FR 2903419 A1 20080111 FR 0606072 A 20060704 1 La présente invention concerne essentiellement une nouvelle souche de Trichoderma atroviride, un ou des clones issus de cette nouvelle souche, un ascomycète possédant les caractéristiques de cette nouvelle souche, un milieu de culture, un concentré déshydraté, une poudre à base de ce nouveau Trichoderma atroviride, les utilisations de ce dernier, en particulier comme stimulateur de la germination et/ou de la croissance des plantes et/ou comme agent de biocontrôle, ainsi que son procédé d'isolement. Le genre Trichoderma est un groupe agronomiquement important car il comprend des champignons agents de biocontrôle dont le mode d'action a fait l'objet de nombreux travaux. Des études récentes font en effet état d'une capacité de ce champignon filamenteux à intervenir selon divers mécanismes : mycoparasitisme, antagonisme (compétition), antibiose (production d'antibiotiques), stimulation racinaire, stimulation de la croissance par solubilisation de minéraux fertilisants, stimulation des défenses naturelles des plantes, etc. Les champignons du genre Trichoderma appartiennent au phylum Ascomycota, classe des Ascomycetes, famille des Hypocreales. Ce sont des champignons microscopiques dont il existe des espèces terrestres et des espèces marines. On en trouve dans les bois en décomposition, les résidus végétaux et dans tous les sols (humus forestiers, terres agricoles) (de 10 à 10000 propagules/g dans les sols tempérés ou tropicaux). Ils colonisent les racines des plantes herbacées et ligneuses sans aucun dommage. En outre, ce champignon peut pénétrer dans les racines et favoriser le développement, la nutrition et la résistance aux maladies. L'espèce atroviride est l'une des espèces courantes de Trichoderma. La colonisation des racines par Trichoderma sp. peut augmenter la croissance et le développement des racines, le rendement des cultures, la résistance aux stress abiotiques et l'absorption et l'utilisation des nutriments (Harman G.E. et al., Nature Reviews / Microbiology, 2, 43-56, 2004). Lorsqu'ils existent, les effets de stimulation de croissance proviennent de l'action directe des Trichoderma sur les plantes et ne sont pas directement liés aux antagonismes avec les pathogènes. Ces effets sont visibles aussi bien sur des substrats de culture non désinfectés que sur des substrats stériles. Les mécanismes de stimulation de croissance sont mal élucidés et pourraient être dus à la suppression des dommages oxydatifs sur les racines, à la sécrétion de facteurs de croissance par le champignon, à l'inhibition de la microflore gênante et à l'amélioration du transport des micronutriments. Les effets sont inégaux d'une souche à l'autre. Certaines souches possèdent des effets stimulateurs de croissance mais d'autres ont des effets inhibiteurs (par exemple, Trichoderma viride RF1, J.G. Menzies, Plant Pathology, 42, 784-791, 1993). Les brevets FR2700542 et FR2780972 divulguent différentes aikyl-lactones produites par les souches de Trichoderma harzianum 1-1235 et 1-1536 pour le premier brevet et 1-1571 pour le second et capables de stimuler la germination et la croissance. Le brevet US6753295 présente un mélange de peptaibols et d'alkyl-cyclopenténones produits par le T. harzianum SK-5-5 (NIBH 13327) stimulant la croissance et la défense des plantes. Le recours à la fusion de protoplastes de 2 souches mutantes a permis à A. Sivan et G.E. Harman (J. Gen. Microbiol., 137, 23-29, 1991) de produire une nouvelle souche de 2903419 2 Trichoderma harzianum 1295-22 (ATCC 20847) dont la compétence avec la rhizosphère est améliorée et qui favorise la croissance du maïs de 66 % par rapport au témoin non traité (Bjôrkman et al., J. Am. Soc. Hort., 123, 35-40, 1998). 5 Les propriétés antagonistes des Trichoderma sont mieux documentées que les propriétés stimulatrices. Le potentiel antagoniste des Trichoderma vis-à-vis de nombreux champignons du sol pathogènes des plantes a été découvert dans les années 1930 (Weindling R ., Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi , Phytopathology, 22, 837-845, 1932) . L'application la plus évidente est la lutte biologique en agriculture 10 (biocontrôle), y compris en agriculture biologique où le règlement (CE) n 2092/91 prévoit cette utilisation. Les chercheurs ont remarqué très tôt que les propriétés antagonistes varient significativement d'une espèce à l'autre, et au sein d'une même espèce, d'une variété à 15 l'autre. L'usage de Trichoderma comme antifongique en agriculture a commencé à se développer en 1976 avec la lutte contre Botrytis cinerea de la vigne (SEPPIC FR2345921 (30/03/1976), Trichoderma viride Bisby). Par la suite, sont apparues des applications 20 contre de nombreux autres champignons pathogènes tels Armillaria mellea, Stereum purpureum, Ceratocystis ulmi, Pythium ultimum et Sclerotinia sclerotiorum et Eutypa tata : - Ricard J. GB1573850 (12/09/1977), souche 1-030, Trichoderma viride Bisby, propriétés antifongiques contre diverses maladies, y compris B. cinerea , 25 -Papavizas G. US4489161 (25/10/1982), souche T-1-R9, T. viride Pers. ex S.F. Gray, agent de biocontrôle de Fusarium oxysporum du chrysanthème, Merlier O. et al. - ORSAN FR2545099 (28/4/1983), souche 1-223 / ATCC 20672, Trichoderma harzianum Rifai, usage de la souche ou de peptides (trichorzianines) produits par la souche pour lutter contre Botrytis cinerea, Stereum purpureum, 30 Ceratocystis ulmi et Sclerotinia, - Harman G. EP0285987, souche 1295-22 (T-22) / ATCC 20847, Trichoderma sp., souche obtenue par fusion des protoplastes destinée à la protection des semences contre les maladies du sol, - Speakman J.B. et al. - BASF EP0383201 (16/02/1989), souche 35/84 / IMI 311756 / 35 DSMZ 5067, Trichoderma sp., fongicide pour les semences en particulier contre Pythium - Elad Y. ù PERI DEVELOPMENT APPLICATION EPO466133 (12/07/1990), souche T-39 / I-952, Trichoderma harzianum, antagoniste de Botrytis cinerea et Sclerotinia sclerotiorum compatible avec plusieurs fongicides chimiques 40 - Monte Vasquez E. û Universidad de Salamanca WO9716974 (07/11/1995), souches IMI 352940, IMI 352941, CECT 20179 et CECT 20178, respectivement trois T. harzianum Rifai et un T. viride Pers., agents de biocontrôle contre les maladies des plantes Besnard O. û B2B WO2005068609 (07/01/2004), souches 1-1571 et I-3151, deux T. 45 harzianum Rifai, agents de lutte contre les maladies du bois de la vigne en particulier Eutypiose et ESCA Les espèces les plus fréquemment utilisées comme agents de biocontrôle, sont T. harzianum Rifai, T. viride Persoon et Trichoderma polysporum. La capacité de T. harzianum à produire des métabolites antifongiques, y compris des composés volatils, explique bien cet usage. Les chitinases, glucanases et protéases 50 2903419 3 libérées par ces Trichoderma dégradent les parois des champignons pathogènes sans altérer les cellules des racines des plantes. Les métabolites antibiotiques, tels les peptaibols (par exemple, trichorzianines), agissent en synergie avec les enzymes pour attaquer les champignons cibles. T. harzianum se développe au contact des racines et les 5 colonise superficiellement sans aucun dommage. Il a été montré que Trichoderma virens colonise les racines du coton et inhibe la croissance de Macrophomina phaseolina (pourriture des racines) apporté par le sol (Howell C.R., Plant disease, 87, 4-10, 2003). Le mycoparasitisme de Pythium ultimum par 10 T. atroviride est un phénomène actif qui se produit directement sur la surface des graines et des racines de concombre. Le mycoparasitisme est un principe essentiel du biocontrôle qui n'exclut pas la participation de la compétition trophique, de l'occupation de l'espace, de l'antibiose et de la stimulation des défenses de la plante (Lu Z. et al., Appl. Environ. Microbiol., 70, 3073-3081, 2004). 15 La capacité particulière des Trichoderma à détruire des substances toxiques a été signalée et l'usage de Trichoderma en bioremédiation a été proposé (cf. Lynch J. WO03045596 (23/11/2001), T. harzianum pour la bioremédiation des sols contaminés par le cyanure et les hydrocarbures). On rappelle, à titre informatif, que la bioremédiation est 20 un ensemble de techniques consistant à augmenter la biodégradation ou la biotransformation, en inoculant des microorganismes spécifiques (bioaugmentation) ou en stimulant l'activité de populations microbiennes indigènes (biostimulation) par apport de nutriments et par ajustement des conditions de milieu (potentiel d'oxydoréduction, humidité). Cette capacité particulière de destruction des substances toxiques, permet aux 25 Trichoderma de détruire les toxines secrétées par les champignons et ainsi protéger les plantes des attaques de champignons phytopathogènes. L'eutypine, le 4-hydroxybenzaldehyde et l'acide 3-phenyllactique sont des phytotoxines produites par les champignons qui provoquent l'eutypiose et l'ESCA, maladies du bois de la vigne. Les Trichoderma peuvent dégrader ces toxines, et certaines souches les métabolisent 30 complètement (Christen D. et al., J. Agric. Food Chem., 53, 7043-7051, 2005). Les Trichoderma peuvent résister aux toxiques et plus particulièrement aux antifongiques en dénaturant les molécules par oxydation. La protection des plantes par les Trichoderma sp. s'établit au travers de nombreux 35 mécanismes. Tous les Trichoderma ne sont pas équivalents car un bon agent de lutte biologique doit être un bon colonisateur et un bon antagoniste mais il doit également être compatible avec la rhizosphère et avec les plantes. Il est apparu de manière surprenante que la souche de Trichoderma atroviride qui a été 40 isolée et purifiée selon l'invention possède d'excellentes propriétés stimulatrices de croissance, des propriétés antagonistes utiles en agriculture ainsi qu'une grande stabilité en matière de viabilité. La souche et les clones de Trichoderma atroviride isolés et purifiés par le déposant, ont 45 été déposés auprès des Collections Coordonnées Belges de Microorganismes (BCCMTM)/Mycothèque de l'Unversité catholique de Louvain (MUCL), le 3 mai 2004, sous le numéro BCCMTM/MUCL 45632 ; cet organisme étant reconnu autorité de dépôt internationale au sens du Traité de Budapest. Cette nouvelle souche sera dénommée, ci-après, Trichoderma atroviride MUCL 45632 ou, plus simplement, MUCL 45632. 50 2903419 4 En conséquence, un des objets de l'invention est la souche de Trichoderma atroviride déposée à la Mycothèque de l'Université catholique de Louvain sous la référence BCCM/MUCL 45632. 5 Cette souche de Trichoderma atroviride MUCL 45632 possède les aspects culturaux suivants : - sur milieu PDA (Potato Dextrose Agar), il apparaît rapidement, en deux jours environ, un thalle ras translucide qui devient blanc le troisième jour avec l'apparition des 10 conidiophores ; ce mycélium ras vire au vert très sombre au bout de cinq jours, signe d'une sporulation intense et le revers de la culture est incolore ; - sur milieu MA (Malt Agar), son développement est légèrement différent et caractéristique de l'espèce Trichoderma atroviride, le mycélium forme des cercles concentriques de 15 sporulation vert intense autour du point d'inoculation avec un thalle qui reste translucide jusqu'à la fin de la culture ; l'aspect microscopique est le même sur les deux milieux, les conidiophores sont très ramifiés avec des cellules conidiogènes (phialides) disposées en verticille par 2 ou 3, lesdites phialides sont ampulliformes, droites ou incurvées, de dimensions 2,5 à 3 pm par 8 à 14 pm et les conidies réunies au sommet de la phialide, 20 sont globuleuses à paroi lisse, de couleur verte et mesurent environ 3 pm de diamètre ; ladite souche se développe entre 12 C et 36 C avec un optimum de croissance entre 20 C et 25 C sur les milieux gélosés classiques de type PDA, MA, OA (Oat Meal Agar). 25 Un autre objet de l'invention est un Ascomycète tel que déposé à la Mycothèque de l'Université catholique de Louvain sous la référence BCCM/MUCL 45632. Un autre objet de l'invention est un clone de Trichoderma atroviride obtenu à partir de la nouvelle souche selon l'invention. 30 Un tel clone peut être obtenu par reproduction du champignon ou par mutation. Bien évidemment, un tel clone pourra comporter des séquences génétiques supplémentaires, introduites par manipulation génétique, permettant par exemple de conférer une résistance à certains fongicides et/ou antibiotiques ou de surexprimer une ou plusieurs 35 protéines. Une telle séquence supplémentaire pourra être introduite, par exemple, lors de la fusion de protoplastes à l'aide de vecteurs (vecteurs d'expression, vecteurs recombinants, transfection) bien connus tels que des plasmides ou des cosmides. Un objet de l'invention est également un milieu de culture de Trichoderma atroviride 40 BCCM/MUCL 45632 comprenant au moins un Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632 et au moins un substrat, particulièrement un substrat d'origine végétale et plus particulièrement un substrat riche en polyholosides tels que l'amidon, l'hémicellulose ou la cellulose. 45 De préférence, ce milieu de culture comprend au moins un diluant minéral inerte. De manière préférée, ce diluant est spécifiquement sélectionné pour diluer et/ou aérer ledit milieu de culture, par exemple, ledit diluant est choisi dans le groupe constitué par les 50 argiles calcinées en grains telles que l'attapulgite, les billes d'argile soufflées, les poudres de roches volcaniques comme la pouzzolane ou la pierre ponce, la perlite expansée, la vermiculite expansée et la laine de roche. 2903419 5 Préférentiellement, le milieu de culture selon l'invention comprend au moins un élément minéral utile à la croissance du Trichoderma atroviride tel qu'un nitrate, de l'ammonium, un orthophosphate, du potassium, du magnésium, du calcium ou un oligo-élément. Selon un mode de réalisation préféré, ce milieu de culture comprend un acide, de préférence minéral, permettant de maintenir le pH du milieu entre 2 et 4 et de préférence entre 2,7 et 3,3. 10 Un autre objet de l'invention est un concentré déshydraté de Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632, particulièrement sous forme de poudre. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une poudre à base de Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632, ledit procédé comprenant les étapes de 15 fermentation du milieu de culture selon l'invention, de déshydratation à basse température, éventuellement suivies d'une étape de broyage. L'invention a également pour objet une poudre susceptible d'être obtenue par le procédé précité. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632 comme stimulant de la germination et/ou de la croissance des plantes. L'invention a également pour objet l'utilisation de Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 25 45632 en tant qu'agent de biocontrôle, notamment contre les champignons pathogènes des plantes. II convient de noter que, concernant les deux utilisations précitées, Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632, pourra être administré, entre autres, directement sous une forme 30 appropriée et plus particulièrement sous forme de poudre. Cette poudre pourra être du champignon brut mais préférablement sera la poudre obtenue via le procédé d'obtention précité, c'est-à-dire après fermentation du milieu de culture précité, déshydratation à basse température, puis broyage. 35 Un autre objet de l'invention consiste en un procédé d'isolement de Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632, comprenant les étapes successives suivantes : a) Prélèvement d'un extrait de champignon Trichoderma atroviride dans un milieu adéquat comme un sol inculte ou cultivé, sur les plantes ou dans les bois en décomposition issus 40 de ceps de vigne, de branches ou de troncs d'arbres, b) Dilution de l'extrait prélevé avec de l'eau stérile, c) Culture de cet extrait sur au moins un milieu sélectif, ledit milieu sélectif étant compris dans le groupe constitué par : le milieu MA2 (malt agar 2%) et le milieu RB-S-F (McFadden et Sutton), 45 d) Repiquage des champignons Trichoderma atroviride issus de spores isolées dans des boîtes de Pétri contenant du milieu PDA (Potato Dextrose Agar), e) Culture des champignons repiqués dans une étuve à 25 degrés Celsius pendant une durée comprise entre deux et cinq jours, de préférence entre trois et quatre jours, f) Identification, via une observation microscopique réalisée sur un fragment de mycélium 50 prélevé à l'issue de l'étape précédente et préalablement coloré avec un colorant bleu coton au lactophénol, de champignons Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632. 5 20 2903419 6 La description détaillée ci-après a pour but d'exposer l'invention de manière suffisamment claire et complète, notamment à l'aide d'exemples, mais ne doit pas être considérée comme limitant l'étendue de la protection aux modes de réalisation particuliers et aux exemples présentés. Exemple d'extraction de Trichoderma atroviride MUCL 45632 Selon un mode préférentiel l'extraction de Trichoderma atroviride MUCL 45632 est 10 réalisée partir du sol. Les prélèvements sont effectués jusqu'à 30 à 40 cm de profondeur, correspondant à la rhizosphère, à l'aide d'ustensiles préalablement désinfectés à l'alcool. La terre ainsi récoltée est tamisée sur tamis de 2 mm afin d'éliminer les gros débris (cailloux, débris 15 racinaires et feuilles). Les échantillons de terre sont séchés à 25 C pendant 3 jours. Ils sont ensuite utilisés immédiatement pour la recherche de champignon du genre Trichoderma. L'extraction est réalisée par la technique des suspensions-dilutions . Cela consiste à 20 mettre 10 g de chaque échantillon dans 90 ml d'eau distillée stérile, puis à agiter pendant 30 minutes. Cet extrait correspond à la suspension mère. Les dilutions sérielles de suspension mère peuvent aller jusqu'à la dilution 10-6. II n'est pas utile d'aller plus loin dans les dilutions car les sols en friche ne sont pas extrêmement riches en Trichoderma. 25 Dans cet exemple la culture est réalisée sur deux types de milieux sélectifs : Milieu MA2 (malt agar 2%) extrait de malt 20g__ Agar 20 g_ _ Eau 1000 mL Milieu RB-S-F (Mc Fadden et Sutton) KH2PO4 1 MgSO477H2O 0,5 g__... Peptone 59 Glucose 10g rose bengale 17 mg sulfate de streptomycine 30 mg Gélose 20 g Eau 1000 mL Formol ajouté après autoclavage 0,2 mL Deux séries de boîtes de Pétri reçoivent respectivement des volumes de 1 mL des 30 dilutions 10-4, 10-5 et 10-6 de chaque échantillon. Les milieux sélectifs sont coulés en surfusion à 45 C sur les dépôts de liquide dans chaque série de boites de Pétri. L'homogénéisation est faite manuellement par un mouvement circulaire des boîtes. Les boîtes sont laissées sous la hotte à flux laminaire jusqu'à leur complet durcissement. Elles sont ensuite placées dans une étuve à 25 C et observées quotidiennement jusqu'à 35 l'apparition des mycéliums sans confluence. 5 2903419 Isolement monosporal et identification A partir des mycéliums non confluents apparus sur les deux milieux de sélection, on repique uniquement les champignons issus de spores isolées dans des boîtes de Pétri 5 contenant du milieu PDA (Potato Dextrose Agar) puis on les cultive dans une étuve à 25 C. PDA (Potato Dextrose Agar) extrait de pommes de terre 1000 m L glucose agar Après 3 à 4 jours de culture, quand les hyphes ont commencé à couvrir la surface de la 10 boîte, on procède à leur identification par observation microscopique par la technique du ruban adhésif : Sous une hotte à flux laminaire, la face collante d'un petit morceau de ruban adhésif transparent est appliquée légèrement sur le mycélium afin d'en récupérer quelques 15 fragments. Le ruban adhésif est déposé sur une lame porte-objet sur laquelle on a préalablement mis une goutte de colorant bleu coton au lactophénol. On met une autre goutte de colorant sur le ruban adhésif puis on place une lamelle dessus. L'observation du montage est effectuée sous microscope aux grossissements 100 ou 400. Colorant bleu coton au lactophénol 50 mg de bleu coton (ou bleu de méthyle, acid blue 93, C.I. n 42780) dissous dans 100 ml de lactophénol d'Amann (25 g de phénol pur cristallisé dissous à chaud dans 25 ml d'eau distillée, 25 g d'acide lactique 85 % et 50 g de glycérol anhydre) Grâce à cette méthode, la souche Trichoderma atroviride MUCL 45632 a été identifiée. II est apparu que cette souche possédait des propriétés particulièrement avantageuses notamment en matière de compétition avec les pathogènes, de viabilité, de résistance aux toxiques, etc. Identification génétique de Trichoderma atroviride MUCL 45632 La technique employée pour l'identification génétique de la souche Trichoderma atroviride MUCL 45632 a été le séquençage des espaceurs internes transcrits 1 et 2 (ITS 1 et 2). 30 Cette technique, largement répandue et fréquemment utilisée, permet de caractériser certaines espèces animales ou végétales en fonction de la variabilité génétique de ces séquences. En l'espèce, le séquençage des ITS 1 et 2 de cette nouvelle souche a permis de confirmer qu'elle appartenait à l'espèce Trichoderma atroviride en raison de l'identité de ses séquences nucléotidiques ITS avec celles d'autres Trichoderma atroviride (telle la 35 souche ATCC 36042, n d'accession (Genbank) de la séquence des ITSs : AF278796). Identification biochimique de la souche Trichoderma atroviride MUCL 45632 et comparaison avec d'autres Trichoderma Identification biochimique 7 20 25 40 2903419 8 Les souches de Trichoderma peuvent être identifiées et comparées en les cultivant sur différents milieux et dans différentes conditions. L'analyse se fait selon deux critères : l'aspect des mycéliums et l'effet du milieu de culture (inhibition ou stimulation de la croissance et/ou de la sporulation de la souche). Les cultures durent 12 jours. Les 5 conditions de culture utilisées pour la comparaison sont : (1) milieu PDA à 25 C (potato dextrose agar Sigma 39 g/L) (2) milieu minimum à 4 C, (glucose 5 g/L + peptone 5 g/L + Mg SO4, 7 H2O 0,5 g/L + KH2PO4 1 g/L + rose bengale 25 mg/L + agar 15 g/L) 10 (3) milieu minimum à 25 C (idem) (4) milieu minimum à 37 C (idem) (5) milieu minimum 1 % glucose à 25 C (le glucose à 5 g/L du milieu minimum est augmenté à 10 g/L) (6) milieu minimum 1 % éthanol à 25 C (le glucose à 5 g/L du milieu minimum est 15 remplacé par de l'éthanol à 10 mL/L) (7) milieu minimum 1 % acide citrique à 25 C (le glucose à 5 g/L du milieu minimum est remplacé par de l'acide citrique à 10 g/L) (8) milieu minimum 1 % acide lactique à 25 C (le glucose à 5 g/L du milieu minimum est remplacé par de l'acide lactique à 10 g/L) 20 (9) milieu minimum 0,2 % glycine à 25 C (la peptone à 5 g/L du milieu minimum est remplacée par de la glycine à 2 g/L) (10) milieu minimum 0,2 % oxalate d'ammonium à 25 C (la peptone à 5 g/L du milieu minimum est remplacée par de l'oxalate d'ammonium à 2 g/L) (11) milieu minimum 1 % oxalate d'ammonium à 25 C (la peptone à 5 g/L du milieu 25 minimum est remplacée par de l'oxalate d'ammonium à 10 g/L) (12) milieu minimum 0,2 % d'urée à 25 C (la peptone à 5 g/L du milieu minimum est remplacée par de l'urée à 2 g/L) (13) milieu minimum 0,2 % nitrite de sodium à 25 C (la peptone à 5 g/L du milieu minimum est remplacée par du nitrite de sodium à 2 g/L) 30 (14) milieu minimum avec cristal violet à 10 mg/L à 25 C (15) milieu minimum avec cristal violet à 50 mg/L à 25 C (16) milieu malt-sulfate de cuivre à 25 C à la lumière (malt extract 10 g/L + CuSO4, 5 H2O 200 mg/L + agar 15 g/L) (17) milieu malt-sulfate de cuivre à 25 C à l'obscurité (idem) 35 (18) milieu Czapek-ammonium à 25 C (sucrose 30 g/L + NaNO3 3 g/L + K2HPO4 1 g/L + MgSO4, 7 H2O 0,5 g/L + KCI 0,5 g/L + FeSO4, 7 H2O 10 mg/L + (NH4)2SO4 5 g/L + agar 15 g/L) (19) milieu nitrito-saccharose à 25 C (saccharose 10 g/L + NaNO2 2 g/L + agar 15 g/L) 40 (20) milieu glycérol-nitrate à 25 C (glycérol 5 ml/ : + NaNO3 3g/L + agar 15 g/L) (21) Le profil biochimique de la souche Trichoderma atroviride MUCL 45632 est résumé dans le tableau qui suit. 45 50 2903419 9 Milieu de culture (1) milieu de référence PDA 25 C Vitesse de croissance Aspect de la sporulation vert intense très rapide Aspect de la sporulation par rapport au milieu PDA absente intense verte à beige (4) milieu minimum 37 C (5) milieu minimum 1% glucose 25 C (6) milieu minimum 1 % éthanol 25 C milieu minimum 1 % acide citrique 25 C milieu minimum 1 % acide lactique 25 C milieu minimum 0,2 0/0 glycine 25 C (10) milieu minimum 0,2 % oxalate d'ammonium 25 C (11) milieu minimum 1 % oxalate d'ammonium 25 C (12) milieu minimum 0,2% urée 25 C (13) milieu minimum 0,2% nitrite de sodium 25 C (14) milieu minimum à 10 mg/I cristal violet 25 C (15) milieu minimum à 50 mg/I cristal violet 25 C (16) milieu extrait de malt-sulfate de cuivre à la lumière 25 C (17) milieu extrait de malt-sulfate de cuivre à l'obscurité 25 C (18) milieu Czapek-ammonium 25 C (7) (8) (9) Milieu de culture (2) milieu minimum 4 C (3) milieu minimum 25 C (19) milieu nitrito-saccharose 25 C (20) milieu glycérolùnitrate 25 C Vitesse de croissance par rapport au milieu PDA très lente très légèrement ralentie pas de croissance ralentie mycélium plus étendu mais moins dense mycélium moins dense légèrement ralentie légèrement ralentie légèrement ralentie très ralentie mycélium plus étendu mais moins dense mycélium plus étendu mais moins dense très ralentie très ralentie mycélium moins dense mycélium moins dense mycélium plus étendu moins dense en zone centrale mycélium beaucoup moins dense mycélium beaucoup moins dense as de sporulation plus faible plus faible absente .................................................. plus faible plus faible inchangée absente plus faible inchangée inchangée absente inchangée inchangée un peu plus faible beaucoup plus faible beaucoup plus faible Le profil est unique. Il est influencé par le genre, l'espèce et la variété du champignon. Il 5 permet d'identifier spécifiquement chaque souche de champignon Trichoderma. Comparaison avec diverses souches de Trichoderma : 2903419 10 Dans cet exemple, les souches de Trichoderma étudiées sont : -MUCL 45632 (T. atroviride, identifié par séquençage des ITS-1 et caractérisé à l'aide de tests biochimiques ; souche isolée par la demanderesse d'un sol en 5 friche) CNCM 1-1571 (T. atroviride, identifiée par séquençage des ITS-1, Brevet FR2780972) - T-39 (CNCM 1-952) (Trichoderma harzianum Rifai, identifiée par séquençage des ITS-1, Brevet EPO466133) 10 - T-22 (1295-22, ATCC 20847) (Trichoderma harzianum Rifai, identifiée par séquençage des ITS-1, Brevet EP0285987) - TV1 (Nixe 13602A) (T. harzianum, identifiée par séquençage des ITS-1, souche de produit commercial Agribiotec, Italie) - Nixe 00401A (T. atroviride, identifiée par séquençage des ITS-1, souche isolée 15 par la demanderesse d'une culture de champignons Pleurotus ostreatus) Nixe 30301E (Trichoderma sp., souche isolée par la demanderesse d'une culture hors-sol d'Allium porum) 20 Contrôle des similitudes d'aspect des colonies sur boîtes de Pétri : Les boites obtenues avec chaque condition de culture sont comparées deux à deux. Pour chaque condition de culture, on attribue la note 1 lorsque deux souches donnent des colonies d'aspect similaire pour une condition de culture donnée. Lorsque l'aspect est 25 différent, la note est 0. Il y a 20 tests de culture au total. Pour chaque couple, l'ensemble des notes est additionné. La note maximale est 20. Exemples : note 7/20 - la souche 1-1571 est trouvée 7 fois associée avec la souche MUCL 45632, c'est-àdire qu'elles donnent des colonies d'aspect similaire dans sept conditions 30 de culture différentes ; note 0/20 - la souche T-39 n'est jamais associée à la souche MUCL 45632. Tableau des notations comparées des similitudes d'aspect (sur 20) : MUCL 1-1571 45632 7 0 0 T-39 0 0 6 T-22 1 1 18 4 TV1 5 15 1 0 2 00401A 0 2 5 11 5 2 30301E 35 La souche MUCL 45632 est apparentée aux souches 1-1571 (7/20) et 00401A (5/20). Les souches1-1571 et 00401A sont proches (15/20). Ces 3 souches sont des T. atroviride, génétiquement proches comme cela a été confirmé par séquençage des ITS-1 (INRA 40 Versailles), mais sont toutefois différentes et différenciables. Les souches T. harzianum T-39 et TV1 sont très proches l'une de l'autre (18/20) suggérant une origine commune. La souche 30301 E, isolée d'une culture d'Allium porum, 2903419 11 non séquencée, est proche de la souche T-22 et donc d'un Trichoderma harzianum. Les souches T-39, TV1, T-22 et 30301E forment un autre groupe de type T. harzianum au sein duquel les souches T-22 et T-39 se distinguent bien entre elles. Contrôle de l'effet des milieux sur les souches : Pour chaque condition de culture, les souches ont été comparées pour les effets de stimulation ou d'inhibition par les milieux de culture et d'intensité de sporulation. Les 10 variations de croissance et de sporulation sont estimées par rapport à la référence : milieu PDA à 25 C. II y a 20 tests de culture au total. Pour chaque condition de culture, on attribue la note 1 à un couple lorsque le comportement est identique et 0 lorsque le comportement est différent. 15 Le tableau suivant récapitule toutes les associations réalisées. Comme précédemment, la note totale correspond à la somme des réponses pour chaque couple. La note maximale est 20. Tableau des notations comparées de l'effet des milieux (sur 20) : MUCL 1-1571 45632 12 7 9 T-39 7 7 13 T-22 7 8 13 9 TV1 11 13 9 8 11 00401A 6 8 9 8 8 10 30301E Les notes sont moyennes et proches les unes des autres. Ce test montre que les souches sont toutes des Trichoderma sp., mais différentes les unes des autres. Les 25 souches MUCL 45632, 1-1571 et 00401A forment un groupe hétérogène et les souches T-39, T-22 et TV1 un autre groupe hétérogène. Les souches TV1 et 00401A peuvent être rapprochées. 30 Moyenne géométrique des notations des tests : La moyenne géométrique des notes de chacun des couples permet de distinguer clairement les souches entre elles. La moyenne géométrique est la racine carrée du produit des deux notes obtenues précédemment. 35 Tableau des moyennes géométriques des notations comparées des aspects de colonies et des effets des milieux : 5 20 40 2903419 12 MUCL 45632 9 I-1571 0 0 T-39 0 0 9 T-22 3 3 15 6 TV1 7 14 3 0 5 00401A 0 4 7 9 6 4 30301E - Les résultats montrent un regroupement des souches par espèce, mais il n'y a jamais identité complète au sein d'un couple. 5 - Les souches 1-1571 et 00401A sont assez proche. II en est de même pour les souches T-39 et TV1. - La souche T. atroviride MUCL 45632 se distingue clairement de toutes les autres et plus particulièrement des souches T. harzianum Rifai. 10 Conditions de culture du champignon Trichoderma atroviride MUCL 45632 Choix du mode de culture 15 Dans le milieu naturel, les champignons sont des micro-organismes qui se développent sur des substrats solides et humides. Pour la production industrielle, il existe deux options : la culture submergée en milieu liquide ou aérienne sur milieu solide. Le choix peut être fait notamment à partir de nos essais en laboratoire et des travaux de G.A. Munoz. et al. (FEMS Microbiology Letters, 125, 63-70, 1995) et de A. Durand. (Les 20 colloques de l'INRA, 18, 263-277, 1983 et Biofutur, 181, 41-43, 1998). La culture doit donner un produit concentré qui conserve bien son activité. Les formes de conservation de Trichoderma atroviride sont les conidiospores et les chlamydospores. Le mycélium ne survit pas longtemps à la dessiccation et au manque de nutriments. 25 Les essais de culture submergée en milieu liquide en fermenteur agité, en secoueur ou cytoculteur ne permettent pas une bonne production de spores dans des milieux spécifiques des champignons. Le champignon T. atroviride se développe en surface et il sporule mal. La culture en milieu liquide donne essentiellement du mycélium et des 30 chlamydospores. Les spores de T. atroviride obtenues en milieu liquide ont des parois fines et incomplètes. Elles sont moins résistantes aux stress malgré leur richesse en tréhalose. Leur pouvoir germinatif diminue à moins de 15 % après 45 jours de stockage sous une humidité relative (HR) de 75 % (a,v 0,75). Elles sont hydrophiles et peu adhérentes. Elles sont peu résistantes aux fortes doses d'UV. Les spores cultivées en 35 milieu liquide interagissent plus facilement avec le milieu (eau et nutriments) ce qui permet une réponse rapide avec un temps de germination plus court que pour les spores aériennes. Mais cela les rend aussi beaucoup plus sensibles aux détériorations. La culture submergée en milieu liquide n'est pas bien adaptée à la production du 40 champignon Trichoderma. La culture sur milieu solide reproduit les conditions naturelles. Elle est adaptée aux champignons filamenteux notamment Trichoderma. Pour se développer, les champignons ont besoin d'air et d'une humidité sans excès, contrairement aux bactéries et les 2903419 13 meilleures conditions sont de l'air humide contenant 61 à 94 % d'humidité relative (a, de 0,61 à 0,94). Ces conditions, peu favorables aux contaminants bactériens qui ont besoin d'une humidité élevée (a, 0,91 à 1,0), permettent de travailler avec des mesures de stérilité simplifiées. 5 Les études structurelles et biochimiques montrent que les spores de T. atroviride sont de meilleure qualité en culture en milieu solide. Elles offrent une plus grande résistance aux stress et leur viabilité est pleinement maintenue pendant 45 jours de stockage sous une humidité relative de 75 % (a,v 0,75). De plus, elles sont capables de résister à de fortes 10 doses d'UV, ce qui semble être en relation avec l'épaisseur de leur paroi et avec les pigments vert foncé qui se trouvent à la surface des spores. Le taux de tréhalose des spores aériennes est plus faible que celui des spores submergées (0,5 % contre 5,6 0/0 selon G.A. Munoz, 1995, supra). Bien que le tréhalose soit connu comme agent stabilisant des spores, il ne semble pas jouer sur la qualité des spores submergées et l'élévation du 15 taux de tréhalose est plus la caractéristique d'un stress lors de la culture qu'un avantage particulier de conservation. Les spores aériennes présentent un état dormant naturel qui les rend résistantes. Les essais montrent que les niveaux de production par unité de volume peuvent être plus 20 importants en milieu solide qu'en culture submergée. Le principal inconvénient que présente la culture en milieu solide sur de gros volumes est la régulation de la température car au cours de leur croissance, les micro-organismes produisent de la chaleur métabolique qui ne peut pas être évacuée par circulation du 25 milieu de culture. Cependant, l'insertion de surfaces d'échange de chaleur dans le lit de culture et la ventilation de la masse de substrat permettent le contrôle de la température et évitent la mort du champignon par surchauffe. La production de spores en milieu solide donne de meilleurs produits avec un meilleur 30 rendement mais demande un équipement de manutention plus complexe qu'en milieu liquide. Le rendement et la qualité des spores sont des critères essentiels dans la production de T. atroviride MUCL 45632 et ainsi la culture en milieu solide est préférée à celle en milieu liquide, malgré les problèmes liés à la manipulation des solides. 35 Mode opératoire pour la production du Trichoderma en fermenteur en milieu solide Le milieu de culture est essentiellement constitué d'un substrat d'origine végétale riche en polyholosides tels l'amidon, l'hémicellulose et la cellulose. Ce substrat pourra être constitué de manière non limitative, de graines de céréales (orge, avoine) ou de 40 légumineuses (soja, lupin, fèves), de sous-produits de l'industrie des céréales (son de céréales, germes de blé, coques de riz), de tourteaux d'extraction d'oléagineux (tournesol, coton), de déchets de l'industrie du sucre et de l'industrie de l'amidon (pulpe de betterave, bagasse de canne à sucre), de paille ou de copeaux de bois. Le substrat végétal doit être broyé grossièrement pour former une masse perméable à l'eau et à l'air. 45 Aux substances végétales, on pourra ajouter des diluants minéraux inertes destinés à diluer et à aérer le milieu. Ces diluants pourront être choisis de manière non limitative parmi les argiles calcinées en grains (attapulgite), les billes d'argile soufflées, les poudres de roches volcaniques (pouzzolane, pierre ponce), la perlite expansée, la vermiculite 50 expansée, la laine de roche. 2903419 14 Le milieu pourra être complémenté en éléments minéraux utiles à la croissance du champignon : nitrate, ammonium, ortho-phosphate, potassium, magnésium, calcium et oligo-éléments. 5 Le pH sera avantageusement acidifié à l'aide d'un acide de préférence minéral, comme l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide ortho-phosphorique, entre pH 2,7 et pH 4 et de préférence entre 2,7 et 3,3. Un milieu de culture particulièrement approprié est composé de : Milieu Pulpe de betterave Pulpe de betterave déshydratée 25,7 kg Perlite expansée 25,7 kg Acide sulfurique 92 0/0 1,2 kg Eau 47,4 L Ce milieu est soigneusement mélangé puis il est désinfecté par chauffage à 100 C pendant 2 heures directement dans le fermenteur. Le pH final après refroidissement est 15 voisin de 3. Le milieu est ensemencé à froid à l'aide d'une suspension de spores de T. atroviride dans l'eau stérile titrant entre 106 et 10' spores/mL. Le volume de suspension utilisé est 10 L pour 100 kg de milieu désinfecté. La fermentation dure de 2 à 3 semaines. Le fermenteur est alimenté en air stérile avec un débit constant de 12 L/mn pour 100 kg de milieu. La température du milieu est maintenue entre 12 et 35 C, de préférence en 20 dessous de 34 C, de manière particulièrement préférée de 20 à 25 C. En fin de culture la concentration en spores viables atteint 1 à 5.109 spores viables/g. Le substrat fermenté est ensuite déshydraté à basse température avant d'être broyé pour obtenir une poudre. La taille des grains qui compose cette poudre est variable. On pourra préparer une poudre fine (granulométrie inférieure à 100 pm) ou une poudre plus grossière (diamètre moyen 25 del à 3 mm), en fonction des usages. Cette poudre pourra être ensuite dispersée, préalablement à son administration, dans un liquide tel que de l'eau puis sera appliquée par pulvérisation ou aspersion sur les parties aériennes et/ou les racines des plantes. Alternativement, cette poudre peut être incorporée directement dans le support de culture 30 des plantes avant ou après plantation. Alternativement, cette poudre peut être mélangée à du terreau ou tout autre support de culture, le mélange sera alors déposé au pied de la plante. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la poudre est filtrée et/ou tamisée afin d'enlever les grosses particules. Ensuite, la poudre ainsi tamisée peut être incorporée 35 dans de la terre ou du terreau, comme susmentionné, ou être appliquée directement sur le feuillage des plantes à traiter. Bien évidemment, cette poudre fine pourrait également être dispersée et appliquée sur les plantes par aspersion. Les poudres précitées pourront avoir différentes utilisations. Elles pourront notamment être appliquées aux plantes à des fins phytosanitaires. Une telle application peut trouver 40 un intérêt notamment dans la lutte biologique et notamment la lutte contre certains champignons pathogènes. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, ces poudres pourront être utilisées pour stimuler la germination et/ou la croissance des graines et/ou des plantes. En effet, d'excellents résultats ont été obtenus pour de telles utilisations. 10 2903419 15 Etude de la stabilité de conservation des spores de MUCL 45632 à température ambiante 5 La stabilité de la viabilité est une propriété remarquable de la souche Trichoderma atroviride MUCL 45632. Dans les conditions habituelles de fabrication, le champignon MUCL 45632 est multiplié sur un substrat de culture solide. A l'issue de la période de fermentation, le substrat 10 chargé en spores est séché à basse température. Le produit fini déshydraté contient environ 8,5 % (poids) de spores de champignon. La viabilité des spores de la souche MUCL 45632 dans le produit fini a été étudiée sur plusieurs lots de production d'essai pendant plusieurs mois. Les spores viables sont dénombrées selon la norme NF ISO 7954. Les résultats ont été obtenus sur 5 lots successifs dans les mêmes conditions de 15 production. Les lots ont été stockés à température ambiante (de 18 à 28 C), à la lumière naturelle et dans des sacs transparents scellés. 20 Spores viables par gramme de produit sec : temps de stockage lots (date production) 0 mois 1 mois 2 mois 3 mois 4 mois B26 (été 2005) 3,0.109 2,8.109 1,6.109 1,0.109 2,3.109 B27 (été 2005) 2, 0.109 B28 (automne 2005) 1,4.109 2,1.109 B29 (automne 2005) 2, 6.1 B30 (automne 2005) moyenne 2,3.109 2,2409 1,8.109 2,0.109 1,9.109 Ecart-type 0,3.109 Les lots conservent tous une viabilité supérieure ou égale à 109 spores/g après 4 mois. En 25 moyenne, la concentration en spores viables ne change pas au cours des 4 mois d'observation. Le produit fini à base de T. atroviride MUCL 45632 conserve toute sa viabilité pendant au minimum 4 mois sans artifice, contrairement à des produits similaires qui réclamant un 30 stockage au réfrigérateur ou au congélateur ou bien l'ajout de régulateurs osmotiques. La stabilité de la viabilité de la souche MUCL 45632 est une propriété particulièrement remarquable qui répond aux attentes des utilisateurs qui recherchent des produits que l'on peut transporter et stocker sans risque de perte à température ambiante et sans le 35 problème de respect de la chaîne du froid. Effet de la température sur la croissance de la souche MUCL 45632 40 Les champignons Trichoderma sont utilisés dans la rhizosphère ou sur le feuillage des plantes. Ils sont soumis à des températures variables. II est important de connaître la 2903419 16 plage de température de croissance et il est préférable que celle-ci soit la plus large possible. L'étude de l'effet de la température consiste à mettre des bouchons mycéliens de 5 Trichoderma sur des boîtes de Pétri gélosées au PDA. Les boîtes sont ensuite déposées dans des incubateurs à 4, 14, 20, 25, 30 et 37 C. La culture dure 15 jours. Ensuite, elles sont observées pour comparer leur état de développement et de sporulation. Dans cet exemple, les souches de Trichoderma étudiées sont : - MUCL 45632 (T. atroviride, identifiée ITS-1, souche isolée par la demanderesse d'un sol en friche) - T-39 (CNCM 1-952) (Trichoderma harzianum Rifai, identifiée ITS-1, Brevet 15 EPO466133) - T-22 (1295-22, ATCC 20847) (T. harzianum Rifai, identifiée ITS-1, Brevet EP0285987) 20 Nixe 30301E (Trichoderma sp., souche isolée par la demanderesse d'une culture hors-sol d'Allium porum) - Inra AP (Trichoderma sp., collection Mme Dubos, INRA, UMR Santé Végétale, Villenave d'Ornon, France) Inra APS (Trichoderma sp., collection Mme Dubos, INRA, UMR Santé Végétale,..DTD: Villenave d'Ornon, France) Inra B11 (Trichoderma sp., collection Mme Dubos, INRA, UMR Santé Végétale, 30 Villenave d'Ornon, France) - Inra P1 (Trichoderma sp., collection Mme Dubos, INRA, UMR Santé Végétale, Villenave d'Ornon, France) Notation de la croissance et de la sporulation à différentes températures : température d'incubation Souche 4 C 14 C 20 C 25 C 30 C 37 C MUCL 45632 0 2 2 2 2 0 T-39 0 1 1 2 0 T-22 1 1 0 APS 0 1 2 2 2 1 P1 1 2 2 2 0 40 Notation : 0 pas de croissance ; 1 croissance du mycelium ; 2 croissance et sporulation 10 25 35 2903419 17 La sporulation de la souche MUCL 45632 est très intense à 20 C, ce qui correspond à son optimum de croissance. A 14 C, son développement est correct mais sa sporulation n'est pas à son maximum. A 4 C, le mycélium ne s'est pas développé mais il n'est pas mort. En effet, une fois le bouchon repiqué sur PDA et mis à incuber à 20 C, ce dernier repart 5 très bien. Par contre à 37 C, le bouchon mycélien ne repart pas ce qui signifie que le champignon MUCL 45632 est mort. Le manque de viabilité du mycélium à 37 C n'est pas gênant car les champignons pathogènes cibles ne se développent pas à cette température. La souche MUCL 45632 se comporte mieux à basse température que les autres souches 10 testées. La souche MUCL 45632 a été retenue pour sa capacité à se développer et à agir dès que les températures remontent au printemps. La plage de température active de la souche MUCL 45632 est assez large pour couvrir la période de croissance des plantes et assurer une protection pendant les périodes à risques. 15 Etude de la stimulation de la croissance des plantes. La souche Trichoderma atroviride MUCL 45632 qui se multiplie dans le sol, à proximité ou en symbiose avec les racines possède des propriétés de stimulation de la croissance des 20 plantes. Cela a été démontré par plusieurs essais sur différentes plantes. A. Stimulation de croissance des concombres (premier exemple) : Culture de concombre Cucumis sativa, variété Vert long des maraîchers en tube 25 conique de 50 ml sur perlite expansée autoclavée sous rampes lumineuses de 6000 lux pendant 21 jours. La préparation de Trichoderma MUCL 45632 (109 spores/g) est apportée dans la Perlite aux doses de 1 % (vol.) et de 3 % (vol.). Le poids frais et le poids sec des racines ont été mesurés. 30 Les résultats sont rapportés dans le tableau ci dessous (valeurs calculées par rapport au témoin): modalités poids frais par plant MUCL 45632 1 0/0 370 mg MUCL 45632 3 % 380 mg Témoin non traité 100 mg coefficient de poids sec par coefficient de variation plant variation du du poids frais poids sec 3,6 15,4 mg 2,6 16,5 mg 2,8 5,9 mg L'augmentation de poids sec, d'après le tableau ci-dessus, prouve qu'il y a eu une 35 augmentation de la production de biomasse. En outre, à la dose 1 %, le poids frais des racines est multiplié par 2,7 par rapport au témoin et le poids sec des mêmes racines par 1,6. Pour la dose 3 % les valeurs obtenues sont supérieures démontrant l'efficacité de la souche. B. Stimulation de croissance des concombres (second exemple) : 40 10 2903419 18 Culture de concombre Cucumis sativa, variété Marketer en pot sur terreau dans un Phytotron. L'intensité lumineuse est de 10000 lux, la température de 22 C et la photopériode de 16 h pendant 45 jours. La préparation de Trichoderma MUCL 45632 (109 5 spores/g) est apporté au terreau à la dose de 2 % (vol.). Le poids frais des racines et des parties aériennes sont mesurés. Les résultats sont rapportés dans le tableau ci dessous (valeur calculée par rapport au témoin): Racines Partie aérienne variation poids frais variation par plant 7,5 g 15,4 % modalités poids frais par plant 9,6 g MUCL 45632 2% 35,2 % Témoin non traité 7,1 g 6,5 g La stimulation de croissance à la dose de 2 % est importante au niveau des racines avec 35, 2 % d'augmentation. Au niveau des parties aériennes elle est de 15,4 %. 15 C. Stimulation de croissance des laitues : Culture de salade Lactuca sativa, variété Grand Rapids sur plaque multipots sur terreau. L'intensité lumineuse est de 3000 lux, la température de 25 C et la photopériode de 16 h pendant 21 jours. La préparation de Trichoderma MUCL 45632 (109 spores/g) est 20 apportée au terreau à la dose de 5 % (vol.). Le poids frais et le poids sec des parties aériennes ont été mesurés. Les résultats sont rapportés dans le tableau ci dessous (valeurs calculées par rapport au témoin): 25 MUCL 45632 5% modalités poids frais par coefficient de poids sec par coefficient de plant variation plant variation du du poids frais poids sec 144,6 mg 2,0 2,1 Témoin non traité 72,5 mg 8,4 mg 4,0 mg La stimulation de croissance à la dose de 5 % est efficace. Les coefficients d'augmentation de matière sont élevés démontrant une excellente stimulation de croissance de la part de Trichoderma MUCL 45632. L'observation du poids sec montre 30 que ce qui a été crée est de la biomasse. Trichoderma MUCL 45632 n'a pas induit une turgescence des cellules végétales mais bien une multiplication organisée de cellules végétales. C. Stimulation de croissance du riz : Culture de riz Oriza sativa, variété Ruille en tube conique de 50 ml sur Perlite autoclavée pendant 15 jours. L'intensité lumineuse est de 6000 lux, la température de 25 C et la photopériode de 16 h. La préparation de Trichoderma MUCL 45632 (109 spores/g) 35 2903419 19 est apporté dans la perlite expansée à la dose de 1 % (vol.). Le poids frais et le poids sec des tiges ont été mesurés. Les résultats sont rapportés dans le tableau ci dessous (valeurs calculées par rapport au 5 témoin) : modalités poids frais par coefficient de plant variation du poids frais 2,0 L'augmentation de poids frais s'accompagne de l'augmentation de matière sèche preuve que Trichoderma atroviride MUCL 45632 a favorisé la production de biomasse du riz en 10 culture submergée. D. Stimulation de croissance de tomates (premier exemple) : Culture de tomates Solanum lycopersicum, variété Saint Pierre en pot (7 x 7 x 6 cm) 15 sur terreau. L'intensité lumineuse est de 10000 lux, la température de 22 C et la photopériode de 16 h pendant 45 jours. La préparation de Trichoderma MUCL 45632 (109 spores/g) est apportée avec le terreau à la dose de 2 % (vol.). Le poids frais et le poids sec des tiges ont été mesurés. 20 Les résultats sont rapportés dans le tableau ci dessous (valeurs calculées par rapport au témoin) : MUCL 45632 1% Témoin non traité 43,7 mg 22,1 mg poids sec par coefficient de plant variation du poids sec 2,0 6,0 mg 3,0 mg Racines modalités poids frais variation par plant MUCL 45632 2% 1,88 g 34 % Témoin non traité 1,40 g Partie aérienne poids sec variation par plant 4,12 g 60 % 2,58 g Une fois encore, il apparaît une augmentation du poids frais aussi bien sur les racines que 25 sur les parties aériennes grâce à l'action du Trichoderma MUCL 45632. E. Stimulation de croissance de tomates (second exemple) : Culture de tomates Solanum lycopersicum, variété Saint Pierre en tube conique de 50 30 ml sur Perlite autoclavée pendant 1 mois. L'intensité lumineuse est de 6 000 lux, la température de 25 C et la photopériode de 16 h. La préparation de Trichoderma MUCL 45632 (109 spores/g) est apportée dans la Perlite à la dose de 3 % (vol.). Le poids frais et le poids sec des racines et des parties aériennes ont été mesurés. 35 Pour les racines, les résultats sont rapportés dans le tableau ci dessous (valeurs calculées par rapport au témoin) : 2903419 poids sec des coefficient de racines par plant variation du poids sec 9,5 Pour les parties aériennes, les résultats sont rapportés dans le tableau ci dessous (valeurs calculées par rapport au témoin) : 5 modalités poids frais des coefficient de poids sec des coefficient de parties variation parties variation du aériennes par du poids frais aériennes par poids sec plant plant MUCL 45632 3% 170,3 mg 8,5 14,7 mg 7, 7 Témoin non traité 20,1 mg 1,9 mg Les résultats de cette expérience démontrent une fois de plus l'effet stimulateur de la souche Trichoderma MUCL 45632. Les plants obtenus sont plus vigoureux avec un 10 chevelu racinaire très étoffé et des parties aériennes plus denses. Conclusion : L'effet stimulateur de Trichoderma MUCL 45632 a été mis en évidence dans les 6 15 exemples précédents et cela aussi bien sur les racines que les parties aériennes. Ce champignon stimule significativement la synthèse de biomasse par la plante qui se caractérise par une amélioration de la croissance, une meilleure précocité et un meilleur rendement. 20 Comme mentionné précédemment, Trichoderma atroviride MUCL 45632 possèdeégalement des propriétés antagonistes à l'égard de champignons pathogènes et constitue donc un bon agent de lutte biologique. Propriétés antagonistes Essais in vitro : La souche MUCL 45632 a fait l'objet de tests au laboratoire contre divers champignons 30 pathogènes du sol et des parties aériennes. Ces essais ont été faits à différentes températures dans la plage de développement de la souche MUCL 45632. Dans une boite de Pétri gélosée au PDA, on place à la périphérie un bouchon mycélien de la souche de Trichoderma atroviride MUCL 45632 et à l'opposé, un bouchon mycélien du 35 champignon pathogène. Après 15 jours de culture à la température choisie, le comportement de la souche de Trichoderma face au pathogène est analysé sur la base des critères : mycélium recouvert ou pas, avec ou sans sporulation. La viabilité du bouchon du pathogène est analysée en le prélevant, en le déposant sur une boîte PDA et 20 modalités poids frais des coefficient de racines par plant variation du poids frais MUCL 45632 3% 117,7 mg 9,1 Témoin non traité 12,9 mg 7,6 mg 0,8 mg 25 2903419 21 en le cultivant à 25 C. Cela permet de déterminer si, après confrontation avec Trichoderma, il est toujours capable de donner naissance à un mycélium ou s'il a été entièrement détruit. 5 Résultat des tests de compétition in vitro contre différents champignons pathogènes : Champignons pathogènes Aspergillus carbonarius Botrytis cinerea Fusarium oxysporum Phytophthora infestans Sclerotinia minor Sclerotinia sclerotiorum 15 C 25 C n.d. détruit détruit détruit détruit détruit ............................ de fruit 30 C >30 C détruit détruit détruit détruit détruit détruit détruit détruit de fruit détruit détruit détruit n.d. : non déterminé 10 La souche est remarquable dans le sens où, à partir de 15 C, elle tue Botrytis cinerea, Sclerotinia minor et Sclerotinia sclerotiorum qui sont des pathogènes actifs à basse température. Pour Aspergillus carbonarius, Fusarium oxysporum et Phytophthora infestans, la souche 15 MUCL 45632 les éradique à leur température optimale de croissance entre 25 et 30 C. Les propriétés antagonistes destinées à lutter spécifiquement contre les maladies du bois de la vigne ont été testées. Pour ce faire les tests de compétition suivants ont été réalisés : La souche MUCL 45632 a été confrontée in vitro contre divers champignons pathogènes des maladies du bois de la vigne (ITV Nîmes France). Esca : Phaeomoniella chlamydospora (Pc LR47 et Pc LR 81), Phaeoacremonium 25 aleophilum (Pa LR3 et Pa LR23) et Fomitiporia punctata (Fp LR14 et Fp LR30). Eutypiose : Eutypa tata (EIcc260 et El MT 247) Dépérissement de la syrah : Botryosphaeria obtusa (Bo F98-1 et Bo F99-8) 30 Black Dead Arm : Botryosphaeria parva (Bd 021) Greffés-soudés : Botryosphaeria stevensii (Bs 001) 35 Dans une boite de Pétri gélosée au Malt-Agar, on place à la périphérie un bouchon mycélien de la souche de Trichoderma atroviride MUCL 45632 et à l'opposé, un bouchon mycélien du champignon pathogène. Trois répétitions sont faites pour chaque test. Les boîtes de Pétri sont cultivées à 25 C. La croissance du champignon pathogène seul sert de témoin. La distance d'inhibition I, exprimée en mm, correspond à la différence entre le 40 rayon moyen R1 de la colonie de la boîte témoin et le rayon moyen R2 qui est situé sur la droite reliant le centre des deux protagonistes en confrontation (I = R1 - R2). Le taux d'inhibition est calculé au bout de : 20 2903419 22 4 jours pour Botryosphaeria parva (Bd 021), 5 jours pour Botryosphaeria obtusa (Bo F98-1 et Bo F99-8) et Botryosphaeria 5 stevensii (Bs 001), 7 jours pour Eutypa tata (EIcc260 et El MT 247) et Fomitiporia punctata (Fp LR14 et Fp LR30), 10 9 jours pour Phaeomoniella chlamydospora (Pc LR47 et Pc LR 81), 12 jours pour Phaeoacremonium aleophilum (Pa LR3 et Pa LR23). Le comportement de la souche de Trichoderma face au pathogène est analysé sur la base 15 des critères de recouvrement du mycélium, de sporulation et de zone de mélanisation. La viabilité du bouchon du pathogène après essai est analysée en le prélevant, en le déposant sur une boîte Malt-Agar et en le cultivant à 25 C. Cela permet de déterminer si, après confrontation avecTrichoderma, il est toujours viable ou a été détruit. La souche MUCL 45632 est comparée à la souche de Trichoderma 1-3151 qui a subi les mêmes tests dont les résultats sont publiés dans le brevet FR2864832. Résultat des tests de confrontation in vitro contre différents champignons pathogènes du 25 bois de la vigne : Distance d'inhibition (mm) Champignon pathogène MUCL 45632 1-3151 Phaeomoniella chlamydospora Pc LR47 4,3 3 Phaeomoniella chlamydospora Pc LR81 Phaeoacremonium aleophilum Pa LR3 Phaeoacremonium aleophilum Pa LR23 Fomitiporia punctata Fp LR14 Fomitiporia punctata Fp LR30 Eutypa lata Elcc260 Eutypa lata El MT 247 Botryosphaeria obtusa Bo F98-1 Botryosphaeria obtusa Bo F99-8 Botryosphaeria parva Bd 021 Botryosphaeria stevensii Bs 001 La souche MUCL 45632 présente une efficacité incontestable contre les maladies dues 30 aux Botryosphaeria : dépérissement de la syrah, Black Dead Arm et greffés-soudés. Les diamètres d'inhibition sont élevés, démontrant ainsi l'action positive de MUCL 45632. A l'observation binoculaire, elle recouvre entièrement les pathogènes et fructifie en les tuant irrémédiablement. 20 2903419 23 Contre l'esca de Phaeomoniella chlamydospora et de Fomitiporia punctata, elle montre une bonne efficacité car elle recouvre entièrement les pathogènes et fructifie en les tuant complètement. Son efficacité est limitée contre l'esca due aux souches Pa LR3 et Pa LR23, dans le sens où elle inhibe la croissance des pathogènes mais ne les tue pas, de la 5 même manière que la souche 1-3151. Contre l'eutypiose (EIcc260 et El MT 247), la souche MUCL 45632 montre des diamètres d'inhibitions acceptables. 10 En conclusion, la souche Trichoderma atroviride MUCL 45632 possède une bonne capacité de lutte contre les maladies du bois : elle est très efficace contre le dépérissement de la syrah, le Black Dead Arm et les greffés-soudés et équivalente à la souche Trichoderma 1-3151 dans le cas des autres maladies. 15 Essais en champ et sous serre : A. Etude sur radis (Raphanus sativus) contre Fusarium oxysporum et Rhizoctonia solani du sol. Le produit formulé Trichoderma atroviride MUCL 45632 (109 spores/g) a été appliqué selon deux modalités sur une culture de radis dans un sol infectée par F. oxysporum et R. solani. Le nombre de plantes est 130.000 sur 500 m2. Dans cet essai, le Trichoderma est apporté par aspersion. 25 Produit testé Modalité Plantes malades Préparation 1 application 2 g/m2 au semis et 1 24 0/0 MUCL 45632 application 1 g/m2 à 15 jours Préparation 1 application 2 g/m2 au semis et 2 0 % MUCL 45632 applications 2 g/ m2 espacées de 7 j Traitement conventionnel conditions standard 0% Laicon-L (Polyoxin B) Le traitement par la préparation de Trichoderma atroviride MUCL 45632 offre une protection comparable à celle du produit antibiotique Laicon-L (Polyoxin B). 30 B. Essai sur tomate (Solanum lycopersicum) sous serre contre Botrytis cinerea. Le produit formulé Trichoderma atroviride MUCL 45632 (109 spores/g) a été appliqué sur des plants de tomates dont 4 feuilles ont été sectionnées. Après séchage de l'application de Trichoderma, les plantes sont infectées artificiellement par une suspension de Botrytis 35 cinerea. Le nombre de plantes est 48 (4 parcelles de 12). L'évolution de la maladie sur les plaies de section des feuilles est observée après 13 jours. 20 40 2903419 24 Produit testé Modalité Indice d'infection Indice d'infection plaies à l'air libre plaies enveloppées Préparation 1 pulvérisation à 1 1,07 / 4 2,65 / 4 MUCL 45632 Traitement 1 pulvérisation à 1,14 / 4 conventionnel Scala 0,2 mL/m2 (Pyrimethanil) Témoin non traité 3,65/4 Le traitement par la préparation de Trichoderma MUCL 45632 offre une protection comparable à celle du traitement chimique conventionnel. 5 Lorsque les plaies de taille sont à l'air libre, cette protection est bonne. C. Essai sur piment (Capsicum annuum) sous serre contre Phytophthora capsici. Le produit formulé Trichoderma atroviride MUCL 45632 (109 spores/g) a été appliqué sur 10 les plants de piment 1 mois après le semis en février puis tous les 15 à 30 jours, jusqu'au mois d'août. Les semis ont été faits sous tunnel en terrain désinfecté et les jeunes plantes ont été transplantées en champ en mai. Le nombre de plantes est 1800 (environ 800 m2). L'infection par Phytophthora capsici est naturelle. Les symptômes de la maladie sont mesurés dès leur apparition au mois d'août. Produit testé Modalité Taux de plantes Taux de plantes malades malades 16/08 28/08 Préparation 3 pulvérisations de semis à 1,5 % 7,6 0/0 MUCL 45632 33, 20 et 10 g/m2, 1 pulvérisation en champ à 20 kg/ha, 5 pulvérisation en champ à 4,5 kg/ha Témoin non traité Le traitement par la préparation de Trichoderma MUCL 45632 réduit significativement le taux de plantes malades. 20 D'autres aspects de l'invention, en particulier d'autres utilisations du Trichoderma atroviride selon l'invention ou de ses produits dérivés, seront apparents à l'homme du métier et sont compris dans l'étendue de la protection. 15..FT: NOUVELLE SOUCHE DE TRICHODERMA ATROVIRIDE, UN MILIEU DE CULTURE LA CONTENANT, AINSI QUE L'UTILISATION DE LADITE SOUCHE NOTAMMENT COMME STIMULANT DE LA GERMINATION ET/OU DE LA CROISSANCE DES PLANTES REVENDICATIONS 5 1. Souche de Trichoderma atroviride, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche Trichoderma atroviride déposée à la Mycothèque de l'Université catholique de 10 Louvain sous la référence BCCM/MUCL 45632. 2. Souche de Trichoderma atroviride selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle possède les aspects culturaux suivants : 15 - sur milieu PDA (Potato Dextrose Agar), il apparaît rapidement, en deux jours environ, un thalle ras translucide qui devient blanc le troisième jour avec l'apparition des conidiophores ; ce mycélium ras vire au vert très sombre au bout de cinq jours, signe d'une sporulation intense et le revers de la culture est incolore ; 20 - sur milieu MA (Malt Agar), son développement est légèrement différent et caractéristique de l'espèce Trichoderma atroviride, le mycélium forme des cercles concentriques de sporulation vert intense autour du point d'inoculation avec un thalle qui reste translucide jusqu'à la fin de la culture ; l'aspect microscopique est le même sur les deux milieux, les conidiophores sont très ramifiés avec des cellules 25 conidiogènes (phialides) disposées en verticille par 2 ou 3, lesdites phialides sont ampulliformes, droites ou incurvées, de dimensions 2,5 à 3 pm par 8 à 14 pm et les conidies réunies au sommet de la phialide, sont globuleuses à paroi lisse, de couleur verte et mesurent environ 3 pm de diamètre ; 30 - ladite souche se développe entre 12 C et 36 C avec un optimum de croissance entre 20 C et 25 C sur les milieux gélosés classiques de type PDA, MA, OA (Oat Meal Agar). 3. Ascomycète tel que déposé à la Mycothèque de l'Université catholique de Louvain 35 sous la référence BCCM/MUCL 45632. 4. Clone de Trichoderma atroviride caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de la nouvelle souche selon la revendication 1 ou 2. 40 5. Milieu de culture de Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632 caractérisé en ce qu'il comprend au moins un Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632 et au moins un substrat, particulièrement un substrat d'origine végétale et plus particulièrement un substrat riche en polyholosides tels que l'amidon, l'hémicellulose ou la cellulose. 45 6. Milieu de culture selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comprend au moins un diluant minéral inerte. 7. Milieu de culture selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit diluant est spécifiquement sélectionné pour diluer et/ou aérer ledit milieu de culture, par 50 exemple, ledit diluant est choisi dans le groupe constitué par les argiles calcinées en grains telles que l'attapulgite, les billes d'argile soufflées, les poudres de roches volcaniques comme la pouzzolane ou la pierre ponce, la perlite expansée, la vermiculite expansée et la laine de roche. 2903419 26 8. Milieu de culture selon l'une des revendication 5 à 7 caractérisé en ce qu'il comprend au moins un élément minéral utile à la croissance du Trichoderma atroviride tel qu'un nitrate, de l'ammonium, un orthophosphate, du potassium, du magnésium, du calcium ou un oligo-élément. 9. Milieu de culture selon l'une des revendications 5 à 8 caractérisé en ce qu'il comprend un acide, de préférence minéral, permettant de maintenir le pH du milieu entre 2 et 4 et de préférence entre 2,7 et 3,3. 10. Concentré déshydraté de Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632, particulièrement sous forme de poudre. 11. Procédé d'obtention d'une poudre à base de Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632 caractérisé ce qu'il comprend les étapes de fermentation du milieu de culture selon les revendications 5 à 9, de déshydratation à basse température, éventuellement suivies d'une étape de broyage. 12. Poudre susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 11. 13. Utilisation de Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632 comme stimulant de la germination et/ou de la croissance des plantes. 14. Utilisation de Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632 en tant qu'agent de biocontrôle, notamment contre les champignons pathogènes des plantes. 15. Procédé d'isolement de Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : a) Prélèvement d'un extrait de champignon Trichoderma atroviride dans un milieu adéquat comme un sol inculte ou cultivé, sur les plantes ou dans les bois en décomposition issus de ceps de vigne, de branches ou de troncs d'arbres, b) Dilution de l'extrait prélevé avec de l'eau stérile, c) Culture de cet extrait sur au moins un milieu sélectif, ledit milieu sélectif étant compris dans le groupe constitué par : le milieu MA2 (malt agar 2%) et le milieu RB-SF (McFadden et Sutton), d) Repiquage des champignons Trichoderma atroviride issus de spores isolées dans des boîtes de Pétri contenant du milieu PDA (Potato Dextrose Agar), e) Culture des champignons repiqués dans une étuve à 25 degrés Celsius pendant une durée comprise entre deux et cinq jours, de préférence entre trois et quatre jours, f) Identification, via une observation microscopique réalisée sur un fragment de mycélium prélevé à l'issue de l'étape précédente et préalablement coloré avec un colorant bleu coton au lactophénol, de champignons Trichoderma atroviride BCCM/MUCL 45632.