FR 2901136 A1 20071123 FR 0604443 A 20060518 1 UTILISATION DE CELLULES DÉRIVÉES DU TISSU ADIPEUX POUR LA PRÉPARATION D'UN MÉDICAMENT ANTI-TUMORAL La présente Invention est relative à l'utilisation de cellules dérivées du tissu adipeux pour la préparation d'un médicament à action anti-tumorale. Le traitement efficace des cancers reste l'un des défis majeurs de la médecine d'aujourd'hui. L'efficacité des thérapeutiques conventionnelles chirurgicales ou à visée cytolytique (chimiothérapie et radiothérapie) reste très limitée dans de nombreux cancers. En effet, certains cancers de fréquence élevée (tractus gastro-intestinal, en particulier), sont toujours difficiles à traiter compte tenu de leur aspect massif qui s'oppose à la diffusion des agents thérapeutiques. Leur traitement nécessite donc en premier lieu l'exérèse chirurgicale, suivie d'une chimiothérapie éventuellement associée à une radiothérapie. Toutefois, dans les cas où la chirurgie n'est pas ou plus possible, une chimiothérapie alternative et efficace sans être toxique est nécessaire. Toutefois, les produits disponibles présentent une efficacité limitée ou une toxicité inacceptable. Il existe donc un besoin de nouveaux traitements anti-cancéreux, afin de disposer d'une panoplie suffisamment étendue de traitements et d'augmenter ainsi les chances de guérison. Dans le cas des cancers du tractus gastro-intestinal (oesophage, estomac, intestin grêle, gros intestin, colon) et de ses glandes annexes (foie, vésicule biliaire, pancréas), par exemple, le manque de traitements curatifs est avéré, lorsque la l'exérèse chirurgicale n'est pas ou plus possible. En effet, les traitements existants, qui sont essentiellement basés sur la chimiothérapie (5-fluorouracile ou 5-FU, gemcitabine...), et la radiothérapie, ont un faible impact sur la survie et sont surtout utilisés à des fins palliatives, notamment dans le cas des cancers colorectaux, gastriques et pancréatiques (pour revue, DIAZ-RUBIO, The Oncologist, 2004, 9, 282-294). Outre l'absence de traitements efficaces, la toxicité des agents chimiothérapeutiques habituellement utilisés (fluoro-uracile, acide folinique, dérivés du platine, tel qu'oxaliplatine, mitomycine C, par exemple) et les effets secondaires associés à ces traitements représentent un autre inconvénient majeur. 2 De nouveaux anticancéreux ont été testés, notamment dans les cancers du tractus gastro-intestinal tels que le pemetrexed (antifolate : agent cytotoxique), des vaccins, des inhibiteurs de kinase (bryostatin, UCN-01, flavopiridol, CI-1040), des inhibiteurs de l'EGFR (cetuximab, gefitinib, GW572016, CI-1033, 5 erlotinib) et des inhibiteurs du VEGF (bevacizumab, PTK787/ZK 222584, angiozyme, ZD6474). Par exemple : . le cetuximab est un anticorps monoclonal chimérique qui se lie spécifiquement au domaine extra-cellulaire du récepteur du facteur de croissance 10 épidermique humaine (EGFR) et inhibe la prolifération de cellules tumorales exprimant l'EGFR et induit une apoptose. . le bevacizumab est un anticorps monoclonal de type IgG I qui se lie au VEGF (Vascular Endotlielial Growth Factor) et inhibe de ce fait la liaison du VEGF à ses récepteurs, Fit-1 (VEGFR-1) et KDR (VEGFR-2), situés à la surface des cellules 15 endothéliales aussi bien in vitro qu'in vivo. Il est constitué d'une partie constante d'origine humaine et d'une partie variable d'origine murine. Les résultats obtenus avec ces nouveaux produits seuls ou en association ne montrent pas d'amélioration par rapport aux traitements antérieurs, en particulier dans le traitement des cancers du tractus digestif, tant du point de vue de 20 l'efficacité que de la toxicité. Dans le cas du cancer du pancréas, qui représente la cinquième cause de décès par cancer dans les pays occidentaux, le médecin est encore plus démuni ; outre une agressivité et une révélation clinique souvent tardive, son pronostic est très mauvais (survie à 5 ans inférieure à 3,5 %) ; de surcroît, l'exérèse chirurgicale n'est 25 possible que dans 10 à 15 Vo des cas. La radiothérapie ou la chimiothérapie n'ont que peu d'effet sur la survie des patients dont la tumeur n'a pas été réséquée (médiane de survie 5-6 mois) (Safioleas MC et al., Hepatogastroenterology, 2004, 51 (57) : 862- 868 ; Jemal A. et al., CA Cancer J Clin, 2002, 52 (1) : 23-47 ; Rosewicz S., et al., Lancet, 1997, 349 (9050) : 485-489., Jafari M. et al., Surg Oncol Clin NAm, 2004, 13 30 (4) : 751-760, xi ; Kullke MH et al., Curr Treat Options Oncol, 2002, 3 (6) : 449-457). Les cancers du pancréas non-résécables, notamment le cancer de la tête du pancréas, font l'objet de dérivations palliatives, de la mise en place d'endoprothèses biliaires ou duodénales, voire d'alcoolisation antalgique du plexus coeliaque. La survie des patients demeure très faible : - En cas de cancer localement avancé non-métastatique et non résécable ou de cancer métastatique, le traitement de référence actuel est la gemcitabine, avec laquelle on observe une amélioration des signes cliniques (douleur, troubles du transit) alors que le pronostic vital reste faible (7 à 10 mois) (Safioleas MC et al., Hepatogastroenterology, 2004, 51 (57) : 862-868 ; Jemal A. et al., CA Cancer J Clin, 2002, 52 (1) : 23-47 ; Rosewicz S., et al., Lancet, 1997, 349 (9050) : 485-489., Jafari M. et al., Surg Oncol Clin N Am, 2004, 13 (4) : 751-760, xi ; Kullke MH et al., Curr Treat Options Oncol, 2002, 3 (6) : 449-457). - Une des voies de recherche pour améliorer le pronostic du cancer du pancréas est de disposer d'un traitement efficace applicable notamment aux tumeurs non résécables dans le but de réduire la progression de la maladie. Des protocoles d'investigations cliniques utilisant la thérapie génique ou la thérapie cellulaire ont ainsi été mis en place : . Par exemple, MULVIHILL et al. (Gene Therapy, 2001, 8, 308-315) ont conduit des essais cliniques de phase I, au cours desquels ils ont procédé à l'injection intra-tumorale, à l'aide d'un dispositif de tomographie assistée par ordinateur (CT pour computed tomography ), chez des patients atteints d'un carcinome de pancréas non-résécable, de l'adénovirus ONYX-015 (d11520), un adénovirus délété au niveau du gène EJB-55kD qui se réplique préférentiellement dans les cellules tumorales dépourvues de protéine p53 et tue celles-ci. L'injection d'adénovirus est bien tolérée mais aucune réponse objective n'est démontrée. Les Auteurs soulignent que la réplication virale intra-tumorale n'est pas assez importante et que l'efficacité des adénovirus pourrait être optimisée en multipliant les injections d'ONYX-015 ou bien en les associant avec un traitement chimiothérapeutique. . Plus récemment, HECHT et al. (Clinical Cancer Research, 2003, 9, 555-561) ont modifié ce protocole en proposant de remplacer le dispositif de CT, trop encombrant et susceptible de provoquer des complications sérieuses telles que des infections ou des perforations, par l'endoscopie à ultrasons. Cependant, les essais en phases U11 conduits par cette équipe n'ont pas révélé d'amélioration de l'efficacité du 4 traitement par ONYX-015. En outre, des cas de perforations duodénales, dus à l'endoscope ont été observés. . D'autres adénovirus ont été testés pour traiter des tumeurs digestives. C'est ainsi que l'équipe de SANGRO et al. (Journal of Clinical Oncology, 2004, 22, 8, 1389-1397) a décrit l'injection intra-tumorale d'un adénovirus exprimant l'interleukine 12 (IL-12), dénommé Ad.IL-12, chez des patients atteints de cancers pancréatiques, colorectaux ou hépatiques. Ces essais de phase I n'ont révélé qu'une activité anti-tumorale modérée. Toujours en orientant ses recherches sur l'expression intra-tumorale d'IL-12 par l'adénovirus Ad.IL-12 (également dénommé AFIL-12), la même équipe a plus récemment testé l'injection intra-tumorale de cellules dendritiques transfectées par l'adénovirus AFIL-12 (MAllOLINI et al., Journal of Clinical Oncology, 2005, 23, 5, 999-1010). Cependant, des essais cliniques supplémentaires sont nécessaires pour évaluer la réelle efficacité de ce traitement. . Enfin, l'administration intra-tumorale d'un vecteur adénoviral codant pour le TNF-a associé à une radio-chimiothérapie par 5-FU a également été expérimentée. Cet essai fait état d'une activité anti-tumorale aux doses maximales de vecteur adénoviral-TNF-a (Senzer N. et al., J Clin Oncol, 2004, 22 (4) : 592-601). Toutefois, l'injection d'un vecteur adénoviral s'accompagne généralement d'évènements indésirables tels que la fièvre, des nausées, une lymphopénie etc.. Outre les stratégies faisant appel aux adénovirus, des thérapies utilisant l'approche des gènes-suicide (en anglais : GDEPT pour gene-derived enzyme prodrug therapy ), c'est-à-dire associant l'administration d'une pro-drogue et d'un gène dont le produit de traduction métabolise ladite pro-drogue en dérivé(s) actif(s) toxique(s) pour la cellule tumorale, ont également été développées et testées contre des cancers du tractus gastro-intestinal tel que le cancer du pancréas. L'article de GÜNZBURG et SALMONS (Acta Biochimica Polonica, 2005, 52, 3, 601-607) fait le point sur cette approche associée à la thérapie cellulaire dans le cadre du cancer du pancréas. Les Auteurs de cet article soulignent le besoin de la mise au point de nouvelles stratégies plus efficaces de traitement du cancer, que les traitements existants. C'est ainsi que les Auteurs de cet article ont proposé d'administrer, dans des cancers du pancréas non-opérables, des microcapsules de sulfate de cellulose contenant des cellules 1-TEK 293 recombinantes exprimant le cytochrome P450 2B1, en association avec l'ifosfamde et ce pour diminuer les doses efficaces d'ifosfamide, habituellement très toxique, en raison d'une demi-vie très courte de la forme plasmatique active. L'administration des microcapsules est effectuée soit directement dans la tumeur, soit dans la circulation vasculaire alimentant cette tumeur, et permet de 5 concentrer le cytochrome P450 au niveau de ladite tumeur et donc de cibler l'action des métabolites de l'ifosfamide. (LâHR et al., The Lancet, 2001, 357, 1591-1592). Les essais cliniques conduits jusqu'à présent chez l'homme ont montré un doublement de la médiane de survie (LâHR et al., 2001) et un taux de survie multiplié par 3 (LâHR et al., 2001 ; GUNZBURG et SALMONS, 2005). Cependant, les résultats obtenus ne sont pas satisfaisants et ne permettent pas d'augmenter la survie des patients de manière significative (médiane de survie de 10 mois et taux de survie après un an de 35,7 %). Plus récemment, cette technique a été étendue à d'autres types de cancers mais cela reste, pour le moment, limité aux modèles animaux. Ainsi, SAMEL et al. (Cancer Gene Therapy, 2006, 13, 65-73) appliquent la chimiothérapie ciblée à des modèles murins et montrent que l'injection desdites microcapsules associée à une administration d'ifosfamide chez des souris développant un cancer colorectal humain associé à une carcinose péritonéale peut conduire à une rémission complète de la tumeur péritonéale. La thérapie cellulaire mettant en oeuvre des cellules 20 microencapsulées présente l'inconvénient majeur d'utiliser une lignée cellulaire humaine tumorigène (lignée HEK 293). Il existe donc un besoin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses, adaptées à tous les cancers et notamment adaptées au traitement des tumeurs solides, telles que les tumeurs du tractus gastro-intestinal. 25 Les Inventeurs se sont donc donné pour but de proposer un nouveau type de thérapie anticancéreuse, qui, associée à d'autres thérapeutiques, est efficace et moins toxique que les traitements actuellement proposés ; cette thérapie est particulièrement bien adaptée aux cancers du tractus gastro-intestinal, tel que des cancers du pancréas non-opérables. 30 La présente invention a pour objet l'utilisation de cellules isolées du tissu adipeux blanc extra-médullaire, sélectionnées dans le groupe constitué par la fraction stroma-vasculaire et une sous-population de ladite fraction stroma-vasculaire constituée par des cellules adhérentes, pour la préparation d'un médicament antitumoral. Le tissu adipeux existe sous différentes formes chez les mammifères : le tissu adipeux blanc extra-médullaire qui représente le principal organe de réserve de l'organisme, le tissu adipeux blanc médullaire dont le rôle exact n'est pas connu et le tissu adipeux brun thermogénique. Du fait de son potentiel d'expansion important qui persiste tout au long de la vie de l'individu, le tissu adipeux blanc de l'adulte constitue une source de cellules abondantes et faciles à obtenir. Ce tissu adipeux blanc est constitué par deux fractions cellulaires : -une fraction adipocytaire qui représente 30% à 60% des cellules du tissu adipeux et est caractérisée par l'accumulation de triglycérides (fraction de cellules flottantes). Cette fraction est composée en grande majorité (99 %) d'adipocytes différenciés et de quelques macrophages contaminants, riches en gouttelettes lipidiques, et - une fraction non-adipocytaire, appelée fraction stroma-vasculaire (FSV ou en anglais SVF pour stroma-vascular fraction ). Ces deux fractions cellulaires peuvent être séparées par leur différence de densité, selon des procédés tels que ceux décrits par BJâRNTORP et al. (J. 20 Lipid. Res., 1978, 19, 316-24). La fraction stroma-vasculaire, classiquement utilisée pour étudier la différenciation des préadipocytes en adipocytes matures, est une fraction hétérogène comprenant différents types cellulaires (ou sous-populations de cellules) (PLANATBERNARD V. et al., Circulation, 2004, 109, 656-663 ; ZUK PA. et al., Mol. Biol. 25 Cell, 2002, 13, 4279-95 ; ERICKSON GR. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 290, 763-9 ; COUSIN B. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 301, 1016-22 ; SAFFORD KM. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 294, 371-9 ; Demande Internationale WO 02/055678 et Demande Américaine US 2003/0082152). Les Inventeurs ont déjà décrit des applications de cette fraction 30 stroma-vasculaire dans le traitement des maladies dans lesquelles on observe une déplétion médullaire et dans le traitement des myopathies, des cardiomyopathies et des 7 pathologies liées à une dégénérescence musculaire (infarctus du myocarde) (Demande Internationale WO 02/055678). Une sous-population de cellules homogènes de la FSV exprimant les antigènes de surface CD13 et HLA ABC a également été utilisée dans la reconstruction totale ou partielle d'un réseau vasculaire fonctionnel (Demande Internationale WO 2005/025584). De façon surprenante, les Inventeurs ont maintenant mis en évidence l'activité anti-tumorale des cellules du tissu adipeux blanc extra-médullaire sélectionnées dans le groupe constitué par la fraction stroma-vasculaire et une sous- population de cellules isolées de ladite fraction stroma-vasculaire, constituée par les cellules qui, après mise en culture de ladite FSV, adhèrent au support de culture. Cette sous-population de cellules adhérentes sera par la suite indifféremment désignée par les termes sous-population de cellules adhérentes , cellules adhérentes , ou cellules adhérentes de la FSV. Dans la suite ensemble des cellules de la FSV ou FSV ont la même signification. Au sens de la présente invention, on entend par FSV, la fraction stroma-vasculaire comprenant l'ensemble des cellules la constituant. Dans la suite, l'expression cellules de la fraction stroma-vasculaire inclut aussi bien la fraction stroma-vasculaire complète que la sous-population de cellules adhérentes. La souspopulation de cellules adhérentes représente environ 50 à 60 % de la population cellulaire totale de la FSV. De manière surprenante, aussi bien la FSV que ladite sous-population de cellules adhérentes ralentissent de manière significative la progression tumorale. Cet effet est observé non seulement lorsque la fraction stroma-vasculaire ou lesdites cellules adhérentes sont injectées localement au niveau intratumoral, mais également lorsqu'elles sont administrées de façon systémique, par exemple par voie intra-veineuse. Également de manière surprenante, la FSV peut être utilisée pour la préparation d'un médicament anti-tumoral, avec ou sans expansion, avec ou sans traitement physiologique ou pharmacologique et avec ou sans modification par une quelconque manipulation du profil d'expression génique ou protéique ; les cellules 8 adhérentes peuvent être utilisées pour la préparation d'un médicament anti-tumoral, avec ou sans traitement physiologique ou pharmacologique et avec ou sans modification par une quelconque manipulation du profil d'expression génique ou protéique. Également de manière surprenante, outre l'effet anti-tumoral direct des cellules de la fraction stroma-vasculaire, lesdites cellules exercent également un effet anti-tumoral de façon indirecte : en effet, un milieu conditionné par la sous-population de cellules adhérentes inhibe la viabilité des cellules cancéreuses. Cet effet est en outre amplifié lorsque ladite sous-population de cellules adhérentes sont préalablement mises en présence de cellules cancéreuses, de préférence des cellules issues du cancer à traiter. Selon une disposition avantageuse de ladite utilisation, ledit médicament anti-tumoral est constitué par lesdites cellules isolées, avant ou après mise en culture. Conformément à l'invention, ladite sous-population de cellules est susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant : - l'obtention de la fraction stroma-vasculaire à partir du tissu adipeux blanc extra-médullaire ; - la purification de ladite fraction stroma-vasculaire ; - l'isolement des cellules de ladite sous-population à partir de ladite fraction purifiée par mise en culture dans un milieu liquide convenable, sélection des cellules adhérentes sur le support de culture (plastique...) par élimination des cellules non-adhérentes, récupération des cellules après confluence, dans un milieu convenable, centrifugation et récupération du culot. Un exemple du procédé d'obtention de ces cellules est décrit dans l'article de BJâRNTORP et al. (cité plus haut). Selon une modalité avantageuse de cette disposition, lesdites cellules sont associées à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Conformément à l'invention, lesdites cellules peuvent de surcroît être 30 génétiquement modifiées : -Elles peuvent comprendre au moins une mutation d'un gène autologue. 9 - Elles peuvent contenir au moins une copie d'un gène hétérologue. Selon un autre mode de réalisation avantageux, lesdites cellules comprennent un gène hétérologue, dont le produit de traduction est une protéine d'intérêt thérapeutique, telle qu'une enzyme capable de métaboliser une pro-drogue en composé(s) actif(s) toxique(s) pour la cellule tumorale. Lesdites cellules génétiquement modifiées sont de préférence d'origine humaine. Selon une autre disposition avantageuse de ladite utilisation, ledit médicament anti-tumoral est constitué par le surnageant de culture de ladite sous-10 population de cellules adhérentes. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit surnageant est obtenu à partir d'une co-culture de la sous-population de cellules adhérentes telle que définie plus haut avec des cellules cancéreuses ou avec des cellules d'une lignée cellulaire cancéreuse. 15 Le tissu adipeux extra-médullaire est d'origine animale ou d'origine humaine ; de préférence, aussi bien les cellules de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux extra-médullaire que les cellules cancéreuses sont celles du patient à traiter et ont été préalablement prélevées chez ledit patient à traiter. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, 20 ledit cancer est un cancer solide ou un cancer liquide. On entend par cancer solide, tout cancer touchant les organes tels que le foie, le pancréas, les poumons, les reins etc., pour lesquels une tumeur se développe localement puis se disperse par la circulation sanguine ou lymphatique et forme des métastases. Cancer solide s'oppose aux cancers liquides qui concernent les cancers du 25 sang ou du système lymphatique. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit cancer est un cancer solide du tractus gastro-intestinal (cancer du pancréas, cancer gastrique, cancer colo-rectal). On entend par cancer du tractus gastro-intestinal les tumeurs et /ou 30 cancers de l'oesophage, de l'estomac, de l'intestin grêle, du gros intestin, ou du colon ainsi que les cancers ou tumeurs des glandes annexes du tractus gastro-intestinal telles que le foie, la vésicule biliaire, le canal cholédoque et le pancréas. 10 De manière préférée, le médicament anti-tumoral tel que défini ci-dessus est particulièrement bien adapté au traitement du cancer du pancréas, et de manière encore plus préférée au traitement du cancer du pancréas non-opérable. Dans un tel cas, lorsque l'on utilise une co-culture de la sous- population de cellules adhérentes et d'une lignée cellulaire cancéreuse, cette dernière est avantageusement la lignée de cellules pancréatique Capan-1 (ATCC HTB-79). Le médicament anti-tumoral selon l'invention est utilisé préférentiellement par voie intra-tumorale, mais il peut aussi être administré par toutes autres voies, éventuellement par voies multiples, notamment par voies intraveineuse, intra-péritonéale, topique, transdermique, sous-cutanée, intra-artérielle, pulmonaire, naso-pharyngée ou orale, en solution, en suspension aqueuse ou en poudre ou sous toute autre forme pharmaceutiquement acceptable. Les doses efficaces seront déterminées en fonction de l'âge, de l'état de santé, du poids du patient et du type de cancer à traiter. Conformément à l'invention, l'utilisation du médicament antitumoral, tel que défini ci-dessus, peut être combinée avec d'autres thérapies, notamment la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie, l'immunothérapie et les thérapies différenciantes. L'effet anti-tumoral observé, caractérisé par le ralentissement ou l'inhibition de la croissance tumorale, est essentiellement dû aux cellules de la sous-population cellulaire telle que définie plus haut, c'est-à-dire aux cellules présentes dans la fraction stroma-vasculaire et sélectionnées sur la base de leur adhérence sur support solide (support de culture) ; toutefois aussi bien l'ensemble de la fraction stroma-vasculaire que les cellules de ladite sous-population peuvent être mises en oeuvre dans l'invention. Le médicament anti-tumoral tel que défini ci-dessus (sous-population de cellules adhérentes FSV, ou surnageant de culture des cellules de ladite sous-population) est particulièrement avantageux pour les raisons suivantes : - le prélèvement d'échantillons de tissu adipeux est facile à 30 réaliser, par exemple par liposuccion ou par biopsie sous anesthésie locale ; I1 compte tenu de son abondance, des stocks peuvent être aisément constitués ; en outre, le tissu prélevé peut être rapidement régénéré chez le sujet prélevé ; - ces propriétés rendent les cellules dérivées du tissu adipeux 5 particulièrement adaptées à une greffe homologue (par exemple greffe autologue) ou hétérologue ; - le prélèvement de tissu adipeux et son utilisation ultérieure à des fins thérapeutique ne devraient théoriquement rencontrer aucun obstacle d'ordre éthique puisque le prélèvement est peu invasif et beaucoup de prélèvements de tissus 10 adipeux sont actuellement détruits ; en outre, il convient de noter que le temps d'hospitalisation nécessaire audit prélèvement est réduit (notamment il n'est pas besoin de recourir à une cytaphérèse ou à une anesthésie générale). il est possible de maintenir et multiplier, voire immortaliser ces cellules in vitro dans un milieu défini ; par ailleurs, ces cellules sont transfectables et 15 peuvent être utilisées pour exprimer un gène hétérologue, d'autant plus qu'elles possèdent un fort pouvoir sécréteur. Il est donc possible de les utiliser pour exprimer une protéine thérapeutique, par exemple une enzyme capable de convertir une pro-drogue en drogue active. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un agent 20 anti-tumoral tel que défini ci-dessus, à savoir sélectionné dans le groupe constitué par des cellules du tissu adipeux blanc extra-médullaire telles que définies ci-dessus, le surnageant de culture desdites cellules ou le surnageant d'une co-culture desdites cellules avec des cellules cancéreuses ou des cellules d'une lignée cellulaire cancéreuse convenable, comme adjuvant en thérapie anticancéreuse. 25 La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un agent anti-tumoral tel que défini ci-dessus, à savoir sélectionné dans le groupe constitué par des cellules du tissu adipeux blanc extra-médullaire telle que définie ci-dessus, le surnageant de culture desdites cellules ou le surnageant d'une co-culture desdites cellules avec des cellules cancéreuses ou des cellules d'une lignée cellulaire 30 cancéreuse convenable, pour cribler in vitro d'autres médicaments anti-tumoraux, notamment aptes à agir en synergie avec lesdites cellules ou surnageant desdites cellules. 12 La présente invention sera mieux comprise au regard des exemples et figures exposés ci-après et qui sont exposés dans un but illustratif et ne doivent donc pas être utilisés dans un but de limitation de l'objet de ladite invention. FIGURES - Figure 1 : Détermination in vivo de la progression tumorale après injection intra-tumorale de la sous-population de cellules de la FSV sélectionnées sur la base de leur adhérence sur le support de culture (D) ou de PBS (a). Abscisses nombre de jours après l'injection ; ordonnées : pourcentage de progression tumorale. * : p 13 d'antibiotiques+antifongique : Amphotéricine 0,25 pg/ml, Streptomycine 100 g/ml, Pénicilline G 100 pg/ml) (référence SIGMA A7292), 0,5 ml de biotine à 16 mM (0,016 mM final) (référence SIGMA B4639), 0,5 ml d'acide panthoténique à 18 mM (P5155 Sigma) (0,018 mM final), 0,5 ml d'acide ascorbique à 100 mM (A4034 Sigma) (100 M final). - Le tampon de digestion contient du DMEM F 12-OK, 2 % de BSA (albumine sérique bovine) et 2 mg/ml de collagénase (référence SIGMA) à raison de 10 ml de milieu de digestion pour 3 g de tissu. Ce tampon est filtré à l'aide de filtres 0,2 m (Acrodisc PF 0.8/0.2 m, ref PALL6224187, VWR). - Le tampon de lysecomprend 100 ml de solution A (2,08 g de tampon Tris pH 7,65 dans 100 ml H2O stérile) et 900 ml de solution B (8,3 g de NH4C1 dans 1000 ml H2O stérile). - Le milieu RPMI complet est préparé à partir de milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 (Gibco/Invitrogen (réf 21875034)) supplémenté de 10 % de sérum de veau nouveau-né (NCS ou newborn calf serum (Gibco 18010-159)), de 100 la/ml de pénicilline, 100 p./ml de streptomycine, et 0,25 pg/ml de fungizone (Invitrogen, 15240-096). - La solution de PBS provient de chez Gibco (réf 14200-067). - La solution de trypsine/EDTA provient de chez Gibco (réf 25300-20 054). 2) Obtention de la fraction stroma-vasculaire Digestion Le tissu adipeux provient de patients qui subissent une dermolipectomie ou une liposuccion : 25 Pour une dermolipectomie : La quantité de tissu adipeux nécessaire est pesée dans une boîte stérile, puis l'ensemble du travail est fait sous hotte de culture. Le tissu subit une dissociation mécanique par un hachage très fin au moyen de ciseaux, et les fragments obtenus sont rincés avec du PBS. 30 Le tissu adipeux prélevé est disséqué sous microscope dans des boites stériles contenant du PBS, de manière à enlever toute trace de tissu musculaire, 14 puis digéré à 37 C pendant 30 min, dans du milieu de digestion. La digestion est accélérée par une agitation manuelle toutes les 10 min. Pour une liposuccion : Le protocole est identique à l'exception de l'étape de dissociation 5 mécanique du tissu à l'aide d'une paire de ciseaux, qui n'est pas nécessaire. Purification de la fraction stroma-vasculaire (FSV ou SVF) Après élimination des fragments non digérés par filtration (filtres de 25 m, (PA 25/21, 25 um, Tissage de Tissus Techniques, Sailly-Saillisel), les adipocytes matures sont séparés du culot contenant les cellules de la SVF par 10 centrifugation (600 g, 10 min). Les cellules stroma-vasculaires ainsi isolées (culot) sont remises en suspension dans 2 ml de milieu DMEM:F12 + 10 % de SVN (Sérum de Veau Nouveau-né) et comptées (comptage manuel sur cellule hématimétrique ou compteur à particule Coulter) et les cellules remises en suspension dans le même milieu. Le même volume de tampon de lyse est ajouté et la suspension cellulaire est 15 centrifugée 5 minutes à 1600 rpm (500 g). Le surnageant est éliminé et le culot repris dans du DMEM:F12 OK (de 500 l à 1 ml en fonction de la taille du culot). 3) Culture cellulaire et obtention de la sous population cellulaire Après obtention de la fraction stroma vasculaire (FSV) brute, selon la méthode décrite ci-dessus, les cellules sont ensemencées dans des flacons de 25 cm' 20 (Nunc col incliné et bouchon filtrant, ref 055422, Dominique Dutscher) à raison de 5x105 à 106 cellules par boite et mises en culture dans le milieu DMEM : F12 OK. Les cellules sont rincées avec du PBS le lendemain de la mise en culture afin d'éliminer toutes les cellules mortes et/ou non adhérentes, puis elles sont cultivées pendant 4 à 7 jours dans du milieu DMEM:F12 OK + 10 % NCS. 25 Après confluence (soit après 4 à 7 jours de culture), les cellules sont rincées avec du PBS de manière à éliminer toute trace de milieu. Les cellules sont décollées à l'aide d'une solution de trypsine/EDTA puis comptées à l'aide d'un compteur de cellules (Coulter ZI). La suspension cellulaire est centrifugée 5 min à 1600 rpm (500 g), puis le culot est repris dans un volume adéquat de PBS, de manière 30 à avoir une concentration de l'ordre de 106 cellules/100 l. 15 4) Lignée Capan-1 et modèle murin du cancer du pancréas humain - Lignée Capan-1 Les cellules Capan-1 sont dérivées de métastases hépatiques d'adénocarcinomes pancréatiques humains (ATCC HTB-79). Les cellules Capan-1 sont cultivées en routine dans le milieu de culture RPMI complet à 37 C et 5 % de CO2, dans des flacons de cultures (référence BD Falcon T-175 353028), et sont repiquées lorsqu'elles atteignent 70 à 80 % de confluence. - Souris Swiss nu/nu Les souris femelles athymiques Swiss Nude (nu/nu) (Charles River) sont âgées de 6 à 8 semaines au moment de l'expérimentation. Après réception, les souris Swiss nu/nu sont tatouées à l'oreille pour identification ultérieure, puis acclimatées aux conditions d'élevage pendant 1 semaine en environnement A2 avant expérimentation (service de zootechnie de l'IFR31 à Toulouse), selon des cycles diurnes et nocturnes de 12 heures. Les souris Swiss nu/nu sont hébergées au nombre de 5 par cages sur portoir ventilé. - Injection des cellules Capan-1 Préparation des suspensions cellulaires injectables Le milieu de culture de cellules Capan-1 est aspiré et les cellules rincées par 10 ml de PBS stérile. Après 5 minutes d'incubation à température ambiante, le PBS est aspiré, et les cellules sont dissociées à l'aide de 3 ml d'une solution de trypsine/EDTA, pendant 5 minutes à 37 C. Les cellules sont ensuite reprises dans 7 ml de milieu complet puis dissociées à la pipette après 10 cycles d'aspiration/refoulement, puis récoltées dans un tube de 50 ml stérile (Falcon Blue Max 50 ml 352070). Les cellules sont comptées à l'aide d'un compteur de cellules Z.I. Coulter. L'équivalent de 107 cellules Capan-1 par souris à injecter est centrifugé pendant 5 min à 1400 rpm (200 g) en conditions stériles. Le surnageant est éliminé, puis le culot est repris dans 25 ml de milieu complet puis dissocié à la pipette après 10 cycles d'aspiration/refoulement afin d'éliminer toute trace de trypsine. Après une centrifugation de 5 min.à 1400 rpm (200 g), le surnageant est éliminé, et le culot est soumis à 3 cycles de lavages dans du milieu 16 RPMI afin d'éliminer toute trace de sérum. Enfin, 10' cellules Capan-1 sont reprises dans 100 pl de PBS stérile pour culture cellulaire. Implantation des tumeurs Capan-1 Les souris, strictement manipulées sous hotte PSM (Poste de Sécurité Microbiologique), sont identifiées grâce à leur tatouage, pesées, puis anesthésiées par isofluorane 0,1 % (Aerrane, Baxter) pendant 5 minutes avant manipulation. Ce protocole d'anesthésie générale permet un confort dans la manipulation des individus et assure la reproductibilité des résultats, tout en prévenant des artefacts expérimentaux consécutifs au stress de l'animal. Après constatation de l'endormissement de l'animal, les cellules Capan-1 (100 l) sont injectées en sous-cutané dans le flanc gauche de l'animal, à l'aide d'une seringue tuberculine 0,3 ml 29G sur 33 mm sans volume mort, à la vitesse de 1 ml/h. Le site de l'injection est désinfecté, et les souris reconditionnées dans des cages à litière propre. Le réveil des souris dans ces conditions d'expérimentation est constaté 5 à 7 minutes après anesthésie. Les signes vitaux des souris injectées sont analysés macroscopiquement 24 et 48 h suivant l'opération. Dans ces conditions, le taux de mortalité mesuré est de 0 %. 5) Injection des cellules de la sous population de cellules adhérentes L'injection de la sous-population de cellules adhérentes est réalisée 11 à 14 jours après implantation des tumeurs Capan-1 dans les souris athymiques Swiss nu/nu. Le volume moyen des tumeurs est alors de 250+18 mm3. Comme indiqué précédemment, les souris, strictement manipulées sous hotte PSM, sont identifiées grâce à leur tatouage, pesées, puis anesthésiées par isofluorane 0,1 % pendant 5 minutes avant manipulation. Après constatation de l'endormissement de l'animal, les cellules (5x105 dans 50 pl de PBS) sont injectées soit directement dans la tumeur, soit dans la veine caudale. Pour la greffe intratumorale, les cellules sont injectées à l'aide d'une seringue tuberculine 0,3 ml 29G sur 33 mm sans volume mort, à la vitesse de 1 ml/h. Pour l'injection intraveineuse, les souris sont placées en chambre d'injection chauffée à 50 C pour faciliter la dilatation de la veine caudale, et les cellules sont injectées à l'aide d'un dispositif pour lymphographie sans volume mort de calibre 29G en PVC. 17 Dans les deux cas, 50 pl de PBS stérile sont injectés dans les souris contrôles soit au niveau intra-tumoral soit par voie systémique. Le site de l'injection est désinfecté, et les souris reconditionnées dans des cages à litière propre. 6) Analyse statistique L'analyse statistique est réalisée à l'aide du logiciel Graphpad Instat V3.05. L'analyse de variance est réalisée par le test unilatéral ANOVA complété par un test de comparaisons multiples Student-Newman-Keuls. Une probabilité inférieure à 0.05 est considérée comme statistiquement significative. EXEMPLE 2 : Effet anti-tumoral in vivo des cellules dérivées du tissu adipeux L'effet anti-tumoral des cellules de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux extra-médullaire est évalué lorsque lesdites cellules sont injectées au niveau intra-tumoral ou par voie systémique chez des souris Swiss nu/nu développant une tumeur pancréatique dérivée des cellules Capan-1. 1) Injection intra-tumorale Les conditions de préparation des souris, de l'injection des cellules Capan-1 et de l'injection de la sous-population de cellules adhérentes sont décrites dans l'Exemple I. Après l'injection de la sous-population de cellules adhérentes, le poids des souris et la croissance des tumeurs sont mesurés et répertoriés tous les 2 jours et ce jusqu'à 14 jours suivant l'injection desdites cellules, la croissance tumorale étant mesurée in situ sur l'animal vivant. La mesure des longueurs (L) et largeurs (1) des tumeurs Capan-1 est réalisée à l'aide d'un pied à coulisse, selon le calcul suivant : Volume tumoral (mm3) = L2 (mm) x 1 (mm) x 0,52 Le pourcentage de progression tumorale est évalué 3, 6 et 13 jours 25 après injection intra-tumorale desdites cellules ou de PBS (contrôle) selon la formule suivante : % de progression tumoral au temps t = [(volume tumoral au temps t)/(volume tumoral à to)]x100 ; to correspondant à l'injection de la sous-population de cellules adhérentes ou de PBS. 30 L'expérimentation est stoppée 10 à 15 jours après transfert de la sous-population de cellules adhérentes (21 à 39 jours après implantation des tumeurs) 18 en raison de la progression exponentielle des tumeurs témoins, de leur ulcération et du risque de décès élevé des souris portant ces tumeurs. Outre la détermination de la progression tumorale au moyen de la mesure de la taille de la tumeur, le poids de la tumeur est également déterminé. Pour cela, les souris sont sacrifiées treize jours après injection intra-tumorale des cellules et les tumeurs sont prélevées, pesées et photographiées. Les valeurs obtenues d'une part pour la progression tumorale et d'autre part pour la mesure du poids de la tumeur sont représentatives de 3 expériences indépendantes, correspondant à trois préparations différentes de la sous-population de cellules adhérentes, et 5 souris par groupe. Les résultats du test d'inhibition de la progression tumorale sont illustrés dans la figure 1. Ils montrent une diminution drastique et significative de la taille des tumeurs Capan-1 de 46 % 13 %, 38 % 8 % et 57 % + 14 % respectivement 3, 6 et 13 jours après l'injection des cellules de la sous-population. Ces données montrent un effet anti-tumoral se manifestant par la diminution drastique de la progression des tumeurs pancréatiques Capan-1 après transfert intra-tumoral de cellules. L'expérience n'a pu être poursuivie en raison de la croissance exponentielle et de l'ulcération des tumeurs témoins. Les résultats relatifs à la mesure du poids et de la taille des tumeurs 13 jours après l'injection de la sous-population de cellules adhérentes sont illustrés dans la figure 2. Ils montrent une diminution de 50 % 0,1 % du poids des tumeurs Capan-1 après injection intra-tumorale desdites cellules. Ces résultats sont en accord avec ceux relatifs au pourcentage de progression tumorale, obtenus à partir de la mesure extrinsèque de la taille des tumeurs (figure 1) et confirment donc le rôle anti- tumoral des différentes cellules lorsque celles-ci sont injectées au niveau intra-tumoral. 2) Injection systémique Parallèlement à ces études de diminution de la progression tumorale par une injection intra-tumorale de la sous-population de cellules adhérentes, les Inventeurs ont procédé à l'administration de ces cellules par voie sanguine, afin de déterminer si elles pouvaient migrer jusqu'au site de la tumeur et y exercer leur effet. Les conditions de préparation des souris et d'injection des cellules Capan-1, de la sous-population de cellules adhérentes et du PBS sont décrites dans 19 l'Exemple I. Plus précisément, les Inventeurs ont comparé l'effet des cellules de la sous-population administrées soit directement dans les tumeurs Capan-1 (injection intra-tumorale) soit dans la veine caudale (injection systémique). La taille des tumeurs est mesurée comme indiqué ci-dessus 3 jours après le transfert des cellules de la sous- population. Les valeurs obtenues sont représentatives de 2 expériences indépendantes correspondant à deux préparations de cellules différentes, et 3 ou 4 souris par groupe. Les résultats sont illustrés dans la figure 3. Ils montrent que l'amplitude de l'inhibition de la progression tumorale mesurée 3 jours après transfert des cellules de la FSV, lorsque celles-ci sont injectées dans la veine caudale des souris porteuses de tumeurs Capan-1, est comparable à celle observé lorsque ces cellules sont directement administrées dans la tumeur (-56 % 22 % vs -65 % 26 %). Ces résultats sont en faveur d'un effet anti-tumoral in vivo des cellules de la sous-population lorsque celles-ci sont injectées par voie systémique. L'ensemble des résultat présentés dans l'Exemple 2, montrant l'inhibition de la progression tumorale par les cellules de la sous-population injectées localement au niveau intra-tumoral ou bien administrées par voies systémique au niveau de la veine locale suggère fortement un rôle anti-tumoral des cellules de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux blanc extra-médullaire. En outre, ces résultats montrent le ciblage de la tumeur pancréatique par les cellules de la FSV sélectionnées sur la base de leur adhérence sur le support de culture lorsque celles-ci sont administrées à distance dans la circulation sanguine systémique. EXEMPLE 3 : Mesure de la viabilité cellulaire Les Inventeurs ont également mesuré la viabilité des cellules Capan-1 en présence de surnageant de cultures de la sous-population de cellules adhérentes in vitro, afin de confirmer et de valider les résultats obtenus in vivo (Exemple 2). Les cellules Capan-1 sont ensemencées en sextuplés dans des boîtes de culture 96 puits à fond plat (Nunc 167008), à raison de 25000 cellules par puits dans un volume final 30 de 100 l, 48 h après, les cellules sont rincées puis traitées : - par 100 .rl de milieu RPMI sans sérum (témoin négatif, non représenté sur la figure 4) ; 20 - par 100 l de milieu RPMI complet (témoin positif, non représenté sur la figure 4) ; - par 100 l de milieu DMEM : F12 supplémenté de 10 1.1g/m1 de TNF-a (témoin positif d'inhibition de la viabilité) ; - par 100 l de milieu DMEM : F12 OK - par 100 l de surnageant de culture de cellules de la sous-population de cellules adhérentes ; ou - par 100 l de surnageant de co-culture de cellules de la sous-population de cellules adhérentes et de cellules Capan-1. Deux jours (48 h) après, la mesure de la viabilité cellulaire est réalisée à l'aide du kit CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega G3582). Les valeurs obtenues sont représentatives de 3 expériences indépendantes correspondant à trois préparations de cellules de sous-population différentes. Les résultats sont illustrés dans la figure 4. Ils montrent que le milieu conditionné par la sous-population de cellules adhérentes (surnageant de culture) est capable d'inhiber de façon significative la viabilité des cellules Capan-1. De plus, le surnageant de co-cultures de la sous-population de cellules adhérentes avec des cellules Capan-1 présente un effet inhibiteur sur la viabilité des cellules Capan- 1 plus prononcé que le surnageant conditionné par la sous-population de cellules adhérentes seules, ce qui montre que ces cellules sont capables de réagir à la présence de cellules cancéreuses pancréatiques. Ces résultats sont en faveur d'un effet anti-tumoral d'un milieu conditionné par les cellules de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux blanc extra-médullaire, ledit effet pouvant être amplifié lorsque les cellules sont activées par des cellules cancéreuses telles que les cellules de la lignée Capan-1. REVENDICATIONS 1 ) Utilisation de cellules isolées du tissu adipeux blanc extra-médullaire, sélectionnées dans le groupe constitué par la fraction stroma-vasculaire et une sous-population de ladite fraction stroma-vasculaire constituée par des cellules adhérentes, pour la préparation d'un médicament anti-tumoral. 2 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite sous-population de cellules adhérentes est susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant : -l'obtention de la fraction stroma-vasculaire à partir du tissu adipeux 10 blanc extra-médullaire ; - la purification de ladite fraction stroma-vasculaire ; - l'isolement de ladite sous-population de cellules à partir de ladite fraction purifiée par mise en culture dans un milieu liquide convenable, sélection des cellules adhérentes sur plastique, récupération des cellules après confluence, dans un 15 milieu convenable, centrifugation et récupération du culot. 3 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdites cellules sont associées à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 4 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, 20 caractérisée en ce que lesdites cellules comprennent un gène hétérologue, dont le produit de traduction est une protéine d'intérêt thérapeutique, telle qu'une enzyme capable de métaboliser une pro-drogue en composé(s) actif(s) toxique(s) pour la cellule tumorale. 5 ) Utilisation selon les revendications 1 à 4 , caractérisée en ce que 25 ledit médicament anti-tumoral est constitué par le surnageant de culture de ladite sous-population de cellules adhérentes. 6 ) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit surnageant est obtenu à partir d'une co-culture de ladite sous-population de cellules avec des cellules cancéreuses ou avec des cellules d'une lignée cellulaire cancéreuse. 30 7 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit cancer est un cancer solide ou un cancer liquide. 22 8 ) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit cancer est un cancer solide du tractus gastro-intestinal (cancer du pancréas, cancer gastrique, cancer colo-rectal). 9 ) Utilisation d'un agent anti-tumoral tel que défini aux revendications 1 à 6, à savoir sélectionné dans le groupe constitué par des cellules du tissu adipeux blanc extra-médullaire telles que définies à la revendication 1, le surnageant de culture desdites cellules ou le surnageant d'une co-culture desdites cellules avec des cellules cancéreuses ou des cellules d'une lignée cellulaire cancéreuse convenable, pour la préparation d'un adjuvant en thérapie anticancéreuse. 10 ) Utilisation d'un agent anti-tumoral tel que défini aux revendications 1 à 6, à savoir sélectionné dans le groupe constitué par des cellules du tissu adipeux blanc extra-médullaire telles que définies à la revendication 1, le surnageant de culture desdites cellules ou le surnageant d'une co-culture desdites cellules avec des cellules cancéreuses ou des cellules d'une lignée cellulaire cancéreuse convenable, pour cribler in vitro d'autres médicaments anti-tumoraux, notamment aptes à agir en synergie avec lesdites cellules ou surnageant desdites cellules.