FR 2908892 A1 20080523 FR 0610181 A 20061121 1 Procédé pour le dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C et nécessaire de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C, dans les plasmas ou les fractions thérapeutiques. La présente invention concerne un procédé de dosage de l'activité du facteur de coagulation VIII :C ou Facteur Anti-Hémophilique A, en particulier dans des fractions thérapeutiques (extraites du plasma, hautement purifiées ou recombinantes). Ce procédé de dosage est rapide, fiable, reproductiblle et sensible, et permet de mesurer la totalité de l'activité de ce facteur VIII :C, de façon identique qu'il soit dans son environnement plasmatique ou non. L'invention concerne également un nécessaire de dosage de l'activité du facteur VIII :C en particulier dans les fractions thérapeutiques pour la mise en oeuvre du procédé de la présente invention. Le processus de coagulation met en jeu de nombreux facteurs sanguins interagissant en cascade. L'un des facteurs essentiels de la coagulation est le facteur VIII :C. En effet, ce facteur VIII :C s'associe au facteur IX activé (IXa) et ce complexe VIII :C/IXa, en présence de calcium et de phospholipides, va permettre une activation du facteur X. Ce facteur X activé (Xa) va se complexer au facteur V et, en présence de phospholipides et de calcium, ce complexe va permettre de cliver la prothrombine en thrombine (facteur Ila) laquelle va à son tour permettre au fibrinogène de devenir de la fibrine. Cette fibrine sera un constituant principal du caillot de coagulation. Ce processus de coagulation est représenté de façon schématique sur la figure 1. Dans le plasma, le facteur VIII :C est une protéine d'environ 230 [(Da constituée d'une chaîne polypeptidique lourde dans un complexe d'ions métalliques associée à une chaîne polypeptidique légère. Ce facteur VIII :C comporte six dornaines : Al-A2-B-A3-C1-C2. Dans la circulation sanguine, le facteur VIII :C est sous la forme d'un complexe avec une protéine de haut poids moléculaire (le Facteur von Willebrand, noté vWF) qui le stabilise. Un déficit en facteur VIII :C est observé dans l'hémophilie A ou la maladie de von Willebrand (par défaut de stabilisation). Cela se traduit par des épisodes hémorragiques cataclysmiques, contrôlés cliniquement grâce à 2908892 2 l'utilisation de concentrés thérapeutiques riches en facteur VIII :C (extrait du plasma, ou d'origine recombinante). On réalise fréquemment un dosage de l'activité du facteur de coagulation VIII :C du 5 plasma humain lors d'analyses sanguines pour le diagnostic de pathologies telles que l'hémophilie de type A ou la maladie de Willebrand, ou pour le suivi des traitements substitutifs (apportant du facteur VIII :C au patient). Lors de l'élaboration de médicaments ou de fractions thérapeutiques pour le traitement de telles pathologies sanguines, on doit également effectuer des dosages de l'activité du 10 facteur VIII :C purifié (extrait du plasma), ou d'un facteur VIII :C recombinant. Plusieurs techniques de dosage sont ainsi utilisées : des dosages par coagulation où on utilise du plasma substrat déficient en facteur VIII :C auquel on ajoute le plasma dilué à tester. On mesure le temps 15 de coagulation qui va être alors inversement proportionnel au taux de facteur VIII :C présent dans le plasma à tester. des dosages chromogéniques où on utilise des réactifs purifiés et un substrat chromogène spécifique du facteur de coagulation Xa. Le facteur VIII :C à doser (facteur limitant) est incubé avec du facteur IXa, des traces de 20 thrombine, du calcium, des phospholipides et du facteur X. Le complexe facteur IXaNIII :C/phospholipides et calcium formé, active le facteur X en facteur Xa, de façon dépendante du taux de facteur VIII :C. Ce facteur Xa formé est ensuite mesuré par son action sur le substrat chromogène spécifique du Xa. L'intensité de la coloration sera proportionnellle à l'activité du 25 Xa qui, elle-même, est corrélée à la concentration de facteur VIII :C activé dans l'échantillon. Les procédés de dosages chromogéniques existants fonctionnent selon le principe suivant : Divers réactifs apportent des facteurs de coagulation, des phospholipides, des ions Cal+ et un substrat chromogène spécifique d'un des facteurs de coagulation (ici, le facteur Xa). On ajoute soit du plasma humain contenant le facteur VIII :C, soit du facteur VIII :C purifié à partir de plasma humain, bovin ou autres ou un facteur VIII :C 30 2908892 3 recombinant. Ce facteur VIII :C apporté va activer une cascade métabolique jusqu'à l'activation du facteur X (facteur Xa). Cette quantité de facteur Xa sera proportionnelle au taux de facteur VIII :C apporté. On ajoute ensuite le substrat chromogène spécifique du facteur Xa avec de l'EDTA, un agent chélatant le Cal+ qui 5 arrête la cascade d'activation du Xa. Le substrat est constitué d'une séquence peptidique avec une séquence de stabilisation p-nitroanilide (pNA) incolore. Grâce au facteur Xa, un clivage va s'opérer entre la séquence peptidique et la séquence de stabilisation pNA laquelle sera alors détectable par colorimétrie avec une absorption à 405 nm. Cette coloration sera donc proportionnelle à la quantité de facteur Xa et 10 donc proportionnelle à la quantité de VIII :C ajoutée. La figure 2 illustre de façon schématique le principe de fonctionnement de ces procédés de dosages chromogéniques. Par conséquent, la qualité d'un procédé de dosage chromogénique est fonction de 15 sa grande précision dans la mesure colorimétrique corrélée à la quantité de facteur VIII :C activé, de sa sensibilité de détection, de sa reproductibilité ainsi que de sa rapidité de dosage. Les procédés de dosages chromogéniques existants se composent de la façon 20 suivante réactif 1 (R1) contenant du facteur X humain en excès. - réactif 2 (R2) contenant du facteur IXa humain, de la thrombine, du calcium et des phospholipides synthétiques sous forme de micelles en quantités constantes et optirnisées. 25 réactif 3 (R3) contenant un substrat chromogène spécifique du facteur Xa réactif 4 (R4) constitué par un tampon Tris-BSA de dilution des échantillons en présence d'albumine, 1% BSA et de l'azide de sodium. L'échantillon à doser contenant du facteur VIII :C (plasma humain, facteur VIII :C purifié ou recombinant). 30 Cette méthode chromogénique de dosage de l'activité du facteur VIII :C est en particulier référencée dans la Pharmacopée Européenne. 2908892 4 De tels réactifs R1 et R2 peuvent être mélangés dans un seul réactif. Toutefois, la durée de stabilité du réactif unique est inférieure à celle de l'utilisation de deux réactifs. 5 Les techniques de l'art antérieur visant à doser l'activité du facteur VIII :C dans des fractions thérapeutiques par dosage chromogène présentent l'inconvénient de ne pas être reproductibles, fiables et sensibles, en particulier pour le dosage des concentrés thérapeutiques de facteur VIII :C, très purifiés, et a fortiori les préparations de facteur VIII :C recombinantes. En effet, les résultats sont très 10 médiocres au niveau de la sensibilité. L'activité du facteur VIII :C est inférieure à très inférieure à ce qu'elle est dans un milieu plasmatique. Ainsi, pour chaque lot de facteur VIII :C purifié ou recombinant, un ré-étalonnage est nécessaire, augmentant ainsi le temps et le coût du dosage. 15 Lors du dosage d'échantillons thérapeutiques (tel que, par exemple, ceux connus sous la dénomination commerciale ReFacto commercialisée par les Laboratoires Wyeth), lorsque l'on ajoute une quantité donnée 1 de facteur VIII :C recombinant délété du domaine B dilué dans le tampon de dilution (réactif 4 (R4) décrit plus haut), on ne dose qu'une très faible activité de ce facteur VIII :C alors que, lorsque l'on 20 utilise la même quantité de ce facteur recombinant dans un plasma délété du facteur VIII :C, on dose toute l'activité biologique liée au facteur VIII :C recombinant. La figure 3 illustre ce résultat qui témoigne que, sans plasma, le dosage de l'activité du facteur VIII :C recombinant n'est pas sensible, ni fiable. 25 Le procédé de dosage chromogénique fait partie des méthodes de contrôle utilisées par les laboratoires pharmaceutiques produisant ces concentrés naturels ou recombinants de facteur VIII :C. Or, comme énoncé ci-dessus, il n'est: pas performant et il est important de pouvoir proposer un procédé de dosage chromogénique qui ne nécessite pas l'apport de plasma délété pour des impératifs de sécurité. 30 Par conséquent, le but à la base de l'invention est de pouvoir proposer un procédé de dosage chromogénique sensible et fiable in vitro du facteur de coagulation VIII :C contenu en particulier dans des fractions thérapeutiques en vue de réaliser des 2908892 5 médicaments correctement dosés en facteur VIII :C pour le traitement de pathologies telles que l'hémophilie de type A ou la maladie de von Willebrand. A cet effet, les inventeurs ont choisi de rechercher de quelle manière le plasma 5 pouvait jouer un rôle essentiel dans un tel dosage de l'activité du facteur VIII :C. Ils ont mené diverses études sur le plasma délété du facteur VIII :C. Ces études leur ont permis d'identifier au moins une substance plasmatique potentialisant: le dosage de l'activité du facteur VIII :C activant le facteur X en facteur Xa. 10 Ainsi, l'invention concerne un procédé de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C en particulier dans des fractions thérapeutiques, dans lequel le dosage de l'échantillon thérapeutique à tester contenant le facteur VIII :C purifié ou recombinant est réalisé à l'aide de réactifs apportant au moins la thrombine, le facteur IXa, des phospholipides, du calcium, le facteur X, le tampon de dilution des 15 échantillons avec de l'albumine, le substrat chromogène spécifique du facteur Xa et I'EDTA, caractérisé en ce que ledit procédé de dosage comporte en outre une étape d'addition d'au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, cette substance étant identifiée comme étant présente dans le plasma, ladite substance étant constituée d'au moins un ion métallique à l'exception du Ca2+. 20 De préférence, la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, et identifiée comme étant une substance présente dans le plasma est au moins un ion métallique divalent positif autre que le Ca2+. 25 Le Ca2 est utilisé dans les dosages chromogéniques depuis plusieurs années. On a pu remarquer qu'il n'a cependant pas d'action potentialisatrice au sens de la présente invention. Cette au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, 30 et identifiée comme étant une substance présente dans le plasma peut avantageusement être une combinaison d'au moins deux ions métalliques divalents portant deux charges positives. 2908892 6 De façon encore plus avantageuse, la présente invention concerne un procédé de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C, en particulier dans les fractions thérapeutiques, fiable grâce à l'ajout d'au moins une substance potentialisant le dosage étant au moins un ion métallique divalent positif, autre que le 5 Cal+, complexé à au moins une protéine plasmatique telle que la céruloplasmine ou la glycoprotéine acide a1 (AGP), autrement appelée Glycoprotéine Alpha Acide, Glyco-Proteine Acide, Glyco-Proteine Alpha Acide, ou encore Orosomucoïde. En effet, des fractions du plasma de haut poids moléculaire (45 000 à 500 000 10 Daltons), potentialisent également le dosage de l'activité du facteur VIII :C, suggérant l'intervention de ladite substance sous forme d'un complexe entre le ou les ion(s) métallique(s) et diverses protéines ou substances du plasma. Dans ces modes de réalisation où la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est un ion métallique divalent positif complexé à au moins une protéine plasmatique telle 15 que la glycoprotéine acide al (AGP) complexée au Cul+, la concentration nécessaire dudit ion métallique est très faible, de l'ordre de 1 pg/ml de complexe soit moins de 0,1 pg de Cul+. Ainsi, de manière avantageuse, à partir des fractions thérapeutiques diluées dans un 20 tampon R4 tel que défini précédemment, la caractéristique principale de la présente invention est la potentialisation du procédé de dosage et sa sensibilité accrue dans un contexte sans plasma grâce à l'ajout, dans le milieu de dosage de l'activité du facteur VIII :C, d'au moins une substance identifiée comme présente dans le plasma. La au moins une substance de potentialisation est de préférence ajoutée au tampon 25 R4 qui est alors appelé le tampon R4+. Le procédé objet de l'invention propose donc de doser par une méthode chromogénique l'activité du facteur VIII :C dans des fractions thérapeutiques pour la réalisation de médicaments en mettant en oeuvre l'addition d'une substance 30 complémentaire qui confère alors au procédé l'avantage de pouvoir être réalisé de façon manuelle ou automatisée, de manière fiable même sur des fractions thérapeutiques. Dans la mesure où cette substance est identifiée comme présente dans le plasma, elle peut être extraite du plasma ou provenir de toute autre source, 2908892 7 et être intégrée au niveau des réactifs permettant la mise en oeuvre du procédé de dosage sans avoir recours à du plasma lui-même. Pour la fabrication de médicaments visant à soigner des pathologies sanguines telles 5 que l'hémophilie A ou la maladie de von Willebrand, des fractions thérapeutiques riches en facteur VIII :C sont préparées. Ces fractions contiennent essentiellement du facteur VIII :C purifié à partir de plasma ou du facteur VIII :C recombinant. Les facteurs VIII :C peuvent être purifiés à partir de plasma humain, porcin ou autres. En règle générale, le facteur VIII :C humain est utilisé en thérapeutique. 10 Plusieurs types de facteurs VIII :C purifiés à partir de plasma existent : - le concentré de facteur VIII :C, riche en facteur de von Willebrand (vWF), qui le stabilise. II est par ailleurs très difficile de séparer le facteur VIII :C du vWF lors de l'extraction plasmatique, les deux protéines étant très solidement associées. 15 Ce facteur de Willebrand est une glycoprotéine multimérique de 1000 à 20000 KDa. se complexant au facteur VIII non activé mais pas au facteur VIII :C activé. Cette liaison permet une stabilisation du facteur VIII :C et une augmentation de sa demi-vie dans la circulation sanguine. La concentration molaire en vWF est toujours très largement en excès par rapport à celle du facteur VIII :C (de 10 à plus de 100 fois 20 supérieure). Dans le plasma, par exemple, il y a 0.1 pg/ml de facteur VIII :C pour 10 pg/ml de vWF. le facteur VIII :C très pur qui est obtenu à partir d'un plasma passé au travers d'une colonne d'affinité pourvue d'un anticorps monoclonal spécifique du 25 facteur VIII :C. Les facteurs VIII :C recombinants sont de plusieurs types : le facteur VIII :C recombinant complet (rec-VIII :C) avec les six domaines A1-A2-B-A3-C1-C2 du facteur VIII :C natif. 30 le facteur VIII :C recombinant dépourvu du domaine B (B domainless FVIII :C) que l'on peut trouver dans le commerce sous la dénomination commerciale ReFacto (laboratoires Wyeth). Ce facteur VIII :C recombinant dépourvu du domaine B possède la même activité que le facteur VIII :C natif et la même absence d'immunogénicité chez le patient. De 2908892 8 plus, il est très intéressant d'utiliser un tel composé pour des traitements car sa rapidité d'action est cent fois supérieure à celle observée avec le composé recombinant natif et le rendement de production est vingt fois supérieur en comparaison à la production du facteur VIII :C dans sa structure nativeä Pour l'élaboration de médicaments, plusieurs étapes de contrôle sont indispensables avant une mise sur le marché de ce médicament. Parmi ces tests, la quantité de facteur VIII :C contenue dans un échantillon est dosée. 10 Comme déjà évoqué, la qualité d'un procédé de dosage chromogénique est fonction de sa grande précision dans la mesure colorimétrique corrélée à la quantité de facteur VIII :C activé, de sa sensibilité de détection, de sa reproductibilité ainsi que de sa rapidité de dosage. Le procédé de dosage proposé selon la présente invention réunit toutes ces qualités et notamment une sensibilité nettement supérieure à celle 15 obtenue avec les procédés de l'art antérieur. En effet, après de nombreuses études fines de filtration et d'identification, cette sensibilité accrue a été obtenue grâce à l'ajout d'au moins une substance dans le procédé de dosage chrornogénique selon l'invention. Cette au moins une substance 20 potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est choisie notamment parmi au moins une substance ionique métallique, autre que le Cal+, présente dans le plasma. Cette substance ionique métallique est choisie parmi celles exposant deux charges positives telles que le Cul+ et ses sels, le Zn2+ et ses sels, le Mn 2+ et ses sels, le Mg2+ et ses sels, le Lie+ et ses sels, ou d'autres ions métalliques et leurs sels 25 ayant des propriétés équivalentes à ceux-ci, à l'exception du Cal+ et ses sels. De plus, cette substance potentialisant le dosage peut être une combinaison de plusieurs ions métalliques divalents positifs telle qu'une combinaison du Cul+ et du Zn2+, du Cul+ et du Mn2+, du Cul+ et du Mg2+ , du Zn2+ et du Mn 2+ ou d'autres 30 combinaisons de deux, trois ou plus d'ions métalliques. D'autre part, cette substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, et identifiée comme étant une substance présente dans le plasma peut être avantageusement au moins un ion métallique divalent positif autre que le Cal+ complexé à au moins une protéine 5 2908892 9 plasmatique capable d'interagir avec des ions métalliques divalents positifs. De telles protéines peuvent être I'AGP ou la céruloplasmine. De façon plus préférentielle, l'activité optimale est obtenue avec comme substances 5 potentialisant le dosage, une concentration définie de Cul+, additionnée d'une petite quantité de Zn2+ et de traces d'AGP. Cette combinaison semble permettre la présentation du facteur VIII :C dans sa forme la plus active. La présente invention porte donc également sur un procédé de dosage chromogénique cle l'activité du facteur VIII :C, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de 10 l'activité du facteur VIII :C est en majorité du Cul+, le reste étant du Zn2+ complexés à des traces d'AGP. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C est réalisé avec une majorité de cuivre 15 Cul+, le reste étant du Zn2+ et des traces de céruloplasmine. Dans d'autres modes de réalisations, le zinc utilisé en petites quantités est remplacé soit par du Mn2+, du Mg2+, du Lie+ ou un autre ion métallique divalent positif 20 II est rappelé que diverses protéines ou substances plasmatiques sont capables de fixer les ions divalents positifs. Ainsi de telles protéines plasmatiques comme l'AGP ou la céruloplasmine peuvent fixer un ou plusieurs ions métalliques tels que le Mn2+, le Mg2+, le Lie+ ou d'autres ions ayant des propriétés équivalentes. 25 Pour les dosages des fractions thérapeutiques particulièrement, la présente invention permet de pallier également aux défauts des techniques antérieures : le dosage selon la présente invention permet d'être réalisé sur la fraction thérapeutique en mesurant son activité physiologique réelle, et avec un étalonnage reproductible, et 30 ceci avec une réalisation plus simple en comparaison aux dosages réalisés dans l'art antérieur. En effet, la présente invention permet de détecter de façon reproductible et fiable, avec un niveau de sensibilité accru. 2908892 10 Lors de leurs recherches en filtration, les inventeurs ont observé un dosage nettement plus fiable et sensible lorsque la substance potentialisant le dosage est le cuivre ou ses sels ou une protéine capable d'interagir avec le cuivre telle que notamment la glycoprotéine acide al (AGP) ou la céruloplasmine additionnées ou 5 non du zinc Zn2+. La au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C et présente dans le plasma peut être obtenue à partir de plasma humain, bovin ou de toute autre origine. Les réactifs utilisés pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention 10 sont ceux décrits plus haut, déjà utilisés dans l'art antérieur et connus de l'homme du métier à savoir les réactifs appelés ici RI, R2 (ou une combinaison des réactifs R1 et R2), R3, R4 tels que définis précédemment apportant en quantités adéquates au moins la thrombine, le facteur IXa, des phospholipides, du calcium, le facteur X, le tampon de dilution des échantillons avec de l'albumine, le substrat chromogène 15 spécifique du facteur Xa et l'EDTA. De plus, dans la méthode de dosage manuelle, en point final , d'autres réactifs et matériels habituels et connus de l'homme du métier peuvent être nécessaires tels que l'eau distillée stérile, l'acide acétique à 20% ou l'acide citrique à 2%. Lors des 20 calibrations du facteur VIII :C, il est également utilisé des plasmas ou fractions concentrées en facteur VIII :C comme matériel de référence et lors des contrôles, des plasmas ou des fractions thérapeutiques dosées précisément par rapport au matériel de référence sont employés. Ces calibrations et contrôles sont établis par rapport aux standards internationaux ou de la pharmacopée. 25 Comme nous l'avons dit précédemment, le procédé de dosage est plus fiable lorsque l'on ajoute au moins une substance potentialisant ce dosage de l'activité du facteur VIII :C et cette au moins une substance est constituée de préférence par du cuivre ou ses sels et ceci dans des proportions optimales comprises entre 5 pg/ml et 50 30 pg/ml. Lorsque le zinc Zn2+ est utilisé en tant que au moins une substance potentialisant le dosage, ses proportions sont comprises entre 0.5 tag/ml et 25 pg/ml. 2908892 11 Lorsque le dosage est réalisé avec une protéine plasmatique, telle que l'AGP ou la céruloplasmine, en tant que substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, les proportions de protéine plasmatique sont comprises entre 0.1 pg/ml et 100 pg/ml. Ainsi, lorsque le dosage est réalisé avec la glycoprotéine acide al (AGP) en tant que substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, les proportions optimales d'AGP sont comprises entre 0.25 pg/ml et 2 pg/ml. 10 Les proportions optimales dans les dosages utilisant la céruloplasmine sont comprises entre 0.1 et 10 pg/ml. Lorsque la substance potentialisant le dosage du facteur VIII :C est une combinaison de Cul+, de Zn2+ complexés à des traces d'AGP, les concentrations utilisées pour le 15 dosage sont de l'ordre d'environ 15 pg/ml de Cul+, 0,5 à 5 pg/ml de Zn2+ et environ 1 pg/ml d'AGP. Cependant, ces quantités relatives doivent être optimisées pour la plus grande fiabilité du dosage. 20 D'autres sources testées (milieux biologiques ou non) ont également un effet potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C dans les fractions thérapeutiques. Il s'agit notamment des urines et du jus d'orange dans lesquels on retrouve également les substances potentialisantes présentes également dans le plasma. De même, le cuivre provenant d'oligosol ou de granules disponibles en 25 pharmacie (granions) ou du cuivre associé à l'AGP ou à la céruloplasmine est utilisable dans le procédé selon la présente invention. Cette dernière expérimentation ne montre pas de grandes différences dans les résultats en comparaison avec la céruloplasmine seule car cette protéine porte déjà 95% du cuivre circulant dans le sang. Les résultats de dosage obtenus avec de tels composés sont très satisfaisants 30 et plus fiables qu'avec les procédés de dosage de l'art antérieur. Le pH est également un facteur influent pour la sensibilité du dosage. Tous les dosages seront effectués avec un pH proche de 7.2 et à 37 C, ce qui équivaut aux conditions physiologiques. 5 2908892 12 La figure 4 illustre les courbes dose-réponse obtenues lors du dosage de l'activité du facteur VIII :C dans différents types d'échantillons avec ajout ou non d'au moins une substance potentialisant le dosage, telle que décrite précédemment. Sur la figure 4, 5 Tampon R4+ signifie que la au moins une substance potentialisant le dosage a été ajoutée au réactif de dilution 4 (R4) dans la mise en oeuvre du procédé. Cependant, cette au moins une substance peut être ajoutée dans l'un des réactifs du dosage (RI, R2, R3 ou R4) tels que cités précédemment mais elle peut également être ajoutée isolément. Les échantillons dosés apparaissant sur la figure 4 sont : 10 - le ReFacto, un facteur VIII :C recombinant décrit précédemment (noté VIII refacto sur la figure 4) le facteur VIII :C de la société Octapharma, qui est un facteur VIII :C d'extraction purifié par affinité à partir de plasmas (noté VIII octapharma sur la figure 4) 15 un Plasma pool Pontoise qui équivaut à un plasma normal. Chaque courbe permet d'illustrer que le dosage est plus sensible lorsque le R4+ est utilisé c'est-à-dire lorsque la au moins une substance de potentialisation est ajoutée dans le procédé de dosage de l'activité du facteur VIII :C selon la présente invention. 20 Des résultats identiques non montrés ont été obtenus lorsque la au moins une substance potentialisant le dosage telle que décrit précédemment a été ajoutée seule ou à l'un des réactifs RI, R2 ou R3 et à différentes étapes du procédé. Dans ces courbes de dosage chromogène, les pourcentages utilisés correspondent 25 à des valeurs relatives. Les valeurs données intègrent les dilutions utilisées pour le dosage. Le taux de 200% dans le dosage chromogène utilisé correspond à l'activité du facteur VIII :C dans le plasma pool Pontoise (plasma normal) ou le Refacto ou le facteur VIII :C purifié de la société Octapharma respectivement diilué à 1/20. La dilution standard du dosage chromogène étant le 1/40, un pool de plasma normal ou 30 le Refacto ou le facteur VIII :C purifié de la société Octapharma respectivement dilué à 1/40 correspond alors au point 100% de facteur VIII :C. Dans un plasma normal non dilué, la concentration de facteur VIII :C est comprise entrel00 à 200 ng/ml. Pour un concentré en facteur VIII :C, il est d'usage de faire au préalable une pré-dilution pour amener la concentration en facteur VIII :C dudit concentré à une 2908892 13 concentration comprise entre 100 ng/ml et 200 ng/ml , la concentration en facteur VIII :C d'un plasma normal non dilué, puis d'appliquer la dilution du dosage à 1/40 ou d'autres dilutions appropriées. 5 Pour réaliser un dosage fiable et reproductible, une gamme d'étalonnage est réalisée à l'aide d'un plasma calibrateur de concentration définie précisément. Ces techniques de réalisation d'une gamme d'étalonnage sont bien connues de l'homme du métier. 10 Les exemples de réalisation de l'invention ne sont fournis qu'à titre illustratif et ne sauraient en aucun cas limiter la portée de l'invention. En effet, par exemple, un tel procédé de dosage de l'activité du facteur VIII :C selon la présente invention peut bien entendu être utilisé pour doser le facteur VIII :C du plasma humain à tester, en particulier lors d'utilisation de dilutions importantes. 15 La présente invention concerne également un nécessaire de dosage chromogénique de l'activité du facteur de coagulation VIII :C en particulier dans les fractions thérapeutiques. Ce nécessaire fonctionne selon le procédé de dosage de la présente 20 invention. II est constitué au moins des réactifs (R1 à R4, avec une combinaison possible des réactifs R1 et R2) décrits précédemment pour la mise en oeuvre du procédé de la présente invention et apportés dans les proportionsadéquates. De plus, ce nécessaire est caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une 25 substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, ladite au moins une substance étant identifiée comme présente dans le plasma et étant constituée d'au moins un ion métallique autre que le Cal+. 30 Elle peut être obtenue à partir de plasma humain, bovin ou d'autres origines mais elle peut également être obtenue à partir de tout autre milieu, biologique ou non, pouvant la contenir tels que des urines ou des oligosols, ou des granions. La substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est au moins une substance étant identifiée comme une substance ionique métallique divalente 2908892 14 positive autre que le Cal+. Cette au moins une substance ionique métallique potentialisant le dosage est choisie parmi celles exposant deux charges positives telles que le Cul+ ou ses sels, le Zn2+ et ses sels, le Mn 2+ et ses sels, le Mg2+ et ses sels, le Lie+ et ses sels, ou d'autres ions métalliques ayant des propriétés 5 équivalentes à ceux-ci, à l'exception du Cal+ et ses sels. De plus, cette substance potentialisant le dosage peut être une combinaison de plusieurs ions métalliques divalents portant deux charges positives, telle qu'une combinaison du Cul+ et du Zn2+, du Cul+ et du Mn2+, du Cul+ et du Mg2+ , du Zn2+ et 10 du Mn 2+ ou d'autres combinaisons de deux, trois ou plus d'ions métalliques. D'autre part, cette substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, et identifiée comme étant une substance présente dans le plasma peut être avantageusement au moins un ion métallique divalent positif autre que le Cal+ complexé à au moins une protéine plasmatique capable d'interagir avec des ions 15 métalliques divalents positifs. De telles protéines peuvent être l'AGP ou la céruloplasmine. De façon préférentielle, l'activité optimale dans ce nécessaire de dosage chromogénique, est obtenue avec comme substances potentialisant le dosage, une 20 majorité de Cul+, le reste étant du Zn2+ et de traces d'AGP. Cette combinaison semble permettre la présentation du facteur VIII :C dans sa forme la plus active. La présente invention porte donc également sur un nécessaire de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C en particulier dans des fractions thérapeutiques, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de 25 l'activité du facteur VIII :C est une majorité de Cul+, le reste étant du Zn2+ et des traces d'AGP. Dans un autre mode réalisation de l'invention, le nécessaire de dosage utilisant le procédé de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C est réalisé avec 30 une concentration définie de Cul+ associée à de faibles quantités de Zn2+ et des traces de céruloplasmine. Dans d'autres modes de réalisations, le zinc utilisé en petites quantités est remplacé soit par du Mn2+, du Mg2+, du Lie+ ou un autre ion métallique divalent positif. 2908892 15 Il est rappelé que diverses protéines ou substances plasmatiques sont capables de fixer les ions métalliques divalents positifs. Les quantités relatives apportées de chacune des substances potentialisant le 5 dosage de l'activité du facteur VIII :C dans ce nécessaire sont identiques à celles utilisées dans le procédé de dosage décrit en première partie de la présente demande. Ledit nécessaire de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C selon la 10 présente invention est caractérisé en ce que la au moins une substance potentialisant le dosage est obtenue à partir de plasma humain ou anirnal. De plus, cette au moins une substance potentialisant le dosage selon la présente invention est obtenue à partir d'un milieu biologique la contenant tel que l'urine mais 15 elle peut également être obtenue à partir d'un milieu non biologique la contenant tel que le jus d'orange ou des gravions. Le nécessaire non utilisé se présente dans une forme lyophilisée à reconstituer avec 20 de l'eau distillée, stérile de préférence, dans des proportions et les conditions précisées dans les exemples de réalisation de l'invention. Les résultats de dosage de l'activité du facteur VIII :C dans les plasmas ou les fractions thérapeutiques sont exprimés en pourcentage ou en Unités Internationales 25 (UI), 1 Unité Internationale étant la teneur dans 1 ml de plasma normal, tel que défini dans les standards internationaux (WHO/NIBSC). Exemple de réalisation 30 Par définition, un pool de plasmas normaux correspond à 100% de facteur VIII :C. La dilution standard du dosage étant le 1/40, cette dilution au 1/40 correspond alors à 100% de facteur VIII :C et la dilution au 1/20 à 200%. Ceci sera rappelé plus loin dans la partie étalonnage. Dans ces conditions de dosage, 200% équivaut à environ 5 à 10 ng/ml de facteur VIII :C dans le pool de plasmas. 2908892 Réactifs : RI : Réactif 1 : Facteur X humain 5 Facteur X humain, lyophilisé en présence d'un inhibiteur de polymérisation de la fibrine 2 flacons (à reconstituer par 2,5 ml d'eau distillée). R2 : Réactif 2 : Réactif activateur (IXa û Thrombine û Calcium û Phospholipides) 10 Facteur IXa humain, en quantité constante et optimisée, contenant de la thrombine humaine, du calcium et des phospholipides synthétiques, lyophilisé : 2 flacons (à reconstituer par 2,5 ml d'eau distillée). R3 : Réactif 3 : SXa-11 15 Substrat chromogène spécifique du facteur Xa (SXa-11), lyophilisé : 2 flacons de 15 mg(à reconstituer par 2,5 ml d'eau distillée). R4 : Réactif 4 : Tampon Tris-BSA Tampon Tris - BSA, prêt à l'emploi. Contient 1% de BSA et de l'azide de sodium. (4 20 flacons de 25 ml). La substance de potentialisation du dosage selon l'invention peut être ajoutée seule ou à l'un de ces réactifs lors du dosage. De préférence, cette substance telle l'ion Cul+ est ajoutée dans une concentration comprise dans la plage de 5 pg/ml à 50 25 pg/ml au réactif 4 (R4) qui est alors nommé réactif 4+ (R4+). Réactifs et matériels nécessaires mais non fournis : Réactifs : Eau distillée. 30 Acide acétique (20%) ou acide citrique 2% (méthode en point final ). Plasmas de calibration (fournis par la Société Hyphen Biomed sous le nom BIOPHEN Plasma Calibrator et sous la référence 222101)). Plasmas contrôles normaux ou anormaux (fournis par la Société Hyphen Biomed sous le nom BIOPHEN Normal Control Plasma avec la référence 16 2908892 17 223201 et sous le nom BIOPHEN Abnormal Control Plasma avec pour référence 223301). Matériels : Spectrophotomètre ou automates pour dosages chromogéniques, à 405nm. 5 -Chronomètre. - Pipettes calibrées. Conservation : Les réactifs non encore utilisés doivent être conservés à 2-8 C, dans leur coffret 10 d'origine. Ils sont alors stables jusqu'à la date d'expiration indiquée sur l'étiquette. Préparation et stabilité des réactifs : RI : Réactif 1 : Facteur X humain 15 reconstituer chaque flacon par exactement 2,5 ml d'eau distillée. Laisser stabiliser 30 minutes à température ambiante (18-25 C). Agiter délicatement avant utilisation. Stabilité du facteur X reconstitué, conservé dans son flacon d'origine : ^ 72 heures à 2-8 C. 20 ^ 24 heures à température ambiante (18-25 C). ^ Ne pas congeler. R2 : Réactif 2 : Réactif activateur Reconstituer chaque flacon par exactement 2,5 ml d'eau distillée. 25 Laisser stabiliser 30 minutes à température ambiante (18-25 C). - Agiter délicatement avant utilisation. Stabilité du flacon reconstitué, conservé dans son flacon d'origine : ^ 72 heures à 2-8 C. ^ 24 heures à température ambiante (18-25 C). 30 ^ Ne pas congeler. R3 : Réactif 3 : Substrat chromogène spécifique du facteur Xa (SXaù11) -Reconstituer chaque flacon par exactement 2,5 ml d'eau distillée. 2908892 18 Laisser stabiliser la solution 30 minutes à température ambiante (18-25 C), en agitant de temps en temps. Bien agiter lors de la reconstitution (vortex) jusqu'à dissolution complète. Bien homogénéiser avant toute utilisation. 5 Stabilité du substrat reconstitué, conservé dans son flacon d'origine : ^ 3 mois à 2-8 C. ^ 7 jours à température ambiante (18-25 C). ^ Ne pas congeler. 10 R4 : Réactif 4 : Tampon TrisBSA Tampon prêt à l'emploi (25 ml par flacon). Agiter avant emploi. Ce réactif est stable jusqu'à la date de péremption, conservé à 2-8 C, à l'abri de toute contamination. 15 La substance de potentialisation du dosage selon l'invention est alors ajoutée seule ou à l'un de ces réactifs lors du dosage. De préférence, cette substance telle l'ion Cul+ est ajoutée dans une concentration comprise dans la plage de 5 pg/ml à 50 pg/ml au réactif 4 (R4) qui est alors nommé réactif 4+ (R4+). 20 Précautions : Pour assurer une bonne stabilité des réactifs, refermer les flacons après usage, avec leurs bouchons respectifs (capsule verte pour le facteur X (RI) rouge pour le mélange activateur avec IXa (R2), capsule jaune pour le 25 substrat SXa-11 (R3), et bouchon blanc pour le tampon (R4+)). Manipuler les réactifs avec précautions d'usage afin d'éviter toute contamination. Si le substrat jaunit, ceci indique la présence d'une contamination. II doit être rejeté et un nouveau flacon doit être utilisé. 30 Nota : Les flacons R1, R2 et R3 sont lyophilisés sous vide ; retirer délicatement le bouchon de lyophilisation pour s'affranchir de toute perte du produit à l'ouverture du flacon. 2908892 19 Suivant la méthode automatique utilisée , les réactifs peuvent être reconstitués avec des volumes différents de ceux indiqués. Dans tous les cas, les rapports respectifs de chaque réactif, R1, R2 et R3, préconisés dans la méthode manuelle (concentration finale dans le milieu réactionnel et volume 5 total), doivent être respectés. Utiliser uniquement les réactifs d'un même lot de coffrets. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots de coffrets pour réaliser un dosage. Les réactifs R1, R2 et R3 sont optimisés pour chaque lot de coffrets. Les études de vieillissement, réalisées à 30 C pendant 3 semaines, montrent 10 que les réactifs peuvent être expédiés à température ambiante, sans aucun dommage. Etalonnage : 15 Gamme haute (0 à 200%)_ La gamme haute est réalisée à l'aide d'un plasma calibrateur, de concentration ( C) en facteur VIII :C précisément définie, ou d'un pool de plasma citratés normaux (au moins 30 individus normaux, hommes et femmes, de 18 à 55 ans, sans traitement ou 20 pathologie connue), qui par définition titre 100% de facteur VIII :C. Le coffret BIOPHEN Plasma Calibrator, commercialisé par la société Flyphen BioMed sous la référence 222101,, peut être utilisé pour obtenir la gamme d'étalonnage. Le dosage intègre une dilution du plasma au 1/40. La dilution du plasma au 1/40 représente par définition 100% de facteur VIII :C. La gamme d'étalonnage va de 0 à 25 200% de facteur VIII :C. La dilution au 1/20 (en tampon Tris-BSA (R4+)) représente 200% de facteur VIII :C. Pour un calibrateur titrant C, le taux de 200% (dans les conditions du dosage) est obtenu en diluant ce calibrateur par le facteur suivant : 20 x (C) / 100. 30 A partir de cette solution, faire la gamme d'étalonnage suivante dans le diluant R4 + : % facteur VIII :C Etalon 200% facteur VIII :C ( l) Tampon Tris-BSA (R4+) ( l) 0 0 500 2908892 20 50 125 375 100 250 250 200 500 0 Pour les concentrés de facteur VIII :C, l'échantillon à tester doit être pré-dilué en R4+ de façon à cibler une concentration de facteur VIII :C inférieure à 2UI/ml. Il est recommandé d'effectuer une pré-dilution, afin d'amener la concentration théorique de 5 facteur VIII :C entre 0,2 et 2 UI/ml, puis une dilutionl/40 pour la réalisation du test. La concentration en facteur VIII :C attendue se situe ainsi entre 20 et 200%. Gamme basse (0 à 25%) 10 L'étalonnage peut être réalisé à l'aide d'un pool de plasmas citratés normaux ou d'un calibrateur commercial à taux de facteur VIII :C connu, soit C. Diluer ce plasma avec du plasma déficient en facteur VIII :C (commercialisé sous la référence DPO40A/K par la société Hyphen BioMed) de façon à obtenir un taux de 25% (le facteur de dilution en plasma déficient en facteur VIII :C est de 4 pour un pool normal, ou de 4 x 15 C/100 pour le calibrateur avec un taux C). Le dosage intègre une dilution du plasma au 1/10. La gamme d'étalonnage va de 0 à 25% de facteur VIII :C. La dilution au 1/10 (en tampon Tris-BSA (R4+)) représente 25% de facteur VIII :C. A partir de cette dilution faire la gamme d'étalonnage suivante dans le diluant R4 + : 20 fo Etalon 200% facteur VIII :C ( l) Tampon Tris-BSA (R4+) ( l) facteur VIII :C 0 0 500 6,25 125 375 12,5 250 250 25 500 0 ^ Réaliser la gamme d'étalonnage extemporanément afin d'éviter toute dégradation du facteur VIII :C. 25 Mode opératoire : 2908892 Méthode manuelle : Gamme haute : Diluer les échantillons à tester et les contrôles au 1/40 en tampon Tris-BSA (R4+). Pour les concentrés thérapeutiques où le facteur VIII :C est recherché, cibler une concentration en facteur VIII :C comprise entre 0,005 et 0,050 UI/ml dans une dilution finale (soit environ 20 à 200% de facteur VIII :C selon ce protocole opératoire) Gamme basse : Diluer les échantillons à tester et les contrôles au 1/10 en tampon Tris-BSA (R4+). Dans les puits d'une microplaque ou dans des tubes plastique incubé à 37 C, introduire : Réactifs Microplaque Tube plastique Calibrateur ou échantillons dilués à tester ou 50 l 100 l contrôles RI : Facteur X, préincubé à 37 C 50 100 R2 : Mélange IXa, préincubé à 37 C 50 l 100 l Mélanger et incuber à 37 C, pendant 5 minutes puis introduire : R3 : Substrat SXa-11 préincubé à 37 C 50 l 100 l Mélanger et incuber à 37 C, pendant 5 minutes exactement Arrêter la réaction en introduisant : Acide citrique (20g/L) ou 20% d'acide acétique 50 l 100 l Mélanger et mesurer la densité optique à 405 nm contre le blanc correspondant La couleur jaune obtenue stable pendant 2 heures. Le blanc échantillon est obtenu par mélange des réactifs dans l'ordre inverse de celui du test: Acide Citrique (20g/L), substrat SXa-11, échantillon dilué, facteur X, 20 mélange IXa. Mesurer la densité optique à 405 nm. La valeur du blanc mesurée doit être soustraite de l'absorbance obtenue pour le test. 21 5 10 15 2908892 Méthode automatisée : Les adaptations sur les divers automates présents sur le marché sont disponibles sur 5 demande. Pour toute adaptation, les rapports respectifs des réactifs et de l'échantillon testé et le protocole général de la méthode manuelle doivent être respectés. Nota : 10 Suivant les méthodes utilisées, si des volumes plus ou moins importants doivent être utilisés, respecter très exactement le rapport des volumes et des concentrations des différents réactifs constituant le milieu réactionnel. Résultats : 15 Pour la méthode en point final, tracer la droite étalon en portant en ordonnées la densité optique (DO) à 405 nm et en abscisses le taux de facteur VIII :C (%), en coordonnées bi-logarithmiques pour la gamme haute et en coordonnées linéaires pour la gamme basse. 20 La concentration en facteur VIII :C dans l'échantillon à doser est déduite directement de la courbe d'étalonnage ; les résultats sont exprimés en % de facteur VIII :C. • En technique automatique, les taux sont directement calculés par l'instrument en fonction des valeurs d'étalonnage. • La zone de mesure va de 5 à 200% pour la gamme haute, de 1 à 25% pour la 25 gamme basse. Si la dilution utilisée est 1/40 (gamme haute) ou 1/10 (gamme basse), le taux de facteur VIII :C est obtenu directement sur la courbe. Si d'autres dilutions sont utilisées, le taux mesuré, multiplié par le facteur de dilution D utilisé et divisé par 40, soit D/40, pour la gamme haute, et 10, soit D/10, pour la 30 gamme basse. Contrôle de qualité : 22 2908892 23 L'utilisation de plasmas de contrôle, titrés en facteur VIII :C, permet de valider la courbe d'étalonnage et la réactivité homogène du dosage, dans les différentes séries, pour un même lot de réactifs. Différents plasmas de contrôle sont disponibles ; 5 - Biophen Normal Control Plasma (commercialisé par la société Hyphen BioMed, sous la référence 223201) -Biophen Abnormal Control Plasma (commercialisé par la société Hyphen BioMed, sous la référence 223301) 10 Performances et caractéristiques : La limite de détection est déterminée en mesurant sur la courbe d'étalonnage le taux apparent de facteur VIII :C, correspondant à la DO moyenne obtenue pour un taux réactionnel sans facteur VIII :C incrémentée à 3 écart-types. Cette limite de détection est d'environ 10% en gamme haute et 2% en gamme basse. 15 Valeurs attendues : Le taux normal de facteur VIII :C varie de 50 à 200%. Ce taux dirninue dans les pathologies comme l'hémophilie A ou la maladie de Von Willebrand. Des 20 concentrations élevées de facteur VIII :C sont observées dans les atteintes hépatiques ou les pathologies inflammatoires. REVENDICATIONS 1- Procédé de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C en particulier dans des fractions thérapeutiques dans lequel le dosage de l'échantillon thérapeutique à tester contenant le facteur VIII :C purifié ou recombinant est réalisé à l'aide de réactifs apportant au moins la thrombine, le facteur IXa, des phospholipides, du calcium, le facteur X, le tampon de dilution des échantillons avec de l'albumine, le substrat chromogène spécifique du facteur Xa et l'EDTA, caractérisé en ce que ledit procédé de dosage comporte en outre une étape d'addition d'au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, identifiée comme étant présente dans le plasma, ladite substance étant constituée d'au moins un ion métallique à l'exception du Cal+. 2- Procédé de dosage chromogénique selon la revendication 1, 15 caractérisé en ce que la au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est au moins un ion métallique divalent positif autre que le Cal+. 3- Procédé de dosage chromogénique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur 20 VIII :C est au moins un ion métallique divalent exposant deux charges positives choisi parmi le Cul+ ou ses sels, le Zn2+ et ses sels, le Mn2+ et ses sels, le Mg2+ et ses sels, le Lie+ et ses sels, ou d'autres ions métalliques ayant des propriétés équivalentes à ceux-ci, à l'exception du Cal+ et ses sels. 25 4- Procédé de dosage chromogénique selon la revendication 3, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est une combinaison d'au moins deux ions métalliques divalents portant deux charges positives. 30 5- Procédé de dosage chromogénique selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est au moins un ion métallique divalent positif autre que le Cal+ complexé à au moins une protéine plasmatique telle que I'AGP (glycoprotéine acide a1) ou la céruloplasmine. 24 2908892 25- 6- Procédé de dosage chromogénique selon la revendication 5, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est constituée d'une majorité de Cul+, le reste étant constitué de Zn2+ et de 5 traces d'AGP. 7- Procédé de dosage chromogénique selon la revendication 5, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est constituée d'une majorité de Cul+, le reste étant constitué de Zn2+ et de 10 traces de céruloplasmine. 8- Procédé de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est obtenue à partir de plasma humain ou animal. 9- Procédé de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est obtenue à partir d'un milieu biologique la contenant tel que l'urine 10- Procédé de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est obtenue à partir d'un milieu non biologique la contenant tel que le jus d'orange ou des granions. 11- Nécessaire de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C en particulier dans des fractions thérapeutiques, pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant au moins les réactifs suivants - réactif 1 (RI) contenant du facteur X humain en excès, 2908892 2G réactif 2 (R2) contenant du facteur IXa humain, de la thrombine, du calcium et des phospholipides synthétiques sous forme de micelles en quantités constantes et optimisées, R1 et R2 pouvant être sous forme combinée potentiellement, 5 - réactif 3 (R3) contenant un substrat chromogène spécifique du facteur Xa réactif 4 (R4) constitué par un tampon Tris-BSA de dilution des échantillons en présence d'albumine, 1% BSA et de l'azide de sodium apportés dans les proportions adéquates et, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une substance potentialisant le 10 dosage de l'activité du facteur VIII :C, ladite au moins une substance potentialisant le dosage étant identifiée comme présente dans le plasma et étant constituée d'au moins un ion métallique autre que le Cal+. 12- Nécessaire de dosage chromogénique selon la revendication 11, 15 caractérisé en ce que la au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est au moins un ion métallique divalent positif autre que le Cal+. 13- Nécessaire de dosage chromogénique selon l'une des revendications 11 et 12, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur 20 VIII :C est au moins un ion métallique divalent positif choisi parmi le Cul+ ou ses sels, le Zn2+ et ses sels, le Mn 2+ et ses sels, le Mg2+ et ses sels, le Lie+ et ses sels, ou d'autres ions métalliques ayant des propriétés équivalentes à ceux-ci, à l'exception du Cal+ et ses sels. 25 14- Nécessaire de dosage chromogénique selon la revendication 13, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est une combinaison d'au moins deux ions métalliques divalents portant deux charges positives cités dans la revendication 13. 30 15- Nécessaire de dosage chromogénique selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est au moins un ion métallique divalent positif autre que le Cal+ complexé à au moins une protéine plasmatique telle que I'AGP ou la céruloplasmine. 2908892 27 16- Nécessaire de dosage chromogénique selon la revendication 15, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est constituée d'une majorité de Cul+, le reste étant constitué de Zn2+ et de traces d'ACP. 17- Nécessaire de dosage chromogénique selon la revendication 15, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est constituée d'une majorité définie de Cul+, le reste étant constitué de Zn2+ et de traces de céruloplasmine. 18- Nécessaire de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C selon l'une des revendications 11 à 17, caractérisé en ce que la au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est obtenue à partir de plasma humain ou animal. 15 19- Nécessaire de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C selon l'une des revendications 11 à 18, caractérisé en ce que la au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est obtenue à partir d'un milieu biologique la contenant tel que 20 l'urine 20- Nécessaire de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C selon l'une des revendications 11 à 18, caractérisé en ce que la au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité 25 du facteur VIII :C est obtenue à partir d'un milieu non biologique la contenant tel que le jus d'orange ou des granions. 5 10