FR 2909879 A1 20080620 FR 0610855 A 20061213 1 DESCRIPTION DU BREVET UTILISATION D'UN HEPTAPEPTIDE À ACTIVITÉ ANXIOLYTIQUE POUR LA PRÉPARATION DE MÉDICAMENTS ET DE COMPLÉMENTS ALIMENTAIRES La présente invention est relative à l'utilisation d'un heptapeptide à activité anxiolytique issu de la caséine as, pour la préparation de médicaments, compléments alimentaires et de produits alimentaires. 10 La caséine donne, par diverses techniques de fractionnement, les principales fractions qui sont dénommées : caséine K, caséine 8, caséine as, et caséine as2. Les séquences en acides aminés de ces caséines sont bien connues, en particulier celle de la caséine as, a été déterminée par MERCIER et al. (1) et NAGAO et al. (2).11 a été montré que certains fragments peptidiques de ces différentes caséines ont des activités biologiques diverses et notamment des activités opiacées ou 15 anti-opiacées et des activités inhibitrices de l'enzyme de conversion de l'angiotensine I. Ainsi, les peptides 90-96 et 90-95 de la caséine as, ont une nette activité opiacée [ZIOUDROU et al. (3) et LOUKAS et al. (4)]. Les peptides 23-34 et 194-199, quant à eux, sont des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine I [MARUYAMA et SUZUKI (5) et MARUYAMA et al. (6)]. Un peptide présentant une activité originale de type anxiolytique a été mis en évidence dans un 20 hydrolysat trypsique de caséine as, [Brevet, MICLO et al. (7)] Il correspond au fragment 91-100 et a été nommé a-casozépine [MICLO et a/. (8)]. La structure de ce décapeptide a été étudié par 1HRMN bidimensionnelle. La séquence comprise entre les résidus de glycine 93 et de leucine 99 adopte, en milieu micellaire, une structure en hélice 310 initiée et terminée par un tour d'hélice a. Les chaînes latérales des résidus hydrophobes se situent sur la même face de l'hélice alors que 25 les chaînes latérales des résidus hydrophiles se situent sur l'autre face, ce qui confère un caractère amphiphile au peptide et peut lui permettre des interactions avec les membranes. Les interactions ioniques entre le groupement guanidinium du résidu d'arginine 100 et les groupements carboxyliques des résidus d'acide glutamique 96 et d'arginine 100 montre le rôle capital du résidu d'arginine carboxy-terminal dans la stabilisation de la structure hélicoïdale. Dans une telle 30 structure, les noyaux aromatiques des deux résidus de tyrosine en position 91 et 94 sont orientés de telle façon que la distance entre leur centre (0,56 nm en moyenne) est comparable à la distance observée entre les centres des noyaux aromatiques du nitrazépam, benzodiazépine connue pour ses propriétés anxiolytiques [LECOUVEY et al. (9)]. La substitution du résidu d'arginine 100 par un résidu d'alanine diminue fortement l'hélicité du décapeptide et il en résulte une diminution de 35 l'affinité de ce peptide pour le site benzodiazépine du récepteur GABAA d'un facteur 300.000 [Thèse Céline Frochot, (10)]. Ce décapeptide, après absorption orale, peut subir des attaques protéolytiques par les enzymes du tractus digestif ce qui peut diminuer sa biodisponibilité et par conséquent l'empêcher d'atteindre sa cible biologique. Or il est bien connu pour les petits peptides que l'absorption entérocytaire est plus 40 efficace que celle de fragments plus importants et que leur résistance vis-à-vis des protéases 2909879 2 digestives est accrue. Ainsi, parmi les fragments générés au cours de la digestion du décapeptide, certains pourraient être plus absorbables et plus résistants, mais au vu des données structurales issues du décapeptide, sans pouvoir conserver la moindre activité de type anxiolytique. 5 De manière surprenante un heptapeptide obtenu par hydrolyse enzymatique du décapeptide et ne contenant pas le résidu-clé d'arginine 100 montre dans des tests comportementaux in vivo chez le rat des propriétés anxiolytiques. Ainsi la présente invention a pour objet l'utilisation de l'heptapeptide ayant la séquence en acides 10 aminés : Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln pour la préparation de médicaments destinés au traitement de l'anxiété. L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques contenant à titre d'ingrédient actif une quantité efficace dudit heptapeptide en combinaison avec un véhicule pharmaco-15 cinétiquement acceptable. L'invention concerne également les compléments alimentaires contenant à titre de principe actif ledit heptapeptide de la caséine as,. Ces compléments alimentaires conviennent pour supplémenter l'alimentation des personnes sujettes notamment à l'anxiété. Les médicaments utiles pour le traitement de l'anxiété par l'heptapeptide défini selon l'invention peuvent être administrés par différentes voies d'administration, en particulier par voie orale ou par voie parentérale. 25 Pour une administration par voie orale, les compositions selon l'invention peuvent être sous forme de comprimés, gélules, poudres, granulés toutes autres formes administrables par voie orale. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent en outre contenir des véhicules pharmaco-cinétiquement acceptables couramment utilisés pour la préparation de formes orales. Pour l'administration par voie parentérale, on pourra utiliser des solutions salines isotoniques, des solutions injectables qui peuvent contenir des agents de dispersion compatibles. L'heptapeptide peut être utilisé comme principe actif soit dans des composés alimentaires en 35 combinaison avec des supports alimentaires de nature protéique ou glucidique, soit dans des produits alimentaires destinés à une alimentation particulière. L'invention va être maintenant décrite plus en détail par les exemples ci-après non limitatifs. 20 30 40 1. Modalités d'obtention de l'heptapeptide 2909879 3 La caséine entière est obtenue à partir du lait par précipitation acide et neutralisation à l'aide d'un alcali selon des procédés bien connus. Par exemple, on peut utiliser la méthode de NITSCHMANN et LEHMANN (11). La caséine aS1, utilisée comme produit de départ pour l'obtention de 5 l'heptapeptide selon l'invention, peut être obtenue par les procédés classiques bien connus de l'homme du métier à partir du lait, de caséines entières, de caséinates et de concentrés de protéines totales du lait, obtenus par exemple selon les procédés décrits par THOMSON (12) et MAUBOIS (13). Par exemple, on peut préparer la caséine as1 en mettant en oeuvre la méthode décrite par SANOGO et al. (14). Cette méthode est une méthode de fractionnement sur DEAE- cellulose utilisant un gradient discontinu de chlorure de calcium comme éluant. Elle présente l'avantage de séparer rapidement l'ensemble des caséines. Elle peut être avantageusement mise en oeuvre avec, comme support échangeur d'anions, la DEAE-cellulose DE 52 [commercialisée par WHATMAN Ltd, Springfeld, Grande-Bretagne] qui est une résine pré-conditionnée ne nécessitant aucun pré-cycle acido-basique avant sa première utilisation. L'heptapeptide ayant la séquence en acides aminés ci-après : Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln de masse moléculaire de 884 Da, correspond au peptide 91-97 de la caséine as1. Il peut être obtenu à partir de la caséine (41 par hydrolyse enzymatique, en particulier à l'aide de la trypsine et ensuite de la pepsine. L'hydrolyse par la trypsine de la caséine aS1 libère des fragments peptidiques divers. L'ensemble des fragments trypsiques subissent une hydrolyse par la pepsine A (EC 3.4.23.1) (issu de muqueuse gastrique porcine, avec une activité de 3.200-4.500 unités/mg de protéine), dans un rapport E/S=1/200 à un pH acide, dans un tampon et à une température optimum pour l'activité de l'enzyme pendant 240 minutes. Cette dernière hydrolyse libère de nouveaux fragments dont l'heptapeptide 91-97 de la caséine as1. L'heptapeptide peut être ensuite concentré ou isolé par chromatographie liquide haute perforrnance (CLHP) en phase inversée, par chromatographie liquide haute performance d'échange d'anions ou par chromatographie de gel filtration de seuil 1.000 Da ou par centrifugation sur membrane et autres techniques de séparation sur membrane (microfiltration, ultrafiltration, etc.). L'heptapeptide peut aussi être obtenu par synthèse peptidique selon les procédés bien connus de l'homme de l'art, tels que ceux décrits par exemple par MERIFFIELD (15). 2. Etudes pharmaco-comporternentales chez le rat Wistar 2.1. Enfouissement défensif conditionné 2.1.1. Principe Le test de l'enfouissement défensif conditionné a été utilisé pour mesurer le niveau d'anxiété chez le rat. Développé par PINEL et TREIT (16), ce test est basé sur la tendance innée des rongeurs, 2909879 4 placés dans un environnement familier, à enfouir tout objet perçu comme dangereux en projetant sur celui-ci la litière présente au niveau du sol. L'expression du comportement d'enfouissement par l'animal est représentatif de son niveau d'anxiété : plus il est anxieux, plus il enfouit. Ainsi, une électrode délivrant un choc unique de faible intensité provoque l'apparition du comportement 5 d'enfouissement chez le rat et l'administration de molécules à propriétés anxiolytiques réduit significativement la durée d'expression de ce comportement. 2.1.2. Appareillage 10 Le test se déroule dans une boîte en Plexiglas (44 x 28 x 18 cm) dont l'une des parois présente un orifice permettant d'insérer une électrode (7 x 2 x 0,5 cm). Le fond de la boîte est recouvert d'une épaisse couche de sciure (5 cm). L'électrode est reliée à un générateur délivrant un courant d'une intensité de 1 mA lorsqu'il est activé par l'expérimentateur. L'ensemble de l'expérimentation est réalisé en lumière de faible intensité. 15 2.1.3. Protocole L'expérimentation se compose d'une phase d'habituation de 2 jours suivie d'une phase de test. Lors de la phase d'habituation, les rats sont placés 20 min par jour dans la boîte de test, sans 20 l'électrode, de manière à les habituer au dispositif expérimental. Lors de la phase de test, chaque rat est placé individuellement dans la boîte qui contient l'électrode. Lorsque l'animal touche l'électrode pour la première fois, il reçoit un unique choc. A partir de cet instant, son comportement est filmé pendant 5 min et les variables comportementales quantifiées. 25 2.1.4. Observations La durée totale d'enfouissement et la latence d'apparition du comportement d'enfouissement après le choc sont les variables les plus importantes. Est également comptabilisé un certain nombre de comportements orientés vers l'électrode et corrélés avec le niveau d'anxiété du rat (approches, 30 fuites, contacts). Enfin, des indicateurs du niveau d'activité du rat tels que le nombre de redressements sont relevés. 2.2. Traitements 35 L'étude a portée sur 23 rats répartis en trois groupes : un groupe témoin (8 rats) ayant reçu 1 mL/kg de sérum physiologique [NaCl 0,9% (m/v)], - un groupe traité avec du diazépam (Valium , Roche, Neuilly-sur-Seine, France) à la dose de 0,5 mg/kg (8 rats) servant de contrôle positif, 2909879 5 un groupe traité avec le fragment 91-97 de la caséine aS1, préalablement dissous dans une solution de NaCl 0,9% (m/v), à la dose de 0,5 mg/kg (7 rats). Les animaux reçoivent leur traitement respectif par voie intra-péritonéale une demi-heure avant le 5 passage dans le test d'enfouissement défensif conditionné. 2.3 Résultats L'effet de l'injection intrapéritonéale chez le rat Wistar de 1 mL/kg de NaCI 0,9 % (m/v) (n=8), ou de 10 0,5 mg/kg de diazépam (n=8) ou de 0,5 mg/kg de l'heptapeptide CN as,-(f91-97) (n=7) sur la durée d'enfouissement d'une sonde aversive après un choc unique de 1 mA a été étudiée par analyse de variance non paramétrique (Kruskall-Wallis) et les comparaisons de moyennes ont été réalisées par le test de Mann-Whitney (a,b moyennes pour chaque traitement significativement différentes p REVENDICATIONS 1. Utilisation de l'heptapeptide ayant la séquence en acides aminés ci-après : Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln caractérisé en ce qu'il est utilisé pour la préparation de médicaments pour le traitement de 5 l'anxiété. 2. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent à titre de principe actif une quantité efficace de l'heptapeptide ayant la séquence en acides aminés ci-après : Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln en combinaison avec un véhicule pharmaco-cinétiquement acceptable. 3. Compléments alimentaires, caractérisés en ce qu'ils contiennent une quantité efficace de l'heptapeptide ayant la séquence en acides aminés ci-après : Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln en combinaison avec des supports alimentaires de nature protéique ou glucidique. 15 4. Produits alimentaires destinés à une alimentation particulière caractérisé en ce qu'il contient une quantité efficace de l'heptapeptide ayant la séquence en acides aminés ci-après : Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gin. 10