FR 2907686 A1 20080502 FR 0609412 A 20061026 DISPOSITIF ET PROCEDE DE CHROMATOGRAPHIE A CONTRE COURANT VRAI s La présente invention concerne un dispositif et un procédé de chromatographie liquide liquide à contre courant vrai. La chromatographie est une technique d'analyse et ou de purification par séparation des composés d'un mélange. Cette méthode est basée sur les io différences d'affinités des composés à l'égard de deux phases appelées stationnaire et mobile. Selon la technique choisie, des composés entrainés par la phase mobile interagissent ou non avec la phase stationnaire et leur séparation résulte 15 soit de leur adsorption et leur désorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur coefficient de partage relatif à chaque phase. Les appareils de chromatographie sont généralement constitués d'une pompe d'élution, d'un système d'injection, d'une colonne 20 chromatographique, d'un détecteur et d'un système d'enregistrement et/ou d'analyse des chromatogrammes résultant. La présente invention concerne une amélioration d'un dispositif et d'un procédé de chromatographie liquide liquide basée sur le partage de 25 solutés entre deux phases liquides non miscibles préparées à partir du mélange de deux ou plusieurs solvants appelés systèmes de solvants biphasiques. 2907686 2 En chromatographie liquide liquide, une phase est maintenue stationnaire dans la colonne par une force centrifuge, pendant que l'autre phase mobile est percolée au travers. Les solutés se séparent le long de la colonne en fonction de leur affinité pour l'une ou l'autre des phases s définissant ainsi leur ordre d'élution. Cette technique permettant d'injecter tous types de mélange liquide ou solution est limitée à une injection de volume défini de mélange dite discontinue ou batch nécessitant d'augmenter le volume des colonnes s'il io est souhaité d'injecter des volumes plus grands ou avoir une plus grande productivité. Ceci présente l'inconvénient majeur de disposer d'installations encombrantes et onéreuses et une mise au point rigoureuse. De plus, la maintenance de ce type de dispositif se révèle complexe. ls De nombreux progrès sont encore à réaliser et les recherches actuelles portent sur l'injection en continu de ce dispositif. Les systèmes d'injection continue de solution à traiter à fin de purifier 20 une quantité indéfinie de solutés existent en Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP). Cette technique repose sur le principe d'une chromatographie à lit mobile simulé (LMS) qui est un procédé de séparation continu dans lequel un mouvement à contre-courant des phases liquide et solide est simulé par une commutation périodique 25 de pompes ou vannes d'entrée et de sortie (cf. brevet américain n US6544413). L'injection en continu est limitée à l'injection de solutions non complexes. De plus, ce type de chromatographie ne permet pas de résoudre les problèmes liés au support solide utilisé pour maintenir la phase stationnaire en CLHP. De plus, il consomme des solvants en 2907686 3 grande quantité et nécessite un traitement préalable des solutions avant leur injection dans la colonne qui elle-même ne possède pas une grande capacité d'injection. Une technique de chromatographie liquide liquide mettant en oeuvre une injection continue est décrite dans le brevet français n 0308076. Ce dispositif, fonctionnant selon un système hydrostatique, permet d'injecter en continu une solution et donc de purifier une quantité indéfinie de solutés. Les cellules de ce dispositif connu possèdent une entrée et une sortie et sont reliées par de simples canaux. L'injection continue se lo réalise en un point situé entre les extrémités de la colonne chromatographique. Les solutés purifiés sont récupérés en alternance de chaque côté du dispositif. En effet, on procède par des cycles successifs avec alternance de phases mobiles et stationnaires. Ce dispositif permet d'automatiser le procédé mais possède cependant l'inconvénient d'être is coûteux à mettre en oeuvre, en main d'oeuvre et se révèle difficile à utiliser. De plus, ce procédé peut se révéler instable dans le temps, c'est-à-dire que la proportion des phases dans la colonne varie au cours du temps. En outre, il ne permet pas la récupération des solutés purifiés en continu. 20 II existe également des systèmes hydrodynamiques d'extraction. Ces dispositifs fonctionnent de manière similaire au dispositif du brevet susmentionné et permettent une injection continue et une récupération de solutés purifiés en alternance par l'intermédiaire de cycles. Ce dispositif 25 est complexe et nécessite une maintenance trop importante. Ce type de dispositif est, en outre, très fragile. La présente invention remédie aux inconvénients de l'art antérieur en proposant un dispositif permettant d'injecter des mélanges liquides ou 2907686 4 solutions et de récupérer en continu des solutés purifiés avec un meilleur rendement. De plus, il permet une optimisation de la productivité et un gain de temps s sans augmenter le volume des colonnes chromatographiques utilisées. Le dispositif selon l'invention propose une technique de mise en oeuvre plus simple, plus rapide et moins onéreuse. En outre, le dispositif selon l'invention propose une simplification du 10 procédé continu et discontinu avec une automatisation possible. De même, le dispositif selon l'invention permet la récupération de solutés non élués dans leur intégralité par simple vidange et évaporation. 1s L'utilisation du dispositif selon l'invention permet un choix de systèmes de solvants biphasiques presque illimité et différents modes d'élution. Avantageusement ce dispositif permet l'injection de tous types de mélanges, tel que des extraits naturels ou issus de matrices biologiques, 20 de réactions de synthèse, sans opération ou traitement préalable. De manière avantageuse, il permet une réduction de consommation en solvant. 25 A cette fin, le dispositif de chromatographie selon l'invention comprend au moins une colonne soumise à une centrifugation ou au moins un ensemble de dispositifs de centrifugation à cellules, au moins un système de solvants biphasique, et un moyen d'injection d'une solution 2907686 s comprenant des solutés à extraire, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens d'extraction en continu desdits solutés. Lesdits moyens d'extraction en continu sont formés d'au moins deux s phases liquides non miscibles à contre-courant vrai continu dudit au moins un système de solvants biphasique et de cellules comportant chacune deux entrées et deux sorties correspondant à la phase lourde et légère dudit au moins un système de solvants biphasique. io Plus précisément, chaque cellule comprend des moyens de connexion reliant deux cellules contiguës. Alternativement, chaque cellule peut être un mélangeur. 15 Avantageusement, lesdites au moins deux phases liquides non miscibles du dispositif selon l'invention, circulent à contre-courant vrai en même temps dans lesdites cellules de chaque colonne ou de chaque ensemble de dispositifs par l'intermédiaire de pompes. 20 De manière plus précise, ledit moyen d'injection est disposé en un point intermédiaire de ladite au moins une colonne ou dudit au moins un ensemble de dispositifs. Alternativement, l'injection peut être réalisée de manière discontinue ou continue. 25 A cette fin, le procédé selon l'invention continu de chromatographie comprenant les étapes suivantes : i) centrifugation par au moins une colonne à cellules ou au moins un ensemble de dispositifs de centrifugation d'au moins un système de solvants biphasique, 20 2907686 6 ii) injection d'une solution comprenant des solutés à extraire, est caractérisé en ce qu'il comprend une extraction en continu desdits solutés. s Plus précisément, le procédé continu de chromatographie comprend les étapes suivantes : i) injection (en continu ou discontinu) d'une solution comprenant des solutés à extraire ; ii) passage simultané d'au moins deux phases liquides non io miscibles dudit au moins un système de solvants biphasique à contre-courant vrai dans des cellules, comprenant deux entrées et deux sorties desdites au moins deux phases, de chaque colonne chromatographique ou de chaque ensemble de dispositifs de centrifugation ; 15 iii) extraction en continu des solutés. L'invention sera bien comprise à la lumière de la description qui suit, se rapportant à des exemples illustratifs, et en aucun cas exhaustifs, de la présente invention, en référence aux dessins, ci-joints, dans lesquels : - la figure 1 est un schéma global représentant le fonctionnement du dispositif selon l'invention ; - les figures 2 à 5 sont des schémas illustrant le fonctionnement d'un lit 25 mobile vrai ; - la figure 6 est une vue schématique partielle en perspective d'un exemple de colonne comportant les cellules selon l'invention; 15 25 2907686 7 - les figures 7 et 8 sont des schémas d'exemples de fonctionnement des cellules selon l'invention. La présente invention propose un dispositif de chromatographie de 5 partage centrifuge liquide liquide à contre courant vrai basé sur le partage de soluté entre deux phases liquides non miscibles préparées à partir du mélange d'au moins deux solvants également appelé systèmes de solvants biphasiques . lo La figure 1 est un schéma global représentant le fonctionnement du dispositif selon l'invention. Le dispositif selon l'invention comprend au moins une colonne chromatographique, 1. De préférence, le dispositif selon l'invention comporte au moins deux colonnes chromatographique 1 et 2 soumise à une centrifugation. Ces colonnes sont, par exemple, des colonnes à disques et sont illustrées 20 dans la demande de brevet français n 0503225 et brevet français n 2791578. De manière alternative, les colonnes peuvent être à cylindre et sont illustrées, par exemple, dans le brevet français n 2852104. Alternativement, ladite au moins une colonne soumise à centrifugation peut être substituée par au moins un ensemble de dispositifs de centrifugation. 2907686 8 Dans le but d'une meilleure compréhension de l'invention et à titre d'exemple illustratif mais en aucun cas limitatif, le cas où le dispositif selon l'invention comprend des colonnes chromatographiques sera étudié dans la suite de la présente description. 5 En un point intermédiaire des deux colonnes, une pompe 3 et un moyen d'injection 4 permettent l'injection continue d'un mélange liquide ou solution 5 comprenant des solutés à séparer (par exemple, une solution comprenant au moins deux solutés A et B), dans un mélange d'au moins deux phases ou flux 6 et 7. Ces deux phases légère 6 et lourde 7 ou flux, non miscibles, évoluent à contre-courant dans l'ensemble du dispositif et sont pompées par l'intermédiaire d'au moins deux pompes 8 et 9. En fonction de leur affinité, ou coefficient de partage, pour chacune des phases, le soluté A est entraîné dans la phase légère 6, et le soluté B dans la phase lourde 7. 20 On entend par phase lourde , une phase ayant la plus grande masse volumique et par phase légère , une phase ayant la plus faible masse volumique. Une injection et une séparation en continu des solutés A et B sont ainsi 25 réalisées. De manière alternative, l'injection de la solution en un point de la colonne peut se réaliser de manière discontinue. 2907686 9 Ce type de procédé ou dispositif comprenant une partie des moyens d'extraction en continu, c'est-à-dire deux flux ou phases liquides non miscibles circulant en vrai contre-courant, permettent de réaliser un système de vrai contre-courant selon le modèle de séparation du type lit 5 mobile vrai . Les figures 2 à 5 sont des schémas illustrant le fonctionnement simplifié d'un lit mobile vrai . On entend par lit mobile vrai un procédé de séparation continu par lo chromatographie. Les deux phases sont en mouvement, sans simulation par l'intermédiaire de jeux de commutations cycliques de vannes dit de lit mobile simulé régulé en fonction de la vitesse d'élution de chacune des solutés. 15 Le circuit est représenté par une boucle fermée dans laquelle circulent deux phases en sens opposé. L'injection de la solution, S, contenant les deux solutés A et B est effectuée (voir figure 2). Le soluté A possède plus d'affinité avec la phase légère 6 et le soluté B avec la phase lourde 7. Après une période de temps T, les solutés se séparent suivant des directions opposées (voir figure 3). 25 Leur extraction est réalisée en une position déterminée (voir figure 4). L'invention reprend ce principe de lit mobile vrai et l'extraction et l'injection sont ainsi réalisées en continu à contre-courant vrai (voir figure 5). 10 15 2907686 10 La figure 6 est une vue schématique partielle en perspective d'un exemple de colonne comportant les cellules selon l'invention. 5 Le dispositif selon l'invention est constitué d'un axe où repose un rotor ou colonne 1 et 2. La colonne représentée à la figure 6 à est un exemple illustratif pour la clarté de la description et n'est donc en aucun cas limitatif. Chaque colonne 1 et 2 est formée d'un ou plusieurs disques 10. Chacun des disques 10 contient, dans son épaisseur et à son extrémité distale par rapport à l'axe de rotation, une succession de cellules 11. A deux extrémités de chaque colonne 1 et 2, il est prévu des raccords rotatifs 12 et 13 permettant un passage des mélanges 5, 6 et 7. Les figures 7 et 8 sont des schémas d'exemples représentant le 20 fonctionnement des cellules selon l'invention. La figure 7 est un exemple illustratif et en aucun cas limitatif de la forme des cellules. Les cellules classiquement employées comportent une seule entrée et une seule sortie ne permettant le fonctionnement que d'un lit mobile simulé par une alternance de cycles. 10 2907686 11 Les cellules 11, selon l'invention, constituant la deuxième partie des moyens d'extraction en continu, sont disposées en série par l'intermédiaire d'un ensemble de canalisations et sont de géométrie variable dépendant de l'opération de purification ou d'extraction s souhaitée. A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, les cellules peuvent être de géométrie sensiblement, ovoïde, ronde, parallélépipédique, ou trapézoïdale. De manière alternative, les cellules peuvent être sensiblement filiformes afin qu'elles forment une structure rectangulaire étirée ou pseudorectangulaire. 1s Les cellules peuvent également être équivalentes à des parties de tubes reliés entre eux par l'ensemble de canalisations ou de fins capillaires. Alternativement, les cellules peuvent être disposées en quinconce ou sous forme de spirale partant de la périphérie vers le centre du disque. 20 Dans le cas où les colonnes sont substituées par des ensembles de dispositifs de centrifugation, les cellules sont assimilées à des mélangeurs, comprenant de la même manière deux entrées et deux sorties permettant une circulation à contre courant vrai des deux phases à 25 l'intérieur de ces derniers par l'intermédiaire de pompes. Chaque cellule 11 comporte une entrée 14 et une sortie 15 pour la phase lourde 7, et une entrée 16 et une sortie 17 pour la phase légère 6 soit quatre moyens de connexion ou canaux ou fins capillaires reliant deux 10 2907686 12 cellules contigües, permettant l'entrée et la sortie simultanée des deux phases 6 et 7 et donc leur mouvement à vrai contre-courant continu. Les cellules 11 sont reliées entre elles de telle sorte que chaque flux 5 arrive toujours du même côté de la cellule. La phase légère 6 passe à travers la phase lourde et vice-versa résultant en un mélange des deux phases sous forme d'émulsion au milieu de chaque cellule. Ainsi, le soluté A passe successivement à travers l'ensemble des cellules de la colonne 2, et le soluté B à travers l'ensemble des cellules de la colonne 1. 15 Les colonnes ou alternativement des ensembles de dispositifs de centrifugation 1 et 2 sont soumis à un ou plusieurs champs centrifuges homogènes en tous points permettant d'accélérer le processus de décantation à l'intérieur de chaque cellule 11. 20 Le nombre de cellules 11 et leur dimensionnement pour chacune des colonnes 1 et 2 sont à définir selon l'utilisation souhaitée. Afin de mettre au point une séparation par chromatographie de partage centrifuge liquide liquide à contre-courant vrai, la première étape consiste 25 en la détermination d'un système de solvant biphasique. Ensuite le système de solvants biphasique est préparé. Le choix de ce dernier est un facteur important. En effet, il est nécessaire de sélectionner 20 2907686 13 des systèmes biphasiques ayant une polarité adaptée aux molécules ou solutés à traiter. La colonne initialement vide est ensuite remplie avec chaque phase s mobile 6 et 7 en proportion à déterminer. La colonne est donc intégralement remplie par les deux phases mobiles correspondant au volume total disponible du dispositif. Un ou plusieurs champs de force centrifuge sont ensuite établis. Les phases mobiles sont 10 alors introduites à des débits fixés par l'opérateur à chaque extrémité du dispositif. Une fois le régime permanent atteint, le mélange liquide à purifier est injecté en continu dans l'une ou l'autre des deux phases liquides ou 1s encore dans un mélange des deux. Les molécules ou les solutés A et B se répartissent alors dans chacune des phases du système de solvants biphasique selon leur coefficient de partage et sont entraînées par l'une ou l'autre phase. Les solutés ainsi séparés sont ensuite collectés en continu pour être soumis à une détection. La plupart des détecteurs utilisés sont des détecteurs UV visibles, à 25 diffusion de lumière, spectromètres de masse ou RMN, électrodes de pH. La nature des molécules détectées permet de définir le mode de détection. 2907686 14 Afin d'éviter tout risque de contamination entre l'extraction de solutions différentes, il est préférable d'opérer un rinçage des colonnes avec un mélange tel que acétone/eau avec au moins une fois son volume total. s Le tableau ci-après synthétise les avantages du dispositif et procédé selon l'invention (dite TCCC) par rapport aux méthodes de chromatographie liquide/liquide centrifuge et au système de séparation de type lit mobile simulé connus. 2907686 15 CPC/CCC Lit mobile simulé en CPC PC Présente invention classique HPLC Brevet Français TCCC n 0308076 INJECTION Volume fini de A et Injection continue de Injection continue de A et Injection continue de A et B injecté à une A et B, en un point B en un point situé au B en un point situé au extrémité de la situé entre les milieu de la colonne milieu de la colonne colonne colonnes, avec mouvement de ce point d'injection ELUTION Mode ascendant ou - Élution alternative dans Elution en mode descendant les deux modes ascendant et descendant ascendant puis simultané descendant ou vice versa avec une fréquence définie par l'opérateur FRACTIONS Fractions collectées Fractions collectées Fractions collectées aux Fractions collectées aux COLLECTEES à l'extrémité de la entre les colonnes deux extrémités de la deux extrémités de la colonne opposée à avec mouvement de colonne de façon colonne de façon celle de l'injection ces points de collecte alternative avec une continue fréquence définie REMPLISSAGE Phase stationnaire, Colonnes Remplissage simultané Remplissage simultané DE puis mise en commercialisées pré avec les deux phases avec les deux phases LA COLONNE équilibre avec la remplies selon un ratio défini par selon un ratio défini par phase mobile avant l'opérateur l'opérateur ou au moment de l'injection TYPE DE Cellules à canal Techniques Cellule simple canal : une Cellule double canaux, CELLULE unique : une entrée différentes (support entrée une sortie deux entrée deux sortie une sortie solide) PRINCIPE Lit mobile simulé par Lit mobile simulé par Lit mobile vrai par contre- mouvement des élution alternative dans courant de phases points d'injection et les deux modes avec une d'extraction fréquence définie 5 2907686 16 A titre illustratif mais en aucun cas limitatif, la présente invention possède des applications dans l'analyse et/ou la purification par séparation de substances naturelles, telles que des polyphénols, mélanges de synthèse ou de molécules chirales, par exemple. En outre, la présente invention permet également l'enrichissement d'extrait et de mélange ainsi que des applications dans les processus de dépollution. 10 De plus, la présente invention concerne les procédés d'élimination très précis d'impuretés pour l'obtention de molécules ou principes actifs ultra-purs, par exemple, dans les domaines pharmaceutique, cosmétique, biotechnologique ou agro-alimentaire. 15 REVENDICATIONS 1. Dispositif de chromatographie comprenant au moins une colonne soumise à une centrifugation ou au moins un ensemble de dispositifs de centrifugation à cellules (1, 2), au moins un système de solvants biphasique (6, 7), et un moyen d'injection (4) d'une solution (5) comprenant des solutés à extraire, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens d'extraction en continu desdits solutés. i0 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits moyens d'extraction en continu sont formés d'au moins deux phases liquides non miscibles (6, 7) à contre-courant vrai continu dudit au moins un système de solvants biphasique. 3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que chaque cellule (11) comporte deux entrées (14, 16) et deux sorties (15, 17) correspondant à la phase lourde (7) et légère (6) dudit au moins un système de solvants biphasique. 20 4. Dispositif selon l'une des revendications 1 ou 3, caractérisé en ce que chaque cellule (11) comprend des moyens de connexion reliant deux cellules contiguës. 25 5. Dispositif selon l'une des revendications 1, 3 ou 4, caractérisé en ce que chaque cellule (11) est un mélangeur. 6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites au moins deux phases (6, 7) dudit au moins un 5 2907686 18 système de solvants biphasique circulent à contre-courant vrai en même temps dans lesdites cellules (11) de chaque colonne ou de chaque ensemble de dispositifs (1, 2) par l'intermédiaire de pompes (8, 9). 7. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit moyen d'injection (4) est disposé en un point intermédiaire de ladite au moins une colonne ou dudit au moins un ensemble de dispositifs (1, 2). 8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un moyen d'injection (4) apte à réaliser une injection manière discontinue ou continue. 9. Procédé continu de chromatographie comprenant les étapes suivantes : i) centrifugation par au moins une colonne à cellules ou au moins un ensemble de dispositifs de centrifugation (1, 2) d'au moins un système de solvants biphasique (6, 7), ii) injection d'une solution (5) comprenant des solutés à extraire, caractérisé en ce qu'il comprend une extraction en continu desdits solutés. 10. Procédé continu de chromatographie selon la revendication 9, 25 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : i) injection (en continu ou discontinu) d'une solution (5) comprenant des solutés à extraire ; ii) passage simultané d'au moins deux phases liquides non miscibles (6, 7) dudit au moins un système de solvant 2907686 19 biphasique à contre-courant vrai dans des cellules (11), comprenant deux entrées (14,16) et deux sorties (15, 17) desdites au moins deux phases, de chaque colonne chromatographique ou de chaque ensemble de dispositifs de s centrifugation ; iii) extraction en continu des solutés.