FR 2906532 A1 20080404 FR 0653982 A 20060928 1 DESCRIPTION La présente invention concerne un nouvel oligonucléotide marqué. L'invention concerne également l'utilisation d'un tel oligonucléotide, ainsi qu'un procédé mettant en oeuvre un tel oligonucléotide. Il est souvent nécessaire, dans les technologies relatives aux acides nucléiques et au matériel génétique, de déterminer si un gène, une partie de gène ou une séquence nucléotidique est présent dans un organisme vivant, un extrait cellulaire de cet organisme ou tout autre un échantillon biologique. Différents types de méthodes de détection des acides nucléiques sont décrits dans la littérature. Ces méthodes, et particulièrement celles qui requièrent la détection de polynucléotides, reposent sur les propriétés d'appariement des brins complémentaires d'acides nucléiques, communément appelée "hybridation d'acides nucléiques" ou simplement "hybridation". D'une manière générale, après avoir identifié la séquence spécifique d'un organisme ou d'une maladie qui doit être analysée, il convient d'extraire les acides nucléiques d'un échantillon, d'amplifier et de détecter la séquence d'intérêt. De nombreuses méthodes d'amplification et de détection ont été développées dans ce but. Ainsi, la PCR (Polymerase Chain Reaction) est basée sur la répétition d'un processus en trois étapes : la dénaturation de l'ADN double brin, l'hybridation des amorces à l'ADN simple brin, et l'extension enzymatique des amorces par une ADN polymérase thermostable qui synthétise un brin d'ADN complémentaire à celui servant de cible pour les amorces oligonucléotidiques. L'amplification peut être analysée en fin de cycle (PCR end point ) ou en temps réel (PCR en temps réel) grâce à l'utilisation d'un marquage fluorescent du produit amplifié. Il existe plusieurs techniques de PCR en temps réel. L'une d'elles met en oeuvre des sondes particulières appelées molecular beacons , qui sont des séquences en épingle à cheveux (ou hairpin ) comprenant une structure boucle loop , une tige stem contenant un fluorophore à une extrémité de la séquence et un extincteur de fluorescence (ou quencher ) à l'autre extrémité (Tyagi, S. and Kramer, Fll., Nat. Biotechnol., 1996, 14, 2906532 2 303-308, Marras, SA. et al., Genet Anal., 1999, 14, 151-156). En dessous de la température d'hybridation, ces séquences, non hybridées à une séquence cible, adoptent une configuration dite en " épingle à cheveux ": les extrémités 5' et 3' sont proches, il n'y a pas d'émission de fluorescence. Lorsque la sonde via la séquence de la boucle (loop) 5 reconnaît et s'hybride à un amplicon, qui correspond à la séquence cible amplifiée, la structure tige (stem) est déstabilisée, les extrémités sont éloignées, le "quencher" ne joue plus son rôle et il y a émission de fluorescence. Toutefois, dans certaines conditions, l'émission de fluorescence par des sondes molecular beacons peut être parasitée par un bruit de fond dû à l'éloignement du fluorophore et 10 du quencher suite à une dégradation par des nucléases présentes lors de la réaction d'amplification. C'est notamment le cas brs d'une PCR classique , puisque l'enzyme Taq polymérase elle même possède une activité 5' nucléase. De plus, outre l'émission de fluorescence parasite qui apparaît lors d'une PCR en temps réel, le clivage des molecular beacons du à la présence résiduelle d'enzyme thermostable polymerase en fm 15 de cycle affecte une analyse de gradient de température postérieure ( end point ) à l'amplification. Or cette analyse de gradient de température postérieure à l'amplification est la méthode la plus sensible pour détecter des variations simples des séquences, comme les SNP ("single nucleotide polymorphisme , ou polymorphisme d'un seul nucléotide) par les molecular beacons . 20 La NASBA est une autre technologie d'amplification, isotherme, de l'acide nucléique reposant sur l'action conjointe de trois enzymes (transcriptase inverse AMV, RNAse-H et polymérase-ARN T7). L'amplification peut être analysée en fin de cycle (NASBA end point ) ou en temps réel (NASBA en temps réel) grâce à l'utilisation d'un marquage fluorescent du produit amplifié, par l'utilisation de sondes molecular beacons . Toutefois, 25 en end point , la présence de RNAse H, enzyme indispensable lors de l'initiation de la NASBA, peut induire, en fm de réaction, une dégradation de l'ARN cible hybridé sur le molecular beacon . On observe alors une diminution du signal de fluorescence qui est due au clivage de l'ARN cible. Une analyse de gradient de température postérieure à l'amplification est donc délicate. 15 2906532 3 Que ce soit en PCR ou en NASBA , l'émission de fluorescence peut également être parasitée par l'hybridation non spécifique de la partie tige du molecular beacon sur l'amplicon. Il est alors important de réduire cette hybridation parasite. Enfin, les molecular beacons peuvent être également utilisés pour la détection de 5 séquences cibles indépendamment d'une amplification. En effet, il est possible d'analyser l'expression d'un gène dans des cellules vivantes par l'injection de molecular beacons , la fluorescence émise reflétant l'hybridation de la sonde sur un transcrit cible. Toutefois, la présence de nombreuses nucléases en activité dans la cellule implique une forte dégradation des sondes, et donc induit l'émission de fluorescence qui n'est pas due à l'hybridation de la 10 sonde sur une séquence cible. Il est donc important d'améliorer les techniques d'amplification actuelles afin de les rendre plus sensibles, en diminuant notamment les phénomènes de clivage et d'hybridation non spécifiques des molecular beacons de l'état de la technique. La présente invention se propose de résoudre l'ensemble des inconvénients de l'état de la technique en présentant de nouveaux oligonucléotides marqués spécifiques, stables et résistants aux nucléases. 20 A ce titre, l'invention concerne un oligonucléotide marqué comprenant un premier segment nucléotidique, un deuxième segment nucléotidique, complémentaire d'une séquence cible, et un troisième segment nucléotidique, complémentaire dudit premier segment nucléotidique caractérisé en ce qu'il comprend un fluorophore, un extincteur et au moins un nucléoside d'anomérie alpha. 25 Préférentiellement, lesdits premier et troisième segments sont de part et d'autre du deuxième segment. Préférentiellement, l'oligonucléotide marqué selon l'invention est caractérisé en ce que ledit deuxième segment comprend au moins un nucléoside d'anomérie alpha. 2906532 4 Préférentiellement, ledit deuxieme segment comprend au moins 5, au moins 10, au moins 15, au moins 20, au moins 25 nucleoside d'anomerie alpha. Préférentiellement, ledit deuxieme segment est constitué de nucléosides d'anomerie alpha. Préférentiellement, l'oligonucléotide marqué selon l'invention est caractérisé en ce que le 5 fluorophore est à une extrémité dudit oligonucléotide et l'extincteur est à l'autre extrémité dudit oligonucléotide. Préférentiellement, ledit fluorophore est une fluoresceine. Préférentiellement, ledit extincteur est le dabsyl. Préférentiellement, ledit premier segment comprend de 3 à 8 nucléotides, ledit deuxième 10 segment comprend de 10 à 35 nucléotides, et ledit troisième segment, lorsqu'il est présent comprend de 3 à 8 nucléotides. L'invention concerne également l'utilisation d'un oligonucléotide comprenant au moins un nucléoside d'anomérie alpha pour bloquer une activité 5' nucléase d'une enzyme polymérase et/ou pour bloquer une activité RNAseH. De telles utilisations sont très 15 pertinentes puisqu'on peut ainsi détecter une séquence cible par l'utilisation de sondes de type "molecular beacon" tout en évitant le clivage de celles-ci par l'activité 5' nucléase d'une enzyme polymérase lors d'une Réaction de Polymérisation en Chaîne ou lors de mesures en end-point post-amplification, ou par l'activité nucléase d'une RNAse H, notamment en NASBA, lors de mesures en end point . 20 L'invention concerne également un procédé pour détecter un matériel nucléique dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a) on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique, b) on amplifie le matériel nucléique pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique 25 c) on utilise, simultanément à l'étape b) ou postérieurement à l'étape b), au moins un oligonucléotide marqué selon l'invention d) on détecte la présence desdits amplicons 2906532 5 Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on amplifie le matériel nucléique par PCR. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on amplifie le matériel nucléique par NASBA. 5 Les définitions suivantes permettront de mieux comprendre l'invention. Au sens de la présente invention, on entend par amont , une région située du coté de l'extrémité 5' de l'acide nucléique ou de la séquence polynucléotidique, et par aval une région située du coté de l'extrémité 3' dudit acide nucléique ou de ladite région 10 polynucléotidique. Les ternies fragment nucléotidique, fragments d'acide nucléique, segment nucléotidique, segment d'acide nucléique, séquence nucléotidique, séquence d'acide nucléique, ou oligonucléotide, désignent un fragment d'ADN ou d'ARN naturel, un polynucléotide naturel ou de synthèse, un fragment d'ADN ou d'ARN de synthèse non modifiée ou 15 comprenant au moins une base modifiée telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycitidine, la diméthylamino-5-desoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino 2,6 purine, la bromo 5 désoxyuridine, la pseudouridine, la pseudoisocytidine, ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Chacune des modifications peut être prise en combinaison. Par oligonucléotide marqué, ou sonde, on entend un enchaînement de nucléosides, 20 comprenant en outre au moins une molécule permettant la détection dudit oligonucléotide. Cet oligonucléotide peut être notamment une sonde de détection agissant par reconnaissance moléculaire. Par sonde de détection agissant par reconnaissance moléculaire, on entend une séquence nucléique de 10 à 100 motifs nucléotidiques, notamment de 15 à 45 motifs nucléotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans 25 des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence nucléique cible et émettant un signal lors de l'hybridation de la sonde sur la séquence nucléique cible. La sonde de détection peut être notamment une sonde de détection molecular beacon telle que décrite par Tyagi & Kramer (Nature Biotech, 1996, 14 :303-308). Ces 2906532 6 molecular beacons deviennent fluorescentes lors de l'hybridation. Elles possèdent une structure de type tige-boucle et contiennent un fluorophore et un groupe quencher . La fixation de la séquence de boucle spécifique avec sa séquence complémentaire d'acide nucléique cible provoque un déroulement de la tige et l'émission d'un signal fluorescent lors 5 de l'excitation à la longueur d'onde qui convient. La sonde de détection peut être notamment une sonde intégrée dans des amorces ou primers du type Scorpion (Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 19 3752-3761)ou Amplifluor ( Genome Research Vol 1 163-169, 2001 Myakishev M. et al). 10 Les Amplifluor sont des séquences nucléotidiques qui possèdent du côté 5' une séquence avec une structure tige-boucle, avec un fluorophore à l'extrémité 5', et un "quencher" de type Dabsyl à l'autre extrémité de la structure. Du côté 3', les Amplifluor possèdent une séquence qui est complémentaire d'une séquence de la cible et qui agit en tant qu'amorce lors de la réaction d'amplification. 15 Les Scorpions sont des séquences qui possèdent du côté 5' une séquence avec une structure tige-boucle avec un "quencher" à une extrémité de la dite structure et un fluorophore à l'autre extrémité de la dite structure. Du côté 3', les Scorpions possèdent une séquence qui est complémentaire d'une séquence de la cible et qui agit en tant qu'amorce lors de la réaction d'amplification. Dans le mode classique des Scorpions, un 20 espaceur , situé entre la séquence amorce et la séquence tige-boucle permet d'empêcher la reconnaissance de la séquence tige-boucle par la polymerase. Cet espaceur devient optionnel si les Scorpions sont réalisés selon l'invention. Au sens de la présente invention, on entend par fluorophore une molécule qui émet un 25 signal de fluorescence entre 500 et 700nm quand elle est excitée par de la lumière à une longueur d'onde qui convient (ou entre 450 et 650 nm). Le fluorophore peut être notamment une rhodamine ou un dérivé tel que Texas Red, une fluorescéine ou un dérivé, tel que la 5 bromométhyl-fluorescéine, un fluorophore de la famille des Alexa tels que l'Alexa532 et l'Alexa647, Alexa 405, Alexa 700, Alexa 680 , ou tout autre fluorophore 2906532 7 qui convienne en fonction de l'appareil de mesure utilisé. Les fluorophores disponibles pour les sondes de détection sont très variés et connus de l'homme du métier. Au sens de la présente invention, on entend par fluorescéine une molécule chimique aromatique qui émet un signal de fluorescence avec un maximum d'émission autour de 530 5 nm, quand elle est excitée par de la lumière à une longueur d'onde autour de 495 nm. Au sens de la présente invention, on entend par extincteur (ou ""quencher"") une molécule qui interfère avec la fluorescence émise par un fluorophore. Cet extincteur est notamment choisi parmi des molécules aromatiques non fluorescentes, pour éviter des émissions parasites. Préférentiellement, le dit extincteur est un Dabsyl ou un Dabcyl ou 10 un Black hole quencherTM . Le Dabcyl, le Dabsyl et les Black hole quencherTM sont des molécules aromatiques non fluorescentes qui empêchent l'émission de fluorescence quand elles se trouvent physiquement à proximité d'un fluorophore, ou par FRET. Par nucléoside d'anomérie alpha ou alpha nucléosides, ou nucléosides alpha, on entend des déoxynucléosides à configuration anomérique non naturelle alpha, dans lequel la base 15 azotée portée par le carbone anomérique du deoxyribose est située en dessous du plan au lieu d'être en dessus du plan comme dans le cas des nucléosides beta. Préférentiellement, les nucléotides alpha sont ceux décrits dans la demande WO 88/04301. Par extrémité , on entend le point de départ et le point de terminaison de la synthèse d'un oligonucléotide généralement définis par le numéro porté par les hydroxyles libres 20 portés par le premier ou le dernier nucléoside soit 3' ou 5'. Il est entendu que par un choix approprié des unités d'élongation (les phosphoramidites des nucléosides alpha ou beta), on peut synthétiser un oligonucléotide dans le sens 3' vers 5' ou l'inverse et voire alterner pendant la synthèse le sens de l'élongation. Ceci conduit à des oligonucléotides portant des extrémités 3'-5, 5'-3' ou 3'-3', 5'-5'. 25 Par premier segment , on entend une séquence nucléotidique qui peut être complémentaire et de polarité adaptée audit troisième segment lors de la présence de ce dernier. Par deuxième segment , on entend une séquence nucléotidique complémentaire et de polarité adaptée à la séquence de la cible. 2906532 8 Par troisième segment , on entend une séquence nucléotidique complémentaire et de polarité adaptée audit premier segment. On parle également de parties tige pour lesdits premier et troisième segment, et de partie boucle pour ledit deuxième segment. Ce mode de réalisation particulier permet 5 d'obtenir un oligonucléotide marqué de type molecular beacons . Par séquence ou région capable de s'hybrider sur une autre séquence/région, ou séquence complémentaire, on entend une séquence ou une région pouvant s'hybrider sur une autre séquence/région dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. On parle également de séquences/régions complémentaires. 10 Une séquence ou région strictement complémentaire d'une autre est une séquence dans laquelle chacune des bases peut s'apparier avec une base de l'autre séquence, sans mésappariement. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogènes 15 stables et spécifiques. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction 20 des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes d'hybridation utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être 25 déterminées par l'homme du métier. Par polarité , on entend l'orientation de la séquence nucléotidique, 5' vers 3' ou 3' vers 5', par rapport à sa séquence complémentaire. Ainsi des segments peuvent être orientés de façon : 2906532 9 ^ antiparallèle : c'est le cas d'un oligonucléotide de configuration naturelle 13 et de sa cible de configuration naturelle 13? ou c'est le cas d'un oligonucléotide de configuration non naturelle a et de sa cible de configuration non naturelle a ? ^ parallèle : c'est le ces d'un oligonucléotide de configuration non naturelle a et de 5 sa cible de configuration naturelle ?En fonction de ces règles de polarité, on peut obtenir des oligonucléotides 5'-3', 3'-3' ou 5'-5' qui sont synthétisés par l'homme du métier à partir de molécules adaptées. Par enzyme polymérase , on entend une enzyme capable de synthétiser un fragment d'ADN ou d' ARN complémentaire à partir d'une matrice d'acide nucléique et d'un 10 oligonucléotide initiateur (ou primer). Les enzymes polymérase ont parfois une activité nucléase qui conduit à la dégradation des fragments d'acides nucléiques qui s'hybrident sur la cible en cours de copie : bloquer cette activité est alors très pertinent dans une approche en temps réel car le signal enregistré est dû uniquement à la reconnaissance moléculaire et non à une dégradation enzymatique. 15 Au sens de la présente invention, on entend par matériel nucléique , une séquence d'acides nucléiques telle que une séquence d'acides désoxyribonucléiques (ADN) ou d'acides ribonucléiques (ARN). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel nucléique comprend une séquence d'acides désoxyribonucléiques. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel nucléique est extrait d'un échantillon 20 biologique prélevé chez un patient. Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique , tout échantillon susceptible de contenir un matériel nucléique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être prélevé chez un patient et peut être notamment un échantillon de tissus, de sang, de sérum, de salive, de cellules circulantes du patient. Cet échantillon peut 25 également être un échantillon alimentaire. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Au sens de la présente invention, on entend par séquence cible , une séquence nucléotidique dont au moins une partie de l'enchaînement en motifs nucléotidiques est 2906532 10 spécifique et complémentaire de la séquence nucléotidique de la sonde de détection utilisée. Au sens de la présente invention, lors de l'étape a) on extrait le matériel nucléique d'un 5 échantillon biologique par tout protocole connu de l'homme du métier. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléiques peut être réalisée par une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afm de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des cellules (comme des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse 10 telles que décrite dans les demandes de brevet WO 00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, WO 99/53304 sur la lyse électrique, et WO 99/15321 sur la lyse mécanique. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels 15 que les sels de guanidium (US 5,234,809). Cette étape de lyse peut également être suivie d'une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adapté à la purification d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques 20 éventuellement revêtues d' oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant 25 de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet WO 97/45202 et WO 99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n 28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep Silica, Promega: MagneSilTM Paramagnetic particles). D'autres 2906532 11 méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-Agarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société 5 Xtrana: matrice Xtra-BindTM) Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement l'ADN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter l'ADN avec de l'alcool 70%. L'ADN peut alors être culoté par centrifugation, lavé et remis en suspension. 10 Au sens de la présente invention, l' étape b) est un processus générant de multiples copies (ou amplicons) d'une séquence nucléique par l'action d'au moins une enzyme polymérase. Au sens de la présente invention, on entend par amplicons les copies de la séquence cible obtenues lors d'une réaction d'amplification enzymatique. 15 Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on amplifie le matériel nucléique par PCR et l'étape b) est une succession de cycles comprenant les étapes suivantes : o la dénaturation de la séquence cible afin d'obtenir deux brins cibles d'ADN complémentaires, ou de destructurer le brin cible d'ARN, 20 o l'hybridation de chacun des brins cibles, obtenus lors de l'étape de dénaturation précédente avec au moins une amorce d'amplification , o la formation à partir des amorces d'amplification des brins complémentaires aux brins sur lesquels elles sont hybridées en présence d'une enzyme polymérase et de nucléosides triphosphate 25 ce cycle étant répété un nombre de fois déterminé pour obtenir la séquence cible dans une concentration suffisante pour permettre sa détection. Selon ce mode de réalisation, les étapes b) et c) sont effectuées en même temps ou l'une après l'autre. 2906532 12 Lorsque les étapes b) et c) sont effectuées en même temps, ce mode de réalisation est préférentiellement mise en oeuvre par PCR en temps réel qui regroupe en une étape unique la technique d'amplification PCR et la détection, et qui fait appel notamment à des molecular beacons . La réaction PCR intervient dans le tube, produisant des amplicons 5 avec lequel les molecular beacons spécifiques peuvent s'hybrider pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ADN est mesurée en temps réel par contrôle du signal dans un lecteur fluorescent, pendant l'étape d'hybridation. L'utilisation d'oligonucléotides marqués selon la présente invention permet d'éviter que les sondes de détection soient dégradées par l'enzyme d'amplification (par exemple la Taq Polymérase), 10 ce qui augmente la sensibilité de la détection et améliore les performances de la technique. Lorsque les étapes b) et c) sont effectuées l'une après l'autre, la réaction PCR intervient dans le tube, produisant des amplicons. A la fm de cette étape d'amplification, les molecular beacons sont ajoutés au milieu de réaction, et peuvent s'hybrider pour donner un signal fluorescent. L'utilisation d'oligonucléotides marqués selon la présente 15 invention permet d'éviter que les sondes de détection soient dégradées par l'enzyme polymérase thermostable d'amplification, qui reste de manière résiduelle dans le tube de réaction, ce qui augmente la sensibilité de la détection et améliore les performances de la technique. 20 Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b), on amplifie le matériel nucléique par NASBA. Selon ce mode de réalisation, les étapes b) et c) sont préférentiellement effectuées l'une après l'autre. A la fm de l'étape d'amplification, les molecular beacons sont ajoutés au milieu de réaction, et peuvent s'hybrider pour donner un signal fluorescent. L'utilisation 25 d'oligonucléotides marqués selon la présente invention permet d'éviter que les sondes de détection soient dégradées par l'enzyme RNAseH, qui reste de manière résiduelle dans le tube de réaction, ce qui augmente la sensibilité de la détection et améliore les performances de la technique. 2906532 13 L cas d'hybridation est une augmentation exponentielle du signal de fluorescence à 40 C à partir du moment ou le nombre d'amplicons augmente. En cas de clivage, ai attend une augmentation exponentielle de la fluorescence à 95 C parallèle à 20 celle observée pour l'hybridation. Les augmentations ou diminutions linéaires du signal ne correspondent pas à une quelconque détection de l'amplicon, car celui ci est généré de façon exponentielle. Les profils à 40 C démontraient que les sondes nucléotidiques modifiées A, B et C ainsi que le contrôle non modifié MB détectaient spécifiquement la présence des amplicons issus 25 de la réaction enzymatique d'amplification in vitro. Les profils à 95 C démontraient que les sondes MB et A étaient clivées spécifiquement pendant la réaction d'amplification alors que les sondes modifiées B et C n'étaient pas clivées dans les mêmes conditions. 2906532 21 Les figures 5 à 7 présentent le comparatif des augmentations de fluorescence à 95 C pour la sonde non modifiée MB et, respectivement, pour la sonde modifiée oligonucléotide A , oligonucléotide B et oligonucléotide C . On pouvait observer une augmentation spécifique de la fluorescence seulement pour la sonde MB et la sonde oligonucleotide 5 A , quand l'amplification a lieu. Quand l'amplification n'a pas lieu (contrôles négatifs, c- ) et quand le deuxième segment dit boucle de la sonde nucleotidique est modifié (oligonucléotides B et C), il n'y a pas de clivage par l'activité 5'-nuclease de la Taq Polymerase, et il n'y a donc pas d'augmentation de fluorescence par rapport à l'échantillon négatif. 10 Conclusion: Les molecular beacons modifiés dans le deuxième segment dit boucle selon l'invention (oligonucléotides B et C) s'hybridaient spécifiquement avec les amplicons issus du cyclage sur lightcycler, donnant lieu à une détection en temps réel comparable à celle obtenue avec le molecular beacon non modifié MB et avec le molecular beacon modifié 15 dans la tige (oligonucléotide A). Les molecular beacons modifiés dans la boucle n'étaient pas clivés par l'activité 5'-nuclease de la Taq Polymerase, contrairement au molecular beacon contrôle MB et au molecular beacon modifié sur la tige oligonucléotide A . 20 Exemple 3: étude de la spécificité de l'hybridation à leur séquence cible des oligonucléotides selon l'invention (figure 8) Objectif : Le but de l'expérience est de vérifier si des beacons comportant des nucléotides de type 25 alpha sont plus spécifiques pour leur cible que des beacons composés uniquement de nucléotides de type bêta. La spécificité peut être mesurée par le calcul de la différence de Tm (ici ATm) entre une sonde en solution avec sa cible parfaitement complémentaire et cette sonde en solution avec une cible comportant une variation d'un nucléotide dans sa séquence (ici mismatch). 20 2906532 22 Les ATm seront calculés pour chaque sonde et pour chaque séquence complémentaire étudiée. Dans notre cas la spécificité sera mesurée par la valeur des ATm calculés avec les sondes Oligonucléotide A, B et C et quatre séquences complémentaires dont une est parfaitement 5 complémentaire du deuxième segment des sondes et les trois autres comportent un mismatch C, T ou A par rapport au complémentaire parfait. Design expérimental Les sequences des sondes et des complémentaires utilisés sont decrites dans le tableau 1 ci 10 dessous. La fluorescence de solutions contenant les sondes, en présence de cible parfaitement complémentaire ou avec un mismatch, a été mesurée en fonction de la température entre 69 et 27 C dans un spectrofluorimètre thermoanalyseur EasyQ (bioMérieux bv, Boxtel, NL).. Toutes les mesures ont été effectuées sur des solutions de 20 L de volume à une 15 concentration de la sonde de 100nM , et à la concentration en cible de 1 M, dans une solution aqueuse tamponnée du Nasba Basic kit (bioMérieux bv, Boxtel, NL) . SEQ ID Noms Séquences 9 MB fam-CGA TG-C AAC TGC AGT GACACC CTC ATC ATT GCA-CAT CG-dabsyl 10 Oligo A fam-CGA TG-C AAC TGC AGT GAC ACC CTC ATC ATT GCA-CAT CG-dabsyl 11 Oligo B fam-GCT ACACG TTA CTA CTC CCA CAG TGA CGT CAA C -GT AGC-dabsyl 12 Oligo C fam-GCTAC-ACG TTA CTA CTC CCA CAG TGA CGT CAA CùGTACG-dabsyl 13 comp G TT ATG ATG AGG GTG TCA CTG CATI 14 comp C TT ATG ATG AGG CTG TCA CTG CAT T 15 comp T TT ATG ATG AGG TTG TCA CTG CATI 16 comp A TT ATG ATG AGG ATG TCA CTG CAT T Tableau 1 : Séquences des sondes et complémentaires utilisés. En italique gras : nucléotides alpha ; Souligné : mismatch. Toutes les séquences sont écrites dans le sens 5'-3'. Résultats Les profils de dénaturation thermique obtenus sont représentés dans la figure 8. La Tm correspond au maximum de la première dérivée de chaque profil. Les valeurs de Tm obtenus sont indiqués dans le tableau 2 ci dessous. 25 2906532 23 Tm en C MB Oligonucléotide A Oligonucléotide B Oligonucléotide C comp G 56,9 56,4 44,3 42,3 comp C 44,9 (-12,0) 41,8 (-14,6) REVENDICATIONS 1) Oligonucléotide marqué comprenant un premier segment nucléotidique, un deuxième segment nucléotidique, complémentaire d'une séquence cible, et un troisième segment nucléotidique, complémentaire dudit premier segment nucléotidique, caractérisé en ce qu'il comprend un fluorophore, un extincteur et au moins un nucléoside d'anomérie alpha 2) Oligonucléotide marqué selon la revendication 1 caractérisé en ce que lesdits 10 premier et troisième segments sont de part et d'autre du deuxième segment. 3) Oligonucléotide marqué selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que ledit deuxième segment comprend au moins un nucléoside d'anomérie alpha. 15 4) Oligonucléotide marqué selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le fluorophore est à une extrémité dudit oligonucléotide et l'extincteur est à l'autre extrémité dudit oligonucléotide. 5) Oligonucléotide marqué selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 20 caractérisé en ce que ledit fluorophore est une fluoresceine. 6) Oligonucléotide marqué selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que ledit extincteur est le dabsyl. 25 7) Oligonucléotide marqué selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que ledit premier segment comprend de 3 à 8 nucléotides, ledit deuxième segment comprend de 10 à 35 nucléotides, et ledit troisième segment comprend de 3 à 8 nucléotides. 30 5 2906532 -28- 8) Procédé pour détecter un matériel nucléique dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a) on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique, b) on amplifie le matériel nucléique pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique c) on utilise, simultanément à l'étape b) ou postérieurement à l'étape b), au moins un oligonucléotide marqué tel que revendiqué dans les revendications 1 à 7 d) on détecte la présence desdits amplicons