FR 2912147 A1 20080808 FR 0700809 A 20070205 NOUVELLES MOLÉCULES MULTIMÉRIQUES, LEUR PROCÉDÉ DE PRÉPARATION, ET LEUR UTILISATION POUR LA PRÉPARATION DE 5 MÉDICAMENTS L'invention a pour objet de nouvelles molécules multimériques, leur procédé de préparation, ainsi que leur utilisation pour la préparation de médicaments. L'invention a également pour objet des molécules capables d'activer ou d'inhiber 10 la réponse immunitaire. L'importance du couple CD40/CD40L dans la réponse immunitaire a amené de nombreux groupes à utiliser des anticorps dirigés contre ces deux molécules à des fins thérapeutiques, de manière à inhiber ou activer le système immunitaire. L'administration d'anticorps anti-CD40L, a donné des résultats encourageants dans le 15 traitement de maladies auto-immunes comme l'encéphalomyélite allergique expérimentale murine (un modèle de la sclérose en plaques humaine)(Howard et al., 1999) ou dans le traitement de rejet d'allogreffes rénales chez les singes (Kirk et al., 1999). Dans ces deux cas, les anticorps ont inhibé une activité néfaste du système immunitaire. Inversement, l'utilisation d'anticorps anti-CD40 agonistes a permis d'une 20 part, d'améliorer fortement la réponse à des vaccins anti-tumoraux peptidiques chez la souris (Diehl et al., 1999) et d'autre part., d'augmenter l'efficacité des cellules T CD4+ dans la lutte contre des tumeurs murines (Sotomayor et al., 1999 ; Lode et al., 2000). Une régression de tumeur dans des modèles murins a été mise en évidence après injection de cellules dendritiques (CDs) transformées par un adénovirus codant le 25 CD40L (Kikuchi et al., 2000). Enfin, une activation des cellules dendritiques par l'interaction de leur molécule CD40 avec CD40L est capable de protéger des souris d'une infection par un parasite, Trypanosoma Cruzi (Chaussabel et al., 1999). Dans tous ces travaux, la valence particulière de la molécule CD40L, qui s'associe sous forme de trimère pour former avec le CD40 des complexes hexavalents, rend difficile la 30 production d'anticorps fonctionnels capables d'interférer avec les fonctions du couple CD40/CD40L. Le développement des adénovirus codant pour CD40L répond en partie à cet inconvénient. Cependant, leur utilisation n'est pas sans poser de problèmes chez l'homme. Enfin, la valence particulière du système rend difficile la découverte de molécules de synthèse capables d'interférer avec l'interaction CD40/CD40L. L'invention a pour but de fournir des ligands multimériques conçus pour interférer dans des interactions protéine-protéine. La présente invention a également pour but la préparation de molécules pouvant interférer avec des interactions multivalentes protéines-protéines. La présente invention a également pour but la préparation de molécules pouvant moduler l'activité des membres des familles du TNF et du TNF-R. La présente invention a pour but de fournir une molécule de synthèse agissant sur le système CD40/CD40L. La présente invention concerne un composé répondant à la formule suivante (I) : Re (I) 20 25 30 R /k R dans laquelle : k et j représentent indépendamment l'un de l'autre 0 ou 1, Y représente un macrocycle dont le cycle comprend de 9 à 36 atomes, et est fonctionnalisé par trois fonctions amines permettant l'accrochage de Rc par sa fonction carboxylique C-terminale et par une chaîne permettant l'accrochage du bras espaceur. Z via une liaison X, Rc représente un motif de liaison à un récepteur de la superfamille du TNF, et de préférence correspond à une séquence dérivée d'un ligand, choisie parmi les résidus formant l'interface avec le récepteur du ligand, laquelle séquence est susceptible d'interagir avec le récepteur, ledit ligand étant choisi parmi les ligands de récepteurs de la superfamille du TNF, et notamment parmi les ligands suivants : EDA, CD40L, FasL, OX40L, AITRL, CD30L, VEGI, LIGHT, 4-1BBL, CD27L, LTa, TNF, LT13, TWEAK, APRIL, BLYS, RANKL et TRAIL, X représente une fonction chimique permettant de relier le groupe Y au bras espaceur et est choisi parmi les fonctions suivantes : O O a b - J~. - H a H ti. amide-1 amide-2 (1') (2') N-acyl-Prolyl (3') O O N-acyl-glycyl (4') N H 0 thioether-1 (5') thioether-3 (7' ) oxime-2 (11') 0 à'N N b urée (8') a thioether-2 (6' ) a •S. - a O b S b disulfure (9' ) a - N oxi_me-1 (10') 20 N N. b N-b 1,2,3-triazole 1,2,3-triazole 1,4-disubstitué-1 1,4-disubstitué-2 (12') (13')N-N N ''b 1,2,3-triazole 1,2,3-triazole 1,5-disubstitué-1 1,5-disubstitué-2 (14') (15') 25 30 a représentant la liaison avec le groupe Y et b représentant la liaison avec le groupe Z, Z représente un bras espaceur bi-, tri- ou tétrafonctionnel permettant la Rc YùRc dimérisation, trimérisation ou tétramérisation de I par la formation d'une liaison de type X, les bras espaceurs Z répondant à l'une des formules suivantes : lorsque j = k = 0 : * lorsque X représente un groupe de formule (1'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes : .---'-,.--.~/'- O-'"-,-- " - --(CH2)n----'m m étant un nombre entier variant de 1 à 40, n étant un nombre entier variant de 1 à 10, 5 * lorsque X représente un groupe de formule (2'), (3') et (4') , Z répond à l'une des formules suivantes : ,,NC) ~o I " N Nù(CH2)nùN H H H N (Pro)n )p ll HN/ lP ----(Pro)n NH 10 N\ H u 15 20 o in NH 1 ---(Pro)n * lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14') , Z répond à l'une des formules suivantes : H N 0 H --- (Pro)n o 0 NH H Wù(Pro)n'N1 ) p HN--Wù(Pro)n W W HNù(CH2)p ùNH W 25 H W-(Pro)n' N ~~~O~iC~p HN~ W-(Pro)n 30 m et n étant tels que définis ci-dessus, p étant un nombre entier variant de 1 à 6, u étant un nornbre entier variant de 1 à 4, O W représentant un groupe de formule H O ou un groupe de formule ~~ O le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', * lorsque X représente un groupe de formule (1'), (2'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (11'), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes : H Wù(Pro)n'N''(- )p HN" Wù(Pro)n HN~ I W-(Pro)n H W-(Pro)n'N~~O'` vO~p N H W W HNù(CH2)p ùNH 15 20 m et n étant tels que définis ci-dessus, p étant un nombre entier variant de 1 à 6 u étant un nombre entier variant de 1 à 4 W représentant un groupe de formule r r étant un nombre entier variant de 1 à 4 O le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', • lorsque j = 1 ou k = 1 * lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14'), Z répond à l'une des formules suivantes : 25 NON ONO, N W H,( `N H 0m \0 w H W-(Pro) n W-(Pro)n~N~\N ~~NH 30 ,NH W-(Pro)n 5 u étant un nombre entier variant de 1 à 4 n étant un nombre entier variant de 1 à 10 W représentant un groupe de formule ou un groupe de formule O le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', * lorsque X représente un groupe de formule (l'), (2'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (1 l'), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes : O H O H W-(Pro)n /N~/~ \V-(Pro)n ,NH W-(Pro)n 10 N/~~N( N H W v \ ` n O/n 15 20 u étant un nombre entier variant de 1 à 4 n étant un nombre entier variant de 1 à 10 W représentant un groupe de formule r r étant un nombre entier variant de 1 à 4 0 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', * Z pouvant également représenter l'une des formules suivantes : R'NH HN'R HN" R NH2 H H R, o -N-R N N O~N R' NH 30 25 R 10 dans laquelle : - lorsque X représente un groupe de formule (1'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (13') et (15') : R représente l'un des groupes suivants (CH,)n (CHZ-CHZ0)m-CHZ-CH,,-CO m ,a variant de 3 à 6 n variant de 1 à 10 H O N . a' m variant de 1 à 40 O le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', m -lorsque X représente un groupe de formule (2'), (3') et (4') : 15 H H OI m a' m variant de 1 à 40 0 R représente l'un des groupes suivants O a' NH-(CHZ CHZ O)m-CHZ-CHZ-CO--- m variant de 3 à 6 O (Pro)n- -Nù(CHZ)n a' H a' 20 25 n représentant un nombre entier variant de 1 à 10 u représentant un nombre entier variant de 1 à 4 le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14') : R représente l'un des groupes suivants H O O~ Y'''' W-NH-(CH2-CH2-0)m-CH2-CH2-CO- H m om variant de 3 à 6 m variant de 1 à 40 le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', O W-- W-(Pro)n--- W-Nù(CH Z)n ~f H . 30 n n représentant un nombre entier variant de 1 à 105 O W représentant un groupe de formule H ou un groupe de formuleO [1 o le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', - lorsque X représente un groupe de formule (1'), (2'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (11'), (13') et (15') : R représente l'un des groupes suivants : 8 W-NH-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-CO-m variant de 3 à 6 O O H m m variant de 1 à 40 10 15 O W-- W-(Pro)n- -- W-Nù(CH2)n H u et n étant tels que définis ci-dessus, a W représentant un groupe de formules r , O r étant un nombre entier variant de 1 à 4 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a'. 20 Ainsi, la présente invention concerne des dimères (lorsque j = k = 0), des trimères REù YùRc (lorsque j = 1 ou k = 1) et des tétramères (lorsque j = k = 1) du motif 1 Rc Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de l'invention sont 25 caractérisés en ce que Rc représente un peptide dérivé du ligand du récepteur CD40 humain ou murin (CD40L), ledit peptide appartenant à la séquence primaire du ligand CD40L de CD40 et dont le nombre d'acides aminés est compris entre 3 et 10. Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de l'invention sont caractérisés en ce que Rc représente un peptide dérivé du ligand du récepteur CD40 30 humain ou murin (CD40L), ledit peptide appartenant à la séquence primaire du ligand CD40L et dont le nombre d'acides aminés est compris entre 3 et 10 choisi parmi les séquences suivantes (LQWAEKGYYTMSNN (séquence humaine SEQ ID NO : 1) ; LQWAKKGYYTMKSN (séquence murine SEQ ID NO : 2) ; PGRFERILLRAANTH 10 15 20 25 30 (séquence humaine SEQ ID NO : 3) ; SIGSERILLKAANTH (séquence murine SEQ ID NO : 4). La présente invention concerne des composés tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce que R, représente un groupe de formule H-Xa-(Xb)J-Xe-Xd-Xe-(Xf);-5 ou H-X'a-L-X'b-Xe-Xd-Xe-(Xf);-, dans laquelle : • 1 représente 0 ou 1, • i représente 0 ou 1, • Xa est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants : - lysine ; - arginine ; - ornithine ; - les [3-acides aminés correspondant à la lysine, l'arginine ou l'ornithine, portant la substitution en position a ou (3 ; - acide tranéxamique ; -acide N-méthyl-tranéxamique ; - acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ; -acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ; - acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ; - N-(4-aminobutyl)-glycine ; - NH2-(CH2)ä-COOH, n variant de 1 à 10 ; -NH2-(CH2-CH2-0)m-CH2CH2COOH, m variant de 3 à 6 - 4-carboxym éthyl-pipérazine ; - acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ; - acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ; - acide 4-aminophénylacétique ; -4-(2aminoéthyl)-1-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; - acide trans-4-aminocyclohexane acétique ; -4-amino-1-carboxyméthyl pipé:ridine ; - acide 4-aminobenzoïque ; - acide 4(2-arninoéthoxy)benzoïque ; 10 • Xb est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants - glycine ; - isoleucine ; - leucine ; - valine ; - asparagine - D-alanine ; - D-valine ; - L-proline substituée ou non en position (3, y ou 8 ; - D-proline substituée ou non en position (3, y ou 8 ; - acides aminés naturels N-alkylés, le groupe alkyle étant un groupe méthyle, éthyle ou benzyle ; - acides aminés ciialkylés acycliques de formule suivante : R R 15 OH (A) O R représentant H, Me, Et, Pr ou Bu ; -acides aminés dialkylés cycliques de formule suivante 20 OH (B) 25 30 O k représentant 1, 2, 3 ou 4 ; • X, est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants - tyrosine ; - isoleucine ; - leucine ; - valine ; - phénylalanine ; - 3-nitro-tyrosine ; - 4-hydroxyméthyl-phénylalanine ; - 3,5-dihydroxy-phénylalanine ; - 2,6-diméthyl-tyrosine ; -3,4-dihydroxy-phénylalanine (DOPA) ; 10 15 20 25 30 11 • Xd est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants : - tyrosine ; -isoleucine ; - leucine ; - valine ; - phénylalanine ;, - 3-nitrotyrosine ; - 4-hydroxyméthyl-phénylalanine ; - 3,5-dihydroxy-phénylalanine ; -2,6-diméthyl-tyrosine ; - 3,4-dihydroxy-phénylalanine ; • Xe est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants : - arginine ; --(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ; - -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ; -NH2-(CH2)ä-COOH, n variant de 1 à 10 ; - NH2-(CH2-CH2-O),,,-CH2CH200OH, m variant de 3 à 6 - acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ; - acide tranéxamique ; - acide N-méthyl-tranéxamique ; - acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ; - acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ; -N-(4-aminobutyl)-glycine ; - 4-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ; - acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ; -acide 4-aminophénylacétique ; 4-(2aminoéthyl)-1-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexanec:arboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; - acide trans-4-aminocyclohexane acétique ; -4-amino-1-carboxyméthyl pipéridine ; - acide 4-aminobenzoïque ; 10 15 20 25 30 - acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ; • Xf est choisi parmi les résidus d"acides aminés suivants : - -(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ; --(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ; - NH2-(CH2),-COOH, n variant de 1 à 10 ; -NH2-(CH2-CH[2-O)m-CH2CH2OOOH, m variant de 3 à 6 ; - acide 8-ami no-3,6-dioxaoctanoïque ; - acide tranéxamique ; - acide N-méthyl-tranéxamique - acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ; - acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ; - N-(4-aminobutyl)-glycine ; -4-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ; acide 3-(4-a.minophényl)propanoïque ; - acide 4-aminophénylacétique ; -4-(2aminoéthyl)-1-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; - acide trans-4-aminocyclohexane acétique ; -4-amino-1-carboxyméthyl pipéridine ; - acide 4-aminobenzoïque ; - acide 4(2-arninoéthoxy)benzoïque ; • -L- représente une liaison de nature pseudopeptidique entre les résidus X'a et X'b, choisie notamment dans la liste ci-dessous : -L- = -yr(CH2CH2)- ; -W(CH(Fk)=CH(Fk'))- ; -yi(CH2NH)-; -yi(NHCO)- ; -yr(NHCONH)- ; -w(CO-O)- ; -w(CS-NH)- ; -w(CH(OH)-CH(OH))-; -yr(S-CH2)- ; -w(CH2-S)- ; -yr(CH(CN)-CH2)- ; -yJ(CH(OH))- ; -yJ(COCH2)-; -yr(CH(OH)CH2)- ; -yr(CH(OH)CH2NH)- ; -yJ(CH2)- ; -W(CH(Fk))- ; -yr(CH2O); -yi(CH2-NHCONH)- ; -w(CH(Fk)NHCONFk')- ; -yf(CH2-CONH)- ; -y(CH(Fk)CONH)- ; - yr(CH(Fk)CH[(Fk')CONH)- ; 10 15 20 ou -v(CH2N)- ; -yr(NHCON)- ; -yr(CS N)- ; -yr(CH(OH)CH2N)- ; -yf(CH2-NHCON)- ; -w(CH2-CON)- ; -W(CH(Fk)CON)- ; -w(CH(Fk)CH(Fk')CON)-lorsque X'b représente la chaîne latérale d'une proline, Fk et Fk' représentant, indépendamment l'un de l'autre, un hydrogène, un halogène, un groupe alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, ou un groupe aryle dont la structure du cycle contient de 5 à 20 atomes de carbone, • X'a représente la chaîne latérale de la lysine, de l'arginine ou de l'ornithine ; et • X'b représente la chaîne latérale de l'un des résidus d'acides aminés suivants : - glycine ; - isoleucine ; - leucine ; - valine ; - asparagine - D-alanine ; - D-valine ; - L-proline substituée ou non en position (3, y ou 8 ; - D-proline substituée ou non en position (3, y ou ; - acides aminés naturels N-alkylés, le groupe alkyle étant un groupe méthyle, éthyle ou benzyle ; - acides aminés dialkylés acycliques de formule suivante : R R HZN OH (A) 25 O R représentant H, Me, Et, Pr ou Bu ; -acides aminés dialkylés cycliques de formule suivante : OH (B) O k représentant 1, 2, 3 ou 4. 30 Ainsi, Xa est notamment choisi parmi les groupes suivants : lysine arginine ornithine O HZN\ HN O H,N H2N HZN H2N O 'C O H h N O H2N 32-arginine (32-ornithine o 32-lysine o o HZN N H H NN\/NHz H NH HZN R3-lysine (33-arginine (33-ornithine --N H coq N'es^\~~~~CO--~ CH3 acide tranéxamique -7 acide N-méthy]-tranéxamique acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque O N \ o O acide 4(pipéridinyl-4-yl)butanoïque acide 3(pipéridin-4-yl)propionique N-(4-aminobutyl)-glycine n= 1-10 m=3-6 4-carboxyméthyl-pipérazine o ùN~CHz CHz O CHZ CH2 H o H~"/ O O O acide 4-(L.-aminophényl)butanoïque _ acide 3-(4-amino.hényl).ropanoï que acide 4-amino.hénylacéti•ue HH N N O HN H 4-(2-aminoéthyl)-1-carboxyméthyl-pipérazine acide trans-4-amino-cyclohexanecarboxylique acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique O )-) acide cis-4-aminocyclohexaneacétique acide trans-4-amino-cyclohexaneacétique 4-amino- l -carboxyméthyl pipéridine H O acide 4-aminobenzoïque acide 4(2-aminoét oxy)benzoïque Xb est notamment choisi parmi les groupes suivants : o O = N \/ CH3 HH H O N O/ z H N~~H SS 2 O O H3C CH3 glycine asparagine D-alanine D-valine D-proline R R H1\1") H O R = H, Me, Et, Pr ou Bu k = 1-4 O acides aminés dialkylés acycliques acides aminés dialkylés cycliques L-proline H Xc et Xd sont notamment choisis parmi les groupes suivants : O O OzN O O NH HO,~NH HO~NH tyrosine phénylalanine 3-nitro-tyrosine 4-hydroxyméthyl-phénylalanine li D. HO HO OH 3,5-dihydroxyphénylalanine Xe et Xf sont notamment choisis parmi les groupes suivants : acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ùN \ 2--"-\ H2N O O acide 4(pipéridinyl-4-yl)butanoïque _ acide 3(pipéridin-4-yl)pro•ionique N-(4-aminobutyl)-glycine N N H \H \_/ O O 4-carboxyméthyl-pipérazine __ acide 4-(4-aminophényl)butanoïque acide 3-(4-aminophényl)propanoïque CH3 acide tranéxamique acide N-méthyl-tranéxamique col o 2,6-diméthyltyrosine 3,4-dihydroxy-phénylalanine (ou L-DOPA) H 2 n n= 1-10 1- Nùf -CHz CHZ O-) CHz H m=3-6 CO H O O5 --Nû H \ /' \ ùH H N N / O O acide 4-aminophénylacétique 4-(2-aminoéthyl)-1-carboxyméthyl- acide trans-4-amino- __ pipérazine cyclohexanecarboxylique 2_H H H ~~ SS acide cis-4-amino- acide cis-4-amino -0 acide trans-4-amino-cyclohexanecarboxylique cyclohexaneacétique cyclohexaneacétique -N N / \ H \ H / / \ N H \O O O 4-amino-1-carboxyméthyl acide 4-aminobenzoïque acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque pipéridine La présente invention concerne également des composés de formule (I) tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce que Y répond à la formule suivante (II) : /A\ c -- B B 2 - dans laquelle : 10 û A représente un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé choisi indifféremment parmi : HN HN (1) (2) (3) (4) 0 HN HN SNH HN HN ~E ~E N N i O O (7) (8) (5) 1NH NH HN (10) o H O O (12) n représentant 0, 1, 2 ou 3 ; p représentant 0, 1, 2 ou 3 ; E représentant NH ou O ; 15 Bl est un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé choisi de manière indépendante parmi : O O Ra O Ra (13) (14) HH (15) (16) (17) (18) (19) 20 n représentant 0, 1, 2 ou 3 ; p représentant 0, 1, 2 ou 3 ; E représentant NH ou O ; Ra représentant la chaîne d'un acide aminé protéinogénique, C1-C8 alkylé ; 25 - un groupe de formule O cH 1 g (X9)i-- lorsque X représente un groupe de formule (13') et (15'), O û B2 est choisi de manière indépendante parmi les groupes suivants : la liaison c représentant la liaison au groupe X, R E Y H ô H O \N H H (16) '-NH D,N (15) (19) (20) D, N H D-NH 10 15 (21) (25) s'N H O O (23) (24) OD' )p o f(N H ( H H o o (26) (27) (28) n représentant 0, 1, 2 ou 3 ; p représentant 0, 1, 2 ou 3 ; E représentant NH ou O ; Rb représentant une chaîne alkyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone ; D' représentant l'un des groupes suivants : 20 25 ---(Gly)vùN C ---(Pro)vùN H H m représentant un nombre entier variant de 1 à 40 ; v représentant un nombre entier variant de 1 à 10 ; la liaison c' représentant la liaison au groupe X, D représentant l'un des groupes suivants : H n H --Nù(CH2)vùN ùD N,D --Nù(CH2)v d 2.0 o ou un groupe de formule ou de formule 9 (Xg)i-- 10 15 20 25 30 O lorsque X représente un groupe de formule (1'), (2'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (1 l'), (12') et (14'), la liaison c' représentant la liaison au groupe X, q représentant un nombre entier variant de 2 à 6 ; Xg correspondant au résidu de l'un des groupes suivants : -(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ; -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ; -NH2-(CH2),,-000H, n variant de 1 à 10 ; -NH2-(CH2-CH2-O),,,-CH2CH2OOOH, m variant de 3 à 6 ; acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ; acide tranéxamique ; acide N-méthyl-tranéxamique ; acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ; acide 3(pipéridin-4-yl)-propionique ; N-(4-aminobutyl)-glycine ; 4-carboxyméthyl-pipérazine ; acide 4-(4-aminophenyl)butanoïque ; acide 3-(4-aminophenyl)propanoïque ; acide 4-aminophénylacétique ; 4-(2-aminoéthyl)- 1 -carboxyméthyl-pipérazine ; acide trans-4-aminocyclohexane carboxylique ; acide cis-4-aminocyclohexane carboxylique ; acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; acide trans-4-aminocyclohexane acétique ; 4-ami no- 1 -carboxyméthyl pipéridine ; acide 4-aminobenzoïque ; acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque. Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de l'invention sont des composés de formule (I) telle que définie ci-dessus dans laquelle Y répond à l'une des formules suivantes : H Ra O N H/ 0 HN 1 R~ Ra" Nù~ù N 0 H 101 _ H R. 10 HùN NùH NùH H Râ O HN~I H ,NH 20 15 Rc N H HùN Rc Rc ,NH H NùRc Rc / N HùN NùH D' 25 30 Re /NH Rc N H NH Rc' Rc ï / H H 11H 0N _N H NùRc NùH ND H N 0 H HùN H H H Rc N /N N 0/ HùN H 0 O>N Nom_ H NùH (V) HN Rc r(Xg)i 9 H 0 HùN NùH 15 20 HN. Rc Ra, Re, D, D', Xg, q, i et p étant tels que définis ci-dessus. Les composés préférés selon l'invention sont des composés répondant à l'une des formules suivantes (III-a) ou (III-b) : .R0 HN N H 25 30 ,NH R 23 ,R HN RN H v H H I~ H -"/N`RC N-H 0 H N 0 H H -N N' N 15 20 25 ,NH R (II][-b) R, et m étant tels que définis ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de l'invention sont caractérisé en ce que lequel Rc est choisi parmi l'un des groupes suivants : H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-, H-Lys-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-C O-, Ahx-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-, H-Lys-y(CH2N)-(D)Pro-Ty7-Tyr-NH-(CH2)s-CO-, -yr(CH2N)- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type méthylène-amino, ù H-Lys-yr(CH2)-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-, -yr(CH2)- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type méthylène, -H-Lys-y1(CH2-CH2)-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-, -yr(CH2CH2)-correspondant à une liaison pseudopeptidique de type éthylène, ù H-Lys-Gly-DOPA-Tyr-NH-(CH2)5-CO- et ù H-Arg-Ile-Ile-Leu-Arg- N I-(CH2)5-CO-. 30 NH R dans laquelle : ù n est égal à 1, 2 ou 6 ; ù Rc représente un groupe H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-. 15 La présente invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de substance active un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable. La présente invention concerne également une composition vaccinale caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de substance active un composé de formule (I) telle que 20 définie ci-dessus, en association avec un adjuvant pharmaceutiquement acceptable. La présente invention concerne également l'utilisation de composés tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'inhibition ou l'activation de la réponse immunitaire. La réponse immunitaire doit être inhibée au cours des maladies inflammatoires 25 (rhumatismes inflammatoires), des maladies auto-immunes, des réactions d'hypersensibilités en général et des allergies en particulier, des rejets de greffes, des réactions du greffon contre l'hôte. La réponse immunitaire doit être activée dans les vaccinations en général, dans l'immunothérapie des cancers, dans les maladies bactériennes ou virales induisant une 30 i:mmunosuppression (rougeole, SIDA, virus de l'herpes, cytomégalovirus...), dans le traitement des maladies bactériennes virales ou impliquant des agents infectieux non conventionnels (prions) chez les personnes présentant un déficit immunitaire primaire cu secondaire. formule suivante (III-a) : La présente invention concerne également un composé tel que défini ci-dessus de ,R0 HN H H O ON 0 N-NJ O N, pO H-N Ri--N H N H 10 La présente invention concerne également l'utilisation de composés tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'inhibition de la réponse immunitaire, telles que les rejets de greffes, les allergies ou les maladies auto-immunes. La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'augmentation de la réponse immunitaire, telles que les cancers ou les infections parasitaires, bactériennes, virales ou impliquant des agents infectieux non conventionnels tels que les prions. Les maladies impliquant l'inhibition de la réponse immunitaire comprennent les maladies auto-immunes telles que les diabètes, la sclérose en plaques, le lupus érythémateux disséminé ou l'arthrite rhumatoïde, les rejets de greffes, notamment dans le cadre d'allogreffes, de xénogreffes ou les réactions du greffon contre l'hôte, ainsi que les réactions d'hypersensibilités telles que les allergies, notamment le rhume des foins et les dermatites atopiques, ou les granulomes. Les composés selon la présente invention, utilisés dans le cadre de l'inhibition de la réponse immunitaire, peuvent être administrés par voie intraveineuse, par les voies muqueuses (orales, aériennes, nasales, vaginales), par voie sous-cutanée, intradermique ou épicutanée. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé selon la présente invention, pour le traitement de pathologies impliquant l'inhibition de la réponse immunitaire, lequel composé est présent dans la composition pharmaceutique en quantités telles qu'il peut être administré à raison d'environ 100 ng à environ 5 mg par jour et par individu. La présente invention concerne également l'utilisation telle que mentionnée ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'augmentation de la réponse immunitaire, telles que les cancers ou les infections parasitaires, bactériennes, virales ou impliquant des agents infectieux non conventionnels tels que les prions. Les cas impliquant l'activation de la réponse immunitaire comprennent les vaccinations en général, notamment les vaccins contre la grippe ou contre les maladies infantiles, l'immunothérapie des cancers. notamment dans le cadre de mélanomes ou de cancers à métastases, ou les maladies bactériennes ou virales induisant une immunosuppression, notamment dans le cadre de la rougeole, du SIDA, du virus de .6 L'herpès ou du cytomégalovirus, ou les vaccins destinés aux personnes présentant un déficit immunitaire primaire ou secondaire. Les composés selon la présente invention, utilisés dans le cadre de l'activation de la réponse immunitaire, peuvent être administrés par voie intraveineuse, par les voies 5 muqueuses (orales, aériennes, nasales, vaginales), par voie sous-cutanée, intradermique ou épicutanée. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé selon la présente invention, pour le traitement depathologies impliquant l'activation de la réponse immunitaire, lequel 10 composé est présent dans la composition pharmaceutique en quantités telles qu'il peut être administré à raison d'environ 100 ng à environ 5 mg par jour et par individu. La présente invention concerne également un procédé de préparation sur support solide d'un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 15 ù la formation d'un précurseur linéaire de Y tel que défini ci-dessus, lequel précurseur est constitué d'un enchaînement d'acides aminés formant une chaîne peptidique en croissance, synthétisée par des cycles successifs de couplage entre des résidus d'acides aminés N-protégés, dont trois portent un groupe de type amine, et la fonction amine de la chaîne peptidique en croissance, et de déprotection, le premier 20 résidu d'acide aminé étant accroché sur un support solide, ledit précurseur linéaire de Y comprenant au moins un résidu D-Alanine, ledit résidu D-Alanine étant substitué par un résidu D-Lysine dont l'amine E-NH a été acylée par un acide carboxylique portant la fonction désirée correspondant au groupe X tel que défini cl-dessus, ù la cyclisation du précurseur linéaire de Y protégé susmentionné, afin d'obtenir 25 un cycle fonctionnalisé protégé, ù la réaction dudit cycle fonctionnalisé protégé avec un bras espaceur dérivé de Z tel que défini ci-dessus, afin d'obtenir un cycle fonctionnalisé protégé dimérisé, ù le clivage des susdits groupes protecteurs, pour libérer les susdites fonctions amines protégées et obtenir un cycle fonctionnalisé déprotégé dimérisé, 30 ù le couplage des fonctions amines libérées susmentionnées avec un peptide déjà formé ou formé in situ par l'assemblage séquentiel des résidus d'acides aminés correspondant au groupe Re tel que défini ci-dessus, et 10 15 20 25 û le clivage de la molécule du support solide, après la suppression de tous les groupements protecteurs présents sur les chaînes latérales fonctionnalisées du groupe Rc, afin d'obtenir le composé tel que défini ci-dessus. La présente invention concerne également un procédé de préparation tel que défini ci-dessus d'un composé de formule (III-a) ou (III-b), ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : û la réaction d'un cycle fonctionnalisé protégé de formule suivante : NH GP GP représentant un groupe protecteur notamment choisi parmi : Boc, Z ou Alloc, X' représentant un groupe -SH ou o H O Z' avec un groupe espaceur de formule Z'\ ,, O~~ n représentant un nombre entier variant de 1 à 10 0 et Z' représentant un groupe N3 ou un groupeN O O étant entendu que lorsque X' représente un groupe Z' représente un. groupe N3, H GP o H NHH 'LN' N-GP N~ N--H OO ~\N v X' H N o H H-N et lorsque X' représente un groupe -.SH, Z' représente un groupe 30 5 afin d'obtenir un composé de formule (VIII) suivante : GP NH 10 GP ,NH HN GP GP étant tel que défini ci-dessus et Y' répondant à l'une des formules ci-dessous : 0 0 N o~/'o,i~/ H/ N=N N=N o\ 0 (B) \~N~ v( v IO S~ 0 étant entendu que Y' répond à la formule (A) lorsque Z' représente un groupe N3 O et que Y' répond à la formule (B) lorsque Z' représente un groupe 25 û la déprotection des susdits groupes protecteurs GP, pour libérer les fonctions amines protégées et le couplage de ces :Fonctions amines libérées susmentionnées avec un peptide déjà formé ou formé in situ par l'assemblage séquentiel des résidus d'acides aminés correspondant au groupe R, tel que défini ci-dessus, et û le clivage de la molécule du support solide, après la suppression de tous les 30 groupements protecteurs présents sur les chaînes latérales fonctionnalisées du groupe Re, afin d'obtenir le composé de formule (III-a) ou (III-b) tel que défini ci-dessus. (A) 15 20 DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 représente la synergie entre L1 (voir formule plus loin) et l'anticorps anti-5 CD40 agoniste 3/23. L'axe des ordonnées représente l'absorption de 3H-thymidine en cpm. La Figure 2 représente le profil HPLC de la réaction 1,3-dipolaire entre le macrocycle IV.23 et le diazoture IV.15 dans les conditions de l'entrée 6 et après traitement au TFA. (HPLC : gradient linéaire, 5-65% B, 20 min). La Figure 3 représente le profil HPLC de la réaction 1,3-dipolaire entre le macrocycle IV.23 et le diazoture IV.14 dans les conditions de l'entrée 5 et après traitement au TFA. (HPLC : gradient linéaire, 5-65% B, 20 min). 15 La Figure 4A représente le profil HPLC du brut réactionnel de la réaction de couplage entre le macrocycle dimérisé IV.25 et du pentapeptide protégé Pl après traitement au TFA. La Figure 4B représente le profil HPLC du ligand L41 après purification par HPLC préparative. (HPLC : gradient linéaire, 5-65% B, 20 min). La Figure 4C représente le profil MALDI-TOF du ligand L41 (masse attendue : 5529). 20 Les Figures 5A et 5B représentent l'induction d'apoptose des lymphomes de Burkitt (BL41) et la prolifération des cellules B par L1 et L41. Les colonnes blanches correspondent au ligand L1 et les colonnes noires au ligand L41. Dans la Figure 5A, l'axe des ordonnées représente le pourcentage d'apoptose spécifique 25 et l'axe des abscisses représente la concentration du ligand en M. Dans la Figure 5B, l'axe des ordonnées représente les coups par minutes (cpm) correspondant à l'incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN des lymphocytes B durant la synthèse d'ADN et l'axe des abscisses représente la concentration du ligand en M. Les colonnes blanches correspondent au ligand LI et les colonnes noires au ligand L41. 10 30 En interagissant avec leurs ligands respectifs, les récepteurs de la superfamille du TNF transmettent un signal qui permet la survie, la prolifération et la différentiation cellulaire et/ou l'apoptose (mort cellulaire programmée). Suivant le récepteur de la superfamille du TNF considéré et/ou le type cellulaire, le degré d'oligomérisation nécessaire à la transduction du signal est différent : certains sont activés par le ligand homotrimérique sous forme soluble alors que d'autres sont activés uniquement par le ligand homotrimérique membranaire. Ainsi les ligands TWEAK, TNF et BAFF sont actifs sous formes solubles. En revanche, l'activation par FasL, TRAIL, CD40L ou CD30L nécessite le recrutement de deux ou plusieurs homotrimères spatialement proches (Holler, N.; Tardivel, A.; Kovacsovics-Bankowski, M.; Hertig, S.; Gaide, O.; Martinon, F.; Tinel, A.; Deperthes, D.; Calderara, S.; Schulthess, T.; Engel, J.; Schneider, P.; Tschopp, J. Molec. Cell. Biol. 2003, 23, 1428-1440; Schneider, P.; Holler N.; Bodmer, J.L.; Hahne, M.; Frei, M.; Fontana, A.; Tschopp, J.1 Exp. Med. 1998, 187, 1205-1213). Dans le cas de la signalisation par CD40, il a été démontré que sur certains types cellulaires et notamment sur les cellules B, la formation du seul complexe hexamérique 3:3 n'était pas suffisante pour induire la transduction du signal. Dans ce cas, l'unité minimale de signalisation correspond, non pas à un, mais à plusieurs complexes hexamériques proche les uns les autres. Cette observation a incité les biochimistes à développer des outils pour augmenter l'oligomérisation du récepteur induite par le ligand soluble. Cette approche permet, d'une part d'augmenter l'effet biologique produit par l'engagement du récepteur, et d'autre part d'étudier les mécanismes par lesquels la multimérisation permet cette augmentation. A ce jour, seules des approches biochimiques ont été décrites pour amplifier l'oligomérisation de CD40. Essentiellement, deux stratégies ont été décrites. La première est basée sur l'utilisation de deux partenaires : le ligand et un agent amplificateur d'oligomérisation. La deuxième stratégie est basée sur la construction de protéines de fusion multimériques. Ces deux approches ont été utilisées pour amplifier l'effet biologique de CD40L et de FasL. Dans le cas de la première stratégie, l'agent amplificateur peut être un anticorps monoclonal anti-récepteur (ex : mAb ami-CD40) agissant en synergie avec le ligand soluble (Pound, J.D.; Challa, A.; Holder, M.J.; Armitage, R.J.; Dower, S.K.; Fanslow, W.C.; Kikutani, H.; Paulie, S.; Gregory, C.D.; Gordon, J. Int. Immunol. 1999, 11, 11-20 ; Schneider, P.; Holler, N.; Bodmer, J.L.; Hahne, M.; Frei, K.; Fontana, A.; Tschopp, J. J. Exp. Med. 1998, 187, 1205-1213) ou bien un anticorps monoclonal anti-Flag permettant 1.'oligomérisation du ligand recombinant fusionné avec un peptide Flag (Haswell, L.E.; Glennie, M.J.; Al-Shamkhani, A. Eur. J. Immunol. 2001, 31, 3094-3100). La deuxième stratégie consiste à construire des protéines de fusion constituées de plusieurs copies du ligand. A cette fin, le groupe de JOrg Tschopp à l'université de Lausanne a construit une molécule dans laquelle FasL ou CD40L est fusionnée au domaine collagène de la protéine ACRF'30. Cette protéine, membre de la superfamille du C l q, possède une géométrie particulière et deux têtes homotrimériques qui permettent d'associer par fusion deux domaines homotrimériques sur la même molécule. Dans une démarche similaire, Haswell et al. a décrit une molécule capable de t o présenter quatre homotrirnères de CD40L. Ils ont pour cela remplacé le domaine lectine de la Jung surfactant protein-D (SP-D : membre de la superfamille des lectines) par ].e domaine extracellulaire C-terminal de CD40L (Haswell, L.E.; Glennie, M.J.; Al-Shamkhani, A. Eur. J. 1mmunol. 2001, 31, 3094-3100). L'utilisation de ces protéines multimériques ACRP30 et SP-D fusionnées à 15 CD40L homotrimérique a permis de démontrer que la plus petite unité active capable d'induire une prolifération robuste des lymphocytes B spléniques de souris est un dimère de CD40L homotrimérique. La combinaison des deux stratégies à savoir le crosslinking de la protéine de fusion CD40L:ACRP30 contenant un Flag avec un anticorps anti-Flag permet d'augmenter de manière significative l'effet de la protéine 20 CD40L:ACRP30 sur les cellules B démontrant ainsi la nécessité d'amplifier le degré d'oligomérisation du récepteur pour une signalisation efficace. 15 20 PARTIE EXPÉRIMENTALE Comme la molécule CD40L soluble, les mimes synthétiques (ex : L1 tel que décrit dans la demande W003/102207) n'induisent pas la prolifération des cellules B spléniques rnurines. Les résultats de la littérature discutés précédemment suggèrent l'intérêt que pourraient avoir des stratégies visant à augmenter encore davantage le pouvoir d'oligomérisation de nos ligands synthétiques. Ceci est conforté par les résultats obtenus au laboratoire avec l'anticorps monoclonal 3/23. En effet, nous avons pu montrer que l'action de L1 sur des cellules B spléniques, comme celle de CD40L homotrimérique soluble, est potentialisée par cet anticorps anti-CD40 agoniste. L'association de ces 2 molécules permet d'induire la prolifération des cellules B (Figure 1). H-Lys-Gly-Tyr-Tyr\ NH 0 H-Lys-Gly-Tyr-Tyr/N 5 N 4 H-N ,(( H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-- )S Parallèlement les Inventeurs ont cherché à développer la conception de molécules permettant de présenter au moins deux copies du ligand synthétique mimant CD40L homotrimérique. L'idée étant de mettre en évidence un effet amplificateur résultant de 25 l''oligomérisation du ligand et d'identifier l'entité minimale permettant d'induire une prolifération des lymphocytes B. Pour cela, il a été choisi de synthétiser des dimères des ligands synthétiques. 32 30 DIMERISATION DES LIGANDS SYNTHETIQUES. 1) Approche rétrosynthétique générale Les molécules dimérisées sont synthétisées à partir de deux architectures trimériques de type cyclo.-D,L-a-peptide reliées l'une à l'autre par l'intermédiaire d'un bras espaceur de type n-alkyle ou polyéthylène glycol. Afin de créer ce lien, deux approches ont été envisagées : l'une utilise la chimie des thiols (réaction d'addition de Michael d'un thiol sur un maléimide) et l'autre la click chemistry , réaction de cycloaddition [3+2] dipolaire (ou réaction de Huisgen) entre un alcyne et un azoture. Alors que dans la première approche, le lien introduit est un thioéther, l'approche par click chemistry génère un lien de type 1,2,3-triazole 1,4-disubstitué. La stratégie générale utilisée repose sur la synthèse d'un macrocycle D,L-a-peptide sur lequel est accroché un groupement fonctionnalisé : soit un alcyne vrai dans le cas de l'approche par click chemistry , soit un groupement thiol dans le cas de la seconde approche selon le schéma suivant : N--''Ni o'\.-N %^N ,I dans le cas de la "click chemistry" n W--N H o~ ~s o\^b--\,N dans le cas de la chimie des thiols n Y' _ 25 34 RHN RHN NH R NHR NHR V HN O RHN HN o NH N H NHR dans le cas de la "click chernistry" : X'= H et Z'= N3 O dans le cas de la chimie des thiols : x'= SH et z'= Ce cycle fonctionnalisé est préparé suivant la stratégie suivante : un des trois résidus D-Alanine est substitué, au moment de la préparation du précurseur peptidique, par un résidu D-Lysine dont l'amine 'NH a été acylée au préalable par un acide carboxylique portant la fonctionnalité désirée. 2) Dimérisation par la réaction d'addition de Michael entre un thiol et un 10 maléimide Il a d'abord été envisagé de dimériser les mimes fonctionnels de CD40L par la réaction d'addition de Michael entre un ligand fonctionnalisé de manière exocyclique par un groupement thiol et un bras espaceur bismaléimide à 6 carbones (IV.1). Ce bras espaceur est préparé à partir de la diamine correspondante, par réaction 15 avec le N-(Méthylcarbonyl)maléimide dans un mélange de THF et d'une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium ((a) Bodanszky, M.; Bodanszky, A. In the Practice of Peptide Svnthesis; Springer-Verlag: New York, 1984, 29-31. (b) Cheronis, J.C.; Whalley, E.T.; Nguyen, K.T.; Eubanks, S.R.; Allen, L.G.; Duggan, M.J.; Loy, S.D.; Bonham, K.A.; Blodgett, K. J. 1fed. Chem. 1992, 35, 1563-1572). Le produit désiré est obtenu par simple lavage, sans purification supplémentaire. H2N NH2 IV.I (a) N-(Méthylcarbonyl) maléimide, NaHCO3/THF, 100%. a. Synthèse du macrocvcle fonctionnalisé Une des étapes clé de cette synthèse est la préparation du macrocycle fonctionnalisé par un groupement thiol. Il a fallu dans un premier temps trouver un groupement protecteur approprié pour cette fonctionnalité, orthogonal au groupement Boc mais stable dans les conditions classiques de synthèse peptidique. Pour cela, le groupement acétamide (Acm) a été utilisé. Ce groupement protecteur est, en effet, stable dans les conditions de déprotection du groupement Fmoc (20% pipéridine dans le DMF) mais également en présence d'acide trifluoroacétique. La synthèse de l'intermédiaire acide 3-(Acétylamino-méthylsulfanyl) propionique (IV.2) nécessaire à la fonctionnalisation du macrocycle est présentée sur le schéma suivant : HS\ OH + N~OH ùa \/NOS\ ^ /OH ù AcmS\ ^ /OH 00 0[ J0] v 00 v 00 IV.2 (a) TFA, 100%. La protection du dérivé thiol, de l'acide 3-mercaptopropanoïque, par le groupement protecteur acétamide, s'effectue dans l'acide trifluoroacétique en présence de N-(hydroxyméthyl)acétamide (Phelan, J.C.; Skelton, N.J.; Braisted, A.C.; 25 McDowell, R.S. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 455-460). L'acide IV.2 est alors couplé sur l'amine ENH du dérivé D-Lysine convenablement protégé IV.4. Le composé obtenu, IV.5, est ensuite déprotégé de ces groupements Fmoc et ester de benzyle. Puis, la partie N-terminale du zwitterion ainsi formé est à nouveau protégée par un groupement Fmoc afin d'obtenir le précurseur IV.7 30 nécessaire à l'assemblage du peptide linéaire en vue de la macrocyclisation. 5 e) OH OBf OBf FmocHN FmocHN FmocHN H2N 0 C) IV.3 : R = Boc b) IV.4 : R = NH3, TFA- (a) BnBr (3 eq.), KHCO3 (1.6 eq.), Bu4NI (0.1 eq.), DMSO, 100% ; (b) TFA, 100% ; (c) IV.1, BOP, DIEA, DMF, 90% ; (d) LiOH 1N (1 eq.), DMF, 91% ; (e) FmocOSu (1 eq.), K2CO3 (2 eq.), acétone/H20, 66%. Ce monomère contenant un groupement thiol protégé est alors incorporé lors de la synthèse sur support solide de l'hexapept:ide linéaire IV.8. La synthèse s'effectue à partir de la résine chlorure de 2-chlorotrityle selon la stratégie Fmoc comme illustré ci-après : SAcm HNO 36 o 00 o NHBoc NHR AcmS' NH AcmSNH AcmS" NH J OH OH FmocHN O O IV.6 IV.7 a), b), c), d) H2N J et NHBoc NHBoc NHBoc HN, R IV.9 : R = Boc IV.10 : R = NH3, TFA- 10 (a) Fmoc-Lys(Boc)-OH (2 eq.), DIEA (6 eq.), CH2C12; (b) 25% pipéridine/DMF; (c) SPPS : Fmoc-Xaa-OH (5 eq.), BOP (5 eq.), HOBt (5 eq.), DIEA (15 eq.), DMF ; (d) HFIP/CH2C12 (60/40 v/v) ; (e) EDC.HC1 (1.2 eq.), HOBt (1.2 eq.), DIEA (1.5 eq) , DMF, 77% ; (f) TFA, 85%. 1) La cyclisation du précurseur linéaire IV.8 s'est avérée problématique. En effet, les premiers essais effectués dans les conditions standards utilisées lors de la synthèse du macrocycle II.2 ont abouti à des profils HPLC du produit macrocyclisé brut, après déprotection, accompagné de quantités importantes de produits de polymérisation. Une étude plus détaillée des conditions de macrocyclisation a donc été nécessaire. Pour cela, nous avons fait varier la nature des réactifs de couplage, la concentration du milieu réactionnel ainsi que le temps de réaction. Les résultats de cette étude sont résumés dans le tableau 1. Dans ce tableau, le pourcentage de pureté correspond à la pureté estimée à partir du profil HPLC du composé IV.10 brut obtenu après de traitement de IV.9 au TFA. En effet, l'analyse HPLC du cycle complètement protégé IV.9 est impossible car ce composé est très peu soluble dans les solvants utilisés classiquement en HPLC. Tableau 1 : Différentes conditions utilisés pour la réaction de macrocyclisation Entrée Réactifs de Concentration du Temps de Pureté brut du couplage utilisé peptide dans le réaction composé IV.10 mélange réactionnel 1 EDC.HCI (1.2 eq), 1.10"2 M 48 heures 8% HOBt (1.2 eq), DIEA (1.5 eq) 2 EDC.HCI (1.2 eq), 1.5.10'3 M 72 heures 17% HOBt (1.2 eq), DIEA (1.5 eq) 3 EDC.HCI (1.2 eq), 4.10-3 M 48 heures 8% HOBt (1.2 eq), DIEA (1.5 eq) __ EDC.HCI (1.2 eq), 4.10 M 72 heures 63% 4 HOBt (1.2 eq), DIEA (1.5 eq) 5 BOP (1.2 eq), 4.10-3 M 48 heures 60%[ DIEA (1.5 eq) Il apparaît que cette réaction est très sensible aux conditions expérimentales employées. Dans un premier temps, nous avons pu remarquer que la concentration à laquelle s'effectue la réaction est très importante. En effet, suivant la dilution du milieu réactionnel, la pureté du macrocycle IV.10 varie fortement (entrées 1, 2 et 4 du tableaul). Une concentration de 4.10'3 M semble être adaptée pour former le macrocycle IV.10 avec une pureté satisfaisante. De même, l'issue de la réaction est fortement influencée par le réactif de couplage utilisé ainsi que par le pH auquel est réalisée la réaction (pH 7 pour le couplage à l'EDC.HCI, pH ù 8-9 pour le couplage au BOP). En effet, le réactif BOP donne un résultat très nettement inférieur à l'EDC.HCI (entrées 4 et 5). Enfin, le temps de réaction a été évalué. Dans le cas du couplage à l'EDC.HC1, 72 heures sont nécessaires pour une macrocyclisation totale (entrées 3 et 4). Une différence de réactivité a également été observée en fonction de la température à laquelle s'effectue la réaction. A une température de 40 C, les produits de 5 polymérisation sont très largement majoritaires. Le macrocycle IV.10 ainsi obtenu est couplé au pentapeptide protégé Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(OtBu)-Tyr (OtBu)-Ahx-OH P1 en présence de BOP sans purification supplémentaire pour conduire au ligand trimérique entièrement protégé. Les 10 groupements protecteurs Boc et tBu ainsi que l'Acm sont éliminés dans une même étape et le ligand L38 possédant une fonction thiol est purifié par HPLC préparative C18. 'H3N O H-LysGIyTyr-Tyr-Ahx-NH SH ~ NH3+ TFA" TFa" O NH HN o HN O= H-Lys-G ly-Tyr-Tyr-Ahx-N H HN a), b), c) H-Lys-G ly-Tyr-Tyr-Ahx-N H O NH Iv.10 L38 20 (a) Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(OtBu)-Tyr(OtBu)-Ahx-OH P1 (3.3 eq.), BOP (3.3 eq.), DIEA (15 eq.), DMF ; (b) CF3COOAg (100 eq/Acm), TFA/Anisole puis DTT, AcOH aq IN ; (c) RP-HPLC C 18. En principe, le groupement acétamide peut être éliminé dans différentes 25 conditions qui pour certaines sont orthogonales aux conditions d'élimination des groupements protecteurs 13oc/tBu. On citera notamment le traitement du peptide par des sels de mercure dans un milieu acide (Hg[OAc]2 dans une solution tampon à pH 4) (Veber, D.; Milkowski, J.D.; Varga, Varga, S.L.; Denkewalter, R.G.; Hirschmann, R. J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 5456-5461), l'utilisation de sels d'argent (ex : CF3SO3Ag en 30 présence d'anisole dans l'acide trifluoroacétique)(Fujii, N.; Otaka, A.; Watanabe, T.; Okamachi, A.; Tamamura, H.; Yajima, H.; Inagaki, Y.; Nomizu, M.; Asano, K. J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1989, 283-284), le traitement par des sels de thalium (Tl(CF3CO2)2)(Fujii, N. et al. Chem. Pharm. Bull. 1987, 36, 2339) ou par de l'iode (Kamber, B. et al. Helv. Chim. Acta 1980, 63, 899) (dans ces deux derniers cas un pont 35 disulfure est formé). Il a été choisi d'utiliser du trifluoroacétate d'argent CF3CO2Ag dans l'acide trifluoroacétique en présence d'anisole. Ces conditions de déprotection permettent d'éliminer à la fois le groupement protecteur acétamide et les groupements tertl3utyloxycarbonyle (Boc) et éthers tert-butyliques (tBu) présents sur le peptide ((a) Albericio, F. et al. in "Fmoc solid phase peptide synthesis : a practical approach", W.C. Chan & P.D. White (Eds.), Oxford University Press, Oxford, 2000, pp.104 ; (b) catalogue Novabiochem 2004/5 pp 3.21). Le ligand est ensuite traité par une solution de 1.,4-dithiothréitol (DTT) dans l'acide acétique afin de réduire d'éventuels ponts disulfure formés. Après purification par HPLC préparative sur colonne C18, le ligand L38 est rapidement engagé dans la réaction de dimérisation. b. Réaction d'addition de Michael entre le ligand thiol et le bras espaceur bismaléimide La réaction d'addition de Michael s'effectue dans un mélange eau/acétonitrile. Une solution du bismaléimide IV.1 (1 eq.) dans l'acétonitrile est ajoutée à une solution du ligand L38 (3 eq) dans l'eau. Bien que la réaction d'addition de Michael soit rapide, il a été préféré effectuer la réaction dans des conditions relativement diluées (2,5.10-3 M) afin de prévenir la formation éventuelle de ponts disulfure entre deux ligands L38. Réaction de dimérisation par réaction d'addition de Michael de L38 sur IV.1 RHN 30 35 L39' NHR o HN IV.1 + L38 O N N H O RNH HN 01 HN O O NH 'NHR + HN o NH HN NH n NHR RHN NH H N H (a) H2O/CH3CN La réaction a été suivie par HPLC analytique et il a été observé qu'après 15 minutes de réaction, une nette proportion de ligand monoadduit L39' est déjà formé. Il reste cependant du bismaléimide IV.1 et du ligand thiol L38 qui est mis en excès. Au bout de 24 heures, on voit apparaître la fonnation du produit de dimérisation L39. Cependant, ce n'est qu'après dix jours que la réaction arrive à complétion. On remarque que la totalité du composé monoadduit a réagit avec le ligand L38 mis en excès pour former le dimère attendu L39. c. Conclusions L'étape clé de cette stratégie de synthèse est la préparation du macrocycle fonctionnalisé. L'issu de cette réaction de macrocyclisation s'est révélée très sensible aux choix des conditions expérimentales. Leur optimisation a néanmoins permis d'obtenir le racrocycle avec une pureté satisfaisante et suffisante pour l'engager dans la suite de la 15 synthèse sans purification préalable. La réaction d'addition de Michael est simple à mettre en oeuvre puisqu'elle ne nécessite que de mettre en solution le ligand fonctionnalisé par un groupement thiol et le bras espaceur bismaléimide dans un mélange eau/acétonitrile. Un ajustement du pH (pHû7) peut permettre d'accélérer la réaction et de diminuer le temps de formation du 20 dimère. La purification du brut réactionnel par HPLC préparative permet d'obtenir le ligand dimérisé. Cependant, des difficultés de purification du produit de dimérisation ont été rencontrées lorsque d'autres bismaléimides ont été utilisés. En effet, cette réaction a également été effectuée à partir d'un bras espaceur bismaléimide de type polyéthylène glycol IV.11. o 25 Iv.11 3) Dimérisation des ligands par la voie click chemistry Parallèlement à l'approche utilisant la réaction de Michael, la dimérisation de nos 30 ligands synthétiques par une stratégie de click chemistry a été envisagée. a) La réaction de click chemistry La réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire entre un alcyne et un azoture a été découverte dans les années 1960 par Huisgen et al. (Huisgen, R.; Szeimies, G.; Moebius, L. Chem. Ber. 1967, 100, 2494-2507 ; Huisgen, R. Pure Appl. Chem. 1989, 61, 613-628). Cette réaction permet de former des motifs triazoles selon le schéma présenté ci-dessus : O O p R- - + N__ R, R1 1:1 Récemment, le groupe de Sharpless et al. a découvert que l'utilisation de Cuivre I en quantité catalytique permet d'adoucir les conditions de la réaction (réaction à température ambiante) et d'améliorer les rendements ainsi que la sélectivité de la réaction (formation préférentielle du régioisomère 1,4) (Kolb, H.C.; Finn, M.G.; Sharpless, K.B. Angew. Chem. 1-nt Ed. 2001, 40, 2004-2021 ; Rostovtsev, V.V.; Green, L.G.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599). Cette réaction catalysée au cuivre permet une grande variété de conditions, que ce soit au niveau du solvant, du pH ou bien encore de la source de cuivre. Habituellement, la réaction s'effectue à l'aide de Cu(SO4).5H20 qui est réduit in situ par un réducteur tel que l'ascorbate de sodium ou l'acide ascorbique. Cependant, dans le cas où ces conditions ne donnent pas de résultats, une source de cuivre I (Cul, CuBr, CuOTf.C6H6...) peut être directement utilisée. Dans ce cas, la réaction est plus sensible à l'oxydation, et la formation de produits secondaires est parfois observée. Afin d'éviter ces réactions parasites, la réaction doit être protégée de l'air et une base tel que la 2,6-lutidine doit être ajoutée. De manière concomitante à Sharpless, le groupe de Meldal décrit l'utilisation de sels de cuivre I (Cul) pour la préparation en phase solide de peptides 1,4-triazole à partir d'azotures organiques et d'un alcyne accroché à l'extrémité d'un peptide-résine (Tornoe, C.W.; Christensen, C.; Meldal, M. J. Org. Chem. 2002, 67, 3057-3064). Comme en solution, cette réaction tolère toutes sortes de solvants (acétonitrile, N,N-diméthylformamide, toluène, dichlorométhane) et permet d'accéder facilement et dans d'excellentes puretés au peptide triazole désiré. Depuis cette découverte, la réaction de Huisgen 1,3-dipolaire est aujourd'hui utilisée dans de nombreux champs d'applications : que ce soit en chimie combinatoire (Lber, S.; Rodriguez-Loaiza, P.; Gmeiner, P. Org. Lett. 2003, 5, 1753-1755 ; Kolb, H.C. et al. Preparation of 1,2,3-triazole carboxylic acids from azides and [3ùketoesters in t:ae presence of base. US2.003135050), en chimie organique ((a) Fazio, F.; Bryan, M.C.; Blixt, O.; Paulson, J.C.; Wong, C.-H. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14397-14402; (b) Bodine, K.D.; Gin, D.Y.; Gin, M.S. J. Ain. Chem. Soc. 2004, 126, 1638-1639; (c) Seo, T.S.; Li, Z.; Ruparel, H.; Ju, J. J. Org. Chem. 2003, 68, 609-612; (d) Zhou, Z.; Fahrni, C.J. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 8862-8863; (e) Jin, T.; Kamijo, S.; Yamamoto, Y. R2,N,N R2,1 ,N L N + sL N Fur. J. Org. Chem. 2004. 3789-3791) ou encore dans la synthèse de bioconjugués ((a) Wang, Q.; Chan, T.R.; Hilgraf, R.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B.; Finn , M.G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192-3193. (b) Link, A.J.; Tirell, D.A. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 11164-11165. (c) Speers, A.E.; Adam, G.C.; Cravatt, B.F. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 4686-4687. (d) Seo, T.S.; Li, Z.; Ruparel, H.;Ju, J. J. Org. Chem. 2003, 68, 609-612. (e) Speers, A.E.; Cravatt, B.F. Chem. Biol. 2004, 11, 535-546. (f) Lee, L.V.; Mitchell, M.L.; Huang, S.-J.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B.; Wong, C.-H. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 9588-8589). l0 b. Préparation des deux réactifs nécessaires à la réaction de click chemistry : le diazoture et le macrocycle fonctionnalisé par un alcyne vrai N3 O~Of /n IV.12:n=1 IV.15:n=1 IV.13:n=2 IV.16:n=2 IV.14 : n = 6 IV.17 : n = 6 15 (a) MsCI (2.5 eq.), NEt3 (3 eq.) ou DIEA (2.5 eq.), CH2C12, 74-96%; (b) NaN3 (2.5 eq.), DMF, 70-96%. Le diol est tout d'abord transformé en dimésylate et celui-ci est ensuite substitué par addition d'azoture de sodium. Afin de pouvoir évaluer l'importance de la longueur du bras espaceur, trois diazotures de taille différente (IV.15-IV.17) ont ainsi été 20 préparés (n = 1, 2, 6). La préparation du macrocycle D,L-a-peptide débute par la synthèse du dérivé D-Lysine IV.21 incorporant la fonction alcyne vrai et convenablement protégé en vue de son utilisation en synthèse peptidique sur support solide. Le dérivé alcyne vrai (IV.18) servant à construire IV.21 et donnant lieu à la 25 fonctionnalité du macrocycle, provient de la réaction entre l'anhydride succinique et la mono-propargylamine comme suit : Oy0 / + 'I a) HO N ,// H2N IV.18 (a) DIEA, ACN, 71% 30 L'acide N-Prop-2-ynyl-succinamique (IV.18) ainsi obtenu est alors couplé à l'acide aminé D-Lysine N-Fmoc protégé afin de former le dérivé IV.19. Une série de Les bras espaceurs diazotures sont préparés en deux étapes à partir des chaînes polyéthylène glycol correspondantes comme suit : HOMO O ,iOH a) Ms0~~0~^O~ /OMs n n b) N3 o déprotection et de protection permet d'obtenir le précurseur IV.21 en 5 étapes avec un rendement global de 23% : Synthèse de l'intermédiaire couplé à un alcyne vrai. o o o HN NH HN LNH HNNH job J o J NHBoc J NHR o a) FmocHNOH FmocHN' c) OBn O FmocHNOBn OH FmocHN d) e) o o IV.20 IV.21 O 0 IV.3 : R = Boc b) '. IV..4 : R = NH3, TFA5 (a) BnBr (3 eq.), KHCO3 (1.6 eq.), Bu4N][ (0.1 eq.), DMSO, 100% ; (b) TFA, 100% ; (c) IV.17, BOP, DIEA, ACN, 64% ; (d) LiOH 1N (1 eq.), DMF, 54% ; (e) FmocOSu (1 eq.), K2CO3 (2 eq.), Acetone/H20, 66%. Ce précurseur fonctionnalisé ainsi préparé est alors incorporé lors de la synthèse de 10 l'hexapeptide linéaire IV.22 en phase solide. Le peptide est ensuite cyclisé afin de former le macrocycle IV.23. OffN v HNO o IV.19 CI 15 NHBoc NHBoc NHBoc H R" J 20 o R NH HN HN, R IV.23 : R = Boc IV.24 : R = NH3, TFA" (a) Fmoc-Lys(Boc)-OH (2 eq.), DIEA (6 eq.), CH2C12; (b) 25% pipéridine/DMF; (c) SPPS : Fmoc-Xaa-OH (5 eq.), BOP (5 eq.), HOBt (5 eq.), DIEA (15 eq.), DMF ; (d) 30 HFIP/CH2C12 (60/40 v/v) (e) BOP (1.2 eq.), DIEA (1.5 eq.) DMF, 83% ; (f) TFA, 87%. 25 f) A nouveau, la réaction de macrocyclisation a dû être optimisée. En effet, le profil HPLC de la réaction de cyclisation effectuée à l'aide du réactif de couplage EDC.HC1 montre un pic fin correspondant au macrocycle déprotégé IV.24, mais celui-ci est accompagné d'un massif important correspondant à des produits de polymérisation. Même si la dilution du milieu réactionnel a permis d'augmenter la pureté du macrocycle, le rendement de la réaction avec ce réactif de couplage reste très faible. Il a alors été envisagé d'utiliser le réactif BOP. Celui-ci a permis d'augmenter largement le rendement (83%) et la pureté du macrocycle après déprotection (67%) des groupements Boc. L'optimisation des conditions de cyclisation a permis d'envisager la réaction de couplage peptidique afin de former le ligand L40 correspondant, sans purification préalable du macrocycle IV.24 par HPLC préparative. RNH NH HN NH a), b) NH O HN O RNH~~ HN â H RNH L40' : R = Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(OtBu)-Tyr(OtBu)-Ahx NH NH3' TFA- TFA- +H3N~ NH3+ TFA- O HN NH IV.24 c) L40 : R = H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Ahx (a) Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(OtBu)-Tyr(OtBu)-Ahx-OH Pl (3.3 eq.), BOP (3.3 eq.), DIEA (15 eq.), DMF ; (b) TFA ; (c) RP-HPLC CL8. c. Réaction de click chemistry i. Mise au point de la réaction de click chemistry La réaction de click chemistry a tout d'abord été envisagée à partir du ligand déprotégé (L40) ou non (L40') de ces groupements protecteurs. Les essais de réactivité ont été réalisés avec le diazoture IV.15. Le tableau 2 résume les conditions expérimentales utilisées. L'avancement de la réaction est suivie par HPLC analytique soit par injection directe du brut réactionnel dans 25 le cas des expériences effectués sur le ligand déprotégé (L40), soit après traitement au .5 préalable à l'acide trifluoroacétique dans le cas des réactions effectuées à partir du ligand protégé (L40'). En effet, la faible solubilité du ligand L40' rend son analyse en HPLC en phase inverse et le suivi direct de la réaction de dimérisation par click chemistry difficile. On a tout d'abord utilisé les conditions standards décrites par Sharpless à savoir une source de cuivre II, Cu(SO4).5H20, introduite en quantité catalytique et réduite in situ par un réducteur, l'ascorbate de sodium. Le ligand L40, qui est très hydrophile, a été solubilisé dans le mélange tBuOH/H2O (1:1, v/v), utilisé classiquement par Sharpless. Les réactions effectuées avec le ligand protégé L40' ont été réalisées dans le N,N'-diméthylformamide, seul solvant qui permet sa solubilisation. Après quatre jours de réaction aucune évolution n'a été observée en HPLC, quelque soit le ligand de départ (L40 ou L40') et malgré l'ajout de quantités supplémentaires de Cuivre II et de réducteur. La réaction a également été effectuée à 80 C ainsi que sous micro-ondes. Cependant aucun résultat n'a été obtenu : au contraire, on observe une dégradation du produit de départ. Tableau 2 : Conditions expérimentales utilisées pour la réaction 1,3-dipolaire à partir des ligands L40 ou L40' Entrée Ligand Conditions Solvant 1 j,40, Cu(SO)4.5H20 (0.02 eq.) DMF Ascorbate de sodium (0.2 eq.) 2 L40' Cul (13 eq.), acide ascorbique (7 eq.) DMF/Pyridine DIEA (17 eq.) 3 L40' Cul (2 eq.), 2,6-lutidine (2 eq.), DMF DIEA (2 eq.) 4 L40 Cu(SO)4.5H20 (0.02 eq.) tBuOH/ H20 Ascorbate de sodium (0.2 eq.) 5 L40 Cul (13 eq.), acide ascorbique (7 eq.), DMF/Pyridine DIEA (17 eq) 6 L40 Cul (2 eq.), 2,6-lutidine (2 eq.), DMF DIEA (2 eq.) On a donc envisagé l'utilisation directe d'une source de cuivre I, en s'appuyant sur les travaux réalisés par les groupes de Kirschenbaum (Tang, H.; Fafarman, A.; Holub, J.M.; Kirschenbaum, K. Org. Lett. 2005, 7, 1951-1954) et Ghadiri (Van Maarseveen, J.H.; Home, W.S., Ghadiri M.R. Org. Lett. 2005, 7, 4503-4506), qui effectuent des réactions 1,3-dipolaires à partir de peptides soit en solution soit en phase solide, à l'aide d'iodure de cuivre (CuI). L'utilisation d'une source de cuivre I nécessite de travailler sous atmosphère inerte et de dégazer le solvant à l'argon après solubilisation du produit. Malgré ces précautions, aucune évolution n'a été observée lorsque la réaction est effectuée à partir des ligands L40 et L40'. Une explication possible de ce manque de réactivité est la forte proportion d'amines libres présentes sur le ligand L40. Il est en effet, possible que le cuivre se chélate autour de ces fonctionnalités, ]'empêchant de chélater la fonction alcyne présente sur le rnacrocycle. Cette explication a déjà été évoquée par Nolte et al. dans le cas de réactions réalisées sur des peptides contenant des résidus arginines (Dirks, A.J.; Van Berkel, S.S.; Hatzakis, N.S.; Opsteen, J.A.; Van Delft, F.L.; Cornelissen, J.J.L.M.; Rowan, A.E.; Van Hest, J.C.M.; Rutjes, F.P.J.T. ; Nolte, R.J.M. Chem. Commun. 2005, 4172-4174). Alternativement, le fort encombrement lié à la présence du pentapeptide sur les bras du macrocycle peut empêcher ou du moins gêner la chélation du cuivre. Suite à ces difficultés, il a été décidé de réaliser la réaction de click chemistry à partir du macrocycle protégé (IV.23) ou non protégé (IV.24). Le tableau 3 indique les conditions expérimentales utilisées lors de la réaction des macrocycles et du diazoture lV.15. Comme précédemment, l'avancement de la réaction est suivi par HPLC analytique soit par injection directe du mélange réactionnel dans le cas des expériences effectuées sur le macrocycle déprotégé (IV.24), soit après traitement au préalable à l'acide trifluroroacétique dans le cas des réactions effectuées à partir du macrocycle protégé (IV.23). Dans les conditions de Kirschenbaum, aucune évolution n'a été observée par HPLC analytique (entrée 1). Par contre, dans les conditions de Ghadiri (entrées 2, 3 et 4), on a pu observer une diminution significative du produit de départ accompagnée de l'apparition d'un nouveau produit. Ce produit n'a cependant pas pu être caractérisé à ce stade. Ces réactions ont été réalisées dans l'acétonitrile (entrées 2 et 4) ou dans un mélange eau/acétonitrile (entrée 3). Ce solvant a été choisi car il est préconisé par Sharpless lors de l'utilisation d'une source de Cuivre I (Rostovtsev, V.V.; Green, L.G.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599).30 Tableau 3 : Conditions expérimentales utilisés pour la réaction 1,3-dipolaire à partir du macrocycle protégé ou non. Entrée Macrocycle Conditions Solvant 1 IV.24 Cul (13 eq.), acide ascorbique (7 eq.), DMF/Pyridine DIEA (17 eq.) 2 IV 24 Cul (2 eq.), 2,6-lutidine (2 eq.), CH3CN DIEA (2 eq.) 3 IV.24 Cul (2 eq.), 2,6-lutidine (2 eq.), H2O/CH3CN DIEA (2 eq.) 4 23 Cul (2 eq.), 2,6-lutidine (2 eq.), CH3CN DIEA (2 eq.) IV.23 CuBr (0.2 eq.), DBU (3 eq.), 80 C THF/CH3CN 6 IV.23 Cul (2 eq.), 2,6-lutidine (25 eq.), DMF DIEA (25 eq.) 5 A partir de ces résultats, il a été décidé d'effectuer la réaction à partir du macrocycle protégé IV.24 dans le N,N'-diméthylfonmamide pour une meilleure solubilisation. En synthèse pseudopeptidique, Meldal utilise 2 équivalents de Cul et 50 équivalents de DIEA (Tornoe, C.W.; Christensen, C.; Meldal, M. J. Org. Chem. 2002, 67, 3057-3064). Dans notre cas, la proportion de base a été augmentée à 25 équivalents de DIEA et 25 équivalents de 2,6-lutidine (entrée 6). Après trois jours d'agitation et traitement au TFA, l'analyse HPLC révèle la disparition quasi complète du cycle de départ (transformé en IV.24 après TFA, environ 2% restant) et l'apparition d'un produit majoritaire. La purification du brut réactionnel par HPLC préparative a permis d'identifier le produit majoritaire comme étant la molécule dimérique attendue IV.25 issue de la réaction par click chemistry . D'après l'analyse HPLC, le rapport IV.24:IV.25 est de 3:97 (Figure 2). L'utilisation de CuBr (entrée 5) a également été explorée. La réaction a été arrêtée après trois jours d'agitation à 80 C. Comme précédemment, l'analyse HPLC montre une conversion quasi complète du produit de départ (12% de IV.24 restant) mais cette fois ci deux produits sont formés majoritairement dans un rapport 41:59 (IV.25:IV45'). Il s'agit du composé dimérisé attendu IV.25 et du dérivé IV.25' résultant de la formation d'un seul motif triazole (Figure 3). Même si ces conditions permettent d'accéder au produit de dimérisation, elles sont cependant moins efficaces que celles mettant en jeu l'iodure de cuivre car elles conduisent après 3 jours à un mélange de trois produits. Par conséquent, les conditions décrites dans l'' entrée 6 du tableau 2 ont été conservées afin de généraliser la réaction de dimérisation 1,3-dipolaire aux autres bras espaceurs IV.16 et IV.17. Réaction de dimérisation du macrocycle fonctionnalisé à partir de différents bras espaceurs. N 3O O N3 BocHN . = O O.HN' HN NH NH O NHBoc HN ( 1:1 (NHBoc IV.23IV.15 : n =1 IV.16:n=2 IV.17 : n = 6 a), b), c) TFA-NH3+ TFA- TFA IV.25 : n = 1 IV.26 : n = 2 IV.27 : n = 6 (a) Cul (2 eq.), DIEA (25 eq.), 2,6-lutidine (25 eq.), DMF ; (b) TFA ; (c) C18 RP-HPLC. Les composés IV.25 à IV.27 ont été isolés dans des rendements allant de 12 à 20% après purification par HPLC préparative. Les ligands correspondants L41 à L43 ont alors été préparés par couplage des 10 macrocycles dimérisés et du pentapeptide protégé Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(OtBu)- Tyr(OtBu)-Ahx-OH (Pl), déprotection des groupements protecteurs et purification par HPLC préparative. Habituellement, la réaction de couplage est effectuée en deux jours. Ici, la réaction nécessite une semaine d'agitation à température ambiante pour arriver à complétion. L'arrêt de la réaction après seulement trois jours montre la présence de plusieurs produits intermédiaires résultant d'un couplage partiel du pentapeptide sur les amines ENH disponibles. TFA- NH3+ TFA- TFA IV.25 : n = 1 IV.26 : n=2 IV.27 : n = 6 RHN 0 - HN~NHO 0 HN NH -NHR 0 0 O 0 HNNH H~/ N' - 1~ Oes) R = H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Ahx L41 : n = 1 L42:n=2 L43:n=6 (a) Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(OtBu)-Tyr(OtBu)-Ahx-OH P1 (6.6 eq.), BOP (6.6 eq.), DIEA (20 eq.), DMF, 1 semaine ; (b) TFA, 5% H2O ; (c) C18 RP-HPLC. Chacun de ces ligands ont été caractérisés par HPLC, masse (MALDI-TOF) 10 (Figures 4A, 4B et 4C). NHR HN NH HN RH RHN RHN 15 Tableau 4 : Analyse par RMN du ligand L41. Expérience RMN réalisée dans H20/tert-Butanol-d9 à 300K sur un spectromètre 500MHz. Résidus NH CHa CM CHy autres (PPm) (PPm) (PPm) (PPm) (PPm) Lys143 - 4.09 1.99 1.56 SCH 1.81; 'CH 3.08 Glyi44 - 4.09 - -Tyr145 8.23 4.63 2.96 - - Tyr146 8.03 4.49 2.97 - - Ahx 7.47 2.23 1.55 1.14 bCH 1.37; 'CH 3.03/3.20 Lysine 8.33/8.23 (a) 4.31 1.78/1.74 1.42/1.4 bCH 1.56/1.54; 'CH 3.21 (coeur) 7.95/7.91 (e) D-Alanine 8.33 4.45 1.41 -(coeur) ii. Remarques sur la réaction de click chemistry L'ordre d'addition des réactifs semble être important dans la réaction mise au point précédemment. En effet, les deux bases doivent être ajoutées avant l'addition de l'iodure de cuivre. Si le métal est ajouté en premier, on observe une diminution de la pureté du macrocyle dimérisé en fin de réaction. De plus, il est intéressant de noter que l'utilisation de deux équivalents de cycle fonctionnalisé par rapport au diazoture n'est pas nécessaire à la formation du dimère. En effet en réalisant un mélange équimoléculaire, la réaction de dimérisation arrive également à complétion. Il semble donc, comme l'a déjà mentionné Sharless, que l'utilisation d'un diazoture facilite la formation du ditriazole, et que la formation du premier triazole favorise la formation du deuxième (Rodionov, V.O.; Fokin, V.V.; Finn, M.G. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 2210-2215). Enfin, l'utilisation d'un additif comme le tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) pourrait être la solution pour réaliser la réaction de click chemistry directement à partir du ligand L40 ou L40' ((a) Wang, Q.; Chan, T.R.; Hilgraf, R.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B.; Finn , M.G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192-3193. (b) Chan, T.R.; Hilgraf R.; Sharpless K.B.; Fokin, V.V. Org. Lett. 2004, 6, 2853-2855). Identifié par Sharpless, le TBTA enveloppe le cuivre I et évite les interactions déstabilisantes provenant des sites de liaison libres comme les amines. De plus, il permet d'accélérer la réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire. 4) Résultats biologiques Il a été observé que le ligand L41, ligand dimérique issu de la synthèse par click chemistry , induit un pourcentage d'apoptose spécifique des lymphomes de Burkitt 5 (BL41) à des doses où L1 n'est pas actif De plus ce ligand induit seul la prolifération des cellules B spléniques murines alors que le ligand monomérique L1 ne le faisait pas sans potentialisation avec l'anticorps anti-CD40 3/23 (Figures 5A et 5B). 10 PARTIE EXPÉRIMENTALE DÉTAILLÉE Bismaléimidohexane (IV'.1) o On ajoute du N-(méthoxy-carbonyl)maléimide (320 mg ; N N 2,06 mmol) à 0 C à une solution agitée de N,N'- o diaminohexane (100 mg ; 0,86 mmol) dans NaHCO3 saturé / THF (tétrahydrofurane) (VI = 8 ml, 1:1 v/v). Le mélange réactionnel est agité à 0 C pendant 10 min et est ensuite agité pendant 4 h à température ambiante. Le produit a ensuite été isolé par extraction avec de l'acétate d'éthyle. Les couches organiques combinées ont été lavées avec de l'eau et de la saumure, séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous vide pour obtenir le composé IV.1 (230 mg ; rendement = 100%) : CLHP tR 15,78 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; RMN 1H (300 MHz, CDC13, 298 K) 8 6,67 (s ; CH maléimide ; 4H) ; 3,48 (t ; NCH2 ; J = 7,2 Hz ; 4H) ; 1,62-1,54 (m, NCH2CH2, 4H) ; 1,31-1.26 (m, NCH2CH2CH2, 4H) ; RMN 13C (300 MHz, CDC13, 298 K) 170,84 (4 CO) ; 134,03 (4 CH) ; 37,67 (2 CH2) ; 28,32 (2 CH2) ; 26,15 (2 CH2) ; HRMS (ESI) : m/z : calculé pour C14H17N204 277,11 ; trouvé : 277,1183 ; calculé pour C14H16N2O4Na : 299,11 ; trouvé : 299,1002. Acide 3-((acétamidométhyl)sulfanyl)propanoïque (Acm) (IV.2) ~~S De l'acide 3-mercaptopropanoïque (1,64 mL ; 19 mmol) est N-(hydroxyméthyl)acétamide (1,6 g ; 19 mmol). Après agitation pendant 30 minutes à température ambiante, le TFA (acide trifluoroacétique) est retiré par évaporation pour obtenir IV.2 : HPLC tR 7.1 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; RMN 1H (300 MHz, CDC13, 298 K) 8 12,4 (s, COOH, 1H) ; 7,74 (d, NH, J = 5,8 Hz, 1H) ; 4,34 (d, SCH2NH, J= 6 Hz, 2H) ; 2,81 (t, CH2SCH2NH, J= 6,4 Hz, 2H) ; 2,67 (t, CH2COOH, J = 6,4 Hz, 2H) ; 2,1 (s, NHCOCH3, 3H) ; RMN 13C (300 MHz, CDC13, 298 K) 177,45 (CO) ; 174,63 (CO) ; 41,60 (CH2) ; 34,37 (CH2) ; 25,67 (CH2) ; 21,46 (CH3). H HOOC dissous dans de l'acide trifluoroacétique (30 mL). On ajoute du o30 DMSO (diméthylsulfoxyde) (22 mL). On ajoute séquentiellement KHCO3 (1,6 g ; 16 mmol) et Bu4NI (390 mg ; FmocHN 1 mmol). Après 30 min d'agitation, on ajoute du bromure de benzyle (3,8 mL ; 30 mmol). Le mélange est ensuite agité pendant une nuit. On ajoute ensuite de l'eau à la solution et la couche aqueuse est extraite avec de l'acétate d'éthyle. Les couches organiques combinées sont lavées avec du NaHCO3 saturé, une solution saturée de Na2S2O3 et de la saumure. L'évaporation du solvant et la précipitation dans du cyclohexane à -78 C donne le composé IV.3 (5,80 g ; rendement = 98%) : HPLC tR 16,94 min (gradient linéaire, 30-100% B., 20 min) ; RMN 'H (300 MHz, CDC13, 298 K) 8 7,76 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,4 Hz, 2H) ; 7,60 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,4 Hz, 2H) ; 7,42-7,25 (m, CH Arom Fmoc et Ph, 9H) ; 5,18 (s, CH2Ph, 2H) ; 4,47-4,23 (m, CH2 Fmoc et CH Fmoc, 3H) ; 4,21 (t, FmocNHCH, J = 6,9 Hz, 1H) ; 3,09-3,01 (m, CH2 Lysine, 2H) ; 1,95-1,64 (m, CH2 Lysine, 2H) ; 1,51-1,22 (m, CH2 Lysine et C(CH3)3, 13H) ; RMN 13C (300 MHz, CDC13, 298 K) 172,33 (CO) ; 156,08 (CO) ; 156,00 (CO) ; 143,93 (2 C) ; 141,3 (C) ; 135,27 (2 C) ; 128,65 (2 CH) ; 128,54 (2 CH) ; 128,37 (CH) ; 127,71 (2 CH) ; 127,08 (2 CH) ; 125,12 (2 CH) ; 119,98 (2 CH) ; 79,20 (C) ; 67,19 (CH2) ; 67,03 (CH2) ; 53,80 (CH) ; 47,16 (CH) ; 40,04 (CH2) ; 32,11 (CH2) ; 29,58 (CH2) ; 28,43 (CH3) ; 22,30 (CH2). Sel Fmoc-D-Lys-OBn, TFA (IV.4) NH3* TFA- Le composés IV.3 (5,80 g ; 10,34 mmol) est dissous dans du TFA (16 mL). Après agitation pendant 30 minutes à température 25 = ambiante, le TFA est éliminé par évaporation avec de l'éther et FmocHN du cyclohexane. Le composé IV.4 a été obtenu : HPLC tR 10,91 Amin (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; RMN 1H (300 MHz, CDC13, 298 K) 87,71 d, CH Arom Fmoc, J = 7,5 Hz, 2H) ; 7,53 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,5 Hz, 2H) ; 7,37-7,21 (m, CH Arom Fmoc et Ph, 9H) ; 5,6 (d, NH, J = 8,06 Hz, 1H) ; 5,12 (s, CH2Ph, 30 2H) ; 4,33 (m, CH Fmoc et CH2 Fmoc, 3H) ; 4,14 (t, FmocNHCH, J = 6,94 Hz, 1H) ; 2,91-2,83 (m, CH2 Lysine, 2H) ; 1,65-1,52 (m, CH2 Lysine, 4H) ; 1,39-1,26 (m, CH2 Lysine, 2H) ; RMN ' 3C (300 MHz, CDC13, 298 K) 172,12 (CO) ; 156,30 (CO) ; 143,66 2 (C) ; 141,26 (C) ; 135,08 (2 C) ; 128,63 (2 CH) ; 128,57 (2 CH) ; 128,33 (CH) ; Fmoc-D-Lys(Boc)-OBn (IV.3) NHBoc Du Fmoc-D-Lys(:Boc)-OH (5 g ; 10 mmol) est dissous dans du 127,77 (CH) ; 127,10 (CH) ; 125,10 (CH) ; 120,01 (CH) ; 67,38 (CH2) ; 67,21 (CH2) ; 53,61 (CH) ; 47,01 (CH) ; 39,55 (CH2) ; 31,76 (CH2) ; 26,69 (CH2) ; 21,98 (CH2). (9H-fluorén-9-y1)méthyl l-((benzyloxy)carbonyl)-5-(3-((acétamidométhyl)sulfanyl) 5 propanamido)pentylcarbamate (IV.5) Le composé IV.2 (2,2 g ; 12,41 mmol) est dissous dans du DMF (diméthylformamide) (40 mL). On ajoute du DIEA (N,N- sJ diisopropyléthylèneamine) (2 mL ; 12,41 mmol) au TFA HN~O neutralisé. Ensuite on ajoute séquentiellement le composé IV.4 10 J (10,34 mmol) dans du DMF (20 mL) avec de la DIEA (2 mL ; 12,41 mmol), du BOP (benzotriazol-1-yloxy- tris(diméthylamino)phosphonium hexafluorophosphate) (2,2 g ; 12,41 mmol). Le mélange réactionnel est ajusté à pH = 8/9 avec de la DIEA. Après 6h d'agitation, le DMF est évaporé sous pression réduite et replacé dans du CH2C12 qui 15 a été lavée avec du NaHCO3 saturé, de l'eau et du KHSO4 1N plusieurs fois. Le séchage sur Na2SO4 et l'évaporation du filtrat a permis d'obtenir une huile qui a été précipatée clans CH2C12 / IPE (diisopropyléther) pour obtenir le composé IV.5 pur (5,74 g ; rendement = 90 %) : HPLC tR 13,29 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 8 8,46 (t, NH, J = 6,11 Hz, 1H) ; 7,9 (d, CH Arom 20 Fmoc, J = 7,4 Hz, 2H) ; 7,87-7,81 (m, NH, 2H) ; 7,71 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,2 Hz, 2H) ; 7,45-7,26 (m, CH Arom Fmoc et Ph, 9H) ; 5,12 (s, CH2Ph, 2H) ; 4,31 (d, CHFmoc, J= 6,3 Hz, 1H) ; 4,20 (d, CH2 Fmoc, J= 6,3 Hz, 2H) ; 4,06-4,01 (m, FmocNHCH, 1H) ; 3,0 (m, CH2 Lysine, 2H) ; 2,72 (t, CH2CONH, J = 7,2 Hz, 2H) ; 2,53 (s, NHCOCH3, 3H) ; 2,35 (t, CH2SCH2NHCOCH3, J = 7,2 Hz, 2H) ; 1,83 (s, SCH2NH, 2H) ; 1,71-1;60 25 (m, CH2 Lysine, 2H) ; 1,30-1,39 (m, CH2 Lysine, 4H) ; 13C RMN (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 172,78 (CO) ; 170,70 (CO) ; 169,68 (CO) ; 156,63 (CO) ; 144,25 (2 C) ; 141,17 (C) ; 136,40 (2 C) ; 128,66 (2 CH) ; 128,54 (2 CH) ; 128,33 (CH) ; 127,76 (2 CH) ; 127,11 (2 CH) ; 125,12 (2 CH) ; 120,11 (2 CH) ; (CH) ; 47,07 (CH) ; 40,18 (CH2) ; 38,66 (CH2) ; 30 (CH2) ; 26,62 (CH2) ; 23,35 (CH2) ; 23,01 (CH3). FrnocHN o 66,31 (CH2) ; 66,12 (CH2) ; 54,41 36,07 (CH2) ; 30,72 (CH2) ; 29,06 Acide 6-(3-((acétamidométhyl)sulfanyl)propanamido)-2-aminohexanoïque (IV.6) Le composé IV.5 (4,6 g ; 7,4 mmol) est dissous dans du DMF (50 mL). A 0 C on ajoute doucement une solution de LiOH 1N (22 mL). Après 5 heures d'agitation, le DMF est évaporé sous pression réduite et précipité dans de l'acétonitrile pour donner le composé IV.6 (1,91 g ; rendement = 91%). H2N OH o 10 Fmoc-D-Lys(Acm)-OH (IV.7) HN~O Le composé IV.6 (2,21 g ; 7,2 mmol) est dissous dans une sJ solution de H20 (50 mL) avec K2CO3 (2 g ; 14,4 mmol). Ensuite on ajoute doucement du Fmoc-OSu (9-fluorénylméthyloxycarbonyl-N-hydroxysuccinimide) (2,4 g ; 7,2 mmol) dans de l'acétone (50 mL). Après 7 heures d'agitation, on ajoute de l'eau. La phase aqueuse est lavée rapidement avec de l'éther et est ajustée à pH = 3 avec du HC1 IN et est ensuite extraite avec CH2C12. Le séchage sur Na2SO4 et l'évaporation du filtrat permet d'obtenir une huile qui est précipitée dans CH2C12/IPE (diisopropyléther) pour 20 donner le composé pur IV.7 (2,24 g ; rendement = 60%) : HPLC tR 8,9 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; 'H RMN (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 88,47 (t, NH, J= 6,07 Hz, 1H) ; 7,9 (d, CH Arom Fmoc, J= 7,46 Hz, 2H) ; 7,85 (t, NH, J= 5,92 Hz, 1H) ; 7,73 (d, CHArom Fmoc, J= 7,4 Hz, 2H) ; 7,58 (d, NH, J= 8 Hz, 1H) ; 7,44-7,30 (m, CH Arom Fmoc, 4H) ; 4,26 (t, CH Fmoc, J == 7,5 Hz, 1H) ; 4,20 (d, CH2 Fmoc, J = 6,3 Hz, 25 2H) ; 3,90 (m, FmocNHCH, 1H) ; 3,05-2,99 (m, CH2 Lysine, 2H) ; 2,72 (t, CH2CONH, J _= 7,3 Hz, 2H) ; 2,5 (s, NHCOCH3, 3H) ; 2,36 (t, CH2SCH2NHCOCH3, J= 7,23 Hz, 2H) ; 1,67- 1,57 (m, CH2 Lysine, 2H) ; 1,42-1,33 (m, CH2 Lysine, 4H) ; 13C RMN (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 174,48 (CO) ; 170,70 (CO) ; 169,68 (CO) ; 156,58 (CO) ; 144,25 (2 C) ; 141,15 (2 C) ; 128,85 (CH) ; 128,08 (2 CH) ; 127,51 (2 CH) ; 125,73 (2 CH) ; 66,03 30 (CH2) ; 54,26 (CH) 47,10 (CH) ; 40,21 (CH2) ; 38,73 (CH2) ; 36,09(CH2) ; 30,91 (CH2) ; 29.12 (CH2) ; 26,64 (CH2) ; 23, 50 (CH2) ; 23,24 (CH3) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C27H33N306S : 527,21. Trouvé [M+Na+] _= 550,11; [M+K+] = 566,20. HN sJ HN HN~O 15 OH FnocHN o NHBoc (charge = 1,6 mmol/g) sont lavés deux fois avec du CH2C12 distillé. On ajoute à la résine H2N N N OH Y H ä H H O un mélange de Fmoc-Lys(Boc)-OH (2 éq.) et de la DIEA (6 éq.) dans CH2C12. Après 3 h d'agitation, la résine est filtrée et lavée avec CH2C12. La résine est regonflée dans du méthanol sous agitation pendant 1h et ensuite lavée avec du DMF, de I'isopropanol, du CH2C12, de l'éther diéthylique, et séchée sous vide. La charge de la résine est déterminée par UV du dérivé fmoc après traitement avec 20% de pipéridine dans du DMF (charge 0,3 mmol/g). FmocXaaOH (5 eq.) est couplé deux fois à température ambiante pendant 30 min à la résine Fmoc-déprotégée en présence de BOP (5 eq.), HOBt (1-hydroxybenzotriazole) (5 eq.) et DIEA (15 eq.). Le composé IV.7 (2,5 eq.) est couplé une fois à température ambiante pendant 2 h en présence de BOP (2,5 eq.), HOBt (2,5 eq.) et DIEA (10 eq.). Après répétition de ces étapes de déprotection et couplage, le peptide est clivé de la résine avec un mélange de HFIP (hexafluoroisopropanol) et C'H2C12 (60/40). Après agitation pendant 2 h, la résine est filtrée et lavée plusieurs fois avec CH2C12. L'évaporation du solvant permet d'obtenir le composé IV.8 (rendement : 100%) : HPLC tR 7.62 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 30-100 % B, 20 min) : 73% ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C51H93N11015S : 1131,66. Trouvé : [M+Na+] =1154,27, {M+K+] = 1170.21 ; HRMS(ESI) : m/z : calculé pour C51H94N11015S : 1132.66, trouvé : 1132. 6646 ; calculé pour C51H93N11O15SNa : 1154,66, trouvé : 1154,6466. H-(D)Ala-Lys(Boc)-(D)Lys(Acm)-Lys(Boc)-(D)Ala-Lys(Boc)-OH (IV.8) 800 mg de résine 2-chlorotritylchlorure NHBoc NHBoc HNO SAcm30 Cyclo [(D)Ala-Lys(Boc)-(D)Lys(Acm)-LLys(Boc)-(D)Ala-Lys(Boc)] (IV.9) Le peptide IV.8 (500 mg 0,44 mmol) est NHBoc [-NH dissous dans du DMF (100 mL) à s température ambiante. On ajoute séquentiellement EDC, HC1 (101,16 mg ; 0,53 mmol), HOBt (71,56 mg ; 0,53 mmol) et de la DIEA (110 L ; 0,66 mmol). Après agitation pendant 3 jours à température ambiante, le mélange réactionnel est NHBoc précipité dans une grande quantité de NaHCO3 saturé. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO3 saturé puis de l'eau, du KHSO4 1N, de la saumure, de l'acétate d'éthyle, de l'acétonitrile et du cyclohexane. Le solide blanc IV.9 est séché sous vide (222 mg, rendement : 77%) ; HPLC tR 10,09 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC 15 (gradient linéaire, 30-100 % B, 20 min) : 87 % ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C51H91N11O14S : 1113,6.5. Trouvé : [M+Na+] = 1136,44 ; [M+K+] = 1152,42. cyclo [D)Ala-Lys-(D)Lys(Acm)-Lys-(D)Ala-Lys] (IV.10) Le composé IV.9 (100 mg ; 0,089 mmol) NH NH3* s est dissous dans de l'acide trifluoroacétique (5 mL) avec 5% d'eau. Après 20 min d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité avec de NH l'éther. Le sel de TFA attendu est filtré, lavé avec de l'éther. Le solide blanc IV.10 est séché sous vide (84 mg, rendement : NH3+ TFA- 85%) : HPLC tR 6.56 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 5-65 % B, 20 min) : 86% ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C36H67NI108S : 813,05. Trouvé : 30 [M+Na+] = 836,44 ; [M+K+] = 852,41 ; HRMS(ESI) : m/z : calculé pour C36H68N1108S 814,05 ; trouvé : 814,497. BocHN NH 1 o= ~=o NH HN TFA- 20 25 +H3Nä TFA- HN Bismaléimidodiéthylèneglycol (IV.11) (méthoxy-carbonyl)maléimide (251 mg ; 1,62 mmol). Le mélange réactionnel est agité à 0 C pendant 10 minutes et est ensuite laissée agiter pendant 4 heures à température ambiante. Le produit est ensuite isolé par extraction avec de l'acétate d'éthyle. Les couches organiques combinées sont lavées avec de l'eau et de la saumure,séchées sur Na2SO4, filtrées et concentréess sous vide pour obtenir le composé IV.11 (150 mg, rendement = 72%) : HPLC tR 10.40 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; 'H RMN (300 MHz, CDC13, 298 K) 8 6,67 (s, CH maléimide, 4H) ; 3,68-3,63 (m, NCH2CH2O, 4H) ; 3,58-3,54 (m, NCH2CH2O, 4H) 3,51 (s, OCH2CH2O, 4H) ; 13C RMN (300 MHz, CDC13, 298 K) 170,66 (4 CO) ; 134,13 (4 CH) ; 69,97 (2 CH2) ; 67,77 (2 CH2) ; 37,09 (2 CH2) ; HRMS (ES)[) : m/z : calculé pour C14H17N2O6 : 309,10 ; trouvé : 309,1081 ; calculé pour C14H16N2O6Na : 331,10 ; trouvé : 331,0901.. Dimésylate (IV.12) O OMs Du triéthylène glycol (2 g ; 13,31 mmol) est dissous dans du CH2C12 (20 mL). On ajoute séquentiellement de la DIEA (5,6 mL ; 33,3 mmol) et du méthanesulfonylchlorure (2,6 mL ; 33,3 mmol). Le mélange est agité pendant 3 h et ensuite le CH2C 12 est évaporé. Le résidu est replacé dans de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec du NaHCO3 saturé, de l'eau, du KHSO4 1N et de la saumure. Le séchage sur Na2SO4 et l'évaporation du solvant permet d'obtenir IV.12 (3,93 g ; rendement = 96%) : 'H RMN (300 MHz, CDC13, 298 K) 8 4,25-4,22 (m, CH2OMs, 4H) ; 3,64 (m, CH2CH2OMs, 4H) ; 3,55 (s, OCH2CH2O, 4H) ; 2,96 (s, SO2CH3, 6H) ; 13C RMN (300 MHz, CDC13, 298 K) 70,33 (CH2) ; 69,43 (CH2) ; 68,82 (CH2) ; 37,42 (CH3). Dimésylate (IV.14) MsOooMs De l'octaéthylène glycol (540 mg ; 1,46 mmol) est dissous 6 dans CH2Cl2 (2 mL). A 0 C, on ajoute successivement dans le mélange de la triéthylamine (606 ; 4,37 mmol) et du méthanesulfonylchlorure (288 L ; 3,6 mmol). Après 4h d'agitation, le solvant est évaporé. Le résidu est replacé avec de l'acétate d'éthyle et la couche organique est lavée avec du NaHCO3 saturé et du 58 N NaHCO3 saturé / THF (VI = 6mL, 1:1 v/v) à 0 C du N- o On ajoute à une solution agitée de N,N'- 0 diaminodiéthylèneglycol (100 mg ; 0,67 mmol) dans KHSO4 1N. Le séchage sur Na2SO4 et l'évaporation du solvant permet d'obtenir IV.14 (560 mg ; rendement = 73%) : 1H RMN (300 MHz, CDC13, 298 K) 4,26-4,22 (m, CH2OMs, 4H) ; 3,65-3,62 (m, CH2CH2OMs, 4H) ; 3,53-3,50 (m, OCH2CH2O, 24H) ; 2,96 (s, OSO2CH3, 6H) ; 13C RMN (300 MHz, CDC13, 298 K) 70,43 (CH2) ; 69,47 (CH2) ; 68,88 (CH2) ; 37,57 (CH). 1 .,2-Bis(2-azidoéthoxy)éthane (IV.15) On ajoute de l'azoture de sodium (1,33 g ; 20,57 mmol) à une solution de IV.12 (1,05 g ; 3,4 mmol) dans du DMF (10 mL). Le mélange réactionnel est chauffé pendant une nuit à 60 C. Après refroidissement, on ajoute de l'eau et la phase aqueuse est extraire avec de l'éther. La phase organique est ensuite lavée avec de l'eau et séchée sur Na2SO4. L'évaporation du solvant donne IV.15 (670 mg, rendement = 96%) : HPLC tR 8,29 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; 1H RMN (300 MHz, CDC13, 298 K) 62,98-2,94 (rn, CH2CH2N3, 4H) ; 2,94 (s, OCH2CH2O, 4H) ; 2,67-2,63 (m, CH2N3, 4H) ; 13C RMN (300 MHz, CDC13, 298 K) 70,44 (CH2) ; 69,88 (CH2) ; 50,45 (CH2). 1)iazide (IV.17) On ajoute de l'azoture de sodium (170 mg ; 2,6 mmol) à une N3 O ./~O N3 6 solution agitée de IV.14 (550 mg, 1.044 mmol) dans du DMF (8 mL). Le mélange réactionnel est chauffé pendant une nuit à 60 C. Après refroidissement, on ajoute de l'eau et la phase aqueuse est extraite avec de l'éther. La phase organique est ensuite lavée avec de l'eau et séchée sur Na2SO4. L'évaporation du solvant permet d'obtenir IV.17 (300 mg, rendement = 70%) : HPLC tR 6,59 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; 1H RMN (300 MHz, CDC13, 298 K) S 3,66-3,60 (m, OCH2CH2O and CH2CH2N3, 28H) ; 3,38-3,33 (m, CH2N3, 4H) ; 13C RMN (300 MHz, CDC13, 298 K) 70,68 (CH2) ; 70,66(CH2) ; 70,62 (CH2) ; 70,57 (CH2) ; 50,67 (CH2). Acide N-Propyl-2-ynyl-succinamique (Nps) (IV.18) o On dissout de la dihydrofuran-2,5-dione (3,9 g ; 40 mmol) dans de Ho o H l'acétonitrile (40 mL). On ajoute de la prop-2-yn-l-amine (1,5 mL ; 51 mmol). Après 2 h d'agitation, la précipitation se produit. Le précipité est filtré et lavé avec de l'acétonitrile. Le composé IV.18 est obtenu (4,12 g ; rendement = 71%) : 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 8 3,83 (dd, NHCH2CCH, J = 5,4 and 2,5 Hz, 2H) ; 3,33 (d, CCH, J = 2,5 Hz, 1H) ; 2,42-2,36 (m, CH2CO2H, 2H) ; 2,33-2,27 (m, CH2CONH, 2H) ; 13C RMN (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 174,33 (CO) ; 172,29 (CO) ; 81,69 (CH) ; 73,45 (C) ; 30,35 (CH2) ; 29,66 (CH2) ; 28, 24 (CH2). (9H-Fluorén-9-y1)méthy l 1-((benzyloxy)carbonyl)-5-(succinamido)pentylcarbamate (Fmoc-Lys(Nps)-OBn) (IV.19) Le composé IV.4 (9,7 mmol) est dissous dans de oyNH l'acétonitrile (30 mL) avec de la DIEA (1,9 mL ; 11.6 mmol). On ajoute séquentiellement de l'acide 3-(prop-2- HN ynylcarbamoyl)propanoïque (1,8 g ; 11,6 mmol), de la BOP (5,13 g ; 11,6 mmol) et de la DIEA (1,9 mL ; 11.6 mmol). Après 3 heures d'agitation, la précipitation se produit. Le FmocHN--'''(o o précipité est filtré et lavé avec du NaHCO3 saturé, de l'eau et 15 du KHSO4 1N et ensuite de l'acétonitrile et du diisopropyléther. Le composé IV.19 est obtenu (3,7 g ; rendement = 64%) : 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 8 8,32 (t, NH, J = 5,27 Hz, 1H) ; 7,90-7,85 (m, 2 NH et CH Arom Fmoc, 4H) ; 7,71 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,33 Hz) ; 7,42 (t, CH Arom Fmoc, J = 7,32 Hz, 2H) ; 7,34-7,28 (m, CH Arom Fmoc et CH Arom Bn, 7H) ; 5,13 (s, CH2Ph, 2H) ; 4,32-4,10 (m, CH2 Fmoc et 20 CH Fmoc, 3H) ; 4,09-4,02 (dd, NHCHCH2,1H) ; 3,84 (dd, NHCH2CCH, J = 5,25 et 2,32 Hz, 2H) ; 3,085 (t, CCH, J = 2,35 Hz, 1H) ; 2,35-2,30 (m, COCH2CH2CO, 4H) ; 1,78-1,59 (m, CH2 Lysine, 2H) ; 1,41-1,22 (m, CH2 Lysine, 4H) ; 13C RMN (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 172,8 (CO) ; 171,62 (CO) ; 171,46 (CO) ; 155,66 (CO) ; 144,27 (2 C) ; 141,18 (C) ; 136,42 (2 C) ; 128,86 (2 CH) ; 128,47 (2 CH) ; 128,21 (2 CH) ; 128,11 25 (CH) ; 127,53 (2 CH) ; 125,7 (2 CH) ; 120,57 (2 CH) ; 81,73 (CH) ; 73,32 (C) ; 66,34 (CH2) ; 66,16 (CH2) ; 54,44 (CH) ; 47,10 (CH) ; 38,67 (CH2) ; 31,03 (CH2) ; 30,76 (CH2) 30,98 (CH2) ; 29,10 (CH2) ; 28,26 (CH2) ; 23,38 (CH2) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C35H37N306 : 595,27. Trouvé [M+H+] = 595,78 ; [M+Na+] = 618,26 ; [M+K+] = 634,35. 10 30 HN~O 4 h d'agitation, le DMF est évaporé sous pression réduite et précipité i dans de l'acétonitrile pour donner le composé IV.20 (912 mg ; rendement = 54%). HZN'-'yOH o Fmoc-D-Lys(Nps)-OH (IV.21) r e- Le composé IV.20 (972 mg ; 3,43 mmol) est dissous dans un O,,NH mélange d'eau et d'acétone (50 mL, v/v : 1/1). On ajoute du K2CO3 (948 mg ; 6,86 mmol) dans de l'eau (25 mL). Ensuite on J ajoute doucement du Fmoc-OSu (9-fluorénylmethyloxycarbonyl-N-hydroxysuccini:mide) (1,16 g ; 3,43 mmol) dans de l'acétone oH (25 mL). Après une nuit d'agitation, on ajoute de l'eau. La phase aqueuse est lavée rapidement avec de l'éther et est ajustée à pH = 3 avec du HC1 1N et est ensuite extraite avec CH2C12. Le séchage sur Na2SO4 et l'évaporation du filtrat donne une huile qui est précipitée dans CH2C12/IPE pour donner 20 le composé pur IV.21 (1,7 g ; rendement = 62%) : HPLC tR 8.61 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; 'H RMN (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 8 8,26 (t, NH, J = 5,36 Hz, 1H) ; 7,89 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,42 Hz, 2H) ; 7,81 (t, NH, J = 5,25 Hz, 1H) ; 7,73 (d, CHArom Fmoc, J= 7,38 Hz, 2H) ; 7,62 (d, FmocNH, J= 7,98 Hz, 1H) ; 7,42 (t, CH Arom Fmoc, J = 7,41 et 1,06 Hz, 2H) ; 7,33 (dt, CH Arom Fmoc, J = 7,47 et 25 0,88 Hz, 2H) ; 4,29-4,19 (m, CH2 Fmoc et CH Fmoc, 3H) ; 3,94-3,87 (m, FmocNHCH, 1H) ; 3,83 (dd, NHCH2CCH, J = 5,45 et 2,51 Hz, 2H) ; 3,07 (t, CCH, J = 2,51 Hz, 1H) ; 3,04-2,96 (m, CH2 Lysine, 2H) ; 2,33-2,26 (m, CH2CONH et CH2CONH, 4H) ; 1,72-1,54 (m, CH2 Lysine, 4H) ; 1,41-1,24 (m, CH2 Lysine, 4H) ; 13C RMN (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 173,89 (CO) ; 171,04 (CO) ; 170,88 (CO) ; 156,08 (CO) ; 143,72 (2 30 C) ; 140,62 (2 C) ; 127,56 (CH) ; 126,98 (CH) ; 125,19 (CH) ; 120,03 (CH) ; 81,54 (CH) ; 72,80 (CH) ; 65,52 (CH2) ; 53,68 (CH) ; 46,57 (CH) ; 38,73 (CH2) ; 30,46 (CH2) ; 30,41 (CH2) ; 30,34 (CH2) ; 28,60 (CH2) ; 27,71 (CH2) ; 22,99 (CH2) ; MS (YIALDI-TOF) calculé pour C28H31N306 : 505,22. Trouvé [M+Na+] = 528,79 ; [M+K+] 545,57. Acide 2-amino-6-(succinamido)hexanoi'que (H-Lys(Nps)-OH) (IV.20) Le composé IV.19 (3,6 g ; 6,0 mmol) est dissous dans du DMF (25 mL). Oy NH A 0 C, on ajoute doucement une solution de LiOH 1N (12 mL). Après HN O FrnocHN o H-(D)Ala-Lys(Boc)-(D)Lys(Nps)-Lys(Boc)-(D)Ala-Lys(Boc)-OH (IV.22) H2N 10 On lave 2 fois 1,3 g de résine 2-chlorotritylchlorure (charge = 1,8 mmol/g) avec du CH2C12 distillé. On ajoute à la résine un mélange de Fmoc-Lys(Boc)-OH (2 eq.) et de DIEA (6 eq.) dans du CH2C12. Après 3 h d'agitation, la résine est filtrée et lavée avec du CH2C12. La résine est regonflée dans du méthanol sous agitation pendant 1h et est ensuite lavée avec du DMF, de l'isopropanol, séchée sous vide. La charge de la résine est fmoc après traitement avec 20% de pipéridine 15 20 25 du CH2C12, de l'éther diéthylique et déterminée par analyse UV du dérivé dans du DMF (charge = 0,5 mmol/g). FmocXaaOH (5 eq.) est couplé deux fois à température ambiante pendant 30 min à la résinie Fmoc-déprotégée en présence de BOP (5 eq.), HOBt (5 eq.) et DIEA (15 eq.). Le composé IV.21 (2.5 eq.) est couplé une fois à température ambiante pendant 2 h à la résine Fmoc-déprotégée en présence de BOP (2.5 eq.), HOBt (2.5 eq.) et DIEA (10 eq.). Après répétition de ces étapes de déprotection et de couplage, le peptide est clivé de la résine avec un mélange de HFIP et de CH2C12 (60/40). Après 2 h d'agitation, la résine est filtrée et lavée plusieurs fois avec CH2C12. L'évaporation du solvant donne le peptide IV.22 (rendement : 100 %) : HPLC tR 8.54 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 30-100 % B, 20 min) : 60% ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C52H91N11015 : 1109,67. Trouvé : [M+Na+] 1132,45 ; [M+K+] = 1148,43 ; HRMS(ESI) : m/z : calculé pour C52H92N11O15 1110,67 ; trouvé : 1110,6769 ; calculé pour C52H91N11O15Na : 1132,67 ; trouvé : 1132,6588. 30 Cyclo [(D)Ala-Lys(Boc)-(D)Lys(Nps)-Lys(Boc)-(D)Ala-Lys(Boc)] (IV.23) Le peptide IV.22 (60 mg ; 0,054 mmol) est dissous dans du DMF (12 mL) à NHE3oc O H HN HN BocHN- NH f 1' =0 NH oJ "O température ambiante. On ajoute NH séquentiellement du BOP (28,6 mg ; 0,064 mmol) et de la DIEA (14 L ; 0,081 mmol). Après agitation pendant 3 jours à température ambiante, le mélange N--'\ H o réactionnel est précipité dans une grande NHBoc quantité de NaHCO3 saturé. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO3 saturé, puis par de l'eau, du KHSO4 1N, de la saumure, de l'acétate d'éthyle, de l'acétonitrile et du cyclohexane. Le solide blanc IV.23 est séché sous vide (49 mg, rendement : 83%) : HPLC tR 12.92 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient 15 Linéaire, 30-100% B, 20 min) : 60 % ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C52H89N11014 : 1091,66. Trouvé : [M+Na+] = 1114,58 ; [M+K+] = 1130,56. cyclo [(D)Ala-Lys-(D)Lys(Nps)-Lys-(D)Ala-Lys] (IV.24) /// Le composé IV.23 (38 mg ; 0,035 mmol) est dissous dans de l'acide trifluoroacétique (3,5 mL) avec de l'eau à 5%. Après 15 min d'agitation à température ambiante, le mélange HN réactionnel est précipité dans de l'éther. Le sel H2Nû ~ _-" de TFA attendu est filtré, lavé avec de l'éther. NH Le solide blanc IV.23 est séché sous vide (34 mg, rendement : 87%) : HPLC tR 6.28 min NH2 (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 5-65 % B, 20 min) : 66 % ; MS (MALDI-TOF) calculé for C37H65NI1O8 : 791,5. Trouvé : [M+H+] = 792,57 ; [M+Na+] = 30 814,54 ; [M+K+] = 830,52. O 10 20 HN 25 Procédure générale pour la "click chemnistry" (IV.25-IV.27) Le composé IV.23 (1 eq) est dissous dans du DMF (c = 6.10-3 M). On ajoute une solution de diazoture IN dans du DMF (1 eq). Ce mélange est dégazé d'oxygène avec de l'argon pendant 30 min. On ajoute successivement de la DIEA (25 eq), de la 2,6-lutidine (25 eq) et du Cul (2 eq). Après agitation pendant 3 jours à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans une grande quantité de NaHCO3 saturé. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO3 saturé, puis de l'eau, du KHSO4 1N et de la saumure. Le solide blanc est séché sous vide. ce composé est dissous dans de l'acide trifluoroacétique avec 5% d'eau. Après 30 min d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans de l'éther. Le sel de TFA attendu est filtré et lavé avec de l'éther et sécher sous vide. La purification par C18 RP-HPLC semi-preparative (5-65% B, 20 min) suivie d'une lyophilisation permet d'obtenir le composé attendu. IV.25 : En utilisant la procédure générale, on obtient le composé IV.25. La pureté du produit brut est de 47 /n (déterminée par C18 RP-HPLC). La purification par C18 RPHPLC semi-préparative donne le composé pur IV.25 (rendement 40% et pureté >99%) : HPLC tR 6,63 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C80H142N28O18 : 1783,11. Trouvé : [M+Na+] = 1806,48 ; [M+K+] = 1823,39 ; HRMS(ESI) : m/z : calculé pour C80H142N28O18Na : 1806,11 ; trouvé : 1806,095. IV.26 : En utilisant la procédure générale, on obtient le composé IV.26. La pureté du produit brut est de 30 /% (déterminée par C18 RP-HPLC). La purification par C18 RPHPLC semi-préparative donne le composé pur IV.26 (rendement 13% et pureté >99 %) : HPLC tR 6,95 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C82H146N28O19 : 1827,13. Trouvé : [M+H+] = 1828,14 ; [M+Nal = 1850,14 ; [M+K+] = 1866,14. IV.27 : En utilisant la procédure générale, on obtient le composé IV.27. La pureté du produit brut est de 54% (déterminée par C18 RP-HPLC). La purification par C18 RP- HPLC semi-préparative donne le composé pur IV.27 (rendement 20% et pureté >99 %) : HPLC tR 7,8 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C90H162N28O23 : 2003,24. Trouvé : [M+H+] = 2004,34 ; [M+Na+] = 2026,34 ; [M+K+] = 2042,31. Procédure générale pour le couplage Le coeur IV.24, IV.25 ou IV.26 (1 eq.) est dissous dans du DMF. A température ambiante, on ajoute le peptide (6,6 eq.), du BOP (6,6 eq.) et de la DIEA (20 eq.). Le mélange réactionnel est agité pendant une semaine et précipité dans une grande quantité d~ NaHCO3 saturé. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO3 saturé, puis de l'eau, du KHSO4 1N, de la saumure et du cyclohexane. Le solide est séché sous vide. Le produit brut est dissous dans de l'acide trifluoroacétique avec 5% d'eau. Après 3D min d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans de l'éther. Le sel attendu de TFA est filtré, lavé avec de l'éther et séché sous vide. La purification par C18 RP-•HPLC semi-préparative (5-65% B, 20 min) suivie d'une lyophilisation permet d'obtenir le ligand attendu. L41 : En utilisant la procédure générale décrite ci-dessus, on obtient le ligand L41. La pureté du ligand brut est de 51% (déterminée par C18 RP-HPLC). La purification par C18 RP-HPLC semi-préparative permet d'obtenir le ligand L41 pur (rendement 12% et pureté >99 %) : HPLC tR 10,65 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDITOF) calculé pour C272H406N64O60 : 5529,07. Trouvé : [M+H+] = 5529,78. L42 : En utilisant la procédure générale décrite ci-dessus, on obtient le ligand L42. La pureté du ligand brut est de 58% (déterminée par C18 RP-HPLC). La purification par C18 RP-HPLC semi-préparative permet d'obtenir le ligand L42 pur (rendement 15% et pureté >99 %) : HPLC tR 10,89 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDITOF) calculé pour C275H411N65O61 : 5600,11. Trouvé : [M+H+] = 5580. L43 : En utilisant la procédure générale décrite ci-dessus, on obtient le ligand L43. La pureté du ligand brut est de 54% (déterminée par Cu RP-HPLC). La purification par C18 RP-HPLC semi-préparative permet d'obtenir le ligand L43 pur (rendement 15% et pureté >99 %) : HPLC tR 11,04 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDITOF) calculé pour C282H426N64O65 : 5749,2. Trouvé : [M+H+] = 5751. 5 10 15 20 25 30 REVENDICATIONS 1. Composé répondant à la formule suivante (I) : R, 1 ,,Y-. R, I R, /R RùY -X -Z XùY--R c R /k R c% dans laquelle : û k et j représentent indépendamment l'un de l'autre 0 ou 1, - Y représente un macrocycle dont le cycle comprend de 9 à 36 atomes, et est fonctionnalisé par trois fonctions amines et par une chaîne permettant l'accrochage du bras espaceur Z via une liaison X, R, représente un motif de liaison à un récepteur de la superfamille du TNF, et de préférence correspond à une séquence dérivée d'un ligand, choisie parmi les résidus formant l'interface avec le récepteur du ligand, laquelle séquence est susceptible d'interagir avec le récepteur, ledit ligand étant choisi parmi les ligands de récepteurs de la superfamille du TNF, et notamment parmi les ligands suivants : EDA, CD4OL, FasL, OX40L, AITRL, CD30L, VEGI, LIGHT, 4-1BBL, CD27L, LTa, TNF, LT/3, TWEAK, APRIL, BLYS, RANKL et TRAIL, X représente une fonction chimique permettant de relier le groupe Y au bras espaceur et est choisi parmi les fonctions suivantes : O O 0 b. 0 I O a + ~l b a -' H aH b ~N H amide-1 amide-2 (1') (2') a S .b a S O N b N a NNb thioether-1 a H H S~ b O O urée thioether-2 thioether-3 (5') (6') (7') (8') (I) N-acyl-Prolyl (3') o O N-acyl-glycyl (4') Oa ,.S, - - S-b disulfure (9') .O.b a O,N~.b N oxime-1 oxime-2 (10') (11') a N,N a b NùN' b 1,2,3-triazole 1,2,3-triazole 1,4-disubstitué•-1 1,4-disubstitué-2 (12') (13') N NùN b 1,2,3-triazole 1,2,3-triazole 1, 5-disubstitué-1 1,5-disubstitué-2 (14') (15') N 10 a représentant la liaison avec le groupe Y et b représentant la liaison avec le groupe Z, Z représente un bras espaceur bi-, tri- ou tétrafonctionnel répondant à l'une des formules suivantes : 15 • lorsque j = k = 0 * lorsque X représente un groupe de formule (1'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes : -.,ioO -(CH2)n----m m étant un nombre entier variant de 1 à 40 20 n étant un nombre entier variant de 1 à 10 * lorsque X représente un groupe de formule (2'), (3') et (4') , Z répond à l'une des formules suivantes : 25 H H • (CH2)n H H (Pro)n )p 30N. O p i~~/O NH 20 25 H --NO\ (Pro)n O' \ ' p 7 NH - - -(Pro)n * lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14') , Z répond à l'une des formules suivantes : H N W W W Wù(Pro)n)p HNù(CH2)p ùNH HN~ Wù(Pro)n W N H m et n étant tels que définis ci-dessus, p étant un nombre entier variant de 1 à 6 u étant un nombre entier variant de 1 à 4 O a W représentant un groupe de formule Sz,/\N H ou un groupe de formule O a; O le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a' * lorsque X représente un groupe de formule (1'), (2'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7' (10'), (1 l'), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes : W,N,~iO H p H W-(Pro)n' N----O HN--1 H W-(Pro)n \H N ~~~0 \O> p H w- N H H W W NEW HNù(CH2)p ùNH H Wù(Pro)n'N-(- )p HN Wù(Pro)n p 30 H W-(Pro)n' N~~O~iO~p HN--W-(Pro)n 30 H W-(Pro)n W-(Pro)n X1\1 N N H I\1 * lorsque X représente un groupe de formule (1'), (2'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (11'), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes : N~~N/~/N N H W 5 10m et n étant tels que définis ci-dessus, p étant un nombre entier variant de 1 à 6 u étant un nombre entier variant de 1 à 4 W représentant un groupe de formule r étant un nombre entier variant de 1 à 4 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a' • lorsque j = 1 ou k = 1 * lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14'), Z répond à l'une des formules suivantes : a' . r 0 O N^N 0 0 15 NH,u/N~\N/~~N W H H ` \ n W NH NT ` u H 0/n H W-(Pro)n ~NH W-(Pro) n'N W-(Pro)n,NH 20 25 u étant un nombre entier variant de 1 à 4 n étant un nombre entier variant de 1 à 10 W représentant un groupe de formule ou un groupe de formule \)- 0 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', o a'. H o W-(Pro)n NH70 u étant un nombre entier variant de 1 à 4 n étant un nombre entier variant de 1 à 10 W représentant un groupe de formule r r étant un nombre entier variant de 1 à 4 0 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', * Z pouvant également représenter l'une des formules suivantes : R,NH HN'R HN'R 10 15 20 R NH2 O H R' -- O ''NÂN~ H .,N,R 25 30 dans laquelle : - lorsque X représente un groupe de formule (1'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (13') et (15') : R représente l'un des groupes suivants : a' --(CH2-CHz O)m-CH2-CH2-CO m variant de 3 à 6 m variant de 1 à 40 O le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', H ON a' Ç (CH2)n , a• n variant de 1 à 10 ONH-(CHZ-CHZ O)m-CHZ-CHZ-CO-m variant de 3 à 6 m variant de 1 à 40 - lorsque X représente un groupe de formule (2'), (3') et (4') : R représente l'un des groupes suivants : H O H O~^O~m --a' O Pro)n --- O N Nù(CH2)n--4 a' H H a' 10 15 20 25 30 n représentant un nombre entier variant de 1 à 10 u représentant un nombre entier variant de 1 à 4 le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14') : R représente l''un des groupes suivants : H O 0, N --/ -c,W-NH-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-CO-H m O m variant de 3 à 6 O /n n représentant un nombre entier variant de 1 à 10 O W représentant un groupe de formule -a-; H ou un groupe de formule C) le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a', -lorsque X représente un groupe de formule (1'), (2'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (11'), (13') et (15') : R représente l'un des groupes suivants : H 0 OO , W-NH-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-CO- H m O mvariantde3à6 m variant de 1 à 40 le groupe R se liant au groupe Nil via la liaison en pointillés a', W W W-(Pro )n--- W-Nù(CH )n / t u f l. H 2 m variant de 1 à 40W-VAT-(Pro)n--- W-N--(CH2)n H u et n étant tels que définis ci-dessus, a' représentant un groupe de formule r r étant un nombre entier variant de 1 à 4 0 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a'. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Re représente un 10 peptide dérivé du ligand du récepteur CD40 humain ou murin (CD40L), ledit peptide appartenant à la séquence primaire du ligand CD40L de CD40 et dont le nombre d'acides aminés est compris entre 3 et 10. 3. Composé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que Rc représente un 15 peptide dérivé du ligand du récepteur CD40 humain ou murin (CD40L), ledit peptide appartenant à la séquence primaire du ligand CD40L et dont le nombre d'acides aminés est compris entre 3 et 10 choisi parmi les séquences suivantes : LQWAEKGYYTMSNN (SEQ ID NO : 1) ; LQWAKKGYYTMKSN (SEQ ID NO : 2) ; PGRFERILLRAANTH (SEQ ID NO : 3) ; SIGSERILLKAANTH (SEQ ID NO : 4). 20 4. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Rc représente un groupe de formule H-Xa-(Xb)I-Xc-Xd-Xe-(Xf)i- ou H-X'a-L-X'b-Xe-Xd-Xe-(Xf);-, dans laquelle : • 1 représente 0 ou 1, 25 • i représente 0 ou 1, • Xa est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants : - lysine ; - arginine ; - ornithine ; 30 - les (3-acides aminés correspondant à la lysine, l'arginine ou l'ornithine, portant la substitution en position a ou [3 ; - acide tranéxamique ; -acide N-méthyl-tranéxamique ; 5 15 20 25 30- acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ; - acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ; acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ; - N-(4-aminobutyl)-glycine ; -NH2-(CH2)n-CO0H, n variant de 1 à 10 ; - NH2-(CI12-CH2-0),n-CH2CH2000H, m variant de 3 à 6 ; - 4-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ; - acide 3-(4-amin.ophényl)propanoïque ; -acide 4-aminophénylacétique ; 4-(2aminoéthyl)-1-carboxyméthyl-pipérazine ; acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ; acide cis•-4-aminocyclohexanecarboxylique ; acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; acide trans-4-aminocyclohexane acétique ; 4-amino-1-carboxyméthyl pipéridine ; - acide 4-aminobenzoïque ; - acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ; • Xb est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants : - glycine ; - isoleucine ; - leucine ; - valine ; - asparagine ; - D-alanine ; - D-valine ; - L-proline substituée ou non en position (3, y ou 6 ; - D-proline substituée ou non en position (3, y ou 6 ; - acides aminés naturels N-alkylés, le groupe alkyle étant un groupe méthyle, éthyle ou benzyle ;- acides aminés dialkylés acycliques de formule suivante : R R H2N OH (A) O R représentant H, Me, Et, Pr ou Bu ; -acides aminés dialkylés cycliques de formule suivante : H2N OH (B) 15 20 25 30 O k représentant 1, 2, 3 ou 4 ; • Xe est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants - tyrosine ; - isoleucine ; - leucine ; -valine ; - phénylalanine ; - 3-nitro-tyrosine ; -4-hydroxyméthyl-phénylalanine ; - 3,5-dihydroxy-phénylalanine ; -2,6-dimét:hyl-tyrosine ; - 3,4-dihydroxy-phénylalanine (DOPA) ; • Xd est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants - tyrosine ; -isoleucine ; - leucine ; - valine ; - phénylalanine ; - 3-nitro-tyrosine ; - 4-hydroxyméthyl-phénylalanine ; - 3,5-dihydroxy-phénylalanine ; -2,6-diméthyl-tyrosine ; - 3,4-dihydroxy-phénylalanine ; • Xe est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants10 15 20 25 30 75 -arginine ; - -(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ; - -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ; - NH2-(CH2)ä-COOH, n variant de 1 à 10 ; -NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2OOOH, m variant de 3 à 6 ; - acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ; - acide tranéxamique ; - acide N-méthyl-tranéxamique ; - acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ; - acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ; - N-(4-aminobutyl)-glycine ; -4-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ; acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ; - acide 4-aminophénylacétique ; -4-(2aminoéthyl)-1-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; - acide trans-4-aminocyclohexane acétique ; -4-amino-1-carboxyméthyl pipéridine ; - acide 4-aminobenzoïque ; - acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ; • Xf est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants : - -(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ; - -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ; - NH2-(CH2)n-COOH, n variant de 1 à 10 ; -NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2OOOH, m variant de 3 à 6 ; - acide 8-arnino-3,6-dioxaoctanoïque ; - acide tranéxamique ; - acide N-méthyl-tranéxamique ; - acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ; - acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ; - N-(4-aminobutyl)-glycine ; 10 15 20 25 30- 4-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ; -acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ; - acide 4-aminophénylacétique ; -4-(2aminoéth yl)- 1 -carboxyméthyl-pipérazine ; - acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-.4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; - acide trans-4-aminocyclohexane acétique ; -4-amino-1-carboxyméthyl pipéradine ; - acide 4-aminobenzoïque ; - acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ; • -L- représente une liaison de nature pseudopeptidique entre les résidus X'a et X'b, choisie notamment dans la liste ci-dessous : -L- = -y(CH2CH2)- W(CH(Fk)=CH(Fk'))- ; -v(CH2NH)- ; -W(NHCO)- - w(NHCONH)- ; -w(CO-O)- ; -yf(CS-NH)- ; -yr(CH(OH)-CH(OH))- ; -yf(S-CH2)- ; -w(CH2-S)- ; -w(CH(CN)-CH2)- ; -yr(CH(OH))- ; -yf(COCH2)- ; -yr(CH(OH)CH2)- ; -w(CH(OH)CH2NH)- ; -w(CH2)- ; -w(CH(Fk))- ; -w(CH2O)- ; -yJ(CH2-NHCONH)- ; -w(CH(Fk)N}ICONFk')- ; -w(CH2-CONH)- ; -W(CH(Fk)CONH)-; - yl(CH(Fk)CH(Fk')CONH)- ; ou -yi(CH2N)- ; -yf(NHCON)- ; -w(CS-N)- ; -yr(CH(OH)CH2N)- ; -w(CH2-NICON)- ; -yJ(CH2-CON)- ; -W(CH(Fk)CON)- ; -w(CH(Fk)CH(Fk')CON)-lorsque X'b représente la chaîne latérale d'une proline, Fk et Fk' représentant, indépendamment l'un de l'autre, un hydrogène, un halogène, un groupe alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, ou un groupe aryle dont la structure du cycle contient de 5 à 20 atomes de carbone, • X'a représente la chaîne latérale de la lysine, de l'arginine ou de l'ornithine ; et • X'b représente la chaîne latérale de l'un des résidus d'acides aminés suivants : - glycine ; -isoleucine ; - leucine ; - valine ; - asparagine ;5- D-alanine ; -D-valine ; - L-proline substituée ou non en position f3, y ou 8 ; -D-proline substituée ou non en position 13, y ou b ; - acides aminés naturels N-alkylés, le groupe alkyle étant un groupe méthyle, éthyle ou benzyle ; - acides aminés dialkylés acycliques de formule suivante : H2N OH (A) 10 15 20 O R représentant H, Me, Et, Pr ou Bu ; - acides aminés dialkylés cycliques de formule suivante : 5)k ~OH H2N O k représentant 1, 2, 3 ou 4 ; 5. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que Y répond à la formule suivante (II) : B A c B, z (B) 25 dans laquelle : ù A représente un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé choisi indifféremment parmi : HN HN HN HN (1) (2) (3) (4) 30(5) (6) HN HN O "^^ O (7) (8) HN O (10) 10 n représentant 0, 1, 2 ou 3 p représentant 0, 1, 2 ou 3 E représentant NH ou O ; B1 est un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé choisi de manière indépendante panai : O 0 Ra O Ra O H H (13) (14) (15) (16) 15 E N Y O (17) O (18) Ra si•N---,,iE H 0 Ra 12''-H 0 (19) (20) 20 n représentant 0, 1, 2 ou 3 p représentant 0, 1, 2 ou 3 ; E représentant NH ou O ; Ra représentant la chaîne d'un acide aminé protéinogénique, C1-C8 alkylé ; 25ù B2 est choisi de manière indépendante parmi les groupes suivants : la liaison c représentant la liaison au groupe X, Rb Rb •N~iE ~/ H H O H O (15) (16) (19) (20) D.NH -NH D. N _p H O (22) (24) D' fp JN /E/ ` H o o (26) (27) (28) (25) O D' 20 25 n représentant 0, 1, 2 ou 3 ; p représentant 0, 1, 2 ou 3 ; E représentant NH ou O ; Rb représentant une chaîne alkyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone ; D' représentant l'un des groupes suivants : ---Nù(CHZ)vùNùD --Nù(CH,)v o, 4 H m / -(Gly)vùH (Pro)vùN H m représentant un nombre entier variant de 1 à 40 ; v représentant un nombre entier variant de 1 à 10 ; la liaison c' représentant la liaison au groupe X, 5 10 15 25 3080 D représentant l'un des groupes suivants : un groupe de formule OO O cH V q (Xg)i- lorsque X représente un groupe de formule (13') et (15') O ou un groupe de formule (Xg)i--- q ou de formule O lorsque X représente un groupe de formule (1'), (2'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (11'), (12') et (14'), la liaison c' représentant la liaison au groupe X, q représentant un nombre entier variant de 2 à 6 ; Xg correspondant au résidu de l'un des groupes suivants : -(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ; -(Pro )n-, n variant de 1 à 10 ; - NH2.-(CH2)ä-COOH,, n variant de 1 à 10 ; - NH2-(CH2-CH2-0)m-CH2CH2OOOH, m variant de 3 à 6 ; acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ; acide tranéxamique ; acide N-méthyl-tranéxamique ; acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ; acide 3(pipéridin-4-yl)-propionique ; N-(4-aminobutyl)-glycine ; 4-carboxyméthyl-pipérazine ; acide 4-(4-aminophenyl)butanoïque ; acide 3-(4-aminophenyl)propanoïque ; acide 4-aminophénylacétique ; 4 -(2-aminoéthyl)- 1 -carboxyméthyl-pipérazine ; acide trans-4-aminocyclohexane carboxylique ; acide cis-4-aminocyclohexane carboxylique ; acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; acide trans-4-aminocyclohexane acétique ; 4-amino-1-carboxyméthyl pipéridine ;acide 4-aminobenzoïque ; acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque. 6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que Y répond à l'une des formules suivantes : H \ Ra O H N N~~N~R •H R rO NùH 10 /ä/'' Rb N~ N H O )p H HN- 'O HùN Rb 15 Rc N H HùN NùH HùN 20 Rc ,NH Rc/NH NùH NùH NH Rc/ 30 25 NùH HùN Rc /NH HùN NùH R. NùRc R N H [ / H O N N 10 15 Rc '--...--- o N ~f~/N~RH (Xg)i_N H HùN NùH HùN (V) HN. Rc 20 Ra, Rc, D, D', )(g, q, i et p étant tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, répondant à l'une Re 25 30 Rc N H des formules suivantes (III-a) ou (III-b) : HN 0 H H\ /H O NùH II H 1 N o \ O H HùN H O ON NùNJ NùH N0 \ H H 0 H N H R NH 83,R, HN N H H ,./NùRc H S 0 H HùN o 15 20 25 NH R (III-b) RR et m étant tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5. ._ /N NùH 0 8. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel R, est : ù H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO- ou ù H-Lys-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO- ou Ahx--(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-ou ù H-Lys-yf(CH2N)-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)s-CO-, -yr(CH2N)- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type méthylène-amino, ou -H-Lys-yr(CH2)-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-, -yf(CH2)- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type méthylène, ou ù H-Lys-yJ(CH2-CH2)-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-, -yr(CH2CH2)-correspondant à une liaison pseudopeptidique de type éthylène, ou ù H-Lys-Gly-DOPA-Tyr-NH-(CH2)s-CO-, ou ù H-Arg-Ile-Ile-Leu-Arg-NI-I-(CH2)5-CO-. 9. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, répondant à la formule suivante (III-a) : HN 30 R~ N H H HùN o H H N Re ,NH R• 84 dans laquelle : û n est égal à 1, 2 ou 6 ; - R, représente un groupe H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-. 10. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de substance active un composé selon l'une des revendications 1 à 9, en association avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable. 11. Composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de 10 substance active un composé selon l'une des revendications 1 à 9, en association avec un adjuvant pharmaceutiquement acceptable._ 12. Utilisation de composés selon l'une des revendications 1 à 9, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant 15 l'inhibition ou l'activation de la réponse immunitaire. 13. Utilisation selon la revendication 12, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'inhibition de la réponse immunitaire, telles que les rejets de greffes, les allergies ou les maladies auto-immunes. 14. Utilisation selon la revendication 12, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'augmentation de la réponse immunitaire, telles que les cancers ou les infections parasitaires, bactériennes, virales ou impliquant des agents infectieux non conventionnels tels que les prions. 25 15. Procédé de préparation sur support solide d'un composé, selon l'une des revendications 1 à 9, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : û la formation d'un précurseur linéaire de Y tel que défini dans la revendication 30 1, lequel précurseur est constitué d'un enchaînement d'acides aminés formant une chaîne peptidique en croissance, synthétisée par des cycles successifs de couplage entre des résidus d'acides aminés N-protégés, dont trois portent un groupe de type amine, et la fonction amine de la chaîne peptidique en croissance, et de déprotection, le premier résidu d'acide aminé étant accroché sur un support solide, ledit précurseur linéaire de Y 20comprenant au moins un résidu D-Alanine, ledit résidu D-Alanine étant substitué par un résidu D-Lysine dont l'amine c-NH a été acylée par un acide carboxylique portant la fonction désirée correspondant au groupe X tel que défini dans la revendication 1, ù la cyclisation du précurseur linéaire de Y protégé susmentionné, afin d'obtenir un cycle fonctionnalisé protégé, ù la réaction dudit cycle fonctionnalisé protégé avec un bras espaceur dérivé de Z tel que défini dans la revendication 1, afin d'obtenir un cycle fonctionnalisé protégé dimérisé, ù le clivage des susdits groupes protecteurs, pour libérer les susdites fonctions 10 amines protégées et obtenir un cycle fonctionnalisé déprotégé dimérisé, ù le couplage des fonctions amines libérées susmentionnées avec un peptide déjà formé ou formé in situ par l'assemblage séquentiel des résidus d'acides aminés correspondant au groupe Re tel que défini dans la revendication 1, et ù le clivage de la molécule du support solide, après la suppression de tous les 15 groupements protecteurs présents sur les chaînes latérales fonctionnalisées du groupe Re, afin d'obtenir le composé selon l'une des revendications 1 à 9. 16. Procédé de préparation selon la revendication 15 d'un composé de formule (III-a) ou (III-b) selon la revendication 7, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il 20 comprend les étapes suivantes : la réaction d'un cycle fonctionnalisé protégé de formule suivante : H N---GP H-N N-H uo O H 0 H 25 30 ,NH GP GP représentant un groupe protecteur notamment choisi parmi : Boc, Z ou Alloc, X' représentant un groupe -SH ou o H86 avec un groupe espaceur de formule Z'!oo n représentant un nombre entier variant de 1 à 10 0 et Z' représentant un groupe N3 ou un groupe 1ùN 0 o étant entendu que lorsque X' représente un groupe Z' représente un groupe N3, H /Z' 10 15 et lorsque X' représente un groupe -SH, Z' représente un groupe afin d'obtenir un composé de formule (VIII) suivante : GP NH 20 NH GP HN, GP 25 30 GP étant tel que défini ci-dessus et Y' répondant à l'une des formules ci-dessous : o o yHN N/ N=N N==N étant entendu que Y' répond à la formule (A) lorsque Z' représente un groupe N3 o et que Y' répond à la formule (B) lorsque Z' représente un groupe o (A) û la déprotection des susdits groupes protecteurs GP, pour libérer les fonctions amines protégées et le couplage de ces fonctions amines libérées susmentionnées avec un peptide déjà formé ou formé in situ par l'assemblage séquentiel des résidus d'acides aminés correspondant au groupe Re tel que défini dans la revendication 1, et û le clivage de la molécule du support solide, après la suppression de tous les groupements protecteurs présents sur les chaînes latérales fonctionnalisées du groupe Rc, afin d'obtenir le composé de formule (III-a) ou (III-b) selon la revendication 7.