FR 2907000 A1 20080418 FR 0609039 A 20061013 NOUVELLE COMPOSITION ET SES APPLICATIONS, NOTAMMENT COSMETIQUES, POUR TRAITER LA DESITYDRATATION DE LA PEAU L'invention concerne une nouvelle composition et ses applications, notamment cosmétiques, pour améliorer la qualité de la peau en agissant sur la fonction barrière de la peau. Les compositions de l'invention servent notamment à traiter la déshydratation de la t o peau. Les fonctions principales de la peau sont notamment de maintenir une protection mécanique, chimique, contre les radiations et les pathogènes de l'environnement et de prévenir la perte en eau. Cette fonction barrière de la peau est assurée par la couche supérieure de l'épiderme : le Stratum Corneum (SC), correspondant au stade final de 15 maturation des kératinocytes. Ainsi la stimulation de la différenciation des kératinocytes améliore la physiologie de la peau et notamment l'hydratation en limitant les pertes en eau au niveau de la peau. De nombreuses substances et notamment l'acide gamma-linolénique (GLA) et les polyphénols de thé vert (GTP) sont connus pour leurs effets bénéfiques sur la peau. 20 Les effets de l'acide gamma-linolénique (GLA) sur la peau peuvent être déclinés sous 3 aspects. En premier lieu, les GLA peuvent s'intégrer dans les membranes cellulaires et la matrice extracellulaire du Stratum Corneum (SC) composée de substances telles que des acides gras et des céramides et peuvent ainsi agir sur le contrôle de l'hydratation de la peau. Par ailleurs, le GLA participe à la régulation de la balance des eicosanoïdes de série 25 1 qui jouent un rôle anti-inflammatoire et anti-allergique. Enfin, par l'activation du récepteur PPAR (récepteur activé par les proliférateurs de péroxysomes) qui favorise l'expression de différentes protéines de maturation et l'inhibition de la synthèse d'ADN (et donc de la prolifération), le GLA pourrait stimuler la maturation du kératinocyte basal en cornéocyte. 30 Les polyphénols de thé vert (GTP) améliorent la fonction barrière de la peau via la stimulation de la maturation du kératinocyte basal en cornéocyte. Par ailleurs, le GTP et particulièrement l'épigallocatéchine gallate (EGCG) apporte une protection contre le stress oxydatif, contre les radicaux libres et une stabilisation de la membrane du lysozome réduisant la fuite de médiateurs ou d'enzymes pro-inflammatoires. 2907000 2 La présente invention a pour but de fournir de nouvelles compositions ayant un effet synergique sur la physiologie de la peau. La présente invention concerne l'utilisation d'une combinaison comprenant de l'acide gamma-linolénique et au moins un polyphénol de thé vert, dans laquelle le rapport 5 entre l'acide gamma-linolénique et le polyphénol de thé vert varie d'environ 1 à environ 10, et en particulier varie d'environ 2 à environ 8 et encore plus particulièrement d'environ 4 à environ 6, pour augmenter la différenciation in vitro et ex vivo de kératinocytes. Il a été constaté de manière inattendue que la combinaison d'acide gammalinolénique et de polyphénols de thé vert agit de façon bénéfique et synergique sur la 1 o physiologie de la peau, et notamment vis-à-vis de la différenciation des kératinocytes. Par effet synergique, on définit l'effet de la combinaison de deux ingrédients qui dépasse l'addition des effets qu'aurait eu individuellement chacun de ces ingrédients. Par acide gamma-linolénique on entend l'isomère gamma de l'acide linolénique, qui appartient à la famille des acides gras oméga 6. Ces acides gras oméga 6 sont dits 15 essentiels car ils sont indispensables à notre corps et ne pouvant être synthétisés par le corps, doivent donc être apportés par l'alimentation. L'acide gamma-linolénique peut être produit à partir de l'acide linoléique par une succession de réactions enzymatiques provoquées par des désaturases et des élongases et est un intermédiaire essentiel du métabolisme des acides gras polyinsaturés. La A6 désaturase, qui est une enzyme 20 indispensable à la fabrication du GLA, est une enzyme absente dans les cellules de la peau (kératinocytes et cornéocytes notamment). Par polyphénols de thé vert on entend des catéchines dont la plus importante dans le thé vert est l'épigallocatéchine gallate (40%), suivie de l'épigallocatéchine (18%) puis de l'épicatéchine (8 ,%o). D'autres catéchines mineures sont présentes dans les extraits de thé 25 telles que la gallocatéchine (GC), l'épicatéchine gallate (ECG), la gallocatéchine gallate (GCg) et la catéchine (C). L'expression pour augmenter la différenciation in vitro et ex vivo de kératinocytes signifie que la composition permet de faire progresser le kératinocyte dans son processus de maturation lui permettant d'assurer au mieux ses fonctions spécifiques. 30 Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une combinaison dans laquelle le polyphénol de thé vert est sélectionné parmi des composés de la classe des flavan-3-ol des flavonoïdes. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une combinaison dans laquelle le polyphénol de thé vert est 2907000 sélectionné parmi 1'épigallocatéchine gallate (EGCg), l' épigallocatéchine (EGC), l'épicatéchine (EC), la gallocatéchine (GC), la gallocatéchine gallate (GCg), l'épicatéchine gallate (ECg) et la catéchine (C). Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation 5 telle que définie ci-dessus, d'une combinaison dans laquelle le polyphénol de thé vert est contenu dans un extrait végétal tel que l'extrait de thé vert. L'extrait de thé vert est obtenu selon des méthodes totalement connues de l'homme du métier (voir entre autre la norme NF ISO 6079 de septembre 1991). Selon un autre mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une combinaison dans laquelle l'acide gammalinolénique est contenu dans une huile végétale telle que l'huile de bourrache, l'huile de primevère ou l'huile de pépins de cassis. La présente invention concerne également une combinaison comprenant de l'acide gamma-linolénique et au moins un polyphénol de thé vert, dans laquelle le rapport entre l'acide gamma-linolénique et le polyphénol de thé vert varie d'environ 1 à environ 10, et en particulier varie d'environ 2 à environ 8 et encore plus particulièrement d'environ 4 à environ 6. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une combinaison comprenant de l'acide gamma-linolénique et au moins un polyphénol de thé vert, dans laquelle le rapport entre l'acide gamma-linolénique et le polyphénol de thé vert varie d'environ 1 à environ 10, et en particulier varie d'environ 2 à environ 8 et encore plus particulièrement d'environ 4 à environ 6, et dans laquelle la quantité totale d'acide gammalinolénique et de polyphénol est comprise d'environ 100 à environ 500 mg, en particulier d'environ 150 à environ 400 mg, plus particulièrement d'environ 350 mg. La présente invention concerne une composition comprenant une combinaison telle que définie ci-dessus., dans laquelle : - la concentration en acide gamma-linolénique est comprise d'environ 0,1 à environ 0,5%, plus particulièrement d'environ 0,1 à environ 0,3%, encore plus particulièrement d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition et - la concentration en polyphénol de thé vert est comprise d'environ 0,01 à environ 0,1%, plus particulièrement d'environ 0,02 à environ 0,07%, encore plus particulièrement d'environ 0,045% en poids par rapport au poids de la composition. 2907000 4 Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle le polyphénol de thé vert est sélectionné parmi des composés de la classe des flavan-3-ol des flavonoïdes. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une 5 composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle le polyphénol de thé vert est sélectionné parmi l'épigallocatéchine gallate (EGCg), l'épigallocatéchine (EGC), l'épicatéchine (EC)., la gallocatéchine (GC), la gallocatéchine gallate (GCg), l'épicatéchine gallate (ECg) et la catéchine (C). Selon un autre mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une 10 composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle le polyphénol de thé vert est contenu dans un extrait végétal tel que l'extrait de thé vert. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle l'acide gamma-linolénique est contenu dans une huile végétale telle que l'huile de bourrache, l'huile de primevère ou 15 l'huile de pépins de cassis. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle la concentration en acide gammalinolénique est comprise d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition. 20 En dehors de ces gammes, soit aucun effet n'est obtenu (pour des concentrations inférieures à 0,15%), soit des problèmes liés à l'équilibre nutritionnel et organoleptique du produit apparaissent. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle la concentration en polyphénol de thé 25 vert est d'environ 0,045% en poids par rapport au poids total de la composition. Cette valeur permet d'obtenir un effet avantageux. Selon un autre mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle la concentration en acide gamma- linolénique est comprise d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total 30 de la composition et la concentration en polyphénol de thé vert est d'environ 0,045% en poids par rapport au poids total de la composition. La présente invention concerne également une composition orale comprenant une combinaison telle que définie ci-dessus, ladite composition se présentant sous la forme d'un produit alimentaire, d'un complément alimentaire, ou d'une composition cosmétique. 2907000 5 Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition orale telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que le produit alimentaire est sélectionné dans le groupe constitué par un produit laitier frais, un yoghourt, un fromage frais, un produit laitier fermenté, un dessert, une boisson, un liquide, une crème, 5 une purée de fruits et/ou de légumes. L'expression lait fermenté ou yoghourt doit être comprise comme étant notamment en accord avec les normes officielles du Codex alimentarius (notamment son volume 12 et la norme Codex Stan 1-11 (a)-1975) ou le décret français n 88-1203 du 31 décembre 1988. 10 Selon un autre mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition orale telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que le complément alimentaire est sélectionné dans le groupe constitué par des dragées, des pilules, des gélules, du sirop, du gel., de la poudre à reconstituer. Selon un autre mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une 15 composition orale telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que la composition cosmétique est sélectionnée dans le groupe constitué par des crèmes, des émulsions, des lotions, de la pâte, de la gomme. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une composition orale telle que définie ci-dessus, dans laquelle la concentration en acide 20 gamma-linolénique est comprise d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition et la concentration en polyphénol de thé vert est d'environ 0,045% en poids par rapport au poids total de la composition. Les doses journalières recommandées de cette composition orale sont de 1 à 2 portions, c'est à dire correspondant aux gammes de 150 à 300 mg de GLA et de 45 à 90 25 mg de GTP. La présente invention fait également état d'un produit cosmétique comprenant une combinaison telle que définie ci-dessus, en association avec un excipient approprié pour l'administration par voie topique. On entend par excipient approprié pour l'administration par voie topique , des 30 excipients permettant à l'ingrédient actif d'atteindre le Stratum Corneum. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne un produit cosmétique telle que définie ci-dessus, dans lequel la concentration en acide gammalinolénique est comprise d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total 2907000 6 de la composition et la concentration en polyphénol de thé vert est d'environ 0,045% en poids par rapport au poids total de la composition. La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une combinaison telle que définie ci-dessus, en association avec un véhicule 5 pharmaceutiquement acceptable. On entend par véhicule pharmaceutiquement acceptable , des excipients permettant de conduire l'ingrédients actif à sa cible. La présente invention a aussi pour objet une méthode de traitement cosmétique, comprenant l'absorption par voie orale d'une composition cosmétique telle que définie ci- 10 dessus. La présente :invention a aussi pour objet une méthode de traitement cosmétique, comprenant l'application topique d'un produit cosmétique tel que défini ci-dessus. La présente invention concerne l'utilisation d'une combinaison telle que définie ci- dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à améliorer la qualité de la peau en 15 agissant sur la fonction barrière de la peau. La présente invention concerne l'utilisation d'une combinaison telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de pathologies impliquant une altération, notamment une diminution, de la différenciation des kératinocytes. 20 Les pathologies impliquant une altération, notamment une diminution de la différenciation des kératinocytes peuvent être par exemple, une dermatite atopique ou du psoriasis. FIGURE : 25 Figure 1 : La Figure 1 représente le pourcentage d'expression de la Transglutaminase K (TGK) dans les kératinocytes préalablement traités avec du GLA et du GTP seul et en combinaison. La colonne A correspond au traitement des kératinocytes avec 1,25 gg/ml de GLA. La colonne B correspond au traitement des kératinocytes avec 3,75 g/ml de GLA. La colonne C correspond au traitement des kératinocytes avec 0,5 30 g/ml de GTP. La colonne D correspond au traitement des kératinocytes avec 2,5 rg/ml de GLA et 0,5 g/ml de GTP. La colonne E correspond au traitement des kératinocytes avec du calcium à une concentration de 1,5 mM bien connu pour stimuler la différenciation des kératinocytes. 2907000 EXEMPLES : Exemple 1 : Fabrication d'un produit laitier contenant une combinaison d'acide gamma-linoléniaue et de polyphénols de thé vert 5 Le produit laitier est fabriqué par un procédé classique de préparation d'un yaourt brassé. Dans une première étape, le lait écrémé, préalablement enrichi en protéines par l'ajout de poudre de lait ou de lait concentré est pré-chauffé (95 C, 4 à 8 minutes) afin d'éliminer les contaminants bactériens. Puis une étape d'incorporation en ligne d'huile de 10 bourrache a lieu avant l'homogénéisation (50-300 bars, 40 à 95 C). Un traitement thermique, un charnbrage et un refroidissement sont réalisés successivement. Puis, des ferments sont ajoutés et la fermentation (30 à 45 C, 5 à 10 heures) a lieu en cuve. Un décaillage est ensuite effectué suivi d'un refroidissement. A ce stade, est ajouté l'extrait de thé vert, la vitamine E et éventuellement une 15 préparations de fruits. Le mélange obtenu est ensuite conditionné et stocké en chambre froide. Exemple 2 : Etude de biodisponibilité Si du GLA ou des catéchines sont absorbés par voie orale, leurs effets ne peuvent 20 s'exercer sur la peau que par l'intermédiaire du sang qui est le seul véhicule permettant d'amener ces ingrédients au niveau de la totalité des tissus concernés (en l'occurrence, la peau). Cette étude évalue la biodisponibilité de la combinaison des catéchines avec du GLA, et notamment la biodisponibilité de cette combinaison dans un yaourt contenant 25 des probiotiques (voir Tableau 1). Pour évaluer cette biodisponibilité, les concentrations plasmatiques de GLA et de catéchines sont suivies à différents moments après ingestion des produits 1, 2 , 3 ou 4. D'après les données de la littérature, une dose d'environ 300 mg /jour de GLA permet d'avoir un effet. De façon à évaluer l'absorption du GLA et sa concentration 30 sérique correspondante, deux doses de GLA ont été utilisées : 300 et 150 mg/jour. 7 2907000 8 Produits testés Trois types de produits ont été développés et testés tel que décrit dans le tableau 1. Tableau 1: Composition des produits testés dans l'étude de biodisponibilité Produit laitier frais + ingrédients actifs Huile de bourrache Extrait de thé seule vert seul Produit 1 Produit 2 Produit 3 Produit 4 Matrice Produit laitier fermenté avec S. thermophilus, Ingrédients seuls: Ingrédients seuls L. bulgaricus, L. casei* huile de bourrache : extrait de thé vert dans une solution aqueuse Huile de 1.5 g (équivalent à 300 mg de 0.75 g (équivalent 1.5 g (équivalent à bourrache GLA) à 150 mg de GLA) 300 mg de GLA) Extrait 50 mg (équivalent à 50 mg 50 mg de thé 45 mg de catéchines) (équivalent à (équivalent à vert 45 mg de 45 mg de catéchines) catéchines) 5 *Les produits 1 et 2 ont été fabriqués selon le procédé de fabrication décrit dans l'exemple 1. Protocole de l'étude Cette étude est une étude normocentrée, randomisée, ouverte. Elle a été réalisée 10 avec 12 sujets féminins volontaires (âge moyen 30.8 ansù Indice de Masse Corporelle (BMI) moyen de 21.4). Pour chaque sujet, l'étude a duré entre 2 et 3 semaines. Chaque sujet a fait quatre visites de 24h à la clinique : une première étant la visite d'inclusion (V1) (1 semaine avant la première visite d'évaluation) et les trois 15 autres étant des visites d'évaluation à JO (V2), à J+4 (V3) et J+8 (V4). A chaque visite, un examen clinique a été réalisé et un prélèvement de sang a été effectué de manière à mesurer la concentration sanguine de GLA et de catéchines et à suivre les cinétiques d'absorption. Après la première visite d'inclusion (V1), les sujets ont passé la première 20 semaine à mettre en pratique les recommandations alimentations qui les sensibilisaient au fait de réduire leur consommation en produits alimentaires contenant beaucoup des ingrédients testés (pour limiter toute interférence avec les dosages effectués). Les trois évaluations ont été séparées par au moins 4 jours et au maximum 7 jours. 2907000 9 Protocole pour les visites d'évaluation Durant chaque visite d'évaluation (V2, V3, V4), les sujets ont consommé un produit au hasard (parmi les 4 produits). Ainsi à la fin de la troisième visite d'évaluation, ils avaient consommé chacun des trois produits testés. 5 Sept prises de sang ont été faites dans les 6 heures suivant l'ingestion du produit. La concentration plasmatique des ingrédients actifs a été mesurée à 6 moments (T0, Tlh, T2h, T3h, T4h, T6h) pour mesurer les cinétiques plasmatiques du GLA et des catéchines. Deux prélèvements ont été faits en plus afin de mieux prendre en compte les 10 différences en terme d'absorption des ingrédients actifs : - T0,5h a été utilisé pour la détermination de la biodisponibilité des catéchines dans le plasma. - T5h a été utilisé pour la détermination de la biodisponibilité du GLA dans le plasma. 15 Analyses plasmatiques Les concentrations plasmatiques en catéchines et spécifiquement en épicatéchine (la EC), en épigallocatéchine (EGC), et d'épigallocatéchine gallate (EGCG) ont été déterminées par CLHP comme décrit par Lee et al. (Lee MJ, Prabhu S, Meng X, Li C, 20 Yang CS. An improved method for the determination of green and black tea polyphenols in biomatrices by high-performance liquid chromatography with coulometric array detection. Anal Biochem. 2000 ;279:164û9) et en se basant sur les connaissances générales de l'homme du métier. Les résultats sont exprimés en mol/mL. Les concentrations en GLA ont été obtenues sur la fraction des chylomicrons 25 obtenue par isolement par ultracentrifugation. L'extraction des lipides des chylomicrons a été faite selon le protocole de Moilanen et al. (Moilanen T, Nikkari T. The effect of storage on the fatty acid composition of human serum. Clin Chim Acta. 1981;114:111û6).Les mesures ont été réalisées en utilisant la chromatographie en phase gazeuse. L'identification de GLA a été faite par des méthodes connues par 30 l'homme du métier notamment par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats sont exprimés en tgmL. 2907000 10 Analyses statistiques Pour évaluer la biodisponibilité du GLA et des catéchines, les paramètres suivants ont été analysés : - l'aire sous la courbe (AUC) qui donne une information sur la cinétique de 5 biodisponibilité (g/:mL/h), - la concentration maximale pendant l'analyse de cinétique (Cmax) (tg/mL), - le temps pour lequel la concentration est maximale (Tmax) (h). Un test t de Student a été utilisé. L'analyse a été effectuée sur la population per protocol (PP) (n=11) parce qu'un des 12 sujets inclus n'a pas accompli toutes les 10 visites. Résultats • Résultats de la biodisponibilité du GLA La biodisponibilité du GLA mis dans un yaourt (Produit 1 ou 2) ou comme 15 simple ingrédient administré par l'intermédiaire de l'huile (Produit 3), a été mesurée de deux manières : - AUC, Cmax et Tmax - la cinétique de GLA sur les 6 heures suivant la consommation pour 11 sujets. Les résultats de l'analyse d'AUC, de Cmax et de Tmax de GLA sont montrés 20 dans le tableau 2. Tableau 2: GLA AUC, Cmax and Tmax analyses pour chaque produit. AUCO-6h Cmax Tmax ( g/mL/h) ( g/mL) (h) Produit 1 27,9 9,1 * 12,1 7,03** 2,00 1,00*** (GLA 300 mg + Catéchines 45 mg dans un produit laitier fermenté) 12,3 3,1 6,5 2,7 1,91 1,58*** Produit 2 (GLA 150 mg + Catéchines 45 mg dans un produit laitier fermenté) 15,2 10,5 9,4 5,2 4,55 1,29 Produit 3 : Huile de bourrache seule (équivalent à 300 mg GLA) Résultats :moyenne + SD (déviation standard) statistiquement différente des produits 2 et 3 (p 5.10' - Lactobacillus bulgaricus et Streptocccus > 10' - thermophilus (ufc /g) Vitamine E (mg) 2 0 L'étude a duré 7 mois. Elle a été divisée en deux parties : une phase de sélection (4semaines) et une phase de consommation (24 semaines). Les sujets ont 10 effectué 4 visites d'évaluation séparées de 6 semaines durant la période de consommation du produit. Une période de consommation de 6 mois permet la comparaison de l'effet du produit sur une période de temps étendue et cela permet aussi la comparaison de l'effet en fonction des saisons. Le premier objectif de cette étude était de déterminer si la consommation d'un 15 produit laitier fermenté durant 12 semaines permettait d'améliorer la fonction barrière de la peau sur l'avant-bras du sujet. Cette évaluation a été mesurée par le TEWL avec du laurylsulfate de sodium (SLS). Le TEWL a été mesuré sur la partie interne de l'avant bras avec un EVAPORIMETER EP2 et exprimé en g/m2/h. ( SERVOMED, Sweden). 20 Le second objectif de cette étude était de déterminer si la consommation du produit laitier contenant la combinaison de l'invention permettait d'améliorer la 2907000 14 fonction barrière de la peau sur l'avant-bras au cours du temps et cela, en mesurant le TEWL dans du SLS. D'autres paramètres ont été mesurés tels que l'hydratation, l'élasticité, les marqueurs sanguins de l'inflammation et la qualité globale de la peau par une 5 évaluation clinique et un questionnaire personnel. L'étude a été initiée en automne et poursuivie jusqu'au printemps de manière à comparer l'effet du produit à différents moments de l'année. Pour rappel, la fonction barrière de la peau est censée se détériorer pendant les mois d'hiver. L'analyse a été réalisée sur tous les sujets. 10 Analyse statistique Les données ont été analysées de deux façons : - comparaison entre deux groupes à différents moments (6, 12, 18 et 24 semaines) en utilisant un test d'ANOVA (analyse de la variance) non-paramétrique 15 (en raison de la distribution, les valeurs sont exprimées en médianes plutôt qu'en moyenne) ; - comparaison de l'évolution de l'effet au cours du temps ; cette analyse plus globale de la cinétique de réponse permet de tenir compte des différences entre les deux produits et des variations environnementales ; un test d'ANOVA basé sur des 20 mesures répétées sur deux périodes de temps (étude totale de 24 semaines et jusqu'à 12 semaines (premier critère de l'étude)) a été utilisé. Ces analyses tiennent compte des niveaux de références dans chaque cas. Résultats 25 • Population à traiter (Intend to treat population ou (ITT)) L'analyse de la population ITT (n=67) a montré une amélioration chiffrée de la fonction barrière de la peau évaluée par le TEWL (sans SLS), pour des sujets ayant consommé le produit testé par rapport à ceux qui ont consommé le produit contrôle et cela, tout au long de l'étude. 30 Il y a une variation naturelle de la fonction barrière (par exemple une faible détérioration en hiver montre une valeur augmentée du TEWL) mais le produit actif a tendance à être supérieur au contrôle à 6 semaines, et, à 8 semaines, les différences sont statistiquement très significatives. Il n'y a pas de différences significatives à 12 2907000 15 et 24 semaines entre les traitements avec le produit testé et le produit contrôle (valeurs moyennes). La comparaison des pourcentages relatifs de l'augmentation des valeurs du TEWL dans les deux groupes montre la différence la plus importante (27,5%) à 18 semaines. 5 A 24 semaines, une amélioration de la fonction barrière du groupe test a été observée (valeur négative du TEWL comparée au niveau de référence) suggérant un effet d'accumulation globale de la consommation du produit. L'analyse des effets au cours du temps révèle que le produit testé réduit significativement le TEWL pendant l'étude (24 semaines de consommation [p=0,02]) et 10 aussi dans la phase jusqu'à 12 semaines de consommation ([p=0,036]). En moyenne, pendant la période globale de l'étude, la différence du TEWL entre les deux groupes est 14%, indiquant que la consommation du produit provoque 14% d'augmentation de la rétention d'eau par la peau. • Sous groupe BMI 95%. Les NHEK sont ainsi incubés pendant 24 heures. Le milieu est ensuite éliminé. Puis les NHEK sont incubés pendant 48 heures en présence soit : - du milieu SFM (milieu sans sérum) additionné d'acide gamma-linolénique et des polyphénols de thé vert à la concentration de1, 25 ; 2,5 ou 3,75 g/mL pour le GLA et à la concentration de 0,5 g/ml pour le GTP ; 10 - du milieu SFM (milieu sans sérum) sans calcium qui sert de contrôle négatif ; - du milieu SFM (milieu sans sérum) additionné de calcium (1,50 mM) qui sert de contrôle positif. Une élimination des milieux est réalisée et une seconde incubation en présence des 3 types de milieux est effectuée. 15 Test de cytotoxicité Tout d'abord, afin de pouvoir évaluer la concentration maximale des deux principes actifs tolérée par les NHEK dans ces conditions, un test de cytotoxicité est entrepris. La viabilité cellulaire des NHEK est évaluée après un marquage au 344,5- 20 Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (SIGMA). Ainsi, pour le GLA la concentration maximale sans perte de viabilité des NHEK est 5,00 g/mL. Pour le mélange de GTP, la concentration maximale sans perte de viabilité des NHEK est 1,00 g/mL. 25 Quantification du marqueur de différenciation cellulaire Le milieu de culture est éliminé puis un rinçage avec du PBS est réalisé. Les cellules sont ensuite perméabilisées et fixées par du méthanol absolu pendant 10 minutes à -20 C. Puis un séchage et une saturation non spécifique avec un mélange PBS-Tween 20- 30 Protéines de lait sont réalisés, suivi d'un rinçage avec du PBS. Les cellules NHEK sont marquées avec un anticorps monoclonal anti-TGK (Référence : TEBU 0175003), puis incubées 1 heure à température ambiante et rincées avec du PBS. 25 2907000 18 La révélation est réalisée avec un anticorps secondaire conjugué GAM-FITC (Référence : Life Technologie A 11001) et la fluorescence est mesurée grâce à un logiciel (Référence : NIKKON LICIA Software). Le marquage et le comptage des noyaux se fait grâce à la technique de Hoechst. En 5 premier lieu, le milieu est éliminé et un rinçage avec du PBS est réalisé. Un marquage de Hoechst (Référence : bis-benzimide Sigma B1155) est ensuite utilisé et l'incubation se fait pendant 1 heure à température ambiante. Suivent un rinçage avec du PBS, une saisie d'image et une quantification des fluorescences. Les résultats sont exprimés en fluorescence spécifique de la TGK c'est à dire qu'ils 10 sont rapportés au nombre de noyaux de façon à s'affranchir des variations de croissance des cellules. De plus, tous ces résultats sont également rapportés aux résultats du contrôle négatif (qui représente une différentiation normale) et qui est fixé à 100%. 15 Analyse statistique des résultats : L'analyse statistique des résultats est effectuée à l'aide du logiciel JUMP 6 SAS Institute. Un test de Dunnett (test spécialisé pour la comparaison multiple par exemple des comparaisons faites qu'avec le groupe témoin contre tous les autres groupes) permet de 20 confirmer la significativité des résultats en comparaison à la condition contrôle non-traitée. Résultats : Les résultats sont exprimés dans la Figure 1. Expression de la pdunnett TGK TGK (moyenne) Contrôle négatif non-traité 0 --- GLA 1,25 g/mL 250 0,012 GLA 3,75 g/mL 220 0,026 GTP 0,5 g/mL 29 0,98 GLA 2,5 g/mL, + GTP 0,5 g/mL 605 REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une combinaison comprenant de l'acide gamma-linolénique et au moins un polyphénol de thé vert, dans laquelle le rapport entre l'acide gamma-linolénique et le polyphénol de thé vert varie d'environ 1 à environ 10, et en particulier varie d'environ 2 à environ 8 et encore plus particulièrement d'environ 4 à environ 6, pour augmenter la différenciation in vitro et ex vivo de kératinocytes. 2. Utilisation d'une combinaison selon la revendication 1, dans laquelle le polyphénol de thé vert est sélectionné parmi des composés de la classe des flavan-3-ol des flavonoïdes. 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle le polyphénol de thé vert est sélectionné parmi l'épigallocatéchine gallate (EGCg), l'épigallocatéchine (EGC), l'épicatéchine (EC), la gallocatéchine (GC), la gallocatéchine gallate (GCg), l'épicatéchine gallate (ECg) et la catéchine (C). 4. Utilisation d'une combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le polyphénol de thé vert est contenu dans un extrait végétal tel que l'extrait de thé vert. 5. Utilisation d'une combinaison selon la revendication 1, dans laquelle l'acide gamma-linolénique est contenu dans une huile végétale telle que l'huile de bourrache, l'huile de primevère ou l'huile de pépins de cassis. 6. Combinaison comprenant de l'acide gamma-linolénique et au moins un polyphénol de thé vert, dans laquelle le rapport entre l'acide gamma-linolénique et le polyphénol de thé vert varie d'environ 1 à environ 10, et en particulier varie d'environ 2 à environ 8 et encore plus particulièrement d'environ 4 à environ 6. 7. Combinaison comprenant de l'acide gamma-linolénique et au moins un polyphénol de thé vert, dans laquelle le rapport entre l'acide gamma-linolénique et le 35 polyphénol de thé vert varie d'environ 1 à environ 10, et en particulier varie d'environ 2 à 2907000 21 environ 8 et encore plus particulièrement d'environ 4 à environ 6, et dans laquelle la quantité totale d'acide gamma-linolénique et de polyphénol est comprise d'environ 100 à environ 500 mg, en particulier d'environ 150 à environ 400 mg, plus particulièrement d'environ 350 mg. 5 8. Composition comprenant une combinaison selon l'une des revendications 6 ou 7, dans laquelle, - la concentration en acide gamma-linolénique est comprise d'environ 0,1 à environ 0,5%, plus particulièrement d'environ 0,1 à environ 0,3%, encore plus particulièrement 10 d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition et - la concentration en polyphénol de thé vert est comprise d'environ 0,01 à environ 0,1%, plus particulièrement d'environ 0,02 à environ 0,07%, encore plus particulièrement d'environ 0,045% en poids par rapport au poids de la composition. 15 9. Composition selon la revendication 8, dans laquelle le polyphénol de thé vert est sélectionné palliai des composés de la classe des flavan-3-ol des flavonoides. 10. Composition selon l'une des revendications 8 ou 9, dans laquelle le polyphénol de thé vert est sélectionné parmi l'épigallocatéchine gallate (EGCg), l'épigallocatéchine 20 (EGC), l'épicatéchine (EC), la gallocatéchine (GC), la gallocatéchine gallate (GCg), l'épicatéchine gallate (ECg) et la catéchine (C). 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans laquelle le polyphénol de thé vert est contenu dans un extrait végétal tel que l'extrait de thé vert. 12. Composition selon la revendication 8, dans laquelle l'acide gamma-linolénique est contenu dans une huile végétale telle que l'huile de bourrache, l'huile de primevère ou l'huile de pépins de cassis. 30 13. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, dans laquelle la concentration en acide gamma-linolénique est comprise d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition. 25 2907000 22 14. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, dans laquelle la concentration en polyphénol de thé vert est d'environ 0,045% en poids par rapport au poids total de la composition. 5 15. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 14, dans laquelle la concentration en acide gamma-linolénique est comprise d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition et la concentration en polyphénol de thé vert est d'environ 0,045% en poids par rapport au poids total de la composition. 10 16. Composition orale comprenant une combinaison selon l'une des revendications 6 ou 7, se présentant sous la forme d'un produit alimentaire, d'un complément alimentaire, ou d'une composition cosmétique. 17. Composition orale selon la revendication 16, caractérisée en ce que le produit 15 alimentaire est sélectionné dans le groupe constitué par un produit laitier frais, un yoghourt, un fromage frais, un produit laitier fermenté, un dessert, une boisson, un liquide, une crème, une purée de fruits et/ou de légumes. 18. Composition orale selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisée en ce 20 que le complément alimentaire est sélectionné dans le groupe constitué par des dragées, des pilules, des gélules, du sirop, du gel, de la poudre à reconstituer, de la pâte, de la gomme. 19. Composition orale selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, 25 caractérisée en ce que la composition cosmétique est sélectionnée dans le groupe constitué par des crèmes, des émulsions, des lotions. 20. Composition orale selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, comprenant une combinaison dans laquelle la concentration en acide gamma-linolénique 30 est comprise d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition et la concentration en polyphénol de thé vert est d'environ 0,045% en poids par rapport au poids total de la composition. 2907000 23 21. Produit cosmétique comprenant une combinaison selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, en association avec un excipient approprié pour l'administration par voie topique. 5 22. Produit cosmétique selon la revendication 21, dans lequel la combinaison dans laquelle la concentration en acide gamma-linolénique est comprise d'environ 0,15 à environ 0,3% en poids par rapport au poids total de la composition et la concentration en polyphénol de thé vert est d'environ 0,045% en poids par rapport au poids total de la composition. 10 23. Composition pharmaceutique contenant à titre de substance active, une combinaison selon l'une des revendications 6 ou 7, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 15 24. Méthode de traitement cosmétique, comprenant l'absorption par voie orale d'une composition cosmétique selon la revendication 19. 25. Méthode de traitement cosmétique, comprenant l'application topique d'un produit cosmétique selon l'une des revendications 21 ou 22. 26. Utilisation d'une combinaison selon l'une des revendications 6 ou 7, pour la préparation d'un médicament destiné à améliorer la qualité de la peau en agissant sur la fonction barrière de la peau. 25 27. Utilisation d'une combinaison selon l'une des revendications 6 ou 7, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de pathologies impliquant une altération, notamment une diminution, de la différenciation des kératinocytes. 20