FR 2909838 A1 20080620 FR 0610867 A 20061213 Utilisation de champignons entomopathogènes comme moyen de lutte biologique contre Paysandisia archon La présente invention se rapporte au domaine technique de la lutte biologique contre les insectes nuisibles. Elle concerne plus particulièrement l'utilisation de champignons entomopathogènes, tels que Beauveria bassiana, pour lutter contre Paysandisia archon, un papillon ravageur des palmiers. Le papillon Paysandisia archon est un lépi- doptère ravageur des palmiers appartenant à la famille des Castniidae, sous-famille des Castniinae. Cet insecte palmivore est originaire d'Argentine et d'Uruguay. En Argentine, P. archon s'attaque aux palmiers locaux tels que Trithrinax campestris et Butia yatay, ainsi qu'à des espèces exotiques telles que Latania, Chamaerops, ou Phoenix canariensis (Drescher et Dufay, 2002). Peu étudié, cet insecte fait peu de dégâts sur le continent sud-américain. Il semblerait qu'un ennemi naturel maintienne sa population en équilibre, bien qu'aucun lien factuel n'ait été mis en évidence entre P. archon et un supposé ennemi naturel (Sarto et al., 2005). Il pourrait s'agir d'un oiseau (par exemple pie, moqueur ou Mimus saturninus) ou d'un insecte (par exemple un ichneumonidé du genre ophion). Ainsi, Sarto et al. rapportent que des larves de nématodes, de mites et de mouches ont été observées dans un cadavre de larve de P. archon. Toujours selon Sarto et al., les caractéristiques morphologiques de certains oeufs de P. archon suggèrent la possibilité qu'ils soient parasités par des hyménoptères ou des hémiptères. Toutefois, ces études ne permettent pas de déterminer avec certitude s'il existe effective-ment un ennemi naturel de P. archon. Au cours des années 1990, Paysandisia archon a été introduit accidentellement en Espagne et en France par des importations de palmiers adultes en provenance d'Argentine. 2909838 2 Depuis son introduction, le papillon se propage en Europe à la fois par le vol des adultes (dispersion naturelle) et par le transport des palmiers infestés, assurant la dissémination du nuisible sur de 5 longues distances. Actuellement, la zone de distribution de l'insecte en Europe concerne essentiellement le sud de l'Espagne, le sud de l'Italie et la France. En France, elle touche de nombreux départements du sud et de 10 l'ouest. Ainsi, Paysandisia archon a été détecté dans le Var (1999), l'Hérault (2001) et toute la côte du Roussillon, en Midi-Pyrénées (2004) et dans la ville de Rennes (2006). Des études réalisées en France suggèrent que 15 ce papillon possède un long cycle de développement (Drescher et Dufay, précité) : les adultes, actifs pendant le jour, sont observés de juin à septembre. P. archon pond ses oeufs sur les feuilles de palmier. Les larves (chenilles) creusent des galeries dans le stipe 20 (tronc) ou dans les nouvelles feuilles, et se nourrissent ensuite du coeur du palmier. Résistantes au froid, elles passent au stade de chrysalide grâce à un cocon confectionné à l'intérieur des galeries avec des fibres de palmes. A la fin de son développement, le papillon adulte 25 se libère de l'enveloppe au niveau de l'extrémité du cocon située en regard de la sortie de la galerie. Les dégâts observés sur le palmier sont caractéristiques du passage de P. archon (Sarto et al., 2005) . présence de sciure sur la base de la couronne et/ou 30 du stipe ; palmes perforées ou grignotées ; présence de galeries axiales et transversales dans le stipe ; développement anormal de bourgeons axillaires ; 35 déformation ou torsion (vrille) anormale du stipe ; dessèchement anormal des palmes, et notamment des feuilles centrales ; 2909838 3 Le dépérissement du palmier intervient dans un laps de temps variable, qui dépend du nombre de larves. Lorsque celles-ci sont nombreuses, la mort peut inter-venir à assez brève échéance (1 à 2 ans). 5 Outre les espèces originaires d'Amérique du sud, telles que celles mentionnées plus haut, les hôtes connus en France de P. archon sont notamment les espèces suivantes : Chamaerops humilis, Livistona chinensis, L. decipiens, L. saribus, Sabal spp., Phoenix canariensis, 10 P. dactylifera, P. reclinata, Trachycarpus fortunei, et Washingtonia filifera (Drescher et Dufay, 2001). En Espagne, le papillon a été observé sur Trachycarpus fortunei, Phoenix canariensis, Washingtonia spp. et Chamaerops humilis (Aguilar, 2001). Les espèces Trachycarpus fortunei (ou Chamaerops excelsa, palmier de Chine) et Chamaerops humilis (palmier nain) sont particulièrement sensibles car elles possèdent un coeur tendre et les fibres de leur stipe facilitent la ponte des œufs. Un grand nombre de palmeraies, certaines d'une grande valeur historique, sont actuellement menacées en Europe, et de nombreuses villes doivent prendre des mesures d'arrachage. Outre les palmiers, d'autres végétaux ont été 25 décrits comme pouvant être la cible de Paysandisia archon. En effet, des attaques contre des céréales telles que le maïs ou encore contre des plantes ornementales, telles que des yuccas ou des cannes provençales, ont été observées. 30 Les moyens de lutte contre Paysandisia archon sont encore assez limités et peu efficaces. En effet, selon Sarto et al. (Sarto et al., précité) . les larves sont presque exclusivement endophages, ce qui rend l'usage d'insecticides beaucoup moins effi- 35 cace que lorsqu'ils sont utilisés pour lutter contre des insectes exophages ; 15 20 2909838 4 les pièges de lumières sont inefficaces car Paysandisia archon adulte a une activité diurne ; les leurres empoisonnés sont inopérants contre les papillons adultes car à ce stade, ceux-ci ne se 5 nourrissent pas ; le contrôle par des phéromones synthétiques pourrait également être inopérant, dans la mesure où la femelle P. archon semble ne pas produire un large spectre de phéromones sexuelles. 10 Actuellement, les moyens de lutte contre Paysandisia archon sont de deux types : mécanique et chimique : Moyens mécaniques : les arbres infestés ou susceptibles de l'être sont recouverts d'un voile 15 d'hivernage ou d'un filet anti-grêle. En outre, ils doivent être systématiquement arrachés, broyés puis brûlés. Moyens chimiques : on peut citer l'utilisation de composés organophosphorés inhibiteurs de la 20 cholinestérase, tels que le chlorpyrifos (Suxon vert , Nufarm), l'acéphate, le diméthoate (Dimézyl 40 EC , Agriphyt), et le phosalone (Zolone , Fertiligène). Cependant ils sont peu efficaces lorsque les larves sont déjà enfouies à l'intérieur 25 du palmier. De plus, les cocons de Paysandisia archon sont imperméables aux insecticides (Sarto et al., précité). Pour surmonter ces difficultés, ces insecticides doivent être utilisés de manière répétée, selon une fréquence choisie en fonction de 30 l'importance de l'infestation : par exemple, lorsque l'infestation est faible, deux traitements uniques peuvent suffire, l'un en juin et l'autre en août ; lorsque l'infestation est importante, le traitement peut être mensuel, de fin mai à fin septembre (Sarto 35 et al., précité). Ces traitements chimiques peuvent être combinés avec l'utilisation d'un voile d'hivernage ou d'un 2909838 5 filet anti-grêle de façon à ralentir l'évaporation du produit et éviter l'évasion des papillons issus des éventuelles larves survivantes. En France, l'importance des dégâts occasionnés 5 par P. archon et le risque que représente ce papillon pour les palmeraies sont tels que Paysandisia archon a fait l'objet d'un arrêté de lutte biologique obligatoire (Journal Officiel du 21 février 2002). Toutefois, les moyens de lutte (mécanique ou chimique) actuels contre P. 10 archon présentent l'inconvénient majeur de ne pas produire de résultats satisfaisants. Il existe donc un réel besoin d'améliorer la lutte contre Paysandisia archon, et plus particulièrement un besoin d'améliorer les traitements existants et/ou de développer des straté- 15 gies de lutte alternatives ou complémentaires plus efficaces. En conséquence, les inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à des moyens de luttes efficaces contre Paysandisia archon qui répondent mieux aux besoins 20 de la pratique que les moyens utilisés jusqu'à présent. Ils ont ainsi mis au point une méthode de lutte biologique contre P. archon, qui met en oeuvre des champignons entomopathogènes. Les champignons entomopathogènes sont des 25 microorganismes capables de provoquer des désordres pathologiques chez certains insectes. On dénombre plus de sept cents espèces de champignons pathogènes pour les insectes (Feng et al., 1994). Ces agents sont particulièrement intéressants du fait de leur aptitude à infecter 30 l'hôte par ingestion ou par simple contact, à tous les stades du développement des insectes (oeufs, larves, adultes). La découverte d'isolats de champignons dans des cadavres d'insectes a permis de mettre en évidence 35 leur pouvoir pathogène envers leurs hôtes d'origine. A titre d'exemple, Pannolis flammea et Castnia licus, des lépidoptères éloignés de Paysandisia archon, 2909838 6 sont respectivement des hôtes d'un isolat de Beauveria bassiana et d'un isolat de Beauveria brongniiarti (Hicks et al., 2000 ; Humber et Hansen, 2005). Castnia licus est en outre décrit comme étant un hôte d'isolats de 5 Beauveria brongniartii (Humber et Hansen, 2005) et d'isolats de Metarhizium anisopliae (Figueiredo et al., 2002). Il existe plus de deux cents hôtes du champi-gnon entomopathogène Beauveria bassiana, principalement 10 chez les lépidoptères, tels que Castnia licus et Panolis flammea, et chez les coléoptères. Cependant, les épizooties causées par Beauveria bassiana arrivent peu fréquemment (Feng et al., 1994). D'une manière générale, les isolats de Beauveria bassiana sont davantage patho- 15 gènes envers leurs hôtes d'origine ou envers les espèces proches dans la classification (Feng et al., précité ; Moore et al., 1993). L'utilisation de champignons entomopathogènes comme agent de contrôle des insectes nuisibles existe 20 depuis longtemps (Bartlett et Jaronsky, 1988). Les genres les plus étudiés en tant que mycoinsecticides sont Beauveria, Metarhizium, Verticillium, Hirsutella, Erynia (ou Zoophtora), Nomurae, Aspergillus, Aschersonia, Paecilomyces, Tolypocladium, Leptolegnia, Culicinomyces, 25 Coelomomyces et Lagenidium (Moore et Prior, 1993). Par exemple, l'isolat Beauveria bassiana GHA (Bb GHA, ou Bb GHA 1991), dont l'hôte d'origine est la chrysomèle maculée du concombre (Diabrotica undecimpunctata), est commercialisé comme mycoinsecticide (Botaniguard ) ; 30 l'isolat Beauveria bassiana 147 (Bb 147), est commercialisé notamment comme moyen de lutte contre son hôte d'origine, la pyrale du maïs, Ostrinia nubilalis (Ostrinil , Natural Plant Protection (FR)). De façon surprenante, les inventeurs ont 35 maintenant montré qu'il est possible d'utiliser des champignons entomopathogènes pour lutter contre Paysandi- sia archon. En effet, lesdits champignons peuvent se 2909838 7 substituer aux moyens de lutte actuels, aussi bien à titre préventif qu'à titre curatif. De surcroît, lesdits champignons peuvent être associés à des moyens mécaniques ou chimiques, de façon à améliorer leur efficacité. En 5 outre, lesdits champignons constituent un moyen de lutte biologique parfaitement adapté à la lutte contre le papillon notamment en milieu urbain. Un tel résultat est inattendu parce qu'aucun champignon n'était jusqu'à présent considéré comme 10 pathogène envers Paysandisia archon. En effet, aucun champignon n'a été retrouvé dans des cadavres de P. archon. En outre, en ce qui concerne Beauveria bassiana, ce résultat est également inattendu parce que ce papillon est originaire d'Amérique du sud, alors que les hôtes 15 connus de Beauveria bassiana sont peu présents sur le continent américain (Aquino de Muro et al., 2003). La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un champignon entomopathogène comme moyen de lutte biologique contre Paysandisia archon. 20 La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un champignon entomopathogène, pour le traitement d'un végétal contre une infestation par Paysandisia archon. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux 25 desdites utilisations, ledit champignon entomopathogène est une souche ou un isolat issus de la subdivision des Deuteromycètes, tel qu'un champignon de la classe des Hyphomycètes ou de la classe des Coelomycètes. Selon une disposition avantageuse de ce mode 30 de mise en oeuvre, ledit champignon est sélectionné dans le groupe constitué par les champignons des genres Beauveria, Metarhizium, Verticillium, Hirsutella, Erynia (ou Zoophtora), Nomurae, Aspergillus, Aschersonia, Paecilomyces, Tolypocladium, Leptolegnia, Culicinomyces, 35 Coelomomyces et Lagenidium. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit champignon est sélectionné dans le groupe 2909838 8 constitué par les espèces Beauveria bassiana, Beauveria brongniartii, Metarhizium anisopliae, Metarhizium flavoviride, Paecilomyces fumusoroseus, Paecilomyces farinosus et Nomuraea rileyi. De préférence, il est 5 sélectionné parmi Beauveria bassiana, Beauveria brongniatrii ou Metarhizium flavoviride. De préférence, ledit champignon entomopathogène est du genre Beauveria ; avantageusement, il s'agit d'un champignon de l'espèce Beauveria bassiana, et 10 de manière préférée, ledit champignon entomopathogène est sélectionné dans le groupe constitué par : - la souche de Beauveria bassiana, dénommée Bb INRA pyr, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) sous le numéro I- 15 867 le 7 juin 1989 (Brevet FR8908553) ; -la souche de Beauveria bassiana, dénommée 111B004, déposée auprès de la C.N.C.M. sous le n I-2960 le 3 décembre 2002 ; et - la souche de Beauveria bassiana, dénommée Bb 20 GHA, déposée auprès de l'ATCC (American Type Culture Collection) sous le numéro 74250 le 11 octobre 1993 (Brevet US 5,939,065). Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux desdites utilisations, ledit champignon entomo- 25 pathogène est utilisé sous forme de spores ou sous forme de mycélium. Lorsqu'il est utilisé sous forme de spore, il s'agit par exemple de conidies (ou conidiospores) ou bien de blastospores. De préférence, ledit champignon est utilisé sous forme de conidies. 30 La préparation des spores de champignons entomopathogènes fait appel à des techniques connues de l'homme du métier. Lorsqu'il est sous forme de spores, le champi- gnon peut par exemple être formulé soit sous la forme 35 d'un produit solide, soit sous la forme d'un produit liquide. 2909838 9 Produit solide : il est notamment possible d'utiliser directement les spores pures. Il est cependant préférable d'associer les spores lyophilisées à un émulgateur adapté, de manière à réaliser une poudre 5 mouillable ( wettable powder ). Par exemple, le Brevet Français FR8908553 décrit la formulation de spores pures sur leurs substrats de fermentation à base de granulés d'argile. A titre d'illustration de la formulation sous forme de poudre mouillable, on peut citer le composé 10 BotanigardWP préparé à partir d'une poudre mouillable comprenant des spores de la souche Bb GHA de Beauveria bassiana. Produit liquide : on peut notamment citer des suspensions de spores préparées à partir de poudres 15 mouillables, telles que les suspensions de conidies enrobées dans l'argile ou les suspensions de conidies enrobées dans des granules d'alginate décrites dans le brevet FR8908553. On peut également citer les mélanges de spores avec une huile minérale ou végétale. Avantageusement, ce 20 type de mélange comprend en outre un émulgateur adapté, de façon à rendre le produit miscible dans l'eau. Ce type de préparation, comprenant une suspension de spores dans une émulsion, est notamment décrit dans le Brevet US 5,939,065 (Clifford et al.), qui applique cette technique 25 à l'isolat B. bassiana Bb GHA, en vue d'une application comme mycoinsecticide. De préférence, la composition du champignon entomopathogène utilisable dans la présente invention est une composition ayant déjà fait ses preuves par ailleurs 30 comme agent mycoinsecticide contre d'autres insectes que P. archon. Par exemple, :il est possible d'utiliser le composé Botanigarde comprenant des spores de la souches Bb GHA de Beauveria bassiana. Il est également possible d'utiliser le composé Ostrinil comprenant des spores de 35 la souche Bb 147 de Beauveria bassiana. Ladite composition peut être utilisée telle quelle ou bien diluée par exemple dans l'eau ou dans une émulsion H/E. 2909838 10 Lorsqu'il est sous forme de mycélium, le champignon peut par exemple être formulé sous la forme d'un produit liquide tel qu'une suspension de mycélium du type de la suspension décrite dans le Brevet FR 8908553. 5 D'autres techniques peuvent être mises en œuvre par l'homme du métier pour préparer les spores de champignons entomopathogènes. Par exemple, l'article de synthèse de Feng et al. expose des techniques de fermentation adaptées à la production massive de spores de 10 Beauveria bassiana, ainsi que des procédés d'obtention d'une poudre de spores pures de Beauveria bassiana. Cet article fournit également plusieurs méthodes de formulation du champignon Beauveria bassiana, sous forme de spores (conidies ou blastospores) ou sous la forme d'un 15 mycélium. D'autres documents décrivent d'autres procédés de préparation de mycoirisecticides (par exemple, la Demande Internationale WO 96/21358) utilisables dans la présente invention. Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux desdites utilisations, ledit champignon entomopathogène est utilisé en combinaison avec un ou plusieurs autres champignons entomopathogènes. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ledit autre champignon entomopathogène 25 appartient à une famille différente de celle dudit champignon entomopatogène. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en œuvre, ledit autre champignon entomopathogène appartient à un genre différent de celui dudit 30 champignon entomopathogène. Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en œuvre, ledit autre champignon entomopathogène appartient à une espèce différente de celle dudit champignon entomopathogène. 35 Selon une autre disposition de ce mode de mise en œuvre, ledit autre champignon entomopathogène appartient à la même espèce que celle dudit champignon 2909838 11 entomopathogène ; avantageusement, il s'agit de l'utilisation combinée des souches Bb 147 et Bb GHA de Beauveria bassiana. On entend par utilisation combinée ou utilisa- 5 tion en combinaison, soit l'utilisation des champignons sous la forme d'un mélange de plusieurs champignons, soit l'utilisation de plusieurs compositions distinctes, chacune comprenant un seul champignon. Il peut également s'agir d'une utilisation associant un ou plusieurs 10 mélange(s) de plusieurs champignons, avec une ou plusieurs composition(s) comprenant chacune un seul champignon. Dans le cas de l'utilisation desdits champi-gnons entomopathogènes pour traiter un végétal : 15 - ledit végétal est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par (i) les céréales, telles que le maïs, (ii) les palmiers, et (iii) les plantes ornementales telles que les yuccas ou les cannes provençales. De préférence, il s'agit d'un palmier, tel qu'un palmier 20 agricole (par exemple palmier à huile, dattier, cocotier) ou encore un palmier ornemental. Ledit palmier est par exemple sélectionné dans le groupe constitué par les palmiers de genres Trithrinax, Butia, Latania, Chamaerops, Phoenix, Livistona, Sabal, Trachycarpus et 25 Washingtonia ; il s'agit par exemple d'un palmier sélectionné parmi Chamaerops humilis et Trachycarpus fortunei. - ledit traitement est un traitement curatif. Le terme curatif est employé ici pour qualifier le traitement d'un végétal, tel qu'un palmier, déjà infesté 30 par Paysandisia archon. C'est par exemple le cas lorsque ledit palmier contient des oeufs, des larves, et/ou des chrysalides de P. archon. C'est également le cas lorsque P. archon est au stade adulte, par exemple lorsqu'il s'apprête à pondre sur les feuilles du palmier ou bien 35 lorsqu'il sort du cocon avant de s'échapper du palmier. Ledit traitement curatif peut être mis en oeuvre quel que soit le stade de développement de Paysan- 2909838 12 disia archon (oeuf, larve chrysalide, adulte) ; de manière avantageuse, ledit traitement curatif est mis en oeuvre lorsque P. archon est au stade d' oeuf ; de manière préférée, il est mis en oeuvre lorsque P. archon est au stade 5 de larve. Préférentiellement encore, il est mis en oeuvre lorsque P. archon est au stade de chrysalide ; de manière encore préférée, ledit traitement curatif est mis en oeuvre lorsque P. archon est au stade adulte. - ledit traitement est un traitement préven- 10 tif. Le terme préventif est employé ici pour désigner le traitement d'un végétal, tel qu'un palmier, non encore infesté par P. archon. Il désigne également le traitement d'un végétal qui a déjà été infesté au moins une fois mais qui ne contient plus d'oeufs, de larves, de chrysa- 15 lides ou d'adultes de P. archon. La présente invention a également pour objet un procédé de traitement d'un végétal contre une infesta- tion par Paysandisia archon comprenant une étape consistant à mettre en contact ledit végétal avec un champignon 20 entomopathogène tel que défini plus haut. La mise en contact du végétal avec le champi- gnon entomopathogène peut être mise en oeuvre par tout type de procédé connu en soi par l'homme du métier. A titre d'exemple, la mise en contact peut comprendre 25 l'application sur une, plusieurs ou toutes partie(s) aérienne(s) dudit végétal (par exemple, le stipe et/ou les palmes d'un palmier), d'une composition comprenant le champignon entomopathogène. Ladite application peut être réalisée par arrosage (pulvérisation ou aspersion). Par 30 exemple, elle peut être réalisée à l'aide d'un pulvérisa- teur, tel qu'un pulvérisateur à dos, un pulvérisateur tracté ou tout autre type de pulvérisateur. L'arrosage peut avoir lieu depuis le sol (par exemple à l'aide de tourniquet, de rampe ou de canon), ou bien depuis un 35 point élevé, tel qu'une nacelle ou un véhicule aérien. Une telle application est notamment adaptée à un traite-2909838 13 ment préventif. Elle convient aussi à un traitement cura-tif. La mise en contact du végétal avec le champi-gnon entomopathogène peut aussi comprendre l'application 5 de la solution à l'intérieur dudit végétal. Par exemple, dans le cas d'un palmier, une telle application peut être réalisée par injection sous pression de la solution dans le stipe (tronc) au moyen d'un injecteur adapté. Elle peut être également effectuée par perfusion dans le stipe 10 (tronc) de la solution qui pénètre par gravité entre les fibres du stipe et s'y répartit par capillarité. La solution peut aussi être directement versée dans les galeries creusées par les larves de Paysandisia archon. Une telle application convient particulièrement à un traitement 15 curatif. Elle peut toutefois également être mise en oeuvre dans le cadre d'un traitement préventif. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit traitement est un traitement cura-tif, tel que défini plus haut ; de préférence, ledit 20 traitement est effectué lorsque P. archon est au stade d'oeuf ; de manière encore préférée, il est effectué lorsque P. archon est au stade de larve ; préférentielle-ment encore, il est effectué lorsque P. archon est au stade de chrysalide ; de manière encore plus préférée, 25 ledit traitement curatif est mis en oeuvre lorsque P. archon est au stade adulte. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit traitement est un traitement préventif, tel que défini plus haut. 30 Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit champignon entomopathogène est tel que défini ci-dessus. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit champignon entomo- 35 pathogène est sous forme de spores, telles que des conidies (ou conidiospores) ou des blastospores, ou sous 2909838 14 forme de mycélium. De manière avantageuse, ledit champi-gnon est sous forme de conidies. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit champignon entomopathogène est 5 utilisé en combinaison avec un ou plusieurs autre(s) champignon(s) entomopathogène(s). Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ledit autre champignon entomopathogène appartient à une famille différente de celle dudit 10 champignon entomopatogène. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ledit autre champignon entomopathogène appartient à un genre différent de celui dudit champignon entomopathogène. 15 Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ledit autre champignon entomopathogène appartient à une espèce différente de celle dudit champignon entomopathogène. Selon une autre disposition de ce mode de mise 20 en oeuvre, ledit autre champignon entomopathogène appartient à la même espèce que celle dudit champignon entomopathogène ; avantageusement, il s'agit de l'utilisation combinée des souches Bb 147 et Bb GHA de Beauveria bassiana. 25 Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, ledit végétal est sélectionné dans le groupe constitué par (i) les céréales, telles que le maïs, (ii) les palmiers, et (iii) les plantes orne-mentales telles que les yuccas et les cannes provençales. 30 De préférence, ledit végétal est un palmier, tel qu'un palmier agricole (par exemple palmier à huile, dattier, cocotier) ou encore un palmier ornemental. Ledit palmier est par exemple sélectionné dans le groupe constitué par les palmiers de genres Trithrinax, Butia, 35 Latania, Chamaerops, Phoenix, Livistona, Sabal, Trachycarpus et Washingtonia ; il s'agit par exemple d'un 2909838 15 palmier sélectionné parmi Chamaerops humilis et Trachycarpus fortunei. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui 5 ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne 10 constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE I : Matériels et méthodes 1) Origine des insectes et des champignons Les oeufs de Paysandisia archon proviennent de la société VEGETECH (FR). 15 Les oeufs d'Ostrinia nubilalis sont fournis par l'Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) de Surgères (France). La souche de Beauveria bassiana Bb 147 est la souche utilisée pour le produit Ostrinil (Arysta 20 Lifescience). Cette souche a en outre été déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganisme (C.N.C.M.) le 3 décembre 2002 sous le numéro I-2960. La souche de Beauveria bassiana Bb GHA, égale-ment dénommée Bb GHA 1991, est la souche utilisée dans le 25 produit Botanigard (Mycotech). Elle a fait l'objet d'un dépôt auprès de l'A.T.C.C. (American Type Culture Collection) sous le numéro 74250. 2) Méthodes d'élevage Paysandisia archon 30 Des oeufs de Paysandisia archon de trois lots différents, numérotés lots 1 à 3, sont disposés dans des boîtes rectangulaires au creux d'une petite logette sur du sable fin humidifié. Les oeufs des lots 1 et 2 sont incubés à 25 C 35 sous photopériode 16:8 (c'est-à-dire suivant plusieurs cycles de 24 heures constitués de 16 heures à la lumière 2909838 16 suivies de 8h à l'obscurité) et sous humidité élevée due au sable mouillé, jusqu'à éclosion. Les larves sont alors élevées sur rachis de palmier à 25 C sous photopériode 16 :8 en attendant l'inoculation. 5 Les oeufs du lot 3 sont inoculés, comme indiqué ci-après, dès réception sans leur laisser le temps d'éclore. Ostrinia nubilalis Les oeufs d'Ostrinia nubilalis sont incubés à10 25 C sous photopériode 16:8 et sous humidité ambiante jusqu'à éclosion. Des larves d'Ostrinia nubilalis issues de deux lots d'oeufs sont installées sur leur milieu nutritif semi-synthétique avant inoculation (Darazy-Choubaya 15 (2002) La perception gustative des phytoectdystéroïdes par les larves de la pyrale du maïs, Ostrinia nubilalis Hübner (Lepidoptera, Pyralidae) ; Thèse INA-PG ; Paris ; 149pp). 3) Production des spores des souches Bb 147 et 20 Bb GHA de Beauveria bassiana Les souches Bb 147 et Bb GHA de Beauveria bassiana sont mises en culture en solution nutritive liquide (saccharose 115 g/1, protéinal 70 g/l), pendant 4 jours sous agitation. Les suspensions ainsi obtenues, le 25 cas échéant ajustées à 1.10' spores/ml, sont alors étalées sur une boîte de PDA (Potatoe Dextrose Agar, Biokar Diagnostics) rectangulaire de taille 243 mm x 243 mm. Les boîtes sont incubées 7 à 10 jours à 25 C. Les spores sont alors récoltées en grattant la surface de la gélose avec 30 un racloir puis séchées en sac Osmofilm (Fischer Bioblock A16994) pendant une dizaine de jours à 25 C avant de passer le sac sous cloche à vide pour permettre une déshydratation encore plus poussée. Les spores sont triées sur tamis 100 pm (Fischer Bioblock A82308) afin 35 d'éliminer les débris de gélose puis conservées à 4 C, 2909838 17 ensachées en sac aluminium fermé hermétiquement, en attendant leur formulation. Un contrôle de l'humidité et des propriétés germinatives des spores est alors effectué. Il a permis 5 de déterminer que le pourcentage d'humidité relative est inférieur à 5%, et que le pourcentage de germination, calculé en se basant sur la numération des spores, est supérieur à 95%. 4) Formulation des spores 10 Les compositions Bb 147 et Bb GHA sont formulées comme indiqué dans le Tableau I. Tableau I Composition des formulations réalisées pour les essais Ingrédient (% w/w) Blanc de Bb 147 Bb GHA formulation Spores pures (type) 0% 16% 16% Huile minérale 85% 71% 71% Emulgateur 15% 13% 13% Le blanc de formulation représente le témoin 15 négatif dans les exemples suivants. Une fois diluées, ces trois compositions seront, sauf précision contraire, utilisées pour inoculer les oeufs et les larves de Paysandisia archon et d'Ostrinia nubilalis. 20 Par la suite et sauf précision contraire, les compositions Blanc de formulation , Bb 147 et Bb GHA sont des dilutions au centième (1/100) des formulations obtenues selon le Tableau I. Parmi les émulgateurs utilisables, on peut 25 citer la lécithine de soja ou encore un mélange en dispersion colloïdale d'alcool cétostéarylique et d'émulgateurs non-ioniques à base d'éthers polyglycoliques d'alcools gras saturés (Emulgade 1000NI, Henkel). 30 2909838 18 5) Réalisation des inoculations A- Inoculation des œufs de Paysandisia archon A réception, les oeufs de P. archon du lot 3 sont installés dans des boîtes rectangulaires comparti- 5 mentées sur du sable et sont inoculés selon trois approches différentes de la façon suivante : 14 oeufs sont inoculés avec la composition blanc de formulation , 45 oeufs avec la composition Bb 147 et 45 oeufs avec la composition Bb GHA . 10 L'inoculation est réalisée par le dépôt sur chaque oeuf de 4 pl de la composition testée. L'incubation est réalisée à 25 C et sous humidité élevée, sous photopériode 16:8. Après l'éclosion, les larves sont élevées sur 15 rachis de palmier pour permettre le calcul de la survie larvaire. B- Inoculation des larves de Paysandisia archon et d'Ostrinia nubilalis a) Essai préalable 20 Une manipulation préparatoire a été menée afin d'évaluer si les adjuvants de la formulation peuvent être à eux seuls pathogènes pour les larves de P. archon. Elle avait aussi pour optique de permettre la détermination de la dilution des formulations à tester adéquate afin 25 d'éviter tout biais expérimental suite à une surmortalité des larves due au choc toxique causé par ces adjuvants. Pour cela, cinq larves de P. archon ont été inoculées, comme indiqué plus haut, avec le blanc de formulation dilué au 1/100 et au 1/1000. 30 Il est apparu qu'après 6 jours d'incubation à 25 C à l'obscurité, la survie larvaire était de 100% pour la dilution au 1/100 et de 60% pour la dilution au 1/1000. Ce résultat montre que les adjuvants du blanc de formulation dilué au 1/100 ne sont pas létaux pour les 35 larves de P. archon. Par la suite, il a donc été décidé de travailler avec une dilution au 1/100. 2909838 19 b) Inoculation des larves de P. archon Les larves, d'âge variable, issues des oeufs des lots 1 et 2 sont séparées du morceau de palmier sur lequel elles avaient été déposées lors de l'éclosion de 5 l'oeuf (voir Exemple I.2), puis sont trempées avec une pince dans la solution testée pendant quelques secondes. 30 larves sont ainsi inoculées avec la solution Bb 147, et 30 autres avec la solution Bb GHA. Pour le témoin négatif, 30 larves sont inoculées avec la solu- 10 tion blanc de formulation . Pour le témoin positif, 5 larves sont inoculées avec la poudre de spores pures Bb 147. Chaque larve est ensuite déposée dans une boîte de Pétri de diamètre 4,5 cm, dont le fond est 15 recouvert d'un papier filtre (Sartorius, Fischer Bioblock A16179) préalablement humidifié, et dans laquelle un petit morceau de rachis de palmier est placé. Les boîtes sont disposées dans une barquette contenant deux serviettes en tissu humidifiées recou20 vertes d'une grille. Ces barquettes sont fermées hermétiquement et incubées à l'obscurité à 25 C. c) inoculation des larves d'Ostrinia nubilalis La Pyrale du maïs étant l'hôte d'origine de la souche Bb 147 de Beauveria bassiana, cet insecte est uti- 25 lisé comme témoin positif de l'apparition des mycoses. La souche Bb GHA n'a pas été inoculée à cet insecte. Les larves, d'âge variable, sont séparées du milieu nutritif sur lequel elles avaient été installées lors de l'éclosion de l'oeuf (voir Exemple I.2), puis sont 30 trempées avec une pince dans la solution testée pendant quelques secondes. 30 larves sont ainsi inoculées avec la solution Bb 147 et 30 autres avec la solution blanc de formulation utilisée comme témoins négatif . 35 Les dispositifs d'élevage des larves d'Ostrinia nubilalis sont identiques à ceux utilisés pour les larves de Paysandisia archon. Le morceau de rachis 2909838 20 est remplacé par un morceau de milieu semi-synthétique (voir Exemple I.2). 6) Lecture et exploitation des résultats bruts Les lectures sont réalisées à environ J+3, 5 J+5, J+7, J+10, J+12, J+14, J+17, J+20, J+24 et J+27, c'est-à-dire respectivement environ 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 20, 24 et 27 jours après l'inoculation. Pour chaque insecte, la boîte est ouverte sous une hotte à flux laminaire, et la larve est recherchée 10 dans le morceau de rachis ou de milieu nutritif. Si nécessaire, de la nourriture est ajoutée. Les boîtes où les larves sont mortes ou mycosées sont identifiées. Le pourcentage de mortalité brute est déterminé selon la formule suivante : 15 % mortalité brute = (nombre d'individus morts)/(nombre d'individus pris en compte pour le test) La mortalité naturelle correspond à la mortalité brute dans les essais témoins (blanc de formulation 1/100) 20 Afin de tenir compte de la mortalité naturelle, la mortalité brute est corrigée selon la formule d'Abbott : % mortalité corrigée = [(%mortalité brute)-(%mortalité naturelle)]/[1-(%mortalité naturelle)] 25 Par exemple, si le pourcentage de mortalité brute est de 35% et le pourcentage de mortalité naturelle de 10%, alors le pourcentage de mortalité corrigée est de : (0,35-0,10)/(1-0,10) = 28%. EXEMPLE II : Evaluation de la pathogénicité des souches 30 Bb 147 et Bb GHA de Beauveria bassiana envers les oeufs de Paysandisia archon Pour évaluer la pathogénicité des spores de Beauveria bassiana envers les oeufs de Paysandisia archon, l'expérience suivante est réalisée : des œufs de P. 35 archon sont inoculés, avec soit le blanc de formulation, soit la composition Bb 147, soit la composition Bb GHA, comme indiqué dans l'Exemple I.5.A. Après l'inoculation, 2909838 21 les oeufs sont incubés dans des conditions permettant l'éclosion et la survie des larves (Exemple I.5.A). La pathogénicité des spores de Bb 147 et Bb GHA est alors déterminée par le calcul de la survie 5 larvaire, c'est-à-dire le pourcentage de larves survivantes par rapport au nombre total d'oeufs testés. Les résultats obtenus avec la souche Bb GHA sont présentés dans le Tableau II. Tableau II : Détermination de la survie 10 larvaire après inoculation des oeufs de P. archon avec la composition Bb GHA. Test oeufs Larves Survie testés larvaire total mycosés non mycosés mortes survivantes total non éclos éclos Blanc de 14 0 14 4 10 1 9 64% formulation Bb GHA 45 31 14 10 4 2 (mortes 2 4% et mycosées) Lorsque les oeufs sont inoculés avec le témoin (blanc de formulation 1/100), le pourcentage d'oeufs éclos est de l'ordre de 71% (10 oeufs éclos sur 14 testés). La 15 survie larvaire est de l'ordre de 64% (9 larves survivantes sur 14 oeufs testés). La mortalité augmente lorsqu'on utilise la composition Bb GHA. En effet, 69% des oeufs sont mycosés et seulement 9% des oeufs éclosent. La survie larvaire est 20 de l'ordre de 4%. Des résultats similaires sont obtenus avec la composition Bb 147, à savoir une diminution du nombre d'oeufs éclos et du pourcentage de survie larvaire par rapport au témoin. 25 Ces résultats montrent que les spores de la souche de Beauveria bassiana Bb 147 d'une part, et ceux de la souche de Beauveria bassiana Bb GHA d'autre part, sont pathogènes envers les oeufs de Paysandisia archon. 2909838 22 EXEMPLE III : Pathogénicité des souches Bb 147 et Bb GHA de Beauveria bassiana sur les larves de Paysandisia archon Pour confirmer les résultats obtenus avec les 5 oeufs de P. archon, les souches Bb GHA et Bb 147 ont également été testées sur les larves de P. archon. Dans un premier temps, les inventeurs ont cherché à valider le choix de la souche Bb 147 pour cette étude. Pour cela, ils ont recherché si la souche Bb 147 10 utilisée est bien pathogène envers son hôte d'origine, la pyrale du maïs (Ostrinia nubilalis). Cette expérience permet en outre de constituer un témoin positif de pathogénicité de la souche Bb 147. Dans un deuxième temps, ils ont testé la 15 pathogénicité des souches Bb GHA et Bb 147 directement sur les larves de P. archon. Enfin, les inventeurs ont étudié la relation dose-effet entre la souche Bb 147 et la mortalité des larves de Paysandisia archon. 20 1) Pathogénicité de la souche Bb 147 de Beauveria bassiana envers les larves d'Ostrinia nubilalis Dans cette étude, les larves d'Ostrinia nubilalis sont inoculées comme indiqué dans l'Exemple I.5.B avec soit le blanc de formulation 1/100, 25 soit la composition Bb 147 1/100. Les pourcentages de mortalité brute et corrigée, déterminés comme indiqués dans l'Exemple I.6, sont présentés dans le Tableau III ci-dessous. 5 2909838 23 Tableau III : Détermination des pourcentage de mortalité brute et corrigée des larves d'Ostrinia nubilalis inoculées avec la composition Bb 147 1/100 Modalité Nb de jours % % mortalité après mortalité corrigée inoculation brute 3 6,7% 5 10,0% 7 10,0% (Ostrinia 10 10,0% nubilalis - 12 13,3% Blanc de 14 13,3% formulation 17 13,3% 1/100) 20 13,3% 24 13,3% 27 13,3% 3 6,7% 0,0% 5 13, 3% 3,7% 7 26,7% 18,6% (Ostrinia 10 26,7% 18,6% nubilalis - 12 26,7% 15,5% souche Bb147 14 26,7% 15,5% 1/100) 17 26,7% 15,5% 20 26,7% 15,5% 24 26,7% 15,5% 27 26,7% 15,5% Le pourcentage de mortalité corrigée calculé après inoculation par la souche Bb 147 est de 3,7% à J+3, et 18,6% à J+7. Il atteint 15,5% dès J+12. Ces résultats confirment que la composition Bb 147 est pathogène envers les larves d'Ostrinia nubilalis. 2909838 24 2) Pathogénicité des souches Bb 147 et Bb GHA de Beauveria bassiana envers les larves de Paysandisia archon Pour tester si les souches Bb 147 et Bb GHA 5 ont également un effet pathogène envers les larves de Paysandisia archon, l'expérience suivante a été réalisée : Les larves de Paysandisia archon sont inoculées, comme indiqué dans l'Exemple I.5.B, avec le blanc 10 de formulation 1/100 (modalité 1), la composition Bb 147 1/100 (modalité 2) la composition Bb GHA 1/100 (modalité 3) ou la poudre de spores pures Bb 147 (témoin positif). Les pourcentages de mortalité brute et corrigée ont ensuite été calculés comme indiqué dans 15 l'Exemple I.6. Le Tableau IV illustre les résultats obtenus pour la souche Bb GHA. 2909838 25 Tableau IV : Détermination du pourcentage de mortalité brute et corrigée des larves de Paysandisia archon inoculées avec la composition Bb GHA 1/100 Modalité Nb de jours % % mortalité après mortalité corrigée inoculation brute 1 3 6,7% 5 6,7% (Paysandisia 7 6,7 archon - blanc 10 10,0% de formulation 12 14,3% 1/100) 14 17,9% 17 17,9% 20 22,2% 24 23,1% 27 30,8% 3 3 10,0% 3,6% 5 36,7% 32,1% 7 60,0% 57,1% (Paysandisia 10 80,0% 77,8% archon - 12 80,0% 76,7% souche BbGHA 14 83,3% 79,7% 1/100) 17 93,3% 91,9% 20 93,3% 91,4% 24 93,3% 91,3% 27 93,3% 90,4% 5 Le pourcentage de mortalité corrigée, calculé après inoculation par la souche Bb GHA est de 3,6% dès le troisième jour ; il dépasse 50% à J+7 et dépasse 90% à J+17. Des résultats similaires sont obtenus avec la 10 composition Bb 147 1/100 (modalité 2). Le témoin positif réalisé à partir de la poudre de spores pures Bb 147 2909838 26 confirme l'effet pathogène de la souche Bb 147 envers P. archon. Ces résultats montrent que les compositions Bb 147 et Bb GHA sont pathogènes envers les larves de 5 Paysandisia archon. Les inventeurs ont en outre constaté que, de manière étonnante, bien que l'hôte d'origine de la souche Bb 147 soit Ostrinia nubilalis, celle-ci est néanmoins davantage pathogène envers Paysandisia archon qu'envers 10 Ostrinia nubilalis (résultats non représentés). Ces résultats, ainsi que ceux de l'Exemple précédent, démontrent plus généralement la pathogénicité du champignon Beauveria bassiana envers Paysandisia archon. 15 3) Relation dose-effet entre la souche Bb 147 et la mortalité des larves de P. archon Les exemples précédents ont notamment permis de montrer que la souche Bb 147 est pathogène envers P. archon. 20 Pour vérifier s'il existe une relation dose-effet entre la souche Bb 147 et la mortalité des larves de P. archon, les inventeurs ont testé l'effet sur les larves de Paysandisia archon d'une gamme de dilutions dans l'eau (dilutions au :L/10, 1/30, 1/100, 1/300 et au 25 1/1000) d'une solution mère comprenant 6,89.1012 spores viables de Bb 147 par litre d'un mélange huile/émulgateur. Des larves de Paysandisia archon âgées de 1 à 29 jours sont réparties dans six groupes reproduisant la 30 variabilité d'âge de l'échantillon total, puis chaque groupe est testé avec une dilution comme indiqué dans le Tableau V. 2909838 27 Tableau V : répartition des dilutions testées dans les groupes de larves étudiés Groupe Dilution Nombre de larves testées Groupe 1 eau 20 (témoin) Groupe 2 1/10 20 Groupe 3 1/30 21 Groupe 4 1/100 24 Groupe 5 1/300 25 Groupe 6 1/1000 22 Le dénombrement des larves mortes ainsi que le calcul du pourcentage de mortalité brute et corrigée sont 5 effectués comme indiqué dans l'Exemple I.6. Les résultats sont représentés dans le Tableau VI. Tableau VI : Relation dose-effet de la athogénicité de Bb 147 envers la larves de P. archon Groupe Nombre de % % Mortalité jours après Mortalité corrigée inoculation brute 0 0,0% 3 0,0% 5 0,0% 7 0,0% 10 0,0% Groupe 1 12 0,0% (Témoin) 14 0,0% 17 0,0% 21 0,0% 24 0,0% 26 0,0% 10 2909838 28 o 0,0% 0,0% 3 60,0% 60,0% 5 90,0% 90,0% 7 100,0% 100,0% Groupe 2 10 100,0% 100,0% (1/10) 12 100,0% 100,0% 14 100,0% 100,0% 17 100,0% 100,0% 21 100,0% 100,0% 24 100,0% 100,0% 26 100,0% 100,0% 0 0,0% 0,0% 3 38,1% 38,1% 5 66,7% 66,7% 7 95,2% 95,2% Groupe 3 10 95,2% 95,2% (1/30) 12 95,2% 95,2% 14 95,2% 95,2% 17 95,2% 95,2% 21 100,0% 100,0% 24 100,0% 100,0% 26 100,0% 100,0% 0 0,0% 0,0% 3 16,7% 16,7% 5 45,8% 45,8% 7 83,3% 83,3% Groupe 4 10 95,8% 95,8% (1/100) 12 95,8% 95,8% 14 100,0% 100,0% 17 100,0% 100,0% 21 100,0% 100,0% 24 100,0% 100,0% 26 100,0% 100,0% 2909838 29 0 0,0% 0,0% 3 12,0% 12,0% 5 24,0% 24,0% Groupe 5 7 64,0% 64,0% (1/300) 10 84,0% 84,0% 12 88,0% 88,0% 14 92,0% 92,0% 17 92,0% 92,0% 21 92,0% 92, 0% 24 96,0% 96,0% 26 96,0% 96,0% 0 0,0% 0,0% 3 9,1% 9,1% 5 13,6% 13,6% 7 31,8% 31,8% Groupe 6 10 45,5% 45,5% (1/1000) 12 50,0% 50,0% 14 50,0% 50, 0% 17 54,5% 54,5% 21 61,9% 61,9% 24 66,7% 66,7% 26 66,7% 66,7% Les larves inoculées avec la composition comprenant la plus forte concentration en spores Bb 147 (dilution au 1/10 ; groupe 2) ont une mortalité corrigée 5 de 60% dès le 3ème jour, et 100% dès le 7ème jour après l'inoculation. Lorsque les dilutions sont plus importantes, la mortalité corrigée diminue : elle dépasse 95% à partir du 7 ème jour pour la dilution au 1/30, à partir du 10ème 10 jour pour la dilution au 1/100, et à partir du 24ème jour pour la dilution au 1/300. La mortalité est encore plus faible pour la plus forte dilution, puisque elle atteint 50% au 12ème jour et atteint seulement 66,7% au dernier jour de l'étude. 2909838 30 Ces résultats montrent qu'il existe une relation dose-effet entre les spores de la souche Bb 147 et les larves de Paysandisia archon. EXEMPLE IV : Influence de l'âge des larves de Paysandisia 5 archon sur leur sensibilité à la souche Bb 147 de Beauveria bassiana Pour déterminer si l'âge de la larve de Paysandisia archon a une influence sur leur sensibilité vis-à-vis des spores de la souche Bb 147, l'expérience 10 suivante a été réalisée : Des larves de Paysandisia archon d'âges différents sont réparties dans quatre groupes, de façon à ce que dans chaque groupe la répartition des larves selon leur âge soit la même que dans le groupe de larves de 15 départ. Les larves des groupes 1, 2, 3 et 4 sont inoculées respectivement avec le blanc de formulation pur (non-dilué), le blanc de formulation 1/100, la composition Bb 147 1/100, et une poudre de spores Bb 147 pures. Aucune corrélation n'a pu être établie entre 20 l'âge des larves au moment de l'inoculation et leur durée de vie. Ces résultats suggèrent que la virulence du champignon n'est pas influencée par l'âge des larves. EXEMPLE V : Efficacité de la souche Bb147 sur larves de P. archon en conditions naturelles 25 Pour tester l'efficacité de Beauveria bassiana en condition naturelle, des palmiers sont traités préventivement par la souche Bb 147, puis l'infestation a été testée sur des palmiers adultes en plein air. 20 palmiers de 5 à 6 ans, de l'espèce Phoenix 30 canariensis, mesurant 30 à 35 cm de haut, sont répartis en quatre groupes de cinq individus, numérotés groupes 1 à 4. Les essais sont réalisés en plein air, à l'automne, dans des cages de type inse_ct-proof (Diatex). Les palmiers sont traités préventivement à des 35 doses variables de Bb 147 en formulation liquide. La solution mère de Bb 147 utilisée comprend 6,89.1012 spores viables par litre d'un mélange huile + émulgateur. 2909838 31 Des études préparatoires ont permis de déterminer que le volume d'eau nécessaire pour couvrir toute la surface foliaire au point de ruissellement est de 400 ml. Les palmiers sont donc traités avec 400 ml de la 5 composition à tester comme indiqué dans le Tableau VII : Tableau VII : Compositions comprenant la souche de Bb 147 utilisée pour le traitement préventif des palmiers Groupe Composition testée Evaluation du nombre de spores par arbres groupe 1 400 ml d'eau 0 (témoin) groupe 2 0,2 ml de Bb147 dans 1,4.109 400 ml d'eau groupe 3 0,6 ml de Bb147 dans 4,1.109 400ml d'eau groupe 4 2,0 ml de Bb 147 dans 1,4.1010 400 ml d'eau Quelques heures après le traitement, 25 larves 10 de P. archon, âgées de 36 à 43 jours, sont déposées sur le feuillage de chaque arbre, la couronne foliaire ayant eu le temps de sécher. Résultats : a) Taux d'attaque et mortalité corrigée 15 Les premiers dégâts visuels apparaissent au bout de trente jours. Ils se manifestent par l'apparition de sciure au point de pénétration de la larve. Les observations sont effectuées à J+39, c'est-à-dire 39 jours après le traitement. 20 Le taux d'attaques représente le pourcentage d'attaques par rapport au nombre de larves (25). L'efficacité est déterminée selon la formule suivante : 2909838 32 Efficacité pour un groupe donné = (taux d'attaques du groupe témoin - taux d'attaque dudit groupe donné) / taux d'attaque du groupe témoin. Les résultats sont représentés dans le Tableau 5 VIII ci-après. Tableau VIII : Détermination de l'efficacité de la souche Bb 147 sur la réduction du taux d'attaques des palmiers par les larves de P. archon Groupe Attaques Taux Efficacité visible d'attaques Groupe 1 11 44% (témoin) Groupe 2 6 24% 45% Groupe 3 3 12 % 73% Groupe 4 1 4% 91% A J+70 environ, les palmiers sont tronçonnés 10 et dépiautés à la main pour trouver les larves survivantes ou leur cadavres à l'intérieur du végétal, et évaluer le niveau de dégâts pour chaque groupe de palmiers. Les résultats sont illustrés dans le Tableau 15 IX ci-après. Tableau IX : Détermination des pourcentages de mortalité brute et corrigée des larves de P. archon après traitement préventif des palmiers par la souche Bb 147. Chenilles Attaques Attaques Chenilles Mortalité Mortalité survivantes avortées totales perdues brute corrigée Groupe 1 13 ! 3 16 9 19 % Groupe 2 8 11 19 6 5 8% 4 8% Groupe 3 5 15 20 5 75 % 69 % Groupe 4 4 18 2 2 3 8 2% 7 8% Les attaques sont les points de pénétration 20 sur la couronne foliaire. Certaines attaques ont donné lieu à une galerie profonde dans laquelle la larve est toujours active. D'autres attaques ont été rapidement 2909838 33 stoppées par la mort de la larve, sous l'effet insecticide de la souche Bb 147 ou bien pour des raisons indéterminées. Dans les galeries vides la capsule céphalique est couramment retrouvée. En revanche, très peu de 5 cadavres sont retrouvés compte tenu de la durée de l'essai. On observe très nettement un effet dose sur la mortalité des larves et le nombre d'attaques qui se poursuivaient au jour du dépiautage. Dans la modalité la 10 plus forte (groupe 4), :La mortalité avoisine les 80%. Pour les groupes 2 et 3, toutes les larves retrouvées vivantes dans le végétal y sont entrées via la périphérie de la couronne foliaire, ce qui suggère que l'efficacité des composition testées sur ces groupes 15 pourrait être améliorée en augmentant leur volume. b) Taille des larves survivantes La taille moyenne initiale des larves utilisées dans ces essais est de 10 à 12 mm. Les larves retrouvées dans les palmiers 20 dépiautés à J+70 sont mesurées et les résultats sont représentés dans le Tableau. X : 5 2909838 34 Tableau X : Détermination de la taille des larves de P. archon survivantes après le traitement préventif des palmiers par des compositions comprenant la souche Bb 147 Numéro Groupe Numéro du longueur de la palmier (en mm) larve 1 1 35 2 1 21 3 1 14 4 2 12 5 _2 17 6 Groupe 1-2 20 7 (témoin) _3 20 8 3 50 9 3 20 10 4 22 11 4 non mesurée 12 5 19 13 5 20 14 1 22 15 2 35 16 2 27 17 Groupe 2 2 30 18 3 15 19 3 18 20 3 35 21 4 22 22 1 6 23 1 6 24 Groupe 3 2 17 25 3 11 26 5 32 27 2 8 28 Groupe 4 2 14 29 3 10 30 5 10 Les larves survivantes retrouvées à J+70 dans le groupe 1 (témoin) et dans le groupe 2 (faible dose de Bb147) présentent une taille moyenne de 20 à 25 mm. Dans les groupes 3 et 4, la taille des larves 10 survivantes est de 10 à 15 mm. 2909838 35 L'ensemble de ces résultats montre que la souche Bb 147 de Beauveria bassiana présente une efficacité à deux niveaux, à savoir une efficacité directe sur la mortalité des larves, et une efficacité indirecte sur 5 le retard de croissance. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'un champignon entomopathogène comme moyen de lutte biologique contre Paysandisia archon. 2) Utilisation d'un champignon entomopathogène pour le traitement d'au moins un végétal contre une infestation par Paysandisia archon. 3) Utilisation, selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ledit champignon 10 appartient à la subdivision des Deuteromycètes. 4) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit champignon appartient à la classe des Hyphomycètes ou la classe des Coelomycètes. 5) Utilisation selon la revendication 4, 15 caractérisée en ce que ledit champignon est sélectionné dans le groupe constitué par les champignons des genres Beauveria, Metarhizium, Verticillium, Hirsutella, Erynia (ou Zoophtora), Nomurae, Aspergillus, Aschersonia, Paecilomyces, Tolypocladium, Leptolegnia, Culicinomyces, 20 Coelomomyces et Lagenidium. 6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit champignon est sélectionné dans le groupe constitué par les espèces Beauveria bassiana, Beauveria brongniartii, Metarhizium anisopliae, 25 Metarhizium flavoviride, Paecilomyces fumusoroseus, Paecilomyces farinosus et Nomuraea rileyi. 7) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit champignon est sélectionné dans le groupe constitué par la souche de Beauveria 30 bassiana déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) sous le numéro I-867 le 7 juin 1989, la souche de Beauveria bassiana déposée à la C.N.C.M. sous le numéro I-2960 le 3 décembre 2002, et la souche de Beauveria bassiana déposée auprès 35 de l'ATCC (American Type Culture Collection) sous le numéro 74250 le 11 octobre 1993. 2909838 37 8) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit champignon est sous forme de spores ou de mycélium. 9) Utilisation selon la revendication 8, 5 caractérisée en ce que ledit champignon est sous forme de conidies. 10) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ledit champignon est utilisé en combinaison avec au moins un autre champignon entomopathogène. 11) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisée en ce que ledit végétal est un palmier. 12) Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit palmier est sélectionné dans le groupe constitué par les palmiers des genres Trithrinax, Butia, Latania, Chamaerops, Phoenix, Livistona, Sabal, Trachycarpus et Washingtonia. 13) Procédé de traitement d'un végétal contre une infestation par Paysandisia archon comprenant une étape consistant à mettre en contact ledit palmier avec un champignon entomopathogène. 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit champignon entomopathogène 25 est tel que défini aux revendications 3 à 7. 15) Procédé selon la revendication 13 ou la revendication 14, caractérisé en ce que ledit champignon est sous forme de spores ou sous forme de mycélium. 16) Procédé selon la revendication 15, carac- 30 térisé en ce que ledit champignon est sous forme de conidies. 17) Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que ledit champignon est utilisé en combinaison avec au moins un autre champi- 35 gnon entomopathogène. 18) Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que ledit palmier 2909838 38 est sélectionné dans le groupe constitué par les palmiers des genres Trithrinax, Butia, Latania, Chamaerops, Phoenix, Livistona, Sabal, Trachycarpus et Washingtonia.