FR 2907794 A1 20080502 FR 0706815 A 20070928 MÉTHODE DE DÉTECTION D'OLIGONUCLÉOTIDES COURTS La présente demande revendique la priorité de la demande de brevet provisoire U.S. N 60/848 236, déposée le 29 septembre 2006, qui est incorporée ici à titre de référence dans son entièreté. La présente invention est réalisée avec un support gouvernemental sous le NIH Grant N GM31528 et AI28799, du National Institute of Health (NIH). Le gouvernement des Etats-Unis peut avoir certains droits sur l'invention. La présente invention concerne de manière générale, des méthodes ou procédés de détection d'acides nucléiques, et plus particulièrement, des procédés de détection d'oligonucléotides courts, comme de petits ARN de régulation, des microARN et de petits ARN interférants. Les petits ARN de régulation, comme les microARN (miARN) sont une famille d'ARN non codant de 21-25 nucléotides, qui régulent l'expression génique au niveau post-transcriptionnel. L'interaction entre le miARN et sa cible ARNm résulte souvent en l'inhibition de la synthèse protéique. Actuellement, plus de 1000 miARN ont été identifiés chez les animaux et dans les plantes selon le registre des miARN. Des preuves croissantes suggèrent que les miARN sont des régulateurs importants de la division cellulaire et de la différenciation, ainsi que comme gène du cancer humain. Récemment, la découverte des effets régulateurs sur l'expression génique a conduit à de nombreuses études sur la caractérisation de la fonction des miARN 2907794 2 dans les processus moléculaires et comme outils possibles dans la découverte de médicaments. L'intérêt pour les petits ARN de régulation, comme les miARN, a créé une demande pour de nouveaux outils 5 pour étudier l'expression. Actuellement, le transfert de Northern est la technique standard pour l'analyse de l'expression des petits ARN. L'avantage principal du transfert de Northern est qu'il n'exige pas d'étape d'amplification, qui peut générer artificiellement des 10 faux positifs. Cependant, un inconvénient majeur du transfert de Northern est sa faible sensibilité, en particulier lors du contrôle de l'expression de séquences courtes de nucléotides comme les miARN. En outre, une grande quantité d'ARN total est souvent 15 exigée pour les transferts de Northern. Malgré des améliorations dans la détection comme l'utilisation d'échantillons d'acide nucléique verrouillé, les procédures du dosage par transfert de Northern restent un travail long et important au laboratoire. 20 La présente invention concerne un procédé de détection d'une série de différents oligonucléotides courts. Le procédé comprend la mise à disposition d'un isolat biologique comprenant au moins un oligonucléotide court. L'isolat biologique peut être 25 mis en contact avec au moins un oligonucléotide de détection ayant une partie de marqueur et au moins un oligonucléotide de pont, dans des conditions telles que au moins un oligonucléotide court et au moins un oligonucléotide de détection sont préférentiellement additionnés sur l'oligonucléotide de pont pour produire au moins un oligonucléotide court marqué. Au moins un 2907794 3 réactif de ligature peut être ajouté pour joindre préférentiellement ledit au groins un oligonucléotide court et ledit au moins un oligonucléotide de détection. Le au moins un oligonucléotide court marqué peut alors 5 être détecté. Dans un autre aspect de la présente invention, une trousse est proposée, pour détecter une série de oligonucléotides courts dans un isolat biologique. La trousse comprend un oligonucléotide de détection, qui 10 comprend d'environ 5 à environ 500 nucléotides (par exemple, d'environ 5 à environ 50 nucléotides) et ayant une extrémité 5' et une extrémité 3'. L'oligonucléotide de détection se ligature de préférence au oligonucléotide court La trousse peut comprendre 15 également, une partie de marqueur pour marquer préférentiellement l'oligonucléotide de détection. La partie de marqueur peut être liée à l'oligonucléotide de détection. De plus, la trousse peut comprendre des réactifs pour ligaturer l'oligonucléotide court à 20 l'oligonucléotide de détection. Les caractéristiques précédentes et d'autres de la présente invention deviendront évidentes pour l'homme de métier auquel la présente invention s'adresse, à la lecture de la description suivante en référence aux 25 dessins annexés, dans lesquels : La figure 1 est un organigramme montrant un procédé de détection d'une série d'oligonucléotides courts selon un aspect de la présente invention. Les figures 2A-C montrent l'expression 30 quantitative de miR-21 à l'aide de la présente invention (figure 2A, supérieur) et d'un transfert de 2907794 4 Northern (figure 2A, inférieur). Les dosages représentés à la figure 2A sont réalisés en parallèle à l'aide de l'ARN total de cellules HeLa, avec les quantités indiquées. Les images sont quantifiées à 5 l'aide d'une analyse par phosphoimageur (figure 2B). La figure 2C est un tableau montrant les paramètres expérimentaux et les sensibilités résultantes de chaque dosage. Les figures 3A-B montrent les profils d'expression 10 de miARN dans le tissu musculaire (figure 3A, supérieur) et le tissu cérébral (figure 3A, centre), et des cellules HeLa (figure 3A, inférieur) à l'aide de la présente invention. La figure 3B est un tableau comparant les paramètres expérimentaux entre la 15 présente invention et le dosage par transfert de Northern, et Les figures 4A-C illustrent un exemple comparatif de la présente invention et un dosage hybridation en solution/protection par ribonucléase. Les figures 4A-B 20 montrent la détection de miR-124a et miR133a-1 par la présente invention (figure 4A) et le dosage hybridation en solution/protection par ribonucléase (figure 4B). Les deux dosages sont réalisés en parallèle à l'aide de l'ARN total avec les quantités indiquées. L'image est 25 développée après une exposition de 2 heures d'un film pour rayons X à -80 C. La figure 4C est un tableau comparant les paramètres expérimentaux entre la présente invention et les sensibilités résultantes de la présente invention et du dosage hybridation en 30 solution/protection par ribonucléase. 2907794 5 La présente invention concerne de manière générale, des procédés de détection d'acides nucléiques, et plus particulièrement, des procédés de détection d'oligonucléotides courts, comme de petits ARN de 5 régulation (par exemple, microARN (miARN) et de petits ARN interférant (siARN)). Il a été découvert qu'un oligonucléotide de détection marqué, en combinaison avec un oligonucléotide de pont peuvent être utilisés pour détecter des oligonucléotides courts, comme de 10 petits ARN de régulation (par exemple, miARN et siARN). Sur la base de cette découverte, la présente invention propose un procédé de détection de plusieurs oligonucléotides courts dans par exemple, environ 50 ng ou moins d'ARN total sans nécessiter d'une étape 15 d'amplification. Avantageusement, le procédé de la présente invention est rapide (par exemple, capture et marquage des oligonucléotides courts en environ 2 heures) et présente une gamme linéaire de détection d'environ 0,1 à environ 10 femtomoles. 20 La présente invention permet également la détection simultanée de plusieurs oligonucléotides courts. Parce que plusieurs oligonucléotides courts peuvent être simultanément détectés, la diversité des oligonucléotides courts présents dans une cellule ou un 25 organisme peut être aisément évaluée en recherche ou pour une mise au point clinique à l'aide de la présente invention. Telle qu'utilisée ici, l'expression oligonucléotides courts signifie un acide nucléique 30 ayant une longueur d'environ 5 à environ 500 nucléotides (par exemple, d'environ 5 à environ 2907794 6 50 nucléotides, environ 5 à environ 30 nucléotides ou environ 10 à environ 30 nucléotides) et se terminant par un phosphate en 5' et/ou un hydroxyle en 3'. Un phosphate en 5' est une partie (PO4)2, (PO4H) ou 5 (PO4H2), attachée de manière covalente au carbone 5' du ribose via un des oxygènes. Un hydroxyle en 3' est une partie OH ou 0-, lié de manière covalente au carbone 3' du ribose via l'oxygène. L'homme du métier reconnaîtra que la présence ou l'absence de l'hydrogène dans les 10 parties phosphate et hydroxyle, comme indiquées ci-dessus, est fonction de leur valeur pKa et du pH de l'environnement. Les oligonucléotides courts peuvent être identifiés selon leur fonction dans une cellule, y 15 compris par exemple, d'avoir une séquence non-codante (à savoir, ne pas être traduit en protéine) (par exemple, ARN non codant) et d'être capable de réguler l'expression d'au moins un gène (par exemple, petit ARN de régulation). Les oligonucléotides courts peuvent 20 également être identifiés selon leur biosynthèse. Par exemple, un type d'oligonucléotides courts, les siARN, est synthétisé typiquement à partir de molécules d'ARN endogène ou exogène double brin (ARNdb), ayant des structures en épingle à cheveu, et traités de sorte que 25 de nombreuses molécules de siARN sont produites à partir des deux brins de l'épingle à cheveu. Les termes siARN et miARN sont cohérents avec leur utilisation dans la technique, comme décrit par exemple dans Ambros et coll. ARN 9 : 277-279 (2003). 30 Si un oligonucléotide court comprend un petit ARN de régulation, comme un siARN ou un miARN, les 2907794 7 oligonucléotides courts peuvent être distingués de l'ARNm sur base de la présence d'une structure de coiffe en 5' dans l'ARNm et de l'absence de la structure de coiffe dans l'oligonucléotide court. La 5 structure de coiffe en 5' trouvée typiquement dans les ARNm eucaryotes est un 7-méthylguanylate ayant une liaison triphosphate 5' à 5' sur le nucléotide terminal. Les petites molécules d'ARN interférant ou miARN peuvent également être distinguées de l'ARNm sur base 10 de la présence d'une séquence terminale polyadénylate à l'extrémité 3' de l'ARNm, qui est absente dans les siARN et les miARN. Telle qu'utilisée ici, l'expression isolat biologique signifie une ou plusieurs substances 15 isolées d'au moins une molécule également présente d'un organisme. Un acide nucléique isolé peut être par exemple, essentiellement exempt d'autres acides nucléiques, de sorte qu'il est augmenté à une fraction significativement plus élevée de l'acide nucléique 20 total présent dans l'isolat biologique, par rapport aux cellules desquelles il est prélevé. Par exemple, un acide nucléique isolé peut être enrichi d'au moins 2, 5, 10, 50, 100, 1000 fois ou plus dans l'isolat biologique, par comparaison à la cellule de laquelle il est prélevé. 25 Un isolat biologique peut être obtenu d'un organisme, tissu ou cellule intacte. Des exemples d'eucaryotes desquels les isolats biologiques peuvent dériver dans un procédé de l'invention, comprennent sans limitation, un mammifère, comme un rongeur, une souris, un rat, un 30 lapin, un cochon d'Inde, un ongulé, un cheval, un mouton, un porc, une chèvre, un boeuf, un chat, un chien, 2907794 8 un primate, un primate humain ou non humain ; une plante comme Arabidopsis thaliana, le maïs (Zea mays), le sorgo, l'avoine (Oryza sativa), le blé, le riz, le canola, ou le soya ; une algue comme Chlamydomonas 5 reinhardtii ; un nématode comme Caenorhabditis elegans ; un insecte comme Drosophila melanogaster, le moustique, la mouche des fruits, l'abeille mellifère ou une araignée ; un poisson comme le poisson zèbre (Danio rerio) ; un reptile ; un amphibien comme une grenouille 10 ou Xenopus laevis ; un Dictyostelium discoideum ; un champignon, comme Pneumocystis carinzî, Takifugu rubripes, une levure, Saccharomyces cerevisiae ou Schizosaccharomyces pombe ; ou Plasmodium falciparum. En plus des systèmes animaux et végétaux, la présente 15 invention peut être utilisée avec un système procaryote comprenant par exemple, une bactérie comme Escherichia co1i, Staphylococci ou Mycoplasma pneumoniae ; une Archée ; un virus comme le virus de l'hépatite C ou le virus de l'immunodéficience humaine, ou un viroïde. Les 20 oligonucléotides courts endogènes peuvent être isolés d'un système biologique par lequel ils sont synthétisés. Les oligonucléotides courts exogènes peuvent être isolés d'un système biologique duquel ils sont transmis, par exemple par infection virale ou traitement avec un 25 précurseur d'oligonucléotide court. Des précurseurs de l'oligonucléotide court exemplaires comprennent les ARNdb, comme ceux décrits de manière plus détaillée ci-dessous. Telle qu'utilisée ici, l'expression 30 oligonucléotide de détection signifie une séquence d'oligonucléotide, comprenant d'environ 5 à environ 2907794 9 500 nucléotides (par exemple, d'environ 5 à environ 200 nucléotides, d'environ 5 à-environ 100 nucléotides, ou d'environ 5 à environ 50 nucléotides), et se terminant en une extrémité 5' et une extrémité 3'. Dans 5 un aspect de la présente invention, l'oligonucléotide de détection peut comprendre un phosphate en 5' une extrémité 3' modifiée. Un phosphate en 5' est une partie (PO4) 2-, (PO4H)- ou (PO4H2), attachée de manière covalente au carbone en 5' du ribose via un des 10 oxygènes. Dans un autre aspect de l'invention, l'oligonucléotide de détection peut comprendre un hydroxyle en 3' et une extrémité 5' modifiée. Un hydroxyle en 3' est une partie OH ou O-, lié de manière covalente au carbone en 3' du ribose via l'oxygène. 15 L'homme du métier reconnaîtra que la présence ou l'absence de l'hydrogène dans les parties phosphate et hydroxyle, comme indiquées ci-dessus, est fonction de leur valeur pKa et du pH de l'environnement. Une extrémité 3' ou 5' modifiée peut comprendre 20 toute modification chimique ou structurale d'au moins un nucléotide, qui peut prévenir, inhiber et/ou réduire la formation d'une liaison phosphodiester entre deux nucléotides. Des exemples de telles modifications comprennent sans limitation, des espaceurs C-3, des 25 agents modifiant amino, des dT inversés, et des didésoxy-C. En incorporant une extrémité 5' ou 3' modifiée, la formation de produits non désirés de ligature peut être réduite ou prévenue. L'oligonucléotide de détection peut être composé 30 d'ARN, ADN naturel ou synthétique, ou d'autres oligonucléotides, comme un analogue d'un acide 2907794 10 nucléique naturel. Au moins une molécule d'acide nucléique verrouillé (LNA) peut également être incluse dans l'oligonucléotide de détection. Un LNA peut comprendre un nucléotide d'ARN modifié, par exemple 5 dans lequel la partie ribose du LNA est modifié avec un pont supplémentaire connectant les carbones 2' et 4'. Le pont peut verrouiller le ribose en une conformation 3'-endo, augmentant ainsi la stabilité de la base et la pré-organisation du squelette. 10 Un analogue d'acide nucléique peut avoir un squelette alternatif, comprenant sans limitation, des liaisons phosphoramide (voir par exemple, Beaucage et coll., Tetrahedron 49 : 1925 (1993) ; Lestinger, J. Org. Chem. 35 : 3800 (1970) ; Sprinzl et coll., Eur. J. 15 Biochem. 81 : 579 (1977) ; Letsinger et coll., Nucl. Acids Res. 14 : 3487 (1986) ; Sawai et coll., Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et coll., J. Am. Chem. Soc. 110 : 4470 (1988) ; et Pauwels et coll., Chemica Scripta 26 : 141 (1986)), phosphorothioate (voir par 20 exemple, Mag et coll., Nucleic Acid Res. 19 : 1437 (1991) et brevet US N 5 644 048), phosphorodithioate (voir par exemple, Briu et coll., J. Am. Chem. Soc. 111 : 2321 (1989)), 0-méthylphosphoramidite (voir par exemple Eckstein, Oligonucleotides and Analogues : A 25 Practical Approach, Oxford University Press), et des squelettes et liaison acide nucléique peptidique (voir par exemple, Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114 : 1895 (1992) ; Meier et coll., Chem. Ind. Ed. Engl. 31 : 1008 (1992) ; Nielsen, Nature 365 : 566 (1993) ; Carlsson et 30 coll., Nature 380 : 207 (1996)). D'autres structures analogues comprennent celles avec des squelettes 2907794 11 positifs (voir par exemple, Dempey et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 6097 (1995)) ; des squelettes non ioniques (voir par exemple, brevet US N 5 386 023, 5 637 684, 5 602 240, 5 216 141 et 4 469 863 ; 5 Kiedrowshi et coll., Angew. Chem. Int. Ed. English 30 : 423 (1991) ; Letsinger et coll., J. Am. Chem. Soc. 110 : 4470 (1988) ; Letsinger et coll., Nucleoside & Nucleotide 13 : 1597 (1994); chapitres 2 et 3, ACS Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in 10 Antisense Research", éd. Y.S. Sanghui et P. Dan Cook ; Mesmaeker et coll., Bioorganic & Medicinal Chem. Left. 4 : 395 (1994) ; Jeffs et coll., J. Biomolecular NMR 34 : 17 (1994) ; Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996) et des squelettes non ribose, y compris par exemple ceux 15 décrits dans les brevets US N 5 235 033 et 5 034 506, et chapitres 6 et 7, ACS Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research", éd. Y.S. Sanghui et P. Dan Cook. Des structures analogues contenant un ou plusieurs sucres carboxyliques sont 20 également utiles dans les procédés et sont décrits par exemple, dans Jenkins et coll., Chem Soc. Rev. (1995) pages 169-176. Plusieurs autres structures analogues, qui sont utiles dans l'invention, sont décrites dans Rawls C. & E. News, 2 juin 1997, page 35. Des analogues 25 similaires peuvent être utilisés dans une sonde ou un autre acide nucléique de l'invention. Un acide nucléique ou analogue d'acide nucléique utilisé dans la présente invention peut comprendre des bases natives ou non natives ou les deux. Les bases 30 natives d'acide désoxyribonucléique comprennent l'adénine, la thymine, la cytosine, ou la guanine et 2907794 12 les bases natives d'acide ribonucléique comprennent l'uracile, l'adénine, la cytosine, ou la guanine. Des exemples de bases non natives, qui peuvent être utilisées dans l'invention, comprennent, sans 5 limitation, 1'inosine, la xathanine, l'hypoxathanine, l'isocytosine, l'isoguanine, la 5-méthylcytosine, la 5-hydroxyméthylcytosine, la 2-aminoadénine, la 6-méthyladénine, la 6-méthylguanine, la 2-propylguanine, la 2-propyladénine, le 2-thioluracile, la 2-thiothymine, 10 la 2-thiocytosine, le 15-halouracile, la 15- halocytosine, le 5-propynyluracile, la 5-propynylcytosine, le 6-azouracile, la 6-azocytosine, la 6-azothimidine, le 5-uracile, le 4-thiouracile, la 8-haloadénine ou -guanine, la 8-aminoadénine ou -guanine, 15 la 8-thioladénine ou -guanine, la 8-thioalkyladénine ou -guanine, la 8-hydroxyadénine ou -guanine, l'uracile ou la cytosine 5-halosubstituée, la 7-méthylguanine, la 7-méthyladénine, la 8-azaguanine, la 8-azaadénine, la 7-déazaguanine, la 7-déazaadénine, la 3-déazaguanine, la 20 3-déazaadénine, ou similaire. Telle qu'utilisée ici, l'expression oligonucléotide de pont signifie une séquence nucléotidique comprenant environ 10 à 100 nucléotides ou plus, et se terminant en une extrémité 5' et une 25 extrémité 3'. L'oligonucléotide de pont peut comprendre un ARN, ADN naturel ou synthétique, ou d'autres oligonucléotides, comme un analogue d'un acide nucléique naturel (décrit de manière détaillée ci-dessus). Les deux extrémités 5' et 3' de 30 l'oligonucléotide de pont peuvent comprendre une modification, comme un espaceur C-3, un dT inversé, un 2907794 13 agent modifiant amino, un didésoxy-C, ou un autre agent pour réduire ou prévenir la formation de produits non désirés de ligature. En variante, les extrémités 5' et 3' peuvent comprendre respectivement, un phosphate en 5 5' et un hydroxyle en 3' ; cependant, de tels groupes terminaux ne sont pas préférés car ils peuvent représenter une plus grande probabilité de génération de produits de ligature. L'oligonucléotide de pont peut être complémentaire à l'oligonucléotide de détection et 10 un oligonucléotide court aux extrémités 5' et 3', respectivement. En variante, l'oligonucléotide de pont peut être complémentaire à l'oligonucléotide de détection et un oligonucléotide court aux extrémités 3' et 5', respectivement. De plus, une partie de 15 l'oligonucléotide de pont entre les extrémités 5' et 3' peut être complémentaire de l'oligonucléotide court, alors que les extrémités 5' et 3' peuvent être complémentaires à une série d'oligonucléotides de détection. 20 Telle qu'utilisée ici, l'expression partie de marqueur signifie un ou plusieurs atomes, qui peuvent être détectés spécifiquement pour identifier une substance, comme un acide nucléique, auquel le un ou plusieurs atomes sont attachés. Une partie de marqueur 25 peut être un marqueur primaire, qui est directement détectable, ou un marqueur secondaire, qui peut être indirectement détecté, par exemple via une interaction avec un marqueur primaire. Des exemples de marqueur primaire comprennent sans limitation, un marqueur 30 isotopique, comme un isotope lourd non abondant naturel ou un isotope radioactif, dont des exemples comprennent 2907794 14 14C, 1231, 1241, 1251, 1311, 32p, 33p, 35s ou 3H ; des parties optiquement détectable, comme un' chromophore, un luminophore, un fluorophore, une boîte quantique ou un marqueur nanoparticulaire diffractant la lumière ; un 5 marqueur à spin électromagnétique ; un agent calorimétrique ; une substance magnétique ; un matériau riche en électrons, comme un métal, un marqueur électrochimioluminescent, comme Ru(bpy)32+' une partie qui peut être détectée sur base d'une caractéristique 10 nucléaire magnétique, paramagnétique, électrique, charge à masse, ou thermique ; ou des matériaux diffractant la lumière ou à résonance plasmon, comme des particules d'or ou d'argent. Les fluorophores qui peuvent être utilisés dans l'invention, comprennent par 15 exemple, des complexes fluorescents de lanthanide, y compris ceux de l'europium et du terbium, la fluorescéine, l'isocyanate de fluorescéine, la dichlorotriazinylamine de la fluorescéine, la rhodamine, la tétraméthylrhodamine, l'umbelliférone, l'éosine, 20 l'érythrosine, la coumarine, les méthylcoumarines, le pyrène, le vert de Malachite, le Cy3, le Cy5, le stilbène, le jaune Lucifer, le CASCADE BLUE, le rouge Texas, les colorants alexa, le chlorure de dansyle, la phycoérythrine, la protéine fluorescente verte et ses 25 variants à longueur d'onde déplacée, le bodypy et d'autres connus dans la technique, comme ceux décrits dans Haugland, Molecular Probes Handbook (Eugene, Oreg.) 6ème édition ; The Synthegen catalog (Houston, Texas), Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2ème 30 édition, Plenum Press New York (1999) ou WO 98/59066. 2907794 15 Des exemples de marqueurs secondaires sont des parties de liaison, comme un récepteur, un ligand ou un autre membre d'une paire de molécules ayant une spécificité de liaison l'une pour l'autre. Des parties 5 de liaison exemplaires ayant une spécificité de liaison l'une pour l'autre, comprennent sans limitation, le streptavidine/biotine, l'avidine/biotine ou un complexe antigène/anticorps comme l'IgG de lapin et l'IgG antilapin. Une affinité spécifique entre deux partenaires 10 de liaison signifie la liaison préférentielle d'un partenaire à un autre, par comparaison à la liaison du partenaire à d'autres composants ou contaminants dans le système. Les partenaires de liaison, qui sont liés spécifiquement, restent typiquement liés dans les 15 conditions de détection ou de séparation décrites ici, y compris les étapes de lavages pour éliminer la liaison non spécifique. En fonction des conditions particulières de liaison utilisées, les constantes de dissociation de la paire peuvent être par exemple, 20 inférieures à environ 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 ou 10-12 M-1. Des marqueurs secondaires comprennent également des enzymes, qui produisent un produit détectable, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la j3-galactosidase ou 25 l'acétylcholine estérase. Tel qu'utilisé ici, le terme ligand signifie une molécule, qui est capable de se lier sélectivement à une autre molécule. La figure 1 est un organigramme illustrant un 30 procédé 10 pour la détection d'oligonucléotides courts selon un aspect de l'invention. Dans le procédé 10, en 2907794 16 20, un isolat biologique comprenant au moins un oligonucléotide court est proposé. L'isolat biologique peut provenir d'une variété d'organismes, comprenant sans limitation, ceux indiqués ci-dessus. Dans beaucoup 5 de cas, les isolats biologiques peuvent être accessibles à partir de source commerciales ou de banques et dépôts administrés par des institutions publiques ou privées comme l'American Type Culture Collection (ATCC). Pour beaucoup d'applications, il est 10 désirable que les protocoles d'isolement utilisés par les sources commerciales ne soient pas prévenus d'une rétention des oligonucléotides courts intéressants pour une application particulière de la présente invention. Un isolat biologique peut provenir d'une ou de 15 plusieurs cellules, fluides ou tissus corporels. Des procédés connus peuvent être utilisés pour obtenir un fluide corporel comme le sang, la sueur, des larmes, la lymphe, l'urine, la salive, le sperme, le fluide cérébrospinal, les fèces ou le liquide amniotique. De 20 manière similaire, les procédés connus de biopsie peuvent être utilisés pour obtenir des cellules ou tissus, comme le frottis buccal, un lavage buccal, un prélèvement chirurgical, la biopsie par aspiration ou similaire. Un isolat biologique peut également être 25 obtenu d'une ou plusieurs cellule ou tissu en culture primaire, dans une lignée cellulaire propagée, un échantillon d'archive fixé, un échantillon de médecine légale ou un échantillon archéologique. Des types exemplaires de cellules, desquelles un 30 isolat contenant des acides nucléiques peut être obtenu dans le procédé 10 de la présente invention, peuvent 2907794 17 comprendre sans limitation, une cellule sanguine comme un lymphocyte B, un lymphocyte T, 'un leucocyte, un érythrocyte, un macrophage ou un neutrophile ; une cellule musculaire comme une cellule squelettique, une 5 cellule de muscle lisse ou une cellule de muscle cardiaque ; une cellule germinale comme un spermatozoïde ou un ovule ; une cellule épithéliale ; une cellule du tissu conjonctif comme un adipocyte, un fibroblaste ou un ostéoblaste ; un neurone ; un 10 astrocyte ; une cellule stromale ; une cellule de rein ; une cellule pancréatique ; une cellule de foie, ou un kératinocyte. Une cellule à partir de laquelle un isolat est obtenu, peut être en un stade particulier du développement, y compris par exemple une cellule souche 15 hématopoïétique, ou une cellule qui provient d'une cellule souche hématopoïétique comme un globule rouge, un lymphocyte B, un lymphocyte T, une cellule tueuse naturelle, un neutrophile, un basophile, un éosinophile, un monocyte, un macrophage ou une plaquette. D'autres 20 cellules comprennent une cellule stromale de moelle osseuse (cellule souche mésenchymateuse) ou une cellule qui se développe à partir de celle-ci comme une cellule osseuse (ostéocyte), des cellules de cartilage (chondrocyte), une cellule de graisse (adipocyte) ou 25 d'autres types de cellules de tissu conjonctif comme celle trouvée dans les tendons ; des cellules souches neurales ou une cellule qui donne lieu à par exemple, une cellule nerveuse (neurone), un astrocyte ou un oligodendrocyte ; une cellule souche épithéliale ou une 30 cellule qui provient d'une cellule souche épithéliale comme une cellule d'absorption, une cellule calciforme, 2907794 18 une cellule de Paneth ou une cellule entéroendocrine ; une cellule souche de peau'; unè cellule souche épidermique, ou une cellule souche folliculaire. De manière générale, tout autre type de cellule souche 5 peut être utilisé, y compris, sans limitation, une cellule souche embryonnaire, une cellule souche d'adulte ou une cellule souche pluripotente. Une cellule de laquelle un isolat biologique est obtenu pour un usage dans la présente invention, peut 10 être une cellule normale ou une cellule présentant un ou plusieurs symptômes d'une maladie ou d'un état particulier. Ainsi, un isolatbiologique utilisé dans un procédé de la présente invention peut être obtenu d'une cellule cancéreuse, d'une cellule néoplasique, 15 d'une cellule nécrotique ou d'une cellule présentant une maladie ou un état décrit ci-dessous. L'homme du métier connaît ou est capable de déterminer aisément les procédés d'isolement des échantillons d'une cellule, un fluide ou un tissu à l'aide des procédés connus dans 20 la technique, comme ceux décrits dans Sambrook et coll., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Sème édition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001) ou dans Ausubel et coll., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md (1998). 25 Un autre aspect de la présente invention peut encore comprendre les étapes d'isolement d'un type particulier de cellule ou de tissu. Des procédés exemplaires, qui peuvent être utilisés pour isoler une cellule particulière d'autres cellules dans une 30 population, comprennent mais ne sont pas limités au tri fluorescent de cellules activées (FACS), comme décrit 2907794 19 par exemple dans Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3eme édition Wiley-Liss (1995), •la centrifugation sur gradient de densité, ou la séparation manuelle par des procédés de micromanipulation avec assistance 5 microscopique. Des dispositifs exemplaires de séparation cellulaire, qui sont utiles dans l'invention, comprennent, sans limitation, un système d'élutriage centrifuge Beckman JE-6, un trieur cellulaire par cytométrie à contrôle par ordinateur Beckman Coulter 10 EPICS ALTRA, un cytomètre à flux modulaire de Cytomation Inc., un coulter counter et un système à canal, un appareil de gradient de densité, une cytocentrifugeuse, une centrifugeuse Beckman J-6, un trieur cellulaire laser EPICS V, ou un cytomètre à flux 15 EPICS PROFILE. Un tissu ou une population de cellules peut également être prélevé par des techniques chirurgicales. Par exemple, une tumeur ou des cellules d'une tumeur peuvent être prélevées d'un tissu par des procédés chirurgicaux, ou inversement, des cellules non 20 cancéreuses peuvent être prélevées du voisinage d'une tumeur. Un isolat biologique peut être préparé pour un usage dans le procédé 10 de la présente invention par lyse d'une cellule, qui contient un ou plusieurs acides 25 nucléiques désirés. Typiquement, une cellule est lysée dans des conditions qui préservent sensiblement l'intégrité de l'acide nucléique désiré. Par exemple, les cellules peuvent être lysées ou des sous-fractions obtenues dans des conditions qui stabilisent 30 l'intégrité de l'ARN. De telles conditions comprennent par exemple, la lyse des cellules dans des dénaturants 2907794 20 forts, y compris des sels chaotropes comme le thiocyanate de guanidine, des détergents ioniques comme le dodédcylsulfate de sodium, des solvants organiques comme le phénol, des concentrations élevées en chlorure 5 de lithium ou d'autres conditions connues dans la technique pour être efficaces pour limiter l'activité des RNases endogènes pendant la purification de l'ARN, comme décrit par exemple, dans Sambrook et coll. ci-dessus (2001) ou dans Ausubel et coll., ci-dessus 10 (1998). En outre, des acides nucléiques relativement non endommagés comme l'ARN peuvent être obtenus d'une cellule lycée par une enzyme, qui dégrade la paroi cellulaire. Les cellules sans paroi cellulaires, de manière naturelle ou par élimination enzymatique, 15 peuvent également être lysées par exposition à une contrainte osmotique. D'autres conditions qui peuvent être utilisées pour lyser une cellule, comprennent l'exposition à des détergents, une rupture mécanique, une sonication, la chaleur, une pression différentielle 20 comme un dispositif à presse de French, ou une homogénéisation de Dounce. Selon un autre aspect de la présente invention, l'ARN total peut être préparé à l'aide d'isothiocyanate de guanidine, de phénol:chloroforme, et d'un support 25 inerte comme le glycogène ou un polyacrylamide linéaire. Par exemple, environ 20 ng de glycogène par ml (volume de réaction) peuvent être ajoutés pendant la précipitation alcoolique pour augmenter la récupération de l'ARN total. Les échantillons peuvent alors être 30 préparés par des procédés de purification sur colonne commerciale, comme la trousse de purification miRACLE 2907794 21 miRNA de STRATAGENE (La Jolla, CA). L'ARN isolé peut être dilué dans le tampon TE .ou de'l'eau sans RNase, par exemple, et stocké de manière appropriée. Les agents qui stabilisent les acides nucléiques 5 peuvent être inclus dans un lysat cellulaire ou un autre isolat biologique, y compris par exemple, des inhibiteurs de nucléase comme des inhibiteurs de ribonucléase ou des inhibiteurs de désoxyribonucléase, des agents de chélation, des sels tampons et similaire. 10 Les procédés de lyse de cellules pour obtenir les acides nucléiques peuvent être réalisés dans des conditions connues dans la technique comme décrit par exemple, dans Sambrook et coll. ci-dessus (2001) ou dans Ausubel et coll., ci-dessus (1998). 15 Dans un autre aspect de la présente invention, un isolat biologique peut être un lysat cellulaire brut, obtenu sans autre isolement des acides nucléiques. En variante, un acide nucléique intéressant peut être isolé des autres composants cellulaires selon la 20 présente invention. Le procédé 10 de la présente invention peut être réalisé sur l'ARN purifié ou partiellement purifié. L'ARN peut être isolé par des procédés connus de séparation, y compris par exemple, l'extraction en phase liquide, la précipitation ou 25 l'extraction en phase solide. De tels procédés sont décrits par exemple, dans Sambrook et coll. ci-dessus (2001) ou dans Ausubel et coll., ci-dessus (1998), ou sont disponibles chez divers vendeurs, commerciaux y compris par exemple, Qiagen (Valencia, Californie) ou 30 Promega (Madison, Wisconsin). 2907794 22 Si désiré, les acides nucléiques peuvent être séparés sur base de propriétés comme la masse, la charge en fonction de la masse, ou la présence d'une séquence particulière. Les procédés de séparation des 5 acides nucléiques comprennent, mais ne sont pas limités à l'électrophorèse sur des gels d'agarose ou de polyacrylamide, l'électrophorèse capillaire, les procédés de chromatographie classique comme la chromatographie d'exclusion de taille, la 10 chromatographie en phase inverse, ou la chromatographie par échange d'ions ou des procédés d'affinité comme la chromatographie d'affinité ou la précipitation à l'aide d'une phase solide d'oligonucléotides polydT. L'homme du métier connaît ou est capable de déterminer le 15 procédé de séparation approprié ou la combinaison de procédés pour obtenir un isolat biologique d'une composition et d'une pureté désirées d'acides nucléiques. Les protéines et le grand ADN génomique peuvent être éliminés de l'ARN, par exemple par des 20 procédés de précipitation et de centrifugation, qui exploitent la plus grande taille de l'ADN génomique et des protéines. L'ARN messager peut être éliminé des autres espèces d'ARN, par exemple par précipitation avec des billes d'oligonucléotide polydT ou la 25 chromatographie d'exclusion de taille. De tels procédés peuvent être utilisés en combinaison avec modification sélective du phosphate en 5" des oligonucléotides courts pour distinguer les oligonucléotides courts des autres composants cellulaires. 30 En 30, l'isolat biologique est mis en contact avec un oligonucléotide de détection marqué et un 2907794 23 oligonucléotide de pont, pour capturer un oligonucléotide court de l'isolat` biologique. Par capture , on entend qu'un acide nucléique, comme un oligonucléotide court, s'hybride à un acide nucléique 5 complémentaire, comme l'oligonucléotide de pont. La détection de l'oligonucléotide peut être préparée dans des conditions telles que le phosphate en 5' et/ou l'hydroxyle en 3' de l'oligonucléotide de détection sont de préférence modifiés, pour comprendre 10 une partie de marqueur. Le cas échéant ou en outre, la partie de marqueur peut être incorporée de manière interne dans l'oligonucléotide de détection. Selon un autre aspect de la présente invention, un réactif réagissant avec un phosphate, comprenant une partie de 15 marqueur ou une partie de précurseur de marqueur, peut être utilisé de sorte que la modification du phosphate en 5" produise un oligonucléotide de détection contenant la partie de marqueur. L'oligonucléotide de détection peut également être préparé de sorte que 20 l'extrémité 5' ou l'extrémité 3' comprend une modification (par exemple, dT inversés), qui prévient ou réduit la formation des produits de ligature secondaires. A titre d'exemple, l'oligonucléotide de détection 25 peut être généré par le marquage sur l'extrémité 5' d'un oligonucléotide ADN avec [y-32P] -ATP, y compris un dT inversé à l'extrémité 3', puis élimination de tout isotope non incorporé. Brièvement, les réactifs (à savoir, l'oligonucléotide de détection, l'eau sans 30 RNase, le tampon de réaction 1OX OPTIKINASE, le [y-32P]- ATP et l'OPTIKINASE) peuvent être dégelés sur de la 2907794 24 glace, mélangés intimement, centrifugés brièvement, puis combinés à température ambiante. Le mélange peut alors être incubé pendant environ 30 à 60 minutes. Après incubation, des fractions aliquotes du mélange 5 peuvent être traitées pour éliminer le [y-32P]-ATP non incorporé. Ensuite, une population d'oligonucléotides de détection marqués peut être générée et utilisée comme décrit ci-dessous. Il convient de comprendre qu'une variété de 10 réactifs réagissant avec un phosphate peut être utilisée dans la présente invention. De manière générale, le réactif réagissant avec un phosphate peut additionner préférentiellement une partie à un phosphate dans un mélange réactionnel. Par exemple, un 15 agent réagissant avec un phosphate peut être ajouté à une population d'oligonucléotides de détection, de sorte qu'il réagit préférentiellement avec le phosphate en 5' de l'oligonucléotide de détection. Les réactifs réagissant avec un phosphate peuvent comprendre ceux 20 qui ne réagissent pas avec l'extrémité 3' des acides nucléiques. Un réactif réagissant avec un phosphate peut être une seule molécule ou une combinaison de molécules. Par exemple, une seule molécule peut contenir une partie 25 réactive, liée à une partie de marqueur, de sorte qu'une réaction entre la partie réactive et le phosphate en 5' de l'oligonucléotide de détection, produit un oligonucléotide de détection lié à une partie de marqueur. 30 En variante, une combinaison de molécules peut être utilisée comme réactif réagissant avec un 2907794 25 phosphate. Par exemple, une première molécule de marqueur peut être mise 'en contact avec un oligonucléotide de détection et une deuxième molécule, qui active le phosphate en 5' ou la première molécule 5 de marqueur, pour produire un oligonucléotide de détection avec un marqueur attaché. Le réactif réagissant avec un phosphate peut en outre ou en variante, comprendre une partie de marqueur, ayant un groupe amino lié et une deuxième molécule étant une 10 molécule de carbodiimide, qui active le phosphate en 5" pour réagir avec le groupe amino, pour produire un oligonucléotide de détection ayant une liaison phosphoramidite avec la partie de marqueur. D'autres réactifs réagissant avec un phosphate exemplaires 15 comprennent sans limitation, l'hydrazide de la s-(6-(biotinoyl)amino)hexanoyl-L-lysine ; le DSB-X hydrazide de la biotine ; le DSB-X desthiobiocytine (-desthiobiotinoyl-L-lysine) ; le DSB-X biotine éthylènediamine (chlorhydrate de la desthiobiotine-X 20 éthylènediamine) ; la biotine-X cadavérine ; l'Alexa Fluor cadavérine ; la 5-(aminoacétamido)fluorescéine (fluorescéinyl glycine amide) ; le chlorhydrate de 4'-(aminométhyl)-fluorescéine ; la 5-(((2-(carbohydrazino)méthyl)thio)-acétyl)aminofluorescéine ; 25 le 5-thiosemicarbazide de la fluorescéine ; le N-méthyl-4-hydrazino-7-nitrobenzo-furazane ; le vert Orégon 488 cadavérine ; ; le chlorhydrate de 5-((5- aminopentyl)thiouréidyl)éosine ; le rouge Texas cadavérine ; l'hydrazide de rouge Texas ; la bimane 30 amine ; le poly(éthylèneglycol)méthyléther, à terminaison amine, et l'éthylènediamine de la Lissamine 2907794 26 rhodamine B. L'homme du métier sait que l'une quelconque d'une série de parties de marqueur peut être remplacée par celles indiquées parmi ces réactifs. Par exemple, la fluorescéine peut être remplacée par 5 d'autres fluorophores décrits ici. L'oligonucléotide de pont peut être un oligonucléotide ADN, complémentaire de l'oligonucléotide de détection et d'un oligonucléotide court spécifique aux extrémités 5' et 3' de 10 l'oligonucléotide de pont, respectivement. En variante, l'oligonucléotide de pont peut être complémentaire de l'oligonucléotide de détection et d'un oligonucléotide court aux extrémités 3' et 5', respectivement. Il se peut que si, par exemple, la partie de marqueur est 15 attachée au groupe phosphate à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide de détection, et que l'oligonucléotide de pont est destiné à joindre l'oligonucléotide de détection sur le groupe hydroxyle 3' de l'oligonucléotide court, la partie marquée 20 phosphate ne doit pas avoir des propriétés qui préviennent une réaction de ligature. A titre d'exemple, un oligonucléotide court peut être capturé par combinaison d'un isolat biologique avec un oligonucléotide de détection marqué et un 25 oligonucléotide de pont. Un contrôle positif contenant un oligonucléotide court intéressant et un contrôle négatif (à savoir, ne contenant pas d'ARN) peuvent également être préparés. Le mélange réactionnel peut alors être mélangé, brièvement agité, et incubé pendant 30 une période désirée à une température appropriée. Un oligonucléotide court peut être capturé par 2907794 27 l'oligonucléotide de pont, par hybridation à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide de pont. L'oligonucléotide de détection marqué peut également s'hybrider à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide de 5 pont, avant, simultanément à ou après que l'oligonucléotide court a été capturé. En variante, un oligonucléotide court peut être capturé par l'oligonucléotide de pont, par hybridation à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide de pont. Dans ce 10 cas, l'oligonucléotide de détection marqué peut s'hybrider à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide de pont, avant, simultanément à ou après que l'oligonucléotide court a été capturé. Après incubation du mélange réactionnel, au moins 15 un réactif de ligature peut être ajouté au mélange réactionnel en 40. Un réactif de ligature tel qu'utilisé ici, se réfère à une molécule, typiquement une enzyme, capable de faciliter la formation d'une liaison phosphodiester entre deux nucléotides. Des 20 exemples de réactifs de ligature comprennent les ligases d'ADN, comme la ligase d'ADN T4, qui peut former des liaisons phosphodiester covalentes entre l'extrémité hydroxyle 3' d'un nucléotide et l'extrémité phosphate 5'd'un autre nucléotide. D'autres exemples de 25 réactifs de ligature comprennent une ligase d'ARN, les ligases d'ADN I-IV, ainsi que des agents chimiques de réticulation connus dans la technique. Après la capture de l'oligonucléotide court, en 40, l'oligonucléotide court capturé et l'oligonucléotide de 30 détection marqué sont ligaturés pour former un oligonucléotide court marqué. L'oligonucléotide court 2907794 28 capturé et l'oligonucléotide de détection marqué peuvent être ligaturés .par combinaison de l'oligonucléotide court capturé et l'oligonucléotide de détection marqué avec au moins un réactif de ligature. 5 Ledit au moins un réactif de ligature peut comprendre, par exemple, une composition comprenant la ligase d'ADN T4. Le réactif de ligature peut être ajouté au mélange réactionnel, et le mélange réactionnel résultant est brièvement agité et incubé pendant une période désirée 10 à une température appropriée. Par addition du réactif de ligature au mélange réactionnel, le phosphate en 5' de l'oligonucléotide de détection et l'hydroxyle en 3' de l'oligonucléotide court forment une liaison phosphodiester covalente de sorte que les extrémités 5' 15 et 3' de l'oligonucléotide de détection et de l'oligonucléotide court sont respectivement ligaturées. En variante, lorsque l'oligonucléotide de détection et l'oligonucléotide court sont respectivement hybridés aux extrémités 3' et 5' de l'oligonucléotide de pont, 20 l'hydroxyle en 3' de l'oligonucléotide de détection et le phosphate en 5' de l'oligonucléotide court peuvent former une liaison phosphodiester covalente de sorte que les extrémités 3' et 5' de l'oligonucléotide de détection et de l'oligonucléotide court sont 25 respectivement ligaturées. Dans un exemple, la taille de l'oligonucléotide court et de l'oligonucléotide de détection ligaturés peut être d'environ 35 à environ 39 nucléotides (par exemple, environ 21 à environ 25 nucléotides de 30 l'oligonucléotide court plus environ 14 nucléotides de l'oligonucléotide de détection marqué). Il convient de 2907794 29 noter que la taille de l'oligonucléotide court et de l'oligonucléotide de détection.ligaturé peut être plus faible ou plus grande en fonction de la taille de l'oligonucléotide court et de l'oligonucléotide de 5 détection. Après ligature de l'oligonucléotide court capturé et de l'oligonucléotide de détection marqué, l'oligonucléotide de détection en excès et/ou les parties marquées de tout oligonucléotide de détection 10 non ligaturé du mélange réactionnel peuvent être éliminés. Les parties marquées en excès peuvent être éliminées à l'aide par exemple, d'un réactif de nettoyage comprenant une phosphatase. La phosphatase peut éliminer les groupes phosphate des extrémités 5' 15 des oligonucléotides courts contenant des parties phosphate marquées. L'élimination des groupes phosphate marqués peut prévenir l'interférence dans la détection et l'analyse de l'oligonucléotide court. Il convient de noter que les réactifs de nettoyage ne sont pas exigés 20 en fonction des propriétés de la partie de marqueur et/ou lorsque la partie de marqueur est incorporée. Lors de l'élimination de tout oligonucléotide de détection non ligaturé du mélange réactionnel, une série d'oligonucléotides courts marqués est générée, 25 qui peut être ensuite détectée. Après ligature, en 50, les oligonucléotides courts marqués peuvent être détectés. L'oligonucléotide court marqué peut être détecté et distingué des autres molécules, qui sont démunies de marqueur, à l'aide de 30 procédés connus dans la technique. Des propriétés exemplaires sur lesquelles la détection peut être basée, 2907794 30 comprennent, mais ne sont pas limitées aux signaux massiques, de conductivité électrique, ou optiques, comme un signal fluorescent, un signal d'absorption, un signal luminescent, un signal chimioluminescent ou 5 similaires. La détection peut également être basée sur l'absence ou un taux réduit d'un ou de plusieurs signaux, par exemple par la présence d'une partie d'extinction ou la dégradation d'une partie de marqueur. Différents procédés de détection, comme des 10 dosages en phase solution et en phase solide, peuvent être utilisés pour détecter les oligonucléotides courts marqués. Les procédés de détection en phase solution peuvent être basés sur la charge, la masse, le rapport charge à masse ou d'autres propriétés de distinction. 15 De telles propriétés de distinction peuvent être détectées, par exemple, dans un système chromatographique comme l'électrophorèse capillaire, le gel d'acrylamide, le gel d'agarose ou similaire, ou dans un système spectroscopique comme la spectrométrie 20 de masse. Par exemple, la détection de la fluorescence peut être réalisée en irradiant un oligonucléotide court marqué avec une longueur d'onde d'excitation et en détectant le rayonnement émis depuis un fluorophore dans celui-ci, par des procédés connus dans la 25 technique et décrits dans Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2ème édition, Plenum Press New York (1999). Un fluorophore peut être détecté sur base de l'un quelconque d'une variété de phénomènes de fluorescence, y compris par exemple la longueur d'onde 30 d'émission, la longueur d'onde d'excitation, l'intensité du transfert d'énergie par résonance de 2907794 31 fluorescence (FRET), l'extinction, l'anisotropie ou la durée de vie. Le FRET peut être utilisé pour identifier l'hybridation entre un premier oligonucléotide attaché à un fluorophore donneur et un deuxième oligonucléotide 5 attaché à un fluorophore accepteur par transfert d'énergie depuis le donneur excité vers l'accepteur. Ainsi, l'hybridation peut être détectée comme un déplacement de la longueur d'onde causé par une réduction de l'émission du donneur et l'apparition de 10 l'émission de l'accepteur dans l'hybride. Dans un autre aspect de la présente invention, l'oligonucléotide court marqué peut être détecté à l'aide d'une électrophorèse sur gel. Brièvement, un gel de polyacrylamide-UREE d'environ 12 % à 15 % peut être 15 préparé, puis chargé avec les échantillons d'un mélange réactionnel contenant les oligonucléotides courts marqués. Le gel peut être traité avec un ampérage approprié jusqu'à ce que chaque échantillon a atteint un point final approprié sur le gel. Le gel résultant 20 peut être transféré sur une feuille d'un matériau support non diffusible, comme un film traité, puis développé par exposition aux rayons X ou un écran de phosphoimageur pendant une période appropriée. Après développement du gel, la présence des bandes foncées en 25 des positions connues sur le gel peut indiquer la présence des oligonucléotides courts dans l'isolat biologique. La présente invention propose un procédé plus rapide et plus efficace de détection d'oligonucléotides 30 courts par rapport à la technique standard de l'analyse de l'expression des oligonucléotides courts, à savoir 2907794 32 le transfert de Northern. Le transfert de Northern présente une faible sensibilité, exige de grandes quantités d'ARN total, et est long et laborieux. Comme illustré aux figures 2A-C, la présente invention 5 propose une détection meilleure de 50 fois, au niveau du temps de réaction et de la quantité d'ARN total nécessaire pour réaliser le dosage. En référence aux figures 3A-B, par exemple, la quantité d'ARN total nécessaire pour la présente invention, n'est que de 10 18 pg, alors que 180 pg d'ARN total sont nécessaires pour le transfert de Northern. De manière similaire, le temps de réaction nécessaire dans la présente invention n'est que de 2 à 4 heures, alors que le temps de réaction nécessaire pour le transfert de Northern est 15 de 2 à 3 jours. Comme indiqué, d'autres procédés de détection, comme les dosages en phase solide, peuvent être utilisés pour détecter les oligonucléotides courts. Par exemple, différents types d'assemblages peuvent être 20 utilisés. Un assemblage se réfère à une population de différentes molécules d'échantillon, qui sont attachées à un ou plusieurs substrats, de sorte que les différentes molécules de l'échantillon peuvent être différenciées les unes des autres selon l'emplacement 25 relatif. Un assemblage peut comprendre différentes molécules d'échantillon, qui sont chacune localisées en un emplacement adressable différent sur un substrat. En variante, un assemblage peut comprendre des substrats séparés, chacun portant une molécule d'échantillon 30 différente. Les échantillons attachés à des substrats séparés peuvent être identifiés selon les emplacements 2907794 33 des substrats sur une surface, à laquelle les substrats sont associés ou selon les emplacemènts des substrats dans un liquide. Des assemblages exemplaires, dans lesquels des substrats séparés sont localisés sur une 5 surface, comprennent sans limitation, ceux comprenant des billes dans des puits. Un autre aspect de la présente invention peut comprendre une trousse pour la détection d'une série de différents oligonucléotides courts. La trousse peut 10 comprendre un oligonucléotide de détection, une partie de marqueur pour le marquage préférentiel de l'oligonucléotide de détection, et des réactifs pour la ligature de l'extrémité 3' de l'oligonucléotide court à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide de détection. 15 Dans un autre aspect de la présente invention, la trousse peut comprendre des composants supplémentaires, y compris, par exemple, des réactifs pour éliminer les parties de marqueur non liées, des réactifs pour éliminer les oligonucléotides de détection non 20 ligaturés, des réactifs pour détecter les oligonucléotides courts marqués, un contrôle positif, et un contrôle négatif. Le contrôle positif peut être utilisé pour estimer les composants de la trousse et la procédure, alors que le contrôle négatif peut être 25 utilisé pour estimer les signaux d'arrière-plan des échantillons testés. Des trousses commerciales pour la détection des oligonucléotides courts comprennent des dosages d'hybridation en solution/protection de ribonucléase, 30 comme la trousse d'isolement mirVana miRNA disponible chez Ambion (Austin, TX). La présente invention procure 2907794 34 plusieurs avantages sur de tels dosages commerciaux. Par comparaison à la trousse d'isolement mirVana miRNA, par exemple, la présente invention propose une sensibilité plus élevée de détection du miARN en une 5 période de réaction plus courte. Comme le montre les figures 4A-C, la trousse d'isolement mirVana miRNA présente non seulement une sensibilité plus faible pendant une période de réaction plus longue, mais exige également l'obtention séparée d'une trousse de marquage 10 et l'optimalisation de la quantité de sonde marquée, les conditions d'hybridation, et la quantité de ribonucléase. Au sein de cette demande, différentes publications, brevets et demandes de brevet ont été référencés. Les 15 descriptions de ces publications dans leur entièreté sont incorporées à titre de référence dans la présente demande, afin de décrire plus complètement l'état de la technique auquel l'invention se rapporte. Les exemples suivants ont pour objet 20 l'illustration seulement et ne sont pas destinés à limiter le cadre des revendications, qui sont annexées. Exemple 1 Préparation d'un Oligo de détection et nettoyage 25 La première étape est de marquer sur l'extrémité 5', l' Oligo de détection avec [y-32P] -ATP et d'éliminer l'isotope non incorporé. 1. Décongeler les réactifs congelés sur de la glace, mélanger soigneusement, suivi d'une brève 30 agitation, puis placer sur de la glace. 2907794 2. Préparation l'Oligo de détection marqué [32P] en combinant les composants suivants à température ambiante . Composants Oligo de Couleur du détection capuchon du composant Oligo de détection 2 pl Bleu Eau exempte de RNase 12 pl Blanc Tampon de réaction 10X 2 pl bleu OPTIKINASE [y-32P]-ATP (6000 Ci/mmole, 2 pl Non fourni 150 mCi/ml) OPTIKINASE 2 pl Bleu Volume total 20 pl 3. Mélanger intimement, puis bref passage dans une microcentrifugeuse. Incuber pendant 30 à 60 minutes à 37 C. 4. Lorsque les réactions incubent, préparer la 10 colonne de nettoyage de la manière suivante : a. Centrifuger la colonne de nettoyage pendant 30 secondes à 750 x g pour récolter la résine sèche au fond de la colonne. b. Hydrater la résine en ajoutant 600 pl 15 d'eau sans RNase, puis vortex. Eliminer les bulles d'air par vortex ou en tapant sur la colonne. Incuber au moins 30 minutes à température ambiante. c. Remettre en suspension la résine déposée par retournement de la colonne plusieurs fois. 20 S'assurer que l'on ne voit aucune bulle d'air. 5 2907794 36 Enlever le tampon de fond et placer dans un tube de collecte de 2,0 ml. d. Centrifuger pendant 2 minutes à 750 x g pour éliminer l'eau restante.Ecarter l'éluant de passage. 5 5. Après 30 minutes d'incubation, diluer les réactions de marquages à 100 p1 en ajoutant 80 pl d'eau sans RNase. 6. Placer la colonne de l'étape 4d dans un tube propre pour micriocentrifugeuse de 1,5 ml. Sans 10 perturber le lit de gel, appliquer soigneusement l'échantillon dilué, directement sur le haut du lit de gel. 7. Après la charge de l'échantillon, centrifuger la colonne pendant 4 à 6 minutes à 750 x g. Ecarter la 15 colonne usagée dans un récipient pour déchets radioactifs. 8. L'oligo de détection radiomarqué et le marqueur sont à présent prêts à l'utilisation. 20 Exemple 2 Capture des miARN, ligature et nettoyage Une fois que l'Oligo de détection est radiomarqué, on procède au dosage de détection des miARN. Conception et préparation à la page 12. 25 L'oligonucléotide de pont doit être dilué à 0,1 pmole/pl avec le tampon de capture 10X fourni. 1. Décongeler les réactifs congelés sur de la glace, mélanger soigneusement, suivi d'une brève agitation, puis placer sur de la glace. 30 2. Assembler la réaction de capture sur de la glace selon le tableau suivant : 2907794 37 Composants Contrôle Contrôle Echantillon Couleur positif sans ARN du capuchon du composant Echantillon d'ARN 0 pl 0 pl Pour Non total faire fourni 8 p1 Contrôle positif 1 pl 0 pl 0 pl Rouge Ajuster à 8 pl avec de l'eau sans RNase Blanc 0,1 pmole/pl 1 pl 1 pl 1 pl Non d'Oligo de pont fourni dans 10x tampon de capture Oligo de 1 pl 1 pl 1 pl N/A détection radiomarqué Volume total 10 pl 10 pl 10 pl • Préparer un mélange maître oligonucléotide de pontoligonucléotide de détection pour le réglage du 5 dosage. Par échantillon, combiner : 1 pl d'oligonucléotide de pont dans 10x tampon de capture + 1 pl Oligo de détection radiomarqué • Diluer tous les échantillons de test avec 8 pl d'eau sans RNase, puis ajouter 2 pl du mélange maître 10 Oligo de pont-Oligo de détection. 3. Mélanger intimement, puis bref passage en microcentrifugeuse. Incuber le mélange à 94 C pendant 1 minute, 65 C pendant 2 minutes et 37 C pendant 10 minutes. Pour plus de commodité, on peut utiliser un 15 thermocycleur. 2907794 38 4. Ajouter 5 pl du Premix 3X Ligate-ITTM (capuchon rouge) à chaque réaction. 5. Mélanger intimement, puis bref passage en microcentrifugeuse. Incuber pendant 1 heure à 30 C. En 5 option : si l'on ne traite pas dans l'étape suivante immédiatement, inactiver la réaction par incubation pendant 10 minutes à 75 C, puis stocker à -20 C pour utilisation ultérieure. 6. Ajouter 1 pl de mélange de nettoyage (capuchon 10 rouge) à chaque réaction. 7. Mélanger intimement, puis bref passage en microcentrifugeuse. Incuber pendant 15 minutes à 37 C. En option : si l'on ne traite pas dans l'étape suivante immédiatement, inactiver la réaction par incubation 15 pendant 10 minutes à 75 C, puis stocker à -20 C pour utilisation ultérieure. 8. Le miARN ligaturé est à présent prêt pour l'électrophorèse sur gel. 20 Exemple 3 Analyse électrophorétique 1. Préparer un gel UREE-polyacrylamide à 12 % ou 15 % avec le tampon d'élution 1X. (Voir l'information supplémentaire sur la préparation du gel de UREE- 25 polyacrylamide). En option : préélution et chauffage du gel pendant 30 minutes. 2. Transférer une fraction aliquote de 3-15 pl de la réaction dans un nouveau tube. Ajouter un volume égal de Gel Loading Dye. 2907794 39 3. Transférer une fraction aliquote de marqueur de faible poids moléculaire marqué [32P] dans un nouveau tube. Ajouter un volume égal de Gel Loading Dye. 4. Mélanger intimement, puis bref passage en 5 microcentrifugeuse. Incuber pendant 3 minutes à 95 C. Immédiatement refroidir sur de la glace. 5. Rincer les puits du gel pour éliminer les débris d'acrylamide, d'urée et les bulles d'air. 6. Charger et séparer les réactions dénaturées. 10 Inclure le marqueur de faible poids moléculaire marqué [32P] sur chaque gel. • La taille attendue du miARN ligaturé est de 35 à 39 nucléotides (21 à 25 nucléotides de la séquence du miARN mature plus 14 nucléotides de l'Oligo de 15 détection marqué). • Dans les gels à 12 % et 15 les positions approximatives des bandes du bleu de bromophénol et du xylènecyanol (colorants de charge) sont à 10 et 30 nucléotides, respectivement. 20 • Pour des gels de 13 cm x 15 cm, élués à 20 à 30 mA et arrêtés lorsque le front du colorant bleu de bromophénol a migré jusqu'au fond du gel. Pour les gels de 36 cm x 43 cm, l'élution à 60 mA est arrêtée lorsque le front du colorant bleu de bromophénol a migré 25 jusqu'au milieu du gel. 7. A la fin de la séparation, transférer du gel sur une feuille d'un matériau support non diffusible comme film traité. Envelopper le film d'une enveloppe saran et exposer aux rayons X ou à un écran de 30 phosphoimageur. 2907794 • Il n'est pas nécessaire de sécher le gel si l'on utilise l'isotope [32P] . Exposer le gel à un film pour rayons X avec un écran d'intensification. Stocker pendant 2 heures à une nuit à -80 C. Le gel peut être 5 réexposé plusieurs fois, si nécessaire. • Il est recommandé de sécher le gel si l'on utilise un écran de phosphoimageur pour prévenir des dommages de l'écran. Traiter l'écran de phosphoimageur selon les instructions du fabricant. 10 A partir de la description ci-dessus, l'homme du métier percevra des améliorations, changement et modifications. De tels améliorations, changements et modifications dans le cadre de la technique, sont couverts par les revendications annexées. Toutes les 15 références, brevets et publications cités sont incorporés ici à titre de référence, dans leur entièreté. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection d'au moins un oligonucléotide court, comprenant : la mise à disposition d'un isolat biologique comprenant au moins un oligonucléotide court ; la mise en contact de l'isolat biologique avec au moins un oligonucléotide de détection ayant une partie de marqueur et au moins un oligonucléotide de pont, dans des conditions telles que ledit au moins un oligonucléotide court et ledit au moins un oligonucléotide de détection sont préférentiellement additionnés sur l'oligonucléotide de pont pour produire au moins un oligonucléotide court marqué ; l'addition d'au moins un réactif de ligature pour joindre préférentiellement ledit au moins un oligonucléotide court et ledit au moins un oligonucléotide de détection, et la détection dudit au moins un oligonucléotide 20 court marqué. 2. Procédé selon la revendication 1, ledit au moins un oligonucléotide court comprenant un ADN, un petit ARN de régulation, un ARN non codant, un microARN ou un petit ARN interférant. 25 3. Procédé selon la revendication 1, ledit au moins un oligonucléotide de détection comprenant un ADN, un ARN, des nucléotides modifiés ou une combinaison d'ADN, d'ARN et de nucléotides modifiés. 4. Procédé selon la revendication 1, ledit au 30 moins un oligonucléotide de détection comprenant d'environ 5 à environ 500 nucléotides. 2907794 42 5. Procédé selon la revendication 4, ledit au moins un oligonucléotide de détection ayant une extrémité 5', une extrémité 3' et une partie de marqueur, la partie de marqueur étant liée à 5 l'extrémité 5', l'extrémité 3' ou une partie interne de l'oligonucléotide de détection. 6. Procédé selon la revendication 5, l'extrémité 5' de l'oligonucléotide de détection comprenant un phosphate et étant liée à la partie de marqueur via une 10 liaison phosphoramide. 7. Procédé selon la revendication 5, l'extrémité 5' et/ou l'extrémité 3' comprenant au moins un d'un espaceur C-3, un agent modifiant amino, un dT inversé, un didésoxy-C ou d'un agent qui prévient une réaction 15 secondaire de ligature. 8. Procédé selon la revendication 5, l'extrémité 5' de l'oligonucléotide de détection étant liée à l'extrémité 3' d'au moins un oligonucléotide court par au moins un réactif de ligature. 9. Procédé selon la revendication 5, l'extrémité 3' de l'oligonucléotide de détection étant liée à l'extrémité 5' d'au moins un oligonucléotide court par au moins un réactif de ligature. 10. Procédé selon la revendication 5, la partie de marqueur comprenant une partie optiquement détectable, choisie parmi un chromophore, un luminophore, un fluorophore, une boîte quantique ou un marqueur nanoparticulaire diffractant la lumière, un marqueur à spin électromagnétique, un agent calorimétrique, une substance magnétique, un matériau riche en électrons, un marqueur électrochimioluminescent, un marqueur qui 2907794 43 peut être détecté sur base d'une caractéristique nucléaire magnétique, pararrtagnéti'que, électrique, charge à masse, ou thermique, et des matériaux diffractant la lumière ou à résonance plasmon. 5 11. Procédé selon la revendication 10, la partie de marqueur comprenant un marqueur isotopique choisi parmi le groupe consistant en 14C, 1231, 1241, 1251, 1311, 32p, 33p, 35s ou 3H. 12. Procédé de détection d'au moins un 10 oligonucléotide court, comprenant : la mise à disposition d'un isolat biologique comprenant au moins un oligonucléotide court ; la mise en contact de l'isolat biologique avec au moins un oligonucléotide de détection et au moins un 15 oligonucléotide de pont, dans des conditions telles que ledit au moins un oligonucléotide court et ledit au moins un oligonucléotide de détection sont préférentiellement additionnés sur l'oligonucléotide de pont pour produire au moins un oligonucléotide court 20 marqué, ledit au moins un oligonucléotide de détection ayant une extrémité 5', une extrémité 3' et une partie de marqueur, la partie de marqueur étant liée à l'extrémité 5', l'extrémité 3' ou une partie interne de l'oligonucléotide de détection ; 25 l'addition d'au moins un réactif de ligature pour joindre préférentiellement ledit au moins un oligonucléotide court et ledit au moins un oligonucléotide de détection, et la détection dudit au moins un oligonucléotide 30 court marqué. 2907794 44 13. Procédé selon la revendication 12, ledit au moins un oligonucléotide court comprenant un ADN, un petit ARN de régulation, un ARN non codant, un microARN ou un petit ARN interférant. 5 14. Procédé selon la revendication 12, ledit au moins un oligonucléotide de détection comprenant d'environ 5 à environ 500 nucléotides. 15. Procédé selon la revendication 12, l'extrémité 5' de l'oligonucléotide de détection comprenant un 10 phosphate et étant liée à la partie de marqueur via une liaison phosphoramide. 16. Procédé selon la revendication 12, l'extrémité 5' et/ou l'extrémité 3' comprenant au moins un d'un espaceur C-3, un agent modifiant amino, un dT inversé, 15 un didésoxy-C ou d'un agent qui prévient une réaction secondaire de ligature. 17. Procédé selon la revendication 12, l'extrémité 5' de l'oligonucléotide de détection étant liée à l'extrémité 3' d'au moins un oligonucléotide court par 20 au moins un réactif de ligature. 18. Procédé selon la revendication 12, l'extrémité 3' de l'oligonucléotide de détection étant liée à l'extrémité 5' d'au moins un oligonucléotide court par au moins un réactif de ligature. 25 19. Procédé selon la revendication 12, la partie de marqueur comprenant une partie optiquement détectable, choisie parmi un chromophore, un luminophore, un fluorophore, une boîte quantique ou un marqueur nanoparticulaire diffractant la lumière, un 30 marqueur à spin électromagnétique, un agent calorimétrique, une substance magnétique, un matériau 2907794 45 riche en électrons, un marqueur électrochimioluminescent, un marqueur qui peut être détecté sur la base d'une caractéristique nucléaire magnétique, paramagnétique, électrique, charge à masse, 5 ou thermique, et des matériaux diffractant la lumière ou à résonance plasmon. 20. Procédé selon la revendication 12, la partie de marqueur comprenant un marqueur isotopique choisi parmi le groupe consistant en 14C, 1231, 1291, 1251, 131', 10 32P, 33P, 35s ou 3H. 21. Trousse pour détecter au moins un oligonucléotide court dans un isolat biologique, comprenant : un oligonucléotide de détection, comprenant 15 d'environ 5 à 500 nucléotides et ayant une extrémité 5' et une extrémité 3', l'oligonucléotide de détection se ligaturant de préférence à un oligonucléotide court ; une partie de marqueur pour marquer préférentiellement l'oligonucléotide de détection, la 20 partie de marqueur pouvant être liée à l'oligonucléotide de détection, et des réactifs pour ligaturer l'oligonucléotide court à l'oligonucléotide de détection. 22. Trousse selon la revendication 21, comprenant : 25 des réactifs pour éliminer les parties de marqueur non liées, des réactifs pour éliminer les oligonucléotides de détection non ligaturés, des réactifs pour détecter les oligonucléotides 30 courts marqués, un contrôle positif, et 2907794 46 un contrôle négatif. 23. Trousse selon la revendication 21, la partie de marqueur comprenant une partie optiquement détectable, choisie parmi un chromophore, un 5 luminophore, un fluorophore, une boîte quantique ou un marqueur nanoparticulaire diffractant la lumière, un marqueur à spin électromagnétique, un agent calorimétrique, une substance magnétique, un matériau riche en électrons, un marqueur 10 électrochimioluminescent, un marqueur qui peut être détecté sur base d'une caractéristique nucléaire magnétique, paramagnétique, électrique, charge à masse, ou thermique, et des matériaux diffractant la lumière ou à résonance plasmon. 15 24. Trousse selon la revendication 21, ledit au moins un oligonucléotide de détection ayant un phosphate en 5' et une extrémité 3' modifiée, le phosphate en 5' étant lié à la partie de marqueur. 25. Trousse selon la revendication 21, ledit au 20 moins un oligonucléotide de détection ayant un hydroxyle en 3' et une extrémité 5' modifiée, l'hydroxyle en 3' étant lié à la partie de marqueur.