FR 2901143 A1 20071123 FR 0604358 A 20060516 Méthode de construction de matériaux vivants fonctionnels, matériaux obtenus et applications L'invention a pour objet une méthode de construction de biomatériaux fonctionnels. Elle vise également les biomatériaux tels qu'obtenus par cette méthode et leurs applications. Le terme biomatériau sera utilisé par la suite pour désigner un objet 3D (biohybride), constitué au minimum de macromolécules, de cellules vivantes et d'autres composés (molécules. particules. ésicules. ...). comme un tissu ou un organe par exemple, à moins d'indications contraires. On sait qu'il existe une forte demande en biomatériaux fonctionnels, pour réparer des tissus détériorés ou détruits suite à des maladies, et en particulier un besoin crucial en organes pour des transplantations. 15 Diverses approches ont été proposées pour répondre à ces besoins, mais sont loin de permettre une production en routine. même de simples tissus. L'approche classique utilisée en ingénierie tissulaire consiste à coloniser une matrice poreuse inorganique ou hybride par des cellules (1). Cette technique ne permet pas toutefois de créer 20 des biomatériaux complexes qui dépendent de l'organisation à la fois de nombreuses cellules et de cellules différentes. aucun contrôle ne pouvant être exercé sur la structuration du tissu généré et l'environnement individuel autour de chaque type cellulaire. Une méthode de transfert de couche cellulaire sur un support cellulaire a également été 25 proposée (2) et appliquée à l'empilement de quelques couches cellulaires. Mais ce procédé ne permet pas de contrôler la structuration 2D et 3D d'un biomatériau et l'environnement individuel autour de chaque cellule. Dans deux approches plus récentes. les auteurs proposent d'effectuer un dépôt de cellules 30 viables sur une surface à l'aide d'un distributeur de cellules vivantes (cell print) ou de manière préférée à l'aide d'une imprimante à jet d'encre (3) ou par une impression lazer (4). Une organisation 3D est obtenue par dépôt successive d'une couche support formée d'un hydrogel, d'une couche de cellules et d'une autre couche support. Le biomatériau obtenu ne répond toutefois pas aux caractéristiques requises pour disposer d'un biohybride 3D comme un tissu 10 et u fortiori un organe fonctionnel. L'utilisation d'un hydrogel en tant que matrice extracellulaire ne permet pas de contrôler l'organisation 2D et 3D d'un biomatériau et l'environnement individuel autour de chaque cellule. Les recherches des inventeurs dans ce domaine les ont amené à développer des moyens, en exploitant une technique de dépôt dite couche par couche (LbL en abrégé, pour Layer by Layer) (5-10), afin d'organiser tous les éléments nécessaires pour obtenir un biomatériau fonctionnel vivant, en particulier permettant de construire un tissu ou un organe (biohybride complet), ainsi qu'une structure biohybride, fonctionnels autour d'un implant ou d'un dispositif biomédical à implanter (biohybride partiel) (Figurel). L'invention a donc pour but de fournir une méthode de construction de biomatériaux vivants fonctionnels apportant une solution aux exigences de la technique dans ce domaine, et exploitable en routine grâce à sa mise en oeuvre aisée et à un faible coût de fabrication. Elle vise également les biomatériaux ainsi obtenus, en tant que produits nouveaux et leurs applications, en particulier biomédicales et en nano-biotechnologies. La méthode de construction selon l'invention d'un biomatériau artificiel vivant fonctionnel, 20 est caractérisée par l'assemblage couche par couche (3D) d'une matrice et de couches (2D) de cellules vivantes fonctionnelles en contrôlant leurs interactions et la structuration 3D en fonction de l'organisation et de la forme finale souhaitées pour le biomatériau (tissu ou organe), où chaque couche a son propre motif adapté aux couches voisines et à la fonctionnalité des biomatériaux artificiels entiers.. Les couches de cellules 2D sont plus spécialement fabriquées soit d'une façon homogène (couches non structurées) par trempage, pulvérisation (11) ou par un procédé donnant une couche mince d'hydrogel (épaisseur du nanomètre au micromètre) pendant la période d'immobilisation, soit de façon hétérogène (couches structurées en motifs particuliers) par 30 dépôt cellule par cellule "spotting" à l'aide d'une imprimante ou d'un dispositif robotique. Plus particulièrement, la méthode selon l'invention est caractérisée en ce qu'on dépose, consécutivement, sur un support. des motifs 2D de cellules vivantes fonctionnelles ou souches, d'éléments nécessaires à leur survie, à leur croissance et à leur différenciation et15 d'une matrice extra-cellulaire. avec une structuration 2D et 3D selon l'organisation et la forme finale souhaitées pour l'objet biohybride (tissu ou organe), où chaque couche a son propre motif adapté aux couches voisines et à la fonctionnalité des biomatériaux artificiels entiers. Ces dispositions permettent de réaliser et de contrôler avec une précision de l'ordre du micromètre (2D) et du nanomètrc (3D). une structuration tridimensionnelle fine des différents types de cellules vivantes et de macromolécules, au sein d'un même biomatériau, et de contrôler la composition de la matrice extracellulaire indispensable à la survie des cellules et à 10 leur communication. Lors du dépôt 2D cellule par cellule dans chaque couche et du dépôt 3D consécutif de plusieurs couches monocellulaires et de couches de matrice selon le processus couche par couche, on apporte en effet localement, à chaque cellule individuelle, les éléments nécessaires 15 à sa survie, comme les substances nutritives, les agents de transport ou de fixation de l'oxygène. les facteurs de croissance. les facteurs de différenciation cellulaire, les agents antioxydants, les promoteurs d'adhésion cellulaire, les agents anti-inflammatoires, les agents antibactériens, les agents asti-viraux,les facteurs ou inhibiteurs d'angiogénèse, les agents immunosuppresseurs. les co-facteurs, les vitamines, des ADN, des agents de transfection de 20 gènes, ou tout facteur stimulant ou bloquant l'activité cellulaire, biologique ou thérapeutique. L'invention fournit ainsi les moyens de procurer à chaque cellule l'environnement biochimique optimal par rapport à ses besoins et à sa position dans le biomatériau en cours d'élaboration. Selon un mode de mise en ouvre de l'invention, pour la construction plus spécialement d'un biomatériau simple, on procède au dépôt d'une seule couche de cellules. Il s'agit de cellules d'un même type ou de cellules d'au moins deux types cellulaires différents. 30 Selon un autre mode de réalisation de l'invention, pour la construction d'un biomatériau complexe, on procède au dépôt consécutif de plusieurs couches alternées de polymères et de cellules de types différents selon l'architecture souhaitée. 25 Les cellules déposées sont par exemple des cellules qui forment la surface finale de l'organe (peau), des cellules endothéliales. des cellules de muscle lisse, des cellules de tissus connectifs, des cellules f rmant les vaisseaux sanguins, des cellules constitutives de tissus ou d'organes et des cellules souches dont la différenciation en cellules fonctionnelles sera induite par des facteurs de différenciation. Les cellules sont déposées selon le motif requis compte tenu de leur fonction. Pour contrôler l'interaction cellule-matrice, on utilise des cellules nues ou individuellement enrobées par des multicouches de polyélectrolytes (12-15) ou. des cellules immobilisées lors de la gélification en surface d'une couche mince d'hydrogel (épaisseur du nanomètre au micromètre) composé par exemple d'alginate de calcium. Ces différentes approches d'immobilisation permettent d'assurer la fixation des cellules, soit de façon hétérogène selon des motifs qui sont imposés par le procédé de dépôt et la distance entre les cellules (cellules nues, cellules encapsulées et couche mince d'hydrogel) soit de façon homogène (cellules nues. cellules encapsulées et couche mince d'hydrogel), ainsi que la survie et la fonctionnalité maximales des cellules dans les objets biohybrides. ). Les biohybrides sont construits avec une structure 2D/3D où chaque cellule individuelle possède un environnement biochimique optimal par rapport à ses besoins et sa position dans l'organe artificiel. Dans une variante de réalisation de l'invention, on utilise des cellules vivantes encapsulées (12-15) par un revêtement d'une épaisseur de l'ordre du nanomètre. Des composés appropriés pour l'élaboration du revêtement comprennent des macromolécules fonctionnelles adaptées à l'enrobage cellulaire. Une telle encapsulation permet, en modifiant leur surface, d'utiliser des cellules qui sont normalement non-adhérentes. Elle permet en outre de rendre la cellule invisible par rapport à une reconnaissance quelconque, de contrôler l'accès/sortie des molécules ou macromolécules à [interface cellule-environnement (effet de filtration, filtration sélective) ou de limiter la fibrose. La méthode de construction définie ci-dessus comprend également le dépôt d'éléments nécessaires à la survie. à la croissance et à la différenciation des cellules. De tels éléments comprennent. notamment, comme indiqué ci-dessus des facteurs de croissance, des agents anti-inflammatoires, des agents anti-bactériens, des facteurs de différenciation ou encore des promoteurs de vascularisation. En ce qui concerne la matrice extra-cellulaire, elle est construite soit dans le sens LhL, à partir de molécules, macromolécules ou de composés colloïdaux (par exemple hydrogel en forme de nano-particules, vésicules. ...) interagissant par des interactions covalentes et/ou non covalentes, soit par gélification de 2 composés ou plus, tels que par exemple l'alginate de sodium et le calcium. Lors de la construction, il est possible d'incorporer des molécules soit dans la matrice multicouche. soit de part et d'autre de la matrice d'hydrogel naissante en surface composée par exemple d'alginate de calcium. La matrice présente une composition adaptée selon le type cellulaire en utilisant des polymères avec des fonctions chimiques bien contrôlées. De manière avantageuse. elle est principalement composée de macromolécules biotolérantes ou bioinertes, le cas échéant biodégradables ou bioactives. Lors de la réalisation de l'invention. l'immobilisation de cellules sur la matrice multicouche ou dans la matrice d'hydrogel naissante en surface est envisagée selon 4 approches en fonction des besoins (Figures 2A a 2D) - la première (2A) réside dans le dépôt couche par couche de cellules nues (adhésion cellulaire contrôlée) sur un substrat préalablement modifié par un traitement multicouche. Ensuite, il est possible de recouvrir les cellules par un autre système multicouche ; - la seconde (2B) implique le dépôt couche par couche de cellules encapsulées individuellement (4) par des multicouches de polyélectrolytes sur un substrat préalablement modifié par un traitement multicouche : - la troisième (2C) est basée sur l'incorporation de cellules dans une matrice d'hydrogel naissante en surface dont l'épaisseur est fonction de l'épaisseur du réservoir multicouche contrôlant la concentration d'un des composés nécessaire à la gélification tel que, par exemple, le calcium, PLI. ou des oligoamines. Par exemple, la matrice d'alginate de calcium est formée par gélification d'une solution d'alginate de sodium contenant des cellules au contact d'un gélifiant. le calcium - la quatrième (2D), une variante de la troisième, repose aussi sur l'inclusion de cellules dans une matrice d'hydrogel naissante en surface composée par exemple d'alginate de calcium, mais sans implication d un réservoir multicouche. La construction de la matrice d'alginate de calcium est réalisée, par exemple. par dépôt simultané d'une solution d'alginate de sodium contenant les cellules et d'une solution de calcium. La matrice d'hydrogel naissante en surface, obtenue par pulvérisation, peut être déposée entre des multicouches de polyélectrolvtes contenant des principes actifs, tels que par exemple des facteurs de croissance et des facteurs de différenciation. Cette approche d'immobilisation des cellules peut également être utilisée dans la construction d'un objet biohybride impliquant une structure en motifs par dépôt d'agents de gélification à l'aide d'une imprimante ou d'un dispositif robotique. L'opération de dépôt des différents composants impliqués dans la construction du biomatériau est réalisée soit par trempage ou pulvérisation pour former une couche 2D non structurée, soit à l'aide d'une imprimante (Figure 3) ou d'un dispositif robotique pour construire une couche 2D structurée en motifs particuliers ou non structurée. La technique par pulvérisation (9,10) présente l'avantage de permettre un dépôt rapide et homogène sur la surface et également de construire des matrices totalement à façon. en modulant les composants tout au long de la construction. Les biomatériaux tels qu'obtenus par la méthode définie ci-dessus sont des produits nouveaux et à ce titre sont également visés par l'invention. Ces biomatériaux constituent une solution au problème aigu de la demande non satisfaite en organes en vue de transplantations essentielles à la survie de patients (biohybride total ou partiel). Ils constituent aussi des solutions de remplacement dans les cas où les transplantations de certains organes ont peu de chances de pouvoir être réalisées avec succès. De plus, de manière avantageuse. leur emploi permet de supprimer les fortes doses d'immunosuppresseurs administrées à un transplanté et qui l'empêchent de récupérer un maximum de qualité de vie après la transplantation. ;0 La structuration des biomatériaux de l'invention se rapprochant de celle du tissu réel, ils sont utilisables, de manière générale. pour les réparations tissulaires, comme par exemple la reconstruction du cartilage. Dans ce cas, l'acide hyaluronique, constituant clé du cartilage, est alors incorporé dans les matrices destinées à la réparation ostéochondrale. A l'image de l'hétérogénéité du tissu hvalin natif, les matrices utilisées peuvent également inclure des chondrocytes. Ces biomatériaux s'avèrent donc particulièrement appropriés pour des applications biomédicales et en nano biotechnologies, comme réacteurs à l'interface ou membranaires en couche mince pour la bio-fàbrication de molécules d'intérêt par des cellules vivantes, ou comme organe artificiel. soit complètement biohybride, soit en tant que dispositif synthétique enrobé par une couche biohybride. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés ci-après dans la description de modes de réalisation. ce qui ne doit nullement être interprété comme une limitation de l'invention à ces caractéristiques. Dans la description qui suit, il sera fait référence aux figures 1 à 7, qui illustrent, respectivement, - la figure 1 : la représentation schématique d'un biohybride 2D/3D complètement construit couche par couche (1A) et d'un biohybride construit autour d'un implant ou d'un dispositif biomédical à implanter (1B) ; - la figure 2 : la représentation schématique des 4 approches (2A à 2D) d'immobilisation de cellules utilisées pour la réalisation de l'invention ; - la figure 3 : une méthode d'assemblage des éléments d'un biomatériau à l'aide d'une imprimante à jet d'encre _ - la figure 4 : une représentation schématique d'une couche cellulaire au sein d'une architecture multicouche (4A) et une photo en microscopie optique d'une couche d'érythrocytes humains incorporés dans un film multicouche (4B); - les figures 5 A et 5C : une représentation schématique de deux couches cellulaires au sein d'une architecture multicouche (5A) et deux photos en microscopie optique de 2 couches d'érythrocytes humains incorporés dans un film multicouche (5B et 5C) ; -la figure 6 : une photo de l'imprimante jet d'encre HP 690C avec un agrandissement du substrat au niveau de la zone d'impression ; - la figure 7 : une section verticale de la stratégie selon l'invention de dépôt par pulvérisation des différents constituants du cartilage. Exemple : fabrication d'objets biohvbrides fonctionnels La figure 3 illustre la construction d'un objet biohybride à l'aide d'un dépôt couche par couche 3D mettant en (feuvre une imprimante à jet d'encre. Sur cette représentation schématique, la tête de l'imprimante comprend 3 buses de distribution de liquides, par exemple contenant, respectivement. des cellules vivantes, des polyanions et des polycations. Pour la préparation de biomatériaux complexes, on utilise des têtes d'imprimantes comportant le nombre de buses requis pour les différents dépôts à effectuer. On procède au dépôt des liquides contenant les composants souhaités selon de quantités allant de picolitres à des microlitres de manière à f )rmer des couches successives des éléments constitutifs du biomatériau et de la matrice extracellulaire. Cette technique met en jeu par exemple des interactions entre charges opposées (LbL-électrostatique), d'autres interactions non- covalentes (liaisons hydrogènes par exemple) et des interactions covalentes (LbL-covalent) entre les matériaux constituant les couches. Les dépôts successifs sont réalisés de manière à contrôler l'épaisseur et la structuration 2D et 3D de chaque couche. Pour constituer la matrice artificielle de type hydrogel, on procède au dépôt de couches de polysaccharides ou de peptides biodégradables à croissance exponentielle, ce qui permet de former des couches épaisses de caractère hydrogel, mais de structure lâche, tout en n'effectuant qu'un nombre réduit de cycles. En combinant des couches à croissance linéaire avec des couches à croissance exponentielle, on peut fabriquer. si on le souhaite, des films comportant plusieurs compartiments. Protocole de préparation de multicouches contenant des érythrocytes sur du verre : Les érythrocytes ont été choisis du fait qu'ils s'agissent de cellules non fonctionnelles 30 difficiles à immobiliser. L'immobilisation de ces cellules constitue donc un véritable défi et leur capacité à traverser des structures vasculaires de petite taille leur confère une parfaite adaptation au micro-cisaillement induit par la pulvérisation. L'absence d'éclatement des érythrocytes en présence de PDDAC (Poly(diallyl diméthyl ammonium chlorure) contrairement à PLL (Poly-L-Lysine) ou PAH (Poly(allylamine) hydrochlorure) a induit l'utilisation de ce polymère pour le contact direct avec le matériel sanguin (couche avant et après dépôt des érythrocytes non encapsulés dans le cas d'un dépôt sur une surface ainsi que la couche d'encapsulation des érythrocytes). A) Activation de la surlhce Les substrats (lamelles de verres circulaires) sont préalablement nettoyés à l'éthanol et le cas échéant à l'acétone puis séchées sous flux d'azote dans le but d'obtenir une surface propre. Ensuite, les lamelles sont activées par immersion consécutive dans une solution HCl/MeOH (50/50 v/v) et une solution concentrée de H2SO4 au moins pendant 4 heures pour chacune d'entre elles. Pour ces différentes opérations, on utilise un portoir en Téflon réalisé précédemment à l'ICS qui permet de maintenir 6 lamelles verticalement. B) Préparation des solutions de polyélectrolytes Les solutions de polyélectrolytes sont préparées à 0,1% (w/v) dans un tampon Tris (25mM) contenant du NaCl (0.13 à 0.15M) où le pH a été ajusté à 7,3 (+/-0,1). Les polyéléctrolytes qui ont été utilisés pour la construction des multicouche sont : PEI (poly(éthylène imine)), Alginate, PLL, PSS (poly(styrène sulfonate) de sodium), PAH et PDDAC. C) Préparation des aliquotes sanguins Un prélèvement de sang total humain est centrifugé et rincé au moins une fois avec environ 12ml, de tampon Tris (voir section B). Un aliquote de 30 L de cette préparation est prélevé et dilué qsp 1 mL dans du tampon fris avant dépôt sur les surfaces préalablement activées et traités par des multicouches terminé par PDDAC. D) Construction du multicouche mixte Les lamelles activées sont rincées à l'eau ultrapure avant dépôt des couches polyélectrolytes. *Dépôt d'une couche polyélectrolyte : Les lamelles sont immergées durant 15min dans environ 15mL d'une solution de polyélectrolyte telle que décrite en B). Elles sont ensuite rincées deux fois dans 15mL de tampon pendant 2min pour chaque bain de rinçage, avec agitation manuelle du portoir pendant environ l min. C'e procédé est répété avec une solution de polyéléctrolyte de charge opposée, ceci le nombre de lois nécessaire pour réaliser la construction désirée (voir suivant). *Dépôt d'une couche cellulaire : L'aliquote dilué est prélevé à la pipette pasteur et déposé sur les lamelles traitées (terminées PDDAC) de telle sorte que la goutte recouvre toute la surface de la lamelle. Après 20 minutes de contact:, la lamelle est rincée de la même manière que pour le rinçage des couches polyélectrolytes. Alternativement. le dépôt d'érythrocytes peut également être réalisé par pulvérisation. La construction d'une multicouche débute toujours avec PEI. La couche suivante contient soit directement (PSS/PDDAC),,. soit après l'adsorption préalable de (PSS/PAH),, avec PAH couplé à FITC (fluorophore) pour visualisation de la fluorescence par microscopie confocale. Les couches recouvrant directement les érythrocytes sont composées soit de (PDDAC/PSS)ä ou (PDDAC/PSS)ä ensuite recouverts de PAH/PSS avec PAH fluorescent pour visualisation du recouvrement par microscopie confocale ou de fluorescence. Dans le cas d'érythrocytes encapsulés (14,15) avec le PDDAC. leur incorporation dans la multicouche est réalisée entre 2 couches de polyanions. Dans le cas où plusieurs couches d'érythrocytes sont déposées. Les érythrocytes peuvent être soit directement déposés sur la multicouche (peu de couches polyélectrolytes suffisent) soit une multicouche à caractère hydrogel (croissance exponentielle) peut également être construite entre les deux couches cellulaires pour assurer une bonne séparation spatiale (ici. (PLL/Alg)n avec n de 8 à 20). La figure 4 montre une image de microscopie optique d'érythrocytes humains incorporés dans un film multicouche (grossissement de 400). Les figures 5B et 5C montrent deux images de microscopie optique où 2 couches d'érythrocytes humains ont été incorporés au sein d'une multicouche. Ces 2 images ne diffèrent que par la mise au point qui a été faite au niveau de chaque couche cellulaire. 30 Contrôle de l'environnement local: Pour contrôler l'environnement local de chaque cellule, on fonctionnalise chaque cellule à sa surface par enrobage Lb l, avcc des macromolécules biofonctionnelles. -); En variante, on fixe des agents actifs tels que RGD (tripeptide qui facilite l'adhésion cellulaire) ou aûMSH (agent anti-inflammatoire) à des polyélectrolytes tels que la poly-L-lysine (16-19), ce qui conduit à des polymères qui peuvent être aisément caractérisés en solution et déposés sur différentes surfaces en utilisant le protocole de dépôt couche par couche. La figure 6 montre l'imprimante I IP 690C utilisée pour imprimer "ICS Strasbourg" avec une multicouche de polyélectrolytes sur un substrat de silicium. Protocole d'impression d'un film polyélectrolyte à l'aide d'une imprimante HP 690C : A) Préparation des solutions : PSS et PAH ont été utilisés à la concentration de lmg/mL en solution aqueuse de Milli-Q. On travaille sans sel. B) Préparation d'une cartouche d'imprimante : Pour commencer, il faut eider la cartouche d'encre noire, la seule que l'on utilise, en perçant un trou au niveau de la membrane sur la face supérieure de la cartouche. Une fois vidée, la cartouche est nettoyée avec de l'eau du robinet jusqu'à ne plus voir d'encre coulée, ni d'encre à 1-intérieur. Enfin, la cartouche est abondamment rincée avec une solution d'eau Milli- Q puis séchée à l'azote. Les solutions de polyélectrolytes sont introduites avec une seringue par la face supérieure. Ç Préparation de l'imprimante : L'imprimante utilisée. un modèle HP 690C où la cartouche noire est dissociée de la cartouche de couleur, permet d'imprimer à partir d'une seule cartouche d'encre, la noire dans le cas de l'expérimentation. Le substrat est collé sur la poutre noire plastifiée de l'imprimante où se fera l'impression. . La calibration de la zone d'impression a été réalisée à partir du logiciel Canevas en imprimant f) d'abord sur une vraie page blanche, puis sur un ruban collé sur la barre plastifiée. D) Imprimer un film multicouche. Pour imprimer un film multicouche sur un substrat de silicium, on imprime donc alternativement le même dessin (ICS Strasbourg) avec respectivement une cartouche contenant du PSS et une cartouche contenant du PAH. Comme la cartouche ne contient pas de sel, on peut imprimer sans rinçage. Remarque_ Si l'on désire imprimer à partir de solutions contenant du sel, il faut impérativement rincer la surface après le dépôt de chaque couche car des cristaux de sel sont très rapidement obtenus en surtàce. Pour cette étape, il faut décoller et recoller le substrat au même endroit. Protocole d'immobilisation de cellules par gélification d'alginate pulvérisé sur une I O surface riche en calcium. L'alginate de sodium est solubilisé à 0.6 % (w/v) dans un tampon Krebs-Ringer-Hepes, composé de 25 mM Hepes. 90 mM NaCl, 4.7 mM KC1, 1..2 mM KH2PO4 and 1.2 mM MgSO4.7H2O, dont le pl1 a été ajusté à 7.3 avec une solution de NaOH 1M. Ensuite, les 15 cellules sont dispersées dans la solution d'alginate. La suspension ainsi obtenue est pulvérisée à une pression approximative de 1.3 atmosphère sur une boîte de Pétri préalablement traitée par une multicouche (PLI./Alg)L/Ca. Finalement, le matériau contenant les cellules est rincé par immersion consécutive dans deux bains de tampon Hepes. Le dépôt additionnel de couches de polyélectrol~,tes sur le gel d'alginate peut être réalisé. 20 Protocole d'encapsulation de cellules avec des polyélectrolytes L'encapsulation individuelle des cellules est réalisée par dispersion successive des cellules dans une solution à 0.3% (\v/v) d'alginate dans du tampon Hepes et dans une solution 0.1% 25 (w/v) de PLL dans du tampon 1 lepes pendant 15 minutes. Entre chaque couche, la suspension est centrifugée à 2000 tpm pendant 5 minutes, rincée avec du tampon Hepes et centrifugée à nouveau. Reconstruction tridimensionnelle du cartilage par pulvérisation séquentielle de cellules 30 et des constituants matriciels Les composants de la matrice du cartilage sont déposés par pulvérisation simultanément et/ou de manière alternée, selon trois sous- unités cellules-matrice de structure et de nature différentes à savoir : (i) un film de (acide hyaluronique (HA)/PLL) comme compartiment actif (ii) un gel d'alginate de calcium contenant les cellules, (iii) un mélange de collagène et d'hydroxyapatite . Les gels d'alginate et les films fonctionnalisés, par exemple par des facteurs de croissance, ont un rôle de tuteur dans le processus de différenciation cellulaire et de régénération du cartilage, alors que le mélange de collagène et d'hydroxyapatite facilite l'ancrage du biomatériau dans I"os sous-chondral. Cette construction est représentée sur la figure 7 qui montre, en section verticale, la stratégie suivie pour le dépôt par pulvérisation des différents constituants du cartilage utilisés : (1) une couche de collagène et d'apatite comme matrice ostéo-chondrale, (2) un film muticouche (par exemple le système HA/poly-L-lysine (PLL)) commecompartiment fonctionnalisé par des facteurs de croissance d'intérêt comme BMP-2 et TGF- (3, (3) une couche d'alginate contenant des cellules souches, à différencier en chondrocytes, exprimant le collagène de ripe X. (4) un film multicouche (HA!P1.1.) comme compartiment actif (5) une couche d'alginate contenant des cellules souches, à différencier en chondrocytes, exprimant le collagène de type I IH spécifique du cartilage, (6) un film multicouches (HA, PLL) comme compartiment actif, (7) une couche d'alginate contenant des cellules souches, à différencier en chondrocytes. exprimant le collagène de ty pe 1 et II. Les deux réactifs pour former le gel d'alginate de calcium sont le CaCl2 et l'alginate de sodium, qui est un polymère naturel constiuté de deux unités monosaccharidiques, l'acide D-mannuronique (M) et l'acide 1 -guluronique (G). La proportion en M et G varie d'une espèce à l'autre. Dans les expériences rapportées dans ces exemples, l'alginate de sodium utilisé provient de l'algue Macrocystis pyrifera (Sigma-Aldrich). Cet alginate de sodium présente une plus grande proportion de blocs M et le quotient M/G est d'environ 1,6. Le gel est obtenu par pulvérisation simultanée d'une solution d'ions Cal+ à une concentration de 0,125M et d'une solution d'alginate de sodium avec un rapport Ca/alginate en mole de 1/1. Pour la pulvérisation de cellules. les cellules sont mises en suspension dans la solution d'alginate de sodium. La viabilité des cellules pulvérisées dans les gels d'alginate de calcium a été vérifiée par la méthode de MTT et a permis de confirmer que la pulvérisation des cellules dans les gels n'entraînait pas de mort cellulaire significative. L'observation en microscopie confocale de gels renfermant des fibroblastes a montré que les cellules restent bien entre deux couches de gels et conservent leur phénotype. 10 Références bibliographiques 1. Langer R., Vacanti .I. P.. Tissue engineering, Science, 1993, 260, 920-926. 2. Brevets de Yamato M. et al. basés sur le concept "Cell Sheet" utilisé pour différentes applications en ingénierie tissulaire : EP1600177 ù 2005, EP1598417 ù 2005, W02005103233 -- 2005. .1P2005130838 ù 2005, US2004009566 ù 2004. US2004028657 ù 2004. JP2005000608 ù 2005. JP2004261533 ù 2004, JP2004261532 --2004, US2003036196 ù 2003..IP2003038170 ù 2003, EP1264877 ù 2002, JP5168470 ù 1993. 3. Boland T., Cris Wilson JR. W., Xu T.. Ink-jet printing of viable cells, Brevet US0237822 ù 2004. 4. Barron J. A., Spargo B. .1.. Ringeisen B. R., Biological laser printing of three dimensional cellular structures. Appl. Phys. A, 2004, 79, 1027ù1030. 5. Decher G. Hong .I.-D.. One- or multilayered layer elements applied to supports and their production, Brevet 1255208111 ù 1993. 6. Decher G., Fuzzv Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites, Science, 1997. 277. 1232-1237. 7. Multilayer Thin Films: Sequential Assembly of Nanocomposite Materials; Decher, G. and Schlenoff, J. B.. eds.. Wilev-VCH: Weinheim, 2003 524 pages. 8. Voegel J.-C., Decher G.. Schaaf P.. Multicouches de polyélectrolytes dans le domaine des biotechnologies. L'Ac•itialiié Chimique, Nov.-Déc. 2003, 28-36. 9. Schlenoff J. B.. 1)ubas S. 1".. Farhat T., Sprayed polyelectrolyte multilayers, Langmuir, 2000, 16 (26). 9968-9969. 10. Izquierdo, S. S. Ono. J.-C. Voegel, P. Schaaf, G. Decher, Dipping versus spraying: exploring the deposition conditions for speeding up Layer-by-Layer assembly, Langmuir, 2005. 2/. 7558-7567. 11. Nahmias Y., Arneja A.. Tower T. T., Renn M. J., Odde D. J., Cell Patterning on Biological Gels via Cell Spraying through a Mask, Tissue Eng., 2005, 11 (5-6). 701-708. 12. Neu B., Baumler H.. Donath F.. Moya S., Sukhobukov G., Whwald H., Caruso F.. Polyelectrolyte coverings on biological templates, Brevet US 6699501 -2004. 13. Diaspro A., Silvano D.. Krol S.. Cavalleri O., Gliozzi A., Single living cell encapsulation in nano-organized polyelectrolyte shells, Langmuir, 2002, 18, 5047-5050. 14. Frank Caruso, Hollovv Capsule Processing through Colloidal Templating and Self- Assembly, Chef' Fur. . 1 . 2000, 6 (3). 413-419. 15. Neu B., Voigt A.. Mitlôhner R.. Leporatti S., Gao C. Y., Donath E., Kiesewetter H., Môhwald H., Meiselman H..1., Bâu-nler H., Biological cells as templates for hollow microcapsules, .1 ; l licroencahsulation, 2001, 18 (3), 385-395. 16. Chluba J., Voegel .1.-C.. Decher G.. Erbacher P., Schaaf P., Ogier J., Peptide hormone covalently bound to polvelectrolytes and embedded into multilayer architectures conserving full biological activity, Biomacromolecules, 2001, 2 (3), 800-805. 17. Benkirane-Jessel N.. l av aile P., Meyer F., Audouin F., Frisch B., Schaaf P., Ogier .1.. Decher G., Voegel ,l.-C..: Control of monocyte morphology on and response to model surfaces for implants equipped with anti-inflammatory agents, Adv. Mater., 2004. 16 (17).1507-1511. 18. Schultz P., Vautier I).. Richert L, Jessel N., Haikel Y., Schaaf P., Voegel J.-C., Ogier J., Debry C., Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an antiinflammatory peptide. alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis, Biomaterials, 2005. 26 (15), 2621-2630. 19. Picart C., Elkaim R.. Richert L., Audoin T., Arntz Y., Cardoso M. D., Schaaf P., Voegel J.-C., Frisch B.. Primary cell adhesion on RGD-functionalized and covalently crosslinked thin polyelectrolyte multilayer films, Adv. fuie'. mater., 2005, 15 (1), 83-94. Revendications 1/ Méthode de construction d'un biomatériau artificiel vivant fonctionnel, caractérisée par l'assemblage couche par couche (3D) d'une matrice et de couches 2D de cellules vivantes fonctionnelles en contrôlant leurs interactions et la structuration 3D en fonction de l'organisation et de la forme finale souhaitées pour le biomatériau, où chaque couche a son propre motif adapté aux couches voisines et à la fonctionnalité des biomatériaux artificiels entiers. 2/ Méthode selon la revendication 1. caractérisée par des couches de cellules 2D fabriquées soit d'une façon homogène (couches non structurées) par trempage, pulvérisation ou par un procédé donnant une couche mince d'hydrogel (épaisseur du nanomètre au micromètre) pendant la période d'immobilisation. soit de façon hétérogène (couches structurées en motifs particuliers) par dépôt cellule par cellule à l'aide d'une imprimante ou d'un dispositif robotique. 3/ Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par l'apport localement à chaque cellule individuelle les éléments nécessaires à sa survie comme les substances nutritives, les agents de transport ou de fixation de l'oxygène, les facteurs de croissance, les facteurs de différenciation cellulaire. les agents anti-oxydants. les promoteurs d'adhésion cellulaire, les agents anti-inflammatoires. les agents anti-bactériens, les agents anti-viraux,les facteurs ou inhibiteurs d'angiogénèse, les agents immunosuppresseurs, les co-facteurs, les vitamines, des ADN. des agents de transfection de gènes, ou tout facteur stimulant ou bloquant l'activité cellulaire, biologique ou thérapeutique. 4/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la construction d'un biomatériau simple, caractérisée en ce qu'on procède au dépôt d'une seule couche de cellules,ces cellules, immobilisées selon la revendication 2 par la méthode couche par couche selon la revendication 1. étant d'un même type ou d'au moins deux types cellulaires différents.5/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la construction d'un biomatériau complexe, caractérisée en ce qu'on procède au dépôt consécutif de plusieurs couches alternées de polymères et de cellules de types différents selon l'architecture souhaitée. 6/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les cellules déposées sont des cellules qui forment la surface finale de l'organe (peau), des cellules endothéliales, des cellules de muscle lisse, des cellules de tissus connectifs, des cellules formant les vaisseaux sanguins, des cellules constitutives de tissus ou d'organes et des cellules souches dont la différenciation en cellules fonctionnelles sera induite par des facteurs de différenciation, à l'exclusion des cellules souches embryonnaires d'origine humaine. 7/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que, pour contrôler l'interaction cellule-matrice dans l'espace, on utilise des cellules nues ou individuellement enrobées par des multicouches de polyélectrolytes ou des cellules immobilisées dans une couche mince d'hydrogel naissante (épaisseur du nanomètre au micromètre). 8/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'on utilise des cellules vivantes encapsulées par un revêtement d'une épaisseur de l'ordre du nanomètre, ce revêtement comprenant des macromolécules fonctionnelles adaptées à l'enrobage cellulaire. 9/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la matrice extra-cellulaire, composée de macromolécules biotolérantes ou bioinertes, le cas échéant biodégradables ou bioactives, est construite couche par couche dans le sens LbL à partir de molécules, macromolécules ou de composés colloïdaux, par exemple hydrogel en forme de nano-particules ou vésicules, interagissant par des interactions covalentes et/ou non covalentes, soit par gélification de 2 composés ou plus tels que, par exemple, l'alginate de sodium et le calcium. 10/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que, lors de la construction, les molécules sont incorporées soit dans la matrice multicouche, soit de part et 35 d'autre de la matrice.1 1 / Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que l'immobilisation de cellules sur la matrice est réalisée : - par dépôt de cellules nues ou encapsulées individuellement par des multicouches de 5 polyélectrolytes sur un substrat préalablement modifié par un traitement multicouche dont la surface est de charge opposée : - par incorporation de cellules dans une matrice d'hydrogel naissante en surface, composée par exemple d'alginate de calcium, dont l'épaisseur est fonction de l'épaisseur du réservoir multicouche contrôlant la concentration d'un des composés nécessaire à la gélification ; 10 - par inclusion de cellules dans une matrice d'hydrogel naissante en surface, composée par exemple d'alginate de calcium. mais sans implication d'un réservoir multicouche 12/ En tant que produits nouveaux. les biomatériaux tels qu'obtenus par la méthode définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13/ Application des biomatériaux selon la revendication 12, dans le domaine biomédical et en nano biotechnologie. 14/ Application selon la revendication 13 , comme réacteurs à l'interface ou membranaires en 2O couche mince pour la bio-fabrication de molécules d'intérêt par des cellules vivantes. 15/ Application selon la revendication 13, comme organe artificiel soit complètement biohybride, soit en tant que dispositif synthétique enrobée par une couche biohybride. 16/ Application selon la revendication 13. pour la réparation tissulaire, en particulier pour la réparation du cartilage. 15