FR 2899580 A1 20071012 FR 0603146 A 20060410 LE NITRA GIN ET LA ZEOLITE NATURELLE : NOUVEAUX PROCEDES DE LEUR UTILISATION DANS L'AGRICULTURE L'invention a trait à la microbiologie agricole et peut être utilisée pour la fabrication d'engrais à bactéries, en particulier le Nitragin . Le but de l'invention est d'obtenir de nouvelles souches de bactéries des genres de Rhizobium et de Bradyrhizobium, capables de pénétrer dans les racines des cultures agricoles et de constituer sur elles des nodosités fixatrices d'azote. Le procédé consiste à obtenir, à partir des souches de bactéries formant des nodosités des genres de Rhizobium et de Bradyrhizobium, des sphéroplastes à l'aide du lysozyme dans le tampon TRIS-HC1 par exposition de plus de 10 à 12 heures à 37 de température, l'inoculation aux graines ou aux pousses des plantes à l'aide de la suspension des sphéroplastes obtenus, suivi de la croissance de la plante et de l'obtention de la culture pure de la souche des bactéries de Rhizobium et de Bradyrhizobium à partir des nodosités formées sur les racines des plantes. Mélangé à la zéolite, le Nitragin constitue un engrais à bactéries qui améliore la nutrition en azote des plantes. L'action du Nitragin mélangé avec la zéolite est basée sur l'utilisation de l'activité des nodosités de bactéries ayant la capacité de fixer l'azote de l'air en symbiose avec les plantes. Grâce à cela, le sol s'enrichit en azote. On utilise le Nitragin pour augmenter la récolte de différentes cultures agricoles. Le traitement des cultures au Nitragin fait croître la récolte de 1,6 à 2,0 quintaux par hectare et celui des cultures annuelles et pluriannuelles de 8 à 10 quintaux par hectare. Les sphéroplastes ont été obtenus à partir des souches de bactéries formant des nodosités, conservées dans la collection de l'Institut de microbiologie de l'Académie Nationale des Sciences de la République d'Arménie : Rhizobium leguminosarum INMIA B-5609 ; Rhizobium meliloti INMIA-5521 (souche mutée), ainsi que des souches de bactéries conservées à l'Institut de microbiologie agricole de Russie : Bradyrhizobium japonicum 649. Les sphéroplastes sont obtenus de la manière suivante : Les bactéries sous forme de cultures de 24 à 48 heures sont placées dans une solution de lysozyme dans le tampon TRIS-HC1 à pH 8,1. L'incubation dans le lysozyme est effectuée à 37 de température par exposition de plus de 10 à 12 heures. Les sphéroplastes sont ensuite lavés de la solution d'incubation avec de l'eau stérile, puis suspendus dans de l'eau. L'argumentation de la quantité optimale de sphéroplastes est donnée dans le tableau 1. La quantité de sphéroplastes dans la suspension est définie par la méthode du calcul direct des cellules sous microscope. D'après les résultats de tableau 1, la quantité de sphéroplastes de 0,5 à 1 million par plante est optimale, car alors la formation de nodosités sur les racines des plantes est la meilleure ou égale à la plus haute dose de sphéroplastes. Tableau 1 Niveau de contamination des plantes selon la dose de sphéroplastes introduits par inoculation Plantes à tubercules, %, lors de l'inoculation de sphéroplastes Formes sur 1 plante 0,2 à 0,3 0,5 à 1,0 0,5 milliards de 1,0 milliard de million de million de cellules cellules cellules cellules Contrôle (sans inocu- 0 0 0 0 lation) 5609 ù Rh. legumi- 0 0 0 0 nosarum 5609 û sphéroplastes 50 71 70 70 5609 ù sphéroplastes 66 100 80 80 des tubercules de blé 5521 ù Rh. meliloti 100 100 100 100 5521 - sphéroplastes des tubercules de blé 649 ù B. japonicum 43 66 - - sphéroplastes Propriétés des souches obtenues des nodosités. Les souches passées par les diverses phases du traitement sont semblables aux initiales, celles dont les sphéroplastes ont été obtenus, mais après leur passage par les céréales, elles 25 modifient certaines de leurs propriétés. Toutes les souches étudiées après passage appartiennent aux bactéries Gram-négatives, elles ont une forme de bâtonnets, de même que les souches initiales. Les souches initiales des Rhizobiums 5609 et 5521 et les souches obtenues après passage poussent sur l'agar-agar, dans le milieu sans azote d'Ashby. Elles ne coagulent pas le lait et ne liquéfient pas la gélatine. Il y a des différences dans l'intensité de 30 croissance des souches initiales et de celles qui sont capables de former des nodosités sur les racines des céréales et dans leur rapport avec les différentes sources de carbone. Les souches obtenues sur les céréales contaminent l'ancienne plante maîtresse. C'est la principale propriété qui confirme que les souches obtenues se rapportent au Rhizobium. Les données 10 15 20 t\...) N ù 7 en O Tableau 2 Particularités morphologiques des souches initiales de Rhizobium et des souches obtenues des tubercules de blé après passages I et III tn n O n 0 j Bactéries Couleur selon Gram Cellules Colonies Forme Dimensions, Capsule Forme, Dimensions, Couleur, millimicrons surface millimicrons Consistance 5609-R.legumi- négative bâtonnet (1-2)+(0,5-0,6) + ronde, lisse 3-5 crème, dense nasorum initiale 5609, du blé, pass.I -"- -"- (0,8-1,2)+(0,4-0,5) + -"- 3-8 -- 5609, du blé pass.IlI -"- -"- (0,8-1,2)+(0,4-0,5) + -"- 3-8 -"5521-R.meliloti -"- -"-(1-1,8)+(0,5-0,7) + ronde, rugueuse 1-25 blanc, à petits mutée, initiale granules 5521- du blé, pass.I -"- -"(1-1,2)+(0,4-0,5) + ronde, lisse 3-5 blanc, dense 5521- du blé, pass.Ill -"- -"- (1-1,2)+(0,4-0,5) + -"- 3-5 -"- Note : (+) présence de la capsule ; (1) la capsule est étroite et pas présente dans toutes les cellules. o Toutes les souches passées par le blé et étudiées ne se colorient pas au Gram, c'est-à-dire qu'elles font partie des bactéries Gram-négatives, de même que les souches initiales des Rhizobiums 5609 et 5521 qui ont servi à obtenir des sphéroplastes pour en faire l'inoculation au blé et à l'avoine. Les souches ont des cellules en forme de bâtonnets, mais de dimensions plus réduites que cultures initiales (voir tableau 2). Restaurant la membrane cellulaire, les sphéroplastes constituent également des cellules plus petites que celles de la culture initiale. Les souches initiales 5609 et 5521, de même que celles qui forment des nodosités sur les céréales, poussent sur l'agar-agar, dans le milieu sans azote d'Ashby. Elles ne coagulent pas le lait et ne liquéfient pas la gélatine. A l'encontre des souches initiales, les souches passées croissent plus faiblement. Leurs colonies sont plus grandes. La souche 5521, qui constitue des nodosités sur les céréales après passages I et III, est semblable à la souche parente dont provient la souche mutée 5521. L'étude de l'assimilation des hydrates de carbone et des acides organiques révèle quelques différences entre les souches initiales et celles qui forment des nodosités sur les céréales. La souche 5609 du passage III, contrairement à l'initiale, croît dans un milieu à amidon, bien que très faiblement. Des différences plus notables ont été remarquées dans l'assimilation des acides organiques. Ainsi, les bactéries capables de contaminer les céréales sont dans une grande mesure semblables aux initiales dont sont obtenus les sphéroplastes d'inoculation, mais elles modifient certaines de leurs propriétés après leur passage par les cultures des céréales. Le Nitragin est largement utilisé dans la pratique agricole. Pour sa production, nous avons utilisé un mélange de bactéries symbiotiques et non symbiotiques fixatrices d'azote. Cette préparation a été expérimentée dans différentes conditions climatiques et sur différents sols d'Arménie, ainsi qu'au cours d'expériences sur les champs de diverses exploitations sur le territoire de l'ex-URSS, en particulier dans le Réseau géographique des expériences sur le Nitragin (Saint-Pétersbourg). Il existe de nombreux comptes-rendus des expériences. La préparation de Nitragin est écologiquement pure, absolument inoffensive pour l'homme et les animaux, elle augmente le rendement d'un certain nombre de cultures agricoles (soja, tabac, céréales, certains tubercules) de 15 à 40 pourcent. Nous avons mis en place un procédé absolument nouveau de préparation et d'utilisation d'un engrais dont le principe est la fabrication d'un mélange de Nitragin avec de la zéolite. Qu'est-ce que la zéolite ? Des silicates d'aluminium (formule générale : Men, AL2O3 xSiO2 yH2O, où M est un cation de métal et n la valence) qui contiennent dans leur composition des oxydes de métaux alcalins et autres, se distinguant par une structure extrêmement régulière des pores qui sont remplis d'eau dans des conditions ordinaires de température. Ci-dessous, voyez les caractéristiques physico-chimiques de la zéolite naturelle du tuf 5 (pierre volcanique) : Contenu en zéolite naturelle (en pourcentage du poids) û 60-95 Contenu en oxydes (en pourcentage du poids) SiO2û 61,0-71,0 MnO ûtraces-0,1 TiO2 û 0,1-0,4 Na2O û 0,9-3,4 10 AL203 û 11,0-14,0 K20 û 1,0-2,8 Fe203 û 0,3-2,5 P205 û traces-0,15 FeO ù 0,3-2,0 H20 ù 2,0-6,0 CaO ù 2,8-5,0 MgO û 0,5-2, 5 15 Contenu en éléments toxiques (en pourcentage du poids) Limite tolérée Contenu réel F û jusqu'à 0,15 nul As û jusqu'à 0,01 traces Pb û jusqu'à 0,006 0,001-0,006 20 Hg û jusqu'à 0,0005 traces Cd û jusqu'à 0,05 traces Contenu en minéraux additionnels (en pourcentage du poids): Montmorillonite 1-20 Quartz 1-6 25 Calcite 1-4 Feldspath 1-4 Biotite + verre volcanique 1-6 Composition de l'alvéole élémentaire (coefficients de formule) de zéolite naturelle Si û 29,55 Na û 0,70 30 Al û 6,53 K -1,22 Mg û 0,10 H2O û 19,6 Ça û 2,20 Dimensions des pores (en angstrôms) û 4 Paramètres de l'alvéole élémentaire : a ù 17,63 À ; B = 17,90 Â ; c = 17,90 â Porosité 24,87-32,36% moyenne ù 28,17% Densité 2,2-2,6 g/cm3 Masse des terres rapportées à l'extraction 1,3-1,6 g/cm3 Masse volumique 1,7-1, 0 glcm3 Limite de solidité à la pression mono-axiale 334-952 kg/cm3 moyenne ù 438 kg/cm3 Principaux cations d'échange ù Ca+Na+K+Mg Quantité de cations d'échange (en mg équiv. pour 100g de roche) 10 Cal+ ù 22,0-59,0 Mg2+ ù 4,0-18,0 Na+ ù 22,0-59,0 K+ù 1,2-10,0 Somme (Ca2+ + Mg2+ + Na+ + K+) ù 72-123 15 Rapport Na++ K+ = 0,26-1,77 Ca2+ + Mg2+ Résistance aux acides (pH) ù de 0,4 à 7 Résistance aux bases (pH) ù de 7 à 13,8 20 L'utilisation de l'engrais susmentionné (Nitragin mélangé de zéolite dans une proportion déterminée) offre de grands avantages. La zéolite conserve la structure du sol, ce qui en favorise l'aération permanente, elle retient l'humidité et, ce qui est le plus important, contribue à l'utilisation dosée de la préparation biologique, prolonge les délais de son action 25 et de sa réactivation. La zéolite possède une autre capacité importante : elle accroît sensiblement la résistance des grains à l'égard de toute sorte de maladies. Selon les données des chercheurs américains, japonais et de nos chercheurs, l'emploi de la zéolite augmente de 10 à 12% le rendement des cultures agricoles, alors que mélangée à la préparation biologique susmentionnée, l'effet s'améliore d'au moins 2 à 2,5 fois selon la culture. 30 Citons comme exemple les résultats d'une expérience faite en 2002 sur un champ de quatre hectares de blé d'automne. Voir tableau 3. 5 15 20 25 30 Tableau 3 Poids en g Azote Protéine de grains % % Champ de contrôle 24,80 1,8 1,8 x 5,7 non traité champ traité au 36,20 2,7 2,7 x 5,7 mélange Nitragin + zéolite Les spécificités des interrelations des bactéries formant des nodosités avec les plantes cultivées à l'aide de la zéolite sont exposées dans le tableau 4. Tableau 4 Variantes Poids des plantes Azote mg/g de racines Albumine sèches en % mg% Pois Rh. leguminosarum st. N B-5609 147,6 9,1 16,25 st. N B-5618 203,0 10,8 21,25 Contrôle 100 2,7 11,9 Soja Br. japonicum st. N 649 220,5 8,6 26,56 Contrôle 100 3,5 14,0 Pois fourrager Rh. Cicer st. N 85 130,4 14,4 23,94 Contrôle 100 2,3 19,2 Luzerne Rh. meliloti st. N B-5502 194,0 3,4 19,95 st. N B-5521 209,0 3,7 22,27 Contrôle 100 1,7 15,96 Blé Rh. leguminosarum st. N B-5618 (pois) 144,3 3,36 9,3 Br. japonicum st. N 649 (soja) 104,6 3,25 6,8 Rh. meliloti st. N B-552 (luzerne) 126,2 3,7 8,4 Contrôle 100 0,63 6,2 RESULTATS DE L'ANALYSE GAMMA-SPECTROMETRIQUE D'UN ECHANTILLON DE ZEOLITE, PRELEVE DU GISEMENT DE NOYEMBERIAN (ARMENIE) L'activité et la composition en éléments radioactifs de l'échantillon de zéolite, prélevé du gisement de Noyembérian (Arménie) sont déterminées sur une installation gamma-spectrométrique bas-phonique à détecteur semi-conducteur Ge-Li et programme ASPECT de soutien pour le traitement des spectres. Masse de l'échantillon : 170 grammes. Erreur relative de mesurage : 6,9%. Les mesurages ont été effectués au laboratoire du contrôle extérieur de radiation de la Centrale Atomique Arménienne. Les résultats de l'analyse ont montré que l'échantillon contient des éléments radioactifs naturels du type d'uranium-238 (238U) et de thorium-232 (232Th), ainsi que l'élément_ radioactif Potassium-40 (40K). Le tableau 5 présente les résultats de l'analyse de l'échantillon susmentionné. Tableau 5 Éléments Activité Bk/kg radioactifs Uranium-238 20 Thorium-232 9 Potassium-40 831 Ci-dessous, nous citons pour comparaison les données de l'activité spécifique typique 25 des éléments radioactifs dans les roches ordinaires (A.A. Moisséev, V.I. Ivanov, Livre de Référence de dosimétrie et d'hygiène de la radiation, Moscou, Energoatomizdat , 1984, p. 71). Voir tableau 6. 30 5 10 Tableau 6 Activité spécifique, Bk/kg Type de la roche 40K L38U 232Th Volcaniques Acides (ex. granits) 1000 60 80 Intermédiaires (ex. diorites) 700 20 30 Basaltes 240 10 10 Sédimentaires Calcaires 90 30 7 Carbonates 27 8 Grès 370 19 10 Schistes 700 44 45 15 20 25 30 Revendications 1. Procédé de traitement des graines ou des pousses des plantes avec un mélange de 5 zéolite et une suspension de sphéroplastes, obtenus des bactéries à nodosités des genres de Rhizobium et de Bradyrhizobium, ledit procédé comprenant les étapes de : • Obtention des bactéries à nodosités des genres de Rhizobium et de Bradyrhizobium ; • Culture des plantes en présence lesdites bactéries ; 10 • Obtention de la culture pure des bactéries capables de fixer l'azote à partir des nodosités ; • Obtention de sphéroplastes ; • Traitement des plantes avec la suspension des sphéroplastes obtenues des bactéries en mélange avec la zéolite, le rôle de zéolite consistant à conserver 15 la structure et l'humidité du sol et à accroître la résistance des plantes contre les maladies. 2. Procédé selon la revendication n 1, caractérisé en ce que les plantes sont traitées avec un mélange de zéolite et d'une suspension de sphéroplastes à raison de 0,5 à 1 million de ces dernières par plante. 20 25 30