FR 2907793 A1 20080502 FR 0654549 A 20061026 1 PROCEDE D'IDENTIFICATION MOLECULAIRE ET GENOTYPAGE DES BACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS La présente invention concerne une méthode d'identification moléculaire des différentes espèces de bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis et le génotypage desdites espèces par des techniques de détection et/ou d'amplification et séquençage d'acides nucléiques desdites bactéries à l'aide de sondes ou d'amorces oligonucléotidiques. Les bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis sont des bactéries bacillaires, mal colorées par la coloration de Gram et bien colorées par la coloration de Ziehl-Neelsen dont on reconnaît actuellement 5 espèces (figure 1) : Mycobacterium tuberculosis est une espèce strictement humaine, il s'agit d'un agent ubiquitaire de la tuberculose ; Mycobacterium africanum, qui comporte deux sous-types I et II, est une espèce strictement humaine, il s'agit d'un agent de la tuberculose en Afrique sub-saharienne ; le statut taxonomique de cette espèce est discuté, et le sous-type II est pratiquement indiscernable de l'espèce Mycobacterium tuberculosis en dehors de l'aspect macroscopique des colonies et de la décoloration du milieu au bromocrésol [Arnold C. et al. Single-nucleotide polymorphism-based differentiation and drug resistance detection in Mycobacterium tuberculosis from isolates or directly from sputum. Clin. Microbiol. Infect. 2005 ; 11:122-130 ; Niemann S, Harmsen D, Rusch-Gerdes S, Richter E. Differentiation of clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates by gyrB DNA sequence polymorphism analysis. J Clin Microbiol. 2000 ;38:3231-4] ; le sous-type II de l'espèce Mycobacterium africanum est maintenant considéré comme un variant phenotypique de l'espèce Mycobacterium tuberculosis [Nieman S. et al. The species Mycobacterium africanum in the light of new molecular markers. J. Clin. Microbiol. 2004 ; 42:3958-3962] ; Mycobacterium canettii est une espèce de réservoir inconnu, responsable en Afrique de tuberculose ganglionnaire et de tuberculose systémique chez les patients co-infectés par le virus de l'immunodéficience humaine ; Mycobacterium bovis (qui comporte trois sous-espèces, 2907793 2 Mycobacterium bovis ssp. bovis, Mycobacterium bovis ssp. caprae et Mycobacterium bovis souche vaccinale BCG (ci-après Mycobacterium ssp BCG)) est une espèce ubiquitaire animale, responsable de tuberculose chez les animaux à sang chaud, y compris l'homme ; Mycobacterium microti est une espèce 5 ubiquitaire animale responsable de tuberculose chez les animaux à sang chaud, et exceptionnellement de tuberculose humaine [Pfyffer GE, Brown-Elliott BA, Wallace RJ, Jr. Mycobacterium : general characteristics, isolation, and staining procedures. In : Murray PR, baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH : Manual of Clinical Microbiology 8th Edition, American 10 Society for Microbiology, Washington DC, 2003, pp. 532-559]. Ces espèces sont fréquemment cultivées à partir de prélèvements cliniques vétérinaires et de prélèvements cliniques humains. Chez l'homme, ces différentes espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis sont responsables de tuberculose communautaire et exceptionnellement de tuberculose 15 nosocomiale. Toutefois, l'espèce Mycobacterium tuberculosis est la souche la plus fréquemment isolée dans les cas de tuberculose humaine. La tuberculose est une maladie infectieuse contagieuse par transmission par voie aérienne, spontanément mortelle, curable par traitement antibiotique comportant 3 à 4 antibiotiques différents, prolongé 20 pendant plusieurs mois. Un problème émergent est celui des souches de l'espèce Mycobacterium tuberculosis dites multi-résistantes, c'est-à-dire résistantes à la rifampicine et à au moins un autre antibiotique antituberculeux. Ces souches sont plus difficiles à traiter et sont associées à un mauvais pronostic de la tuberculose. L'espèce Mycobacterium tuberculosis est 25 une bactérie persistante dans l'organisme du fait d'une immunité non-stérilisante, c'est-à-dire que les bactéries transmises par voie aérienne demeurent vivantes et conservent une capacité à se multiplier, dans des gîtes ganglionnaires durant la vie entière. Ces bactéries quiescentes sont capables de se multiplier et de provoquer une tuberculose maladie lors 30 d'une diminution de l'immunité de la personne. Ces différentes espèces bactériennes posent le problème de leur détection dans les prélèvements pathologiques chez l'homme, et de leur 2907793 3 identification au niveau de l'espèce et de la sous-espèce et de leur génotypage au niveau des souches lorsqu'elles ont été isolées à partir desdits prélèvements. Les méthodes conventionnelles de détection reposent en effet sur la mise en évidence de bactéries bacillaires Ziehl positif, à 5 l'examen direct du produit pathologique. Il est cependant connu que cette détection microscopique des bactéries du genre Mycobacterium dans les prélèvements cliniques a un seuil de sensibilité de 104 CFU/ml. Il est donc tout à fait possible qu'un prélèvement pathologique chez l'homme ou chez l'animal contienne une des espèces considérées qui ne soit pas détectée à 10 l'examen microscopique direct de ce prélèvement pathologique. Lorsque qu'une bactérie d'une des espèces considérées est isolée au laboratoire, les méthodes conventionnelles d'identification phénotypique sont les plus couramment utilisées pour l'identification des bactéries des espèces du genre Mycobacterium. Elles comprennent l'étude du métabolisme 15 du glycérol et du pyruvate sur milieu de Lowenstein-Jensen, l'étude du caractère microaérophile, l'accumulation de la niacine, l'activité nitrateréductase, l'aspect des colonies et l'étude de la résistance au thiophen-2-carboxylic-acid hydrazide et au pyrazinamide. Sur ce plan, le degré d'identification en pratique courante est variable. Il est reconnu qu'il existe 20 un certain degré de subjectivité dans l'appréciation des résultats des tests phénotypiques, en particulier pour apprécier l'aspect des colonies qui peut changer en fonction de la virulence de la souche et de sa résistance aux antibiotiques [Kamerbeek J et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. 25 J Clin Microbiol. 1997; 35:907-914]. Parmi les méthodes phénotypiques, l'analyse des acides mycoliques de paroi par chromatographie liquide ne permet de distinguer que Mycobacterium bovis souche BCG des autres espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis [Floyd M. Separation of Mycobacterium bovis BCG from Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by using 30 high-performance liquid chromatography of mycolic acids. J Clin Microbiol. 1992 ; 30 :1327-1330]. 2907793 4 Plusieurs systèmes moléculaires ont été développés pour l'identification des différentes espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis mais aucune méthode ne permet actuellement de réaliser l'identification d'espèce en une seule étape par l'analyse de séquences 5 génomiques. En effet, la méthode princeps basée sur la séquence du gène 16S ARNr codant l'ARN ribosomal 16S, est commercialisée sous forme d'un système d'hybridation de sonde froide AccuProbe (Gen-Probe, San Diego, CA) très utilisé pour la détection et l'identification des bactéries du 10 complexe Mycobacterium tuberculosis. Cependant, le fait que la séquence du gène 16S ARNr comme celle de l'ITS 16S-23S [Frothingham R. et al. Extensive DNA sequence conservation throughout the Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin. Microbiol. 1994 ; 32:1639-1643] soient rigoureusement identiques pour les différentes espèces du complexe, ne 15 permet pas à ces systèmes de distinguer chacune des cinq espèces du complexe [Kirschner P. Genotypic identification of mycobacteria by nucleic acid sequence determination : report of a twoyear experience in a clinical laboratory. J Clin Microbiol. 1993 ; 31 :2882-2889]. Un deuxième système d'hybridation basé sur la séquence du gène 23S 20 ARNr, commercialisé sous le nom de GenoType MTBC (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Allemagne) permet de distinguer M. tuberculosis, M. bovis ssp. bovis et M. africanum sous-type I [Richter E. et al. Usefulness of the GenoType MTBC assay for differentiating species of the Mycobacterium tuberculosis complex in cultures obtained from clinical specimens. J Clin 25 Microbiol. 2004; 42:4303-4306], mais ne permet pas de distinguer les autres espèces de ce complexe. De même, la séquence du gène rpoB est identique pour les différentes espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis et ne permet donc pas l'identification d'espèce [Arnold C. et al. Single-nucleotide polymorphism- 30 based differentiation and drug resistance detection in Mycobacterium tuberculosis from isolates or directly from sputum. Clin. Microbiol. Infect. 2907793 5 2005 ; 11:122]. Les seules variations de séquence rpoB connues sont liées à la résistance à la Rifampicine chez Mycobacterium tuberculosis. L'analyse de la séquence du gène oxyR permet de différencier uniquement l'espèce Mycobacterium bovis au sein du complexe Mycobacterium 5 tuberculosis [Sreevatsan S. et al. Identification of a polymorphic nucleotide in oxyR specific for Mycobacterium bovis. J Clin Microbiol 1996; 34:2007-2010]. De la même façon, la séquence partielle du gène hupB permet d'identifier Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium bovis [Prabhakar S. et 10 al. Use of the hupB gene encoding a histone-like protein of Mycobacterium tuberculosis as a target for detection and differentiation of M. tuberculosis and M. bovis. J Clin Microbiol 2004; 42:2724-2732]. L'analyse des profils de régions de différences ("DR") qui sont des régions répétées, obtenus par amplification permet de différencier les 15 différentes espèces du complexe par différence de taille des amplifiats obtenus [Parsons LM et al. Rapid and simple approach for identification of Mycobacterium tuberculosis complex isolates by PCR-based genomic deletion analysis. J Clin Microbiol. 2002; 40:2339-45]. Egalement, l'analyse des profils des restriction du gène gyrB permet de distinguer Mycobacterium 20 tuberculosis et Mycobacterium bovis [Chimara E. et al. Mycobacterium tuberculosis complex differentiation using gyrB-restriction fragment length polymorphism analysis. Mem Inst Oswaldo Cruz 2004; 99:745-748]. Cependant les résultats des analyses des profils ne peuvent pas être comparés d'une expérience aux suivantes car les conditions de migration 25 des gels modifient sensiblement les profils obtenus. Il faut donc introduire systématiquement des témoins dans chaque expérience. Les résultats sont difficilement exportables et comparables d'un laboratoire à un autre. Le séquençage du gène gyrB permet de distinger M. tuberculosis, M. bovis, M. african type I et M. microti [Niemann S, Harmsen D, Rusch-Gerdes 30 S, Richter E. Differentiation of clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates by gyrB DNA sequence polymorphism analysis. J Clin 2907793 6 Microbiol. 2000 ;38:3231-4]. De façon dérivée du séquençage, l'analyse des profils de restriction du gène gyrB amplifié ou l'analyse des singlenucleotide polymorphims (SNP) par pyroséquençage [Arnold C. et al. Single-nucleotide polymorphism-based differentiation and drug resistance 5 detection in Mycobacterium tuberculosis from isolates or directly from sputum. Clin. Microbiol. Infect. 2005 ; 11:122] permettent également de distinguer les mêmes espèces. Cependant, l'utilisation du gène gyrB ne permet pas de distinguer M. tuberculosis, M. africanum type II et M. canettii. Un premier but de l'invention est de fournir une méthode 10 d'identification moléculaire des différentes espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis reposant sur l'analyse de séquences nucléotidiques du génome desdites bactéries. Lorsqu'un isolat clinique a été identifié comme appartenant à une espèce, notamment l'espèce Mycobacterium tuberculosis, il est utile de 15 disposer, en outre, d'un système de génotypage permettant de regrouper cet isolat avec d'autres isolats réalisés chez des patients différents au sein d'une même souche, c'est-à-dire de reconnaître les isolats clonaux, issus d'une même souche de ladite espèce, notamment Mycobacterium tuberculosis. Les différentes techniques de génotypage contribuent ainsi à distinguer, 20 chez un patient donné, la ré-infection (liée à une nouvelle souche) de la rechute (liée à une souche unique, latente dans un site ganglionnaire) de tuberculose. De même, le génotypage contribue à déterminer les patients exposés à une source unique devant des cas groupés (cas familiaux par exemple) et à l'étude des épidémies ; l'utilisation de techniques de 25 génotypage permet ainsi de démasquer des épidémies passées inaperçues par les méthodes purement cliniques et épidémiologiques. Enfin, le génotypage permet de démasquer les contaminations des prélèvements au laboratoire, qui sont une source de résultats faux-positifs. En effet, les méthodes actuelles reposent sur l'analyse de profils obtenus : 30 - soit par restriction de l'ADN chromosomique : méthode par électrophorèse sur gel par champ pulsé ("pulsed-field gel electrophoresis") 2907793 7 après restriction par des enzymes à basse fréquence de coupure [Zhang, Y., Mazurek, GH., Cave, MD., Eisnach, KD., Pang, Y., Murphy, DT., and RJ. Wallace. 1992. DNA polymorphism in strain of Mycobacterium tuberculosis analysed by Pulsed Gel Electrophoresis a tool for epidemiolgy. 5 J. Clin. Microbiol. 30: 1551-1556; Singh, SP., Salamon, H., Lahti, CJ., Farid-Moyer, M., And PM. Small. 1999. Use of Pulsed Field Gel Electrophoresis for molecular epidemiologic and population genetic studies of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 6: 1927-1931] et méthode d'hybridation de sonde de l'élément d'insertion IS61 10 [Eisenach, 10 KD., Crawford, JT., and JH. Bates. 1988. Repetitive DNA sequences as probes of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 11: 2240-2245; Van Embden, JD., Caves, MD., Crawford, JT., Dale, JW., Eisenach, KD., Gicquel, B., Hermans, P., Martin, C. Mc., Adam, R., and TM. Shinnick. 1993. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA 15 fingerprinting recommendation for standardised methodology. J Clin Microbiol. 31:406-409]; - soit par amplification d'éléments répétés dans des régions du génome appelées "direct repeat regions" (spoligotyping) [Kamerbeek, J., Schouls, L., Kolk, A., Van Agterveld, M., Van soolingen, D., Kuijper, S., 20 Bunschoten, A., Molhuizen, H., Shaw, R., Goyal, M., and JD. Van Embden. 1997. Simultaneous detection and strain differentiation of mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J. Clin. Microbiol. 35:907-914; Dale, JW., Brittain, D., Cataldi, AA., Cousins, D., Crawford, JT., Driscoll, J., Heersma, H., Lillebaek, T., Quitugua, T., Rastogi ,N., Skuce, RA., Sola, 25 C., Van soolingen, D., Vincent, V.,and al. Spacer oligonucleotide typing of bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex: recommendations for standardised nomenclature. 2001. Int J Tuberc Lung Dis. 5:216-219], ou par amplification de "variable number tandem repeats" (VNTR) dans des régions disséminées dans l'ensemble du génome, ou encore par 30 amplification de "mycobacterial interspersed repeat units" (MIRU) [Frothingham, R., Meeker-O'Connel. WA. 1998. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem 2907793 8 DNA repeats. Microbiology. 144:1189-96 ; Mazars, E., Lesiean, S., Banuls, AL., Gilbert, M., Vincent, V., Gicquel, B., Tibayrenc, M., Locht, C.,and P. Supply. 2001. High-resolution minisatellite-based typing as a portable approach to global analysis of Mycobacterium tuberculosis molecular 5 epidemiology. Proc Natl Acad Sci USA. 98:1901-1906 ; Supply, P., Pan, X., Stockbaner, KE., Connel, ND., Kreiswirth, BN., Whittman, TS., and JM. Musser. 2001. Restricted structural gene polymorphism in the Mycobacterium tuberculosis complex indicates evolutionarily recent global dissimination. J. Clin. Microbiol. 39:3563-3571; Gibson, A., Brown, T., 10 Baker, L.,and F Drobniewski. 2005. Can 15-locus mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat analysis provide insight into the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Appl. Environ. Microbiol. 71:8207-13]. Un concept de génotypage par analyse de zones intergéniques a déjà 15 été appliqué à d'autres espèces bactériennes, telles que Yersinia pestis [Drancourt M, Roux V, Dang LV, Tran-Hung L, Castex D, Chenal-Francisque V, Ogata H, Fournier PE, Crubezy E, Raoult D. Genotyping, Orientalis-like Yersinia pestis, and plague pandemics. Emerg Infect Dis. 2004 Sep;10(9):1585-92], Bartonella quintana [Foucault C, La Scola B, 20 Lindroos H, Andersson SG, Raoult D. Multispacer typing technique for sequence-based typing of Bartonella quintana. J Clin Microbiol. 2005 Jan;43(1):41-8] , Bartonella henselae [Li W, Chomel BB, Maruyama S, Guptil L, Sander A, Raoult D, Fournier PE. Multispacer typing to study the genotypic distribution of Bartonella henselae populations. J Clin Microbiol. 25 2006 Jul;44(7):2499-506.], Rickettsia prowaekii [Zhu Y, Fournier PE, Ogata H, Raoult D. Multispacer typing of Rickettsia prowaekii enabling epidemiological studies of epidemic typhus. J Clin Microbiol. 2005 Sep;43(9):4708-12], Rickettisia conorii [Fournier PE, Zhu Y, Ogata H, Raoult D. Use of highly variable intergenic spacer sequences for multispacer 30 typing of Rickettsia conorii strains. J Clin Microbiol. 2004 Dec;42(12):5757-66], Coxiella burnetii [Glazunova O, Roux V, Freylikman O, Sekeyova Z, Fournous G, Tyczka J, Tokarevich N, Kovacava E, Marrie 2907793 9 TJ, Raoult D. Coxiella burnetii genotyping. Emerg Infect Dis. 2005 Aug;11(8):1211-7]. Mais, les zones intergéniques concernées n'étaient pas applicables aux espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis, et en outre, ces 5 méthodes de génotypage permettaient de réaliser seulement le génotypage des isolats d'une même espèce bactérienne, sans différencier les espèces de bactéries d'un même genre. Il n'existe actuellement aucune technique de génotypage des espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis et notamment de l'espèce 10 Mycobacterium tuberculosis par analyse de séquence. Un deuxième but de la présente invention est donc de fournir une méthode d'identification moléculaire qui permette, en outre, le génotypage des isolats et souches d'une espèce du complexe Mycobacterium tuberculosis et notamment de l'espèce Mycobacterium tuberculosis reposant sur l'analyse de 15 séquences nucléotides et, plus particulièrement fournir une méthode de génotypage plus discriminante que les méthodes actuellement disponibles. Les inventeurs ont déterminé selon la présente invention, un système appelé "Multi Spacer Typing" (abrégé ci-après en MST) constitué d'une série de fragments d'acides nucléiques de zones intergéniques non codantes 20 du génome des bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis, lesdits fragments constituant des marqueurs génétiques permettant l'identification des différentes espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis et le génotypage des isolats d'une même espèce du complexe Mycobacterium tuberculosis, et notamment de l'espèce Mycobacterium tuberculosis, par 25 l'analyse des séquences desdits fragments des zones appelées MST. Ces régions intergéniques non codantes qui ne codent pas pour des protéines ni pour des ARNs, sont aussi appelées ci-après "spacers". Pour chaque fragment desdites zones intergéniques, plusieurs événements génétiques de même signification évolutive peuvent distinguer les différents variants 30 génotypiques : mutation ponctuelle, délétion ou insertion. La combinaison des différents variants génotypiques de chaque fragment de zone 2907793 10 intergénique constitue un code qui permet d'identifier les espèces au sein du complexe Mycobacterium tuberculosis. D'autre part, l'analyse comparative des séquences de plusieurs fragments de "spacers", simultanée et combinée de plusieurs, notamment de 2 à 8 séquences de "spacers", qui sont des 5 régions génomiques situées entre les gènes bactériens, e+ permet de réaliser le génotypage des isolats au sein d'une même espèce et, notamment de l'espèce Mycobacterium tuberculosis. Avant d'exposer plus en détail l'invention, différents termes, utilisés dans la description et les revendications, sont définis ci-après : 10 - Par "acide nucléique extrait de bactéries" on entend soit l'acide nucléique total, soit l'ADN génomique, soit les ARN messagers, soit encore l'ADN obtenu à partir de la transcription inverse des ARN messagers. - Un "fragment nucléotidique" ou un "oligonucléotide" sont deux 15 termes synonymes désignant un enchaînement de motifs nucléotidiques caractérisé par une séquence informationnelle des acides nucléiques naturels (ou éventuellement modifiés) et susceptibles de s'hybrider, comme les acides nucléiques naturels, avec un fragment nucléotidique complémentaire ou sensiblement complémentaire, dans des conditions 20 prédéterminées de stringence stricte. L'enchaînement peut contenir des motifs nucléotidiques de structure différente de celle des acides nucléiques naturels. Un fragment nucléotidique (ou oligonucléotide) peut contenir par exemple jusqu'à 100 motifs nucléotidiques. Il contient généralement au moins 8, et en particulier au moins 12 motifs nucléotidiques, en particulier 25 de 18 à 35, et peut être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique. -Un motif nucléotidique est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée choisie parmi l'adénine 30 (A), la guanine (G), l'uracile (U), la cytosine (C), la thymine (T) ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments 2907793 11 constitutifs précédents ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, qui peut s'hydrider avec toute base A, T, U, C ou G, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine ou 5 toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide [Nielsen PE et al. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science. 1991 ; 254:1497-1500], soit encore au niveau du groupement phosphate, par 10 exemple par remplacement par des esters choisis notamment parmi les diphosphates, les alkylphosphonates et les phosphorothioates. - Par "hybridation", on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de s'associer 15 par des liaisons hydrogène stables et spécifiques, pour former un double brin. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la "stringence", c'est à dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est fonction notamment de la composition en bases d'un duplex 20 sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction d'hybridation, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La 25 stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépend notamment des sondes utilisées. Toutes ces données sont bien connues de l'homme de l'art et les conditions appropriées peuvent éventuellement être déterminées dans chaque cas par des expériences de routine. En général, selon la longueur des sondes utilisées, 30 la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 65 C, en particulier entre 35 et 65 C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à 1 M. 2907793 12 - Une "sonde" est un fragment nucléotidique possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique ayant, dans le cas présent, une séquence nucléotidique comprise soit dans un ARN messager, soit dans 5 un ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN messager, produit de transcription; une sonde peut être utilisée à des fins de diagnostic (notamment sondes de capture ou de détection) ou à des fins de thérapie, -Une "sonde de capture" est une sonde immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, par exemple 10 par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur un solide. Des exemples de supports comprennent les plaques de microtitration et les puces à ADN. -Une "sonde de détection" est une sonde marquée au moyen d'un agent marqueur choisi par exemple parmi les isotopes radioactifs, les 15 enzymes, en particulier les enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline), les composés chimiques chromophores, les composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, les analogues des bases nucléotidiques et les ligands tels que la biotine. 20 - Une "sonde d'espèce" est une sonde permettant l'identification spécifique de l'espèce d'une bactérie. - Une "sonde de genre" est une sonde permettant l'identification spécifique du genre d'une bactérie. - Une "amorce" est une sonde comprenant par exemple 10 à 100, de 25 préférence 12 à 35, de préférence encore 18 à 30 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour les réactions d'amplification enzymatique. - Par "amplification" ou "réaction d'amplification", on entend une réaction de polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique 2907793 13 d'amplification telle que la PCR, initiée par des oligonucléotides amorces et utilisant une ADN polymérase. - Par "séquençage" ou "réaction de séquençage", on entend l'obtention de la séquence d'un fragment d'acide nucléique ou d'un gène 5 complet par la technique de Sanger, à savoir un procédé de polymérisation abortive à partir d'amorces oligonucléotidiques et utilisant lesdits didésoxynucléotides [Sanger F, Coulson AR. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J.Mol.Biol. 1975 ; 94 : 441] ou séquençage par incoporation sucessive de 10 bases avec libération de pyrophosphate dit "pyroséquençage" [Diggle MA, Clarke SC. Related Articles, Links Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light. Mol Biotechnol. 2004 ; 28:129-37] ou hybridations multiples avec des sondes multiples fixées sur support solide telles qu'utilisées dans les puces ADN par exemple. 15 - par "génotypage", on entend une méthode permettant d'identifier une souche bactérienne donnée par la caractérisation de positions nucléotidiques spécifiques, - par "taux de similarité", on entend un pourcentage d'identité de séquence, c'est-àdire un pourcentage de nucléotides de la séquence qui 20 sont identiques et à la même position entre deux séquences, les deux séquences étant alignées à partir de leurs extrémités 5', - par "séquence spécifique d'une bactérie d'une espèce donnée ou d'une bactérie d'un genre donné", on entend que ladite séquence peut constituer une sonde ou amorce d'espèce ou respectivement sonde ou 25 amorce de genre, c'est-à-dire capable de s'hybrider avec ou respectivement d'amplifier uniquement le génome d'une dite bactérie de ladite espèce ou dudit genre dans certaines conditions d'hybridation ou respectivement d'amplification. La présente invention fournit des séquences d'acides nucléiques 30 permettant l'identification de chaque espèce du complexe Mycobacterium 2907793 14 tuberculosis, et le génotypage de chaque souche au sein de chaque espèce du complexeMycobacterium tuberculosis et, notamment, de l'espèce Mycobacterium tuberculosis. Pour ce faire, la présente invention a pour objet un fragment isolé 5 d'acide nucléique de zone intergénique non codante d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis choisi parmi les fragments d'acides nucléiques des 16 zones intergéniques MST1 à MST16 amplifiables par des couples d'amorces constituées par des oligonucléotides de séquences consistant en au moins 10 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 10 18 nucléotides consécutifs, tirés des séquences SEQ. ID n 1 à 32, ou de préférence encore consistant dans lesdites séquences SEQ. ID. n 1 à 32 suivantes du listage de séquences et leurs séquences complémentaires, avec les couples d'amorces 5', 3', tirés des séquences suivantes pour les fragments suivants 15 - pour le fragment de la zone intergénique MST1 • amorce 5'= SEQ. ID. n 1 • amorce 3'= SEQ. ID. n 2 - pour le fragment de la zone intergénique MST2 • amorce 5'= SEQ. ID. n 3 20 • amorce 3'= SEQ. ID. n 4 - pour le fragment de la zone intergénique MST3 • amorce 5'= SEQ. ID. n 5 • amorce 3'= SEQ. ID. n 6 - pour le fragment de la zone intergénique MST4 : 25 • amorce 5'= SEQ. ID. n 7 2907793 15 • amorce 3'= SEQ. ID. n 8 - pour le fragment de la zone intergénique MST5 • amorce 5'= SEQ. ID. n 9 • amorce 3'= SEQ. ID. n 10 5 - pour le fragment de la zone intergénique MST6 • amorce 5'= SEQ. ID. n 11 • amorce 3'= SEQ. ID. n 12 - pour le fragment de la zone intergénique MST7 • amorce 5'= SEQ. ID. n 13 10 • amorce 3'= SEQ. ID. n 14 - pour le fragment de la zone intergénique MST8 • amorce 5'= SEQ. ID. n 15 • amorce 3'= SEQ. ID. n 16 - pour le fragment de la zone intergénique MST9 : 15 • amorce 5'= SEQ. ID. n 17 • amorce 3'= SEQ. ID. n 18 pour le fragment de la zone intergénique MSTIO • amorce 5'= SEQ. ID. n 19 • amorce 3'= SEQ. ID. n 20 20 - pour le fragment de la zone intergénique MST11 ^ amorce 5'= SEQ. ID. n 21 2907793 16 • amorce 3'= SEQ. ID. n 22 - pour le fragment de la zone intergénique MST12 • amorce 5'= SEQ. ID. n 23 • amorce 3'= SEQ. ID. n 24 5 - pour le fragment de la zone intergénique MST13 • amorce 5'= SEQ. ID. n 25 • amorce 3'= SEQ. ID. n 26 - pour le fragment de la zone intergénique MST14 : • amorce 5'= SEQ. ID. n 27 10 • amorce 3'= SEQ. ID. n 28 - pour le fragment de la zone intergénique MST15 • amorce 5'= SEQ. ID. n 29 • amorce 3'= SEQ. ID. n 30 - pour le fragment de la zone intergénique MST16 : 15 • amorce 5'= SEQ. ID. n 31 ^ amorce 3'= SEQ. ID. n 32 On comprend que le signe "_" signifie ici que l'amorce 5', 3', mentionnée est tirée de la séquence SEQ. ID. n i mentionnée ci-dessus. Les amorces ci-dessus permettent d'amplifier les fragments 20 respectivement des zones intergéniques MSTI à MST16 comme indiqué et ce, pour toutes les bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis. 2907793 17 Dans la méthode d'identification selon la présente invention explicitée ci-après, ces fragments permettent l'identification d'espèces au sein du complexe Mycobacterium tuberculosis, à savoir : Mycobacterium tuberculosis ; Mycobacterium africanum, qui comporte deux sous-types I et II ; 5 Mycobacterium canettii; Mycobacterium bovis (qui comporte trois sous-espèces, Mycobacterium bovis ssp. bovis, Mycobacterium bovis ssp. caprae et Mycobacterium bovis souches vaccinales BCG et Mycobacterium microti. Mais, en pratique, les infections humaines sont principalement dues à Mycobacterium tuberculosis ; et plus rarement Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis ssp bovis et les 10 souches vaccinales BCG de Mycobacterium bovis. Plus particulièrement, la présente invention fournit un fragment isolé d'acide nucléique de zone intergénique non codante d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis choisi parmi les fragments d'acides nucléiques des 16 zones intergéniques MST1 à MST16 selon l'invention, 15 caractérisé en ce qu'il présente une séquence choisie parmi les séquences SEQ. ID. n 33 à 79 du listage de séquences et leurs séquences complémentaires, avec les séquences suivantes pour les espèces suivantes : - pour l'espèce Mycobacterium tuberculosis : ^ les séquences du fragment de la zone intergénique MST1, 20 consistant dans les 4 séquences SEQ. ID. n 52 à 55, ^ les séquences du fragment de la zone intergénique MST2, consistant dans les 3 séquences SEQ. ID. n 56 à 58, ^ les séquences du fragment de la zone intergénique MST3, consistant dans les 2 séquences SEQ. ID. n 59-60, 25 • les séquences du fragment de la zone intergénique MST4, consistant dans les 5 séquences SEQ. ID. n 61 à 65, ^ les séquences du fragment de la zone intergénique MST8, consistant dans les 3 séquences SEQ. ID. n 66 à 68, 2907793 18 ^ les séquences du fragment de la zone intergénique MST11, consistant dans les 4 séquences SEQ. ID. n 33 à 36, ^ les séquences du fragment de la zone intergénique MST12, consistant dans les 7 séquences SEQ. ID. n 41 à 47, 5 • les séquences du fragment de la zone intergénique MST13, consistant dans les 11 séquences SEQ. ID. n 69 à 8a 79, - pour Mycobacterium africanum : ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 37, et 10 • la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 48, - pour Mycobacterium bovis ssp bovis : ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 38, et 15 • la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 49, - pour Mycobacterium bovis ssp BCG : ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 39, et 20 • la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 50, - pour Mycobacterium canettii : ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 40, et 2907793 19 la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 51. Les séquences SEQ. ID. n 33 à 79 ci-dessus sont amplifiables par les couples d'amorces indiqués précédemment pour les fragments de Jones intergéniques MST1 à 5 MST 16 concernées. La présente invention a également pour objet un oligonucléotide apte à servir d'amorce d'amplification d'un fragment d'acide nucléique de dite zone intergénique choisi parmi les fragments d'acide nucléique des 16 zones intergéniques MST1 à MST16 selon l'invention, caractérisé en ce 10 qu'il présente une séquence comprenant au moins 10, de préférence de 18 à 35 nucléotides consécutifs situés à l'une des extrémités 5' ou 3' des séquences desdits fragments de zones intergéniques MST1 à MST16. Plus particulièrement, la présente invention fournit un oligonucléotide amorce selon l'invention, caractérisé en ce qu'il présente 15 une séquence comprenant au moins 10, de préférence au moins 18 nucléotides consécutifs inclus dans l'une des séquences SEQ. ID. n 1 à 32, de préférence consistant dans l'une des séquences SEQ. ID. n 1 à 32 du listage de séquences et leurs séquences complémentaires. La présente invention fournit donc, plus particulièrement, des 20 oligonucléotides présentant des séquences tirées des séquences SEQ. ID. n 33 à 79 et leurs séquences complémentaires situées aux extrémités 5' et 3' desdites séquences SEQ. ID. n 33 à 79, ledit oligonucléotide étant apte à servir d'amorce d'amplification desdites séquences SEQ. ID. n 33 à 79. Plus particulièrement encore, la présente invention fournit des 25 oligonucléotides présentant des séquences nucléotidiques consistant dans au moins 8 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 18, inclus dans l'une des séquences SEQ. ID. n 1 à 16 et 21 à 26 et leurs séquences complémentaires, avec les séquences suivantes pour les fragments amplifiés suivants, lesdits fragments étant amplifiés par les amorces 5', 3' 30 mentionnées précédemment : 2907793 20 - pour le fragment de la zone intergénique MSTI : SEQ. ID n 52 à 55 - pour le fragment de la zone intergénique MST2 : SEQ. ID n 56 à 58 5 - pour le fragment de la zone intergénique MST3 : SEQ. ID n 59 à 60 - pour le fragment de la zone intergénique MST4 : SEQ. ID n 61 à 65 - pour le fragment de la zone intergénique MST8 : SEQ. ID n 66 à 10 68 - pour le fragment de la zone intergénique MST11 : SEQ. ID n 33 à 40 - pour le fragment de la zone intergénique MST12 : SEQ. ID n 41 à 51 15 - pour le fragment de la zone intergénique MST13 : SEQ. ID n 69 à 79 La présente invention a également pour objet un oligonucléotide présentant une séquence tirée des séquences des fragments selon la revendication 1 ou 2, de préférence une séquence tirée des séquences SEQ. 20 ID. n 33 à 79 et leurs séquences complémentaires, de préférence comprenant au moins 10, de préférence encore 18 à 35 nucléotides consécutifs inclus dans lesdites séquences, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique dudit oligonucléotide inclut une séquence spécifique d'une bactérie, d'une espèce, sous espèce, sous type ou génotype 25 donné(e) du complexe Mycobacterium tuberculosis, utilisable à titre de sonde d'une dite bactérie. Les sondes selon l'invention peuvent être utilisées, à des fins de diagnostic, comme mentionné précédemment, par la détermination de la 2907793 21 formation ou de l'absence de formation d'un complexe d'hybridation entre la sonde et un acide nucléique cible dans un échantillon, selon toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques de dépôt ponctuel sur filtre, dites " DOT-BLOT " [Maniatis et al. (1982) Molecular 5 Cloning, Cold Spring Harbor], les techniques de transfert d'ADN dites " SOUTHERN BLOT " [Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 1975 5 ; 98:503-17], les techniques de transfert d'ARN dites " NOTHERN BLOT ", ou les techniques dites " sandwich ", en particulier avec une 10 sonde de capture et/ou une sonde de détection, lesdites sondes étant capables de s'hybrider avec deux régions différentes de l'acide nucléique cible, et l'une au moins desdites sondes (généralement la sonde de détection étant capable de s'hybrider avec une région de la cible qui est spécifique de l'espèce, étant entendu que la sonde de capture et la sonde de 15 détection doivent avoir des séquences nucléotidiques au moins partiellement différentes. L'acide nucléique à détecter (cible) peut être de l'ADN ou de TARN (le premier obtenu après amplification par PCR). Dans le cas de la détection d'une cible de type acide nucléique double brin, il convient de 20 procéder à la dénaturation de ce dernier avant la mise en oeuvre du procédé de détection. L'acide nucléique cible peut être obtenu par extraction selon les méthodes connues des acides nucléiques d'un échantillon à examiner. La dénaturation d'un acide nucléique double brin peut être effectuée par les méthodes connues de dénaturation chimique, physique ou enzymatique, 25 et en particulier par chauffage à une température appropriée, supérieure à 80 C. Pour mettre en oeuvre les techniques d'hybridation précitées, et en particulier les techniques "sandwich", une sonde de l'invention, appelée sonde de capture est immobilisée sur un support solide, et une autre sonde 30 de l'invention, appelée sonde de détection, est marquée avec un agent marqueur. Les exemples de support et d'agent marqueur sont tels que définis précédemment. 2907793 22 De manière avantageuse, une sonde d'espèce est immobilisée sur un support solide, et une autre sonde d'espèce est marquée par un agent marqueur. Un oligonucléotide de l'invention utilisé comme amorce 5 nucléotidique comprenant une oligonucléotide monocaténaire choisi parmi les oligonucléotides ayant une séquence d'au moins 12 motifs nucléotidiques inclus dans l'une des séquences SEQ. ID. n 1-32, est utilisable dans la synthèse d'un acide nucléique en présence d'une polymérase par un procédé connu en soi, notamment dans des méthodes 10 d'amplification utilisant une telle synthèse en présence d'une polymérase (PCR, retro-transcription-PCR, real-time PCR, etc.). Selon un cas particulier ladite amorce comprenant un oligonucléotide de l'invention comprend en outre la séquence sens ou anti-sens d'un promoteur reconnu par une ARN polymérase (promoteurs T7, T3, SP6 par 15 exemple [Studier FW, Moffatt BA. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 1986 May 5;189(1):113-30] : de telles amorces sont utilisables dans des procédés d'amplification d'acide nucléique faisant intervenir une étape de transcription, tels que, par exemple, les techniques NASBA ou 3SR [Van 20 Gemen B. et al. Abstract MA 1091, 7'h International Conference on AIDS (1991) Florence, Italy]. On peut tirer des différentes séquences issues des fragments d'acide nucléique correspondant aux dites zones intergéniques MST1-MST16, des pluralités d'oligonucléotides sondes correspondant aux différents sites 25 discriminants dans les différents fragments desdites zones intergéniques MST1 à MST16, différents oligonucléotides sondes étant présentés sous forme de "biopuces", c'est-à-dire fixés sur des supports solides, notamment en verre, selon le procédé décrit dans le brevet US 5 744 305 (Affymetrix, Fodor et al) en utilisant la stratégie de reséquençage décrite dans la 30 demande WO 95/11995 (Affymax, Chee et al) ou selon la méthode décrite par A Troesch et al. [A Troesch et al. dans J. Clin. Microbiol., vol. 37(1), p 2907793 23 49-55, 1999]. Les oligonucléotides synthétisés sur la "biopuce" réalisent le re-séquençage de chacun desdits "spacers", c'est-à-dire la description de la séquence du spacer basée non pas sur le séquençage direct de ce spacer, mais sur l'analyse des hybridations permettant de retrouver sa séquence 5 antérieurement décrite (re-séquençage). Ce procédé présente un avantage considérable en terme de coût de production et sans compromis sur la qualité de l'identification des différentes espèces et des différents génotypes de l'espèce Mycobacterium tuberculosis de part le choix de ces séquences d'identification. De préférence, ces oligonucléotides fixés sur le 10 support solide de la "biopuce" comportent de 10 à 30 bases par exemple 20 bases, avec une position d'interrogation située dans la région centrale comme par exemple en 12ème position par rapport à l'extrémité 3' de la séquence pour des oligonucléotides de 20 bases. Un autre exemple consiste à utiliser des oligonucléotides de 17 bases, avec 2 positions 15 d'interrogations : une en 10ème et une en Sème position. D'autres oligonucléotides ont des longueurs comprises entre 10 et 25 nucléotides. Les positions d'interrogation varient alors en fonction de la longueur de l'oligonucléotide. L'analyse est effectuée sur le système complet GeneChip (référence 20 900228, Affymetrix, Santa Clara, CA) qui comprend le lecteur GeneArray , le four d'hybridation GeneChip , la station fluidique GeneChip et le logicel d'analyse GeneChip . La présente invention fournit également un procédé d'identification d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis permettant 25 l'identification de l'espèce, le cas échéant la sous espèce ou le sous type de ladite bactérie, et le cas échéant permettant le génotypage des dites espèces, sous espèces et sous types de bactéries dans un échantillon biologique contenant des acides nucléiques d'une dite bactérie dans lequel on effectue les étapes suivantes dans lesquelles: 30 1) on réalise l'amplification enzymatique de type PCR dans l'acide nucléique dudit échantillon, d'au moins 1 fragment d'acide nucléique d'une 2907793 24 zone intergénique choisie parmi 16 zones intergéniques MST1 à MST16 du génome des différentes dites espèces et sous espèces ou sous type et, le cas échéant, génotypes de bactéries selon l'invention, à l'aide d'un couple d'amorce apte à amplifier ledit fragment, ledit couple d'amorces étant 5 constitué par des oligonucléotides amorces selon l'invention, de préférence de séquences comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 18, inclus dans les séquences du listage de séquences et leurs séquences complémentaires, avec les couples d'amorces 5', 3', tirés des séquences suivantes pour les fragments suivants : 10 - pour le fragment de la zone intergénique MST1 • amorce 5'= SEQ. ID. n 1 • amorce 3'= SEQ. ID. n 2 • pour le fragment de la zone intergénique MST2 : • amorce 5'= SEQ. ID. n 3 15 • amorce 3'= SEQ. ID. n 4 - pour le fragment de la zone intergénique MST3 • amorce 5'= SEQ. ID. n 5 • amorce 3'= SEQ. ID. n 6 - pour le fragment de la zone intergénique MST4 : 20 • amorce 5'= SEQ. ID. n 7 • amorce 3'= SEQ. ID. n 8 - pour le fragment de la zone intergénique MST5 • amorce 5'= SEQ. ID. n 9 ^ amorce 3'= SEQ. ID. n 10 2907793 25 -pour le fragment de la zone intergénique MST6 • amorce 5'= SEQ. ID. n 11 • amorce 3'= SEQ. ID. n 12 - pour le fragment de la zone intergénique MST7 5 • amorce 5'= SEQ. ID. n 13 • amorce 3'= SEQ. ID. n 14 - pour le fragment de la zone intergénique MST8 • amorce 5'= SEQ. ID. n 15 • amorce 3'= SEQ. ID. n 16 10 - pour le fragment de la zone intergénique MST9 : • amorce 5'= SEQ. ID. n 17 • amorce 3'= SEQ. ID. n 18 - pour le fragment de la zone intergénique MST10 • amorce 5'= SEQ. ID. n 19 15 • amorce 3'= SEQ. ID. n 20 - pour le fragment de la zone intergénique MSTII • amorce 5'= SEQ. ID. n 21 • amorce 3'= SEQ. ID. n 22 - pour le fragment de la zone intergénique MSTI2 20 • amorce 5'= SEQ. ID. n 23 ^ amorce 3'= SEQ. ID. n 24 2907793 26 - pour le fragment de la zone intergénique MST13 • amorce 5'= SEQ. ID. n 25 • amorce 3'= SEQ. ID. n 26 - pour le fragment de la zone intergénique MST14 : 5 • amorce 5'= SEQ. ID. n 27 • amorce 3'= SEQ. ID. n 28 - pour le fragment de la zone intergénique MST15 • amorce 5'= SEQ. ID. n 29 • amorce 3'= SEQ. ID. n 30 10 - pour le fragment de la zone intergénique MST16 • amorce 5'= SEQ. ID. n 31 • amorce 3'= SEQ. ID. n 32 2) on réalise le séquençage du fragment amplifié à l'étape 1), et 3) on identifie l'espèce, la sous espèce ou le sous type, et le cas 15 échéant le génotype de ladite bactérie en comparant la séquence obtenue à l'étape 2) avec les séquences d'une banque de données de séquences d'au moins un dit fragment d'acide nucléique de dite zone intergénique choisie parmi 16 dites zones intergéniques MST1 à MST16 de différentes espèces, sous espèces et sous type et le cas échéant génotypes de bactéries du 20 complexe Mycobacterium tuberculosis. Ladite banque de séquences est donc constituée à partir d'une collection d'isolats de souche appartenant à une espèce, sous espèce, sous type ou génotype connu ou précédemment déterminé. 2907793 27 Plus particulièrement, à l'étape 3), lesdites séquences constituant ladite banque ont été déterminées par amplification et séquençage de dit(s) fragment(s) de zone(s) intergénique(s) des différentes bactéries d'une collection de différents isolats de bactéries de différentes espèces, sous 5 espèces et sous types de bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis dont les espèces, sous espèces et sous types et, le cas échéant, génotypes, sont connus. Avantageusement, dans un procédé selon l'invention, on identifie une espèce, sous espèce ou sous type de bactérie parmi les bactéries 10 Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis ssp bovis, Mycobacterium bovis ssp BCG, Mycobacterium bovis ssp caprae, Mycobacterium africanum sous type I, Mycobacterium canettii, Mycobacterium microti. De préférence, on identifie une espèce sous espèce ou sous type de bactérie parmi les bactéries Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis ssp 15 bovis, Mycobacterium bovis ssp BCG, Mycobacterium africanum sous type I, Mycobacterium canettii. Dans un mode préféré de réalisation d'un procédé selon l'invention, dans lequel on identifie l'espèce, sous espèce ou sous type d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis, en réalisant les étapes dans 20 lesquelles : 1) on réalise l'amplification enzymatique de type PCR dans l'acide nucléique dudit échantillon, d'au moins 1 fragment d'acide nucléique d'une zone intergénique choisie parmi les 2 dites zones intergéniques MST11 et MST 12, à l'aide d'un couple d'amorces aptes à amplifier ledit fragment, 25 ledit couple d'amorces étant constitué par des oligonucléotides de séquences tirées des séquences SEQ. ID. n 21 à 24 suivantes du listage de séquences et leurs séquences complémentaires : - pour le fragment de la zone intergénique MST11 : amorce 5'= SEQ. ID. n 21 2907793 28 • amorce 3'= SEQ. ID. n 22 - pour le fragment de la zone MST12 : • amorce 5' : SEQ. ID. n 23 • amorce 3' : SEQ. ID. n 24 5 2) on réalise le séquençage du fragment amplifié à l'étape 1), et 3) on identifie l'espèce, la sous espèce ou le sous type de ladite bactérie, en comparant la séquence obtenue à l'étape 2) avec les séquences d'une banque de données des séquences d'au moins ledit fragment d'acide nucléique d'une dite zone intergénique choisie parmi les 2 dites zones 10 intergéniques MST11 et MST 12 respectivement des différentes espèces, sous espèces et sous type de bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis. Plus particulièrement, à l'étape 3), lesdites séquences de ladite banque comprennent les séquences SEQ. ID. n 33 à 51 suivantes du listage 15 de séquences et leurs séquences complémentaires pour les espèces suivantes : - pour Mycobacterium tuberculosis : • les séquences du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans l'une des séquences SEQ. ID. n 33 à 36, 20 • les séquences du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans l'une des séquences SEQ. ID. n 41 à 47, - pour Mycobacterium africanum : • la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 37, 25 • la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 48, 2907793 29 - pour Mycobacterium bovis ssp bovis : ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 38, ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 5 consistant dans SEQ. ID. n 49, - pour Mycobacterium bovis ssp BCG : ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 39, ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 10 consistant dans SEQ. ID. n 50, - pour Mycobacterium canettii : ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 40, ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 15 consistant dans SEQ. ID. n 51, Dans un autre mode de réalisation d'un procédé selon l'invention, on identifie le génotype d'une espèce, sous espèce ou sous type donné d'une bactérie parmi les bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis, en réalisant les étapes dans lesquelles 20 1) on réalise l'amplification enzymatique de type PCR dans l'acide nucléique dudit échantillon, d'au moins 2 fragments d'acides nucléiques d'au moins 2 zones intergéniques choisies parmi 16 dites zones intergéniques MST1 à MST16, à l'aide respectivement des au moins 2 dits couples d'amorces aptes à amplifier les dits fragments des au moins 2 dites 25 zones intergéniques, et 2) on réalise le séquençage des fragments amplifiés à l'étape 1), et 2907793 30 3) on identifie le génotype de l'espèce, sous espèce ou sous type de dite bactérie en comparant les séquences des fragments amplifiés obtenues à l'étape 2) avec les séquences d'une banque de données des séquences des au moins 2 dits fragments d'acides nucléiques des au moins 2 dites zones 5 intergéniques choisie parmi 16 dites zones intergéniques des différents génotypes de dites bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis, les différents génotypes correspondant aux différentes combinaisons possibles des au moins 2 séquences des au moins 2 dits fragments d'acide nucléique des au moins 2 dites zones intergéniques. 10 On entend ici par "combinaisons différentes de séquences" que dans chaque combinaison l'une au moins des séquences d'une dite jone intergénique est différente, chaque combinaison comprenant autant de séquences que de fragments de dites Jones intergéniques choisies parmi MST 1 à MST 16 prises en considération. Plus particulièrement, à l'étape 3), les séquences constituant ladite 15 banque ont été déterminées par amplification et séquençage desdits au moins 2 fragments des au moins 2 dites zones intergéniques des différentes bactéries d'une collection de différents isolats de bactéries de ladite espèce, sous espèce ou sous type connues du complexe Mycobacterium tuberculosis, les différents génotypes correspondant à des combinaisons 20 différentes des au moins 2 séquences desdites au moins 2 zones intergéniques des bactéries de ladite collection. Avantageusement, on identifie le génotype d'une bactérie de l'espèce Mycobacterium tuberculosis en réalisant les étapes dans lesquelles : 1) on réalise l'amplification enzymatique de type PCR dans l'acide 25 nucléique dudit échantillon, d'au moins 8 fragments d'acides nucléiques, d'au moins 8 zones intergéniques choisie parmi 16 dites zones intergéniques MST1 à MST16, à l'aide respectivement d'au moins 8 couples d'amorces aptes à amplifier les dits fragments de dites zones intergéniques, et 30 2) on réalise le séquençage des fragments amplifiés à l'étape 1), et 2907793 31 3) on identifie le génotype de ladite espèce Mycobacterium tuberculosis en comparant les 8 séquences obtenues à l'étape 2) avec les séquences d'une banque de données des séquences d'au moins les 8 dits fragments d'acides nucléiques des au moins 8 dites zones intergéniques choisie parmi 5 16 dites zones intergéniques des différents génotypes de bactéries de l'espèce Mycobacterium tuberculosis, les différents génotypes correspondant à différentes combinaisons des au moins 8 séquences des au moins 8 dites zones intergéniques. Plus particulièrement, dans ce procédé selon l'invention, lesdits 10 fragments des au moins 8 zones intergéniques sont les 10 fragments desdites zones intergéniques MST1, MST2, MST3, MST4, MST8, MST11, MST12 et MST13, amplifiables par leurs dits couples d'amorces respectives de séquences tirées des séquences SEQ. ID. n 1 à 16 et 21 à 26, avec: - pour le fragment de la zone intergénique MST1 15 • amorce 5'= SEQ. ID. n 1 • amorce 3'= SEQ. ID. n 2 - pour le fragment de la zone intergénique MST2 • amorce 5'= SEQ. ID. n 3 • amorce 3'= SEQ. ID. n 4 20 - pour le fragment de la zone intergénique MST3 • amorce 5'= SEQ. ID. n 5 • amorce 3'= SEQ. ID. n 6 - pour le fragment de la zone intergénique MST4 : • amorce 5'= SEQ. ID. n 7 25 • amorce 3'= SEQ. ID. n 8 2907793 32 - pour le fragment de la zone intergénique MST8 : • amorce 5'= SEQ. ID. n 15 • amorce 3'= SEQ. ID. n 16 - pour le fragment de la zone intergénique MST11 5 • amorce 5'= SEQ. ID. n 21 • amorce 3'= SEQ. ID. n 22 - pour le fragment de la zone intergénique MST12 • amorce 5'= SEQ. ID. n 23 • amorce 3'= SEQ. ID. n 24 10 - pour le fragment de la zone intergénique MST13 • amorce 5'= SEQ. ID. n 25 • amorce 3'= SEQ. ID. n 26 On identifie donc le génotype d'une bactérie de l'espèce Mycobacterium tuberculosis par amplification et séquençage des fragments des 15 au moins 8 zones intergéniques MST1, MST2, MST3, MST4, MST8, MST11, MST12 et MST13 de la bactérie à identifier, puis comparaison avec les séquences d'une dite banque de séquences des fragments desdites 8 zones intergéniques. On comprend qu'à partir deladite banque de séquences, on peut discriminer différents génotypes correspondant aux différentes 20 combinaisons possibles de 8 dites séquences de fragments MST1, MST2, MST3, MST4, MST8, MST11, MST12 et MST13. Plus particulièrement encore, lesdites séquences de ladite banque comprennent les séquences SEQ. ID. n 33 à 79 du listage de séquences et leurs séquences complémentaires pour les fragments de zones intergéniques 25 MST1 à MST16 suivants : 2907793 33 - pour le fragment de la zone intergénique MST1, les 4 séquences SEQ. ID. n 52 à 55 - pour le fragment de la zone intergénique MST2, les 3 séquences SEQ. ID. n 56 à 58 5 - pour le fragment de la zone intergénique MST3, les 2 séquences SEQ. ID. n 59-60 - pour le fragment de la zone intergénique MST4, les 5 séquences SEQ. ID. n 61 à 65 - pour le fragment de la zone intergénique MST8, les 3 séquences 10 SEQ. ID. n 66 à 68 - pour le fragment de la zone intergénique MST11, les 4 séquences SEQ. ID. n 33 à 36 - pour le fragment de la zone intergénique MST12, les 7 séquences SEQ. ID. n 41 à 47 15 - pour le fragment de la zone intergénique MST13, les 11 séquences SEQ. ID. n 69 à 79. Dans un mode préféré de réalisation d'un procédé selon l'invention, on vérifie au préalable que l'échantillon sur lequel on réalise ladite identification, contient effectivement des acides nucléiques d'une dite 20 bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis. Pour ce faire, on peut réaliser un examen direct sur la méthode dite Ziehl ou par culture. Dans un mode préféré de réalisation, on réalise une identification moléculaire de la manière suivante : 25 a- on réalise l'amplification du fragment d'acide nucléique d'une zone intergénique 16S-23S appelée ITS, avec des amorces suivantes : 2907793 34 - amorce 5' : 5'-GGGTGGGGTGTGGTGTTTGA-3' (SEQ. ID. n 80) - amorce 3' : 5'-CAAGGCATCCACCATGCGC-3' (SEQ. ID. n 81) 5 et on vérifie la présence d'une bactérie du genre Mycobacterium par hybridation avec une sonde de genre de séquence 5'TGGATAGTGGTTGCGAGCATC-3' (SEQ. ID. n 82), et b- si le résultat de l'étape a- est positif, on vérifie que ladite bactérie du genre Mycobacterium est bien une bactérie du complexe Mycobacterium 10 tuberculosis par hybridation avec une sonde spécifique du complexe de séquence nucléotidique suivantes 5'-GCTAGCCGGCAGCGTATCCAT-3' (SEQ. ID. n 83), De préférence après une amplification des acides nucléiques de l'échantillon à tester en présence des mêmes amorces qu'à l'étape a-. 15 Cette méthode d'identification d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis est décrite dans les références [Bruijnesteijn Van Coppenraet ES, Lindeboom JA, Prins JM, Peeters MF, Claas EC, Kuijper EJ. Real-time PCR assay using fine-needle aspirates and tissue biopsy specimens for rapid diagnosis of mycobacterial lymphadenitis in children J 20 Clin Microbiol. 2004 Jun;42(6):2644-50)]. Les différentes séquences d'acides nucléiques décrites dans la présente description sont identifiées dans le listage de séquences annexé à la présente description, dans les séquences SEQ. ID. n 1 à 83. L'invention sera mieux comprise à l'aide de la description détaillée 25 sous forme de deux exemples de réalisation faite en référence aux figures 1 et 2, dans lesquelles la figure 1 représente un profil d'électrophorèse en gel d'Agarose des amplifiats obtenus par PCR utilisant les amorces des zones 2907793 intergéniques MST11 avec les espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis, respectivement de gauche à droite M. tuberculosis, M. bovis ssp bovis, M. africanum, M. Canetti et M. bovis ssp BCG, et la figure 2 représente un profil d'électrophorèse en gel d'Agarose des 5 amplifiats obtenus par PCR utilisant les amorces des zones intergéniques MST12 avec les espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis, respectivement de gauche à droite M. tuberculosis, M. bovis ssp bovis, M. africanum, M. Canetti et M. bovis ssp BCG). Exemple 1. Génotypage d'isolats de Mycobacterium tuberculosis. 10 Les inventeurs ont réalisé l'alignement de deux génomes entiers de Mycobacterium tuberculosis: - la souche H37Rv (GenBank accession number AL 123456) [Cole, ST., Broch, R., Parkhill, J., Garnier, T., Churcher, C., Harris, D., Gordon, SV., Eiglmeier, K., Gas, S., Barry, CE., Tekaia, F., Badcock, K., Basham, 15 D., Brown, D., Chillingworth, T., Connor, R., Davies, R., and BG. Barrel. 1998. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature. 6685: 537-544] qui servira de séquence de référence dans cet exemple, et - la souche CDC1551 (Gen Bank accession number AE 000516) 20 [Fleischmann, RD., Alland, D., Eisen, JA., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., DeBoy, R., Dodson, R., Gwinn, M., Haft, D., Hickey, E., Kolonay, JF., Nelson, WC., Umayam, LA., Ermolaeva, M., Salzberg, SL., Delcher, A., Utterback, T., Weidman, J., Khouri, H., Gill, J., Mikula, A., Bishai, W., Jacobs, Jr., Venter, JC., and CM. Fraser. 2002. Whole-genome 25 comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184:5479-90]. Des fragments de zones intergéniques appelés MST1 à MST 16 ou "spacers" ont été déterminés, répondant aux critères suivants: 2907793 36 1) taille du "spacer" chez les 2 souches de référence 600 pb; cette longueur de séquence étant choisie pour être compatible avec les capacités des séquenceurs capillaires ayant une capacité de séquençage de 800 paires de bases, auxquelles il convient de retrancher 100 paires de bases à chaque 5 extrémité correspondant à la longueur des amorces et à la zone d'ombre de mauvaise qualité de séquence en aval de l'amorce nucléotidique; 2) similarité des séquences des "spacers" entre les deux génomes comprise entre 70% et 99% ; la valeur basse de 70% étant choisie afin de garantir dans la première phase de recherche un minimum de stringence 10 garantissant l'homologie du spacer entre les deux génomes pris pour référence; la valeur haute de 99% étant choisie afin de garantir un minimum de variabilité de séquence du spacer entre les différentes souches testées; 3) les "spacers" ne correspondant pas aux régions génomiques 15 précédemment utilisées pour le génotypage par VNTR, ou MIRU, ou spoligotyping. Il a été ainsi possible de déterminer 16 fragments de zones intergéniques appelés MST1-MST16 présentant les 3 critères mentionnés. La localisation de ces 16 "spacers" MST1-MST16 sur le chromosome de 20 l'espèce Mycobacterium tuberculosis souche H37Rv (GenBank accession number AL 123456) est présentée dans le tableau 1 ci-après. Dans le tableau 1 ci-après, la position des 16 "spacers" MST1-MST16 est présentée par rapport aux gènes en amont et aval. Les inventeurs ont ensuite extrait de chaque séquence de spacer une 25 séquence d'au maximum 350 paires de bases afin de désigner pour chaque spacer une paire d'amorces d'amplification par PCR à l'aide du logiciel Pimer3 software program (INFOBIOGEN, Evry, France). La séquence de ces amorces est présentée dans le tableau 2 suivant. 2907793 37 Ces amorces ont été utilisées pour l'amplification des 16 "spacers" identifiés selon les modalités suivantes : 20 isolats de Mycobacterium tuberculosis choisis au hasard dans une collection de 105 isolats cliniques dont la nature et l'origine sont explicité au tableau 3, ont été inactivés 5 selon un protocole publié par deux des inventeurs [Djelouadji, Z. and M. Drancourt. 2006. Inactivation of cultured Mycobacterium tuberculosis organisms prior to DNA extraction. J. Clin. Microbiol. 44:1594-1595]. Après extraction de l'ADN de chaque isolat selon les recommendations du fournisseur (Qiagen, Courtaboeuf, France), les PCRs ont été réalisées sous 10 un volume final de 50 l contenant 33 l H2O, 5 l 10 X tampon (Qiagen), 2 l 25 MgC12, 5 l 100 dDNTP, 1 l d'amorce directe, 1 l d'amorce reverse, 0.25 l hotstart Taq (Qiagen) et 2 l d'ADN. Les PCRs ont été réalisées selon le protocole suivant: 15 minutes d'activation de l'enzyme à 95 C, suivies de 34 cycles comprenant 95 C pendant 30s, 60 C pendant 15 30s, 72 C pendant 1 minute et 5 minutes d'élongation à 72 C Après contrôle de la taille des amplifiats par électrophorèse sur gel d'agarose, les amplifiats ont été purifiés par addition de 50 l d'eau distillée et utilisation d'une plaque de purification (Millipore, Molshein, France) agitée pendant 10 minutes. Les solutions de séquençage contiennent 3 l de tampon (Big 20 Dye VI, Applied Biosystems, Coutaboeuf, France), 5 l d'eau distillée et 1 l d'amorce à 3.2 pmol/ l pour un volume final de 11 l. Les reactions de séquence comprennent une étape initiale de 1 minute à 95 C suivie de 25 cycles de dénaturation comprenant une étape de dénaturation à 96 C pendant 10s, hybridation des amorces à 50 C pendant 5s, et une étape 25 d'élongation à 60 C pendant 3 minutes. Les produits de séquençage ont été purifiés sur plaque de sephadex (Amersham biosciences, Uppsala, Sweden) centrifugée à 720 g pendant 3 minutes et les produits de séquençage purifiés ont été déposés sur une plaque de séquençage Micro Amp Optical 96 well reaction plate (Applied Biosystems). L'électrophorèse de 30 séquençage a été réalisée sur une séquenceur automatique 3100 genetic analyser (Applied Biosystems), les séquences ont été éditées par le Auto assembler program (Applied Biosystems), et alignées par CLUSTAL W 2907793 38 (http://pbil.ibcp.fr). Ces séquences déterminées expérimentalement par les inventeurs pour 20 isolats de Mycobacterium tuberculosis et les séquences déposées dans GenBank pour les deux souches de référence de Mycobacterium tuberculosis CDC 1551 et H37 Rv ont permis de constituer une 5 première base de données. Les inventeurs ont déterminé que, par rapport à la collection des 105 isolats analysés, les 8 "spacers" suivants; MST5, MST6, MST7, MST9, MSTIO, MST14, MST15 et MST16, ne présentaient que deux variants de séquences chacun, et avaient un très faible pouvoir discriminant puisque 10 chaque "spacer" MST5, MST6, MST7, MST9, MSTIO, MST14, MST15 et MST16 ségrégeait 17/20 (85%) des isolats dans un seul de deux variants. Ces huit "spacers" n'étant donc pas suffisamment informatifs n'ont plus été utilisés par la suite pour l'analyse de la collection de souches étudiée dans cet exemple. En revanche, les 8 autres "spacers": MSTI, MST2, MST3, 15 MST4, MST8, MSTII, MST12, et MST13 ont été appliqués sur l'ensemble de la collection de 105 isolats de M. tuberculosis (Tableau 3). Ils ont permis de déterminer respectivement 4, 3, 2, 5, 3, 4, 7 et 11 variants de séquences qui, comme montré au tableau 4 ci-après, ont permis d'identifier 32 génotypes correspondant à 32 combinaisons différentes de ces 8 séquences 20 sur l'ensemble des 105 isolats de l'espèce Mycobacterium tuberculosis testés et les deux souches de référence. Les différents variants de séquences pour les 8 zones intergéniques MSTI, MST2, MST3, MST4, MST8, MST11, MST12 et MST13, déterminés expérimentalement par amplification et séquençage, sont présentés dans les 25 tableaux 5 à 12 ci-après, en faisant apparaître des mutations ponctuelles en caractères gras, ainsi que des délétions par alignement des séquences. Dans les alignements des tableaux 5 à 12 ci-après, les amorces nucléotidiques mises en oeuvre sont indiquées également en caractères gras aux extrémités des séquences. 30 Dans le tableau 5, les variants 1 à 4 de MSTI pour M. tuberculosis sont identifiés dans le listage de séquences comme des séquences 2907793 39 respectivement SEQ. ID. n 52 à 55, avec variant 1 = SEQ. ID. n 52, variant 2 = SEQ. ID. n 53, variant 3 = SEQ. ID. n 54, variant 4 = SEQ. ID. n 55. Dans le tableau 6, les trois variants de MST2 sont identifiés dans le 5 listage de séquences sous les séquences SEQ. ID n 56 à 58 respectivement, avec variant 1 = SEQ. ID. n 56, variant 2 = SEQ. ID. n 57, variant 3 = SEQ. ID. n 58. Dans le tableau 7, les deux variants de MST3 sont identifiés dans le listage de séquences sous les séquences SEQ. ID n 59-60 respectivement, 10 avec variant 1 = SEQ. ID. n 59, variant 2 = SEQ. ID. n 60. Dans le tableau 8, les cinq variants de MST4 sont identifiés dans le listage de séquences sous les séquences SEQ. ID n 61 à 65 respectivement, avec variant 1 = SEQ. ID. n 61, variant 2 = SEQ. ID. n 62, variant 3 = SEQ. ID. n 63, variant 4 = SEQ. ID. n 64, variant 5 = SEQ. ID. n 65. 15 Dans le tableau 9, les trois variants de MST8 sont identifiés dans le listage de séquences sous les séquences SEQ. ID n 66 à 68 respectivement, avec variant 1 = SEQ. ID. n 66, variant 2 = SEQ. ID. n 67, variant 3 = SEQ. ID. n 68. Dans le tableau 10, les quatre variants de MST11 sont identifiés dans 20 le listage de séquences sous les séquences SEQ. ID n 33 à 36 respectivement, avec variant 1 = SEQ. ID. n 33, variant 2 = SEQ. ID. n 34, variant 3 = SEQ. ID. n 35, variant 4 = SEQ. ID. n 36. Dans le tableau 11, les sept variants de MST12 sont identifiés dans le listage de séquences sous les séquences SEQ. ID n 41 à 47 respectivement, 25 avec variant 1 = SEQ. ID. n 41, variant 2 = SEQ. ID. n 42, variant 3 = SEQ. ID. n 43, variant 4 = SEQ. ID. n 44, variant 5 = SEQ. ID. n 45, variant 6 = SEQ. ID. n 46, variant 7 = SEQ. ID. n 47. Dans le tableau 12, les onze variants de MST13 sont identifiés dans le listage de séquences sous les séquences SEQ. ID n 69 à 79 2907793 respectivement, avec variant 1 = SEQ. ID. n 69, variant 2 = SEQ. ID. n 70, variant 3 = SEQ. ID. n 71, variant 4 = SEQ. ID. n 72, variant 5 = SEQ. ID. n 73, variant 6 = SEQ. ID. n 74, variant 7 = SEQ. ID. n 75, variant 8 = SEQ. ID. n 76, variant 9 = SEQ. ID. n 77, variant 10 = SEQ. 5 ID. n 78, variant 11 = SEQ. ID. n 79. Dans le tableau 4 ci-après, on indique dans les différentes colonnes pour les différentes zones intergéniques MST1, MST2, MST3, MST4, MST8, MST11, MST12 et MST13, les numéros des variants des séquences des tableaux 5 à 12, et, dans la colonne de droite, on a identifié 32 10 génotypes différents correspondants à 32 combinaisons différentes de séquences de variants des différentes zones intergéniques MST1, MST2, MST3, MST4, MST8, MST11, MST12 et MST13 des tableaux 5 à 12. La méthode MST selon l'invention a été comparée à la méthode de référence par analyse des VNTR. On obtient un pouvoir discriminant 15 mesuré par l'index de Hunter-Gaston supérieur pour la méthode MST que pour la méthode VNTR (index de 0.959 and 0.640, respectivement). Au total, ces résultats expérimentaux démontrent que : 1) l'ensemble des spacers prédits par les données bio-informatiques accessibles n'était pas utilisable pour le génotypage des isolats de 20 Mycobacterium tuberculosis, 2) il était nécessaire de tester les différents spacers sur une collection d'isolats de l'espèce Mycobacterium tuberculosis provenant de différents sources géographiques, ce qui n'était pas anticipé au début de ce travail, et 25 3) la combinaison de certains spacers qui font l'objet de la présente invention, permettait pour la première fois le génotypage de Mycobacterium tuberculosis basé sur l'analyse de séquences génomiques, et 4) la méthode MST permet un génotypage de Mycobacterium tuberculosis davantage discriminant que les méthodes antérieures. 2907793 41 Exemple 2. Identification des différentes espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis Les inventeurs ont montré que l'analyse de certains spacers permettait l'identification des espèces du complexe Mycobacterium 5 tuberculosis. Pour ce faire, les inventeurs ont appliqué les 8 spacers présentés dans l'exemple 1 à une collection de souches types des espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis habituellement responsables des infections chez l'homme, comprenant Mycobacterium tuberculosis CIP 103471 et les 105 souches cliniques représentant les différents génotypes décrits 10 pour chaque spacer considéré dans l'exemple 1, Mycobacterium bovis ssp. bovis CIP 10505, Mycobacterium bovis souche BCG CIP 105050, Mycobacterium africanum CIP 105147 (sous-type I), Mycobacterium canettii CIP 105090. Mycobacterium africanum sous-type II n'a pas été inclus dans ce test, car il est actuellement considéré comme un variant de l'espèce Mycobacterium 15 tuberculosis [Niemann S, Kubica T, Bange FC, Adjei O, Browne EN, Chinbuah MA, Diel R, Gyapong J, Horstmann RD, Joloba ML, Meyer CG, Mugerwa RD, Okwera A, Osei I, Owusu-Darbo E, Schwander SK, Rusch-Gerdes S. The species Mycobacterium africanum in the light of new molecular markers. J Clin Microbiol. 2004 ; 42:3958-62. 20 Parmi les 8 spacers, seuls les spacers MST 11 et MST 12 permettent de distinguer sans ambiguïté les 5 espèces testées. Les autres spacers présentés dans l'exemple 1 n'ont pas été retenus pour l'identification des espèces à l'intérieur du complexe M. tuberculosis car ils ne permettent pas de différencier l'espèce M. tuberculosis de M. africanum, M. bovis et 25 M. bovis ssp. BCG, contrairement aux spacers MST11 et MST12. Les conditions expérimentales étaient les mêmes que celles rapportées dans l'exemple 1. La figure 1 reproduit à titre d'exemple le profil d'électrophorèse en gel d'agarose à 1,5% des amplifiats obtenus avec les amorces des spacers MST11 et MST12, montrant la différence de taille 30 des amplifiats obtenus avec chacune des ces espèces. Il a été ensuite montré que l'analyse des séquences des spacers MST11 et MST12, pris 2907793 42 isolément, permet d'identifier chacune des espèces testées. Il s'agit de la première méthode d'identification des espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis basée sur l'analyse de séquences. Ces données sont illustrées par les alignements des tableaux 13 et 14 ci-après : 5 Les séquences des fragments de la zone intergénique MST11 pour les espèces considérées au tableau 13, sont listées dans le listage de séquences dans les séquences SEQ. ID. n 33 à 40, avec - M. tuberculosis variant 1 = SE,Q. ID. n 33 - M. tuberculosis variant 2 = SE,Q. ID. n 34 10 - M. tuberculosis variant 3 = SE,Q. ID. n 35 - M. tuberculosis variant 4 = SE,Q. ID. n 36 - M. africanum = SE,Q. ID. n 37 - M. bovis ssp bovis = SE,Q. ID. n 38 - M. bovis ssp BCG= SEQ. ID. n 39 15 - M. canettii = SE,Q. ID. n 40 Ces alignements du tableau 13 montrent que le spacer MST11 permet la différenciation des espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis par rapport à la séquence de référence de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GenBank accession number AL 123456) par les éléments suivants : 20 - M. canettii présente une substitution du C en A en position 94 et une deuxième substitution du A en G en position 114 ; - M. africanum présente une insertion de 51 paires de bases en position 350 ; - M. bovis présente une insertion de 116 paires de bases en position 25 326 ; 2907793 43 - M. bovis ssp BCG présente une délétion de 58 paires de bases en position 350 Au tableau 14, les séquences des fragments de la zone intergénique MST12 pour les espèces considérées ci-dessus, sont listées dans le listage 5 de séquences dans les séquences SEQ. ID. n 41 à 51, avec - M. tuberculosis variant 1 = SE,Q. ID. n 41 - M. tuberculosis variant 2 = SE,Q. ID. n 42 M. tuberculosis variant 3 = SE,Q. ID. n 43 - M. tuberculosis variant 4 = SE,Q. ID. n 44 10 - M. tuberculosis variant 5 = SE,Q. ID. n 45 - M. tuberculosis variant 6 = SE,Q. ID. n 46 - M. tuberculosis variant 7 = SE,Q. ID. n 47 - M. africanum = SE,Q. ID. n 48 - M. bovis ssp bovis = SE,Q. ID. n 49 15 - M. bovis ssp BCG= SE,Q. ID. n 50 - M. canettii = SE,Q. ID. n 51 Ces alignements du tableau 14 montrent que le spacer MST12 permet la différenciation des espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis par rapport à la séquence de référence de Mycobacterium tuberculosis H37Rv 20 (GenBank accession number AL 123456) par les éléments suivants : - M. africanum : une substitution du C en T en position 76 ; - M. bovis : une délétion de 284 paires de bases en position 236. - M. bovis subsp BCG : une délétion de206 paire de bases en position 303. 2907793 44 - M. canettii : une délétion de 304 paires de bases en position 196 avec une substitution du T en A en position 194. D'autres expériences ont été conduites avec des souches cliniques des espèces du complexe autres que l'espèce Mycobacterium tuberculosis, qui 5 ont confirmées les résultats ci-dessus concernant le caractère discriminant au niveau de l'espèce des séquences des zones intergéniques MST11 et MST12. Tableau 1 : Position des 16 "spacers" sur le génome de M. tuberculosis H37Rv et les gènes encadrant spacer Position Gène en amont Gène en aval MST1 71487-71795 Conserved transmembrane proteine "Rv0064" Conserved hypothetical protein "Rv0065"similaire à Rv06090 MST2 206690-207028 mcelF (Mce Family protein MCEF1) Mce-associated membrane protein "Rv0175" MST3 240150-240131 Conserved hypothetical protein "Rv1443c" Conserved hypothetical protein "Rv14444c" MST4 36463-636767 qcr B (Ubiquinol cytochrome C reductase Conserved transmembrane proteine "Rv2197c" subunit B) MST5 304084-304375 GNTR ( transcriptional regulatory protein) Fad E22 (Acyl coA Deshydrogenase FADE22) MST6 273108-273711 Hely (Helicase hely ATP- dependant DNA) TatC (sec-independent protein translocase transmembrane MST7 322829-323360 Conserved hypothetical protein "Rv2141c" Conserved hypothetical protein "Rv2142c" MST8 416-440 PbpB(Penicillin-binding membrane protein) Conserved hypothetical protein "Rv63c" T c~mS i 9 217346-217871 Conserved integral membrane Conserved hypothetical protein "Rv2674" M protein"Rv26 7 3 MSTIO 250110-250591 SigB (RNA polymerase SIGMA factor) IdeR (Iron-dependant repressor and acitivator MER) MST11 235244-235936 Conserved hypothetical protein "Rv0486" Conserved integral membrane protein"Rv0488" 46 MST12 238575-239212 senX3 (putative histidine kinase senx3) regX3 (sensory transduction protein) MST13 224126-224680 conserved hypothetical protein "Rv1728c" pbp-4 (Penicillin-binding protein 4) MST14 128029-128677 whiB1(transcriptional regulatory protein Two component sensor kinase whiB-like) MST15 223496-223514 conserved hypothetical protein "Rv3304c" conserved hypothetical protein "Rv3305c" MST16 323365-333650 dap E2 ( acetylornithine-deacetylase E2) conserved hypothetical protein "Rv2142c" 2907793 47 Tableau 2 : Séquence des amorces pour l'amplification par PCR et le séquençage des 16 ""spacers"" présentés dans le Tableau 1. N Amorce Sequences (5'-3') SEQ.ID n 1 lsite242F GATGGTCTCCCGGCTGAT SEQ.ID n 2 1 site588R GCTGGCCGATCTGCGCGC SEQ.ID n 3 2site210F GCGCCAAGGCCACCGGCCAA SEQ.ID n 4 2site540R GCCCGGCCAGCGGTGAACTGG SEQ.ID n 5 8site481F CTGTGGCAGGCTCCCGGTAG SEQ.ID n 6 8site780R TCGAGGATTCTGGGACTAT SEQ.ID n 7 9site301F GATCAGCTACGGGTTGGCCG SEQ.ID n 8 9site720R ATGGGTTCGCCAGACGGCGAG SEQ.ID n 9 10site781 F CGGCCAGCCGCGGCGGACGA SEQ.ID n 10 1 10site1140R GATTGCGl1'GCTGGACGGOOO SEQ.ID n 11 10ghisF CTGTGAGATCGGTGTGC'fl 1 SEQ.ID n 12 1 l0ghisR CTGCTGATCGTGATGCTGAA SEQ.ID n 13 llghisF GCACCGGATTCAACGTATTC SEQ.ID n 14 llghisR TAGTAGGGCACTAGCACCTC 1 SEQ.ID n 15 12ghisF CCGCAATCACAAACTTCAATAC SEQ.ID n 16 12ghisR GCTACTTCGACGACGTGTAT SEQ.ID n 17 17ghisF CTTCATGACGTTGGATCGCT SEQ.ID n 18 17ghisR CGCAATGCGACTCGAATTTC SEQ.ID n 19 18ghisF CTTTGGGCGATTTCATCGAG SEQ.ID n 20 18ghisR CTCTTCCTCGAGGTCGTAGAT SEQ.ID n 21 3ghisF AGGTGTTAGAGGTGGTGGAT SEQ.ID n 22 3ghisR AACCAAAGTCATATTGGGATGAG SEQ.ID n 23 4ghisF GTTGATCGAGGCCTATCACG SEQ.ID n 24 4ghisR GAATAGGGCTTGGTCACGTA 2907793 48 SEQ.ID n 25 8ghisF CGAGTTCACCGTCCATCATC SEQ.ID n 26 8ghisR GAGACAACGGTCATCGACTT SEQ.ID n 27 20ghisF CATAGTGAGGAGTAACGACTAA SEQ.ID n 28 20ghisR CTGATCATGGTGATCACCGA SEQ.ID n 29 2lghisF TTTGCGGCAACGAGATCTT SEQ.ID n 30 2lghisR GATGCATGTTCGACCCGTA SEQ.ID n 31 Vn1F TTAGGCAAGTTCCGAATGACAG SEQ.ID n 32 Vn2R CTATAGAGCTAAGAAGTTGTGTCC 2907793 49 Tableau 3 : Liste de 105 isolats cliniques de l'espèce Mycobacterium tuberculosis utilisés pour le génotypage par la méthode MST. Un seul isolat par patient. La deuxième colonne indique la nature du prélèvement d'où l'isolat a été cultivé, la troisième colonne indique l'origine géographique du 5 patient. Tubi Tub2 Tub3 Tub4 Tub5 Tub6 Tub? Tub8 Tub9 Tub 10 Tubi 1 Tub12 Tub 13 Tub14 Tub15 Tub16 Tub17 Tub18 Tub19 Tub2O Tub2l Tub22 Tub23 Tub24 Tub25 Tub26 Expectoration Abcès Aspiration bronchique Ganglion Ganglion Expectoration Liquide pleural Aspiration bronchique Expectoration Abcès Expectoration Expectoration Î Expectoration Expectoration Expectoration Expectoration Abcès Aspiration bronchique Ganglion Expectoration Expectoration Expectoration Expectoration Ganglion Expectoration Expectoration Afrique sub-saharienne Vietnam Algérie Algérie Algérie Italie Italie Pologne Espagne Afrique sub-saharienne Thaïlande Thaïlande Afrique sub-saharienne Algérie Pologne Afrique sub-saharienne France Algérie France Thaïlande France France Algérie France Vietnam Espagne 2907793 Tub27 Expectoration Algérie Tub28 Expectoration Tunisie Tub29 Expectoration France Tub3O Expectoration France Tub3l Liquide pleural France Tub32 Expectoration France Tub33 Expectoration France Tub34 Expectoration Algérie Tub35 Expectoration Philippines Tub36 Expectoration Algérie Tub37 Ganglion France Tub38 Ganglion Turquie Tub39 Expectoration Algérie Tub4O Expectoration Afrique sub-saharienne Tub4l Ganglion Afrique sub-saharienne Tub42 Expectoration Algérie Tub43 Expectoration France Tub44 Expectoration Tunisie Tub45 Expectoration France Tub46 Ganglion Thaïlande Tub47 Expectoration France Tub48 Expectoration France Tub49 Expectoration Afrique sub-saharienne Tub5O Expectoration France Tub5l Expectoration France Tub52 Expectoration Kurdistan Tub53 Expectoration Comores Tub54 Expectoration Comores Tub55 Expectoration Comores Tub56 Expectoration Comores Tub57 Expectoration France Tub58 Expectoration France Tub59 Expectoration France Tub6O Expectoration Comores 2907793 51 Tub6l Expectoration Comores Tub62 Expectoration Comores Tub63 Expectoration Comores Tub64 Expectoration France Tub65 Expectoration Tunisie Tub66 Expectoration Tunisie Tub67 Expectoration Vietnam Tub68 Expectoration Vietnam Tub69 Ganglion Afrique sub-saharienne Tub7O Ganglion Afrique sub-saharienne Tub7l Ganglion Afrique sub-saharienne Tub72 Expectoration Afrique sub-saharienne Tub73 Expectoration Afrique sub-saharienne Tub74 Expectoration Afrique sub-saharienne Tub75 Expectoration Vietnam Tub76 Expectoration Vietriam Tub77 Expectoration Algérie Tub78 Aspiration bronchique Algérie Tub79 Expectoration Algérie Tub8O Ganglion Algérie Tub8l Expectoration Phillipine Tub82 Expectoration Tunisie Tub83 Expectoration Tunisie Tub 84 Expectoration Tunisie Tub85 Expectoration France Tub86 Expectoration France Tub87 Expectoration France Tub88 Expectoration France Tub89 Expectoration France Tub9O Expectoration France Tub9l Expectoration France Tub92 Expectoration France Tub93 Expectoration France Tub94 Expectoration Kurdista:a 2907793 52 Tub95 Tub96 Tub97 Tub98 Tub99 Tubi 00 Tub101 Tub102 Tub 103 Tubi 04 Tub 105 Expectoration Expectoration Expectoration Expectoration Expectoration Expectoration Expectoration Expectoration Expectoration Expectoration Expectoration Thaïlande Pologne France France France France France France France France France 2907793 53 Tableau 4 : Résultats du génotypage de 105 isolats de l'espèce Mycobacterium tuberculosis par la méthode MST. MST Souche 1 2 3 4 8 11 12 13 Génotypes Tubi 1 1 1 1 1 1 1 2 1 TublO 1 1 1 1 1 1 1 2 1 Tub13 1 1 1 1 1 1 1 2 1 Tub16 1 1 1 1 1 1 1 2 1 Tub4O 1 1 1 1 1 1 1 2 1 Tub4l 1 1 1 1 1 1 1 2 1 Tub49 1 1 1 1 1 1 1 2 1 Tub71 1 1 1 1 1 1 1 2 1 Tub72 1 1 1 1 1 1 1 2 1 Tub73 1 1 1 1 1 1 1 2 1 Tub74 1 1 1 1 1 1 1 2 1 Tub75 1 1 1 1 1 1 1 2 1 Tub76 1 1 1 1 1 1 1 2 1 Tub2 1 1 1 1 1 1 1 5 2 Tub77 1 1 1 1 1 1 1 5 2 Tub78 1 1 1 1 1 1 1 5 2 Tub25 1 1 1 1 3 1 1 5 14 Tub69 1 1 1 1 3 1 1 5 14 Tub7O 1 1 1 1 3 1 1 5 14 Tub2O 1 1 1 1 1 1 2 3 12 Tub46 1 1 1 1 1 1 2 3 12 Tub11 3 1 1 1 1 1 1 2 7 Tub12 3 1 1 1 1 1 1 2 7 Tub9l 3 1 1 1 1 1 1 2 7 Tub35 1 1 1 5 1 1 2 4 20 Tub2O 1 1 1 5 1 1 2 4 20 Tub52 1 1 1 1 1 4 1 1 26 Tub9O 1 1 1 1 1 4 1 1 26 Tubé 1 1 1 1 1 3 1 3 6 Tub9O 1 1 1 1 1 3 1 3 6 Tub15 1 1 2 1 1 2 1 1 9 Tub6 1 1 1 1 1 3 1 1 5 Tub? 1 1 1 1 1 3 1 1 5 Tub17 3 1 1 1 1 1 1 1 10 Tub32 3 1 1 1 1 1 1 1 10 Tub33 3 1 1 1 1 1 1 1 10 Tub101 1 1 1 1 1 1 1 1 19 Tub102 1 1 1 1 1 1 1 119 Tub103 1 1 1 1 1 1 1 1 19 2907793 54 Tub48 1 1 1 3 1 1 1 1 25 Tub87 1 1 1 3 1 1 1 1 25 Tub88 1 1 1 3 1 1 1 1 25 Tub89 1 1 1 3 1 1 1 1 25 Tub93 1 1 1 3 1 1 1 1 25 Tub94 1 1 1 3 1 1 1 1 25 TublO4 1 1 1 3 1 1 1 1 25 Tub105 1 1 1 3 1 1 1 1 25 Tub64 1 1 1 1 1 1 1 4 30 Tub165 1 1 1 1 1 1 1 4 30 Tub43 2 1 2 2 1 1 2 3 22 Tub45 1 1 1 1 1 2 1 1 24 Tub29 1 1 1 1 1 2 1 1 18 Tub3O 1 1 1 1 1 2 1 1 18 Tub95 1 1 1 1 1 2 1 1 18 Tub96 1 1 1 1 1 2 1 1 18 Tub2l 1 1 1 1 1 2 1 1 18 Tub22 1 1 1 1 1 2 1 1 18 Tub19 1 1 2 1 1 2 1 1 11 Tub24 1 1 2 1 1 2 1 1 11 Tub47 1 1 2 1 1 2 1 1 11 Tub5O 1 1 2 1 1 2 1 1 11 Tub51 1 1 2 1 1 2 1 1 11 Tub58 1 1 2 1 1 2 1 1 11 Tub59 1 1 2 1 1 2 1 1 11 Tub97 1 1 2 1 1 2 1 1 11 Tub98 1 1 2 1 1 2 1 1 11 Tub99 1 1 2 1 1 2 1 1 11 Tub38 1 1 1 1 1 1 2 3 21 Tub28 1 2 2 1 1 2 3 6 17 Tub44 4 1 1 1 1 1 1 3 23 Tub66 4 1 1 1 1 1 1 3 23 Tub67 4 1 1 1 1 1 1 3 23 Tub68 4 1 1 1 1 1 1 3 23 Tub84 4 1 1 1 1 1 1 3 23 Tub85 4 1 1 1 1 1 1 3 23 Tub86 4 1 1 1 1 1 1 3 23 Tub3 1 1 1 1 2 1 2 1 15 Tub79 1 1 1 1 1 1 2 1 3 Tub8O 1 1 1 1 1 1 2 1 3 Tub8l 1 1 1 1 1 1 2 1 3 Tub82 1 1 1 1 1 1 2 1 3 Tub27 1 3 1 1 1 1 4 7 16 Tub14 1 1 2 1 1 1 1 2 8 Tub42 1 1 2 1 3 1 1 2 8 Tub4 1 1 1 1 1 1 1 2 4 Tub5 1 1 1 1 1 1 1 2 4 2907793 Tub36 1 1 1 1 1 1 1 2 4 Tub34 1 1 1 1 1 1 1 2 4 Tub39 1 1 1 1 1 1 1 1 4 Tub23 1 1 2 1 1 1 5 8 13 Tub63 1 1 2 1 1 1 6 9 29 Tub62 1 1 1 1 2 1 1 1 28 Tub61 1 1 1 1 2 1 1 1 28 Tub6O 1 1 1 1 2 1 1 1 28 Tub53 4 1 1 4 2 1 1 1 27 Tub54 4 1 1 4 2 1 1 1 27 Tub55 4 1 1 4 2 1 1 1 27 Tub56 4 1 1 4 2 1 1 1 27 Souche 3 2 1 2 3 3 5 10 31 H37Rv Souche 3 1 1 5 1 4 7 11 32 CDC1551 56 Tableau 5 : Variants MST1 pour M. tuberculoses : 4 variants V. 1 GATGGTCTCCCGGCTGATCCTGGGCTGGCAGTGCTGGCGAGCGCCTGTTCCAGGATCTCGATTGCCTCGGCCTT GTC V.2 GATGGTCTCCCGGCTGATCCTGGGCTGGCAGTGCTGGCGAGCGCCTGTTCCAGGATCTCGATTGCCTCGGCCTT GTC V. 4 GATGGTCTCCCGGCTGATCCTGGGCTGGCAGTGCTGACGAGCGCCTGTTCCAGGATCTCGATTGCCTCGGCCTT GTC V. 3 GATGGTCTCCCGGCTGATCCTGGGCTGGCAGTGCTGGCGAGCGCCTGTTCCAGGATCTCGATTGCCTCGGCCTT GTC V. 1 CGGCCCCGCACCCCTTCGATGAGCTTGGTGCGCATATACGTCTGCAGCGACTGCCCCGC V. 2 GGCCCCGCACCCCTTCGATGAGCTTGGTGCGCATATACGTTTGCAGCGACTGCCCCGC V. 4 CGGCCCCGCACCCCTTCGATGAGCTTGGTGCGCATATACGTCTGCAGCGACTGCCCCGC V. 3 CGGCCCCGCACCCCTTCGATGAGCTTGGTGCGCATATACGTCTGCAGCGACTGCCCCGC V. 1 GCGGTGGCGCGCCGTCGATAGGTTTCGGCGACATCTTCGGGCAAATCCCGAACTTGAAT V. 2 GCGGTGGCGCGCCGTCGATAGGTTTCGGCGACATCTTCGGGCAAATCCCGAACTTGAAT V. 4 GCGGTGGCGCGCCGTCGATAGGTTTCGGCGACATCTTCGGGCAAATCCCGAACTTGAAT V. 3 GCGGTGGCGCGCCGTCGATAGGTTTCGGCGACATCTTCGGGCAAATCCCGAACTTGAAT 57 V. 1 GTAGCCATAGCGCTATTCTAGCGTCAGATTAGCGCCAGAACAGCGCTCGGAGTTCACCG V. 2 GTAGCCATAGCGCTATTCTAGCGTCAGATTAGCGCCAGAACAGCGCTCGGAGTTCACCG V. 4 GTAGCCATAGCGCTATTCTAGCGTCAGATTAGCGCCAGAACAGCGCTCGGAGTTCACCG V. 3 GTAGCCATAGCG GAGTTCACCG V. 1 GCTAAGAATGCCGGCTTATCCACCGGGCGTTTCGGCGGCATCGATGGCCTTCTCTAACCG V. 2 GCTAAGAATGCCGGCTTATCCACCGGGCGTTTCGGCGGCATCGATGGCCTTCTCTAACCG V. 4 GCTAAGAATGCCGGCTTATCCACCGGGCGTTTCGGCGGCATCGATGGCCTTCTCTAACCG V. 3 GCTAAGAATGCCGGCTTATCCACCGGGCGTTTCGGCGGCATCGATGGCCTTCTCTAACCG V. 1 GTCGAGCACCGCGCGCAGATCGGCCAGC V. 2 GTCGAGCACCGCGCGCAGATCGGCCAGC V. 4 GTCGAGCACCGCGCGCAGATCGGCCAGC V. 3 GTCGAGCACCGCGCGCAGATCGGCCAGC 58 Tableau 6 : Variants MST2 pour M. tuberculosis : 3 variants V. 1 GCGCCAAGGCCACCGGCCAACGCGAGCAGCGTCGCCGCAATGCCAACAAGCCAGCCTCGCCGCAACCGCGACGG GCGCCG V. 3 GCGCCAAGGCCACCGGCCAACGCGAGCAGCGTCGCCGCAATGCCAACAAGCCAGCCTCGCCGCAACCGCGACGG GCGCCG V. 2 GCGCCAAGGCCACCGGCCAACGCGAGCAGCGTCGCCGCAATGCCAACAAGCCAGCCTCGCCGCAACCGCGACGG GCGCCG V. 1 CTCGACGAGGGCCTGTTCTGGGCACGCGTCCTCGCCGAGCTCTCCGGCGTCAGATTCCGC V. 3 CTCGACGAGGGCCTGTTCTGGGCACGCGTCCTCGCCGAGCTCTCCGGCGTCAGATTCCGC V. 2 CTCGACGAGGGCCTGTTCTGGGCACGCGTCCTCGCCGAGCTCTCCGGCGTCAGATTCCGC V. 1 CGAATCCGCCGCCTTCACCTGCGGGCCAGTCTGGTCGGCTCCGGCGTCAGATTCCGCCGA V. 3 CGAATCCGCCGCCTTCACCTGCGGGCCAGTCTGGTCGGCTCCGGCGTCAGATTCCGCCGA V. 2 CGAATCCGCCGCCTTCACCT U. 1 A1CCG00GCC'l'TCACCTCCGTAGACGACGACTTATTCGCATCGGCAGGGTTCAGCTGGCC V. 3 ATCCGCCGCCTTCACCTCCGTAGACGACGACTTATTCGCATCGGCAGGGTTCAGCTGGCC V. 2 CCGTAGACGACGACTTATTCGCATCGGCAGGGTTCAGCTGGCC 59 V. 1 GGCGCCAGCATCTCCTTCCATCCGTCGTCTCCTGTTGTGCTCGAGTTTGCGACGGCGTAC V.3 GGCGCCAGCATCTCCTTCCATCCGTCGTCTCCTGTTGTGCTCGAGTTTGCGACCGCGTAC V. 2 GGCGCCAGCATCTCCTTCCATCCGTCGTCTCCTGTTGTGCTCGAGTTTGCGACGGCGTAC V. 1 TTGACACCATCCGGCCCCACCAGTTCACCGCTGGCCGGGC V. 3 TTGACACCATCCGGCCCCACCAGTTCACCGCTGGCCGGGC V. 2 TTGACACCATCCGGCCCCACCAGTTCACCGCTGGCCGGGC Tableau 7 : Variants MST3 pour M. tuberculosis : 2 variants V. CTGTGGCAGGCTCCCGGTAGCCACCGGCCTCGCCGTATTCGTCGGCATTTGGTTCGTCGCGTCTCCGTAAGGCG TTTCAG V. 2 CTGTGGCAGGCTCCCGGTAGCCACCGGCCTCGCCGTATTCGTCGGCATTTGGTTCGTCGCGTCTCCGTAAGGCG TTTCAG V. 1 GGCCTTCGAGGTCGCGCTTCCCCACCCGAAGACACCGAGTGCGGCGCCTGCGACCACGA V. 2 GGCCTTCGAGGTCGCGCTTCCCCACCCGAAGACACCGAGTGCGGCGCCTGCGACCACGA V.1 TGACCGAGAGAAAAGTCAGCGGCCCTGACAGAGCAGCTGCGCGGAATCAGTAGCTTCGCG V. 2 TGACCGAGAGAAAAGTCAGCGGCCCTGACAGAGCAGCTGCGCGGAATCAGTAGCTTCGCG V.1 GCAGCGCCGCGACCATCGCCTCGACCTGGGCCCGGGTGAGAACCGTGATGCTGGAGTCTGATAGTCCCAGAATC CTCGA V. 2 GCAGCGCCGCGACCATCGCCTCGACCTGGTCCCGGGTGAGAACCGTGATGCTGGAGTCTGATAGTCCCAGAATC CTCGA 61 Tableau 8 : Variants MST4 pour M. tuberculosis : 5 variants V. 1 GATCAGCTACGGGTTGGCCGGGGTGGTCACCGCGGGCATGCCGGTGATCGAGTGGCTATACGCTCGGCAGCTGC GCCGGG V. 2 GATCAGCTACGGGTTGGCCGGGGTGGTCACCGCGGGCATGCCGGTGATCGAGTGGCTATACGCTCGGCAGCTGC GCCGGG V. 3 GATCAGCTACGGGTTGGCCGGGGTGGTCACCGCGGGCATGCCGGTGATCGAGTGGCTATACGCTCGGCAGCTGC GCCGGG V. 4 GATCAGCTACGGGTTGGCCGGGGTGGTCACCGCGGGCATGCCGGTGATCGAGTGGCTATACGCTCGGCAGCTGC GCCGGG V. 5 GATCAGCTACGGGTTGGCCGGGGTGGTCACCGCGGGCATGCCGGTGATCGAGTGGCTATACGCTCGGCAGCTGC GCCGGG V.1 TGGTGGCGCCCCAGTCCAGTTAGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGT V. 2 TGGTGGCGCCCCAGTCCAGTTAGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGT V. 3 TGGTGGCGCCCCAGTCCAGTTAGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGT V. 4 TGGTGGCGCCCCAGTCCAGTTAGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGT V. 5 TGGTGGCGCCCCAGTCCAGTTAGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGT C GT G C C G A C C C G G GT C G T C G C C G G G C TA G T G CGTGCCGACCCGGGTCGTCGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGTCGT V. 1 V. 2 62 V. 3 CGTGCCGACCCGGGTCGTCGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGTCGT V. 4 CGTGCCGACCCGGGTCGTCGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGTCGT V. 5 CGTGCCGACCCGGGTCGTCGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGTCGT V. 1 --------------------------------------- - --------------------------------------------------------- - --------- V. 2 GCCGACCCGGGTCGTCGCCGGGCTAGTG V. 3 GCCGACCCGGGTCGTCGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGTCGTGCC V. 4 GCCGACCCGGGTCGTCGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGTCGTGCC V. 5 GCCGACCCGGGTCGTCGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGTCGTGCC V. 1 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 2 - - --- -----------------------------------------------------------------------------------------------------V .3 GACCCGGGTCGTCGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGTCGTGCCGAC V. 4 GACCCGGGTCGTCGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGTCGTGCCGAC V. 5 GACCCGGGTCGTCGCCGGGCTAGTG 63 V. 1 V. 2 V. 3 CCGGGTCGTCGCCGGGCTAGTG V.4 CCGGGTCGTCGCCGGGCTGTGCTTGATTTGCCCGGTTCCTTCCCGGGTCGTGCCGACCCG V. 5 ----V.1 CTCGCCGTCTGGCGAACCCAT V. 2 CTCGCCGTCTGGCGAACCCAT V. 3 CTCGCCGTCTGGCGAACCCAT V. 4 GGTCGTCGCCGGGCTAGTGCTCGCCGTCTGGCGAACCCAT V. 5 CTCGCCGTCTGGCGAACCCAT 64 Tableau 9 : Variants MST8 pour M. tuberculosis : 3 variants V.1 CCGCAATCACAAACTTCAATACCCCGCACCTCCGACCAGCTCAGCACGACTTCACGAATCCCAGACCTGCGACA CCGTCGGC V. 2 CCGCAATCACAAACTTCAATACCCCGCACCTCCGACCAGCTCAGCACGACTTCACGAATCCCAGACCTGCGACA CCGTAGGC V. 3 CCGCAATCACAAACTTCAATACCCCGCACCTCCGACCAGCTCAGCACAACTTCACGAATCCCAGACCTGCGACA CCGTCGGC V. 1 AGGGCTTTCGATCCTATAACAATCTGGAAACAGGATGTCGCACTTTCCTTAAAAGAGCTT V. 2 AGGGCTTTCGATCCTATAACAATCTGGAAACAGGATGTCGCACTTTCCTTAAAAGAGCTT V. 3 AGGGCTTTCGATCCTATAACAATCTGGAAACAGGATGTCGCACTTTCCTTAAAAGAGCTT V.1 CCGCCAACCCGATCGTCAGCGCGCACATGTTGCGCAAAAGTTGTTGGAGCCGAAACGAAC V. 2 CCGCCAACCCGATCGTCAGCGCGCACATGTTGCGCAAAAGTTGTTGGAGCCGAAACGAAC V. 3 CCGCCAACCCGATCGTCAGCGCGCACATGTTGCGCAAAAGTTGTTGGAGCCGAAACGAAC V.1 CGGCGCGCGCCGTTACCGGCGCCGCCGCCCTAGGTGGCCTGCAAGACCAAAGGAGGCCCG V. 2 CGGCGCGCGCCGTTACCGGCGCCGCCGCCCTAGGTGGCCTGCAAGACCAAAGGAGGCCCG V. 3 CGGCGCGCGCCGTTACCGGCGCCGCCGCCCTAGGTGGCCTGCAAGACCAAAGGAGGCCCG V.1 GGATCGGGTGACAGCGGGCCGTTTTCGCGCTGCATCAGCCAGCCCGCGATGTTGTGGAAC V. 2 GGATCGGGTGACAGCGGGCCGTTTTCGCGCTGCATCAGCCAGCCCGCGATGTTGTGGAAC V. 3 GGATCGGGTGACAGCGGGACGTTTTCGCGCTGCATCAGCCAGCCCGCGATGTTGTGGAAC V.1 AGCGGGGCGGCCGAGTGCCCAGGCGCGCCGTCGGAGTTGCGCGCCGGGTTGTCCAACATG V. 2 AGCGGGGCGGCCGAGTGCCCAGGCGCGCCGTCGGAGTTGCGCGCCGGGTTGTCCAACATG V. 3 AGCGGGGCGGCCGAGTGCCCAGGCGCGCCGTCGGAGTTGCGCGCCGGGTTGTCCAACATG V.1 ATGCCGATCACGTAGCGGGGATTGTCGGCAGTGGCGATTCCGGCGAAGGTGATCCAATACACGTCGTCGAAGTA GC V. 2 ATGCCGATCACGTAGCGGGGATTGTCGGCAGTGGCGATTCCGGCGAAGGTGATCCAATACACGTCGTCGAAGTA GC V. 3 ATGCCGATCACGTAGCGGGGATTGTCGGCAGTGGCGATTCCGGCGAAGGTGATCCAATACACGTCGTCGAAGTA GC 66 Tableau 10 : Variants MST11 pour M. tuberculosis : 4 variants V.1 AGGTGTTAGAGGTGGTGGATTCGGACTTCAATGCGTTGTTGGAGTTGGGATTTCGGTCGTCGATTCAACGAGAG TGGCAG V. 2 AGGTGTTAGAGGTGGTGGATTCGGACTTCAATGCGTTGTTGGAGTTGGGATTTCGGTCGTCGATTCAACGAGAG TGGCAG V. 3 AGGTGTTAGAGGTGGTGGATTCGGACTTCAATGCGTTGTTGGAGTTGGGATTTCGGTCGTCGATTCAACGAGAG TGGCAG V. 4 AGGTGTTAGAGGTGGTGGATTCGGACTTCAATGCGTTGTTGGAGTTGGGATTTCGGTCGTCGATTCAACGAGAG TGGCAG V. 1 TGGCGGTTATCTCGCGGTGAGTCGCTGCAGAACCTGCAGGCCTTCGCTCACTTACGCCCG V. 2 TGGCGGTTATCTCGCGGTGAGTCGCTGCAGAACCTGCAGGCCTTCGCTCACTTACGCCTG V. 3 TGGCGGTTATCTCGCGGTGAGTCGCTGCAGAACCTGCAGGCCTTCGCTCACTTACGCC-- V.4 TGGCGGTTATCTCGCGGTGAGTCGCTGCAGAACCTGCAGGCCTTCGCTCACTTACGCC-- V.1 ACGACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGAC V. 2 ACGACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGAC V. 3 C G A C V. 4 67 V.1 GACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGA V.2 GACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGA V. 3 GACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGA V. 4 -- - --C G A C G A V.1 CGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGACG V. 2 CGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGACG V. 3 CGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGACG V.4 CGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGACG V.1 ATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAATAGCACTCGTGGAGGTCAAGACGCCCGCCGGTG V. 2 ATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAATAGCACTCGTGGAGGTCAAGACGCCCGCCGGTG V. 3 ATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAATAGCACTCGTGGAGGTCAAGACGCCCGCCGGTG V. 4 ATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAATAGCACTCGTGGAGGTCAAGACGCCCGCCGGTG V.1 ATGGGCTGGTGGCGCTCACCCCGTTCCGGACTCAGAAATTCGCGATCACAATTTGCGCGT 68 V. 2 ATGGGCTGGTGGCGCTCACCCCGTTCCGGACTCAGAAATTCGCGATCACAATTTGCGCGT V. 3 ATGGGCTGGTGGCGCTCACCCCGTTCCGGACTCAGAAATTCGCGATCACAATTTGCGCGT V. 4 ATGGGCTGGTGGCGCTCACCCCGTTCCGGACTCAGAAATTCGCGATCACAATTTGCGCGT V.1 TCAAGTCATTGGCATGCATGTGATGGTTTAGCGTTCCGCTGTGCCTCTTCAGGTGTTTGT V. 2 TCAAGTCATTGGCATGCATGTGATGGTTTAGCGTTCCGCTGTGCCTCTTCAGGTGTTTGT V. 3 TCAAGTCATTGGCATGCATGTGATGGTTTAGCGTTCCGCTGTGCCTCTTCAGGTGTTTGT V. 4 TCAAGTCATTGGCATGCATGTGATGGTTTAGCGTTCCGCTGTGCCTCTTCAGGTGTTTGT V. 1 CGGCTTCGTTGCCATGATGACGCTCAAGGTCGCGATCGGCCCGCAAAACGCATTTGTCCT V. 2 CGGCTTCGTTGCCATGATGACGCTCAAGGTCGCGATCGGCCCGCAAAACGCATTTGTCCT V. 3 CGGCTTCGTTGCCATGATGACGCTCAAGGTCGCGATCGGCCCGCAAAACGCATTTGTCCT V. 4 CGGCTTCGTTGCCATGATGACGCTCAAGGTCGCGATCGGCCCGCAAAACGCATTTGTCCT V.1 GCGCCAAGGAATTAGGCGAGAATACGTGCTGGTCATTGTGGCGCTGTGCGGGATCGCTGA V. 2 GCGCCAAGGAATTAGGCGAGAATACGTGCTGGTCATTGTGGCGCTGTGCGGGATCGCTGA 69 GCGCCAAGGAATTAGGCGAGAATACGTGCTGGTCATTGTGGCGCTGTGCGG(ATCGCTGA GCGCCAAGGAATTAGGCGAGAATACGTGCTGGTCATTGTGGCGCTGTGCGGGATCGCTGA TGGGGCACTGATTGCCGCGGGCGTTGGCGGCTTCGCTGCGCTGATTCACGCTCATCCCAATATGACTTTGGTT TGGGGCACTGATTGCCGCGGGCGTTGGCGGCTTCGCTGCGCTGATTCACGCTCATCCCAATATGACTTTGGTT TGGGGCACTGATTGCCGCGGGCGTTGGCGGCTTCGCTGCGCTGATTCACGCTCATCCCAATATGACTTTGGTT TGGGGCACTGATTGCCGCGGGCGTTGGCGGCTTCGCTGCGCTGATTCACGCTCATCCCAATATGACTTTGGTT V. 3 V. 4 V. 1 V. 2 V. 3 V. 4 Tableau 11 : Variants MST12 pour M. tuberculosis : 7 variants GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG V. 1 V. 2 V. 3 V. 4 V. 5 V. 6 V. 7 V. 1 V. 2 V. 3 V. 4 V. 5 71 AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGG V. 1 GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG TGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGC GGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG V. 6 V. 7 V. 2 V. 3 V. 4 V. 5 V. 6 V. 7 V. 1 V. 2 V. 3 V. 4 72 V. 2 GGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACC V. 5 CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG V. 6 CGTAGCGATGAGGTGGGTGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG V. 7 CCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGT CCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGT CCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGT CCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGT C C G A C G A C G AT G C A G A G C GT A G C G AT G A G G C C G A C G A C G AT G C A GA G C GT A G C G AT GA G G--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V.1 GGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACC V. 1 V. 2 V. 3 V. 4 V. 5 V. 6 V. 7 V. 3 GGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGG 73 V. 4 GGCGCTGATGACC V. 5 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 6 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 7 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 1 CGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGAT V. 2 CGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGAT V. 3 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 4 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 5 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 6 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 7 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 1 GAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACG V. 2 GAGG 74 V. 3 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 4 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ V. 5 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ V. 6 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ V. 7 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 1 ATGCAGAGCGTAGCGATGAGGAGGAGTGGCGCTGATGACCAGTGTGTTGATTGTGGAGGA V. 2 AGGAGTGGCGCTGATGACCAGTGTGTTGATTGTGGAGGA V. 3 -AGGAGTGGCGCTGATGACCAGTGTGTTGATTGTGGAGGA V. 4 ---- ----- ---AGTGTGTTGATTGTGGAGGA V. 5 AGGAGTGGCGCTGATGACCAGTGTGTTGATTGTGGAGGA V. 6 AGGAGTGGCGCTGATGACCAGTGTGTTGATTGTGGAGGA V. 7 AGGAGTGGCGCTGATGACCAGTGTGTTGATTGTGGAGGA V. 1 CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT GGTGGTGACCGATGGTCCG G CAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT V. 2 V. 3 V. 4 V. 5 V. 6 V. 7 V. 1 V. 2 V. 3 V. 4 V. 5 V. 6 V. 7 76 V. 1 V. 2 V. 3 V. 4 V. 5 V. 6 V. 7 CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGCTACGTGACCAAGCC CTATTC CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGCTACGTGACCAAGCC CTATTC CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGCTACGTGACCAAGCC CTATTC CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGCTACGTGACCAAGCC CTATTC CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGCTACGTGACCAAGCC CTATTC CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGCTACGTGACCAAGCC CTATTC CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGCTACGTGACCAAGCC CTATTC 77 Tableau 12 : Variants MST13 pour M. tuberculosis : 11 variants CGAGTTCACCGTCCATCATCTTGGTGAACAAATCCAGCCCCACCGCACGGACCAGGGGTTCGGCGAACGGATCG TTGATC CGAGTTCACCGTCCATCATCTTGGTGAACAAATCCAGCCCCACCGCACGGACCAGGGGTTCGGCGAACGGATCG TTGATC CGAGTTCACCGTCCATCATCTTGGTGAACAAATCCAGCCCCACCGCACGGACCAGGGGTTCGGCGAACGGATCG TTGATC CGAGTTCACCGTCCATCATCTTGGTGAACAAATCCAGCCCCACCGCACGGACCAGGGGTTCGGCGAACGGATCG TTGATC CGAGTTCACCGTCCATCATCTTGGTGAACAAATCCAGCCCCACCGCACGGACCAGGGGTTCGGCGAACGGATCG TTGATC CGAGTTCACCGTCCATCATCTTGGTGAACAAATCCAGCCCCACCGCACGGACCAGGGGTTCGGCGAACGGATCG TTGATC CGAGTTCACCGTCCATCATCTTGGTGAACAAATCCAGCCCCACCGCACGGACCAGGGGTTCGGCGAACGGATCG TTGATC CGAGTTCACCGTCCATCATCTTGGTGAACAAATCCAGCCCCACCGCACGGACCAGGGGTTCGGCGAACGGATCG TTGATC CGAGTTCACCGTCCATCATCTTGGTGAACAAATCCAGCCCCACCGCACGGACCAGGGGTTCGGCGAACGGATCG TTGATC CGAGTTCACCGTCCATCATCTTGGTGAACAAATCCAGCCCCACCGCACGGACCAGGGGTTCGGCGAACGGATCG TTGATC CGACTTCACCGTCCATCAT C T TG GTGAACAAA T CCAG CCCCACCGCACGGAC CAGGGG 1 1 CGGCGAACGGÂ 1 CG T 1 GA 1 C AAACCGCGCGGATCCTTGGTGGCCAGCGCACGCCCGACCGCGACAATGGTCGCGGTGACG AAACCGCGCGGATCCTTGGTGGCCAGCGCACGCCCGACCGCGACAATGGTCGCGGTGACG V. 1 V. 7 V. 3 V. 6 V. 4 V. 11 V. 8 V. 9 V. 5 V. 10 V.2 V. 1 V. 7 78 AAACCGCGCGGATCCTTGGTGGCCAGCGCACGCCCGACCGCGACAATGGTCGCGGTGACG AAACCGCGCGGATCCTTGGTGGCCAGCGCACGCCCGACCGCGACAATGGTCGCGGTGACG AAACCGCGCGGATCCTTGGTGGCCAGCGCACGCCCGACCGCGACAATGGTCGCGGTGACG AAACCGCGCGGATCCTTGGTGGCCAGCGCACGCCCGACCGCGACAATGGTCGCGGTGACG AAACCGCGCGGATCCTTGGTGGCCAGCGCACGCCCGACCGCGACAATGGTCGCGGTGACG AAACCGCGCGGATCCTTGGTGGCCAGCGCACGCCCGACCGCGACAATGGTCGCGGTGACG AAACCGCGCGGATCCTTGGTGGCCAGCGCACGCCCGACCGCGACAATGGTCGCGGTGACG AAACCGCGCGGATCCTTGGTGGCCAGCGCACGCCCGACCGCGACAATGGTCGCGGTGACG AAACCGCGCGGATCCTTGGTGGCCAGCGCACGCCCGACCGCGACAATGGTCGCGGTGACG CCGACGCTAGACGTCAGATCCCAGTTGTCGTCGTCGGTGCGGGCCACCAGCCCACCCTAG CCGACGCTAGACGTCAGATCCCAGTTGTCGTCGTCGGTGCGGGCCACCAGCCCACCCTAG CCGACGCTAGACGTCAGATCCCAGTTGTCGTCGTCGGTGCGGGCCACCAGCCCACCCTAG CCGACGCTAGACGTCAGATCCCAGTTGTCGTCGTCGGTGCGGGCCACCAGCCCACCCTAG CCGACGCTAGACGTCAGATCCCAGTTGTCGTCGTCGGTGCGGGCCACCAGCCCACCCTAG V. 3 V. 6 V. 4 V. 11 V.8 V. 9 V. 5 V. 10 V.2 V. 1 V. 7 V 3 V. 6 V. 4 79 CCGACGCTAGACGTCAGATCCCAGTTGTCGTCGTCGGTGCGGGCCACCAGCCCACCCTAG CCGACGCTAGACGTCAGATCCCAGTTGTCGTCGTCGGTGCGGGCCACCAGCCCACCCTAG CCGACGCTAGACGTCAGATCCCAGTTGTCGTCGTCGGTGCGGGCCACCAGCCCACCCTAG CCGACGCTAGACGTCAGATCCCAGTTGTCGTCGTCGGTGCGGGCCACCAGCCCACCCTAG CCGACGCTAGACGTCAGATCCCAGTTGTCGTCGTCGGTGCGGGCCACCAGCCCACCCTAG CCGACGCTAGACGTCAGATCCCAGTTGTCGTCGTCGGTGCGGGCCACCAGCCCACCCTAG V. 1 TCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCT TCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCT TCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTCGTCT TCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCT TCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTCGTCT TCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTCGTCT TCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCT TCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCT V. 11 V.8 V. 9 V. 5 V. 10 V.2 V. 7 V. 3 V. 6 V. 4 V. 11 V.8 V. 9 TCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTCGTCT TCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTCGTCT TCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAAC GATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCTGAT GATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCTGAT GATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTCGTCTGAT GATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCTGAT GATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGT GATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGT GATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGT GATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCTGAT GATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTC V. 5 V. 10 V.2 V. 1 V. 7 V. 3 V. 6 V. 4 V. 11 V.8 V. 9 V. 5 V. 10 GATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAAC------------------------------------------V.2 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 81 V. 1 TGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGT V. 7 TGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCTGATTGC V. 3 TGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCTGATTGC V. 6 TGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGT V. 4 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 11 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V.8 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 9 TGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCTGATTGC V. 5 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 10 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V.2 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 1 CGTCTGATTGCCCG V. 7 CCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTCGTCTGATTGCCCG V. 3 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 82 V. 6 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 4 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 11 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V.8 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 9 CCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTAGTCTGATTGCCCG V. 5 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 10 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V.2 V. 1 GTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTCGTCTGATTGCCCGGTT V. 7 GTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTCGTCTGATTGCCCGGTT V. 3 CGTCTGATTGCCCGGTT V. 6 CGTCTGATTGCCCGGTT V. 4 CGTCTGATTGCCCGGTT V. 11 CGTCTGATTGCCCGGTT 83 V.8 AGTCTGATTGCCCGGTT V. 9 GTTCCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTCGTCTGATTGCCCGGTT V. 5 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 10 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V.2 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 1 CCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTC V. 7 CCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTC V. 3 CCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTC V. 6 CCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTC V. 4 CCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTC V. 11 CCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTC V.8 CCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTC V. 9 CCTCCTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTGTCTGATTGCCCGGTTCCTC V. 5 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 84 V. 10 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V.2 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 1 GTCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCG V. 7 GTCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCG V. 3 ---- - GTCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCG V. 6 - ---GTCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCG V. 4 GTCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCG V. 11 ----------GTCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCG V.8 GTCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCG V. 9 CTCGCGCCGCAAACGGCGCGCATCGTCACCGGGCGTGTCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCG V. 5 GTCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCG V. 10 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V.2 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- V. 1 CGCCGCAAACCAAGCCGGCTGGTGCTGTGCTATTGGCGTCGGAACAGACGGCCGTGCTGG CGCCGCAAACCAAGCCGGCTGGTGCTGTGCTATTGGCGTCGGAACAGACGGCCGTGCTGG CGCCGCAAACCAAGCCGGCTGGTGCTGTGCTATTGGCGTCGGAACAGACGGCCGTGCTGG CGCCGCAAACCAAGCCGGCTGGTGCTGTGCTATTGGCGTCGGAACAGACGGCCGTGCTGG CGCCGCAAACCAAGCCGGCTGGTGCTGTGCTATTGGCGTCGGAACAGACGGCCGTGCTGG CGCCGCAAACCAAGCCGGCTGGTGCTGTGCTATTGGCGTCGGAACAGACGGCCGTGCTGG CGCCGCAAACCAAGCCGGCTGGTGCTGTGCTATTGGCGTCGGAACAGACGGCCGTGCTGG CGCCGCAAACCAAGCCGGCTGGTGCTGTGCTATTGGCGTCGGAACAGACGGCCGTGCTGG CGCCGCAAACCAAGCCGGCTGGTGCTGTGCTATTGGCGTCGGAACAGACGGCCGTGCTGG CAAGCCGGCTGGTGCTGTGCTATTGGCGTCGGAACAGACGGCCGTGCTGG CAAGCCGGCTGGTGCTGTGCTATTGGCGTCGGAACAGACGGCCGTGCTGG TACAGAACCAGGCGATGTTGCCGTCCGGCCCGCGCACGAAGTTGGAGCGACTGCCGGTG TACAGAACCAGGCGATGTTGCCGTCCGGCCCGCGCACGAAGTTGGAGCGACTGCCGGTG TACAGAACCAGGCGATGTTGCCGTCCGGCCCGCGCACGAAGTTGGAGCGACTGCCGGTG TACAGAACCAGGCGATGTTGCCGTCCGGCCCGCGCACGAAGTTGGAGCGACTGCCGGTG V. 7 V. 3 V. 6 V. 4 V. 11 V.8 V. 9 V. 5 V. 10 V.2 V. 1 V. 7 V. 3 V. 6 86 TACAGAACCAGGCGATGTTGCCGTCCGGCCCGCGCACGAAGTTGGAGCGACTGCCGGTG TACAGAACCAGGCGATGTTGCCGTCCGGCCCGCGCACGAAGTTGGAGCGACTGCCGGTG TAC AGAACCAGGCGATGTTGCCGTCCGGCCCGCTCACGAAGTTGGAGCGACTGCCGGTG TACAGAACCAGGCGATGTTGCCGTCCGGCCCGCGCACGAAGTTGGAGCGACTGCCGGTG ACAGAACCAGGCGATGTTGCCGTCCGGCCCGCGCACGAAGTTGGAGCGACTGCCGGTG TACAGAACCAGGCGATGTTGCCGTCCGGCCCGCGCACGAAGTTGGAGCGACTGCCGGTG ACAGAACCAGGCGATGTTGCCGTCCGGCCCGCGCACGAAGTTGGAGCGACTGCCGGTG GCTTGTTGTCGGGTCCAAGGTCGAGCCCATAGTCGGGCCGATAGAAGGCGAGGCCCAGA GCTTGTTGTCGGGTCCAAGGTCGAGCCCATAGTCGGGCCGATAGAAGGCGAGGCCCAGA GCTTGTTGTCGGGTCCAAGGTCGAGCCCATAGTCGGGCCGATAGAAGGCGAGGCCCAGA GCTTGTTGTCGGGTCCAAGGTCGAGCCCATAGTCGGGCCGATAGAAGGCGAGGCCCAGA GCTTGTTGTCGGGTCCAAGGTCGAGCCCATAGTCGGGCCGATAGAAGGCGAGGCCCAGA GCTTGTTGTCGGGTCCAAGGTCGAGCCCATAGTCGGGCCGATAGAAGGCGAGGCCCAGAGCTTGTTGTCGGGTCCAAGGTCGAGCCCATAGTCGGGCCGATAGAAGGCGAGGCCCAGA V. 4 V. 11 V. 8 V. 9 V. 5 V. 10 V.2 V. 1 V. 7 V. 3 V. 6 V. 4 V. 11 V.8 87 G C T T G TT G T C G G G T C C GCTTGTTGTCGGGTCCAAGGTCGAGCCCATAGTCGGGCCGATAGAAGGCGAGGCCCAGA GCTTGTTGTCGGGTCCAAGGTCGAGCCCATAGTCGGGCCGATAGAAGGCGAGGCCCAGA GCTTGTTGTCGGGTCCAAGGTCGAGCCCATAGTCGGGCCGATAGAAGGCGAGGCCCAGA TGGCGCTGTTTTGGCCATCCGGGTTGGCATCGTCGGTGCTCATGCTTCCAGCAAGCAAGTCGATGACCGTTGTC TC TGGCGCTGTTTTGGCCATCCGGGTTGGCATCGTCGGTGCTCATGCTTCCAGCAAGCAAGTCGATGACCGTTGTC TC GGCGCTGTTTTGGCCATCCGGGTTGGCATCGTCGGTGCTCATGCTTCCAGCAAGCAAGTCGATGACCGTTGTCT C TGGCGCTGTTTTGGCCATCCGGGTTGGCATCGTCGGTGCTCATGCTTCCAGCAAGCAAGTCGATGACCGTTGTC TC GGCGCTGTTTTGGCCATCCGGGTTGGCATCGTCGGTGCTCATGCTTCCAGCAAGCAAGTCGATGACCGTTGTCT C TGGCGCTGTTTTGGCCATCCGGGTTGGCATCGTCTGTGCTCATGCTTCCAGCAAGCAAGTCGATGACCGTTGTC TC G G C G C T GTTTT G G C C AT C C G G GTT G G C AT C GT C G GT G C T CAT G C TT C C A G C A A G C AA G T C G AT GA C C G T T GT C T C TGGCGCTGTTTTGGCCATCCGGGTTGGCATCGTCGGTGCTCATGCTTCCAGCAAGCAAGTCGATGACCGTTGTC TC TGGCGCTGTTTTGGCCATCCGGGTTGGCATCGTCGGTGCTCATGCTTCCAGCAAGCAAGTCGATGACCGTTGTC TC V. 9 V. 5 V. 10 V.2 V. 1 V. 7 V. 3 V. 6 V. 4 V. 11 V.8 V. 9 V. 5 V. 10 V.2 88 GGCGCTGTTTTGGCCATCCGGGTTGGCATCGTCGGTGCTCATGCTTCCAGCAAGCAAGTCGATGACCGTTGTCT C 89 Tableau 13 : Identification des espèces par l'analyse de la séquence du spacer MST11 : M. tuberculosis 1 AGGTGTTAGAGGTGGTGGATTCGGACTTCAATGCGTTGTTGGAGTTGGGATTTCGGTCGTCGATTCAACGAGAG TGGCAG M. tuberculosis 2 AGGTGTTAGAGGTGGTGGATTCGGACTTCAATGCGTTGTTGGAGTTGGGATTTCGGTCGTCGATTCAACGAGAG TGGCAG M. bovis AGGTGTTAGAGGTGGTGGATTCGGACTTCAATGCGTTGTTGGAGTTGGGATTTCGGTCGTCGATTCAACGAGAG TGGCAG M. africanum AGGTGTTAGAGGTGGTGGATTCGGACTTCAATGCGTTGTTGGAGTTGGGATTTCGGTCGTCGATTCAACGAGAG TGGCAG M. bovis ssp BCG AGGTGTTAGAGGTGGTGGATTCGGACTTCAATGCGTTGTTGGAGTTGGGATTTCGGTCGTCGATTCAACGAGAG TGGCAG M. tuberculosis 3 AGGTGTTAGAGGTGGTGGATTCGGACTTCAATGCGTTGTTGGAGTTGGGATTTCGGTCGTCGATTCAACGAGAG TGGCAG M. canettii AGGTGTTAGAGGTGGTGGATTCGGACTTCAATGCGTTGTTGGAGTTGGGATTTCGGTCGTCGATTCAACGAGAG TGGCAG M. tuberculosis 4 AGGTGTTAGAGGTGGTGGATTCGGACTTCAATGCGTTGTTGGAGTTGGGATTTCGGTCGTCGATTCAACGAGAG TGGCAG M. tuberculosis 1 TGGCGGTTATCTCGCGGTGAGTCGCTGCAGAACCTGCAGGCCTTCGCTCACTTACGCCCG M. tuberculosis 2 TGGCGGTTATCTCGCGGTGAGTCGCTGCAGAACCTGCAGGCCTTCGCTCACTTACGCCTG M. bovis TGGCGGTTATCTCGCGGTGAGTCGCTGCAGAACCTGCAGGCCTTCGCTCACTTACGCCCG M. africanum TGGCGGTTATCTCGCGGTGAGTCGCTGCAGAACCTGCAGGCCTTCGCTCACTTACGCCCG M. bovis ssp BCG TGGCGGTTATCTCGCGGTGAGTCGCTGCAGAACCTGCAGGCCTTCGCTCACTTACGCCCG M. tuberculosis 3 TGGCGGTTATCTCGCGGTGAGTCGCTGCAGAACCTGCAGGCCTTCGCTCACTTACGCCCG M. canettii TGGCGGTTATCTCGCGGTGAGTCGCTGCAGAACATGCAGGCCTTCGCTCACTTGCGCCCG M. tuberculosis 4 TGGCGGTTATCTCGCGGTGAGTCGCTGCAGAACCTGCAGGCCTTCGCTCACTTACGCCCG 91 M. tuberculosis 1 ACGACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGAC M. tuberculosis 2 ACGACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGAC M. bovis ACGACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGAC M. africanum ACGACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGAC M. bovis ssp BCG ACGAGGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGAC M. tuberculosis 3 ACGACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGAC M. canettii ACGACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGAC M. tuberculosis 4 ACGACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGAC 92 M. tuberculosis 1 GACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGA M. tuberculosis 2 GACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGA M. bovis GACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGA M. africanum GACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGA M. bovis ssp BCG GACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGA M. tuberculosis 3 GACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGA M. canettii GACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGA 11~. tuberculosis 4 GACGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAA 93 M. tuberculosis 1 CGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGACG M. tuberculosis 2 CGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGACG M. bovis CGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGACG M. africanum CGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGACG M. bovis ssp BCG CGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGACG M. tuberculosis 3 C G A T G C A G A G C G C G C A G C G C G AT G A G A A M. canettii CGATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAA M. tuberculosis 4 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 94 M. tuberculosis 1 ATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAA M. tuberculosis 2 ATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAA---- - M. bovis ATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGACGAT M. africanum ATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGC M. bovis ssp BCG ATGCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGC---- M. tuberculosis 3 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. canettii ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. tuberculosis 4 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. tuberculosis 1 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. tuberculosis 2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. bovis GCAGAGCGCGCAGCGCGATGAGAAGGAGTTGGGCGGTTAGGTCGAGCCCGACGACGATGC M. africanum T C GA G C C C G A C G A C G A T G C M. bovis ssp BCG - - --CCGACGACGATGC M. tuberculosis 3 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. canettii -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. tuberculosis 4 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 96 M. tuberculosis 1 ATA G C A C T C G T G G A G G T C A A G A C G C C C G C C G G T G A T G M. tuberculosis 2 A T A G C A C T C G T G G A G G T C A A G A C G C C C G C C G G T G A T G M. bovis AGAAGCGCGCAGCGCGATGAGAAATAGCACTCGTGGAGGTCAAGACGCCCGCCGGTGATG M. africanum AGAGCCGCGCAGCGCGATGAGAAATAGCACTCGTGGAGGTCAAGACGCCCGCCGGTGATG M. bovis ssp BCG AGAG-CGCGCAGCGCGATGAGAAATAGCACTCGTGGAGGTCAAGACGCCCGCCGGTGATG M. tuberculosis 3 ATAG C A C T C GT G G A G GT C A A G A C G C C C G C C G GT G A T G M. canettii ATAGCACTCGTGGAGGTCAAGACGCCCGCCGGTGATG M. tuberculosis 4 AT A G C A C T C G T G G A G G T C A A G A C G C C C G C C G G T G AT G 97 M. tuberculosis 1 GGCTGGTGGCGCTCACCCCGTTCCGGACTCAGAAATTCGCGATCACAATTTGCGCGTTCA M. tuberculosis 2 GGCTGGTGGCGCTCACCCCGTTCCGGACTCAGAAATTCGCGATCACAATTTGCGCGTTCA M. bovis GGCTGGTGGCGCTCACCCCGTTCCGGACTCAGAAATTCGCGATCACAATTTGCGCGTTCA M. africanum GGCTGGTGGCGCTCACCCCGTTCCGGACTCAGAAATTCGCGATCACAATTTGCGCGTTCA M. bovis ssp BCG GGCTGGTGGCGCTCACCCCGTTCCGGACTCAGAAATTCGCGATCACAATTTGCGCGTTCA M. tuberculosis 3 GGCTGGTGGCGCTCACCCCGTTCCGGACTCAGAAATTCGCGATCACAATTTGCGCGTTCA M. canettii GGCTGGTGGCGCTCACCCCGTTCCGGACTCAGAAATTCGCGATCACAATTTGCGCGTTCA M. tuberculosis 4 GGCTGGTGGCGCTCACCCCGTTCCGGACTCAGAAATTCGCGATCACAATTTGCGCGTTCA 98 M. tuberculosis 1 AGTCATTGGCATGCATGTGATGGTTTAGCGTTCCGCTGTGCCTCTTCAGGTGTTTGTCGG M. tuberculosis 2 AGTCATTGGCATGCATGTGATGGTTTAGCGTTCCGCTGTGCCTCTTCAGGTGTTTGTCGG M. bovis AGTCATTGGCATGCATGTGATGGTTTAGCGTTCCGCTGTGCCTCTTCAGGTGTTTGTCGG M. africanum AGTCATTGGCATGCATGTGATGGTTTAGCGTTCCGCTGTGCCTCTTCAGGTGTTTGTCGG M. bovis ssp BCG AGTCATTGGCATGCATGTGATGGTTTAGCGTTCCGCTGTGCCTCTTCAGGTGTTTGTCGG M. tuberculosis 3 AGTCATTGGCATGCATGTGATGGTTTAGCGTTCCGCTGTGCCTCTTCAGGTGTTTGTCGG M. canettii AGTCATTGGCATGCATGTGATGGTTTAGCGTTCCGCTGTGCCTCTTCAGGTGTTTGTCGG M. tuberculosis 4 AGTCATTGGCATGCATGTGATGGTTTAGCGTTCCGCTGTGCCTCTTCAGGTGTTTGTCGG 99 M. tuberculosis 1 CTTCGTTGCCATGATGACGCTCAAGGTCGCGATCGGCCCGCAAAACGCATTTGTCCTGCG M. tuberculosis 2 CTTCGTTGCCATGATGACGCTCAAGGTCGCGATCGGCCCGCAAAACGCATTTGTCCTGCG M. bovis CTTCGTTGCCATGATGACGCTCAAGGTCGCGATCGGCCCGCAAAACGCATTTGTCCTGCG M. africanum CTTCGTTGCCATGATGACGCTCAAGGTCGCGATCGGCCCGCAAAACGCATTTGTCCTGCG M. bovis ssp BCG CTTCGTTGCCATGATGACGCTCAAGGTCGCGATCGGCCCGCAAAACGCATTTGTCCTGCG M. tuberculosis 3 CTTCGTTGCCATGATGACGCTCAAGGTCGCGATCGGCCCGCAAAACGCATTTGTCCTGCG M. canettii CTTCGTTGCCATGATGACGCTCAAGGTCGCGATCGGCCCGCAAAACGCATTTGTCCTGCG M. tuberculosis 4 CTTCGTTGCCATGATGACGCTCAAGGTCGCGATCGGCCCGCAAAACGCATTTGTCCTGCG M. tuberculosis 1 CCAAGGAATTAGGCGAGAATACGTGCTGGTCATTGTGGCGCTGTGCGGGATCGCTGATGG M. tuberculosis 2 CCAAGGAATTAGGCGAGAATACGTGCTGGTCATTGTGGCGCTGTGCGGGATCGCTGATGG M. bovis CCAAGGAATTAGGCGAGAATACGTGCTGGTCATTGTGGCGCTGTGCGGGATCGCTGATGG M. africanum CCAAGGAATTAGGCGAGAATACGTGCTG--TCATTGTGGCGCTGTGCGGGATCGCTGATGG M. bovis ssp BCG CCAAGGAATTAGGCGAGAATACGTGCTGGTCATTGTGGCGCTGTGCGGGATCGCTGATGG M. tuberculosis 3 CCAAGGAATTAGGCGAGAATACGTGCTGGTCATTGTGGCGCTGTGCGGGATCGCTGATGG M. canettii CCAAGGAATTAGGCGAGAATACGTGCTGGTCATTGTGGCGCTGTGCGGGATCGCTGATGG M. tuberculosis 4 CCAAGGAATTAGGCGAGAATACGTGCTGGTCATTGTGGCGCTGTGCGGGATCGCTGATGG 101 M. tuberculosis 1 GGCACTGATTGCCGCGGGCGI"TGGCGGCTTCGCTGCGCTGATTCACGCTCATCCCAATATGACTTTGGTT M. tuberculosis 2 GGCACTGATTGCCGCGGGCGTTGGCGGCTTCGCTGCGCTGATTCACGCTCATCCCAATATGACTTTGGTT M. bovis GGCACTGATTGCCGCGGGCGTTGGCGGCTTCGCTGCGCTGATTCACGCTCATCCCAATATGACTTTGGTT M. africanum GGCACTGATTGCCGCGGGCGTTGGCGGCTTCGCTGCGCTGATTCACGCTCATCCCAATATGACTTTGGTT M. bovis ssp BCG GGCACTGATTGCCGCGGGCGTTGGCGGCTTCGCTGCGCTGATTCACGCTCATCCCAATATGACTTTGGTT M. tuberculosis 3 GGCACTGATTGCCGCGGGCGTTGGCGGCTTCGCTGCGCTGATTCACGCTCATCCCAATATGACTTTGGTT M. canettii GGCACTGATTGCCGCGGGCGTTGGCGGCTTCGCTGCGCTGATTCACGCTCATCCCAATATGACTTTGGTT M. tuberculosis 4 GGCACTGATTGCCGCGGGCGTTGGCGGCTTCGCTGCGCTGATTCACGCTCATCCCAATATGACTTTGGTT 102 Tableau 14 : Identification des espèces par l'analyse de la séquence du spacer MST12 M. tuberculosis 1 GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG M. tuberculosis 2 GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG M tuberculosis 3 GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG M. africanum GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG M. tuberculosis 4 GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG M. bovis ssp BCG GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG M. tuberculosis 5 GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG 103 M. tuberculosis 7 GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG M. bonis GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG M. canettii GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG M. tuberculosis 6 GTTGATCGAGGCCTATCACGACGACGAGCGACCCGAGCAGGCGCGAGAGCCCGAACTGCGGTCAAACAGGTCAC AACGAG M. tuberculosis 1 AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG M. tuberculosis 2 AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG M. tuberculosis 3 AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG M. africanum AGGAAGAGCTGAGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG 104 M. tuberculosis 4 AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG M. bovis ssp BCG AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG M. tuberculosis 5 AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG M. tuberculosis 7 AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG M. bovis AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG M. canettii AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGG M. tuberculosis 6 AGGAAGAGCTGAGCCGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGAGG- M. tuberculosis 1 GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG M. tuberculosis 2 GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG M. tuberculosis 3 GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG M. africanum GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG M. tuberculosis 4 GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG M. bovis ssp BCG GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG M. tuberculosis 5 GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG M. tuberculosis 7 TGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG M. bovis GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAG 106 M. canettii GGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCI'GCGCCGACGACGATGCAGAG M. tuberculosis 6 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. tuberculosis 1 CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG M. tuberculosis 2 CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG M. tuberculosis 3 CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG M. africanum CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG M. tuberculosis 4 CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG M. hovis ssp BCG CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG 107 M. tuberculosis 5 CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG M. tuberculosis 7 CGTAGCGATGAGGTGGGTGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCG M. bovis CGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACC--- M. canettii C G T A G C G A T G A G GA G G M. tuberculosis 6 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. tuberculosis 1 CCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGT M. tuberculosis 2 CCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGT M. tuberculosis 3 CCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGT 108 M. africanum CC GACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGT M. tuberculosis 4 CCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGT M. bovis ssp BCG CCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGT M. tuberculosis 5 CCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGAGG M. tuberculosis 7 CCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGAGG M. bovis ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. canettii ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. tuberculosis 6 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 109 M. tuberculosis 1 GGCGCTGATGACCTGCGCCGAGGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACC M. tuberculosis 2 GGCGCTGATGACCTGCGCCGAGGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGGTGGGGGCACCACC M. tuberculosis 3 GGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGG--- - M. africanum GGCACTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGATGAGG M. tuberculosis 4 GGC M. bovin ssp BCG GGC M. tuberculosis 5 M. tuberculosis 7 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. bovin ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. canettii M. tuberculosis 6 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. tuberculosis 1 CGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGAT M. tuberculosis 2 CGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACGATGCAGAGCGTAGCGAT M. tuberculosis 3 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ M. africanum ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. tuberculosis 4 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 111 M. bovis ssp BCG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ M. tuberculosis 5 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------ M. tuberculosis 7 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ M. bovis -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. canettii ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ M. tuberculosis 6 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ M. tuberculosis 1 GAGGTGGGGGCACCACCCGCTTGCGGGGGAGAGTGGCGCTGATGACCTGCGCCGACGACG M. tuberculosis 2 G A G G 112 M. tuberculosis 3 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. africanum ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ M. tuberculosis 4 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. bonis ssp BCG ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- M. tuberculosis 5 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ M. tuberculosis 7 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ M. bonis ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ M. canettii ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 113 M. tuberculosis 6 M. tuberculosis 1 ATGCAGAGCGTAGCGATGAGGAGGAGTGGCGCTGATGACCAGTGTGTTGATTGTGGAGGA M. tuberculosis 2 AGGAGTGGCGCTGATGACCAGTGTGTTGATTGTGGAGGA M. tuberculosis 3 --- --- AGGAGTGGCGCTGATGACCAGTGTGTTGATTGTGGAGGA M. africanum --AGGAGTGGCGCTGATGACCAGTGTGTTGATTGTGGAGGA M. tuberculosis 4 G C T GA T G A C C A G T GT GTT G ATT GT G GA G G A M. bovin ssp BCG G C T G A T G A C C A GT GT GTT GA TT GT G G A G G A M. tuberculosis 5 AGTGGCGCTGATGACCAGTGTGTTGATTGTGGAGGA 114 M. tuberculosis 7 AGT G G C G C T G AT G A C C A G T G T G TT G A T T G T G G A G G A M. bovin A G T G T GTT G ATT GT G G A G G A M. canettii A G T G G C G C T G A T G A C C A G T G T G TT G A T T GT G G A G G A M. tuberculosis 6 AGT G G C G C T G AT G A C C A G T GT G TT G ATT G T G G A G G A M. tuberculosis 1 CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC M. tuberculosis 2 CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC M. tuberculosis 3 CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC M. af ricanum CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC M. tuberculosis 4 CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC M. bovis ssp BCG CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGACGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC M. tuberculosis 5 CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC M. tuberculosis 7 CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC M. bovis CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGACGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC M. canettii CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC M. tuberculosis 6 CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGCTGGCGTTTCTGCTGCGCAAGGAGGGCTTTGAGGCCAC M. tuberculosis 1 GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT 116 M. tuberculosis 2 GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT M. tuberculosis 3 GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT M. africanum GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT M. tuberculosis 4 GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT M. bovis ssp BCG GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT M. tuberculosis 5 GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT M. tuberculosis 7 GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT M. bovis GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT 117 M. canettii GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT M. tuberculosis 6 GGTGGTGACCGATGGTCCGGCAGCTCTCGCCGAGTTCGACCGGGCCGGCGCCGACATCGT M. tuberculosis 1 CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGC M. tuberculosis 2 CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGC M. tuberculosis 3 CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGC M. africanum CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGC M. tuberculosis 4 CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGC M. bovin ssp BCG CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGC 118 M. tuberculosis 5 CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGC M. tuberculosis 7 CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGC M. bovin CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGC M. canettii CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGC M. tuberculosis 6 CCTGCTCGATCTGATGCTGCCTGGGATGTCGGGTACCGATGTATGCAAGCAGTTGCGCGC M. tuberculosis 1 TCGGTCCAGCGTTCCGGTGATCATGGTGACCGCCCGGGATAGCGAGATCGACAAGGTGGT M. tuberculosis 2 TCGGTCCAGCGTTCCGGTGATCATGGTGACCGCCCGGGATAGCGAGATCGACAAGGTGGT M. tuberculosis 3 TCGGTCCAGCGTTCCGGTGATCATGGTGACCGCCCGGGATAGCGAGATCGACAAGGTGGT 119 M. africanum TCGGTCCAGCGTTCCGGTGATCATGGTGACCGCCCGGGATAGCGAGATCGACAAGGTGGT M. tuberculosis 4 TCGGTCCAGCGTTCCGGTGATCATGGTGACCGCCCGGGATAGCGAGATCGACAAGGTGGT M. bovis ssp BCG TCGGTCCAGCGTTCCGGTGATCATGGTGACCGCCCGGGATAGCGAGATCGACAAGGTGGT M. tuberculosis 5 TCGGTCCAGCGTTCCGGTGATCATGGTGACCGCCCGGGATAGCGAGATCGACAAGGTGGT M. tuberculosis 7 TCGGTCCAGCGTTCCGGTGATCATGGTGACCGCCCGGGATAGCGAGATCGACAAGGTGGT M. bovis TCGGTCCAGCGTTCCGGTGATCATGGTGACCGCCCGGGATAGCGAGATCGACAAGGTGGT M. canettii TCGGTCCAGCGTTCCGGTGATCATGGTGACCGCCCGGGATAGCGAGATCGACAAGGTGGT M. tuberculosis 6 TCGGTCCAGCGTTCCGGTGATCATGGTGACCGCCCGGGATAGCGAGATCGACAAGGTGGT M. tuberculosis 1 CGGCCTGGAGCTGGGCGCTGACGACTACGTGACCAAGCCCTATTC M. tuberculosis 2 CGGCCTGGAGCTGGGCGCTGACGACTACGTGACCAAGCCCTATTC M. tuberculosis 3 CGGCCTGGAGCTGGGCGCTGACGACTACGTGACCAAGCCCTATTC M. africanum CGGCCTGGAGCTGGGCGCTGACGACTACGTGACCAAGCCCTATTC M. tuberculosis 4 CGGCCTGGAGCTGGGCGCTGACGACTACGTGACCAAGCCCTATTC M. bovis ssp BCG CGGCCTGGAGCTGGGCGCTGACGACTACGTGACCAAGCCCTATTC M. tuberculosis 5 CGGCCTGGAGCTGGGCGCTGACGACTACGTGACCAAGCCCTATTC M. tuberculosis 7 CGGCCTGGAGCTGGGCGCTGACGACTACGTGACCAAGCCCTATTC 121 M. bovis CGGCCTGGAGCTGGGCGCTGACGACTACGTGACCAAGCCCTATTC M. canettii CGGCCTGGAGCTGGGCGCTGACGACTACGTGACCAAGCCCTATTC M. tuberculosis 6 CGGCCTGGAGCTGGGCGCTGACGACTACGTGACCAAGCCCTATTC 2 REVENDICATIONS 1. Fragment isolé d'acide nucléique de zone intergénique non codante d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis choisi parmi les fragments d'acides nucléiques des 16 zones intergéniques MST1 à MST16 amplifiables par des couples d'amorces constituées par des oligonucléotides de séquences consistant en au moins 8- 10 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 18 nucléotides consécutifs, tirés des séquences SEQ. ID n 1 à 32, ou de préférence encore consistant dans lesdites séquences SEQ. ID. n 1 à 32 suivantes du listage de séquences et leurs séquences complémentaires, avec les couples d'amorces 5', 3', tirés des séquences suivantes pour les fragments suivants : - pour le fragment de la zone intergénique MST1 • amorce 5'= SEQ. ID. n 1 • amorce 3'= SEQ. ID. n 2 - pour le fragment de la zone intergénique MST2 • amorce 5'= SEQ. ID. n 3 • amorce 3'= SEQ. ID. n 4 - pour le fragment de la zone intergénique MST3 • amorce 5'= SEQ. ID. n 5 • amorce 3'= SEQ. ID. n 6 - pour le fragment de la zone intergénique MST4 : • amorce 5'= SEQ. ID. n 7 • amorce 3'= SEQ. ID. n 8 -pour le fragment de la zone intergénique MST5 2907793 123 • amorce 5'= SEQ. ID. n 9 • amorce 3'= SEQ. ID. n 10 - pour le fragment de la zone intergénique MST6 • amorce 5'= SEQ. ID. n 11 5 • amorce 3'= SEQ. ID. n 12 - pour le fragment de la zone intergénique MST7 • amorce 5'= SEQ. ID. n 13 • amorce 3'= SEQ. ID. n 14 - pour le fragment de la zone intergénique MST8 10 • amorce 5'= SEQ. ID. n 15 • amorce 3'= SEQ. ID. n 16 - pour le fragment de la zone intergénique MST9 • amorce 5'= SEQ. ID. n 17 • amorce 3'= SEQ. ID. n 18 15 - pour le fragment de la zone intergénique MSTIO • amorce 5'= SEQ. ID. n 19 • amorce 3'= SEQ. ID. n 20 - pour le fragment de la zone intergénique MST11 • amorce 5'= SEQ. ID. n 21 20 • amorce 3'= SEQ. ID. n 22 - pour le fragment de la zone intergénique MST12 2907793 124 • amorce 5'= SEQ. ID. n 23 • amorce 3'= SEQ. ID. n 24 - pour le fragment de la zone intergénique MST13 • amorce 5'= SEQ. ID. n 25 • amorce 3'= SEQ. ID. n 26 - pour le fragment de la zone intergénique MST14 : • amorce 5'= SEQ. ID. n 27 • amorce 3'= SEQ. ID. n 28 - pour le fragment de la zone intergénique MST15 • amorce 5'= SEQ. ID. n 29 • amorce 3'= SEQ. ID. n 30 - pour le fragment de la zone intergénique MST16 • amorce 5'= SEQ. ID. n 31 ^ amorce 3'= SEQ. ID. n 32 15 2. Fragment isolé d'acide nucléique de zone intergénique non codante d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis choisi parmi les fragments d'acides nucléiques des 16 zones intergéniques MSTI à MST16 selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente une séquence choisie parmi les séquences SEQ. ID. n 33 à 79 du listage de 20 séquences et leurs séquences complémentaires, avec les séquences suivantes pour les espèces suivantes : - pour l'espèce Mycobacterium tuberculosis : 5 10 2907793 125 • les séquences du fragment de la zone intergénique MST1, consistant dans les 4 séquences SEQ. ID. n 52 à 55, • les séquences du fragment de la zone intergénique MST2, consistant dans les 3 séquences SEQ. ID. n 56 à 58, 5 • les séquences du fragment de la zone intergénique MST3, consistant dans les 2 séquences SEQ. ID. n 59-60, ^ les séquences du fragment de la zone intergénique MST4, consistant dans les 5 séquences SEQ. ID. n 61 à 65, ^ les séquences du fragment de la zone intergénique MST8, 10 consistant dans les 3 séquences SEQ. ID. n 66 à 68, ^ les séquences du fragment de la zone intergénique MST11, consistant dans les 4 séquences SEQ. ID. n 33 à 36, ^ les séquences du fragment de la zone intergénique MST12, consistant dans les 7 séquences SEQ. ID. n 41 à 47, 15 • les séquences du fragment de la zone intergénique MST13, consistant dans les 11 séquences SEQ. ID. n 69 à 8a 79, - pour Mycobacterium africanum ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 37, et 20 • la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 48, - pour Mycobacterium bovis ssp bovis : ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 38, et 2907793 126 ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 49, - pour Mycobacterium bovis ssp BCG : ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 5 consistant dans SEQ. ID. n 39, et ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 50, - pour Mycobacterium canettii : ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 10 consistant dans SEQ. ID. n 40, et ^ la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 51. 3. Oligonucléotide apte à servir d'amorce d'amplification d'un fragment d'acide nucléique de dite zone intergénique choisi parmi les 15 fragments d'acide nucléique des 16 zones intergéniques MST1 à MST16 selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il présente une séquence comprenant au moins 10, de préférence de 18 à 35 nucléotides consécutifs situés à l'une des extrémités 5' ou 3' des séquences desdits fragments de zones intergéniques MST1 à MST16. 20 4. Oligonucléotide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il présente une séquence comprenant au moins 10, de préférence au moins 18 nucléotides consécutifs inclus dans l'une des séquences SEQ. ID. n 1 à 32, de préférence consistant dans l'une des séquences SEQ. ID. n 1 à 32 du listage de séquences et leurs séquences complémentaires. 5. Oligonucléotide présentant une séquence tirée des séquences des fragments selon la revendication 1 ou 2, de préférence une séquence tirée des séquences SEQ. ID. n 33 à 79 et leurs séquences complémentaires, de préférence comprenant au moins 10, de préférence 2907793 127 encore 18 à 35 nucléotides consécutifs inclus dans lesdites séquences, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique dudit oligonucléotide inclut une séquence spécifique d'une bactérie, d'une espèce, sous espèce, sous type ou génotype donné(e) du complexe Mycobacterium tuberculosis, 5 utilisable à titre de sonde d'une dite bactérie. 6. Procédé d'identification d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis permettant l'identification de l'espèce, le cas échéant la sous espèce ou le sous type de ladite bactérie, et le cas échéant permettant le génotypage des dites espèces, sous espèces et sous types de 10 bactéries dans un échantillon biologique contenant des acides nucléiques d'une dite bactérie dans lequel on effectue les étapes suivantes dans lesquelles: 1) on réalise l'amplification enzymatique de type PCR dans l'acide nucléique dudit échantillon, d'au moins 1 fragment d'acide nucléique d'une 15 zone intergénique choisie parmi 16 zones intergéniques MST1 à MST16 du génome des différentes dites espèces et sous espèces ou sous type et, le cas échéant, génotypes de bactéries selon la revendication 1 ou 2, à l'aide d'un couple d'amorce apte à amplifier ledit fragment, ledit couple d'amorces étant constitué par des oligonucléotides selon l'une des revendications 3 à 20 5, de préférence de séquences comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 18, inclus dans les séquences du listage de séquences et leurs séquences complémentaires, avec les couples d'amorces 5', 3', tirés des séquences suivantes pour les fragments suivants : - pour le fragment de la zone intergénique MST1 : 25 • amorce 5'= SEQ. ID. n 1 • amorce 3'= SEQ. ID. n 2 • pour le fragment de la zone intergénique MST2 • amorce 5'= SEQ. ID. n 3 2907793 128 • amorce 3'= SEQ. ID. n 4 - pour le fragment de la zone intergénique MST3 • amorce 5'= SEQ. ID. n 5 • amorce 3'= SEQ. ID. n 6 5 - pour le fragment de la zone intergénique MST4 : • amorce 5'= SEQ. ID. n 7 • amorce 3'= SEQ. ID. n 8 - pour le fragment de la zone intergénique MST5 • amorce 5'= SEQ. ID. n 9 10 • amorce 3'= SEQ. ID. n 10 - pour le fragment de la zone intergénique MST6 • amorce 5'= SEQ. ID. n 11 • amorce 3'= SEQ. ID. n 12 - pour le fragment de la zone intergénique MST7 15 • amorce 5'= SEQ. ID. n 13 • amorce 3'= SEQ. ID. n 14 - pour le fragment de la zone intergénique MST8 • amorce 5'= SEQ. ID. n 15 • amorce 3'= SEQ. ID. n 16 20 - pour le fragment de la zone intergénique MST9 ^ amorce 5'= SEQ. ID. n 17 2907793 129 • amorce 3'= SEQ. ID. n 18 - pour le fragment de la zone intergénique MST10 • amorce 5'= SEQ. ID. n 19 • amorce 3'= SEQ. ID. n 20 5 - pour le fragment de la zone intergénique MST11 • amorce 5'= SEQ. ID. n 21 • amorce 3'= SEQ. ID. n 22 - pour le fragment de la zone intergénique MST12 • amorce 5'= SEQ. ID. n 23 10 • amorce 3'= SEQ. ID. n 24 - pour le fragment de la zone intergénique MST13 • amorce 5'= SEQ. ID. n 25 • amorce 3'= SEQ. ID. n 26 - pour le fragment de la zone intergénique MST14 : 15 • amorce 5'= SEQ. ID. n 27 • amorce 3'= SEQ. ID. n 28 - pour le fragment de la zone intergénique MST15 • amorce 5'= SEQ. ID. n 29 • amorce 3'= SEQ. ID. n 30 20 - pour le fragment de la zone intergénique MST16 ^ amorce 5'= SEQ. ID. n 31 2907793 130 amorce 3'= SEQ. ID. n 32 2) on réalise le séquençage du fragment amplifié à l'étape 1), et 3) on identifie l'espèce, la sous espèce ou le sous type, et le cas échéant le génotype de ladite bactérie en comparant la séquence obtenue à 5 l'étape 2) avec les séquences d'une banque de données de séquences d'au moins un dit fragment d'acide nucléique de dite zone intergénique choisie parmi 16 dites zones intergéniques MSTI à MST16 de différentes espèces, sous espèces et sous type et le cas échéant génotypes de bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis. 10 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que à l'étape 3), lesdites séquences constituant ladite banque ont été déterminées par amplification et séquençage de dit(s) fragment(s) de zone(s) intergénique(s) des différentes bactéries d'une collection de différents isolats de bactéries de différentes espèces, sous espèces et sous types de 15 bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis dont les espèces, sous espèces et sous types et, le cas échéant, génotypes, sont connus. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'on identifie une espèce, sous espèce ou sous type de bactérie parmi les bactéries Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis ssp bovis, Mycobacterium 20 bovis ssp BCG, Mycobacterium bovis ssp caprae, Mycobacterium africanum sous type I, Mycobacterium canettii, Mycobacterium microti. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on identifie une espèce sous espèce ou sous type de bactérie parmi les bactéries Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis ssp bovis, Mycobacterium 25 bovis ssp BCG, Mycobacterium africanum sous type I, Mycobacterium canettii. 10. Procédé selon l'une des revendications 6 à 9, dans lequel on identifie l'espèce, sous espèce ou sous type d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis, caractérisé en ce qu'on réalise les étapes dans lesquelles : 2907793 131 1) on réalise l'amplification enzymatique de type PCR dans l'acide nucléique dudit échantillon, d'au moins 1 fragment d'acide nucléique d'une zone intergénique choisie parmi les 2 dites zones intergéniques MST11 et MST 12, à l'aide d'un couple d'amorces aptes à amplifier ledit fragment, 5 ledit couple d'amorces étant constitué par des oligonucléotides de séquences tirées des séquences SEQ. ID. n 21 à 24 suivantes du listage de séquences et leurs séquences complémentaires : -pour le fragment de la zone intergénique MST11 • amorce 5'= SEQ. ID. n 21 10 • amorce 3'= SEQ. ID. n 22 - pour le fragment de la zone MST12 : • amorce 5' : SEQ. ID. n 23 • amorce 3' : SEQ. ID. n 24 2) on réalise le séquençage du fragment amplifié à l'étape 1), et 15 3) on identifie l'espèce, la sous espèce ou le sous type de ladite bactérie, en comparant la séquence obtenue à l'étape 2) avec les séquences d'une banque de données des séquences d'au moins ledit fragment d'acide nucléique d'une dite zone intergénique choisie parmi les 2 dites zones intergéniques MST11 et MST 12 respectivement des différentes espèces, 20 sous espèces et sous type de bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que, à l'étape 3), lesdites séquences de ladite banque comprennent les séquences SEQ. ID. n 33 à 51 suivantes du listage de séquences et leurs séquences 25 complémentaires pour les espèces suivantes : - pour Mycobacterium tuberculosis : 2907793 132 • les séquences du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans l'une des séquences SEQ. ID. n 33 à 36, • les séquences du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans l'une des séquences SEQ. ID. n 41 à 47, 5 - pour Mycobacterium africanum : • la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 37, • la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 48, 10 - pour Mycobacterium bovis ssp bovis : • la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 38, • la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 49, 15 - pour Mycobacterium bovis ssp BCG : • la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 39, • la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 50, 20 -pour Mycobacterium canettii : • la séquence du fragment de la zone intergénique MST11 consistant dans SEQ. ID. n 40, • la séquence du fragment de la zone intergénique MST12 consistant dans SEQ. ID. n 51, 2907793 133 12. Procédé selon une des revendications 6 à 11, dans lequel on identifie le génotype d'une espèce, sous espèce ou sous type donné d'une bactérie parmi les bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis caractérisé en ce que on réalise les étapes dans lesquelles : 5 1) on réalise l'amplification enzymatique de type PCR dans l'acide nucléique dudit échantillon, d'au moins 2 fragments d'acides nucléiques d'au moins 2 zones intergéniques choisies parmi 16 dites zones intergéniques MST1 à MST16, à l'aide respectivement des au moins 2 dits couples d'amorces aptes à amplifier les dits fragments des au moins 2 dites 10 zones intergéniques, et 2) on réalise le séquençage des fragments amplifiés à l'étape 1), et 3) on identifie le génotype de l'espèce, sous espèce ou sous type de dite bactérie en comparant les séquences des fragments amplifiés obtenues à l'étape 2) avec les séquences d'une banque de données des séquences des 15 au moins 2 dits fragments d'acides nucléiques des au moins 2 dites zones intergéniques choisie parmi 16 dites zones intergéniques des différents génotypes de dites bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis, les différents génotypes correspondant aux différentes combinaisons possibles des au moins 2 séquences des au moins 2 dits fragments d'acide nucléique 20 des au moins 2 dites zones intergéniques. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que, à l'étape 3), les séquences constituant ladite banque ont été déterminées par amplification et séquençage desdits au moins 2 fragments des au moins 2 dites zones intergéniques des différentes bactéries d'une collection de 25 différents isolats de bactéries de ladite espèce, sous espèce ou sous type connues du complexe Mycobacterium tuberculosis, les différents génotypes correspondant à des combinaisons différentes des au moins 2 séquences desdites au moins 2 zones intergéniques des bactéries de ladite collection. 2907793 134 14. Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que l'on identifie le génotype d'une bactérie de l'espèce Mycobacterium tuberculosis et on réalise les étapes dans lesquelles : 1) on réalise l'amplification enzymatique de type PCR dans l'acide 5 nucléique dudit échantillon, d'au moins 8 fragments d'acides nucléiques, d'au moins 8 zones intergéniques choisie parmi 16 dites zones intergéniques MST1 à MST16, à l'aide respectivement d'au moins 8 couples d'amorces aptes à amplifier les dits fragments de dites zones intergéniques, et 10 2) on réalise le séquençage des fragments amplifiés à l'étape 1), et 3) on identifie le génotype de ladite espèce Mycobacterium tuberculosis en comparant les 8 séquences obtenues à l'étape 2) avec les séquences d'une banque de données des séquences d'au moins les 8 dits fragments d'acides nucléiques des au moins 8 dites zones intergéniques choisie parmi 15 16 dites zones intergéniques des différents génotypes de bactéries de l'espèce Mycobacterium tuberculosis, les différents génotypes correspondant à différentes combinaisons des au moins 8 séquences des au moins 8 dites zones intergéniques. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que lesdits 20 fragments des au moins 8 zones intergéniques sont les 8 fragments desdites zones intergéniques MST1, MST2, MST3, MST4, MST8, MST11, MST12 et MST13, amplifiables par leurs dits couples d'amorces respectives de séquences tirées des séquences SEQ. ID. n 1 à 16 et 21 à 26, avec: - pour le fragment de la zone intergénique MST1 25 • amorce 5'= SEQ. ID. n 1 • amorce 3'= SEQ. ID. n 2 - pour le fragment de la zone intergénique MST2 : • amorce 5'= SEQ. ID. n 3 2907793 135 • amorce 3'= SEQ. ID. n 4 - pour le fragment de la zone intergénique MST3 • amorce 5'= SEQ. ID. n 5 • amorce 3'= SEQ. ID. n 6 5 - pour le fragment de la zone intergénique MST4 : • amorce 5'= SEQ. ID. n 7 • amorce 3'= SEQ. ID. n 8 - pour le fragment de la zone intergénique MST8 : • amorce 5'= SEQ. ID. n 15 10 • amorce 3'= SEQ. ID. n 16 - pour le fragment de la zone intergénique MST11 • amorce 5'= SEQ. ID. n 21 • amorce 3'= SEQ. ID. n 22 - pour le fragment de la zone intergénique MST12 15 • amorce 5'= SEQ. ID. n 23 • amorce 3'= SEQ. ID. n 24 - pour le fragment de la zone intergénique MST13 • amorce 5'= SEQ. ID. n 25 • amorce 3'= SEQ. ID. n 26 20 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que lesdites séquences de ladite banque comprennent les séquences SEQ. ID. 2907793 136 n 33 à 79 du listage de séquences et leurs séquences complémentaires pour les fragments de zones intergéniques MSTI à MST16 suivants : - pour le fragment de la zone intergénique MSTI, les 4 séquences SEQ. ID. n 52 à 55 5 - pour le fragment de la zone intergénique MST2, les 3 séquences SEQ. ID. n 56 à 58 - pour le fragment de la zone intergénique MST3, les 2 séquences SEQ. ID. n 59-60 - pour le fragment de la zone intergénique MST4, les 5 séquences 10 SEQ. ID. n 61 à 65 - pour le fragment de la zone intergénique MST8, les 3 séquences SEQ. ID. n 66 à 68 - pour le fragment de la zone intergénique MST11, les 4 séquences SEQ. ID. n 33 à 36 15 -pour le fragment de la zone intergénique MST12, les 7 séquences SEQ. ID. n 41 à 47 - pour le fragment de la zone intergénique MST13, les 11 séquences SEQ. ID. n 69 à 8-a 79. 17. Procédé selon l'une des revendications 6 à 16, caractérisé en 20 ce que l'on vérifie au préalable que l'échantillon sur lequel on réalise ladite identification, contient effectivement des acides nucléiques d'une dite bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis.