FR 2911962 A1 20080801 FR 0700699 A 20070130 10 La présente invention concerne le domaine de l'analyse par chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle. En particulier, l'invention propose une méthode d'analyse quantitative d'échantillons pétroliers par chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle. 15 La chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle (GC 2D) est une technique séparative particulièrement efficace pour effectuer des analyses moléculaires détaillées. Cette technique bien connue des spécialistes est décrite par exemple dans les brevets suivants : US 5,135,549 et US 5,196,039. Ces documents décrivent le principe du couplage en continu de deux colonnes de séparation différentes afin d'obtenir des chromatogrammes bidimensionnels. 20 La chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle est une technique séparative dans laquelle tous les composés élués d'une première colonne sont successivement soumis à une séparation dans une deuxième colonne de sélectivité différente. Les deux colonnes sont connectées en série au moyen d'un modulateur qui est l'élément clé du dispositif. Cette interface échantillonne l'effluent de la première colonne sous forme d'impulsions chimiques 25 et les transfère vers la deuxième colonne. La durée requise pour effectuer cette opération, appelée période de modulation, impose en général une deuxième séparation très rapide (quelques secondes) : les caractéristiques de la deuxième colonne sont choisies de telle sorte que chaque impulsion soit séparée durant la période de modulation. La figure 1 schématise le principe de la GC-2D. 1 Plus le composé a d'affinité avec la phase stationnaire, plus il mettra de temps à sortir de chacune des deux colonnes. A la sortie de la seconde colonne, les composés rencontrent un détecteur. Cet appareil mesure différentes propriétés physique du mélange gazeux sous forme d'une intensité en fonction du temps. Ce signal, nommé signal chromatographique ou lD brut , comporte un ensemble de pics, caractéristique de chaque constituant, dont la forme est fonction de l'intensité de la propriété mesurée. Chaque pic est nommé pic d.'élution ou encore pic chromatographique . Le maximum de l'intensité correspondant à un pic est appelé temps de rétention Le signal ainsi enregistré peut être de différente nature en fonction du détecteur utilisé. Les détecteurs (TCD, FID, SCD, NCD...) sont choisis en fonction du type d'application par l'homme de l'art : Certains détecteurs permettent de détecter quelques ppm (parties par million) d'un composant. Le pic d'élution issu de la première colonne est échantillonné périodiquement par le modulateur. Chaque fraction est focalisée puis injectée en continu dans la deuxième colonne. Le signal chromatographique détecté, le signal 1D brut, correspond donc à une succession de séparations (matérialisées par des pics sur le signal) réalisées dans la deuxième dimension. En accolant ces chromatogrammes avec un offset, il est: possible de reconstruire un signal dans les deux dimensions : le début de chaque cycle de modulation marque le temps de rétention d'un composé dans la première dimension, tandis que le maximum de chaque pic marque le temps de rétention dans la deuxième dimension. Pour que l'ordre de rétention dans la seconde dimension soit correct, il faut introduire un offset. Il permet de décaler tous les temps de rétention sur l'axe des ordonnées d'une valeur constante. Cette opération est utile pour représenter correctement la structure d'un chromatogramme dans lequel le temps de rétention secondaire (i.e. sur l'axe y) absolu d'un composé est supérieur à la période de modulation, à condition que la différence de temps de rétention entre le composé le moins retenu et le composé le plus retenu soit inférieure à la période de modulation (i.e. absence de chevauchement des séparations, ou wrapping around ). Le résultat peut se présenter soit sous la forme d'un chromatogramme à trois dimensions, deux des axes représentant les temps de rétention sur chacune des dimensions de séparation, et le troisième axe indiquant l'intensité du signal (3D sur la figure 1). La représentation la plus courante est bidimensionnelle (chromatogramme 2D), les deux axes du plan de séparation indiquant les coordonnées temporelles. Les pics chromatographiques (pics d'élution) forment alors des taches dont l'intensité est traduite par un dégradé de couleur. Cette représentation s'apparente à une image moléculaire de l'échantillon. Dans l'exemple présenté en figure 1, deux solutés coélués après la première séparation sont séparés lors de la deuxième séparation, pourvue que la nature des phases stationnaires revêtant chaque colonne soit adaptée. Cependant, les résultats issus d'une chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle (GC 2D) doivent être couplés à des méthodes d'analyses de données complexes. État de la technique Comme en CPG (chromatographie en phase gazeuse) conventionnelle, la quantification d'un soluté en GC-2D s'effectue en étalonnant la réponse du détecteur par la mesure de l'aire du pic d'élution. Dans le cas spécifique de la GC-2D, le chromatogramme est généralement représenté sous la forme d'une surface iso-réponse qu'il convient d'intégrer pour obtenir le volume d'un pic d'élution proportionnel à la quantité de soluté introduite. Comme indiqué par la publication ci-dessous, on connaît trois types d'analyses quantitatives en chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle (GC 2D). Toutes ces méthodes reposent sur la définition de zones délimitant les taches représentatives des pics d'élution. Ces zones sont appelées blobs par les spécialistes. Van Mispelaar V.G. et al., 2005, "Novel system for classifying chromatographic 20 applications, exemplified by comprehensive two dimensional gas chromatography and multivariate analysis", Journal of Chromatography A., 1071 (2005) pp. 229-237. 1- Détermination des concentrations d'un certain nombre de composés prédéfinis. Les composés sont identifiés par leurs temps de rétention selon les deux axes (i.e. les temps du maximum d'une zone). L'aire de la zone est convertie en concentration par le biais 25 d'un étalon. On suppose dans cette analyse un retour net à la ligne de base entre deux zones. La ligne de base correspond au signal enregistré en l'absence de composés (i.e. en présence de la phase mobile seule). 2- Détermination des concentrations de groupes de pics. Pour certaines applications, le nombre de pics est de plusieurs dizaines de milliers avec 30 de fortes co-élutions. Il est alors pratiquement impossible d'identifier chaque pic individuellement. L'objectif est de les regrouper selon des pseudo-composants ayant des propriétés chimiques ou structurales communes (même type chimique (homologues structuraux, même nombre d'atomes de carbones, même nombre de double liaison, même nombre de cycles aromatiques, etc.). 3- Détermination des points communs et des différences entre plusieurs analyses. L'objectif est de déterminer automatiquement les différences en termes de présence et de concentration des composés. Des techniques de traitement d'image et de classification sont utilisées. Ces techniques sont utilisées en particulier pour les analyses de suivi ou pour faire du screening d'échantillon, sans s'intéresser au détail analytique. Pour mettre en oeuvre ce type d'analyse, on connaît trois types de modes opératoires. Mode 1. Le principe est le suivant : - Définition d'un masque générique de zones de contour de chaque constituant (ou blob) pour un type d'image. Des méta-données (nom du composant, propriétés du composant) peuvent éventuellement être ajoutées. - Application du masque sur une nouvelle image - Modification manuelle des blobs pour déterminer la position exacte sur la nouvelle image de chaque contour afin de tenir compte (i) des incertitudes expérimentales et (ii) des variations liées à la concentration des constituants Ce mode de fonctionnement est proposé dans le logiciel GC Image (Zoex, États-unis). Ce mode de fonctionnement est difficilement applicable : la définition des zones de contour de chaque blob est en effet très dépendante de l'utilisateur et de la manière de définir les pics individuels à partir de l'image complète. La méthode n'est donc ni très juste ni très répétable. Mode 2. Le principe est le suivant : Détermination automatique de tous les pics de l'image par analyse d'image - Association bi-univoque d'un pic à un blob - Attribution manuelle d'un composant chimique pour chaque blob Ce mode de fonctionnement est proposé dans la publication ci-dessous. Les pics sont déterminés directement sur l'image par un algorithme de type ligne de partage des eaux ( watershed ). S.E. Reichenbach, V. Kottapalli, M Ni,A. Visvanathan, 2005, Computer language for identifying chemicals with compehensive two-dimensional gas chomatography and mass spectrometry, Journal of Chromatography, Vol. 1071, pp. 263-269. Ce mode n'est pas adapté au type d'analyse 2 car le nombre de pics est beaucoup trop 5 élevé (plusieurs milliers). Il est alors impossible d'attribuer un composant à chaque pic. De plus, l'hypothèse implicite de relation bi-univoque entre un blob et un pic est fausse : un blob est souvent composé de plusieurs pics. Mode 3. Le principe est le suivant : Détermination automatique de tous les pics de l'image 10 Identification de pics par des règles. Ce mode de fonctionnement est proposé dans la. publication suivante : M. Ni, S.E. Reichenbach, A. Visvanathan, J. TerMaat, E.B. Ledford, 2005, Peak pattern variations related to comprehensive two-dimensional gas chromatography, Journal of Chromatography, Vol. 1086, pp. 165-170. 15 La mise en place des règles est cependant délicate. Mode 4. Le principe est le suivant : - Détermination automatique de tous les pics du signal 1D brut (SB) correspondant à l'image par intégration conventionnelle (techniques de GC 1D). Définition de zones (blobs) dans l'image par l'utilisateur. 20 L'aire finale du blob correspond à la somme des aires des pics du signal 1D brut (SB) appartenant au blob. Ce mode de fonctionnement est proposé le logiciel HyperChrom (Thermo, États-unis). Daniela Cavagnino, Paolo Magni, Giacinto Zilioli, Sorin Trestianu, 2003, Comprehensive two-dimensional gas chromatography using large sample volume injection 25 for the determination of polynuclear aromatic hydrocarbons in complex matrices, Journal of Chromatography A, 1019 (2003) 211ù220 Cette méthode a cependant les inconvénients suivants : - Il n'est pas possible de définir un masque prédéfinissant plusieurs blobs à appliquer pour chaque nouvelle analyse (pattern). Pour chaque nouvelle analyse, l'utilisateur doit définir un nouveau masque, ce qui est coûteux en temps d'analyse et opérateur -dépendant. - Un blob est forcément un quadrilatère prédéfini, qui peut être ensuite déformé. 5 Certains blobs ne peuvent donc être correctement placés pour détourer correctement chaque pic d'élution. Hors le type 2 impose de pouvoir délimiter des zones correspondant à plusieurs centaines de pics dont le contour peut être très tortueux. - En cas de fortes co-élutions, il peut être très difficile de définir précisément les pics d'élution sur le chromatogramme secondaire correspondant à la seconde séparation. Dans ce 10 cas, l'intégration proposée est généralement erronée car la zone à intégrer à partir du blob est mal définie. Il n'y a pas de contrôle a posteriori lors de l'absence de détection d'un pic. -L'utilisateur ne peut visualiser réellement les limites de chaque blob. Mode 5. Le principe est le suivant : - Définition d'un masque de zones (blob) dans l'image 15 - Détermination automatique de tous les pics de l'image Attribution des pics définis précédemment aux blobs via des analyses statistiques. Ce mode de fonctionnement est proposé dans la publication suivante : M Ni, S.E. Reichenbach2005, Using Edge pattern Matching for Automatic Chemical Identification in GC 2D, Automatic Target Recognition XIV. Edited by Sadjadi, Firooz A. 20 Proceedings of the SPIE, Volume 5426, pp. 155-163 (2004). L'ajustement entre les images est effectué pic par pic. Les auteurs réduisent les données en ne travaillant que sur le maximum du pic. Cependant, ils supposent implicitement une relation hi-univoque entre un pic et un blob (et donc un composant chimique). Ceci n'est pas le cas en pratique. De plus, la méthode proposée est très dépendante de la composition 25 chimique du produit. Un blob pouvant contenir plusieurs pics dont le ratio de concentration peut varier, le maximum d'un blob peut être très variable. En somme, la chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle est une technique particulièrement efficace et utilisée dans l'industrie pour réaliser des analyses quantitatives 30 d'échantillons, pétroliers par exemple. Cette technique implique cependant des méthodes d'analyses complexes. Les méthodes actuelles d'analyse ne sont pas entièrement satisfaisantes : - la définition de polygones délimitant les taches dans l'image est parfois difficile car le nombre de pics est très élevé. Ces zones peuvent également regrouper plusieurs pics. - l'identification de zones (blobs) : l'association d'un composé chimique à une zone est délicate. Plus le nombre d'atomes de carbone est élevé, plus le nombre d'isomères est élevé. Il est alors délicat d'associer un composant à un pic. De plus, ces méthodes d'analyses des résultats issus d'une chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle (GC 2D) sont manuelles et présentent donc deux inconvénients majeurs : elles nécessitent beaucoup de temps et leur résultats sont dépendants de la personne qui interprète. De ce fait, de telles analyses sont difficilement utilisables dans la pratique du fait de leur imprécision. Le nombre de polygones étant généralement supérieur à 150, des méthodes automatisées doivent donc être mises en place. L'objet de la présente invention est de proposer une nouvelle méthodologie pour analyser des résultats de chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle, permettant de s'affranchir des problèmes ci-dessus mentionnés, et notamment de fournir une méthode d'analyse permettant d'une part d'ajuster automatiquement la forme des polygones entourant les zones (blobs), et d'autre part, de permettre l'utilisation de masque de polygones pour d'autres analyses en recalant automatiquement les polygones sur la nouvelle image (chromatogramme 2D). La méthode selon l'invention L'invention concerne une méthode d'analyse quantitative d'un mélange de composés 25 moléculaires par chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle, dans laquelle : - on enregistre un signal chromatographique (SB) comportant des pics chromato graphiques ; - on génère un chromatogramme (CHR) en deux dimensions dont chaque colonne correspond à une portion dudit signal chromatographique, lesdits pics chromatographiques 30 formant des taches sur ledit chromatogramme ; - on délimite lesdites taches à l'aide de polygones. La méthode comporte les étapes suivantes pour au moins un polygone : on identifie des portions dudit signal chromatographique comprises entre deux intersections dudit polygone avec des colonnes dudit chromatogramme ; - on détermine des temps de début, des temps de fin et des maximums de pics chromatographiques présents sur lesdites portions ; on ajuste ledit polygone en déplaçant lesdits points d'intersection en fonction desdits temps de début, desdits temps de fin et desdits maximums de pics chromatographiques ; - on détermine une quantité d'au moins un composé moléculaire en calculant l'aire dudit polygone ainsi ajusté. Selon la méthode, on peut ajuster le polygone en réalisant les étapes suivantes pour chaque point d'intersection entre ledit polygone et une colonne dudit chromatogramme : - si ledit point d'intersection est compris entre le début et le maximum d'un pic chromatographique, le point est déplacé vers le temps de début du pic, - si ledit point d'intersection est compris entre le maximum et la fin d'un pic chromatographique, le point est déplacé vers le temps de fin du pic, - si ledit point d'intersection ne se situe pas entre un temps de début et un temps de fin d'un pic chromatographique, le point est déplacé verticalement le long d'une colonne vers le pic le plus proche, tant que ledit point n'est pas confondu avec la limite dudit polygone, ou avec la limite dudit chromatogramme, ou avec un début ou une fin de pic chromatographique. On peut également ajuster les polygones en partant d'un premier point du polygone et tant que le dernier point n'est pas traité, en retirant un point du milieu si un point courant est aligné avec les deux suivants, et l'on retourne deux points en arrière, sinon on passe au point suivant. On peut aussi calculer la position finale d'un sommet d'un polygone par une interpolation linéaire par rapport aux sommets voisins. Selon l'invention les taches peuvent être délimitées en construisant des polygones manuellement, ou à l'aide d'un masque de polygones que l'on adapte à la chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle utilisée en replaçant chaque sommet formant ledit polygone sur la colonne dudit chromatogramme la plus proche. On peut déterminer les temps de début, les temps de fin et les maximums de pics chromatographiques, à partir des dérivées première, seconde et troisième desdites portions dudit signal chromatographique. Les dérivées peuvent être calculées à l'aide de la méthode de filtrage de Savitzky-Golay. D'autres caractéristiques et avantages de la méthode selon l'invention, apparaîtront à la lecture de la description ci-après d'exemples non limitatifs de réalisations, en se référant aux 10 figures annexées et décrites ci-après. Présentation succincte des figures - La figure 1 illustre le principe de construction d'un chromatogramme en GC-2D. La figure 2 illustre un signal 1D brut (SB) enregistré en fonction du temps (t) par le 15 détecteur en sortie de la seconde colonne. - La figure 3 représente un chromatogramme 2D obtenu pour la séparation de composés azotés contenus dans un échantillon de distillat moyen. - Les figures 4A et 4B présentent trois polygones (Pl, P2 et P3) avant (figure 4A) et après (figure 4B) resserrement des polygones sur les pics chromatographiques. 20 - Les figures 5A et 5B présentent un polygones avant (figure 5A) et après (figure 5B) resserrement sur un pic chromatographique. - La figure 6 illustre les étapes de la méthode selon l'invention. Description détaillée de la méthode 25 La méthode selon l'invention permet de réaliser des analyses quantitatives de mélange de composés moléculaires, tels que des produits pétroliers, en analysant des chromatogrammes issus de chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle. Après avoir réalisé une chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle (GC2D) sur un échantillon dont on souhaite déterminer la composition moléculaire., la méthode comporte principalement quatre étapes (figure 6) : 1- On construit un chromatogramme en deux dimensions(CHR) à partir de la 5 chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle (GC2D) ; 2- On délimite les taches du chromatogramme par des polygones (POL) ; 3- On ajuste les polygones aux taches identifiées sur le chromatogramme (ADJ) ; 4- On détermine la composition moléculaire de l'échantillon en analysant les polygones (COMP). 1- Construction d'un chromatogramme en deux dimensions L'image sur laquelle s'applique la méthode est un chromatogramme en deux dimensions. Un tel chromatogramme est caractérisé par les éléments suivants : la période de modulation (MC2) : durée requise pour échantillonner l'effluent de la 15 première colonne sous forme d'impulsions chimiques et les transférer vers la deuxième colonne. la coordonnée temporelle du premier point pris en compte (TS : Time Start). Ce point est choisit par l'utilisateur car les débuts de signaux sont parfois inexploitables. - l'offset de deuxième colonne (OC2). 20 Ce chromatogramme est construit de la façon suivante (figure 1) : - au cours de la chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle on enregistre un signal 1D brut (signal chromatographique), qui correspond au signal enregistré par le détecteur en sortie de la seconde colonne en fonction du temps (t). Un tel signal ID brut (SB) est représenté en fonction du temps (t) sur la figure 2. Il est constitué d'un ensemble de points 25 P(t) ; -les points de ce signal chromatographique (SB) ayant une coordonnée temporelle inférieure à TS+OC2 sont retirés du signal ; - le signal est découpé en morceaux successifs de longueur MC2, c'est la modulation (MOD) 10 - ces morceaux sont concaténés (CONC) verticalement côte à côte pour former une image 2D, appelée chromatogramme 2D (CHR). L'offset entre les colonnes est OC2. Ce chromatogramme 2D est la représentation la plus courante, il consiste donc en un ensemble de tranches (de largeur égale à la période de modulation MC2) de données brutes concaténées côte à côte. La figure 3 représente un chromatogramme 2D obtenu pour la séparation de composés azotés contenus dans un échantillon de distillat moyen. Les deux axes du plan de séparation indiquant les coordonnées temporelles de séparation pour la première colonne en abscisse et pour la seconde colonne en ordonnée. Des pics chromatographiques forment alors des taches dont l'intensité est traduite par un dégradé de couleur. Cette représentation s'apparente à une image moléculaire de l'échantillon. Effectuer ces opérations revient à appliquer les formules suivantes à chaque point P(t) du signal 1D brut (SB) ayant une coordonnée temporelle supérieure à TS+ OC2 : x = MC2 * floor((t ùTS ù OC2)/ MC2) + TS +OC2 (1) y = mod((t ùTS ù OC2);MC2) (2) Avec : t : position temporelle du point P(t) sur le signal 1 D brut ; x, y les coordonnées spatiales sur le chromatogramme 2D du point P(t) ; - floor : fonction qui retourne le plus grand entier qui n'est pas supérieur à l'argument ; - mod : fonction qui renvoie le reste d'une division. Notons que les relations exprimées ci-dessus ((1) et (2)), qui permettent de calculer les coordonnées spatiales (x, y) d'un point P(t) à partir de ses coordonnées temporelles sont réversibles : t = x + y . Cette relation liant le temps absolu (t) et les coordonnées (x, y) d'un point sur l'image est respectée pour tout point apparaissant sur cette image (chromatogramme 2D), qu'il soit issu du signal 1D brut (SB) ou de la définition d'un polygone. 2- Délimitations des taches par des polygones sur ce chromatogramme Le chromatogramme 2D ainsi construit présente des taches dont l'intensité est traduite par un dégradé de couleur et qui représentent les pics chromatographiques. L'aire de ces taches est proportionnelle à la quantité d'un composé moléculaire spécifique. Une tache est une zone du chromatogramme 2D comportant au moins un pic d'élution. Ces taches sont appelées blobs par les spécialistes. Ces taches sont de petits espaces de couleur différente (couleur des pics) tranchant sur un fond d'une autre couleur (couleur de la ligne de base). Il convient donc, dans un premier temps, de délimiter ces zones. Cette délimitation forme un polygone, c'est-à-dire une figure géométrique fermée et limitée par des segments de droite (côtés), dont chacun a une extrémité commune (sommet) avec le précédent et le suivant. Deux solutions peuvent être envisagées. Soit les polygones sont créés manuellement par une personne qui interprète l'image 2D, soit on applique un masque de polygones, c'est-à-dire un ensemble de polygones préalablement déterminés. Il peut s'agir d'un masque issu d'une analyse antérieur d'un soluté similaire par exemple. Dans ce second cas, le masque doit être adapté à l'étude en cours. Le paragraphe précédent a montré comment l'image 2D (le chromatogramme 2D) était constituée de juxtapositions de segments du signal 1D brut (SB) tracés verticalement. La relation t = x + y qui lie les points de l'image avec ceux du signal ID brut (SB) n'est valable que pour les points au centre des colonnes. Elle ne peut donc pas être appliquée directement. Un recalage horizontal doit être effectué. Il consiste à replacer chaque sommet de polygone saisi à la souris par l'utilisateur sur la colonne la plus proche : x'= round ((xûOC2ûTS)/MC2)*MC2+OC2+TS avec round : fonction retournant l'entier le plus proche du nombre passé en argument. A offset de deuxième colonne (OC2), coordonnée temporelle du premier point pris en compte (TS) et période de modulation (MC2) fixes, une bijection t = x + y peut être définie. Elle associe à chaque instant un jeu de coordonnées dans l'image. Les polygones sont donc stockés sous la forme suivante : {tir} : coordonnées temporelles sur le signal 1D brut (SB) des k sommets du polygone, - OC2 : offset de deuxième colonne à la création du polygone, -TS : valeur de la coordonnée temporelle du premier point pris en compte à la création du polygone, MC2 : période de modulation à la création du polygone. Le stockage de la période de modulation permet de déterminer si un polygone est cohérent avec les paramètres d'acquisition d'une analyse (même période). Le stockage de l'offset de deuxième colonne et du TS permet de disposer d'au moins une configuration dans laquelle le polygone entier est visible sur l'image. Ce mode de stockage permet de réappliquer facilement un masque de polygone sur une nouvelle analyse même si l'offset utilisé est différent. Les fonctionnalités d'ajout, suppression, modification de sommets de polygone peuvent alors être facilement implémentées : les positions spatiales sont automatiquement converties en position temporelles. Cette structure de données permet alors : - d'avoir une relation bijective entre l'image et le signal 1D brut (SB) ; - d'être indépendant de l'offset choisi par l'utilisateur. Un masque de polygones défini avec un certain offset peut être appliqué sur une nouvelle analyse même si elle a un offset différent. - de pouvoir utiliser les temps correspondants à l'intégration sur un signal 1 D brut (SB) pour recaler les points sur l'image 2D. 3- Ajustement des polygones à des taches identifiées sur le chromatogramme Grâce à la structure de données décrite précédemment, il est possible d'appliquer un masque de polygones sur une nouvelle analyse (ceci indépendamment de l'offset). L'objectif est ensuite de recaler les polygones sur une nouvelle analyse. C'est à dire de les caler sur des 20 temps de début et de fin de pics d'élution sur les signaux 1D correspondant à l'intersection entre les colonnes de l'image et le polygone. L'ajustement des polygones est décomposé en trois étapes distinctes : - détermination de signaux 1D (morceaux du signal 1D brut (SB)) correspondant à l'intersection entre un polygone et les colonnes de l'image ; 25 - détermination des pics d'élution sur ce signal ID ; - ajustement d'un polygone sur les temps de début et de fin des pics calculés précédemment. 3.1- Détermination des portions du signal chromatographique (SB) à traiter (EXT ù figure 6) L'opération initiale est la déteiinination de l'ensemble des points sur le 30 chromatogramme 2D définissant le contour d'une zone, c'est-à-dire un polygone. L'extraction15 de portions de signaux 1 D est effectuée en respectant les étapes suivantes, pour chaque segment de polygone, parcouru dans le sens de stockage des sommets du polygone : - Soient A et B les deux extrémités d'un segment, tA et tB leurs coordonnées temporelles. -Soit n=(floor( (tB-tA)/MC2) -1) le nombre de colonnes de l'image traversées par le segment AB, extrémités exclues. - Connaissant le nombre de colonnes, les coordonnées temporelles des sommets du polygone : tk = tA+k*(tB-tA)/(n+l), avec k variant de 1 à n, sont calculées par intersection entre le côté du polygone et chaque colonne. Cas particuliers Les traitements s'effectuant sur le signal (1D) nécessitent que les points obtenus, une fois triés, soient une alternancede paires, notée [TIN ; TouT], définissant les portions de signal situées à l'intérieur du polygone. Un certain nombre de configurations particulières doivent 15 être recherchées. - Lorsque le polygone comporte une excroissance en forme de pointe orientée latéralement, le sommet doit être dupliqué (TIN=TOUT) pour que le point du signal éventuellement superposé soit pris en compte dans les calculs. - Lorsque le polygone comporte un trou en forme de pointe orientée 20 latéralement, le sommet doit être tronqué, afin d'éviter que le point éventuellement superposé avec le sommet ne soit compté deux fois. - Lorsque le polygone comporte des segments verticaux entourés par deux segments partant dans des sens différents, l'extrémité du segment qui définit la pointe concave doit être supprimée, afin d'éviter que l'alternance des TIN TouT ne soit rompue. 25 A l'issue de cette étape, sont extraites les portions du signal chromatographique (SB) comprises entre deux intersections de polygone avec des colonnes du chromatogramme. 3.2- Détermination des pics sur ces portions de signal 1D (TDP, TFP, TMP -- figure 6) Le paragraphe précédent a permis de déterminer les temps de début et de fin de chaque colonne de l'image appartenant au polygone considéré, définissant des portions de signal chromatographique. Ce paragraphe précise la méthode développée pour déterminer sur ces portions ainsi obtenues les temps de début (TDP), les temps des maximums (TMP) et les temps de fin (TFP)de chaque pic. La détermination de pics sur un signal 1D est généralement effectuée via des calculs de dérivée : dérivée première et seconde pour des co-élution faibles, et dérivée première, seconde et troisième pour des co-élution fortes. La publication suivante recense les différentes méthodes utilisées : G. Vivo-Truyols a, J.R. Torres-Lapasi, A.M. van Nederkassel, Y. Vander Heyden, U.L. Massart, 2005, Automatic program for peak detection and deconvolution of multi-overlapped chromatographic signais, Journal of Chromatography A, 1096 (2005) 133-145. Cependant, les auteurs précédents montrent que l'utilisation de la dérivée première n'est pas suffisante dans le cas de forte co-élution (i.e. les deux pics sont très proches, il est très difficile de détecter visuellement la présence des deux pics) : il n'y a pas retour à zéro de la dérivée première. Ainsi selon l'invention, la méthode de détection des pics comporte les étapes suivantes, pour chaque portion de signal 1D obtenu précédemment : 1Calcul des dérivées première, seconde (et éventuellement troisième) des portions de 20 signal ID ; 2- Calcul des seuils de traitement. Ils sont fixés par essais et erreurs. Les valeurs sont fixées pour chaque type de produit. 3- Détection des pics sur la portion Pour une faible co-élution : 25 - la valeur de la dérivée première est nulle en P(t), négative avant et positive après ; la différence des valeurs de la dérivée première entre le point P(t) et le point suivant est supérieure au seuil seuil3rd ; la valeur de la dérivée seconde en ce point P(t) est négative et d'amplitude au seuil seuil2nd ; 30 - la valeur du signal en ce point P(t) est supérieure au seuil ampThreshof). Pour une forte co-élution, la dérivée première est remplacée par la dérivée troisième : la valeur de la dérivée troisième est nulle en P(t), négative avant et positive après ; la différence des valeurs de la dérivée troisième entre le point P(t) et le point suivant est supérieure au seuil seuil3rd ; - la valeur de la dérivée seconde en ce point P(t) est négative et d'amplitude supérieure au seuil seuil2nd ; - la valeur du signal en ce point P(t) est supérieure au seuil ampThreshold. Pour le calcul des dérivées on peut utiliser de façon préférentielle la méthode de filtrage de Savitzky-Golay, mais d'autres méthodes de filtrage robustes peuvent être employées. Une telle méthode est décrite par exemple dans: Savitzky A., Golay M. J. E.," Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures , Anal. Chem., vol. 36, pp. 1627-1639, 1964. Si toutes ces conditions sont vérifiées au point P(t), un pic d'élution est enregistré en ce point, ou plus exactement, un maximum de pic chromatographique est enregistré au point P(t). Avant de détecter un nouveau pic, un test est ajouté pour vérifier que la dérivée seconde s'éloigne suffisamment de la zone "proche de zéro". Cette zone est délimitée par la valeur d'un seuil, seuilPeakProcheZero3rd. 4Vérification Recherche des début et fin de chaque pic. Pour une faible co-élution, et pour chaque pic : Détermination d'une variation de signe de la dérivée première. Ceci correspond au premier passage à zéro. Tant que la valeur absolue de la dérivée première est inférieure au seuil seuilStartStopProcheZero3rd ne pas rechercher de nouveau passage à zéro. -Rechercher un nouveau passage à zéro de la dérivée première. Pour une forte co-élution, l'algorithme est identique, mais la dérivée troisième est utilisée. Contrôle a posteriori : - S'il existe un pic entre le pic courant et le premier passage à zéro, alors le pic Stop (respectivement Start) prendra la valeur du pic courant. S'il existe un pic entre le pic courant et le second passage à zéro, alors le pic Stop (respectivement Start) prendra la valeur du premier passage à zéro. -Sinon, le pic Stop (respectivement Start) prendra la valeur du second passage à zéro. 5- Affinement des résultats obtenus - Amélioration du premier pic Start. Le premier pic Start ne possédant aucun voisin avec le précédant, il peut être déplacé vers le début du signal (le traitement est effectué sur une colonne), jusqu'à ce que la hauteur du signal ne dépasse pas la valeur ampThreshold. 15 Ceci permet de prendre en compte plus de valeurs pour le premier pic. - Regroupement possible des pics S'tart et Stop et des pics voisins. Quand deux pics sont voisins, il est possible que la meilleure solution soit de regrouper le pic Stop du voisin précédent avec le pic Start du voisin suivant. Avant d'effectuer ce regroupement, le test suivant est effectué sur le minimum entre les deux point à regrouper. Si cette valeur est 20 supérieure à ampThreshold, les deux pics sont regroupés sur ce point. Sinon, ils ne sont pas modifiés. -Amélioration du dernier pic Stop. Le dernier pic Stop ne possédant aucun voisin avec le suivant, il peut être déplacé vers la fin du signal, jusqu'à ce que la hauteur du signal ne dépasse plus la valeur ampThreshold. Cela permet de prendre en compte plus de 25 valeurs pour le dernier pic. 6- Analyse a posteriori par suppression des pics ne respectant pas les critères suivants: hauteur du pic inférieur à un seuil fixé par l'utilisateur ; - largeur du pic inférieur à un seuil fixé par l'utilisateur ; - aire du pic inférieur à un seuil fixé par l'utilisateur. 10 Les seuils de traitement suivants sont donc utilisés (ils sont fixés par essais et erreurs pour chaque type de produit). Des valeurs sont données à titre d'exemple non limitatif : seuil2nd : 5 ampThreshold : 200 seuil3rd : 2 seuilPeakProcheZero3rd : 5 seuilStartStopProcheZero3rd : 1 Ainsi, à l'issue de cette étape, on connaît les temps de début (pic Start), les temps des 10 maximums (P(t)), et les temps de fin (pic Stop) de chaque pic chromatographique présent sur les portions de signaux. 3.3-Ajustement d'un polygone sur les temps de début et de fin des pics La méthode précédente a permis de déterminer les temps de début et de fin de chaque 15 pic sur chaque colonne de l'image. Ces temps sont ensuite utilisés pour ajuster automatiquement les polygones. La relation bijective entre les coordonnées spatiales et leurs coordonnées temporelles est utilisée. La méthode suit les étapes suivantes : Pour chaque point d'intersection entre le polygone et une colonne de l'image : Si le point ne se trouve sur aucun pic (i.e. il n'est pas compris entre un pic Start et 20 un pic Stop) : tant que le point n'est pas égale à la limite du polygone, ou à la limite de l'image, ou à un début ou un fin de pic, le point est déplacé verticalement vers le pic le plus proche (temps de début ou de fin d'un pic). - Si le point est compris entre un début et un maximum de pic : le point est déplacé vers le début du pic. 25 Si le point est compris entre un maximum de pic et une fin de pic, le point est déplacé vers la fin du pic. Dans certains cas, deux sommets auparavant éloignés verticalement deviennent distants d'une distance inférieure ou égale à un pixel. Ils deviennent alors confondus. On supprime alors les sommets suivants : Les sommets groupés sur les extrémités horizontales du polygone. Les sommets dont les voisins horizontaux sont alignés avec lui même (donc inutile pour le stockage en mémoire du contour). Cet algorithme garantit la jointure entre polygones. Aucune partie du signal n'est donc perdue. 5 Selon un mode de réalisation, on ajoute une étape supplémentaire de simplification des polygones. En effet, les opérations précédentes peuvent produire des polygones dont certaines arêtes contiennent plus d'un point. Il est donc utile de pouvoir les simplifier, ne serait-ce que pour permettre une manipulation plus aisée lors des modifications à la souris. La méthode 10 suivante est utilisée. En partant du premier point du contour, et tant que le dernier n'est pas traité : Si le point courant est aligné avec les deux suivants, alors Retirer le point du milieu, Retourner deux points en arrière, 15 Sinon, passer au point suivant. Analyse a posteriori du contour : si la variation du point est trop importante (en relation avec la longueur de la portion), la position finale du point est calculée comme l'interpolation linéaire par rapport à ses voisins. Le contour final est ainsi obtenu. 4- Détermination de la composition moléculaire de l'échantillon Les taches du chromatogramme 2D représentent un ensemble de pics chromatographiques. L'aire de ces taches est proportionnelle à la quantité d'un composé moléculaire spécifique. 25 Si toutes les coordonnées temporelles des intersections du polygone définissant le polygone avec les colonnes de l'image sont connues et ont été retraitées selon les principes énoncés au paragraphe précédent, alors les aires peuvent être calculées simplement avec l'algorithme suivant : Trier les coordonnées temporelles par ordre croissant (les tranches seront définies 30 pour tout k par [t2k-1 t2k]), 20 - Ajouter des points doubles sur la ligne de franchissement du bord de l'image, Sommer les valeurs du signal sur les tranches par colonne, et leurs sommes cumulées. Les traitements ne sont effectués pour chaque polygone que si la période de modulation courante est identique à celle mémorisée dans le polygone. Les calculs d'aires sont tous effectués avec un offset calculé de sorte que le polygone soit au centre de l'image. Cela permet d'obtenir pour chaque analyse des fichiers de résultat indépendants de l'offset de deuxième colonne. Seules les coordonnée géographiques du maximum de chaque polygone figurant dans le fichier de résultat sont alors dépendantes de l'offset de deuxième colonne. Selon un mode de réalisation, les polygones peuvent être affichés. Pour affecter un masque à une nouvelle analyse, il est impératif de prendre en compte le fait que l'offset peut être différent. De plus, quel que soit le polygone considéré, il existe une valeur de l'offset de deuxième colonne qui va le décaler suffisamment vers le haut ou le bas de l'image pour qu'il finisse par franchir le bord, devenant partiellement invisible. Pour que le polygone soit complètement visible, trois étapes successives sont nécessaires : - Calcul des coordonnées des sommets du polygone en configuration initiale (offset de deuxième colonne, TS et période de modulation de création) : [x0,y0J = f(t,OC2,TS,MC2) Décalage à l'offset de deuxième colonne courant : [xl,ylJ = [x0,y0J + [OC2-OC20 ùOC2+0C20J -Calcul et affichage des polygones situés au-dessus et au-dessous par décalage: [x2,y2J = [xl,ylJ + [MC2 MC2J [x3,y3J = [xl, ylJ + [-MC2 MC2J Les trois polygones ainsi obtenus, dont tous les points respectent t=x+y, sont tracés. Ainsi, soit le polygone central est totalement visible, soit il déborde de l'image, et l'un des polygone au-dessus ou au dessous apparaît, représentant la partie qui déborde, et revient par l'autre bord de l'image.30 Résultats obtenus Les figures 4A et 4B présentent trois polygones (Pl, P2 et P3) avant (figure 4A) et après (figure 4B) resserrement. L'axe des abscisses représente le temps de séparation selon la première colonne (tl) et l'axe des ordonnées représente le temps de séparation selon la seconde colonne (t2). Les limites inférieures et supérieures des polygones correspondent bien à des débuts et de fins de pics, comme l'illustre les figure 5A (avant resserrement) et 5B (après resserrement), pour le polygone P2. Les intersections du polygone avec le signal lD sont notées IP 1 et IP2. Les tableaux 1 et 2 montrent le résultat d'une étude de répétabilité. Le même échantillon est analysé cinq fois. L'erreur de dispersion est calculée par un test de Student pour un niveau d'erreur de 99%. L'erreur est de 25.6%. Après resserrement, l'erreur est de 16.2%. Ceci correspond à une amélioration notable de la répétabilité. 131ob numero 20802 20802 2 020802 3 020802 4 020802 5 Moyenne Ecart Type Intervalle de Ecart relatif Erreur de dise condiance a 99% Sans Sans Sans Sans Sans Sans Sans 1 693.6132 677.422 638.9863 688.7529 600.0112 660 39.69 153 23.2 24.24167333 2 2632.8263 2760.8976 2554.0544 2795.0653 2618.5905 2672 101.67 391 14.6 15.33230536 3 4430.6724 4520.2499 4552.3978 4488.6817 4458.3786 4490 48. 30 186 4.1 4.334714466 4 4371.3873 4409.2807 4560.4943 4193.0855 4269.2032 4361 140.41 541 12.4 12.97608431 5 2952.2289 3253.7824 2956.6574 3302. 1977 3148.9983 3123 163.34 629 20.1 21.07977468 6 3236.0866 3237.5037 3378. 3946 3368.8354 3606.3818 3365 151.11 582 17.3 18.09444814 8 1259.66 1218.1999 1210.8659 1190.1887 1113.1557 1198 53.93 208 17.3 18.13531695 9 2533.5911 2316.7573 2638.2751 2490.2113 2527.4731 2501 116.91 450 18.0 18.83538558 10 2334.2034 2163.4456 2052.7626 2131.5606 2116.0108 2160 105.60 407 18.8 19.70505252 11 1453.451 1346.0544 1456.5842 1585.1523 1333.2416 1435 102.00 393 27.4 28.64807037 12 4746.8259 4600.3953 4634.1487 4659.3319 4550.3252 4638 73.17 282 6.1 6.357278762 13 5895.684 5897.3614 5970.0231 5948.8879 5891.6733 5921 36.20 139 2.4 2.463659877 14 4046.6803 4007.7299 4108.1151 4020.697 3974.0226 4031 50.21 193 4.8 ,... 5.019568544 16 405.6626 159.8395 209.1948 199.3375 216.3829 238 96.19 370 155.6 162.8226345 17 792.702 643.9954 707.9638 684.1475 542.2587 674 91.65 353 52.3 54.78521606 18 6014.4004 5859.8967 5851.3828 5854.5308 5834.8535 5383 74.04 285 4.8 5.071954037 19 9649.6001 9488.3745 9778.6676 9660.4628 9715.5641 9659 108.08 416 4.3 4.509474891 20 8913.5894 9024.296 8845.8939 9198.3286 8773.009 8851 166.34 640 7.2 7.488934271 24 370.4966 340.469 345.5483 315.5919 387.1903 352 27.75 107 30.4 31.78470349 26 297.7412 338.888 295.6542 299.1189 280.7397 302 21.67 83 27.6 28.87751123 27 1234.7348 1411.9928 1217.4489 1235.1751 1287.7685 1277 79.72 307 24.0 25.14946643 28 2886.1509 2869.4489 2862.6869 2814.2043 2829.2772 2852 29.70 114 4.0 4.196702337 32 911.9924 782.2021 920.9414 701.143 802.7238 824 92.78 35743.4 45.38838304 34 1738.799 1705.1357 2313.468 2160.7415 1896.4163 1963 266.05 1024 52.2 54.62126328 35 310.281 277.8327 285.0977 313.8031 294.9582 296 15.57 60 20.2 21.17466407 Somme 74113.0608 73311.4514 74345.7078 74299.2332 73068.6081 2953.1 90.1 346.9 24.5 25.6 Tableau 1 : Cinq analyses manuelles par GC2D du même échantillon 21 1 327.0229 327.0229 327.0229 327.0229 327.0229 327 0.00 0 2 2049.1434 2049.1434 2049.1434 2049.1434 2049.1434 2049 0.00 0 3 3907.1145 3950.93 3951.0624 3857.1669 3907.1145 3915 38.92 150 4 3814.2792 3680.8984 3814.6387 3552.5253 3677.254 3708 110.14 424 2462.2322 2498.7872 2390. 9256 2636.7412 2502.0068 2498 89.46 344 6 2776.5712 2707.5659 2870.9512 2798.4047 2994.0766 2830 108.90 419 8 787.652 821.3382 788.2291 787.652 787.652 795 15.00 58 9 1924.8644 1533.331 1727.2909 1718.0022 1855.307 1752 150.11 578 1643.6372 1477.7094 1486.3356 1554.3509 1555.0996 1543 66.85 257 11 1102.7736 1102.7736 1102.7736 1102.7736 1102.7736 1103 0.00 0 12 3911.3286 3911.7861 3911.3286 3911.6787 3911.9992 39.2 0.29 1 13 5222.5367 5153.0005 5153.0005 5222.5367 5153.2036 5181 38.05 147 14 3277.0673 3325.3886 3346.5749 3286.2045 3235.0641 3294 43.50 168 16 36.7006 36.7006 36.7006 36.7006 36.7006 37 0.00 0 17 395.0539 395.0539 395.0539 395.0539 395.0539 395 0.00 0 18 5450.6448 5450.6448 5450.6448 5450.6448 5450.6448 5451 0.00 0 19 9187.3002 9199.4373 9187.3002 9187. 3002 9187.3002 9190 5.43 21 20 8702.6044 8704.4868 8637.662 8744.231 8499.4546 8658 96.35 371 24 370.4966 340.469 345.5483 237.4559 299.3495 319 52.09 201 26 216.0155 216.0155 216.0155 267.6556 216.0155 226 23.09 89 27 393.0941 316.8948 416.9703 377.2603 443.0711 389 47.59 183 28 813.2213 782.7559 809.9898 783.0572 848.0357 807 26.89 104 32 2694.7855 2379.9089 1818.8017 2598.2624 2594.5693 24'17 353.82 1362 34 135.7673 119.5965 135.7673 135.7673 135.7673 133 7.23 28 35 479.5001 435.0798 394.6555 394.6555 394.6555 420 37.73 145 Somme 62081.4075 60916.719 60764.3873 61412.2477 61558.3353 2453.9 52.5 202.0 Tableau 2 : Cinq analyses manuelles puis resserrement par GC2D du même échantillon 5 Enfin, le tableau 3 illustre l'amélioration obtenue dans la prédiction des concentrations des constituants d'un produit pétrolier : Concentration C4-DI-AROMATICS C12-N-PARAFFINS Avant resserrement 9.3 %m/m 0.42 %m/m Après resserrement 11 %m/m 0.36 %m/m Tableau 3 : Amélioration obtenue dans la prédiction des concentrations Avantages 10 Le resserrement automatique de chaque polygone est basé sur des critères physiques : chaque colonne de l'image correspond à un signal de chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle issu de la seconde colonne. La limite inférieure (respectivement supérieure) d'un polygone doit donc correspondre à un début (respectivement fin) de pic d'élution sur le signal ID. Ces traitements permettent d'une part de minimiser le temps de traitement (via l'application du masque et le resserrement automatique) et d'autre part d'améliorer la répétabilité et la justesse (via le resserrement automatique). La méthode selon l'invention peut donc est être appliquée à la détermination de la composition massique d'hydrocarbures et d'autres constituants des produits issus de l'industrie 20 chimique ou pétrolière. Elle permet d'améliorer la justesse et la répétabilité des analyses. 6.64817_-06 0 4.006953873 11.97021108 14.43115513 15.51084172 7.609775305 34.53436058 17.45512646 0 0.030233054 2.959737113 5.322299714 0 5.50331E-06 0 0.23803035 4.3 4.485094278 65.8734)088 41.11865945 47.1 49.24334744 12.8 -', 13.42025606 56.4 58.98873746 21.0 21.99009281 34.6 36.22809801 15.5 16.2 REVENDICATIONS 1) Méthode d'analyse quantitative d'un mélange de composés moléculaires par chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle, dans laquelle : -on enregistre un signal chromatogaphique (SB) comportant des pics chromatographiques ; - on génère un chromatogramme (CHR) en deux dimensions dont chaque colonne correspond à une portion dudit signal chromatographique, lesdits pics chromatographiques formant des taches sur ledit chromatogramme ; - on délimite lesdites taches à l'aide de polygones, la méthode étant caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes suivantes pour au moins un polygone : on identifie des portions dudit signal chromatographique comprises entre deux intersections dudit polygone avec des colonnes dudit chromatogramme ; on détermine des temps de début, des temps de fin et des maximums de pics chromatographiques présents sur lesdites portions ; on ajuste ledit polygone en déplaçant lesdits points d'intersection en fonction 15 desdits temps de début, desdits temps de fin et desdits maximums de pics chromatogaphiques ; - on détermine une quantité d'au moins un composé moléculaire en calculant l'aire dudit polygone ainsi ajusté. 20 2) Méthode selon la revendication 1, dans laquelle on ajuste ledit polygone en réalisant les étapes suivantes pour chaque point d'intersection entre ledit polygone et une colonne dudit chromatogramme : - si ledit point d'intersection est compris entre le début et le maximum d'un pic chromatographique, le point est déplacé vers le temps de début du pic, 25 si ledit point d'intersection est compris entre le maximum et la fin d'un pic chromatographique, le point est déplacé vers le temps de fin du pic, - si ledit point d'intersection ne se situe pas entre un temps de début et un temps de fin d'un pic chromatographique, le point est déplacé verticalement le long d'une colonne vers le pic le plus proche, tant que ledit point n'est pas confondu avec la limite dudit polygone, ou 30 avec la limite dudit chromatogramme, ou avec un début ou une fin de pic chromatographique. 3) Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle on ajuste lesdits polygones en partant d'un premier point du polygone et tant que le dernier point n'est pas traité, en retirant un point du milieu si un point courant est aligné avec les deux suivants, et l'on retourne deux points en arrière, sinon on passe au point suivant. 4) Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle on ajuste lesdits polygones en calculant la position finale d'un sommet dudit polygone par une interpolation linéaire par rapport aux sommets voisins. 5) Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle on délimite lesdites taches en construisant des polygones manuellement. 6) Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle on délimite lesdites taches à l'aide d'un masque de polygones que l'on adapte à la chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle utilisée en replaçant chaque sommet formant ledit polygone sur la colonne dudit chromatogramme la plus proche. 7) Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle on détermine 15 des temps de début, des temps de fin et des maximums de pics chromatographiques, à partir des dérivées première, seconde et troisième desdites portions dudit signal chromatographique. 8) Méthode selon la revendication 6, dans laquelle on calcule les dérivées à l'aide de la méthode de filtrage de Savitzky-Golay.