FR 2905467 A1 20080307 FR 0706124 A 20070831 1 ISOFORMES DE tNOX SPECIFIQUES DE LA NEOPLASIE ET PROCEDES ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION Le domaine de l'invention est le domaine de la biochimie des protéines, en particulier, tel que lié au diagnostic des cellules néoplasiques et malades, tel que lié précisément aux isoformes particulières d'un marqueur de surface cellulaire caractéristique de néoplasie en général et avec des formes spécifiques d'expression protéique indicatives de types de cancers spécifiques. La détection des isoformes particulières s'effectue en utilisant des anticorps spécifiques. Il existe une famille unique liée à la croissance d'hydroquinone ou NADH oxydases de surface cellulaire avec une activité d'échange thiol-disulfure des protéines appelées protéines ECTO-NOX (pour les NADH oxydases de surface cellulaire) (1,2). Un membre de la famille ECTO-NOX, appelé tNOX (pour tumor associated û associé à la tumeur) est spécifique des surfaces des cellules cancéreuses et des sérums des patients cancéreux (3,4). La présence de la protéine tNOX a été démontrée pour plusieurs tissus de tumeurs humains (carcinome mammaire, cancer de la prostate, neuroblastome, carcinome du côlon et mélanome) (5) et l'analyse sérique suggère une association beaucoup plus vaste avec le cancer humain (6, 7). Les protéines NOX sont des ectoprotéines ancrées dans le feuillet externe de la membrane plasmique (8). Comme il est caractéristique d'autres exemples d'ectoprotéines (sialyl et galatosyl transférase, dipeptidylamino peptidase IV, etc.), les protéines NOX sont relarguées. Elles apparaissent sous forme soluble dans des milieux conditionnés de cellules cultivées (5) et dans les sérums des patients (6,7). La forme sérique des tNOX des patients cancéreux présente le même degré de réactivité aux médicaments que la forme associée à la membrane. Les activités de tNOX en réponse aux médicaments sont observées dans les sérums d'une variété de patients cancéreux humains, dont les patients atteints de leucémie, lymphomes ou tumeurs solides (prostate, sein, côlon, poumons, pancréas, ovaires, foie) (6,7). Une 2905467 2 extrême stabilité et une résistance à la protéase de la protéine tNOX (9) peuvent aider à expliquer sa capacité à s'accumuler dans les sérums des patients cancéreux à des taux facilement détectables. En revanche, aucune activité des NOX sensibles aux médicaments n'a été observée dans les sérums de volontaires en bonne santé (6,7) ou 5 dans les sérums des patients avec des troubles autres que la néoplasie. Si la base pour la spécificité au cancer de la tNOX de surface cellulaire n'a pas été déterminée, le concept est fortement soutenu par plusieurs éléments. Une activité de tNOX en réponse aux médicaments a été rigoureusement déterminée comme étant absente des membranes plasmiques des cellules et tissus humains et 10 animaux non transformés (3). Les protéines tNOX sont dépourvues d'un domaine de liaison transmembranaire (10) et sont libérées de la surface cellulaire par un bref traitement à pH faible (9). Aucune activité de tNOX en réponse aux médicaments n'a été détectée dans les sérums des volontaires en bonne santé ou des patients avec des maladies autres que le cancer (6, 7). Plusieurs antisérums de tNOX ont identifié la 15 bande immunoréactive à 34 kDa (le poids moléculaire traité d'une des formes de surface cellulaire de tNOX) avec l'analyse Western blot ou l'immunoprécipitation quand on utilise des cellules ou tissus transformés ou des sérums de patients atteints de cancers comme source d'antigènes (5,10,11). La bande immunoréactive à 34 kDa est absente avec l'analyse Western blot ou l'immunoprécipitation quand on utilise 20 des cellules et tissus non transformés ou des sérums de volontaires en bonne santé ou de patients avec des troubles autres que le cancer (5,10,11). Ces antisérums comprennent un anticorps monoclonal (5), un fragment variable simple chaîne (scFv) qui réagit avec la NADH oxydase de surface cellulaire des cellules normales et néoplasiques, des antisérums polyclonaux produits en réponse à la tNOX exprimée 25 (11) et des antisérums de peptides polyclonaux contre la région conservée de liaison du nucléotide adénine de tNOX (11). L'ADNc de tNOX a été cloné (GenBank Accession Na AF207881 ; 11 ; US Patent Publication 2003-0207340 Al). Le poids moléculaire dérivé du cadre ouvert de lecture était de 70,1 kDa. Les motifs fonctionnels comprennent un site de liaison quinone, un site de liiaison du nucléotides adénine et une paire de cystéine CXXXXC comme site d'échange disulfure-thiol de protéine potentiel basé sur la mutagenèse dirigée (Il). Selon les informations génomiques disponibles (12) le gène tNOX est 2905467 3 situé sur le chromosome X, et il est composé de plusieurs exons (treize). On sait qu'il existe plusieurs ARNm d'épissage alternatif et protéines exprimés. La lignée cellulaire hybridome qui produit l'anticorps monoclonal spécifique de la NADH oxydase tumorale MAB 12.1 a été déposée à l'American Type Culture 5 Collection, Manassas, Virginie, 20108 le 4 avril 2002, sous les termes du Traité de Budapest. Ce dépôt est identifié par le numéro d'accès ATCC PTA-4206. Le dépôt sera conservé avec restriction dans le dépôt ATCC pendant une période de 30 ans à partir de la date de dépôt, ou 5 ans après la demande la plus récente, ou pendant la vie efficace du brevet, quelle que soit la période la plus longue, et sera remplacée si 10 le dépôt devient non viable pendant cette période. Cet anticorps monoclonal est décrit dans le brevet US 7 053 188, délivré le 30 mai 2006. Etant donné que le cancer constitue une menace importante pour la santé humaine et parce que le cancer entraîne des coûts économiques importants, on ressent depuis longtemps dans le métier la nécessité d'un système efficace, 15 économique et techniquement simple pour déterminer la présence de cancer. RESUME DE L'INVENTION La présente invention propose un procédé pour l'analyse d'un échantillon biologique pour la présence d'isoformes particulières de l'antigène pan-cancer 20 désigné sous le nom tNOX (ou NADH oxydase spécifique de tumeur). Le présent procédé comprend une électrophorèse sur gel bidimensionnelle et un immunotransfert utilisant un anticorps spécifique de l'antigène tNOX pan-cancer et les diverses isoformes qui caractérisent les types de cancers particuliers. Tel qu'illustré précisément, environ 4-6 mg de protéines sont chargés pour l'analyse. 25 La présente invention propose un procédé pour la détection d'isoformes tNOX particulières de plasma ou de sérum spécifique du cancer comme indicateurs de la présence de cancer et du type de cellules ou de tissus d'origine cancéreuse (sein, ovaires, prostate, etc.). Les isoformes de tNOX sont identifiées selon leur masse moléculaire et le point isoélectrique avec une détection utilisant un anticorps 30 monoclonal spécifique de tNOX (MAB) (brevet US Na US 7 053 188), utilisant un fragment variable simple chaîne (ScFv) qui reconnaît toutes les protéines NOX de surface cellulaire (à la fois liés à l'âge, aux cellules normales et à la NADH oxydase 2905467 4 spécifique de néoplasie) ou en utilisant des sérums polyclonaux dirigés contre tNOX. Les protéines ECTO-NOX sont d'abord enrichies et concentrées à partir d'un échantillon biologique, de préférence un échantillon de sérum, par liaison au nickelagarose puis élution. Après libération des protéines du nickel-agarose par vortex, les 5 protéines sont séparées dans la première dimension par électrofocalisation et dans la seconde dimension par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Tel qu'illustré précisément ici, l'étape d'électrofocalisation se fait sur une zone de pH de 3 à 10, et la séparation par taille se fait sur un gel de polyacrylamide 10 %. La plupart des isoformes de tNOX spécifiques du cancer présentent des points électriques dans une 10 gamme très serrée entre pH 4,4 et 5,4 mais diffèrent en poids moléculaire de 34 à 136 kDa. Dans le système de gel 2D précisément illustré, les isoformes spécifiques de cancer sont situées dans les Quadrants I (matériel à poids moléculaire relativement élevé) et IV (matériel à poids moléculaire plus faible, notamment les isoformes de 34 et 43 kDa). Les chaînes lourdes d'IgG (Quadrant II) et les chaînes 15 légères d'IgG (Quadrant III) réagissent de façon croisée avec l'anticorps ScFv et servent de témoins de charge. L'absence de toutes les isoformes de tNOX indique l'absence de cancer ; la présence d'une isoforme de tNOX indique la présence de cancer. Le poids moléculaire particulier présent dans un échantillon de sérum ou une combinaison particulière d'isoformes donne une indication du type de cellules ou du 20 tissu d'origine du cancer. Le procédé non seulement détermine la présence de cancer, mais également le procédé de la présente invention fournit des informations diagnostiques concernant le tissu d'origine. Actuellement il n'existe pas d'autres tests pan-cancer (toutes les formes de cancer) avec ces capacités particulières. La présente invention propose un procédé pour déterminer la néoplasie chez 25 un mammifère, y compris un humain, ledit procédé comprenant les étapes consistant à détecter la présence de cancer, dans un échantillon biologique. La présente invention propose en outre d'autres informations pour l'évaluation de la néoplasie, dont la mesure de la masse tumorale, par exemple dans le sérum, le plasma, l'urine, la salive ou dans un matériel de biopsie. 30 Sont également dans la portée de la présente invention les isoformes particulières de tNOX associées à des cancers (primaires) spécifiques : une protéine tNOX avec des poids moléculaires apparents d'environ 64, 66 et/ou 68 kDa est associée à un cancer du sein ; deux protéines tNOX d'environ 40,5 et 52 kDa sont 2905467 5 associées à un cancer du poumon à petites cellules ; une protéine tNOX d'environ 40,5, 52 et 80 kDa caractérise un cancer des ovaires ; deux isoformes de tNOX d'environ 75 kDa désignées 75a et 75(3 sont associées au cancer de la prostate ; une protéine tNOX d'environ 94 kDa est associée au cancer du col de l'utérus ; une 5 protéine tNOX d'environ 43 et 52 kDa est caractéristique du cancer du côlon ; et une isoforme de tNOX d'environ 54 kDa est associée à un cancer du poumon non à petites cellules. Lorsqu'un patient est suspecté d'avoir un cancer, un échantillon biologique, de préférence un échantillon de sérum, peut être préparé, et l'électrophorèse sur gel 2D / l'analyse immunologique de la présente invention 10 peuvent être effectuées. Des résultats positifs sont indicateurs de la présence d'un cancer, et la détection des protéines caractéristiques permet une présomption quant à l'incidence primaire du cancer chez le patient en fonction de l'association d'une ou plusieurs protéine(s) particulière(s) avec des origines cancéreuses particulières, comme énoncé ci-dessus. 15 Les procédés de la présente invention peuvent également être appliqués pour évaluer la réponse au traitement, avec des quantités décroissantes d'isoforme(s) de NOX reflétant un traitement réussi, ainsi que la détection précoce de la maladie récurrente (reflétée par une augmentation ou une réapparition des isoformes spécifiques de tNOX). 20 BREVE DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 donne les résultats de l'électrophorèse sur gel 2-D des protéines sériques enrichies ECTO-NOX à partir d'une préparation de mélange de sérums de patients cancéreux (sein, ovaires, poumons et côlon) concentrés par précipitation par 25 nickel-agarose, suivie par une analyse par immunotransfert. La séparation dans la première dimension s'est faite par électrofocalisation et dans la seconde dimension par SDS-PAGE (en utilisant des ampholytes sur la zone de pH de 3 à 10 et du gel de polyacrylamide 10 %). A des fins d'interprétation, le gel est divisé en quadrants I-IV avec de l'albumine non réactive (albumine) au centre. La détection s'est faite avec un 30 anticorps à région variable simple chaîne (scFv) recombinant anti-tNOX (MAB 12.1 scFv) portant une étiquette S suivie d'un anti-S lié à la phosphatase alcaline (Novagen cat. # 69598-3 ou un produit équivalent) avec un substrat NBT Western 2905467 6 Blue (Promega, Madison, WI ; Cat. N S3841 ou produit équivalent). Les protéines réactives apparaissent en bleu rouge. La figure 2 montre les résultats de la carte de gel 2-D analytique généralisée des isoformes de tNOX situées dans le quadrant I identifié utilisant le système 5 diagnostique de la figure 1. La figure 3 montre les résultats de la carte de gel 2-D analytique généralisée des isoformes de tNOX putatives situés dans le quadrant IV identifié en utilisant le système diagnostique de la figure 1. La figure 4 montre les résultats de l'électrophorèse sur gel 2-D analytique et 10 l'immunotransfert utilisant un anticorps spécifique de tNOX sur le quadrant IV du gel 2-D du sérum d'une patiente avec un cancer des ovaires. Les isoformes de tNOX du cancer des ovaires de 40,5, 52 et approximativement 80 kDa sont marquées par des flèches. La figure 5 montre les résultats de l'électrophorèse sur gel 2-D analytique et 15 l'immunotransfert utilisant un anticorps spécifique de tNOX ; comme sur la figure 1 sauf qu'elle montre seulement les quadrants I et IV du même gel 2-D de sérum d'un patient avec un cancer des poumons à petites cellules. Ces sérums contiennent à la fois les isoformes de tNOX 40,5 kDa et 52 kDa (flèches), typiques des sérums de patients avec ce cancer. 20 La figure 6 rnontre les résultats de l'électrophorèse sur gel 2-D analytique et l'immunotransfert utilisant un anticorps spécifique de tNOX. Cette figure est comme sur la figure 1 sauf qu'elle montre seulement le quadrant I et le quadrant IV du gel 2-D du sérum d'un patient avec un cancer du poumon non à petites cellules. Ce sérum contient une isoforme de tNOX de 54 kDa caractéristique du cancer du poumon non 25 à petites cellules (flèche). La figure 7 montre les résultats de l'électrophorèse sur gel 2-D analytique et l'immunotransfert utilisant un anticorps spécifique de tNOX. Cette figure est comme sur la figure 1 sauf qu'elle montre seulement le quadrant I et le quadrant IV du gel 2-D du sérum d'une patiente avec un cancer du sein. Ce sérum contient une isoforme 30 de tNOX de 68 kDa, l'une des isoformes caractéristiques du cancer du sein (flèche). La figure 8 montre les résultats de l'électrophorèse sur gel 2-D analytique et de l'immunotransfert utilisant un anticorps spécifique de tNOX. Cette figure est comme sur la figure 1 sauf qu'elle montre seulement le quadrant I du gel 2-D du 2905467 7 sérum d'un patient avec un cancer de la prostate. Le plasma et le sérum des patients atteints du cancer de la prostate contiennent une isoforme de tNOX de 75 kDa caractéristique (flèches) de points isoélectriques pH 5,8 (a) et pH 5,2 ((i) respectivement. 5 La figure 9 montre les résultats de l'électrophorèse sur gel 2-D analytique et de l'immunotransfert utilisant un anticorps spécifique de tNOX. Cette figure est comme sur la figure 1 sauf qu'elle montre seulement le quadrant I d'un gel 2-D de sérum d'une patiente avec un cancer du col de l'utérus. Ces sérums contiennent une isoforme de tNOX de 94 kDa caractéristique du cancer du col de l'utérus (flèche). 10 La figure 10 montre les résultats de l'électrophorèse sur gel 2-D analytique et de l'immunotransfert utilisant un anticorps spécifique de tNOX. Cette figure est comme sur la figure 1 sauf qu'elle montre seulement le quadrant I d'un gel 2-D de sérum d'un patient avec un cancer du côlon. Ce sérum contient des isoformes de tNOX de 52 et 43 kDa caractéristiques du cancer du côlon (flèches). 1 5 La figure I l montre les résultats de l'électrophorèse sur gel 2-D analytique et de l'immunotransfert utilisant un anticorps spécifique de tNOX. Cette figure est comme sur la figure 1 sauf qu'elle montre seulement le quadrant I et le quadrant IV du gel 2-D du sérum d'un patient avec un cancer primaire inconnu. Ce sérum contient des isoforrrtes tNOX de 40,5, 52 et environ 80 kDa. Le diagnostic basé sur 20 cette analyse est que le cancer primaire est d'origine ovarienne. La figure 12 montre les résultats de l'électrophorèse sur gel 2-D analytique et de l'immunotransfert utilisant un anticorps spécifique de tNOX de sérums d'un patient avec un lymphome non hodgkinien illustrant l'isoforme de tNOX de 43 kDa de point isoélectrique bas caractéristique des cancers hématologiques. 25 La figure 13 montre les résultats de l'électrophorèse sur gel 2-D analytique et de l'immunotransfert utilisant un anticorps spécifique de tNOX. Cette figure est comme sur la figure 1 sauf qu'elle montre seulement le quadrant I et le quadrant IV du gel 2-D de mélanges de sérums de plus de 25 patients aléatoires avec des troubles autres que le cancer. ou des sérums et plasma de volontaires en bonne santé. Les 30 quadrants I et IV sont: tous deux dépourvus d'isoformes de tNOX. La figure 14 résume les isoformes tNOX particulières caractéristiques des cancers survenant couramment. 2905467 8 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Le système diagnostique du cancer de la présente invention utilise des techniques d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide bidimensionnel pour la séparation des protéines dans les sérums humains pour générer des patrons et des 5 compositions d'isoformes spécifiques du cancer indicatives de la présence de cancer, du type de tumeur., de la gravité de la maladie et de la réponse thérapeutique. Le protocole est conçu pour la détection d'au moins 20 isoformes de tNOX spécifiques du cancer qui sont séparées pour indiquer la présence de cancer et la gravité de la maladie. Ce mémoire illustre le processus du protocole d'électrophorèse sur gel 10 bidimensionnel séparant les isoformes et l'immunoanalyse ultérieure pour détecter les isoformes tNOX qui reflètent les cancers particuliers. L'électrophorèse sur gel bidimensionnelle sépare par déplacement en deux dimensions orientées à angles droits l'une par rapport à l'autre et l'immunotransfert identifie les isoformes tNOX. Dans la première dimension les isoformes sont 15 séparées selon la charge (pl) par électrofocalisation (IEF). Les isoformes sont ensuite séparées selon la taille (Mr) par SDS-PAGE dans une seconde dimension. Les isoformes sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose pour une analyse plus approfondie en utilisant une préparation d'anticorps spécifique pan-cancer. 20 Des lapins ont été immunisés et des sérums ont été préparés contre un composant de 33,5 kDa de milieu de culture conditionné par la croissance des cellules HeLa qui présentaient une activité antitumorale de la NADH oxydase inhibée par la sulfonylurée (Morré et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1240:11-17) et la capsaïcine (Morré et al. (1995) Proc. Nat/. Acad. Sci . USA 92 : 1831-1835) et 25 étaient capables de se lier au (3H)-LY181984. Ces antisérums avaient une réaction croisée sur les Western blots avec la protéine tNOX de 34 kDa des cellules HeLa et avec les bandes de multimères de 68 kDa et 136 kDa du matériel des séparations FPLC enrichies en activité de la NADH oxydase inhibée par la capsaïcine. Aucune réactivité n'a été observée avec les sérums pré-immuns. 30 Les anticorps spécifiques de la tNOX de membrane plasmique et les formes répandues dans l'urine et le sérum des patients atteints de cancer et des animaux avec des troubles néoplasiques sont utiles, par exemple, comme sondes pour cribler les bibliothèques d'expression d'ADN ou pour détecter ou diagnostiquer un trouble 2905467 9 néoplasique dans un échantillon d'un humain ou un animal. Les anticorps (ou anticorps secondaires qui sont spécifiques de l'anticorps qui reconnaît la tNOX) peuvent être liés à une substance qui fournit un co-facteur, un inhibiteur, un agent fluorescent, un agent chimioluminescent, des particules magnétiques ou autre signal 5 détectable. Les étiquettes adaptées comprennent mais sans s'y limiter les radionucléides, les enzymes, les substrats, les particules magnétiques et analogues. Les brevets US décrivant l'utilisation de ces fractions détectables (étiquettes) comprennent, mais sans s'y limiter, les N 3 817 837 ; 3 850 752 ; 3 939 350 ; 3 996 345 ; 4 277 437 ; 4 275 149 ; 4 331 647 ; 4 348 376 ; 4 361 544 ; 5 444 744 ; 10 4 460 561 ; 4 624 846 ; 4 366 241 ; 5 716 595, entre autres. Pour une utilisation dans les schémas thérapeutiques, l'anticorps de la présente invention peut être couplé à un radionucléide thérapeutique, un agent chimioluminescent, un agent ribonucléolytique ou une toxine. Voir, entre autres, les brevets US N 5 541 297, 6 395 276. L'invention peut être mieux comprise par les exemples suivants non limitants. 15 La préparation des échantillons est effectuée comme suit : Concentration et enrichissement de laprotéine sérique tNOX 1. Ajouter 40 pl de billes de nickel-agarose dans un tube microfuge 20 a. Secouer les billes pour rompre les agrégats et amener complètement à une solution b. Couper environ 2 mm de l'extrémité avant utilisation 2. Laver les billes a. Ajouter 400 pl de l'H2O distillée désionisée pour remplir les tubes 25 b. Vortexer les tubes, en mélangeant complètement les billes pendant 2-3 secondes c. Centrifuger les tubes à 1 000 g pendant 30 secondes d. Placer les tubes verticalement dans des porteurs permettant aux agrégats de se sédimenter 30 e. Eliminer le surnageant d'eau / éthanol 3. Ajouter 400 l de sérum aux billes 4. Vortexer les tubes pendant 2-3 secondes pour rompre les agrégats 2905467 10 5. Incuber les tubes sur le côté horizontal à 4 C sur un agitateur pendant une nuit Purification des protéines 5 1. Centrifuger les tubes (ci-dessus) à 1 000 g pendant 30 secondes 2. Eliminer le surnageant 3. Laver les billes 3x avec de l'H2O distillée désionisée tel que décrit ci-dessus 10 La première dimension (électrofocalisation, IEF) est effectuée comme suit : Ré-hydratation des bandes 1. Préparer, / décongeler la solution de ré-hydratation a. Ajouter du dithiothréitol (DTT) 1 % à la solution immédiatement avant 15 l'utilisation (0,014 g/1,4 ml) 2. Ajouter 150 l de solution de ré-hydratation à l'échantillon lié à l'agarose 3. Vortexer les tubes pendant 75 minutes 4. Retirer les bandes d'Immobiline DryStrips (Amersham Pharmacia Biotech) du congélateur et lets laisser s'équilibrer à température ambiante pendant 5 minutes 20 (mais pas plus de 10 minutes avant l'utilisation). 5. Marquer le dos en plastique des bandes avec un marqueur noir. 6. Centrifuger l'échantillon à 1 000 g pendant 1 minute pour agréger les billes. 7. Placer les tubes dans le porteur verticalement et laisser l'agrégat se sédimenter complètement. 25 8. Charger 125 tl d'échantillon (surnageant) sur un plateau à plat par DryStrip de 7 cm. 9. Placer les DryStrips côté gel vers le bas sur l'échantillon 10. Vérifier que l'échantillon est réparti uniformément sur la bande en soulevant soigneusement la bande et en la replaçant dans l'échantillon plusieurs fois 30 si nécessaire. 11. Si les échantillons sont concentrés dans une région de la bande, répartir l'échantillon par pipetage. 2905467 11 12. Retirer les bulles d'air en appuyant doucement sur la DryStrip avec une pointe de pipette. 13. Placer un couvercle sur le plateau, et placer le plateau dans un sac plastique avec des serviettes en papier humides. 5 14. Sceller le sac. 15 Laisser l'échantillon se réhydrater toute la nuit (entre 12 et 24 heures) à température ambiante sur une surface plane en laissant les bandes absorber les échantillons. 10 Autre préparation d'échantillon 1. Préparer / décongeler la solution de ré-hydratation a. Ajouter du dithiothréitol (DTT) 1 % à la solution immédiatement avant l'utilisation (0,014 g/1,4 ml) (mise en contact avec un agent réducteur) 2. Ajouter 135 pl de solution de ré-hydratation par tube microfuge 15 3. Ajouter 15 !al de sérums par tube microfuge 4. Faire tourner les tubes pendant 15 minutes 5. Retirer les bandes d'Immobiline DryStrips (Amersham Pharmacia Biotech) du congélateur et les laisser s'équilibrer à température ambiante pendant 5 minutes (mais pas plus de 10 minutes). 20 6. Marquer le dos en plastique des bandes. 7. Charger 125 1.11 d'échantillon sur un plateau à plat par DryStrip de 7 cm. 8. Placer les DryStrips côté gel vers le bas sur l'échantillon 9. Vérifier que l'échantillon est réparti uniformément sur la bande en soulevant soigneusement la bande et en la replaçant dans l'échantillon plusieurs fois 25 si nécessaire. 10. Si les échantillons sont concentrés dans une région de la bande, répartir l'échantillon par pipetage. 11. Retirer les bulles d'air en appuyant doucement sur la DryStrip avec une pointe de pipette. 30 12. Placer un couvercle sur le plateau, et placer le plateau dans un sac plastique avec des serviettes en papiers humides. 13. Sceller le sac. 2905467 12 14. Laisser l'échantillon se réhydrater toute la nuit à température ambiante à la surface de niveau en laissant les bandes absorber les échantillons a. Entre 12 et 24 heures 15. Continuer jusqu'à l'électrofocalisation des bandes. 5 Electrofocalisation des bandes 1. Allumer l'IPGphor 3 (Amersham) 2. Retirer les bandes du plateau et retirer délicatement l'excès d'échantillon des bandes en buvardant les deux côtés avec un papier. 10 3. Placer les bandes sur le plateau de focalisation collecteur (Amersham) comme suit : a. Gel vers le haut b. Extrémité positive (acide) vers l'arrière c. Les bandes sont alignées 15 d. Entre les bandes métalliques (de sorte que les électrodes s'ajustent et touchent la bande métallique) 4. Utiliser 2 mèches en papier (Amersham Pharmacia, #80-6499-14) par bande 5. Mouiller les mèches avec 150 1 d'eau distillée par mèche. 20 6. Placer les mèches sur les extrémités anodes et cathodes du gel (environ 0,3 cm) 7. Placer les électrodes sur les mèches, mais à distance du gel (vérifier que la broche est sur la plaque métallique), et verrouiller. 8. Couvrir les bandes, en remplissant toute la ligne et les lignes à côté des 25 bandes avec du DryStrip Cover Fluid (Amersham Pharmacia, #17-1335-01) 9. Fermer l'appareil 10. Procéder à l'électrofocalisation avec IPGphor 3 (Amersham) à un ampérage maximum de 50 p.Amps à 20 C. Si nécessaire, faire une pause et remplacer les mèches, en continuant le tour jusqu'à ce que le front de colorant 30 disparaisse. Bande de 7 cm pH Etape Tension Temps / Vh 3-10 20 2905467 13 1- 250 V 15 min. Stp. 2- 500 V 15 min. Stp. 3- 1 000 V 30 min. Stp. 4- 4 000 V 2 h. Grd. 5- 4 000 V 25 000 Vh Stp. 6- 500 V Maintenir Stp. La seconde dimension (SDS-PAGE) est effectuée comme suit. Préparation du Gel SDSPAGE 5 1. Avant utilisation, laver et frotter les plaques soigneusement avec du savon et de l'eau chaude. 2. Rincer dans de l'eau distillée 3. Laisser les plaques sécher à l'air ou essuyer avec des lingettes imprégnées de méthanol 10 4. Assembler les plaques dans la chambre de coulage multi-gel Proteans-plus 5. Vérifier que les vis sont bien serrées. 6. Dégazer la solution en gel avant l'ajout d'APS et de TEMED 7. Verser doucement la solution de gel dégazée à travers les plaques de gel pour empêcher la formation de bulles d'air. 15 8. Arrêter de verser quand le gel est à environ 3 cm du haut des plaques de verre. 9. Recouvrir doucement les gels d'eau distillée. 10. Couvrir avec un film plastique. 11. Laisser les gels se polymériser pendant au moins une heure Equilibrage des bandes d' éléctrofocalisation 2905467 14 1. Retirer les bandes du plateau et les placer sur un papier filtre Whatman pour retirer l'excès d'huile 2. Buvarder les deux côtés des bandes avec un papier pour retirer l'excès d'huile. 5 3. Placer les bandes dans une plaque d'équilibrage (Bio-Rad) le gel vers le haut ; congeler ou équilibrer. Si elles sont congelées, les plaques sont enveloppées dans un film plastique et stockéesà -80 C. Puis, les bandes sont décongelées avant l'équilibrage (les bandes sont claires quand elles sont décongelées). a. Equilibrage : couvrir les bandes avec un tampon d'équilibrage, environ 10 1,5 ml par bande 4. Secouer 25 minutes à température ambiante Charger et faire migrer le gel de seconde dimension 1. Préparer les marqueurs en ajoutant 10 l de standard sur du papier de 15 chromatographie Whatman 3MM coupé à environ 3 cm x 0,5 cm. 2. Décanter le tampon d'équilibrage. 3. Couvrir les bandes dans un tampon d'électrophorèse SDS pour rincer et éliminer le tampon d'équilibrage. 4. Retirer le tampon d'équilibrage des bandes. 20 5. Répéter les étapes 3 et 4. 6. Placer délicatement les bandes gel vers l'extérieur sur la plaque arrière du gel de seconde dimension. 7. Recouvrir les bandes avec de l'agarose 1 % à basse fusion, à température ambiante, vérifier qu'aucune bulle d'air ne s'est formée sous le gel. 25 8. Insérer le marqueur à proximité de l'extrémité basique de la bande de gel, en vérifiant que le marqueur est à ras de la bande de gel L'agarose doit être assez froid pour ne pas rompre le marqueur 9. Laisse l'agarose se solidifier 10. Continuer pour chaque bande à charger dans la seconde dimension 30 11. Placer les gels dans un réservoir Dodeca, charnière vers le bas 12. Une fois que tous les gels ont été mis dans le réservoir, vérifier que les gels sont couverts entièrement par le SDS, l'électrophorèse de seconde dimension est à 13 C, 250 volts pendant 1 heure 35 minutes. 2905467 15 Western blot et coloration à l'argent Transfert des protéines 1. Emplir un plateau en Pyrex (assez grand pour contenir le gel) avec du 5 tampon de transfert 2. Placer les éponges dans un Bio-Rad transblot cell, 2 éponges par gel 3. Emplir le réservoir avec du tampon de transfert pour permettre aux éponges de saturer avec le tampon de transfert 4. Retirer le gel du réservoir Dodeca et couper à la taille souhaitée 10 5. Faire tremper la membrane de transfert pré-coupée dans du tampon de transfert 6. Assembler la cassette de transfert comme suit a. Côté noir vers le bas b. Eponge trempée dans le tampon de transfert 15 c. Papier filtre d. Gel e. Membrane de nitrocellulose ù une fois placée sur le gel ne pas retirer la membrane f. Papier filtre 20 g. Eponge 7. Vérifier que toutes les bulles d'air ont été retirées entre le gel et la membrane 8. Placer le plateau dans un réservoir Transblot, le côté noir (côté du gel) du plateau vers le côté noir du réservoir 25 9. Transférer à 4 C à 100 volts pendant 60 minutes. Coloration à l'argent pour visualiser les protéines totales (optionnel). 1. Placer 50 ml de Silver Stain-Fix dans un conteneur et ajouter 25 l de formaldéhyde 37 % 30 2. Placer le gel dans la solution et laisser remuer pendant 1 heure pour fixer les protéines 3. Retirer soigneusement le Silver Stain-Fix a. Ne toucher les gels que sur les bords 2905467 16 4. Couvrir les gels avec 50 ml de Silver Stain-Wash et agiter pendant 20 minutes. 5. Retirer la solution de Silver Stain-Wash 6. Ajouter 50 ml de Silver Stain-Pretreat et agiter à la main pendant 1 minute. 5 7. Retirer soigneusement le Silver Stain-Pretreat a. Ne toucher les gels que sur les bords 8. Rincer soigneusement les gels dans de l'eau distillée pendant 20 secondes. a. Retirer l'eau distillée b. Répéter le rinçage deux fois 10 9. Couvrir les gels avec 50 ml de Silver Stain-Impregnate et agiter pendant 20 min. 10. Rincer soigneusement les gels dans de l'eau distillée pendant 20 secondes. a. Retirer l'eau distillée b. Répéter une fois 15 11.Couvrir les gels avec 50 ml de Silver Stain-Develop c. Secouer les gels et surveiller le développement de taches 12. Rincer soigneusement les gels dans de l'eau distillée pendant 20 secondes. d. Retirer l'eau distillée e. Répéter le rinçage deux fois 20 13.Couvrir les gels avec 50 ml de Silver Stain-Fix 14. Agiter les gels pour fixer les protéines pendant 10 minutes. L'analyse immunologique du buvard est effectuée comme suit : 25 Anticorps primaire 1. Retirer la membrane du transfert 2. Colorer la membrane avec du Ponceau-S jusqu'à ce que le fond soit rouge. 3. Retirer le Ponceau-S (remettre dans la bouteille pour une réutilisation) 4. Rincer la membrane avec de l'eau et marquer. 30 5. Scanner la membrane 6. Laver la membrane avec du TTBS pour retirer tout le Ponceau-S 7. Ajouter 5 % de lait (suffisamment pour couvrir la membrane) au plateau et bloquer pendant 20 minutes à température ambiante 2905467 17 8. Préparer la solution d'anticorps primaires (NTI ScFv MAB 12.1 : TTBS ù 1 : 150) dans un conteneur 9. Retirer le lait 10, Rincer pour retirer l'excès de lait dans du TTBS 5 11. Placer la membrane dans le conteneur avec la solution d'anticorps primaires 12. Incuber à 4 C pendant la nuit. Anticorps secondaire 10 1. Retirer l'anticorps secondaire 2. Laver la membrane 3 fois i. Couvrir la membrane avec du TTBS ii. Agiter doucement à température ambiante pendant 10 minutes. 3. Préparer la solution d'anticorps secondaires (NTI Anti S : TTBS 15 1 : 5 000) 4. Couvrir la membrane la une solution d'anticorps secondaires 5. Incuber à 4 C pendant 4 heures. Développer et scanner 20 1. Retirer la solution d'anticorps secondaires 2.Laver la membrane comme ci-dessus 3. Couvrir la membrane avec du Western Blue (Promega, #53841) 4. Laisser développer 5. Interrompre le développement en rinçant à l'eau 25 6. Sécher la membrane Les solutions utilisées dans les protocoles précédents sont données ci-dessous. Solutions pour la première dimension 30 Tampon de réhydratation pH 7 (25 ml) : 7 M Urée (FW 60.06) ù 10,5 g 2 M Thiourée (FW 76.12) ù 3,8 g 2%CHAPS--0,5g 2905467 18 0,5 % asb-14 - 0,125 g 0,5 % Ampholytes - 330 l (40% Ampholytes) 0,5 % Tampon IPG - 125 l Bleu de bromophénol ù 3 mg 5 Dissoudre l'urée et la thiourée dans 20 ml d'eau distillée. Ajouter CHAPS, AsB-14, Ampholytes, tampon IPG et bleu de bromophénol Remplir jusqu'à 25 ml avec de l'eau distillée - Aliquoter à 1,4 ml et stocker à -80 C 10 - Ajouter du DTT 1 % - 14 mg (0,014 g) avant utilisation Solutions pour la seconde dimension Tampon Tris (1,5 M, pH 8,8) (1000ml) : Tris-base (F'W 121.1) ù 36,33 g 15 Dissoudre le Tris dans environ 150 ml d'eau distillée. Ajuster le pH à 8,8 avec du HC1, et compléter jusqu'à un volume total de 200 ml avec de l'eau distillée. -Stocker à 4 C 20 Tampon d'équilibrage (400 ml) : 1,5 M Tris-HC1, pH 8,8 ù 26,8 ml Urée (60.06) - 144 g Glycérol (100 %) ù 120 ml (150 g) SDS ù 10 g 25 Bleu de bromophénol ù Trace (ajouter avec une pointe de pipette) -Ajouter de l'eau pour arriver à 400 ml - Aliquoter et stocker à -20 C Gel d'acrylamide 2D 30 375 mM Tris-HC1, pH 8,8 Acrylamide/Pipérazine Diacrylyl (40 % T/2,5 % C) 0,12 % (v/v) TEMED 0,055 % (v/v) persulfate d'ammonium (APS) 2905467 19 %T = Pourcentage total d'acrylamide et de piperazine diacrylyl dans du gel d'acrylamide 2D %C = pourcentage d'agent de réticulation (piperazine diacrylyl) 5 Formulation pour les gels Protean II (20x20 ; 1 mm d'épaisseur) % Gels Tampon 40 % Eau (ml) 10 % APS TEMED de gel (ml) acrylamide (ml) ( l) (1,875 M (ml) Tris-HC1) p/PDA (39:1) 10 2 30 37,5 82,5 0,825 235 4 50 62,5 137,5 1,375 340 6 70 87,5 192,5 1,925 545 8 90 112,5 247,5 2,5 700 10 110 137,5 302,5 3,025 855 12 130 162,5 357,5 3,575 1000 Tampon gel Réactifs 1,875 M Tris Eau Ajuster le pH à 8,8Quantités 22,7 g Remplir jusqu'à 100 ml Utiliser HC1 concentré 10 Stocker le tampon à 4 C pendant 2 semaines maximum. Stock d'acrylamide 40 % T/2,5 % C Réactifs Quantités Acrylamide 39 g Pipérazine 1 g diacrylamide Eau Remplir jusqu'à 100 ml Filtrer (0,45 m) ; stocker à 4 C pendant 2 semaines maximum. 2905467 20 Persulfate d'ammonium 10 % (APS) Réactifs Quantités 10%APS 0,1g Eau Remplir jusqu'à 100 ml Faire du persulfate d'ammonium 10 % frais pour chaque utilisation Tampon d'électrophorèse SDS 10x (41) : 5 Tris (FW 75.07) û 75.69 g Glycine (FW 121.14) û 360.34 g SDS û 20 g Eau distillée Remplir jusqu'à 4 1 Stocker à température ambiante 10 Solution d'agarose (1 (Yo) Peser 1,5 g d'agarose, ajouter 150 ml de tampon d'électrophorèse SDS û chauffer jusqu'à dissolution. Agarose fusion basse 1 % 1,5 g d'agarose faible fusion 1 x SDS tampon d'électrophorèse Remplir jusqu'à 100 ml Chauffer jusqu'à ébullition de l'agarose et dissolution complète 15 Ajouter 150 l.il de bleu de bromophénol à 0,05 % Stocker à 4 C Solutions pour le buvardage et la coloration à l'argent Tampon de transfert de type Western (41): 20 Trizma base 1' 2,12g Glycine - 57,6 g Méthanol - 800 ml SDS-3 g Eau -Remplir jusqu'à 4 1 25 Coloration à l'argent û fixation 50 % méthanol -500 ml 12 % acide acétique - 120 ml 2905467 21 eau distillée - remplir jusqu'à 1 1 Coloration à l'argent ù Ethanol 50 % éthanol - 500 ml 5 Eau distillée - remplir jusqu'à 1 1 Coloration à l'argent û Pré-traitement 0,04 % Na2S203-5H2O - 0,04 g eau distillée - remplir jusqu'à 200 ml Coloration à l'argent ù Imprégnation 0,4 % AgNO3 - 0,4 g 0,028 % formaldéhyde - 150 l de formaldéhyde 37 % eau distillée - remplir jusqu'à 200 ml 15 Coloration à l'argent ù Développement 12%Na2CO3 -12g 0,019 % formaldéhyde - 100 l de formaldéhyde 2 % Pré-traitement - 4 ml 20 eau distillée - remplir jusqu'à 200 ml Formaldéhyde 37 Formaldéhyde 37 % - 37 ml de formaldéhyde Eau distillée remplir jusqu'à 100 ml Tampon de blocage (lait 5 %) Lait 5 % - 5g de lait 0,2 % N3Na - 0,2 g N3Na Eau distillée -remplir jusqu'à 100 ml 10x TTBS (41) 100 mM Trizma - 48,4 g 1,5 M NaCl -350,6 g 10 25 30 2905467 0,5 % Tween 20 - 20 g Ajouter Trizma et NaCl à 3800 ml d'eau désionisée ù H2O Ajuster le pH à 8,0 en utilisant le HCl 5 Ajouter le Tween 20 Remplir jusqu'à 4 1 avec l'eau distillée EXEMPLES Exemple 1. Mélanges de sérums 10 Des protéines sériques enrichies en NOX (environ 4-6 mg) de mélanges de sérums de patients cancéreux (sein, ovaires, poumon et côlon) ont été séparées par électrophorèse sur gel 2D avec détection par un anticorps recombinant anti-ECTONOX (région variable simple chaîne ScFv) portant une étiquette S suivie par un anti-S lié à la phosphatase alcaline avec le substrat de phosphatase alcaline Western Blue 15 NBT ce qui a donné plusieurs protéines présentes dans les sérums cancéreux (figure 1) mais absentes des sérums de patients non cancéreux ou de volontaires en bonne santé. Les protéines tNOX ont été enrichies et concentrées à partir des sérums par précipitation par nickel agarose. Cette étape entraîne une élimination d'environ 90 % des protéines sériques avant l'analyse. 20 Quand les sérums spécifiques de tNOX ou ECTO-NOX sont utilisés, généralement la dilution est de 1 : 10 à 1 : 1000, l'anticorps monoclonal (par ex. 12.1 produit par l'hybridome déposée sous le numéro d'accès PTA-4206) est de 1 : 100-1 : 1 000, de préférence 1 : 100 ou le liquide d'ascite de la croissance du même hybridome peut être d'environ 1 : 10 à environ 1 : 1 000, de préférence environ 25 1 : 100. Exemple 2. Analyse des sérums des patients avec divers cancers Les résultats combinés sur un total de huit sérums cancéreux différents regroupés étaient similaires à ceux de la figure 1 et le total des résultats est récapitulé 30 sur la figure 2 pour le quadrant I des gels 2-D. Des protéines tNOX supplémentaires ont été situées dans le quadrant IV et le total des résultats est récapitulé sur la figure 3. 22 2905467 23 Exemple 3. Analyse de sérum d'une patiente atteinte d'un cancer des ovaires L'analyse sur gel 2-D comme sur la figure 4 quand elle est appliquée au sérum d'une patiente avec un cancer des ovaires a donné des protéines tNOX spécifiques du cancer des ovaires d'environ 80 et 40,5 kDa dans les quadrants I et IV 5 (figure 4). Exemple 4. Analyse du sérum d'un patient atteint d'un cancer du poumon à petites cellules L'analyse sur gel 2-D comme sur la figure 5 quand elle est appliquée aux 10 sérums d'un patient avec un cancer du poumon à petites cellules contenait une protéine tNOX de 40,5 kDa dans le quadrant IV et une protéine tNOX de 52 kDa dans le quadrant I (figure 5). Exemple 5. Analyse du sérum d'un patient atteint d'un cancer du poumon non à 15 petites cellules L'analyse sur gel 2-D comme sur la figure 1 quand elle est appliquée au plasma d'un patient avec un cancer du poumon non à petites cellules a révélé une isoforme tNOX spécifique du cancer du poumon non à petites cellules de 54 kDa dans le quadrant I (figure 6). 20 Exemple 6. Analyse du sérum d'une patiente atteinte d'un cancer du sein L'analyse sur gel 2-D comme sur la figure 1 quand elle est appliquée aux sérums d'une patiente avec un cancer du sein a révélé une protéine tNOX spécifique du cancer du sein de 68 kDa dans le quadrant I (figure 7). 25 Exemple 7. Analyse du sérum d'un patient atteint d'un cancer de la prostate L'analyse sur gel 2-D comme sur la figure 1 quand elle est appliquée aux sérums d'un patient avec un cancer de la prostate a révélé une isoforme de tNOX spécifique du cancer de la prostate à 75 kDa (figure 8) et aux points isoélectriques de 30 pH 5,8 (a) et 5,2 (03). La forme [3 est plus évidente avec le plasma et est rarement présente dans les sérums des patients avec un cancer de la prostate. 2905467 24 Exemple 8. Analyse du sérum du sérum d'une patiente atteinte d'un cancer du col de l'utérus L'analyse sur gel 2-D comme sur la figure 1 quand elle est appliquée au plasma d'une patiente atteinte d'un cancer du col de l'utérus a révélé une isoforme de 5 tNOX spécifique du cancer du col de l'utérus à 94 kDa (figure 9). Exemple 9. Analyse du sérum d'un patient atteint d'un cancer du côlon L'analyse sur gel 2-D comme sur la figure 1 quand elle est appliquée au plasma d'un patient avec un cancer du côlon a révélé une isoforme de tNOX 10 spécifique du cancer du côlon à 43 et 52 kDa (figure 10). Exemple 10. Isoformes spécifique de cancer Pour chaque type de cancer il s'avère qu'il existe une isoforme de tNOX (ovaire, sein, col de l'utérus, côlon, poumon non à petites cellules, prostate, poumon 15 à petites cellules) ou une combinaison d'isoformes de tNOX qui est spécifique du tissu ou du type de cellules d'origine pour le cancer (figure 14). Exemple 11. Analyse du sérum de patient lorsque le cancer est d'origine inconnue Le gel 2-D de la figure 11 est celui d'un patient avec un cancer dont la tumeur 20 primaire était inconnue. La présence d'isoformes tNOX de 40,5, 52 et environ 80 kDa indique que le cancer primaire est un cancer des ovaires. Exemple 12. Analyse des mélanges de sérums normaux Dans plus de 25 sérums de consultants externes sélectionnés de façon 25 aléatoire et de sérums de volontaires en bonne santé, les quadrants I et IV des gels 2-D étaient tous deux dépourvus d'isoformes tNOX (figure 12), confirmant les observations précédentes que les protéines tNOX sont absentes chez les patients non cancéreux ou les sérums des volontaires en bonne santé. 30 Exemple 13 La stratégie diagnostique de l'invention combine les séparations par électrophorèse sur gel de polyacrylamide uni- et bi-dimensionnelle de sérums humains pour produire des patrons et des compositions d'isoformes spécifiques de 2905467 25 cancer indicatives de présence de cancer, de type de tumeur, de gravité de la maladie et de la réponse thérapeutique. Au moins 20 isoformes tNOX spécifiques de cancer sont séparées indicatives de la présence de cancer et de gravité de la maladie. Le système consiste en une étape de concentration dans laquelle les protéines ECTO- 5 NOX sont séparées du gros de l'albumine et autres protéines sériques en utilisant une précipitation par nickel-agarose. La détection utilise un anticorps recombinant simple chaîne (scFv) qui a une réaction croisée avec toutes les isoformes connues d'ECTONOX d'origine humaine ; cet anticorps a également une étiquette S qui réagit avec un second anticorps I (anti-S). L'anticorps scFv est décrit dans la demande US 10 provisoire 60/824 398, déposée le 1 e` septembre 2006 et ci-dessous. L'anticorps monoclonal généré contre la NADH oxydase de tNOX spécifique de cellule tumorale a été produit dans des cellules de myélome sp-2 ; toutefois, l'anticorps monoclonal a ralenti la croissance des cellules de myélome sp-2 qui ont été utilisées pour la fusion avec les cellules spléniques au bout de 72 h. Ce 15 phénomène a rendu difficile la production d'anticorps en quantité. Pour surmonter ce problème, les séquences codantes de la région variable de la liaison de l'antigène de la chaîne lourde et la chaîne légère (région Fv) de l'ADNc de l'anticorps ont été clonées et liées en un gène chimère, en amont de la séquence codante de l'étiquette S. La portion Fv d'un anticorps, consistant en des domaines variables lourds (VH) et 20 variables légers (VL), peut maintenir la spécificité de liaison et l'affinité de l'anticorps original (Glockshuber et al. 1990. Biochemistry 29 : 1262-1367). Pour un anticorps recombinant, les ADNc codant les régions variables de la chaîne lourde de l'imunoglobuline (Vu) et la chaîne légère (VL) sont clonés en utilisant des amorces dégénératives. Les immunoglobulines de mammifères des 25 chaînes lourde et légère contiennent des régions conservées adjacentes aux régions de détermination complémentaires (RDC) hypervariables. Les ensembles d'amorces oligo dégénérées permettent à ces régions d'être amplifiées en utilisant la PCR (Jones et al. 1991. Bio/Technology 9 : 88-89 ; Daugherty et al. 1991. Nucleic Acids Research 19: 2471-2476). Les techniques d'ADN recombinant ont facilité la 30 stabilisation des fragments variables en liant de façon covalente les deux fragments par un lieur polypeptide (Huston et al. 1988. Froc. Nad. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Soit VL soit VH peuvent fournir le domaine terminal NH2 du fragment variable simple chaîne (ScFv). Le lieur devrait être conçu pour résister à la 2905467 26 protéolyse et pour minimiser l'agrégation des protéines. La longueur et les séquences du lieur contribuent et contrôlent la flexibilité et l'interaction avec le scFv et l'antigène. Les lieurs les plus souvent utilisés ont des séquences consistant en des résidus de glycine (Gly) et sérine (Ser) pour la flexibilité, avec des résidus chargés 5 sous forme d'acide glutamique (Glu) et de lysine (Lys) pour la solubilité (Bird et al. 1988. Science 242 : 423-426 : Huston et al. 1988, supra). L'ARN total a été isolé des cellules hybridomes produisant des anticorps monoclonaux spécifiques de tNOX par la procédure suivante modifiée par Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 156-159 et Gough (1988) Anal. 10 Biochem 176: 93-95. Les cellules ont été récoltées dans le milieu et agrégées par centrifugation à 450 x g pendant 10 min. Les agrégats ont été doucement resuspendus avec 10 volumes de PBS glacé et de nouveau centrifugés. Le surnageant a été jeté et les cellules ont été resuspendues avec un volume égal de PBS. Une solution dénaturante (0,36 ml de 2-mercaptoéthanol/50 ml de solution stock de 15 guanidinium û 4 M guanidinium thiocyanate, 25 mM de citrate de sodium, pH 7,0, 0,5 % sarkosyl), 10 ml pour 1 g d'agrégat cellulaire, a été ajoutée avant utilisation et mélangée doucement. De l'acétate de sodium (pH 4,0, 1 ml de 2M), 10 ml de phénol en solution aqueuses saturée et 2 ml de mélanges chloroforme : alcool isoamylique (24: 1) ont ensuite été ajoutés après chaque ajout. La solution a été mélangée 20 soigneusement par inversion. La solution a été secouée vigoureusement pendant 10 secondes, refroidie sur de la glace pendant 15 min puis centrifugée 12 000 x g pendant 30 min. Le surnageant a été transféré et un volume égal de 2-propanol a été ajouté et placé à -20 C pendant la nuit pour précipiter l'ARN. L'ARN a été agrégé pendant 15 min à 12 000 x g, et l'agrégat a été resuspendu avec 2-3 ml de solution 25 dénaturante et 2 volumes d'éthanol. La solution a été placée à -20 C pendant 2h, puis centrifugée à 12 000 x g pendant 15 min. L'agrégat d'ARN a été lavé avec de l'éthanol 70 % puis de l'éthanol 100 %. L'agrégat a été resuspendu avec de l'eau sans activité RNase (eau traitée au DEPC) après centrifugation à 12 000 x g pendant 5 min. La quantité d'ARN isolé a été mesurée par spectrophotométrie et calculée à 30 partir de l'absorbance à 280 nm et 260 nm. Le kit d'isolement de l'ARNm poly (A) a été acheté auprès de Stratagene. L'ARN total a été appliqué sur une colonne de cellulose oligo(dT) après avoir chauffé l'ARN total à 65 C pendant 5 min. Avant l'application, les échantillons 2905467 27 d'ARN ont été mélangés avec 500 tl de tampon d'échantillon 10 x (10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 M NaCI). Les échantillons d'ARN ont été poussés dans la colonne à une vitesse d' l goutte toutes les 2 secondes. Les éluats ont été regroupés et ré-appliqués à la colonne et de nouveau purifiés. Le tampon d'élution pré-chauffé 5 (65 C) a été appliqué, et l'ARNm a été élué et collecté dans 1,5 ml de tubes à centrifuger sur la glace. La quantité d'ARNm a été déterminée à DO260 (1 unité DO = 40 gg d'ARN). Les quantités d'ARN total et d'ARNm obtenues à partir des cellules 4 x 108 étaient de 1328 g et 28 g respectivement. L'ARNm (1-2 g) dissous dans l'eau traité au DEPC a été utilisé pour la 10 synthèse d'ADNc. L'ARNm isolé à trois dates différentes a été regroupé pour la synthèse d'ADNc premier brin. Le kit de synthèse de l'ADNc a été acheté auprès de Pharmacia Biotech. L'ARNm (1,5 1_tg/5 pl d'eau traitée au DEPC) a été chauffé à 65 C pendant 10 min et refroidi immédiatement sur la glace. Le mélange premier brin amorcé contenant la transcriptase inverse MuLV (11 l) et les tampons 15 appropriés pour la réaction ont été mélangés avec l'échantillon d'ARNm. Une solution de DTT (1 l de 0,1 M) et de l'eau sans activité de RNase (16 1.11) ont également été ajoutées à la solution. Le mélange a été incubé pendant 1 h à 37 C. Des amorces dégénérées pour la chaîne légère et la chaîne lourde (Novagen, Madison, WI) ont été utilisées pour la PCR. La synthèse de PCR a été effectuée dans 20 des volumes réactionnels de 100 l dans des tubes microcentrifuges en utilisant Robocycler (Stratagene, La Jolla, CA). Toutes les synthèses par PCR comprenaient 2 l d'amorces sens et antisens (20 pmoles/ l), 1 l d'ADNc premier brin comme matrice, 2 pl de 10 rnM de dNTPs, 1 l de Vent polymérase (2 unités/ l), 10 gl de 10 x tampon de PCR (100 mM Tris-HC1, pH 8,8 à 25 C, 500 mM KCI, 15 mM 25 MgCl2, 1 % Triton X-100), 82 l de H2O. Le Triton X-100 est du toctylphénoxypolyéthoxyéthanol. Tous les profils de PCR consistaient en 1 min de dénaturation à 94 C, 1 min d'hybridation à 55 C et 1 min d'extension à 72 C. Cette séquence a été répétée 30 fois avec une extension de 6 min à 72 C dans le cycle final. Les produits de la PCR ont été purifiés avec le kit d'extraction sur gel QIAEX II de 30 Qiagen, Valencia, CA. Les produits de l'amplification par PCR pour les séquences codantes des chaînes légères et lourdes ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose et étaient longs d'environs 340 paires de bases (pb) et 325 pb respectivement. 2905467 28 L'ARN ou ADN total a été analysé par électrophorèse sur gel d'agarose (gels d'agarose 1 %). L'agarose (0,5 g dans 50 ml de tampon TAE, 40mM de Tris-acétate, 1 mM d'EDTA) a été chauffé pendant 2 min dans un micron-ondes pour fondre et disperser uniformérnent l'agarose. La solution a été refroidie à température ambiante, 5 et du bromure d'éthidium (0,5 gg/ml) a été ajouté et versé dans l'appareil. Chaque échantillon a été mélangé avec du tampon de charge de gel 6 x (0,25 % bleu de bromophénol, 0,25 % xylène cyanol FF, 40 % (p/v) de saccharose dans l'eau). Le tampon TAE a été utilisé comme tampon d'électrophorèse. La tension (10 v.cm) a été appliquée pendant 60-90 min. 10 Selon la bonne taille pour les ADNc des chaînes lourdes et légères, les bandes ont été excisées des gels sous illumination UV, et les gels excisés ont été placés dans des seringues de 1 ml avec des aiguilles de grosseur 18. Les gels ont été écrasés sur un tube Eppendorf de 1,5 ml. Le corps de chaque seringue a été lavé avec 200 l de phénol saturé en tampon (pH 7,9 0,2). Le mélange a été soigneusement centrifugé 15 et congelé à -70 C pendant 10 min. Le mélange a été centrifugé pendant 5 min, et la phase aqueuse supérieure a été transférée dans un autre tube. La phase aqueuse a été extraite de nouveau avec du phénol / chloroforme (1 : 1). Après centrifugation pendant 5 min, la phase aqueuse supérieure a été transférée dans un tube propre, et l'extraction au chloroforme a été effectuée. De l'acétate de sodium (10 volumes de 3 20 M) et 2,5 volumes d'éthanol glacé ont été ajoutés à la phase aqueuse supérieure pour précipiter l'ADN à -20 C pendant la nuit. Les ADNc purifiés des chaînes lourdes et légères ont été liés dans un vecteur plasmidique pSTBlue-1 et transfectés dans des cellules compétentes NovaBlue (Stratagene). Les colonies contenant les ADN des chaînes lourdes et légères ont été 25 criblées par sélection des colonies bleues et blanches et confirmées par analyse PCR. Les ADN des chaînes lourdes et légères ont été isolés et séquencés en utilisant des techniques standards. Les tableaux 1A et 1B montrent les séquences ADN des ADN des chaînes lourdes et légères de ScFv. L'amplification par PCR et l'assemblage du gène unique ScFv ont été 30 effectués selon Davis et al. (1991) Bio/Technology 9 : 165-169. Le plasmide pSTBlue-1 portant les gènes VH et VL a été combiné aux quatre amorces d'oligonucléotides dans une seule synthèse de PCR. Après la première synthèse de PCR, un dixième du premier produit de la PCR a été retiré et ajouté au second 2905467 29 mélange réactionnel de la PCR contenant seulement l'amorce a (amorce sens VFI) et l'amorce d (amorce anti-sens VL). Le produit de la seconde synthèse de PCR a donné un gène unique ScFv. Le gène unique ScFv a été lié au plasmide pT-Adv (Clontecht, Palo Alto, CA). Le pT-Adv portant le gène ScFv a été utilisé pour le séquençage de 5 l'ADN. Le gène ScFv complet a été assemblé à partir des gènes VH, VL et lieurs pour donner un gène unique ScFv par PCR (Tableaux 2A et 2B). La séquence ADN codant le lieur était longue de 45 nucléotides (GGAGGCGGTGGATCGGGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCT ; SEQ 10 ID N 6) qui se traduit en un peptide de 15 acides aminés (GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer ; SEQ ID N 5). Les amorces pour l'amplification par PCR sont indiquées dans les Tableaux 2A et 2B. Le peptide S a été lié au terminus C de ScFv[ScFv(S)]. Le peptide S se lie à la protéine S conjuguée à la phosphatase alcaline pour l'analyse Western blot. La séquence ADN 15 du peptide O S est AAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGC (SEQ ID N 7) qui se traduit en peptide S (LysGluThrAlaAlaAlaLysPheGluArgInHisMetAspSer ; SEQ ID N 8). Le ScFv(S) recombinant a été exprimé dans E. coll. Premièrement, les 20 oligonucléotides codant le peptide S ont été liés à l'extrémité 3' du cadre ouvert de lecture (ORF) de l'ADN de ScFv par amplification par PCR. L'incorporation du peptide S permet de détecter la protéine ScFv exprimée par la protéine S conjuguée à la phosphatase alcaline. La séquence codante de ScFv(S) spécifique de tNOX a ensuite été sous-clonée dans le plasmide pET-1 la, un plasmide conçu pour 25 l'expression des protéines dans E. coli (Stratagene, CA). Pour l'amplification par PCR, deux amorces ont été conçues pour amplifier l'ORF de ScFv(S) contenant les sites de restriction de l'endonucléase (Ndel et Nhel) et les résidus de peptide S. Le plasmide pET-11 a et l'ORF de ScFv(S) ont été digérés avec les enzymes de restriction Ndel et Nhl et liés pour produire le plasmide pETl1-ScFv(S). E.coli 30 BL2I (DE3) a été transformé avec pET11-ScFv(S) et cultivé à 37 C pendant 12 heures dans un milieu LB contenant de l'ampicilline (100gg/ml). Le ScFv a été exprimé par ajout de 0,5 mM IPTG et incubation pendant 4 h. Les cellules ont été récoltées et lysées en utilisant un French Pressure Cell (French Pressure Cell Press ; 2905467 30 SLM Instruments, Inc.) (trois passages à 20 000 psi). Les extraits cellulaires ont été centrifugés à 10 000 x g pendant 20 min. Les agrégats contenant des inclusions cellulaires dénaturées de ScFv ont été collectés. La renaturation des inclusions cellulaires de ScFv s'est faite selon Goldberg et al. (1995) Folding & Design 1 : 21- 5 27. Tableau 1A Séquence ADN de ScFv chaîne lourde (Va) SEQ ID N 1 1 gaggtcaagc tgcaggagtc aggaactgaa gtggtaaagc ctggggcttc 51 agtgaagttg tcctgcaagg cttctggcta catcttcaca agttatgata 101 tagactgggt gaggcagacg cctgaacagg gacttgagtg gattggatgg 151 atttttcctg gagaggggag tactgaatac aatgagaagt tcaagggcag 201 ggccacactg agtgtagaca agtcctccag cacagcctat atggagctca 251 ctaggctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc tagaggggac 301 tactataggc gctactttga cttgtggggc caagggacca cggtcaccgt 351 ctcctca 10 Tableau 1B Séquence ADN de ScFV chaîne légère (VL), SEQ ID N 2 1 gaaaatgtgc tcacccagtc tccagca.atc atgtctgcat ctccagggga 51 gagggtcacc atgacctgca gtgccagctc aagtatacgt tacatatatt 101 ggtaccaaca gaagcctgga tcctccccca gactcctgat ttatgacaca 151 tccaacgtgg ctcctggagt cccttttcgc ttcagtggca gtgggtctgg 201 gactccttat tctctcacaa tcaaccgaat ggaggctgag gatgctgcca 251 cttattactg ccaggagtgg agtggttatc cgtacacgtt cggagggggg 301 accaagctgg agctgaaagc g 15 Tableau 2A Séquence codante pour ScFv, SEQ ID N 3 2905467 gtggtaaagc ctggggct.t.c 1 gaggtcaagc tgcaggagtc 51 agtgaagttg tcctgcaagg 101 tagactgggt gaç3gcagauy 151 atttttcctg gagaggggag 20.1. ggccacactg agtgtagaca 251 ctaggctgac atctgaggac 301 tactataggc gctactttga 351 ctcctcagga gq gtggat 401 ctgaaaatgt gctcacccag 451 gagagggtc+a ceatgacctg 501 ttggtaccaa cagaagcctg 551 catccaacgt ggctcctgga 31 aggaactgaa cttctggcta c: c t. gad C ag g tactgaa tac agtcctccag tctgctgtct cttgtggggc cg gcg• t g rieur tctCCagcaa cdgtgccagc gatcctcccc gtcccttttccatcttcaca gaC t tc agtg aatgagaagt cacagcctat atttctgtgc caagggacca cggctcgggt tCatgtctgc tcaagtatac cagactcctg gcttcagtgg agttatgata gattggatgg tcaagggcag atggagctca tagaggggac cggtcaccgt gcccgcggc t atctccaggg gttacatata atttatgaca cag t ggg tc t aatcaaccga ggagtggtta gcgaaagaaa 601 gggacctctt attctctcac 651 cacttattac tgccaggagt 701 ggaccaagct ggagctgaaa 751 cgccagcaca tggacagc atggaggctg aggatgctgc tccgtacacg ttcggagggg ccgctgctgc taaattcgaa peptide s 5 Tableau 2B Séquence d'acides aminés pour ScFv SEQ ID N 4 1 EVXLQFSGTE VVKPGASVKL SCKASGYIFT SYDIDWVRQT PEQGLEWIGW 51 IFPGEGSTRY NEKFKGRATL SVDKSSSTAY MELTRLTSED SAVYFCARGD 101 YYRRYFDLWG QGTTVTVSSG GGG SGGîGSG GGGSENVLTQ SPAIMSASPG lieur 151 ERVTNTCSAS SSIRYIYWYQ QKPGSSPRLL IYDTSNVAPG VPFRFSGSGS 201 GTSYSLTINR MEAEDAATYY CQEWSGYPYT FGGGTKLELK AKETAAAKFE 251 RONDS peptide s Les techniques standards pour le clonage, l'isolement de l'ADN, l'amplification et la purification, pour les réactions enzymatiques impliquant l'ADN 10 ligase, l'ADN polymérase, les endonucléases de restriction et analogues, et les diverses techniques de séparations sont celles connues et communément employées par l'homme du métier. Plusieurs techniques standards sont décrites dans Sambrook et al. (1989 Moleculra Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York ; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring 15 Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (ed) (1993) Meth. Enzymol. 218, Part I ; Wu (ed) (1979) Meth. Enzymol. 68; Wu et al. (eds) (1983) Meth. Enzymol 100 et.. 101; Grossmann and Moldave (eds) Meth. Enzymol 65 ; Miller (ed) (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose (1981) Principles of Gene Manipulation, 2905467 32 University of California Press, Berkley ; Schleif and Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Biology ; Glover (ed) (1985) DNA Cloning Vol. land II, IRL Press, Oxford, UK ; Hames and Higgins (eds) (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UL ; Setlow and Hollaender (1979) Genetic Engineering : 5 Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York ; Fitchen et al. (1993) Annu. Rev. Microbiolo. 47 : 739-764 ; Tolstoshev et al (1993) in Genomic Research in Molecular Medicine and Virology, Academic Press ; et Ausubel et al. (1992) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York, NY. Les abréviations et la nomenclature, quand elles sont employées, sont considérées 10 comme standards dans le domaine et communément utilisées dans les revues professionnelles telles que celles citées ici. Les vaccins à anticorps sont décrits dans Dillman R.O. (2001) Cancer Invest. 19(8) : 833-841. Durrant L.G. et al. (2001) Int J. Cancer 1 ; 92(3) : 414-20 et Bhattacharya-Chatterjee M (2001) Curr. Opin. Mol. Ther. Feb ; 3(1):63-9 décrivent des anticorps anti-idiotypes. Nombre des procédures 15 utiles pour mettre en pratique la présente invention, qu'elles soient décrites ou non ici en détail, sont bien connues de l'homme du métier dans les arts de la biologie moléculaire, la biochimie, l'immunologie et la médecine. Les anticorps monoclonaux, polyclonaux, spécifiques de peptides et les anticorps recombinants simple chaîne et les fragments se liant aux antigènes de l'un 20 quelconque des précédents, réagissant spécifiquement avec les protéines isoformes de tNOX décrites ici, peuvent être faits par des procédés connus dans l'art. Voir par exemple Harlow and Lane (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories ; et Goding (1986) Monoclonal Antibodies : Principles and Practices, 2d ed., Academic Press, New York. 25 Les exemples fournis ici sont à des fins d'illustrations, et ne visent pas à limiter la portée de l'invention telle que revendiquée ici. Toute variation dans les exemples d'anticorps, épitopes, procédés de purification, procédés diagnostiques, procédés préventifs, procédés thérapeutiques, et autres procédés qui surviennent pour l'homme du métier visent à entrer dans la portée de la présente invention. 2905467 33 Bibliographie 1. Morré, D.J. (1998) dans Plasma Membrane Redox Systems and Their Role in Biological Stress and Disease (Asard, H., Béerczi, A. et Caubergs, R.J., Eds) pp. 121-156, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Pays-Bas. 5 2. Morré, D.J. et Morré, D.M. (2003) Free Radical Res. 37: 795-808 3. Morré, D.J., Chueh, P.-J. et Morré, D.M. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1831-1835. 4. Bruno, M., Brightman, A.O., Lawrence, J., Werderitsh, D., Morré, D.M. et Morré, D.J. (1992) Biochem. J. 284: 625-628. 10 5. Cho, N., Chueh, P.-J, C., Caldwell, S., Morré, D.M. et Morré, D.J. (2002) Cancer Immunol. Immunother. 51: 121-129. 6. Morré, D.J., Caldwell, S., Mayorga, A., Wu, L-Y et Morré, D.M. (1997) Arch. Biochem. Biophys. 342:224-230. 7. Morré, D.J. et Reust, T. (1997) J. Bioenerg. Biomemb. 29, 281-289. 15 8. Morré, D.J. (1995) Biochem. Biophys. Acta 1240 :201-208. 9. del Castillo-Olivares A., Chueh, P.-J., Wang, S., Sweeting, M., Yantiri, F., Sedlak, D., Morré, I).J. et Morré, D.M. (1998) Arch. Biochem. Biophys. 358:125-140. 10. Morré, D.J., Sedlak, D., Tang, X., Chueh, P.J., Geng, T. et Morré, D.M. (2001) Arch. Biochem. Biophys. 392:251-256. 20 11. Chueh, P.J., Kim, C., Cho, N., Morré, D.M. et Morré, D.J. (2002) Biochemistry 41: 3732-3741. 12. Bird, C. (1999) Direct submission of human DNA sequence from clone 875H3 (part of APK1 antigen) toGenbank database at NCBI. (Accession n ALO49733). 25 13. Braman, J., Papworth, C. et Greener, A (1996) Methods Mol. Biol. 57:31-44. 14. Wilkinson, F.E., Kim, C., Cho, N., Chueh, P.J., Leslie, S., Moya-Camerena, S., Wu, L.-Y., Morré, D.M. et Morré, D.J. (1996) Arch. Biochem. Biophys. 336:275-282. 30 15. Morré, D.J., Wu, L.-Y et Morré, D.M. (1995) Biochem. Biophys. Acta 1240 :11-17. 16. Morré, D.J., Kim, C., Paulik, M., Morré, D.M. et Faulk, W.P. (1997) J. Bioenerg. Biomembr 29: 269-280. 2905467 34 17. Morré, D.J., Bridge, A., Wu, L.-Y et Morré, D.M. (2000) Biochem. Pharmacol. 60 : 937-946. 18. Kozak M. (1978) Cell. 15: 1109-23. 19. Kozak, M. (1989) J. Cell. Biol. 108: 229-241. 5 20. Tatyana, V., Borukhov, S.I. et Hellen C. (1998) Int J. Biochem. Cell Biol. 31 :87-106. 21. Van der Veiden, A.W. et Thomas, A.A. (1999) Int. J. Biochem. Cell Biol. 31:87-106. 22. Suzuki, Y., Ishihara, D., Sasaki, M. Nakagawa, H., Hata, H., Tsunoda, T., 10 Wantanabe, M., Komatsu, T., Ota, T., Isogai. T., Suyama, A et Sugano, S. (2000) Genomics 64 : 286-297. 23. Kozak, M. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 8125-8148. REVENDICATIONS 1. Procédé pour détecter les protéines isoformes de tNOX spécifiques du cancer ECTO-NOX dans un échantillon biologique, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : (a) concentrer les protéines isoformes de tNOX spécifiques du cancer ECTO-NOX à 5 partir d'un échantillon biologique ; (b) séparer les protéines tNOX spécifiques du cancer ECTO-NOX par point isoélectrique ; (c) séparer par taille les protéines tNOX spécifiques de cancer ECTO-NOX séparées à l'étape (b) par point isoélectrique ; et 10 (d) détecter les protéines isoformes de tNOX spécifiques de cancer ECTO-NOX en utilisant un anticorps qui se lie spécifiquement à la NADH oxydase de la surface cellulaire. 2. Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre l'étape consistant à 15 quantifier les isoformes tNOX spécifiques du cancer par scintigraphie et un algorithme commandé par ordinateur. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'étape de concentration se fait par liaison au nickel-agarose, par précipitation à l'éthanol ou par précipitation au 20 sulfate d'ammonium. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les protéines tNOX spécifiques de cancer ECTO-NOX concentrées sont mises en contact avec un réducteur. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'étape de séparation des protéines concentrées se fait par électrofocalisation et l'étape de séparation par taille se fait par électrophorèse sur gel de sodium dodécyl sulfate û polyacrylamide. 25 30 2905467 36 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'anticorps est l'anticorps monoclonal 12.1, produit par l'hybridome en dépôt à l'American Type Culture Collection sous le numéro d'accès PTA-4206. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-5, dans lequel l'anticorps est un anticorps ScFv qui a une séquence d'acides aminés donnée dans la SEQ ID N 4. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la liaison de l'anticorps est détectée par des procédés enzymatique, chromogénique, chimioluminescent, radiographique, magnétique ou fluorescent. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l'anticorps est un anticorps recombinant étiqueté par S et ledit procédé comprend en outre une étape consistant à lier un second anticorps spécifique anti-S détectable. 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel ledit second anticorps détectable est lié à la phosphatase alcaline et dans lequel la liaison est détectée en présence d'un substrat de phosphatase alcaline chromogénique ou dans lequel ledit second anticorps est lié à la peroxydase du raifort et la liaison est détectée en présence d'un substrat chromagénique de la peroxydase du raifort. 11. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'anticorps spécifique de tNOX contient une étiquette de reconnaissance. 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel l'étiquette de reconnaissance est une étiquette S, une étiquette His, une étiquette myc ou une étiquette NUS et dans lequel un second anticorps détectable spécifique se lie à ladite étiquette. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel ledit échantillon biologique est composé de cellules, sérum, plasma, urine, salive ou tissu de biopsie d'un patient suspecté d'avoir une affection néoplasique. 2905467 37 14. Procédé in vitro pour diagnostiquer une origine particulière de cancer, ledit procédé comprenant l'étape consistant à associer la présence dans un échantillon biologique préalablement préparé d'une isoforme de tNOX de 64, 66 et/ou 68 kDa avec le cancer du sein ; une isoforme de tNOX de 54 kDa avec un cancer du poumon 5 non à petites cellules, les isoformes de tNOX de 52 et 40,5 kDa avec le cancer du poumon à petites cellules, deux isoformes de tNOX de 75 kDa de différents points isoélectriques avec le cancer de la prostate ; un isoforme de tNOX de 94 kDa avec le cancer du col de l'utérus, des isoformes de tNOX de 43 et 52 kDa avec le cancer du côlon ou des isoformes de 40,5, 52 et environ 80 kDa avec le cancer des ovaires.