquées plus haut (ICAM-1, VCAM-1). Ces cellules sont de puissants agents de défense de l'organisme, mais les toxines qu'ils libèrent (incluant des espèces oxygénées réactives) sont nocives pour les propres tissus de l'organisme, ainsi que pour des agents envahisseurs. C'est pourquoi l'inflammation chronique s'accompagne presque toujours d'une destruction des tissus. Les compositions pharmaceutiques comprenant un extrait d'algues polyphénolique selon l'invention peuvent être administrées à des sujets humains par les voies normales, par exemple par voie orale. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées telles quelles ou intégrées dans une matrice alimentaire. La dose et le temps d'administration varient en fonction des voies d'administration, de la gravité de la maladie, du poids corporel, etc. Les compositions peuvent être administrées à un adulte en une dose journalière unique ou par doses fragmentées. Selon ce mode d'administration, les compositions selon invention peuvent être fournies sous l'une quelconque des formes normalement utilisées dans des produits pharmaceutiques. Les compositions peuvent être fournies en particulier sous la forme de poudres, granules, comprimés, pilules, gélules, etc. . Les compositions pharmaceutiques peuvent être préparées d'une façon classique, au moyen de véhicules traditionnels pour des préparations. À savoir, dans le cas de fabrication de préparations orales, on ajoute au composant actif des excipients ou véhicules, et si nécessaire des liants, des désintégrants, des lubrifiants et des colorants sont encore ajoutés, et on met ensuite ce mélange sous forme de comprimés, granules, poudres, gélules, etc. Le médicament comprenant une composition à base d'extrait d'algues selon l'invention est indiqué pour des processus inflammatoires. Le procédé permettant l'extraction à la purification sélective des composés phénoliques à partir d'algues est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - on soumet les algues broyées à une ou plusieurs extractions solide/liquide, en présence ou en absence d'eau ajoutée ; - on sépare ensuite la phase liquide de la phase solide, par exemple par centrifugation ; - on effectue éventuellement une filtration du mélange ; - éventuellement on purifie le liquide ainsi obtenu, privé du résidu solide, à l'aide d'une technique de filtration sur membrane ou de chromatographie, afin d'éliminer une partie de l'iode et de concentrer les polyphénols d'intérêt ; - dans le cas de la technique de purification par chromatographie, on injecte le liquide dans une colonne garnie d'une résine adsorbante ; - après lavage, on effectue l'élution avec une solution aqueuse-alcoolique contenant entre 20 et 90 % en poids d'alcool, et de préférence entre 50 et 80 % en poids d'alcool ; - l'extrait ainsi obtenu est ensuite concentré sous pression réduite, à une température inférieure à 80 C, de préférence inférieure à 60 C ; - le produit ainsi obtenu est ensuite séché par atomisation ou lyophilisé, pour l'obtention d'une poudre marron contenant entre 11 et 19 % en poids de polyphénols, et de préférence au moins 15 % en poids de polyphénols. Les algues sont récoltées, lavées rapidement à l'eau douce, séchées à 50 C pendant 24 heures ou à 100 C pendant une heure, et ensuite finement broyées (120-250 m). On effectue une extraction aqueuse afin de solubiliser les polyphénols et l'iode à la température ambiante, à une concentration d'algues dans l'eau de 2,5 à 5 %, avec agitation mécanique, pendant 4 heures. L'extraction aqueuse peut être réduite si l'on utilise des algues fraîches en tant que produit de départ. Après filtration sur un filtre-presse, on sépare le résidu solide de l'extrait aqueux. On soumet L'extrait aqueux à une première étape de purification, afin d'éliminer les alginates par précipitation des alginates en présence d'un excès de chlorure de calcium. Après filtration, on soumet l'extrait aqueux à une seconde étape de purification par diafiltration sur une membrane ayant un seuil de coupure de 1 000 daltons, afin d'éliminer l'iode et les composés de faible masse moléculaire. Le rétentat est conservé. L'extrait aqueux purifié est séché soit par lyophilisation, soit par séchage par atomisation. L'extrait peut être obtenu par le procédé décrit plus haut, de préférence à partir d'algues alimentaires, avantageusement provenant des espèces Fucus sp. et Ascophyllum sp. L'extrait d'algues alimentaires ayant les caractéristiques énoncées, étant éventuellement obtenu selon le procédé décrit plus haut, peut être utilisé pour la fabrication de médicaments destiné à la prévention de processus inflammatoires, notamment dans le cas de l'arthrite et de l'allergie. L'invention est illustrée à l'aide des exemples ci-après, qui ne sont pas limitatifs. Exemple 1 : Préparation d'un extrait d'algues brunes Des algues brunes Fucus sp. et/ou Ascophyllum sp. sont récoltées et ensuite séchées à 100 oc pendant 1 heure. Ensuite on les broie pour obtenir une plage de taille de particule allant de 0,3 à 1 cm. On effectue ensuite une extraction aqueuse à pH acide, à chaud, à une température supérieure à 80 C, à un pH compris entre 1 et 1,5 obtenu par acidification à l'acide sulfurique, pendant au moins 2 heures, avec une concentration d'algues dans la solution acide de 5 à 20 %. Après l'avoir pressé pour séparer le résidu solide de l'extrait liquide, on soumet cet extrait à une ultrafiltration afin d'éliminer les insolubles de celui- ci. Le perméat est ensuite concentré sous vide, à une température inférieure à 70 C, afin de réduire le volume de l'extrait. La purification est effectuée sur une colonne contenant une résine adsorbante. Après injection de l'extrait, on lave la résine avec de l'eau purifiée, afin d'éliminer les impuretés. Les polyphénols sont ensuite élués avec une solution aqueuse-alcoolique contenant entre 20 et 80 % en poids d'éthanol. L'éluat est ensuite concentré sous pression réduite, à une température inférieure à 50 C. Le liquide extrait ainsi obtenu est ensuite séché par atomisation ou lyophilisé, pour l'obtention d'une poudre marron riche en polyphénols, l'extrait CEVETE 1. Exemple 2 : Dosage des composés phénoliques sur l'extrait CEV-ETE1 Ce dosage des phlorotanins est effectué par la méthode Folin Ciocalteu selon Glombitza. Le principe de cette méthode est basé sur l'oxydation des phénols en présence d'acide phosphomolybdique et d'acide phosphotungstique, conduisant à la formation de composés bleus ("bleu de molybdène" et "bleu de tungstène"), dont le maximum d'absorption est à 760 nm. On a préparé une série d'étalonnage à partir de phloroglucinol (Merck, n 107069, n CAS 108-73-6) aux concentrations de 0, 40, 60, 80, 100 et 120 mg/1. On a ajouté à 2 ml de ces différentes solutions de phloroglucinol 10 ml d'eau, 12 ml de Na2CO3 (à 29 % m/v) et 1 ml de réactif Folin-Ciocalteu (Merck, n 109001). Après 30 minutes de réaction à l'obscurité, on a ensuite lu l'absorbance à 760 nm (spectrophotomètre UV -visible Lambda Perkin-Elmer). On a dissous 50 mg d'extrait sec CEV-ETE1 dans 25 ml d'eau. On a ensuite dilué 10 ml de cette solution avec 15 ml d'eau, pour obtenir la solution à doser. On a ensuite traité 2 ml de cette solution. On a préparé des dilutions en série afin d'obtenir une absorbance comprise entre 0,3 et 0,8. Les résultats obtenus correspondent aux polyphénols totaux et sont exprimés en équivalent phloroglucinol. Pour l'algue normale (fucus), on a effectué les préparations de solutions sur la 5 base du même protocole. Algue normale Extrait CEV-ETE 1 Polyphénols totaux en éq. phloroglucinol 6 19 (méthode Folin Ciocalteu), en % par rapport au poids sec Exemple 3 : Méthode de dosage d'iode dans l'extrait CEV-ETE1 en poudre : La méthode pour le dosage de l'iode dans des algues et des produits dérivés 10 d'algues est extraite du Food Chemical Codex III. En bref, on soumet la matière à base d'algues à une minéralisation alcaline à chaud. On extrait ensuite les iodures, puis on les oxyde en iodates avec du brome. Les iodates sont réduits en iode moléculaire, qui est ensuite titré à l'aide de thiosulfate de sodium. 15 Algue normale Extrait CEV-ETE 1 Iode dosé par la méthode FCC III, 756 307 en mg/kg Exemple 4 : Evaluation de vitamines sanguines antioxydantes par étude in vitro chez des sujets humains sains Quarante sujets volontaires humains sains ont été répartis en deux groupes et 20 affectés à la prise d'extrait polyphénolique [500 mg (4 gélules) d'extrait polyphénolique CEV-ETEl] ou de placebo dans une étude avec permutation pendant 6 semaines (6 semaines d'interruption de prise entre les traitements). Traitement 6 semaines 6 semaines 6 semaines Groupe A (n = 20) extrait interruption placebo Groupe B (n = 20) placebo interruption extrait On a recueilli des échantillons de sang de chaque participant avant la prise et 3, 9, 16, 21 et 42 jours après ingestion. a) Détermination de la vitamine C dans le plasma Une solution de référence comprenant 50 mg d'acide ascorbique (SIGMA, code 2174) a été diluée dans 50 ml de MPA à 1 %. La solution de référence a été diluée à 1:50, 1:100, 1:200 et 1:400. Les concentrations obtenues étaient les suivantes : 2,5 1/ml, 5 1/ml, 10 1/ml, 20 1/ml. On a immédiatement transféré 300 l de plasma frais dans un tube Eppendorf (1 ml) qui contenait 300 l d'acide métaphosphorique (MPA, à 10 %). Le tube été conservé à -80 C jusqu'à l'analyse par HPLC. Après décongélation, les échantillons ont été centrifugés à 10 000 g pendant 1 minute. On a filtré le surnageant et l'échantillon obtenu a été utilisé pour l'analyse par HPLC (Atlantis dCl8 250 mm x 4,6 mm de diamètre interne). Taux plasmatiques de vitamine C, en moyennes erreurs-types ( moles/ml) Jours 0 21 42 Placebo (n = 20) 54,2 6,5 52,5 8,1 56,4 4,6 CEV-ETE1 (n = 20) 56,1 6,2 61,8 5,5a 66,6 4,9a : significativement différent du placebo Les taux de vitamine C plasmatique étaient significativement plus élevés après 20 21 et 42 jours de complémentation avec l'extrait de fucus CEV-ETE1, par comparaison avec une poudre d'algues normale. b) Détermination des vitamines A et E dans le plasma La solution de référence contenait 50 mg d'a-tocophérol ou de rétinol 25 (SIGMA) dilués dans 50 ml d'éthanol absolu. Les solutions utilisées pour l'injection ont été diluées à 1:50, 1:100 ; 1:200 et 1:400, et les concentrations obtenues ont été vérifiées par spectrophotométrie à 292 et 325 nm, respectivement. On a immédiatement transféré 100 l de plasma frais dans des flacons foncés (1 ml). On a agité les flacons pendant 10 secondes sur un agitateur à vortex, on y a 30 introduit 200 l de n-hexane et on les a ensuite agités pendant 40 secondes sur un agitateur à vortex. Les échantillons ont été centrifugés à 1 000 g pendant 5 minutes. 150 gl du surnageant ont été transférés dans un flacon foncé (2 ml), évaporés avec de l'azote et on a dilué le résidu dans 100 l d'un mélange de méthanol/tétrahydrofuranne (950:5 v/v). Taux plasmatiques de vitamine A, en moyennes erreurs-types ( g/ml) Jours Placebo (n = 20) Extrait de fucus CEV-ETE1 (n = 20) 0 0,57 0,02 0,56 0,01 3 0,60 0,04 0,54 0,02 9 0,61 0,05 0,57 0,02 12 0,58 0,09 0,55 0,02 21 0,55 0,04 0,51 0,03 42 0,57 0,1 0,54 0,08 Les taux de vitamine A plasmatique n'étaient pas affectés par la complémentation avec de l'extrait de fucus CEV-ETE 1. 10 Taux plasmatiques de vitamine E, en moyennes erreurs-types ( g/ml) Jours Placebo (n = 20) Extrait de fucus CEV-ETE1 (n = 20) 0 8,52 0,57 8,23 0,49 3 8,80 0,92 8,34 0,34 9 8,37 0,55 8,76 0,79 12 9,54 0,99 8,45 0,25 21 8,6 0,48 8,12 0,67 42 8,44 1,28 8,07 0,50 Les taux de vitamine E plasmatique n'étaient pas affectés par la complémentation avec de l'extrait de fucus CEV-ETE1. c) Détermination d'a-tocophérol dans les globules rouges 15 La solution de référence contenait 50 mg d'a-tocophérol (SIGMA) dilués dans 50 ml d'éthanol absolu. Les solutions utilisées pour l'injection ont été diluées à 1:50,5 1:100 ; 1:200 et 1:400. Les concentrations obtenues ont été vérifiées par spectrophotométrie à 292 nm. On a effectué l'extraction et la détermination par HPLC de l'a-tocophérol dans les globules rouges comme décrit par Hatam et Kayden (Hatam L.J., Kayden H.J., J. Lipid Res., 1979, 20, 639-645) avec les ajustements suivants : dans des tubes en matière plastique de 10 mL, on a pesé 0,3 g de globules rouges, séparés du sang entier par centrifugation à 10 000 g pendant 1 minute et lavés deux fois avec un volume égal de sérum physiologique (NaCl à 0,9 % en poids/volume). On a ajouté 500 l de Triton X-100 (à 1 % p/v dans de l'eau), 500 l d'eau distillée et 1 ml d'acide ascorbique (à 1 % p/v dans de l'alcool éthylique). Après avoir agité sur un agitateur à vortex pendant 10 secondes, on a utilisé un bain ultrasonique pendant 5 minutes pour effectuer la lyse des cellules. On a ajouté 4 ml d'hexane et on a agité le contenu des tubes pendant 10 minutes sur un agitateur à vortex. Après centrifugation à 800 g pendant 10 minutes, on a transféré 3,5 ml du surnageant dans des tubes propres de 10 ml contenant 50 l de BHT (hydroxytoluène butylé) (à 0,1 % p/v dans de l'hexane). On a introduit 2,5 ml d'hexane dans les tubes contenant les globules rouges, pour effectuer une seconde extraction par agitation pendant 10 minutes sur un agitateur à vortex et, après centrifugation à 800 g pendant 10 minutes, on a transféré 2 ml du surnageant dans le tube correspondant. La totalité du solvant utilisé pour l'extraction a été évaporée sous vide et sous un courant d'azote, puis on a ajouté 500 l d'hexane au résidu, on a agité le contenu des tubes pendant 10 secondes sur un agitateur à vortex, puis on l'a transféré dans un flacon en verre. Pour l'analyse par HPLC, on a utilisé une pompe modèle 9001 (Varian, Cary, Australie) reliée à un collecteur automatique Ultra Wisp 715 (Waters, Milford, MA, USA) et à un détecteur de fluorescence LC 240 (Perkin-Elmer, Beaconsfield, GB). L'intégration du chromatogramme a été obtenue avec un système Millennium (Waters). On a effectué les séparations sur une colonne LiChrosorb Si60 de 250 x 4,6 mm de diamètre interne (Merck, Darmstadt, Allemagne) en utilisant comme phase mobile un mélange d'hexane et d'acétate d'éthyle (1 000 : 75, v/v). Le débit était de 2 ml/min. Le détecteur de fluorescence était réglé à une excitation à 290 nm et une émission à 330 nm. On a obtenu des courbes d'étalonnage par injection d'a-tocophérol de référence, et la linéarité était estimée dans la plage de 0,8 à 8 g/ml. Concentration d'a-tocophérol dans les globules rouges, en moyennes erreurs-types ( g/g) Jours Placebo (n = 20) Extrait de fucus CEV-ETE1 (n = 20) 0 2,07 0,04 2,06 0,08 21 2,08 0,04 2,05 0,05 42 2,15 0,09 2,12 0,06 Les concentrations d'a-tocophérol plasmatique n'étaient pas affectées par la complémentation avec l'extrait de fucus CEV-ETE1. Exemple 5 : Evaluation de l'inflammation par étude in vivo sur des rats sains Des rats sains ont reçu (inclus dans une ration alimentaire semi-synthétique) 200 mg d'extrait de fucus CEV-ETE1 par kg de poids corporel par jour ou 43 mg de phloroglucinol par kg de poids corporel pendant 4 semaines. Les résultats ont été comparés à un groupe témoin. A la fin de la période d'alimentation, les rats ont été anesthésiés à l'isofluorane et saignés. On a utilisé de l'héparine en tant qu'anticoagulant pour la collecte du sang. Après avoir centrifugé le sang à 1 770 g pendant 15 minutes, à 4 C, on a obtenu le plasma. L'aorte thoracique a été excisée et découpée en segments comme décrit précédemment (Lépez et coll., 2001). On a ensuite contrôlé l'évolution du poids corporel de ces rats sains. Evolution du poids corporel de rats sains (en grammes) au cours du traitement. Les données sont des moyennes erreurs-types ; n = 8 Semaine Sema 0 1 2 3 4 Témoin 199 8 198 6 242 5 273 6 299 8 Extrait de fucus CEV-ETE1 201 9 206 7 241 5 271 6 295 7 Phloroglucinol 193 11 186 9 220 7 248 6 270 6 a) Modulation de la production de superoxyde (02-) et d'oxyde nitrique (NO) par l'aorte ex vivo 02- et NO sont deux radicaux libres qui exercent des fonctions régulatrices et inflammatoires dans le tissu vasculaire. La production d'02- par des segments d'aorte a été analysée à partir des quatre groupes de rats en présence d'un cofacteur ressemblant à NADPH et de coelentérazine (Tarpey et coll., 1999). On a mesuré la production de NO de base dans d'autres segments par résonanceparamagnétique électronique (RPE) (Lépez et coll., 2004), en utilisant Fe et de l'acide diéthyldithiocarbamique (DETC) comme agents de piégeage qui transforment NO en le complexe Fe-DETC-NO. L'expression de eNOS a été également évaluée dans l'aorte de rat par analyse western blot. Production de superoxyde et d'oxyde nitrique par l'aorte de rat après administration de doses journalières d'extraits pendant 4 semaines Production de superoxyde Production d'oxyde nitrique (unités de luminescence/ (unités de RPE/mg de tissu) mg de tissu) Témoin 1198 21 452 21 Extrait de fucus 1177 39 669 39*** CEV-ETE1 Phloroglucinol 1 156 24 559 35* Les données sont les moyennes ETM, n = 8. Les différences des groupes traités par rapport au témoin sont indiquées par * P Les régimes alimentaires ne modifiaient par la production de 02-, mais la 20 production de NO de base était accrue, ce qui est en corrélation avec les augmentations de 80 % et 20 % de l'expression de l'expression de eNOS chez les rats ayant reçu l'extrait de fucus CEV-ETE1. Le phloroglucinol n'avait pas d'effet. Toutefois, l'augmentation de la production de NO au niveau vasculaire ne se reflétait pas par une augmentation de sa concentration dans le plasma, probablement en raison de la grande 25 dilution de NO. b) Nitrites dans le plasma On peut utiliser la concentration de nitrites plasmatiques comme indicateur de la production globale de NO par l'organisme. On dose les nitrites par un système de conversion catalytique qui transforme les nitrites des échantillons en NO, contrôlé par une électrode à NO. Concentration de nitrites dans le plasma de rats après administration pendant 4 semaines de doses journalières d'extraits Nitrites dans le plasma ( moles/1) Témoin 2,86 0,24 Extrait de fucus CEV-ETE1 2,99 0,23 Phloroglucinol 3,06 0,18 Les données sont des moyennes ETM, n = 8. La concentration des nitrites n'est pas modifiée par l'addition d'extrait de fucus ni de phloroglucinol. Exemple 6 : Marqueurs de l'inflammation a) Expériences sur des souris ApoE-/- Après sevrage, deux groupes de souris ApoE-/- mâles (Charles River, France) ont été alimentés à partir de l'âge de 4 semaines avec des rations alimentaires semipurifiées contenant 0,15 % de cholestérol, 5 % de lipides et 200 ou 43 mg/kg/jour des extraits ou de phloroglucinol respectivement, qui avaient été préparés dans notre laboratoire. Les rations alimentaires ont été préparées chaque semaine et conservées à ù 20 C afin d'empêcher l'oxydation, et l'aliment a été fourni et retiré chaque jour. On a noté chaque semaine le poids corporel. Evolution du poids corporel (en grammes) de souris déficientes en ApoE au cours du traitement. Les données sont des moyennes ETM, n = 14 Semaine 0 1 2 3 4 5 Témoin 16 0,52 18 0,44 20 0,43 22 0,51 23 0,40 23 0,43 Extrait de fucus 16 0,89 18 1,05 20 0,90 22 0,95 23 1,00 24 0,93 CEV-ETE1 Phloroglucinol 15 0,61 17 0,50 19 0,36 21 0,41 23 0,43 24 0,50 Semaine 6 7 8 9 10 11 Témoin 24 0,51 24 0,55 25 0,50 26 0,45 26 0,57 26 0,61 Extrait de fucus 25 0,98 26 1,02 27 0,88 27 0,98 28 0,96 28 0,93 CEV-ETE1 Phloroglucinol 25 0,61 26 0,58 26 0,70 27 0,67 27 0,83 28 0,64 Le traitement chez les souris ApoE-/- n'a présenté aucun signe de toxicité après aucune de ces longues durées de traitement. L'évolution du poids corporel était normale. Ces résultats diffèrent de ceux observés chez des rats sains, mais les souris ApoE-/- ne sont pas saines et leur augmentation de poids corporel est plus faible que chez les souris Swiss saines. Les doses d'extraits d'algues ingérées étaient d'environ 200 mg/kg de poids corporel et de 40 mg/kg pour le phloroglucinol. A l'âge de 16 semaines, les souris ont été anesthésiées à l'uréthane sodique (1,5 mg/kg i.p.) et saignées par ponction cardiaque à l'aide d'héparine en tant que coagulant. Le plasma a été obtenu après centrifugation à 1 770 g pendant 15 minutes, à 4 C, et une partie aliquote a été congelée à -80 C. Les modes opératoires et le traitement des souris étaient en conformité avec les directives de l'Union Européenne. b) Immunofluorescence Sept coupes (10 m) en série de la racine aortique ont été lavées dans une solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate (STP) et glycine 20 mM, et bloquées avec de l'albumine de sérum bovin (ASB) à 1 % dans STP 10 mM. En outre, deux témoins négatifs étaient présents dans toutes les séries de coloration. Enfin, le calibrage d'un analyseur d'image Olympus, pour la totalité de l'étude, a été maintenu au même réglage initial. On a utilisé les anticorps polyclonaux primaires suivants : sélectine P dirigée contre souris (IgG de lapin, 5 g/ml) acquis auprès de Chemicon, Immunostains, anti-VCAM-1 murine (IgG2a de rat, k ; 10 g/ml) acquis auprès de eBioscience et anti-ICAM-1 murine (IgG de chèvre, 2 g/ml) acquis auprès de R&D Systems. Ils ont été visualisés après incubation avec les anticorps secondaires correspondants [anticorps d'âne anti-IgG de lapin marqué 647 (1/500), anticorps d'âne anti-IgG de rat marqué 488 et anticorps d'âne anti-IgG de chèvre marqué 546) acquis auprès de Molecular Probes (ville, pays). La protéine chimiotactique de monocyte 1 (MCP-1) joue un rôle dans le recrutement de monocytes vers les sites de lésion et d'infection. Les chimiokines constituent une famille de cytokines pro-inflammatoires inductibles par activation, ou petites protéines signal sécrétées. Les chimiokines induisent une chimiotaxie dirigée dans les cellules répondeuses proches, d'où le nom de cytokines chimiotactiques. La sélectine P et les molécules d'adhésion aux cellules vasculaires (VCAM) et les molécules d'adhésion intercellulaire (ICAM) sont impliquées dans le roulement et, respectivement, la migration des monocytes dans l'espace sub-endothélial. Les monocytes dans l'espace subendothélial deviennent des macrophages. Lorsque les macrophages phagocytent les LDL oxydés, ils deviennent des cellules spumeuses qui déclenchent le processus d'athérosclérose. Dosage de MCP-1, sélectine P, VCAM et ICAM dans la racine aortique de souris ApoE_i_ MCP-1 Sélectine P VCAM-1 ICAM-1 Témoin 185 0,9 148 22 184 21 160 5 Extrait de fucus CEV-ETE1 167 7* 100 7* 170 16 120 12* Phloroglucinol 178 2* 86 14* 163 1 135 29 Les données sont les moyennes ETM, n= 3-4. Les différences des groupes traités par rapport au témoin sont indiquées par * P REVENDICATIONS 1. Extrait d'algues, caractérisé en ce qu'il comprend entre 11 et 19 % de polyphénols, pourcentage exprimé en poids de polyphénols par rapport au poids sec de l'extrait. 2. Extrait d'algues selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient au moins 15 % de polyphénols, pourcentage exprimé en poids de polyphénols par rapport au poids sec de l'extrait. 3. Extrait d'algues selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il contient entre 0 et 1 % en poids d'iode, par rapport au poids sec de l'extrait. 4. Extrait d'algues selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdites algues sont des micro-algues ou des macro-algues alimentaires. 5. Extrait d'algues selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdites algues sont des algues de la classe des Phaeophyceae. 6. Extrait d'algues selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdites algues appartiennent à l'espèce Fucus sp. et/ou à l'espèce Ascophyllum sp. 7. Extrait d'algues selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour son utilisation en tant que médicament. 8. Composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, un extrait d'algues selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Médicament contenant au moins un extrait d'algues selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour le traitement de processus inflammatoires. 10. Procédé pour la préparation d'un extrait d'algues selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant les étapes suivantes : a) on effectue une extraction solide/liquide des algues, séchées ou non, broyées ou non au préalable, b) on effectue une séparation de la phase liquide et de la phase solide du mélange, c) on purifie la phase liquide,d) on recueille la phase riche en polyphénols, et éventuellement on la concentre et/ou on la lyophilise ou on la sèche par atomisation. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel l'étape b) pour la séparation de la phase liquide et de la phase solide est effectuée par filtration. 12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, dans lequel l'étape c) pour la purification de la phase liquide est effectuée par une méthode chromatographique. 13. Utilisation d'un extrait d'algues selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de processus inflammatoires. 14. Utilisation d'un extrait d'algues selon la revendication 13, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'allergies. 15. Utilisation d'un extrait d'algues selon la revendication 13, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de l'arthrite.