FR 2898131 A1 20070907 FR 0601838 A 20060301 -1- SYSTEME DE PRODUCTION DE MOLECULES AROMATIQUES PAR BIOCONVERSION La présente invention concerne la production de molécules aromatiques naturelles. Plus particulièrement, l'invention concerne un nouveau système d'expression chez la levure utilisant une cassette d'expression et permettant la production de dérivés phénoliques par bioconversion, lesdits dérivés phénoliques étant utilisables pour la production de molécules aromatiques naturelles employées en aromatique alimentaire ou en parfumerie (arômes ou fragrances). La production de molécules aromatiques naturelles peut être obtenue soit par voie biologique soit par synthèse 15 chimique. Par exemple, la vanilline peut être obtenue par l'une ou l'autre de ces deux voies. La vanilline (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) est le composant principal responsable des propriétés olfactives et gustatives de l'extrait de vanille dérivé de gousses de 20 Vanillia planifolia. Il s'agit de l'une des molécules aromatiques les plus utilisées dans l'industrie. Cependant, la production de vanilline naturelle à partir de gousse de vanille ou d'extrait de vanille ne couvre que 20% de ce marché ; son utilisation est limitée en raison d'une part du 25 potentiel de gousses disponibles au niveau mondial et d'autre part en raison du prix élevé, très fluctuant, de ces gousses (de l'ordre de 30 {/kg à 450 {/kg soit au minimum 1500 {/kg de potentiel en vanilline naturelle). 30 La vanilline de synthèse est donc fréquemment utilisée comme un substituant bon marché (environ 15 {/kg) de la vanilline naturelle. Cependant, si la vanilline de 2898131 -2- synthèse convient à des applications en parfumerie et en cosmétique, elle peut soulever des difficultés d'ordre réglementaire dans les industries agro-alimentaires. De plus, les arômes de synthèse sont généralement moins appréciés par 5 les consommateurs que les arômes naturels. C'est pourquoi l'on cherche à obtenir des molécules aromatiques naturelles, en particulier la vanilline, par des procédés biologiques, notamment de bioconversion, qui mettent 10 en oeuvre des microorganismes (bactéries, levures, moisissures), des cellules végétales ou leurs systèmes enzymatiques. Au sens de la présente invention, on entend par bioconversion la transformation biologique d'un substrat, de préférence issu d'une source naturelle, pour obtenir des arômes, des fragrances ou des précurseurs d'arômes ou de fragrances naturels. La vanilline peut être produite suivant le schéma réactionnel suivant : OMe OMe û> OH - OMe ù> OH OH OH eugénol alcool coniférylique acide férulique vanilline Chacune des molécules citées peut permettre l'accès à 25 la vanilline pour peu qu'elles soient disponibles, sachant que les plus importantes sont l'acide férulique et l'eugénol. 2898131 -3- Par exemple, les demandes EP 453 368, PCT WO/96/08576 et PCT WO/00/61721 décrivent des procédés permettant la production de vanilline naturelle par bioconversion à partir d'acide férulique en présence de champignons filamenteux. 5 L'acide férulique utilisé dans ces procédés provient de l'extraction de co-produits agricoles contenant des esters d'acide férulique maïs, riz, betterave ou blé. Mais la faible concentration en acide férulique de ces co-produits et les multiples étapes nécessaires à son extraction-purification 10 font que le rendement d'extraction à partir de ces esters reste assez faible ; ce qui induit un prix élevé pour cette matière première et donc un prix de revient élevé pour la vanilline qui en dérive. Pour qu'un procédé biologique employant des 15 microorganismes puisse être rentable, il est donc préférable d'utiliser un substrat plus disponible et bon marché. C'est le cas de l'eugénol qui peut être source d'alcool coniférylique ou d'acide férulique. L'article publié par J. Overhage et al. décrit que 20 l'expression du gène de la vanillyl alcool oxydase issu de Penicillium simplicissimum dans Escherichia coli permet de catalyser la conversion de l'eugénol en alcool coniférylique. Pour convertir l'alcool coniférylique en acide férulique, J. Overhage et al expriment ensuite deux autres enzymes issues de Penicillium simplicissimum dans Escherichia coli : la coniféryl alcool déshydrogénase et la coniféryl aldéhyde déshydrogénase (Highly efficient biotransformation of eugenol to ferulic acid and further conversion to vanillin in recombinant strains of Escherichia coli, 2003, Applied and Environmental microbiology p 6569-6576). Si ce procédé utilise bien un substrat disponible et peu coûteux, l'eugénol, ce système de production d'acide férulique dans E. coli reste 2898131 -4- cependant difficile à mettre en oeuvre du fait du triple clonage nécessaire pour convertir de l'eugénol en acide férulique. 5 La présente invention a donc pour objet un procédé de production de précurseurs de vanilline naturelle ou de vanilline naturelle elle-même, à un coût de production moindre que celui de l'art antérieur, et avec un procédé simple à mettre en oeuvre industriellement. 10 Les solutions proposées par l'invention sont d'utiliser ou de produire des substrats naturels disponibles, de faible coût comme l'eugénol et l'acide férulique. Ce dernier qui est le substrat le plus utilisé pour la synthèse de la vanilline, est souvent d'un prix élevé et d'une qualité 15 difficile à contrôler. Un autre objet de l'invention est donc un procédé simple et efficace de production d'acide férulique naturel et/ou d'alcool coniférylique naturel, d'un prix industriellement acceptable. Si l'acide férulique peut être 20 utilisé comme précurseur de la vanilline naturelle, l'alcool coniférylique peut être source d'alcool déhydroconiférylique que l'on rencontre dans des parfums rares comme celui de fleurs de tiaré et peut, par oxydation, être source d'acide férulique. 25 Le moyen essentiel des procédés selon l'invention est une levure comprenant au moins un gène codant la vanillyl alcool oxydase, du type du gène de la vanillyl alcool oxydase (SEQ ID n 1) issu de Penicillium Simplicissi:mum (référence 30 Genbank Y15627), ou toute séquence nucléotidique ayant au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, d'identité avec la séquence de SEQ ID n l. 2898131 -5- Ainsi, un objet de l'invention est de proposer la bioconversion de substrats de faible coût, dans une levure comprenant au moins un gène codant la vanillyl alcool oxydase. La bioconversion d'eugénol par la levure de 5 l'invention permet d'une part la production d'acide férulique et/ou d'alcool coniférylique naturels, sans impureté et de bas prix, et d'autre part la production de vanilline naturelle. Selon un mode de réalisation de l'invention, la 10 levure comprend au moins un système d'expression qui contient le gène codant la vanillyl alcool oxydase. Avantageusement, ledit système d'expression comprend : (1) des moyens visant à l'intégration dudit système dans le génome de ladite cellule, comprenant deux séquences 15 nucléotidiques, (2) des moyens visant à la sélection de ladite cellule ayant intégré ledit système, comprenant un insert de sélection comprenant deux séquences LoxP encadrant un promoteur, un marqueur de sélection du type gène de résistance 20 aux antibiotiques et un terminateur, (3) une cassette d'expression du gène codant la vanillyl alcool oxydase, comprenant un promoteur permettant l'expression dudit gène, au moins un site de clonage permettant l'intégration dudit gène, et un terminateur. 25 On entend par cassette d'expression une séquence nucléotidique comprenant un promoteur, un site d'insertion pour le clonage du gène d'intérêt ou un site multiple de clonage (MCS pour Multiple Cloning Site) et un terminateur. On 30 entend par promoteur une séquence d'ADN nécessaire à l'initiation et au contrôle de la transcription, par site d'insertion pour le clonage ou site multiple de clonage 2898131 -6- une séquence d'ADN contenant un ou plusieurs sites de restriction, et par terminateur une séquence d'ADN nécessaire à la terminaison de la transcription. On entend par vecteur toute séquence d'ADN dans laquelle il est possible 5 d'insérer des fragments d'acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d'introduire de l'ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes 10 artificiels dérivés du bactériophage Pl (PAC), les vecteurs dérivés de virus. On entend par marqueur de sélection un gène dont l'expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Il s'agit par exemple d'un gène de résistance aux antibiotiques. 15 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le site de clonage comprend les sites de restriction d'enzymes de restriction, Notl, BamHI, Mfel, XhoI, permettant l'insertion de la séquence nucléotidique de la vanillyl alcool 20 oxydase dans la cassette d'expression. Avantageusement, ce site de clonage a pour séquence la séquence SEQ ID n 2 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 2. 25 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'encadrement du marqueur de sélection par deux sites LoxP va permettre l'excision de ce marqueur de sélection grâce au système CRE/Lox. L'enzyme CRE est une recombinase qui 30 reconnaît spécifiquement les sites LoxP. La séquence nucléotidique comprise entre ces deux sites est qualifiée d'ADN cible et sera éliminée en présence de l'enzyme CRE. En 2898131 -7- effet, lorsque l'enzyme CRE se lie aux sites LoxP, elle coupe ces sites en deux et recolle ensemble deux moitiés après que l'ADN cible ait été éliminé. Avantageusement, les séquences LoxP ont pour séquence la 5 séquence SEQ ID n 3 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 3. Selon un mode de réalisation préféré de la présente 10 invention, les séquences permettant l'intégration du système d'expression dans le génome de ladite levure sont multiples et sont choisies dans le groupe comprenant les séquences TY, les séquences télomériques X et Y', les séquences DUP, la séquence 8 ou toutes séquences répétées dans le génome de la levure. 15 Avantageusement, lesdites séquences sont les séquences TY1A et TY1B de Saccharomyces cerevisiae, et ont de préférence pour séquence les séquences SEQ ID n 4 et SEQ ID n 5 respectivement ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 20 Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, les promoteurs utilisés dans le système d'expression sont des promoteurs forts, c'est-à-dire des promoteurs qui induisent une forte transcription des gènes 25 sous leur contrôle. Des exemples de promoteurs forts sont 1) des promoteurs gouvernant l'expression de gènes dont les protéines sont abondantes dans la levure comme les promoteurs gouvernant l'expression de protéines de la glycolyse ou du métabolisme de l'azote ; 2) des promoteurs dont l'expression 30 est spécifique, par exemple des promoteurs dont l'activité est régulée par la présence de sucre ou d'azote ; 3) des promoteurs dont l'activité est importante au vu des 2898131 -8-expériences de transcriptome ; ou 4) des promoteurs artificiels conçus pour permettre une forte transcription des gènes qu'ils régulent. Les terminateurs utilisés dans le système d'expression sont choisis pour leur capacité à 5 permettre une bonne stabilité des ARNm. Avantageusement, le terminateur choisi correspond au promoteur fort choisi précédemment. Avantageusement, le promoteur permettant l'expression du gène d'intérêt dans le système d'expression est le promoteur du 10 gène TDH3 de Saccharomyces cerevisiae, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 6 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 6. Avantageusement, le terminateur associé est le terminateur du 15 gène CYC1 de Saccharomyces cerevisiae, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 7 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 7. Avantageusement, le promoteur et le terminateur permettant 20 l'expression du marqueur de sélection sont le promoteur et le terminateur du gène TEF1 de Ashbya gossypii, et ont de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 8 et SEQ ID n 9 respectivement ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 25 Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le marqueur de sélection utilisé dans le système d'expression est un gène de résistance aux antibiotiques choisi dans le groupe comprenant les gènes de résistance à la 30 généticine, nourseothricine, phléomycine, zéocine ou tout autre gène de résistance à un antibiotique dominant pour lequel la levure sauvage est sensible. 2898131 -9Avantageusement, le marqueur de sélection utilisé dans le système d'expression est le gène de résistance à la généticine, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 10 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de 5 préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 10. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le système d'expression contenant le gène de la 10 vanillyl alcool oxydase a pour séquence la séquence nucléotidique de SEQ ID n 11 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 11. 15 La présente invention a également pour objet un vecteur comprenant un système d'expression tel que défini précédemment. Selon un autre mode de réalisation préféré de 20 l'invention, le vecteur comprenant le système d'expression est un plasmide, et avantageusement pUC57. L'invention englobe également des bactéries transformées, comprenant au moins un vecteur tel que défini 25 ci-dessus. Ces bactéries transformées peuvent appartenir à n'importe quelle espèce permettant la réplication du vecteur support choisi. Avantageusement, il s'agit de bactéries du genre E. 30 Coli. 2898131 -10- La présente invention a également pour objet un vecteur d'excision du gène de résistance aux antibiotiques, ledit vecteur d'excision comprenant : (1) des moyens visant à la sélection des cellules le 5 contenant, comprenant le promoteur et le terminateur du gène TEF1 de Ashbya gossypii et le gène de résistance à la nourseothricine, et (2) des moyens visant à l'excision du marqueur de sélection présent dans le système d'expression, comprenant le 10 promoteur du gène GAL1 de Saccharomyces cerevisiae, le gène CRE et le terminateur du gène CYC1 de Saccharomyces cerevisiae. Avantageusement, le vecteur d'excision comprend la séquence SEQ ID n 12 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de 15 préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 12. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le vecteur d'excision décrit ci-dessus est choisi parmi les 20 vecteurs qui sont mal ségrégés pendant les divisions cellulaires, conduisant par cette caractéristique à une perte du vecteur en absence de pression de sélection fréquente, par exemple des vecteurs réplicatifs de type multicopies. Avantageusement, le vecteur d'excision est le plasmide pFL44s. 25 Ce vecteur d'excision a pour premier avantage de permettre l'élimination du gène de résistance aux antibiotiques présent dans le génome des levures à la suite de leur transformation avec le système d'expression. Les levures 30 permettant la production de molécules aromatiques selon l'invention ne contiennent donc pas d'ADN non originaire de 2898131 -11- souches appartenant au même genre ou à la même famille, à l'exception du gène codant la vanillyl alcool oxydase. De plus, l'élimination du gène de résistance par le vecteur d'excision permet aussi de transformer plusieurs fois 5 une levure, de façon à augmenter le nombre de copies du système d'expression présentes dans le génome et ainsi augmenter la quantité de protéine vanillyl alcool oxydase produite. 10 L'invention a pour objet des levures comprenant le système d'expression contenant la vanillyl alcool oxydase, ledit système d'expression ayant pour séquence la séquence SEQ ID n 11 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ 15 ID n 11. L'invention a aussi pour objet des levures telles que décrites précédemment et/ou transformées avec le vecteur d'excision tel que décrit précédemment. 20 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les levures appartiennent à toute espèce de levure capable de réaliser la bioconversion des précurseurs de vanilline (notamment eugénol, acide férulique, alcool coniférylique) en 25 vanilline selon des procédés connus de l'homme de l'art. Au sens de la présente invention, on entend par levure toute levure diploïde ou polyploïde ou tout clone haploïde issu de la sporulation de l'une de ces souches ou encore tout clone diploïde issu du croisement de deux clones 30 haploïdes. Avantageusement, les levures appartiennent à toute espèce de levure hémiascomycètes, de préférence au genre 2898131 -12- Saccharomyces ou ses hybrides. Très préférentiellement, les levures proviennent d'une souche cerevisiae ou ses hybrides. La présente invention a pour objet un procédé de 5 production d'alcool coniférylique et/ou d'acide férulique naturels, comprenant les étapes suivantes : a) clonage de la séquence nucléotidique du gène codant la vanillyl alcool oxydase dans le système d'expression, b) transformation de la levure avec le système d'expression 10 ainsi obtenu, c) culture de la levure dans les conditions permettant l'expression de la vanillyl alcool oxydase, d) mise en contact de la levure avec de l'eugénol. 15 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence nucléotidique du gène codant la vanillyl alcool oxydase et le vecteur comprenant le système d'expression sont dans un premier temps digérés par une ou plusieurs enzymes de restriction. La séquence du gène codant la vanillyl alcool 20 oxydase est ensuite insérée par simple ligation ou tout autre moyen d'insertion dans le système d'expression porté par le vecteur. De façon à amplifier le système d'expression, des bactéries sont transformées selon n'importe quel procédé connu avec le 25 produit de ligation (vecteur portant le système d'expression contenant le gène de la vanillyl alcool oxydase). Les bactéries ayant intégré le système d'expression sont sélectionnées grâce au gène de résistance aux antibiotiques présent sur le vecteur portant le système d'expression 30 contenant le gène codant la vanillyl alcool oxydase. Dans un second temps, le vecteur portant le système d'expression est digéré pour une ou plusieurs enzymes de 2898131 -13- restriction, de préférence PvuII, coupant de part et d'autre du système d'expression. Le système d'expression est ensuite purifié puis transformé dans les levures selon n'importe quel procédé connu. Les levures ayant intégré le système 5 d'expression présent dans Enfin, les conditions l'expression 10 est ajouté à catalyser sa sont sélectionnées grâce au gène de résistance le système d'expression. levures transformées sont cultivées dans les connues de l'homme du métier permettant de la vanillyl alcool oxydase. Lorsque l'eugénol la culture, la vanillyl alcool oxydase permet de bioconversion en alcool coniférylique et/ou en acide férulique. L'invention a aussi pour objet un procédé de 15 production d'alcool coniférylique et/ou d'acide férulique naturels, dans lequel le marqueur de sélection présent dans le génome de la levure a été excisé, ledit procédé comprenant après l'étape b) et avant les étapes c) et d), les étapes bl), b2) et b3) suivantes : 20 bl) transformation de la levure avec le vecteur d'excision, b2) culture de la levure dans les conditions permettant l'expression de l'enzyme CRE, b3) isolement des levures ayant perdu le marqueur de sélection. 25 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence nucléotidique du gène codant la vanillyl alcool oxydase est insérée dans le système d'expression, et les levures sont dans un premier temps transformées avec ce 30 système d'expression comme décrit précédemment. Les levures ayant intégré le système d'expression sont sélectionnées grâce à la présence d'un premier marqueur de sélection, de 2898131 -14- préférence un gène de résistance aux antibiotiques. Les levures sélectionnées positivement sont ensuite transformées avec le vecteur d'excision selon n'importe quel procédé connu. Les levures ayant intégré le vecteur d'excision sont 5 sélectionnées grâce au gène de résistance à la nourseothricine présent dans le vecteur d'excision. Les levures, ayant donc intégré le système d'expression et le vecteur d'excision, sont alors cultivées dans les conditions permettant l'expression de l'enzyme CRE. L'enzyme CRE active 10 va permettre d'exciser le premier marqueur de sélection encadré par les séquences loxP dans le système d'expression. Les levures ayant perdu ce marqueur de sélection sont ensuite sélectionnées. Par exemple, les levures ayant perdu ce premier gène de résistance à un antibiotique sont sélectionnées grâce 15 à leur absence de résistance à cet antibiotique. Les levures obtenues à la suite de cette étape de sélection ne possèdent plus le marqueur de sélection présent dans le système d'expression, mais possèdent encore le gène de résistance à la nourseothricine présent dans le vecteur 20 d'excision. Tel que décrit précédemment, le vecteur d'excision est choisi parmi les vecteurs qui sont mal ségrégés pendant les divisions cellulaires. De part cette caractéristique, le vecteur d'excision est facilement perdu en absence de pression de sélection fréquente. On entend par pression de sélection 25 tout procédé contribuant à sélectionner les cellules. Par exemple, maintenir en culture des levures possédant un gène de résistance à un antibiotique en présence de cet antibiotique correspond à un procédé de pression de sélection. Les levures obtenues à l'étape précédente sont donc cultivées en absence 30 de pression de sélection de façon à perdre le vecteur d'excision, puis sont sélectionnées pour la perte du gène de résistance à la nourseothricine. 2898131 -15- Les levures ainsi obtenues ont intégré dans leur génome le système d'expression permettant l'expression de la vanillyl alcool oxydase, tandis que leur génome ne contient plus de gènes de résistance aux antibiotiques. Les levures 5 transformées sont alors cultivées dans les conditions connues de l'homme du métier permettant l'expression de la vanillyl alcool oxydase. Lorsque l'eugénol est ajouté à la culture, la vanillyl alcool oxydase permet de catalyser sa bioconversion en alcool coniférylique et/ou en acide férulique. 10 Enfin, l'invention a également pour objet un procédé production d'alcool coniférylique et/ou d'acide férulique naturels dans lequel les étapes b), bl), b2) et b3) sont répétées autant de fois qu'il est souhaité de copies du 15 système d'expression, dans le but d'augmenter le nombre de copies du système d'expression dans le génome de la levure. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les levures sont dans un premier temps transformées avec le 20 système d'expression puis sélectionnées comme décrit précédemment. Ces levures sont ensuite transformées avec le vecteur d'excision, de façon à permettre l'élimination du marqueur de sélection comme décrit précédemment. Les levures ainsi obtenues ne possèdent plus de marqueur de sélection dans 25 leur génome et ont intégré au moins une copie du système d'expression. Dans un second temps, de façon à augmenter le nombre de copies du système d'expression, ces levures sont de nouveau transformées avec le système d'expression. Le même procédé de 30 sélection, de transformation avec le vecteur d'excision et de sélection finale est réalisé comme précédemment. Les levures ainsi obtenues ne possèdent plus de marqueurs de sélection et 2898131 -16- ont intégré dans leur génome au moins deux copies du système d'expression. Ce procédé peut être renouvelé autant de fois que souhaitées. 5 La présente invention a pour objet un procédé de production de vanilline comprenant les étapes a), b), c) et d) telles que décrites précédemment et une étape ultérieure de conversion de l'acide férulique et/ou de l'alcool 10 coniférylique, produit à l'étape d), en vanilline. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la levure de part son propre matériel génétique est capable de convertir l'acide férulique produit à l'étape d) en vanilline. Selon un autre mode de réalisation préféré de 15 l'invention, l'étape de conversion de l'acide férulique et/ou de l'alcool coniférylique en vanilline est réalisée par voie enzymatique ou voie biochimique selon les procédés décrits dans les brevets EP 0 606 441 et EP 0 804 606. 2898131 -17- La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention du système d'expression comprenant la vanillyl alcool oxydase, de vecteurs comprenant ce système 5 d'expression, de vecteurs d'excision, et de leur utilisation pour la production, par bioconversion de l'eugénol, d'alcool coniférylique et d'acide férulique. Dans les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, il sera fait référence aux figures en annexe, dans lesquelles : 10 - la figure 1 présente un schéma du système d'expression, - la figure 2 présente l'expression de la vanillyl alcool oxydase par les levures, - la figure 3 présente le procédé d'obtention du vecteur d'excision pFL44s-NATl-CRE. 15 20 Exemple 1 : Expression de la vanillyl alcool oxydase dans la levure par transformation de la levure avec le système 25 d'expression. 1/ Synthèse du système d'expression. Le système d'expression comprend la séquence nucléotidique de 30 2715 pb décrite dans SEQ ID n 13. Cette séquence nucléotidique a été construite à partir d'une séquence synthétique (SEQ ID n 14) et d'un insert de sélection (SEQ ID n 15). La séquence synthétique possède une taille de 1225 pb et a été synthétisé par GenScript Corporation. Cette séquence 35 comprend : 2898131 -18- - la séquence TY1A - une séquence LoxP - la séquence du promoteur du gène TDH3 une séquence de sites multiples de clonage 5 - la séquence du terminateur du gène CYC1 - la séquence TY1B L'insert de sélection a été isolé à partir du vecteur pUG6 cloné dans E. coli (Güldener, U., Heck, S., Fiedler, T., BeinHauer, J., and Hegemann, J.H. 1996. A new efficient gene 10 disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. 24:2519-2524). L'insert de sélection comporte 1500 pb et comprend : - une séquence loxP - la séquence du promoteur du gène TEF1 15 - la séquence du gène kanr - la séquence du terminateur du gène TEF1 Cet insert a été isolé par digestion du vecteur pUG6 avec les enzymes de restriction Sall et Sacl. 20 Le système d'expression comprenant la séquence synthétique a été cloné dans le vecteur pUC57 (GenScript Corporation) grâce aux sites de restriction EcoRI et Pstl. Le vecteur pUG6 et le vecteur pUC57 contenant le système 25 d'expression ont été digérés par les enzymes de restriction Sall et Sacl. L'insert de sélection est ensuite inséré par simple ligation dans la séquencesynthétique entre TY1A et la séquence LoxP situés de part et d'autre des sites de restriction Sall et Sacl. 30 Le vecteur ainsi obtenu comportant le système d'expression (séquence synthétique + insert de sélection) est appelé pM2-KAN (figure 1) 2898131 -19- Les sites de restriction XbaI et SacI présents dans l'insert de sélection permettent de changer le marqueur de sélection et ses séquences d'expression si l'utilisateur le souhaite. Les sites de restriction Sall et Spel permettent d'éliminer ou 5 de remplacer l'ensemble des séquences constitué par le marqueur de sélection et ses séquences d'expression encadrés par les deux séquences LoxP. 2/ Insertion du gène codant la vanillyl alcool oxydase dans le 10 système d'expression. La séquence nucléotidique de la VAO est issue de Penicillium Simplicissium (référence Genbank Y15627). La séquence VAO (SEQ ID n 1) utilisée dans cette expérience a été synthétisée avec 15 un site NotI en 5' et XhoI en 3' pour permettre son clonage dans le vecteur pivex, et ceci en phase avec une séquence nucléotidique permettant de produire une protéine avec une étiquette de six histidines en C-terminal. Le vecteur pivex contenant la séquence VAO telle que décrite 20 ci-dessus a été digéré par NotI et EcoRI defaçon à libérer la séquence VAO-6His. Cette séquence est ensuite clonée par simple ligation dans le vecteur pUC57 contenant le système d'expression digéré préalablement par NotI et MfeI. 25 3/ Transformation des levures avec le système d'expression comprenant le gène codant la vanillyl alcool oxidase. Le vecteur pUC57 contenant le système d'expression est digéré par l'enzyme de restriction PvuII. Cette enzyme coupe de part 30 et d'autre du système d'expression contenant le gène d'intérêt : la VAO. Le fragment d'ADN issu de cette digestion 2898131 -20- est purifié et transformé dans les levures selon une méthode de choc thermique en présence de PEG/lithium acétate. Les levures transformées, grâce à la présence du gène de résistance KANr porté par le système d'expression, sont 5 sélectionnées sur milieu riche YPD (extrait de levure 1%, peptone 1%, glucose 2%) contenant 300 mg/1 de Geneticin. Vingt-quatre clones de levures Saccharomyces cerevisiae (souche 92411) ont été obtenus après transformation (clones 92411 KANVAO). 10 3/ Analyse de l'expression de vanillyl alcool oxydase par les levures transformées. Les levures transformées sont cultivées sur milieu complet 15 Glucosé (YPD). La protéine VAO est ensuite purifiée par affinité sur résine Ni NTA comme dans l'exemple 1. Les protéines retenues sur la résine sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (gel SDS-PAGE) et détectées au bleu de coomassie. La figure 2 montre pour deux 20 clones que la protéine VAO est produite (colonnes E 92411 KANVAO). Le clone 92411 T- correspond au témoin négatif, c'est-à-dire à une souche 92411 non transformée, ne produit pas de protéine VAO, tandis que BL21 I+F correspond à un témoin positif résultant du clonage de la vanillyl VAO dans le 25 vecteur pivex et de sa production dans E. Coli. Exemple 2 : Production d'alcool coniférylique et d'acide férulique par bioconversion de l'eugénol dans les levures exprimant la vanillyl alcool oxydase. Les levures transformées avec le système d'expression contenant la vanillyl alcool oxydase, telles que décrites 30 2898131 -21-précédemment, ont été sélectionnées tout d'abord pour leur capacité à convertir l'eugénol en alcool coniférylique puis, pour certaines d'entre elles, pour leur capacité à produire de l'acide férulique. Ainsi, le clone 93205, pré-sélectionné pour 5 sa capacité à former de l'alcool coniférylique s'est montré capable par la suite, via ses dérivés, de convertir l'eugénol en acide férulique. Le clone 93207 et sa descendance, ont été choisis comme exemples de souches capables de convertir l'eugénol en alcool 10 coniférylique en fermenteur. 1/ Production d'alcool coniférylique en fermenteur avec la souche 93207 et un de ses dérivés 93334. 15 Deux spores de la souche 93207 ont été croisées pour donner la souche diploïde 93334, qui comprend ainsi deux copies du système d'expression contenant la vanillyl alcool oxydase. La souche 93334 est ensuite cultivée dans 100 ml de milieu au malt pendant deux jours pour atteindre une concentration 20 d'environ 3 à 6 x 108 cellules/ml. Les cellules sont ensuite inoculées dans un fermenteur contenant 3 litres de milieu au malt. L'inoculation est effectuée avec la moitié du volume de préculture, à 30 C et sous agitation de 500 rpm. L'aération est portée à 1 litre d'air/minute. 25 Après 20h de culture, l'eugénol est ajouté en solution dans du glucose 50% (60g d'eugénol + 120 ml de glucose à 50% dans H20). Après 18h de conversion, la fermentation est arrêtée. Un prélèvement est effectué. Il est acidifié avec de l'acide phosphorique, dilué par 2 dans de l'éthanol et centrifugé à 30 8000 rpm. Le surnageant est analysé en HPLC. 2898131 -22- Les résultats montrent qu'en 18 heures l'eugénol est converti en quasi-totalité et que 22g/1 d'alcool coniférylique ont été synthétisés (rendement molaire proche de 100 %). 5 2/ Production d'acide férulique en fermenteur avec la souche 93205 et un de ses dérivés 93342. La souche haploïde 93242, issue de la sporulation de la souche 93205, est cultivée dans 100 ml de milieu au malt pendant deux 10 jours, sous agitation (150 rpm) et à 30 C. Les cellules sont ensuite mises en culture dans un fermenteur contenant 3 litres de milieu au malt. L'inoculation est effectuée avec la moitié du volume de préculture, sous agitation (500 rpm) et à 30 C. L'aération est portée à 0,45 litre d'air/minute pendant 24h. 15 Après 24h de culture, la solution d'eugénol est ajoutée en continu avec un débit de 0,25 à 0,5 g d'eugénol par heure. Des prélèvements sont effectués régulièrement pour suivre la conversion du substrat en dérivés phénoliques. Chaque prélèvement est acidifié avec de l'acide phosphorique et 20 centrifugé à 8000 rpm. Le surnageant est analysé en HPLC. Débit de substrat : 2.5 mVH Concentrations en gramme par litre temps (heures) Eugénol eugénol alcool Acide distribué _ restant coniférylique Féruli•ue 0 0 0 0 0 16 1.6 0 0.7 0.75 40 3.8 0 0 3.8 64 7.1 0 0.2 6.7 112 10 0 0 10.11 Dans ces conditions, 10 g/1 d'acide férulique sont produits à partir de 10 g/1 d'eugénol (rendement molaire = 85%). 25 2898131 -23- Exemple 3 : Excision du marqueur de sélection du génome des levures transformées. 1/ Construction du vecteur pFL44s-NATl-CRE pour l'excision du 5 marqueur de sélection. Le vecteur d'excision a pour vecteur originel dans cet exemple le vecteur pFL44s (référence Genbank X70266). Ce vecteur d'une taille de 4319 pb possède : 10 - la séquence du gène URA3 - la séquence du gène de résistance AmpR - un site multiple de clonage - la séquence de l'origine de réplication 2 micron. 15 Dans ce vecteur pFL44s sont insérés un insert comprenant un marqueur de sélection et un insert comprenant la séquence de l'enzyme CRE. L'insert comprenant le marqueur de sélection, ici le gène de résistance à la nourseothricin NAT1, est obtenu à partir du 20 vecteur codant pour la nourseothricin (référence Genbank X73149). Ledit vecteur et le vecteur pFL44s sont digérés par les enzymes de restriction BglII et EcoRI. L'insert NAT1 comprenant le promoteur du gène TEF, la séquence du gène NAT1 et le terminateur du gène TEF, est inséré par simple ligation 25 dans le vecteur pFL44s. Le vecteur ainsi obtenu est le vecteur pFL44s-NAT1. L'insert comprenant la séquence de l'enzyme CRE est obtenu à partir du vecteur psh47 (référence Genbank AF298782). Le vecteur psh47 et le vecteur pFL44s-NAT1 sont digérés par 30 l'enzyme de restriction PvuII. L'insert CRE comprenant le promoteur du gène GAL1, la séquence de gène CRE et le terminateur du gène CYC1, est ensuite inséré par simple 2898131 -24-ligation dans le vecteur pFL44s-NAT1. Le vecteur ainsi obtenu est le vecteur pFL44s-NATl-CRE ayant pour séquence la séquence SEQ ID n 11 (figure 3). 5 2/ Transformation des levures avec le vecteur d'excision pour éliminer le marqueur de sélection présent dans le génome des levures. Les levures comprenant le système d'expression contenant la 10 vanillyl alcool oxydase, par exemple la souche 93334, sont transformées avec le vecteur d'excision pFL44s;-NATI-CRE. Les levures transformées sont sélectionnées sur milieu riche (YPD) additionné de clonNAT (100 mg/ml). Les levures sélectionnées positivement sont ensuite cultivées 15 dans un milieu YPGalactose. Le promoteur du gène CRE étant inductible en présence de Galactose, cette condition de culture permet l'induction de l'expression de l'enzyme CRE dans les levures. Les résultats de cette expérience montrent que 80% des clones 20 ont perdu le marqueur KanR. Le procédé de conversion d'eugénol en alcool coriiférylique tel que décrit en 1/ est réalisé avec une souche 93334 ayant perdu le marqueur de sélection. Après 18h de conversion, les mêmes résultats sont obtenus, suggérant que la perte du marqueur de 25 sélection n'affecte pas la capacité de bioconversion de la souche. REVENDICATIONS 1. Levure comprenant au moins un gène codant la vanillyl alcool oxydase ayant pour séquence la séquence SEQ ID n 1 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement à 90% à la séquence SEQ ID n 1. 2. Levure selon la revendication 1, caractérisée en ce que le gène codant la vanillyl alcool oxydase est contenu dans un système d'expression, ledit système comprenant : (1) des moyens visant à l'intégration dudit 15 système dans le génome de ladite levure, comprenant deux séquences nucléotidiques, (2) des moyens visant à la sélection de ladite levure ayant intégré ledit système, comprenant un insert de sélection comprenant deux séquences LoxP encadrant un 20 promoteur, un marqueur de sélection du type gène de résistance aux antibiotiques et un terminateur, (3) une cassette d'expression du gène codant la vanillyl alcool oxydase, comprenant un promoteur permettant l'expression dudit gène, au moins un site de clonage 25 permettant l'intégration du gène, et un terminateur. 3. Levure selon la revendication 2, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques d'intégration dudit système d'expression dans le génome de la levure sont les 30 séquences TY1A et TY1B de Saccharomyces cerevisiae ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 2898131 -26- 4. Levure selon l'une des revendications 2 à 3, caractérisée en ce que le promoteur permettant l'expression de la vanillyl alcool oxydase est le promoteur du gène TDH3 5 de Saccharomyces cerevisiae, et le terminateur associé est le terminateur du gène CYC1 de Saccharomyces cerevisiae ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 10 5. Levure selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que le promoteur et le terminateur permettant l'expression du marqueur de sélection sont le promoteur et le terminateur du gène TEF1 de Ashbya gossypii ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 6. Levure selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que le marqueur de sélection est un gène de résistance aux antibiotiques choisi dans le groupe comprenant les gènes de résistance à la généticine, nourseothricine, phléomycine, zéocine ou tout autre gène de résistance à un antibiotique dominant pour lequel la levure sauvage est sensible et est de préférence le gène de résistance à la généticine ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 7. Levure selon l'une des revendications 2 à 6, dans laquelle le système d'expression contenant la vanillyl 30 alcool oxydase a pour séquence la séquence nucléotidique SEQ ID n 11 ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 2898131 -27- 8. Levure selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle appartient à toute espèce de levures capables de réaliser la bioconversion de 5 précurseurs de vanilline en vanilline. 9. Levure selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle appartient à toute espèce de levures hémiascomycètes, de préférence au genre 10 Saccharomyces ou ses hybrides, très préférentiellement à la souche cerevisiae ou ses hybrides. 10. Vecteur comprenant le système d'expression tel que défini dans l'une des revendications 2 à 7. 11. Plasmide comprenant le système d'expression tel que défini dans l'une des revendications 2 à 7, de préférence pUC57. 20 12. Bactérie comprenant le vecteur selon l'une des revendications 10 à 11, de préférence E.coli. 13. Vecteur d'excision, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les vecteurs multicopies, de préférence 25 pFL44s, et qu'il comprend la séquence SEQ ID n 12 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 12. 14. Procédé de production d'alcool coniférylique 30 et/ou d'acide férulique naturels, comprenant les étapes suivantes . 15 2898131 -28- a) clonage de la séquence nucléotidique du gène codant la vanillyl alcool oxydase dans le système d'expression tel que défini dans l'une des revendications 2 à 7, 5 b) transformation de la levure avec le système d'expression ainsi obtenue, c) culture de la levure dans les conditions permettant l'expression de la vanillyl alcool oxydase, d) mise en contact de la levure avec de l'eugénol. 10 15. Procédé selon la revendication 14, comprenant après l'étape b) et avant les étapes c)et d), les étapes bl), b2) et b3) suivantes : bl) transformation de la levure avec le vecteur 15 d'excision tel que défini dans la revendication 13, b2) culture de la levure dans les conditions permettant l'expression de l'enzyme CRE, b3) isolement des levures ayant perdu le marqueur de sélection. 20 16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel les étapes b), bl), b2) et b3) sont répétées autant de fois qu'il est souhaité de copies du système d'expression. 17. Procédé de production de vanilline comprenant les étapes a), b), c) et d) telles que décrites dans l'une quelconque des revendications 14 à 16 et une étape ultérieure de conversion de l'acide férulique et/ou de l'alcool coniférylique produits à l'étape d) en vanilline. 18. Procédé de production de vanilline selon la revendication 17 dans lequel l'étape de conversion de 25 2898131 -29- l'acide férulique et/ou de l'alcool coniférylique produits à l'étape d) en vanilline s'effectue dans une levure ou par voie biochimique ou voie enzymatique.