FR 2906243 A1 20080328 FR 0608345 A 20060922 1 NOUVELLE CLASSE DE COMPOSES DERIVES DE TERPENE A ACTIVITE ANTIBIOTIQUE, COMPOSITIONS LES CONTENANT ET UTILISATIONS La présente demande concerne une nouvelle classe de 5 composés dérivés de terpène, possédant une activité antibiotique, de formules (I) ou (II) (I) (Il) dans laquelle A est choisi parmi NR1, O, S, CR2R3 ou R-(CH2),-,-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, et RI, R2 et R3 sont des substituants, et n est supérieur ou égal à 1, en 10 particulier égal à 2. Les progrès apportés par les antibiotiques dans le domaine médical sont aujourd'hui remis en question par l'apparition et la propagation de germes résistants à ces antibiotiques. Ainsi, en France, un des pays où 15 l'on consomme le plus d'antibiotiques, on observe de nombreuses bactéries résistantes aux antibiotiques. La relation de cause à effet entre ces deux phénomènes semble claire, même si elle n'est pas rigoureusement démontrée. Parmi les exemples les plus importants, on retrouve les Staphylocoques qui sont parmi les bactéries les plus résistantes (comme 20 par exemple le staphylocoque doré résistant à la méthicilline) ainsi que le Streptococcus pneumoniae résistant à la pénicilline, les entérocoques résistants à la vancomycine, les salmonelles polypharmacorésistantes et la tuberculose à bacilles multirésistants. De plus, à l'heure actuelle, relativement peu de biomatériaux 25 sont protégés par des antimicrobiens. Les cathéters imprégnés 0 ou 2906243 2 d'antimicrobiens sont les dispositifs médicaux pour lesquels on dispose du plus de données. On retrouve essentiellement deux combinaisons de molécules: la chlorhexidine et la sulfadiazine d'argent ou la minocycline et la rifampicine. L'efficacité in vivo des premiers est controversée et serait limitée dans te temps ( TFA en 30 mn avec un flux de 10 ml/mn. Après lyophilisation, 30 mg de margaucine ont été obtenus à partir de 10L de culture. 25 Détemination de la structure La formule moléculaire a été déterminée par une combinaison de techniques spectroscopiques: RMN à une et deux dimension(s) et spectrométrie de masse. Les analyses 13C, DEPT, 1H, COSY, HMQC et HMBC qui ont 30 été réalisées en milieu CD3OD avec un Bruker Avance DPX-300 équipé 2906243 20 d'une sonde directe QNP 5mm fonctionnant à 300 MHz pour 1H et à 75 MHz pour 13C sont présentées dans le Tableau 1. Propriétés bioloqiques 5 a. Détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI), et test sur des bactéries multirésistantes Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) ont été évaluées sur des souches de référence, par microdilution dans le milieu 10 Mueller Hinton Broth (MHB) selon les normes CLSI/NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards. (2003). Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow AerobicallyùSixth Edition: Approved Standard M07-A6. NCCLS, Villanova, PA, USA). La CMI a été déterminée comme étant la plus petite 15 concentration de margaucine qui inhibe toute culture visible d'une souche bactérienne, après 18 heures de culture à 37 C. L'activité antimicrobienne de la margaucine est présentée dans les Tableaux 2 et 3. 20 b. Evaluation de la toxicité in vitro de la margaucine La toxicité de la margaucine in vitro a été déterminée sur une lignée cellulaire du cancer du sein (MCF7) ; brièvement, une boite de culture 96 puits est ensemencée avec des cellules MCF7 (ATCC HTB-22T^^ environ 10000 cellules/puit), dans un milieu RPMI contenant 10% de 25 sérum de veau foetal (t=0). A t+1 (en jours, par rapport à l'ensemencement), la molécule à tester est ajoutée. A t+2, la cytotoxicité est mesurée par incorporation de MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), selon Heeg K et al. (J Immunol Methods. 1985 Mar 18;77(2):237-46.). Les résultats de la cytotoxicité sont présentés 30 dans le tableau 4. 2906243 21 c. Evaluation de la toxicité in vivo de la margaucine Trois (3) souris femelles OF1 de 25g (Charles River) ont reçu, par Injection intra péritonéale 200pI d'une solution de margaucine à 12,5 mg/ml dans 10% de méthanol et 90% d'H2O (soit une dose de 100mg/kg). 5 Le contrôle de la survie des souris à été réalisé à T24, T48, T72 et T96 (temps en heures) d. Détermination de l'efficacité de la margaucine in vivo sur une infection bactérienne 10 La molécule a été testée sur un modèle de septicémie à Staphylococcus aureus, après infection de souris OF1 par injection intraperitonéale de bactéries. Sur un total de 11 souris femelles OF1, 25g (charles River), à T0, 3 souris ont reçu une injection intra péritonéale de 200pl de LB + 5% de 15 mucine (contrôle des conditions d'élevage), et 8 souris ont reçu une injection intrapéritonéale de 200pl d'une suspension bactérienne de Staphylococcus aureus Smith (108 CFU/ml) dans du milieu LB + 5% mucine (souris infectées). Les 8 souris infectées ont été divisées en deux lots : à 20 t+3heures, 5 souris ont reçu une solution de margaucine à 12,5 mg/ml dans 10% de méthanol et 90% d'H2O (soit une dose de 100mg/kg), tandis que les 3 autres souris n'ont pas reçu de margaucine (contrôle de l'infection). La survie des souris a été contrôlée à 24 et 48 heures. 25 B. RESULTATS Structure Les analyses structurales ont permis de démontrer que la formule brute de la margaucine est C12H18O3. 30 L'analyse ESI-MS a permis de déterminer que la masse moléculaire de la margaucine est de 210 Da. 2906243 22 La RMN du 93C montre 5 signaux (40.4, 71.6, 95.6, 105.0 et 170.2) et la RMN du1H montre deux groupements de signaux (Tableau 1) : - un premier groupe avec 3 signaux 1H (à 2.66, 3.63 et 5.81 ppm) correspondant à des protons liés à des carbones avec une 5 résonance visible sur le spectre 13C, tous ces signaux sont des singulets, et - un second groupe avec 2 signaux 1H avec un shift chimique presque identique au premier groupe, liés à des carbones avec une résonance non visible sur le spectre du 13C. Ils correspondent à une 10 forme alcool de la margaucine. Un groupement méthylène non protégé a 3.63 ppm peut être attribué à la présence en position a d'un atome d'oxygène et d'un groupement carbonyle. Le spectre COSY ne montre aucune corrélation alors que les 15 protons sont en position ci d'un carbone quaternaire ou d'un hétéroatome. La présence de deux carbones quaternaires (170.2 et 105 ppm), un methine (95.6 ppm), un méthylène (71.6 ppm) et deux groupements méthyl équivalents (40.4 ppm) a été déduite du spectre DEPT (Tableau 1). 20 L'attribution des protons liés à ces carbones par une liaison 13C-1H est obtenue grâce au spectre HMQC. La structure de la margaucine est confirmée par le spectre HMBC et ses interactions scalaires longues distances avec des pics liés C1/H3, C2/H3 et C2/H5 (Tableau 1). La combinaison des données de RMN et des informations de 25 masse suggère une molécule symétrique. Les expériences de MS/MS réalisées sur l'ion moléculaire à m/z 211 permettent l'obtention d'un ensemble de fragments en parfaite adéquation avec la structure proposée figurel. (ions obtenus : 193, 175, 169, 165, 153, 151, 147, 141, 133, 129, 123, 119, 111, 109, 105, 95, 93, 91, 85, 83, 81, 79, 71, 69, 67, 65, 57, 55, 30 43). Le spectre d'absorption UV montre deux maximum - Àmax: 269 et 330. 2906243 23 Carbone n S13C/ppm DEPT/HMQC 5 1H/ppm 1* HMBC 1 170,2 C C1/H3 2 105,0 C C2/H3; 3 95,6 CH 5,81 S 5,79 4 71,6 CH2 3,63 S C4/H4 3,62 5 40,4 CH3 2,66 S C5/H5 6 33 CH3 2,63 S Tableau 1 : Données 1H et 13C NMR, DEPT, HMQC et HMBC de la margaucine dans CD3OD La structure de la margaucine est divulguée à la Figure 1, et 5 est dénommée 1,1'-Oxybis [4-méthylpent-3-en-2-on]. Concentrations minimales inhibitrices (CMI) Les CMI de la margaucine vis à vis de différentes bactéries 10 gram-positives ou gram négatives, ainsi que de levures ont été déterminées et reprises dans le Tableau 2. Ainsi, la margaucine est active uniquement contre les bactéries gram positives, mais ne présente pas d'activité antibiotique vis-à-vis des bactéries gram négatives ni d'activité antifongique vis-à-vis de 15 Candida albicans (levure). De façon tout à fait intéressante, la présente expérience démontre également que la souche E. coli toIC (bactérie gram négative) est sensible à la margaucine. Cette souche toIC est déficiente au niveau d'un système de pompes à efflux, ce qui permet de faire l'hypothèse que la cause de l'inactivité de la margaucine vis-à-vis des bactéries gram 20 négatives est liée au problème de la pénétration de la paroi bactérienne (composée de plusieurs couches dont une lipidique chez les bactéries gram-négatives alors qu'elle est composée d'une seule couche épaisse de 2906243 24 muréine ou peptidoglycane chez les bactéries gram-positives). De plus, le Tableau 2 montre que la molécule est efficace contre des bactéries à Gram+, à des concentrations aussi faibles que 3,125 pg/ml. ORGANISME GRAM CMI (pg/ml) Bactérie 3,125 Staphylococcus aureus CIP 76.25 + Staphylococcus epidermidis CIP 68.21 + 3,125 Staphylococcus aureus H1 + 3,125 Staphylococcus aureus H3 + 3,125 Staphylococcus aureus H4 + 1,563 Staphylococcus aureus H7 + 3,125 Staphylococcus aureus H9 + 3,125 Staphylococcus aureus H16 + 3,125 Staphylococcus aureus H18 + 3,125 Enterococcus faecalis H + 3,125 Bacillus anthracis + 3,125 Bacillus subtilis ATCC 27370 + 6,25 Escherichia coli CIP 76.24 - > 100 Escherichia coli ToIC - 3,125 Salmonella typhi - > 100 Serratia marcescens - > 100 Pseudomonas aeruginosa CIP 76.110 > 100 Levure > 100 Candida albicans n.a. 5 Tableau 2. Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) de la margaucine vis-à-vis de différentes souches bactériennes gram positives (+) ou gram négatives (-) et de Candida albicans. (n.a : non-applicable ; CIP : Collection Institut Pasteur ; ATCC : American Type Culture Collection). 10 Enfin, il a été démontré que la margaucine était également active contre des souches gram positives multirésistantes, telles que différentes souches de Staphylococcus aureus (H1, H3, H4, H7, H9, H16 et H18) (Tableau 3). 2906243 25 Staphylococcus aureus H1 H3 H4 H7 H9 H16 H18 Pénicilline G R R R R R R R Amoxicilline R R R R R R R Piperacilline R R R R R R R Oxacilline S S R S S R R Cefazoline S S R S S R R Tobramycine S S R S S R R Amikacine S S R S S R R Gentamicien S S S S S R S Tetracycline S S S - - R Doxycycline S S S S S L S Erythromycine S R S R R R R Clindamycine S R S R S R R Pristinamycine S S S S S L S Co-trimoxazole S S S S S S S Pefloxacine - - R R S R Ofloxacine S R R R S R R Norfloxacine S R R R S R R Ciprofloxacine - R R S R Rifampicine S S S S S R S Acide fusidique S S S S R S S Fosfomycin S S S S S R R Vancomycine S S S S S S R Teicoplanine S S S S S L R Margaucine* 3,125 3,125 3,125 1,563 3,125 3,125 3,125 Tableau 3: Susceptibilité de différentes souches de Staphylococcus aureus à divers antibiotiques dont la margaucine. (R : souche résistante à l'antibiotique concerné ; S : souche sensible à l'antibiotique concernée ; L : souche dont la résistance est intermédiaire à 5 l'antibiotique concerné ; - : non testé ; * : CMI déterminée selon la méthode décrite ci-dessus). Il n'a été observé aucune résistance croisée avec des antibiotiques commerciaux ; de plus, aucune souche résistante spontanée 10 n'a été isolée, même après mutagenèse aléatoire. 2906243 26 Toxicité in vitro et in vivo Avant d'envisager l'utilisation de la margaucine in vivo pour lutter contres les bactéries gram positives, des tests de toxicité aussi bien in vitro (culture cellulaire) qu'in vivo (animal) ont été réalisés. 5 Dans un premier temps et comme démontré au tableau 4 aucune cytotoxicité n'a été mesurée sur une culture cellulaire de cellules MCF7 traitée avec la margaucine à une concentration variant de 1 jusqu'à 100 mg/ml. En effet, le nombre de cellules dans une culture traitée par la margaucine est identique à celui d'une culture contrôle (n'ayant pas reçu 10 d'antibiotique). OD ^ Contrôle (sans margaucine) 1,4 0,1 Margaucine 1 mg/ml 1,3 0,2 Margaucine 10 mg/ml 1,2 0,2 Margaucine 100 mg/ml 1,3 0,1 Tableau 4: Cytotoxicité de la margaucine sur une culture de cellules MCF7. De plus, l'injection de margaucine à une dose de 100 mg/kg d'animal n'a entraîné aucune toxicité sur les 3 souris, qui étaient vivantes à 15 96 heures. Ces résultats confirment donc l'innocuité de la margaucine in vivo. Par conséquent, la margaucine n'est pas toxique sur des cellules eucaryotes, aussi bien in vitro qu'in vivo, à des concentrations 20 aussi élevées que 100 mg/kg. Efficacité in vivo L'efficacité de la margaucine a enfin été évaluée in vivo sur un modèle murin de septicémie à Staphylococcus aureus. Les résultats 25 sont repris dans le tableau 5. 2906243 27 Souris Nombre Survie Souris ayant reçu de infectées de la souris à24h à48h margaucine 3 3 souris vivantes 3 souris vivantes + - 3 3 souris mortes / + + 5 3 souris vivantes 3 souris vivantes 2 mortes 2 mortes Tableau 5 : Survie des souris à 24 et 48 heures post-infection (- : non ; + : oui). Ces résultats démontrent que l'infection par Staphylococcus 5 aureus est fatale chez 100% des souris n'ayant pas reçu d'antibiotique. En revanche, 3 des 5 souris ayant reçu 100 mg/kg de margaucine ont survécu à l'infection. Par conséquent, ces résultats confirment, d'une part les tests de CMI réalisés in vitro, et d'autre part que la margaucine a une activité 10 antibiotique in vivo contre des bactéries gram positives, telles que Staphylococcus. Conclusion Un nouveau composé possédant une activité antibiotique, la 15 margaucine, produit par une souche bactérienne a été identifié. Ce composé est caractérisé d'un point de vue structural et est de faible poids moléculaire. De plus, la margaucine est à large spectre Gram positive, est non toxique, efficace sur des modèles d'infection animaux et ne croise avec aucune résistance connue. D'autres composés de structure analogue, et 20 présentant une activité antibiotique, sont également proposés dans la présente demande, pour illustrer l'intérêt de cette classe de composés à des fins d'application antibiotique. REVENDICATIONS : 1. Composé de formule (I) ou (II) ou (I) (II) dans laquelle A est choisi parmi NH, S, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2. 2. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) ou (Il) selon ou (I) (II) dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, 10 comprenant : a. mettre en culture une souche bactérienne, et b. purifier le composé de formule (I) ou (II) à partir du surnageant de culture. 15 3. Procédé de préparation selon la revendication 2, dans lequel la souche bactérienne est la souche JPL84 déposée le 15 septembre 2006, auprès de la C.N.C.M., sous le numéro CNCM 1-3669. 2906243 29 4. Procédé de préparation selon la revendication 2 ou 3, dans lequel le composé produit à la formule suivante : YY ou 5. Composé de formule (I) ou (II) ou 0 (I) 5 dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, obtenu par un procédé comprenant : a. mettre en culture une souche bactérienne, et b. purifier le composé de formule (I) ou (II) à partir du surnageant de culture. 6. Composé selon la revendication 5, dans lequel la souche bactérienne est la souche JPL84 déposée le 15 septembre 2006, auprès de la C.N.C.M., sous le numéro CNCM 1-3669. 2906243 30 7. Composé selon la revendication 5 ou 6, qui possède la formule suivante : 1rY ou 10 8. Composé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le carbone en 5 position 1 est un CH2, le carbone en position 3 est un CH et le carbone en position terminale est un CH3. 9. Composé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, qui possède un rapport C12/C13 différent du même composé produit chimiquement. 10. Composition comprenant a) un composé de formule (I) ou (II) ou un mélange de ces composés Y1~ ou (I) (II) dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2 ; et 15 b) au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 2906243 31 11. Composition comprenant : a) un composé de formule (I) ou (Il) ou un mélange de ces composés (I) (II) dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2 ; et 5 b) au moins une deuxième molécule active contre des microorganismes, et de façon optionnelle un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que la au 10 moins deuxième molécule active contre des microorganismes est un antibiotique. 13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé de formule (I) et un composé de formule (II), dans 15 laquelle A est identique dans les deux composés et est choisi parmi NH, S, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2. 14. Composé de formule (I) ou (II) ou ou 2906243 32 dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, pour l'utilisation comme médicament. 5 15. Composé tel que défini dans la revendication 14, pour l'utilisation comme antibiotique ou bactéricide. 16. Composé tel que défini dans la revendication 14, pour l'utilisation dans le traitement ou la prophylaxie des infections bactériennes, de préférence 10 des infections à bactéries gram positives. 17. Composition choisie parmi une composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13 ou une composition comprenant un composé de formule (I) ou (II) selon (I) (II) 15 dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, pour l'utilisation comme médicament. 18. Composition telle que définie dans la revendication 17, pour l'utilisation 20 comme antibiotique ou bactéricide. 19. Composition telle que définie dans la revendication 17, pour l'utilisation dans le traitement ou la prophylaxie des infections bactériennes, de préférence des infections à bactéries gram positives. ou 2906243 33 20. Utilisation d'un composé de formule (I) ou (Il) tel que défini dans la revendication 14 pour la fabrication d'une composition utile dans la lutte contre les infections bactériennes. 5 21. Utilisation d'un composé de formule (I) ou (II) tel que défini dans la revendication 14, pour l'imprégnation de dispositifs biomédicaux. 22. Utilisation d'une composition choisie parmi une composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13 ou une composition comprenant un 10 composé de formule (I) ou (Il) selon (I) (II) dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, pour l'imprégnation de dispositifs biomédicaux. 15 23. Dispositif biomédical imprégné d'un composé de formule (I) ou (II) : (I) (II) dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2. ou ou 2906243 34 24. Dispositif biomédical imprégné d'une composition choisie parmi une composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13 ou une composition comprenant un composé de formule (I) ou (II) selon : (I) (II). dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel 5 R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2. 25. Dispositif selon la revendication 23 ou 24 qui est un cathéter, un pansement, un ciment osseux, un shunt cérébral ou une valve cardiaque. 10 26. Souche bactérienne susceptible de produire un composé de formule (I) ou (II) : y ou (I) (II) dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2. 15 27. Souche bactérienne selon la revendication 26 qui est la souche JPL84, déposée le 15 septembre 2006, auprès de la C.N.C.M., sous le numéro CNCM I-3669. ou 2906243 35 28. Souche dérivée d'une souche bactérienne selon la revendication 26 ou 27, caractérisée en ce qu'elle conserve la capacité de produire un composé de formule (I) ou (Il). 5 29. Souche selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle conserve la capacité de produire un composé de formule ou (III) (IV) dans laquelle A est choisi parmi NH, S, O, CH2 ou R-(CH2)2-R' dans lequel R et R' sont, indépendamment l'un de l'autre, NH, O, S ou CH2, et le carbone en position 1 est un CH2, le carbone en position 3 est un CH, le 10 carbone en position terminale est un CH3. 30. Procédé de modulation du profil bactérien d'un échantillon biologique ou d'une surface, comprenant la mise en contact de cet échantillon ou de cette surface avec au moins un composé selon la formule (I) ou (Il) tel que 15 défini dans la revendication 14, d'une composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13 ou d'une composition comprenant les composés de formule (I) ou (II). ïY