FR 2906259 A1 20080328 FR 0608452 A 20060927 PROCÉDÉ OPTIMAL DE PRODUCTION RECOMBINANTE D'UNE MÉTALLOPROTÉINE MARINE ET SES APPLICATIONS L'invention concerne un procédé de synthèse, selon des techniques issues des biotechnologies, d'une métalloprotéine d'origine marine à la stabilité et l'activité enzymatique "superoxyde dismutase" remarquables. L'invention concerne également les applications cosmétique et thérapeutique de la métalloprotéine obtenue. Pour lutter contre les effets néfastes du stress oxydant et des espèces oxygénées réactives libérées dans tout organisme vivant, celuiûci produit entre autres, dans ses cellules, des enzymes antioxydantes. La superoxyde dismutase (ou "SOD") est l'une d'entre elles, avec une capacité à dismuter l'anion "délétère' superoxyde en molécule d'oxygène et molécule de peroxyde d'hydrogène. Jouant un rôle particulièrement important dans la protection des membranes cellulaires, des protéines et lipides essentiels, de l'ADN, etc., la superoxyde dismutase n'existe toutefois pas sous une forme unique, mais sous plusieurs isoformes selon la nature du métal situé au coeur de cette enzyme (Zelko et al., Free Rad. Biol. Med. (2002), vol.33, p.337). Les principales métalloprotéines sont ainsi la superoxyde dismutase dite à cuivre-zinc (ou "CuZnSOD"), la superoxyde dismutase dite à fer (ou "FeZnSOD") et la superoxyde dismutase dite à manganèse (ou "MnSOD"). Toutefois, il a été montré, tant chez l'homme que chez l'animal, que les niveaux de superoxyde dismutase dans l'organisme déclinent avec l'âge ("Une superoxyde dismutase capable de limiter au quotidien les lésions oxydatives", Nutranews, Novembre 2005), conduisant alors à une accumulation de plus en plus grande de dommages radicalaires et oxydatifs, et contribuant in fine à l'apparition de nombre de maladies inflammatoires ou 2906259 2 dégénératives, mais aussi plus simplement à une accélération du processus naturel de vieillissement, tel celui de la peau. Dans les domaines thérapeutique, cosmétique ou 5 nutraceutique, au regard de l'abondance de l'état de la technique porté à la disposition du public, un apport exogène de superoxyde dismutase focalise l'intérêt des industriels de ces filières depuis plusieurs décennies. L'origine de ces superoxydes dismutases exogènes est 10 ainsi, classiquement, soit naturelle, avec une enzyme extraite du règne animal ou du règne végétal, soit chimique, avec la synthèse des molécules à propriétés superoxydes dismutases (dites "SoD-like"), ou encore biotechnologique, lorsque l'enzyme est produite par 15 exemple à partir d'un vecteur d'expression introduit dans un organisme hôte de production. Parmi les différentes isoformes de superoxyde dismutase, nombre d'essais, notamment dans le domaine thérapeutique, ont porté sur la superoxyde dismutase à 20 cuivreûzinc. Longtemps, l'origine bovine a été prisée pour ce type de SOD, avec une enzyme extraite du sang des bovins en raison d'une forte concentration dans leurs globules rouges. L'utilisation de tels extraits, notamment dans l'industrie cosmétique, est aujourd'hui 25 considérablement freinée, voire même stoppée, de par le risque de contamination engendré depuis l'apparition de l'encéphalopathie spongiforme bovine. Depuis une quinzaine d'années, des alternatives végétales ou bactériennes apparaissent pour l'obtention de cette 30 CuZnSOD. Dans la littérature, il est ainsi relevé de nombreuses superoxydes dismutases extraites de plantes, algues, légumes, souches bactériennes diverses. Certaines espèces des fonds marins sont également étudiées, notamment les invertébrés marins que sont les coraux et les anémones de mer, de la famille des cnidaires. Ils présentent en effet la particularité de vivre en symbiose avec des organismes unicellulaires photosynthétiques, les 2906259 3 dinoflagellés, également appelés zooxanthelles (Symbiodinium sp.). Cette co-existence ou association a lieu à l'intérieur même de leurs tissus, et l'intérêt actuel de ces coraux et anémones de mer tient à leur mode 5 de vie qui les contraint, afin d'assurer la photosynthèse de leurs symbiotes, à s'exposer à des quantités suffisantes de soleil et ses radiations, en conséquence à des quantités d'oxygène inhabituelles et toxiques. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires 10 susceptibles d'expliquer la capacité d'adaptation de ces espèces cnidariennes à un tel état d'hyperoxie, une équipe de chercheurs s'est intéressée il y a peu à l'anémone de mer méditerranéenne Anemonia viridis, en la retenant comme modèle d'étude physiologique. Cette équipe 15 a tout d'abord identifié les différentes superoxydes dismutases présentes dans les deux "compartiments" de l'anémone, ses propres tissus et son zooxanthelle. Les résultats ont alors démontré, de façon peu commune dans le règne animal, une grande diversité dans les 20 superoxydes dismutases identifiées (CuZnSOD, MnSOD et FeSOD) distribuées tant dans les tissus de l'animal "hôte" qu'au sein du zooxanthelle (Richier et al., Biochim. Biophys. Acta (2003), vol.1621, pp.84û91). Concernant l'isoforme majoritaire, à savoir la superoxyde 25 dismutase à cuivre et zinc, les auteurs dudit article font l'hypothèse d'une forme biologiquement inactive lorsqu'elle est associée au zooxanthelle. Par la suite, à partir d'ARN extrait des tentacules de l'animal, cette même équipe a identifié, puis cloné, 30 deux gènes de structure susceptibles de coder pour une superoxyde dismutase à cuivre et zinc, l'un pour la forme extracellulaire de l'enzyme appelée "EC-CuZnSOD", l'autre pour sa forme intra-cellulaire appelée "ICCuZnSOD" (Plantivaux et al., Free Rad. Biol. Med.(2004), 35 vol.37, pp.117Oû1181). Dans ce dernier article, par correspondance entre codons et acides aminés, il est 2906259 4 ainsi décrit la séquence supposée en acides aminés de ces deux protéines enzymatiques. Quelle que soit la nature de cette CuZnSOD, extra-cellulaire ou intraùcellulaire, il est à noter, dans les 5 deux documents de l'état de la technique susmentionnés, nulle comparaison de son activité antioxydante inhérente avec des SOD couramment utilisées et disponibles commercialement (dites "SOD standards"). Compte tenu de ce qui précède, le problème technique 10 que se propose de résoudre l'invention est de réussir à produire industriellement cette supéroxyde dismutase d'origine marine, réduite à sa forme extra-cellulaire mais pleinement fonctionnelle, présentant une activité antioxydante efficace dans le traitement et la prévention 15 des effets néfastes du stress oxydant, ainsi qu'un procédé pour la synthétiser ne présentant pas les inconvénients des procédés de l'art antérieur. La solution de l'invention à ce problème a pour premier objet un procédé de synthèse d'une superoxyde 20 dismutase à cuivre et zinc dite EC-CuZnSOD recombinante comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une superoxyde dismutase à cuivre et zinc extra-cellulaire dite EC-CuZnSOD endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis. 25 Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes de . introduction, dans un micro-organisme hôte, d'un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codante pour la superoxyde dismutase, dite 30 EC-CuZnSOD recombinante, ainsi qu'une séquence nucléotidique promotrice de la transcription de cette séquence codante dans ledit micro-organisme; - introduction, dans ledit micro-organisme, d'un acide nucléique comprenant une séquence codante pour une 35 protéine métallochaperonne, ainsi qu'une séquence nucléotidique promotrice de la transcription de cette séquence codante dans ledit microorganisme; et de 2906259 5 culture dudit micro-organisme dans un milieu de culture supplémenté en ions cuivre et zinc, à une température inférieure à 30 C. L'invention est illustrée par les séquences, les 5 tests et compositions ci-après et la figure ci-jointe, donnés purement à titre indicatif et non limitatif. La figure 1 montre un schéma d'un vecteur selon l'invention. L'invention a également pour deuxième objet un acide nucléique synthétique, destiné à être introduit dans le 10 micro-organisme hôte et, comprenant une séquence nucléotidique codante pour une EC-CuZnSOD recombinante dont la séquence en acides aminés est identique ou homologue à la séquence en acides aminés d'une EC-CuZnSOD endogène d'Anemonia viridis. Cet acide nucléique comprend 15 avantageusement, en outre, une séquence promotrice de la transcription de la séquence codante pour la EC-CuZnSOD recombinante. Par séquence nucléotidique synthétique, on entend une séquence nucléotidique hors de son environnement 20 chromosomique naturel, c'estùàùdire qui n'est pas à l'état naturel. On entend notamment une séquence qui a été isolée et/ou purifiée, c'estùàùdire qui a été prélevée directement ou indirectement, par exemple par copie, son environnement ayant été au moins partiellement 25 modifié. On entend également désigner un acide nucléique obtenu par synthèse chimique. La séquence codante pour la EC-CuZnSOD endogène d'Anemonia viridis est la séquence SEQ ID NO 1, montrée en séquence 1 ci-après. La séquence en acides aminés de 30 la EC-CuZnSOD endogène est la séquence SEQ ID NO 2, montrée en séquence 2 ci-après (Plantivaux et al. Free Rad. Biol. Med. (2004), vol.37, pp. 1170ù1181). Les codons et acides aminés en position 1 à 18 des séquences SEQ ID NO 1 et 2 respectivement codent pour ou 35 correspondent à un peptide signal, tandis que les codons et acides aminés en position 19 à 192, reportés 2906259 6 respectivement aux séquences SEQ ID NO 3 et SEQ ID NO 4, codent pour ou correspondent à une protéine ayant une activité superoxyde dismutase. Ainsi, de façon préférée, l'acide nucléique 5 introduit dans l'hôte comprend une séquence codante pour une EC-CuZnSOD recombinante dont la séquence en acides aminés est identique ou homologue à la séquence SEQ ID NO 4. De préférence, la séquence de EC-CuZnSOD 10 recombinante comprend entre 180 et 210 acides aminés, et de préférence 200 à 205 acides aminés. Par séquence en acides aminés homologue à une séquence de référence, et en particulier à la séquence SEQ ID NO 4, on entend désigner une séquence comprenant, 15 par rapport à celle-ci, certaines modifications comme en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncature ou un allongement et/ou une fusion chimérique. On préfère une séquence homologue présentant au moins 80% d'identité, de 20 préférence au moins 95% d'identité avec la séquence de référence, à l'exclusion de 100% d'identité. Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs, peuvent être remplacés par des acides aminés équivalents. L'expression acide 25 aminé équivalent vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la séquence de référence sans cependant en modifier les caractéristiques ou propriétés fonctionnelles essentielles, comme l'activité anti-oxydante. C'est le 30 cas par exemple de la substitution de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes 35 conditions. Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou d'acides 2906259 7 aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard sur toute leur 5 longueur. On entend désigner par meilleur alignement l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité est le plus élevé. L'acide nucléique introduit dans l'hôte comprend une séquence codante pour une EC-CuZnSOD recombinante, telle 10 que définie précédemment, qui est choisie de manière à coder pour ladite EC-CuZnSOD recombinante avec un fort taux d'expression dans l'organisme hôte. La séquence nucléotidique est déterminée notamment en tenant compte de la nature dégénérée du génome : les codons sont 15 choisis parmi les codons les plus exprimés dans le micro-organisme hôte. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le choix des codons est tel que la séquence codante pour la EC-CuZnSOD recombinante présente un index 20 d'adaptation des codons, ou C.A.I., de 0,95, dans le micro-organisme hôte, soit une homologie d'au moins 95 % (à l'exception de 100%) entre une séquence codante selon l'invention et la séquence endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis . La séquence codante pour la EC-CuZnSOD 25 recombinante peut être la séquence SEQ ID NO 5 montrée en séquence 5 ci-après. Celle-ci code pour une EC-CuZnSOD de séquence SEQ ID NO 2. De préférence, la séquence codante préférée est ou comprend la séquence en position 19 à 192 de SEQ ID NO 5, qui code pour EC-CuZnSOD de séquence SEQ 30 ID NO 4. Tout particulièrement, la séquence préférée codante pour la EC-CuZnSOD est la séquence SEQ ID NO 6, montrée en séquence 6. Elle code pour la EC-CuZnSOD de séquence SEQ ID NO 7, montrée en séquence 7, qui comprend notamment une étiquette polyhistidine en position 5 à 10. 35 L'invention a également pour troisième objet un micro-organisme hôte génétiquement modifié et exprimant une EC-CuZnSOD, dite recombinante, comprenant une 2906259 8 séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une superoxyde dismutase à cuivre et zinc extra-cellulaire endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis. Le micro-organisme hôte peut être, par exemple, un 5 micro-organisme procaryotique, tel qu'une bactérie, ou eucaryotique, tel qu'une levure. De préférence, le micro-organisme hôte est une souche bactérienne de Escherichia Coli ou E. Coli largement connue de l'Homme du Métier (fournisseur : InVitrogenTM, référence : C6000-3). Selon 10 un mode de réalisation préféré de l'invention, il est retenu la souche référence de E. Coli "BL21Star(DE3)" (fournisseur : InVitrogenTM, référence : C6010-3). Tout particulièrement, il est choisi la souche "BL21Star(DE3)plysS" (fournisseur : InVitrogenTM, 15 référence : C6020-3), résistante à la toxicité de la ECCuZnSOD recombinante, tout en permettant un taux d'expression accru pour celle-ci. En outre, puisque la Demanderesse a retenu comme micro-organisme hôte préféré la bactérie Escherichia 20 Coli, très largement utilisée dans le domaine des biotechnologies, il est à souligner les nombreuses difficultés liées à son utilisation : protéines recombinantes incorrectement repliées, précipitation de ces protéines, formation de corps d'inclusion, étape de 25 renaturation nécessaire , etc. Ces difficultés reconnues n'auraient pas incité l'Homme du métier à choisir E. Coli comme hôte préféré dans le procédé selon l'invention. De préférence, le micro-organisme hôte selon l'invention comprend un acide nucléique comprenant la 30 séquence codante SEQ ID NO 6. L'acide nucléique introduit dans l'hôte comprend en outre avantageusement une séquence promotrice de la transcription de la séquence codante pour la EC-CuZnSOD recombinante, telle que définie précédemment. De 35 préférence, et en particulier lorsque le micro-organisme hôte est E. Coli, ladite séquence promotrice est celle d'un bactériophage, en particulier le bactériophage T7, 2906259 9 portée par le plasmide "pDestl7" (fournisseur : InVitrogenTM, référence : 11803-012). Tout particulièrement, le promoteur du bactériophage T7 permet une expression optimale de EC-CuZnSOD recombinante de 5 séquence identique à SEQ ID NO 7 à partir de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 6 dans E. Coli BL21Star(DE3)plysS. Une souche E. Coli "BL21Star(DE3)plysS" préférée exprimant une EC-CuZnSOD recombinante de séquence SEQ ID 10 NO 7 a été déposée le 7 septembre 2006 auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes (CNCM) à L'institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, avec le numéro d'enregistrement CNCM I-3667. Ce micro-organisme hôte déposé selon l'invention 15 comprend un vecteur "pDestl7" (fournisseur : InVitrogenTM, référence : 11803-012) lequel comprend la séquence SEQ ID NO 6 codante pour la EC-CuZnSOD recombinante de séquence SEQ ID NO 7 (figure 1). L'invention a également pour objet une superoxyde 20 dismutase à cuivre et zinc recombinante comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à la séquence en acides aminés d'une EC-CuZnSOD endogène d'Anemonia viridis. De préférence, la EC-CuZnSOD selon l'invention est de séquence SEQ ID NO 7. 25 L'invention a également pour objet un vecteur comprenant l'acide nucléique objet de l'invention et tel que défini précédemment. De façon préférée, un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprend l'acide nucléique tel que 30 défini précédemment, comprenant une séquence codante pour la EC-CuZnSOD recombinante, et une séquence promotrice de transcription. Les vecteurs selon l'invention comportent les éléments nécessaires à l'expression, notamment, de 35 préférence, un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ces 2906259 10 vecteurs peuvent être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite. 5 Les différents signaux de contrôle sont choisis en fonction du microorganisme hôte utilisé. A cet effet, l'acide nucléique selon l'invention peut être inséré dans un vecteur à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou dans un vecteur intégratif de l'hôte choisi. 10 Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de préférence en fonction de l'hôte, des systèmes de type plasmide, cosmide, phagemide ou minichromosome, ou des systèmes de type viral. L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes 15 (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning : a laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Parmi les vecteurs intégratifs de l'hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou 20 viral. Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN nu ou l'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de bactérie (BAC, "bacterial 25 artificial chromosome") ou les chromosomes artificiels de levure (YAC, "yeast artificial chromosome") pour l'expression dans la levure. De façon préférée, le vecteur utilisé est le vecteur "pDestl7" (fournisseur : InVitrogenTM, référence : 11803- 30 012) dans lequel la séquence codante SEQ ID NO 6 a été intégrée entre les sites de restriction DraI et EcoRl sur la carte dudit vecteur, en aval de la séquence promotrice du promoteur du bactériophage T7 et selon les techniques classiques de sous-clonage par digestion enzymatique 35 (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning : a laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 2906259 11 Un schéma du vecteur préféré est donné à la figure 1, sur lequel T7 indique une séquence promotrice du bactériophage T7, RBS indique le site de liaison des ribosomes, 6xHis indique une étiquette (ou tag ) 5 polyhistidine, EC-CuZnSOD indique la séquence SEQ ID NO 6 (considérée à partir de la position 31), yCCS une séquence codant pour une protéine métallochaperonne et Ampicillin indique un gène de résistance à l'Ampicilline. Il s'agit du vecteur qui a été introduit dans la souche 10 déposée auprès de la CNCM et décrite précédemment. De tels vecteurs sont préparés sous forme de clones selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier. L'acide nucléique ou le vecteur comprenant l'acide 15 nucléique comprenant une séquence codante pour une ECCuZnSOD recombinante et une séquence promotrice de transcription est introduit dans un micro-organisme hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc 20 thermique, la transformation après perméabilisation chimique de la membrane, la fusion cellulaire. L'acide nucléique introduit dans le micro-organisme hôte et codant pour une protéine métallochaperonne comprend une séquence codante pour ladite protéine et, de 25 préférence, une séquence promotrice de sa transcription. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, il est retenu une métallochaperonne de levure, tout particulièrement la yCCS ou "yeast copper chaperone for Cu/ZnSOD" (Ahl et al., Protein Expression Purif. (2004), 30 vol.37, pp.311-319), et son gène LYS7 qui appartient à l'état de la technique (Horecka J. et al., Gene (1995), 162(1), pp.87-92). La séquence promotrice est telle que définie pour EC-CuZnSOD. Le micro-organisme selon l'invention peut comprendre 35 en outre un tel acide nucléique et peut co-exprimer une telle protéine chaperonne. 2906259 12 De façon préférée, un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprend cet acide nucléique. Le vecteur est tel que défini précédemment pour EC-CuZnSOD. La séquence codante pour une protéine métallochaperonne 5 et la séquence codante pour une EC-CuZnSOD peuvent être sur un même vecteur ou sur deux vecteurs distincts. De préférence, il est choisi un même vecteur, la construction étant réalisée selon une méthode classique de recombinaison (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., 10 Molecular Cloning : a laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Les techniques d'introduction de l'acide nucléique codant pour une protéine métallochaperonne ou du vecteur comprenant cet acide nucléique dans l'hôte sont telles 15 que définies pour EC-CuZnSOD. Ainsi, un même micro-organisme hôte coexprime une EC-CuZnSOD recombinante et une protéine métallochaperonne, pour assurer l'expression d'une EC-CuZnSOD recombinante suffisamment porteuse d'ions cuivre. En effet, l'état de la technique rapporte 20 des insuffisances quant à la métallisation en ions cuivre pour des protéines issues de systèmes bactériens (Hartman J.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1986), vol.83, pp.7142ù7146). Une telle coùexpression est également nécessaire pour permettre un repliement de la EC-CuZnSOD 25 recombinante proche de celui de la protéine endogène. Le micro-organisme hôte comprenant un acide nucléique codant pour une EC-CuZnSOD recombinante et un acide nucléique codant pour une protéine chaperonne, est cultivé dans un milieu de culture approprié, supplémenté 30 en ions cuivre et zinc, pour obtenir un taux d'expression optimal de la protéine recombinante et le remplissage de ses sites métalliques. En effet, il est admis une assimilation des ions métalliques par le micro-organisme hôte, en particulier E. Coli (Ahl et al., Protein 35 Expression Purif. (2004), vo1.37, pp.311ù319), au détriment de leur incorporation dans la protéine recombinante d'intérêt. 2906259 13 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, il est retenu un milieu de culture à base de peptone, d'un extrait de levure et de chlorure de sodium, tel le milieu "Luria Bertani" (LB Broth Base Powder , 5 fournisseur InVitrogenTM), supplémenté en ions métalliques par des solutions de sulfate de cuivre et sulfate de zinc, avec, préférentiellement, des concentrations de 3 à 6 mM pour la première, de 25 à 50 mM pour la seconde. 10 Le micro-organisme est de préférence cultivé à une température d'expression inférieure à 30 C pour réduire la formation de corps d'inclusion. Il est ainsi particulièrement retenu la température de 25 C, notamment avec un hôte E. Coli, et pour un temps de culture allant 15 de 1h30 à 3 heures. La densité optique de l'inoculât initial est préférentiellement de 0,6 à 0,8, tandis que celle de la culture est préférentiellement de 4 à 8 au moment de la récolte de la protéine recombinante. Le procédé selon l'invention peut comprendre, en outre, une 20 étape de récolte de la EC-CuZnSOD recombinante exprimée et produite par le micro-organsime hôte, le mode de récolte par centrifugation étant retenu de préférence. Le procédé peut comprendre ensuite une étape de purification, par toute technique connue de l'Homme du 25 métier, par exemple par chromatographie d'affinité avec une étiquette marquée de plusieurs molécules d'histidine. Le procédé peut enfin comprendre une étape de dosage de EC-CuZnSOD exprimée, par exemple par la méthode de Bradford. 30 Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention a pour objet un procédé de synthèse d'une EC-CuZnSOD, dite recombinante, ayant une séquence en acides aminés identique ou homologue à la séquence SEQ ID NO 4, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les 35 étapes suivantes de : - introduction, dans un micro-organisme E. Coli, d'un acide nucléique comprenant une séquence codante pour 2906259 14 la superoxyde dismutase EC-CuZnSOD recombinante, et une séquence promotrice de la transcription de cette séquence codante dans ledit micro-organisme, ladite séquence codante présentant un index d'adaptation des codons, ou 5 C.A.I., de 0,95 par rapport à la séquence SEQ ID NO 3 et, ladite séquence promotrice étant d'origine bactériophage; - introduction, dans ledit micro-organisme, d'un acide nucléique comprenant une séquence codante pour une protéine métallochaperonne, ainsi que d'une séquence 10 nucléotidique promotrice de la transcription de cette séquence codante dans ledit microorganisme; et de culture dudit micro-organisme dans un milieu de culture supplémenté en ions cuivre et zinc, à une température inférieure à 30 C. 15 Le procédé selon l'invention a ainsi permis à la Demanderesse d'obtenir de larges quantités de EC-CuZnSOD recombinante fonctionnelle, afin par exemple d'évaluer son activité antioxydante. Ce procédé est également avantageux en ce qu'il évite les difficultés liées à un 20 procédé d'obtention de EC-CuZnSOD endogène à partir de la source animale. Ces difficultés comprennent notamment le caractère urticant de l'anémone, les variations en concentration de EC-CuZnSOD dans ses cellules, et l'impossibilité de cultiver in vitro ses cellules. Le 25 procédé selon l'invention permet également de préserver la nature et d'exclure toute technique extractive sur l'animal. De plus, puisqu'il n'a jamais été décrit, dans l'état de la technique, un procédé permettant, par des 30 techniques de recombinaison génétique, la production de cette EC-CuZnSOD particulière, telle que définie ci- avant, la Demanderesse a dû établir, au prix de recherches intensives, les conditions du procédé selon l'invention. En effet, bien que la production de 35 macromolécules humaines ou animales dans un système d'expression hétérologue, procaryote par exemple, soit une technique couramment utilisée, il est admis qu'il 2906259 15 n'existe pas de conditions dites "universelles", applicables quelle que soit la macromolécule visée. La mise au point des conditions spécifiques d'un procédé de synthèse d'une nouvelle protéine recombinante est donc 5 inventive. Le procédé selon l'invention permet notamment de produire la EC-CuZnSOD d'intérêt avec une expression optimale. Par expression optimale on entend notamment une expression dans des quantités suffisantes pour 10 permettre une exploitation industrielle. On entend également une expression qui permet ensuite d'isoler la EC-CuZnSOD recombinante sous une forme soluble et stable, avec une pureté satisfaisante, permettant ainsi l'obtention d'une métalloprotéine fonctionnelle, c'est-à- 15 dire active enzymatiquement et apte à être utilisée sans effets secondaires dans des formulations cosmétiques outhérapeutiques. La Demanderesse a également évalué l'activité enzymatique de la EC-CuZnSOD ainsi synthétisée, en 20 particulier dans plusieurs fractions d'élution après une étape de purification. Une telle activité enzymatique a été estimée doublement par la Demanderesse , d'une part, par la détermination du pouvoir antioxydant desdites fractions à inhiber la réduction du cytochrome c dans le 25 système couplé xanthine-xanthine oxydase (test 1 ci-après) et, d'autre part, par le calcul de leur activité spécifique. L'activité spécifique d'une enzyme correspond à la quantité de produit (en moles) formé par l'enzyme par unité de temps (en général la minute) par mg de 30 protéines totales dans le milieu réactionnel. L'activité spécifique est exprimée, en règle générale, en unité (Unit) par gramme de protéines purifiées solubles. La Demanderesse a ainsi constaté que la EC-CuZnSOD 35 recombinante selon l'invention présente une activité enzymatique remarquable au regard des résultats de pouvoir antioxydant et d'activité spécifique de deux 2906259 16 supéroxydes dismutases disponibles commercialement (dites SOD "standards"), dont une CuZnSOD d'origine humaine. En effet, dans le test 1, l'activité enzymatique des SOD standards et de la EC-CuZnSOD recombinante selon 5 l'invention a été déterminée en suivant l'inhibition de la réduction du cytochrome c par le couple xanthine-xanthine oxydase. Les résultats présentés dans le tableau 1 montrent que l'enzyme EC-CuZnSOD recombinante selon l'invention présente des propriétés antioxydantes 10 doublement supérieures aux deux enzymes de référence, pour une activité spécifique quasi-identique ou légèrement inférieure. Une telle activité s'accompagne, en outre, et contrairement aux SOD standards, d'une stabilité 15 exceptionnelle sur une large plage de température pouvant aller jusqu'à 80 C. En effet, dans le test 2, des échantillons de 10 g de protéine (SOD standards ou EC-CuZnSOD selon l'invention) ont été soumis pendant 20 minutes à chacune 20 des températures suivantes : 20, 40, 60 et 80 C. Ensuite, l'activité enzymatique a été déterminée comme dans le test 1. Les résultats présentés dans le tableau 2 montrent que l'activité de la ECûCuZnSOD recombinante selon l'invention reste intacte pour des températures 25 allant de 20 à 80 C. Nulle perte d'activité n'y est en effet observée, ce qui traduit une forte résistance à des températures élevées, de surcroît sur une gamme de pH allant de 6 à 8. Dans l'optique d'une utilisation dans les domaines 30 cosmétique et thérapeutique, la Demanderesse a ensuite évalué l'efficacité in vitro de la EC-CuZnSOD selon l'invention, précisément sur un modèle illustrant la viabilité cellulaire de fibroblastes en culture soumis à un stress oxydant. Pour cela, dans le test 3, une lignée 35 cellulaire de fibroblastes de souris est maintenue pendant 1 heure dans un milieu de culture additionné de 5 mM de 1,1'-dimethyl-4,4'-bipyridium, ou Paraquat, 2906259 17 générateur d'anions superoxydes, en l'absence d'enzyme antioxydante (témoin) puis en présence de ECûCuZnSOD selon l'invention et aux concentrations de 0,25 et 1 M. La viabilité des cellules de fibroblastes est mesurée. 5 Les résultats présentés dans tableau 3 démontrent, en comparaison avec des fibroblastes témoin, un effet cytoprotecteur variable de 30 à 80 % selon les concentrations d'ECCuZnSOD objet de l'invention utilisées. A la concentration de 1 M notamment, il est 10 même atteint une excellente protection de la lignée cellulaire de fibroblastes face au stress oxydant induit. Ainsi, selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant, une quantité efficace d'une EC-CuZnSOD, dite 15 recombinante, ayant une séquence en acides aminés identique ou homologue à la séquence d'une EC-CuZnSOD, dite endogène, de l'anémone de mer Anemonia viridis, de préférence à titre d'agent actif à forte activité antioxydante et/ou antiradicalaire, et un ou plusieurs 20 véhicules inertes usuels. De préférence, la EC-CuZnSOD dite recombinante est telle que définie précédemment et, telle qu'obtenue au terme du procédé défini précédemment. Parmi les véhicules inertes cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables, on peut citer, à titre 25 d'exemple, un tensioactif, un conservateur, un colorant, un agent émulsionnant, un agent gélifiant, un agent humectant, un agent chélatant, etc. Selon les besoins du domaine considéré, ladite composition peut également contenir d'autres ingrédients 30 actifs, tels une autre enzyme antioxydante. Préférentiellement, cette dernière, d'origine synthétique, animale, végétale, bactérienne ou à nouveau recombinante, est choisie dans le groupe constitué par une autre supéroxyde dismutase, une catalase ou un 35 glutathion péroxydase. De manière avantageuse, la teneur en EC-CuZnSOD dite recombinante dans les compositions selon l'invention est 2906259 18 comprise entre 0,01 et 5 % en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence entre 0,1 et 1 % en poids. Les compositions conformes à l'invention peuvent se 5 présenter sous toutes les formes envisageables dans les domaines cosmétique et thérapeutique. Ils sont, en particulier, adaptés pour une administration par voie topique sous forme, par exemple, de lait, gel, crème, etc. 10 Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant de la EC-CuZnSOD, dite recombinante, comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une EC-CuZnSOD, dite 15 endogène, de l'anémone de mer Anemonia viridis, destinée à prévenir ou à lutter contre l'accumulation et/ou la surproduction de dérivés réactifs de l'oxygène, notamment les radicaux libres, et/ou ses conséquences, notamment cutanées. 20 De préférence, ladite EC-CuZnSOD recombinante est telle que définie précédemment et telle qu'obtenue au terme du procédé défini précédemment. L'origine de ces dérivés réactifs de l'oxygène comprend des radiations ultraûviolettes, divers 25 polluants, la fumée de cigarettes, des oxydants chimiques, etc. Les conséquences cutanées de l'accumulation de dérivés réactifs de l'oxygène comprennent les signes du vieillissement, naturel ou photo-induit de la peau et, en 30 particulier, la dégradation des fibres de collagène dans la matrice extra-cellulaire du derme, les manifestations inflammatoires de la peau, par exemple l'érythème. La ECCuZnSOD selon l'invention permet en particulier de réduire le nombre de sites neutrophiles d'inflammation. 35 L'invention a également pour objet l'utilisation de la EC-CuZnSOD dite recombinante, telle que définie précédemment, et, de préférence, telle qu'obtenue au 2906259 19 terme du procédé défini précédemment pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou à lutter contre l'accumulation et/ou de la surproduction de dérivés réactifs de l'oxygène ou de radicaux libres et/ou ses 5 conséquences pathologiques. Lesdites conséquences pathologiques comprennent notamment le diabète, le cancer, certaines maladies inflammatoires, neurodégénératives et autoûimmunes (Parkinson, Alzheimer, arthrite, etc). 10 Dans les applications ciûdessus, la superoxyde dismutase à cuivre et zinc, telle que définie précédemment et telle qu'obtenue au terme du procédé défini précédemment, est tout particulièrement utilisée comme agent antioxydant et/ou anti-radicalaire. 15 Séquence 1 : Séquence nucléotidique SEQ ID NO 1 endogène codant pour la EC-CuZnSOD endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis 20 ATG AAG CTC TTA GCG TTT CTT TTG GTG TGT TCC AGT GTT GTT CAG ACA TGT GCT GAA GGT GCG GCA ATG TGT TAC ATG AAG CCA AAC CCA GTA CTC CCT GAC ACC ATA GAC ACC AAA GTG ACA GGA ACC GTC ATG CTT TCT CAA AAG TCT CCA TCA GCT AAA ATC AAA ATC ACT TTG AAT TTG AAA GGC TTA CCA CCA AAC ACT CCA CAT GGA TTT CAT GTA CAT CAA TAT GGG GAT ATC GAC ACG AAC GGT TGT 25 CAG AGT ACC GCT TCT CAC TTC AAT CCT TTT GGT GCT ACA CAC GGC GGA CCT CAA GAT GAT GAA AAA CAC CGA CAC GTT GGT GAC CTT GGT AAC GTG ATG TCA AAC GCA GAA GGC AGA ATC AAG ATA ATG TTG TCC GAC TAC TTG GTG TCT CTT TAT GGA CCT TAC TCT GTT ATT GGT CGC TCA TTT GTG ATA CAC GCC AAA ATA GAC GAC TTA GGA AGA GGT ACA GGA GCA GCA AGA AAA GAG AGT TTA AAG ACT 30 GGT AAC GCT GGA GCA CGT CTG GCA TGT TGT ACG ATT GTC CAT GCA GCT CCT GCG GCT GCT TTG AAA TAA Séquence 2 : Séquence d'acides aminés SEQ ID NO 2 de la EC-CuZnSOD endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis, 35 et susceptible d'être codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1. MKLLAFLLV C S S V V QTC AEGAAMCYMKPNP V LPDTIDTK V TGT V MLSQKSP SAKIKITLNLK GLPPNTPHGFHVHQYGDIDTNGCQSTASHFNPFGATHGGPQDDEKHRHVGDLGNVMSNAEG 2906259 20 RIKIMLSDYLV SLYGPYSVIGRSFVIHAKIDDLGRGTGAARKESLKTGNAGARLACCTIVHAAP AAALK Séquence 3 : Séquence nucléotidique SEQ ID NO 3 5 correspondant aux codons 19 à 193 de la séquence SEQ ID NO 1. GAA GGT GCG GCA ATG TGT TAC ATG AAG CCA AAC CCA GTA CTC CCT GAC ACC ATA GAC ACC AAA GTG ACA GGA ACC GTC ATG CTT TCT CAA AAG TCT CCA TCA 10 GCT AAA ATC AAA ATC ACT TTG AAT TTG AAA GGC TTA CCA CCA AAC ACT CCA CAT GGA TTT CAT GTA CAT CAA TAT GGG GAT ATC GAC ACG AAC GGT TGT CAG AGT ACC GCT TCT CAC TTC AAT CCT TTT GGT GCT ACA CAC GGC GGA CCT CAA GAT GAT GAA AAA CAC CGA CAC GTT GGT GAC CTT GGT AAC GTG ATG TCA AAC GCA GAA GGC AGA ATC AAG ATA ATG TTG TCC GAC TAC TTG GTG TCT CTT TAT 15 GGA CCT TAC TCT GTT ATT GGT CGC TCA TTT GTG ATA CAC GCC AAA ATA GAC GAC TTA GGA AGA GGT ACA GGA GCA GCA AGA AAA GAG AGT TTA AAG ACT GGT AAC GCT GGA GCA CGT CTG GCA TGT TGT ACG ATT GTC CAT GCA GCT CCT GCG GCT GCT TTG AAA TAA 20 Séquence 4 : Séquence d'acides aminés SEQ ID NO 4 correspondant aux acides aminés 19 à 192 de la séquence SEQ ID NO 2. EGAAMCYMKPNP VLPDTIDTKVTGTVMLSQKSP SAKIKITLNLKGLPPNTPHGFHVHQYGDI 25 DTNGCQSTASHFNPFGATHGGPQDDEKHRHVGDLGNVMSNAEGRIKIMLSDYLVSLYGPYS V IGRSF V IHAKIDDLGRGTGAARKES LKTGNAGARLACCTI VHAAPAAALK Séquence 5 : Séquence nucléotidique optimisée SEQ ID NO 5 codant pour une EC-CuZnSOD recombinante de séquence en 30 acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO 2. ATG AAA CTG CTG GCG TTT CTG CTG GTT TGT AGC AGC GTT GTT CAG ACC TGT GCC GAA GGT GCG GCG ATG TGT TAT ATG AAA CCG AAT CCG GTT CTG CCG GAT ACC ATC GAT ACC AAA GTT ACC GGC ACC GTT ATG CTG AGC CAG AAA AGC CCG 35 AGC GCG AAA ATC AAA ATC ACC CTG AAC CTG AAA GGT CTG CCG CCG AAT ACC CCG CAT GGC TTT CAT GTT CAC CAG TAT GGC GAT ATT GAT ACC AAC GGT TGT CAG AGC ACC GCC AGC CAT TTT AAT CCG TTT GGT GCC ACC CAT GGT GGT CCG CAG GAT GAT GAA AAA CAT CGC CAT GTG GGC GAT CTG GGT AAC GTT ATG AGC AAT GCC GAA GGC CGT ATC AAA ATC ATG CTG AGC GAT TAT CTG GTG AGC CTG TAT GGT CCG TAT AGC GTG ATT GGC CGT AGC TTT GTG ATC CAC GCC AAA ATT GAT GAT CTG GGT CGT GGC ACC GGT GCA GCC CGT AAA GAA AGC CTG AAA ACC 2906259 21 GGT AAT GCC GGT GCC CGT CTG GCG TGT TGT ACC ATT GTT CAT GCC GCC CCG GCG GCG GCG CTG AAA TAA Séquence 6 : Séquence nucléotidique optimisée SEQ ID NO 5 6codant pour une EC-CuZnSOD recombinante de séquence en acides aminés SEQ ID NO 7. ATG TCG TAC TAC CAT CAC CAT CAC CAT CAC CTC GAA TCA ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TTT AAA GAA AAT TTA TAC TTC CAA GGT GAA GGT GCG GCG 10 ATG TGT TAT ATG AAA CCG AAT CCG GTT CTG CCG GAT ACC ATC GAT ACC AAA GTT ACC GGC ACC GTT ATG CTG AGC CAG AAA AGC CCG AGC GCG AAA ATC AAA ATC ACC CTG AAC CTG AAA GGT CTG CCG CCG AAT ACC CCG CAT GGC TTT CAT GTT CAC CAG TAT GGC GAT ATT GAT ACC AAC GGT TGT CAG AGC ACC GCC AGC CAT TTT AAT CCG TTT GGT GCC ACC CAT GGT GGT CCG CAG GAT GAT GAA AAA 15 CAT CGC CAT GTG GGC GAT CTG GGT AAC GTT ATG AGC AAT GCC GAA GGC CGT ATC AAA ATC ATG CTG AGC GAT TAT CTG GTG AGC CTG TAT GGT CCG TAT AGC GTG ATT GGC CGT AGC TTT GTG ATC CAC GCC AAA ATT GAT GAT CTG GGT CGT GGC ACC GGT GCA GCC CGT AAA GAA AGC CTG AAA ACC GGT AAT GCC GGT GCC CGT CTG GCG TGT TGT ACC ATT GTT CAT GCC GCC CCG GCG GCG GCG CTG AAA 20 TAA GAA TTC Séquence 7 : Séquence d'acides aminés SEQ ID NO 7 de la EC-CuZnSOD recombinante (sans peptide signal, avec une étique polyhistidine). MSYYHHHHHHLESTSLYKKAGFKENLYFQGEGAAMCYMKPNPV LPDTIDTKVTGTVMLSQ KSPSAKIKITLNLKGLPPNTPHGFHVHQYGDIDTNGCQSTASHFNPFGATHGGPQDDEKHRHV GDLGNVMSNAEGRIKIMLSDYLVSLYGPYSVIGRSFVIHAKIDDLGRGTGAARKESLKTGNAG ARLACCTIVHAAPAAALK 30 Test 1 : Détermination et comparaison des activités enzymatiques de SOD standards et d'une fraction purifiée de EC-CuZnSOD recombinante selon l'invention. 35 L'activité enzymatique des SOD standards et de EC-CuZnSOD recombinante selon l'invention a été déterminée en suivant l'inhibition de la réduction du cytochrome c par le couple xanthine-xanthine oxydase, selon le protocole décrit par Mc Cord et al. (The J. Biol. Chem. (1969), 40 vol.244(22), pp.6049ù6055). Les conditions de l'étude ont 25 2906259 22 été les suivantes : - absorbance : 550 nm -pH 7,8 - température 25 C. 5 Les résultats de cette étude sont reportés dans le tableau 1 ci-après. Tableau 1 SOD standard 1 SOD standard 2 EC-CuZnSOD (SOD végétale) (cuZnSOD recombinante humaine) % d'inhibition 46 % 39 % 83 % de la réduction du cytochrome c Activité 184.000 136.842 122.000 spécifique (Unit /g de protéine) Test 2 : détermination et comparaison des stabilités 10 thermiques de SOD standards et d'une fraction purifiée de EC-CuZnSOD. Des échantillons de 10 g de protéine (SOD standards ou EC-CuZnSOD selon l'invention) ont été soumis pendant une 15 durée de 20 minutes, à chacune des températures suivantes 20, 40, 60 et 80 C, et selon le protocole décrit par Pan S.M. et al. (Bot. Bull. Acad. 5m. (1999), vol.40, pp.275û281). Au terme des 20 minutes de chauffage, il est déterminé l'activité enzymatique pour chaque échantillon, 20 identiquement au test 1 ci-dessus. Les résultats de cette étude sont reportés dans le tableau 2 ci-après. Tableau 2 Température ( C) 20 40 60 80 SOD standard 1 + + - - 2906259 23 (SOD végétale) SOD standard 2 + + + -(CuZnSOD humaine) EC-CuZnSOD + + + + recombinante Test 3 : mise en évidence de l'effet cytoprotecteur d'une fraction purifiée de EC-CuZnSOD sur des fibroblastes en culture. 5 Le test a été réalisé sur une lignée cellulaire de fibroblastes de souris maintenus pendant 1 heure dans un milieu de culture additionné de 5 mM de Paraquat générateur d'anions superoxydes, en l'absence d'enzyme 10 antioxydante (témoin) puis en présence de ECùCuZnSOD selon l'invention et aux concentrations de 0,25 et 1 M. La viabilité des cellules de fibroblastes est mesurée par la méthode d'incorporation au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2, 5-diphényltétrazolium (dite 15 MTT ). Les résultats de cette étude sont reportés dans le tableau 3 ci-après. Tableau 3 témoin EC-CuZn5OD EC-CuZnSOD recombinante recombinante (0,25 M) (1 M) % de viabilité 5 30 80 des fibroblastes Composition 1 20 EC-CuZnSOD selon l'invention 1 0 BrijTM 1,2 % Alcool cétylique 2 0 Huile de Paraffine 5 0 2906259 24 Acétate de Vitamine E 0,5 % TrisaminoTM (trométhamine) 0,6 % Glycérine 5 % PhenonipTM (parabènes (parahydroxybenzoate) de butyle, 5 éthyle, isobutyle, méthyle, propyle et phénoxyéthanol) 0,5% 0 Eau qsp 100 Composition 2 10 Ec-CuZnSOD selon l'invention 0,2 % Glycol dipropylène 7 % Methyl paraben (parabène (parahydroxybenzoate) de méthyle) 0,1 % 15 Polyacrylate de sodium 0,008 % AlginTM 0,005 % Ethylènediamine-sel disodique dihydraté de l'acide tétraacétique (EDTA) 0,03 % Eau qsp 100 20 REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse d'une superoxyde dismutase à cuivre et zinc comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une superoxyde dismutase à cuivre et zinc extra-cellulaire endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes de : introduction, dans un micro-organisme hôte, d'un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codante pour la superoxyde dismutase, ainsi qu'une séquence nucléotidique promotrice de la transcription de cette séquence codante dans ledit micro-organisme; - introduction, dans ledit micro-organisme, d'un acide nucléique comprenant une séquence codante pour une protéine métallochaperonne, ainsi qu'une séquence nucléotidique promotrice de la transcription de cette séquence codante dans ledit micro-organisme; et de - culture dudit micro-organisme dans un milieu de culture supplémenté en ions cuivre et zinc, à une température inférieure à 30 C. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de récolte de la superoxyde dismutase produite par le micro-organisme hôte. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le micro-organisme hôte est Escherischia Coli et en ce que la séquence nucléotidique codante pour la superoxyde dismutase présente un index d'adaptation des codons de 0,95 dans E. Coli. 2906259 26 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence codante pour ladite superoxyde dismutase est la séquence SEQ ID NO 6. 5 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence en acides aminés de la superoxyde dismutase à cuivre et zinc synthétisée est identique à la séquence SEQ ID NO 7. 10 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite protéine métallochaperonne est une métallochaperonne de levure. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en 15 ce que ladite métallochaperonne de levure est la métallochaperonne yCCS. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'acide nucléique codant pour la protéine 20 métallochaperonne yCCS est le gène LYS7. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le micro-organisme hôte est la souche référence BL21Star(DE3) d'E. Coli et 25 en ce que le promoteur de transcription est le promoteur bactériophage est le promoteur de bactériophage T7. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite souche référence BL21Star(DE3) est la 30 souche BL21Star(DE3)plysS. 11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend de la peptone, un extrait de levure et du chlorure de sodium et est supplémenté en ions cuivre et zinc par des solutions de sulfate de cuivre et sulfate de zinc. 2906259 27 12. Acide nucléique synthétique comprenant une séquence nucléotidique codante pour une superoxyde dismutase à cuivre et zinc comprenant une séquence en 5 acides aminés identique ou homologue à celle d'une superoxyde dismutase à cuivre et zinc extra-cellulaire endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis. 13. Acide nucléique selon la revendication 12, 10 caractérisé en ce que la superoxyde dismutase à cuivre et zinc codée comprend une séquence en acides aminés identique ou homologue à la séquence SEQ ID NO 7. 14. Acide nucléique selon l'une des revendications 15 12 ou 13, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codante comprend la séquence en position 19 à 192 de SEQ ID NO 5. 15. Acide nucléique selon l'une des revendications 20 12 à 14, caractérisé en qu'il comprend en outre une séquence promotrice de la transcription de ladite séquence nucléotidique. 16. Vecteur recombinant de clonage et/ou 25 d'expression exprimant une superoxyde dismutase à cuivre et zinc, dite recombinante, comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une superoxyde dismutase à cuivre et zinc extra-cellulaire endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis, 30 caractérisé en ce qu'il comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 12 à 15. 17. Composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant une quantité efficace d'une superoxyde 35 dismutase à cuivre et zinc, dite recombinante, comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une superoxyde dismutase à cuivre et zinc extra-2906259 28 cellulaire endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis, à titre d'agent actif à forte activité antioxydante et/ou antiradicalaire, et un ou plusieurs véhicules inertes usuels. 5 18. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce que la superoxyde dismutase dite recombinante comprise dans la composition comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID 10 NO 7. 19. Composition selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une autre enzyme antioxydante, d'origine synthétique, animale, 15 végétale, bactérienne ou recombinante, choisie dans le groupe constitué par une superoxyde dismutase, une catalase ou un glutathion peroxydase. 20. Composition selon l'une quelconque des 20 revendications 17 à 19, caractérisée en ce que la teneur en superoxyde dismutase dite recombinante est comprise entre 0,01 et 5 % en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence entre 0,1 et 1 % en poids. 25 21. Composition selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de lait, gel, crème pour une application par voie topique. 30 22. Utilisation d'une composition cosmétique selon l'une des revendications 17 à 21 pour prévenir ou lutter contre l'accumulation de dérivés réactifs de l'oxygène ou de radicaux libres et/ou de ses conséquences cutanées. 35 23. Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que lesdites conséquences cutanées comprennent les signes du vieillissement naturel ou 2906259 29 photo-induit de la peau, en particulier la dégradation des fibres de collagène dans la matrice extraûcellulaire du derme. 5 24. Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que lesdites conséquences cutanées comprennent les manifestations inflammatoires de la peau, par exemple l'érythème, et en particulier le nombre de sites neutrophiles d'inflammation. 10 25. Utilisation d'une superoxyde dismutase à cuivre et zinc, dite recombinante, comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une superoxyde dismutase à cuivre et zinc extracellulaire présente dans l'anémone de mer Anemonia viridis, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou lutter contre l'accumulation de dérivés réactifs de l'oxygène ou de radicaux libres et/ou de ses conséquences pathologiques. 20 26. Utilisation selon la revendication 25, caractérisée en ce que lesdites conséquences pathologiques comprennent le diabète, le cancer, certaines maladies inflammatoires, neurodégénératives et 25 autoûimmunes. 27. Micro-organisme hôte, caractérisé en ce qu'il comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 12 à 15 ou un vecteur selon la 30 revendication 16. 28. Superoxyde dismutase à cuivre et zinc recombinante comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à la séquence en acides aminés 35 d'une EC-CuZnSOD endogène d'Anemonia viridis.