FR 2913336 A1 20080912 FR 0753728 A 20070308 La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de l'algue Phaeodactylum tricornutum comme agent cosmétique dépigmentant ainsi qu'une méthode de soin cosmétique de la peau destinée à atténuer ou supprimer les taches pigmentaires ou à éclaircir le teint, les poils ou les cheveux. De nombreux agents dépigmentants sont connus dans l'état de la technique antérieur. Le protéasome est un complexe protéolytique multienzymatique intracellulaire très important dans la maintenance cellulaire puisqu'en charge notamment de l'élimination des protéines endommagées (Friguet B. et al., Protein degradation by the proteasome and its implication in ageing, Ann NY Acad Sci (2000) 908:143-154). Le système pmtéasomal est constitué d'un complexe catalytique, le protéasome 20S et de plusieurs composants régulateurs qui influent sur son activité et sa spécificité. L'association du régulateur 19S au protéasome 20S forme le protéasome 26S qui assure la dégradation des protéines ubiquitinées. Le protéasome est localisé dans les cellules de mammifères à la fois dans le cytosol et le noyau, et il existe des interactions avec le reticulum endoplasmique et la membrane cellulaire. Le protéasome 20S a une masse moléculaire de 700 kDa et est composé de 14 sous-unités différentes codées par des gènes soit de type a. soit de type J3. Les 14 sous-unités sont arrangées comme un empilement cylindrique de 4 anneaux de 7 sous-unités, les anneaux apicaux étant constitués de sous unités a et les anneaux centraux de sous-unités 8. Ce complexe protéolytique clive préférentiellement les protéines à l'extrémité C-terminale des résidus basiques (activité "trypsine-similaire"), hydrophobes (activité "chymotrypsine-similaire") et acides (activité "peptidylglutamyl-peptide hydrolase"). Ces activités peptidases sont portées par 3 sous-t étés R différertses et sont localisée- à l'intérieur la structure, évitant ainsi la dégradation intempestive des proteines lulaires mais posant le problème de l'accessibilité des sites actifs à leurs )strats potentiels. Enfin, au cours du vieillissement cellulaire, on assiste une accumulation de protéines endommagées porteuses de iupements carbonyl{ 1-1f iifiratinnc ries aminnariric3c35 aging epidermal cells. J Gerontol A Biot Sei. (2000) 55A : B220-227 et Friguet B., Oxidized protein degradation and repair in ageing and oxidative stress, FEBS Letters (2006) 580:2910-2916). Par ailleurs, Ando H. et al., dans Fatty acids regulate pigmentation via proteasomal degradation of tyrosinase : a new aspect of ubiquitinproteasome fonction. J Biol Chem. (2004). 279 :15427-33, ont démontré que, dans des cellules B16F10, (lignée mélanocytaire de souris qui exprime la tyrosinase de manière stable et produit de la mélanine), la tyrosinase est dégradée par la voie de protéolyse dépendante du protéasome et que cette dégradation peut être stimulée à la suite d'un traitement par l'acide linoléique ou a contrario diminuée par un traitement par l'acide palmitique. L'algue Phaeodactylum tricornutum, est une algue unicellulaire diatomée qui fait partie du phytoplancton et qui provient des climats 15 tempérés. Il a été décrit dans la demande internationale WO 02/080876 au nom de la Demanderesse, l'utilisation d'un extrait de cette algue comme agent cosmétique destiné à protéger activement la peau contre les effets néfastes d'une exposition aux UV ou pour prévenir ou retarder les effets 20 du vieillissement cutané. Selon cette demande internationale, les propriétés de cet agent cosmétique s'expliquent par le fait que cet extrait favorise l'activation du protéasome des cellules de la peau, en particulier des kératinocytes, conduisant ainsi à favoriser la dégradation des protéines oxydées. 25 Il a également été décrit dans la demande internationale WO 2006/008401 un procédé de préparation d'un milieu de culture clarifié d'au moins un micro-organisme marin et/ou d'eau douce phytosynthétique et l'utilisation de ce milieu de culture clarifié notamment dans le domaine de la cosmétique. 30 :e docun lt, même s'il cite parmi les applications possibles des mil le culture clarifiés des applications comme agent soit pigmentant, soit dépigmentant, ne s'intéresse nullemer utilisation de la biomasse -même ou ut-raits, AH CI irnll Inriirma nllP !p HA rifieS riez ri'-i dedacti cornu 35 On rappelle que le mécanisme de formation de la pigmentation cutanée fait intervenir la synthèse de la mélanine au sein des mélanocytes. Ce mécanisme fait intervenir schématiquement les principales étapes suivantes : Tyrosine Dopa -1> Dopaquinone --o. Dopachrome Mélanine La tyrosinase est une enzyme qui joue un rôle essentiel dans cette suite de réactions. La tyrosinase catalyse notamment la réaction de transformation de la tyrosine en Dopa (Dihydroxyphénylalanine) et la réaction de transformation de la Dopa en Dopaquinone conduisant à la formation des pigments mélaniques. Une substance est reconnue comme dépigmentante si elle agit directement sur les mélanocytes en inhibant l'activité de ces cellules ou si elle bloque l'une des étapes de la biosynthèse de la mélanine. C'est le cas notamment lorsque la substance considérée inhibe l'une des enzymes impliquées dans la mélanogénèse. C'est le mérite des inventeurs d'avoir mis en évidence que les extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum présentent de remarquables propriétés dépigmentantes de la peau, alors même que cette algue est réputée contenir des quantités substantielles d'acide palmitique connu d'après la publication scientifique citée ci-dessus (Ando et al., J. Biol. Chem. (2004) 279, 15427-33), pour son activité inhibitrice de la dégradation de la tyrosinase. Ainsi, selon un premier aspect, l'invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique d'un extrait de l'algue Phaeodactylum tricornutum, en tant qu'agent actif dépigmentant destiné en particulier à atténuer ou à supprimer 'es taches pigmentaires de la peau ou à éclaircir !eÇ nOï[S -c Elle conc( )lus particulièrement selon ce premier aspect, une utilisation selon laquelle l'agent actif est destiné à dépigmenter ou à blanchir la peau. Selon un deuxième aspect ention concerne ,,r,. méthode ci soin cosmétique destinée "' supprime Selon ce deuxième aspect, l'extrait est utilisé en quantité efficace pour obtenir l'effet recherché et, en particulier, induire une stimulation de la dégradation de la tyrosinase dans la peau. Dans les deux aspects ci-dessus, l'extrait d'algue est utilisé dans la composition à une concentration comprise de préférence entre 0,001 et 5% en poids, encore plus préférentiellement entre 0,001 et 1010 en poids. Les essais réalisés par les inventeurs de la présente invention ont montré que l'extrait est d'autant plus actif qu'il contient davantage d'acides gras. C'est pourquoi on utilisera selon chacun des deux aspects de l'invention, un extrait de Phaeodactylum tricornutum aussi riche que possible en acides gras et de préférence un extrait contenant au moins 40% en poids d'acides gras, de préférence au moins 60% en poids. Pour obtenir un tel extrait, on pourra utiliser tout procédé permettant l'obtention d'un extrait riche en lipides. Selon une première variante, afin d'obtenir un extrait riche en lipides, on utilisera un procédé comprenant au moins une étape d'extraction par un solvant ou un milieu solvant suffisamment apolaire pour extraire les acides gras. Un tel solvant ou milieu solvant sera désigné ci-après par solvant apolaire. A titre d'exemple de tels solvants apolaires, on citera l'isopropanol, l'hexane, le cyclohexane et l'heptane. Toutefois, il est avantageux de ne pas se limiter à une telle étape de traitement de l'algue par un solvant apolaire mais d'utiliser dans bien des cas, une succession d'étapes d'extraction parmi lesquelles on trouve en plus de l'étape d'extraction par un solvant apolaire, au moins une étape d'extra, 101' -Dar on e-orvant. pare. _a tinalite d'une telle étape d'extraction par un solvant polaire est 30 de provoquer l'hydrolyse d'acides gras estérifiés, en particulier des glycérides, et de les extraire sous forme de sels. D'one façon avantageuse, un tel procédé comprenant u moins }ter iction par un solvant apola comprend en :tiller au act. 35 le chloroforme et le dichlorométhane, les esters en C3-C6 d'acides organiques tels que l'acétate d'éthyle, les alcanes en C6-C10 tels que l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, les éthers en C5-C8 tels que le diisopropyléther, ledit solvant étant éventuellement alcalinisé. Selon une variante particulièrement avantageuse du procédé utilisé pour préparer l'extrait de l'invention, on applique à l'algue une première étape d'extraction par un mélange hydroalcoolique alcalinisé, l'alcool dudit mélange hydroalcoolique étant de préférence choisi parmi l'isopropanol, l'éthanol et le méthanol, ladite étape permettant de récupérer les acides gras sous forme salifiée dans la phase hydroalcoolique. Selon une variante particulièrement avantageuse du procédé ci-dessus selon lequel on traite l'algue dans une première étape par un mélange hydroalcoolique alcalinisé, on fait subir à la fraction ainsi récupérée, différentes opérations visant à récupérer dans une phase apolaire, un extrait particulièrement enrichi en acides gras. En particulier, on acidifie le mélange hydroalcoolique alcalinisé avant de lui appliquer une étape d'extraction liquide/liquide au moyen d'un solvant apolaire. Un tel procédé comprend également une étape de récupération d'une huile contenant ledit extrait par élimination dudit solvant apolaire. Ce solvant apolaire sera avantageusement l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane. D'une manière générale avant toute opération d'extraction, l'algue est avantageusement congelée. De préférence la congélation est réalisée à une température située entre - 40 C et - 20 C environ et pendant une durée comprise de préférence entre 1 et 7 jours environ. Cette étape préalable est avantageusement utilisée pour réaliser ne choc thermique par contact avec le futur solvant d'extraction afin de fac ?r la décantation de la silice (issue du squelette des cellules de l'algue). Igue est ensuite mise en contact avec le solvant d'extraction. Selon une variante de réalisation avantageuse, l'algue congelée ,nee irertement dans le celvan d'extreetlee el-,uffcs :ageus Selon une variante de réalisation avantageuse, on réalise une macération de l'algue à température ambiante et de préférence pendant une durée comprise entre 5 minutes et 80 minutes environ, et de préférence encore, pendant une durée comprise entre 20 minutes et 40 minutes environ. Selon encore une variante de réalisation avantageuse, l'extraction est réalisée sous reflux. Selon encore une autre variante de réalisation avantageuse, l'extraction peut-être réalisée sous atmosphère inerte, de préférence sous atmosphère saturée en azote. Ceci permet d'éviter en particulier une dégradation oxydative prononcée des molécules actives. Le conditionnement de cet extrait est réalisé avantageusement sous gaz inerte tel que de l'azote, des antioxydants pouvant être également ajoutés afin de protéger les molécules actives. Selon une variante de réalisation avantageuse, la quantité de solvant d'extraction utilisée est comprise entre 0,1 litre et 20 litres environ, de préférence comprise entre 2 litres et 10 litres environ, pour une quantité de 100 g de l'algue, exprimée en poids sec d'algue. Selon encore une variante avantageuse d'un procédé où l'étape d'extraction par un solvant apolaire est précédée d'une extraction avec un mélange hydroalcoolique alcalinisé, l'extrait de l'algue précité est obtenu après la succession des étapes suivantes dont certaines sont décrites ci-dessus : a) l'algue est congelée comme décrit précédemment puis plongée dans le solvant d'extraction 1)) Une macération de l'algue est effectuée e) le solvant d'extraction es alcalinisé jusqu'à compris 10 et 14, de préférence à un pH à 13, par exemple avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium eu avec une solution aqueuse d'hydroxyde de potassi!. nsolubles sont éliminés de la phase hydroalcooliqi distillée ,t ajoutée à la phase hydroalcooliqu hydroalcoolique ainsi otite e est la \, 3 )o avec la phase hydroalcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, g) la phase contenant le solvant apolaire est éliminée, h) la phase hydro-alcoolique récupérée après élimination de la phase contenant le solvant apolaire, est acidifiée jusqu'à un pH compris entre 1 et 3, de préférence à un pH égal à 2, par exemple avec une solution aqueuse d'acide sulfurique ou avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique, ) la solution obtenue après acidification subit une extraction liquide-liquide avec un solvant apolaire non miscible avec la phase alcoolique ou hydro-alcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, j) la phase hydro-alcoolique est ensuite éliminée, k) la phase contenant le solvant apolaire récupérée après élimination de la phase hydro-alcoolique subit une évaporation afin d'obtenir une huile exempte de solvant apolaire, cette huile étant l'extrait recherché selon l'invention. L'emploi d'un alcool alcalinisé, puis acidifié permet d'obtenir un extrait aux caractéristiques visuelles et olfactives acceptables dans des compositions cosmétiques (couleur jaune, et odeur acceptable). Selon un deuxième mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait de l'algue précité est obtenu par extraction de l'algue au CO2 supercritique. L'usage de ce solvant particulier implique que l'algue ait été au préalable lyophilisée. D'autres caractéristiques, buts et avantages de la présente invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre faite en référence à piusleur,:'_-syrmoles de de l'invention, ainsi qu'à des essais d'activite corn , 's, et des exemples de formulation de compositions cosmétiques, donnés simplement à titre d'illustration et e sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Dans semples, n Les figures sont données en référence aux tests présentés dans la partie II des exemples. Elles illustrent respectivement, de façon comparative : - figure 1A : l'activité chymotrypsine similaire, - figure 1B : l'activité hydrolase-post-glutamique similaire, - figure 1C : l'activité trypsine similaire, - figure 2A : les résultats du Western-blot anti-protéasome, obtenu pour des lyses à 24 h, - figure 2B : les résultats du Western-blot anti-protéasome, obtenu 10 pour des lyses à 72 h, - figure 3A : les résultats des Western-blot anti-ubiquitine, obtenu pour des lyses à 24 h, - figure 3B : les résultats des Western-blot anti-ubiquitine, obtenu pour des lyses à 72 h, 15 - figure 4A : les résultats du Western-blot anti-tyrosinase, pour des lyses à 24 h, - figure 4B : les résultats du Western-blot anti-tyrosinase, pour des lyses à 72 h, - figure 5 : la mesure de l'activité tyrosinase, 20 - figure 6 : le résultat des tests d'immunoprécipitation. EXEMPLES 1. PREPARATION D'EXTRAITS SELON L'INVENTION Exempte 1 Extraction avec un solvant polaire, tel que risoprodanol (IPA), suivant un premier procédé. Selon le mode préféré du procédé, l'ensemble de l'extraction est r.,=;lisé sous atmosphère inerte r,,_1uration en azote) afin d'éviter une gradation prononcée des molecuies actives. 30 Dans cet exemple, on utilise 250 kg de biomasse (Phaeodactylum tricornutum). Cette biomasse, qui est congelée à -20 C. Puis plongée dans de l'isopropanol (TPA) nnrt~ 11 reflux à Pn-P cous r-lifai-inr-1 1 c3 La quantité de solvant utilisée est de 10 litres d'IPA pour 1 litre d'eau contenue dans la biomasse. Ainsi, pour un pourcentage de matière sèche de 30%, les 250 kg précités de biomasse se répartissent comme suit en une quantité de matière sèche de 75 kg et 175 kg d'eau. La quantité d'IPA utilisée est ici de 1750 kg. L'ensemble (biomasse + IPA) est maintenu au reflux pendant une demi-heure sous agitation à environ 80 C, avant d'être refroidi vers 50 C. Après le refroidissement de la biomasse et de l'IPA vers 50'C, l'ensemble est transféré dans un filtre de type GUEDU afin de réaliser la séparation biomasse épuisée/extrait d'algue solubilisé dans PIPA. L'extrait est concentré dans un réacteur batch (facteur de concentration = 71,5). L'extrait concentré présente un aspect huileux. Cet extrait huileux est ensuite repris dans de PIPA à froid à raison de 10 kg de solvant pour 1 kg d'huile. L'agitation est prolongée pendant 20 minutes. Le jus est ensuite filtré (ceci permet d'éliminer la boue collante résiduelle). Un traitement de décoloration et de désodorisation est réalisé en deux batchs dans un réacteur Schott de 80 litres et dure 30 minutes à température ambiante par addition de zéolithe et de charbon actif. La quantité de zéolithe (ABSENT 2000, fournisseur UOP) ajoutée est de 0,94 kg et celle de charbon actif (ON, fournisseur CECA) est de 1,6 kg. Le rapport charbon sur zéolithe est de 1,7. La zéolithe et le charbon sont ensuite éliminés par filtration sur papier. Des antioxydants (DL a-tocophérol à 0,05% de concentration finale en poids et palmitate d'ascorbyle à 0,05% de concentration finale en poids) sont incorporés par une solution mère dans de PIPA. Le filtrat contenant les antioxycias iLs est enc ,fte concentré en batch, sous gaz inerte tel que de l'azote jusqu'à l'obtention d'une huile de couleur brune. Cette huile sera nommée cl-a xtrait l'invention s l'algue Phaeodactylum tricornutum, Exemple 2 Extraction suivant un second procédé en deux étapes, L'extraction débute par une dispersion de 49,8 kg de masse sèche congelée issue de 250 kg de biomasse (Phaeodactylum tricornutum), soit environ 20% en masse sèche dans 539 kg d'éthanol anhydre à 96%, alcalinisé par 9 kg de solution aqueuse sodique à 30,5%. Après une macération de 30 minutes au reflux de l'éthanol et sous atmosphère azotée, l'ensemble est refroidi à 18 C. Les insolubles sont alors séparés par essorage sous azote et sont éliminés. Les 573,9 kg de filtrat sont additionnés de 151 kg d'eau distillée. Cette phase hydro-alcoolique est agitée lentement pendant 10 minutes pour être ensuite lavée grâce à un procédé liquide/liquide avec 162 kg d'heptane. L'épiphase heptanique de la partition liquide/liquide est éliminée. L'hypophase est récupérée car elle contient les acides gras sous forme saline, en raison de l'alcalinisation pratiquée au début de l'extraction. L'opération de lavage heptanique est répétée deux autres fois et l'hypophase est récupérée systématiquement. Les 720 kg d'hypophase ainsi obtenus sont acidifiés par ajout de 2,8 kg d'acide sulfurique pour amener le pH à une valeur de 2,2 et obtenir ainsi les acides gras sous forme acide. L'ensemble de la solution est agité 10 minutes sous azote pour être ensuite soumis à une extraction liquide/liquide avec un solvant apolaire, ledit solvant apolaire étant constitué ici par une fraction de 158 kg d'heptane. L'opération de lavage à l'heptane est répétée cinq fois pour récupérer au total 697 kg de phase heptanique issus des cinq fractions contenant les acides gras libres. Cette phase évaporée à cec l'évapor rotatif puis par distillation / ire fournit i extrait actif s( l'invention soit une qua resentant 0,65 kg d'huile. L'huile produite est un liquide homogène et présente une couleur jaune foncée. 2913336 Il - acide myristique 4,16% - acide palmitique 13,82% - acide palmitoléique 16,48% - acide eicosapentaènoïque 24,75% -acide docosahexaènoïque 1,75% IL TESTS DE MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE DES EXTRAITS DE L'INVENTION SUR LE PROTEASOME DE MELANOCYTES ET SUR 10 L'ACTIVITE TYROSINASE DE CES MELANOCYTES 1. Principes des tests Les tests décrits ci-après ont pour but de caractériser l'influence des 15 extraits de l'invention sur les différentes activités du protéasome des mélanocytes, en mesurant les différentes activités de ce protéasome. Ils ont également pour but de caractériser l'influence des extraits de l'invention sur la quantité de protéines ubiquitinées. Ils ont également pour but de caractériser l'effet des extraits de 20 l'invention sur la quantité et l'activité de la tyrosinase. Tous les extraits décrits dans cette partie ont été réalisés en utilisant l'extrait E2 préparé selon l'exemple 2 ci-dessus. 2. Matériel et méthodes 2.1 Traitements des cellules MNT1 Menées cellulaires de mélanocytes humains) en vue de doser les activités du rotéasome.e e osinase 2,1A: Culture cellulaire Les réactifs utilisés sont définis ci-après dans le texte. ?rotocole n e rwe e 0 25 Dans milieu MNT1 2 ml/boites Traitement à n - Acide linoléique 25 pM - Acide palmitique 25 pM - Phaéodactylum 5 pg/ml dans milieu MNT1 10 + 1% BSA + Vit E 50 pM + Vit C 1mM - Acide linoléique 25 pM - Acide palmitique 25 pM - Phaéodactylum 5 pg/ml dans milieu MNT1 + 1% BSA+ Vit E 50 pM + Vit C 1mM Agitation au barreau magnétique à 37 pendant 1h 2ème traitement à 34 +Cycloheximide lpg/ml (inhibiteur de la synthèse des protéines) + 120 nM Mg132 pour le dosage de l'activité tyrosinase. 25 - Préparation lysats après 4h 2 rinçages au PBS Sur lit de glace ; récupération dans 150pl de tampon de lyse par grattage. Congélation à -20 C 30 - Dosage des protéines par la méthode de Bradford - Dosage des activités du protéasome lilieux et réactifs 12 15 20 35 - Milieu de culture MNT1 +10% complément AIMV(Gibco :12055-091) +1% Pyruvate de Na 100mM(Gibco : 12360-039) + 1% NEAA(Gibco : 11140-035) - Solutions mères -Acide linoléique (Sigma ;L1012) 2,8 mg/mi dans EtOH (0,25% dans milieu) - Acide palmitique (Sigma ;P5585) 2,56 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu) -Phaéodactylum 2 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu) - Vit C 25,6 mg/ml dans PBS (1% dans milieu) - Vit E 21,55 mg/ml dans EtOH (0,1% dans milieu) -Mg132(Sigma ;C2211) 120pM dans DMSO (0,1% dans milieu) -Cycloheximide (Sigma ;C7698) - Tampon de lyse Tris-HCI 1,5 M, pH7,5 45,375g de Tris base (Sigma; T1503) à dissoudre dans 200 ml d'eau distillée, ajuster le pH à 7,5 avec HCI 12N puis compléter à 250 ml Solution de saccharose â 1M(Merck; réf.7654) 8,55g à dissoudre dans 2 0 H d'eau distillée 1_ pis ajuster 25m1. Solution de plySO4 à 2mpi(Sigma; /506) 6 mg à dissoudre dans 25 ml d'eau distillée. MgSO4,7H30 (Sigma; réf -592 12,4 mg à dissoudre dans 25 distillée 5 15 Solution de Triton XIOO à 4% (Sigma; réf.X100) 0, 8g à dissoudre dans 20 ml d'eau distillée.(très long) Aliquoter à 0,5 ml et conserver à -20 C Solution de PMSF à 40mM (Sigma; réf.P7626) 14mg à dissoudre dans 2 ml d'éthanol absolu. Aliquoter à 50 ml et conserver à 4 C, 9 mois Solution de leupeptine à 0/5 mg/mi (Sigma; réf.L2884; conservé à - 20 C) Soluble dans l'eau.Aliquoter à 50 pl et conserver à -20 C, 1 mois. Solution de DL-Dithiotbréitol à (Sigma; réf.D0632 conservé à 4 C) 0,154g à dissoudre dans 1 ml d'eau distillée. Aliquoter à 10 pl et conserver à -20 C. Solution EDTA tétrasodique à 500mfrl (Sigma; réf.ED4S) 3,8g à dissoudre dans 20 ml d'eau distillée conservée à 4 C. - Préparation du tampon de lyse (pour 100ml) Préparation d'une solution incomplète aliquotée à 4,39 ml et conservée à -20 C : 5mM 0,25M Tris-MI 1 1 7.5 0,33m1 ;LVI 25 ml 10 ml 4 ml 2 + 10 pl de DU 1M + 50 pI de leupeptine 0,5mg/ml + 50 pI de PMSF à 40mM pour le dosage d'activités enzymatiques la leupeptine n'est pas ajoutée car elle inhibe l'activité du protéasome. 2.1B: Dosage des protéines par la méthode de Bradford (se reporter à la publication "A Rapid and Sensitive Method for the IO Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding", Bradford M. Anal. Biochem. (1976) 72:248-254 a) Préparation de la gamme étalon: 15 Solution mère de BSA: 50pg/ml (BIORAD;protéine standard; réf.500-0006)) Qté Prut. ( g/tube) BSA H20 (.tl) 0 800 20 780 2 40 760 60 740 4 80 720 5 100 700 6 680 11-o Dans chaque tube: addition de 200pl de bleu de Coomassie G25 bleu de Coomassie. est nréparé extE inément par dilution au 1/5 15 b) Préparation des échantillons: On procède comme suit : - récupération des cellules dans le tampon de lyse puis traiter aux ultrasons avant de doser la concentration en protéines Si la concentration protéique> 3mg/ml, les diluer au 1/100, puis prendre 100p1 d'extrait cellulaire dilué +700pl d'eau mQ + 200p1 de bleu ou si faible concentration 10p1 d'extrait cellulaire 10 +7900 d'eau mQ +200pl de bleu - Agitation au vortex, attendre 5 minutes et lire à 595nm 15 2-1C : Dosage des activités du protéasome Les cellules sont rincées deux fois avec du PBS puis chaque activité peptidase du protéasome est déterminée en utilisant un substrat peptidique fluorogène spécifique de chacune des activités, en présence et en absence d'un inhibiteur spécifique du protéasome, le MG 132 (Leu-Leu- 20 Leucinal). Les substrats peptidiques sont les suivants: Leu-Leu-Val-Tyramc (LLVY-amc) pour l'activité chymotrypsine similaire, Leu-Leu-Glu-na (LLE-na) pour l'activité hydrolase post-glutamique et Leu-Ser-Thr-Arg-amc (LSTR-amc) pour l'activité trypsine similaire. Le principe du dosage consiste à suivre au cours du temps l'augmentation de fluorescence dû à 25 la libération des fluorophores aminomethylcoumarine ou L1-naphthylamine à partir des peptides fluorogènes. Activité LLVY (Chymotrvpsine similaire 30 a.l ù Principe :éasome (activité L motrypsÎne-simila Lecture au spectrofluorimètre à la longueur d'onde d'excitation de 350 nm et la longueur d'onde d'émission de 440nm. a.2 ù Réactifs - Tampon TRIS 25mM pH 7,5 - 7- amino- 4-méthylcoumarine (MCA) (Sigma : A9891) Solution stock à 20mM (3,5mg /lml DMSO) 1 0 - Substrat fluorogénique : NùSuccinyl-Leu-Leu-Val-Tyrù7ùamidoù4-Méthyl coumarine (Sigma : S6510) Solution stock à 10mM dans le DMSO 15 a3ù Gamme étalon de MCA (7- amino- 4-méthylcoumarine) On procède comme suit : - Diluer la solution stock de MCA à 4pM dans le tampon TRIS. 20 - Dans une plaque 96 puits, distribuer chaque quantité en double : Qté de MICA. ( MCA (ni TRIS 200 0 5 95 0.2 0 90 0.1 1.5 40 50 30 - Lire au spectrofluorimêtre à une longueur d'onde d'excitation de 350nm et une longueur d'onde d'émission de 440nm. Avec le FLUOstar (BMG) à 355nm et 460nm au gain 40. , a.4 ù Dosage de l'activité LLVY (Chymotrypsine-similaire) On procède comme suit : - Dans une plaque 96 puits, introduire en double un volume fixe de lysat I O cellulaire (déterminé à partir de la concentration la plus faible en protéine des échantillons et doit correspondre à 20pg de protéines) et compléter à 100pl avec du tampon TRIS. -Ajouter 100pl de substrat LLVY-MCA dilué préalablement à 25pM dans le tampon TRIS (12,5pM finale). 15 - Faire les lectures au spectrofluorimêtre à une longueur d'onde d'excitation de 355nm et une longueur d'onde d'émission de 460nm au gain 40 toutes les 2 minutes et ceci pendant 30 minutes. a.5 ù Résultats Les résultats bruts sont exprimés en U.F./min. Le dosage est réalisé sur 200pl de volume réactionnel contenant un volume V de lysat cellulaire fixé en fonction des concentrations de protéine des lysats. Les protéines dosées extemporanément sont exprimées en pg/pl. eut-être exprirr Emme suit, en e MCA libéré %minute/mg protéines : 10 15 25 b.1ù Principe b ù Activité LLE (hvdrolase post-glutamique)) On étudie la réaction de clivage suivante : Protéasome (activité LLE (hydrolase post-glutamique) N-CBZ-LLE-NA > N-CBZ-LLE-+ NA fluorescent Lecture au spectrofluorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 333nm et une longueur d'onde d'émission de 410nm. b.2 ù Réactifs - Tampon TRIS 25mM pH 7,5 - B-Naphtylamide (NA) (Sigma : N8381) Solution stock à 20mM (5,73mg /2ml DMSO) -Substrat fluorogénique N ù CBZ-Leu-Leu-Glu-f3-Naphtylamine (Sigma : C0788) Solution stock à 10mM dansle DMSO b.3 ù Gamme étalon de NA (B-Naphtylamide) L'étalonnage est traité comme suit : - Diluer la solution stock de NA à 4 pM dans le tampon - Dans une plaque 96 puits. distribuer chaque quantité en double : Comme indiqué dans le tableau ci-dessous. Qté de NA. (ptl'I) NA (gl) TRIS (pi) 0 0 200 0 .1 5 195 0.2 10 190 0 ,3 15 185 0 ,4 20 180 0.5 25 175 0.6 30 170 0,7 35 165 0 ,8 40 160 1,0 50 150 - Faire un blanc : 200 pl de tampon TRIS. Lire au spectrofluorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 333nm et une longueur d'onde d'émission de 410 nm. Avec le FLUOstar (BMG) à 340 nm et 410 nm au gain 83. 10 b.4 ù Dosage de l'activité LLE (hydrolase post-glutamique) On procède comme suit : - Dans une plaque 96 puits, introduire en double un volume fixe de lysat (déterminé à partir de la concentration la plus faible en protéine 15 dei 'Ions et doit correspondre à 20 pg de protéit ;) et corn ter à 100pl avec du tampon TRIS. - Ajouter 100pl de substrat LLE-NA dilué préalablement à 300pM dans tampon TRIS (1500M final 20 oo b.5 ù Résultats Les résultats bruts sont exprimés en U.F./min. Le dosage est réalisé sur 200pl de volume réactionnel contenant un volume V de lysat cellulaire fixé en fonction des concentrations de protéine des lysats. Les protéines dosées extemporanément sont exprimées en pg/pl. A partir de la gamme étalon l'activité peut-être exprimée en pmol 10 de MCA libéré/minute/mg de protéines : Vitesse moi, U.F./min x 200 x 10-6 x 10-6 x le Protéine ,ug/pl x V.10-1 x coefficient de la pente a avec a = 0,966.104 c) Activité LSTR (trypsine-similaire) cl ù Principe Protéasome(activité LSTR (trypsine similaire)) 20 Nt Boc LSTR-MCA Nt Boc LSTR + MCA fluorescent Lecture au spectrofluorimêtre à la longueur d'onde d'excitation de 350nm et la longueur d'onde d'émission de 440nm. 2 Réactifs - Tampon Tl amie )891) 15 25 - Substrat fluorogénique : N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg7ù7ùamidoù4-Méthyl coumarine (Sigma : B4636) Solution stock à 10mM dans le DMSO Inhibiteur du protéasome : Mg132 (Z-Leu- Leu-Leu- CHO) (Affinity, 5 ZW8440) Solution stock à 2OmM dans le DMSO c.3 ù Gamme étalon de MCA Le tracé de la courbe d'étalonnage est fait comme suit : (voir tableau ci-dessous) - Diluer la solution stock de MCA à 4pM dans le tampon TRIS 15 - Dans une plaque 96 puits, distribuer chaque quantité en double : Qté de MCA. (t1\'I) MCA (g TRIS (g 0 200 0 ,l 195 0 ,2 10 190 0 ,3 15 185 0 ,4 20 180 0 ,5 25 175 0 ,6 30 170 0.7 35 165 0 ,8 40 160 50 - Faire un blanc : 200pl de tampon TRIS . - Lire au spectrofluorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 350nm Innhueur d'nnrle ci',miceion de 440nm. Avec le FLUOstar (BMG) à 10 c.4 ù Dosage de l'activité LSTR -Dans une plaque 96 puits, introduire en double un volume fixe de lysat cellulaire (déterminé à partir de la concentration la plus faible en protéines des échantillons et qui doit correspondre à 50pg de protéines) et compléter à 100pl avec du tampon TRIS. -Ajouter 100pl de substrat LSTR-MCA dilué préalablement à 80pM dans le tampon TRIS (40pM finale). -En parallèle, vérifier qu'il s'agit bien de l'activité du protéasome en testant l'inhibiteur Mg 132. - Ajouter au 50pg de protéines 10pl de solution de Mg132 diluée préalablement à 400pM dans le tampon TRIS(20pM finale) et compléter à 100pl avec du tampon TRIS. Puis ajouter 100p1 de substrat LSTR dilué préalablement à 80pM dans le tampon TRIS (40pM finale). -Faire les lectures au spectrofluorimêtre à une longueur d'onde d'excitation de 355nm et une longueur d'onde d'émission de 460nm au gain 30 toutes les 2 minutes et ceci pendant 30 minutes. c.5 ù Résultats Les résultats bruts sont exprimés en U.F./min. Le dosage est réalisé sur 200pl de volume réactionnel.contenant un volume V de lysat cellulairefixé en fonction des concentrations de protéine des lysats. Les protéines dosées extemporanément sont exprimées en pet. A partir de la gamme étalon l'activité peut-être exprimée en pmol de MCA libéré/minute/mg de protéines :30 2.1D : Mesure de l'activité tvrosinase Principe du dosage Le dosage est basé sur la mesure de l'activité dopa-oxydase de la tyrosinase. Le principe du dosage est basé sur la détection de dopachrome qui absorbe à 475 nm sur le FLUOstar (BMG) Matériel : 10 - Tampon de lyse - Substrat : L-DOPA (Sigma, D-9628, PM 197,2) à 10 mM dans le PBS, préparé extemporanément du fait d'une auto-oxydation de la L-Dopa. Des Mélanocytes humains en culture ont été traités par 25 pM 15 d'acide linoléique (+/120 nM MG132) ou 25 pM d'acide palmitique (+/-120 nM MG132) ou 5 pg/mL de Phaeodactylum (+/- 120 nM MG132) dans un milieu MNT1 contenant 1 % BSA, 50 pM vitamine E et 1mM vitamine C. Les mélanocytes ont été récupérés et lysés à 72 heures après traitement. 50pg d'extrait sont ensuite incubés avec 1mM de L-Dopamine pour une 20 heure à 37 C. La mesure de l'activité tyrosinase s'effectuant à 475 nm toutes les 2 minutes à l'aide du lecteur de microplaques thermostaté à 37 C. L'activité Dopa-oxydase est obtenue en DO/min/mg de protéines. Le blanc étant réalisé avec du tampon de lyse en présence de L-DOPA. 12 Traitements des cellules MNT1 en vue de doser le protéasome, les protéines ubiquitinées et la tyrosinase par Western Blot 55_ 30 2.2A: Culture cellulaire a) Protocole : Ensemencement à 3Q 73qm drupF 25 35 Traitement à 31 - Acide linoléïque 25 pM - Acide palmitique 25 pM - Phaéodactylum 5 pg/ml dans milieu MNT1 + l% sérum albumine bovine (BSA)+ Vitamine E (Vit E) 50 pM + Vitamine C (Vit C) 1mM - Acide linoléïque 25 pM - Acide palmitique 25 pM - Phaéodactylum 5 pg/ml 15 dans le milieu MNT1 + 1% BSA+ Vit E 50 pM + Vit C 1mM + 120 nM Mg132 Agitation au barreau magnétique 37 pendant 1h Préparation lysats à 32, 33 et 34 2 rinçages au PBS Récupération du tapis cellulaire dans 150pl de Tampon Leamli 2X +D 1 1 à 25 1% (10mM) par grattage. 2 btes/tube Ependorf Congélation à -20 C Dosage des pe- e et La protéines que celle utilisée précédemment de même que celle de Western-Biot, Suite au dosage des protéines dans des tubes Eppendorf, les échantillons sont dilués dans dl' tampon Laemmli 7Y Afin d'obtenir l'In/ nroté A f-ar Hiù .Jé 10 20 b) Milieux et réactifs - Milieu de culture MNT1 DMEM 4,5g/ml de glucose (Gibco :61965-026) +20% SVF +10% complément AIMV(Gibco :12055-091) +1% Pyruvate de Na 100mM(Gibco : 12360-039) + 1% NEAA(Gibco : 11140-035) 10 - Solutions mères -Acide linoléique (Sigma ;L1012) 2,8 mg/mi dans EtOH (0,25% dans milieu) - Acide palmitique (Sigma ;P5585) 2,56 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu) 15 -Phaeodactylum 2 mg/mi dans EtOH (0,25% dans milieu) - Vit C 25,6 mg/ml dans PBS (1% dans milieu) - Vit E 20 21,55 mg/ml dans EtOH (0,1% dans milieu) -Mg132(Sigma ;C2211) 120pM dans DMSO (0,1% dans milieu) - Tampon de lyse 25 Solution de DL -Dithiothréitol à 1M(Sigma; réf.D0632 conservé à 4 C) 0,154g à dissoudre dans 1 mi d'eau distillée Un, atc à 10 pl et conserver à -20'C. - Tampon d'échantillon réducteur Laemmli 2X (dénaturant 30 Tris-HCL 0,06M pH6,8 ; SDS 2,3% ; Glycérc' 10% 26 - tampon de gel de concentration Tris 0,5M pH 6,8 6.25ml - SDS 10% 11,50 ml - Glycérol 5 ml -Eau distillée compléter à 50 ml 2.2B: Western-blot a) Préparation des échantillons et électrophorèse L'électrophorèse des protéines est réalisée en minigel de polyacrylamide de lmm à 1,5mm d'épaisseur, en conditions dénaturantes et réductrices, en tampon discontinu selon la méthode de Laemmli (1970). Les gels à 12% T, 2.7% C permettent de séparer les protéines à faibles poids moléculaires variant de 20 à 120 kDa. Et les gels à 8% T ; 2,7%C les protéines à hauts poids moléculaires de 35 à 250 kDa. Toutes les solutions nécessaires à l'élaboration des gels sont présentées en annexe A ci-après. - Gel de séparation Ce gel peut être coulé soit la veille soit le jour même mais de toute façon une à deux heures avant la migration. Le coulage du gel est réalisé à l'aide d'une pipette jusqu'à environ 0,5 mm du bas du peigne prévu pour le gel de concentration. De l'éthanol est ajout ri Lei sir régulière ( lml /gel -Gel de concentration (Stacking Gel L'éthanol est éliminé. 28 2,5ml de gel est coulé à l'aide d'une pipette Pasteur de transfert en polyéthylène (Biorad, réf.223-9528) puis les peignes sont insérés. Après une heure le gel est polymérisé. Préparation des échantillons Avant de récupérer les cellules des boîtes elles sont rincées au PBS 2 fois. Après le dernier rinçage le PBS est éliminé au maximum. Les cellules sont récupérées dans le tampon Laemmli 2X + 10 mM de DTT (voir Annexe A ci-après) par grattage (5.106 cellules / ml de tampon de 10 lyse minimum). Les lysats récupérés dans des tubes Eppendorf 1,5ml sont congelés à -20 C Avant de réaliser l'électrophorèse les lysats décongelés sont chauffés à 95 C pendant 10 min et les protéines sont dosées. Le dosage des protéines est réalisé pendant la polymérisation du 15 gel de séparation ou la veille (voir annexe C). Dans des tubes Eppendorf, les échantillons sont dilués dans du tampon Laemmli 2X afin d'obtenir des solutions identiques _1pg/pl de protéines. A ces solutions d'échantillons sont ajoutés du bleu de bromophénol 10X. 20 Dépots Les échantillons sont chauffés à 95 C pendant 5 min. Le volume à déposer est fonction de la quantité de protéine 25 pL pour un gel de 1mm pour un gel de 25 1,Drnui). 10 pg de protéines soit 10 pl. est la quantité de référe ensuite elle est adaptée selon 'expression de la protéine ciblée. 1 es peignes sont retir' de tampon de migration 1X sont ral ix gels, Les échantillons sont déposés à l'aide d'une pointe effilée adaptée sur la micropipette ainsi que 10 pl de témoins de masse moléculaire précolorés (Biorad, Prestained SDS-PAGE standards Low Range réf.161-0305 ) ou (Amersham, Full Range Rainbow ; réf. RPN800W). Migration L'électrophorèse est réalisée à température ambiante, à 200V. Celle-ci est arrêtée lorsque le front de migration est sorti du gel (environ 40 min. de migration). b) Transfert semi-sec des protéines sur membrane Deux feuilles de papier filtre épaisses (Biorad, réf.17033960) et les membranes de cellulose (Biorad, réf.162-0115) sont trempées dans le 15 tampon de transfert de Towbin et al. (1979) à l'origine de cette méthode (voir annexe B). Dans l'appareil de transfert semi-sec (Biorad) une feuille de papier filtre épaisse humidifiée est déposée sur l'anode. Une fois la migration terminée, le gel de concentration est éliminé 20 et le gel de séparation est déposé sur la membrane de cellulose. La membrane, le gel sont déposés sur la feuille de papier filtre. La deuxième feuille de papier filtre est déposée sur le gel. Au copra e la fabrication "saildwiah 1 faut liminer toutes 25 L appareil est fermé par uli Luw/t'ut Lulibuwe ue Id LdLrIUUe. ransfert de protéines est réalisé à - endai 10 c) Marquage au rouge Ponceau Pour vérifier la qualité du transfert les protéines sont colorées au 5 rouge Ponceau (Sigma P7170). La membrane de cellulose est rincée à l'eau milliQ puis trempée dans un bain au rouge Ponceau 1X pendant 10 min sous agitation. Elle est ensuite lavée dans plusieurs bains d'eau milliQ jusqu'à ce que la coloration ne subsiste que sur les bandes protéiques. 10 La membrane est insérée dans un plastique et scannée. Les bandes protéiques peuvent être quantifiées pour déterminer la totalité des protéines transférées. d) Blocage des sites de liaisons aspécifiques La membrane est placée sous agitation pendant une nuit à 4 C ou 1h30 à température ambiante dans une solution de blocage des sites de liaisons aspécifiques constituées de 5% de lait écrémé (Régilait) dans du tampon PBS-T préparé dans l'annexe B ci-après (20m1/membrane). e)-Immunodétection référera,-'es et les dilutions optimales des anticorps se trouvent en Après blocage des sites non spés'Ç'on la membrane est rincée rapidement dans du PBS-T. Ensuite, cette memhrRne est mise nrésenre rlp l'Antimrn 30 15 20 à 30 31 Elle est ensuite rincée rapidement puis trois fois 10 min dans du PBS-T afin d'éliminer l'excès d'anticorps libre non fixé. Puis elle est mise en contact avec l'anticorps secondaire adéquat couplé à la peroxydase dilué dans le PBS-T ou le lait 5% (5ml) sous 5 agitation à température ambiante. Après 45 min d'incubation, elle est rincée rapidement deux fois, puis lavée 5 fois pendant 5 min avec du tampon PBS-T et une dernière fois dans du PBS 1X. Egouttée, elle est placée sur un film alimentaire (SARAN), coté 10 protéine vers le haut. La membrane est révélée à l'aide d'un kit de détection par chimioluminescence (Amersham; ECL Western blotting réf.RPN2209), hautement sensible utilisant le luminol comme substrat de la peroxydase. Sous l'action de la péroxydase et d'un amplificateur, le luminol est oxydé 15 et passe dans un état excité transitoire. Le retour à l'état fondamental se fait par émission de photons qui impressionnent un film autoradiographique placé sur la membrane. 1 ml de chacune des deux solutions du kit de détection sont mélangés, (2 ml, volume minimum nécessaire au recouvrement de la 20 membrane). Aussitôt, le mélange est versé uniformément sur la membrane et laissé en contact pendant exactement une minute à température ambiante. La membraT égouttée e L. enferm sous file alimentaire Saran et mise sous l'ab: 25 autoradiographique pré-flashé lei sl Ialll, Hypeniim cLL Après ! lin d'exposition le film auto radiographique est révélé. )liveau film est réexposé si nécessaire, pour optimiser le signal 2.3 Préparation d'extraits protéiques de MNT1 en vue de réaliser des immunoprécipitations de la tyrosinase 2.3A: Culture cellulaire a) Protocole Ensemencement à JO MNT1 10 6 cell/boites diam 35mm en triplicate Dans Milieu MNT1 2 mI/boites Traitement à 31 - Acide linoléique 25 pM - Acide palmitique 25 pM -Phaéodactylum 2,5 et 5 pg/ml dans milieu MNT1 + 1% BSA+ Vit E 50 pM + Vit C 1mM - Acide linoléique 25 pM - Acide palmitique 25 pM - Phaéodactylum 2,5 et 5 pg/ml 25 dans milieu MNT1 + 1% BSA+ Vit E 50 pM + Vît C 1mM + 120 nM Mg132 au barreau magnétique à 37 pen 1 h Taration des lysats et comptage tiges ~i PRS 30 Rinçage au PBS +0,5 ml Trypsine/EDTA +0,5 ml PBS+10%SVF Comptage compteur Z2 Sur 0,5 ml de suspension+ 10 ml Isoton b) Milieux et réactifs 10 - Milieu de culture MNT1 DMEM 4,5g/ml de glucose (Gibco :61965-026) +20% SVF +10% complément AIMV(Gibco :12055-091) +1% Pyruvate de Na 100mM(Gibco : 12360-039) 15 + 1% NEAA(Gibco : 11140-035) - Solutions mères -Acide linoléique (Sigma ;L1012) 2,8 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu) 20 - Acide palmitique (Sigma ;P5585) 2,56 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu) - Phaeodactylum 2 mg/ml dans EtOH (0,25% dans milieu) - Vit C 25 25,6 mg/ml dans PBS (1% dans milieu) - Vit E 21, 55 mg/rn! 31ans EtOH (0,1% dans milieu) . Mg13 Sig' 02211) ans DMSO (0,1% dans milieu) 30 - Tampon de lyse 10 15 ajuster le pH à 7,5 avec HCI 12N puis compléter à 250 Solution de saccharose à 1M (Merck; réf.7654) 8,55g à dissoudre dans 20 ml d'eau distillée, puis ajuster à 2 Solution de Mg504 à 2mM (Sigma; réf.M7506) 6 mg à dissoudre dans 25 ml d'eau distillée. Ou IvlgSO4,7H20 (Sigma; réf.M5921) 12,4 mg à dissoudre dans 25 ml d'eau distillée conserver à 4 C. Solution de Triton XI 00 à 4% (Sigma; réf.X100) 0,8g à dissoudre dans 20 ml d'eau distillée.(très long) Aliquoter à 0,5 ml et conserver à -20 C Solution de PMSFà 40mM (Sigma; réf.P7626) 14mg à dissoudre dans 2 ml d'éthanol absolu. Aliquoter à 50 pl et conserver à 4 C, 9 mois Solution de leupeptine à o,s mg/ml (Sigma; réf.L2884; conservé à 20 C) Soluble dans l'eau.Aliquoter à 50 pl et conserver à -200C, 1 mois. Solution de DL -Dithiothréitol à 1M (Sigma; réf.D0632 conservé à 4 C) 0,154g à dissoudre dans 1 ml d'eau distillée. Aliquoter à 10 pl et conserver à -20 C. Solution EDTA tétrasodique à 500mM (Sigma; réf.ED4S) 3,8g à dissoudre dans 20 ml d'eau distillée ; conservée à 40 - PREPARATION DU TAMPON DE LYSE (POUR 100ML) Préparation d'une solution incomplète aliquotée à 4,39 ml et conservée à -20 C : Solutions Volumes Co il c en tr a tion s finales Tris-IICI 1,5M. pH 7,5 0.33m1 5m\l Saccharose 1M 25 ml 0,25M MgSO4 2mM 10 ml 0,2mM EDTA 500mM 4 ml 20mM Eau distillée 48,47 ml La solution complète est préparée extemporanément avec: 4,39 ml de solution incomplète + 500 pl de triton 100X à 4% 10 +10 pl de DTT 1M + 50 pI de leupeptine 0,5mg/ml + 50 pI de PMSF à 40mM pour le dosage d'activités enzymatiques la leupeptine n'est pas ajoutée car 15 elle inhibe l'activité du protéasome. 23B: Protocole d'imrnunoprécipitation Des mélanocytes humains en culture ont été traités par 25 pM J'acide linoléique (+1- 120 nM MG132) ou 25 HM d'acide palmitique (+/-1 ~q MG132) ou F./,hL de Phaeodactylurr, 120 nM MG132) dans Mr'-'-" -Jntenant 1 % BSA, 50 pM vitamine E et 1mM vitamir lélano :opérés heures a ier 36 T311) Lab vision corporation) ou anti-ubiquitine (Anti-monoubiquitine monoclonal (SC-8017, Santa Cruz)).pendant 1 heure à 4 C. Ce mélange a été ensuite traité avec 50 pL de protéine A-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, 17-5280-01) et incubé pendant 16 heures à 4 C. Le mélange est ensuite centrifugé à 1000g pendant 5 min. Le culot est lavé et resuspendu avec 200pL de PBS, 1% NP40 ((Amersham Pharmacia Biotech, US19628) et centrifugé à 1000g pendant 5 min. Après trois lavages successifs le culot a été déposé sur un gel SDS-PAGE puis transféré sur une membrane de nitrocellulose. La membrane a été ensuite incubée avec un anticorps monoclonal anti-tyrosinase pendant une heure (anticorps monoclonal Tyrosinase Ab-1 (clone T311) Lab vision corporation) (1/2000). Le Western-blot a été révélé grâce à un anticorps anti-immunoglobuline de souris couplé à la peroxydase (1/5000), et au kit ECL (Amersham Pharmacia Biotech, NA9310). 3. Résultats 3.1 Modulation de l'activité du protéasome induite par ajout d'extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum dans la lignée mélanocytaire MNT-1 De manière à caractériser l'influence des extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum sur la synthèse de la mélanine, différentes cultures de cellules mélanocytaires de la lignée MNT-1 ont été réalisées (milieu de culture supplémenté ou non, par des extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum, par des acides gras, ou par un inhibiteur de la protéolyse protéasome dépendante MG132). Comme exposé précédemment une étude antérieure a révélé que a tes en présence d'acide lino( Je condu i une diminution de la quantité de mélanine, en favorisar a dégradation de la osinase par le protéasome que la même culture réalisée sence d'acide palmitiqu( quait ers del composé 37 tyrosinase, enzyme limitante de la synthèse de la mélanine qui régit la pigmentation de la peau. A partir de ces mêmes extraits cellulaires de la lignée mélanocytaire MNT-1, une étude de l'activité du protéasome a été réalisée. A l'aide de peptides substrats synthétiques fluorogènes, spécifiques des trois sites catalytiques du protéasome 20S, les activités du protéasome ont été mesurées. En parallèle, à l'aide d'anticorps spécifiques les formes 20S et 26S du protéasome ont été quantifiées par Western Blot. Pour le dosage des activités du protéasome, les cellules ont été lysées à 72 H après le traitement des cellules et la concentration en protéines a été déterminée. Les résultats présentés dans les figures] C montrent que 72 heures après l'addition de l'extrait d'algue (Ph),ou d'acide linoléique les 3 activités peptidases du protéasome, mesurées à l'aide de peptides fluorogènes, augmentent et ceci, de manière significative (activités chymotrypsine similaire, hydrolase post-glutamique et trypsine similaire). Par ailleurs, dans les mélanocytes traités par l'acide palmitique pendant 72 heures, les deux activités peptidases sont diminuées (activités chymotrypsine similaire et hydrolase post-glutamique). Les activités du protéasome mesurées à partir d'extrait cellulaire de lignée MNT-1 cultivés en présence d'un inhibiteur de la protéolyse protéasome dépendante MG132 servent de contrôle positif. Tous ces résultats sont rassemblés dans le tableau 1 en annexe. i 1er la -diva activités peptidasLs u,asome, nous avuil cvalUe bai la Western Blot la quantité de protéasome dans les homogénats issus c a lyse de MNT-1 24 h et après leur traitement par rtpc extrAits 38 Les résultats présentés en figure 2A et 2B montrent que ces traitement ne modifie pas la quantité de protéasome dans les extraits cellulaires. Ces résultats indiquent que la stimulation de l'activité du protéasome par les extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum ou par l'acide linoléique ne modifie pas l'expression ni la distribution des formes 20S et 26S du protéasome, dans les cellules de la lignée mélanocytaire MNT-1. 10 3.2 Statut des protéines modifiées par l'ubiquitine suite à un ajout d'extraits de l'algue Phaeodacty/um tricornutum dans la lignée mélanocytaire MNT-1. Nous avons montré que 24h et 72 heures après traitement par les acides gras ou l'extrait d'algue le niveau de protéines ubiquitinées 15 (figure3A,3B) n'étaient pas modifié sauf lorsque les cellules étaient cultivées en présence d'un inhibiteur du protéasome le MG132. Ces observations démontrent que la machinerie d'ubiquitination n'est pas touchée par les traitements par l'algue ou l'acide linoléique. 20 3.3 Modulations de l'expression et de l'activité de la tyrosinase, induite par ajout d'extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum dans la lignée mélanocytaire MNT-1. A partir des extraits cellulaires de mélanocytes MNT-1 cultivés dari- r- oil-fei [au, 101 c a' afu 1 Jan part. e "matériel et méthodes', effets u, extraits d haeodac /uia tricornutum sur la quantité et l'activité de vrosinase ont été caractérisés. 3s après iter 30 20 39 4A et 48), et que cette diminution peut être réversée lorsque l'on traite les cellules par le MG132 qui est un inhibiteur du protéasome. Nous avons quantifié cette diminution à l'aide du logiciel Image master 1D (Amersham Pharmacia) et les résultats sont présentés dans les tableaux 2 et 3. Ces observations préliminaires démontrent que la tyrosinase est un substrat physiologique du protéasome, et que sa dégradation peut-être activée par des extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum. Dans un premier temps, la mise au point d'une technique spécifique de dosage l'activité de la tyrosinase, applicable aux extraits cellulaires de la lignée MNT-1, a été entreprise. Nous avons mesuré l'activité tyrosinase dans les cellules 72 heures après traitement de mélanocytes MNT-1 par Phaeodactylum tricornutum ou par l'acide linoléique et nous avons observé une diminution significative de cette dernière (figure 5 et tableau 4). Contrôle Acide Acide Phaedactylum Contrôle Acide Acide linoléique Phaedaetylum 1 palmitique linoléique tricornutum +MG132 palmitique +MG132 Tricornutum +MG132 +MG132 100 135 75 60 100 98 1 110 111 100 1 127 51 56 Tableau 2 : Quantification de la tyrosinase à 24 heures VIU 1 J l32 22 Tableau 3 : Quantification de la tyrosinase à 72heures Contrôle Acide Acide Phaedactylum Contrôle Acide Phaedactylum 1 (DO/min) palmiddac =MGI32 :linoléique Tricumutum MG132 ùMGI32 1ïp 14.3 =3.5 18.75=1.9 1 9.65=2 .2=037 18.35=1.55 19.8= 2 19.9=0.74 18.7=2 Tableau 4 : Activité de la tyrosinase à 72 heures Pour vérifier que la tyrosinase substrat du protéasome était mieux dégradée dans des extraits de cellules mélanocytaires de la lignée MNT-1 traités par des extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum, une étude qualitative et quantitative de la tyrosinase et des formes 10 conjuguées à l'ubiquitine de la tyrosinase a été réalisée par détection immunochimique et immuno-précipitation à 72 heures. (Figure 6). Ces résultats montrent que dans les cellules traitées par des extraits de l'algue Phaeodactylum tricornutum, la tyrosinase ne s'accumule pas sous forme ubiquitinée car elle est rapidement dégradée. 15 III. EXEMPLES DE COMPOSITIONS COSMETIQUES L'extrait utilisé dans les exemples ci-dessous est l'extrait E2. 1. Crème cosmétique de jour dépigmentante sous forme. 20 d'émulsion-gel Glycérine 5 00% \/,- - raorvlul c iuÂycir ~l vit le ,uo"o uiméthicor iolyol 1% Acrylates / .0-30 alkyl acrylate cross ol mer i% Extrait lipidique E2 de Phaeodactylum ÉriCOrnUtUM 0,01' Neli-1rA liAnf- L'utilisation de l'émulsion-gel ci-dessus permettra aux personnes soumises au rayonnement plus ou moins intense de la lumière du jour, voire du soleil directement, de conserver un teint clair et d'éviter l'apparition de taches pigmentées. 2. Composition cosmétique fluide protectrice du rayonnement solaire (SPF 30) Pentacyclométhicone volatile 49,00% Dioxyde de titane 15,00% Méthoxycinnamate d'oc le 7,50% Glycérine 5,00% Phényltriméthicone 5,00% Diméthicone copolyol 3,00% Polyméthylméthacrylate 2,50% Butyl méthoxydibenzoyle méthane 1,00% Extrait lipidique de Phaeodacty/um tricornutum, selon 0, 1% l'invention Neutralisant, Parfum, Conservateurs, antioxydants qs. Eau qsp. 100% Cette composition prévient l'apparition de taches pigmentaires, chez les personnes prédisposées à ce phénomène lors d'une exposition à un rayonnement solaire intense. Il est à noter que la présence d'une concentration élevée en filtre solaire permet de compenser la diminution de la protection naturelle, conséquence de la baisse du taux de mélanine. 1.5 20 3. Lotion cosmétique visage pour éclaircir le teint Alcool éthylique 30,00% PPG-3 Myristyl éther 5,00% Glycérine 2,00% Carbomer 0,20% Polysorbate 20 0,20% Extrait lipidique de Phaeodactylum tn"cornuturn, 0,05% selon l'invention Neutralisant, Parfum, Conservateurs qs. Eau qsp. 100% Cette lotion pour éclaircir le teint s'utilise après le démaquillage et 5 le nettoyage de la peau. 4. Sérum cosmétique éclaircissant pour le visage Eau qsp 100% Glycérine 2% EDTA tétrasodique qsp pH 6,5 Acide citrique Citrate trisodique Gomme xanthane 0.25% Polyacrylamide, C13.14 isoparaffin, 0.5% laureth-7 Diméthicone copolyol 0.25% Extrait lipidique Phaeo acryIum1.0% JrIum, colorant, conservao qs IO Une goutte de cette composition très concentrée sérum, S'appliqUP CI Ir 1P \/iCrIP ru&ne'irInrnen s pplicai-inn Inn ~rôrrla nhl Ir L. .43 5. Lotion cosmétique pour éclaircir la pilosité corporelle Eau 1 qsp 100% Alcool 50% Panthényléthyl ether 0.5% Acétate DL- a -tocopherol 0.2% Polysorbate 60 1% Extrait lipidique de Phaeodacty/um tricornutum, selon 5.0% l'invention Parfum 0.2% Glycérine 0.5% Colorant qs Cette lotion s'applique sur les zones pileuses à éclaircir, notamment 5 les bras, pendant la durée suffisante pour obtenir un éclaircissement progressif des poils. 6. Gel crème cosmétique anti-taches pour les mains Ca prilic/ca pric diglyceryl succinate 6% Octyl octanoate 2.5% Méthoxycinnamate d'octyle 6% Extrait lipidique de Phaeodactylum tricornutum, selon l'invention 0.01% Phényltriméticone 2.5% Benzophénone- 3 0.5% Hyaluronate de sodium 0.05% Gomme xanthane 0.2% Acrylates/CI0.30 aikyl ac opolymer 0.5% Glycérine 2% PEG 150 3 Io Neutralisant ant servateurs q EE urifiée ) 100% 10 çl Ir 15 ANNEXE A - Tampons et solutions utilisées pour les gels d'électrophorèse en conditions dénaturantes et réductrice en tampon discontinu Solution de monomères: acrylamide Bis-acrylamide, 30% T, 2,67% C ( Biorad; réf.161-0158) 10 Tampon de gel de résolution: Tris-HCL 1,5M pH 8,8. - 18,15g de Tris base(Sigma; T1503) pour 100 ml d'eau distillée - ajuster le pH à 8,8 avec de I'HCL 12N Tampon de gel de concentration: Tris-HCL 0,5M pH 6,8. - 6g de Tris base pour 100 ml d'eau distillée - ajuster le pH à 6,8 avec de l'HCL 12N Tampon de migration 1X: Tris 0,25M pH 8,3 , glycine 1,92M; SDS 1% Tris base 12 g Glycine(Research Organics Inc; 5037G) 57,6 g SDS 10% (Sigma; L5750) 40 ml Eau distillée compléter à 400 ml Ces solutions sontconservés à 4 C Persulfate d'ammonium N hl 45 Tampon d'échantillon réducteur Laemmli 2X: Tris-HCL 0,06M pH6,8 ; SDS 2,3% ; Glycérol 10% ; Bleu de bromophénol 0,02% - tampon de gel de concentration Tris 0,5M pH 6,8 6,25 ml -SDS 10% 11,50m1 - Glycérol 5 ml - Eau distillée compléter à 50 ml Bleu de bromophénol .IOX (solution saturée) mettre une pointe de spatule de bleu de bromophénol dans 5 ml de Tampon Laemmli 2X, agiter, soniquer, centrifuger et récupérer seulement le surnageant. 10 Ces solutions se conservent à température ambiante Standards précolorés- - à bas poids moléculaires (Biorad; réf.161-0305) Ils sont composés de : - Phosphorylase B 104 kDa 15 - Bovine serum albumin 82 kDa - Ovalbumin 48,3 kDa - Carbonic anhydrase 33,4 kDa - Soybean trypsin inhibitor 28,3 kDa Lyosyme 20 - a 250 kDa 19,4 kDa o à Gels d'électrophorèse Solutions Volumes Concentrations pour 2 gel (10m/) finale Solution de monomère 4,0 ml 12T; 2,7% C Tampon de gel de résolution 2,5 ml 0,375M SDS 10% 100 pl 0,1% Persulfate d'ammonium (10%) 50 pl 0,05 lo TEMED(Research Organics Inc; 3009T) 5 pl Eau distillée 3,4 ml -Préparation du gel de concentration à 12% T Solutions Volumes Concentrations pour 2 gel s (5ml) finales Solution de monomère 2 ml 12%T; 2,7% C Tampon de gel de résolution 1,25 ml 0,375M SDS 10% 50 pl 0,1% Persulfate d'ammonium (10%) 25 pl 0,050/0 TEMED(Research Organics Inc; 3009T) 5 pl Eau distillée 4,2 ml ANNEXE B Solutions pour le transfert et l'immunodétection Tampon de transfert de TowbM : Tris-HCL 25mM, pH 8,3 ; Glycine 192 mM ; 20% Méthanol - Tris base 3,03g - Glycine(Research Organics Inc; 5037G) 14,4 g à dissoudre dans 100ml d'eau distillée - Méthanol 200 ml - Eau distillée compléter à 1000 ml 10 Tampon PBS-T Dilution au 1/10 du PBS 10X (Invitrogen ; 14200-067 ) y ajouter du Tween 20 à 0,1% (Sigma ; P1379) Ces solutions sont conservées à 4 C 15 Rouge Ponceau (Sigma P7170) Solution à 0,1% (p/v) dans une solution d'acide acétique à 5% ANNEXE C Dosage des protéines (Kit Biorad ; protéine standard; réf.500-0006 Méthode de Bradford Avant de réaliser l'électrophorèse les lysats décongelés sont chauffés à 10 95 C pendant 10 min. Pour les lysats dans le tampon de lyse dénaturant (tampon Laemli 2X+ DTT lomm) Le tampon Leamli n'est pas compatible avec le réactif du kit, il est 15 donc indispensable de l'éliminer pour réaliser le dosage par cette méthode. Dans un tube Eppendorf, 500pl d'acétone sont ajoutés à 5pl de lysat (volume à adapter en fonction de la concentration en protéines). Les tubes sont placés au moins 10 min. à -20 C. 20 Puis ils sont centrifugés à 17 000G, 10 min. à 4 C. Le surnageant est éliminé par retournement, après évaporation de l'acétone le culot est dissout dans 50p1 de NaOH à 0,1M et les protéines sont dosées par la méthode Bradford. (Dilution au 1/10 de l'échantillon). 25 Pour les lysats dans le taon L erse non dénaturant 1 es constituants de ce tan p,)n de lyse n'interfèrent pas avec le réa u kit Biorad à cette concentration (141 d'échantillon/puit Seuler l'échantillon doit être ou non dilué pour se placer dans la gamm référentiellement )artie supérieu Prén tinn rie na mime Main La gamme est préparée dans des tubes Eppendorf et peut être congelée ou conservée à 4 C. Solutions stocks Qté Prot. (pg/pl) MA (pl) H2O (pl) En pg/tube final 0 1000 0,1 50 950 2 0,2 100 900 3 0,3 150 850 4 0,4 200 800 0,5 250 750 6 0,6 300 700 7 0,7 350 650 8 0,8 400 600 9 0,9 450 550 1,0 500 500 5 Le réactif (bleu de Coomassie G250) est dilué extemporanément au 1/5 (se conserve 1 heure). Dans une plaque 96 puits, additionner 200pl de réactif dilué à : -10 pl de solution stock pour la gamme -10 pl d'H20 pour le blanc 0 -10 pl de NaOH O,IM pour le blanc échantillon - 10 pl d'échantillon à doser (en triplicate ou quadruplicate) Agiter la plaque et laisser la coloration se développer 10min. Mesurer les absorbances à 595nm. La coloration est stable jusqu'à 40 minutes.15 ANNEXE D Liste anticorps primaires et secondaires Anticorps référence dilution Temps d'incubation anticorps (clone T311) Lab 1/2000. 1 heure monoclonal vision corporation. Tyrosinase Ab- Anti-20S (ST 1053, 1/2000 1 heure proteasome humain Calbiochem) polyclonal Anti-26S anti PA700, 539147, 1/2000 heure proteasome humain Calbiochem) polyclonal Anti-monoubiquitine (SC-8017, Santa 1/ 5000 1 heure monoclonal Cruz) Anti rabbit IgG HRP Amersham NA9340 1,/50000 1 heure Anti mouselgG HRP Amersham NA9310 1/50000 1 heure 51 TABLEAU 1 pp. _ pppp_ Contrôle Acide Acide Phaedactylum Contrôle Acide Acide Phaedactylum palmitique linoléique tricornutum +MG132 palmitique linoléique Tricornutum +MG132 +MG132 +MG132 _ ppp_ppppp __ _ 3.8 3 0.37 6.3 0.37 7 0.33 3 0.3 1.36 0.29 3.5 0.24 4.6 0.25 0.32 _ post- 55.5 54 6 78 3.6 88 6.8 42 5 44 2.2 59 5.5 61 7 2.4 _pp 1915 1998 2848 627 569 2054 +258 456 169 456 248 171 261 424 282 261 ppp.ppp_ _ _ ableau Mesure aci;ivités du protéasome REVENDICATIONS 1. Utilisation dans une composition cosmétique d'un extrait de l'algue Phaeodactylum tricornutum, en tant qu'agent actif dépigmentant 5 destiné en particulier à atténuer ou supprimer les taches pigmentaires de la peau ou à éclaircir le teint ou les poils ou les cheveux. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit extrait d'algue est utilisé dans ladite composition à une concentration comprise entre 0,001 % et 5 % en poids, de préférence entre 0,001 et 10 1 % en poids, par rapport au poids total de la composition finale. 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit extrait contient au moins 40 % en poids d'acides gras, de préférence au moins 60% en poids. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en 15 ce que ledit extrait est obtenu à partir de ladite algue dans un procédé comprenant au moins une étape d'extraction par un solvant suffisamment apolaire pour extraire les acides gras. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit solvant est l'isopropanol, l'hexane, la cyclohexane ou l'heptane 20 6. Utilisation selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que ledit procédé d'extraction comprend au moins une étape d'extraction par un solvant d'extraction choisi parmi les alcools en C1-C61 les mélanges hydroalcooliques de ces alcools, les polyalcools en C2-C6 tels que l'éthylèneglycol, les solvants chlorés tels que le chloroforme et le 25 dichlorométhane, les esters en C3-C6 d'acides organiques tels que l'acétate d'éthyle, les alcanes en C6-CIO tels que l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, les éthers en C5-C8 tels que le diisopropyléther, ledit solvant d'extraction étant éventuellement alcalinisé P,ine de- reve, t is 4 à 6, caractér 30 ce que ledit extrait est obtenu dar Jn procede d'extraction comprenant une première étape d'extracti Je l'algue par un mélange hydroalcoolique alcalinisé, l'alcool dudit mélange hydroalcoolique étant de )référence choisi dans le groupe de l'isopropanol. de l'éthanol et du ape permettent rie récupérer Iee rlrMC 358. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit procédé d'extraction comprend en outre une étape de récupération des acides gras dans une phase apolaire, consistant à acidifier ledit mélange hydroalcoolique puis à procéder à une extraction liquide-liquide au moyen d'un solvant apolaire et enfin à éliminer ledit solvant apolaire pour obtenir ledit extrait sous forme d'une huile. 9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit solvant apolaire est choisi dans le groupe constitué de l'heptane, de l'hexane et du cyclohexane. 10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit extrait de l'algue est obtenu par extraction au moyen du CO2 supercritique. 11. Méthode de soin cosmétique destinée à atténuer ou à supprimer les taches pigmentaires de la peau ou à éclaircir le teint ou les poils ou les cheveux, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur au moins une zone concernée de la peau, d'une composition cosmétique telle que définie dans l'une des revendications 1 à Io. 12. Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite composition contient une quantité efficace dudit extrait pour obtenir l'effet recherché.