FR 2903905 A1 20080125 FR 0653020 A 20060718 2903905 1 MEDICAMENTS POUR LE TRAITEMENT DES SARCOGLYCANOPATHIES DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne le traitement des sarcoglycanopathies. Elle préconise l'utilisation d'inhibiteurs de la voie de dégradation associée au réticulum endoplasmique, notamment d'inhibiteurs de la mannosidase I, comme 10 médicaments pour le traitement de certaines formes de ces maladies. ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE Les sarcoglycanopathies sont des maladies musculaires du groupe des myopathies des 15 ceintures ("Limb Girdle Muscular Dystrophy" ou LGMD) et se transmettent sur le mode autosomique récessif. Quatres formes ont été identifiées (LGMD 2C, LGMD 2D, LGMD 2E, LGMD 2F), dues respectivement à des défauts dans les gènes de la y-, a-, 13- et 8-sarcoglycanes (11, 17). La LGMD2C est particulièrement répandue dans le bassin méditerranéen et chez les 20 populations tziganes résidant en Europe. La LGMD2D a été identifiée à travers le monde chez des patients en Europe, Afrique, Japon et Brésil. La LGMD2E a été retrouvé particulièrement dans la communauté amish et au Maghreb. La LGMD2F n'a été jusqu'à présent décrite que dans 7 familles d'origine brésilienne, turque et italienne. Les sarcoglycanopathies se traduisent par un déficit progressif des muscles des 25 ceintures pelviennes et scapulaires fréquemment associée à une hypertrophie des mollets. L'intellect est toujours conservé. Une atteinte cardiaque de type cardiomyopathie est parfois retrouvée dans les LGMD2C, LGMD2E et LGMD2F. Au niveau histologique, les muscles présentent des zones de régénération et de dégénération, des infiltrats inflammatoires, de la fibrose et une variabilité de la taille 30 des fibres. Les sarcoglycanopathies présentent une sévérité variable, même au sein des fratries. Dans les formes les plus graves, les patients perdent la marche avant 30 ans et ont une espérance de vie réduite. 2903905 2 Deux des sarcoglycanopathies présentent des mutations récurrentes. Pour la LGMD2C, la mutation de1521T est fréquemment retrouvée dans les populations maghrébines et la mutation C283Y dans les populations tziganes (4, 13). La mutation la plus fréquente présente dans la LGMD2D correspond à une substitution de l'arginine en position 77 par une cystéine (R77C). Cette mutation est retrouvée chez un tiers des patients en Europe à l'exception de la Finlande où elle est retrouvée chez 100% des patients la plupart du temps sur les deux allèles (5, 9). Les sarcoglycanes (SG) constituent un groupe de glycoprotéines intégrées à la membrane plasmique et participant au complexe associé à la dystrophine (12). Ce complexe participe à la liaison entre le cytosquelette d'actine et la matrice extracellulaire et par conséquent à la stabilité de la membrane de la fibre musculaire (10). Les sarcoglycanes sont composées d'un petit domaine intracellulaire localisé en C-terminal (a-sarcoglycane) ou en N-terminal (y-, 13- et 8-sarcoglycanes), un domaine transmembranaire unique et un large domaine extracellulaire qui contient des sites de N-glycosylation. Le complexe des sarcoglycanes se forme au cours du transit de ces protéines dans le réticulum sarcoplasmique et l'appareil de Golgi (6, 16). La (3-sarcoglycane sert d'initiateur à la formation du complexe. Son association avec la 8-sarcoglycane positionne le complexe dans la membrane. Enfin, l'incorporation de l'a-sarcoglycane et son interaction avec la y-sarcoglycane achève l'assemblage. Des mutations dans n'importe laquelle des sarcoglycanes peuvent empêcher le complexe de se former, entraînant une déficience secondaire des autres sarcoglycanes. Si, aujourd'hui, on sait diagnostiquer les sarcoglycanopathies, et même identifier la composante mutée responsable du phénotype (y-, a-, 13- ou 8-sarcoglycane), ainsi que la mutation en cause, les moyens pour prendre en charge cette maladie restent modestes. A ce jour, aucun traitement spécifique n'est connu et la plupart des patients nécessitent une kinésithérapie pour prévenir l'aggravation des contractures. Cependant, plusieurs équipes ont rapportés des résultats positifs au niveau expérimental par des approches de transfert de gène à l'aide de vecteurs viraux ou de thérapie cellulaire dans des modèles animaux (1, 7, 14). Ainsi, le document WO 00/20582 préconise une thérapie par remplacement des gènes de sarcoglycanes défectueux, véhiculés notamment par des AAV. 5 2903905 3 Il existe donc un besoin crucial de développer de nouvelles thérapies, notamment médicamenteuses, permettant de traiter les sarcoglycanopathies. OBJET DE L'INVENTION La présente invention repose sur la mise en évidence par les inventeurs que : - certaines mutations dans les sarcoglycanes, associées à une sarcoglycanopathie, donnent lieu à des glycoprotéines présentant un mauvais repliement ; 10 - ces protéines "misfoldées" sont prises en charge par la voie de dégradation protéolytique des glycoprotéines associée au réticulum endoplasmique ; -des inhibiteurs de cette voie bloquent la dégradation des sarcoglycanes mutées ; - lorsqu'elles sont non dégradées (en présence d'inhibiteurs), les sarcoglycanes 15 mutées peuvent être correctement transloquées à la membrane plasmique et intégrées au complexe des sarcoglycanes, ce qui se traduit par la restauration d'un phénotype normal. Pour rappel, les glycosidases du réticulum endoplasmique (RE) jouent un rôle dans le 20 contrôle de la qualité de la production des glycoprotéines. Elles assurent que seules celles correctement repliées sont transportées vers leur destination finale. En particulier, le clivage des résidus mannose dans le RE par les a-mannosidases agit comme un signal pour diriger les glycoprotéines mal repliées vers une dégradation par le protéasome. 25 Les a-mannosidases sont classées en deux groupes. Celles de classe I (mannosidase I) sont inhibées par la 1-déoxymannojirimycin et la kifunensine, alors que celles de la classe II sont spécifiquement inhibées par la swainsonine. Le protéasome, quant à lui, est un complexe protéique impliqué dans la dégradation des protéines intracellulaires 30 dans le cytosol et peut être inhibé par exemple par le MG132 ou le bortézomib. Tout inhibiteur de cette voie de dégradation (ERAD en anglais pour "Endoplasmic reticulum-associated degradation") peut être utilisé. Dès lors, l'invention concerne l'utilisation d'inhibiteurs de la dégradation associée au réticulum endoplasmique (ERAD) pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des sarcoglycanopathies. 2903905 4 Toutefois, selon un mode de réalisation avantageux, un inhibiteur de la mannosidase I est préféré, ceci dans un but de plus grande sélectivité et d'efficacité. Cliniquement, ceci se traduit par des effets secondaires potentiels moindres. 5 Avantageusement, l'inhibiteur de la mannosidase I utilisé est la kifunensine. Le mode d'administration, la dose administrée, ainsi que la fréquence d'administration sont déterminés au cas par cas, selon des protocoles classiques, connus de l'homme du métier. En effet, ces paramètres peuvent notamment dépendre de la mutation à traiter 10 et de l'inhibiteur choisi. La kifunensine, préférentiellement choisie, présente l'avantage d'être une molécule soluble dans l'eau, pouvant se prêter à une administration par voie orale. Ce traitement s'avère particulièrement adapté dans le cas d'une sarcoglycanopathie 15 liée à une a-sarcoglycane mutée, notamment en raison de la présence d'une mutation R77C dans l'a-sarcoglycane humaine. Ce traitement peut s'appliquer potentiellement à toutes les mutations aujourd'hui identifiées dans les quatre sarcoglycanes humaines. Toutefois, seules les mutations 20 ponctuelles sont des candidats potentiels à ce traitement puisque dans le cas de codons stop ou de délétions, il est a priori exclu que la protéine tronquée, même si elle n'est pas dégradée, puisse être active. Les principales mutations ponctuelles répertoriées à ce jour sont listées dans le tableau 25 ci-dessous : a-sarcoglycane (3-sarcoglycane Exon Mutation dans gène Mutation dans protéine Exon Mutation dans gène Mutation dans protéine 02 c.92T>C p.Leu3lPro 03 c.265G>A p.Va189Met 02 c.100C> T p.Arg34Cy5 03 c.271C>T p.Arg9lCy5 02 c.101G>A p.Arg34Hi5 03 c.272G>C p.Arg9lPro 03 c.184T>C p.Tyr62Hi5 03 c.274_275AT>TC p.Ile92Ser 03 c.203G>A p.Gly68Gln 03 c.275T>C p.Ile92Thr 03 c.220C>T p.Arg74Trp 03 c.299T>A p.Metl00Ly5 03 c.229C>T p.Arg77Cy5 03 c.323T>G p.Leul08Arg 03 c.266_267inv p.Leu89Pro 03 c.341C>T p.5er114Phe 03 c.269A>G p.Tyr9OCy5 03 c.355A>T p.Ilell9Phe 03 c.271G>C p.Gly9lArg 03 c.416G>A p.Gly139A5p 03 c.278C>T p.Ala93Val 04 c.452C>G p.Thrl5lArg 03 c.290A>G p.A5p97Gly 04 c.499G>A p.Gly1675er 03 c.292C>T p.Arg98Cy5 04 c.538T>C p.Phel8OLeu 03 c.293G>A p.Arg98Hi5 04 c.544A>G p.Thr182Ala 2903905 5 03 c.308T>C p.Ilel03Thr 04 c.551A>G p.Tyr184Cy5 04 c.329G>T p.Argll0Leu S-sarcoglycane 04 c.371T>C p.Ilel24Thr 04 c.212G>C p.Arg7lThr 05 c.409G>A p.Glu137Ly5 06 c.451T>G p.5erl5lAla 05 c.421C>A p.Argl4l5er 08 c.593G>C p.Arg198Pro 05 c.472C>T p.Leul58Phe 08 c.631A>T p.A5n2llTyr 05 c.518T>C p.Leu173Proa 09 c.784C>A p.Glu262Ly5 05 c.524T>C p.Va1175Alaa 'y-sarcoglycane 05 c.541C>T p.Argl8lCy5 03 c.205G>C p.Gly69Arg 06 c.586G>A p.Va119611e 03 c.206G>C p.Gly69A5p 06 c.614C>A p.Pro205Hi5 03 c.269T>C p.Leu9O5er 06 c.662G>A p.Arg221Hi5 07 c.581T>C p.Leu1945er 06 c.683C>A p.Pro228Gln 07 c.629A>G p.Hi52lOArg 06 c.724G>T p.Val242Phe 08 c.787G>A p.Glu263Ly5 06 c.725T>C p.Val242Ala 08 c.848G>A p.Cy5283Tyr 06 c.739G>A p.Val247Meta 07 c.850C>T p.Arg284Cy5 Selon un second aspect, l'invention concerne donc un procédé d'évaluation in vitro de l'efficacité d'un inhibiteur de la dégradation associée au réticulum endoplasmique (ERAD) sur la sarcoglycanopathie comprenant les étapes suivantes : 5 - cotransfection dans des cellules des quatre gènes codant les sarcoglycanes (y-, a-, 13- ou 8-), l'un des gènes étant porteur de la mutation testée ; - incubation pendant plusieurs heures en présence de l'inhibiteur ; - localisation du complexe des sarcoglycanes. 10 Avantageusement, il s'agit des sarcoglycanes humaines, portant des mutations ponctuelles. Dans le cas où le complexe est localisé dans la membrane plasmique, il en est conclu que l'inhibiteur testé est efficace vis-à-vis de la mutation testée, et donc constitue une 15 approche thérapeutique pour cette forme de sarcoglycanopathie. La détection du complexe dans la membrane plasmique signifie : - d'une part la prévention de la dégradation de la protéine mutée par l'inhibiteur ; 20 - et d'autre part une translocation correcte de la protéine mutée et son intégration dans le complexe au niveau de la membrane plasmique. 2903905 6 De manière avantageuse, le procédé est mis en oeuvre en parallèle : - sur des cellules cotransfectés avec les gènes codant les quatre sarcoglycanes non mutées. Ceci constitue un témoin positif ; - en réalisant une incubation en l'absence de l'inhibiteur testé. Ce témoin permet 5 de conclure quant à l'effet éventuel de l'inhibiteur testé. De manière préférée, la détection du complexe est réalisée par immunohistochimie, à l'aide d'anticorps dirigé contre au moins l'une des sarcoglycanes. 10 Alternativement, l'une des sarcoglycanes peut être marquée, notamment par fluorescence, puis détectée par microscopie ou par triage. Cette solution est avantageuse dans la mesure où l'étape de détection est moins lourde que la détection immunologique. Toutefois, il est important de vérifier que la protéine fusion (sarcoglycane + marquage) ne perturbe pas la formation du complexe. 15 Dans les deux cas, la détection (choix de l'anticorps ou choix de la sarcoglycane à fusionner) peut avoir pour cible la sarcoglycane mutée mais pas nécessairement. 20 L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées. Ceux-ci n'ont toutefois aucune portée limitative. L'invention est illustrée plus avant en rapport avec l'a-sarcoglycane portant la 25 mutation R77C et en présence des inhibiteurs MG132 (inhibiteur du protéasome) et kifunensine (inhibiteur de la mannosidase I). Figure 1 : Marquage immunohistochimique des a-, 13-, y-sarcoglycanes et de la dystrophine d'une biopsie musculaire d'un patient portant la mutation R77C de l'a-30 sarcoglycane. Figure 2: Marquage immunohistochimique des a-, 13-, y-sarcoglycanes et de la dystrophine chez la souris, au niveau de muscles normaux (WT), Sgca77C/77C et Sgca-lFigure 3 : Histologie des muscles Sgca-/-, WT et Sgca77CmC (Qua= quadriceps, Ga=gastrocnémius, Pso=psoas, Del= deltoide). 35 Figure 4 : Détection de cellules en nécrose par bleu Evans dans les muscles Sgca-let Sgca77C/77C 2903905 7 Figure 5 : Marquage immunohistochimique de l'a-sarcoglycane et la (3-sarcoglycane de muscles Sgca-/- injectés par un AAV-humainSGCA77C. A gauche : a seule ; au centre : (3 seule ; à droite : a + P. Figure 6 : Histologie des muscles Sgca-/- injectés par un AAV-Sgca77C (gauche: 5 zone non transduite, droite : zone transduite). Figure 7 : Marquage immunohistochimique de l'a-sarcoglycane de cellules quadri transfectées non perméabilisées. A gauche, quadritransfection par une a-sarcoglycane normale, à droite avec l'a-sarcoglycane mutée. Figure 8 : Marquage immunohistochimique de l'a-sarcoglycane (à gauche) et de la 10 calreticuline (au centre). Les deux marquages superposés sont montrés à droite. Figure 9 : Marquage immunohistochimique de l'a-sarcoglycane de cellules quadritransfectées avec une a-sarcoglycane mutée en présence de MG132. Figure 10 : Marquage immunohistochimique de l'a-sarcoglycane de cellules quadritransfectées avec une a-sarcoglycane mutée en présence de kifunensine. 15 Figure 11 : Marquage immunohistochimique de l'a-sarcoglycane montrant l'absence d'agrégats au niveau de muscle Sgca-l-injecté avec une a-sarcoglycane mutée et après traitement des souris par la kifunensine pendant une semaine. I) MATERIEL ET METHODES 20 1 -Génération de la souris Sgca'7cv77c Un fragment BamHI-Sfil de 1075 pb portant les exons 2 et 3 du gène Sgca est amplifié par PCR sur l'ADN d'un phage contenant le gène Sgca puis inséré dans le vecteur plasmidique pSP72 (Promega). La mutation H77C est introduite dans l'exon 3 par 25 TGCGCTGTGTGTAGCACAGCCACCTGGGC-3' (SEQ ID 2). La présence de la mutation ponctuelle est confirmée par séquençage. Un fragment 5' Bglll-BamHl d'environ 4 kb et un fragment 3' Sfil-Spel de 2981 pb sont clonés aux deux extrémités du fragment muté du vecteur pSP72. Une cassette loxP-neor-loxP du vecteur pGEM- 30 neor est insérée au niveau d'un site EcoRV présent dans l'intron 3 et une cassette thymidine kinase (TK) est insérée en aval du fragment 3' pour réaliser le vecteur de recombinaison final. mutagénèse dirigée à l'aide des oligonucléotides suivants : 5'-GCCCAGGTGGCTGTGCTACACACAGCGCA-3' (SEQ ID 1) et 5'- 2903905 8 Le vecteur de recombinaison (25 g) est linéarisé par digestion Sall et introduit dans des cellules ES 129Sv par électroporation. L'ADN des colonies résistantes au G418 est isolé et analysé par PCR ou Southern blot pour vérifier les événements de recombinaison. Deux clones recombines indépendants (IB4 et VIIICII) sont injectés 5 dans des blastocystes C57B1/6 et des souris chimères sont produites. Les mâles chimériques sont croisés avec des femelles C57B1/6 pour produire des souris hétérozygotes. La cassette neor est éliminée par croisement avec la souche deleter (15). Les souris résultantes excisées de la cassette neor sont croisées entre elle pour produire des souris homozygotes mutantes. 10 Le génotypage est réalisé par PCR sur de l'ADN de queue extrait par le kit Qiagen DNeasy Tissue Kit, en utilisant les oligonucléotides amont a-sarcoQ5': 5'-TATAACCCTGGCTTCCTCTA-3' (SEQ ID 3) et testNeol 5'-CGAATTCGCCAATGACAAGACGCT-3' (SEQ ID 4) et l'oligonucléotide aval asarcoQ3' 5'-TAGTGGCTCATGCCTTTAAT-3' (SEQ ID 5), produisant un fragment 15 de 639 pb pour l'allèle mutant portent la cassette nec,' et un fragment de 484 pb pour l'allèle sauvage, dans les conditions de PCR suivantes : 94 C pendant 3 minutes, puis 30 cycles de 94 C pendant 30s, 61 C pendant 40s et 72 C pendant 1 minute, puis 3 minutes à 72 C. Après excision de la cassette neor, le génotype est réalisé avec l'oligonucléotide a-sarcoQ5' (SEQ ID 3) et l'oligonucléotide a-sarcoQ3' (SEQ ID 5) 20 produisant un fragment de 575 pb pour l'allèle mutant. Pour vérifier la présence de la mutation H77C dans le gène Sgca du modèle, une PCR avec les oligonucléotides Klgenoseg2.s: 5'-TGTGTTTGGGACTTATGGGG-3' (SEQ ID 6) et Klgenoseg2.as: 5'-CAATCAGCAGCAGCAGCCTC-3' (SEQ ID 7) est réalisée sur de l'ADN de queue, produisant un fragment de 659 pb qui est analysé par 25 séquençage. 2 - Histologie et immunohistochimie Les coupes (8 m d'épaisseur) préparées à partir de muscle congelés sont colorées par hématoxyline et éosine (H&E). Les coupes correspondant aux souris injectées par bleu Evans sont révélées par excitation fluorescente à 633 nm. 30 Les coupes séchées, puis hydratées en PBS, ou les cellules fixées sont traitées 20 min avec 1% triton dilué en PBS, puis incubées 30 min à température ambiante (TA) en PBS contenant 15% de sérum de veau foetal. Des anticorps polyclonaux contre les sarcoglycanes (a-sarcoglycane : dilution 1/1000, dirigé contre les acides aminés 2903905 9 366-379 de l'a-sarcoglycane humaine ; (3-sarcoglycane : dilution 1/20, NCL-b-SARC (Novocastra) ; y-sarcoglycane : dilution 1/20, NCL-g-SARC (Novocastra) ; dystrophine : dilution 1/20, NCL-DYS2 (Novocastra) ; et calréticuline : dilution 1/70, ab4109 (Abcam)) sont déposés sur les coupes qui sont ensuite incubés 1 à 2 heures à 5 TA puis lavées 3 fois en PBS. Les anticorps primaires sont révélés après incubation pendant 1 heure à TA avec un anticorps secondaire conjugué aux fluorochromes A1exa488 (A-11032, Molecular Probes) ou A1exa594 (A-11037, Molecular Probes), dilués au 1:1000 dans du PBS. Les coupes sont lavées trois fois en PBS, sont montées avec du fluoromount-G (SouthernBiotech 0100-01) puis examinées avec un 10 microscope confocal (Leica). Les analyses d'immunohistochimie sur les biopsies humaines sont réalisées comme décrit dans Hackman et al. (9). 3 -Constructions des plasmides et vecteurs AAV. Les plasmides pAAV_C5-12_a-SG, pcDNA3_a-SG, pcDNA3_(3-SG, pcDNA3y-SG et pcDNA3_8-SG sont obtenus par PCR sur de l'ADNc de muscle squelettique et 15 clones à l'aide du kit TOPO TA cloning kit (Invitrogen). Les sarcoglycanes sont ensuite sous-clonées dans le plasmide pcDNA3 (Invitrogen) ou pAAV_C5-12_MCS (3). Les plasmides pcDNA3_a-SG-R77C et pAAV_C5-12_a-SG-R77C sont obtenus à partir de pcDNA3-a-SG ou pAAV_C5-12_a-SG par mutagenèse dirigée en utilisant le kit Quickchange site-directed mutagenesis kit (Stratagene) à l'aide de 20 l'oligonucléotide 5'-GCCCCGGTGGCTCTGCTACACCCAGCGC-3' (SEQ ID 8). Les constructions sont vérifiées par digestion enzymatique et séquençage. Les préparations virales AAV 2/1 adenovirus-free sont obtenus en incorporant les génomes recombinant AAV2-ITRs dans des capsides AAV1 en utilisant un protocole de tritransfection (2). Les génomes viraux sont quantifiés par dot blot contre des 25 dilutions sériées de plasmide standard. 4 - Cultures cellulaires Les cellules NIH3T3 ou 911 sont cultivés en milieu modifié Dulbecco's D'Eagle, supplémenté avec de la glutamine, de la gentamicyne et 10% de sérum de veau foetal. Les cellules sont transfectées en utilisant 6 l de Fugene (ROCHE) pour 1 g de 30 plasmide. Pour des boîtes 6 puits, 0,5 g de chaque plasmide (a-SG ou a-SG-R77C et f3-SG, y-SG, 8-SG) est utilisé. Pour les traitements, les cellules sont incubées 43 heures après transfection avec l'inhibiteur de la mannosidase (5 M de kifunensine, VWR) ou un inhibiteur du protéasome (5 M de MG132 dissous dans du DMSO, 2903905 10 Sigma) pendant 5 heures. Les cellules sont lavées en PBS et fixées 15 min à TA avec du formaldéhyde 3.7% en PBS puis rincées trois fois en PBS avant le marquage immunohistochimique. 5 - Expériences in vivo 5 Les souris Sgca77 77c sont soumises à un exercice de course pendant 30 minutes sur un tapis roulant (Columbus treadmill instrument Exer 6M) pendant 3 jours consécutifs. Le tapis roulant est incliné selon une pente de 15 degré en descente et la vitesse fixée à 10 mètres par minute. A la fin des 3 jours, les souris sont injectés en intrapéritonéal par du bleu Evans (0,5 mg/g). Le jour suivant, les souris sont sacrifiées 10 et les muscles deltoide, psoas, gastrocnemius, glutéus, extensor digitorum longus et quadriceps sont prélevés et rapidement congelés en isopentane refroidi à l'azote liquide. Les préparations virales rAAV2/1 sont injectées (1010 viral génome (vg) dans 30 l au total) dans le muscle tibialis anterior gauche de souris Sgca-/-. Aux jours 20, 22, 25 et 15 27 après injection, 10 M de kifunensine ou 20 M de MG132 sont injectés dans le muscle (soit 2 et 4 fois les concentrations utilisées in vitro pour tenir compte de la diffusion dans le muscle). Un jour avant sacrifice (jour 27), les souris sont injectées en intrapéritonéal par du bleu Evans. Les tibialis droit et gauche sont prélevés et rapidement congelés en isopentane refroidi à l'azote liquide. 20 II) RESULTATS 1 - La forme mutée R77C de l'a-sarcoglycane est absente de la membrane chez l'homme. La présence de la mutation R77C sur 1' a-sarcoglycane entraîne la déstabilisation du complexe des sarcoglycanes chez l'homme, comme montré par un marquage 25 immunohistochimique à l'aide d'anticorps dirigée contre les différentes protéines du complexe (Figure 1). 2 - La présence d'une cystéine en position 77 chez la souris ne perturbe pas l'adressage à la membrane de l'a-sarcoglycane et n'entraîne pas de manifestation pathologique. 30 Afin d'étudier ce phénomène de déstabilisation, nous avons réalisé, par recombinaison homologue, un modèle animal (Sgca77l777C) portant une cystéine en position 77. Il faut 2903905 11 noter que l'espèce murine porte à cette position un résidu histidine au lieu d'un résidu arginine. L'analyse des muscles des souris ainsi obtenue par immunohistochimie à l'aide d'anticorps dirigé contre les différentes protéines du complexe DGC a montré que la présence de la mutation n'empêche pas l'adressage de l'a-sarcoglycane à la 5 membrane ni la formation du complexe des sarcoglycanes (Figure 2). Des coupes de souris normales et déficientes en a-sarcoglycane (Sgca-/-, 8) ont été utilisées comme contrôle. L'histologie des muscles deltoide, psoas, gastrocnemius et quadriceps issues de la souris Sgca77 77c âgée de 3 et 6 mois a été examinée par coloration à 10 l'hématoxyline/éosine et comparée à celle de souris Sgca-/-. Tandis que ces derniers présentent des signes dystrophiques sévères, aucune anomalie n'a pu être détectée au niveau des muscles Sgca77 77c (Figure 3). L'absence d'anomalies musculaires a été confirmée par une analyse fonctionnelle. Des souris Sgca77 77c ont été soumise à un exercice favorisant les contractions 15 excentriques puis ont été injectées en intrapéritonéal par un colorant marquant spécifiquement les cellules en nécrose, le bleu Evans. Aucune pénétration de bleu Evans n'a pu être mis en évidence dans les muscles des souris Sgca77 77c (Figure 4). Afin de déterminer si les différences observées au niveau des conséquences de la présence d'un résidu cystéine en position 77 entre l'homme et la souris étaient liées à 20 la nature de la protéine humaine, nous avons réalisé des expériences de transfert de gène dans le muscle de souris déficiente en a-sarcoglycane à l'aide d'un vecteur viral dérivé du virus associé à l'adénovirus (AAV) portant le gène humain de l'asarcoglycane mutée en position 77. L'analyse des muscles injectés a permis de montrer que la forme mutée se localise à la membrane bien qu'une partie soit retenue 25 dans le réticulum, que le complexe sarcoglycane se forme et qu'elle corrige la pathologie (Figures 5 et 6). A noter à la figure 5 l'accumulation périnucléaire de l'asarcoglycane dans certaines cellules. 3 - La présence de la mutation entraîne une rétention de l'a-sarcoglycane et une dégradation par le protéasome. 30 Nous avons établi un modèle cellulaire reproduisant les phénomènes observés chez l'homme par quadruple transfection de plasmides codant pour les différentes sarcoglycanes. Dans ce modèle, le complexe est correctement formé à la membrane quand l'a-sarcoglycane normale est cotransfecté avec les trois autres sarcoglycanes, 2903905 12 alors qu'il n'est pas détecté à la membrane lorsque l'a-sarcoglycane porte la mutation R77C. Ceci a pu être montré par un marquage immunohistochimique à l'aide d'un anticorps dirigé contre la partie extracellulaire de l'a-sarcoglycane sur des cellules non perméabilisées (Figure 7). 5 Un co-marquage de l'a-sarcoglycane avec un marqueur du réticulum endoplasmique (calreticulum) sur des cellules perméabilisées montre que la protéine mutée est retenue dans les voies de sécrétion (Figure 8). Nous avons postulé que l'a-sarcoglycane mutée serait reconnue comme anormale par le système de contrôle-qualité des protéines au niveau du réticulum, et secondairement 10 dégradée par le protéasome. Ceci a pu être confirmé par l'emploi de l'inhibiteur du protéasome MG132 qui permet de restaurer l'adressage à la membrane (Figure 9). 4 -L'adressage à la membrane est restauré par inhibition de la mannosidase I Le système de contrôle-qualité du réticulum permet la dégradation de protéines mal 15 repliées. L'enzyme mannosidase I joue un rôle important dans ce processus par l'intermédiaire d'une modification de chaînes d'oligosaccharides des protéines glycosylées, comme les sarcoglycanes. En fonction de cette donnée et de nos résultats, nous avons postulé que l'utilisation d'un inhibiteur de cette enzyme permettrait de restaurer l'adressage à la membrane de la forme mutée d'a-sarcoglycane. Cette 20 hypothèse a été démontrée sur des cellules quadritransfectées avec une forme mutée d'a-sarcoglycane dans le modèle cellulaire traitée par la kifunensine (Figure 10). Les différences entre espèces humaine et murine observées précédemment ne nous permettent pas de disposer d'un modèle in vivo équivalent à l'homme. Cependant, une réduction de la rétention partielle de la forme mutée dans le réticulum après transfert 25 de gène nous permettrait de suggérer que l'inhibition de la mannosidase I aurait un effet bénéfique sur l'adressage de l'a-sarcoglycane. Afin de déterminer si l'utilisation de l'inhibiteur pourrait être efficace in vivo, nous avons injecté ce produit en intramusculaire trois fois pendant une semaine dans les muscles de souris Sgca-/-ayant été préalablement injectée (15 jours avant) par le vecteur AAV-SGCA77C. Les 30 observations des muscles injectées et traités montrent une absence quasi-totale des agrégats en particulier l'absence d'accumulation périnucléaire et donc valide l'hypothèse de travail (Figure 11). 2903905 13 En conclusion, il a été montré que l'espèce murine se différencie de l'espèce humaine en ce qui concerne la prise en charge de la forme d'a-sarcoglycane portant une cystéine en position 77 et que cette forme mutée, quand elle est correctement localisée, est fonctionnelle et corrige la pathologie liée à la déficience en 5 sarcoglycane. Nous avons montré dans un modèle cellulaire que l'inhibition de la mannosidase I empêche la dégradation de la forme mutée et son adressage correct à la membrane. L'utilisation in vivo de ce produit semble également exercer le même effet. 2903905 14 BIBLIOGRAPHIE 1 - Allamand, V., K.M. Donahue, V. Straub, R.L. Davisson, B.L. Davidson, and K.P. Campbell. 2000. Early adenovirus-mediated gene transfer effectively prevents 5 muscular dystrophy in alpha-sarcoglycan-deficient mice. Gene Ther. 7:1385-91. 2 - Bartoli, M., J. Poupiot, A. Goyenvalle, N. Perez, L. Garcia, O. Danos, and I. Richard.2006a. Non-invasive Monitoring of Therapeutic Gene Transfer in Animal Models of Muscular Dystrophies. Gene Therapy. 13:20-8. 3 - Bartoli, M., C. Roudaut, S. Martin, F. Fougerousse, L. Suel, J. Poupiot, E. Gicquel, 10 F. Noulet, O. Danos, and I. Richard. 2006b. Safety and efficacy of AAV-mediated calpain 3 gene transfer in a mouse model of limb-girdle muscular dystrophy type 2A. Mol Ther. 13:250-9. 4 - Bonnemann, C.G., J. Wong, K.J. Jones, H.G. Lidov, C.A. Feener, F. Shapiro, B.T. Darras, L.M. Kunkel, and K.N. North. 2002. 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Moore, D.P. Venzke, R.F. Hrstka, R.H. Crosbie, M. 30 Durbeej, C.S. Lebakken, A.J. Ettinger, J. van der Meulen, K.H. Holt, L.E. Lim, J.R. Sanes, B.L. Davidson, J.A. Faulkner, R. Williamson, and K.P. Campbell. 1998. 2903905 15 Progressive muscular dystrophy in alpha-sarcoglycan-deficient mice. J Cell Biol. 142:1461-71. 9 - Hackman, P., V. Juvonen, J. Sarparanta, M. Penttinen, T. Aarimaa, M. Uusitalo, M. Auranen, H. Pihko, R. Alen, M. Junes, T. Lonnqvist, H. Kalimo, and B. Udd. 5 2004. Enrichment of the R77C alpha-sarcoglycan gene mutation in finnish LGMD2D patients. Muscle Nerve. 10 - Lapidos, K.A., R. Kakkar, and E.M. McNally. 2004. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94:1023-31. 11 - Nigro, V. 2003. Molecular bases of autosomal recessive limb-girdle muscular 10 dystrophies. Acta Myol. 22:35-42. 12 - Ozawa, E., Y. Mizuno, Y. Hagiwara, T. Sasaoka, and M. Yoshida. 2005. Molecular and cell biology of the sarcoglycan complex. 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REVENDICATIONS , 1/ Utilisation d'inhibiteurs de la dégradation associée au réticulum endoplasmique (ERAD) pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des 5 sarcoglycanopathies. 2/ Utilisation d'inhibiteurs selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur est choisi dans le groupe comprenant : 1-deoxymannojirimycin, kifunensine, swainsonine, MG132 et bortezomib. 3/ Utilisation d'inhibiteurs selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur est un inhibiteur de la mannosidase I, avantageusement la kifunensine. 4/ Utilisation d'inhibiteurs selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en 15 ce que la sarcoglycanopathie est liée à une a-sarcoglycane mutée. 5/ Utilisation d'inhibiteurs selon la revendication 4, caractérisé en ce que la sarcoglycanopathie est liée à une mutation R77C dans l'a-sarcoglycane humaine. 20 6/ Procédé d'évaluation in vitro de l'efficacité d'un inhibiteur de la dégradation associée au réticulum endoplasmique (ERAD) sur les sarcoglycanopathies comprenant les étapes suivantes : cotransfection dans des cellules des quatre gènes codant les sarcoglycanes (y-, a-, (3- ou 5-), l'un des gènes étant porteur d'une mutation ; 25 incubation pendant plusieurs heures en présence d'un inhibiteur tel que défini à l'une des revendications 1 à 5 ; localisation du complexe des sarcoglycanes. 7/ Procédé d'évaluation in vitro de l'efficacité d'un inhibiteur de la dégradation 30 associée au réticulum endoplasmique (ERAD) selon la revendication 6 caractérisé en ce que le procédé est mis en oeuvre en parallèle sur des cellules cotransfectées par les gènes non mutés codant les quatre sarcoglycanes. 10 2903905 17 8/ Procédé d'évaluation in vitro de l'efficacité d'un inhibiteur de la dégradation associée au réticulum endoplasmique (ERAD) selon la revendication 6 ou 7 caractérisé en ce que le procédé est mis en oeuvre en parallèle sur des cellules incubées en l'absence de l'inhibiteur. 9/ Procédé d'évaluation in vitro de l'efficacité d'un inhibiteur de la dégradation associée au réticulum endoplasmique (ERAD) selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisé en ce que la localisation du complexe est réalisée par marquage l0 immunohistochimique.