FR 2900656 A1 20071109 FR 0603952 A 20060503 10 L'invention concerne un procédé pour la synthèse de composés C-glycopeptides gem-difluorés. Elle s'applique plus particulièrement, mais non exclusivement, à la préparation de composés ou compositions utilisables notamment pour la préservation de matériaux biologiques tels que des cellules, tissus et organes à différentes températures, mais également dans 15 le traitement de l'inflammation. Une famille de glycoprotéines antigels présentent notamment chez certains poissons et leur permettant de survivre dans un environnement ou les températures sont voisines ou inférieures à 0 C, a montré une activité 20 protectrice de matériaux biologiques dans de nombreuses études à basses voire très basses températures (environ +4 C à -196 C). Depuis de nombreuses années, les scientifiques étudient l'influence de ces composés antigels extraits du milieu naturel (poissons, amphibiens, plantes, 25 insectes...) et s'orientent vers la synthèse de composés analogues suffisamment stables et présentant une activité au moins égale voire supérieure aux molécules naturelles pour des applications commerciales. En effet ces composés naturels présentent de nombreuses limitations : 30 -une extraction du milieu naturel ou des synthèses difficiles, - des analyses complexes avec des puretés faibles, - des produits instables face aux hydrolyses chimiques et enzymatiques. 1 -2- Les glycoprotéines, en raison de la présence d'une liaison osidique (liaison impliquant l'oxygène dit en position anomérique), sont fragiles vis-à-vis de plusieurs systèmes enzymatiques dont les enzymes glycosidases et sont également sensibles aux hydrolyses acido-basiques, ce qui rend leur synthèse plus difficile. II est donc intéressant, pour permettre aux composés de conserver leurs propriétés biologiques, de remplacer l'oxygène de la liaison osidique afin que cette liaison ne soit plus dégradée par un processus enzymatique. Des analogues où l'oxygène est remplacé par un groupement CH2 ont été synthétisés, mais, en dépit d'un accroissement de la stabilité et d'un encombrement stérique semblable à celui de l'oxygène, le groupement CH2 ne s'est pas toujours révélé être un bon mime de l'oxygène osidique. En conséquence, on ne retrouve pas forcément les propriétés biologiques du composé initial. D'autres classes de composés où l'oxygène est remplacé par un azote ou un soufre et plus récemment par un groupe difluorométhylène sont étudiées afin de conférer aux composés glycoconjugués une stabilité accrue en milieu biologique. En effet, le groupe CF2 est particulièrement résistant aux processus de dégradations biochimiques et il permet donc la synthèse de structures non hydrolysables. Cette transposition O/CF2 semble particulièrement adaptée pour mimer l'oxygène sur le plan électronique ; les deux atomes de fluor jouant le rôle des deux doublets libres de l'oxygène. Le Demandeur a développé des gem-difluoroglycopeptides qui ont démontré une très forte activité de préservation de différentes lignées cellulaires à des températures variant de -78 C à +37 C.30 -3- En effet, les modifications structurales apportées par rapport aux composés natifs et l'observation d'un véritable effet anti-apoptose, c'est-à-dire pas de mort cellulaire, à des températures physiologiques ont conduit le Demandeur à étendre le spectre d'activité de nos composés. Ces composés ont été baptisés AAGP pour Anti Aging GlycoProteins. Dans un souci de développer de nouveaux analogues toujours plus actifs c'est-à-dire apportant une meilleure préservation des matériaux biologiques et avec en première instance la volonté d'améliorer la préservation de fibroblastes pour des applications en cosmétologie, nous nous sommes orientés vers la synthèse de composés de plus faible poids moléculaire pouvant ainsi avoir une meilleure biodisponibilité tout en simplifiant les étapes de synthèse. De tels composés seraient utilisables en vue de nombreuses applications telles que la préservation des cellules, plaquettes sanguines, tissus et organes. Il existe en effet une forte demande afin d'améliorer le stockage et la 20 conservation de matériaux vivants avec beaucoup moins de dommages que par les méthodes couramment utilisées. On parle plus généralement de préservation en incluant la préservation à des températures différentes y compris la cryopréservation jusqu'à des 25 températures de -196 C. Ainsi, des composés utilisés comme adjuvants lors de la conservation et présentant une bonne stabilité pourraient être utiles pour préserver des matériaux biologiques notamment dans le domaine médical : 30 - pour maintenir des organes humains entiers tels que des reins, des coeurs et des foies à transplanter sans contrainte de temps, - pour préserver des tissus délicats avec un minimum de dommages et suffisamment longtemps pour permettre leur distribution éventuellement internationale, - pour conserver des plaquettes sanguines et des cellules, - pour protéger certains organismes, bactéries, virus ou des vaccins, mais également dans le domaine dermatologique et/ou cosmétique pour protéger la peau contre les dégradations causées par le stress oxydant ou les UV par exemple. L'invention a pour objet de résoudre ces inconvénients. A cet effet, elle propose un composé C-glycopeptide gem-difluoré de 10 formule I : OR où n est un nombre entier compris entre 3 et 4, 15 R représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle linéaire ou ramifié, benzyle, acétyle, triméthylsilyle, tert-butyldiméthylsilyle, tertbutyldiphénylsilyle, RI représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié, benzyle, alkylcarbamate, allylcarbamate, benzylcarbamate, 20 acétyle, R2 représente OR avec R tel que défini précédemment, NR'R" avec R' et R" identiques ou différents représentent un hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié, benzyle, acétyle, alkylcarbamate, allylcarbamate, benzylcarbamate ou un acide aminé, 25 R3 représente un atome d'hydrogène ou une fonction alcool libre ou protégé, -5- ainsi que ses dérivés à l'état de base, de sel d'addition à un acide minéral ou organique, d'hydrate ou de solvat physiologiquement ou pharmaceutiquement acceptables. Les groupes alkyles linéaires ou ramifiés pourront être des groupes possédant de 1 à 10 atomes de carbones. Ledit acide aminé pourra être une alanine ou une glycine. Par physiologiquement acceptable, on entend compatible avec la peau, les lèvres, le cuir chevelu et/ou les cheveux. L'invention a également pour objet un médicament comprenant en tant que principe actif au moins un composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I 15 tel que défini précédemment. Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne l'utilisation d'au moins un composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I tel que défini précédemment pour la préparation de médicaments destinés à traiter 20 l'inflammation. L'invention concerne également l'utilisation d'un composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I pour la préparation de composés ou compositions utilisables pour la préservation ou la cryopréservation de matériaux 25 biologiques tels que des fibroblastes. Un autre objet de l'invention se rapporte à une composition comprenant au moins un composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I tel que défini précédemment. Bien entendu, la composition selon l'invention pourra comprendre un composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I seul ou en mélange et en toutes proportions. 30 -6- La composition selon l'invention pourra être destinée à un usage cosmétique ou pharmaceutique notamment dermatologique. La composition pourra être ingérée, injectée ou appliquée sur la peau, les lèvres, le cuir chevelu et/ou les cheveux. Selon le mode d'administration, la composition selon l'invention pourra se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées. La composition pourra comprendre un milieu et/ou un support physiologiquement ou pharmaceutiquement acceptable. Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration par voir orale, sublinguale, inhalée, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale ou rectale, les principes actifs pourront être administrés sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiquement acceptables classiques. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration topique, les implants, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intranasale ou intraoculaire et les formes d'administration rectale. Outre les excipients inertes, non toxiques et pharmaceutiquement acceptables, tels que l'eau distillée, le glucose, le lactose d'amidon, le talc, les huiles végétales, l'éthylène glycol..., les compositions ainsi obtenues pourront également contenir des agents de préservation. D'autres principes actifs pourront être ajoutés dans ces compositions. La quantité de composé selon l'invention et d'autres éventuels principes actifs dans de telles compositions pourra varier selon les applications, l'âge et le poids du malade ou de l'utilisateur le cas échéant. -7 Pour une application topique sur la peau, les lèvres, le cuir chevelu et/ou les cheveux, la composition selon l'invention pourra comprendre un milieu et/ou un support physiologiquement acceptable. De plus, la composition pourra se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées pour une application topique, notamment sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile ou multiple, d'un gel aqueux ou huileux, d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide, d'une dispersion d'huile dans une phase aqueuse à l'aide de sphérules pouvant être des micro/nanocapsules ou micro/nanoparticules, des dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique. Cette composition pourra être plus ou moins fluide et avoir l'aspect d'une crème blanche ou colorée, d'une pommade, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d'une pâte, d'une mousse. Elle pourra également se présenter sous forme solide et, par exemple, sous forme de stick. Elle pourra être utilisée comme produit de soin, comme produit de nettoyage, comme produit de maquillage. La composition selon l'invention pourra aussi être une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant. La composition pourra également contenir des adjuvants habituels dans les 25 domaines cosmétiques ou dermatologiques. Les quantités des différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés. Ces adjuvants, selon leur nature, pourront être introduits dans une phase aqueuse, une phase huileuse, dans des vésicules et/ou dans des 30 micro/nanoparticules. Il est entendu que ces adjuvants ainsi que leur concentration devront être tels qu'ils ne modifient pas la propriété recherchée pour la composition selon l'invention. -8- L'invention a également pour objet un procédé de traitement cosmétique pour protéger la peau, les lèvres et/ou les cheveux, le cuir chevelu contre le stress oxydant et/ou les UV consistant à appliquer sur la peau, les lèvres et/ou les cheveux, le cuir chevelu, une composition comportant au moins un milieu physiologiquement acceptable et au moins un composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I tel que défini précédemment ou un de ses dérivés à l'état de base, de sel d'addition à un acide minéral ou organique, d'hydrate ou de solvat physiologiquement ou pharmaceutiquement acceptables. Des modes d'exécution de l'invention seront décrits ci-après, à titre d'exemples non limitatifs, avec référence aux dessins annexés dans lesquels : La figure 1 est une équation de réaction pour obtenir le composé 2 ; La figure 2 est une équation de réaction pour obtenir le composé 3 ; La figure 3 est une équation de réaction pour obtenir le composé 4 ; La figure 4 est une équation de réaction pour obtenir le composé 5 ; La figure 5 est une équation de réaction pour obtenir le composé 6 ; La figure 6 est une équation de réaction pour obtenir le composé 7 ; La figure 7 est une équation de réaction pour obtenir le composé 8 ; La figure 8 est une équation de réaction pour obtenir le composé 9 ; La figure 9 est une équation de réaction pour obtenir le composé 10 ; La figure 10 est une équation de réaction pour obtenir le composé 13 j La figure 11 est une équation de réaction pour obtenir le composé 14 ; La figure 12 est une équation de réaction pour obtenir le composé 15 ; La figure 13 est une représentation des effets du composé 15 sur des fibroblastes adultes de la peau traités UV ; La figure 14 est une représentation des effets du composé 10 sur des 30 fibroblastes adultes de la peau traités UV ; La figure 15 est une représentation des effets du composé 15 sur des fibroblastes adultes de la peau à -3 C La figure 16 est une représentation des effets du composé 10 sur des fibroblastes adultes de la peau à -3 C Les abréviations rencontrées sont définies ainsi : éq. : équivalent g : gramme Hz : Hertz mg : milligramme MHz : mégaHertz min.: minute mL: millilitre mmol: millimole !mol: micromole nmol : nanomole app : apparent Les caractéristiques des appareils utilisés pour effectuer les analyses de tous 10 les composés décrits dans la présente demande sont indiquées ci-dessous : Les spectres RMN 1H, 13C, 19F ont été enregistrés sur des spectromètres BRUKER DPX 300 et DPX 600. En RMN 1H et 13C, le tétraméthylsilane est utilisé comme référence interne. En RMN 19F, la 15 référence externe est le fluorotrichlorométhane CFCI3. Les déplacements chimiques sont exprimés en partie par million (ppm), les constantes de couplage J en Hertz (Hz). Les abréviations suivantes ont été utilisées : s pour singulet, bs pour un large singulet, d pour doublet, t pour triplet, q pour 20 quadruplet, m pour multiplet ou massif, dd pour doublet de doublet... Les spectres de masse ont été obtenus sur un spectrophotomètre de type Micromass TOF-SPEC, E 20 kV, a-cyano. pour l'ionisation Maldi et JEOL AX500, 3 kV, Canon FAB JEOL, Xe, 4 kV, courant limite 10 A, Gly-NBA 25 50 : 50 pour l'ionisation FAB. Les séparations par chromatographie sur colonne sont réalisées sous pression légère en suivant les techniques de chromatographie sur silice Kieselgel 60 (230-400 Mesh, Merck). 30 Le suivi est assuré par chromatographie sur couches minces (CCM) avec des plaques Kieselgel 60E-254-0.25mm. On appelle rapport frontal (Rf) le rapport de la distance de migration d'un composé sur un support donné sur la distance de migration d'un éluant. -10-Synthèse du composé 2 (Figure 1) Dans un ballon sous atmosphère inerte contenant le méthyl-D-galactopyranoside 1 (5 g; 26 mmol ;1 éq.) et de l'iodure de tétrabutylammonium nBu4Nl (500 mg ; 1,3 mmol ; 0,05 éq.) dans le diméthylformaldéhyde DMF (250 mL) est introduit de l'hydrure de sodium 10 NaH (3,7 g ; 0,15 mol ; 6 éq.) par petites portions. Puis du bromure de benzyle BnBr (18 mL ; 0,15 mol ; 6 éq.) est additionné et le mélange est laissé sous agitation pendant au moins 24 heures. Le milieu est hydrolysé avec de l'eau. Puis la phase aqueuse est extraite 15 trois fois avec de l'éther. Les phases organiques sont ensuite rassemblées, lavées plusieurs fois à l'eau, séchées sur du sulfate de magnésium, filtrées puis évaporées. Le produit ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur une colonne de 20 silice avec comme éluant un mélange cyclohexane / acétate d'éthyle dans des proportions de neuf pour un. Après concentration des fractions recueillies, le produit 2 se présente sous la forme de cristaux blancs avec un rendement pondéral de 95%. 25 C35H3806 M= 554,67 g.mol"1 Rf : 0.38 (cyclohexane/acétate d'éthyle 8/2).5 -11-Synthèse du composé 3 (Fiqure 2) Dans un ballon contenant le 1-O-Méthyl-2,3,4,6-Tetra-O-Benzyl-D-galactopyranose 2 (5,5g ; 9,92 mmol) dans 80 mL d'acide acétique, est additionné 11 mL d'acide sulfurique H2SO4 à une concentration molaire de 3M. Le milieu réactionnel est chauffé à 100 C pendant une heure. La solution est ensuite diluée dans 100 mL d'eau froide. Le mélange est extrait quatre fois avec 100 mL de toluène. Les phases organiques sont rassemblées, puis lavées avec 100 mL d'eau, 100 mL d'une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium NaHCO3 et enfin avec 100 mL d'eau. La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée. Le produit ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur une colonne de silice avec comme éluant un mélange cyclohexane / acétate d'éthyle dans des proportions de 8,5 pour 1,5. Après concentration des fractions recueillies, le produit 3 se présente sous la forme de cristaux blancs avec un rendement pondéral de 75%. C34H36O6 M= 540,65 g.mol"' Rf : 0,65 (cyclohexane/acétate d'éthyle 6/4).25 -12-Synthèse du composé 4 (Figure 3) Dans un ballon sous atmosphère inerte, contenant le 2,3,4,6-Tétra-O-Benzyl- D-Galactopyranose 3 (4 g ; 7,4 mmol) sont introduits le diméthylsulphoxyde DMSO (25,6 mL) et l'anhydride acétique Ac2O (16,8 mL). Le mélange est laissé sous agitation pendant 12 heures. Puis, de l'eau est ajoutée et la phase aqueuse est extraite trois fois avec de l'éther. Les phases organiques sont rassemblées, puis lavées avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium NaHCO3 puis de l'eau. La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée. Le produit est ensuite purifié par chromatographie sur une colonne de silice avec comme éluant un mélange cyclohexane / acétate d'éthyle dans des proportions de huit pour deux. Après concentration des fractions recueillies, la lactone 4 se présente sous la forme d'une huile incolore avec un rendement pondéral de 82%. C34H3406 M= 538,63 g.mol-1 Rf : 0,61 (cyclohexane/acétate d'éthyle 8/2). RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 3,6 (m, 2H, H6) ; 3,8 (dd, 2,1-9,6, 1H, H3) ; 4,1 (s, 1H, H4) ; 4,2 (m, 1H, H5) ; 4,4-5,1 (m, 9H, H2 ; 4OCH2Bn) ; 7,2 (m, 20H, H ar.) RMN 13C (CDCI3, 75,5 MHz) 67,4 (C6) ; 72,4 (C5) ; 72,6 (OCH2Bn) ; 73,5 (OCH2Bn) ; 74,5 (C4) ; 75,1 (OCH2Bn) ; 77,1 (C2) ; 79,9 (C3) ; 127,4 -128,3 (Car.) ; 137,2 ; 137,3 ; 137,6 (Car. quat.) ; 169,8 (CO). aD=+79,0 (c=1; CHCI3) -13-Synthèse du composé 5 (Figure 4) Dans un ballon sous atmosphère inerte contenant du zinc Zn (1,7 g ; 26 mmol ; 7 éq.) préalablement activé et décapé dans du tétrahydrofurane THF (30 mL) au reflux, un mélange constitué de la lactone 4 (2 g ; 3,7 mmol ; 1 éq.) et de bromodifluoroacétate d'éthyle 6 (1,42 mL ; 11 mmol ; 3 éq.) dans le THF (30 mL) est additionné goutte à goutte. La réaction est laissée au reflux pendant 3 heures. Après retour à la température ambiante, le zinc est filtré, puis une solution d'acide chlorhydrique HCI 1 N (60 mL) puis du dichlorométhane (6 mL) sont ajoutés au milieu réactionnel. Les phases aqueuses et organiques sont séparées et la phase aqueuse est extraite à nouveau deux fois au dichlorométhane. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées puis concentrées. Le produit est ensuite purifié par chromatographie sur une colonne de silice avec comme éluant un mélange cyclohexane / acétate d'éthyle dans des proportions de huit pour deux. Après concentration des fractions recueillies, le produit 5 se présente sous la forme de cristaux blancs avec un rendement pondéral de 82%. C38H40F208 M= 662,72 g.mol-1 Rf : 0,35 (cyclohexane/acétate d'éthyle 8/2). RMN 19F (CDCI3 ; 282,5 MHz) -118,4 (d, JF_F=256Hz) ; -120, 2 (d, JF_F=256Hz). - 14 - RMN 1H (CDCI3, 300MHz) 1,1 (t; 7,2; 3H; CH3); 3,4-3,5 (m; 2H; H6) ; 3,7-3,8 (dd; 2,5-9,5; 1H; H3); 3,8 (d; 2; 1H; H4) ; 4-4,1 (m; 3H; H5 ; C!) ; 4,25-4,85 (m; 9H; H2 ; 4OCH2Bn) ; 7,2 (m; 20H; !jar). RMN 13C (CDCI3, 75,5 MHz) 14,2 (CH3) ; 63,6 (CH2) ; 68,6 (C6) ; 71,7 (C5) ; 73,2 (OCH2Bn) ; 73,9 (OCH2Bn) ; 74,1 (C4) ; 74,9 (OCH2Bn) ; 75,1 (C2) ;75,8 (OCH2Bn) ; 81,2 (C3) ; 96,9 (t, 27Hz, Cl) ; 113 (t , 264Hz, CF2) ; 128,0 -128,9 (Car.) ; 138,2 ;138,3 ; 138,6 ; 139,1 (par. quat.) ; 163,3 (t, 31Hz, CO2Et). ap=+52,6 (c=1; CHCI3) Synthèse du composé 6 (Figure 5) Dans un ballon contenant l'ester 5 (0,5 g ; 1,75 mmol, 1 éq.) dans le THF (5 mL) est ajoutée une solution aqueuse de lithine LiOH (84 mg ; 3.5 mmol, 2 éq.) solubilisée dans une quantité minimum d'eau. Le mélange est laissé 12 heures sous agitation puis repris dans l'acétate d'éthyle. Le mélange est acidifié avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 N puis extrait plusieurs fois avec de l'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées puis concentrées Le composé 6 est obtenu sous la forme d'une huile blanche avec un rendement quantitative. C36H36 F2O8 M= 634,66g.mo1-1 RMN 19F (CDCI3, 282, 5 MHz)25 -15- -117,3 (d, JF_F=259Hz) ; -119,0 (d, JF_F=259Hz). RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 3,2 (dd; 4,5Hz et 9,8Hz ;1H; H6) ; 3,5 (dd; 7,7Hz et 9,8Hz;1 H; H6) ; 3,7 (d; 2Hz; 1 H; H4) ; 3,8 (dd; 2,6Hz et 9,5Hz; 1H; H3); 4 (dd; 4,5Hz et 7,7Hz ;1H, H5) ; 4,3-4,9 (m; 9H; H2 ; 4OCH2Bn) ; 7,2 (m; 20H; Mar). RMN 13C (CDCI3, 75,5 MHz) 69,4 (C6) ; 71,7 (C5) ; 73,5 (OCH2Bn) ; 74,0 (OCH2Bn) ; 74,1 (C4) ; 75,0 (OCH2Bn) ; 75,1 (C2) ; 75,9 (OCH2Bn) ; 80,8 (C3) ; 95,4 (t, 27Hz, Cl) ; 112,5 (t, 260Hz, CF2) ; 127,8 -129,0 (par.) ; 137,6 ; 138,0 ; 138,1 (Car. quat.) ; 163,1 (t; 30Hz; CO2H). Synthèse du composé 7 (Figure 6) Dans un ballon sous atmosphère inerte contenant le composé 5 (50 mg ; 0,075 mmol ; 1 éq.) en solution et de l'acétate de Boc-lysine-OMe 8 (48 mg ; 0,15 mmol ; 2 éq.) dans le dichloroéthane (3 mL) est ajoutée de la triéthylamine Et3N (53 pl ; 0,375 mmol ; 5 éq.). Le mélange est chauffé au 20 reflux pendant 48 heures puis hydrolysé avec de l'eau et extrait trois fois avec du dichlorométhane. Les phases organiques sont collectées, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées puis concentrées. Le solvant est évaporé puis le mélange est purifié par chromatographie sur une colonne de silice avec comme éluant un mélange cyclohexane / acétate 25 d'éthyle dans des proportions de sept pour trois. Après concentration des fractions recueillies, le produit 7 se présente sous la forme d'un solide blanc avec un rendement pondéral de 84%.15 - 16 - C48H58F2N2011 M= 876,98 g.mol-1 Rf : 0,58 (cyclohexane/acétate d'éthyle 7/3). RMN 19F (CDCI3; 282,5 MHz) -117,1 (d, JF_F=260Hz) ; -121,8 (d, JF_F=260Hz). RMN 1H (CDCI3; 300 MHz) 1,1(m, 2H, CH2) ;1,2-1,5 (m, 2H, CH2);1,3 (s, 9H, (CH3)3C);1,6 (m, 2H, CH2); 3,0-3,1 (m, 2H, CH2NH) ; 3,4-3,5 (m, 2H, H6); 3,6 (s, 3H, OCH3); 3,8 (m, 2H, H3 ; H4); 4,1 (m, 2H, CHNH (Lys) ; H5); 4,2-4,9 (m, 8H, 4OCH2Bn ); 4,3 (d, 3,3, 1H, H2); 5 (s, 2H, 2NH) ; 6,7 (s, 1H, 1NH) ; 7,2 (m, 20H, H ar.). RMN 13C (CDCI3; 75,5 MHz) 22,9 (CH2) ; 27,3 (CH2) ; 28,7 ((CH3)3C) ; 32,4 (CH2) ; 39,4 (CH2N) ; 52,7 (OCH3) ; 53,6 (NCH Lys) ; 68,7 (06) ; 71,1 (C5) ; 73,4 and 73,7 (2OCH2Bn) ; 74,5 (C4) ; 75,0 (OCH2Bn ; C2) ; 75,8 (OCH2Bn) ; 80, 3 ((CH3)3C) ; 80,9 (C3) ; 97,1 (t, 28Hz, Cl) ;112,8 (t ; 260Hz) ; 128,0 -128,9 (par.) ; 138,2 ; 138,3 ; 138,7 ; 139,0 (par. quat.) ; 155,9 (CO(Boc)) ; 164,1 (t, 28Hz, CF2CONH) ; 173,6 (pO2Et). Synthèse du composé 8 (Figure 7) Dans un ballon sous atmosphère inerte contenant le produit de départ 7 (750 mg ; 0,855 mmol; 1 éq.) dans le dichlorométhane (20 mL) est introduit 25 de l'acide trifluoroacétique TFA (1,3 mL ; 0,017mol ; 20 éq.). Le mélange est laissé à réagir pendant 12 heures puis le milieu réactionnel est concentré. Quatre à cinq co-évaporations au toluène sont effectuées pour obtenir le produit 8 avec un rendement quantitatif. 2900656 -17- C45H51 F5N2011 M= 890,85g.mo1-1 RMN 19F (CDCI3, 282,5 MHz) -76 (s, 3F) ; -117,2 (d, IF, JF_F=260Hz) ; -120,2 (d, IF, JF_F=260Hz). 5 RMN 1H (CDCI3,300MHz) 1,2 (m; 2H; CH2); 1,3 (m; 2H; CH2); 1,6 (m; 2H; CH2); 3,0 and 3,1 (2m; 2H; CH2NH); 3,4-3,5 (m; 2H; H6); 3,5 (t; 6Hz; 1H; CHNH (Lys)) ; 3,6 (s; 3H; CH3) ; 3,8 (m; 2H; H3 ; H4) ; 4,1 (t; 6,5Hz; 1H; H5) ; 4,2 (d; 9,4; 1H; H2); 4,3-4,9 (m; 8H; 4OCH2Bn) ; 7 (t; 1H; NH); 7,2 (m; 20H; Mar.). 10 RMN 13C (CDCI3,75,5MHz) 21,6 (CH2) ; 28,2 (CH2) ; 29,6 (CH2) ; 38,7 (CH2N) ; 53,0 (OCH3) ; 53,7 (NCH Lys) ; 68,2 (C6) ; 71,3 (C5) ; 73,4 et 73,8 (2OCH2Bn) ; 74,2 (C4) ; 74,9 (C2) ; 75,0 (OCH2Bn) ; 75,8 (OCH2Bn) ; 81 (C3) ; 97,0 (t, 28Hz, Cl) ; 127,9 -129,4 (Car.) ; 138,0 ; 138,2 ; 138,6 ; 138,ç (Car. quat.) ; 170,1 15 (CO2Me). Synthèse du composé 9 (Fiqure 8) 20 Dans un ballon contenant le composé 8 (0,782 g ; 0,892 mmol ; 1 éq.) en solution dans le THF (5 mL), une solution de lithine LiOH (64 mg ; 2.7 mmol ; 3 éq.) dans l'eau (1 mL) est ajoutée. Le mélange est laissé pendant 24 heures en réaction et repris dans du dichlorométhane. Le mélange est acidifié avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 N (5 mL) puis extrait plusieurs fois avec du dichlorométhane. Les phases organiques sont rassemblées, lavées à l'eau (5 mL), séchées sur sulfate de magnésium, filtrées puis concentrées -18- Le produit 9 se présente sous la forme d'un solide blanc avec un rendement pondéral quantitatif. C42H49CIF2N2O9 M= 799,3 g.mol-1 5 RMN 19F (CDCI3; 282,5 MHz) -117,1 (d, JF_F=259Hz) ; -120,5 (d, JF_F=259Hz). RMN 1H (CDCI3,300MHz) 1,2 (m, 4H, 2CH2); 1,7 (m, 2H, CH2); 3,0-3,1 (m, 2H, CH2NH); 3,4 (m, 2H, H6); 3,8 (m, 2H, H3 ; H4, CHNH (Lys)) ; 4,0 (m, 1H, H5); 4,2 (d, 9,3Hz, 1H, 10 H2) ; 4,3-4,9 (m, 8H, 4OCH2Bn); 7,2 (m, 20H, Har.). Synthèse du composé 10 (Figure 9) 15 Un ballon contenant le produit de départ 9 (150 mg ; 0,188 mmol) dans un mélange d'acide acétique CH3CO2H (2,5 mL), de tétrahydrofurane THF (0,8 mL) et d'eau (0,8 mL) en présence d'une pointe de spatule de palladium sur charbon Pd/C est placé sous atmosphère d'hydrogène. Le mélange est 20 laissé sous agitation pendant une nuit puis filtré sur un filtre Millipore . Le mélange est ensuite concentré pour obtenir le produit 10 sous la forme d'un solide blanc avec un rendement de 82%. RMN 19F (CDCI3, 282,5 MHz) 25 -117,1 (d, JF_F=259Hz) ; -120,5 (d, JF_F=259Hz). RMN 1H (CDCI3, 300MHz) -19- 1,2 (m, 2H, CH2); 1,4 (m, 2H, CH2) ;1,7 (m, 2H, C I-12); 3,0-3,1 (m, 2H, CH2NH); ); 3,4-3,6 (m, incluant 2H6); 3,7 (dd, 2,6-9,6Hz) ; 3,9 (m, incluant CHLys); 4,0 (tapp, 8,2Hz); 4,3 (d; 8,2Hz H2) .(de 3,5 à 4,3 ; 7H) RMN 13C (D20; 75,5 MHz) 16,2 (CH3) ; 21,5 (CH2) ; 28,0 (CH2) ; 30,7 (CH2) ; 39,3 (CH2N) ; 49,1 (CH Ala) ; 53,2 (NCH Lys) ; 61,1 et 62,6 (C6) ; 67,0 ; 68,9; 70,6; 70,9; 72,5; 73,9; 75,5 ; 80,2 (C5 C4 C3 C2) ; 169,9 et 176,3 (CO). Synthèse du composé 13 (Figure 10) Dans un ballon sous atmosphère inerte contenant la Boc-Lysine(Z)-OH 12 (2 g ; 5,26 mmol ; 1 éq.) dans le dichlorométhane (40 mL), le 15 carbonyldiimadozale CDI (878 mg ; 5,42 mmol ; 1,03 éq.) est additionné. La réaction est laissée sous agitation pendant une heure. Puis à ce mélange est ajouté une solution préparée sous atmosphère inerte et constituée de CI-+H3N-AlanineOBn 11 (1,13g; 5,26 mmol ; 1 éq.), et de diisopropyléthylamine DIEA (1,92 mL ; 11,04 mmol ; 2, éq.) dans dichlorométhane (40 mL). La 20 réaction est poursuivie pendant 24 heures puis hydrolysée avec de l'eau et extraite trois fois au dichlorométhane. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées puis concentrées. Le mélange est ensuite purifié par chromatographie sur une colonne de silice avec comme éluant un mélange cyclohexane / acétate d'éthyle dans des 25 proportions de sept pour trois. Après concentration des fractions recueillies,10 - 20 - leproduit 13 se présente sous la forme d'un solide jaune pâle avec un rendement pondéral de 66%. C32H37N3O7 M=544,5 g.mol-1 5 RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 1,3 (m; 16H; CH3; (CH3)3C; 2CH2) ;1,6-1,7 (m; 2H; CI-I2) ; 3,0 (m; 2H; NHCH2) ; 4,1 (m; 1H; CHLys) ; 4,5 (m; 1 H; CHAIa) ; 4,6 (m; 1H; NH) ; 5,0 (s; 2H; PhCH2) ; 5,1 (m; 1H; ZNH); 5,5 (d; 7Hz; 1H; NH) ; 6,8 (d; 6,5Hz;1 H; NH) ; 7,3 (m; 5H; Har.). 10 RMN 13C (CDCI3, 75,5 MHz) 18,4 (CH3) ; 22,6 (CH2) ; 28,8 ((CH3)3C) ; 29,8 (CH2) ; 32,6 (CH2) ; 40,1 (NCH2) ; 48,6 (CHAIa) ; 54,9 (CHLys) ; 67,4 et 67,5 (2CH2Bn) ; 80,2 ((CH3)3C) ; 128,5 -129 (par.) ; 135,6 et 136,6 (Car. quat.) ; 156,6 (CO(Boc) et CO(Z)) ; 171,8 et 172,9 (CONH et CO2Et). 15 Synthèse du composé 14 (Figure 11) 20 Déprotection du peptide Dans un ballon sous atmosphère inerte contenant le peptide 13 (1, 8 g ; 3,36 mmol; 1 éq.) dans le dichlorométhane (40 mL) est introduit de l'acide trifluoroacétique TFA (5 mL ; 67,2 mmol ; 20 éq.). Le mélange est laissé à réagir pendant 12 heures puis le milieu réactionnel est concentré. Quatre à 25 cinq co-évaporations au toluène sont effectuées pour obtenir le produit déprotégé avec un rendement quantitatif. Couplage Dans un ballon sous atmosphère inerte contenant l'acide 6 (1,38 g ; 2,18 mmol ; 1,05 éq.), le peptide précédemment déprotégé (1,15 g ; 2900656 - 21 - 2,08 mmol ; 1 éq.), le 1-hydroxybenzotriazole HOBT (0,336 g ; 2,5 mmol ; 1,2 éq.) et la N-méthylmorpholine NMM (0,57 mL ; 5,2 mmol ; 2,5 éq.) dans le DMF (35 mL), l'EDCI (0,478 g ; 2,49 mmol ; 1,2 éq.) est ajouté. La réaction est laissée sous agitation pendant 24 heures, puis le solvant est évaporé et le milieu est repris dans le dichlorométhane. Le milieu est ensuite extrait deux fois avec HCI 1M (2*100 mL). La phase organique est collectée, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée. Le mélange est ensuite purifié par chromatographie sur une colonne de silice avec comme éluant un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle. Après concentration des fractions recueillies, le produit 14 se présente sous la forme d'un solide blanc avec un rendement pondéral de 83%. C60H65F2N3O12 M=1058,17 g.mol-1 Rf : 0,48 (Cyclohexane/acétate d'éthyle 5/5). RMN 19F (CDCI3, 282,5 MHz) -116,9 (d, JF_F=259Hz) ; -121,7 (d, JF_F=259Hz). RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 1,2-1,4 (m; 7H; ICI-I3. 2CH2); 1,5 (m; 1H; CH2) ; 1,6 (m; 1H; C 2); 3,0 et 3,2 (2m; 2H; NHCH2); 3,4 (m; 2H; H6); 3,8-3,9 (m; 2H; H3; H4); 4,0 (m; 2H; CHNH (Lys); H5); 4,2-4,9 (m; 9H; 4OCH2Bn ; CH (Ala)); 4,2 (d; 9Hz; 1H; H2); 5,0 (s; 2H; PhCH2) ; 5,1 (m; 1H; ZNH); 5,4 (d; 7,8 ; 1H; NH); 6,5 (d; 7,2 ; 1H; NH) ; 6,7 (s; 1H; NH); 7,2 (m; 30H; Har.). RMN 13C (CDCI3, 75,5 MHz) 18,3 (CH3) ; 22,4 (CH2) ; 28,7 (CH2) ; 32,5 (CH2) ; 39,3 (CH2N) ; 48,6 (CH Ala) ; 54,9 (NCH Lys) ; 67,4 et 67,6 (2CH2Bn); 68,7 (C6) ; 71,2 (C5) ; 73,5 et 73,8 (2OCH2Bn) ; 74,4 (C4) ; 75,0 (OCH2Bn ; C2) ; 75,8 (OCH2Bn) ; 80,9 (C3) ; 97,2 (t, 27Hz, Cl) ; 113 (t, CF2); 127,9 -129 (par.) ; 135,7; 136,7; 138,2 ;138,3 ;138,7 ; 139,0 (par. quat.) ; 156,0 (pO(Z)) ;163,7 (t, 28Hz, CF2CONH) ; 172,0 (CONH) ; 173,0 (CO2Ph).30 - 22 - Synthèse du composé 15 (Figure 12) Un ballon contenant le produit de départ 14 (150 mg ; 0,133 mmol) dans un mélange de tétrahydrofurane THF (3 mL) et d'HCI 1 N (2 mL) en présence d'une pointe de spatule de palladium sur charbon Pd/C est placé sous atmosphère d'hydrogène. Le mélange est laissé sous agitation pendant une nuit puis filtré sur un filtre Millipore . Le mélange est ensuite concentré pour obtenir le produit 15 sous la forme d'un solide jaune orangé avec un rendement de 92%. C17H30CIF2N3O10 M=509,88 g.mol"1 RMN 19F (D2O, 282,5 MHz) -119,4 (d, JF_F=256Hz) ; -120,6 (d, JF_F=256Hz) ; -121,0 (d, JF_F=257Hz) ; - 122,0 (d, JF_F=257Hz). RMN 1H (D2O, 300 MHz) 1,4 (d; 7,3Hz; 1CH3) ; 1,4 (m; 2H; CH2); 1,5 (m; 1H; CH2) ; 1,8 (m; 1H; CH2); 3,2 (m; 2H; NHCH2); 3,5-3,6 (m; incluant 2H6); 3,7 (dd; 2,6-9,6Hz) ; 3,9 (m; incluant CHLys); 4,0 (tapp; 8Hz); 4,3 (m; CH (Ala); H2) .(De 3,5 à 4,3 : 8H) NMR 13C (D2O, 75,5 MHz) 16,2 (CH3) ; 21,5 (CH2) ; 28,0 (CH2) ; 30,7 (CH2) ; 39,3 (CH2N) ; 49,1 (CH Ala) ; 53,2 (NCH Lys) ; 61,1 et 62,6 (C6) ; 67,0 ; 68,9; 70,6; 70,9; 72,5; 73,9; 75,5 ; 80,2 (C5 C4 C3 C2) ; 169,9 et 176,3 (CO). 2900656 -23- Résultats de préservation de cellules Expérience 1 5 Introduction: Les expériences ont été réalisées afin de démontrer l'efficacité des composés 10 et 15 contre les expositions aux UV. 10 Résultats: (Figures 13 et 14) Dans les expériences suivantes, les études ont été réalisées à 37 C sur des fibroblastes primaires adultes de la peau. Les cellules ont été exposées à une irradiation sous UV-C pendant 2 heures en présence des dérivés 15 d'AAGP. Protocoles expérimentaux sur les Fibroblastes Températures utilisées 37 C Type de cellules fibroblastes adultes primaires de la _peau Conditions de culture Pour ces expériences, un milieu sans sérum avec 0.5mM EDTA a été utilisé. Les cellules ont été exposées sous UV-C (254nm) pendant 2 heures à température ambiante, puis placées à 37 C pendant la durée de l'expérience. Temps d'échantillonnage -A 0, 6, 18, 48, 72 jours après exposition UV pour AAGP-15 - A 0, 6, 18, 48 et 96 heures après exposition UV pour AAGP-10 Composés AAGP - AAGP-15 -AAGP-10 Concentration AAGP - 8.6mM Lors de ces expériences, nous constatons que le compose AAGP-15 présente d'excellentes propriétés protectrice. 20 - 24 - Résultats Expérimentaux Température Résultats Préliminaires Commentaires 37 C Après 72 heures, toutes les -Après 3 jours, le composé cellules du contrôle sont AAGP-15 montre un très haut mortes alors qu'avec AAGP- niveau de protection des 15 on observe encore 92% cellules face aux UV. de cellules vivantes (Figure Après 4 jours, on trouve 13). encore 60% de cellules Après 4 jours, les cellules du vivantes avec AAGP-15, alors contrôle ainsi que celles en que toutes sont presque présence d'AAGP-10 sont mortes dans le contrôle (ne presque toutes mortes. figure pas sur le graphe) (Figure 14). - AAGP-10 ne montre pas d'activité de préservation des cellules dans ces conditions. Expérience 2 Introduction: Dans l'expérience suivante, le but est de tester l'activité préservatrice des 10 composés AAGP 10 et 15 à basses températures. Résultats: (Figures 15 et 16) Les cellules sont ainsi incubées à -3 C en présence des 2 composés AAGP. Protocoles expérimentaux sur les Fibroblastes Températures utilisées - A -3 C Type de cellules - fibroblastes adultes primaires de la peau Conditions de culture - Pour ces expériences, un milieu sans sérum avec 0.5mM EDTA a été utilisé. Les cellules ont été incubées à -3 C. Temps d'échantillonnage - A 0, 1, 2, 4, et 6 jours Composés AAGP - AAGP-15 -AAGP-10 Concentration AAGP - 8.6mM 15 -25- De la même façon lors de cette expérience, on observe une très forte activité de préservation d'AAGP-15 sur les fibroblastes à basses températures. Résultats Expérimentaux Température Résultats •réliminaires Commentaires -3 C - Après 6 jours, les cellules du _ AAGP-15 montre dans contrôle sont toutes mortes alors ces résultats une très forte que celles traitées par AAGP-15 activité de préservation présentent environ 100% de des cellules. survie (Figure 15). _ AAGP-10 ne montre - Après 6 jours, les cellules du aucune activité de contrôle sont toutes mortes ainsi préservation des cellules que celles traitées par AAGP-10 (Figure 16). Revendications 1. Composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I : O\\ R2 RO NHR1 OR où n est un nombre entier égal 3 ou 4, R représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle linéaire ou ramifié, benzyle, acétyle, triméthylsilyle, tert-butyldiméthylsilyle, tert- butyldiphénylsilyle, RI représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié, benzyle, alkylcarbamate, allylcarbamate, benzylcarbamate, acétyle, R2 représente OR avec R tel que défini précédemment, NR'R" avec R' et R" identiques ou différents représentent un hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié, benzyle, acétyle, alkylcarbamate, allylcarbamate, benzylcarbamate ou un acide aminé, R3 représente un atome d'hydrogène ou une fonction alcool libre ou protégé, ainsi que ses dérivés à l'état de base, de sel d'addition à un acide minéral ou organique, d'hydrate ou de solvat physiologiquement ou pharmaceutiquement acceptables. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les groupes alkyles linéaires ou ramifiés sont des groupes possédant de 1 à 10 atomes de carbones.-27- 3. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit acide aminé est une alanine ou une glycine. 4. Médicament comprenant en tant que principe actif au moins un composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I selon la revendication 1. 5. Composition comprenant au moins un composé C-glycopeptide gemdifluoré de formule I selon la revendication 1. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé C-glycopeptide gemdifluoré de formule I seul ou en mélange et en toutes proportions. 7. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme galénique la rendant conforme à un usage cosmétique ou pharmaceutique notamment dermatologique. 8. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme galénique la rendant conforme à être ingérée, injectée ou appliquée sur la peau, les lèvres, le cuir chevelu et/ou les cheveux. 9. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend un milieu et/ou un support physiologiquement ou pharmaceutiquement acceptable. 10. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend d'autres principes actifs. 11. Composition adaptée à une application topique sur la peau, les lèvres, le cuir chevelu et/ou les cheveux comprenant un milieu et/ou un support physiologiquement acceptable,30-28- caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I selon la revendication 1. 12. Procédé de traitement cosmétique pour protéger la peau, les lèvres et/ou les cheveux, le cuir chevelu contre le stress oxydant et/ou les UV consistant à appliquer sur la peau, les lèvres et/ou les cheveux, le cuir chevelu, une composition comportant au moins un milieu et/ou un support physiologiquement acceptable et au moins un composé C- glycopeptide gemdifluoré de formule I selon la revendication 1 ou un de ses dérivés à l'état de base, de sel d'addition à un acide minéral ou organique, d'hydrate ou de solvat physiologiquement acceptable. 13. Utilisation d'un composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I selon la revendication 1 pour la préparation de composés ou compositions utilisables pour la préservation ou la cryopréservation de matériaux biologiques. 14. Utilisation d'un composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I selon la revendication 1 pour la préparation de composés ou compositions utilisables pour la préservation de fibroblastes. 15. Utilisation d'au moins un composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I selon la revendication 1 pour la préparation de médicaments destinés à traiter l'inflammation. 16. Utilisation d'au moins un composé C-glycopeptide gem-difluoré de formule I selon la revendication 1 pour la préparation de composés ou compositions utilisables en cosmétologie et/ou en pharmacie notamment en dermatologie.25