FR 2910897 A1 20080704 FR 0656061 A 20061229 La présente invention a pour objet de nouveaux composés pro-fluorescents activables par un phénomène physique, chimique ou biologique, notamment par hydrolyse enzymatique, et la mise en oeuvre de ces composés dans des procédés de qualification et/ou de quantification de ces phénomènes, par exemple une activité enzymatique. De nombreux composés ayant la propriété de générer un signal lumineux, par exemple de fluorescence sont utilisés en biologie cellulaire, que ce soit dans l'étude de réactions biochimiques, ou de phénomènes plus complexes tels que la mitose, la migration cellulaire ou l'apoptose. Des fluorophores sont ainsi utilisés pour marquer des molécules destinées à être utilisées comme agents réactifs dans de nombreux protocoles expérimentaux fondés sur la génération ou la destruction d'un composé fluorescent. Ces composés pro-fluorescents constituent un moyen efficace pour suivre une réaction impliquant un changement d'environnement tel qu'une variation de pH, de concentrations de certains ions, ou une activité enzymatique. Ainsi de tels composés sont utilisés dans des tests chromogéniques, fluorescents ou luminescents, afin, par exemple, de détecter l'activité de diverses enzymes. L'obtention d'un système sensible de détection dans un protocole d'essai fondé sur la fluorescence nécessite un signal de bruit de fond le plus petit possible, de telle sorte que le signal de fluorescence généré à la suite de la réaction à suivre soit aisément détectable. Dans de nombreuses situations, le bruit de fond réduit le seuil de détection et la sensibilité des essais. Il existe donc un besoin de disposer dans ces essais de composés générant peu ou pas de bruit de fond. Les composés pro-fluorescents activables par un phénomène physique, chimique ou biologique, notamment par voie enzymatique, peuvent être composés d'une structure labile activable par le phénomène considéré, par exemple un motif substrat hydrolysable par une enzyme, directement reliée à la molécule fluorescente ou fluorophore. L'activation de la structure labile, telle que l'hydrolyse de la liaison entre un motif substrat et un composé fluorescent, libère ce dernier conduisant à la génération d'un signal lumineux. Malheureusement, de tels composés présentent l'inconvénient de ne pouvoir mettre en oeuvre que des fluorophores présentant naturellement une fonction réactive apte à être couplée à la structure labile activable. Or il existe peu de fluorophores dont la structure contient une ou plusieurs fonctions dont la modification chimique réversible permet de masquer/réveler des propriétés spectrales, en particulier dans le proche infra-rouge. Ainsi, suivant les phénomènes à détecter, il existe peu de possibilité de mise en oeuvre de fluorophores possédant une fonction ûOH ou une fonction ûSH réactive. Par conséquent, seul un faible choix de fluorophores est disponible, conduisant à une gamme limitée de longueurs d'ondes d'excitation et d'émission susceptibles d'être utilisées. Pour surmonter en partie cette difficulté, il est possible de mettre en oeuvre 10 dans ces composés pro-fluorescents un bras réactif entre le composé fluorescent et le motif substrat. WO 2005/047245 propose l'utilisation de composés pro-fluorescents pour suivre des réactions enzymatiques activées par des estérases, des glucosidases ou une leucineaminopeptidase. 15 JONES et al. (Bioorganic Medicinal Chemistry, 2006, 14: 418) décrit un profluorophore comprenant un fluorophore relié à un bras réactif par une fonction ûNH2 réactive, le bras étant relié à un substrat reconnu par l'enzyme PSA (Prostate Specific Antigen). Toutefois, ces systèmes ne permettent pas d'élargir sensiblement la gamme des 20 structures de fluorophores utilisables. Ainsi, ces systèmes offrent peu de souplesse et de latitude en terme de longueurs d'onde d'excitation et d'émission exploitables, notamment en proche infrarouge. La présente invention a précisément pour objet de proposer de nouveaux 25 composés pro-fluorescents offrant une large gamme de longueurs d'onde d'excitation et d'émission, permettant ainsi de diversifier les domaines d'utilisation de tels composés. La présente invention a également pour objet de proposer de nouveaux composés pro-fluorescents convenant à la détection, à la quantification et au suivi de réaction enzymatique libérant une fonction amine libre, par exemple mettant en oeuvre une 30 hydrolase de type amidase, comme par exemple une protéase à cystéine ou une pénicilline amidase. Ce procédé peut être élargi à d'autres enzymes ou réactions chimique et également à des modifications de milieu (changement de pH ou décomplexation d'ions métalliques par exemple) libérant une amine. Les inventeurs ont ainsi observé, de manière inattendue, qu'il est possible de coupler une structure labile activable par un phénomène physique, chimique ou biologique, tel qu'un substrat hydrolysable par exemple par une protéase à cystéine, à une grande variété de fluorophores comprenant au moins une fonction réactive ûOH ou ûSH au moyen d'un bras réactif tel que détaillé par la suite. Ainsi, selon un premier objet, la présente invention a pour objet un composé pro-fluorescent de formule générale (I) : A-B-X-F (I) dans laquelle : - A figure une structure labile activable par un phénomène physique, chimique ou biologique, - B figure un bras réactif, activable par libération de A et apte à générer un radical portant un substituant nucléophile, éventuellement anionique, ledit radical étant apte à subir un réarrangement intramoléculaire conduisant à la libération de F, - X figure un atome de soufre, d'oxygène, un motif OC(0), OC(0)N, OC(0)O, OS(0) ou OP(0), - F figure un radical fluorophore compatible avec l'établissement d'une liaison éther, thioéther, ester, carbamate, carbonate, sulfate, sulfonate, sulfinate, posphate, phosphonate, phosphinate ou aminophosphonate avec B via le motif X et étant tel que le spectre d'émission et/ou d'excitation de F lié à B est décalé relativement au spectre d'émission et/ou d'excitation de F libre, B étant choisi parmi les radicaux de formules générales (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf), 25 et (IIg), suivantes : R' R2 \. A • * Y 4 * Y * Y * Y * Y et dans lesquelles : - Y représente O, NH ou S, - R' et R2, indépendamment l'un de l'autre, peuvent représenter H, un radical 5 alkyle en C1-C3, un radical alcoxy en C1-C3, - R3 et R4, indépendamment l'un de l'autre, peuvent représenter H, un radical alkyle en C1-05, un radical alcoxy en C1-05 ou un radical électro-attracteur ou électro-donneur tel qu'un groupe ester, nitrile, nitro, éther, amine, ou amide, - n est égal à 1 ou 2, - -* symbolise une liaison vers A, et - -^ symbolise une liaison vers X, ou un de ses dérivés. Au sens de l'invention, on entend par composé pro-fluorescent , une architecture moléculaire constituée : (A) d'une entité possédant un ou plusieurs motifs susceptibles d'interagir avec l'entité à détecter (par exemple une enzyme) et de subir une ou plusieurs transformations chimiques sous l'effet de ladite entité chimique ; (B) d'une molécule fluorescente (fluorophore) qui, lorsqu'elle est associée de façon covalente à l'entité (A) voit ses propriétés optiques significativement modifiées, notamment tel qu'un décalage de son spectre d'émission et/ou d'excitation. Le décalage peut s'effectuer en terme de variation d'intensité des maxima des spectres. Ainsi, le niveau de fluorescence du pro-fluorophore peut être quasiment nul ou très largement inférieur à celui du fluorophore libre. Le décalage peut s'effectuer sur la position des longueurs d'onde des maxima des spectres d'émission et/ou d'excitation. Ainsi, dans certains cas, un déplacement des longueurs d'ondes d'excitation et/ou d'émission de fluorescence vers les plus courtes longueurs d'ondes (effet ipsochrome) est observé. Dans d'autres cas, le déplacement peut s'effectuer vers des longueurs d'excitation et/ou d'émission plus grandes (effet bathochrome). Ainsi, l'interaction entre la sonde pro-fluorescente et l'entité à détecter se traduit par la libération du fluorophore et l'apparition d'un signal (après excitation à la longueur d'onde appropriée) facilement détectable. Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un composé profluorescent conforme à l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique et/ou de diagnostic. Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition 25 pharmaceutique et/ou de diagnostic comprenant au moins une quantité efficace d'au moins un composé pro-fluorescent conforme à l'invention. Au sens de l'invention, on entend par quantité efficace , la quantité d'un composé donné nécessaire à l'obtention d'un effet, par exemple biologique, pharmaceutique ou diagnostique, désiré. 30 Selon encore un autre objet, la présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou de quantification d'un phénomène physique, chimique ou biologique comprenant au moins les étapes de : a) mettre en contact, avec un milieu apte à la manifestation dudit phénomène, un composé pro-fluorescent conforme à l'invention dans des conditions appropriées à la libération de la structure labile activable A, et b) détecter la présence ou l'absence d'un signal de fluorescence de F. Un procédé conforme à l'invention peut être effectué in vitro, ex vivo ou in vivo. Un phénomène biologique peut être une activité enzymatique. Notamment l'activité enzymatique peut être celle d'une enzyme libérant une fonction amine libre, telle qu'une protéase à cystéine ou une pénicilline amidase. Selon encore un autre aspect, la présente invention a pour objet un kit de 10 diagnostic comprenant au moins un composé pro-fluorescent conforme à l'invention. DÉFINITIONS Au sens de la présente invention, on entend désigner par dérivé , des formes tautomères, des formes stéréoisomères, des formes polymorphes, des sels acceptables et 15 des solvates acceptables pharmaceutiquement ou en diagnostic. Au sens de la présente invention, on entend désigner par forme tautomère , l'un des isomères dont les structures diffèrent par la position d'un atome, en général d'hydrogène, et d'une ou de plusieurs liaisons multiples et qui sont capables de se transformer facilement et réversiblement l'un dans l'autre. 20 Au sens de la présente invention, on entend désigner par forme stéréoisomére des isomères de molécules de constitution identique, et qui ne diffèrent que par un ou des arrangement(s) différents de leurs atomes dans l'espace. Au sens de la présente invention, on entend désigner par sels des composés obtenus par réaction d'un composé de formule générale (I) avec une base ou un acide. 25 A titre d'exemple de base convenant à l'invention on peut mentionner l'hydroxyde de sodium, le méthoxyde de sodium, l'hydrure de sodium, le t-butoxyde de potassium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de magnésium, et analogues, et leurs mélanges, dans des solvants tels que le THF (tétrahydrofurane), le méthanol, le t-butanol, le dioxane, l'isopropanol, l'éthanol, leurs analogues, et leurs mélanges. 30 Les bases organiques comme la lysine, l'arginine, la diéthanolamine, la choline, la trométhamine, la guanidine et leurs dérivés peuvent également être utilisées. A titre d'exemple de sels d'addition d'acide convenant à l'invention, on peut citer ceux susceptibles d'être préparés par réaction d'un composé pro-fluorescent conforme à l'invention avec un acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide nitrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide p-toluènesulfonique, l'acide méthanesulfonique, l'acide acétique, l'acide trifluoroacétique (TFA), l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide salycilique, l'acide hydroxynapthoïque, l'acide ascorbique, l'acide palmitique, l'acide succinique, l'acide benzoïque, l'acide benzènesulfonique, l'acide tartrique, et analogues, et leurs mélanges, dans les solvants tels que l'acétate d'éthyle, l'éther, des solvants alcooliques, l'acétone, le THF, le dioxane, leurs analogues et leurs mélanges. On entend désigner par forme polymorphe , des composés obtenus par cristallisation d'un composé conforme à l'invention dans différentes conditions, telles que par exemple l'utilisation de différents solvants, généralement utilisés pour la cristallisation. La cristallisation à différentes températures implique, par exemple, différents modes de refroidissement, par exemple des refroidissements très rapides à très lents impliquant des étapes de chauffage ou fusion de composés suivie par un refroidissement graduel ou rapide. La présence de formes polymorphes peut être déterminée au moyen d'analyses par spectroscopie RMN, par spectroscopie IR (infrarouge), par DSC (Differencial Scaning Calorimetry), par diffraction de rayons X ou d'autres techniques analogues. Au sens de la présente invention, on entend par "radical alkyle", un radical hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique, condensé ou non, saturé ou insaturé, de 1 à 5 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone et mieux encore de 2 à 3 atomes de carbone susceptible d'être substitué par des radicaux tels que définis ci-après. A titre d'exemple, sont inclus dans cette définition des radicaux tels que méthyle, éthyle, isopropyle, n-butyle, t-butyle, t-butylméthyle, n-propyle, pentyle. Au sens de la présente invention, on entend par "radical alkyle cyclique", un cycle alkylène de 3 à 5 atomes de carbone, tel que le cyclopropyle ou le cyclopentyle. Au sens de la présente invention, on entend par "radical alcoxy", un radical -OR dans lequel le reste alkyle R est un radical hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique, condensé ou non, saturé ou insaturé, tel que défini ci-dessus. On peut citer, à titre d'exemple, les groupes méthoxy, éthoxy, propoxy, butoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, n-pentoxy, isopentoxy, sec-pentoxy, t-pentoxy. Au sens de la présente invention, on entend par "radical acyle", un radical hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique, condensé ou non, saturé ou insaturé, comprenant une fonction terminale C=0 et ayant de 1 à 5 atomes de carbone, en particulier de 1 à 4 atomes de carbone et de préférence de 2 à 3 atomes de carbone par exemple, un radical formyle, un radical acétyle, un radical succinyle. La chaîne hydrocarbonée des radicaux précités peut être interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, pour former par exemple un radical hétéroalkyle comme un radical alkyléther, un radical alkylester ou un hétérocycle. A titre d'exemples de substituants susceptibles d'être utilisés pour substituer les radicaux précités, il peut être fait mention d'un radical hydroxyle, un motif oxo, un radical thio, un radical amino, un atome d'halogène, d'un radical alkyle, un radical carboxy, un radical acyle, un radical amido, un radical alcoxy, un radical alkyl- ou dialkyl-amino, un radical alkylthio, un radical halogénoalkyle tel que par exemple le perfluoroalkyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-silyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-siloxy, un radical aryle, tel que défini précédemment. Au sens de la présente invention, on entend par "atome d'halogène", un atome de F, Cl, Br ou I. Les atomes d'halogène avantageusement mis en oeuvre dans la présente invention sont le fluor et le chlore. Au sens de la présente invention, on entend par "radical halogénoalkyle", un radical alkyle tel que défini précédemment substitué par un plusieurs atomes d'halogène tel que défini précédemment, et notamment, à titre d'exemple non limitatif, le perfluorométhyle. BRAS REACTIF Un composé pro-fluorescent conforme à l'invention peut comprendre un bras réactif figuré par B de formules générales telles que définies précédemment. En particulier, le motif B-X peut être choisi parmi les radicaux de formules (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId), (IIIe), (IIIf), (IIIg) et (IIIh) suivantes : O-@ * N / * N H H (Illa) (IIIb) MeO . MeO O@ (IIIc) (Illd) 0-@ *-N H *-N H (Ille) (111f) *-N H (Illg) et (Illh) dans lesquelles, -* a la même signification que précédemment et -@ symbolise la liaison vers F et n est égal à 1 ou 2. En particulier, le motif B-X représente un radical de formule (IIIa), (IIIb) ou (IIIc) telle que définie ci-dessus. STRUCTURE LABILE A Dans la formule générale (I) des composés conformes à l'invention, A représente une structure labile activable par un phénomène chimique, physique, ou biologique. Par "phénomène physique", on entend désigner au sens de la présente invention, par exemple, une variation de température, une variation de pression. Par "phénomène chimique", on entend désigner au sens de la présente invention un phénomène faisant intervenir, par exemple, une variation de pH, une variation de la salinité, une variation du potentiel rédox, une apparition ou une disparition d'espèces chimiques, par exemple des ions tels que F, RS-, HS- ou S2-, et des ions métaux alcalino- terreux tels que Cal-'. Lorsque A représente une structure labile activable par un phénomène chimique, A peut avantageusement être, par exemple un ammonium, un amide, une amine, un ester, un organosilane, un thiol, un carbamate, ou un carbonate. Par "phénomène biologique", on entend désigner au sens de la présente invention un phénomène faisant intervenir l'activité d'une entité biologique, par exemple une activité enzymatique, à l'image par exemple d'une hydrolyse, d'un transfert d'un groupement amine, d'une isomérisation. Ainsi, lors de l'activation des composés selon l'invention par un phénomène biologique, les composés sont soumis à l'action d'une entité biologique. A titre d'illustration d'une entité biologique susceptible d'activer les composés selon l'invention, on peut mentionner, de manière non limitative, les enzymes, les ribozymes, les abzymes. A titre d'exemple d'enzymes susceptibles d'activer les composés conformes à l'invention, il peut être fait mention des transférases, telles que les aminotransférases, les hydrolases telles que les estérases ou les phosphatases (phosphatase alcaline par exemple), les glucosidases, les protéases (trypsine, métalloprotéinases ou caspases par exemple), les isomérases. Selon un mode de réalisation, A peut figurer une structure labile par action d'une enzyme, et notamment par action d'une hydrolase, par exemplede type amidase. Selon un mode de réalisation, A peut figurer un motif substrat par une hydrolase de type protéase ou pénicilline amidase. Avantageusement, A peut représenter un substrat peptidique ou pseudopeptidique de longueur suffisante pour permettre sa reconnaissance et son hydrolyse par une enzyme, et notamment une protéase. A titre d'exemple de protéases susceptibles de convenir à la mise en oeuvre de la présente invention, il peut être fait mention, non limitativement, des caspases telles que la caspase-3, de l'acylaminoacyl peptidase, de l'aminopeptidase M, de la pénicilline amidase ou pénicillinase G acylase, de la thermolysine, des cathepsines B, G, L, des métalloprotéinases, de l'élastase, de la subtilisine, de l'activateur du plasminogène, de l'urokinase. Selon un mode de réalisation, lorsque A est un substrat peptidique, il peut comprendre au moins deux résidus acides aminés, en particulier au moins quatre, en particulier au mois six et plus particulièrement au moins huit résidus acides aminés. A peut comprendre de 2 à 10 acides aminés, en particulier de 3 à 8 acides aminés et plus particulièrement A peut comprendre 4 acides aminés. Les acides aminés entrant dans la séquence peptidique du motif substrat A 10 peuvent être des acides aminés de configuration L ou D. Un motif substrat peptidique A convenant à l'invention peut comprendre optionnellement un ou plusieurs acides aminés naturels, modifiés ou non, ou synthétiques. En particulier, les acides aminés peuvent être des acides aminés naturels modifiés. A titre d'exemple de modifications convenant à l'invention, on peut mentionner 15 l'addition d'un ou plusieurs substituants sur la chaîne latérale ou sur une fonction amine ou carboxylique non engagée dans une liaison peptidique. La ou les modification(s) apportées à un acide aminé naturel présent dans le motif substrat A ou l'introduction d'un acide aminé synthétique sont opérées de manière à ne pas affecter substantiellement l'hydrolyse du motif substrat A par l'enzyme à détecter. 20 Les substituants convenant à la mise en oeuvre de l'invention peuvent être notamment un radical de type R-C(0)- ou R-W-C(0)-, avec W=0 ou NH, et R pouvant être un radical alkyle linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé en C1 à C5, un radical acyle, un radical cyclique en C3 à C10, saturé ou insaturé, en particulier un radical aryle. Un substituant peut être un phényle ou une fonction hydroxyle. En particulier, un substituant 25 convenant à l'invention peut être un radical acétyle. Selon un mode de réalisation, la protéase peut être une protéase à cystéine aspartyle spécifique (caspase). Plus particulièrement, la protéase à cystéine peut être la caspase-3. Selon un mode de réalisation A peut représenter un tétrapeptide choisi parmi 30 WEHD (SEQ ID NO: 1), YVAD (SEQ ID NO:2), LEHD (SEQ ID NO:3), DETD (SEQ ID NO: 4), DEVD (SEQ ID NO: 5), DEHD (SEQ ID NO: 6), VEHD (SEQ ID NO: 7), LETD (SEQ ID NO: 8), LEHD (SEQ ID NO: 9), SHVD (SEQ ID NO: 10), DELD (SEQ ID NO: 11), DGPD (SEQ ID NO: 12), DEPD (SEQ ID NO: 13), DGTD (SEQ ID NO: 14), DLND (SEQ ID NO: 15), DEED (SEQ ID NO: 16), DSLD (SEQ ID NO: 17), DVPD (SEQ ID NO: 18), DEAD (SEQ ID NO: 19), DSYD (SEQ ID NO: 20), ELPD (SEQ ID NO: 21), VEID (SEQ ID NO: 26) ou IETD (SEQ ID NO: 24). En particulier, A peut être un tétrapeptide, notamment DEVD (SEQ ID NO 5), modifié par addition d'un radical acétyle (Ac) à l'extrémité N-terminale. Selon un mode de réalisation, A peut figurer un motif reconnu par une hydrolase de type pénicilline amidase. Selon une autre variante de réalisation, A peut figurer une structure labile par action d'une hydrolase de type estérase, telle qu'une carboxyestérase, une phosphatase ou une lipase. Dans ce cas, A peut représenter un motif comprenant un radical issu d'un acide carboxylique, notamment d'un acide gras reconnu par une enzyme de type estérase ou glucosidase ou un radical phosphate reconnu par une enzyme de type phosphatase. Un radical phosphate convenant à l'invention peut être de formule suivante : O Pù0 M+ O M+ dans laquelle M+ représente un cation tel un métal alcalin, comme Na+ ou K+, un ammonium, ou un cation ammonium quaternaire N(R)4+ dans lequel chaque R peut être un alkyle en C1-C2, un aralkyle comme un benzyle, ou former une partie d'un hétérocycle, comme un pyridinium. De telles structures sont avantageusement hydrolysées par une phosphatase alcaline. Selon une variante de réalisation, A peut figurer une structure labile par action d'une enzyme de type glucosidase. Dans ce cas, A peut comprendre un radical issu d'un sucre. A titre d'exemple de sucre susceptible de convenir à la mise en oeuvre de l'invention, on peut mentionner l'a-D- ou le (3-D-galactoside, l'a-D- ou le (3-D-glucoside, l'a-D- ou le (3-D-mannoside et l'a-D ou le (3-D-fructofuranoside. Selon un autre mode de réalisation A peut figurer une structure labile par action d'une aminotransférase, telle que par exemple, et de manière non limitatif, une alanine aminotransférase ou une aspartate aminotransférase. FLUOROPHORE Un fluorophore convenant à l'invention est tel que le spectre d'émission et/ou d'excitation du fluorophore lié à B est décalé par rapport au spectre d'émission et/ou d'excitation du fluorophore libre. Le décalage peut s'opérer en terme de variation d'intensité des maxima des 10 spectres, ou par un déplacement des longueurs d'onde des maxima vers des longueurs d'onde plus courtes ou plus grandes. En particulier, un fluorophore convenant à l'invention est tel que le signal de fluorescence de ce fluorophore lié à B est sensiblement diminué, voire nulle ou proche de zéro, par rapport au signal de fluorescence de F libre. 15 Un fluorophore F convenant à l'invention comprend dans sa structure au moins une fonction réactive apte à être engagée dans une liaison de type thioéther, éther, ester carbamate, carbonate, sulfate, sulfonate, sulfinate, phosphate, phosphonate, phosphinate, aminophosphonate, avec B, et pour laquelle S, O, OC(0), OC(0)N, OC(0)O, OS(0) ou OP(0) est figuré par X en formule générale (I). 20 A titre d'exemple de fluorophore convenant à l'invention, on peut mentionner les fluorophores choisis parmi , les hydroxynaphtalènes, les hydroxypyrènes, l'acridine et ses dérivés tels que les hydroxyacridines, la 9-méthylacridine, la 7-hydroxy-9H(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one) (DDAO), et la 7-hydroxy-9H-(9,9-diméthylacridin-2-one) (DAO), la coumarine et ses dérivés tel que la 7-hydroxycoumarine, les 25 hydroxystilbènes, le furane, l'oxazole, l'oxadiazole, le nitrobenzoxadiazole et ses dérivés tels que les hydroxynitrobenzoxadiazoles, l'indole et ses dérivés, les benzoindoles, le benzopyrane et ses dérivés (chromène et dérivés), le benzothiazole et ses dérivés, la phénoxazine et ses dérivés, les benzophénoxazines (crésyl violet, Nile red, Nile blue, ...), la fluorescéine et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés tels que la tétraméthylrhodamine, 30 la tétraéthylrhodamine, les rhodols et leurs dérivés, l'éosine et ses dérivés, l'érythrosine et ses dérivés tels que les hydroxyérythrosines, la résorufine et ses dérivés tels que les hydroxyrésorufines, la quinoléine et ses dérivés tels que la 6-hydroxyquinoléine et la 6-aminoquinoléine, les hydroxyaryl 4-(3H)-quinazolinones, les cyanines fluorescentes et dérivés telles que les hydroxycyanines, et plus généralement tous les fluorophores à chaîne polyméthine (i.e., chaîne polyènique). Selon un mode de réalisation, F peut représenter, en particulier, un radical issu d'un fluorophore choisi parmi la DDAO, la DAO, la 7-hydroxycoumarine et la résorufine. Selon un mode de réalisation, un composé pro-fluorescent de l'invention apte à être activé par une protéase à cystéine, et notamment une caspase peut en particulier être tel que : - A peut représenter Ac-DEVD, dans lequel Ac est un radical acétyle, - B-X peut représenter un motif de formule (IIIa) ou (IIIb) : O Où@ / \ O * H * N / H (IIIa) (IIIb) - F peut être choisi parmi un radical issu de la 7-hydroxycoumarine, un radical issu de la DAO et un radical issu de la DDAO. Selon un mode de réalisation, un composé pro-fluorescent convenant à 15 l'invention peut être choisi parmi les formules (IVa) et (IVb) suivantes : O OH AcH N N H OH o 'OH (IVa) OH N O AcH N (IVb) 20 Selon un mode de réalisation, un composé pro-fluorescent de l'invention apte à être activé par une pénicilline amidase peut être telle que :15 - A peut représenter : - B-X peut représenter un radical de formule (IIIa) ou (IIId) : MeO \ /0ù@ MeO *N H (IIIa) (IIId) - F peut être choisi parmi un radical issu de la 7-hydroxycoumarine, un radical issu de la DAO et un radical issu de la DDAO. Selon un mode de réalisation, un composé pro-fluorescent convenant à l'invention peut être de formule (V) suivante : (V) CIBLAGE 15 Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut comprendre, en outre au niveau de la structure labile activable, une structure de ciblage D. Ainsi, un composé peut être de formule générale (VI) suivante : D-A-B-F 10 dans laquelle : - D figure une structure de ciblage, et - A, B et F sont tels que définis précédemment. La structure de ciblage D, ou ligand, est un élément susceptible de reconnaître ou de lier préférentiellement des cellules exprimant un élément cellulaireparticulier, tel que par exemple, et de manière non limitative, un récepteur, une enzyme, une protéine de structure, une glycoprotéine, un sucre, un lipide ou un phospholipide. Avantageusement l'élément cellulaire est un élément membranaire, de préférence possédant une partie de sa structure disposée dans le milieu extracellulaire. Selon un mode de réalisation, cet élément cellulaire peut être spécifique d'un état physiologique ou pathologique de la cellule ou du tissu environnant la cellule ou de l'organe comprenant la cellule. Ainsi, et de manière non limitative, l'élément cellulaire peut être spécifique de l'état de croissance de la cellule, de sa position dans le cycle cellulaire, d'une réponse inflammatoire de la cellule ou du tissu, d'une apoptose, d'une dégénérescence tissulaire, .... L'expression "reconnaître ou se lier préférentiellement" vise à indiquer que la structure de ciblage D possède une affinité particulière pour les cellules ou tissus considérés, même si une liaison non spécifique ou moins importante avec d'autres cellules ou d'autres tissus ne peut être totalement exclue in vivo ou ex vivo. La liaison préférentielle permet toutefois un ciblage des composés conformes à l'invention vers les sites d'intérêt, réduisant la dissémination du composé selon l'invention vers les tissus et/ou les cellules de moindres intérêts. Ainsi, la structure de ciblage D peut être choisie, par exemple et de manière non limitative, parmi une lectine, un anticorps ou un fragment de celui-ci reconnaissant spécifiquement un élément présent à la surface des cellules tel que par exemple une protéine, un sucre, un lipide ; un ligand d'un récepteur cellulaire telle que par exemple un peptide comme le neuropeptide Y, une catécholamine telle que l'adrénaline, un antagoniste comme par exemple un antagoniste de récepteurs 13-adrénergiques, tel que le propranolol, un facteur de croissance, un acide aminé ou un dérivé de celui-ci tel que par exemple le glutamate, une cytokine tel que par exemple une interleukine, un interféron ou un TNF ou le HIF (hypoxy-inducing factor), une hormone, une vitamine, une apolipoprotéine, le cholestérol ; un ligand susceptible d'interagir avec un lipide ou phospholipide membranaire 16 tel que par exemple une annexine ; un ligand susceptible d'interagir avec un sucre présent à la surface des cellules. On entend désigner par "récepteur cellulaire" tout élément cellulaire capable de transduction d'une information de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule. Il relève des connaissances de l'homme de l'art de déterminer la nature de la structure D appropriée au ciblage désiré, le cas échéant en faisant appel à des méthodes d'essais habituellement pratiquées dans le domaine. Selon un mode de réalisation, la structure de ciblage D peut être un ligand, par exemple un polypeptide, capable de se lier à la surface de cellules présentes de façon caractéristique ou spécifique dans un tissu particulier ou présentant une pathologie. La structure de ciblage D peut également se lier à la surface de cellules tumorales ou présentes dans un tissu tumoral, ou à la surface de cellules présentes dans un tissu inflammatoire. La structure de ciblage D peut, par exemple, se lier à la surface des cellules engagées dans un processus d'apoptose, qui exposent à leur surface des lipides chargés négativement, comme par exemple la phosphatidylsérine. Selon une variante de réalisation la structure de ciblage D peut être une protéine ou un fragment de protéine tel qu'un peptide ou un polypeptide ou un pseudopeptide. Parmi les protéines susceptibles de se lier aux membranes exposant des lipides chargés négativement, on peut mentionner, de manière non limitative, la famille des annexines, les familles des protéines comportant un domaine Cl ou C2, telles que les facteurs V et VIII de la coagulation sanguine, les familles des protéines comportant un domaine PH ou un domaine FYVE, ou encore des protéines comportant un domaine identique ou homologue du domaine 5 des 132-glycoprotéines-I ((3GP-I). Ces protéines ou des domaines issus de leurs séquences peuvent être utilisés comme structure de ciblage dans des composés conformes à l'invention. Selon un autre mode de réalisation, à une structure de ciblage D peuvent être fixés un ou plusieurs composés de formule générale (I), afin d'augmenter, notamment, l'intensité du signal émis. Ainsi, il peut être fixé par élément de ciblage D, au moins une, notamment au moins deux, en particulier au moins 3, en particulier au moins 4, et plus particulièrement au moins 5 composés de formule A-B-F. PROCÉDÉ DE DÉTECTION Comme précisé précédemment, la présente invention a également pour objet une utilisation, à des fins de détection et/ou de quantification d'un phénomène physique, chimique ou biologique, d'au moins un composé pro-fluorescent conforme à l'invention, dans lequel A figure une structure labile activable. Un procédé conforme à l'invention comprend au moins les étapes de mise en contact d'au moins une quantité efficace d'au moins un composé pro-fluorescent conforme à l'invention, et notamment de formule générale (I), avec un milieu apte à la manifestation d'un phénomène physique, chimique ou biologique dans des conditions appropriées à la libération de la structure labile activable A, et la détection de la présence ou de l'absence d'un signal de fluorescence de F. En détectant la présence ou l'absence du signal fluorescent, il est possible de mettre en évidence la présence ou l'absence de la manifestation du phénomène physique, chimique ou biologique. En mesurant l'intensité d'un tel signal, il est également possible de déterminer l'ampleur du phénomène. Un procédé selon l'invention peut être effectué in vitro, ex vivo ou in vivo. En particulier, la présente invention vise à proposer également un procédé de détection et/ou de quantification d'un phénomène biologique figuré par une entité biologique. Une entité biologique peut être une enzyme. Ainsi A peut figurer un motif hydrolysable par une enzyme, par exemple une hydrolase telle qu'une protéase à cystéine ou une pénicilline amidase. Notamment une protéase à cystéine peut être une caspase. Ainsi un milieu apte à la manifestation d'un phénomène biologique peut être un milieu présumé comprendre une enzyme. Un composé pro-fluorescent selon l'invention mis en oeuvre dans cette utilisation peut comprendre un motif B-X choisi parmi les formules (IIIa), (IIIb) ou (IIIc). Dans cette mise en oeuvre, la structure A labile figure un substrat reconnu par ladite enzyme. L'action de l'enzyme sur le substrat A, dans des conditions propices à la manifestation de la réactivité de l'enzyme, conduit à l'émission d'un signal fluorescent. En détectant la présence ou l'absence d'un signal fluorescent, il est possible de mettre en évidence la présence ou l'absence de l'enzyme. En mesurant l'intensité du signal de fluorescence, il est également possible de mettre en évidence la concentration et/ou les caractéristiques cinétiques de l'enzyme ainsi détectée. Un milieu convenant au procédé de l'invention peut être un milieu biologique, 10 synthétique ou naturel, à l'image d'un échantillon de fluide biologique. Un procédé conforme à l'invention peut être, en particulier, mis en oeuvre dans un échantillon biologique comprenant des cellules. Un tel échantillon peut être obtenu par culture de cellules primaires ou de cellules en lignée. Les cellules primaires peuvent être obtenues par biopsie. 15 La détection d'un signal de fluorescence de F peut être indicative d'une réponse biologique, notamment d'une réponse cellulaire, par exemple une apoptose. Selon un mode de réalisation, un milieu approprié à la mise en oeuvre de l'invention peut être représenté par des cellules neuronales. Il peut être avantageux d'utiliser, in vitro, ou le cas échéant ex vivo, 20 conjointement à un composé conforme à l'invention, au moins un amplificateur de lumière susceptible d'augmenter le signal fluorescent résultant de la dégradation dudit composé conforme à l'invention. De tels composés sont déjà connus. A titre d'exemple de ces amplificateurs, il peut être fait mention de la 25 fluorescéine, de l'albumine bovine, de l'albumine humaine, et des sels de polymère d'onium quaternaires tels que le chlorure de polyvinylbenzyltriméthylammonium (TMQ), le chlorure de polyvinylbenzyltributylammonium (TBQ) (Sapphire-IITM), le chlorure de polyvinylbenzyldiméthylammonium (BDMQ) (Sapphire-ITM), le chlorure de polyvinylbenzyltributylphosphonium, le chlorure de polyvinylbenzyltributylsulfonium, le 30 chlorure de poly(benzyldiméthylvinylbenzyl)ammonium, un sel de sodium de la fluoresceine (Emerald TM), le poly(benzyltributyl)ammonium et le sel de sodium de fluoresceine (Emerald IITM) Lorsque le procédé conforme à l'invention est mis en oeuvre in vitro, la détection du signal de fluorescence peut se faire par tout appareil habituellement mis en oeuvre par l'homme de l'art dans ce domaine. Par exemple un échantillon mis en contact avec un composé selon l'invention peut, éventuellement après une période d'incubation, être soumis à une méthode analytique comprenant, ou non, une étape de séparation des éléments composant l'échantillon, par exemple par chromatographie (par exemple une chromatographie liquide haute performance, HPLC), et une étape d'analyse spectrale (par exemple par spectroscopie UV) des différentes fractions issues de l'étape de séparation. La détection et la mesure du signal spectroscopique spécifique d'un composé selon l'invention (par exemple la hauteur et la surface d'un pic de chromatographie) peuvent être corrélées à la présence, et/ou à l'intensité/quantité du phénomène à détecter, tel que par exemple la présence, la quantité, et/ou l'activité cinétique d'une enzyme. Selon un mode de réalisation de l'invention, un procédé ou une utilisation conforme à l'invention peuvent être mis en oeuvre in vivo avec un composé pro-fluorescent selon l'invention comprenant à titre de fluorophore F, un fluorophore dont le spectre d'émission se situe dans le proche infrarouge, par exemple entre 650 nm et 900 nm. Un procédé et une utilisation conformes à l'invention peuvent être mis en oeuvre in vivo. Un composé pro-fluorescent conforme à l'invention peut être préalablement administré à un être vivant, tel que par exemple un animal ou un être humain, puis la détection du signal de fluorescence peut être réalisée in vivo selon les moyens usuellement mis en oeuvre dans le domaine. Avantageusement, la mise en oeuvre in vivo d'une utilisation conforme à 25 l'invention permet d'établir des images des tissus ou organes dans lesquels l'activité d'une enzyme à détecter/quantifier est susceptible de se manifester. Selon un mode particulier de réalisation il est possible de construire une ou des images des tissus ou organes susceptibles d'exprimer une enzyme à détecter et/ou à quantifier. 30 Ainsi, selon un mode particulier de réalisation, un procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre dans des méthodes d'imagerie médicale. Selon un autre mode de réalisation, un procédé selon l'invention est un procédé de diagnostic in vitro in vivo comprenant la détection et/ou la quantification d'une enzyme au moyen d'un composé de formule générale (I). Le procédé conforme à l'invention peut être appliqué, par exemple et de manière non exhaustive, à des visées diagnostiques médicales, expérimentales, cliniques ou pré-cliniques chez des êtres humains ou chez des animaux tels que des animaux de laboratoires ou des animaux utilisés dans l'agriculture, tels que le rat, la souris, le cobaye, le primate non humain, le cochon d'inde, ou le cochon. Selon un mode de réalisation, l'enzyme susceptible d'être détectée et/ou quantifiée par un procédé selon l'invention peut être une hydrolase telle qu'une protéase, en particulier une protéase à cystéine, plus particulièrement une caspase et notamment, une caspase 3. Selon un autre mode de réalisation, l'enzyme à détecter et/ou quantifier peut être une pénicilline amidase. Dans le cadre de la mise en oeuvre in vivo, les composés conformes à l'invention peuvent être formulées afin d'être adaptés à une administration par voie orale, ou parentérale, notamment intraveineuse, intraartérielle, intracardiaque, intracérébroventriculaire, intrapéritonéale, intratumorale, ou pour une administration par voie pulmonaire, nasale, ophtalmique et éventuellement rectale, vaginale ou topique. Les composés conformes à l'invention peuvent être ainsi mis en oeuvre dans une formulation adaptée au procédé de détection à réaliser et à la voix d'administration choisie. Par exemple, les composés conformes à l'invention peuvent être préparés sous la forme d'un comprimé, d'une gélule ou d'une solution aqueuse concentrée ou non. Cette 25 solution aqueuse peut être avantageusement stérile. Selon un autre mode de réalisation, les composés conformes à l'invention peuvent être sous forme solide, par exemple en poudre, et être préparés en solution aqueuse, avantageusement stérile, juste avant leur administration. Ainsi, selon un de ses aspects la présente invention se rapporte également à 30 l'utilisation d'un composé conforme à l'invention, notamment de formule générale (I) pour la fabrication d'une composition pharmaceutique et/ou de diagnostic. Une composition de l'invention peut être destinée à la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vivo, notamment une méthode d'imagerie médicale. Ainsi selon un autre de ses aspects, la présente invention se rapporte également à une composition pharmaceutique comprenant au moins une quantité efficace d'au moins un composé conforme à la présente invention, notamment de formule générale (I). Avantageusement, la mise en oeuvre d'un composé selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique peut se faire sous la forme d'un dérivé, tel qu'un sel ou un ester pharmaceutiquement acceptable. Ainsi, la présente invention se rapporte également aux sels et esters des composés conformes à l'invention. A titre d'exemple d'ester d'un composé selon l'invention, on peut mentionner un succinate, un hémisuccinate, un malate, un tartrate, un glycolate d'un composé selon l'invention. A titre d'exemple de sel d'un composé selon l'invention, on peut mentionner un sulfate, un phosphate, un sel de sodium, un sel de calcium d'un composé selon l'invention. L'ajustement des quantités efficaces adéquates du ou des composés conformes à l'invention, à mettre en oeuvre dans un procédé ou une utilisation selon l'invention, dépend de la protéase à cystéine, à détecter/quantifier et de l'environnement dans lequel le procédé selon l'invention est effectué (in vitro, ex vivo ou in vivo). In vivo, les quantités efficaces peuvent, également, être ajustées selon la taille, le poids de l'individu à qui le procédé selon l'invention est appliqué, ou chez qui l'utilisation selon l'invention est mise en oeuvre, ainsi que selon l'organe ou le tissu ciblé. Les ajustements peuvent être réalisés par toutes méthodes usuellement pratiquées par l'homme de l'art. Selon un autre mode particulier de réalisation, la présente invention se rapporte à un kit pour la détection et/ou la quantification d'une protéase à cystéine, ledit kit comprenant au moins un composé pro-fluorescent conforme à la présente invention. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention se rapporte à un kit pour la détection et/ou la quantification d'une protéase à cystéine, comprenant un composé conforme à la présente invention, et notamment de formule générale (I). Selon une mise en oeuvre particulière, le kit conforme à la présente invention peut également comprendre au moins un amplificateur de lumière tel que défini précédemment. La présente invention sera mieux comprise d'après les exemples suivants. Ces exemples sont présentés à titre d'illustrations de l'invention et ne doivent pas être interprétés comme pouvant limiter la portée de la présente invention. LEGENDES DES FIGURES Figure 1 : illustre le spectre d'émission du modèle coumarine 29 Figure 2 : illustre la cinétique de clivage du modèle coumarine 29 Figure 3 : illustre le spectre d'émission du modèle DAO 31 Figure 4 : illustre la cinétique de clivage du modèle DAO 31 Figure 5 : illustre le spectre d'émission de la sonde Ac-DEVD(OH)-PABA-10 Coumarine 23 Figure 6 : illustre la cinétique de clivage de la sonde Ac-DEVD(OH)-PABACoumarine 23 Figure 7 : évolution temporelle de l'émission de fluorescence de la sonde Ac-DEVD(OH)-PABA-Coumarine 23 15 Figure 8 : illustre le spectre d'émission de la sonde Ac-DEVD(O-)-PABADAO 25 Figure 9 : illustre le clivage de la sonde Ac-DEVD(O-)-PABA-DAO 25 Schéma 1 : synthèse des composés modèles 29, 30 et 31 Schéma 2 : synthèse du composé modèle 32, et hydrolyse par une pénicilline 20 amidase Schéma 3 : synthèse du dipeptide Ac-DE-OH 5 Schéma 4 : synthèse du dipeptide H-VD-Bn 6 Schéma 5 : synthèse du tétrapeptide Ac-DEVD-OH 3 Schéma 6 : introduction du linker PABA 4 sur le tétrapeptide Ac-DEVD-OH 3 25 Schéma 7 : synthèse de la sonde Ac-DEVD(OH)-PABA-Coumarine 23 Schéma 8 : synthèse de la sonde Ac-DEVD(O-)-PABA-DAO 25 EXEMPLES SECTION EXPERIMENTALE 30 I Séparations par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP) Différents systèmes de chromatographie ont été utilisés pour les expériences analytiques et les étapes de purification : - système A : une CLHP en phase inverse (C18, Hypersil GOLD, 5 m, 4,6 x 150) avec CH3CN et de l'acide trifluoroacétique à 0,1 % (TFA 0,1 % pH 2,0) en tant qu'éluants (100 % TFA (5 min), puis un gradient linéaire de 0 à 100 % (50 min) de CH3CN] selon un débit de 1,0 ml/min. Une double détection UV-Visible a été effectuée à 210 et 254 nm. - système B : une CLHP en phase inverse (C18, Hypersil GOLD, 5 m, 4,6 x 150) avec CH3CN et de l'acide trifluoroacétique à 0,1 % (TFA 0,1 % pH 2,0) en tant qu'éluants (80 % TFA (5 min), puis un gradient linéaire de 20 à 100 % (40 min) de CH3CN) à un débit de 1,0 ml/min. Une double détection UV-Visible a été effectuée à 210 et 254 nm. - système C : une CLHP en phase inverse (C18, Hypersil GOLD, 5 m, 4,6 x 150) avec CH3CN et un tampon acétate de triéthylammonium (TEAA 100 mM, pH 7,0) en tant qu'éluants (90 % TEAA (2 min), puis un gradient linéaire de 10 à 90 % (40 min) de CH3CN) à un débit de 1,0 ml/min. Une double détection UV-Visible a été effectuée à 254 et 285 nm. II Procédures générales 11.1. Procédure générale pour l'introduction des groupes TMSE L'acide aminé est dissous dans un mélange de DMF anhydre et de CH3CN 20 (1,4 M). De la pyridine fraîchement distillée (2 eq.) et du 2-triméthylsilyl(éthanol) (1,2 eq.) ont été ajoutés, puis le mélange a été refroidi à 0 C et du N,N'-dicyclohéxylcarbodiimide (DCC 1,1 eq.) a été ajouté. Après agitation pendant 1 heure à température ambiante, la solution a été filtrée sur de la Celite, puis lavée avec du AcOEt. Les filtrats ont été concentrés sous pression réduite, l'huile obtenue a été dissoute dans du AcOEt, puis lavés 25 avec de l'acide citrique en solution aqueuse (10 %), de l'eau déminéralisée, une solution aqueuse saturée de NaHCO3, puis une nouvelle fois avec de l'eau déminéralisée. La phase organique a été séchée sur du Na2SO4, puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu a été purifié par chromatographie sur un gel de silice (CH2C12/AcOEt), conduisant à l'obtention de l'acide aminé protégé sous forme d'une huile incolore. 10 15 30 I1.2. Procédure générale pour l'élimination du groupement Boc La déprotection du groupement Boc a été effectuée avec du TFA (20 eq.) dans du CH2C12 (0,8 M) ; la réaction a été suivie par chromatographie sur couche mince (CH2C12/AcOEt). A la fin de la réaction, le mélange a été refroidi à 0 C et neutralisé avec une solution saturée de NaHCO3. La phase aqueuse a été extraite avec du CH2C12 puis les phases organiques combinées ont été lavées avec de l'eau déminéralisée, et séchées sur du Na2SO4, filtrées et concentrées sous pression réduite. 1,1 eq. de TFA a été ajouté aux composés 6 et 13 afin d'éviter leur dégradation. 11 .3. Procédure générale pour l'élimination des esters benzyliques Les esters benzyliques ont été dissous dans de l'acétate d'éthyle (0,06 M). Le milieu a été refroidi à 0 C, puis du palladium sur charbon (10 %, Pd/C) a été ajouté et le mélange a été maintenu sous agitation à température ambiante et sous atmosphère d'hydrogène pendant une nuit. La solution a été filtrée sur de la Celite et les filtrats ont été concentrés sous vide, conduisant à l'obtention des acides libres correspondants. 11 .4. Procédure générale pour le couplage des acides aminés Les acides et les amines ont été dissous dans de l'acétonitrile anhydre (0,1 M). Le réactif de couplage hexafluorophosphate de O-benzotriazol-l-yloxytris (diméthylamino)phosphonium (BOP, 1 eq.) et de la N,N-diisopropyléthylamine (DIEA, 3 eq.) ont été ajoutés et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 2 heures. Ensuite, le mélange a été concentré sous pression réduite, le résidu huileux obtenu a été dissous dans du CH2C12, puis lavé avec de l'acide citrique en solution aqueuse (10 %), de l'eau déminéralisée, une phase aqueuse saturée de NaHCO3, puis d'eau déminéralisée. La phase organique a été séchée sur du Na2SO4, puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu a été purifié par chromatographie sur gel de silice (CH2C12/AcOEt). 115. Procédure générale pour l'élimination des groupes TMSE Les composés 23 et 25 ont été obtenues à partir de 22 et 24 après traitement avec un excès de fluorure de tétraméthylammonium (TMAF) dans du DMF anhydre. La réaction a été suivie par CLHP analytique en phase inverse. Une fois l'élimination complète des groupes TMSE, les composés ont été purifiées par CLHP semi-préparative en phase inverse en utilisant une solution aqueuse de TFA (0,1 %) et de l'acétonitrile comme éluants. 11.6. Synthèse des composés 29, 30 et 31 Le N-(4-hydroxyméthyl)phényl)-2-phénylacétamide 27 (443 mg, 1,84 mmol) a été dissous dans de l'acétone anhydre (23 ml) et refroidi à 0 C. La triéthylamine (770 l, 5,5 mmol, 3 eq.) et le chlorure de méthane sulfonyle (425 l, 5,5 mmol, 3 eq.) ont été ajoutés et le milieu réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant la nuit. Ensuite, du CH2C12 (20 ml) a été ajouté et la solution a été versée sur une solution aqueuse refroidie (0 C) d'HC1 (2N). La phase aqueuse a été extraite avec du CH2C12 (30 ml), et les phases organiques réunies ont été lavées avec de l'eau déminéralisée (30 ml), séchées sur Na2SO4, filtrées puis concentrées sous pression réduite, conduisant à l'obtention du méthane sulfonate 4-(2-phénylacétamido)benzyle 28 sous la forme d'un solide blanc. Le résidu obtenu, relativement instable, a été utilisé directement dans l'étape suivante sans purification supplémentaire. 'H RMN (300 MHz, CDCI3): 8 3.62 (s, 3H, CH3), 3.69 (s, 2H, ArCH2), 4.49 (s, 2H, CH2OH), 7.22-7.40 (m, 9H, ArH); 13C RMN (75.4 MHz, CDCI3): 8 44.7, 46.2, 52.8, 120.5, 127.8, 129.4, 129.6, 129.7, 133.8, 134.6, 138.0. Les différents fluorophores ont été dissous dans du CH2C12 anhydre (pour la 7-hydroxycoumarine 18) ou du DMF anhydre (pour la DDAO 20 et la DAO 21, 1,2 eq., [c] = 0,1 M). K2CO3 (2 eq.) a été ajouté et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation pendant 15 minutes. Ensuite, le composé 28 (1 eq.) a été ajouté et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant la nuit. La formation du produit a été suivie par CLHP en phase inverse. En fin de réaction, la solution a été concentrée sous pression réduite, et du CH2C12 (10 ml) a été ajouté et la solution a été lavée avec de l'eau déminéralisée. La phase organique a été séchée sur du Na2SO4, puis filtrée et évaporée sous pression réduite. Le résidu obtenu a été purifié par CLHP semipréparative en phase inverse (TFA (0,1 %) et CH3CN comme éluants), conduisant à l'obtention des composés 29, 30 et 31. IL 7. Synthèse du Ac-DEVD(TMSE)-PABA-OH 2 Ac-DEVD(TMSE)-OH 3 (598 mg, 0,73 mmol) a été dissous dans du DMF anhydre (7 ml) et refroidi à -4 C. Ensuite, l'alcool para-aminobenzylique (PABA) (90 mg, 0,73 mmol, 1 eq.) et l'hydrochlorure de N-éthyl-N'-(3- diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDCI) (154 mg, 0,80 mmol, 1, 1 eq.) ont été ajoutés et le mélange a été maintenu sous agitation pendant 1 heure à température ambiante. Le solvant a été éliminé sous vide, et le solide obtenu a été dissous dans du CH2C12 (40 ml) puis lavé avec de l'acide citrique en solution aqueuse (10 %) (15 ml) et de l'eau déminéralisée (20 ml). La phase organique a été séchée sur du Na2SO4 puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu a été purifié par chromatographie sur un gel de silice (CH2Cl2/AcOEt 3/7), conduisant à l'obtention de Ac-DEVD(TMSE)-PABAOH 2 sous forme d'un mélange (85/15) de deux diastéréoisomères qui ont été ensuite séparés par CLHP semi-préparative en phase inverse (solides jaune, 580 mg, 86 %). I1.8. Synthèse du Ac-DEVD(TMSE)-PABA-coumarine 22 Ac-DEVD-PABA(TMSE)-OH 2 (152 mg, 0,16 mmol) a été dissous dans de l'acétone anhydre (2 ml) et refroidi à 0 C. Ensuite, le triéthylamine (67 L, 0,48 mmol, 3 eq.) et le chlorure de méthane sulfonyle (37 L, 0,48 mmol, 3 eq.) ont été ajoutés et le mélange a été maintenu sous agitation pendant la nuit. Le milieu réactionnel a été dilué avec du CH2C12 (5 ml) et versé sur une solution aqueuse refroidie de HC1 (2 N). La phase aqueuse a été extraite avec du CH2C12 (10 ml). Les phases organiques combinées ont été lavées avec de l'eau déminéralisée (8 ml), puis séchées sur du Na2SO4 puis filtrées et évaporées sous pression réduite, conduisant à l'obtention de Ac-DEVD(TMSE)-PABAOMs sous forme d'un solide jaune. Le résidu obtenu a été utilisé sans purification supplémentaire dans l'étape suivante. La 7-hydroxycoumarine 18 (29 mg, 0,18 mmol, 1,1 eq.) a été dissoute dans du CH2C12 anhydre (2 ml). Du K2CO3 (44 mg, 0,32 mmol, 2 eq.) a été ajouté et le mélange a été maintenu sous agitation pendant 20 minutes, la solution devient alors jaune. Puis le Ac-DEVD(TMSE)-PABA-OMs, en solution dans du CH2C12 anhydre (2 ml) a été ajouté et le mélange a été maintenu sous agitation sur la nuit à température ambiante. La formation du produit a été suivie par CLHP en phase inverse. A la fin de la réaction, la solution a été diluée dans du CH2C12 (10 ml) et lavée avec de l'eau déminéralisée (10 ml). La phase organique a été séchée sur du Na2SO4 filtrée puis évaporée sous pression réduite. Le résidu a été purifié par CLHP semi-préparative en phase inverse (TFA (0,1 %) et CH3CN comme éluants), permettant la séparation des deux diastéréoisomères et conduisant à l'obtention de Ac-DEVD(TMSE)-PABA-coumarine 22 sous la forme d'un solide blanc (32 mg, 25 %). I1.9. Synthèse du Ac-DEVD(TMSE)-PABA-DAO 24 De la 7-hydroxy-9-H-(9,9-diméthylacridin-2-one) (DAO) 21 (10 mg, 0,042 mmol, 1, 2 eq.) a été dissous dans du DMF anhydre (800 id). Du K2CO3 (12 mg, 0,084 mmol, 2,4 eq.) a été ajouté et le mélange a été maintenu sous agitation pendant 20 minutes, la solution devient alors bleue. Ensuite, le Ac-DEVD(TMSE)-PABA-OMs (35 mg, 0,035 mmol, 1 eq.) a été ajouté et le mélange a été maintenu sous agitation sur la nuit à température ambiante. La formation du produit a été suivie par CLHP en phase inverse. A la fin de la réaction, la solution a été concentrée, du CH2C12 (15 ml) a étéajouté et la phase organique a été lavée avec de l'eau déminéralisée (7 ml), puis séchée sur du Na2SO4 puis filtrée et évaporée sous pression réduite. Le résidu obtenu a été purifié par CLHP semipréparative en phase inverse permettant la séparation des deux diastéréoisomères et conduisant à l'obtention de Ac-DEVD(TMSE)-PABA-DAO 24 sous la forme d'un solide orange (4 mg, 13 %). Exemple I : Synthèse de composés modèles 29, 30, 31 OR CI R. O O 070C1 o /0o 29 30 N 31 Rdt sur 2 28% 7% 14% étapes Le chlorure de phénylacétyle 26 a été mis en réaction avec l'alcool para-aminobenzylique 4 en présence de pyridine. Après purification sur gel de silice, le composé 27 est ainsi obtenu avec un rendement de 78 %. La fonction alcool du composé 27 est ensuite activée à l'aide de chlorure de mésyle et de triéthylamine. Les fluorophores 18, 20 et 21 ont ensuite été introduits, conduisant aux sondes 29-31 avec des rendements respectifs sur 2 étapes (activation et greffage) de 28, 7 et 14% (Schéma 1). Composé 29 'H RMN (300 MHz, CDC13): 8 3.66 (s, 2H, ArCH2), 4.96 (s, 2H, CH2OH), 6.15 (d, J = 9 Hz, 1H, ArHcoum), 6.74-6.81 (m, 2H, ArHcoum), 7.15-7.31 (m, 8H, ArH + ArHPABA + ArHcoum), 7.39 (d, J= 8 Hz, 2H, ArHPABA), 7.54 (d, J= 9 Hz, 1H, ArHcoum); 13C RMN (75.4 MHz, CDC13): 8 45.1, 70.4, 102.2, 113.5, 113.6, 120.3, 128.0, 128.7, 129.1, 129.6, 129.8, 1320, 134.7, 138.1, 143.8, 156.0, 161.6, 162.1, 169.6; Rf 0..05 (CH2C12/AcOEt 5/5); MS (ESI, mode positif): calc pour [C24H20NO4]+ 386.14, déterminée 386.33; CLHP (système B) : Rt = 29.4 min (pureté = 95 %); UV (CH3CN) : Xiax 275, c(275) = 63000 M-' cm-1. Composé 30 'H RMN (300 MHz, CDC13): 8 1.78 (s, 3H, CH3), 1.85 (s, 3H, CH3), 3.77 (s, 2H, ArCH2), 5.04 (s, 2H, CH2OH), 6.66-6.69 (m, 1H, ArHDDAO), 7.13 (s, 1H, ArHDDAO), 7.30-7.51 (m, 10H, 5ArH + 4ArHPABA + ArHDDAO), 7.63 (s, 1H, ArHDDAO), 7.75 (s, 1H, NH); 13C RMN (75.4 MHz, CDC13): 8 29.1, 38.4, 45.2, 75.0, 114.1, 114.3, 120.0, 120.3, 128.1, 128.8, 128.9, 129.1, 129.6(6), 129.7, 129.9, 130.6, 132.5, 132.9, 133.7, 134.6, 138.3, 139.8, 140.4, 141.0, 141.3, 148.7, 153.0, 153.5, 169.5, 187.7; Rf 0.5 (CH2CL2/AcOEt 6/4); MS (ESI mode positif): calc pour [C3oH24C12NaN2O3]+ 553.11, déterminée 553.33; CLHP (système B) : Rt 36.8 min (pureté = 94%); UV (PB/acétone, 8/2, v/v) : XII. 424, c (424) = 15000 M-' cm-'. Composé 31 'H RMN (300 MHz, (CD3)2CO): 8 1.57 (s, 6H, 2CH3), 3.70 (s, 2H, ArCH2), 5.20 (s, 2H, CH2OH), 6.55 (dd, J = 2 et 10 Hz, 1H, ArHDAO), 6.68 (d, J = 2 Hz, 1H, ArHDAO), 7.07 (dd, J = 3 et 9 Hz, 1H, ArHDAO), 7.22-7.48 (m, 9H, 5ArH + 2ArHPABA + 2ArHDAO), 7.60 (d, J = 9 Hz, 1H, ArHDAO), 7.71 (d, J = 8 Hz, 2H, 2ArHPABA); 13C RMN (75.4 MHz, CDC13): 8 32.2, 37.7, 44.3, 70.3, 113.4, 114.4, 119.6, 127.1, 127.6, 128.8, 129.1, 129.7, 131.3, 132.1, 134.0, 136.4, 137.2, 139.9, 140.2, 142.0, 148.1, 150.8, 161.7, 169.4, 186.8; MS (ESI, mode positif): cale pour [C30H27N2O3]+ 463.20, déterminé 463.13; 5 CLHP (système B) : Rt = 31.6 min (pureté = 95%); UV(PB/acétone, 8/2, v/v) : XII. 458, c(458) = 17000 M-' cm-1. Exemple II : Synthèse du composé 32 32 Le composé modèle 32 possède un motif 7-hydroxycoumarine fluorescent à pH physiologique mais qui perd son caractère fluorescent lorsque la fonction phénol est estérifiée. Cette sonde a été préparée en deux étapes à partir du dérivé de l'acide 15 homovanillique 33 et de l'ester benzylique de l'acide (7-hydroxycoumarin-4-yl)acétique 34 (Schéma 2). L'acide 4,5-diméthoxy-2-[(phénylacétamino)méthyl]phénylacétique (33, 50 mg, 0,14 mmol) et le (7-hydroxycoumarine-4-yl)acétate de benzyle (34, 54 mg, 0,17 mmol) ont été dissous dans du DMF anhydre (1 ml). De la triéthylamine (70, 6 l, 20 0,51 mmol) et le réactif de couplage BOP (72, 3 mg, 0,16 mmol) ont été ajoutés et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation sous atmosphère d'argon pendant deux heures. La réaction de couplage a été suivie jusqu'à son terme par CCM et CLHP, puis le mélange réactionnel a été évaporé à sec. Le résidu huileux a été purifié par COOH OMe OMe 10 chromatographie sur un gel de silice (10 g, gradient d'AcOEt dans du CH2C12, 0-20 %) pour obtenir le composé 35 sous forme d'un solide blanc (45 mg, 45 %). Composé 35 Rf (CH2C12/ACOEt 7/3, v/v) : 0.43. HPLC (system C) Rt 27.8 min. UV (enregistré lors de l'analyse CLHP) Xmax 236, 280 and 310 nm, Xmm 252 and 300 nm. IR (KBr) 3411, 3274, 3070, 2935, 1756 (intense), 1724, 1644, 1616, 1522, 1431, 1393, 1334, 1325, 1261, 1118, 1001, 838, 697, 559. MS (MALDI-TOF, mode positif, matrice CHCA) m/z 696.34 (M+K)+, 658.27 (M+Na)+ (masse calculée pour C37H33NO9 635.68). 'H NMR ((CD3)2SO, 300 MHz): 6 8.53 (t, J= 5.3 Hz, 1H), 7.78 (d, J= 8.6 Hz, 1H, H5-coumarine), 7.39-7.18 (m, 12H, H-phényle and H6- et H8-coumarine), 6.98 (s, 1H, H- acide phénylacétique), 6.84 (s, 1H, H- acide phénylacétique), 6.57 (s, 1H, H3-coumarine), 5.19 (s, 1H, CH -Bn), 4.31 (d, J 6.0 Hz, 2H, Ph-CH2-C(0)-N(H)-CH -), 4.16 (s, 2H, CH2-CO2Bn), 4.03 (s, 2H, Ph-CH-C(0)-N(H)-), 3.78 (s, 3H, CH3-O), 3.67 (s, 3H, CH3-O), 3.49 (s, 2H, CH -CO2-coumarine). Le composé 35 (40 mg, 0,06 mmol) a été mis en suspension dans un mélange de CH2C12 (1 ml) et d'acétate d'éthyle (1 ml). 6.5 mg de palladium sur charbon (10 %, Pd/C) ont été ajoutés et une atmosphère d'hydrogène a été établie. Le mélange réactionnel (légèrement chauffé pour augmenter la solubilité du matériel de départ) a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 19 heures. La déprotection a été suivie jusqu'au terme de la réaction par CLHP. Ensuite, le mélange réactionnel a été filtré sur Celite et les filtrats concentrés sous vide. Le résidu huileux a été dissous dans de l'eau diminéralisée et lyophilisé pour conduire au composé 32 sous forme d'un solide blanc (30 mg, 88 %). Composé 32 CLHP (system C) Rt 16.8 min. UV (enregistré lors de l'analyse CLHP) ~,max 235, 281 and 308 nm, Xmm 253 and 300 nm. IR (KBr) 3552, 3484, 3416, 2963, 1734 (faible), 1717, 1636, 1617, 1522, 1384, 1261, 1100, 1021, 828, 621, 559. MS (MALDITOF, mode positif, matrice CHCA) m/z 584.09 (M+K)+, 568.13 (M+Na)+ (masse calculée pour C30H27NO9 545.45). 'H RMN ((CD3)2SO, 300 MHz): 6 8.55 (t, J= 5.3 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.7 Hz, 1H, H5-coumarine), 7.38-7.23 (m, 12H, H-phényle and H6- and H8-coumarine), 7.00 (s, 1H, H- acide phénylacétique), 6.87 (s, 1H, H- acide phénylacétique), 6.57 (s, 1H, H3-coumarine), 4.33 (d, J = 6.0 Hz, 2H, Ph-CHz-C(0)-N(H)-CH -), 4.06 (s, 2H, CH2-CO2Bn), 4.00 (s, 2H, Ph-CH-C(0)-N(H)-), 3.80 (s, 3H, CH3-O), 3.70 (s, 3H, CH3-O), 3.51 (s, 2H, CH -CO2-coumarine). Exemple III : Synthèse de Ac-DEVD(OH)-PABA-Coumarine 23 OH AcH N N H OH LI Synthèse du tétrapeptide Ac-DEVD-OH 3 I.1.a. Synthèse du dipeptide Ac-DE-OH 5 OTMSE O O H N AcHN OH O 7 OOTMSE La synthèse du composé 5 s'effectue en 7 étapes à partir des dérivés protégés d'acides glutamique et aspartique 7 et 8. OH OBn BocH N O 7 8 La fonction acide carboxylique des chaînes latérales est protégée par un groupement TMSE en présence d'alcool 2-((triméthyle)sylil)éthylique, de DCC et de pyridine. Les composés ainsi obtenus sont déprotégés respectivement par traitement à l'acide trifluoroacétique (TFA) et par hydrogénation catalytique pour conduire à l'amine 10 et à l'acide 11 avec des rendements sur deux étapes de 83 et 99 %. Les composés 10 et 11 sont ensuite couplés en présence de BOP (Castro et al. ; Tetrahedron Letters, 1975 : 1219) et de DIEA pour conduire au dipeptide 12 avec un rendement de 98 %. La déprotection du groupement Boc s'effectue par traitement au TFA et permet d'obtenir le sel 13 avec un rendement de 82 %. Le composé 13 réagit ensuite avec l'anhydride acétique en présence de pyridine, puis l'ester benzylique est sélectivement déprotégé par hydrogénation catalytique sur Pd/C. Le composé Ac-DE-OH 5 est ainsi obtenu avec un rendement sur deux étapes de 77 % (Schéma 3) Ac-Asp(TMSE)-Glu(TMSE)-OH 5 (huile incolore, 100%) 'H RMN (300 MHz, CDC13): 6 0.03 (s, 9H, 3CH3), 0.06 (s, 9H, 3CH3), 0.96-1.02 (m, 4H, 2CH2Si), 1.96-2.10 (m, 4H, CH3 + CH2G11i), 2.15-2.30 (m, 1H, CH2G11i), 2.32-2.51 (m, 2H, CH2COGh,), 2.63 (dd, J = 6 et 17 Hz, 1H, CH2Asp), 2.98 (dd, J = 4 et 17 Hz, 1H, CH2Asp), 4.09-4.22 (m, 4H, OCH2), 4.46-4.53 (m, 1H, C*HG1u), 4.83-4.89 (m, 1H, C*HAsp), 7.03 (d, J = 8 Hz, NHAsp), 7.56 (d, J = 8 Hz, NHGh,); 13C RMN (75.4 MHz, CDC13): 8 -1.17 (6C), 17.5, 17.6, 23.5, 26.8, 30.9, 36.1, 49.6, 52.6, 63.5, 64.0, 171.3, 171.4, 172.7, 173.9, 174.0; IR (net): 3308, 2954, 1733, 1656, 1536 cm-1; [a]21365 +32.1 (c 0.39, CHC13); Rf0.2 (100% AcOEt); MS (MALDI-TOF, mode positif, matrice CHCA): calc. pour [C21H40N208Si2Na]+ 527.22, déterminée 527.58; Anal calc. pour C21H40N2O8Si2, 0.14 CH2C12: C, 49.13; H, 7.86; N, 5.42. Déterminée: C, 48.87; H, 7.84; N, 5.50. I.1.b. Synthèse du dipeptide H-VD-Bn 6 o H OBn OTMSE o Le composé H-VD-Bn 6 est obtenu avec un rendement sur 4 étapes de 77 % à partir du dérivé protégé d'acide aspartique 8. La protection de la chaîne latérale par l'alcool 2-((triméthyl)sylil)éthylique s'effectue de la même manière que précédemment. La déprotection du groupement Boc par traitement au TFA conduit à l'amine 15 avec un rendement sur 2 étapes de 85 %. Le composé 15 est ensuite couplé à la valine commerciale 9 en présence de BOP et de DIEA, permettant l'obtention du dipeptide 16 avec un rendement quantitatif. Enfin, le dipeptide H-VD-Bn 6 est obtenu par déprotection de 16 par traitement au TFA avec un rendement de 92 % (Schéma 4). H-Val-Asp(TMSE)-Bn/TFA 6 (solide blanc, 92%) 'H RMN (300 MHz, CDC13): 8 0.01 (s, 9H, 3CH3), 0.88-0.99 (m, 8H, CH2Si + 2CH3vai), 2.13-2.19 (m, 1H, CHCH3), 2.76 (dd, J = 5 et 17 Hz, 1H, CH2), 2.98 (dd, J = 5 et 17 Hz, 1H, CH2), 3.85 (d, J = 5 Hz, 1H, C*Huai), 4.05-4.13 (m, 2H, OCH2), 4.91-4.94 (m, 1H, C*HAsp), 5.13 (dd, J = 11 et 12 Hz, OCH2Ar), 7.27-7.31 (m, 5H, ArH); 7.55 (d, J = 8 Hz, 1H, NHAsp), 8.0-8.3 (mbroad, 3H, NH3); '3C RMN (75.4 MHz, CDC13): 8 -1.3 (3C), 17.4, 17.8, 18.0, 30.6, 35.9, 49.1, 59.0, 64.0, 68.1, 128.8-128.9 (2 pics, 5C), 135.3, 168.3, 170.3, 171.7; IR (KBr): 3366, 2947, 1671, 1542 cm-' ; [a]2'365 +38.7 (c 0.97, CHC13) ; MS (ESI, mode positif): calc. pour [C2,H35N2O5Si]+ 423.23, déterminée 423.13; Anal Calc. pour C23H35F3N2O7Si: C, 51.48; H, 6.57; N, 5.22. Déterminée: C, 51.51; H, 6.43; N, 5.17. I.1.c. Synthèse du tétrapeptide Ac-DEVD-OH 3 OTMSE O H OH OTMSE AcH N O O O (_')OTMSE Le tétrapeptide 17 est obtenu par réaction de couplage des dipeptides Ac-DEOH 5 et H-VD-Bn 6 en présence de BOP et de DIEA. L'hydrogénation catalytique sur Pd/C permet d'obtenir Ac-DEVD-OH 3 avec un rendement sur deux étapes de 95 % (Schéma 5). Ac-Asp(TMSE)-Glu(TMSE)-Val-Asp(TMSE)-OH 3 (solide gris, 99%) 1H RMN (300 MHz, CD3OD): 8 0.08 (s, 27H, 9CH3), 0.96-1.08 (m, 12H, 3CH2Si + 2CH3vai), 1.91-2.05 (m, 4H, CH2Gru + CH3), 2.12-2.24 (m, 2H, CHCH3 + CH2G11i), 2.38-2.50 (m, 2H, CH2COGiu), 2.65-2.93 (m, 4H, 2CH2Asp), 4.16-4.28 (m, 7H, C*Huai + OCH2), 4.40-4.45 (m, 1H, C*HGh,), 4.70-4.8â (m, 2H, C*HAsp), 7.97 (d, J= 8 Hz, 1H, NHvai), 8.22 (d, J = 8 Hz, 1H, NHAsp), 8.32 (d, J = 8 Hz, 1H, NHAsp), 8.41 (d, J = 8 Hz, 1H NHGh,); 13C RMN (75. 4 MHz, CD3OD): 8 -0.6 (9C), 19.0 (3C), 19.6, 20.6, 23.4, 28.8, 32.3, 32.6, 37.8, 38.1, 51.2, 52.2, 55.0, 61.0, 64.7, 65.0, 65.2, 173.1, 173.3, 173.8, 173.9, 174.0, 174.2(0), 174.2(4), 175.7; IR (KBr): 3926, 2958, 1732, 1694, 1668, 1645, 1564, 1538 cm-1; [a]21365 +17.5 (c 0.94, CHC13). Rf 0.5 (CH2C12/MeOH 95/5); MS (MALDI-TOF, mode positif, matrice CHCA): calc. pour [C35H66N4O12Si3Na]+ 841.39, déterminée 841.57; Anal calc. pour C35H66N4012Si3, 1.2 CH2C12: C, 47.20; H, 7.48; N, 6.08. Déterminée: C, 47.14; H, 7.22; N, 6.21. I1.1. Introduction du bras réactif : Ac-DEVD(TMSE)-PABA OH 2 L'introduction du bras réactif (PABA) a été effectuée par couplage peptidique du composé 3 avec l'alcool para-aminobenzylique 4 (Schéma 6). Un carbodiimide hydrosoluble l'EDCI (1-Ethyl-3-(3-Diméthylamino-propyl) Carbodiimide) est utilisé comme agent de couplage. III.1. Introduction du fluorophore 7-hvdroxvcoumarine 18 HO La fonction alcool de 2 a été activée par l'intermédiaire d'un groupement mésyle. Puis, l'introduction de la 7-hydroxycoumarine 18 sur l'extrémité C-terminale de ce tétrapeptide-PABA a été effectuée en présence d'une base minérale (K2CO3). La sonde Ac-DEVD(TMSE)-PABA-Coumarine 22 a été obtenue avec un rendement sur 2 étapes de 25% après séparation des deux diastéréoisomères par CLHP semi-préparative sur phase inverse. La déprotection des groupements TMSE a été effectuée avec du fluorure du TMAF et a permis l'obtention quantitative du composé 23 (Schéma 7).30 Ac-DEVD(TMSE)-PABA-OH 2 1H RMN (300 MHz, CD3OD): 6 0.07 (s, 27H, 3Si(Me3)3), 0.99-1.04 (m, 12H, 3CH2Si + 2CH3 vai), 1.95-2.10 (m, 4H, CH2Glu + CH3), 2.10-2.18 (m, 2H, CHCH3 + CH2Gl1i), 2.41-2.48 (m, 2H, CH2COGiu), 2.7-3.1 (m, 4H, 2CH2Asp), 4.05-4.25 (m, 7H, C*Huai + 30CH2), 4.36-4.42 (m, 1H, C*HGIU), 4.58 (s, 2H, ArCH2O), 4.70-4.76 (m, 1H, C*HAsp), 4.80-4.95 (m, 1H, C*HAsp), 7.33 (d, J = 8 Hz, 2H, ArH), 7.63 (d, J = 8 Hz, 2H, ArH), 7.94 (d, J= 7 Hz, 1H, NHuai), 8.31 (d, J = 8 Hz, 1H, NHAsp), 8.42-8.47 (m, 2H, NHGru + NHAsp), 9.48 (s, 1H, 011); 13C RMN (75. 4 MHz, CD3OD): 8 -0.6, 19.1, 20.0, 20.5, 23.4, 28.4, 32.1, 32.3, 37.7, 52.3, 53.1, 55.7, 62.2, 64.8, 65.1, 65.3, 65.7, 122.2, 129.4, 139.3, 139.7, 171.4, 173.0, 173.4, 174.2(6), 174.3(4), 174.4, 175.2, 175.7; [a]21365 -125.5 (c 1.1, CHC13); Rf 0.5 (CH2C12/AcOEt 3/7); MS (ESI, mode positif): calc. pour [C42H73N5013Si3Na]+ 946.40, déterminée 946.45; CLHP (système B) : Rt = 30.5 min (pureté > 95%). Ac-DEVD(OH)-PABA-Coumarine 23 1H RMN (300 MHz, CDC13): 6 0.84-0.89 (m, 6H, 2CH3vai), 1.70-2.10 (m, 6H, CHCH3 + CH2Giu + CH3), 2.25-2.31 (m, 2H, CH2COGiu), 2.52-2.80 (m, 4H, 2CH2Asp), 4.15-4.21 (m, 1H, C*Huai), 4.35-4.41 (m, 1H, C*HG1u), 4.50-4.54 (m, 1H, C*HAsp), 4.67-4.73 (m, 1H, C*HAsp), 5.18 (s, 2H, ArOCH2), 6.33 (d, J = 9 Hz, 1H, ArHcoum), 7.04 (d, J = 9 Hz, 1H, ArHcoum), 7.11 (s, 1H, ArHcoum), 7.44 (d, J= 9 Hz, 2H, 2ArHPABA), 7.66 (m, 3H, ArHcoum + 2ArHPABA) 7.85 (d, J = 8 Hz, 1H, NHuai), 8.01-8.15 (m, 3H, ArHcoum + NHGru + NHAsp), 8.42 (d, J= 7 Hz, 1H, NHAsp), 10.00 (s, 1H, C0011), 12.2-12.5 (mLarge, 2H, 200011); IR (KBr): 3278, 2971, 2883, 1742, 1686, 1664, 1618, 1542, 1490, 1384, 1197, 1140 cm-1; MS (ESI, mode positif): calc. pour [C36H42N5014]+ 768.27, déterminée 768.20; CLHP (système A) : Rt = 23.6 min (95%); UV : Xmax 250, 320 nm, e (320) = 17000 M-1 cm-1. Exemple IV : Synthèse de Ac-DEVD-PABA 25 OH AcHN OOH O I.1. Synthèse de Ac-DEVD-PABA-OH 2 Le composé 2 a été obtenu comme indiqué à l'Exemple 1. I.2. Introduction du fluorophore DAO 21 HO Le composé 2 a été activé par un groupement mésyle, puis la réaction avec DAO en présence de K2CO3 a permis d'obtenir la sonde Ac-DEVD(TMSE)-PABA-DAO 24 avec un rendement sur 2 étapes de 10%. La déprotection par traitement au TMAF a permis l'obtention de la sonde Ac-DEVD(OH)-PABA-DAO 25 (Schéma 8) Ac-DEVD(TMSE)-PABA-DAO 24 'H RMN (300 MHz, CDC13): 6 0.02 (s, 9H, Si(Me3)3), 0.03. (s, 9H, Si(Me3)3), 0.05. (s, 9H, Si(Me3)3), 0.78-1.02 (m, 12H, 3CH2Si + 2CH3vai), 1.19 (s, 3H, CH3DAO), 1.25 (s, 3H, CH3DAO), 1.95-2.20 (m, 5H, CH2Gl1i + CH3), 2.25-2.39 (m, 1H, CHCH3), 2.45-2.62 (m, 2H, CH2COGiu), 2.80-3.12 (m, 4H, 2CH2Asp), 3.95-4.22 (m, 8H, C*Huai + C*HGIu + 30CH2), 4.65-4.72 (m, 1H, C*HAsp), 4.95-5.09 (m, 3H, ArCH2O + C*HAsp), 6.58-6.66 (m, 3H, 3ArHDAO), 6.93-6.97 (m, 1H, ArHDAO), 7.08-7.12 (m, 2H, NHvai + NHAsp), 7.35-7.41 (m, 3H, ArHDAO + 2ArHPABA), 7.58-7.63 (m, 2H, NHAsp + ArHDAO), 7.77-7.80 (d, 2H, J= 9 Hz, 2ArHPABA), 8.47 (d, J = 4 Hz, 1H, NHGiu), 8.67 (s, 1H, NHPABA); MS (ESI): calc. pour [C57H85N6O13Si3]+ 1145.55, déterminée 1145.33; CLHP (système A) : Rt = 39.5 min (pureté = 90%); UV : Xmax 247, 457 nm, g(457 nm) = 6500 M-' cm-'. MS (ESI, mode positif): calc. pour [C42H47N6O13]+ 843.32, déterminée 843.40; HPLC (système A) : Rt = 25.8 min (pureté = 91%); UV-Visible : Xmax 247, 457 nm, e(457) = 6500 M-' cm-'. Exemple V : Clivage des composés 29, 31 et 32 par une pénicilline amidase Pour les expériences de clivage, une pénicilline amidase immobilisée sur un support solide inerte de type Eupergit C a été utilisée, ce qui permet d'accroître sa tolérance vis à vis de certains solvants organiques (acétone et méthanol). Ainsi, les différents essais25 ont été réalisés dans un mélange tampon phosphate (PB, 0.1 M, pH 7.4) et acétone dans les proportions 8/2 (v/v). Le spectre UV-Visble du modèle 29 (2.6 mM) a été enregistré dans un mélange PB/acétone (8/2, v/v ; pH 7.5 ; 37 C) ; il présente un maximum d'absorption à X = 275 nm (e = 63000 M-' cm-'). Le spectre d'émission de fluorescence a également enregistré été (XEx. = 275 nm) ; une très faible fluorescence de la sonde (XEm. = 395 nm) dans l' acétonitrile et une fluorescence quasi-nulle dans le mélange PB/acétone (8/2, v/v) est observée (Figure 1). La pénicilline amidase (6,4 unités) est ensuite ajoutée dans le milieu et la cinétique de clivage est suivie par mesure de fluorescence (XEX. = 360 nm, XEm. = 460 nm). On observe une augmentation progressive de la fluorescence à X = 460 nm caractéristique de la 7-hydroxycoumarine 18 ; il y a donc bien libération progressive dans le milieu du fluorophore (Figure 2, courbe c). Une expérience de contrôle a été réalisée en absence d'enzyme et montre qu'il n'y a pas de libération de la 7-hydroxycoumarine 18 par hydrolyse non spécifique de la sonde pro-fluorescente (Figure 2, courbe d). Les caractéristiques UV-Visible du modèle DAO 31 (2,2 mM), déterminées dans un mélange PB/acétone (8/2, v/v, 37 C ) sont les suivantes : Xmax = 458 nm et e = 17000 M-' cm'. Le spectre d'émission de fluorescence a également été enregistré et une faible fluorescence a été observée à X = 599 (XEX. = 458 nm) (Figure 3). Des expériences similaires ont été réalisés avec le composé modèle 32. La libération de la coumarine fluorescente est également observée. Un test de clivage par la pénicilline amidase (6,2 unités) a été effectué et montre clairement une augmentation significative de l'émission du DAO (2, 2 mM ; pH 7.5 ; 37 C) (XEX. = 638 nm, XEm. = 652 nm) au cours du temps (Figure 4). Il y a donc bien libération du fluorophore, libération qui est seulement imputable à l'action attendue de l'enzyme. Exemple VI: Propriétés spectrales et clivage enzymatique de Ac-DEVD(OH)-PABA-Coumarine 23 par la caspase-3 Les spectres UV-Visible (Xmax = 250 et 320 nm, e(320) = 17000 M-' cm-') et de fluorescence de la sonde Ac-DEVD(OH)-PABA-Coumarine 23 (3 M) ont été enregistrés dans un tampon (sucrose 10 % (m/v) 40 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.1% (m/v) CHAPS), pH 7,4) à 37 C, avec des spectrophotomètres UV/visible Varian Cary 50 scan et de fluorescence Varian Eclipse. Une microcellule de mesure de fluorescence (Hellmâ , 105.51-QS, 3 x 3 mm, 45 l) a été utilisée pour ces mesures. Une émission résiduelle de la sonde pro-fluorescente 23 est observée à X = 393 nm (%EX. = 320 nm) (Figure 5). 1 l de caspase-3 recombinante humaine (1,6 10-3 unité) a été ajouté et la fluorescence a été suivie à XEm. = 460 (%EX. = 360 nm) en fonction du temps (par incrément de 5 secondes) (Figure 2). La courbe (Figure 6) montre une libération progressive de la 7-hydroxycoumarine 18 fluorescente dans le milieu. Dans les mêmes conditions que précédemment (3 M, pH = 7,4, 37 C), une mesure en absence d'enzyme a été effectuée. La courbe de la Figure 7 montre clairement qu'il n'y a pas de libération de 7-hydroxycoumarine 18. La libération du fluorophore observée lors de l'expérience de clivage enzymatique (Figure 6) est donc bien due à la caspase-3. Exemple IV : Propriétés spectrales et clivage enzymatique de Ac-DEVD(OH)-PABA-DAO 25 par la caspase-3 50 l de la sonde Ac-DEVD(OH)-PABA-DAO 25 (solution du sel d'ammonium dans l'eau déminéralisée (pH 6.0), [c] = 23.0 M) ont été transférés dans une microcellule de mesure de fluorescence (Hellmâ , 105.51 QS, 3 x 3 mn, 45 l). Le spectre UV-Visible enregistré à 37 C indique un maximum d'absorption à Xmax = 457 nm (e = 6500 M-' cm-') alors que le spectre d'émission de fluorescence montre deux bandes assez larges à 606 et 641 nm (Figure 8). 2 l de caspase-3 recombinante humaine ont été introduits (3. 2 10-3 unités) et la cinétique de clivage a été suivie par mesure de fluorescence (%EX. = 638 nm, XEm. = 652 nm, incrément de 5 secondes). Les résultats montrent une forte d'augmentation de fluorescence à 652 nm, indiquant que le DAO 21 est bien libéré dans le milieu (Figure 9). La libération de ce fluorophore n'est due qu'à l'action de l'enzyme car en absence de celle-ci, on n'observe pas d'augmentation du signal à X = 652 nm. LISTE DE SEQUENCES SEQ ID NO: 1 : WEHD SEQ ID NO:2 : YVAD SEQ ID NO:3 : LEHD SEQ ID NO: 4 : DETD SEQ ID NO: 5 : DEVD SEQ ID NO: 6 : DEHD SEQ ID NO: 7 : VEHD SEQ ID NO: 8 : LETD SEQ ID NO: 9 : LEHD SEQ ID NO: 10 : SHVD SEQ ID NO: 11 : DELD SEQ ID NO: 12 : DGPD SEQ ID NO: 13 : DEPD SEQ ID NO: 14 : DGTD SEQ ID NO: 15 : DLND SEQ ID NO: 16 : DEED SEQ ID NO: 17 : DSLD SEQ ID NO: 18 : DVPD SEQ ID NO: 19 : DEAD SEQ ID NO: 20 : DSYD SEQ ID NO: 21 : ELPD SEQ ID NO: 26 : VEID SEQ ID NO: 24 : IETD REVENDICATIONS 1. Composé pro-fluorescent de formule générale (I) : A-B-X-F (I) dans laquelle : A figure une structure labile activable par un phénomène physique, chimique ou biologique, B figure un bras réactif, activable par libération de A et apte à générer un radical portant un substituant nucléophile, éventuellement anionique, ledit radical étant apte à subir un réarrangement intramoléculaire conduisant à la libération de F, - X figure un atome de soufre, d'oxygène, un motif OC(0), OC(0)N, OC(0)O, OS(0) ou OP(0), - F figure un radical fluorophore compatible avec l'établissement d'une liaison éther, thioéther, ester, carbamate, carbonate, sulfate, sulfinate, sulfonate, phosphate, phosphopate, phosphinate ou aminophosphonate avec B via le motif X et étant tel que le spectre d'émission et/ou d'excitation de F lié à B est décalé relativement au spectre d'émission et/ou d'excitation de F libre, B étant choisi parmi les radicaux de formules générales (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (Ilf) et (IIg) suivantes : 42 2910897 *ùY * ùY *ùY (Ilf) et (Ilg) dans lesquelles : Y représente O, NH ou S, R1 et R2, indépendamment l'un de l'autre, peuvent représenter H, un radical alkyle en C1-C3, un radical alcoxy en C1-C3, 5 -R3 et R4, indépendamment l'un de l'autre, peuvent représenter H, un radical alkyle en C1-05, un radical alcoxy en C1-05 ou un radical électro-attracteur ou électrodonneur tel qu'un groupe ester, nitrile, nitro, éther, amine, ou amide, n est égal à 1 ou 2, -* symbolise une liaison vers A, et 10 -^ symbolise une liaison vers X, ou un de ses dérivés. 2. Composé selon la revendication 1, dans lequel le phénomène biologique fait intervenir l'action d'une entité biologique. 3. Composé selon la revendication 2, dans lequel l'entité biologique est une 15 enzyme, notamment une hydrolase. 4. Composé selon la revendication 3, dans lequel l'enzyme est une protéase à cystéine aspartyle spécifique (caspase). 5. Composé selon la revendication 4, dans lequel la protéase est une caspase-3. 43 2910897 6. Composé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel A représente un substrat peptidique, ledit substrat peptidique comprenant optionnellement un ou plusieurs acides aminés naturels, modifiés ou non, ou synthétiques. 7. Composé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel A 5 représente un tétrapeptide choisi parmi WEHD (SEQ ID NO: 1), YVAD (SEQ ID NO:2), LEHD (SEQ ID NO:3), DETD (SEQ ID NO: 4), DEVD (SEQ ID NO: 5), DEHD (SEQ ID NO: 6), VEHD (SEQ ID NO: 7), LETD (SEQ ID NO: 8), LEHD (SEQ ID NO: 9), SHVD (SEQ ID NO: 10), DELD (SEQ ID NO: 11), DGPD (SEQ ID NO: 12), DEPD (SEQ ID NO: 13), DGTD (SEQ ID NO: 14), DLND (SEQ ID NO: 15), DEED (SEQ ID NO: 16), DSLD 10 (SEQ ID NO: 17), DVPD (SEQ ID NO: 18), DEAD (SEQ ID NO: 19), DSYD (SEQ ID NO: 20), ELPD (SEQ ID NO: 21), VEID (SEQ ID NO: 26) ou IETD (SEQ ID NO: 24). 8. Composé selon la revendication précédente, dans lequel le tétrapeptide est modifié par addition d'un radical acétyle à l'extrémité N-terminale. 9. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel 15 B-X est choisi parmi les radicaux de formules (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId), (IIIe), (IIIf), (IIIg) et (IIIh) suivantes : MeO o-@ MeO (Illd) *ùN H *ùN H (Ille) (111f) 44 2910897 *ùN H (Ilig) et dans lesquelles, -* a la même signification qu'en revendication 1, -@ symbolise la liaison vers F, et n égal 1 ou 2. 10. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel 5 B-X représente un radical de formule (Illa), (IIIb) et (IIIc). 11. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel F représente un radical issu d'un fluorophore choisi parmi les hydroxynaphtalènes, les hydroxypyrènes, l'acridine et ses dérivés tels que les hydroxyacridines, la 9-méthylacridine, la 7-hydroxy-9H(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one) (DDAO), et la 7-hydroxy-9H-(9,9- 10 diméthylacridin-2-one) (DAO), la coumarine et ses dérivés tel que la 7-hydroxycoumarine, les hydroxystilbènes, le furane, l'oxazole, l'oxadiazole, le nitrobenzoxadiazole et ses dérivés tels que les hydroxynitrobenzoxadiazoles, l'indole et ses dérivés, les benzoindoles, le benzopyrane et ses dérivés (chromène et dérivés), le benzothiazole et ses dérivés, la phénoxazine et ses dérivés, les benzophénoxazines (crésyl violet, Nile red, Nile blue, ...), la 15 fluorescéine et ses dérivés , la rhodamine et ses dérivés tels que la tétraméthylrhodamine, la tétraéthylrhodamine, les rhodols et leurs dérivés, l'éosine et ses dérivés, l'érythrosine et ses dérivés tels que les hydroxyérythrosines, la résorufine et ses dérivés tels que les hydroxyrésorufines, la quinoléine et ses dérivés tels que la 6-hydroxyquinoléine et la 6-aminoquinoléine, les hydroxyaryl 4-(3H)-quinazolinones, les cyanines fluorescentes et dérivés telles que les hydroxycyanines, et des fluorophores à chaîne polyméthine (i.e., chaîne polyènique). 12. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel F représente un radical issu d'un fluorophore choisi parmi la DDAO, la DAO, la 7-hydroxycoumarine et la résorufine. 13. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : A représente Ac-DEVD, dans lequel Ac est un radical acétyle, B-X représente un motif de formule (IIIa) ou (IIIb), 45 2910897 F est choisi parmi un radical issu de la 7-hydroxycoumarine et un radical issu de la DAO. 14. Utilisation d'un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la préparation d'une composition pharmaceutique et/ou de 5 diagnostic. 15. Utilisation d'un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour la détection et/ou la quantification d'un phénomène physique, chimique ou biologique. 16. Utilisation selon la revendication précédente dans laquelle le phénomène 10 biologique fait intervenir l'action d'une entité biologique. 17. Utilisation selon la revendication précédente, dans laquelle l'entité biologique est une enzyme. 18. Composition pharmaceutique et/ou de diagnostic comprenant au moins une quantité efficace d'au moins un composé tel que défini selon l'une quelconque des 15 revendications 1 à 13. 19. Procédé de détection et/ou de quantification d'un phénomène physique, chimique ou biologique, in vitro ou ex vivo, comprenant au moins les étapes de : a) mettre en contact, avec un milieu apte à la manifestation dudit phénomène, un composé pro-fluorescent tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 20 dans des conditions appropriées à la libération de la structure labile activable A, et b) détecter la présence ou l'absence d'un signal de fluorescence de F. 20. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel le phénomène biologique est une activité enzymatique. 21. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'activité enzymatique 25 est celle d'une protéase à cystéine. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, dans lequel la détection d'un signal de fluorescence de F est indicatif d'une réponse cellulaire, notamment une apoptose. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, dans lequel le milieu est représenté par des cellules neuronales. 24. Kit de diagnostic comprenant au moins un composé pro-fluorescent tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.