FR 2909180 A1 20080530 FR 0610444 A 20061129 METHODE DE MESURE FONCTIONNELLE DE L'ACTIVITE DE LA THROMBOMODULINE PLASMATIQUE. L'invention concerne le domaine de l'hémostase et en particulier les désordres de la coagulation. La présente demande a pour objet une méthode de mesure de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline plasmatique dans un échantillon biologique. La méthode selon l'invention est réalisée in vitro à partir d'un échantillon biologique, en particulier d'un échantillon de sang prélevé chez un patient. La méthode selon l'invention permet la mesure de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline en milieu plasmatique. La présente demande vise en particulier une méthode de détermination de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline en milieu plasmatique, ladite détermination étant par exemple réalisée au moyen d'une méthode chromogénique ou fluorométrique. La thrombomoduline (TM) est un protéoglycane récepteur de la thrombine faisant partie intégrante de la membrane des cellules endothéliales. Responsable en partie de la propriété anticoagulante de l'endothélium, c'est une protéine de 557 acides aminés regroupés en trois parties : une partie C-terminale intra cytoplasmique impliquée dans les mécanismes d'endocytose ; une partie intra membranaire hydrophobe ; et une partie N-terminale constituée d'une longue chaîne peptidique. Cette dernière comprend quatre régions : une région riche en Ser/Thr, suivie d'une région de six domaines homologues à l'Epidermal Growth Factor (EGF-like), une région hydrophobe et enfin un domaine lectin-like. (Figure 1). En 1981, Owen W.G. et Esmon C.T. caractérisent l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline (Proceedings of the National Academy of Science USA, 1981, vol. 78, pages 2249-52 et Journal of Biological Chemistry 1981 vol. 256, pages 6632-5) mettant en évidence une activation de la protéine C plasmatique 2909180 2 en protéine C activée anticoagulante, par la thrombine, catalysée par la thrombomoduline. La séquence codante de la thrombomoduline humaine a été caractérisée et identifiée dans Wen D.Z. et al en 1987 (Biochemistry, 1987, vol. 26, pages 4350-7) décrite dans EMBL sous la référence BC 035602 et Weiler H. et al (J. Thromb. Haemost. 2003 Jul, 1(7) : 151-24). La TM est présente à la surface de tous les vaisseaux sanguins (artères, veines, capillaires) et lymphatiques de l'organisme, avec une abondance particulière dans les organes richement vascularisés comme le placenta et le poumon. Elle est également exprimée par les kératinocytes, les ostéoblastes, les cellules mésangiales, les plaquettes et les neutrophiles. La régulation de la synthèse de la TM est principalement sous la dépendance de l'AMP cyclique, du TNFa, de l'IL-1, et de l'acide rétinoïque. La TM n'est pas secrétée par les cellules endothéliales, et n'est pas dégradée par la thrombine. Ce n'est que sous l'effet de différents types d'agressions de la cellule endothéliale (élastase des polynucléaires ; cytokines, macrophages, lipopolysaccharides...) que la TM endothéliale est clivée en fragments qui sont libérés dans la circulation sous forme soluble puis éliminés par voie rénale. La TM cellulaire une fois clivée est une forme soluble i.e., plasmatique, de TM, délétée des régions cytoplasmiques et membranaires (Ishiih et al, 1985, J. clin. Invest. 76, 2178). Le dosage de la TM plasmatique soluble (TMp) constitue un bon marqueur de lésion endothéliale. La fonction principale de la TM est de s'opposer à l'action procoagulante de la thrombine, par différents mécanismes. Lors de sa liaison avec la TM, la thrombine (Th) subit une modification conformationnelle. Elle perd ses propriétés coagulantes et son affinité pour les plaquettes et pour le fibrinogène. Toutefois elle peut toujours être inactivée par l'antithrombine III (ATM). La formation du complexe TM-Th est décuplée en présence de chondroïtine sulfate. Ces interactions permettent à la TM d'éliminer la Th circulante du plasma. Ce complexe TM-Th est capable d'activer la protéine C qui, en 2909180 3 présence de protéine S, inhibe les facteurs Va et Vllla ; cette succession d'interactions et de réaction constitue le système de la protéine C. Le complexe TM-Th joue également un rôle dans l'activation de la protéine C liée au récepteur endothélial à la protéine C (EPCR) ainsi que dans l'activation d'une procarboxypeptidase plasmatique impliquée dans la fibrinolyse : le TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor). Enfin, la TM possède une activité antithrombotique en présence d'ATIII. Un rôle de la TM dans l'inflammation et dans la prolifération / différenciation cellulaire a également été évoqué (Figure 2). La thrombomoduline agit donc comme un inhibiteur de la coagulation, en particulier en accélérant l'activation de la protéine C en protéine C activée (PCa) qui elle-même, en présence de protéine S cofacteur, inactive les facteurs de la coagulation Va et Vllla. La synthèse in vivo de thrombomoduline est augmentée par différents facteurs, tels que l'AMPc, les rétinoïdes, les hormones tyroïdiennes, et l'hyperthermie (Conway E.M. et al, 1994, J. Biol. Chem, 269, 22804). D'autres agents tels que les cytokines, ILI, TNF, LPS, et l'homocystéine, ainsi que des microorganismes intracellulaires (cytomégalovirus, Herpès, rickettsies) influencent négativement son expression et son activité, conduisant dès lors à une augmentation transitoire de l'activité procoagulante des cellules endothéliales. Alors que les taux de TM soluble (TMs) sont élevés chez le nouveau-né, l'âge n'a pas d'influence chez les sujets sains et ce quelle que soit la tranche d'âge considérée entre 20 et 60 ans mais le sexe de l'individu a une influence car on observe des valeurs significativement plus élevées chez l'homme que chez la femme. Une élévation du taux de TMs associée à une agression de l'endothélium a été décrite dans de nombreuses pathologies telles que la CIVD, le diabète, la leucémie myéloïde chronique, les insuffisances hépatique et rénale, mais également dans les prééclampsies, le purpura thrombotique thrombocytopénique, les rickettsioses, la maladie de Behçet, l'hornocystinurie. 2909180 4 Des taux diminués ont été observés dans des études sur des malades avec hypertension artérielle pulmonaire et au cours de mélanomes. Enfin des mutations du gène de la TM ont été décrites et associées à une diminution du taux de TMs. Sur le plan thérapeutique, la perfusion de TM recombinante chez l'animal a montré son efficacité pour prévenir la survenue de thrombose. Compte tenu de son influence directe sur les étapes de la coagulation, en particulier dans l'activation du système de la protéine C, il est apparu intéressant de pouvoir déterminer l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline. Des tests de détermination d'activité de la thrombomoduline ont d'ores et déjà été proposés dans l'état antérieur de la technique mais ils ne conduisaient pas à la détermination de l'activité de la thrombomoduline dans des systèmes plasmatiques mais uniquement cellulaires. Récemment a été décrite une méthode de dosage en milieu plasmatique par âhlin A. K. et al (Journal of Thrombosis and Hemostasis, 2005, 3 : 976-982). Cependant, cette publication ne propose pas un test direct de la TMs mais nécessite une première étape d'isolement et de séparation par des anticorps monoclonaux dirigés contre la thrombomoduline du plasma. En effet, dans une première étape du test décrit par âhlin A.K. et al, le plasma testé, éventuellement dilué, est incubé sur une microplaque dont les puits comprennent un anticorps monoclonal contre la thrombomoduline humaine. Après avoir écarté le plasma, les puits des microplaques sont lavés afin de ne conserver que les fragments de thrombomoduline ayant lié l'anticorps. Dans une seconde étape, les puits de la microplaque ainsi préparés sont mis en présence des réactifs nécessaires pour obtenir de la protéine C activée. Après incubation, un substrat chromogénique ou fluorométrique permet la révélation de la protéine C activée. Les auteurs de la publication concluent qu'il serait important dans le futur, de concevoir un test qui permette de mesurer directement dans le plasma l'activité de la thrombomoduline sans passer par une étape d'isolement et de séparation de la thrombomoduline. 2909180 Le dosage de la thrombomoduline plasmatique repose donc actuellement uniquement sur un dosage antigénique de la protéine soluble qui correspond à la protéine membranaire clivée ayant perdu la région cytoplasmique carboxyterminale et transmembranaire hydrophobe. La TMs reste capable de lier la thrombine et d'activer la protéine C, fonctions localisées sur les motifs EGF répétitifs. Divers tests mettant en oeuvre des réactions immunologiques entre des anticorps antithrombomoduline et la thrombomoduline soluble sort disponibles à ce jour. La société Diagnostica Stago propose par exemple un test ELISA pour le dosage de la thrombomoduline (Asserachrom Thrombomodulin). C'est le problème du dosage in vitro de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline que résout l'invention en proposant une méthode de mesure de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline, en milieu biologique et en particulier en milieu plasmatique, c'est-à-dire une méthode qui permet le dosage in vitro de la thrombomoduline soluble contenue dans le milieu biologique qui la soutient, en particulier dans le plasma, sans séparation de la thrombomoduline des autres constituants du milieu biologique, notamment du plasma, testé. En d'autres termes, l'invention propose un test de mesure de la thrombomoduline, en milieu biologique et en particulier en milieu plasmatique, en présence des réactifs nécessaires à l'activation du système de Ira protéine C. En outre, l'invention propose un test qui permet, en milieu biologique et en particulier en milieu plasmatique, de surmonter la difficulté liée à la coagulation de l'échantillon sous l'effet des réactifs nécessaires à l'activation de la protéine C. La méthode de l'invention et les moyens pour la mettre en oeuvre sont définis pour être utilisables dans le cadre d'examens biomédicaux effectués in vitro. Pour rappel, l'activation de la protéine C en PCa se produit in vivo sous l'action du complexe formé à la surface de l'endothélium vasculaire par la 2909180 6 thrombomoduline et la thrombine (Facteur Ila). La PCa se complexe ensuite avec la protéine S pour se fixer sur les phospholipides à la surface de plaquettes ou de l'endothélium. Ces complexes PCa-PS-Phospholipides catalysent l'inactivation des facteurs Va et Vllla, ralentissant ainsi les phénomènes de coagulation. L'invention concerne donc une méthode de mesure in vitro de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline, ladite mesure étant opérée en milieu biologique à partir d'un échantillon préalablement prélevé chez. un patient. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, un échantillon permettant la mesure de l'activité thrombomoduline en milieu biologique, est un échantillon de plasma. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'échantillon permettant la mesure de l'activité thrombomoduline est un échantillon de sang total ou de liquide céphalo-rachidien (LCR) ou de liquide amniotique. La méthode de dosage in vitro selon l'invention comprend la mesure, dans le milieu biologique de l'échantillon, de l'activation de la protéine C en protéine C activée (PCa), ladite activation étant réalisée sous l'effet de la thrombine, en présence de son cofacteur, la thrombomoduline de l'échantillon. La mesure est faite après addition de protéine C purifiée en excès. D'autres agents nécessaires à l'activation du système de la protéine C sont aussi ajoutés à l'échantillon, ainsi qu'un inhibiteur de la polymérisation de la fibrine. L'invention a en particulier pour objet une méthode de mesure in vitro de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline plasmatique, laclite méthode comprenant le dosage en milieu plasmatique, de l'activation de la protéine C en protéine C activée (PCa) par la thrombine en présence de son cofacteur, ladite thrombomoduline plasmatique. Pour la réalisation de cette mesure; on ajoute, en excès, de la protéine C purifiée, dite protéine C exogène purifiée, au plasma testé, ainsi que des agents nécessaires à l'activation du système de la protéine C et un inhibiteur de la polymérisation de la fibrine. 2909180 7 Alternativement à l'addition de protéine C purifiée, on peut ajouter du TAFI (Carboxipeptidase U plasmatique dont l'activation catalysée par la thrombine, est accrue pour la thrombornoduline) pour mesurer son activation en TAFI activé (TAFIa). La mesure de l'activité est dite une mesure de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline, car elle permet de mesurer l'activité de la thrombomoduline en milieu biologique, en particulier en milieu plasmatique en ajoutant au milieu, notamment au plasma testé, de la protéine C en excès et les agents nécessaires à l'activation du système de la protéine C. Un observera que l'excès de protéine C utilisée est suffisant pour s'affranchir, lors de la mesure, de tout déficit quantitatif ou qualitatif relatif à la présence dans le milieu testé, de protéine C endogène. En d'autres termes, par excès de protéine C exogène on entend donc pour la réalisation de l'invention que la protéine C exogène est ajoutée en quantité telle que la mesure de son activation en PCa est indépendante de la teneur en protéine C de l'échantillon. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le dosage effectué en milieu plasmatique est réalisé sur un échantillon de plasma obtenu à partir d'un échantillon biologique préalablement prélevé chez un patient. La thrombomoduline plasmatique que l'on mesure selon l'invention est la protéine soluble (thrombomoduline soluble ou TMs dite aussi thrombomoduline plasmatique TMp) qui correspond à la thrombomoduline membranaire clivée et donc séparée de ses régions cytoplasmique carboxyterminale et transmembranaire hydrophobe. La thrombomoduline soluble reste en effet capable de lier la thrombine et d'activer la protéine C en PCa puisque cette fonction d'activation est localisée sur les motifs EGF répétés de la protéine. En revanche, lorsque l'activité de la thrombomoduline est mesurée dans un échantillon de LCR ou de liquide amniotique, la thrombomoduline est sous sa forme complète (non tronquée). Les agents nécessaires à l'activation du système de la protéine C que l'on apporte à l'échantillon de plasma testé sont principalement pour les 2909180 8 différents modes de réalisation de l'invention, la thrombine (en particulier l'a-thrombine humaine purifiée) et des ions calcium. Les ions calcium sont par exemple apportés sous forme de CaCl2. En outre, la méthode de mesure de l'activité de la thrornbomoduline plasmatique selon l'invention comporte l'apport au niveau de l'échantillon testé, d'un inhibiteur entrant en compétition avec la thrombine et bloquant ainsi la transformation du fibrinogène en fibrine. Une méthode de mesure in vitro de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline plasmatique selon l'invention comprend : - la mise en contact d'un échantillon de plasma testé pour l'activité de la thrombomoduline, avec de la protéine C exogène purifiée, de la thrombine, des ions calcium et un inhibiteur de la polymérisation de la fibrine; l'incubation du milieu obtenu pour permettre la production de la protéine C activée ; le dosage fonctionnel de la protéine C activée. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode de rnesure selon l'invention, la quantité de protéine C activée formée est dosée par son activité sur un substrat. Ce substrat est en particulier un substrat enzymatique, naturel ou synthétique; par exemple il s'agit d'un substrat chromogénique ou fluorométrique. Un substrat approprié pour doser l'activité de la PCa peut être un substrat protéique, par exemple un peptide. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le substrat enzymatique de la protéine C activée mesurée est un substrat permettant de doser l'activité amidolytique de la PCa. En particulier, il s'agit d'un substrat chromogénique ou fluorométrique. Au titre des substrats synthétiques utilisables dans le cadre de l'invention, on citera les substrats oligopeptidiques synthétiques. A titre d'exemple, on mentionne le substrat synthétique CBS 42.46 cle la société 2909180 9 Diagnostica Stago (oligopeptide : THC-Pro-Arg-pNa). Un autre exemple de substrat chromogénique est le substrat S-2366 (oligopeptide pyr)Glu-Pro-ArgpNa) ou S-2238 (oligopeptide H-D-Phe-Pip-Arg-pNa). Dans le cadre de l'invention, différents inhibiteurs de polymérisation de la fibrine peuvent être choisis. On cite à titre d'exemple, les inhibiteurs peptidiques synthétiques, par exemple l'inhibiteur oligopeptidique H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH.AcOH (GPRP.AcOH) (Pefabloc FG de la société Pentapharm). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode de mesure de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline plasmatique comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact d'un échantillon de plasma avec un réactif 1 comprenant la t hrombine, contenue d ans u n milieu permettant l'activation du système de la protéine C, en particulier comprenant des ions calcium, le réactif 1 comprenant en outre un inhibiteur de la polymérisation de la fibrine ; b) l'incubation du milieu constitué à l'étape a) avec un réactif 2 comprenant de la protéine C purifiée, pendant un temps suffisant pour permettre son activation en PCa par la thrombine complexée à son cofacteur, la thrombomoduline contenue dans l'échantillon de plasma ; c) la mise en contact du milieu constitué à l'étape b) comprenant la protéine C activée, avec un substrat enzymatique de la PCa ; d) la quantification de la transformation du substrat de la PCa. Pour la réalisation de l'invention, la protéine C utilisée est Line protéine C purifiée, par exemple la protéine C isolée selon la méthode décrite par Ohlin A.K. et aI, J. Biol. Chem., 1988, 263: 19240-8. Selon un mode dè réalisation particulier de l'invention, la protéine C utilisée est la protéine C humaine purifiée. La protéine C utilisée est apportée à une concentration comprise dans l'intervalle 0,5 pM/l et 2,5 pM/I. 2909180 La protéine C est dite purifiée pour exprimer qu'elle est substantiellement dépourvue d'autres composants protéiques et de contaminants, indépendamment de toute référence à son mode de préparation. La protéine C apportée peut être une protéine recombinante. La protéine C est aussi disponible sous forme purifiée et active pour la réalisation de la mesure selon l'invention, auprès des sociétés Diagnostica Stago, Enzyme Research Laboratories, American Diagnostica. Dans le cadre de la méthode de l'invention, la mise en contact de la thrombine apportée avec la thrombomoduline présente dans le plasma testé, conduit à la formation du complexe thrombine / thrombomoduline. Le réactif apportant la thrombine et les ions calcium peut être constitué par la thrombine diluée dans un tampon comprenant les ions calcium. L'inhibiteur de la polymérisation de la fibrine peut également être ajouté au tampon. D'autres constituants habituellement contenus dans ce type de tampon peuvent en outre être ajoutés. Le réactif ainsi constitué permet l'interaction de la thrombine apportée avec la thrombomoduline de l'échantillon de plasma et l'activation cle la protéine C. Parmi les autres composants du réactif constitué, on cite par exemple un inhibiteur de l'héparine ou d'un autre anticoagulant, utilisé dans I,a mesure où l'échantillon à tester a été préalablement prélevé chez un patient traité avec de l'héparine ou avec un autre anticoagulant et est donc caractéristique d'un patient traité avec de l'héparine ou un autre anticoagulant. Si toutefois l'échantillon provient d'un patient traité avec un anticoagulant de la famille des anti-vitamine K, on n'ajoute pas d'inhibiteur de cet anticoagulant, dans la mesure où aucun inhibiteur n'est à ce jour disponible. Alternativement à la dilution de l'échantillon en tampon Owren Koller, on propose de réaliser la dilution dans un plasma normal selon les critères habituels de sélection connus de l'homme du métier, ledit plasma étant rendu déficient en thrombomoduline. On ajoute alors à ce plasma la thrombine 2909180 11 exogène ainsi que la protéine C purifiée et l'inhibiteur de la polymérisation de la fibrine et comme indiqué ci-dessus, l'inhibiteur de l'héparine lorsque l'échantillon biologique provient d'un patient traité avec de l'héparine, ou un autre inhibiteur s'il s'agit d'un anticoagulant différent. L'apport de thrombine est réalisé par le plasma. On entend par plasma déficient thrombomoduline un plasma qui comprend moins de 1 % de cette protéine. Un plasma déficient en thrombomoduline peut être préparé par toute méthode en soi connue. On peut par exemple utiliser la technique d'immunoadsorption en mettant en oeuvre des anticorps dirigés contre cette protéine, par exemple des anticorps immobilisés sur un support. Le plasma à traiter est citraté. La protéine C purifiée, est apportée dans des conditions permettant sa réaction avec le complexe thrombine/thrombomoduline conduisant à l'activation de cette dernière sous la forme d'une protéine C activée (PCa). C'est sous cette forme de PCa, que la protéine C, interagissant avec les ions calcium ainsi que des phospholipides et son cofacteur la protéine S, est capable d'interagir avec ses substrats et notamment dans le processus de coagulation, les Facteurs Va et Vllla (FVa, FVIlla). On peut ainsi doser l'inhibition du facteur Va pour mesurer l'activité de la thrombomoduline. La mesure de l'activité fonctionnelle de la protéine C activée comprend la réaction du réactif obtenu, avec un substrat enzymatique de la protéine C activée. Ce substrat a été décrit plus haut et on rappelle qu'il peut être un substrat naturel ou synthétique. Lorsqu'il s'agit d'un substrat naturel, il peut s'agir d'une protéine plasmatique de la coagulation, telle que le FVa ou le FVIIIa. Alternativement, le substrat mesuré, révélateur de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline peut être le TAFI activé (TAFIa) ou un substrat du TAFI activé. Lorsque le substrat enzymatique de la PCa est de nature synthétique, il 2909180 12 peut s'agir par exemple d'un substrat peptidique. Avantageusement, le substrat en question est un substrat chromogériique ou fluorométrique. En particulier, il peut s'agir d'un substrat permettant de doser l'activité amidolytique de la PCa. Un tel substrat est par exemple le substrat oligopeptidique synthétique CBS42.46 de la société Diagnostica Stago. D'autres substrats ont été cités précédemment à titre d'exemple. L'étape de quantification de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline est basée sur la quantification de la transformation du substrat de la PCa. Cette quantification peut être réalisée en mesurant la densité optique du mélange réactionnel dans une fenêtre de lecture déterminée en fonction du substrat choisi. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le plasma obtenu à partir de l'échantillon biologique prélevé chez le patient est dilué. Par exemple, le plasma est dilué moins de vingt fois, par exemple moins de dix fois et notamment est dilué au 1 /3 ou au 1/4. La dilution réalisée peut être décidée en fonction de la sensibilité du substrat : plus le substrat est sensible, plus la dilution peut être forte. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'inhibiteur de la polymérisation de la fibrine est un inhibiteur polypeptidique. En particulier, il peut s'agir de l'oligopeptide H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH.AcOH GPRP.AcOH / Pefabloc FG de la société Pentapharm). Cet inhibiteur peut être utilisé dans la réaction de dosage, à une concentration variant de 1 à 15 g/l, choisie selon la dilution du plasma échantillon. Par exemple, lorsque le plasma est dilué au 1/3, on utilisera avantageusement 10 g/I de cet inhibiteur. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'inhibiteur de la polymérisation de la fibrine est un anticorps anti-fibrinogène tel que décrit ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la mesure de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline comprend l'utilisation du tampon thrombine ayant la constitution suivante : 2909180 13 NaCl (0,15 mmol/I), Tris (20 mmol/l), CaCl2 (2,5 mmol/I), BSA (5mg/ml) et, lorsque l'échantillon de plasma provient d'un patient sous héparine, un inhibiteur de l'héparine, par exemple le polybrène (10g/I). Lorsque le substrat enzymatique de la protéine C activée est le CBS42.46, ou un autre substrat enzymatique notamment un substrat synthétique, la lecture de la densité optique peut être faite dans une fenêtre de lecture allant de 6 à 500 secondes, à une longueur d'onde de 405 rem. Alternativement, la densité optique peut être lue dans une fenêtre allant de 6 à 200 secondes, à une longueur d'onde de 405nm. L'étape d'incubation du plasma mis en contact avec la thrombine en présence d'ions calcium, avec la protéine C peut être réalisée pendant une durée d'environ 1 à 120 minutes, par exemple d'environ 600 secondes. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode de mesure de l'activité fonctionnelle de la PCa est mise en oeuvre dans les conditions suivantes : pour l'étape a), on met en contact 70 pl d'échantillon de plasma dilué au 1/3, avec 40 pI de thrombine 10 NIH diluée dans un tampon contenant NaCI (0,15 mmol/l), Tris (20 mmol/l), CaCl2 (2,5 mmol/I), BSA (5mg/ml) et en présence d'inhibiteur de la polymérisation de la fibrine, par exemple GPRP.AcOH (10g/l) et, lorsque l'échantillon de plasma provient d'un patient sous héparine, un inhibiteur de l'héparine, par exemple le polybrène (10g/l) ; pour l'étape b) 30 pI de protéine C purifiée sont incubées pendant 600s avec le milieu constitué à l'étape a) ; - pour l'étape c) 110 pI de substrat enzymatique de la protéine C activée, par exemple de CBS 42.46, la quantité de substrat enzymatique transformé est déterminée par lecture optique dans une zone de 6 à 500 s, à une longueur d'onde de 405 nm. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la mesure de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline plasmatique est faite 2909180 14 parallèlement à la mesure de la même activité d'un contrôle interne. Ce contrôle peut être obtenu en utilisant un plasma standard traité comme l'échantillon. Pour quantifier l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline, selon un mode de réalisation particulier, l'invention propose de comparer le résultat obtenu de la réaction, par exemple la valeur lue de la densité optique, à des valeurs établies sur une courbe de calibration. Cette courbe de calibration par exemple est obtenue en mesurant l'activité fonctionnelle de la thrornbomoduline au moyen - d'un échantillon de plasma standard dilué en tampon Owren Koller, par exemple un plasma qui comprend des quantités statistiquement habituelles, dites normales, des facteurs de la coagulation connus dans les voies endogène et exogène de la coagulation. Il peut être obtenu à partir d'échantillons normaux de plasma, soit d'échantillons normaux utilisés en pool, soit d'échantillons testés individuellement pour ensuite déterminer une valeur moyenne des valeurs individuelles obtenues de l'activité de la thrombomoduline. Les valeurs statistiquement habituelles des facteurs de coagulation sont situées dans des intervalles donnés dans les manuels connus de l'homme du métier. A titre d'exemple, on considérera comme plasma normal, un plasma donnant des resultats qualifiés de normaux dans des tests du fibrinogène, du temps de céphaline avec activateur (TCA), du temps de thrombine (TB), de la PC et du facteur V. A cet égard, on peut aussi se reporter aux normes définies dans l'ouvrage : How to define and determine reference intervals in theclinical laboratory : Approved Guidelines û Second Edition. NCCLS document C28-A2 (ISBN 1-56238-406-6) NCCLS-USA 2000. - d'un plasma déplété en thrombomoduline auquel est ajoutée une quantité croissante de TM purifiée. II peut être obtenu par toute méthode en soi connue, par exemple par immunoadsorption au moyen d'anticorps antithrombomoduline. 2909180 On peut ainsi former une gamme de dilution d'un pool de plasmas normaux ou de plasmas rendus déficients en TM auxquels on ajoute des quantités croissantes de TM. La thrombomoduline ajoutée aux échantillons de plasma pour établir la courbe de calibration peut être complète ou soluble. Il peut s'agir aussi d'une molécule recombinante tronquée et soluble de thrombomoduline, comme la solulin commercialisée par la société Berlex Biosciences, San Francisco USA. Cette molécule peut être utilisée comme standard pour la réalisation d'un contrôle interne ou pour la réalisation d'une courbe de calibration. L'invention a également pour objet un kit pour la mesure de l'activité de la thrombomoduline plasmatique, en milieu plasmatique, comprenant : un réactif 1 comprenant la thrombine diluée dans un tampon comprenant un inhibiteur de la polymérisation de la fibrine et comprenant des ions calcium et le cas échéant un inhibiteur de l'héparine ; un réactif 2 comprenant la protéine C purifiée ; ou alternativement du TAFI (Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor) un réactif 3 comprenant un substrat enzymatique de la protéine C activée, ou un substrat spécifique du TAFI. Le dosage de l'activité du TAFI consistant à mesurer le TAFIa (TAFI activé) a par exemple été décrit dans le brevet WO 03/004516, au moyen de substrats chromogènes du TAFIa dérivés de composés arazoformyl. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le kit est caractérisé en ce que le réactif 1 comprend essentiellement les composés suivants : NaCI (0,15 mmol/l), Tris (20 mmol/l), CaCl2 (2,5 mmol/l), BSA (5mg/ml) et pour des échantillons de plasma de malades traités par l'héparine ou un autre anticoagulant, un inhibiteur de l'héparine ou dudit anticoagulant, par exemple le polybrène (10g/I) et un inhibiteur de la polymérisation de la fibrine. 2909180 16 Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'inhibiteur de la polymérisation de la fibrine est le GPRP.AcOH utilisé à une concentration de 1 à 15 g/I. La concentration est déterminée en fonction du degré de dilution du plasma testé. Par exemple, lorsque le plasma est dilué au tiers, on utilise 10 g/I du GPRP.AcOH. Les propriétés et conditions d'utilisation de cet inhibiteur ont été décrites plus haut. L'invention a aussi pour objet un kit tel que défini ci-dessus, dans lequel l'inhibiteur de la polymérisation de la fibrine est un anticorps anti-fibrinogène. Dans un mode de réalisation particulier, le kit comprend en outre un contrôle interne défini comme indiqué dans la présente demande. Selon un mode de réalisation particulier, le kit peut encore comprendre une courbe de calibration de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline, ou les moyens propres à la réalisation d'une telle courbe. L'invention a également pour objet une méthode de détection in vitro d'une anomalie de la coagulation, comprenant la mesure de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline en milieu plasmatique, telle que décrite dans la présente demande. Il peut s'agir de détecter une augmentation du taux de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline ou une diminution de ce taux. Chez un sujet adulte, on considère qu'une variation (élévation ou diminution) anormale du taux de thrombomoduline est un marqueur de risque thrombotique ou de lésion(s) endothéliale(s). Selon un mode de réalisation particulier de cette méthode, on compare l'activité fonctionnelle mesurée de la thrombomoduline en milieu plasmatique à une valeur de cette activité, mesurée sur un plasma standard. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la valeur ainsi obtenue dite valeur standard ou normale est obtenue après dosage de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline sur un pool d'échantillons de plasmas standards. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, ladite valeur standard est établie à partir de valeurs de l'activité fonctionnelle de la 2909180 17 thrombomoduline mesurées sur des échantillons de plasmas normaux (standards) dosés individuellement. Les moyens, méthodes et kits décrits dans la présente demande sont utilisables pour la détection d'une augmentation du taux de thrombomoduline, éventuellement associée à des symptômes cliniques. Ainsi, une augmentation du taux de thrombomoduline peut être associée à des symptômes de coagulation intravasculaire disséminés (CIVD), de diabète, de leucémie myéloïde chronique, d'insuffisance hépatique et rénale, de prééclampsie, de purpura thrombotique thrombocytopénique, de rickettsioses, de maladie de Behçet, d'homocystinurie, de fausse couche. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les moyens, méthodes et kits, sont utilisés pour la détection d'une diminution du taux de thrombomoduline éventuellement associée à des symptômes cliniques. Ces symptômes peuvent être des symptômes d'hypertension artérielle pulmonaire ou à des mélanomes ou autre. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les moyens, méthodes et kits décrits, sont utilisés pour la détection d'une diminution du taux de thrombomoduline associée à une mutation du gène de la thrombomoduline. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples qui suivent en particulier pour illustrer les variations du taux de thrombomoduline liées à des états pathologiques et dans les figures. Figure 1 : Schéma de l'organisation structurelle de la thrombomoduline : EGF=Epidermal growth factor (EGF-like). La séquence de la thromboduline est décrite dans l'article de Weiler H. et Isermann B.H. de 2003 (Journal of Thrombosis and Haemostasis, vol. 1, pages 1515-1524). Figure 2 : Schéma de l'activité de la thrombomoduline : PC : protéine C ; PCa : protéine C activée ; Th : thrombine ; ATIII-Th : complexe anti-thrombine III-thrombine ; EPCR-PC : Récepteur Endothélial de la Protéine C û Protéine 2909180 18 C ; TAFI : Thrombin Activatable Fibrinolisis inhibitor ; TAFIa : TAFI activé ; TM : Thrombomoduline ; V : Factor V ; Va : Factor V activé. Figure 3 : Courbe illustrant la spécificité du dosage. (Def TM : déficient en TM). Figure 4 : Détection de plasmas pathologiques et de plasmas normaux. Figure 5 : Courbe de calibration de la mesure (DDO) de l'activité de la thrombomoduline en fonction de sa concentration. Figure 6 : Mesure de la sensibilité de l'activité de la thrombomoduline, en fonction du taux de protéine C de l'échantillon : Figure 7 : Sensibilité au taux de facteur II de l'échantillon. Figure 8 : Sensiblité au taux de TAFI de l'échantillon. Figure 9 : Estimation de la stabilité. Les conditions de l'obtention de ces résultats sont décrites dans les exemples. EXEMPLES I Méthode de dosage Le dosage de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline a été réalisé comme suit, sur un échantillon de plasma de 70 pl dilué au 1/3. A) Réactifs • 40 pl de Thrombine 10 NIH en tampon thrombine constitué par: 0.15 mol// Nacl mmol// Tris 2.5 mmol// CaCl2 5 mg/m/ BSA 10 g/I GPRP.AcOH (inhibiteur de polymérisation de la fibrine) 2ml/l polybrène 10g/I 2909180 19 • 30 pl de protéine C purifiée à 100 pg/ml reprise par 1 ml d'eau distillée • 110 pl de substrat synthétique de la PCa (CBS42.46 de la société Diagnostica Stago) repris par 6 ml d'eau distillée / Hirudine à 20 ATU) B) Activation de la protéine C et dosage de la PCa L'échantillon de plasma a été mis en contact avec la thrombine dans le tampon thrombine et incubé à 37 C avec la protéine C, pendant une durée d'environ 600 secondes, pour activer la protéine C. Le milieu obtenu a été mis en contact avec le substrat synthétique. L'activité amidolytique de la PCa a ensuite été déterminée à 37 C par lecture de densité optique dans une zone de lecture de 6 à 500 sec, à 405 nm. C) Contrôle de la spécificité de la mesure La spécificité de la mesure de la densité optique par rapport à l'activité de la PCa a été vérifiée en comparant l'activité obtenue avec un pool de plasmas normaux et avec un plasma déficient en TM auquel on a ajouté la TM purifiée (de chez American Diagnostica ou Haematologic Technologies INC par exemple). Les résultats sont présentés à la figure 3 et confirment la spécificité du dosage. D) Contrôle de la répétabilité Les mesures de répétabilité ont été opérées et les résultats sont rapportés aux tableaux 1-3. E) Valeurs d'activité de la PCa 43 plasmas normaux ont été dosés pour l'activité thrornbomoduline, suivant la méthode de l'invention. Les mesures de densité optique et les pourcentages d'activité TM correspondants sont rapportés au Tableau 4. Ces mesures peuvent être considérées comme indicatrices des valeurs normales d'activité fonctionnelle de la thrombomoduline. 2909180 Tableau 4 Plasmas normaux Normaux (n=43) DDO / Moyenne 1.281 106 Médiane 1.,291 109 Min 1..122 65 Max 1.451 151 On a considéré que 100% d'activité fonctionnelle TIO est défini arbitrairement comme le taux de TM qui résulte en la formation de 0,03 pmol/l de PCa quand les concentrations en thrombine et en PC sont respectivement de 10 NIH et 100 pg/ml en présence de 2,5 mmol/l d'ions Cal+. Par ailleurs, des plasmas obtenus à partir d'échantillons biologiques prélevés chez des patients affectés par des pathologies identifiées, ont été également dosés pour l'activité fonctionnelle de la TM, selon la méthode de l'invention. Les résultats en pourcentage d'activité TM sont donnés au tableau 5. Ces résultats sont illustrés à la figure 4. II Exemple de préparation d'une courbe de calibration Pour établir la courbe de calibration, donnant l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline, on a utilisé - soit la dilution d'un pool de plasmas normaux en tampon Owren Koller ou dans un déficients en thrombomoduline. -soit la surcharge d'un plasma déficient en thrombomoduline par de la thrombomoduline purifiée. - soit en définissant arbitrairement le taux de 100 % d'activité thrombomoduline comme étant de taux de thrombomoduline qui résulte en la 20 2909180 21 formation de 0,03 pml/l de PCa quand la concentration en thrombine est de 10 NIH et la concentration en PC est de 100 pg/mI, en présence de 2,5 1-molli de Cal+. Chaque dilution de plasmas est testée au 1/3 dans la configuration. On a déterminé la concentration en TM ajoutée au pool de plasmas correspondant à une activité de 200%, 150%, 100%, 50%, 25%, 12,5% et 0% de la thrombomoduline suivant la règle ci-dessus définie. L'activité de la thrombomoduline a été déterminée sur un substrat synthétique de la PCa, le CBS 42.46. On a mesuré l'activité amidolytique de la PCa par la libération de paranitroaniline (de couleur jaune) à une longueur d'onde de 405 nm. On a déterminé la densité optique, qui correspond à chaque valeur (en pourcentage) d'activité de la thrombomoduline, dans une fenêtre de lecture allant de 6 à 500 secondes à une longueur d'onde de 405 nm. Une courbe de calibration est présentée à la figure 5. III Evaluation de la sensibilité du dosage à différentes protéines plasmatiques de la coaqulation, ou à des aqents interférant avec la coagulation. A) Sensibilité à l'héparine La sensibilité a été évaluée en ajoutant au plasma dosé dans les conditions de dosage décrites ci-dessus, des concentrations croissantes de calciparine . L'influence de la calciparine est décrite dans le tableau 6 suivant et s'avère peu déterminante sur l'activité fonctionnelle de la TM. 2909180 Tableau 6 Sensibilité à l'héparine DDO % Recouvrement % Calciparine 0 1.183 119 100 Calciparine 0.4 1.135 107 90 Calciparine 0.8 1.159 113 95 Calciparine 1.0 1.199 123 103 Calciparine 1.4 1.239 133 111 Calciparine 1.8 1.271 141 118 Calciparine 2.0 1.214 127 106 B) Sensibilité au taux de protéine C contenue dans l'échantillon de plasma Des plasmas comprenant une concentration variable déterminée en protéine C ont été dosés selon la méthode décrite ci-dessus. Il s'agit de : • Plasma déficient en protéine C (colonne 0) ; • Plasmas d'un pool rendus plus ou moins déficients en protéine C (colonnes 12.5-50) ; • Plasma d'un pool normal (pool GK (Georges King)) (colonne 100) ; Les résultats (Tableau 7 et figure 6) montrent que le taux de PC de l'échantillon influence peu la valeur de l'activité fonctionnelle de la TM. 22 2909180 Tableau 7 Sensibilité au taux de protéine C de l'échantillon (1) Taux de PC 0 12.5 25 50 100 150 300 (%) Tx théorique 110 103 104 106 102 102 102 (%) Tx mesuré 110 110 101 107 102 96 96 (%) Recouvrement 100 107 97 101 100 94 94 0= Déf PC Clinisys 12.5-50= Pol/Déf PC 100 = Pool GK 150-300= Pool/PC purifiée C) Sensibilité au taux de Facteur Il contenu dans l'échantillon de plasma Des plasmas comprenant une concentration variable déterminée en Facteur Il ont été dosés selon la méthode décrite ci-dessus. Il s'agit de : • Plasma déficient en Facteur Il (colonne 0) ; • Plasmas d'un pool rendus plus ou moins déficients en Facteur Il (colonnes 25-87,5) ; • Plasma d'un pool normal (pool GK) (colonne 100) ; Les résultats (Tableau 8 et figure 7) montrent que le taux de FII de l'échantillon influence peu la valeur de l'activité fonctionnelle de la TM. 23 2909180 Tableau 8 Taux de Fll (%) 100 87.5 75 50 25 0 Taux théorique 100 95 90 79 69 58 (%) Taux mesuré 100 95 88 76 74 58 (%) Recouvrement 100 100 98 96 107 100 (%) O=DéfIlGK 25-87.5= Pool/Déf Il 100= Pool GK D) Sensibilité au taux de TAFI contenu dans l'échantillon de plasma Des plasmas comprenant une concentration variable déterminée en TAFI ont été dosés selon la méthode décrite ci-dessus. II s'agit de : • Plasma déficient en TAFI ; • Plasmas d'un pool rendus plus ou moins déficients en TAFI ; • Plasma d'un pool normal (pool GK) ; Les résultats (Tableau 9 et figure 8) montrent que le taux de TAFI de l'échantillon influence peu la valeur de l'activité fonctionnelle de la TM. 24 2909180 Tableau 9 Sensibilité aux taux de TAFI de l'échantillon (1) Echantillons PooI+TAFI Pool + Pool + Pool Pool '% z en Def TAFI 10 TAFI TAFI def 20 30 TAFI Avec DDO 1.102 1.097 1.079 1.144 1.077 0.980 CPI % 95 94 89 103 85 59 Sans DDO 1.112 1.094 1.097 1.124 1.062 0.964 CPI % 98 93 94 97 81 55 A -3 1 -5 5 4 4 E) Estimation de la stabilité Le dosage de l'activité fonctionnelle de la TM a été reproduit dans le temps pour estimer la stabilité de la réaction. Le dosage réalisé à 4h d'intervalle sur un même échantillon a montré des valeurs correctement stables (Tableau 10 et figure 9). Tableau 10 T=0 T=4h Ecart-relatif DDO % DDO % % Pool Stago 1.195 101 1.216 106 5 PIN 725-17 1.220 107 1.274 121 13 PIN 725-17 est un plasma normal fourni par la société Manchester et correspondant au lot 725-17. 2909180 26 F) Zones de lecture La zone de lecture des densités optiques a été modifiée pour lire dans une fenêtre de 6-500 sec puis dans une fenêtre de 6-200 sec. Les résultats obtenus sur différents plasmas étaient sensiblement équivalents (Tableau 11). IV Corrélation entre une auqmentation de l'activité thrombornoduline et la perte précoce du foetus chez la femme enceinte. La perte précoce du foetus est un problème clinique sérieux qui ne peut pas toujours expliqué adéquatement ou détecté. En dehors des causes anatomiques, chromosomiques ou des problèmes hormonaux, le syndrome anti-phospholipide (APS en anglais) est la seule cause commune qui peut être diagnostiquée jusqu'à présent. L'un des mécanismes proposés pour expliquer la fausse couche est l'hypoxie due à la thrombose utéro-placentaire. L'activité thrombomoduline peut être u n m arqueur important pour cette thrombose. Un test selon l'invention, de l'activité de la thrombomoduline, basé sur sa capacité à promouvoir l'activation de la protéine C par la thrombine, a été mis en oeuvre dans une étude de contrôle chez des patientes ayant subi une fausse couche précoce. Les résultats obtenus à partir d'échantillons de sang collectés durant le premier trimestre de grossesse chez les patientes (N=35), n'ayant pas d'historique de thrombose et ayant subi une fausse couche précoce (non liée à l'APS) ont été comparés avec les résultats obtenus à partir d'échantillons obtenus durant le premier trimestre de grossesse chez des femmes d'un groupe d'âge similaire ayant une grossesse normale (N=37) et avec des patientes normales qui n'étaient pas enceintes (N=32). Les échantillons de sang ont été collectés chez le groupe des patientes i mmédiatement après 1 a fausse couche. Tous les échantillons de sang (1 : 10 dans 109 MN de citrate) ont été agités deux fois et le plasma a été congelé à -80 C jusqu'au test pour le 2909180 27 test aPTT et pour l'activité thrombomoduline (Diagnostica Stago, France). Aucune modification dans le temps aPTT n'a été observée. Les valeurs moyennes du test de l'activité thrombomoduline étaient 106 12% pour le contrôle versus 120 10% pour les grossesses normales et 158 14% pour les fausses couches (p inférieur à 0,001). Bien que des études supplémentaires soient requises pour déterminer la capacité et la spécificité de ce test, la détermination de ce paramètre peut être un outil utile pour aider la détection des femmes à risque de fausse couche. L'activité thrombomoduline apparaît comme un marqueur prédictif précoce intéressant de la complication hypertensive de la grossesse qui, chez une femme à risque, peut permettre l'intervention p harmaceutique d estinée à prévenir I es m anifestations cliniques les plus sévères. Tableau 11 Echantillon Grossesse Fausse normal normale couche n= 32 n=37 n=35 TM 106 120 158 (activité) 65 - 139 69 - 152 77 - 279 aPTT 34.7 33.9 32.7 29.4-39.6 29.5-40.4 28.6-37.3 REVENDICATIONS 1. Méthode de mesure in vitro de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline, ladite méthode comprenant le dosage en milieu biologique, à partir d'un échantillon biologique, de l'activation de la protéine C en protéine C activée (PCa) par la thrombine en présence de son cofacteur ladite thrombomoduline, ladite méthode comprenant l'addition au plasma de l'échantillon, des agents nécessaires à l'activation du système de la protéine C, l'addition de protéine C purifiée et également l'addition d'un inhibiteur de la polymérisation de la fibrine. 2. Méthode de mesure in vitro de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline selon la revendication 1, caractérisée en ce que la thrombomoduline dosée est la thrombomoduline plasmatique, l'échantillon biologique étant un échantillon de plasma, le dosage étant réalisé en milieu plasmatique. 3. Méthode selon la revendication 1 o u 2 , caractérisée en ce que, pour activer le système de la protéine C, on ajoute de la thrombine et des ions calcium. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'on détermine l'activité de la protéine C activée à l'aide d'un substrat enzymatique. 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'on dose l'activité a midolytique d e I a p rotéine Ç a ctivée, a u moyen d 'un s ubstrat chromogénique ou fluorométrique de la PCa. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'on dose la libération de paranitroaniline par le substrat synthétique CE3S 42.46. 7. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'on dose une protéine plasmatique de la coagulation dont l'inhibition dépend de la PCa, par exemple le facteur Va, le facteur Vllla, ou le TAFIa. 2909180 29 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, comprenant les étapes de : a) mise en contact d'un échantillon de plasma avec un réactif 1 comprenant la thrombine, contenue dans un milieu permettant l'activation du système de la protéine C, en particulier comprenant des ions calcium, le réactif 1 comprenant en outre un inhibiteur de la polymérisation de la fibrine; b) incubation du milieu constitué à l'étape a) avec un réactif 2 comprenant la protéine C purifiée, pendant un temps suffisant pour permettre son activation en PCa par la thrombine complexée à son cofacteur la thrombomoduline contenue dans l'échantillon de plasma ; c) la mise en contact du milieu constitué à l'étape b) comprenant la protéine C activée, avec un substrat enzymatique de la PCa ; d) la détection de la transformation du substrat de la PCa. 9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 8, caractérisée en ce que l'échantillon de plasma est dilué, par exemple dilué au 1/3. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la polymérisation de la fibrine est un inhibiteur polypeptidique, par exemple le H-GlyProArgPro-OH.AcOH (GPRP.AcOH). 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la polymérisation de la Fibrine est un anticorps anti-fibrinogène. 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications .8 à 11, caractérisée en ce que le tampon thrombine comprend essentiellement les composés suivants : NaCI (0,15 mmol/l), Tris (20 mmol/l), CaCl2 (2,5 mmol/l), I3SA (5mg/ml) et, lorsque l'échantillon de plasma est caractéristique d'un patient traité par l'héparine, un inhibiteur de l'héparine, par exemple le polybrène (10g/I). 2909180 30 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 10 ou 12, caractérisée en ce que l'inhibiteur de polymérisation de la fibrine, GPRP.AcOH est ajouté à une concentration de 1 à 15 g/I selon la dilution du plasma échantillon. 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisée e n ce que le substrat enzymatique de la protéine C activée est l'oligopeptide THC-Pro-Arg-pNa. 15. Méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 14, caractérisée en ce que la mesure quantitative de la transformation du substrat enzymatique de la PCa se fait par lecture de densité optique. 16. Méthode selon l'une quelconque des revendications 8 à 15, caractérisée en ce que les constituants mis en oeuvre de la réaction est effectuée dans les conditions suivantes : pour l'étape a), on met en contact 70 pI d'échantillon de plasma dilué au 1/3, avec 40 pl de thrombine 10 NIH diluée dans un tampon contenant NaCl (0,15 mmol/l), Tris (20 mmol/l), CaCl2 (2,5 mmol/l), BSA (5mg/ml) et en présence d'inhibiteur de la polymérisation de la fibrine, par exemple GPRP.AcOH (10g/l) et, lorsque l'échantillon de plasma est celui d'un patient traité par l'héparine, un inhibiteur de l'héparine, par exemple le polybrène (10g/I) ; pour l'étape b) 30 pI de protéine C incubée pendant 600s avec le milieu constitué à l'étape a) ;; pour l'étape c) 110 pI de substrat enzymatique de la protéine C activée, la quantité de substrat enzymatique transformé étant déterminée par lecture optique dans une zone de 6 à 500 s, à une longueur d'onde de 405 nm. 17. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre le dosage d'un contrôle interne. 2909180 31 18. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que les valeurs de densité optique obtenues sont comparées à une courbe de calibration. 19. Méthode selon l'une quelconque des revendications 8 à 18, caractérisée en ce que le réactif est la thrombine contenue dans un plasma déficient en thrombomoduline, auquel on a ajouté un inhibiteur de la polymérisation de la fibrine est, lorsque le plasma testé est caractéristique d'un patient traité par un anticoagulant, un inhibiteur dudit anticoagulant. 20. Kit pour la mesure fonctionnelle de l'activité de la thrombomoduline, en milieu biologique, notamment plasmatique, comprenant : un réactif 1 comprenant la thrombine diluée dans un tampon comprenant un inhibiteur de la polymérisation de la fibrine et comprenant du calcium ; un réactif 2 comprenant la protéine C purifiée ; et le cas échéant, un réactif 3 comprenant un substrat enzymatique de la protéine C activée. 21. Kit selon la revendication 20, caractérisé en ce que le réactif 1 comprend essentiellement les composés suivants : NaCl (0,15 mmol/l), Tris (20 mmol/I), CaCl2 (2,5 mmol/l), BSA (5mg/ml) et lorsque l'échantillon de plasma de patient traité par l'héparine, un inhibiteur de l'héparine, par exemple le polybrène (10g/I) et un inhibiteur de la polymérisation de la fibrine. 22. Kit selon la revendication 20 ou la revendication 21, caractérisé en ce que l'inhibiteur de la polymérisation de la fibrine est le GPRP.AcOH utilisé à une concentration de 1 à 15 g/I. 23. Kit pour la mesure fonctionnelle de l'activité de la thrombomoduline, en milieu biologique, notamment plasmatique, comprenant : un réactif 1 comprenant la thrombine diluée dans un tampon comprenant un inhibiteur de la polymérisation de la fibrine et comprenant du calcium ; un réactif 2 comprenant le TAFI et, le cas échéant, 2909180 32 - un réactif 3 comprenant un substrat du TAFI. 24. Kit selon l'une quelconque des revendications 20 à 24 caractérisé en ce qu'il comprend en outre un contrôle interne. 25. Kit selon l'une quelconque des revendications 19 à 23 caractérisé en ce qu'il comprend une courbe de calibration de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline. 26. Méthode d e d étection in vitro d'une a nomalie de la coagulation, comprenant la mesure de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline plasmatique selon l'une quelconque des revendications 2 à 20. 27. Méthode selon la revendication 25, comprenant la comparaison du niveau de l'activité fonctionnelle mesurée de la thrombomoduline, à une valeur normale de cette activité. 28. Méthode selon la revendication 27, dans laquelle la valeur normale est obtenue après dosage de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline sur un pool d'échantillons de plasma normaux. 29. Méthode selon la revendication 27, dans laquelle la valeur normale est établie à partir de valeurs de l'activité fonctionnelle de la thrombomoduline mesurées sur des échantillons de plasma normaux dosés individuellement. 30. Méthode selon l'une quelconque des revendications '1 à 19 ou 26-29, pour la détection d'une augmentation du taux de thrombomoduline associée à des symptômes de coagulation intravasculaires disséminées (CIVD), de diabète, de leucémie myéloïde chronique, d'insuffisance hépatique et rénale, de prééclampsie, de purpura thrombotique thrombocytopénique, de rickettsioses, de maladie de Behçet, d'homocystinurke, de fausse couche. 31. Méthode selon l'une quelconque des revendications 'à 19 ou 26-29, pour la détection d'une diminution du taux de thrombomoduline associée à des symptômes d'hypertension artérielle pulmonaire ou à des mélanomes. 2909180 33 32. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 ou 26-29, pour la détection d'une diminution du taux de thrombomoduline associée à une mutation du gène de la thrombomoduline. 33. Kit selon l'une quelconque des revendications 20 à 25, pour la détection d'une augmentation du taux de thrombomoduline associée à des symptômes de coagulation intravasculaires disséminées (CIVD), de diabète, de leucémie myéloïde chronique, d'insuffisance hépatique et rénale, de prééc/ampsie, de purpura thrombotique thrombocytopénique, de rickettsioses, de maladie de Behçet, d'homocystinurie, de fausse couche. 34. Kit selon l'une quelconque des revendications 20 à 25, pour la détection d'une diminution du taux de thrombomoduline associée à des symptômes d'hypertension artérielle pulmonaire ou à des mélanomes. 35. Kit selon l'une quelconque des revendications 20 à 25, pour la détection d'une diminution du taux de thrombomoduline associée à une mutation du gène de la thrombomoduline.