FR 2903312 A1 20080111 FR 0606097 A 20060705 1 La présente invention se place dans le domaine du traitement de situations pathologiques ou non, liées à l'accumulation et/ou la persistance dans les cellules de protéines prénylées. Le noyau des cellules eucaryotes est délimité par une double membrane percée de pores, l'enveloppe nucléaire, qui contrôle les échanges moléculaires entre les deux compartiments nucléaire et cytoplasmique. Cette enveloppe isole partiellement le contenu du noyau, c'est-à-dire le matériel génétique et toute la machinerie enzymatique nécessaire aux fonctions du génome nucléaire. L'enveloppe nucléaire est constituée de 2 membranes concentriques, la membrane externe, en continuité avec le réticulum endoplasmique, et la membrane interne. Cette dernière est bordée sur sa face interne par un maillage fibrillaire dense appelé lamina nucléaire. Il s'agit d'un réseau protéique essentiellement composé de polymères de lamines et de protéines associées. Chez les vertébrés, on distingue deux sous-classes de lamines : les lamines de type A (lamines A et C), et de type B (lamines B1, B2 et B3) qui participent toutes à l'élaboration de la lamina. Cette dernière est maintenue en place par l'association avec d'autres protéines, fixées à la membrane interne de l'enveloppe nucléaire (pour revue, Gruenbaum & al. 2005). Les lamines sont des protéines en forme de filament appartenant à la famille des filaments intermédiaires qui ont toutes une structure commune : un court segment globulaire N-terminal (tête) séparé d'un autre segment globulaire C-terminal (queue) par un long domaine central organisé en plusieurs hélices alpha. La queue globulaire contient notamment un signal de localisation nucléaire (NLS) permettant l'adressage au noyau après la synthèse. Le domaine central permet l'association de deux molécules de lamine tête-bêche et leur organisation en filaments. Cette structure leur confère des propriétés mécaniques très résistantes. Le précurseur de la lamine A et des lamines B se termine par un motif CaaX caractéristique (C est une cystéine, a un acide aminé à chaîne aliphatique non chargée et X un acide aminé quelconque, pour revue, Lévy & Cau 2003). Seules la lamine A et les lamines B subissent une maturation après la synthèse d'un précurseur (pour revue, Gruenbaum & al. 2000). La lamine C est directement synthétisée sous sa forme mature. Le motif CaaX C-terminal permet 2903312 2 la fixation d'un acide gras (en général, un acide gras en C15, farnésyle) par une farnésyl-transférase. Cette prénylation (le motif farnésyle dérive d'une unité aliphatique de base en C5 appelée isoprène) permet aux prélamines de venir s'insérer dans la membrane du réticulum endoplasmique après leur synthèse 5 cytosolique. Elles y subissent l'action d'une endoprotéase elle-même insérée dans la membrane d'enveloppe du réticulum et dont le site actif est cytosolique. L'endoprotéase spécifique de la prélamine A est Facel (ou ZMPSTE24), tandis que Face2 (ou Rcel) est spécifique des prélamines B. Ces enzymes catalysent l'hydrolyse de la liaison peptidique entre la cystéine et l'aminoacide suivant 10 (aliphatique), raccourcissant les prélamines de 3 acides aminés. L'extrémité carboxyle de la cystéine farnésylée est ensuite reconnue par une isoprénylcystéine-carboxyméthyl transférase (ICMT) qui vient y fixer un groupement méthyle par estérification. Seule la maturation de la prélamine A se poursuit avec un deuxième clivage 15 endoprotéolytique par Face 1 (ou Face 2 dans une moindre mesure), qui libère un famésyl- pepticle de 15 acides aminés et la lamine A mature. Cette lamine A ne comporte plus l'acide gras, et se localise dans la lamina nucléaire elle-même ainsi que dans le reste du compartiment nucléaire, constituant un véritable squelette nucléaire (Gruenbaum & al. 2005). La lamine B mature en revanche 20 possède toujours à l'extrémité C-terminale sa cystéine famésylée et méthylestérifiée. Elle reste donc insérée dans la membrane d'enveloppe du réticulum, puis dans la face nucléoplasmique de l'enveloppe nucléaire, d'où sa localisation exclusive à la lamina nucléaire. Sous le terme de prénylation on entend la fixation au groupe thiol de la 25 cystéine soit d'une chaîne farnésyle de 15 atomes de carbone, on parle alors de farnésylation, soit d'une chaîne géranyl-géranyle de 20 atomes de carbone, on parle alors de géranyl-géranylation sur le résidu cystéine du motif CaaX de l'extrémité C-terminale des protéines (Reid & al. 2004). La farnésylation, catalysée par la farnésyl-transférase (FTase) qui reconnaît 30 la séquence consensus C-terminale (CaaX), fixe un groupement farnésyle sur le résidu cystéine du motif. La géranyl-géranylation est la fixation par la géranylgéranyl-transférase (GGTase) d'un groupement géranylgéranyle sur le résidu cystéine du motif. 2903312 n Ces acides gras sont issus de la voie de biosynthèse, qui, à partir de l'hydroxyméthyl-glutaryl-Coenzyme A, est utilisée par les cellules pour fabriquer de très nombreuses molécules importantes, dont le cholestérol, les stéroïdes, l'hème de l'hémoglobine et les ubiquinones (Hampton & al. 1996). 5 La famille des protéines prénylées comporte environ 300 membres dans le génome humain, dont la majorité est identifiable par le motif C-terminal CaaX (Reid & al. 2004). Les protéines des familles Ras, Rho, Rab (Leung & al. 2006) certaines protéines assurant une fonction d'import vers la mitochondrie (HDJ2), certaines protéines mitotiques (CENPE, CENPF) sont notamment prénylées 10 (Winter-Vann & Casey 2005). En général, si dans le motif CaaX X est une sérine, une méthionine, une cystéine, une alanine ou un glutamate, l'isoprénoïde préférentiellement greffé est le famésyle. Si X est une leucine, la reconnaissance du motif CaaL se fera préférentiellement par la GGTase, qui catalysera le transfert d'un groupement géranyl-géranyle (Basso & aI. 2006). II est probable 15 que d'autres groupements dérivés de l'isoprène peuvent aussi être fixés sur cette cystéine, bien que cela ne soit pas décrit dans la littérature. Chez l'homme, il existe trois gènes de lamines. Le gène LMNA, situé en 1 g21.2-g21.3 (Wydner & al. 1996), donne par épissage alternatif les lamines A et C. Le gène LMIVA est composé de 12 exons. Le début de l'exon 1 code 20 l'extrémité globulaire N-terminale commune aux lamines A et C ; la fin de l'exon 1 et jusqu'au début de l'exon 7 codent la partie hélicoïdale centrale ; enfin, les autres exons codent l'extrémité globulaire C-terminale (Lévy & Cau 2003). En fait, le gène code pour 4 produits épissés différemment, dont les lamines C et la prélamine A sont les 2 principaux (Lin & Worman 1993). La production 25 différentielle des lamines A et C se fait par l'utilisation d'un site d'épissage alternatif au niveau de l'exon 10 du pré-messager, de telle sorte que la lamine C est codée par les exons de 1 à 10 et la lamine A est codée par les exons de 1 à 9, les premières 90 paires de bases de l'exon 10, et les exons 11 et 12 (lamine A-spécifiques). 30 Par conséquent, les peptides prélamine A et lamine C sont identiques au niveau des premiers 566 acides aminés, les extrémités C-terminales des lamines C et de la prélamine A contenant ensuite respectivement 6 et 98 acides aminés spécifiques. 2903312 4 Les lamines de type B comprennent trois protéines différentes (Shelton & aI. 1981) : les lamines B1, B2 (les deux isoformes les plus représentées) et B3. Le gène LMNBI est situé en 5g23.3-g31.1 et comporte 11 exons codant la lamine B1 (Lin & Worman 1995). Le gène LMNB2 est localisé en 19p13.3 et 5 code pour les lamines B2 et B3 par un mécanisme d'épissage alternatif (Biamonti & al. 1992). Les lamines de type B sont exprimées constitutivement dans toutes les cellules à partir des premiers stades de développement, tandis que les lamines de type A sont en général absentes dans les cellules souches embryonnaires 10 (Rober et al. 1989, Stewart et al. 1987) et sont exprimées dans toutes les cellules somatiques différenciées. Les lamines interagissent avec un nombre très élevé de partenaires protéiques ayant des fonctions très diverses; elles sont par conséquent impliquées dans un grand nombre de processus nucléaires, incluant la 15 réplication et la réparation de l'ADN, le contrôle de la transcription et de l'épissage, l'organisation de la structure chromatinienne (pour revue, voir Shumaker & al. 2003, Zastrow & al. 2004, Hutchison & al. 2004, Gruenbaum & al. 2005). Les altérations de la structure de la lamina sont à l'origine de nombreuses pathologies héréditaires humaines. Elles sont dues à des mutations 20 des gènes codant les lamines, ou d'autres protéines de la lamina. On a regroupé ces pathologies sous le terme générique de laminopathies (Broers & al. 2004, Maraldi & al. 2005). Récemment, des mutations dans les gènes des enzymes responsables de la maturation des lamines (Face 1 notamment), ont été identifiées, donnant lieu à des pathologies appartenant également au groupe des 25 laminopathies (Navarro & al 2004 et 2005). A ce jour, aucune pathologie chez l'homme n'a été associée à des mutations des gènes LMNB1 ou 2. Cependant, il a été démontré in vitro par des expériences de RNAi (RNA-interférence) (Harborth & al. 2001), ainsi que chez le modèle murin (Vergnes & al. 2004), que les lamines de type B sont essentielles 30 pour le développement et l'intégrité cellulaire. En effet, la déficience en lamine B1 entraîne chez la souris une létalité périnatale. Par ailleurs, les noyaux des fibroblastes embryonnaires des mêmes souris LMNB1 déficientes montrent des altérations remarquables de la morphologie nucléaire, proches des celles 2903312 5 observées chez les patients porteurs de mutations du gène LMNA. De plus, il a été montré très récemment que les lamines B sont nécessaires à la formation du fuseau de division pendant la mitose, ce qui tend à prouver que leur rôle est dynamique et multiple au cours du cycle cellulaire, et pas uniquement restreint 5 au maintien de l'architecture du noyau (Tsai & al. 2006). Les altérations fonctionnelles des lamines NC, dues à des mutations du gène LMNA, sont à l'origine d'au moins 15 désordres regroupant des pathologies très diverses dans un spectre clinique allant de formes peu sévères, affectant un seul tissu de façon isolée, à des formes systémiques létales en période 10 périnatale. Nombre de mutations du gène LMNA modifient de façon notable l'assemblage des protéines dans l'enveloppe nucléaire et en perturbent le fonctionnement. Dans les cellules de divers tissus, la morphologie des noyaux est altérée : ils présentent souvent des hernies qui extrudent du matériel 15 génétique dans le cytoplasme (Goldman & al. 2004). Les protéines habituellement associées à l'enveloppe nucléaire, les lamines B, certaines protéines des pores nucléaires et les protéines LAP2, sont absentes du pourtour de ces hernies. Ces anomaliies morphologiques sont suivies d'altérations fonctionnelles, qui 20 finissent par entraîner la mort cellulaire. Parmi ces pathologies on citera la dystrophie musculaire d'Emery-Dreifuss autosomique dominante (Bonne & al. 1999, Raffaele di Barletta & al. 2000). La plupart des mutations qui causent cette maladie sont des mutations faux-sens réparties sur la totalité de la région codante commune aux lamines A et C (exons 25 1 à 10). Les signes cliniques de cette laminopathie sont similaires à ceux de la dystrophie musculaire d'Emery-Dreifuss liée au chromosome X, plus fréquente, et associée à des mutations récessives du gène codant l'émerine (Bione & al. 1994), une autre protéine de la lamina nucléaire interagissant directement avec les lamines NC (Sakaki & al. 2001). 30 On citera encore la myopathie des ceintures de type 1B (LGMD1 B, Muchir & al. 2000) et la cardiomyopathie dilatée (CMDIA, Fatkin & al. 1999), toutes deux résultant de mutations du gène LMNA. La lipodystrophie partielle familiale de Dunnigan est une pathologie du tissu adipeux lié à des mutations dans les 2903312 6 exons 8 et 11 du gène LMNA (Cao & Hegele 2000, Shackleton & al. 2000). Une des formes les plus fréquentes de cette pathologie résulte de mutations dans le domaine globulaire C-terminal des lamines NC. Des lamines NC déficientes sont aussi responsables d'une forme de neuropathie périphérique héréditaire, 5 AR-CMT2 (appartenant au groupe de syndromes de Charcot-Marie-Tooth), due à une mutation dans l'exon 5 du gène LMNA (De Sandre-Giovannoli & al. 2002). Les maladies décrites précédemment ont des effets notables dans un type de tissu en particulier et sont des laminopathies classées comme partielles . Elles affectent toutes les cellules, mais se manifestent surtout dans un type de 10 tissu particulier (les muscles squelettiques, la peau, le tissu adipeux, les nerfs périphériques, les os...). On peut penser que ce sont les interactions des protéines mutées avec des partenaires spécifiques de ces tissus qui entraînent spécifiquement les effets observés. Toutefois, d'autres mutations causent des laminopathies dites systémiques , plus sévères, dont les dégâts graves 15 entraînent la mort des patients. Ce sont principalement le syndrome de Hutchinson-Gilford, ou Progéria (De Sandre-Giovannoli & al. 2003, Eriksson & al. 2003), et la dermopathie restrictive (Navarro & al. 2004). Dans ces 2 syndromes, la cause physiopathologique est une accumulation et une persistance dans les cellules des malades de prélamine farnésylée non maturée. 20 La dermopathie restrictive, létale autour de la période natale, se caractérise par des signes cliniques qui sont presque tous la conséquence d'un déficit cutané qui restreint les mouvements in utero. Cette pathologie est très rare. La peau est rigide et tendue, elle cède par endroits, provoquant par exemple des déchirures au niveau des aisselles ou du cou. Les cils, les sourcils et le duvet 25 cutané sont absents ou très clairsemés. Un hydramnios est souvent présent, et la diminution des mouvements foetaux est signalée dès le 6ème mois de grossesse. Au niveau du squelette, la radiographie révèle des contractures de toutes les articulations, des pieds en piolet, des clavicules fines, dysplasiques et bi-partites, des côtes en ruban, des os longs tubulaires des bras et une 30 déminéralisation au niveau du crâne. La transmission de la dermopathie restrictive létale est récessive autosomique. Des mutations de LMNA et de ZMPSTE24/Facel ont été rapportées pour cette pathologie (Navarro & al. 2004). Dans les 2 cas, le mécanisme 2903312 7 physiopathologique est le même : la prélamine A ne peut pas maturer (mutation nulle de Facel ou disparition du site de clivage par mutation de la prélamine A), et reste farnésylée, et donc insérée dans la membrane nucléaire. L'accumulation et la persistance dans les cellules de ces précurseurs anormaux, qui empêchent 5 probablement l'interaction normale des lamines B et C avec leurs partenaires, entraînent la mort des cellules et, à brève échéance, du patient. II a été clairement démontré que c'est bien la persistance du groupement farnésyle, et non l'absence de lamine A mature, comme on pourrait le penser de prime abord, qui est responsable de la toxicité cellulaire (Fong & al. 2004). 10 A ce jour, aucune mutation des autres gènes codant les protéines impliquées dans la maturation des prélamines n'a été mise en évidence comme cause de syndrome similaire, mais plusieurs indices, dont des modèles murins, permettent de penser qu'on en identifiera prochainement. Les inventeurs sont en train d'explorer ces possibilités. 15 En avril 2003, à partir d'un recoupement des symptômes communs à la dysplasie acromandibulaire et à certaines maladies se traduisant par un vieillissement prématuré, les inventeurs ont montré que la Progéria, la forme la plus typique et la plus grave de vieillissement précoce, résulte d'une mutation du gène LMNA (De Sandre-Giovannoli & al. 2003). Les enfants atteints par cette 20 maladie, aussi nommée syndrome de Hutchinson-Gilford, souffrent d'un vieillissement accéléré, jusqu'à dix fois plus rapide que celui d'un individu normal, et ont une espérance de vie qui ne dépasse pas 13 ans. En France, un enfant sur environ six millions est touché. Les symptômes sont un vieillissement cutané, une calvitie, une réduction de la taille de la mâchoire et des problèmes liés à la 25 vieillesse, par exemple, une raideur des articulations et des troubles cardio-vasculaires. Ces derniers, tels l'infarctus du myocarde ou l'athérosclérose, sont souvent la cause de la mort. La mutation incriminée, située dans l'exon 11 du gène LMNA, active un site cryptique d'épissage du pré-ARNm, conduisant à un ARNm délété de 150 30 nucléotides (De Sandre-Giovannoli & al. 2003, Eriksson & al. 2003). Cet ARNm délété est traduit en une prélamine A anormale, la progérine, qui ne peut pas être maturée en lamine A normale : l'absence de 50 acides aminés comportant le site de reconnaissance de la protéase bloque le 2e clivage de la progérine dont 2903312 8 l'extrémité C-terminale conserve son groupement farnésyle. Ici encore, la progérine reste insérée par son groupement farnésyle dans la face nucléoplasmique de l'enveloppe nucléaire, qui présente les altérations caractéristiques, hernies du nucléoplasme dans le cytosol et anomalies de la 5 répartition de l'hétérochromatine périphérique (Goldman & al. 2004). Ici encore, c'est la persistance du groupe farnésyle, par ailleurs nécessaire pour l'ancrage à la membrane d'enveloppe du réticulum dans laquelle sont localisées certaines des enzymes responsables de la maturation (clivages, méthylation) qui est responsable de la toxicité cellulaire de la progérine (Fong & al. 2004). 10 Ces pathologies systémiques présentent la particularité d'être associées à l'apparition précoce de signes habituellement liés au vieillissement. Leur caractéristique physiopathologique commune est de générer une lamine prénylée, avec les conséquences décrites. Deux études récentes ont montré qu'une réduction de l'accumulation 15 intranucléaire de la prélamine famésylée, tronquée ou non, prévient efficacement l'apparition du phénotype cellulaire. La première a été réalisée sur le modèle murin progéroïde déficient en protéase Facel (Pendas & al. 2002). Lorsqu'elles sont croisées avec des souris exprimant moitié moins de Lamine A (souris Lmna +1-), le phénotype est restauré (Varela & al. 2005). La deuxième étude montre 20 que le traitement de cellules de patients HGPS par des morpholino ciblant le site d'épissage cryptique abolit le phénotype mutant (Scaffidi & Misteli 2005). Une autre étude très récente (Scaffidi & Mistelli 2006) montre l'implication de la lamine A dans le processus de vieillissement physiologique. En particulier, cette étude démontre qu'au cours du vieillissement physiologique, une lamine A 25 aberrante, s'accumule au cours du temps à la périphérie du noyau des cellules. Cette lamine aberrante est en fait de la progérine, la cellule au cours de sa vie et de son fonctionnement normal utilisant accidentellement de temps en temps le site d'épissage cryptique de l'exon 11, la progérine produite s'accumule petit à petit sous la lamina. Finalement, la cellule âgée normale peut présenter des 30 hernies caractéristiques d'une laminopathie causée par ces événements d'épissage accidentel, qui entraînent sa mort. Les auteurs de cette étude concluent que des mécanismes moléculaires identiques sont d'une part responsables des signes de vieillissement prématuré 2903312 9 des individus atteint de Progéria et d'autre part, à un niveau beaucoup plus faible, interviennent dans le vieillissement physiologique d'individus non porteurs de mutations. Il existe dans l'art antérieur une seule voie thérapeutique décrite pour 5 améliorer le phénotype cellulaire causé par la production pathologique de progérine. Cette solution consiste à inhiber la farnésyl-transférase, l'enzyme qui catalyse le transfert du groupement farnésyle sur les prélamines à partir de farnésyle-pyrophosphate. Lorsque de tels inhibiteurs (FTI) sont utilisés, une enveloppe nucléaire normale n'est que partiellement restaurée sur des cellules 10 HGPS (Progéria) en culture, et la survie de souris RD (KO ZMPSTE24) est améliorée (Glynn & Glover 2005, Capell & al. 2005, Toth & al. 2005, Fong & al. 2006). Cependant, le blocage de la farnésylation peut induire une géranylgéranylation compensatoire (Bishop & al. 2003). 15 D'autre part, il a été rapporté très récemment que les FTI induisent un arrêt du cycle cellulaire en bloquant le protéasome (Demyanets & al. 2006, Efuet & Keyomarsi 2006) Ainsi, le traitement induit sans doute une accumulation dans le nucléoplasme de progérine probablement ubiquitinylée non dégradée par le protéasome. 20 Finalement, les FTI sont spécifiques d'une seule des voies de prénylation protéique, et ne peuvent être envisagés comme inhibiteurs globaux des prénylations post--traductionnelles. Après de longues recherches, les inventeurs ont montré que l'association d'un inhibiteur de l'hydroxyméthylglutaryl-coenzyme A réductase (famille des 25 statines) et d'un inhibiteur de la farnésyl-pyrophosphate synthase (famille des amino-biphosphonates, NBP), ou de l'un de leurs sels physiologiquement acceptable, est un traitement efficace des situations, pathologiques ou non, liées à l'accumulation et/ou la persistance dans les cellules de protéines prénylées, en ce sens qu'elle bloque l'ensemble de la voie de prénylation des protéines, tant en 30 C15 qu'en C20 ou dans les formes non caractérisées. Les inventeurs ont en outre constaté que l'association d'un inhibiteur de l'hydroxyméthylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) réductase et d'un inhibiteur de la farnésyl-pyrophosphate synthase présente un effet synergique dans la 2903312 10 restauration du phénotype normal chez des fibroblastes de patients atteints de Progéria. L'effet de l'association est nettement supérieur à ce qu'est l'effet de l'un ou l'autre des inhibiteurs utilisé individuellement. L'utilisation de l'association sur des cellules de patients atteints de Progéria 5 conduit à l'apparition de prélamine non farnésylée non mature caractéristique et à l'amélioration des symptômes nucléaires. Ces résultats permettent d'envisager l'utilisation d'un inhibiteur de l'hydroxyméthylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) réductase et d'un inhibiteur de la farnésyl-pyrophosphate synthase, ou de l'un de leurs sels physiologiquement 10 acceptable, dans la préparation d'une composition, particulièrement d'une composition pharmaceutique, destinée au traitement des situations, pathologiques ou non, liées à l'accumulation et/ou la persistance dans les cellules de protéines prénylées. L'invention a ainsi pour objet l'utilisation d'au moins un inhibiteur de 15 l'hydroxyméthylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) réductase et d'au moins un inhibiteur de la farnésyl-pyrophosphate synthase, ou de l'un de leurs sels physiologiquement acceptable, dans la préparation d'une composition, particulièrement d'une composition pharmaceutique, destinée au traitement des situations, pathologiques ou non, liées à l'accumulation et/ou la persistance dans 20 les cellules de protéines prénylées. Avantageusement, la composition selon l'invention peut être destinée, au traitement des situations, pathologiques ou non, liées à l'accumulation et/ou la persistance dans les cellules de protéines farnésylées et/ou géranylgéranylées. Très particullièrement, la composition selon l'invention peut être destinée au 25 traitement des situations, pathologiques ou non, liées à l'accumulation et/ou la persistance dans les cellules de progérine, encore plus particulièrement au traitement des situations liées à l'accumulation et/ou la persistance dans les cellules de prélamine A farnésylée, que celle-ci soit ou non tronquée ou modifiée. Selon l'invention, tout inhibiteur de la farnésyl-pyrophosphate synthase, ou 30 l'un de ses sels physiologiquement acceptable, peut être utilisé dans la préparation de la composition selon l'invention. Les sels physiologiquement acceptables peuvent être par exemple des sels formés avec les acides chlorhydrique, bromhydrique, nitrique, sulfurique, 2903312 11 phosphorique, les acides carboxyliques tels que par exemple les acides acétique, formique, propionique, benzoïque, maléique, fumarique, succinique, tartrique, citrique, oxalique, glyoxylique, aspartique, les alcanes sulfoniques tels que les acides méthane ou éthane sulfoniques, ou encore les arylsulfoniques tels que les 5 acides benzène ou paratoluène sulfoniques. Particulièrement l'inhibiteur de la farnésyl-pyrophosphate synthase peut être un des membres de la famille des aminobiphosphonates (NBP), ou l'un de ses sels physiologiquement acceptable. A cet égard et à titre d'exemple, l'aminobiphosphonate peut être choisi parmi 10 - l'acide alendronique ou sa forme ionique, l'alendronate ; - l'acide clodronique ou sa forme ionique, le clodronate ; l'acide étidronique ou sa forme ionique, l'étidronate ; - l'acide ibandronique, ou sa forme ionique, l'ibandronate ; - l'acide médronique ou sa forme ionique le médronate ; 15 - l'acide néridronique ou sa forme ionique, le néridronate ; - l'acide olpadronique ou sa forme ionique, l'olpadronate ; - l'acide pamidronique ou sa forme ionique, le pamidronate ; - l'acide risédronique ou sa forme ionique, le risédronate ; - l'acide tiludronique ou sa forme ionique le tiludronate ; 20 - l'acide zolédronique ou sa forme ionique le zolendronate ; - l'acide 4-N,N-diméthylaminométhane diphosphonique ou sa forme ionique le diméthylaminométhanediphosphonate ; - l'a-amino-(4-hydroxybenzylidène) diphosphonate ; Préférentiellement selon l'invention, on préfère utiliser l'acide alendronique 25 ou sa forme ionique, l'alendronate. Selon l'invention, tout inhibiteur de HMG-CoA réductase, ou l'un de ses sels physiologiquement acceptable, peut être utilisé dans la préparation de la composition. Particulièrement l'inhibiteur de HMG-CoA réductase peut être une molécule 30 de la famille des statines, ou l'un de ses sels physiologiquement acceptable. A cet égard et à titre d'exemple, une statine peut être choisie parmi l'atorvastatine, la simvastatine, la pravastatine, la rivastatine, la mévastatine, la fluindostatine, la vélostatine , la fluvastatine, la dalvastatine, la cérivastatine, la pentostatine, la 2903312 12 rosuvastatine, la lovastatine, ou de l'un de leurs sels physiologiquement acceptable. Préférentiellement selon l'invention on utilise la pravastatine. Bien entendu il est possible selon l'invention d'utiliser un, voire deux ou 5 plusieurs inhibiteur(s) de la famésyl-pyrophosphate synthase associés à un, voire deux ou plusieurs inhibiteur(s) de HMG-CoA réductase. Selon une forme particulière de l'invention, la composition peut être destinée au traitement de situations, pathologiques ou non, nécessitant de bloquer la prénylation des protéines. 10 Selon encore une autre forme particulière de l'invention, la composition peut être destinée au traitement de situations, pathologiques ou non, présentant des signes de vieillissement prématuré ou accéléré. Préférentiellement, la composition selon l'invention est une composition pharmaceutique destinée au traitement de la Progéria (HGPS, Hutchinson- 15 Gilford Progeria Syndrome) et de la dermopathie restrictive (DR ou RD). Selon l'invention, l'inhibiteur de la farnésyl-pyrophosphate synthase et l'inhibiteur de la HMG-CoA réductase sont avantageusement présents dans la composition à des doses physiologiquement efficaces. De manière générale, les doses à administrer peuvent être adaptés par 20 l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie, du mode d'administration, etc. Il est entendu que des administrations répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres ingrédients actifs ou tout véhicule acceptable sur le plan physiologique (tampons, solutions saline, isotonique, enprésence d'agents stabilisants, etc.). 25 En général la dose journalière des inhibiteurs sera la dose minimum pour obtenir l'effet thérapeutique souhaité. Les composiitions utilisant un inhibiteur de l'hydroxyméthylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) réductase et un inhibiteur de la farnésyl-pyrophosphate synthase, selon l'invention, peuvent être formulées pour la voie digestive ou parentérale. 30 Lesdites compositions peuvent comprendre en outre au moins un autre ingrédient actif, particulièrement un autre ingrédient thérapeutiquement actif, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. Selon l'invention, l'inhibiteur de l'hydroxyméthylglutaryl-coenzyme A (HMG-2903312 13 CoA) réductase et l'inhibiteur de la farnésyl-pyrophosphate synthase, peuvent être utilisés dans la composition, en mélange avec un ou plusieurs excipients ou véhicules inertes, c'est à dire physiologiquement inactifs et non toxiques. On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, 5 tamponnées, etc..., compatibles avec un usage physiologique et connues de l'homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc... Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations (liquides et/ou 10 injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales ou animales, l'acacia, etc... Les compositions peuvent être formulées sous forme de suspension 15 injectable, de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc..., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons. L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme 20 du métier, de préférence par voie orale ou par injection, typiquement par voie intra-musculaire, intra-veineuse ou intra-péritonéale. L'administration par voie orale est préférée. S'agissant d'un traitement à long terme, la voie d'administration préférée sera sublinguale, orale ou transcutanée. 25 Les exemples suivants servent à illustrer l'invention sans la limiter aucunement. EXEMPLE 1 : Effet de l'association d'un inhibiteur de l'hydroxyméthylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) réductase et d'un inhibiteur de 30 la farnésyl-pyrophosphate synthase sur des cellules progéroïdes A) PROTOCOLES • Cellules et culture cellulaire Les lignées de cellules sont soit des fibroblastes témoins AG16409 2903312 14 provenant du Coriell Institute, soit des fibroblastes issus de biopsies de patients atteint de Dermopathie Restrictive, sont cultivées à 37 C sous 5% de CO2 en salle P2. Le milieu de culture complet usuel est 5 - RPMI (Invitrogen) complémenté avec Sérum de Veau Foetal 20% (Invitrogen) - L-Glutarnine 200 mM (Invitrogen) Mélange Pénicilline/Streptomycine/Fungizone 1 X (Stock 100 X, Cambrex) 10 • Récolte des cellules La récolte des cellules est réalisée par trypsinisation de la façon suivante (protocole pour une grande flasque, 75 cm2, BD Falcon) : Le milieu est aspiré ; Les cellules sont lavées avec 10 ml de PBS 1X (Invitrogen), 10 ml ; 15 5 ml d'une solution de Trypsine/EDTA 1X (Cambrex) sont ajoutés La flasque est incubée environ 6 min à 37 C, le temps que les cellules se décollent ; La trypsine est inhibée par dilution dans 15 ml de milieu complet ; Les cellules sont culottées par centrifugation 10 min à 1000 tours par 20 minutes à 16 C ; Le culot est resuspendu dans 2 ml de PBS 1X, et re-centrifugé dans les mêmes conditions ; Soit les cellules sont congelées pour une utilisation ultérieure, soit elles sont repiquées à partir de ce culot lavé. 25 • Traitements La solution de pravastatine (statine) utilisée est préparée comme suit : 40 mg de pravastatine sont repris dans de l'eau stérile pour constituer une solution stock à 10 mM. Les concentrations finales testées ont été de 50 et 100 NM, obtenues en 30 diluant la solution stock dans du milieu complet. La solution d'alendronate (NBP) utilisée est préparée comme suit : Une solution d'acide (4-amino-1-hydroxybutylidène) biphosphonique (0,8 mg/ml) est ajustée pour une solution stock de 2 mM. 2903312 15 Les concentrations finales testées ont été de 50 et 100 pM, obtenues en diluant la solution stock dans du milieu complet. • Western blot o Préparation des cellules 5 Pour une expérience de Western blotting, les cellules sont traitées comme suit : Environ 7,5 x 105 cellules sont ensemencées dans une grande flasque et cultivées dans les conditions ci-dessus jusqu'à presque confluence (4 jours). Au bout de 4 jours, les cellules sont lavées avec du PBS 1X, et reprise dans 10 du milieu complet supplémenté avec le traitement. Les cellules sont incubées le temps du traitement (24 ou 48h jusqu'à présent) dans l'incubateur à 37 C. A l'issue du traitement, les cellules sont trypsinisées (protocole ci-dessus) et le culot obtenu stocké à -80 C jusqu'à extraction des protéines. 15 o Extraction des protéines pour Western blot Le culot cellulaire est repris dans 300 pl de tampon de lyse Triton X100 1 % SDS 0,1 Désoxycholate de sodium 0,5 % 20 NaCI 50 mM EDTA 1 mM TrisHCl pH 7,4 20 mM Inhibiteur de Protéase 1 pastille pour 50 ml (Roche 11697498001) 25 Extemporanément, on ajoute Orthovanadate de sodium 1 mM PMSF 1 mM Les cellules sont exposées à une sonication 2 fois 30 sec (Brandson Sonifier Cet! Disruptor B15). 30 Les débris cellulaires sont centrifugés pendant 10 min à 10 000 tours par minutes à 4 C. Le surnageant protéique est conservé à -80 C jusqu'à utilisation. Le dosage des protéines est effectué à la décongélation. 2903312 o Western blot • Gel Un gel d'acrylamide 8 % est classiquement utilisé pour détecter les différentes formes de lamines A/C. 5 Acrylamide/bisacrylamide 37/1 8 % TrisHCl pH 8,8 375 mM SDS 0,1 % APS 0,1 % TEIVIED 0,01 % 10 Un gel de concentration est coulé sur le gel séparatif Acrylamide/bisacrylamide 37,5/1 3 TrisHCl pH 6.8 375 mM SDS 0,1 % APS 0,1 % TEIVIED 0,01 % La concentration en protéines des échantillons est dosée, et des aliquots sont ajustés à 50 pg par tube dans du tampon de lyse en qsp 15 pl. 5 pl de tampon de charge sont ajoutés à chaque échantillon SDS 4 TrisHCl pH 6,8 100 mM Glycérol 20 % (3-mercaptoéthanol 20 % Bleu de bromophénol traces Les échantillons sont dénaturés par chauffage 5 min à 95 C et déposés 25 dans les puits. La migration a lieu à 50, puis 100 Volts, dans un tampon Tris-Base 0,3 % Glycine 1,44 % SDS 0,1 % 30 Transfert La membrane de transfert (Hybon P, Amersham Biosciences) est préparée par trempage dans l'éthanol, suivi d'un bain de 5 min dans l'eau stérile, et de 10 min dans le tampon de transfert : 16 15 20 2903312 17 Tris-Base Glycine Ethanol 12 mM 96 mM 20 0/0 Le gel est humidifié pendant 20 min dans le tampon de transfert, puis le 5 sandwich est monté (système Miniprotéan, Biorad). Le transfert a lieu en général sur la nuit, en chambre froide, à 10 Volts. La membrane est rincée dans du PBS 1X, conservée à l'humidité, et utilisé telle quelle pour la détection. ^ Détection 10 La membrane est incubée l h à température ambiante dans une solution de saturation : Caséine 10 Tween 20 0,1 % PBS 1 X 15 On la rince 2x 10 min dans du tampon de lavage (Tween 20 0,1% / PBS 1X). L'anticorps primaire est dilué dans le tampon de saturation (détails et dilution, voir ci-dessous immunomarquage). La membrane est incubée avec les anticorps primaires 1h à température 20 ambiante sous agitation. A l'issue, elle est rincée 3x avec du tampon de lavage, puis lavée 3x 15 min avec le même tampon. L'anticorps secondaire (système couplé à la péroxydase, Jackson Immunoresearch) est dilué au 1110000e dans du tampon de saturation. 25 La membrane est incubée avec cette solution 30 à 45 min à température ambiante sous agitation. A l'issue, ellle est rincée 3x avec du tampon de lavage, puis lavée 3x 15 min avec le même tampon. La détection est effectuée avec le kit ECL Plus Western Blotting System 30 d'Amersham Bioscience, selon les indications du fournisseur. Après révélation, la membrane est exposée sur film Biomax MR (Kodak), le temps nécessaire pour avoir un signal satisfaisant. • Immunomarquage 2903312 18 o Préparation des cellules Une culture de cellules est trypsinisée, et les cellules comptées sur cellule de Neubauer. Des puits de culture style Labtech (Nunc, réf. 177399) sont ensemencés, à 5 raison de 5x104 cellules par puits. Le milieu de culture complet est supplémenté par le ou les traitements (statine, NBP, les 2), et les cellules cultivées pendant le temps ad hoc. A l'issue, le milieu de culture est aspiré, les puits démontés. Les lames sont lavées dans du PBS 1X. 10 Les cellules sont fixées dans une solution de paraformaldéhyde 4% (dans PBS) pendant 10 minutes à température ambiante. Un lavage de 10 min dans du PBS 1X est effectué. Les cellules sont déshydratées par des bains successifs de 3 min dans des solutions de pourcentage éthanolique croissant (70, 90, 100%, ce dernier bain 15 étant répété). Après séchage, les lames sont stockées à -80 C jusqu'à utilisation. o Immunomarquage Après décongélation, les cellules sont incubées 5 min à température ambiante en charnbre humide dans 50 pl d'une solution de perméabilisation : PBS 1 X Triton X100 0,5 % RNS 5 % (Rabbit Normal Serum, Vector S5000) Inhibiteur de Protéase 1 pastille pour 50 ml (Roche 11697498001) 3 bains de préincubation de 15 min chacun sont effectués dans 50 pl de la solution d'incubation : PBS 1 X RNS 5 % Inhibiteur de Protéase 1 pastille pour 50 ml (Roche 11697498001) L'anticorps primaire est dilué au 1/100e dans 50 pl de solution d'incubation et mis au contact des cellules pendant 1h à température ambiante en chambre 20 25 30 2903312 humide. Les anticorps primaires utilisés sont de 2 types : - Souris anti-lamine NC (côté N-terminal), clone 4A7, don de G. Morris (Oswestry, UK) 5 - Chèvre anti-prélamine A (15 aa extrémité C-terminale), produit SC6214, Santa Cruz Biotechnology, Inc. 3 rinçages dans 50 pI de PBS 1X sont effectués pendant 15 min chacun. L'incubation avec l'anticorps secondaire a lieu pendant 1h dans 50 ml de solution d'incubation à température ambiante en chambre humide. Les anticorps 10 secondaires sont de deux types : - Ane anti-souris, Jackson Immunoresearch, dilution au 1/100' - Ane asti-chèvre, Jackson Immunoresearch, dilution au 1/200' 3 rinçages dans 50p1 de PBS 1X sont effectués pendant 10 min chacun. Une incubation avec 100 pI de solution DAPI 50 ng/ml (SERVA, réf. 18860) 15 est réalisée pendant 15 min à température ambiante en chambre humide. 3 rinçages dans du PBS 1X sont effectués dans des bacs porte-lames pendant 5 min chacun. Un ultime rinçage est effectué pendant 5 min dans une solution de Tween20 à cm % dans du PBS. 20 o Montage Les cellules sont immergées dans une goutte de VectaShield (Vector), recouvertes d'une lamelle couvre-objet et observées sur un microscope à fluorescence (Leica DMR, Leica Microsystems), équipé d'un système de caméra cooISNAP (Princeton). 25 B) RESULTATS B.1) Western blot Des fibroblastes témoins "normaux" ont été traités soit avec une statine hydrosoluble (pravastatine, 50 pM), soit avec un aminobiphosphonate (NBP), 30 (alendronate, 100 pM), soit avec les deux drogues. Le western-blot montre "l'apparition" d'une bande correspondant à la taille de la prélamine A non mature (non tronquée), ce qui confirme que la farnésylation est nécessaire à la maturation de la lamine A ; mais montre surtout que le blocage de la synthèse du 19 2903312 20 farnésyl-PP en 2 points de la voie métabolique est plus efficace qu'un blocage en un seul point sur l'inhibition de la farnésylation de la prélamine A, au moins ex-vivo. B.2) Immunohistochimie 5 Le noyau des cellules traitées par les deux drogues contient de la prélamine A. B.3) Conclusion L'association pravastatine/alendronate est efficace à des doses pour lesquelles quasiment aucun effet n'est observé avec les molécules administrées 10 séparément. 2903312 Références : • Biamonti G, Giacca M, Perini G, Contreas G, Zentilin L, Weighardt F, Guerra M, Della Valle G, Saccone S, Riva S et al. The gene for a nove/ human lamin maps at a highly transcrihed locus of chromosome 19 which replicates at the onset of S -phase. 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Utilisation d'un inhibiteur de I'hydroxyméthylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) réductase et d'un inhibiteur de la farnésyl-pyrophosphate synthase, ou de l'un de leurs sels physiologiquement acceptable, dans la préparation d'une composition destinée au traitement des situations, pathologiques ou non, liées à l'accumulation et/ou la persistance dans les cellules de protéines prénylées. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition 10 est destinée au traitement des situations, pathologiques ou non, liées à l'accumulation et/ou la persistance dans les cellules de protéines farnésylées et/ou géranylgéranylées. 3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement des situations, 15 pathologiques ou non, liées à l'accumulation et/ou la persistance dans les cellules de progérine. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement des situations, pathologiques ou non, liées l'accumulation et/ou la persistance dans les 20 cellules de prélamine A farnésylée. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la prélamine A farnésylée peut en outre être tronquée. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à5, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la farnésyl-pyrophosphate synthase est une molécule 25 de la famille des aminobiphosphonates (NBP) ou l'un de ses sels physiologiquement acceptable. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'aminobiphosphonate peut être choisi parmi - l'acide alendronique ou sa forme ionique, l'alendronate ; 30 - l'acide clodronique ou sa forme ionique, le clodronate ; - l'acide étidronique ou sa forme ionique, l'étidronate ; - l'acide ibandronique, ou sa forme ionique, l'ibandronate ; - l'acide médronique ou sa forme ionique, le médronate ; 2903312 26 -l'acide néridronique ou sa forme ionique, le néridronate ; l'acide olpadronique ou sa forme ionique, l'olpadronate ; - l'acide pamidronique ou sa forme ionique, le pamidronate ; - l'acide risédronique ou sa forme ionique, le risédronate ; 5 - l'acide tiludronique ou sa forme ionique, le tiludronate ; - l'acide zolédronique ou sa forme ionique le zolendronate ; - l'acide 4-N,N-diméthylaminométhane diphosphonique ou sa forme ionique le diméthylaminométhanediphosphonate ; - l'a-amino-(4-hydroxybenzylidène) diphosphonate ; préférentiellement selon l'invention, on préfère utiliser l'acide alendronique ou sa forme ionique, l'alendronate. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'inhibiteur de HMG-CoA réductase est une molécule de la famille des statines ou l'un de ses sels physiologiquement acceptable. 9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que la statine peut être choisie parmi l'atorvastatine, la simvastatine, la pravastatine, la rivastatine, la mévastatine, la fluindostatine, la vélostatine, la fluvastatine, la dalvastatine, la cérivastatine, la pentostatine, la rosuvastatine, ou la lovastatine, ou de l'un de leurs sels physiologiquement acceptable. 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement de situations, pathologiques ou non, nécessitant de bloquer la prénylation des protéines. 11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement de situations pathologiques ou non, présentant des signes de vieillissement prématuré ou accéléré. 12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que la composition est une composition pharmaceutique. 13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est destinée au traitement de la Progéria ou de la 30 dermopathie restrictive.