FR 2902440 A1 20071221 FR 0605430 A 20060619 METHODE DE DETECTION ET DE DENOMBREMENT DES CELLULES EN CYTODIERESE. La présente invention concerne le domaine de la biologie, en particulier de la santé, en fournissant une méthode de détection et de dénombrement de cellules en cytodiérèse. La présente invention fournit aussi une méthode de tri des cellules en cytodiérèse, ainsi qu'une méthode de criblage d'agent capable d'interférer avec la cytodiérèse, i.e. visant à inhiber ou activer la division cellulaire, pour des applications dans les domaines de la thérapie antitumorale, l'infectiologie, l'agro-alimentaire ou l'agronomie. La cytodiérèse (ou cytokinèse) est une étape clé dans le processus de prolifération cellulaire (Field C et al. Cytokinesis in eukaryotes: a mechanistic comparison. Curr Opin Cell Biol 1999;11(1):68-80. Glotzer M. The molecular requirements for cytokinesis. Science 2005;307(5716):1735-9. Guertin DA et al. Cytokinesis in eukaryotes. Microbiol Mol Biol Rev 2002;66(2):155-78. Robinson DN et Spudich JA. Mechanics and regulation of cytokinesis. Curr Opin Cell Biol 2004;16(2):182-8. Balasubramanian MK et al. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol 2004;14(18):R806-18.). Certains types cellulaires présentent une absence physiologique de cytodiérèse (notamment les hépatocytes, les cellules pancréatiques, les mégacaryocytes, les neurones). En revanche, dans la grande majorité des cellules, la perturbation de la cytodiérèse entraîne soit la mort cellulaire, soit des anomalies de la ploïdie qui sont caractéristiques de la transformation cancéreuse. Les cellules cancéreuses présentent en effet très souvent des anomalies chromosomiques qui portent sur leur structure ou sur leur nombre. L'anomalie de nombre de chromosomes (aussi appelée aneuploïdie) est dans de très nombreux cas un facteur de mauvais pronostic. L'aneuploïdie est par exemple associée à un mauvais pronostic dans les cancers du sein et les cancers colorectaux (Bottger et al., 1993, Cancer ; 72 :3579-87). Des cellules ayant échoué la cytodiérèse sont génétiquement instables et peuvent ainsi se transformer (Fujiwara, T et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells., Nature 2005 ; 437 :1043-1047). Le cycle cellulaire est divisé en plusieurs phases : - la phase G1, première phase de croissance, - la phase S durant laquelle le matériel génétique est répliqué, - la phase G2, seconde phase de croissance cellulaire, - et la phase M, durant laquelle a lieu la mitose. La mitose (figure 1) permet la division cellulaire : lors de la division mitotique, la cellule mère donne naissance à deux cellules filles génétiquement identiques (Mitchison TJ, Salmon ED. Mitosis: a history of division. Nat Cell Biol 2001;3(1):E17-21.). La mitose comprend quatre phases majeures : la prophase, la métaphase, l'anaphase et la télophase. Les étapes de prophase et métaphase sont considérées comme des étapes précoces de la mitose, tandis que les étapes d'anaphase et télophase sont considérées comme des étapes tardives de la mitose. La cytodiérèse, étape finale du cycle cellulaire, est initiée durant l'anaphase et a lieu après la télophase. Au cours de la prophase, les chromatides soeurs se condensent et forment les chromosomes, tandis que les deux centrosomes fils prennent position aux deux pôles de la cellule. La prophase s'achève par la dissolution de l'enveloppe nucléaire. Le cytosquelette de microtubules se réorganise pour former le fuseau mitotique. Au cours de la métaphase, les microtubules alignent les chromosomes sur le plan équatorial de la cellule, pour former la plaque équatoriale. Puis, lors de l'anaphase, les chromatides soeurs se séparent et migrent en sens opposé vers les deux pôles de la cellule. Enfin, lors de la télophase, une enveloppe nucléaire commence à se reformer à chaque pôle de la cellule autour des chromatides soeurs qui se décondensent. Lors de l'étape finale du cycle de division cellulaire, la cytodiérèse, un sillon de division formé dès l'anaphase dans un plan perpendiculaire à l'axe du fuseau mitotique, sépare la cellule en deux cellules filles identiques. Le sillon de division se resserre jusqu'à former un pont cytoplasmique contenant un corps intermédiaire, formant un passage étroit entre les deux cellules filles, riche en microtubules. Lorsque le pont cytoplasmique sera clivé en début de G1, les cellules filles pourront se séparer complètement. L'inhibition ou la perturbation de la cytodiérèse peuvent produire des cellules binucléées, ou entraîner une mauvaise ségrégation des chromosomes, conduisant à la formation de cellules filles polyploïdes ou aneuploïdes. Pour mieux comprendre moléculairement le mécanisme de cytodiérèse et évaluer l'effet thérapeutique de nouveaux agents sur l'inhibition ou l'activation d'un tel mécanisme, il est nécessaire de disposer d'une méthode permettant de détecter et de dénombrer les cellules en cytodiérèse. A l'heure actuelle, le seul moyen disponible pour détecter des cellules en cytodiérèse repose sur la morphologie des cellules analysées individuellement par microscopie. Les cellules peuvent être vivantes en culture ou in vivo, ou fixées. Par exemple, des cellules sont fixées puis l'ADN est coloré et/ou un marquage de protéines caractéristiques de la cytodiérèse est réalisé. Après photographie de plusieurs champs microscopiques (au minimum 5), les cellules en cytodiérèse sont alors comptées manuellement sur un nombre significatif de cellule (au minimum 500 cellules). La réalisation de film de cellules vivantes a plus récemment permis le suivi en temps réel de la cytodiérèse. Cette technique repose sur la vidéo-microscopie en temps réel en chambre de culture ou imagerie intra-vitale d'un organe sur organisme vivant. Cette technique implique de posséder un équipement de vidéo-microscopie dédié à cette analyse puisqu'un seul échantillon cellulaire peut être filmé à chaque fois, pendant 2 à 48h, de monter manuellement le film et de visionner le film pour dénombrer les évènements de cytodiérèse au cours du temps. Les techniques disponibles à l'heure actuelle ne permettent pas de réaliser facilement et rapidement la détection et le dénombrement de cellules en cytodiérèse. En effet, le débit d'analyse des échantillons dépend de la disponibilité des microscopes et de la vitesse d'analyse manuelle. De plus, la signification statistique des valeurs obtenues (pourcentage de cellules en cytodiérèse) est limitée par la taille de l'échantillon cellulaire analysé (nombre total de cellules filmées ou analysées). La demanderesse a donc cherché à mettre au point une autre méthode de détection et de dénombrement de cellules en cytodiérèse qui soit plus facilement et rapidement mise en œuvre, et qui permette de réaliser une analyse d'échantillons en série de manière industrielle. La demanderesse a trouvé qu'après coloration quantitative de l'ADN par un colorant fluorescent, les cellules en cytodiérèse présentent un signal de fluorescence caractéristique, qui définit la population C (figure 2). 10 15 20 Le signal de fluorescence comprend deux paramètres qui 25 correspondent aux composantes spatio-temporelles du signal : - l'aire sous la courbe - la hauteur du pic. Au sens de la présente invention, l'aire sous la courbe 30 correspond à l'intensité du signal de fluorescence pour une cellule donnée. L'aire sous la courbe correspond au contenu en ADN des cellules ou DNA index (DI), et est égale à 1 lorsque les cellules sont en phase GO ou G1 du cycle cellulaire ou est égale à 2 lorsque les cellules sont en phase G2 ou M du cycle cellulaire, i.e. lorsqu'elles ont dupliqué leur ADN. La hauteur du pic correspond à la hauteur maximale de l'intensité du signal de fluorescence pour une cellule donnée à un instant t. La hauteur du pic correspond au contenu en ADN des cellules ou DNA index (DI), et est égale à 1 lorsque les cellules sont en phase GO ou G1 du cycle cellulaire ou est égale à 2 lorsque les cellules sont en phase G2 ou M du cycle cellulaire, i.e. lorsqu'elles ont dupliqué leur ADN. La demanderesse a ainsi observé que de manière caractéristique les cellules en cytodiérèse présentent une aire sous la courbe similaire à celle de cellules en phase G2 ou M du cycle cellulaire, i.e. DI=2 et une hauteur de pic similaire à celle de cellules en phase GO/G1, i.e. DI=1. En effet, les cellules en cytodiérèse correspondent à deux cellules filles qui ont chacune un contenu en ADN DI=1 puisqu'elles sortent de mitose ; en revanche, ces deux cellules filles sont toujours reliées entre elles par un pont, ce qui résulte en deux courbes de fluorescence très proches correspondant à DI=1, qui sont confondues en une seule courbe de fluorescence dont l'aire sous la courbe est équivalente à DI=2. Ainsi, la présente invention a pour but de proposer une méthode alternative de détection et de dénombrement de cellules en cytodièrèse, qui permet d'analyser en série un grand nombre d'échantillons et d'obtenir des résultats quantitatifs par mesure du pourcentage et/ou du nombre de cellules en cytodiérèse dans l'échantillon cellulaire analysé. La présente invention a aussi pour but de proposer une méthode de tri des cellules en cytodiérèse, à des fins d'analyse cellulaire ou moléculaire. Enfin, la présente invention a également pour but de proposer une méthode de criblage d'agents capables d'accélérer ou de ralentir, d'activer ou d'inhiber la cytodiérèse, dans le but d'ouvrir de nouvelles pistes de recherche en cancérologie, biologie, infectiologie ou agro-alimentaire. La présente invention a plus particulièrement pour objet une méthode de détection et de dénombrement de cellules en cytodiérèse, comprenant : la fixation des cellules et optionnellement la perméabilisation des cellules, - la coloration quantitative de l'ADN des cellules par colorant fluorescent vital ou non, la mesure par tout moyen approprié de l'intensité de fluorescence du pic d'ADN et 20 de l'aire sous la courbe, le dénombrement des cellules en cytodiérèse (population C sur la figure 2) selon les caractéristiques suivantes : les cellules en cytodiérèse présentent une aire sous la 25 courbe similaire à celle de cellules en phase G2 ou M du cycle cellulaire et un pic de fluorescence similaire à celui des cellules en phase GO ou G1 du cycle cellulaire. 30 Au sens de la présente invention, on entend par détection la mesure de l'intensité de fluorescence du pic d'ADN et de l'aire sous la courbe de cellules dont l'ADN a préalablement été coloré. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape de fixation et optionnellement de perméabilisation des cellules est réalisée par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier. La perméabilisation est requise uniquement si la coloration ultérieure de l'ADN est effectuée avec un colorant auquel la cellule est imperméable (notamment l'iodure de propidium). Dans un premier mode de réalisation, les cellules sont fixées par un agent pontant comme le formaldéhyde, puis perméabilisées par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier, par exemple par un détergent comme le triton X-1000. Dans un deuxième mode de réalisation, les cellules sont perméabilisées et fixées en même temps par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier, par exemple la perméabilisation et fixation par un solvant comme l'éthanol à 70%. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules sont dans un premier temps fixées et optionnellement perméabilisées puis la coloration de l'ADN des cellules est réalisée dans un second temps, notamment à l'aide d'un intercalant fluorescent (par exemple l'iodure de propidium, le bromure d'éthidium), d'un colorant liant les bases A :T (par exemple le Hoechst 33342 ou 33258 ) ou les bases G :C (par exemple la 7-amino-actinomycine D), d'une cyanine perméante (par exemple la série des SYT00) ou imperméante (par exemple le TOTO-1 ). Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules vivantes sont colorées à l'aide d'un colorant vital de l'ADN, par exemple le Hoechst 33342 , puis elles sont fixées par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier. La perméabilisation n'est pas indispensable Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la mesure de l'intensité de fluorescence du pic d'ADN et de l'aire sous la courbe est réalisée à l'aide d'un cytomètre en flux, et le dénombrement des cellules en cytodiérèse : détermination du pourcentage et/ou du nombre de cellules en cytodiérèse, est réalisé à l'aide d'un logiciel d'analyse approprié au cytomètre en flux, notamment CellQuest , CellQuestPro , Expo32 . Selon l'invention, la méthode permet de détecter toute cellule eucaryote en cytodiérèse, notamment les cellules animales, les protoplastes et les organismes unicellulaires. Ladite méthode est notamment applicable à des cellules en culture adhérentes ou en suspension, ou à des cellules primaires dissociées à partir de tissus. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite méthode comprend en outre une étape préliminaire de purification des cellules mitotiques. Par étape préliminaire, on entend préalablement à toute autre étape de la méthode selon l'invention telle que décrite précédemment. Les cellules mitotiques obtenues à la suite de cette étape sont ensuite remises en culture jusqu'à la cytodiérèse pendant un laps de temps variable, afin de suivre la sortie de mitose, la cytodiérèse et le retour en interphase, de préférence de 0 à 360 minutes, plus préférentiellement de 0 à 180 minutes, et très préférentiellement de 30 à 90 minutes. Dans un premier mode de réalisation, la purification 30 des cellules mitotiques est réalisée par élutriation, qui est une méthode de centrifugation à contre-courant. Dans un second mode de réalisation, la purification des cellules mitotiques est réalisée par tri au cytomètre en flux, après coloration vitale de l'ADN, par exemple par le Hoechst 33342 . Dans un troisième mode de réalisation, notamment dans le cas d'une culture de cellules adhérentes, les cellules mitotiques sont séparées des cellules interphasiques, par exemple par détachement des cellules en mitose par chocs sur les boites ( mitotic shake-off ). Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite méthode comprend en outre une étape préliminaire d'enrichissement de la culture cellulaire en cellules mitotiques. Cette étape d'enrichissement en cellules mitotiques peut optionnellement être suivie d'une étape de purification des cellules mitotiques. L'enrichissement en cellules mitotiques est réalisé par synchronisation des cellules en métaphase de mitose. Cette synchronisation est obtenue par activation du point de contrôle mitotique (encore appelé point de contrôle du fuseau). Cette activation peut être obtenue par addition pendant 2 à 20h selon le type de cellules d'un inhibiteur de la polymérisation des microtubules, notamment le nocodazole, la colchicine, ou par un inhibiteur de la kinésine mitotique Eg5 (notamment le monastrol ), dans des conditions réversibles. Par condition réversible, on entend au sens de la présente invention qu'en cas d'absence de l'inhibiteur ou d'arrêt de l'ajout de l'inhibiteur les cellules peuvent reprendre leur mitose. Après l'étape d'enrichissement de la culture en cellules mitotiques par synchronisation des cellules en métaphase de mitose, les cellules mitotiques peuvent être purifiées comme décrit précédemment. Les cellules mitotiques enrichies et optionnellement purifiées sont ensuite remises en culture pendant un laps de temps variable, afin de suivre la sortie de mitose, la cytodiérèse et le retour en interphase, de préférence pendant 0 à 360 minutes, plus préférentiellement pendant 0 à 180 minutes, et très préférentiellement pendant 90 minutes. Cette étape d'enrichissement en cellules mitotiques par synchronisation des cellules en métaphase de mitose, suivie d'une étape optionnelle de purification des cellules mitotiques et de remise en culture de ces cellules permet ainsi d'enrichir la culture cellulaire en cellules en cytodiérèse. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite méthode comprend en outre une étape d'immunomarquage avec des marqueurs mitotiques sélectifs ou des marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse, préalablement, en même temps ou après l'étape de coloration de l'ADN. Ces marqueurs mitotiques sélectifs sont notamment cycline B1, MPM2 ou phospho-histone H3 (Juan G et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry 1998;32(2):71-7). Les marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse sont notamment les protéines présentes dans le complexe de protéines passagères, telles que Aurora B, survivine, Polo-like kinase et les kinésines associées MKLP1 et MKLP2 (Pines J. Mitosis: a matter of getting rid of the right protein at the right time. Trends Oeil Biol 2005. Clute P, Pines J. Temporal and spatial control of cyclin B1 destruction in metaphase. Nat Cell Biol 1999;1(2):82-7. Stewart S, Fang G. Destruction box-dependent degradation of aurora B is mediated by the anaphase-promoting complex/cyclosome and Cdhl. Cancer Res 2005;65(19):8730-5). La présence ou l'absence des marqueurs mitotiques sélectifs et des marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse permet en effet d'exclure les cellules en phase G1 ou en phase de mitose précoce (prophase, métaphase) ou tardive (anaphase, télophase) qui contaminent la population de cellules en cytodiérèse. Les marqueurs mitotiques présents dans les cellules en mitose mais pas dans les cellules en cytodiérèse sont notamment cycline B1, MPM2 ou phospho-histone H3. Les marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse présents dans les cellules en mitose et dans les cellules en cytodiérèse mais pas dans les cellules en G1 sont notamment les protéines présentes dans le complexe de protéines passagères, comme Aurora B, survivine, Polo-like kinase. La présente invention a aussi pour objet de fournir une méthode de tri des cellules en cytodiérèse, ladite méthode comprenant à la suite des étapes de détection et de dénombrement des cellules en cytodiérèse telles que décrites précédemment, une étape de tri de la population de cellules en cytodiérèse à l'aide d'un trieur de cellules. Dans un mode de réalisation de l'invention, les cellules en cytodiérèse sont détectées et dénombrées par la méthode décrite précédemment, puis ces cellules sont triées à l'aide d'un trieur de cellules sur la base des signaux de fluorescence émis par la coloration de l'ADN et optionnellement par les marqueurs mitotiques sélectifs ou les marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse. Cette méthode permet d'obtenir une population de cellules comprenant en majorité soit des cellules en cytodiérèse, soit des cellules en mitose tardive. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cultures sont préalablement enrichies en cellules en cytodiérèse par synchronisation préalable en mitose comme décrit précédemment puis les cellules mitotiques sont purifiées comme décrit précédemment et cultivées jusqu'en cytodiérèse. Un marquage à l'aide de marqueurs mitotiques sélectifs ou de marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse est enfin optionnellement réalisé. L'enrichissement préalable de la culture en cellules mitotiques et la purification des cellules mitotiques permet d'éliminer une partie des cellules contaminantes préalablement à la coloration de l'ADN. L'utilisation de marqueurs sélectifs ou de marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse tels que décrits précédemment permet d'exclure au moment du tri cellulaire toute cellule qui n'est pas considérée comme étant une cellule en cytodiérèse. Ces deux étapes permettent ainsi d'obtenir une population de cellules triées comprenant plus de 90% de cellules en cytodiérèse. La présente invention a également pour objet de fournir une méthode de criblage d'agents capables d'accélérer ou de ralentir, d'activer ou d'inhiber la cytodiérèse, ladite méthode comprenant la culture de cellules dans un milieu adéquat en présence de l'agent à tester, et la détection et le dénombrement des cellules en cytodiérèse tel que décrit précédemment Aucune connaissance préliminaire de la ou des cible(s) moléculaire(s) des agents testés n'est nécessaire. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, une étape d'enrichissement en cellules mitotiques et une étape de purification des cellules mitotiques sont optionnellement préliminairement réalisées. Les cellules sont ensuite mises en culture dans un milieu adéquat en présence de l'agent à tester pendant un laps de temps variable, afin de suivre la sortie de mitose, la cytodiérèse et le retour en interphase. L'agent à tester peut être : un agent physique, notamment la température, les radiations ionisantes, les ultraviolets, les infrarouges, la pression ; un agent chimique, notamment des substances naturelles ou synthétiques, des espèces réactives de l'oxygène, des macromolécules ; un agent biologique, notamment un vecteur de transfert de gène, un agent pathogène comme un virus, une bactérie, un parasite eucaryote, un prion, un microorganisme. Une expérience de contrôle est aussi menée en parallèle 15 comprenant des cellules non traitées par l'agent ou traitées par le solvant de l'agent testé. Les différents paramètres de culture comme la durée, l'intensité/concentration du traitement et la cinétique d'analyse après remise en culture des cellules mitotiques sont à établir par l'homme du métier 20 en fonction du type de cellule utilisé et de l'agent testé. Les cellules sont ensuite récoltées puis fixées et optionnellement perméabilisées et l'ADN des cellules est coloré selon la méthode décrite précédemment. Optionnellement, une étape d'immunomarquage avec des marqueurs mitotiques 25 sélectifs ou des marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse peut être réalisée comme décrit précédemment. Enfin l'intensité de fluorescence des cellules est mesurée en cytométrie en flux selon la méthode décrite précédemment et le pourcentage et/ou le nombre de cellules en cytodiérèse est 30 déterminé. Cette méthode permet ainsi de tester si l'agent à tester perturbe la cytodiérèse. 10 La présente invention fournit ainsi une méthode de détection et de dénombrement des cellules en cytodiérèse, qui est facilement et rapidement mise en œuvre, qui permet une analyse quantitative, et qui permet une analyse en série d'un grand nombre d'échantillons à l'échelle industrielle. La présente invention fournit aussi une méthode de tri des cellules en cytodiérèse, qui permet d'obtenir une population fortement enrichie en cellules en cytodiérèse, ce qui facilite l'analyse cellulaire et moléculaire de ces cellules. Les cellules en cytodiérèse triées peuvent notamment être analysées in situ après collecte sur lame de microscopie, séchage, réhydratation, marquage spécifique (immunoenzymatique, immunofluorescence, hybridation in situ...) et observation au microscope, ou être lysées pour une analyse biochimique (transcriptome, protéome, lipidome...). La présente invention fournit également une méthode de criblage d'agents capables d'accélérer ou de ralentir, d'activer ou d'inhiber la cytodiérèse. De tels agents seraient intéressants en . - cancérologie : des activateurs ou inhibiteurs de la cytodiérèse pourraient enrichir le panel des substances anti-prolifératives ou pro-apoptotiques connues, biologie : des activateurs de la cytodiérèse pourraient favoriser la prolifération à l'état diploïde, in vitro ou in vivo, de cellules différenciées déficientes pour ce processus (hépatoblastes, hépatocytes, mégacaryocytes, cellules pancréatiques, cardiomyoblastes, cardiomyocytes, neurones, cellules souches, cellules épithéliales (notamment oesophage de Barrett...), - infectiologie : des activateurs ou inhibiteurs de la cytodiérèse pourraient enrichir le panel des substances anti-fongiques et anti-parasitaires, agro-alimentaire : des activateurs ou inhibiteurs de la cytodiérèse pourraient être présents dans certains composés ; considérés comme des agents carcinogènes potentiels, leur détection et leur identification grâce à la méthode proposée permettrait de les retirer avant leur mise sur le marché ou leur dissémination dans l'environnement, selon le principe de précaution . agronomie : en alternative à la colchicine, des inhibiteurs de la cytodiérèse appliqués à des cultures de protoplastes (index ADN, DI=1) pourraient permettre l'obtention de protoplastes polyploïdes (index ADN, DI=2), permettant de régénérer des plantes polyploïdes. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de détection, dénombrement et tri de cellules en cytodiérèse. Dans les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, il 20 sera fait référence aux figures en annexe : la figure 3 présente l'analyse en cytométrie en flux du pourcentage de cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire à différents temps, 25 la figure 4 présente l'analyse en cytométrie en flux du pourcentage de cellules en phases G1, M ou cytodiérèse avant et après tri cellulaire, - la figure 5 présente l'analyse en 30 microscopie du cytosquelette de microtubules dans les cellules mitotiques et dans les cellules en cytodiérèse 90 minutes après collecte et mise en culture des cellules mitotiques, la figure 6 présente l'analyse en microscopie du cytosquelette de microtubules au cours du cycle cellulaire, la figure 7 présente l'analyse en microscopie de la présence de a-tubuline et phospho-histone H3 dans les cellules en cytodiérèse, la figure 8 présente l'analyse de la présence de Cycline B1 et Aurora B dans les cellules mitotiques et dans les cellules en cytodiérèse par immunoblot. Exemples 1- Matériels et méthodes Culture cellulaire et synchronisation Les cellules HeLa ont été cultivées dans du DMEM (Gibco/BRL Inc Life Technoligies) supplémenté avec 10% de sérum de veau fétal et de la pénicilline-streptomycine (100 IU/mL et 100 pl/mL respectivement) à 37 C et 5% CO2. Pour synchroniser les cellules en métaphase, les cellules en croissance exponentielle ont été traitées pendant 16h avec 50 ng/ml de nocodazole (Sigma). Les cellules mitotiques ont été récupérées par choc sur les boites dans du PBS, lavées deux fois dans du PBS et de nouveau, cultivées pendant 0 à 180 minutes dans du DMEM complet en absence de nocodazole. Pour récupérer les cellules à chaque point de cinétique (0-90 min), les cellules ont été re-suspendues dans du milieu de culture par pipetage, de façon à dissocier les agrégats de cellules non adhérentes et à détacher de la plaque de culture les cellules ayant commencé à adhérer. Aux derniers points de cinétique, le milieu de culture contenant une minorité de cellules non adhérentes est enlevé et les cellules adhérentes sont détachées à l'aide de la trypsine. Les cellules contrôles asynchrones sont récupérées après détachement à la trypsine. Fixation cellulaire et coloration de l'ADN Pour les analyses de la progression du cycle cellulaire en cytométrie en flux, les cellules ont été centrifugées et le culot a été resuspendu dans 100 pL de milieu de culture complet avant fixation dans 2 mL d'éthanol 70% dans du PBS pendant au moins 30 min à -20 C. L'utilisation du milieu complet au lieu du PBS, pour resuspendre les cellules avant la fixation, est essentielle pour minimiser la formation de doublets et plus généralement d'agrégatscellulaires. Après fixation, les cellules ont été centrifugées et re-suspendues dans 1 mL de solution de marquage (PBS contenant soit 100 pg/mL de RNAse A (Sigma) et 40 pg/mL d'iodure de propidium, soit 1 pM de Hoechst 33258) et incubées pendant 30 min à température ambiante. Cytométrie en flux Les analyses et les tris ont été réalisés avec un cytomètre de flux Coulter Elite-ESP (Beckman-Coulter), en utilisant un laser argon émettant 15 mW à 488 nm et une largeur de faisceau de 86,9 pm. La fluorescence de l'iodure de propidium est collectée au travers d'un filtre à bande passante de 620 nm et affichée en échelle linéaire. Lorsque le Hoechst 33258 est utilisé, l'excitation est effectuée à l'aide d'un laser argon émettant 100 mW à 350 nm et une largeur de faisceau de 81,5 pm de laser argon refroidi par l'eau, la fluorescence émise est collectée au travers d'un filtre à bande passante de 450 nm. Les cellules sont triées selon plusieurs fenêtres du cycle cellulaire basées sur l'intensité de marquage de l'iodure de propidium ou du Hoechst. La fraction de mitose tardive et cytodiérèse (population C) est fenêtrée sur la base des composants spatio-temporels du signal de fluorescence, avec une valeur du pic d'ADN correspondant à l'index d'ADN (DI=1) versus une valeur intégrée de l'ADN correspondant à DI=2. On peut noter que la largeur du faisceau est similaire à la distance entre les noyaux de deux cellules filles durant la cytodiérèse. Microscopie à immunofluorescence Environ 2000 cellules de la population C décrite précédemment ont été triées directement sur des lames de microscope, séchées à l'air et preparées pour une détection immunofluorescente. Après rinçage dans du PBS, les cellules ont été incubées pendant 30 minutes avec 10% de sérum de chèvre dans du PBS à température ambiante. Après trois lavages dans du PBS, les cellules ont été incubées pendant 1h à température ambiante avec les anticorps primaires anti-atubuline (dilution 1/1000 dans du PBS, DM1A, Sigma), le phospho-épitope MPM2 mitotique (dilution 1/250 dans du PBS, O.T.181, Abcam) et l'histone H3 Serl0-phosphorylée (dilution 1/500, Sigma), ont été lavées dans du PBS et marquées pendant 1h à température ambiante avec les anticorps secondaires appropriés conjugués à Alexa 488 ou Alexa 568 (dilution 1/1000 dans du PBS, Molecular Probes). Les cellules ont été ensuite post-fixées pendant 30 minutes avec du PBS 1% paraformaldéhyde et montées dans du milieu Vectashield (Vector). Environ 500 cellules aléatoires ont été analysées au microscope pour la morphologie des microtubules et de l'ADN et pour la positivité pour MPM2 ou phospho-histone H3. Les images ont été obtenues sur un microscope à fluorescence Olympus BX41 (objectif x40) à partir d'une caméra CoolSnap pilotée par le logiciel Metaview (Universal Imaging). Les images ont été traitées avec le logiciel Adobe Photoshop (v6.0). Immunomarquage Les cellules triées ont été collectées par centrifugation et lysées pendant 5 minutes à 100 C dans du tampon Laemmli 2X (Tris-HC1 125 mM, pH 6,8, 20% glycérol, 0,04% de bleu de bromophénol, 4% SDS, 4% (3-mercaptoéthanol). Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE (12%, pH 8,7) et transférées sur membrane de nitrocellulose (Hybond C, Amersham). Les membranes ont été saturées avec 5% de lait à faible teneur en matière grasse dans du tampon TNT (25 mM Tris-HC1, pH7,5, 0,2 M MaCl, 0,1% tween 20) et incubées pendant la nuit dans du tampon TNT supplémenté avec 2% de sérum de cheval avec les anticorps contre cycline B1 (dilution 1/200, GNS1, Santa Cruz), Aurora B (dilution 1/250, AIM1, BD Bioscience) et Cdkl (p34cdc2,sc-54, dilution 1/500, Santa Cruz). Après incubation avec les anticorps secondaires appropriés conjugués à la peroxydase (dilution 1/10000, Amersham), les membranes ont été révélées en utilisant le système SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce). 2- Résultats Détection d'une population cellulaire, qui apparaît transitoirement après levée de l'arrêt mitotique.30 Des cellules synchronisées en prométaphase en présence de nocodazole ont été récoltées par choc sur les boites et cultivées en absence de drogue. Dans ces conditions, il est connu que la plupart des cellules reprennent la mitose et entrent en cytodiérèse en moyenne 90 minutes après la remise en culture. Les cellules ont été récoltées et fixées à différents temps, l'ADN a été coloré avec de l'iodure de propidium ou du Hoechst et une analyse de la fluorescence a été réalisée au cytomètre. Comme montré dans la figure 3a, une population cellulaire, appelée population C, apparaît transitoirement avec un contenu en ADN total DI=2 et une valeur du pic d'ADN similaire à celle des cellules en phase Gl (DI=1). Cette population serait interprétée comme des doublets de cellules G1 en analyse classique du cycle cellulaire basée sur le contenu en ADN, et serait normalement exclue. Cependant, dans cette expérience, la population C correspond bien à l'hypothèse d'une accumulation transitoire de cellules en mitose tardive et cytodiérèse. Cette hypothèse est en outre supportée par les cinétiques, qui montrent que la population C représente un stade intermédiaire entre la métaphase et la phase G1, avec une valeur maximale de 35% 90 minutes après levée de l'arrêt mitotique (figure 3b, les barres grises représentent les cellules en mitose, les barres noires les cellules en cytodiérèse, et les barres hachurées les cellules en phase G1 ). La population C est fortement enrichie en cellules en cytodiérèse Pour caractériser la population C, les cellules ont été synchronisées comme décrit précédemment, récoltées 90 minutes après levée de l'arrêt mitotique et triées sur la base de leur intensité de fluorescence de l'ADN versus le pic (région R3 correspondant à la population C sur la figure 4a). Pour tester la pureté de la population C triée, les cellules ont été analysées par cytométrie en flux (figure 4b). Les résultats montrent un enrichissement de 4 fois de la population C. Dans la même expérience, les cellules de la population C ont été triées directement sur des lames pour analyse microscopique (figure 5). Pour identifier le stade du cycle cellulaire et distinguer les cellules en cytodiérèse des vrais doublets de cellules en phase G1, le cytosquelette de microtubules a été immunomarqué avec un anticorps contre l'a-tubuline (figure 5). Les cellules mitotiques ont été identifiées par immunomarquage avec MPM2 (données non montrées). L'histone H3 phosphorylée sur la sérine 10 a aussi été utilisée comme un marqueur caractéristique de la mitose. Comme illustré par la figure 7, l'histone H3 phosphorylée est détectée dans les cellules mitotiques de la métaphase à la télophase, tandis que les cellules en cytodiérèse sont négatives. Les résultats du comptage cellulaire par la méthode utilisant la microscopie sont résumés dans le tableau 1. Tableau 1 Contrôle (a) 90 minutes (b) Non Population Non Population triées C triée triées C triée Interphase 90,3% 31,7% 15,1% 4,5% Doublets G1 3,6% 37,4% 0,6% 0,8% Métaphase 3,8% 0,8% 65,0% 0,7% Anaphase/télophase 0,1% 5,7% 5,0% 17,6% cytodiérèse 2,2% 24,4% 14,3% 76,4% (a) cellules asynchrones (b) temps de récolte après mise en culture de cellules mitotiques synchronisées par le nocodazole La population C comprend une majorité (76,4%) de cellules en cytodiérèse et un pourcentage significatif de cellules en mitose tardive. Il est à remarquer que la population C présente seulement une contamination minime par des cellules G1 (au total 5,3%) et des cellules en métaphase (moins de 1%). Ces résultats démontrent que les cellules en cytodiérèse et mitose tardive sont triées efficacement par cytométrie en flux en tant que population C. Il est à noter que le pourcentage de cellules en cytodiérèse est Il% plus faible lorsqu'il est déterminé par cytométrie en flux (65%, figure 4b) par rapport au comptage direct sur les lames de microscopie (76,5%, tableau 1). Cette différence peut être expliquée par la rupture du pont inter-cellulaire pendant la seconde analyse en cytométrie en flux des cellules triées. Il existe en effet une différence correspondante dans les pourcentages de cellules en G1 déterminés par ces deux méthodes (18,2% en cytométrie en flux, figure 4b versus 5,3% en microscopie, tableau 1). L'analyse microscopique des cellules triées en G1 après un second passage au cytomètre montre que la majorité des cellules présente une rupture du pont (figure 6f). De plus, une observation similaire a été faite lors de l'analyse des cellules G1 récoltées pendant le premier passage au cytomètre. Tandis que 55% de ces cellules étaient en interphase, 44% présentaient un pont typique de cytodiérèse cassé. La population C triée à partir de culture de cellules HeLa asynchrones a aussi été analysée. Comme montré dans le tableau 1, les cellules en cytodiérèse sont enrichies 10 fois après tri cellulaire. Cependant, la population C ne contient que 24% de cellules en cytodiérèse et présente une majorité de cellules en Gl. Ainsi, la mesure du pourcentage de cellules dans la population C ne permet pas une détermination exacte du pourcentage de cellules en cytodiérèse dans une culture asynchrone. Parce que l'arrêt du cycle cellulaire induit par le nocodazole peut affecter la croissance cellulaire et le métabolisme, une expérience permettant de détecter des cellules en cytodiérèse dans une culture de cellules mitotiques a été réalisée, en récoltant par choc sur les boites les cellules en mitose à partir d'une culture de cellules asynchrones non traitées. Comme attendu, une accumulation transitoire de cellules dans la population C a été observée, indiquant que la cytodiérèse a lieu rapidement, environ 30 minutes après la mise en culture dans ces conditions. La présence de cellules en cytodiérèse dans la population C a été confirmée par analyse microscopique de la population triée. Une majorité de cellules en cytodiérèse (60%) ou en mitose tardive (30%) ont été observées, mais aussi des cellules contaminantes en métaphase (3%) et en interphase (9% de singulets et doublets Gl). Ainsi, la population C est moins pure que celle obtenue après une synchronisation préalable par le nocodazole. Cette moins bonne pureté résulte de la méthode de choc, qui détache aussi bien les cellules en mitose tardive que les cellules en métaphase. L'analyse biochimique après tri cellulaire montre que la population C exprime Aurora B mais pas cycline B1 Un certain nombre de protéines régulatrices sont dégradées lors de la sortie de mitose. La protéine mitotique Cycline Bl commence à être dégradée aussitôt que la cellule entre en anaphase, tandis que la dégradation de Aurora B n'a lieu que plus tard durant la cytodiérèse et la phase Gl. La population C devrait donc présenter des niveaux détectables de Aurora B mais peu ou pas de cycline B1. Les cellules triées ont été lysées directement dans du tampon dénaturant Laemmli. L'immunomarquage de 104 cellules triées, en mitose ou dans la population C, a montré la présence de Aurora B dans les deux cas. Les niveaux de Aurora B ne sont pas significativement différents entre les cellules de la population C et celles en métaphase, ce qui est en accord avec sa cinétique de dégradation en phase G1 précoce. Comme attendu, la cycline Bl est pratiquement indétectable dans la population C (figure 8). Ces résultats montrent que la procédure incluant la synchronisation cellulaire, la fixation à l'éthanol, la coloration de l'ADN et le tri au cytomètre en flux de la population C est compatible avec une analyse postérieure en immunomarquage.15 REVENDICATIONS 1. Méthode de détection et de dénombrement de cellules en cytodiérèse, comprenant : la fixation des cellules et optionnellement la perméabilisation des cellules, la coloration quantitative de l'ADN des cellules par un colorant fluorescent vital ou non, - la mesure par tout moyen approprié de l'intensité de fluorescence du pic d'ADN et de l'aire sous la courbe, le dénombrement des cellules en cytodiérèse selon les caractéristiques suivantes : les cellules en cytodiérèse possèdent une aire sous la courbe similaire à celle de cellules en phase G2 ou M du cycle cellulaire et un pic de fluorescence similaire à celui des cellules en phase GO ou G1 du cycle cellulaire. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la mesure de l'intensité de fluorescence du pic d'ADN et 20 de l'aire sous la courbe est réalisée à l'aide d'un cytomètre en flux, et le dénombrement des cellules en cytodiérèse est réalisé à l'aide d'un logiciel d'analyse approprié au cytomètre en flux. 25 3. Méthode selon quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que la coloration de l'ADN est réalisée à l'aide d'un colorant fluorescent, notamment un intercalant (l'iodure de propidium, le bromure d'éthidium), un colorant liant les bases A :T (le Hoechst 33342 ou 33258 ) ou les 30 bases G :C (la 7-amino-actinomycine D), ou une cyanine. 10 15 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est applicable à toute cellule en culture adhérente ou en suspension, ou cellule primaire dissociée à partir d'un tissu. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape préliminaire de purification et de remise en culture des cellules mitotiques. 10 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape préliminaire d'enrichissement des cellules mitotiques suivie optionnellement d'une étape de purification des cellules 15 mitotiques. 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'étape d'enrichissement est réalisée par synchronisation des cellules en métaphase de mitose. 20 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape d'immunomarquage avec des marqueurs mitotiques sélectifs ou des marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse, 25 préalablement, en même temps ou après l'étape de coloration de l'ADN. 9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que les marqueurs mitotiques sélectifs sont choisis parmi le 30 groupe constitué par cycline Bl, MPM2 ou phospho-histone H3.5 10. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que les marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse sont choisis parmi le groupe constitué par les protéines présentes dans le complexe de protéines passagères, telles que Aurora B, survivine, Polo-like kinase, et les kinésines associées MKLP1 et MKLP2. 11. Méthode de tri des cellules en cytodiérèse, ladite méthode comprenant à la suite des étapes de détection et de dénombrement des cellules en cytodiérèse telles que décrites dans les revendications 1 à 10, une étape de tri de la population de cellules en cytodiérèse à l'aide d'un trieur de cellules. 12. Méthode de tri selon la revendication 11, caractérisée en ce que une étape d'enrichissement en cellules en cytodiérèse consécutive à une étape de purification et de remise en culture des cellules mitotiques sont préliminairement réalisées, et un marquage à l'aide des marqueurs mitotiques sélectifs ou des marqueurs conjoints de la mitose et de la cytodiérèse tel que décrit dans les revendications 8 à 10 est en outre réalisé. 13. Méthode de criblage d'agents capables d'accélérer ou de ralentir, d'activer ou d'inhiber la cytodiérèse, ladite méthode comprenant la culture de cellules dans un milieu adéquat en présence de l'agent à tester et la détection et le dénombrement des cellules en cytodiérèse tel que décrit dans les revendications 1 à 10.30