FR 2905381 A1 20080307 FR 0706125 A 20070831 ANTICORPS DE REGION VARIABLE PAN ECTO-NOX (ScFv) MONOCATENAIRE, SEQUENCE CODANTE ET PROCEDES ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION L'invention concerne en général des anticorps monocaténaires recombinants ayant une utilité dans des combinaisons avec d'autres techniques pour la détection de marqueurs sériques caractéristiques de cellules malades, en particulier d'isoformes de la NADH oxydase de surface cellulaire (ECTO-NOX), des molécules d'acide nucléique codant pour des anticorps monocaténaires spécifiques du marqueur de surface cellulaire caractéristique des cellules néoplasiques et de certaines autres cellules malades, des cellules recombinantes produisant ces anticorps monoclonaux spécifiques de marqueurs néoplasiques et des anticorps monocaténaires de spécificité semblable ou différente. Il existe une famille unique, liée à la croissance, d'hydroquinone ou NADH oxydases de surface cellulaire avec une activité d'échange de disulfure des protéines- thiol appelées les protéines ECTO-NOX (pour NADH oxydases de surface cellulaire) (1, 2). Un membre de la famille ECTO-NOX, appelé tNOX (pour associé à une tumeur) est spécifique des surfaces des cellules cancéreuses et du sérum des patients cancéreux (3, 4). La présence de la protéine tNOX a été démontrée pour plusieurs tissus tumoraux humains (carcinome mammaire, cancer de la prostate, neuroblastome, carcinome du côlon et mélanome) (5), et une analyse du sérum suggère une association bien plus large avec le cancer humain (6, 7). Les protéines NOX sont des ectoprotéines ancrées dans le feuillet externe de la membrane plasmique (8). Ainsi que cela est caractéristique d'autres exemples d'ectoprotéines (la sialyle et galactosyle transférase, la dipeptidylamino peptidase IV, etc.), les protéines NOX sont relarguées. Elles apparaissent sous forme soluble dans des milieux conditionnés de cellules cultivées (5) et dans le sérum de patients (6, 7). La forme sérique de la tNOX de patients cancéreux présente le même degré de réactivité aux médicaments que la forme associée à la membrane. Les activités de la 2905381 2 tNOX réactive aux médicaments sont observées dans le sérum d'une variété de patients cancéreux humains, y compris des patients atteints de leucémie, de lymphomes ou de tumeurs solides (prostate, sein, côlon, poumon, pancréas, ovaire, foie) (6, 7). Une stabilité extrême et une résistance à la protéase de la protéine tNOX 5 (9) peut aider à expliquer sa capacité à s'accumuler dans le sérum de patients cancéreux à des niveaux facilement détectables. En revanche, aucune activité de NOX réactive aux médicaments n'a été observée dans le sérum de volontaires sains (6, 7), ni dans le sérum de patients atteints de troubles autres que la néoplasie. Si la base de la spécificité du cancer de la tNOX de surface cellulaire n'a pas 10 été déterminée, le concept est fortement soutenu par plusieurs séries d'éléments probants. Une activité de tNOX réactive aux médicaments a été rigoureusement déterminée comme étant absente des membranes plasmiques de cellules et de tissus humains et animaux non transformés (3). Les protéines tNOX ne possèdent pas de domaine de liaison transmembranaire (10) et sont libérées de la surface cellulaire par 15 un bref traitement à faible pH (9). Il n'a pas été détecté d'activité de tNOX réactive aux médicaments dans le sérum de volontaires sains, ni de patients atteints de maladies autres que le cancer (6, 7). Plusieurs antisérums contre tNOX ont identifié la bande immunoréactive à 34 kDa (le poids moléculaire traité de l'une des formes de surface cellulaire de tNOX) avec une analyse de transfert de western ou une 20 immunoprécipitation lors de l'utilisation de cellules et de tissus transformés ou de sérum de patients atteints de cancers en tant que source d'antigènes (5, 10, 11). Aucune bande immunoréactive à 34 kDa n'a été observée avec une analyse de transfert de western ni avec une immunoprécipitation lors de l'utilisation de cellules et de tissus non-transformés ou de sérum de volontaires sains ou de patients atteints 25 de troubles autres que des cancers en tant que source d'antigènes (5, 10, 11). Les antisérums comprennent un anticorps monoclonal (5), un fragment de région variable monocaténaire (ScFv) qui réagit avec la NADH oxydase de surface cellulaire de cellules normales et néoplasiques, les antisérums polyclonaux fabriqués en réponse à la tNOX exprimée (11) et les antisérums peptidiques polyclonaux contre la région conservée de liaison du nucléotide adénine de la tNOX (11). L'ADNc de la tNOX a été cloné (No. d'accès GenBank AF207881 ; I l ; publication de brevet US 2003-0207340 Al). Le poids moléculaire dérivé du cadre ouvert de lecture était de 70,1 kDa. Les motifs fonctionnels comprennent un site de 2905381 3 liaison de la quinone, un site de liaison du nucléotide adénine et une paire de cystéines CXXXXC en tant que site d'échange de protéine disulfure-thiol potentiel sur la base d'une mutagenèse dirigée (11). Sur la base des informations génomiques disponibles (12), le gène tNOX est situé sur le chromosome X et il est constitué de 5 plusieurs exons (treize). On sait qu'il existe un certain nombre de variants d'épissage d'ARNm et de protéines exprimés. La lignée de cellules d'hybridome qui produit l'anticorps monoclonal MAB 12.1 spécifique de la NADH oxydase tumorale a été déposée auprès de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginie, 20108 le 4 avril 2002 sous les 10 conditions du Traité de Budapest. Ce dépôt est identifié par le No. d'accès ATCC PTA-4206. Le dépôt sera conservé avec restriction dans le dépôt ATCC pendant une période de 30 ans à partir de la date de dépôt ou 5 ans après la requête la plus récente, ou pendant la durée de vie effective du brevet, quelle que soit la période la plus longue, et sera remplacé si le dépôt devient non viable au cours de cette période. Cet 15 anticorps monoclonal est décrit dans le brevet US 7 053 188, établi le 30 mai 2006. Les régions variables d'ADN de chaîne légère et lourde sur lesquelles la production de ScFv se fonde sont issues de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome déposé auprès de la American Type Culture Collection sous le No. d'accès PTA-4206. Consulter également le brevet US No. 7 053 188. 20 Du fait que le cancer représente une importante menace pour la santé de l'homme et du fait que le cancer entraîne des coûts élevés, il existe depuis longtemps dans l'art le besoin d'un système techniquement simple, économique et efficace dans lequel la présence d'un cancer peut être évaluée et, pour une utilisation dans un tel essai, une source régénérée de manière pratique de l'anticorps spécifique peut 25 identifier les protéines caractéristiques d'affections néoplasiques. RESUME DE L'INVENTION La présente invention propose un anticorps monocaténaire recombinant spécifique de l'Ecto-NOX, les séquences codantes pour celuici et des procédés de 30 production recombinante de cet anticorps monocaténaire. Cet anticorps recombinant est utile pour l'analyse d'un échantillon biologique quant à la présence d'isoformes particulières de l'antigène pan-cancer connu en tant que tNOX (pour NADH oxydase 2905381 4 spécifique d'une tumeur) et d'autres membres de la famille de protéines ECTO-NOX dans des transferts de western. La séquence d'acides aminés de l'anticorps monocaténaire spécifique des protéines Ecto-NOX, y compris la tNOX, est présentée sur la figure 4B, et une séquence codante spécifiquement illustrée est exposée sur la 5 figure 4A ; on comprend que les séquences codantes synonymes se trouvent dans la portée de la présente invention et que les anticorps monocaténaires fonctionnellement équivalents ayant la même spécificité de liaison se trouvent également dans la portée de la présente invention. Il a été démontré que l'anticorps de région variable monocaténaire (ScFv) 10 permettant l'identification d'isoformes d'ECTO-NOX sur des transferts de western était utile dans la détection, le diagnostic du cancer et le contrôle de la progression de la maladie. La détection des isoformes de tNOX sur des transferts de western de gels 2-D de sérum de patients est décrite dans la demande de brevet US provisoire 60/824 333, déposée le 1 e` septembre 2006, Neoplasia Specific tNOX isoforms and 15 Methods . BREVE DESCRIPTION DES FIGURES La figure lA et la SEQ ID NO : 1 fournissent la séquence codant pour la chaîne lourde spécifique de l'Ecto-NOX ScFv (VH) et la figure 1B et la SEQ ID NO : 20 2 fournissent la séquence d'ADN codant pour la chaîne légère spécifique de l'Ecto-NOX ScFv (VL). La figure 2 présente la stratégie pour la synthèse du gène ScFv. La figure 3 est un diagramme du vecteur d'expression pET-1 la (disponible auprès de Stratagene, La Jolla, CA). La séquence de la portion de site multiple de 25 clonage est également représentée (SEQ ID NO : 17), de même que la séquence N-terminale du peptide du gène 10 T7 leader (SEQ ID NO : 18). Les figures 4A et 4B fournissent la séquence codante d'ADN et les séquences d'acides aminés déduites de ScFv(S), respectivement. Consulter également la SEQ ID NO : 3 et la SEQ ID NO : 4, respectivement. 30 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention propose un anticorps monocaténaire recombinant qui se lie spécifiquement à toutes les protéines Ecto-NOX, y compris la forme spécifique 2905381 5 d'une tumeur associée aux cellules tumorales et à d'autres cellules néoplasiques (tNOX), lorsque ces protéines sont résolues par électrophorèse sur gel et transférées sur un support solide (tel qu'un support de nylon) (transfert de western, analyse d' immunodétection par transfert électrophorétique). 5 L'expression et la fonction de l'anticorps monocaténaire de la présente invention destiné à une utilisation dans des transferts de western se sont révélées dépendantes du lieur particulier qui relie la portion lourde variable et la portion légère variable. Ainsi qu'illustré spécifiquement, la séquence du lieur est GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 5). L'anticorps monocaténaire illustré 10 spécifiquement contient également, à son extrémité C-terminale, ce qu'on appelle un S-tag, une séquence d'acides aminés qui permet l'utilisation d'un deuxième anticorps qui se lie spécifiquement à cette séquence de protéine S, facilitant ainsi la détection de la liaison de l'anticorps monocaténaire à une immunoempreinte. En variante au S-tag illustré spécifiquement, on comprend que d'autres 15 séquences d'étiquette qui servent de sites de liaison pour des deuxièmes anticorps détectables ou une autre molécule détectable (avec une spécificité de liaison pour l'anticorps monocaténaire de la présente invention) ou afin de faciliter la purification sur une colonne d'affinité ou une colonne d'immunoaffinité, peuvent être substituées à l'étiquette S. Ces étiquettes et les vecteurs d'expression les contenant comprennent, 20 sans restriction, la GST (glutathione S-transférase), l'antigène flagellaire, le Myc, le Nus, entre autres. D'autres étiquettes oligopeptidiques qui peuvent être fusionnés à une protéine d'intérêt par des techniques de biologie moléculaire comprennent, sans restriction, le strep-tag (Sigma-Genosys, The Woodlands, TX) qui dirige la liaison à la streptavidine ou son dérivé la streptactine (Sigma-Genosys) ; un système 25 de fusion du gène de la glutathione-S-transférase qui dirige la liaison au glutathion couplé à un support solide (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède) ; un système de fusion de peptide de liaison à la calmoduline qui permet la purification en utilisant une résine de calmoduline (Stratagene, La Jolla, CA) ; un système de fusion de protéine de liaison du maltose permettant la liaison à une résine d'amylose (New 30 England Biolabs, Beverly, MA) ; et un système de peptide de fusion d'oligo-histidine qui permet la purification en utilisant une colonne Nie+NTA (Qiagen, Valencia, CA). Les acides aminés qui sont présents dans les différentes séquences d'acides aminés mentionnés dans le mémoire ont leurs abréviations usuelles en trois lettres et 2905381 6 en une lettre utilisées couramment dans l'art : A, Ala, Alanine ; C, Cys, Cystéine ; D, Asp, Acide Aspartique ; E, Glu, Acide Glutamique ; F, Phe, Phénylalanine ; G, Gly, Glycine ; H, His, Histidine ; I, Ile, Isoleucine ; K, Lys, Lysine ; L, Leu, Leucine ; M, Met, Méthionine ; N, Asn, Asparagine ; P, Pro, Proline ; Q, Gln, Glutamine ; R, Arg, 5 Arginine ; S, Ser, Sérine ; T, Thr, Thréonine ; V, Val, Valine ; W, Try, Tryptophane ; Y, Tyr, Tyrosine. Une protéine est considérée comme une protéine isolée s'il s'agit d'une protéine isolée d'une cellule hôte dans laquelle elle est produite de manière recombinante. Elle peut être purifiée ou elle peut simplement être exempte d'autres 10 protéines et matières biologiques avec lesquelles elle est associée dans la nature. Un acide nucléique isolé est un acide nucléique dont la structure n'est pas identique à celle d'un acide nucléique naturel quelconque ni à celle d'un fragment quelconque d'un acide nucléique génomique naturel couvrant plus de trois gènes distincts. Le terme englobe donc, par exemple, (a) un ADN qui a la séquence d'une 15 partie d'une molécule d'ADN génomique naturelle, mais n'est flanquée d'aucune des séquences codante et non codante qui flanquent cette partie de la molécule dans le génome de l'organisme dans lequel elle est présente dans la nature ; (b) un acide nucléique incorporé dans un vecteur ou dans l'ADN génomique d'un procaryote ou d'un eucaryote d'une manière telle que la molécule obtenue n'est pas identique à un 20 vecteur naturel ou un ADN génomique quelconques ; (c) une molécule distincte telle qu'un ADNc, un fragment génomique, un fragment produit par réaction de polymérase en chaîne (PCR) ou un fragment de restriction ; et (d) une séquence de nucléotides recombinante qui fait partie d'un gène hybride, c'est-à-dire un gène codant pour une protéine de fusion. Sont spécifiquement exclus de cette définition, 25 les acides nucléiques présents dans des mélanges de (i) molécules d'ADN, (ii) de cellules transformées ou transfectées et (iii) de clones de cellules, par exemple, tels que ceux présents dans une bibliothèque d'ADN comme une bibliothèque d'ADNc ou d'ADN génomique. Telle qu'utilisée ici, l'expression dirigée par une séquence particulière 30 correspond à la transcription et à la traduction d'une séquence d'aval associée. Dans le présent contexte, un promoteur est une région d'ADN qui comprend des séquences suffisantes pour provoquer la transcription d'une séquence (d'aval) associée. Le promoteur peut être régulé, c'est-à-dire qu'il n'agit pas constitutivement 2905381 7 de manière à provoquer la transcription de la séquence associée. S'il est inductible, il existe des séquences qui induisent la régulation de l'expression de sorte que la séquence associée soit transcrite uniquement lorsqu'une molécule d'inducteur est présente dans le milieu dans ou sur lequel l'organisme est cultivé. 5 Dans le présent contexte, une séquence de régulation de la transcription comprend une séquence de promoteur et peut en plus comprendre des séquences actives en cis destinées à l'expression régulée d'une séquence associée en réponse à des signaux environnementaux. Une partie ou une séquence d'ADN est en avant d'une deuxième partie ou 10 séquence d'ADN lorsqu'elle est située à 3' de la deuxième séquence. Une partie ou séquence d'ADN est en amont d'une deuxième partie ou séquence d'ADN lorsqu'elle est située à 5' de cette séquence. Une molécule ou séquence d'ADN et une autre sont hétérologues l'une par rapport à l'autre si les deux ne sont pas issues de la même source naturelle finale. Les 15 séquences peuvent être des séquences naturelles, ou au moins une séquence peut être conçue par l'homme, comme dans le cas d'une région de site multiple de clonage. Les deux séquences peuvent être tirées de deux espèces différentes ou une séquence peut être produite par synthèse chimique à la condition que la séquence de nucléotides de la partie synthétisée n'ait pas été tirée du même organisme que l'autre 20 séquence. Un polynucléotide ou une molécule d'acide nucléique isolée ou essentiellement pure est un polynucléotide qui est essentiellement séparé d'autres séquences de polynucléotides qui accompagnent naturellement une séquence de régulation de la transcription native. Le terme englobe une séquence de 25 polynucléotide qui a été retirée de son environnement naturel et comprend des isolats d'ADN recombinants ou clonés, des analogues synthétisés chimiquement et des analogues synthétisés biologiquement par des systèmes hétérologues. On dit qu'un polynucléotide code pour un polypeptide si, lorsqu'il est manipulé par des procédés connus de l'homme du métier, il peut être transcrit et/ou 30 traduit afin de produire le polypeptide ou un fragment de celui-ci. Une séquence de nucléotides est liée de manière opérationnelle lorsqu'elle est placée dans une relation fonctionnelle avec une autre séquence de nucléotides. Par exemple, un promoteur est lié de manière opérationnelle à une séquence codante si le 2905381 8 promoteur effectue sa transcription ou expression. En général, lié de manière opérationnelle signifie que les séquences en cours de liaison sont contiguës et, lorsqu'il est nécessaire de joindre deux régions codantes d'une protéine, contiguës et dans un cadre de lecture. Cependant, on sait bien que certains éléments génétiques, 5 tels que des amplificateurs, peuvent être liés de manière opérationnelle, même éloignés, c'est-à-dire même s'ils ne sont pas contigus. Le terme polynucléotide recombinant fait référence à un polynucléotide qui est constitué par la combinaison de deux segments de séquence séparés en d'autres circonstances réalisée par la manipulation artificielle de segments de polynucléotides 10 isolés par des techniques de génie génétique ou par synthèse chimique. De cette façon, il est possible de joindre des segments de polynucléotide de fonctions souhaitées afin de générer une combinaison de fonctions souhaitée. De grandes quantités des polynucléotides peuvent être produites par réplication dans une cellule hôte adaptée. Des fragments d'ADN naturels ou 15 synthétiques codant pour une protéine d'intérêt sont incorporés dans des constructions de polynucléotides recombinants, typiquement des constructions d'ADN, pouvant être introduites ou se répliquer dans une cellule procaryote ou eucaryote, en particulier une cellule de mammifère en culture, par exemple, des cellules Vero, des cellules CHO, entre autres, ou Aspergillus pullulans ou 20 Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei, Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris, lorsque l'expression de la protéine est souhaitée. En général, la construction est adaptée à une réplication dans un hôte unicellulaire, tel qu'une bactérie, mais un hôte eucaryote multicellulaire peut également être adapté, avec ou sans intégration dans le génome de la cellule hôte. Les cellules hôtes procaryotes utilisées 25 couramment comprennent des souches de Escherichia coli, bien que d'autres procaryotes, tels que Bacillus subtilis ou une pseudomonade, puissent également être utilisés. Des facteurs tels que la facilité de manipulation, la capacité à glycosyler de manière adaptée les protéines exprimées, le degré et le contrôle de l'expression des protéines, la facilité de purification des protéines exprimées par rapport aux 30 contaminants cellulaires ou d'autres facteurs, influencent le choix de la cellule hôte. Les polynucléotides peuvent également être produits par synthèse chimique, par exemple par le procédé du phosphoramidite décrit par Beaucage et Caruthers (1981) Tetra. Letts. 22 : 1859-1862 ou le procédé du triester selon Matteuci et al. 2905381 9 (1981) J. Am. Chem. Soc. 103 : 3185, et peuvent être obtenus sur des synthétiseurs d'oligonucléotides automatisés disponibles dans le commerce. Un fragment à double brin peut être obtenu à partir du produit de synthèse chimique à simple brin soit en synthétisant le brin complémentaire et en hybridant les brins ensemble dans des 5 conditions adaptées ou en ajoutant le brin complémentaire en utilisant une ADN polymérase avec une séquence d'amorce adaptée. Les ADN recombinants préparés pour l'introduction dans un hôte procaryote ou eucaryote comprendront typiquement un système de réplication (c'est-à-dire un vecteur) reconnu par l'hôte, comprenant le fragment d'ADN visé codant pour le 10 polypeptide souhaité, et comprendront également de préférence des séquences de régulation de la transcription et de la traduction liées de manière opérationnelle au segment codant pour le polypeptide. Les systèmes d'expression (vecteurs d'expression) peuvent comprendre, par exemple, une origine de réplication ou une séquence de réplication autonome (ARS) et des séquences de contrôle de 15 l'expression, un promoteur, un amplificateur et des sites de traitement d'informations nécessaires, tels que des sites de liaison des ribosomes, des sites d'épissage d'ARN, des sites de polyadénylation, des séquences de terminaison de la transcription et des séquences de stabilisation des ARNm. Des peptides signaux peuvent également être inclus lorsque cela est approprié à partir de polypeptides sécrétés de la même espèce 20 ou d'une espèce associée, lesquels permettent à la protéine de traverser et/ou se loger dans les membranes cellulaires ou d'être sécrétée par la cellule. Un promoteur adapté et d'autres séquences de vecteur nécessaires seront sélectionnés de manière à être fonctionnels dans l'hôte. Des exemples de combinaisons fonctionnelles de lignées de cellules et de vecteurs d'expression sont 25 décrits in Sambrook et al. (1989), se reporter ci-dessous ; Ausubel et al. (Ed.) (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York ; et Metzger et al. (1988) Nature, 334: 31-36. De nombreux vecteurs utiles pour l'expression dans des cellules de bactéries, de levures, de champignons, de mammifères, d'insectes, de plantes ou autres sont bien connus dans l'art et 30 peuvent être obtenus auprès de fournisseurs tels que Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech et d'autres. De plus, la construction peut être liée à un gène pouvant être amplifié (par exemple DHFR) de sorte que de multiples copies du gène puissent être préparées. Afin de déterminer les amplificateurs adaptés et les 2905381 10 autres séquences de contrôle de l'expression, consulter également Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1983). Si ces vecteurs d'expression peuvent se répliquer de façon autonome, ils peuvent de manière moins préférée se répliquer en étant insérés dans le génome de la cellule hôte. 5 Les vecteurs d'expression et de clonage contiennent avantageusement un marqueur pouvant être sélectionné, c'est-à-dire un gène codant pour une protéine nécessaire à la survie ou à la croissance d'une cellule hôte transformée avec le vecteur. Même si un tel gène marqueur peut être porté sur une autre séquence de polynucléotide co-introduite dans la cellule hôte, il est le plus souvent contenu sur le 10 vecteur de clonage. Seules les cellules hôtes dans lesquelles le gène marqueur a été introduit survivront et/ou se développeront dans des conditions choisies. Les gènes de sélection typiques codent pour des protéines qui confèrent une résistance aux antibiotiques ou à d'autres substances toxiques, par exemple l'ampicilline, la néomycine, le méthotrexate, etc. ; complètent les déficiences auxotrophes ; ou 15 fournissent des nutriments essentiels non disponibles dans les milieux complexes. Le choix du marqueur sélectionnable approprié dépendra de la cellule hôte ; les marqueurs adaptés pour différents hôtes sont connus dans l'art. Les cellules hôtes recombinantes, dans le présent contexte, sont celles qui ont été modifiées génétiquement afin de contenir une molécule d'ADN isolée de la 20 présente invention. L'ADN peut être introduit par un moyen quelconque connu dans l'art qui est adapté pour le type de cellule particulier, y compris, sans restriction, la transformation, la lipofection ou l'électroporation. L'homme du métier reconnaît que les séquences d'ADN peuvent varier en raison de la dégénérescence du code génétique et de l'usage des codons. Toutes les 25 séquences d'ADN qui codent pour le polypeptide ou la protéine d'intérêt sont comprises dans la présente invention. De plus, l'homme du métier reconnaîtra que des variations peuvent intervenir dans la séquence codante illustrée spécifiquement ici, lesquelles ne changeront pas sensiblement l'activité de la séquence d'acides aminés du polypeptide codé. Toutes 30 ces séquences d'ADN équivalentes sont comprises dans la portée de la présente invention et la définition de la région de promoteur régulée. L'homme du métier comprendra que la séquence de la séquence illustrée peut être utilisée afin 2905381 11 d'identifier et de préparer des séquences de nucléotides supplémentaires non illustrées qui sont fonctionnellement équivalentes aux séquences données. Par conséquent, les variantes de mutation, d'insertion et de délétion de la séquence de nucléotides décrite peuvent être préparées facilement par des procédés 5 qui sont bien connus de l'homme du métier. Ces variantes peuvent être utilisées de la même manière que les séquences d'amorce illustrées dans la mesure où les variantes ont une homologie de séquence sensible avec la séquence d'origine. Telle qu'utilisée ici, une identité de séquence sensible fait référence à une identité qui est suffisante pour permettre à la variante de polynucléotide de fonctionner avec la même capacité 10 que l'anticorps monocaténaire spécifique de l'Ecto-NOX illustré spécifiquement. De préférence, cette identité est supérieure à 85 %, de manière encore davantage préférée, cette identité est supérieure à 90 % et, de manière préférée entre toutes, cette identité est supérieure à 95 %. L'homme du métier saura tout à fait préparer des variantes de mutation, d'insertion et de délétion qui soient équivalentes en fonction 15 ou soient conçues pour améliorer la fonction de la séquence ou fournir sinon un avantage méthodologique. Les substitutions, les insertions ou les délétions de 1 à 5 acides aminés qui n'affectent pas la spécificité de liaison se trouvent dans la portée de la présente invention. Les procédés destinés à confirmer la spécificité de liaison de l'antigène (Ecto-NOX tNOX) sont bien connus dans l'art. 20 La réaction de polymérase en chaîne (PCR) est une amplification amorcée, enzymatique, répétitive d'une séquence d'acides nucléiques. Cette procédure est bien connue et est couramment utilisée par l'homme du métier (consulter Mullis, brevets US Nos. 4 683 195, 4 683 202 et 4 800 159 ; Saiki et al. (1985) Science 230: 1350-1354). En utilisant une ADN polymérase thermostable telle que la Taq polymérase, 25 qui est isolée à partir de la bactérie thermophile Thermus aquaticus, le processus d'amplification peut être entièrement automatisé. Les autres enzymes qui peuvent être utilisées sont connues de l'homme du métier. On comprend que la PCR peut également être utilisée afin de joindre des fragments d'ADN et/ou d'introduire des mutations définies dans une séquence d'intérêt. Les techniques standard de clonage, 30 d'isolation, d'amplification et de purification d'ADN, pour les réactions enzymatiques impliquant l'ADN ligase, l'ADN polymérase, des endonucléases de restriction et l'équivalent, et les différentes techniques de séparation sont celles connues et couramment utilisées par l'homme dumétier. Un certain nombre de 2905381 12 techniques standard sont décrites in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, deuxième édition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York ; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York ; Wu (éd.) (1993) Meth. Enzymol. 218, partie I ; Wu (éd.) (1979) Meth. 5 Enzymol. 68 ; Wu et al. (éd.) (1983) Meth. Enzymol. 100 et 101 ; Grossman et Moldave (éd.) Meth. Enzymol. 65 ; Miller (éd.) (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York ; Old et Primrose (1981) Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley ; Schleif et Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Biology ; 10 Glover (éd.) (1985) DNA Cloning Vol. I et II, IRL Press, Oxford, Royaume-Uni ; Harnes et Higgins (éd.) (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, Royaume-Uni ; Setlow et Hollaender (1979) Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York ; Fitchen, et al. (1993) Annu. Rev. Microbiol. 47 : 739-764 ; Tolstoshev, et al. (1993) in Genomic Research in 15 Molecular Medicine and Virology, Academic Press ; et Ausubel et al. (1992) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York, NY. Les abréviations et la nomenclature, lorsqu'elles sont utilisées, sont considérées comme classiques dans le domaine et couramment utilisées dans les revues professionnelles telles que celles citées ici. Les vaccins à base d'anticorps sont décrits in Dillman R.O. (2001) Cancer 20 Invest. 19(8) : 833-841. Dunant L.G. et al. (2001) Int. J. Cancer 1 ; 92(3) : 414-420 et Bhattacharya-Chatterjee M. (2001) Curr. Opin. Mol. Ther. Feb. 3(1) : 63-69 décrivent des anticorps anti-idiotype. Bon nombre des procédures utiles à la pratique de la présente invention, qu'elles soient ou non décrites ici en détails, sont bien connues de l'homme du métier de la biologie moléculaire, de la biochimie, de 25 l'immunologie et de la médecine. Les exemples suivants sont proposés à des fins d'illustration et ne sont pas censés limiter la portée de l'invention telle que revendiquée ici. Toutes les variations dans les anticorps monocaténaires, les séquences codantes et les séquences d'acides aminés, les épitopes, les procédés de purification, les procédés de diagnostic, les 30 2905381 13 procédés préventifs, les procédés de traitement et les autres procédés illustrés qui viennent à l'esprit de l'homme du métier sont censées tomber dans la portée de la présente invention. 5 EXEMPLES Exemple 1 : Anticorps monocaténaire spécifique de la tNOX recombinant L'anticorps monoclonal généré contre la tNOX NADH oxydase spécifique d'une cellule tumorale a été produit dans des cellules de myélome sp-2, cependant, l'anticorps monoclonal a ralenti la croissance des cellules de myélome sp-2 qui ont 10 été utilisées pour la fusion avec les cellules de rate après 72 heures. Ce phénomène a rendu difficile la production d'anticorps en quantité. Afin de surmonter ce problème, les séquences codantes de la région variable de liaison aux antigènes de la chaîne lourde et de la chaîne légère (région Fv) de l'ADNc de l'anticorps ont été clonées et liées dans un gène chimérique en amont de la séquence codante S-tag. La portion Fv 15 d'un anticorps, constituée des domaines lourd variable (VH) et léger variable (VO, peut conserver la spécificité et l'affinité de liaison de l'anticorps original (Glockshuber et al. 1990. Biochemistry 29 : 1262-1367). Exemple 2 : Clonage d'ADNc codant pour les régions variables de la chaîne lourde 20 et de la chaîne légère d'immunoglobuline Pour un anticorps recombinant, les ADNc codant pour les régions variables de la chaîne lourde (VH) et de la chaîne légère (VL) d'immunoglobuline sont clonés en utilisant des amorces dégénérées. Les immunoglobulines de mammifère de chaîne légère et lourde contiennent des régions conservées adjacentes aux régions 25 hypervariables déterrninant la complémentarité (CDR). Les groupes d'amorces oligo dégénérées permettent d'amplifier ces régions par PCR (Jones et al. 1991. Bio/Technology 9:88-89 ; Daugherty et al. 1991. Nucleic Acids Research 19 : 2471-2476). Les techniques d'ADN recombinant ont facilité la stabilisation des fragments variables par liaison covalente des deux fragments par un lieur polypeptidique 30 (Huston et al. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5879-5883). Soit VL ou VH peut fournir le domaine NH2 terminal du fragment variable monocaténaire (ScFv). Le lieur doit être conçu pour résister à la protéolyse et afin de minimiser l'agrégation des protéines. La longueur et les séquences de lieur contribuent et contrôlent la 2905381 14 flexibilité et l'interaction avec le ScFv et l'antigène. Les lieurs les plus couramment utilisés ont des séquences constituées de résidus de glycine (Gly) et de sérine (Ser) pour la flexibilité, avec des résidus chargés sous la forme d'acide glutamique (Glu) et de lysine (Lys) pour la solubilité (Bird et al. 1988. Science 242 : 423-426 ; Huston et 5 al. 1988. ci-dessus). Exemple 3 : Isolation d'ARN L'ARN total a été isolé des cellules d'hybridome (No. d'accès ATCC PTA-4206) produisant des anticorps monoclonaux spécifiques de la tNOX par la 10 procédure suivante modifiée à partir de Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162 : 156-159 et Gough (1988) Anal. Biochem 176:93-95. Les cellules ont été récoltées à partir du milieu et agrégées par centrifugation à 450 x g pendant 10 minutes. Les culots ont été remis doucement en suspension avec 10 volumes de PBS glacé et centrifugés à nouveau. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été 15 remises en suspension avec un volume égal de PBS. Une solution de dénaturation (0,36 ml de 2-mercaptoéthanol/50 ml de solution mère de guanidinium-4 M de thiocyanate de guanidinium, 25 mM de citrate de sodium, pH 7,0, 0,5 % de sarkosyle) à 10 ml pour 1 g de culot de cellules a été ajoutée avant utilisation et mélangée doucement. De l'acétate de sodium (pH 4,0, 1 ml de 2 M), 10 ml d'eau saturée de 20 phénol et 2 ml de mélanges de chloroforme : alcool isoamylique (24 : 1) ont été ajoutés successivement après chaque addition. La solution a été mélangée soigneusement par inversion. La solution a été agitée vigoureusement pendant 10 secondes, rafraîchie sur de la glace pendant 15 minutes, puis centrifugée à 12000 x g pendant 30 minutes. Le surnageant a été transféré et un volume égal de 2-propanol a 25 été ajouté et placé à -20 C pendant la nuit afin de précipiter l'ARN. L'ARN a été agrégé pendant 15 minutes à 12000 x g et le culot a été remis en suspension avec 2-3 ml de solution de dénaturation et 2 volumes d'éthanol. La solution a été placée à - 20 C pendant 2 heures, puis centrifugée à 12000 x g pendant 15 minutes. Le culot d'ARN a été lavé avec 70 % d'éthanol, puis 100 % d'éthanol. Le culot a été remis en 30 suspension avec de l'eau exempte de RNase (eau traitée au DEPC) après centrifugation à 12000 x g pendant 5 minutes. La quantité d'ARN isolé a été mesurée par spectrophotométrie et calculée à partir de l'absorbance à 280 nm et 260 nm. 2905381 15 Le kit d'isolation de poly(A)ARNm a été acquis auprès de Stratagene. L'ARN total a été appliqué à une colonne de cellulose oligo(dT) après chauffage de l'ARN total à 65 C pendant 5 minutes. Avant l'application, les échantillons d'ARN ont été mélangés avec 500 l de 10 x tampon d'échantillon (10 mM de Tris-HC1, pH 5 7,5, 1 mM d'EDTA., 5 M de NaCl). Les échantillons d'ARN ont été passés à travers la colonne à une vitesse de 1 goutte toutes les 2 secondes. Les éluats ont été regroupés et appliqués de nouveau à la colonne et purifiés de nouveau. Le tampon d'élution préchauffé (65 C) a été appliqué et l'ARNm a été élué et recueilli dans des tubes de centrifugation de 1,5 ml sur de la glace. La quantité d'ARNm a été 10 déterminée à OD260 (1 unité OD = 40 g d'ARN). Les quantités d'ARN total et d'ARNm obtenues à partir de 4 x 108 cellules ont été de 1328 gg et 28 g, respectivement. L'ARNm (1-2 g) dissous dans de l'eau traitée au DEPC a été utilisé pour la synthèse d'ADNc. L'ARNm isolé à trois dates différentes a été regroupé pour la 15 synthèse du premier brin d'ADNc. Le kit de synthèse d'ADNc a été acquis auprès de Pharmacia Biotech. L'ARNm (1,5 pg/5 l d'eau traitée au DEPC) a été chauffé à 65 C pendant 10 minutes et rafraîchi immédiatement sur de la glace. Le mélange du premier brin amorcé contenant la MuLV transcriptase inverse (11 pl) et des tampons adaptés pour la réaction ont été mélangés avec l'échantillon d'ARNm. Une solution 20 de DTT (1 pl de 0,1 M) et de l'eau exempte de RNase (16 l) ont également été ajoutées à la solution. Le mélange a été incubé pendant 1 heure à 37 C. Exemple 4 : Conception de l'amorce ScFv Des amorces dégénérées pour la chaîne légère et la chaîne lourde (Novagen, 25 Madison, WI) ont été utilisées pour la PCR. La synthèse par PCR a été mise en oeuvre dans 100 l de volumes de réaction dans des tubes de microcentrifugation de 0,5 ml en utilisant un Robocycler (Stratagene, La Jolla, CA). Toutes les synthèses par PCR comprenaient 2 l d'amorces sens et antisens (20 pmoles/ l), 1 gl d'ADNc premier brin en tant que matrice, 2 l de 10 mM de dNTP, 1 pl de Vent polymérase 30 (2 unités/ l), 10 gl de 10 x tampon de PCR (100 mM de Tris-HCI, pH 8,8 à 25 C, 500 mM de KC1, 15 mM de MgCl2, 1 % de Triton X-100), 82 .il de H2O. Le triton X-100 est le t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol. Tous les profils de PCR consistaient en 1 minute de dénaturation à 94 C, 1 minute d'hybridation à 55 C et 1 minute 2905381 16 d'extension à 72 (. Cette séquence a été répétée 30 fois avec une extension de 6 minutes à 72 C lors du cycle final. Les produits de PCR ont été purifiés avec le kit d'extraction sur gel QIAEX II de Qiagen, Valencia, CA. Les produits d'amplification par PCR pour les séquences codantes de chaîne lourde et légère ont été analysés par 5 électrophorèse sur gel d'agarose et étaient d'environ 340 paires de bases (bp) de long et 325 bp de long, respectivement. L'ARN ou L'ADN total a été analysé par électrophorèse sur gel d'agarose (gels d'agarose à 1%). L'agarose (0,5 g dans 50 ml de tampon TAE, 40 mM de Tris-acétate, 1 mM d'EDTA) a été chauffé pendant 2 minutes dans un micro-onde afin de 10 faire fondre l'agarose et de le disperser de manière régulière. La solution a été refroidie à la température ambiante et du bromure d'éthidium (0,5 g/ml) a été ajouté et versé dans l'appareil. Chaque échantillon a été mélangé avec 6 x tampon de chargement sur gel (0,25 % de bleu de bromophénol, 0,25 % de xylène cyanol FF, 40 % (m/v) de saccharose dans de l'eau). Un tampon de TAE a été utilisé en tant que 15 tampon de migration. Une tension (10 v.cm) a été appliquée pendant 60-90 minutes. Exemple 5 : Amplification par PCR Selon la taille propre des ADNc de chaîne lourde et légère, les bandes ont été excisées à partir des gels sous éclairage UV et les gels excisés ont été placés dans des 20 seringues de 1 ml pourvues d'aiguilles de calibre 18. Les gels ont été écrasés dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Le cylindre de chaque seringue a été lavé avec 200 l de phénol saturé de tampon (pH 7,9 + 0,2). Le mélange a été centrifugé soigneusement et congelé à -70 C pendant 10 minutes. Le mélange a été centrifugé pendant 5 minutes et la phase aqueuse supérieure a été transférée dans un nouveau tube. La 25 phase aqueuse a été extraite de nouveau avec du phénol/chloroforme (1 : 1). Après une centrifugation pendant 5 minutes, la phase aqueuse supérieure a été transférée dans un tube propre et une extraction du chloroforme a été pratiquée. De l'acétate de sodium (10 volumes de 3 M) et 2,5 volumes d'éthanol glacé ont été ajoutés à la phase aqueuse supérieure afin de précipiter l'ADN à -20 C pendant la nuit. 30 Les ADNc de chaîne lourde et légère purifiés ont été ligaturés dans le vecteur plasmidique pSTBlue-1 et transfectés dans les cellules NovaBlue compétentes (Stratagene). Les colonies contenant les ADN de chaîne lourde et légère ont été criblées par sélection des colonies bleues et blanches et confirmées par analyse de 2905381 17 PCR. Les ADN de chaîne lourde et légère ont été isolés et séquencés en utilisant des techniques standard!. Les figures lA et 1B montrent les séquences d'ADN des ADN de chaîne lourde et légère de ScFv. L'amplification par PCR et l'assemblage du gène ScFv simple ont été mis en 5 oeuvre selon Davis et al. (1991) Bio/Technology 9 : 165-169 (figure 2). Le plasmide pSTBlue-1 portant les gènes VH et VL a été combiné avec les quatre amorces d'oligonucléotides dans une seule synthèse par PCR (figure 3). Après la première synthèse par PCR, un dixième du premier produit par PCR a été éliminé et ajouté à un deuxième mélange de réaction par PCR contenant uniquement l'amorce a (amorce 10 sens VH) et l'amorce d (amorce antisens VL). Le produit de la deuxième synthèse par PCR a donné le gène ScFv simple. Le gène ScFv simple a été ligaturé au plasmide pT-Adv (Clontech, Palo Alto, CA). Le pT-Adv portant le gène ScFv a été utilisé pour le séquençage de l'ADN. 15 Exemple 6 : Conception du lieur Le gène ScFv total a été assemblé à partir des gènes VH, VL et du lieur afin de donner un gène ScFv unique par PCR (figure 4). La séquence d'ADN codant pour le lieur était de 45 nucléotides de longueur (GGAGGCGGTGGATCGGGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCT ; SEQ 20 ID NO: 6), ce qui se traduit en un peptide de 15 acides aminés (GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer ; SEQ ID NO : 5). Les amorces pour l'amplification par PCR sont représentées dans le Tableau 3. Le peptide S a été lié à l'extrémité C-terminale de ScFv[ScFv(S)]. Le peptide S se lie à la protéine S conjuguée à la phosphatase alcaline pour l'analyse par transfert de 25 western. La séquence d'ADN du peptide S est AAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGC (SEQ ID NO: 7), ce qui se traduit en peptide S (LysGluThrAlaAlaAlaLysPheGluArgGlnHisMetAspSer ; SEQ ID NO : 8). 30 Exemple 7 : Expression de ScFv recombinant Le ScFv(S) recombinant a été exprimé dans E. coli. Tout d'abord, les oligonucléotides codant pour le peptide S ont été liés à l'extrémité 3' du cadre ouvert de lecture (COL) de l'ADN de ScFv par amplification par PCR. L'incorporation du 2905381 18 peptide S permet de détecter la protéine ScFv exprimée par la protéine S conjuguée à la phosphatase alcaline. La séquence codant pour ScFv(S) spécifique de la tNOX a ensuite été sous-clonée dans le plasmide pET-11 a, un plasmide conçu pour l'expression de la protéine dans E. coli (Stratagene, CA). Pour l'amplification par 5 PCR, deux amorces ont été conçues afin d'amplifier le COL de ScFv(S) contenant les sites de restriction d'endonucléase (Ndel et Nhel) et les résidus du peptide S. Le plasmide pET-1 la et le COL de ScFv(S) ont été digérés avec les enzymes de restriction Ndel et Nhel et ligaturés afin de produire le plasmide pET11-ScFv(S). E. coli BL21 (DE3) a été transformé avec pET! l-ScFv(S) et cultivé à 37 C pendant 10 12 heures dans un milieu LB contenant de l'ampicilline (100 g/ml). ScFv a été exprimé par l'addition de 0,5 mM d'IPTG et une incubation pendant 4 heures. Les cellules ont été recueillies et lysées en utilisant une French Pressure Cell (French Pressure Cell Press, SLM Instruments, Inc.) (trois passages à 20000 psi). Les extraits de cellules ont été centrifugés à 10000 x g pendant 20 minutes. Les culots contenant 15 les corps d'inclusion dénaturés de ScFv ont été recueillis. La renaturation des corps d'inclusion contenant le ScFv a été pratiquée selon Goldberg et al. 1995. Folding & Design 1 : 21-27. Tableau 1 : Amorces pour l'amplification par PCR du gène ScFv(s) 20 1. Amorces pour le clonage de régions variables de chaîne lourde et de chaîne légère d'anticorps. (A) Amorces pour chaîne lourde (VH) Amorce sens : 5'-GGCCCAGCCGGCCGAGGTCAAGCTGCAGGAGTCAGGA-3' 25 Amorce antisens : 5'-CTCGGAACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC- 3' (B) Amorces pour chaîne légère (VL) Amorce sens : 5' -TCCAAAGTCGACGAAAATGTGCTCACCCAGTCTCCA- 3' Amorce antisens : 5' -AGCGGCCGCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCCCC- 3' 30 2. Amorces pour le sous-clonage du gène ScFv(s) dans le vecteur d'expression pET-1 l.a (A) Amorces pour l'amplification de chaîne lourde (VH) et de lieur Amorce sens : 5' -GTCAAGCTGCAGGAGTCAGGA- 3' 2905381 19 Amorce antisens : 5' -AGAGCCGCCGCCACCCGAGCCGCCACCGCCCGATCC ACCGCCTCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT- 3' (B) Amorces pour l'amplification de chaîne légère (VL), de lieur et d'étiquette S 5 Amorce sens : 5' ùGGAGGCGGTGGATCGGGCGGTGGCGGCTCGGGTGGC GGCGGCTCTGAAAATGTGCTCACCCAGTCT- 3' Amorce antisens : 5' -AGTCAGGCTAGCTTAGCTGTCCATGTGCTGGCGTTCG AATTTAGCAGCAGCGGTTTCTTTCGCTTTCAGCTCCAGCTT-3' 10 2905381 20 BIBLIOGRAPHIE 1. Morré, D.J. (1998) in Plasma Membrane Redox Systems and Their Role in Biological Stress and Disease (Asard, H., Bérczi, A. et Caubergs, R.J., Ed.) 5 pp. 121-156, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Pays-Bas. 2. Morré, D.J. et Morré, D.M. (2003) Free Radical Res. 37 : 795-808 3. Morré, D.J., Chueh, P.-J. et Morré, D.M. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :1831-1835. 4. Bruno, M., Brightman, A.O., Lawrence, J., Werderitsh, D., Morré, 10 D.M. et Morré, D.J. (1992) Biochem. J. 284 : 625-628. 5. Cho, N., Chueh, P.-J., Kim, C., Caldwell, S., Morré, D.M. et Morré, D.J. (2002) Cancer Immunol. Immunother. 51 : 121-129. 6. Morré, D.J., Caldwell, S., Mayorga, A., Wu, L-Y. et Morré, D.M. (1997) Arch. Biochem. Biophys. 342 : 224-230. 15 7. Morré, D.J. et Reust, T. (1997) J. Bioenerg. Biomemb. 29, 281-289. 8. Morré, D.J. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1240 : 201-208. 9. del Castillo-Olivares, A., Chueh, P.-J., Wang, S., Sweeting, M., Yantiri, F., Sedlak, D., Morré, D.J. et Morré, D.M. (1998) Arch. Biochem. Biophys. 358 : 125-140. 20 10. Morré, D.J., Sedlak, D., Tang, X., Chueh, P.J., Geng, T. et Morré, D.M. (2001) Arch. Biochem. Biophys. 392 : 251-256. 11. Chueh, P.J., Kim, C., Cho, N., Morré, D.M. et Morré, D.J. (2002) Biochemistry 41 : 3732-3741. 12. Bird, C. (1999) Soumission directe de la séquence d'ADN humain du 25 clone 875H3 (partie de l'antigène APK1) à la banque de données GenBank au NCBI. (No. d'accès AL049733). REVENDICATIONS 1. Molécule d'acide nucléique comprenant une séquence codante pour un anticorps monocaténaire qui réagit spécifiquement avec des protéines ECTO-NOX, ladite séquence codante comprenant la séquence codante de chaîne légère variable et la séquence codante de chaîne lourde variable de l'anticorps monoclonal spécifique de la tNOX exprimé par une lignée de cellules d'hybridome déposée auprès de la American Type Culture Collection sous le No. d'accès PTA-4206, et une séquence codante pour le lieur de la séquence d'acides aminés GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO : 5) lié de manière covalente en phase entre ladite séquence codante de chaîne lourde variable et ladite séquence codante de chaîne légère. 2. Molécule d'acide nucléique selon la revendication 1, comprenant en outre une séquence codant pour une étiquette de protéine. 3. Molécule d'acide nucléique selon la revendication 2, dans laquelle ladite étiquette de protéine est une étiquette S ou. une étiquette de protéine polyhistidine, une étiquette calmoduline, une étiquette de protéine de liaison de maltose, une étiquette de protéine Nus, une étiquette de protéine Myc, une étiquette d'antigène flagellaire, une étiquette streptavidine ou une étiquette glutathione S-transférase 4. Molécule d'acide nucléique selon la revendication 3 codant pour un anticorps monocaténaire qui réagit spécifiquement avec des protéines ECTO-NOX, dans laquelle ledit anticorps monocaténaire comprend la séquence d'acides aminés exposée dans le SEQ ID NO : 4. 5. Molécule d'acide nucléique selon la revendication 4, dans laquelle la séquence codante pour ledit anticorps monocaténaire est telle qu'exposée dans le SEQ ID NO : 3. 6. Molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans 30 laquelle la séquence codante est liée de manière opérationnelle aux séquences de 2905381 22 contrôle de la transcription et dans laquelle ladite molécule comprend en plus des séquences de vecteur. 7. Cellule hôte comprenant la molécule d'acide nucléique selon la revendication 6. 8. Procédé d'expression recombinante d'un anticorps monocaténaire qui réagit spécifiquement avec des protéines ECTO-NOX, comprenant l'étape de culture de la cellule hôte selon la revendication 7. 10 9. Procédé selon la revendication 8 comprenant en outre l'étape de récupération de l'anticorps monocaténaire exprimé. 10. Procédé de jonction d'une région variable de chaîne légère d'anticorps et d'une région variable de chaîne lourde d'anticorps, ledit procédé comprenant l'étape 15 d'insertion d'une séquence codante pour un lieur peptidique constituée de la séquence d'acides aminés GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO : 5) en phase entre une séquence codante pour une région variable de chaîne légère d'anticorps et une séquence codante pour une région variable de chaîne lourde d'anticorps. 5