FR 2903999 A1 20080125 FR 0653028 A 20060719 1 L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs de la C-4 méthyl stérol oxydase, pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies. Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200 g/cm2 mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P. acnes en particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions acnéiques. Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des antiandrogènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant ces agents présentent des effets secondaires potentiellement sévères. Ainsi, toute grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le foetus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients masculins. Il existe donc un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des hormones stéroïdes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire, mais avec des effets secondaires réduits. Les inventeurs ont maintenant trouvé que le gène codant pour la C-4 méthyl stérol oxydase était exprimé dans les glandes sébacées humaines, et que son expression était régulée par les androgènes, in vivo, dans un modèle de glande sébacée de souris. Ils proposent dès lors de cibler ce gène ou son produit d'expression l'enzyme C-4 méthyl stérol oxydase, pour prévenir ou améliorer les phénomènes d'acné, ainsi que tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée, notamment l'aspect de peau grasse. 2903999 2 Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle. 5 SC4mol La C-4 méthyl stérol oxydase (ou "SC4mol") catalyse la première des trois étapes enzymatiques d'élimination des deux groupes méthyles C-4 de la 4,4-diméthylzymostérol conduisant à la formation de cholestérol chez l'animal. Des 10 changements dans l'activité de cette enzyme résultent dans des modifications du métabolisme lipidique, incluant l'accumulation des acides gras, des triglycérides, des méthyl stérols, et autres précurseurs de stérols (Li and Kaplan (1996) J. Biol. Chem. 271:16927-16933). Dans le contexte de l'invention, le terme gène SC4mol ou acide nucléique 15 SC4mol signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la C-4 méthyl stérol oxydase. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant une C-4 méthyl stérol oxydase hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour l'enzyme. 20 Une séquence d'ADNc humain de SC4mol est reproduite en annexe (SEQ ID No.1). Il s'agit de la séquence NM006745 dont la partie codante se situe de l'acide nucléique 131 à 1012. Applications diagnostiques 25 Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine C-4 méthyl stérol oxydase (SC4mol), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon 30 biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle. L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette protéine SC4mol par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité 35 de SC4mol peut être également envisagé. Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet contrôle est un sujet sain . 2903999 3 Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre cutané lié a une hyperséborrhée, le sujet contrôle fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence de l'expression ou d'activité de la protéine SC4mol, de 5 l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur de la SC4mol, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce 10 traitement. Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de 15 l'expression ou de l'activité de la protéine C-4 méthyl stérol oxydase (SC4mol), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle. Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine SC4mol par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre 20 méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de SC4mol peut être également envisagé. Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à une hyperséborrhée ou un acné. Le sujet contrôle , dans cette méthode, signifie 25 un sujet ou une population de référence saine . La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé 30 peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum. 2903999 4 Méthodes de criblage Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou de tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité 5 d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la C-4 méthyl stérol oxydase ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou 10 l'activité de la C-4 méthyl stérol oxydase, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des 15 désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels 20 avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine SC4mol, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; 25 d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine SC4mol, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. 30 Par modulation , on entend tout effet sur le niveau d'expression ou d'activité de l'enzyme, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle ou complète. Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus inhibent de préférence l'expression 35 ou l'activité de la protéine SC4mol, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. La différence d'expression obtenue avec le composé testé par 2903999 5 rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus. Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par 5 expression d'une protéine , on entend la quantité de cette protéine ; Par activité d'une protéine , on entend son activité biologique ; Par activité d'un promoteur , on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante). 10 Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés. 15 Différents techniques peuvent être mises en oeuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité de la C-4 méthyl stérol oxydase. Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules 20 transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène SC4mol, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT 25 (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codé par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres. 30 Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour la C-4 méthyl stérol oxydase, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. 2903999 6 La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène SC4mol de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, 5 clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau. Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour une C-4 méthyl stérol oxydase, de préférence humaine, ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par 10 exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection. 15 Dans ces méthodes, l'expression du gène de la C-4 méthyl stérol oxydase peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine 20 correspondante produite. L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la Rnase). Il peut être avantageux 25 d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques or autres ligands (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation 30 spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN 35 entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que 2903999 7 seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie. 5 Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti û C-4 méthyl stérol oxydase peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière. 10 L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide 15 nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSES pour E.coli). 20 Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de 25 polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques. Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des 30 protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du 35 métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano- 2903999 8 HPLC) basé sur leurs propriétés physico-chimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art 5 (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot). Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme C-4 méthyl 10 stérol oxydase, un substrat de l'enzyme et un système réductase (par exemple du NADH avec un système générateur de NADH ou du NADPH avec un système générateur de NADPH), et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'activité enzymatique. L'enzyme SC4MOL peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant les 15 cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21. La mesure de l'activité enzymatique comprend de préférence la mesure de la 20 capacité de couplage de la méthyl stérol oxydase à une décarboxylase. Des dosages de l'activité enzymatique de la SC4mol sont décrits dans la littérature (voir par exemple Miller et al, Biochemistry, 1967, 6 :2673-2678 ; Brady et al, The Journal of Biological Chemistry, 1980, 255(22) :10624-10629 ; Fukushima et al, The 25 Journal of Biological Chemistry, 1981, 256(10) :4822-4826 ; ). Le mélange réactionnel peut par exemple comprendre la mise en réaction de microsomes lavés qui apportent la SC4mol et la décarboxylase endogène, (1 à 2mg), avec 0,5mM NAD+ ou 0,1mM NADH avec un générateur de NADH ou 0,1mM 30 NADPH avec un générateur de NADPH. Les systèmes de génération peuvent être 10mM b-hydroxybutyrate et 0,31 unités/mi de b-hydroxybutyrate déshydrogénase pour le NADH, et 10mM d'isocitrate avec 0,44 unités/mi d'isocitrate déshydrogénase pour le NADPH. Le substrat stérol est par exemple en concentration de 50mM. Il peut être marqué au 14C , l'activité oxydase étant dosée en recueillant le 14CO2 libéré 35 suite au couplage de la réaction d'oxydation (C-4 méthyl stérol oxydase) avec l'activité décarboxylase également présente dans les microsomes. 2903999 9 Les réactions catalysées par l'enzyme, et qui peuvent être suivies, sont schématisées ci-après: 4a-formyl-5a-cholesta-8,24-dien-313-ol + NAD(P)H + 02 = 4a-carboxy-5a-cholesta- 5 8,24-dien-313-ol + NAD(P)(+) + H2O , 4a-hydroxymethyl-5a-cholesta-8,24-dien-313-ol + NAD(P)H + 02 = 4a-formyl-5acholesta-8,24-dien-313-ol + NAD(P)(+) + 2 H2O , 4a-methyl zymosterol + NAD(P)H + 02 = 4a-hydroxymethyl-5a-cholesta-8,24-dien-313-01 + NAD(P)(+) + H2O , 10 4a-formyl-4R-methyl-5a-cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)H + 02 = 4a-carboxy-4R-methyl-5a-cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)(+) + H2O , 4a-hydroxymethyl-4R-methyl-5a-cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)H + 02 = 4aformyl-4R-methyl-5a-cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)(+) + 2 H2O , 4,4-dimethyl-5a-cholesta-8,24-dien-3-13-ol + NAD(P)H + 02 = 4a-hydroxymethyl-4R- 15 methyl-5a-cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)(+) + H2O Modulateurs de l'enzyme L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'enzyme humaine C-4 méthyl stérol oxydase susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes 20 décrites ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant 25 l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de l'enzyme humaine C-4 méthyl stérol oxydase, à un patient nécessitant un tel traitement. L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de l'enzyme humaine C-4 méthyl stérol oxydase, pour le traitement esthétique des peaux grasses. 30 De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de l'enzyme. Le terme inhibiteur se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit substantiellement l'activité enzymatique de la C-4 méthyl stérol oxydase. Le terme substantiellement signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée 35 d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui 2903999 10 interagit avec, et bloque, le site catalytique de l'enzyme, comme des composés de type inhibiteur compétitif. Un inhibiteur préféré interagit avec l'enzyme en solution à des concentrations en inhibiteur de moins de 1 M, de préférence moins de 0,1 M, de préférence encore 5 moins de 0,01 M. Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti- C-4 méthyl stérol oxydase, de préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration plasmatique d'environ 0.01 g par ml à environ 100 g/ml, de 10 préférence d'environ 1 g par ml à environ 5 g/ml. Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci). 15 L'invention comprend l'utilisation de composés inhibiteurs de C-4 méthyl stérol oxydase, tels que ceux identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut, pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée. 20 Plus particulièrement, à titre non limitatif, on peut citer comme exemples d'inhibiteurs de la C-4 méthyl stérol oxydase, les composés suivants : - la 6-((2S)-2-Hydroxypentyl)(3S,9R)-2-aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl] methyl}-2,9-d imethyl-5-oxacyclotridecane-1,4-dione 25 - la (3S,9R)-2-Aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-2, 9-dimethyl-5-oxa-6-pentylcyclotridecane-1,4-dione. Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions 30 peuvent être administrées par exemple par voie entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de 35 vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie 2903999 11 parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme 5 d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut 10 se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion. La composition peut comprendre une teneur en modulateur de la C4-méthyl stérol 15 oxydase allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition. La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que : 20 - des agents mouillants; -des agents d'amélioration de la saveur; - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque; - des agents stabilisants; - des agents régulateurs d'humidité; 25 - des agents régulateurs de pH; -des agents modificateurs de pression osmotique; - des agents émulsionnants; - des filtres UV-A et UV-B - et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le 30 butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. 35 Légende des figures : 2903999 12 Les Figures 1A, 1B et 1C montrent l'expression de la SC4MOL dans la glande sébacée de la peau de souris et dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ. La Figure 1A est une photographie d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde sens de SC4MOL (contrôle négatif; animal 5 53, gonadectomisé). La Figure 1B est une photographie d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal intact (animal 44). La Figure 1C est une photographie d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 53). 10 Les Figures 2A, 2B et 2C montrent l'expression de SC4MOL dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ. La Figure 2A est une photographie d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde sens de SC4MOL (contrôle négatif; animal 45). La Figure 2B est une photographie d'une 15 coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal intact (animal 45). La Figure 2C est une photographie d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 52). 20 La Figure 3 est un graphe qui montre la mesure de l'expression du gène SC4MOL chez des souris mâles gonadectomisées. Des souris mâles ont été gonadectomisées et ensuite étaient traitées avec le véhicule, le DHT, le DHEA ou la combinaison de DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement long terme). A la fin de l'expérience les glandes préputiales ont été enlevées, l'ARN a été 25 isolé et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix. GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule DHT: souris gonadectomisées et traitées avec leDihydrotestosterone (agoniste du récepteur aux androgènes) DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone 30 (précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales il est métabolisé en androgène actif) DHEA-Flu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagoniste du récepteur aux Androgènes; qui bloque les effets des agonistes DHT et DHEA). 35 Niveau d'expression: niveau d'expression de l'ARNm 2903999 Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES Exemple 1 : Expression de l'enzyme SC4MOL dans la glande sébacée humaine 5 et dans l'épiderme humain. Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN totaux ont été préparés à partir des glandes sébacées et à partir de 10 l'épiderme. L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fournis par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en ADNc. A partir d'ADNc double brin, on synthétise un ARNc marqué à la biotine en utilisant la 15 polymérase T7 et un précurseur NTP conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système Lab on a chip d'Agilent pour confirmer la bonne efficacité des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un 20 fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un 25 gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement ( perfect match ) versus un oligonucléotide qui contient une mutation,( single mismatch ) dans la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1). Tableau 1 : mesure de l'expression de SC4MOL dans l'épiderme et dans la glande 30 sébacée humaine par utilisation de la technologie des puces Affymetrix. Identifiant Nom du Expression Expression Significativité Significativité Affymetrix gène dans la dans de de glande l'épiderme l'expression* l'expression* sébacée humain dans la dans humaine glande l'épiderme sébacée humain 13 2903999 14 humaine 209146 at La C-4 1023 348 1 1 méthyl stérol oxydase *Indicateur de la significativité de l'expression du gène analysé dans l'échantillon indiqué : présence (=1) ou absence (=0). Résultats: 5 L'enzyme SC4MOL est bien exprimée dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme). L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et l'épiderme humain montre que l'expression est significativement plus forte dans la glande sébacée par rapport à l'épiderme. 10 Exemple 2 : Expression de SC4MOL dans la glande sébacée de la peau de souris par hybridation in situ Méthodes : Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du gène SC4MOL par 15 incubation du gène linéarisé (2pg) avec 63pCi de [35S]UTP (1250 Ci/mmol ; NEN, Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé dans de la paraffine. Des sections (4pm de large) ont ensuite été déparaffinées dans du toluène et réhydratées dans un gradient d'alcool. Après séchage, les différentes 20 sections ont été incubées dans un tampon de préhybridation pendant deux heures. L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon de préhybridation avec 10mM DTT et 2X106 cpm ARN/pl 35Smarqué) à 53 C. L'excès de sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées dans une émulsion LM1 (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4 C pendant au moins un 25 mois. Les coupes ont alors été développées et contre colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. L'hybridation avec la sonde sens a été utilisée comme témoin négatif et on a uniquement détecté le bruit de fond. Ces sondes ont été incubées avec des coupes histologiques de la peau de souris ou de la glande préputiale de souris. Suite à l'incubation en présence d'une émulsion 30 photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se 2903999 15 manifeste par un marquage positif avec la sonde antisense (Figure 1B et Figure 1 C) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 1A) utilisé comme contrôle négatif. 5 RESULTATS: On observe sur la Figure 1A qu'il n'y a pas d'accumulation de grains argentés (pas de marquage) ce qui est en accord avec les attentes des inventeurs car elle correspond au contrôle négatif. La Figure 1B montre un très fort marquage de la couche basale de la glande sébacée, visible par accumulation de grains argentés. La 10 Figure 1C montre aussi un marquage de la couche basale de la glande sébacée. SC4MOL est bien exprimée dans les couches basales des glandes sébacées de la peau de souris. Une analyse fine basée sur l'observation de coupes histologiques obtenues pour 4 animaux intacts et 4 animaux gonadectomisés indique une 15 expression légèrement plus forte dans les glandes sébacées des animaux intacts. Exemple 3 : Expression de SC4MOL dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ Méthodes : Les méthodes utilisées dans cet exemple sont identiques à celles de l'exemple 2. Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et 25 sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. RESULTATS: La Figure 2A ne montre pas de marquage au niveau de la glande préputiale ce qui est en accord avec les attentes des inventeurs car elle correspond au contrôle 30 négatif. La Figure 2B montre un fort marquage dans les acini de la glande préputiale de souris dans un animal normal. La Figure 2C montre un marquage plus modéré des acini de la glande préputiale dans un animal gonadéctomisé. SC4MOL est exprimée dans les acini (Figure 2B) de la glande préputiale de souris. 35 Une analyse de plusieurs coupes histologiques provenant de 4 animaux contrôles et 20 2903999 16 4 animaux gonadectomisés indique une expression légèrement plus forte dans les glandes préputiales des animaux intacts (Figure 2B et 2C). En résumé, ces résultats d'hybridation in situ indiquent que l'expression de l'enzyme 5 SC4MOL diminue dans des conditions caractérisées par un manque de stimulation androgénique (animaux gonadectomisés). Exemple 4 : Expression de SC4MOL dans la qlande préputiale de souris suite à une stimulation androgénique Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une taille suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des technologies de microdissection. 15 Les inventeurs ont analysé l'expression de l'enzyme SC4MOL dans les glandes préputiales de souris dans des conditions de déficience en hormones stéroïdiennes (notamment d'hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés ont ensuite été traités avec des quantités physiologiques de 20 Dihydrotestosterone (DHT) ou de Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de DHEA-Flutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux androgènes, bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces conditions expérimentales permet 25 d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques. L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix décrit ci-dessus. 30 Résultat: La Figure 3 met en avant l'expression de SC4MOL en fonction du traitement administré. On observe que l'ARNm de l'enzyme SC4MOL est induit par un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale de souris. 10 35 Exemple 5 : Exemples de Compositions 2903999 A- VOIE ORALE Comprimé de 0,2 g - 6-((2S)-2-Hydroxypentyl)(3S, 9R)-2-aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-2,9- 5 dimethyl-5-oxacyclotridecane-1,4-dione 0,001 g 10 - Amidon 0,114 g -Phosphate bicalcique 0,020 g - Silice 0,020 g - Lactose 0,030 g - Talc 0,010 g - Stéarate de magnésium 0,005 g B- VOIE TOPIQUE 15 (a) Onguent -6-((2S)-2-Hydroxypentyl)(3S, 9R)-2-aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-2, 9-dimethyl-5-oxacyclotridecane-1,4-dione 0,300 g 20 - Vaseline blanche codex qsp 100 g (b) Lotion -(3S,9R)-2-Aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-2, 9-dimethyl-5-oxa-6-pentylcyclotridecane-1,4-dione 0,100 g 25 Polyéthylène glycol (PEG 400) 69,900 g - Ethanol à 95% 30,000 g 17 REVENDICATIONS 1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la C-4 méthyl stérol oxydase ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine C-4 méthyl stérol oxydase, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine C-4 méthyl stérol oxydase, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent l'expression ou l'activité de la protéine C-4 méthyl stérol oxydase, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour la C-4 méthyl stérol oxydase, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. 2903999 19 5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour la C-4 méthyl stérol oxydase, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer 5 l'expression dudit gène. 6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des sébocytes. 10 7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue codant pour la C-4 méthyl stérol oxydase. 8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du 15 gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène. 9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène. 20 10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les mélanges réactionnels comprennent chacun une enzyme C-4 méthyl stérol oxydase, un substrat de l'enzyme et un système réductase, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'activité enzymatique. 25 11. Méthode selon la revendication 10, dans laquelle la mesure de l'activité enzymatique comprend la mesure de la capacité de couplage de la méthyl stérol oxydase à une décarboxylase.