FR 2899689 A1 20071012 FR 0651294 A 20060410 ! Procédé de suppression d'un signal de FRET, Agents suppresseurs d'un signal de FRET et utilisation dans un Procédé de multiplexage d'évènements biologiques. Les outils permettant de mesurer plusieurs événements ou molécules dans un échantillon biologique unique sont particulièrement précieux. De tels outils, en permettant le multiplexage de dosages biologiques par exemple, offrent de nouvelles perspectives dans l'étude d'évènements biologiques complexes, mais aussi dans la recherche de nouveaux médicaments. La compréhension de certains processus biologiques ainsi que le diagnostic précis de certaines maladies peuvent nécessiter la détection simultanée de plusieurs biomolécules ou/et événements biologiques. Les technologies de multiplexage d'essais biologiques revêtent donc un intérêt remarquable dans plusieurs domaines : la recherche fondamentale, le diagnostic des maladies et également le criblage à haut débit de molécules potentiellement actives en pharmacologie. Par multiplexage, on entend la possibilité de détecter plusieurs biomolécules et/ou événements biologiques dans un échantillon biologique unique, contenus ou se produisant dans un volume réactionnel unique. Les composés photoluminescents, c'est à dire capables d'absorber et de re-émettre de la lumière, sont bien adaptés pour le multiplexage d'essais biologiques. Les techniques de multiplexage actuelles sont de deux types : 1) La plupart utilisent plusieurs composés photoluminescents pouvant être discriminés par leurs propriétés photophysiques : -5pectre d'absorption (ou d'excitation) - et/ou spectre d'émission - et/ou durée de vie de luminescence. Ces techniques nécessitent l'utilisation d'instruments sophistiqués capables: -d'exciter l'échantillon à plusieurs longueurs d'onde - et/ou de détecter plusieurs longueurs d'onde d'émission - et/ou de discriminer plusieurs durées de vie de luminescence. 2 2) D'autres techniques, utilisant des composés luminescents, reposent sur une localisation spatiale des événements biologiques à détecter. Parmi les techniques existantes permettant le mutliplexage d'événement 5 biologiques, on peut citer : - La technologie connue sous le nom connrneuja! DELFIA , commercialisée par la société PerkinElmer qui est une méthode de dosage hétérogène par fluorescence en temps résolu, comprenant une étape 10 d'augmentation du signal. Une mise en oeuvre particulière de DELFIA permet d'effectuer des dosages par multidétection en phase hétérogène, fondés sur l'utilisation de chélates de lanthanides caractérisés par des temps de vie et des spectres d'émission différents. Cette technique requiert la détection de plusieurs 15 longueurs d'onde d'émission et la discrimination temporelle des signaux. (Kimura et al., ForensioSci Int2OOO Sep 113:345 - 51) - La technologie connue sous le nom conmrnenja! Trupoint , exploitée par la société PerkinElmer, qui est une méthode basée sur l'utilisation de 20 chélates de lanthanides d'une part, d'agents extincteurs de fluorescence d'autre part ( quenchers en langue anglaise), et sur la mesure de fluorescence en temps résolu. Une mise en oeuvre particulière de cette technique, consistant à utiliser plusieurs terres rares émettant à différentes longueurs d'onde, permet d'effectuer des dosages en 25 multidétection. Cette technique requiert la mesure de fluorescence à plusieurs longueurs d'onde d'émission et la discrimination temporelle des signaux. - Un certain nombre de techniques basées sur des réactions en chaine de 30 polymérisation d'acide nucléique (connues sous le terme de wPCR*) permettent la détection quantitative d'acides nucléiques. Les techniques connues sous les noms commerciaux de wTdqMan , LightCycler , et 35 Arnp!UOumr mettent en oeuvre des fluorophores et peuvent être adaptées à multidétection, en utilisant plusieurs fluorophores 3 caractérisés par des spectres d'émission différents. Ces techniques requièrent !a détection de la fluorescence émise par chacun de ces fluorophores, à différentes longueurs d'onde d'émission. 5 - Certains auteurs ont décrit une technique de multidétection en phase homogène fondée sur la détection de la polarisation de fluorescence de plusieurs traceurs à différentes longueurs d'onde d'émission (Lynch et al., 1999 ; Blommel et al., 2004). 10 - Dans le domaine de la microscopie, il est courant d'utiliser plusieurs composés fluorescents simultanément dans les marquages cellulaires. Ces techniques requièrent l'utilisation combinée de plusieurs longueurs d'onde d'excitation et d'émission. Les systèmes de microscopie confocale nécessitent, en plus, plusieurs sources d'excitation. 15 - La technologie exploitée sous le nom cornrnerda! FM/A' (Fluorometric Microvolume Assay tehcnology), développée par les sociétés Beckton Dickinson et PerkinElmer Biosystems, est basée sur l'utilisation d'un LASER qui scanne des plaques micropuits. Cette technique permet la 20 mesure d'événements biologiques par multiplexage, mais requiert l'utilisation combinée de plusieurs longueurs d'onde d'excitation et d'émission en complément de la localisation spatiale du signal via le LASER (Swartzman et Al., 1999) 25 - La technologie connue sous le nom commercial xMAP de la société Luminex, est basée sur l'utilisation de microsphères colorées séparées par cytométrie de flux. Le multiplexage de la technologie repose sur l'utilisation de plusieurs sources d'excitation et de détection. L'essai ne se déroule pas vraiment en phase homogène : il yo aspiration du contenu de 30 chaque puits pour passage dans le système en cytométrie de flux. - a développé une technologie, en phase homogène, qui permet le multiplexage d'essais biologiques en utilisant un seul composé luminescent. Cette technologie repose sur la localisation 35 spatiale de chaque analyte à détecter: le volume réactionnel est déposé 4 dans un puit d'une microplaque, les différents analytes sont capturés et détectés sur des points distincts pre-déposés sur le fond du puits. Les technologies développées par les sociétés Luminex et Meso Scale 5 Discovery permettent un degré élevé de multiplexage, en revanche elles ne sont pas adaptées pour la détection de biomolécules à l'intérieur de cellules intactes ou en milieu homogène, un support solide étant requis. - La technologie connue sous le nom cornnnenda! eTaIrm de la société 10 Aclara, est une technologie permettant le multiplexage d'essais biologiques en utilisant une seul longueur d'onde d'excitation et une seul longueur d'onde d'émission. Néanmoins elle requiert la discrimination de chaque sonde par électrophorèse capillaire. Elle repose en fait sur l'utilisation de sondes caractérisées par les mêmes propriétés de 15 fluorescence, mais possédant différents rapports masse/charge (Chan-Hui et al. 2004 ; Tian et al. 2004). - Bradford et al. (2OO4)ontdécrit un système de multidétection combinant cytométrie de flux et intensité de fluorescence: l'utilisation du système de 20 marquage indirect développé par Molecular Probes (ZENON technology) permet d'obtenir des conjugués fluorescents possédant chacun une intensité de fluorescence définie. Chaque conjugué anticorp-composé fluorescent est dirigé contre un antigène de surface cellulaire donné. En détectant la fluorescence dans un cytomètre de flux, on peut connaître le 25 pourcentage de cellules exprimant tel ou tel antigène de surface en fonction de l'intensité de fluorescence mesurée sur les cellules. Quelques articles additionnels présentent des composés fluorescents pouvant permettre la mise en œuvre d'essais multiplexés : 30 - Kurner et al., 2001 décrivent des nanosphères phosphorescentes (commercialisées par la société Chromeon) caractérisées par des temps de vie et des longueurs d'onde d'émission différentes qui peuvent être excitées à la même longueur d'onde. 35 - Tong et al. (2001) décrivent l'utilisation de 3 #uorophones pour la fabrication de 8 sondes, excitables à la même longueur d'oOde| 5 3 longueurs d'onde de détection sont nécessaires pour l'identification des sondes. (technique connue sous le terme CFET tags , pour Combinatorial fluorescence energy transfer tags en langue anglaise) 5 - Tyagi et al. (2000) décrivent des balises moléculaires constituées d'acides nucléiques marqués par des fluorophores (connues sous le terme anglo-saxon de molecular beacnns ) excitables à la même longueur d'onde et émettant à des longueurs d'onde différentes. 10 Les techniques de l'art antérieur sont donc toutes basées sur des appareillages de mesure permettant de discriminer les signaux émis par le milieu réactionnel : appareillages permettant la mesure de signaux lumineux émis à différentes longueurs d'ondes, appareillages permettant de séparer les signaux par électrophorèses (etags), dispositifs permettant une localisation 15 spatiale spécifique de chaque évènement biologique étudié, et donc de chaque signal. La mise en oeuvre de ces techniques pour le multiplexage d'événements biologiques n'est donc pas toujours aisée puisqu'elles nécessitent le plus 20 souvent un appareillage complexe, ou bien des étapes de séparation ou de lavage, qui ne sont pas toujours adaptées aux besoins de l'industrie pharmaceutique, notamment les besoins dans le domaine du criWageà haut débit. 25 Un certain nombre de composés possédant un domaine de liaison à des fluorophores ont été décrits, ainsi que leurs effets éventuels sur les propriétés photophysiques desfluorophnnes qu'ils reconnaissent. Le brevet américain US 6,747,135 divulgue des polypeptides, appelés 30 Ouorettes ayant une affinité élevée pour des fluorophores. Ces fluorettes sont particulièrement utiles pour coupler des Ounrophores à des protéines, de manière non-covalente. Par ailleurs ce brevet divulgue une fluorette spécifique du rouge texas, qui provoque un décalage des spectres d'absorption et d'émission de ce fluorophore. Les autres fluorettes présentées 35 n'ont pas d'effet significatif sur les propriétés de fluorescence. 6 Watt et Al (1977) décrivent que la liaison d'un anticorps anti-fluorescéine avec la fluorescéine modifie les propriétés photophysiques de cette dernière: baisse de 9096 de son rendement quantique, déplacement de ses longueurs d'ondes maximum d'émission et d'excitation. 5 La demande de brevet US 2005 /0064512 divulgue des polypeptides, en particulier des anticorps, liant spécifiquement des fluorophores organiques, notamment de la famille des cyanines. Les anticorps selon US 2005/0064512 provoquent des changements dans les propriétés photophysiques de ces 10 fluorophores et notamment un changement important dans leur maximum d'excitation et d'émission. Babendure et al., 2003, décrit de courtes séquences nucléotidiques (appelées Aptamères) capables de se !ierà desMuonophores organiques tels que ceux 15 comportant un motif triphénylméthane. Les auteurs ont par ailleurs mis en évidence une augmentation de la fluorescence émise lors de la liaison de !'aptannèneaufluorophore. La société Molecular Probes commercialise un certain nombre d'anticorps, 20 dont la plupart sont des anticorps polyclonaux, ayant une affinité pour des Muorophoneohe!s que des anticorps anti-fluorescéine, des anticorps anti Alexa Fluor 488, des anticorps anti-tétraméthylrhodamine, des anticorps anti-Bodipy, des anticorps anti-dansyl. Ces anticorps modifient les propriétés des fluorophores auxquels ils se lient : ils entraînent une extinction ou au 25 contraire une exaltation de fluorescence. Ces composés possèdent tous un domaine de liaison à un fluorophore et certains d'entre eux entraînent des variations des propriétés spectroscopiques lorsqu'ils se lient au fluorophore, mais aucun d'eux n'a été décrit en tant 30 qu'agent suppresseur de FRET. De plus, on peut noter que leurs effets ne sont pas homogènes, puisque certains vont décaler les spectres d'émission ou d'excitation, d'autres vont provoquer une exaltation ou une extinction de fluorescence, et d'autres enfin ne vont pas modifier les caractéristiques des f!uon3phores. 7 DESCRIPTION DE L'INVENTION La demanderesse a découvert une méthode permettant de supprimer un eignal de FRET ( Fluorescence Resonnace EnengyTranafer , ou fluorescence 5 résultant d'un transfert d'énergie de résonance). Cette méthode a permis le développement de procédés de multiplexage d'évènements biologiques dans un milieu réactionnel. Certains moyens mis en oeuvres dans ces procédés sont également l'objet de la présente invention, en particulier certains agents suppresseurs du signal FRET, ainsi que des nécessaires de composants ( kits 10 of parts en langue anglaise) permettant la mise en oeuvre des procédés selon l'invention. Les procédés de multiplexage selon l'invention présentent de nombreux avantages par rapport aux procédés de l'art antérieur, puisqu'ils peuvent être 15 mis en oeuvre en milieu homogène, ne nécessitent aucune étape de séparation, de lavage, et peuvent être utilisés avec les fluorimètres habituellement utilisés pour détecter un événement biologique unique. De plus, ces procédés ne nécessitent pas de résolution temporelle des signaux ni de localisation spatiale des biomolécules à détecter. 20 Les procédés selon l'invention sont basés sur la technique de FRET qui consiste à mesurer le transfert d'énergie non radiatif de résonance entre un fluorophore donneur et un OuorophoreaccepLeur. Après excitation lumineuse à la longueur d'onde d'excitation du fluorophore donneur, un transfert 25 d'énergie a lieu entre le fluorophore donneur et le fluorophore accepteur s'ils sont proches l'un de l'autre. La détection du phénomène de FRET peut se faire par la mesure de différents paramètres du signal de fluorescence émis soit par le donneur, soit par l'accepteur, soit par les deux molécules. Parmi les techniques les plus 30 utilisées, on peut notamment citer : - La mesure de !a baisse de fluorescence du donneur induite par le phénomène de FRET> - La mesure de l'augmentation de la fluorescence de l'accepteur induite par l'énergie provenant du donneur au travers du FRET | 35 - La détermination du ratio [(augmentation fluorescence accepteur)/(dirninutionOuorescence donneur)] ; 8 - La mesure de la diminution de la durée de vie de fluorescence du donneur induite par le phénomène de FRET. Celle-ci est notamment mesurée par la technique de Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) ; - La mesure de l'augmentation de la fluorescence du donneur impliqué dans 5 un FRET après le photoblanchiment de l'accepteur. Cette technique de photoblanchiment est connue sous le nom de Fluorescence KecovaryAfter Photob!eaching/FRAP\. La technique de FRET est une techniuedechoixpourétudierdesinten cbons 10 chimiques ou biologiques qui entraînent une modification de la distance entre un fluorophore donneur et un fluorophore acceptaur: le principe général consiste à préparer des conjugués fluorescents en couplant les partenaires de FRET à des molécules impliquées dans un processus biologique ou à des sondes reconnaissant de telles molécules, et à mesurer les variations de FRET 15 en réponse à une stimulation, par exemple en ajoutant dans le milieu des composés qui vont affecter le processus biologique étudié. Ces composés peuvent par exemple intervenir dans la régulation de réactions enzymatiques, provoquer des modifications de conformation tridimensionnelles de protéines, provoquer la production d'un analyte et la formation d'un complexe 20 analyte/partenaires de FRET| dans tous les cas, une modification de l'évènement biologique étudié provoque une modification du FRET entre les composés fluorescents donneurs et accepteurs. 1- Procédé de suppression de FRET La demanderesse a maintenant mis au point un procédé basé sur la suppression du FRET entre deux conjugués fluorescents partenaires de FRET et spécifiques d'un événement biologique, non pas en intervenant sur cet événement biologique, mais sur les partenaires de FRET. 30 Un des objets de l'invention est donc un procédé de suppression du FRET émis par un milieu réactionnel contenant un couple de conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifiques d'un événement biologique, caractérisé en ce que l'on introduit dans ce milieu un agent supppeSseurdu signal FRET, ledit 35 agent suppresseur du signal FRET ne perturbant pas ledit événement biologique. 25 9 Ce procédé peut être utilisé dans le cadre de l'étude de nombreux évènements biologiques tels que : les évènements biologiques impliquant des réactions enzymatiques (telle que les activités de type kinase, phosphorylase, transférase, hydrolase, lyase, ligase, isomérase, polymérase...), la présence 5 ou la variation de concentration d'un ana!ytedany le milieu réactionnel (par exemple la présence ou variation de concentration de protéines, enzymes, substrats d'enzymes, messagers intracellulaires, tels que les nucléotides cycliques (AMPc, GMPc etc...), les phospholipides (PIP2, PIP3...), facteurs de transcription, composés comportant un cycle inositol (IP1, IP2, IP3, IP4...), 10 acides nucléiques, facteurs de croissance), le rapprochement de deux molécules dans le milieu réactionnel, les modifications de conformations tridimensionnelles de molécules. Les exemples décrits illustrent quelques applications de l'invention mais il serait injustifié de limiter l'invention à ces évènements. 15 La demanderesse a mis en évidence, de manière surprenante, que certains composés peuvent supprimer le signal de FRET résultant du rapprochement de 2 conjugués partenaires de FRET. 20 Par agent suppresseur du signal FRET, on entend un composé qui provoque une diminution de signal de FRET d'au moins 7096 par rapport au signal mesuré en l'absence de cecomposé. Les agents suppresseurs du signal FRET provoquant une diminution du FRET d'au moins 8096, ou d'au moins 9096 sont préférés. 25 Les agents suppresseurs du signal FRET utilisés dans le procédé selon l'invention ne perturbent pas l'événement biologique étudié dans la mesure où ils agissent au niveau d'un desOuorophores impliqués dans le FRET, et non pas au niveau de l'évènement biologique étudié : ils n'ont aucun effet sur la 30 distance séparant les molécules impliquées dans l'événement biologique. Afin de déterminer si un composé est suppresseur du signal FRET au sens de l'invention, il peut être mis en contact avec un couple de conjugués fluorescent partenaires de FRET émettant un signal de FRET, par exemple 35 deux conjugués fluorescents reconnaissant une même molécule, ou encore deux conjugués fluorescents dont l'un comprend une biotine et l'autre la 10 10 streptavidine ; Le signal de FRET émis par le milieu réactionnel est mesuré en présence et en l'absence dudit composé, les suppresseurs du signal FRET étant ceux qui entraînent une diminution de igDal d'au moins 70%. Ce test simple perrnetà l'homme du métier d'isoler des agents suppresseurs de FRET 5 au sens de l'invention. Ces agents peuvent être de différente nature, avoir différentes fonctions, mais dans tous les cas permettent de supprimer le signal de FRET émis par un couple donneur-accepteur donné : a) Agents suppresseurs de signal de FRET agissant par fixation spécifique par liaison non covalente sur l'un des fluorophores impliqués dans le FRET : Ces agents possèdent un domaine permettant une liaison spécifique et 15 non-covalente avec le fluorophore, et peuvent être choisis parmi : des protéines, notamment des anticorps ou des fragments d'anticorps, des peptides, ou dasaptarnéres, chacun possédant un domaine de liaison pour l'un des fluorophores partenaires de FRET 20 L'homme du métier dispose de techniques lui permettant de fabriquer ces composés, et de tester leur liaison avec des fluorophores (par exemple les techniques classiques de production d'anticorps, ou encore le procédé SELEX de sélection d'aptamères). 25 Des agents suppresseurs du signal FRET préférés sont, dans le cas d'un FRET impliquant un chélate ou un cryptate de terre rare, les composés capables de se lier de manière non covalente à des cryptates ou chélates de terre rare, comme par exemple : des protéines, notamment des anticorps ou des fragments d'anticorps, des peptides, ou des aptamères 30 possédant un domaine de liaison pour un cryptate ou chélate de terre rare. Des agents suppresseurs du signal FRET encore plus préférés sont les anticorps anti-chélate de terre rare ou anti-cryptate de terre rare. 35 ll Les anticorps anti-cryptates sont produits par les techniques bien connues de l'homme du métier d'immunisation d'un mammifère avec un antigène. Dans le cas où l'antigène est de petite taille, comme c'est le cas du 5 cryptate de terre rare, il doit être couplé à une molécule porteuse immunogène. Pour cela, le cryptate est fonctionnalisé, comme décrit dans le brevet EP 321 353. De préférence, un bras alkylamine est greffé au cryptate. Les molécules porteuses peuvent être choisies parmi : la sérum albumine 10 bovine (BSA) ou la BSA cationique (cBSA), la KLH (keyhole Limpets Hernocyanineou hémocyanine de patelle), la thyroglobuline, l'ovalbumine. Les molécules porteuses peuvent également être des liposomes ou des molécules porteuses synthétiques comme des polymères de L-Lysine, ou d'acide L-glutamique, du ficoll, du dextran, ou encore du polyéthylène 15 glycol. Ces molécules porteuses comportent généralement des groupes fonctionnels qui réagiront avec le cryptate fonctionnalisé, ou bien de tels groupes pourront être introduits par des techniques classiques. De préférence, un cryptate de terre rare portant un groupe alkylamine est conjugué à la BSA. 20 L'immunogène ainsi obtenu est ensuite mélangé à un adjuvant, comme par exemple l'adjuvant de Freund. Des mammifères - par exemple des souris - sont immunisés par injection 25 sous-cutanée de cette solution, et après une période nécessaire à l'induction de l'immunité, les sérums des animaux sont recueillis et les anticorps polyclonaux purifiés, par exemple par chromatographie d'affinité Les anticorps monoclonaux and-cryptate sont produits en utilisant 30 diverses techniques connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut évoquer la technique issue des travaux de KÜh/er et Milstein : quelques semaines après l'immunisation, la rate de la souris immunisée avec l'antigène est prélevée. Un mélange de lymphocytes et de plasmocytes provenant de cette rate est fusionné in vitro avec des cellules 35 myélomateuses en présence d'un inducteur de fusion cellulaire, comme le polyéthylène glycol. Une lignée cellulaire myélomateuse mutante, 12 dépourvue d'hypoxanthine guanosine phosphohbosv!transférase (HGPRT), est utilisée pour permettre de sélectionner aisément les cellules hybrides. Ces cellules sont cultivées dans un milieu contenant de l'hypoxanthine, de !'amOin0ptérine (méthotréxate) et de la thymine (milieu HAT) afin 5 d'éliminer les cellules myélomateuses non fusionnées et de sélectionner les hybridomes d'intérêt. Les cellules de rate non fusionnées meurent car elles ne sont pas capables de proliférer in vitro. Les cellules hybrides, en revanche, survivent. Les hybridomes ainsi obtenus sont cultivés dans les puits d'une plaque de culture cellulaire. Les surnageants de ces puits sont 10 testés pour la présence d'anticorps spécifiques anti-cryptate de terre rare dans un test de criblage simple tal que !'ELISAou RIA. Les hybridomes sont ensuite clonés et peuvent être injectés à des mammifères pour induire des myélomes sécrétant en grande quantité d'anticorps anticryptate dans le liquide d'ascite. 15 Les anticorps anti-cryptate de terre rare poly- ou mono-clonaux obtenus, peuvent être ensuite testés pour leur capacité à supprimer le signal de FRET émis par un couple de partenaires de FRET comprenant ledit cryptate de terre rare en tant que donneur d'énergie. Pour cela, on peut procéder 20 comme décrit ci-dessus et dans l'exemple 1 présenté ci-après. b)Agents suppresseurs de FRET agissant par découplage du fluorophore avec l'événement biologique : 25 Co mme décrit plus haut, l'étude d'événements biologiques en utilisant le phénomène de FRET est basée sur le marquage de molécules impliquées dans l'événement biologique par des fluorophores partenaires de FRET. Si ce marquage est effectué de manière non covalente, via des partenaires 30 de liaison, il est possible de découpler un des fluorophores de l'événement biologique. Par exemple, Si une molécule impliquée dans l'événement biologique est lié de manière covalente à un membre d'un couple de partenaires de 35 liaison (par exemple un oligonucléotide simple brin), et que le fluorophore est lié de manière covalente à l'autre membre de ce couple par exemple 13 un oligonucléotide simple brin complémentaire), alors l'ajout dans le milieu de mesure du premier membre de ce couple (le premier oligonucléotide simple brin, sous forme libre) va découpler le marquage de la molécule biologique par le fluorophore, par un phénomène de compétition selon le schéma suivant : Molécule impliquée dans l'événement biologique Molécule impliquée dans l'événement biologique Molécule marquée par le Découplage du marquage fluorophore via une interaction non-covalente et réversible entre deux partenaires de liaison Ces agents suppresseurs de signa de FRET sont donc des membres de 10 couples de partenaires de liaison, et ne sont bien sûr utilisables comme agents suppresseurs de signal de FRET que si leur partenaire est greffé sur la molécule impliquée dans l'événement biologique étudié. Ils peuvent être choisis parmi les membres des couples suivants : acides nucléiques simple-brin complémentaires, tag/anti-tag et en particulier les membres 15 des couples: DNP/ anticorps anti-DNP, dans lequel DNP représente le din!tnophéno!; GST/anticorps anti-GST dans lequel GST représente la g!utaUoneS-transféraee ; biotine/avidine ; 6HIS/anticorps anti-6HIS dans lequel 6HIS est un peptide constitué de 6 histidines ; Myc/anticorps anti-MyCdans lequel Myc est un peptide constitué des acides aminés 410-419 20 de la protéine Myc humaine ; FLAG /anticorps anti-FLAG @ dans lequel FLAG est un peptide ayant les 8 acides aminés ci-après DYKD[}DDK; HA/anticorps anti HA dans lequel HA est un épitope de l'hémaglutinine d'Influenza. 14 c) Agents suppresseurs de FRET agissant par modification de la nature du fluomphore 5 D ans le cas ou le fluorophore est un chélate de terre rare, les agents suppresseurs de FRET peuvent réduire la stabilité du fluorophore, en rentrant en compétition soit avec la terre rare pour la liaison avec le chélate, soit avec le chélate pour la liaison avec la terre rare. 10 Par exemple, l'ajout au milieu de mesure d'un ion qui va rentrer en compétition avec la terre rare pour la liaison avec le chélate peut favoriser la formation d'un nouveau complexe non-fluorescent chélate-ion. Un tel ion peut être l'ion Manganèse Mnz+ dans le cas des chélates de terre rare. A titre d'exemple de compétition avec le chélate, on peut citer l'utilisation 15 d'agents complexant les métaux, tels que l'EDTA, qui va entraîner la formation d'un complexe EDTA-terre rare, non fluorescent, au détriment du complexe fluorescent chélate-terre rare. Par ailleurs, certains fluorophores sont sensibles aux variations de force 20 ionique du milieu : c'est le cas en particulier des fluorophores protéiques comportant plusieurs sous-unités liées par des liaisons électrostatiques, et dont la structure quaternaire sera déstabilisée lors d'une diminution de la force ionique du milieu. On peut citer à titre d'exemple le cas de l'allophycocyanine, qui se dissocie dans ces conditions. Lorsque de tels 25 fluorophores sont utilisés, le signal deFRET pourra donc être supprimé en diminuant la force ionique du milieu réactionnel. d) Agents suppresseurs de FRET agissant par modification des propriétés 30 Ce type d'agents suppresseurs de FRET entraîne un effet d'extinction de fluorescence ( quenching en langue anglaise). 35 On peut citer à titre d'exemple l'acide urique qui, dans le cas où le fluorophore est un chélate ou un cryptate de terre rare, peut provoquer 15 des réactions d'oxydo-réduction de la terre rare qui peuvent aboutir à une suppression du FRET. D'autres fluorophores sont sensibles au variation de pH et les agents 5 modifiant le pH peuvent dans ce cas être également utilisés en tant qu'agents suppresseurs du signal de FRET. De manière générale les agents modifiant le spectre d'émission ou d'absorption d'un fluorophore, ou encore ceux inhibant la fluorescence 10 peuvent être utilisés dans les procédés selon l'invention, sous réserve qu'ils provoquent effectivement une suppression du signal de FRET au sens de l'invention. Cette caractéristique peut être testée simplement comme mentionné plus haut. 15 Couple de conjugués fluorescents partenaires de FRET : Un couple de conjugués fluorescents partenaires de FRET au sens de l'invention est constitué d'un conjugué fluorescent donneur et d'un conjugué fluorescent accepteur dont les spectres d'émission et d'absorption sont 20 compatibles. Chacun de ces cojuguéa est constitué d'un fluorophore lié de manière covalente à une sonde, cette sonde étant impliquée dans un événement biologique, ou bien reconnaissant de manière spécifique une molécule impliquée dans un événement biologique. 25 La notion de partenaires de FRET est bien connue de l'homme du métier qui est capable, sur la base des caractéristiques spectroscopiques des composés fluorescents connus, de sélectionner des couples de fluorophores compatibles en termes de FRET. Il pourra en outre se référer à l'ouvrage de Lakowicz, Principles of fluorescence spectroscopy, ~^ edition,Kluwer academic/plenum 30 publishers, NY (1999). Parai!!eucS/ le terme FRET est ici utilisé au sens large et inclus le FRET en temps résolu (TR-FRET). Les fluorophores : Les fluorophores peuvent être choisis parmi le groupe suivant comprenant 35 les protéines luminescentes, telles que la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variants, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, la R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les fluorophores connus sous la dénomination BODIPY, les fluorescéines, les composés connus sous la dénomination AlexaFluor; les complexes supra-moléculaires, tels que les cryptates de terre rare, les chélates de terre rare (en particulier les chélates et cryptates d'europium, de terbium, de samarium, de dysprosium, de neodymium); les particules inorganiques luminescentes comme les quantum dots; ces fluorophores peuvent être utilisés soit comme donneurs soit comme accepteurs dans un système de FRET. Les complexes de terre rare sont des composés connus qui sont décrits par exemple dans les brevets US 4 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. D'autres chélates sont composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine (EP 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909). La terre rare peut être l'europium ou le terbium. Les cryptates de terres rares sont décrits dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 601 113 et la demande WO 01/96 877. Avantageusement, le complexe de terre rare est un chélate ou un cryptate d'europium. Lorsque la terre rare est l'europium, le complexe de terre rare est de préférence un cryptate de terre rare à motif pyridine, de manière encore plus préférée à motif pyridine-bipyridine. Les sondes : La sonde présente dans un conjugué fluorescent peut être une molécule directement impliquée dans l'événement biologique étudié, ou encore une molécule reconnaissant une autre molécule impliquée dans ledit évènement, par exemple un anticorps anti-protéine d'intérêt, dans le cas ou l'événement biologique est une interaction entre deux protéines d'intérêt. De manière générale et selon l'invention, la notion de molécule impliquée dans un évènement biologique signifie que cette molécule joue un rôle dans l'événement biologique, ou bien est recrutée ou à tendance à s'accumuler sur le site de l'événement biologique. Par exemple, si l'événement biologique est 17 la production d'un analyte, une molécule impliquée dans cet événement pourra être : un précurseur de l'analyte, une enzyme participant à la synthèse de cetana!yte, un anticorps reconnaissant l'analyte. Les molécules impliquées dans des évènements biologiques peuvent êtne: 5 des protéines, des peptides, des enzymes, des substrats d'enzymes, des messagers intracellulaires tels que les nucléotides cycliques (AMPc, GMPc etc...), des phospholipides (PIP2, PIP3...), des facteurs de transcription, des composés comportant un cycle inositol (IP1, IP2, IP3, IP4...), des acides nucléiques, des oligonucléotides, des facteurs de croissance. 10 Les composés reconnaissant des molécules impliquées dans des évènements biologiques peuvent être : des anticorps ou des fragments d'anticorps, des anticorps ou fragments d'anticorps anti-étiquette (anti-tag) reconnaissant des étiquettes (tags) greffées sur les molécules impliquées dans les évènements 15 biologiques, des aptamères, des peptides, des protéines, des acides nucléiques simple-brin pouvant s'hybrider avec une séquence complémentaire greffée sur les molécules impliquées dans des évènements biologiques . Les systèmes tag/anti-tag couramment utilisés incluent les couples : DNP/ anticorps anti-DNP, dans lequel DNP représente le dinitrophénol > 20 GST/anticorps anti-GST dans lequel GST représente la glutatione S-transférase ; biotine/avidine| 6HIS/anticorps anti-6HIS dans lequel 6HIS est un peptide constitué de 6 histidines ; Myc/anticorpyant!-Mycdans lequel Myc est un peptide constitué des acides aminés 410-419 de la protéine Myc humaine ; FLAG /anticorps anti-FLAG @ dans lequel FLAG est un peptide 25 ayant les 8 acides aminés ci-après DYNDODDK; HA/anticorps anti HA dans lequel HA est un épitope de l'hémaglutinine d'Influenza. Les sondes détermineront donc la spécificité d'un couple de conjugués fluorescents partenaires de FRET pour un événement biologique donné. Le 30 procédé selon l'invention peut être utilisé pour étudier de nombreux évènements biologiques tels que : les évènements biologiques impliquant des réactions enzymatiques (telle que les activités de type kinase, phosphorylase, transférase, hydrolase, lyases, ligases, isomérase, polymérase...), la présence ou la variation de concentration d'un analyte dans le milieu réactionnel (par 35 exemple la présence ou variation de concentration de protéines, enzymes, substrats d'enzymes, messagers intracellulaires tels que les nucléotides 18 cycliques (AMPc, GMPc etc...), phospholipides (PIP2, PIP3...), facteurs de transcription, composés comportant un cycle inositol (IP1, IP2, 2P3, lP4..), acides nucléiques, facteurs de croissance), le rapprochement de deux molécules dans le milieu réactionnel, les modifications de conformations 5 tridimensionnelles de molécules. Les exemples décrits ci-après illustrent quelques applications de l'invention mais il serait injustifié de limiter l'invention à ces évènements. L'homme du métier est à même de préparer des couples de conjugués 10 fluorescents partenaires de FRET spécifiques d'un évènement biologique : la conjugaison d'un fluorophore avec une sonde au sens de l'invention est en effet largement décrite dans la littérature (par exemple dans Biocojugahe Techniques , G.T. Hermanson, Academic Press, 1996.) et fait appel à l'utilisation des groupes réactionnels classiquement utilisés. 15 Le procédé de suppression du signal de FRET dans un milieu réactionnel est particulièrement utile lorsque plusieurs signaux de FRET issus de plusieurs couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET, spécifiques de plusieurs évènements biologiques, doivent être nmesurés: il rend en effet 20 possible la détection d'évènements biologiques par multiplexage. Un autre objet de l'invention est un procédé de détection d'au moins deux 25 évènements biologiques dans un milieu réact!onnel qui consiste : 1) à introduire dans ce milieu : - au rnoins2 couples de conjugués fluonescenLo partenaires de FRET, chaque couple étant spécifique d'un des évènements biologiques étudiés, la longueur d'onde à laquelle les conjugués fluorescents 30 donneurs sont excités étant la même pour tous les couples, et la longueur d'onde à laquelle sont mesurés les signaux émis par les conjugués fluorescents accepteurs étant la mêmes pour tous les couples ; - des agents suppnesseurSde s!gnal de FRET entre deux partenaires 35 de FRET donnés, et ce sans perturber les évènements biologiques 19 étudiés, ces composés étant introduits dans le milieu de manière séquentielle ; et 2) à mesurer de manière séquentielle les différents signaux de FRET émis par le milieu réactionnel. 5 Selon l'invention, le procédé de détection de n évènements biologiques dans un milieu réactionnel comprend les étapes suivantes : (i) mise en contact du milieu réactionnel avec un premier couple de conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifique d'un premier 10 évènement biologique ; (il) excitation du milieu réactionnel à la longueur d'onde À1 ; /iii\ mesure du signal de FRET émis par le milieu réactionnel à la longueur d'onde À2 (signal correspondant au premier événement biologique) ; (iv) ajout d'un agent suppresseur du signal de FRET spécifique du dernier 15 couple de partenaires de FRET mis en contact dans le milieu ; (v) mise en contact du milieu réactionnel avec un couple de conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifiques d'un évènement biologique différent de celui (ceux) détecté (s) dans les étapes précédentes ; 20 (vi) excitation du milieu réacUonnel à la longueur d'onde À1 ; (vii) mesure du signal de FRET émis par le milieu réactionnel à la longueur d'onde À2 (signal correspondant à l'événement biologique dont est spécifique le dernier couple de partenaires de FRET mis en contact dans le milieu) ; 25 les étapes (iv) à (vii) étant répétées (n-2) fois, n étant un nombre entier compris entre Zet 10, c'est-à-dire égal à 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Les conjugués fluorescents partenaires de FRET comprenant un fluorophore donneur et un Muorophoreaccepteur, À1 étant la longueur d'onde d'excitation des fluorophores donneurs et À2 étant la longueur d'onde d'émission des 30 fluorophores accepteurs. Les conjugués fluorescents partenaires de FRET et les agents suppresseurs du signal FRET ont été définis précédemment. 35 20 L'expression mise en contact du milieu réactonnel avec un couple de conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifiques d'un évènement biologique signifie que les partenaires de FRET se retrouvent simultanément dans le milieu réactionnel. On peut parvenir à ce résultat en les introduisant 5 simultanément au cours de l'une des étapes (i) ou (v) ou bien en les introduisant de manière séquentielle dans le milieu réactionnel : dans ce cas, la mise en contact correspondra à l'ajout du deuxième membre de ce couple, à condition que son partenaire ait été introduit dans une étape antérieure, par exemple au cours de l'étape (i). Selon l'invention, les couples de conjugués 10 fluorescents partenaires de FRET sont en effet formés de manière séquentielle. Ainsi, dans une mise en oeuvre particulière de procédé selon l'invention, l'étape (i) consiste à introduire d'une part un membre de chacun des n 15 couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifiques des n évènements biologiques à étudier, (soit n membres de n couples) et à introduire d'autre part un second membre de l'un des ces couples pour effectivement mettre en contact le couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifique du premier évènement biologique à détecter. 20 Les seconds membres des autres couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET sont introduits de manière successive, dans chacune des étapes (v) suivantes. Dans une autre mise en oeuvre, les membres des couples de conjugués 25 fluorescents partenaires de FRET sont introduits simultanément dans le milieu de mesure, le premier couple étant introduit dans le milieu réac ionnal dans l'étape (i), et les autres couples étant introduit de manière successive dans chacune des étapes (v). 30 Le procédé précédent repose sur le principe de la formation séquentielle de couples de partenaires de FRET et la mesure puis l'extinction séquentielle du signal de FRET associé. Chaque signal mesuré est représentatif d'un événement biologique donné. 35 Un procédé alternatif consiste à introduire l'ensemble des n couples partenaires de FRET dans le milieu de mesure, à mesurer le signal total émis 21 et correspondant à la somme des signaux spécifiques à chaque événement biologique, puis à introduire séquentiellement les agents suppresseurs de FRET et à mesurer le signal émis après chaque étape d'introduction desdits agents. L'ensemble des mesure permet, par une méthode mathématique 5 simple, de calculer la valeur du signal spécifique à chaque couple de partenaire de FRET et donc à chaque évènement biologique. En pratique et à titre d'exemple pour 3 événements biologiques, les mesures suivantes sont effectuées : 10 A=S1 + S2 fG3 (somme des signaux correspondant à chaque événement biologique) ; B = S1 + S2 (mesuré après addition d'un suppresseur de FRET entre les fluorophores spécifiques de l'événement 3) ; C =S1 (mesuré après addition de suppresseurs de FRET entre 15 les fluorophores spécifiques des événements 3 et 2). Les valeurs A, B, et C étant connues (mesurées), celles des signaux Si, S2 et S3 peuvent être aisément calculées. Ce procédé alternatif de détection de n évènements biologiques dans un 20 milieu réac1imnnel comprend les étapes suivantes : (i) mise en contact du milieu réactionnel avec les n couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifiques de n évènements biologiques ; (ii) excitation du milieu réactionnel à la longueur d'onde À1 ; 25 (iii) mesure du aignal de FRET émis par le milieu réactionnel et correspondant à l'ensemble des événements biologiques étudiés | (iv) introduction dans le milieu néactiunn8l d'un agent suppresseur du signal de FRET spécifique d'un desdits couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET, le cas échéant différent de ceux 30 introduits dans les étapes précédentes (v) excitation du milieu réac ionnel à la longueur d'onde À1 ; (vi) mesure du sign l de FRET émis par le milieu réactionnel, correspondant à tous les évènements réactionnels moins ceux dont le sign l a été bloqué dans une étape précédente) | 35 les étapes (iv) à /vi) étant répétées /n-1\ fois, n étant un nombre entier compris entre 2 et 10, c'est-à-dire éga!à 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. 22 (vii) Détermination des valeurs de signal de FRET pour chacun des n événements biologiques, par la résolution mathématique des n équations obtenues dans les étapes (iii) et chacune des étapes (vi). Les conjugués fluorescents partenaires de FRET comprenant un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur, À1 étant la longueur d'onde d'excitation des fluorophores donneurs et À2 étant la longueur d'onde d'émission des fluorophores accepteurs. 10 Comme décrit plus haut, les procédés selon l'invention font intervenir plusieurs couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifiques d'un événement biologique donné. Chaque couple est constitué de deux conjugués, chacun comprenant un fluorophore couplé de manière covalente à une sonde spécifique. Il est tout a fait possible que certains couples aient des 15 éléments cornrnuns: deux couples donnés peuvent ainsi partager le même conjugué donneur, le même conjugué accepteur, ou encore comporter les nnArneafluorophores donneurs, ou les mêmes fluorophores accepteurs. Certains couples partagent un conjugué fluorescent, autrement dit un des 20 conjugués fluorescent va avoir plusieurs partenaires de FRET. Par exemple, un premier couple peut être constitué d'un membre flurophorel-sondel et d'un membre fluorophore 2-sonde 2, et l'autre couple peut être constitué d'un membre fluorophorel-sondel etf!uorophore 3-sonde 3. 25 Certains couples peuvent comporter les mêmes fluorophores mais dans ce cas ils diffèrent par leur sondes : Par exemple, un premier couple peut être constitué d'un membre flurophorel-sondel et d'un membre fluorophore2-sonde 2, et l'autre couple peut être constitué d'un membre Ouorophona1-sonde3etMuorophore3-sonde 4. 30 Dans les procédés selon l'invention, chaque suppresseur de signal de FRET utilisé est spécifique d'un Seul couple de partenaires de FRET. Ceci est une des caractéristiques essentielles de l'invention permettant de différencier les signaux correspondant à chaque événement biologique que l'on souhaite 35 étudier. 23 Les techniques de FRET en temps résolu offrent des avantages certains pour l'étude d'événements biologiques ayant lieu dans des milieux biologiques. Ainsi, dans une mise en oeuvre particulière des procédés selon l'invention, les conjugués fluorescents partenaires de FRET sont partenaires de TR-FRET (en 5 langue anglaise Time Resolved FRET ). L'étude d'évènements biologiques peut nécessiter une étape de stimulation du milieu ré c ionnel afin de déclencher ou faire varier les évènements biologiques que l'on souhaite étudier. Cette stimulation peut être, notamment, 10 de nature chimique, pharmacologique, électrique, thermique ou mécanique. Par exemple, si l'événement biologique étudié est la production d'un analyte dans une cellule en réponse à la stimulation d'un récepteur transmembranaire, il sera nécessaire d'ajouter un agoniste dudit récepteur. Dans une mise en oeuvre particulière, l'étape de stimulation consiste à 15 rajouter au milieu ré ctionnel un agoniste, un antagoniste, un modulateur allostérique ou un agoniste inverse d'un récepteur donné. Dans la mesure où les procédés selon l'invention permettent d'étudier plusieurs événements biologiques dans un même milieu réactionnel, il peut être nécessaire d'effectuer plusieurs stimulations. 20 Par ailleurs, une même stimulation peut activer plusieurs voies de signalisation parallèles ou encore une cascade de voies de signalisation et donc plusieurs évènements biologiques détectables grâce aux procédés selon l'invention. Dans ce cas, ces procédés ne comprendront qu'une seule étape de 25 stimulation qui provoquera une variation des différents évènements biologiques à détecter. On peut citer l'exemple d'une stimulation pharmacologique entraînant l'activation de protéines kinases (évènement biologique 1) qui vont elles-mêmes entraîner la phosphorylation de protéines (événement 2). 30 Les procédés selon l'invention permettent de détecter plusieurs évènements biologiques et donc bien sur leur variation en présence d'agents dont on veut déterminer l'effet sur plusieurs évènements biologiques ayant lieu dans le milieu réactionnel. Les procédés selon l'invention peuvent donc être 35 avantageusement utilisés dans une méthode de criblage de composés biologiquement actifs qui peuvent être utiles, par exemple, comme 24 médicaments. Pour cela, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape d'ajout d'un composé à tester dans le milieu réactionnel. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre dans divers milieux 5 réactionnels, en particulier des milieux comprenant un mélange de composés biologiques, tels qu'un mélange de protéines, d'anticorps, d'acides nucléiques, de messagers intracellulaires, extracellulaires etc... Le milieu né c1ionnel peut également contenir des cellules provenant de cultures cellulaires, des cellules obtenues par dissociation de tissus, des cellules perméabilisées, des broyats 10 cellulaires, des préparations de membranes. Le milieu réactionnel est par ailleurs contenu dans un contenant classiquement utilisé, par exemple un puit de microplaque, une chambre d'incubation cellulaire adaptable sur microscope. 15 L'homme du métier est à même de comprendre que le procédé selon l'invention ne saurait être limité à des milieux réactionnels particuliers du moment que ces milieux réactionnels comprennent les matériaux indispensables à l'étude des évènements biologiques visés : à titre d'exemple, si les évènements biologiques sont des réactions enzymatiques, le milieu 20 réac ionnel devra comprendre les enzymes et les substrats correspondants. Les procédés de multiplexage selon l'invention permettant de détecter de façon simultanée plusieurs événements biologiques sont particulièrement avantageux dans les applications suivantes : Détection de molécules sécrétées simultanément par des cellules. Par exemple, la détection des différentes cytokines sécrétées en réponse à une stimulation de la cellule permet d'affiner la compréhension des 38 mécanismes de communication inter-cellulaires : dans ce cas, les couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET seront chacun spécifiques d'une cytokine donnée. Un autre exemple consiste à détecter et quantifier les peptides béta-35 amyloïdes : chez les patients atteints par la maladie d'Alzheimer, une augmentation du ratio peptide amyloïde A8-42 / peptide A8-40 a été 25 25 observée. Les procédés de l'invention permettant de mesurer les différents peptides amyloïdes sécrétés par une même cellule ou culture cellulaire, ils facilitent grandement la compréhension des mécanismes de développement des plaques amyloïdes et la recherche de médicaments 5 susceptibles d'agir sur la concentration de chacun des peptides amyloïdes. En vue de cette application, les procédés selon l'invention comprendront l'utilisation de conjugués partenaires de FRET permettant de détecter ces peptides. 10 ~ Exploration parallèle de différentes voles de signalisation cellulaire (exemples : dosage simultané de seconds messagers ou autres Il est particulièrement intéressant dans l'étude des processus cellulaires de 15 pouvoir obtenir des informations sur les différentes voies de signalisation activées simultanément dans une cellule en réponse à une stimulation extracellulaire. Les procédés selon l'invention sont particulièrement avantageux pour 20 détecter simultanément les voies de signalisation impliquant les protéines Gs, Q, Gq ou G11/G12, et les petite protéines G Protéine Ras, Rho, Rab, Ran) Les voies de signalisation intracellulaires peuvent être mesurées 25 notamment en détectant les évènements suivants : - stimulation ou inhibition de Vadényl-cyclase par exemple en mesurant la quantité d'AMPc dans la cellule ; - activation de la phospholipase C, par exemple en mesurant la quantité dans la cellule de composés contenant des inositols (IP3, IP1, IP2 30 etc...), DAG ; - activation des kinases couplées aux RCPG (GRK) | - translocation de la béta-arrestine. L'homme du métier est familiarisé avec ces différentes voies de 35 signalisation, qui sont citées qu'à titre limitatif. Des conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifiques de chacune de ces voies de signalisation 26 peuvent être mis en oeuvre dans les procédés selon l'invention : ils peuvent être constitués d'un flurophore et d'anticorps spécifiques d'une molécule caractéristique d'une voie de signalisation donnée (IP3, AMPc etc...) marqués par des partenaires de FRET, ou bien d'une molécule 5 impliquée dans une de ces voies de signalisation, marquée par un composé fluorescent : béta-arnesUnecouplée à unDuorophore, sous-unité de protéine G, récepteur rnernbranairecouplé à unfluorophone. I! a été récemment montré que certains récepteurs membranaires, 10 notamment les RCPGg, entraînent l'activation de différentes voies de signalisation intracellulaire en fonction de l'agoniste qui se lie à leur domaine extracellulaire. Ce phénomène est connu sous le terme anglo-saxon de AgonistTnafficking . 15 Les procédés selon l'invention sont idéaux pour étudier ces phénomènes d Etude d'une cascade de signalisation cellulaire. La transmission du signal à l'intérieur de la cellule met le plus souvent en 25 oeuvre des cascades d'événements biologiques. Les procédés selon l'invention, en permettant la détection de ces évènements dans une même cellule ou une même population de cellules, fournissent une information bien plus complète que ceux ne mesurant qu'un seul événement : en mettant en évidence l'activation d'au moins deux événements connus pour 30 être impliqués dans une cascade de signalisation, il devient possible de caractériser de manière très précise le mode d'action d'un composé donné. Cela est particulièrement avantageux lorsque l'un des événements bio|ogiquesa plusieurs effets dans la cellule. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cascades de phosphory!ationdans la voie de signalisation des MAP Kinases. 27 Déorphelanisation de récepteurs dits "m orphelins : associer un RCPG à un ligand et à une voie de signalisation. Un certain nombre de récepteurs membranaires ont été identifiés depuis 5 l'avènement du séquençage massif des génomes, notamment du génome humain. Néanmoins pour environ 150 d'entre eux, aucun ligand naturel n'a été identifié et ces récepteurs sont dits orphelins . Les procédés selon l'invention facilitent l'identification de ligands de récepteurs orphelins d'une part, et d'autre part permettent de déterminer les voies de IO signalisation intracellulaires activées par un récepteur orphelin. Le procédé classique pour dé-orphe!aniser de tels récepteurs, c'est-à-dire, pour en identifier le ou les ligand(s) naturel(s), consiste à faire surexprimer ledit récepteur par des cellules et à rajouter au milieu de 15 culture un composé dont on veut savoir g'il est un ligand n turel dudit récepteur. La liaison du ligand potantiel peut être facilement mesurée par les techniques connues de l'homme du métier. Les procédés selon l'invention permettent d'appliquer cette approche à la 20 wdé-orphe!aniyaUon simultanée de plusieurs récepteurs orphelins : ces procédés permettent en effet de détecter de manière individuelle la liaison d'un ligand à différents récepteurs membranaires exprimés sur une même cellule ou population de cellules : pour cette application particulière des procédés selon l'invention, chacun des couples de conjugués partenaires 25 de FRET permettra de détecter la liaison d'un même ligand potentiel avec les différents récepteurs orphelins. Les molécules impliquées dans l'événement biologique sont dans ce cas un ligand potentiel d'une part, et différents récepteurs orphelins d'autre part. Les événements biologiques sont constitués par la liaison potentielle du ligand à chacun des récepteurs 30 orphelins. Dans la mesure où le même ligand pohentiel est impliqué dans différents évènements biologiques, il est particulièrement avantageux dans cette applicationprécise que les couples de partenaires de FRET aient un élément commun, en l'occurrence le conjugué comprenant ou reconnaissant le ligand. 35 28 Une autre approche visant à dé-orphelaniser un récepteur consiste à mesurer l'activation de différentes voies de signalisation intracellulaires par un procédé selon l'invention comme décrit ci-dessus, après la mise en contact de cellules surexprimant un récepteur orphelin avec un ligand 5 potant!el dudit récepteur, ce ligand étant introduit dans le milieu ré ctionnel au cours d'une étape de stinnu!ation: Ce type d'approche permet d'associer un ligand potentiel, un récepteur orphelin et une voie de signalisation. 10 L'invention concerne également un nécessaire de composants (kit of parts en langue anglaise) permettant de mettre en oeuvre le procédé selon l'invention : un tel nécessaire comprend au minimum les éléments suivants, fournis ensemble ou séparément : - au moins deux couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET 15 spécifiques d'événement biologiques ; - au moins un agent suppresseur du signal FRET. Un nécessaire de composants selon l'invention peut en outre contenir des instructions décrivant un protocole de mise en contact dans le milieu 20 réactionnel des différents couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET, ainsi que des instructions pour la suppression séquentielle des phénomènes de FRET dans le milieu réactionnel par l'ajout de suppresseurs du signal FRET. 25 Formats Théoriques : Le procédé de multiplexage, selon l'invention, peut être mis en oeuvre selon plusieurs formats : 30 (i) Format 1 : reconnaissance spécifique d'une partie du conjugué donneur par un agent suppresseur du signal FRET et suppression du FRET; Fornlat2 : reconnaissance spécifique d'une partie du conjugué accepteur par un agent suppresseur du signal FRET et suppression du FRET ; (tif) Fornnat3 : reconnaissance spécifique d'une partie du conjugué accepteur 35 par un agent suppresseur du signal FRET et suppression du eignal de FRET. 29 (i) Format 1 : reconnaissance spécifique d'une partie du conjugué donneur par un agent suppresseur du signal FRET et suppression du FRET. 5 Le schéma ci-dessous illustre un exemple de mise en oeuvre de ce format de multiplexage pour la détection de deux analytes )(et Y. Ce format repose sur l'utilisation de : deux donneurs, Cl et D2, excitables par un même stimuli (par exemple une même longueur d'onde d'excitation lumineuse), 10 p un accepteur A commun aux deux donneurs, et un agent suppresseur du signal FRET capable de reconnaître spécifiquement un des deux donneurs et de supprimer le FRET entre ce donneur et l'accepteur. Etape ~ Reconnaissancede DI par le produitFk et extinction du FRE7DrA. Détection de rpar le FRET DrA. 15 Dans une première étape, !'ana!yte)fest détecté par le FRET entre le donneur CI et !'accepteurA portés par deux anticorps spécifiques de l'analyte X. Dans une deuxième étape, le produit Fk reconnaît spécifiquement le donneur DI et 20 supprime le FRET entre CI et l'accepteur A. La suppression du FRET éteint le Signa! engendré par la présence de l'analyte X. Simultanément, !'ana!yLe Y est détecté par le FRET entre le donneur D2 et l'accepteur A, portés par deux anticorps spécifiques de l'analyte Ce format est mis en oeuvre dans l'exemple Z. E ap'1: Détection deX par ùmaTDrA 25 30 (H) Format 2 : reconnaissance spécifique d'une partie du conjugué accepteur par un agent suppresseur du signal FRET et suppression du FRET. 5 Le schéma ci-dessous illustre un exemple de mise en oeuvre de ce format de multiplexage pour la détection de deux ana!ytesX et Y. Ce format repose sur l'utilisation de : w deux accepteurs, AI et A2, détectables à la même longueur d'onde ; un donneur D commun aux deux accepteurs ; 10 et un agent suppresseur du signal FRET capable de reconnaître spécifiquement un des deux accepteurs et de supprimer le FRET entre le donneur et cet accepteur. Etape u Reconnaissance de AI par le produit Fk et extinction du FRET D-Al. Détection de Y par le FRET D-A,. 15 Dans une première étape, !'anak/be)(est détecté par le FRET entre le donneur D et l'accepteur AI portés par deux anticorps spécifiques de l'analyte X. Dans une deuxième étape, le produit Fk reconnaît spécifiquement l'accepteur AI et supprime le FRET entre D et Al. La suppression du FRET éteint le signal 20 engendré par la présence de l'analyte X. Simultanément, l'analyte Y est détecté par le FRET entre le donneur D et l'accepteur A2, portés par deux anticorps spécifiques de l'analyte Y. Ce format est illustré par l'exemple 5. xupe1: Détection de X par le FRET D-Al 31 (iii) Format 3 : reconnaissance spécifique d'une partie du conjugué accepteur par un agent suppresseur du signal FRET et suppression du signal de FRET. 5 Le schéma ci-dessous illustre un exemple de mise en oeuvre de ce format de multiplexage pour la détection de deux analytes X et Y. Ce format repose sur l'utilisation de : * deux accepteurs, /4z etAz détectables à la même longueur d'onde ; o un donneur D commun aux deux accepteurs ; 10 * et un agent suppresseur du signal FRET capable de reconnaître spécifiquement un des deux accepteurs et de supprimer le signal de FRET de cet accepteur. Etape a Reconnaissance de A, par le produit Fk et extinction du signal du FRET D-Al. Détection de Ypar le FRET D-A2. 15 Dans une première étape, !'ana!yteX est détecté par le FRET entre le donneur D et l'accepteur AI portés par deux anticorps spécifiques de !'ana!yte)i Dans une deuxième étape, le produit Fk reconnaît spécifiquement l'accepteur AI et supprime le signal de FRET de Al. Simultanément, l'analyte Y est détecté par 20 !e FRET entre le donneur D et l'accepteur A2, portés par deux anticorps spécifiques de l'analyte Y. /aw,1: Détection de X par le FRET D-Al 32 L'invention va être décrite plus en détail par les exemples illustratifs ci-après dans lesquels il est fait référence aux figures 1A, 1B, 2-7 dont une brève description est donnée ci-après : 5 Brève description des fiuures : Figure 1A : Suppression du signal de FRET par un anticorps anti-cryptate . . Après une étape de détection de la protéine PSZ-{SST par le FRET entre le TBP et l'accepteur A647 (graphe I), des concentrations croissantes d'anti-TBP ont 10 été ajoutées au volume réactionnal et le signal de l'accepteur engagé dans le FRET a été suivi au cours du temps (graphe II. Losanges : antiTBP 6nM ; triangles : antiTBP ]UnM; carrés : antiTBP 15OnM). A des concentrations adaptées, le signal de l'accepteur engagé dans le FRET disparaît rapidement 3Ornin). Cette extinction du signal de l'accepteur découle de l'interaction 15 entre !el-BP et !'antil[BPqui supprime le FRET, comme cela est montré par l'expérience présentée dans la figure IB. Figure 1B : La même expérience que celle présentée dans la figure 1A a été conduite en utilisant le donneur TBP5COOH et le même accepteur A647. Après 20 avoir détecté PS2-{5ST par le FRET entre le TBP5COOH et l'accepteur A647 (graphe I), des concentrations croissantes d'antiTBP ont été ajoutées au volume réactionnml et le sign l de l'accepteur engagé dans le FRET a été suivi au cours du temps (graphe II : cercles : absence d'antiTBP ; losanges : antiTBP 6nM ; triangles : antiTBP 3OnM; carrés : antiTBP 15OnM\. Le signal 25 de l'accepteur engagé dans le FRET ne diminue pas, quelle que soit la concentration en antiTBP. Exemple de multidétection de deux protéines par reconnaissance d'un donneur et suppression du FRET : Après une étape de détection de la 30 protéine PS2-GST par le FRET entre le TBP et !'accepteurXL655 (graphe D, l'antiTBP et le deuxième anticorps pour la détection du TNFa sont ajoutés. L'antiTBP reconnaît spécifiquement le TBP,Supprirne le FRET entre le TBP et la XL665 et éteint ainsi le signal de la PS2-GST. Simultanément, le TNFa est détecté par le FRET entre le TBP5COOH et la XL665 (graphe II, barres 35 foncées), portés par deux anticorps spécifique du TNFa. Les signaux obtenus 33 dans l'essai en multidétection (graphe II, barres foncées) sont comparables à ceux obtenus dans un essai de simple détection (graphe II, barres gris clair). Figure 3 : Exemple de multidétection des peptides amyloides AB-40 et A0-42 5 par reconnaissance d'un donneur et suppression du FRET : Après une étape de détection du peptide A8-42 par le FRET entre le TBP et l'accepteur d2 (graphe I), l'antiTBP et l'anticorps pour la détection spécifique du A8-40 sont ajoutés. L'antiTBP reconnaît spécifiquement le TBP, supprime le FRET entre le TBP et d2 et éteint ainsi le aignal du A8-42. Simultanément, le A8-40 est 10 détecté par le FRET entre un autre type de cryptate d'europium K (porté par un anticorps spécifique du A0-40) et d2 (graphe II, barres foncées). Les signaux obtenus dans l'essai en multidétection (graphe II, barres foncées) sont comparables à ceux obtenus dans un essai de simple détection (graphe II, barres gris clair). 1.5 Figure4 : Après une étape de détection du TNRz par le FRET entre un donneur cryptate d'europium et la sonde accepteur aSl-Cy5 (graphe 1), des concentrations croissantes d'oligonucléotide eSl ont été ajoutées au volume réac ionnal et le signal de l'accepteur engagé dans le FRET a été suivi au 20 cours du temps (graphe II : cercles : eSl 8nM ; losanges : eS1 2Ony4| triangles : aSl 1OOnM ; carrés : eS1 200nM). Les o!igonu!céntidemaS1 eteS1 sont complémentaires. Les concentrations finales de eSi et de aSl-Cy5 sont de 2nM et 4nM respectivement. A des concentrations adaptées, le signal de l'accepteur engagé dans le FRET disparaît complètement et rapidement 25 3Urnin\. Figure 5 : Exemple de multidétection de deux protéines par reconnaissance d'une partie du conjugué accepteur et suppression du FRET. Après une étape de détection de TNFa par mesure du FRET (graphe 1), les produits eSl et 30 aS2-Cy5 sont ajoutés. L'oligonucléotide eSl reconnaît spécifiquement la séquence aS1 et découple la sonde aSl-Cy5 de l'anticorps anti TNFa, supprimant ainsi le FRET dû à la présence de TNFa. Simultanément, la sonde aS2-Cy5 s'hybride à la séquence S2, ce qui permet la détection de la protéine PS2-GST. Les signaux obtenus dans l'essai en multidétection (graphe II, 35 barres foncées), sont similaires à ceux obtenus dans un essai en simple détection (graphe II, barres claires). 34 Figure 6 Utilisation d'un ion divalent ou d'un aqent chélatant comme agent suppresseur de FRET : 5 Figure 7 : Utilisation de l'acide urique comme agent suppresseur de FRET Les abréviations utilisées dans ces exemples ont les significations ci-après : - PS2-GST: désigne une protéine de fusion comprenant la protéine PS2 10 (décrite notamment dans le brevet EP 345 ]15) et la protéine GST (glutathion-S-transférase). Une telle protéine de fusion est produite selon les techniques classiques de biologie moléculaire, par exemple à l'aide d'un système d'expression tel qu'un plasmide comprenant la séquence d'acides nucléiques codant pour cette protéine de fusion. Les séquences 15 de !aPS2 et de la GST sont connues. - TBP : désigne !ecryptatetris-bipyridine. - TBP5COOH : désigne cryptate tris-bipyridine penta-acide. - PBP4COOH : désigne le cryptate pyridine-bispyridine tétra-acide. - A647 : désigne le Ouonophorea!exaG47 de la société Molecular Probe. 20 - XL665 : Allophycocyanine réticulée, utilisé comme fluorophore accepteur, commercialisée parCI6 bio international. - d2 : composé fluorescent accepteur ayant les mêmes caractéristiques photophysiques que XL665. - Cy5 : Cyanine 5, fluorophore accepteur commercialisé par la société GE 25 Healthcare. Dans ces exemples, on a utilisé les anticorps suivants qui sont spécifiques de divers antigènes connus et ont été préparés à l'aide des techniques 30 - Anticorps GSS11 : désigne un anticorps monoclonal spécifique de la protéine GST. - Anticorps BCO4: désigne un anticorps monoclonal spécifique de la protéine PS2. 35 - Anticorps IPM3 : désigne un anticorps monoclonal spécifique du TNFa, différent de l'anticorps IPM2. 35 - Anticorps IPM2 : désigne un anticorps monoclonal spécifique du TNFa, différent de l'anticorps IPM3. - Anticorps G211 : désigne un anticorps monoclonal spécifique du peptide amyloïde Ag 1-42 5 - Anticorps 13E9 : désigne un anticorps rnonoc!onal spécifique du peptide amyloïde A8 1-40 - Anticorps 1E8: désigne un anticorps monoclonal reconnaisoantà la fois les peptides amyloïdes Af3 1-42 et 1-40. 10 Exemple 1 : Suppression du FRET entre un donneur et un accepteur par un acient suppresseur du sicmal FRET reconnaissant spécifiquement une partie du conluqué donneur Maure 1). 15 Un anticorps qui reconnaît spécifiquement un complexe de terre rare, le cryptate d'europium tris-bipyridine TBP a été produit selon les techniques classiques (anticorps antiTBP). Dans cet exemple, il est démontré que l'antiTBp reconnaît spécifiquement le cryptate d'europium TBP et supprime le FRET entre le TBP et son accepteur. 20 Protocole Deux expériences identiques visant à détecter une protéine de fusion PS2-GST ont été conduites. Dans chacune des expériences, une structure particulière de cryptate d'europium a été utilisée comme donneur de FRET : 25 soit le cryptate tris-bipyridine T8p soit le cryptate tris-bipyridine penta-acide TBP5COQH (figure 4). HO v ao R R TBP TBP5COOH 36 R est un groupe réactionnel classique permettant le couplage du cryptate avec la substance à marquer. Ces deux expériences sont illustrées par les figures 1A et IB. 5 La protéine de fusion P52-65T est distribuée dans une plaque 96 puits. Sa présence est détectée par un FRET entre le donneur (le TBP ou le TBp5CO{)8) (porté par l'anticorps GSS11) et l'accepteur A647 (porté par l'anticorps B[04), après incubation pendant 16h à température ambiante. Le signal émis par l'accepteur engagé dans le FRET (c'est-à-dire le signal de 10 l'accepteur suite à l'excitation sélective du donneur) est appelé S(665nm). Des concentrations croissantes de antiTBP sont ensuite ajoutées au temps t=O et !e signal S(665nm) de l'accepteur engagé dans le FRET a été suivi au cours du temps (température ambiante, = 20 C). 15 Concentrations finales : PS2-GST 500pM; GSS1 1 1.5nM; BC04 0.677nM| antiTBP 0,6nM,3OnMet15Ony4 Volume réactionnel final : 20Offl Tampon /phosphate 1OOrnM pH7.O,KF4OOrnM,BSAO.10/0 20 Les signaux ont été détectés sur un Rubystar (BMG Labtechnologies, excitation laser 337nm Résultats La figure 1A illustre les résultats de l'expérience conduite avec le TBP. 25 La protéine à détecter (PS2-GST) est reconnue par deux anticorps spécifiques portant le donneur TBP et l'accepteur A647. Suite à la reconnaissance de la protéine par les deux anticorps, le TBP et son accepteur se retrouvent en proximité. En excitant sélectivement le TBp/337nrn\, son énergie d'excitation est alors en partie transférée à l'accepteur par FRET. Ce transfert d'énergie 30 provoque une émission de fluorescence de l'accepteur (le signal S(665nm . L'apparition de l'émission de l'accepteur suite à l'excitation sélective du donneur permet de détecter la protéine. Après avoir ainsi détecté la protéine (figure 1A, graphe 1), l'anticorps antiTB/rest ajouté, au temps t=0/ au volume réactionnel. On observe alors l'extinction du Sign ! S/665nm>, c'8st-à-dipedu Gigna! de !'accepteur8ngagé dans le FRET (figure 1A, graphe II). 37 L'extinction de ce signal n'est pas due à une interaction de l'antiTBP avec l'accepteur utilisé, mais découle uniquement de la suppression du FRET suite à l'interaction spécifique de !'antiTBPavec le TEP. Pour prouver cela, la même expérience a été conduite en utilisant un donneur différent (le 5 TBP5{27O//au lieu du TBP\,et le même accepteur A647 (figure 1B). Le FRET entre le TBP5COOH et le A647 permet de détecter la protéine (figure 1B, graphe l). La présence de !'antiT8P ne modifie pas ce FREl[: le signal S(665nm) ne diminue pas, quelle que soit la concentration en anti-TBP (figure 1B, graphe H). La disparition du signal de l'accepteur observée avec le TBP 10 (figure 1A, graphe II) est donc bien due à la suppression du FRET entre le donneur TBP et l'accepteur suite à la reconnaissance spécifique du TBPp r Exemple 2 : Détection multiplexée de deux protéines, PS2ùGST et 15 TNFa -Suppression du FRET un agent se liant à un des fluorophores donneurs (figure 2). Cet exemple repose sur l'utilisation de deux donneurs excitables à la même longueur d'onde (le 7799 et le et un seul accepteur 20 commun détectable à 665nm (la protéine fluorescente XL665). L'agent suppresseur du signal FRET est l'anticorps antiTBP, qui reconnaît spécifiquement le TBP et supprime le FRET entre le TBP et son accepteur comme cela est montré dans l'exemple précédent. 25 Protocole L'expérience est illustré par la figure 2, pour la détection de deux analytes : la protéine PS2-GST et la protéine TNFa. Une gamme de concentrations de TNFa a été mesurée, après une première étape de détection de la protéine PS2-GST et extinction du signal de FRET 90 correspondant. Expérience de multiplexage Une gamme de concentrations de TNFa en présence d'une concentration fixe de PS2-GST est distribuée dans une plaque 96 puits. 38 La protéine PS2-G5Teot tout d'abord détectée par le FRET entre le cryptate d'europium TBP (porté par l'anticorps GSS11) et }'accepteurXL665 (porté par l'anticorps BC04), après incubation pendant 16h. à température ambiante. Les composés suivants sont ensuite ajoutés aux volumes réactionnels : 5 * l'antiTBP pour supprimer le FRET entre le TBP et la XL665 et donc le signal dû à la présence de la protéine PS2-GST ; et le deuxième anticorps pour la détection de la protéine 77VFm: l'anticorps IPM3 portant l'accepteur XL665 (l'anticorps IPM2 portant le donneur cryptate d'europium 7BP5{%]O8étant distribué dans l'étape I). 10 Après une incubation de 4h à température ambiante (pour permettre la reconnaissance du TNFa par l'anticorps spécifique IPM3), les signaux obtenus dans les puits contenant les différentes concentrations de TNFa sont mesurés. Expérience de contrôle : détection simple 15 Les signaux ainsi obtenus dans l'essai de multiplexage sont comparés avec les signaux obtenus dans un essai de détection simple du TNFa (c'est-à-dire la même expérience illustrée par la figure 2, mais en l'absence de PS2-GST). Concentrations finales des protéines et des anticorps: 20 PS2-GST 500pM ; GSSI1 1.5nM ; BC04 O.667nM ; antiTBP 15OnM| TNFa O, 10, 20, 40, 80 et 12OpM ; IPM2 0.33nM ; IPM3 O.8nM Volume réactionnel final: 2OOil Tan/pon: phosphate lOOmM pH 7.0, KF 400mM, BSA O.1% 25 Les signaux ont été détectés sur un Rubystar (excitation laser 337n Résultats Dans une première étape, la protéine PS2-GST a été détectée par le 30 FRET entre le TBP et l'accepteur XL665. Le signal du FRET S(665nnl), engendré par la présence de la protéine PS2-GST, est représenté par la barre de l'histogramme 1, figure 2. Dans une deuxième étape, ont été ajoutés aux volumes réactionnels l'anticorps antiTBP pour supprimer le FRET dû à la protéine PS2-GST, et le deuxième anticorps pour la détection du TNFa. Les 35 signaux détectés après l'addition de ces composés sont représentés par les barres foncées de l'histogramme II, figure 2. 39 Une expérience de contrôle a permis de valider cette expérience de multiplexage : Les résultats obtenus en multiplexage sont comparés avec ceux obtenus dans un essai de détection simple. Plus précisément la même expérience que celle illustrée dans le schéma de la figure 2 a été conduite, 5 mais en absence de la protéine PS2-GST. Dans cet essai à détection simple, aucun signal n'est à éteindre et les différentes concentrations de TNFa sont détectées directement. Les signaux obtenus sont représentés par les barres claires de l'histogramme II, figure 2 Les signaux issus du multiplexage sont comparables à ceux issus de la détection simple. 10 Af3-42 û Suppression du FRET par un aqent reconnaissant un des 15 fluoronhore donneurs (ficmre 3) Les peptides amyloïdes A/3-40 et Ag-42 sont impliqués dans la maladie d'Alzheimer. Dans cette maladie, la production du peptide neurotoxiqueA8-42 est favorisée par rapport à celle du A,6-40. Le peptide A/3-42 se différentie du 20 pepbdeAB-40 par la présence de deux aminoacides supplémentaires à une extrémité. La figure 3 illustre la détection multiplexée des peptides amyloïdes Afl'40 et A,3-42. L'expérience repose sur l'utilisation : o de deux conjugués donneurs (un conjugué pour la reconnaissance spécifique du peptide A/3-42 et portant un cryptate d'europium TBP et un 25 conjugué pour la reconnaissance spécifique du peptide Afl-40 et portant un cryptate d'europium différent, le TBP5COOH, également dénommé daprèacryptate d'europium K | o d'un seul conjugué accepteur pouvant reconnaître les deux peptides Afl-42 et ,48-42 / 30 • et de l'agent SupprasSeurdu signal FRET antiTBP. Protocole L'expérience est illustrée par !a figure 3: une gamme de peptide A8-40 a été mesurée, après une étape de détection du peptide A6- 42 et extinction 35 du signal de FRET correspondant. Expérience de multiplexage Une gamme de concentrations de A/-40 en présence d'une concentration fixe de A8-42 est distribuée dans une plaque 96 puits. Les deux peptides sont 5 reconnus par un anticorps (le 1E8) portant un accepteur (l'accepteur d2) commun aux deux donneurs utilisés dans cette expérience. Le peptide Afl-42 est également reconnu par un anticorps spécifique (le G211) portant un cryptate d'europium TEP. Après avoir ainsi détecté le peptide A/3-42 par le FRET entre le TBP et l'accepteur d2, les composés suivants sont ajoutés aux 10 volumes réactionnels : l'antiTBP pour supprimer le FRET entre le TBP et l'accepteur d2 et donc le signal dû à la présence du A/3-42 ; * et un anticorps (le 13E9) pour la détection spécifique du A6-40| cet anticorps portant le cryptate d'europium K qui n'est pas reconnu par 15 !'ant/TBP. Après une incubation de 3h à 40C (pour permettre la reconnaissance du Afl-40 par son anticorps), les signaux obtenus sont mesurés dans les puits contenant les différentes concentrations de Afl-40. 20 Expérience de contrôle : détection simple Les signaux ainsi obtenus dans l'essai de multiplexage sont comparés avec les signaux obtenus dans un essai de détection simple duAfl-4O (c'est à dire la même expérience que celle illustrée par la figure 3, mais en absence du peptide A/3-42). 25 Concentrations finales des peptides et des anticorps : Afl.- 42 3200pg/rn!; A,8-40 200, 400, 800 et 1200oo/nn! | 1E8 3.3nM ; G21I 0.8nM ; 13E9 0.34nM 30 Volume réactionnel final : 100111 Tàn7pnn: phosphate 5OrnM pH 7.4, KF 250rnM, BSA O.296, Tween 0.05%, EDTAO.Z5rnM Les signaux ont été détectés sur un RubySt r(8xcitation laser 337nm). 35 41 Résultats Dans une première étape, le peptide A/3-42 est détecté par le FRET entre le TBP et l'accepteur d2. L'accepteur d2 est porté par un anticorps reconnaissant les deux peptides, tandis que le donneur TBP est porté par un 5 anticorps reconnaissant spécifiquement le peptide A/3-42. Le signal S(665nm) de l'accepteur impliqué dans le FRET est représenté par la barre de l'histogramme 1, figure 3. Dans une deuxième étape, ont été ajoutés aux volumes réactionnels l'antiTBP (pour supprimer le signal dû au peptide A/3-42) et un anticorps qui reconnaît !0 spécifiquement le peptide A/3-40 et qui porte le cryptate d'europium K différent du TBP. Les signaux détectés après l'addition de ces composés sont représentés par les barres foncées de l'histogramme II, figure 3. Pour valider les signaux obtenus dans cette expérience de multiplexage, la même expérience que celle illustrée figure 3 a été conduite, mais en l'absence du 15 peptide A8-42. Dans cet essai de détection simple, aucun aignal n'est à éteindre et les différentes concentrations de A/3-40 sont détectées directement. Les signaux obtenus sont représentés par les barres claires de l'histogramme II, figure 3. Les signaux issus du multiplexage sont comparables à ceux issus de la détection simple. 20 Exemple 4 : Suppression du FRET entre un donneur et un accepteur par un agent sunpresseur du signal FRET agissant par découplaqe du fluorphore accepteur (figure 4). Cet exemple est relatif à un agent suppresseur du signal FRET qui agit en formant un complexe non-covalent avec l'un des conjugués partenaire de FRET, et va le découpler de l'événement biologique dont il est spécifique, par un mécanisme de compétition. 30 Nature et mode d'action de cet agent suppresseur du signal FRET Cet agent suppresseur du signal FRET est un oligonucléotide. La figure 4 illustre son mode d'action. Dans cet exemple, le conjugué fluorescent accepteur est constitué 35 d'une petite molécule organique fluorescente (une cy nineCy5) couplée à un oligonucléotide de séquence aS.1. Cette séquence s'hybride à une séquence 25 42 complémentaire SI couplée à un anticorps spécifique de la protéine à détecter. Après avoir détecté l'événement biologique par le FRET entre un conjugué donneur et ce conjugué accepteur, un oligonucléotide eS2 de 5 séquence complémentaire à a51 est ajouté au volume réactionnel. La séquence eS1 reconnaît spécifiquement la séquence a5l et déplace ainsi le conjugué fluorescent accepteur (aS1-Cv5) de l'anticorps spécifique de la protéine à détecter. Le déplacement du conjugué fluorescent accepteur supprime le FRET entre le conjugué donneur et le conjugué accepteur. 10 L'oligonucléotide a51 constitue un exemple d'agent suppresseur du signal FRET qui reconnaît spécifiquement une partie du conjugué accepteur et supprime le FRET. La spécificité de reconnaissance repose dans ce cas sur l'appariement de deux séquences complémentaires d'ADN. 15 Protocole La protéine 77VFoe a été distribuée dans une plaque 96 puits. Sa présence a été détectée par un FRET entre un donneur cryptate d'europium (porté par !'anticnrpsIPM2) et le conjugué accepteuraS1-[yS (qui se lie par appariement des brins complémentaires à !'anticorpsD,M3, comme précisé ci- 20 dessus). S(665nm) est le signal de l'accepteur engagé dans le FRET. Après avoir détecté la protéine, des concentrations croissantes d'u!igonudéotideeSl ont été apportées au temps t=0at !esigna! 5(66Snn) de l'accepteur engagé dans le FRET a été suivi au cours du temps (température ambiante). 25 Concentrations finales protéine et anticorps: TNFa15OpM ; IPM2 0.33nM ; IPM3 1.O7nM. Concentrations finales oligonucléotides: S1 2nM; aSl-CwS 4nM ; eSl 8, 20, 100 et 200ny4 30 Séquences : S1 3 , aSI 5 ' eSl 3'TTgATtGCgACCATtGTTCAgCATG5' les nucléotides en caractère minuscule sont des LNA (Locked 43 Volume réactionnel final: 300u Tbnpmn: HEPES 5OnmM pH 7.0, KF 400mM, BSA U.196| température ambiante Les signaux ont été détectés sur un Rubystar (excitation laser 337nm). 5 Résultats L'hybridation entre le conjugué accepteur aSI-Cy5 et la séquence SI portée par l'anticorps, permet de détecter la protéine par FRET (figure 4, 10 graphe I). Après avoir ainsi détectée la protéine, le produit eS2 est ajouté au volume réactionnel. En présence du produiteS2, on observe alors l'extinction du signal S(665nm) du conjugué accepteur engagé dans le FRET (figure 4, graphe H). L'extinction de ce signal est due au déplacement de du conjugué a5I-Cv5 pareS2. Le déplacement du conjugué accepteur supprime le FRET 15 entre les conjugués donneur et accepteur. ,Exemple 5 : Détection multiplexée de deux protéines, TNFot et PS2-20 ,GST - Suppression du FRET par découplage d'un des fluorophores ,accepteurs (figure 5), Cet exemple repose sur l'utilisation d'un seul donneur 1] (un cryptate d'europium) et de deux conjugués accepteurs /aS2-[v5 et aS2-Cv5\. Les 25 conjugués accepteurs sont constitués d'une cyanine couplée à une séquence oligonucléotidique aSl d'une part et aS2 d'autre part. L'agent suppresseurdu signal FRET est un oligonucléotide qui reconnaît spécifiquement une partie d'un des conjugués accepteurs et supprime le FRET, selon le mode d'action illustré dans l'exemple précédent. 30 Protocole La figure 5 illustre le principe de l'expérience de multidétection, pour la détection de deux protéines: T7V/a et PS2-GST. Une gamme de concentrations da/S2-6STa été mesurée après une étape de détection de la 35 protéine TNFaet extinction du signal de FRET correspondant. 44 Expérience de multiplexage Une gamme de concentrations PS2-GST est distribuée dans une plaque 96 puits en présence d'une concentration fixe de TNFa. Pour la détection de la première protéine (TNFa) , les composés suivants sont 5 introduits dans chaque puit : w un anticorps (IPM2) portant un donneur cryptate d'europium * et un conjugué constitué d'un anticorps (IPM3) portant un oligonucléotide Si. Le conjugué accepteur est constitué d'une Cy5 couplée à un oligonucléotide aSl qui s'hybride spécifiquement avec SI. 10 De façon similaire, pour la détection de la deuxième protéine (PS2-GST) nous avons utilisé * un anticorps (GSS11) portant un donneur cryptate d'europium * et un conjugué accepteur constitué d'un anticorps (8(]04) portant un oligonucléotide S2. Le conjugué accepteur est constitué d'une Cy5 couplée 15 à un o!igonudéoUdeaf2 qui s'hybride spécifiquement avec S2. Dans une première étape, tous les anticorps ainsi que le conjugué accepteur a52-Cv5 ont été distribués dans les puits. Après incubation pendant 16h. à température ambiante, la protéine TNFa est détectée en mesurant le signal de FRET émis par chaque puit. 20 Dans une deuxième étape, les composés suivants sont introduits dans les puits : o !\u!igunudéotidee51, de séquence parfaitement complémentaire ëa52 * et le conjugué accepteur aS2-Cy5. L'oligonucléotide eS2 s'hybride spécifiquement avec aS1 et déplace ainsi la 25 sonde aSI-Cv5 du conjugué accepteur ; le FRET n'a plus lieu et donc le signal de la protéine TNFa disparaît. Simultanément, la sonde a52-Cv5 s'hybride avec S2 et permet d , Expérience de contrôle : détection simple Les signaux ainsi obtenus dans l'essai de multiplexage sont comparés avec les 35 signaux obtenus dans un essai de détection simple de la /S2-G5T/c\ast-à- dire la même expérience que celle illustrée dans la figure 5, mais en absence de TNFa). Concentrations finales protéine et anticorps: 5 TNFa8OpM ; IPM2 0.33nM ; IPM3 1.O7ny1 ; PS2-GST 0, 75, 150, 250, 350 et500po4 ; SSI1 1n 4 ; BC040.69nM Concentrations finales o/igonuc/éob*des S1 2nM; aSl-Cy5 4nM ; eS2 1OOnM S2 2nM ; aaS2-Cw,5 2OnM 10 Séquences : SI 37-FGAJ-7TCGACAATTGTT5' aSl 5'AA[3AACGCTGGTAACAAGTCGTAC3' eSl 37ToATtGCgACCATtGTTCAgCAJG5' les nucléotides en caractère minuscule sont des LNA (Locked Nucleic 15 Acids) | S2 3YTATT'GGTAGlTCCAGAT5' aS2 51ATAACCATCAAGGTCTA3' Volume réactionnel final / 200p!. Tan7pon: HEPES 5OrnM pH 7.0, KF 400mM, BSA 0.1% ; température 20 ambiante. Les signaux ont été détectés sur un RUBYstar(exdtation laser 337nm). Résultats 25 Dans une première étape, la protéine TNFa est détectée via l'hybridation de la smndeaSl-[\.5 avec SI: le signal S(665nm) du conjugué accepteuraSI-Cv5 engagé dans le FRET est représenté dans l'histogramme 1, figure 5. Dans une deuxième étape est ajouté !'o!igonudéotide suppnasseurdu signal FRET e5l et le conjugué accepteur aS2-Cy5. Les signaux détectés 30 après l'addition de ces produits sont représentés par les barres foncées de l'histogramme II, figure 5. Pour valider cette expérience de multiplexage, les signaux ainsi obtenus sont comparés avec ceux obtenus dans un essai à détection simple, c'est-à-dire un essai comme celui illustré figure 5, mais en absence de /a 35 protéine 77VFx Dans cet essai de détection simple, aucun signal n'est à éteindre et les différentes concentrations de PS2-GST sont directement 5 46 détectées. Les signaux de l'essai de détection simple sont représentés par les barres claires de l'histogramme II, figure 5: ils sont comparables avec ceux obtenus dans l'essai de multidétection. Exemple 6 : Utilisation d'un ion divalent ou d'un apent chélatant comme ai:lent suppresseur du FRET entre un donneur et un accepteur (fipure 61 10 Dans cet exemple, il est démontré que l'ion manganèse ou un agent chélatant de type EDTA sont capables de supprimer sélectivement le FRET existant entre un donneur de type complexe de terre rare et un accepteur. 15 Protocole Deux expériences identiques visant à détecter une protéine GS7-b/obneont été conduites. Dans chacune des expériences, un complexe de terre rare particulier a été utilisé comme donneur de FRET : soit le cryptate tris- 20 bipyridine TBP soit un chélate de terbium commercialisé sous forme conjugué à un anticorps anti-GST par la société Invitrogen (Cat n PV3568). La protéine GST biotinylée a été distribuée dans une plaque 96 puits. Sa présence a été détectée par un FRET entre le donneur (le TBP ou le chélate de terbium) (portés par un anticorps anti-GST) et l'accepteur d2 (porté par la 25 streptavidine), après incubation pendant 16h à température ambiante en présence ou en absence de 2OnnM de chlorure de manganèse (MnCl2) ou d'EDTA. [}n effectue une mesure de fluorescence en temps résolu (td = 5Opy, tg = 400ps) à 620nrn et 665nm (respectivement E620 et E665) sur un appareil Rubyytan0 (BMG Labtech). A partir des valeurs d'intensité de 30 fluorescence, E020 et E665, on calcule le rapport d'intensité E665/E620 dénommé ratio que l'on multiplie par 10 000 pour plus de commodité. Les valeurs de delta FSont calculées par rapport au ratio mesuré dans un puits négatif ne contenant pas la GST biotinylée (cf G. Mathis, Clin. Chem. 39 (1993) 1953 et la demande VVO92/13264). Afin de comparer les deltas F 35 obtenus dans les différents milieux pour un même donneur, ceux-ci sont normalisés par rapport au delta F obtenu en tampon (10096). 47 Concentrations finales : S0'biotinylée 1.25nM|anti-GST 2nM; Streptavidine 5nM; MnCIzou EDTA 2OmM Volume réa ctionnel final: 2UOu 5 Tampon / phosphate 1OOrnM pH 7.0, KF4OOnnM, BSA 0.1% Résultats La figure 6 illustre les résultats obtenus dans les deux expériences. 10 L'ajout de 2OnnM de MnC!zou d'EDTA ne modifie pas le signal de FRET (delta F normalisé) obtenu avec le donneur TBP en présence de GST biotinylée. A l'inverse, le MnCl2 ou I'EDTA agissent comme suppresseurs de FRET (signal de FRET inhibé de plus de 7096\ si l'on utilise le chélate de terbium comme donneur pour détecter la GSTbioUny/ée. Le reste des composants de l'essai 15 étant identiques, on peut en conclure que ces deux suppresseurs de FRET ont agit sélectivement sur le chélate de terbium. 20 Exemple 7 : Utilisation d'un composé chimique, l'acide urique comme aqent suppresseur du FRET entre un donneur et un accepteur. Dans cet exemple, il est démontré que l'acide urique est capable de supprimer sélectivement le FRET existant entre un donneur de type complexe de terre 25 rare et un accepteur. Protocole Deux expériences identiques visant à détecter une protéine GST-biotine ont 30 été conduites. Dans chacune des expériences, un complexe de terre rare particulier a été utilisé comme donneur de FRET : soit le cryptate tris-bipyridine TBP soit un cryptate pyridine-bis(bipyridine) PBP4Cl]O8 de formule : 48 R R est un groupe réactionnel classique permettant le couplage du cryptate avec la substance à marquer. 5 La protéine GSTbioUnvée a été distribuée dans une plaque de 96 puits. Sa présence a été détectée par un FRET entre le donneur (le TBP ou PBP4COOH) (porté par l'anticorps anti-GST) et l'accepteur d2 (porté par la streptavidine), après incubation pendant 16h. à température ambiante en présence ou en absence de 6OpM d'acide urique. On effectue une mesure de fluorescence en 10 temps résolu (td = 5Opo, tg = 400ps) à 620nnn et 665nm (respectivement E620 et E665) sur un appareil Rubystar@ (8 4G Labtech). A partir des valeurs d'intensité de fluorescence, E630 et E665, on calcule le rapport d'intensité E665/E620 dénommé ratio que l'on multiplie par 10 000 pour plus de commodité. Les valeurs de delta F sont calculées par rapport au ratio mesuré 15 dans un puits négatif ne contenant pas la {]S7-biotinylée (cf G. Mathis, Clin. Chem. 39 (1993) 1953 et la demande W092/13264). Afin de comparer les deltas F obtenus dans les différents milieux pour un même donneur, ceux-ci sont normalisés par rapport au delta F obtenu en tampon (10096). 20 Concentrations finales : GST biotnylée 1.25nM|anti-GST 2nM; Streptavidine 5nM; Acide Urique 60pM Volume réactionnel final : 200111 Tampon : phosphate 1O0rnM pH 7.0, BSAO.196 25 49 Résultats La figure 7 illustre les résultats obtenus dans les deux expériences. L'ajout de 6OpM d'acide urique ne modifie pas le aignal de FRET (delta F normalisé) obtenu avec le donneurPBP4C{}OH en présence de GSTbiotiny!ée. 5 A l'inverse, l'acide urique agit comme suppneaseurdm FRET (eignal de FRET inhibé de plus de 85%) si l'on utilise le TBP comme donneur pour détecter la GST biotinylée. Le reste des composants de l'essai étant identiques, on peut en conclure que ce suppnessaurde FRET agit sélectivement sur le cryptate d'europium TBP. 10 Références bibliographiques : Lynch BA, Minor C, Loiacono KA, van Schravendijk MR, Ram MK, Sundaramoorthi R, Adams SE, Ph!UipsT, Ho!t D, Rickles R], MacNeil IA 5 Sinnu!taneousassayofSrcSH3 andSH2dornainbindingusingdifferent vvave/engthfluorescence po/ahzation probes. Ana/ B/ochenn.1999 275(l):62-73 Blornnne! P, Han onGT,Voga! KW 10 Multiplexing fluorescence polarization assays to increase information content per screen: applications for screening steroid hormone receptors. JB/onno/5creen. 2004 9(4):294-382 Swartzman et Al. 15 An homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using Muoronnetriornicrovo!urneassaytechno!ogy. Ana/. Biochem. 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Procédé de détection d'au moins deux évènements biologiques dans un milieu réactionnel, comprenant les étapes suivantes : - introduction dans le milieu réactionnel d'au moins 2 couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET, chaque couple étant spécifique d'un des évènements biologiques étudiés, et la longueur d'onde à laquelle les conjugués fluorescents donneurs sont excités étant la même pour tous les couples, et la longueur d'onde à laquelle sont mesurés les signaux émis par les conjugués fluorescents accepteurs étant la même pour tous les couples ; introduction d'agents suppresseurs de signal de FRET capables de supprimer sélectivement le FRET entre deux partenaires donnés, ces composés étant introduits dans le milieu de manière séquentielle ; mesure de manière séquentielle des différents signaux de FRET émis par le milieu réactionnel. 2. Procédé de détection de n évènements biologiques dans un milieu réactionnel comprenant les étapes suivantes : (i) mise en contact du milieu réactionnel avec un premier couple de conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifiques d'un premier évènement biologique ; (ii) excitation du milieu réactionnel à la longueur d'onde Al ; (iii) mesure du signal de FRET émis par le milieu réactionnel à la longueur d'onde À2 et correspondant au premier événement biologique ; (iv) introduction dans le milieu réactionnel d'un agent suppresseur du signal de FRET spécifique du dernier couple de partenaires de FRET mis en contact dans le milieu ; (v) mise en contact du milieu réactionnel avec un couple de conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifiques d'un évènement biologique différent de celui ou ceux détecté(s) dans les étapes précédentes ; (vi) excitation du milieu réactionnel à la longueur d'onde À1 ; (vii) mesure du signal de FRET émis par le milieu réactionnel à la longueur d'onde À2, correspondant à l'événement biologique dont est spécifique le dernier couple de partenaires de FRET mis en contact dans le milieu ; les étapes (iv) à (vii) étant répétées (n-2) fois, n étant un nombre entier compris entre 2 et 10;les conjugués fluorescents partenaires de FRET comprenant un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur, À1 étant la longueur d'onde d'excitation des fluorphores donneurs et À2 étant la longueur d'onde d'émission des fluorophores accepteurs. 3. Procédé de détection de n évènements biologiques dans un milieu réactionnel comprenant les étapes suivantes : (i) mise en contact du milieu réactionnel avec les n couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifiques de n évènements biologiques ; (ii) excitation du milieu réactionnel à la longueur d'onde Àl ; (iii) mesure du signal de FRET émis par le milieu réactionnel et correspondant à l'ensemble des événements biologiques étudiés ; (iv) introduction dans le milieu réactionnel d'un agent suppresseur du signal de FRET spécifique d'un desdits couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET, le cas échéant différent de ceux introduits dans les étapes précédentes ; (v) excitation du milieu réactionnel à la longueur d'onde Al ; (vi) mesure du signal de FRET émis par le milieu réactionnel, correspondant à tous les évènements réactionnels moins ceux dont le signal a été bloqué dans une étape précédente) ; les étapes (iv) à (vi) étant répétées (n-1) fois, n étant un nombre entier compris entre 2 et 10, c'est-à-dire égal à 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, (vii) Détermination des valeurs de signal de FRET pour chacun des n événements biologiques, par la résolution mathématique des n équations obtenues dans les étapes (iii) et chacune des étapes (vi) ; les conjugués fluorescents partenaires de FRET comprenant un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur, Al étant la longueur d'onde d'excitation des fluorophores donneurs et À2 étant la longueur d'onde d'émission des fluorophores accepteurs. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de stimulation appliquée au milieu réactionnel, cette stimulation étant de nature chimique, pharmacologique, électrique, thermique ou mécanique. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'étape de stimulation consiste à rajouter au milieu réactionnel un agoniste, un antagoniste, un agoniste inverse ou un modulateur allostérique d'un récepteur donné. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que chacun des conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifique d'un événement biologique comprend un fluorophore lié de manière covalente à une sonde, cette sonde étant spécifique dudit événement biologique, et ladite sonde étant constitué d'une molécule impliquée dans cet événement, ou bien comprend un domaine de liaison à une molécule impliquée dans cet évènement. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la sonde est une molécule impliquée dans un événement biologique, choisie parmi : une protéine, un peptide, une enzyme, un substrat d'enzyme, un messager intracellulaire, un nucléotide cyclique, un phospholipide, un facteur de transcription, un composé comportant un cycle inositol, un acide nucléique, un oligonucléotide. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la sonde comprend un domaine de liaison à une molécule impliquée dans un événement biologique, et est choisie parmi : un anticorps ou un fragment d'anticorps ; un anticorps ou fragment d'anticorps antiétiquette (anti-tag) reconnaissant une étiquette (tag) greffée sur la molécule impliquée dans ledit évènement biologique; un aptamère ; un peptide ; une protéine ; un acides nucléique simple-brin pouvant s'hybrider avec un acide nucléique de séquence complémentaire greffé sur la molécule impliquée dans ledit évènement biologique. 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les fluorophores partenaires de FRET sont choisis dans le groupe suivant : les protéines luminescentes, telles que la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variants, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, la R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les fluorophores connus sous la dénomination BODIPY, les fluorescéines, les composés connus sous la dénomination AlexaFluor; les cryptates de terre rare, les chélates de terre rare (en particulier les chélates et cryptates d'europium, de terbium, de samarium, de dysprosium, de neodymium),les particules inorganiques luminescentes comme les quantum dots. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les agents suppresseurs du signal FRET sont des composés capables de se lier de manière spécifique à un des fluorophores du couple de partenaires du FRET que l'on souhaite supprimer, et provoquent une diminution d'au moins 70% dudit signal. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les agents suppresseurs du signal FRET se liant de manière spécifique à un fluorophore impliqué dans le FRET à supprimer sont choisis parmi : des protéines, notamment des anticorps ou des fragments d'anticorps, des peptides, ou des aptamères, chacun possédant un domaine de liaison pour l'un des fluorophores partenaires de FRET. 12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'un des conjugués fluorescents comporte un chélate ou un cryptate de terre rare, et en ce que l'agent suppresseur du signal FRET correspondant est choisi parmi : une protéine notamment un anticorps ou un fragment d'anticorps; un peptide; un aptamère, chacun possédant un domaine de liaison pour un chélate ou cryptate de terre rare. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'au moins un des conjugués fluorescents d'au moins un couple de partenaires de FRET est constitué d'un fluorophore couplé de manière covalente à un premier acide nucléique simple-brin, dont le brin complémentaire est fixé de manière covalente sur une molécule impliquée dans l'événement biologique dont ledit couples de partenaires de FRET est spécifique, ou sur une molécule reconnaissant une molécule impliquée dans ledit l'événement biologique, et en ce que l'agent suppresseur du signal FRET est un acide nucléique simple-brin dont la séquence est complémentaire audit premier acide nucléique simple-brin. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'au moins un des couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET comprend un chélate de terre rare, et en ce que l'agent suppresseur dudit signal de FRET est choisi parmi : un ion rentrant en compétition avec la terre rare pour la complexation avec le chélate de terre rare, tel que l'ion Mn2+, ou bien un agent chélatant rentrant en compétition avec le chélate de terre rare pour la complexation avec la terre rare, tel que l'EDTA.. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'au moins un des couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET comprend un chélate ou un cryptate de terre rare, et en ce que l'agent suppresseur dudit signal de FRET est un agent induisant des réactions d'oxydo-réduction au niveau de la terre rare, tel que l'acide urique. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'au moins un des couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET est sensible au pH en ce que l'agent suppresseur dudit signal de FRET est un agent modifiant le pH, tel qu'un acide ou une base. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que l'événement biologique est choisi parmi : une réaction enzymatique, (telle que les activités de type kinase, phosphorylase, transférase, hydrolase, lyases, ligases, isomérase, polymérase...), la présence ou la variation de concentration d'un analyte dans le milieu réactionnel (par exemple la présence ou variation de concentration de protéines, enzymes, substrats d'enzymes, messagers intracellulaires tels que les nucléotides cycliques (AMPc, GMPc etc...), phospholipides (PIP2, PIP3...), facteurs de transcription, composés comportant un cycle inositol (IP1, IP2, IP3, IP4...), acides nucléiques, facteurs de croissance), le rapprochement de deux molécules dans le milieu réactionnel, les modifications de conformations tridimensionnelles de molécules. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que les évènements biologiques détectés sont la présence de différentes cytokines sécrétées par une population de cellules dans le milieu réactionnel, et ce que les couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET sont chacun spécifique d'une seule cytokine. 19. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que les évènements biologiques détectés sont la présence des différents peptides R-amyloides dans le milieu réactionnel, et en ce que les couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET sont chacun spécifiques d'un seul peptide [3-amyloide, de préférence choisi parmi les peptides A[3-42 et A[3-40. 20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que les évènements biologiques détectés sont l'activation ou l'inhibition de voies de signalisation intracellulaire et en ceque les couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET sont chacun spécifiques d'une voie de signalisation. 21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que les voies de signalisation intracellulaires sont choisies parmi les voies de signalisation impliquant les protéines : Gs, Gi, Gq, G11/G12, et les petites protéines G Protéine Ras, Rho, Rab, Ran. 22. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que les voies de signalisation intracellulaires sont mesurées par la détection d'évènements choisis parmi : l'activation de l'adényl-cyclase, l'inhibition de l'adényl-cyclase, l'activation de la phospholipase C, l'activation de protéines G monomériques, l'activation des kinases couplées aux RCPG (GRK), la translocation de la béta-arrestine, 23. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que les évènements biologiques détectés sont la liaison de différents ligands potentiels pour un récepteur orphelin donné, et en ce que les couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET sont chacun spécifiques de la liaison d'un ligand potentiel avec ledit récepteur orphelin. 24. Agent suppresseur du signal FRET entre 2 fluorophores partenaires de FRET, caractérisé en ce qu'il possède un domaine de liaison à l'un desdits fluorophores, et en ce qu'il provoque une diminution d'au moins 70% du signal de FRET par rapport au signal émis en l'absence dudit agent. 25. Agent suppresseur du signal FRET selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : une protéine notamment un anticorps ou un fragment d'anticorps ; un peptide; un aptamère, chacun possédant un domaine de liaison pour l'un des fluorophores partenaires de FRET. 26. Agent suppresseur du signal FRET selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'un des partenaires de FRET est un chélate ou un cryptate de terre rare, et en ce que ledit agent étant choisi parmi : une protéine notamment un anticorps ou un fragment d'anticorps; un peptide; un aptamère, chacun possédant un domaine de liaison pour ledit chélate ou cryptate de terre rare.27. Agent suppresseur du signal FRET selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il est un anticorps anti-cryptate. 28. Nécessaire de composants (kit of parts en langue anglaise) caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants, fournis ensemble ou séparément : au moins deux couples de conjugués fluorescents partenaires de FRET spécifiques d'au moins deux événements biologiques, au moins un agent suppresseur du signal FRET. 29. Nécessaire de composants (kit of parts en langue anglaise) selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il comprend un agent suppresseur du signal FRET selon les revendications 24 à 27. 30. Utilisation du procédé selon l'un quelconque des revendications 1 à 3 pour le criblage de composés biologiquement actifs.