FR 2906260 A1 20080328 FR 0608425 A 20060926 1 Procédé d'analyse de substrats de décontamination La présente invention concerne un nouveau procédé d'analyse de substrats de décontamination, tels que des substrats contenus dans des bioréacteurs, ledit substrat comprenant des microorganismes compétents, appropriés pour le traitement d'effluents, notamment d'effluents phytosanitaires, en particulier pour des traitements de décontamination des sols. Le procédé selon l'invention permet d'identifier à la fois les caractéristiques intrinsèques du substrat, la quantité de microorganismes compétents et l'état physiologique desdits microorganismes compétents. Il permet en particulier de déterminer la capacité du substrat à décontaminer. Les bioréacteurs comprenant un lit biologique ou substrat sont notamment employés en agriculture pour le traitement des effluents phytosanitaires. De tels lits sont bien connus de l'homme du métier (et ont été décrits par exemple par Fogg et al, 2003. Pest Manag Sci 59:527-537). De tels bioréacteurs sont notamment décrits dans la demande de brevet FR 06 00739 déposée le 26 janvier 2006. Le lit biologique est généralement confiné dans un volume déterminé. Ce volume peut être déterminé par un contenant approprié, comme par exemple un ou plusieurs réservoirs ou cuves, dans lesquels circulent les effluents à traiter. Il peut également s'agir d'un espace canalisé dit à ciel ouvert ou même plus largement d'un espace naturel dont le sol permet le traitement des effluents, comme des champs dits d'épandage. Le substrat comprend un support solide comprenant des microorganismes compétents pour mettre en oeuvre une ou plusieurs réactions biologiques de décontamination intervenant dans le traitement des effluents. Le support solide permet donc notamment d'apporter aux microorganismes les moyens nécessaires à leur croissance et à leur activité. Ils peuvent être synthétiques ou naturels, leur composition étant bien connue de l'homme du métier (cf références supra). Il s'agit généralement de mélanges de matières organiques et minérales. Un mode de réalisation particulier des substrats pour bioréacteurs microbiens comprend des prélèvements de sols comme substrats, de la terre en particulier, éventuellement supplémentés par l'ajout de composants organiques et/ou minéraux susceptibles de favoriser la croissance des microorganismes compétents et leur activité. Le substrat peut aussi être constitué de sols contaminés, par exemples les sols de sites industriels, qui peuvent être transportés ou non pour une phase de décontamination, cette décontamination pouvant résulter de l'action de microorganismes présents dans le sol ou encore après inoculation de microorganismes appropriés (seuls ou supportés par un substrat approprié). 2906260 2 Il y a aujourd'hui une demande de suivi du fonctionnement des substrats de décontamination, notamment substrats de bioréacteurs ou lits biologiques, de la part des utilisateurs pour vérifier leur fonctionnement, effectuer un diagnostic pour entretien éventuel, régénération et épandage du substrat. 5 Il n'existe pas à ce jour de solution à ce problème, toutes les solutions envisagées procurant des informations parcellaires. En différence aux analyses ponctuelles d'un état à un instant donné d'un substrat, on cherche à connaître l'efficacité d'une ou de plusieurs fonctions et du potentiel à maintenir cette efficacité puisque le bioréacteur peut être employé en marche en continu. 10 Les analyses classiques comme celle de la réactivité ou l'activité potentielle des microorganismes ne permettent pas de prendre en compte les stress et la capacité des microorganismes à réagir aux stress. D'autres analyses nécessitent l'analyse d'échantillon obligatoirement "frais". Ces échantillons frais sont des échantillons conservés humides et analysés rapidement après 15 prélèvement. Outre les problèmes de traitement de ces échantillons, ceci ne renseigne ni sur l'activité potentielle ni sur la rapidité de mise en action de cette microflore. On peut aussi effectuer le dosage du produit à dégrader mais ce type d'analyse donne également des résultats incomplets et incertains. L'analyse à l'instant T de ce qui reste dans un dispositif alimenté en continu par des effluents dont la concentration et le 20 volume ne peuvent qu'être estimés grossièrement sera difficile à interpréter. L'absence du contaminant au moment de l'analyse ne préjuge pas que le dispositif sera encore capable de décontaminer dans l'avenir. Dans le cas de bioréacteurs destinés à dégrader des polluants multiples comme les produits phytosanitaires, il y aura trop de produits à doser, augmentant les coûts et les difficultés d'interprétation des résultats. 25 Le procédé objet de la présente invention est compatible avec l'analyse en série qui évite la contrainte apportée par l'analyse obligatoire d'échantillons de "sol frais". Il est entendu que le procédé selon l'invention peut s'appliquer aux échantillons dits frais comme aux échantillons stockés à l'état sec ou humide pendant de longues périodes, par exemple à basse température (de l'ordre de 2 à 5 C) sur une période allant jusqu'à 1 ou 2 30 ans, voire plus. La présente invention concerne donc un procédé d'analyse de substrats de décontamination, tels que des substrats contenus dans des bioréacteurs microbiens, ledit substrat comprenant des microorganismes compétents pour mettre en oeuvre une ou plusieurs réactions biologiques de décontamination, plus particulièrement de bioréacteurs 35 utilisés notamment pour le traitement des effluents, en particulier d'effluents phytosanitaires. Le procédé selon l'invention consiste à analyser à la fois : a. les caractéristiques intrinsèques du substrat, b. la quantité de microorganismes compétents, et 2906260 3 c. l'état physiologique desdits microorganismes compétents, et d. l'activité desdits microorganismes, à comparer les résultats obtenus à au moins une valeur de référence pour chaque paramètre analysé de façon à mettre en évidence les différences entre la valeur obtenue 5 pour chacun des paramètres analysés. Les microorganismes compétents pour mettre en oeuvre une ou plusieurs réactions biologiques de décontamination sont des microorganismes, bactéries, levures ou champignons, que l'on trouve naturellement dans les sols. Il peut s'agir également de microorganismes modifiés, par génie génétique ou par simple culture sous pression de 10 sélection. Ces microorganismes modifiés sont optimisés pour la réalisation de réactions biologiques particulières de décontamination dans les conditions d'utilisation du substrat de décontamination. Par décontamination, on entend selon l'invention le fait d'éliminer un ou plusieurs contaminants d'un milieu biologique, qu'il s'agisse d'un liquide, dans ce cas on parlera de 15 traitement d'effluents, ou d'un solide, en particulier un sol. Ces contaminants sont généralement le résultat d'activités industrielles et agricoles, comme, par exemple, l'épandage de produits phytosanitaires ou la contamination des sols de sites industriels. Les microorganismes compétents comme les contaminants et les réactions de 20 décontamination sont bien connus de l'homme du métier (voir par exemple pour la décontamination des produits phytosanitaires: Soil ecotbxicology, eds. Tarradellas J., Bitton G., Rossel D., 1996, CRC Lewis publishers). Bien entendu, le procédé pourra être aisément adapté à des substrats de décontamination de tout type de contaminant. La valeur de référence, pour chaque paramètre analysé est de préférence choisie 25 parmi une référence standard , et/ou une référence préalablement déterminée correspondant à l'analyse du substrat à un moment déterminé. La référence standard sera avantageusement identifiée à partir de données de la littérature et/ou de résultats d'analyses préalablement effectuées. Ces données sont de préférence contenues dans une base de données sur tout support approprié. 30 La comparaison avec une valeur standard donne une information de caractère statique sur l'état du substrat au moment de l'analyse. La comparaison avec une valeur préalablement déterminée à un moment déterminé permet d'obtenir des informations dynamiques sur l'évolution du substrat dans le temps en fonction de ses paramètres de fonctionnement. 35 L'analyse de l'activité des microorganismes compétents permet d'obtenir des informations sur leur capacité à dégrader les contaminants dans les effluents à traiter. Ces différences constituent un ou plusieurs indicateurs de l'état du substrat et des microorganismes par rapport au substrat et aux microorganismes (le référence permettant 2906260 4 de caractériser le substrat, son efficacité dans une opération de décontamination donnée et sa capacité à maintenir cette efficacité. De manière avantageuse, le procédé selon l'invention comprend en outre l'analyse et la comparaison avec une valeur de référence correspondante d'au moins une des 5 caractéristiques additionnelles suivantes : e. l'adaptation des microorganismes à mettre en oeuvre la ou les réactions biologiques appropriées, et f. la biodiversité des microorganismes. La dernière analyse est plus particulièrement adaptée à un substrat approprié pour la 10 réalisation de plusieurs réactions biologiques nécessitant plusieurs types de microorganismes compétents, soit indépendants, soit complémentaires. Les analyses ci-dessus, effectuées dans le procédé selon l'invention, peuvent être réalisées simultanément ou de manière séquentielle. Dans le cas d'analyses réalisées de manière séquentielle, la réalisation de l'analyse suivante peut être conditionnée par les 15 résultats de l'analyse précédente. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les analyses sont effectuées de manière séquentielle, dans l'ordre exposé ci-dessus. Pour chacune des caractéristiques analysées, une ou plusieurs méthodes peuvent être employées. Le fait d'employer plusieurs méthodes d'analyse pour une caractéristique donnée permet de réunir des informations sur plusieurs paramètres et donc d'améliorer la 20 pertinence de l'analyse. Les méthodes d'analyse employées sont bien connues de l'homme du métier de manière isolée. On citera notamment les méthodes ci-dessous, utilisées pour les analyses de sol, qui peuvent être employées seules ou en combinaisons. 25 = Les caractéristiques du substrat o Les méthodes connues de la littérature comme celles décrites dans Manual for Soil Analysis -Monitoring and Assessing Soil Bioremediation. (Edited by Margesin, Rosa; Schinner, Franz (Springer 2005)). o Analyse des caractéristiques physico-chimiques, notamment pH, présence 30 d'éléments minéraux nécessaires à la croissance (Evaluation de la qualité des sols, AFNOR, 2004, volumes 1 et 2). o Analyse de la capacité à maintenir une Biomasse microbienne, notamment matières organiques totales et minéralisables. (Evaluation de la qualité des sols, AFNOR, 2004, volume 2). 35 o Analyse de la présence de composés toxiques pour les microorganismes (par exemple Hendricks C. W. 1996. In Soil ecotoxicology, eds. Tarradellas J., Bitton G., Rossel D., pp235-269. CRC Lewis publishers). 2906260 5 • La quantité de microorganismes o Biomasse ^ Méthode par fumigationextraction (AFNOR X31-227) ^ Méthode par respiration induite (AFNOR X31-226) 5 ^ Détermination des PLFA/PhosphoLipids Fatty Acids, par exemple décrite par Frostegard & Baath (1996. Biology and Fertility of Soils 22 (1/2) : 59-65) ^ Méthode moléculaire, par exemple décrite par Martin-Laurent & al. (2003. Pest Manag. Sci. 59:259-268) o Dénombrement 10 ^ Dénombrement des microorganismes par toute technique de culture en plaque ou par détermination du nombre le plus probable en culture liquide ou à l'aide de cultures en microplaques (par exemple Gamo M. Shoji T., 1999, Applied Env. Microbiol., 65:4419-4424) ^ Dénombrement des microorganismes par comptage au microscope selon les 15 méthodes usuelles ^ Dénombrement des microorganismes par Cytométrie en flux comme par exemple Resina-Pelfort et al (2003. FEMS Microbiology Ecology 43 (1) : 55-61) ^ Détermination des activités métaboliques respectives des champignons et 20 des bactéries par l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques (par exemple Anderson J. P. E., Domsch K. H. 1975. Canadian Journal of Microbiology 21 (3) : 314-322.). o Présence de microorganismes pathogènes pour l'homme, les animaux, et les cultures en utilisant les méthodes classiques connues (voir par exemple la norme 25 AFNOR NF T 90-420 et les autres normes complémentaires). Cette dernière analyse sera particulièrement importante en vue de l'épandage du substrat en fin de cycle d'utilisation du procédé de décontamination (tous les 4 ou 5 ans environ). 30 • Leur état physiologique o Détermination de la respiration et du quotient métabolique (par exemple Anderson T. H., Domsch K. H. 1993. Soil Biology & Biochemistry 25 (3) : 393-395). o Mesure du ratio entre les acides ribonucléiques/ARN et les acides 35 désoxvribonucléiques/ADN. (par exemple Ka J. O., Yu Z., Mollit W. W. 2001. Microbial Ecology 42 (3) : 267-273). 2906260 6 o Détermination de la réactivité métabolique après l'application de stress au substrat (teneur en eau, aération, produits toxiques pour la microflore du sol) et tout autre stress naturel ou provoqué : 1. par mesure de la respiration, du quotient métabolique, du ratio 5 ARN/ADN comme décrit précédemment. 2. par détermination des cinétiques de croissance et/ou de transformations métaboliques de substrats carbonés, toxiques ou non pour la microflore comme par exemple Mondini& Insam (2003. European Journal of Soil Biology 39 (3) : 141-148). 10 3. par utilisation de tout biocapteur permettant de suivre l'activité métabolique de la microflore des sols comme par exemple Hollis & al. (2000. Applied Env. Microbiol. 66:1676-1679.). 4. par l'utilisation de puces à ADN ou bio-puces permettant de détecter l'état d'activités enzymatiques rendant compte de l'activité métabolique 15 générale des microorganismes (Kelly, J. J. 2003. Soit Science 168 (9) : 597-605). • Leur adaptation à mettre en oeuvre une activité de dégradation de tout substrat organique, produit phytosanitaire ou polluants organiques de toute nature 20 o Activités enzymatiques (Morra, M. J. 1997. In Manual of environmental microbiology, Eds Hurst, C. J.; Knudsen, G. R.; McInerney, M. J.; Stetzenbach, L. D.; Walter, M. V. pp. : 459-465, American Society for Microbiology (ASM); Washington; USA). o Mesure d'activités liées au fonctionnement microbiologique du substrat 25 ^ Mesure du potentiel de dégradation de composés organiques utilisant des molécules marquées au carbone 14 comme par exemple pour les produits phytosanitaires (par exemple Puitti S., 2002. .Biol Fertil Soils 36:434-441). ^ Présence de gènes de fonctions clés dans la dégradation ou toute 30 autre fonction d'intérêt dans le dispositif. (par exemple : Martin-Laurent F. et al. 2004. FEMS Micobiol. Ecol. 48:425-435.). ^ Estimation de l'activité dégradante utilisant des biocapteurs spécifiques d'une réaction clé dans le processus de dégradation d'un polluant à dégrader (par exemple Bundy J. G., Paton G. I., Campbell C. D. 2004. 35 Soil Biology & Biochemistry 36 (7) : 1149-1159) ou de bio-puces adaptées à ces polluants (par exemple Rhee, S. K. ; Liu, X. D.; Wu, L. Y.; Chong, S. C.; Wan, X. F.; Zhou, J. Z. 2004. Applied and Environmental Microbiology 70 (7) : 4303-4317). 2906260 7 ^ Dénombrement des microorganismes dégradant des substrats carbonés à éliminer comme par exemple pour les produits phytosanitaires (par exemple Fournier J.C., 1980. Chemosphere 9:169-174). 5 • Leur Biodiversité: o La détermination de la biodiversité métabolique notamment: en utilisant des plaques de type Biolog comme par exemple Garland & Lehman (1999. FEMS Microbiology Ecology 30 (4) : 333-343). o La détermination de la biodiversité génomique par exemple par l'analyse 10 des profils RISA (Ranjard et al., (2003). Environ. Microbiol. 5:1111-1120), l'analyse des profils ARDRA et par toute autre méthode appropriée. Les données obtenues sont comparées à des données correspondantes de référence. De manière avantageuse, les données de référence sont contenues dans une base de 15 données. Cette base de données est avantageusement alimentée avec les résultats des études réalisées par le procédé selon l'invention ou toute source d'information pertinente disponible, littérature scientifique notamment. Cet enrichissement de la base de données est un facteur important pour améliorer la pertinence du diagnostic réalisé par le procédé selon l'invention. 20 La base de données peut être supportée par tout support approprié, usuel pour ce type de bases de données, en particulier sous un format électronique approprié pour la gestion de bases de données. La Figure 1 représente un mode particulier de réalisation du procédé selon l'invention où les analyses sont effectuées de manière séquentielle. Il s'agit d'une analyse 25 du substrat d'un bioréacteur microbien utilisé pour le traitement des effluents phytosanitaires avec un schéma décisionnel. La Figure 2 représente un tableau récapitulatif des données analysées pour un bioréacteur utilisé pour le traitement d'effluents phytosanitaires avec du sol comme substrat. 30 Les résultats obtenus par le procédé selon l'invention permettent de fournir non seulement les données brutes, mais également des données prévisidnnelles sur l'évolution du substrat. Ils peuvent être présentés sous forme de tableau ou tout autre moyen approprié pour leur lecture, par exemple sous forme de document électronique. REVENDICATIONS 1. Procédé d'analyse de substrats de décontamination, ledit substrat comprenant un support solide et des microorganismes compétents pour mettre en oeuvre une ou plusieurs réactions biologiques de décontamination, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer à la fois les étapes suivantes : a. analyser les caractéristiques intrinsèques du substrat, b. analyser la quantité de microorganismes compétents, et c. analyser l'état physiologique desdits microorganismes compétents, d. analyser l'activité desdits microorganismes compétents, puis comparer les résultats obtenus à au moins une valeur de référence pour chaque paramètre analysé de façon à mettre en évidence les différences entre la valeur obtenue pour chacun des paramètres analysés et la ou les valeurs de référence. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'analyse et la comparaison avec une valeur de référence correspondante d'au moins une des caractéristiques additionnelles suivantes : e. l'adaptation des microorganismes à mettre en oeuvre la ou les réactions biologiques appropriées et f. la biodiversité des microorganismes. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la valeur de référence, pour chaque paramètre analysé, est choisie parmi une référence standard , et/ou une référence préalablement déterminée correspondant à l'analyse du substrat à un moment déterminé. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que pour 25 chacune des caractéristiques analysées, une ou plusieurs méthodes sont employées pour chacune des caractéristiques analysées. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les résultats sont présentés sous forme de tableau. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les 30 données de référence sont contenues dans une base de données. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la base de données est alimentée avec les résultats obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 4. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le 35 substrat est un sol. 2906260 9 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le substrat est un lit biologique contenu dans un bioréacteur. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le substrat de décontamination est approprié pour le traitement des effluents, en particulier 5 d'effluents phytosanitaires.