FR 2904312 A1 20080201 FR 0606993 A 20060731 1 La présente invention concerne un nouveau procédé d'extraction d'oléocanthal à partir d'huile d'olive, et plus particulièrement un procédé d'extraction et de purification susceptible de fournir des extraits à teneur élevée en oléocanthal Le maintien de la santé et du confort de vie est devenu l'une des principales préoccupations des populations des pays développés. Il en résulte des besoins croissants en médicaments, en soins médicaux et en produits alimentaires de qualité contrôlée. En particulier, dans le domaine de l'alimentation, de nombreuses recherches ont été consacrées aux suppléments et compléments alimentaires, entraînant le développement des domaines de la "nutraceutique" et des "alicaments", pour la mise au point d'aliments ou de compléments alimentaires destinés à favoriser les fonctions biologiques affectées par le vieillissement. De plus, les consommateurs recherchent aujourd'hui de plus en plus souvent des produits naturels ou d'origine naturelle ayant subi un traitement aussi peu dénaturant que possible. Des études épidémiologiques ont montré les effets bénéfiques pour la santé des régimes diététiques méditerranéens comprenant un apport élevé en fibres, fruits, légumes, et en huile d'olive qui constitue la source principale de matière grasse. L'huile d'olive contient notamment des acides gras mono-insaturés (acide oléique) ainsi que des composés phénoliques qui ont pour effet de retarder l'oxydation des lipoprotéines LDL. Parmi ces composés phénoliques, on distingue des alcools phénoliques tels que le tyrosol et l'hydroxytyrosol, des acides benzoïques, des acides caféique et éléno- lique estérifiés par le tyrosol et l'hydroxytyrosol, ainsi que des flavonoïdes tels que des flavones et flavonols. Le brevet FR 2.825.022 décrit une méthode de valorisation des phases aqueuses dans les procédés de préparation de l'huile d'olive, par extraction des polyphénols qui y sont contenus pour les utiliser dans des compositions diététiques et cosmétiques. B1668FR 2904312 2 G.K. Beauchamp et al. Nature, vol. 437, 45-46 (Sept. 2005), ont montré que l'huile d'olive vierge obtenue par première pression à froid contient notamment un dérivé phénolique particulier, l'oléocanthal, qui présente des 5 propriétés inhibitrices des enzymes COXl et COX2, c'est-à-dire des propriétés anti-inflammatoires voisines de celles de l'ibuprofène, molécule utilisée depuis de nombreuses années comme médicament anti-inflammatoire non-stéroidien. L'oléocanthal, ou deacetoxy-ligstroside aglycone, est un 10 dérivé phénolique qui a été détecté dans des huiles d'olive de diverses provenances, plus particulièrement dans l'huile d'olive vierge obtenue par première pression à froid, à des concentrations très faibles qui varient généralement de 20 à 200 ppm (masse), soit de 0,002 à 0,02% en poids, en fonction 15 de la provenance de l'huile d'olive. Il peut être représenté par la formule générale suivante : O Une utilisation pharmaceutique ou nutraceutique de ce composé requiert l'obtention de fractions beaucoup plus 20 concentrées. De plus, l'oléocanthal est un produit très fragile, facilement détruit par la chaleur et par oxydation, comme le sont d'ailleurs la plupart des autres composés polyphénoliques naturellement présents dans les huiles végétales. Différentes méthodes d'extraction des composés phéno- 25 liques présents dans l'huile d'olive ont été comparées par G. Montedoro et al., J. Agric. Food Chem., 1992, 40, 9, 1571-1576. Selon les auteurs, pour être optimale, l'extraction doit se faire avec un mélange méthanol/eau 80/20. La purification HO 2904312 3 de l'extrait est ensuite réalisée par lavage à l'hexane de l'extrait solubilisé dans l'acétonitrile. Cependant, les auteurs ont optimisé cette méthode par rapport aux composés phénoliques totaux présents dans l'huile d'olive, et leur 5 étude n'est pas directement transposable à l'obtention d'extraits riches en oléocanthal. De plus, une partie importante des composés triglycéridiques est toujours présente même après purification. D'autres purifications de l'oléocanthal sont décrites Io dans la littérature. Elles font appel systématiquement à des purifications par chromatographie sur plaque de verre, sur colonne ouverte, ou par chromatographie préparative, et n'ont pour but que l'obtention de produit purifié pour caractérisation. 15 Ainsi, la quantité d'oléocanthal dans l'huile d'olives étant très faible (20 à 200 ppm soit 0.002 à 0.02% d'oléocanthal), il est difficile d'obtenir un extrait suffisamment enrichi en oléocanthal sans faire appel à des méthodes chromatographiques. 2.0 Il est donc souhaitable de pouvoir mettre au point un procédé permettant d'obtenir des extraits à teneur élevée en oléocanthal. Les études effectuées par le demandeur ont montré qu'il est possible d'extraire efficacement l'oléocanthal présent en 25 très faibles concentrations dans l'huile d'olive en choisissant un système de solvants appropriés, suivi si nécessaire d'une purification. La présente invention a pour objet un procédé d'extraction d'oléocanthal à partir d'huile d'olive vierge, de 30 préférence d'huile d'olive vierge préparée par première pression à froid, procurant un extrait titré en oléocanthal supérieur à 10% et généralement compris entre 10% et 25%. La présente invention a encore pour objet un procédé d'extraction et de purification d'oléocanthal à partir d'huile 35 d'olive vierge, de préférence d'huile d'olive vierge préparée 2904312 4 par première pression à froid, procurant un extrait titré en oléocanthal supérieur à 7o% exempt de composés triglycéridiques et d'impuretés phénoliques, notamment de tyrosol et d' hydroxytyrosol. 5 Le procédé conforme à la présente invention comprend les étapes suivantes . a) addition d'un hydrocarbure à l'huile d'olive ; b) extraction au moyen d'un mélange de solvants binaire eau / alcool ou acétone, ou ternaire eau / alcool ou acétone / 10 solvant non miscible à l'eau ; c) élimination de la phase organique et concentration totale ou partielle de la phase aqueuse ; d) purification de l'extrait concentré. Les études et analyses effectuées ont permis de 15 déterminer les solvants et les rapports préférentiels eau / alcool ou acétone et eau / alcool ou acétone / solvant non miscible à l'eau, et ils ont montré de manière inattendue que la presque totalité de l'oléocanthal, soit plus de 95%, est extraite dès l'étape b) du procédé suivant l'invention, la 20 teneur en oléocanthal au terme de cette étape étant comprise entre 10% et 25%. Cette teneur est ensuite portée à plus de 70% par les étapes c) et d) suivantes. L'étape c) du procédé de l'invention, après la première étape d'extraction, permet de purifier partiellement l'extrait 25 et d'éliminer efficacement les constituants entraînés lors de l'extraction dont les propriétés physico-chimiques sont proches de celles de l'oléocanthal. Cette étape est cruciale pour obtenir un extrait à forte concentration en oléocanthal. La concentration de l'extrait obtenu dans l'étape b) peut être 30 totale de manière à obtenir un extrait sec que l'on reprend ensuite dans l'étape d). En cas de concentration partielle, il est avantageux de procéder ensuite à une étape de centrifugation avant d'effectuer la purification par l'étape d). Le taux de concentration partielle doit être d'au moins 50%. 2904312 5 L'étape d) consiste à purifier soit par extraction liquide/liquide par un mélange eau/alcool/solvant non miscible à l'eau, soit par addition d'un solvant non miscible à l'eau, par exemple une cétone, pour faire précipiter les insolubles. 5 L'étape a) du procédé de l'invention permet de faciliter la séparation entre la phase organique et la phase aqueuse. L'hydrocarbure utilisé peut comporter de 5 à 10 atomes de carbone et est choisi de préférence dans le groupe constitué par l'hexane, le cyclohexane et l'heptane. 10 Dans le cas d'un mélange binaire de solvants eau / alcool, l'alcool est choisi de préférence dans le groupe constitué par le méthanol, l'éthanol, le n-propanol, l'isopropanol. Lorsque l'on utilise un mélange ternaire de solvants eau 15 / alcool ou acétone / solvant non miscible à l'eau, ce dernier peut être par exemple un solvant chloré, une cétone ou un acétate d'alkyle. Le solvant chloré comporte généralement 1 à 8 atomes de carbone et peut être choisi de préférence dans le groupe constitué par le dichlorométhane, le chloroforme et le 20 chlorocyclohexane, la cétone comporte de préférence 4 à 8 atomes de carbone et peut être choisie dans le groupe constitué par la méthyléthylcétone et les pentanones, et l'acétate d'alkyle comporte généralement de 3 à 8 atomes de carbone et est de préférence l'acétate de méthyle ou d'éthyle. 25 Les proportions de solvants utilisées peuvent varier selon les conditions opératoires, mais elles sont généralement comprises entre 80/20 et 40/60 dans le cas d'un mélange binaire eau / alcool ou acétone, et par exemple on utilise avantageusement un mélange eau / méthanol 60/40. 30 En ce qui concerne l'étape d, dans le cas de l'extraction liquide/liquide, le solvant non miscible à l'eau est choisi parmi les alcools, les cétones, les solvants chlorés ou les acétates d'alkyles avec une utilisation préférentielle des butanols-1 et -2, de la méthyléthylcétone, du dichlorométhane 35 et de l'acétate d'éthyle. Dans le cas d'une précipitation des 2904312 6 insolubles par un solvant miscible à l'eau, ce dernier est choisi parmi les cétones, les alcools, l'acétonitrile, le tétrahydrofurane, le diméthylsulfoxide et le dioxane, et est préférentiellement du méthanol ou de l'acétone. 5 Le procédé suivant la présente invention permet en particulier d'isoler l'oléocanthal de presque tous les autres composés phénoliques présents à l'origine dans l'huile d'olive. Il s'agit notamment des alcools phénoliques tels que le tyrosol et l'hydroxytyrosol ; des acides libres de la série 10 benzoïque tels que les acides protocatéchique, gallique, vanillique, syringique, ou de la série cinnamique tels que les acides p-coumarique, caféique, et sinapique ; des dérivés estérifiés de l'acide caféique (verbascoside) ou de l'acide élénolique (oleuropéine glycosylée ou non, en grande partie 15 responsable de l'amertume de l'huile d'olive), ces deux acides étant estérifiés par le tyrosol ou l'hydroxytyrosol ; et enfin des flavonoïdes tels que flavones (lutéoline) et flavonol (quercétine et kaemférol glycosylés ou non). L'oléocanthal est également isolé des autres composants de l'huile d'olive tels 20 que hydrocarbures (par exemple squalène), stérols (par exemple p-sitostérol), alcools triterpéniques, et tocophérol (sous formes a, 3 ou y). Il est tout particulièrement intéressant de noter que l'extrait obtenu suivant le procédé de l'invention contient 25 l'oléocanthal comme composé phénolique fortement prédominant ainsi que de faibles quantités de dérivés de l'oleuropéine aglycone et du ligstroside aglycone, tandis que le tyrosol et l'hydroxytyrosol, et leurs dérivés, en particulier les acétates, sont totalement éliminés, de même que les composés 30 triglycéridiques. Ainsi, l'extrait obtenu est titré à plus de 70% d'oléocanthal par chromatographie HPLC contre un échantillon étalon d'oléocanthal préparé par chromatographie préparative. 2904312 7 Les exemples suivants illustrent l'invention plus en détail sans en limiter la portée. Sauf indication contraire, les rapports et pourcentages sont exprimés en poids. Exemple 1 5 Cet exemple décrit l'extraction par un mélange ternaire comprenant un solvant chloré, la purification par centrifugation et extraction liquide/liquide ou par précipitation d'insolubles. A partir d'une huile contenant environ 90 mg d'oléolo canthal par kilogramme, on effectue tout d'abord une extraction en procédant de la manière suivante. Dans un réacteur de 50 litres, on charge 10 kilogrammes d'huile d'olive et 20 litres de cyclohexane. Pour une lère extraction liquide/liquide, on ajoute 10 litres d'un mélange 15 dichlorométhane/méthanol/eau 30/50/20 v/v/v, et on maintient le milieu à température ambiante sous agitation pendant 5 minutes et on laisse décanter les 2 phases. On procède à une deuxième extraction dans les mêmes conditions. On ajoute 20 litres de cyclohexane sur la lère phase 20 aqueuse. Le milieu est maintenu sous agitation à température ambiante pendant 5 minutes et on laisse décanter les 2 phases. On procède à un lavage de la 2ème phase aqueuse avec la même phase cyclohexane. Les phases aqueuses sont regroupées et concentrées 25 partiellement jusqu'à environ 1 litre de phase aqueuse en ne dépassant pas la température de 40 C dans le bain. La phase aqueuse est centrifugée(centrifugeuse Sigma 6K15C, environ 4000-5000 tours/min), et le surnageant est concentré à sec de manière à obtenir un extrait concentré 30 (1,5 g) de teneur en oléocanthal égale à 42%. L'extrait concentré est repris par un minimum de méthanol et on y ajoute environ 5 volumes d'eau par rapport au méthanol introduit. La solution aqueuse ainsi obtenue est extraite par la méthyléthylcétone. La phase organique méthyléthylcétone est 2904312 8 concentrée (évaporation à sec), en ne dépassant pas la température de 40 C dans le bain. On obtient ainsi un extrait concentré en oléocanthal (0,65 g), à 70%. 5 Suivant une variante, la dernière étape de purification par extraction peut être remplacée par l'addition d'acétone sur l'extrait concentré repris dans un minimum d'eau, pour faire précipiter les insolubles. Les insolubles sont éliminés par filtration et la phase aqueuse évaporée à sec, en ne 10 dépassant pas la température de 40 C dans le bain. Exemple 2 Cet exemple décrit l'extraction par un mélange ternaire comprenant un solvant chloré, la purification par centrifugation de 2 phases liquides et extraction liquide/liquide ou 15 précipitation d'insolubles. A partir d'une huile contenant environ 56 mg d'oléocanthal par kilogramme, on effectue tout d'abord une extraction comme indiqué ci-après. Dans un réacteur de 50 litres, on charge 10 kilogrammes 20 d'huile d'olive et 20 litres de cyclohexane et on ajoute, pour la 1ère extraction liquide/liquide, 10 litres d'un mélange dichlorométhane/méthanol/eau 30/50/20 v/v/v. Le milieu est maintenu sous agitation à température ambiante pendant 5 minutes, puis on laisse décanter les 2 phases. L'extraction 25 est répétée une deuxième fois dans les mêmes conditions. On ajoute sur la phase aqueuse 20 litres de cyclohexane. Le milieu est maintenu sous agitation à température ambiante pendant 5 minutes, puis on laisse décanter les 2 phases. Les phases aqueuses sont regroupées et concentrée par 30 évaporation à sec en ne dépassant pas 40 C dans le bain. On obtient ainsi environ 4.7 g d'extrait à environ 12% d'oléocanthal. L'extrait concentré est repris par un volume de méthanol équivalent à environ 50 fois son poids. On élimine par 2904312 9 décantation ou centrifugation la phase grasse non miscible, et on concentre par évaporation à sec la phase méthanolique en ne dépassant pas 40 C dans le bain. L'extrait concentré est repris par un volume de méthanol 5 équivalent à environ 40 fois son poids, et on ajoute le volume d'eau adéquat pour avoir de l'eau à 5% de méthanol. La solution ainsi obtenue est extraite par un volume de dichlorométhane équivalent à environ 25 fois le poids de l'extrait. Le milieu est maintenu sous agitation à température 10 ambiante pendant 5 minutes, puis on laisse décanter les 2 phases. On récupère la phase dichlorométhane et on la relave par le même volume d'eau à 5% de méthanol que pour la 'ère extraction. La phase dichlorométhane est concentrée par évaporation à sec en ne dépassant pas 40 C dans le bain. 15 L'extrait concentré est repris par un volume de méthanol équivalent à environ 50 fois son poids. On agite et on concentre la solution quasi-totalement. La solution est centrifugée et la phase colorée est séparée de la phase incolore. On obtient ainsi environ 1.2 g d'extrait à plus de 30% 20 d'oléocanthal. L'extrait concentré est repris par un minimum de méthanol et on ajoute environ 5 volumes d'eau par rapport au méthanol introduit. On extrait la solution aqueuse ainsi obtenue par le butanol. La phase organique butanol est concentrée par 25 évaporation à sec, en ne dépassant pas 40 C dans le bain. Suivant une variante, on fait précipiter les insolubles par addition d'eau sur l'extrait concentré repris dans un minimum de méthanol. Les insolubles sont éliminés et la phase aqueuse évaporée à sec, en ne dépassant pas la température de 30 40 C dans le bain. On obtient ainsi environ 0.4 g d'extrait à plus de 70% d'oléocanthal. 2904312 10 Exemple 3 Cet exemple décrit l'extraction par un mélange binaire, purification par extraction liquide/liquide et précipitation d'insolubles. 5 A partir d'une huile contenant environ 70 mg d'oléocanthal par kilogramme, on effectue tout d'abord une extraction comme indiqué ci-après. Dans un réacteur de 50 litres, on charge 10 kilogrammes d'huile d'olive et 20 litres de cyclohexane. Pour la lère 10 extraction liquide/liquide, on ajoute 20 litres d'un mélange méthanol/eau 40/60 v/v, et on agite le milieu à température ambiante pendant 5 minutes, puis on laisse décanter les 2 phases. L'extraction est répétée une deuxième fois dans les mêmes conditions. 15 On ajoute sur la lère phase aqueuse 20 litres de cyclohexane. Le milieu est maintenu sous agitation à température ambiante pendant 5 minutes puis on laisse décanter les 2 phases. On procède à un lavage de la 2ème phase aqueuse avec la même phase cyclohexane. 20 Les 2 phases aqueuses sont regroupées et concentrées par évaporation à sec en ne dépassant pas 40 C dans le bain. On obtient ainsi environ 7.0 g d'extrait à environ 10% d'oléocanthal. L'extrait concentré est repris par un volume de dichloro- 25 méthane équivalent à environ 100 fois son poids. On ajoute un volume d'eau à 5% de méthanol environ 5 fois supérieur au volume de dichlorométhane. Le milieu est maintenu sous agitation à température ambiante pendant 5 minutes et on laisse décanter les 2 phases. La phase dichlorométhane est 30 récupérée et relavée par le même volume d'eau à 5% de méthanol que pour la lère extraction. La phase dichlorométhane est concentrée par évaporation à sec en ne dépassant pas 40 C dans le bain. L'extrait concentré est repris par un volume d'eau 35 équivalent à 20 fois son poids. On agite et centrifuge ou 2904312 11 filtre la solution sur une cartouche de 0.45 m. La phase aqueuse est récupérée et concentrée par évaporation à sec en ne dépassant pas 40 C dans le bain. On obtient ainsi environ 1.2 g d'extrait à plus de 40% 5 d'oléocanthal. L'extrait concentré est repris par un minimum de méthanol et on ajoute environ 5 volumes d'eau par rapport au méthanol introduit. La solution aqueuse ainsi obtenue est extraite par du dichlorométhane. On concentre la phase organique dichloro-10 méthane par évaporation à sec en ne dépassant pas 40 C dans le bain. Suivant une variante, on fait précipiter les insolubles par addition d'acétonitrile sur l'extrait concentré repris dans un minimum d'eau. Les insolubles sont éliminés et la 15 phase aqueuse évaporée à sec, en ne dépassant pas la température de 40 C dans le bain. On obtient ainsi environ 0.5 g d'extrait > à 7o% d'oléocanthal. Exemple 4 20 Cet exemple décrit l'extraction par un mélange ternaire comprenant un acétate d'alkyle, purification par centrifugation et extraction liquide/liquide ou précipitation d'insolubles. A partir d'une huile contenant environ 56 mg d'oléo-25 canthal par kilogramme, on effectue tout d'abord une extraction comme indiqué ci-après. Dans un réacteur de, 50 litres, on charge 10 kilogrammes d'huile d'olive et 20 litres de cyclohexane. On ajoute pour la lère extraction liquide/liquide, 10 litres d'un mélange acétate 30 d'éthyle/méthanol/eau 40/30/30 v/v/v. Le milieu est agité à température ambiante pendant 5 minutes et on laisse décanter les 2 phases. L'extraction est répétée une deuxième fois dans les mêmes conditions. 2904312 12 On ajoute sur la lère phase aqueuse 20 litres de cyclohexane. On agite le milieu à température ambiante pendant 5 minutes et on laisse décanter les 2 phases. On procède à un lavage de la 2ème phase aqueuse avec la même phase cyclohexane. 5 Les 2 phases aqueuses sont regroupées et concentrées par évaporation à sec en ne dépassant pas 40 C dans le bain. On obtient ainsi environ 3.7 g d'extrait à environ 15% d'oléocanthal. Les purifications sont ensuite menées comme décrit dans Io l'exemple 1. On obtient ainsi 0.4 g d'extrait à 72% d'oléocanthal. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction d'oléocanthal à partir d'huile d'olive vierge, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes . a) addition d'un hydrocarbure à l'huile d'olive ; b) extraction au moyen d'un mélange de solvants binaire eau / alcool ou acétone, ou ternaire eau / alcool ou acétone / solvant non miscible à l'eau ; c) élimination de la phase organique et concentration totale ou partielle de la phase aqueuse ; d) purification de l'extrait concentré. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'alcool utilisé dans l'étape b) est choisi dans le groupe constitué par le méthanol, l'éthanol, le n-propanol, et l'isopropanol. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant non miscible à l'eau de l'étape b) est solvant chloré, une cétone ou un acétate d'alkyle. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le solvant chloré est choisi dans le groupe constitué par le dichlorométhane, chloroforme et le chlorocyclohexane, la cétone est choisie parmi la méthyléthylcétone et les pentanones, et l'acétate d'alkyle est l'acétate de méthyle ou d'éthyle. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la purification de l'étape d) est effectuée soit par extraction liquide/liquide par un mélange eau/alcool/solvant non miscible à l'eau, soit par addition d'un solvant non miscible à l'eau pour faire précipiter les insolubles. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydrocarbure est choisi dans le groupe constitué par l'hexane, le cyclohexane et l'heptane. 2904312 14 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape c) comprend une concentration partielle suivie d'une centrifugation. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 5 que la concentration totale de l'extrait dans l'étape c) est faite par évaporation à sec manière à obtenir un extrait sec que l'on reprend ensuite dans l'étape d). 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la purification de l'étape d) est faite soit par extraction liquide/liquide par un mélange eau/alcool/solvant non miscible à l'eau, soit par addition d'un solvant miscible à l'eau pour faire précipiter les insolubles. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'huile d'olive est une 15 huile d'olive vierge préparée par première pression à froid.