FR 2903572 A1 20080118 FR 0652899 A 20060711 35 2903572 1 La présente invention a pour objet un dispositif microbistatique constitué d'un contenant à porosités sélectives renfermant une matière réactive d'origine végétale émettrice d'isothiocyanates (ITC). Ces dernières décennies, on a pu observer un changement radical des habitudes alimentaires des habitants des pays industrialisés, essentiellement consécutif au nombre croissant de femmes travaillant à l'extérieur et n'ayant plus qu'un temps limité à consacrer à la préparation des repas. Pour tenir compte de cette situation, les industriels ont récemment mis au point une large gamme de produits et de denrées prêts à consommer, conditionnées sous atmosphère contrôlée dans des emballages (sacs ou barquettes) plus ou moins étanches aux gaz et présentées au rayon frais des grandes surfaces. Ces denrées peuvent être de type très varié et en particulier 15 constituées par des produits frais ou semi-frais prêts à l'emploi (crudités, fruits découpés, fromages, viandes ou poissons crus...) ou encore par des plats cuisinés à base de viande, de poisson ou de légumes, des plats de charcuterie ou de charcuterie pâtissière tels que quiches ou pizzas, ou encore des entrées ou plats de pâtisseries sucrées... 20 Pour concevoir de telles denrées, les spécialistes des indus-tries agro-alimentaires doivent tenir compte des exigences des consommateurs qui recherchent des produits sains autant que possible exempts d'additifs ou de conservateurs de synthèse, dont les qualités organoleptiques soient proches de celles des produits natifs et qui soient parallèle- 25 ment pratiques d'emploi, avec une durée de conservation aussi longue que possible. Or, ces exigences ne sont pas toujours compatibles avec celles imposées par la réglementation qui est de plus en plus sévère en matière d'hygiène et de sécurité des aliments. L'un des principaux obstacles à la conservation des denrées alimentaires prêtes à consommer est lié au développement de micro-organismes qui entraînent une dégradation de la qualité sanitaire et/ou organoleptique de l'aliment qui devient à la longue impropre à la consommation. Pour remédier à cet inconvénient, les spécialistes ont déjà eu l'idée d'introduire dans les emballages dans lesquels sont condition-nées les denrées alimentaires prêtes à consommer des dispositifs ayant 2903572 2 pour fonction de contrôler et autant que possible d'éviter le développement de ces micro-organismes. De tels dispositifs renferment des matières actives qui agis-sent en bloquant les gaz présents dès l'origine dans l'emballage ou générés 5 dans celui-ci au cours de la conservation par des processus chimiques ou biologiques, ou encore en générant in situ des gaz susceptibles d'améliorer la conservation des denrées conditionnées. Dans ce contexte, l'invention a pour objet de proposer un dispositif microbistatique renfermant une matière réactive d'origine végé-10 tale naturellement émettrice d'isothiocyanates (ITC). Les propriétés microbistatiques (fongistatiques, bactériostatiques, insecticides) des ITC de formule R-N=C=S (où R est un radical chimique de nature structurale variable) 15 sont connues depuis longtemps et ont largement déjà été décrites dans la littérature. Il est également connu depuis longtemps que certains végétaux, en particulier les crucifères, sont capables dans certaines conditions de dégager des composés volatils soufrés et notamment des ITC et 20 peuvent ainsi se protéger naturellement des bio-agresseurs. Ces propriétés sont traditionnellement utilisées dans le domaine de l'agriculture notamment dans le cadre d'une pratique ancestrale : la bio-fumigation qui consiste à enfouir dans le sol, une culture intermédiaire le plus souvent de crucifères en intersaison. 25 La matière organique végétale enfouie a trois fonctions, à savoir une fonction nutritionnelle en qualité d'engrais naturel, une fonction de texturation du sol et une fonction d'assainissement du sol. Cette troisième fonction résulte de la génération de vapeurs bistatiques et en particulier d'ITC qui permettent de protéger la culture 30 suivante contre les phytopathogènes (notamment des champignons et des bactéries), en assainissant le sol. Les spécialistes ont pu établir que l'aptitude de toutes les crucifères à libérer des ITC (avec un spectre - c'est-à-dire des radicaux R - différent selon la plante) est liée à la présence de substrats particuliers 35 existant naturellement chez ces espèces, à savoir les glucosinolates qui n'ont en eux-mêmes aucune valeur microbistatique. Les glucosinolates se transforment en effet en ITC grâce à l'action d'une enzyme endogène, la myrosinase et en présence d'humidité. 2903572 3 Dans la plante vivante, les glucosinolates et la myrosinase sont dans des compartiments séparés et ne sont pas au contact de sorte que la réaction de production des ITC ne se produit pas. En revanche, suite à une agression provoquée par toute 5 coupure ou blessure qui correspond à une source d'entrée d'agents micro-biens, les glucosinolates et la myrosinase entrant en contact l'un de l'autre. La plante se défend alors en transformant naturellement les glucosinolates en glucose et en ITC microbistatiques. Les glucosinolates sont ainsi des précurseurs d'ITC. Il est à noter que l'on a déjà eu l'idée d'utiliser les propriétés microbistatiques des ITC pour la préservation de produits alimentaires. On a ainsi déjà proposé des dispositifs microbistatiques renfermant une matière active émettrice d'ITC d'origine végétale ou de synthèse. Toutefois dans ces dispositifs, cette matière active, en règle générale les ITC eux-mêmes, est obtenue par voie semi-naturelle ou par synthèse chimique, ce qui de plus exige en règle générale la mise en oeuvre d'étapes d'extraction par solvant, de mise en solution, de concentration... ce qui n'est pas recommandé par la réglementation. De plus de tels dispositifs microbistatiques ne peuvent émettre qu'un spectre limité d'ITC. Or, il est avantageux d'élargir au maximum le spectre d'ITC émis dans la mesure où un micro-organisme peut être sensible à un ITC 1 et non à un ITC2 alors qu'un autre sera sensible à l'ITC 2 mais pas à l'ITC 1. Un autre inconvénient des dispositifs microbistatiques con-nus est lié au fait que la matière réactive est adsorbée sur un support, en règle générale de type buvard et est intrinsèquement apte à relarguer immédiatement des ITC. Il est par suite nécessaire de contrôler en permanence ce dégagement d'ITC avant utilisation en protégeant la matière réactive dans des emballages étanches coûteux dont la manipulation est particulière- ment incommode. La présente invention a pour objet de remédier à ces incon- vénients en proposant un dispositif microbistatique du type susmentionné renfermant une matière réactive non pas synthétique mais naturelle, donc compatible avec la réglementation et pouvant être stocké avant utilisation par une simple protection contre l'eau et l'humidité. 2903572 4 Selon l'invention, ce dispositif microbistatique est à usage unique et caractérisé en ce que la matière réactive est au moins une crucifère déshydratée susceptible de produire in situ des ITC en présence d'humidité, intégrée dans un contenant membranaire sélectif ayant une 5 porosité choisie pour permettre à la matière réactive de puiser dans son environnement extérieur l'humidité nécessaire au déclenchement de la réaction d'émission des ITC et de maîtriser la vitesse d'émission des ITC vers l'extérieur. Le contenant membranaire sélectif mis en oeuvre conformément à l'invention est donc un contenant (i) dont la porosité depuis son environnement extérieur vers l'intérieur est adaptée au passage de la va-peur d'eau nécessaire au déclenchement de l'action de la myrosinase et (ii) dont la porosité depuis l'intérieur vers l'extérieur de son environnement extérieur est adaptée au passage régulé des vapeurs d'ITC. 15 Cette double sélectivité permet (i) au dispositif de pouvoir par lui-même, en présence de la seule humidité, générer des ITC et (ii) de maîtriser la vitesse d'émission des ITC vers l'extérieur du dispositif. Une telle crucifère correspond à un végétal traditionnelle-ment consommable, et pouvant même le cas échéant présenter un carac- 20 tère favorable pour la santé ; son utilisation ne peut pas, dans cette mesure, faire l'objet de critiques. Selon l'invention, la crucifère déshydratée constituant la matière active du dispositif microbiostatique est en règle générale fractionnée et peut se présenter sous différentes formes en particulier sous 25 forme de paillettes ou de préférence sous une forme pulvérulente. Une telle poudre de crucifère peut être obtenue par simple broyage et séchage de tout ou partie de la plante en sélectionnant la granulométrie en fonction des caractéristiques recherchées. La matière réactive générant elle-même son efficacité en 30 présence d'humidité, les ITC émis par le dispositif microbiostatique con-forme à l'invention présentent ainsi la particularité d'être natifs. Contrairement à la plante vivante, la matière réactive con-forme à l'invention renferme les précurseurs d'ITC (glusinolates) et l'enzyme (myrosinase) non pas séparés dans des compartiments différents 35 mais en mélange. Toutefois, cette matière réactive étant déshydratée, elle est quasiment stable lorsqu'elle est stockée sous atmosphère sèche et la réac- 2903572 5 tion de formation des ITC qui nécessite la présence d'humidité ne se pro-duit pas. Conformément à l'invention, la matière réactive peut être constituée par une large gamme de crucifères dont les multiples crucifères 5 comestibles connus, à titre d'exemple chou, colza, radis... Il est toutefois à noter que les espèces de crucifères cultivées pour la consommation humaine sont en règle générale sélectionnées de manière à leur enlever leur caractère piquant ce qui a pour corollaire de diminuer leur aptitude à émettre des ITC. 10 Par suite, selon l'invention, la crucifère utilisée peut avantageusement être la moutarde et est de préférence le raifort. L'invention concerne également un emballage fortement étanche aux gaz dans lequel sont conditionnés des produits ou denrées alimentaires, notamment un produit frais ou semi-frais prêt à l'emploi ou 15 un plat préparé industriel. Selon l'invention, un tel emballage est caractérisé en ce qu'il renferme un dispositif microbistatique du type susmentionné, l'humidité nécessaire au déclenchement de la réaction d'émission des ITC provenant du produit ou de la denrée alimentaire ainsi conditionné. 20 La quantité de matière réactive (poids ou volume) du dispositif microbiostatique est choisie en fonction des caractéristiques de la denrée alimentaire conditionnée et du volume de l'emballage. L'identification de ce dispositif par sa taille (poids ou volume de matière réactive) et/ ou toute autre information, permet à un utilisateur 25 éventuel d'en déduire les volumes d'ITC susceptibles d'être émis et de faire ainsi un choix adapté en fonction des volumes et natures des produits qu'il a à traiter sur le plan microbiostatique. Dans un emballage conforme à l'invention, on pourrait craindre dans certains cas que l'équilibre biologique se trouve rompu suite 30 à l'émission d'ITC. Par suite, certains micro-organismes plus résistants à ces molécules que les autres et n'entrant donc plus en compétition avec eux peuvent profiter de cette modification pour se développer et envahir le mi-lieu. 35 Or, ces micro-organismes plus résistants peuvent ne pas être anodins et nuire à la durée de conservation des denrées alimentaires conditionnées dans l'emballage, notamment en altérant leur texture ou 2903572 6 leurs qualités organoleptiques, en particulier dans le cas des denrées particulièrement fragiles. Pour éviter ce phénomène et garantir la bio protection des denrées alimentaires conditionnées dans l'emballage, on a eu l'idée con- 5 formément à l'invention d'introduire dans celui-ci des micro-organismes alimentaires inoffensifs, insensibles ou rendus résistants aux ITC dans les conditions de pH des denrées et à la température de conservation de celles-ci qui est en règle générale de l'ordre de 4 C. Ces micro-organismes inoffensifs peuvent ainsi occuper le 10 terrain et empêcher que d'autres micro-organismes pouvant avoir un caractère nocif se développent dans le milieu. Par suite, et selon une autre caractéristique de l'invention, l'emballage renferme une quantité prédéterminée de micro-organismes alimentaires susceptibles de résister et/ou de se développer parallèlement 15 et/ou postérieurement à la présence d'ITC, ces micro-organismes alimentaires étant ajoutés sur ou dans le produit ou la denrée à titre de bio protection. Bien entendu, si les micro-organismes alimentaires sont simplement résistants ou rendus résistants aux ITC sans être aptes à se 20 développer en présence de ces composés, il est essentiel qu'ils soient ajoutés en quantité suffisante pour remplir leur fonction. De tels micro-organismes peuvent être, selon les cas, incorporés dans la masse de la denrée alimentaire (produits en sauce) ou ajoutés à celle-ci en surface (produits carnés) par exemple par la techni- 25 que du spray. Ces micro-organismes peuvent être de type quelconque sans pour cela sortir du cadre de l'invention (levures, moisissures, bactéries...). On peut à titre d'exemple choisir à cet effet des bactéries 30 lactiques appartenant à des souches intrinsèquement résistantes ou rendues résistantes aux ITC. Il est à noter que le dispositif microbistatique objet de l'invention peut être utilisé dans des domaines autres que l'industrie alimentaire, à titre d'exemple non limitatif pour l'assainissement des locaux, 35 des containers, des surfaces ou des réfrigérateurs et des ustensiles. L'efficacité microbiostatique d'une poudre de crucifère a été vérifiée par des tests dont les résultats sont reportés ci-dessous. 2903572 7 Ces travaux ont porté sur 7 germes tests mentionnés dans le tableau cidessous cultivés sur les milieux de culture appropriés dans des boîtes de Petri retournées de telle sorte que le milieu de culture soit dans la partie supérieure et que la poudre de crucifère soit dans la partie 5 inférieure. La poudre de crucifère est placée dans un verre de montre avec la myrosinase et le tampon (en fait 500 mg de poudre de crucifère et 1,5 ml de tampon phosphate de potassium à 33mM (pH7) dans lesquels on ajoute 0,023 mg de myrosinase (ref. SIGMA T4528). Les boîtes de Petri sont fermées par un film étirable et in-cubées à 20 C pendant 2, 5, 8 et 14 jours, après le délai prévu elles sont ouvertes, le verre de montre et son contenu sont éliminés puis les boîtes sont refermées et placées à la température optimale de croissance du microorganisme considéré. Le volume libre dans une boîte de Petri est alors de 83 ml. 15 Un représentant des espèces suivantes Justification du choix Salmonella entendais PT4 de 1987 à 2002, 41% des TIAC déclarés sont dues à Salmonella le Serovar et le Lysovar choisis viennent en tête (rapport annuel 2003, Institut de Veille Sanitaire) Listeria monocytogenes Serovar 4b Serovar le plus fréquent dans des cas de ou bien Serovar 1/2a TIAC Serovar le plus fréquent dans l'environnement, notamment dans les filiè- res liées à la viande -Bull. liaison CTSCCV, 2000, 10(1), 11-19) Staphylococcus aureus enterotoxinogène 10% des TIAC déclarées entre 1987 et 2002 (rapport annuel 2003, Institut de Veille Sa- nitaire) Escherichia coli 0157 : H7 représentant des VTEC (E.coli producteurs de vérotoxines), virotype émergent Pseudomonas fluorescens ou P. putida ou P représentant classique des flores psychro-fragi trophes d'altération des aliments. ce sont de plus les principales bactéries d'altération de la volaille réfrigérée (Arnaut Rollier et al, 1999) Yarrowia lipolytica levure aux fortes activités protéolytique et lipolytique en général. rôle reconnu dans l'altération de la volaille fraîche ou transformée stockée à 5 (Ismail et al, 2000, Deak, 2001) Penicillium sp. Microorganisme sensible aux ITC. Témoin positif de l'efficacité du dispositif 2903572 8 Cas de la poudre de raifort : - Les boîtes ensemencées avec P. expansum (à raison de 1,7x10E7 ufc/ml) présentent 100% d'inhibition au moins jusqu'à 14 jours et restent indemne même 7 jours après retrait de la poudre 5 des boîtes de Petri. - Avec S. aureus ensemencé en culture pure à 5, 5x 10E8 ufc/ml l'inhibition est totale au moins jusqu'à J+3, pour un ensemence-ment à 5,5x10E5 ufc/ml l'inhibition est totale au moins jusqu'à 14 jours et le reste même 7 jours après retrait de la poudre des boîtes 10 de Petri. - Pour E. coli, l'inhibition est totale jusqu'à 5 jours pour un ensemencement à 3x10E8 ufc/ml et au moins jusqu'à 14 jours pour un ensemencement à 3x10E2 ufc/ml. Par contre l'inhibition est au moins partiellement levée après retrait de la poudre des boîtes de Petri. 15 - Pour L. monocytogenes, l'inhibition est totale jusqu'à au moins 14 jours pour un ensemencement à 4,3x10E8 ufc/ml et cette inhibition se maintient au moins 14 jours après retrait de la poudre des boîtes de Petri. - Pour S. entendis, l'inhibition est totale jusqu'à au moins 14 jours 20 pour un ensemencement à 6,1xlOE8 ufc/ml et l'inhibition est maintenue au moins 14 jours après retrait de la poudre des boîtes de Petri. - Pour P. fluorescens, l'inhibition est totale jusqu'à au moins 14 jours pour un ensemencement à 5,6x10E8 ufc/ml et elle est maintenue 25 pendant au moins 14 jours après retrait de la poudre des boîte de Petri. - Pour Y. lipolytica, l'inhibition est totale jusqu'à au moins 14 jours pour un ensemencement à 9,4x10E5 ufc/ml et elle est maintenue au moins 14 jours après retrait de la poudre des boîtes de Petri.. 30 Une seconde expérimentation avec une incubation à 8 C au lieu de 20 C a montré des inhibitions encore supérieures notamment pour E. coli l'inhibition est totale jusqu'à 15 jours à 8 C pour un ensemence-ment à 3x 10E8 ufc/ml. Cas de la poudre du radis blanc : 35 - Pour P. expansum un retard de croissance et une inhibition partielle ont été observés à 20 C notamment lors d'un ensemencement à 1,2x10E3 ufc/ml. A la même concentration mais à 8 C, il y a une 2903572 9 inhibition totale jusqu'à 10 jours puis une inhibition partielle au moins jusqu'à 15 jours. - Pour P. fluorescens à 4,1x1 0E3 ufc/ml, un retard de croissance et une inhibition partielle ont été observés jusqu'à 14 jours à 20 C. Il y 5 a une inhibition totale jusqu'à 3 jours puis une inhibition partielle jusqu'à 14 jours à 8 C. - Pour E. coli à 4,7x10E3 ufc/ml, seul un retard de croissance est ob- servé à 20 C alors qu'à 8 C il y a inhibition totale jusqu'à 10 jours puis inhibition partielle jusqu'à 14 jours pour un ensemencement à io 3xlOE3 ufc/ml. - Pour S. aureus à 2,2x10E3 ufc/ml un retard de croissance avec inhibition partielle est observé jusqu'à 14 jours à 20 C alors qu'à 8 C seul un léger retard de croissance est observé pour une population de 3x10E3 ufc/ml. 15 Cas du radis noir : Les résultats sont de même nature que pour les radis blancs, toutefois pour P. expansum à 8 C l'inhibition est seulement partielle. Application sous forme de sachets : 20 Des essais complémentaires ont été réalisés avec 3 types de sachets dénommés OS, HV et FT contenant 250 mg de poudre de raifort, les sachets ont été utilisés avec et sans hydratation (1,5 ml de tampon) préalable par introduction dans les boîtes de Petri en lieu et place du verre de montre utilisé dans les expérimentations décrites précédemment. 25 Les sachets ont tous les mêmes dimensions à sa-voir 50*50 mm et sont constitués de matériaux différents présentant des porosités à l'air et à la vapeur d'eau différentes. - OS est un sachet adhésif constitué d'un adhésif (a) permanent à base acrylique agréé pour contact alimentaire, appliqué à raison de 42g/m2 30 sur une pellicule de PET (b) (polyéthylène téréphtalate) de 12 microns, elle-même contrecollée sur une pellicule de PEBD (c) (polyéthylène basse densité) de 50 microns, soudée sur son pourtour sur le matériau constituant la face perméable du sachet. Cette face perméable est constituée d'une pellicule de non-tissé de polyéthylène (Tyvek ) (d) 35 de 42,5g/m2 contrecollée sur une pellicule de 12 microns de PET per-forée imprimée sur sa face interne. Le non-tissé (d) est soudé sur le polyéthylène basse densité (c). La perméabilité de la membrane 30 35 2903572 10 Tyvek /PET perforé (d+e) est de l'ordre de 100 ml/mn au porosimètre Bendtsen. - HV est un sachet constitué d'une face imperméable en complexe PET/PEBD (PET 12 microns, PEBD blanc 50 microns), le PEBD 5 est soudé sur un matériau non-tissé de PE (Tyvek ) 75g/m2 enduit sur sa face externe d'un vernis hydrophobe (5g/m2). La porosité Bendtsen du non-tissé enduit est de l'ordre de 100 à 500 ml/mn. - FT est un sachet dont les deux faces sont perméables et identiques, le matériau est constitué de trois pellicules ; à l'intérieur une pellicule 10 de PP (polypropylène blanc 30 microns) perforée, une pellicule intermédiaire de papier non-tissé et une pellicule extérieure de PET (12 microns) perforée, la pellicule interne de PP est soudée sur elle-même pour former le sachet. La porosité Bendtsen de ce matériau triplex est typiquement comprise entre 50 et 100 ml/mn. 15 Avec E. coli à 20 C en culture pure à 4,6x10E8 ufc/ml, l'inhibition est totale jusqu'à 7 jours puis partielle au moins jusqu'à 14 jours. Cette inhibition partielle est plus forte pour les sachets OS et HV que pour les sachets FT. L'inhibition partielle est plus marquée pour les sachets hydratés mais il apparaît nettement que l'hydratation peut se réa-20 liser spontanément par absorption de vapeur d'eau cédée par le substrat (gélose dans le cas de cette expérimentation). Pour un ensemencement à 4,6x10E3 ufc/ml de E. coli, l'inhibition est totale au moins jusqu'à 14 jours sauf dans le cas des sachets FT non hydratés, dans ce cas si l'inhibition n'est pas totale le taux 25 de réduction est cependant de l'ordre de 99,87%. Cette expérimentation montre que les résultats antérieurs sont extrapolables à la mise en oeuvre de poudre de crucifère conditionnée en sachet comme emballage actif microbiostatique. Remarques : La poudre de raifort est obtenue à partir de racines de rai-fort frais correctement nettoyées et lavées, coupées et séchées. Les copeaux ainsi obtenus sont réduits en poudre. La poudre de radis blanc est obtenue par le même procédé de racines de raids blanc dit de Munich. La poudre de radis noir est obtenue quant à elle à partir de racines de radis noir. 15 REVENDICATIONS 1 ) Dispositif microbistatique renfermant une matière réactive végétale émettrice d'isothiocyanates (ITC) caractérisé en ce que la matière réactive est au moins une crucifère déshydratée susceptible de produire in situ des ITC en présence d'humidité intégrée dans un contenant membranaire sélectif ayant une porosité choisie pour permettre à la matière réactive de puiser dans son environnement extérieur l'humidité nécessaire au déclenchement de la réaction d'émission des ITC et de mai- triser la vitesse d'émission des ITC vers l'extérieur. 2 ) Dispositif microbistatique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matière réactive est de la poudre sèche de crucifère. 3 ) Dispositif microbistatique selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la crucifère est du raifort. 20 4 ) Emballage fortement étanche aux gaz dans lequel est conditionné un produit ou denrée alimentaire, notamment un produit frais ou semi-frais prêt à l'emploi ou un plat préparé industriel caractérisé en ce qu' 25 il renferme un dispositif microbistatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, l'humidité nécessaire au déclenchement de la réaction d'émission des ITC provenant du produit ou de la denrée ainsi condition-né. 30 5 ) Emballage selon la revendication 4, caractérisé en ce qu' il renferme une quantité prédéterminée de micro-organismes alimentaires susceptibles de résister et/ou de se développer parallèlement et/ou postérieurement à la présence d'ITC, ces micro-organismes alimentaires étant 35 ajoutés sur ou dans le produit ou la denrée à titre de bio protection. 6 ) Emballage selon la revendication 5, caractérisé en ce que 2903572 12 les micro-organismes alimentaires sont des bactéries lactiques. 5