FR 2902429 A1 20071221 FR 0511974 A 20051125 La présente invention concerne un procédé de marquage d'acides nucléiques en présence d'au moins un support solide. La présente invention concerne des oligonucléotides destinés à permettre l'amplification et la détection de deux séquences cibles localisées respectivement dans les 5 gènes H5 et N1 du génome du virus Influenza A. L'invention concerne également l'utilisation de ces oligonucléotides, une méthode de détection et un kit permettant de diagnostiquer la présence des gènes H5 et Ni du virus Influenza A. 10 Parmi les techniques classiques utilisées en routine pour le diagnostic de la grippe, on peut citer l'agglutination, l'inhibition d'agglutination ou la diffusion en gel d'agar. Ces méthodes sont communément employées et permettent la caractérisation du virus A de la grippe. Une alternative possible à ces méthodes est la culture virale dans des oeufs au stade 15 d'embryon ou dans des cellules MDCK, selon le protocole du manuel de l'OIE (Office International des Epizooties). Cependant, plusieurs jours sont nécessaires pour obtenir les résultats de caractérisation, délai parfois incompatible avec les besoins ou urgences cliniques. Des techniques d'ELISA pour la détection d'anticorps ou d'antigène ou des tests d'immunofluorescence ont été également massivement développées mais ces méthodes de 20 détection, dites immunologiques, sont souvent moins sensibles et moins spécifiques que la culture virale classique. L'émergence récente d'une forme hautement pathogénique du virus de la grippe aviaire, le sous-type H5N1, a donc fortement relancé le besoin d'un test de diagnostic rapide, spécifique et très sensible. Pour cette raison, les différentes méthodes précédemment 25 énumérées ont été progressivement remplacées par des techniques dites moléculaires, telle que la technique de RT-PCR (transcription inverse associée à une réaction de polymérisation en chaîne). La RT-PCR, plus sensible, ne nécessite pas la présence de virus viable dans les échantillons, et a ainsi permis le typage et sous-typage des différentes formes du virus de la grippe. Le développement de cette technique en temps réel ( real time RT-PCR ) a 30 également grandement favorisé son utilisation pour le diagnostic du virus de type A. 2 Par exemple, Whiley D. M. et al. décrivent dans une récente publication (Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases (2005), sous presse), un test pour la détection d'un large spectre de sous-types de la grippe dans des échantillons cliniques, basé sur une réaction de RT-PCR faisant intervenir une 5' nucléase. Deux oligonucléotides et une sonde ont été choisis de façon à être homologues au gène codant la protéine M (matrice) de 23 sous-types du virus A. Ce test permet donc la détection du virus Influenza A dans des échantillons cliniques mais ne permet pas par contre le sous-typage précis de la forme impliquée. Ng E.K.O. et al. ont récemment divulgué (Emerging Infectious Diseases (2005) vol. 11 (8), p. 1303-1305) un test basé sur une réaction de RT-PCR en multiplex comprenant deux étapes, utilisant deux jeux d'oligonucléotides et de sondes marquées afin de cibler spécifiquement deux régions du gène HA de H5N1. Ceci a ainsi permis de développer un test rapide et sensible pour détecter directement le sous-type H5 dans des échantillons humains. Ce test a été validé sur des échantillons cliniques provenant de patients infectés à Hong Kong et au Vietnam par le sous-type H5N1 du virus, mais ne permet pas de diagnostiquer directement quel sous-type de virus est impliqué dans l'infection. Payungporn S. et al. décrivent (Viral Immunology (2004) vol. 17 (4), p. 588-593 et Journal of Virological Methods (2005), sous presse) une méthode de détection simultanée des séquences M, H5 et N1 du soustype H5N1, basée sur un test multiplex RT-PCR en temps réel et en une seule étape. Des oligonucléotides correspondant aux séquences M, H5 et N1, ainsi que différentes sondes TaqMan marquées ont été sélectionnées et utilisées dans le test afin de détecter simultanément trois signaux fluorescents. Les oligonucléotides H5 et NI ont été choisis à partir de régions invariantes couvrant plus de 50 séquences connues spécifiques du virus H5N1. Cependant, il est à noter que cette méthode de RT-PCR, non isotherme, est parfois assujettie à des contaminations. Une autre méthode moléculaire pouvant être employée pour détecter la présence d'agent infectieux est la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification). Par exemple, Collins R.A et al. décrivent (Journal of Virological Methods (2002) vol. 103, p.213-225 et Avian Diseases (2003) vol. 47 (3), p. 1069-1074) la détection du sous-type H5 de la grippe aviaire (détection du sous-type hautement pathogénique et faiblement pathogénique) en utilisant la technique NASBA couplée à un système de détection ECL (electrochemiluminescence). La technique NASBA est une méthode d'amplification 3 isotherme d'acides nucléiques faisant intervenir plusieurs activités enzymatiques, qui permet une détection rapide du virus H5. L'amplification d'acides nucléiques par cette voie convient bien aux génomes à ARN, comme le génome du virus de la grippe, grâce à l'introduction de l'étape de transcription inverse directement dans la réaction d'amplification. Néanmoins, même si la méthode décrite dans cette publication permet de détecter et de distinguer les souches faiblement pathogéniques des souches hautement pathogéniques, elle ne permet d'identifier spécifiquement la forme H5N1 du virus. Un test d'identification du virus Influenza A sous sa forme H5N1 utilisant une technique d'amplification transcriptionnelle, particulièrement adaptée à l'amplification et à la détection de virus à ARN, est donc toujours attendu. De plus un test multiplexe, c'est-à-dire permettant l'amplification et la détection simultanément des deux gènes H5 et N1, la technique d'amplification étant une technique d'amplification transcriptionnelle telle que la NASBA, est particulièrement avantageuse. La présente invention concerne donc une double paire d'oligonucléotides destinée à permettre l'amplification de deux séquences cibles localisées respectivement dans le gène H5 et dans le gène N1 du génome du virus Influenza A, la paire d'oligonucléotides destinée à l'amplification du gène H5 consistant en : un premier oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 1 : TGTATGTTGTGGAATGGCA, ou sa séquence complémentaire, et un second oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 2 : GCCGAATGATGCCATCAA, ou sa séquence complémentaire, alors que la paire d'oligonucléotides destinée à l'amplification du gène N1 consiste en : un premier oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 3 : CGTGGATTGTCTCCGAAA, ou sa séquence complémentaire, et un second oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 4 : GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, ou sa séquence complémentaire. 4 L'invention peut également avoir trait à une paire d'oligonucléotides destinée à permettre l'amplification d'une séquence cible localisée dans le gène H5 du génome du virus Influenza A, la paire d'oligonucléotides consistant en : un premier oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 1 : TGTATGTTGTGGAATGGCA, ou sa séquence complémentaire, et un second oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 2 : GCCGAATGATGCCATCAA, ou sa séquence complémentaire. De la même manière, l'invention peut aussi couvrir une paire d'oligonucléotides destinée à permettre l'amplification d'une séquence cible localisée dans le gène N1 du génome du virus Influenza A, la paire d'oligonucléotides consistant en : un premier oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 3 : CGTGGATTGTCTCCGAAA, ou sa séquence complémentaire, et un second oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 4 : GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, ou sa séquence complémentaire. Dans les trois cas de figure précédents, dans la (ou les) paire(s) d'oligonucléotides, le premier oligonucléotide comprend additionnellement une séquence promotrice qui peut être reconnue par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante. Plus précisément, la séquence promotrice qui peut être reconnue par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante est une polymérase T7. En relation avec les deux cas précédents, lorsque cet oligonucléotide, auquel est additionnée la séquence promotrice, permet l'amplification de la séquence cible localisée dans le gène H5, il consiste essentiellement en la séquence suivante : SEQ ID No. 5 : aattctaatacgactcactataggggTGTATGTTGTGGAATGGCA, ou sa séquence complémentaire. La partie de la séquence en lettres minuscules correspond à la séquence promotrice T7. De la même manière que précédemment, lorsque cet oligonucléotide permet l'amplification de la séquence cible localisée dans le gène N1, il consiste essentiellement en la séquence suivante: SEQ ID No. 6 : aattctaatacgactcactataggggCGTGGATTGTCTCCGAAA, ou sa séquence complémentaire. Dans tous les cas de figure, chaque oligonucléotide peut être d'une longueur comprise 5 entre 12 et 30 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 16 nucléotides consécutifs, et préférentiellement d'une longueur comprise entre 15 et 26 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 18 nucléotides consécutifs. L'invention concerne également une paire d'oligonucléotides destinée à être utilisée comme sonde de détection de deux séquences cibles localisées respectivement dans les gènes H5 et N1 du génome du virus Influenza A, la sonde destinée à la détection du gène H5 consistant en : SEQ ID No. 7 : ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT, ou sa séquence complémentaire, alors que la sonde destinée à la détection du gène N1 consiste en : SEQ ID No. 8 : GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA, ou sa séquence complémentaire, 15 chaque séquence comportant au moins un moyen de marquage. L'invention peut également avoir trait à un oligonucléotide, destiné à être utilisé comme sonde de détection d'une séquence d'acides nucléiques amplifiée résultant de l'amplification d'une séquence cible localisée dans le gène H5 du génome du virus Influenza A, ladite amplification étant réalisée par l'intermédiaire d'une paire d'oligonucléotides telle 20 que décrite précédemment, la sonde de détection étant d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 7 : ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT, ou sa séquence complémentaire, la séquence comportant au moins un moyen de marquage. Lorsque l'on souhaite détecter le gène Ni du génome du virus Influenza A, l'invention 25 préconise un oligonucléotide, destiné à être utilisé comme sonde de détection d'une séquence d'acides nucléiques amplifiée résultant de l'amplification d'une séquence cible localisée dans ce gène N1, ladite amplification étant réalisée par l'intermédiaire d'une paire d'oligonucléotides telle que décrite précédemment, la sonde de détection étant d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides 30 consécutifs issus de : SEQ ID No. 8 : GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA, ou sa séquence complémentaire, 6 la séquence comportant au moins un moyen de marquage. Dans un mode de réalisation intéressant de l'invention, la sonde de détection est constituée par un molecular beacon , appellé par la suite sonde moléculaire. Les sondes moléculaires sont des sondes de détection sous forme d'oligonucléotides simple brin, qui ont une structure en tige et bouche (stem loop structure) bien connue de l'homme du métier. La bouche contient une séquence sonde complémentaire de la séquence cible (amplicon en général), et la tige est formée par l'hybridation de deux séquences formant bras, qui sont localisées chacune à chaque extrémité de la sonde. Un fluorophore est lié de façon covalente à l'extrémité d'un des deux bras et un absorbeur de fluorescence (quencher) est lié de façon covalente à l'extrémité de l'autre bras. Les sondes moléculaires ne fluorescent pas lorsqu'ils sont libres en solution. Cependant, en présence d'amplicons complémentaires, quand ils s'hybrident à ces cibles, ils subissent un changement conformationnel qui leur permet de fluorescer. En l'absence de cibles, la tige conserve le fluorophore en étroite proximité avec l'absorbeur de fluorescence, ce qui entraîne le transfert de la fluorescence du fluorophore vers l'absorbeur. Ledit absorbeur de fluorescence est un chromophore non fluorescent qui dissipe l'énergie reçue du fluorophore en chaleur. Quand la sonde rencontre une cible moléculaire, il y a formation d'un hybride sonde-cible qui est plus long et plus stable que l'hybride créé par les deux bras de la tige. La rigidité et la longueur de l'hybride sonde-hybride empêchent l'existence simultanément de l'hybride tige. En conséquence, la sonde moléculaire subit une réorganisation conformationnelle spontanée qui force l'hybride tige à se dissocier et le fluorophore et l'absorbeur à s'éloigner l'un de l'autre, ce qui restaure la fluorescence. Plus précisément la sonde de détection est constituée par une sonde moléculaire préférentiellement constituée par : SEQ ID No. 9 : [6-FAM]-cgatcgACACCAAGTGTCAAACTCCAATcgatcg-[DabSyl], pour la détection du gène H5, SEQ ID No. 10 : [6-FAM]-cgatcgGCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGAcgatcg-[DabSyl], pour la détection du gène N1. Lorsque le test que l'on souhaite effectuer et un test multiplexe où la détection des 30 gènes H5 et N1 est simultanée et effectuée dans un unique récipient, il convient d'utiliser deux marqueurs différents. Parmi les marqueurs fluorescents possibles, citons de manière non limitative : • la fluorescéine (FAM), • la tétrachloro-6-carboxyfluorescéine (TET), • la tétraméthylrhodamine (TMR), • la 5-carboxyrhodamine 6G (RHD), • la carboxy-rhodamine (ROX), et • la cyanine 5 (CY5). Chacune des deux séquences SEQ ID Nos. 9 et 10 ci-dessus sera donc munie d'un de ces marqueurs, les deux marqueurs utilisés étant différents l'un de l'autre afin de permettre une 10 différentiation des signaux détectés. L'invention propose aussi l'utilisation d'une ou deux paires d'oligonucléotides, telle(s) que décrite(s) précédemment, dans une réaction d'amplification d'acides nucléiques ou comme sonde de détection du génome du virus Influenza A suspecté d'être présent dans un 15 échantillon biologique. L'invention concerne encore une méthode de détection d'acides nucléiques du virus d'Influenza A susceptible d'être présent dans un échantillon, dans laquelle l'échantillon est soumis à une réaction d'amplification d'acides nucléiques utilisant une paire 20 d'oligonucléotides, telle que décrite précédemment, en présence des réactifs d'amplification nécessaires à une telle amplification et la présence d'amplicons d'intérêt est détecté. Cette méthode de détection peut être basée sur une réaction d'amplification RT-PCR. Alternativement, cette méthode de détection peut être basée sur une technique d'amplification transcriptionnelle. Préférentiellement cette technique est la technique 25 NASBA. L'invention concerne aussi une méthode d'amplification de deux gènes H5 et N1 du virus d'Influenza A susceptible d'être présent dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : - incuber l'échantillon dans un tampon d'amplification en présence : 30 • de deux amorces d'amplification, chacune ayant une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides, l'une comprenant additionnellement une séquence promotrice, 8 l'autre de polarité opposée à l'amorce associée à la séquence promotrice, pour s'hybrider respectivement en amont et en aval d'une zone d'intérêt localisée dans le gène H5 du virus d'Influenza A, • de deux amorces d'amplification, chacune ayant une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides, l'une comprenant additionnellement une séquence promotrice, l'autre de polarité opposée à l'amorce associée à la séquence promotrice, pour s'hybrider respectivement en amont et en aval d'une zone d'intérêt localisée dans le gène N1 du virus d'Influenza A, - ajouter les réactifs suivants dans l'échantillon: • une enzyme ayant une activité RNA dépendant DNA polymérase, • une enzyme ayant une activité DNA dépendant DNA polymérase, • une enzyme ayant une activité RNase H, • une enzyme ayant une activité DNA dépendent RNA polymérase, et -maintenir le mélange réactionnel ainsi créé sous des conditions appropriées et 15 pendant une durée de temps suffisante pour qu'une amplification ait lieu. Les enzymes ci-dessus énumérés sont au nombre de quatre mais il est tout à fait possible de recourir à une enzyme ayant deux voir trois des activités ci-dessus mentionnées, dans ce cas l'utilisation de trois voir de deux enzymes reste possible et couverte par l'invention. De plus, d'autres éléments nécessaires à l'établissement d'une amplification sont nécessaires tels que 20 des nucléotides. De tels éléments sont bien connus de l'homme du métier. Enfin l'invention propose un kit de détection des gènes H5 et N1 du virus Influenza A susceptible d'être présent dans un échantillon, contenant : deux paires d'oligonucléotides ou amorces d'amplification telles que décrites 25 précédemment pour réaliser l'amplification des deux régions d'intérêt H5 et N1, deux oligonucléotides marqués ou pouvant être marqués, tels que décrits précédemment, et ayant une séquence d'acide nucléique substantiellement complémentaire avec au moins une partie de la séquence d'acide nucléique amplifiée H5 ou N1, 30 des réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification. Par substantiellement complémentaire on entend qu'une hybridation est réalisée 9 entre un oligonucléotide marqué ou pouvant être marqué, autrement appelé sonde de détection, et au moins une partie de la séquence d'acide nucléique amplifiée ou amplicon, cette hybridation étant spécifique et sélective de manière suffisante pour permettre la détection de l'amplicon d'intérêt. D'autre part, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification sont des réactifs permettant une amplification NASBA. Par marqueur détectable , on entend au moins un marqueur capable de générer directement un signal détectable. Par exemple la présence de biotine est considéré comme un marquage direct, car elle est détectable, même s'il est possible de l'associer ultérieurement avec de la streptavidine marquée. Une liste non limitative de ces marqueurs suit : • les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la (3-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, • les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants, • les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leur propriété électrique comme la conductivité, l'ampérométrie, la voltamétrie, l'impédance, • les groupements détectables, par exemple dont les molécules sont de tailles suffisantes pour induire des modifications détectables de leurs caractéristiques physiques et/ou chimiques, cette détection peut être réalisée par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation de surface, la variation d'angle de contact ou des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, • les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 125I. De préférence, le marqueur n'est pas un marqueur radioactif pour éviter les problèmes de sécurité liés à ces marqueurs. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention le marqueur est détectable électrochimiquement, et en particulier le marqueur est un dérivé d'un complexe de fer, comme un ferrocène. Le terme acide nucléique signifie un enchaînement d'au moins deux désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide 10 modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates, les alkylphosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides (FR 2 607 507) ou les PNA (M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 114, 1895-1897, 1992 ou les 2' O-alkyl ribose et les LNA (BW, Sun et al., Biochemistry, 4160-4169, 43, 2004). L'acide nucléique peut être naturel ou synthétique, un oligonucléotide, un polynucléotide, un fragment d'acide nucléique, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique telle que : • PCR (Polymerase Chain Reaction), décrite dans les brevets US-A-4,683,195, US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159, et sa dérivée RT-PCR (Reverse Transcription PCR), notamment dans un format en une étape, tel que décrit dans le brevet EP-B-0.569.272, • LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-0.201.184, • RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069, • 3SR (Self Sustained Sequence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995, • NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO-A- 91/02818, et • TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491. • RCA (Rolling Circle Amplification (US-6,576,448). On parle alors d'amplicons pour désigner les acides nucléiques générés par une technique d'amplification enzymatique. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Les étapes d'amplification et de détection ci-dessus exposées peuvent être précédées par une étape de purification. Par étape de purification , on entend notamment la séparation entre les acides nucléiques des micro-organismes et les constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse qui précède la purification des acides nucléiques. Ces étapes de lyse sont bien 11 connues à titre d'exemple indicatif, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet : -WO-A-00/60049 sur la lyse par sonication, - WO-A-00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, - WO-A-99/53304 sur la lyse électrique, et - WO-A-99/15621 sur la lyse mécanique. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les traitements par des agents chaotropiques, tels que les sels de guanidium (brevet US-A-5,234,809). Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des supports solides, tels que des particules magnétiques (voir à ce sujet les brevets US-A-4,672, 040 et US-A-5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques, qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet WO-A-97/45202 et WOA-99/35500. Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être fixé un acide nucléique. Des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides, tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose, ou le dextran ; des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels, etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane, d'une particule ou d'une plaque sensiblement plane de verre ou silicium ou dérivés. On peut réaliser l'ensemble du protocole (de l'échantillon prélevé aux amplicons prêts 30 à être hybridé) dans un seul et même tube, traité manuellement ou dans un automate. 12 Les exemples ci-joints représentent des modes particuliers de réalisation et ne peuvent pas être considérés comme limitant la portée de la présente invention. Exemple 1 : Expérience d'évaluation des amorces H5N1 sur un ARN H5N1 provenant 5 d'échantillon clinique d'Asie : Les séquences des paires d'oligonucléotides (N1_P1 et N2_P2, utilisées pour l'amplification et la détection de la séquence N1, et H5_13 1 et H5_P2, utilisées pour 10 l'amplification et la détection de la séquence H5) et des sondes de détection présentes sous forme de sondes moléculaires (sonde moléculaire N1 et sonde moléculaire H5) sont indiquées ci-dessous : N1 P2 5'-GGAATGCTCCTGTTATCCTGA-3' Ni P1 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGCGTGGATTGTCTCCGAAA-3' Ni Sonde 5'-CGATCGGCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGACGATCG-3' H5_P2 5'-GCCGAATGATGCCATCAA3' H5 P1 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTGTATGTTGTGGAATGGCA-3' H5 Sonde 5'-CGATCGACACCAAGTGTCAAACTCCAATCGATCG-3' 15 La séquence indiquée en gras correspond à la séquence promotrice T7, reconnue par l'ARN polymérase T7 et est retrouvée dans les oligonucléotides P1 pour la mise en oeuvre de la technique NASBA. Le traitement de l'échantillon se fait à l'aide du système miniMAG, comme décrit dans le protocole opératoire. Les kits utilisés sont : 20 - NucliSens Lysis Buffer, bioMérieux B. V. (Boxtel, Hollande), Lot No. 200295, et - NucliSens Magnetic Extraction Reagents, bioMérieux B. V., Lot No. #200297. Protocole opératoire du test de détection: Selon les instructions du kit Nuclisens EasyQ Basic Kit (bioMérieux B.V., Boxtel, 25 Hollande, Lot No. #285006), deux mélanges réactionnels, l'un servant à l'amplification et à la détection de la séquence H5 ( mix H5 ) et le second à l'amplification et à la détection de la séquence N1 ( mix N1 ) ont été préparés. Brièvement, à 64 l de diluant ont été ajoutés 11 l d'eau, 13 l de KC1 à 1,2 M, 4 l de chaque oligonucléotide (H5_P1 et H5_P2 ou N1_P1 20 13 et N1 P2, solution mère à 10 M) et 0,8 gl de la sonde de détection appropriée (la sonde moléculaire H5 ou la sonde moléculaire Ni, solution mère à 2 M). Un volume de 10 gl de chaque mélange a ensuite été ajouté à 5 l de la cible ARN. Parallèlement, une solution d'enzymes a été préparée, et 5 l de cette solution ont été ajoutés au mélange réactionnel dans le tube,pour un volume final de 20 l. Les échantillons ont ensuite été placés dans les conditions de réaction préconisées par le kit Nuclisens EasyQ Basic Kit afin de permettre l'amplification et la détection des séquences d'intérêt par la technique isotherme NASBA (Kievits T. et al. J. Virol. Methods (1991) vol. 35(3) p.273-286). Afin de valider ce test de détection, les cibles ARN utilisées ont été les suivantes: H5N1: Influenza A sous-type H5N1 Vietnam 1194/2004, Influenza A: sous-type H3N2, ARN contrôle H5: sous-type H5N3, Influenza B. Les contrôles appropriés (positif et négatif) ont été inclus dans le test. Après amplification et détection sur le système NucliSens EasyQ, les résultats suivants ont été obtenus : Virus Résultats H5 NASBA Résultats Ni NASBA Contrôle négatif Négative Négative Influenza A H3N2 Négative Négative Negative Négative Négative Flu A H5N1 Vietnam 1194/2004 Positive Positive Contrôle négatif Négative Négative Flu A H5N1 Vietnam 1194/2004 Positive Positive Flux A H5N3 Duck control virus Positive Négative Ces résultats montrent que les oligonucléotides et sondes de détection H5N1 sont spécifiques et détectent bien leurs cibles respectives H5 et N1. 25 14 Exemple 2 : Expérience d'évaluation des amorces et sondes de détection pour H5N1 dans un test multiplex : Dans le cas du multiplex, la sonde moléculaire N1 utilisée est marquée au CY5, alors 5 que la sonde moléculaire H5 reste marquée au FAM. Selon les instructions du kit Nuclisens EasyQ Basic Kit (bioMérieux B.V., Boxtel, Hollande, Lot No. #285006 ), un mélange réactionnel permettant la détection simultanée du gène H5 et du gène N1 est préparé. Brièvement, à 64 l de diluant ont été ajoutés 11 gl d'eau, 10 13 l de KC1 à 1,2 M, 8 l d'une solution d'oligonucléotides et de sondes moléculaires (contenant les oligonucléotides Pl et P2 pour H5 à 10 M, les oligonucléotides Pl et P2 pour N1 à 10 M, la sonde moléculaire H5-FAM à 2 M et la sonde moléculaire N1-CY5 à 21.tM). Un volume de 10 l de chaque mélange a ensuite été ajouté à 5 l de la cible ARN. Parallèlement, une solution d'enzymes a été préparée, et 5 id de cette solution ont été ajoutés 15 au mélange réactionnel dans le tube, pour un volume final de 20 l. Les échantillons ont ensuite été placés dans les conditions de réaction préconisées par le kit Nuclisens EasyQ Basic Kit afin de permettre l'amplification et la détection des séquences d'intérêt par la technique isotherme NASBA (Kievits T. et al. J. Virol. Methods (1991) vol. 35(3) p. 273-286). 20 REVENDICATIONS 1. Double paire d'oligonucléotides destinée à permettre l'amplification de deux séquences cibles localisées respectivement dans le gène H5 et dans le gène N1 du génome du 5 virus Influenza A, la paire d'oligonucléotides destinée à l'amplification du gène H5 consistant en : un premier oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 1 : TGTATGTTGTGGAATGGCA, ou sa séquence complémentaire, et 10 un second oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 2 : GCCGAATGATGCCATCAA, ou sa séquence complémentaire, alors que la paire d'oligonucléotides destinée à l'amplification du gène N1 consiste en : un premier oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et 15 comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 3 : CGTGGATTGTCTCCGAAA, ou sa séquence complémentaire, et un second oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 4 : GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, ou sa séquence complémentaire. 20 2. Paire d'oligonucléotides destinée à permettre l'amplification d'une séquence cible localisée dans le gène H5 du génome du virus Influenza A, la paire d'oligonucléotides consistant en : un premier oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et 25 comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 1 : TGTATGTTGTGGAATGGCA, ou sa séquence complémentaire, et un second oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 2 : GCCGAATGATGCCATCAA, ou sa séquence complémentaire. 30 3. Paire d'oligonucléotides destinée à permettre l'amplification d'une séquence cible 16 localisée dans le gène N1 du génome du virus Influenza A, la paire d'oligonucléotides consistant en : un premier oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 3 : CGTGGATTGTCTCCGAAA, ou sa séquence complémentaire, et un second oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 4 : GGAATGCTCCTGTTATCCTGA, ou sa séquence complémentaire. 4. Paire(s) d'oligonucléotides, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée(s) par le fait que le premier oligonucléotide comprend additionnellement une séquence promotrice qui peut être reconnue par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante. 5. Paire(s) d'oligonucléotides, selon la revendication 4, caractérisée(s) par le fait que la séquence promotrice qui peut être reconnue par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante est une polymérase T7. 6. Premier oligonucléotide, selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, lorsque cet oligonucléotide permet l'amplification de la séquence cible localisée dans le gène H5, caractérisé par le fait qu'il consiste essentiellement en la séquence suivante : SEQ ID No. 5 : AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTGTATGTTGTGGAATGGCA, ou sa séquence complémentaire. 7. Premier oligonucléotide, selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, lorsque cet oligonucléotide permet l'amplification de la séquence cible localisée dans le gène N1, caractérisé par le fait qu'il consiste essentiellement en la séquence suivante : SEQ ID No. 6 : AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGCGTGGATTGTCTCCGAAA, ou sa séquence complémentaire. 8. Paire d'oligonucléotides, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 17 caractérisé par le fait que chaque oligonucléotide est d'une longueur comprise entre 12 et 30 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 16 nucléotides consécutifs, et préférentiellement d'une longueur comprise entre 15 et 26 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 18 nucléotides. 9. Paire d'oligonucléotides destinée à être utilisé comme sonde de détection de deux séquences cibles localisées respectivement dans les gènes H5 et N1 du génome du virus Influenza A, la sonde destinée à la détection du gène H5 consistant en : SEQ ID No. 7 : ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT, ou sa séquence complémentaire, 10 alors que la sonde destinée à la détection du gène N1 consiste en : SEQ ID No. 8 : GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA, ou sa séquence complémentaire, chaque séquence comportant au moins un moyen de marquage. 10. Oligonucléotide, destiné à être utilisé comme sonde de détection d'une séquence 15 d'acides nucléiques amplifiée résultant de l'amplification d'une séquence cible localisée dans le gène H5 du génome du virus Influenza A, ladite amplification étant réalisée par l'intermédiaire d'une paire d'oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications 2, 4 à 8, la sonde de détection étant d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : 20 SEQ ID No. 7 : ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT, ou sa séquence complémentaire, la séquence comportant au moins un moyen de marquage. 11. Oligonucléotide, destiné à être utilisé comme sonde de détection d'une séquence d'acides nucléiques amplifiée résultant de l'amplification d'une séquence cible localisée dans 25 le gène N1 du génome du virus Influenza A, ladite amplification étant réalisée par l'intermédiaire d'une paire d'oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, la sonde de détection étant d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 8 : GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA, ou sa séquence complémentaire, 30 la séquence comportant au moins un moyen de marquage. 30 18 12. Sonde de détection, selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une sonde moléculaire . 13. Sonde de détection, selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une sonde moléculaire, préférentiellement constitué par : SEQ ID 9: [6-FAM]-cgatcgaCACCAAGTGTCAAACTCCAAtcgatcg-[DabSyl], pour la détection du gène H5, SEQ ID 10: [6-FAM]-cgatcgGCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGAcgatcg-[DabSyl], pour la détection du gène N1. 14. Utilisation d'une ou deux paires d'oligonucléotides, selon l'une quelconque des revendications 1-8, dans une réaction d'amplification d'acides nucléiques ou comme sonde de détection du génome du virus Influenza A suspecté d'être présent dans un échantillon biologique. 15. Méthode de détection d'acides nucléiques du virus d'Influenza A susceptible d'être présent dans un échantillon, dans laquelle l'échantillon est soumis à une réaction d'amplification d'acides nucléiques utilisant une paire d'oligonucléotides, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, en présence des réactifs d'amplification nécessaires à une telle amplification et la présence d'amplicons d'intérêt est détecté. 16. Méthode, selon la revendication 15, caractérisée en ce que la réaction d'amplification utilisée est une RT-PCR. 17. Méthode, selon la revendication 15, caractérisée en ce que la réaction d'amplification utilisée est une technique d'amplification transcriptionnelle. 18. Méthode, selon la revendication 17, caractérisée en ce que la réaction d'amplification utilisée est la technique NASBA. 19. Méthode d'amplification de deux gènes H5 et N1 du virus d'Influenza A susceptible 19 d'être présent dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : - incuber l'échantillon dans un tampon d'amplification en présence : • de deux amorces d'amplification, chacune ayant une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides, l'une comprenant additionnellement une séquence promotrice, l'autre de polarité opposée à l'amorce associée à la séquence promotrice, pour s'hybrider respectivement en amont et en aval d'une zone d'intérêt localisée dans le gène H5 du virus d'Influenza A, • de deux amorces d'amplification, chacune ayant une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides, l'une comprenant additionnellement une séquence promotrice, l'autre de polarité opposée à l'amorce associée à la séquence promotrice, pour s'hybrider respectivement en amont et en aval d'une zone d'intérêt localisée dans le gène N1 du virus d'Influenza A, - ajouter les réactifs suivants dans l'échantillon: • une enzyme ayant une activité RNA dépendant DNA polymérase, • une enzyme ayant une activité DNA dépendant DNA polymérase, • une enzyme ayant une activité RNase H, • une enzyme ayant une activité DNA dependant RNA polymérase, et - maintenir le mélange réactionnel ainsi créé sous des conditions appropriées et pendant une durée de temps suffisante pour qu'une amplification ait lieu. 20. Kit de détection des gènes H5 et N1 du virus Influenza A susceptible d'être présent dans un échantillon, contenant : deux paires d'oligonucléotides selon les revendications 1 à 8, deux oligonucléotides marqués ou pouvant être marqués, selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, et ayant une séquence d'acide nucléique substantiellement complémentaire avec au moins une partie de la séquence d'acide nucléique amplifiée, des réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification. 21. Kit selon la revendication 20, dans lequel les réactifs nécessaires à la réalisation 30 d'une réaction d'amplification sont des réactifs permettant une amplification NASBA.