FR 2898132 A1 20070907 FR 0601837 A 20060301 SYSTEME D'EXPRESSION D'UN GENE D'INTERET CHEZ LA LEVURE. La présente invention concerne un nouveau système d'expression d'un gène d'intérêt chez la levure, mettant 5 notamment en oeuvre une cassette d'expression. L'expression d'un gène d'intérêt met généralement en oeuvre des technologies d'ADN recombinant consistant à isoler ou synthétiser un gène d'intérêt, et à le cloner dans 10 un hôte hétérologue. L'hôte est ensuite cultivé dans des conditions convenables pour permettre l'expression du gène en grande quantité. Plusieurs facteurs peuvent affecter l'expression du gène dans la cellule hôte. Ces facteurs dépendent en premier lieu du choix de l'hôte employé. La 15 levure est utilisée depuis longtemps dans des procédés de fermentations à grande échelle et la technologie de production à grande échelle de levures est bien connue. La levure présente plusieurs avantages en tant qu'hôte pour l'expression d'un gène d'intérêt: 1) elle peut être cultivée 20 à une plus grande densité que d'autres types de cellules eucaryotes, 2) sa machinerie de modifications posttranscriptionnelles et post-traductionnelles est similaire à celle trouvée dans les cellules de mammifères, permettant ainsi la production de protéines eucaryotes fonctionnelles. 25 De plus, les levures sont cultivées dans un milieu de culture plus simple et de plus faible coût que ceux utilisés pour la culture d'autres types de cellules eucaryotes. Enfin, le génome des levures est bien caractérisé et est facilement manipulable pour permettre l'expression d'un gène 30 hétérologue. Plusieurs systèmes ont préalablement été décrits pour permettre l'expression d'un gène hétérologue chez la levure, par exemple dans les demandes de brevet CA 02381347 et US 2005/0191726. - 2 - Pour faciliter la compréhension de la présente demande, plusieurs termes doivent être définis préalablement. On entend par cassette d'expression une séquence nucléotidique comprenant un promoteur, au moins un site d'insertion pour le clonage du gène d'intérêt ou un site multiple de clonage (MCS pour Multiple Cloning Site) et un terminateur. On entend par promoteur une séquence d'ADN nécessaire à l'initiation et au contrôle de la transcription, par site d'insertion pour le clonage ou site multiple de clonage une séquence d'ADN contenant respectivement un ou plusieurs sites de restriction, et par terminateur une séquence d'ADN nécessaire à la terminaison de la transcription. On entend par vecteur toute séquence d'ADN dans laquelle il est possible d'insérer des fragments d'acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d'introduire de l'ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage Pl (PAC), les vecteurs dérivés de virus. Ainsi, la demande de brevet CA 0238/347 revendique une cassette d'expression et un vecteur la comprenant pour permettre l'expression d'un gène d'intérêt chez la levure. La demande de brevet US 2005/0191726 décrit un vecteur comprenant une ou plusieurs cassettes d'expression qui contiennent une séquence nucléotidique codant un gène d'intérêt, permettant ainsi l'expression d'une protéine d'intérêt chez la levure. Ces différents systèmes permettant l'expression d'un gène d'intérêt chez la levure reposent sur l'utilisation - 3 - d'un vecteur et la transformation de la levure par ledit vecteur. De ce fait, une construction moléculaire particulière est en général réalisée pour chaque vecteur à chaque fois que l'on cherche à exprimer un gène d'intérêt dans la levure. Chaque construction n'est utilisable en général qu'une seule fois par souche, se limite à une seule intégration et nécessite un long travail de synthèse sans garantie de réussite. La présente invention propose donc un système d'expression simple et rapide permettant une expression fiable de n'importe quel gène d'intérêt chez la levure. De plus, le procédé de transformation de la levure par un tel vecteur ne peut être réalisé qu'une seule fois pour chaque souche de levure. Ainsi, l'augmentation du nombre de copies du gène d'intérêt dans la levure ne peut être obtenue que par génétique classique en croisant deux souches de levures transformées. En effet, lors d'une première transformation, les levures ayant bien intégré le système d'expression dans leur génome sont sélectionnées positivement grâce à la présence d'un marqueur de sélection. On entend par marqueur de sélection un gène dont l'expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Il s'agit par exemple d'un gène de résistance aux antibiotiques. Cependant, comme toutes les levures sélectionnées positivement possèdent dans leur génome ce marqueur de sélection, une seconde transformation est impossible puisqu'il n'existe plus de moyen pour sélectionner positivement les levures qui auraient intégré une seconde fois le système d'expression. De ce fait, le rendement de l'expression du gène d'intérêt est limité. - 4 - La présente invention propose donc un système d'expression permettant de transformer plusieurs fois une levure, de façon à augmenter le nombre de copies du système d'expression présentes dans le génome et ainsi augmenter l'expression du gène d'intérêt. Une augmentation du nombre de copies du système d'expression présentes dans le génome de la levure pourrait aussi être obtenue par une possible insertion multiple suivant les sites d'intégration utilisés par ce système. D'autre part, les procédés de l'art antérieur conduisent à l'expression d'un gène d'intérêt dans des levures qui ont intégré un gène de résistance aux antibiotiques dans leur génome. Or pour la commercialisation dans le domaine de l'industrie agro-alimentaire, il peut être intéressant d'utiliser un procédé d'expression d'un gène d'intérêt dans lequel les levures ne contiennent pas d'ADN non originaire de souches appartenant au même genre, de préférence à la même espèce de levure, et notamment de gènes de résistance aux antibiotiques, à l'exception du gène d'intérêt codant pour une protéine non produite naturellement par la souche de levure. La présente invention propose donc un système permettant d'éliminer le gène de résistance aux antibiotiques du génome des levures transformées. La présente invention concerne donc un nouveau système d'expression chez la levure simple et rapide, permettant d'une part une expression fiable du gène d'intérêt, d'autre part d'augmenter le nombre de copies du système d'expression intégrées dans le génome de la levure, et enfin permettant d'éliminer le gène de résistance aux antibiotiques intégré dans le génome de la levure. -5 Les inventeurs ont élaboré un système d'expression chez la levure comprenant des éléments connus assemblés de telle façon que ce système d'expression est beaucoup plus performant que les systèmes d'expression de l'art antérieur. Ce nouveau système d'expression est constitué de séquences spécifiques d'intégration du système dans le génome de la levure, d'un insert de sélection et d'une cassette d'expression du gène d'intérêt. Cette invention procure ainsi un système simple et rapide pour l'expression d'un gène d'intérêt chez la levure, puisque seule reste à réaliser l'étape de clonage du gène d'intérêt dans le système d'expression. L'utilisation dans ce système d'expression de séquences spécifiques d'intégration dans le génome de la levure permet une intégration simple ou multiple conduisant à la fiabilité du succès de l'expression du gène d'intérêt. En combinaison avec un vecteur d'excision, ce nouveau système permet d'exciser le marqueur de sélection associé au système d'expression intégré dans le génome de la levure. Enfin, le nombre de copies du système d'expression intégrées dans le génome de la levure peut être facilement augmenté, puisque l'excision du marqueur de sélection donne l'avantage de pouvoir transformer à nouveau des levures contenant déjà une copie du système d'expression. L'invention a donc pour objet un système d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule, de préférence une levure, comprenant : (1) des moyens visant à l'intégration dudit système dans le génome de ladite cellule, comprenant deux 30 séquences nucléotidiques, (2) des moyens visant à la sélection de ladite cellule ayant intégré ledit système, comprenant un insert de sélection comprenant deux séquences LoxP encadrant un - 6 -promoteur, un marqueur de sélection du type gène de résistance aux antibiotiques et un terminateur, (3) une cassette d'expression du gène d'intérêt, comprenant un promoteur permettant l'expression dudit gène, au moins un site de clonage permettant l'intégration du gène, et un terminateur. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le site de clonage comprend les sites de restriction d'enzymes de restriction NotI, BamHI, MfeI et XhoI, permettant l'insertion de la séquence nucléotidique du gène d'intérêt dans la cassette d'expression. Avantageusement, ce site de clonage a pour séquence la SEQ ID n l ou toute séquence identique à au moins 70%, de préférence 15 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n l. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'encadrement du marqueur de sélection par deux séquences LoxP va permettre l'excision de ce marqueur de 20 sélection grâce au système CRE/Lox. L'enzyme CRE est une recombinase qui reconnaît spécifiquement les séquences LoxP. La séquence nucléotidique comprise entre ces deux sites est qualifiée d'ADN cible et sera éliminée en présence de l'enzyme CRE. En effet, lorsque l'enzyme CRE se lie aux sites 25 LoxP, elle coupe ces sites en deux et recolle ensemble deux moitiés après que l'ADN cible ait été éliminé. Avantageusement, les séquences LoxP ont pour séquence la SEQ ID n 2 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence 30 SEQ ID n 2. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, dans lequel la cellule est une levure, les - 7 - séquences permettant l'intégration du système d'expression dans le génome de ladite levure sont multiples et sont choisies dans le groupe constitué par les séquences TY, les séquences télomériques X et Y', les séquences DUP, la séquence b ou toutes séquences répétées dans le génome de la levure. Ces séquences d'intégration multiples permettent d'obtenir une intégration multiple du système d'expression, augmentant ainsi le nombre de copies intégrées dans le génome de la levure. Avantageusement, lesdites séquences d'intégration dans le génome de la levure sont les séquences TYlA et TY1B de Saccharomyces cerevisiae, et ont de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 3 et SEQ ID n 4 respectivement ou toutes séquences homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, aux séquences SEQ ID n 3 et SEQ ID n 4. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, les promoteurs utilisés dans le système d'expression sont des promoteurs forts, c'est-à-dire des promoteurs qui induisent une forte transcription des gènes sous leur contrôle. Des exemples de promoteurs forts sont 1) des promoteurs gouvernant l'expression de gènes dont les protéines sont abondantes dans la levure comme les promoteurs gouvernant l'expression de protéines de la glycolyse ou du métabolisme de l'azote ; 2) des promoteurs dont l'expression est spécifique, par exemple des promoteurs dont l'activité est régulée par la présence de sucre ou d'azote ; 3) des promoteurs dont l'activité est importante au vu des expériences de transcriptome ; ou 4) des promoteurs artificiels conçus pour permettre une forte transcription des gènes qu'ils régulent. Les terminateurs utilisés dans le système d'expression sont choisis pour leur capacité à - 8 -permettre une bonne stabilité des ARNm. Avantageusement, le terminateur choisi correspond au promoteur fort choisi précédemment. Avantageusement, le promoteur permettant l'expression du gène d'intérêt est le promoteur du gène TDH3 de Saccharomyces cerevisiae, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 5 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 5. Avantageusement, le terminateur associé est le terminateur du gène CYC1 de Saccharomyces cerevisiae, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 6 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 6. Avantageusement, le promoteur et le terminateur permettant l'expression du marqueur de sélection sont le promoteur et le terminateur du gène TEF1 de Ashbya gossypii, et ont de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 7 et SEQ ID n 8 respectivement ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le marqueur de sélection est un gène de résistance aux antibiotiques choisi dans le groupe comprenant les gènes de résistance à la généticine, nourseothricine, phléomycine, zéocine ou tout autre gène de résistance dominant à un antibiotique pour lequel la levure sauvage est sensible. Avantageusement, le marqueur de sélection utilisé dans le système d'expression est le gène de résistance à la généticine et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 9 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de - 9 - préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 9. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le système d'expression a pour séquence la séquence nucléotidique de SEQ ID n 10 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 10. La présente invention a également pour objet un vecteur comprenant un système d'expression tel que défini précédemment. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le 15 vecteur comprenant le système d'expression est un plasmide, et avantageusement pUC57. L'invention englobe également des bactéries transformées, comprenant au moins un vecteur recombinant tel 20 que défini ci-dessus. Ces bactéries transformées peuvent appartenir à n'importe quelle espèce permettant la réplication du vecteur support choisi. Avantageusement, il s'agit de bactéries du genre E. 25 Coli. L'invention a également pour objet un kit comprenant d'une part un vecteur comprenant le système d'expression décrit précédemment et d'autre part un vecteur 30 d'excision du marqueur de sélection présent dans le système d'expression. Ce kit permet l'élimination dudit marqueur de sélection intégré dans le génome de la levure par l'intermédiaire du système d'expression. - 10 - Ledit vecteur d'excision comprend : (1) des moyens visant à la sélection des cellules le contenant comprenant un promoteur, un marqueur de sélection et un terminateur, et (2) des moyens visant à l'excision du marqueur de sélection présent dans le système d'expression comprenant un promoteur, le gène CRE, et un terminateur. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les promoteurs utilisés pour l'expression du marqueur de sélection et l'expression du gène CRE sont des promoteurs forts tels que décrits précédemment, et les terminateurs associés sont des terminateurs permettant une bonne stabilité des ARNm. Avantageusement, le terminateur choisi correspond au promoteur fort choisi précédemment. Avantageusement, les promoteurs et terminateurs régulant l'expression du marqueur de sélection sont les promoteurs et terminateurs du gène TEF1 de Ashbya gossypii, et ont de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 7 et 8 respectivement ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. Avantageusement, le promoteur permettant l'expression du gène CRE est le promoteur du gène GAL1 de Saccharomyces cerevisiae, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 11 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 11. Avantageusement, le terminateur associé au gène CRE est le terminateur du gène CYC1 de Saccharomyces cerevisiae, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 6 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 6. 2898132 - 11 - Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le marqueur de sélection présent dans le vecteur d'excision est un gène de résistance aux antibiotiques choisi dans le groupe comprenant les gènes de résistance à la 5 généticine, nourseothricine, phléomycine, zéocine ou tout autre gène de résistance dominant à un antibiotique pour lequel la levure sauvage est sensible. Avantageusement, le marqueur de sélection utilisé dans l'insert de sélection est le gène de résistance à la 10 nourseothricine, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 12 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 12. 15 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le gène CRE a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n 13 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 13. 20 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le vecteur d'excision décrit précédemment est choisi parmi les vecteurs qui sont mal ségrégés pendant les divisions cellulaires, conduisant par cette caractéristique à 25 une perte du vecteur en absence de pression de sélection fréquente, par exemple des vecteurs réplicatifs de type multicopies. Avantageusement, le vecteur d'excision comprenant les deux séquences nucléotidiques décrites précédemment est le 30 plasmide pFL44s. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le vecteur d'excision est un vecteur multicopie, - 12 - de préférence pFL44s, dans lequel les moyens visant à la sélection des cellules le contenant comprennent le promoteur TEF1 de Ashbya gossypii, le gène de résistance à la nourseothricine et le terminateur TEF1 de Ashbya gossypii (séquence portée par le vecteur dont la référence Genbank est X73149), et les moyens visant à l'excision du marqueur de sélection présent dans le système d'expression comprennent le promoteur GAL1 de Saccharomyces cerevisiae, le gène CRE et le terminateur CYC1 de Saccharomyces cerevisiae (séquence portée par le vecteur dont la référence Genbank est AF298782). Avantageusement, le vecteur d'excision comprend la séquence SEQ ID n 14 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 14. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le kit comprend un vecteur d'excision choisi parmi les vecteurs multicopies, de préférence pFL44s, ledit vecteur d'excision comprenant la séquence SEQ ID n 14 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n 14. L'invention englobe également des levures transformées, comprenant au moins un système d'expression tel 25 que décrit précédemment. L'invention a aussi pour objet des levures transformées telles que ci-dessus et/ou transformées avec le vecteur d'excision tel que décrit précédemment. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les levures appartiennent à toute espèce de levures hémiascomycètes, de préférence au genre Saccharomyces 30 - 13 - ou ses hybrides et très préférentiellement, les levures proviennent de l'espèce cerevisiae ou ses hybrides. Au sens de la présente invention, on entend par levure toute levure diploïde ou polyploïde ou tout clone haploïde issu de la sporulation de l'une de ces souches ou encore tout clone diploïde issu du croisement de deux clones haploïdes. La présente invention a pour objet un procédé 10 d'expression d'un gène d'intérêt dans la levure, comprenant les étapes suivantes : a) clonage de la séquence nucléotidique du gène d'intérêt dans le système d'expression, b) transformation de la levure avec le système 15 d'expression ainsi obtenu, c) culture de la levure dans les conditions permettant l'expression du gène d'intérêt. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la 20 séquence nucléotidique du gène d'intérêt et le vecteur comprenant le système d'expression sont dans un premier temps digérés par une ou plusieurs enzymes de restriction. La séquence du gène d'intérêt est ensuite insérée par simple ligation ou tout autre moyen d'insertion dans le système 25 d'expression porté par le vecteur. De façon à amplifier le système d'expression, des bactéries sont transformées selon n'importe quel procédé connu avec le produit de ligation (vecteur portant le système d'expression contenant la séquence du gène d'intérêt). Les bactéries 30 contenant le vecteur sont sélectionnées grâce au marqueur de sélection, de préférence un gène de résistance aux antibiotiques, présent sur le vecteur. - 14 -Dans un second temps, le vecteur contenant le système d'expression est digéré pour une ou plusieurs enzymes de restriction, de préférence PvuII, coupant de part et d'autre du système d'expression. Le système d'expression est ensuite purifié puis transformé dans les levures selon n'importe quel procédé connu. Les levures ayant intégré le système d'expression sont sélectionnées grâce au marqueur de sélection, de préférence un gène de résistance aux antibiotiques, présent dans le système d'expression. Enfin, les levures transformées sont cultivées dans les conditions permettant l'expression du gène d'intérêt. L'invention a aussi pour objet un procédé d'expression d'un gène d'intérêt dans lequel le marqueur de sélection présent dans le génome de la levure a été excisé, ledit procédé comprenant après l'étape b) et avant l'étape c), les étapes bl), b2) et b3) suivantes : bl) transformation de la levure avec le vecteur d'excision, b2) culture de la levure dans les conditions permettant l'expression de l'enzyme CRE, b3) isolement des levures ayant perdu le marqueur de sélection. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence nucléotidique du gène d'intérêt est insérée dans le système d'expression, et les levures sont dans un premier temps transformées avec de système d'expression comme décrit précédemment. Les levures ayant intégré le système d'expression sont sélectionnée grâce à la présence d'un premier marqueur de sélection, de préférence un gène de résistance aux antibiotiques. Les levures sélectionnées positivement sont ensuite transformées avec le vecteur - 15 - d'excision selon n'importe quel procédé connu. Les levures ayant intégré le vecteur d'excision sont sélectionnées grâce à un second marqueur de sélection, de préférence un gène de résistance aux antibiotiques, présent dans le vecteur d'excision. Les levures, ayant donc intégré le système d'expression et contenant le vecteur d'excision, sont alors cultivées dans les conditions permettant l'expression de l'enzyme CRE. L'enzyme CRE active va permettre d'exciser le premier marqueur de sélection encadré par les séquences loxP dans le système d'expression. Les levures ayant perdu ce marqueur de sélection sont ensuite sélectionnées. Par exemple, les levures ayant perdu ce premier gène de résistance à un antibiotique sont sélectionnées grâce à leur absence de résistance à cet antibiotique. Les levures obtenues à la suite de cette étape de sélection ne possèdent plus le marqueur de sélection dans le système d'expression, mais possèdent encore celui présent dans le vecteur d'excision. Tel que décrit précédemment, le vecteur d'excision est choisi parmi les vecteurs qui sont mal ségrégés pendant les divisions cellulaires. De part cette caractéristique, le vecteur d'excision est facilement perdu en absence de pression de sélection fréquente. On entend par pression de sélection tout procédé contribuant à sélectionner les cellules. Par exemple, maintenir en culture des levures possédant un gène de résistance à un antibiotique en présence de cet antibiotique correspond à un procédé de pression de sélection. Les levures obtenues à l'étape précédente sont donc cultivées en absence de pression de sélection de façon à perdre le vecteur d'excision, puis sont sélectionnées pour la perte du second marqueur de sélection. Les levures ainsi obtenues ont intégré dans leur génome le système d'expression permettant l'expression du gène - 16 - d'intérêt, tandis que leur génome ne contient plus de gènes de résistance aux antibiotiques. Ces levures sont alors cultivées dans les conditions connues de l'homme du métier permettant l'expression du gène d'intérêt. Enfin, l'invention a également pour objet un procédé d'expression d'un gène d'intérêt dans lequel les étapes b), bl), b2) et b3) sont répétées autant de fois qu'il est souhaité de copies du système d'expression, dans le but d'augmenter le nombre de copies du système d'expression dans le génome de la levure. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les levures sont dans un premier temps transformées avec le système d'expression puis sélectionnées comme décrit précédemment. Ces levures sont ensuite transformées avec le vecteur d'excision, de façon à permettre l'élimination du marqueur de sélection comme décrit précédemment. Les levures ainsi obtenues ne possèdent plus de marqueur de sélection dans leur génome et ont intégré au moins une copie du système d'expression. Dans un second temps, de façon à augmenter le nombre de copies du système d'expression, ces levures sont de nouveau transformées avec le système d'expression. Le même procédé de sélection, de transformation avec le vecteur d'excision et de sélection finale est réalisé comme précédemment. Les levures ainsi obtenues ne possèdent plus de marqueurs de sélection et ont intégré dans leur génome au moins deux copies du système d'expression. Ce procédé peut être renouvelé autant de fois que souhaitées. La présente invention peut être utilisée dans des domaines d'application très divers. Par exemple, en santé - 17 - humaine, elle peut permettre la production de protéines thérapeutiques (hormone peptidique, enzyme, anticorps), d'antigènes vaccinants contre des virus, des toxines ou des parasites, ou encore de standards pour le diagnostic (marqueurs sanguins, infectiologie). L'invention peut aussi permettre de modifier le métabolisme de la levure, i.e. synthétiser des métabolites (acides aminés, hormone non peptidique, vitamine, facteur de croissance) qu'elle ne synthétise pas naturellement ou qu'elle synthétise en quantité non significative, ou lui permettre de modifier ou dégrader d'autres métabolites. L'invention peut permettre l'optimisation de souches de levures utilisables notamment dans le secteur alimentaire, en particulier la levurerie, la panification-boulangerie, la brasserie, la vinification, la cidrerie. L'invention peut aussi permettre la production de molécules aromatiques utilisables pour la fabrication de parfums, de matières ou compositions odorantes, de compositions cosmétiques, d'arômes alimentaires ou d'additifs alimentaires odorants et/ou sapides ou encore de complémentsalimentaires (acides aminés, vitamines, acides organiques...). Enfin, l'invention peut permettre la production d'enzyme à usage industriel telles que des hydrolases, des isomérases ou des protéines structurantes de solutions. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention du système d'expression, de vecteurs comprenant ce système, de vecteurs d'excision, et de leur utilisation pour l'expression d'un gène d'intérêt dans la levure et pour l'excision du marqueur de sélection présent dans le génome de la levure. - 18 - Dans les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, il sera fait référence aux figures en annexe, dans lesquelles : - la figure 1 présente un schéma du système d'expression pM2-KAN, - la figure 2 présente l'analyse du clonage de la GFP, dans le système d'expression pM2-KAN, - la figure 3 présente le résultat de la transformation des levures avec le système d'expression, - la figure 4 présente la production de la GFP par les levures, - la figure 5 présente un test de fonctionnalité de la GFP dans les levures, - la figure 6 présente la production de la VAO par les levures, - la figure 7 présente le procédé d'obtention du vecteur d'excision pFL44s-NATl-CRE. Exemple 1 : Transformation des levures avec le système 20 d'expression contenant le gène d'intérêt : la GFP. 1/ Synthèse du système d'expression. Le système d'expression comprend la séquence nucléotidique de 25 2715 pb décrite dans SEQ ID n 10. Cette séquence nucléotidique a été construite à partir d'une séquence synthétique (SEQ ID n 15) et d'un insert de sélection (SEQ ID n 16). La séquence synthétique possède une taille de 1225 pb et a 30 été synthétisé par GenScript Corporation. Cette séquence comprend : - la séquence TYlA de Saccharomyces cerevisiae - une séquence LoxP 15 - 19 - - la séquence du promoteur du gène TDH3 de Saccharomyces cerevisiae - une séquence de sites multiples de clonage - la séquence du terminateur du gène CYC1 de Saccharomyces cerevisiae - la séquence TY1B de Saccharomyces cerevisiae L'insert de sélection a été isolé à partir du vecteur pUG6 cloné dans E. coli (Güldener, U., Heck, S., Fiedler, T., BeinHauer, J., and Hegemann, J.H. 1996. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. 24:2519-2524). L'insert de sélection comporte 1500 pb et comprend : - une séquence loxP - la séquence du promoteur du gène TEF1 de Ashbya gossypiii - la séquence du gène kanr - la séquence du terminateur du gène TEF1 de Ashbya gossypii Cet insert a été isolé par digestion du vecteur pUG6 avec les 20 enzymes de restriction Sall et Sacl. Le système d'expression comprenant la séquence synthétique a été cloné dans le vecteur pUC57 (GenScript Corporation) grâce aux sites de restriction EcoRI et Pstl. 25 Le vecteur pUG6 et le vecteur pUC57 contenant le système d'expression ont été digérés par les enzymes de restriction Sall et Sacl. L'insert de sélection est ensuite inséré par simple ligation dans la séquence synthétique entre TY1A et la 30 séquence LoxP situés de part et d'autre des sites de restriction Sall et Saci. - Le vecteur ainsi obtenu comportant le système d'expression (séquence synthétique + insert de sélection) est appelé pM2-KAN (figure 1) Les sites de restriction XbaI et SacI présents dans l'insert de sélection permettent de changer le marqueur de sélection et ses séquences d'expression si l'utilisateur le souhaite. Les sites de restriction Sall et Spel permettent d'éliminer ou de remplacer l'ensemble des séquences constitué par le marqueur de sélection et ses séquences d'expression encadrés par les deux séquences LoxP. 2/ Insertion du gène d'intérêt dans le système d'expression. La séquence nucléotidique du gène d'intérêt la GFP a été obtenue par PCR en utilisant les amorces 5' GFP Not (SEQ ID n 17) et 3' GFP Xho (SEQ ID n 18) et en utilisant comme matrice le vecteur pUG30 (référence Genbank : AF298781). Pour cet exemple, l'amorce 3' permet l'ajout d'une séquence codant 6 histidines (en C-terminal de la GFP) permettant ultérieurement la détection ou la purification par affinité de la protéine produite. La séquence du gène d'intérêt : la GFP, est obtenue par PCR (SEQ ID n 19). La séquence du gène d'intérêt : la GFP, amplifiée par PCR, et 25 le vecteur pUC57 portant le système d'expression sont digérés par les enzymes de restriction NotI et XhoI. La séquence d'intérêt est insérée par simple ligation entre le promoteur du gène TDH3 et le terminateur du gène CYC1 situés de part et d'autre des sites de restriction NotI et 30 XhoI. - 21 -3/ Clonage du système d'expression contenant la séquence du gène d'intérêt dans E. coli. Pour augmenter l'efficacité du clonage, le vecteur pUC57 portant le système d'expression contenant la séquence du gène d'intérêt est digéré par l'enzyme de restriction BamHI avant transformation dans E. coli. Les bactéries E. coli sont ensuite transformées avec ce produit selon n'importe quel procédé de transformation connu. La figure 2 présente le résultat de la digestion par les enzymes de restriction Notl et Xhol du vecteur contenant le système d'expression pM2-KAN et contenant le gène d'intérêt : la GFP (colonnes 1 et 2) ou ne le contenant pas (colonne pM2-KAN). 4/ Transformation des levures avec le système d'expression comprenant le gène d'intérêt : la GFP. Le vecteur pUC57 contenant le système d'expression est digéré par l'enzyme de restriction PvuII. Cette enzyme coupe de part et d'autre du système d'expression contenant le gène d'intérêt : la GFP. Le fragment d'ADN de 3465 pb (séquence synthétique + insert de sélection = 2715 pb + séquence du gène d'intérêt : la GFP = 750 pb) est purifié et transformé dans les levures selon une méthode de choc thermique en présence de PEG/lithium acétate. Les levures transformées, grâce à la présence du gène de résistance KANr porté par le système d'expression, sont sélectionnées sur milieu riche YPD (extrait de levure 1%, peptone 1%, glucose 2%) contenant 300 mg/1 de Geneticin. La figure 3 montre les clones obtenus après transformation des levures Saccharomyces cerevisiae (souche 92411). Les levures transformées sans ADN (la boite du haut) ne survivent pas, tandis que les levures transformées avec le système - 22 - d'expression issu du vecteur pM2-KAN par digestion avec l'enzyme de restriction PvuII (les deux boites du bas) survivent et forment des colonies. Exemple 2 : Analyse de la production de la protéine d'intérêt : la GFP dans les levures transformées par le système d'expression contenant la séquence du gène d'intérêt. Sept clones de levures transformés selon le protocole décrit 10 dans l'exemple 1 ont été analysés pour la production de la protéine d'intérêt : la GFP. Un contrôle négatif a été réalisé avec la même souche de levure transformée avec le système d'expression ne contenant pas la séquence du gène d'intérêt. 15 Les levures transformées sont cultivées sur milieu complet Glucosé (YPD). Les cellules sont lysées par agitation forte en présence de microbilles de verre dans un tampon de lyse (tampon de lyse : 50 mM tampon phosphate pH8, 300 mM NaCl, 10 20 mM Imidazole), puis l'extrait total est clarifié par centrifugation pour éliminer les débris cellulaires. La protéine GFP est purifiée par affinité sur résine Ni NTA grâce à la séquence de 6 histidines présente en C-terminal de la protéine. Brièvement, la fraction soluble est incubée 1h 25 en présence de résine Ni NTA (Quiagen). Après lavage (tampon de lavage : 50 mM tampon phosphate pH8, 300 mM NAcl, 20 mM Imidazole), les protéines GFP-6His retenues sur la résine sont éluées (tampon d'élution : 50 mM tampon phosphate pH8, 300 mM NaCl, 150 mM Imidazole) et analysées par 30 électrophorèse sur gel de polyacrylamide (gel SDS-PAGE 10%) et détectées au bleu de coomassie. La figure 4 montre que la protéine GFP, dont la taille théorique attendue est d'environ 25 kDa, est produite par - 23 - toutes les levures transformées avec le système d'expression contenant le gène d'intérêt : la GFP (colonnes 1 à 7 92411 KAN-GFP). La levure transformée avec le système d'expression vide (colonne 1 92411 KAN) ne produit pas de protéine GFP. La lettre E de la figure 4 correspond à la fraction d'élution de la résine Ni-NTA. Pour analyser la fonctionnalité de la protéine GFP produite, les levures transformées par le système d'expression et les levures contrôle négatif (pas de séquence de la GFP dans le système d'expression) ont été observées en microscopie à fluorescence après croissance sur milieu complet glucosé (figure 5). Le contrôle négatif ne montre aucune fluorescence (panneau 1). Les levures exprimant la GFP (panneaux 2 et 3) présentent une fluorescence diffuse dans l'ensemble du cytoplasme. Toutes les cellules du champ d'observation expriment la GFP (panneau 4 : microscopie à fluorescence, panneau 5 : microscopie Nomarski). Exemple 3 : Transformation des levures avec le système d'expression contenant le gène d'intérêt : la vanillyl alcool oxydase. Le système d'expression mis au point dans l'exemple 1 a été 25 utilisé dans cet exemple pour permettre l'expression de la vanillyl alcool oxydase (VAO) dans les levures. 1/ Insertion du gène d'intérêt dans le système d'expression. 30 La séquence nucléotidique de la VAO codant la protéine VAO de Penicillium simplicissimum a pour référence Genbank le numéro Y15627. La séquence VAO utilisée dans cette expérience (SEQ ID n 20) a été synthétisée avec un site Notl en 5' et XhoI en - 24 - 3' pour permettre son clonage dans le vecteur pivex, et ceci en phase avec une séquence nucléotidique permettant de produire une protéine avec une étiquette de six histidines en C-terminal. Le vecteur pivex contenant la séquence VAO telle que décrite ci-dessus a été digéré par Notl et EcoRI defaçon à libérer la séquence VAO-6His. Cette séquence est ensuite clonée par simple ligation dans le vecteur pUC57 contenant le système d'expression digéré préalablement par Notl et Mfel. 2/ Transformation des levures avec le système d'expression comprenant le gène d'intérêt : la vanillyl alcool oxidase. Le vecteur pUC57 contenant le système d'expression est digéré par l'enzyme de restriction PvuII. Cette enzyme coupe de part et d'autre du système d'expression contenant le gène d'intérêt : la VAO. Le fragment d'ADN issu de cette digestion est purifié et transformé dans les levures selon une méthode de choc thermique en présence de PEG/lithium acétate. Les levures transformées, grâce à la présence du gène de résistance KANr porté par le système d'expression, sont sélectionnées sur milieu riche YPD (extrait de levure 1%, peptone 1%, glucose 2%) contenant 300 mg/1 de Geneticine. Vingt-quatre clones de levures Saccharomyces cerevisiae (souche 92411) ont été obtenus après transformation (clones 92411 KANVAO). 3/ Analyse de la production de la vanillyl alcool oxydase par les levures transformées. Les levures transformées sont cultivées sur milieu complet Glucosé (YPD). La protéine VAO est ensuite purifiée par affinité sur résine Ni NTA comme dans l'exemple 1. Les30 - 25 - protéines retenues sur la résine sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (gel SDS-PAGE) et détectées au bleu de coomassie. La figure 6 montre pour deux clones que la protéine VAO est produite (colonnes E 92411 KANVAO). Le clone 92411 T- correspond au témoin négatif, c'est-à-dire à une souche 92411 non transformée, ne produit pas de protéine VAO, tandis que BL21 I+ F correspond à un témoin positif résultant du clonage de la VAO dans le vecteur pivex et de sa production dans E. Coli. Pour analyser la fonctionnalité de la protéine produite, la biosynthèse d'alcool coniférylique et de vanilline en erlenmeyer a été étudiée dans les levures transformées. La VAO possède en effet une activité alcool oxydase qui permet la conversion de l'eugénol en alcool coniférylique et en vanilline. Les levures transformées ont été cultivées à 30 C sous agitation dans du milieu YPD. Leur nombre doit atteindre 3 à 4 x 108 cellules / ml. Les cellules sont ensuite centrifugées et reprises directement dans un tampon glycine / NaOH pH 10 pour la conversion de l'eugénol. Ce dernier est distribué sans dissolution, directement dans le milieu à hauteur de 6 g/1. Les moûts sont incubés à 30 C, sous agitation pendant 48h avant d'être analysés En fin de conversion, le milieu est acidifié avec de l'acide phosphorique, centrifugé et dilué une fois avec de l'éthanol 96 %. La phase aqueuse est alors analysée en chromatographie haute pression sur phase liquide (HPLC). Souche Eugénol Total Eugénol à Acide Férulique Alcool coniférylique vanilline (g/1) t48H (g/I) (g/I) 93204 6 g/I 0 0 6 g/I 0,12 g/I 93205 6 g/I 0 0 4.9 g/1 0,09 g/1 93206 6 g/I 0 0 6 g/I 0,09 g/I30 - 26 - Les résultats montrent que les clones 93204, 93205 et 93206, ayant été transformés avec le système d'expression contenant le gène de la VAO, sont capables de convertir de l'eugénol en alcool coniférylique et en vanilline. Exemple 4 : Excision du marqueur de sélection du génome des levures transformées. 1/ Construction du vecteur pFL44s-NATl-CRE pour l'excision du 10 marqueur de sélection. Le vecteur d'excision a pour vecteur originel dans cet exemple le vecteur pFL44s (accession number X70266). Ce vecteur d'une taille de 4319 pb possède : 15 - la séquence du gène URA3 - la séquence du gène de résistance AmpR - un site multiple de clonage - la séquence de l'origine de réplication 2 micron. 20 Dans ce vecteur pFL44s sont insérés un insert comprenant un marqueur de sélection et un insert comprenant la séquence de l'enzyme CRE (SEQ ID n 14). L'insert comprenant le marqueur de sélection, ici le gène de résistance à la nourseothricine NAT1, est obtenu à partir du 25 vecteur codant pour la nourseothricine (référence Genbank X73149). Ledit vecteur et le vecteur pFL44s sont digérés par les enzymes de restriction BglII et EcoRI. L'insert NAT1 comprenant le promoteur du gène TEF, la séquence du gène NAT1 et le terminateur du gène TEF, est inséré par simple ligation 30 dans le vecteur pFL44s. Le vecteur ainsi obtenu est le vecteur pFL44s-NAT1. L'insert comprenant la séquence de l'enzyme CRE est obtenu à partir du vecteur psh47 (référence Genbank AF298782). Le5 - 27 - vecteur psh47 et le vecteur pFL44s-NAT1 sont digérés par l'enzyme de restriction PvuII. L'insert CRE comprenant le promoteur du gène GAL1, la séquence de gène CRE et le terminateur du gène CYC1, est ensuite inséré par simple ligation dans le vecteur pFL44s-NAT1. Le vecteur ainsi obtenu est le vecteur pFL44s-NAT1-CRE (figure 7). 2/ Transformation des levures avec le vecteur d'excision pour éliminer le marqueur de sélection présent dans le génome des 10 levures. Les levures transformées dans un premier temps avec le système d'expression contenant la séquence du gène d'intérêt, sont transformées dans un deuxième temps avec le vecteur 15 d'excision, ici pFL44s-NAT1-CRE. Les levures transformées sont sélectionnées sur milieu riche (YPD) additionné de clonNAT (100 mg/ml). Les levures sélectionnées positivement sont ensuite cultivées dans un milieu YPGalactose. Le promoteur du gène CRE étant 20 inductible en présence de Galactose, cette condition de culture permet l'induction de l'expression de l'enzyme CRE dans les levures. Les résultats de cette expérience montrent que 100% des clones ont perdu le marqueur KanR. 25 REVENDICATIONS 1. Système d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule, de préférence une levure, comprenant : (1) des moyens visant à l'intégration dudit système dans le génome de ladite cellule, comprenant deux séquences nucléotidiques, (2) des moyens visant à la sélection de ladite cellule ayant intégrée ledit système, comprenant un insert de sélection comprenant deux séquences LoxP encadrant un promoteur, un marqueur de sélection du type gène de résistance aux antibiotiques et un terminateur, (3) une cassette d'expression du gène d'intérêt, comprenant un promoteur permettant l'expression dudit gène, au moins un site de clonage permettant l'intégration du gène, et un terminateur. 2. Système d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que les séquences nucléotidiques d'intégration dudit système d'expression sont multiples et sont choisies dans le groupe constitué par les séquences TY, les séquences télomériques X et Y', les séquences DUP, la séquence 8 ou toute séquence répétée dans le génome de la levure, de préférence lesdites séquences sont les séquences TY1A et TY1B de Saccharomyces cerevisiae ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 3. Système d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits promoteurs sont des promoteurs forts et lesdits terminateurs assurent une bonne stabilité des ARNm. - 29 - 4. Système d'expression selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur permettant l'expression du marqueur de sélection est le promoteur du gène TEF1 de Ashbya gossypii ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, et le terminateur associé à l'expression du marqueur de sélection est le terminateur du gène TEF1 de Ashbya gossypii ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 5. Système d'expression selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur fort du gène d'intérêt est le promoteur du gène TDH3 de Saccharomyces cerevisiae ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90% et le terminateur associé à l'expression du gène d'intérêt est le terminateur du gène CYC1 de Saccharomyces cerevisiae ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 6. Système d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marqueur de sélection est un gène de résistance aux antibiotiques choisi dans le groupe comprenant les gènes de résistance à la généticine, nourseothricine, phléomycine, zéocine ou tout autre gène de résistance dominant à un antibiotique pour lequel la levure sauvage est sensible, et de préférence le gène de résistance à la généticine ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%.- 30 - 7. Système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il a pour séquence la séquence nucléotidique SEQ ID n 10 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90% à la séquence SEQ ID n 10. 8. Vecteur comprenant le système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Plasmide comprenant le système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ledit plasmide étant de préférence pUC57. 10. Bactérie comprenant le vecteur selon l'une 15 quelconque des revendications 8 à 9, ladite bactérie étant de préférence E.coli. 11. Kit constitué d'une part d'un vecteur comprenant le système d'expression selon l'une quelconque 20 des revendications 1 à 7, et d'autre part d'un vecteur d'excision du marqueur de sélection, ledit vecteur d'excision comprenant : (1) des moyens visant à la sélection des cellules l'ayant intégré comprenant un promoteur, un marqueur de 25 sélection et un terminateur, et (2) des moyens visant à l'excision du marqueur de sélection présent dans le système d'expression comprenant un promoteur, le gène CRE, et un terminateur. 30 12. Kit selon la revendication 11, caractérisé en ce que lesdits promoteurs sont des promoteurs forts, et lesdits terminateurs associés assurent une bonne stabilité des ARNm.- 31 - 13. Kit selon la revendication 12, caractérisé en ce que le promoteur et le terminateur régulant l'expression du marqueur de sélection présent dans le vecteur d'excision sont le promoteur et le terminateur du gène TEF1 de Ashbya gossypii ou les séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 14. Kit selon la revendication 13, caractérisé en ce que le promoteur régulant l'expression du gène CRE loxP est le promoteur du gène GAL1 de Saccharomyces cerevisiae, et le terminateur régulant l'expression du gène CRE loxP est le terminateur du gène CYC1 de Saccharomyces cerevisiae ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 15. Kit selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que le marqueur de sélection présent dans le vecteur d'excision est un gène de résistance aux antibiotiques choisi dans le groupe comprenant les gènes de résistance à la généticine, nourseothricine, phléomycine, zéocine ou tout autre gène de résistance dominant à un antibiotique pour lequel la levure sauvage est sensible, de préférence le gène de résistance à la nourseothricine ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. 16. Kit selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que le vecteur d'excision est choisi parmi les vecteurs qui sont mal-32 - ségrégés pendant les divisions cellulaires, de préférence le plasmide pFL44s. 17. Kit selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, caractérisé en ce que le vecteur d'excision est choisi parmi les vecteurs multicopies, de préférence pFL44s, et qu'il comprend la séquence SEQ ID n 14 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90% à la séquence SEQ ID n 14. 18. Vecteur d'excision caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les vecteurs multicopies, de préférence pFL44s, et qu'il comprend la séquence SEQ ID n 14 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90% à la séquence SEQ ID n 14. 19. Levure comprenant au moins un système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 7. 20. Levure selon la revendication 19 transformée en outre avec le vecteur d'excision tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 11 à 17. 25 21. Levure selon l'une quelconque des revendications 19 à 20, caractérisée en ce qu'elle appartient à toute espèce de levures hémiascomycètes, de préférence au genre Saccharomyces ou ses hybrides, très 30 préférentiellement à l'espèce cerevisiae ou ses hybrides. 22. Procédé d'expression d'un gène d'intérêt dans la levure, comprenant les étapes suivantes : - 33 - a) clonage de la séquence nucléotidique du gène d'intérêt dans le système d'expression selon l'une des revendications 1 à 7, b) transformation de la levure avec le système d'expression ainsi obtenu, c) culture de la levure dans les conditions permettant l'expression du gène d'intérêt. 23. Procédé selon la revendication 22, comprenant, après l'étape b) et avant l'étape c), les étapes bl), b2) et b3) suivantes : bl) la transformation de la levure avec le vecteur d'excision tel que décrit l'une des revendications 11 à 17, b2) la culture de la levure dans les conditions permettant l'expression de l'enzyme CRE, b3) l'isolement des levures ayant perdu le marqueur de sélection. 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23, dans lequel les étapes b), bl), b2), b3) sont répétées autant de fois qu'il est souhaité de copies du système d'expression. 25. Utilisation du système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, du vecteur selon la revendication 8, du plasmide selon la revendication 9, de la bactérie selon la revendication 10, du kit selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, du vecteur d'excision selon la revendication 18, ou de la levure selon l'une quelconque des revendications 19 à 21 pour la production de protéines thérapeutiques, d'antigènes vaccinants, de standards pour le diagnostic. 2898132 - 34 - 26. Utilisation du système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, du vecteur selon la revendication 8, du plasmide selon la revendication 9, 5 de la bactérie selon la revendication 10, du kit selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, du vecteur d'excision selon la revendication 18, ou de la levure selon l'une quelconque des revendications 19 à 21 pour la modification du métabolisme de la levure. 10 27. Utilisation du système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, du vecteur selon la revendication 8, du plasmide selon la revendication 9, de la bactérie selon la revendication 10, du kit selon 15 l'une quelconque des revendications 11 à 17, du vecteur d'excision selon la revendication 18, ou de la levure selon l'une quelconque des revendications 19 à 21 pour la production de molécules aromatiques utilisables pour la fabrication de parfums, de matières ou compositions 20 odorantes, de compositions cosmétiques, d'arômes alimentaires ou d'additifs alimentaires odorants et/ou sapides ou encore de compléments alimentaires. 28. Utilisation du système d'expression selon 25 l'une quelconque des revendications 1 à 7, du vecteur selon la revendication 8, du plasmide selon la revendication 9, de la bactérie selon la revendication 10, du kit selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, du vecteur d'excision selon la revendication 18, ou de la levure selon 30 l'une quelconque des revendications 19 à 21 pour l'optimisation de souches de levures utilisables notamment dans le secteur alimentaire, en particulier la levurerie,- 35 - la panification-boulangerie, la brasserie, la vinification, la cidrerie. 29. Utilisation du système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, du vecteur selon la revendication 8, du plasmide selon la revendication 9, de la bactérie selon la revendication 10, du kit selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, du vecteur d'excision selon la revendication 18, ou de la levure selon l'une quelconque des revendications 19 à 21 pour la production d'enzymes à usage industriel telles que des hydrolases, isomérases ou protéines structurantes de solutions.