FR 2898276 A1 20070914 FR 0650799 A 20060308 1 En particulier, la présente invention a pour objet des nouveaux vaccins destinés au traitement ou à la prévention des infections par parasites de la famille des Taenidae, et en particulier Echinococcus (E.) granulosus et donc de l'hydatidose. Les parasites de la famille des Taenidae, et en particulier du genre Echinococcus appartiennent à l'ordre des Cestodes .Ils ont un cycle évolutif dixène. Dans le cas des échinocoques, l'hôte définitif est un carnivore domestique ou sauvage chez lequel le parasite est localisé au niveau intestinal, le plus souvent dans les premières parties de l'intestin grêle. Il se contamine par ingestion des protoscolex contenus dans les larves. L'hôte intermédiaire est, suivant le parasite en cause, un ongulé pour Echinococcus granulosus responsable de l'hydatidose, un rongeur pour Echinococcus multilocularis responsable de l'échinococcose alvéolaire. La larve renfermant les protoscolex se développe principalement, mais non exclusivement, au niveau du foie ou du poumon. La contamination s'effectue par ingestion des oeufs éliminés en même temps que les fèces des carnivores, principalement du chien dans le cas d' Echinococcus granulosus. Dans les deux cas, l'homme peut également jouer le rôle d'hôte intermédiaire avec les mêmes localisations larvaires que les ongulés. L'hydatidose est une zoonose à distribution mondiale provoquée par le cestode E. granulosus. La forme larvaire du parasite infecte les bovins, les ovins, les camelidés, cervidés, etc., et l'homme. En zone d'endémie, la prévalence peut être très importante à la fois chez le bétail (jusqu'à 95% des moutons dans certains districts en Tunisie et au Maroc) et chez le chien (70% des animaux dans la région de Fès, au Maroc). Le parasite est la source de pertes économiques considérables (par exemple, plus de la moitié des abats nobles doivent être détruits au Maroc ; les brebis atteintes présentent des phénomènes d'émaciation et de perte en production de laine). Le parasite est également à l'origine d'un problème de santé humaine important : la prévalence chez l'homme atteint 1,43/1000 en zone rurale de la province du Rio Negro, en Argentine, 1,97/1000 dans le Xinjiang en Chine, 2,2/1000 dans le district du Turkana au Kenya, et des valeurs de 20 % ont été relevées localement dans des villages des Andes péruviennes. A titre d'exemple, la moitié des interventions chirurgicales hépatiques au Maroc sont liées à ce parasite. Les moyens de lutte actuels se situent essentiellement à 2 niveaux : - la modification des pratiques d'élevage, incluant la surveillance stricte des chiens, vecteurs de dissémination, qui se nourrissent des abats d'animaux d'élevage contaminés et rejetés; ces changements de pratique rencontrent souvent des difficultés d'application notamment dans les pays en voie de développement ; -l'utilisation de vermifuges type Praziquantel ou Arécoline, qui ne sont cependant pas ovicides. Un vaccin pour ovins a été mis au point à partir de protéines recombinantes exprimées par l'embryon (Lightowlers M.W., 1996, Int. J. Parasitol., 26, pp836-842), mais son application se révèle lourde car si l'efficacité est satisfaisante, la durée de protection est courte et le nombre d'animaux à traiter, donc à manipuler, important (l'ensemble du cheptel pour un éleveur). On comprend aisément qu'il est urgent de trouver de nouveaux vaccins contre cette maladie. Pour cela, les inventeurs ont réalisé leurs essais chez le chien. En effet, la disparition ou la forte réduction du nombre de chiens disséminant les oeufs serait un moyen d'interrompre le cycle de vie du parasite, et donc de réduire ou de supprimer la contamination du bétail et de l'homme. Le choix du chien comme cible du traitement conduit à avoir un nombre d'animaux à traiter considérablement plus réduit que si la cible est le bétail lui même. Dans un travail antérieur (Fu et al., Mol. Biochem. Parasitol., 102, p.43û 52, 1999), une protéine du parasite détectée en raison de son immunogénicité très importante lors des infections naturelles ou expérimentales chez le chien a été identifiée et préparée. Une banque ADNc d'Echinococcus granulosus dans le vecteur d'expression lambda gt22 avait été criblée à l'aide de sérum de chiens infectés par le parasite (3 mois en élevage protégé). L'ensemble des clones ADNc exprimant les protéines reconnues par les anticorps avaient été analysés une seconde fois avec les sérums individuels de chiens infectés et les intensités des réactions comparées : le clone fournissant la réaction la plus forte avec les sérums de tous les chiens avait été retenu et dénommé EgA31. Cette publication permet donc de mettre en évidence l'existence d'anticorps circulants dirigés contre la protéine EgA31 chez des chiens infectés par le parasite E. granulosus. Cet ADNc code pour une protéine riche en leucine, de structure putative hélicoïdale, comportant un domaine riche en proline de type SH3 (Sarc Homology 3 type 1) proche de la région C terminale de la protéine; ces domaines sont impliqués notamment dans des interactions protéine û protéine. Par ailleurs, 28 sites de phosphorylation et 4 sites de myristylation putatifs peuvent être repérés grâce au logiciel PROSITE. La séquence de EgA31 a été déposée (GenBank) sous le numéro AF 067 807. Les inventeurs ont également mis en évidence, dans Parasite Immunology, 25(10), 2003, 489-501 et WO 2005/058350 que la protéine nommée EgA31, ainsi que certains de ses fragments ou variants, et en particulier les fragments nommés Pst-Hind de séquence SEQ ID N 1 : AEKQAM DDSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRNLELQN DLERLQRETRDE LDEQKAEIEKLHKELVGADNSKTTVQSIRNEMRGIQVQIQLLRGGYLDLFH DKIGHYK EKLQESETKLLELQGTHDQTKRIH DVEKDKLAQELKYM EKQIN LCSN ENNKLKDALA SMENQITGLLNGNELLKKKIEMLETRAETKEINTKLEN et Pst-Dra SEQ ID N 2 : AEKQAM DDSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRNLELQNDLERLQRETRDE LDEQKAEIEKLHKELVGADNSKTTVQSIRN EMRGIQVQIQLLRGGYLDLFH DKIGHYK E KLQ ESETKLLE LQGTH DQTKRI H DVEKDKLAQELKYM EKQIN LCSN EN NKLKDALA SM EN QITG LLN G N ELLKKKIEM LETRAETKEINTKLEN LLKTETQELLTTIKDLDSKLT ESGEEVKELKKQLEKAEKQIRDAEVLTDEKN KIIEEM KKTIN KLSETKKEVEDKNSELR KASIQKQSLIEEKEILGRQLELKDTIISAMKKEKDALRHELHEMRDTINTLTEKIATIKI PEPLPMKPIEIPKPLQKEGVNKAMENEIQTYKDTIKTLKDEIFDKSRVINENQVIIKQLE RD présentent une activité immunogène d' E. granulosus et entraînent, notamment chez le chien, une modification de la réponse du duodénum à l'infection ultérieure par E gram/osus et peut donc de ce fait faire l'objet de vaccins contre les infections dues à ce type de parasites. La tropomyosine est une protéine hélicoïdale présente entre autre dans les larves d' E gram/osus (Esteves A., Parasitol. Res., 2003, Apr 89(6), 501- 2). La séquence nucléotidique de la tropomyosine a été déposée dans GenBAnk sous le numéro AAB65799. C'est un composant des cellules musculaires intervenant, en association avec l'actine et la myosine dans la contraction musculaire. Elle est connue pour induire une immunité protectrice contre des Nématodes parasites lors d'infestations expérimentales. Néanmoins, à ce jour, il n'a pas été mentionné, ni même suggéré que que la tropomyosine pouvait induire une protection efficace des infections par parasites de la famille des Taenidae. Dans ce contexte dans lequel le besoin pour de nouveaux vaccins plus efficaces est toujours exprimé, la présente invention a pour objet une composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un microorganisme permettant : - l'expression d'une première protéine recombinante PR1 de 48 à 435, de préférence de 65 à 219 acides aminés, qui correspond à un fragment d'EgA31 ou à un analogue d'un fragment d'EgA31, ledit fragment d'EgA31 comprenant la séquence SEQ ID N 3 : ISAAEKQAMDDSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRNLELQNDLERLQRET RDELDEQKAEIE -et l'expression d'une deuxième protéine recombinante PR2 de séquence 25 SEQ ID N 4 : ETSTKLDDASKAAEESERN RKTLETRSISD DERMAQLEEQVKEAKYIAEDAERKYDEA ARRLAVTEVDLERAESRLETSESKIVELEEELRIVGN N M KSLEVSEQESLQREESYEET IRDLTERLKTAEQRAAEAERQVSKLQNEVDRLEDELLSKERYRAISGELDTTFAELTSF ou d'un de ses analogues. 30 La séquence SEQ ID N 3 correspond aux acides aminés n 168 à 237 de la séquence déposée sous le n AF067807 dans GenBank. Au sens de l'invention, par analogues de l'une des protéines sus-mentionnées, on entend une protéine dont la séquence correspond à la protéine dont elle est l'analogue et dont la séquence diffère par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui permet d'obtenir une activité protectrice vis-à-vis des Taenidae et en particulier, des parasites du genre Echinococcus au moins équivalente. Les analogues d'une protéine contiennent donc au moins un épitope de ladite protéine, responsable de l'activité immunogène vis-àvis des parasites du genre Echinococcus du fragment de EgA31 ou du fragment de la tropomyosine, respectivement, et restent donc fonctionnellement équivalents à ces derniers. Ils pourront contenir, par rapport au fragment de EgA31 ou au fragment de la tropomyosine respectivement, sur un ou plusieurs sites spécifiques, des amino acides à la place d'autres amino acides équivalents qui correspondent à des substitutions conservatives qui conduisent à une forme de la protéine et à une fonction équivalente. Les groupes d'amino acides ci-après sont généralement reconnus comme équivalents : - Ala, Ser, Thr, Pro, Gly - Asn, Asp, Glu, Gln, - His, Arg, Lys, - Met, Leu, Ile, Val, - Phe, Tyr, Trp. Les analogues d'une protéine de référence (fragment de EgA31 ou fragment de la tropomyosine) présenteront, de préférence, après alignement un pourcentage d'homologie d'au moins 80%, de préférence d'au moins 95%, préférentiellement d'au moins 98%, et avantageusement de 100% avec la protéine dont ils sont l'analogue. Le degré d'homologie peut, au sens de l'invention, être déterminé localement par les techniques de comparaison de séquences protéiques, et par exemple la technique BLAST P telle que décrite par ALTSCHUL S.F. et al. dans Nucleic Acid Research 1997, 25, 3389-3402. Dans ce cas, est considérée comme une séquence protéique, analogue d'une autre séquence protéique de référence, une protéine qui présente, sur un nombre d'acides aminés au moins égal à 80% du nombre d'acides aminés de la séquence protéique de référence, un pourcentage d'homologie donné par la technique BLAST P correspondant aux valeurs indiquées précédemment, à savoir un pourcentage d'homologie d'au moins 80%, de préférence d'au moins 95%, préférentiellement d'au moins 98%, et avantageusement de 100%. L'alignement optimal qui correspond à l'alignement qui donne le nombre le plus important d'acides aminés identiques après alignement entre les deux séquences d'acides aminés comparées, peut être obtenu, éventuellement par glissement des séquences les unes par rapport à l'autre et/ou l'insertion dans l'une des séquences comparées, d'un gap entre 2 acides aminés consécutifs. De façon préférée, la première protéine recombinante PR1 est un fragment contenu dans la portion d'EgA31 de séquence SEQ ID N 5 : ISAAEKQAMDDSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRNLELQNDLERLQRET RDELDEQKAEIEKLHKELVGADNSKTTVQSIRNEMRGIQVQIQLLRGGYLDLFHDKIG HYKEKLQESETKLLELQGTH DQTKRIH DVEKDKLAQELKYM EKQIN LCSN EN N KLKD ALASMENQITGLLNGNELLKKKIEMLETRAETKEINTKLENLLKTETQELLTTIKDLDS KLTESGEEVKELKKQLEKAEKQIRDAEVLTDEKNKIIEEMKKTINKLSETKKEVEDKNS E LRKASI Q KQS LI E E KE I LG RQ L E LK DTI I SA M KKE KDA L RH E LH E M RDTI NTLTE KIAT IKIPEPLPMKPIEIPKPLQKEGVNKAMENEIQTYKDTIKTLKDEIFDKSRVINENQVIIK QLERD de préférence, dans la portion d'EgA31 de séquence SEQ ID N 6 : ISAAEKQAM DDSTASSDGIYFAIE EERKKSAELRRALITQESRN LELQN DLERLQRET RD ELDEQKAEIEKLH KELVGADNSKTTVQSIRN EM RGIQVQIQLLRGGYLDLFH DKIG HYKEKLQESETKLLELQGTH DQTKRIH DVEKDKLAQELKYM EKQI N LCSN EN N KLKD ALASMENQITGLLNGNELLKKKIEMLETRAETKEINTKLEN, ou un analogue d'un tel fragment. Selon une variante particulièrement préférée, la première protéine recombinante PR1 est un fragment qui comprend de 60 à 75 acides aminés et qui est contenu dans la séquence SEQ ID N 6 : ISAAEKQAM DDSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRN LELQN DLERLQRET RDELDEQKAEIEKLHKELVGADNSKTTVQSIRNEMRGIQVQIQLLRGGYLDLFHDKIG HYKEKLQESETKLLELQGTHDQTKRIH DVEKDKLAQELKYMEKQIN LCSNENNKLKD ALASM E N QITG LLNG N ELLKKKIE M LETRAETKEINTKLEN, ou un analogue d'un tel fragment. En particulier, la première protéine recombinante PR1 correspond à la protéine de séquence SEQ ID N 3 : ISAAEKQAMDDSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRN LELQNDLERLQRET RDELDEQKAEIE ou à un analogue de cette protéine. Egalement de façon avantageuse, la deuxième protéine PR2 présente la séquence SEQ ID N 4 : ETSTKLDDASKAAEESERN RKTLETRSISDDERMAQLEEQVKEAKYIAEDAERKYDEA ARRLAVTEVDLERAESRLETSESKIVELEEELRIVGNNMKSLEVSEQESLQREESYEET IRDLTERLKTAEQRAAEAERQVSKLQNEVDRLEDELLSKERYRAISGELDTTFAELTSF Les microorganismes utilisés pour l'expression des protéines recombinantes sont, avantageusement des microorganismes atténués, tel que des virus atténués ou des bactéries atténuées. De façon avantageuse, le microorganisme utilisé permet une libération des protéines exprimées, au niveau des muqueuses de l'hôte à traiter. Dans le cadre de l'invention, il est possible d'utiliser une seul microorganisme permettent l'expression des deux protéines PR1 et PR2 ou deux microorganismes permettant chacun l'expression de l'une des protéines. La bactérie atténuée peut être choisie parmi différents genres dont les genres Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus et Yersinia. La bactérie atténuée peut, également, être une souche atténuée de Escherichia coli entérotoxigène. En particulier, les espèces suivantes peuvent être mentionnées : S. enterica serovar Typhimurium ù l'agent de la salmonellose chez plusieurs espèces animales, un des agents d'empoisonnement alimentaire chez l'homme ; S. cholerae suis ù un agent de la salmonellose chez les porcins ; Bordetella bronchiseptica,; Haemophilus influenzae et Yersinia ù un agent d'empoisonnement alimentaire. Dans le cadre de l'invention, il est préférable de disposer d'un vaccin ayant pour cible le chien et permettant une diminution importante du nombre d'oeufs du parasite disséminés dans l'environnement, et ainsi réduire la contamination du bétail et de l'homme. De plus le nombre de chiens à traiter est nettement inférieur à celui du bétail et la manipulation est plus simple, puisqu'une administration per os par appâts est possible. Par conséquent, on utilisera de façon avantageuse, une souche de Salmonelle spécifique du chien, de préférence la Salmonella typhi ou la Salmonella enterica. A titre d'exemple particulièrement préféré, on peut citer, la LVRO1, décrite dans Vaccine, 2001, 19, 460-469. Parmi les virus atténués utilisés comme carriers, on peut citer la vaccine utilisée dans les vaccins contre la rage, la famille des Pox virus, Herpes simplex, le virus de la stomatite vésiculeuse. L'atténuation du microorganisme est obtenue notamment par délétion des gènes de la pathogénicité. L'atténuation peut être attribuée à une mutation irréversible dans un gène de la voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques de la bactérie. Il y a au moins dix gènes impliqués dans la synthèse du chorismate, composé situé au carrefour de la voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques. Plusieurs d'entre eux sont localisés à des endroits très différents dans le génome bactérien, par exemple aroA (5-énolpyruvateshikimate-3-phosphate synthase), par exemple aroC (chorismate synthase), aroD (3-dihydroquinate déhydratase) et aroE (shikimate déshydrogénase). Une mutation peut donc apparaître dans le gène aroA, aroC, aroD ou aroE. Cependant, de préférence, une bactérie atténuée contient une mutation irréversible dans chacun de deux gènes distincts de sa voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques. De telles bactéries sont décrites dans EP-A-O 322 237. Des doubles mutants aro appropriés sont aroA aroC, aroA aroD et aroA aroE. D'autres bactéries ayant des mutations dans d'autres combinaisons des gènes aroA, aroC, aroD et aroE sont cependant utilisables. Les doubles mutants aro de Salmonella sont particulièrement préférés, par exemple les double mutants aro de S. typhi ou de S. typhimurium ou avantageusement de S. enterica, en particulier les mutants aroA aroC, aroA aroD et aroA aroE. La bactérie atténuée peut, également, contenir une mutation irréversible dans un gène impliqué dans la régulation d'un ou plusieurs autres gènes (EP-A-0 400 958). De préférence, la mutation se produit dans le gène ompR ou un autre gène impliqué dans la régulation. Ce type de bactérie atténuée peut contenir une seconde mutation dans un second gène. De préférence, le second gène est un gène codant pour une enzyme impliquée dans une voie de biosynthèse essentielle, en particulier des gènes impliqués dans la voie de synthèse du pré- chorismate impliqué dans la biosynthèse des composés aromatiques. La seconde mutation est donc, de préférence, dans le gène aroA, aroC ou aroD. Un autre type de bactérie atténuée est une bactérie dans laquelle l'atténuation est due à la présence d'une mutation irréversible dans un des gènes impliqués dans la réponse à un stress de l'environnement. De telles bactéries sont décrites dans WO 91/15572. La mutation irréversible peut être une délétion, une insertion, une inversion ou une substitution. Une mutation par délétion peut être générée en utilisant un transposon. Le gène codant pour les protéines induisant des réponses immunitaires, peut être inséré dans un plasmide ou directement incorporé 15 dans le chromosome du microorganisme. Un microorganisme atténué, utilisable dans un vaccin selon la présente invention, peut être préparé en transformant le microorganisme atténué avec une construction d'ADN, permettant l'expression de la protéine immunogène souhaitée. Toute technique de transformation appropriée peut être utilisée, 20 telle que l'électroporation. De cette manière, on peut obtenir une bactérie atténuée capable d'exprimer une protéine ou des protéines hétérologues pour la bactérie. Une culture de la bactérie atténuée peut être cultivée dans des conditions aérobies. Une quantité suffisante de bactéries est donc préparée, en vue d'une formulation comme vaccin, avec une expression 25 minimale de la protéine hétérologue. Selon une technique avantageuse, il est possible d'utiliser un promoteur capable de promouvoir l'expression d'une séquence ADN et dont l'activité est inductible in vivo, dans des conditions anaérobies, et en particulier le promoteur de la nitrite réductase de E. coli nirB, comme décrit par N. S. 30 Chatfield et al. Biotechnology, vol 10, 888-892, 1992. Le promoteur NirB a, par exemple, été décrit dans la demande de brevet WO 92/15689. Selon un aspect avantageux, on utilise une construction d'ADN comprenant un promoteur tel que défini ci-dessus, lié de manière fonctionnelle à une séquence ADN codant pour deux séquences protéiques liées par une liaison charnière : l'une des séquences protéiques sera la première protéine PR1 et l'autre séquence sera de préférence une séquence antigénique comprenant le fragment C de la toxine tétanique ou des épitopes de celui-ci, comme décrit dans EP 0652962 auquel on pourra se référer. La construction d'ADN peut donc être un vecteur d'expression capable de se répliquer comprenant le promoteur nirB lié, de manière fonctionnelle, à une séquence d'ADN codant pour le fragment C de la toxine tétanique ou des épitopes de celui-ci et la seconde protéine hétérologue, liés par une région charnière. Le promoteur nirB peut être inséré dans un vecteur d'expression, dans lequel est déjà incorporé un gène codant pour l'une des protéines hétérologues (par exemple le fragment C de la toxine tétanique), à la place du promoteur existant, contrôlant l'expression de la protéine. La région charnière et le gène codant pour la seconde protéine hétérologue (par exemple une séquence antigénique) peuvent, ensuite, être insérés. Le vecteur d'expression doit, bien entendu, être compatible avec la bactérie atténuée dans laquelle le vecteur doit être inséré et sera, avantageusement, un plasmide. Comme décrit dans ce document, incorporé ici par référence, il est préférable d'utiliser uniquement la partie du promoteur nirB qui répond uniquement à l'anaérobiose. Telles qu'utilisées ici, les référence au promoteur nirB désignent le promoteur lui-même ou une partie ou des dérivés de celui-ci qui sont capables de promouvoir l'expression d'une séquence codante dans des conditions anaérobies. La séquence préférée et qui contient le promoteur nirB est : AATTCAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTT AAGGTAGGCGGTAGGGCC (SEQ ID N 7) La région charnière est une région construite afin d'induire le repliement indépendant, à la fois de la première et de la seconde protéine en fournissant, à la fois une séparation spatiale et temporelle entre les domaines. La région charnière est typiquement une séquence codant pour une proportion élevée d'acides aminés proline et/ou glycine. La région charnière peut être composée entièrement d'acides aminés proline et/ou glycine. La région charnière peut comprendre une ou plusieurs unités dipeptidiques glycine-proline. La région charnière peut, par exemple contenir jusqu'à environ quinze acides aminés, par exemple au moins quatre et, de préférence, six à quatorze acides aminés, le nombre d'acides aminés étant tel qu'il confère la flexibilité entre la première et la seconde protéine. Il a été démontré qu'en fournissant une séquence d'ADN codant pour le fragment C de la toxine tétanique (TetC) liée, via une région charnière, à une seconde séquence codant pour un antigène, l'expression de la séquence dans les cellules bactériennes est accrue par rapport à des constructions dans lesquelles le fragment C et la région charnière sont absents. La composition de vaccin de la présente invention peut comprendre un ou plusieurs adjuvants appropriés. Les vaccins selon l'invention sont de préférence adaptés pour une administration par voie orale et se présentent par exemple sous la forme de comprimés, d'une solution ou suspension buvable, de sachet ou granulés dispersibles dans l'eau. La dose de vaccin qui doit être administrée dépend du type, du poids, de la taille de l'homme ou de l'animal à qui le vaccin doit être administré et du degré d'immunogénicité de l'agent vaccinant. Le vaccin de la présente invention peut être utilisé dans le traitement prophylactique d'un hôte, tel qu'un animal et, en particulier, d'un chien. Une infection, provoquée par des parasites de la famille Echinococcus, en particulier un vaccin selon l'invention. La bactérie exprime alors les protéines recombinantes PR1 et PR2 capables d'induire la production d'anticorps dirigés contre des parasites de la famille Echinococcus. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un microorganisme permettant : - l'expression d'une première protéine recombinante PR1 comprenant de 48 à 435, de préférence de 65 à 219 acides aminés, qui correspond à un fragment d'EgA31 ou à un analogue d'un fragment d'EgA31, ledit fragment d'EgA31 comprenant la séquence SEQ ID N 3 : ISAAEKQAM DDSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRN LELQN DLERLQRET RDELDEQKAEIE - et l'expression d'une deuxième protéine recombinante PR2 de séquence SEQ ID N 4 : ETSTKLDDASKAAEESERNRKTLETRSISDDERMAQLEEQVKEAKYIAEDAERKYDEA ARRLAVTEVDLERAESRLETSESKIVELEEELRIVGNNMKSLEVSEQESLQREESYEET IRDLTERLKTAEQRAAEAERQVSKLQNEVDRLEDELLSKERYRAISGELDTTFAELTSF ou d'un de ses analogues, pour la fabrication d'un vaccin destiné à traiter ou prévenir une infection, 10 provoquée par des parasites de la famille Echinococcus. L'invention concerne également une méthode de traitement pour traiter ou prévenir une infection, provoquée par des parasites de la famille Echinococcus, qui met en oeuvre : - une première protéine recombinante PR1 comprenant de 48 à 435, de 15 préférence de 65 à 219 acides aminés, qui correspond à un fragment d'EgA31 ou à un analogue d'un fragment d'EgA31, ledit fragment d'EgA31 comprenant la séquence SEQ ID N 3 : ISAAEKQAM DDSTASSDGIYFAI EEERKKSAELRRALITQESRN LELQN DLERLQRET RDELDEQKAEIE 20 - et une deuxième protéine recombinante PR2 de séquence SEQ ID N 4 : ETSTKLDDASKAAEESERNRKTLETRSISDDERMAQLEEQVKEAKYIAEDAERKYDEA ARRLAVTEVDLERAESRLETSESKIVELEEELRIVGNNMKSLEVSEQESLQREESYEET IRDLTERLKTAEQRAAEAERQVSKLQNEVDRLEDELLSKERYRAISGELDTTFAELTSF ou d'un de ses analogues. 25 Ces protéines sont avantageusement des protéines recombinantes et sont, de préférence, administrées sous la forme d'un microorganisme, tel que précédemment défini, assurant leur expression. Toutes les variantes préférées décrites précédemment, dans le cadre de la description des vaccins conformes à l'invention, s'appliquent à 30 l'utilisation et à la méthode de traitement ci-dessus définies. L'utilisation et la méthode selon l'invention, sont, en particulier, en particulier appliquées au traitement des chiens et au traitement par voie orale. Les exemples ci-après mettent en évidence l'efficacité de l'association de de deux protéines PR1 et PR2. A/ Fragment de la tropomyosine La séquence de cDNa de la tropomyosine est accessible dans GenBank avec le N AF011923. On pourra se référer à la publication de Esteves, A., Sefiorale, M., and Ehrlich R. A "Tropomyosin gene is differentially expressed in the larval stage of Echinococcus granulosus" Parasitol. Res. 2003 Apr,89(6):501-2. La construction utilisée pour la préparation du vaccin a été obtenue de la manière suivante : La région clonée correspondant au numéro AF011923 dans GenBank codant pour EgTrp (Tropomysin-like gene d'Echinococcus granulosus) a été amplifiée par PCR en utilisant des primers spécifiques puis clonée dans le vecteur pTECH 2 aux sites Bam HI-Hind 111. Une fois clonée, elle a été séquencée de nouveau, ce qui a montré la présence d'une erreur probablement introduite par la Taq polymerase. La nouvelle séquence (n AAB65799 dans GenBank), est la suivante : SEQ ID N 8 gaaacatctactaagcttgacgatgctagcaaagctgctgaggagagcgaaaggaatcgaaaaaccctt gagaccaggtctatttctgacgatgaacgaaaggcccaactagaagaacaggtaaaggaggcgaagt acatcgctgaagatgccgaacggaaatacgatgaagctgctcgccgcttggcagtgaccgaggtcgact tggagcgagcggagtctcgtttggaaacctcggagagcaaaatcgttgaacttgaggaagaactgcgca ttgttggtaacaacatgaaatctctcgaagtctccgagcaagagtctcttcagcgcgaagaaagttacgaa gaaaccattcgagatttgacagagcgcttgaagacggcagagcagcgtgctgccgaagctgaacgcca agtgtccaagctccaaaatgaagttgaccgccttgaagatgagctactatccgagaaggaacgttaccga gccatcagcggagaactggatactaccttcgcggagctcacttccttctga B/ Les Salmonelles Leur préparation a été décrite dans : Construction, expression and immunogenicity of the Schistosoma mansoni P28 glutathion S-transferase as a genetic fusion to tetanus toxin fragment C in a live Aro attenuated vaccine strain of Salmonella ûAnjam Khan C.M. et al, Proc. Nat/. Acad. Sci. USA, 1994, 91,11261-11265." 14 Le principe repose sur l'utilisation de Salmonelles, souche Aro, dans lesquelles un plasmide permet l'expression du fragment C de la toxine tétanique (Tet C) sous contrôle du promoteur nirB (promoteur de la nitrite réductase) d'E. coli. Ce promoteur est induit pari' anaérobiose. Le fragment TetC est non toxique mais fortement immunogène et peut fonctionner comme adjuvant pour un antigène associé. La souche P228067 de Salmonella typhi a été délétée de 600 paires de base dans la phase de lecture ouverte du gène AroC comme décrit dans Chabalgoity et al., Vaccine ,19, 2001,460-469. L'un des mutants (LVROI), ampicilline sensible et dépendant de la présence de composés aromatiques pour sa croissance, a été sélectionné et utilisé pour la suite du travail. Cl Les Plasmides pTECH EgA31 : Il est préparé à partir du plasmide pTETmir 15 déjà existant (Chatfield et al., Biotechnology, 10,1992,888-892.)comme décrit par Anjam Khan et al., dans PNAS, 91,1994,11261-11265. Brièvement des sites de restriction permettant l'insertion du fragment d'ADN codant pour la séquence SEQ ID N 3 ont été incérés à proximité d'un domaine codant pour un motif Gly-Pro-Gly-Pro . Ce type de domaine crée une charnière qui permet l'individualisation du domaine protéique qui le suit. pTECH Df5: Le protocole est le même que le précédent. Les sites de restriction permettent l'insertion du fragment d'ADN codant pour le fragment de la tropomyosine (SEQ ID N 4) pFES EgA31 : Le fragment d'ADN codant pour la séquence SEQ ID N 3 est d'abord fusionné au gène SseA (Proteines du groupe SPI2 de Salmonelles associées au système de sécrétion de type III). Une meilleure exportation de l'antigène est attendue de cette association. Trois cultures de Salmonelles LVR01 sont transformées chacune par un de ces trois plasmides selon les méthodes décrites dans Sambrook J. Fritsch E. F. , Maniatis T. 1989, Molecular cloning Laborarory Manual (Cold spring harbor Lab. Press, Plainview, N. Y.) tel que décrit dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 911 11261-11265, 1994. Les bactéries sont cultivées sur milieu LB sous agitation à 37 C. Lorsque la culture atteint la phase exponentielle de croissance, elle est centrifugée, et les bactéries sont lavées 1 fois dans 10mI d'eau distillée, glycérol 10% (volume-volume) à 4 C, puis resuspendues à la concentration de 1010 cellules/ml. 60pl de cette suspension et 1pg d'ADN plasmidien repris dans 5pl d'eau distillée sont déposés dans une cellule d'électroporation (0,2cm, Biorad, Richmond) prérefroidie à 0 C. L'électroporation est faite dans un électroporateur Biorad (1750 volts, 25 F, 800ohms; la durée des chocs électriques est de 12 à 15 millisecondes). Le mélange est ensuite transféré immédiatement dans de milieu LB froid, puis incubé à 37 C sous agitation pendant 1h30. Les bactéries sont étalées sur boite de Pétri et cultivées à 37 C sur milieu LB contenant 100pg/ml d'ampicilline pour sélection des colonies transformées. La production in vitro des protéines recombinantes est contrôlée par électrophorèse et utilisation d'anticorps spécifiques. Dl Protocole d'administration et d'infestation Les Salmonelles LVR01 ont été cultivées sur milieu LB comme décrit par Chabalgoity et al., dans Vaccine ,19, 2001,460-469. Les essais de vaccination ont été réalisés parallèlement au Maroc et en Tunisie. Dans chaque cas, les animaux provenaient d'élevages locaux. Ils ont été vermifugés 3 semaines à 1 mois et demi, avant le début de l'expérimentation par du Praziquantel et de l' Albendazole au Maroc et en Tunisie. Leur âge variait de 2 à 5 mois au Maroc, de 4 mois à 1 an en Tunisie. Les chiens ont été mis à jeun 24 h avant le début de l'expérimentation. lls ont reçu soit : - le vaccin composé de 33% de chacune des 3 constructions dans les Salmonelles - des Salmonelles sans plasmide - du PBS - rien Le vaccin, les salmonelles vides et le PBS ont été administrés deux fois à 20 jours d'intervalle, per os, dans 4ml de PBS. Préalablement à l'administration des Salmonelles, le comptage des colonies a été effectué en boite de Pétri sur gélose-Agar. Les Salmonelles renfermant les plasmides ont été administrées à la dose de 1,8 X1011 salmonelles puis de 3,4X 1011 pour la seconde administration. 26 jours après la seconde administration, tous les animaux ont reçu une dose challenge de 75 000 protoscolex viables. Le taux de viabilité a été évalué par le test de coloration à l'éosine. Les animaux ont été euthanasiés 26 jours plus tard, à l'aide d'une solution de barbituriques. Les vers présents dans la partie antérieure de l'intestin ont été comptés après lavage et raclage de la muqueuse puis sédimentation. Au Maroc : 5 animaux ont reçu les constructions vaccinales. 3 animaux ont reçu des Salmonelles sans plasmides 6 animaux ont servi de témoins (PBS + challenge et challenge seul) Le total des vers pour chaque lot a été respectivement de : 2820, 4495, 15765 soit une moyenne de 564, 1498, 2627 soit une diminution de 78% du nombre de vers. En Tunisie : 6 animaux ont reçu les constructions vaccinales. 3 animaux ont reçu des Salmonelles sans plasmides 5 animaux ont servi de témoins (PBS + challenge et challenge seul Le nombre de vers a été évalué par 100mI de remise en suspension dans le liquide de lavage. Animaux vaccinés : moyenne 65 vers /100ml Animaux avec Salmonelles seules : 135 vers /100ml Animaux témoins d'infestation : 246 vers/100ml soit une réduction de 73% du nombre de vers Dans les deux cas, au Maroc comme en Tunisie, un retard de croissance des vers a été observé chez les animaux vaccinés. II correspond à 44 % des vers encore présents dans l'intestin des chiens après vaccination au Maroc. Or, la diminution du nombre de vers et le retard de croissance constituent les deux critères d'efficacité pour un vaccin en parasitologie. REVENDICATIONS 1. - Composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un microorganisme permettant : - l'expression d'une première protéine recombinante PR1 comprenant de 48 à 435, de préférence de 65 à 219 acides aminés, qui correspond à un fragment d'EgA31 ou à un analogue d'un fragment d'EgA31, ledit fragment d'EgA31 comprenant la séquence SEQ ID N 3 : ISAAEKQAM DDSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRN LELQN DLERLQRET RDELDEQKAEIE - et l'expression d'une deuxième protéine recombinante PR2 de séquence SEQ ID N 4 : ETSTKLDDASKAAEESERNRKTLETRSISDDERMAQLEEQVKEAKYIAEDAERKYDEA ARRLAVTEVDLERAESRLETSESKIVELEEELRIVGNNMKSLEVSEQESLQREESYEET IRDLTERLKTAEQRAAEAERQVSKLQN EVDRLEDELLSKERYRAISGELDTTFAELTSF ou d'un de ses analogues. 2 - Composition vaccinale selon la revendication 1, caractérisée en ce que la première protéine recombinante PR1 est un fragment contenu dans la portion d'EgA31 de séquence SEQ ID N 5 : ISAAEKQAMDDSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRN LELQNDLERLQRET RDELDEQKAEIEKLHKELVGADNSKTTVQSIRNEMRGIQVQIQLLRGGYLDLFHDKIG HYKEKLQESETKLLE LQGTH DQTKRI H DVEKDKLAQELKYM EKQI N LCSN EN N KLKD ALASMENQITGLLNGNELLKKKIEMLETRAETKEINTKLENLLKTETQELLTTIKDLDS KLTESG EEV KELKKQLEKAEKQI RDAEVLTDEKN KIIEEM KKTIN KLSETKKEVED KNS ELRKASIQKQSLIEEKEILGRQLELKDTIISAM KKEKDALRH ELH EM RDTINTLTEKIAT IKIPEPLPM KPIEIPKPLQKEGVN KAM EN EIQTYKDTIKTLKDEIFDKSRVIN ENQVIIK QLERD de préférence, dans la portion d'EgA31 de séquence SEQ ID N 6 : ISAAEKQAM DDSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRN LELQN DLERLQRET RDELDEQKAEIEKLH KELVGADNSKTTVQSIRN EM RGIQVQIQLLRGGYLDLFH DKIG HYKEKLQESETKLLELQGTHDQTKRIHDVEKDKLAQELKYMEKQINLCSNENNKLKD ALASMENQITGLLNGN ELLKKKIEMLETRAETKEINTKLEN, ou un analogue d'un tel fragment. 3 - Composition vaccinale selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la première protéine recombinante PR1 est un fragment qui comprend de 60 à 75 acides aminés et qui est contenu dans la séquence SEQ ID N 6 : ISAAEKQAM DDSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRN LE LQN DLERLQRET RDELDEQKAEIEKLHKELVGADNSKTTVQSIRN EMRGIQVQIQLLRGGYLDLFHDKIG HYKEKLQESETKLLELQGTHDQTKRIHDVEKDKLAQELKYMEKQIN LCSN EN N KLKD ALASM ENQITG LLNGN ELLKKKIEM LETRAETKEINTKLEN, ou un analogue d'un tel fragment. 4 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la première protéine recombinante PR1 correspond à la protéine de séquence SEQ ID N 3 : ISAAEKQAM D DSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRN LELQN DLERLQRET RDELDEQKAEIE. 5 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le microorganisme est un microorganisme atténué qui permet une libération des protéines exprimées, au niveau des muqueuses de l'hôte à traiter. 6 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est destinée et adaptée à une administration par voie orale. 7 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le ou les microorganismes utilisés sont des bactéries atténuées, et en particulier des Salmonelles atténuées. 8 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend une première bactérie atténuée permettant l'expression de la première protéine recombinante PR1 et une deuxième bactérie permettant l'expression de la deuxième protéine recombinante PR2. 9 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la ou les bactéries sont des Salmonella enterica. 10 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la ou les bactéries sont LVRO1. 11 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que les protéines recombinantes PR1 et PR2 sont exprimées par l'intermédiaire d'un vecteur d'expression inséré dans le(s) microorganismes. 12 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'un plasmide est utilisé en tant que vecteur d'expression. 13 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que l'ADN codant pour la première protéine recombinante PR1 est fusionné avec une séquence nucléotidique d'exportation. 14 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement ou à la prévention des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier E. granu/osus et E mu/ti/ocu/aris, chez l'homme ou chez l'animal. 15 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement des chiens. 16 - Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement de l'hydatidose. 17 - Protéine de SEQ ID N 3 : ISAAEKQAM DDSTASSDGIYFAIEEERKKSAELRRALITQESRNLELQNDLERLQRET RDELDEQKAEIE