FR 2903118 A1 20080104 FR 0705585 A 20070731 L'invention concerne un procédé de remplacement spécifique d'une copie d'un gène présent dans le génome d'un organisme eucaryote receveur par l'intégration d'un gène différent du gène inactivé. De préférence, le gène receveur sera présent en au moins 2 exemplaires dans la cellule hôte transfectée. Le gène receveur est défini comme étant le gène ou se fera l'insertion du gène différent. Plus particulièrement, l'invention concerne la production d'animaux transgéniques dans lesquels le gène étranger a été introduit d'une manière ciblée pour permettre, à la fois, le maintien des fonctions génétiques normales de l'animal et l'expression du gène étranger sous le contrôle de promoteurs endogènes. Par "gène différent ou étranger" on entend toute séquence nucléotidique correspondant à la totalité ou à une partie d'un gène "étranger ou différent" du gène récepteur telle qu'elle est trouvée normalement dans le génome (ARN ou ADN), ou elle correspond également à une séquence modifiée artificiellement du gène normal ou encore à un fragment de cette séquence. L'invention concerne également le procédé de production de ces animaux transgéniques. Dans la production d'animaux transgéniques, les méthodes conventionnelles utilisées pour l'introduction de séquences d'ADN hétérologues dans la lignée cellulaire germinale, ne permettent pas de contrôler le site de l'intégration du gène étranger 1 2903118 2 dans le génome, ni le nombre de copies ainsi introduit. L'intégration du gène étranger se fait au hasard et, en général, plusieurs copies du. gène s'intègrent en même temps, parfois sous forme de 5 tandem tête à queue, le site de l'intégration et le nombre de copies intégrées variant d'un animal transgénique à l'autre. Les gènes introduits dans la lignée. germinale. sont : 10 - soit des gènes "complets", comprenant des séquences codantes flanquées de leurs propres séquences régulatrices; -soit des gènes composites, formés de la séquence codante d'un gène fusionnée à la séquence promotrice 15 d'un autre gène, les deux fragments appartenant même parfois à deux. espèces animales différentes.. On a pu ainsi confirmer que la. spécificité de l'expression des gènes dans tel ou tel tissu est déterminée par leur(s) séquence(s) régulatrices. 20 Le choix du promoteur approprié pour l'expression du gène étranger chez l'animal transgénique est donc d'une importance primordiale. Il peut donc arriver que des gènes cellulaires endogènes, situés au point d'insertion, soient ainsi 25 inactivés, sans que cela soit facilement décélable en raison de nombreuses insertions au hasard. Si le produit de ces gènes est important pour le développement de l'animal, celui-ci sera sérieusement perturbé. D'ailleurs, l'insertion aléatoire du gène 30 étranger peut se faire à un site qui n'est pas approprié pour l'expression du gène. De plus, le fait qu'il y ait variation du site et du nombre d'insertions d'animal en animal rend l'interpétation des études d'expression extrêmement difficile. 5 10 15 20 25 30 2903118 3 part, la mutagénése dirigée de gènes des cellules souches embryonnaires a été réalisée en faisant appel à une de "ciblage génétique" (gene targeting) al., 1987; Thompson et al., 1989). le premier cas, le gène murin HPRT a insertion et remplacement et, dans deuxième cas, un gène HPRT muté a été corrigé. Thomson et al. ont étendu leurs expériences jusqu'à l'obtention de souris chimères et ont constaté le passage de la modification génétique dans la lignée cellulaire germinale. Dans chacun des documents cités, le site précis de l'intégration a été ciblé par recombinaison homologue entre, d'une part, des séquences exogènes comportant la mutation ou correction incluses dans un vecteur, sous le contrôle d'un promoteur exogène, et d'autre part, leur homologue génomique. Ceci étant, il faut remarquer que les auteurs antérieurs ont réalisé leurs expériences sur un gène spécifique (HPRT) dont la mutation s'accompagnait d'un phénotype décélable. Les séquences exogènes sur le vecteur servent donc à la fois à cibler le site d'intégration et à introduire la modification. Suite à la recombinaison homologue, le gène modifié se trouve toujours dans son environnement génétique normal. Rappelons qu'un problème qui se pose au cours de la production d'animaux transgéniques est le danger d'inactiver un gène cellulaire endogène qui se trouve au point d'insertion du gène étranger. Selon la fonction du produit du gène inactivé, une telle inactivation peut conduire à des désordres physiologiques ou morphologiques importants chez D'autre murins dans récemment technique (Thomas et Dans muté par été le 2903118 4 l'animal transgénique, ou pourrait même empêcher sa survie. En revanche, l'inactivation d'un gène pourrait être considéré comme avantageux si le gène en question 5 codait pour un récepteur de virus ou autre agent infectieux. Un problème majeur rencontré dans la production d'animaux transgéniques, est l'obtention de l'expression du gène étranger. D'une manière générale, 10 deux types d'expérience ont été réalisés chez les souris. Les inventeurs ont étudié la possibilité d'éviter les inconvénients décrits plus haut, et associés dans certains cas à l'inactivation possible d'un ou 15 plusieurs gènes cellulaires endogène de fonction importante au cours de la production d'animaux transgéniques. L'invention a pour objet un procédé de remplacement spécifique, notamment par ciblage d'un 20 ADN, dit ADN d'insertion constitué par une partie d'un gène susceptible d'être rendu fonctionnel, ou dont le fonctionnement peut être rendu plus efficace, lorsqu'il est recombiné avec un ADN de complément pour alors fournir un gène recombinant complet dans le 25 génome d'une cellule eucaryote, caractérisé en ce que - le site d'insertion se trouve dans un gène choisi, dit gène receveur, et contenant l'ADN de complément, et en ce que - l'on transfecte des cellules eucaryotes avec un 30 vecteur contenant un insérat comprenant lui-même l'ADN d'insertion et deux séquences dites "flanquantes" de part et d'autre de l'ADN d'insertion, respectivement homologues à deux séquences génomiques qui jouxtent le site d'insertion souhaité dans le gène receveur, 5 10 15 20 25 30 2903118 5 - l'ADN d'insertion étant hétérologue vis-à-vis du gène receveur, et - les séquences flanquantes, étant choisies parmi celles qui constituent le susdit ADN de complément et qui autorisent, par recombinaison homologue avec des séquences correspondantes du gène receveur, la reconstitution d'un gène recombinant complet dans le génome de la cellule eucaryote. L'invention concerne aussi un procédé de production d'animaux transgéniques, caractérisé en ce que des cellules E.S. sont transfectées dans les conditions sus-décrites et sélectionnées pour l'évènement de recombinaison homologue, à savoir l'intégration correcte du gène étranger, les cellules transfectées sont injectées dans des embryons à un stade oë ils sont aptes à intégrer les cellules transfectées (par exemple au stade blastocyste), ceux-ci sont ensuite réimplantés dans une mère porteuse et les individus chimères obtenus au terme de la gestation sont accouplés. Si les cellules E.S. ont colonisé la lignée germinale de l'animal chimère, des animaux transgéniques hétérogozytes pour le gène remplacé seront obtenus par accouplement (F1) dans la descendance. L'invention concerne aussi un plasmide apte à effectuer l'insertion ciblée d'un gène recombinant dit gène d'insertion dans le génome d'une cellule eucaryote, caractérisé en ce qu'il contient un insérat comprenant lui-même le gène d'insertion et deux séquences dites "flanquantes" de part et d'autre du gène d'insertion, respectivement homologues aux deux séquences génomiques qui jouxtent le site d'insertion souhaité dans le gène receveur. 5 10 15 20 25 30 2903118 6 L'invention concerne également des animaux transgéniques dans lesquels au moins un gène endogène a été inactivé par l'insertion d'un gène qui est différent du gène inactivé, le gène d'insertion étant inséré dans une position qui permet l'expression de ce gène sous le contrôle des séquences régulatrices du gène endogène inactivé. Le procédé de l'invention permet, donc, grâce au phénomène de recombinaison homologue, d'insérer d'une manière ciblée des gènes étrangers, en particulier des séquences codantes dépourvues du promoteur qui leur est normalement associé, dans le génome d'un organisme eucaryote à un site qui permet leur expression sous le contrôle du promoteur endogène du gène où se fait l'insertion, et par conséquence, d'inactiver le gène endogène ciblé. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le gène receveur ciblé est un gène qui est présent dans le génome en au moins deux exemplaires. L'utilisation de la technique d'électroporation (Ref. 11) assure l'introduction d'une copie seulement du gène étranger. Selon cette variante de l'invention, l'insertion ciblée du gène d'intérêt (c'est-à-dire le gène dit d'insertion) a pour effet d'inactiver la seule copie du gène cellulaire endogène où se fait l'insertion et laisse intacte et fonctionnelle la ou les autre(s) copie(s) de ce gène. De cette façon, le fonctionnement génétique de l'animal transgénique n'est pas ou peu perturbé par l'introduction du gène étranger, même si l'insertion inactive une seule copie d'un gène essentiel receveur pour le développement de l'animal. Soit son développement ne serait donc pas affecté par 5 10 15 20 25 30 2903118 7 l'insertion du gène étranger, soit les perturbations mineures possibles dans le cas de l'inactivation d'un gène critique ne seraient probablement pas léthales pour l'animal. Les effets de l'insertion du gène étranger à l'état homozygote pourraient être de toute nature et seraient observés en 2ème génération (F2) après croisements d'individus hétérozygotes (Fi) entre eux. Si, par contre, l'inactivation de toutes les copies d'un gène est souhaitée, par exemple, dans le cas où le gène code pour un récepteur d'agent infectieux, de multiple copies du gène étranger sont introduites. Le contrôle de la quantité introduite peut être assuré en faisant appel à des techniques connues. L'insertion ciblée du gène étranger permet donc son introduction dans un site où son expression est sous le contrôle des séquences régulatrices du gène endogène où se fait l'insertion. Le procédé de l'invention permet ainsi d'insérer le gène étranger derrière un promoteur endogène qui a les fonctions désirées (par exemple, spécificité d'expression dans tel ou tel tissu), et cela; le cas échéant, sans inactiver les autres copies du gène receveur. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'ADN d'insertion peut comporter une séquence régulatrice étrangère. Le site d'insertion et, par conséquence, les séquences flanquantes sont choisies en fonction du but désiré, à savoir soit l'insertion de la séquence régulatrice étrangère pour donner un effet de "double promoteur" avec la séquence régulatrice endogène, ou soit le remplacement d'un promoteur endogène par le promoteur étranger. La 2903118 8 séquence codante qui se trouve sous le contrôle de la séquence régulatrice peut être endogène. Une autre possibilité serait l'insertion ciblée d'un ADN étranger qui comporte à la fois une séquence 5 régulatrice et une séquence codante. Il est possible que la séquence régulatrice soit celle qui est naturellement associée avec la séquence codante. Le procédé de l'invention met en oeuvre un vecteur contenant deux séquences "flanquantes" de part 10 et d'autre du gène étranger. Ces séquences flanquantes ont au moins 150 paires de bases et sont de préférence inférieures à la longueur du gène receveur. Il est essentiel que ces deux séquences flanquantes soient homologues aux deux séquences génomiques qui jouxtent 15 le site d'insertion souhaité. La séquence flanquante du vecteur qui se trouve en amont du gène étranger à introduire, est normalement homologue à la séquence génomique qui est située du côté 5' du site d'insertion. De la même manière, la séquence 20 flanquante du vecteur qui se trouve en aval du gène étranger, est normalement homologue à la séquence génomique qui est située au côté 3' du site d'insertion. Il est possible d'introduire des séquences 25 "intercalantes" entre l'une ou l'autre des séquences flanquantes et le gène étranger, par exemple des séquences permettant la sélection des transformants (des marqueurs), des séquences permettant le clonage du vecteur, etc... 30 La position de ces séquences intercalantes vis-à-vis du gène étranger doit pourtant être choisie afin de ne pas empêcher l'expression du gène étranger, en particulier de la séquence d'ADN codante étrangère sous le contrôle du promoteur endogène ou, à 2903118 9 l'inverse, la séquence codante d'ADN endogène sous le contrôle d'éléments de régulation étrangers apportés par la séquence d'insertion. Malgré la présence des séquences flanquantes, qui encourage une recombinaison homologue, il est possible qu'un certain nombre d'intégrations se fasse au hasard. Afin de vérifier que l'insertion ciblée a bien eu lieu dans le site ciblé et non pas dans un autre endroit, la technique du "Polymerase Chain Reaction" (P.C.R.) (voir Ref. 10) est utilisée pour amplifier la séquence d'ADN du locus où l'insertion aurait dû se faire. De cette façon, seuls les clones transformés à la suite d'une recombinaison homologue sont sélectionnés. 15 Les séquences flanquantes du vecteur sont bien évidemment choisies en fonction du site d'insertion désiré pour que la recombinaison homologue puisse avoir lieu. Le cas échéant, les séquences flanquantes peuvent comporter des séquences répliques du promoteur endogène et/ou des modifications aux séquences qui précèdent le codon d'initiation pour améliorer le taux de traduction (séquences amont) et séquences répliques des séquences de terminaison notamment des sites de polyadénylation (séquences aval). Le gène d'insertion peut être n'importe quel gène d'intérêt. On citera comme exemples non-limitatifs, le gène lac.Z (comme dans le modèle décrit plus loin), les gènes codant pour l'interleukine ou l'interféron, les gènes de récepteur, par exemple de l'acide rétinoique ou beta-3 adrénergique ou de H.I.V., et des gènes connus comme étant liés à certaines maladies, par exemple la myopathie, etc... 5 10 20 25 30 5 10 15 20 25 30 2903118 10 Selon une variante préférée de l'invention, les cellules eucaryotes sont des cellules souches embryonnaires (voir Ref. 14 et 15). En effet, une cellule E.S. mutée peut être injectée dans un embryon précoce qui, après réimplantation, pourra naître sous une forme chimère. Si la lignée germinale est colonisée par la cellule mutée, l'animal chimère transmettra la mutation à sa descendance. Par la suite, on pourra observer les effets de cette mutation, à l'état homozygote chez certains individus, sur leur développement, leur comportement, leur métabolisme, leur pathologie, etc.. La figure 1 montre le plasmide pGN, La figure 2 montre la molécule construite à partir du plasmide pGN par rapport au gène Hox-3.1. Ce plasmide est un plasmide de mutagénèse. Les deux parties de la phase codante du gène Hox-3.1 sont représentées, sur le chromosome 15, avec la boîte "homéo" en noir. Les séquences correspondantes de Hox-3.1 ont été clonées dans le plasmide pGN. (A : signal de polyadénylation; Enh/Pro : enhancerpromoteur). 07 et 08 figurent les deux oligonucléotides utilisés dans la PC]R. Les figures 3 à 6 montrent les plasmides utilisés dans la construction du pGN. Le procédé de l'invention est d'application industrielle très large et peut varier selon la nature du gène étranger introduit. La génétique des mammifères va progresser de manière considérable grâce à la possibilité récente de mutagénéiser spécifiquement n'importe quel gène, permettant ainsi de mieux définir son rôle. Par cette technologie qui fait intervenir recombinaisons 5 10 15 20 25 30 2903118 11 homologues et cellules E.S., des informations précieuses seront apportées sur des oncogènes, des facteurs de croissance, des facteurs de transcription, etc..., gènes qui concernent des sujets très actuels de la recherche fondamentale ou la recherche appliquée. Un débouché important pour la recherche médicale est la possibilité de reproduire une maladie humaine dont la détermination génétique est connue (certaines maladies humaines à pathologie, telle la myopathie de Duchesne) ceci afin de mieux en étudier les mécanismes et de rechercher une thérapeutique. En appliquant le procédé de l'invention, un gène connu comme étant responsable d'une certaine maladie est inséré d'une manière ciblée dans le génome d'une cellule E.S. L'animal transgénique qui est produit à la suite présente un modèle utile de cette maladie. Si nécessaire, et comme décrit plus haut, les fonctionnements génétiques normaux peuvent être sensiblement maintenus, malgré l'insertion du gène étranger. Une autre application du procédé de l'invention consiste à insérer un gène d'insertion qui est facilement décélé e.g. le gène lac.Z et qui peut donc jouer le rôle d'un marqueur cellulaire. De cette manière, des études de filiation e.g. chez des animaux de concours sont facilitées, et la race peut être suivie. L'insertion du gène lac.Z comme gène d'insertion rend aussi possible des études de promoteur. Grâce à la possibilité de déceler l'activité p-galactosidase, l'activité et la spécificité de différents promoteurs endogènes peuvent être étudiées en ciblant différents sites dans le même type ou différents types de cellules. Les mêmes études pourront être effectuées sur un organisme entier, au cours du développement ou à l'état 5 10 15 20 25 30 2903118 12 adulte, en utilisant les techniques d'animaux chimères ou transgéniques. Grâce à la possibilité de modifier le génome d'un animal, le procédé de l'invention peut également être utilisée en tant que "thérapie génique". Les utilisations les plus évidentes consisterait à inactiver les gènes de récepteurs d'agents infectieux (virus ou bactéries) ou toxiques. Si cette mutagénèse s'avérait léthale, il faudrait rétablir la fonction perdue sans rétablir la sensibilité aux agents nuisibles. Un gène modifié codant pour un tel recepteur pourrait être réintroduit dans la cellule mutée, à moins que la modification puisse être provoquée par la recombinaison homologue. Cette modification du patrimoine génétique conférerait à l'animal une immunité contre la maladie considérée. Ce protocole peut aussi intervenir dans le cadre d'auto-greffe. Des cellules, malades ou saines, prélevées sur un patient, pourraient être soignées et immunisées, puis réimplantées chez le même individu. La technique de l'invention se prête aussi aux études d'activité de produits pharmaceutiques présumés avoir une activité à l'égard des produits d'expression d'un gène pathologique lié à une maladie. Dans ce cas, le gène d'insertion est constitué par le gène pathologique et on administre à l'animal transgénique le produit pharmaceutique en vue d'évaluer son activité sur la maladie. L'invention va être illustrée en faisant référence au plasmide pGN et son utilisation dans l'insertion ciblée d'un gène étranger (lac.Z, codant pour l'enzyme {d-glactosi.dase d'E.Coli) dans le génome d'une cellule d'E.S. de souris. Le gène lac.Z a été choisi en raison du fait que son expression peut être facilement décelée et est simplement à titre illustratif. 5 10 15 20 25 30 2903118 13 La phase codante de l'enzyme fl-galactosidase d'E.Coli (lac.Z; 1-3057), fusionnée avec une séquence génomique (7292-3) du gène murin Hox.3-1 (Ref. 1), débute par le codon d'initiation de ce gène. En effet, la séquence qui précède le codon d'initiation de Hox-3.1 est identique à la séquence consensus observée chez les vertébrés (Ref. 2), permettant ainsi un meilleur taux de traduction de la fl-galactosidase dans les cellules de vertébrés. Le gène lac.Z est suivi d'un signal de polyadénylation par exemple du virus SV 40, comme la plupart des gènes eucaryotes, afin de stabiliser les ARNS messagers. L'activité de la 0-galactosidase d'E.Coli, qui est fonctionnelle dans les cellules eucaryotes, peut être décelée de différentes manières. Des cellules exprimant le gène lac.Z prennent une coloration bleue, après fixation, en présence de X-Gal, qui est un substrat de la fl-galactosidase (Ref. 3). Un nouveau substrat, le FDG (flurorosceine di-f-galactopyranoside), permet de déceler et de doser l'activité e-gal. tout en gardant les cellules vivantes (Ref. 4). Les cellules exprimant lac.Z accumulent un produit fluorescent et peuvent être isolées à l'aide d'un trieur de cellule ou FACS (fluorescence-activated cell sorter). L'unité de transcription du gène de résistance à la néomycine provient, en grande partie, du plasmide pRSV neo (Ref. 5). Le LTR (long terminal repeat) du virus du sarcome de Rous procure des séquences activatrice et promotrice très puissantes dans de nombreuses cellules eucaryotes (Ref. 6). Du transposon bactérien Tn5, viennent un promoteur actif dans E.Coli et la phase codante de l'enzyme phosphotransférase (Ref. 7), qui est suivie du signal de polyadénylation du virus SV40. Le même gène sous le double contrôle des promoteurs RSV et Tn5 peut conférer la résistance à la néomycine ou la 5 10 15 20 25 30 2903118 14 kanamycine aux bactéries et la résistance au G418 aux cellules eucaryotes. Par l'effet d'une simple mutation ponctuelle, l'unité B des séquences activatrices (enhancer) de la souche PyEC F9.1 du virus du Polyome est devenue beaucoup plus active dans différents types de cellules, et en particulier dans les cellules de carcinome embryonnaire (EC) (Ref. 8). Deux copies de cet enhancer Py F9.1 ont été insérées en tandem dans le plasmide pGN, en amont du LTR-RSV, et dans l'orientation "promoteur tardif" de la région régulatrice du Polyome. Afin d'améliorer le taux de traduction de la phosphotransférase, la séquence précédent le codon d'initiation a été modifiée lors d'une mutagénèse par oligonucleotide. Ainsi la séquence T T C G C A U G est devenue G C A C C A U G, correspondant beaucoup mieux à la séquence consensus d'initiation de la traduction chez les vertébrés (Ref. 2). Les améliorations apportées à l'unité de transcription du gène de résistance à la néomycine ont pu être estimées en transfectant des cellules souches embryonnaires (ES) de souris. A molarité égale en plasmide, une construction avec les enhancer Py F9.1 a produit 7,5x plus de clones résistants au G418 que le pRSV neo. A nouveau, le nombre de clones a été augmenté 60x, soit 450x par rapport au pRSV neo, en modifiant la séquence d'initiation de la traduction. Le plasmide pGN contient, en outre, une origine de réplication bactérienne de type colEl, pBR322, qui permet les clonages et les préparations dans E.Coli. Enfin, un site de clonage multiple (M.C.S.), synthétisé in vitro, qui ne contient que des sites de coupure uniques dans pGN, a été inséré en amont de lac.Z, afin de faciliter les utilisations de ce plasmide. 5 10 15 20 25 30 2903118 15 Les séquences "flanquantes" plasmidiques qui provoquent la recombinaison homologue sont ajoutées aux extrémités du plasmide pGN après linéarisation du plasmide en amont de lac.Z, par un site du MCS (voir fig. 2). En l'occurence, les séquences flanquantes choisies sont homologues des séquences chromosomates issues de Hox-3.1 devant ultérieurement intervenir dans la recombinaison homologue. La figure 2 situe la molécule construite à partir du plasmide pGN par rapport au gène Hox-3.1. Dans ce cas, une recombinaison entre les séquences plasmidiques et chromosomales de Hox-3.1 resulterait en une insertion au début de la phase codante de ce gène, donc à son inactivation totale. Le plasmide pGN rassemble plusieurs avantages pour cette méthodologie, qui est applicable à n'importe quel gène. L'évènement de recombinaison homologue pouvant être assez rare (de l'ordre de 1 pour 1000 intégrations non-homologues), il est nécessaire de pouvoir analyser un grand nombre de clones dont la résistance au G418 soit suffisament forte pour s'exprimer dans n'importe quelle partie du génome. Les modifications apportées à l'unité de transcription de la phosphotransférase répondent parfaitement à ces problèmes. La méthode de mutagénèse par recombinaison homologue équivaut à inactiver un gène par une insertion ou une substitution, mais le plasmide pGN présente l'avantage supplémentaire de pouvoir substituer l'expression de la fl-galactosidase à celle du gène muté. Enfin, le MCS facilite les clonages de fragments génomiques. EXEMPLES I - Construction du plasmide pGN Les plasmides intermédiaires sont numérotés selon leur étape. 5 10 15 20 25 30 2903118 16 l' étape : Insertion d'un site Xho I dans le site Bgl I de pRSV neo Insertion d'un linker Xho I dans le site Bgl I de pRSV neo, rempli par le fragment Klenow de l'ADN polymérase d'E.Coli. 2' étape : Insertion d'un site Cla I dans le site Nde I du plasmide p1 Insertion d'un linker Cla I dans le site Nde I de pl, rempli par la polymérase Klenow. 3' étape : Insertion d'enhancer Py F9.1 dans le site Cla I du plasmide p Insertion d'enhancer Py F9.1 Pvu II-Pvu II isolé par un site unique, Acc I, dans le site Cla I de p2. Sélection d'un clone contenant deux enhancers orienté dans le sens "promoteur tardif". 4' étape : Déletion Sma I-Hpa I du plasmide p3 Les deux enzymes, donnant des extrémités "bouts-francs", peuvent être ligués directement. Cette délétion enléve l'intron de l'antigène t de SV 40, qui n'est pas très utile, et diminue de manière appréciable la taille de l'unité de transcription de la phosphotransférase. 5' étape : Insertion d'un site Xho I dans le site Bam HI de pCH110 Insertion d'un linker Xho I dans le site Bam HI du plasmide pCH 110 (Pharmacia), rempli par la polymlérase Klenow. 6' étape : Insertion du 3' lac.Z-polyA SV 40 dans le plasmide L4 2903118 17 La partie 3' de la phase codante de la pgalactosi_dase, suivie du signal de polyadénylation du virus SV 40 est isolée du plasmide p5 par les sites Xho I-Aat II et clonée dans le plasmide p4 par les 5 mêmes sites. 7 étape : Insertion du 5' lac.Z dans le vecteur KS- La partie 5' de la phase codante de la 8-galactosidase est isolée du plasmide pMC 1871 (Pharmacia) par les 10 sites Pst I-Sac I et clonée dans le vecteur KS-(Stratagene) par les mêmes sites. 8 étape : Fusion d'une séquence génomique Hox-3.1 avec le 5' lac.Z 15 Une séquence génomique du gène Hox-3.1, clonée dans le vecteur KS-, est purifiée par digestions successives par l'enzyme Sac I, puis par la nucléase Mung bean et enfin par l'enzyme Apa I. Cet insert est fusionné avec la partie 5' de la phase codante de la 8-galactosidase 20 par clonage dans le plasmide p7 digéré par Apa I-Sma 1. La protéine ainsi fusionnée contient le codon d'initiation de la traduction du gène Hox-3.1 suivi de la phase codante de la 8-galactosidase (vérifiée ensuite par séquençage). Met Ser Ser De Pro Gy Asp Pro CCAGC ATG AGC TOC ATT CCC G'GG GAT CCC GGTCG TAC TÇG AGG TAA GGG CCC CTA GGG I Sac 1 CCAGC ATG AGC T I Sma 1 GGTCG TAC nucléase Mung bean CCAGC ATG GGG GAT CCC GGTCG TAC CCC CTG GGG. Met Gy Asp Pro CCAGC ATG GGG GAT CCC GGTCG TAC CCC CTA GGG _ 25 30 5 10 15 20 25 2903118 18 9 étape : Insertion de Hox-3.1-5' lac.Z dans le plasmide p6 La fusion Hox-3.1-5' lac.Z est isolée du plasmide p8 par les sites Apa I-Sac I et clonée dans le plasmide p6 par les mêmes sites. Ce clonage a pour effet de reconstituer la phase codante de la 8-galactosidase dans sa totalité. 10 étape . Insertion du gène NeoR dans le vecteur KS+ Le gène de résistance à la néomycine (promoteur bactérien et phase codante de laphosphotransférase) est isolée du pRSV neo par les sites Hind III-Eco RI et clonée dans le vecteur KS+ (Stratagene). 11 étape : Mutagénèse de la séquence d'initiation de NeoR dans p10 La séquence d'initiation de la traduction de la phnosphotransférase est modifiée pour être identique à la séquence consensus observée chez les vertébrés et permettre ainsi un taux supérieur d'initiation de la traduction donc une résistance accrue au G418 pour les cellules de mammifères. La modification crée également un site Apa LI qui permet de contrôler l'efficacité de la mutagénèse. GTTTCGCATG Aoa Ll GTGCACC& Q 30 Un oligonucléotide (CTTGTTCAATCATGGTGCACGATCCTCA) comportant une région de misappariement avec la séquence du pRSV neo (soulignée) est synthétisé (Gene Assembler, Pharmacia) puis phosphorylée par la polynucléotide kinase du bactériophage T4. Une matrice 5 10 15 20 25 30 2903118 19 simple brin du plasmide p10 est préparée grâce à l'origine fl du plasmide KS+ et hybridée avec l'oligonucléotide de mutagénèse. Le deuxième brin est synthétisé et réparé par la polymérase Klenow et l'ADN ligase du bactériophage T4. Aprés transformation de bactéries, les clones mutés sont criblés à l'aide de l'oligonucléotide marqué au 32P. La mutagénèse a été vérifiée en digérant par Apa LI ainsi que par séquençage. 12 étape : Remplacement de la séquence d'initiation dans le plasmide p9 Un fragment contenant la séquence modifiée d'initiation de la traduction du gène de résistance à la néomycine est isolée du plasmide pli par les enzymes Hind III-Eag I et clonée dans le plasmide p9 par les mêmes sites. 13 étape : Insertion du site de clonaqe multiple dans le plasmide p12 Deux oligonucléotides complémentaires sont synthétisés (Gene Assembler, Pharmacia) puis phosphorylés. Après appariement, le MCS est cloné dans les sites Apa I-Sac II du plasmide p12 grâce à ses extrémités cohésives. )(mal Asp718 Xmn 1 ,L_ Sms 1 _rani_ _Dia_ _NIL_ _Baal_ 5' CCCCGGGGGTACCTCTAGAATGCATTCCGC 3' CCGGGGGGCCCCCATGGAGATCTTACGTAAGG S Le site de clonage multiple a également été vérifié par sequençage. 5 10 15 20 25 30 2903118 20 II - Addition des séquences "flanquantes" aux extrémités du plasmide pGN linéarisé en amont de lac.Z' par un site du M.C.S Les séquences flanquantes utilisées ont été choisies en fonction du site d'insertion souhaité (par exemple, Hox-3.1, voir Fig. 2) Dans les étapes expérimentales qui suivent, le protocole décrit par Thompson et al. 1989, a été suivi pour la production d'animaux chimères. III - Transfection de cellules embryonnaires de souris La méthode décrite par Thompson et al. 1989, a été utilisée pour transfecter des cellules embryonnaires de souris. L'utilisation de la technique de l'électroporation assure l'introduction d'une seule copie du gène étranger (lac.Z) par cellule. Après transfection, plusieurs clones exprimant la pgalactosidase ont été isolés. IV - Production de souris chimères Les clones exprimant la 8-galactosidase ont été injectées dans des blastocystes et ont colonisé des individus normaux et les ont rendu chimères. V - Passage de la modification dans la lignée cellulaire germinale production d'animaux transgéniques Les effets en Fi et en Fs de la modification apportée par l'insertion ciblée ont été observés après reproduction des chimères. Le passage de la modification dans la lignée cellulaire germinale a été constaté. VI - Utilisation de la technique P.C.R. Des cellules ES ont également été transfectées avec le plasmide de mutagénèse de Hox-3.1 (figure 2). Plusieurs événements de recombinaison homologue ont été identifiés par "polymerase chain reaction" (PCR). 5 10 15 20 25 30 2903118 21 BIBLIOGRAPHIE 1. 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(1981) Nature, 292, 154-155, 15.Robertson, E.J., (1986) Trends in Genetics, 9-13 2903118 22 La présente invention concerne notamment les points suivants : Selon un premier point, l'invention concerne un procédé de remplacement spécifique, notamment par ciblage 5 d'un ADN, dit ADN d'insertion constitué par une partie d'un gène susceptible d'être rendu fonctionnel, ou dont le fonctionnement peut être rendu plus efficace, lorsqu'il est recombiné avec un ADN de complément pour alors fournir un gène recombinant complet dans le génome 10 d'une cellule eucaryote, caractérisé en ce que : le site d'insertion se trouve dans un gène choisi, dit gène receveur choisi, et contenant l'ADN de complément, et en ce que l'on transfecte des cellules eucaryotes avec un 15 vecteur contenant un insérat comprenant lui-même l'ADN d'insertion et deux séquences dites "flanquantes" de part et d'autre de l'ADN d'insertion, respectivement homologues à deux séquences génomiques qui jouxtent le site 20 d'insertion souhaité dans le gène receveur, l'ADN gène d'insertion étant hétérologue vis-à-vis du gène receveur, et les séquences flanquantes, étant choisies parmi celles qui constituent le susdit ADN de complément 25 et qui autorisent, par recombinaison homologue avec des séquences correspondantes du gène receveur, la reconstitution d'un gène recombinant complet dans le génome de la cellule eucaryote. L'invention concerne aussi, d'après un second point, 30 un procédé selon le point 1, d'insertion ciblée d'un ADN, dit ADN d'insertion contenant soit une séquence codante, 2903118 23 soit une séquence régulatrice dans le génome d'une cellule eucaryote, caractérisé en ce que : le site d'insertion se trouve dans un gène choisi dit gène receveur et en ce que 5 l'on transfecte des cellules eucaryotes avec un vecteur contenant un insérat comprenant lui-même l'ADN d'insertion et deux séquences dites "flanquantes" de part et d'autre de l'ADN d'insertion, respectivement homologues à deux 10 séquences génomiques qui jouxtent le site d'insertion souhaité dans le gène receveur, l'ADN d'insertion étant hétérologue vis-à-vis du gène receveur et, les séquences flanquantes étant choisies afin de 15 permettre par recombinaison homologue selon le cas, soit l'expression de la séquence codante de l'ADN d'insertion entier sous le contrôle des séquences régulatrices du gène receveur, soit l'expression d'une séquence codante du gène receveur sous le 20 contrôle de séquences régulatrices de l'ADN d'insertion. L'invention concerne un procédé selon le point 1 ou 2 caractérisé en ce que l'ADN d'insertion contient une séquence codante dépourvue d'élément de régulation, 25 notamment d'un promoteur qui lui est propre. L'invention concerne également un procédé selon l'un quelconque des points précédents, caractérisé en ce que le gène receveur est présent dans le génome de la cellule eucaryote en au moins deux exemplaires. 30 L'invention concerne un procédé selon l'un quelconque des points précédents, caractérisé en ce que chacune des 2903118 24 séquences flanquantes a une longueur supérieure à 150 paires de bases, et inférieure à la longueur du gène receveur. L'invention concerne un procédé selon l'un quelconque 5 des points précédents, caractérisé en ce que les cellules eucaryotes sont des cellules souches embryonnaires (E.S.). L'invention concerne un procédé selon l'un des points précédents, caractérisé en ce que le gène d'insertion est 10 un gène hétérologue à l'espèce transfectée. L'invention concerne également un procédé selon l'un des points précédents, caractérisé en ce que le vecteur contient des séquences intercalées entre le gène d'insertion et les séquences flanquantes. 15 L'invention concerne un procédé selon le point précédent, caractérisé en ce que les séquences intercalantes contiennent un marqueur permettant la sélection des transformants et/ou le clonage du vecteur. L'invention concerne aussi un procédé selon l'un des 20 points précédents, caractérisé en ce que la transfection est effectuée par électroporation. L'invention concerne également un procédé selon l'un des points précédents, caractérisé en ce que la technique de Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) est utilisée pour 25 amplifier la séquence d'ADN du locus où se fait l'insertion pour vérifier que l'insertion a eu lieu dans le site souhaité. L'invention est également dirigée vers un procédé de production d'animaux transgéniques, caractérisé en ce que 30 des cellules E.S. sont transfectées par le procédé selon l'un des points précédents et sélectionnées pour 2903118 25 l'événement de recombinaison homologue, a savoir l'intégration correcte du gène étranger, les cellules sont injectées dans des embryons à un stade où ils sont aptes à intégrer les cellules transfectées, par exemple 5 au stade blastocyste, ceux-ci sont ensuite réimplantés dans une mère porteuse et, les individus chimères obtenus au terme de la gestation et chez lesquels est constaté la colonisation par les cellules E.S. de la lignée germinale, sont accouplés pour obtenir des animaux 10 transgéniques hétérozygotes pour le gène remplacé. L'invention est également dirigée vers un plasmide apte a effectuer l'insertion ciblée d'un gène dit gène d'insertion dans le génome d'une cellule eucaryote, caractérisé en ce qu'il contient un insérat comprenant 15 lui-même le gène d'insertion et deux séquences dites "flanquantes" de part et d'autre du gène d'insertion, respectivement homologues aux deux séquences génomiques qui jouxtent le site d'insertion souhaité dans le gène receveur. 20 L'invention concerne également un plasmide pGN comme illustré dans la figure 1. L'invention a également pour objet des cellules eucaryotes transformées par le procédé du point 1. L'invention concerne également lesdites cellules 25 caractérisées en ce que ce sont des cellules E.S. L'invention est également dirigée vers un animal transgénique dans lequel une seule copie d'un gène qui est présent dans le génome à au moins deux exemplaires, a été inactivé par l'insertion d'un gène qui est différent 30 du gène inactivé, le gène d'insertion étant inséré dans une position qui permet l'expression de ce gène sous le 2903118 26 contrôle des séquences régulatrices du gène endogène inactivé. L'invention concerne également l'application du procédé du point 1 pour la thérapie génique. 5 L'invention concerne aussi l'application du procédé du point 1 pour la production d'animaux transgéniques. L'invention est également dirigée vers un procédé selon le point précédent pour marquage génétique d'animaux. 10 L'invention est de plus dirigée vers l'application du procédé selon le point 1 pour le criblage de produits pharmaceutiques présumés avoir une activité à l'égard des produits d'expression d'un gène pathologique lié à une maladie, caractérisée en ce que le gène d'insertion est 15 constitué par le gène pathologique ou un fragment de celui-ci et en. ce que l'on administre à l'animal transgénique le produit pharmaceutique à tester, en vue d'évaluer son activité sur la maladie. REVENDICATIONS : 1. Cellules eucaryotes transformées par un procédé de remplacement spécifique, notamment par ciblage d'un ADN, dit ADN d'insertion constitué par une partie d'un gène susceptible d'être rendu fonctionnel, ou dont le fonctionnement peut être rendu plus efficace, lorsqu'il est recombiné avec un ADN de complément pour alors fournir un gène recombinant complet dans le génome d'une cellule eucaryote, caractérisé en ce que - le site d'insertion se trouve dans un gène choisi, dit gène receveur choisi, et contenant l'ADN de complément, et en ce que - l'on transfecte des cellules eucaryotes avec un vecteur contenant un insérat comprenant lui-même l'ADN d'insertion et deux séquences dites "flanquantes" de part et d'autre de l'ADN d'insertion, respectivement homologues à deux séquences génomiques qui jouxtent le site d'insertion souhaité dans le gène receveur, - l'ADN d'insertion étant hétérologue vis-à-vis du gène receveur, et - les séquences flanquantes, étant choisies parmi celles qui constituent le susdit ADN de complément et qui autorisent, par recombinaison homologue avec des séquences correspondantes du gène receveur, la reconstitution d'un gène recombinant complet dans le génome de la cellule eucaryote. 2. Cellules selon la revendication 1 caractérisées en ce que 30 ce sont des cellules E.S. 3. Cellules selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que l'ADN d'insertion contient une séquence codante dépourvue d'élément de régulation, notamment d'un 35 promoteur qui lui est propre. 2903118 28 4. Animal transgénique dans lequel une seule copie d'un gène qui est présent dans le génome à au moins deux exemplaires, a été inactivé par l'insertion d'un gène qui 5 est différent du gène inactivé, le gène d'insertion étant inséré dans une position qui permet l'expression de ce gène sous le contrôle des séquences régulatrices du gène endogène inactivé. 10 5. Animal transgénique dans lequel au moins un gène endogène a été inactivé par l'insertion d'un gène qui est différent du gène inactivé, le gène d'insertion étant inséré dans une position qui permet l'expression de ce gène sous le contrôle des séquences régulatrices du gène 15 endogène inactivé. 6. Animal transgénique selon la revendication 4 ou 5, dans lequel le gène d'insertion est choisi parmi le gène lac.Z, les gènes codant pour l'interleukine ou 20 l'interféron, les gènes de récepteur et les gènes connus comme étant liés à certaines maladies. 7. Animal transgénique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le gène d'insertion est le gène du récepteur de 25 l'acide rétinoïque ou béta-3 adrénergique ou de H.I.V.