FR 2908415 A1 20080516 FR 0609866 A 20061110 1 Acide hyaluronique réticulé et son procédé de préparation La présente invention concerne un nouvel acide hyaluronique réticulé ainsi que son procédé de préparation et ses utilisations, notamment cosmétiques. L'acide hyaluronique est un polysaccharide constitué d'unités acide D-glucuronique et d'unités N-acétyl-D- glucosamine, qui est notamment connu pour être utilisé en chirurgie réparatrice ou oculaire ou encore dans le domaine esthétique comme produit de comblement des rides. Dans cette dernière application en particulier, l'acide hyaluronique est préféré à d'autres produits de comblement en raison de sa biocompatibilité et de ses propriétés physico-chimiques. Il présente toutefois l'inconvénient de se dégrader rapidement, nécessitant ainsi des injections répétées. Pour remédier à ce désavantage, il a été proposé différents procédés de réticulation de l'acide hyaluronique visant à le rendre moins sensible aux différents facteurs de dégradations tels que les attaques enzymatiques et/ou bactériennes, la température et les radicaux libres et à améliorer ainsi sa résistance à la dégradation in vivo et par conséquent sa durée d'action. Ces procédés impliquent notamment une éthérification, une estérification ou une amidification des fonctions hydroxyle et/ou acides de l'acide hyaluronique natif. Les procédés de réticulation d'acide hyaluronique, notamment par amidification, de l'art antérieur présentent toutefois l'inconvénient de conduire à des dérivés d'acide hyaluronique difficilement formulables et 2908415 2 seringuables en milieu aqueux et/ou insuffisamment résistants aux facteurs de dégradation, en particulier après stérilisation du produit. 5 Il en est ainsi de l'acide hyaluronique insoluble dans l'eau préparé selon la demande US 2001/0393369 par réaction en milieu acide d'acide hyaluronique avec un agent activateur tel que le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et un nucléophile 10 qui peut être une polylysine. On pense en effet qu'à des pH inférieurs ou égaux à 7, la réaction d'amidification attendue est en compétition avec une réaction d'estérification 15 intramoléculaire, qui conduit à une auto-réticulation de l'alcool primaire porté par l'acide hyaluronique sur l'ester d'acide hyaluronique activé. Cette réaction parasite se traduit notamment par une augmentation importante de la viscosité (prise en masse) et une 20 opacification du mélange réactionnel qui se présente ainsi sous forme d'un mélange hétérogène d'eau et de polymère insoluble. Il devient alors impossible de formuler l'acide hyaluronique obtenu. 25 En outre, la demande EP-1 535 952 divulgue un revêtement constitué d'acide hyaluronique réticulé formé in situ par réaction d'une polylysine avec de l'acide hyaluronique en présence d'EDC et de NHS à un pH de 2 à 9 et de préférence de 4 à 7,5. L'article pourvu de ce 30 revêtement peut notamment être une prothèse utilisable en chirurgie esthétique. Ce document ne divulgue pas d'acide hyaluronique réticulé précipité dans un solvant organique en vue d'être disponible sous forme sèche et susceptible 2908415 3 ainsi d'être formulé sous forme d'hydrogel de façon extemporanée. Par ailleurs, le brevet US-6,630,457 décrit un acide 5 hyaluronique modifié préparé par réaction d'une amine primaire sur un acide hyaluronique activé par un carbodiimide tel que l'EDC et un dérivé de N-hydroxysulfosuccinimide tel que la NHS, à un pH de 7,0 à 8,5. Le composé obtenu peut être réticulé dans des 10 conditions physiologiques, par exemple avec du glutaraldéhyde, pour obtenir un hydrogel qui reste sensible aux glycosidases et se dégrade sensiblement entièrement en moins de 50 heures. Cette cinétique de dégradation est compatible avec l'utilisation envisagée 15 comme vecteur de cellules et de facteurs de croissance mais ne convient pas à une utilisation comme matériau de comblement en chirurgie esthétique, par exemple. Enfin, la demande WO 2006/021644 décrit un procédé 20 de préparation d'acide hyaluronique réticulé par activation de l'acide hyaluronique avec un agent de couplage tel que l'EDC et un catalyseur tel que le NHS, suivie d'une réaction avec un polypeptide tel que la dilysine, à un pH de 4 à 10, par exemple de 4 à 6. Le pH 25 peut éventuellement être remonté, en fin de réaction, à une valeur de 6 à 7 pour augmenter le rendement de l'extraction pendant la phase de précipitation. La Demanderesse a découvert que l'utilisation d'un 30 pH acide pendant la phase de réaction n'était pas toujours favorable à la réaction d'amidification et pouvait conduire, comme indiqué précédemment, à des réactions parasites, notamment d'estérification 2908415 4 intramoléculaire, susceptibles d'affecter les propriétés physicochimiques du produit obtenu. Il subsiste donc le besoin de proposer un acide 5 hyaluronique réticulé susceptible d'être obtenu sous forme sèche puis reformulé aisément en milieu aqueux pour former un hydrogel présentant de bonnes propriétés physico-chimiques, se traduisant notamment par un module élastique G et un angle de perte delta inférieur à 30, 10 lequel hydrogel est lui-même susceptible d'être soumis à un traitement thermique, en particulier de stérilisation en vue d'être utilisé pour la fabrication d'un implant lui-même suffisamment stable vis-à-vis des différents facteurs de dégradations tels que les attaques 15 enzymatiques et/ou bactériennes, la température et les radicaux libres pour ne pas se résorber totalement in vivo en moins de 4 mois. Or, la Demanderesse a découvert tout à fait 20 fortuitement que le pH de précipitation dans un solvant organique de l'acide hyaluronique réticulé par un polypeptide déterminait ses propriétés rhéologiques et sa sensibilité vis-à-vis des facteurs de dégradation tels que la température, les radicaux libres et les enzymes 25 telles que les hyaluronidases. A la suite de multiples expérimentations, la Demanderesse a ensuite identifié les conditions de précipitation optimales en vue de l'obtention d'un acide hyaluronique réticulé peu sensible à la dégradation thermique, c'est-à-dire conservant ses 30 propriétés rhéologiques après remise en solution du composé précipité et stérilisation. Tout se passe ainsi comme si l'acide hyaluronique réticulé conservait une fois reformulé une mémoire de son organisation 2908415 5 moléculaire au moment de la précipitation. Il a par ailleurs été démontré que cet arrangement moléculaire influait en outre sur la capacité du polymère à se resolubiliser. 5 Sans vouloir être lié par cette théorie, on pense que le procédé précité permet de densifier et solidifier le réseau macromoléculaire de l'acide hyaluronique non seulement au moyen de liaisons covalentes avec l'agent 10 réticulant, mais également au moyen d'interactions ioniques et/ou de liaisons hydrogène se développant au moment de la précipitation. La présente invention a donc pour objet un acide 15 hyaluronique réticulé, susceptible d'être obtenu suivant un procédé comprenant : - l'activation d'un acide hyaluronique à l'aide d'un agent de couplage et d'un auxiliaire de couplage, pour obtenir un acide hyaluronique activé, 20 - la réaction de l'acide hyaluronique activé avec un agent réticulant comprenant au moins 50% en poids d'oligo-ou polypeptide, dans un milieu réactionnel ajusté à un pH de 8 à 12, pour obtenir un acide hyaluronique réticulé, 25 - l'ajustement du pH du milieu réactionnel à une valeur allant de 5 à 7, - la précipitation de l'acide hyaluronique réticulé dans un solvant organique pour obtenir des fibres d'acide hyaluronique réticulé, et 30 - éventuellement, le séchage des fibres d'acide hyaluronique réticulé obtenues. 2908415 6 L'acide hyaluronique réticulé obtenu selon l'invention est soluble dans l'eau. Par cette expression, on entend que 1 g des fibres déshydratées obtenues comme décrit ci-dessus se désagrègent en quelques minutes et se 5 solubilisent totalement dans un litre de solution de sérum physiologique après quelques heures, sans agitation. L'acide hyaluronique mis en oeuvre dans le procédé 10 ci-dessus est généralement utilisé à l'état natif, c'est-à-dire tel qu'il est naturellement présent dans un organisme vivant ou excrété par les bactéries lors de sa production par fermentation bactérienne. Il a ainsi généralement une masse moléculaire allant de 500.000 à 15 7.000.000 Daltons et est habituellement utilisé sous forme de sel de sodium. L'acide hyaluronique est activé avant réticulation, en utilisant un agent de couplage et un auxiliaire de 20 couplage. Des exemples d'agents de couplage sont les carbodiimides hydrosolubles tels que le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), le 1-éthyl-3-(3- 25 triméthylaminopropyl) carbodiimide (ETC) et le 1-cyclohexyl-3-(2-morphilinoéthyl) carbodiimide (CMC) ainsi que leurs sels et leurs mélanges. L'EDC est préféré pour une utilisation dans la présente invention. 30 Des exemples d'auxiliaires de couplage sont le N-hydroxy succinimide (NHS), le N-hydroxy benzotriazole (HOBt), le 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazole (HOOBt), le 1-hydroxy-7-azabenzotriazole 2908415 7 (HAt) et le N-hydroxysylfosuccinimide (sulfo NHS) et leurs mélanges. Sans se limiter au choix du NHS, celui-ci est préféré pour une utilisation dans la présente invention. Le rôle de l'agent et de l'auxiliaire de couplage est illustré dans l'Exemple 1 ci-après. On préfère selon l'invention que le rapport molaire 10 de l'agent de couplage aux unités acide carboxylique de l'acide hyaluronique soit compris entre 2% et 200%, plus préférentiellement entre 5% et 100%. En outre, le rapport molaire de l'auxiliaire de 15 couplage à l'agent de couplage est avantageusement compris entre 1 :1 et 3 :1, de préférence entre 1,5 :1 et 2,5 :1, bornes incluses, et plus préférentiellement égal à 2. 20 La réaction d'activation de l'acide hyaluronique par l'agent de couplage peut être effectuée à un pH allant par exemple de 3 à 6, de préférence de 4 à 5. La concentration d'acide hyaluronique dans le milieu 25 réactionnel est par exemple comprise entre 0,1 et 5% en poids, par exemple entre 0,1 et 1% en poids, bornes incluses. L'agent réticulant comprend au moins 50% en poids, 30 et est avantageusement constitué, d'un oligo- ou polypeptide qui peut être un homo- ou copolypeptide statistique, bloc, segmenté, greffé ou en étoile. L'agent réticulant est généralement sous forme de sel et en 5 2908415 8 particulier de chlorhydrate ou éventuellement de bromhydrate ou de trifluoroacétate, notamment. Des exemples de polypeptides utilisables dans la 5 présente invention sont les homo- et copolymères de lysine, d'histidine et/ou d'arginine, en particulier les polylysines possédant au moins deux, voire au moins cinq, unités lysine, telles que la dilysine, les polyhistidines et les polyarginines, sans que cette liste ne soit 10 limitative. Ces acides aminés peuvent se trouver sous forme D et/ou sous forme L. La dilysine et ses sels ainsi que ses dérivés sont préférés pour une utilisation dans la présente invention. 15 On préfère selon l'invention que le nombre de fonctions amine du polypeptide mis en jeu représente de (1 à 100%), de préférence de 10 à 50 % du nombre de fonctions acide carboxylique de l'acide hyaluronique mis en jeu. 20 Dans une première variante préférée de l'invention, l'agent de couplage est mis en oeuvre en quantité stoechiométrique par rapport aux fonctions amine de l'agent réticulant. De cette manière, à l'issue de la 25 première étape du procédé selon l'invention, la quantité de fonctions acides carboxyliques de l'acide hyaluronique qui sont activées est égale à la quantité de fonctions amines qui seront ajoutées à la seconde étape. 30 Dans une seconde variante de l'invention, l'agent de couplage est mis en oeuvre en quantité stoechiométrique par rapport aux fonctions acides carboxyliques de l'acide hyaluronique. Dans ce cas, à l'issue de la première étape 2908415 9 du procédé selon l'invention, toutes les fonctions acides carboxyliques de l'acide hyaluronique sont activées et la quantité d'agent réticulant mise en œuvre dans la deuxième étape pourra par exemple être de moins de 30%, 5 mieux, de moins de 10%, voire d'environ 5% (en nombre de moles d'agent réticulant par rapport au nombre de moles de fonctions acides carboxyliques). La réaction de réticulation est généralement 10 effectuée dans des conditions de température et pendant une durée tout à fait classiques pour l'homme du métier, par exemple à une température de 0-45 C, de préférence 5-25 C, pendant 1 à 10h, de préférence 1 à 6h. Pour favoriser la formation de liaisons amides, le pH de la 15 réaction est compris entre 8 et 12 et de préférence entre 8 et 10 (bornes incluses). Ce pH peut être ajusté à l'aide de toute base, préférentiellement une base faiblement nucléophile comme une amine telle que la diisopropyléthylamine (DIEA). 20 Cette réaction est habituellement conduite dans un solvant tel qu'une solution aqueuse de chlorure de sodium. 25 La concentration d'acide hyaluronique dans le milieu réactionnel est par exemple comprise entre 0,01 et 5% en poids, par exemple entre 0,1 et 1% en poids, bornes incluses. 30 Après réaction, le pH du milieu réactionnel est ajusté à une valeur allant de 5 à 7 et de préférence de 5,5 à 7 à l'aide d'un acide quelconque tel que l'acide chlorhydrique, avant que l'acide hyaluronique réticulé 2908415 10 obtenu ne soit précipité. L'étape de précipitation est réalisée dans un solvant organique tel que l'éthanol, l'isopropanol, l'éther ou l'acétone, ou leurs mélanges, par exemple, l'éthanol étant préféré dans cette 5 invention. Le solvant est avantageusement utilisé en quantité représentant de 5 à 20 fois, par exemple environ 10 fois, le volume de milieu réactionnel. Une étape éventuelle de séchage est alors 10 préférentiellement mise en œuvre, de façon à obtenir une forme déshydratée d'acide hyaluronique réticulé qui est plus facile à manipuler et se conserve mieux. La conservation peut notamment être effectuée en froid négatif. 15 L'invention a également pour objet le procédé de fabrication d'un acide hyaluronique réticulé, tel que décrit précédemment. 20 Ce procédé peut également comprendre d'autres étapes que celles explicitement mentionnées et notamment une étape de mélange dudit acide hyaluronique réticulé déshydraté avec un solvant aqueux, tel qu'une solution de chlorure de sodium, une solution de sérum physiologique 25 ou une solution tamponnée injectable (notamment une solution saline de tampon phosphate), pour former un hydrogel. La concentration d'acide hyaluronique dans ledit hydrogel peut aller de 1 à 4% et de préférence de 1,5 à 3% en poids/volume. 30 L'invention a donc également pour objet un tel hydrogel, renfermant un acide hyaluronique réticulé tel que décrit précédemment, dans un solvant aqueux. 2908415 11 L'hydrogel ainsi obtenu présente après stérilisation, par exemple à 118-130 C pendant 2 à 30 minutes, conformément à l'invention, un module élastique 5 G' d'au moins 100 et par exemple compris entre 200 et 600 Pa, bornes incluses, et une variation de son module élastique de moins de 30%, et de préférence de moins de 20%, après étuvage à 93 C pendant 1 Heure. Il présente en outre avantageusement un module visqueux G" allant de 50 10 à 200 Pa; un angle de perte 8 [=Inv tan (G" /G') ] allant de 15 à 35 et une viscosité r~ allant de 1000 à 3000 Pa.s. La mesure du module élastique, du module visqueux et de l'angle de perte peut être effectuée de la manière suivante : l'hydrogel est traité avec une géométrie cône- 15 plan 4cm, 4 , à une température de 25 C. Il subit un test viscoélastique non destructif à 1Hz, avec une déformation imposée de 1%. La mesure du module élastique est réalisée à l'aide d'un rhéomètre type AR 1000 de la société TA Instruments. Le même appareillage peut être utilisé pour 20 mesurer la viscosité en utilisant un gradient de cisaillement de 5.10 sec-1. L'invention a donc également pour objet un hydrogel stérilisé renfermant de l'acide hyaluronique réticulé par 25 un agent réticulant renfermant au moins 50% en poids d'oligo- ou polypeptide, caractérisé en ce qu'il présente une variation de son module élastique de moins de 30% après un étuvage à 93 C pendant 1 Heure. 30 Cet hydrogel est avantageusement utilisé pour la fabrication d'implants. 2908415 12 Ces implants peuvent notamment être injectés par voie sous-cutanée (hypodermique) ou intradermique dans le tissu fibreux. 5 Ils peuvent renfermer, en plus de l'hydrogel précité, un fluide vecteur comprenant au moins un polysaccharide, par exemple au moins un dérivé de cellulose tel que la carboxyméthylcellulose et/ou au moins un glycosaminoglycane tel qu'un hyaluronate de 10 sodium et/ou des particules d'un matériau biocompatible biorésorbable tels que l'acide polylactique (PLLA), l'acide polyglycolique (PGA), les acides poly(lactiqueco-glycolique) (PLGA), le phosphate tricalcique (TCP), l'hydroxyapatite (HAP), et leurs mélanges. 15 Des exemples de tels minéraux d'implants les contenant sont notamment décrits dans la demande WO 2004/069090. 20 Les implants selon l'invention sont biorésorbables, en ce sens qu'ils sont capables de se dégrader dans l'organisme en 6 à 18 mois. Ils peuvent en particulier être utilisés pour : 25 - la supplémentation d'une cavité ou organe déficitaire en acide hyaluronique (typiquement en dermatologie, en médecine esthétique ou dans les traitements orthopédiques) ; - la reconstitution d'un volume épanché lors 30 d'interventions chirurgicales (typiquement en chirurgie oculaire), ou -l'application topique sur le derme sain ou lésé (typiquement en cosmétologie et dermatologie). 2908415 13 L'implant précité est particulièrement bien adapté à une utilisation dans le comblement des rides et ridules faciales et/ou des cicatrices du corps humain. 5 La présente invention a donc également pour objet l'utilisation de l'acide hyaluronique réticulé tel que décrit précédemment pour la fabrication d'implants injectables destinés à une utilisation en chirurgie esthétique et/ou réparatrice, pour la fabrication de 10 produits de comblement, notamment des rides, ridules, cicatrices ou dépressions cutanées telles que les lipodystrophies. L'invention sera maintenant illustrée par les 15 exemples non limitatifs suivants. EXEMPLES Exemple 1 : Synthèse d'acide hyaluronique réticulé par un 20 polypeptide selon l'invention 1. Schéma réactionnel Le schéma réactionnel suivi peut être illustré de la 25 manière suivante (en prenant comme exemple la dilysine): 2908415 14 OH OH Acide hyaluronique OH OH EDC NHS Base Eau P Acide hyaluronique réticulé La réaction de réticulation (schéma 1) consiste en un double couplage peptidique entre les fonctions acides 5 carboxyliques de deux chaînes d'acides hyaluronique et les fonctions amines de la dilysine. Les réactifs de couplage utilisés sont le l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ainsi que le N-hydroxysuccinimide (NHS). 10 Le mécanisme de la réaction de couplage peut être illustré ainsi . /- NH O + NH . N NH, H H~/~i I ^ ^'NHz H O COOH EDU + N OH 15 2908415 15 La première étape consiste en une attaque nucléophile de la fonction acide carboxylique de l'acide hyaluronique sur la fonction carbodiimide de l'agent de couplage EDC. L'O-acylurée résultante est ensuite substituée par le NHS 5 pour former un ester activé plus stable (production de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) urée). En effet, 1'0-acylurée peut se réarranger en N-acylurée inerte en milieu aqueux légèrement acide et lors de long temps de réaction. La dernière étape consiste enfin en l'attaque 10 nucléophile d'une des fonctions amines de la dilysine (de préférence terminale, favorisée stériquement) sur l'ester activé afin de former une liaison amide avec relargage de NHS. 15 2. Protocole lère étape : phase de gonflement Dans un réacteur en verre de 500 ml, on introduit 20 successivement 3 g de chlorure de sodium dans 300 ml d'eau milliQ. Après dissolution du chlorure de sodium au sonicateur, on introduit dans le réacteur contenant la solution saline 2 g d'acide hyaluronique (HTL Sarl, batch N PH 1016, Mw= 2.6 106 daltons, ci-après HA) en prenant 25 soin d'effilocher le plus possible les fibres d'HA à la main. Après avoir agité le milieu hétérogène à la spatule pendant 1 minute, le réacteur est placé à 4 C pendant 15h sans agitation et couvert de papier aluminium pour protéger le milieu réactionnel. 30 2eme étape : phase de réticulation 2908415 16 Le mélange réactionnel est retiré du réfrigérateur puis mis sous agitation à température ambiante (18-25 C) pendant 10 minutes. (visuellement, la solution doit être parfaitement limpide et homogène présentant une certaine 5 viscosité, comme du miel fluide). L'agitation utilisée est de type mécanique avec un agitateur en forme de demi-lune en téflon. La vitesse de rotation est de 60 tr/min. 10 On prépare ensuite une solution de 464 mg (4,03 mmol) de N-hydroxysuccinimide (ACROS, pureté 98%, ci-après NHS) dans 5ml d'eau milliQ dans un tube à hémolyse puis on agite sous vortex pour dissoudre la totalité du NHS. On 15 ajoute cette solution au milieu réactionnel goutte à goutte à raison de 5 ml/min. On laisse le mélange sous agitation pendant 5 minutes, puis on ajoute une solution de 313 mg (2,02 mmol) de 20 chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N-éthylcarbodiimide (Sigma-Aldrich , ref 03450-5G, ci-après EDC) dans 4 ml d'eau milliQ. La dissolution s'effectue au vortex puis l'addition au goutte-à-goutte à une vitesse de 5ml/min. 25 On laisse le mélange sous agitation pendant trente minutes puis on ajoute à raison de lml/min la solution aqueuse de dilysine au milieu réactionnel. Cette solution est préparée en solubilisant par vortex dans 1 ml d'eau 30 milliQ, 233 mg (0,67 mmol) de chlorhydrate de dilysine (Fournisseur BACHEM, ref G2675), puis 1302 111 (10,08 mmol) de diisopropyléthylamine (Fournisseur ACROS ref 115225000, ci-après DIEA), le tout dans un tube à 2908415 17 hémolyse. Ce mélange présente deux phases distinctes formant une émulsion réversible après vive agitation. On essaye de mélanger le plus possible l'émulsion tandis qu'elle est ajoutée au milieu réactionnel. Le pH du 5 milieu réactionnel doit être compris entre 8,5 et 10,5. On laisse l'ensemble sous agitation pendant 3h. 3eme étape : phase de purification Après arrêt de l'agitation, on ajuste le pH de la solution avant précipitation avec HCl 1M pour le diminuer jusqu'à un pH de 5,7. 15 On prépare ensuite un réacteur d'un litre de contenance, muni d'un agitateur mécanique et d'une tige d'agitation en forme de râteau. On verse dans ce réacteur 420 ml d'éthanol à 95 et on met en route l'agitation mécanique à très grande vitesse (1000 tr/min environ). 20 On aspire ensuite 42 ml de mélange réactionnel contenant le hyaluronate réticulé à l'aide d'une seringue de 50 ml, puis on l'introduit de façon continue, en filet, dans le réacteur. La solution doit être limpide, incolore et 25 assez visqueuse. Dès que l'addition est terminée, on maintient l'agitation pendant deux minutes supplémentaires. On ôte ensuite la tige d'agitation du réacteur et on déroule le polymère 30 obtenu sur un fritté de porosité II à l'aide d'une pince. On sèche rapidement le polymère sur une fiole à vide pendant 15 secondes maximum, puis on le laisse sécher 10 2908415 18 dans un dessiccateur sous vide pendant douze heures minimum. Le produit final doit être parfaitement blanc. 4ème étape : phase de reformulation Pour préparer 10 ml de gel à 2,4%, on introduit dans une seringue en polypropylène standard munie d'un bouchon (en 10 sortie de seringue), 240 mg de polymère réticulé et séché. On ajoute ensuite 10 ml de solution tamponnée** au solide, puis on laisse gonfler l'ensemble à 4 C pendant 12 à 15 heures. 5 15 Après avoir retiré la seringue du réfrigérateur, on met le produit sous agitation rapide à l'aide d'une agitation mécanique, à une vitesse de 1000 tr/min. La tige d'agitation utilisée est une spatule de laboratoire en forme de cuillère en acier inoxydable. La durée de 20 l'agitation est d'environ 5 minutes pour ce produit, mais variable suivant la viscosité. Le gel final doit être incolore et parfaitement homogène. Exemple 2 : Test de dégradation ou de rémanence 25 Principe : L'homme du métier est habitué à pratiquer des tests de dégradations accélérés prédictifs de la résistance d'un polymère aux différents facteurs de dégradation in vivo 30 (voir notamment FR 2861 734). Dans cet exemple, on a mis en ouvre un de ces tests, qui consiste à mesurer les caractéristiques rhéologiques de produits réticulés préalablement stérilisés puis ayant 2908415 19 subi une phase de chauffage à 93 C pendant une heure. On calcule ensuite le pourcentage de perte du module élastique (G') au cours du chauffage. Plus ce pourcentage est faible, mieux le produit résiste à la chaleur et est 5 considéré comme susceptible de résister aussi aux autres facteurs de dégradation. Ce test est donc prédictif de la vitesse de dégradation in vivo de l'acide hyaluronique réticulé et donc de la durée de comblement des rides qui peut être obtenue. 10 Produits testés : Tous les produits testés sont des produits stériles. On a testé plusieurs produits du commerce, ainsi que : 15 - le Produit 1 qui était un acide hyaluronique obtenu comme décrit à l'Exemple 1, et - le Produit 2 qui était un acide hyaluronique obtenu comme décrit à l'Exemple 1, excepté qu'on a utilisé 45% mol d'EDC ; 90% mol de NHS ; et 15% mol de dilysine, par 20 rapport au nombre de moles d'unités COOH de l'acide hyaluronique, et un ratio DIEA/NHS de 2,22. Résultats : 25 Le Tableau 1 suivant rassemble les résultats obtenus pour les différents acides hyaluroniques réticulés testés. Tableau 1 Test de dégradation des acides hyaluroniques réticulés 30 2908415 20 TO Ti après 1H00 à 93 C Echantillons module Angle Module Angle % Perte stériles élastique de élastique de G' (G') perte (G') perte (A) _ _ (A) _ PERLANE 500 8.5 360 8.4 28% JUVEDERM 63.5 22 43.5 25 31% 30HV0 ESTHELIS 89 25 43 27 52% Basic Produit 1 262 26 224 30 14% Produit 2 206 25 199 30 3% Il ressort de ce tableau que les acides hyaluroniques modifiés selon l'invention présentent une plus faible chute de leur module élastique que les acides 5 hyaluroniques réticulés du commerce, ce qui démontre qu'ils résistent mieux aux facteurs de dégradation. Exemple 3 : Influence du pH de précipitation 10 On a comparé les propriétés physico-chimiques d'acides hyaluroniques réticulés synthétisés sensiblement comme décrit à l'Exemple 1 et précipités à différents pH dans l'éthanol. Les paramètres des procédés de synthèse de ces composés sont rassemblés dans le Tableau 2 ci-dessous 15 Tableau 2 Paramètres de synthèse d'acides hyaluroniques réticulés 2908415 21 Produit %EDC* oNHS* odilysine* Ratio pH de DIEA/NHS précipitation Produit 1 40% 80% 13,33% 2,5 5,7 Produit A 40% 80% 13,33% 2,5 9,0 Produit B 40% 80% 13,33% 2,5 4,0 Produit 3 100% 200% 5% 2,0 5,7 Produit C 100% 200% 5% 2,0 4,0 Produit 4 45% 90% 15% 2,22 5,20 Produit D 45% 90% 15% 2,22 4,0 * par rapport au nombre de moles de fonctions acides carboxyliques de l'acide hyaluronique 5 On a évalué les propriétés physico-chimiques des produits ci-dessus, une fois reformulés comme décrit à l'Exemple 1, avant et après passage à l'étuve pendant une heure à 90 C. On a plus précisément évalué la viscosité de l'hydrogel et mesuré son module élastique. Les résultats 10 obtenus sont rassemblés dans le Tableau 3 ci-dessous : Des classes de 1 à 5 ont été utilisées, qui représentent une note synthétique tenant compte de l'élasticité et de la viscosité du gel. Plus le gel est considéré comme élastique, plus la note est élevée. A contrario, un gel 15 non homogène et/ou fluide a une note faible.Tableau 3 Propriétés physico-chimiques des acides hyaluroniques réticulés 20 2908415 22 Produit Aspect de G' Aspect de G' % l'hydrogel (To) l'hydrogel (T60) perte (To) (T60) G' Produit 1 Clair, un 262 Clair, 224 14% peu élastique granuleux (Classe 5) (Classe 5) Produit A Très peu -- --- --visco- élastique (classe 2) Produit B Clair, -- Clair -- -- visqueux (Classe 3) (Classe 4) Produit 3 Très clair 296 Très clair 215 27% (Classe 5) (Classe 5) Produit C Très clair -- Très clair -- -- (Classe 5) (Classe 2) Produit 4 Clair, un 206 Clair, 199 3% peu élastique granuleux (Classe 5) (Classe 5) Produit D Très clair, -- Très peu -- -- viscovisco-élastique élastique (Classe 5) (Classe 2) I1. ressort de ce tableau que les acides hyaluroniques réticulés précipités à pH basique, bien qu'aisés à reformuler sous forme d'hydrogels, ne donnent pas des 5 hydrogels satisfaisants pour une application de produit de comblement de rides. On pense que ce phénomène est dû 2908415 23 à un développement insuffisant de liaisons ioniques lors de la précipitation. En outre, les acides hyaluroniques réticulés précipités à 5 un pH trop acide donnent des hydrogels présentant une bonne visco-élasticité (sous réserve de pouvoir les reformuler, ce qui n'est pas toujours possible), mais qui se dégradent nettement lors du passage à l'étuve et seront donc sensibles aux facteurs de dégradation 10 endogènes. Il apparaît en fait que seul un pH de précipitation allant de 5 à 7 permet de formuler facilement un hydrogel homogène présentant une visco-élasticité très 15 satisfaisante et qui n'est pas sensiblement réduite après un test de dégradation. Ceci confirme qu'à cette gamme de pH, le réseau macromoléculaire formé par les liaisons électrostatiques et covalentes est optimal pour une application comme matériau de comblement. REVENDICATIONS 1. Acide hyaluronique réticulé, susceptible d'être obtenu suivant un procédé comprenant : - l'activation d'un acide hyaluronique à l'aide d'un agent de couplage et d'un auxiliaire de couplage, pour obtenir un acide hyaluronique activé, - la réaction de l'acide hyaluronique activé avec un agent réticulant comprenant au moins 50% en poids d'oligo- ou polypeptide, dans un milieu réactionnel ajusté à un pH de 8 à 12, pour obtenir un acide hyaluronique réticulé, - l'ajustement du pH du milieu réactionnel à une valeur allant de 5 à 7, - la précipitation de l'acide hyaluronique réticulé dans un solvant organique pour obtenir des fibres d'acide hyaluronique réticulé, et - éventuellement, le séchage des fibres d'acide hyaluronique réticulé obtenues. 2. Acide hyaluronique selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de couplage est choisi parmi : le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), le 1-éthyl-3-(3-triméthylaminopropyl) carbodiimide (ETC) et le 1-cyclohexyl-3-(2-morphilinoéthyl) carbodiimide (CMC) ainsi que leurs sels et leurs mélanges. 3. Acide hyaluronique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'auxiliaire de couplage est choisi parmi : le N-hydroxy succinimide (NHS), le N-hydroxy benzotriazole (HOBt), le 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-2908415 25 1,2,3-benzotriazole (HOOBt), le 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HAt) et le N-hydroxysylfosuccinimide (sulfo NHS) et leurs mélanges. 5 4. Acide hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le rapport molaire de l'agent de couplage aux unités acide carboxylique de l'acide hyaluronique est compris entre 5 et 100%, bornes incluses. 10 5. Acide hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le rapport molaire de l'auxiliaire de couplage à l'agent de couplage est compris entre 1 :1 et 3 :1, bornes incluses. 6. Acide hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la réaction d'activation de l'acide hyaluronique par l'agent de couplage est effectuée à un pH allant de 3 à 6. 7. Acide hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le polypeptide est un homo- ou copolymère de lysine. 25 8. Acide hyaluronique selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'homopolymère de lysine est la dilysine. 9. Acide hyaluronique selon l'une quelconque des 30 revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'agent de couplage est mis en oeuvre en quantité stoechiométrique par rapport aux fonctions amines de l'agent réticulant. 15 20 2908415 26 10. Acide hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'agent de couplage est mis en œuvre en quantité stoechiométrique par rapport aux fonctions acides carboxyliques de l'acide 5 hyaluronique. 11. Acide hyaluronique selon la revendication 10, caractérisé en ce que la quantité d'agent réticulant mise en œuvre dans la deuxième étape est de moins de 30% , en 10 nombre de moles d'agent réticulant par rapport au nombre de moles de fonctions acides carboxyliques. 12. Acide hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la réaction 15 de réticulation est effectuée à un pH de 8 à 10. 13. Acide hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le pH de précipitation va de 5 à 7. 14. Acide hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le solvant organique est l'éthanol ou l'isopropanol. 25 15. Procédé de fabrication d'un acide hyaluronique réticulé, caractérisé en ce qu'il est tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 14. 16. Hydrogel caractérisé en ce qu'il renferme un 30 acide hyaluronique réticulé tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans un solvant aqueux. 20 2908415 27 17. Hydrogel stérilisé renfermant de l'acide hyaluronique réticulé par un agent réticulant renfermant au moins 50% en poids d'oligo- ou polypeptide, caractérisé en ce qu'il présente une variation de son 5 module élastique de moins de 30% après un étuvage à 93 C pendant 1 Heure. 18. Utilisation de l'acide hyaluronique réticulé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour la 10 fabrication d'implants injectables destinés à une utilisation en chirurgie esthétique et/ou réparatrice, pour la fabrication de produits de comblement, notamment des rides, ridules, cicatrices ou dépressions cutanées.