FR 2904691 A1 20080208 FR 0607065 A 20060802 --> PROCEDE ET DISPOSITIF DE RECONSTRUCTION 3D DE LA DISTRIBUTION D'ELEMENTS FLUORESCENTS DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE ET ART ANTÉRIEUR L' invention concerne le domaine de l'imagerie moléculaire de fluorescence sur les tissus biologiques par des méthodes optiques résolues en temps . Elle s'applique notamment à l'imagerie moléculaire optique sur le petit animal et à l'imagerie moléculaire optique sur l'homme (cerveau, sein, autres organes où des fluorophores peuvent être injectés). Les techniques optiques d' imagerie moléculaire de fluorescence se développent de plus en plus actuellement grâce à l'utilisation de marqueurs fluorescents spécifiques. Ceux-ci viennent se fixer de façon préférentielle sur les cellules cibles d' intérêt (par exemple des cellules cancéreuses) et offrent un meilleur contraste de détection que les marqueurs non spécifiques. Ces techniques ont pour but de localiser spatialement la fluorescence mais aussi d'en déterminer la concentration. Les systèmes de tomographie optique utilisent diverses sources de lumière. Il existe donc des appareils en mode continu, des appareils en mode fréquentiel (qui utilisent des lasers modulés en fréquence) et enfin des appareils fonctionnant en mode temporel, qui utilisent des lasers puisés. -->Les données temporelles sont celles qui contiennent le plus de contenu informationnel sur le tissu traversé, mais pour lesquelles les techniques de reconstruction sont les plus complexes. La mesure en chaque point d'acquisition est en effet une fonction dépendante du temps (appelée TPSF pour Temporal Spread Function , ou fonction d'étalement temporel). On cherche à extraire des paramètres simples de la TPSF, dont on connaît par ailleurs l'expression théorique. Ensuite, la résolution du problème inverse permet de retrouver la distribution de fluorescence. Dans le document WO 2006/032151, on extrait les trois premiers moments des courbes temporelles, qui sont appelés les moments normalisés car ce sont les moments des courbes normées par la courbe d'excitation. Or les moments des courbes temporelles sont dépendants de la connaissance du temps de vie de fluorescence. Par conséquent, dans ce document, afin de résoudre le problème inverse, le temps de vie de fluorescence est supposé connu. Or ce temps de vie peut être sensible à l'environnement et est délicat à mesurer in vivo. Un mauvais choix de ce paramètre conduit à des résultats erronés. L'article de A. T. N. Kumar et al. "Fluorescence lifetime-based tomography for turbid média," Opt . Lett. 30(24), 3347-3349 (2005) décrit une méthode qui reconstruit un ou plusieurs temps de vie. En fait, elle est basée sur une détermination des différents temps de vie sur les courbes de déclin ; puis sur une reconstruction à partir de leurs -->amplitudes respectives. Une approximation sur le temps de vie est faite a priori. Cette technique est surtout intéressante si on a deux temps de vie bien distincts. L'article "Time - Domain Fluorescence Molecular Tomography Based on Generalized Puise Spectrum Technique", Fen GAO, Wei LIU et al., Proceedings BIO ED 2006 présente une méthode basée sur les transformées de Laplace des courbes temporelles à deux fréquences, qui nécessite deux reconstructions, une sur la concentration et l'autre sur le temps de vie. Cette méthode est plus complexe et plus coûteuse en temps de calcul car basée sur des calculs en éléments finis pour obtenir les transformées de Laplace (il n' y a pas d'expression analytique). II se pose donc le problème de la détermination de la distribution spatiale de fluorophore dans un milieu diffusant, sans connaissance préalable du temps de vie de fluorescence. EXPOSÉ DE L'INVENTION L'invention concerne d'abord un procédé de traitement de signaux de fluorescence émis, après excitation par un rayonnement provenant d'une source de rayonnement, par au moins un fluorophore à durée de vie τ dans un milieu environnant, ces signaux étant détectés par des moyens de détection, ce procédé comportant : - la détection d'une pluralité de signaux de fluorescence (Φfi uo ) émis par le fluorophore dans son milieu environnant, chaque signal correspondant à une -->position relative, d'une part du fluorophore et d'autre part de la source et des moyens de détection, le calcul, à partir de ces signaux détectés de fluorescence, des valeurs d'une variable, indépendante de τ mais dépendante de la position ou de la distribution spatiale de fluorophore dans ledit milieu, - la détermination de la position ou de la distribution spatiale de fluorophore dans ledit milieu à partir des valeurs de ladite variable. Un procédé selon l'invention peut par exemple s'affranchir du temps de vie de fluorescence en considérant une mesure normalisée, par exemple à la mesure qui donne le plus petit temps de vie de fluorescence. La variable indépendante de τ peut aussi résulter d'une fonction normalisée en fréquence, par exemple par rapport à un signal de fluorescence particulier. Cette méthode peut être adaptée à d'autres transformations que le temps moyen (par exemple les transformées de Mellin-Laplace) qui permettent de s'affranchir du temps de vie grâce à la normalisation. Selon un mode de réalisation, ladite variable indépendante de τ résulte de la différence entre le temps moyen τ calculé pour chaque signal de fluorescence et le temps moyen calculé pour un signal de fluorescence particulier, de préférence celui pour lequel le temps moyen calculé est minimal. -->Selon un autre mode de réalisation la variable indépendante résulte des transformées de Mellin - Laplace des signaux de fluorescence. La détermination de la position ou de la répartition ou de la distribution spatiale de fluorophore dans le milieu peut être réalisée une méthode d' inversion utilisant des valeurs de la variable. La méthode d'inversion peut résulter de la minimisation d'une fonction d'erreur entre la mesure et ladite variable, par exemple à l'aide d'une méthode de simplex. Selon un autre mode de réalisation, la détermination de la distribution spatiale de fluorophore dans ledit milieu met en œuvre la résolution d'un système d'équations linéaires : M = P x C, Où M est un vecteur colonne de mesures, P une matrice de poids et C un vecteur colonne de la répartition. Selon l'invention, un calcul du premier moment de la courbe de fluorescence du signal de fluorescence en fonction du temps peut être réalisé. Un procédé selon l'invention peut comporter en outre une étape préalable de mesure de signal de fluorescence émis par le milieu environnant, en l'absence de fluorophore, puis une étape de correction des signaux de fluorescence ( fiuo) émis par le fluorophore dans son milieu environnant. L' invention concerne également un dispositif de traitement de signaux de fluorescence -->émis par au moins un fluorophore, à durée de vie τ dans un milieu environnant, comportant : une source de rayonnement pour l'excitation dudit fluorophore, - des moyens de détection pour détecter un signal de fluorescence émis par ledit fluorophore, - des moyens pour effectuer un déplacement relatif de la source et des moyens de détection par rapport au fluorophore, - des moyens pour calculer des valeurs d'une variable indépendante de τ, à partir d'une pluralité de signaux de fluorescence (Φfi uo ) émis par le fluorophore dans son milieu environnant, chaque signal correspondant à une position relative, d'une part du fluorophore et d'autre part de la source et des moyens de détection, - des moyens pour déterminer la position (cas d'un seul fluorophore) ou la distribution spatiale (cas de plusieurs fluorophores) de fluorophore (s) dans ledit milieu à partir des valeurs de ladite variable. Les moyens de détection sont par exemple de type TCSPC ou des moyens de type caméra. Un dispositif selon l'invention peut en outre comporter des moyens de représentation visuelle ou graphique de la position ou de la distribution spatiale du ou des fluorophores . La variable indépendante de τ peut résulter d'une fonction normalisée en fréquence, par rapport à un signal de fluorescence particulier. -->Selon un mode de réalisation la variable qui est indépendante de τ résulte de la différence entre le temps moyen τ calculé pour chaque signal de fluorescence et le temps moyen calculé pour un signal de fluorescence particulier. Ce signal de fluorescence particulier est avantageusement celui pour lequel le temps moyen calculé est minimal. Selon un mode de réalisation, les moyens pour déterminer la position ou la distribution spatiale (ou la distribution) de fluorophore dans le milieu mettent en œuvre une minimisation d'une fonction d'erreur des valeurs de ladite variable, cette minimisation pouvant être un traitement par ajustement à l'aide d'une méthode de simplex. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS - Les figures IA et 1B représentent chacune un exemple de dispositif expérimental pour la mise en oeuvre de l'invention, - les figures 2A et 2B représentent respectivement une série d' impulsions laser et de photons uniques émis, et une courbe de fluorescence obtenue à partir des données relatives aux photons uniques, - La figure 3 représente des exemples de courbes de déclins temporels de fluorescence, avec et sans fluorophore, - La figure 4 représente schématiquement la position relative d'un couple source - détecteur et d'une inclusion de fluorophore, -->la figure 5 représente des données de fluorescence pour différentes positions d'un fluorophore sous des fibres d' excitation et de détection, - la figure 6 représente des temps moyens calculés à partir de mesures de fluorescence pour différentes positions ou profondeurs d'un fluorophore, - la figure 7 représente trois courbes de déclin temporel de fluorescence, l'une résultant d'une mesure, et deux de simulations, la figure 8 représente une grille de détecteurs, la figure 9 représente l'évolution de temps moyens de détection pour différentes positions de l'ensemble détecteurs - fluorophore, - la figure 10 représente l'évolution de temps moyens de détection en fonction du chemin optique total parcouru par les photons. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS La figure IA est un exemple de système expérimental 2 utilisant comme détecteur 4 un photomultiplicateur et une carte TCSPC (Time Correlated Single Photon Counting) , en fait intégrée dans un ensemble de moyens 24 de traitement de données. La lumière est émise par une source 8 de rayonnement en impulsions, est envoyée et collectée par des fibres 10, 12 qui peuvent être déplacées. Les deux fibres peuvent être montées sur des moyens de déplacement en translation verticaux et horizontaux -->(suivant les axes X et Y de la figure 1) . La distance d entre les fibres est par exemple d'environ 0,2 cm. La source 8 d' impulsions de rayonnement peut également être utilisée comme moyen de déclenchement de la carte TCSPC (voir la liaison 9 entre la source 8 et les moyens 24) . Selon un mode particulier de réalisation, la source 8 est une diode laser puisée, à la longueur d'onde 631 nm et avec un taux de répétition de 50 MHz. La lumière laser passe de préférence par un filtre interférentiel 14 pour éliminer toute lumière à une longueur d'onde supérieure à la longueur d'onde d' excitation. La fibre 12 collecte la lumière en provenance du milieu 20 étudié. Un filtre interférentiel 16 et un filtre coloré absorbant les longueurs d'onde élevées peuvent être placés devant le détecteur 4 pour sélectionner la lumière de fluorescence (par exemple : λ > 650 nm, la source étant à la longueur d'onde 631 nm) d'un fluorophore 22 disposé dans le milieu 20 et optimiser l'élimination de la lumière d'excitation. Selon la technique TCSPC (pour Time Correlated Single Photon Counting , ou comptage de photons uniques correles en temps) on détecte, à l'aide du photomultiplicateur, un photon émis par le fluorophore après une impulsion de la source de rayonnement . Le système permet donc une détection résolue en temps des impulsions de fluorescence. -->La figure 2A représente une série d'impulsions laser Li (i = 1 - 4) et une série de photons uniques pi (i = 1 - 4) correspondants. Chaque photon est en fait détecté par rapport au départ de l'impulsion correspondante : sur la figure 2A, ti représente la durée écoulée entre chaque impulsion laser Li et l'instant de détection de chaque photon pi. Il est donc ensuite possible d'établir une répartition statistique, comme illustré sur la figure 2B, du nombre de photons de fluorescence détectés, en fonction du temps écoulé t par rapport à chaque impulsion laser. Une telle courbe Φ f i uo (t) peut ensuite être traitée pour en tirer des informations caractéristiques comme on va l'expliquer ci-dessous. Des moyens électroniques 24 tels qu'un micro ordinateur sont programmés pour mémoriser et traiter les données de la carte TCSPC. Plus précisément une unité centrale 26 est programmée pour mettre en oeuvre un procédé de traitement selon l'invention. Des moyens 27 d'affichage ou de visualisation permettent, après traitement, de représenter le positionnement ou la distribution spatiale des fluorophores dans le milieu 20 examiné. D'autres techniques de détection peuvent être employées, par exemple une caméra intensifiée ultra - rapide de type gated caméra ; dans ce cas la caméra s'ouvre sur une porte temporelle, de largeur par exemple environ 200 ps, puis cette porte est décalée, par exemple de 25 ps en 25 ps. La figure 1B est un exemple d'un autre système expérimental 2 utilisant comme détecteur 32 une -->caméra rapide. Un faisceau 30 d'excitation de la fluorescence d'un milieu 20, contenant un ou plusieurs fluorophores 22, est émis par une source de rayonnement (non représentée sur la figure) qui peut être du même type que celle présentée ci-dessus en liaison avec la figure IA. Un photodétecteur 36 permet de commander des moyens 40 formant ligne à retard. La référence 24 désigne, comme sur la figure IA, des moyens électroniques de traitement de données de type microordinateur, programmés pour mémoriser et traiter les données de la caméra 32. Une unité centrale de ces moyens 24 est programmée pour mettre en oeuvre un procédé de traitement selon l'invention. Là encore, des moyens d'affichage ou de visualisation permettent, après traitement, de représenter le positionnement ou la distribution spatiale des fluorophores dans le milieu 20 examiné. Il est également possible de travailler avec des impulsions dans le domaine de la femto seconde, à condition de disposer de la source de rayonnement adéquate, c'est - à - dire d'une source laser 8 dont chaque impulsion a une largeur temporelle également dans le domaine de la femto seconde. Une mesure préliminaire simple permet de mesurer la réponse (on utilise par la suite l'abréviation IRF pour Instrument Response Function ) du dispositif : on aligne les deux fibres 10, 12, séparées par une distance prédéterminée et une impulsion est émise de la première fibre 10 vers la deuxième fibre 12. Le signal obtenu en sortie de la deuxième fibre 12 fournit la réponse IRF. La largeur à -->mi hauteur de ce signal, compte tenu des distances mises en jeu, peut être de l'ordre de quelques dizaines de ps, environ 80 ps dans l'exemple donné. Un fantôme peut être utilisé, contenant de l'eau distillée dans laquelle une encre de Chine (de Dalbe, France) est introduite comme milieu absorbant et de l' intralipid (de Fresenius, France) comme milieu diffusant. Les concentrations relatives sont ajustées au niveau des paramètres des tissus biologiques. Le fantôme est contenu dans un cylindre en plastique de diamètre 11 cm et de hauteur 10 cm. Un volume de 1 μl de fluorophore Cy5 (de Amersham) à une concentration d'environ 10μmol.L-l est placé à l'extrémité d'un tube capillaire fin 21 (voir figure 1B) en verre (longueur 3 cm et épaisseur 1 mm) . Le tube est inséré dans le fantôme par un trou. Les propriétés optiques du fantôme et la durée de vie du fluorophore sont mesurées par des techniques de type TCSPC (comptage de photons uniques) et sont données dans le tableau I ci-dessous. a , r 0.0534 cm "1 11.82 cm "1 1.02 ns Tableau I Lors des mesures, les fibres sont introduites sur environ 2,5 cm dans le milieu 20, ce qui permet d'approcher la géométrie d'un milieu infini. Des scans peuvent être réalisés à l'aide des moyens informatiques 24 (avec un logiciel tel que Labview) qui contrôlent à la fois les moyens de -->déplacement des fibres et la carte TCSPC (ou la caméra 32 de la figure 1B) avec un port de communication parallèle . On prend d'abord l'exemple d'un milieu infini avec un seul fluorophore. On considère un fluorophore ponctuel M dans le milieu, à une position (inconnue) repérée par un vecteur r dans un repère OXYZ. La source d'excitation (ou plutôt l'extrémité de la fibre 10, côté fluorophore) est localisée en r s et le détecteur (ou plutôt l'extrémité de la fibre 12, côté fluorophore) en position r d . L'instant d'émission d'une impulsion est désigné par t 0 . La distance source - fluorophore est notée \r s - r\ = r sr et la distance fluorophore - détecteur est notée |r —r^| - rd . Dans le domaine temporel, le flux de photons d'excitation à l'instant t est noté φ x (r sr , t -t 0 ) . L' indice x correspond à la longueur d' onde d' excitation λ x . Le fluorophore 22 absorbe la lumière d'excitation et réémet la lumière de fluorescence à l'instant t , à la longueur d'onde λ m , et avec une décroissance temporelle r. L'expression du flux de photons émis par le fluorophore localisé en r à l'instant t est la convolution de la fonction de propagation φ χ et de la décroissance temporelle de la fluorescence: s ) = a f J o Φ χ (r„,f - -exp f i_{ di (1) -->Où a est un facteur d' échelle qui dépend de la puissance d'illumination, de l'efficacité quantique du fluorophore. L'équation (1) donne l'expression temporelle de l'intensité du rayonnement émis par le fluorophore. Ce rayonnement sera ensuite détecté par le détecteur 4 (ici aussi il s'agit de l'extrémité de la fibre, du côté du milieu 20), en position r d , à l'instant t , après avoir transité du fluorophore 22 à ce même détecteur. Le flux de photons de fluorescence résultant est proportionnel à une double convolution : pour la propagation de la source au fluorophore : la convolution de φ x (à la longueur d'onde d'excitation) avec la durée de décroissance de la fluorescence, cette première convolution conduisant à l'expression S f ci-dessus (équation (1)), et, ensuite, celle de S f (donné par l'équation (1)) avec φ m (à la longueur d'onde d'émission), pour la propagation du fluorophore vers le détecteur. On peut donc écrire le flux détecté de photons de fluorescence : β ri r r t ≈aΛ S f (r sι ,i,t 0 ) φ m (r rd ,t-i)di J o = \ \ Φ x ( r , r >t-t 0 )-exp Jo.0 T ( i_ (2) Φ m (r rd ,t-t)dtdt Pour avoir une solution simplifiée, on peut utiliser la solution pour un milieu infini, en faisant l'approximation que les coefficients optiques sont les -->mêmes en excitation et en émission. L'expression obtenue est la suivante: 2 ^( , ".r^ = αj dt t K. + rd r sr r rd [4πc(t-t e )f 2 eχp[- a c(r-r e )]eχp ( r sr+r rd ) AcD(t-t e ) exp(-t e / r (3) Où μ a est le coefficient d'absorption, et D le coefficient de diffusion. Pour plusieurs fluorophores, on utilise, comme indiqué plus loin, une intégrale sur le volume, et on fait l'hypothèse d'un milieu faiblement absorbant puisque ce modèle ne tient pas compte d'une éventuelle réabsorption et d'une éventuelle diffusion. Cette fonction théorique Φfi uo correspond à la courbe, obtenue par mesures expérimentales, de la figure 2B. On peut extraire de cette fonction, donc de l'équation 3, la durée moyenne (ou le premier moment) . Pour une fonction de distribution g(t) , la durée moyenne est donnée par: = J J —oo tg(t)àt r g ήdt (4) Pour développer cette formule, considérons, plutôt que l'expression temporelle du flux, son expression fréquentielle : φ /f o 0 fo r ,r„ /> ω) = α ' e*p[ik(r sr +r rd j\ 1 r„ + K rd \-iωτ (5) -->Où a est une constante indépendante de la fréquence et k 2 = -μ a / D + iω/(cD) . Puis, en utilisant la formule suivante: = ι dΦ ι|α)=ox 1 (6) dω (ω)\ω=o l'expression analytique du temps moyen théorique peut être trouvée: 2c^μ a D Dans cette expression apparaît la durée de vie τ du fluorophore. La position inconnue r est contenue dans les expressions de r sr et r rd . Le traitement des données expérimentales va maintenant être décrit. Tout d' abord, le calcul du temps moyen sur les données expérimentales peut être sensible aux perturbations dues à la lumière d' excitation ou à la fluorescence du milieu environnant le fluorophore, qui se produisent lorsque le signal de fluorescence est faible. En particulier la lumière d'excitation qui arrive en premier peut diminuer le temps moyen du signal. Afin de corriger cette perturbation, le signal peut être mesuré, mais sans fluorophore. Cette mesure sans fluorophore est designée par mesure ]L et est composée : - partiellement de la lumière d'excitation qui passe par les filtres, -->et partiellement (partie longue du signal) par la fluorescence du milieu environnant, ou du fantôme sans fluorophore. Cette mesure peut être soustraite des données mesurées avec fluorophore ( mesure βuo ) , si on souhaite corriger ces dernières de la lumière résiduelle, et pour obtenir le signal réel, désigné par signal nm (pour indiquer la différence avec une mesure directe, voir équation 8). La soustraction permet également de supprimer le bruit de fond. En prenant en compte les expressions des durées de détection (respectivement T βm pour mesure fluo et T IL pour mesure 1L ) , le signal de fluorescence peut être exprimé comme suit : T signal^ = mesure flu0 - -^- mesure IL (8) * IL La figure 3 donne le signal avec fluorophore (courbe I) et sans fluorophore (courbe II) pour une inclusion à une profondeur z = 0,74 cm. Les extrémités des fibres tournées vers le milieu 20 sont séparées par 0,2 cm. Pour le calcul du premier moment les valeurs limites d' intégration sont définies par des durées définies par 1% du temps correspondant à l'amplitude maximum du TPSF, pour la limite supérieure et inférieure, de façon à s'affranchir du bruit de fond en accord avec l'étude de A.Liebert et al. Evaluation of optical properties of highly scattering média by moments of distributionss of times of flight -->of photons Applied optics, vol. 42, n° 28, 5785 5792 (2003) . Pour comparer le temps moyen du signal sιgnal avec le temps moyen théorique [équation 7], l' IRF (fonction déjà définie ci-dessus) peut être prise en compte. Le signal est la convolution de l'IRF avec la réponse théorique ou la réponse propre du milieu diffusant. Les propriétés du premier moment montrent que le temps moyen expérimental peut être écrit comme la somme du temps moyen théorique lheo et du temps moyen IRF IRF : t >s, g na, = >,eo + >IRF (9) Le problème inverse, c'est - à - dire la détermination de la position de l'inclusion en fonction des mesures, peut être résolu pour des mesures audessus de l'inclusion (voir la figure 4 qui présente la géométrie des extrémités des fibres 10, 12 et la position du fluorophore 22) . La distance inter - fibres étant faible (d = 0.2 cm), on peut supposer que r sr + r rd ~ 2z , où z représente la profondeur de l'inclusion sous les fibres. On peut donc réécrire l'équation 9: s^= r = IRF ~ + τ+ ι*F= r Z —r+τ+ iRF (10) 2c μ ~ D IιR*FF jM D Cette expression peut être inversée pour obtenir z lorsque les paramètres optiques, la durée de vie et la durée moyenne de l'IRF sont connus: z-c M ~ O ~ D ( sιgnal -τ- 1RF ) (11) -->Cependant cette méthode ne peut être exploitée que si les extrémités des fibres 10, 12 sont placées exactement au-dessus de l'inclusion afin de satisfaire à l'hypothèse r sr + r rd ~ 2z et pour déterminer la durée de vie et la durée moyenne de l'IRF. Pour éviter cette connaissance a priori de la position de l'inclusion, de la durée de vie et de la durée moyenne de l' IRF, une méthode plus générale a été développée afin de déterminer une position complètement inconnue. Un balayage est effectué au-dessus de l'inclusion pour N positions relatives fluorophore fibres. La position relative des deux fibres, donc d'une fibre par rapport à l'autre, reste de préférence constante. La durée moyenne, s , gna i, ι ' * 6 D'-^ J ' es ^ calculée pour chaque position du balayage. Puis on sélectionne et on soustrait de chaque durée moyenne une autre durée moyenne, de préférence la plus faible: min( sιgna! l ) . Ce choix est justifié par la fait que cette durée la plus faible correspond à la position de mesure la plus proche de l'inclusion avec le meilleur rapport signal sur bruit. On considère ensuite A sιgnal l comme la nouvelle variable: Δ s lg nal, , = Slg nal, , ~ H sιgna ,, ^ i N ]) sr, i rd, t sr, mm rd, min V / 2c^μ a D 2c^μ a D Cette nouvelle variable est indépendante de la durée de vie et de la durée moyenne de l' IRF du fait de la différence effectuée. Elle dépend par contre de -->la position ou de la distribution spatiale du fluorophore. Dans le cas d'un seul fluorophore, cette position de l'inclusion, de coordonnées (x,y,z) , est ensuite définie comme celle permettant de minimiser la fonction d'erreur χ 1 : χ x,y,z) = (A sιgnahl -A the J (13) Les variables d' entrée sont les valeurs de Δ a/ i extraites des mesures . Elles sont comparées à la formule théorique où A theo ι est donné par : Δ theo, , = theo ^ -min( theo ), i e [1,N]) (14) Où j est l'indice qui repère le signal expérimental qui possède le plus petit temps moyen. La procédure d'ajustement est par exemple basée sur une méthode de simplex telle que celle décrite dans l'article de J.C.Lagarias et al. Convergence properties of the Nelder -Mead simplex method in low dimensions , SIAM Journal on Optimization, vol.9(1), p. 112 - 147, 1998. Des résultats expérimentaux vont être présentés, qui permettent de valider le modèle cidessus. On présente ensuite des mesures qui montrent qu'on peut, avec la méthode selon l'invention, résoudre le problème inverse, c'est - à - dire déterminer l'emplacement de l'inclusion. Des signaux résolus en temps pour une distance interfibre de 0,2 cm et pour des inclusions à différentes profondeurs sous les fibres (z= 0.24; 0.34; -->0.44; 0.54; 0.64; 0.74 cm) sont présentés en échelle semi-logarithmique en figure 5. Les amplitudes sont représentées sur cette figure en échelle arbitraire. Dans cette représentation, le déclin exponentiel de la fluorescence du Cy5 apparaît comme tendant vers une ligne droite. Plus la profondeur z s'accroît, plus la position temporelle du maximum est décalée vers les durées longues, du fait du trajet plus important des photons. L'expression théorique de la durée moyenne a d'abord été validée. La durée moyenne de l'IRF a été soustraite de la durée moyenne mesurée afin de faire une comparaison avec la formule théorique de l'équation 9. La figure 6 représente le temps moyen expérimental corrigé de la réponse de l'instrument (= s i gna i ' t > i RF en fonction de la profondeur z de l'inclusion. En accord avec l'expression théorique (équation 10), le temps moyen est une fonction linéaire de la position de l'inclusion. La pente mesurée expérimentalement est 1.14, égale à la pente théorique [c Jμ a D] calculée à partir de l'équation (10) avec les coefficients optiques du milieu. L'ordonnée à zéro, 0.96 ns, est assez proche de la durée de vie mesurée ( 7=1.02 ns) . Puis, le modèle de fluorescence a été testé pour déterminer si il correspond aux mesures. La solution calculée (équation 3 avec les paramètres du tableau I) est convoluee avec l'IRF et comparée avec les mesures. Les courbes sont normalisées à la même -->surface que la courbe expérimentale sur un intervalle de temps arbitraire (1% du maximum sur les côtés droits et gauches) . En figure 7 sont illustrés les résultats expérimentaux pour un fluorophore à la profondeur z = 0.74 cm et deux simulations pour deux durées de vie différentes (0,96 ns : courbe en trait plein, 1,02 ns : courbe en traits interrompus) . Un bon accord est trouvé entre les simulations et les résultats expérimentaux. Le tableau II ci-dessous donne les résultats de la formule d'inversion pour τ=0.96 ns et τ=1.02 ns. On constate un bon accord entre les valeurs calculées et réelles. Zexp (Cm) 0.24 0.34 0.44 0.54 0.64 0.74 z calculé (7=0.96 ns) 0.24 0.33 0.45 0.54 0.64 0.74 z calculé (τ=l.02 ns) 0.19 0.28 0.40 0.49 0.59 0.69 Tableau II La résolution du problème inverse va être illustrée pour différentes profondeurs d' inclusion en utilisant des grilles de mesure. L'échantillonnage est effectué avec une grille de mesure comportant 5 x 5 détecteurs disposés selon un pas de 0.2 cm. La grille est positionnée audessus de l'inclusion. La figure 8 illustre la grille de détecteurs. La fibre 10 d'émission est à -0.2 cm (selon l'axe x) de la fibre 13 de détection. L'inclusion est centrée à (0, 0) et placée à -->être comparées à la pente théorique différentes profondeurs. Le centre (0, 0) correspond à la fibre 12 de collection. La procédure d'ajustement est appliquée aux données obtenues de tous les points de détection. Pour la première profondeur (0.24 cm), par exemple, la valeur expérimentale du temps moyen différentiel expérimental ( Δ sιgna , ) et le temps moyen différentiel calculé par ajustement sont représentés en figure 9. En figure 10, est représenté le temps moyen en fonction de r sr + r rd (tra et des photons), pour une inclusion positionnée à z=0.24 cm. Le Tableau III montre les résultats de l'ajustement pour chaque profondeur de l'inclusion et les pentes correspondant au tracé du temps moyen en fonction de r sr +r rd . Ces pentes peuvent 1 2c^μ ~ D [Eq. (7)], calculée en utilisant les valeurs du tableau I et égale à 0.572. On retrouve donc la pente théorique, ce qui est une confirmation de la validité du modèle retenu. Le dispositif est celui de la figure IA, mais les fibres sont séparées de 2 mm et un balayage avec un pas de 2 mm est effectué au-dessus de l'inclusion (le fantôme a un volume d'environ 1 mm 3 ) . La position de l'inclusion est repérée avec une précision meilleure que te mm (200 μ . sur le eu de mesures réalisées) . z réel (cm) x (cm) y (cm) z (cm) Pente 0.24 -0.01 -0.01 0.24 0.572 0.34 -0.02 0.01 0.33 0.577 -->0.44 -0.02 0.02 0.42 0.578 0.54 -0.02 0.04 0.53 0.577 Tableau III Des scans ont été réalisés avec des grilles non centrées sur l'inclusion. L' inclusion, positionnée initialement à z = 0,3 cm sous les fibres (position initiale = (0 ;0 ;0,34)) a été déplacée le long de l'axe x vers deux autres positions : (-0.2, 0, 0.34) puis (-0.4, 0, 0.34). La position zéro est indiquée seulement pour comparaison. Comme le montre le tableau IV, qui donne les positions obtenues par ajustement, en comparaison des positions réelles, tant la localisation (x, y) que la profondeur sont correctement déterminées par la procédure d'ajustement pour les trois localisations. Position (0, 0, 0.3) (-0.2, 0, 0.3) (-0.4, 0, 0.3) réelle Position (-0.00, 0.00, 0.32) (-0.20, 0.00, 0.32) (-0.41, 0.00, 0.31) par ajustement Tableau IV Ces essais montrent que la méthode ne nécessite pas a priori de connaissance de la position (x, y) de l'inclusion et reste valable si la grille est décalée par rapport à l'inclusion. -->Expliquée ci-dessus dans le cas d'un seul fluorophore, l'invention s'applique également au cas de plusieurs fluorophores, comme va le montrer la suite. Dans ce deuxième cas, on essaie de retrouver la distribution spatiale des fluorophores dans le milieu 20. Cette distribution spatiale est la quantité à reconstruire dans le cadre du problème inverse. Le même type de dispositif expérimental que celui utilisé pour un seul fluorophore, par exemple celui de la figure IA ou 1B, peut être utilisé dans le cas de plusieurs fluorophores . On se place à cette fin, comme dans le premier cas, dans le cadre théorique de l'approximation de la diffusion, pour modéliser la propagation de la lumière dans le milieu diffusant. L'équation de la diffusion qui donne la densité de photons Φ pour un milieu homogène est de la forme : L )_ D . V ^φ( r ,t) + μ a φ(r,t)=S(r,t) (15) dt ou: - c n est la vitesse de propagation de la lumière dans le milieu. Si on note n l'indice de réfraction du milieu, alors c n = c/n avec c la vitesse de propagation de la lumière dans le vide ; - D = l (μ a +μ' s )] est le coefficient de diffusion, où μ a et μ' s sont les coefficients d'absorption et de diffusion réduits du milieu. — S le terme de source. Dans le domaine fréquentiel, la solution s'écrit: --> φ( ) = ^exp kr) = _Q^ G(r ω) (16) ' 4πD r 4πD ' où Q 0 est un facteur dépendant de la puissance de la source, _ / \ expfikr) G(r,ωJ = -—- est la fonction de Green du système et r où Je est défini par la relation suivante : k 2 =-^-^ (17) D cD D'autres modèles peuvent aussi être utilisés (modèle par transfert radiatif, par marche aléatoire, ou simulations numériques, de type Monte Carlo par exemple). Cela signifie qu'on peut calculer une fonction de Green dans d'autres cadres que l'approximation de la diffusion. Les équations 15 et 16 ci-dessus sont le pendant de l'expression (1) donnée ci-dessus dans le cas d'un seul fluorophore . Considérons un milieu diffusant homogène qui contient des fluorophores. Une impulsion source est émise en r s à to, et un détecteur est placé en r d . On note φ x (jr-r s |,t") la densité de photons qui atteint le point r à t". L'indice x indique que la longueur d'onde est celle de la source d'excitation λ x . Aucune hypothèse n'est nécessaire sur la forme de Φ x . On peut noter que, si le milieu est infini, Φ x aura la forme donnée par la solution (16) en milieu infini. Un fluorophore placé en r va absorber cette lumière Φ x et émettre de la lumière de fluorescence à -->t' , avec un temps de vie de fluorescence τ (aussi appelé déclin de fluorescence) et une efficacité η. La densité de photons en r à t' est la convolution de la fonction de propagation Φ x et du déclin de fluorescence : δS f jr-r ,t^I 0 t r-r s |,t^ 0 )^fflϋexp τ(r) t'-t (18) Nous l'avons noté δS f car ce terme devient alors un terme source à la longueur d'onde d'émission λ m qui va se propager et être détectée en r d à t. D'où l'expression de la densité de photons finale δφ f2uo qui est la convolution de terme précédent et de la fonction de propagation Φm entre l'inclusion et le détecteur : δφ flu r-r s |,|r-r d |,t)=£δS f (]r-r s |,t')φ m ήr d -r|,t-t*)df = £É ' Φx(|r-r.|,t--t 0 p^e Xfl τ(r) :i9) t'-t " \ c(r) !φ r d -r|,t-f)dfdt" On peut adopter les notations suivantes pour alléger l'écriture : r„ = r-r_ et,r, , ^,rd [20: S'il y a plusieurs fluorophores dans le milieu, on intègre sur tout le volume pour obtenir l'expression finale : Φfiu o ( r sr , r r d > = J v drδφ fl (r sr , r rd , t) ( 21 ) Pour cette intégration en volume on néglige les éventuelles réabsorptions et diffusions par les autres fluorophores qui ne sont pas prises en compte dans ce modèle. -->Si on effectue la transformée de Fourier de l'expression précédente, on obtient l'expression de la densité de photons de fluorescence Φ f (r s ,r d ,ω) dans le domaine fréquentiel. Cette expression présente l'avantage d'être un peu plus simple et bien adaptée aux calculs qui suivront : Φ f (r sr ,r rd ,ω) = f v Φ x (r sr ,ω)-^ φ m (r rd ,ω)dr 3 (22) 1 + ιωτ(r ) Les courbes temporelles de fluorescence sont mesurées pour un ensemble de positions relatives d'une part de l'ensemble source - détecteur et d'autre part du milieu 20. Si on considère un milieu infini, en chaque point, le signal mesuré est proportionnel à la densité de photons de fluorescence. La densité de photons peut être assimilée au signal en lui affectant un coefficient de proportionnalité, qui ne dépend que de facteurs instrumentaux (puissance d'excitation, gain des détecteurs, atténuation des filtres...) . On exprime la densité de photons en fonction de ce facteur instrumental, des coefficients de diffusion D et des fonctions de Green G qui sont connues (aux deux longueurs d'ondes qui sont toujours indiquées par les indices x et m) : Φ fc r .'-m.û ≈ ≈JJJL - G x {r sr ,ω) η ^ G m {r rd , ω)dr' (23) J J J J V D x D m \ + ιωτ(r) Cette équation peut être discrétisée en passant à une somme sur les voxels, où k représente la taille du pas de discrétisation : -->Φ f {r sr ,r rd ,ω) = a ∑ - —G x {r sr ,ωj tf ' ^' G,( ,^ 3 (24 v ^ Xe i s D χ D m l + ιωτ(r v ) tf ' fcM') On fait l'approximation que les coefficients optiques sont les mêmes aux deux longueurs d'onde, et on pose donc : D = Dx = Dm. Parmi toutes les mesures, on repère le couple source - détecteur (noté r s -r d ) pour lequel le temps moyen de la TPSF est le plus petit : cette mesure est notée φ mιn (r s ,r d j. Elle est de préférence choisie par rapport à d'autres, car elle possède la plus grande amplitude, et donc le meilleur rapport signal sur bruit pour une puissance de la lumière d'excitation constante sur les acquisitions. Les nouvelles fonctions considérées sont maintenant définies par : Φ N (rr„ s ,rr„ d ,ωω) == -—- ^7- '-° - / r (25' Φ 1 "" 1 ! \^≈m ,r d u m ,ω) Pour ω = 0 la formule ci-dessus donne l'expression du moment d'ordre 0, c'est - à - dire en fait de l'intégrale dans le temps de Φfi uo - Nous pouvons préciser l'expression de φmm ( r m ,r d J: (r, m ,r d , ω)= a ∑ G x (r v , ,ω) M ^i .α,). 3 (26) v= ,£> \ + ιωτ{r v ) où le facteur α reste le même facteur que précédemment puisque les conditions expérimentales n'ont pas changées. Rappelons ici la définition du temps moyen mi pour une distribution g(t) : m 1 = π 0 tg(t)dt/π 0 g(t)dt -->Dans les notations présentées ci-dessus, le dénominateur (l'intégrale de g dans le temps) de cette expression constitue πio. Le temps moyen de la fonction Φ N s'écrit : f Φ f ^ mι (φ N )= m, = m 1 (φ f )-m 1 (φ min ) L'expression du temps moyen mi (Φ f ) est la Φ suivante + r . r .d + O l(φ ^ffln^7 f ], v= ∑vox ffln^ f , v= voxels x s ,, cjμ a D D xG m (r rd ,ω = θ) h'η{r v )c{r v ) ~G x (r s ,,ω = θ) D (27: et m 0 (Φ f ) s'écrit : m Q (φ J )= ∑^G x (r sr ,ω = θ) G m (r r d ,ω = θ)a h 3 η{r v ) c(r v ) (28) Cette quantité est en fait connue par la mesure : Φ f est mesurée, et m 0 (Φ f ) (ainsi d'ailleurs que mι(Φ f )) peut être déduit de cette fonction Φ f obtenue expérimentalement . Le terme τ dépend de l'environnement du fluorophore. Mais on peut supposer que cet environnement est le même pour les différents fluorophores au cours d'une même mesure. Si, donc, on effectue l'hypothèse que τ est indépendant de r v , ce terme τ sort de la somme et on peut simplifier l'expression de mi (Φ f ) : -->(29) -G : L,ω = θ) D + r r,d 2c^μ a D m (φ )= m o(Φ) ' + r G m (r, d ,ω = θ)ah'η(r v )c{r v ) Pour m^Φ" 1 " 1 ] l'expression est la même en changeant par Φ par Φ mιn et r s par r sm (respectivement rd par r^) Ainsi dans le calcul du temps moyen de Φ N le temps de vie de fluorescence disparaît dans la soustraction et on obtient : + r . r .d m ( Φ *)=_ I ' lc μ a D -i G * (^ > ω = m [ d , c = θ)ah 3 η(r v )c(r v ) D (30) + r . o!*"") v \{ 2c μ ~ D r . r. - G x (r^ , ω = θ)β m (r rdm , ω = θ}xh 3 η(r v )C(r v ) Nous pouvons exprimer cette quantité de façon linéaire en fonction de αη(r v )C(r v ), la quantité à reconstruire, en introduisant une fonction de poids : m 1 (φ N )=∑P ( ^ r -[αη(r v )c(r v )] avec p m 0 m, ( A> 17 m 0 * ( Φ *71 r sr t +r r t d 2c μ -^G x (r sr ,ω = θ)G m (r rd ,ω = θ)h 2 ^(Φ mm ) r s„r t +r r ^ d m 2cjμ a D -^G x (r Sml .,ω = θ)G m (r rdm ,ω = θ -->, , m 0 ( ( et -t r sont eux aussi mesurés et injectés dans la m 0 (φ ιmn ) fonction de poids P qui est calculée, le système d'équations linéaires est ainsi établi, indépendamment de la valeur du temps de vie de fluorescence. En d'autres termes, on est ramené à la résolution d'un système : M = P x C Où M est un vecteur colonne de mesures, P une matrice de poids (qui dépend du modèle choisi, donc de la fonction G et des quantités -, et 1 ^ et m 0 (φ f ) njφ™( C un vecteur colonne des inconnues. Une fois le système résolu, on connaît les composantes du vecteur C qu'il est possible de représenter en 3 dimensions. La solution peut donc être représentée à un opérateur sur des moyens de visualisation tels que les moyens 27 de la figure IA ou 1B. Les moyens 24 de traitement des données permettent de résoudre un système d'équations tel que le système ci-dessus, et sont donc programmés à cet effet . La résolution du problème de la localisation ou de la distribution spatiale des fluorophores peut mettre en œuvre une ou plusieurs des différentes techniques décrites par exemple dans A.C. Par conséquent, m 1 (φ N )est mesuré, les rapports j m 0 ( ( --> Kak et al. principles of computerized tomographic imaging , IEEE, NY, 1987. Les données peuvent aussi être acquises en mode frequentiel à différentes fréquences de manière à reconstruire les TPSFs en effectuant une transformée de Fourier . Les développements ci-dessus montrent que l'on peut utiliser, dans le cadre de l'invention, une fonction de la fréquence (et non plus du temps) . Cette fonction fréquentielle peut être normalisée, par exemple par rapport à celle qui correspond au temps moyen minimal. --> REVENDICATIONS 1. Procédé de traitement de signaux de fluorescence émis après excitation par un rayonnement provenant d'une source (8) de rayonnement, par au moins un fluorophore (22) à durée de vie τ dans un milieu environnant (20), ces signaux étant détectés par des moyens (4) de détection, ce procédé comportant : la détection, pour chaque couple de positions de la source (8) de rayonnement et des moyens (4, 6) de détection, d'un signal de fluorescence (Φfi uo ) émis par ledit au moins un fluorophore (22) dans son milieu environnant, le calcul, à partir de ces signaux détectés de fluorescence, des valeurs d'une variable, indépendante de la durée de vie τ, - la détermination de la position ou de la distribution spatiale dudit au moins un fluorophore (22) dans ledit milieu (20) à partir des valeurs de ladite variable. 2. Procédé selon la revendication 1, ladite variable indépendante de τ résultant d'une fonction normalisée en fréquence. 3. Procédé selon la revendication 2, ladite fonction étant normalisée en fréquence par rapport à un signal de fluorescence particulier. -->4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, ladite variable indépendante de τ résultant de la différence entre le temps moyen calculé pour chaque signal de fluorescence et le temps moyen calculé pour un signal de fluorescence particulier. 5. Procédé selon la revendication 3 ou 4 , ledit signal de fluorescence particulier étant celui ayant un temps moyen minimal ou ayant un temps moyen calculé minimal. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, ladite variable indépendante résultant des transformées de Mellin - Laplace à partir des signaux de fluorescence ou des moments d'ordres supérieurs des fonctions de fluorescence normalisées. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, la détermination de la position ou de la distribution spatiale de fluorophore (22) dans ledit milieu (20) étant réalisée par une méthode d'inversion utilisant des valeurs de ladite variable. 8. Procédé selon la revendication 7, le traitement statistique des valeurs de ladite variable étant une minimisation d'une fonction d'erreur à l'aide d'une méthode de simplex. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, la détermination de la répartition ou de la distribution spatiale de fluorophore (22) dans ledit -->milieu (20) mettant en œuvre la résolution d'un système d' équations linéaires : M = P x C, Où M est un vecteur colonne de mesures, P une matrice de poids et C un vecteur colonne de la répartition. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, comportant un calcul du premier moment de la courbe de fluorescence du signal de fluorescence en fonction du temps. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, comportant en outre une représentation visuelle ou graphique de la position ou de la répartition du ou des fluorophores. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, la source (8) étant de type femto - seconde. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, les signaux de fluorescence étant détectés par technique TCSPC ou par caméra. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, comportant en outre une étape préalable de mesure de signal de fluorescence par le milieu environnant (20), en l'absence de fluorophore (22), puis une étape de correction des signaux de fluorescence (Φfi u o) émis par le fluorophore dans son milieu environnant. -->15. Dispositif de traitement de signaux de fluorescence émis par au moins un fluorophore (22), à durée de vie τ dans un milieu environnant (20), comportant : - une source (8) de rayonnement pour l'excitation dudit fluorophore, - des moyens (4) de détection pour détecter un signal de fluorescence émis par ledit fluorophore, - des moyens pour effectuer un déplacement relatif de la source (8) et des moyens (4) de détection par rapport au fluorophore, - des moyens pour calculer, à partir d'une pluralité de signaux de fluorescence (Φfi uo ) émis par le fluorophore (22) dans son milieu environnant, chaque signal correspondant à une position relative, d'une part du fluorophore et d'autre part de la source (8) et des moyens (4) de détection, des valeurs d'une variable indépendante de τ , - des moyens pour déterminer la position ou la répartition ou de la distribution spatiale de fluorophore (22) dans ledit milieu (20) à partir des valeurs de ladite variable. 16. Dispositif selon la revendication 15, lesdits moyens de détection comportant des moyens de type TCSPC ou des moyens de type caméra. 17. Dispositif selon l'une des revendications 15 ou 16, comportant en outre des moyens (27) de représentation visuelle ou graphique de la -->position ou de la distribution spatiale du ou des fluorophores . 18. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 17, ladite variable indépendante de τ résultant d'une fonction normalisée en fréquence. 19. Dispositif selon la revendication 18, ladite fonction étant normalisée en fréquence par rapport à un signal de fluorescence particulier. 20. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 19, ladite variable indépendante de τ résultant de la différence entre le temps moyen τ calculé pour chaque signal de fluorescence et le temps moyen calculé pour un signal de fluorescence particulier. 21. Dispositif selon la revendication 19 ou 20, ledit signal de fluorescence particulier étant celui ayant un temps moyen minimal ou un temps moyen calculé minimal. 22. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 17, ladite variable indépendante résultant des transformées de Mellin - Laplace des signaux de fluorescence ou des moments d'ordres supérieurs des fonctions de fluorescence normalisées. 23. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 22, lesdits moyens pour déterminer -->la position ou la distribution spatiale de fluorophore (22) dans ledit milieu (20) mettant en œuvre une méthode d' inversion utilisant des valeurs de ladite variable . 24. Dispositif selon la revendication précédente, le traitement statistique des valeurs de ladite variable étant une minimisation d'une fonction d'erreur à l'aide d'une méthode de simplex.