FR 2905375 A1 20080307 FR 0607580 A 20060829 1 VARIANTS AMELIORES DE L'INTERFERON ALPHA HUMAIN Introduction : La présente invention relève du domaine de l'amélioration des protéines. Elle porte sur l'amélioration de l'interféron alpha humain (IFN-a), ainsi que des compositions comprenant un IFN-a amélioré, un acide nucléique codant celui-ci, et leurs utilisations. Les interférons ont été les premières cytokines à être découvertes par leur activité antivirale et les premières à être utilisées dans le domaine thérapeutique. Ce sont des médiateurs d'activité antivirale, antiproliférative et immunomodulatrice, sécrétés en réponse à des stimuli variés et en particulier en réponse aux infections virales. Les interférons sont classés en deux grands types : le type I qui consiste en sept classes différentes d'interférons : IFN-a, IFN-13, IFN-E, IFN-x, IFN-w, IFN-8 et IFN-i. - le type II contenant l'interféron y. Alors qu'il n'existe qu'un type d'IFN-13 humain, au moins douze espèces d'IFN-a ont été identifiées chez l'homme ainsi que de nombreux variants alléliques, codés par quatorze gènes différents situés sur le bras court du chromosome 9. Certaines molécules d'IFN-a sont très proches, telles que les molécules d'IFN-a2a et IFN-a2b qui ne diffèrent que par un seul résidu acide aminé, l'acide aminé 23, qui est un résidu arginine dans IFN-a2a et un résidu lysine dans IFN-a2b. La synthèse des IFN-a est induite dans les cellules leucocytaires (monocytes et lymphocytes B) principalement en réponse aux infections virales. Les molécules d'IFN-a présentent une masse relative de 17,5 à 23 kDa et sont très peu glycosylées. L'IFN-a est une molécule monomérique synthétisée sous forme d'un précurseur de 188 acides aminés dont les 23 premiers résidus constituent un peptide signal qui permet l'adressage et la sécrétion de la molécule d'IFN-a mature, après clivage. Les structures secondaires de l'IFN-a sont typiques de celles des interférons de classe I et se caractérisent par cinq hélices a (A-E) réliées entre elles par une grande boucle (AB) et 2905375 2 trois segments plus petits (BC, CD et DE). Quatre des cinq hélices, A, B, C et E sont agencées de manière antiparallèle pour former une structure tertiaire typique. L'action de l'IFN-a au niveau cellulaire passe par l'interaction avec au moins deux 5 glycoprotéines (IFN AR1 et IFN AR2) qui s'associent en réponse à la liaison du ligand sur l'une d'entre elles pour former le récepteur membranaire à l'IFN-a. Cette association déclenche la mise en route de cascades de transduction intracellulaires impliquant principalement des protéines kinases de la famille des Janus kinases (Jakl, Jak2 & Tyk2) chargées d'activer des facteurs de transcription de la famille STAT. Ces 10 derniers activent les gènes contenant un interferon sensitive response element au niveau de leur promoteur. Une stimulation par l'IFN-a augmente l'expression dans les cellules de plus de 200 protéines ; les effets biologiques sont pléiotropiques : -antivirales -antiprolifératifs 15 -stimulateurs de l'activité cytotoxique de différentes cellules du système immunitaire (lymphocytes T, cellules NK, monocytes, macrophages) pour augmenter l'expression des antigènes de surface associés à certaines tumeurs -stimulateurs d'autres antigènes de surface tels que les antigènes de classe I du complexe majeur d'histocompatibilité 20 -inducteurs ou activateurs de gènes pro-apoptotiques (ligands reliés au Tumor Necrosis Factor, caspases, Bak, Bax) -répresseurs de gènes anti-apoptotiques (Bd-2, protéine inhibitrice de l'apoptose) -modulateurs de différenciation -antiangiogéniques. 25 Ce très large spectre d'activité a fait de ces molécules des agents parmi les plus prometteurs pour traiter différentes maladies majeures. Bien que les interférons aient été découverts par des virologistes, leurs premières 30 utilisations cliniques en 1979 ont été pour combattre des myélomes [Joshua DE et al, Blood Rev. 1997, Déc 11(4) : 191-200]. Les interférons ont depuis démontré leur efficacité sur de nombreuses maladies d'origine virale, tumorale, allergique, inflammatoire ou angiogénique [Tilg H., Gastroenterology, 1997 Mar 112(3) 1017-21]. Pour l'instant l'IFN-a est le seul médicament approuvé pour le traitement de l'hépatite 2905375 3 C en Europe et en Amérique du Nord [Moussalli et al, J. Viral Hepat. 1998 Mar 5(2) 73-82], en association ou non à la ribavirine; il est également reconnu comme le traitement de choix pour l'hépatite B chronique sévère. 5 Ces deux maladies d'origine virale touchent un grand nombre de personnes à travers le monde. L'hépatite C chronique causée par une infection par le virus HCV, toucherait plus de 10 millions de personnes dans les principaux marchés mondiaux, dont 5 millions en Europe. Elle constitue le principal facteur des maladies hépatiques chroniques et l'une des premières causes de greffe du foie en Europe. L'Hépatite C est 10 la maladie chronique d'origine sanguine la plus commune en Chine avec environ 80 millions de personnes infectées. Elle est responsable de la mort d'environ 1 million de personnes par an à travers le monde. L'infection par le virus HBV, responsable de l'hépatite B, peut évoluer en cancer du 15 foie et en cirrhose. Cinq cent millions de personnes sont infectées à travers le monde par ce virus. Par ces propriétés antiprolifératives, l'IFN-a s'est avéré efficace dans le traitement de nombreux cancers, principalement dans le traitement des leucémies telles que les 20 leucémies myéloïdes ou lymphocytaires chroniques [Williams CD and Linch DC, Br. J. Hosp. Med. 1997 May 7-20 ; 57(9) : 436-9], mais aussi dans le traitement des carcinomes des cellules rénales, des tumeurs de la prostate ou des cancers ovariens [Bonnem, E.M. et al (1984) J. Biol. Response Modifiers 3 : 580 ; Oldham, R.K. (1985) Hospital Practice 20: 71]. L'IFN-a a également démontré son efficacité dans le 25 traitement du sarcome de Kaposi associé au SIDA et a été reconnu par la FDA pour le traitement de maladies vénériennes. Les utilisations cliniques des interférons sont répertoriées dans les revues de Gresser I. [J. Leuko Biol 1997 May 61(5) : 567-574] et Pfeffer LM [Semin. Oncol 1997 Jun 24 (3 suppl. 9) S9-63-S9-69]. 30 Les IFN-a actuellement commercialisés et utilisés sont principalement : -les interférons alpha recombinants IFN alfacon-1 (Infergen ), l'IFN-a2a (Roferon-A et Laroferon ) et l'IFN-a2b (Intron A et Viraféron ). -les dérivés peggylés de ces mêmes molécules, le Peginterferon alfa-2a (Pegasys )et le Peginterferon alfa-2b (Viraferonpeg ). 2905375 4 Deux catégories de problèmes sont permanents à l'utilisation de l'IFN-a comme agent thérapeutique : - les effets indésirables qu'il entraine 5 - la rapide inactivation de la molécule dans les systèmes circulants. Les principaux effets indésirables sont de quatre ordres : généraux, neuropsychiatriques, hématologiques et hépatiques. Les symptômes sont le plus souvent dose dépendants, cumulatifs et s'aggravant avec le temps. Les effets sont liés au rythme 10 d'administration : réduits par un rythme régulier et majorés en cas d'administration irrégulière. Ces effets sont le plus souvent temporaires et réversibles, spontanément ou après réduction des doses. La toxicité aigüe entraîne dans les trois à six heures, voire 30 à 120 minutes après l'injection, céphalées, malaises, nausées et vomissements. D'une manière générale les effets indésirables les plus sérieux sont dépressions, lymphopénies 15 ou de rares cas de nécrose au site d'injection sous-cutané. Les effets indésirables les plus fréquents sont les symptômes pseudo-grippaux, les réactions inflammatoires au site d'injection et l'élévation des transaminases. Lors de leur utilisation thérapeutique, les molécules d'interféron peuvent être 20 administrées intramusculairement, en sous-cutanée ou en intraveineuse, chacune de ces voies d'administration entraînant un profil pharmacocinétique différent. Durant une perfusion intraveineuse, les concentrations déclinent rapidement et ne représentent que 1/20 à 1/30 des valeurs initiales à la 34 ème heure après la perfusion. En sous-cutanée la résorption de l'IFN-a est prolongée par rapport à la voie intraveineuse et les 25 concentrations maximales (Cmax) plus lentement atteintes et de valeur moins importante. Ces Cmax apparaissent de une à huit heures après l'injection et les concentrations sont mesurables de quatre à 24 heures. Les demi-vies d'élimination sont de quatre à 16 heures pour l'IFN-a. 30 Les principaux facteurs d'élimination in vivo de l'IFN-a sont la protéolyse via les protéases du sérum, la clairance rénale et les voies d'endocytose médiées par récepteur. Ils entraînent la disparition de la cytokine du plasma quelques heures après son administration [Rostaing, et al., 1998, J Am. Soc. Nephrol. 9, 2344-2348]. 2905375 5 Cette rapide disparition de l'IFN-a dans les systèmes circulants du corps et dans des tissus variés [O'Kelly, et al., 1985. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 178, 407-411] reste la limite principale à l'utilisation de ces molécules en thérapeutique. Pour des traitements qui ne peuvent être efficaces que sur de nombreux mois, elle contraint le patient à des 5 injections fréquentes d'IFN-a, particulièrement inconfortables à long terme et le soumet aux effets secondaires de la molécule à chaque injection. Depuis les premiers brevets concernant la production d'IFN-a recombinants dans les années 1980 (US 4,530,901 ; EP 0128467), de nombreux axes de recherche ont été 10 développés dans le but d'améliorer la biodisponibilité des IFN-a recombinants dans le temps et donc leur efficacité. Des molécules chimériques entre différents IFN-a ont été construites au milieu des années 1980 donnant lieu à plusieurs brevets parmi lesquels EP 0146903 ; US 5,071,761. 15 Différentes molécules d'IFN-a présentant des modifications ponctuelles ont également été produites : -C11669394 décrit la construction de molécules dans lesquelles les résidus cystéines ont été éliminés pour éviter les problèmes d'agrégation conséquents à d'éventuels ponts 20 disulfure intermoléculaires. -Une forme d'IFN-a allongée de 1, 2 ou 3 acides aminés est décrite dans FR 2669824. -Un IFN-a 0-glycosylé est rapporté dans EP 0538300. Aucune de ces formes n'a cependant conduit au développement de médicaments. L'apparition des formes pegylées de l'IFN-a, présentant une demie-vie prolongée dans 25 le sang, a constitué la seconde génération de molécules d'IFN-a utilisable à des fins thérapeutiques. Les interférons pégylés sont constitués par l'interféron conjugué à du polyéthylène glycol (PEG). Deux types de peg-IFN-a ont été développés (EP 0730470 et EP 0809996) qui se différencient par leur taux de pegylation. La pegylation diminue la clairance rénale aboutissant à une augmentation importante de la demie-vie des 30 molécules. Cela permet d'obtenir une concentration plasmatique d'interféron plus stable et prolongée dans le temps, couvrant toute une semaine. Cette amélioration de la pharmacocinétique des molécules nécessite la réalisation d'une seule injection par semaine des peg-IFN-a au lieu de trois avec l'interféron standard. 2905375 6 En juin 1998, la FDA a autorisé pour les patients souffrant d'hépatite chronique C l'utilisation de l'IFN-a sous forme pegylée ou non de façon combinée avec la ribavirine, un analogue nucléosidique de la guanosine qui présente une forte activité antivirale sur 5 plusieurs virus. Ce traitement en combinaison a montré chez de nombreux patients un effet plus soutenu qu'avec l'IFN-a seul ; il présente également une solution supplémentaire aux patients ayant déjà été traités avec l'IFN-a seul et présentant une rechute. Les traitements actuels nécessitent pendant plusieurs mois trois injections par semaine pour les formes classiques de l'IFN-a et une injection par semaine pour les 10 formes pegylées de l'IFN-a . Cependant ce confort de traitement apporté par les IFN-a pegylés ne concerneraient que les patients ayant une infection par le virus HCV de génotype 1 et ne présentant qu'une faible charge virale, c'est-à-dire environ 50% des patients en Europe et aux Etats-Unis. Par ailleurs, les formes pegylées des IFN- a présentent deux inconvénients majeurs : 15 - leur activité réduite, qui nécessite l'injection de quantités plus importantes d'IFN-a pour obtenir le même effet thérapeutique. - leur complexité de production pour assurer une reproductibilité du taux de pegylation et de la stabilité de la molécule conjuguée. 20 Très récemment, une protéine résultant de la fusion entre la serum albumine humaine et l'IFN-a2b a été présentée comme une évolution par rapport aux formes pegylées d'IFN-a (US20060051859). Cette molécule, actuellement en phase clinique II, devrait permettre aux patients de réduire à deux fois par mois leur injection en IFN-a. L'approche de construire des protéines de fusion pour améliorer la demi-vie de l'IFN-a 25 avait été déjà tentée avec un fragment Fc d'anticorps (US2005042729) et une sous-unité du récepteur humain à l'IFN-a (EP 1037658). Trois familles de brevets de la société Maxygen Inc. (US20040219131, US20040002474, WO2005113592) présentent des nouvelles molécules d'IFN-a 30 obtenus par shuffling des différentes sous-familles naturelles d'IFN-a , conjugués ou non à un polymère et présentant une activité antivirale augmentée ou un ratio activité 2905375 7 antivirale / activité antiproliférative dans le but d'améliorer l'utilisation thérapeutique des IFN-a. Récemment, des variants d'IFN-a présentant une résistance accrue à la protéolyse ont 5 été présentés dans le brevet WO2004022593 ; ces variants résisteraient particulièrement à la protéolyse dans le tractus gastro-intestinal et seraient donc susceptibles d'être administrés par voie orale, représentant un gain non négligeable en terme de soins de santé. 10 Ainsi, l'obtention d'interféron ayant une durée de vie prolongée dans l'organisme reste toujours une priorité. Une molécule plus stable (soit parce qu'il s'agit d'un variant, soit parce que des additifs sont ajoutés à la molécule, soit parce que la formulation est améliorée) représenterait une nouvelle génération de molécules susceptibles de supplanter les molécules actuellement sur le marché. 15 Elle permettrait un meilleur effet in vivo de l'IFN-a, cet effet in vivo étant la conséquence de la combinaison entre l'activité spécifique de la protéine et sa durée d'action ; elle permettrait également de réduire l'impact des effets secondaires sur les patients. 20 Au moins une étude a montré une corrélation entre thermostabilité améliorée d'une molécule et l'augmentation de ses caractéristiques pharmacocinétiques [Cha et al, Journal of Biological Chemistry,1998, 273 (4), 2153-2160]. Dans de nombreux cas, les molécules ayant une thermostabilité augmentée sont des molécules plus compactes sur 25 certaines zones de leur structure et cette caractéristique permettrait une meilleure résistance à la protéolyse de ces variants et donc une demie-vie augmentée in vivo. Contrairement à d'autres molécules thérapeutiques telles que l'EPO et l'insuline, il n'existe pas de molécules mutantes d'IFN-a non conjuguées sur le marché. La présente invention propose un variant de l'IFN-a sélectionné pour sa thermostabilité accrue, et présentant des caractéristiques pharmacocinétiques améliorées permettant une activité in vivo prolongée de l'IFN-a. 30 2905375 8 Résumé de l'invention La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-a humain présentant des caractéristiques pharmacocinétiques améliorées et une activité in vivo prolongée. 5 En particulier, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-a humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en D2S, D2N, D2M, D2L, L3M, Q5S, Q5I, H7S, H7T, H7L, S8I, S8C, S11M, R12T, M16S, M21I, R22G, R22T, R22Y, R23A, I24L, I24D, L26T, K31G, P39H, E41M, E41V, E41T, E42V, F43A, N45T, Q46R, 10 F47Y, F47V, F47I, Q48P, I53D, P54L, L56P, L56H, M59F, Q61L, N65F, L66A, F67S, F67L, S72Y, W76G, T79S, F84S, Y89C, L92N, L95D, A97M, Q 101 M, Q 101 Y, Q101R, G102V, P109L, M111N, M111P, E113Y, D114S, A118S, A118G, K121W, Y122P, Y122S, F123P, F123Y, Q124P, R125I, S136A, W140L, W140T, V142D, V142M, V142L, V142E, V143A, R144S, E146M, S150P, F151S, L157T, S160R, 15 R162Q, et S163T. La présente invention concerne également un variant thermostable de l'IFN-a humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une unique substitution L3M, T79S ou R162Q, une combinaison de plusieurs de ces trois mutations, ou une, deux ou trois 20 substitutions sélectionnées parmi L3M, T79S et R162Q en combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe consistant en D2S, D2N, D2M, D2L, Q5S, Q5I, H7S, H7T, H7L, S8I, S8C, S11M, R12T, M16S, M21I, R22G, R22T, R22Y, R23A, I24L, I24D, L26T, K31G, P39H, E41M, E41V, E41T, E42V, F43A, N45T, Q46R, F47Y, F47V, F47I, Q48P, I53D, P54L, L56P, L56H, M59F, Q61L, N65F, 25 L66A, F67S, F67L, S72Y, W76G, F84S, Y89C, L92N, L95D, A97M, Q 101 M, Q 101 Y, Q101R, G102V, P109L, M111N, M111P, E113Y, D114S, A118S, A118G, K121W, Y122P, Y122S, F123P, F123Y, Q124P, R125I, S136A, W140L, W140T, V142D, V142M, V142L, V142E, V143A, R144S, E146M, S150P, F151S, L157T, S160R et S 163T. 30 Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne en particulier un variant thermostable de l'IFN-a humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en D2S, D2N, D2M, D2L, L3M, Q5S, Q5I, H7S, H7T, H7L, S8I, S8C, S11M, R12T, M16S, M21I, 2905375 9 R22G, R22T, R22Y, R23A, I24L, I24D, L26T, K31 G, P39H, E41M, E41V, E41T, E42V, F43A, N45T, Q46R, F47Y, F47V, F471, Q48P, I53D, P54L, L56P, L56H, M59F, Q61L, N65F, L66A, F67S, F67L, S72Y, W76G, T79S, F84S, Y89C, L92N, L95D, A97M, Q101M, Q101Y, Q101R, G102V, P109L, M111N, M111P, E113Y, D114S, 5 A118S, A118G, K121W, Y122P, Y122S, F123P, F123Y, Q124P, R125I, S136A, W 140L, W 140T, V142D, V142M, V142L, V142E, V143A, R144S, E146M, S 150P, F 151 S, L157T, S 160R, R162Q, et S163T. De préférence, la substitution est sélectionnée parmi le groupe consistant en D2N, D2M, L3M, H7T, H7L, N45T, M59F, T79S, Y89C, F123Y, R125I, R162Q et V143A. 10 Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-a humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en Q101M + F123P, R22T + V142L, S8I + E41T, M111P + S150P, L3M + W140T, F47V + P54L + 15 G102V, S8C + L26T + T79S, R22Y + E42V + S163T, E41V + L56H + E146M, H7S + R22G + E41M, D2S + R12T + V142M, Q48P + Y122P + V142D, S72Y + L95D + L157T, D2L + Q5I + I24D + P39H, F47I + W76G + V142E + R144S, F67L + L92N + D114S+R162Q, L3M+Q61L+A118G+F151S, I24L + F47Y + I53D + P109L + K121W, K31G + T79S + M111N + Y122S + S160R, L66A + A97M + Q101R + 20 A118S + W140L + R162Q, Q5S + S11M + M21I + F43A + N65F + Q101Y + E 113Y, et M16S + R23A + Q46R + L56P + F67S +F84S + Q124P + S136A. La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention, une cassette d'expression d'un acide 25 nucléique selon la présente invention, un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné de préférence parmi un plasmide et un vecteur viral. La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide, d'une cassette 30 d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule. Elle concerne en outre une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant un variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention. Elle concerne l'utilisation d'une telle cellule pour produire un variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention. Elle concerne 2905375 10 également une méthode de production d'un variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du 5 variant thermostable de l'IFN-a humain produit par la cellule. La cellule peut être procaryote ou eucaryote. La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention ou un acide nucléique 10 codant pour celle-ci. Ainsi, elle concerne en outre un variant thermostable de l'IFN-a humain ou une composition pharmaceutique selon la présente invention en tant que médicament. Notamment, la présente invention concerne l'utilisation d'un variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention ou d'une composition pharmaceutique le comprenant pour la préparation d'un médicament antiviral, 15 antiprolifératif ou immunomodulateur. En particulier, le médicament selon la présente invention est destiné au traitement d'une infection virale, en particulier des hépatites chroniques à virus B ou C, d'une leucémie telle que la leucémie myéloïde ou lymphocytaire chronique, un cancer, en particulier un carcinome des cellules rénales, une tumeur de la prostate ou un cancer ovarien, un sarcome de Kaposi associé au SIDA 20 ou d'une maladie vénérienne. L'IFN-a humain selon la présente invention peut être utilisé en combinaison avec un autre principe actif, par exemple un analogue de nucléoside tel que la ribavirine. Le variant thermostable selon la présente invention peut également être conjugué à un 25 polymère de façon covalente ou non, ce polymère pouvant être par exemple un polyéthylène glycol (PEG). Le taux de pegylation et la taille du polymère peuvent être variables. Le variant thermostable selon la présente invention peut être utilisé dans une composition pharmaceutique, telle que décrite ci-dessus, dans sa forme conjuguée. 30 Brève description des figures Tableau 1 : Mutants de l'IFNa présentant une thermostabilité accrue identifiés en crible primaire. La numérotation des résidus correspond à celle de la SEQ ID N 3. Pour chacun des mutants, les résidus mutés sont indiqués ainsi que les acides aminés sauvage et mutant selon le code à une lettre des acides aminés. 2905375 11 Tableau 2 : Mutants de l'IFN-a validés en crible secondaire pour leur thermostabilité accrue. La numérotation est la même que celle mentionnée ci-dessus. 5 Figure 1 : Alignement de la séquence des interférons humains IFN-a 10, IFN-a 17, IFN-a 4, IFN-a 7, IFN-a 21, IFN-a 16, IFN-a 8, IFN-a 14, IFN-a 1, IFN-a 13, IFN-a 6, IFN-a 2 et IFN-a 5 dans leur forme précurseur. Description détaillée de l'invention 10 La présente invention concerne des variants de l'interféron alpha humain (IFN-a) dont la stabilité, en particulier la stabilité thermique, est accrue par rapport à l'IFN-a humain sauvage. Les variants protéiques de l'IFN-a humain de cette invention présentent des caractéristiques pharmacocinétiques améliorées et en particulier une demie-vie in vivo allongée. La stabilité face à la dénaturation thermique des candidats améliorés ainsi que 15 la conservation de leur activité a été validée par des tests biologiques. Les variants de cette invention constituent des alternatives aux IFN-a humains recombinants actuellement utilisés dans le domaine thérapeutique, notamment dans les traitements des infections virales et en particulier dans les traitements des hépatites B et C chroniques, des leucémies, des cancers tels que des carcinomes rénaux, des tumeurs de la prostate, 20 des cancers ovariens, du sarcome de Kaposi et des maladies vénériennes. La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFN-a humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution décrite dans le tableau 2. 25 La présente invention concerne de préférence un variant thermostable de l'IFN-a humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en D2S, D2N, D2M, D2L, L3M, Q5S, Q5I, H7S, H7T, H7L, S8I, S8C, S11M, R12T, M16S, M21I, R22G, R22T, R22Y, R23A, 30 124L, 124D, L26T, K31 G, P39H, E41 M, E41 V, E41 T, E42V, F43A, N45T, Q46R, F47Y, F47V, F47I, Q48P, I53D, P54L, L56P, L56H, M59F, Q61L, N65F, L66A, F67S, F67L, S72Y, W76G, T79S, F84S, Y89C, L92N, L95D, A97M, Q101M, Q1O1Y, Q101R, G102V, P109L, M111N, M111P, E113Y, D114S, A118S, A118G, K121W, Y122P, Y122S, F123P, F123Y, Q124P, R1251, S136A, W140L, W140T, V142D, 2905375 12 V142M, V142L, V142E, V143A, R144S, E146M, S 150P, F151S, L157T, S 160R, R162Q, et S163T ou une combinaison de ceux-ci. La combinaison peut consister en 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 substitutions sélectionnées dans ce groupe. Par ailleurs, le variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention peut comprendre d'autres 5 mutations non décrites dans ce groupe, de préférence des substitutions, notamment certaines connues dans le domaine. Dans un mode de réalisation préféré, le variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention comprend moins de 40 substitutions par rapport à sa forme naturelle, de préférence moins de 30 ou 20 substitutions, et dans un mode de réalisation encore plus préféré moins de 10 10 substitutions. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne également un variant thermostable de l'IFN-a humain présentant une unique substitution sélectionnée parmi L3M, T79S et R162Q, une combinaison de plusieurs de ces trois substitutions, ou une, deux ou trois substitutions parmi L3M, T79S et R162Q, en combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe 15 consistant en D2S, D2N, D2M, D2L, Q5S, Q5I, H7S, H7T, H7L, S8I, S8C, S11M, R12T, M16S, M211, R22G, R22T, R22Y, R23A, I24L, I24D, L26T, K31G, P39H, E41M, E41V, E41T, E42V, F43A, N45T, Q46R, F47Y, F47V, F47I, Q48P, I53D, P54L, L56P, L56H, M59F, Q61L, N65F, L66A, F67S, F67L, S72Y, W76G, F84S, Y89C, L92N, L95D, A97M, Q101M, Q101Y, Q101R, G102V, P109L, M111N, M111P, 20 E113Y, D114S, A118S, A118G, K121W, Y122P, Y122S, F123P, F123Y, Q124P, R1251, S136A, W 140L, W 140T, V142D, V142M, V142L, V142E, V143A, R144S, E146M, S150P, F151S, L157T, S160R, et S163T. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un variant 25 thermostable de l'IFN-a humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en D2S, D2N, D2M, D2L, L3M, Q5S, Q5I, H7S, H7T, H7L, S8I, S8C, S11M, R12T, M16S, M211, R22G, R22T, R22Y, R23A, I24L, I24D, L26T, K31G, P39H, E41M, E41V, E41T, E42V, F43A, N45T, Q46R, F47Y, F47V, F47I, Q48P, I53D, P54L, L56P, L56H, M59F, Q61L, N65F, 30 L66A, F67S, F67L, S72Y, W76G, T79S, F84S, Y89C, L92N, L95D, A97M, Q101M, Q101Y, Q101R, G102V, P109L, M111N, M111P, E113Y, D114S, A118S, Al18G, K121W, Y122P, Y122S, F123P, F123Y, Q124P, R125I, S136A, W140L, W140T, V142D, V142M, V142L, V142E, V143A, R144S, E146M, S 150P, F151S, L157T, S 160R, R162Q, et S163T. De préférence, la substitution est sélectionnée parmi le 2905375 13 groupe consistant en D2N, D2M, L3M, H7T, H7L, N45T, M59F, T79S, Y89C, F123Y, R125I, R162Q et V 143A. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un variant 5 thermostable de l'IFN-a humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en Q 101 M + F123P, R22T + V142L, S8I + E41T, M111P + S150P, L3M + W140T, F47V + P54L + G102V, S8C + L26T + T79S, R22Y + E42V + S163T, E41V + L56H + E146M, H7S + R22G + E41M, D2S + R12T + V142M, Q48P + Y122P + V142D, S72Y + L95D + 10 L157T, D2L + Q5I + I24D + P39H, F47I + W76G + V142E + R144S, F67L + L92N + D114S + R162Q, L3M + Q61L + A118G + F151S, I24L + F47Y + I53D + P109L + K121W, K31G + T79S + M111N + Y122S + S160R, L66A + A97M + Q101R +A118S+W140L+R162Q,Q5S+S11M+M211+F43A+N65F+Q101Y+E113Y, et M16S + R23A + Q46R + L56P + F67S +F84S + Q124P + S 136A. 15 L'IFN-a humain peut être tout interféron de la famille des IFN-a humains. Notamment, l'IFN-a humain peut être un interféron alpha humain sélectionné parmi l'IFN-a 10, l'IFNa 17,1' IFN-a 4,1' IFN-a 7, l'IFN-a 21, l'IFN-a 16, l'IFN-a 8, l'IFN-a 14, l'IFN-a 1, l'IFN-a 13, l'IFN-a 6, l'IFN-a 2 et l'IFN-a 5. Ces interférons présentent une forte 20 identité, en particulier au minimum 75 % d'identité (voir Figure 1). Les séquences SEQ ID N 2 et SEQ ID N 3 décrivent les séquences protéiques de l'IFN-a2b humain précurseur et mature, respectivement. Les séquences SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6 décrivent les séquences protéiques de l'IFN-a2a humain précurseur et mature, respectivement. Ainsi, le variant thermostable de l'IFN-a humain de la présente 25 invention peut être l'IFN-a2b ou l'IFN-a2a. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le variant thermostable de l'IFN-a selon la présente invention présente une séquence SEQ ID N 5 ou N 6 avec la ou les substitutions sélectionnées. Dans un autre mode de réalisation particulier, le variant thermostable de l'IFN-a selon la présente invention présente une séquence SEQ ID N 2 ou N 3 avec la ou les substitutions 30 sélectionnées. Dans un mode de réalisation préféré, le variant thermostable de l'IFN-a selon la présente invention présente la séquence de l'interféron mature. La numérotation adoptée dans la présente demande est celle qui tient compte des résidus de l'IFN-a2 dans sa forme mature (SEQ ID No 3), c'est-à-dire sans le peptide signal. La 2905375 14 position de la substitution dans la forme précurseur ou dans d'autres interférons de la famille des IFN-a humains pourra facilement être déterminée par l'homme du métier. Les séquences SEQ ID Nos 1 et 4 décrivent un exemple de séquence nucléique codant 5 pour l'IFN-a2b et l'IFN-a2a, respectivement. Un acide nucléique codant pour un variant selon la présente invention peut facilement être préparé sur la base de ces séquences par les techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple par mutagenèse dirigé du codon à modifier pour obtenir la substitution d'acide aminé désirée. 10 Par fragment fonctionnel est entendu un fragment de l'IFN-a humain présentant l'activité de l'IFN-a humain. Le fragment peut comprendre 100, 110, 120, 130 ou 140 acides aminés consécutifs de l'IFN-a humain. 15 Les variants de la présente invention présentent une augmentation de la thermostabilité par rapport à l'IFN-a humain sauvage. Cette augmentation est d'au moins 5%, de préférence au moins 10, 20 ou 30%. Par thermostabilité , est entendu la capacité de la protéine à conserver son activité après avoir été soumise à l'action de la chaleur. Par exemple, la protéine peut être incubée 10 minutes à 59 C. La thermostabilité du variant 20 est alors estimée par le pourcentage d'activité résiduelle après ce prétraitement. Cette mesure de la thermostabilité d'un variant est alors comparée à la même valeur obtenue en utilisant l'IFN-a humain sauvage produit dans les mêmes conditions. Un variant qui présente une thermostabilité améliorée mais une activité réduite peut être utilisable. De préférence, les variants thermostables de la présente invention conservent 25 une activité (condition sans prétraitement) qui correspond à au moins 10 % de l'activité de l'IFN-a humain sauvage, et de préférence à au moins 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 % de l'activité de l'IFN-a humain sauvage. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, les variants thermostables de la présente invention conservent une activité équivalente à celle de l'IFN-a humain sauvage, voire augmentée. 30 Un facteur intéressant de sélection des variants d'intérêt est l'activité relative du variant multiplié par le pourcentage d'activité résiduelle. 2905375 15 La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention. La présente invention concerne également une cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention. Elle concerne en outre un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette 5 d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné parmi un plasmide et un vecteur viral. L'acide nucléique peut être de l'ADN (ADNc ou ADNg), de l'ARN, un mélange des deux. Il peut être sous forme simple chaîne ou en duplex ou un mélange des deux. Il 10 peut comprendre des nucléotides modifiés, comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. Il peut être préparé par toutes méthodes connues de l'homme du métier, dont la synthèse chimique, la recombinaison, la mutagenèse, etc... 15 La cassette d'expression comprend tous les éléments nécessaires à l'expression du variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention, notamment les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être procaryote ou eucaryote. En particulier, la cassette d'expression comprend un promoteur et un terminateur, facultativement un amplificateur. Le 20 promoteur peut être procaryote ou eucaryote. Des exemples de promoteurs procaryotes préférés sont les suivants : Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, les promoteurs d'ARN polymérase de bactériophage T3 or T7, le promoteur de la polyhèdrine, le promoteur PR ou PL du phage lambda. Des exemples de promoteurs eucaryotes préférés sont les suivants : promoteur précoce du CMV, promoteur de la thymidine 25 kinase de HSV, promoteur précoce ou tardif de SV40, le promoteur de la métallothionéine-L de souris, et les régions LTR de certains rétrovirus. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996; Immunology in Current Protocols in 30 Molecular Biology). La présente invention concerne un vecteur portant un acide nucléique ou une cassette d'expression codant pour un variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention. Le vecteur est de préférence un vecteur d'expression, c'est-à-dire qu'il 2905375 16 comprend les éléments nécessaires à l'expression du variant dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être un procaryote, par exemple E. coli, ou un eucaryote. L'eucaryote peut être un eucaryote inférieur comme une levure (par exemple, S. cerevisiae) ou un champignon (par exemple du genre Aspergillus) ou un eucaryote supérieur comme une 5 cellule d'insecte, de mammifère ou de plante. La cellule peut être une cellule mammifère, par exemple COS, CHO (US 4,889,803 ; US 5,047,335). Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire. Le vecteur peut être un plasmide, un phage, un phagemide, un cosmide, un virus, un YAC, un BAC, un plasmide pTi d'Agrobacterium, etc... Le vecteur peut comprendre de préférence un ou 10 plusieurs éléments sélectionnés parmi une origine de réplication, un site de clonage multiple et un gène de sélection. Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur est un plasmide. Des exemples non-exhaustifs de vecteurs procaryotes sont les suivants : pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDl0, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, 15 pKK233-3, pDR540, pBR322, et pRIT5 (Pharmacia), pET (Novagen). Des exemples non-exhaustifs de vecteurs eucaryotes sont les suivants : pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia); et pQE-30 (QLAexpress). Les vecteurs viraux peuvent être de manière non-exhaustive des adénovirus, des AAV, des HSV, des 20 lentivirus, etc... De préférence, le vecteur d'expression est un plasmide ou un vecteur viral. La séquence codant l'IFN-a humain selon la présente invention peut comprendre ou ne pas comprendre le peptide signal. Dans le cas où elle ne le comprend pas, une 25 méthionine peut être éventuellement ajoutée à l'extrémité N-terminale. Dans une autre alternative, un peptide signal hétérologue peut être introduit. Ce peptide signal hétérologue peut être dérivé d'un procaryote tel que E. coli ou d'un eucaryote, notamment une cellule mammifère, d'insecte ou d'une levure. 30 La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule. La présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant un variant thermostable de l'IFN-a humain et son utilisation pour produire un variant thermostable de l'IFN-a 2905375 17 humain recombinant selon la présente invention. Elle concerne également une méthode de production d'un variant thermostable de l'IFN-a humain recombinant selon la présente invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la 5 mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant thermostable de l'IFN-a humain produit par la cellule. Dans un mode de réalisation alternatif, la méthode de production d'un variant thermostable de l'IFN-a humain recombinant selon la présente invention comprend la fourniture d'une cellule comprenant un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la 10 présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant thermostable de l'IFNa humain produit par la cellule. En particulier, la cellule peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable par l'acide nucléique codant le variant. Cet acide nucléique peut être contenu dans la cellule sous forme d'épisome ou sous forme chromosomique. Les méthodes de production de 15 protéines recombinantes sont bien connues par l'homme du métier. Par exemple, on peut citer les modes spécifiques décrits dans US 5,004,689, EP 446 582, Wang et al. (Sci. Sin. B 24:1076-1084, 1994 et Nature 295, page 503) pour une production dans E. coli, et James et al. (Protein Science (1996), 5:331-340) pour une production en cellules mammifères. 20 L'activité in vitro de l'IFN-a humain peut être déterminée en mesurant son activité antivirale, par la capacité de l'IFN-a à réduire l'effet cytopathique de virus sur des lignées cellulaires sensibles à ces virus. Plusieurs couples virus/lignées cellulaires sont disponibles parmi lesquels ECMV (virus de l'encéphalomyocardite)/HuH7 (lignée 25 hépatique humaine), ECMV/Hela, ECMV/WISH, VSV (virus de la stomatite vésiculaire)/HuH7, VV (virus de la vaccine)/Hela, YFV (virus de la fièvre jaune)/HepG2, HIV(virus de l'immunodéficience humaine)/CD4 primaire. L'activité antiproliférative de l'IFN-a peut également être déterminée grâce à des tests 30 basés sur l'utilisation des lignées cellulaires humaines Daudi. L'activité de l'IFN-a peut également être testée en utilisant un gène rapporteur, par exemple la luciférase, placée sous le contrôle d'un promoteur sensible à l'IFN-a contenant des élements ISRE (Interferon Stimulated Response Element). La production 2905375 18 du gène rapporteur est ainsi dosée en réponse à une stimulation par l'IFN-a. Le vecteur pISRE/luciférase est disponible commercialement. Dans un mode de réalisation préféré, cette méthode utilisant ce vecteur est utilisée pour déterminer l'activité de l'IFN-a. 5 L'augmentation de la thermostabilité de l'IFN-a tout en conservant son activité biologique permet d'envisager l'élaboration de traitements plus efficaces permettant, à activité biologique égale, une réduction des doses thérapeutiques utilisées et donc une réduction des effets secondaires indésirables associés au traitement. 10 La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un variant de l'IFN-a humain thermostable selon la présente invention. La présente invention peut également concerner une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique codant un variant de l'IFN-a humain thermostable selon la présente invention. La composition pharmaceutique peut comprendre en outre un support ou un 15 excipient pharmaceutiquement acceptable. De tels supports et excipients sont bien connus de l'homme du métier (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed. , 20 Pharmaceutical Press[2000]). La composition pharmaceutique peut comprendre en outre un autre principe actif. La présente invention concerne également un variant de l'IFN-a humain thermostable selon la présente invention en tant que médicament. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont appropriées pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra- auriculaire, ledit principe actif pouvant être administré sous forme unitaire d'administration. Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des gels, des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales ou injectables, des timbres transdermiques (patch), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-auriculaire, par inhalation, des 25 30 2905375 19 formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, des formes d'administration rectale ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres. Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes usuelles des domaines considérés. Dans 5 un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique est liquide. Les dites formes unitaires sont dosées pour permettre une administration journalière de 0,001 à 100 gg de principe actif par kg de poids corporel, selon la forme galénique. Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont 10 appropriés; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse du patient. Dans un mode de réalisation préféré, l'IFN-a est administré par la voie parentérale, et préférentiellement par injection sous-cutanée. Par exemple, une dose habituelle l'IFN-a par injection sous- 15 cutanée est comprise entre 1 et 100 1.tg/m2 si la surface corporelle est supérieure à 0,5 m2 et entre 0,01 et 10 gg/kg de poids corporel si la surface corporelle est inférieure ou égale à 0,5 m2. Les très larges propriétés pharmacologiques de l'IFN-a ont fait qu'il a été développé au 20 niveau thérapeutique pour le traitement de nombreuses maladies variées. Pour ces propriétés antivirales, l'IFN-a est le seul médicament approuvé pour le traitement de l'hépatite C en Europe et en Amérique du Nord; il est également reconnu comme le traitement de choix pour l'hépatite B chronique sévère. Pour ses propriétés antiprolifératives, l'IFN-a s'est avéré efficace dans le traitement de nombreux cancers, 25 principalement dans le traitement des leucémies telles que les leucémies myéloïdes ou lymphocytaires chroniques, mais aussi dans le traitement des carcinomes des cellules rénales, des tumeurs de la prostate ou des cancers ovariens. L'IFN-a a également été prouvé efficace dans le traitement du sarcome de Kaposi associé au SIDA et a été reconnu par la FDA pour le traitement de maladies vénériennes. 30 Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un variant de l'IFN-a humain thermostable ou d'une composition pharmaceutique selon la présente invention pour la préparation d'un médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. Ainsi, ce médicament est destiné à traiter des maladies inflammatoires, des cancers, des 2905375 20 infections, des troubles osseux, des maladies auto-immunes, etc... Dans un mode de réalisation préféré, le médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'hépatite C, l'hépatite B, les leucémies telles que les leucémies myéloïdes ou lymphocytaires chroniques, un cancer tel qu'un carcinome des cellules 5 rénales, un cancer de la prostate, un cancer ovarien, le syndrome de kaposi associé au SIDA. Le variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention peut être utilisé en combinaison avec un autre principe actif, par exemple un principe actif sélectionné 10 parmi un anticorps, un agent anti-tumoral ou de chimiothérapie, un glucocorticoïde, un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique, un vaccin, un bronchodilatateur, un stéroïde, un agent beta-adrénergique, un agent immunomodulateur, une cytokine, l'hydroxyurée, un agent alkylant, un antagoniste de l'acide folique, un antimétabolite du métabolisme des acides nucléiques, un poison 15 fusoral, un antibiotique, un analogue de nucléotides, un analogue nucléosidique de la guanosine présentant une activité antivirale (ou un dérivé), un rétonoïde, un inhibiteur de lipoxygénase et de cyclooxygénase, un acide fumarique et ses sels, un analgésique, un spasmolytique, un antagoniste du calcium et une combinaison de ceux-ci. Le principe actif additionnel peut être administré avant, simultanément ou après 20 l'administration d'IFN-a selon la présente invention. De plus, il peut être administré par la même voie d'administration ou par deux voies d'administration distinctes. Ainsi, la présente invention concerne un produit comprenant un variant thermostable de l'IFN-a selon la présente invention et un autre principe actif, de préférence sélectionné dans la liste ci-dessus, pour une préparation combinée destinée à une utilisation simultanée, 25 séquentielle ou séparée pour le traitement d'une des pathologies citées ci-dessus. Le variant thermostable selon la présente invention peut également être conjugué à un polymère de façon covalente ou non, ce polymère pouvant être par exemple un polyéthylène glycol (PEG). Le taux de pegylation et la taille du polymère peuvent être 30 variables. Le variant thermostable selon la présente invention peut être utilisé sous sa forme conjuguée dans une composition pharmaceutique telle que décrite dans le paragraphe ci-dessus. 2905375 21 La présente invention concerne en outre une méthode de traitement antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur chez un patient le nécessitant, comprenant l'administration à ce même patient d'une quantité thérapeutique efficace d'un variant thermostable de l'IFN-a humain selon la présente invention. De préférence, la méthode 5 de traitement est destinée au traitement d'une pathologie citée ci-dessus. Facultativement, la méthode peut comprendre en outre l'administration d'un autre principe actif, de préférence sélectionné parmi ceux cités ci-dessus. Exemples : 10 Exemple 1 : Identification de mutants thermostables de l'IFN-a. La liste des mutants de l'IFN-a identifiés par leur thermostabilité améliorée dans un crible primaire de thermostabilité est présentée dans le tableau 1. Les mutations portées par les clones sélectionnés ont été identifiées ; la numérotation des résidus correspond à 15 celle de la SEQ ID N 3. Pour chacun des mutants, les résidus mutés sont indiqués ainsi que les acides aminés sauvage et mutant selon le code à une lettre des acides aminés. Les différents mutants isolés lors de cette sélection primaire ont été transformés à nouveau individuellement et leurs niveaux de thermostabilité comparés à celui de l'IFN-20 a sauvage. La liste des mutants de l'IFN-a confirmés pour leur thermostabilité améliorée dans ce crible secondaire est présentée dans le tableau 2. La numérotation des résidus est la même que celle mentionnée ci-dessus. 25 Exemple 2 : Analyse fonctionnelle des mutants thermostables de l'IFN-a. Les variants de l'IFN-a humain ainsi sélectionnés pour leur thermostabilité améliorée sont exprimés transitoirement en cellules animales COS-7. Ces protéines sont sécrétées dans le surnageant de culture. De façon à évaluer la stabilité et la conservation de 30 l'activité de ces variants, les surnageants de culture de cellules COS-7 sont soumis à une dénaturation thermique (10 minutes à 59 C). Ces protéines (dénaturées ou non) sont ensuite mises en contact avec des cellules HeLa transfectées contenant la luciférase comme gène rapporteur, celle-ci étant placée sous contrôle d'un promoteur contenant 2905375 22 des éléments ISRE sensibles à l'IFN-a. Après 16 heures de stimulation, pour chaque mutant et pour chaque condition, le signal de la firefly luciférase correspondant à l'activité de l'IFN-a testé est mesuré. Les activités induites par la protéine non dénaturée et par cette même protéine dénaturée sont ensuite comparées et il en est 5 déduit l'activité résiduelle après dénaturation thermique de la protéine étudiée (Activité résiduelle = Activité dénaturée/Activité non dénaturée * 100). L'activité basale du variant non dénaturé est également comparée à celle de l'IFN-a sauvage. Culture cellulaire 10 Tous les réactifs de culture cellulaire sont fournis par Invitrogen. Les cellules HeLa (human cervix epitheloid carcinoma cells) et les cellules COS-7 (African green monkey SV40 transformed kidney cells) sont cultivées dans des conditions standards de culture (37 C en atmosphère humide contenant 5% CO2) en utilisant respectivement les milieux Dulbecco's Modified Eagle's Medium (D-MEM) et Iscove's Modified 15 Dulbecco's Medium (IMDM). Tous ces milieux de culture contiennent un analogue de la L-glutamine (le glutamax) et sont supplémentés en sérum de veau foetal décomplémenté (10% final) et en antibiotiques à raison de 100 units/ml de pénicilline et 0.1 mg/ml de streptomycine. Le vecteur pSV-betagal TM (Promega), qui exprime la béta galactosidase sous le contrôle du promoteur précoce SV40, est utilisé pour 20 normaliser les efficacités de toutes les transfections réalisées. Expression des mutants de l'IFN-a humain en cellules de mammifères COS-7 Afin de réaliser les transfections des cellules COS-7 par les constructions pORF/IFN-a natif ou muté, ces cellules sont trypsinées lorsqu'elles atteignaient 90% de confluence. 25 Les cellules COS-7 sont ré-ensemencées suivant le ratio (c'est-à-dire de façon à ce qu'elles représentent, une fois adhérées sur la surface, une confluence de 25% environ). La transfection des cellules COS-7 est réalisée en plaque 24 puits avec un ensemencement de 30 000 à 60 000 cellules par puits lorsque les cellules atteignent 70-80% confluence. La transfection est réalisée avec environ 50ng d'ADN et du Jet PEI 30 (Polyplus transfection) en utilisant un ratio Jet PEUADN de 5 pendant 30 minutes à température ambiante. Après 24 heures de transfection, le milieu (5001.tL IMDM SVF + antibiotiques) est changé. Les surnageants contenant l'IFN-a (avec un niveau 2905375 23 d'expression de l'ordre de 0,5 à 1 tg/ml) est récupérés à T=24H post-transfection. Ils sont aliquotés et conservés à -20 C avant le dosage de l'activité de l'IFN-a. Test primaire d'activité 5 Il a été déjà été décrit que l'IFN-a active spécifiquement les récepteurs à l'IFNa présents sur les cellules HeLa. La stimulation de la voie de signalisation des Jak(Jakl/Tyk2)/Stat(Stat1-3) dans les cellules HeLa par 1'IFN-a s'effectue en ayant, en particulier, pour conséquence l'activation de la transcription des gènes sous le contrôle de promoteur possédant des séquences ISRE ( interferon stimulated response 10 element ). Il est alors possible de mesurer et de comparer les activités des variants de l'IFN-a en transfectant dans les cellules HeLa un système de gène rapporteur dans lequel la luciférase (firefly luciferase) est en aval d'un promoteur possédant plusieurs sites ISRE (plasmide pISRE/Luciférase de Stratagene). 15 Transfection transitoire des cellules HeLa par le pISRE /Luciférase Les cellules HeLa sont trypsinées lorsqu'elles atteignent 90% de confluence et sont ré-ensemencées avec un ratio de 1/3. Les transfections de cellules HeLa à 50-80 % de confluence sont réalisées en plaque 96 puits selon le protocole du fournisseur : 20 000 cellules par puits sont transfectées avec environ 150ng d'ADN pISRE/Luciférase et du 20 jet PEI dans un rapport Jet PEI/ADN de 5. Le tout est vortexé 30s et laissé à température ambiante 30 min. Puis, 20 L du mélange ADN/Jet PEI sont répartis dans chaque puits de la plaque et les cellules ainsi transfectées sont cultivées pendant 24 heures à 37 C et en 5% CO2. 25 Mesure de l'activité totale basale des variants de 1' IFN-a (protéine non dénaturée)/protéine sauvage Les surnageants de cellules COS-7 contenant l'IFN-a sont dilués au 1/100ème. 101.tL de ces dilutions de surnageants de cellules COS-7 contenant l'IFN-a sont ajoutés sur les cellules HeLa transfectées par du pISRE/Luciférase. Après 16 heures à 37 C 5% CO2 30 pendant lesquelles l'expression cytoplasmique de la firefly luciférase s'est effectuée, les culots de cellules sont récupérés et congelés. 501. tL de Glo lysis buffer TM (Promega), sont ajoutés pour lyser les cellules. La lyse est effectuée pendant 10 min sous agitation à température ambiante de façon à libérer la luciférase produite en réponse à la 2905375 24 stimulation spécifique de l'IFN-a. Le test de l'activité luciférase est initialisé par l'ajout du réactif Bright Glo TM (Promega) et la quantité de luciférase accumulée est ensuite comptée avec un luminomètre (FLX 800, Bio-Tek Instrument). Le calcul de l'activité totale (par rapport à la protéine sauvage) de chaque variant (non dénaturé) est une 5 moyenne réalisée sur la base de résultats obtenus sur 5 manipulations différentes et sur des surnageants de culture provenant, au minimum, de deux transfections indépendantes. Les barres d'erreur présentées sont calculées par la formule de l'erreur standard sur la moyenne (s.e.m). L'une des façons de présenter les résultats d'activité totale est de rapporter l'activité de base de chaque variant en pourcentage de l'activité de base de 10 l'IFN-a non muté exprimé dans les mêmes conditions pour chaque transfection. Mesure de l'activité résiduelle des variants de 1'IFN-a par gène rapporteur luciférase après dénaturation thermique Comme précédemment décrit par le test primaire d'activité par gène rapporteur, la 15 quantité de luciférase est mesurée après stimulation des cellules HeLa par 104, de surnageants de cellules COS-7 dilués au 1/100ème contenant l'IFN-a qui, suivant les cas, sont soumis à un traitement thermique de 10 minutes à 59 C ou bien ne sont pas traités. L'une des façons de présenter la fraction d'activité de chaque variant conservée après dénaturation thermique est de calculer l'activité résiduelle conservée de chaque variant 20 définie par le pourcentage de l'activité basale du même variant avant dénaturation. Le calcul de l'activité résiduelle par rapport à une activité totale déterminée avant dénaturation est une moyenne réalisée sur la base de résultats obtenus sur 5 manipulations différentes et sur des surnageants de culture provenant, au minimum, de deux transfections indépendantes. Les barres d'erreur présentées sont calculées sur la 25 formule de l'erreur standard sur la moyenne (s.e.m). Mesure d'un indice d'amélioration des variants de l'IFN-a (amélioration de la thermostabilité et/ou de l'activité) Après avoir vérifié qu'un variant de l'IFN-a étudiéprésente à la fois une amélioration 30 de la thermostabilité et une conservation au moins partielle de l'activité intrinsèque de la protéine, on peut calculer le produit de l'activité résiduelle du mutant étudié après prétraitement, par son activité (sans prétaitement). Cet indice donne une idée de la 2905375 25 résultante du gain de thermostabilité et de perte relative d'activité, et donne donc une idée de l'effet in vivo attendu de la protéine. Exemple 3 : Validation in vivo de la pharmacocinétique des mutants thermostables 5 Le but de cette étude est de déterminer la demi-vie in vivo des variants de l'IFN-a et de la comparer à celle de l'IFN-a sauvage. L'IFN-a sauvage et les variants thermostables sont produits et purifiés à partir de surnageants de cellules de mammifères en culture (COS-7 ou CHO). Après injection intraveineuse chez la souris, des prélèvements sanguins sont effectués régulièrement pour déterminer l'évolution au cours du temps de 10 la concentration et de l'activité résiduelle in vivo des variants thermostables, comparée à celle de la molécule sauvage. Les concentrations sont déterminées par dosage ELISA des IFN-a et les activités résiduelles par le test pISRE/Luciférase sur cellules HeLa décrit précédemment. 15 Animaux utilisés Les animaux utilisés pour cette étude sont des souris C57BL/6. Les animaux sont acclimatés pendant une semaine sous une température constante de 24,1 C, une humidité constante de 55% et des cycles repos/sommeil de 12 heures. Après la semaine d'acclimatation, l'expérience est réalisée sur une journée pour chaque 20 animal, suivie par l'euthanasie correspondant au dernier point de la cinétique. Doses injectées et mode d'injection La demi-vie des IFN-a est déterminée par une administration intraveineuse (veine caudale) de 100-200 gl par souris, représentant une dose injectée de 3 à 10 g des 25 cytokines à tester. [P. Kurre et al. Experimental Hematology 30 (2002) 1257-1262 ; Rutenfranz et Kirchner, J.Interferon Res., 1988, Oct 8 (5) : 573-80]. Les cytokines à tester sont injectées dans une solution isotonique (20 mM acétate de sodium, 140 mM chlorure de sodium). 30 Prélèvements Les prélèvements de sang sont effectués au niveau du sinus rétro-orbitaire. Chaque animal est prélevé deux fois au maximum. Le volume des prélèvements est de 50 .1. La cinétique de chaque molécule comporte les points suivants : 0,5 ; 1h ; 2h ; 4h ; 6h & 12h. 2905375 26 Chaque cytokine est testée sur cinq souris. Avant administration intraveineuse, un échantillon sanguin est prélevé dans la veine de la queue pour s'assurer qu'aucune activité basale d'IFN-a n'était détectable. Les sérums utilisés dans les tests ELISA et tests d'activité sont préparés en laissant 5 coaguler le sang pendant 20 minutes à température ambiante suivi d'une centrifugation à 20 C de 20 minutes à 5000 g. Les sérums sont ensuite isolés et stockés à -80 C. Exemple 4 : Validation ex-vivo de la pharmacocinétique des mutants thermostables Le but de cette étude est de déterminer la résistance à la protéolyse des variants de 10 l'IFN-a et de la comparer à celle de l'IFN-a sauvage en mesurant l'activité résiduelle des différentes molécules après incubation dans des plasmas et sérums humains pendant des temps variables. L'IFN-a sauvage et les variants thermostables sont produits et purifiés à partir de surnageants de cellules de mammifères en culture (COS-7 ou CHO). 15 Différentes quantités des cytokines à tester (molécule sauvage et variants) sont incubées dans 1 ml de sérum ou plasma humain à 37 C, représentant une gamme de concentrations de cytokines allant de 2 pg/ml à 30 ng/ml. Les temps d'incubation sont de 0 ; 0,5 ; 2 ; 4 ; 24 ; 48 & 72 heures. Aux temps appropriés les différents extraits sont immédiatement congelés jusqu'à leur utilisation dans les tests in vitro. 20 Plusieurs tests in vitro sont réalisés sur les différents échantillons : 1) Mesure de la concentration résiduelle en cytokine par ELISA 2) Tests d'activités par le test pISRE/Luciférase sur cellules HeLa comme décrit précédemment. 3) Immunoprécipitation des IFN-a et détermination des quantités résiduelles par 25 western Blot. Revendications 1- Variant thermostable d'un interféron alpha humain (IFN-a) ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution, et de préférence une à dix, sélectionnées parmi le groupe consistant en D2S, D2N, D2M, D2L, L3M, Q5S, Q5I, H7S, H7T, H7L, S81, S8C, S11M, R12T, M16S, M211, R22G, R22T, R22Y, R23A, 124L, I24D, L26T, K31G, P39H, E41M, E41V, E41T, E42V, F43A, N45T, Q46R, F47Y, F47V, F471, Q48P, I53D, P54L, L56P, L56H, M59F, Q61L, N65F, L66A, F67S, F67L, S72Y, W76G, T79S, F84S, Y89C, L92N, L95D, A97M, Q101M, Q101Y, Q101R, G102V, P109L, M111N, M111P, E113Y, D114S, A118S, A118G, K121W, Y122P, Y122S, F123P, F123Y, Q124P, R125I, S136A, W140L, W140T, V142D, V142M, V142L, V142E, V143A, R144S, E146M, S150P, F151S, L157T, S160R, R162Q, S163T, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID N 3. 2- Variant thermostable d'un IFN-a selon la revendication 1, dans lequel le variant présente une unique substitution, de préférence sélectionnée parmi le groupe consistant en D2N, D2M, L3M, H7T, H7L, N45T, M59F, T79S, Y89C, F123Y, R1251, R162Q et V143A. 3- Variant thermostable d'un IFN-a selon la revendication 1, dans lequel le variant présente une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en Q101M + F123P, R22T + V142L, S81 + E41T, M111P + S150P, L3M + W140T, F47V + P54L + G102V, S8C + L26T + T79S, R22Y + E42V + S163T, E41V + L56H + E146M, H7S + R22G + E41M, D2S + R12T + V142M, Q48P + Y122P + V142D, S72Y + L95D + L157T, D2L + Q5I + I24D + P39H, F47I + W76G + V142E + R144S, F67L + L92N + D114S + R162Q, L3M + Q61L + A118G + F151S, I24L + F47Y + I53D + P109L + K121W, K31G + T79S + M111N + Y122S + S160R, L66A + A97M + Q101R + A118S + W140L + R162Q, Q5S + S11M + M21I + F43A + N65F + Q101Y + E113Y, M16S + R23A + Q46R + L56P + F67S +F84S + Q124P + S136A, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID N 3. 27 2905375 28 4- Variant thermostable d'un IFN-a selon la revendication 1, présentant une unique substitution L3M, T79S ou R162Q, une combinaison de plusieurs de ces trois mutations, ou une, deux ou trois substitutions sélectionnées parmi L3M, T79S et R162Q en combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe S consistant en D2S, D2N, D2M, D2L, Q5S, Q5I, H7S, H7T, 117L, S8I, S8C, SIIM, R12T, M16S, M21I, R22G, R22T, R22Y, R23A, I24L, I24D, L26T, K31G, P39H, E41M., E41V, E41T, E42V, F43A, N45T, Q46R, F47Y, F47V, F47I, Q48P, I53D, P54L, L56P, L56H, M59F, Q61 L, N65F, L66A, F67S, F67L, S72Y, W76G, F84S, Y89C, L92N, L95D, A97M, Q101M, Q101Y, QIO1R, G102V, P109L, M111N, 10 M111P, E113Y, D114S, A118S, A118G, K121W, Y122P, Y122S, F123P, F123Y, Q 124P, R125I, S 136A, W 140L, W 140T, V 142D, V 142M, V 142L, V 142E, V 143 A, R144S, E146M, S150P, F151S, L157T, S160R et 5163"l', les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID N 3. 15 5- Variant thermostable de I'IFN-a selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'IFN-a est un interféron alpha humain sélectionné parmi l'IFN-a 10, I'IFN-a 17, l'IFN-a 4, l'IFN-a 7, l'IFN-a 21, l'IFN-a 16, l'IFN-a 8, l'IFN-a 14, l'IFN-a 1, l'IFN-a 13, l'IFN-a 6, l'IFN-a 2 et l'IFN-a 5. 20 6-Variant thermostable de I'IFN-a selon la revendication 5, caractérisé en ce que I'IFN-a 2 est l'IFN-aga. 7- Variant thermostable de l'IFN-a selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'IFN-a 2 est l'IFN-a2b. 8- Acide nucléique codant un variant thermostable de 1'IFN-a selon l'une quelconque des revendications 1-7. 9- Cassette d'expression d'un acide nucléique selon la revendication 8. 10- Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 8 ou une cassette d'expression selon la revendication 9. 25 30 2905375 29 Il-Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 8 ou une cassette d'expression selon la revendication 9 ou un vecteur selon la revendication 10. 12- Composition pharmaceutique comprenant un variant thermostable de l'IFN-a selon 5 l'une quelconque des revendications 1-7. 13- Composition pharmaceutique selon la revendication 12, comprenant en outre au moins un autre principe actif sélectionné parmi le groupe constitué par un anticorps, un agent de chimiothérapie, un analogue nucléosidique, un glucocorticoïde, un agent anti- 10 histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique, une cytokine, un vaccin. 14- Variant thermostable de l'IFN-a selon l'une quelconque des revendications 1-7 ou composition pharmaceutique selon la revendication 12 en tant que médicament. 15- Utilisation d'un variant thermostable de l'IFN-a selon l'une quelconque des revendications 1-7 ou d'une composition pharmaceutique selon la revendication 12 ou 13 pour la préparation d'un médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. 20 16-Utilisation selon la revendication 15, dans laquelle le médicament est destiné au traitement des hépatites chroniques à virus B ou C, d'une leucémie telle que la leucémie myéloïde ou lymphocytaire chronique, d'un cancer, en particulier un carcinome des cellules rénales, une tumeur de la prostate ou un cancer ovarien, un sarcome de Kaposi associé au SIDA ou d'une maladie vénérienne. 25 17- Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 8, une cassette d'expression selon la revendication 9, un vecteur selon la revendication 10 ou d'une cellule selon la revendication 11 pour produire un variant thermostable de l'IFN-a selon l'une quelconque des revendications 1-7. 15 30