FR 2909560 A1 20080613 FR 0610645 A 20061206 1 La présente invention concerne des implants injectables par voie sous-cutanée ou intradermique à base d'acide hyaluronique. L'acide hyaluronique (HA) sous sa forme acide ou sous forme de sel (hyaluronate) est la composante majeure de la matrice extracellulaire. Il est surtout présent dans les tissus conjonctifs dits mous par opposition à d'autres glycosaminoglycanes comme l'acide chondroïtine sulfurique présents dans les tissus dits durs tels que le cartilage. On le retrouve ainsi en quantités importantes principalement dans la peau. Le HA est un glycosaminoglycane linéaire non sulfaté composé d'unités répétitives de D-acide glucuronique et de N-acetyl-D-glucosamine (Tammi R., Agren UM., Tuhkanen AL., Tammi M. Hyaluronan metabolism in skin. Progress in Histochemistry & Cytochemistry. 29(2):1-81, 1994). Dans la peau normale, le HA est synthétisé essentiellement par les fibroblastes dermiques et les kératinocytes épidermiques (Tammi R., déjà cité). Grâce à ses résidus portant une charge négative, le HA joue le rôle d'une pompe à eau permettant de maintenir l'élasticité de la peau. Le HA a un rôle principal dans le contrôle de la diffusion des aliments, des hormones, des vitamines et des sels inorganiques du tissu conjonctif et dans le nettoyage des déchets métaboliques pouvant induire des réactions inflammatoires. Avec l'âge, la quantité de HA et son degré de polymérisation diminuent, résultant en une diminution de la quantité d'eau retenue dans le tissu conjonctif. La peau subit alors un processus de vieillissement qui aboutit à une augmentation de la fibrose et à une baisse de la teneur en fibres élastiques. Dans la peau humaine normale, le HA existe sous forme d'un polymère de haut poids moléculaire (600 000 - 1 000 000 Da). La dégradation physiologique du HA dans la peau se fait par (i) l'internalisation par les kératinocytes et (ii) la fragmentation intracellulaire en fragments de taille intermédiaire par les hyaluronidases (60 000-300 000 Da). Le HA fragmenté est relâché par les 2909560 2 kératinocytes, passe la membrane basale et est libéré directement dans les vaisseaux lymphatiques (Tammi R. et al., déjà cité). Le rôle de l'acide hyaluronique (HA) en dermatologie est connu dans de nombreux domaines dont celui de la cicatrisation, et de l'hydratation. L'acide 5 hyaluronique agit le plus souvent par ses interactions avec des protéines de liaison et surtout avec son récepteur transmembranaire CD44 (Tool B.P. 2001, Sem. Cell. Devel. Biol. 12 : 79-87 , Liao Y-H., Stuart A.J., Drug Delivery, 12 : 327-342, 2005). L'activation de ce récepteur se traduit par un rôle de morphogenèse, dans la multiplication et la prolifération cellulaire, l'angiogenèse et la migration cellulaire 10 (G.Weindl, M.Schaller, Skin Pharm. Physiol. 2004 ; 17 ; 207-213). Les données de la littérature suggèrent que ces différentes actions seraient fonction de l'environnement de la cellule, du poids moléculaire de l'acide hyaluronique et de sa concentration. Par exemple les hauts poids moléculaires inhiberaient l'angiogenèse, alors que les oligosaccharides la stimuleraient. 15 La demande de brevet japonaise JP-11279042 met en évidence en topique une action de fragments d'acide hyaluronique (HAF) sulfatés (de masse moléculaire comprise entre 1 et 50 kDa) qui permettraient de maintenir l'élasticité de la peau et d'éviter la kératinisation. Une étude récente réalisée sur des fragments de HA (de masse moléculaire 20 entre 50 et 750 kDa) en topique, met en évidence une relance de la synthèse de l'acide hyaluronique par les kératinocytes (demandes de brevets FR 2 865 651, WO 2005/082327). Cette activité prolifératrice serait induite par des HAF de poids moléculaires précis, activité qui n'apparaîtrait pas sur des poids moléculaires supérieurs ou inférieurs. 25 Dans le domaine de l'esthétique, de nombreux produits-injectables à base d'acide hyaluronique existent. En mésothérapie, des solutions de vitamines, d'antioxydant, de sels minéraux ou d'acide hyaluronique sont utilisées. Les vitamines sont présentes pour stimuler et entretenir le métabolisme cellulaire, et ainsi relancer la production de collagène, les anti-oxydants luttent contre le vieillissement, les sels 30 minéraux seraient indispensables aux activités enzymatiques cellulaires. Quant à l'acide hyaluronique, il permet de maintenir le volume et l'hydratation de la peau, et 2909560 3 de créer un écran protecteur face aux dégradations par les radicaux libres (H.Trommer, S.Wartewig, Int. Journ. Of Pharm. 254(2003) 223-234). A des concentrations suffisantes, l'acide hyaluronique créerait un environnement optimal pour la prolifération cellulaire, la néo-synthèse de collagène. Dans le domaine du 5 comblement des rides, des gels de HA réticulé chimiquement sont injectés en intradermique pour combler la dépression creusée par la ride. La réticulation permet d'augmenter la rémanence du produit à l'intérieur du derme. Ainsi, si le produit est injecté correctement et selon le profil génétique de chacun, le produit permet un comblement en 4 à 6 voir 8 mois. Il est ensuite totalement résorbé dans le derme. 10 Jusqu'à aujourd'hui, plusieurs produits ont été utilisés dans cette même application. Les gels ou huiles de silicones sont faciles à mettre en oeuvre, mais présentent l'inconvénient de migrer dans les tissus situés juste sous les points d'injection. Des phénomènes d'inflammation chroniques ou de réactions allergiques sont ainsi apparus. De plus la silicone n'est pas biodégradable, et se retrouve dans 15 certains organes tels que le foie. Différentes suspensions de particules polymériques ont aussi été proposées, mais la plupart ont provoqué des réactions de rejets, des infections, ou des inflammations. Enfin des suspensions de collagène ont été mises en oeuvre au cours des dernières années. Toutefois le collagène est résorbé relativement rapidement (entre 1 et 3 mois), et provoque certaines réactions 2 0 allergiques dues à sa provenance, généralement d'origine bovine ou porcine. Il subsiste donc le besoin de disposer d'implants injectables capables de revitaliser le derme et l'épiderme, et n'ayant pas les inconvénients évoqués ci-dessus, ou de manière beaucoup moins prononcée, tout en étant très simples de mise en oeuvre. 2 5 La présente invention concerne donc un implant injectable par voie sous-cutanée ou intradermique sous la forme d'un hydrogel monophasique, caractérisé en ce qu'il comprend en poids de 0,5% à 5%, de préférence 0, 5% à 4%, plus préférentiellement 2% d'acide hyaluronique, et dans lequel : 50% à 95%, de préférence 60% à 90%, plus préférentiellement encore 85% en 30 poids de l'acide hyaluronique est sous forme de gel réticulé ; 2909560 4 5% à 50%, de préférence 10% à 30 %, plus préférentiellement encore 15% en poids de l'acide hyaluronique est sous forme libre, ou sous la forme d'un de ses sels physiologiquement acceptables, d'une masse moléculaire comprise entre 500 et 2800 kDa, de préférence entre 750 et 2600 kDa, plus préférentiellement 5 entre 800 et 2500 kDa, plus préférentiellement encore entre 1000 et 1500 kDa, dans un fluide vecteur physiologiquement acceptable, le rapport entre le poids du gel d'acide hyaluronique réticulé et le poids de l'acide hyaluronique libre étant compris entre 1:1 et 1:0,05. Dans le cadre de la présente invention, par acide hyaluronique ou HA on 10 entend un glycosaminoglycane linéaire non sulfaté composé d'unités répétitives d'acide D-glucuronique et de N-acétyl-D-glucosamine. On désigne par hydrogel monophasique un hydrogel sous la forme d'une seule phase homogène. On désigne par sel d'acide hyaluronique physiologiquement acceptable 15 notamment les sels de sodium et de potassium ainsi que leurs mélanges. Avantageusement, le sel est le sel de sodium. Avantageusement, le gel constitué d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention à une viscosité comprise entre 200 et 2000 Pa.s, plus avantageusement entre 1000 et 1800 Pa.s. 2 0 Avantageusement, l'acide hyaluronique réticulé constituant le gel selon l'invention a une masse moléculaire comprise entre 1000 et 6000 kDa, plus avantageusement comprise entre 1000 et 4000 kDa. Selon un aspect avantageux de l'invention, l'implant injectable contient en outre du sulfate de chondroïtine. 25 Avantageusement, la quantité de sulfate de chondroïtine représente en poids entre 0,05% et 5% du poids total. Avantageusement, le sulfate de chondroïtine a une masse moléculaire comprise entre 2 et 80 kDa, plus avantageusement entre 20 et 50 kDa. L'implant selon l'invention peut contenir divers additifs habituels. On citera à 30 titre d'exemple les colorants, les pigments colorants, les huiles végétales, les épaississants, les modificateurs de pH, les ajusteurs de l'osmolarité. 2909560 5 L'acide hyaluronique libre, ou l'un de ses sels physiologiquement acceptables, est avantageusement réparti de façon homogène à l'intérieur du gel d'acide hyaluronique réticulé. Le fluide vecteur est avantageusement un tampon isotonique stérile 5 apyrogène. L'implant injectable selon l'invention contient en outre avantageusement au moins un autre principe actif utilisé en dermo-cosmétique. Avantageusement, le principe actif dermo-cosmétique est choisi parmi les vitamines, les anti-oxydants, les sels minéraux et les antiseptiques. 10 L'implant selon la présente invention est injecté dans le derme superficiel, moyen ou profond. Il présente l'avantage de pouvoir, dès l'injection, provoquer une relance fibroblastique en favorisant la prolifération cellulaire et la néo-synthèse de collagène. L'activation des fibroblastes génère alors une modulation des mécanismes impliqués 15 dans le remodelage de la matrice extracellulaire, ce qui se traduit par une revitalisation du derme. L'association du HA libre de masse moléculaire comprise entre 500 et 2800 kDa avec le gel de HA réticulé a pour conséquence l'hydratation et le maintien du volume de la peau, de façon immédiate. De plus elle induit une relance fibroblastique 2 0 du derme, principalement due à la présence du HA libre, et cette relance fibroblastique est prolongée dans le temps au fur et à mesure de la dégradation in vivo du gel de HA réticulé. Donc l'implant selon l'invention combine l'effet mécanique du gel réticulé, qui gonfle et remodèle la ride, avec l'action biologique du HA libre. 25 L'invention a également pour objet un kit se présentant sous la forme de seringue contenant un implant injectable tel que décrit précédemment. L'invention a encore pour objet l'implant tel que décrit précédemment en tant que médicament. L'invention concerne également l'utilisation d'un implant injectable tel que 30 précédemment décrit pour le comblement des rides, ridules, dépressions cutanées et/ou cicatrices comprenant l'injection sous-cutanée d'un tel implant. 2909560 6 L'implant injectable selon l'invention peut être utilisé pour la préparation d'un médicament destiné à stimuler le métabolisme épidermique et dermique et/ou à relancer l'activité cellulaire épidermique. L'implant injectable selon l'invention peut être utilisé pour la préparation 5 d'un médicament destiné à stimuler l'activité anti-oxydante du derme. L'invention concerne également un procédé cosmétique de comblement des rides et/ou ridules, comprenant l'injection d'au moins un implant injectable selon l'invention. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un implant 10 injectable tel que décrit précédemment. Il peut être préparé par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par un diépoxy, notamment le butanediol diglycidyle éther (BDDE) ou le 1,2,7,8-diépoxy-octane. Avec une réticulation en milieu basique, la concentration en diépoxy peut varier par exemple entre 5 et 15% par rapport à l'acide hyaluronique pour une réticulation en bain-marie à 45-55 C 15 pendant 1,5 à 6 h. Le gel réticulé est ensuite purifié par les techniques classiques de l'homme de l'art: différents bains d'eau désionisée, précipitation alcoolique, dialyse... pour éliminer les traces de réticulant résiduel. A ce gel purifié, du HA de poids moléculaire adéquat, préalablement hydraté dans un tampon adéquat, sera ajouté. Le produit fini sera enfin dégazé, mis en seringue ou tout autre récipient adéquat et 2 0 stérilisé par autoclavage. Un procédé avantageux selon l'invention comprend les étapes successives suivantes: - introduction de l'acide hyaluronique dans un fluide iso-osmolaire et tamponné basique, 25 - gonflement, réticulation et homogénéisation à chaud sous agitation lente, - neutralisation du gel obtenu et élimination du réticulant, ajout de l'acide hyaluronique hydraté par une solution tampon basique, -homogénéisation du mélange, dégazage optionnel, 30 - conditionnement en flacons ou seringues, stérilisation. 2909560 7 Avantageusement, le pH du gel après stérilisation est ajusté à environ 7 et l'osmolarité à environ 320 mOsm. L'invention va maintenant être illustrée, de manière non limitative, par les 5 exemples suivants. Exemple 1 : Caractérisation de l'activité de HA de différentes masses moléculaires sur : - des fibroblastes sains ; 10 - des fibroblastes sénescents (par stress oxydatif à H2O2). La MMP-1 (ou collagénase 1) est une collagénase interstitielle qui dégrade la triple hélice des collagènes fibrillaires comme les collagènes I et III. Au niveau cutané, elle est exprimée et sécrétée par les fibroblastes et les kératinocytes. La MMP-1 est impliquée dans le vieillissement. En effet, sa surproduction au cours du 15 vieillissement pourrait être impliquée dans la perte de fermeté et d'élasticité, et l'apparition des rides. Lorsque l'on induit la sénescence avec H2O2, on observe chez les fibroblastes une très forte augmentation de la MMP-1. Les principes actifs capables de réduire cette surproduction pourraient donc avoir des propriétés "antiage". 20 Les fibroblastes sont obtenus à partir de peau provenant de déchets opératoires de sujets jeunes. Les échantillons ont été lavés dans du PBS et de l'éthanol. Des petits morceaux de peau ont été coupés et répartis dans des boîtes de culture et immergés dans un milieu favorable à la prolifération des fibroblastes (DMEM + 10% SVF). A ce milieu, de la primocine a été ajoutée. Celle-ci est antibiotique, antifongique et 2 5 antimicoplasme. Les boîtes de cultures sont mises à incuber. Pour induire la sénescence, les fibroblastes sont ensemencés dans des boites de cultures. 24 heures après, le principe actif à tester est rajouté selon la concentration appropriée, dans du DMEM. Après 24 heures d'incubation, les cellules sont soumises à un stress oxydant. Elles sont incubées pendant 2 heures à 37 C, dans une solution 30 d'H2O2 à 75 M dans du PBS. Il s'agit d'un stress aigu qui induit la sénescence des 2909560 8 cellules. Les fibroblastes sont ensuite replacés dans du DMEM complété avec 10% de SVF. 72 heures après la fin du stress, les fibroblastes sont rentrés en sénescence. 1.1. Protocole d'incubation. 5 Pour les fibroblastes sénescents : les HA sont ajoutés à une concentration finale de 1 g/ml, ils sont laissés pendant le stress H2O2, soit 24 h d'incubation. Pour les fibroblastes sains : les HA sont incubés également 24 h à 1 gg/ml. 1.2. Extraction des ARN totaux à l'aide du kit d'extraction Rneasy (Qiagen) à la fin 10 de l'expérience (J5, c'est à dire 72h post-stress). 1.3. Dosage des ARN totaux. Le dosage qualitatif et quantitatif des ARN totaux est réalisé à l'aide du kit de dosage RNA 6000 Nano LabChip et de l'appareil Bioanalyseur 2100 (Agilent). Il repose sur 15 le principe de la migration électrophorétique des échantillons dans une nanopuce. Le rapport des ARN ribosomaux 28S/18S est calculé ; il est informatif pour évaluer l'intégrité des ARN. De plus, la pureté des ARN vis à vis de l'ADN génomique est estimée. 20 1.4. Analyse des taux de transcription par PCR en temps réel. La PCR en temps réel permet de quantifier le niveau d'expression transcriptionnel d'un gène d'intérêt par amplification des ADNc, obtenus par transcription inverse, des ARNm du gène présent dans le lysat cellulaire. Le mélange réactionnel est constitué d'ADNc et du mélange du couple d'amorces d'intérêt avec une solution 25 d'iQ SybrGreen Supermix (Biorad) contenant, entre autres, la Taq Polymérase et un agent intercalant du petit sillon des doubles hélices d'ADN : le Sybr Green (agent intercalant fluorescent). La réaction se fait dans le thermocycleur Icycler IQ (Biorad); il s'agit d'une suite de cycles de dénaturation/hybridation/élongation. 30 2909560 9 1.4.1. Transcription inverse : les ARN totaux sont retro-transcrits en ADNc à l'aide du kit Reverse Transcription System (Promega) et de l'appareil Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer). 1.4.2. Mesure du taux de transcription d'un gène d'intérêt : le niveau d'expression du 5 gène d'intérêt est normalisé par le niveau d'expression de gènes de référence, qui varient peu avec la sénescence. Le niveau d'expression du gène d'intérêt est calculé selon la formule : 2 (CTmin-CT) où CT signifie "cycle threshold". Il est normalisé, par rapport à l'expression des trois gènes de référence sélectionnés, selon le calcul : 2 (CTmin-CT) / facteur de normalisation. 10 1.5. Résultats. Les fibroblastes rendus sénescents par incubation avec H2O2 exprimaient 2,14 fois plus la MMP-1 que les fibroblastes normaux (donc la sénescence a bien été induite). En présence de Vitamine E (contrôle positif), la surexpression de MMP-1 par les 15 fibroblastes sénescents était réduite de 40%. La surexpression de MMP-1 était réduite de 40% en présence de HA 450 kDa (10 gg/ml), de 75% en présence de HA 800 kDa (10 gg/ml), de 71% en présence de HA 1500 kDa (10 g/ml), de 83% en présence de HA 2600 kDa (10 ug/ml). 2 0 1.6. Conclusion. En conclusion de cette expérience, il apparaît que les HA exercent une activité anti-MMP-1 (soit anti-oxydante donc ayant potentiellement une activité anti-âge) dans ce modèle de sénescence induite. Les HA de plus haute masse molaire (800, 1500 et 2600 kDa) semblent plus efficaces que le HA de 450kDa. 25 Exemple 2: Préparation d'un implant selon l'invention. 2.1. Préparation du HA réticulé. 5 g de hyaluronate de sodium de poids moléculaire de 1,6 MDa ont été ajoutés à de la soude 1% (35,6g). Le mélange est laissé à l'homogénéisation discontinue pendant 30 1h30. 315 mg de BDDE ont été ajoutés au mélange HA/NaOH qui a été 2909560 10 homogénéisé, fermé puis placé au bain-marie à 50 C pendant 2 h. Le mélange a été neutralisé par l'ajout de 5 g de HC1 1N. Le gel ainsi obtenu a été ajouté à la concentration souhaitée par ajout d'EDI et de sels garantissant l'iso-osmolarité, ainsi qu'un pH neutre stable pour donner un gel à 20 5 mg/g en HA. 2.2. Préparation de l'implant. A ce gel purifié est ajouté du HA de 1,2 MDa, préalablement hydraté dans du tampon phosphate. Aux 226 g de gel réticulé obtenus, sont ajouté 60 g de gel de HA 1,2 10 MDa, de concentration 20 mg/g. Les 2 gels sont homogénéisés dans un mélangeur classique à pâles pendant 1 à 2 heures. Le produit fini peut enfin être dégazé, rempli en seringues et stérilisé par autoclavage vapeur suivant un cycle par exemple de 125 C pendant 7 min, de 127 C pendant 4 min. ou de 130 C pendant 3 min. 15 Après stérilisation, le pH du produit est de 7,1, l'osmolarité de 320 mOsm, et les caractérisations rhéologiques donnent un module élastique G' de 45 Pa.s à une fréquence de 1 Hz. La concentration finale du gel est dosée à 19,8 mg/g (dosage au carbazole, méthode de la Pharmacopée Européenne), pour une concentration prévue de 20 mg/g. 20 REVENDICATIONS 1. Implant injectable par voie sous-cutanée ou intradermique sous la forme d'un hydrogel monophasique, caractérisé en ce qu'il comprend en poids de 0,5% à 5%, de préférence 0,5% à 4%, plus préférentiellement 2% d'acide hyaluronique, et dans lequel : - 50% à 95%, de préférence 60% à 90%, plus préférentiellement encore 85% en poids de l'acide hyaluronique est sous forme de gel réticulé ; 5% à 50%, de préférence 10% à 30 %, plus préférentiellement encore 15% en poids de l'acide hyaluronique est sous forme libre, ou sous la forme d'un de ses sels physiologiquement acceptables, d'une masse moléculaire comprise entre 500 et 2800 kDa, de préférence entre 750 et 2600 kDa, plus préférentiellement entre 800 et 2500 kDa, plus préférentiellement encore entre 1000 et 1500 kDa, dans un fluide vecteur physiologiquement acceptable, le rapport entre le poids du gel d'acide hyaluronique réticulé et le poids de l'acide hyaluronique libre étant compris entre 1:1 et 1:0,05. 2. Implant injectable selon la revendication 1, caractérisé en ce que gel constitué d'acide hyaluronique réticulé a une viscosité comprise entre 200 et 2000 Pa.s, de 2 0 préférence entre 1000 et 1800 Pa.s. 3. Implant injectable selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'acide hyaluronique constituant le gel réticulé a une masse moléculaire comprise entre 1000 et 6000 kDa, de préférence comprise entre 1000 et 2 5 4000 kDa. 4. Implant injectable selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il contient en outre du sulfate de chondroïtine. 2909560 12 5. Implant injectable selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le sulfate de chondroïtine a une masse moléculaire comprise entre 2 et 80 kDa, préférentiellement entre 20 et 50 kDa. 5 6. Implant injectable selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'acide hyaluronique libre, ou l'un de ses sels physiologiquement acceptables, est réparti de façon homogène à l'intérieur du gel d'acide hyaluronique réticulé. 10 7. Implant injectable selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le fluide vecteur est un tampon isotonique stérile apyrogène. 8. Implant injectable selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il contient en outre au moins un autre principe actif utilisé en 15 dermo-cosmétique. 9. Implant injectable selon la revendication 8, caractérisé en ce que le principe actif dermo-cosmétique est choisi parmi les vitamines, les anti-oxydants, et les sels minéraux. 10. Kit se présentant sous la forme de seringue et contenant un implant injectable selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 en tant que 25 médicament. 12. Utilisation d'un implant injectable selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ou du kit selon la revendication 10, pour le comblement des rides, ridules, dépressions cutanée et/ou cicatrices comprenant l'injection sous-cutanée d'un tel 30 implant. 2909560 13 13. Utilisation d'un implant injectable selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la préparation d'un médicament destiné à stimuler l'activité anti-oxydante du derme. 5 14. Procédé cosmétique de comblement des rides et/ou ridules, comprenant l'injection d'au moins un implant injectable selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 15. Procédé de préparation d'un implant injectable selon l'une quelconque des 10 revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : introduction de l'acide hyaluronique dans un fluide isoosmolaire et tamponné basique, gonflement, réticulation et homogénéisation à chaud sous agitation lente, 15 - neutralisation du gel obtenu et élimination du réticulant, - ajout de l'acide hyaluronique hydraté par une solution tampon basique, homogénéisation du mélange, dégazage optionnel, conditionnement en flacons ou seringues, 2 0 -stérilisation.