FR 2913502 A1 20080912 FR 0701583 A 20070305 -- 1 - "Procédé de dosage d'ergostérol et de mycotoxines" La présente invention concerne un procédé de dosage d'ergostérol aéroporté et d'au moins une mycotoxine polaire aéroportée à partir d'un échantillon unique prélevé dans un environnement intérieur. Par environnement intérieur on entend un espace confiné à l'intérieur d'un bâtiment qui est aéré de façon non continu. Des exemples d'environnements intérieurs peuvent être trouvés dans les habitations, les musées, les églises, les caves, les monuments historiques, les bâtiments administratifs, les écoles et les hôpitaux. Depuis les années 70 et le premier choc pétrolier, la politique d'économie d'énergie mise en œuvre a entraîné un confinement des habitations avec notamment l'isolation accrue des bâtiments. Cette politique associée à la généralisation d'équipements ménagers générateurs de vapeur, tels que des lave-linge et des sèche-linge, a eu pour conséquence une augmentation de l'humidité relative favorable à la prolifération des microorganismes, notamment des moisissures, sur la plupart des supports tels que des matériaux de construction. Les locaux sont alors susceptibles de constituer des niches écologiques pour le développement de ce type de microorganismes. Ce phénomène s'est ainsi traduit par une augmentation du nombre de locaux contaminés par les moisissures depuis les trente dernières années. La présence de moisissures dans les environnements intérieurs n'est pas sans conséquences sanitaires. En effet, de nombreuses études ont démontré leur rôle à la fois dans la dégradation des matériaux et des ouvrages qu'elles colonisent, mais également dans l'apparition de symptômes chez les occupants de locaux comportant des moisissures. - 2 -Au cours des deux dernières décennies, de nombreuses études réalisées en Amérique du Nord et en Europe ont mis en évidence que, dans certaines circonstances d'exposition, ces microorganismes pouvaient être responsables de l'apparition de maladies notamment respiratoires telles que des allergies, infections ou toxi-infections. A ce jour, la méthode culturale est préconisée pour l'évaluation de l'exposition des personnes aux aérosols fongiques dans l'habitat. Cependant, cette mesure ne permet d'obtenir qu'un cliché du niveau de contamination, les échantillonnages associés à cette méthode excédant rarement 2 minutes de collecte. De ce fait, cette technique semble mal adaptée à l'évaluation de la biocontamination des locaux soumise à des perturbations discontinues et à la génération de bouffées polluantes ponctuelles difficilement mesurables par une mesure instantanée. De plus, la méthode culturale ne permet pas d'accéder à la biomasse totale puisque seule la fraction cultivable est considérée. Pourtant, cette fraction ne représente qu'une faible proportion des particules susceptibles d'entraîner des manifestations immuno-allergiques ou toxique. Dans le cadre de l'évaluation de l'exposition des personnes aux mycotoxines dans les environnements intérieurs, la méthode adoptée classiquement consiste à rechercher et à identifier les souches toxinogènes. Or, la production de toxines par ces souches n'est pas systématique. La littérature fait en effet référence à de nombreux facteurs qui pourraient influencer leur production : la température, l'activité de l'eau, le pH, la concentration d'oxygène et la présence d'autres microorganismes. Aucune méthode permettant d'accéder aux mycotoxines potentiellement inhalées n'a encore été proposée. Or la mesure des aérosols de mycotoxines apparaît être le moyen le plus direct pour évaluer le - 3 - danger lié à l'exposition de ces moisissures toxiques. De plus, la réponse de ces techniques de mesure est longue puisqu'il est nécessaire d'attendre la croissance en laboratoire des microorganismes prélevés avant de pouvoir réaliser l'analyse. Un objet de la présente invention est donc de pallier à tout ou partie des inconvénients cités ci-dessus. C'est ainsi que la Société Demanderesse a eu le mérite de développer après de longs et approfondis travaux de recherche un procédé de dosage d'ergostérol aéroporté et de mycotoxines polaires aéroportées, à partir d'un échantillon unique. Ce procédé permet la détection d'une contamination fongique dans un environnement intérieur même en l'absence de signes visibles de contaminations. Le procédé de dosage d'ergostérol aéroporté et de mycotoxines polaires aéroportées, selon l'invention comprend les étapes suivantes : a. prélèvement d'un échantillon de particules 20 aéroportées dans un environnement intérieur ; b. extraction par un liquide de l'ergostérol et d'au moins une mycotoxine polaire, à partir de l'échantillon obtenu à l'étape a) ; c. dosage de l'ergostérol à partir d'une fraction 25 de l'extrait obtenu à l'étape b) ; d. dosage de la ou des mycotoxine(s) polaire(s) à partir d'une autre fraction de l'extrait obtenu à l'étape b). Le procédé de dosage selon l'invention permet le dosage 30 de l'ergostérol aéroporté et d'au moins une mycotoxine polaire aéroportée à partir d'un prélèvement de particules aéroportées dans un environnement intérieur. De préférence, en plus de l'ergostérol aéroporté, on dose plusieurs mycotoxines polaires aéroportées à la 35 fois. Les mycotoxines polaires susceptibles d'être dosées par le procédé selon l'invention comprennent les trichotécènes polaires, la stérigmatocystine, la 5- - 4 - méthoxy-stérigmatocystine, et les ochratoxines. Les trichotécènes polaires comprennent notamment la T2-toxine, le déoxynivalénol, la satratoxine H, la satratoxine G, la T2-tetrataol, le 3-acétyl- déoxynivalénol, la roridine A, la roridine E, la roridine L-2, le verrucarol, le tricodermol, la toxine Ht-2. La famille des ochratoxines comprend notamment l'ochratoxine A. Des mycotoxines polaires préférées comprennent la T2-toxine, le déoxynivalénol, la satratoxine H, la satratoxine G, la stérigmatocystine, la 5-méthoxy-stérigmatocystine, et l'ochratoxine A. Le prélèvement de l'échantillon de particules aéroportées est avantageusement réalisé avec un capteur individuel de poussières (CIP) ou un capteur atmosphérique de poussières (CAP). De préférence le capteur est équipé d'une tête de prélèvement permettant uniquement le prélèvement des particules aéroportées susceptibles d'être respirées. On entend par particules aéroportées susceptibles d'être respirées des particules de la fraction inhalable dont le diamètre aérodynamique de coupure, Daeso, est inférieur ou égal à 100pm. La contamination fongique d'un environnement intérieur est un phénomène soumis à l'aéraulique et à la formation abrupte de vagues de pollution qui sont difficiles à mesurer par une collecte instantanée des contaminants présents dans l'air ambiant. Une collecte instantanée des contaminants fongiques présenterait donc un risque important de surestimation ou de sous- estimation de la contamination réelle selon le moment de la collecte. Par exemple, une collecte au moment du dégagement d'une vague de contaminants résulterait en une surestimation de la contamination réelle. Afin d'obtenir un échantillon qui est représentatif de la contamination réelle d'un environnement intérieur, il est donc préféré de réaliser le prélèvement de l'échantillon de particules aéroportées durant une période prolongée, de préférence de 5 à 15 jours, et - 5 - plus préférentiellement encore d'environ 7 jours. De cette façon, l'échantillon prélevé est plus représentatif de l'exposition moyenne des occupants aux contaminants fongiques. A l'étape b) du procédé selon l'invention, l'échantillon de particules aéroportées prélevé à l'étape a) est soumis à une extraction par liquide afin d'extraire à la fois l'ergostérol et au moins une mycotoxine polaire. Etant donné que tant l'ergostérol que les mycotoxines à extraire sont des composés polaires, on utilisera un solvant polaire ou un mélange de solvants polaires en tant que liquide d'extraction. Un système de solvants particulièrement préféré est le mélange eau/méthanol dans un rapport volumique de 40 : 60 à 60 : 40, de préférence de 50 : 50. Ce système de solvant permet d'extraire à la fois l'ergostérol et des mycotoxines polaires, aéroportés. Ainsi, l'extrait obtenu à l'issue de l'étape b) du procédé de dosage selon l'invention peut être utilisé à la fois pour le dosage de l'ergostérol aéroporté et de mycotoxines polaires aéroportées. Le dosage de l'ergostérol est de préférence réalisé par chromatographie liquide haute performance suivi d'une détection par spectroscopie UV (HPLC/UV). La phase mobile est de préférence du méthanol et la phase stationnaire est composée de silice greffée C18 (Colonne C18 en Phase Inverse). Le dosage de la ou des mycotoxine(s) polaire(s) aéroportée(s) est généralement réalisé par chromatographie liquide haute performance suivi d'une détection par spectroscopie UV (HPLC/UV). La phase mobile est de préférence un mélange méthanol/eau dans un rapport volumique, de 80 : 20 à 90 : 10, de préférence de 85 : 15. la phase stationnaire est composée de silice greffée C18 (Colonne C18 en Phase Inverse). - 6 - Etant donné que les mycotoxines polaires aéroportées ne sont présentes dans l'air ambiant que dans de très faibles quantités, typiquement de l'ordre du ng/g de poussière, leur dosage nécessite généralement une purification et concentration préalables de l'extrait obtenu à l'issue de l'étape b). De préférence, la purification et la concentration de l'extrait obtenu à l'issue de l'étape b) sont réalisées par extraction en phase solide (SPE : Solid Phase Extraction) en phase inverse. Les mycotoxines polaires présentes dans l'extrait obtenu à l'issue de l'étape b) sont retenues quantitativement par la cartouche SPE en phase inverse puis éluées avec du méthanol. De préférence le volume de méthanol utilisé pour l'élution est inférieur au volume de l'extrait soumis à la SPE. L'avantage de la SPE par rapport à d'autres techniques de concentration est qu'elle permet également la purification de l'échantillon. Ainsi, une partie des impuretés sont retenues sur la cartouche lors de l'élution des mycotoxines polaires. L'éluat ainsi obtenu est ensuite soumis au dosage d'au moins une mycotoxine polaire par chromatographie liquide haute performance suivi d'une détection par spectroscopie UV (HPLC/UV). Le taux de récupération des mycotoxines polaires après 25 la SPE est élevé. Pour la stérigmatocystine il est, par exemple, de 97%. Dans un mode de réalisation de la présente invention, l'étape de dosage d) comprend le dosage simultané de plusieurs mycotoxines polaires aéroportées. De 30 préférence on dose simultanément la T2-toxine, le déoxynivalénol, la satratoxine H, la satratoxine G, la stérigmatocystine, la 5-méthoxy-stérigmatocystine, et l'ochratoxine A, et plus préférentiellement le déoxynivalénol, la stérigmatocystine et l'ochratoxine 35 A. L'association du dosage de l'ergostérol aéroporté à celui d'au moins une mycotoxine polaire, aéroportée, - 7 permet d'évaluer à la fois le risque de contamination fongique globale d'un environnement intérieur et l'exposition des occupants aux toxines liées à une telle contamination. Par ailleurs, les méthodes traditionnelles utilisant la culture permettent simplement d'apprécier un instantané du niveau de contamination et de l'exposition des occupants, alors que le procédé de dosage selon l'invention permet l'évaluation d'une éventuelle contamination pendant une période prolongée de plusieurs jours, par exemple d'une semaine. De plus, étant donné que le taux de transfert substrat/air des mycotoxines est dépendant du support de croissance, le dosage de ces toxines à partir de biomasse déposée sur les matériaux contaminés ne permet pas d'évaluer l'exposition des occupants. En revanche, le dosage des mycotoxines polaires aéroportées, selon la présente invention permet d'évaluer l'exposition réelle des occupants aux mycotoxines polaires, car il tient réellement compte de la fraction respirables des mycotoxines polaires présentes dans un environnement intérieur. En d'autres termes, la mesure directe des mycotoxines polaires aéroportées permet d'estimer les concentrations de ces toxines susceptibles d'être respirées par les occupants de locaux contaminés. En ce qui concerne, le dosage de l'ergostérol selon la présente invention, il présente l'avantage de permettre non seulement le dosage de la fraction de spores cultivables, mais aussi de la fraction de spores non cultivables, qui sont néanmoins susceptibles d'entraîner des manifestations immuno-allergiques voire toxiques. La fraction de spores non cultivables comprend notamment des fragments de parois de spores, qui ne peuvent pas être comptabilisés par une culture cellulaire. Ainsi, le procédé de dosage selon l'invention permet, contrairement aux méthodes de l'art antérieur, de tenir compte de la totalité de spores et fragments de spores susceptibles d'entraîner des -8- problèmes de santé, tels que des manifestations immunoallergiques voire toxiques, et notamment de l'asthme. Le dosage simultané de l'ergostérol et d'au moins une mycotoxine polaire, aéroportés, a aussi l'avantage d'être économique, car il permet de réaliser deux dosages différents à partir d'un seul prélèvement in situ, ce qui est non seulement un gain financier mais aussi un gain de temps. Le procédé de dosage simultané de l'ergostérol aéroporté et d'au moins une mycotoxine aéroportée est particulièrement utile dans l'évaluation d'une contamination fongique d'un environnement intérieur et des risques de santé liés à une telle contamination pour ses occupants, car il prend en compte différents types de toxines qui se trouvent dans l'air ambiant et qui peuvent donc être respirés par les occupants des locaux. EXEMPLE 1 : Dosage de l'ergosterol dans l'air ambiant ETAPE 1 : Prélèvement d'échantillons d'air sur différents sites Des prélèvements d'air sont réalisés dans différents - 9 - sites : dans un laboratoire (ventilation double flux avec filtration haute efficacité de l'air), dans un bureau paysager occupé (ventilation double flux) et dans 6 logements (habitations 1 à 6) et 2 écoles (école A, école B). On effectue un premier prélèvement à l'intérieur de chaque local à 1 mètre du sol, ainsi qu'un second prélèvement à l'extérieur de chaque local, également à 1 mètre du sol. La collecte des particules aéroportées est effectuée à l'aide de capteurs individuels de particules (CIP, ARELCO). L'air est aspiré à un débit de 10 L/min. Les capteurs sont munis d'une coupelle rotative contenant une mousse en polyuréthane surmontée d'une tête de prélèvement spécifique (sélecteur) permettant de sélectionner la fraction inhalable. Le temps de collecte est de sept jours. ETAPE 2 : Extraction de l'ergostérol et de mycotoxines Le protocole d'extraction consiste à placer les échantillons dans 15 mL de solvant (eau-méthanol (50:50) puis à les Boume':tre aux ultrasons durant 1 heure. L'extrait est ensuite filtré à travers une membrane de 0,2 pm. L'échantillon est scindé en deux aliquotes (1 mL et 25 14 mL). ETAPE 3 : Dosage de l'ergostérol Après extraction des structures fongiques (spores et hyphes), l'ergostérol contenu dans l'aliquote de 1 mL 30 est dosé par HPLC. Ce dosage, qui s'appuie sur l'absorbance de cette molécule à 281 nm dans l'UV, permet la détection et la quantification de la biomasse fongique collectée. Les paramètres de l'analyse sont les suivants : 35 - Débit de la phase mobile (méthanol 100 %) de 1,5 mL/min, - Une température constante de 38 C, -10-Pourcentage du temps de dégazage durant les manipulations (Sparge) : 50 % - Volume de la boucle : 200 L Les concentrations d'ergostérol mesurées lors de ces mesures ont atteint un maximum de 6,47 ng/m3 pour l'habitation 3. Plusieurs situations d'aérobiocontamination ont été observées : Pour 5 sites (habitations 4, 5 ; Ecoles A, B et le bureau paysager), les concentrations extérieures et intérieures ne sont pas significativement différentes. Les locaux évalués sont a priori exempts de sources endogènes fongiques. Les champignons microscopiques présents dans l'air intérieur sont principalement issus de l'extérieur. Le niveau de contamination atteint dans ces environnements est alors essentiellement le résultat de variations saisonnières. Nous avons observé sur 4 sites (habitations 1, 2, 6 et le laboratoire) une teneur à l'intérieur plus faible qu'à l'extérieur. Il n'existe pas de source endogène dans ces locaux. Le système de ventilation et éventuellement de climatisation assure alors une réduction du transfert d'environ 50 % de la pollution fongique extérieure. Le laboratoire équipé d'un système de filtration spécifique (filtre très haute efficacité) limite totalement la pénétration de l'ensemble des contaminations fongiques. Dans le cas du logement 3, la concentration intérieure est deux fois plus importante que le niveau de contamination extérieur. Il existe donc une source de contamination fongique dans le local: matériaux contaminés, plantes ou encore une contamination du système de ventilation. Ainsi, les principales situations de contamination intérieure ont été examinées, les résultats obtenus - 11 - démontrent que la mesure de l'ergostérol est une méthode valable pour évaluer quantitativement la flore fongique aéroportée. EXEMPLE 2 : ETAPE 1 : Prélèvement d'un échantillon d'air De manière à explorer le mode d'exposition des personnes aux mycotoxines nous avons, dans une enceinte de 1m3, simulé une perturbation aéraulique sur un matériau contaminé par Aspergillus versicolor. Dans ce volume était positionné un capteur individuel de particules (CIP, Arelco). L'air est aspiré à un débit de 10 L/min. Les capteurs sont munis d'une coupelle rotative contenant une mousse en polyuréthane surmontée d'une tête de prélèvement spécifique (sélecteur) permettant de sélectionner la fraction inhalable. Cette fraction regroupe les particules ayant un diamètre aérodynamique de coupure (Da50) inférieur à 100 pm (AFNOR, 1996). Le temps de collecte est de sept jours. Dans cette approche, nous avons utilisé comme substrat de croissance un papier peint vinyle additionné de solution nutritive, ce matériau ayant été pertinent pour sa représentativité dans les environnements intérieurs. La surface de matériau utilisée est de 0,5 m2, ce qui, selon certains auteurs, représente une contamination dite moyenne pouvant engendrer des risques sanitaires (Chasseur, C. et Nolard, N., Les champignons dans l'habitat, CSTC magazine (2003),pp.3-15). Après 10 jours d'incubation, nous procédons a l'aérosolisation avec une vitesse d'air de 100 cm/s puis nous collectons les particules aérosolisées. Le profil granulométrique de l'aérosol produit par cette perturbation est présenté sur la figure 2. L'air de la chambre environnementale est renouvelé 32 fois par le CIP afin de récupérer l'ensemble des - 12 - particules générées. ETAPE 2 : Extraction de l'ergostérol et de mycotoxines Le protocole d'extraction consiste à placer l'échantillon récupéré avec le capteur de particule dans 15 mL de solvant (eau/méthanol (50:50) puis à les soumettre aux ultrasons durant 1 heure. L'extrait est ensuite filtré à travers une membrane de 0,2 pm. L'échantillon est scindé en deux aliquotes (1 mL et 14 mL). ETAPE 3 : Dosage de l'ergostérol Après extraction des structures fongiques (spores et hyphes), l'ergostérol contenu dans l'aliquote de 1 mL est dosé par HPLC. Ce dosage, qui s'appuie sur l'absorbance de cette molécule à 281 nm dans l'UV, permet la détection et la quantification de la biomasse fongique collectée. Les paramètres de l'analyse sont les suivants : Débit de la phase mobile (méthanol - 100 %) de 1,5 mL/min, - Une température constante de 38 C, - Pourcentage du temps de dégazage durant les manipulations (Sparge) : 50 % - Volume de la boucle : 200 L La quantité d'ergostérol retrouvé dans l'échantillon est de 0,038 ng. ETAPE 4 : Dosages de mycotoxines polaires Le deuxième aliquote de 14 mL est employé pour l'extraction et la purification des mycotoxines par extraction en phase solide (SPE : Solide Phase Extraction), le protocole mis en oeuvre comporte trois - 13 - phases : - Percolation de la solution à travers une cartouche de silica gel C18, en phase inversée préalablement conditionnée avec 2 mL de méthanol et 2 mL d'eau ultrapure. La mycotoxine est piégée dans la cartouche tandis que les solvants et une partie des impuretés sont éliminés. - Rinçage des impuretés résiduelles avec 4 mL d'eau ultrapure. - Elution de la mycotoxine par désorption sélective avec 2 mL de méthanol. L'analyse des mycotoxines a été réalisée avec les paramètres suivants . - Débit de la phase mobile (méthanol/eau - 85/15 %) de 1 mL/min, - Une température constante de 30 C, - Pourcentage du temps de dégazage durant les manipulations (Sparge) : 50 - Volume de la boucle de 200 L. La quantité de stérigmatocystine aéroportée retrouvé dans le second aliquote est de 107 ng. Ces résultats confirment que les techniques de collecte et de dosage mises au point permettent à la fois la quantification de l'ergostérol et de la stérigmatocystine aéroportée. Lors de cet essai nous avons également pu identifier la présence d'une autre mycotoxine : la 5-méthoxystérigmatocystine. L'analyse des quantités de stérigmatocystine produites sur le matériau avant l'aérosolisation indique qu'après 10 jours d'incubation, la moisissure a produit 29 ng de cette toxine par cm2 de matériau ce qui, ramené à la dimension de l'échantillon (5000 cm2) correspond à une - 14 -masse totale de stérigmatocystine sur le support égale à 145 pg. Par conséquent, il apparaît que dans ces conditions d'essais 0,07% des quantités de stérigmatocystine produite ont été aérosolisées.5 REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage de l'ergostérol aéroporté et d'au moins une mycotoxine polaire aéroportée, comprenant les étapes suivantes : a. prélèvement d'un échantillon d'ergostérol aéroporté et d'au moins une mycotoxine polaire aéroportée dans un environnement intérieur ; b. extraction par un liquide de l'ergostérol et de la ou des mycotoxine(s) polaire(s), à partir de l'échantillon obtenu à l'étape a) ; c. dosage de l'ergostérol à partir d'une fraction de l'extrait obtenu à l'étape b) ; d. dosage de la ou des mycotoxine(s) polaire(s) à 15 partir d'une autre fraction de l'extrait obtenu à l'étape b). 2. Procédé de dosage de l'ergostérol aéroporté et d'au moins une mycotoxine polaire aéroportée, 20 selon la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide d'extraction de l'étape b) est un mélange eau/méthanol dans un rapport volumique de 40 :60 à 60 :40, de préférence de 50 :50. 25 3. Procédé de dosage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le dosage de l'ergostérol est réalisé par HPLC/UV. 4. Procédé de dosage selon l'une quelconque des 30 revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le dosage de la ou des mycotoxine(s) polaire(s) est réalisé par extraction en phase solide (SPE) en phase inverse suivie de HPLC/UV. 35 5. Procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 4,, caractérisé en ce que le prélèvement de l'échantillon d'ergostérol aéroporté et d'au moins une mycotoxine polaire- 16 - aéroporté et d'au moins une mycotoxine polaire aéroportée, est réalisé avec un capteur individuel de poussières (CIP) ou un capteur atmosphérique de poussières (CAP). 6. Procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le prélèvement de l'échantillon d'ergostérol aéroporté et d'au moins une mycotoxine polaire aéroportée, est réalisé durant une période de 5 à 15 jours, de préférence durant environ 7 jours. 7. Procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la ou des mycotoxine(s) polaire(s) aéroportée(s) est/sont choisie(s) dans le groupe comprenant les trichotécènes polaires, la stérigmatocystine, la 5-méthoxy-stérigmatocystine, et les ochratoxines et leurs mélanges. 8. Procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la ou des mycotoxine(s) polaire(s) aéroportée(s) est/sont choisie(s) dans le groupe comprenant la T2-toxine, la déoxynivalénol, la satratoxine H, la satratoxine G, la stérigmatocystine, la 5-méthoxystérigmatocystine et l'ochratoxine A et leurs mélanges.30