FR 2913978 A1 20080926 FR 0753970 A 20070321 2913978 La présente invention concerne un procédé de synthèse de peptides sans solvant. Les peptides sont à présent considérés comme des principes actifs pharmaceutiques, du fait de leur indice thérapeutique élevé et de leur faible toxicité. En raison du développement de nouveaux systèmes d'administration accroissant leur biodisponibilité, on s'attend à ce que le marché des peptides thérapeutiques se développe rapidement au cours des prochaines années. Mais il existe toujours un besoin de méthodes de synthèse efficaces pour ces composés. En dépit des procédures de production bien établies (en solution, en phase solide, par recombinaison) il subsiste encore de nombreux problèmes de développement associés à l'énorme quantité de solvant nécessaire à la synthèse, notamment sur supports solides (2000 à 5000 kg pour un gros peptide). Le domaine de la chimie verte prend une ampleur grandissante en raison de la gravité des problèmes environnementaux actuels. Plusieurs domaines de cette discipline ont émergé : l'utilisation d'une matière première alternative et d'un réactif non toxique, l'emploi de processus naturels, l'utilisation de solvants alternatifs, la conception de produits chimiques plus sûrs, le développement d'autres conditions de réaction, la minimisation de la consommation énergétique... Un domaine particulièrement actif repose sur l'utilisation de solvants alternatifs tels que des liquides aqueux, ioniques, fluorés ou supercritiques, pour remplacer les solvants organiques ou chlorés volatils et afin de résoudre les problèmes de traitement ou de recyclage des déchets à base de solvants. Une approche alternative consiste à réaliser des réactions chimiques en l'absence de solvant. Des techniques telles que le mélange ou le broyage de solides se sont avérées efficaces. Néanmoins, aucune application de ces techniques à des domaines tels que la synthèse des peptides ou d'aminoacides n'a été entreprise, en dépit de l'importance de ces biomolécules. 2 2913978 Les auteurs de la présente invention ont découvert de manière surprenante de nouvelles voies de synthèse de peptides dans des conditions sans solvant. De manière surprenante, les auteurs ont réalisé le couplage de carboxyanhydrides d'aminoacides protégés par un uréthane (UNCA) avec des 5 aminoacides ou aminoesters, alors que tous ces composés sont restés sous leur forme solide, dans des conditions de broyage à billes et à température ambiante. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de synthèse d'un composé de formule (I) suivante : Ra,N H 10 dans laquelle : n est un entier supérieur ou égal à 1, avantageusement compris entre 1 et 100, plus avantageusement compris entre 1 et 50, plus avantageusement encore égal à 1 ou 2; - Rb et chaque Rn représentent indépendamment les uns des autres un atome 15 d'hydrogène, un groupe aryle(alkyle en C1 à C6) ou un groupe alkyle en CI à C6 substitué ou non par un groupe aryle, -COOH, -COO-(alkyle en CI à C6), -CONH2, - SH, hétéroaryle, -NH2, -NHC(NH)(NH2), -S-(alkyle en CI à C6), -OH ou phénol ; Ra représente un groupe N-protecteur ; Rc représente un groupe -ORd dans lequel Rd représente un groupe alkyle en CI 20 à C6 ou un groupe -NReRf dans lequel Re et Rf représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe N-protecteur, caractérisé en ce qu'il comprend une étape (a) consistant à faire réagir en présence d'une base et sans solvant le composé de formule (II) suivante : Rb Ra-N O (II) 25 dans laquelle Ra et Rb sont tels que définis précédemment, avec le composé de formule (III) suivante : 3 2913978 H Rn (III) dans laquelle n, Rn et Rc sont tels que définis précédemment, ainsi que ses sels pharmaceutiquement acceptables, de préférence les chlorures, acétates et trifluoroacétates. 5 Par le terme groupe alkyle en CI à C6 , on entend au sens de la présente invention tout groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbones, linéaire ou ramifié, en particulier, les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyle, iso-butyle, sec-butyle, t-butyle, n-pentyle, n-hexyle. Avantageusement il s'agit d'un groupe méthyle ou t-butyle. 10 Par le terme groupe aryle , on entend au sens de la présente invention un ou plusieurs cycles aromatiques ayant 5 à 8 atomes de carbones, pouvant être accolés ou fusionnés. En particulier, les groupes aryles peuvent être des groupes monocycliques ou bicycliques, de préférence phényle, naphthyle, tetrahydronaphthyle ou indanyle. Avantageusement il s'agit d'un groupe phényle. 15 Par le terme groupe hétéroaryle , on entend au sens de la présente invention tout groupe aromatique hydrocarboné de 3 à 9 atomes contenant un ou deux hétéroatomes, tels que par exemple des atomes de soufre, azote ou oxygène. L'hétéroaryle selon la présente invention peut être constitué par un ou deux cycles fusionnés ou accolés. Des exemples de groupes hétéroaryle sont les groupes furyle, 20 isoxazyle, pyridyle, pyrimidyle, benzimidazole, benzoxazole, benzothiazole. Par le terme groupe N-protecteur , on entend au sens de la présente invention tout substituant qui protège le groupe NH2 contre les réactions indésirables tels que les groupes N-protecteur décrits dans Greene, "Protective Groups In Organic Synthesis", (John Wiley & Sons, New York (1981)) et Harrison et al. Compendium 25 of Synthetic Organic Methods", Vols. 1 à 8 (J. Wiley & sons, 1971 à 1996). Les groupes N-protecteur comprennent les carbamates, amides, dérivés N-alkylés, dérivés amino acétal, dérivés N-benzylés, dérivés imine, dérivés énamine et dérivés N-hétéroatome. En particulier, le groupe N-protecteur comprend le formyle, l'acétyle, le benzoyle, le pivaloyle, le phénylsulfonyle, le benzyle (Bn), le t- 4 2913978 butyloxycarbonyle (boc), le benzyloxycarbonyle (cbz), le p-méthoxybenzyloxycarbonyle, le p-nitrobenzyl-oxycarbonyle, le trichloroéthoxycarbonyle (troc), l'allyloxycarbonyle (alloc), le 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (finoc), le trifluoroacétyle, les carbamates de benzyle 5 (substitués ou non) et similaires. Il est avantageux d'utiliser soit du boc soit du cbz en tant que groupe N-protecteur en raison de la facilité relative d'élimination, par exemple par des acides modérés dans le cas du boc, par exemple l'acide trifluoroacétique ou l'acide chlorhydrique dans de l'acétate d'éthyle ; ou par une hydrogénation catalytique dans le cas de cbz. Avantageusement, il s'agit du groupe 10 boc. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, n est égal à 1 et l'étape (a) consiste à faire réagir en présence d'une base et sans solvant le composé de formule (II) avec le composé de formule (III-1) suivante : O HCI.H2N Rc Rn (III-1) 15 dans laquelle R1 et Rc sont tels que définis précédemment de façon à obtenir le composé de formule (I-1) suivante : Rb Ra,N H (I-1) dans laquelle Ra, Rb, Rc et Rn sont tels que définis précédemment. L'étape (a) est avantageusement effectuée au moyen d'un broyage à billes. 20 Il est particulièrement avantageux d'effectuer l'étape (a) à partir de produits de départ de formule (II) et (III) fraîchement préparés. La base peut être avantageusement choisie dans le groupe constitué par les carbonates, de préférence les hydrogénocarbonates de sodium, de potassium et de césium, et les carbonates de sodium, de potassium et de césium. Avantageusement il 25 s'agit de l'hydrogénocarbonate de sodium. Les substituants Rb et chaque substituant Rn peuvent être choisis indépendamment dans le groupe constitué par l'hydrogène, -CH3, le groupe benzyle, -CH2CONH2, -CHCH3C2H5, -(CH2)3NHC(NH)(NH2), -CH(OH)CH3, -CH2COOH, R 5 2913978 -CH2SH, -CH2CH2COOH, -CH2CH2CONH2, imidazolylméthyle, propyle, -CH2CH(CH3)2, -(CH2)4NH2, -(CH2)2SCH3, -CH2OH, indol-2-ylméthyle, p-méthylphénol, isopropyle. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention : 5 Ra, Re et Rf sont choisis indépendamment l'un de l'autre dans le groupe constitué par le tert-butyloxycarbonyle, le 9-fluorénylméthyloxycarbonyle, le benzyloxycarbonyle, le nitroveratryloxycarbonyle ; - Rb est choisi dans le groupe constitué par l'isopropyle, le benzyle et -CH20OOt-Bu ; 10 -chaque Rn est choisi indépendamment des autres dans le groupe constitué par le méthyle, le benzyle et -CH2CH(CH3)2 ; Rd est choisi dans le groupe constitué par le méthyle et le tertiobutyle. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le composé (II) est choisi dans le groupe constitué par les composés de formules (II-a), (II-b) et (II-c) 15 suivantes : O -O N o O O (II-a) ; (II-b) ; (II-c) ; le composé (III) est choisi dans le groupe constitué par les composés de formules (III-a), (III-b), (III-c), (III-d) et (III-e) suivantes : 6 2913978 HCI.H2N HCI. H2N (III-d) ; (III-e). HCI.H2N 01 (III-c) ; (III-a) ; (III-b) ; O 1 Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, 5 le composé de formule (II) a la formule (II-2) suivante : O (II-2) dans laquelle Ra est tel que défini précédemment, le composé de formule (III) a la formule (III-2) suivante : O HCI.H2N (III-2), 10 et le composé de formule (I) a la formule (I-2) suivante : O H (V); 2) réaction du composé de formule (V) avec un halogénure de benzyle en présence d'une base, avantageusement le carbonate de césium, pour obtenir le composé de 10 formule (VI) suivante : Ra..N H 15 dans laquelle Ra est tel que défini ci-dessus ; 3) protection du groupe amine du composé de formule (VI) par un groupe N-protecteur Rg pour former le composé de formule (VII) suivante : (VII) dans laquelle Ra et Rg sont tels que définis ci-dessus ; 4) réduction du composé de formule (VII) en composé de formule (VIII) suivante : 8 2913978 0 Ra.N2000H Rg (VIII) dans laquelle Ra et Rg sont tels que définis ci-dessus ; 5) cyclisation du composé de formule (VIII) en composé de formule (II-2) par réaction avec la DMF et le chlorure d'oxalyle. 5 Les substituants Ra et Rg représentent avantageusement le tertbutyloxycarbonyle. Dans un mode de réalisation avantageux, le procédé comprend les étapes successives supplémentaires suivantes : - (b) faire réagir le composé de formule (I-2) obtenu à l'étape (a) avec un acide, 10 avantageusement l'acide chlorhydrique gazeux, pour former le composé de formule (I-3) suivante : (I-3) ; - (c) faire réagir le composé de formule (I-3) avec une base, avantageusement le bicarbonate de sodium, pour former le composé de formule (I-4) suivante : CO2- 0 H3N NH/~Oi O 15 (I-4). L'invention va maintenant être illustrée de manière non limitative par les exemples suivants. Exemple 1 : Synthèse de dipeptides Les inventeurs ont réalisé la réaction sans solvant entre un UNCA et un 20 dérivé d'aminoacide pour former un dipeptide selon l'équation ci-dessous. 9 2913978 Rb Cette réaction a été testée dans le couplage de Boc-Val-NCA, Fmoc-Val-NCA et Boc-Phe-NCA (1 éq.) avec divers acides aminés (1 éq.) en présence de NaHCO3 (1,5 éq.) dans une cuve en acier trempé contenant des billes d'acier. La 5 cuve a été agitée pendant 1 heure à une fréquence de 30 Hz. L'analyse du mélange réactionnel a détecté l'existence exclusive du dipeptide. Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 avec divers UNCA et dérivés d'acides aminés. Tableau 1. UNCA Acides aminés Dipeptides Conversion (%) Rendement (%) Boc-Val-NCA HCI.H-Leu-OMe Boc-Val-Leu-OMe 100 87 HCI.H-Leu-OBut Boc-Val-Leu-OBut 97 85 HCI.H-Ala-OMe Boc-Val-Ala-OMe 100 100 HCI.H-Ala-OBut Boc-Val-Ala-OBut 100 100 HCI.H-Phe-OMe Boc-Val-Phe-OMe 100 88 Fmoc-Val-NCA HCI.H-Leu-OMe Fmoc-Val-Leu-OMe 90 HCI.H-Leu-O-But Fmoc-Val-Leu-OBut 92 HCI.H-AIa-OMe Fmoc-Val-Ala-OMe 100 76 HCI.H-Ala-OBut Fmoc-Val-Ala-OBut 78 HCI.H-Phe-OMe Fmoc-Val-Phe-OMe 93 Boc-Phe-NCA HCI.H-Leu-O-Me Boc-Phe-Leu-OMe 85 HCI.H-Leu-OBut Boc-Phe-Leu-OBut 100 70 HCI.H-AIa-OMe Boc-Phe-Ala-OMe 99 79 HCI.H-Ala-OBut Boc-Phe-Ala-OBut 100 73 HCI.H-Phe-OMe Boc-Phe-Phe-OMe 58 10 Les divers dérivés d'UNCA ne présentent pas le même profil de réactivité. Dans tous les cas, Boc-Val-NCA a été transformé quantitativement en vue de la formation du dipeptide tandis que Fmoc-Val-NCA dans les deux cas a donné une conversion légèrement inférieure. Il convient de noter que les meilleurs résultats ont été obtenus avec une 15 substance de départ fraîchement préparée, soit dUNCA, soit l'aminoester. La réaction était sinon incomplète et l'hydrolyse de dUNCA a été observée. Exemple 2 : Synthèse de l'aspartame. .N N\~ORd + CO2 ORd Broyage à billes jj R1 30 Hz O R1 o NaHCO3 10 2913978 L'aspartame, ou a-L-aspartyl-L-phénylalanine-méthyle-ester, est un édulcorant nutritif approximativement 150 fois plus intense que le saccharose. C'est un dipeptide commercialement attrayant qui n'a pourtant pas encore été préparé par le biais des UNCA, ni en présence, ni en l'absence de solvant. 5 Les inventeurs ont obtenu de l'aspartame protégé en une étape à partir de HPhe-OMe.HC1 (III-e) et de Boc-Asp(O-t-Bu)-NCA (II-a) par broyage à billes sans solvant. Les groupes protecteurs Boc et t-Bu ont été choisis puisqu'ils peuvent être clivés en même temps dans des conditions acides. Afin d'éviter davantage 10 l'utilisation de solvant, HC1 gazeux a été utilisé pour éliminer les groupes protecteurs. 2.1. Préparation de Soc-Asp(O-tBu)-NCA (II-a) Cette méthode a consisté en la cyclisation de l'acide carboxylique libre à chaîne principale avec l'un des Boc protégeant la fonction amine, nécessitant de ce 15 fait tout d'abord la préparation de (Boc)2-Asp(O-t-Bu)-OH (VII-a). Ceci a été réalisé par l'estérification de l'acide a- carboxylique de Boc-Asp(O-t-Bu)-OH (V-a) en ester benzylique (VI-a), suivie d'une réaction avec Boc2O en présence de DMAP pour donner le composé aminé protégé par deux groupes boc (VII-a), puis d'une déprotection du groupe ester benzylique par hydrogénation pour donner (VIII-a). 20 ~CO2t-Bu boc2O NEt3 H2N COOH H2O/dioxane quant. (IV) boc. N X CO2Bn H boc2O 82% DMAP CH3CN CO2t-Bu (VI-a) Cs2CO3 BnBr DM F quant. H2 Pd-C CO2t-Bu boc.NXco2H boc MeOH CH3CN DMF pyridine 90% (VIII-a) quant. O (I I-a)boc.N lCO2Bn boc (VII-a) CO2t-Bu 11 2913978 L'étape suivante a consisté en la cyclisation de l'aminoacide (VIII-a) protégé avec le sel de Vilsmeier. Les meilleurs résultats ont été obtenus en formant le sel avec de la DMF et du chlorure d'oxalyle dans de l'acétonitrile. Le composé (II-a) a été obtenu avec un rendement de 90 %. 5 2.2. Préparation de l'aspartame La procédure décrite ci-dessus pour la préparation de dipeptides a été appliquée à la préparation de l'aspartame. CO2t-Bu bocùN+ HCI.H2N O (H-a) (III-e) Na2CO3(aq) pH = 5,2 En partant de Boc-Asp(O-t-Bu)-NCA (II-a) et de H-Phe-OMe.HC1 (III-e), le 10 dipeptide (I-a) a été obtenu après 1 heure de broyage à billes. Il a ensuite réagi directement avec HC1 gazeux pendant 2 heures en l'absence de solvant pour éliminer les groupes protecteurs Boc and t-Bu et pour donner la forme chlorhydrate de 1' aspartame. Notons que l'élimination des groupes protecteurs Boc et t-Bu n'a donné que des produits secondaires volatils. Il convient également de 15 noter que le rendement des deux étapes était quantitatif. Le chlorhydrate a été dissous dans l'eau et le pH a été ajusté à 5,2 avec une solution aqueuse de Na2CO3. L'aspartame obtenu a précipité. Il a été filtré et séché sous vide pour donner un solide avec un rendement de 40%. L' aspartame a donc été obtenu sous forme pure, sans utiliser de solvants 20 organiques, et sans produits secondaires organiques. L'unique étape de purification a consisté en une précipitation dans de l'eau pour obtenir de l'aspartame solide. + H3N NaHCO3 OMe Broyage à billes 30 Hz O boc.N H 12 REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse d'un composé de formule (I) suivante : Ra,N H 5 dans laquelle : - n est un entier supérieur ou égal à 1, de préférence compris entre 1 et 100, plus préférentiellement compris entre 1 et 50, plus préférentiellement encore égal à 1 ou 2 10 - Rb et chaque Rn représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène, un groupe aryle(alkyle en CI à C6) ou un groupe alkyle en C1 à C6 substitué ou non par un groupe aryle, -COOH, -COO-(alkyle en CI à C6), -CONH2, - SH, hétéroaryle, -NH2, -NHC(NH)(NH2), -S-(alkyle en CI à C6), -OH ou phénol ; Ra représente un groupe N-protecteur ; 15 - Rc représente un groupe -ORd dans lequel Rd représente un groupe alkyle en CI à C6 ou un groupe -NReRf dans lequel Re et Rf représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe N-protecteur, caractérisé en ce qu'il comprend une étape (a) consistant à faire réagir en présence d'une base et sans solvant le composé de formule (II) suivante : Rb Ra - N "NO 20 O (II) dans laquelle Ra et Rb sont tels que définis précédemment, avec le composé de formule (III) suivante : H N H Rn 13 2913978 dans laquelle n, Rn et Rc sont tels que définis précédemment, ainsi que ses sels pharmaceutiquement acceptables, de préférence les chlorures, acétates et trifluoroacétates. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que n est égal à 1 et en ce que l'étape (a) consiste à faire réagir en présence d'une base et sans solvant le composé de formule (II) avec le composé de formule (III-1) suivante : O HCI.H2N Rc Rn (III-1) dans laquelle R1 et Rc sont tels que définis précédemment de façon à obtenir le 10 composé de formule (I-1) suivante : Rb Ra.N H (I-1) dans laquelle Ra, Rb, Rc et Rn sont tels que définis précédemment. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce 15 que l'étape (a) est effectuée au moyen d'un broyage à billes. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la base est choisie dans le groupe constitué par les carbonates, de préférence les hydrogénocarbonates de sodium, de potassium et de césium, et les carbonates de 20 sodium, de potassium et de césium. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que Rb et chaque Rn sont choisis indépendamment dans le groupe constitué par l'hydrogène, -CH3, le groupe benzyle, -CH2CONH2, -CHCH3C2H5, 25 -(CH2)3NHC(NH)(NH2), -CH(OH)CH3, -CH2COOH, -CH2SH, -CH2CH2COOH, - CH2CH2CONH2, imidazolylméthyle, propyle, -CH2CH(CH3)2, -(CH2)4NH2, - (CH2)2SCH3, -CH2OH, indol-2-ylméthyle, p-méthylphénol, isopropyle. O 14 2913978 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que : - Ra, Re et Rf sont choisis indépendamment l'un de l'autre dans le groupe constitué par le tert-butyloxycarbonyle, le 9-fluorénylméthyloxycarbonyle, le benzyloxycarbonyle, le nitroveratryloxycarbonyle ; 5 - Rb est choisi dans le groupe constitué par l'isopropyle, le benzyle et - CH2OOOt-Bu ; - chaque Rn est choisi indépendamment des autres dans le groupe constitué par le méthyle, le benzyle et -CH2CH(CH3)2 ; - Rd est choisi dans le groupe constitué par le méthyle et le tertiobutyle. 10 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que : - le composé (II) est choisi dans le groupe constitué par les composés de formules (II-a), (II-b) et (II-c) suivantes : )LNO 0 0 (II-a) ; (II-b) ; 15 (II-c) ; - le composé (III) est choisi dans le groupe constitué par les composés de formules (III-a), (III-b), (III-c), (III-d) et (III-e) suivantes : 15 2913978 (III-a) ; 0 HCI.H2N~O~ (III-d) ; (III-b) ; O 1 (III-e). HCI.H2N O (III-c) ; 5 8. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que : le composé de formule (II) a la formule (II-2) suivante : O (II-2) dans laquelle Ra est tel que défini à la revendication 1, le composé de formule (III) a la formule (III-2) suivante : O HCI.H2N (III-2), et le composé de formule (I) a la formule (I-2) suivante : O Ra.N H (I-2) dans laquelle Ra est tel que défini à la revendication 1. 16 2913978 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le composé de formule (II-2) est préparé par un procédé comprenant les étapes successives suivantes : 1) protection du groupe amine du composé de formule (IV) suivante : O O- 5 H2N COOH (IV) par un groupement N-protecteur Ra pour former le composé de formule (V) suivante Ra'N2000H H (V) ; 2) réaction du composé de formule (V) avec un halogénure de benzyle en présence 10 d'une base pour obtenir le composé de formule (VI) suivante : O Ra,N H (VI) ; dans laquelle Ra est tel que défini ci-dessus 3) protection du groupe amine du composé de formule (VI) par un groupe N-protecteur Rg pour former le composé de formule (VII) suivante : (VII) ; dans laquelle Ra et Rg sont tels que définis ci-dessus 4) réduction du composé de formule (VII) en composé de formule (VIII) suivante : 17 2913978 O O Ra-N2000H Rg (VIII) ; dans laquelle Ra et Rg sont tels que définis ci-dessus 5) cyclisation du composé de formule (VIII) en composé de formule (II-2) par réaction avec la DMF et le chlorure d'oxalyle. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que Ra et Rg représentent le tert-butyloxycarbonyle. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'il 10 comprend les étapes successives supplémentaires suivantes : - (b) faire réagir le composé de formule (I-2) obtenu à l'étape (a) avec un acide pour former le composé de formule (I-3) suivante : CO2H O O (I-3) ; - (c) faire réagir le composé de formule (I-3) avec une base pour former le 15 composé de formule (I-4) suivante : 5 + H3N (I-4).