FR 2913424 A1 20080912 FR 0753738 A 20070309 Domaine de l'invention La présente invention a pour objet des dérivés de cyanine qui absorbent la lumière et émettent de la fluorescence dans le rouge et le proche infra-rouge. Ces dérivés de cyanine sont capables de traverser les membranes cellulaires et sont fonctionnalisés de telle sorte qu'ils puissent être aisément utilisés comme marqueurs fluorescents. L'invention concerne également des conjugués fluorescents comprenant un dérivé de cyanine de l'invention, lié de manière covalente à un agent de couplage permettant le marquage de molécules dans la cellule. Les dérivés de cyanine selon l'invention sont particulièrement adaptés au marquage de protéines dans les cellules. Enfin l'invention concerne également des conjugués fluorescents comprenant un dérivé de cyanine de l'invention, lié de manière covalente à une substance que l'on souhaite faire rentrer dans la cellule, ladite substance étant rendue fluorescente par le couplage avec le dérivé de cyanine. L'invention a également pour objet l'utilisation des dérivés de cyanine de l'invention pour marquer des produits présents dans les cellules vivantes. Les composés selon l'invention sont particulièrement utiles pour marquer des biomolécules se trouvant dans le milieu intracellulaire sans modifier l'intégrité de la membrane plasmique, en particulier sans utiliser de produits destinés à perméabiliser cette membrane. Les composés selon l'invention ont en effet un caractère lipophile, dans la mesure où ils ne possèdent pas de groupes sulfates, sulfonates, phosphates, phosphonates ou carboxylates classiquement utilisés dans l'art antérieur pour résoudre les problèmes d'agrégation. Ces groupes ont été remplacés par des esters (de préférence diester) de phosphonate ou phosphate qui n'affectent pas le caractère lipophile de ces composés et permettent, après hydrolyse par les enzymes intracellulaires, de prévenir les phénomènes d'agrégation dans la cellule. L'invention concerne donc également l'utilisation de dérivés de cyanine selon l'invention comportant un agent de couplage, en tant que marqueurs fluorescents. L'invention concerne en outre une méthode de marquage d'une biomolécule présente dans une cellule intacte, qui consiste à introduire dans le milieu extracellulaire un dérivé selon l'invention comportant un agent de couplage, ladite biomolécule comportant un domaine de couplage. Cette méthode est très avantageuse puisqu'elle permet de marquer des composés à l'intérieur des cellules sans perméabiliser leur membrane.40 Domaine technique Les colorants fluorescents qui absorbent et émettent de la lumière dans la région spectrale du visible et du proche infra-rouge ont été couramment utilisés pour diverses applications d'analyse dans le domaine de la biochimie, de la biologie et du diagnostic, notamment en raison de leur absorption molaire et/ou de leur rendement quantique de fluorescence élevé. En particulier, seuls les dérivés de cyanine absorbent et émettent dans le proche infra-rouge, région du spectre électromagnétique particulièrement intéressante pour étudier les cellules vivantes car cette gamme de longueurs d'onde permet d'éviter le blanchiment ( bleaching ) dû à la décomposition photochimique des colorants utilisés comme marqueurs fluorescents (ce phénomène augmente en fonction de l'énergie des photons et est donc peu prononcé dans le proche infra-rouge). De plus, les molécules biologiques ne présentent pas d'autofluorescence dans le proche infra-rouge, ce qui limite les problèmes de bruit de fond non spécifique. Malgré ces avantages, le caractère lipophile des cyanines, dû à la présence de groupes polycycliques et d'une chaine polyméthine hydrophobe, n'est pas toujours compatible avec de bonnes performances en tant que marqueur fluorescent. Par exemple les cyanines ont tendance à former des agrégats en solution. Ainsi le vert d'indocyanine voit son rendement quantique chuter suite à une extinction de fluorescence due à la formation d'agrégats lorsqu'il est utilisé à des concentrations supérieures à 125 pM. Ce phénomène, assez général (il existe aussi dans le cas de la fluorescéine), est particulièrement prononcé dans la série des cyanines. Par ailleurs, et malgré ce caractère lipophile, les cyanines traversent très mal, voire pas du tout, les membranes biologiques, notamment en raison de leur masse moléculaire élevée (de l'ordre de 700-800 daltons), alors que des molécules plus petites comme la fluorescéine (337 daltons) ne présentent pas cet inconvénient. Les solutions techniques pour parer au problème de solubilité et d'agrégation des cyanines ne sont pas très satisfaisantes. Des conjugués de cyanines avec des peptides hydrophiles, des polyéthylèneglycols ou des oligosaccharides ont été utilisés et plusieurs études ont été consacrées à l'utilisation de colorants pour le proche infrarouge ainsi que sur leurs conjugués avec des biomolécules. Cette approche a l'inconvénient de nécessiter des synthèses multi-étapes, ce qui implique des rendements modestes. D'autre part, dans le cas de l'utilisation d'oligosaccharides ou d'oligopeptides hydrophiles le coût de revient peut être élevé et la purification de ces conjugués nécessite des techniques de purification autres que celles utilisées dans la synthèse organique classique. 2 L'approche la plus utilisée pour améliorer les propriétés photophysiques et donc les performances analytiques en tant que traceur fluorescent a été de limiter le phénomène d'agrégation en augmentant le caractère hydrophile par l'introduction de groupes chimiques portant une charge négative sur les noyaux indoles, tels que des sulfonates et/ou des groupes alkylesulfonates (sulfoalkyle) ainsi que des groupes carboxyliques. Ainsi, les dérivés non-sulfonés d'indocyanine (comme le produit connu sous la dénomination commerciale IR-786 de Sigma) ont des solubilités inférieures à 10 pM, et leur utilisation en milieu aqueux nécessite l'utilisation d'adjuvants. La tétra-sulfonation de ces dérivés permet d'augmenter la solubilité en milieu aqueux jusqu'à plus de 10 mM. En revanche, la sulfonation n'a qu'un faible impact sur le rendement quantique de fluorescence qui en moyenne est inférieur à 15% pour un composé tétra-sulfoné. Art antérieur La demande internationale WO 2005/056689 A2 concerne des composés colorants à pH physiologique possédant un squelette cyanine et comportant un substituant chargé négativement. La demande internationale WO 2005/061456 Al concerne un milieu de contraste fluorescent proche infrarouge contenant un composé de cyanine qui présente un groupe soluble dans l'eau. La demande internationale WO 2005/089813 A2 concerne des colorants de cyanine, ainsi que des conjugués biologiques de ceux-ci, utilisés dans l'imagerie diagnostic et en thérapie. Les conjugués consistent notamment en plusieurs colorants de cyanine avec une variété d'homologues d'acide bis-et tétrakis carboxylique. La demande internationale WO 2005/056687 A2 a pour objet des colorants de cyanine dont le reste méthine est substitué, qui conviennent au marquage des acides nucléiques et qui consistent en des dérivés de cyanine substitués notamment par des chaines sulfoalkyle ou carboxyalkyle. La demande internationale WO 2004/039894 A2 porte sur des colorants de cyanine fonctionnalisés et sur leurs dérivés utiles comme intermédiaires dans la préparation de colorants de cyanine, ainsi que sur des procédés de préparation de ces colorants et sur les colorants ainsi obtenus. Les dérivés de cyanine comportent tous des fonctions sulfonates. La demande internationale WO 03/082988 Al a trait à des fluorochromes hydrosolubles de proche 35 infrarouge, utiles par exemple pour l'imagerie biomédicale. La demande internationale WO 02/068537 A2 concerne des colorants fluorescents notamment des colorants de cyanine fluorescents et solubles dans l'eau qui contiennent des sites supplémentaires de fixation à des biomolécules. La solubilité dans l'eau est assurée par la présence de groupes 40 sulfonates. La demande internationale WO 02/24815 Al décrit des dérivés de cyanine comportant des groupes sulfonates. La demande internationale WO 01/77229 A2 concerne des colorants de cyanine qui présentent des 5 substituants alkyle en position méso de la chaîne méthine, des groupes sulfoaryle ainsi qu'au moins un groupe réactif permettant la liaison à une substance cible. La demande internationale WO 01/52746 Al concerne des conjugués colorant-peptide qui conviennent pour l'imagerie médicale et la thérapie. Ces conjugués colorant-peptide comprennent 10 plusieurs colorants à base de cyanine avec une variété d'homologues bis- et tétrakis (acide carboxylique). La demande internationale WO 00/66664 Al concerne des colorants cyanines asymétriques contenant un fragment cyclique aza-benzolium, notamment des colorants cyanines substitués par une 15 chaîne latérale cationique, des colorants cyanines monomères et dimères, des colorants cyanines réactifs au plan chimique et des conjugués de colorants cyanines. La demande internationale WO 01/57237 A2 décrit des cyanines non fluorescentes, comportant un groupe NO2 et des esters d'acides carboxyliques. Une tentative a été faite d'utiliser une fonction phosphonate (acide phosphonique) dans le but de réduire le phénomène d'agrégation des cyanines. [Oswald B., et al. Novel diode lasercompatible fluorophores and their application to single molecule detection, protein labeling and fluorescence resonance energy transfer immunoassay. Photochem Photobiol. (2001)74(2):237-45j. 25 La demande internationale WO 01/36973 A2 concerne un procédé d'amélioration de la solubilité dans l'eau de marqueurs optiques consistant à introduire des restes d'acide phosphorique ou des restes d'acide phosphonique, ou leurs sels ou monoesters, dans les marqueurs. Ces marqueurs sont utiles pour le marquage de biomolécules, de polymères et d'agents pharmaceutiques. Cette demande 30 décrit, en particulier, une cyanine pentaméthine portant un alkyl-phosphonate-monoester sur l'azote du cycle indole. Gruber et al. (Journal of Fluorescence, Vol. 15, No 3, May 2005, 207-214), décrivent deux composés dérivés de cyanines (dénommés chroméon 546 et chroméon 642), dans lesquels un des atomes 35 d'azote est substitué par un éthyl ester de phosphonate porté par un bras diméthylène, et l'autre par un groupe réactionnel N-hydroxysuccinimide porté par un bras polyméthylène. On notera que le groupe phosphonate ne permet pas, à priori, à ces composés de traverser les membranes biologiques. 20 Mazières et al (Dyes and Pigments, 74 (2007) pp 404-409) décrit des cyanines symétriques substituées au niveau des azotes des cycles indoles par des groupes diéthoxy-phosphoryl-propyle. Ces composés, après hydrolyse, conduisent à des cyanines portant des groupes acides phosphoniques solubles dans l'eau. La demande de brevet US 2006/0199955 divulgue des cyanines comportant un groupe phosphonate zwitterionnique, destiné à augmenter la polarité de la cyanine et donc sa solubilité ; les composés décrits sont également porteurs d'un groupe sulfonate et ne peuvent donc pas traverser les membranes cellulaires de cellules intactes. 1.0 Les colorants fluorescents dans le proche infra-rouge et possédant une structure carbocyanine ainsi que des fonctions chargées, tels que ceux décrits ci-dessus (sulfate, sulfonate, carboxyle, phosphate ou phosphonate), sont rapportés comme présentant une faible perméabilité membranaire à cause de leur masse moléculaire élevée (comparé par exemple à celle de la rhodamine = 334 Da) et de la 15 présence de charges multiples. On a également observé qu'avec l'augmentation du nombre de charge les colorants fluorescents restent dans les compartiments extra-cellulaires. [Frangioni JV, Curr Opin Chem Biol. 2003, 7(5):626-34. In vivo near-infrared fluorescence imaging]. Enfin, lorsque plusieurs composés fluorescents de ce type sont fixés à une même biomolécule une extinction de fluorescence a été observée [Lin Y. et al. Bioconjug. Chem. 2002 13(3):605-10. Novel near-infrared 20 cyanine fluorochromes: synthesis, properties, and bioconjugation]. Il existe donc un besoin pour des dérivés de cyanines capables de traverser les membranes cellulaires, ne présentant pas de propension à l'agrégation, et pouvant être utilisés comme marqueurs fluorescents. Il est important de noter que les solutions de l'art antérieur pour pallier l'agrégation (ajout 25 de groupes chargés négativement), s'opposent à une bonne perméabilité membranaire. A l'inverse, les cyanines lipophiles susceptibles de traverser les membranes ont tendance à s'agréger. Les paramètres gouvernant la propension pour un colorant à traverser les membranes des cellules sont connus (caractère lipophile, charge et caractère polaire qui pris ensemble définissent un 30 caractère amphiphile, taille et forme de la molécule) mais leur influence relative et leur utilisation comme outil prédictif de la faculté de traverser les membranes reste limité. Malgré ces obstacles, on a maintenant mis au point de nouveaux dérivés de cyanines capables de traverser les membranes cellulaires sans pour autant présenter de problème d'agrégation et de solubilité. 35 Les cyanines selon l'invention ont la particularité de comporter : • au moins un ester (de préférence diester) de phosphate ou un ester (de préférence diester) de phosphonate, greffé sur la cyanine via un bras de liaison, et • un groupe fonctionnel, ou bien un agent de couplage, ou encore une substance conjuguée que l'on souhaite faire rentrer dans la cellule sous forme marquée, ce groupe fonctionnel, agent de 40 couplage ou substance étant porté par un bras de liaison.5 Les composés selon l'invention sont capables de traverser les membranes cellulaires, dans la mesure où ils comportent les groupements hydrophobes propres aux cyanines (polycycles, chaînes polylméthines), et ne comportent pas de groupes polaires tels que ceux proposés dans l'art antérieur pour pallier au problème d'agrégation et de solubilité : les composés selon l'invention ne comportent pas de groupes sulfates, sulfonates, phosphates, phosphonates ou carboxylates. En revanche, les dérivés de cyanines selon l'invention comportent au moins un ester (de préférence diester) de phosphate ou phosphonate ces groupes ont la particularité de subir une hydrolyse dans le cytoplasme de la cellule, catalysée par les enzymes cellulaires, en particulier les l0 phosphodiesterases, et ce malgré la présence de la structure cyanine, dont la taille aurait pu gêner les processus enzymatiques. Par ailleurs, les dérivés de cyanines selon l'invention sont fonctionnalisés, ce qui permet à l'homme du métier de les coupler à tout groupe ou molécule qu'il souhaite marquer. Les produits selon l'invention 15 peuvent également comporter un agent de couplage qui va leur permettre de marquer les biomolécules comportant un domaine de couplage approprié. Ces caractéristiques font des dérivés de cyanine selon l'invention des composés particulièrement adaptés au marquage de molécules biologiques intracellulaires par des composés fluorescents 20 excitables et émettant dans le rouge et le proche infra-rouge, et ce sans forcément perméabiliser les cellules. Description de l'invention Les composés fluorescents selon l'invention sont des dérivés de cyanines de formule (1): (U R5 RI 0 dans laquelle les lignes en pointillés représentent les atomes nécessaires à la formation d'un ou deux cycles aromatiques fusionnés, chaque cycle comportant 5 ou 6 atomes de carbone ; RI, R2, R3, R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : - un atome d'hydrogène v~ . - un groupe alkyle en CI-C16 substitué ou non-substitué ; - un groupe alkoxy en C1-C6; - un groupe C2-C12 dialkylamino; - un groupe C1-C6 a!koxycarbon\de; - un groupe C2-C12 dialkylamido; ungroupearyle.eryo/kylaou aryloxy substitué ou non-substitué; un atome d'halogène ; un groupe nitro ; un groupe choisi parmi : Ll-W, L2-M, L2-A, L2-G ; R6, R6 représentent indépendamment l'un de l'autre : - ungroupea]kyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ; -ungroupaaryleouerya!kyleaubstituéounon-oubstitué; - un groupe choisi parmi : Ll-W, L2-M, L2-A, L2-G ; X est choisi parmi : 0, S, CR7R8 ; 25 Y est choisi parmi : C).S,CRoRm; R7, R8, R9, Rm représentent ment : - ungroupea]kvle en C1-C15 substitué ou non-substitué; - ungnoupeanyle.anda!kylaouanloxyaubatitué ou non-substitué ; 30 - un groupe choisi parmi : Ll-W, L2-M, L2-A, L2-G ; R7 et R8 et/ou R9 et Rmpeuvent également former ensemble un cycle à 5 ou 8atomes ou un hétérocycle comprenant 4 à 5 atomes de carbone et un atome d'oxygène ; 15 20 B représente un pont polyméthine comportant 1 à 5méthinn,dans lequel les groupes méthine sont individuellement non-substitués ou substitués par un groupe choisi parmi : - ungvoupoa!kyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ; - un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué; - ungnoupen!ho; -ungroupeohoiaiparmi: L1W, L2-KA.L2-A,L2-G, ou bien deux substituants de méthines adjacentes peuvent former ensemble un cycle hydrocarboné saturé ou insaturé à 4, 5 ou 6 atomes, éventuellement substitué une ou plusieurs fois par un groupe choisi parmi : un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ; - un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ; un atome d'halogène ; un groupe nitro ; - ungnoupeohoiaiparmi: L1-W, L2-M.L2-A,L2-G ; L1, L2 sont des bras de liaison, G est un groupe réactionnel, A est un agent de couplage, M est une molécule conjuguée, West un ester (de préférence diester) de phosphate ou de phosphonate: sous réserve que le dérivé de cyanine comporte au moins un groupe Ll-W et au moins un groupe choisi parmi : L2-A, L2-G et L2-M. Les dérivés deoyanine de formule (1) de l'invention comportent un contre-ion "Z (non représenté) qui contrebalance la ou les charges positives ou négatives du dérivé de cyanine. La nature du contre-ion n'est pas essentielle selon l'invention ; elle dépend du procédé de synthèse mis en oeuvre ou du milieu dans lequel se trouve le dérivé de cyanine. Par exemple, Z aere: - ï dans le cas d'une alkylation par un iodure, tel que par exemple CHoCHo ; - C si on réalise une hydrolyse avec HC!; -CFnCOC)'ou HCOO'dano le cas d'une purification par HPLC en phase inverse en présence respectivement de l'acide trifluoroacétique (CF3COOH) ou de l'acide formique (HCOOH). 35 Avantageusement, le contre-ion Z est choisi parmi r, Cr, Br-, CF3COO", HCOO-, Na+. 40 25 Définitions Dans la présente description, les groupes ont les significations suivantes : • groupe alkyle en C1-C15 : chaine hydrocarbonée linéaire, ramifiée ou cyclique (dans ce cas éventuellement interrompue par un hétéroatome tel que O, S, N) comportant de 1 à 15 atomes de carbone, éventuellement substituée par un ou plusieurs substituants choisis parmi les groupes : chloro, fluoro, bromo, nitro, C1-C6 alkoxy, C2-C12 dialkylamino, C1-C6 alkoxycarbonyle, C1-C6 alkylcarboxylate, N, N-di(C2-C12)alkylamido, amido. Exemples de groupes alkyle : méthyle, éthyle, isopropyle, n-propyle, butyle, tertio-butyle, n-hexyle, n-décyle, n-dodécyle, cyclohexyle, octyle. • groupe alcoxy en C1-C6: chaine hydrocarbonée linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbones, liée à un atome d'oxygène. Des exemples de groupes alcoxy sont les groupes : méthoxy, éthoxy, propoxy, tertio-butoxy et n-butoxy. • groupe alkoxycarbonyle en C1-C6 : chaine hydrocarbonée linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbones, liée à l'oxygène d'un groupe carboxyle -OOC-. • groupe alkyl carboxyl en C1-C6 : chaine hydrocarbonée linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbones, liée au carbone d'un groupe carboxyle -COO- • groupe dialkylamino en C2-C12: azote comportant deux groupes alkyles identiques ou différents, linéaires ou ramifiés, constitués chacun de 2 à 12 atomes de carbone. • groupe N,N-dialkylamido en C2-C12: groupe dialkylamino en C2-Ci2 lié au carbone d'un groupe carbonyle ûCO-. • groupe aryle en C5-C14 : cycle aromatique à 5 ou 6 atomes de carbone, ou bicycle aromatique à 30 8 à 10 atomes, ou un tricyle aromatique à 10-14 atomes. Le groupe aryle peut être éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants choisis parmi les groupes : C1-C15 alkyle, chloro, fluoro, bromo, nitro, C1-C6 alkoxy, amino di-(C1-C15)-alkyle, C1-C6 alkoxycarbonyle. • groupe hétéroaryle à 5 -10 éléments : groupe aryle dont le(s) cycle(s) comprennent de 5 à 10 35 atomes de carbone dont l'un au moins est remplacé par un hétéroatome choisi parmi : N, O, S. Un groupe hétéroaryle peut être éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants choisis parmi les groupes : C1-C15 alkyle, chloro, fluoro, bromo, nitro, C1-C6 alkoxy, amino di-(C1-C15)-alkyle, C1-C6 alkoxycarbonyle. 9 Des exemples de groupes hétéroaryles : pyrrolyle, pyridyle, thienyle, furanyle, oxazolyle, isoazolyle, oxadiazolyle, imidazolyle, benzoxazolyle, benzimidazolyle, quinolyle, benzofuranyle, indolyle, carbazolyle, coumarine et benzocoumarine. • groupe arylalkyle en C6-C25 : groupe aryle en C5-C10 lié à un groupe alkyle en C1-C15. • un halogène : chloro-, fluoro-, ioda-, bromo-. • B bras de liaison : peut être une liaison covalente simple ou un bras d'espacement comprenant de 1 à 20 atomes différents de l'hydrogène, choisis parmi les atomes de carbone, azote, phosphore, oxygène et soufre, ce groupe de liaison étant linéaire ou ramifié, cyclique ou hétérocyclique, saturé ou insaturé, et constitué d'une combinaison de liaisons choisies parmi : les liaisons carbone-carbone qui peuvent être simples, doubles, triples ou aromatiques; les liaisons carbone-azote; les liaisons azote-azote; les liaisons carbone-oxygène; les liaisons carbone-soufre; les liaisons phosphore-oxygène; les liaison phosphore-azote ; les liaisons éther ; les liaisons ester ; les liaisons thioéther; les liaisons amines ; les liaisons amides ; les liaisons carboxamide; les liaisons sulfonamide; les liaisons urée; les liaisons uréthane ; les liaisons hydrazine; les liaisons carbamoyle. • Cellule intacte : désigne une cellule dont l'intégrité membranaire et l'intégrité intracellulaire sont conservées, par exemple une cellule qui n'a pas fait l'objet d'un traitement chimique destiné à perméabiliser sa membrane. Composés préférés de l'invention Les dérivés de cyanines préférés selon l'invention sont les composés répondant aux formules suivantes, dans lesquelles les groupes R1-R6, B, X et Y sont tels que définis ci-dessus : N+ v B N 1 R6 35 40 R5 R6 Le pont polvméthine B Les composés de l'invention comportent un pont polyméthine entre les structures cycliques. Comme indiqué plus haut, ces méthines peuvent être substituées, ou encore des méthines adjacentes peuvent former ensemble un cycle hydrocarboné saturé ou insaturé à 4, 5 ou 6 éléments, éventuellement substitué. Les composés préférés de l'invention comportent des méthines non substituées, ou bien seule la méthine centrale est substituée, ou encore 2 méthines centrales forment un cycle. A titre illustratif et non limitatif, le pont peut être constitué des chaines polyméthines suivantes : R15 12 R16 R16 R15 R15 R15 dans lesquelles R15, R16 sont choisis parmi : - un atome d'hydrogène ; - un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ; - un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ; - un atome d'halogène ; - un groupe nitro ; - un groupe choisi parmi : L2-M, L2-A, L2-G, L1-W. 20 L1, L2 sont des bras de liaison, G est un groupe réactionnel, A est un agent de couplage, M est une molécule conjuguée, W est un ester (de préférence diester) de phosphate ou de phosphonate. 15 25 De préférence, le pont polyméthine répond à l'une des formules ci-après : R15 R15 R15 L'ester (de préférence diester) de phosphate ou phosphonate Les esters (de préférence diester) de phosphate ou de phosphonate portés par un bras, présents sur les dérivés de cyanine selon l'invention, offrent plusieurs avantages techniques : ils n'augmentent pas la polarité des composés et favorisent donc leur passage à travers les membranes biologiques lipidiques ; d'autre part, une fois à l'intérieur de la cellule, les esters (de préférence diesters) de phosphate ou de phosphonates sont hydrolysés par les enzymes cellulaires pour donner des groupes phosphates ou phosphonates. Ces groupes phosphates ou phosphonates contribuent à l'efficacité des cyanines selon l'invention pour marquer en particulier des protéines, puisqu'ils permettent dé remédier aux phénomènes d'agrégation généralement observés lorsque les cyanines sont utilisées dans cette application. Ces groupes peuvent être greffés sur la cyanine selon des méthodes de synthèse connues de l'homme du métier. Par exemple, l'introduction d'un ester de phosphonate sur un noyau aromatique est réalisée à partir d'un dérivé bromé, tel que le 5-bromo-2,3,3-triméthyl-3H-indole comme décrit dans l'exemple 13 en suivant le protocole décrit dans la littérature [A Novel Synthesis of Dialkyl Arenephosphonates, Hirao, T. et al. Synthesis, (1), 56-57 (1981)]. La partie expérimentale ci-après illustre des voies de synthèse de dérivés de cyanines comportant des esters de phosphates ou de phosphonates. Dans le cas où des esters de phosphate sont introduits au niveau des cycles aromatiques de la 25 cyanine, ces groupes doivent obligatoirement être portés par un bras de liaison. 30 Les groupes W ester (de préférence diester) de phosphate ou de phosphonate ont pour formules : 0 0 P ù 0ù CHRIIR13 0 0 ù CHR12R14 0 ù CHR12R14 ù CHR11 R13 OH0 0ù CHRIIR13 ù 0ùP ùOùCHRIIR13 OH Alk 0 o 0 0 Pj 0/ \ 0ù 0/ 15 20 25 dans lesquelles : Rll et R12 sont identiques ou différents et sont choisis parmi : - un atome d'hydrogène ; - un groupe alkyle en C1-05 non-substitué ; R13, R14 sont identiques ou différents et sont choisis parmi : un atome d'hydrogène ; un groupe alkyle en C1-C15 non-substitué ; un groupe alkoxycarbonyle en C1-C6 ; un groupe alkylcarboxyle en C1-C6 ; un groupe N,N-dialkylamido en C2-C12 ; un groupe amido ; un groupe de formule ûC-S-CO-Alk, Alk étant un alkyle linéaire ou ramifié non substitué, en C1-C4 ; R11 et R12 et/ou R13 et R14 peuvent également former ensemble un groupe phtalidyle de formule : Les dérivés de cyanine, particulièrement préférés selon l'invention, sont ceux dans lesquels les esters de phosphates/phosphonates sont greffés sur le cycle aromatique indole de la cyanine. Les diesters de phosphonates de formule générale suivante sont préférés : O P O CHR11R13 O CHR12R14 dans laquelle : 10 Rä et R12 sont identiques et sont choisis parmi : - un atome d'hydrogène ; - un groupe alkyle en C1-05 non-substitué ; R13 et R14 sont identiques et sont choisis parmi les groupes suivants : - méthylcarboxyl (= -O-CO-CH3 = ester d'acétoxyméthyl) ; 15 - tertiobutylcarboxyl (= -O-CO-C(CH3)3 = ester de triméthylacétoxyméthyl) ; - méthyloxycarbonyl (= -CO-OCH3 = ester de méthyl glycolate) ; - méthanamido (= -CO-NH2 = ester de glycolamide) ; -N,N-diméthylméthanamide (= -CO-N(CH3)2 =ester de glycolamide substitué) ; - N-méthylméthanamide. 20 En particulier, les dérivés de cyanine comportant les esters de phosphonate suivants, sont plus facilement hydrolysés par les enzymes cellulaires que les simples esters d'alkyle : 25 Ester d'acétoxyméthyle O o 0 Ester d'acétoxyméthyle, le groupe méthyle étant éventuellement substitué par un groupe H ou alkyle en CI-05 : W= 0 oEster de triméthylacétoxyméthyle : o 0 Ester de méthyl-glycolate ou éthyl-glycolate (acide glycolique = HOCH2COOH, méthyl glycolate HOCH2COOMe) o W. _P/ Ho OMe 0 OMe 10 Ester de glycotamide non substitué (glycolamide HOCH2CONH2) O VV= O---~ NHz NH, Ester de glycolamide substitué (N-methyl-glycolamide HOCH2CONHCH3 ou N,N-diméthylglycolamide ~~~ ~~ o `N/ o N Les dérivés de cyanines selon l'invention peuvent comporter un agent de couplage porté par un bras de liaison. De préférence, cet agent de couplage est capable de traverser la membrane cellulaire. Cet agent de couplage a pour fonction de permettre le couplage covalent ou non-covalent de la 15 cyanine avec une molécule cible, par exemple présente dans une cellule. Pour cela, la molécule cible doit comporter le domaine de couplage approprié. Dans le cas où la molécule cible est présente dans une cellule, il est nécessaire que l'agent de couplage soit lui-même capable de traverser la membrane plasmique. 20 L'agent de couplage A peut ainsi être un anticorps, un fragment d'anticorps ou encore un aptamère peptidique spécifique de la molécule cible. Ces anticorps, fragments d'anticorps ou aptamères peuvent reconnaître un domaine naturellement présent dans la molécule cible, ou encore un domaine introduit dans cette molécule par les techniques bien connues de l'homme du métier, en particulier les techniques de biologie moléculaire permettant l'introduction dans une biomolécule d'une étiquette 25 protéique. .8 L'agent et le domaine de couplage peuvent être des membres d'un couple de partenaires de liaison, les deux membres étant capables de lier de manière non-covalente, comme par exemple les couples suivants : • avidine (ou streptavidine)/biotine : ce couple peut être utilisé pour marquer une protéine d'intérêt exprimée par la cellule sous forme de protéine de fusion avec le domaine de liaison de l'avidine ou de la streptavidine. Dans ce cas, les dérivés de cyanine selon l'invention sont conjugués à la biotine en tant qu'agent de couplage. Le couple (strept)avidine/biotine est connu de l'homme du métier qui n'aura aucun mal à coupler les dérivés de cyanine selon l'invention avec la biotine. • composés bi-arsenic/motif tétracystéine : Ce couple de partenaires de liaison a été initialement décrit par Adams et al., ( New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications , J. Am. Chem. Soc. 2002 May 29;124(21):6063-76). Un dérivé de cyanine selon l'invention, conjugué à un motif bi-arsenic, permet de marquer une protéine d'intérêt exprimée par la cellule sous forme de protéine de fusion avec un domaine tétracystéine capable de se lier avec le motif biarsenic. La séquence du domaine tétracystéine est : Cys-Cys-aal-aa2-Cys-Cys (dans laquelle aal et aa2 sont tout acide aminé naturel, et de préférence aal = Pro et aa2 = Gly). • méthotrexate (ou triméthoprime)/dihydrofolate reductase (DHFR) : La liaison de haute affinité entre la DHFR et des composés tels que le méthotrexate ou la triméthoprime est décrite notamment par Miller et al. ( Methotrexate Conjugates: a molecular in vivo protein tag , Angew. Chem. Int. Edn. Engl., 43, 1672-1675 (2004)). Des dérivés de cyanines selon l'invention, conjugués au méthotrexate ou à la triméthoprime comme agent de couplage, seront capables de marquer une protéine d'intérêt exprimée par la cellule sous forme de protéine de fusion avec la DHFR. • SLF'/FKBP(F36V) : Clakson et al. ont décrit le couple composé d'un ligand artificiel SLF' se liant à un mutant de la protéine FKBP ( Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity , Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Sep 1;95(18):10437-42) Des dérivés de cyanines selon l'invention, conjuguées au SLF' comme agent de couplage, seront capable de marquer une protéine d'intérêt exprimée par la cellule sous forme de protéine de fusion avec la FKBP(F36V). L'agent de couplage A des dérivés de cyanine selon l'invention peut également être un agent permettant un couplage par liaison covalente avec un domaine de couplage présent sur la molécule d'intérêt que l'on souhaite marquer. En particulier, l'agent de couplage peut être le substrat d'une enzyme dite suicide , présente dans 40 la cellule. Les enzymes suicides sont des protéines qui ont une activité enzymatique modifiée par des mutations spécifiques qui leur confèrent une capacité à lier rapidement et de façon covalente un substrat. Ces enzymes sont dites suicides car chacune ne peut lier qu'une seule molécule fluorescente, l'activité de l'enzyme étant bloquée par la fixation du substrat. Les enzymes suicides ont été récemment utilisées dans des méthodes de marquage de protéines : ces méthodes consistent à fabriquer une protéine de fusion comprenant une protéine que l'on souhaite marquer et une enzyme suicide, et en mettant en contact cette protéine de fusion avec, par exemple, un fluorophore marqueur lié de manière covalente au substrat de ladite enzyme suicide. Actuellement, deux familles d'enzymes suicides connues permettent ce type de marquage : Le mutant d'une alkylguanine-DNA alkyltransférase (ou SnapTag commercialisé par la société Covalys, décrite dans la demande WO 02/083937 A2), dont le substrat est la benzylguanine ou un dérivé de benzylguanine. Par dérivé de benzylguanine on entend une benzylguanine modifiée mais qui est néanmoins reconnue par l'enzyme suicide. De tels substrats sont décrits dans les demandes WO 2005/085470 et WO 2004/031405 ; Le mutant d'une haloalcane déhalogénase ( HaloTag commercialisé par Promega) qui génère également une réaction enzymatique du type suicide (technique décrite dans WO 2004/072232 A2), dont le substrat un haloalcane, de préférence un chloroalcane. Des substrats sont décrits dans WO 2004/072232 et WO 2006/093529. Dans le cas ou l'on souhaite marquer de telles enzymes suicides par un dérivé de cyanine selon l'invention, ladite cyanine comportera l'agent de couplage qui sera un groupe benzylguanine (ou un de ses dérivés), ou encore un haloalcane (de préférence un chloroalcane), lié à la cyanine via un bras de liaison. Pour résumer, l'agent de couplage A des dérivés de cyanines selon l'invention peut être un membre d'un couple de partenaires de liaison non-covalente ou un membre d'un couple de partenaires de liaison covalente. 30 En particulier, A peut être choisi parmi les composés suivants : un anticorps, un fragment d'anticorps, un aptamère peptidique, la biotine, un composé bi-arsenic, le trimétropine, le méthotrexate, le SLF', un groupe benzylguanine, un chloroalcane. 35 Groupe réactionnel G Les dérivés de cyanines selon l'invention peuvent contenir un groupe réactionnel G, qui est un groupe capable de réagir avec un groupe fonctionnel présent sur une autre substance ou molécule, pour former une liaison covalente. En l'occurrence, le groupe réactionnel G réagira avec un groupe 40 fonctionnel présent sur la substance ou la molécule que l'on souhaite conjuguer au dérivé de cyanine selon l'invention.25 Typiquement, le groupe réactionnel est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié, respectivement. La réaction de conjugaison entre le dérivé de cyanine comportant un groupe réactionnel et une molécule à conjuguer M portant un groupe fonctionnel entraîne la formation d'une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactionnel. A titre d'exemples, les couples de groupes électrophiles/nucléophiles et le type de liaison covalente formée lorsqu'ils sont mis en présence sont listés ci-dessous : Groupe électrophile Groupe nucléophile Type de liaison acrylamides thiols thioéthers halogénures d'acyle amines/anilines carboxamides aldéhydes amines/anilines imines aldéhydes ou cétones hydrazines hydrazones aldéhydes ou cétones hydroxylamines oximes alkyl sulfonates thiols thioéthers anhydrides amines/anilines carboxamides halogénure d'aryle thiols thiophénols halogénure d'aryle amines aryl amines aziridines thiols thioéthers carbodiimides acides carboxyliques N-acylurées ou anhydrides esters activés* amines/anilines carboxamides haloacetamides thiols thioéthers halotriazines amines/anilines Aminotriazines imido esters amines/anilines amidines isocyanates amines/anilines urées isothiocyanates amines/anilines thiourées maleimides thiols thioéthers sulfonate esters amines/anilines alkyl amines halogénures de sulfonyle amines/anilines sulfonamides * : par ester activé, on entend des groupes de formule COY, ou Y est : • un groupe partant, choisi parmi les groupes succinimidyloxy (-C4H4O2), sulfo succinimidyloxy (-OC4H3O2-SO3H) ; • un groupe aryloxy substitué ou non par au moins un substituant électrophile tels que les groupes 15 nitro, fluoro, chloro, cyano, trifluorométhyle, formant ainsi un aryle ester activé ; • un acide carboxylique activé par un groupe carbodiimide, formant un anhydride -OCORa ou ûOCNRaNHRb, dans lesquels Ra et Rb sont identiques ou différents et sont choisis parmi les groupes alkyles en C1-C6, perfluoroalkyles en C1-C6, alkoxy en C1-C6, cyclohexyle ; • 3-diméthylaminopropyle, N-morpholinoéthyle. A titre d'exemple non limitatif, la substance ou molécule à conjuguer M comprend au moins un des groupes fonctionnels suivants, avec lequel réagira le groupe réactionnel G : amines, amides, thiols, aldéhydes, cétones, hydrazines, hydroxylamines, amines secondaires, halogénures, époxydes, esters de carboxylate, acides carboxyliques, des groupes comportant des doubles liaisons, ou une combinaison de ces groupes fonctionnels. Le groupement fonctionnel porté par la molécule M qui réagira avec le groupe réactionnel G sera par exemple un groupe amine, thiol, alcool, aldéhyde ou cétone. De manière préférée le groupement réactionnel G réagira avec un groupe fonctionnel amine ou thiol. Des méthodes d'introduction de ces groupes fonctionnels sont notamment décrites dans C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2' edition, L.J. Kricka (1995), Ed. Academic press Ltd., Londres, p. 66-72. 15 De préférence, le groupement réactionnel G est un groupe dérivé d'un des composés ci-après : un acrylamide, une amine activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, une haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un 20 isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, ou un thiol, une cétone, une amine, un halogénure d'acide, un hydroxysuccinimidyl ester, un hydroxysulfosuccinimidyl ester, un azidonitrophényl, un azidophényl, une 3-(2-pyridyl dithio)-propionamide, glyoxal et en particulier les groupes de formule :10 C--NH oCH2)nNCS ~ \ BJ ENH / 2n NCS (CR]^ ` /P NCO 0 , /U \ - / C-O-N C--NH \ / O [\ c/ O SI 0 O U (CH)u-C-ON ~_C_NH ` /' )~-~ ~ 0 U N ` Hu . CùND \ /p 0 ( II \ II \ KJ-NUùAr (CH ~u ` ' C ùNH. CB2>o -S --S -- Ar' , \ CùNR / O E NH (cD)u ^ù~~ ' NU K]- -) o /" \ `/p ( /P ou +CH2) ii ùN8 \ . (CH ùSH E_NH /" ~o où n varie de O à 8 et p est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons comprenant 1 à 3héAéroatomeo. éventuellement substitué par un atome d'halogène. De manière préférée, le groupement réactionnel G est un acide carboxylique, un succinimidyl ester d'acide carboxylique, un haloacétamide, une hydrazine, un iackhiooyanata, ungroupnna{é\nnide' une amine aliphatique. Molécule conjuguée M Bien que les dérivés de cyanine selon l'invention soient particulièrement avantageux pour le marquage fluorescent de composés se trouvant dans la cellule, ils peuvent être couplés à tout type de molécules par les techniques de conjugaison classique, et l'utilisation de groupes réactionnels tels que décrits ci-dessous. La molécule conjuguée M peut être par exemple une biomolécule. Par biomolécule, on entend une molécule présente dans un organisme vivant, et en particulier les molécules constituant la structure d'un organisme, celles impliquées dans la production et la transformation d'énergie ou dans la transmission des signaux biologiques. Cette définition englobe les acides nucléiques, les protéines, les sucres, les lipides, les peptides, les oligonucléotides, les intermédiaires métaboliques, les enzymes, les hormones et les neurotransmetteurs. Bras de liaison Les dérivés de cyanines selon l'invention comporte un groupe réactionnel G, un agent de couplage A, une molécule conjuguée M ou encore un ester (de préférence diester) de phosphate ou phosphonate W. Chacun de ces groupes est lié à la cyanine via un bras de liaison. Dans le cas où la cyanine comporte plusieurs de ces groupes, par exemple 2 groupes phosphonates et un agent de liaison, ces groupes peuvent être portés par des bras identiques ou différents. Le bras de liaison L qui porte les groupe G, M, A ou W, peut être une liaison covalente simple ou un 25 bras d'espacement comprenant de 1 à 20 atomes différents de l'hydrogène, choisis parmi les atomes de carbone, azote, phosphore, oxygène et soufre, ce bras de liaison étant linéaire ou ramifié, cyclique ou hétérocyclique, saturé ou insaturé, et constitué d'une combinaison de liaisons choisies parmi : les liaisons carbone-carbone qui peuvent être simples, doubles, triples ou aromatiques; les liaisons carbone-azote; les liaisons azote-azote; les liaisons carbone-oxygène; les liaisons carbone-soufre; les 30 liaisons phosphore-oxygène; les liaison phosphore-azote ; les liaisons éther ; les liaisons ester ; les liaisons thioéther; les liaisons amine ; les liaisons amide ; les liaisons carboxamide; les liaisons sulfonamid; les liaisons urée; les liaisons uréthane ; les liaisons hydrazine; les liaisons carbamoyle. De préférence, le bras de liaison L comprend de 1 à 20 atomes différents de l'hydrogène et choisis 35 parmi C, N, O, P et S et peut comprendre des combinaisons de liaisons éther, thioéther, carboxamide, sulfonamide, hydrazine, amine, ester et des liaisons aromatiques ou hétéroaromatiques. De manière préférée, L est constitué d'une combinaison de liaisons simples carbone-carbone et de liaisons carboxamide ou thioéther. 23 40 15 20 A titre d'exemple, L peut être choisi parmi les chaînes suivantes : polyméthylène, arylène, al a. arylènealkyle, ouamlthio Selon un aspect avantageux, le bras de liaison L est constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en C1-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons ou triples liaisons et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou oarboxamido; les groupes cycloalkylène en C6-C6 et les groupes arylène en C6-C14, lesdits groupes a!ky!ène, oyc!ne/ky!èneou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate. En particulier, le groupe de liaison L est choisi parmi les groupes : 7\ --~(CH)n e--NH 2) ` - ` em 0 5) ---/CH-\n--'NH-C--/CH.\--- ~ 0 6) --~(CH)n `ù~^--NH-C--~CH^n J--N -^ ^ 0 Sù(CH2)r 0 71 --~/CM]o ^--NH-C-- S S 7) ` ` 2'v 25 8) --(CH)--NH 9) --/CH` --NH S--/CH` ---10A ù donaleaouels : - n et maont des nombres entiers de 2 à 16, de préférence de 2 à8; - p et r sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5. 15 Les groupes de liaison 1)à0sont particulièrement appropriés lorsque le groupe réactionnel est un groupe carbamoyl et le groupe fonctionnel sur la substance ou molécule M est un groupe amide, thioéther. Les groupes de liaison 2)'6).7)`et 10à 12) sont particulièrement appropriés lorsque le groupe 20 réactionnel est un groupe éther et le groupe fonctionnel sur la substance ou molécule M est un groupe amide ou thioéther. /CH)-NM---0 Parmi les composés de l'invention, on préfère tout particulièrement l'un des groupes de composés oiaprea: 25 - composés de formule dans laquelle X est le groupe CR7R8 at/omYest le groupe CR9RIo, un ou deux groupes R1-R4 représentent un groupe L1-W, et un ou deux groupes R7-R10 représentent k2-4. L2'GouL2'K8 ; - composés de formule U\ dans laquelle X est le groupe CR7R5 et/ou Y est le groupe CR9R,o, R5 et/ou R6 représentent un groupe L1-W, et un ou deux groupes RrRm représentent un groupe !0 - composés de formule (!)dans laquelle R5 et/ou R6 représentent un groupe U-W et le pont [olyméthineB est choisi parmi les formules ci-dessus dans lesquelles R15 ou R16 représente un groupe L2-A.L2-G ouL2'yW; - composés de formule (1) dans laquelle un ou deux R1-R4 représentent un groupe Ll-W et le pont 5 polyméthine B est choisi parmi les formules ci-dessus dans lesquelles R15 ou R16 représente un groupe L2-A, L2-G ou L2-M. Parmi ces composés, on préfère tout particulièrement ceux dans lesquels les lignes en pointillés représentent le groupe phényl et dans lesquels le pont polyméthine répond à l'une des formules ci-10 après: R15 R15 Procédés de synthèse 15 La synthèse de dérivés de cyanine est largement décrite dans la littérature et l'homme du métier peut s'y référer pour préparer les dérivés selon l'invention. La synthèse de cyanine repose en général sur l'utilisation de 3 réactifs de départ: les groupes polycycliques et la chaine méthine. Ces 3 réactifs sont modifiés avant ou après leur condensation pour leur faire porter les substituants voulus. 20 Des informations sur la synthèse des intermédiaires utilisés dans la fabrication des cyanines de l'art antérieur sont disponibles notamment dans les publications suivantes : - Mujumdar et al. (1993). " Cyanine dye labeling reagents: sulfoindocyanine succinimidyl esters." Bi000njugChern. 4(2): 105'11. - Mujumdar et al. (1986)."Cyanine-Lobe!ingHeagonta: Gu/fnbenzindooyenineSuooinimnidy!Estare." 25 Bioconjugate Chem.7(3): 356 -362. Ces articles permettent à l'homme de l'art de synthétiser les intermédiaires nécessaires à la synthèse des cyanines. - Hung, S.-C. et al. (1996). "C|yanine Dyes with High Absorption Cross Section as Donor {}hnomophoreainEnergyTnonoferPrimeru"Ana!ytioa!Bioohemistry243(1): 15-27 30 Les exemples de la partie expérimentale illustrent par ailleurs la synthèse de quelques dérivés selon EXEMPLES Dans ces exemples, les abréviations ci-après sont utilisées : DIPEA : Diisopropyléthylamine TSTU : N,N,N',N"-Tétraméthylsuccinimidouronium tétrafluoroborate TBTU = 2-(1 H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium tétrafluoroborate HPLC : chromatographie liquide haute performance RP-HPLC : chromatographie liquide haute performance en phase inverse TFA : acide trifluoroacetique MS : Spectroscopie de Masse DMF : Diméthylformamide TR : temps de rétention DY647: Fluorophore commercialisé par la société Dyomics, soluble dans l'eau, le méthanol, le DMSO, et dont les propriétés spectrales sont similaires à celles de Cy5 DY647-NHS : dérivé N-hydroxysuccinimide du DY647 DMEM : acronyme du milieu de culture connu sous le terme anglosaxon dulbecco modified essential medium DAPI : 4',6-diamidino-2-phénylindole colorant des noyaux ACN : Acétonitrile NHS : N-hydroxysuccinimide BG : Benzylguanine BG-CY5 : conjugué benzylaguanine-cyanine CY5 CY5 : indocyanine dont le pont polyméthine comporte cinq méthines, commercialisée par la société AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH. Exemple 1: Synthèse du bromure de 1-[2-(Diéthoxyphosphoryl)-éthyl]-2,3,3-triméthyl-3H-indolium 27 o -o + gré/P'O OPâ 1,59 g (10,0 mmol) de 2,3,3-triméthyl-3H-indole et 2,94 g (12,0 mmol) de bromoéthyl-diéthylphosphonate sont mélangés et chauffés à 70 C pendant 40 h sous agitation. Après refroidissement du mélange réactionnel, 10 ml de méthanol sont ajoutés puis ensuite 30 ml d'eau. Le composé recherché est isolé par chromatographie sur colonne (silice RP-18) avec un gradient de méthanol/eau allant de 1:1 to 5:1. MS (ESI+): 324,2 .Rendement: 775 mg (19 %). Exemple 2 : Synthèse du chlorure de 3-(3-Carboxypropyl)-1-[2-(diéthoxyphosphoryl)-éthyl]-2, 3-diméthyl-314-indolium o + P'O J HOOC 70. HOOC 2,31 g (10,0 mmol) de 3-(3-Carboxypropyl)-2,3-diméthyl-3H-indole et 2,94 g (12,0 mmol) de bromoéthyl-diéthylphosphonate sont dissous dans 10 ml d'éthanol et agités à 70 C pendant 64 h. Après retour à température ambiante, le liquide restant est extrait par deux fois avec 20 ml d'eau. Les deux phases aqueuses réunies sont extraites deux fois par 20 ml de diéthyléther. Le produit désiré resté dans la phase aqueuse est isolé par chromatographie sur colonne (silice RP-18) avec un gradient de méthanol/eau allant de 1:3 to 3:2 (chaque solvant contenant 2% en volume d'acide chlorhydrique 3M). La solution contenant le produit désiré est neutralisée par du bicarbonate de sodium, le mélange est concentré puis déposé sur une colonne courte de silice RP-18. Après avoir éliminé les sels inorganiques par lavage à l'eau, le produit sous forme de sel de sodium est élué avec du méthanol. MS (ESI+): 396,2. Rendement: 575 mg (12 %) Exemple 3 : Synthèse du chlorure de 1-[2-(diéthoxyphosphoryl)-éthyl]-3,3-diméthyl-2-((1 E,3E)-4-phénylamino-buta-1,3-diényl)-3H-indolium Cl 404 mg (1,0 mmol) de bromure de 1-[2-(diéthoxyphosphoryl)-éthyl]-2,3,3-triméthyl-3H-indolium et 285 mg (1,1 mmol) de chlorhydrate du dianilide de l'aldéhyde malonique sont dissous dans 10 ml d'un mélange d'acide acétique et d'anhydride acétique (v/v = 3:2) et le mélange est agité 8 h à 60 C. After retour à température ambiante 150 ml water d'eau sont ajoutés. La solution est déposée sur une colonne de silice RP-18. After lavage avec 200 ml d'eau, le produit recherché est élué par un gradient acétonitrile/eau allant de 1:2 à 3:2 (chaque solvant contenant 2% en volume d'HCI 3M). La solution contenant le produit désiré est neutralisée par du bicarbonate de sodium, le mélange est concentré puis déposé sur une colonne courte de silice RP-18. Après avoir éliminé les sels inorganiques par !avageà l'eau le produit sous forme de sel de sodium eoté!ué avec du méthanol. MS /ES! : 453.2 Rendement: 76 mg (14 M. Exemple 4: Synthèse du chlorure de 2-{(1E,3E)-5- mmpyl11-[2- !0 Ad hyl-1,3-dAhydno-imdol-(2E)-/ 1,3-dié,wl}-l-[2-(diéthoxyphmmphoxy\)-éthVl]-3,3-dkmnéthn\-3H-indmWwm (cyanine 1 sous forme de d;éthy!phosphonmmmter) 15 01 \--O^ 0-- '* ` o O cl- 48 mg (100 pmol) chlorure de 1-Q-(d .3'dhnéthvl-3H- indo!ium ubh*nuà l'exemple 2, et 53 mg (100 pmol) de chlorure de 1'[2-(d phory)-éthyU' 20 3,3-diméth}l-2- l E'3E)-4-phény!amino-buta-1.3-diénW)-3H-indo!ium obtenu à l'exemple 3, et 25 mg (300pmo!) d'acétate de sodium oontdiaauuia dans 5 ml d'un mélange d'acide acétique et d'anhydride acétique (v/v = 3:2) et le mélange est agité 3 h à 60 C. Après concentration sous vide, le résidu est d'abord dissous dans 1 ml de méthanol, et 2 ml d'eau sont ajoutés. Le composé recherché est isolé par chromatographie sur une colonne de silice RP-18 en éluant par un gradient méthanol/eau, 25 gradient allant de 1:1 à 9:1. MS (ESI : 755,3. Rendement: 32 mg (38 %). 30 Exemple 5 : Synthèse du dérivé aminoéthylamide de la cyanine 1 sous forme de bisdiéthylphosphono ester. Afin de pouvoir greffer une molécule d'intérêt tel qu'un substrat d'une enzyme permettant un marquage intra-cellulaire, on introduit un groupement amine primaire. Une solution de la cyanine 1 sous forme de bis-diéthylphosphono ester obtenu à l'exemple 4 (160 nmol) dans 100 pI de DMF est traitée par 5 équivalents de diisopropyléthylamine, 2,5 équivalents de tert-butyl N-(2-aminoéthyl)carbamate (N-boc-éthylènediamine) et 2 équivalents de TBTU après 24 h à température ambiante le produit de départ (tn=15.7mn)eat transformé en un nouveau produit (tR = 16,8 mn). Conditions HPLC : colonne Liohroopher 100, RP18, 5 pm' 125mm x 4mm ; gradient d'acétonitrile (ACN) dans l'acide hif!u ue (TFA) à O.1% dans l'eau à 1 ml/mn. !oocretklue5% ACN 3 min' gradient linéaire de 5% à 100% en 12 min. Le produit intermédiaire obtenu, dissous dans de l'acétonitrile, est traité par l'acide trifluoroacétique (ACN/TFA: 2/1 (v/v)). Le produit possédant l'amine déprotégée (tR=1 1,5 mn) est isolé par HPLC semipréparative (colonne Grace-Vydac Protein & Peptide C18, 218TP510) débit 4 ml/mn avec un gradient ACN/TFAàO'1% dans l'eau identique au gradient analytique. Exemple 7 : Synthèse du dérivé N-Hydroxysuccinimide de la cyanine 1 sous forme de bisdiéthylphosphono ester. La cyanine sous forme de bis-diéthylphosphono ester obtenue dans l'exemple 4(1.5mg1.79 pmole) est dissoute dans 70 pI de OMFanhydre et on ajoute 1,25 pl de DIPEA et 0,55 mg de TSTU. Par analyse en HPLC (colonne Lichroapherc) 100. RP18, 54m' 125mm x 4mm ; gradient d'acétonitrile (ACN) dans [aoidetrif!uoreoétique (TFA) à0.1% dans l'eau à 1 mNnn; !aocm8i ueO% ACN 5 min, gradient linéaire de 0% éO5% en 13 min puis de 85% à 100% en 2 min) on observe la formation d'un pic présentant un temps de rétention plus long (tR=17,8 mn) que le produit de départ (tR= 17,3 mn). Ce produit est isolé par HPLC semi-préparative (colonne Grace-Vydac Protein & Peptide C18, 218TP510) débit 5 ml/mn avec un gradient ACN/TFA à O'1% dans !'emu, identique au gradient analytique. Rendement 1,1 pmo!e60%. Exemple 8 : Synthèse d'un dérivé benzylguanine de la cyanine 1 sous forme de bisdiéthylphosphono ester. La 0644-0 3-Amino-2,5,8,11-tétraoxa-tridécyl)-oxyméthyl-benzyl]guanine préparée selon le protocole de la littérature [Gendreizig S. et al. (2003). "!nduoed protein dimerization in vivo through covalent lobe!ing."J Am Cham Soc. 125(49): 14970] (0.46 pmole) dans 70 pl de DMF anhydre est traitée par 0.3 pl de O(PEAet 0.48pmo Rendement 0.30 pmole (66%). UV(H20) 643 (180 000 N[1.nm'l), 280 nm 16 800 M-l.om'l). MS : (MALD/'TOF)/!OAA(matrice =acide tryn '! m/z =118S.3(oalc. 1185.36). Exemple 9 : Synthèse d'un dérivé Benzylguanine du DY647. La 06-[4-(amino-méthyl)-benzyl]guanine préparée selon la littérature (Keppler, S. et al. (2003). "A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo" Nature Biotechnology 21(1): 86 - 89) (0,9 mg, 3,3 pmole) dans 200 pl de D1VIF anhydre est traitée par 2,5 pmole de dérivé N-hydroxysuccinimide du DY647 (analogue sulfoné de cyanine / Dyomics) pendant 16h à température ambiante. Par analyse en HPLC (colonne X'bridgo'C18.5 ym'2GOmmx 4,6 mm ; gradient d'ooétunitri!e (ACN) dans l'acide trifluoracétique (TFA) à 0,05% dans l'eau à 1 mNmn.iaocratique 10% ACN 5 min, gradient linéaire de 10% 840% en 24 mm, détection à 280 nm) on observe la disparition du pic correspondant au dérivé guanine de départ (tR=5,8 mn) et formation d'un nouveau pic présentant un temps de rétention intermédiaire (tR = 19,8 mn) plus court que le pic correspondant au réactif OY647-NHG. Ce produit est isolé parHPLC semi-préparative (colonne X-bridge C18'10mmx25Omm)débit 5 ml/mn avec un gradient linéaire ACN/TFA à 0,05% dans l'eau identique au gradient analytique. Rendement 1.60 pmo!e (64%) par rapport au DY647-NHS engagé. UV(H20) 643 (250 000 K8'1nm'l), 280 nm 16 200 M''.cm'l). LC'W1G: (ES+'TOF) m/z = 895,4 (calc. 40 Exemple 10 : Synthèse d'un dérivé Benzylguanine de la cyanine CY5. La O6-[4-(Amino-methyl)-benzyl]guanine 0.8 mg (3,3 pmole) est traitée par le dérivé N-hydroxysuccinimide de la cyanine CY5 (2,65 pmol) monoréactive (Munjumdar R .B. et al. Bioconjug. Chem. 1993, 4(2), 105-111) et 3 pmole de DIPEA dans 400 pl de DMF anhydre pendant 90 mn à température ambiante. Par analyse en HPLC (colonne Lichrospher 100, RP18, 5 pm, 125mm x 4mm; gradient d'acétonitrile (ACN) dans l'acide trifluoracétique (TFA) à 0,05% dans l'eau à 1 ml/mn. Isocratique 5% ACN 5 min, gradient linéaire de 5% à 55% en 14 min, détection à 600 nm) on observe la disparition du pic correspondant au dérivé CY5-NHS (tR = 15,5 mn) et formation d'un pic présentant un temps de rétention plus court (tR = 14,9 mn) correspondant au conjugué qui est isolé par HPLC semi-préparative (colonne Grace-Vydac Protein & Peptide C18, 218TP510) débit 5 ml/mn avec un gradient linéaire ACN/TFA à 0,05% dans l'eau identique au gradient analytique). UV(H2O) 647 (250 000 M'I.cm-l), 280 nm (14 000 M"'.cm"'). LC-MS : (ES±TOF) m/z = 909,15 (calc. 909,10). Exemple 11 : Test de perméabilité cellulaire de conjugués de la Benzylguanine avec le DY647, le CY5 et la cyanine 1 sous forme de bis-diéthylphosphono ester. Les cellules utilisées sont issues d'une lignée stable CHO exprimant le SnapTag au niveau nucléaire grâce à la séquence NLS. Les composés sont ajoutés dans le milieu de culture (milieu DMEM complémenté par 10% de SVF inactivé 30min à 60 C) à une concentration de 5 pM et laissés en contact une heure avec les cellules. Après l'incubation, trois lavages sont effectués avec du milieu de culture. Une heure supplémentaire d'incubation uniquement dans milieu est faite pour permettre le marquage du SnapTag par le substrat. Une coloration du noyau est ensuite réalisée avec le DAPI avant l'analyse microscopique. L'incubation des cellules avec les conjugués BG-DY647 et BG-CY5 produisent des images peu intenses ; en augmentant le gain on observe de la fluorescence uniquement sous forme d'un bruit de fond ce qui montre que les conjugués testés n'on pas traversé la membrane plasmique des cellules. Au contraire l'incubation des cellules avec le conjugué BG-CEP (BG-Cyanine Ethyl Phosphonate), préparé selon l'exemple 8, produit une fluorescence intense localisée à l'intérieur des cellules montrant que le composé a traversé la membrane plasmique. Les images ci-dessus sont représentées sur la figure 1. 5 Exemple 12 : Synthèse du bromure de 2-{(1 E,3E,5E)-5-[3-(3-Carboxypropyl)-1-[2-(éthoxyphosphoryl)-éthyl]-3-méthyl-1 ,3-dihydro-indol-2H-ylidène]-penta-1,3-diènyl}-1-[2-(éthoxyphosphoryl) -éthyi]-3,3-diméthyt-3H-indolium (cyanine 1 sous forme d'éthylphosphono ester) OùPùO\ O 1 /OùPùO I(" O COOH COOH Cyanine diéthylphosphono ester Cyanine éthylphosphono ester La cyanine 1 sous forme de diéthylphosphono ester de l'exemple 4 (100 nmol) est dissoute dans 100 pl de dichlorométhane (exempt d'éthanol), plus on ajoute du bromure de triméthylsilyle (12 pmol) 10 [McKenna C.E. et al. Letrahedron Lett. 18, 2 (1977), 155-158.] ; après 1 h30 on observe un précipité, on évapore la solution, reprend le résidu dans un mélange d'eau et d'acétonitrile et purifie par RP-HPLC (détecteur barette de diodes Shimadzu SPD-Ml 0A, Pompe Merck L6200A, colonne Vydac 218TP510). A : H20 contenant 0.1% TFA B : acétonitrile. Débit = 4 ml/min. Gradient linéaire de 5% ACN à 100 % d'acétonitrile en 15 min. Le produit de départ (tR=11,9 min) donne majoritairement le 15 composé recherché portant deux fonctions éthylphosphono ester (tR= 0,1 min). On observe également des pics à tR=10,6 min et à tR=9,7 min correspondant respectivement à la diphosphono cyanine portant trois groupes éthyle et un groupe éthyle. 20 Exemple 13 : Préparation des dérivés 2-{(1 E,3E,5E)-5-[3-(5-carboxypentyl)-4-éthyl-3-méthyl-5-phophono-1, 3-dihydro-2H-indol-2-ylidène]penta-1,3-dienyl}-5-phosphono-3,3-diméthyt-1 -(4-éthyl)-3H -indolium. Le procédé de synthèse de ce composé est représenté sur le schéma réactionnel 1. 25 13.1. 5-bromo-2,3,3-triméthyl-3H-indole (14a): Le 4-bromophénylhydrazine.HCI 13 (6,5 g) et la 3-méthyl-2-butanone (6,4 ml) sont dissous dans du benzène contenant une quantité catalytique d'acide acétique et le mélange est porté à reflux (16h) avec entrainement azeotropique de l'eau. Le mélange concentré est repris par de l'acide acétique 30 (70 ml) et chauffé au bain d'huile (120 C) pendant 12 heures ; on observe la formation d'un produit solide. L'analyse par HPLC (RP-18 gradient acétonitrile dans l'eau à 1% de TFA) montre la formation d'un nouveau produit. Après évaporation sous vide le résidu est repris par de l'acétate d'éthyle et lavé avec une solution saturée d'hyd ' noarbonobs de aVdium, et la phase organique est séchée ( et évaporée, le produit brut est purifié par chromatographie-Flash sur silice en éluant par un gradient d'acétate d'éthyle dans l'hexane. {}n obtient 5.5g(80%)d produit pur. `H-RyNN (CDQJâ= 7.5(1H.d) , 7.2-7.3(2H, m).2.3(3H.o) ' 1.3(6H. s).[Letcher, R.M. skoLJ. Chem. Soc. Perkin Trans., 1 (1993) 939-944]. 13.2. 5-(diéthoxyphosphono)-2,3l3-trhn ndole (15a) : Le 5-bromo-2,3,3-triméthyl-3H-indole 14a (5g , 21 mmol) est dissous dans du toluène (5m!); on dégaze puis on ajoute de la triéthylamine (3,2 m!), du diethylphosphite (3m!) et du tétrakiu(triphén}4phoaphine)'paUadium(0) (1'2 g); on chauffe à8O"C pendant 3h sous azote et sous agitation. On chromatographie (chromatographie flash) sur silice en éluant avec un gradient d'acétate d'éthyle dans l'hexane. On obtient 3 g (48%) de produit pur. 1H'Rk8N(CDQ3)8 =7.7 (2H.m) ,7.6 (1H' 13.3. 5-(dîéthoxyphosphono)-l-éthyl-2,3,3-triméthyl-3H-indolium iodure (16a): Le 5-(diéthoxyphosphono)-2,3,3-triméthyl-3H-indole 15a (3g) est traité par de l'iodure d'éthyle (10 ml) à reflux 16h sous azote. L'iodure d'éthyle est évaporé sous vide et le résidu est trituré avec de l'hexane, collecté par centrifugation et séché. Il est utilisé tel quel pour la réaction suivante. 13.4. ono)-1 '3,3-trhnethyl-3H- indo!iumbromuna: Le 5-(diéthoxyphosphono)-2,3,3-triméthyl-3H-indolium 16a est traité par un excès de bromure de triméthylsilyle dans le dichlorométhane (5 ml) selon le protocole de la littérature [McKenna C.E. et al. LetraheoromLe/t 18.2 (1977). 155-1581. On obtient ainsi le dérivé complètement déprotégé sous la forme "acide phwophoniquo"17a. 13.5. Préparation du3,3-dhnédhvl-1 1E,3 ino-buta+1,3-dëmy0-5-(phouphono)-3H'indoiumoh!oruny(1B): Le bromure de 1 ,3^3-triméthv'38-indolium 17a (10 mmol) est traité par de l'anhydride acétique (10 ml) et du diani!ideda l'aldéhyde malonique (20 mmo!) ; on laisse réagir 8h à 60 C. On refroidit, ajoute de l'éther (50 ml) et de l'hexane (50 ml), puis on sépare le produit huileux (qui est yand recherché) par déoantatinn, on purifie par chromatographie (RP-18 exemple 3) pour donner l'anil 18. Rendement: g (40%). 13.6. Préparation du 5-bromo-3-(5-carboxypentyl)-2,3-diméthyl-3H-indole U4b\: Le 4-Bromophénylhydrazine, HC!13 (6.5g) et l'acide 7-méthyl-8-oxo-nonanoique (6,7 g) [préparé à partir du 2-méthylacetoacetate d'éthyle et du 6-bromohexanoate d'éthyle selon le procédé décrit par LEUNG, Wai-Yee dans le WO 02/26891] sont portés à reflux dans de l'acide acétique (50 ml) pendant 5 heures. Après évaporation le produit est purifié par chromatographie-Flash sur silice. (rendement40 13.7. Préparation du 3-(5-Carboxypentyl)-5-(diéthoxyphosphono)-2,3-diméthyl-3H-indole (15b) : Le 5-bromo-3-(5-carboxypentyl)-2,3-diméthyl-3H-indole (14b) est traité par le diéthylphosphite comme décrit dans l'exemple 132 pour donner le dérivé 15b. 13.8. Préparation du iodure de 3-(5-Carboxypentyl)-5-(diéthoxyphosphono)-2, 3-diméthyl-1-éthyle-3H-indolium (16b) : Le 3-(5-Carboxypentyl)-5-(diéthoxyphosphono)-2,3-diméthyl-3H-indole (15b) est traité par l'iodure d'éthyle (voir exemple 13.3) pour donner le composé 16b. 13.9. Préparation du bromure de 3-(5-Carboxypentyl)-2,3-diméthyl-1-éthyl-5-(phosphono)-3H-indolium (17b) : Le iodure de 3-(5-Carboxypentyl)-5-(diéthoxyphosphono)-2, 3-diméthyl-1-ethyle-3H-indolium (16b) est traité par le bromure de triméthylsilyl (voir exemple 13.4) pour donner le composé 17b. 13.10. Diphosphonocyanine fonctionnalisée carboxylate (19 2-{(1 E,3E,5E)-5-[3-(5-carboxypentyl)-3-m éthyl-4-éthyl-5-phophono-1,3-dihydro-2H-indol-2-ylidène]penta-1,3-diényl} -5-phosphono-3,3-diméthyl-l-(4-éthyl)-3H-indolium : L'anil 18 (g, 7 mmol), et le bromure de 3-(5-Carboxypentyl)-2,3-diméthyl-1-éthyl-5-(phosphono)-3H-indolium (17b) sont dissous dans le diméthylformamide (10 ml), on ajoute de la triethylamine (1 ml) et de l'anhydride acétique (1 ml) et chauffe à 60 C pendant 1 heure. On refroidit, ajoute de l'éther éthylique (50 ml), et le précipité est collecté repris par de l'acide chlorhydrique dilué (2 N) puis purifié par chromatographie (Lichroprep Merck C18) en éluant avec 1 ) une solution d'acétate de sodium (1,5 mM) 2 ) de l'eau distillée ; le produit recherché 19 est ensuite élué par un mélange éthanol-eau (4/6). On obtient ainsi la diphosphonocyanine 19 sous la forme de sel de sodium. A côté de la diphosphonocyanine 19 recherchée on observe aussi la présence d'une diphosphocyanine non fonctionnalisée 20 provenant du couplage de 18 sur le composé 17a contaminant 18, ces deux composés étant séparables par chromatographie en phase inverse. HPLC (détecteur barette de diodes Shimadzu SPD-Ml 0A, Pompe Merck L6200A, colonne Vydac 218TP510). A : H2O contenant 0.1% TFA B : acétonitrile. Débit = 4 ml/min. Gradient linéaire de 5% ACN à 60% acétonitrile en 23 min. Composé 19 : tR=14,8 min. (N.B. le composé 20 présente un tR = 14 min dans les mêmes conditions). Rendement: 0,5 g (8%). Masse (ES-) m/z = 669,3 (100%) (ES+) m/z = 671,2 (60%). Spectre UV-Vis : 2 max (tampon PO4 0,1 M pH 7) = 649 nm (ee49 98 000 M-1.cm -1) ratio A649/A604 = 2,6. Spectre de fluorescence : Mesure sur appareil Perkin-Elmer LS50 , les échantillons ont été dilués dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7 contenant 0.1 % BSA (absorbance maximum = 0, 04 à la longueur d'onde d'excitation). Excitation : 600 nm (10nm). Emission (max) = 670,5nm (rendement quantique = 13%). Exemple 14 : Diphosphonocyanine tetraester fonctionnalisée amine (II): (voir schéma réactionnel 2) 141. Dérivé N-Boc (21 : La Diphosphonocyanine fonctionnalisée carboxylate 19 (24 mg, 32.6 pmol) est dissoute dans le DMF (2 ml) et on ajoute 9 pl de DIPEA et une solution de TSTU (35 mg dans 500pl de DMF). Après 20 min on ajoute le dérivé mono-BOC de l'éthylène diamine. Après 1h de réaction on purifie par RP-HPLC comme décrit dans l'exemple 12. On obtient ainsi le dérivé N-BOC 21. MS (ES+) m/z = 811,6 (100%) calculé pour C41 H55N4O9P2 . 14.2. Dérivé N-Boc de la Cyanine di-(phosphono-mono-ester méthylglycolique) (22 : Le dérivé N-BOC (21) (3 mg, 4,7 pmol) est repris par du DMF anhydre (550 pl), on ajoute de la triéthylamine anhydre (distillée sur hydrure de calcium, 14 pl, 100pmol) du méthyl bromoacétate (10pl, 105pmol). On chauffe à 70 C pendant 16h sous argon. Le mélange réactionnel est purifié par RP-HPLC comme décrit dans l'exemple 12 (colonne Vydac 218TP510 , A : H2O contenant 0.1% TFA B : acétonitrile. Débit = 4 mI/min. Gradient linéaire de 5% ACN à 100 % d'acétonitrile en 40 min). Le produit de départ (tR=16 min) a donné majoritairement le composé recherché 22 portant deux fonctions phosphono ester glycolique (tR = 22.6 min). Rendement 15 %. MS (ES+) m/z = 957,5 (100%) calculé pour C47H66N4O13P2• 14.3. Dérivé N-Boc de la Cyanine di(phosphonodiester méthylique et méthylglycolique) (J : Methode A. Le dérivé phosphono ester monoglycolique (22) est traité par l'iodure de méthyle, on obtient ainsi le dérivé 23 portant ayant chaque groupe phosphonate sous la forme phosphono diester méthyle et méthyle glycolique. Methode B. Le dérivé phosphono ester monoglycolique (22) dans le DMF est traité par du BOP en présence de méthanol pour donner le produit 23. Le produit est purifié par RP-HPLC (colonne Vydac 218TP510 , A : H2O contenant 0.1% TFA B : acétonitrile. Débit = 4 mI/min. Gradient linéaire de 5% ACN à 100 % d'acétonitrile en 40 min). On observe majoritairement le composé recherché 23 (ta = 31,7 min). Rendement 50 %. UV(H2O/ACN , 1 :1) ; 7 14.4. Cyanine di-(phosphonodiester méthylique et méthylglycolique) fonctionnalisée amine (M): La cyanine di-(phosphonodiester méthylique et méthylglycolique) 23 est traitée par l'acide 35 trifluoracétique dans le dichlorométhane (30 min à 20 C) ; après évaporation du solvant le produit est purifié par RP-HPLC. On obtient ainsi la cyanine tétraester fonctionnalisée amine 24. Exemple 15 : Synthèse d'un dérivé benzylguanine de diphosphonocyanine tétraester (26): La cyanine 24 est traitée par le dérivé NHS 25 obtenu a partir de du glutaramide obtenu par réaction de l'anhydride glutarique sur la 06-[4-(Amino-methyl)-benzyl]guanine préparé selon la littérature (Keppler, S. et al. (2003) Nature Biotechnology 21(1): 86 - 89). On obtient ainsi le composé 26. Exemple 16. Dérivé benzyl-guanine de la Cyanine di-(phosphonodiester méthylglycolique) (.U): (voir schéma réactionnel 3) Le dérivé phosphono ester monoglycolique (22 dans le DMF est traité par du BOP en présence de méthyl glycolate pour donner le produit 27. Le produit est purifié par RP-HPLC (colonne Vydac 218TP510, A : H2O contenant 0.1% TFA B : acétonitrile. Débit = 4 ml/min. Gradient linéaire de 5% ACN à 100 % d'acétonitrile en 40 min). On observe le composé portant trois fonctions esters méthylglycolique (tR=29,9 min) ainsi que le composé recherché 27 portant quatre fonctions esters methylglycolique recherché. Rendement 20 %. MS (ES+) m/z = 1102. Calculé pour C53H75N4O17P2. Le dérivé 27 est traité 15 min dans l'acide trifluoracétique pur pour enlever le groupe protecteur BOC, puis, après évaporation sous vide et coévaporation au toluène, le produit 28 ainsi obtenu est repris par du DMF contenant de la DIPEA et traité par l'ester de NHS 29 obtenu par réaction d'un excès de DSS (di-succinimidyl suberate) sur la 06-[4-(amino-méthyl)-benzyl]guanine dans le DMF (le produit 29 est purifié par RP-HPLC dans des conditions semblables à celles utilisées pour la purification des cyanines dans les exemples précédents). Le composé recherché 30 portant quatre fonctions esters méthylglycolique et fonctionnalisé par un groupe benzyl-guanine est obtenu après purification par RP-HPLC (colonne Vydac 218TP510, A : H2O contenant 0,1% TFA B : acétonitrile. Débit=4 ml/min. Gradient linéaire de 5% ACN à 100 % d'acétonitrile en 40 min). Exemple 17 : Comparaison des rendements quantiques de différents dérivés de Cyanine : Les fonctions esters de phosphate/phosphonate des dérivés de cyanine selon l'invention, sont hydrolysées dans la cellule par les enzymes cellulaires en fonction phosphate/phosphonate ; Les rendements quantiques des dérivés de cyanine portant des groupes phosphonates, correspondant donc aux composés selon l'invention tels qu'ils sont présents dans la cellule, après hydrolyse des fonctions esters, ont été mesurés, afin de déterminer si la position des groupes esters de phosphate/phosphonate a une influence sur les propriétés photophysiques des composés.35 Longueur d'onde Longueur d'onde Rendement d'absorption d'émission quantique (0k) max. (nm) max. Ho Ho 649 642 670 666 13% Ces résultats montrent que les cyanines comportant des fonctions phoephonabeaeu niveau des cycles indoles ont un rendement quantique 3 fois plus élevé que celles comportant des 5 phosphonates au niveau des azotes des cycles indoles. Schéma réactionnel 1 OH NùNH 2 H 14a 13 CH3 14b CH3 15b o o-P o 17a Ph Ph N ,Ph Ho o Pro -o o o -o 19 Schéma réactionnel 2 HO H3C,0 0_CH3 O H3C,0 ,CH, H3C~ O O.p - O O I-O P O REVENDICATIONS 1. Dérivés de cyanine de formule : R1 ^ --~~^ -~~m~~~~~ (1) dans laquelle les lignes en pointillés représentent les atomes nécessaires à la formation d'un ou deux 5 cycles aromatiques fusionnés, chaque cycle comportant 5 ou 6 atomes de carbone ; RI, R2, R8, R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : 'unatome d'hydrogène v~ . - un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ; - ungnoupao]hoxvenCrCs; - un groupe C2-C12 dialkylamino; - un groupe C1-C6 aikoxycarbonyle; - un groupe C2-C12 dialkylamido; un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué; unatome d'halogène o~ . un groupe nitro ; un groupe choisi parmi : L1-W, L2-M,L2'A,[2-G ; Rs R6 représentent indépendamment l'un de l'autre : - un groupe alkyle en CI-C,6 substitué ou non-substitué ; -ungnoupeeryenueryla!kv!eaubstitué ou non-substitué ; - un groupe choisi parmi : L1 -W, L2-M, L2-A, L2-G ; X est choisi parmi : 0\S, CRrRo; 25 y est choisi parmi : 0, S, CRyRIn; R7, R8, R9, Rio représentent indépendamment : - un groupe alkyle en CI-C,6 substitué ou non-substitué ; - un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ; 30 -ungnoupeuhoiaiparmi: L1'W, L2'K8.L2-A.L2'G ; R7 et R8 et/ou R9 et R10 peuvent également former ensemble un cycle à 5 ou 6 atomes ou un hétérocycle comprenant 4 à 5 atomes de carbone et un atome d'oxygène ; !0 15 20 25 30 35 40 B représente un pont polyméthine comportant 1 à 5 méthine, dans lequel les groupes méthine sont individuellement non-substitués ou substitués par un groupe choisi parmi : - un groupe alkyle en C1-Ct5 substitué ou non-substitué ; - un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ; - un groupe nitro ; un groupe choisi parmi : L1-W, L2-M, L2-A, L2-G, ou bien deux substituants de méthines adjacentes peuvent former ensemble un cycle hydrocarboné saturé ou insaturé à 4, 5 ou 6 atomes, éventuellement substitué une ou plusieurs fois par un groupe choisi parmi : un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ; - un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ; - un atome d'halogène ; - un groupe nitro ; -un groupe choisi parmi : L1-W, L2-M, L2-A, L2-G, 15 L1, L2 sont des bras de liaison, G est un groupe réactionnel, A est un agent de couplage, M est une molécule conjuguée, W est un ester (de préférence diester) de phosphate ou de phosphonate: 20 sous réserve que le dérivé de cyanine comporte au moins un groupe Li-W et au moins un groupe choisi parmi : L2-A, L2-G et L2-M. 2. Dérivés selon la revendication 1, répondant à l'une des formules ci-après : R5 10 10 15 20 25 30 35 40 dans lesquelles les groupes R1-R6, X, Y et B sont tels que définis dans la revendication 1. 3. Dérivés selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que pont po/yméthinaB est choisi parmi les formules suivantes : (1n R16 R15 R1 R15 n`s dans lesquelles R15, R16 sont choisis parmi : -unabomed'hydrugène; -unQnoupea]kvle en CI-C,5 substitué ou non-substitué ; - un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué; un atome d'halogène ; - un groupe nitro ; - un groupe choisi parmi: L2'M, L2'A,L2-G,L1-VV. L1, L2 sont des bras de liaison, G est un groupe réactionnel, A est un agent de couplage, M est une molécule conjuguée, W est un ester (de préférence diester) de phosphate ou de phophonate. 4. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que X est le 20 groupe CR,R5 et/ou Yeat le groupe CR9RIo, en ce que un ou deux groupes R1-R4 représentent un groupe L1-W, et en ce que un ou deux groupes R7-R10 représentent L2-A, L2-G ou L2-M. 5. Dérivé de cyanin*oelon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que X est le groupe CR7R5 et/ou Y est le groupe CR9R10, en ce que R5 et/ou R6 représentent un groupe Li -W, et 25 en ce que un ou deux groupes R7-R10 représentent un groupe L2-A, L2-G ou L2-M. 1.0 6. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R5 et/ou R6 représentent un groupe L1-W, et en ce que R15 ou R16 représente un groupe L2-A, L2-G ou L2-M. 7. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que un ou 5 deux R1-R4 représentent un groupe L1-W et en ce que R15 ou R16 représente un groupe L2-A, L2-G ou L2-M. 8. Dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le groupe W est un diester de phosphonate. 9. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'ester de phosphate ou de phosphonate W est choisi parmi les composés de formules suivantes : 15 0 ù P ù 0 ù CHR1 R13 0 ù CHR12R14 P ù 0ù CHR11R13 OH 0 ùOùPùOùCHRIIR13 0 ù CHR12R14 O -0ùP ùOùCHRIIRI3 OH 20 25 dans lesquelles : R11 et R12 sont identiques ou différents et sont choisis parmi : - un atome d'hydrogène ; - un groupe alkyle en C1-05 non-substitué, R13, R14 sont identiques ou différents et sont choisis parmi : - un atome d'hydrogène; - ungroupeedkvle en CI-C15 non-substitué ; - un groupe alkoxycarbonyle en C1-C6,; - un groupe alkylcarboxyle en C1-C6; 'ungroupe N.N'die!ky!amido en C2-C12 ; 'ungroupe amidn; - un groupe de formule ûC-S-CO-Alk, Alk étant un alkyle linéaire ou ramifié non substitué, en C1-C4 ; Rn et R12 et/ou R13 et R14 peuvent également former ensemble un groupe phtalidyle de formule : 15 10. Dérivé de cyanine selon la revendication 9, caractérisé en ce que W est un diester de phosphonate de formule : ù P ù CHR1 R13 20 dans laquelle : HI1 ekR12 sont identiques et sont choisis parmi: - un atome d'hydrogène; - un groupe alkyle en C1-05 non-substitué ; 25 R13 et R14 sont identiques et sont choisis parmi les groupes suivants : 'méthy!carboxy!(='O'C{}-CH =ester d`aoétoxyméthy!e); -hartiobudy\ca,boxy! (= -{J-C[>-C(CHu)n= ester detriméthy>acétoxynnéthWe) ; 'méihy!onyoarbony!(='C(]-OCHa=ester daméthy/g!yco!ete) ; 'méthenamido(=-CO'NHo=ester deg!yco!amide) ; 30 -N.N'diméthy!màhunaDnide(=-CO'N(CHx)z=oaterdeg!yoo(amideeubuhtué); -N'méthy!mb{honamide. 10 11. Dérivé de oyaninene!on l'une quelconque des revendications 1 à Io, caractérisé en ce que les bras de liaison L1 et L2 sont choisis parmi : une liaison covalente simple ou un bras d'espacement comprenant da1 à 20 atomes différents de l'hydrogène choisis parmi les atomes de carbone, azote, phosphore, oxygène et soufre, ce groupe de liaison étant linéaire ou ramifié, cyclique ou hétérocyclique, saturé ou insaturé, et constitué d'une combinaison de liaisons choisies parmi: les liaisons carbonecarbone qui peuvent être simples, doubles, triples ou aromatiques; les liaisons carbones-azote; les liaisons azotes-azote; les liaisons carbone-oxygène; les liaisons carbone-soufre; les liaisons phosphore-oxygène; les liaison phosphore-azote ; les liaisons éther; les liaisons ester ; les liaisons thioéther; les liaisons am/ne; les liaisons amide; les liaisons carboxamide; les liaisons sulfonamide; les liaisons urée; les liaisons urethone; les liaisons hydrazine; les liaisons carbamoyle. 12. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 1, caractérisé en ce que le groupe de liaison Lcomprend de1à 20 atomes, différents de l'hydrogène, choisis parmi les atomes de carbone, azote, phosphore, oxygène et soufre et comprend en outre au moins une liaison choisie parmi les liaisons éther, thioéther, carboxamide, sulfonamide, hydrazine, amine, ester et des liaisons aromatiques ou hétéroaromatiques. 13. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le groupe de liaison L est choisi parmi les chaînes substituées ou non substituées suivantes : 14. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 13,caractérisé en ce que le groupe réactionnel G est choisi parmi les groupes dérivés des composés suivants : une acrylamide, une amine activée (par exemple une cadaverine ou une éthylènediamine), un ester activé, un 25 a)déhvd , un halogénure d'alkyle, un onhydride, une ani!ine, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, undiazoo/kano' uneha!oeuétemide' une ha/ctriazino.telle quemnnoch!orothazinn' la dioh!ontriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de su!fony!e, ou thiol, une cétone, une amine, un halogénure d'aoide, un hydroxyeuuo/nimidyl ester, un hydroxysulfosuccinimidyl ester, un 30 azidonitrophényl, unazidophényi. une3'(2'pyridy! dithio)-pnopionamide, glyoxal et en particulier les groupes de formule: - U 8 ~~ U 0 ~~ U () ~ ~ ) ~~~ -- ` / ~ " ' KCBju -{~-0-y4 {~ùNB / ` ^ ` 'P 0 O CùND -. N \ ~ \ /. O o[ ~ ^ 3 ~ ~~--p~B C H2)nNCO ` ' ( _ ` ~ '' \ /p ^^ ~_- / 'p [ùNH 15. Dérivé de cyanine selon la revendication 14 caractérisé en ce que le groupe A est choisi parmi : la benzylguanine ou un de ses dérivés substrat de l'alkylguanyl transférase ; un haloalcane substrat de l'haloalcane déhalogénase en particulier un chloroalcane ; un anticorps ; un fragment d'anticorps ; un aptamère protéique ; la biotine, un composé bi-arsenic, le triméthoprim, le méthotrexate, SLF'. 16. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le groupe M est une biomolécule choisie parmi : les acides nucléiques, les protéines, les sucres, les lipides, les peptides, les oligonucléotides, les intermédiaires métaboliques, les enzymes, les hormones, les neurotransmetteurs 17. Utilisation d'un dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 en tant que marqueur fluorescent. 18. Méthode de marquage d'une biomolécule présente dans une cellule, caractérisée en ce qu'elle 15 consiste à introduire dans le milieu extracellulaire un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, comportant un agent de couplage A, ladite biomolécule comportant un domaine de couplage. 20