FR 2907028 A1 20080418 FR 0609052 A 20061016 La présente invention a trait à une méthode de séparation bidimensionnelle des constituants d'un mélange, mettant en oeuvre la technique de l'électrophorèse capillaire. Cette technique s'avère notamment utile pour la purification et/ou l'analyse fine des constituants de tels mélanges. Les techniques de séparation dites "bidimensionnelles" consistent à effectuer la séparation des constituants d'un mélange selon deux critères successifs distincts. Ainsi, ces méthodes mettent en général en oeuvre une première étape qui consiste à séparer les constituants du mélange dans de premières conditions de séparation, puis une deuxième étape consistant à io soumettre tout ou partie des fractions séparées obtenues à l'issue de la première étape à une nouvelle séparation dans de nouvelles conditions. Les deux étapes successives de séparation utilisées dans ces procédés mettent généralement en oeuvre deux séparations de types différents, fondées sur deux caractéristiques distinctes des constituants à séparer. Ces deux étapes de séparation 15 successives sont dites "orthogonales" entre elles. Le terme de "séparation bidimensionnelle" provient du fait qu'à l'origine, ce type de séparation désigne une séparation effectuée sur des supports à deux dimensions, tel que des plaques. Ainsi, par exemple, la chromatographie bidimensionnelle consiste à déposer un échantillon de mélange sur une plaque, à 20 réaliser une élution du mélange par un premier éluant dans une première direction de la plaque, puis à éluer chacune des fractions séparées du mélange (alignées selon la première direction) à l'aide d'un second éluant dans une direction orthogonale à la première direction, ce par quoi on obtient une séparation des constituants dans les deux dimensions de la plaque. De façon 25 similaire, on a développé des techniques bidimensionnelles d'électrophorèse sur couche de gel, comprenant une première séparation électrophorétique des composés d'un mélange par migration selon une première direction du gel, suivie d'une seconde migration dans une direction orthogonale, dans d'autres conditions d'électrophorèse. Ces techniques sont largement utilisées, notamment 30 dans le domaine de la séparation et de l'analyse de mélanges de protéines. Dans ce cadre, on a notamment développé des techniques d'électrophorèse bidimensionnelle sur gel dites (IEF/SDS-PAGE), adaptées à la séparation de 2907028 2 protéines ou de peptides, dans lesquelles la première séparation est effectuée par une focalisation isoélectrique (IEF) qui permet une séparation selon le point isoélectrique dans une première direction du gel, et à la seconde étape est une migration électrophorétique dans une direction orthogonale, réalisée en présence 5 d'un gel de polyacrylamide et de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). Pour plus de renseignements concernant les techniques d'électrophorèses bidimensionnelles, et notamment les techniques de type (IEF/SDS-PAGE), on pourra notamment se reporter à l'article de P. A. Haynes, S. P. Gygi, D. Figeys, R. Aebersold, dans Electrophoresis, 19, 1862-1871 (1998). io Par extension, le terme de séparation "bidimensionnelle" a ensuite été étendu à toute méthode mettant en oeuvre deux étapes de séparation monodimensionnelle successives, et où la deuxième étape consiste à séparer les composés d'au moins une des fractions séparées lors de la première étape. Par analogie avec les techniques sur support bidimensionnel, on dit que la deuxième 15 étape de séparation est effectuée "selon une direction orthogonale", même dans les cas où aucun support bidimensionnel n'est concrètement mis en oeuvre. Différentes techniques de séparation bidimensionnelles sont actuellement connues, qui couplent deux (voire plusieurs) étapes successives de séparations "monodimensionnelles" telles que des étapes de chromatographie ou 20 d'électrophorèse. A titre d'exemples de techniques de séparation bidimensionnelle de ce type, on peut notamment citer les techniques décrites dans l'ouvrage High Performance Capillary Electrophoresis, Chemica/ Analysis Series, vol. 146, n 17, 581-612 (1998) ou celles décrites par J. M. Hille, A.L. Freed, et H. Watzig, dans Electrophoresis, 22, 4035-4052 (2001). 25 En particulier, on a développé des techniques de séparation bidimensionnelles mettant en oeuvre au moins une étape d'électrophorèse capillaire dans leurs étapes de séparation. Dans ce cadre, certains auteurs ont notamment décrit le couplage de deux étapes successives d'électrophorèse capillaire. A ce sujet, on pourra notamment se reporter aux articles de Mark R; 30 Shure dans Anal.Chem. 71, 1645-1657 (1999), ou de Deepa Mohan et Cheng S. Lee dans Electrophoresis 23, 3160-3167 (2002). 2907028 3 Ces méthodes de séparation bidimensionnelle semblent a priori séduisantes, notamment dans la mesure où elles semblent à même de combiner les avantages de la séparation bidimensionnelle à l'efficacité particulièrement prononcée de la séparation électrophorétique. Toutefois, en pratique, ces 5 méthodes nécessitent en général la mise en oeuvre de dispositifs complexes et le plus souvent onéreux, et la séparation réalisée n'est pas toujours à la hauteur de la qualité escomptée. En particulier, les techniques mettant en oeuvre deux étapes successives d'électrophorèse capillaire consistent actuellement à réaliser le couplage de deux capillaires, de façon à pouvoir réaliser les deux électrophorèses dans des milieux distincts. Ce couplage de deux capillaires est en général difficile à mettre en oeuvre, et il nécessite des dispositifs de couplages souvent onéreux. De plus, comme souligné notamment par Shure et al. dans Anal.Chem. 71, 1645-1657 (1999), la mise en oeuvre de ces dispositifs de couplage affecte en général la qualité de la séparation réalisée, en conduisant notamment à des phénomènes d'étalement des pics qui ne peuvent être limités que très difficilement. De plus, le couplage de deux capillaires passe le plus souvent par des étapes d'échantillonnage, au cours desquelles une partie des composés à analyser est susceptible d'être perdue, ou par des processus de dilution qui s'avèrent notamment préjudiciables pour la sensibilité de la détection des composés séparés, tout particulièrement lorsque le mélange initial à analyser est un milieu dilué. Pour réaliser une séparation bidimensionnelle mettant en oeuvre deux étapes successives d'électrophorèse capillaire tout en s'affranchissant des problèmes précités, il a été décrit dans la demande FR 2 859 113 un procédé mettant en oeuvre un unique capillaire pour les deux étapes d'électrophorèse, ce qui permet de s'affranchir des problèmes techniques et/ou de coût liés à la mise en oeuvre des systèmes de couplage capillaire/capillaire précités. Dans le procédé de FR 2 859 113, on effectue une première séparation par électrophorèse au sein d'un capillaire ("première dimension" de la séparation) ; on isole ensuite une fraction des composés séparés au sein du capillaire utilisé ; puis, sous l'effet d'une différence de potentiel appliquée entre l'entrée et la sortie 2907028 4 du capillaire, on injecte dans le capillaire un milieu séparateur ayant une vitesse de migration apparente plus importante que la fraction isolée au sein du capillaire, ce par quoi ce milieu séparateur rattrape la fraction isolée au sein du capillaire, modifiant ainsi les conditions d'électrophorèse de cette fraction, ce qui 5 permet une nouvelle séparation électrophorétique des constituants de la fraction (deuxième dimension de la séparation). Les séparations bidimensionnelles effectuées selon le procédé de FR 2 859 113 sont particulièrement intéressantes et efficaces. Néanmoins, elles sont limitées à la mise en oeuvre d'un milieu séparateur spécifique lors de la 10 séparation électrophorétique de leur deuxième étape. En effet, il est requis (1) que le milieu séparateur employé puisse être introduit dans le capillaire grâce au flux électroosmotique ; et (2) qu'il ait une vitesse de migration apparente plus importante que la fraction isolée. Ces conditions limitent la nature du milieu de migration utilisable, ainsi que celle des espèces qui peuvent être séparées. 15 Un but de la présente invention est de fournir un procédé de séparation bidimensionnelle comprenant deux étapes successives d'électrophorèse capillaire, qui s'affranchisse des inconvénients liés à l'utilisation des systèmes de couplage capillaire/capillaire mis en oeuvre dans les techniques d'électrophorèse capillaire bidimensionnelle généralement connues, mais sans nécessiter la mise 20 en oeuvre des milieu de séparation spécifiques requis dans le procédé de FR 2 859 113. Plus généralement ; l'invention se fixe comme objectif de fournir un procédé de séparation bidimensionnelle efficace, simple de mise en oeuvre et peu onéreux qui soit utilisable efficacement sur un grand nombre de composés, de préférence en évitant au maximum les phénomènes d'élargissement de pics 25 électrophorétiques. A cet effet, selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé de séparation des constituants d'un mélange M par électrophorèse capillaire au sein d'un unique capillaire, ledit procédé comprenant les étapes où : (A), on introduit et on fait migrer les composés du mélange M au sein du 30 capillaire selon la technique de l'électrophorèse capillaire, sous l'effet d'une différence de potentiel appliquée entre l'entrée et la sortie du capillaire, en 2907028 5 employant un premier milieu de séparation MS', de façon à réaliser une séparation des composés du mélange M au sein du capillaire, selon leur vitesse de migration dans les conditions de l'étape (A) ; (B) on isole dans le capillaire une fraction F des composés séparés dans s l'étape (A), et on fait migrer ladite fraction F isolée à proximité d'une des extrémités du capillaire, en maintenant cette fraction F au sein du capillaire en mettant en oeuvre l'une et/ou l'autres des étapes suivantes : (B.1) on évacue hors du capillaire une partie des composés ayant les vitesses de migration les plus élevées dans les conditions de l'électrophorèse io de l'étape (A), en laissant migrer ces composés en sortie du capillaire, le plus souvent en maintenant la différence de potentiel de l'étape (A) ; et/ou (B.2) on évacue hors du capillaire une partie des composés ayant les vitesses de migration les plus faibles dans les conditions de l'électrophorèse 15 de l'étape (A), en faisant migrer ces composés vers l'entrée du capillaire, en général en appliquant une surpression en sortie du capillaire, l'extrémité opposé et/ou en appliquant entre l'entrée et la sortie du capillaire une différence de potentiel de polarité contraire à celle de l'étape (A), étant entendu qu'au sens de l'étape (B), on entend par "entrée" du capillaire, 20 l'extrémité du capillaire où est faite l'injection, la "sortie" étant l'autre extrémité ; (C) en appliquant une différence de pression entre les extrémités du capillaire, on introduit dans le capillaire un deuxième milieu de séparation MS2, distinct du milieu de séparation MS1 employé dans l'étape (A) par l'extrémité du 25 capillaire à proximité de laquelle est localisée la fraction F, ce par quoi on fait migrer la fraction F vers l'autre extrémité du capillaire tout en remplissant le capillaire par le milieu de séparation MS2 ; et (D) on effectue une électrophorèse capillaire au sein du capillaire ainsi rempli par le milieu de séparation MS2 en faisant migrer les composés de la fraction F 30 sous l'effet d'une différence de potentiel appliquée entre l'entrée et la sortie du capillaire, en employant le milieu MS2 à titre de milieu de séparation. 2907028 6 Le procédé proposé dans le cadre de la présente invention est un procédé de séparation bidimensionnelle des composés du mélange M, permettant de réaliser une première séparation des constituants du mélange M par électrophorèse capillaire ("première dimension" de l'étape (A) mettant en oeuvre 5 un premier milieu de séparation ms , suivie d'une deuxième séparation des constituants d'une fraction des composés ainsi séparés ("deuxième dimension" de l'étape (E)). De façon caractéristique, dans le procédé de l'invention, ces deux séparations successives sont réalisées au sein d'un même et unique capillaire, io ce qui est permis par la succession d'étapes (B) à (C). Dans ces étapes, on isole une fraction F séparée dans l'étape (A) en faisant sortir du capillaire les autres fractions (étape (B)), puis on substitue le milieu séparateur MS1 employé dans l'étape (A) et présent dans le capillaire à l'issue de l'étape (B) par un autre milieu séparateur MS2 (étape (C)). 15 La substitution de milieu séparateur qui est réalisée dans l'étape (C) s'opère très aisément, simplement en injectant sous pression par une des extrémités du capillaire le milieu MS2 substituant, ce qui chasse hors du capillaire le milieu MS1. Dans le même temps, la fraction d'intérêt, prise "en sandwich" entre le milieu MS2 qui est introduit et le milieu MS1 qui est chassé, se retrouve 20 poussée vers l'autre extrémité du capillaire. De façon surprenante, les inventeurs ont maintenant mis en évidence que la mise en oeuvre de l'étape (C) peut s'effectuer sans que la différence de pression appliquée entre les extrémités du capillaire induise un élargissement trop important des pics par dispersion hydrodynamique susceptible de nuire à 25 l'efficacité de la séparation. A l'issue de l'étape (C), on obtient ainsi un capillaire substantiellement rempli de milieu séparateur MS2 et contenant un fraction F à proximité d'une de ses extrémités, ce qui permet d'effectuer immédiatement la séparation électrophorétique de l'étape (C) dans le capillaire. 2907028 7 Le procédé de l'invention permet dans ce cadre de substituer le premier milieu séparateur MS1 par n'importe quel autre milieu séparateur MS2, sans aucune limitation quant à la nature de ce nouveau milieu séparateur. Le procédé constitue de ce point de vue un perfectionnement notable du procédé de 5 FR 2 859 113, où seuls certains milieux séparateurs spécifiques étaient envisageables pour la deuxième dimension de la séparation. De façon plus générale, la possibilité offerte par le procédé de l'invention de moduler la nature du milieu de séparation dans l'électrophorèse de l'étape (D) ouvre la voie à des séparations bidimensionnelles par électrophorèse particulièrement efficaces et io adaptables à la séparation de nombreux types de mélanges complexes. De façon générale, la succession des étapes (A) à (D) peut être mise en oeuvre pour effectuer une séparation fine de constituants initialement intimement mêlés dans le mélange M, selon une technique de séparation bidimensionnelle de type usuelle, l'étape (D) étant alors mise en oeuvre pour améliorer les 15 performances séparatives de la séparation monodimensionnelle de l'étape (A). Selon un mode de réalisation plus spécifique, l'étape (A) peut être mise en oeuvre pour effectuer une purification du mélange M, où des composés d'intérêt sont séparés d'impuretés (neutres ou chargées), lesdits composés d'intérêt étant alors conservés dans le capillaire à titre de fraction F dans l'étape (B), et l'étape 20 (D) est ensuite mise en oeuvre pour séparer les composés d'intérêt présents dans la fraction F. Dans ce cadre, le procédé constitue une alternative très intéressante aux procédés d'électrophorèse usuels qui nécessitent le plus souvent une pré-purification des échantillons analysée (dite "sample clean-up'), ce qui implique en règle générale la mise en oeuvre de dispositifs consommables 25 onéreux (consommables de dialyse, centrifugation, ou ultrafiltration notamment). Le procédé de l'invention, permet une purification moins coûteuse, notamment dans la mesure où elle ne nécessite pas l'utilisation de tels consommables. De plus elle s'avère plus aisée à mettre en oeuvre, en réduisant les manipulations et les traitements des échantillons, ce qui la rend facilement automatisable. 30 De façon générale, le mélange M dont on sépare les constituants selon le procédé de l'invention peut être tout mélange adapté à une séparation par 2907028 8 électrophorèse capillaire, ce mélange contenant avantageusement (et le plus souvent) des composés électriquement chargés. Pour plus de précisions concernant les mélanges séparables par électrophorèse capillaire, on pourra notamment se reporter à l'article de M. G. Khaledi dans High Performance 5 Capillary Electrophoresis, Chemical Analysis Series, vol. 146, (1998), ou encore à l'ouvrage de S. F. Y. Li "Capillary electrophoresis : principles, practice and applications", Journal of Chromatography Library, vol. 52, troisième impression (1996). Le plus souvent, le mélange M est un mélange de plusieurs composés io chargés, le plus souvent de même charge. Ainsi, selon un premier mode de réalisation, le mélange M est un mélange d'espèces chargées négativement, tel que, par exemple, un mélange comprenant des polymères synthétiques porteurs de groupements anioniques et/ou de charge négatives, des protéines et/ou des peptides à un pH suffisamment élevé pour qu'elles portent des charges 15 négatives, de polysaccharides chargés négativement, et/ou de molécules anioniques (par exemple des acides sous forme déprotonée, notamment des acides organiques déprotonés). Selon un autre mode de mise en oeuvre, le mélange M est un mélange d'espèces chargées positivement, comprenant par exemple des polymères synthétiques chargés positivement porteurs de 20 groupements cationiques et/ou de charge positives, de protéines et/ou de peptides à un pH suffisamment faible pour qu'elles portent des charges positives, de polysaccharides chargés positivement, ou des molécules cationiques (par exemple des bases sous forme protonée, et notamment des bases organiques protonées). 25 L'étape (A) du procédé de l'invention est une étape de séparation par électrophorèse capillaire classique, qui est avantageusement conduite de façon à séparer au mieux les constituants du mélange M, en général selon leur charge ou selon leur rapport charge/masse. Il est des compétences du spécialiste en électrophorèse d'adapter les conditions à mettre en oeuvre pour obtenir une 30 séparation la plus efficace possible dans l'étape (A). Pour plus de détails concernant les conditions générales de mise en oeuvre d'une électrophorèse conduite de façon à séparer un mélange de composés selon leur charge ou selon 2907028 9 leur rapport charge/masse, on pourra notamment se reporter à l'article de M. G. Khaledi dans High Performance Capillary Electrophoresis, Chemical Analysis Series, vol. 146, (1998), ou à l'ouvrage précité de S. F. Y. Li "Capillary electrophoresis : principles, practice and applications", Journal of 5 Chromatography Library, vol. 52, troisième impression (1996). A l'issue de l'électrophorèse de l'étape (A), on obtient, de façon générale, une séparation des composés du mélange en plusieurs fractions, chacune de ces fractions comprenant les composés ayant une vitesse de migration donnée dans les conditions de l'étape (A). Chacune de ces fractions apparaît sous la forme io d'un pic unique sur un électrophérogramme. Toutefois, en particulier dans le cas de mélanges complexes tels que des mélanges de protéines ou de peptides, chacun des pics observés contient souvent un mélange de plusieurs constituants. La fraction F qui est isolée dans le capillaire à l'issue de l'étape (B) est généralement un mélange de composés ayant des vitesses de migration 15 comprises entre deux valeurs de coupure Vmin et Vmax (avec Vmin conducteur électriquement que le milieu MS1 (typiquement de force ionique plus faible). L'électrolyte ainsi injecté forme une zone électrolyte jouxtant le mélange 20 M dans le capillaire, qui peut avoir différents avantages : (i) cette zone peut contribuer à éviter l'éjection hors du capillaire de composés d'intérêt lors de l'étape (B) : en effet, elle décale l'échantillon injecté par rapport à l'extrémité du capillaire ; et (ii) elle conduit à une meilleure efficacité dans le cas où l'électrolyte injecté 25 est moins conducteur électriquement que le milieu MS1. Selon un mode de réalisation intéressant, on peut introduire à titre de milieu MS2 un milieu comprenant des polymères en solution ou sous forme de gel. Selon ce mode de réalisation, l'étape (A) peut par exemple être une électrophorèse conduite en milieu libre (milieu MS1 de type solution aqueuse 30 tamponnée) et l'étape (D) peut être conduite dans un milieu MS2 similaire au milieu MS1 mais comprenant en outre un polymère. Il est également possible, à 2907028 19 l'inverse d'employer à titre de milieu MS1 un milieu comprenant des polymères en solution ou sous forme de gel et un milieu libre à titre de milieu MS2. Dans ce cadre, selon un autre mode de réalisation, l'étape (A) peut être une électrophorèse conduite dans un milieu MS1 comprenant des polymères et 5 l'étape (D) peut être conduite en milieu libre, par exemple dans un milieu MS2 de type solution aqueuse tamponnée. On peut également introduire à titre de milieu MS2 un milieu micellaire, à savoir un milieu de séparation comprenant des micelles, notamment des micelles de tensioactif tel que, par exemple, le dodécylsulfate de sodium, notamment du 10 type des milieux micellaires décrits par J. M. Davis dans M. G. Khaledi, High Performance Capillary Electrophoresis, Chemical Analysis Series, vol. 146, Chapitre 3, pp 77131 (1998). Le milieu MS2 diffère généralement du milieu MS1 par sa composition chimique. II peut également varier du milieu MS' par la valeur de son pH. Selon 1s un mode de réalisation particulier, les milieux MS1 et MS2 diffèrent uniquement par leur pH. Ce mode de réalisation peut par exemple permettre de modifier les charges portées par les espèces contenues dans la fraction F entre l'étape (A) et l'étape (D). II peut notamment être mis en oeuvre pour l'analyse de mélanges à base d'acides aminés, ou bien encore de peptides, de protéines, de polymères 20 synthétiques ou de latex. Quelle que soit sa nature exacte, le milieu MS2 est avantageusement introduit dans l'étape (C) en appliquant une différence de pression adaptée entre les extrémités du capillaire, de préférence une différence de pression suffisamment faible pour éviter une perte trop importante de la définition du pic 25 de la fraction F séparée lors des étapes (A) et (B). A cet effet, la différence de pression appliquée entre les extrémités du capillaire pour introduire le milieu de séparation MS2 dans l'étape (C) va avantageusement de 0,1 psi à 5 psi (0,69 Pa à 34,47 Pa), typiquement de 0,3 psi à 3 psi , en particulier pour des capillaires de diamètre interne de l'ordre de 25 à 50 micron. 30 La différence de pression appliquée entre l'entrée et la sortie du capillaire dans l'étape (C) est généralement induite en appliquant une surpression au 2907028 20 niveau de l'extrémité du capillaire par laquelle on souhaite faire entrer le milieu séparateur MS2. Toutefois, selon une variante particulière, on peut également introduire une dépression au niveau de l'autre extrémité du capillaire. L'étape (D) est quant à une étape de séparation usuelle par 5 électrophorèse capillaire de zone, mettant en oeuvre à titre de milieu de séparation le milieu MS2 introduit dans l'étape (C). Cette étape peut être conduite selon tout moyen connu en soi. II est des compétences du spécialiste dans le domaine d'adapter les conditions de mise en oeuvre de l'étape (D) pour atteindre la séparation recherchée. Cette étape de séparation peut être effectuée aussi io bien en milieu libre qu'en présence de polymères, et en absence ou en présence de tensioactif. La plupart des dispositifs d'électrophorèse capillaire usuels peuvent être utilisés pour conduire les étapes (A) à (D) procédé de l'invention. Par exemple, le procédé de l'invention peut avantageusement être mis en oeuvre dans un is appareil d'électrophorèse capillaire de type 3DCE commercialisé par Agilent Technologie, ou bien un appareil de type PACE MDQ vendu par Beckman Coulter. De façon plus générale, le capillaire mis en oeuvre dans les étapes (A) à (D) est avantageusement un capillaire de diamètre interne compris entre 5 et 100 20 microns. Notamment de façon à pouvoir conduire les étapes (B2) et (C) de façon optimale, ce diamètre interne est avantageusement inférieur ou égal à 50 microns, de préférence inférieur ou égal à 40 microns, et avantageusement inférieur ou égal à 30 microns, voire, dans certains cas, inférieur à 20 microns. II est toutefois préférable que ce diamètre interne reste égal ou supérieur à 10 25 microns, voire à 15 microns, notamment de façon à ne pas diminuer de façon trop importante la sensibilité de la détection. Ainsi, à titre de capillaire avantageusement utilisable pour mettre en oeuvre le procédé de séparation selon l'invention, on peut notamment citer les capillaires de diamètre interne entre 10 et 50 microns, tels que les capillaires usuels de 2907028 21 diamètre interne égal à 10 microns, 25 microns ou à 50 microns, les capillaires de 25 microns se révélant en particulier bien adaptés dans la plupart des cas. Par ailleurs, notamment de façon à optimiser la qualité de la séparation des étapes (A) et (D), un capillaire utilisé pour le procédé de l'invention est de 5 préférence un capillaire de longueur la plus faible possible, de préférence inférieure à 1 m et avantageusement inférieure à 50 cm. En général, et en particulier lorsque l'étape (B.2) est mise en oeuvre, on préfère que la longueur du capillaire reste inférieure ou égale à 40 cm, cette longueur étant avantageusement inférieure ou égale à 35 cm, notamment pour permettre 10 d'effectuer l'étape (B.2) sans observer de phénomènes d'élargissement de pics trop prononcés. Ainsi, typiquement, la longueur d'un capillaire mis en oeuvre dans les étapes (A) à (C) du procédé de l'invention est avantageusement compris entre 20 et 60 cm, de préférence entre 20 et 40 cm (typiquement de l'ordre de 30 à 35 cm). 15 Le procédé de séparation de la présente invention est un procédé à la fois simple et efficace à mettre en oeuvre, qui permet le plus souvent d'obtenir une séparation particulièrement résolutive de constituants du mélange M. A ce sujet, il est à noter que les avantages du procédé de l'invention ne sont pas limités à la mise en oeuvre d'une séparation électrophorétique 20 bidimensionnelle. En fait, il est tout à fait possible d'intégrer le procédé de l'invention dans un procédé de séparation tridimensionnel (et plus généralement multidimensionnel). Dans ce cadre, selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention comprend, à l'issue aux étapes (A) à (D), un ou plusieurs cycle(s) supplémentaire(s) de séparation / analyse électrophorétique, 25 comprenant des étapes similaires aux étapes (B) à (D) précitées. Dans ce cadre, le procédé de l'invention peut par exemple comprendre, suite aux étapes (A) à (D), un ou plusieurs cycles de séparation/analyse électrophorétique, comprenant chacun les étapes suivantes (B-bis) à (D-bis) suivantes: (B-bis) on isole, dans le capillaire employé dans les étapes (A) à (D), une 30 fraction (f) des composés séparés dans l'étape précédant l'étape (B-bis), et on 2907028 22 fait migrer ladite fraction (f) isolée à proximité d'une des extrémités du capillaire, en maintenant cette fraction (f) au sein du capillaire, typiquement en mettant en oeuvre l'une et/ou l'autres des étapes suivantes : (B-bis.1) on évacue hors du capillaire une partie des composés ayant les 5 vitesses de migration les plus élevées dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape précédant l'étape (B-bis), en laissant migrer ces composés en sortie du capillaire ; et/ou (B-bis.2) on évacue hors du capillaire une partie des composés ayant les vitesses de migration les plus faibles dans les conditions de l'électrophorèse io de l'étape précédant l'étape (B-bis), en faisant migrer ces composés vers l'entrée du capillaire, (C-bis) en appliquant une différence de pression entre les extrémités du capillaire, on introduit dans le capillaire un milieu de séparation MS2b;S, distinct des milieux de séparation employés dans les étapes de séparation 15 précédentes, cette introduction du nouveau milieu de séparation étant réalisée par l'extrémité du capillaire à proximité de laquelle est localisée la fraction (f) à l'issue de l'étape (B-bis) ; et (D-bis) on effectue une électrophorèse capillaire au sein du capillaire ainsi rempli par le milieu de séparation MS2bis en faisant migrer les composés de la 20 fraction (f) sous l'effet d'une différence de potentiel appliquée entre l'entrée et la sortie du capillaire, en employant le milieu MS2bis à titre de milieu de séparation. Dans ce cadre, il n'y a, selon l'invention, aucune restriction sur le nombre de dimensions que l'on peut effectuer au cours d'une analyse, si ce n'est le 25 temps d'analyse qui, bien sûr croît avec le nombre de dimensions réalisées. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention peut par exemple être une méthode de séparation tridimensionnelle comprenant : - une étape (A) mise en oeuvre pour purifier le milieu M à analyser, de préférence à faible force ionique (première dimension) ; 2907028 23 - une étape (D) mise en oeuvre pour séparer les solutés selon un premier critère moléculaire, de préférence à force ionique plus élevée que dans l'étape (A), par exemple une séparation en milieu libre selon le rapport charge / masse (deuxième dimension) ; et 5 - une étape (D-bis) mise en oeuvre pour séparer les solutés selon un deuxième critère moléculaire, avantageusement à force ionique plus élevée que dans l'étape (D), par exemple lié à la chiralité ou à la masse molaire (troisième dimension). Le procédé de l'invention présente en outre l'intérêt d'être conduit au sein io d'un unique capillaire, ce qui permet de récupérer les composés séparés à la sortie dudit capillaire comme dans le cas d'une électrophorèse capillaire classique. Cette caractéristique permet notamment d'envisager l'analyse des constituants séparés obtenus à l'issu de l'étape (C). Pour ce faire, suite à la séparation de l'étape (C), les composés sous forme séparée sont injectés du is capillaire vers un dispositif d'analyse, tel qu'un spectromètre de masse (quadrupôle, trappe d'ions, temps de vol), ou bien encore un détecteur conductimétrique ou électrochimique (injection en ligne du capillaire vers un autre dispositif d'analyse). Cette utilisation particulière du procédé constitue un autre objet spécifique de la présente invention. 20 Compte tenu de ces différents avantages, le procédé de l'invention est adapté pour réaliser la séparation des constituants de nombreux mélanges. En fait, le procédé de l'invention peut, en pratique, être conduit sur tout mélange adapté à une séparation par électrophorèse. En particulier, le procédé peut être employé pour le diagnostic médical. Le 25 mélange M séparé en différents constituants dans ce cadre peut alors être par exemple, un échantillon d'urine, un échantillon sanguin (plasma), un mélange de protéines (isoformes, formes glyquées / non glyquées), un mélange de peptides, un mélange d'acides aminés (neurotransmetteurs par exemple). Dans ce cadre, la séparation bidimensionnelle peut être utilisée pour réaliser la purification de 2907028 24 l'échantillon ("sample clean up") en première dimension, et la séparation des composés d'intérêt en deuxième dimension ; ou bien encore pour réaliser deux séparations permettant d'obtenir des sélectivités très différentes dans le but d'augmenter la capacité de pics par rapport à une séparation 5 monodimensionnelle. Selon ce deuxième mode, on citera la possibilité de séparer des composés selon deux dimensions ayant les propriétés suivantes : chirale /non chirale ; non micellaire / micellaire ; en milieu libre / en solution de polymère ou en solution de polymère / en milieu libre, ou encore deux électrolytes de pH différents. io Le procédé peut aussi être mis en oeuvre pour l'analyse protéomique (analyse bidimensionnelle par électrophorèse capillaire de peptides issus d'une digestion enzymatique). Enfin, le procédé est aussi particulièrement adapté à la séparation de macromolécules synthétiques, de latex ou de colloïdes. Dans ce cas, l'étape (A) 15 est avantageusement une étape d'électrophorèse sans milieu séparateur ("en milieu libre"), permettant une séparation des macromolécules selon leur rapport charge/masse, le milieu séparateur MS2 introduit dans l'étape (C) étant alors de préférence une solution d'un polymère non chargé adaptée à une séparation des composés présent dans la fraction isolée F selon leur masse molaire. 20 De façon plus générale, le mélange M séparé en plusieurs constituants selon l'invention peu comprendre des protéines, des peptides, des acides nucléiques, des polysaccharides, des acides humiques, des acides fluviques, des latex, des colloïdes, des nanoparticules, et/ou des polymères synthétiques. Différents aspects et avantages du procédé apparaîtront de façon encore 25 plus explicite au vu de l'exemple ci-après, et des figures annexées où : -La Fiqure 1 est un schéma illustratif des étapes (A) à (D) du procédé de l'invention. - La Fiqure 2 reporte des électrophérogramme obtenus dans le cadre de la séparation effectuée dans les conditions de l'exemple. 2907028 25 Sur la figure 1, il est représenté sous la forme d'une succession de schémas la séparation effectuée dans le cadre du procédé de l'invention. Sur cette succession de schémas, le premier schéma en partant du haut représente le mélange M introduit dans le capillaire, les extrémités du capillaire 5 étant plongées chacune dans un récipient rempli par un premier milieu de séparation MS1. Bien que cela ne soit pas représenté sur la figure, l'injection du mélange M peut être avantageusement suivie d'une injection d'électrolyte formant une zone électrolyte jouxtant le composé M dans le capillaire. Le deuxième schéma représente le système à l'issue de l'étape de io séparation (A), le mélange M étant séparé sous la forme de plusieurs fractions (FI, F2 et F sur le schéma). Les extrémités du capillaire sont toujours chacune plongées dans un récipient rempli par le premier milieu de séparation MS1 Le troisième schéma représente le système à l'issue de l'étape (B) : lesfractions autres que la fraction F (FI et F2) ont été éliminées hors du capillaire et 15 la fraction F a migré à proximité de l'extrémité gauche du capillaire. Là encore les extrémités du capillaire sont chacune plongées dans un récipient rempli par le milieu de séparation MS1. Cet état se situe juste avant l'étape (C) où on va remplir le capillaire par un deuxième milieu de séparation MS2 en faisant dans le même temps migrer la fraction F vers l'autre extrémité du capillaire. A ce stade, 20 on remplace le récipient de gauche par un récipient rempli par ce deuxième milieu de séparation MS2 Le quatrième schéma représente le système à l'issue de l'étape (C), le capillaire étant maintenant rempli par le milieu de séparation MS2, et la fraction F se trouvant à proximité de l'extrémité droite du capillaire, prête à être séparée par 25 l'électrophorèse de l'étape (D). Les extrémités du capillaire sont maintenant chacune plongées dans un récipient rempli par le deuxième milieu de séparation MS2. Le cinquième et dernier schéma représente le système à l'issue de la séparation de l'étape (D), la fraction F ayant été séparés en différentes fractions 30 (f1, f2 et f3) par électrophorèse capillaire au sein du milieu MS2. Un détecteur 2907028 26 situé au niveau de l'extrémité gauche du capillaire (non représenté sur le schéma) permet d'identifier les pics correspondants. La figure 2 se rapporte à l'exemple ci-dessous. 5 EXEMPLE Séparation bidimensionnelle dans un unique capillaire (purification et séparation d'un mélange de dérivés d'acides aminés). Dans cet exemple, le procédé de l'invention a été utilisé pour effectuer à la fois (1) la purification d'un mélange complexe et (2) l'analyse des constituants du io mélange ainsi purifié, en employant uniquement un seul et unique capillaire. Plus précisément, on a effectué la séparation d'un mélange complexe issu d'une réaction d'un mélange d'acide aminés avec de la chloroéthylnitrosourée (Cl-(CH2)2-N=N-OH) dans un mélange eau / acétone. Le mélange d'acide aminés dérivés soumis à la réaction contient 15 initialement, 10-3 mol/L de chaque acide aminé (sérine (Ser),proline (Pro),acide alpha-isobutyrique (AIB), Valine (Val),isovaline (lVal),alanine (Ala),glycine (GIy)Ieucine (Leu), isoleucine (Ileu),méthyl-leucine (Meleu),glutamate (Glu),asparatate (Asp). Dans le mélange eau / acétone employé, la chloroéthylnitrosourée mène à 20 une des composés à fonctinalité isocyanate selon la réaction suivante: NO NH Ci CIù(CH2)2N-= NùOH + [o=--R, o Les composés à fonction isocyanate ainsi formés réagissent avec la fonction amine des acides aminés pour donner l'acide aminé dérivé selon la 25 réaction suivante : H COOH + [0=C=NùR1J . R1ùNHùCùNH• II o HOOC R NH2 2907028 27 Pour effectuer la séparation du mélange obtenu, on a utilisé un capillaire en silice vierge, de diamètre interne de 25 microns et de longueur égale à 30 cm. Pour suivre l'évolution des séparations au sein du capillaire, on a placé un détecteur à 20 cm de la sortie du capillaire (Détection par absorbance UV à 214 5 nm). On a travaillé à une température de 25 C. (a) Séparation électrophorétique (Première dimension) On a rempli le capillaire par un premier milieu séparateur qui est une solution SI constituée par un tampon borate de sodium 200 mM, de pH 9,2 dans io un mélange eau / isopropanol (à 85/15 en volume). Cette solution S1 a été injecté sous pression dans le capillaire. Le capillaire a été purgé pendant 5 minutes par le tampon borate. On a ensuite injecté le mélange à analyser dans le capillaire, sous une pression de 0,3 psi (2,07 Pa) pendant 3 secondes. 15 On a ensuite immédiatement injecté du tampon S1 (injection sous une pression de 0,3 psi (2,07 Pa) pendant 3 secondes), formant ainsi une zone électrolyte ( plug ) immédiatement derrière le mélange. On a ensuite appliqué, entre l'entrée et la sortie du capillaire, plongées/. chacune dans un récipient rempli de solution S1, une différence de potentiel de 20 +20 kV pendant 4,82 min (rampe en tension de 0,25 min), de façon à séparer les constituants du mélange M par électrophorèse. On a observé, au niveau du détecteur, l'apparition d'un premier pic (pic de tête) correspondant à des impuretés (composés neutres). (b) Isolation de la fraction d'intérêt (Purification du mélange) 25 On a maintenu la différence de potentiel de -20 kV appliquée dans l'étape précédente, de façon à laisser sortir les impuretés dans le capillaire, et à ne conserver que les composés d'intérêt dans le capillaire (acides aminés fonctionnalisés). Pour procéder à cette élimination, on a mesuré le temps T mis par les 30 impuretés pour parcourir les 10 premiers centimètres du capillaire (de l'entrée au 2907028 28 détecteur) et, à compter du moment où ces impuretés ont été détectées, on les a laissé migrer pendant le temps 2T (nécessaire pour parcourir les 20 centimètres restant), plus quelques dizaines de secondes pour s'assurer que toutes les impuretés soient bien éliminées. 5 On a ensuite inversé le sens de la polarité appliquée entre les deux extrémités du capillaire (à savoir en appliquant différence de potentiel de -20 kV entre l'entrée et la sortie du capillaire), de façon à faire migrer les composés débarrassés des impuretés à l'entrée du capillaire. Au cours de cette migration, les différents composés se sont remélangés et on a ainsi obtenu à proximité de io l'entrée du capillaire une fraction du mélange initial, à savoir les composés d'intérêt du mélange sans les impuretés initialement présentes. On a maintenu la différence de potentiel de -20 kV pendant la durée totale de migration à -20 kV effectuée dans l'étape précédente. Le "plug" injecté initialement immédiatement derrière l'échantillon permet d'assurer de ne pas faire 15 sortir les composés d'intérêt hors du capillaire. (c) Introduction d'un nouveau milieu séparateur dans le capillaire On a plongé l'entrée du capillaire dans une solution S2 comprenant un tampon borate de sodium 200 mM, pH 9,2 dans un mélange eau I isopropanol 20 additionné de 50 mM de SDS (agent tensioactif : dodécylsulfate de sodium, formant des micelles dans le milieu, propres à mieux séparer les différents acides aminés dérivés selon leur nature chimique). On a introduit sous pression ce nouveau milieu séparateur S2 dans le capillaire, de façon à faire migrer la fraction séparée dans l'étape (b) vers la sortie 25 du capillaire (sans toutefois l'en faire sortir) et à remplir le capillaire avec le nouveau milieu de séparation. Pour ce faire, on a appliqué une surpression de 0,4 psi (2,76 Pa) pendant 10,06 min à l'entrée du capillaire. t.- 2907028 29 (d)Séparation électrophorétique en présence du nouveau milieu séparateur On a appliqué une différence de potentiel de +20 kV entre l'entrée du capillaire plongée dans un récipient rempli de solution S2, et la sortie également 5 plongée dans un récipient rempli de solution S2. On a observé au niveau du détecteur une séparation des différents acides aminés modifiés. L'électrophérogramme correspondant est représenté sur la Figure 2 (électrophérogramme du milieu). A des fins de comparaison, il est représenté sur la partie basse de la figure io 2 l'électrophérogramme correspondant à une séparation électrophorétique du mélange dans les conditions de l'étape (d), utilisant la solution S2 à base de micelles de SDS sans la purification antérieure de l'étape (a). Cet électrophérogramme fait apparaître de nombreux pics parasites (indexés par une étoile) qui disparaissent dans les conditions du procédé de l'invention. 15 Il est à noter que l'emploi d'un capillaire de diamètre interne de 25 microns au lieu de 50 microns augmente l'efficacité de la séparation et réduit l'effet dispersif de la pression hydrodynamique employée dans l'étape (b). II est à noter par ailleurs qu'on peut encore améliorer la séparation telle qu'obtenue en remplaçant la solution SI employée dans l'étapes (a) par une 20 solution SI de plus faible force ionique que la solution S2. On a vérifié ce point en employant une solution Si' à 50mM en tampon borate. On a obtenu ainsi une pré-concentration des espèces avec une augmentation des efficacités des pics. L'amélioration de la séparation est visible sur l'électrophérogramme du haut de la figure 2 (diamètre 25 micron et solution SI' à 50mM). REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation des constituants d'un mélange M par électrophorèse capillaire au sein d'un unique capillaire, ledit procédé comprenant les étapes où : (A), on introduit et on fait migrer les composés du mélange M au sein du capillaire selon la technique de l'électrophorèse capillaire, sous l'effet d'une différence de potentiel appliquée entre l'entrée et la sortie du capillaire, en employant un premier milieu de séparation MS1, de façon à réaliser une séparation des composés du mélange M au sein du capillaire, selon leur io vitesse de migration dans les conditions de l'étape (A) ; (B) on isole dans le capillaire une fraction F des composés séparés dans l'étape (A), et on fait migrer ladite fraction F isolée à proximité d'une des extrémités du capillaire, en maintenant cette fraction F au sein du capillaire en mettant en oeuvre l'une et/ou l'autres des étapes suivantes : 15 (B.1) on évacue hors du capillaire une partie des composés ayant les vitesses de migration les plus élevées dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape (A), en laissant migrer ces composés en sortie du capillaire, le plus souvent en maintenant la différence de potentiel de l'étape (A) ; et/ou 20 (B.2) on évacue hors du capillaire une partie des composés ayant les vitesses de migration les plus faibles dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape (A), en faisant migrer ces composés vers l'entrée du capillaire, en général en appliquant une surpression en sortie du capillaire et/ou en appliquant entre l'entrée et la sortie du capillaire une différence de potentiel 25 de polarité contraire à celle de l'étape (A), étant entendu qu'au sens de l'étape (B), on entend par "entrée" du capillaire, l'extrémité du capillaire où est faite l'injection, la "sortie" étant l'autre extrémité ; 2907028 31 (C) en appliquant une différence de pression entre les extrémités du capillaire, on introduit dans le capillaire un deuxième milieu de séparation MS2, distinct du milieu de séparation MS1 employé dans l'étape (A) par l'extrémité du capillaire à proximité de laquelle est localisée la fraction F, ce par quoi on fait 5 migrer la fraction F vers l'autre extrémité du capillaire tout en remplissant le capillaire par le milieu de séparation MS2 ; et (D) on effectue une électrophorèse capillaire au sein du capillaire ainsi rempli par le milieu de séparation MS2 en faisant migrer les composés de la fraction F sous l'effet d'une différence de potentiel appliquée entre l'entrée et la sortie du capillaire, en employant le milieu MS2 à titre de milieu de séparation. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape (B) consiste à mettre en oeuvre l'étape (B.2) sans mettre en oeuvre l'étape (B.1), la fraction F isolée au sein du capillaire étant alors une fraction de tête. 3. Procédé selon la revendication 2, où la fraction de tête F est 15 constituée par les composés du pic de tête observable sur un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A). 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape (B) consiste à mettre en oeuvre l'étape (B.1) pour évacuer une fraction de tête, puis l'étape (B.2) pour évacuer une fraction de queue, la fraction F isolée au sein du capillaire étant 20 alors une fraction de coeur. 5. Procédé selon la revendication 4, où la fraction de coeur F est constituée par les composés d'un des pics compris entre le pic de queue et le pic de tête observables sur un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A). 25 6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape (B) consiste à mettre en oeuvre l'étape (B.1) sans mettre en oeuvre l'étape (B.2), la fraction F isolée au sein du capillaire étant alors une fraction de queue. 2907028 32 7. Procédé selon la revendication 6, où la fraction de queue F est constituée par les composés du pic de queue observable sur un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A). 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, où le 5 milieu de séparation MS2 introduit dans l'étape (C) est un milieu plus conducteur électriquement que le milieu de séparation MS1 employé dans l'étape (A), par exemple un milieu ayant une force ionique supérieure à celle du milieu de séparation MS1. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, où, dans io l'étape (C), on introduit d'abord une faible quantité d'un premier milieu de séparation ms2 différent des milieux MS1 et MS2, puis le milieu MS2, ce par quoi on obtient un capillaire rempli par le milieu de séparation MS2 avec la fraction F à séparer à proximité d'une des extrémités du capillaire et une faible quantité de milieu ms2 entre la fraction F et le milieu de séparation MS2, cette faible quantité de milieu ms2 assurant le rôle de zone électrolyte transitoire dans l'étape de séparation (D). 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, où, dans l'étape (A), après injection du mélange M et avant la séparation, on introduit une faible quantité d'un électrolyte, avantageusement moins conducteur électriquement que le milieu MS1, l'électrolyte ainsi injecté formant une zone électrolyte jouxtant le mélange M dans le capillaire. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, où le milieu de séparation MS2 introduit dans l'étape (C) est un milieu comprenant des polymères en solution ou sous forme de gel. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, où le milieu de séparation MS2 introduit dans l'étape (C) est un milieu micellaire. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, où le milieu de séparation MS2 introduit dans l'étape (C) diffère du milieu MS1 par la valeur de son pH. 2907028 33 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, permettant une séparation tri- ou multi-dimensionnelle, qui comprend, suite aux étapes (A) à (D), un ou plusieurs cycles de séparation/analyse électrophorétique supplémentaires, comprenant chacun les étapes suivantes (B-bis) à (D-bis) 5 suivantes: (B-bis) on isole, dans le capillaire employé dans les étapes (A) à (D), une fraction (f) des composés séparés dans l'étape précédant l'étape (B-bis), et on fait migrer ladite fraction (f) isolée à proximité d'une des extrémités du capillaire, en maintenant cette fraction (f) au sein du capillaire, io (C-bis) en appliquant une différence de pression entre les extrémités du capillaire, on introduit dans le capillaire un milieu de séparation MS2bis, distinct des milieux de séparation employés dans les étapes de séparation précédentes, cette introduction du nouveau milieu de séparation étant réalisée par l'extrémité du capillaire à proximité de laquelle est localisée la fraction (f) à is l'issue de l'étape (B-bis) ; et (D-bis) on effectue une électrophorèse capillaire au sein du capillaire ainsi rempli par le milieu de séparation MS2bis en faisant migrer les composés de la fraction (f) sous l'effet d'une différence de potentiel appliquée entre l'entrée et la sortie du capillaire, en employant le milieu MS2bis à titre de milieu de 20 séparation. 15. Procédé selon la revendication 14, qui comprend : - une étape (A) mise en oeuvre pour purifier le milieu M à analyser ; une étape (D) mise en oeuvre pour séparer les solutés selon un premier critère moléculaire, de préférence à force ionique plus élevée que dans 25 l'étape (A) - une étape (D-bis) mise en oeuvre pour séparer les solutés selon un deuxième critère moléculaire, avantageusement à force ionique plus élevée que dans l'étape (D). 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, où le capillaire utilisé a un diamètre interne compris entre 5 et 100 microns. 2907028 34 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, où le capillaire utilisé a une longueur inférieure à 1 m. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, où le mélange M est un échantillon d'urine, un échantillons sanguin ou un mélange de 5 protéines. 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, où le mélange M comprend des protéines, des peptides, des acides nucléiques, des polysaccharides, des acides humiques, des acides fluviques, des latex, des colloïdes, des nanoparticules, et/ou des polymères synthétiques.