FR 2899901 A1 20071019 FR 0603254 A 20060413 L'invention a pour objet l'application de tensioactifs hémifluorés zwittérioniques de type amidosulfobétaïne, selon la structure (I) dans laquelle 1 = 2, 4, 6, 8 ou 10, m est un nombre entier allant de 2 à 12, n et p sont des nombres entiers supérieurs ou égaux à 1 (Figure 1), à l'extraction et la solubilisation de protéines tissulaires, cellulaires et membranaires, suivies de séparations en électrophorèses 2D* afm d'optimiser l'étude des protéomes (protéomique). O F- CF CH CH ( 2)Iù( 2)mC~N/ ( 2)n (CH2)p ù$03 N H CH/3 \CH3 Figure 1 : Formule générale des tensioactifs dont l'utilisation en analyse protéomique est revendiquée dans la présente invention ETAT DE L'ART Jusqu'ici le seul domaine d'application revendiqué des tensioactifs hémifluorés zwittérioniques de type amidosulfobétaïne est lié au domaine des mousses anti-incendie. En effet afin de stabiliser ce type de mousses l'utilisation de tensioactifs est nécessaire et de nombreux tensioactifs sont utilisables. Parmi eux, la structure C8FI7C2H4CONH(CH2)3N+(CH3)2(CH2)3S03- appartenant à la série précédemment schématisée est revendiquée pour être utilisée dans l'élaboration de mousses anti-incendie [Bertocchio, R., Foulletier, L., Lantz, A., Produits chimiques Ugine Kuhlmann, Fr ; Eur. Pat. Appl. (1980) ; EP 0017568]. Nous revendiquons, du fait de la spécificité de leur mode d'action, l'application de ces tensioactifs hémifluorés zwittérioniques de type amidosulfobétaïne dans un domaine complètement différent, celui de l'analyse protéomique et plus particulièrement l'extraction, la solubilisation des protéines et leurs analyse par la technique électrophorétique bidimensionnelle. En effet, alors que le génome est comparativement statique, le protéome est une entité hautement dynamique car le contenu protéique d'une cellule peut varier en fonction de changements de l'environnement, de l'état physiologique de la cellule, du stress, de drogues et de la santé ou de l'état pathologique [Wasinger, V.C., Cordwell, S.J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J.X., Gooley, A.A., *Electrophorèse 2D : couplage de deux types de séparation sur la base de deux caractéristiques physico-chimiques différentes : une isoelectrofocalisation (IEF) des protéines dans des conditions dénaturantes permet d'exposer les charges portées par les chaînes polypeptidiques et les sépare en fonction de leur point isoélectrique dans un gel contenant un gradient de pH. Le détergent utilisé est non ionique ou zwittérionique. Une deuxième séparation réalisée à 90 C par rapport à la première se fait en fonction de la masse moléculaire. Il s'agit de la technique de SDS PAGE (pour PolyAcrylamide Gel Electrophoresis en milieu Sodium Dodecyl Sulfate). (I) -2- Wilkins, M.R., Duncan, M.W., Harris, R., Williams, K.L., Humphery-Smith, I., Electrophoresis, 1995, 16, 1090-1094]. De plus différents types cellulaires à l'intérieur d'un organisme multicellulaire peuvent avoir différents protéomes alors que le génome est maintenu relativement constant. Ces protéomes sont très complexes. Un potentiel énorme de variations moléculaires peut se produire entre un gène et son produit correspondant actif dans la cellule. Cette complexité explique pourquoi la protéomique devient une science d'échelle au moins égale à la génomique. Pour analyser cette complexité, l'analyse protéomique repose sur des techniques de solubilisation suivies de séparations des constituants extraits utilisant des techniques telles que la chromatographie ou l'électrophorèse, elles-mêmes suivies ou couplées à des techniques d'identification, par exemple celles de spectrométrie de masse. Si les techniques chromatographiques se développent pour analyser des complexes protéiques et des protéines membranaires, il n'en reste pas moins que l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel à haute performance [Klose, J., Hum. Genet., 1975, 26, 231-243; O'Farrell, P.H., J. Biol. Chem., 1975, 250, 4007-4021] est la technique de séparation la plus résolutive pour analyser simultanément un grand nombre de constituants protéiques et leurs isoformes dans un mélange complexe, et cela bien que le nombre de protéines identifiées ne représente qu'un faible pourcentage du protéome prédit du fait du manque de sensibilité de la détection, de la difficulté de séparation de protéines de haut poids moléculaires et des protéines basiques, ou encore du défaut de maintien en solution des protéines dans des conditions particulières comme celles imposées par la focalisation isoélectrique (force ionique faible, détergents non chargés). En ce qui concerne la stratégie Extraction-solubilisationElectrophorèse 2D utilisée en analyse protéomique, l'état de l'art concernant l'utilisation des tensioactifs, détergents ou non, hydrocarbonés ou fluorés est le suivant. Les lipides et protéines qui composent les membranes biologiques peuvent être dispersés classiquement en utilisant des détergents. La partie hydrophobe des détergents entre en compétition avec les lipides vis-à-vis de la surface transmembranaire hydrophobe des protéines et les rend donc solubles dans l'eau. Bien qu'une perturbation directe de la structure protéique par le détergent ne soit pas exclue, le caractère dissociatif des détergents est cependant responsable de problèmes d'inactivation rencontrés fréquemment en biochimie des protéines membranaires [le Maire, M., Campeil, P., Moller, J.V., Biochim.Biophys. Acta 2000,1508, 86-111; Breyton. C., Tribet, C., Olive, J., Duback, J.P., Popot, J.L., J. Biol. Chem., 1997, 272, 21892-21900 ; Popot, J.L., Berry, E.A., Charvolin, D., Creuzenet, C., Ebel, C., Engelman, D.M., Floetenmyer, M., Giusti, F, Gohon, Y., Herve, P., Hong, Q., Lakey, J.H., Leonard, K., Shuman, H.A., Timmins, P., Warschawski, D.E., Zito, F., Zoonens, M., Pucci, B., Tribet, C., Cell. Mol. Life Sci., 2003, 60, 1559-1574]. Du fait que le 2899901 -3- détergent ne peut être utilisé en dessous de la CMC, des micelles libres sont présentes et compliquent le travail de purification car elles peuvent provoquer des dissociations de cofacteurs hydrophobes liés et de lipides. Cependant baisser la CMC conduit en général à la précipitation. Pour solubiliser les protéines intégrales de membrane, des détergents, chargés négativement, 5 chargés positivement ou bien neutres ont été utilisés. Les détergents neutres, comme le Triton X-100 (TX-100) ou le Lubrol (Figure 2), sont largement utilisés permettant quelquefois de conserver une forme enzymatiquement active des protéines. 10 HOCCH3(CH2)17O(CH2C H20)9H Nonaéthylèneglycol mono-n-dodecyt éther (Lubrol) CH,(CH2)11OS03 Na + Sodium dodecylsulfate (SDS) (Dodecylsulfate de sodium) CH2CH2O 1ùH &10 Polyethylene glycol-p-isooctylphenyl ether (TritonX-100) OH //tep Na+ Sodium deoxycholate (deoxycholate de sodium) + _ CH3(CH2)15N(CH,)3 Br + _ CH3(CH2)ä -2C(0)NH(CH2)3N(CH3)2(CH2)3SO3 15 Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) (Bromure de cétyl triméthyl ammonium) Amidosulfobetaine (ASB-n) + CH3(CH2)7N (CH,)2(CH2)3SO3 Sulfobetaine (SB3_8) 20 HO OH 3-(3-(cholamidopropyl)dimethyl-ammonio)-propane sulfonate (Chaps) (Sulfonate de 3-(3-(cholamidopropyl)dimethyl-ammonio)propane) Figure 2 : Les principaux détergents utilisés en protéomique et cités dans ce brevet 25 Les détergents anioniques, comme le déoxycholate de sodium (DOC) et le dodécylsulfate de sodium (SDS), sont plus efficaces pour la solubilisation, mais aussi pour la dénaturation et ne peuvent être utilisés si l'on veut conserver l'activité. Certains détergents semblent avoir des actions spécifiques ; c'est le cas du détergent cationique, bromure de cétyl triméthyl ammonium (CTAB), qui solubilise certaines protéines comme la rhodopsine. Enfin, une autre génération de 30 détergents, de type zwittérionique (bétaïnes et sulfobétaïnes) comme le sulfonate de 3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]- 1-propane (CHAPS), a présenté un intérêt particulier pour sa spécificité à solubiliser certains récepteurs [Simons, W., Koski, G., Streaty, R.A., Hjelmeland, L.M., Klee,W.A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1980, 77, 4623-4627]. De plus, le caractère zwittérionique amphiphile des sulfobétaïnes est similaire de celui des diacylphospholipides 35 phosphatidylcholines (lécithine) et phosphatidyl éthanolamines qui sont les principaux 2899901 -4constituants des membranes cellulaires ; de ce fait, ces détergents seraient donc les meilleurs substituts des lipides dans les membranes natives et pourraient expliquer une certaine rétention d'activité des protéines. Les problèmes liés aux détergents ont amené le développement de nouveaux concepts 5 pour la solubilisation de protéines membranaires. Les amphipols [Tribet, C., Audebert, R., Popot, J ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 15047-15050 ; Popot, J.L., Berry, E.A., Charvolin, D., Creuzenet, C., Ebel, C., Engelman, D.M., Floetenmyer, M., Giusti, F, Gohon, Y., Herve, P., Hong, Q., Lakey, J.H., Leonard, K., Shuman, H.A., Timmins, P., Warschawski, D.E., Zito, F., Zoonens, M., Pucci, B., Tribet, C., Cell. Mol. Lift Sci., 2003, 60, 1559-1574] sont des 10 polymères amphiphiles qui se lient à la surface transmembranaire et entourent les portions hydrophobes de la protéine membranaire. Le complexe amphipol-protéine est stable et l'amphipol libre est inexistant. Une autre approche originale repose sur la diminution de la miscibilité du surfactant aux lipides, de sorte que des micelles ne puissent agir dans le sens de la déstabilisation. La difficulté pour le surfactant est de rester capable de prévenir l'agrégation 15 protéique. Il semblerait que ces exigences puissent être réunies grâce à l'utilisation de surfactants hemifluorés reconnus pour se mélanger faiblement aux lipides alors qu'ils s'adsorbent assez efficacement sur la surface transmembranaire [Chaudier,Y., Zito, F., Barthélémy, P., Stroebel, D, Améduri, B., Popot, J.L., Pucci, B. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12, 1587-1590; Barthélémy, P. Ameduri, B., Chabaud,E., Popot, J.L., Pucci, B. Org.Lett. 1999, 1, 1689-1692]. Parce qu'ils ne 20 sont pas détergents, ils reçurent peu d'attention des biochimistes des membranes. Depuis 1995, l'étude du potentiel des tensioactifs fluorés pour l'extraction et la solubilisation de protéines, en particulier membranaires, a fait l'objet de quelques publications dans lesquelles il apparaît que les tensioactifs fluorés de type sulfobétaine n'ont jamais été utilisés bien que la tête polaire hydrophile ait montré son efficacité en protéomique comme on 25 peut le voir dans la figure 1. Les premiers essais effectués avec des tensioactifs fluorés étaient basés sur l'hypothèse de départ selon laquelle les interactions entre une protéine et un tensioactif hautement fluoré ou un tensioactif hydrocarboné sont identiques ; ils ont été réalisés par F.H. Shepherd et A. Holzenburg [Shepherd, F.H., Holzenburg, A., Anal. Biochem., 1995, 224, 21-27] sur diverses protéines membranaires et semblaient prometteurs. En fait, l'utilisation d'un 30 tensioactif chargé, le perfluorooctanoate d'ammonium, permet d'atteindre de hautes concentrations (40-80g/L) en tensioactif, dans lesquelles les membranes (2-5g protéines/L) sont au moins partiellement solubilisées. Nous relevons ensuite les travaux de C. Der Mardirossian, F. Lederer et Coll. dont les premiers essais encourageants de purification du flavocytochrome b558 par des perfluorophosphocholines [Der Mardirossian, C., Lederer, F., Biochem. Soc. Trans., 35 1996, p.24] ne se sont pas confirmés sur la solubilisation d'autres protéines [Der Mardirossian, -5- C., Krafft, M.P., Gulik-Krzywicki, T., le Maire, M., Lederer, F., Biochimie, 1998, 80, 531-541]. Les résultats les plus intéressants sont, sans nul doute, ceux obtenus par B. Pucci et Coll. sur des amphipols hémifluorés pouvant permettre de conserver les protéines à l'état natif afin d'en étudier l'activité. Ces travaux dont le plus récent date de 2004 ne sont pas à considérer ici compte tenu de l'éloignement des objectifs visés par la présente invention par rapport à ceux de ces travaus ; néanmoins, ces résultats nous ont conforté dans l'idée que les tensioactifs hémifluorés, si leur structure est adaptée, ont un rôle à jouer en analyse protéomique [Breyton, C., Chabaud, E., Chaudier, Y., Pucci, B., Popot, J.L., FEBS Letters, 2004, 564, 312-318]. A part quelques expériences avec la technique très répandue de SDS PAGE pour analyser les composants protéiques d'une extraction membranaire en surfactant fluoré et une méthode propre nommée PFO PAGE pour l'évaluation de la structure oligomérique des protéines membranaires par l'utilisation de l'acide perfluorooctanoique (PFO) [Ramjeesingh, M., Huang, L.J., Garami, E., Bear, C.L., Biochem.J. , 1999, 342, 119-123], les surfactants fluorés n'ont jamais été employés à grande échelle en électrophorèse et jamais utilisés en 2-DE. Les surfactants de type sulfobétaine (I) n'ont jamais été utilisés bien que la tête polaire sulfobétaine ait été introduite dans des tensioactifs hydrocarbonés intensément utilisés en analyse protéomique. Ainsi dans le cas où on s'intéresse plutôt à l'analyse globale du mélange de protéines solubilisées, une des méthodes de choix est l'électrophorèse bidimensionnelle. Cette méthode utilise uniquement les détergents neutres ou zwitterioniques en première dimension, laquelle peut avoir lieu en gradient de pH immobilisé (IPG) [Righetti, P.G., Gianazza, E., Bjellqvist, B., i Biochem. Biophys. Methods, 1983, 8, 89-108]. Or, l'efficacité de l'IEF est également directement liée aux pouvoirs solubilisant des détergents et aux procédés de solubilisation des protéines qui doivent satisfaire à des objectifs parallèles : i) casser les interactions macromoléculaires dans le but de séparer les chaînes polypeptidiques, comme les ponts disulfures et les interactions non covalentes à la fois entre protéines et entre protéines et composés non protéiques comme les lipides et les acides nucléiques; ii) éviter les modifications artéfactuelles dans le milieu de solubilisation (protéolyse, déamidation, par exemple) ; iii) éliminer les substances interférant avec l'électrophorèse 2-D si leur quantité est importante (sels, lipides, polysaccharides, acides nucléiques) ; iv) garder les protéines en solution pendant la séparation. Si la seconde dimension en milieu SDS de l'électrophorèse ne pose presque jamais de problèmes et si l'électrophorèse 2D dans son ensemble s'avère la technique de choix pour les protéines solubles (par exemple, celles contenues dans les fluides biologiques) ou pour les extraits cellulaires totaux dans lesquels les protéines solubles prédominent, par contre de nombreux problèmes surviennent lorsque des protéines moins solubles doivent être analysées -6- comme les protéines membranaires [Adessi, C., Miege, C. ; Albrieux, C. ; Rabilloud, T., Electrophoresis, 1997, 18, 127-135 ; Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud,T., Electrophoresis, 2000, 21,1054-1070 ] et les protéines nucléaires [Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J., Electrophoresis, 1997, 18, 307-316]. Dans ce cas, des pertes très significatives en protéines sont constatées ce qui empêche l'utilisation de l'IPG en première dimension lorsqu'on travaille sur des micro-échantillons. Le remède à ces problèmes est donc d'accroître la solubilité des protéines lors de l'étape d'électrofocalisation. Dans ce but, les chercheurs font varier la nature des détergents qu'ils utilisent avec des agents chaotropes tels que les mélanges uréethiourée qui donnent de bons résultats et augmentent la solubilité des protéines dans de nombreux cas [Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J., Electrophoresis, 1997, 18, 307-316]. Naturellement, les conditions idéales devraient combiner le pouvoir chaotropique le plus élevé (thiourée 2M et urée 7-8M) avec un cocktail de détergents aussi efficace que possible, ce qui, en l'état actuel des détergents commerciaux, est évidemment impossible. Il apparaît que si les détergents commerciaux compatibles avec de fortes concentrations en urée (par exemple, le CHAPS ou SB3-8, voir Figure 1) sont peu efficaces [Navarette, R. ; Serrano, R., Biochim. Biophys. Acta, 1983, 728, 403-408], par contre des détergents avec des chaînes hydrophobes plus longues sont plus efficaces mais incompatibles avec de fortes concentrations en urée. C'est pour cela que de nouvelles classes de sulfobétaïnes avec une tête zwittérionique, plus polaire, une queue alkylée plus longue (> 12 atomes de carbone), une fonction amide ont été synthétisées (Figure 2) et testées sur des préparations membranaires pour l'analyse bidimensionnelle en étant maintenues dans le milieu pendant le processus de migration : ce sont les amidosulfobétaïnes ASB-n (Figure 2) [Chevallet, M., Santoni, V., Poinas, A., Rouquié, D., Fuchs, A., Kieffer, S., Rossignol, M., Lunardi, J., Garin, J., Rabilloud, T., Electrophoresis, 1998, 19, 1901-19091. L'amidosulfobétaine-14 (ASB-14) semble être actuellement le plus efficace si l'on se réfère à sa capacité à solubiliser la H+ATPase membranaire [Santoni, V., Kieffer S., Desclaux, D., Masson, F., Rabilloud, T., Electrophoresis, 2000, 21, 3329-3344] et la bande 3 de l'érythrocyte qui est une molécule possédant douze domaines transmembranaires [Luche, S., Santoni, V., Rabilloud, T., Proteomics, 2003, 3, 249-25 ; Tastet, C., Charmont, S., Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T., Proteomics, 2003, 3, 111-121], pris comme modèles. De plus, l'une des nouvelles stratégies pour la solubilisation et la séparation des protéines hydrophobes fait appel à des détergents aussi efficaces que l'ASB-14 à la dernière étape d'un procédé appelé solubilisation séquentielle et dont les premières étapes utilisent divers composés comme les sels ou bien les détergents classiques [Molloy, M.P., Anal. Biochem., 2000, 280, 1-10].35 -7- DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention concerne l'application de tensioactifs hémifluorés de type amidosulfobétaines, F(CF2)i(CH2)mC(0)NH(CH2)äN+(CH3)2(CH2)pSO3-, pour leur capacité à moduler l'extraction et la solubilisation des protéines tissulaires, cellulaires et membranaires, et faciliter ainsi leur analyse en électrophorèse 2D. Cette capacité est due à l'introduction au sein de la structure du tensioactif de type amidosulfobétaine, d'une chaîne perfluorocarbonée de longeur variable. En effet, il est bien connu [Kissa, E., dans "Fluorinated surfactants synthesis, properties, applications", Surfactant science series, Marcel Dekker, New York, 1994] que lorsqu'un fragment hydrocarboné est remplacé par un fragment homologue perfluoré, les propriétés globales du tensioactif sont largement modifiées. Ces modifications sont dues aux caractéristiques particulières de l'atome de fluor et à sa présence en nombre important sur une chaîne carbonée [Smart, B.E, dans "Organofluorine chemistry principles and commercial applications", Banks, R.E., Smart, B.E., Tatlow, J.C., Eds; Plenum Press; New York, 1994]. Il a été montré que : - La liaison C-F est extrêmement stable (chaleur de formation de la liaison C-F : 116 kcal/mole ; chaleur de formation de la liaison C-H : 98,8 kcal/mole) ce qui rend les composés fluorocarbonés inertes vis-à-vis d'un grand nombre de réactifs (acide, base, oxydant, réducteur) - Les composés fluorocarbonés ayant des forces intermoléculaires faibles, possèdent par conséquent des tensions de surface basses (15 à 25 mN/m au lieu de >25 mN/m). - Les valeurs de la CMC sont plus faibles pour les tensioactifs hautement fluorés que pour leurs homologues hydrocarbonés (au moins 10 fois plus faibles) ; par exemple, les valeurs de la CMC des tensioactifs perfluorés en C7ùC8 sont à comparer à celles des homologues hydrocarbonés en C11ùC12 . - Les chaînes fluorocarbonées sont non seulement hydrophobes, mais également oléophobes ; associées à des fragments hydrocarbonés, elles permettent de moduler l'oléophobie (ou la lipophilie) des tensioactifs hémifluorés obtenus. Ce sont toutes ces raisons qui font des tensioactifs hémifluorés, F(CF2)I(CH2)mC(0)NH(CH21,N+(CH3)2(CH2)pSO3 , des candidats potentiels pour l'analyse protéomique, plus particulièrement et à titre non limitatif pour l'extraction et la solubilisation spécifiques de protéines membranaires en vue de leur séparation en électrophorèse bidimensionnelle. Comme nous l'avons dit précédemment, les nouveaux tensioactifs hydocarbonés de type amidosulfobétaïne, ASB-n, ont montré leur efficacité en électrophorèse 2D vis-à-vis d'un grand nombre de protéines membranaires, efficacité modulée par la longueur de la chaîne -8- hydrocarbonée, c'est à dire par les modifications de la partie hydrophobe. C'est pour cette raison que, tout en conservant les propriétés et avantages apportés par la tête polaire des tensioactifs de type ASB-n, nous affirmons que la modification des propriétés hydrophobes et lipophiles de leur queue à la fois par modification de leur longueur et par introduction de fragments perfluorés de longueur variable agit sur leur pouvoir d'extraction et de solubilisation et permet ainsi la mise au point d'analyses protéomiques électrophorétiques directes et séquentielles en jouant sur l'affinité relative des protéines et des tensioactifs revendiqués dans la présente invention avec la phase lipidique. De plus, cette modification par rapport aux tensioactifs amidosulfobétaines totalement hydrocarbonés permet de comparer les effets solubilisants des amidosulfobetaines dans les séries carbonées et fluorées. Ainsi les tensioactifs hémifluorés dont l'utilisation pour l'extraction, la solubilisation de protéines tissulaires, cellulaires et membranaires, suivies d'électrophorèse bidimensionnelle est revendiquée dans la présente invention possèdent au sein de la même structure : - une tête polaire sulfobétaïne, - un connecteur de type amide, - un espaceur hydrocarboné de longueur variable, - un fragment terminal perfluoroalkylé de longueur variable Ils sont représentés par la formule générale (I) de la figure 1. Par analogie avec les ASB-n, ils sont nommés FASB-1,m,n,p. Une voie possible, mais non limitative, pour la synthèse des composés de la présente invention peut être décrite selon le schéma réactionnel résumé dans la figure 3 : pour m = 2 pourm > 2 F-(CF2)1(CH2)2I + Mg 1 1 F-(C F2),(CH2)2MgI 1) CO2 2) HCI F-(CF2)I(CH2)2000H F-(C F2),(CH2)m000H Figure 3 : Exemple non limitatif de schéma réactionnel conduisant à la synthèse des tensioactifs dont l'utilisation est revendiquée dans la présente invention F-(CF2)1(CH2)mC(0)NH(CH2)äN(Me)2 3 =S ùo o F-(C F2) (CH2)mC(0)NH(CH2),N(Me)2(CH2),S03 (I) 30 35 F-(CF2),I + H2C ùCH (CH2)i _2 COOH 1 F-(CF2)1CH2 CI H(CH2),,_2000H Réducteur -9- Les tensioactifs dont l'utilisation en analyse protéomique est revendiquée dans la présente invention sont solubles dans les milieux de réactifs utilisés pour l'analyse bidimensionnelle sur gel et sont adaptés aux conditions physico-chimiques imposées par les techniques de séparation des protéines. Ils permettent d'extraire et de solubiliser les protéines et ils amènent des spécificités d'extraction par rapport aux détergents classiques d'une part et, dans la série fluorée, en fonction des variations de structure d'autre part. Leur caractère oléophobe permet d'envisager un nouveau mécanisme d'extraction protéique membranaire. De plus, ils sont utilisables en analyse séquentielle, avec un minimum d'étapes dans le domaine de l'analyse protéomique. Ils permettent d'offrir un enrichissement en protéines intégrales de membrane en 2ème étape d'une analyse séquentielle, laissant présager des charges protéiques importantes lors des séparations nécessaires en vue d'identification. PARTIE EXPERIMENTALE Les exemples suivants visent à illustrer la présente invention, mais ne sont nullement limitatifs. Exemples de Protocoles expérimentaux de synthèses Exemple 1 : synthèse des acides à chaîne hydrocarbonée courte, 2, F(CF2)1CH2CH2OOOH. 20 Dans un ballon tricol équipé d'un réfrigérant, d'une agitation magnétique, d'une ampoule à brome et sous atmosphère d'azote, on introduit 0,1 mole de magnésium et 25 mL d'éther diéthylique anhydre. A l'aide de l'ampoule à brome, 0,1 mole d'iodure de 2-perfluoroalkyléthyle en solution dans un minimum d'éther anhydre est additionnée pendant 2 heures. L'agitation est 25 maintenue 2 heures supplémentaires à température ambiante, puis le mélange est refroidi par un bain d'eau glacée. 10 g de carboglace sont alors ajoutés par petites fractions et le mélange est maintenu 15 min. sous agitation. La solution est refroidie dans un bain de glace et 50 mL d'une solution aqueuse d'acide sulfurique à 10% sont ajoutés. Les phases aqueuses et éthérées sont séparées. La phase organique est séchée puis évaporée. Le produit obtenu est recristallisé dans 30 l'hexane. Les acides sont obtenus sous la forme de solide et les rendements sont par exemple de l'ordre de 40 et 50% pour C6F13CH2CH2COOH et C4F9CH2CH2OOOH, respectivement. Identification, à titre d'exemple, des acides de formule F(CF )1CH2CH7000H F(CF2)8CH2CH2COOH (commercial) ù F C = 91-92 35 RMN 1H (CDC13) S (en ppm /TMS) : 2,3-2,8 (m, 4, CF2CH2CH2OOOH). -10- RMN 19F (CDC13) S (en ppm /CFC13) : -82,5 (3, CF3); -116 (2, CF2CH2); -122,4 à 123,3 (8, (CF2)4CF2 CF2CH2); -124 (2, CF2CF2CH2) ; -127,5 (2, CF3CF2). F(CF2)6CH2CH2O00H - F C = 63-64 RMN 1H (CDC13) 8 (en ppm /TMS) : 2,3-2,8 (m, 4, CF2CH2CH2OOOH) RMN 19F (CDC13) 8 (en ppm /CFC13) : -82,5 (3, CF3); -116 (2, CF2CH2); -123 (2, CF2CF2CH2); -124 (2, CF2CF2CF2CH2) ; -125 (2, CF3CF2CF2) ; -127,5 (2, CF3CF2). F(CF2)4CH2CH2OOOH - F C = 43-44 RMN 1H (CDC13) S (en ppm /TMS) : 2,3-2,8 (m, 4, CF2CH2CH2OOOH) RMN 19F (CDC13) S (en ppm /CFC13) : -82,5(3, CF3); -116 (2, CF2CH2); -125 (2, CF3CF2CF2) ; 10 -127,5 (2, CF3CF2). Exemple 2 : synthèse des acides à chaîne hydrocarbonée longue, 2', F(CF2)i(CH2)m000H 2.1. synthèse de l'acide 11 perfluorobutylundécanoïque, F(CF2)4(CH2)10000H 15 2.1.1 Synthèse de l'acide 10-iodo-11-perfluorobutylundécanoïque Dans un ballon tricol équipé d'un réfrigérant, d'une agitation magnétique et sous atmosphère d'azote, on introduit 7,5.10-2 mole de C4F9I et 1.10-3 mole d'AIVN. Le mélange est porté à 65 C et 5.10-2 mole d'acide -undécenylique est ensuite lentement ajoutée par petites fractions. Après 12 heures d'agitation à 65 C, le mélange est purifié par distillation et l'adduit iodé est obtenu 20 sous forme d'un liquide visqueux jaune avec un rendement de l'ordre de 90%. 2.1.2 préparation de l'acide 11-perfluorobutylundécanoïque Dans un ballon équipé d'un réfrigérant et d'une agitation magnétique, on introduit 1.10- 2 mole d'adduit iodé synthétisé précédemment et 5.10-2 mole d'acide acétique en solution aqueuse à 20%. Le mélange est chauffé à 70 C et 5.10-3 mole de poudre de zinc métallique sont 25 additionnées par petites fractions. Le mélange est laissé à 70 C sous agitation pendant 12 heures. La solution est ensuite refroidie à température ambiante, le produit étant insoluble dans la solution, le mélange est filtré et rincé à l'eau glacée. Le produit est purifié par recristallisation dans l'hexane. L'acide 11-perfluorobutylundécanoïque est obtenu sous la forme de solide blanc avec un rendement de l'ordre de 56%. 30 Caractérisation : F C = 48-49 RMN IH (MeOD) S (en ppm /TMS) : 1,25 (m, 12,(CH2)6CH2C2H4CO2H); 1,5 (m, 4, CF2CH2CH2(CH2)6CH2); 1,95 (m, 2, CF2CH2(CH2)8CH2CO2H); 2,25 (m, 2, CH2COOH). RMN 19F (MeOD) S (en ppm /CFC13) : -84,5 (3, CF3); -118 (2, CF2CH2); -128,5 (2, 35 CF2CF2CH2); -129,5 (2, CF3CF2). 2899901 -11- 2.2. synthèse de l'acide 11 perfluoroéthylundécanoïque, F(CF2)2(CH2)10000H 2.2.1 synthèse de l'acide 10-iodo-11-perfluoroéthylundécanoïque Dans une ampoule à sceller refroidie dans un bain de glace et munie d'un barreau aimanté, on 5 introduit 5.10-2 mole d'acide co-undécenylique, 1.10-3 mole d'AIVN et 7,5.10-2 mole de C2F51. L'ampoule est gelée dans l'azote liquide puisscellée. Une fois revenue à température ambiante, elle est laissée sous agitation à 70 C pendant 24 heures. L'ampoule est ouverte et le produit est purifié par distillation. L'adduit iodé est obtenu sous forme d'un liquide visqueux jaune avec un rendement de l'ordre de 84%. 2.2.2 Préparation de l'acide 11-perfluoroéthylundécanoïque Le protocole est identique à celui décrit plus haut pour l'homologue perfluorobutylé. Le rendement en 11- perfluoroéthylundécanoïque après purification est de 48%. Caractérisation, à titre d'exemple, de l'acide 11-perfluoroéthylundécanoïque : F C = 37-38 RMN IH (MeOD) S (en ppm /TMS) : 1,25 (m,12,(CH2)6CH2C2H4CO2H); 1,5 (m, 4, CF2CH2CH2(CH2)6CH2); 1,95 (m, 2, CF2CH2(CH2)8CH2CO2H); 2,25 (m, 2, CH2OOOH). RMN 19F (MeOD) 8 (en ppm /CFC13) : -88,5 (3, CF3); -121 (2, CF2CH2). Exemple 3 : synthèse des amides 3 avec n = 3, F(CF2),(CH2)mC(0)NH(CH2)3N(Me)2 Dans un ballon équipé d'un réfrigérant et d'une agitation magnétique, on introduit 1,64.10-3 mole d'acide fluoré 2 ou 2', 1,64.10-3 mole d'EDC et 1,64.104 mole de DMAP et 10mL de dichlorométhane. Après 15 min d'agitation, on ajoute 1,8.10-3 mole de 3-N,N-diméthylamino propylamine. Le mélange est laissé sous agitation pendant 24 heures, puis lavé 3 fois à l'eau. La phase organique est séchée puis évaporée afin d'obtenir le produit souhaité. Les amides sont obtenus avec des rendements compris entre 71 et 86 %. Caractérisation, à titre d'exemple, des amides de formule F(CF21(CH2)I0C(0)NH(CH2 N(CH F(CF2)4(CH2)loC(0)NH(CH2)3N(CH3)2 - F C = 40-41 RMN 1H (MeOD) S (en ppm /TMS) : 1,3 (m, 12,(CH2)6CH2C2H4CO); 1,5 (m, 6, CF2CH2CH2(CH2)6CH2, NHCH2CH2); 2,2 (m, 12, CF2CH2,CH2CO,CH2N(CH3)2); 3,2 (m, 2, NHCH2). RMN 19F (MeOD) S (en ppm /CFC13) : -84,5 (3, CF3); -118 (2, CF2CH2); -128,5 (2, CF2CF2CH2); -129,5 (2, CF3CF2). F(CF2)2(CH2)10C(0)NH(CH2)3N(CH3)2 - Eb C/mmHg =112/7,6.10-3; -12- RMN 1H (MeOD) 5 (en ppm /TMS) : 1,3 (m, 12, (CH2)6CH2C2H4CO); 1,5 (m, 6, CF2CH2CH2(CH2)6CH2, NHCH2CH2); 2,2 (m, 12, CF2CH2,CH2CO,CH2N(CH3)2); 3,2 (m, 2, NHCH2). RMN 19F (MeOD) 8 (en ppm /CFC13) : -88,5 (3, CF3); -121 (2, CF2CH2) Caractérisation, à titre d'exemple, des amides de formule F(CF2.)j(CH,12C(0)NH(CH,bN(CH-112 : F(CF2)8(CH2)2C(0)NH(CH2)3N(CH3)2 ù Eb C/mmHg = 140 / 7,6.10-3 RMN 1H (MeOD) 8 (en ppm /TMS) : 1,65 (m, 2, NHCH2CH2); 2,2 (s, 6, N(CH3)2); 2,35 (m, 2, CH2 N(CH3)2); 2,4-2,6 (m, 4, CF2CH2CH2); 3,15 (t, 2, NHCH2,3J=7 Hz) RMN 19F (CDC13) (en ppm /CFC13) : -82,5 (3, CF3); -116 (2, CF2CH2); -123 (2, (CF2)3CF2CH2); -124 (2, CF2CF2CF2CH2) ; -125 (2, CF3CF2CF2) ; -127,5 (2, CF3CF2). F(CF2)6(CH2)2C(0)NH(CH2)3N(CH3)2 - Eb C/mmHg =128 / 7,6.10-3 RMN 1H (MeOD) 8 (en ppm /TMS) : 1,65 (m, 2, NHCH2CH2); 2,2 (s, 6, N(CH3)2); 2,35 (m, 2, CH2N(CH3)2); 2,4-2,6 (m, 4, CF2CH2CH2); 3,15 (t, 2, NHCH2,3J=7 Hz) RMN 19F (MeOD) 8 (en ppm /CFC13) : -82,5(3, CF3); -117,2 (2, CF2CH2); -122,4 à -123,3 (4, CF3CF2(CF2)2) ; -123,6 (2, CF2CF2CH2); -127,5 (2, CF3CF2). F(CF2)4(CH2)2C(0)NH(CH2)3N(CH3)2 - Eb C/mmHg =121 / 7,6.10-3 RMN 1H (MeOD) 8 (en ppm /TMS) : 1,65 (m, 2, NHCH2CH2); 2,2 (s, 6, N(CH3)2); 2,35 (m, 2, CH2 N(CH3)2); 2,4-2,6 (m, 4, CF2CH2CH2); 3,15 (t, 2, NHCH2,3J=7 Hz) RMN 19F (MeOD) 8 (en ppm /CFC13) : -82,5 (3, CF3); -116 (2, CF2CH2); -125 (2, CF3CF2CF2) ; -127,5 (2, CF3CF2). Exemple 4 : synthèse de détergents (I) avec n = 2 et p = 3 Dans un ballon équipé d'un réfrigérant et d'une agitation magnétique, on introduit 2.10-3 mole d'amide fluoré 3 5.10-3 mole de propane sultone et 20 ml d'un mélange éther diéthylique/acétonitrile (2/1). Le mélange est chauffé à 50 C pendant 24 heures, puis le précipité est filtré et lavé avec de l'acétone afin d'obtenir le tensioactif souhaité, excepté pour les détergents possédant une chaîne perfluorée C2F5, qui sont purifiés par chromatographie sur colonne (éluant : Méthanol). Les détergents sont obtenus avec des rendements compris entre 49 et 66%. Caractérisation des détergents de formule F(CF21(CHI)IOC(0)NH(CH23N+(CHI (CH21SOi F(CF2)4(CH2)2C(0)NH(CH2)3N+(CH3)2(CH2)3SO3 - Indice de réfraction à 25 C : n25 = 1,4430 - 13 - RMN 1H (MeOD) S (en ppm /TMS): 1,3 (m, 12, ,(CH2)6CH2C2H4CO); 1,6 (m, 4, CF2CH2CH2(CH2)6CH2); 1,95 (m, 2, NHCH2CH2); 2,2 (m, 6, CF2CH2,CH2CO,CH2CH2SO3-); 2,85 (m, 2, CH2S03); 3,05 (s, 6, N+(CH3)2); 3,3-3,5 (m, 6, NHCH2,CH2N+(CH3)2CH2). (L'attribution a été confirmée par RMN 2D). RMN 19F (MeOD) S (en ppm /CFC13) : -84,5 (3, CF3,3F); -118 (2, CF2CH2); -128,5 (2, CF2CF2CH2); -129,5 (2, CF3CF2). RMN 13C (MeOD) S (en ppm /TMS) : 18,5 (s, 1, CH2CH2SO3-); 20 (s, 1, CF2CH2CH2); 22(s, 1, NHCH2CH2); 25 (s, 1, CH2CH2CO); 28 (s, 6, CH2(CH2)6CH2); 29,5 (m, 1, CF2CH2); 36 (s, 2,CH2CONHCH2) ; 47 (s, 1, CH2S03-); 50,5 (s, 2, N+(CH3)2); 62 (m, 2, CH2N+(CH3)2CH2). (L'attribution a été confirmée par RMN 2D). Spectre de masse (ESI+) - m/z : 611,4 [M+H]+ ; 633,4 [M+Na]+ ; 1243,7 [2M+Na]+ F(CF2)2(CH2)loC(0)NH(CH2)3N+(CH3)2 (CH2)3SO3 - Eb C/mmHg = 160 / 7,6.10-3 û Indice de réfraction à 25 C : n25 = 1,4280 RMN 1H (MeOD) S (en ppm /TMS) : 1,3 (m, 12, ,(CH2)6CH2C2H4CO); 1,6 (m, 4, CF2CH2CH2(CH2)6CH2); 1,95 (m, 2, NHCH2CH2); 2,2 (m, 6, CF2CH2,CH2CO,CH2CH2SO3-); 2,85 (m, 2, CH2SO3 ); 3,05 (s, 6, N+(CH3)2); 3,3-3,5 (m, 6, NHCH2,CH2N+(CH3)2CH2). (L'attribution a été confirmée par RMN 2D). RMN 19F (MeOD) S (en ppm /CFC13) :-88,5 (3, CF3); -121 (2, CF2CH2) RMN 13C (MeOD) S (en ppm /TMS) : 18,5 (s, 1, CH2CH2SO3); 20 (s, 1, CF2CH2CH2); 22(s, 1, NHCH2CH2); 25 (s, 1, CH2CH2CO); 28 (s, 6, CH2(CH2)6CH2); 29,5 (m, 1, CF2CH2); 36 (s, 2,CH2CONHCH2) ; 47 (s, 1, CH2SO3-); 50,5 (s, 2, N+(CH3)2); 62 (m, 2, CH2N+(CH3.CH2). (L'attribution a été confirmée par RMN 2D). Spectre de masse (ESI+) - m/z : 511,4 [M+H]+; 533,4 [M+Na]+; 1043,7 [2M+Na]+ 25 Caractérisation des détergents de formule F(CFZ)1(CHz)2C(0)NH(CH N+(CH (CH,)35l- : F(CF2)8(CH2)2C(0)NH(CH2)3N+(CH3)2(CH2)3SO3 - Indice de réfraction à 25 C : n25 _ 1,4196 RMN 1H (MeOD) S (en ppm /TMS) : 1,95 (m, 2, NHCH2CH2); 2,2 (m, 2, CH2CH2SO3-); 2,5 (m, 30 4, CF2CH2CH2); 2,85 (m, 2, CH2SO3-); 3,05 (s, 6, N+(CH3)2); 3,3-3,6 (m, 6, NHCH2, CH2N+(CH3)2CH2). (L'attribution a été confirmée par RMN 2D). RMN 19F (MeOD) S (en ppm /CFC13) : -82,5 (3, CF3); -116 (2, CF2CH2); -123 (2, (CF2)3CF2CH2); -124 (2, CF2CF2CF2CH2) ; -125 (2, CF3CF2CF2) ; -127,5 (2, CF3CF2). - 14 - RMN 13C(MeOD) S (en ppm /TMS) : 18,5(s,1, CH2CH2SO3-); 22(s, 1, NHCH2CH2); 26,5 (m, 2, CF2CH2CH2); 36 (s, 1, NHCH2); 47(s,l, CH2SO3-); 50,5 (s, 2, N+(CH3)2); 62 (m, 2, CH2N+(CH3)2CH2). (L'attribution a été confirmée par RMN 2D). Spectre de masse (ESI+) - m/z : 699,3 [M+H]+. F(CF2)6(CH2)2C(0)NH(CH2)3N+(CH3)2 (CH2)3SO3 RMN 1H (MeOD) S (en ppm /TMS) : 1,95 (m, 2, NHCH2CH2); 2,2 (m,2, CH2CH2SO3-); 2,5 (m, 4, CF2CH2CH2); 2,85 (m, 2, CH2SO3-); 3,05 (s, 6, N+(CH3)2); 3,3-3,6 (m, 6, NHCH2CH2N+(CH3)2CH2). (L'attribution a été confirmée par RMN 2D). RMN 19F (MeOD) S (en ppm /CFC13) : -82,5 (3, CF3); -116 (2, CF2CH2); -123 (2, CF2CF2CH2); -124 (2, CF2CF2CF2CH2) ; -125 (2, CF3CF2CF2) ; -127,5 (2, CF3CF2). RMN 13C (MeOD) S (en ppm /TMS) : 18,5(s,1, CH2CH2SO3); 22(s, 1, NHCH2CH2); (s,l, CH2SO3) ; 26,5 (m, 2, CF2CH2CH2); 36 (s, 1, NHCH2); 47(s,l, CH2SO3-); 50,5 (s, 2, N+(CH3)2); 62 (m, 2, CH2N+(CH3)2CH2). Spectre de masse (ESI+) - m/z : 599,3 [M+H]+ ; 621, [M+Na]+ ; 1219,5 [2M+Na]+. F(CF2)4(CH2)2C(0)NH(CH2)3N+(CH3)2 (CH2)3SO3 - F C = 108-109 RMN 1H (MeOD) S (en ppm /TMS) : 1,9 (m, 2, NHCH2CH2); 2,2 (m, 2, CH2CH2SO3-); 2, 5 (m, 4, CF2CH2CH2); 2,85 (m, 2, CH2S03); 3,05 (s, 6, N+(CH3)2); 3,3-3,6 (m, 6, 20 NHCH2,CH2N+(CH3)2CH2). RMN 19F (MeOD) S (en ppm /CFC13) : -82,5 (3, CF3); -116 (2, CF2CH2); -125 (2, CF3CF2CF2) ; -127,5 (2, CF3CF2). RMN 13C (MeOD) S (en ppm /TMS): 18,5(s, 1, CH2CH2SO3); 22(s, 1, NHCH2CH2); 26,5 (m, 2, CF2CH2CH2); 36 (s, 1, NHCH2); 47(s, 1, CH2SO3-); 50,5 (s, 2, N+(CH3)2); 62 (m, 2, 25 CH2N+(CH3)2CH2). Spectre de masse (ESI+) - m/z : 499,3 [M+H]+; 521,3 [M+Na]+; 1209,4 [M+Na]+. Concentrations micellaires critiques (CMC) et Tensions superficielles (ys) A titre d'exemple, nous donnons les valeurs des tensions superficielles (ys) et des concentrations micellaires (CMC) de quelques détergents décrits dans la présente invention. Les mesures ont été effectuées à 30 C dans une solution aqueuse d'éthanol à 10% [Low, T.Y., Seow, T.K., Chung, M.C.M., Proteomics, 2002, 2, 1229-1239] et sont reportées dans le tableau 1. 30 35 2899901 -15Tableau 1 : Valeurs des ys et des CMC de l'ASB-14 et de quelques détergents synthétisés FASB-1,n,m,p Tensioactif CMC Tension de surface FASB-1,m,n,p (mmol/L) à la CMC (mN/m) ASB-14 6,03 0,05 34,3 0,2 FASB-4,2,3,3 1,58 0,05 25,2 0,2 FASB-6,2,3,3 0,31 0,05 22,6 f 0,2 FASB-8,2,3,3 0,16 0,05 18,5 0,2 FASB-2,10,3,3 0,19 f 0,05 22,1 0,2 FASB-4,10,3,3 0,018 0,005 20,5 0,2 Exemples de protocoles expérimentaux d'analyse protéomique 5 I- Exemples de préparation d'échantillons biologiques pour l'analyse électrophorétique 2-D 1-1. Exemple 1 : sur fraction membranaire de testicules de rat La fraction membranaire de testicules de rat est obtenue par broyage au potter de 600 mg de testicule de rat dans 6 ml de tampon 50 mM Tris pH 7.5 contenant un cocktail d'inhibiteur de 10 protéases CompleteTM (1mM EDTA) de chez Roche Applied Science par exemple et à la concentration recommandée par le fournisseur, du [3-glycérophosphate 10 mM et des inhibiteurs de phosphatases orthovanadate de sodium 1mM et fluorure de sodium 50 mM. L' homogénat obtenu est centrifugé 15 minutes à 1500 g pour enlever les noyaux, puis 15 minutes à 8000 g pour ôter les mitochondries. Le surnageant final est ultracentrifugé 40 minutes à 100 000 g. Le 15 culot obtenu est appelé fraction membranaire testiculaire . Ce culot est repris en Tris 25 mM pH 8,5 CompleteTM (1mM EDTA) pour le dosage des protéines. La comparaison sur l'action d'un tensioactif fluoré et de l'ASB-14 se fait en utilisant par exemple 100 g de proteines dans 135 l de tampon d'extraction et solubilisation pour l'IEF qui contient 2M de thiourée, 7M d'urée purifié préalablement par des billes échangeuses d'ions Amberlite AMB150 (10 mg/mi), 46 mM de ASB-14 ou 23 mM de tensioactif FASB-8,2,3,3, 65mM de DTT, 0,8% (w/v) d'ampholines pH 3-10 et le cocktail d'inhibiteurs de protéases CompleteTM (1 mM EDTA). Après une heure à T ambiante, l'échantillon est centrifugé à 20 000g à 16 dans une mini- centrifugeuse de type Eppendorff. Le surnageant est complété à 155 l par du tampon d'extraction et solubilisation pour l'IEF et deviendra l'échantillon de l'analyse 2D. Il sera introduit dans la bandelette IPG de 7 cm ayant un gradient de pH 3-10 par réhydratation du gel toute la nuit par exemple. Cette technique est dite In-Gel [Rabilloud, T., Valette, C., Lawrence, J., Electrophoresis, 1994, 15, 1552-1558 ; Sanchez, J.C., Rouge, V, Pisteur, M., -16- Ravier, F., Tonella, L., Moosmayer M., Wilkins, M.R., Hochstrasser, D.F, Electrophoresis, 1997, 18, 324-327]. I-2. Exemple 2 : sur membrane de globule rouge humain Les globules rouges humains (RBC) sont obtenus à partir d'un pool de sang humain normal prélevé sur anticoagulant, puis fractionné sur gradient discontinu de Percoll [Giudicelli, J., Philip, P.J.M., Delque, P., Sudaka, P., J. Immunological Methods, 1982, 54, 43-46] les séparant ainsi de deux fractions leucocytaires, granulocytes et plaquettes. Les globules rouges isolés sont ensuite lysés, puis lavés à 4 C en tampon phosphate 5mM, en présence d'inhibiteurs de protéases, ici le mélange CompleteTm (EDTA 1 mM) de chez Roche Applied Science. Chaque lavage est suivi d'une ultracentrifugation à 100 000 g pendant 40 minutes à 4 C. Après dosage des protéines, les membranes sont aliquotées et conservées à- 80 C. La quantité de membranes à séparer (180 g par analyse) subit un autre lavage dans le même tampon, puis est centrifugée à 100 000 g et est ensuite placée en présence du tampon d'extraction et solubilisation pour l'IEF, contenant 2M de thiourée, 7M d'urée comme agents chaotropiques mélange purifié préalablement par des billes échangeuses d'ions Amberlite AMB150 (10 mg/mi), 65mM de DTT, 0,8% (w/v) d'ampholines pH 4-7, le cocktail d'inhibiteurs de protéases Complete'rm (EDTA 1 mM) et 65 mM CHAPS ou 46 mM de ASB-14. Les surfactants fluorés dans ce mélange sont aussi utilisés à la concentration de 46 mM pour FASB-4,2,3,3 ou FASB-4,10,3,3 sauf FASB-8,2,3,3 utilisé à 23 mM pour une meilleure solubilisation dans la solution chaotropique. Après une heure à température ambiante, l'échantillon est centrifugé une heure à 20 000 g dans une mini-centrifugeuse de type Eppendorff et à 16 C. Les surnageants (SN1) sont obtenus par action de nos tensioactifs fluorés ou de détergents classiques pour une étude comparative. Ils sont donc les échantillons de l'analyse bidimensionnelle et sont introduits dans la bandelette d'IPG de 7 cm par une technique InGel (voir précédemment) sous un volume ajusté à 155 l pour l'IEF. Dans quelques expériences, une analyse bidimensionnelle sur gel du culot restant est réalisée. Pour cela, le culot est lavé avec 200 gl de tampon phosphate 5 mM pH 7,4 à 4 C et centrifugé 30 minutes à 20 000g. Ce lavage est répété trois fois. Trois culots sont regroupés et mélangés à 150 l de tampon d'extraction et solubilisation pour l'IEF contenant l'ASB-14 à 46 mM. La réaction se fait à 20 C pendant 60 minutes et est suivie d'une centrifugation à 20 000g pendant 60 minutes à 16 C. Cela permet de récupérer un surnageant (SN2) de 14511l qui est ensuite ajusté à 155 l dans le tampon d'extraction et solubilisation pour l'IEF contenant l'ASB-14. II- Exemple d'analyse protéomique par analyse bidimensionnelle II-1. Exemple de conditions opératoires pour la focalisation isoélectrique La séparation analytique commence par la focalisation programmée sous huile et à 20 C [Gôrg, 35 A., Postel, W., Friedrich, C., Strahler J.R., Hanash, S.M., Electrophoresis, 1991,12, 653-658] en - 17 - utilisant, par exemple et à titre non limitatif, l'appareil Multiphor II connecté au générateur EPS XL 3500 (Amersham Biosciences). Pour les IPG de 7 cm de pH 3-10, on utilise un mode Gradient dans la distribution de volts, c'est à dire, montée progressive à 3500 volts pendant 1h 30 puis plateau à 3500 V pour atteindre 7500 Vh. Le courant est limité à 2 mA, la puissance à 5 W. Pour les IPG 4-7, essentiellement utilisés pour les membranes de globules rouges, nous atteignons 8000 Vh. Les IPG peuvent être conservés à -80 C jusqu'à utilisation pour la seconde dimension. II-2. Exemple d'équilibrage L'échantillon séparé en première dimension dans la bandelette d'IPG doit être dénaturé pour la 2eme dimension en milieu SDS. L'équilibrage des IPG pour la 2eme dimension se fait, par exemple, dans une solution contenant 30% de glycérol (wlv); 6M urée, 0,25 %(w/v) de bleu de bromophénol dans 50 mM Tris-HC1 pH8,8 [Gôrg, A., Obennaier, C., Boguth, G., Csordas, A., Diaz, J.J., Madjar, J.J., Electrophoresis, 1997, 18, 328-337] modifiée par 1 mM EDTA [Westermeier, R. (ed.) Electrophoresis in practice. VCH, Weinheim, 1993 p.170] et 3 ou 4 % SDS. Dans un premier temps, la bandelette est équilibrée dans la solution précédente en présence de 65 mM de DTT. Dans un deuxième temps, la solution d'équilibration contient 260 mM d'iodoacétamide, chaque étape d'équilibration durant 15 minutes dans nos exemples. II-3. Exemple d'électrophorèse de 2 e dimension (SDS PAGE) La seconde dimension se fait en condition dénaturante dans un gel d'acrylamide/bis-acrylamide, par exemple, 10 %T, 2,6 %C selon la terminologie de Hjertén [Hjertén, S., Arch. Biochem. Biophys. Suppl., 1962, 1, 147-151]. L'agent dénaturant est le sodium dodécylsulfate (SDS) à 0,1 % dans le gel et dans le tampon d'électrode. Cette 2eme dimension est réalisée par exemple verticalement avec le système de tampons de Laemmli [Laemmli, U.K., Nature 1970, 227, 680-685] mais sans gel de concentration. La bandelette d'IPG équilibrée comme défini en II-2 est déposée sur le gel de 2e dimension et fixée par de l'agarose 0,8 %. La migration s'effectue à 10 mA par gel par exemple pour les mini-gels 1,5x 80 x 70 mm utilisés pour la fraction membranaire testiculaire de rat et 25 mA par gel par exemple pour les gels de polyacrylamide 1,5 x 180 x170 mm utilisés pour la membrane de globule rouge humain. A la fm de la migration les gels sont fixés en méthanol 40%, acide acétique 10%. II-4. Exemple de détection Les spots protéiques résultant de la séparation en deux dimensions sont révélés par une coloration au nitrate d'argent (de sensibilité égale à o, l ng protéine/mm2 de gel). On utilise par exemple la méthode de Blum [Blum, H., Beier, H., Gross, H.J., Electrophoresis, 1987, 8, 93-99]. Les gels sont scannés avant séchage pour une acquisition de l'image.35 -18- Exemples de résultats de solubilisation et d'électrophorèse bidimensionnelle Bien qu'il y ait une décroissance de la CMC en utilisant les surfactants fluorés par rapport à leurs homologues carbonés, dans nos exemples et à titre comparatif, les surfactants fluorés sont utilisés à des concentrations similaires à celles où l'ASB-14 est utilisé en analyse protéomique. Afin d'illustrer la présente invention, nous présentons ici, à titre d'exemples non limitatif, les résultats obtenus sur des milieux biologiques complexes comme le sont les tissus, les cellules, les membranes en amenant toutefois un enrichissement membranaire : i) la fraction membranaire de tissu testiculaire de rat et ii) la membrane purifiée du globule rouge humain. Exemple 1 (figure 4) : Analyse bidimensionnelle sur une fraction membranaire de testicule de 10 rat Le couplage de deux modes de séparations (1EF et SDS-PAGE) agissant sur deux caractéristiques physico-chimiques différentes résulte en l'apparition, sur le gel de deuxième dimension, de spots polypeptidiques après détection par une coloration à l'argent. La comparaison des gels 2-D correspondants à une fraction membranaire de testicule de rat 15 (membranes plasmiques, golgiennes et lysosomiales) extraite et solubilisée en présence d'ASB-14 (Figure 4a) et de FASB-8,2,3,3 (Figure 4b) est réalisée. La traînée verticale en zone acide (Figure 4b) pourrait révéler : trop de protéines focalisées en bout de gradient de pH, une trop forte concentration du tensioactif fluoré à la 1è`e dimension et donc non déplacé par le SDS à la 2ème dimension malgré son utilisation à 3% dans cette expérience. La zone indiquée par R 20 (Figure 4a) montre des spots de meilleure résolution en ASB-14. Les flèches indiquent 5 spots ou trains de spots supplémentaires en ASB-14 (Figure 4a) et trois spots supplémentaires en FASB-8,2,3,3 (Figure 4b) montrant ainsi une spécificité d'action. Exemple 2 (figure 5 et 6) : Analyse bidimensionnelle sur la membrane purifiée de globule rouge 25 humain Prenons à titre d'exemples, les structures fluorées synthétisées, FASB-4,10,3,3, FASB-8,2,3,3 et FASB-4,2,3,3 utilisées en extraction et solubilisation suivi d'analyse bidimensionnelle sur gel et comparées aux détergents classiques : ASB-14 et CHAPS. 30 Comme on peut le voir sur les figures n 5 et 6, l'analyse bidimensionnelle sur gel de membrane purifiée de globule rouge humain révèle des spots isolés ou en train avec de faibles variations de points isoélectriques ou isoformes, pouvant résulter de modifications post-traductionnelles. Il nous est possible de repérer quelques molécules connues sur nos gels : -la protéine transporteur d'anion appelée Bande III (banques NCBIISWISS-PROT n 35 d'accession P02730) est connue pour son caractère transmembranaire avec douze domaines transmembranaires. Elle apparaît dans le surnageant SN1 sur le gel utilisant l'ASB-14 (Figure -19- 5a). C'est le spot majoritaire (Mr.10-3/pI :104,31/5,18) ; son niveau d'expression nous laisse également présumer de la bonne qualité de notre préparation membranaire, la Bande III pouvant être sujette à protéolyse lors des préparations membranaires longues et lors de séparations aussi longues que l'analyse bidimensionnelle [Oliveri, E., Herbert, B., Righetti, P.G., Electrophoresis, 2001, 22, 560-565]. -L'actine cytoplasmique 1 ou (3-actine (banques NCBI/SWISS-PROT n d'accession P02570) est une protéine du cytosquelette dans la cellule. Cette protéine ubiquitaire est en interaction avec la membrane par des liaisons non covalentes. C'est donc un contaminant incontournable des préparations. Elle apparaît en electrophorèse 2D avec ses trois isoformes (Mr.10-3/pI : 44,49/5,16 ; 44,49/5,27 ; 45,12/5,39) et est présente sur tous les types de gels que nous avons réalisés (Figures 5 et 6) La figure 5 illustre par des gels 2D à la fois une extraction, solubilisation et séparation des surnageants (SN1) de membrane de globule rouge résultant de l'action du tampon d'extraction-solubilisation en ASB 14 (Figure 5a) et en FASB-4,10,3,3 (Figure 5b) et aussi une solubilisation séquentielle incorporant une deuxième étape (Figure 5c). Cette deuxième étape concerne l'extraction et la solubilisation du culot proteique obtenu après action de FASB-4,10,3,3. Ce culot resolubilisé par du tampon d'extraction-solubilisation en ASB-14 donne naissance à un surnageant (SN2). La figure 5 montre qu'un nombre de spots relativement important est présent lors de l'utilisation de FASB-4,10,3,3 (Figure 5b). Il semble donc que l'extraction en surfactant fluoré est quantitativement similaire à celle d'un détergent de type amidosulfobétaïne classique en série carbonée (Figure 5a). La différence majeure entre les deux surnageants SNI est la présence de la Bande III, notre protéine intégrale de référence lors de l'extraction en ASB 14 (Figure 5a) et l'absence totale de cette protéine intégrale de membrane lors de l'extraction en FABS-4,10,3,3 (Figure 5b). Par contre la présence de la Bande III, dans l'analyse 2-D du surnageant SN2 (Figure 5c) représentant les protéines non extraites par le surfactant fluoré, confirme le caractère relativement oléophobe de ce type de surfactant. Cette caractéristique s'exprime par une loi du tout ou rien en analyse séquentielle par rapport à une action successive de détergents classiques qui peut amener des recouvrements de spots entre gels [Molloy, M.P., Anal. Biochem., 2000, 280, 1-10]. En utilisant un de nos surfactants fluorés en première étape, nous sommes donc en mesure de réaliser une analyse séquentielle en deux étapes dans le but d'enrichir un milieu en protéines intégrales. Dans cette figure 5c, on peut aussi apercevoir d'autres spots ou trains de spots faiblement exprimés. Quelques autres molécules très hydrophobes existent dans la membrane de globule rouge [Low, T.Y., Seow, T.K., Chung, M.C.M., Proteomics 2002,2,1229-1239]. -20- Les résultats peuvent aussi être analysés par la spécificité d'action des surfactants utilisés. Le gel 2-D résultant de l'extraction, solubilisation, séparation en FASB-4,10,3,3 (Figure 5b) indique des différences d'expression de polypeptides faiblement représentés lorsqu'on les compare au gel résultant de l'extraction, solubilisation et séparation en ASB-14 (Figure 5a). Outre la bande III, cette spécificité se manifeste par quelques spots absents ou moins exprimés dans le cas de FASB- 4,10,3,3 par rapport à ASB-14. Il y a aussi quelques groupes de spots apparaissant pour FASB 4-10,3,3 dans les trois encadrements de la figure 5b qui n'existent pas en figure 5a. En figure 6, nous comparons aussi les gels 2-D des membranes de globules rouges après extraction-solubilisation par nos surfactants fluorés et par un détergent classique, le CHAPS, peu efficace dans l'extraction de la Bande III. Nous comptabilisons par un système informatisé d'analyse d'images 229 spots en CHAPS (Figure 6a), 255 spots en FASB-4,10,3,3 (Figure 6b), 244 spots pour FASB-8,2,3,3 (Figure 6c) montrant un grand nombre d'espèces protéiques solubilisées avec nos surfactants fluorés. Quelques spots sont mieux exprimés en FASB-4,10,3,3 (Figure 6b) par rapport au CHAPS (Figure 6a) et sont indiqués dans la figure. Nous comparons aussi les surfactants fluorés choisis dans cet exemple, entre eux. Des différences d'extraction et solubilisation sont également mises en évidence dans les figures 6b, 6c et sont indiquées par des encadrements respectifs sur les différentes parties de la figure 6. Cette propriété s'étend aussi au surfactant fluoré FASB-4,2,3,3 dont le mode d'action semble quelque peu différent (Figure 6d) : Il présente également une extraction spécifique sur certains spots. Toutefois la distribution des spots est atypique en figure 6d et le gel présente moins de spots qu'en utilisant les autres structures. Nos composés fluorés permettent donc une modulation dans l'extraction qui entraînera une modulation dans l'analyse séquentielle. 30 35 REVENDICATIONS 1) Utilisation des composés hémifluorés zwittérioniques de type amidosulfobétaïne répondant à la formule générale suivante : O F-(CF2)iù(CH2)m/C^.N(CH2)n (CH2)p ùs03 nl H CH/3 \CH3 10 dans laquelle 1 = 2, 4, 6, 8 ou 10, m est un nombre entier allant de 2 à 12, n et p sont des nombres entiers supérieurs ou égaux à 1, comme agents tensioactifs pour l'extraction et/ou la solubilisation de 15 protéines tissulaires, cellulaires et membranaires, en présence d'autres agents fluorés ou non et en présence d'électrolytes ou non. 2) Utilisation des composés selon la revendication 1, dans lesquels m est égal à 2 ou à 10, n et p sont égaux à 3 comme agents d'extraction et/ou de solubilisation de protéines tissulaires, 20 cellulaires et membranaires, en présence d'autres agents fluorés ou non et en présence d'électrolytes ou non. 3) Application des composés des revendications 1 et 2 dans le domaine de l'analyse protéomique, plus précisément par utilisation de techniques d'électrophorèse 2-D et 25 éventuellement en association avec d'autres tensioactifs et des électrolytes. 4) Procédés d'extraction et/ou de solubilisation de protéines tissulaires, cellulaires et membranaires en présence d'autres agents fluorés ou non et en présence d'électrolytes ou non, utilisant les composés selon revendications 1, 2 et 3 (1) 30 ** *- 23 - REVENDICATIONS 1) Utilisation des composés hémifluorés zwittérioniques de type amidosulfobétaïne répondant à la formule générale suivante : 0 F-(CF2)1ù(CH2)m-'C' V (CH2)n (CH2)P ùS03 N H CH/ "CH3 dans laquelle 1 = 2, 4, 6, 8 ou 10, m est un nombre entier allant de 2 à 12, n et p sont des nombres entiers supérieurs ou égaux à 1, comme agents tensioactifs pour l'extraction et/ou la solubilisation de protéines tissulaires, cellulaires et membranaires, en présence d'autres agents fluorés ou non et en présence d'électrolytes ou non. 2) Utilisation des composés selon la revendication 1, dans lesquels m est égal à 2 ou à 10, n et p sont égaux à 3 comme agents d'extraction et/ou de solubilisation de protéines tissulaires, cellulaires et membranaires, en présence d'autres agents fluorés ou non et en présence d'électrolytes ou non. 3) Application des composés des revendications 1 et 2 dans le domaine de l'analyse protéomique, plus précisément par utilisation de techniques d'électrophorèse 2-D et éventuellement en association avec d'autres tensioactifs et des électrolytes. 4) Procédés d'extraction et/ou de solubilisation de protéines tissulaires, cellulaires et membranaires en présence d'autres agents fluorés ou non et en présence d'électrolytes ou non, utilisant les composés selon revendications là 3 ** * (I) 30 35