FR 2910492 A1 20080627 FR 0655721 A 20061220 1 La présente invention vise un procédé pour obtenir une diversité de bactériophages recombinants dont les protéines de ciblage ont été modifiées de manière aléatoire, ainsi que des banques de bactériophages pouvant être 5 obtenus par ce procédé. Les bactériophages se présentent comme des virus capables d'infecter spécifiquement les bactéries et de s'y répliquer. Leur existence a été mise en évidence au début du XXeme siècle par le Britannique Frederick Twort et le Québécois Félix d'Hérelle. 10 Les bactériophages occupent toutes les niches écologiques où se trouvent des bactéries. Ils se manifestent principalement sous deux formes : la forme lysogénique, par laquelle ils peuvent demeurer de manière quiescente à l'intérieur de leur hôte, ou bien sous forme lytique, lorsqu'ils se répliquent de manière active en lysant la cellule bactérienne. La forme lytique amène les 15 bactériophages à être libéré en grand nombre dans l'environnement sous une forme infectieuse. Afin de conserver leur caractère infectieux vis-à-vis de leurs hôtes qui connaissent parfois des mutations rapides, les bactériophages sont amenés à évoluer constamment. De ce fait, Ils présentent naturellement un degré élevé 20 de spécialisation pour les espèces bactériennes qu'ils parasitent et sont très diversifiés. Dès leur découverte, les bactériophages ont été considérés comme un moyen de lutter contre les infections bactériennes, et ce bien avant l'ère des antibiotiques. 25 La démarche consistant à identifier dans la nature des bactériophages spécifique d'une bactérie pathogène afin de traiter les patients infectés par cette bactérie s'est ainsi développée en Russie et dans les pays de l'ancien bloc soviétique pendant la première moitié du XXeme siècle. Cependant l'emploi des antibiotiques, dont le spectre est généralement 30 beaucoup plus large, s'est généralisé dans la seconde moitié du XXeme siècle de façon massive, sans exploiter toutes les possibilités offertes par les bactériophages. 2910492 2 Aujourd'hui, face à l'apparition de souches bactériennes multirésistantes aux antibiotiques, et au vu des difficultés rencontrées pas la communauté scientifique pour mettre au point de nouveaux antibiotiques, les bactériophages suscitent un nouvel intérêt pour le traitement des infections bactériennes difficiles à éradiquer, notamment en cas de contaminations nosocomiales [Thiel, K., Nature Biotechnology, 2004, 22 :31-36]. Certaines difficultés persistent toutefois dans l'utilisation des bactériophages, notamment dans le fait que les bactéries peuvent échapper aux bactériophages en masquant ou en modifiant les éléments constitutifs de 10 leur paroi externe. Le cycle de réplication des bactériophages nécessite, en effet, une étape de reconnaissance et d'adhésion du bactériophage à la paroi de la bactérie hôte, laquelle conditionne la possibilité pour le bactériophage d'infecter la bactérie, c'est-à-dire d'injecter le matériel génétique contenu dans sa capside 15 à l'intérieur du cytoplasme de la bactérie. Le bactériophage T4, par exemple, qui est un bactériophage qui infecte les bactéries de type Escherichia coli, a un cycle de réplication qui dure environ 30 minutes à 37 C. Ce cycle de réplication débute immédiatement après la reconnaissance de la bactérie hôte par le bactériophage, par la phase 20 d'absorption et de pénétration. Il se traduit par l'arrêt immédiat de l'expression des gènes de la bactérie hôte, la synthèse des enzymes nécessaires à la réplication du bactériophage, 5 minutes après l'infection, puis la réplication de l'ADN (démarrant après 10 minutes) et la formation du virus (démarrant après 12 minutes). Le cycle de réplication conduit à l'éclatement de la bactérie (après 25 30 minutes) et la libération dans l'environnement d'environ cinquante bactériophages par bactérie lysée. L'adhésion à la bactérie est essentiellement assurée par les protéines de la plate-forme basale (baseplate) servant d'ancrage au bactériophage et la reconnaissance est assurée plus particulièrement par des protéines formant les 30 filaments périphériques, appelées fibres de queue . Néanmoins, les protéines de fibres de queue et du baseplate peuvent être à la fois impliquées dans la reconnaissance et l'adhésion du bactériophage à la paroi bactérienne. 2910492 3 L'ensemble de ces protéines dites de ciblage est représenté sur les figures 1 et 3 de la présente demande. Parmi les protéines impliquées dans cette reconnaissance ou cette adhésion chez le bactériophage T4, on peut citer plus particulièrement les 5 glycoprotéines GP12 de la plate forme basale, et les glycoprotéines GP 36, GP 37 et GP 38 des fibres de queue. Afin de limiter l'émergence de bactéries résistantes au dispositif de reconnaissance des bactériophages, il est généralement proposé d'utiliser simultanément différents formes de bactériophages capables de cibler une 10 même bactérie. Ces bactériophages sont prélevés dans la nature ou issus de collections, pour former ensemble ce qu'on appelle un cocktail de bactériophages . Cependant, il convient pour la mise au point de ces cocktails de 15 bactériophages de sélectionner individuellement et rigoureusement les bactériophages qui les composent, en s'assurant, notamment, que ces bactériophages sont lytiques et non lysogèniques ou partiellement lysogèniques, comme c'est le cas souvent des bactériophages prélevés dans le milieu naturel. 20 La nécessité de tester individuellement les bactériophages pour s'assurer de leur efficacité réelle rend le développement des cocktails de bactériophages long et fastidieux, et ce d'autant qu'il faut prévoir un cocktail différent pour chaque bactérie considérée. La demande WO 01/51066 décrit une telle préparation de 25 bactériophages comprenant six bactériophages différents utilisée en tant qu'agent de conservation de produits alimentaires frais pour détruire la bactérie Listeria monocytogenes, responsable de la listériose. Cette préparation naturelle est conditionnée en pulvérisateur pour être pulvérisée sur de la viande ou des produits laitiers. Elle est sans danger pour l'homme, les 30 animaux ou les plantes, car les bactériophages ne peuvent infecter que des bactéries du genre Listeria et non les cellules des organismes pluricellulaires. Pour remédier aux problèmes posés par la sélection des 2910492 4 bactériophages naturels, il est proposé dans la demande WO 06/066224 une méthode pour obtenir des bactériophages dont les protéines de ciblage sont modifiées en vue de cibler spécifiquement un facteur de virulence donné. Les facteurs de virulence sont des molécules décrites comme étant nécessaires à la 5 bactérie pour développer une infection. Ces molécules sont considérées comme des éléments stables, moins susceptibles de varier au cours de l'infection que les éléments de structures externes comme, par exemple, les lipopolysaccharides. Plus particulièrement, cette méthode propose de sélectionner une protéine issue d'un bactériophage naturel (par exemple p37 du bactériophage T4) capable de reconnaître un facteur de virulence décrit dans la littérature (par exemple OmpC d'E.coli), de transférer le gène codant cette protéine dans un bactériophage lambda et d'utiliser le bactériophage lambda pour modifier cette protéine. La modification de la protéine consiste à opérer des échanges entre les différents domaines impliqués dans la reconnaissance du facteur de virulence (par exemples les domaines His de gp37). Les bactériophages lambda sont ensuite testés pour leur capacité à adhérer au facteur de virulence ciblé. Cette méthode, qui s'apparente à la technique du bactériophage display, permet d'isoler différents variants du bactériophage lambda capables de cibler le facteur de virulence, et ainsi de disposer de différentes protéines de ciblage. Les gènes correspondants à ces différentes protéines de ciblage, peuvent, par la suite, être transférés dans des bactériophages infectieux. Ces bactériophages peuvent alors constituer des cocktails de bactériophages actifs vis-à-vis de la bactérie porteuse du facteur de virulence ciblé au départ. Cette méthode constitue un progrès dans l'obtention de bactériophages diversifiés pour la mise au point de cocktails de bactériophages. Néanmoins, il reste que de tels cocktails ne visent que l'espèce bactérienne exprimant le facteur de virulence ciblé initialement. Cette méthode ne peut donc être mise en oeuvre que pour des 30 bactéries pathogènes cultivables sur lesquelles une identification préalable des facteurs de virulence a pu être effectuée. Pour rendre l'emploi des bactériophages plus universel, il serait utile de disposer de bactériophages infectieux vis-à-vis d'un plus grand nombre 2910492 5 d'espèces, par exemple, en créant des bactériophages dont le spectre d'infectivité serait modifié ou élargi. De tels bactériophages pourraient être utilisés à l'encontre de nouvelles espèces bactériennes, notamment à l'encontre de bactéries pathogènes émergentes ou à l'origine d'infections nosocomiales. 5 Néanmoins, la production de bactériophages modifiés dans leur spectre d'infectivité se heurte à la contrainte technique que l'obtention des bactériophages est dépendante de l'hôte bactérien dans lequel le bactériophage est transformé puis multiplié. Les étapes de modification génétique des bactériophages comprennent généralement plusieurs étapes de 10 réplication dans un seul hôte bactérien. Dans les expériences décrites dans les documents de l'art antérieur précités, de nombreux cycles de réplication sont nécessaires pour modifier les bactériophages servant à cibler les facteurs de virulence. La recombinaison homologue qui est la technique la plus souvent rencontrée pour transformer le 15 génome des bactériophages implique de nombreux cycles de réplication et de sélection successifs chez la bactérie. Or, les bactériophages modifiés, s'ils parviennent à acquérir la capacité d'infecter des hôtes différents de leurs hôtes habituels, peuvent aussi perdre la capacité d'infecter l'hôte utilisé pour leur réplication. Dès lors, ils se trouvent éliminés de la sélection et échappent à 20 l'expérimentateur. II en résulte une importante perte de diversité des bactériophages modifiés susceptibles d'être obtenus. Pour remédier aux difficultés précitées, la présente invention propose un nouveau procédé consistant à diversifier les protéines de ciblage des bactériophages par insertion dans leurs gènes de séquences d'ADN produites 25 de manière aléatoire. Ce procédé est conçu pour être mis en oeuvre avec un minimum de cycle de réplication dans la bactérie hôte, voir un seul. Ce procédé permet d'obtenir une grande diversité de bactériophages recombinants sous forme de banques de bactériophages infectieux prêts à l'emploi, utiles pour traiter, par exemple, des bactéries émergentes ou mutantes. Le procédé selon l'invention est détaillé ci-après, ainsi que les différents objets pouvant en résulter. 2910492 6 Figure 1 : représentation du bactériophage T4 montrant les différentes éléments constitutifs du bactériophage. Les protéines considérées dans le 5 cadre de la présente invention sont encadrées. Figure 2 : représentation du génome complet du bactériophage T4. Les gènes cités dans la présente demande sont indiqués à l'aide d'une flèche perpendiculaire aux cadres ouverts de lecture. Figure 3 : représentation en trois dimensions de la plate-forme basale 10 du bactériophage et des fibres de queue impliquées dans la reconnaissance et l'adhésion du bactériophage à la bactérie hôte, permettant de visualiser les protéines de ciblage modifiées selon le procédé de l'invention. Figure 4 : schéma résumant le principe d'obtention d'une banque de bactériophages recombinants selon l'invention. Le cadre en haut à gauche 15 représente une bactérie hôte comprenant 3 vecteurs de recombinaison homologues visant à introduire des oligonucléotides dont la séquence est produite de manière aléatoire dans trois gènes codant les protéines de ciblage du bactériophage. Ces vecteurs représentent des constructions d'ADN au sens de la présente invention, porteuses d'une grande diversité génétique. Après 20 infection par un bactériophage et recombinaison homologue, un grand nombre de bactériophages (banque de bactériophages) ayant des protéines de ciblage modifiées sont obtenus, formant une source de diversité de ciblage . Les bactériophages obtenus sont criblés vis-à-vis de nouveaux hôtes potentiels (sélection positive) afin de sélectionner des bactériophages capables d'infecter 25 ces hôtes. Ils peuvent être également testés sur des hôtes non bactériens (cellules eucaryotes) pour s'assurer qu'ils ne sont pas dangereux pour l'homme ou les animaux. Figure 5 : comparaison de la séquence polypeptidique de GP12 du bactériophage T4 (ligne haute) et de son homologue présente dans le 30 bactériophage RB 69 (ligne basse) selon le protocole BLAST. Les acides aminés communs aux deux protéines sont indiqués sur la ligne intermédiaire. Le symbole + signifie que les acides aminés sont similaires. La partie N- terminale encadrée correspond au domaine de ces deux protéines qui permet 2910492 7 l'ancrage du bactériophage sur la paroi de la bactérie. C'est ce domaine d'ancrage, qui est muté de manière aléatoire puis insérée par recombinaison homologue dans le génome du bactériophage selon l'invention. Les segments internes Dl à D4 correspondent aux séquences de la protéine qui sont 5 conservées au cours du procédé de diversification aléatoire mis en oeuvre par PCR selon l'invention. Figure 6 : figure récapitulant les étapes du procédé par PCR mis en oeuvre selon l'invention pour obtenir, notamment, une copie du domaine d'ancrage de gp12 dans laquelle sont insérés des oligonucléotidiques produits 10 de manière aléatoire. Les segments internes Dl à D4 dont on souhaite conserver l'identité de la séquence sont figurés par des rectangles. Ces domaines correspondent à ceux mentionnés dans la figure 5 ci-dessus. Les deux segments externes délimitent la séquence du domaine d'ancrage de gp12. A : le domaine d'ancrage de gp12 est amplifié par PCR haute fidélité. B : 15 4 PCR erreur sont réalisées de manière indépendante à l'aide des oligonucléotides mentionnés. C : Les produits d'amplifications obtenus en B sont purifiés et rassemblés dans une même réaction de PCR haute fidélité. Lesdits produits d'amplification se chevauchent si bien qu'il est possible d'assembler les différents fragments, mais à condition que les domaines Dl à 20 D4 soient suffisamment conservés pour pouvoir hybrider les amorces utilisées. D : Il résulte de la PCR réalisée à l'étape C, deux fragments PA-1 et PB-1 qui sont assemblés en utilisant les amorces correspondant aux segments externes du domaine d'ancrage de GP12. Au final, on obtient une copie du domaine d'ancrage de gp12 dont la séquence a été modifiée de manière aléatoire sauf 25 au niveau des domaines Dl à D4 dont l'identité a été conservée. L'invention porte donc sur un procédé de préparation de bactériophages génétiquement modifiés sous la forme d'une banque de bactériophages recombinants Ce procédé comprend les étapes suivantes : 30 i) on transforme une bactérie hôte à l'aide d'au moins une construction d'ADN permettant l'insertion d'un oligonucléotide dont la séquence a été produite de manière aléatoire, dans au moins un gène codant une protéine de ciblage d'un bactériophage ; 2910492 8 ii) on infecte les bactéries transformées à l'étape i) avec ledit bactériophage ; iii) on place les bactéries infectées à l'étape ii) dans des conditions telles que les bactériophages puissent se répliquer, et qu'au moins une partie 5 des oligonucléotides produits de manière aléatoire puissent s'insérer dans au moins un gène codant une protéine de ciblage dudit bactériophage; iv) on récolte les bactériophages qui se sont répliqués dans les bactéries infectées à l'étape ii). 10 1) Constructions d'ADN permettant l'insertion d'un oligonucléotide produit de manière aléatoire. Selon l'invention des oligonucléotides produits de manière aléatoires sont insérés dans les gènes codant les protéines de ciblage des 15 bactériophages. Cette insertion a pour but d'introduire de la variabilité génétique au niveau de certains segments des protéines de ciblage codé par lesdits gènes. Les protéines ainsi traduites, sont susceptibles de présenter des propriétés de reconnaissance ou d'adhésion différentes des protéines initiales du bactériophage. 20 Les protéines de ciblage du bactériophage se définissent comme des protéines qui participent à la reconnaissance et à l'adhésion du bactériophage à la bactérie hôte. Ces protéines sont de préférence choisies parmi celles constituant les fibres de queue ou de la plateforme basale du bactériophage T4. Une protéine particulièrement adaptée au procédé selon l'invention est la 25 protéine GP12 de la plate forme basale dont la séquence nucléotidique correspond à SEQ ID N 1. D'autres protéines de ciblage préférées sont GP36, GP37 ou GP38 constitutives de la partie distale des fibres de queue. Bien entendu, des protéines homologues de celles citées ci-dessus présentes chez d'autres bactériophages sont également préférées. Par séquence homologue, il 30 faut entendre des protéines ayant au moins 50 % d'identité avec ces dernières, de préférence au moins 70 %, plus préférentiellement au moins 90 %. Préférentiellement, les oligonucléotides produits de manière aléatoire, remplacent par insertion les segments des gènes de protéines de ciblage 2910492 9 correspondant aux domaines de la protéine impliqués dans les fonctions d'adhésion ou de reconnaissance. De préférence, ces segments correspondent à des domaines variables, c'est-à-dire à des séquences des domaines de reconnaissance moins conservées d'une espèce de bactériophage à l'autre. 5 Inversement, il est préférable de conserver les domaines les plus constants des protéines de ciblage en ce qu'en général ils sont nécessaires à la structure tridimensionnelle de ces protéines. L'exemple est donné dans la présente demande de la modification de la protéine GP12 du bactériophage T4, particulièrement préféré selon l'invention. 10 La protéine GP12 présente un domaine d'ancrage dans lequel il est souhaitable d'introduire de la variabilité tout en maintenant l'intégrité de certains segments notés D (figure 5), lesquels segments correspondent à des domaines conservés chez les protéines homologues des bactériophages de type-T. Les oligonucléotides destinés à être insérés dans les domaines des 15 protéines choisis, peuvent être produits de manière aléatoire par différentes techniques bien connues de l'homme du métier. L'objectif est de produire des séquences nucléotidiques recouvrant le plus grand nombre possible de combinaisons différentes de nucléotides. A titre d'exemple, il est possible d'avoir recours à des oligonucléotides 20 de synthèse dont la succession de bases naturelles A, T, C et G a été laissée au hasard, ou bien encore à des oligonucléotides résultant d'une amplification par PCR-erreur (error-prone PCR). Par PCR-erreur, on entend une réaction de polymérisation en chaîne effectuée dans des conditions ne permettant pas une réplication fidèle des 25 séquences d'ADN. Ce type de réaction peut être obtenu en mettant en oeuvre une polymérase classique de type Taq en condition faiblement stringente et en présence de sels de manganèse, ainsi que cela est décrit dans la littérature [Cadwell, R.C.et al., Randomization of genes by PCR mutagenesis, PCR Methods Appl.,1992, 28-33]. 30 Une PCR fidèle est, au contraire, une réaction de polymérisation en chaîne permettant d'amplifier une matrice d'ADN avec un taux d'erreur de réplication très faible. Ce type de réaction peut être obtenu en mettant en oeuvre, par exemple, une polymérase de type Pfu en condition stringente, ainsi 2910492 10 que cela est décrit dans la littérature [Inmis, M.A. et Eds., PCR Protocols : a guide to methods and applications, 1989, Academic Press]. Avantageusement, les segments des gènes que l'on cherche à diversifier servent eux-mêmes de matrice pour produire les oligonucléotides par 5 PCR erreur. Selon un autre aspect de l'invention, plusieurs oligonucléotides correspondant à différents segments d'un gène ou de plusieurs gènes sont produits de manière aléatoire de sorte à être pourvus d'extrémités 3' ou 5' identiques. De cette manière les oligonucléotides peuvent être permutés ou 10 substitués les uns aux autres dans la séquence modifiée, ce qui permet d'accroître la diversité des séquences génétiques en résultant. Les oligonucléotides produits aléatoirement peuvent aussi inclure des bases non naturelles, notamment des bases ambiguës permettant la traduction d'une seule séquence nucléotidique en des polypeptides différents. 15 Selon un aspect préféré de l'invention, les oligonucléotides produits de manière aléatoire sont insérés dans les gènes du bactériophage codant les protéines de ciblage au moyen de la recombinaison homologue. Pour cela, il est nécessaire d'avoir recours à des constructions d'ADN permettant de réaliser la recombinaison homologue. 20 De telles constructions dérivent en général de vecteurs décrits dans la littérature, bien connus de l'homme du métier. Néanmoins, pour obtenir des constructions d'ADN utiles aux fins de la présente invention, il est nécessaire d'adapter les vecteurs de recombinaison connus en y clonant une copie du gène ou de la partie du gène modifié que l'on 25 souhaite introduire dans le génome. Selon l'invention, les gènes sont modifiés par introduction de plusieurs oligonucléotides produits de manière aléatoire, de préférence, en des endroits correspondant à des segments variables dudit gène. A cet égard, notamment dans le cas de la protéine GP12 citée plus 30 haut, il est nécessaire selon l'invention de reconstituer tout ou partie du gène codant la protéine de ciblage désirée en y incluant, aux endroits souhaités, les différentes oligonucléotides produits de manière aléatoire. Cette reconstitution peut être effectuée de manière classique par 2910492 11 reconstitution d'une copie modifiée du gène ou d'une partie de ce gène par assemblage des segments conservés et non conservées de la séquence dans un même vecteur. Néanmoins, cette étape peut s'avérer très fastidieuse, en raison des sous clonages et vérifications que cela peut impliquer. 5 La présente invention, propose, dans un de ses aspects particuliers, un procédé visant à faciliter la production d'une copie d'un gène ou d'une partie d'un gène incluant des oligonucléotides produits de manière aléatoire. Ce procédé peut s'appliquer à toute séquence nucléotidique dont on cherche à faire varier sélectivement de manière aléatoire certains segments. 10 Ce procédé peut trouver des applications dans de nombreux domaines thérapeutiques. Sa mise en oeuvre est, en effet particulièrement utile dès lors qu'on cherche à modifier le spectre d'activité d'une protéine en modifiant des domaines ciblés de sa séquence génétique. Ce procédé s'applique plus particulièrement au domaine d'ancrage de 15 gp12 dans lequel on cherche à conserver certains domaines invariants Dl à D4 représentés dans la figure 5. Ce procédé consiste en un procédé de PCR permettant de muter de manière aléatoire une séquence nucléotidique S, délimitée à ses extrémités 5' et 3' par deux segments F1 et F2, en conservant l'identité d'au moins un 20 segment interne D de ladite séquence nucléotidique. Il comprend les étapes suivantes : i) on effectue une PCR-erreur sur la totalité de la séquence S à l'aide d'amorces correspondant aux segments FI et F2, par laquelle la séquence S va être mutée de manière aléatoire sur toute sa longueur; 25 ii) on élue les produits d'amplification obtenus; iii) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits d'amplification élués à l'étape ii), en utilisant les couples d'amorces correspondant respectivement à au moins F1 et D, et F2 et D, afin d'amplifier au moins les régions F1-D et D-F2 de S mutées à l'étape i) dont le segment 30 interne D a conservé son identité; iv) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits d'amplification obtenus à l'étape iii) en utilisant les amorces correspondant à F1 et F2; 2910492 12 v) on purifie les produits de PCR obtenus dont la taille correspond à celle de la séquence nucléotidique S. Ce procédé est particulièrement avantageux lorsqu'on cherche à conserver l'identité de plusieurs segments internes DN à DN+1 de la séquence 5 nucléotidique S (comme c'est le cas de la protéine GP12). Le procédé comprend alors les étapes suivantes : i) on effectue une PCR-erreur sur la totalité de la séquence S à l'aide d'amorces correspondant aux segments FI et F2, par laquelle la séquence S va être mutée de manière aléatoire sur toute sa longueur ; 10 ii) on élue les produits d'amplification obtenus; iii) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits d'amplification élués à l'étape ii), en utilisant les couples d'amorces correspondant respectivement à au moins F1 et DN+1, et F2 et DN (N étant supérieur à 1, de préférence supérieur à 2) afin d'amplifier au moins les régions 15 F1- DN+1 et DN -F2 de S mutées à l'étape i) dont les segments internes DN+1 et DN ont conservé leur identité; iv) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits d'amplification obtenus à l'étape iii) en utilisant les amorces correspondant à F1 et F2; 20 v) on purifie les produits de PCR obtenus dont la taille correspond à celle de la séquence nucléotidique S. Les produits d'amplifications obtenus selon ce procédé particulier constituent une banque de séquences nucléotidiques S diversifiées de manière aléatoire dont les domaines internes DN ont été conservés, lesquelles 25 séquences comprennent : - l'insertion d'un ou plusieurs oligonucléotides produits de manière aléatoire ; et - des segments de séquence dudit gène ayant conservé leur identité. En général les segments internes DN conservent, selon le procédé de 30 l'invention, plus de 50 % d'identité par rapport à leur séquence initiale dans la protéine sauvage, de préférence plus de 70 %, et plus préférentiellement plus de 90 %, voire plus de 99 % selon les conditions de PCR utilisées. Une fois traduites en protéine, les séquences nucléotidiques contenues 2910492 13 dans la banque susvisée peuvent résulter en l'expression de protéines présentant une diversité de séquences polypeptidiques produites de manière aléatoire incluant des domaines internes DN dont la séquence est conservée. Ces séquences peuvent être directement clonées dans des vecteurs 5 d'expression, ou plus préférentiellement dans des vecteurs de recombinaison homologue, dont l'homme du métier dispose. Il est possible grâce au procédé décrit ci-dessus de modifier le génome d'un bactériophage à l'aide de vecteurs de recombinaison homologue diversifiés incluant des variants aléatoires d'un même gène, de préférence un 10 gène codant une protéine de ciblage d'un bactériophage. Les constructions d'ADN selon l'invention comprennent de préférence : - une région permettant la duplication de ladite construction dans une bactérie hôte ; - une région permettant la recombinaison homologue dans le génome 15 du bactériophage au niveau d'un gène codant une protéine de ciblage, ladite région comprenant deux séquences d'ADN homologues aux séquences dudit gène codant une protéine de ciblage, lesquelles délimitent un segment d'insertion incluant un oligonucléotide dont la séquence est produite de manièrealéatoire, de préférence selon le procédé par PCR décrit ci-dessus. 20 Selon un aspect préféré de l'invention, la région permettant la recombinaison homologue comprend tout ou partie du gène codant la protéine de ciblage, de préférence la totalité de la séquence du gène. De préférence, cette seconde région consiste en un produit d'amplification susceptible d'être obtenu selon le procédé de mutation aléatoire 25 exposé ci-dessus. Les constructions d'ADN selon l'invention, prises dans leur ensemble, permettent d'intégrer dans le génome du bactériophage un très grand nombre de séquences nucléotidiques différentes codant des protéines de ciblage modifiées. 30 Selon un aspect préféré de l'invention plusieurs gènes codant des protéines de ciblage du bactériophage sont mutés simultanément par recombinaison homologue selon le procédé de l'invention. Pour parvenir à un tel résultat, l'invention prévoit de transformer la bactérie hôte successivement à 2910492 14 l'aide de vecteurs différents, ciblant chacun un gène différent. Les vecteurs préférés permettant de modifier simultanément les gènes GP12, GP37 ou GP38 du bactériophage T4 selon l'invention dans la bactérie hôte E.coli sont, par exemple, les vecteurs pACYC184 (ATCC 37033), pBAD18- 5 K (ATCC 87397) et RR1 (ATCC 87076). De tels vecteurs présentent l'avantage de posséder des marqueurs conférant une résistance à des antibiotiques différents et ne partagent pas de séquences nucléotidiques communes susceptibles d'occasionner des recombinaisons entre les différents vecteurs une fois ceux-ci intégrés dans la bactérie hôte. 10 2) Transformation de la bactérie hôte Un bactériophage selon l'invention est, de préférence, un bactériophage lytique, naturel ou modifié. 15 De préférence, le bactériophage utilisé est un bactériophage de type-T, tels que les bactériophages T4, T5, T6 et T7, bien connus de l'homme du métier et plus particulièrement le bactériophage T4, dont le génome a été séquencé [Miller, E.S. et al., Bacteriophage T4 genome, Microbiol Mol. Biot. Rev., 2003, 67(1):86-156]. La séquence complète du génome du bactériophage 20 est disponible dans Genbank (AF 158101). Une bactérie hôte selon l'invention est une bactérie utilisée couramment pour répliquer le bactériophage que l'on cherche à modifier. De préférence, la bactérie hôte est une souche que l'on peut transformer à l'aide d'une construction d'ADN selon l'invention permettant de modifier le 25 bactériophage par recombinaison homologue. Une bactérie hôte particulièrement adaptée aux bactériophages de type-T pour la mise en oeuvre du procédé de la présente invention, est Escherichia coli, par exemple la souche DK8 (ATCC 47038). Dans le cadre de la modification des bactériophages de type-T, il est 30 avantageux d'utiliser une souche d'E.coli transformée à l'aide d'un vecteur de type Mini-lambda, dérivé du prophage lambda et comprenant les gènes exo, bet et gam. Un tel vecteur permet de contrôler, par exemple, la recombinaison homologue en fonction de la température à laquelle la bactérie hôte est cultivée 2910492 15 et ainsi limiter les événements de recombinaison aux seules étapes de réplication prévues selon l'invention. Les techniques de recombinaison homologue utilisées pour la mise en oeuvre de la présente invention sont connues de l'homme du métier. Elles sont 5 décrites par exemple dans [Poteete, A.R. et al., FEMS Microbiol. Lett., 2001, 201(1) :9-14 ; Kuzminov, A. et al. PNAS, 2001, 98(15) :8298-305]. L'étape de transformation de la bactérie hôte selon le procédé de l'invention peut intervenir en une ou plusieurs fois. Lorsque plusieurs vecteurs sont utilisés pour modifier des gènes différents de protéines de ciblage, il est 10 avantageux de procéder séquentiellement, c'est-à-dire en introduisant les vecteurs les uns après les autres. II est alors possible de conserver les bactéries transformées à chaque étape. II est ainsi toujours possible de revenir à l'étape précédente pour réintroduire un nouveau vecteur à la place de celui introduit en dernier. De nombreuses combinaisons de vecteurs peuvent ainsi 15 être testés sans avoir à réintroduire tous les vecteurs dans la bactérie hôte. Au terme de l'étape de transformation, on dispose d'une ou plusieurs banques de bactéries hôte transformées à l'aide d'une ou plusieurs des constructions selon l'invention. Chacune des bactéries de cette banque contient potentiellement une 20 construction capable de transformer par recombinaison homologue une ou plusieurs des protéines de ciblage du bactériophage de manière différente. Un objet de la présente invention consiste donc en une banque de bactéries hôtes transformée à l'aide des constructions d'ADN décrites ci-dessus, susceptible d'être infectée à l'aide d'un bactériophage. 25 Une telle banque de bactéries hôte présente l'avantage de pouvoir être multipliée et conservée. Elle constitue un produit intermédiaire renouvelable utile pour la production des bactériophages recombinants décrits ci-après. 3) Infection et réplication du bactériophage dans les bactéries hôte 30 transformées L'étape d'infection des bactéries hôtes par le bactériophage sélectionné ne pose aucune difficulté particulière dans la mesure où le 2910492 16 bactériophage n'est pas modifié à ce stade. L'infection est initiée de préférence durant la phase exponentielle de croissances des bactéries hôtes, à environ 30 C. C'est ensuite au cours de l'étape de réplication du génome du 5 bactériophage dans la bactérie que la recombinaison homologue peut s'effectuer entre la région homologue du gène incluant l'oligonucléotide produit de manière aléatoire et le gène présent dans le génome du bactériophage. Cette étape de réplication débute immédiatement après l'infection des bactéries hôte par les bactériophages. 10 Selon un aspect préféré de l'invention les bactériophages sont introduits dans la culture des bactéries hôtes transformées en même temps qu'un choc thermique entre environ 40 et 45 C est appliqué. Cette température est maintenue pendant une durée limitée comprise entre 5 et 15 minutes, de préférence entre 12 et 15 minutes, ce qui permet d'activer la recombinaison 15 homologue. Les bactéries hôtes étant préférentiellement transformées à l'aide d'un vecteur Mini-lambda permettant de conditionner la recombinaison homologue à certaines conditions de température, notamment en cas de choc thermique, la recombinaison homologue se produit sur une durée équivalente ou inférieure à celle d'un cycle de réplication. Les bactéries hôtes sont ensuite 20 transférées dans une culture à une température normale d'environ 30 C à laquelle la recombinaison homologue se produit beaucoup plus difficilement. Cette seconde période à environ 30 C dure approximativement 25 minutes, soit une durée équivalant à un seul cycle de réplication. Un aspect particulièrement innovant du procédé selon l'invention réside 25 dans le fait qu'on récolte les bactériophages à l'issue de la seconde période de culture, au terme d'un seul cycle de réplication, en moyenne. Cette manière de procéder présente l'avantage de récolter les bactériophages recombinants, avant qu'un nouveau cycle de réplication dans la bactérie hôte ne se produise. 30 En se limitant ainsi à un seul cycle de réplication, les bactériophages n'ont pas le temps de réinfecter les bactéries hôte pour un second cycle de réplication. On peut ainsi récolter les bactériophages modifiés ayant perdu la capacité de reconnaître ou infecter leur bactérie hôtes, lesquels autrement 2910492 17 seraient éliminés au cours des cycles suivants de réinfection. 4) Banques de Bactériophages recombinants 5 Le procédé visé par la présente invention permet d'obtenir un ensemble de bactériophages recombinants très diversifié. Ces bactériophages forment une banque de bactériophages selon l'invention. 10 Pour qu'une banque de bactériophages selon l'invention recouvre le plus grand nombre possible de bactériophages différents, il convient de mettre en oeuvre un nombre suffisant de bactéries hôtes transformées car c'est ce nombre qui détermine le nombre de bactériophages récoltés. Si ce nombre est suffisant, une banque de bactériophages selon 15 l'invention comprend au minimum, au moins 106, de préférence 108, plus préférentiellement 1010 variants différents d'un même bactériophage, lesdits variants se distinguant par la séquence d'au moins une de leurs protéines de ciblage. Le procédé selon l'invention vise en effet, en premier lieu, à augmenter la 20 diversité des protéines de ciblages exprimées par les bactériophages et empêche l'élimination des bactériophages recombinants, notamment ceux qui ne se seraient pas ou moins vite répliqués dans la bactérie hôte au cours des cycles successifs de réplication. La diversité des bactériophages dans la banque selon l'invention peut se 25 justifier par un calcul simple de dénombrement. Ainsi, si on considère que préférentiellement : 3 gènes codant des protéines de ciblages sont modifiés ; par l'insertion d'au moins 3 oligonucléotides composés de séquences aléatoires d'au moins 12 nucléotides ; et que 30 - 1/3 des séquences nucléotidiques imposent une modification polypeptidique au niveau des protéines de ciblage ; et que -seulement 3 des 4 bases (A, T, C, G) sont susceptibles de produire une mutation par rapport à la protéine initiale ; 2910492 18 On obtient alors un minimum de 324 possibilités de mutations au niveau polypeptidique, ce qui revient à dénombrer quelques 2,8.1011 bactériophages potentiellement différents. La présente invention vise plus particulièrement un bactériophage 5 recombinant isolé, issu de la banque de bactériophage selon l'invention, capable d'infecter une bactérie cible et de s'y multiplier. Un tel bactériophage peut être obtenu en procédant selon les étapes suivantes : i) on introduit dans au moins un gène codant une protéine de ciblage 10 d'un bactériophage, un oligonucléotide dont la séquence est produite de manière aléatoire, ainsi que cela est décrit plus haut ; ii) on met en contact les bactériophages génétiquement modifiés obtenus selon l'étape i) avec une cellule dont l'identité est connue ou inconnue; iii) on sélectionne au moins un bactériophage mis en contact à l'étape 15 ii) capable d'infecter ladite cellule dont l'identité est connue ou inconnue. Afin de faciliter la sélection des bactériophages recombinants capables d'infecter les bactéries dont l'identité est connue ou inconnue selon l'invention, il est avantageux de disposer de bactériophages détectables par fluorescence ou luminescence. 20 A cet égard le bactériophage utilisé pour infecter les bactéries hôtes peut être un bactériophage lui-même préalablement modifié, rendu fluorescent par l'introduction d'un gène codant une protéine luminescente ou fluorescente. Selon un aspect préféré de l'invention le bactériophage comprend une protéine de capside fusionnée à une protéine luminescente ou fluorescente 25 comme par exemple la GFP (Green Fluorescent Protein). De préférence la protéine Hoc [Genbank NP 049793] de la capside du bactériophage, ou bien une partie de celle-ci, est fusionnée à cette protéine luminescente ou fluorescente. Cette fusion reste normalement sans effet sur les propriétés de reconnaissance et d'adhésion du bactériophage à la bactérie. La 30 présence d'une protéine fluorescente permet de localiser les bactéries qui, du fait de leur infection, recèlent de nombreux bactériophages. La concentration des bactériophages à leur endroit permet d'atteindre un niveau de fluorescence pouvant être détecté par les instruments de mesure connus de l'homme du 2910492 19 métier. Ces bactériophages modifiés s'avèrent particulièrement utile pour cribler les bactériophages infectieux lorsque les bactéries sont cultivées de manière étalées sur un support solide. L'invention vise également une protéine de ciblage modifiée extraite d'un 5 bactériophage recombinant selon l'invention ou traduite à partir de l'ADN provenant dudit bactériophage. La présente invention couvre également tout procédé pour obtenir des protéines de ciblage modifiées de bactériophage caractérisé en ce qu'on met en oeuvre un bactériophage recombinant selon l'invention. 10 5) Utilisation des bactériophages recombinants obtenus Une banque de bactériophages selon l'invention peut être utilisée pour lutter contre des bactéries connues ou inconnues. En effet, la diversité des 15 bactériophages recombinants présents dans la banque ayant des protéines de ciblages différentes est telle que la probabilité que l'un de ces bactériophages puisse infecter la bactérie connue ou inconnue est significativement non nulle. Une bactérie inconnue, au sens de la présente invention, est une bactérie n'ayant pas encore été caractérisée, ou du mois pas suffisamment pour pouvoir 20 établir, par exemple, son antibiogramme. II peut s'agir d'une bactérie émergente contre laquelle il n'existe aucun antibiotique actif ou bien encore une bactérie dont l'existence n'est pas encore établie. Une banque de bactériophages selon l'invention peut avantageusement être utilisée de manière préventive, à l'encontre de bactéries connues ou 25 inconnues susceptibles de se développer à la surface d'un objet ou chez les êtres vivants. L'invention porte donc également sur un procédé d'aseptisation caractérisé en ce qu'on met en oeuvre une banque de bactériophages comprenant des bactériophages modifiés par insertion, dans un ou plusieurs 30 gènes codant des protéines de ciblage de ce bactériophage, un oligonucléotide produit de manière aléatoire. Un autre objet de l'invention concerne une composition solide ou liquide comprenant une banque de bactériophage selon l'invention, par exemple, une 2910492 20 poudre pouvant être pulvérisée sur une surface que l'on cherche à rendre exempte de bactéries. Une application préférée consiste à traiter les dispositifs de climatisation, notamment les systèmes aéroréfrigérants à l'aide des banques de 5 bactériophages selon l'invention. Une telle composition peut être utilisée également en tant que médicament, notamment pour prévenir ou traiter des infections bactériennes et plus particulièrement pour traiter les affections des voies respiratoires ou cutanées. 10 Un bactériophage recombinant selon l'invention, qui est identifié comme capable d'infecter une bactérie donnée, peut être utilisé seul dans une des applications décrites ci-dessus. Selon un aspect préféré de l'invention, un bactériophage recombinant selon l'invention peut être utilisé en tant que bactériophage de référence pour la 15 détection et/ou l'identification de la bactérie connue ou inconnue qu'il est capable d'infecter. Un bactériophage de référence, au sens de l'invention, est un bactériophage rendu capable de cibler un type de bactérie donné, de sorte à pouvoir servir en tant qu'outil de détection ou de diagnostic. 20 Les bactériophages recombinants selon l'invention sont en général obtenus à l'aide de souches bactériennes de laboratoires faciles à cultiver. Ils peuvent donc s'avérer utiles vis-à-vis de bactéries qui, au contraire, sont difficiles à cultiver dans les conditions de laboratoire. Un bactériophage recombinant selon l'invention peut donc être mis en 25 oeuvre dans des méthodes de diagnostic, par exemple des méthodes comprenant la mise en contact dudit bactériophage avec des échantillons provenant de patients chez lesquels une infection bactérienne est à rechercher. Selon un aspect préféré, les bactériophages sont fluorescents ou luminescent, ce qui permet un suivi en temps réel de l'évolution d'une infection, 30 notamment en ce qu'on peut tracer les bactéries à l'aide de leurs bactériophages respectifs. Les utilisations et méthodes décrites ci-dessus sont particulièrement utiles dans des situations d'urgence pour détecter ou lutter contre une bactérie 2910492 21 émergente ou résistante. Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer l'invention sans en limiter la portée. 5 Préparation des séquences de variants gp12, gp37 et gp38 de bactériophages T4 Ce qui suit décrit le mode opératoire utilisé pour gp12, mais il peut être 10 transposé sans difficulté pour l'homme du métier à la modification selon l'invention de gp37 et gp38. Etape 1 : Préparation du gène gp12 15 Le gène gp12 est amplifié par PCR à partir de l'ADN génomique du T4 de type sauvage obtenu à partir d'une culture concentrée de lysat de bactériophages (voir ci-dessus) en utilisant comme amorces gp12F 5'-TGAGTAATAATACATATCAACACG (SEQ ID No.2), et gp12R 5'-TGATTCTTTTACCTTAATTATGTAC (SEQ ID No.3). 20 Après purification sur un gel d'agarose préparatif, le produit de PCR (gp12A) est utilisé comme matrice dans des réactions PCR sensibles à l'erreur avec pour but d'introduire des mutations et insertions ponctuelles dans la région codante correspondant au domaine de liaison au récepteur de gp12 (voir figure 5). 25 Etape 2 : Introduction de mutations aléatoires dans le domaine de liaison au récepteur. Une série de 4 réactions PCR emboîtées (40 cycles chacune) est mise 30 en oeuvre en présence de Mn2 de manière à induire des erreurs de polymérase aléatoires. Les PCR-erreur sont conduites dans un volume réactionnel de 100 pl, en utilisant des matrices et amorces à des concentrations finales 2910492 22 respectivement égales à 400 ng et 30 pmol, avec 0,2 mM de dATP et dGTP (de chacun), 1 mM de dCTP et dTTP (de chacun), 2,5 mM de MgCl2, 0,7 mM de MnCl2 et 5 U d'ADN-polymérase Taq (New England Biolabs, Inc.) dans du tampon réactionnel 1 x. La PCR est effectuée à 96 C pendant 2 min, avec 5 30 cycles à 95 C pendant 1 min, 56 C pendant 1 min et 72 C pendant 2 min, et une extension finale à 72 C pendant 7 min. La première réaction (P1-1) utilise comme amorces : p12NFI F 5'-TCAAGGTAACCGCATCGTAAC (SEQ ID No.4) p12NF2R 5'-AAAGACCACGCATGTCAG (SEQ ID No.5) 10 La deuxième réaction (P2-1) utilise comme amorces : p12NF2F 5'-TGCCATGGTGGAACTGTTCA (SEQ ID No.6) p12NF3R 5'-CACCTAATCTAGGTTTAC (SEQ ID No.7) La troisième réaction (P3-1) utilise comme amorces : p12NF3F 5'-CTGACATGCGTGGTCTTT (SEQ ID No.8) 15 p12NF4R 5'-ATGTTTATGATAAGACAT (SEQ ID No.9) La quatrième réaction (P4-1) utilise comme amorces : p12NF4F 5'-GTAAACCTAGATTAGGTG (SEQ ID No.10) p12NF5R 5'-TCATTCTTTTACCTTAATTAT(SEQ ID No.11) Chacun de ces produits de réaction présente un chevauchement partiel 20 avec deux autres produits de réaction et les amorces utilisées correspondent à des domaines invariants conservés dans la protéine gp12. Ces domaines doivent être préservés fidèlement dans les structures de gènes mutés finales produites. Cependant, certains des fragments produits par les réactions PCR sensibles à l'erreur peuvent parfaitement avoir subi une mutagenèse dans ces 25 régions. Afin de préserver des domaines intacts, chacun des produits précités doit alors être soumis à des réactions PCR à haute fidélité ayant pour but d'amplifier sélectivement seulement les fragments dans lesquels le domaine conservé a été retenu. 30 Etape 3 : Amplification sélective des fragments désirés. Celle-ci est effectuée par deux séries de réactions PCR à haute fidélité comprenant chacune 25 cycles. 2910492 23 Les PCR haute fidélité sont conduites dans un volume réactionnel de 50 pl, en utilisant des matrices et amorces à des concentrations finales respectivement égales à 250 ng et 40 pM, dans du tampon pour pfu 1 x (Tris-HCI 20 mM à pH 9,0, KCI 10 mM, MgSO4 1 mM, (NH4)2SO4 6 mM, 0,1 % de 5 Triton X-100, 0,1 mg/ml de SAB) avec 200 pM de dNTP et 5 U de polymérase pfu (Promega). Les profils de PCR sont les suivants : 94 C pendant 20 s, 45 C pendant 15 s et 72 C pendant 30 s, avec répétition pendant 20 cycles. Dans la première série de réactions (P1-2 à P4-2), une portion aliquote (environ 250 ng) de chacun des produits de PCR précités est amplifiée en 10 utilisant les amorces F correspondantes (par exemple : p12NF1 F) biotinylées à l'extrémité 5'. Cela est nécessaire pour séparer les produits désirés des matrices non amplifiables (domaines conservés mutés) qui ont des longueurs pratiquement identiques et qui ne peuvent être séparées par électrophorèse sur gel. 15 Les produits de chaque réaction sont ensuite passés sur des minicolonnes d'exclusion dimensionnelle (pour éliminer l'excès d'amorces), purifiés individuellement sur des billes de streptavidine, lavés dans du tampon de liaison, élués, précipités et remis en suspension dans ddH2O. Dans la seconde série de réactions, une portion aliquote des produits 20 de réaction P1-2 purifiés est mélangée à une quantité égale de produits de réaction P2-2. Ceux-ci ont en commun le site d'amorçage F2-R1 et F3-R2. En conséquence, le brin - des produits de réaction P2-2 sert d'amorce pour le brin + des produits de réaction P1-2 et l'extension avec une polymérase débute au site d'amorçage F2-R1 interne de P1-2. L'extension échoue pour les 25 produits de réaction P1-2 où ce site conservé a été muté de manière significative. De manière similaire, le brin + des produits de réaction P1-2 sert d'amorce pour le brin - des produits de réaction P2-2 et l'extension avec une polymérase débute au site d'amorçage F3-R2 interne de P2-2. L'extension 30 échoue pour les produits de réaction P2-2 où ce site conservé a été muté de manière significative. 2910492 24 Les produits de PCR amplifiés avec succès (PA-1) correspondent à une fusion des fragments P1-2 et P2-2 dans laquelle chacun des quatre domaines conservés (F1 + F2-R1 + F3-R2 + F4-R3) a été retenu à l'état non muté. Un mélange similaire est préparé à partir des produits de réaction P3-2 5 et P4-2. Dans ces réactions, une extension couronnée de succès est basée sur des sites conservés internes F4-R3 (P3-2) et F5-R4 (P4-2) intacts et les produits de PCR résultants (PA-1 et PB-1) correspondent à une fusion des fragments P3-2 et P4-2 dans laquelle chacun des quatre domaines conservés (F3-R2 + F4-R3 + F5-R4 + R5) a été obtenu à l'état non muté. 10 Les produits obtenus sont purifiés par électrophorèse sur gel préparatif puisque les dimensions des produits de PCR fusionnés sont très différentes de celles des matrices individuelles. Afin d'augmenter le rendement dans cette seconde série de réactions PCR, le protocole d'extension peut être modifié de la manière suivante : 15 10 cycles avec seulement les produits P1-2 et P2-2, et P3-2 et P4-2 dans les mélanges réactionnels. Les réactions sont interrompues, 50 ng de chacune des amorces p12NFI F et p12NF3R sont ajoutés au mélange PA-1 tandis que 50 ng de chacune des amorces p12NF3F et p12NF5R sont ajoutés au mélange PB-1, en 20 laissant ensuite les réactions PCR se poursuivre pendant 15 cycles supplémentaires. Etape 4 : Reconstitution du domaine d'ancrage muté de gp12. 25 Après purification, des portions aliquotes égales des produits PA-1 et PB-1 sont utilisées ensemble dans une réaction PCR à haute fidélité comprenant 30 cycles ayant pour but de reconstituer le domaine total de liaison au récepteur de gp12 en fragments uniques renfermant les diverses mutations introduites ci-dessus. 30 Dans ce cas, comme dans la série précédente de réactions, les produits PA-1 servent d'amorces d'extension pour les produits PB-1 et vice versa. 2910492 25 Le produit de PCR fusionné final (gp12BD-Fu) est purifié par électrophorèse sur gel puisque ses dimensions sont très différentes de celles des matrices individuelles. Afin d'augmenter le rendement, le protocole d'extension peut être 5 modifié en procédant à une réaction comprenant 15 cycles avec seulement les produits P1-2 et P2-2, et P3-2 et P4-2 dans les mélanges réactionnels. Les réactions sont interrompues, 50 ng de chacune des amorces p12NF1 F et p12NF5R sont ajoutés au mélange, puis on laisse ensuite les réactions PCR se poursuivre pendant 15 cycles supplémentaires. 10 Après purification, une portion aliquote (environ 250 ng) du domaine de liaison au récepteur de gp12 reconstitué est utilisée comme matrice dans une nouvelle série de quatre réactions PCR sensibles à l'erreur, avec ensuite des amplifications sélectives et des reconstitutions des domaines de la manière décrite ci-dessus. 15 Cependant, puisque, à chaque étape de fusion (étapes 3 et 4 ci-dessus), toutes les mutations possibles introduites individuellement dans chaque sous-domaine sont brassées de manière aléatoire dans le domaine reconstitué final de liaison au récepteur, il existe des limites quant au nombre de cycles de mutagenèse qui peuvent être effectués sans effet négatif sur les 20 domaines conservés. En raison des étapes nécessaires d'amplification sélective, il est estimé que, au-delà de 4 cycles successifs, toutes les mutations nouvellement introduites présenteront une forte probabilité d'effet négatif sur un domaine conservé ou d'introduction d'une réversion restituant la séquence T4 originale, non mutée. 25 Etape 5 : Reconstitution de la copie modifiée du gène gp12 dans son entier 1) Amplification du segment de gp12 en amont du domaine de liaison au récepteur. 30 Le gène gp12, engendré par PCR, produit ci-dessus (gp12A) est utilisé comme matrice conjointement avec les amorces gp12F 5'-TGAGTAATAATACATATCAACACG (SEQ ID No.12), et gpl2AR 5'-GTTACGATGCGGTTACCTTGT (SEQ ID No.13) 2910492 26 Il s'ensuit une purification des produits d'amplifications obtenus sur un gel d'agarose préparatif, une précipitation puis une remise en suspension dans ddH2O. 2) Amplification du domaine de liaison muté de gp12 5 Une portion aliquote (environ 500 ng) du produit de PCR (gp12B) est utilisée conjointement avec une quantité égale de domaine de liaison au récepteur de gp12 reconstitué (gp12BD-Fu) dans une réaction PCR à haute fidélité. Il faut noter que ces deux produits présentent seulement en commun un chevauchement de 20 pb. En conséquence, le profil de la réaction PCR doit 10 être modifié pour prendre ce fait en considération. Profil de PCR modifié : A) 30 min à 96 C puis 5 cycles d'l min à 94 C, de 10 s à 45 C, et ensuite B) 5 cycles d'l min à 94 C et de 20 s à 50 C, puis C) 5 cycles d' 1 min à 94 C, de 30 s à 50 C, et finalement D) 15 cycles d' 1 min à 94 C, d'l min à 55 C, de 5 secondes à 72 C. 15 Afin d'augmenter le rendement, la réaction peut être interrompue à la sous-étape D ci-dessus et les amorces gp12F et p12NF5R peuvent être introduites dans le mélange. On laisse ensuite la réaction se rétablir et s'effectuer jusqu'à son terme. Les produits finals (gp12-Mut) sont purifiés sur un gel d'agarose 20 préparatif, précipités et remis en suspension dans ddH2O jusqu'à leur utilisation. Clonage du gène gp12 muté dans un vecteur alternatif pour recombinaison homologue 25 Les modes opératoires précités ont permis d'engendrer, de façon similaire à gp12, les gènes mutants gp37 et gp38 de T4. Le but des modes opératoires suivants est alors d'introduire ces gènes de T4 variants de manière à favoriser leur introduction, par recombinaison homologue, dans le génome du bactériophage T4 de manière à produire des 30 descendances de T4 ayant des spécificités de ciblage d'hôtes différentes de celle du bactériophage parental. 2910492 27 A cet effet, les gènes mutés engendrés ci-dessus doivent être introduits dans des vecteurs alternatifs (un vecteur différent pour chaque gène). Dans le cas présent, les vecteurs pACYC184, pBAD18-K et RR1 sont utilisés pour cloner chacun des gènes mutés. 5 Le vecteur choisi (par exemple pACYC184 pour le clonage de gpl2Mut) est coupé au niveau du site Sma I, purifié et remis en suspension dans 20 pl de ddH2O et mélangé au produit de PCR gpl2Mut en un rapport de 1:3. Après ligation, l'ADN est purifié, remis en suspension dans ddH2O et transformé dans des cellules DK8 (ATCC 47038) électrocompétentes . Ce 10 vecteurporte un gène de résistance au chloramphénicol (Chl). Ainsi, après une électroporation et une période de rétablissement de 1 h, les cellules sont transférées à 10 ml de milieu LB contenant 170 pg/ml de chloramphénicol et sont cultivées à 30 C pendant 4 h avec aération constante. Puis les cellules sont étalées sur des plaques de milieu LB + Chl et cultivées pendant une nuit à 15 30 C. Quelques colonies sont prélevées pour la vérification par PCR de la présence du segment d'insertion gpl2Mut et quelques colonies positives sont cultivées dans du milieu LB + Chl pour la préparation d'une culture concentrée de cellules (DK8-p12C). 20 Introduction des gènes mutés gp37 et gp38 dans la bactérie hôte Une culture fraîche d'une nuit de DK8-p12C est utilisée pour préparer des cellules électrocompétentes. Le vecteur pBAD18-K est coupé au niveau du site Sma I, purifié et 25 remis en suspension dans 20 pl de ddH2O et mélangé au produit de PCR gp37Mut en un rapport de 1:3. Après ligation, l'ADN est purifié, remis en suspension dans ddH2O et transformé dans des cellules DK8-p12C électrocompétentes . Le vecteur utilisé dans ce cas porte un gène de résistance à la 30 kanamycine (Kan). Ainsi, après une électroporation et une période de rétablissement de 1 h, les cellules sont transférées à 10 ml de milieu LB contenant 170 pg/ml de chloramphénicol et 50 pg/ml de kanamycine et sont cultivées à 30 C pendant 4 h avec aération constante. Puis les cellules sont 2910492 28 étalées sur des plaques de milieu LB + Chl + Kan et cultivées pendant une nuit à 30 C. Quelques colonies sont prélevées pour la vérification par PCR de la présence des segments d'insertion gpl2Mut et gp37Mut et quelques colonies positives sont cultivées dans du milieu LB + Chl + Kan pour la préparation d'une 5 culture concentrée de cellules (DK8-p12C-p37K). Une culture fraîche d'une nuit de DK8-p12C-p37K est utilisée pour préparer des cellules électrocompétentes. Le vecteur RR1 est coupé au niveau du site Sma I, purifié et remis en suspension dans 20 pl de ddH2O et mélangé au produit de PCR gp37Mut en un rapport de 1:3. Après ligation, l'ADN est 10 purifié, remis en suspension dans ddH2O et transformé dans des cellules DK8-p12C-p37K électrocompétentes . Le vecteur utilisé dans ce cas porte un gène de résistance à l'ampicilline (Amp). Ainsi, après une électroporation et une période de rétablissement de 1 h, les cellules sont transférées dans 10 ml de milieu LB contenant 170 pg/ml de chloramphénicol + 50 pg/ml de kanamycine + 15 60 pg/ml d'ampicilline et sont cultivées à 30 C pendant 4 h avec aération constante. Puis les cellules sont étalées sur des plaques de milieu LB + Chl + Kan + Amp et cultivées pendant une nuit à 30 C. Quelques colonies sont prélevées pour la vérification par PCR de la présence des segments d'insertion gpl2Mut, gp37Mut et gp38Mut et quelques colonies positives sont cultivées 20 dans du milieu LB + Chl + Kan + Amp pour la préparation d'une culture concentrée de cellules (DK8-p12C-p37K-P38A). II reste à présent à construire un hôte capable de présenter une puissance de recombinaison extrêmement efficace. 25 Construction de bactérie hôtes E. colt mini-k Pour obtenir la recombinaison efficace de l'ADN donneur dans des fonds recA+ ou recA-, on prépare l'hôte E. colt qui contient un prophage portant les gènes de recombinaison exo, bet et gam sous le contrôle d'un 30 répresseur cl de sensible à la température. Les gènes exo, bet et gam peuvent être aisément actionnés à 42 C et inhibés à 32 C. Lorsque les fonctions de sont actionnées pendant un temps réduit à 5 min, les cellules deviennent plus recombinogènes et absorbent l'ADN linéaire sans sa 2910492 29 destruction. Gam inhibe l'attaque de l'ADN linéaire par la nucléase RecBCD de E. coli, et Exo et Beta engendrent une activité de recombinaison pour cet ADN linéaire. De manière plus importante, cette recombinaison est efficace avec des homologies d'ADN limitées à 30 à 50 pb aux extrémités des substrats 5 consistant en ADN linéaire. Les oligonucléotides 5' GTATGCATGCTGGGTGTGG (MXRf) et 5' CGCACTCTCGATTCGTAGAGCCTCG (MXRr) sont utilisés comme amorces pour l'amplification par PCR de l'ADN provenant de la région attP-cro en utilisant l'ADN de 1 c1857 comme matrice. 10 Une fois le prophage X engendré par PCR, une possibilité consiste à le cloner le prophage X dans le plasmide pFN476 (ATCC86962) à petit nombre de copies avec sélection par LacZ, par exemple. Le vecteur pFN476 est coupé au niveau du site Sma I (extrémité franche), purifié, remis en suspension dans 20 pl de ddH2O et mélangé au 15 produit de PCR du prophage a, en un rapport de 1:3. Après ligation, l'ADN est purifié, remis en suspension dans ddH2O et transformé dans des cellules DK8-p12C-p37K-p38A électrocompétentes . Après rétablissement, les cellules sont étalées sur des plaques de milieu LB X-gal + Chl + Kan + Amp (voir ci-dessus) et mises en incubation à 30 C. 20 Quelques colonies blanches sont sélectionnées pour la vérification par PCR de la présence du prophage X. Une colonie positive de prophages est ensuite cultivée pendant une nuit à 30 C dans du milieu LB + Chl + Kan + Amp pour préparer une culture concentrée de cellules (DK8-T4Mut-X) à utiliser dans les manipulations ultérieures. 25 A cette étape, les hôtes transformés sont inductibles par à température élevée, lacZ-positifs et contiennent des copies de gènes gp12, gp37 et gp38 de T4 mutés prêts pour la recombinaison homologue. 30 2910492 30 Production de la descendance du bactériophage T4 avec des gammes d'hôtes étendues Une culture fraîche d'une nuit de cellules DK8-T4Mut-2, est préparée 5 dans du milieu LB + Chl + Kan + Amp à 30 C. Les cultures pour infection par T4 sont commencées avec un volume égal ou inférieur à 0,05 ml de cellules d'une culture d'une nuit pour 10 ml de milieu LB + Chl + Kan + Amp afin de garantir que les cellules passent à la phase de croissance exponentielle avant l'addition du bactériophage. 10 Pour améliorer l'aération, ces cultures sont multipliées dans des fioles d'Erlenmeyer de 250 ml à branche latérale, bouchées non hermétiquement, dans un bain d'eau d'agitateur par secousses à 30 C. 250 ml de cellules dans du milieu LB + Chl + Kan + Amp sont cultivés à une densité de 3 x 108 cellules par ml à 30 C avec agitation par secousses. 15 Des portions aliquotes de 10 ml de cellules à croissance exponentielle sont ensuite transférées à 40 ml de milieu LB + Chl + Kan + Amp préchauffé à 42 C et mises en incubation pendant exactement 15 min à 42 C avec aération constante. Du tryptophane est ajouté à une concentration de 0,02 mg/ml et suivi par le bactériophage T4 à une multiplicité d'environ 10 particules par cellule. 20 Les cultures sont transférées à un bain d'eau à 30 C, en laissant la croissance se poursuivre pendant exactement 25 min. Le but dans ce cas consiste à isoler la descendance de la première salve et à interrompre la propagation avant que cette descendance de bactériophages de première génération ait eu le temps de se transformer en 25 reproducteurs. Récupération de la descendance des bactériophages Les cellules sont recueillies par centrifugation à 5000 tr/min pendant 30 5 minutes et le surnageant est récupéré, quelques gouttes de chloroforme sont ajoutées et le mélange est centrifugé de nouveau pendant 10 min à 6000 tr/min. Le surnageant, en excluant le chloroforme, est ajusté à une concentration en tampon SM 1 x (MgSO4 10 mM, NaCl 100 mM, 0,01 % de gélatine et Tris-HCI 2910492 31 50 mM [pH 7,5]) en utilisant du tampon concentré 5x, et est stocké à 4 C avant l'analyse. Les cellules rassemblées en un culot sont remises en suspension dans 8 ml de solution de Tris-chlorhydrate 0,05 M à pH 8,0 avec 25 % de 5 saccharose. Une portion aliquote de 1,6 ml de lysozyme (5 mg/ml) est ajoutée et le mélange est mis en incubation pendant 5 min à 0 C. Une portion aliquote de 3,2 ml de solution d'EDTA 0,2 M est ajoutée et le mélange est mis en incubation pendant une période de temps supplémentaire de 15 min à 0 C. Le lysat cellulaire est ajusté à 500 mM de Tris-HCI à pH 7,4, 100 mM de MnCl2 au 10 moyen de tampon concentré 10x, mis à l'équilibre à 15 C et mis en incubation avec 10 U de Dnasel (Sigma) pendant 2 h. Le mélange est ensuite centrifugé à 6000 tr/min pendant 10 min. Le surnageant limpide est prélevé avec précaution, ajusté à une concentration en tampon SM 1 x et stocké de la manière précitée. Vérification des extensions des gammes d'hôtes 15 Des cultures de souches bactériennes pathogènes (Yersinia sp., Salmonella sp., E. col/ 0157 H7, Enterobacter sakazakii, etc.) sont préparées. Des portions aliquotes de 3 ml sont ensuite infectées avec 1 ml de culture concentrée de la descendance et mises en incubation à 30 C avec 20 agitation. La turbidité de la culture est déterminée par colorimétrie immédiatement après l'infection et ensuite toutes les 60 min. Une chute significative de la turbidité de culture en un temps de 5 heures indique que les particules capables d'infecter l'hôte testé étaient présentes dans la descendance de T4 recombinante. Quelques gouttes de chloroforme sont 25 ajoutées à la ou les cultures, ce qui provoque une chute nette de turbidité, et les cultures sont ensuite centrifugées à 5000 tr/min pendant 5 min. Le surnageant est récupéré et utilisé comme substance infectieuse pour la production de particules de bactériophages dédiées à la bactérie testée, laquelle dans la nature, ne peut être attaquée par le bactériophage sauvage de 30 type T4. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une banque de bactériophages génétiquement modifiés, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : i) on transforme une bactérie hôte à l'aide d'au moins une construction d'ADN permettant l'insertion d'un oligonucléotide dont la séquence a été 10 produite de manière aléatoire, dans au moins un gène codant une protéine de ciblage d'un bactériophage ; ii) on infecte les bactéries transformées à l'étape i) avec ledit bactériophage ; iii) on place les bactéries infectées à l'étape ii) dans des conditions 15 telles que les bactériophages puissent se répliquer, et qu'au moins une partie des oligonucléotides produits de manière aléatoire puissent s'insérer dans au moins un gène codant une protéine de ciblage dudit bactériophage; iv) on récolte les bactériophages recombinants qui se sont répliqués dans lesdites bactéries hôtes infectées. 20 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'insertion des oligonucléotides est effectuée par recombinaison homologue. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la bactérie hôte est la souche DK8 d'E.coli. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce 25 qu'on récolte les bactériophages à l'étape iv), au terme d'un seul cycle , en moyenne, de réplication des bactériophages dans les bactéries hôtes transformées. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le bactériophage utilisé pour infecter les bactéries hôtes 30 transformées est un bactériophage de la famille T, de préférence un bactériophage de type T4. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le bactériophage utilisé pour infecter les bactéries hôtes 2910492 33 transformées est un bactériophage lui-même modifié rendu fluorescent par l'introduction d'un gène codant une protéine luminescente ou fluorescente. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le bactériophage utilisé pour infecter les bactéries hôtes transformées est un 5 bactériophage présentant une protéine de capside fusionnée à une protéine luminescente ou fluorescente. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la protéine luminescente ou fluorescente est fusionnée avec la protéine Hoc de la capside du bactériophage ou bien une partie de celle-ci. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la protéine de ciblage du bactériophage dont le gène est modifié par insertion d'un oligonucléotide dont la séquence est aléatoire, est choisie parmi les protéines GP12, GP36, GP37 et GP38 ou bien des protéines homologues de celles-ci. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la protéine de ciblage du bactériophage dont le gène est modifié par insertion d'un oligonucléotide dont la séquence est aléatoire, est la protéine GP12. 11. Une banque de bactériophages recombinants susceptible d'être obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12. Une banque de bactériophages recombinants, caractérisée en ce que ladite banque comprend des bactériophages, dont plusieurs gènes codant des protéines de ciblage comportent des séquences oligonucléotidiques produites de manière aléatoire. 13. Une banque de bactériophages recombinants selon la revendication 12, caractérisée en ce que lesdites protéines de ciblage sont choisies parmi GP12, GP36, GP37, GP38 ou des protéines homologues de celles-ci. 14. Une banque de bactériophages recombinants selon la 30 revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que lesdits gènes codant des protéines de ciblage ont été modifiés simultanément. 2910492 34 15. Une banque de bactériophages selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 106, de préférence 108, plus préférentiellement 1010 variants d'un même bactériophage, lesdits variants se distinguant par la séquence d'au moins une de leurs protéines de ciblage. 5 16. Procédé pour introduire des séquences oligonucléotidiques produites de manière aléatoires dans la séquence d'un gène codant une protéines de ciblage d'un bactériophage, en conservant l'identité de plusieurs segments internes DN à DN+1 de cette séquence de gène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 10 i) on effectue une PCR-erreur sur la totalité de la séquence S à l'aide d'amorces correspondant aux segments FI et F2, par laquelle la séquence S va être mutée de manière aléatoire sur toute sa longueur ; ii) on élue les produits d'amplification obtenus; iii) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits 15 d'amplification élués à l'étape ii), en utilisant les couples d'amorces correspondant respectivement à au moins F1 et DN+1, et F2 et DN afin d'amplifier au moins les régions FI- DN+1 et DN -F2 de S mutées à l'étape i) dont les segments internes DN+1 et DN ont conservé leur identité; iv) on effectue une PCR haute fidélité à partir des produits 20 d'amplification obtenus à l'étape iii) en utilisant les amorces correspondant à F1 et F2; v) on purifie les produits de PCR obtenus dont la taille correspond à celle de la séquence nucléotidique S. 17. Construction d'ADN utile pour insérer une séquence nucléotidique 25 produite aléatoirement dans un gène codant une protéine de ciblage d'un bactériophage par recombinaison homologue, caractérisée en ce qu'elle comprend un produit d'amplification susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 16. 18. Construction d'ADN selon la revendication 17, caractérisée 30 en ce qu'elle comprend en outre : - une région permettant la duplication de ladite construction dans une bactérie hôte . 19. Une banque de bactéries hôte constituée de bactéries 2910492 35 transformées à l'aide d'une pluralité de constructions d'ADN selon la revendication 17 ou 18. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre à l'aide d'une construction d'ADN selon 5 les revendications 17 ou 18. 21. Procédé de sélection d'un bactériophage génétiquement modifié permettant de cibler une cellule dont l'identité est connue ou inconnue, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : i) on met en contact les bactériophages génétiquement modifiés 10 obtenus selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou 20 avec une cellule dont l'identité est connue ou inconnue. ; ii) on sélectionne au moins un bactériophage recombinant mis en contact avec ladite cellule dont l'identité est connue ou inconnue, capable d'infecter ladite cellule. 15 22. Procédé d'aseptisation non thérapeutique caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une banque de bactériophage selon l'une quelconque des revendications 11 à 15. 23. Banque de bactériophages selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, en tant qu'agent thérapeutique. 20 24. Utilisation d'une banque de bactériophages recombinants selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, ou d'au moins un bactériophage sélectionné issu de ladite banque selon la revendication 11, pour la préparation d'un médicament destiné à lutter contre ou prévenir une infection bactérienne. 25. Utilisation d'une banque de bactériophages selon l'une des 25 revendications 11 à 15, pour obtenir un bactériophage de référence d'une bactérie connue ou inconnue. 26. Utilisation d'une banque de bactériophages selon l'une des revendications 11 à 15, pour la détection et/ou l'identification de bactéries in-vitro. 27. Utilisation d'une banque de bactériophages selon l'une des revendications 11 à 15, pour diagnostiquer une infection in-vitro. 28. Une composition pharmaceutique comprenant au moins un bactériophage issu d'une banque de bactériophage selon la revendication 11.