FR 2899088 A1 20071005 FR 0602793 A 20060331 " Microscopie de fluorescence fibrée à base de Bleu de Méthylène." La présente invention se rapporte à un procédé d'acquisition d'imagerie s de fluorescence, in vivo, d'un tissu au moyen d'un système d'acquisition comprenant au moins une fibre optique d'excitation du tissu par faisceau lumineux. La présente invention trouve une application particulièrement intéressante dans le domaine de l'imagerie médicale in vivo. Pour ce faire, on ~o utilise un système fibré permettant d'obtenir, grâce à un traitement informatique, une image construite en temps réel point à point. Un tel système permet d'observer et d'analyser un tissu biologique in vivo in situ en temps réel, notamment accessible via le canal opérateur d'un endoscope ou intégré à l'endoscope. 15 D'une façon générale, un tel système peut comprendre une unité de traitement apte à générer une image à partir de signaux électriques en provenance de photo-détecteurs. Ces photodétecteurs reçoivent des signaux de fluorescence en provenance du tissu et véhiculés par au moins une fibre optique. Le système comprend également des moyens de balayage pour que 20 le faisceau d'excitation balaye point par point le champ imagé dans le tissu. En imagerie de fluorescence, un photon vient exciter une molécule. La désexcitation de cette dernière provoque l'émission d'un photon fluorescent. L'énergie du photon excitateur correspond exactement à la quantité d'énergie nécessaire pour porter la molécule à un état excité donné. 25 En général, la fluorescence observée peut provenir d'un composé exogène (typiquement un marqueur administré) ou d'un composé endogène qui est soit fabriquée par des cellules (marqueur de type transgénique) d'un tissu biologique, soit naturellement présent dans les cellules (autofluorescence). En particulier, lorsqu'on utilise un composé exogène 3o destiné à être administré, il est généralement admis et conseillé d'utiliser un marqueur présentant un fort caractère fluorescent. On peut ainsi avantageusement utiliser un laser de faible puissance (énergie d'excitation), la quantité de photons fluorescents étant largement suffisant pour élaborer des images de grande qualité. 2899088 - 2- On utilise généralement les marqueurs suivants qui sont reconnus pour leurs propriétés de fluorescence : les rhodamines, fluorescéines, cyanine,... Toutefois, le problème avec de tels marqueurs est qu'ils sont onéreux et pour la plupart toxiques. La présente invention a pour but un procédé d'imagerie in vivo simplifié, peu onéreux et permettant une acquisition rapide. On atteint au moins l'un des objectifs précités avec un procédé d'acquisition d'imagerie de fluorescence, in vivo, d'un tissu au moyen d'un système d'acquisition comprenant au moins une fibre optique d'excitation du ~o tissu par balayage d'un faisceau lumineux. Selon l'invention, on utilise ledit système pour la détection de signaux de fluorescence émis par du Bleu de Méthylène présent dans le tissu. La présente invention est notamment remarquable par le fait qu'on utilise le Bleu de Méthylène pour ses propriétés de fluorescence dans un ts système fibré pour de l'imagerie in vivo. Ce système peut notamment être de type confocal. Le caractère confocal est obtenu grâce à un filtrage spatial permettant de détecter un signal de retour provenant uniquement du point excité du tissu et empruntant le même chemin optique que le signal d'excitation. 20 L'utilisation du Bleu de Méthylène, ou chlorure de rnéthylthioninium, va à l'encontre d'un préjugé généralement admis selon lequel le marqueur doit posséder de grandes capacités de fluorescence. Au contraire dans le procédé selon la présente invention, on a privilégié la simplicité d'utilisation plutôt que l'efficacité du marqueur en terme de fluorescence. Ce procédé permet de 25 simplifier le processus d'acquisition d'imagerie de fluorescence par utilisation d'une substance qui est couramment utilisée dans le domaine médical mais pour des usages différents. En effet, les propriétés pharmacologiques pour lesquels on utilise généralement le Bleu de Méthylène sont les suivantes antidote, colorant, antiseptique, ou encore agent diagnostique. 3o Par ailleurs, et plus précisément, le bleu de méthylène est utilisé en endoscopie comme "colorant vital". Cela s'appelle alors de la "chromoendoscopie" ou "chromoscopie". Le bleu de méthylène est aussi utilisé comme agent de contraste dans une nouvelle technique appelée "Endocytoscopy". Dans ce cas, il est seulement utilisé comme marqueur. Le 35 bleu de méthylène est aussi utilisé comme agent de contraste pour le photodiagnostic. Dans tous ces cas d'utilisation en tant que colorant vital, marqueur ou encore agent de contraste, les propriétés de fluorescence du bleu de méthylène ne sont pas utilisées. Le Bleu de Méthylène est donc couramment utilisé, notamment en tant que substance antiseptique. A ce titre, on peut donc utiliser le Bleu de Méthylène sur un tissu lors d'une étape préalable de traitement antiseptique, et profiter avantageusement de sa présence sur le tissu pour acquérir une image de fluorescence du tissu. On voit tout de suite les avantages, en terme de coût et de délai, qui découlent du procédé puisqu'il n'est plus nécessaire to d'administrer un autre fluorophore. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, le système d'acquisition utilisé est un système d'endo-microscopie confocale (microscopie pendant l'endoscopie). Suivant une caractéristique avantageuse de l'invention, le faisceau 15 lumineux d'excitation est un faisceau laser. En outre, la longueur d'onde du faisceau lumineux d'excitation peut être comprise entre 600nm et 680nm. L'utilisation d'un système d'endomicroscopie confocale avec une longueur d'onde adéquate permet d'obtenir des images au niveau microscopique. Avantageusement, lors d'une utilisation sur des tissus humains 20 notamment, la concentration du Bleu de Méthylène peut être sensiblement égale à 0.5%. On préconise une telle valeur particulièrement pour lutter contre la toxicité du Bleu de Méthylène. Cependant, dans le cas présent, en exploitant au mieux les propriétés de fluorescence du Bleu de Méthylène par éclairage laser notamment, il se crée de la phototoxicité. Pour lutter contre 25 cela, on peut aussi prévoir l'utilisation d'une concentration maximum du Bleu de Méthylène égale à 0.5%. Dans ce cas, la puissance du faisceau laser d'excitation et la sensibilité du système d'acquisition sont adaptées de façon à détecter un signal de fluorescence de niveau suffisamment élevé pour permettre au système d'acquisition d'élaborer une image. A titre d'exemple, 30 la puissance du faisceau laser d'excitation est inférieure ou égale à 10 mW pour une microseconde d'éclairage. Plus précisément, la puissance du laser est adaptée pour ne pas atteindre le seuil de phototoxicité du bleu de méthylène, typiquement entre 1 et 5 mW sur le tissu. Selon encore l'invention, on peut avantageusement utiliser des 35 concentrations de bleu de méthylène entre 0.1% et 0.01% pour une 2899088 -4 puissance laser comprise entre 10 et 15 mW. Ceci permet notamment encore d'obtenir des images de bonne qualité. Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, le système d'acquisition est équipé d'un guide d'image constitué d'une pluralité de fibres 5 optiques éclairées tour à tour, chaque fibre étant apte à véhiculer le signal d'excitation et le signal de fluorescence rétro-émis. Le système selon l'invention permet la réalisation d'une image de fluorescence in vivo, in situ, déportée avec une résolution microscopique. Le guide d'image ou "fiber bundle" en langue anglaise, présente une flexibilité et une taille permettant Io une application en endoscopie notamment par insertion dans un canal opérateur. Le champ à imager dans le tissu peut être balayé point à point ou ligne par ligne par le signal d'excitation. De préférence, le faisceau lumineux balaye le tissu de façon à acquérir en temps réel au moins douze images par seconde. 15 Suivant un autre aspect de l'invention, il est proposé une application du procédé tel que défini ci-dessus pour l'acquisition d'images de noyaux cellulaires en endomicroscopie confocale. La présente invention sera mieux comprise et d'autres avantages apparaîtront à la lumière de la description qui va suivre d'un exemple de 20 réalisation, description faite en référence aux dessins annexés sur lesquels : - la figure 1 représente schématiquement ledit exemple choisi de réalisation ; et - la figure 2 est un schéma fonctionnel de l'appareillage selon l'invention. 25 Bien que l'invention n'y soit pas limitée, on va maintenant décrire un système d'imagerie microscopique confocale de fluorescence à base du bleu de méthylène. Le système d'acquisition peut consister en l'un des appareils (avec ou sans tête optique) décrits dans la demande de brevet WO 2004/008952. Mais on peut aussi utiliser tout autre appareil de fluorescence 3o adapté. L'élément 13 est un tissu biologique dans lequel on a injecté du bleu de méthylène de façon à marquer des noyaux cellulaires. Pour un tissu humain par exemple, on prend soin de ne pas dépasser la concentration de 0.5%. Selon l'exemple choisi et représenté sur les figures 1 et 2, 35 l'appareillage comporte : - une source lumineuse 1 ; - des moyens 2 de mise en forme du faisceau d'excitation ; - des moyens 3 de séparation de longueurs d'onde ; des moyens 4 de balayage ; des moyens 5 d'injection de faisceau ; - un guide d'image 6 constitué de fibres optiques souples ; - une tête optique de focalisation 7 ; - des moyens 8 de réjection du faisceau d'excitation ; des moyens 9 de focalisation du signal de fluorescence ; ~o des moyens 10 de filtrage spatial du signal de fluorescence ; des moyens 11 de détection du signal de fluorescence ; et des moyens 12 de traitement électronique et informatique du signal de fluorescence détecté et de visualisation. Ces différents éléments sont détaillés ci-après. 15 La source lumineuse 1 est un laser émettant à une longueur d'onde d'excitation comprise entre 600nm et 680nm permettant d'exciter le bleu de méthylène, par exemple 635nm. Pour optimiser l'injection dans l'une des fibres du guide d'image 6, le faisceau d'excitation est circulaire pour pouvoir injecter une fibre de section également circulaire et, pour optimiser le 20 taux d'injection, le laser est de préférence monomode longitudinal pour présenter le meilleur front d'onde possible pour l'injection dans une fibre optique faiblement multimode. Le laser émet de manière continue et stable (bruit le plus faible possible, Sur la voie de détection, le signal de fluorescence, en sortie du filtre de réjection 8, est ensuite focalisé par les moyens 9, constitués par exemple d'une lentille de détection, dans un trou de filtrage des moyens 10 de filtrage spatial. La focale de la lentille de détection est calculée pour que le signal de fluorescence provenant d'une fibre soit de la taille ou légèrement inférieure à celle du trou de filtrage. Ce dernier permet de conserver la lumière de fluorescence ne provenant que de la fibre illuminée par le faisceau incident. Il permet de rejeter la lumière qui aurait pu être couplée dans les fibres adjacentes à celle qui est illuminée. La taille du trou est calculée pour que l'image d'une fibre s'y inscrive parfaitement. Ici, elle est de 20 pm. Par 1s ailleurs, dans un souci d'optimiser la quantité de photons traversant le trou de filtrage, et donc le flux détecté, les moyens de balayage 4, les moyens d'injection 5, les moyens de focalisation 7 de la tête optique, et les moyens de détection 8, 9 et 10 sont adaptés au fluorophore détecté : ces moyens sont choisis pour être suffisamment achromatiques pour collecter des photons 20 sur la bande la plus large d'émission du fluorophore qui est le bleu de méthylène. Les moyens de détection 11 ont une sensibilité maximale aux longueurs d'onde de fluorescence du bleu de méthylène. On peut utiliser par exemple une photodiode à avalanches (APD) ou bien un photomultiplicateur. 25 D'une façon générale, on optimise toute la chaîne d'acquisition (tête optique, guide d'onde, détecteur, électronique et logiciel de traitement d'image) de façon à détecter quelques centaines de pico watts de fluorophore dans in intervalle d'environ 80 nanosecondes. On détecte ainsi peu de photons de bleu de méthylène avec un système fonctionnant en temps réel. 30 En outre, pour obtenir une image en temps réel, la bande passante est choisie de préférence pour optimiser le temps d'intégration du signal de fluorescence. Elle est de 2 MHz, ce qui correspond à la fréquence d'échantillonnage minimale du guide d'image avec un temps d'intégration optimisé sur chaque pixel. 2899088 - 9- Les moyens électroniques et informatiques 12 de commande, d'analyse et de traitement numérique du signal détecté et de visualisation comprennent les cartes suivantes: - une carte de synchronisation 20 qui a pour fonctions : 5 - de commander de manière synchronisée le balayage, c'est-à-dire le mouvement des miroirs ligne M1 et trame M2 ; - de connaître à tout instant la position du spot laser ainsi balayé ; et de gérer toutes les autres cartes par l'intermédiaire d'un microcontrôleur lui-même pouvant être piloté ; Io - une carte détecteur 21 qui comprend un circuit analogique qui réalise notamment une adaptation d'impédance, un convertisseur analogique numérique puis un composant logique programmable (par exemple un circuit FPGA) qui met en forme le signal ; - une carte d'acquisition numérique 22 qui permet de traiter un flot de données numériques à fréquence variable et de l'afficher sur un écran 23 ; - une carte graphique 24. En variante, on peut utiliser une seule carte regroupant les fonctionnalités de ces différentes cartes. Le traitement d'image se fait de la manière suivante. A la mise en place d'un guide d'image dans l'appareillage, une première opération est effectuée pour reconnaître le motif des fibres dans le guide d'image, et donc connaître l'emplacement réel de chaque fibre destinée à être utilisée. Les opérations suivantes sont également réalisées préalablement à l'utilisation de l'appareillage : - la détermination du taux d'injection propre à chaque fibre, à l'aide d'un échantillon homogène, ce taux d'injection pouvant varier d'une fibre à une autre ; et la mesure de l'image de fond, effectuée sans échantillon. 3o Ces deux opérations peuvent être réalisées régulièrement en fonction de la fréquence d'utilisation de l'appareillage. Les résultats obtenus vont être utilisés pour corriger en fonctionnement le signal numérique en sortie de la carte détecteur. En fonctionnement, selon l'invention 2 groupes de traitements sont 35 effectués sur le signal numérique en sortie de la carte détecteur : Le premier groupe consiste dans un premier temps à corriger le signal numérique notamment pour tenir compte du taux propre réel d'injection de la fibre dont est issu ledit signal et pour lui soustraire la partie du flux correspondant à l'image de fond. Cela permet de ne traiter qu'un signal correspondant réellement à l'échantillon observé. On utilise pour ce groupe de traitement un algorithme de calcul classique qui est optimisable pour respecter le cas échéant la contrainte du temps réel. Le second groupe consiste ensuite, à partir du signal corrigé, à reconstruire l'image numérique qui sera visualisée par le praticien. Le but du ~o traitement effectué est d'offrir à la visualisation une image numérique reconstituée qui ne soit pas simplement une mosaïque d'éléments d'image correspondant chacun à un signal numérique corrigé d'une fibre mis côte à côte, mais d'offrir une image numérique reconstituée qui ne fasse plus apparaître les fibres. On utilise pour cela un algorithme destiné à effectuer un 15 certain nombre d'opérations sur chaque pixel, l'algorithme étant choisi pour respecter la contrainte de temps réel, c'est à dire qu'il doit représenter un bon compromis entre la complexité des opérations demandées, la qualité du résultat que l'on peut obtenir et le temps de calcul. A titre d'exemple, on peut utiliser un algorithme de filtrage passe-bas Gaussien. 20 Le fonctionnement de l'appareillage est le suivant. La source 1 produit un faisceau parallèle circulaire d'excitation à À=635 nm, qui est ensuite remis en forme dans le système afocal 2 afin de lui donner la taille adéquate pour la meilleure injection possible dans le coeur d'une fibre. Ce faisceau est ensuite envoyé vers le système de séparation dichroïque 3 qui réfléchit la longueur 25 d'onde d'excitation. Le faisceau incident est ensuite dévié angulairement dans le temps dans les deux directions de l'espace par le système de balayage optomécanique de miroirs 4, et injecté grâce aux moyens optiques d'injection 5 dans l'une des fibres du guide d'image 6. Les moyens électroniques 12 servent à commander l'injection à un instant donné de l'une des fibres 30 optiques du guide d'image en déviant angulairement le faisceau au moyen des miroirs, et ce point par point pour une ligne donnée, et ligne après ligne, pour constituer l'image. En sortie du guide, la lumière émergeant de la fibre injectée est focalisée dans l'échantillon grâce à la tête optique 7 en un point situé à une profondeur donnée située sensiblement entre quelques dizaines 35 de pm et une centaine de pm. Grâce au balayage, l'échantillon est illuminé point par point. A chaque instant, le spot illuminant le tissu émet alors un signal de fluorescence qui a la particularité d'être décalé vers des plus grandes longueurs d'onde. Ce signal de fluorescence est capté par la tête optique 7, puis suit le chemin inverse du faisceau d'excitation jusqu'au filtre dichroïque 3 qui va transmettre le signal de fluorescence vers la voie de détection. Les réflexions parasites se produisant à la longueur d'onde d'excitation vont ensuite être rejetées par le filtre de réjection 8. Enfin, le signal de fluorescence est focalisé dans le trou de filtrage 10 pour ne sélectionner que la lumière provenant de la fibre excitée et les photons sont ~o détectés par la photodiode à avalanche 11. Le signal détecté est ensuite numérisé et corrigé. Les signaux détectés, les uns après les autres, sont traités en temps réel grâce au traitement d'image décrit plus haut pour permettre la reconstruction d'une image en temps réel visualisée à l'écran. La mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, pour 15 notamment l'observation du tissu humain peut se faire en limitant la concentration du Bleu de Méthylène dans le tissu : on faible concentration de l'ordre de 0.5%; en limitant la puissance du faisceau laser : une faible puissance de l'ordre de 10mW/ps; et en augmentant la sensibilité de détection du système de façon à détecter un maximum de fluorophore. 20 Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l'invention. On peut notamment utiliser un système comprenant une seule fibre optique ou un "bundle" de fibres optiques, un balayage point à point ou ligne à ligne, un balayage distal ou proximal, avec 25 ou sans tête optique, pour de la fluorescence ou de la réflectance. REVENDICATIONS 1. Procédé d'acquisition d'imagerie de fluorescence, in vivo, d'un tissu au moyen d'un système d'acquisition comprenant au moins une fibre optique d'excitation du tissu par balayage d'un faisceau lumineux, caractérisé en ce qu'on utilise ledit système pour la détection de signaux de fluorescence émis par du Bleu de Méthylène présent dans le tissu. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit système to est un système d'endo-microscopie confocale (microscopie pendant l'endoscopie). 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le faisceau lumineux d'excitation est un faisceau laser. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la longueur d'onde du faisceau lumineux d'excitation est comprise entre 600nm et 680nm. 20 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration du Bleu de Méthylène est sensiblement égale à 0.5%. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé 25 en ce qu'on utilise une concentration maximum du Bleu de Méthylène égale à 0.5%, et en ce que la puissance du faisceau laser d'excitation et la sensibilité dudit système sont adaptées de façon à détecter un signal de fluorescence de niveau suffisamment élevé pour permettre au système d'élaborer une image. 3o 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la puissance du faisceau laser d'excitation est inférieure ou égale à 10 mW pour une microseconde d'éclairage. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise une 35 concentration de Bleu de Méthylène comprise entre 0.1 et 0.01%, et en ce 15 2899088 - 13- que le faisceau lumineux est un faisceau laser de puissance comprise entre 10 et 15mW. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 5 caractérisé en ce que ledit système est équipé d'un guide d'image constitué d'une pluralité de fibres optiques éclairées tour à tour, chaque fibre étant apte à véhiculer le signal d'excitation et le signal de fluorescence rétro-émis. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, ~o caractérisé en ce que le faisceau lumineux balaye le tissu de façon à acquérir en temps réel au moins douze images par seconde. 11. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes pour l'acquisition d'images de noyaux cellulaires en 15 endomicroscopie confocale.