FR 2903311 A1 20080111 FR 0606253 A 20060710 1 La présente invention concerne le domaine des médicaments destinés à réduire, voire annuler certains effets secondaires de traitements utilisés en chimiothérapie anticancéreuse. Plus particulièrement, l'invention propose une nouvelle approche pour protéger les précurseurs hématopoïétiques, en bloquant leur cycle cellulaire, par l'administration d'un agoniste du récepteur H4 de l'histamine. Malgré de nombreux progrès dans la compréhension de la physiopathologie des maladies tumorales et l'utilisation de thérapeutiques plus ciblées, la chimiothérapie reste la base du traitement de la majorité des pathologies malignes. Or, la toxicité des drogues anticancéreuses demeure un facteur limitant de leur utilisation. Cet effet délétère se manifeste contre tous les tissus à prolifération rapide : moelle osseuse, tube digestif, peau et phanères, gonades. La toxicité hématologique est l'effet secondaire le plus fréquemment associé à la chimiothérapie. Elle est déterminante dans la posologie utilisable ou l'association éventuelle de plusieurs médicaments à mécanisme d'action différent. Cette toxicité, conséquence du renouvellement rapide des cellules hématopoïétiques, peut affecter soit l'ensemble des trois lignées hématopoïétiques (hématies, polynucléaires, plaquettes), soit une ou deux lignées seulement, selon le type d'agent chimiothérapeutique et la dose utilisée. Elle apparaît fréquemment au cours de la chimiothérapie des tumeurs solides et expose les sujets traités à des effets secondaires de type infectieux et/ou hémorragiques parfois gravissimes. La protection des progéniteurs hématopoïétiques contre les effets toxiques de la chimiothérapie a fait depuis longtemps l'objet d'une recherche active. Parmi les moyens qui sont d'ores et déjà mis en oeuvre pour atténuer l'aplasie médullaire consécutive à ce traitement, on peut citer l'autogreffe de cellules souches périphériques isolées du sang du patient, soit en sortie d'aplasie après chimiothérapie, soit après injection de facteurs de croissance (Filip et al., 2001). Dans ce cas, les cellules prélevées sont congelées et le produit décongelé est transfusé au patient qui a reçu les jours précédents une chimiothérapie myéloablative. Cette technique permet une réduction de la durée d'aplasie post-greffe significative, diminuant ainsi l'incidence des infections et le nombre de jours d'hospitalisation. Néanmoins, son application est loin d'être simple, sans compter que chez certains malades, on ne parvient pas à mobiliser les cellules souches, en particulier chez ceux qui ont déjà subi d'autres chimiothérapies. Une autre possibilité pour réduire l'hématotoxicité de la chimiothérapie consiste à administrer avant ou pendant le traitement anticancéreux, un ou plusieurs facteurs de croissance hématopoïétiques, comme le G-CSF (Gabrilove, 2001) pour combattre la neutropénie, l'érythropoïétine pour pallier l'anémie (Gabrilove, 2001) ou le SCF pour 2903311 2 protéger les précurseurs érythroïdes (Zeuner et al., 2003). Bien qu'efficaces, ces molécules sont coûteuses, délicates à manier et non dénuées d'effets secondaires. Parmi les approches visant à protéger spécifiquement les cellules souches hématopoïétiques sans empêcher l'effet anti-tumoral, on peut citer les travaux effectués avec 5 le tétrapeptide AcSDKP (Cashman et al., 1994; Masse et al., 1998). Il s'agit d'une molécule produite de manière endogène dans la moelle osseuse, au même titre que le TGF(3 qui est également un régulateur négatif de l'hématopoïèse. L'AcSDKP agit de manière préférentielle sur les cellules souches ou CFU-S par un mécanisme qui n'est pas clairement défini, mais qui pourrait impliquer sa capacité de stimuler l'angiogénèse (Liu et al., 2003). Plus récemment, il 10 a été proposé de protéger les cellules souches du patient avant chimiothérapie en y introduisant un ou plusieurs gènes de résistance tel que le MDR1, une approche qui a abouti à des résultats encourageants dans des modèles murins (Banerjee and Bertino, 2002). Par ailleurs, il faut mentionner les effets radio- et chimioprotecteurs de l'amofostine, qui diminue la toxicité des traitements anti-cancéreux en captant les radicaux libres produits dans ces 15 conditions (Santini, 2001). En dehors des traitements par les facteurs de croissance et l'autogreffe qui ne protègent pas les cellules hématopoïétiques au cours de la chimiothérapie mais diminuent la phase consécutive d'aplasie, aucun des procédés cités plus haut n'est employé couramment en clinique. L'amifostine a fait l'objet d'essais cliniques en phase I et a été approuvée comme 20 drogue radioprotectrice dans le traitement des cancers touchant le cou et la tête et comme complément au cours de chimiothérapies à base de cisplatine (Santini, 2001). Néanmoins, cette drogue ne cible pas spécifiquement les progéniteurs hématopoïétiques mais agit de manière plus large en captant les radicaux libres. Quant au AcSDK, son effet spécifique sur la mise en cycle a suscité beaucoup d'espoir, mais son efficacité n'est pas entièrement prouvée 25 chez l'homme, probablement au cause de son instabilité in vivo due à une dégradation rapide par le "angiotensin I-converting enzyme" (ACE) (Charrier et al., 2004). Quant aux procédés faisant appel aux cellules souches transfectées, il s'agit là des techniques lourdes qui nécessitent encore un développement technologique. D'autres procédés proposent l'utilisation de cellules souches transfectées, mais leur mise en oeuvre fait appel à des technologies 30 sophistiquées qui ne sont pas entièrement maîtrisées à l'heure actuelle. Une approche alternative pour réduire l'hématotoxicité de la chimiothérapie consisterait à protéger spécifiquement les cellules souches hématopoïétiques contre l'effet des drogues, tout en maintenant leur efficacité anti-tumorale. Ceci peut être obtenu en bloquant de façon réversible le cycle cellulaire des progéniteurs hématopoïétiques. Or à ce jour, il n'existe 35 aucun procédé efficace connu pour bloquer spécifiquement la prolifération des progéniteurs 2903311 3 hématopoïétiques, qui prolifèrent activement, et sont donc très sensibles aux effets toxiques d'une chimiothérapie. La présente invention utilise justement cette approche, puisqu'elle vise à diminuer les effets toxiques de ces traitements en empêchant les progéniteurs 5 hématopoïétiques d'entrer en cycle. Les inventeurs ont en effet mis en évidence des propriétés myéloprotectrices d'une nouvelle classe de molécules, les agonistes du récepteur histaminérgique H4 (H4R). Ce récepteur est exprimé préférentiellement dans la moelle osseuse, alors que les cellules humaines non-hématopoïétiques (Liu et al., 2001a) ou tumorales (JURKAT, UT7, résultats non montrés) en sont pratiquement dépourvus. Cette 10 caractéristique permet donc d'envisager une nouvelle stratégie thérapeutique visant à protéger de façon spécifique les progéniteurs hématopoïétiques des effets toxiques des chimiothérapies antimitotiques, tout en augmentant l'efficacité du traitement et en limitant la durée de l'aplasie post-thérapeutique. La présente invention porte donc, en premier lieu, sur l'utilisation d'un 15 agoniste du récepteur H4 de l'histamine, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à protéger les progéniteurs hématopoïétiques contre les effets toxiques de médicaments actifs sur les cellules en prolifération. Par "médicaments actifs sur les cellules en prolifération", on entend essentiellement les médicaments utilisés en chimiothérapie antitumorale. Les agents 20 antinéoplasiques utilisés en chimiothérapie se divisent en plusieurs classes suivant leur mécanisme d'action. On peut notamment citer : • les alkylants dont les principaux agents sont le Cyclophosphamide, le Melphalan, le Chloraminophène, le Nitroso-urées, le Busulfan. Ils possèdent un ou plusieurs radicaux électrophiles qui se lient aux régions riches en électrons des bases puriques et 25 pyrimidiques de l'ADN : création de cassures, de mutations ou de liaisons anormales entre les brins d'ADN. • les antimétabolites dont le méthotrexate (qui inhibe la synthèse de la thymidine), le 5-fluorouracile (précurseur du 5-FdUMP qui inhibe la thymidilate synthétase et précurseur du FUTP qui s'incorpore dans l'ARN et inhibe ses fonctions) et le cytosine 30 arabinoside (précurseur de l'ARA-CTP qui inhibe l'ADN polymérase). • les poisons du fuseau mitotique dont les principaux agents sont le docetaxel, la vincristine, la vinblastine, la vindésine, et la navelbine. Ils inhibent la polymérisation de la tubuline principale protéine du fuseau mitotique. • les inhibiteurs de la topo-isomérase 2 dont le Vépéside et le Téniposide. 35 La topoisomérase 2 assure la relaxation de l'hélice d'ADN au cours de sa synthèse, de sa traduction en ARN ou de sa réparation. 2903311 4 • les intercalants dont les principaux agents sont le Doxorubicine, d'autres anthracyclines, le Mitoxantrone et l'Actinomycine D. Ils s'intercalent dans la molécule d'ADN en perturbant sa structure, sa réplication et sa traduction en ARN. Ils inhibent la DNA polymérase et la topo-isomérase 2. 5 les agents divers. La Bléomycine provoque des cassures du DNA. La Mitomycine C est un alkylant et un intercalant. La Cisplatine est un alkylant bifonctionnel créant des liaisons entre les brins d'ADN. L'Asparaginase détruit un acide aminé, l'asparagine, qui est nécessaire au métabolisme des lymphoblastes. Comme montré dans la partie expérimentale ci-dessous, l'effet protecteur 10 vis-à-vis des progéniteurs hématopoïétiques est dû au fait que l'agoniste du récepteur histaminergique H4 bloque leur cycle cellulaire en phase GO/G1, empêchant ainsi leur prolifération. Son action protectrice s'exercera donc a priori quel que soit le type d'agent antinéoplasique utilisé pour la chimiothérapie. En particulier, cet effet a été démontré in vivo au cours d'un traitement par le cyclophosphamide et le 5-fluorouracil (5-FU) et in vitro par le 15 docetaxel. La présente invention est particulièrement utile pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée à des patients atteints de tumeurs solides, notamment lorsqu'ils sont soumis à un traitement par le cyclophosphamide, le 5-FU, et/ou le docetaxel. 20 Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'agoniste du récepteur H4 de l'histamine qui est utilisé est le clobenpropit. Toutefois, ce dernier a été conçu initialement comme un antagoniste du récepteur H3 de l'histamine, qui était à ce moment-là sa seule cible pharmacologique connue. Il est relativement peu affin vis-à-vis du H4R en tant qu'agoniste, et surtout, il n'est pas complètement spécifique de ce récepteur, ce 25 qui pourrait compliquer son administration in vivo, car il faudrait tenir compte d'éventuels effets secondaires occasionnés par sa liaison au récepteur H3. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'agoniste du récepteur H4 de l'histamine qui est utilisé est spécifique de H4R. Un exemple d'agoniste spécifique du récepteur H4 est la 4-méthylhistamine (Lim et al., 2005). 30 L'agoniste du récepteur H4 utilisé selon l'invention peut être employé, par exemple, à une concentration comprise entre 5 mg/kg et 60 mg/kg, de préférence entre 10 mg/kg et 30 mg/kg par dose. La composition pharmaceutique préparée selon l'invention a été administrée par injection intra-péritonéale chez la souris, mais elle peut avantageusement être formulée 35 pour une administration par injection intraveineuse ou par voie orale. 2903311 5 La présente invention porte également sur une méthode de traitement du cancer, en particulier des tumeurs solides, comprenant l'administration d'un agoniste du récepteur H4 de l'histamine préalablement et/ou simultanément à l'administration d'un agent chimiothérapeutique. Bien entendu, les spécifications décrites plus haut s'appliquent 5 également à cet aspect de l'invention. La séquence d'administration des produits est définie par le clinicien. A titre d'exemple non limitatif, on peut citer la séquence suivante : deux injections ou prises orales de l'agoniste à J-1, une autre à 4 h avant la chimiothérapie et une dernière à Ji. Un autre aspect de l'invention est un médicament de support comprenant, à 10 titre de principe actif, un agoniste du récepteur H4 de l'histamine. Par "médicament de support", on entend ici un médicament qui est habituellement administré en conjonction avec un autre médicament, afin d'en atténuer les effets secondaires. Un autre médicament objet de la présente invention est un médicament anticancéreux qui comporte une association d'au moins une molécule choisie parmi les agents 15 antinéoplasiques utilisables en chimiothérapie, et d'un agoniste du récepteur H4 de l'histamine. A titre d'exemples non limitatifs d'agents antinéoplasiques qui peuvent faire partie d'un médicament selon cet aspect de l'invention, on peut citer le cyclophosphamide, le 5-FU, et le docetaxel. L'agoniste du récepteur H4 de l'histamine présent dans un médicament 20 selon l'invention (médicament de support ou anticancéreux) peut être le clobenpropit (drogue utilisée en expérimentation animale exclusivement), mais de façon préférée, on utilisera un agoniste plus spécifique du récepteur H4 tel que, par exemple, la 4-méthylhistamine. Bien entendu, un cocktail de plusieurs agonistes différents, incluant ou non le clobenpropit et/ou l'imetit et/ou la 4-méthylhistamine, peut également être introduit dans un médicament selon 25 l'invention. Dans un médicament anticancéreux selon l'invention, l'agent antinéoplasique et l'agoniste du récepteur H4 de l'histamine peuvent être présents sous forme d'un mélange ou, de façon préférée, dans deux formulations séparées. Ces deux formulations séparées peuvent être destinées à être mélangées de façon extemporanée avant 30 l'administration. Elles peuvent également être destinées soit à une administration séquentielle, soit à une administration simultanée, mais par des voies différentes. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront des exemples expérimentaux ci-dessous, et des figures annexées. LEGENDE DES FIGURES 35 Figure 1 : Effet inhibiteur du clobenpropit (CB) et de l'imetit sur la formation des colonies en méthylcellulose. Essai clonogénique en méthylcellulose (CFU-C) 2903311 6 avec l'IL-3 comme seul facteur de croissance pendant 7 jours de culture, avec ou sans CB (10-s à 10-7 M). Figure 2 : Le clobenpropit n'induit pas l'apoptose des progéniteurs hématopoïétiques de la moelle osseuse. L'apoptose a été mesurée par un marquage à 5 l'annexine V-FITC qui reconnaît les résidus phosphatidylserine exposés sur les membranes des cellules en apoptose (panneau A). Le pourcentage de cellules mortes est ensuite déterminé par une coloration avec l'iodure de propidium, qui pénètre dans les cellules dont la membrane est endommagée (panneau B). L'expérience a été réalisée avec des populations médullaires enrichies en cellules indifférenciées (Lin-) cultivées pendant 72 h avec un cocktail de facteurs 10 de croissance (IL-3, IL-6, SCF). Figure 3 : Le CB augmente le pourcentage de cellules de moelle osseuse Lin" c-kit+ en phase GO/G1. Des cellules Linde moelle osseuse ont été incubées pendant 3 jours en milieu StemSpan (milieu sans sérum, StemCell Technologies), additionné de facteurs de croissance (IL-3, IL-6, SCF). Après coloration avec l'iodure de propidium, le contenu en 15 ADN de ces cellules a été analysé (* p = 0.013 ; **p = 0.004; n = 7 ; Test Mann-Whitney). Figure 4 : Le CB inhibe la prolifération des cellules de moelle osseuse Lin" c-kit+ induite par les facteurs de croissance. Des cellules de moelle osseuse Lin- ont été incubées pendant 3 jours en milieu StemSpan (StemCell Technologies), additionné de facteurs de croissance (IL-3, IL-6, SCF), en présence de CFSE (to). La fluorescence des 20 cellules Lin- c-kit+ a été analysée. Figure 5 : Le CB maintient l'expression de c-kit dans les cellules de moelle osseuse Lin- en inhibant la prolifération/différenciation induite par les facteurs de croissance. Des cellules de moelle osseuse Lin- ont été incubées pendant 3 jours en milieu StemSpan (StemCell Technologies), additionné de facteurs de croissance (IL-3, IL-6, SCF), 25 en présence ou non de CB et d'un antagoniste du récepteur H4. Figure 6 : Le blocage du cycle cellulaire par le CB est réversible. Les cellules ont été incubées pendant 72h dans le cocktail de facteurs de croissance avec ou sans CB. Elles ont ensuite été lavées et restimulées pendant 24h avec les facteurs de croissance, avant d'analyser leur distribution dans le cycle cellulaire. 30 Figure 7: Le CB inhibe l'expression de la cycline D3 au niveau protéique. Les cellules ont été incubées pendant 24h dans le cocktail de facteurs de croissance avec ou sans CB avant marquage avec un anticorps anti-cycline D3 conjugué au FITC et coloration de l'ADN au iodure de propidium. Figure 8 : Le CB inhibe la prolifération de plusieurs sous-populations 35 de progéniteurs myéloïdes, allant du CFU-Mix au BFU-E. Test HALO-Hemogenix : essai 2903311 7 de viabilité cellulaire par luminescence (ATP/luciférine) après 5 jours de culture en présence de différents cocktails de facteurs de croissance avec ou sans CB. Figure 9 : Le CB inhibe la formation de colonies de progéniteurs lymphoïdes communs (CLP). Des cellules de moelle osseuse ont été cultivées en 5 méthylcellulose additionnée d'IL-7 humaine recombinante (10 ng/ml), de SCF murin recombinant (100 ng/ml) et de Flt-3L murin recombinant (20 ng/ml). Les colonies ont été comptées au jour 7. Figure 10 : Inhibition de CFU-C par l'histamine. Les cellules de moelle osseuses Lin- ont été prétraitées pendant 24h en milieu StemSpan additionné d'IL-3 avec 10 différentes doses d'histamine, avant de les planter en méthylcellulose avec de l'IL-3 pendant 7 jours. Deux expériences séparées sont représentées. Figure 11 : Schéma du protocole pour évaluer in vivo l'effet protecteur du CB contre la myéloablation induite par le cyclophosphamide. Figure 12 : Le traitement in vivo au CB protège les CFU-C médullaires 15 et accélère la reconstitution hématopoïétique périphérique. Les traitements avec le CB et le cyclophosphamide ont été effectués selon le protocole ci-dessus. A J2 et J5 les cellules de moelle osseuse et de rate, respectivement, ont été évaluées pour leur contenu en progéniteurs hématopoïétiques dans les différentes conditions expérimentales. Figure 13 : Le CB protège les progéniteurs Scal+ c-kit+ dans la moelle 20 osseuse et augmente leur fréquence dans la rate. La fréquence des cellules primitives identifiées par l'expression simultanée de Scal et c-kit a été déterminée, respectivement, 2 et 5 jours après le traitement dans la moelle osseuse et dans la rate. Le protocole est celui représenté dans la Fig. 11. Figure 14 : Le CB ne protège pas les granulocytes matures de la moelle 25 osseuse (caractérisés par l'expression concomitante de CD11b/Grl) contre la cytotoxicité du cyclophosphamide. Le protocole est celui de la Fig. 11. Figure 15 : In vivo, le CB inhibe l'entrée des cellules Lin de la moelle osseuse dans le cycle cellulaire. 30 mg/kg de CB ont été injectés aux souris 48h, 24h et 4h avant le sacrifice. Figure 16 : Le CB exerce une protection partielle contre la diminution des la formation des CFU-C induite par le docetaxel. Des cellules de moelle osseuse ont été incubées pendant 24h avec ou sans CB en présence d'IL-3, avant traitement par le docetaxel à différentes concentrations, pendant 30 minutes. Les cellules ont ensuite été lavées et évaluées pour leur capacité à former des colonies en réponse à l'IL-3. Figure 17 : Le CB inhibe la formation des colonies à partir de cellules humaines CD34+ dans une culture de 14 jours en méthylcellulose en présence d'IL-3. Les 30 35 2903311 8 cellules CD34'ont été purifiées à partir de sang de cordon et ensemencées en méthylcellulose à une concentration de 1000 cellules par ml. Figure 18 : Le CB inhibe la prolifération des précurseurs hématopoïétiques CD34+ induite par l'IL-3. Les cellules ont été cultivées pendant 6 jours 5 dans un milieu StemSpan complémenté avec 10 ng/ml d'IL-3 humaine recombinante, en partant d'une concentration de 105 cellules/ml. Figure 19 : Le CB maintient l'expression de CD34 sur les précurseurs hématopoïétiques. Des cellules CD34+ purifiées à partir de sang de cordon ombilical, ont été cultivées pendant 6 jours avec 10 ng/ml d'IL-3, avec ou sans CB. Les cellules ont été 10 marquées ensuite avec un anticorps anti-CD34. EXEMPLES Matériels et méthodes Tests clonogéniques La fréquence de différents types de progéniteurs dans la moelle osseuse et la rate des souris 15 témoins ou au cours d'une chimiothérapie avec ou sans injection de CB a été déterminée dans le test classique en méthylcellulose (StemCell Technologies), soit en réponse à l'IL-3 seule, soit en présence d'un cocktail de facteurs de croissance. Dans certaines expériences, une technique développée par HémoGenix et basée sur des mesures de luminescence dans un système ATP/luciférine a été utilisée selon les recommandations du fabricant. En fonction de 20 la composition du cocktail de facteurs de croissance, différentes sous-populations de progéniteurs peuvent ainsi être quantifiées après 7 jours de culture en methylcellulose classique et après 5 jours de culture dans le test HemoGenix. Pour les expériences in vitro, l'effet des ligands du H4R a été évalué soit au cours de la culture en milieu semi-solide, soit après une préincubation avec les drogues pendant 24 h. La concentration des cellules 25 hématopoïétiques mises en culture dépend de la fréquence estimée en progéniteurs hématopoïétiques et peut aller de 1000 à 106 cellules/ml. Une méthylcellulose adaptée aux cellules humaines (StemCell Technologies) a été utilisée pour les expériences avec les progéniteurs CD34' humains purifiés à partir de sang ombilical par sélection magnétique positive selon le procédé commercialisé par Miltenyi. 30 Préparation de populations médullaires enrichies en progéniteurs hématopoïétiques Les cellules de moelle osseuse sont incubées avec un cocktail d'anticorps (StemCell Technologies) contre les antigènes de surface spécifiques de lignées matures (CDS, CD45R, CD1 lb, TER119, Ly-6G, 7-4) dans le PBS, 2% SVF, 1 mM EDTA à 108cellules/ml pendant 20 min, soit manuellement, soit automatiquement par le RoboSep de StemCell Technologies. 35 Les cellules positives sont ensuite éliminées en utilisant la technique SpinSep après couplage avec des particules denses ou la sélection magnétique avec le RoboSep, respectivement. 2903311 9 Analyse du cycle cellulaire des progéniteurs hématopoïétiques Les populations enrichies en progéniteurs hématopoïétiques sont incubées pendant 1-3 jour(s) avec un cocktail de facteurs de croissance (rmIL-3 10 ng/ml, rhlL-6 10 ng/ml, rmSCF 50 ng/ml) dans le milieu StemSpan sans sérum avec ou sans CB, en présence ou absence d'un 5 antagoniste du H4R. Les cellules sont ensuite colorées au iodure de propidium (PI) pour l'analyse du cycle selon le protocole suivant: -Marquage avec CD117-FITC (2 x 106cellules/ml pendant 20 min) dans le PBS -Lavage dans PBS - Fixation dans le PBS 1% formaldéhyde sans méthanol à 4 C pendant 5 min 10 - Lavage dans PBS - 1 ml de PI/TritonX100 + RNAse A sans DNAse (0,2 microg/ml), PI (20 microg/ml) dans le PBS pendant 30 min à température ambiante - Analyse au FACS (FL2-area/FL2-width pour l'analyse du cycle et FL1 pour le marquage de surface 15 Coloration au CFSE Incuber 106 cellules enrichies en progéniteurs hématopoïétiques dans 2 ml de CFSE 5 mM dans le PBS pendant 10 min à 37 C - Arrêter la réaction par l'addition de PBS froid en excès (5x) et centrifuger 5 min à 1700 rpm -Resuspendre les cellules dans le milieu StemSpan sans sérum et stimuler avec le cocktail de 20 facteurs de croissance - Analyser au FACS (FL1) après 72 h de culture Traitement in vitro au docetaxel Les cellules de moelle osseuse totales sont incubées pendant 24 h dans le milieu StemSpan en présence d'IL-3 (1 ng/ml) Le docetaxel est ensuite ajouté à des concentrations allant de I0-6 à 25 10-8 pendant 30 min. Après lavage, les cellules sont ensemencées en méthylcellulose et la fréquence des CFU-C est évaluée après 7 jours de culture en IL-3 Exemple 1 : Le clobenpropit inhibe la prolifération des CFU-C en les bloquant en phase GO/Gl du cycle cellulaire Le récepteur H4R est exprimé quasi-exclusivement dans la moelle osseuse 30 (Liu et al., 2001a). Les inventeurs ont donc tiré parti du fait que certaines drogues initialement caractérisées comme antagonistes du récepteur H3 reconnaissent également le type H4, pour tester leur effet sur les progéniteurs hématopoïétiques qui forment de colonies en méthylcellulose. La figure 1 montre que le clobenpropit (CB), qui se comporte comme un agoniste du H4R, exerce un effet inhibiteur significatif sur la formation des colonies en 35 méthylcellulose (entre 10"5-10-' M), au cours de 7 jours de culture avec l'IL-3 comme seul facteur de croissance. L'imetit, un agoniste des récepteurs H3 et H4 de l'histamine (Ling et al., 2903311 10 2004; Liu et al., 2001b), inhibe aussi la formation des colonies, à un degré moindre. En revanche, les antagonistes du récepteur H3 qui ne reconnaissent pas le type H4 ne partagent pas cet effet Des résultats similaires ont été obtenus en prétraitant les cellules de moelle 5 osseuse uniquement avec le CB aux mêmes doses pendant 24 h avant la culture en méthylcellulose. On observe une inhibition semblable quand le test clonogénique est réalisé en présence d'un cocktail de facteurs de croissance plutôt qu'en IL-3 seule (résultats non montrés). Exemple 2 : Confirmation de l'implication spécifique du récepteur H4 dans l'effet 10 inhibiteur du clobenpropit Pour prouver que l'effet inhibiteur du clobenpropit impliquait spécifiquement le récepteur H4, un antagoniste hautement spécifique (Jablonowski et al., 2003; Thurmond et al., 2004), développé par Johnson & Johnson et fourni par UCB-Pharma, a été utilisé. Ce produit (noté ici JNJ) inhibe totalement l'effet du CB alors qu'il n'a pas 15 d'effet en tant que tel (résultats non montrés). Exemple 3 : Analyse de l'effet du clobenpropit sur le cycle cellulaire des progéniteurs hématopoïétiques Le CB n'est pas toxique pour les progéniteurs hématopoïétiques de la moelle osseuse comme l'atteste l'absence d'apoptose (évaluée par l'expression de 20 phosphatidylserine membranaire révélée par l'Annexine V-FITC) dans les populations enrichies en cellules indifférenciées (Lin) cultivées pendant 72 h dans un cocktail de facteurs de croissance (IL-3, IL-6, SCF) (figure 2). Pour expliquer l'inhibition de la formation de colonies en méthylcellulose, les inventeurs ont fait l'hypothèse que l'activation du T14R sur les progéniteurs 25 hématopoïétiques par son agoniste affectait leur cycle cellulaire. Pour vérifier cette hypothèse, les deux techniques classiques pour déterminer le pourcentage de cellules en cycle ont été utilisées. Ces techniques consistent en un traitement à l'hydoxy-urée ou la thymidine tritiée, qui toutes les deux tuent les cellules qui prolifèrent. Il s'est avéré qu'une préincubation des cellules médullaires avec le CB (10-5 M, pendant 24 h en présence d'IL-3) réduisait 30 sensiblement le pourcentage des CFU-C en cycle (résultats non montrés). Pour confirmer ce résultat, une méthode cytométrique permettant de déterminer les différentes phases du cycle cellulaire par leur contenu en ADN mesuré par l'intensité de fluorescence en iodure de propidium (PI) a été utilisée. Etant donné que les CFU-C sont très minoritaires dans la moelle osseuse, l'incorporationdu PI dans l'ADN a été 35 associée avec un marquage membranaire de c-kit, qui est exprimé sur les cellules immatures préalablement enrichies par élimination de la population mature. Comme le montre la figure 2903311 11 3, le CB augmente nettement le pourcentage des cellules Lin- c-kit+ en phase GO/G1 et diminue d'autant la phase G2/M, après trois jours de culture en présence d'un cocktail de facteurs de croissance. Cet effet est également mis en évidence par une technique qui permet de 5 tracer les cellules en division par le carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFSE), un colorant fluorescent qui s'incorpore dans les cellules et dont l'intensité de fluorescence diminue à fur et à mesure qu'elles se divisent. Comme l'illustre la figure 4, le nombre de divisions effectuées par les cellules Liri c-kit+ est clairement diminué par l'agoniste du H4R. De même, le clobenpropit augmente le nombre de cellules c-kit+ présentes 10 après 3 jours d'incubation de cellules Lin- avec un cocktail de facteurs de croissance (figure 5), ce qui reflète un blocage de la différenciation cellulaire. L'inhibition de la progression du cycle cellulaire est également étayée par des critères morphologiques, les populations générées en présence de CB contenant davantage de cellules immatures que celles incubées avec de l'IL-3 seule. La figure 6 montre que cet effet inhibiteur est réversible, puisqu'il tend à 15 disparaître après 24h d'incubation suivant l'élimination du CB du milieu de culture. Une analyse détaillée des modifications de l'expression des gènes impliqués dans le cycle cellulaire, en réponse au CB, a été effectuée en utilisant une puce à ADN et des oligonucléotides permettant de mettre en évidence une centaine de gènes impliqués dans le cycle cellulaire (SuperArray, Inc.). Ces expériences ont été réalisées avec de l'ARNm de 20 cellules BMC Lin- fraîchement isolées, ou après 24h d'incubation avec des facteurs de croissance, en présence ou en absence de CB. Le traitement des progéniteurs hématopoïétiques avec le cocktail de facteurs de croissance induit l'expression de la plupart des transcrits codant pour des protéines du cycle, tandis que le CB la réduit d'une manière drastique. Bien que la diminution de l'expression de l'ARNm de la cycline D3 soit moins 25 marquée que celle d'autres transcrits, le niveau d'expression de cette protéine, particulièrement importante dans l'initiation de la phase S du cycle cellulaire, a été analysé par FACS, en utilisant un anticorps fluorescent. Il a ainsi été montré que l'augmentation de la cycline D3 induite dans les cellules Lin- c-kit+ par le cocktail de facteurs de croissance dans la phase GO/G1 du cycle était clairement moindre quand le CB était présent au cours des 24 h 30 d'incubation (figure 7). Exemple 4: Evaluation de l'effet anti-prolifératif du clobenpropit sur des lignées particulières de progéniteurs Les inventeurs ont cherché à savoir si le clobenpropit affectait préférentiellement la prolifération de certains types de progéniteurs hématopoïétiques. Pour 35 cela, un essai clonogénique récemment développé par Hemogenix a été utilisé. Le kit HALO-Hemogenix, contrairement aux essais clonogéniques standards, mesure la prolifération (plutôt 2903311 12 que la différentiation) de sous-populations distinctes de progéniteurs, en réponse à différents cocktails de facteurs de croissance. Dans ce cas, les colonies ne sont plus comptées en microscopie optique, mais la prolifération est mesurée après 5 jours de culture par un dosage d'ATP en chimioluminescence. Grâce à l'utilisation de cocktails de croissance appropriés 5 fournis par le fabricant, ce procédé a permis de conclure que le CB ne ciblait pas spécifiquement une sous-population particulière de progéniteurs, mais affectait les CFUGEMM, CFU-GM et BFU-E de la même façon (figure 8). De plus, comme montré dans la figure 9, le CB inhibe la formation de colonies lymphoïdes, évaluée en méthylcellulose supplémentée avec de l'IL-7, du SCF et du 10 Flt-L (essai classique pour les progéniteurs lymphoïdes). En conclusion, ces résultats indiquent que l'agoniste du H4R cible une gande variété de progéniteurs ayant des potentiels de différenciation distincts. Exemple 5 : Evaluation de l'histamine pour sa capacité d'inhiber la mise en cycle des CFU-C en réponse à l'IL-3, par l'intermédiaire du récepteur H4 15 Comme montré dans la figure 10, une inhibition des CFU-C similaire à celle obtenue avec du CB a été observée lorsque des cellules de moelle osseuse enrichies en progéniteurs ont été pré-incubées avec de l'histamine, dans un milieu dépourvu de sérum (pour éviter sa dégradation par l'histaminase présente dans le SVF). Cette observation apporte un argument supplémentaire en faveur de l'implication du H4R dans cette activité biologique. 20 Exemple 6 : in vivo, le clobenpropit protège les souris contre l'effet hématotoxique du cyclophosphamide L'administration de clobenpropit avant et au cours d'un traitement chimiothérapeutique, selon le protocole expérimental résumé dans la figure 11, protège les CFU-C contre l'effet myéloablatif du cyclophosphamide et aboutit à une reconstitution 25 hématopoïétique plus rapide. Les résultats de trois expériences réalisées dans ces conditions sont présentés dans la figure 12. Ils montrent d'une part que deux jours après injection i.p. de cyclophosphamide, le nombre de CFU-C était significativement plus élevé dans la moelle osseuse des souris ayant reçu le clobenpropit que dans les témoins. D'autre part, la reconstitution extramédullaire 5 jours après le début du traitement était plus importante dans 30 la rate des souris ayant reçu du CB. Pour expliquer ce dernier point, on peut imaginer qu'en plus de leur effet protecteur vis-à-vis des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse, les agonistes du récepteur H4 exerceraient aussi un effet chimiotactique sur les progéniteurs, qui les mobiliseraient en plus grand nombre et contribuerait ainsi à la reconstitution extramédullaire. Cette hypothèse fait l'objet d'une investigation par un essai en 35 chambre de Boyden. 2903311 13 L'analyse phénotypique de l'expression conjointe de Scal et c-kit, qui identifie les cellules souches dans la moelle osseuse et la rate, donne des résultats cohérents avec l'effet protecteur du CB sur les progéniteurs hématopoïétiques et leur mobilisation accrue vers la rate, puisque l'expression de ces antigènes est augmentée dans les deux organes 5 après traitement au CB. Ces résultats sont résumés dans la figure 13. Il apparaît au contraire que les granulocytes matures Macl+/Grl+ ne sont pas protégés de la myélotoxicité du cyclophosphamide (figure 14). L'arrêt du cycle cellulaire des progéniteurs hématopoïétiques, observé in vitro en réponse au CB, a également été étudié in vivo. Pour assurer un effet optimal du 10 traitement, la dose a été augmentée à 30 mg/kg deux fois par jour (jour -2, jour -1, et 4h avant le sacrifice). Aucun effet secondaire n'a été observé. En revanche, une augmentation du pourcentage de cellules en G0/Gl, similaire à celle observée in vitro, a été mise en évidence (figure 15). Exemple 7 : Evaluation de l'effet protecteur du clobenpropit contre l'effet 15 hématotoxique du docetaxel Contrairement au cyclophosphamide, le docetaxel est actif in vitro, ce qui a permis de tester in vitro l'effet myéloprotecteur du CB contre cette drogue. Les résultats obtenus, présentés dans la figure 16, montrent une protection partielle des CFU-C contre la cytotoxicité du docetaxel. 20 Exemple 8 : Le CB inhibe les CFUC humains et diminue la prolifération des cellules CD34+ Les expériences réalisées sur les cellules humaines CD34+, purifiées à partir de sang de cordon ou de cytaphérèse, donnent des résultats similaires à ceux obtenus chez la souris. En effet, on observe une diminution du nombre de colonies formées à partir de cellules 25 CD34+ en méthylcellulose en réponse à un cocktail de facteurs de croissance (SCF + IL-6 + IL-3) en présence de CB (figure 17) ainsi qu'une inhibition de leur prolifération en milieu liquide (figure 18). Dans les deux cas, l'antagoniste du H4R JNJ abolit l'effet. Des données préliminaires, montrant le maintien d'une population immature identifiée par l'expression de CD34 en présence de CB (figure 19), alors que les cellules témoin se différencient, indiquent 30 que cet effet serait également dû à un blocage du cycle cellulaire dont le mécanisme exact reste à préciser. Exemple 9: Evaluation de nouveaux agonistes du récepteur H4, pour leur effet inhibiteur de la croissance des colonies in vitro Le clobenpropit a été conçu initialement comme un antagoniste du récepteur 35 H3 de l'histamine, qui était à ce moment-là sa seule cible pharmacologique connue, ce qui explique qu'il est relativement peu affin vis-à-vis du H4R en tant qu'agoniste. Même si cette 2903311 14 double spécificité n'affecte pas les résultats in vitro, sachant que le récepteur H3 n'est pas exprimé dans la moelle osseuse, elle pourrait compliquer son administration in vivo, compte tenu du rôle de ce récepteur dans le système nerveux central. Il est donc impératif de disposer d'un agoniste véritablement spécifique, et éventuellement plus affin, pour augmenter 5 l'efficacité du traitement. Récemment, la 4-méthyhistamine été identifiée comme agoniste du récepteur H4 (Lim et al., 2005). Cet agoniste est testé, ainsi que d'autres molécules, afin de disposer de drogues potentiellement plus efficaces et sélectives que le clobenpropit. 2903311 15 REFERENCES Cashman, J. D., Eaves, A. C., and Eaves, C. J. (1994). The tetrapeptide AcSDKP specifically blocks the cycling of primitive normal but not leukemic progenitors in long-term culture: evidence for an indirect mechanism. Blood 84, 1534-1542. 5 Charrier, S., Michaud, A., Badaoui, S., Giroux, S., Ezan, E., Sainteny, F., Corvol, P., and Vainchenker, W. (2004). Inhibition of angiotensin I-converting enzyme induces radioprotection by preserving murine hematopoietic short-term reconstituting cells. Blood 104, 978-985. Filip, S., Blaha, M., Petera, J., Vavrova, J., and Knizek, J. (2001). Peripheral 10 progenitor cells (PBPC) in supportive care after high-dose chemotherapy in breast cancer. Neoplasma 48, 39-47. Gabrilove, J. L. (2001). Cancer therapy. New strategies and treatment modalities for optimizing patient outcomes. Semin Hematol 38, 1-7. Jablonowski, J. A., Grice, C. A., Chai, W., Dvorak, C. A., Venable, J. D., 15 Kwok, A. K., Ly, K. S., Wei, J., Baker, S. M., Desai, P. J., et al. (2003). The first potent and selective non-imidazole human histamine H4 receptor antagonists. J Med Chem 46, 3957-3960. Lim, H. D., van Rijn, R. M., Ling, P., Bakker, R. A., Thurmond, R. L., and Leurs, R. (2005). Evaluation of histamine HI-, H2-, and H3-receptor ligands at the human 20 histamine H4 receptor: identification of 4-methylhistamine as the first potent and selective H4 receptor agonist. J Pharmacol Exp Ther 314, 1310-1321. Ling, P., Ngo, K., Nguyen, S., Thurmond, R. L., Edwards, J. P., Karlsson, L., and Fung-Leung, W. P. (2004). Histamine H4 receptor mediates eosinophil chemotaxis with cell shape change and adhesion molecule upregulation. Br J Pharmacol 142, 161-171. 25 Liu, C., Ma, X., Jiang, X., Wilson, S. J., Hofstra, C. L., Blevitt, J., Pyati, J., Li, X., Chai, W., Carruthers, N., and Lovenberg, T. W. (2001a). Cloning and pharmacological characterization of a fourth histamine receptor (H(4)) expressed in bone marrow. Mol Pharmacol 59, 420-426. Liu, C., Wilson, S. J., Kuei, C., and Lovenberg, T. W. (2001b). Comparison 30 of human, mouse, rat, and guinea pig histamine H4 receptors reveals substantial pharmacological species variation. J Pharmacol Exp Ther 299, 121-130. Liu, J. M., Lawrence, F., Kovacevic, M., Bignon, J., Papadimitriou, E., Lallemand, J. Y., Katsoris, P., Potier, P., Fromes, Y., and Wdzieczak-Bakala, J. (2003). The tetrapeptide AcSDKP, an inhibitor of primitive hematopoietic cell proliferation, induces 35 angiogenesis in vitro and in vivo. Blood 101, 3014-3020. 2903311 16 Masse, A., Ramirez, L. H., Bindoula, G., Grillon, C., Wdzieczak-Bakala, J., Raddassi, K., Deschamps de Paillette, E., Mencia-Huerta, J. M., Koscielny, S., Potier, P., et al. (1998). The tetrapeptide acetyl-N-Ser-Asp-Lys-Pro (Goralatide) protects from doxorubicin-induced toxicity: improvement in mice survival and protection of bone marrow 5 stem cells and progenitors. Blood 91, 441-449. Santini, V. (2001). Amifostine: chemotherapeutic and radiotherapeutic protective effects. Expert Opin Pharmacother 2, 479-489. Thurmond, R. L., Desai, P. J., Dunford, P. J., Fung-Leung, W. P., Hofstra, C. L., Jiang, W., Nguyen, S., Riley, J. P., Sun, S., Williams, K. N., et al. (2004). A potent and 10 selective histamine H4 receptor antagonist with anti-inflammatory properties. J Pharmacol Exp Ther 309, 404-413. Zeuner, A., Pedini, F., Signore, M., Testa, U., Pelosi, E., Peschle, C., and De Maria, R. (2003). Stem cell factor protects erythroid precursor cells from chemotherapeutic agents via up-regulation of BCL-2 family proteins. Blood 102, 87-93. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un agoniste du récepteur H4 de l'histamine, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à protéger les progéniteurs hématopoïétiques contre les effets toxiques de médicaments actifs sur les cellules en prolifération. 2. Utilisation selon la revendication 1, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à protéger les progéniteurs hématopoïétiques contre les effets toxiques d'une chimiothérapie antitumorale. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée à des patients atteints de tumeurs solides. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée à des patients traités par le cyclophosphamide, le 5-FU, le docetaxel ou d'autres drogues anti-cancéreuses. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit agoniste du récepteur H4 de l'histamine est le clobenpropit. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit agoniste du récepteur H4 de l'histamine est un agoniste spécifique de ce récepteur. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit agoniste spécifique du récepteur H4 de l'histamine est la 4-méthylhistamine. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'agoniste du récepteur H4 est utilisé à une concentration comprise entre 5 mg/kg et 60 mg/kg, de préférence entre 10 mg/kg et 30 mg/kg par dose. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est administrable par injection intra-péritonéale, intraveineuse, ou par voie orale. 10. Médicament de support, caractérisé en ce qu'il comprend, à titre de principe actif, un agoniste du récepteur H4 de l'histamine. 11. Médicament anticancéreux, caractérisé en ce qu'il comporte une association d'au moins une molécule choisie parmi les agents antinéoplasiques, et au moins un agoniste du récepteur H4 de l'histamine. 12. Médicament selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comporte une association d'au moins une molécule choisie parmi le cyclophosphamide, la le 5-FU, et le docetaxel, et au moins un agoniste du récepteur H4 de l'histamine. 2903311 18 13. Médicament selon la revendication 11 ou la revendication 12, dans lequel l'agent antinéoplasique et l'agoniste du récepteur 114 de l'histamine sont présents dans deux formulations distinctes. 14. Médicament selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, 5 caractérisé en ce que ledit agoniste du récepteur H4 de l'histamine est le clobenpropit. 15. Médicament selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que ledit agoniste du récepteur 1-14 de l'histamine est un ligand spécifique de ce récepteur. 16. Médicament selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit 10 agoniste spécifique du récepteur H4 de l'histamine est la 4-méthylhistamine.