FR 2903601 A1 20080118 FR 0652900 A 20060711 PROCEDE D'OBTENTION D'UN PRINCIPE ACTIF AUGMENTANT LA LONGEVITE CELLULAIRE ET TISSULAIRE CUTANEE, PRINCIPE ACTIF ET COMPOSITIONS La présente invention se rapporte à un procédé d'obtention d'un principe actif issu de Myrtus communis, pour augmenter la longévité cellulaire et tissulaire et limiter l'apparition des signes du vieillissement cutané. L'invention concerne également le principe actif susceptible d'être obtenu par ce 5 procédé et les compositions cosmétiques associées. Avec l'augmentation de la durée de vie, on accorde de plus en plus d'importance au vieillissement de la peau. Femmes et hommes ont tendance à vouloir rester jeunes le plus longtemps possible et cherchent à retarder et limiter l'apparition des marques du vieillissement cutané, premiers signes extérieurs du 10 vieillissement. Le vieillissement est un processus complexe dépendant du déterminisme génétique, de mécanismes épigénétiques, et de diverses influences externes telles que le soleil, la pollution atmosphérique, l'alimentation, l'hygiène de vie, etc. La longévité et le déclin des cellules et des tissus de la peau sont donc sous 15 l'influence de nombreux facteurs. Pour prévenir efficacement le vieillissement cutané et limiter l'apparition des effets néfastes qui en découlent, il est important de retarder les phénomènes de sénescence cellulaire et de limiter la dégénération tissulaire. C'est pourquoi la présente invention propose un procédé d'obtention d'un principe 20 actif issu de Myrtus communis, capable de limiter et faire reculer l'apparition 2903601 2 des signes du vieillissement cutané en agissant sur au moins trois mécanismes moléculaires fortement impliqués dans la longévité cellulaire et tissulaire. Chez l'homme, le vieillissement est associé à une augmentation du taux de graisse corporelle. Récemment, il a été démontré que l'activation des protéines SIRT-1 réduit l'accumulation des graisses dans les tissus adipeux en réprimant un facteur de transcription participant à l'adipogenèse. En simulant une restriction calorique, SIRT-1 entraîne des effets bénéfiques au niveau de la longévité. Les SIRT-1 interviennent également dans diverses fonctions biologiques comme la transcription, la réparation de l'ADN, les processus d'apoptose et de sénescence cellulaire. Ce sont des régulateurs clés de la survie cellulaire. Or l'expression endogène des SIRT-1 décroît progressivement dans les fibroblastes humains vieillis. De fait, la présente invention a pour objectif de favoriser l'expression des gènes de longévité SIRT-1 et ainsi réduire les phénomènes de sénescence cellulaire et 15 augmenter la longévité des cellules et des tissus de la peau. Des facteurs épigénétiques sont aussi impliqués dans l'explication du déclin des fonctions au cours du vieillissement. C'est le cas notamment de la communication entre les cellules qui est essentielle à leur bon fonctionnement et donc garante de leur longévité. Elle est en effet 20 impliquée dans de nombreux mécanismes biologiques comme l'assimilation des nutriments, l'apoptose, la transmission d'informations, etc. Toute communication entre cellules et tissus passe par des récepteurs qui reconnaissent un messager et transmettent un message à l'intérieur de la cellule. Un aspect majeur de la transmission membranaire est la nécessité d'assembler 25 rapidement et efficacement tous les composants impliqués dans la transduction du signal. Cet assemblage est permis grâce à la présence de micro-domaines membranaires spécialisés, tels que les cavéoles, qui assurent le contact entre le récepteur et ses voies d'activation. Les cavéoles sont des structures spécialisées 2903601 3 enrichies en lipides caractérisées par la présence de protéines appelées cavéolines. Les cavéolines interagissent directement avec les molécules de signalisation telles que le récepteur de l'EGF (Epidermal Growth Factor), la protéine G, la protéine kinase C, etc. 5 Les cellules sénescentes sont caractérisées par l'altération de leur membrane entraînant un dysfonctionnement des équipement membranaires de signalisation. Ces cellules sénescentes ne réagissent plus aux facteurs de croissance type EGF ce qui conduit à la perte de leur capacité proliférative. Cette réponse limitée des cellules sénescentes à des stress intrinsèques ou extrinsèques est due à une 10 augmentation du taux de cavéoline au niveau des cavéoles qui provoque un dysfonctionnement de l'endocytose. L'état de sénescence des cellules peut être reversé en un état fonctionnel actif en restaurant les équipements membranaires de signalisation. Notamment, en limitant la formation des structures cavéoles, il est possible de restaurer les voies de signalisation régulées par l'EGF dans les cellules sénescentes et stimuler à nouveau leurs capacités prolifératives. Aussi, la présente invention se propose donc également de réduire l'expression des cavéolines dans les membranes des cellules de la peau et ainsi stimuler la signalisation cellulaire et limiter la sénescence cellulaire. Une des caractéristiques du vieillissement est le ralentissement du fonctionnement cellulaire pouvant conduire à la production de molécules modifiées et donc incapables d'effectuer normalement leurs tâches. Parmi ces modifications, la glycation est connue pour être l'une des causes principales du vieillissement de la peau. La glycation est l'ensemble des réactions qui se produisent en l'absence d'enzymes entre les sucres réducteurs, comme le glucose, et les groupements aminés libres des protéines. Elle entraîne la formation de liaisons croisées anormales et irréversibles entre les macromolécules matricielles via la formation 2903601 4 de résidus de glycation. Elle modifie ainsi les propriétés des macromolécules constitutives de la matrice extracellulaire, en particulier des collagènes. Les protéines glyquées perdent leur fonctionnalité biologique : les tissus cutanés se rigidifient et se sclérosent et le vieillissement tissulaire s'accélère. 5 C'est pourquoi, la présente invention vise également à bloquer la réaction de glycation des protéines impliquées dans le vieillissement accéléré, de façon à préserver la fonctionnalité des tissus cutanés et à augmenter la longévité tissulaire de la peau. Le principe actif selon la présente invention permet donc de retarder les 10 phénomènes de sénescence cellulaire de la peau et de limiter la dégénération tissulaire en agissant à la fois sur des facteurs génétiques et épigénétiques, à savoir : - en stimulant l'expression du gène de restriction calorique SIRT-1, - en contrôlant la signalisation intercellulaire, notamment en réduisant 15 l'expression de la cavéoline-1, et - en limitant le phénomène de glycation, en particulier la glycation du collagène. Ainsi en stimulant les mécanismes moléculaires fortement impliqués dans la longévité cellulaire et tissulaire, le principe actif selon l'invention permet de 20 préserver la fonctionnalité des tissus de la peau. Il limite la dégénération des tissus cutanés et l'apparition des signes du vieillissement au niveau de la peau. La présente invention est maintenant décrite en détail pour permettre de mieux appréhender les résultats obtenus regroupés en tableaux. 25 I/ PROCEDE D'OBTENTION DU PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION : Le procédé d'obtention du principe actif selon la présente invention comprend la succession des étapes suivantes : 2903601 5 - solubilisation de poudre de Myrtus communis dans l'eau en milieu acide, préférentiellement de poudre de feuilles de Myrtus communis, -hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanée(s) et/ou successive(s), -séparation des phases soluble et insoluble par filtration, centrifugation 5 ou décantation, inactivation par traitement thermique, - purification par clarification, concentration de la fraction active, - filtration, et 10 - filtration stérilisante. II/ Caractérisation du principe actif II.1/ Matières sèches On mesure le taux de matières sèches par passage à l'étuve à 105 C d'un 15 échantillon de poids initial donné jusqu'à obtention d'un poids constant. Le taux de matières sèches est compris entre 20 et 200 g/I, plus particulièrement entre 28 et 42 g/I. II.2/ Mesure du pH Le pH mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante 20 conduit à des valeurs comprises entre 3,0 et 6,0, plus particulièrement entre 3,5 et 4,5. II.3/ Détermination de la teneur en sucres totaux On utilise la méthode de DUBOIS (DUBOIS M. & al [1956], Analytical chemistry, 28, n 3 p 350-356). 25 En présence d'acide sulfurique concentré et de phénol, les sucres réducteurs donnent un composé jaune-orangé. A partir d'une gamme étalon, on peut déterminer le taux de sucres totaux d'un échantillon. 2903601 6 Le taux de sucres totaux du principe actif selon la présente invention est de 5 à 64 g/I, préférentiellement de 7 à 14 g/I. II.4/ Caractérisation des carbohydrates a. Dosage de sucres simples 5 Le taux de sucres simples est réparti en 35,3% de glucose, 30,2% d'acide galacturonique, 15,3% d'arabinose, 10,1% de galactose, 5,2% de rhamnose, 2,8% de xylose et 1,1% de mannose. b. Degré de polymérisation L'analyse de polymérisation montre que la fraction glucidique du 10 principe actif selon la présente invention est composé essentiellement de glucose et d'acide galacturonique présents sous forme d'oligosaccharides. Degré de Taux de polymérisation carbohydrates 5 71 % 5 200 5% II.5/ Détermination de la teneur en composés phénoliques Les composés phénoliques forment en présence de ferricyanure de 15 potassium des composés colorés, l'intensité de cette coloration étant proportionnelle à la quantité de composés phénoliques. En se rapportant à une gamme étalon d'acide gallique, en l'occurrence de 10 à 120mg/I, on peut déduire la quantité de composés phénoliques. Les résultats donnent 0,5 à 10,5g/I et plus particulièrement 0,9 à 2,3g/l. 20 II.6/ Caractérisation des composés phénoliques 2903601 7 La caractérisation et la quantification des composés phénoliques du principe actif selon la présente invention sont réalisées par HPLC, (High Performance Liquid Chromatography). Le chromatogramme du principe actif selon l'invention montre la présence 5 de composés hydroxybenzoïques et de flavonols, les proportions étant sensiblement de l'ordre des valeurs données dans le tableau suivant : Composés phénoliques Concentration identifiés Flavonols 14, 5% Hydroxybenzoïques 85, 5% dont 38% d'acide gallique III/ Evaluation de l'effet du principe actif obtenu selon l'invention 10 III.1/Evaluation de l'effet sur l'expression des SIRT-1 Cette étude a pour objectif d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur l'expression des SIRT-1, protéines impliquées dans la longévité. Cette étude est réalisée sur fibroblastes humains normaux et fibroblastes 15 humains sénescents, dont le vieillissement est induit par traitements successifs d'H2O2, selon le protocole opératoire qui suit. A J1, les fibroblastes sont ensemencés dans un milieu complet puis incubés à 37 C. A J4, le milieu de culture est éliminé et remplacé : 20 - pour les cellules jeunes, • par du milieu de culture pour le témoin non traité, • par du milieu de culture contenant le principe actif selon l'invention à 0,25%, 0,5% et 1%, pour les cellules sénescentes, 2903601 8 • par du milieu de culture contenant de l'H2O2 à 60pM, pour induire la sénescence, pour le témoin non traité, • par du milieu contenant de l'H2O2 à 60pM, pour induire la sénescence, et le principe actif selon l'invention à 0,25%, 0,5% 5 et1%. Les cellules sont ensuite incubées à 37 C. A J5, J6 et J7, les cellules sont traitées de la même manière qu'à J4. A J8, les extraits cellulaires sont récupérés par potterisation des cellules puis stockés à -80 C en attente du dosage des SIRT-1. 10 Le dosage des SIRT-1 est réalisé par Western Blot. Les résultats, donnés en pourcentage d'expression de SIRT-1 par rapport au témoin non traité sur fibroblastes humains normaux, sont présentés dans le tableau suivant : Expression des SIRT-1 (%) Fibroblastes humains Fibroblastes humains normaux sénescents Témoin (non traité) 100 77 Principe actif selon l'invention à 0,25% 102 88 Principe actif selon l'invention à 0,5% 111 97 Principe actif selon l'invention à 1% 136 108 On constate que l'expression des SIRT-1 par les fibroblastes 15 sénescents est réduite significativement de 23% par rapport aux fibroblastes humains normaux. Le principe actif selon l'invention dosé à 1% augmente significativement de 36% l'expression des SIRT-1 par les fibroblastes normaux et restaure significativement l'expression des SIRT-1 par les fibroblastes 20 sénescents. III-2/ Evaluation de l'effet sur l'expression des cavéolines1 2903601 9 L'objectif de l'étude est d'évaluer l'effet du principe actif obtenu selon l'invention sur l'expression des cavéolines-1, protéines impliquées dans la signalisation cellulaire. Cette étude est réalisée sur fibroblastes humains sénescents, dont le 5 vieillissement est induit par traitements successifs d'H2O2 en comparaison à des fibroblastes humains normaux. Le protocole opératoire est le suivant. A J1, les fibroblastes sont ensemencés dans un milieu complet puis incubés à 37 C. 10 A J4, le milieu de culture est éliminé et remplacé : - pour les cellules jeunes, par du milieu de culture pour le témoin non traité, - pour les cellules sénescentes, • par du milieu de culture contenant de l'H2O2 à 60pM, pour induire 15 la sénescence, pour le témoin non traité, • par du milieu contenant de l' H2O2 à 60pM, pour induire la sénescence, et le principe actif selon l'invention à 0,25%, 0,5% et 1%. Les cellules sont ensuite incubées à 37 C. 20 A J5, J6 et J7, les cellules sont traitées de la même manière qu'à J4. A J8, les extraits cellulaires sont récupérés par potterisation des cellules puis stockés à -80 C en attente du dosage des cavéolines-1. Le dosage des cavéolines-1 est réalisé par Western Blot. Les résultats, donnés en pourcentage d'expression de cavéolines-1 par rapport au témoin 25 non traité sur fibroblastes humains normaux, sont présentés dans le tableau suivant : 5 10 15 20 2903601 10 Expression des cavéolines-1 (%) Témoin non traité (fibroblastes normaux) 100 Témoin non traité (fibroblastes sénescents) 150 Principe actif selon l'invention à 0,25% 119 Principe actif selon l'invention à 0,5% 106 Principe actif selon l'invention à 1% 94 On constate que l'expression des cavéolines-1 par les fibroblastes sénescents est augmentée significativement de 50% par rapport aux fibroblastes humains normaux. Le principe actif selon l'invention dosé à 1% renormalise l'expression des cavéolines-1 par les fibroblastes sénescents. III.3/ Evaluation de l'effet sur la glycation du collagène Cette étude a pour objectif d'évaluer la capacité du principe actif selon l'invention à limiter la réaction de glycation du collagène. L'étude est réalisée selon le protocole opératoire qui suit. A JO, on prépare des échantillons à tester dans des tubes à hémolyse stériles - un témoin collagène non glyqué, contenant 25 1ml de collagène de queue de rat 3mg/ml, collagène glyqué, contenant ^ 1ml de collagène de queue de rat 3mg/ml, et ^ 0,3m1 d'une solution de glycolaldéhyde induisant la réaction de glycation, - un témoin positif, contenant • 1ml de collagène de queue de rat 3mg/ml, - un témoin à 143mM, 2903601 11 • 0,3ml d'une solution de glycolaldéhyde à 143mM, induisant la réaction de glycation, et • 32pl d'aminoguanidine à 3,39M, inhibiteur de la réaction de glycation, 5 - des essais produits, contenant • 1ml de collagène de queue de rat 3mg/ml, • 0,3ml d'une solution de glycolaldéhyde à 143mM, induisant la réaction de glycation, et • le principe actif selon l'invention à 1%, 2,5% et 5%. 10 Les échantillons sont incubés à 37 C à l'abri de la lumière pendant 14 jours. A J14, on mesure la fluorescence émise par les produits de glycation formés à l'aide d'un spectrofluorimètre. Les résultats, exprimés en pourcentage d'efficacité sont présentés dans le tableau suivant : Valeur de Efficacité (%) fluorescence Témoin collagène non glyqué 0 Témoin collagène glyqué 449 Témoin positif 189 -58 Principe actif selon l'invention 1% 376 -16 Principe actif selon l'invention 2,5% 300 -33 Principe actif selon l'invention 5% 268 -40 15 On constate que le principe actif selon l'invention inhibe la réaction de glycation du collagène. Cet effet est dose-dépendant. III.4/Etude des propriétés anti-rides Cette étude a pour objectif de quantifier in vivo l'efficacité anti-rides du 20 principe actif selon l'invention formulé à 4% en émulsion contre placebo. 2903601 12 Elle est réalisée sur 21 volontaires sains de sexe féminin d'âge compris entre 43 et 69 ans. L'efficacité anti-rides est mesurée par l'intermédiaire d'empreintes siliconées réalisées au niveau des pattes d'oie des volontaires. L'analyse de 5 ces empreintes à l'aide d'un prof ilomètre muni d'un analyseur d'images permet d'obtenir trois paramètres : le nombre de rides, la surface totale ridée et la longueur totale des rides. L'étude est réalisée selon le protocole ci-dessous. Entre J-15 et JO, les volontaires appliquent deux fois par jour une crème 10 placebo. A JO, on détermine deux zones cutanées symétriques au niveau des pattes d'oie, une destinée à être traitée par le placebo, l'autre par le principe actif, et on prend les empreintes sur ces deux zones. Entre JO et J27, le principe actif et le placebo sont appliqués deux fois 15 par jour. A J28, les empreintes sont prises sur les deux zones étudiées. Entre J28 et J55, le principe actif et le placebo sont appliqués deux fois par jour. A J56, les empreintes sont prises sur les deux zones étudiées. 20 Les résultats obtenus pour le principe actif par rapport à ceux obtenus pour le placebo sont exprimés en pourcentage dans le tableau qui suit : Variation/Placebo (%) J28 J56 Nombre de rides -16 -30 Surface totale ridée -33 -39 Longueur totale -25 -36 2903601 13 On constate qu'après 28 jours d'applications biquotidiennes en comparaison au placebo, le principe actif obtenu selon l'invention formulé à 4% en émulsion diminue à la fois le nombre de rides de 16%, la surface totale ridée de 33% et la longueur totale des rides de 25%. Après 56 jours la 5 diminution est de 30% pour le nombre de rides, de 39% pour la surface totale ridée et de 36% pour la longueur totale des rides. IV/ COMPOSITION COSMETIQUE INCLUANT LE PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION La présente invention couvre aussi les compositions cosmétiques incluant le 10 principe actif selon la présente invention dans différentes formes galéniques, notamment gel, solution, émulsion, crème.... Il convient alors d'analyser la stabilité des formes galéniques incluant le principe actif selon l'invention, ceci dans des proportions comprises entre 1 et 5 %. La stabilité est caractérisée par une absence de précipitation de l'actif, une 15 absence de crémage et une absence de déphasage. On peut citer des formulations ayant montré une stabilité physique incluant 5% de principe actif selon l'invention. - Carbopol : 0,5% avec Triéthanolamine qsp pl-I=6,5 - Phénonip : 0,7% - Principe actif : 5,0% - Eau:93,8% - Sépigel 305: 2,0% - Phénonip : 0,7% - Principe actif : 5,0% - Eau:92,3% - Montanov 202: 3,0% - Isopropyl palmitate : 12,0% Gel limpide : 20 Gel opaque : 25 Gel émulsionné : 2903601 14 - Phénonip : 0, 7% - Sépigel 305: 2,0% - Principe actif : 5,0% - Eau : 77,3% 5 Emulsion non ionique : - Montanov 202 : 3,0% - Simulsol 165: 2,0% - Isopropyl palmitate : 20,0% - Phénonip : 0,7% - Principe actif : 5,0% 10 - Eau : 69,3% Emulsion anionique : - Acide stéarique : 7,0% - Triethanolamine : 3,5% -Isopropyl palmitate : 20,0% - Phénonip : 0,7% 15 - Principe actif : 5,0% -Eau:63,8% Emulsion cationique : - Quaternium-82 : 5,0% - Alcool cétylique : 2,0% - Isopropyl palmitate : 15,0% 20 - Alcool cétéarylique : 1%, - PEG 100 stéarate : 1%, - Phénonip : 0,7% - Principe actif : 5,0% Eau : 71, 3% 25 De plus, des tests ont montré la compatibilité du principe actif avec les matières premières utilisées en cosmétique. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un principe actif cosmétique obtenu à partir de Myrtus communis pour augmenter la longévité des cellules et des tissus de la peau. 2. Procédé d'obtention d'un principe actif selon la revendication 1, 5 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - solubilisation de poudre de Myrtus communis dans l'eau en milieu acide, - hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanée(s) et/ou successive(s), - séparation des phases soluble et insoluble par filtration, centrifugation ou décantation, 10 -inactivation par traitement thermique, - purification par clarification, -concentration de la fraction active, - filtration, et - filtration stérilisante. 15 3. Procédé d'obtention d'un principe actif selon la revendication 2, caractérisé en ce que la poudre de Myrtus communs est de la poudre de feuilles de Myrtus communis. 4. Principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé par les paramètres suivants : 20 - taux de matières sèches compris entre 20 et 200 g/l, - pH compris entre 3,0 et 6,0, - teneur en sucres totaux comprise entre 5 et 64 g/I, et - teneur en polyphénols totaux comprise entre 0,5 et 10,5 g/l. 5. Principe actif selon la revendication 4, caractérisé par les 25 paramètres suivants : 2903601 16 - taux de matières sèches compris entre 28 et 42 g/l, - pH compris entre 3,5 et 4,5, - teneur en sucres totaux comprise entre let 14 g/l, - teneur en polyphénols totaux comprise entre 0,9 et 2,3g/I. - présence de glucose et d'acide galacturonique essentiellement sous forme d'oligosaccharides, et - présence de composés phénoliques sous forme d'hydroxybenzd ques et de flavonols. 6. Utilisation du principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 2 ou 3 pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à augmenter la longévité tissulaire et cellulaire cutanée. 7. Utilisation du principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 2 ou 3 pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à limiter l'apparition des signes du vieillissement. 8. Utilisation du principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 2 ou 3 pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à favoriser l'expression des gènes de la longévité SIRT-1. 9. Utilisation du principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé 20 selon l'une des revendications 2 ou 3 pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à favoriser la signalisation cellulaire en inhibant l'expression des cavéolines-1. 10. Utilisation du principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 2 ou 3 pour la fabrication d'une composition 25 cosmétique destinée à limiter la réaction de glycation du collagène.